FR 2877668 A1 20060512 FR 0452591 A 20041110 PROCEDE DE COUPLAGE DE MOLECULES NON IMMUNOGENES, COMPOSE INTERMEDIAIRE, PRODUIT FINAL OBTENU ET UTILISATIONS La présente invention concerne un procédé de couplage de petites molécules non immunogènes afin de les rendre immunogènes. L' invention couvre également un composé intermédiaire intervenant dans ce procédé, le procédé d'obtention de ce produit intermédiaire, le produit final obtenu et ses utilisations. Le développement et la production d'anticorps dirigés contre des molécules du vivant présente de nombreuses applications notamment dans le domaine des sciences biologiques et médicales. On sait cependant que ce procédé n'est réalisable que si les molécules d'intérêt sont immunogènes, ou antigéniques, c'est à dire susceptibles d'être identifiées par des structures de reconnaissance du système immunitaire telles que des molécules anticorps ou des récepteurs des lymphocytes T, et de déclencher une réponse immunitaire. Or toutes les molécules ne sont pas immunogènes par elles-mêmes. C'est le cas notamment de nombreuses molécules de petite taille qui ne possèdent pas d'encombrement stérique suffisant pour induire une réponse immunitaire. Parmi ces molécules, on peut citer à titre d'exemples, les acides gras, les acides aminés, les neuromédiateurs, ou encore les vitamines. Aussi pour induire la production d'anticorps dirigés contre ces molécules, il est possible de les associer à des macromolécules grâce à des techniques de couplages chimiques, et de synthétiser ce qu'on appelle des conjugués. Les petites molécules deviennent alors antigéniques tout en conservant leur structure et leur activité biologique propres. On connaît différentes techniques de couplages permettant de rendre immunogéniques des petites molécules. La méthode la plus simple consiste à adsorber directement la petite molécule sur la protéine porteuse par simple contact. Il existe un autre procédé, basé sur une réaction chimique de type Friedel et Crafts entre la petite molécule et la protéine porteuse par l'intermédiaire d'un dérivé halogéné iodé de type iodure de sodium, diodopropane ou diodopyridone. On connaît également une technique réalisée à partir d'un dérivé de la petite molécule, ce dérivé étant ensuite couplé sur la protéine porteuse par un agent chimique tel que le glutaraldéhyde. Il existe aussi une autre méthode, plus stable que les précédentes, qui recourt à l'utilisation d'un composé chloré intermédiaire comme par exemple 15 l'éthylchloroformate. Bien que ces méthodes de couplage soient couramment utilisées pour de nombreuses applications, elles ne sont pas applicables à toutes les molécules. En effet certaines catégories de petites molécules ne possèdent pas de groupements fonctionnels appropriés au couplage à une protéine porteuse, comme par exemple un groupement carboxyle. C'est le cas notamment des molécules de poids moléculaire inférieur à 1000 ()citons (Da), qui possèdent au moins un cycle aromatique ou un hétérocycle. L'obtention d'anticorps dirigés contre de telles molécules représente un enjeu important notamment dans le domaine de l'immunologie appliquée aux sciences 25 médicales. Le but est donc de trouver une nouvelle méthode de couplage qui permette de greffer une petite molécule sur une protéine porteuse malgré l'absence de groupements fonctionnels appropriés. Pour pallier ce problème la présente invention vise à réaliser, par oxydation de la petite molécule, un produit intermédiaire qui possède les groupements fonctionnels appropriés au couplage sur une protéine porteuse. On connaît des techniques d'oxydation in vivo décrites dans un grand nombre de publications. Ces procédés connus concernent l'oxydation de neurotransmetteurs qui deviennent alors réactifs envers certaines molécules. C'est le cas des catécholamines et en particulier de la dopamine qui est très oxydable et qui en présence de cystéine (par exemple par liaison avec une N-acétyl-cystéine), génère la dopamine cystéinylée. 5i l'on connaît bien les mécanismes d'oxydation des neurotransmetteurs pour modifier leurs propriétés, on ne connaît pas l'intérêt de ces neurotransmetteurs modifiés pour obtenir des anticorps dirigés contre eux après couplage. La présente invention vise donc l'obtention d'un conjugué immunogénique à partir de petites molécules ne possédant pas de groupements fonctionnels associés au couplage. Plus particulièrement, la présente invention propose une méthode de couplage reproductible et facilement mesurable comprenant une étape faisant appel à un mécanisme d'oxydoréduction. Le composé intermédiaire obtenu est ensuite couplé à une protéine porteuse. L'invention est maintenant décrite en détail. bans la présente description, on désigne par petites molécules (A), des petites molécules de poids moléculaire inférieur à 1000ba, possédant au moins un cycle aromatique ou un hétérocycle, et au moins un site permettant une attaque nucléophile. A titre d'exemples, on peut citer comme molécules entrant dans cette catégorie l'acide folique, la thiamine, la riboflavine, la nicotinamide, les hydrocarbures aromatiques polycycliques