FR 2884255 A1 20061013 FR 0503583 A 20050411 La présente invention vise à fournir des lignées de cellules souches aviaires utiles pour la réplication de virus, notamment de virus de l'influenza virus, et pour la production de vaccins viraux, notamment de vaccins contre la grippe humaine et aviaire. L'invention vise également à protéger les procédés de production de vaccins ainsi que les vaccins correspondants. DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte aux domaines de la virologie et notamment au développement et à la production de vaccins viraux. Plus particulièrement, l'invention concerne la réplication et la production de virus, notamment le virus de l'influenza, dans des cultures de cellules souches aviaires établies en lignées. L'invention est particulièrement utile pour la production de vaccins destinés à la protection des animaux et des hommes contre des pathogènes viraux, et plus particulièrement pour la production de vaccins contre la grippe humaine, aviaire, porcine et/ou équine. ART ANTERIEUR Les virus de l'influenza sont les agents responsables d'épidémies annuelles de pathologies respiratoires aiguës. Dans les seuls USA, on estime que 25 à 50 millions d'américains sont affectés par la grippe annuellement, résultant en 150 000 hospitalisations et entre 20 000 à 40 000 décès. Si l'on extrapole ces chiffres au niveau mondial, on estime le nombre de cas de grippe à 1 milliard, dont 3 à 5 millions de cas pathologiques sévères et entre 250 000 et 500 000 décès. En plus de ces épidémies annuelles de grippe, surviennent, à intervalles variables et non prédictibles, des pandémies autrement plus meurtrières. Trois de ces pandémies se sont déroulées au siècle passé. La grippe espagnole de 1918 est de loin la plus sévère. On estime qu'environ 50% de la population mondiale a été infectée, dont 25% ont soufferts de signes cliniques. La mortalité totale est estimée entre 20 et 40 millions d'individus, essentiellement chez les individus jeunes. Cette pandémie a déprimé le croissance de la population mondiale pendant 10 ans. La grippe asiatique de 1957 a quant à elle provoqué 1 million de morts. Plus près de nous, la grippe de Hong-Kong de 1968 a tué 70 000 personnes. La dernière manifestation de grippe associée à une forte mortalité et susceptible d'évoluer vers une pandémie, est survenue à Hong-Kong en 1997. Elle s'est caractérisée par l'émergence d'une nouvelle souche d'influenza virus (H5N1), tuant un tiers des personnes affectées. Heureusement, le virus n'était pas capable de se propager de personne à personne, permettant ainsi de stopper rapidement cette épidémie. Un virus similaire est apparu à Hong-Kong en 2003. Aux USA, les projections relatives à une prochaine pandémie, en prenant comme hypothèse une pandémie similaire à celles de 1957 ou 1968, font état de 18 à 42 millions de personnes infectées, 314 000 à 734 000 hospitalisations, et entre 89 000 à 207 000 décès. Une extrapolation au niveau mondial conduit aux chiffres moyens suivants: 1 à 2 milliards de cas de grippe, 5,3 à 12,3 millions de cas pathologiques sévères, et 1,5 à 3,5 millions de morts. Les virus de l'influenza qui appartiennent à la famille des orthomyxovirus se divisent en trois sous-types A, B et C. Ces sous-types se distinguent par leur génome et nucléoprotéines. Les ortho-myxovirus ont tous un génome à ARN (acide ribonucléique) simple brin négatif Les types A et B possèdent chacun 8 molécules d'ARN simple brin formant le génome segmenté. Les virus de type A et B sont responsables des maladies chez l'homme. Le type A a été associé à toutes les pandémies du siècle passé. Le type C peut affecter les humains, mais presque toujours de manière asymptomatique. L'homme, les oiseaux, dont les oiseaux sauvages et la volaille domestique, les porcs, les chevaux, le bétail et quelques autres animaux sont susceptibles d'êtres infectés par l'influenza virus A. Certaines espèces animales peuvent être infectées par un sous-type et des variants d'une autres espèces (par exemple: oiseaux à porc; porcs à homme). A ce propos, le porc constitue un hôte intermédiaire pour la génération de nouvelles souches de virus ayant une origine aviaire potentiellement pathologiques pour l'homme. La manifestation d'influenza virus A H5N1 à Hong-Kong en 1997 montre que des influenza virus A hautement pathogéniques peuvent être directement transmis de l'espèce aviaire à l'homme. Les pandémies sont le résultats de nouveaux sous-types A créés par le réassortiment du génome segmenté (changement antigénique ou antigenic shift ), alors que les épidémies annuelles sont le résultats de l'évolution d'antigènes de surface d'influenza virus A et B (glissement antigénique ou antigenic drift ). Les protéines neuraminidase (NA) et hémagglutinine (HA) présentent dans l'enveloppe virale constituent les déterminants antigéniques primaires des virus influenza. Lors du réassortiment de génome segmenté, de nouveaux variants HA et NA sont créés en permanence contre lesquels un organisme nouvellement infecté n'a pas mémorisé une réponse immune. Les vaccins utilisés dans le monde contiennent les glycoprotéines de surface, HA et NA de souches d'influenza virus dont la circulation est expectée dans la population humaine pour la saison suivante. L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) recommande chaque années la composition du vaccin influenza, en général en Février pour l'hémisphère nord et en Septembre pour l'hémisphère sud, en tenant compte des variations antigéniques causées par 1 Cette pratique annuelle d'établissement du vaccin influenza présente un certain nombre de désavantages et limitations. Tout d'abord, elle limite a une période de 9 mois la production et le contrôle du vaccin. Ensuite, les limitations du système de production à base d'oeufs embryonnés sont: (i) la qualité biologique variable des oeufs à cause de la présence d'agents accidentels (virus, toxines, ...) ou des problèmes de stérilité, (ii) la constance dans l'approvisionnement en oeufs tout au long de l'année, (iii) l'absence de flexibilité dans la production des oeufs en cas d'une augmentation soudaine de la demande (i.e. dans le cas d'une épidémie ou d'une pandémie soudaine), (iv) le coût financier important d'une telle production. Il convient de rappeler que dans une opération classique de production à base d'oeufs embryonnés, environ un oeuf est nécessaire pour produire deux doses de vaccin contre la grippe. En conséquence, une solution à ces problèmes réside dans la production d'influenza virus en culture cellulaire. Les virus de l'influenza peuvent être cultivés dans un grand nombre de cellules primaires diploïdes, telles que les cellules de rein de singe, les cellules de reins de veau, les cellules de rein d'hamster et les cellules de rein de poulet. Par exemple, la réplication et la propagation de l'influenza virus a été démontrée dans des cultures de cellules primaires de fibroblastes d'embryons de poulets (CEF pour chicken embryo fibroblasts ). Cependant ces cellules primaires souffrent de nombreux désavantages, tels que les difficultés à obtenir et à préparer de telles cellules en culture, la nécessité de ré-établir des lignées de cellules primaires à chaque préparation de vaccin, la qualité variable des cellules en culture, les risques de contamination par des agents accidentels, les sensibilités différentes à des variants d'un même virus, les faibles titres viraux obtenus, les coûts élevés de production des virus, et la nécessité d'utiliser des sera d'origine animale pour complémenter le milieu de culture, avec les risques inhérents de contamination par des mycoplasmes, des virus ou les agents de l'encéphalite spongiforme bovine (BSE). C'est la raison pour laquelle, il a été proposé l'utilisation de lignées cellulaires continues immortalisées. En dépit de nombreux efforts, l'une des seules lignées cellulaires continues actuellement développée qui semble produire des titres suffisamment élevés de virus de l'influenza est la lignée cellulaire dérivée du rein de chien Madin-Darby (MDCK) (Tobita et al., 1975 Med. Microbiol. Immunol. 162: 9- 14). Différentes sociétés pharmaceutiques développent la production de vaccin contre la grippe produit sur lignée cellulaire MDCK. Néanmoins, à ce jour, hormis en Hollande, aucun vaccin contre la grippe produit sur MDCK n'a été approuvé par les autorités réglementaires, vraisemblablement parce que la lignée MDCK est une lignée tumorigène. Deux autres lignées cellulaires continues: les cellules du rein de singe vert d'Afrique (VERO; cf US5,824,536) et les cellules de rein de bébé hamster (BHK21) ont été approuvées et certifiées par l'OMS pour la production de vaccin humain. Cependant, ces lignées produisent de faibles titres viraux, notamment avec la souche B du virus de l'influenza. De plus la croissance de l'influenza virus B sur les cellules BHK21 résulte dans la sélection de variants viraux. La lignée cellulaire MRC5 a également pu être utilisée pour la production de vaccin contre les virus de l'influenza. Cependant, les cellules MRC5 nécessitent des conditions de culture extrêmement stringentes difficilement conciliables avec une production industrielle. Plus récemment, la lignée cellulaire PER.C6 (WO01/38362) a été proposée pour la production de vaccin contre les virus de l'influenza. Cette lignée cellulaire dérivée de cellules de rétine d'embryon humain a été générée par transfection de séquence codant pour les gènes Ela et Elb de l'adénovirus sous le contrôle du promoteur humain de la phosphoglycérate kinase (PGK). Le caractère potentiellement tumorigène de cette lignée n'a pas encore été évalué, et la PER.C6 n'est pas encore approuvée à ce jour par les autorités réglementaires pour la production de vaccins. Pris dans son ensemble, l'analyse de l'art antérieur fait apparaître un besoin inassouvi et longtemps attendu, de développer un procédé de réplication de virus de la grippe et de production de vaccins dans un système cellulaire ne présentant pas les désavantages des oeufs embryonnés de poulets, des cellules primaires diploïdes ou des lignées cellulaires continues actuellement disponibles. Plus spécifiquement, il existe un grand besoin de développer une lignée cellulaire alternative (i) capable de supporter des hauts titres de réplication de sous- types d'influenza virus, (ii) capable d'être cultivée en suspension dans un milieu de culture, de préférence asérique, acceptée par les autorités réglementaires pour la production de vaccin, de sorte à éviter la présence d'agents toxiques (virus, mycoplasmes, toxines, prions...), (iii) n'ayant