FR 2876388 A1 20060414 FR 0410715 A 20041011 La présente invention est relative à l'amélioration de la production d'hydrogène par Chlamydomonas reinhardtii. L'hydrogène est une matière première essentielle de l'industrie chimique, et constitue également un combustible appelé à jouer un rôle majeur dans les décennies à venir. Les piles à combustibles alimentées par de l'hydrogène permettent, par réaction de l'hydrogène avec l'oxygène de l'air, de produire de l'électricité de manière non-polluante, en ne rejetant que de la vapeur d'eau. Les avancées technologiques dans le domaine des piles à combustibles rendent leur utilisation à grande échelle de plus en plus envisageable. Toutefois, la majeure partie de l'hydrogène actuellement utilisé est produit à partir de sources d'énergie fossiles, telles que le pétrole ou le charbon, par des techniques elles-mêmes génératrices de pollution, telles que la conversion catalytique des hydrocarbures du gaz naturel ou le craquage du pétrole ou du charbon. Il apparaît donc souhaitable de disposer de procédés rentables permettant la production d'hydrogène à partir d'une source d'énergie primaire renouvelable et propre (non libératrice de gaz à effet de serre). Certaines algues vertes unicellulaires appartenant aux genres Scenedesmus, Chlorococcum, Chlorella (ordre des Chlorococcales), Lobochlamys et Chlamydomonas (ordre des Volvocales), telles que l'espèce Chlamydomonas reinhardtii, sont capables de produire de l'hydrogène à partir d'énergie solaire, en utilisant l'eau comme donneur 30 d'électrons et de protons. Chez ces algues, l'hydrogène est produit par une hydrogénase à fer, ayant une forte activité spécifique. Cette enzyme est connectée à la chaîne photosynthétique de transfert d'électrons PSI via un transporteur d'électrons commun, la ferrédoxine. Les électrons nécessaires à la production d'hydrogène peuvent être fournis au PSI soit par l'activité du PSII (voie A), soit par l'utilisation des réserves carbonées via la réduction non-photochimique des plastoquinones (voie B). Ces deux voies sont schématisées sur la Figure 1. Légende de la Figure 1: En traits pleins, la voie A, PSII-dépendante; en pointillés la voie B, reposant sur une réduction des plastoquinones, indépendante du PSII. PSI: Photosystème I; PSII: Photosystème II RuBP: ribulose 1,5 bisphosphate; LHC: light harvesting complex; FNR: ferrédoxine NADP réductase; Fd ferrédoxine; Pc:plastocyanine; cytb6: cytochrome b6 cytf: cytochrome f; NDH: NADH-deshydrogénase; PQ(H)2 plastoquinol; Qa: quinone a; P680 et P700: centres réactionnels des PSI et PSII, respectivement. En conditions naturelles, la production d'H2 n'est qu'un phénomène transitoire. En effet, l'hydrogénase est très sensible à l'02. Or, la photolyse de l'eau intervenant au niveau du photosystème II, qui fournit des électrons pour la production d'H2 par la voie A, produit également de 1'02 qui induit une inhibition rapide de l'hydrogénase. Diverses solutions ont été proposées pour remédier à ce problème. La première solution repose sur une production à l'obscurité, les autres sur une production à la lumière utilisant en partie la voie B, qui, contrairement à la voie A, ne conduit pas à une production d'oxygène. Par exemple, le Brevet U.S. 4,532,210 décrit un procédé alternant des phases de lumière et d'obscurité. Au cours des périodes lumineuses, les algues produisent de l'O2 et accumulent des réserves hydrocarbonées produites par photosynthèse. Ces réserves sont ensuite utilisées en anaérobie pendant les phases obscures pour produire de l'hydrogène. Cette méthode nécessite une purge à l'azote pour atteindre l'anaérobie. Elle est en outre limitée par l'efficacité de la production d'H2 à l'obscurité, qui est inférieure d'un ordre de grandeur à la production à la lumière. La Demande U.S. 2001/0053543 décrit un procédé basé sur l'inhibition réversible du photosystème II par une carence en soufre. Ce procédé comprend une étape de culture des algues vertes, à la lumière, et dans un milieu à teneur normale en soufre, pour permettre l'accumulation de réserves hydrocarbonées, et une étape de culture en récipients scellés et à la lumière, dans un milieu dépourvu de soufre. L'inhibition du photosystème II entraîne la cessation de la production d'oxygène par la photosynthèse. Lorsque les algues (dont la respiration n'est pas inhibée par la carence en soufre) ont utilisé la totalité de l'oxygène présent dans le milieu, elles deviennent anaérobies et utilisent les réserves hydrocarbonées constituées grâce à la photosynthèse pour produire de l'H2. L'alternance de phases de culture en présence et en absence de soufre permet une séparation temporelle des phases lumineuses de production d'02 et d'H2. La Demande U.S. 2003/0162273 propose une méthode alternative pour induire une carence en soufre inhibant le photosystème II; il s'agit de l'utilisation d'une algue génétiquement modifiée sous-exprimant une sulfate perméase chloroplastique. Les méthodes décrites ci-dessus permettent d'éviter l'inhibition de l'hydrogénase à fer, en séparant la production d'O2 et celle d'H2. Cependant, la production d'hydrogène par les trois méthodes décrites cidessus