FR 2882628 A1 20060908 FR 0502211 A 20050304 "Souris transgéniques et leurs applications comme modèle expérimental" L'invention se rapporte à la création de nouvelles souris transgéniques HLA de classe II et à leurs applications comme modèle expérimental modèle expérimental animal pour l'étude de l'efficacité de candidats vaccins. A l'heure actuelle, il existe un besoin urgent en vaccins efficaces contre les infections par des virus responsables de graves pathologies, comme, par exemple, 10 VIH, VHC,CMV, HSV. Pour qu'un vaccin exerce un effet protecteur chez la majorité des sujets vaccinés, la protection vaccinale doit mobiliser conjointement les lymphocytes T CD4+ et les lymphocytes T CD8+ spécifiques du virus, pour un rapide élimination des cellules infectées, ainsi que les lymphocytes B producteurs des anticorps anti-virus neutralisants, pour empêcher la réinfection par le même virus. L'ensemble de ces effets assure une bonne efficacité de protection globale et de mémoire. Les lymphocytes T spécifiques du virus reconnaissent les peptides dérivés de certaines protéines du virus, présentés par les molécules HLA de classe I et de classe II des cellules infectées. Si de nombreux peptides présentés par les molécules HLA de classe I ont été identifiés, en revanche, ceux présentés par les molécules HLA de classe II sont relativement inconnus. L'identification de ces peptides est cependant déterminante pour la réalisation d'un vaccin efficace. L'étude de ces réponses régulatrices à partir de matériel humain est difficile en raison du polymorphisme des molécules HLA de classe II et de l'expression de nombreuses molécules HLA de classe II chez un même individu. Des souris transgéniques HLA de classe II sont actuellement disponibles. Ces souris expriment soit une chaîne HLA-DRa isolée qui s'apparie à la chaîne IEr3b de souris, soit un couple de chaînes a et (3 d'origine humaine. Hagihara et al ont ainsi réalisé des souris transgéniques pour HLADP(3401 a01 sauvage dans le cadre d'études de xénoréactions. Toutefois, les réactions observées sont apparues très faibles. En fait, aucune étude détaillée n'a été fournie sur la fonctionnalité du transgène et son implication dans l'éducation aboutissant à une capacité de réponse immunitaire normale chez ces souris, ce qui suggère fortement que ces souris ne sont pas fonctionnelles. Plus récemment, des souris HLA de classe II transgéniques H-2 de classe II KO par inactivation dans l'haplotype H-2b de la chaîne IA(3 ont été créées pour l'étude de maladies auto-immunes (voir Taneja et David, 2000, Arthritis Res., 2, 205-7). Certaines de ces souris ont permis la validation in vivo d'épitopes CD4 de parasites. Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont amenés à développer un nouveau modèle expérimental animal de souris humanisées transgéniques pour HLA-DP et invalidées pour les gènes H-2 classe II, en utilisant un allèle particulier représenté à raison d'environ 50% dans la population caucasienne, ce qui permet de rechercher un vaccin avec un meilleur recouvrement de la population par rapport aux modèles disponibles à ce jour. Ces souris se sont avérées de grand intérêt pour l'étude pré-clinique comparative de l'efficacité de différents candidats vaccins et pour évaluer les risques liés à une induction non désirée de maladie autoimmune. Elles permettent également de déterminer la meilleure stratégie thérapeutique à adopter. L'invention a donc pour but l'utilisation