FR 2884146 A1 20061013 FR 0503474 A 20050407 La présente invention est relative à une composition comprenant des cellules souches embryonnaires de souris, notamment engagées dans une voie de différenciation vers une lignée cellulaire, à titre de composition thérapeutique destinée à un Primate, en particulier à l'Homme. L'invention a également pour objet l'utilisation de ces cellules souches embryonnaires pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée au remplacement ou à la régénération de cellules ou de tissus chez un primate. En particulier, l'invention a pour objet l'utilisation de ces cellules souches embryonnaires différentiées en cardiomyocytes pour le traitement de l'insuffisance cardiaque chez l'homme. La présente invention a pour domaine la thérapie cellulaire de type régénératrice. Cette thérapie a pour objectif de remplacer des cellules anormales ou disparues par des cellules saines. Parmi les traitements que l'on peut envisager par ce type de thérapie, les perspectives sont: le traitement de certains cancers (sang, foie, ...), du diabète, des maladies liées à la dégénérescence (Alzheimer, Parkinson, ...), des brûlures et maladies de peau. De par leur capacité régénératrice, les cellules souches constituent des outils prometteurs pour de nouvelles approches thérapeutiques. Au cours de la dernière décennie, la thérapie cellulaire est progressivement apparue comme un nouveau traitement possible de l'insuffisance cardiaque d'origine ischémique. Le rationnel sous-jacent est que la défaillance de la fonction ventriculaire gauche est globalement proportionnelle au nombre de cardiomyocytes perdus à la suite d'un (ou plusieurs) infarctus du myocarde et qu'on peut donc espérer améliorer cette fonction en repeuplant les zones nécrosées avec des cellules neuves (1). L'intérêt porté à cette approche, largement sous- tendue par les progrès accomplis en matière de biologie du développement, tient à la prise de conscience de deux facteurs déterminants: - le caractère inquiétant des constatations épidémiologiques concernant l'insuffisance cardiaque (500 000 nouveaux cas par an aux Etats-Unis, environ 120 000 en France avec une incidence qui a augmenté de 148 % entre 1979 et 2000 et ne peut que continuer à croître avec le vieillissement de la population), et - les limites des traitements actuels (2). En effet, en dépit des progrès des traitements médicaux, de la resynchronisation bi-ventriculaire et de la transplantation cardiaque, le pronostic reste sevère avec une mortalité de 40 % pour les patients en classes III-IV de la New York Heart Association (NYHA) et un risque de mort subite multiplié par 6-9 par rapport à la population générale. Le corollaire financier en est un coût considérable, largement du aux hospitalisations itératives, et qu'on estime à environ 5 % du budget total de la santé dans les pays industrialisés. Les myoblastes (ou cellules satellites) squelettiques ont été les premières cellules à être utilisées en clinique en raison de leurs multiples avantages: origine autologue, capacité d'expansion en culture, risque tumoral quasi-nul en raison de leur degré de différenciation avancé et forte résistance à l'ischémie. Aujourd'hui, près d'une quarantaine d'études expérimentales (pour une revue, voir (3)), chez le petit et le gros animal, ont établi que les myoblastes implantés dans des zones de myocarde nécrosé, conservaient leur capacité de différenciation en myotubes et amélioraient la fonction ventriculaire gauche par des mécanismes qui restent encore à élucider mais au sein desquels les effets paracrines (sécrétion de facteurs de croissance et de cytokines agissant sur le remodelage de la matrice extra-cellulaire et/ou le recrutement de cellules souches cardiaques quiescentes) semblent jouer un rôle important. Ces travaux expérimentaux ont ouvert la voie aux premiers essais cliniques en Juin 2000 chez 10 patients atteints d'insuffisance cardiaque ischémique sévère (4). Cette étude chirurgicale et les quelques autres qui l'ont suivie (5-8) ont principalement permis d'établir la faisabilité de ces greffes de myoblastes cultivés pendant 2-3 semaines en conditions GMP avant leur implantation chirurgicale (habituellement couplée à des pontages coronaires en zones non infarcies) et la bonne tolérance de la procédure, sous réserve d'un risque accru de troubles du rythme ventriculaire dont la causalité avec la transplantation des cellules reste encore à établir en raison du caractère intrinséquement arythmogène de la maladie cardiaque sous-jacente. En revanche, les caractéristiques méthodologiques de ces essais de phase I (petits effectifs, absence de groupes contrôles, revascularisation associée par pontage coronaire) interdisent toute conclusion définitive quant à l'efficacité de ces transplantations de myoblastes. Tout au plus peut-on souligner le caractère encourageant des résultats rapportés qui a incité à mettre en oeuvre un essai randomisé, multicentrique, contrôlé contre placebo et aveugle (MAGIC, acronyme de Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopathy) actuellement en cours de réalisation en France et dans plusieurs pays européens. Les résultats de cette étude devraient permettre de dégager des conclusions pertinentes sur la capacité des implantations de cellules myogèniques à améliorer la contractilité des zones initialement akinétiques et l'éventuelle traduction de ce bénéfice sur l'évolution clinique des patients. De plus, l'implantation systématique d'un défibrillateur automatique chez tous les patients inclus devrait permettre, grâce à la lecture des enregistrements Holter intégrés, de comparer l'incidence des arythmies ventriculaires entre les groupes contrôles (injection de liquide de culture seul) et transplantés. Rapidement, les cellules de la moelle sanguine ont été les secondes à faire l'objet d'essais cliniques. A ce jour, toutefois, la plupart des études ont porté sur des injections intra-coronaires de moelle non fractionnée (et par conséquent, essentiellement constituée de cellules mononuclées) en complément d'une procédure interventionnelle (angioplastie et endoprothèse) chez des patients vus au stade aigu de l'infarctus du myocarde (9). Plus rares, et au demeurant moins convaincants, sont les essais portant sur des injections, percutanées ou chirurgicales, de cellules, mononuclées ou sélectionnées (progéniteurs hématopoïétiques CD 133+) chez des patients présentant une insuffisance cardiaque chronique en rapport avec des séquelles de nécrose (10, 11). Dans ce contexte de plaques fibreuses où les signaux permettant d'orienter la différenciation des cellules implantées ont sans doute disparu, les preuves expérimentales (et cliniques) d'efficacité sont minces (par opposition aux lésions ischémiques fraîches où la présence probable de ces signaux explique sans doute les effets essentiellement angiogèniques des cellules médullaires). Quels que soient les avantages de ces différents types cellulaires et les résultats des essais cliniques en cours, ils ont en commun une limite majeure: le caractère très limité de la plasticité des cellules adultes interdisant leur transformation en cardiomyocytes. Cette limite vaut sans équivoque pour les myoblastes squelettiques (12) mais aussi, en dépit des espoirs qu'avait initialement suscité la notion de transdifférenciation, pour les cellules médullaires (13, 14). En particulier, les cellules greffées n'expriment pas les protéines de jonction leur permettant de se connecter avec les cardiomyocytes du receveur; de ce fait, elles ne forment pas avec ces derniers un véritable syncytium qui est pourtant le prérequis pour que les cellules greffées puissent se contracter de façon synchrone avec les cellules de l'hôte (15) et contribuer ainsi à améliorer la fonction systolique. On peut déduire de ces observations que les deux conditions principales pour que les cellules greffées atteignent cet objectif de régénération myocardique sont: - une capacité d'intégration électro-mécanique dans le myocarde receveur, et - des propriétés contractiles leur permettant de générer une force active en réponse à un stimulus électrique approprié. De façon non surprenante, il apparaît que les cellules satisfaisant le mieux à ces impératifs sont les cellules cardiaques elles-mêmes dont on peut concevoir, dans une perspective thérapeutique, trois sources principales: - Les cellules cardiaques foetales: Elles ont permis, il y a une dizaine d'années, d'établir la preuve du concept lorsqu'il a été montré, sur des modèles murins, que ces cellules pouvaient survivre dans les zones d'infarctus où elles avaient été implantées et que leur présence était associée à une amélioration de la fonction cardiaque (16, 17) ; plus récemment, des études électrophysiologiques ont confirmé la capacité de couplage électro-mécanique des cardiomyocytes foetaux dans le myocarde hôte avec, notamment, une parfaite synchronisation des transitoires calciques entre cellules du donneur et cellules du receveur (18). Toutefois, les problèmes éthiques, pratiques (disponibilité) et immunologiques rendraient complexe une éventuelle utilisation clinique. - Les cellules souches cardiaques: De découverte plus récente (19), elles remettent en cause le dogme du coeur conçu comme un organe terminalement différencié et donc sans aucune capacité d'auto- régénération. Au moins quatre problèmes majeurs restent toutefois en suspens: - le nombre résiduel de ces cellules dans un coeur adulte, - l'effet de barrière que pourrait constituer la cicatrice de l'infarctus à l'égard de la diffusion de signaux de recrutement et, en sens inverse, de la migration des cellules ainsi recrutées depuis leurs niches vers le territoire infarci à réparer, - le rôle éventuellement inhibiteur de la contraction du myocarde sain à l'égard de cette migration, et - les possibilités de croissance et de différenciation des cellules mobilisées au sein d'un tissu nécrosé. De plus, les équipes qui ont à ce jour décrit ces cellules les ont identifiées par des marqueurs tous différents (Sca 1, c-kit, SP et Isl-1) qui seraient mutuellement exclusifs, ce qui conduit à s'interroger sur le phénotype réel de ces progéniteurs cardiaques. Enfin, les conditions dans lesquelles ces cellules souches pourraient être exploitées dans un but thérapeutique (prélèvement par biopsie endomyocardique, expansion in vitro puis réinjection ou mobilisation in situ par des agents pharmacologiques) restent encore imprécises. - Les cellules souches embryonnaires: Caractérisées par une capacité de multiplication théoriquement infinie et une pluripotence ou totipotence leur permettant de donner naissance aux tissus issus des trois feuillets embryonnaires, ces cellules paraissent particulièrement bien adaptées à une thérapeutique à visée dans la mesure où elles ont la possibilité d'orienter leur différenciation vers la lignée cellulaire qu'elles sont supposées remplacer. Il n'existe aujourd'hui que peu d'espèces chez lesquelles les cellules souches embryonnaires ont été isolées et assez bien caractérisées: l'homme, primate non humain et la souris. Concernant les cellules souches embryonnaires humaines, on peut envisager leur utilisation sous deux formes: - L'autogreffe: Peut-être l'idéal et nul ne peut dire si cet objectif ne sera pas un jour atteint est-il de cloner une cellule du futur receveur par transfert de son noyau dans un ovocyte énucléé, puis d'isoler, d'expandre et de pré-différencier les cellules du blastocyste ainsi généré avant de les réinjecter au patient. Nul n'est besoin d'insister sur les considérables problèmes éthiques, réglementaires, techniques et économiques de ce clonage dont on soulignera d'ailleurs que le qualificatif de thérapeutique qui lui est communément accolé doit encore être validé par des études expérimentales (20). - L'allogreffe: Les modifications récentes de notre législation autorisent désormais l'accès à des lignées de cellules souches embryonnaires humaines importées et, dès que l'Agence de biomédecine sera opérationnelle, dérivées d'embryons congelés surnuméraires disponibles en France. L'utilisation thérapeutique éventuelle de ces lignées pose toutefois de nombreux problèmes non résolus à ce jour: les procédés d'amplification et de pré-différenciation ne sont pas complètement maîtrisés; l'immunogénicité de ces cellules une fois différenciées ne semble pas pouvoir être négligée (21) ; enfin, leur phénotype final paraît être celui de cellules assez immatures, ce qui pose la question de l'efficacité de leur contribution à la fonction cardiaque. En effet leur potentialité de spécification atriale/ventriculaire reste à être démontrée. En fait, il semblerait qu'en raison de leurs caractéristiques électro-physiologiques très particulières, les cellules souches embryonnaires humaines soient particulièrement adaptées à assurer une fonction pace-maker (22) alors que leur transformation en cardiomyocytes ventriculaires doués d'une fonctionnalité contractile reste encore plus incertaine. Compte tenu de ces limites en matière de cellules souches embryonnaires, les inventeurs ont mis en évidence la possibilité d'envisager une troisième option, celle de la xénogreffe de cellules souches embryonnaires murines chez l'homme. En dehors des arguments pré-cliniques qui font l'objet des exemples ciaprès, la xénogreffe de cellules souches embryonnaires murines chez l'homme présente des arguments pratiques tels que: - une disponibilité illimitée, - la possibilité d'orienter ces cellules vers les lignées cellulaires que l'on souhaite 15 régénérer, comme par exemple la lignée cardiomyogénique, par une technique compatible avec les normes GMP, - le contrôle du degré d'amplification permettant d'obtenir le nombre souhaité de cellules, - la caractérisation précise et la reproductibilité du produit final assurées par la mise en 20 place de banques cellulaires (master cell bank et working cell bank) constituées à partir d'une ampoule unique, - 99 % des gènes de souris ont des homologues chez l'homme et 96 % de ces derniers ont la même localisation chromosomique, et - l'utilisation de cellules dérivées d'une lignée dont la clonalité est un facteur de 25 reproductibilité et de traçabilité. A ce jour, les xénogreffes cellulaires chez l'Homme ont principalement concerné les cellules porcines, cérébrales et pancréatiques, injectées à des patients atteints de maladie de Parkinson ou de diabète avec des résultats virologiques plutôt rassurants (23, 24 et 25). On peut également citer plusieurs études qui ont comporté l'injection de cellules souches embryonnaires de souris dans des zones infarcies de coeur de rat (26-29). Globalement, leurs