pas subi une immortalisation pouvant conférer un caractère tumorigène à la cellule, (iv) capable de répliquer les virus de l'influenza, notamment les souches d'influenza virus A H5N1 hautement pathologiques et mortels pour les embryons de poulets et les cellules primaires diploïdes. La présente invention se propose de répondre à ces différents besoins et à d'autres encore, en fournissant une famille de lignées cellulaires, adhérentes ou non adhérentes, dérivées de cellules souches embryonnaires aviaires. Les lignées cellulaires selon l'invention sont dérivées de cellules souches, embryonnaires ou somatiques, et permettent la réplication de virus, notamment de sous-types d'influenza virus. Les lignées cellulaires aviaires selon l'invention sont donc utiles à la production de vaccins, notamment de vaccins contre la grippe causée par les virus de l'influenza. DESCRIPTION La famille de lignées des cellules souches aviaires selon l'invention, ciaprès appelée EBx, est de manière avantageuse obtenue en mettant en oeuvre un procédé tel que décrit dans les demandes internationales de brevet W003/076601 et W005/007840. Les lignées EBx, présentent des caractéristiques communes telles que décrites ci-après. Les lignées selon l'invention sont obtenues selon un procédé en deux phases. La première phase consiste à la mise en culture de cellules d'embryons de poulet provenant de disques blastodermiques d'ceufs fécondés dérivés de préférence de souches de poules sélectionnées parmi les souches S86N, CNR, Marens et White Leghorn, selon le protocole décrit dans les demandes de brevet W003/076601 et W005/007840. De préférence, la lignée cellulaire aviaire selon l'invention dérive de la souche S86N. La seconde phase consiste dans le sevrage progressif de la culture de cellules d'embryons de poulet, en facteurs de croissance, en tapis de cellules nourricières et en sérum animal. Les lignées de cellules souches aviaires EBx ainsi obtenues sont capables d'être cultivées in vitro en adhérence (par exemple EB45) ou en suspension (par exemples EB1, EB14, EB14-074,...). Par lignée cellulaire, on entend toute population de cellules capables de proliférer indéfiniment en culture in vitro en gardant peu ou prou les mêmes caractéristiques morphologiques et phénotypiques. Les lignées EBx selon l'invention ont conservées certaines caractéristiques remarquables des cellules souches embryonnaires (ES) aviaires: a) prolifération infmie des cellules EBx en culture. Les lignées cellulaires EBx ont conservées la caractéristique des cellules ES aviaires d'exprimer la télomérase. Le taux d'expression élevé de la télomérase, et le maintien de cette expression au cours des passages successifs des cellules EBx en culture (voir Fig. N 4), confère aux cellules EBx un caractère immortel en culture, c'est-à-dire la caractéristique de proliférer indéfiniment en culture tout en conservant un phénotype indifférencié de cellule souche. En effet, les cellules EBx selon l'invention peuvent être maintenues en culture sur de longues périodes de temps, d'au moins 50 jours, d'au moins 100 jours, d'au moins 150 jours et de manière préférée d'au moins 600 jours et au delà. Ainsi, les cellules EBx selon l'invention se distinguent des cellules primaires, notamment des cellules primaires de fibroblastes d'embryons de poulets (CEF pour chicken embryo fibroblasts ) qui sont capables de survivre en culture que quelques passages (moins de 10), leur conférant une durée de vie en culture de quelques jours; les cellules EB14 et EB45 ont quant à elles dépassées les passages p100 et continuent de croître tout en conservant leur phénotype indifférencié. b) une stabilité chromosomique des cellules EBx en culture: De manière remarquable, le caryotype des cellules EBx n'est pas affecté par la culture. Contrairement au caryotype de nombreuses lignées cellulaires, notamment de lignées cellulaires transformées par des oncogènes, le caryotype des EBx demeure normal et diploïde au cours des passages en culture (voir Fig. N 2). Les lignées EBx selon l'invention ont en outre acquis certaines caractéristiques remarquables qui les distinguent des cellules souches embryonnaires (ES) aviaires et les rendent particulièrement intéressantes pour leur utilisation industrielle. Les cellules EBx, notamment les cellules EB14 et EB74-0-74 présentent ainsi les caractéristiques: -d'être cultivées en suspension dans des bioréacteurs à des concentrations cellulaires élevées; - de croître dans un milieu de culture dépourvu de facteurs de croissance exogènes, de sérum animal et/ou de tapis cellulaire nourricier. L'aptitude des cellules EBx a se répliquer dans un milieu minimal en fait un substrat de choix pour la production industrielle de substances biologiques telles les vaccins et protéines. Les lignées EBx selon l'invention se distinguent donc des lignées de cellules aviaires décrites dans la littérature. Une analyse en microscopie électronique des cellules EB14 les distinguent clairement des CEFs (voir Fig. N 1). En outre les cellules EB14 expriment la télomérase contrairement aux CEFs (voir Fig. N 4). Les cellules EBx se distinguent également de la lignée aviaire DF1 (US5,672,485) ; morphologiquement les cellules EBx présentent un phénotype de cellules ES (c'est-à-dire des petites cellules rondes avec un rapport nucléo-cytoplasmique élevé)(voir Fig. N 1) qui les différencie du phénotype fibroblastique des cellules DF1. Par ailleurs, les cellules DF1 n'expriment pas la télomérase contrairement aux cellules EBx. Les cellules EBx se distinguent également de cellules aviaires telles les cellules CHCC-OU2 qui sont des cellules transformées in vitro par le mutagène chimique MNNG (US5,989,805) qui nécessitent de croître en milieu supplémenté en sérum. Les cellules EBx sont des lignées n'ayant pas subi d'événement de transformation lors de leur établissement ni au cours de leur maintien en culture. De fait, les cellules EBx sont non-transformées, que ce soit biologiquement par un gène immortalisant, un virus ou une protéine virale, ou chimiquement par un agent mutagène, ou physiquement par exposition à des rayons ionisants (rayons X, rayons gamma, rayons ultra-violets...). En outre, les lignées de cellules souches aviaires EBx, et notamment les lignées EB45, EB14, EB14-0-74 selon l'invention, présentent au moins une des caractéristiques suivantes (i) un rapport nucléo-cytoplasmique important (Figure N 1), (ii) une activité alcaline phosphatase endogène, (iii) une activité télomérase endogène, (iv) une réactivité avec des anticorps spécifiques dirigés contre les marqueurs cellulaires SSEA-1 (TEC01) et EMA-1 (voir Fig. N 5 et 6). Les lignées de cellules souches aviaires EBx, et notamment les lignées EB45, EB14, EB14-0-74 selon l'invention, présentent également la caractéristique remarquable d'exprimer les récepteurs de surface cellulaire aux virus de l'influenza contenant des oligosaccharides acide Sialique-Galactose (Sia-Gal) dont le résidu acide sialique est lié au galactose par une liaison alpha 2-6 ou alpha 2-3 (Figure N 7). La présence des ces deux récepteurs de surface cellulaire SAa2-3 et SAa2-6 permettent de propager les souches de virus de l'influenza dans les cellules des lignées EBx, et notamment les lignées EB45, EB14, EB14-0-74, sans qu'il y ait eu une sélection de variants de liaison aux récepteurs comme c'est le cas dans les oeufs embryonnés. En effet, la propagation des souches d'influenza virus A et B dans les oeufs embryonnés de poulet conduit toujours à une sélection de variants de liaison aux récepteurs qui présentent des substitutions d'amino-acides dans les régions exposées et fonctionnellement importantes de la partie distale de la tête globulaire de HA. A cause de ces mutations, les souches de virus adaptées par passage en culture sur les oeufs embryonnés peuvent différées de la souche originale de virus par sa virulence et ses propriétés immunogéniques et antigéniques ( voir Govorkova et al., 1999, Virology 262: 31-38). La durée du cycle cellulaire des cellules souches aviaires EBx selon l'invention varie de 16 heures à 24 heures environ. La présente invention vise à couvrir les lignées de cellules aviaires EBx diploïdes, non-tumorigènes, immortelles et non transformées, caractérisée en ce que les dites cellules présentent: - une morphologie ronde et compacte de cellules souches embryonnaires aviaires et un rapport nucléocytoplasmique élevé ; - un temps de doublement de sa population comprise entre 15 et 30 heures, de préférence entre 16 et 24 heures; - une activité alcaline phosphatase endogène; - une activité télomérase endogène; - une réactivité avec des anticorps spécifiques dirigés contre les marqueurs SSEA-1 (TEC01) et EMA-1 et les récepteurs de surface cellulaire contenant des oligosaccharides SAa2-3 et SAa2-6. Plus particulièrement la présente invention vise à couvrir la lignée de cellules adhérentes EB45, de sexe mâle, obtenue à partir de cellules provenant de disques blastodermiques d'embryon de poulet de la souche S86N. La présente invention vise également à couvrir la lignée de cellules EB14 ou EB14-0-74, de sexe mâle, non adhérentes, obtenue à partir de cellules provenant de disques blastodermiques d'embryon de poulet de la souche S86N. C'est également un des objets de la présente invention de couvrir le procédé d'obtention des cellules EBx, notamment EB45, EB14 et EB74-0-74. Les lignées selon l'invention sont particulièrement utiles pour répliquer les virus, tels par exemple, et de façon non limitative, les poxvirus (Avipox, Canary pox, Fowl pox, Modified Ankara Vaccinia virus...) , les orthomyxovirus tels le virus de l'influenza (voir Fig. N 13), les paramyxovirus tel le virus de Newcastle, les réovirus, les birnavirus tel le virus de Gumboro. Les lignées cellulaires selon l'invention sont particulièrement utiles pour la production de vaccin prophylactique ou thérapeutique contre une infection provoquée par un virus. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le dit virus est le virus de l'influenza sélectionné parmi le virus de l'influenza virus humain, le virus de l'influenza virus aviaire, le virus de l'influenza virus équin, le virus de l'influenza virus porcin, le virus de l'influenza félin. Le dit virus de l'influenza est de préférence sélectionné parmi les sous-types A, B et C. Parmi les sous-types A du virus de l'influenza, il convient de citer les différentes combinaisons possibles entre les différents sous-types d'hémagglutinine et de neuraminidase, et notamment, à titre d'exemple non limitatif les souches H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H7N7 et H9N2. Parmi les souches H1N1, on peut plus particulièrement citer: A/Porto Rico/8/34, A/New Caledonia/20/99, A/Beijing/262/95, A/Johannesburg/282/96, A/Texas/36/91. Parmi les souches H3N2, on peut plus particulièrement citer:A/Panama/2007/99, A/Moscow/10/99, A/Johannesburg/33/94. Parmi les sous-types B du virus de l'influenza, il convient de citer à titre d'exemple non limitatif les sous-types B/Porto Rico/8/34, B/Johannesburg/5/99, B/Vienna/1/99, B/Ann Arbor/1/86, B/Memphis/1/93, B/Harbin/7/94, N/Shandong/7/97, B/Hong Kong/330/01, B/Yamanashi/166/98. L'invention vise également à couvrir un procédé de production d'un virus de l'influenza comprenant les étapes de: a) infection des cellules d'une lignée celluaire EBx selon l'invention, de préférence EB14 ou EB14-0-74 avec le virus de l'influenza dans un milieu de culture cellulaire. Le dit milieu de culture est de préférence un milieu asérique, et de manière encore plus préféré, dépourvu en outre de protéines d'origine animale; b) culture des cellules ainsi infectées à l'étape a) dans des conditions de culture permettant la réplication du dit virus; c) récolte du virus entier produit dans le surnageant de culture et/ou dans les dites cellules en culture. Le virus de l'influenza selon l'invention est sélectionné dans un groupe composé d'un virus sauvage, d'un isolat viral primaire obtenu à partir d'un individu infecté, d'un virus recombinant, d'un virus atténué, d'un virus adapté aux basses températures, d'un virus sensible à la température, d'un virus réassorti, d'un virus produit par génétique inverse. Selon un mode préféré de réalisation, l'étape b) comprend l'adjonction d'une enzyme protéolytique dans le milieu de culture, dans des conditions suffisantes pour assurer la propagation du virus dans la culture. La dite enzyme protéolytique est de préférence sélectionnée parmi la trypsine, la chymotrypsine, la thermolysine, la pepsine, la pancréatine, la papaïne, la pronase, la subtilisine A, l'élastase, la furine et la carboxypeptidase. De manière plus préférée, l'enzyme est la trypsine dans une concentration comprise entre environ 1 et environ 25 mg/ml de milieu de culture liquide. De manière préférée, l'enzyme protéolytique est d'origine recombinante, obtenue de préférence de source procaryotique. Selon un autre mode préféré de réalisation, l'infection et la culture des dites cellules EBx selon l'invention est réalisée dans un milieu de culture dépourvu de sérum d'origine animale. De manière encore plus préférée le milieu ne contient en outre pas de protéine d'origine animale. La récolte, la concentration et/ou la purification des virus est réalisée selon les techniques connues de l'homme du métier, telle par exemple par ultrafiltration, par centrifugation (cf Furminger, in Nicholson, Webster and Hay (Eds.), Textbook of influenza, chapter 24 pp324-332). Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une étape additionnelle d) de fabrication d'une préparation vaccinale à partir du virus produit à l'étape c). Selon un premier mode de réalisation, le procédé de préparation d'un vaccin viral selon l'invention comprend en outre l'étape d'inactivation du virus récolté. L'inactivation est de préférence réalisée par un traitement avec la formaldéhyde, le béta-propiolactone, l'éther, l'éther avec du détergent (tel que le Tween-80), le cétyl-triméthyl ammonium bromide (CTAB) et le Triton N102, le sodium deoxycholate et le tri(Nbutyl)phosphate. Selon un second mode de réalisation, l'invention fournit un procédé de préparation de protéines antigéniques de surface à partir du virus entier de l'influenza produit selon le procédé de l'invention, et comprenant les étapes additionnelles de: a) Facultativement, traitement du liquide contenant le virus entier obtenu à partir de la culture cellulaire avec un enzyme de digestion des acides désoxyribonucléiques (ADN), notamment des enzymes DNases (voir la classification EC3.1.21 et EC3.1.22) et les nucléases (voir la classification EC3.1.30 et EC3.1.31). De manière préférée, l'enzyme de digestion de l'ADN est la benzonase (Benzon Nucléase) ou la DNAse I; b) adjonction d'un détergent cationique. Des exemples de détergent cationic sont de manière non-limitative: le sel de cétyl-triméthyl ammonium [par exemple le CTAB (bromure de cétyl-triméthyl ammonium) ou le sel de myristyl-triméthyl ammonium], la lipofectine, la lipofectamine, le DOTMA, le Tween. c) isolement des protéines antigéniques de surface. Cette dernière étape peut être réalisée par centrifugation ou ultrafiltration. C'est également un des objets de la présente invention de fournir un vaccin contre le virus de l'influenza. Selon un premier mode de réalisation, le dit vaccin est un vaccin tué et/ou inactivé obtenu par le procédé de l'invention. Selon un second mode de réalisation de l'invention, le vaccin contre le virus de l'influenza est un vaccin vivant atténué, caractérisé en ce que dans sa forme prête-à-l'emploi, le dit vaccin comprend essentiellement le surnageant de culture des cellules EBx, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, de préférence dépourvu de sérum, optionnellement filtré et/ou concentré et contenant le virus, essentiellement non-modifié. Selon un troisième mode de réalisation, le vaccin contre le virus de l'influenza est à base de protéine(s) antigènique(s) de surface susceptible(s) d'être obtenue(s) à partir de virus de l'influenza propagés en culture dans les cellules EBxselon le procédé selon l'invention. Le vaccin selon l'invention comprend en outre au moins un agent stabilisant et/ou un adjuvant. Le terme adjuvant se réfère à un composé ou un mélange qui augmente la réponse immunitaire à un antigène. Des exemples non limitatifs d'adjuvants incluent sans limitation, l'adjuvant complet de Freund, l'adjuvant incomplet de Freund, la saponine, les gels minéraux tels l'hydroxyde d'aluminium, les substances de surface actives telles la lysolécithine, les polyols pluroniques, les polyanions, les peptides, l'huile ou émulsion hydrocarbonées, ou d'autres adjuvants tels la bacille de Calmette-Guérin et Corynebacterium parvum. Un exemple d'adjuvant synthétique préféré, il convient de citer QS-21. Alternativement, ou en addition, des protéines immunostimulatrices (Interleukines Il-1, Il-2, Il-3, Il-4, IL-12, I1-13, granulocytemacrophage-colony-stimulating factor (GMCSF)...) peuvent être utilisées pour augmenter la réponse immune du vaccin. De préférence, l'adjuvant est pharmaceutiquement acceptable. Le vaccin selon l'invention est de préférence sous la forme d'une préparation liquide, d'une préparation congelée, d'une préparation desséchée et congelée, optionnellement adaptée pour une administration intra-nasale. Le vaccin selon l'invention est utilisé pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique d'une infection par le virus de l'influenza (grippe). Les lignées de cellules EBx selon l'invention sont utiles pour la création et la production de virus de l'influenza réassortants. Le réassortiment est une caractéristique spécifique des virus segmentés tels que les virus de l'influenza. Une double infection des cellules EBx, notamment EB45, EB14 ou EB14-0-74, par au moins deux souches de virus de l'influenza, conduit à la production d'un mélange de segments dérivés des deux souches de virus dans une seule cellule EBx hôte. Durant l'assemblage des virus, théoriquement toutes les combinaisons de fragments sont possibles. Ainsi, certains virus de la descendance sont identiques à ceux des virus utilisés pour réaliser l'infection, et d'autres virus de la descendance sont de nouvelles combinaisons appelés réassortants . Des réassortants particuliers peuvent être spécifiquement sélectionnés en supprimant ou en éliminant, au moyen par exemple d'anticorps, des virus n'ayant pas les propriétés désirées (Voir Kilnourne E.D. in Plotkin SA and Mortimer E.A. Eds, Vaccines 1994). Les lignées de cellules EBx selon l'invention sont également utiles pour la création et la production de virus de l'influenza par génétique inverse (voir Enami, Proc.Natl.Acad.Sci. 8è :3802-3805 (1990), Enami et Palese, J. Virol. 65:2511-2513 (1991) et Luytjes, Cell 59:1107-1113 (1989) ). Dans ce procédé, des transcrits modifiés des ARN viraux du virus de l'influenza sont transcrits in vitro à partir de construction d'ADNc en présence de protéines NP, PB1, PB2 et PA purifiées. Les ribonucléoparticules (RNP) synthétiques ainsi produites sont ensuite transfectées dans des cellules EBx infectées au préalable avec un virus de l'influenza, de préférence un virus de l'influenza helper qui est un virus défectif conditionnel pour la croissance (tel qu'une restriction du type cellulaire ou une sensibilité à la température), permettant ensuite la sélection des virus produits. Des exemples non limitatifs des modes de réalisation de l'invention sont donnés ci-après. Il sera fait référence aux Figures dans la suite de la description. FIGURES Figure N 1: Photographie de microscopie électronique des cellules EB14 et CEF Figure N 2: Caryotype de la lignée cellulaire EB14 Figure N 3: Etude de tumorigenicité comparée des cellules EB14 et des cellules Hela dans le modèle du rat nouveau-né immun-supprimé. Figure N 4: Analyse de l'expression de la telomérase dans les cellules EB45 à différents passages (p66 et p121), des cellules EB14 (p89) et de cellules MDCK prises comme contrôle négatif Figure N 5: Analyse de l'expression de marqueurs spécifiques des cellules souches embryonnaires dans les cellules EB14 (Fig. 5A) et les cellules DF-1 (Fig.5B). Figure N 6: Analyse de l'expression de marqueurs spécifiques des cellules souches embryonnaires SSEA-1 et EMA-1 dans les cellules EB45 et les cellules CHO (contrôle négatif). Figure N 7: Expression des récepteurs de surface cellulaire SAa2-3 et SAa2-6 sur les cellules EB14 et MDCK. Les cellules sont incubées avec des lectines marquée à la Digoxigénine: La lectine agglutinine Sambuca nigra reconnaît spécifiquement la liaison Sia2-6Gal, la lectine agglutinine Maackia amurensis reconnaît spécifiquement la liaison Sia2- 3Gal. Les lectines attachées aux cellules sont détectées avec des anticorps anti-Digoxogénine marqués au FITC selon les techniques connues de l'homme du métier. Le nombre de cellules marquées au FITC sont comptées en utilisant un trieur automatiques de cellules par fluorescence (FACS). Figure N 8: Titration de la production de virus Influenza de souche A/H1N1/New Caledonia/20/99 (fig. 8A) et B/ Johannesburg/5/99 (Fig. 8B) dans les cellules EB14, par le test