FR 2880035 A1 20060630 FR 0453178 A 20041223 PROCÉDÉ DE DÉTECTION DE LA BIOCONTAMINATION D'UN COMBUSTIBLE LIQUIDE DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne un procédé de détection de la biocontamination d'un combustible liquide. Elle s'applique à tout combustible liquide, notamment aux combustibles domestiques tels que le fioule, et aux carburants, par exemple le gas-oil, l'essence pour automobile et les carburants destinés aux aéronefs et aux missiles. L'invention s'applique particulièrement à la détection de la biocontamination des carburéacteurs (en anglais jet fuels ) et plus particulièrement des kérosènes, et aussi de l'exo-THDCPD (exotétrahydrocyclopentadiène). ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE On sait que tout carburéacteur est contaminé par des microorganismes. Les spores de ces derniers engendrent une "bioglée" visqueuse qui peut conduire à des effets néfastes tels que: - l'augmentation de la consommation de carburéacteur, la diminution des performances énergétiques de celui-ci, - le colmatage de filtres du circuit d'alimentation en carburéacteur et le blocage de jauges, ce qui peut conduire à des informations erronées sur la quantité de carburant dans les réservoirs, et - la détérioration des revêtements de protection des fonds des réservoirs de carburéacteur et l'attaque des réservoirs structuraux en alliages légers, par corrosion intercristalline. Le contrôle de la biocontamination des réservoirs des avions permet de définir des traitements préventifs ou curatifs qu'il convient d'appliquer lors de l'entretien de ces avions. Actuellement, la détection de la biocontamination des carburéacteurs est réalisée au moyen d'un procédé de référence , qui est une méthode expérimentale bioanalytique de laboratoire. Ce procédé de référence consiste à isoler et à cultiver les souches de microorganismes, qui sont présentes dans un carburéacteur tel que le kérosène, à la surface d'une membrane filtrante microporeuse et stérile, de type écran. Ce procédé nécessite des moyens d'investigation tels que des dispositifs de stérilisation, de filtration, d'incubation et d'observation microscopique, que l'on trouve dans les laboratoires mais quasiment pas auprès des compagnies aériennes ou des organismes de contrôle de ces dernières. De plus, la mise en oeuvre de ce procédé de référence nécessite des expérimentateurs capables de faire des analyses microbiologiques et des observations microscopiques de colonies de souches de micro- organismes. En outre, ce procédé nécessite, au minimum, 48 à 72 heures d'incubation, pour l'obtention des premiers résultats d'analyse, et deux à trois semaines d'incubation pour l'obtention des résultats définitifs. Certes, on peut simplifier ce procédé en utilisant le système de filtration qui est commercialement disponible auprès de la Société Millipore sous la référence Milliflex-100. Néanmoins, ce procédé reste inadapté à une utilisation à proximité immédiate d'un avion et nécessite l'intervention de personnes ayant des compétences en microbiologie. EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention a pour objet un procédé peu coûteux, que l'on peut mettre en oeuvre à proximité immédiate d'un avion ou d'un réservoir de stockage et qui permet la détection rapide de la présence de microorganismes dans un carburéacteur. Remarquons que seule importe la détection de cette présence et qu'il n'est pas nécessaire d'identifier les microorganismes. Le procédé objet de l'invention permet alors non seulement de contrôler régulièrement le degré de contamination des carburéacteurs mais aussi d'effectuer des interventions précoces sur les réservoirs de tels combustibles, pour y effectuer des traitements préventifs ou curatifs, en ajoutant des produits biocides (fongicides et bactéricides) dans ces réservoirs. Plus généralement, l'invention résout le problème de la détection, d'une manière rapide et peu coûteuse, de la présence de microorganismes dans un combustible liquide. Pour résoudre ce problème, l'invention utilise la technique d'ATPmétrie et bioluminescence (en anglais bioluminescent ATPmetry ), plus simplement appelée ATPmétrie ou dosage de l'ATP, sur laquelle on reviendra par la suite. L'inventeur a trouvé que l'ATPmétrie était compatible avec un combustible liquide tel qu'un carburéacteur. En utilisant des systèmes