résultats montrent que ces cellules achèvent de se différencier in situ en cardiomyocytes qui expriment notamment les protéines constitutives des jonctions communicantes (Connexine 43). Cette évolution phénotypique est associée à une amélioration de la fonction ventriculaire gauche et à un allongement de la survie par rapport à des animaux contrôles recevant seulement le liquide de culture. Les inventeurs ont mis en évidence de manière surprenante qu'il était possible de greffer chez un ovin et chez un primate des cellules souches embryonnaires de souris pré-différenciées in vitro vers une lignée cellulaire souhaitée sans traitement immunosupresseur et sans qu'il soit observé de phénomènes de rejet de cette xénogreffe, ces cellules murines permettant de régénérer efficacement le tissu souhaité. La présente invention a donc pour objet une composition comprenant des cellules souches embryonnaires de souris à titre de composition thérapeutique destinée à un Primate, notamment à l'Homme. Selon l'invention, ladite composition est caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans une voie de différenciation vers une lignée cellulaire l'on souhaite remplacer ou introduire chez ledit Primate. Cet engagement dans la voie de différenciation est réalisé par un procédé mettant en oeuvre une étape de culture in vitro desdites cellules souches embryonnaires de souris en présence d'un facteur de différenciation, de préférence d'origine humaine. Ce(s) facteur(s) ou composé(s) permettant d'engager ou d'initier les cellules souches embryonnaires de souris vers la lignée cellulaire que l'on souhaite remplacer ou introduire chez le primate est (sont) bien connu(s) de l'homme de l'art et ne seront pas développés ici. Pour connaître ces facteurs de différenciation, on pourra par exemple citer le document Loebel et al., 2003 (46). De préférence, dans la composition de l'invention, lesdites cellules souches embryonnaires de souris ne sont pas génétiquement modifiées ou recombinées, notamment par l'incorporation d'un acide nucléique hétérélogue. La présente invention a également pour objet une composition selon l'invention, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris contiennent essentiellement, de préférence à plus de 70 %, de préférence à plus 75 %, 80 %, 85 %, %, 95 % et 99 %, des cellules souches embryonnaires de souris engagées dans ladite voie de différenciation. Selon un mode particulièrement préféré, 100 % desdites cellules souches embryonnaires de souris contenues dans la composition de l'invention sont engagées dans ladite voie de différenciation. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, lesdites cellules souches embryonnaires de souris contiennent à plus de 95 %, 98 %, de manière très préférée à plus de 99 %, des cellules souches embryonnaires de souris engagées dans ladite voie de différenciation. De préférence encore, lesdites cellules souches embryonnaires de souris ne contiennent que des cellules souches embryonnaires de souris engagées dans ladite voie de différenciation. Sous un autre aspect, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont issues d'une même lignée cellulaire, notamment de cellules souches embryonnaires de souris issues de la lignée CGR8, telle que déposée par exemple à l'ECACC sous le numéro 95011018. Avant l'étape de différenciation ou de pré-différenciation lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont préalablement cultivées dans un milieu de culture en présence d'un composé capable d'inhiber la différenciation desdites cellules souches embryonnaires, ceci afin de les faire proliférer tout en les maintenant dans cet état indifférencié. Parmi ces composés capables d'inhiber la différenciation desdites cellules souches embryonnaires, on préfère le LIF ( Leukemia Inhibitory Factor ). Ainsi, selon un mode préféré, l'invention se rapporte à une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition est obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes: a) le maintien in vitro d'une pluralité de cellules souches embryonnaires de souris indifférenciées dans un milieu de culture contenant au moins un composé capable d'inhiber la différenciation desdites cellules souches embryonnaires; et b) la culture in vitro desdites cellules souches embryonnaires indifférenciées dans un milieu de culture en absence dudit composé capable d'inhiber la différenciation, ledit milieu de culture contenant le ou les composés nécessaires pour engager les cellules souches indifférenciées dans la voie de différenciation vers la lignée cellulaire que l'on souhaite remplacer ou régénérer ou dont on souhaite reconstituer la fonction. Selon un mode particulièrement préféré, ledit procédé ci-avant comprend une étape c) dans laquelle les cellules souches embryonnaires indifférenciées sont éliminées. Parmi ces procédés comprenant une étape c) d'élimination des cellules souches embryonnaires indifférenciées, on préfère ceux comprenant une étape c) dans laquelle lesdites cellules souches embryonnaires dont la différenciation a été ainsi engagée sont purifiées soit: - par sélection négative à l'aide d'un anticorps ou ligand dirigé spécifiquement contre un marqueur spécifique de cellules souches embryonnaires indifférenciées, ces cellules ainsi sélectionnées étant éliminées de la composition thérapeutique; ou soit - par sélection positive à l'aide d'un anticorps ou ligand dirigé spécifiquement contre un marqueur spécifique du phénotype des cellules souches dont la différenciation a été initiée, seules les cellules ainsi sélectionnées étant conservées dans la composition thérapeutique. Les méthodes permettant de séparer deux populations cellulaires d'un mélange au moyen d'un marqueur spécifique de l'une des deux populations sont bien connues de l'homme de l'art. Parmi ces méthodes, on pourra citer, mais sans s'y limiter, les méthodes mettant en oeuvre une séparation magnétique à l'aide de billes magnétiques ou encore un trieur automatique de cellules, type Facscan. Selon un aspect préféré, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires dont la différenciation a été ainsi engagée sont purifiées par sélection négative à l'aide d'un anticorps anti-SSEA1, lorsque la sélection est une sélection négative ( SSEA1 pour Stage-Specific Embryonic Antigen 1 ), l'anticorps anti-SSEA1 pouvant être un anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre cet antigène SSEA1. Sous un aspect particulier, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit composé capable d'inhiber la différenciation desdites cellules souches embryonnaires est le BMP-2 et en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans la voie de différenciation en cardiomyocytes ( BMP-2 ou BMP2 pour Bone Morphogenetic Protein 2 ). Ladite protéine BMP-2 est de préférence d'origine murine ou humaine, l'origine humaine étant la plus préférée. Lesdites cellules souches embryonnaires engagées dans la voie de différenciation en cardiomyocytes, exprimeront de préférence l'un au moins ou tous les marqueurs choisis dans le groupe des marqueurs comprenant le Nkx2.5, le GATA-4 et Mef2c. Lesdites cellules souches embryonnaires engagées dans la voie de différenciation en cardiomyocytes n'exprimeront pas ou plus de marqueurs de lignées endodermiques tels que l'a-foétoprotéine, et de marqueurs ectodermiques tels que la cytokératine. Sont également comprises dans la présente invention les compositions selon l'invention dans lesquelles lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans la voie de différenciation d'autres lignées cellulaires telle que par exemple, mais sans s'y limiter, la voie de différenciation: - en hépatocytes ou tout précurseur de cette lignée cellulaire; - en cellules d'ilots pancréatiques, notamment capable de produire de l'insuline, ou tout précurseur de cette lignée cellulaire; en neurones, notamment en neurones dopaminergiques, ou tout précurseur de cette lignée cellulaire. On peut à ce sujet citer le document Lee et al. (30) montrant qu'une différenciation guidée de cellules souches embryonnaires de souris permet d'obtenir un très grand nombre de neurones produisant de la dopamine; - en cellules hématopoiétiques ou tout précurseur de cette lignée cellulaire; - en cellules ostéogéniques ou tout précurseur de cette lignée cellulaire; - en chondrocytes ou tout précurseur de cette lignée cellulaire; - en cellules mésenchymateuses ou tout précurseur de cette lignée cellulaire; - en oligodendrocytes ou tout précurseur de cette lignée cellulaire; ou - en cellules musculaires lisses ou striées ou tout précurseur de ces lignées cellulaires. Sous un autre aspect, la présente invention comprend l'utilisation d'une composition selon l'invention dans le cadre d'une thérapie cellulaire destinée à un primate, de préférence à l'Homme, notamment pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au remplacement ou à la régénération de cellules ou de tissus chez ledit primate, ce remplacement ou cette régénération permettant également de reconstituer la fonction de ces cellules. Dans un mode préféré, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires dont la différenciation a été engagée sont transplantées chez ledit Primate. De préférence, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce qu'aucun traitement immunosuppresseur n'est par ailleurs administré chez ledit Primate. Sous un aspect particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation selon l'invention, dans laquelle lesdites cellules souches embryonnaires de souris de la composition selon l'invention sont engagées dans la voie de différenciation en cardiomyocytes, pour le traitement de l'insuffisance cardiaque, de préférence pour le traitement de l'insuffisance cardiaque ischémique grave mais sans exclure les insuffisances cardiaques d'origine non ischémique. Dans un mode préféré, lesdites cellules souches embryonnaires de souris engagées dans la voie de différenciation en cardiomyocytes sont introduites dans au moins une des zones infarcies du coeur d'un patient ayant subi préalablement un infarctus du myocarde et/ou dans la périphérie d'une des zones infarcies du coeur et/ou le long de l'interface d'une zone nécrosée-myocarde sain de ce patient. Dans un mode également préféré, les cellules souches embryonnaires de souris engagées dans la voie de différenciation en cardiomyocytes sont introduites dans une quantité comprise entre 15.106 et 150.10' cellules, de préférence entre 50.106 et 750.106 cellules, entre 100.106 et 750.106 cellules et entre 125.106 et 200.106 cellules. 150.106 cellules sont particulièrement préférées. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite quantité de cellules est introduite sous la forme de 3 injections ou plus, de préférence dans une des zones infarcies du coeur, dans la périphérie d'une des zones infarcie du coeur et le long de l'interface d'une zone nécrosée-myocarde sain du coeur. Sous un autre aspect particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation selon l'invention, dans laquelle ladite composition est une composition selon l'invention contenant des cellules souches embryonnaires de souris engagées dans la voie de différenciation en hépatocytes ou tout précurseur de cette lignée cellulaire, pour le traitement de maladie nécessitant la régénération de tissu hépatique, notamment pour le traitement de l'hépatite fulminante, de l'hépatite chronique, de la cirrhose ou du cancer du foie ou encore pour toute maladie du foie impliquant une perte, notamment progressive, de la fonction hépatique. Sous un autre aspect particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation selon l'invention, dans laquelle ladite composition est une composition selon l'invention contenant des cellules souches embryonnaires de souris engagées dans la voie de différenciation en cellules d'ilots pancréatiques, de préférence en cellules béta, notamment capables de produire de l'insuline, ou tout précurseur de cette lignée cellulaire, pour le traitement du diabète, notamment de type 1. La thérapie cellulaire appliquée aux maladies du système nerveux a également donné depuis une dizaine d'années des résultats cliniques prometteurs. Parmi ces maladies on peut citer la maladie de Parkinson ou de Huntington dont le traitement peut être envisagé par greffe neuronale. Ainsi sous un autre aspect particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation selon l'invention, dans laquelle ladite composition est unecomposition selon l'invention contenant des cellules souches embryonnaires de souris engagées dans la voie de différenciation en neurones, pour le traitement de maladie liée à une altération du système nerveux, de préférence pour le traitement de maladies neurodégénératives. Parmi ces maladies, on peut citer la maladie de Parkinson, de Huntington ou d'Alzheimer. La présente invention a également pour objet l'utilisation selon l'invention, dans laquelle ladite composition est une composition selon l'invention contenant des cellules souches embryonnaires de souris engagées dans la voie de différenciation en cellules médullaires, en cellules de la moelle épinière ou tout précurseur de cette lignée cellulaire pour le traitement des atteintes de la moelle épinière comme notamment le traitement de paraplégie. Sous un autre aspect particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation selon l'invention, dans laquelle ladite composition est une composition selon l'invention contenant des cellules souches embryonnaires de souris engagées dans la voie de différenciation en cellules hématopoiétiques ou tout précurseur de cette lignée cellulaire, pour le traitement de maladies nécessitant la régénération de cellules sanguines, telles que les érythrocytes, les érythroblastes, les neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles, les monocytes, les macrophages, les mégacaryocytes, les plaquettes ou les lymphocytes, ou pour le traitement de maladies nécessitant la reconstitution d'une des fonctions hématopoiétiques attachées à ces cellules. Parmi ces maladies, on peut citer la leucémie. Sous un autre aspect particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation selon l'invention, dans laquelle ladite composition est une composition selon l'invention contenant des cellules souches embryonnaires de souris engagées dans la voie de différenciation en cellules ostéogéniques, pour le traitement de maladies liées à des troubles du développement osseux ou de maladies nécessitant la régénération de tissus osseux. Sous un autre aspect particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation selon l'invention, dans laquelle ladite composition est une