FR 2873379 A1 20060127 FR 0408199 A 20040723 PROCEDE DE PREPARATION D'ACIDE HYALURONIQUE RETICULE, ACIDE HYALURONIQUE RETICULE SUSCEPTIBLE D'ETRE OBTENU PAR LEDIT PROCEDE, IMPLANT CONTENANT LEDIT ACIDE HYALURONIQUE RETICULE, ET SON UTILISATION L'invention concerne un procédé de préparation d'acide hyaluronique réticulé, généralement soluble dans l'eau, un acide hyaluronique réticulé généralement soluble dans l'eau susceptible d'être obtenu par ledit procédé, et un implant contenant ledit acide hyaluronique réticulé. Ledit acide hyaluronique réticulé est destiné à être utilisé en médecine humaine ou vétérinaire, et en particulier en chirurgie principalement réparatrice et/ou esthétique. L'acide hyaluronique est un polysaccharide qui présente l'avantage de se trouver sous la même forme chimique quelle que soit sa source. Il est constitué d'une alternance d'unités de monosaccharides d'acides N-acétylD-glucosamides et D-glucoroniques reliées par des liaisons glycolides 1-3. L'acide hyaluronique se rencontre habituellement sous la forme d'un gel de hyaluronate de sodium. Le poids moléculaire de l'acide hyaluronique se situe généralement dans la gamme de 500.000 à 7 millions g/mol et même audelà. La formule développée de l'acide hyaluronique est donnée ci-après, où n est généralement de 1.200 à 18.000. Ceci correspond à une gamme de l'acide hyaluronique de 500.000 à 7.000.000 g/mol. Les groupements terminaux sont tels que connus de l'homme du métier. 2 2873379 CO2H CH2OH H OH NH j \CH3 Acide hyaluronique L'acide hyaluronique est présent dans le corps humain, dans l'humeur vitrée en forte concentration, dans les tissus mous où il forme l'un des composants majeurs de la matrice extracellulaire, dans le cartilage hyalin et dans le liquide synovial où il joue le rôle de lubrifiant et d'amortisseur vis-à-vis des chocs, ainsi que dans le tissu dermique et épidermique où il joue un rôle d'hydratation et contribue à l'élasticité des tissus. L'acide hyaluronique peut également être obtenu par plusieurs procédés, parmi lesquels on peut citer une extraction à partir de crête de coq ou une production par fermentation bactérienne. Ces deux origines présentent chacune des avantages et des inconvénients. En effet, l'acide hyaluronique extrait de la crête de coq présente des masses moléculaires très élevées mais contient des protéines animales responsables de phénomènes allergisants. En revanche, l'acide hyaluronique obtenu par fermentation bactériennne (streptococcus) présente OH n 3 2873379 des masses moléculaires moins élevées même si il est dépourvu de protéines animales. Les applications de l'acide hyaluronique dans plusieurs domaines ont été largement référencées comme par exemple dans le domaine médical, par exemple en chirurgie oculaire, en rhumatologie, ou en pharmacologie, ou bien dans le domaine chirurgical et dermatologique (chirurgie réparatrice et/ou esthétique), ou encore dans le domaine de la cosmétique. En effet, sa facilité d'injection et sa sécurité d'emploi, mais surtout sa biocompatibilité et son absence de toxicité, ainsi que ses propriétés physico-chmiques, en font un composé de choix dans diverses applications biomédicales. Les gels de hyaluronate de sodium sont particulièrement appréciés et largement utilisés en chirurgie oculaire. De tels gels présentent de façon remarquable une viscoélasticité intéressante dans les interventions de la chirurgie de la cataracte. Ces mêmes gels sont utilisés en dermatologie et chirurgie plastique dans le traitement du vieillissement cutané comme produit de comblement, mais présentent l'inconvénient de se dégrader rapidement, d'où la nécessité de remédier à des injections répétées. Il a été démontré que les concentrations ainsi que la qualité de l'acide hyaluronique dans les différents tissus de l'organisme diminuent au cours de la vie, que ce soit de façon naturelle ou par le biais de facteurs extérieurs tels qu'une exposition solaire ou une pathologie inflammatoire. Par exemple, dans les problèmes de gonarthrose (pathologie inflammatoire du genou), il a été observé une diminution de la concentration et du poids moléculaire de l'acide hyaluronique présent dans le liquide synovial. Ce phénomène s'explique d'une part par 4 2873379 une baisse de la synthèse endogène d'acide hyaluronique et d'autre part par l'inflammation qui génère des radicaux libres responsables de la dégradation de l'acide hyaluronique. La supplémentation en acide hyaluronique donne d'excellents résultats, en terme de tolérance et d'efficacité, mais reste très éphémère. En effet, l'acide hyaluronique est très sensible à la dégradation par différents facteurs tels que les facteurs thermique, enzymatique, radicalaire et/ou bactérien. C'est pourquoi les