d'hémagglutination. Le titre viral est exprimé en unité HAU/50 l. Les expériences ont été réalisées dans des boites de Pétri de 150 mm sous agitation, (50 rpm). L'infection est réalisée à 10 différentes multiplicités d'infection indiquées sur le graphique. Figure N 9: Titration exprimée en TCID50 de la production de virus Influenza de souche A/H1N1/Porto Rico/8/34 (fig. 9A) et A/H1N1/New Caledonia/20/99 (fig. 9B) dans 15 les cellules EB14. Le titre viral est exprimé en logTCID50/ml. L'infection est réalisée à différentes multiplicités d'infection indiquées sur le graphique. Figure N 10: Titration exprimée en TCID50 de la production de virus Influenza de souche A/H3N2/Wyoming/3/2003 (fig. 10A) et B/Johannesburg/5/99 (fig. 10B) dans les cellules EB14. Le titre viral est exprimé en unité 1ogTCID50/ml. L'infection est réalisée à différentes multiplicités d'infection indiquées sur le graphique. Figure N 11: Titration de la concentration de l'hémagglutinine HA dans le surnageant de culture de cellule EB14 exprimée en g de HA/ml de surnageant infectée par virus de l'influenza de souche A/HIN1/New Caledonia/20/99 (fig. 11A) et A/H3N2/Wyoming/3/2003 (fig. 11B). L'infection est réalisée dans des boites de Petri de 150 mm. Figure N 12 Titration de la concentration de l'hémagglutinine HA dans le surnageant de culture de cellule EB14 exprimée en g de HA/ml de surnageant infectée par 5 virus de l'influenza de souche B/Johannesburg/5/99. L'infection est réalisée dans des boites de Petri de 150 mm. Figure N 13: Photographie de microscopie électronique de cellules EB14 infectées par le virus 10 influenza A/H1N1/New Caledonia/20/99 (72h post infection) EXEMPLES EXEMPLE 1: Procédé d'obtention des lignées de cellules souches aviaires EBx 15 Le procédé d'obtention des lignées EBx comprend 2 phases: É La première phase concerne la mise en culture et à la culture in vitro de cellules souches aviaires. Cette première phase (phase 1) comprend l'étape a) de culture des cellules souches aviaires, de préférence de cellules souches embryonnaires (ES) aviaires dans un milieu de culture complet complémenté en sérum contenant tous les facteurs permettant la croissance cellulaire, et des cellules nourricières, de préférence inactivées; É La seconde phase (phase 2) concerne la dérivation des lignées de cellules EBx à partir des cellules souches aviaires obtenues à l'étape a). Cette seconde phase 25 comprend les étapes suivantes: b) Passages en modifiant le milieu de culture de sorte à obtenir un sevrage progressif des dits facteurs de croissance, du sérum et/ou des cellules nourricières; c) Etablissement des lignées de cellules adhérentes ou non adhérentes EBx capables de proliférer dans un milieu basal en absence de facteurs de croissance exogènes, et/ou de cellules nourricières inactivées, et/ou peu ou pas de sérum animal. Le procédé d'obtention des lignées EBx selon l'invention peut comprendre en outre l'étape d) de sélection de clones adaptés à la production de vaccin ou de protèines recombinantes destinées à la thérapie humaine ou animale. Les techniques de sous-clonage et d'isolement de clones sont bien connues de l'homme du métier. La cellule EB14-0-74 selon l'invention a ainsi été obtenue par dilution limite de cellules EB14 (de sorte à avoir 3 cellules EB14/puits). La présente invention repose sur la double découverte: (i) des conditions de culture in vitro des cellules ES aviaires capables de croître et de se multiplier tout en conservant un phénotype indifférencié de cellules ES (phase 1) ; (ii) d'un procédé de sevrage de la culture de cellules ES aviaires en facteurs de croissance exogènes, en sérum animal et en cellules nourricières, de sorte à induire une pression de sélection permettant l'obtention des lignées cellulaires EBx (phase 2). Le passage d'un milieu de culture cellulaire de base complémenté en facteurs de croissance contenant du sérum animal et des cellules nourricières, à un milieu asérique dépourvu de facteurs de croissance, ne peut être réalisé par leur simple retrait du milieu de culture de base. Le procédé de sevrage (ou déprivation) selon l'invention nécessite de réaliser la déprivation en facteurs de croissance, en cellules nourricières et en sérum de manière séquentielle et progressive. Le terme aviaire ou oiseau selon l'invention se réfère à n'importe quelles espèces, sous-espèces ou races d'organismes de la classe taxonomique ava, telles que, à titre d'exemples non limitatifs, le poulet, la dinde, le canard, l'oie, le faisan, la perdrix, la caille, le perroquet, les aigles, l'autruche, l'émeu, l'outarde. Le terme aviaire inclus les nombreuses souches connues de Gallus gallus, ou poulet, telles que White Leghorn, Brown Leghorn, Barred-Rock, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Ausstralorp, Minorca, Amrox, California Gray, Italian Partidgecolored, ainsi que les souches habituellement élevées de dinde, de canard, d'oie, de faisan, de caille, d'autruche. De préférence, le terme aviaire ou oiseau selon l'invention se réfère à une poule. Les cellules souches aviaires selon l'invention sont des cellules de poules sélectionnées parmi les souches S86N, CNR, Marens et White Leghorn. De manière préférée, les cellules souches aviaires selon l'invention dérive de la souche de poule S86N. Les dites cellules souches aviaires primaires sont sélectionnées parmi les cellules souches totipotentes, les cellules souches pluripotentes, les cellules souches multipotentes, les cellules souches unipotentes, les cellules progénitrices intermédiaires. De manière préférée, la dite cellule souche aviaire primaire est une cellule souche pluripotente, c'est-à-dire une cellule souche embryonnaire (ES) de préférence obtenues par suspension de cellules provenant de disques blastodermiques d'oeufs fécondés (Stade X de la classification d'EYAL-GILADI's: EYAL-GILADI and KOCHAN, 1976, From cleavage to primitive streack formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick . "General Morphology" Dev. Biol. 49: 321-337). Les cellules souches embryonnaires (ES) aviaires se caractérisent par un temps de doublement cellulaire long compris entre 48 et 72 heures en culture à 39 C. Phase 1 Le milieu de culture complet de l'étape a) comprend des facteurs de croissance exogènes. Par milieu de culture complet , on entend désigner un milieu de base complémenté avec des vitamines, nutriments, sels minéraux, facteurs de croissance, sérum, composés divers pour assurer une croissance optimisée des cellules en culture. Selon la présente invention, un milieu de base signifie un milieu dont la formulation permet d'assurer la survie des cellules en culture, et une croissance minimale. Des exemples de milieux de base (ou milieux basiques) sont par exemple le milieu BME (Basal Eagle Medium), MEM (Minimum Eagle's Medium), medium 199, DMEM (Dulbeco's Modified Eagle Medium) , GMEM (Galsgow Modified Eagle's Medium), DMEM-HamF12, Ham-F12 and Ham-Fl0, Iscove's Modified Dulbecco's Medium, MacCoy's 5A medium, RPMI 1640. Le milieu de base comprend des sels minéraux (par exemple: CaC12, KC1, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, MgSO4,...), des acides aminés, des vitamines (thiamine, riboflavine, acide folique, panthothénate de calcium,...) et d'autres composants tels le glucose. Il peut être nécessaire de complémenter le milieu de base avec au moins un des composés suivants: du sérum animal, de la L-glutamine, du pyruvate de sodium, du béta mercaptoéthanol, des acides aminés, des vitamines, des facteurs de croissance pour générer un milieu complet. Les termes facteur de croissance ou facteur permettant leur croissance , utilisé indifféremment dans la présente invention signifie une substance chimique ou biologique (en général il s'agit d'un peptide ou d'une protéine) nécessaire à la survie et la croissance des cellules humaines en culture. Il est possible de distinguer schématiquement deux familles de facteurs de croissance: les cytokines et les facteurs trophiques. Les cytokines sont essentiellement des protéines dont l'action se fait via le récepteur qui est associé avec la protéine GP130. Ainsi, le LIF (Leukemia Inhibitory Factor), l'interleukine 11 (11-11), l'interleukine 6 (Il-6), le récepteur de l'interleukine 6 (Il-6R), le Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), l'oncostatine et la cardiotrophine ont un mode d'action similaire avec le recrutement au niveau du récepteur d'une chaîne spécifique et de la combinaison de cette dernière avec la protéine GP130 sous la forme monomérique ou parfois hétérodimérique. Les facteurs trophiques sont choisis parmi le SCF,1'IGF-1 et le FGF. Lors de l'étape a), la culture des cellules souches aviaires provenant de la mise en culture de cellules d'embryons de poulet de souche S86N provenant de disques blastodermiques d'oeufs fécondés (stade X de la classification d'EYAL- GILADI) est réalisée pendant au moins 3 à 10 passages en milieu complet. De préférence, les cellules d'embryons de poulet proviennent de plusieurs embryons, de préférence d'au moins 1, d'au moins 10, d'au moins 100, d'au moins 200, de manière préférée de plus de 300 embryons de poulet. Les cellules souches aviaires sont ensemencées de préférence dans des flasques à une concentration d'environ 7 X 104/cm2 à 8 X 104/cm2 de cellules souches aviaires dans le milieu de culture complet. De préférence, l'ensemencement est réalisé à environ 7,3 X 104/cm2 (soit 4 X 106/55 cm2 ou 4 X 106 cells/100 mm boite). Les oeufs sont ouverts, le jaune est séparé du blanc lors de l'ouverture. Les embryons sont prélevés sur le jaune soit directement à l'aide d'une pipette Pasteur, soit à l'aide d'un petit filtre de papier absorbant (Papier Whatmann 3M), préalablement découpé sous forme d'un anneau perforé à l'aide d'une perforeuse (diamètre de la perforation = environ 5 mm). Ces petits anneaux sont stérilisés à la chaleur sèche pendant environ 30 min au four. Ce petit anneau de papier est déposé sur la surface du jaune et centré au niveau de l'embryon qui est ainsi entouré par l'anneau de papier. Ce dernier est alors découpé à l'aide de petits ciseaux et l'ensemble prélevé est placé dans une boite de Petri, remplie de PBS ou d'un liquide physiologique. L'embryon ainsi entraîné par l'anneau est nettoyé de l'excès de jaune dans le milieu et le disque embryonnaire ainsi débarrassé de l'excès du vitellus est prélevé avec une pipette Pasteur. Les embryons sont mis dans un tube contenant du milieu physiologique (PBS, TG, milieu, ...). Les embryons sont alors dissociés mécaniquement et ensemencés sur une couche de cellules