composition selon l'invention contenant des cellules souches embryonnaires de souris engagées dans la voie de différenciation en chondrocytes ou tout précurseur de cette lignée cellulaire, pour le traitement de maladies liées à un trouble de la croissance des cartilages ou de l'arthrose, ou de maladies nécessitant la régénération de tissus cartilagineux. Sous encore un autre aspect particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation selon l'invention, dans laquelle ladite composition est une composition selon l'invention contenant des cellules souches embryonnaires de souris engagées dans la voie de différenciation en oligodendrocytes ou tout précurseur de cette lignée cellulaire, pour le traitement maladies nécessitant la régénération de ces cellules, en particulier de la myéline, notamment pour le traitement de la sclérose en plaques. La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples et des figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDES DES FIGURES Figures lA et 1B. Engagement des ESC murines dans la voie de différenciation en cellules cardiaques induit par BMP2 ( ESC pour Cellules Souche Embryonnaires) On a traité les ESC avec 2,5 ng/mL de BMP2 pendant 36 h avant l'extraction d'ARN ou l'analyse de SSEA-1 par FACS. Figure lA: On a quantifié les ARNm codant Nkx2.5, Mef2c, GATA4, Mespl, Mesp2, Tbx6 et l'c -actine par une PCR en temps réel et on les a normalisés vis-à-vis de l'expression de la tubuline. Les résultats sont exprimés sous la forme du taux d'induction par rapport à la teneur de base en ARNm extraits des cellules non traitées. Figure 1B: Analyse par FACS de l'expression de SSEA-1 dans les cellules non traitées ou les ESC traitées par BMP2. Dans des conditions de contrôle, 80 à 90 % des cellules non traitées ont exprimé SSEA-1, ce qui indique que 10 à 20 % des cellules se sont spontanément différenciées vers des cellules trophoectodermiques. La figure est représentative de deux expériences séparées. Figures 2A à 2D. Différenciation in situ des cellules ES murines dans le myocarde de mouton infarci On a injecté 30 106 ESC murines CGR8 génétiquement modifiées pour exprimer à la fois la f3-galactosidase et la protéine fluorescente jaune stimulée (EYFP) sous le contrôle de la transcription des promoteurs de Nkx2.5 et a-actine spécifiques cardiaques, respectivement dans le myocarde de mouton après l'infarctus. Un mois après la greffe cellulaire, on a effectué des cryosections de la zone cicatricielle du myocarde (figure 2A). On a visualisé les cellules cardiaques dérivées des ESC exprimant la f3-galactosidase en utilisant XGal en tant que substrat. On a acquis les images par microscopie à champ large en utilisant une caméra TCC couleur (figure 2B). Les cellules cardiaques dérivées des ESC exprimant EYFP ont été révélées par immunocoloration en utilisant un anticorps anti-GFP. L'insert montre l'organisation sarcomère des cellules exprimant EYFP à un grossissement élevé. Le panel de droite montre l'immunocoloration de contrôle effectuée dans une section d'un myocarde auquel on a injecté un milieu de culture. On a acquis les images par microscopie confocale (figure 2C). On a extrait l'ARN des cryosections auxquelles on a greffé du milieu (CTL) et auxquelles on a greffé des cellules ES (ES2A1 et ES4C1) du myocarde de mouton. On a amplifié la 13-galactosidase et EYFP par RT-PCR. On a répété les expériences dans 5 à 10 sections de chaque coeur de mouton. Deux exemples de gels de PCR sont montrés dans (figure 2D). Figures 3A à 3H. Etape de différenciation des cellules cardiaques murines dérivées de ESC dans le myocarde de mouton infarci On a immunocoloré les cryosections des coeurs auxquels on a greffé des ESC en utilisant des anticorps anti-Nkx2.5 et anti-Ki67 révélés par un anticorps secondaire conjugué à alexa-fluor488- (figure 3A) ou alexa-fluor546-(figure 3B), respectivement. On a acquis les images par microscopie confocale et on en a fusionné 18 en utilisant le logiciel ZEISS LSM510(figure 3D: traduire merged par fusionné ). On a imagé la zone cicatricielle en utilisant une lumière transmise enregistrée par un module d'analyse de la lumière d'un microscope confocal LSM510 META (section optique 1 m) (figure 3C: traduire scar areea par zone cicatricielle ). On a immunocoloré les cryosections en utilisant un anticorps secondaire anti-/3-MHC et un anticorps secondaire conjugué au alexa-fluor546 et on les a fusionnées avec l'image de la lumière transmise. L'insert montre l'organisation sarcomère des cellules positives à /3-MHC (figure 3E). On a intégré les cellules positives à /3-MHC au niveau cellulaire dans la zone cicatricielle (figure 3F). On immunocoloré les cryosections en utilisant un anticorps anti-/3-galactosidase et un anticorps anti-Cx43. On a révélé l'expression de la 13-galactosidase et de Cx43 par un anticorps secondaire conjugué à alexa-fluor488 ou à alexa-fluor546, respectivement (figure 3G). On a effectué une cartographie FISH en utilisant une fente chromosomique marquée à la fluorescéine de mouton sur des cryosections de myocarde de mouton auquel on a greffé des ESC de souris par un anticorps primaire anti-/3-MHC et un anticorps secondaire conjugué à alexa640. Les cartographies chromosomiques des noyaux colorés par DAPI dans la zone cicatricielle sont montrées par des flèches (figure 3H). Figures 4A et 4B. Amélioration de la fonction contractile par la greffe des ESC murines dans le myocarde infarci de mouton On a surveillé des fractions d'éjection ventriculaire gauche de base (LVEF) 1 mois après la greffe cellulaire et on les a comparées à la valeur mesurée deux semaines après l'infarctus avant la greffe des ESC dans un myocarde témoin (myocarde de mouton auquel on a injecté du milieu de culture) et un myocarde greffé par des ESC (*, p = 0,011; p=0,002) (figure 4A). On a également surveillé les volumes de fin de systole de LV (LVESV) dans les deux conditions expérimentales (*, p = 0,015 contre la valeur de base respective et., p=0,015 contre le groupe traité) (figure 4B). Figure 5. Gel de RT-PCR quantitative On a amplifié l'ARNm d'afcetoprotéine par PCR quantitative en temps réel puis puis séparé sur un gel. ESC: ARN des ESC non différenciées; ESC- greffées: ARN des 2 sections myocardiques de mouton greffées par des ESC. Figure 6. La co-culture des cellules ES et des myofibroblastes induit leur différenciation en cardiomyocytes battants. Figure 7. Mouton témoin: le myocarde infarci est remplacé par du tissu cicatriciel fait de tissu fibreux avec certains vaisseaux et des cellules inflammatoires mononucléaires peu abondantes. Mouton greffé : le tissu de l'infarctus présente le même modèle que le tissu de contrôle, en particulier sans différence quelconque pour les cellules inflammatoires. Coloration à 1'hématoxyline/éosine.X10. Figure 8. Fraction d'éjection ventriculaire gauche de contrôle (coeurs auxquels on a injecté un milieu de culture), et myocarde greffé par des ESC d'un mouton immunodéprimé (ciclo+) ou non (ciclo-). EXEMPLE 1: Amélioration du fonctionnement du ventricule gauche dans le myocarde d'un mouton infarci après xénogreffe de cellules souches embryonnaires engagées dans une voie de différenciation vers des cellules cardiaques Cet exemple met en évidence que la xénogreffe de ESC mutine engagées dans 20 une voie de différenciation vers des cellules cardiaques dans le myocarde infarci d'un mouton se différencie en cardiomyocytes matures exprimant des connexines. La colonisation de la zone cicatricielle par les ESC s'accompagne d'un bénéfice fonctionnel pour le myocarde défaillant. Ces résultats obtenus dans un grand modèle animal pertinent d'un point de vue clinique de défaillance cardiaque ouvrent la voie à une utilisation thérapeutique potentielle des ESC pour régénérer un myocarde avec un dysfonctionnement ventriculaire gauche grave. Pour déterminer si le privilège immunitaire des ESC peut permettre de les greffer au travers des barrières spécifiques à une espèce et à un individu, nous avons effectué une greffe d'ESC murines marquées génétiquement et engagées dans une voie de différenciation vers des cellules cardiaques dans un myocarde de mouton infarci (31). A - MATERIELS ET METHODES a) Génération de clones de cellules souches exprimant deux gènes indicateurs Le clone d'une cellule ES CGR8 cultivé comme décrit au préalable (32) est génétiquement modifié pour qu'il exprime la (3galactosidase sous le contrôle du promoteur Nkx2.5 et la protéine fluorescente jaune stimulée (ECFP) sous le contrôle du promoteur de l'or actine spécifique du coeur, sous cloné en amont de EYFP en utilisant les sites de restriction Xho I et Hindlll du vecteur pEYFP sans promoteur (Clonetech). On a linéarisé l'hybride actine-EYFP en utilisant Xho 1, et Nkx(3Gal par Sall/Xhol. On a effectué une électroporation des deux hybrides dans les cellules souches CGR8, et on a dépisté les colonies pour l'hybride par PCR après dix jours de traitement avec G418. b) Modèle d'un coeur défaillant On a créé un infarctus du myocarde chez un mouton de 45 à 50 kg par embolisation intra coronarienne sous contrôle fluoroscopique (31). Deux semaines plus tard, on a approché le coeur par une thoracotomie gauche et on a injecté 30 x 106 cellules murines destinées au coeur dans 25 sites (1,2 x 106 cellules/site) sur les bords et dans le centre de la zone infarcie. En tant que témoin, on a effectué 25 injections de milieu de culture sans sérum (DMEM) dans le myocarde infarci. On a repéré les zones d'injection par de petits points de suture. On a immunodéprimé cinq animaux par cyclosporine (500 mg/kg/jour), en commençant 5 jours avant la greffe et en continuant par la suite de manière ininterrompue. Ce régime avait été déterminé à partir d'études pilotes et il a été couronné de succès pour atteindre des niveaux sériques de cyclosporine moyens de 390 pg/Ml. c) Coloration de la section myocardique et microscopique confocale Après euthanasie, on a effectué un explant du coeur et on l'a congelé. On a récolté des cryosections coupées en parallèle à la direction de la fibre prédominante sur des lames superfrost et on les a gardées à -80 C. On a décongelé les sections, on les a perméabilisées avec 1 % de TRITON X100TMet on les a bloquées avec du PBS complété avec 3 % de BSA avant l'addition de l'anticorps primaire et ensuite de l'anticorps secondaire conjugué à Alexa. Les anticorps primaires comprennent anti-a- MHC (32), Cx43 et /3-galactosidase (Sigma), -Nkx2.5 (Santa Cruz), -Ki67 (Dako) spécifiques. Des images ont été acquises en tant qu'images de 1024 x 1024 pixels en utilisant un microscope confocal (ZEISS LSM 510) laser Arg/Xe (488 nm) ou He (543 nm), des miroirs dichroïques et des filtres de gamme étroite 500-530 nm ou 530-600 nm respectivement. L'étendue des cardiomyocytes dérivés des ESC positifs à f3-MHC dans la zone cicatricielle a été quantifiée en utilisant le logiciel MetaMorphTM (Universal Imaging Corporation) (procédé par seuillage)). d) RT-PCR et PCR quantitative en temps réel On a extrait l'ARN de cryosections et on a effectué une transcription inverse en utilisant RT de MuMLV. On a ensuite effectué une PCR de l'ADNc en utilisant une polymérase taq (Invitrogen) comme décrit au préalable (32). Les séquences des amorces étaient: - pour la 13-galactosidase sens 5'TTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGA-3' (SEQ ID No. 1), et anti-sens 5' ATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCT 3'(SEQ ID No. 2) ; - pour EYFP sens 5'ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3'(SEQ ID No. 3), et anti-sens 5'AAGTCGTGCTGCTTCATGTG-3'(SEQ ID No. 4) ; et - pour la tubuline sens 5'CTTCGTGGAATGGATCCCCAACAA-3'(SEQ ID No. 5), et anti-sens 5'GGAAAGCCTTCCGACGGAACATTG-3' (SEQ ID No. 6). On a effectué des contrôles négatifs en l'absence de RT. On a préparé l'ARN total à partir des cellules souches CGR8 en utilisant un kit (Enzo, USA). Après la transcription inverse, on a utilisé 10 ng d'ADNc pour une PCR quantitative en temps réel, effectuée avec un LightcyclerTM et le kit SYBR green fast startTM (Roche, Allemagne). Les séquences d'amorces utilisées dans la PCR en temps réel étaient - pour Nkx2.5 sens 5'ACATTTTACCCGGGAGCCTACGGTG-3'(SEQ ID No. 7), et anti-sens 5'GCTTTCCGTCGCCGCCGTGCGCGTG-3' (SEQ ID No. 8) ; - pour GATA4 sens 5'GGTTCCCAGGCCTCTTGCAATGCGG-3' (SEQ ID No. 9), et anti-sens 5'AGTGGCATTGCTGGAGTTACCGCTG-3' (SEQ ID No. 10) ; - pourMef2c sens 5'AGATACCCACAACACACCACGCGCC-3' (SEQ ID No. 11), et anti-sens 5'ATCCTTCAGAGAGTCGCATGCGCTT-3' (SEQ ID No. 12) ; - pour Tbx6 sens 5'AGGCCCGCTACTTGTTTCTTCTGG-3' (SEQ ID No. 13), et anti-sens 5'TGGCTGCATAGTTGGGTGGCTCTC-3' (SEQ ID No. 14) ; 5 - pour Mesp 1 sens 5'GCGACATGCTGGCTCTTCTA-3' (SEQ ID No. 15), et anti-sens 5'TGGTATCACTGCCGCCTCTTCC-3' (SEQ ID No. 16) ; - pour Mesp2 sens 5'GTGCCTTTATCTGCCTCTTCTG-3' (SEQ ID No. 17), et anti-sens 5'AGCGGGGGTGTCTTGTCTC-3' (SEQ ID No. 18) ; et - pour a-actine sens 5'CACTGAAGCCCCGCTGAACG-3' (SEQ ID No. 19), et anti-sens 5'TCGCCAGAATCCAGAACAATGC-3' (SEQ ID No. 20). La réaction contenait 1 l d'un mélange de TMMaster SYBR green I (ADN polymérase Taq, tampon, mélange de désoxynucléoside triphosphates et colorant TMSYBR green I), 3 mM de MgC12, et 0,5 gM de chaque amorce auquel on a ajouté 2 gl d'ADNc dilué. On a établi une courbe de concentration standard par une dilution en série de fragments de PCR spécifiques d'un gène purifié sur gel. On a normalisé les données en utilisant la f3-tubuline comme indice de la teneur en ADNc après la transcription inverse. L'amplification comprenait la dénaturation initiale à 95 C pendant 8 min, 45 cycles de dénaturation à 95 C pendant 3 sec., l'annelage à 60 à 65 C pendant 8 à 10 sec., et l'extension à 72 C pendant 7 à 10 sec. effectuée à une vitesse de transition de température de 20 C/sec. On a mesuré la fluorescence à chaque fin de chaque étape d'extension. Après amplification, on a utilisé une courbe de dénaturation thérapeutique acquise par chauffage du produit à 95 C, refroidissement et maintien à 70 C pendant 20 sec., puis chauffage lent (0,3 C/s) à 95 C pour déterminer la spécificité des produits de la PCR, confirmée par électrophorèse sur gel. e) Cytométrie en flux Après traitement avec BMP2 pendant 36 h, on a dissocié les cellules avec de la trypsine et on les a incubées avec 1/5000 anticorps anti-SSEA-1 (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa) et 1/5000 anticorps secondaire conjugué au FITC avant la cytométrie en flux en utilisant un cytomètre en flux TMCalibur FACS et un logiciel d'acquisition et d'analyse TMCellquest (Becton-Dickson). f) Cartographie par FISH On a marqué la sonde par translation de coupure dans 5 l de DTT 100 mM, 10 l d'un