FR 2876104 A1 20060407 FR 0410448 A 20041004 R" 0 /R. R'O P\ OR8 X COMPOSES FLUOROPHOSPHONOCINNAMIQUES, SYNTHESE ET APPLICATIONS L'invention concerne un procédé de préparation de composés organofluorophosphorés. Elle concerne, plus précisément, une nouvelle méthode de fluoration de composés organophosphorés ainsi que la synthèse de composés fluorophosphonocinnamiques. Ces composés fluorophosphonocinnamiques, nouveaux en eux-mêmes, notamment par leur activité antioxydante, présentent un intérêt industriel tout particulier, notamment dans les domaines médical et/ou cosmétique. A l'heure actuelle, on connaît de nombreux esters organofluoro(thio) phosphorés que l'on peut généraliser par la formule suivante: R /0: 5 P R2/ \F et dans laquelle, RI et R2 peuvent désigner des radicaux très variés: alkyle, aryle, alcoyle, amide, anilide... Ces esters sont généralement décrits comme des inhibiteurs des réactions d'acylation enzymatique, particulièrement efficaces sur les acétylcholinestérases. Par ailleurs, de par leur pouvoir bactéricide et fongicide, ils sont classiquement utilisés dans le développement de compositions insecticides et/ou désinfectantes. Chworos et al., 1999 (Tetrahedron Letters, 40:9337-9340) décrit la préparation d'esters organofluorophosphorés particuliers, pour lesquels RI et R2 désignent des radicaux de type phényle, méthoxy, éthoxy et/ou terbutylméthoxy. La préparation de ces composés consiste en une réaction entre des composés de type phosphino(thio)sélénoate, phosphino(thio)chloridate ou leurs analogues phosphono- ou phosphoro-, et le fluorure d'argent (AgF). La réaction est réalisée en solution (de préférence dans le trichlorométhane ou le méthylnitrile) et peut être menée à température ambiante. Le produit d'intérêt apparaît sous la forme d'un précipité insoluble de couleur gris foncé. Il est récupéré après une dilution du mélange dans le dichlorométhane, suivie d'un lavage à la saumure et d'un séchage sur du sulfate de magnésium. La méthode de fluoration décrite par Chworos et al., 1999, bien que facile et rapide à mettre en oeuvre, présente toutefois deux inconvénients majeurs. Le premier inconvénient tient du réactif utilisé, le fluorure d'argent, un réactif particulièrement coûteux. Un autre inconvénient repose sur l'impossibilité d'obtenir par cette méthode, des composés de type fluorothiophosphoré mais uniquement des composés de type fluorophosphoré. En effet, même en partant d'un composé de type thiophosphonate, la fluoration par le fluorure d'argent io s'accompagne également de la conversion de la fonction thiophosphonate en une fonction phosphonate et aboutit en final à la formation d'un composé fluorophosphoré. US 2,962,517 décrit une autre méthode de préparation d'esters organofluorophosphorés et d'ester organofluorothiophosphorés, en particulier des 15 composés répondant à la formule générale suivante: O (5) II OR RO CH =CH PAF R désignant des radicaux de type alkyle. Pour ce faire, une réaction est réalisée entre un dichlorure d'acide (3alcoxy- ou (3-alcoylmercaptovinyl-phosphonique et des fluorures alcalins en présence d'un alcool anhydre et d'un solvant de type benzène, toluène ou chlorobenzène. Les fluorures alcalins (notamment, le fluorure de sodium) doivent être de préférence anhydres et à l'état finement divisé. La température de réaction 25 est de l'ordre de 60-90 C. Non seulement le procédé en question requiert la manipulation du benzène, du toluène ou du chlorobenzène, c'est-à-dire des solvants particulièrement volatils, inflammables, cancérigènes et nocifs notamment par inhalation et par contact cutané, qui plus est, il est prescrit de chauffer le milieu réactionnel, et donc de chauffer ces substances dont la dangerosité est expressément signalée même à température ambiante. L'invention vise, dans ce contexte, à proposer un procédé pour fluorer des composés organophosphorés, y compris organothiophosphorés, en des composés fluoro(thio)phosphorés correspondants, et dont la mise en oeuvre nécessite l'utilisation d'aucune substance ayant un risque sérieux pour la santé ou un quelconque danger de manipulation, dans les conditions normales de mise en oeuvre dudit procédé. En particulier, l'invention vise à permettre la fluoration, selon un procédé simple et rapide à mettre en oeuvre, de composés organo(thio)phosphorés particuliers, en l'occurrence des composés (thio)phosphono- io cinnamiques, pour lesquels des tentatives de fluoration n'ont pour l'instant été que très peu envisagées, voire pas du tout. Un autre objectif de l'invention est de pouvoir proposer de nouveaux composés chimiques ainsi synthétisés ayant une application industrielle d'un intérêt tout particulier et un potentiel sensiblement amélioré par rapport à des composés, correspondants ou analogues, non fluorés. Dans la suite du texte et selon le contexte, les termes "phosphoré", "phosphorique", "phosphonique"... seront utilisés soit de manière spécifique pour désigner des groupes phosphorés dans lesquels l'atome de phosphore se trouve lié, par une double liaison à un atome d'oxygène, soit de manière plus générale, pour