FR 2877575 A1 20060512 FR 0411828 A 20041105 L'invention concerne un milieu protecteur pour semence, une paillette de semence destinée à l'insémination artificielle comportant un tel milieu protecteur, un procédé de tri des spermatozoïdes d'une telle semence, et l'utilisation d'un tel milieu protecteur ou d'une telle paillette pour protéger une semence d'un bovin, d'un porcin, d'un oiseau, de petits ruminants, par exemple d'un ovin ou d'un_caprin, et plus généralement, de tout mammifère. Pour mettre à disposition des éleveurs des gènes de haute qualité, les coopératives d'élevage et d'insémination animale produisent des semences sélectionnées. A cet effet, des éjaculats d'animaux, ou semence , sont recueillis puis subissent un ensemble de contrôles. élaborés afin de sélectionner ceux qui présentent la meilleure qualité, en particulier le moins de spermatozoïdes à anomalies morphologiques et le plus fort pourcentage de spermatozoïdes mobiles. Les semences sont alors diluées dans des milieux protecteurs encore appelés dilueurs . Les milieux protecteurs permettent de maintenir la viabilité et la t5 compétence fonctionnelle des spermatozoïdes qui sinon diminueraient rapidement. La semence ainsi protégée est ensuite aspirée dans des paillettes contenant 10 à 30 millions de spermatozoïdes totaux. Les paillettes peuvent être conservées fraîches , à une température d'environ 4 C ou congelées selon un programme de refroidissement et de congélation réglé éfectroniquement. La semence fraîche et la semence décongelée peuvent être utilisées pour réaliser une insémination artificielle. Le succès de l'insémination dépend du pouvoir fécondant de la semence. Pour améliorer ce pouvoir fécondant, la demande de brevet WO 98/00125 décrit l'addition, dans le milieu protecteur, d'un antioxydant à un sperme ou à un fluide environnant le sperme. L'antioxydant est de préférence choisi parmi des vitamines, des extraits de plantes et des caroténoïdes. II existe cependant un besoin permanent pour un milieu protecteur améliorant encore l'aptitude à la fécondation de la semence destinée à être inséminée. Selon l'invention, on atteint ce but au moyen d'un milieu protecteur pour semence comportant un antioxydant de la famille des thiols. De préférence, l'antioxydant est choisi dans le groupe formé par le R-mercaptoéthanol, la L-cystéine, le dithiotréitol, le glutathion réduit, et leurs mélanges, de préférence dans te groupe formé par te fi-mercaptoéthanot, ta L- cystéine, et Leurs mélanges. Comme on le verra plus en détail dans la suite de la description, les antioxydants de la famille des thiols limitent la dégradation dans le temps de la qualité de la semence, en particulier de la mobilité et de la viabilité des spermatozoïdes. Ils permettent ainsi de. maintenir dans le temps un pouvoir fécondant de la semence satisfaisant, que celle-ci soit fraîche ou congelée. Selon d'autres caractéristiques préférées du milieu protecteur selon l'invention, la concentration moléculaire dudit antioxydant dans le milieu protecteur est comprise entre 0,1 et 10 mM, de préférence entre 0, 5 et 6 mM, de préférence entre 4 et 6 mM ou entre 0,1 et 3 mM, de préférence encore d'environ 5mM lorsque le milieu protecteur est destiné à être congelé ou d'environ 1 mM sinon. Ces faibles doses permettent avantageusement de limiter le coût de fabrication du milieu protecteur selon l'invention. Elles permettent également de s'éloigner de la concentration à partir de laquelle l'antioxydant aurait un effet toxique. La tolérance du dosage est ainsi avantageusement augmentée. L'invention concerne aussi une paillette de semence destinée à t'insémination artificiette comportant un milüeu protecteur selon l'invention. L'invention concerne encore un procédé de tri des spermatozoïdes d'une semence destinée à la fécondation in vitro ou in vivo en particulier par insémination artificielle, remarquable