mélange de dNTP 0,2 mM, 5 id de dTTP (0,1 mM), 0,5' l de fluorescéinedUTP (1 mM), 3 pl d'ADNase, 15 p.. l d'un tampon 10X et 1 pl de polymérase, et 10,5 l d'H20 pendant 3 heures à 37 C. On a fixé les sections colorées avec un anticorps anti-i-MHC comme décrit ci-dessus avec de l'alcool méthylique et on les a déshydratées en utilisant de l'alcool éthylique. On a effectué la dénaturation du tissu dans 70 % de formamide à 72 C pendant 30 sec. On a réalisé une hybridation avec la sonde chromosomique de mouton MSH5 (33) jusqu'au lendemain à 37 C. Après des lavages successifs avec le tampon SSC 1X, on a monté les lames dans un milieu antidécoloration après un marquage au DAPI avant l'observation sous microscope confocal. g) Exploration fonctionnelle myocardique On a tout d'abord estimé la fonction ventriculaire gauche par une échocardiographie épicardique, sous anesthésie générale, en utilisant une sonde de 5,0 MHz connectée à un système échocardiographique Sequoia 512 (AcusonTM, Mountain View, CA, Etats-Unis). On a effectué toutes les mesures en trois exemplaires et elles ont été analysées en aveugle sur le groupe expérimental. On a calculé le volume ventriculaire gauche de fin de diastole (EDV) et de fin de systole (ESV) (mL) en discontinu selon la formule de Simpson à deux dimensions après avoir repéré les contours endocardiaques des vues des chambres 4 et 2 apicales bidimensionnelles; on a ensuite calculé la fraction d'éjection (%) comme 100 x (EDV-EVS)/EDV. On a évalué de manière semi-quantitative l'épaisseur systolique de la paroi ventriculaire gauche régionale en utilisant 3 plans de coupe à petits axes (flux de base, vue du milieu du muscle capillaire et vues apicales) et un modèle de 16 segments, selon les recommandations de l'American Society of Echocardiography. On a noté chaque segment visuellement de 0 (normal) à 1 (hypokinésie modérée), 2 (hypokinésie grave, 3 (akinésie) et 4 (dyskinésie). On a alors informatisé l'indice de mobilité de la paroi ventriculaire gauche globale (WMSi = total des résultats des segments/nombre total des segments notés). h) Analyse statistique Du fait de la distribution non gaussienne des valeurs, on a analysé les données par des tests non paramétriques et elles sont donc exprimées en tant que moyennes et gammes. On a comparé les différences intra-groupe par le test de Wilcoxon concernant l'appariement. On a comparé les différences inter-groupe par les tests de Mann et Withney ou les tests de Kruskall-Wallis avec ajustement pour l'analyse des groupes multiples par le procédé de correction de Holm. B - RESULTATS a) Engagement des ESC murines dans la voie de différenciation en cellules 10 cardiaques Pour engager les ESC vers une lignée cardiaque, on a cultivé les cellules pendant 36 h en présence de sérum de veau foetal et l'interleukine HILDA (LIF) complété par 2,5 ng/mL de BMP2 avant la greffe. Cette combinaison de sérum enrichi avec le facteur cardiogène BMP2 (34) a permis aux cellules d'exprimer les gènes mésodermiques précardiaques et les gènes cardiaques comprenant Tbx6, Mespl/2, Nkx2.5, GATA4, Mef2c et l'a-actine (Figure 1A). On a également observé une augmentation par trois du niveau d'expression de la cycline Dl et de p2lCip (3,5+0,2 et 3,0+0,2, respectivement, n=3), deux régulateurs clés de la transition Gl/S du cycle cellulaire faiblement exprimés dans des ESC non différenciées (35) par PCR en temps réel après avoir provoqué les cellules avec BMP2. Par conséquent, le nombre de cellules exprimant antigènel embryonnaire spécifique des cellules souches (SSEA-1), un marqueur des cellules non différenciées, ont significativement chuté de 80 à 27 %, indiquant en outre que 67 % des cellules étaient engagées vers une lignée cardiaque après un traitement de 36 h avec BMP2 (figure 1B). b) Greffe d'ESC engagées dans la voie de différenciation en cellules cardiaques dans un coeur infarci de mouton Nous avons créé des ESC CGR8 génétiquement modifiées pour exprimer à la fois la (3-galactosidase et la protéine fluorescente jaune stimulée (EYFP) sous le contrôle de la transcription des promoteurs Nkx2.5 spécifiques du coeur (66) et a-actine cardiaque, respectivement. Ces cellules nous ont permis de suivre à la fois les premières cellules progéniteurs cardiaques reconnaissables et ensuite les cardioblastes, respectivement. Ensuite, nous avons créé des infarctus du myocarde chez le mouton adulte par une technique percutanée et nous avons ultérieurement injecté un milieu de culture sans sérum sans cellule ou un milieu contenant 30x106 cellules murines CGR8 destinées au coeur. Un mois après la greffe cellulaire, les animaux ont été euthanasiés et un explant des coeurs a été effectué. On a coloré une série de cryosections (figure 2A) avec du X-Gal pour révéler l'activité de la 13-galactosidase, dévoilant de grands groupes de cellules positives au bleu dérivées des ESC dans le tissu cicatriciel après l'infarctus (figure 2B). De manière similaire, l'observation au microscope confocal soit des sections fixées natives soit des sections immunomarquées avec un anticorps anti-EGFP/EYFP a montré de grandes zones présentant des cellules exprimant EYFP jaune avec une morphologie allongée typique des fibres cardiaques (figure 2C). La présence de la fluorescence de EYFP ou la coloration de X-Gal était indétectable dans les sections de contrôle obtenues à partir d'un myocarde auquel on a injecté le milieu de culture cellulaire (figure 2C, panel de droite). L'expression à la fois de la f3- galactosidase et de EYFP a été confirmée par RT-PCR sur de l'ARNm extrait des sections réalisées dans la zone cicatricielle (figure 2D). De plus, une a-foetoprotéine, un marqueur précoce de la ligne endodermique qui a été détecté par RT-PCR dans des ESC cultivées avant la greffe n'aurait pu être identifiée dans les sections cardiaques un mois après la greffe (figure 5). Ceci suggère qu'un processus de sélection, probablement dicté par des signaux environnementaux, intervient au cours du temps pour conduire de manière élective les ESC déterminées vers la voie de différenciation cardiomyogénique et pour retirer les cellules non différenciées. Conjointement avec l'expression de p2l Cip et de la cycline Dl dans des ESC destinées au coeur, le processus de sélection cellulaire pourrait expliquer le fait qu'on n'a trouvé aucun tératome dans l'une quelconque des sections des coeurs greffés par ESC. Cette découverte démontre que les ESC de rongeurs se sont différenciées in situ en cardiomyocytes quand on les a transplantées dans un environnement cardiaque ovin. Nous avons trouvé que les myofibroblastes peuvent diriger la différenciation cardiaque des ESC (figure 6). Les fibroblastes de la zone cicatricielle sont donc susceptibles de sécréter des facteurs de croissance qui ont favorisé la différenciation des ESC destinées au coeur comme observé au préalable chez les rats (28). De manière importante, un tel phénomène de différenciation cardiaque spontané a été observé à la fois chez le mouton immunodéprimé par cyclosporine (n=5) et le mouton à conservation immunitaire (n=4). Aucune des sections de ces coeurs n'a démontré des infiltrats inflammatoires suggérant une réponse immunitaire contre les cellules greffées (figure 7). Nos données fournissent la preuve d'un privilège immunitaire des ESC quand elles sont transplantées dans le coeur. c) Différenciation in situ des ESC murines dans des coeurs infarcis de mouton Pour définir en outre l'étape de différenciation des cellules cardiaques murines dérivées des ESC dans le myocarde infarci de mouton, on a coloré des sections avec des anticorps spécifiques dirigés contre Nkx2.5, le premier marqueur cardiaque et Ki 67, un marqueur de la prolifération cellulaire. On a trouvé des groupes de cellules positives à Nkx2.5 dans la zone cicatricielle ou proches de celle-ci (figure 3A). Ces cellules ont également été marquées avec l'anticorps anti-Ki67 (figure 3B) montrant la présence dans la zone infarcie de cellules progéniteurs cardiaques dérivées des ESC qui sont toujours dans le processus de différenciation tout en proliférant (figures 3C, 3D). Ces résultats sont cohérents avec les découvertes de Min et al. (26), c'est-à-dire que le pourcentage de cellules ESC marquées par fluorescence identifiées dans les zones des rats infarcis a augmenté entre 6 et 32 semaines après la greffe d'ESC de souris, soutenant ainsi le concept de prolifération cellulaire et de différenciation cellulaire concomitantes au cours du temps à la suite d'une greffe d'ESC, un phénomène observé dans l'embryon au cours de la cardiogenèse originale (37). Pour traiter de manière plus spécifique le potentiel contractile des cardiomyocytes dérivés des ESC, nous avons regardé la myofibrillogenèse des ESC de différenciation greffées. A cette fin, on a utilisé une immunofluorescence avec une chaîne lourde d'anti-/3-myosine (13-MHC) qui reconnaît la myosine de la souris embryonnaire (38) mais pas la myosine du mouton. Immunocoloration avec cet anticorps a révélé de grandes zones régénératrices dans la cicatrice composées d'ESC de souris nouvellement différenciées en cardiomyocytes. En fait, les cardiomyocytes dérivés des ESC ont colonisé 22 % [4,4; 41](moyenne[gamme] ; n=9) de la zone cicatricielle. L'unité sarcomère était bien formée, alignée et présentait une taille (1,60+0,05 m) plus proche de celle des cardiomyocytes foetaux (figure 3E). La figure 3F montre que les cardiomyocytes dérivés des ESC ont intégré le tissu cicatriciel. De plus, les ESC exprimant la 13galactosidase visualisées par immunocoloration exprimaient également la connexine 43 (figure 3G). Les images confocales ont plutôt suggéré que Cx43 faisait partie de connexions partagées par deux cardiomyocytes dérivés des ESC. Cependant, une connexion entre les cardiomyocytes et les fibroblastes ne peut pas être complètement exclue parce que l'expression de Cx43 est régulée à la hausse dans le coeur de mouton infarci (39) et le pontage électrique par les fibroblastes peut intervenir dans le myocarde natif (40, 41). Comme les changements phénotypiques encourus par les cellules dérivées de la moelle osseuse greffés et attribués à la transdifférenciation peuvent en réalité avoir été provoqués par des événements de fusion, nous avons pensé éliminer cette possibilité par une hybridation in situ (FISH) en utilisant des sondes spécifiques au mouton. La sonde d'ADN marqué par fluorescéine s'est hybridée aux chromosomes dans le noyau des cellules de mouton mais pas dans les cardiomyocytes dérivés des ESC de souris colorées par,Q.MHC (figure 3H). Ainsi, on a identifié les cardiomyocytes dérivés des ESC in situ par un marquage génétique qui fournit un moyen non ambigu de suivre la destinéedes cellules greffées. Ces cellules étaient morphologiquement similaires aux cardiomyocytes natifs. Les études de FISH utilisant des sondes spécifiques au mouton ont confirmé que leurs changements phénotypiques étaient dus à la transdifférenciation et non à la fusion. d) Les cardiomyocytes dérivés des ESC améliorent la fonction myocardique des moutons Pour rechercher si la différenciation des ESC murines en cardiomyocytes intégrés dans la zone cicatricielle du myocarde de mouton infarci conduirait à un gain de fonction contractile, on a utilisé une échocardiographie bidimensionnelle avant et un mois après la prise de greffe cellulaire. Les fractions d'éjection ventriculaire gauche de base (LVEF) mesurées 2 semaines après l'infarctus et immédiatement avant la greffe cellulaire, ne différaient pas entre le mouton témoin (41 % [35; 52] moyenne [gamme]) et le mouton transplanté (35 % [29; 53]). A l'inverse, un mois après la greffe cellulaire, la LVEF s'est détériorée dans le groupe témoin par 9,9 % [-20; 0,3] par rapport à la base (p=0,011) alors qu'elle s'est améliorée de 6,6 % [-5,7; 50,8] chez le mouton auquel on a injecté des ESC (p=0,002 contre les témoins) (figure 4A). Une autre analyse a démontré que les volumes de fin de diastole de LV ont augmenté dans une mesure identique dans les deux groupes (données non montrées), ce qui exclut que les ESC aient un quelconque effet avantageux sur le phénomène indésirable qu'est le remodelage. Par contraste, les volumes de fin de systole de LV (LVESV) ont diminué dans le groupe greffé de 2,3 % [-15; 14,5] alors qu'ils ont augmenté de 5,5 % [-2,2; 28,3] dans les témoins (p=0,015 contre la valeur de base respective et p=0,015 contre le groupe traité) (figure 4B). Ces modèles contractiles améliorés sont traduits au niveau régional comme l'indice de mobilité de la paroi a diminué dans les coeurs greffés de 1,75 (1,50; 1,88) à la base à 1,56 (1, 44; 1,75) un mois après les injections de ESC (p=0,012) alors qu'il avait tendance à augmenter, bien que de manière non significative dans le mouton témoin (de 1,56 [1,31; 1,81] à 1,63 [1,31; 1,88] respectivement). Il faut noter que l'amélioration fonctionnelle vue dans le groupe greffé était d'une amplitude similaire chez le mouton traité à la cyclosporine et non traité à la cyclosporine (figure 8). Prises conjointement, ces découvertes indiquent un effet prédominant des ESC sur la fonction contractile et, en tant que telles, sont cohérentes avec leurs modèles morphologiques post-greffe de cellules générant une force active. La régénération "par lui-même" du myocarde infarci implique le remplacement du tissu akinétique avec une cicatrice par de nouveaux cardiomyocytes, correctement connectés au tissu endogène. Jusqu'à présent, il n'a pas été montré de manière convaincante que les myoblastes squelettiques ou les cellules dérivées de la moelle osseuse se transforment en cellules cardiaques (13, 42). Nous montrons ici que les ESC murines xénogéniques destinées au coeur greffées dans les zones d'infarctus chez le mouton se différencient vers la voie cardiomyogène. Les ESC colonisent, intègrent la zone cicatricielle et augmentent la fonction systolique en comparaison avec les témoins auxquels on a injecté du milieu, sans mise en évidence d'un rejet immunitaire ou d'un tératome. Cette dernière est probablement en rapport avec l'engagement cardiaque induit pas BMP2 de la population d'ESC tout comme avec la source xénogénique des ESC. En effet, des études préalables ont montré que l'injection des ESC multipotentes murines non différenciées a eu pour résultat de manière cohérente le développement tumoral chez les souris mais pas chez les rats (43). De plus, les cellules ESC sécrètent le facteur angiogénique VEGF dans des conditions de stress hypoxique (44), un effet endocrine susceptible de faciliter leur survie et leur migration dans la zone cicatricielle ischémique. Ces résultats mettent en évidence que les