FR 2879402 A1 20060623 FR 0413484 A 20041217 NOUVELLE UTILISATION DE CLONES DE BACILLUS SP COMME STIMULATEURS DES DEFENSES NATURELLES DES PLANTES DESCRIPTION La présente invention concerne une nouvelle utilisation de spores, de protéines ou de delta-endotoxines issues de clones de Bacillus sp, comme stimulateur des défenses naturelles des plantes entières par application foliaire, racinaire ou par injection, contre les pathogènes des cultures des types fongiques et/ou bactériens et/ou viraux. Elle concerne également l'obtention desdits composants et la composition qui les incorpore. Les plantes ont développé au cours de leur évolution divers mécanismes de défense efficaces contre de nombreux agents pathogènes comme les champignons, les bactéries, les virus et les insectes. Si certains mécanismes de défense sont constitutifs, d'autres sont induits lorsque la plante a reconnu soit l'un des composants du microorganisme, soit un éliciteur externe (reconnaissance non spécifique). Le recoupement de nombreuses études liées aux modifications métaboliques associées à la résistance induite a mis en évidence des similarités importantes dans les réponses de différentes espèces végétales. Nous citerons à titre d'exemple trois catégories de variations métaboliques: une intense stimulation des enzymes clés Peroxydase et Phenylalanine ammonialyase aboutissant, par activation de la voie des phénylpropanoïde, au renforcement de la barrière mécanique naturelle des cellules végétales (lignine, subérine...), à la synthèse de phytoalexines, de composés phénoliques et de l'acide salicylique; - l'activation de la lipoxygénase (voie des octanoïdes) intervenant dans la production de l'acide jasmonique - la production d'une large gamme de peptides et de protéines de défense (protéines PR ou Pathogenesis-related proteiris) parmi lesquelles, la chitinase, la p-1,3-glucanase, des inhibiteurs de protéases et de polygalacturonase. Il a été démontré que plusieurs substances de natures et de structures chimiques diverses possèdent la propriété de stimuler les défenses naturelles des plantes. Outre les oligosaccharides, certaines protéines et oligopeptides se soit révélés efficaces et les effets des éliciteurs peptidiques et glycoprotéiques sur les plantes supérieures sont bien documentés (Ricci et al, 1989; Nürnberger et al, 1994; Pugin et al, 1997; Ebel et Mithôfer, 1998; Martinez et al, 1999; Picard et al, 2000, Martinez et al, 2001). D'autres molécules telles que les phosphonates (Bonomelli et al, 2002), l'acide 6-aminobutyrique (Daire et al, 2002; Zimmerli et al., 2001; Cohen et al., 1999; Reuveni et al, 1999) se sont également avérées actives en tant qu'éliciteurs. Les brevets FR2821241 (Biophytech) et FR2832409 (CNRS et Biophytech) font aussi état des propriétés élicitrices d'oligopeptides constitués de 3 à 20 acides aminés et dont la caractéristique principale est une structure en hélice alpha. Dans le premier cas, les éliciteurs décrits sont des peptaibols issus du champignon filamenteux Trichoderma harzianum. Ces peptaibols sont de petits oligopeptides linéaires, hydrophobes, dont la masse est comprise entre 1 et 2 kiloDaltons. Ils contiennent des aminoacides peu classiques comme l'acide aminoisobutyrique (Aib) ou l'Isovaline (Ival). Dans le second cas, il s'agit d'une série de composés polymères d'aminoacides permettant aux plantes de lutter contre divers pathogènes. Les bactéries de l'espèce Bacillus thuringiensis (Bt) sont maintenant bien connues pour les toxines insecticides qu'elles produisent et leurs utilisations. Jusqu'à présent l'intérêt des nombreuses formulations commercialisées à base de Bacillus thuringiensis réside d'une part dans leur spécificité d'action vis-à-vis d'un ou plusieurs ordres d'insectes et d'autre part dans leur innocuité vis-à-vis des organismes non cibles et de l'environnement. Les principales composantes de cette activité sont attribuées aux inclusions cristallines produites pendant la sporulation de Bt et contenant les delta-endotoxines suivantes: les protéines du cristal (Cry), selon lesquelles différents types de Bt sont classifiés et les toxines cytolytique, (Cyt) qui augmentent l'action des protéines Cry en rehaussant leur efficacité