d'ATPmétrie commercialement disponibles, il a en effet trouvé qu'une enzyme, la luciférase, n'était pas annihilée par un carburéacteur tel que le kérosène Jet A-1. Les systèmes d'ATPmétrie commercialisés par les Sociétés Prodemat, Merck et préférentiellement Euralam sont intéressants pour la mise en oeuvre de l'invention. Comme on le verra mieux par la suite, l'invention est simple à mettre en oeuvre, fournit rapidement une réponse (généralement en moins de 15 minutes) et permet de détecter les principaux microorganismes capables de vivre dans un combustible liquide tel qu'un carburéacteur, par exemple un kérosène, et l'exo-THDCPD, également appelé JP-10. De plus, l'invention est directement applicable là où se trouve le réservoir de combustible (par exemple à proximité immédiate d'un avion dont on veut contrôler le kérosène) et ne nécessite pas l'intervention de personnes ayant des compétences en microbiologie. L'invention permet aussi de remédier à un inconvénient que présentent des techniques connues d'ATPmétrie. En effet, ces techniques utilisent un stylo d'échantillonnage pourvu d'un écouvillon et, pour effectuer une analyse directe d'un carburant, tel que le kérosène, par ATPmétrie conformément à l'invention, on est conduit à immerger cet écouvillon dans un petit volume du kérosène, généralement de l'ordre de 1 cm3 ou moins, alors que les microorganismes sont uniquement présents dans la phase aqueuse de décantation du kérosène, phase qui peut ne représenter qu'un très faible pourcentage du volume total de carburant. La présente invention permet de remédier à cet inconvénient en augmentant le volume de carburant analysé. De préférence, on utilise alors un volume supérieur à 50 cm3, par exemple 100 cm3, 0,5 dm3 ou même 1 dm3. En outre, on isole alors les souches de microorganismes, présentes dans le kérosène, par filtration à la surface d'une membrane stérile et microporeuse, et l'on met en uvre une technique d'ATPmétrie après avoir brossé la surface de rétention de la membrane stérile après filtration, à l'aide de l'écouvillon mentionné plus haut ou toute autre méthode qui permet de récupérer les microorganismes sur la membrane microporeuse. Les résultats obtenus sont comparables aux dénombrements de colonies et à leur envahissement, que l'on obtient en mettant en uvre le procédé microbiologique de référence par filtration-incubation sur membrane en boîte de Pétri. Ainsi, selon un aspect avantageux de la présente invention, on propose une technique d'ATPmétrie et bioluminescence, optimisée en introduisant une microfiltration du combustible avant l'ATPmétrie proprement dite. De façon précise, la présente invention a pour objet un procédé de détection de la biocontamination d'un combustible liquide, ce procédé étant caractérisé en ce que l'on utilise une technique d'ATPmétrie pour détecter la présence de microorganismes dans le combustible liquide. Selon un mode de mise en uvre particulier 15 du procédé objet de l'invention - on utilise un équipement d'ATPmétrie, - on filtre un volume de combustible liquide sur une membrane microporeuse stérile, de manière à isoler des souches de microorganismes qui sont susceptibles d'être présents dans le combustible liquide, - on recueille les souches de microorganismes ainsi isolées, et - on détecte la présence des microorganismes dans les souches ainsi recueillies, au moyen de l'équipement d'ATPmétrie afin de doser l'ATP. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'équipement comporte un organe de prélèvement d'un échantillon devant être analysé avec cet équipement et l'on recueille les souches au moyen de l'organe de prélèvement. De préférence, le volume de combustible liquide que l'on filtre est environ égal à 100 cm3. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'organe de prélèvement constitue une brosse au moyen de laquelle on brosse la surface de rétention de la membrane microporeuse, pour recueillir les souches de microorganismes. De préférence, on brosse la surface de rétention de la membrane microporeuse suivant deux 10 directions perpendiculaires. De préférence, dans le cas du mode de mise en oeuvre du procédé objet de l'invention qui utilise la membrane microporeuse: - on mesure d'abord une intensité lumineuse blanc correspondant à l'organe de prélèvement seul, au moyen de l'équipement d'ATPmétrie, avant de recueillir les souches de microorganismes au moyen de cet organe de prélèvement, - on fait au moins une mesure d'intensité 20 lumineuse d) au moyen de l'équipement, pour les souches recueillies, - on calcule la différence -blanc et - on détermine la contamination à partir de cette différence. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention: - on fait plusieurs mesures d'intensité lumineuse pour les souches, - on calcule la moyenne arithmétique Orel de ces mesures, - on calcule la différence (Dre, , d)blanc et - on détermine la contamination à partir de cette différence (Drei (DblancÉ L'équipement d'ATPmétrie comprend de préférence: - un écouvillon qui constitue l'organe de prélèvement, - un récipient qui contient des composants permettant la mise en uvre de la technique d'ATPmétrie et dans lequel on plonge l'écouvillon après avoir recueilli les souches de microorganismes au moyen de cet écouvillon, pour que ces souches réagissent avec les composants, et - un luminomètre pour mesurer l'intensité lumineuse émise par les souches ayant ainsi réagi. Selon une application particulière de la présente invention, le combustible liquide est contenu dans un réservoir et l'on effectue un traitement préventif de ce réservoir si la technique d'ATPmétrie utilisée conduit à mesurer une intensité lumineuse supérieure ou sensiblement égale à un seuil préalablement fixé en fonction de l'application envisagée. Ce seuil est de préférence exprimé en unités relatives d'intensité de lumière. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS On montre dans ce qui suit l'intérêt d'utiliser l'ATPmétrie pour détecter la biocontamination d'un combustible liquide, tel qu'un carburéacteur, et l'intérêt d'optimiser l'ATPmétrie par une microfiltration préalable. Rappelons que la technique d'ATPmétrie est une technique de dosage instantané de l'ATP, c'est-à-dire de l'adénosine triphosphate (en anglais adenosine triphosphate ). Cette technique, qui est fondée sur le principe de bioluminescence, met en ouvre une réaction enzymatique qui traduit une quantité d'ATP en quantité de lumière. L'ATP est présente, en concentrations variables, chez tous les organismes vivants. La présente d'ATP indique une souillure par des composé organiques. Partout où elle est présente, existe le risque d'une biocontamination. En outre, la molécule d'ATP est utilisée par les cellules pour le stockage de l'énergie cellulaire et comme co-enzyme. La présence d'ATP dans un milieu inerte, tel qu'un carburéacteur, indique une contamination biologique d'origine microbienne et/ou fongique. Pour mettre en oeuvre l'ATPmétrie, on ajoute un réactif qui induit la luminescence (en anglais luminescence inducing reagent ) au milieu réactionnel à analyser. Ce réactif comprend une enzyme, la luciférase, et son substrat, la luciférine, substance azotée qui est présente chez certains animaux et dont l'oxydation provoque la luminescence. En présence d'ATP, la luciférine est immédiatement transformée en oxyluciférine par la luciférase. La réaction s'accompagne d'une émission de lumière, de couleur jaune vert, qui est proportionnelle à la quantité d'ATP initiale. Le mode opératoire de la technique d'ATPmétrie consiste à ajouter une quantité connue de luciférine et de la luciférase à un volume connu du milieu à analyser, à laisser agir quelques secondes (incubation), puis à mesurer l'intensité de la lumière émise au moyen d'un luminomètre. L'évaluation de la biomasse microbienne, par dosage de l'ATP, tend à se généraliser. Ce constituant est un intermédiaire important du métabolisme cellulaire, puisqu'il est au centre du métabolisme énergétique. La teneur en ATP des cellules varie d'un organisme à un autre. Pour un même organisme, cette variation est fonction de son état physiologique, d'où l'intérêt de son dosage, surtout si l'on travaille avec un seul type de cellule. L'ATP étant par ailleurs absente des constituants du milieu de culture, sa détermination par réaction de bioluminescence est relativement simple, rapide et sensible. Une fois la cellule morte, l'ATP est rapidement détruite. C'est pourquoi le taux d'ATP dans un échantillon peut être rapporté à la population des cellules, ou bactéries vivantes, qui sont présentes. L'ATPmétrie paraît bien adaptée pour la recherche de micro- organismes, sans identification, dans les carburéacteurs, car