FR 2876582 A1 20060421 FR 0410962 A 20041015 R7 R2 -.2 { 4 Îl 5 P 6 Z (I) "UTILISATION DE DERIVES DE PYRROLO-PYRAZINES POUR LA FABRICATION DE MEDICAMENTS POUR LE TRAITEMENT DE LA MUCOVISCIDOSE ET DE MALADIES LIEES A UN DEFAUT D'ADRESSAGE DES PROTEINES DANS LES CELLULES" L'invention vise l'utilisation de dérivés de pyrrolopyrazines pour fabriquer des médicaments capables de restaurer l'adressage de protéines du réticulum endoplasmique vers les membranes plasmiques. Elle vise tout particulièrement le traitement de la mucoviscidose. La mucoviscidose (CF: Cystic Fibrosis) est la maladie génétique récessive, autosomique, létale la plus répandue dans les populations européennes et nord américaines. Le gène CF (locus 7g31) code pour la protéine transmembranaire nommée CFTR (pour Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Des mutations du gène CF provoquent un transport anormal d'eau et d'électrolytes à travers les membranes cellulaires de divers organes comme les poumons, les glandes sudoripares, l'intestin et le pancréas exocrine. Bien qu'il existe plus de 1000 mutations de la protéine CFTR, la mutation la plus fréquente (70 % des patients) est la délétion d'une phénylalanine dans le domaine NBF1 en position 508 (delF508). La principale cause de mortalité des patients CF est liée à cette délétion et conduit à des infections ou à une insuffisance pulmonaire provoquées par une augmentation de la viscosité du mucus. Cette viscosité entraîne l'occlusion des voies respiratoires et favorise les infections par les bactéries opportunistes. Une aggravation est de plus constatée au niveau digestif et notamment pancréatique (patient pancréatique-insuffisant). La protéine CFTR est une glycoprotéine de 1480 acides aminés, appartenant à la superfamille des transporteurs membranaires ABC. CFTR est un canal chlorure localisé dans la membrane plasmique apicale des cellules épithéliales pulmonaires chez les individus sains. CFTR est responsable du transport trans-épithélial d'eau et d'électrolytes et permet chez un individu sain l'hydratation des voies aériennes pulmonaires. Chez les patients CF, homozygotes pour la mutation delF508, et plus généralement pour les mutants de classe II (mutations produisant une protéine absente de la membrane plasmique), cette protéine est absente des membranes plasmiques du fait d'un mauvais adressage de la protéine qui est retenue dans le réticulum endoplasmique (RE). L'hydratation des voies aériennes pulmonaires n'est plus fonctionnelle dans ce cas. La délétion delF508 perturbe le repliement du domaine NBF1 et empêche la maturation complète de la protéine qui est donc dégradée très tôt au cours de sa biosynthèse. Cependant, si la protéine delF508 atteint la membrane, elle fonctionne comme un canal chlorure. Une des clés d'un traitement de cette maladie consiste donc en un réadressage de delF508 vers la membrane plasmique des cellules au niveau de laquelle l'activité de transport de delF508 peut être stimulée par des agonistes physiologiques. De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que des dérivés notamment connus pour leur effet antiprolifératif étaient capables d'activer le CFTR sauvage et des formes mutées et de provoquer une re-localisation membranaire de la protéine delF508-CFTR restaurant ainsi sa capacité de transport trans-membranaire. De manière générale, ces dérivés sont capables de restaurer un défaut d'adressage des protéines dans les cellules. De plus, ces dérivés présentent l'intérêt d'une innocuité 25 élevée. L'invention à donc pour but de fournir une