présente des limitations. La première méthode repose sur l'activité fermentaire de l'algue à l'obscurité, phénomène peu efficace ne conduisant qu'à une production d'hydrogène marginale. Les seconde et troisième méthodes reposent sur le fonctionnement parallèle des voies A et B. La voie A s'accompagnant d'un dégagement d'oxygène, doit être maintenue à un niveau inférieur à la consommation d'O2 respiratoire afin de maintenir l'anoxie. La voie A est donc limitée par la capacité respiratoire des algues. La contribution de la voie B est significative mais limitée. La présente invention a pour but d'améliorer le rendement de cette deuxième voie (B). Dans ce but, les Inventeurs ont eu l'idée d'utiliser dans le chloroplaste une NADH-déshydrogénase de type II pour stimuler la réaction de réduction des plastoquinones. Les NADH-déshydrogénases de type I et II sont des enzymes capables de réduire les quinones des chaînes de transfert d'électrons. Elles sont associées aux chaînes respiratoires mitochondriales et bactériennes (KERSCHER, Biochim. Biophys. Acta 1459: 274-283, 2000). Les NADH déshydrogénases de type I (NDH-I) sont des complexes multimériques transmembranaires comprenant de 14 à environ 50 sous-unités. Ce type de complexe n'oxyde que le NADH et présente une activité associée de pompage de protons. Les NAD(P)H déshydrogénases de type II (NDH-II) sont des enzymes monomériques de type oxydoréductase, de poids moléculaire compris entre 30 et 60 kDa capables de réduire les quinones des chaînes respiratoires bactériennes ou des chaînes mitochondriales des plantes et des levures, en oxydant le NADH ou le NADPH. Leur association avec les chaînes photosynthétiques des plantes et des algues a également été proposée mais n'a pas été démontrée à ce jour. Ce type d'enzyme n'a pas été mis en évidence dans le règne animal. Dans les chloroplastes des plantes supérieures, l'existence d'un complexe NDH-I fonctionnel a été démontrée (BURROWS et al., EMBO J. 17: 868-876, 1998; SAZANOV et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1319-1324, 1998; HORVATH et al., Plant Physiol. 123: 1337-1349, 2000) et l'existence d'une activité de type NDH-II a également été proposée (CORNEILLE et al., Biochim. Biophys. Acta 1363: 59-69, 1998). Chez Chlamydomonas reinhardtii, les gènes codant pour le complexe NDH-I chloroplastique sont absents. Toutefois, l'existence d'une activité de type NDH-II a été suggérée (COURNAC et al., Int. J. Hydrog. Energy 27: 1229-1237, 2002; PELTIER et COURNAC, Annu. Rev. Plant Biol. 53: 523-550, 2002). La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'une NAD(P)H déshydrogénase de type II (NDHII), ou d'un polynucléotide codant pour ladite protéine, pour augmenter capacité d'une algue verte à produire de l'hydrogène. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention ladite algue verte est une algue verte unicellulaire, choisie de préférence parmi les Chlorococcales, notamment les genres Scenedesmus, Chlorococcum, Chlorella, et les Volvocales, notamment les genres Lobochlamys et Chlamydomonas. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ladite algue appartient au genre Chlamydomonas. Avantageusement, ladite algue appartient à l'espèce Chlamydomonas reinhardtii. On définit comme NDH-II toute flavoenzyme possédant. a) des caractéristiques communes à l'ensemble des NAD(P)H déshydrogénases, à savoir i) la capacité à catalyser la réduction des quinones des chaînes de transfert d'électrons par l'oxydation du NADH ou du NAD(P)H, en utilisant le FAD ou le FMN comme cofacteur flavinique, et ii) la présence dans sa séquence, d'au moins un exemplaire du motif consensus GxGxxG où G représente une glycine et x représente un acide aminé quelconque, qui correspond au site de fixation du cofacteur flavinique et du NAD(P)H; b) des caractéristiques spécifiques aux NAD(P)H déshydrogénases de type II, à savoir l'activité sous la forme d'un monomère de 30 à 60 kDa ou d'un homodimère, et le fait de ne pas réaliser de transfert transmembranaire de protons. Pour une revue détaillée sur les NDH-II, on peut notamment se reporter aux revues de YAGI (J. Bioenergetics Biomembranes 23: 211-224, 1991) et de KERSCHER (Biochim. Biophys. Acta 1459: 274-283, 2000). Parmi les NDH-II convenant plus particulièrement à la mise en oeuvre de la présente invention on citera notamment la NDH-II d'Agrobacterium tumefaciens (N d'accès NCBI: AI2824; N d'accès SWISSPROT: Q8UDU6). La séquence nucléotidique codant pour cette enzyme est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1, et la séquence polypeptidique déduite sous le numéro SEQ ID NO: 2. D'autres NDH-II pouvant être utilisées pour la mise en oeuvre de la présente invention sont à titre d'exemples non-limitatifs, les NDH- II d'Acidianus ambivalens (AJ489504), de Corynebacterium glutamicum (CAB41413.1), d'Escherichia coli (NP 415627), de Synechocystis sp. (HOWITT et al., J. Bacteriol. 