contre les insectes (activité hémolytique). Les 8-endotoxines sont produites abondamment durant la sporulation et s'accumulent sous forme d'inclusions cytoplasmiques parasporales pouvant représenter jusqu'à 25% du poids sec des cellules sporulées. C'est grâce à ces composantes essentielles que les propriétés de Bacillus thuringiensis sont employées en protection des cultures contre les insectes ravageurs, en tant que solution alternative aux insecticides chimiques. Cependant, une activité antifongique directe de certaines souches de Bacillus thuringiensis a également été mise en évidence et ceci vis-à- vis de divers pathogènes et au niveau de différentes cultures. A ce titre, nous pouvons citer les études réalisées par Moar William J (brevet US628072) sur une souche productrice de chitinase (AU634) permettant de lutter contre des champignons tels que le Botrytis cinerea ou Alternaria solani. Wigley, P. (brevet US6077506) propose une nouvelle souche (AQ52) utilisable en tant qu'agent de contrôle d'un grand nombre de pathogènes comme Phytophthora infestans, Uncinula necator, Pi'asmopara viticola, Botrytis cinerea, Monilia fructigena...D'autre part, des activités nématicide (Brevet US5378460) et de stimulation de la croissance des plantes (Brevet CA2422343) ont déjà été revendiquées. D'autres espèces de Bacillus tels que purnilis et mycoides (Jacobsen, et al Montana State Univ), subtilis (Gu, Zhen-rong, Shangai Acad of Agric Science), et licheniformis (Argento, US Patent 5665354), ont également des action directes contre les pathogènes. La particularité de l'invention réside à la fois dans le mode et le mécanisme d'action de la souche de Bacillus thuringiensis ou sphaericus et / ou de protéines issues de la bactérie ainsi que dans leur activité. En effet, selon l'invention, il ne s'agit plus ici d'utiliser les spores, les protéines ou les endotoxines de Bacillus thuringiensis ou sphaericus pour leurs propriétés insecticides ou fongicides mais pour leur capacité à stimuler les défenses naturelles des plantes entières. Ces nouveaux types d'éliciteurs sont donc capables de stimuler différentes activités enzymatiques largement impliquées dans les mécanismes de résistance induite contre les parasites des végétaux. La spécificité de l'invention repose donc sur l'utilisation: - d'une part des spores, des protéines ou des delta-endotoxines issus d'un clone de Bacillus thuringiensis var kurstaki de Barjac et Lemille - sérotype 3a et 3b déposée à l'ATCC (American Type Culture Collection)- sous le numéro 33679, - d'autre part des spores, des protéines ou des delta-endotoxines issus du clone Bacillus thuringiensis var israelensis de Barjac, déposé à l'ATCC sous le numéro 35646, - et enfin des spores, des protéines ou des delta-endotoxines d'un clone de Bacillus sphaericus Meyer and Neide thuringiensis var medellin), déposé à I'ATCC sous le 30 numéro 10208. Dans le cas des protéines Cyt de Bacillus thuringiensis, la formation des pores s'effectue différemment; ces protéines sont composées d'un seul domaine constitué de 4 hélices alpha externes entourant plusieurs brins R. Le mécanisme de formation des pores par ces 8- endotoxines Cyt impliquerait l'oligomérisation de plusieurs brins f3 dans la membrane pour former un tonneau R laissant les hélices a exposées sur la surface membranaire (Li et al, 2001). La présente invention a donc pour objet un procédé de lutte contre des agents pathogènes (Champignons et / ou bactéries et / ou virus et / ou insectes) de plantes agronomiquement utiles caractérisé en ce qu'il comprend l'application auxdites plantes de nouveaux éliciteurs. Selon l'invention, l'utilisation de ces composés est essentiellement destinée à la viticulture, à l'arboriculture et au maraîchage. L'invention concerne donc la production des bactéries et de leurs 8-endotoxines Cry et Cyt comme stimulateurs des défenses naturelles des plantes, ces derniers permettant une action principalement préventive mais aussi curative. Les structures hélicoïdales et / ou en feuillet R se logent à l'intérieur des membranes cellulaires et forment un canal ionique ou pore qui modifie la perméabilité membranaire (dépolarisation), constituant un signal précoce pour le