inclure également la possibilité que ledit atome de phosphore puisse aussi être lié, par une double liaison, non pas à un atome d'oxygène, mais à un atome de soufre (en d'autres termes, "phosphoré", "phosphorique", "phosphonique"... pourront également et éventuellement être compris comme respectivement comme "thiophosphoré", "thiophosphorique", "thiophosphonique"... ). L'invention concerne des composés fluorophosphonocinnamiques de formule générale: Rl R2 (I) R'O dans laquelle: X est choisi parmi: un atome d'oxygène ou un atome de soufre, R', R2, R3, R4, R5 et R6 sont choisis parmi: H, un groupe alkyle, un groupe aryle, OH, 0-alkyle, S-alkyle, NH2, NH-alkyle, N-(alkyle)2; R' est choisi parmi: H, un groupe alkyle, un groupe aryle, un groupe silyle; R8 est choisi parmi: H, un groupe alkyle, un groupe aryle, lesdits groupes alkyle et aryle contenant de l'ordre de 1 à 6 atomes de carbone linéairement liés. Selon l'invention, ces composés fluorophosphonocinnamiques de formule générale (I) peuvent être obtenus par fluoration de 15 composés phosphonocinnamiques de départ de formule générale: R1 R2 (II) P\ R8 R R' R6 X dans laquelle: X est choisi parmi: un atome d'oxygène ou un atome de soufre, R' est choisi parmi: un groupe S-alkyle, S-aryle, S- amine, S-amide, NH-alkyle, NH-aryle, NH-benzyle, N-(alkyle)2, N-(aryle)2, R7' est choisi parmi: H, un groupe alkyle, un groupe aryle, lesdits groupes alkyle et aryle contenant de l'ordre de 1 à 6 atomes de carbone 30 linéairement liés. Les composés phosphonocinnamiques (non fluorés) de formule générale (II), qui sont utilisés comme produits de départ dans le procédé R'' O selon l'invention, sont déjà connus de l'état de l'art et des exemples de leur préparation peuvent être trouvés dans les publications telles que Kennedy et al. 1999 (J. Enzyme Inhibition, 14:217-237) et Lapeyre et al., 2003 (Tetrahedron Letters, 44:2445-2447). Selon l'invention, pour fluorer un composé phosphonocinnamique répondant à la formule générale (II), spécifiquement sur l'atome de phosphore, on le fait réagir, à une température comprise entre -20 et 85 C, et avantageusement à température ambiante, avec un agent de fluoration comprenant un complexe formé entre une amine tertiaire, notée R3N, et le fluorure io d'hydrogène (HF) ; ladite amine tertiaire (R3N) étant substituée par des groupes alkyle comprenant de l'ordre de 1 à 6 atomes de carbone linéairement liés. L'invention repose ainsi sur la mise en évidence qu'un complexe formé entre une amine tertiaire et le fluorure d'hydrogène constitue un excellent agent pour la fluoration, spécifiquement sur l'atome de phosphore, des composés phosphonocinnamiques. Le fluorure d'hydrogène sous forme d'un complexe avec une amine tertiaire, est déjà connu comme permettant la substitution d'un groupe partant ad hoc par un atome de fluor (McClinton, 1995, Aldrichimica Acta, 28(2):31- 35). Il est d'ailleurs bien établi que la réactivité, et donc la capacité de fluoration, de ces complexes est fonction de leur nucléophilie. Cette nucléophilie dépend en grande partie de la proportion molaire entre l'amine tertiaire et le fluorure d'hydrogène qui, de manière générale, peut être de l'ordre de 1:1, 1:2 ou 1:3. On distingue alors trois types de complexes notés R3NÉHF, R3N.2HF et R3NÉ3HF qui correspondent respectivement aux proportions molaires précédemment indiquées. La nucléophilie de ces différents complexes varie selon l'ordre suivant: R3NÉ2HF > R3NÉ3HF > R3NÉHF. Toutefois, jusqu'à présent, une substitution médiée par de tels complexes, concernait uniquement des groupes partants censés être portés obligatoirement par des atomes de carbone. Pour fluorer un composé organo(thio)phosphoré au niveau de l'atome de phosphore, des procédés tels que ceux décrits par US 2,962,517 ou par Chworos et al., 1999 (Tetrahedron Letters, 40:9337-9340), avec les inconvénients qui en découlent, étaient utilisés de manière prépondérante, voire exclusive. Un procédé selon l'invention permet de fluorer, de manière simple, spécifiquement l'atome de phosphore de composés organophosphorés de formule générale (II) et ce, en une seule étape avec un bon rendement et une sélectivité totale. Une simple étape de purification classique suffit pour recueillir les composés fluorophosphonocinnamiques ainsi synthétisés. Le procédé selon l'invention présente par ailleurs l'avantage de pouvoir être mené avec des produits de départ et des réactifs facilement accessibles io (c'est-à-dire soit parce qu'ils sont déjà disponibles dans le commerce et ce, à des prix raisonnables, soit parce que leur(s) méthode(s) de synthèse a(ont) déjà été décrite(s) dans la littérature) et dont la dangerosité est négligeable dans les conditions normales de mise oeuvre d'un procédé conforme à l'invention. En particulier, la réaction de fluoration selon l'invention peut avantageusement être menée à température ambiante ou à des températures bien inférieures. Comme amine tertiaire selon l'invention, on peut citer à titre d'exemple, la triméthylamine (Me3N), la triéthylamine (Et3N), la tripropylamine, la tributylamine ou encore la