181(13): 3994-4003, 1999; ORF s1r1743), de Zymomonas mobilis (AAD56918), de Bacillus subtilis (NP 389111), d'Azotobacter vinelandi (AAK19737), de Trypanosoma brucei (AAM95239.1), de Solanum tuberosum (CAB52796.1, CAB52797.1), de Saccharomyces cerevisiae (YML120C, YMR145c, YDL085w), de Neurospora crassa (CAB41986, EAA27430), de Yarrowia lipolytica (XP 505856) , ainsi que les NDH-II putatives identifiées chez Chlamydomonas reinhardtii, disponibles dans le cadre de la séquence complète du génome de Chlamydomonas reinhardtii (version 2) sur le site http://genome.jgi-psf.org/chlre2/chlre2.home.html , sous les identifications C 310108, C 1170009, C 5950001, C 1890016, C 1450028, C 1450029, C 270109. La présente invention a notamment pour objet un procédé pour accroître la capacité d'une algue verte à produire de l'hydrogène, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite algue par un polynucléotide codant pour une NDH-II telle que définie ci-dessus, et l'expression de ladite NDH-II dans ladite algue. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, on utilisera les techniques usuelles du génie génétique. Classiquement, on construit une cassette d'expression en plaçant un polynucléotide codant pour la NDH-II que l'on souhaite exprimer, sous contrôle de séquences de régulation de l'expression (notamment promoteur et terminateur de transcription) appropriées. Avantageusement, ledit polynucléotide codant pour la NDH-II est fusionné à une séquence d'adressage chloroplastique. La cassette d'expression peut également comprendre, en outre, des éléments de régulation de la transcription et/ou de la traduction, parmi lesquels on citera notamment les activateurs (enhancers) ou les atténuateurs (silencers) de transcription, les séquences de tête, les séquences de polyadénylation, etc. La cassette d'expression ainsi obtenue est ensuite insérée dans un vecteur approprié, qui est utilisé pour transformer la cellule ou l'organisme-hôte choisi. Différents outils et méthodes utilisables pour la transformation des algues vertes sont connus en eux-mêmes, et peuvent être utilisés pour la mise en oeuvre de la présente invention (pour revue, ROCHAIX et al., The Molecular Biology of Chloroplasts and Mitochondria in Chlamydomonas, Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 1998). A titre d'exemples non-limitatifs de séquences de régulation de l'expression (promoteurs, terminateurs, etc.), et de séquences d'adressage chloroplastique utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera. pour une expression nucléaire, les promoteurs, terminateurs et peptides d'adressage des gènes RbcS2 codant pour la petite sous-unité de la RUBISCO (ribulose biphosphate carboxylase/oxygénase) (GOLDSCHMIDTCLERMONT et RAHIRE, J. Mol. Biol. 191: 421-432, 1986), AtpC codant pour la sous-unité gamma de l'ATP synthétase chloroplastique (QUINN et MERCHANT, Plant Cell 7: 623-638, 1995; KINDLE et LAWRENCE. Plant Physiol. 116: 1779-1791, 1998), et PetE codant pour la plastocyanine (QUINN et MERCHANT, Plant Cell 7: 623-638, 1995; KINDLE, Plant Mol. Biol. 38: 365-377, 1998), qui peuvent être combinés de façon différente; et - pour une expression chloroplastique, les promoteurs, terminateurs et peptides d'adressage des gènes RbcL codant pour la grande sous unité de la RUBISCO, AtpB codant pour la sous-unité bêta de l'ATP synthétase, et PsbA codant pour la sous-unité Dl du photosystème II (BATEMAN et PURTON, Mol. Gen. Genet. 263: 404-410, 2000). A titre d'exemples non limitatifs de marqueurs de sélection utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera: - pour une expression nucléaire, les gènes Arg7 codant pour l'arginosuccinate lyase de Chlamydomonas qui complémente un mutant déficient et donc auxotrophe pour l'arginine (DEBUCHY et al., EMBO J. 8: 2803-2809, 1989), Nit 1 codant pour la nitrate réductase de Chlamydomonas qui complémente un mutant déficient et donc incapable de croître avec des nitrates comme seule source d'azote (KINDLE et al., J. Cell Biol. 109: 2589-2601, 1989), Nic7 codant pour une enzyme intervenant dans la biosynthèse du nicotinamide de Chlamydomonas qui complémente un mutant déficient et donc auxotrophe pour le nicotinamide (FERRIS, Genetics 141: 543-549, 1995), Oeel codant pour une sous-unité du photosystème II de Chlamydomonas qui complémente un mutant strictement hétérotrophe (MAYFIELD et KINDLE, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 2087-2091, 1990), aadA codant pour l'aminoglycoside adénine transférase d'E. coli qui confère la résistance à la spectinomycine et la streptomycine à n'importe quelle souche de Chlamydomonas (CERUTTI et al., Genetics. 145: 97-110, 1997), ble codant pour une protéine de fixation à la bléomycine de Streptoalloteichus hindustanus qui confère la résistance à la phléomycine à n'importe quelle souche de Chlamydomonas (STEVENS et al., Mol. Gen. Genet. 251: 23-30, 1996) ; les gènes codant pour des résistances aux antibiotiques doivent être exprimés sous le contrôle de séquences régulatrices de Chlamydomonas comme celles du RbcS2; et - pour une expression chloroplastique, la complémentation d'un mutant obtenu par délétion ou insertion dans un gène codant pour une protéine de la chaîne photosynthétique par le gène natif porté par le fragment d'ADN inséré, par exemple le gène psbH codant pour une sous-unité du PSII (BATEMAN et PURTON,. Mol. Gen. Genet. 