nourricières ('feeder cells ) dans du milieu de culture défini. Selon un mode préféré de réalisation, le tapis cellulaire nourricier de l'étape a) se compose de fibroblastes choisis parmi des fibroblastes humains primaires, des fibroblastes humains établis en lignée, des fibroblastes primaires de mammifères, des fibroblastes de mammifères établis en lignée. De préférence, il s'agit de fibroblastes de mammifères, plus particulièrement de fibroblastes de souris établis en lignée, de préférence des cellules STO (American Type Culture Collection ATCC N CRL- 1503) transformées ou non. De préférence le tapis cellulaire nourricier est inactivé. Il peut être inactivé chimiquement par un traitement à la mitomycine par exemple ou physiquement par exposition à des rayons physiques tels les rayons X ou gamma. Parmi les conditions préférentielles utilisées pour les mises en culture, on privilégie le milieu de culture composé du milieu MacCoy comme milieu de base supplémenté avec du sérum de veau foetal à une concentration initiale de 12 à 8 %, avec des acides aminés non essentiels à 1 %, avec un mélange de vitamines d'origine commerciale à 1 %, avec du pyruvate de sodium à une concentration finale de 1mM, avec du beta-mercaptoéthanol à une concentration finale de 0,2 mM, de la glutamine à une concentration finale de 2,9 mM, avec un mélange initial d'antibiotiques contenant de la gentamycine à une concentration finale de 10 ng/ml de la pénicilline à une concentration finale de 100 U/ml et de la streptomycine à une concentration finale de 100 g/ml. Ce mélange d'antibiotiques n'est plus ajouté rapidement après les premiers passages des cellules. Par rapidement, on entend après les 3 à 5 premiers passages en général. Un mélange de nucléosides peut être ajouté également, ce mélange étant constitué comme décrit précédemment (Pain et al., 1996, Development 122:2339-2348). Parmi les milieux de bases testés dans ces mêmes conditions et qui donnent des résultats similaires, on trouve les milieux Ham F12, Glasgow MEM et le DMEM (supplémenté en biotine à une concentration finale de 8 mg/1). Les facteurs de croissance ajoutés dans le milieu de culture sont de façon privilégiée des molécules recombinantes choisis parmi le Stem Cell Factor (SCF), l'Insulin-like Growth factor 1 (IGF-l), le CNTF, l'Interleukine 6 (IL-6), le récepteur soluble de l'IL-6 (IL6-R), le basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) et l'Interleukine 11 (IL-11). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le dit milieu complet à l'étape a) comprend du sérum animal, de préférence du sérum de veau foetal, et IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, et optionnellement bFGF et IL- 11. La concentration de ces facteurs dans le milieu de culture est avantageusement comprise entre environ 0,01 à 10 ng/ml, de préférence entre 0,1 à 5 ng/ml. Selon un mode préférée de réalisation, les facteurs de croissance exogènes sont présents dans le milieu de culture à la concentration suivante: le SCF de souris à une concentration finale de lng/ml, l'IGF-1 à une concentration finale de 1 à 5 ng/ml, le CNTF à une concentration finale de 1 ng/ml, - l'IL-6 à une concentration finale de 1 ng/ml, le récepteur soluble de l'IL-6 à une concentration finale de 0,5 ng/ml à 1 ng/ml; le bFGF à une concentration finale de 1 ng/ml, l'IL-l1 à une concentration finale de 1 ng/ml. Phase 2 La modification du milieu de culture à l'étape b) du procédé de l'invention, de sorte à obtenir une retrait progressif ou total en facteurs de croissance, en sérum et/ou en couches de cellules nourricières peut être réalisé simultanément, de manière successive ou séparée dans le temps. Les dits sevrages en tapis cellulaire nourricier, en facteurs de croissance exogènes, et en sérum sont réalisés successivement ou de manière décalée dans le temps, selon une séquence des sevrages choisie parmi: cellules nourricières / sérum / facteurs de croissance; cellules nourricières / facteurs de croissance /sérum; -sérum / facteurs de croissance / cellules nourricières; - sérum / cellules nourricières / facteurs de croissance; facteurs de croissance / cellules nourricières / sérum; - facteurs de croissance / cellules nourricières / sérum. De préférence, la séquence de sevrage est facteurs de croissance / cellules nourricières / sérum . Sevrage en facteurs de croissance: Lors de l'étape a), la culture des cellules souches humaines est réalisée pendant au moins 3 à 10 passages en milieu complet, puis le milieu complet est ensuite progressivement et séquentiellement déplété en facteurs de croissance (étape b). De préférence, pour chaque facteur de croissance, la déplétion est réalisée directement en une étape unique, d'un passage à l'autre. Alternativement, la déplétion en facteur de croissance est réalisée de manière graduelle, par une diminution progressive à chaque passage de la concentration du facteur de croissance dans le milieu de culture complet. Selon un mode de réalisation préférée, la déplétion en facteurs de croissance est réalisée simultanément pour au moins deux facteurs de croissance. Alternativement la déplétion en facteurs de croissance est réalisée séquentiellement facteur de croissance après facteur de croissance. De manière préférée, la déplétion en facteurs de croissance est réalisée en deux étapes de déplétion. D'abord, SCF, IL6 et IL6R sont directement retirés du milieu complet. Les cellules aviaires sont ensuite maintenues en culture pendant au moins un passage en milieu complet contenant IGF 1 et CNTF et supplémenté avec du sérum animal. Dans un 2ème temps, IGF1 et CNTF sont directement retirés du milieu de culture, qui au final comprend uniquement le milieu basal complémenté en sérum. Lorsque le milieu de culture complet comprend au départ les facteurs de croissance optionnels bFGF et/ou IL11, ceux-ci sont retirés lors de l'étape b) soit lors de la première ou de la deuxième étape de déplétion. De manière préférée, le sevrage en facteurs de croissance exogènes est total. Habituellement, le milieu est totalement déplété en facteurs de croissance aux environs des passages 20 à 30. Sevrage en cellules nourricières Habituellement, la déprivation en cellules nourricières est réalisée après la déprivation en facteurs de croissance. La déprivation en cellules nourricières est progressive et réalisée sur plusieurs passages. Les cellules souches aviaires sont en général ensemencées dans les flasques à une concentration inférieure à celle réalisée à l'étape a) à environ 4 X 104 cells/cm2 jusqu'à 5 X 104 cell/cm2. Les cellules nourricières sont ensemencées dans une flasque à environ 4,2 X 104 cells/cm2. Progressivement, la concentration en cellules nourricières dans les flasques est diminuée. Pratiquement, la même concentration de cellules nourricières est utilisée pendant 2 à 4 passages, puis la concentration en cellules nourricières est diminuée pendant 2 à 4 passages, et ainsi de suite. A titre d'exemple, la flasque est ainsi ensemencée à environ 4,2 X 104 cells/cm2, puis environ 2,2 X 104 cells/cm2, puis environ 1,8 X 104 cells/cm2, puis environ 1,4 X 104 cells/cm2, puis environ 1,1 X 104 cells/cm2, puis environ 0,9 X 104 cells/cm2, puis environ 0,5 X 104 cells/cm2. Enfin la flasque est ensemencée avec 6,5 X 104 cellules aviaires/cm2 à 7,5 X 105 cellules aviaires/cm2 en absence de cellules nourricières. Dans l'hypothèse où les cellules aviaires ne sont pas en bonne condition après la diminution de la concentration en cellules nourricières dans la flasque, alors les cellules aviaires sont cultivées pendant quelques passages additionnels avec la même concentration de cellules nourricières dans la flasque avant de poursuivre la déprivation en cellules nourricières. A l'étape b), un changement de nature du matériel plastique des boites de culture cellulaire utilisées est réalisé simultanément, successivement ou de manière décalée dans le temps avec le sevrage du tapis cellulaire nourricier. Le dit matériel plastique utilisé est traité spécifiquement de sorte à favoriser les interactions non ioniques ou hydrophobiques, de sorte à diminuer l'adhésion des cellules au dit matériel. L'étape b) comprend au moins 30, au moins 50, au moins 75, au moins 100, au moins 125, au moins 130 passages successifs en culture. Ce changement de matériel plastique permet d'adapter progressivement les cellules EBx adhérentes aux conditions de culture en suspension. Ainsi, les cellules EB14 ont-elles été obtenues à partir des cellules adhérentes EB45 en les cultivant sur ce type de support plastique. Sevrage en sérum animal Le serum utilisé dans le milieu complet à l'étape a) est de préférence du sérum animal, de manière plus préféré du sérum de veau foetal. Alternativement, le sérum peut être un substitut de sérum tel qu'actuellement commercialisé par certaines sociétés (ex KO SR de GIBCO-BRL). La concentration en sérum dans le milieu de culture dépourvu de facteur de croissance est progressivement réduite, pour atteindre une concentration d'environ 2% ou moins de sérum animal dans le milieu de culture. A ce stade, le milieu de culture correspond à un milieu de base (i) ne contenant plus de facteurs de croissance exogènes, ni de cellules nourricières inactivées mais un faible taux de sérum ( de préférence 2% ou moins). Le sevrage en sérum est ensuite réalisé selon une des trois manières suivantes: - le milieu de base (i) complémenté avec du sérum (2% ou moins) est dilué avec un nouveau milieu asérique (ii). Ensuite, les cellules aviaires sont cultivées par passages successifs dans un milieu (i) dans lequel la proportion de milieu sans sérum (ii) est progressivement augmentée jusqu'à la complète disparition du milieu de base (i) complémenté en sérum (dilution progressive). - Le milieu de base (i) est remplacé par un nouveau milieu sans sérum ( milieu asérique) (ii) complémenté avec du sérum. Ensuite, les cellules aviaires sont cultivées par passages successifs dans un milieu (ii) dans lequel la proportion de sérum est progressivement diminuée, jusqu'à obtenir un milieu asérique (sevrage progressif). Le milieu de base (i) est remplacé par un nouveau milieu sans sérum (ii) non complémenté en sérum. Ensuite les cellules aviaires sont directement cultivées dans le milieu asérique (ii) (sevrage direct). De préférence, le sevrage en sérum est réalisé par un sevrage progressif. Selon la présente invention, le terme milieu asérique ou milieu sans sérum (SFM) signifie un milieu de culture cellulaire prêt à l'emploi, c'est-à-dire, ne nécessitant pas l'addition de sérum pour permettre la survie