FR 2873700 A1 20060203 FR 0408402 A 20040729 Procédé d'oxydation contrôlée de polysaccharides L'invention a pour objet un procédé d'oxydation contrôlée d'oligo-et/ou de polysaccharides contenant des groupes hydroxyles primaires -CH2OH libres, à l'aide d'un agent oxydant, conduisant de manière sélective à des oligo-et/ou polysaccharides carboxylés. Dans la suite de la description et dans les revendications le terme "polysaccharides" sera utilisé pour désigner indifféremment des oligosaccharides, des polysaccharides, ou leurs mélanges. L'oxydation de polysaccharides par le dioxyde d'azote (NO2/N2O4), comme agent oxydant, est une réaction bien connue. Ainsi, Kenyon et coll. dans US 2 423 707 ou encore Ashton et coll. dans US 3 364 200 ont décrit l'oxydation de la cellulose avec le dioxyde d'azote dans des solvants nonaqueux tels que le Fréon 113 et le Fréon 11. Le brevet US 5 180 398 de Boardman et Saferstein décrit l'oxydation de la cellulose par le dioxyde d'azote dans des solvants perfluorés et Kosowski et coll. dans US 5 914 003 ont utilisé une autre classe de solvant, les hydrofluoroéthers, pour remplacer les chlorofluocarbones utilisés préalablement. L'utilisation de solvants halogénés représente cependant un risque pour l'environnement. En outre, pour les nombreuses applications, et notamment dans le domaine médical, il s'impose de disposer de produits oxydés de manière homogène. Ces impératifs ont conduit les inventeurs à rechercher de nouvelles conditions d'oxydation plus satisfaisantes pour l'environnement et permettant de disposer de polysaccharides carboxylés répondant mieux aux exigences de la pratique. Leurs travaux ont permis de constater qu'il était possible de réaliser une oxydation homogène jusqu'au coeur des fibres de polysaccharides en opérant dans un solvant constitué par un gaz inerte dans des conditions particulières. Par "fibres", on entend également, conformément à l'invention, des fibrilles, microfibrilles, cristaux, poudres ou lyoplilisats. L'invention a donc pour but de fournir un nouveau procédé d'oxydation de polysaccharides permettant d'obtenir un taux d'acide carboxylique en % massique variable, allant dans le cas de la cellulose jusqu'à 25,5% environ (ce qui correspond à 100% d'oxydation des groupes hydroxyles primaires), contrôlé par la durée de la réaction et la quantité d'agent oxydant, réparti de manière homogène, quel que soit le degré d'oxydation. Elle vise également les nouveaux polysaccharides obtenus et la mise à profit de leurs propriétés dans divers domaines industriels. Le procédé de l'invention d'oxydation contrôlée de polysaccharides contenant des groupes -CH20H libres, à l'aide d'un agent oxydant, est caractérisé en ce qu'on réalise la réaction d'oxydation dans un gaz inerte à l'état supercritique. Selon une disposition préférée de l'invention, le gaz inerte est le CO2r ce qui présente l'avantage de disposer d'un solvant de l'agent oxydant, déjà dans son état d'oxydation maximum. Le produit final sera donc dépourvu de contaminants liés au solvant, ce qui présente un grand intérêt au regard des applications industrielles visées pour les polysaccharides carboxylés formés, en particulier pour leurs applications biomédicales. Le CO2 est utilisé seul ou en mélange avec d'autres gaz inertes et/ou d'autres co-solvants. Dans une variante, le ou les gaz inertes sont utilisés avec un co-solvant, comme un solvant perfluoré. On notera de plus avec intérêt que son utilisation s'inscrit dans la logique de procédés sûrs et préservant l'environnement. L'agent oxydant est de préférence le dioxyde d'azote, ce terme désignant le NO2, le dimère N204 et leurs mélanges. La réaction d'oxydation est réalisée dans un système clos, dans des conditions supercritiques, de préférence à une température de l'ordre de 31 à 50 C, notamment de 40 C environ et sous une pression de l'ordre de 74 à 110 bars, notamment de 90 bars environ. Les polysaccharides sont placés dans le réacteur qui est ensuite rempli du gaz inerte supercritique. L'agent oxydant, notamment le dioxyde d'azote, est utilisé en excès par rapport à la quantité de CH2OH qu'on souhaite oxyder. Le CO2,qui constitue le solvant est utilisé en excès par rapport au NO2, étant entendu que les quantités respectives de ces composés seront adaptées par l'homme du métier selon l'ensemble