nouvelle utilisation de ces dérivés pour fabriquer des médicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liées à un défaut d'adressage des protéines dans les cellules. Les dérivés utilisés conformément à l'invention répondent à la formule (I): R7 P2' N 2 -7 r[ 4 I5 dans laquelle R2 et R3 sont identiques ou différents et représentent H, Cl-C6 alkyl, ledit alkyl étant une chaîne alkyle droite ou ramifiée, le cas échéant substituée, - R6 est un cycle aromatique Ar ou un cycloalkyle, le cas échéant substitué, ledit cycloalkyle étant le cas échéant substitué par un groupe aryle qui peut être également substitué, - R7 est H, Cl-C6 alkyl, (alk.)n-hal., CH2-CH = CH2r CH2-cycloalkyl, CH2- Ar, Z est H ou CH3. De préférence, R2 et R3, et/ou Z et/ou R7 sont différents de H. Ar est de préférence un phényl, naphtyl, furyl, thiényl, 15 pyridyl, cyclopropyl phényl, phényl dioxolyl. "Cycloalkyl" est un C3-C6 cycloalkyl. Les substitutions du groupe alkyl, du cycle aromatique ou cycloalkyl sont choisies dans le groupe comprenant un ou plusieurs halogènes (F,Cl, Br, I, CF3), OH, NH2, N(H, alkyl), N(alkyl)2, 0-alkyl, COOH,COO-alkyl, CONH2, CON(H,alkyl), CON(alkyl)2, NHCONH2, NHCON (H, al kyl) , NHCON (al kyl) 2r N(alkyl)CONH2, N (alkyl) CON (H, alkyl) , N(alkyl)CON(alkyl)2, alkoxy, CN, 0-SO2-NH2, 0-SO2-N (H, alkyl) , -O-SO2-N (alkyl) 2, SH,S-alkyl. Un ou plusieurs substituants peuvent être présents. "Alkyl" est un Cl-C6 alkyl et comprend les isomères. "Alkoxy" comprend un groupe Cl-C6 alkyl. "Alk." est un groupe Cl-C6 alkylène, n est 1-6, et "hal." est F, Cl, Br, I or CF3. Lesdits pyrrolo [2,3-b] pyrazines, également désignés par aloïsines ciaprès, sont capables de restaurer l'adressage de la protéine CFTR vers les membranes plasmiques des cellules et constituent donc des composés de grand intérêt pour le traitement de pathologies liées à de tels problèmes de défaut d'adressage. Comme illustré par les exemples, ils sont particulièrement efficaces pour provoquer la re-localisation de la protéine delF508-CFTR dans la mucoviscidose où cette protéine est retenue dans le réticulum endoplasmique, et de restaurer ainsi sa capacité de transfert transmembranaire. Des dérivés préférés de pyrrolo-pyrazines présentent la formule (II): R7 e Z dans laquelle le groupe phényl en position 6 est substitué par un, deux ou trois substituants R choisis dans le groupe comprenant. - H, -OH, alkyl, -0 alkyl, hal., -NH2, -N(H,alkyl), 15 N(alkyl)2, -O-SO2NH2, -O-SO2-N (H, alkyl), -O-SO2-N(alkyl)2, COOH, -COO-alkyl, CONH2, CON(H,alkyl), -CON(alkyl)2r - R7 est H, alkyl, (alk.) n hal., -CH2-CH = CH2, (alk.) ncycloalkyl, alk.- Ar, et Z est H ou CH3. Dans un groupe préféré, Z et/ou R7 sont différents de H. Un composé tout particulièrement préféré correspond à l'aloïsine A répondant à la formule (III) RM39 (Aloisine A) H OH (III) Lors de l'élaboration des médicaments, les principes actifs, utilisés en quantités thérapeutiquement efficaces, sont mélangés avec les véhicules pharmaceutiquement acceptables pour le mode d'administration choisi. Ces véhicules peuvent être solides ou liquides. Ainsi pour une administration par voie orale, les médicaments préparés sous forme de gélules, comprimés, dragées, capsules, pilules, gouttes, sirops et analogues. De tels médicaments peuvent renfermer de 1 à 100 mg de principe actif par unité. Pour l'administration par voie injectable (intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire), les médicaments se présentent 15 sous forme de solutions stériles ou stérilisables. Ils peuvent être également sous forme d'émulsions ou de suspensions. Les médicaments de l'invention sont plus particulièrement administrés sous forme d'aérosols. Les doses par unité de prise peuvent varier de 1 à 50 mg de principe actif. La posologie quotidienne est choisie de manière à obtenir une concentration finale d'au plus 100 pM en dérivé de pyrrolo-pyrazines dans le sang du patient traité. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les résultats rapportés ci-après afin d'illustrer l'invention. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 5 qui représentent, respectivement: - les figures lA à 1C, la formule de l'aloïsine A, l'activation du canal chlorure CFTR par l'aloïsine A sur des cellules CHO (fig.1B) et sur des cellules épithéliales pulmonaires humaines Calu-3 (fig.1C) ; - le figures 2A et 2B, l'activation par l'aloïsine A de la protéine G551D- CFTR dans les cellules CHO (fig.2A) et la protéine de1F508 dans les cellules épithéliales humaines pulmonaires de lignée CF15 (fig.2B) ; - les figures 3A et 3B, l'ECm de l'aloïsine A à 50pM (fig.3A) et l'effet d'inhibiteurs de CFTR sur l'activité de delF508 après traitement par l'aloïsine A; - la figure 4, la localisation de delF508 chez des patients CF et son re- adressage vers la membrane après traitement par l'aloïsine A; et - les figures 5A et 5B, les tests de toxicité de l'aloïsine A sur des cellules CHO-WT après incubation de 2 h (fig. 5A) et de 24 h (fig.5B). MATERIEL ET METHODES M1. Culture cellulaire Cellules CHO-WT: Les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) sont des fibroblastes qui ont été transfectés avec le gène du 15 CFTR sauvage (CFTR-WI). Ces cellules vont donc surexprimer la protéine CFTR. Milieu de culture: Milieu MEM alpha (GIBCO) + 7 % de sérum de veau foetal + 0,5 % de pénicilline/streptomycine + 100 pM de méthotrexate (améthoptérine, Sigma). Cellules CF15: Les cellules CF15 sont des cellules épithéliales humaines d'origine nasale qui expriment le gène AF508-CFTR. Milieu de culture: Milieu DMEM + HAM F12 + 10 % de FCS + 0,6 % de pénicilline/streptomycine + facteurs de croissance (insuline 5 pg/ml, transferrine 5 pg/ml, épinéphrine 5,5 pM, adénine 0,18 mM, EGF 10 ng/ml, T3 2 nM, hydrocortisone 1,1 pM). Cellules Calu-3: Les cellules Calu-3 sont des cellules épithéliales humaines d'origine pulmonaire qui expriment le 30 gène du CFTR sauvage. Milieu de culture: Milieu DMEM/F12 avec glutamax + 7 de sérum de veau foetal + 1 de pénicilline/streptomycine. M2. Immunomarquage L'immunomarquage permet de visualiser la localisation cellulaire de la protéine CFTR grâce à un anticorps (Ac) primaire antiCFTR, puis un anticorps secondaire antianticorps primaire marqué au fluorophore Cy3. Les cellules sont préalablement ensemencées sur des lamelles dans du milieu de culture approprié. 3 lavages au TBS (NaCl: 157 mM, Tris base: 20 qM, pH 7,4) de 5 min chacun sont effectués. Les cellules sont alors fixées par ajout de TBS-paraformaldéhyde (3 %) pendant 20 min. Après 3 lavages au TBS (5 min), les cellules sont incubées avec du TBS-triton 0,1 % (10 min) qui permet la formation de trous dans la membrane cellulaire, puis 3 lavages au TBS sont à nouveau effectués avant la mise en présence des cellules avec le TBSBSA 0,5 saponine 0,05 % pendant 1 h. Les cellules sont ensuite incubées avec l'anticorps primaire anti-C terminal CFTR (2 qg/ml) pendant 1 h. 3 lavages au TBS-BSA-saponine de 5 min chacun sont réalisés avant l'incubation avec l'anticorps secondaire GAM-cy3 (1/400) pendant 1 h. Suite à 2 lavages au TBS de 5 min, les noyaux sont marqués par