FR 2875814 A1 20060331 FR 0410113 A 20040924 Le développement de culture aérobie en poches plastiques se généralise dans de nombreuses applications mettant en oeuvre des cellules animales, végétales, microbiennes, d'insectes, de racines transgéniques. Ces poches présentent de nombreux avantages: elles sont souvent livrées stérilisées, elles sont à usage unique, et peuvent être munies des ports nécessaires au passage de liquides, suspensions, gaz et sondes permettant les cultures en mode continu, discontinu, discontinu alimenté et d'une façon générale en tout mode utilisé avec les bioréacteurs traditionnels. L'utilisation de ces poches, dépourvues d'un mobile d'agitation, implique de les fixer sur la plate-forme d'un agitateur. Les échanges gazeux, oxygénation et ventilation des gaz résultant du métabolisme cellulaire du milieu de culture, se font par aération de surface, souvent en balayant le ciel de la poche (head-space) par de l'air ou par de l'air enrichi en oxygène, voire dans certains cas par de l'oxygène pur. Le débit de gaz est souvent exprimé en volume de gaz soufflé par volume de milieu de culture et par minute (v.v.m). Les échanges gazeux s'effectuent entre l'interface gaz/liquide caractérisée au repos par 15 la surface du liquide contenu dans la poche. La vitesse de transfert d'oxygène (OTR) de la phase gazeuse vers la phase liquide est généralement exprimée par la formule suivante: OTR = KL.a (C* CL) en mg/1 h si C et CL sont exprimés en mg/ 1 (1) KL Coefficient global de transfert de masse par rapport au film liquide (m.s-1) a Surface spécifique d'échange (m2/m3) C* Concentration en oxygène dissous en équilibre avec la pression partielle en oxygène dissous et en l'absence de cellules CL Concentration en oxygène dissous en présence de cellules. Inversement les gaz résultants du métabolisme cellulaire sont éliminés lors de cette aération de surface. L'aération d'une culture aérobie a pour objectif de fournir l'oxygène nécessaire aux cellules et d'éliminer les gaz résultants du métabolisme, gaz carbonique principalement. Lorsque la poche est fixée sur un agitateur, sous l'effet de l'agitation, la surface de contact gaz/liquide est en général augmentée alors que l'épaisseur de la couche liquide de diffusion est diminuée. Compte tenu de la difficulté à mesurer ces deux paramètres, on évalue directement le KLa à partir de l'équation 1. Le KLa est appelé coefficient volumétrique de transfert il s'exprime en h-1. Pour mesurer le KLa nous avons choisi d'utiliser des levures de boulangerie en déterminant tout d'abord leur vitesse spécifique de consommation d'oxygène exprimée en milligrammes d'oxygène consommé par gramme de cellules et par heure (mg/g.h). La vitesse de consommation d'oxygène (OUR) est le produit de la vitesse spécifique de consommation d'oxygène par la concentration cellulaire. L'OUR s'exprime en milligrammes d'oxygène consommé par litre et par heure (mg/l.h). Pour déterminer l'OUR il suffit de mettre une 2875814 -2- quantité connue de cellules dans un milieu saturé en oxygène et de suivre la diminution de la concentration en oxygène dissous à l'aide d'une électrode. En partant d'un milieu de culture saturé en oxygène contenu dans une poche munie d'une électrode à oxygène dissous, fixée sur une table vibrante et dont le ciel est balayé par de l'air, dès l'introduction des levures, la concentration en oxygène dissous va diminuer jusqu'à ce que l'OTR soit égal à l'OUR. A l'équilibre on a donc OUR = OTR. L'OUR ayant été déterminé l'OTR est alors connu et on en déduit le KLa (équation 1). Les principaux agitateurs utilisés Traditionnellement les agitateurs utilisés sont de type va-et-vient ou orbitaux, les vitesses d'agitation varient en général entre 0,1 et 12 Hz et les orbites ou amplitudes entre 2 et 5 mm. Dans les deux cas la plate-forme de l'agitateur se déplace dans un plan horizontal et l'accélération communiquée au fluide est essentiellement horizontale. La Société Metabios Inc. 135 Innovation and Developpment Center, University of Victoria R-Hut, McHenzie Avenue, Victoria, British Colombia, Canada V8W3W2, utilisant les poches Orbicell, recommande de travailler avec ces agitateurs avec une orbite ou une amplitude de 30 mm et des fréquences comprises entre 0,33 et 1,33 Hz, mais ne donne aucune valeur de KLa ni de coefficient de remplissage. Des expériences effectuées avec une poche de volume 5 litres contenant 1,5 litre de milieu avec un débit d'aération de 0,1 v.v.m nous ont permis d'obtenir un KLa