FR 2883884 A1 20061006 FR 0503086 A 20050330 PREPARATIONS DE LEVURES A PROPRIETES ANTI-OXYDANTES AMELIOREES ET LEURS APPLICATIONS L'invention a pour objet des préparations de levures présentant des propriétés anti-oxydantes améliorées et leurs applications comme additifs anti-oxydants. On sait que les levures riches en sélénium, c'est-à-dire titrant plus de 500 ppm environ de sélénium, et avantageusement de l'ordre de 2000 ppm de sélénium, sont utilisées en routine comme compléments alimentaires en nutrition humaine et animale. Dans le cadre de leur recherche de moyens pour améliorer les propriétés anti-oxydantes de telles levures, les inventeurs ont étudié les effets d'ajout de diverses formes de sélénium et /ou de glutathion aux levures. Ils ont ainsi constaté que, de manière inattendue, les propriétés antioxydantes de levures pouvaient être fortement améliorées par un enrichissement en sélénium et en glutathion produit en cours de fermentation par les levures, ou ajouté après fermentation. L'invention a donc pour but de fournir des préparations de levures dotées de propriétés antioxydantes améliorées. Elle vise également leurs applications comme additifs anti-oxydants, en particulier comme compléments alimentaires en nutrition humaine et comme additifs pour l'alimentation animale. Les préparations de levures de l'invention, présentant des propriétés anti-oxydantes améliorées, sont caractérisées en ce qu'elles renferment de manière concomitante du glutathion et du sélénium. Il est en effet apparu que la présence concomitante de glutathion et de sélénium dans les levures conduisait de manière inattendue, à un effet synergique et permettait d'obtenir des propriétés anti-oxydantes supérieures à celles observées avec d'autres modes d'ajouts du glutathion et du sélénium. Par "levure enrichie en glutathion", on entend une levure titrant au moins 15mg de glutathion par gramme de matières sèches. Comme indiqué plus haut, les levures enrichies en sélénium titrent au moins 500 ppm en sélénium. Avantageusement, les préparations de levures de l'invention comprennent de manière concomitante des levures enrichies en glutathion et des levures enrichies en sélénium. Des préparations préférées comprennent des levures enrichies à la fois en glutathion et en sélénium. De manière préférée, lesdites levures sont des levures de panification du genre Saccharomyces, et notamment de l'espèce cerevisiae. Compte tenu de leurs propriétés, les préparations de levures définies cidessus présentent un 15 grand intérêt, de manière générale, comme additifs anti-oxydants. L'invention vise en particulier leur utilisation comme compléments alimentaires pour l'homme ou l'animal, ainsi que les aliments ou nutriments ou alicaments qui les renferment. On citera entre autres des biscuits et pains enrichis par ces préparations, ou encore des produits laitiers comme les yaourts ainsi que des aliments pour animaux. Les préparations de l'invention sont également avantageuses dans le domaine cosmétique, en conférant des propriétés anti-vieillissement aux compositions cosmétiques, ou comme principes actifs de médicaments pour prévenir ou traiter les pathologies associées à la formation de radicaux libres en excès. Dans ces diverses applications, les préparations de l'invention sont utilisées notamment sous forme de poudres ou encore de lyophilisats. De manière générale, elles se présentent sous des formes incorporables dans les préparations alimentaires, pharmaceutiques (comprimés, gélules,.. .) ou cosmétiques (crèmes, onguents, ...). Pour des applications en nutrition humaine, on a avantageusement recours à des doses de 75 à 100 tg/j en Se. En nutrition animale, des concentrations maximales de 0,5 ppm de Se total 2883884 3 dans l'aliment complet apparaissent appropriées. Ces utilisations peuvent être de longue durée. L'invention vise également un procédé d'obtention de préparations de levures telles que définies ci-dessus, caractérisé par la mise en oeuvre de levures titrant environ 15 mg de glutathion/g de matières sèches et contenant des traces de sélénium, et de levures titrant environ au moins 500 ppm de sélénium avantageusement de l'ordre de 2000 ppm de sélénium. Avantageusement, on met en oeuvre des levures titrant à la fois 15 mg environ de glùtathion/g de matières sèches et au moins 500 ppm environ, avantageusement de l'ordre de 2000 ppm, de sélénium. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent. Exemple 1: Etude comparative des propriétés anti-oxydantes d'échantillons de levures Les propriétés anti-oxydantes des échantillons étudiés ont été mesurées selon 3 méthodes: la méthode FOLIN: Cette méthode permet de mesurer par colorimétrie le pouvoir antioxydant de nombreux typesd'antioxydants susceptibles d'être contenus dans les différents échantillons. Ces antioxydants peuvent être des acides aminés facilement oxydables (tryptophane, tyrosine), des composés de sélénium, et le glutathion. Cette méthode est relativement ancienne, mais est encore couramment utilisée pour mesurer les effets d'antioxydants dans les produits alimentaires et les boissons [Methods of Enzymology, Vol.335 p. 103-114 (2001)]. la méthode FRAP: La méthode FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) mise au point par Benzie (Anal.Biochem. 1996 Jul.l5, 239(1) :70-6) est également largement reconnue pour les mesures de pouvoir antioxydant. Cette méthode plus sélective utilise un standard différent de celui utilisé par la méthode FOLIN (tocophérol). De ce fait, les valeurs obtenues par FRAP sont plus basses que celles obtenues par FOLIN. la méthode LAG-TIME (temps de retard)/LAG-TIME lié La mesure de l'oxydation des lipoprotéines de faible densité (Lower Density Lipoproteins ou LDL en abrégé) permet de comparer différents anti-oxydants lors de maladies cardiovasculaires (Free Radic.Biol.Med. 2000 Jun.15, 28(12):1815-26). La méthode standard a été utilisée à pH et température physiologiques [Methods of Enzymology Vol. 335 p. 103-114 (2001)]. Elle permet de mesurer le temps nécessaire aux antioxydants ajoutés pour s'oxyder. Ceci correspond au moment précédant le processus rapide d'oxydation des lipoprotéines (temps de retard) lorsque l'absorbance augmente de façon importante. L'effet de l'antioxydant présent est d'autant plus fort que le temps de retard est 2883884 4 long (en secondes). L'analyse cinétique a été réalisée à 234 nm. Les différents échantillons ont été apportés à la même concentration de I M. On rapporte ci-après les résultats obtenus avec les 9 échantillons de levure du tableau 1 5 suivant:Tableau 1 Description des échantillons N Ech. Dénomination Se (ppm) GSH (mg/g) Inorganique Organique Inorganique Organique 1 LBI2133 0 0 N N 2 LBI2133 2000 0 N N 3 LBI2133 0 0 O N 4 LBI2133 2000 0 0 N Lalmin Se-2000 0 2000 N N 6 Lalmin Se-2000 0 2000 O N 7 Lalmin Antiox 0 2000 N O 8 FSR 0 0 N O 9 FSR + Se sait 2000 0 N O Par sélénium inorganique , on entend du sélénium exogène, sous forme de sels, c-à-d ajouté à la levure, alors que l'expression sélénium organique désigne du sélénium ajouté 10 au milieu de fermentation et incorporé par la levure durant la fermentation. Par GSH inorganique , on entend du GSH exogène, c-à-d ajouté à la levure, alors que l'expression GSH organique désigne du GSH endogène, c-à-d produit par la levure même durant la fermentation. a- Méthode FOLIN Les mesures des concentrations en phénol sur les différents échantillons de levures ont donné les résultats rapportés dans le tableau 2 suivant. 2883884 5 Tableau 2 Concentration en Phénol des différents échantillons de levure N Ech. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 8,44 8,27 13,87 14,29 8,40 15,12 32,27 16,36 14,54 [Phénol] 8,35 8,40 14,45 14,95 8,75 14,54 32,92 14,70 15,04 (umol/g) 8,31 8,09 14, 70 14,87 8,75 14,45 32,60 15,70 15,12 Moyenne 8,37 8,25 14,34 14, 70 8,63 14,70 32,60 15,59 14,90 %STD 1% 2% 3% 2% 2% 2% 1% 5% 2% Dans le tableau 3, on indique les calculs d'analyse statistique des concentrations en phénol où 5 oui correspond à une différence statistiquement significative entre les groupes (P 0,05). Tableau 3 Analyse statistique des concentrations en Phénol N Ech. 1 2 4 5 6 7 8 2 non / / / / / / / 3 oui oui / / / / / / 4 oui oui non / / / / / non non oui oui / / / / 6 oui oui non non oui / / / 7 oui oui oui oui oui oui / / 8 oui oui oui non oui non oui / 9 oui oui non non oui non oui non "Oui" : différence statistiquement significative entre les groupes (P 0,05). Les résultats obtenus montrent que l'addition: É du GSH inorganique (1 vs. 3) ou organique (1 vs. 8) à une levure classique permet d'augmenter significativement le pouvoir antioxydant (8,37 / 14,34 / 15,59). É du GSH inorganique à une levure riche en Se organique (5 vs. 6) permet d'augmenter significativement le pouvoir antioxydant (8,63 vs. 14, 70). 