différentes modifications chimiques de l'acide hyaluronique connues à ce jour, qui sont principalement des réticulations consolidant son réseau tridimensionnel vis-à-vis des attaques enzymatiques, ont pour objectif de mettre à la disposition du corps médical un acide hyaluronique modifié qui conserve ses propriétés originelles en améliorant seulement sa résistance à la dégradation in vivo. Ainsi, il a été largement décrit dans la littérature différentes méthodes pour synthétiser des dérivés réticulés de l'acide hyaluronique, le plus souvent soit par étherification, soit par amidification. Si la réticulation se fait par étherification, on peut utiliser au moins un agent réticulant tel que la divinylsulfone, le formaldéhyde, un bisépoxyde, un composé bis-halogéné ou encore un alcool. Si la réticulation se fait par amidification, on peut utiliser au moins un agent réticulant tel que un amino-acide fonctionnel ou un oligomère ou polymère ayant deux ou plus groupements amines. Dans tous les cas, l'état de la technique fait référence à des méthodes de préparation donnant des produits réticulés insolubles dans l'eau. 2873379 Quelle que soit la méthode utilisée, le degré de réticulation et le choix de l'agent réticulant (plus ou moins hydrophile) déterminent l'insolubilité du gel dans l'eau. Ainsi, la demande de brevet WO 01/58.961 décrit un procédé de réticulation d'acide hyaluronique par un mono-acide aminé bifonctionnel dont la L-Lysine. Mais les liaisons ainsi établies, par réticulation entre l'acide hyaluronique et l'amino-acide, principalement par l'amidification de la liaison amine en chaîne latérale, sont trop faibles pour résister longtemps aux phénomènes d'hydrolyse enzymatique qui se produisent in vivo. De plus, les agents de réticulation comme la L-Lysine ne présentent qu'un nombre limité de groupements amines susceptibles de réagir, ce qui limite les possibilités de formation du réseau recherché. La demande de brevet WO 00/46.252 décrit un procédé de réticulation d'acide hyaluronique et d'au moins un autre polymère. Ce procédé de réticulation fait intervenir au moins deux groupements fonctionnels différents dudit polymère et les fonctions hydroxyles et/ou carboxyles de l'acide hyaluronique. Parmi une nombreuse liste desdits polymères, les polypeptides sont cités de façon générale, sans identification de la nature précise de ces polypeptides. Or, à l'exception de la poly-L-lysine qui n'est pas mentionnée dans ladite demande de brevet, les polypeptides n'ont de façon générale pas de groupement amine en chaîne latérale, et ne sont pas pas susceptibles de réticuler l'acide hyaluronique par amidification. La demande de brevet WO 02/30.990 décrit un procédé de réticulation d'acide hyaluronique et d'au 6 2873379 moins un autre polymère ayant deux ou plus groupements amines donnant des produits insolubles dans l'eau. Ce procédé de réticulation fait intervenir lesdits deux groupements amines dudit polymère et la fonction carboxyle de l'acide hyaluronique. Parmi lesdits polymères, les peptides sont cités de façon générale, sans indication de la possibilité que ledit polymère soit de l'oligo-L-lysine. Parmi les polymères cités, seul le chitosan est exemplifié. Enfin, les acides hyaluroniques réticulés de ces trois demandes de brevet WO 01/58.961, WO 00/46.9252 et WO 02/30.990 présentent l'inconvénient d'être insolubles dans l'eau et très sensibles à une dégradation par voie bactérienne. Le but de la présente invention est de remédier aux inconvénients des produits connus à base d'acide hyaluronique réticulé. En particulier ces inconvénients sont une durée de vie trop courte, une difficulté de remettre ledit acide hyaluronique réticulé en solution aqueuse voire une sensibilité bactérienne élevée. L'invention y remédie principalement par l'élaboration d'un procédé de préparation original qui conduit à des acides hyaluroniques réticulés originaux, tant en terme d'homogénéité en solution aqueuse que de résistance éventuelle vis-à-vis du dévéloppement bactérien. L'invention concerne donc un procédé de préparation d'acide hyaluronique réticulé, généralement hydrosoluble, ledit procédé comprenant la mise en contact d'au moins un acide hyaluronique ou un de ses sels ou un dérivé d'un de ses sels, et d'au moins un agent réticulant comprenant au moins un oligopeptide ou 7 2873379 polypeptide possédant au moins deux, de préférence au moins cinq, unités L-lysine. La formule de la poly-L-lysine est donné ci-après, où m est généralement de 2 à 50. La formule d'une unité L-lysine, elle, correspond à m = 1. Les groupements terminaux sont tels que connus de l'homme du métier. Polylysine NH2 La formule de l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention est donnée ci-après, où