FR 2873927 A1 20060210 FR 0451793 A 20040805 2873927 -1- PROCEDE DE PREPARATION DE COLLAGENE RETICULE ET SUBSTITUT OSSEUX COMPRENANT LE COLLAGENE AINSI RÉTICULE, L'invention concerne un nouveau procédé de préparation de collagène réticulé par un agent réticulant présentant au moins une fonction aldéhyde. Elle a également pour objet un nouveau collagène réticulé dont la caractéristique essentielle est d'être pratiquement exempt d'aldéhyde résiduel après réticulation. Elle se rapporte enfin aux produits contenant le collagène ainsi réticulé et notamment les substituts osseux ainsi que les compresses hémostatiques. Pour l'essentiel, les biomatériaux composites dont notamment les substituts osseux, sont fabriqués à partir d'un mélange de biopolymères (collagène, gélatine, cellulose, lactone, alginate...) en présence de céramique (hydroxyapatite synthétique ou biologique, phosphate tricalcique...) ou de sulfate de calcium. Les substituts osseux peuvent se présenter sous la forme de compresses lyophilisées en poudre ou en solution injectable qui durcit une fois implantée. Bien souvent, les polymères mis en oeuvre sont réticulés partiellement de manière à conférer au produit final des caractéristiques mécaniques satisfaisantes. Le document EP-A-164 483 décrit ainsi un procédé de fabrication de substitut osseux à partir de collagène et d'un composant minéral, tel que apatite et/ou hydroxyapatite et/ou céramique de phosphate de calcium. En pratique, le mélange est réticulé partiellement en présence d'un aldéhyde du type formaldéhyde, glutaraldéhyde ou glyoxal, puis lyophilisé, la lyophilisation pouvant être cependant effectuée avant ou après l'étape de réticulation. Si la réticulation permet d'améliorer les caractéristiques mécaniques du produit, une quantité résiduelle d'aldéhyde libre reste cependant détectable. Or, on a observé que la présence d'aldéhyde dans le substitut, de part de leur toxicité, peut entraîner un processus d'inflammation, d'intolérance locale ou systémique. 2873927 -2- Pour résoudre les problèmes liés à la présence d'aldéhyde résiduel dans le produit fini, les documents US-A-6 187 047 et US-A-5 776 193 décrivent un procédé de fabrication de substitut osseux comprenant une étape d'élimination de l'agent de réticulation consistant en des lavages. Les lavages sont des étapes très longues après lyophilisation et compliquent le procédé de fabrication. Il détériore par ailleurs l'aspect du produit et est source de contamination. En d'autres termes, le problème que se propose de résoudre l'invention est de développer un substitut osseux et plus généralement un biomatériaux contenant du collagène réticulé, dont le taux d'agent de réticulation résiduel n'entraîne pas les effets secondaires précités. Autrement dit, l'invention a notamment pour objectif de proposer un substitut osseux exempt ou pratiquement exempt d'aldéhyde libre résiduel. Le Demandeur a constaté que de manière tout à fait surprenante, un traitement thermique sous vide partiel, après lyophilisation du collagène partiellement ou totalement réticulé, permettait d'obtenir un taux d'aldéhyde résiduel après réticulation, inférieur à 20 ppm, sans altérer la stabilité du produit. En d'autres termes, l'invention a pour objet un collagène partiellement ou totalement réticulé par un agent réticulant présentant au moins une fonction aldéhyde, ledit collagène étant susceptible d'être obtenu par un procédé consistant à faire subir au collagène partiellement ou totalement réticulé, un traitement thermique sous vide partiel. En pratique, le traitement thermique sous vide partiel est effectué à une température comprise entre 50 C et 150 C pendant une durée comprise entre 30 minutes et 48 heures, à une pression comprise entre 10 et 500 mbar. Dans un mode de réalisation avantageux, le traitement thermique est effectué pendant une durée comprise entre 2 et 3 heures, à une température comprise entre 120 et 140 C, à une pression comprise entre 50 et 100 mbar. 2873927 -3- Dans un mode de réalisation perfectionné, le traitement thermique est effectué en présence d'une fuite de vide. Le collagène sur lequel est effectuée la réticulation peut se présenter sous forme fibrillaire ou non, natif ou dénaturé, pepsiné ou non, en solution, en dispersion ou sous forme sèches. Lorsqu'il est en contact avec l'agent réticulant, le collagène peut prendre l'aspect d'une dispersion, d'une solution, d'un gel. ou rester sous forme sèche. Selon l'invention, l'agent réticulant présente au moins une fonction aldéhyde. Il peut s'agir d'un aldéhyde aliphatique mono-fonctionnel ou poly-fonctionnel saturé ou non saturé. En pratique, l'agent réticulant est choisi dans le groupe comprenant le formaldéhyde, le glutaraldéhyde, le glyoxal, l'amidon oxydé, sans que cette liste ne soit limitative. Dans un mode de réalisation avantageux, la réticulation est partielle. Cette réticulation partielle est obtenue dans les mêmes conditions que celles décrites dans le document EP A-164 483, incorporé ici par référence. En pratique, l'agent réticulant est utilisé dans une proportion représentant moins de 1 %, avantageusement entre 0,05 et 0,5 % en poids sec du collagène. Le collagène avant ou après réticulation peut être lyophilisé et se présente alors sous la forme d'une matrice tridimensionnelle ou peut être séché et se présente 25 alors sous la forme d'une membrane ou d'un film. L'invention concerne donc également un procédé de préparation de collagène réticulé par un agent réticulant présentant au moins une fonction aldéhyde consistant à faire subir au collagène partiellement ou totalement réticulé, un traitement thermique sous vide partiel, effectué avantageusement dans les conditions précisées précédemment. 