263: 404-410, 2000), et les gènes aadA codant pour l'aminoglycoside adénine transférase d'E. coli qui confère la résistance à la streptomycine et la spectinomycine, et aphA-6 codant pour l'aminoglycoside phosphotransférase d'Acinetobacter baumanii qui confère la résistance à la kanamycine et l'amikacine. La transformation des algues vertes peut être réalisée par diverses méthodes telles que, par exemple l'insertion d'un ADN dans le génome nucléaire par des transformations par billes de verre (KINDLE, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 1228-1232, 1990), par biolistique (DEBUCHY et al., EMBO J. 8: 2803-2809, 1989), et par électroporation (SHIMOGAWARA et al., Genetics. 148: 1821-1828, 1998). Pour la transformation de l'ADN chloroplastique, et l'expression dans les chloroplastes, on utilisera avantageusement l'insertion par recombinaison homologue d'un ADN encadré par des séquences homologues à celle du génome chloroplastique et correspondant à des zones neutres du génome (non codantes et non régulatrices), ainsi que les techniques de transformation précédemment citées pour l'insertion dans le génome nucléaire, en particulier la biolistique qui donne les meilleurs rendements. L'invention concerne également les algues vertes transformées par un polynucléotide codant pour une NDH-II telle que définie ci-dessus. Les algues vertes conformes à l'invention peuvent être utilisées pour la production d'hydrogène, dans les mêmes conditions que les algues vertes non- transformées. Elles peuvent par exemple être utilisées dans le cadre de procédés tels que ceux décrits dans le Brevet U.S. 4,532,210 ou la Demande U.S. 2001/0053543 citées ci-dessus. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs montrant la capacité d'une NDH-II d'Agrobacterium à interagir avec la chaîne photosynthétique de transport d'électrons de Chlamydomonas reinhardtii et à réduire les plastoquinones, et illustrant la transformation de Chlamydomonas reinhardtii par un polynucléotide codant pour ladite NDH-II. EXEMPLE 1: CLONAGE ET EXPRESSION CHEZ E. COLI DE LA NDH-II 5 D' AGROBACTERIUM TUMEFACIENS. I- Isolement du gène de la NDH-II Le gène Agtundh codant pour la NDH-II d'Agrobacterium tumefaciens (N d'accès NCBI: AI2824; N d'accès SWISSPROT: Q8UDU6) a été amplifié de l'ADN génomique d'Agrobacterium tumefaciens (souche C58) en utilisant le couple d'amorces suivant: Sens: N2Ag.mfe.F CGCCAATTGATGCAAGAACATCATGTT (SEQ ID NO: 3) Anti-sens: N2Ag. 6His.PstR AAAACTGCAGTCAATGATGATGATGATGATGGGCCTCGTCCTTCAGCG (SEQ ID NO: 4) Les sites de restriction mfeI et Pstl (en italique) ont été insérés dans les amorces sens et antisens, respectivement en amont et en aval des codons start et stop (en gras). Une étiquette composée de 6 codons histidine (souligné) a été insérée en amont du codon stop. L'amplification a été réalisée dans les conditions suivantes. - Mélange réactionnel: Tampon réactionnel spécifique contenant 1,5 mM MgC12 Amorces à 0,5 pM final dNTP mix à 200 pM final 300 ng d'ADN 1,5 unités d'Expand High Fidelity Taq polymérase (Roche) 30 - Conditions d'amplification: 3 min 95 C + 1 min à 80 C: 1 cycle 1 min à 95 C + 1 min à 70 C (-0,5 C à chaque cycle) + 2 min à 72 C: 20 cycles 1 min à 95 C + 1 min à 60 C + 2 min à 72 C: 10 cycles 35 6 minutes à 72 C: 1 cycle Le produit d'amplification comprend la séquence codant pour la NDH-II, et en 3' de celle-ci, une séquence codant pour une étiquette composée de 6 codons histidine. II- Expression chez E.coli et purification 1- Clonage Le produit d'amplification a été digéré par mfel et Pstl (New England Biolab, protocole recommandé par le fabricant) et introduit par ligation (ligase de New England Biolab, protocole recommandé par le fabricant) dans un vecteur d'expression digéré par EcoRI et Pstl. Ce vecteur, le pSD80, porte une cassette de résistance à l'ampicilline, un fort promoteur Taq et le gène répresseur Laq iQ (PATEL et DUNN, J. Bacteriol. 177: 3917-3922, 1995; SMITH et al., Biochem. 35: 8805-8814, 1996). Le produit de ligation a ensuite été introduit par électroporation dans E. coli dH1013. Les transformants résistants à l'ampicilline ont ensuite été criblés par PCR en utilisant les mêmes amorces et les même conditions que précédemment indiqué, afin de vérifier la présence du gène Agtundh. La construction a ensuite été vérifiée par 20 séquençage en utilisant des amorces spécifiques du vecteur pSD80 ainsi que des amorces internes au gène Agtundh. PSD80.F 5'-GAGCTGTTGACAATTAAT-3' (SEQ ID NO: 5) PSD80.R 5'AGGACGGGTCACACGCGC-3' (SEQ ID NO: 6) N2Ag.307.F 5'-TGGCCACCGGCGCGCGT-3' (SEQ ID NO: 7) N2Ag.650.f 5'-TGCGAAGGAAGCGCTTGA-3' (SEQ ID NO: 8) N2Ag. 901.R 5'-TTCCTGATTGACCGCGG-3' (SEQ ID NO: 9) Après avoir vérifié que la séquence et l'insertion étaient correctes, ce plasmide a été nommé pSDN2Ag6H et a servi à co-transformer par électroporation la souche E. coli dHlO 13 avec un vecteur (pRare, Novagen) portant les 6 plus rares ARNt d'E. co1i. Un des co-transformants résistants à l'ampicilline et au chloramphénicol a été choisi pour l'expression et la purification de la protéine NDH-II 6His. 2- Expression Une culture de milieu LB (Luria Berthani), en présence d'ampicilline et de chloramphénicol, d'un volume de 1 