incubation au Topro3 (1/1000) pendant 5 min. Enfin, les lamelles peuvent être montées sur lame après 3 derniers lavages au TBS de 5 min. Les lames sont observées au microscope confocal (Bio-Rad) grâce à une excitation au laser aux longueurs d'onde appropriées. Afin de différencier le marquage entre Cy3 et Topro3 la couleur de fluorescence de Topro3 a été changée en bleu (couleur des noyaux). M3. Efflux de radiotraceurs Les mesures de transport d'ions chlorure dans les cellules ont été réalisées à l'aide de la technique des efflux d'iodure radioactif (Becq et al., 1999; Dormer et al., 2001). Le traceur (125I) est incorporé dans le milieu intracellulaire. Puis, la quantité de radiotraceur qui sort de la cellule est comptée après l'ajout de différents agents pharmacologiques. L'iodure est utilisé comme un traceur du transport d'ions chlorure. 125I a de plus l'avantage d'avoir une courte durée de vie comparée à celle d'autres marqueurs comme 35C1 (1/2 vie respective: 30 jours et 300 000 ans). Les cellules sont mises en culture sur des plaques 24 puits dans un milieu adéquat. 2 rinçages avec du milieu d' efflux (NaCl: 136,6 mM, KC1: 5,4 mM, KH2PO4: 0,3 mM, NaH2PO4: 0,3 mM, NaHCO3: 4,2 mM, CaCl2: 1,3 mM, MgC12: 0,5 mM, MgSO4: 0,4 mM, HEPES: 10 mM, D-glucose: 5,6 mM) sont effectués afin d'éliminer les cellules mortes qui relarguent la radioactivité de façon anarchique. Puis, les cellules sont mises à incuber avec 500 pl de charge (1 pCi/ml de 125INa) pendant 30 min pour les CHO-WT ou 1 h pour les 0E15 et Calu-3. L'iodure s'équilibre de part et d'autre de la membrane cellulaire. Le robot (MultiPROBE, Packard) réalise les étapes suivantes: le milieu de charge est rincé avec du milieu d'efflux pour éliminer la radioactivité extracellulaire. Le surnageant est collecté toutes les minutes dans des tubes à hémolyse et le milieu est remplacé par un volume équivalent (500 pl). Les prélèvements des 3 premières minutes ne subissent pas l'addition de drogue, ils permettent d'obtenir une ligne de base stable, caractérisant la sortie passive des ions I. Les 7 prélèvements suivants sont obtenus en présence de la molécule à tester. A la fin de l'expérience, les cellules sont lysées par ajout de 500 pl de NaOH (0,1 N) /0,l % SDS (30 min), ainsi, la radioactivité restée à l'intérieur de la cellule peut être déterminée. La radioactivité présente dans les tubes à hémolyse est comptée en coups par minute (cpm) grâce à un compteur gamma (Cobra II, Packard). Les résultats en cpm sont exprimés sous forme de vitesse de sortie d'iodure radioactif (R) d'après la formule suivante: R (min - 1) _ [In (125I t1) -In (1251 t2) ] / (tl-t2) avec 1251 tl: cpm au temps t; 125I t2: cpm au temps t2. Ce flux d'iodure est représenté sous forme de courbe. Afin de quantifier la sortie d'iodure due à l'administration de la molécule testée, on calcule le flux relatif suivant qui permet de s'affranchir du flux de base: Vitesse relative (min-1)=Rpic-Rbasal. Enfin, ces résultats sont normalisés pour pouvoir comparer l'effet des différentes drogues entre elles. Les résultats sont présentés sous la forme de moyenne +/- SEM. Le test statistique de Student est utilisé pour comparer l'effet des drogues aux contrôles (les valeurs correspondantes à P M4. Test de cytotoxicité Le test de toxicité au MTT est un test colorimétrique qui repose sur la capacité des déshydrogénases mitochondriales à métaboliser le MTT (sel de tétrazolium jaune) en formazan (pourpre). L'absorbance, proportionnelle à la concentration de colorant converti, peut être alors mesurée par