ESC peuvent fournir une source intéressante de cellules thérapeutiques pour effectuer une régénération véritable des cicatrices dans un myocarde ayant un dysfonctionnement ventriculaire sévère. Ainsi, il a été démontré ici que la xénogreffe de ESC murine engagées dans une voie de différenciation vers des cellules cardiaques étaient tolérées même chez des animaux à conservation immunitaire et étaient différenciées en cardiomyocytes. Les cardiomyocytes dérivés de ces cellules ont colonisé la zone cicatricielle ce qui a eu pour résultat un gain significatif dans la fonction du myocarde atteint. EXEMPLE 2: XENOTRANSPLANTATION DE CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES MURINES DANS LE TRAITEMENT DE L'INSUFFISANCE CARDIAQUE ISCHEMIQUE GRAVE CHEZ LE BABOUIN I - PROTOCOLE POUR LA PLASMATHEQUE ET LA CELLULOTHEQUE a) Prélèvements: 3 tubes EDTA de 7 ml prélevés à J0, M1,M2,M3, M6, M12 et M24 b) Préparation de la biothèque: Ne jamais mettre le sang total au réfrigérateur 1. Préparation de 3 aliquots de sang total: É Bien mélanger le sang total par retournement d' l des tubes EDTA É Répartir le sang total de ce tube EDTA en 5 aliquots de 1 ml É Conserver les 5 aliquots à 80 C 2. Préparation de la plasmathèque: É Centrifuger à température ambiante à 2500 tours/mn pendant 10 minutes les 2 tubes EDTA restant É Décanter le plasma et le répartir dans 5 cryotubes de 1 ml É Conserver les 5 cryotubes à -80 C 3. Préparation de la cellulothèque: É Diluer le culot cellulaire des 2 tubes EDTA préalablement centrifugés volume à volume avec du PBS stérile. Préparer un gradient Ficoll-Hypaque (Pharmacia) dans 1 tube à centrifuger conique (14 ml de Ficoll pour 20 ml de sang dilué). Déposer doucement le sang à la surface du Ficoll sans mélanger les 2 phases. É Centrifuger à 1800 tours/mn pendant 20 min à température ambiante. Eliminer le surnageant et recueillir l'anneau de lymphocytes. É Faire 2 lavages dans 20 ml de PBS stérile (le premier à 1500 tours/mn pendant 10 mn et le deuxième à 1200 tours/mn pendant 10 minutes). Compter les cellules. Répartir à raison de 5 x 106 par aliquots au minimum dans 2 cryotubes. É Centrifuger les aliquots 5 min à 15 000 tours/mn, éliminer le surnageant par retournement. É Conserver les aliquots sous forme de culots secs à -80 C II - RESULTATS Pour valider les résultats obtenus chez le mouton, des cellules ES murines engagées dans une voie de différenciation vers des cellules cardiaques et sélectionnées, ont été injectées dans des coeurs de babouins 15 jours après un infarctus crée par une occlusion temporaire (2 heures) d'une artère coronaire. Les résultats préliminaires mettent en évidence une différenciation des cellules injectées en cellules cardiaques (cardiomyocytes) sans signe évident de rejet. EXEMPLE 3: XENOTRANSPLANTATION DE CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES MURINES DANS LE TRAITEMENT DE L'INSUFFISANCE CARDIAQUE ISCHEMIQUE GRAVE CHEZ L'HOMME I - Produit de Thérapie cellulaire A - Produits utilisés a) Cellules Les cellules souches embryonnaires murines utilisées proviennent de la lignée CGR8 fournie par l'European Collection of Cell Cultures (ECACC) sous la référence ECACC 95011018 (J. Tiss. Meth., 1999, 13:89; Proc Natl. Acad. Sci. USA., 1994, 4303; Development, 1990, 110:1341). Elles sont identiques à celles utilisées pour les essais précliniques. Ces cellules sont cultivées sur flacons plastiques recouverts de gélatine et placées dans un incubateur à 37 C sous atmosphère de CO2 à 5 %. Les repiquages en milieu BHK21 supplémenté par 2 mM de glutamine, 2 mM de pyruvate, 10-7 M de mercaptoéthanol, pénicilline/streptomycine de grade clinique, 7,5 % de sérum de veau foetal gamma-irradié VSDA, et 10 g/l de Leukemia Inhibitory Factor (LIF), indispensable au maintien des cellules à l'état indifférencié, sont effectués 3 fois par semaine. *Milieu de culture Les cellules sont propagées du milieu BHK21 (BIOWEST) supplémenté selon la recette suivante: Milieu BHK21 NEEA Na Pyruvate Glutamine Mercaptoéthanol Sérum veau Foetal (Hyclone lot 114) 500 ml ml (2 mM) 5 ml (2 mM) 5 ml (2 mM) 5O0 1(0.1 mM) 35 ml LIF (Leukemia Inhibitory Factor) (équivalent 1000U/L de recombinant) Pénicilline/streptomycine (50U/ml pénicilline; 50 mg/ml streptomycine) Plasmocine 5m1 50.il (stock 1mg/ml) La qualité de la culture est appréciée par observation microscopique et un comptage par numération à la cellule de Malassez est effectué après dilution au bleu 30 trypan. Pour assurer les passages, les cellules sont décollées par un analogue de la trypsine qui présente l'intérêt d'être un produit recombinant donc à faibles risques de contamination virale par des virus porcins. Après plusieurs amplifications, trois banques cellulaires (Malter Cell Bank [MCB], Working Cell Bank [WCB] et End of Production Cell Bank [EPCB]) sont constituées par congélation des cellules en vapeur d'azote à raison de 5 millions par cryotube (100 cryotubes par banque). b) Transformation du LIF Ce produit, protéine recombinante de 20kd exprimée par E. Coli, n'est disponible que sur qualité de grade recherche. Sa transformation en molécule de grade clinique implique la réalisation d'étapes de gel filtration sur colonne Superdex 75 pour affiner le degré de pureté ainsi que des étapes de nanofiltration sur membranes WFP permettant l'élimination des virus de la taille des parvovirus. Ces différentes étapes du procédé ont été préalablement mises au point au stade pilote avant de lancer la fabrication dans l'unité de production clinique en zone d'atmosphère contrôlée. Il n'y a donc pas utilisation d'une couche nourricière de fibroblastes. c) Fabrication de l'anticorps anti-SSEA1 Cet anticorps de type IgM murine disponible sous forme de surnageant de culture non purifié doit également subir différentes étapes de transformation qui visent à: -obtenir un produit pur et actif - assurer l'élimination de DNA cellulaire - éliminer les contaminants viraux - éliminer les endotoxines B - Prédifférenciation Elle se fait au 3eme passage. Les cellules en culture sont traitées pendant 24 à 36 heures avec 2,5 ng/ml BMP2 (Bone Morphogenetic Protein 2). Cette cytokine existe sous forme d'un produit de grade clinique, approuvé pour usage humain par l'AFSSAPS et utilisé dans des indications orthopédiques. C - Sélection: Tri des cellules souches embryonnaires CGR8 spécifiées vers le lignage cardiaque Elle fait appel à un anticorps monoclonal antiSSEA-1 qui reconnaît SSEA-1 qui est un antigène membranaire spécifique des cellules souches embryonnaires murines indifférenciées (la disparition de l'expression de cet antigène témoigne de la perte de l'état indifférencié des cellules). Celles-ci sont identifiées par cytométrie de flux puis éliminées, seules étant retenues les cellules déjà pré-différenciées par la BMP-2 (sélection négative). Une fois sélectionnées, les cellules sont cryocongelées jusqu'à leur utilisation. Les cellules CGR8 en suspension sont incubées pendant 1 heure à 25 C avec le surnageant d'hybridome SSEA1 (référence MC-480 DHSB Iowa University) (43 gg/ml IgM souris). Le surnageant SSEA1 est utilisé au 1/100. Les cellules sont ensuite incubées avec le second anticorps (anti-Ig sourisFITC dilué au 1/500) pendant 1 heure à 25 C. Les cellules sont ensuite lavées au PBS (Phosphate Buffered Saline, Ca-, Mg-free) puis analysées au FACS Calibur (Becton-Dickson). Le tri est effectué à la vitesse de 8000 cellules/s. Les cellules fluorescentes (positive SSEA1, 20-30 %) sont éliminées et les cellules non fluorescentes (70-80 %) sont récupérées à la sortie du FACS et remises en culture. On vérifie qu'au terme de leur exposition aux différents milieux et facteurs ancillaires (LIF, BMP-2, anticorps anti-SSEA-1, en particulier), les cellules ont conservé leur capacité de se différencier en cardiomyocytes (expression de marqueurs spécifiques: Nkx2.5, GATA-4 et Mef2c), sans apparition concomitante, après sélection, de cellules exprimant des marqueurs de lignées endodermiques (a-foetoprotéine) et ectodermiques (cytokératine). D - Contrôle Ils portent sur les critères suivants: 41 Obtention d'une population pure (>_ 99%) de cellules souches embryonnaires prédifférenciées. Absence de contamination virale (l'ensemble des contrôles figure en annexe). 4' Viabilité des cellules (>_ 95%) après décongélation d'une ampoule de 2 mL contenant 5 la suspension finale prête à l'injection, à la concentration de 25 x 106 cellules /mL (soit x 106 dans une ampoule de 2 mL). E - Conditionnement Le conditionnement fourni est celui d'un flacon en verre contenant 150 x 106 10 cellules dans un volume de 6 mL, soit une concentration de 25 x 106 mL. II - Protocole d'Echocardiographie A - Critères de jugement a) Principal: Amélioration au niveau de la zone infarcie transplantée du score semiquantitatif de cinétique segmentaire en échocardiographie bidimensionnelle (2D) et/ou des paramètres systoliques quantitatifs en imagerie Doppler tissulaire (DTI). b) Secondaire: Amélioration de la fraction d'éjection (FE) ventriculaire gauche (VG). B - Matériels Requis - Cassettes SVHS (1 cassette par examen) et disque optique numérique (MOD) pour le 20 DTI; - Machine de dernière génération, avec imagerie fondamentale et d'harmonique et DTI. C - Enregistrement Vidéo a) Mesures/Acquisitions TM: Transventriculaire gauche. b) Mesures/ Acquisitions 2D: '' Parasternales ventriculaire gauche: grand axe, 3 petits axes (base, piliers, apex). 4' Apicales: 4 cavités, 3 et 2 cavités cardiaques gauches. c) Enregistrements sur MOD d) Doppler tissulaire en mode couleur en TM et 2D au niveau de la paroi postérieure avec enregistrement numérique de boucles: - en vues parasternales grand axe et petit axe (aux 3 niveaux), en vues apicales 4, 3 et 2 cavités. D - Analyses a posteriori Par un observateur indépendant, en aveugle quant à la date (pré- ou post-opératoire de l'examen) et à l'identité du patient: 1- Mesures en TM en systole et diastole des septum, paroi postérieure, et VG; 2- Mesures 2D des volumes VG télédiastolique et télésystolique et de la FEVG biplan selon méthode de Simpson biapicale; 3Calcul du score de cinétique segmentaire global après division du myocarde VG en 16 segments selon les recommandations de l'American Society of Echocardiography (pour chaque segment: non analysable=0, normocinésie=l, hypocinésie modérée=2, hypocinésie sévère=3, acinésie =4, dyskynésie=5) et de l'index de cinétique segmentaire (score global/nombre de segments analysés) ; 4- Calcul du score de cinétique segmentaire régional au niveau des segments postérieurs infarcis akinétiques à l'inclusion et greffés, et de l'index de cinétique régionale (score régional/nombre de segments postérieurs akinétiques non viables à l'inclusion) ; 5- Mesures DTI sur station de travail spécifique au niveau de la paroi postérieure des pics de gradients systolique et diastolique (en DTI TM) et du strain et du strain rate (en DTI 2D couleur). III Xénotransplantation de cellules souches embryonnaires murines chez l'Homme (Avant-projet du protocole clinique) L'OBJECTIF PRIMAIRE est la sécurité, plus spécifiquement définie par l'absence de complications rythmiques, infectieuses, immunologiques et tératogènes. 4' LES OBJECTIFS SECONDAIRES sont: - la récupération de la contractilité des segments myocardiques nécrosés qui ont été greffés, -l'évolution de la fonction ventriculaire gauche globale, - la récupération d'une viabilité métabolique dans la zone greffée, - les évènements cliniques: 0 Taux de complications dans les 30 jours suivant la procédure: cardiaques (infarctus, troubles du rythme graves, ...) ou générales, o Etat fonctionnel, apprécié par la classification de la NYHA et qualité de vie évaluée d'après le questionnaire du Minnesota, o Evénements cardiovasculaires: infarctus du myocarde, troubles du rythme ventriculaire, insuffisance cardiaque, accident thrombo-embolique, accident vasculaire cérébral, o Nombre d'hospitalisations après l'intervention, quelle qu'en soit la cause, pour cause cardio-vasculaire et/ou insuffisance cardiaque, - le taux de mortalité globale, cardiovasculaire, par mort subite et/ou insuffisance cardiaque. A - Plan expérimental a) Schéma général de l'essai Il s'agit d'un essai de phase I, avec bénéfice individuel direct, monocentrique, ouvert, et non contrôlé. Bien que l'efficacité ne soit qu'un critère secondaire, la comparaison des données post- et pré-opératoires (échocardiographiques, scintigraphiques et métaboliques) sera faite de façon aveugle par des spécialistes de ces différentes disciplines non directement impliqués dans l'étude. Un Comité de Protection des Personnes se prêtant à une Recherche Biomédicale (CPPRB) saisi est celui de Paris-Cochin. b) Critères d'inclusion et d'exclusion des patients Critères d'inclusion Sont considérés comme éligibles les patients satisfaisant aux critères suivants: É Age supérieur ou égal à 70 ans; É Présence ou antécédents d'insuffisance cardiaque congestive invalidante malgré un 25 traitement médical optimal (classe fonctionnelle III/IV de la NYHA) ; É Altération franche de la fonction ventriculaire gauche reflétée par une fraction d'éjection (mesurée par scintigraphie et/ou échocardiographie) 25% ; É Séquelle significative d'infarctus du myocarde touchant le territoire postéro-inférieur, démontrée par l'existence d'une akinésie étendue à plus de 2 segments postérieurs contigus (sur 16) en échocardiographie, sans viabilité en échocardiographie sous dobutamine (à la dose maximale de 10y/kg/min), en scintigraphie au 201thallium et en tomographie d'émission de positons au 18fluorodéoxyglucose, avec ou sans possibilité technique de revascularisation par pontage sur l'artère coronaire droite ou l'une de ses branches (qu'elles soient opacifiées par voie antéro- ou rétrograde) ; Indication de pontage(s) coronaire(s) sur le réseau gauche avec ischémie et viabilité documentées dans les territoires correspondants; 40 Absence de contre-indication à la mise en place préalable d'un défibrillateur automatique implantable. Les protocoles relatifs à l'échocardiographie dobutamine, à la scintigraphie au 201thallium et à la tomographie d'émission de positons au 18fluorodéoxyglucose figurent dans les annexes. Justification des critères d'inclusion Le choix des critères d'inclusion, fait naturellement avec le souci d'optimiser le rapport bénéfice/risque, s'est principalement fondé sur les considérations suivantes: La tranche d'âge retenue est celle qui est principalement intéressée par l'insuffisance cardiaque ischémique dont la prévalence concerne de plus en plus les sujets âgés. Ainsi, pour préliminaires qu'ils soient, les résultats obtenus devraient avoir une pertinence clinique que n'ont pas nécessairement certains essais dont les critères sont parfois si sélectifs qu'ils finissent par être quelque peu déconnectés de la pratique médicale du monde réel . 