L dans un erlenmeyer de 2,5 L a été inoculée au 1/50 à partir d'une préculture de 15h, et incubée à 37 C sous agitation forte, jusqu'à une densité optique de 0,5. L'expression de la NDH-II 6His a été induite pendant 2h par 0,5 mM d'isopropylthio-J-D-galactoside (IPTG). Les cellules ont ensuite été collectées par centrifugation et rincées avec du milieu de culture neuf et conservées à -80 C. 3- Purification Le protocole de purification a été publié par BJORKLâF et al. (FEBS Letts., 467: 105-110, 2000). Les cellules ont été décongelées et resuspendues dans 2,5 mM EDTA, 0, 2 mM PMSF (phénylméthylsulfonyl fluoride), 200 mM Tris-Cl, pH8, à la concentration d'environ 1 g pour 10 ml. 300 pg/ml de lysozyme ont été ajoutés, et le mélange a été incubé pendant 1 h dans la glace. La suspension a ensuite été centrifugée pendant 60 min à 120 000 x g. Le culot a été soumis à un choc osmotique par resuspension dans un tampon 10 mM de potassium phosphate pH8, contenant 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, et homogénéisé à l'aide d'un potter, puis re-centrifugé (60 min, 120 000 x g) . La fraction membranaire a été reprise dans le tampon précédent et homogénéisée avec un potter. Les membranes ont ensuite été solubilisées par addition de dodécylmaltoside (DM), à la concentration finale de 0,2% (poids/vol) et un ratio détergent/protéine de 0,1, et de NaCl à 500 mM de concentration finale. La suspension est agitée et incubée dans la glace pendant 30 min puis centrifugée (60 min, 120 000 x g). La purification de l'enzyme a été réalisée par chromatographie d'affinité en moyenne pression sur une colonne de nickel (HiTrap chelating column 5 ml, Amersham Biosciences, Uppsala), à 4 C, au moyen d'un système de chromatographie (Âktà FPLC, Amersham Biosciences, Uppsala). La colonne a d'abord été prééquilibrée par du tampon potassium phosphate à 50 mM (pH 7,5) contenant 500 mM de NaCl, 0,2% de DM et 20 mM d'imidazole. Après avoir déposé l'échantillon, la colonne a été rincée par la solution précédente sans imidazole (solution A) pour éliminer toutes les protéines non fixées. La colonne a enfin été éluée par une concentration croissante d'une solution contenant 250 mM d'imidazole (solution B). Des fractions de 5 ml ont été collectées aux différentes proportions de solution concentrée en imidazole (10%, 15%, 50%, 100%). Un pic protéique détecté par fluorescence est apparu sur le chromatogramme pour une concentration de 125 mM d'imidazole (Figure 2A). Le contenu protéique des fractions collectées (26-29) est analysé par éléctrophorèse sur un gel d'acrylamide à 13% en condition dénaturante (SDS-PAGE) (Figure 2B). Pour comparaison, les échantillons correspondants à la fraction totale (T) de départ ainsi qu'aux fractions soluble (S) et membranaire (M), ont été également analysés. Les protéines ont ensuite été transférées sur membrane de nitrocellulose et marquées par immunoblot avec un anticorps primaire monoclonal (Sigma), dirigé contre une séquence polyhistidine, pendant 1h, puis un anticorps secondaire, dirigé contre les IgG de souris, couplé à la phosphatase alcaline, pendant 1h également. On observe sur la Figure 2B (29) la présence d'une forte bande marquée par l'anticorps dont le poids moléculaire est inférieur à 50 kDa, ce qui correspond à la taille de la protéine attendue (44 kDa). On retrouve cette protéine dans la fraction membranaire (M) et pas dans la fraction soluble (S). La fraction 29 a été concentrée par ultrafiltration jusqu'à un volume de 900 pl. Un volume de 220 pl de glycérol pur a été ajouté et l'enzyme a été conservée à -80 C. La concentration de l'enzyme a été évaluée sur un gel SDS-PAGE par comparaison avec une gamme étalon de BSA (Serum Albumine Bovine) 14 III-Caractérisation de l'enzyme 1- Analyse du coenzyme La nature du coenzyme a été déterminée par fluorimétrie comme décrit par FANG et BEATTIE (Biochem. 41: 3065-3072, 2002). L'enzyme purifiée a été portée à ébullition pendant 3 à 4 min puis centrifugée. Le surnageant a été analysé par HPLC en utilisant une colonne Supelcosil LC-DP de 150 x 4,6 mm (Supelco). La phase mobile est composée à 80% de 0, 1 % TFA dans l'eau et à 20% de 0,1% TFA dans l'acétonitrile à 40%. Le débit dans la colonne à température ambiante est de 1 ml/min. Les longueurs d'excitation et d'émission du détecteur de fluorescence ont été réglées respectivement à 450 et 525 nm. Des standards de FAD (Sigma) et FMN (Sigma) ont été analysés en parallèle. On peut voir sur la Figure 3 que le pic d'émission de l'échantillon d'enzyme (N2Ag) correspond exactement au pic du standard de FAD. Ces résultats montrent que le cofacteur de la 20 NDH-II d'Agrobacterium tumefaciens est le FAD. 2- Mesure de l'activité enzymatique sur des membranes bactériennes. Dans l'expérience suivante, la capacité de cette enzyme à transférer des électrons à la chaîne respiratoire d'E. coli a été déterminée. L'activité de la NDH-II d'Agrobacterium tumefaciens a été dosée à l'aide de membranes d'une souche d'E. coli déficiente en NDH-I et NDH- II (ndh::tet; nuoB::nptl). La souche E. coli ANNO222 (souche mère AN398; WALLACE et YOUNG, Biochim. Biophys. Acta. 461: 84-100, 1977) a été cultivée