spectrophotométrie. Les cellules sont mises à incuber sur des plaques 96 puits en présence de l'agent à tester pendant 2 h. 3 contrôles sont réalisés: 100 % cellules vivantes: cellules sans agent; 0 % cellules vivantes: cellules laissées à l'air libre; blanc: milieu sans cellule. Les cellules sont rincées avec du milieu RPMI sans rouge de phénol pour que la couleur du milieu n'interfère pas dans les mesures de l'absorbance. Puis, elles sont incubées pendant 4 h avec 100 pl de solution de RPMI supplémentée en MTT (0,5 mg/ml). Le milieu est alors éliminé, l'ajout de 100 pl de DMSO permet de solubiliser le colorant converti (formazan). L'absorbance est mesurée par spectrophotométrie à 570 nm (pourpre) ; 630 nm (bruit de fond) . Afin de s'affranchir du bruit de fond, le calcul suivant est effectué : DOréelle=D057onm D063onmÉ Puis, les résultats sont normalisés par rapport aux contrôles (100 % et 0 % de cellules vivantes) et sont présentés sous forme de moyenne +/-SEM. RESULTATS R1. L'aloïsine A active CFTR sauvage (wt), G551D et delF508 Une première série d'expérimentations montre que l'aloïsine A est capable d'activer le canal chlorure CFTR dans les cellules CHO (EC50 = 152,1 nM, figure 1A) et dans les cellules épithéliales pulmonaires humaines de lignée Calu-3 (EC50 = 140,1 nM, figure 1B). Deux formes mutées de CFTR ont été également testées. Il s'agit du mutant G551D et de delF508. La figure 2 montre que l'aloïsine A active la protéine G551D-CFTR dans la cellule CHO (EC50 = 1,5 nM, figure 2A) et la protéine delF508 (EC50 = 110 nM, figure 2B) dans les cellules épithéliales humaines pulmonaires de lignée CF15 après incubation des cellules à 27 C (une procédure qui permet de relocaliser la protéine delF508 vers la membrane). Ces résultats démontrent que cette molécule est un activateur de CFTR sauvage, G551D et delF508. R2. Effet de l'aloïsine A sur l'adressage de delF508 dans les cellules CF15 L'étude de l'adressage de la protéine delF508-CFTR a été réalisée en combinant des approches de pharmacologie, d'imagerie cellulaire, des tests biochimiques et électrophysiologiques sur des cellules CF15 épithéliales humaines pulmonaires homozygotes pour la délétion delF508. Pour chaque expérience, l'addition d'un cocktail (Forskoline 10 pM + Génistéine 30 pM) permet l'activation du CFTR quand celui-ci est fixé à la membrane. Ainsi, un efflux d'iodure pourra être observé si l'adressage de delF508 a été restauré. Les résultats, présentés sous forme d'histogramme ont été normalisés par rapport à un traitement de référence (traitement des cellules au MPB-91 250 pM pendant 2 h) pour lequel on considère qu'on a 100 d'activité CFTR. La figure 3A montre qu'après un traitement de 2 h avec pM d'aloïsine A l'activité delF508-CFTR est restaurée. Ces résultats démontrent ainsi que le traitement par l'aloïsine A des cellules CF15 pendant 2 h à 37 C restaure un adressage de la protéine delF508 et permet à celle-ci de fonctionner en tant que transporteur ionique. En l'absence de traitement des cellules, la protéine delF508 n'est pas membranaire et il n'y a pas d'efflux d'iodure stimulé par le cocktail (Forskoline 10 pM, Génistéine 30 pM). L'EC50 (concentration de la molécule qui donne 50 % de l'efficacité maximale) de l'aloïsine A a été déterminé à 50 pM (figure 3A, n=4, pour chaque condition). Pour préciser l'effet observé des inhibiteurs connus de CFTR sur l'activité de delF508 ont été testés après traitement par l'aloïsine A. Les résultats présentés figure 3B montrent que ce transport est bloqué par le glibenclamide et le DPC