n est généralement de 1.200 à 18.000, et m est généralement de 2 à 50. Les groupements terminaux sont tels que connus de l'homme du métier. H N 8 2873379 H N Acide hyaluronique réticulé De préférence, ledit agent réticulant comprend au moins 50% en poids dudit oligopeptide ou polypeptide. De préférence, ledit agent réticulant possède des propriétés bactériostatiques. En particulier, il possède généralement des fonctions NH3+ (issues de groupements NH2) responsables de l'activité bactériostatique vis-à-vis des germes Gram+ et Gram-. Une telle mise en contact est généralement et de préférence une mise en réaction, généralement d'amidification. Par "mise en contact", on entend selon -9 2873379 l'invention la création de liaisons ioniques et hydrogènes. Par "mise en réaction", on entend selon l'invention la création de liaisons covalentes. Avantageusement selon l'invention, l'agent réticulant comprend plusieurs unités cationiques qui interviennent pour établir des liaisons covalentes avec l'acide hyaluronique par amidification et des liaisons non covalentes (hydrogènes, ioniques) avec le même acide hyaluronique. Un réseau se forme alors par la réaction de réticulation. C'est la présence d'au moins deux groupements amine dans les polymères à base de poly-L- lysine, susceptibles de générer ces réactions d'amidification, qui fait que ces composés sont tout à fait particuliers au sein de cette famille de polypeptides. Ainsi, la réticulation par un oligomère ou un polymère (oligopeptide ou polypeptide), contenant au moins, deux unités L-lysine, et de préférence à base de poly-L-lysine, ne fait intervenir qu'un seul type de groupement fonctionnel, les fonctions amine. De plus, il se produit au moins deux fois plus de réactions qu'avec de la L-lysine, ce qui rend le réseau ainsi créé beaucoup plus résistant aux phénomènes d'hydrolyse enzymatique qui se produisent in vivo. Par acide hyaluronique réticulé , on entend selon l'invention un réseau moléculaire constitué par des molécules d'acide hyaluronique liées entre elles par des liaisons covalentes. Ce réseau tridimensionnel ainsi formé est dense et par conséquent résistant vis-à-vis de différents facteurs de dégradation. L'acide hyaluronique mis en oeuvre dans le procédé de la présente invention a généralement une masse moléculaire de 500.000 à 7.000.000 de daltons, de -10- 2873379 préférence de 1.000.000 à 5.000.000 de daltons. Il est le plus souvent utilisé sous la forme d'hyaluronate de sodium de concentration de 0,1 à 5% en poids, de préférence de 0,5 à 3% en poids. Plusieurs acides hyaluroniques de source ou de concentration différentes peuvent être utilisés pour la mise en contact avec l'agent réticulant, bien qu'une seule source d'acide hyaluronique soit généralement préférée. Par un de ses sels , on entend selon l'invention un sel d'acide hyaluronique tel que le hyaluronate de sodium dont la fonction acide a été protégée par un chlorure de sodium. Par dérivé d'un de ses sels , on entend selon l'invention un polymère dont l'ossature principale est celle de l'acide hyaluronique. Les polypeptides peuvent être des homopolypeptides ou copolypeptides à base de L-lysine statistiques, blocs, segmentés, greffés, en étoile; ou copolymères blocs dont l'un au moins des polymères est de structure peptidique à base de L-lysine, i.e. est un oligopeptide ou polypeptide comprenant au moins 50% en poids d'unités L-lysine. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit oligopeptide ou polypeptide est à base de poly-L-lysine. On entend ainsi selon l'invention que ledit oligopeptide ou polypeptide comprend au moins 50% en poids de poly-L-Lysine. Avantageusement selon l'invention, l'agent réticulant présente des propriétés de biocompatibilité, de biodégradabilité et éventuellement des propriétés bactériostatiques. Les oligopeptides poly-cationiques sont reconnus pour leur pouvoir bactériostatique sur les -11- 2873379 germes Gram+ et Gram-. Par exemple la Poly- L - lysine est bactériostatique à des concentrations inférieures à 5pg/ml (Liang, JF&Kim, SC. Not only the nature of peptide but also the characteristics of cela membrane determine the antimicrobial mechanism of a peptide. J.Peptide Res., 1999, 53, 518-522; Nicholas Delihas, Lee W.Riley, Winnie Loo, Jonathan Berkowitz, Natalia Poltoratzskaia. High sensitivity of mycobacterium species to the bactericidal activity by Polylysine. Fems Microbiology letters 132 (1995) 233-237). Ces propriétés de biocompatibilité et ces propriétés bactériostatiques avantageuses peuvent se retrouver avantageusement dans l'acide hyaluronique réticulé à l'aide de ces agents. De telles propriétés bactériostatiques sont généralement vérifiées par une mise en ouvre du challenge test décrit dans