des conditions opératoires choisies pour l'obtention d'un polysaccharide ayant le taux de carboxyle désiré. A la fin de la réaction, on effectue un lavage par dilution en générant un débit de fuite du mélange solvant(s)/agent oxydant dans le réacteur, tout en maintenant, par des moyens appropriés, la pression constamment audessus de la pression critique. L'agent oxydant reste à l'état dissous dans le solvant supercritique et peut être ainsi éliminé progressivement sans se trouver à l'état liquide et donc sans engendrer d'hétérogénéité d'oxydation. Cette disposition de lavage par dilution permet en outre d'éliminer avec efficacité l'agent oxydant ou les autres sous-produits qui pourraient se trouver à l'intérieur des polysaccharides traités. Le procédé de l'invention permet ainsi d'obtenir des produits de couleur blanche alors que les produits obtenus via l'utilisation de solvants sont de couleur jaunâtre, ce qui traduit la présence de résidus dans la matrice polysaccharidique. La détente est ainsi effectuée dans des conditions permettant de rester en système monophasique. On opère notamment à température élevée, de l'ordre de 40 C. Pour s'assurer que tout l'agent oxydant résiduel a été éliminé, on effectue avantageusement un balayage avec le gaz inerte. Les polysaccharides récupérés à l'issue de la réaction d'oxydation sont lavés par un solvant ou un mélange de solvants polaires. Des solvants appropriés sont du type alcool, par exemple isopropanol/eau, pour éliminer les sous-produits de la réaction, comme HNO3. Le taux d'acide carboxylique en % massique peut aller jusqu'à 25,5% dans le cas de la cellulose. Les polysaccharides soumis à la réaction d'oxydation sont des produits semi cristallins ou microfibrillaires, tels que cellulose, chitine, amidon, amylose, nigérane ((a(l->3) a (1- >4) glucane)), R(1->3) glucane, R(1->4) mannane, 3(l->3) xylane, inuline, agarose, carraghénanes. On rappelle que la cellulose native est constituée d'unités Dglucopyranoses liées entre elles par des liaisons R(1->4) et existe sous plusieurs formes cristallines (forme cellulose I à l'état naturel; cellulose II, après un traitement en milieu alcalin ou une dérivatisation, suivie d'une régénération/coagulation; cellulose III, après traitement de la cellulose naturelle en milieu NH3 liquide, ou en présence d'amines). Le terme "cellulose", tel qu'utilisé dans la description et les revendications, désigne indifféremment les différents 30 types de cellulose. La cellulose II peut être notamment sous forme de fils, éponges, films. En particulier, la cellulose II a l'avantage d'être mise en forme dans une filière d'extrusion pour donner des filaments de taille variable. Tous les types de cellulose régénérée peuvent être utilisés, qu'ils soient obtenus selon le procédé viscose ou un procédé solvant, à condition qu'elle ne soit pas traitée par TiO4r ou des métaux lourds. Il sera également possible selon les conditions opératoires d'oxyder des tissus à partir de ces filaments tout en conservant la structure de ces tissus, afin d'obtenir des pansements absorbants, et/ou des applications du type pansements hémostatiques,ou des fils chirurgicaux biorésorbables. La chitine est constituée d'unités N-acétyl-D-glucosamines liées entre elles par des liaisons R (1->4). Le R (1-*3) glucane est constitué d'unités D- glucopyranoses liées entre elles par des liaisons p (1-*3). Le Q (1-4) mannane est constitué d'unités D- mannopyranoses liées entre elles par des liaisons p (1-+4). Le nigérane est constitué d'unités D-glucopyranoses liées entre elles par des liaisons alternées a (1--*3) et a (1-->4). L'amidon est constitué d'unités D-glucopyranoses liées entre elles par des liaisons a (1-34) et qui portent par endroit des branchements constitués d'unités D-glucopyranoses liées entre elles par des liaisons a (1-+6). L'amylose est constitué d'unités D-glucopyranoses liées entre elles par des liaisons a (1-+4). L'inuline est constituée d'unités R (1-+2)-D- fructofuranoses. L'agarose est constitué d'une unité R (1->4)-D-galactopyranose qui alterne avec une unité a (l-+3) 3,6-anhydro-L-galactopyranose. Les carraghénanes sont constitués d'une unité R (1-*4)-D- galactopyranose qui alterne avec une unité a (1->3) 3,6- anhydro-D-galactopyranose, et portent un 1 à 3 groupes sulfates (respectivement K, t et X