mais insensible au DIDS et au calixarène. Ce profil pharmacologique correspond à celui de CFTR. Chez les patients CF, la protéine delF508 est absente des membranes plasmiques du fait d'un mauvais adressage de la protéine qui est retenue dans le réticulum endoplasmique (RE). Par imagerie cellulaire dans les cellules CF15, delF508 est effectivement localisée dans des compartiments intracellulaires (figure 4). En revanche le traitement avec pM d'aloïsine A permet de rediriger la protéine delF508 vers la membrane comme le présente la figure 4. R3. Cytotoxicité de l'aloïsine A Dans le but de tester la cytotoxicité de l'aloïsine A, des cellules CHO-WT ont été incubées 2 h (figure 5A) ou 24 h (figure 5B) avec différentes concentrations d'aloïsine A avant de subir le test de viabilité cellulaire au MTT. Les résultats montrent que les cellules sont viables pour toutes les concentrations. Cette molécule ne présente donc pas de cytotoxicité cellulaire. Les résultats ci-dessus montrent que l'aloïsine A, utilisée pour illustrer la famille des pyrrolo-pyrazines, est (1) un composé activateur de CFTR sauvage, G551D et DelF508 et (2) provoque une relocalisation membranaire de la protéine delF508-CFTR restaurant ainsi sa capacité de transport transmembranaire. Cette molécule n'est pas toxique dans les tests réalisés. De plus, des études de toxicité de l'aloïsine A, réalisées chez l'animal, ont révélé une toxicité très faible. 12 BIBLIOGRAPHIE BECQ et al. (1999) Journal of Biological Chemistry 274, 27415-27425. DORMER et al. (2001) Journal of Cell Science 114, 4073-4081. 13 REVENDICATIONS 1/ Utilisation de dérivés de pyrrolo-pyrazines pour 5 fabriquer des médicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liées à un défaut d'adressage des protéines dans les cellules, ces dérivés répondant à la formule (I): dans laquelle R2 et R3 sont identiques ou différents et représentent H, Cl-C6 alkyl, ledit alkyl étant une chaîne alkyle droite ou ramifiée, le cas échéant substituée, - R6 est un cycle aromatique Ar ou un cycloalkyle, le cas échéant substitué, ledit cycloalkyle étant le cas échéant substitué par un groupe aryle qui peut être également substitué, R7 est H, Cl-C6 alkyl, (alk.) n- hal. , CH2-CH = CH2r 20 CH2-cycloalkyl, CH2-Ar, Z est H ou CH3. 2/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que R2 et R3, et/ou Z et/ou R7 sont différents de H. 3/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits dérivés de pyrrolo-pyrazines présentent la formule (II): 15 (I) 4N e z dans laquelle - le groupe phényl en position 6 est substitué par un, 5 deux ou trois substituants R choisis dans le groupe comprenant. - H, -OH, alkyl, -0 alkyl, hal., -NH2, -N(H,alkyl), -N(alkyl)2, -O-SO2NH2, -O-SO2-N (H, alkyl), -O-SO2-N(alkyl)2, _ COOH, -000-alkyl, CONH2, CON(H,alkyl), -CON(alkyl)2r - R7 est H, alkyl, (alk.) n hal., -CH2-CH = CH2r (alk.) ncycloalkyl, alk.- Ar, et - Z est H ou CH3. 4/ Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que Z et/ou R7 sont différents de H. 5/ Utilisation de l'aloïsine A de formule (III) RM39 (Aloisine A) OH pour fabriquer des médicaments pour le traitement de la mucoviscidose. 6/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration sous formes de gélules, comprimés, dragées ou capsules. 7/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration par voie injectable, sous forme de 5 solution. 8/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration sous forme d'aérosol. 9/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 10 1 à 8, pour le traitement de la mucoviscidose.