de 12 h-1 à 1,33 Hz. La poche est fixée sur un agitateur "Certomat R" de Braun, la mesure des variations en oxygène dissous est effectuée avec une électrode MetlerToledo couplée à un module de régulation Prélude de Biolafitte. Utilisant le système développé par la société Wave Biotec AG, Ringstrasse 24, CH-8317 Tagelswangen, Vijay Singh rapporte dans le journal Cytotechnology 30:149-158, 1999 l'utilisation de poches de 2 litres contenant 100, 500, 1000 ml de liquide, de poches de 20 litres contenant 10 litres de liquide et enfin de poches de 200 litres contenant 100 litres de liquide. Les KLa obtenus varient entre 1, 6 et 4 h-1 à une vitesse de basculement de 30 rpm et un débit d'aération de 0,1 v.v.m. Concernant les agitateurs orbitaux ou va-et-vient il est difficile de travailler avec des poches de volume important à des fréquences supérieures à 3 Hz. Le volume des poches Orbicell est limité à 10 litres, la quantité de mouvement acquise par le milieu de culture est telle que le comportement hydrodynamique du milieu est difficilement compatible avec la culture de cellules. Concernant le système Wave-Biotech la Société propose des systèmes permettant de 35 travailler en poche de 500 litres. Cependant les documents publiés font état de KLa de l'ordre de 4 h-1. Ces faibles valeurs limitent le développement des cultures cellulaires en poche. Le procédé selon l'invention permet de remédier aux problèmes énoncés cidessus en travaillant à des fréquences nettement plus élevées que celles utilisées jusqu'alors avec les agitateurs précédemment décrits. Ceci est rendu possible en utilisant une table vibrante à excitation verticale ou à excitation verticale et horizontale combinée, dans le premier cas l'accélération communiquée aux liquide et cellules est unidirectionnelle et verticale, dans le deuxième cas l'accélération communiquée aux liquide et cellules est bidirectionnelle, horizontale et verticale. Le réacteur peut être solidaire de la surface vibrante ou fixé sur celle-ci. A titre d'exemple et pour évaluer les capacités de transfert du procédé, 3 g levure de boulangerie, ayant une vitesse spécifique de consommation d'oxygène de l'ordre de 20 mg/g.h, sont mises en suspension dans un réacteur constitué d'une poche plastique fabriquée à partir d'une gaine plastique de 40 cm de largeur. La poche et son dispositif de fixation sont obtenus en découpant une longueur de gaine de 45 cm, deux soudures dans le sens de la largeur permettent de délimiter une bande de fixation 9 x 40 cm, la poche proprement dite 27 x 40 cm et une deuxième bande de fixation de 9 x 40 cm. Chaque bande de fixation est munie de trois trous équidistants permettant la fixation de la poche sur la plate-forme. La poche est munie de deux ports permettant l'introduction et la sortie de la phase gazeuse, de deux ports permettant l'introduction de liquide et la fixation de l'électrode à oxygène dissous. La poche est fixée sur la table vibrante de marque CASADIO modèle CTV38/31 par les bandes latérales (9 x 40) de la découpe. La concentration en oxygène dissous est mesurée à l'aide d'une électrode Mettler-Toledo couplée à un amplificateur Prélude de Biolafitte. Exemple 1 Mesure de la variation du KLa en poche plastique en fonction de la fréquence de vibration de la table, la poche décrite ci-dessus étant fixée sur la table de vibration. Paramètres: Volume du liquide: 1500 ml, Concentration en cellules non proliférantes de levure: 3 g/l, Demande en oxygène (OUR) : 64 mg/l.h, C* : sa valeur est arbitrairement fixée à 8 mg/1 à 30 C, Fréquence de vibration variable de 15 à 30 Hz, Aération: 0,1 v.v.m. La figure 1 montre clairement qu'à chaque fréquence correspond un état d'équilibre où l'OTR est égal à l'OUR, ce qui permet de calculer la valeur du KLa correspondant. Pour déterminer l'effet des vibrations sur la vitalité des cellules, il suffit de revenir à la fréquence initiale et de vérifier si l'on obtient la même concentration en oxygène dissous. Si à une fréquence donnée on revient à la même concentration en oxygène dissous la vitalité des cellules n'a pas été affectée par le traitement, si l'on revient à une concentration en oxygène dissous plus élevée, la vitalité des cellules aura diminué. Avec les systèmes traditionnels d'agitation, un problème important posé par l'aération de surface concerne sa faible efficacité lorsque le taux de remplissage du réacteur ou de la poche augmente, il est souvent limité à des valeurs inférieures à 20 % pour les cellules microbiennes