elle donne des résultats en quelques minutes. Elle peut être utilisée "au pied d'un avion", par un personnel ne possédant pas de qualification particulière en microbiologie. Dans un premier temps, on s'est assuré que la luciférase n'était pas inhibée par les composés des combustibles endothermiques aéronautiques, principalement par les composés des kérosènes Jet A-1 et le combustible JP-10, et que l'ATPmétrie était applicable à de tels milieux réactionnels. En outre, parmi les trousses ATP (en anglais ATP kits ) commercialement disponibles, on a choisi celle qui est la mieux adaptée au contrôle des avions, pratiqué sur le terrain, à savoir la trousse de la société Euralam. Cette trousse ATP de la société Euralam est dénommée Pocket Swab . Elle comprend un dispositif en forme de stylo, comprenant un écouvillon (petite brosse) d'échantillonnage et une cuve de réaction, qui contient les composés de lyse (destruction des tissus ou des bactéries par des agents physiques, chimiques ou biologiques), une solution tampon (en anglais buffer solution ), la luciférine et la luciférase. L'écouvillon est utilisé pour le prélèvement puis trempé dans la cuve de réactifs. Après quelques secondes d'incubation, cette incubation étant fondée sur la réaction enzymatique qui met en oeuvre le couple émetteur de lumière luciférine/luciférase, on détecte quantitativement l'émission des photons au moyen d'un luminomètre. On utilise celui qui est commercialisé par la société Charm Sciences sous la référence Luminator T (marque déposée). Ce dernier est capable de traiter statistiquement les résultats, de les stocker, de les afficher sur son écran puis de les transférer ultérieurement vers une imprimante ou un ordinateur, ce qui permet de faire les essais sur site et de restituer les données, à un autre moment et en un autre lieu, soit une imprimante, soit dans un logiciel de traitement. On précise que la teneur en ATP est exprimée en unités relatives d'intensité lumineuse (en anglais Relative Light Units . Plus la lumière est intense, plus les valeurs mesurées sont élevées et plus la teneur en ATP est importante. Des valeurs RLU élevées indiquent ainsi clairement une contamination microbiologique. L'ATPmétrie n'a jamais été mise en uvre avec des kérosènes. Il convient donc de s'assurer que la luciférase n'est pas inhibée par l'un des composés de ces combustibles. L'étude de la compatibilité de l'ATPmétrie avec les kérosènes a été réalisée avec la trousse ATP de la société Euralam sur le kérosène Jet A-1. On a vérifié la capacité de cette trousse ATP à détecter, une à une, la présence de cinq souches de moisissures, à savoir Aspergillus piger, Paecilomyces varioti, Aureobasidium pullulans, Chaetomium globosum et Cladosporium resinae, et d'une bactérie aérobie, à savoir Pseudomonas aeruginosa, parmi celles que l'on rencontre le plus fréquemment dans les kérosènes. Il faut toutefois rappeler que le point faible de la méthode est que l'analyse directe s'effectue en immergeant l'écouvillon dans un petit volume de combustible, environ 1 ml ou moins, alors que les microorganismes sont présents uniquement dans la phase aqueuse de décantation du kérosène qui peut ne représenter qu'un très faible pourcentage du volume total de carburant. Il est donc souhaitable d'optimiser la méthode en augmentant le volume de combustible analysé. On utilise de préférence un volume au moins égal à 100 cm3. On a trouvé qu'il est intéressant d'optimiser l'ATPmétrie par une microfiltration préalable, par comparaison avec le procédé de référence, par microfiltration-incubation dans une boîte de Pétri. On reviendra sur ce procédé de référence à la fin de la présente description. Un exemple de la méthode optimisée par 15 filtration et brossage est donné plus loin. Les résultats (valeurs d'intensité bioluminescente) obtenus par cette méthode sont directement comparables, à partir de 100ml microfiltrés, aux dénombrements de colonies et à leur envahissement, exprimé en % SRF (pourcentage de croissance à la Surface de Rétention du Filtre), exploités lors de la mise en oeuvre du procédé microbiologique de référence par microfiltration et incubation de la membrane en boîte de Pétri, qui se rapporte à 100 cm3 de combustible filtré. Afin de vérifier l'efficacité d'un traitement préventif bactéricide et fongicide d'un kérosène biocontaminé, on a