FR 2876107 A1 20060407 FR 0410425 A 20041001 Séquence polypeptidique d'un ABC transporteur chez Toxoplasma Gondii et ses applications L'invention concerne un polypeptide de transport transmembranaire de Toxoplasma gondii de la famille des protéines ABC transporteurs, des peptides similaires et des fragments dudit polypeptide, les polynucléotides codant pour lesdits polypeptides, des vecteurs de clonage et/ou d'expression incluant lesdits polynucléotides, des cellules transformées par lesdits vecteurs et des anticorps spécifiques dirigés contre lesdits polypeptides. L'invention porte également sur un procédé de préparation d'anticorps, un procédé pour la détection in vitro de composés actifs contre l'invasion et/ou la réplication de Toxoplasma gondii dans un hôte cellulaire et un procédé de criblage de molécules interagissant avec ledit peptide. Toxoplasma gondii, l'agent responsable de la toxoplasmose, est un Apicomplexa parasite protozoaire qui présente une large spécificité d'hôte et de tissu. Ce pathogène ubiquiste est depuis longtemps connu pour causer de sévères infections congénitales chez l'homme et chez les animaux, et plus récemment comme pathogène opportuniste chez les individus immunodéprimés, en particulier les patients transplantés et les personnes atteintes du SIDA [Luft Bj, Remington JS. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis 1992;15:211-22.]. En dépit de son importance clinique, les composés thérapeutiques pour le traitement de la toxoplasmose restent limités et aucun à présent ne permet d'éradiquer totalement le parasite T. gondii ou de traiter ses effets. Ainsi, même sous traitement antitoxoplasmique correctement suivi, des symptômes cliniques peuvent apparaître. Cela pourrait être dû à la faible accumulation des drogues dans le parasite intracellulaire mais aussi extracellulaire comme cela a pu être observé chez Leishmania major [Callahan HL, Roberts WL, Rainey PM, Beverley SM. The PGPA gene of Leishmania major mediates antimony (Sbl/l) resistance by decreasing influx and not by increasing efflux. Mol Biochem Parasitol 1994;68:145-9.] , ou à leur efflux en dehors du parasite par des mécanismes actifs de transport similaires à ceux précédemment décrits pour les cellules cancéreuses [Germann UA. P-glycoprotein-a mediator of multidrug resistance in tumor cells. Eur J Cancer 1996;32:927-44. ; Loe DW, Deeley RG, Cole SPC. Biology of multidrug Resistance-associated Protein, MRP. Eur J Cancer 1996;32:945-57.] et pour Plasmodium falciparum [Peel SA. The ABC transporter genes of Plasmodium falciparum and drug resistance. Drug Resistance Updat 2001;4:66-74.]. La connaissance des mécanismes qui régulent l'influx et l'efflux des substrats et des drogues dans le parasite extracellulaire et dans les cellules infectées par T. gondii pourrait être une première étape dans la compréhension de l'accessibilité et de l'efficacité des drogues dans le parasite. Chez de nombreux parasites protozaires, des gènes ont été identifiés pour être responsables de l'expression de pompes membranaires qui diminuent les concentrations intracellulaires de drogues [U1/man B. Multidrug resistance and P-glycoprotein in parasitic protozoa. J Bioenerg Biomembr 1995;27:77-84.]. Certaines de ces pompes sont des membres de la superfamille des ABC transporteurs. Les ABC transporteurs représentent une des grandes familles de protéines transmembranaires retrouvées chez de nombreux organismes, depuis les bactéries jusqu'à l'homme [Higgins CF. ABC transporters: from microorganisms to man. Annu Rev Cell Biot 1992; 8:67-113.]. Chez l'homme, 49 ABC transporteurs ont été identifiés et subdivisés en 7 sous-familles (voir http://www.humanabc.orq), parmi lesquelles les pompes de résistance multidrogue (phénotype MDR) telles que les P-glycoprotéines (Pgp) et les protéines associées à la résistance multidrogue, par exemple dans le cadre de mécanismes de rejet de composés cytotoxiques (les protéines MRP) [Dean M, Rzhetsky A, Allikmets R. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. Genome Res 2001; 11:1156-66.]. Les membres de la famille ABC peuvent jouer le rôle d'exportateur, d'importateur ou de canaux d'une multitude de substances, et intervenir dans une foule de phénomènes physiologiques incluant l'efflux de drogues des cellules cancéreuses [Higgins CF. ABC transporters: from microorganisms to man. Annu Rev Cet/ Biot 1992;8:67113.]. La structure type d'une protéine ABC fonctionnelle d'eucaryote se compose d'une seule chaîne polypeptidique présentant 4 domaines distincts: 2 domaines transmembranaires hydrophobiques (TMs) qui constituent probablement le site de translocation du substrat et 2 sites de fixation des nucléotides (NBDs: N- et C- terminal) responsables de la fixation et de l'hydrolyse de l'ATP. Les NBDs possèdent les motifs caractéristiques A et B définis par Walker et al., et désignés Walker A et Walker B [Walker JE, Saraste M, Runswick MJ, Gay NJ. Distantly related sequences in the alpha- and betasubunits of the ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold. EMBO J 1982; 1:945-51.], communs à toutes les protéines fixant de l'ATP. Les Walkers A et B sont séparés l'un de l'autre par une boucle d'environ 90 à 120 acides aminés qui comprend une séquence hautement conservée située juste en amont du Walker B, appelée signature des ABC transporteurs. Par ailleurs, les NBDs possèdent un motif court, la boucle Glutamine, située entre le Walker A et la signature ABC. Ces séquences sont spécifiques des ABC transporteurs et les distinguent des autres protéines fixant de l'ATP. Le nombre de gènes identifié codant pour des ABC transporteurs chez les protozaires parasites n'a cessé d'augmenter depuis ces dernières années, avec l'émergence de résistances aux agents antiparasitaires [Ouellette M, Légaré D, Papadopoulou B. Multidrug Resistance and ABC transporters in Parasitic Protozoa. J Mol Microbiol Biotechnol 2001;3:201-6. ; Klokouzas A, Shahi S, Hladky SB, Barrand MA, Van Veen HW. ABC transporters and drug resistance in parasitic protozoa. lnt J Antimicrob Agents 2003;22:301-17.] . Ces gènes ont été décrits chez P. falciparum [Peel SA. The ABC transporter genes of Plasmodium falciparum and drug resistance. Drug Resistance Updat 2001;4:66-74.], P. yoelli et P. Berghei [Ferrer-Rodriguez 1, Pérez-Rosado J, Gervais GW, Peters W, Robinson BL, Serrano AE. Plasmodium yoelii: identification and partial characterization of an MDR1 gene in an artemisininresistant fine. J. Parasitol 2004;90:152-60. ; Szeto AC, Pérez- Rosado J, Ferrer-Rodriguez 1, Vega J, Torruella-Thillet C, Serrano AE. Identification and expression analysis of ABC genes in Plasmodium yoelii and P. berghei. Parasitol Res 2004;92:1-11.], Entamoeba histolytica [Descoteaux S, Ayala P, Samuelson J, Orozco E. Increase in mRNA of multiple Eh pgp genes encoding P-glycoprotein homologues in emetine- resistant Entamoeba histolytica parasites. Gene 1995;164:179-84. ; Orozco E, Lopez C, Gomez C, Perez DG, Marchat L, Banuelos C, Delgadillo DM. Multidrug resistance in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Parasitol Int 2002;51:353-9.], Trypanosoma cruzi [Muria SMF, dos Santos WG, Anacleto C, Nirdé P, Moreira ESA, Romanha AJ. Drug resistance in Trypanosoma cruzi is not associated with amplification or overexpression of P-glycoprotein (PGP) genes. Mol Biochem Parasitol 2001;117:223-8.], T. brucei [Méser P, Kaminsky R. Identification of three ABC transporter genes in Trypanosoma brucei spp. Parasitol Res 1998;84.106-11. ; Shahi SK, Krauth-Siegel RL, Clayton CE. Overexpression of the putative thiol conjugate transporter TbMRPA causes melarsop resistance in Ttypanosoma brucei. Mol Microbiol 2002;43:1129-38.], Cryptosporidium parvum [Perkins ME, Volkman S, Wirth DF, Le Blancq SM. Characterization of an ATP-binding cassette transporter in Cryptosporidium parvum. Mol Biochem Parasitol 1997;87:117-22. ; Zapata F, Perkins ME, Riojas YA, Wu TW, Le Blancq SM. The Cryptosporidium parvum ABC protein family. Mol Biochem Parasitol 2002; 120:157-61.] et Leishmania spp [Callahan HL, Roberts WL, Rainey PM, Beverley SM. The PGPA gene of Leishmania major mediates antimony (SbIII) resistance by decreasing influx and not by increasing efflux. Mol Biochem Parasitol 1994;68:145-9. ; Pérez-Victoria JM, Parodi-Talice A, Torres C, Gamarro F, Castanys S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. Int Microbiol 2001;4:159-66. ; Légaré D, Cayer S, Singh AK, Richard D, Papadopoulou B, Ouellette M. ABC Proteins of Leishmania. J Bioenerg Biomembr 2001;33:469-74.]