4' Le choix de patients à fonction ventriculaire altérée et sévèrement handicapés sur le plan fonctionnel alors qu'ils reçoivent un traitement médical optimal, ne peuvent bénéficier d'aucune thérapeutique alternative (transplantation cardiaque, implantation d'un dispositif d'assistance circulatoire) et n 'ont pas d'indication ou n 'ont pas été améliorés par une resynchronisation biventriculaire, s'inscrit dans le souci éthique de ne proposer cette thérapeutique expérimentale que dans les situations d'impasse thérapeutique conventionnelle. 4' La paroi retenue pour la greffe est la paroi postérieure parce que sa contraction est plus facile à analyser que la paroi antérieure en échocardiographie (l'imagerie par résonance magnétique nucléaire étant interdite du fait de la présence d'un défibrillateur implantable; voir plus loin). La qualité de cette analyse est essentielle non seulement pour apprécier d'éventuelles modifications de la cinétique mais aussi (et surtout) pour dépister des altérations morphologiques évocatrices d'un processus tumoral. Le pontage de la zone greffée tient compte des données expérimentales récentes qui impliquent l'ischémie comme facteur important (bien que non exclusif) de la mortalité des cellules transplantées et soulignent par conséquent l'intérêt d'une revascularisation complémentaire comme moyen d'optimiser la survie du greffon. Il est donc clair que l'objectif premier de ce pontage associé, s'il est techniquement possible, n'est pas d'améliorer la cinétique d'une zone de myocarde dont l'absence de viabilité reflète l'atteinte irréversible des cardiomyocytes qui l'occupent, mais bien de favoriser la survie, la prolifération, la différenciation et l'intégration prolongée des cellules greffées. Ce geste représente un allongement du temps de clampage aortique d'une dizaine de minutes, durée qui n'est pas susceptible d'influencer la morbi- mortalité opératoire. Si l'on tient compte du fait que la revascularisation complémentaire du réseau gauche devrait intéresser en moyenne deux vaisseaux (interventriculaire antérieure et branche de la circonflexe), on est ainsi ramené à la situation courante d'un triple pontage coronaire que n'allongera que de 5 minutes environ l'injection des cellules du fait de la technique utilisée (voir plus loin) . La mise en place systématique d'un défibrillateur procède de deux raisons principales: - l'incertitude quant aux conséquences rythmiques éventuelles de l'implantation des cellules souches embryonnaires murines, même si leur faculté d'intégration électro- mécanique dans le myocarde receveur peut apparaître comme une garantie rassurante. Expérimentalement, ces greffes de cellules souches n'ont d'ailleurs pas entraîné d'arythmies ventriculaires mais les limites inévitables des modèles animaux nous semblent justifier, par souci de sécurité maximale, l'implantation d'un défibrillateur; - les bénéfices documentés de ce dispositif chez les patients satisfaisant aux critères MADIT II (45) et qui sont en fait identiques à ceux inclus dans le présent essai. Sur le plan cognitif, le défibrillateur a de surcroît l'avantage de permettre, grâce à la fonction Holter intégrée, une analyse des évènements rythmiques éventuellement secondaires à l'implantation des cellules. Par comparaison avec les critères d'inclusion de l'essai MAGIC (transplantation 30 de myoblastes squelettiques autologues), on notera des différences importantes dans trois domaines: É Démographiques: les patients de la présente étude sont plus graves (âge, classe fonctionnelle de la NYHA) ; É Topographiques: seule la paroi postérieure peut être greffée; 4.0 Stratégiques: la zone greffée est éventuellement revascularisée. Critères de non inclusion - Patient anéchogène; - Etat de choc cardiogénique; - Nécessité d'une revascularisation coronaire chirurgicale rapide ( 70 ans Classe fonctionnelle II-III III-IV Limite supérieure FE 35% 25% Zone greffée Non spécifique Postérieure Pontage zone greffée Non Oui si possible - Hémophilie; - Participation simultanée à une autre étude avec bénéfice individuel direct. b) Nombre Prévu de patients Calculs et proposition Le nombre de sujets est calculé selon un plan multi-étapes de Fleming, méthode classique utilisée dans les essais de phase III en cancérologie. Les calculs ont été faits avec un programme écrit par Yann De Rycke et Andrew Kramar, Section Médicale de l'Institut Curie. Habituellement, ces plans sont utilisés pour rechercher l'efficacité d'un médicament anticancéreux, et le critère de jugement est l'efficacité (réduction tumorale, 10...). Dans notre cas, le critère de jugement est la sécurité (voir définition dans le paragraphe: Critères de jugement). Les hypothèses choisies sont les suivantes, compte tenu du type des toxicités recherchées: É Nombre d'étapes: 2; É Limites haute et basse de toxicité recherchée pendant les 2 ans de participation à l'étude: 30% (inacceptable) et 10 % (acceptable). Ces limites paraissent raisonnables au vu de la gravité de ces patients; É Nombre total de sujets: 24; É Risque alpha (unilatéral) = 0,08 A la fin de l'étape 1, sur les 12 premiers sujets: É si on n'observe Les risques sont les suivants: É la probabilité de conclure à l'absence de toxicité à l'étape 1 alors que la proportion d'évènements toxiques est de 30,0 %, est bétal = 8,5 % ; É la probabilité de conclure à l'existence d'une toxicité à l'étape 1 alors que la proportion d'évènements toxiques est de 10,0 %, est alphal = 2,6 %. A la fin de l'étape 2, sur les 24 sujets: É si on observe 4 ou moins de 4 toxicités (16,7 %), on arrête l'essai: le pourcentage de toxicité est inférieur ou égal à 10,0 % ; É si on observe 5 ou plus de 5 toxicités (20, 8 %), on arrête l'essai: le pourcentage de toxicité est supérieur à 10,0 %. Les risques sont les suivants: É la probabilité de conclure à l'absence de toxicité à l'étape 2 alors que la proportion d'évènements toxiques est de 30,0 %, est beta2 = 14,8 % ; É la probabilité de conclure à l'existence d'une toxicité à l'étape 2 alors que proportion d'évènements toxiques est de 10,0 %, est alpha2 = 5,3 %. Les risques globaux, à l'issue de la totalité du plan (24 patients) sont de 14, 8% pour béta et 8,0 % pour alpha. Discussion dans le contexte de l'essai Nous sommes ici dans une situation très particulière de première injection à l'homme, avec un risque qui peut être retardé. En effet, le risque de toxicité peut survenir avec un délai relativement long (plusieurs mois). Il paraît donc raisonnable d'espacer l'inclusion des premiers patients; l'utilisation d'une lignée cellulaire clonale, donc parfaitement reproductible, laissant augurer d'une diminution asymptotique du risque, notamment viral, le second patient est inclus qu'après 3 mois d'observation du premier et, notamment, après confirmation virologique d'une absence de séroconversion aux rétrovirus murins. Par ailleurs, toute toxicité inhabituelle , en dehors des critères de jugement, devra faire discuter l'arrêt de l'essai par le Comité indépendant de surveillance des évènements critiques. c) Durée de participation Elle est fixée à 2 ans, avec une surveillance ultérieurement illimitée pour les cancers, la mortalité et les infections graves. Cette surveillance sera étendue à l'entourage immédiat et aux personnels de santé en contact régulier avec le patient (prélèvementssystématiques pré-opératoires pour plasmathèque et cellulothèque selon les protocoles détaillés en annexe) avec rapport immédiat de tout événement, particulièrement infectieux, suspect aux autorités réglementaires. B - Schéma et Conduite de la Recherche a) Interventions Implantation du défibrillateur: Si les patients n'en sont pas déjà porteurs, celui-ci sera implanté entre 2 et 3 semaines avant la date de la chirurgie. Ce délai permet d'être à distance de toute complication infectieuse locale et de réduire le risque de déplacement des sondes lors des manipulations du coeur requises pour les pontages et la greffe des cellules. Technique des injections: Les pontages coronaires seront faits de façon conventionnelle, sous circulation extra-corporelle et arrêt cardioplégique. Après réalisation des anastomoses coronaires distales, et toujours sur coeur arrêté, trois injections de cellules souches embryonnaires, représentant un total de 150 x 106 seront faites parallèlement à l'axe longitudinal du coeur (en pratique, parallèles au sillon interventriculaire postérieur), l'une au milieu de la zone infarcie, les deux autres, à sa périphérie, le long de l'interface zone nécrosée-myocarde sain. Les cellules sont suspendues dans une solution de Dulbecco's Modified Extracellular Medium (DMEM) de grade clinique contenue dans un flacon en verre de 6 mL. A l'aide d'une aiguille (18 gauge) stérile, le contenu de ce flacon est aspiré dans une seringue également stérile de 10 mL par l'instrumentiste. Après retrait de l'aiguille, un connecteur à double embout femelle également stérile est connecté à la seringue de 10 mL qui va servir de réservoir . Une seringue en plastique de 1 mL destinée aux injections est également vissée à l'autre embout du connecteur (photo) et permet d'aspirer un premier volume de la suspension cellulaire. Pendant que l'on procède à l'injection de ce volume (voir ci-dessous), l'instrumentiste remplit une seconde seringue qui est donc prête à être immédiatement utilisée dès la fin de la première injection. La manoeuvre est ainsi répétée jusqu'à ce que les 6 mL aient été injectés. Elle permet de ne pas perdre de temps et de minimiser les fuites de liquide lors des manipulations de fluide précédant les injections. Ces injections utilisent une aiguille métallique non réutilisable spécialement conçue à cet effet. Longue de 5,5 cm et d'un diamètre de 19 gauge (diamètre extérieur: 1,07 mm; diamètre intérieur: 0,69 mm), cette aiguille, coudée à angle droit près de son extrémité proximale de façon à permettre des injections médio-myocardiques (et par conséquent à éviter une perforation intra-ventriculaire inadvertente) est perforée d'orifices latéraux. L'efficacité de ce dessin coudé a été établie lors de nos essais cliniques utilisant les cellules musculaires. Chaque injection est d'un volume de 2 mL qui est ainsi dispersé au travers des orifices (latéraux et celui de la lumière centrale). Le volume total de la suspension fournie dans le flacon de verre est de 6 mL. Trois seringues de 2 mL sont donc utilisées pour chaque chenal d'injection. Ce volume total injecté de 6 mL est identique à celui dont la bonne tolérance a été validée par l'expérience de l'essai MAGIC. La modification principale par rapport à cette expérience est la longueur de l'aiguille et son diamètre plus grand (19 au lieu de 27 gauge) qui permet de forer un micro-chenal puis de réaliser les dépôts de cellules tout le long du trajet de l'aiguille au fur et à mesure de son retrait. Ce système permet un quadrillage rapide (l'ensemble des injections devrait prendre environ 5 minutes ce qui compense l'allongement du temps opératoire requis par la réalisation de l'éventuel pontage de la zone infarcie greffée) et efficace de toute la zone pathologique. Lors du retrait de l'aiguille, une goutte de colle biologique couramment employée en chirurgie cardiaque (TissucolTM) est appliquée sur l'orifice de ponction, à la fois pour assurer l'hémostase et surtout pour limiter la fuite rétrograde de la suspension cellulaire dans le péricarde. Justification de la dose: Dans l'étude faite chez le mouton, l'injection de 30 x 106 cellules a permis de recoloniser avec des cardiomyocytes dérivés du greffon environ 20 % de la zone infarcie. Environ 70 % de ces cellules injectées, soit 21 x 106, avaient été pré-commises vers un phénotype cardiaque par exposition à la Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) comme l'ont montré de façon concordante une méthode de sélection négative (immunomarquage dirigé contre l'anticorps SSEA-1 qui ne marque que les cellules ayant conservé un phénotype indifférencié) et une méthode de sélection positive (tri par cytométrie de flux des cellules exprimant l'YFP et, par conséquent, le gène de l'a-actine). On peut donc estimer que 5 fois plus de cellules pré-commises , soit environ 100 x 106, auraient été nécessaires pour une recolonisation complète de l'infarctus. Le poids des animaux étant d'environ 50 kg, on peut ainsi calculer une dose efficace de 2 x 106 cellules pré-commises par kilogramme. Pour un adulte de 70 kg, la dose théorique est donc de 140 x 106 de cellules que nous avons arrondie à 150 x 106 pour tenir compte des pertes inévitables lors des injections. b) Traitements associés L'intervention est encadrée par une brève corticothérapie par voie intra-veineuse (solumédrol 240 mg à l'induction, 240 mg au déclampage aortique, puis 240 mg sur les 24 premières heures). Ce traitement a pour objet de limiter la réponse inflammatoire importante générée par les injections elles-mêmes et d'optimiser ainsi la viabilité initiale des cellules. Sa bonne tolérance a été validée par l'expérience de l'essai MAGIC. Aucun traitement immunosuppresseur n'est par ailleurs administré. Enfin, le traitement de fond de l'insuffisance cardiaque sera conduit dans les règles habituelles pour chacun des malades. Au nom du principe de précaution, il y sera adjoint une administration d'amiodarone (2 comprimés par jour), commencée deux semaines avant la greffe, après dosage de la TSH et en dehors des contre-indications habituelles, et poursuivie 2 mois après celle-ci. La justification est la prévention d'éventuelles arythmies ventriculaires auxquelles prédispose déjà la cardiopathie ischémique évoluée dont tous ces patients sont, par définition, porteurs. c) Suivi et prise en charge Ils sont assurés au sein du service de cardiologie de l'Hôpital. d) Durée de l'étude Elle est fixée à deux ans (recrutement: 18 mois + suivi des derniers patients inclus: 6 mois). C - Critères de Jugement a) Critère de jugement principal Il s'agit de la sécurité, définie par un critère composite dont les composantes sont les suivantes: ' Complications rythmiques: documentation des troubles du rythme ventriculaire (tachycardie ventriculaire soutenue, fibrillation ventriculaire) pendant l'hospitalisation post-opératoire; lecture des enregistrements Holter des défibrillateurs à 10 jours, 1 mois, 3 mois, 6 mois, 1 an et 2 ans après l'intervention; ces résultats seront à interpréter en fonction des enregistrements Holter pré-opératoires réalisés à raison de 2 examens séparés par une