tripentylamine. On utilise de préférence la triéthylamine (Et3N). Avantageusement et selon l'invention, on utilise à titre d'agent de fluoration, un complexe de type R3NÉHF, en particulier Et3NÉHF; c'est-àdire avec un rapport molaire amine ternaire/fluorure d'hydrogène de l'ordre de 1:1. Les inventeurs ont aussi constaté qu'avec un complexe R3NÉHF (notamment avec la triéthylamine comme amine tertiaire selon l'invention), de nucléophilie significativement moindre par rapport aux complexes de type R3NÉ2HF ou R3NÉ3HF, celui-ci présentait tout de même une réactivité remarquable. De préférence, on effectue la réaction en phase liquide. On peut alors utiliser un solvant dans lequel le composé organique est soluble, par exemple, le dichlorométhane, l'acétonitrile ou encore le tétrahydrofurane. Avantageusement et selon l'invention, on réalise la réaction avec un excès d'agent de fluoration. En particulier, on utilise un rapport molaire, entre le composé de départ de formule (II) et l'agent de fluoration, de l'ordre de 1,2 à 20. De préférence, ce rapport molaire est d'au moins de l'ordre de 5. Avantageusement et selon l'invention, le groupe R8 d'un composé phosphonocinnamique de départ de formule générale (II) est choisi parmi les groupes partants: -SCH2CH2NHCOCH3, -NHCH2Ph (Ph désigne un radical phényle). Avantageusement et selon l'invention, dans la formule générale (II) d'un composé de départ: - R7 désigne un groupe choisi parmi: -H ou -CH3, et R' et R4 désignent des groupes choisis parmi: -H ou -OCH3. Par exemple, on peut réaliser l'invention avec, comme composé phosphonocinnamique de départ répondant à la formule générale (II), un des thioesters phosphonocinnamiques dont un protocole de préparation est décrit dans la publication Lapeyre et al., 2003 (Tetrahedron Letters, 44:2445-2447), ou un composé analogue. Dans cet exemple, le groupe partant est de type S-amine, en particulier un radical N-acétylcystéamine (-SCH2CH2NHOOCH3). Comme autre composé de départ répondant à la formule générale (II), on peut aussi citer l'éthyl-2-N-benzyl-2-(3,4-diméthoxyphényl)éthène phosphonamide dont un protocole de préparation est décrit dans la publication Kennedy et al., 1999 (J. Enzyme Inhibition, 14:217-237), ou un composé analogue ou équivalent. Dans cet exemple, le groupe partant est de type amine secondaire, en particulier -NHCH2Ph. L'invention porte également, en tant que produits nouveaux, sur des composés fluorophosphonocinnamiques de formule générale (I). A l'instar d'un grand nombre de composés de type cinnamique, et des composés phosphonocinnamiques non fluorés de formule (II) en particulier, les composés fluorophosphonocinnamiques selon l'invention, présentent une activité antioxydante particulièrement intéressante dans le cadre d'un traitement thérapeutique ou cosmétique des troubles physiologiques causés par un stress oxydatif. En effet, les travaux des inventeurs ont permis de montrer que l'effet protecteur des composés fluorophosphonocinnamiques selon l'invention contre l'oxydation des LDL est avantageusement très comparable à celui observé avec les composés non fluorés correspondants. Toutefois, à la différence de ces composés non fluorés, les composés fluorophosphonocinnamiques selon l'invention manifestent de façon surprenante également un effet protecteur contre la toxicité afférente à 4-HNE et ceci, très vraisemblablement grâce à leur atome de fluor. De par leur effet protecteur des LDL contre l'oxydation, cumulé à leur effet protecteur des cellules contre la toxicité du 4-FINE, les composés selon l'invention présentent un intérêt d'application majeur dans le traitement de l'athérosclérose et de ses complications cardio- ou neurovasculaires. L'athérosclérose est une pathologie multifactorielle dans io laquelle les lipides jouent un rôle important, à côté d'autres facteurs génétiques ou nutritionnels. Parmi les facteurs métaboliques impliqués dans l'initiation et le développement des plaques, les LDL (qui transportent le cholestérol du sang vers les tissus périphériques), deviennent athérogènes après modification oxydative dans la paroi vasculaire. L'oxydation induite dans les LDL provoque in situ la formation d'aldéhydes (notamment 4-FINE) qui peuvent à leur tour oxyder les LDL. Les LDL oxydées jouent un rôle majeur dans la formation de cellules spumeuses dont l'accumulation en stries graisseuses est à l'origine des premières lésions d'athérosclérose. Ces LDL oxydées présentent également des propriétés proinflammatoires, mitogènes, procoagulantes et proapoptotiques qui sont potentiellement impliquées dans l'évolution des plaques vers des stades plus avancés, voire des phénomènes de rupture et de thrombose qui sont à l'origine des accidents cardiovasculaires. Les molécules capables de bloquer le processus d'oxydation des LDL sont donc extrêmement efficaces pour inhiber le développement des plaques. Dans ce contexte, l'invention fournit ici de nouveaux agents bloqueurs de la voie d'oxydation des LDL et dont l'efficacité est d'autant plus remarquable qu'ils agissent au moins à deux niveaux différents de cette voie (action