dans 50 ml de LBtétracycline jusqu'à la fin de la phase exponentielle de croissance (DO = 1). Les cellules ont ensuite été collectées par centrifugation (15 min, 3200 x g) et lavées deux fois avec 10 ml de solution contenant 200 mM Tris-Cl pH 8, 2.5 mM EDTA et 0.2 mM PMSF. Elles ont ensuite été cassées par deux passages à la presse de French à la pression de 16 000 p. s.i. La fraction membranaire a été récupérée par centrifugation (30 min, 48500 x g) et resuspendue dans 200 pl de tampon d'analyse (50 mM de tampon phosphate, pH 7,5 et 150 mM NaCl). La consommation d'O2 des membranes d'E. coli ANNO222, est mesurée au moyen d'une électrode de Clark (DW2/2, Hansatech, King's Lynn, England). Après ajout de l'enzyme purifiée, cette méthode a permis de déterminer son activité spécifique. Le mélange réactionnel contenant 10 pl de membranes bactériennes, 1,5 pl d'enzyme purifiée (conservée à 1 mg/ml) a été préincubé pendant 10 min dans la glace avant d'être dilué dans 990 pl de tampon d'analyse (50 mM de tampon phosphate, pH 7,5 et 150 mM NaCl) et introduit par pipettage dans la chambre d'analyse de l'électrode. La réaction a été suivie à 25 C en présence de concentrations croissantes de NADH ou NADPH comme donneurs d'électrons. En suivant la réaction en absence de membranes bactériennes, il a étéobservé que l'enzyme présente une activité de prise directe d'O2. Celleci, fortement réduite en présence de SOD et catalase, est liée à la formation d'espèces activées de l'oxygène (Figure 4). Afin de mesurer uniquement l'activité oxydase respiratoire liée aux membranes, de la catalase (1000 U/ml) et de la superoxyde dismutase (SOD) (500 U/ml) ont été ajoutées au mélange réactionnel. L'effet d'inhibition du diphénylène iodonium (DPI) a été quantifié après 10 min d'incubation dans la glace en présence du mélange enzyme-membranes. Les cinétiques d'inhibition ont été réalisées en présence de 200 pM de NADH ou de 2 mM de NADPH. L'activité maximale de la NDH-II d'Agrobacterium (Vmax = 5 pmol O2.min l. mg 1 protéine) est comprise dans l'ordre de grandeur des autres NDH-II décrites dans la littérature. A pH physiologique, cette enzyme a une forte affinité pour le NADH (Km = 10 pM) (Figure 5A), mais également une affinité non négligeable pour le NADPH (Km = 50 pM) (Figure 5B), ce qui est rare pour une enzyme bactérienne. Cette caractéristique est intéressante pour faire fonctionner cette enzyme dans le chloroplaste, car ce compartiment cellulaire contient du NADPH en abondance. L'enzyme est bien affectée par les inhibiteurs classiques des NDH-II, et notamment par le DPI avec un I50 de 10 pM (Figure 5C). EXEMPLE 2: MISE EN EVIDENCE DE LA REDUCTION DES PLASTOQUINONES DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII PAR LA NDH-II 10 D'AGROBACTERIUM L'activité de réduction des plastoquinones par la NDH-II d'Agrobacterium a été analysée en mesurant la fluorescence de la chlorophylle. En présence d'un éclairement faible non-actinique, la mesure de la fluorescence de la chlorophylle fournit une indication de l'état redox des plastoquinones. I- Préparation des membranes thylakoïdiennes. Une culture de 200 ml de Chlamydomonas reinhardtii (de type sauvage 137c) a été prélevée en phase exponentielle de croissance (environ 5x106 cellules.ml-1), puis centrifugée (5 min, 1000 x g). Les cellules ont été lavées dans du tampon HEPES-NaOH à 35 mM (pH 7,2), resuspendues dans 10 ml de tampon de lyse (50 mM Tricine-NaOH pH 8, 10 mM NaCl, 5 mM MgC12, 1% BSA, 1 mM benzamidine et 1mM PMSF) et conservées au froid et à l'obscurité pour les étapes suivantes. La suspension a été passée deux fois à travers une presse de French à 2000 p. s. i. Le lysat a d'abord été centrifugé (5 min, 4 C, 500 x g) pour éliminer les cellules non lysées, et les membranes de thylacoïdes ont ensuite été culottées à 10 000 x g pendant 10 min et resuspendues dans 250 à 500 pl de tampon d'analyse (50 mM Tricine-NaOH pH 7,2, 10 mM NaCl et 5 mM MgC12). II- Réduction des plastoquinones La fluorescence du photosystème II a été mesurée grâce à un fluorimètre à lumière modulée (PAM 101-103, Walz, Effeltrich, Allemagne). Une lumière modulée non actinique (650 nm, 1,6 kHz) a été utilisée pour déterminer le niveau de fluorescence chlorophyllienne Fo. Le niveau maximal de la fluorescence chlorophyllienne Fm a été mesuré sous un flash saturant de 1 seconde (environ 1000 pmol photons.m-2.s-1). Afin d'éviter la réoxydation des plastoquinones, les expériences ont été réalisées en condition anaérobie par ajout dans le mélange réactionnel de glucose (20 mM), glucose oxydase (2 mg.ml-1) et catalase (1000 unités.ml-1). Les membranes thylacoïdiennes ont été incubées avec ou sans la NDH-II (1, 5 pg.ml-1 de concentration finale) pendant 10 min dans la glace et le taux de réduction des plastoquinones a été comparé avant et après addition de 200 pM de NADH. Les résultats sont présentés dans la Figure 6. Légende de la Figure 6: NDH2Ag = présence de la NDH-II d'Agrobacterium Control = présence enzyme native seule DPI = effet d'inhibition du DPI La Figure 6 montre que la fluorescence de la chlorophylle mesurée sur des membranes thylacoïdiennes de Chlamydomonas augmente