. Récemment, un nouveau gène ABC a été identifié chez L. major, qui code pour une protéine nommée PRP1 qui affecte la concentration de l'agent antiparasitaire, la pentamidine, à l'intérieur du parasite [Coelho AC, Beverley SM, Cotrim PC. Functional genetic identification of PRP1, an ABC transporter superfamily member conferring pentamidine resistance in Leishmania major. Mol Biochem Parasitol 2003;130:83-90.]. Les inventeurs se sont intéressés à l'existence de mécanismes d'efflux des drogues chez T. gondii, et ont recherché si un mécanisme de nature similaire à celui des pompes membranaires identifiées chez d'autres agents infectieux pouvait contribuer à l'inefficacité au moins partielle des agents thérapeutiques utilisés pour traiter ou prévenir les effets d'une infection par T. gondii, aucune séquence nucléotidique ou protéique de type ABC n'ayant été rapportée jusqu'à présent. L'invention concerne un polypeptide de transport transmembranaire de la famille des protéines ABC transporteurs de Toxoplasma gondii comportant au moins un domaine similaire à un domaine walker A représenté par une séquence XGSGKTT ou à un domaine walker B représenté par une séquence VLILDEATSS ou similaire aux domaines walker A et walker B représentés par les susdites séquences. Dans un mode de réalisation spécifique de l'invention, le polypeptide de transport transmembranaire de la famille des protéines ABC transporteurs de Toxoplasma gondii comporte au moins un domaine identique aux séquences walker A et B: SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2 suivantes: SEQ ID No1:XGSGKTT SEQ ID No2:VLILDEATSS Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le polypeptide de transport transmembranaire de la famille des protéines ABC transporteurs de Toxoplasma gondii comporte deux domaines identiques aux séquences walker A et B correspondant aux séquences SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2 Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le polypeptide de transport transmembranaire de Toxoplasma gondii (de la famille des protéines ABC transporteurs) est caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins un domaine similaire au domaine codé par la séquence signature ABC transporteur répondant à la séquence L S Q G E R Q L L S I T R A. Dans un exemple spécifique de l'invention, le polypeptide de transport transmembranaire de Toxoplasma gondii (de la famille des protéines ABC transporteurs) comprend la séquence signature ABC transporteur suivante: séquence SEQ ID No 3 (SEQ ID No 3: L S Q G E R Q L L S I T R A), les domaines walker A et walker B qu'il comporte étant similaires ou identiques aux domaines ci-dessus décrits par les séquences X G S G K T T ou V L I L D E A TSS. L'invention concerne également un polypeptide de transport transmembranaire de Toxoplasma gondii (de la famille des protéines ABC transporteurs) qui comporte en outre, au moins un domaine similaire au domaine codé par la séquence boucle Glutamine V L Q D. Dans un exemple spécifique de l'invention, le polypeptide de transport transmembranaire de Toxoplasma gondii (de la famille des protéines ABC transporteurs) comprend la séquence boucle Glutamine suivante: séquence SEQ ID No 4: VLQD, ainsi qu'une séquence signature ABC transporteur similaire ou identique à la séquence suivante: séquence SEQ ID No3(SEQ IDNo3:LSQGERQLLSITRA),lesdomaines walker Aet walker B qu'il comporte étant similaires ou identiques aux domaines ci-dessus décrits par les séquences X G S G K T T ou V L I L D E A T S S. Un polypeptide particulier de l'invention est un polypeptide de transport transmembranaire de Toxoplasma gondii (de la famille des protéines ABC transporteurs) qui comprend la séquence boucle Glutamine VLQD, ainsi qu'une séquence signature ABC transporteur L S Q G E R Q L L S I T R A, et les domaines walker A de séquence X G S G K T T et walker B de séquence VLILDEATSS. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le polypeptide cidessus défini est modifié de façon telle que un, deux ou trois des domaines particuliers précités, n'est (ne sont) pas identique(s) mais est (sont) similaire(s) au(x) domaine(s) de référence précité(s), alors que respectivement trois, deux ou un des autres domaines particuliers restent identiques au(x) domaine(s) de référence précité(s). Toutes les combinaisons de ce type, autorisés par l'association des différents domaines au sein d'un polypeptide de l'invention sont englobées dans la présente demande. Dans la présente description, on utilisera le terme polypeptide pour désigner également une protéine ou un polypeptide. Les polypeptides de la présente invention peuvent être préparés par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier, y compris les techniques d'ADN recombinant. Les polypeptides de l'invention peuvent être également synthétisés par des techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production. Par domaine similaire, on désigne les domaines présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport au domaine de référence défini ci-dessus, comme en particulier une ou plusieurs modifications du type délétion, addition ou substitution, le cas échéant conservative, d'au moins un acide aminé, une troncature, un allongement et/ou une fusion chimérique, le polypeptide obtenu ayant une activité de transport membranaire comparable à celle du polypeptide de référence de T. gondii TgABC1 comprenant les domaines de référence ci-dessus identifiés et/ou ayant des propriétés immunologiques comparables à celles de ce dernier. Un polypeptide de l'invention peut correspondre à un polypeptide naturellement présent dans une souche de T. gondii ou au contraire peut être un polypeptide modifié ou chimérique par rapport à un tel polypeptide naturellement présent dans une souche de T. gondii. Dans ce dernier cas, les modifications ou la modification incorporées dans un ou plusieurs des domaines de référence sont (est) réalisée à une ou des positions telle(s) que ces (cette) modification(s) ne porte(nt) pas significativement atteinte à l'activité biologique du polypeptide obtenu par rapport à l'activité du polypeptide non modifié et/ou à ses propriétés immunologiques. Parmi les domaines similaires, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 % d'identité, de préférence 90 %, de manière préférée 95 % d'identité, avec les acides aminés des domaines de référence correspondant ayant les séquences V L Q D (boucle glutamine), L S Q G E R Q L L S I T R A (signature ABC transporteur), X G S G K T T (domaine walker A), V L I L D E A T S S (domaine walker B) du polypeptide de T. gondii selon l'invention. Chacune des combinaisons de domaines autorisées par la définition cidessus des domaines est comprise dans l'invention. Dans un exemple spécifique, le polypeptide selon l'invention est codé par la séquence de nucléotides représentée à la figure 1 (SEQ ID No 5). Dans un autre exemple spécifique, le polypeptide selon l'invention comprend la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 (SEQ ID No 6), et est désigné TgABC1. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le polypeptide est encore caractérisé en ce qu'il a un poids moléculaire compris entre 140 et 200 kDa, de manière préférée entre 150 et 180 kDa. L'invention concerne également un fragment d'un polypeptide ci-dessus défini, comprenant au moins 8 acides aminés consécutifs formant une séquence caractéristique, en particulier spécifique, d'une protéine ABC transporteur d'au moins une souche de Toxoplasma gondii. Un fragment de polypeptide selon l'invention, est par exemple un polypeptide comportant au moins 10 acides aminés, de préférence au moins 15 acides aminés, de manière préférée au moins 20 acides aminés. L'invention a en particulier pour objet de tels fragments, lorsqu'ils ont des propriétés antigéniques, et qu'ils sont reconnus par des anticorps préparés contre un polypeptide de transport membranaire de la famille des ABC transporteurs de T. gondii, en particulier des fragments reconnus par des anticorps préparés contre TgABC1. En particulier, des fragments de l'invention sont reconnus, seuls ou en association avec d'autres molécules, support ou autre, par un sérum de patient infecté par T. gondii. En particulier de tels fragments ont un intérêt pour la constitution de réactifs de diagnostic in vitro d'une infection par T. gondii. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les fragments sont, seuls ou en combinaison avec une molécule porteuse et/ou un adjuvant, immunogènes. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les fragments sont choisis de telle façon qu'ils conservent les propriétés des polypeptides transporteurs ABC, notamment les propriétés de transport membranaire. En particulier, l'invention concerne des fragments qui comprennent tout ou partie de l'un au moins des domaines de référence des polypeptides de l'invention, soit les domaines Walker A ou B, le domaine signature ABC, ou le domaine glutamine. Selon un selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ces fragments sont spécifiques des polypeptides de l'invention, c'est à dire qu'ils se distinguent des enchaînements d'acides aminés correspondant résultant d'un alignement avec des polypeptides connus pour appartenir à la famille des ABC transporteurs identifiés à la figure 3. Des fragments spécifiques particuliers sont ceux qui comprennent des domaines de référence de la séquence de la figure 1 ou qui consistent en ces domaines, ou des domaines similaires selon la définition donnée cidessus, aux domaines de référence Walker A, Walker B, signature ABC transporteur ou boucle glutamine de la figure 1. Les fragments de polypeptides selon l'invention peuvent être obtenus par synthèse chimique ou par clivage d'un polypeptide de l'invention par une enzyme protéolytique, par un réactif chimique, ou encore en plaçant ledit polypeptide dans un environnement très acide font également partie de l'invention. Dans un exemple spécifique, le fragment de polypeptide est spécifique de l'espèce Toxoplasma gondii et partagé par au moins 4 souches de génotypes différents de Toxoplasma gondii. La souche RH de T. gondii (génotype I, virulente chez la souris) a été utilisée d'un bout à l'autre de cette étude. Trois autres souches de T. gondii, isolées par les inventeurs ont été utilisées: RMS-99-GUI (génotype II, non virulente chez la souris), RMS-97-PAR (génotype III, de virulence intermédiaire) et RUB (souche atypique, virulente). Dans un exemple spécifique de l'invention, le fragment de polypeptide possède au moins 8 acides aminés, et sa séquence est choisie dans ou comprend les séquences du groupe constitué de: -VLILDEATSS -LSQGERQL -LSQGERQLLSITRA Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le fragment de polypeptide comprend l'une des séquences particulières ci-dessus et comporte au plus 20 résidus d'acides aminés, par exemple au moins 10, ou au moins 15 acides aminés. Dans un exemple spécifique, le fragment du polypeptide selon l'invention est impliqué dans des mécanismes de rejet de composés cytotoxiques. Lorsque la description qui suit fait référence aux polypeptides de l'invention, elle s'applique, sauf indication contraire, aux fragments des polypeptides tels que définis ci-dessus. L'invention concerne également un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'invention. Le terme polynucléotide désigne au sens de l'invention tout acide désoxyribonucléique (ADN) ou ribonucléique (ARN). Un ADN peut être plus particulièrement un ADN simple brin ou double brin, un ADN complémentaire (ADNc), un ADN génomique (ADNg) ou un ADN synthétique. Au sens de la présente invention, le terme polynucléotide est également synonyme de acide nucléique . Les polynucléotides de l'invention peuvent être d'origines diverses, et notamment d'origine bactérienne, synthétique ou semi-synthétique. Ils peuvent être isolés par toutes les techniques connues de la biologie moléculaire, en utilisant les données structurales et de séquences fournies par la présente demande. Ainsi, ces polynucléotides peuvent être isolés à partir de banques, par des techniques d'hybridation. Ils peuvent aussi être synthétisés chimiquement ou préparés génétiquement. Dans un exemple spécifique, le polynucléotide comprend la séquence codante correspondant aux nucléotides de la séquence de la figure 1 (SEQ ID No 6) L'invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression d'un polynucléotide selon l'invention tel que précédemment décrit. Le vecteur peut être notamment un plasmide, un cosmide, un phage ou un virus. Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Eventuellement, il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion du polypeptide traduit. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards telles que par exemple la transfection par précipitation au phosphate de calcium, la lipofection, l'électroporation, le choc thermique. Le vecteur selon l'invention comporte les éléments permettant l'expression et éventuellement la sécrétion desdites séquences dans une cellule hôte. L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes comprenant les vecteurs selon l'invention. Dans un exemple spécifique, les cellules hôtes sont transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide selon l'invention. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi les cellules bactériennes, par exemple E. coli, les cellules de levures, ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant le polypeptide en association avec un diluant, un excipient ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par véhicule pharmaceutiquement acceptable, on entend désigner tout type de véhicule employé habituellement dans la préparation de compositions injectables, c'est-à-dire un diluant, un agent de suspension tel une solution saline isotonique ou tamponnée. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, intramusculaire, intradermique ou orale. Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement ou encore les effets secondaires constatés. L'invention porte également sur l'utilisation d'un polynucléotide selon l'invention en tant que sonde appropriée pour la détection in vitro d'une infection par T. gondii, le cas échéant de manière spécifique. Le terme spécifique signifie que le polynucléotide ne donne pas d'hybride stable dans des conditions d'hybridation de forte stringence. Le terme spécifique peut donc signifier par exemple que le polynucléotide ne donne pas d'hybride stable dans des conditions d'hybridation de forte stringence avec des polynucléotides présents chez d'autres espèces de Toxoplasma. Les conditions de forte stringence sont par exemple les suivantes: Température d'hybridation: 50 C, -Tampon: Na2HPO4 0,25 M, pH7,2/SDS 10%/EDTA 1 mM/Blocking reagent 2%, - Lavage: deux fois dans du tampon SSC 2X/SDS 0,1% à température ambiante (15 min chaque), puis deux fois dans du tampon SSC 0,1X/0,1% SDS à 50 C (15 min chaque). L'invention concerne aussi l'utilisation d'oligonucléotides dans des méthodes de détection in vitro d'une infection par T. gondii, par exemple des méthodes de détection requérant l'amplification de séquences d'acides nucléiques, notamment par PCR. Le cas échéant les oligonucléotides sont choisis pour permettre la détection spécifique de l'infection par T. gondii. Dans un exemple spécifique, les sondes spécifiques ont une séquence de nucléotides choisie dans le groupe constitué de, ou comprenant l'une de ces séquences: - GGT TCT GGG AAA ACA AC - GTA TTA CAA GAT - TTAAGTCAAGGTGAACGT - GAT GAA GCC ACA TCA TCA Dans un exemple spécifique, les oligonucléotides spécifiques ont une séquence de nucléotides choisie dans le groupe constitué de: - GGT TCT GGG AAA ACA AC - GTA TTA CAA GAT - TTA AGT CAA GGT GAA CGT - GAT GAA GCC ACA TCA TCA Selon l'invention, les polynucléotides, pouvant être utilisés comme sondes ou comme amorces dans les procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquences nucléiques, présenteront une taille minimale de 12 bases, de préférences 16 bases, et de manière plus préférée 20 bases. Les séquences de polynucléotides selon l'invention non marquées peuvent être utilisées directement comme sonde, amorce ou oligonucléotide, cependant les séquences utilisées sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces, sondes, des oligonucléotides selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 35S, le 3H ou le 1251. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels que la biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couples d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on désigne toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues, en général, il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase. Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARN, par exemple un ARNm, on utilisera avantageusement, préalablement à la mise en oeuvred'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en oeuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARN contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention. Les sondes nucléotidiques selon l'invention hybrident avec une molécule d'ADN ou d'ARN de polynucléotide selon l'invention dans des conditions d'hybridation de forte stringence. Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. En général, une hybridation dans des conditions de forte stringence a un caractère spécifique. Les conditions de forte stringence sont par exemple les suivantes: Température d'hybridation: 50 C, -Tampon: Na2HPO4 0,25 M, pH7,2/SDS 10%/EDTA 1 mM/Blocking reagent 2%, - Lavage: deux fois dans du tampon SSC 2X/SDS 0,1% à température ambiante (15 min chaque), puis deux fois dans du tampon SSC 0,1X/0,1% SDS à 50 C (15 min chaque). La technique d'hybridation la plus générale consiste à immobilier l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tel que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde). Selon un autre mode de mise en oeuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sonde de capture. Dans ce cas, une sonde, dite sonde de capture , est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite sonde de détection , marquée par un élément facilement détectable. L'invention porte également sur des anticorps dirigés contre le polypeptide selon l'invention, notamment contre un domaine spécifique du polypeptide. Dans un exemple spécifique, des anticorps polyclonaux ou des anticorps monoclonaux pourront être obtenus à partir de la séquence choisie ou contenue dans les séquences du groupe constitué de: - SIKIDGVELTKITKK KVASDKITNQE Les polypeptides selon l'invention permettent de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975. Cette technique peut être employée pour obtenir un hybridome produisant un nouvel anticorps monoclonal hautement spécifique d'un épitope du polypeptide selon l'invention. Les anticorps monoclonaux de l'invention sont produits par tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir des cellules spléniques d'un animal, notamment de souris, immunisés contre l'un des polypeptides purifiés de l'invention, d'une part et des cellules d'une lignée de cellules d'un myélome approprié d'autre part, et d'être sélectionné, par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant le polypeptide initialement mis en oeuvre pour l'immunisation des animaux. Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple, par immunisation d'un animal, en particulier un lapin, avec un polypeptide selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés, sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le polypeptide ayant servi d'antigène. Les anticorps polyclonaux selon l'invention peuvent aussi être préparés par purification sur une colonne d'affinité, sur laquelle a été préalablement immobilisé un polypeptide selon l'invention. Les anticorps de l'invention pourront également être marqués de la même manière que décrit précédemment pour les sondes nucléiques de l'invention et de manière préférée avec un marquage de type enzymatique, fluorescent ou radioactif. Par ailleurs, outre leur utilisation pour la purification des polypeptides de l'invention, les anticorps de l'invention, polyclonaux ou monoclonaux, peuvent également être utilisés pour la détection in vitro de ces polypeptides dans un échantillon biologique. Ils constituent ainsi un moyen d'analyse de l'expression du polypeptide selon l'invention, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques. Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression d'un polypeptide selon l'invention doit être observée, et plus particulièrement en immunocystochimie, en immunohistochimie ou dans des expériences de western blotting . Selon un autre aspect, l'invention propose également l'utilisation d'anticorps, de sondes d'oligonucléotides, du polypeptide y compris de fragments du polypeptide selon l'invention pour la détection in vitro d'une infection par Toxoplasma gondii. La détection peut être faite sur un échantillon biologique pour rechercher une infection par T. gondii, ou pour le suivi d'une infection déjà reconnue, notamment pour déterminer l'évolution d'un traitement médical. L'invention a en particulier pour objet l'utilisation de polynucléotides, utiles comme sondes ou amorces pour détecter après amplification, un polynucléotide de Toxoplasma gondii appartenant au gène TgABC1 représenté sur la figure 1. L'invention a pour objet l'utilisation d'un polypeptide ou un fragment de polypeptide selon l'invention pour la détection par un test classique notamment ELISA d'un anticorps dirigés contre le polypeptide TgABC1 représenté à la figure 1, présent dans un échantillon biologique d'un hôte infecté par Toxoplasma gondii. L'invention a pour objet l'utilisation d'anticorps utiles pour la détection d'une séquence peptidique antigénique de TgABC1 présent dans un échantillon biologique d'un hôte infecté par Toxoplasma gondii. L'invention concerne également les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, susceptibles de reconnaître spécifiquement les polypeptides de l'invention, et de former des complexes immunologiques avec ces derniers. L'invention concerne également une méthode pour le diagnostic in vitro d'une infection par Toxoplasma gondii comprenant la mise au contact d'au moins un anticorps/polypeptide tels que définis précédemment, contenus dans un prélèvement biologique d'un hôte infecté par Toxoplasma gondii, dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques entre une séquence polypeptidique de TgABC1/anticorps tels que définis précédemment et le ou lesdits anticorps/polypeptides et la détection des complexes immunologiques éventuellement formés. Selon un autre aspect, l'invention propose également l'utilisation d'anticorps, de sondes d'oligonucléotides, du polypeptide ou de fragments du polypeptide selon l'invention pour détecter d'autres membres de la famille des protéines ABC transporteurs chez Toxoplasma gondii. Selon un autre aspect, l'invention propose un procédé de préparation d'anticorps comprenant les étapes suivantes: - exprimer le gène codant pour le polypeptide selon l'invention, -purifier ledit polypeptide, -injecter ledit polypeptide dans un animal pour induire une réponse immunitaire, -purifier les anticorps produits se liant audit polypeptide. Selon un autre aspect, l'invention propose un procédé pour la détection in vitro de composés actifs contre l'invasion et/ou la réplication de Toxoplasma gondii dans un hôte cellulaire comprenant les étapes suivantes: - infection par Toxoplasma Gondii de cellules hôtes déterminées sensibles à une infection par Toxoplasma Gondii, - mise en contact desdites cellules avec un composé déterminé, - détection de l'activité d'invasion et/ou de réplication de Toxoplasma Gondii. Selon un autre aspect, l'invention propose un procédé de criblage de molécules interagissant avec un polypeptide ou un fragment de polypeptide de l'invention. On peut obtenir des anticorps contre le polypeptide ou fragment de polypeptide de l'invention et tester par compétition la liaison des molécules criblées d'une part et du polypeptide de l'invention ou de ses fragments d'autre part, avec les anticorps. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures qui suivent. LEGENDE DES FIGURES Figure 1: Séquences nucléotidique et peptidique du site ATPasique du gène TgABC1 de Toxoplasma gondii. La traduction a été effectuée à partir du site internet INFOBIOGEN (http://www.infobiogen.fr/services/menuserv.html) . Les motifs conservés Walker A et B, la signature ABC et la boucle Glutamine sont indiqués. Les séquences correspondant à l'amorce sens TgABC1 et l'amorce anti-sens TgABC3R, utilisées pour obtenir le produit PCR TgABC1 sont soulignées. Le site d'action de l'enzyme de restriction Bfa I est indiqué. La séquence représentée figure 1 sera disponible en décembre 2004 dans Genbank (numéro d'accès: AY692486). Figure 2: Amplification par PCR de l'ADNg de tachyzoïte de souches de génotype I, II, III et souches atypiques de T. gondii; ainsi que des cellules humaines THP1. (A) Amplification spécifique du gène TgABC1 de 393 pb utilisant les amorces non-dégénérées TgABC1/ TgABC3R. (B) Amplification des gènes BI et GAPDH (contrôles positifs de PCR. Les pistes CT. Les marqueurs de poids moléculaires sont indiqués sur la gauche; les tailles des produits de PCR sont indiquées par une flèche sans tête sur la droite. Figure 3: Comparaison de la séquence de la protéine ABC de T. gondii avec celles d'autres membres de la superfamille des ABC transporteurs. (A) Alignements de la séquence en acides aminés de la protéine ABC de T. gondii (TgABC1) avec les sites de fixation à l'ATP C-terminaux du gène humain MDR1 (GeneBankTM accession no. M14758), E. histolytica (EhPgpl, Genbank Tm accession no. M88599), L. donovani (LdMDR1, GenBankTM accession no. L01572), P. falciparum (PfMDR1, GenBankTM accession no. M29154), human MRP1 (GenBankTM accession no. NM_004996), L. tarentolae (LtPgpA, GenBankTM accession no. X17154), C. parvum (CpABC, GenBankTM accession no. AF110147) et T. cruzi (TcPgp2, GenBankTM accession no. Z49222). L'alignement a été réalisé en utilisant l'algorithme clustalW. Des écarts sont ajoutés pour optimiser l'alignement. Les acides aminés identiques (noir) et les substitutions conservatives (gris) ont été colorés avec le programme BOXSHADE. Les substitutions conservatives sont définis par les groupes suivants: (I,L,V,M), (K,R,H), (D,E), (F,Y,W), (N, Q) and (S,T). Les nombres sur la droite s'appliquent aux positions des acides aminés des polypeptides alignés. Les motifs conservés Walker A et B, la signature ABC et la boucle Glutamine sont compartimentés et indiqués. (B) Le dendrogramme a été généré en comparant les séquences en acides aminés des sites de fixation à l'ATP C-terminaux de 9 membres de la superfamille des ABC transporteurs en utilisant l'algorithme ClustalW. Figure 4: Analyse de l'expression du gène TgABC1 chez la souche RH (stade tachyzoite). L'ARN total issu de T. gondii et de cellules THP1 a été amplifié par PCR utilisant les paires d'oligonucléotides TgABCl/ TgABC3R (393 pb indiqués par une flèche). Les gènes SAG1 et GAPDH sont utilisés comme contrôle positif. Afin de détecter une éventuelle contamination d'ADN génomique, les ARN totaux de tachyzoites ont fait également l'objet d'une PCR utilisant des amorces spécifiques du gène de la superoxyde dismutase (SOD), qui permettent d'amplifier des fragments de longueur distincte à partir de l'ADNc (211 pb) ou de l'ADNg (735 pb) du fait de la présence d'introns. Les pistes CT1 et CT2 sont des contrôles négatifs sans ARN ou ADNc, respectivement. Les marqueurs de poids moléculaires sont indiqués sur la gauche. Les tailles des produits PCR sont indiquées par des flèches sans tête sur la droite. Figure 5: Analyse par Nothern Blot du transcrit TgABC1. Les ARN totaux (10pg) isolés des cellules THP1 et des tachyzoites sont séparés dans un gel de formaldéhyde dénaturant, transférés sur membrane de nylon et détectés avec le fragment PCR TgABC1 marqué à la digoxygénine (DIG) (exemple A). Une secondemembrane de nylon (exemple B) a été hybridée avec une sonde de 341 pb marquée à la DIG correspondant à un fragment du gène SAG1 (contrôle positif). La taille de l'ARNm de TgABC1 a été estimée par comparaison avec le marqueur de poids moléculaire de type I marqué à la digoxigénine de chez Roche. Les marqueurs de poids moléculaires (pb) sont indiquées sur la droite du gel (A). Les signaux d'hybridation sont indiqués par des têtes de flèche et les puits de dépôt de chaque gel par des flèches. Figure 6: Analyse Southern blot du gène TgABC1. L'ADN génomique (2 pg) de la souche RH de T. gondii a été digéré par différentes enzymes de restriction, puis a fait l'objet d'une électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %, a été transféré sur membrane de nylon et hybridé avec la sonde spécifique TgABC1. Les positions des bandes d'hybridation sont indiquées par des têtes de flèche. Les pistes 1-7 correspondent aux produits digérés par Smal, Hindlll, Xbal, BamHl, Pstl, EcoRl et Bfal; la piste 8 correspond au produit PCR TgABC1 digéré par Bfal; la piste ND correspond à l'ADN génomique non digéré. Les tailles des marqueurs moléculaires (kb) (the 100bp DNA Ladder et the Mass Ruler DNA LadderTM High Range de Fermentas GmbH) sont indiquées respectivement sur la gauche et sur la droite. Des flèches indiquent la position des puits de dépôt de chaque gel. Figure 7: Réactivité de l'antisérum de lapin contre le peptide VS-16CK. Suivi des densités optiques à J0, J53 et J74. Figure 8: Contrôle de l'immunoréactivité sur le peptide VS-16CK. EXEMPLES Exemple 1: Culture des parasites La souche RH de T. gondii (génotype I, virulente chez la souris) a été utilisée d'un bout à l'autre de cette étude. Trois autres souches de T. gondii, isolées dans notre laboratoire ont été utilisées dans nos expériences: RMS-1999-GUI (génotype Il, non virulente chez la souris), RMS-1997-PAR (génotype III, non virulente) et RUB (souche atypique, virulente). Les tachyzoites de T. gondii sont maintenus in vitro par passage sur cellules leucémiques monocytaires humaines, les cellules THP-1, dans du milieu RPMI-1640 supplémenté avec 2% de sérum de veau foetal humain inactivé par la chaleur, 2mM glutamine, 50 U/mL pénicilline et 50 pg/mL de streptomycine à 37 C dans une atmosphère saturée à 5% CO2. Les tachyzoites sont libérés des cellules THP-1 infectées par passage au travers d'une aiguille 20G puis filtrés au travers d'une membrane de polycarbonate de 3 pm afin d'éliminer tous débris cellulaires et cellules hôtes intactes [Roos DS, Donald RG, Morrissette NS, Moulton, AL. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods Cell Biol 1994;45:27-63.]. Le milieu RPMI-1640, le sérum de veau foetal, la trypsine-EDTA, la glutamine et la pénicilline-streptomycine proviennent de la société Invitrogen Corporation. Exemple 2: Extraction de l'ADN génomique L'ADN génomique est extrait des cellules THP-1 et des tachyzoites purifiés par utilisation du 'QlAamp DNA Mini Kit' (QIAGEN) suivant les instructions données par le fournisseur, puis conservé à -20 C avant utilisation. Exemple 3: Réaction PCR et isolement de la séquence TgABC1 Les séquences en acides aminés correspondant à plusieurs domaines ATPasiques d'ABC transporteurs ont été alignées et comparées; un motif consensus a été trouvé dans une région allant du Walker A au Walker B (figures 1 et 3). Un ensemble de primers dégénérés a été élaboré sur la base de ces motifs, qui sont conservés dans les deux domaines ATPasiques. L'amplification PCR a été réalisée en utilisant l'amorce sens 5'-GGTT(C/G)TGG(A/G)AAA(A/T) C(A/T)AC-3' et l'amorce antisens 5'-TGA(A/T)GATGT(T/G)GCTTCATC-3' (50 pmol chaque), 50 ng d'ADN génomique, et 2 U de Taq DNA polymerase (InvitrogenTM life technologies, Cergy Pontoise, France) dans un volume final de 50 pL contenant du tampon 1 X concentré (20 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1.5 mM MgCl2) et 200 pM de chaque dNTPs. L'échantillon a été soumis à 35 cycles d'amplification (94 C for 45 sec, 45 C for 30 sec et 72 C for 2 min) suivis d'une extension finale de 10 min à 72 C. Dix microlitres de produit PCR ont été analysés par électrophorèse dans du tampon TBE 1 X concentré sur gel d'agarose à 2% contenant 0,5 pg/mL de bromure d'éthidium et photographié sous ultraviolet (UV) (Phosphoimager, Biorad, France). Les fragments PCR amplifiés ( 400 bp) ont été purifiés par le 'QlAquick gel Extraction Kit' (QIAGEN), puis séquencés dans les deux directions avec les mêmes amorces par un séquenceur automatique (QIAGEN, Hilden, Allemagne). Les gènes B1 de T. gondii et GAPDH pour les cellules THP-1 ont été utilisés en tant que contrôles positifs de PCR. La société InvitrogenTM Iife technologies a synthétisé les différents amorces. Les séquences des amorces, les températures d'hybridation et le nombre de cycles d'amplification sont résumés dans le Tableau 1. Nom du gène Sequence des amorces Température Nbre Taille et numéro (5' 3') - d'hybridation de attendue d'accès. ( C) cycles (bp) TgABC1 (S)5'ggttctgggaaaacaac-3' 45 35 393 AY692486 (TgABC1) (AS) 5'-tgatgatgtggcttcatc-3' (TgABC3R) BI (S) 5'-ttcaagcgtcaaaacgaactat- 3' 57 30 230 AF179871 (AS) 5'-ctcatttctgggtctacgtcg-3' GAPDH (S) 5'ctctgccccctctgctgatgc-3' 56 30 234 XM_006959 (AS) 5'ccatcacgccacagtttcccg-3' SAG1 (P30) (S) 5'-caatgtgcacctgtaggaagc- 3' 56 35 341 X14080 (AS) 5'-tgggcaggtgacaacttgatt-3' SOD (S) 5'gttaatcgccatggtattcac-3' (SOD3) 52 35 735 AF029915 (AS)5'attattgaaatgctccagtag-3'(SOD2R) (gDNA) (cDNA) ≈Amorces oligonucléotidiques définies dans ce travail S: amorce sens; AS: amorce antisens. Tableau 1: Caractéristiques et séquences des oligonucléotides utilisés comme amorces. Exemple 4: Etude de l'expression des ARNm par RT-PCR L'ARN