la Pharmacopée Européenne (4ème édition). Selon l'invention, ladite mise en contact s'effectue de préférence en milieu aqueux et en présence d'au moins un agent de couplage hydrosoluble et d'au moins un catalyseur. Ledit agent de couplage hydrosoluble est généralement choisi parmi les carbodiimides hydrosolubles, de préférence dans le groupe formé par le 1éthyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), le 1-éthyl-3-(3-trimethylaminopropyl) carbodiimide (ETC) et le 1-cyclohexyl3-(2-morphilinoéthyl) carbodiimide (CMC), leurs sels dérivés et leurs mélanges. Ledit catalyseur est généralement soluble dans l'eau et les solvants organiques. Le plus souvent, ledit catalyseur est choisi parmi les catalyseurs d'amidification permettant la formation d'esters activés, de préférence dans le groupe formé par le N-Hydroxy -12- 2873379 Succinimide (NHS), le N-hydroxy benzotriazole (HOBt), le 3,4dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzo triazole (HOOBt), le 1-hydroxy-7azabenzotriazole (HAt), et le N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS), et leurs mélanges. Le procédé de préparation selon l'invention est généralement tel que la mise en contact s'effectue à une température de 0 à 45 C, de préférence de 5 à 25 C, pour une durée de 0,5 à 10 heures, de préférence pour une durée de 1 à 6 heures, et à un pH de 4 à 10, de préférence de 5 à 8. Le procédé de préparation selon l'invention s'effectue généralement en présence d'un solvant, par exemple constitué d'une solution aqueuse de NaCl (typiquement à 1% en poids). L'agent réticulant est généralement utilisé à raison de 0,02 à 0,2 équivalent d'unité amine par équivalent d'unité monomère d'acide hyaluronique. Le catalyseur est généralement utilisé à raison de 0,015 à 0,025 équivalent par équivalent d'unité monomère d'acide hyaluronique. Le pH est généralement établi et maintenu à sa valeur (sensiblement la même ou une valeur sensiblement dans la (les) fourchette(s) indiquée(s)), à l'aide par exemple d'une solution d'acide chlorhydrique diluée. Pendant la mise en contact, le milieu réactionnel est généralement laissé sous agitation. Après le temps nécessaire à la réaction, l'acide hyaluronique réticulé obtenu étant généralement et pratiquement totalement soluble dans l'eau, le mélange réactionnel est généralement précipité dans un solvant organique type éthanol, isopropanol, acétone, éther ou autre, puis généralement séché sous vide puis éventuellement lyophilisé. Le solvant organique permet -13- 2873379 avantageusement d'éliminer, d'une part, toute trace de catalyseur n'ayant pas réagi au cours de la réaction chimique de réticulation, et, d'autre part, tout type de sous-produit de réaction comme l'urée. Ceci permet de garantir un produit final pratiquement totalement pur, biocompatible et aseptisé par l'action du solvant organique de type éthanol, isopropanol, acétone, éther ou autre. Le caractère reproductible du procédé selon l'invention a été démontré par la détermination de la masse moléculaire de l'acide hyaluronique réticulé obtenu, masse moléculaire généralement obtenue par chromatographie d'exclusion sérique, ainsi qu'il sera explicité par la suite. En effet, il a été possible d'obtenir de façon régulière des fractions solubles dudit acide hyaluronique réticulé polymère, ainsi qu'il sera explicité par la suite. L'invention concerne donc également tout acide hyaluronique réticulé susceptible d'être obtenu selon l'invention, présentant, généralement et le plus souvent, une solubilité dans l'eau déterminée par le calcul de la masse moléculaire par chromatographie d'exclusion sérique révélant une fraction soluble dudit acide hyaluronique réticulé de 100 à 5%, de préférence de 100 à 30%. Un acide hyaluronique réticulé présentant une telle solubilité est qualifié indifféremment de soluble dans l'eau ou d' hydrosoluble . Un tel acide hyaluronique réticulé n'avait jusqu'alors pas été décrit. En effet, dans les demandes de brevet WO 00/46.252 et WO 02/30.990 précédemment citées, il est précisé que, de toutes les façons, le produit obtenu n'est pas soluble dans l'eau (cf. page 20 lignes 1 à 5 de ladite demande de -14- 2873379 brevet WO 00/46.252 et cf. tout le texte de la demande de brevet WO 02/30.990). La détermination de masse moléculaire de l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention est généralement obtenue par chromatographie d'exclusion sérique. Cette méthode d'analyse de masse moléculaire permet généralement de déterminer la masse moléculaire moyenne de l'acide hyaluronique réticulé, englobant des fractions les plus petites aux fractions les plus grosses. Les fractions solubles dudit acide hyaluronique réticulé polymère ainsi mesurées sont toujours de 100% à 