de vecteurs d'expression codant pour des 30 complexes fonctionnels reconnus spécifiquement par des anticorps anti-HLA-DP pour créer des souris transgéniques. Elle a également pour but de fournir de telles souris et leur utilisation comme modèle expérimental pour étudier les réponses immunitaires induites après infection virale ou par les composés testés. L'invention vise ainsi l'utilisation d'une construction de vecteur d'expression, codant pour le complexe HLA-DPa103f3401 fonctionnel reconnu spécifiquement par des anticorps anti-HLA-DP, pour créer des souris transgéniques. Les souris transgéniques de l'invention sont caractérisées en ce qu'il s'agit de souris 10 humanisées exprimant individuellement le transgène HLA-DPa103 ou HLA-DPf3 401ou simultanément les 2 transgènes. Elle vise en particulier des souris transgéniques pour HLA-DP(a 1 0313401) et invalidées pour H-2 classe II (HLA-DP+/+IA(3 / ) Ces souris sont avantageusement obtenues par micro-injection dans les oocytes de souris fondatrices des fragments d'ADN codant pour ledit complexe, obtenus à partir de plasmides les renfermant, croisement entre elles des souris fondatrices exprimant individuellement le transgène HLA-DPa103 ou HLADPf3 401, et croisement des souris exprimant simultanément les deux transgènes avec des souris IA(3 . Ces souris représentent un nouveau modèle expérimental animal de souris humanisées pour identifier des épitopes HLA-DP restreint, immunogéniques chez la souris et chez l'homme. Les épitopes ainsi identifiés sont alors utilisables comme sous-unités pour l'élaboration de vaccins. Ils permettent également l'élaboration de nouveaux réactifs utilisables pour effectuer un suivi de la réponse immunitaire spécifique postinfection ou post-vaccination (par exemple les 30 tétramères peptide/HLA classe II). Ils sont également utilisables pour développer des tests prédictifs de l'état de protection d'un sujet vis-à-vis d'un virus donné et/ou effectuer un suivi d'une infection virale. Le nouveau modèle expérimental de l'invention, permet également, de manière avantageuse, de comparer l'efficacité de la réponse T auxiliaire induite par différents candidats vaccins ou différents protocoles d'immunisation. Ils représentent à ce titre un modèle d'évaluation des risques d'inductions de maladies auto-immunes. Le nouveau modèle expérimental de l'invention peut être également mis à profit pour analyser la coopération cellulaire entre les lymphocytes T CD4 et les lymphocytes T CD8 dans la souris, suite à une immunisation contre un antigène viral, et déterminer, si souhaité, les couples d'épitopes HTL et CTL agissant en synergie. L'invention vise également les lymphocytes CD4+ isolés après immunisation d'une souris transgénique telle que définie ci-dessus. Elle porte en outre sur l'utilisation de ces lymphocytes pour établir des lignées cellulaires spécifiques et pour créer des hybridomes Tspécifiques par fusion cellulaire, selon les techniques classiques, ces lignées cellulaires et ces hybridomes étant également visés par l'invention en tant que produits nouveaux. Ces lignées cellulaires présentent un grand intérêt pour la production des réactifs de suivi 20 spécifiques, par exemple pour le calibrage ou la réalisation de tests de qualité des tétramères HLA classe II. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 9, qui représentent, respectivement, - la figure 1, les cartes de 4 constructions plasmidiques utilisées selon l'invention; la figure 2, l'évaluation de la fonctionnalité de deux vecteurs utilisés selon l'invention; la figure 3, la PCR diagnostique de transgènes HLA-DP; la figure 4, l'analyse de cytométrie de flux de l'expression de molécules de HLA-DP 30 chez des souris transgéniques de l'invention; - la figure 5, le nombre de cellules T spléniques CD8+ et CD4+ ; la figure 6, la diversité de répertoire des différents Vb des TCR des lymphocytes TCD4+ chez les souris (HLA-DP+/IA3+) et des souris C57BL6, - la figure 7, la réponse proliférative spécifique après immunisation par KLH de souris transgéniques de l'invention; la figure 8, la réponse proliférative spécifique après immunisation par un antigène HBs de souris transgéniques de l'invention, et la figure 9, les réponses spécifiques en anticorps après immunisation par un antigène HBs de souris transgéniques de l'invention. Matériels et Méthodes 1) gènes et ADNc de départ Gene IA(3 b: fragment KPNI-XBAI de 9Kb, isolé du cosmide A(319 et dans une configuration entièrement génomique.Le choix des deux sites de restriction est fondé sur la cartographie de Lahrammar (JBC,1985,260, 14111-14119). Gene IAab produit par sous clonage d'un fragment Kpnl-Sall tiré du cosmide LS8.1(après raccourcissement Kpnl) de 6,8 Kb et ligué en 3' à un fragment de 250pb Sall Notl, tiré de pUT 626 et apportant le site de polyadénylation de SV 40. Obtention de l'ADNc de DP(3401 et DPa103 L'ARN total a été isolé de cellules HOM-2 d'haplotype HLA homozygote(A3, Cl, B27, DR1, DOS, DP(30401, DPaO103)qui sont des cellules transformées par le virus d'Epstein Barr et exprimant les molécules de CMH de classeII. Sur ces ARNm, ont été effectuées des RT-PCR en utilisant comme amorces: Pour DP(3401 amorce 5' 5'CCT TTT ATC gAT CCA TgA Tgg TTC TgC Agg 3' avec introduction d'un site BspDl pour le sous clonage dans IA(3b amorce 3' 5' TTA AAA gTC gAC TTA CCT gTT TAT gCA gAT CCT C 3' avec introduction d'un site Sali pour le sous clonage dans IA(3b. Pour DPa103 amorce 5' 5' CCT TTT ATC gAT CAA CAT gCg CCC TgA AgA C 3' avec introduction d'un site BspDl pour sous clonage dans IAab. amorce 3' 5' TTA AAA CTC gAg gTg TgA gCA CgT ACC gTT ggT ggC CTg AgT gTg 3'avec introduction d'un site Xhol pour sous-clonage dans IAab. Des formes longues DPalong et DPPlong ont été réalisées (totalité des ADN complémentaires de DPa et de DP(3) et ont été introduites dans des vecteurs pcR Topo 2 (Invitrogen) puis clonées dans des bactéries RZ1032. 2) Modification par mutagénèse dirigée des gènes IAab et IAf3b Les mutagénèses dirigées ont été réalisées par la méthode de Kunkel (P.N.A.S. USA, 1985 Jan; 82(2) : 488-92) afin d'introduire les sites de restriction nécessaires au clonage des ADNc DPa DPf3 en respectant les différents cadres de lecture.En bref, une matrice d'ADN simple brin est générée en infectant par un bactériophage KO.7 des bactéries RZ1032 (UTPase-, incapables d'enlever les U incorporés par erreur) préalablement transfectées avec des vecteurs contenant les gènes cibles. Sur cette matrice est hybridé l'oligonucléotide de mutagénèse que l'on a phosphorylé. Une ADN polymérase synthetise le brin muté. On réalise ensuite la transfection de bactéries supercompétentes XL 1(UTPase+) ou le brin U substitué (non muté) est dégradé et le brin muté conservé. Formes longues DP(34011ong: sous-clonage du fragment EcoRl (Séquence signal et séquences des domaines (3l et (32 humain) de pcR2 Topo dans un plasmide pBlueScript/KS - contenant le fragment