total de T. gondii a été isolé à partir de 5.10' tachyzoites en utilisation le 'RNeasy Mini Kit' (QIAGEN). Avant de réaliser la RT-PCR, l'ARN total a été traité 15 min à température ambiante avec de la DNase I libre de RNase et la présence d'une contamination en ADN génomique a été contrôlée par PCR en utilisant les amorces SOD3 et SOD2R (Tableau 1), qui amplifient une région du gène de la superoxide dismutase (SOD) de T. gondii contenant un intron [Odberg-Ferragut C, Renault JP, Viscogliosi E, Toursel C, Briche 1, Engels A, Lepage G, Morgenstern-Badarau 1, Camus D, Tomavo S, Dive D. Molecular cloning, expression analysis and iron metal cofactor characterisation of a superoxide dismutase from Toxoplasma gondii. Mol Biochem Parasitol 2000;106:121-9]. Des échantillons de 0,5 pg d'ARN total, dénaturés 10 min à 65 C, ont été transformés en ADNc dans un volume total de 20 pL en utilisant des oligo-(dT)18 comme amorces avec 200 U de Superscript II reverse transcriptase à 42 C pendant 50 min. Cette étape a été suivie par une inactivation de l'enzyme à 70 C pendant 15 min, puis le mélange d'ADNc a été incubé à 37 C pour 20 min avec 2 U de RNase H d'E. coli afin d'éliminer l'ARN complémentaire de l'ADNc. L'amplification par PCR a été réalisée, comme décrit précédemment, excepté qu'il a été utilisé 2 pL d'ADNc et 50 pmol de chacun des amorces TgABC1 et TgABC3R [amorces non dégénérés du gène TgABC1 (Tableau 1)]. SAG1, gène de T. gondii dont les transcrits sont spécifiques du stade tachyzoite [Burg JI, Perelman D, Kasper LH, Ware PL, Boothroyd JC. Molecular analysis of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii. J Immunol 1998;141:3584-91], et le gène GAPDH ont été utilisés comme contrôles positifs de PCR. Deux contrôles négatifs, CT1 et CT2, contenant tous les réactifs excepté l'ARN total ou l'ADNc respectivement, ont été inclus. Les séquences des amorces ont été reportées dans le Tableau 1. Exemple 5: Analyse par Northern Blot Dix microgrammes d'ARN total de tachyzoites souche RH, préparés comme précédemment, et de cellules THP-1 ont été mélangés avec 2 pL de MOPS 10X, 10 pL de formamide déionisé, 4 pL de formaldéhyde 37%, 2 pL d'eau traitée au DEPC et dénaturés 15 min à 65 C. L'ARN a été fractionné par électrophorèse dans un gel d'agarose à 1, 2% contenant du formaldéhyde, transféré par capillarité sur une membrane de nylon chargée positivement (Roche) dans du tampon SSC 10X une nuit à 4 C, puis fixé à la membrane par irradiation UV (pour 5 min), suivie d'un séchage à 80 C pendant 30 min. La membrane a été préhybridée pendant 2 heures à 50 C dans du Na2HPO4 0,25 M, pH7,2/SDS 10%/EDTA 1 mM/Blocking reagent 2% (Roche), puis hybridée une nuit à 50 C en présence du produit d'amplification PCR TgABC1 marqué à la digoxygénine (DIG). Cette sonde a été préparée en utilisant les amorces non dégénérées TgABC1/3R et le 'PCR DIG Probe Synthesis Kit' suivant les instructions du fournisseur (Roche). Une sonde SAG1 marquée à la DIG a aussi été incluse comme témoin positif. Le blot a été lavé deux fois dans du tampon SSC 2X/SDS 0,1% à température ambiante (15 min chaque), puis deux fois dans du tampon SSC 0,1X/0,1% SDS à 50 C (15 min chaque). Le signal d'hybridation a été détecté avec un anticorps spécifique anti-DIG couplé à la phosphatase alcaline par réaction colorimétrique avec le NBT/BCIP en utilisant le kit commercialisé par Roche, le 'DIG Nucleic Acid Detection Kit'. La taille des transcrits a été déterminée par comparaison avec un marqueur de poids moléculaire d'ARN marqué à la digoxygénine [RNA molecular weight marker I, digoxigenin-labeled (Roche)] Exemple 6: Analyse par Southern Blot Approximativement 2 pg d'ADN génomique de tachyzoites souche RH ont été digérés avec 20 U d'enzymes de restriction Smal, Hindlll, Xbal, BamHl, Pstl, EcoRI et Bfal à 37 C pendant 24 heures, puis mis à migrer dans un gel d'agarose à 10/0. Les fragments d'ADN ont été dépurinés dans du HCI 0, 25 M (5 min), dénaturés dans un tampon neutre (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) pendant 20 min et neutralisés dans un tampon 0,5 M Tris pH 7.0, 3 M NaCl (20 min). Après transfert par capillarité pendant une nuit dans du SSC 20X à température ambiante et fixation au UV, le blot a été préhybridé pendant 2 heures à 45 C dans le même tampon que décrit précédemment. L'hybridation s'est déroulée sur une nuit à 45 C en présence de la sonde TgABC1 marquée à la DIG. Les lavages et la méthode de détection ont été les mêmes que ceux décrits précédemment pour le Northern blot. La sonde SAG1 marquée à la DIG a aussi été utilisée en tant que témoin positif. Exemple 7: Analyse de séquence Les séquences d'acides nucléiques et protéiques de plusieurs ABC transporteurs connus ont été alignées grâce au programme d'alignement multiple de séquences, ClustalW disponible sur le site web d'EMBL-EBI (Institut Bioinformatique Européen) (http:/www.ebi. ac.uk//clustalw/index.html). Les recherches d'identité et de substitutions conservatives ont été réalisées par le programme BOXSHADE sur le site web EMBnet (http:/www.ch.embnet.org/software/Boxform.html). Les numéros d'accès à GenBankTM pour les séquences proviennent de la base de données NCBI http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ et sont: Homo sapiens (Humdrl) , M14758; Entamoeba histolytica (EhPgp1), M88599; Leishmania donovani (Idmdrl), L01572; Plasmodium falciparum (pfmdrl), M29154; Homo sapiens (HuMRP1), NM_004996; Leishmania tarentolae (LtPGPA), X17154; Cryptosporidium parvum (CpABC), AF110147; Trypanosoma cruzi (Tcpgp2), Z49222. Les comparaisons des séquences en acides aminés ont été réalisées par l'algorithme BLAST 2.0 (BLASTp) avec la matrice BLOSUM62. Les données relatives à la séquence nucléotidique TgABC1 ont été déposées dans GenBank/EBI (AY692486). Exemple 8: Caractérisation du gène TgABC1 Dans le but de détecter la présence de gènes codant pour des protéines de type ABC transporteur dans le génome de T. gondii, nous avons élaboré un ensemble d'amorces dégénérées qui recouvrent une partie des séquences nucléotidiques codant pour les Walker A et B, qui sont des motifs hautement conservés au sein des protéines de type ABC. L'amplification par PCR de l'ADN génomique de tachyzoites de T. gondii (souche RH) a généré, suivant les paires d'amorces, des bandes distinctes allant de 300-1000 pb (données non montrées) suggérant la présence de multiples gènes de type ABC dans le génome de T. gondii. Les produits de PCR compatibles avec la taille attendue ( 400pb) ont été séquencés dans les deux sens permettant d'isoler une séquence de 393 pb présentant la signature des ABC transporteurs (Fig. 1). A partir de cette séquence, deux amorces non dégénérées (TgABC1 et TgABC3R, soulignés dans la figure 1) ont été choisies pour amplifier spécifiquement le fragment de 393 pb du génome de T. gondii. Comme montré dans la figure 2A, nous avons obtenu une simple bande de taille attendue dans les 4 types de souches de T. gondii analysés (génotypes I, II, III et souche atypique) et aucun polymorphisme n'a été détecté après séquençage. Afin d'examiner la spécificité du produit d'amplification PCR, l'ADN génomique des cellules hôtes THP-1 a été amplifié avec les amorces TgABC1/TgABC3R et aucun produit d'amplification n'a été observé à la taille de 393 pb (Fig 2A) confirmant que ce gène provient du génome de T. gondii. D'autre part, l'intégrité des ADN de T. gondii et des cellules THP-1 a été vérifiée par PCR en utilisant respectivement les gènes BI et GAPDH comme cibles; les fragments de taille attendue ont été amplifiés dans toutes les souches de T. gondii et les cellules TNP-1 (Fig 2B). Exemple 9: Similitude de séquence entre TgABC1 et les autres protéines ABC. La séquence en acides aminés déduite du produit de PCR TgABC1 est constituée de 131 acides aminés (Fig. 1). Afin d'identifier la séquence complète du gène TgABC1, des banques de données ont été examinées incluant la banque Toxoplasma gondii Genome Resource (ToxoDB) (http://toxodb.org/ToxoDB.shyml) et la parasite génome database (http://www.ebi.ac.uk/parasites/parasite-genome.html). Aucun clone, aucune séquence produisant des scores BLAST suffisamment élevés avec la séquence TgABC1 n'ont été identifiés. Une recherche dans les banques EMBUGenBankTM/DDBJ en utilisant l'algorithme BLASTP a révélé que la séquence polypeptidique TgABC1 est hautement similaire à des protéines de transport de type ABC. En effet, l'identité de séquence la plus importante a été trouvée avec le domaine de fixation à I'ATP de la bactérie Thermotoga maritima (Numéro d'accession dans GenBank AE001710, 391-521 AA) avec 49% identité et 75% de substitutions conservatives. L'alignement a permis également d'identifier 41% d'identité et 64% de substitutions conservatives entre la sous-unité de fixation à I'ATP de la protéine de sécrétion hémolysine, HlyB d'Escherichia coli (GenBank M14107, 505-635) et le domaine de fixation à I'ATP, TgABC1. Finalement, TgABC1 montre des niveaux statistiquement significatifs de substitutions conservatives avec de nombreuses perméases. De façon intéressante, le haut pourcentage de similarité avec lesprotéines de transport bactériennes, en particulier HlyB, a été décrit pour les gènes MDR de mammifères tels que mdrl de souris, mdr2, mdr3 [Raymond M, Gros P. Mammalian mu/tidrug-resistance gene: Correlation of exon organization with structural domains and duplication of an ancestral gene. Proc Nat/ Acad Sci USA 1989;86:6488-92.] et pour le gène mdrl humain [Chen CJ, Chin JE, Ueda K, et al. Internai duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdrl (P- glycoprotein) gene from mu/tidrugresistant human cells. Cell 1986;47::381- 9.]