et à 50 % pour les cellules animales. Les expériences rapportées dans l'exemple cidessous permettent de montrer que des valeurs de KLa peuvent être obtenues avec des coefficients de remplissage importants. Exemple II Effet du coefficient de remplissage de la poche sur le KLa à fréquence fixe 25 Hz Paramètres: Concentration en cellules non proliférantes de levure: 3 g/1, Demande en oxygène (OUR) : 64 mg/l.h, C* est fixé à 8 mg/1 à 30 C, Fréquence: 25 Hz, Coefficient de remplissage variable de 30 à 80 %, le volume utile maximum de la poche est de 5 litres, Aération: 0,1 v.v. m. Volume CL KLa Remplissage a (*) (ml) (%) (h-1) (%) (cm2 / ml) 1500 76,5 33,24 30 0,65 2000 75,1 31,38 40 0,48 2500 67,5 24,04 50 0,33 3000 55 17,36 60 0,23 3500 45,5 14,33 70 0,17 4000 25 10,42 80 0,13 (*) a: surface spécifique au repos. Des KLa de l'ordre de 200 h-1 ont été obtenus avec 5 g/1 de levure avec un coefficient de 20 30%à45Hz. Les mêmes expériences faites sur la même table permettant de combiner une accélération verticale à une accélération horizontale conduisent à des valeurs de KLa plus faibles pour chaque fréquence testée. Les observations visuelles permettent de montrer que les vagues formées sont plus écrasées, conduisant ainsi à des surfaces d'échange moindres et donc à des valeurs de KLa moindres. A titre d'exemple, en utilisant la même poche avec un coefficient de remplissage de 30 % et les mêmes levures on obtient un KLa de 16 h-1 soit environ 50 % de la valeur observée avec le système à accélération verticale. Exemple III La poche peut être remplacée par un réacteur constitué par un bac, les valeurs de KLa obtenues sont résumées dans l'exemple décrit ci-dessous. Paramètres: Concentration en cellules non proliférantes de levure: 3 g/1, Demande en oxygène (OUR) : 64 mg/l.h, C* est fixé à 8 mg/1 à 30 C, Fréquence de vibration est fixée à 25 Hz. Réacteur parallélépipédique (30 x 12,5 x 15 cm) 10 Aération: 0,1 v.v.m. Résultats: III. a/ Effet de la surface spécifique au repos: Volume CL KLa a (*) (ml) (%) (h-1) (cm2/ml) 300 68 25,00 1,25 500 48 15,38 0,75 1000 9 8,79 0,38 (*) a: surface spécifique au repos. III. b/ Effet de la fréquence de vibration Même paramètres, le volume du liquide est fixé à 1000 ml et la fréquence de vibration varie de 25 à 40 Hz. Hz CL (%) CL (mg 02/1) KLa (h-1) 9 0,72 8,79 27 2,16 10,96 55 4,4 17,78 81,5 6,52 43,24 La même expérience réalisée avec 4,5 g/1 de biomasse et 2000 ml de liquide à une fréquence de vibration de 45 Hz a permis d'obtenir un KLa de 194 h-'. Les exemples proposés ont pour objectif d'illustrer l'invention, ils ne sauraient limiter ni aux levures ni à la technique les bénéfices de cette invention. Dans les expériences proposées le ciel est balayé par une phase gazeuse (air en l'occurrence), la phase gazeuse peut également être constituée par de l'air enrichi en oxygène ou même dans certains cas par de l'oxygène pur, ce qui a pour effet de changer la valeur de C*. Dans le cas de croissances en anaérobie ou en anoxie les gaz produits peuvent être éliminés en balayant le ciel par des gaz inertes, azote par exemple. Dans les deux cas le ciel est balayé par une phase gazeuse compatible avec la nature de la culture. Le renouvellement de la phase gazeuse du ciel peut également être obtenu par échange entre l'atmosphère ambiante et le ciel du réacteur par diffusion à travers des bouchons ou des membranes perméables aux gaz. Dans ce cas aussi l'atmosphère ambiante doit être compatible avec la nature de la culture. La technique pourra avantageusement être utilisée pour la culture de cellules libres, fixées ou immobilisées sur des supports compatibles. L'utilisation de sacs ou de réacteurs transparents permet d'effectuer des croissances de cellules photosynthétiques, le sac ou le réacteur étant illuminé. L'aération de surface est particulièrement adaptée à la croissance des cellules animales et végétales qui peuvent facilement être endommagées par les bulles résultant de l'aération par insufflation d'air comme décrit dans Trends in Biotechnology 18, 420-432, 2000 et Biotechnology and Bioengineering 67, 775-790, 2000. L'utilisation de l'aération de surface est également mise à profit pour la culture de cellules d'insectes comme décrit dans Cytotechnology 38, 77-85, 2002. Ainsi, toutes les cellules sensibles à l'aération par insufflation d'air peuvent être avantageusement cultivées dans un tel procédé qui, de plus, permet facilement de déterminer l'effet de la fréquence d'agitation sur la vitalité des