carraghénane). Les polymères carboxylés obtenus possèdent un large spectre de propriétés leur conférant un grand intérêt dans de nombreuses applications où ils sont utilisables seuls ou sous forme d'assemblages avec deux ou plusieurs polysaccharides. Ils présentent une grande importance notamment: - dans l'industrie alimentaire, comme épaississants, stabilisants de dispersions, d'émulsions et de suspensions, à titre d'agents tensio- actifs pour des denrées à faible pouvoir calorique,ou à faible proportion de graisses ou de cholestérol - dans l'industrie des peintures, du papier, des textiles, comme agents de stabilisation stérique des charges; - en agriculture, dans des applications de pesticides; - dans l'industrie pharmaceutique, comme excipient de médicaments, agents de contrôle de relargage de principes actifs ou de biomolécules, support de pommades ou de crèmes, agents de transit intestinal, pâtes dentaires, support d'arômes; - dans le domaine médical, biomédical ou paramédical (séparation et purification de protéines, de virus par précipitation/adsorption par affinité) ; en chirurgie, ces polysaccharides sont particulièrement utiles par exemple comme fils et/ou tissus biorésorbables pour la réparation des tissus ou organes chez l'homme ou l'animal. Ils permettent notamment le soutien et la prévention des adhérences entre deux organes au cours d'une opération chirurgicale. Ils sont également avantageux comme pansements, tissus et éponges, qui possèdent des propriétés hémostatiques et/ou bactériostatiques. - dans l'industrie cosmétique, comme agents viscosifiants et gélifiants, en particulier comme gels; ou comme support de pommades et de crèmes, ou autres formulations cosmétiques, en tant qu'agents de stabilisation des charges; - comme agents complexants ou séquestrants, des ions métalliques, comme l'ion calcium, utiles notamment pour les détergents, les cosmétiques, le traitement de surface; - des métaux lourds et les éléments radioactifs dans l'industrie nucléaire. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent et en se référant aux figures 1 et 2, qui représentent la description de l'appareillage utilisé pour l'oxydation de polysaccharides. Description de l'appareillage Mode opératoire Introduction du NO2/N2O4 Le NO2 est d'abord pré-chargé dans un réservoir de transfert R de 20mL maintenu à 10 C et inséré dans un dispositif F comportant plusieurs vannes selon le schéma 1. La bouteille (Air Liquide, réf DR 030259) contenant le NO2 est équilibrée à une température de 10 C, puis connectée à la vanne 1 du dispositif F. Ce dernier a été au préalable séché de façon exhaustive avec un flux d'azote et maintenu ensuite sous une pression d'azote de 2 bars. Cette pression est relâchée au moment précis où la connexion avec la bouteille de NO2 est réalisée. Ces précautions sont prises de façon à éviter le contact du NO2 avec de l'eau initialement présente, en phase gaz ou liquide, dans les tubulures du dispositif F, ce qui conduirait à la formation éventuelle d'acide nitrique. La vanne 6 est reliée par un tuyau flexible en Téflon à un flacon de soude à 2%p/p destiné à neutraliser le NO2 en excès. Le montage est réalisé de façon à ce que la bouteille se trouve au- dessus du réservoir R et que le NO2 puisse s'écouler par gravité. La vanne de la bouteille est ensuite ouverte, suivie des vannes 1,3,4,5 et 6. On observe alors un dégagement gazeux dans le flacon contenant la soude. L'ouverture de la vanne 6 est contrôlée de façon à maintenir le dégagement gazeux à un niveau tel que le NO2 soit effectivement détruit pendant son passage dans le flacon. Le dispositif est ainsi purgé avec du NO2 gaz pendant une minute. Après ce temps, les vannes 5 et 6 sont fermées et on laisse le système s'équilibrer et le NO2 couler de la bouteille vers le réservoir et se condenser complètement dans ce dernier. Au bout de 15 minutes, on ferme les vannes 3 et 4 et on déconnecte le réservoir en conservant l'ensemble E formé par ce dernier et par les vannes 4 et 5. L'ensemble E a été au préalable taré et on détermine alors la quantité de NO2 présente à l'intérieur du réservoir par pesée. Pour introduire le NO2 dans le réacteur on suit le protocole suivant: Les vannes 1' et 2' étant reliées entre elles et ouvertes, le réacteur est d'abord chargé en CO2 à l'état supercritique (40 C