Hindlll-Xbal(3kb) de IA(3b BspDl+ Sall+. Le fragment BspD1-Xbal obtenu à partir de cette construction a été inséré dans pBlueScript/KSIA13b ouvert BspD1-Xbal. La partie terminale de IA(3b a ainsi été reconstituée et D113401complet est inséré. DPa1031ong: sous-clonage du fragment BspDl-Sali (Séquence signal et séquences des domaines al et a2 humain) de pcR Topo 2, dans pBlueScript/ KS- IAa b ouvert BspD1- Sall. La forme D1134011ong a ensuite été introduite dans un vecteur comportant une 30 cassette Hygromycine pour donner la construction finale pIADP(3long (8,5Kb). (Figure 1). La forme DPa 1031ong a été introduite dans un vecteur contenant une cassette Néomycine pour donner la construction finale pIADPalong (8Kb) (Figure 1). Ces différentes constructions ont ensuite été clonées dans les bactéries supercompétentes XL 1 et les bactéries sure (rendues compétentes), puis vérifiées par séquençage par la technique de Sanger. Introduction devant les constructions DP(3a longues d'un promoteur fort de Sarcome de Rous pSRDPalong (7,9kb): sous-clonage du fragment Sacl- EcoRV de DPalong pcR2 Topo dans NT Hygrod ouvert Smal(blunt)- Sacl. pSRDP(31g (7,7kb) : sous-clonage du fragment Sacl-EcoRV(blunt) de DP(3long corrigé c.8-15 pcR2 Topo dans NT Néod ouvert Sacl-EcoRV. 3) Cellules et transfectants. Des cellules HeLa (cellules humaines de col utérin), L Kuhn (fibroblastes de souris C3H H-2') et P815 (mastocytome de souris provenant de souris DBA/2 H-2d) ont été maintenues en milieu RPMI 1640 complet: FCS 10%, Penicilline- Streptomycine (200UI/ml), Sodium-pyruvate (1mM) et L glutamine (2mM). Des cellules en phase exponentielle de croissance ont été cotransfectées par les formes longes +/- CIITA (facteur de régulation transcriptionnelle des gènes de CMH II) ; 24h après la transfection elles ont été selectionnées avec du G418( lmg /ml) puis 24h plus tard avec de l'Hygromycine B (4001_tg/ml). Les clones obtenus ont été testés en immunofluorescence directe et en cytométrie de flux (FACScan, Becton Dickinson). En bref, 500 000 cellules sont incubées 40 minutes avec un anticorps murin reconnaissant HLA-DP (B721), IAd (MKD6) ou HLA -A3 (GAPA 3) en PBS 1% BSA 2mM EDTA, puis, après lavage, incubées 40 minutes avec un second anticorps de chèvre antisouris couplé au FITC, en PBS 1% BSA 2mM EDTA, et lavées en PBS BSA 2mM EDTA. 4) Extraction d'ADN génomique, Analyse de Southern Blot et PCR diagnostiques des transgènes. L'ADN génomique est préparé à partir de transfectants ou à partir de queues de souris selon la méthode suivante: traitement à la protéinase K, Incubation 16h à 56 C, traitement au NaCl saturé, précipitation de l'ADN à l'isopropanol-2, lavages à l'éthanol 70% et reprise du culot d'ADN dans 150.il de TrislOmM EDTA1mM. PH7,5.Des ADN extraits des transfectants DP ont été digérés par BamHI pour le diagnostic par analyse de Southern de DPalong et par EcoR1 pour le diagnostic de DP(3long, puis après électrophorèse en gel 0,6% d'agarose, transférés sur une membrane de nitrocellulose et hybridés avec leur sonde correspondante. La sonde DPa correspond à la totalité de l'ADNc de DPa103, la sonde DP(3 est l'ADNc de DP(3401. Ces sondes ont été radiomarquées au dCTP32 selon les directives du fabriquant (Megaprime DNA labelling system Amersham Pharmacia). L'expression des transgènes DP (3401 et DPa103 a été détectée par PcR en utilisant des amorces spécifiques des séquences DP. La PcR a été réalisée dans des tubes contenant de l'ADN