déclenchement de la cascade d'événements métaboliques amenant la résistance de la plante face à ses agresseurs. Le procédé selon l'invention est en outre caractérisé en ce que: - les spores, les protéines ou les delta-endotoxines sont incorporées à un véhicule autorisé en agriculture de type mouillant et pénétrant; - la composition se présente sous la forme liquide, notamment sous la forme de solution aqueuse; - la composition se présente sous la forme solide, notamment sous la forme de poudres, granulés ou en enrobage de semences. II se caractérise également en ce que la composition est utilisée pour réduire: - lorsqu'elle est appliquée aux céréales, notamment le blé, le maïs et le riz, l'attaque des oïdiums, des septorioses, des rouilles, des fusarioses, des pyricularioses et des maladies bactériennes et virales; lorsqu'elle est appliquée aux arbres fruitiers, notamment le poirier et le pommier, l'attaque des oïdiums, des tavelures, des monilioses, des maladies bactériennes et virales telles que la "Sharka" ; - lorsqu'elle est appliquée à la vigne, l'attaque de l'oïdium, du mildiou, du Botrytis, des maladies du bois, des maladies telluriques et virales telles que le "Court-Noué" ; - lorsqu'elle est appliquée aux gazons et en horticulture, les attaques des pythiacés, champignons à sclérotes, fusarioses, oïdiums, maladies bactériennes et virales; - lorsqu'elle est appliquée aux oléagineux, notamment le soja, le tournesol, les melons, les carottes, le chou-fleur et les pommes de terre, l'attaque des oïdiums, des mildious des pythiacées (Phytophtora, Pythium), des champignons à sclérotes (Rhizoctonia, Scierotinia Pyrenochaeta), des champignons vasculaires (Fusarium, Verticillium), des maladies bactériennes et virales. Le procédé selon l'invention est également caractérisé en ce que l'application desdits composés est réalisée avec une fréquence de 10 à 15 jours, cas le plus courant en agriculture. Les mécanismes de défense sont stimulés à chaque nouveau traitement. Le choix du marqueur biochimique s'est ici porté sur la mesure de l'activité péroxydasique. Ces enzymes sont impliquées dans les réponses précoces à une stimulation des défenses. Ce sont donc des marqueurs du déclenchement d'une réaction de défense comme: - Le renforcement des parois cellulaires et la constitution de barrières pariétales qui bloquent la progression du pathogène à l'intérieur des cellules de l'hôte. - La production de composés toxiques intervenant dans les mécanismes de défense. Les peroxydases catalysent l'oxydation de nombreux substrats par le peroxyde d'hydrogène: Le dosage de cette enzyme se fait par spectrophotométrie en utilisant le guaïacol comme substrat. Incolore au départ, il prend rapidement Jne teinte brune orangée lorsqu'il est oxydé. Cette propriété rend possible l'étude de la cinétique enzymatique par spectrophotométrie. On peut suivre la réaction en mesurant la variation d'absorbance au cours du temps à 470 nm La préparation de l'extrait végétal pour l'extraction de ces protéines solubles est réalisée par broyage des feuilles fraîches dans un tampon acétate de sodium, 50 mM, pH 6 contenant du PolyVinylPyrolidone et en présence de sable de fontainebleau. L'extrait est alors centrifugé à 10 000 g pendant 5 min à 4 C. La cinétique est suivie après addition de guaïacol et de peroxyde d'hydrogène au surnageant. Une description plus détaillée de l'invention est présentée à l'aide des exemples suivants. Ces exemples ne sont en aucun cas destinés à limiter le cadre de cette invention. Exemple 1: Obtention des spores de Bacillus thuringiensis et des protéines Le procédé d'obtention des spores et des protéines de Bacillus thuringiensis selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - une phase de culture bactérienne Le milieu de culture est le milieu usuel glucosé (UG) dont la composition est la suivante: KH2PO4 (6,8 g/1) MgSO4r 7H2O (1,123 g/I) MnSO4, 4H2O (2 mg/1) ZnSO4, 7H2O (0,014 g/1) Fe(SO4)3 (0,020 g/I) CaCl2, 4 H2O (0,183 g,'I). A cette solution saline standard sont ajoutés 0,75% (p/v) de peptone pancréatique et 1% (p/v) de glucose. Le pH est alors ajusté à 7,4. Ce milieu est stérilisé par autoclavage à 120 C pendant 20 minutes. La mise en culture est