après ajout de NADH. Cette augmentation correspond à la réduction non photochimique des PQ par l'enzyme native de l'algue. Cependant, en présence de la NDH-II d'Agrobacterium purifiée (NHD2Ag), l'augmentation de la fluorescence est plus rapide et plus intense. La réduction des plastoquinones est donc supérieure à celle effectuée par l'enzyme native seule (control). Ceci est la démonstration de la capacité de la NDH-II d'Agrobacterium à interagir avec la chaîne photosynthétique de transport d'électrons. Afin de quantifier cet effet de la NDH-II d'Agrobacterium sur le flux d'électrons du NAD(P)H jusqu'aux accepteurs du PSI, des mesures de consommation d'oxygène ont été réalisées en présence de méthyl viologène (un accepteur du PSI),de DCMU (un inhibiteur du PSII) et d'un donneur d'électrons NADH (200 pM) ou NADPH (2 mM). Les thylacoïdes de Chlamydomonas (50 pl, correspondant à 85 pg.ml-1 de chlorophylle) sont placés dans une électrode de Clark contenant 900 pl de tampon d'analyse (50 mM Tricine-NaOH pH 7,2, 10 mM NaCl et 5 mM MgCl2, 25 pM DCMU, 50 pM méthyl viologène, SOD (500 U.ml-1), catalase (1000 U.ml-1), 4 pM de myxothiazol, 800 pM de SHAM (acide salicylhydroxamique). Ces deux derniers composés sont ajoutés afin d'inhiber la prise d'02 respiratoire. Dans ces conditions, la fraction de la prise d'oxygène photo-induite sensible au DNP-INT (2-iodo-6-isopropyl-3-méthyl-2',4,4'-trinitrodiphenyl éther; 10 pM), inhibiteur du cytochrome b6f, est proportionnelle au transfert d'électrons entre le NAD(P)H et la chaîne photosynthétique. L'ajout de 1,5 pg de NDH-II d'Agrobacterium tumefaciens purifiée stimule ce transfert d'électrons de 20 à 45 nmole.min-l.mg-1 chlorophylle lorsque le NADPH est utilisé comme donneur, et de 21 à 67 nmole.min-l.mg-1 chlorophylle lorsque le NADH est utilisé comme donneur. Cette expérience permet donc de quantifier la stimulation du transfert d'électrons entre le NADPH (ou le NADH) et les plastoquinones thylacoïdiennes par l'ajout de la NDH-II d'Agrobacterium tumefaciens. La stimulation est d'un facteur 2 environ dans le cas du NADPH et d'un facteur 3 environ dans le cas du NADH. Ces résultats in vitro permettent de supposer qu'une expression hétérologue d'une NDH-II chez Chlamydomonas reinhardtii (et plus généralement chez toute algue susceptible de produire de l'hydrogène), qu'elle soit chloroplastique, ou nucléaire avec adressage vers le chloroplaste, peut augmenter l'activité plastoquinone réductase intrachloroplastique et la production d'H2 associée. EXEMPLE 3: TRANSFORMATION DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII PAR LA SEQUENCE CODANT LA NDH-II D'AGROBACTERIUM TUMEFACIENS I- Construction du plasmide pSADN2Ag Le gène Agtundh a été amplifié par PCR à partir 5 du génome d'A. tumefaciens (souche C58) en utilisant les amorces suivantes. ndhAgTu.F 5'-TCCCCCGGGATGCAAGAACATCATGTT-3' (SEQ ID NO: 10) (Tm 66,5 C) et ndhAgTu. R 5'-CCGCAATTGTCAGGCCTCGTCCTTCAG-3' (SEQ ID NO: 11) (Tm 69,5 C) et dans les conditions suivantes: - Mélange réactionnel: Tampon réactionnel spécifique contenant 1,5 mM MgCl2 Amorces à 0,5 pM final dNTP mélangés à 200 pM final 300 ng d'ADN 1,5 unités d'Expand High Fidelity Taq polymérase (Roche) - Conditions d'amplification: 3 min 95 C + 1 min à 80 C: 1 cycle 1 min à 95 C + 1 min à 60 C + 2 min à 72 C: 30 cycles 6 minutes à 72 C: 1 cycle Le produit d'amplification a été digéré par Smal/mfel. Le plasmide pGEND2 (FISHER et ROCHAIX, Mol. Genet. Genomics 265: 888-894, 2001) a été digéré par Nael/EcoRI, pour exciser la séquence codant pour la protéine PsaD, à l'exception du peptide d'adressage chloroplastique. Le fragment excisé a été remplacé par le fragment SmaI/mfel obtenu à partir du produit d'amplification du gène N2Ag. Le plasmide résultant, dénommé pSADN2Ag, contient donc la séquence codant pour la NDH-II d'Agrobacterium tumefaciens, sous contrôle du promoteur du gène psaD, et en fusion traductionnelle avec le peptide d'adressage chloroplastique de la protéine PsaD. II- Transformation de Chlamydomonas reinhardtii Un mutant de Chlamydomonas reinhardtii déficient en arginosuccinate lyase [CC-2852 arg7 cwl5 mt+ ; Chlamydomonas Genetic Center (http://www.biology.duke.edu/chlamy/strains/plasmids.html)] , et donc auxotrophe pour l'arginine, a été utilisé. Les algues sont mises en culture sur milieu TAP, dans un volume de 200 mL, (HARRIS, The Chlamydomonas sourcebook, Academic Press, San Diego, 1989) supplémenté par 100 mg/1 d'arginine, sous agitation, température de 25 C, et lumière continue d'environ 35 mol photons.m2.s-1. En fin de phase exponentielle (concentration d'environ 107 cellules/ml), les algues sont concentrées par centrifugation et reprises dans du TAP pour obtenir une suspension à 3.108 cellules/ml. Le plasmide PSADN2Ag est utilisé avec le plasmide p389 [Chlamydomonas Genetic Center (http://www.biology.duke.edu/chlamy/strains/plasmids.html)] composé d'un fragment d'ADN nucléaire de Chlamydomonas d'une taille de 7, 1 kb, incluant le gène Arg7, et cloné en BamHI dans le vecteur pBR329, pour co-transformer les algues. On mélange dans un tube 300 mg de billes de verre de diamètre 0,5 mm (Sigma), 10 pl de plasmide PSADN2Ag (=1 pg), 2 p1 de plasmide p389 (=0,2 pg) et 350 pl de suspension d'algues (=environ 108 cellules). On agite pendant 15 secondes au moyen d'un vortex réglé à la vitesse maximale. On ajoute ensuite 650 pl de TAP, et après homogénéisation, la suspension est utilisée pour inoculer deux boîtes de pétri (450 pl sur chaque boîte) contenant du milieu TAP (agar 15 g/1) sans arginine. Au bout de 10 jours d'incubation en lumière continue (35 mol.m2.s-1) et à 25 C, les algues sont repiquées sur le même milieu. Après 2 repiquages on récolte les transformants ayant poussé sans arginine. Les transformants ayant intégré le gène N2Ag sont sélectionnés en détectant la présence de ce gène par PCR. Les colonies sont lysées selon le protocole suivant: Chaque colonie est reprise dans 100 pl d'eau stérile (filtration milliQ ). Dans un tube de 1, 5 ml on mélange 5 pl de tampon 10X de PCR, 1 pl de SDS à 0.01 1 pl de DTT à 200 mM, 3 pl de cellules et 39pl d'H2O. On effectue 5 cycles de congélation/décongélation entre (azote liquide et bain-marie à 55 C) On ajoute 2 pl de protéinase K à 10 pg/ml et on incube 1 h à 55 C. La protéinase K est inactivée par un traitement de 5 minutes à 95 C. La PCR est effectuée en utilisant les amorces 15 ndhAgTu.F et ndhAgTu.R, et dans les conditions suivantes: - Mélange réactionnel: Pour 25 pl de volume final 2,5 pl de tampon 10X 2 pl de dNTP mix 1,25 pl de chaque amorce 2,5 pl de BSA 10X 3 pl de lysat de cellules 0,3 pl de polymérase Taq (Qiagen) 12,2 pl H2O - Conditions d'amplification: 3 min 95 C + 1 min à 80 C: 1 cycle 1 min à 95 C + 1 min à 60 C + 2 min à 72 C: 30 cycles 6 minutes à 72 C: 1 cycle Un contrôle positif a été effectué en remplaçant l'ADN génomique de Chlamydomonas par le plasmide ayant servi à la transformation. Les produits d'amplification ont été analysés par migration sur un gel d'agarose à 1% et visualisés après marquage du gel au bromure d'éthydium (Figure 7). Un marqueur de poids moléculaire a été déposé en parallèle sur le gel afin d'estimer la taille des produits d'amplification obtenus. Les transformants ayant intégré le gène de la NDH-II présentent une bande d'environ 1,2 kb également observée sur le témoin positif. La proportion de cotransformants (= ayant intégré les deux plasmides) est d'environ 50%. III- Expression de la NDH-II: L'expression du gène de la NDH-II d'Agrobacterium a été vérifiée par RT-PCR dans 6 cotransformants. Les ARN totaux sont extraits à partir de 25m1 de culture en phase exponentielle avec le kit RNeasy , selon les indications du fabricant (Qiagen). Les ADNc sont préparés à l'aide du kit Omniscript , selon le protocole préconisé par le fabricant (Qiagen) en ajustant le volume des différents ARNs pour obtenir 2pg dans chaque réaction. La PCR est effectuée en utilisant les amorces ndhAgTu.F et ndhAgTu.R, et dans les conditions suivantes: - Mélange réactionnel: Tampon réactionnel spécifique contenant 1,5 mM MgCl2 Amorces à 0,5 pM final dNTP mélangés à 200 pM final 300 ng d'ADNc 1,5 unités d'Expand High Fidelity Taq polymerase (Roche) - Conditions d'amplification: 3 min 95 C + 1 min à 80 C: 1 cycle 1 min à 95 C + 1 min à 60 C + 2 min à 72 C: 30 cycles 6 minutes à 72 C: 1 cycle Un contrôle négatif a été réalisé pour vérifier que les amplicons observés ne proviennent pas d'une amplification de l'ADN nucléaire persistant après l'étape de digestion incluse dans le protocole d'extraction des ARNs. Pour ce contrôle, les 300 ng d'ADNc obtenus après l'étape de transcriptase réverse sont remplacés par 5 pl de la solution d'ARN précédant cette étape. Pour contrôler l'efficacité du protocole d'extraction ainsi que le niveau d'expression de la NDH-II, nous avons amplifié en parallèle l'ADNc de l'Active 1 qui est une protéine exprimée constitutivement et en quantité importante. Les produits d'amplification ont été analysés par migration sur un gel d'agarose à 1% et visualisés après marquage du gel au bromure d'éthydium (Figure 8). Un marqueur de poids moléculaire a été déposé en parallèle sur le gel afin d'estimer la taille des produits d'amplification obtenus. Les co-transformants exprimant le gène de la NDH-II présentent une bande d'environ 1,2 kb correspondant à la taille de l'insert. Le contrôle négatif ne présente aucune bande, ce qui signifie que les préparations d'ARN n'étaient pas contaminées par de l'ADN génomique, alors qu'il présente bien un produit d'amplification pour l'actine. Tous les cotransformants testés semblent exprimer le gène de la NDH-II à des niveaux différents mais dans le même ordre de grandeur que celui de l'actine. REVENDICATIONS 1) Procédé pour accroître la capacité d'une algue verte à produire de l'hydrogène, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite algue par un polynucléotide codant pour une NAD(P)H déshydrogénase de type II (NDH-II), et l'expression de ladite NDH-II dans ladite algue. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite NDH-II est la NDH-II d'Agrobacterium tumefaciens, définie par la séquence SEQ ID NO: 2. 3) Algue verte transformée par un polynucléotide codant pour une NDH-II. 4) Utilisation d'une algue verte selon la 15 revendication 3 pour la production d'hydrogène.