2873927 -4- L'invention a également pour objet un substitut osseux contenant, outre le collagène partiellement ou totalement réticulé précédemment décrit, un composant minéral choisi notamment dans le groupe comprenant apatite et/ou hydroxyapatite et/ou céramique, phosphate de calcium, phosphate tricalcique en phase Beta ((3TCP). L'invention concerne également un procédé de fabrication d'un substitut osseux consistant: - à préparer un mélange comprenant le collagène, l'agent minéral et un agent réticulant comprenant au moins une fonction aldéhydique, avant ou après lyophilisation ou séchage, à réticuler partiellement ou totalement le mélange ainsi préparé, puis, à traiter thermiquement le produit obtenu sous-vide partiel pour éliminer l'agent réticulant résiduel. L'invention a enfin pour objet une compresse hémostatique comprenant le collagène partiellement ou totalement réticulé précédemment décrit. 1/Méthode de dosage du formaldéhyde Le dosage du formaldéhyde libre se fait après extraction aqueuse durant 24 heures, par formation d'un composé coloré avec l'acide chromotropique. La lecture se fait par spectrophotométrie à 550 nm. Lors d'un dosage, une gamme étalon est réalisée. 2/Dosage à partir d'un substitut osseux a/ Préparation du substitut osseux Le collagène est dissous dans une solution aqueuse, l'agent réticulant est ajouté à la solution sous agitation. Une dispersion d'hydroxyapatite est ensuite ajoutée à la solution de collagène partiellement réticulé. Le mélange est alors répartis dans des moules pour être lyophilisé puis traité thermiquement sous vide. b/ Dosage du formaldéhyde résiduel après traitement thermique Pour chaque lot, un dosage avant et après traitement thermique est réalisé. Ci-après, les résultats des 10 lots de fabrication consécutifs. Echantillon No. Formaldéhyde en ppm Avant traitement Après traitement thermique thermique 1 58,2 6,4 ou -6-REVENDICATIONS 1/ Collagène partiellement ou totalement réticulé par un agent réticulant présentant au moins une fonction aldéhyde, susceptible d'être obtenu par un procédé consistant à faire subir au collagène partiellement ou totalement réticulé, un traitement thermique sous vide partiel. 2/ Collagène réticulé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le traitement thermique sous vide partiel est effectué à une température comprise entre 50 C et 150 C pendant une durée comprise entre 30 minutes et 48 heures, à une pression comprise entre 10 et 500 mbar. 3/ Collagène réticulé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le traitement thermique sous vide partiel est effectué pendant une durée comprise entre 2 et 3 heures, à une température comprise entre 120 et 140 C, à une pression comprise entre 50 et 100 mbar. 4/ Collagène réticulé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le traitement thermique est effectué en présence d'une fuite de vide. 5/ Collagène réticulé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le collagène se présente sous forme fibrillaire, pepsiné ou non, natif ou dénaturé. 6/ Collagène réticulé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent 25 réticulant est choisi dans le groupe comprenant le formaldéhyde, le glutaraldéhyde, le glyoxal, l'amidon oxydé. 7/ Collagène réticulé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent réticulant représente moins de 1% en poids sec du collagène. 8/ Collagène partiellement réticulé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il subit une étape de lyophilisation ou de séchage effectuée avant traitement thermique sous vide partiel. 2873927 -7- 9/ Collagène partiellement réticulé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la réticulation est effectuée avant ou après l'étape de lyophilisation ou séchage 10/ Procédé de préparation de collagène réticulé par un agent réticulant présentant 5 au moins une fonction aldéhyde consistant à faire subir au collagène partiellement ou totalement réticulé un traitement thermique sous vide partiel. 11/ Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le traitement thermique sous vide partiel est effectué à une température comprise entre 50 C et 150 C pendant une durée comprise entre 30 minutes et 48 heures, à une pression comprise entre 10 et 500 mbar. 12/ Procédé selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que le traitement thermique est effectué en présence d'une fuite de vide. 13/ Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte une étape supplémentaire de lyophilisation ou séchage mise en oeuvre avant traitement thermique sous-vide partiel. 14/ Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la réticulation est effectuée avant ou après l'étape de lyophilisation ou séchage. 15/ Substitut osseux contenant le collagène objet de l'une des revendications 1 à 9, ainsi qu'un composant minéral choisi notamment dans le groupe comprenant apatite et/ou hydroxyapatite et/ou céramique, phosphate de calcium, phosphate tricalcique en phase Beta (13TCP). 16/ Compresse hémostatique comprenant le collagène objet de l'une des revendications 1 à 9.