réalisée en ensemençant une préculture de spores en milieu UG pendant 115 heures à 30 C sous agitation. Les fioles contenant les bactéries en cultures sont ensuite placées à 30 C sous agitation rotative douce (200 rpm) jusqu'à la lyse complète des bactéries (de 48 à 72 heures) . - une phase de séparation des spores et des cristaux analyse des protéines. Cette phase est réalisée à 4 C. Le contenu de chaque fiole est centrifugé à 4500 rpm pendant 30 minutes. Le culot est ensuite repris dans NaCl 1M, lavé deux fois à l'eau distillée contenant 1 mM de phenylmethylsulfonyl fluoride et 10 mM EDTA puis resuspendu dans un volume d'eau déminéralisée. La partie protéique est ensuite purifiée sur un gradient discontinu de sucrose selon la méthode de Thomas et Ellar (1983) [ultracentrifugation à 25 000 rpm et 48 C pendant 16 heures]. La concentration en protéines est déterminée par la méthode de Bradford après solubilisation alcaline de l'extrait et une électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) est réalisée pour la détection des protéines selon la méthode déjà décrites par Thomas et Ellar (1983). Exemple 2: Effet physiologique et agronomique de Bacillus thuringiensis var kurstaki (sérotype 3a et 3b). - Cas de la tomate: de jeunes plants de tomates en pots ont été traités par pulvérisation foliaire puis un prélèvement de feuilles pour le dosage des péroxydases a été effectué 24 heures et 7 jours après le traitement. La rr odalité de traitement par le Bacillus thuringiensis selon l'invention a été comparée à l'activité péroxydasique générée par un extrait protéique, un extrait d'algue ainsi qu'à un témoin eau. Chaque expérience a été répétée 4 fois pour chacune des modalités. Les résultats des dosages sont exprimés ADO / minute / gramme de matière fraîche et sont rassemblés dans le tableau ci-dessous: Modalité testée Activité péroxydasique ( ADO/min/g MF) d'augmentation par rapport au témoin Prélèvement 24 h Prélèvement 7 jours 24 h 7 j Témoin eau 54,85 8,9 68, 18 8,6 Extrait protéique 61,91 9,8 68,54 5,84 12,9 0,52 Extrait d'algue 57,24 10,2 80,72 10,39 4,35 18,4 Bacillus thuringiensis 72,39 4,55 91,7 9,6 32 34,5 Dans le cas des deux prélèvements (24 heures et 7 jours), l'activité péroxydasique décelée dans les plants traités par le Bach/us thuringiensis selon l'invention est largement supérieure au témoin (plus de 30%) ainsi qu'aux autres extraits testés pour leur activité révélée comme élicitrice dans plusieurs travaux. Exemple 3: Effet physiologique et agronomique des protéines Cyt 2 Ba (Bacillus thuringiensis var israelensis) et Cyt 2 Bc (Bach/us thuringiensis var medeliin) - Cas de la vigne: les essais sont réalisés sur vigne en place (cépage syrah). Les traitements sont effectués par aspersion de l'éliciteur. La parcelle est divisée en 3 modalités comprenant les protéines Cyt 2 Ba et Cyt 2 Bc ainsi qu'un témoin eau. La concentration des deux protéines Cyt utilisée dans cet essai est de 250 pg/ml. Les feuilles adultes sont prélevées au cours d'une cinétique d'élicitation au temps t = 0, 9 heures, 5 jours et 15 jours. Une fois le matériel végétal broyé dans le tampon adéquat, on procède à un dosage des péroxydases. Les résultats dosages sont exprimés ADO / minute / gramme de matière fraîche et sont rassemblés dans le tableau ci-dessous: Modalité testée Activité péroxydasique ( ADO/min/g MF) d'augmentation par rapport au témoin Prélèvement 9 h Prélèvement 5 jours 9 h 5 j Témoin eau 18,52 0,65 14,9 4,3 Cyt 2 Ba 28,04 0,76 32,4 5,7 51,4 117,45 Cyt 2 Bc 19, 7 0,2 6,4 Ces tests montrent un double intérêt de cette protéine CYT 2 Ba: Elle présente une 20 stimulation rapide de l'activité péroxydase après pulvérisation. Cette augmentation d'activité est préservée et même augmentée au bout de 5 jours Exemple 4: Effet de protection antipathogénique de Bacillus sphagericus par stimulation des défenses naturelles de la plante La composition à base de spores de Bacillus thuringiensis var kurstaki préparé selon l'exemple 1 est pulvérisée sur différentes plantes afin de tester leur résistance vis-à-vis de divers pathogènes. A titre d'exemple et en comparaison à des témoins non traités, les effets protecteurs de la composition selon l'invention se sont révélés efficaces lors de traitements préventifs renouvelés régulièrement. Nous citerons à titre d'exemples, les couples plante / pathogène suivant: vigne / Mildiou, Vigne / Botrytis, melon / Oïdium, Blé / Oïdium. 