génomique de souris (300 ng pour DP(3401 et DPa103, PcR Buffer, 15pM de chaque amorce, 12pM de chaque dNTP et 1,25 U de Taq Polymérase (GibcoBRL) avec une concentration finale de MgC12 de 2,6 mM pour DP(3401 et de 4,1 mM pour DPa 1 O3.Un 1 er cycle de dénaturation est réalisé 7' à 94 C suivi de 30 cycles consistant en 30" de dénaturation à 94 C, 30" d'hybridation à 55 C et 30" d'extension à 72 C, et d'un cycle final d'extension pendant 4' à 72 C. Pour DPj3401 l'amorce sens est 5' ggATTggAAAgAggCTC 3' et l'amorce antisens est 5' 25 gCACtgCCCgCTTCTCC 3'. Pour DPa103 l'amorce sens est 5' TAATACAAAgTCTgCAgCTggC 3' et l'amorce antisens est 5' AgCAATgTTAgCCAgCC 3' Construction de vecteurs d'expression codant le transgène HLA-DPa103 ou HLA-DP 30 j3401 Les cartes des 4 plasmides pIADPalong, pIADPalong, pSRDPalong et pSRDPalong sont rapportées sur les figures 1A à ID, respectivement. - pIADPalong: promoteur IAa/DPa103/NcIAa pIADP(3long: promoteur IAP/DP(3401/NcIAP - pSRDPalong: promoteur SR/DPa103/NcSV40 - pSRDPalong: promoteur SR/DP(3401/NcSV40 Les plasmides sont entièrement séquencés et vérifiés. Fonctionnalité des constructions Elle a été évaluée par transfection de fibroblastes murins (L Kuhn, H-2k) et de mastocytomes de souris (P815, H2d). Ces deux types cellulaires n'expriment pas naturellement de molécules d'histocompatibilité de classe II. La transfection des gènes DP(3 DPa a été associée à celle d'un plasmide codant pour le facteur de régulation transcriptionnel CIITA humain qui détermine l'activation des gènes HLA de classe II (a et (3) des séries HLA-DP, -DQ, -DR et active également l'expression du gène codant pour la chaîne invariante. Les anticorps MKD6 (anti- IAd) et GAPA3 (anti-HLA-A3) de même isotype immunoglobulinémique que l'anticorps B721, ont été utilisés comme contrôles. L'expression de surface des constructions DPa(3 sauvages a de nouveau pu être documentée à la surface de transfectants L (non réactifs avec l'anti-IAd MKD6) et de transfectants P815. Dans ce dernier cas, une forte réactivité a été observée avec l'anticorps MKD6 pas avec GAPA3, traduisant l'activation transcriptionnelle des gènes IAd suite à la transfection du gène CIITA. Les fonctionnalités des vecteurs pSRDPalong et pSRDP[31ong ont été évaluées par co-transfection de cellules humaines L Kuhn et de cellules HeLa. Celles des vecteurs pIADPalong et pIADP(3long ont été évaluées par co-transfection en plus du plasmide pCIITA et CIITA humain (facteur de régulation transcriptionnel CHTA humain) de cellules P815. Les résultats obtenus sont illustrés sur la figure 2.La figure 2A correspond aux transfectants HLA-DP non transfectés P815, co-transfectés par Dpalong/Dp(31ong/CIITA ou par CIITA, incubés avec l'anticorps monoclonal B721 (anti-HLA-DP), MKD6 (anti-IA) ou GAPA3 (anti-HLA-A3), puis avec une IgG-FITC de chèvre anti-souris. Les cellules sont analysées par cytométrie de flux. La figure 2B correspond aux transfectants L-Kuhn- DP et Hela-DP. Ces évaluations ont permis de vérifier que ces constructions sont fonctionnelles et codent le complexe HLA-DPal03(3401 fonctionnel, reconnu spécifiquement par des anticorps spécifiques anti-HLA-DP. Création de souris transgéniques et PCR diagnostiques des transgènes Deux approches de transgénèse ont été réalisées: une série de transgénèses simples a été realisée à l'hôpital Paul Brousse: Les constructions DPalong, DP(3long ont été microinjectées individuellement dans 10 des oeufs fertilisés de souris