dizaine de jours, le second étant pratiqué 8 jours avant l'intervention; '' Complications infectieuses: Le risque de transmission virale En fait, les complications infectieuses, notamment virales, des xénogreffes restent à ce jour largement hypothétiques et, comme il a été vu plus haut, non documentées par les résultats cliniques rapportés à ce jour. Les complications virales des allogreffes, qui, elles, sont l'objet d'une riche bibliographie, surviennent par deux mécanismes: 1) la réactivation de virus latents (herpésvirus, adénovirus, papovavirus) survenant dans le contexte de l'immunodépression liée à la greffe; 2) l'infection primaire véhiculée par le greffon (cytomégalovirus, virus Epstein Barr, VIH, virus de l'hépatite B et de l'hépatite C). Dans cet essai, des cellules embryonnaires de souris sont greffées à l'homme, l'absence d'immunogénicité de ces cellules autorisant la pratique de la xénogreffe sans traitement immunosuppresseur. Dans ce contexte, si l'on peut espérer l'absence des complications virales classiques de la greffe liées à l'immunodépression, il y a en revanche un risque théorique de transmission de virus murins véhiculés par le greffon à l'homme. On pourrait donc craindre l'émergence de zoonoses provoquées par des virus murins potentiellement présents dans le greffon, notamment ceux appartenant aux familles des Herpesviridae et des Retroviridae. Ce risque de transmission de virus animaux à l'homme avec tous les aléas de la rupture d'une barrière d'espèce et du danger de la diffusion secondaire d'un virus animal, notamment d'un rétrovirus, au sein de l'espèce humaine est naturellement préoccupant. Par ailleurs, le risque de transmission d'agents transmissibles non conventionnels (prions) est actuellement inconnu dans ce type de greffe. L'importance de ce problème nous a conduits à mettre en place un ensemble de contrôles et une chaîne de sécurisation virale maximale (décrite en annexe) afin de réduire, autant que l'état de l'art le permet, tout risque de contamination du patient. La surveillance du risque viral est envisagée à deux niveaux: - La qualification des greffons: Le risque viral potentiel nous a conduits à mettre en place une chaîne de sécurisation virale maximale à toutes les étapes de préparation des cellules murines à greffer, afin de réduire autant que l'état de l'art le permet, tout risque de contamination du patient. Les différentes étapes de la qualification des greffons est décrite en annexe. - La biosurveillance du receveur: É Examen clinique régulier avec documentation de tout épisode infectieux local ou général; É Examens biologiques usuels (numération formule sanguine, C-réactive protéine, transaminases hépatiques) ; É Tests virologiques: - Avant transplantation, on pratiquera les sérologies systématiques dans ce contexte (VIH1 et 2, HTLV1 et 2, HAV, HBV, HCV, CMV, EBV, HSV 1 et 2). - Après transplantation (à J0, M1,M2,M3, M6, M12 et M24), le dépistage d'une séroconversion se fondera sur la recherche d'anticorps anti-gag et un test d'amplification des rétrovirus murins xénotropes. A cet effet, sont créées une plasmathèque (pour la réalisation des sérologies rétrovirales murines et pour la recherche ultérieure d'autres agents pathogènes si nécessaire) et une cellulothèque (pour l'étude des rétrovirus murins en cas de sérologie positive ou pour la recherche d'autres agents pathogènes si nécessaire). De façon générale, la dimension sécuritaire de cet essai a été conçue en fonction des recommandations des diverses instances réglementaires: Committee for proprietary medicinal products; Points to consider on xenogeneic cell therapy medicinal products, EMEA, Décembre 2003; Recommendation Rec(2003) du Conseil des Ministres de l'Union Européenne 30 aux Etats membres sur la xénotransplantation; - US Food and Drug Administration; Center for Biologics Evaluation and Research, PHS Guidelines on infectious disease issues in xenotransplantation & Availability for public disclosure and submission to FDA for public disclosure of certain data and information related to human gene therapy and xenotransplantation, 2001; - Santé Canada, Rapport de l'atelier de surveillance de la xénotransplantation, 2001; - Consultation OCDE/OMS sur la surveillance des activités de xénotransplantation: rapport de synthèse, 2001). Complications immunologiques: Il s'agit d'un rejet dont le diagnostic peut être fondé sur des arguments cliniques (état fébrile, choc), biologiques (syndrome inflammatoire majeur), anatomiques (oedème myocardique à l'échocardiographie et au scanner), voire histologiques (autopsie en cas de décès). Complications tératogènes: - Recherche d'une masse tumorale cardiaque par échocardiographie (tous les mois pendant 3 mois, puis à 6 mois, 1 an, 18 mois et 2 ans après l'intervention) et scanner thoracique (à 3 mois, 6 mois, 1 an, 18 mois et 2 ans après l'intervention). - Ce bilan sera complété par un scanner corps entier à 3 mois, 6 mois, 1 an et 2 ans après l'intervention, une mammographie (à 6 mois) chez les femmes et un dosage des PSA (à 3 mois, 6 mois et 1 an) chez les hommes. b) Critères de jugement secondaires Ils sont au nombre de 6: L'absence de complications hémorragiques liées à l'injection des cellules (saignement per- et postopératoire, reprise pour hémorragie liée aux injections) ; La récupération de la contractilité des segments myocardiques nécrosés qui ont été greffés sera mesurée par échocardiographie réalisée dans le mois précédent l'intervention et au 6ème mois post-opératoire; L'évolution de la fonction ventriculaire gauche globale, sera appréciée par la fraction d'éjection échocardiographique et scintigraphique, mesurée dans le mois précédent l'intervention et au 6ème mois post-opératoire: La récupération d'une viabilité métabolique dans la zone greffée, sera appréciée par scintigraphie au 201thallium et tomographie d'émission de positons au 18fluorodéoxyglucose, réalisées dans le mois précédent l'intervention et au 6eme mois post-opératoire; Les évènements cliniques: É Taux de complications dans les 30 jours suivant la procédure: cardiaques (infarctus, troubles du rythme graves, ...) ou générales, o Etat fonctionnel, apprécié par la classification de la NYHA et qualité de vie évaluée d'après le questionnaire du Minnesota, o Evénements cardiovasculaires: infarctus du myocarde, troubles du rythme ventriculaire (discutés plus haut), insuffisance cardiaque, accident thrombo-embolique, accident vasculaire cérébral, o Nombre d'hospitalisations après l'intervention, quelle qu'en soit la cause, pour cause cardio-vasculaire et/ou insuffisance cardiaque, La mortalité globale, cardio-vasculaire, par mort subite et/ou insuffisance cardiaque. c) Modalités de réalisation des examens complémentaires entrant dans le cadre des critères de jugement La lecture des cassettes d'échocardiographie, des scintigraphies et des tomographies d'émission de positons et leur comparaison longitudinale (post-opératoire vs. préopératoire) sera effectuée pour chaque patient en fin de suivi échographique en aveugle du moment auquel a été réalisé l'examen. De plus, il est prévu de réaliser une surveillance immunologique afin de préciser l'évolution dans le temps des populations de lymphocytes T régulateurs dont l'augmentation pourrait expliquer la tolérance de ces xénogreffes en l'absence de traitement immunosuppresseur. Les anticorps monoclonaux utilisés à cet effet seront dirigés contre les molécules suivantes: CD4, CD25, MHC de classe II, CD45RO et CTLA4. Le calendrier des examens s'établit comme suit: # : 2 Holter pré-op à 10 jours d'intervalle; les Holter post-opératoires correspondent à la lecture des défibrillateurs implantables. * : Un bilan virologique supplémentaire complet le jour de l'intervention. 18FDG TEP: tomographie d'émission de positons au 18fluorodéoxyglucose. D - Gestion des Données Statistiques a) Traitement des données La gestion des données est assurée dans le cadre du Centre d'Investigations Cliniques de l'Hôpital. Une observation standardisée sera mise au point pour le recueil des données, et une double saisie des données sera assurée afin d'éviter toute erreur dans le fichier informatique. Le fichier fera l'objet d'une déclaration à la CNIL. b) Logiciels statistiques et tests Les logiciels statistiques STATVIEW et STATA seront utilisés pour l'analyse statistique. Les tests statistiques usuels seront employés. La distribution de chacune des Examen clinique Echocardiographie x Holter ECG# Angio-coronarographie x Scintigraphie 201thallium x 18FDG TEP x Bilan virologique* x Bilan immunologique x x Scanner thoracique x Scanner corps entier x Mammographie x Antigène spécifique de la x prostate (PSA) Examen Pré-op 1 mois 2 mois 3 mois 6 mois 12 mois 18 mois 24 mois post-op post-op post-op post-op post-op postop post-op x x x x x x x x X X X X X x x x x X X X X X X X x variables sera analysée. En cas de distribution non gaussienne ce qui est vraisemblable pour les critères de jugement secondaires des tests non paramétriques seront utilisés. Le seuil usuel de 5 % sera utilisé pour le risque de première espèce. Ce travail étant le premier essai dans le domaine, les intervalles de confiance seront calculés pour chacun des critères de jugement. Ces estimations serviront de base au schéma des prochaines études, en cas de résultat favorable du présent essai. E - Gestion des Evènements Indésirables Graves et Monitorage des Effets Secondaires Tout événement indésirable grave sera signalé à un Comité de Surveillance dans les 24 heures, par fax, à l'aide d'un formulaire spécifique, précisant notamment le degré d'imputabilité de la complication à la greffe des cellules souches embryonnaires. Ce comité formulera les règles pouvant conduire à l'arrêt de l'essai. F - Aspects Légaux et Ethiques Formulaires d'information aux patients et de consentement adapté. En accord avec les données expérimentales, chez des patients présentant une insuffisance cardiaque ischémique sévère, la transplantation dans une zone de nécrose akinétique, de cellules souches embryonnaires mutines précommises in vitro vers une différenciation cardiomyogènique, est susceptible de régénérer cette zone en permettant sa repopulation par des cardiomyocytes fonctionnels sans que cette xénogreffe s'accompagne de phénomènes de rejet ou du développement d'un tératome. REFERENCES 1. Melo LG, Pachori AS, Kong D et al. Molecular and cell-based therapies for protection, rescue, and repair of ischemic myocardium. Reasons for cautious optismism. Circulation 2004; 109:2386-93. 2. Jessup M, Brozena S. Heart Failure. N Engl J Med 2003; 348:2007-18. 3. Dowell JD, Rubart M, Pasumarthi KB, Soonpaa MH, Field LJ. Myocyte and myogenic stem cell transplantation in the heart. Cardiovasc Res 2003; 58:336-50. 4. Menasché Ph, Hagège AA, Scorsin M et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet 2001; 357:279-80. 5. Menasché Ph, Hagège AA, Vilquin JT, et al. Autologous skeletal myoblast transplatation for severe postinfarction left ventricular dyfunction. J Am Coli Cardiol 2003; 41:1078-83. 6. Herreros J, Prosper F, Perez A, et al. Autologous intramyocardial injection of cultured skeletal muscle-derived stem cells in patients with non-acute myocardial infarction. Eur Heart J 2003; 24:2012-20. 7. Siminiak T, Kalawski R, Fiszer D et al. Autologous skeletal myoblast transplantation for the treatment of postinfarction myocardial injury: phase I clinical study with 12 months of follow-up. Am Heart J 2004; 148:531-7. 8. Dib N, McCarthy P, Dinsmore J, et al. Safety and feasibility of autologous myoblast transplantation in patients with ischemic cardiomyopathy: Interim analysis from the United States experience. Circulation 2002; 106 (suppl II):II-463 (Abstract). 9. Mathur A, Martin JF. Stem cells and repair of the heart. Lancet 2004; 364:183-92. 10. Perin EC, Dohmann HFR, Borojevic R, et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation 2003; 107:2294-302. 11. Stamm C, Westphal B, Kleine HD, et al. Autologous bone-marrow stemcell transplantation for myocardial regeneration. Lancet 2003; 361:45-6. 12. Reinecke H, Poppa V, Murry CE. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting. J Mol Cell Cardiol 2002; 34:241-9. 13. Murry, C. E., Soonpaa, M. H., Reinecke, H., Nakajima, H., Nakajima, H. O., Rubart, M., Pasumarthi, K. B., Virag, J. I., Bartelmez, S. H., Poppa, V., Bradford, G., Dowell, J. D.,Williams, D. A., and Field, L. J. 2004. Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature 428(6983):664-8. 14. Balsam, L. B., Wagers, A. J., Christensen, J. L., Kofidis, T., Weissman, I. L., and Robbins, R. C. 2004. Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemic myocardium. Nature 428(6983):66873. 15. Leobon, B., Garcin, I., Menasche, P., Vilquin, J. T., Audinat, E., and Charpak, S. 2003. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host. Proc Natl Acad Sci USA 100(13):7808-11. 16. Leor, J., Patterson, M., Quinones, M. J., Kedes, L. H., and Kloner, R. A. 1996. Transplantation of fetal myocardial tissue into the infarcted myocardium of rat. A potential method for repair of infarcted myocardium? Circulation 94(9 Suppl):I1332-6. 17. Scorsin M, Hagège AA, Marotte F, et al. Does transplantation of cardiomyocyte improve function of infarcted myocardium. Circulation 1997; 96[Suppl II]:II-188-93. 18. Rubart M, Pasumarthi KBS, Nakajima H, Soonpaa MH, Nakajima HO, Field LJ. Physiological coupling of donor and host cardiomyocytes after cellular transplantation. Circ Res 2003; 92:1217-24. 19. Beltrami AP, Barlucchi L, Torella D, et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell 2003; 114:76376. 20. Rhind SM, Taylor J, De Sousa PA, King T, McGarry M, Wilmut I. Human cloning: 20 can it be made safe ? Nature Reviews Genetics 2003; 4:855-64. 21. Drukker M, Benevisty N. The immunogenicity of human embryonic stemderived cells. Trends Biotechnol 2004; 22:136-41. 22. Kehat I, Khimovich L, Caspi O, et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2004; 25 22:1282-9. 23. Heneine W, Tibell A, Switzer WM, et al. No evidence of infection with porcine endogenous retrovirus in recipients of porcine islet-cell xenografts. Lancet 1998; 352:695-9. 24. Schumacher JM, Ellias SA, palmer EP, et al. Transplantation of embryonic porcine 30 mesencephalic tissue in patients with PD. Neurology 2000; 54:1042-50. 25. Paradis K, Langford G, Long Z, et al. Search for cross-species transmission of porcine endogenous retrovirus in patients trated with living pig tissue. Science 1999; 285:1236-41. 26. Min, J. Y., Yang, Y., Sullivan, M. F., Ke, Q., Converso, K. L., Chen, Y., Morgan, J. P., and Xiao, Y. F. 2003. Long-term improvement of cardiac function in rats alter infarction by transplantation of embryonic stem cells. J Thorac Cardiovasc Surg 125(2):361-9. 