directe sur les LDL, et via 4-HNE). L'invention s'étend donc également à une composition cosmétique ou thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé fluorophosphonocinnamique selon l'invention, en particulier pour leur effet bloqueur de la voie d'oxydation des LDL. Avantageusement et selon l'invention, il s'agit d'une composition thérapeutique destinée au traitement des troubles physiologiques causés par un stress oxydatif, en particulier l'athérosclérose et ses complications cardio- ou neuro-vasculaires. L'invention concerne également un procédé de protection in vitro des LDL contre l'oxydation, dans lequel on met des LDL en contact avec au moins un composé fluorophosphonocinnamique selon l'invention. Avantageusement et selon l'invention, à titre de composé selon l'invention, on peut citer tout particulièrement: - le (E)-2-(4-hydroxy-3-méthoxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule: HO F P\â/ O-CH2-CH3 (5) H3CO - le (E)-2-(4-hydroxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule: HO F \ P/ O-CH2-CH3 (6) - le (E)-2-(4-hydroxy-3,5-diméthoxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule: H3CO HO \ (_OCH2CH3 F --o (7) H3CO - le (E)-2-(3,4-diméthoxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule: H3CO \ /F P\\ OCH2-CH3 (8) O L'invention concerne aussi un procédé de préparation de composés fluorophosphonocinnamiques, des composés fluorophosphono- H3CO i0 cinnamiques, une composition thérapeutique ainsi qu'un procédé pour protéger les LDL de l'oxydation, caractérisés, en combinaison, par tout ou partie des caractéristiques ci-dessus ou ci-après. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit et qui fait référence, d'une part, à la synthèse de composés fluorophosphonocinnamiques particuliers (de formules notées 5 à 8) conformes à l'invention, et d'autre part, à l'étude de l'effet biologique antiathérogène de ces composés. Les résultats expérimentaux font notamment référence aux figures annexées dans lesquelles: io - les figures lA, 1B et 2 sont des représentations statistiques, en bâtonnets, de l'effet antioxydant global de composés particuliers conformes à l'invention, ainsi que de leur effet sur la protection des cellules soumises à un stress oxydatif, - les figures 3 et 4 montrent l'évolution de la survie des 15 cellules en présence de LDL oxydées ou du 4-HNE, en fonction de la concentration du milieu en un composé particulier conforme à l'invention. SYNTHESE CHIMIQUE ET ANALYSE É La synthèse: La méthode de synthèse de ces quelques composés répond 20 schématiquement à l'équation réactionnelle suivante: R1 R1 /R' R7o OCHZCH, Et3N.HF,THF \ O R7' O 1, R'=R''=H, R4=OCH3, R'=S(CH2)2NHCOCH3 5, R'=R'=H, R4=OCH3 2, R'=R4=R''=H, R'=S(CH2)2NH000H3 6, R'=R4=R'=H 3, R'=R4=OCH3, R''=H, R'=S(CH2)2NH000H3 7, R'=R4=OCH3, R'=H 4, R'=H, R4=OCH3, R''=CH3,R'=S(CH2)2NH000H3 R'=H, R4=OCH3, R'=CH3 4', R'=H, R4=OCH3, R''=CH3,R'=NHCH2Ph Les phosphonothioesters désignés 1 à 4, pour lesquels le groupe partant R' est un groupe N-acétylcystéamine, peuvent être préalablement Il synthétisés selon la méthode décrite dans la publication Lapeyre et al., 2003 (Tetrahedron Letters, 44:2445-2447). Le phosphonamide désigné 4', pour lequel le groupe partant R' est une amine secondaire, peut être préalablement synthétisé selon la méthode décrite dans la publication Kennedy et al. 1999 (J. Enzyme Inhibition, 14:217-237). La triéthylamine d'Avocado (pureté 99 %) et le complexe Et3NÉ3HF d'Aldrich (pureté 98 %) sont utilisés pour la génération du complexe Et3NÉHF. Le tétrahydrofurane (THF) anhydre (pureté 99,7 %) et io l'acétate d'éthyle pour HPLC préparative (pureté 99,8%) sont fournis par la société SDS, France. É La purification: L'ensemble des produits est purifié par chromatographie liquide moyenne pression (MPLC) sur un appareil JOBIN- YVON à compression axiale avec des colonnes de 20 ou 40 mm de diamètre remplies de silice 15-40 m (MERCK France) en utilisant les systèmes d'éluants appropriés. É Les analyses: Les chromatographies sur couches minces sont réalisées en utilisant des plaques de silice MERCK 60-F254. Les points de fusion ont été mesurés sur un appareil BUCHI. Les spectres IR sont enregistrés sur un spectrophotomètre Perkin-Elmer à transformée de Fourrier modèle FT-IR spectrophometer 1725x. Les spectres de masse (ionisation chimique DCI ou impact électronique EI) sont réalisés sur un spectromètre quadripolaire NERMAG R10-10. Les spectres ultraviolets sont enregistrés sur un instrument HEWLETT PACKARD 8453. Les spectres RMN sont enregistrés sur des appareils BRÜCKER: AC-250 travaillant à 250 MHz pour le noyau 'H, à 62,5 MHz pour le noyau '3C; 30 AC-200 travaillant à 81 MHz pour le noyau 31P, 188,5 MHz pour le noyau 19F. Les déplacements chimiques (S) sont exprimés en ppm en prenant le signal du tétraméthylsilane comme référence pour les noyaux 'H et 13C, le signal de l'acide phosphorique, comme référence pour le noyau 31P et, le signal de l'acide fluorhydrique, comme référence pour le noyau 19F. Les constantes de couplage J sont exprimées en Hertz et la multiplicité des signaux est indiquée