ou encore le roténone. be même, on désigne par protéines porteuses (D), des macromolécules de poids moléculaire supérieur à 10 000ba. 4 1/ PROCEDE DE COUPLAGE Le procédé de couplage comprend deux étapes. lère étape: Attaque nucléophile sur A et liaison au site le plus réactif La première étape du procédé de couplage consiste à recourir à un composé aliphatique (B) possédant au moins un groupement thiol et au moins un groupement carboxyle, pour former un composé intermédiaire (CI), à partir de A. Parmi les composés B on peut citer à titre d'exemples la thiol cystéine, la NAcétyl-Cystéine (NAC) ou le glutathion. Cette étape préliminaire a lieu en milieu basique. La liaison entre la petite molécule A et le composé B se fait par mécanisme d'oxydoréduction par attaque nucléophile au niveau de sites réactifs très oxydables de A. Le groupement thiol du composé B se lie au site le plus réactif de la petite 15 molécule A. La réaction qui se produit est la suivante: COOH R COOH 2ème étape: Couplage du composé intermédiaire à la protéine porteuse par amidification Le composé intermédiaire CI obtenu peut ensuite être couplé à une protéine porteuse D par réaction d'amidification. Cette réaction consiste à remplacer l'hydroxyle du groupement carboxyle par une amine appartenant à la protéine porteuse D. La réaction qui se produit est la suivante: R' La formation d'une liaison amide entre le groupement carboxyle du composé intermédiaire CI et l'amine de la protéine porteuse D ne se fait pas directement et nécessite le passage par une ou plusieurs réaction(s) intermédiaire(s). Parmi les nombreux moyens permettant l'amidification de CI, on peut citer à titre d'exemple plusieurs variantes: 1) Amidification de CI par intervention d'un chloroformiate Cette réaction se déroule en deux temps. Dans un premier temps, le chlore du chloroformiate réagit avec l'hydrogène du groupement carboxyle du composé intermédiaire CI pour former de l'acide chlorhydrique. Le chloroformiate et le composé intermédiaire CI peuvent ainsi s'associer pour former un produit de réaction (PR). Le produit de réaction PR est ensuite capable de réagir avec la protéine porteuse 25 D pour terminer la réaction d'amidification. 6 La réaction qui se produit est la suivante: CI + C O o R2 HCI O R C OH + HR'N - Protéine O C N Protéine CO2 + HOR2 R' 2) Amidification de CI par intervention d'une carbodiimide Cette réaction se déroule en trois temps. bans un premier temps, la carbodiimide active le groupement carboxyle du composé intermédiaire CI pour former un premier produit de réaction (PR1). On ajoute ensuite à PR1 un N-hydroxysuccinimide (NH5) pour obtenir un second produit de réaction (PR2). Le second produit de réaction PR2 est ensuite capable de réagir avec la protéine porteuse b pour terminer la réaction d'amidification. R H o O N R1 + HO N O C O C O C OH + N R2 O C NH R1 R2 + HR'N - Protéine R O V O R C N Protéine R' 3) Amidification de CI par intervention d'un halogénure d'acyle Cette réaction comprend deux étapes. La première consiste à faire réagir un ion issu de l'halogénure d'acyle (le brome, le chlore, le fer, l'iode, etc.) avec l'hydrogène du groupement carboxyle du composé intermédiaire CI. Ainsi l'halogénure d'acyle peut s'associer à CI pour donner un produit de réaction (PR' ). C'est ce produit de réaction PR' qui interagit avec la protéine porteuse b pour former le conjugué final. X + O R2 R C OH Ir H X HR'N - Protéine + O O R C O C R2 20 CO2 + HR2 R C N Protéine R' L'amidification du composé intermédiaire CI permet donc d'obtenir un conjugué qui a conservé la structure et l'activité biologique de la molécule de départ. 2/ APPLICATIONS Les applications d'un tel procédé peuvent être très diverses. D'une manière générale ce procédé permet la production d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre des molécules non immunogéniques par elles- memes. O Il pourra donc être avantageusement utilisé dans le domaine de l'immunologie en recherche fondamentale et appliquée aux sciences médicales. Il peut par exemple permettre l'élaboration de nouveaux vaccins. Les anticorps produits peuvent également être utilisés en tant que marqueurs de molécules pour détecter certaines pathologies dans le sérum de patients. Ce procédé pourra également trouver des applications intéressantes dans le domaine de l'environnement. En effet, le développement d'anticorps contre certaines molécules toxiques selon ce procédé permettra de doser ces molécules dans divers milieux, biologiques ou non. La présente invention est illustrée ci-après par un exemple unique non limitatif et par la figure 1 qui représente la densité optique moyenne, obtenue par test Elisa sur des sérums de contrôle, sur le conjugué Benzo(a)pyrène en fonction de la durée de conservation du conjugué. 