identifié la réaction de l'ATPmétrie et bioluminescence vis-à-vis des organismes morts. Pour cela, on a utilisé un échantillon de kérosène que l'on a inoculé des cinq souches de moisissures et de la bactérie aérobie étudiée. On a traité le kérosène biocontaminé par une solution mortifère de microorganismes, à savoir l'hypochlorite de sodium (eau de Javel). On a identifié la réaction en utilisant la trousse de la société Euralam, à partir de la méthode optimisée par microfiltration et brossage. A l'origine, le kérosène inoculé donne une intensité de 344144 RLU. Immédiatement après ajout de 500 ml d'eau de Javel, l'intensité bioluminescente notée est de 4536 RLU. Ensuite, en fonction du temps de mortalité de 1 heure à 24 heures, l'intensité bioluminescente présente une décroissance monotone asymptotique jusqu'à 1151 RLU. Sachant que l'intensité bioluminescente de l'eau de Javel est de l'ordre de 4600 RLU, on peut considérer que l'ATPmétrie n'est pas influencée par la présence d'organismes morts et qu'elle réagit seulement vis-à-vis des organismes vivants. En outre, on a montré la possibilité de mettre en uvre l'ATPmétrie et bioluminescence au pied d'un avion , sur un site d'exploitation ou dans une zone de maintien en conditions opérationnelles. Plus précisément, on a validé cette technique en tant que méthode de contrôle de la biocontamination des carburéacteurs, sur le terrain, lorsque l'identification des micro-organismes n'est pas exigée. Pour tout aéronef et toute cuve de stockage que l'on a étudiés, on a mis en oeuvre le protocole suivant, avec la technique Pocket Swab de la société Euralam. Au pied de l'avion, à l'aide d'un outillage de prélèvement connecté au point de purge ou de prélèvement du kérosène, on effectue un échantillonnage du combustible avec la phase aqueuse de décantation. Les volumes prélevés sont d'au moins cm3. Ils sont conditionnés dans des flacons stériles. Les prélèvements de carburant sont agités manuellement afin d'homogénéiser la dispersion des colonies de micro-organismes et leur répartition lors du fractionnement des prises d'essai de kérosène. On procède alors immédiatement, sur place, aux essais d'ATPmétrie, avec des prises d'essai de 100 cm3 de combustible, microfiltrée à 0,45 pm de rétention absolue, par le système Milliflex-100, afin de brosser la surface de rétention de la membrane stérile à l'aide de l'écouvillon du stylo d' échantillonage. Le volume prélevé restant est utilisé pour réaliser les essais microbiologiques de référence par microfiltration sur membrane et incubation en boîte de Pétri au contact d'un milieu nutritif global MTGE . Ces essais permettent, outre la comparaison des valeurs obtenues avec les degrés de biocontamination de référence, de valider l'utilisation de la technique de contrôle de la biocontamination "au pied de l'avion". D'autre part, l'ensemble des résultats expérimentaux comparatifs obtenus servent également à la définition des traitements préventifs et curatifs des réservoirs (voir plus loin). Pour valider la méthode d'ATPMétrie, on a choisi de quantifier: - la biocontamination du kérosène Jet A-1 stocké pendant environ 4 mois dans les réservoirs structuraux de trois avions, et - la biocontamination du kérosène Jet A-1 stocké dans deux cuves de 20000 litres chacune. On a utilisé la méthode rapide par ATPmétrie et bioluminescence et les résultats ont été comparés au procédé de référence par microfiltration et incubation sur membrane. Pour chaque avion, le combustible a été échantillonné au niveau des points de purge des trois réservoirs structuraux central, droit et gauche, selon les règles de l'art. Pour chaque réservoir, un demi-litre de carburéacteur a été soutiré, conditionné et fractionné dans deux flacons ayant chacun un volume de 250 cm3. L'un des flacons a servi à l'expertise microbiologique sur place. L'autre flacon a été utilisé pour des investigations complémentaires et des essais de référence par microfiltration et incubation sur membrane. Sur certains prélèvements de 250 cm3 effectués sur les avions, on a pratiqué la méthode ATPmétrique optimisée selon laquelle, au moyen de la brosse de l'écouvillon du stylo d'échantillonnage, on brosse la surface de rétention de la membrane stérile qui a servi à microfiltrer 100 cm3 de kérosène Jet A-1. Les réalisations expérimentales sont précisées ci-après et