2883884 6 É du GSH inorganique à une levure riche en Se inorganique (2 vs. 4) permet d'augmenter significativement le pouvoir antioxydant (8,25 vs. 14,70). É du Se inorganique (1 vs. 2) ou organique (1 vs. 5) à une levure classique ne permet pas d'augmenter le pouvoir antioxydant (8,37 / 8,25 / 8,63). É du Se inorganique à une levure riche en GSH organique (8 vs. 9) ne permet pas d'augmenter le pouvoir antioxydant (15,59 / 14,90). É du Se inorganique à une levure riche en GSH inorganique (3 vs. 4) ne permet pas d'augmenter le pouvoir antioxydant (14,34 / 14,70). De manière surprenante, l'apport simultané de Se et de GSH organique (Lalmin Antiox: échantillon 7) permet une augmentation très significative du pouvoir antioxydant vs. les autres traitements (32.60). Cet échantillon de levure Lalmin Antiox (éch.7) présente un pouvoir antioxydant qui est très significativement supérieur à celui des levures soumises à des traitements différents. Ces résultats démontrent que l'apport simultané par une même levure de Se organique et de GSH organique ajoutés en cours de fermentation présente un intérêt manifeste pour accroître le potentiel antioxydant. b- Méthode FRAP Les résultats obtenus avec les différents échantillons sont donnés dans le tableau 4 ci-après. Tableau 4 Résultats FRAP des différents échantillons N Ech. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3,25 3,46 3,61 3,57 3,06 4,14 7,77 4,14 4,41 FRAP 3,46 3,42 3,42 3,48 2, 96 4, 14 7,70 4,58 4,54 ( mol/g) 3,29 3,46 3,65 3,67 2,89 4,35 7,62 4,31 4, 33 Moyenne 3,34 3,45 3,56 3,57 2,97 4,21 7,70 4,34 4,43 ( mol/g) 3% 1% 3% 3% 3% 3% 1% 5% 2% %STD 2883884 7 Les calculs d'analyse statistique des concentrations en phénol sont donnés dans le tableau 5 suivant. Tableau 5 Analyse statistique des concentrations en Phénol N Ech. 1 2 3 4 5 6 7 8 2 non / / / / / / / 3 non non / / / / / / 4 non non non / / / / / oui oui oui oui / / / / 6 oui oui oui oui oui / / / 7 oui oui oui oui oui oui / / 8 oui oui oui oui oui non oui / 9 oui oui oui oui oui non oui non Les mentions oui et non ont les significations données plus haut. Cette méthode met à nouveau en évidence que l'échantillon Lalmin Antiox. (échantillon de levure n 7) présente un pouvoir antioxydant qui est très significativement supérieur à celui des échantillons ayant subi des traitements différents. En effet, il apparaît que l'addition: É du GSH inorganique à une levure classique (1 vs. 3) ne permet pas d'augmenter significativement le pouvoir antioxydant (3,34 / 3,56). É du GSH organique à une levure classique (1 vs. 8) permet d'augmenter significativement le pouvoir antioxydant (3,34 / 4,34). É du GSH inorganique à une levure riche en Se organique (5 vs. 6) permet d'augmenter significativement le pouvoir antioxydant (2,97 vs. 4, 21). É du GSH inorganique à une levure riche en Se inorganique (2 vs. 4) ne permet pas d'augmenter significativement le pouvoir antioxydant (3,45 vs. 3,57). É du Se inorganique (1 vs. 2) ou organique (1 vs. 5) à une levure classique ne permet pas d'augmenter le pouvoir antioxydant (3,34 / 3,45 / 2,97). É du Se inorganique à une levure riche en GSH organique (8 vs. 9) ne permet pas d'augmenter le pouvoir antioxydant (4,34 / 4,43). É du Se inorganique à une levure riche en GSH inorganique (3 vs. 4) ne permet pas d'augmenter le pouvoir antioxydant (3,56 / 3,57). 