à 80 bars). On insère alors l'ensemble E sur le circuit d'alimentation en CO2 du réacteur selon le schéma 2 entre les vannes 1' et 2', ces deux dernières étant fermées. On ouvre la vanne 2' puis la vanne 5, la pression s'équilibre alors entre le réservoir R et le réacteur. Une pression résultante de 75 bars est mesurée par le manomètre Pr. De l'autre côté, la pompe est mise en marche jusqu'à atteindre une pression de consigne de 90 bars mesurée par le manomètre Pp. On ouvre alors les vannes 1' et 4 de façon que le CO2 puisse s'écouler de la pompe vers le réacteur et transférer tout le NO2 à l'intérieur de celui-ci. Lorsque la pression atteint 90 bars à l'intérieur du réacteur, on considère que tout le NO2 a été transféré et on ferme la vanne 2'. Le réacteur est muni de 2 hublots en saphir qui permettent par ailleurs de vérifier que le milieu réactionnel présente bien la couleur caractéristique rousse du NO2. Description du réacteur Le réacteur en Inox 316 L, d'une capacité de 250 mL, a été fourni par Parr Industrie (Pmax = 300 bar, tmax = 150 C) . Il est thermostaté, muni de 2 hublots en saphir, équipé d'un agitateur magnétique. Une plaque en Téflon perforée est placée à l'intérieur, ce qui permet de définir 2 compartiments dans le réacteur. La partie inférieure A permet la rotation du barreau magnétique. L'échantillon est placé dans la partie supérieure B. La pompe de mise en pression du CO2 est une pompe pneumatique à piston Top Industrie (réf 0902 10000, Pmax = 600 bars) Exemple 1: 2,90 g de fibres TENCELL ont été placés dans le compartiment B du réacteur (Figure 1), qui a été rempli avec du dioxyde de carbone supercritique (40 C et 80 bars). 33g de dioxyde d'azote sont alors introduits dans le réacteur selon le protocole décrit plus haut. La réaction est réalisée sous agitation à 40 C et 90 bars pendant 4 heures. On maintient la température et la pression et on procède à un lavage avec CO2 dans des conditions supercritiques. La dépressurisation est suffisamment lente pour que la température reste constante. Après ouverture du réacteur, les fibres traitées sont retirées et lavées 3 fois avec un mélange eau: isopropanol (1:1) et 2 fois avec de l'isopropanol pur pour enlever l'eau. L'échantillon est séché dans une étuve à 60 C pendant 3 heures. On récupère 3,15 g de cellulose oxydée, qui se présente toujours sous l'aspect de fibres de couleur blanche. Détermination du taux d'oxydation: 200 mg de cellulose ont été dissous dans 2 mL de NaOH 0,5M et dilués avec 8 mL d'eau. La solution a été titrée avec une solution standard de HC1 0, 05 M jusqu'à la neutralité, en utilisant la phénolphtaléine comme indicateur. Un blanc a été fait sans addition de cellulose. Le contenu en acide carboxylique ainsi mesuré est de 14 Exemple 2: 3,29 g de fibres TENCELL et 2,2 g de fibres Rayonne ont été placés séparément dans le compartiment B du réacteur (Figure 1), qui a été rempli avec du dioxyde de carbone supercritique (40 C et 80 bars). 33g de dioxyde d'azote sont alors introduits dans le réacteur selon le protocole décrit plus haut. La réaction est réalisée sous agitation à 40 C et 90 bars pendant 5 heures. A la fin de la réaction on effectue un "lavage par dilution" du réacteur en générant un débit de fuite dans le réacteur tout en maintenant la pression, grâce à la pompe qui apporte du CO2 pur sous pression. Après dépressurisation, les fibres traités sont retirées du réacteur et lavées 3 fois avec un mélange eau. isopropanol (1. 1) puis avec l'isopropanol pur pour enlever l'eau. On récupère alors un matériau fibreux homogène de couleur blanche avec un contenu en acide carboxylique de 16 % pour les fibres TENCELL et de 17 pour les fibres Rayonne . Exemple 3: 3,1 g de fibres TENCELL , 2,7 g de fibres Rayonne et un morceau d'une éponge Spontex de 1,5 g ont été placés séparément dans le compartiment B du réacteur (Figure 1), qui a été rempli avec du dioxyde de carbone supercritique (40 C et 80 bars). 