par une lettre minuscule: s (singulet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet), m (multiplet). É Quelques exemples de synthèse 1/ Le (E)-2-(4-hydroxy-3 -méthoxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle a) Protocole de synthèse: Le phosphonothioester silylé 1 (0,64 mmol) est dissout dans 4 ml de THF sous azote dans un ballon bicol de 25 mL. 2,1 mmol de triéthylamine puis 1,1 mmol du complexe Et3NÉ3HF sont ensuite ajoutées à la microseringue. La solution ainsi obtenue est agitée à 20 C pendant 2 h. Le brut réactionnel est concentré sous pression réduite puis le composé 5 ainsi obtenu est purifié par MPLC (éluant AcOEt). b) Caractérisation: Aspect: solide blanc. Rendement: 64 %. Rf_ 0,67 (AcOEt). Pf_ 92-93 C. IR: (lames de KBr, CHC13) v (3242 cm', O-H), v (3006 cm 1, C-H alcène), v (1617 cm', C=C aromatique), v (1598, 1516 cm', C=C aromatique), v (1271 cm', P=0), v (1162 cm', P-O-C), 8 (982 cm-', C=C trans), 8 (881, 800 cm 1, aromatique), 8 (756 cm-1, P-O-R). Masse: MS (CI NH3, MNH4+) 278. UV: (Na2HPO4/KH2PO4, 100 mM pH 6.25) = 313 nm, s = 18400 mol-'. L. cm'. RMN 'H (solvant: CDC13, 250 MHz, 8 ppm) 1,38 (t, 3H, 3JH_H = 7,1 Hz, CH3CH2), 3,87 (s, 3H, CH3O), 4,27 (qd, 2H, 3JH_H = 3Jp_o_ cH = 7,1 Hz, CH2O), 6,04 (dd, 1H, 3JH_H = 17,5 Hz, 2Jp_cH = 19,6 Hz, C=CH-P), 6,92 (m, 4H, OH+H-6+H-2+H-5), 7,51 (dd, 1H, 3JH_H = 17,5 Hz, 3Jp_cH=cH = 24,7 Hz, CH=CH-P). RMN 13C (solvant: CDC13, 62,5 MHz, 8 ppm) 17,38 (d, 1C, 3Jc_P = 6,0 Hz, ÇH3CH2), 56,98 (s, 1C, CH3O), 64,58 (d, 1C, 2Jc_P = 6,0 Hz, CH2O), 106,81 (dd, 1C, 'Jc_P = 207,3 Hz, 2JC_F = 32,4 Hz, C=Ç-P), 110,60 (s, 1C, C-6), 116,09 (s, 1C, C-5), 124,16 (s, 1C, C-2), 127,45 (d, 1C, 3Jc_P = 26,2 Hz, C-1), 148,26 (s, 1C, C-4), 150,08 (s, 1C, C-3), 152,85 (dd, 1C, 2Jc_P = 7,9 Hz, 3JC_F = 3,9 Hz, C=C-P). RMN 31P (solvant: CDC13, 81 MHz, S ppm) 19,79 (d, 3JP_F = 1023 Hz, P-F). RMN 19F (solvant: CDC13, 188,3 MHz, S ppm) 11,75 (d, 3JF_P = 1023 Hz, F-P). Analyses élémentaires (théoriques/expérimentales) Carbone (50,78/50,93) Hydrogène (5,42/5,36) 2/ Le (E)-2-(4-hydroxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle a) Protocole de synthèse: Le phosphonothioester 2 (0,64 mmol) est dissout dans 4 ml de THF sous azote dans un ballon bicol de 25 ml. 2,1 mmol de triéthylamine puis 1,1 mmol du complexe Et3NO3HF sont ensuite ajoutées à la microseringue. La solution ainsi obtenue est agitée à 20 C pendant 3 h. Le brut réactionnel est concentré sous pression réduite puis le composé 6 ainsi obtenu est purifié par MPLC (éluant AcOEt). b) Caractérisation: Aspect: huile transparente. Rendement: 66 %. Rf_ 0,64 (AcOEt). IR: (lames de KBr, CHC13) v (3233 cm-', O-H), v (3020 cm-', C-H alcène), v (1604 cm-', C=C), v (1585, 1515 cm-', C=C), v (1230 cm', P=0), v (1170 cm-', P-O-C), S (984 cm-', C=C trans), (843 cm-', aromatique), b (757 cm', P-O-C). Masse MS (CI NH3, MNH4+) 248. UV: (Na2HPO4/KH2PO4, 100 mM pH 6.25) X = 285 nm, s = 21200 mol-1. L. cm-'. RMN 'H (solvant: CDC13, 250 MHz, 8 ppm) 1,41 (t, 3H, 3JH_H = 7,0 Hz, CH3CH2), 4,30 (qd, 2H, 3JH-H = 3JP-O-CH = 7, 0 Hz, CH2O), 6,03 (dd, 1H, 3JH_H = 17,5 Hz, 2JP-CH = 20,4 Hz, C=CH-P), 6, 92 (d, 2H, 3JH-H = 8,7 Hz, H-2+H-6), 7,37 (d, 2H, 3JH_H = 8,7 Hz, H-3+H-5) , 7,54 (dd, 1H, 3JH_H = 17,5 Hz, 3JP-CH=CH = 25,0 Hz, CH=CH-P), 8,54 (s, 1H, OH). RMN 13C (solvant: CDC13, 62,5 MHz, S ppm) 17,41 (d, 1C, 3Jc_P = 6,0 Hz, CH3CH2), 65,00 (d, 1C, 2Jc-P = 6,2 Hz, CH2O) , 105,50 (dd, 1C, 'Jc_P = 208,4 Hz, 2JC-F = 31,5 Hz, C=Ç-P), 117,29 (s, 2C, C-2+C-6), 126,88 (d, 1C, 3Jc_1 = 25,7 Hz, C-1), 131,28 (s, 2C, C-3+C- 5), 153,33 (dd, 1C, 2JC-P = 7,8 Hz, 3JC-F = 4,7 Hz, C=C-P), 161,12 (s, 1C, C-4). RMN 31P (solvant: CDC13, 81 MHz, S ppm) 20,53 (d, 3JP_F = 1024 Hz, P-F). RMN 19F (solvant: CDC13, 188,3 MHz, 8 ppm) 11,17 (d, 3JF_P = 1024 Hz, F-P). 3/ Le (E)-2-(4-hydroxy-3,5-diméthoxyphényl)vinyl-phosphono-15 fluoridoate d'éthyle a) Protocole de synthèse: Le phosphonothioester 3 (0,64 mmol) est dissout dans 4 ml de THF sous azote dans un ballon bicol de 25 mL. 2, 1 mmol de triéthylamine puis 1,1 mmol du complexe Et3NÉ3HF sont ensuite ajoutées à la microseringue. La solution ainsi obtenue est agitée à 20 C pendant 3 h. Le brut réactionnel est concentré sous pression réduite puis le composé 7 ainsi obtenu est purifié par MPLC (éluant AcOEt). b) Caractérisation: Aspect: solide blanc. Rendement: 68 %. Rf_ 0,59 (AcOEt). Pt-1 153-155 C. IR: (lames de KBr, CHC13) v (3255 cm-', O-H), v (3019 cm-1, C-H alcène), v (1618 cm-', C=C aromatique), v (1597, 1513 cm-', C=C aromatique), v (1251 cm-1, P=0), v (1158 cm-', P-O-C), 8 (975 cm-', C=C trans), v (752 cm-1, P-O-R). Masse: MS (CI NH3, MNH4+) 308. UV: (Na2HPO4/KH2PO4, 100 mM pH 6.25) = 310 nm, c = 18000 mol'. L. cm-1. RMN 'H (solvant: CDC13, 250 MHz, 8 ppm) 1,40 (t, 3H, 3Jx_x = 7,0 Hz, CH CH2), 3,90 (s, 6H, CH3O), 4,29 (qd, 2H, 3Jx_x = 3Jp_o_ cx = 7,0 Hz, CH2O), 6,00 (s, 1H, OH), 6,08 (dd, 1H, 3Jx_x = 17,5 Hz, 2Jp_cH = 19,2 Hz, C=CH-P), 6,73 (d, 2H, H-2+H-6), 7,50 (dd, 1H, 3Jx_x = 17,5 Hz, 3Jp_cx=cx = 24,5 Hz, CH=CH-P). RMN13C (solvant: CDC13, 62,5 MHz, 8 ppm) 17,45 (d, 1C, 3Jc_p = 6,0 Hz, ÇH3CH2), 57,44 (s, 2C, CH3O), 64,54 (d, 1C, 2Jc_p = 6,0 Hz, CH2O), 106,12 (s, 2C, C-2+C-6), 107,81 (dd, 1C, 'Jc_p = 207,0 Hz, 2Jc_F = 32,9 Hz, C=Ç-P), 126,60 (d, 1C, 3Jc_p = 26,2 Hz, C-1), 138,88 (s, 2C, C-3+C-5), 148,39 io (s, 1C, C-4), 152,82 (dd, 1C, 2Jc_p = 7,9 Hz, 3JC_F = 4,2 Hz, Ç=C-P). RMN 31P (solvant: CDC13, 81 MHz, 8 ppm) 19,43 (d, 3Jp_F = 1023 Hz, P-F). RMN19F (solvant: CDC13, 188,3 MHz, 8 ppm) 11,90 (d, 3JF_p = 1023 Hz, F-P). Analyses élémentaires (théoriques/expérimentales) Carbone (49,66/49,60) Hydrogène (5,53/5,37) 4/ Le (E)-2-(3,4-diméthoxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle a) Protocole de synthèse: Le phosphonothioester 4 (0,64 mmol) est dissout dans 4 ml de THF sous azote dans un ballon bicol de 25 mL. 2,1 mmol de triéthylamine puis 1,1 mmol du complexe Et3NÉ3HF sont ensuite ajoutées à la microseringue. La solution ainsi obtenue est agitée à 20 C pendant 2 heures. Le brut réactionnel est concentré sous pression réduite puis le composé 8 ainsi obtenu est purifié par MPLC (éluant AcOEt). b) Caractérisation: Aspect: huile transparente. Rendement: 69 %. Rf_ 0,59 (AcOEt). IR: (lames de KBr, CHCl3) v (3019 cm-', C-H alcène), v (2938 cm-', C-H alcane), v (1616 cm-', C=C), v (1583, 1514 cm-', C=C), v (1270 cm-', P=0), v (1160 cm-', P- O-C), S (981 cm', C=C trans), 8 (880, 852 cm', aromatique), 8 (757 cm', P- OR). Masse: MS (CI, MH+) 275 UV: (Na2HPO4/KH2PO4, 100 mM pH 6.25) X = 312 nm, c = 2500 mol'. L. cm'. 5 RMN 'H (solvant: CDC13, 250 MHz, 8 ppm) 1,42 (t, 3H, 3JH_H = 7,0 Hz, CH CH2), 3,92 (s, 6H, CH3O), 4,30 (qd, 2H, 3JH_H = 3Jp_p_ cH = 7,0 Hz, CH2O), 6,09 (dd, 1H, 3JH-H = 2JP-CH = 18,4 Hz,C=CH-P), 6,88 (d, 1H, 2JH_H = 8,2 Hz, H-6), 7,03 (s, 1H, H-2), 7,10 (d, 1H, 2JH_H = 8,2 Hz, H-5), 7,56 (dd, 1H, 3JH_H = 17,4 Hz, 3Jp_cH=cH = 24,4 Hz, CH=CH-P). lo RMN 13C (solvant: CDC13, 62,5 MHz, 8 ppm) 16,34 (d, 1C, 3Jc_p = 6,0 Hz, CH3CH2), 55,94, 56,02 (s, 2C, CH3O), 63,38 (d, 1C, 24_ p = 6,8 Hz, CH2O), 106,85 (dd, 1C, 'Jc_p = 206,9 Hz, 2JC_F = 33,2 Hz, C=C-P), 109,51 (s, 1C, C-6), 111,03 (s, 1C, C-2), 122,75 (s, 1C, C-5), 149,34 (s, 1C, C-1), 151,32 (dd, 1C, 2Jc_p = 8,3 Hz, 3Jc_F = 4,5 Hz, Ç=C-P), 151,73 (s, 2C, C-4 + C-3). RMN 31P (solvant: CDC13, 81 MHz, 8 ppm) 19,49 (d, 3Jp_F = 1024 Hz, P-F). RMN 19F (solvant: CDC13, 188,3 MHz, 8 ppm) 11,92 (d, 3JF_p = 1024 Hz, F-P). c) Observation: Selon une autre méthode de synthèse du composé 8, à titre de composé de départ, on peut également utiliser le (E)-éthyl-2-N-benzyl2(3,4-diméthoxyphényl)éthène phosphonamide. EFFET ANTIATHEROGENE DES COMPOSES SYNTHETISES 1/ Etude de l'effet des composés synthétisés à l'égard de 25 l'oxydation des LDL Les LDL natives sont purifiées à partir de pools de sérum issus de sujets sains, par ultracentrifugation préparative en gradient de KBr. Les LDL sont ensuite dialysées dans un tampon NaCl isotonique (9 g/1, pH 7,2), pour éliminer le KBr, puis stérilisées (filtre 0,2 nm) et conservées sous azote jusqu'à utilisation (au maximum: 2 semaines). Les cellules endothéliales humaines en culture (lignées HMEC ou ECV304) sont cultivées dans des boîtes multi-puits et amenées à subconfluence dans du milieu de culture RPMI 1460 contenant 10 % de sérum de veau fétal et des antibiotiques (pénicilline, streptomycine). Le milieu de culture standard est remplacé par du RPMI 1640 (1 mllpuits) contenant 1 M de CuSO4 (pour initier l'oxydation) et 100 g/ml de LDL natives, ainsi que les différents composés (notés 5 à 8) à tester à concentrations variables. Après 6 heures de contact, une partie du milieu est prélevée pour mesurer les paramètres d'oxydation des LDL (TBARS). Après 24 heures de contact, la viabilité résiduelle des cellules en contact avec les LDL oxydées (et éventuellement protégées de l'oxydation par les CPS) est mesurée (test MTT). Les LDL sont rapidement oxydées par les cellules vasculaires en culture. Des études préliminaires ont montré que cette oxydation nécessite la présence de métaux lourds (tels que le cuivre ou le fer) d'où l'addition de CuSO4. La cinétique d'oxydation est au départ ralentie par les antioxydants endogènes (vitamine E), et se poursuit au-delà de 24 heures (plateau). Nous mesurons l'oxydation des LDL après 6 heures de contact car elle est alors en phase exponentielle et l'effet éventuellement protecteur des antioxydants est plus sensible. L'oxydation est mesurée par le dosage des TBARS (substances réactives à l'acide thiobarbiturique), qui permettent une évaluation globale, quantitative et sensible du phénomène d'oxydation. Les composés précédemment synthétisés, notés respectivement 5 à 8, sont dissous dans du DMSO et testés à des concentrations variant de 0,1 à 100 M (concentration finale en DMSO n'excédant pas 0,05 %). Aucune autotoxicité de ces composés 5 à 8 n'a été observée sur les cellules aux concentrations utilisées dans cette étude (résultats non présentés). Les résultats, présentés à la figure 1A, montrent un effet antioxydant pour chacun des composés 5 à 8, avec toutefois un effet antioxydant bien plus marqué pour le composé 5 avec une protection significative de l'oxydation des LDL dès 1 M et plus important