C57BL/6 X DBA2 - une série de transgénèses doubles a été réalisée à l'hôpital Cochin par microinjection des constructions DPalong / DP(3long dans des oeufs fertilisés de souris C57BL/6 X DBA2. Afin, de détecter les souris fondatrices simples ou double transgéniques, un test de PCR diagnostique a été mis au point et réalisé sur ADN extrait de queues de souris. La Figure 3a montre le résultat obtenu et la détection des transgènes DPalong. Une bande de 445 pb caractéristique de ce transgène apparaît avec les ADN des souris transgéniques pour DPalong. Cette bande est naturellement absente avec les ADN des souris témoins DBA2 et B6. La Figure 3 b illustre la détection des transgènes DP(31ong. La bande de 815 pb obtenue est spécifique de ces transgènes. 11 souris DP transgéniques ont été obtenues: souris DP a long 3 souris DP [3 long Des souris fondatrices exprimant individuellement le transgène HLA-DPa103 ou HLA-DP1401 ont été croisées entre elles. Les souris exprimant simultanément les deux transgènes HLA-DPa103 et HLA-DP(3401 ont ensuite été croisées avec des souris C57BL/6IAP pour obtenir des souris HLA-DPa1031401+IA(3 . L'expression de différents transgènes ou l'absence d'expression du gène IA(3 sont analysées par PCR et pour certaines, en plus, par Southern blot. Protocole de la PCR diagnostique des transgènes: - HLA-DPa103 Produits: TAQ DNA polymérase (Invitrogen) 5 MgC1II 50mM (Invitrogen) PcR Buffer 10X (Invitrogen) H20 stérile dNTP 4mM pour chaque Amorce: promoteur IAa (amorce sens) 5' TAA TAC AAA gTC TgC AgC Tgg C 3' DP2 a antisens 5' AgC AAT gTT AgC CAg CC 3' (MgClII) final = 4,1 mM Tm 55 C Pour DPa, on amplifie ainsi un fragment caractéristique du transgène d'environ 445 pb. Les témoins négatifs B6 et DBA/2 ne présentent aucune amplification. Cycles PCR 94 C 7 minutes (94 C 30 sec, 55 C 30 sec, 72 C 30 sec) X 40 cycles 25 72 C 4 minutes 4 C - HLA-DP[3401 transgène diagnostique PCR Produits: TAQ DNA polymérase (Invitrogen) MgClII 50mM (Invitrogen) PcR Buffer 10X (Invitrogen) H20 stérile dNTP 4mM pour chaque Amorce: promoteur IA13 (amorce sens) 5' ggA TTg gAA AgA ggC TC 3' DP(3 antisens 5' gCA CTg CCC gCT TCT CC 3' (MgC1II) final = 2,6 mM Tm 55 C Pour DP(3 on amplifie ainsi un fragment caractéristique du transgène d'environ 815 15 pb. Les témoins négatifs B6 et DBA/2 ne présentent aucune amplification. Cycles PCR 94 C 7 minutes (94 C 30 sec, 55 C 30 sec, 72 C 30 sec) X 40 cycles 72 C 4 minutes 20 4 C Phénotypages des souris HLA-DPa103(3401+ /IA(3 Le niveau d'expression à la surface cellulaire des complexes transgéniques HLA-DP chez les souris transgéniques HLA-DP+/IA(3 a été mesuré par cytométrie de flux. 25 Les résultats sont donnés sur la figure 4. Le nombre de lymphocytes T CD4+ périphériques et de cellules CD8+ ont été mesurés chez les souris (HLA-DP+/Iab ). La figure 5 illustre les résultats obtenus. Les splénocytes de souris C57BL/6 (B6 dans la figure 5A), HLA-DP/H-2 classe IIKO (DPCHKO dans la figure 5B) et H-2 classe I/classe II-KO (CI CHKO dans la figure 5C) ont été colorés avec des anticorps monoclonaux CTCD4 marqués avec PE (anticorps anti-CD4 de souris, en ordonnées) et marqué par FITC 53-6,7 (anticorps anti-CD8, en abcisse). Les valeurs numériques indiquées correspondent aux cellules T CD4+ (figure 5A, partie supérieure gauche) ou aux cellules T CD8+ (figure 5C,partie inférieure gauche) dans les splénocytes totaux. En utilisant la technologie de l'Immunoscope, on a montré que la diversité