en ce que, après une éventuelle décongélation, ladite semence est dituée au moins dans un milieu protecteur conforme à (invention. L'invention concerne aussi un procédé de protection d'une semence en vue du tri des spermatozoïdes de ladite semence, remarquable en ce que, après une éventuelle décongélation et avant: le tri desdits spermatozoïdes, ladite semence est diluée au moins dans un milieu protecteur conforme à l'invention. L'invention concerne enfin l'utilisation d'un milieu protecteur selon l'invention ou, le cas échéant, d'une paillette selon l'invention pour protéger une semence d'un oiseau ou d'un mammifère, de préférence d'un bovin, d'un équin, d'un porcin, d'un petit ruminant tel qu'un ovin ou un caprin, d'un rongeur ou d'un fagomorphe. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de fa description qui va suivre et à [examen des figures annexées. Un milieu protecteur comporte classiquement plus de 70 % en volume d'un tampon salin, par exemple de TRIS. Dans le cas particulier des milieux protecteurs pour semences de porcins, les milieux protecteurs ne comportent sensiblement qu'un tampon salin. Généralement, un milieu protecteur comporte également au moins 15 % en volume d'un ou plusieurs additifs de protection. Les additifs de protection, protéiques et lipidiques, sont destinés à protéger les membranes des spermatozoïdes. Ils peuvent être d'origine animale, par exemple être constitués de jaune d'ceuf, ou non. Lorsqu'un milieu protecteur est destiné à être utilisé pour congeler de la semence, il comporte enfin un agent empêchant la formation de cristaux dans les spermatozoïdes lors de la congélation, classiquement du glycérol, en une quantité d'au moins 3 % en volume. La figure 1 représente l'évolution au cours du temps du pourcentage de spermatozoïdes mobiles pour différents milieux protecteurs, ainsi que la moyenne des pourcentages obtenus pour ces différents milieux protecteurs. La figure 1 illustre l'effet du p-mercaptoéthanol sur l'évolution du pourcentage de spermatozoïdes mobiles au cours du temps. Les molécules de la nomenclature suivante ont été étudiées. Le code lettre code , utilisé pendant les essais afin de procéder en aveugle, est également parfois utilisé dans la suite de la description. Code Molécule A Acide férulique B Acide gallique C Flavone D Curcumine E Ethyl gallate F Acide caffeique G Rutine H Quercetin I Lutéoline J Catechin K Epicatechin L Resveratrol M N-propyl gallate N bmercaptoethanoi ^ DTT P Lauryl gallate Q Hydroquinone R Coenzyme Q10 S Epigailocatechine gallate T' Octyl gallate U Ethoxyquin V 2,3 tert butyl-4-bydroxyanisole (tira) W Nordihydroguaiaretic acid X Phloroglucinol Y Tanins Z Vitafiavan AA Glutathion réduit AB Glutathion oxydé AC L-cystéine AD L-Glutamine AE Camitine AF N-Acetyt Cystéine Dans tous les essais, la mobilité des spermatozoïdes, c'est-à-dire le pourcentage de spermatozoïdes mobiles, a été mesurée de manière objective à 5 l'aide d'un analyseur automatisé de la mobilité (Hamilton Thome ). La viabilité des spermatozoïdes (pourcentage de spermatozoïdes vivants) a été mesurée dans certains essais par cytométrie en flux en utilisant une méthode de coloration vitale des spermatozoïdes mettant en uvre deux colorants (SYBR 14 et iodure de propidium). Dans d'autres essais, la viabilité des spermatozoïdes a été mesurée au moyen d'une coloration vitale (coloration de Hoechst). Après fixation au glutaraldéhyde et incubation dans le bisbenzimide 33258, les spermatozoïdes ont été examinés au microscope à contraste de phase interférentiel. Les cellules mortes dont les membranes sont lésées et laissent passer le colorant apparaissent bleues et sont donc aisément quantifiables. La qualité du mouvement est évaluée visuellement par observation au microscope à contraste de phase (x 200) d'une goutte d'échantillon déposée entre une lame et une lamelle. La quarté