5%, préférentiellement de 100% à 30%. Par exemple, il a été synthétisé un acide hyaluronique réticulé selon l'invention comportant 31% de fractions solubles, ce qui lui confère une solubilité dans l'eau. Avantageusement, une telle propriété de solubilité de l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention permet généralement de le formuler en gel après l'avoir solubilisé dans un solvant aqueux. De préférence, un tel acide hyaluronique réticulé présente aussi des propriétés bactériostatiques. Cette activité bactériostatique est généralement vérifiée sur les acides hyaluroniques réticulés selon l'invention par le challenge test décrit dans la Pharmacopée Européenne (4ème édition). Un tel test comporte un comptage bactérien lors de la mise en culture dudit acide hyaluronique réticulé dans un milieu contenant un nombre défini de germes pathogènes par rapport à un acide hyaluronique témoin mis dans les mêmes conditions de culture. L'invention concerne aussi un hydrogel comprenant au moins ledit acide hyaluronique réticulé -15- 2873379 selon l'invention et au moins un solvant aqueux. De préférence un tel solvant aqueux est une solution de chlorure de sodium isotonique ou de l'eau pour préparation injectable, généralement additionnée d'un sel. Selon l'invention, on entend par hydrogel un gel d'acide hyaluronique réticulé obtenu par solubilisation dans de l'eau (par exemple par l'intermédiaire d'un solvant aqueux) dudit acide hyaluronique réticulé. L'invention concerne de plus un implant comprenant au moins un acide hyaluronique réticulé conforme à l'invention. En particulier, l'invention concerne un implant comprenant au moins un hydrogel conforme à l'invention. Ainsi l'invention concerne tout implant comprenant au moins un acide hyaluronique réticulé conforme à l'invention, et éventuellement au moins un solvant aqueux. Un tel hydrogel pour implant est un hydrogel tel que défini précédemment, généralement additionné de chlorure de sodium, ou bien c'est un hydrogel tel que défini précédemment pour lequel le solvant aqueux est une solution de chlorure de sodium isotonique. Avantageusement et selon l'invention, ledit implant est injectable, hydrosoluble, et présente généralement une viscosité intrinsèque suffisante pour être injecté à travers une aiguille de gauge 25 à 30, par exemple de 800 à 4000 m3/kg à 25 C. L'invention concerne enfin l'utilisation dudit implant en médecine humaine ou vétérinaire, en particulier en chirurgie réparatrice et/ou esthétique. Dans le cadre de son utilisation en chirurgie esthétique -16- 2873379 et/ou réparatrice, de préférence esthétique, ledit implant selon l'invention est utilisé en tant que matériau de comblement. Ces implantations pourront avoir pour but: _ la supplémentation d'une cavité ou organe déficitaire en acide hyaluronique (typiquement en dermatologie, en médecine esthétique, ou dans les traitements orthopédiques) ; la reconstitution d'un volume épanché lors 10 d'interventions chirurgicales (typiquement en chirurgie oculaire) ; l'application topique sur le derme sain ou lésé (typiquement en cosmétologie et dermatologie) ; ou encore la participation, en tant que fluide vecteur, à l'implantation d'un matériau ou d'un principe actif pharmaceutique. En dermatologie esthétique, par exemple, un tel implant pourra être utilisé à des fins de comblement. Un tel comblement comprend le comblement des rides, ridules, dépressions cutanées et cicatrices du corps humain ou animal, y compris le comblement des défects cutanés secondaires à la prise d'un traitement pouvant entraîner une lipodystrophie se caractérisant le plus souvent par une lipoatrophie faciale. Une telle utilisation se situe donc principalement dans le domaine de la chirurgie réparatrice ou plastique, ou dans le domaine de la dermatologie esthétique. Ledit implant est généralement injectable par voie sous-cutanée ou intradermique dans le tissu fibreux. Ledit implant peut également être injecté directement par voie intraarticulaire synovial afin de restaurer les fonctions physiologiques du liquide synovial, dans le -17- 2873379 domaine orthopédique, et plus précisement dans le traitement de la gonarthrose. Avantageusement, l'implant selon l'invention pallie les inconvénients de l'art antérieur, puisque ledit implant est avantageusement un produit soluble dans l'eau et pratiquement totalement biocompatible avec le corps humain ou animal. Il permet, par exemple, de combler les rides, ridules, citatrices ou dépressions cutanées par un produit simple et efficace, à biorésorbabilité pratiquement totale, et ce sans libération de produits secondaires toxiques. En effet, les produits de dégradation d'un tel implant in vivo sont d'une part les monomères d'acide hyaluronique et d'autre part les unités de L-lysine, amino-acide hydrosolouble, biocompatible et atoxique. Par implant , on entend selon l'invention aussi bien une composition destinée à être implantée qu'une composition qui a été implantée, dans le corps humain ou animal. L'implant selon l'invention peut comprendre en outre au moins un fluide vecteur, différent de l'hydrogel selon l'invention. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'implant comprend ainsi en outre au moins un élément choisi dans le groupe formé par les dérivés cellulosiques tels que la Carboxy Méthyl Cellulose, l'HPMC (Hydroxy Propyl Méthyl Cellulose), l'HPC (Hydroxy Propyl Cellulose) et les glycosaminoglycannes tel qu'un hyaluronate de sodium ou encore les polysaccharides branchés de type xanthane. De préférence dans un tel cas, l'implant est un gel comprenant au moins un élément choisi dans la famille des glycosaminoglycannes tel qu'un acide hyaluronique ou un de ses sels ou un dérivé d'un de -182873379 ses sels, plus ou moins visqueux, réticulé ou non, en plus de l'acide hyaluronique réticulé conforme à l'invention. On entend par fluide vecteur selon l'invention un composé qui coexiste avec l'acide hyaluronique réticulé de l'invention et qui peut véhiculer un autre composé éventuel, par exemple sous forme de poudre solide, et qui est sous forme fluide. Le terme fluide comprend ici aussi un gel par exemple viscoélastique. On entend par gel selon l'invention une structure physique tridimensionnelle ayant des propriétés viscosifiantes, rhéologiques et thixotropiques. Par tissu fibreux , on entend selon l'invention un espace sous-cutané de nature essentiellement fibreuse, et apte à être rempli par des produits de comblement. Par sous-cutanée , on entend selon l'invention hypodermique, donc sous le derme. Par intradermique , on entend selon l'invention dans l'épaisseur du derme. Par intra-articulaire , on entend selon l'invention dans l'espace compris entre deux articulations dans le liquide synovial. Par biocompatible , on entend selon l'invention compatible avec le corps humain ou animal. En particulier un matériau biocompatible est, selon l'invention, un matériau répondant aux critères donnés par la norme ISO 10993 relative aux dispositifs médicaux. L'implantation de l'implant dans l'organisme a essentiellement pour but de pallier à un déficit en acide hyaluronique, notamment dans le traitement de l'arthrose du genou, mais aussi de combler un défect cutané d'origine naturel dans le cas du vieillissement cutané ou d'origine iatrogène et/ou dans le cas de lipoatrophie -19- 2873379 faciale chez les patients infectés par le V.I.H. La démarche suivie est de supplémenter l'organisme par un implant chimiquement modifié totalement biocompatible respectant les propriétés physicochimiques de l'acide hyaluronique endogène en possédant une durée de vie dans l'organisme suffisante pour pallier ce déficit. Le choix d'un implant comprenant au moins un acide hyaluronique réticulé selon l'invention permet avantageusement d'allier le maximum d'efficacité avec un minimum de risques. En effet, aucun implant non résorbable ne paraît généralement souhaitable. Ainsi, avantageusement selon l'invention, l'acide hyaluronique réticulé conforme à l'invention se dégrade ou se solubilise pratiquement totalement après injection sous-cutanée ou intradermique ou intra- articulaire, puis est pratiquement totalement éliminé de l'organisme par les processus naturels tels que l'hydrolyse enzymatique. En outre, l'implant selon l'invention, lorsqu'il est injectable, allie avantageusement la commodité d'emploi, la seringabilité du produit, larésorbabilité en un temps contrôlé, et éventuellement des propriétés bactériostatiques particulièrement intéressantes. L'implant selon l'invention est de façon particulièrement préférée un gel biocompatible, soluble dans de l'eau, pour préparation injectable additionnée d'un chlorure de sodium ou directement une solution de chlorure de sodium isotonique. -20- 2873379 Les exemples suivants illustrent l'invention sans pour autant en limiter la portée. Exemples Dix-neuf exemples de procédés de préparation d'acides hyaluroniques réticulés selon l'invention sont donnés ci-après. Exemple 1 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol) est dissous dans 150 mL d'une solution aqueuse de NaCl à 1 en poids. A cette solution, sont additionnés à 5 C successivement 7,17 mg (62,35}mol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol) , 66,38 mg (274,30}mol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (MW=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC (1-éthyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) (M = 155 g/mol) (2,49 mmol). A 5 C, le pH de la solution est ensuite