3/ EXEMPLE: SYNTHESE D'UN CONJUGUE BENZO(A)PYRENE On solubilise 5mg de benzo(a)pyrène dans un volume de DMSO supérieur à 0,9m1. Parallèlement, 0, 8mg de N-acétyl-Cystéine (NAC) sont repris dans 1ml de soude 4N. La solution de NAC est ensuite ajoutée à la solution de benzo(a)pyrène. Après ajout de 1ml de tampon phosphate, le milieu est ajusté à pH7 par ajout d'acide chlorhydrique puis lyophilisé. Le composé NAC-benzo(a)pyrène lyophilisé est solubilisé dans un volume supérieur à 3ml de DMSO anhydre. On lui ad joint ensuite 50 à 70 pl de triéthylamine anhydre (TEA). Après ajout de 400pl d'ECF diluée au 16éme dans du diméthylformamide, l'activation est effectuée sous agitation pendant 10 min à 4 C. Le composé est alors ajouté goutte à goutte, à 5mg de protéine porteuse préalablement diluée dans un volume supérieur à 3ml d'eau UHP et 40 pl de TEA. La réaction qui se produit est la suivante: SCH2 CH COOH NH I O C O CH2CH3 COCH3 + O CI C O CHZCH3 HCI O COCH3 HOCH2CH3 + CO2 NH + O C NH Protéine CH H2N - Protéine CH2 NH COCH3 L'ensemble est ensuite dialysé contre différents bains. La première dialyse est réalisée pendant une heure contre du bMSO pur de manière à éliminer le B(a)P en excès non fixé. Le bain est ensuite remplacé par un mélange bMSO/Méthanol/Tampon phosphate CaCl2 pour une durée de 24 heures. Finalement, la dernière dialyse est réalisée contre un Tampon phosphate CaCl2 pour éliminer les sels et les solvants organiques. Ce bain est renouvelé deux fois. En fin de dialyse, le conjugué est obtenu en suspension dans un milieu aqueux et peut être conservé à 4 C à l'abri de la lumière pendant une courte période. Les conjugués obtenus sont stables au cours du temps pendant environ deux mois comme le montre la figure 1. Le benzo(a)pyrène, hydrocarbure aromatique polycyclique relativement répandu dans l'environnement, est une petite molécule hydrophobe, carcinogénique. Son 15 poids moléculaire est de 252,3ba. La production d'anticorps dirigés contre cette molécule permet de nombreuses applications dans le domaine de la cancérologie. Il a notamment été mis en évidence sur un modèle animal que le conjugué synthétisé selon l'invention à partir de benzo(a)pyrène a un effet préventif sur des tumeurs chimio-induites. 12 REVENDICATIONS 1. Procédé de couplage d'une première molécule de poids moléculaire inférieur à 1000 Da avec une seconde molécule de poids moléculaire supérieur à 10 000 Da, caractérisé en ce qu'on réalise une réaction sur la première molécule de manière à obtenir un composé intermédiaire (CI) possédant au moins un hétérocycle et au moins un groupement carboxyle, et en ce qu'on réalise une réaction d'amidification entre ce composé intermédiaire (CI) et la seconde molécule, de façon à coupler lesdites première et seconde molécules. 2. Procédé de couplage selon la revendication 1, caractérisé en ce que la seconde molécule est une protéine. 3. Procédé de couplage selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'amidification du composé intermédiaire (CI) se fait par intervention d'un chloroformiate. 4. Procédé de couplage selon la revendication 3, caractérisé en ce que la réaction d'amidification comprend les étapes suivantes: - réaction entre le chlore du chloroformiate et l'hydrogène du groupement carboxyle du composé intermédiaire (CI), obtention d'un produit de réaction (PR), et couplage dudit produit de réaction (PR) à la seconde molécule. 5. Procédé de couplage selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'amidification du composé intermédiaire se fait par intervention d'un carbodiimide. 6. Procédé de couplage selon la revendication 5, caractérisé en ce que 25 la réaction d'amidification comprend les étapes suivantes: 2877668 13 activation du groupement carboxyle du composé intermédiaire (CI) par une carbodiimide, obtention d'un premier produit de réaction (PR1), association d'un N-hydroxysuccinimide audit premier produit de 5 réaction (PR1), obtention d'un second produit de réaction (PR2), et couplage dudit second produit de réaction (PR2) à la seconde molécule. 7. Procédé de couplage selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en 10 ce que l'amidification du composé intermédiaire se fait par intervention d'un halogénure d'acyle. 8. Procédé de couplage selon la revendication 7, caractérisé en ce que la réaction d'amidification comprend les étapes suivantes: réaction entre un ion de l'halogénure d'acyle et l'hydroxyle du 15 groupement carboxyle du composé intermédiaire (CI), obtention d'un produit de réaction (PR' ), et couplage dudit produit de réaction (PR') à la seconde molécule. 9. Procédé d'obtention du composé intermédiaire (CI) pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on réalise une attaque nucléophile de la première molécule par un composé aliphatique possédant au moins un groupement thiol et au moins un groupement carboxyle. 10. Composé intermédiaire obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il possède au moins un hétérocycle et au moins un groupement carboxyle avec un hydroxyle. 11. Produit final obtenu par amidification du composé intermédiaire de la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule de poids moléculaire inférieur à 1000 Da couplé à une molécule de poids moléculaire supérieur à 10 000 Da. 12. Utilisation du produit final de la revendication 11 pour la production d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre des molécules de 5 poids moléculaire inférieur à 1000 Da.