avec des concentrations plus élevées. Dans la figure 1A, les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle (test sans composé synthétisé avec soit les LDL oxydées seules). Le taux de TBARS dans les LDL oxydées par les cellules en 6 heures et de 6 à 10 nmoles de TBARS/mg d'apoB. Les composés 5 à 8 sont ajoutés à concentrations variant de 0,1 à 100 M. Les résultats présentés correspondent à la moyenne de trois expériences séparées réalisées en duplicate. Les LDL oxydées sont toxiques pour les cellules vasculaires en culture. Cet effet toxique peut être étudié par le test colorimétrique MTT qui mesure la viabilité cellulaire. Les résultats, présentés à la figure 1B, montrent une viabilité résiduelle de 15 à 20 % pour les cellules en contact 24 heures avec des LDL oxydées seules (en l'absence des composés 5 à 8). En corrélation avec l'effet sur les TBARS, le composé 5 se révèle très efficace pour prévenir la toxicité des LDL oxydées par les cellules, en fonction de la dose utilisée. Les autres composés ont un effet plus limité. Le composé 5 est très efficace pour protéger les LDL de l'oxydation par les cellules vasculaires et leur toxicité consécutive est limitée. Cet effet est comparable à celui observé avec des polyphénols tels que catéchine ou quercétine, avec un effet moins toxique (pour les cellules) aux concentrations égales ou supérieures à 100 M. 2/ Etude de l'effet cytoprotecteur du composé 5 à l'égard des LDL oxydées Nous avons étudié l'effet cytoprotecteur du composé 5 sur la toxicité de LDL déjà oxydées en l'absence de tout autre composé synthétisé (6 à 8) ou d'agents antioxydants. Ces LDL oxydées sont toxiques pour les cellules endothéliales (toxicité évaluée par le test MTT). Les cellules ECV304 sont incubées avec des LDL oxydées par irradiation UV (200 gg/ml) pendant 24 heures, en absence (0) ou en présence du composé 5 (concentrations de 0,1 à 100 M). A la fin, le test MTT est réalisé. Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle négatif (incubé en l'absence de LDL et du composé 5). Les résultats présentés correspondent à la moyenne de trois expériences séparées réalisées en duplicate. Comme rapporté dans la figure 2, des doses croissantes de ce composé 5 protègent efficacement contre la toxicité des LDL oxydées dans les cellules endothéliales ECV304, ce qui suggère que ce composé 5 a un effet à la fois antioxydant et cytoprotecteur. 3/ Etude comparative des effets des composés 5 et 1 (même structure que le composé 5 sans le groupement fluoré) L'effet antioxydant/piégeur de carbonyl pourrait être augmenté par l'atome de fluor. Pour confirmer cette hypothèse, nous avons étudié l'effet antioxydant et cytoprotecteur du composé 1 dont la structure chimique est identique à celle du composé 5, si ce n'est l'absence de l'atome de fluor. Cet effet des composés 1 et 5 a été étudié d'une part sur l'oxydation des LDL par les ECV304, et leur toxicité consécutive. Pour ce faire, les ECV304 sont incubées pendant 6h avec des LDL natives (100 g/ml) en présence de CuSO4 (1 M) et des concentrations variables de composé 1 ou de composé 5. Le milieu est ensuite récupéré, un aliquot est prélevé pour doser les TBARS, et le reste du milieu est ré-incubé avec d'autres ECV304 afin d'étudier l'effet toxique. Le taux de TBARS dans le contrôle (LDL seules) est de 7,5 nmol/mg apoB. Les résultats obtenus sont présentés dans la Tableau 1 ci-après, et correspondent à la moyenne de 4 expériences séparées réalisées en duplicate. Les résultats obtenus montrent que l'effet contre l'oxydation des LDL et leur toxicité consécutive est comparable entre le composé 1 et le composé 5. Cet effet est donc en principe lié à la présence du groupement phénolique sur les deux molécules. Concentration (gM) TBARS (%) MTT (%) Contrôle (LDL seules) 100 25 5 composé 1 0,1 102 5 23 1 47 5 49 23 5 85 8 5 105 composé 5 0,1 100 5 24 1 51 5 52 24 5 90 7 5 104 Tableau 1 D'autre part, l'effet des composés 1 et 5 a également été 5 comparé au niveau de leur effet cytoprotecteur à l'égard des LDL oxydées et de 4-HNE Pour ce faire, les cellules endothéliales sont incubées avec 200.ig/ml de LDL oxydées ou 25 M de 4-HNE et des concentrations croissantes de composés 1 ou 5. La toxicité est évaluée après 24 heures par un test au MTT. La figure 3 rapporte les résultats obtenus dans les tests réalisés avec les LDL oxydées; les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle non stimulé. La figure 4 rapporte les résultats obtenus dans les tests réalisés avec 4HNE. L'effet protecteur des composés synthétisés sur la toxicité induite par le 4-HNE est uniquement lié à l'effet piégeur de carbonyle. On note sur les résultats, que seul le composé 5 est efficace, dès les concentrations assez faibles (1 M), et persiste à des concentrations plus élevées, alors que le composé 1 est sans effet, et même toxique à doses plus élevées. Ces résultats montrent donc que le composé 5 a un effet piégeur de carbonyle lié au groupement fluor, ce qui permet une protection efficace contre la toxicité induite par les aldéhydes. L'ensemble de ces résultats montre que la