33g de dioxyde d'azote sont alors introduits dans le réacteur selon le protocole décrit plus haut. La réaction est réalisée sous agitation à 40 C et 90 bars pendant 7 heures. A la fin de la réaction on effectue un "lavage par dilution" du réacteur en générant un débit de fuite dans le réacteur tout en maintenant la pression, grâce à la pompe qui apporte du CO2 pur sous pression. Après dépressurisation, les fibres traitées, de couleur blanche, sont retirées du réacteur et lavées 3 fois avec un mélange eau 25: isopropanol (1: 1) puis avec l'isopropanol pur pour enlever l'eau. Le contenu en acide carboxylique est de 17 % pour les fibres TENCELL , de 18,5% pour les fibres Rayonne et de 17% pour l'éponge. Exemple 4: 4,05 g de fibres TENCELL , 2,9 g de fibres Rayonne et un morceau d'une éponge Spontex de 1,3 g ont été placés dans le compartiment B du réacteur (Figure 1), qui a été rempli avec du dioxyde de carbone supercritique (40 C et bars). 33g de dioxyde d'azote sont alors introduits dans le réacteur selon le protocole décrit plus haut. La réaction est réalisée sous agitation à 40 C et 90 bars pendant 2,2 heures. A la fin de la réaction on effectue un "lavage par dilution" du réacteur en générant un débit de fuite dans le réacteur tout en maintenant la pression, grâce à la pompe qui apporte du CO2 pur sous pression. Après dépressurisation, les fibres traitées sont retirées du réacteur et lavées 3 fois avec un mélange eau: isopropanol (1: 1) puis avec l'isopropanol pur pour enlever l'eau. Le contenu en acide carboxylique est de 11 % pour les fibres TENCELL , de 12% pour les fibres Rayonne et de 11% pour l'éponge. Les fibres TENCELL et Rayonne sont de couleur blanche. Des résultats similaires (oxydation ménagée) ont été 15 obtenus avec des fibres textiles naturelles (coton, lin, etc.). Exemple 5: En opérant dans les mêmes conditions que dans l'exemple 4, on procède à l'oxydation d'un tissu en rayonne (tissage et mailles différentes). Le tissu oxydé obtenu est stérilisé par rayonnement y. Son contenu en acide carboxylique est de 12%. REVENDICATIONS 1/ Procédé d'oxydation contrôlée d'oligo-et/ou de polysaccharides contenant des groupes hydroxyles primaires -CH2OH libres, à l'aide d'un agent oxydant, caractérisé en ce qu'on réalise la réaction d'oxydation dans un gaz inerte à l'état supercritique. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gaz inerte est le CO2,utilisé seul ou en mélange avec d'autre gaz inertes et/ou d'autres co-solvants. 3/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'agent oxydant est le dioxyde d'azote, à savoir le NO2, le dimère N2O4 ou leurs mélanges. 4/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'on opère dans un système clos, dans des conditions supercritiques à une température de l'ordre 31 à 50 C, notamment de 40 C environ et sous une pression de l'ordre de 74 à 110 bars, notamment de 90 bars environ. 5/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on place les polysaccharides dans un réacteur clos, qui est ensuite rempli du gaz inerte supercritique. 6/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'agent oxydant est utilisé en excès par rapport à la quantité de CH2OH qu'on souhaite oxyder. 7/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'à la fin de la réaction, on génère un débit de fuite dans le réacteur tout en maintenant la pression constamment au-dessus de la pression critique. 8/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 précédentes, caractérisé par l'utilisation de cellulose en tant que polysaccharide. 9/ Polysaccharides carboxylés tels qu'obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10/ Polysaccharides selon la revendication 9, caractérisés en ce qu'ils présentent un taux d'acide carboxylique en % massique variable, allant jusqu'à 25,5% dans le cas de la cellulose. 11/ Application des polysaccharides selon la revendication 9 ou 10, dans l'industrie alimentaire, dans l'industrie des peintures, du papier, des textiles, en agriculture, dans l'industrie pharmaceutique, dans le domaine médical, biomédical ou paramédical; en chirurgie, dans l'industrie cosmétique, et comme agents complexants ou séquestrants, des ions métalliques, des métaux lourds et les éléments radioactifs dans l'industrie nucléaire. 12/ Application selon la revendication 11, caractérisée en ce que lesdits polysaccharides carboxylés sont utilisés comme fils et/ou tissus biorésorbables pour la réparation des tissus ou organes chez l'homme ou l'animal. 13/ Application selon la revendication 11, caractérisée en ce que lesdits polysaccharides carboxylés sont utilisés comme pansements, compresses, tissus et éponges, ayant des propriétés hémostatiques et/ou bactériostatiques.