constituent un exemple de la méthode optimisée par filtration et brossage. - Avant chaque essai, on détermine le blanc (zéro) du stylo d'échantillonnage: on identifie l'intensité luminescente de l'écouvillon de ce stylo avant brossage du filtre. On introduit l'écouvillon vierge dans le luminomètre et l'on effectue la lecture de l'intensité lumineuse blanc (en valeur empirique RLU). Trois mesures sont effectuées par ordre chronologique. - Sur une membrane microporeuse stérile, de type écran, d'au moins 0,45 pm de rétention absolue, on microfiltre 100 cm3 de kérosène Jet A-l. Pour cette opération, on utilise un séparateur et une unité Milliflex (ensemble de filtration stérile) ainsi que la pompe à vide correspondante Milliflex-100. Remarquons toutefois que d'autres systèmes de micro filtration, commercialement disponibles, pourraient être aussi utilisés. L'analyse est conduite de la façon suivante. - On place un séparateur et une unité Milliflex sur le support de la pompe à vide Milliflex-100. - On verse 100 ml d'échantillon de kérosène dans l'entonnoir et l'on fait le vide, grâce à la pompe, pour filtrer l'échantillon. - Ensuite, on effectue deux rinçages successifs du vase de filtration et du filtre à l'aide des solutions stériles suivantes: 1) 100 cm3 de Triton X-100 dilué à 0,1% en volume dans l'eau permutée, et 2) 30 cm3 de sérum physiologique, contenant 0,85% de NaCl dilué dans de l'eau permutée. - Avec l'écouvillon du stylo d'échantillonnage, on brosse soigneusement la totalité de la surface de rétention de la membrane filtrante en respectant deux directions perpendiculaires qui suivent celles des carrés imprimés sur la membrane. Après brossage, la membrane est jetée. En aucun cas, par ce procédé, la membrane ne peut être utilisée à une mise en incubation au contact d'un milieu nutritif quelconque. - L'écouvillon est mis en contact avec les réactifs luciférine et luciférase . - Après quelques secondes d'incubation, on introduit l'écouvillon dans le luminomètre et l'on effectue la lecture d'intensité bioluminescente relative (en valeur empirique RLU). Trois mesures sont effectuées par ordre chronologique. - La valeur de l'intensité bioluminescente relative (Dre/ est définie par la moyenne arithmétique de ces trois mesures: = 3 (01 + (I)2 + (133) - On détermine la valeur de l'intensité bioluminescente absolue moyenne 1û,,,,. qui est égale à l'intensité bioluminescente relative moyenne moins la valeur de l'intensité lumineuse correspondant au stylo vierge ( blanc ), avant brossage de la surface de rétention de la membrane filtrante: nhs (1)rel hlanc En outre, pour chaque prélèvement de 250 cm3, effectué dans les avions, on procède à des analyses microbiologiques en utilisant le procédé de référence par microfiltration et incubation sur membrane. Pour ce faire, sur une membrane microporeuse stérile, de type écran, de 0,45}gym de rétention absolue, on microfiltre 100 cm3 de kérosène Jet A-l. La membrane est rincée par 100 cm3 de solution Triton X- 100 puis par 30 cm3 de sérum physiologique. Puis la membrane est mise en incubation, en boîte de Pétri, au contact d'un tampon imbibé d'un milieu nutritif global MTG-E . Ce procédé permet d'interpréter les résultats de bioluminescence exprimés en RLU, engendrant l'établissement d'une corrélation avec le dénombrement de souches et leur degré d'envahissement (exprimé en % SRF ) . Les degrés de biocontamination obtenus à partir du procédé microbiologique de référence par microfiltration sur membrane et incubation en boîte de Pétri au contact d'un milieu nutritif global MTG- E permettent de définir des traitements préventifs et curatifs des réservoirs structuraux des avions, ou de réservoirs similaires ou identiques, en fonction des différents niveaux de biocontamination exploités par ATPmétrie et bioluminescence. En pratique, si une détection par ATPmétrie, de préférence au moyen d'une trousse de la société Euralam, et en utilisant au préalable une filtration et un brossage, donne des valeurs supérieures à environ 500 RLU, cette détection doit déclencher les traitements préventifs habituels. Les traitements curatifs sont à étudier au cas par cas à partir du moment où les traitements préventifs ne sont plus efficaces. En conclusion, la technique d'ATPmétrie et bioluminescence est parfaitement compatible avec le kérosène Jet A-1. Elle est