du mouvement est exprimée par une note de 1 à 5. Dans le cas de la semence triée, l'aptitude à la fécondation a été vérifiée à l'aide de manipulations de fécondation et de production d'embryons in vitro selon les techniques développées et en vigueur au laboratoire du Département Recherche et Développement de l'UNCEIA. Ces techniques sont décrites dans Evaluation of bull semen fertility by homologous in vitro fertilisation tests , Marquant Leguienne B, Humblot P, Thibier M & Thibault C. 1990, dans Reproduction Nutrition Developpement, 30:259-266. Première série d'essais Dans une première série d'essais (tableaux 1 à 4), l'activité protectrice in vitro de certaines molécules a été évaluée en testant la résistance des spermatozoïdes vis à vis de l'oxydation par l'eau oxygénée (H2O2). La présence d'eau oxygénée permet d'altérer les membranes des spermatozoïdes par oxydation, et ainsi de simuler les conditions rencontrées par les spermatozoïdes lors d'une congélation de la semence. Les spermatozoïdes ont été incubés pendant une heure dans un tampon salin simple de type Tris supplémenté avec de l'eau oxygénée en dose croissante avec et sans antioxydant ( échantillon et témoin ). Le pourcentage de spermatozoïdes mobiles a été mesuré ainsi que la qualité du mouvement (témoin: pas d'antioxydant; échantillon: avec antioxydant). Tableau 1 É Antioxydant H202 Qualité du mouvement Pourcentage de spermatozoïdes mobiles mercaptoéthanol Témoin Echantillon Témoin Echantillon 0,1 mM OpM 3 3 60 60 0,1 mM 100pM 3 2,75 60 60 0,1 mM 250pM 1 1 25 25 0,1 mM 500pM 0 0 0 0 0,1 mM 1mM 0 0 0 0 0,2 mM DNM 3 3 55 55 0,2 mM 100pM 2,5 2,75 50 55 0,2 mM 250pM 0,5 1 i 20, 0,2 mM 500pM 0,5 0,5 5 5 0,2 mM 1mM 0 0 0 0 0,5 mM OpM 3 3,5 55 55 0,5 mM 100pM 3 2,5 55 55' 0,5 mM 250pM 1 2,5 20 50 0,5 mM 500pM 1 1,5 14 35 0,5 mM 1 mM 0 0 0. 5 1 mM OpM 3 3 55 55. 1 mM _100pM 2,75 2,5 50 50 1 mM 250pM 1 2,5 10 50 1 mM 500pM 0,5 1 10 10 1 mM 1 mM 0 0 t) 0 mM OpM 3 3,25 55 55 mM 100pM 2,5 3,25 55 55 mM 250pM 1 3 20 55 mM 500pM 0,5 2,5 5 45 mM 1 mM 0 2,75 0 45 Tableau 2 Antioxydant H202 Qualité du mouvement Pourcentage de spermatozoïdes mobiles L-Cystéine Témoin Echantillon Témoin Echantillon pM OpM 2 2, 5 45 55 pM ?OOpM 1 2 20 45 pM 250pM 0,5 1 5 10 M OO M 0 0 0 0 pM 1mM 0 0 0 0 pM OpM 2,75 3 60 65 pM 100}JM 2,5 3 55 60 pM 250pM 0,5 1 15 30 pM 500pM 0 0,5 0 5 pM 1 mM 0 0 0 0 500 pM OpM 3 3 65 65 500 pM 10OpM 2,75 2,75 55 60' 500 pM 250pM 1,5 2,5 30 55 500 pM 500pM 0,5 1 5 30 500 pM 1 mM 0 0,5 0 5 1 mM OpM 3 3 60 65 1 mM 100pM 2,5 3 55 60 1 mM 250pM 0,5 2,75 30 55 1 mM 500pM 0,5 2,25 5 50 1 mM 1mM 0 0,5 0 5 mM OpM 3 3 60 65 mM 100pM 2,5 3 55 65. mM 250pM 0,5 2,75 30 60, mM 500pM 0,5 2,75 5 60 mM 1 mM 0 2,5 0 55 Tableau 3 Antioxydant H202 Qualité du mouvement Pourcentage de spermatozoïdes mobiles DTT: Dithiotréitol Témoin Echantillon Témoin Echantillon 0,1 mM OpM 3 3 55 55 _ 0,1 mM 100pM 3 3 _ 55 55 0,1 mM 250 M 0,5 _ 2 10 40 0,1 mM 500pM 0 0,5 0 20 0,1 mM 1 mM 0 0 0 0 0,2 mM OpM 3 3,5 60 60 0,2 mM 10011M 3 3 _ 60 60 0,2 mM 250pM 1 2,75 20 55 0,2 mM 500pM 0 _ _ 0 20 _ 0,2 mM 1 mM 0 0 0 0 0,5 mM OpM 3 3,5 55 60 0,5 mM 10OpM 2,75 3 55 55 0,5 mM 2501jM 0,5 2,75 10 55 0,5 mM 500pM 0 1 0 25 0,5 mM 1 mM 0 0,5 0 5 5mM OpM 3 3 60 55 1OOpM mM 2 3 45 55 mM 250pM 0 3 0 55 mM 500pM 0 3 0 55 mM 1 mM 0 2,75 0 55 Tableau 4 Antioxydant H202 Qualité du mouvement Pourcentage de spermatozoïdes mobiles Glutathion réduit Témoin Echantillon Témoin Echantillon mM OpM 2, 75 3 55 60 _ mM 5011M 2,75 2,75 55 55 mM 1001M 2,75 2,75 60 60 mM 250pM 1,75 2, 75 50 60 mM 50011M 0,5 3 _ 60 mM 750pM 0,25 3 2 60 mM 1 mM 0 2,75 60 Les tableaux ci-dessus démontrent que des effets positifs sont obtenus 5 avec les molécules suivantes: Ji-me:rcaptoéthanol, L-cystéine, dithiotréitol, glutathion réduit. Tous ces composés, appartenant à la famille des thiols, protègent efficacement les spermatozoïdes contre