cellules et de déterminer ainsi les fréquences les mieux adaptées au transfert d'oxygène et à la croissance. Avec les Kea obtenus en poche avec le système proposé en utilisant de l'oxygène pur le C* passe de 8 mg/1 à 32 mg/1. Si l'on veut maintenir une concentration d'oxygène dissous de l'ordre de 2 mg/1, l'OTR peut alors atteindre des valeurs de l'ordre de 6 g/l.h. Des applications nouvelles importantes, dans le domaine de la dépollution en milieu non stérile et dans ceux de la production de levains, de culture de souches microbiennes spécifiques, s'ouvrent alors dans l'utilisation de poches ou de réacteurs ainsi agités. Rappelons également que les cellules peuvent être cultivées en vue de leur multiplication avant leur utilisation ou pour obtenir des produits dérivés utilisés pour leurs propriétés spécifiques. C'est ainsi que la culture de cellules animales peut conduire à la production de vaccins, de protéines à usage thérapeutique (anticorps monoclonaux, hormones de croissance,...) et de cellules servant aux greffes de tissus ou à des tests spécifiques. Dans le cas particulier de cultures de plantules ou de racines transgéniques l'oxygénation des parties immergées peut se faire par la phase aqueuse et celle des parties non immergées par la phase gazeuse du ciel. La souplesse d'utilisation des variateurs de fréquence fait qu'il est facile de changer la fréquence d'agitation, le changement d'amplitude implique lui très souvent une intervention mécanique, ce qui implique de choisir de préférence d'abord l'amplitude d'agitation compatible avec les propriétés mécaniques du système puis de faire varier la fréquence. Le couple amplitude-fréquence étant choisi pour satisfaire la demande en oxygène et la qualité du mélange souhaitées. La souplesse d'utilisation des variateurs de fréquences fait qu'en suivant le protocole défini par la figure 1 on peut facilement adapter l'OTR à l'OUR et réguler ainsi les concentrations en oxygène dissous dans le milieu de culture; de plus si nécessaire on peut facilement programmer des cycles de fréquences adaptés à des OTR variables en fonction des différentes phases de croissance. Les cribles vibrants animés d'un mouvement vertical plan et ceux combinant vibrations horizontales et verticales constituent aussi des supports privilégiés pour mettre en oeuvre l'invention et en particulier pour les changements d'échelle conduisant aux réalisations industrielles. Les fréquences utilisées jusqu'à 45 Hz ne constituent pas une limite, la limite est déterminée par la résistance des cellules et par les dispositifs mécaniques. REVENDICATIONS 1. Procédé d'oxygénation et de ventilation d'un milieu de culture contenant un matériel biologique caractérisé en ce que l'on met en oeuvre un bioréacteur amovible ou non, souple ou rigide comprenant une phase gazeuse et une phase liquide contenant ledit matériel biologique, qui est fixé sur une table vibrante communiquant au liquide et au matériel biologique une accélération unidirectionnelle verticale à fréquence et amplitude variables compatibles avec la viabilité du matériel biologique et permettant ainsi les échanges entre les phases liquide et gazeuse sans injection de la phase gazeuse dans la phase liquide. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le bioréacteur est fixé sur une table vibrante permettant de combiner l'accélération verticale à une accélération horizontale. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que les fréquences de vibrations sont situées dans la gamme 1 à 45 Hz. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la phase gazeuse est injectée en continu dans le ciel du bioréacteur à un débit compatible avec la demande en oxygène (OUR) . 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que le débit de la phase gazeuse est compris entre 0,01 et 0,1 v.v.m. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les échanges sont régulés en temps réel en faisant varier la fréquence des vibrations en combinaison ou non avec la composition de la phase gazeuse. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le matériel biologique consiste en un matériel biologique dont la croissance ou l'utilisation 25 implique des échanges gazeux entre la phase liquide et la phase gazeuse. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le matériel biologique est constitué par des cellules humaines, animales, végétales, d'insectes, microbiennes, libres ou fixées, utilisées pour leur multiplication ou pour des productions dérivées.