très intéressante car elle est simple à mettre en oeuvre. Elle fournit une réponse très rapidement, en moins de 15 minutes, et permet de détecter les principaux organismes viables dans les carburéacteurs. De plus, elle est applicable directement sur le terrain et ne demande pas l'intervention d'un personnel ayant des compétences particulières en microbiologie. On revient dans ce qui suit sur le procédé dit de référence par microfiltration et incubation. Dans le cas de ce procédé, les micro- organismes qui sont présents dans les carburéacteurs, essentiellement dans les kérosènes, sont isolés et cultivés à la surface de rétention d'une membrane filtrante, stérile, microporeuse, de type écran. L'analyse est conduite de la façon qui suit. - On prépare une solution de Triton X-100 , disponible auprès de lasociété Rohm et Haas, diluée à 0,1% en volume dans de l'eau permutée, et une solution de sérum physiologique, à 0,85% en masse de NaCl dilué dans de l'eau permutée. Pour ces deux solutions, l'eau permutée est microfiltrée par une membrane de 0,45 pm de rétention absolue et, après répartition dans des flacons à vis de 10 cm3, les solutions sont stérilisées par autoclavage, pendant 20 minutes à 121 C. - On filtre, sous dépression, 100 cm3 de prélèvement de carburéacteur au moyen d'une membrane stérile, microporeuse, de 0,45 pm de rétention absolue. - On fait des rinçages successifs du vase de filtration et de la membrane filtrante à l'aide des solutions stériles suivantes: 1) 100 cm3 de Triton X-100 , et 2) 30 cm3 de sérum physiologique. - On transfère le filtre dans une boîte de Pétri qui contient un tampon absorbant stérile, imbibé et saturé par 2 cm3 de bouillon MTG-E . Ce bouillon est un milieu nutritif global pour le développement de bactéries, de champignons et d'actinomycètes, stade intermédiaire entre les bactéries et les champignons de la classe des bactéries filamenteuses, vivants dans les carburéacteurs de type kérosène Jet A-1. - On examine le filtre, avant incubation, au microscope binoculaire biologique, sous un grossissement de 40 et par une lumière incidente, dans le but d'identifier toute pollution particulaire solide non biologique. - On met en incubation l'ensemble de la boîte de Pétri retournée, à une température de 30 à 35 C et pendant un temps minimum de 48 heures. Pendant cette incubation, le filtre est en contact avec le tampon imbibé, qui se situe sur la membrane, afin que le bouillon MTG-E vienne en contact avec les micro-organismes, par capillarité au travers des pores. - Au cours de l'incubation et après celle-ci, on examine les filtres au microscope binoculaire biologique, sous des grossissements de 40, de 100 et de 200, et par une lumière incidente, afin de détecter, de dénombrer et d'identifier les colonies et les germes de micro-organismes. Les développements de micro-organismes sont quantifiés, en fonction de leur nature et du temps d'incubation, en pourcentage de croissance à la Surface de Rétention du Filtre (% SRF). Les observations microscopiques sous grossissement de 200 sont faites à l'issue de l'incubation, la distance focale nécessitant un montage de la membrane filtrante entre deux lames de verre. On précise que toutes ces opérations de filtration et de préparation des solutions et des filtres ainsi que les opérations microscopiques en cours d'incubation sont réalisées au sein d'une enceinte à empoussièrement contrôlé, à flux laminaire. Avant et après ces manipulations, toute la verrerie servant à la préparation des solutions et à la filtration est stérilisée par autoclavage, pendant 20 minutes à 121 C. On revient maintenant sur la détection de la biocontamination des carburéacteurs au moyen de la méthode qui utilise le systeme de filtration "Milliflex-100". Dans le cas de cette méthode, les micro- organismes, qui sont présents dans le kérosène, sont isolés et cultivés à la surface d'une membrane filtrante, microporeuse, de type écran. L'analyse est conduite de la façon qui suit. - On place un séparateur et une unité Milliflex sur le support d'une pompe à vide Milliflex ou d'une rampe de filtration sous vide standard. - On verse 100 ml d'un échantillon de kérosène dans un entonnoir et l'on met la pompe en marche pour filtrer l'échantillon. - On place l'unité Milliflex sur une cassette dont le tampon a été préalablement imbibé d'un milieu