. Des niveaux significatifs d'identité et de substitutions conservatives ont aussi été remarqués pour les alignements concernant les protéines encodées par les gènes mdrl de souris et humain. Globalement, on observe 33% d'identité et 60% de substitutions conservatives entre le polypeptide TgABC1 et les séquences peptidiques des sites ATPasiques N- et C-terminais du gène mdrl humain.(Tableau 2A et B). Des pourcentages similaires sont obtenus avec les sites ATPasiques de la protéine mdr2 de souris (données non montrées). De plus amples analyses de comparaison de séquences entre TgABC1 et la séquence protéique complète des gènes Humdrl, EhPgpl, ldmdrl, pfmdrl (Pgp cluster) et HuMRP1, CpABC, LtPGPA, Tcpgp2 (MRP cluster) révèlent que la séquence polypeptidique TgABC1 s'apparie avec les sites ATPasiques Cterminaux de ces 8 protéines de type ABC (Fig. 3A). Le pourcentage d'identité de séquence le pus important a été trouvé avec le domaine ATPasique C-terminal de ldmdrl avec 39% d'identité et 64% de substitutions conservatives sur la totalité de la séquence de 131 acides aminés (aucuns gaps) Tableau 2B). TgABC1 montre aussi une identité significative avec les protéines EhPgpl, HuMRP1, CpABC, Humdrl et pfmdr1. D'autre part, TgABC1 partage seulement 27% et 28% d'identité et approximativement 50% de substitutions conservatives avec respectivement LtPGPA et Tcpgp2 (Tableau 2B). Sur la base de ces similarités de séquence avec d'autres protéines ABC transporteurs, TgABC1 apparaît constituer le site de fixation à I'ATP C-terminal d'une protéine de type Pglycoprotéine (Pgp). Un dendrogramme des similarités de séquences généré par ClustalW dans le but de décrire les relations entre ces 9 protéines, montre Fig. 3A que cette analyse est en accord avec une protéine de type Pgp. (A) Humdrl EhPgpl Ldmdrl Pfmdrl HuMRP1 CpABC1 LtPgpA TcPgp2 TgABC1 35 (62) 36 (63) 35 (61) 29 (46) 24 (46) 27 (49) 22 (46) 23 (39) Espaces 0% 2% 0% 25% 14% 12% 10% 15% (B) Humdrl EhPgpl Ldmdrl Pfmdrl HuMRPI CpABC1 LtPgpA TcPgp2 TgABC1 32 (60) 35 (64) 39 (64) 30 (50) 35 (59) 33 (65) 27 (53) 28 (42) Espaces 1% 2% 0% 8% 0% 0% 1% 2% Tableau 2: Analyse de l'identité (et des substitutions conservatives) des acides aminés du produit PCR TgABC1 par rapport aux sites de fixation à l'ATP N- terminal (A) et C-terminal (B) des protéines Humdr1, EhPgpl, Idmdrl, pfmdrl, HuMRP1, CpABC, LtPGPA et Tcpgp2. L'identité (et les substitutions conservatives) des acides aminés sont exprimées en pourcentage ayant été calculé avec les acides aminés codés par les amorces d'oligonucléotides. Exemple 10: Analyse de l'expression du gène TgABC1 Cette analyse a été réalisée par RT-PCR. L'ADNc provenant de l'ARN total de tachyzoites de souche RH a été amplifié par PCR avec les amorces TgABC1/3R. Comme montré Fig. 4, l'amplification produit un fragment de taille attendue (393 pb) correspondant, après séquençage direct, à la séquence TgABC1. Aucun signal de même taille n'a été obtenu à partir des ARN totaux isolés des cellules hôtes THP-1. La qualité des ARN issus de T. gondii et des cellules THP-1 a été vérifiée par PCR avec respectivement les gènes SAG1 et GAPDH. Exemple 11: Analyse des acides nucléiques du gène TgABC1 L'expression du gène TgABC1 a également été étudiée et confirmée par Northern Blot. L'analyse a été menée en utilisant comme sonde le produit PCR de 393 pb marqué à la DIG. Après hybridation, une seule bande d'environ 7 kb a été détectée à partir des ARN totaux isolés de T. gondii (souche RH), et aucune dans l'échantillon issu des cellules THP-1 (Fig 5A). D'autre part, pour estimer la qualité de l'ARN de T. gondii, nous avons réalisé une hybridation avec une sonde marquée à la DIG correspondant à un fragment nucléotidique du gène SAG1 (contrôle positif). Comme attendu, une bande à 1500 pb a été observée (Fig. 5B) [Burg JL, Perelman D, Kasper LH, Ware PL, Boothroyd JC. Molecular analysis of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii. J Immunol 1988;141:3584-91.]. La sonde TgABC1 a aussi été utilisée pour déterminer si le gène TgABC1 était représenté plus d'une fois dans le génome de T. gondii. L'analyse a été réalisée par Southern Blot sur de l'ADN génomique de T. gondii digéré par 7 enzymes de restriction distinctes. Deux bandes de tailles non similaires pour chaque enzyme de restriction (excepté avec Xbal-ligne 3 et BamHl-ligne 4), allant de 10 à 1 kb approximativement sont observées (Fig. 6). L'hybridation de la sonde TgABC1 avec la digestion par l'enzyme Bfal (ligne 7), qui présente un site de restriction dans la séquence TgABC1, révèle deux bandes d'intensités différentes. Ces résultats suggèrent fortement que la protéine TgABC1 est encodée par un gène simple copie qui contient 2 sites de fixation à l'ATP hautement similaires. La digestion du produit PCR de 393 pb par Bfal (ligne 8) génère 2 bandes de tailles attendues, du fait de la présence d'un site de restriction interne dans TgABC1 (hybridation contrôle). La sonde SAG1 marquée à la DIG a aussi été utilisée comme contrôle positif. Comme attendu, une simple bande a été obtenue après hybridation avec une digestion par EcoRl (données non montrées). Ceci est en accord avec la nature d'un gène simple copie comme démontré par Burg JL et al [Burg JL, Perelman D, Kasper LH, Ware PL, Boothroyd JC. Molecular analysis of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii. J Immunol 1988;141:3584- 91.]. Exemple 12: Protocole d'immunisation et étude de l'immunoréactivité des antisérums de lapin anti-peptide Protocole Jours Protocole J-3 transfert et mise en place en zone d'expérimentation JO Prélèvement Sérum Contrôle (5 ml) et conservation à -20 C 1 ère injection intradermique (1 ml) 1 tube pour 2 lapins; 1 ml Ag + 1 ml Freund incomplet J21 2ème infection intradermique (1 ml) 1 tube pour 2 lapins; 1 ml Aq + 1 ml Freund incomplet J42 3eme injection intradermique (idem J21) J53 Prélèvement Sérum Test (5 à 20 ml) et conservation à 4 C J63 lève injection sous cutanée (1 ml) 1 tube pour 2 lapins; 1 ml Ag + 1 ml Freund incomplet J74 Prélèvement Sérum Test (5 à 20 ml) et conservation à 4 C Etude Prélèvement: JO, J53 et J74 Méthode de dosage: ELISA Antigène: peptide couplé sur une plaque de microtitration peptide: 21 SIK IDG VEL TKI TKK 34 (Cystéine en N- ter) Dilution du sérum: de 1/500 à 1/64000 (de 2 en 2) Détermination du titre: o Rappel: le titre est déterminé par la plus forte dilution pour laquelle la DO obtenue est Supérieure ou égale à 1 o Mode de calcul: le titre est exprimé en inverse de la dilution o Mode d'appréciation: titre ou = 8000: immunoréactivité forte Résultats obtenus: Peptide Jour(s) Lapin 313775 Lapin 313804 VS-16CK J53 2000 4000 J74 8000 8000 Conclusion: A J53, les deux lapins développent des anticorps anti-peptide VS-16CK (immunoréactivité moyenne). A J74, les deux lapins développent des anticorps anti-peptide VS-16CK (immunoréactivité forte) (Fig. 7). Exemple 13: Immunopurification d'antisérum de lapin anti-peptide Etape 1: préparation de la colonne d'affinité Les peptides sont couplés à 1 ml de billes de sépharose activées. Etape 2: chargement de l'antisérum Le sérum est mis en contact avec les billes pendant 1 heure à 37 C. Etape 3: élution Après plusieurs lavages de la colonne, l'élution est effectuée à l'aide d'un