ajusté à 5 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique 1 N. Après 15 minutes d'agitation à 5 C, le mélange réactionnel est précipité dans 1,5 L d'éthanol. Le précipité obtenu est alors filtré, puis séché sous pression réduite en présence de P2O5 pendant 24 heures pour donner 1 g de d'acide hyaluronique réticulé. Exemple 2 La même procédure que dans l'exemple 1 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 7,17 mg (62,35 pmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 16,6 mg -21- 2873379 (68,6}mol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (MW=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 3 La même procédure que dans l'exemple 1 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (MW=2500000-3000000 g/mol), 7,17 mg (62,35 10}mol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 33,19 mg (137,15}.mol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (M,=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 4 La même procédure que dans l'exemple 1 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 7,17 mg (62,35}mol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 49, 79 mg (205,74}mol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 5 La même procédure que dans l'exemple 1 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 7,17 mg (62,35 pmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 165,96 mg -22- 2873379 (685,79}mol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol). 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 6 La même procédure que dans l'exemple 1 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (M,=2500000-3000000 g/mol), 4,3 mg (37,41 pmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 66, 38 mg (274,3 pmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 7 La même procédure que dans l'exemple 1 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 4,3 mg (37,41 pmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 16,6 mg (68,6 pmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol) et 0, 44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 8 La même procédure que dans l'exemple 1 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 28,68 mg (249,38 pmol) de N- hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 16,6 mg (68,6 pmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol). -23- 2873379 Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 9 La même procédure que dans l'exemple 1 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 114,71 mg (1 mmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 16,6 mg {68,6 pmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol) et 0, 44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 10 La même procédure que dans l'exemple 1 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 16,6 mg (68,6 pmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (M,=2700 g/mol), 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol) et sans ajout de Nhydroxysuccinimide (M = 115 g/mol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 11 La même procédure que dans l'exemple 1 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 66,38 mg (274,30 pmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol), 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol) et sans ajout de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol). Après -24- 2873379 filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 12 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidique) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol) est dissous dans 150 mL d'une solution aqueuse de NaCl à 1 en poids. A cette solution, sont additionnés à 5 C successivement 7,17 mg (62,35 pmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 66,38 mg (274,30 pmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw 2700 g/mol) et 478 mg d'EDC.HCl (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol). Après 4 heures d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans 1,5 L d'éthanol. Le précipité obtenu est alors filtré, puis séché sous pression réduite en présence de P205 pendant 24 heures pour donner 1 g de d'acide hyaluronique réticulé. Exemple 13 La même procédure que dans l'exemple 12 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 66,38 mg (274,30 pmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol), 478 mg d'EDC.HCl (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol) et sans ajout de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 14 -25- 2873379 La même procédure que dans l'exemple 12 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 16,6 mg (68,6}mol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol), 478 mg d'EDC.HCl (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol) et