nutritif global pour la culture des micro-organismes. - on applique une pression manuelle afin de séparer l'entonnoir. - On ferme la cassette. - On met la cassette en incubation à 35 C pendant un temps minimum de 48 heures. - On examine les membranes filtrantes au microscope sous des grossissements de 40, 100 et 200. Les exemples de l'invention, que l'on a donnés, sont relatifs à la détection de la biocontamination d'un carburéacteur. Cependant, le 25 procédé objet de l'invention n'est pas limité aux carburéacteurs. L'homme du métier peut adapter les exemples donnés à la détection de la biocontamination de tout combustible liquide. De plus, dans la présente invention, on peut aussi récupérer les microorganismes susceptibles d'être présents dans le combustible liquide par une 20 technique quelconque de récupération, telle que la filtration, et analyser directement les microorganismes ainsi récupérés dans une cellule d'ATPmétrie. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection de la biocontamination d'un combustible liquide, ce procédé étant caractérisé en ce que l'on utilise une technique d'ATPmétrie pour détecter la présence de microorganismes dans le combustible liquide. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel - on utilise un équipement d'ATPmétrie, on filtre un volume de combustible liquide sur une membrane microporeuse stérile, de manière à isoler des souches de microorganismes qui sont susceptibles d'être présents dans le combustible liquide, - on recueille les souches de microorganismes ainsi isolées, et on détecte la présence des microorganismes dans les souches ainsi recueillies, au moyen de l'équipement d'ATPmétrie afin de doser l'ATP. 5. Procédé selon la revendication 2, dans lequel l'équipement comporte un organe de prélèvement d'un échantillon devant être analysé avec cet équipement et l'on recueille les souches au moyen de l'organe de prélèvement. 6. Procédé selon la revendication 3, dans lequel le volume de combustible liquide que l'on filtre est environ égal à 100 cm3. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 et 4, dans lequel l'organe de prélèvement constitue une brosse au moyen de laquelle on brosse la surface de rétention de la membrane microporeuse, pour recueillir les souches de microorganismes. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel on brosse la surface de rétention de la membrane microporeuse suivant deux directions perpendiculaires. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel on mesure d'abord une intensité lumineuse blanc correspondant à l'organe de prélèvement seul, au moyen de l'équipement d'ATPmétrie, avant de recueillir les souches de microorganismes au moyen de cet organe de prélèvement, - on fait au moins une mesure d'intensité 15 lumineuse 0 au moyen de l'équipement, pour les souches recueillies, - on calcule le différence c 4blanc et - on détermine la contamination à partir de cette différence. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel - on fait plusieurs mesures d'intensité lumineuse pour les souches, - on calcule la moyenne arithmétique ',.C, de 25 ces mesures, - on calcule la différence 0re/ Oblanc et - on détermine la contamination à partir de cette différence Ord OblancÉ 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, dans lequel l'équipement d'ATPmétrie comprend: - un écouvillon qui constitue l'organe de 5 prélèvement, - un récipient qui contient des composants permettant la mise en oeuvre de la technique d'ATPmétrie et dans lequel on plonge l'écouvillon après avoir recueilli les souches de microorganismes au moyen de cet écouvillon, pour que ces souches réagissent avec les composants, et - un luminomètre pour mesurer l'intensité lumineuse émise par les souches ayant ainsi réagi. 10. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on récupère les microorganismes par une technique quelconque de récupération, telle que la filtration, et l'on analyse directement les microorganismes ainsi récupérés dans une cellule d'ATPmétrie. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le combustible liquide est contenu dans un réservoir et l'on effectue un traitement préventif de ce réservoir si la technique d'ATPmétrie utilisée conduit à mesurer une intensité lumineuse supérieure ou sensiblement égale à un seuil préalablement fixé en fonction de l'application visée.