tampon contenant 0.02 % d'azide de sodium. Les fractions contenant les anticorps sont rassemblées et la concentration finale en anticorps immunopurifiés est déterminée par lecture de la DO à 280 nm. Etape 4: test des anticorps immunopurifiés par ELISA o Antigène: peptide(s) couplé(s) sur une plaque de microtitration. Peptide: 21 SIK IDG VEL TKI TKK 34 (Cystéine en N-ter) o Dilution des anticorps: de 1000 mg/ml à 8 ng/ml (de 2 en 2) o Témoin positif: sérum avant purification o Détermination du titre: Rappel: arbitrairement, le titre est déterminé par la plus faible concentration d'anticorps pour laquelle la DO obtenue est > ou = 1 à 450 nm. Mode d'appréciation: en règle générale, pour un sérum ayant un bon titre en anticorps anti-peptide, on obtient un titre de 100 ng/ml pour les anticorps immunopurifiés. Résultats: Sérum lapin(s) n 313775 & Anticorps immunopurifiés Peptide VS16CK VS-16CK Titre 2000 63 ng/ml Concentration en anticorps: 55 pg/ml Anticorps immunopurifiés: 1 ml Stockage: tampon 0.1 M Tris / Glycine pH 7, 8 + 0,02 % azide de sodium Conservation: REVENDICATIONS 1 - Polypeptide de transport transmembranaire de la famille des protéines ABC transporteurs de Toxoplasma gondii comportant au moins un domaine similaire à un domaine Walker A représenté par une séquence XGSGKTT ou à un domaine Walker B représenté par une séquence VLILDEATSS ou, au moins un domaine similaire au domaine Walker A et un domaine similaire au domaine Walker B représentés par les susdites séquences. 2 - Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un domaine identique aux séquences Walker A et B: SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2 suivantes: SEQ ID No 1:XGSGKTT SEQ ID No2:VLILDEATSS 3 Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte deux domaines identiques aux séquences Walker A et B correspondant aux séquences SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2 4 - Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins un domaine similaire ou identique au domaine représenté par la séquence signature ABC transporteur répondant à la séquence L S Q G E R Q L L S I T R A. 5 - Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence signature ABC transporteur suivante: séquence SEQ ID No 3(SEQ IDNo3:LSQGERQLLSITRA),lesdomaines walker Aet walker B qu'il comporte étant similaires ou identiques aux domaines représentés par les séquences X G S G K T T ou V L I L D E A T S S. 6 - Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre, au moins un domaine similaire au domaine représenté par la séquence boucle Glutamine V L Q D. 7 - Polypeptide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence boucle Glutamine suivante: séquence SEQ ID No 4: VLQD, ainsi qu'une séquence signature ABC transporteur similaire ou identique à la séquence suivante: séquence SEQ ID No 3 (SEQ ID No 3: L S Q G E R Q L L S I T R A), les domaines walker A et walker B qu'il. comporte étant similaires ou identiques aux domaines représentés par les séquences XGSGKTTouVLILDEATSS. 8 - Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence boucle Glutamine VLQD, ainsi qu'une séquence signature ABC transporteur>) L S Q G E R Q L L S I T R A, et les domaines walker A de séquence X G S G K T T et Walker B de séquence V L I L D E A T S S. 9 - Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes 20 codé par la séquence de nucléotides représentée à la figure 1 (SEQ ID No 5). - Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes 25 comprenant la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 (SEQ ID No 6), et désigné TgABC1. 11 - Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes 30 ayant un poids moléculaire compris entre 140 et 200 kDa, de manière préférée entre 150 et 180 kDa. 12 - Fragment d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 8 acides aminés consécutifs formant une séquence caractéristique, en particulier spécifique, d'une protéine ABC transporteur d'au moins une souche de Toxoplasma gondii. 13 - Fragment selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est spécifique de l'espèce Toxoplasma gondii et partagé par au moins 4 10 souches de génotypes différents de Toxoplasma gondii. 14 - Fragment d'un polypeptide selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce qu'il est reconnu par des anticorps obtenus contre ledit polypeptide. 15 - Fragment d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 12 à 14 caractérisé en ce qu'il possède au moins 8 acides aminés, et en ce que sa séquence est choisie dans ou comprend les séquences du groupe constitué de: -VLILDEATSS -LSQGERQL -LSQGERQLLSITRA 16 - Polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 17 - Polynucléotide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence codante correspondant à la séquence de nucléotides de la figure 1. 18 - Vecteur de clonage et/ou d'expression d'un polynucléotide selon la revendication 16 ou 17. 19 - Vecteur selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide, d'un cosmide, d'un phage ou d'un virus. 20 - Cellule hôte comprenant un vecteur selon la revendication 18 ou 19. 21 - Composition comprenant un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, en association avec un diluant, un excipient ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 22 - Sondes permettant la détection spécifique de l'infection par Toxoplasma gondii ayant une séquence de nucléotides choisie dans le groupe constitué de, ou comprenant l'une de ces séquences: - GGT TCT GGG AAA ACA AC - GTA TTA CAA GAT - TTA AGT CAA GGT GAA CGT - GAT GAA GCC ACA TCA TCA. 23 - Oligonucléotides permettant la détection spécifique de l'infection par 20 Toxoplasma gondii ayant une séquence de nucléotides choisie dans le groupe constitué de: - GGT TCT GGG A AA ACA AC - GTA TTA CAA GAT - TTA AGT CAA GGT GAA CGT - GAT GAA GCC ACA TCA TCA. 24 - Anticorps dirigés contre le polypeptide notamment un domaine spécifique du polypeptide selon les revendications 1 à 11. - Anticorps selon la revendication 24 pouvant être obtenus à partir de la séquence choisie ou contenue dans les séquences du groupe constitué de: - SIKIDGVELTKITKK - KVASDKITNQE 26 - Utilisation d'un polypeptide selon les revendications 1 à 11 ou un fragment de polypeptide selon les revendications 12 à 15 pour la détection par un test classique d'un anticorps dirigés contre le polypeptide TgABC1 représenté à la figure 1, présent dans un échantillon biologique d'un hôte infecté par Toxoplasma gondii. 27 - Utilisation d'anticorps selon la revendication 24 ou 25 utiles pour la détection d'une séquence peptidique antigénique de TgABC1 présent dans 15 un échantillon biologique d'un hôte infecté par Toxoplasma gondii. 28 - Utilisation du polypeptide selon les revendications 1 à 11 ou un fragment de polypeptide selon les revendications 12 à 15 pour détecter d'autres membres de la famille des protéines ABC transporteurs chez Toxoplasma gondii. 29 - Utilisation du polypeptide selon les revendications 1 à 11 ou un fragment de polypeptide selon les revendications 12 à 15 pour diminuer les 25 concentrations intracellulaires de drogues, notamment de cytotoxiques. - Utilisation d'anticorps selon la revendication 24 ou 25 pour détecter d'autres membres de la famille des protéines ABC transporteurs chez Toxoplasma gondii. 31 - Utilisation de sondes selon la revendication 22 pour détecter d'autres membres de la famille des protéines ABC transporteurs chez Toxoplasma gondii. 32- Procédé de préparation d'anticorps comprenant les étapes de: -exprimer le gène codant pour le polypeptide selon les revendications 1 à 11, -purifier ledit polypeptide, -injecter ledit polypeptide dans un animal pour induire une réponse immunitaire, -purifier les anticorps produits se liant audit polypeptide. 33 - Procédé pour la détection in vitro de composés actifs contre l'invasion 15 et/ou la réplication de Toxoplasma gondii dans un hôte cellulaire comprenant les étapes suivantes: -infection par Toxoplasma Gondii de cellules hôtes déterminées sensibles à une infection par Toxoplasma Gondii, - mise en contact desdites cellules avec un composé déterminé interagissant avec un polypeptide selon les revendications 1 à 11 ou un fragment de polypeptide selon les revendications 12 à 15, détection de l'activité d'invasion et/ou de réplication de Toxoplasma Gondii. 34- Procédé de criblage de molécule interagissant avec un polypeptide selon les revendications 1 à 11 ou un fragment de polypeptide selon les revendications 12 à 15.