27. Min JY, Yang Y, Converso KL, Liu L, et al. Transplantation of embryonic stem cells improves cardiac function in postinfarcted rats. J Appl Physiol 2002; 92:288-96. 28. Behfar, A., Zingman, L., Hodgson, D., Rauzier, J., Kane, G., Terzic, A., and Pucéat, M. 2002. Stem cell differentiation requires a paracrine pathway in the heart. FASEB J. 16:1558-1566. 29. Hodgson, D. M., Behfar, A., Zingman, L. V., Kane, G. C., Terzic, C., Alekseev, A. E., Pucéat, M., and Terzic, A. 2004. Stable benefit of embryonic stem cell therapy in 15 myocardial infarction. Am. J. Physiol 287(2): H471-9. 30. Lee SH, Lumelsky N, Studer L, et al. Efficient generation of midbrain and hindbrain neurons from mouse embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2000;18:675-9. 31. Ghostine, S., Carrion, C., Souza, L. C., Richard, P., Bruneval, P., Vilquin, J. T., Pouzet, B., Schwartz, K., Menasche, P., and Hagege, A. A. 2002. Long-term efficacy of myoblast transplantation on regional structure and function after myocardial infarction. Circulation 106(12 Suppl 1):1131-6. 32. Meyer, N., Jaconi, M., Ladopoulou, A., Fort, P., and Puceat, M. 2000. A fluorescent reporter gene as a marker for ventricular specification in ES-derived cardiac cells. FEBS Letter 478(1-2):151-158. 33. Mandon-Pepin, B., Oustry-Vaiman, A., Vigier, B., Piumi, F., Cribiu, E. , and Cotinot, C. 2003. Expression profiles and chromosomal localization of genes controlling meiosis and follicular development in the sheep ovary. Biol Reprod 68(3):985-95. 34. Loebel, D. A., Watson, C. M., De Young, R. A., and Tam, P. P. 2003. Lineage 30 choice and differentiation in mouse embryos and embryonic stem cells. Dev Biol 264(1):1-14. 35. Savatier, P., Lapillonne, H., van Grunsven, L. A., Rudkin, B. B., and Samarut, J. 1996. Withdrawal of differentiation inhibitory activity/leukemia inhibitory factor upregulates D-type cyclins and cyclindependent kinase inhibitors in mouse embryonic stem cells. Oncogene 12(2) :309-22. 36. Reecy, J. M., Li, X., Yamada, M., DeMayo, F. J., Newman, C. S., Harvey, R. P., and Schwartz, R. J. 1999. Identification of upstream regulatory regions in the heartexpressed homeobox gene Nkx2-5. Development 126(4):8039-49. 37. Tam PPL, and Schoenwolf, G. 1999. Cardiac fate map: lineage, allocation, morphogenetic movement and cell commitment. Heart Development (Edited by R.P Harvey and N. Rosenthal):3-18. 38. Eldin, P., Cathiard, A. M., Leger, J., Anoal, M., Pons, F., Mornet, D. , and Leger, J. J. 1993. Probing functional regions in cardiac isomyosins with monoclonal antibodies. Biochemistry 32(10):2542-7. 39. Camelliti, P., Devlin, G. P., Matthews, K. G., Kohl, P., and Green, C. R. 2004. Spatially and temporally distinct expression of fibroblast connexins after sheep ventri cular infarction. Cardiovasc Res 62(2):415-25. 40. Camelliti, P., Green, C. R., LeGrice, I., and Kohl, P. 2004. Fibroblast network in rabbit sinoatrial node: structural and functional identification of homogeneous and heterogeneous cell coupling. Circ Res 94(6):828-35. Epub 2004 Feb 19. 41. Rudy, Y. 2004. Conductive bridges in cardiac tissue: a beneficial role or an arrhythmogenic substrate? Circ Res 94(6):709-11. 42. Kocher, A. A., Schuster, M. D., Szabolcs, M. J., Takuma, S., Burkhoff, D., Wang, J., Homma, S., Edwards, N. M., and Itescu, S. 2001. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nat Med 7(4):430-6. 43. Erdo, F., Buhrle, C., Blunk, J., Hoehn, M., Xia, Y., Fleischmann, B., Focking, M., Kustermann, E., Kolossov, E., Hescheler, J., Hossmann, K. A., and Trapp, T. 2003. Hostdependent tumorigenesis of embryonic stem cell transplantation in experimental stroke. J Cereb Blood Flow Metab 23(7) :780-5. 44. Brusselmans, K., Bono, F., Collen, D., Herbert, J. M., Carmeliet, P., and Dewerchin, M. 2004. A novel role for VEGF as an autocrine survival factor for embryonic stem cells during hypoxia. JBiol Chem 29:29. 45. Moss AJ Prophylactic implantation of a defibrillator in patients with myocardial infarction and reduced ejection fraction. N Engl J Med. 2002, 346:877-83. 46. Loebel DA, Watson CM, De Young RA, Tam PP.Lineage choice and differentiation in mouse embryos and embryonic stem cells. Dev Biol. 2003 Dec 1; 264(1):1-14. REVENDICATIONS 1. Composition comprenant des cellules souches embryonnaires de souris à titre de composition thérapeutique destinée à un Primate. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit primate est l'Homme. 3 Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans une voie de différenciation vers une lignée cellulaire que l'on souhaite remplacer ou introduire chez ledit Primate. 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'engagement dans la voie de différenciation est réalisé par un procédé mettant en oeuvre une étape de culture in vitro desdites cellules souches embryonnaires de souris en présence d'un facteur de différenciation. 5. Composition selon les revendications 3 et 4, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris contiennent essentiellement, de préférence à plus 70 % des cellules souches embryonnaires de souris engagées dans ladite voie de différenciation. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris contiennent à plus 95 % des cellules souches embryonnaires de souris engagées dans ladite voie de différenciation. 7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont issues d'une même lignée cellulaire. 8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite lignée cellulaire de cellules souches embryonnaires de souris est la lignée CGR8 déposée à l'ECACC sous le numéro 95011018. 9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont préalablement cultivées dans un milieu de culture en présence d'un composé capable d'inhiber la différenciation desdites cellules souches embryonnaires. 10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit composé capable d'inhiber la différenciation desdites cellules souches embryonnaires est le LIF ( Leukemia Inhibitory Factor ). 11. Composition selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite composition est obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes: a) le maintien in vitro d'une pluralité de cellules souches embryonnaires de souris indifférenciées dans un milieu de culture contenant au moins un composé capable d'inhiber la différenciation desdites cellules souches embryonnaires; et b) la culture in vitro desdites cellules souches embryonnaires indifférenciées dans un milieu de culture en absence dudit composé capable d'inhiber la différenciation, ledit milieu de culture contenant le ou les composés nécessaires pour engager les cellules souches indifférenciées dans la voie de différenciation vers la lignée cellulaire que l'on souhaite remplacer ou régénérer ou dont on souhaite reconstituer la fonction chez ledit primate. 12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit procédé comprend une étape c) dans laquelle lesdites cellules souches embryonnaires dont la différenciation a été ainsi engagée sont purifiées soit: - par sélection négative à l'aide d'un anticorps ou ligand dirigé spécifiquement contre un marqueur spécifique de cellules souches embryonnaires indifférenciées; ou soit - par sélection positive à l'aide d'un anticorps ou ligand dirigé spécifiquement contre un marqueur spécifique du phénotype des cellules souches dont la différenciation a été initiée. 13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit anticorps est un anticorps anti-SSEA1 lorsque la sélection est une sélection négative. 14. Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans la voie de différenciation en cardiomyocytes et, le cas échéant, en ce que ledit composé capable d'engager la différenciation desdites cellules souches embryonnaires dans cette voie est la BMP-2 (Bone Morphogenetic Protein-2). 15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires engagées dans la voie de différenciation en cardiomyocytes expriment l'un au moins des marqueurs choisis dans le groupe des marqueurs comprenant Nkx2.5, GATA-4 et Mef2c. 16. Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires engagées dans la voie de différenciation en cardiomyocytes n'expriment pas ou n'expriment plus les marqueurs de lignées endodermiques, de préférence l'a-foetoprotéine, et ectodermiques, de préférence la cytokératine. 17. Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans la voie de différenciation en cellules musculaires lisses ou striées ou tout précurseur de cette lignée cellulaire. 18. Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans la voie de différenciation en hépatocytes ou tout précurseur de cette lignée cellulaire. 19. Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans la voie de différenciation en cellules d'ilots pancréatiques, notamment en cellules capables de produire de l'insuline, ou tout précurseur de cette lignée cellulaire. 20. Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que 20 lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans la voie de différenciation en neurones ou tout précurseur de cette lignée cellulaire. 21. Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans la voie de différenciation en cellules hématopoiétiques ou tout précurseur de cette lignée cellulaire. 22. Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans la voie de différenciation en cellules ostéogéniques ou tout précurseur de cette lignée cellulaire. 23. Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans la voie de différenciation en chondrocytes ou tout précurseur de cette lignée cellulaire. 24. Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans la voie de différenciation en cellules de la moelle épinière ou tout précurseur de cette lignée cellulaire. 25. Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires de souris sont engagées dans la voie de différenciation en oligodendrocytes ou tout précurseur de cette lignée cellulaire. 26. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 25 pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à un primate, notamment à l'Homme. 27. Utilisation selon la revendication 26, pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée au remplacement ou à la régénération de cellules ou de tissus chez ledit Primate. 28. Utilisation selon la revendication 26 ou 27, pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à reconstituer la fonction des cellules que l'on souhaite remplacer chez ledit Primate. 29. Utilisation d'une composition pour la préparation d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 26 à 28, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires dont la différenciation a été engagée sont transplantées chez ledit Primate. 30. Utilisation d'une composition pour la préparation d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 26 à 29, caractérisée en ce qu'aucun traitement immunosuppresseur n'est par ailleurs administré chez ledit Primate. 31. Utilisation d'une composition pour la préparation d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 26 à 30, dans laquelle ladite composition est une composition selon l'une des revendications 14 à 16, pour le traitement de l'insuffisance cardiaque, de préférence pour le traitement de l'insuffisance cardiaque ischémique grave ou d'origine non ischémique. 32. Utilisation d'une composition pour la préparation d'une composition thérapeutique selon la revendication 31, caractérisée en ce que lesdites cellules souches embryonnaires sont introduites dans au moins une des zones infarcies du coeur d'un patient ayant subi préalablement un infarctus du myocarde. 33. Utilisation d'une composition pour la préparation d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 31 et 32, dans laquelle lesdites cellules souches embryonnaires sont introduites dans la périphérie d'une des zones infarcies du coeur et/ou le long de l'interface d'une zone nécrosée-myocarde sain d'un patient ayant subi préalablement un infarctus du myocarde. 34. Utilisation d'une composition pour la préparation d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 31 à 33, dans laquelle lesdites cellules souches embryonnaires sont introduites dans une quantité comprise entre 15.106 et 150.107 cellules, de préférence entre 50.106 et 750.106 cellules, entre 100.106 et 750.106 cellules et entre 125.106 et 200.106 cellules. 35. Utilisation d'une composition pour la préparation d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 26 à 30, dans laquelle ladite composition est une composition selon la revendication 18, pour le traitement de l'hépatite fulminate, de l'hépatite chronique, de la cirrhose ou du cancer du foie ou pour toute maladie du foie impliquant une perte, notamment progressive, de la fonction hépatique. 36. Utilisation d'une composition pour la préparation d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 26 à 30, dans laquelle ladite composition est une composition selon la revendication 19, pour le traitement du diabète, notamment de type 1. 37. Utilisation d'une composition pour la préparation d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 26 à 30, dans laquelle ladite composition est une composition selon la revendication 20, pour le traitement de maladie nécessitant la régénération de tissus nerveux, notamment pour le traitement de maladie neurodégénérative. 38. Utilisation d'une composition pour la préparation d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 26 à 30, dans laquelle ladite composition est une composition selon la revendication 21, pour le traitement de maladie nécessitant la régénération de cellules sanguines ou de la fonction hématopoiétique. 39. Utilisation d'une composition pour la préparation d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 26 à 30, dans laquelle ladite composition est une composition selon la revendication 22, pour le traitement de maladies liées à des troubles du développement osseux ou de maladies nécessitant la régénération de tissus osseux. 40. Utilisation d'une composition pour la préparation d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 26 à 30, dans laquelle ladite composition est une composition selon la revendication 23, pour le traitement de maladies liées à un trouble de la croissance des cartilages ou de l'arthrose, ou de maladies nécessitant la régénération de tissus cartilagineux. 41. Utilisation d'une composition pour la préparation d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 26 à 30, dans laquelle ladite composition est une composition selon la revendication 24, pour le traitement de patient atteint de paraplégie.