cytotoxicité des LDL oxydées n'est pas simplement liée à la présence des groupements carbonyle, et que le stress oxydant est également impliqué. Ceci explique un effet protecteur bien plus intéressant avec le composé 5 qu'avec le composé 1 non fluoré. REVENDICATIONS 1/ Procédé de synthèse d'un composé fluorophosphonocinnamique de formule générale: R'O /F (I) P OR8 R4 R3 R6 X X étant choisi parmi: io un atome d'oxygène ou un atome de soufre, R', R2, R3, R4, R5 et R6 étant choisis parmi: H, un groupe alkyle, un groupe aryle, OH, O-alkyle, S-alkyle, NH2, NH-alkyle, N-(alkyle)2, R' étant choisi parmi: H, un groupe alkyle, un groupe aryle, un groupe silyle, R8 étant choisi parmi: H, un groupe alkyle, un groupe aryle, lesdits groupes alkyle et aryle contenant de l'ordre de 1 à 6 atomes de carbone linéairement liés, dans lequel on réalise la fluoration d'un composé phosphonocinnamique de formule générale: R''O R' / OR8 (II) P R4 R3 R6 X X étant choisi parmi: un atome d'oxygène ou un atome de soufre, R' étant choisi parmi: un groupe S-alkyle, S-aryle, S-amine, S-amide, NHalkyle, NH-aryle, N-(alkyle)2, N-(aryle)2, R'' étant choisi parmi: H, un groupe alkyle, un groupe aryle, R1 R2 lesdits groupes alkyle et aryle contenant de l'ordre de 1 à 6 atomes de carbone linéairement liés, en faisant réagir, à une température comprise entre -20 et 85 C, ledit composé phosphonocinnamique avec au moins un agent de fluoration comprenant un complexe formé entre une amine tertiaire, notée R3N, et le fluorure d'hydrogène; ladite amine tertiaire étant substituée par des groupes alkyle comprenant de l'ordre de 1 à 6 atomes de carbone linéairement liés. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite amine tertiaire est la triéthylamine, Et3N. Io 3/ Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on utilise à titre d'agent de fluoration un complexe avec un rapport molaire amine tertiaire/fluorure d'hydrogène de l'ordre de 1:1, noté R3NÉHF. 4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction en phase liquide dans un solvant dans lequel le 15 composé phosphonocinnamique de formule (II) est soluble. 5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise un solvant choisi parmi: le dichiorométhane, l'acétonitrile, le tétrahydrofurane. 6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on réalise la réaction avec une rapport molaire, entre le composé phosphonocinnamique de formule (II) et l'agent de fluoration, de l'ordre de 1,2 à 20. 7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le groupe R8 d'un composé phosphonocinnamique de formule générale (II) est choisi parmi les groupes partants: -SCH2CH2NHCOCH3, -NHCH2Ph. 8/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que dans le composé phosphonocinnamique de départ de formule générale (II) : R désigne un groupe choisi parmi: -H ou -CH3, et R' et R2 désignent des groupes choisis parmi: -H ou -OCH3. 9/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on réalise la fluoration d'un composé phosphonocinnamique de formule: / R' \\ OCHZCH3 R4 O répondant aux caractéristiques choisies parmi: 1) R' = R'' = H, R4= OCH3, R' = S(CH2)2NHCOCH3, 2) R' = R4 = R'' = H, R' = S(CH2)2NHCOCH3, 3) R' = R4 = OCH3, R'' = H, R' = S(CH2)2NHCOCH3, 4) R' = H, R4 = OCH3, R'' = CH3, R' = S(CH2)2NHCOCH3, 5) R' = H, R4 = OCH3, = CH3, R' = NHCH2Ph. 10/ Composés fluorophosphonocinnamiques de formule générale: R7'O F (I) %---- OR' X R'O X étant choisi parmi: un atome d'oxygène ou un atome de soufre, R', R2, R3, R4, R5 et R6 étant choisis parmi: H, un groupe alkyle, un groupe aryle, OH, O-alkyle, S-alkyle, NH2, NH-alkyle, N-(alkyle)2, R7 étant choisi parmi: H, un groupe alkyle, un groupe aryle, un groupe silyle, R8 étant choisi parmi: H, un groupe alkyle, un groupe aryle, lesdits groupes alkyle et aryle contiennent 1 à 6 atomes de carbone linéairement liés. 11/ Composés selon la revendication 10, caractérisés en ce 30 qu'il s'agit du (E)-2-(4-hydroxy-3-méthoxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule: HO F P/ O-CHZ-CH3 % 12/ Composés selon la revendication 10, caractérisés en ce qu'il s'agit du (E)-2-(4-hydroxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule: HO \ \ P/F O-CH 2-C H3 (6) \ô 13/ Composés selon la revendication 10, caractérisés en ce qu'il s'agit du (E)-2-(4-hydroxy-3,5-diméthoxyphényl)vinyl phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule: H3CO H3CO 2876104 HO /F (7) P\ O-CHZ-CH3 O 14/ Composés selon la revendication 10, caractérisés en ce qu'il s'agit du (E)-2-(3,4-diméthoxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule: H3CO / \ F (8) P\/O-CHZ-CH3 15/ Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une des revendications 10 à 14. 16/ Composition thérapeutique selon la revendication 15, 30 pour le traitement d'un trouble physiologique causé par un stress oxydatif. 17/ Composition thérapeutique selon l'une des revendications 15 ou 16, pour le traitement de l'athérosclérose. (5) 15 20 18/ Procédé de protection de l'oxydation des LDL in vitro, dans lequel on met des LDL en contact avec au moins un composé selon l'une des revendications 10 à 14.