2883884 8 En revanche, en combinant l'apport de Se et GSH organique dans l'échantillon de Lalmin Antiox. (échantillon7), on augmente très significativement le pouvoir antioxydant vs. les autres traitements (7,70) . Cet échantillon de levure présente un pouvoir antioxydant qui est très significativement supérieur à celui observé en appliquant d'autres traitements aux levures et confirme l'intérêt de l'apport simultané par une même levure de Se organique et de GSH organique ajoutés en cours de fermentation, pour améliorer les effets anti-oxydants du glutathion. c- Méthode LAG-TIME / LAG-TIME lié Préparation des échantillons On prépare 1mM d'échantillon en mélangeant 395 mg d'échantillon de base à 10 mL d'eau distillée. On soumet le mélange à agitation au Vortex pendant 5 minutes, puis à une centrifugation pendant 10 minutes. On récupère 1mM de surnageant. Ce produit est prêt à l'emploi. (L'échantillon n 7 a été broyé en une poudre fine avant d'être mélangé à l'eau). Préparation LDL/VLDL On opère comme décrit dans Methods of Enzymology, Vol 335, p103-114, 2001. 20 Matériel et Méthode La procédure décrite dans la publication J. Agric. Food Chem. 1995, 43:2798-2799 a été utilisée pour mesurer la vitesse d'oxydation des LDL seuls (témoin) et des LDL auxquels on a ajouté un antioxydant. Cette expérimentation permet ainsi de mesurer la capacité de l'antioxydant testé à inhiber l'oxydation. La préparation de LDL/VLDL et les différents échantillons ont été dilués dans du PBS afin d'obtenir la concentration souhaitée (70 g/mL de LDL/VLDL). Le lot témoin contenait seulement la préparation de LDL/VLDL à 70 g/mL et le PBS. L'absorbante du PBS, du lot témoin et des autres échantillons a été effectuée à une longueur d'onde de 234 nm pendant 10 min sur un appareil Genesys 5. Ensuite 25 M de Cul+ (concentration finale dans la solution) ont été ajoutés mélangés et la mesure d'absorbance a été effectuée toutes les 5 minutes pendant 6 à 8 heures. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 6 ci-après. 2883884 9 Tableau 6 Inhibition de 1 M d'échantillon N Ech. Témoin #5 non-lié #7 non-lié Sélénométhionine Tocophérol non-liée non-lié Lag Time 3035 9480 25371 2805 7285 (secondes) Augmentation du Lag 212% 736% -8% 140% Time 1 (%) Lag Time del' Echantillon - Lag Time du Témoin Augmentation du Lag Time l = x 100 Lag Time du Témoin Les calculs d'analyse statistique des concentrations en tocophérol sont rapportés dans le tableau 7. Tableau 7 Analyse statistique de l'inhibition de 1 M d'échantillon N Ech. Témoin #5 #7 Se-Me Tocophérol #5 Oui / / / / #7 Oui oui / / / Se-Me Non oui oui / / Tocophérol Oui oui oui oui / Les mentions oui et non ont les significations données plus haut. Comparativement au témoin, l'échantillon de Semet n'a pas montré de signes d'inhibition à cette faible concentration. Cependant, le tocophérol et les échantillons 5 & 7 ont montré des niveaux élevés d'inhibition. Ces échantillons présentent une inhibition significativement supérieure au tocophérol. Le pouvoir antioxydant de ces échantillons est supérieur à celui de la Sélénométhionine. L'échantillon 7 de Lalmin Antiox. présente une inhibition significativement supérieure à celle de l'échantillon 5. LAG TIME Lié Matériel et Méthode Les LDL et les différents antioxydants sont inoculés afin que des liaisons se créent. Ce phénomène est sensé représenter ce qui se passe dans le plasma lorsqu'un antioxydant ayant la capacité de se lier est absorbé. Les différents échantillons et la préparation de LDL/VLDL ont été dilués à 1 M et 70 g/mL respectivement dans du PBS, puis incubés à température ambiante pendant 2 heures. Ensuite 25 M de Cul+ (concentration finale dans la solution) ont été ajoutés, mélangés et la mesure d'absorbance a été effectuée toutes les 5 minutes pendant 6 à 8 heures. L'absorbance des échantillons a été mesurée à une longueur d'onde de 234 nm pendant 10 min sur un appareil Genesys 5. Le tocophérol a été utilisé comme témoin positif étant donné qu'il est connu pour se lier au LDL qui est généralement un transporteur du tocophérol dans le plasma. On rapporte les résultats obtenus dans le tableau 8 ci-après. Tableau 8 Inhibition de 1 M d'échantillon N Ech. Témoin #5 lié #7 lié Sélénométhionine Tocophérol liée lié Lag Time 6267 20940 3035 21867 / (secondes) Augmentation du 106% 590% 620% / Lag Time 1 (%) 123% 187% Augmentation du 131% / Lag Time 2 (%) Lag Time de l' Echantillon - Lag Time du Témoin Augmentation du Lag Time 1 = x 100 Lag Time du Témoin Lag Time de l' Ech.lié - Lag Time de l' Ech. non - lié Augmentation du Lag Time 2 = x 100 Lag Time del' Ech. non - lié Les résultats de l'analyse statistique de l'inhibition de 11.tM d'échantillon sont donnés dans le tableau 9 ci-dessous. 