9 REVENDICATIONS 1- Utilisation de spores, de protéines ou de delta-endotoxines issues: de clones de Bacillus thuringiensis var kurstaki de Barjac et Lemille (sérotype 3a et 3b) déposé à l'ATCC sous le N 33679; - de clones de Bacillus thuringiensis var israelensis de Barjac (sérotype H14) 5 déposé à I'ATCC sous le N 35646; - de clones de Bacillus sphaericus déposé à l'ATCC sous le N 10208; comme stimulateur des défenses naturelles des plantes entières par application foliaire, racinaire ou par injection, contre les pathogènes des cultures des types fongiques et/ou bactériens et/ou viraux. 2- Procédé d'obtention de spores, de protéines ou de delta- endotoxines telles que définies dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) une phase de culture bactérienne consistant: - à utiliser un milieu glucosé (UG) dont la composition est: KH2PO4 (6,8 g/1) MgSO4, 7H20 (1,123 g/l) MnSO4, 4H20 (2 mg/1) ZnSO4, 7H20 (0,014 g/1) Fe(SO4)3 (0,020 g/1) CaCl2, 4 H2O (0,183 g/1), dans lequel sont ajoutés 0,75% (p/v) de peptone pancréatique et 1% (plv) de glucose et dont le pH est ajusté à 7,4; - à stériliser ledit milieu par autoclavage à 120 C pendant 20 minutes; - à ensemencer une pré-culture de spores en milieu UG pendant 15 heures à 30 C 20 sous agitation; - à placer les fioles contenant les bactéries à 30 C sous agitation rotative douce (200 rpm) jusqu'à la lyse complète des bactéries (de 48 à 72 heures) ; b) une phase de séparation des spores et des cristaux consistant: - à la réaliser à la température de 4 C; - à centrifuger le contenu de chaque fiole à 4500 rpm pendant 30 minutes; - à reprendre le culot dans NaCl 1M et à le laver deux fois à l'eau distillée contenant 1 mM de phenylmethylsulfonyl fluoride et 10 mM EDTA puis à le re-susprendre dans un volume d'eau déminéralisée; - à purifier la partie protéique sur un gradient discontinu de sucrose selon la 30 méthode de Thomas et Ellar (1983) [ultracentrifugation à 25 000 rpm et 48 C pendant 16 heures] ; - à déterminer la concentration en protéines par la méthode de Bradford après solubilisation alcaline de l'extrait et une électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) réalisée pour la détection des protéines selon la méthode déjà décrites par Thomas et Ellar (1983). 3- Composition comprenant des spores, des protéines ou des deltaendotoxines obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 2, caractérisée en ce que celles-ci sont incorporées à un véhicule autorisé en agriculture de type mouillant et pénétrant. 4- Composition, selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme liquide, notamment sous la forme de solution aqueuse. 5- Composition, selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme solide, notamment sous la forme de poudres, granulés ou en enrobage de semences. 6- Utilisation d'une composition, telle que définie dans la revendication 3, 4 ou 5, pour réduire: - lorsqu'elle est appliquée aux céréales, notamment le blé, le maïs et le riz, l'attaque des oïdiums, des septorioses, des rouilles, des fusarioses, des pyricularioses et des maladies bactériennes et virales; - lorsqu'elle est appliquée aux arbres fruitiers, notamment le poirier et le pommier, l'attaque des oïdiums, des tavelures, des monilioses, des maladies bactériennes et virales telles que la "Sharka" ; - lorsqu'elle est appliquée à la vigne, l'attaque de l'oïdium, du mildiou, du Botrytis, des maladies du bois, des maladies telluriques et virales telles que le "Court-Noué" ; - lorsqu'elle est appliquée aux gazons et en horticulture, les attaques des pythiacés, champignons à sclérotes, fusarioses, oïdiums, maladies bactériennes et virales; - lorsqu'elle est appliquée au soja, au tournesol, aux melons, aux carottes, au chou- fleur et aux pommes de terre, l'attaque des oïdiums, des mildious des pythiacées (Phytophtora, Pythium), des champignons à sclérotes (Rhizoctonia, Sclerotinia Pyrenochaeta), des champignons vasculaires (Fusarium, Verticillium), des maladies bactériennes et virales.