et la croissance des cellules. Le milieu n'est pas nécessairement défini chimiquement et peut contenir des hydrolysats d'origine variée, tel que les hydrolysats d'origine végétale par exemple. De manière préférée, le dit milieu SFM est qualifié sans composant d'origine animal , c'est-à-dire qu'il ne contient pas de composants d'origine animale ou humaine (statut FAO: free of animal origin ). Dans le milieu asérique, les protéines natives du sérum sont remplacées par des protéines recombinantes. Alternativement, Le milieu SFM selon l'invention ne contient pas de protéine (milieu PF: protein-free ) et/ou est défini chimiquement milieu CDM: chemically-defined medium ). Le milieu SFM présente plusieurs avantages: (i) le premier étant son aptitude à satisfaire aux exigences réglementaires (il n'existe pas de risque de contamination par des agents biologiques, tels que les prions ou les virus animaux) ; (ii) l'optimisation du procédé de purification; (iii) la meilleur reproductibilité des performances de la culture cellulaire car le milieu est mieux défini. Des exemples de milieux asériques SFM commercialisés sont VP SFM (InVitrogen Ref 11681-020, catalogue 2003),Opti Pro (InVitrogen Ref 12309-019, catalogue 2003), Episerf (InVitrogen Ref 10732-022, catalogue 2003), Pro 293 SCDM (Cambrex ref 12765Q, catalogue 2003), LC17 (Cambrex Ref BESP302Q), Pro CHO 5-CDM (Cambrex ref 12-766Q, catalogue 2003), HyQ SFM4CHO (Hyclone Ref SH30515- 02), HyQ SFM4CHO-Utility (Hyclone Ref SH30516.02), HyQ PF293 (Hyclone ref SH30356.02), HyQ PF Vero (Hyclone Ref SH30352.02), Ex cell 293 medium (JRH Biosciences ref 14570-1000M), Ex cell 325 PF CHO Protein free medium (JRH Biosciences ref 14335-1000M), Ex cell VPRO medium (JRH Biosciences ref 14560-1000M), Ex cell 302 serum free medium (JRH Biosciences ref 14312-1000M). Le procédé tel que décrit précédemment permet d'obtenir les lignées de cellules souches aviaires EBx selon l'invention. Parmi celles-ci, il convient de citer les cellules adhérentes EB45, les cellules en suspension EB14, et son sous-clone EB14- 0-74. EXEMPLE 2: CARACTERISATION DES LIGNEES DE CELLULES SOUCHES AVIAIRES EBx 1Caryotype des cellules EB14 Le caryotype de la lignée EB14 a été réalisée par le laboratoire du Pr. Michel Franck, Unité de Zootechnie, Ethnologie et Economie rurale, Ecole Nationale Vétériniaire, 1 avenue Bourgelat, 69280 MARCY L'ETOILE, France. Les cellules EB14 ont été caryotypées à deux passages différents (passage 105 et 118) en mettant en oeuvre les techniques classiques de caryotypage connues de l'homme du métier. Les deux passages étudiées des cellules EB 14 présentent les caractéristiques des cellules diploïdes: Le nombre modal de chromosomes au passage 105 est de 78, avec une moyenne de 78,41 et un écart-type de 4, 951 pour 53 métaphases étudiées. - Le nombre modal de chromosomes au passage 118 est de 79 avec une moyenne de 79,68 et un écart-type de 3,733 pour 50 métaphases étudiées. Les chromosomes de la poule se distinguent en deux catégories selon leurs tailles: les macro-chromosomes et les micro-chromosomes. L'étude au passage p105 montre que le nombre modal de macro-chromosomes est de 18 avec une moyenne de 17,81 et un écart-type de 0,833, et le nombre modal de micro-chromosomes est de 60 avec une moyenne de 60,6 et un écart-type de 4,7. L'étude au passage p118 montre que le nombre modal de macrochromosomes est de 18 avec une moyenne de 18,24 et un écart-type de 0,797, et le nombre modal de micro-chromosomes est de 60 avec une moyenne de 61, 44 et un écart-type de 3,688. Il n'existe donc pas de différences significatives de distributions de chromosomes entre les deux passages étudiés. En conclusion, la lignée EB14 présente un caryotype normal aux passages p105 et p118 démontrant ainsi la stabilité chromosomique de cette lignée (Figure 2). 2 Sexe des cellules EBx Les lignées EBx ont été établies à partir d'un ensemble d'embryons de poulet de sexe mâle et femelle. Ainsi les lignées EB45, EB14 et EB14-0-74 ont été générées à partir 10 d'environ 350 embryons de poulet S86N. Au cours du processus d'établissement des lignées EBx, une pression de sélection a permis d'isoler les cellules EB45, EB14 et EB14-0-74. Ces trois lignées de cellules sont des cellules mâles ZZ (Figure 2). 3 Tumorigénicité des cellules EB14 Les cellules établies en lignées continues sont dans leur grande majorité des cellules tumorigènes, c'està-dire que ces cellules ont la capacité à produire des tumeurs dans les animaux de laboratoires. La tumorigénicité des cellules EB14 (p127) a été analysée et comparée à celle des cellules Hela (contrôle positif) dans le modèle du rat nouveauné immunosupprimé (Aventis-Pasteur SA, France). Dix rats nouveaux-nés immuno-supprimés ont reçu une unique administration en sous-cutanée de 107 cellules EB14 /animal. Dix autres rats nouveaux-nés immuno-supprimés ont reçu une unique administration en sous- cutanée de 107 cellules Hela /animal. Tous les animaux ont reçus par voie sous-cutanée 0, 1 ml de sérum de rat anti-thymocyte aux jours 0, +2, +7 et +14. Les animaux ont été observés à intervalles réguliers pour détecter la formation éventuelle de nodules au site d'injection durant 3 semaines. A la fin de cette période d'observation, les animaux ont été sacrifiés et examinés pour l'évidence immédiate de la prolifération des cellules injectées au site d'injection et dans d'autres organes. Les résultats sont résumés dans la figure 3. Les cellules EB14 ne sont pas tumorigéniques dans le modèle du rat nouveau-né. 4 Marqueurs cellulaires spécifiques des cellules ES exprimée par les cellules EBx a) Télomérase L'expression de la télomérase par les cellules EB14 et EB45 en culture dans un milieu de culture asérique (de type OPTIPRO de GIBCO-BRL par exemple) a été réalisée au moyen du kit de diagnostic de détection de la télomérase TRAP (telomerase OCR Elisa, Roche) sur un équivalent de 2000 cellules. Les cellules EBx, notamment les cellules EB45, EB14, EB14-0-74 expriment la télomérase à différents passages en culture (Figure N 4). Un niveau de détection de DO De manière importante, ces résultats démontrent que les cellules EBx se caractérisent par un taux d'expression constant de la télomérase en culture. b) Autres marqueurs cellulaires Alcaline phosphatase Les cellules EBx, notamment les cellules EB45, EB14, EB14-0-74 expriment l'alcaline phosphatase à différents passages en culture (données non montrées). Marqueurs du développement embryonnaire L'analyse de l'expression des marqueurs de développement embryonnaires a été réalisée par fluorométrie de flux selon les techniques connues de l'homme du métier, en utilisant des anticorps primaires dirigés contre EMA-1 (Developmental Studies Hybridoma Bank de l'université de l'IOWA), SSEA-1 (Developmental Studies Hybridoma Bank de l'université de l'IOWA), SSEA-3 (Developmental Studies Hybridoma Bank de l'université de l'IOWA), Paxilline (BD Pharmingen), Tra1-60 (Euromedex) et Me1EM (Developmental Studies Hybridoma Bank de l'université de l'IOWA). Brièvement, les cellules sont dissociées puis reprises dans un mélange PBS-BSA (serum albumine bovine) 1% à une concentration finale de 5.106 cellules/ml. Le mélange est ensuite refroidi 30' dans la glace, puis centrifugé 5 minutes à 11000 rpm. Le culot est ensuite repris dans le même volume de PBS-BSA1%. Le marquage par les anticorps est réalisé dans les puits à fond conique des plaques de 96 puits, à raison de 100 l/puit. La concentration de l'anticorps primaire dans le mélange final est d'environ 1 g/mL. Après le marquage aux anticorps, la mélange est refroidi dans la glace pendant 30 minutes, puis centrifugé 5 minutes à 11000 rpm. Les culots cellulaires sont repris dans glace 1001.1L PBS- BSA1%, puis l'anticorps secondaire couplé au FITC est ajouté à une concentration finale de 1 g/mL. Le mélange est refroidi 30 minutes dans la glace, puis centrifugé 5 minutes à 11000 rpm. Les culots cellulaires sont repris dans 100 L PBS-BSA1%, centrifugé 5 minutes à 11000 rpm puis repris dans 1001_1L NaCl 0.9% avant d'être lu au trieur de cellules (FACS) . Les cellules EBx, notamment les cellules EB45, EB14, EB14-0-74, expriment les marqueurs des cellules souches embryonnaires EMA-1 et SSEA-1 (TEC-01), mais n'expriment pas les marqueurs TROMA-1, MeIM, TRA-1-60, SSEA-3 (Figure N 5 et 6). EXEMPLE 3: REPLICATION DU VIRUS DE L'INFLUENZA DANS LES CELLULES EBx 3.1MATERIELS ET MEHODES 3.1.1- Culture cellulaire Les cellules EB14 sont cultivées en spinner flasks de 120 ml selon le protocole décrit cidessous. Les flasques sont inoculées avec 0,4.106 cells.ml-1 dans 40 ml de milieu de culture suivant (tableau N 1): Tableau N 1 Composants: Concentration finale Milieu DMEM F 12 (Biowhittaker) pour 500m1 Sérum de veau foetal (JRH) 50 ml (10%) Glutamine 200 mM 5 ml (2mM) MEM vitamines 100 X 5 ml (1 X) amino-acides non essentiels 100 X 5 ml (1X) Sodium pyruvate 100 mM 5 ml (1mM) (3-mercaptoethanol 20 1(560 M) Les cellules sont cultivées sous agitation (environ 60 rpm.min-1) à 37 C, 7, 5% CO2 dans une atmosphère humidifiée. 24 heures après l'ensemencement, 40 mL de milieu frais sont ajoutés. 48 heures après, et juste avant l'ensemencement viral, un aliquot de 2 mL est prélevé au moyen d'une pipette. Après avoir réalisé une numération cellulaire, la suspension cellulaire est infectée avec 2 ml de préparation virale avec une MOI adéquate (MOI: multiplicité d'infection). La culture est incubée à 34 C en présence du virus pendant 1 heure puis 40 ml de milieu de culture et 3 gg/mL de trypsine-EDTA sont ajoutés. Toute l'infection est désormais réalisée à 34 C. 4x500 L de suspension cellulaire sont prélevés et stockés à -80 C pour réaliser les titrations TCID50, HAU, ainsi que l'analyse de l'haemagglutinine par SRID et Western blot. Les mêmes prélèvements sont réalisés toutes les 24 heures avec addition de trypsine au même moment. La titration du virus est réalisée à la fin de l'expérience. 