2883884 11 Tableau 9 N Ech. Témoin #5 #7 Se-Me Tocophérol #5 lié Se-Me lié #5 Oui / / / / / / #7 Oui oui / / / / / Se-Me Non oui oui / / / / Tocophérol Oui oui oui oui / / / #5 lié Oui oui oui oui oui / / Se-Me lié oui oui oui oui no oui / Tocophérol lié oui oui oui oui oui oui oui Les mentions oui et non ont les significations données plus haut. Comparativement à l'expérimentation précédente, les LAG TIME de tous les échantillons testés ont augmenté de plus de 100% (celui du Lalmin Antiox. n'est pas représenté car >10 heures). Ces 2 expérimentations montrent que l'échantillon 7 de Lalmin Antiox. présente un pouvoir antioxydant beaucoup plus important que l'échantillon5. L'échantillon 7 non-lié est même supérieur à l'échantillon5 lié. L'échantillon 7 lié présente un LAG TIME de plus de 10 heures, soit 36 000 secondes, ce qui est 50% au-dessus du tocophérol lié et de l'échantillon 5 lié. Exemple 2: Utilisation des préparations de levures dans l'alimentation On utilise une levure enrichie simultanément en glutathion et en sélénium, de manière à amener le pouvoir réducteur du mélange à plus de 15pmole de phénol/g de poudre selon la méthode FOLIN ou à plus de 5 umole/g selon le test de FRAP. La préparation de levure est broyée pour obtenir une poudre. On incorpore la préparation de levure sous forme pulvérulente dans une pâte à biscuits. Exemple 3: Utilisation de préparations de levures contenant des levures enrichies en 25 sélénium et des levures enrichies en glutathion. Des préparations contenant des levures titrant 2000 ppm en sélénium d'une part, et des levures enrichies en glutathion d'autre part, sont formulées pour contenir les mêmes concentrations en sélénium et en glutathion que les levures Lalmin Antiox de l'exemple 1. Ces formulations ont été comparées aux levures Lalmin Antiox selon la méthode Folin. Des résultats similaires ont été obtenus avec en particulier un pouvoir réducteur supérieur à 15!mole de phénol/g de poudre. 13. REVENDICATIONS 1. Préparations de levures, présentant des propriétés anti-oxydantes améliorées, caractérisées en ce qu'elles renferment de manière concomitante du glutathion à raison d'au moins 15 mg/g de matières sèches et du sélénium à raison d'au moins 500 ppm, avantageusement de l'ordre de 2000 ppm. 2. Préparations de levures selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles comprennent de manière concomitante des levures enrichies en glutathion et des levures enrichies en sélénium. 3. Préparations de levures selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles comprennent des levures enrichies à la fois en glutathion et en sélénium. 4. Préparations de levures selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que lesdites levures sont des levures de panification du genre Saccharomyces et notamment de l'espèce cerevisiae. 5. Utilisation de préparations de levures selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comme additifs anti-oxydants. 6. Utilisation selon la revendication 5, dans les aliments ou nutriments destinés à l'homme ou l'animal. 7. Utilisation de préparations de levures selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour préparer des alicaments destinés à l'homme ou l'animal. 8. Utilisation selon la revendication 5, dans le domaine cosmétique. 9. Procédé d'obtention de préparations de levures selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par la mise en oeuvre de levures titrant environ 15 mg de glutathion/g de matières sèches et contenant des traces de sélénium, et de levures titrant environ au moins 500 ppm de sélénium avantageusement de l'ordre de 2000 ppm de sélénium. 2883884 14. 10. Procédé d'obtention de préparations de levures selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3, caractérisé par la mise en oeuvre de levures titrant à la fois 15 mg environ de glutathion/g de matières sèches et au moins 500 ppm environ, avantageusement de l'ordre de 2000 ppm, de sélénium.