du répertoire des différents Vb des TCR des lymphocytes T CD4+ est comparable entre les souris (HLA-DP+/IA(3+) et les souris C57BL6 (voir figure 6). Etude fonctionnelle En utilisant l'antigène KLH (T dépendant), on a montré chez 6/6 souris (HLADP+/IA(3 / ) qu'elles étaient capables d'une réponse proliférative à cet antigène alors qu'aucune réponse n'a été observée chez 6/6 souris (IA(3 / ).Les résultats obtenus sont illustrés par les figures 7A et 7B. D'autres expérimentations ont consisté à utiliser l'antigène d'enveloppe HBs (préS2-S) du virus de l'hépatite B comme modèle d'étude pour analyser simultanément la réponse cellulaire et humorale anti-HBs entre les souris (HLA-DP+/IA(3 / ). Suite à une immunisation génétique par l'injection du plasmide pCMV-HBs codant la protéine HBs (préS2-S). Les tests suivants ont été utilisés: - test ELISA pour suivre la réponse humorale spécifique anti-HBs (anticorps antipréS2 et anti-S) ; -test de prolifération cellulaire spécifique pour suivre la réponse cellulaire auxiliaire spécifique des épitopes HLA-DP restreints dérivés de la protéine HBs (HBs Celis DP) . L'épitope T HBs Celis DP (FLLRILTIP) restreint à HLA-DP est décrit dans E. Celis 30 et RW Karr, J.Virol. 1989, Feb; 63(2) : 747-52. La présence simultanément d'une réponse cellulaire proliférative spécifique forte (index prolifératif >3) pour l'épitope T HBs Celis DP ( voir figure 8) et la présence d'anticorps anti-HBs et anti-pré-S2 (voir figure 9) ont été documentés chez 3 / 4 souris (HLA-DP+/IA5 / ) immunisées contre HBs. Aucune souris Ia(3 immunisées (0/4) avec le plasmide pCMV-S2S ne donne de réponse cellulaire spécifique pour l'épitope T HBs, ni de réponse anticorps antipréS2 ou anti-HBs. Ces résultats montrent que les souris (HLA-DP+/IA(3 / ) représentent un nouveau modèle expérimental animal de souris humanisées optimal pour l'identification des épitopes HLA-DP restreints présents dans les antigènes divers. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une construction de vecteur d'expression, codant pour le complexe HLA-DPa10313401 fonctionnel reconnu spécifiquement par des anticorps anti-HLA-DP, pour créer des souris transgéniques. 2. Souris transgéniques, caractérisées en ce qu'il s'agit de souris humanisées exprimant individuellement le transgène HLA-DPa103 ou HLA-DPf3 401ou simultanément les 2 transgènes. 3. Souris transgéniques pour HLA-DP (a10313401) et invalidées pour H-2 classe II (HLA-DP+/+IA(3 / ) 4. Utilisation des souris selon la revendication 3, pour l'étude pré-clinique comparative de l'efficacité de candidats vaccins. 5. Utilisation des souris selon la revendication 3, pour évaluer les risques liés à 20 une induction non désirée de maladie auto-immune. 6. Utilisation des souris selon la revendication 3, pour déterminer une stratégie thérapeutique. 7. Utilisation des souris selon la revendication 3, pour identifier de nouveaux épitopes permettant l'élaboration de réactifs pour un suivi de la réponse immunitaire spécifique post-infection ou post-vaccination. 8. Lymphocytes CD4+ isolés à partir de souris selon la revendication 3, après 30 leur immunisation. 9. Utilisation des lymphocytes CD4+ selon la revendication 8, pour établir des lignées cellulaires spécifiques. 10. Utilisation des lymphocytes CD4+ selon la revendication 8, pour créer des hybridomes T spécifiques. 11. Les lignées cellulaires établies selon la revendication 9. 12. Les hybridomes obtenus selon la revendication 10.