sans ajout de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 15 La même procédure que dans l'exemple 12 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (M,=2500000-3000000 g/mol), 7,17 mg (62,35 pmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 16, 6 mg (68,6 pmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol) et 478 mg d'EDC.HCl (2,49 mmol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 16 La même procédure que dans l'exemple 12 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 7,17 mg (62,35 pmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 33, 19 mg (137,15}mol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw 2700 g/mol) et 478 mg d'EDC.HCl (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 17 -26- 2873379 La même procédure que dans l'exemple 12 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 4,3 mg (37,41 pmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 66,38 mg (274,3 pmol) de trifluoroacétate de poly-L- lysine (Mw=2700 g/mol) et 478 mg d'EDC.HCl (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 18 La même procédure que dans l'exemple 12 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 4,3 mg (37,41}mol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 16,6 mg (68,6 pmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (M,=2700 g/mol) et 478 mg d'EDC.HCl (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. Exemple 19 La même procédure que dans l'exemple 12 est utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 7,17 mg (62,35 pmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 3, 32 mg (13,72}mol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw 2700 g/mol) et 478 mg d'EDC.HCl (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol). Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc est obtenu. -27- 2873379 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'acide hyaluronique réticulé, ledit procédé comprenant la mise en contact d'au moins un acide hyaluronique ou d'au moins un de ses sels ou un dérivé d'un de ses sels, et d'au moins un agent réticulant comprenant au moins un oligopeptide ou polypeptide possédant au moins deux, de préférence au moins cinq, unités L-lysine. 2. Procédé de préparation selon la revendication précédente, tel que ledit oligopeptide ou polypeptide est à base de poly-L-lysine. 3. Procédé de préparation selon l'une des revendications précédentes, tel que ladite mise en contact s'effectue en milieu aqueux et en présence d'au moins un agent de couplage hydrosoluble et d'au moins un catalyseur. 4. Procédé de préparation selon la revendication précédente, tel que ledit agent de couplage hydrosoluble est choisi parmi les carbodiimides hydrosolubles, de préférence dans le groupe formé par le 1-éthyl-3-(3dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), le 1-éthyl-3-(3trimethylaminopropyl) carbodiimide (ETC) et le 1-cyclohexyl-3-(2morphilinoéthyl) carbodiimide (CMC), leurs sels dérivés et leurs mélanges; et ledit catalyseur est choisi parmi les catalyseurs d'amidification permettant la formation d'esters activés, de préférence dans le groupe formé par le N-Hydroxy Succinimide (NHS), le N-hydroxy benzotriazole (HOBt), le 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzo triazole (HOOBt), le 1-hydroxy-7- azabenzotriazole (HAt), et le N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS), et leurs mélanges. -28- 2873379 5. Procédé de préparation selon l'une des revendications précédentes, tel que la mise en contact s'effectue à une température de 0 à 45 C, de préférence de 5 à 25 C, pour une durée de 0,5 à 10 heures, de préférence pour une durée de 1 à 6 heures, et à un pH de 4 à 10, de préférence de 5 à 8. 6. Acide hyaluronique réticulé susceptible d'être obtenu selon l'une des revendications précédentes, présentant une solubilité dans l'eau déterminée par le calcul de la masse moléculaire par chromatographie d'exclusion sérique révélant une fraction soluble dudit acide hyaluronique réticulé de 100 à 5%, de préférence de 100 à 30%. 7. Acide hyaluronique réticulé selon la revendication précédente présentant des propriétés bactériostatiques vérifiées par une mise en uvre du challenge test décrit dans la Pharmacopée Européenne (4ème édition). 8. Hydrogel comprenant au moins un acide 20 hyaluronique réticulé selon l'une des revendications 6 ou 7 et au moins un solvant aqueux. 9. Implant comprenant au moins un acide hyaluronique réticulé selon l'une des revendications 6 ou 7, et éventuellement au moins un solvant aqueux. 10. Utilisation d'au moins un implant selon la revendication précédente en médecine humaine ou vétérinaire, en particulier en chirurgie réparatrice et/ou esthétique, de préférence en chirurgie esthétique.