3.1.2 Souches de virus de l'influenza Différentes souches de virus de l'influenza ont été utilisées (Tableau N 2): Tableau N 2 SOUCHES A H1N1 H3N2 A/Puerto Rico 8/34 A/Panama/2007/99 A/NewCaledonnia/20/99 A/Moscow/ 10/99 A/Beijing/262/95 A/Johannesburg/33/94 A/Johannesburg/282/96 A/Wyoming/3/2003 A/Texas/36/91 B B/Harbin/7/94 B/Johannesburg/5/99 B/Shandong/7/97 B/Hong-Kong/330/2001 B/Yamanashi/ 166/98 3.1.3 Protocole d'infection des cellules EB14 avec les virus de l'influenza Les cellules EB14 sont dissociées et ensemencées soit: - dans des plaques 6 puits à ultra faible attachement ( Ultra Low Attachment (ULA), Corning Ref. 3471). Pour une infection 48 heures plus tard, les cellules sont ensemencées à raison de 106 cellules/puits dans 2 ml de milieu de culture. Pour une infection 24 heures plus tard, les cellules sont ensemencées à raison de 0,4 X 106 cellules/puits dans 2 ml de milieu de culture. - dans des boites de Pétri de 150 mm (Starstedt, Ref. 821184) à raison de 1 million de cellules/ml dans 40 ml de milieu. Le jour de l'infection, c'est-à-dire 24 ou 48 heures plus tard, les cellules sont comptées dans chaque boite. L'infection est réalisée à différentes multiplicités d'infection (m.o.i = multiplicity of infection) comprises en général entre 10-2 TCID50/ml et 10-6 TCID50/cellule. Chaque puit de la plaque 6 puits est infecté avec 20 ml de mélange d'infection puis incubé pendant 1 heure à 34 C; chaque boite de Pétri de 150 mm est infectée avec 1 ml de mélange d'infection puis incubée pendant 1 heure à 34 C. 1 ml de milieu de culture et 60 ml de milieu de culture sont ensuite ajoutés respectivement dans les puits des boites 6 puits et dans chaque boite de 150mm, ainsi que 3 gg/ml de trypsine-EDTA. L'incubation est poursuivie pendant 120 heures à 34 C avec constitution d'échantillons chaque 24 heures et addition de trypsine au même moment. La titration du virus est réalisée à la fin de l'expérience. 3.1.4 - Test d'hémagglutination Le test d'hémagglutination est réalisé selon les méthodes connues de l'homme de l'art. Préparation des érythrocytes: 15 ml d'une solution d'Alsever (SIGMAALDRICH) est ajoutée à 10 ml d'un mélange de sang de poule. La suspension est centrifugée 10 minutes à température ambiante à 1900 rpm (800 g). Le surnageant est éliminé, de la solution d'Alsever est à nouveau ajouté jusqu'à ce que le volume final atteigne 25 ml. Les érythrocytes sont délicatement mélangés puis centrifugés. Cette étape est réalisée deux fois. Le culot de globules rouges correspond à la concentration 100% et est prêt à l'emploi. Courbe de concentration des globules rouges: la concentration 100% des globules rouges est diluée dans de l'eau distillée afin d'obtenir 1% de globules rouges lysées. A partir de cette solution, les dilutions suivantes sont réalisées: 10, 6,67, 5, 4, 3,33 et 2,86. la courbe de concentration est établie par lecture de la densité optique (DO) à 540 nm. La concentration de globules rouges (concentration de travail) qui sera utilisée correspond à celle ayant une DO de 1,5. Hémagglutination: Des plaques de 96 puits ayant un fond courbe sont utilisées. L'échantillon à titrer (50 pl) est déposé dans la première rangée de la plaque 96 puits, toutes les rangées (N 1 à 12) contiennent 50 pl de tampon phosphate salin (PBS, phosphate buffered saline) sans Ca2+ ni Mg2+ (Biowhittaker). A la fin des dilutions, un volume de 50 pi de la concentration de travail des globules rouges est ajoutée dans les 50 pl de PBS. Le mélange est incubé au minimum 4 heures à 4 C. Les contrôles utilisés sont: le PBS (contrôle négatif), un échantillon référence basse (64-128 HAU/50 pl) et un échantillon référence haute (2048- 4096 HAU/50 pl) . Lecture: Une absence d'hémagglutination (absence de virus) est observée par une précipitation complète des globules rouges. La présence des particules virales est détectées soit par une complète hémagglutination, révélée par une suspension diffuse (absence de précipité), ou soit par une hémagglutination partielle révélée par la présence d'un anneau dans la suspension. Les résultats sont exprimés en HAU/50 pl, c'est-à-dire en Unités d'hémagglutination/50 pl d'échantillon. Une unité est équivalent à la dilution précédent la dilution pour laquelle on obtient une absence totale (100%) d'hémagglutination. 3.1.5 Test TCID50 Préparation de cellules contrôles sensibles à l'infection par le virus de l'influenza: les cellules MDCK (ECACC Number 84121903) ont dissociées en utilisant de la trypsine (500 pg/ml; Biowhittaker) et ensemencées dans des plaques de 96 puits à raison de 3 X 103 cellules/puits à fond plat (Falcon) dans 100 pl de milieu pendant 24 heures [EMEM 2mM Glutamine (Biowhittaker), 10% foetal calf sérum (FCS) (JRH)]. Titration: Après une lente décongélation sur la glace, les échantillons d'une part sont dilués en série (de 10-2 jusqu'à 10-9) dans le milieu correspondant (0% FCS, 5 pg/ml trypsine). Le milieu de culture des MDCK est d'autre part retiré, les cellules sont lavées une fois dans du PBS. 100 pl de virus dilués sont ensemencés dans les plaques (un minimum de 5 rangées répétées contenant des dilutions croissantes à partir de la ligne 1 à 8). Les cellules sont incubées en présence de trypsine (5 g/ml/jour) à 34 C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2 pendant une semaine. Calcul du titre TCID: 50 l de globules rouges (concentration de travail, cf 3.1.4) sont ajoutés dans chaque puit et/ou boite et incubés 2 heures à 4 C. Dans chaque puit, les évenèments d'hémagglutination sont observés au microscope. Les puits positifs (présence d'léagglutination) et les puits négatifs (absence d'hémagglutination) sont comptés et le titre TCID50 est calculé selon la méthode décrite par Reed et Muench (1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am.J.Hyg. 27: 493497). 3.1.6 Estimation de la concentration de l'hémagglutinine HA du virus de 15 l'influenza dans les surnageants de culture L'électrophorèse SDS-PAGE est réalisée telle que décrite par Laemmli UK (1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 259: 680-685) dans un gel de polyacrylamide à 10%. Les proteins sont ensuite transférées selon une technique de transfert semi-sèches (Kyshe-Andersen J. (1984. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. J.Biochem.Biophys. Methods 10:203-209). Les membranes de transfert sont saturées 1h à temperature ambiante avec une solution de saturation (5% de lait en poudre écrémé dans un tampon TBST complémenté avec 1% de FCS (JRH)), suivi par 6 lavages avec du TBST (Tris Buffer Salt Tween). Ensuite les membanes sont incubées avec un sérum de mouton anti-HA (NIBSC) dilué au 1/500 dans une solution contenant 1% de FCS et 5% de lait en poudre écrémé dans du TBST, pendant une nuit. Les membranes sont à nouveau lavées 6 fois dans du TBST puis incubées 1 heure à température ambiante avec un anticorps polyclonal de lapin (dilution 1:5000 dans la solution de saturation; Rockland) conjugué à HRP (horse radish peroxidase) et dirigé contre les IgG de mouton. Après 6 lavages avec du TBST, les complexes protéine-conjugué sont révélés en utilisant la chémiluminescence (kit ECL; Amersham Hyperfilms Amersham). 3.2- EXPRESSION DES RECEPTEURS CELLULAIRES AUX VIRUS DE L'INFLUENZA AVIAIRES ET HUMAINS PAR LES CELLULES EB14. L'expression des résidus SiaamGal et Siaa2_6Gal à la surface des cellules souches embryonnaires aviaires de l'invention a été réalisée au moyen d'une analyse par FACS ( Fluorescent Activated Cell Sorting ). Elle peut être réalisée en utilisant des lectines marquées avec des molécules différentes de digoxigénine (kit Boehringer): - l'agglutinine Sambuca nigra (SNA) reconnaît spécifiquement les liaisons Siaa,2_6Gal -l'agglutinine Maackia amurensis (MAA) reconnaît spécifiquement les liaisons SiaamGal. L'expérience est réalisée sur les cellules souches aviaires nonadhérentes EB14 selon l'invention. Les cellules EB14 sont lavées une fois dans le milieu de culture usuel, puis lavées à nouveau dans de l'HEPES 10mM, NaCl 150mM pH 7.5 (Gibco-BRL), les cellules sont re-suspendues à une concentration approximative de 5.106 cellules/ml dans HEPES 10mM, NaCl 150mM pH 7.5 et incubées 30 minutes dans de la glace. Les aliquots cellulaires sont incubés pendant 15 à 30 minutes dans de la glace avec les lectines marquées à la digoxygénine SNA et MAA. Après 30 minutes, les cellules traitées à la lectine sont lavées au l'HEPES 10mM, NaCl 150mM pH 7.5 et incubées à nouveau 15 à 30 minutes dans de la glace avec un anticorps antidigoxygénine marqué au FITC (Boehringer-Mannheim). Finalement les cellules sont lavées avec du NaCl 0.9% et analysées par FACS. Les cellules souches aviaires selon l'invention, et notamment les cellules non-adhérentes EB14 et son sous-clone EB14-0-74, possèdent les récepteurs de surface cellulaire contenant des oligosaccharides présentant des liaisons SiaamGal et Siam_ 6Gal (Tableau N 3 et Figure N 7) . Tableau N 3 Cellules EBx % de cellules % de cellules qui expriment SAa2-3 qui expriment SAa2-6 (+/- déviation standard) (+/- déviation standard) EB14 78.9 +/- 10 59.97 +/- 6.1 Ce résultat permet d'expliquer pourquoi la propagation des souches d'influenza virus A et B dans les cellules souches aviaires selon l'invention, et notamment les cellules non- adhérentes EB 14 et EB14-0-74, ne conduit pas au phénomène de sélection de variants de liaison aux récepteurs tel qu'observé lors de l'utilisation des oeufs embryonnés de poulet. La présente invention permet de produire des souches de virus adaptées par passage en culture dans les cellules souches aviaires selon l'invention qui ne différent pas de la souche originale de virus par sa virulence et/ou ses propriétés immunogéniques et antigéniques. 3.3 PERMISSIVITE DES CELLULES EB14 ET EB14-0-74 AUX SOUCHES DE VIRUS DE L'INFLUENZA 3.3.1 EVALUTION DE LA PRODUCTIVITE VIRALE AVEC LE TEST D'HEMAGGLUTINATION 3.3.1.1 Souche A/H1N1/New Caledonia/20/99 (voir Figure 8A). Conditions expérimentales: La souche virale, gracieusement obtenue auprès de l'Institut Pasteur (Paris, France), 20 se présente sous la forme de liquide allantoïdien; son titre viral est de 1024 HAU/50 l, 106'7 TCID50/ml. Boite de Pétri de 150mm (100mL final) Milieu de culture: Optipro medium(GIBCO BRL) complémenté avec 4mM LGlutamine Ensemencement dans 40mL de milieu à 1.106 cells.mL-I, 24h avant l'infection Vitesse d'agitation des boites de pétri: 50rpm Concentration en trypsine: 3 g/mL Multiplicité d'infection (Moi): voir sur le graphique exprimé en TCID50/cellule Temperature of incubation: 34 C 3.3.1.2 Souche B/Johannesburg/5/99 (voir Figure 8B) Conditions expérimentales: La souche virale, gracieusement obtenue auprès de l'Institut Pasteur (Paris, France) , se présente sous la forme de liquide allantoïdien; son titre viral est de 2048 HAU/50, 107'7 TCID50/ml. Boite de Pétri de 150mm (100mL final) Milieu de culture: Optipro medium(GIBCO BRL) complémenté avec 4mM LGlutamine Ensemencement dans 40mL de milieu à 1.106 cells.mL-1, 24h avant l'infection Vitesse d'agitation des boites de pétri: 50rpm Concentration en trypsine: 3 g/mL Multiplicité d'infection (Moi): voir sur le graphique exprimé en TCID50/cellule Temperature of incubation: 34 C 3.3.2 EVALUTION DE LA PRODUCTIVITE VIRALE AVEC LE TEST TCID50 3.3.2.1 Souche A/H1N1/Porto Rico/8/34 (cf Figure 9A) Conditions expérimentales: Boite de culture 6 puits de type ULA Milieu de culture: Optipro medium(GIBCO BRL) complémenté avec 4mM L-25 Glutamine Ensemencement dans 2 mL de milieu à 1. 106 cells.mL-1, 24h avant l'infection Vitesse d'agitation des boites de pétri: Orpm Concentration en trypsine: 3gg/mL Multiplicité d'infection (Moi): voir sur le graphique exprimé en TCID50/cellule 30 Temperature of incubation: 34 C 3.3.2.2 Souche A/H1N1/New Caledonia/20/99 (cf Figure 9B) Conditions expérimentales: Boite de Pétri de 150mm (100mL final) Milieu de culture: Optipro medium(GIBCO BRL) complémenté avec 4mM L-5 Glutamine Ensemencement dans 40 mL de milieu à 1.106 cells.mL-1, 24h avant l'infection Vitesse d'agitation des boites de pétri: 50 rpm Concentration en trypsine: 3 g/mL Multiplicité d'infection (Moi): voir sur le graphique exprimé en TCID50/cellule 10 Temperature of incubation: 34 C 3.3.2.3 Souche A/H3N2/Wyoming/03/2003 (cf Figure 10A) Conditions expérimentales: Boite de culture 6 puits de type ULA Milieu de culture: Optipro medium(GIBCO BRL) complémenté avec 4mM LGlutamine Ensemencement dans 2 mL de milieu à 1.106 cells.mL-1, 24h avant l'infection Vitesse d'agitation des boites de pétri: Orpm Concentration en trypsine: 3 g/mL Multiplicité d'infection (Moi): voir sur le graphique exprimé en TCID50/cellule Temperature of incubation: 34 C 3.3.2.4 - - Souche B/Johannesburg/5/99 (cf Figure 10B) Conditions expérimentales: Boite de Pétri de 150mm (100mL final) Milieu de culture: Optipro medium(GIBCO BRL) complémenté avec 4mM LGlutamine Ensemencement dans 40 mL de milieu à 1.106 cells.mL-1, 24h avant l'infection Vitesse d'agitation des boites de pétri: 50 rpm Concentration en trypsine: 3gg/mL Multiplicité d'infection (Moi): voir sur le graphique exprimé en TCID50/cellule Temperature of incubation: 34 C 3.3.3 EVALUTION DE LA PRODUCTIVITE VIRALE PAR ESTIMATION 5 DE LA CONCENTRATION DE HA DANS LE SURNAGEANT DE CULTURE 3.3. 3.1 Souche A/H1N1/New Caledonia/20/99 (Cf Figure 11A) Conditions expérimentales: Boite de Pétri de 150mm (100mL final) Milieu de culture: Optipro medium(GIBCO BRL) complémenté avec 4mM LGlutamine Ensemencement dans 40 mL de milieu à 1.106 cells.mL-1, 24h avant l'infection Vitesse d'agitation des boites de pétri: 50 rpm Concentration en trypsine: 3 g/mL Multiplicité d'infection (Moi): voir sur le graphique exprimé en TCID50/cellule Temperature of incubation: 34 C 3.3.3.2 Souche A/H3N2/Wyoming/03/2003 (Cf Figure N 1 1 B) Conditions expérimentales: Boite de Pétri de 100 mm de type ULA Milieu de culture: Optipro medium(GIBCO BRL) complémenté avec 4mM LGlutamine Ensemencement dans 10 mL de milieu à 1.106 cells.mL-' , 24h avant l'infection 25 Vitesse d'agitation des boites de pétri: Orpm Concentration en trypsine: 3 gg/mL Multiplicité d'infection (Moi): voir sur le graphique exprimé en TCID50/cellule Temperature of incubation: 34 C 3.3.3.3 Souche B/Johannesburg/5/99 (Cf Figure N 12) Conditions expérimentales: Boite de Pétri de 100 mm de type ULA Milieu de culture: Optipro medium(GIBCO BRL) complémenté avec 4mM LGlutamine Ensemencement dans 10 mL de milieu à 1. 106 cells.mL-' , 24h avant l'infection 5 Vitesse d'agitation des boites de pétri: Orpm Concentration en trypsine: 3gg/mL Multiplicité d'infection (Moi): voir sur le graphique exprimé en TCID50/cellule Temperature of incubation: 34 C REVENDICATIONS 1. Lignées de cellules aviaires EBx diploïdes, non-tumorigènes, immortelles et non transformées, caractérisées en ce que lesdites cellules présentent: une morphologie ronde et compacte de cellules souches embryonnaires aviaires et un rapport nucléo-cytoplasmique élevé ; un temps de doublement de sa population comprise entre 15 et 30 heures, de préférence entre 16 et 24 heures; une activité alcaline phosphatase endogène; - une activité télomérase endogène; une réactivité avec des anticorps spécifiques dirigés contre les marqueurs SSEA-1 (TEC01) et EMA1 et les récepteurs de surface cellulaire contenant des oligosaccharides SAa2-3 et SAa2-6. 2. Lignée selon la revendication 1 de cellules EB45, de sexe mâle, adhérentes, obtenue à partir de cellules provenant de disques blastodermiques d'embryon de poulet de la souche S86N. 3. Lignée selon la revendication 1 de cellules EB14 ou EB14-0-74, de sexe mâle, 20 non adhérente, obtenue à partir de cellules provenant de disques blastodermiques d'embryon de poulet de la souche S86N. 4. Utilisation d'une lignée selon l'une des revendications 1 à 3 pour la réplication de virus. 5. Utilisation selon la revendication 4 pour la production de vaccin prophylactique ou thérapeutique contre une infection provoquée par un virus. 6. Utilisation selon les revendications 4 et 5 caractérisée en ce que ledit virus est le virus de l'influenza sélectionné parmi le virus de l'influenza humain, le virus de l'influenza aviaire, le virus de l'influenza équin, le virus de l'influenza porcin, le virus de l'influenza félin. 7. Utilisation selon la revendication 6 caractérisée en ce que ledit virus de l'influenza est sélectionné parmi les sous-types A, B et C. 8. Utilisation selon la revendication 7 caractérisée en ce que ledit virus de 5 l'influenza est le sous-type A sélectionné parmi les souches H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H7N7 et H9N2. 9. Utilisation selon la revendication 7 caractérisée en ce que ledit virus de l'influenza est le sous-type B, choisi de préférence parmi B/Porto Rico/8/34, B/Johannesburg/5/99, B/Vienna/1/99, B/Ann Arbor/1/86, B/Memphis/1/93, B/Harbin/7/94, N/Shandong/7/97, B/Hong Kong/330/01, B/Yamanashi/166/98. 10. Procédé de production d'un virus de l'influenza comprenant les étapes de: a. infection des cellules d'une lignée celluaire selon l'une des revendications 1 à 3 avec le virus de l'influenza dans un milieu de culture cellulaire; b. culture des cellules ainsi infectées à l'étape a) dans des conditions de culture permettant la réplication dudit virus; c. récolte du virus entier produit dans le surnageant de culture et/ou dans lesdites cellules en culture. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que le virus est sélectionné dans un groupe composé d'un virus sauvage, d'un isolat viral primaire obtenu à partir d'un individu infecté, d'un virus recombinant, d'un virus atténué, d'un virus adapté aux basses températures, d'un virus sensible à la température, d'un virus réassorti, d'un virus produit par génétique inverse. 12. Procédé selon l'une des revendications 10 et 11 caractérisé en ce que l'étape b) comprend l'adjonction d'une enzyme protéolytique dans le milieu de culture, dans des conditions suffisantes pour assurer la propagation du virus dans la culture. 13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que ladite enzyme protéolytique est sélectionnée parmi la trypsine, la chymotrypsine, la pepsine, la pancréatine, la papaïne, la pronase et la carboxypeptidase. 14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que l'enzyme est la trypsine dans une concentration comprise entre environ 1 et environ 25 g/ml de milieu de culture liquide. 15. Procédé selon l'une des revendications 10 à 14 caractérisé en ce que 10 l'infection et la culture desdites cellules est réalisée dans un milieu de culture dépourvu de sérum d'origine animale. 16. Procédé de préparation d'un vaccin viral caractérisé en ce qu'il comprend: - la production d'un virus de l'influenza par un procédé selon l'une des 15 revendications 10 à 15; et - l'inactivation du virus récolté à l'étape c) du procédé selon l'une des revendicaitons 10 à 15. 17. Procédé de préparation d'un vaccin viral selon la revendication 16 20 comprenant en outre l'étape d'inactivation du virus récolté. 18. Procédé de préparation de protéines antigéniques de surface à partir du virus entier de l'influenza produit selon le procédé de l'une des revendications 10 à 15, et comprenant les étapes additionnelles de: a) facultativement, traitement du liquide contenant le virus entier obtenu à partir de la culture cellulaire avec une enzyme de digestion de l'ADN; b) adjonction d'un détergent cationique; et c) isolement des protéines antigéniques de surface. 19. Procédé selon l'une des revendications 10 à 18 caractérisé en ce que le virus est le virus de l'influenza, de préférence sélectionné parmi le virus de l'influenza humain, le virus de l'influenza aviaire, le virus de l'influenza équin, le virus de l'influenza porcin, le virus de l'influenza félin. 20. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que le virus est le sous-5 type A du virus de l'influenza sélectionné de préférence parmi les souches H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H7N7 et H9N2. 21. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que le virus est le sous-type B du virus de l'influenza sélectionné de préférence parmi les souches B/Porto Rico/8/34, B/Johannesburg/5/99, B/Vienna/1/99, B/Ann Arbor/1/86, B/Memphis/1/93, B/Harbin/7/94, N/Shandong/7/97, B/Hong Kong/330/01, B/Yamanashi/166/98. 22. Vaccin contre le virus de l'influenza, de préférence vaccin tué obtenu par le procédé selon la revendication 17. 23. Vaccin contre le virus de l'influenza, de préférence vaccin vivant atténué, caractérisé en ce que dans sa forme prête-à-l'emploi, ledit vaccin comprend essentiellement le surnageant de culture des cellules EBx, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendication 10 à 16. 24. Vaccin contre le virus de l'influenza à base de protéine(s) antigènique(s) de surface susceptible(s) d'être obtenue(s) à partir de virus de l'influenza propagés en culture dans les cellules EBx par le procédé selon l'une des revendications 18 à 21. 25. Vaccin selon l'une des revendications 22 à 24 caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un agent stabilisant et/ou un adjuvant. 26. Vaccin selon l'une des revendications 22 à 25 caractérisé en ce que ledit vaccin est sous la forme d'une préparation liquide, d'une préparation congelée, d'une préparation desséchée et congelée, optionnellement adaptée pour une administration intra-nasale. 27. Utilisation d'un vaccin selon l'une des revendications 22 à 26 pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique d'une infection par le virus de l'influenza (grippe). 28. Utilisation de lignées de cellules EBx selon l'une des revendications 1 à 3 pour la production de virus de l'influenza réassortants. 29. Utilisation de lignées de cellules EBx selon l'une des revendications 1 à 3 pour la production de virus de l'influenza réassortants obtenus par génétique inverse.