l'oxydation in vitro par l'eau oxygénée avec un effet dose observé entre 1 et 5 mM. Le tableau 1 montre que l'addition de p-mercaptoéthanol est avantageuse à partir de 0,2 mM et d'efficacité maximale à 5 mM. L'addition de L-cystéine (tableau 2) est efficace sur toutes les doses testées (de 50 pM à 5 mM), et d'autant plus efficace que la dose est croissante. Il en est de même pour le dithiotréitol, testé de 0,1 à 5 mM. Avec les autres composés de la liste de nomenclature ci-dessus, n'appartenant pas à la famille des thiols, il n'a pas été trouvé d'activité protectrice 10 aux doses étudiées. Deuxième série d'essais Dans une deuxième série d'essais, l'effet des antioxydants sur la qualité de la semence congelée a été étudié. Les molécules ayant in vitro des propriétés antioxydantes pour les spermatozoïdes, identifiées par la première série d'essais, ont ensuite été ajoutées à des dilueurs de congélation commerciaux afin d'améliorer la qualité de la semence congelée. La semence de dix taureaux de race Holstein a été collectée et congelée dans un milieu protecteur comportant les molécules antioxydantes identifiées et un dilueur du commerce. Un dilueur à base de Tris et de jaune d'oeuf commercialisé par la société Biovet, France, sous le norn de Optidyl , et un dilueur sans jaune d'oeuf commercialisé sous le nom de Bioxcell par la société IMV, France, ont été testés. La production et le conditionnement de la semence ont été réalisés dans des centres d'insémination agréés selon les procédures classiquement utilisées. Outre la mobilité et la viabilité des spermatozoïdes, la vitesse curvilinéaire (VOL), et l'amplitude latérale de la tête (ALH), descriptifs du mouvement des spermatozoïdes, ont également été mesurés. Le seuil de signification était inférieur à 0,05. T désigne les essais effectués avec un dilueur témoin, non additionné d'antioxydant. Le tableau 5 permet de constater que la mobilité, la viabilité et la vitesse de déplacement des spermatozoïdes sont significativement améliorées lorsque la concentration de R-mercaptoéthanol (molécule N) dans le dilueur Optidyl est de 5 mM. Les autres molécules (L, Z, E) testées dans les mêmes conditions n'ont pas eu d'effet. Tableau 5 Antioxydant ajouté T N L Z E Pourcentage de spermatozoïdes vivants 59, 3 64,1 60 58,6 58 Pourcentage de spermatozoïdes mobiles 49,4 55,3 47,9 50, 1 43,5 Vitesse curvilinéaire (en pm par seconde) _ 196,6 241,3 198,5 197, 5 196,3, Le tableau 6 résume le résultat d'essais effectués avec l'addition, à du dilueur Optidyl , de camitine 1 mM (AE), de L-cystéine 5 mM (AC) et d'un mélange de L-cystéine 1 mM et de camitine 1 mM (ACE). Tableau 6 Antioxydant ajouté T AE AC AE + AC Pourcentage de spermatozoïdes vivants. 46,7 48,8 50,7 52,6 Pourcentage de spermatozoïdes mobiles 56,5 53,8 57, 8 57,3 Qualité du mouvement (note) 2,6 2,6 3,0 3,0 Le tableau 6 permet de constater que l'ajout de camitine ne procure aucun avantage significatif par rapport au dilueur témoin (T). Cet ajout ne modifie cependant pas l'efficacité de la L-cystéine, en particulier sur la qualité du mouvement des spermatozoïdes. Le tableau 7 suivant démontre que la vitesse de déplacement des spermatozoïdes est également significativement améliorée, par des additions de molécules de glutathion réduit ou de p-mercaptoéthanol dans un diuleur Optidyl ou un dilueur Bioxcell . Tableau 7 Antioxydant ajouté T AA VCL en Optidyle (en pm par seconde) 174,2 210,4 VCL en Bioxcelle (en pm par seconde) 214,7 233,7 Troisième série d'essais Dans une troisième série d'essais, l'effet des antioxydants sur la qualité de la semence sexée a été étudié. Le tri des spermatozoïdes selon le sexe, ou sexage des spermatozoïdes , s'effectue par la technique de cytométrie en flux. Cette méthode conduit à une diminution de la qualité de la semence à l'issue du protocole de tri en particulier en raison de contraintes mécaniques exercées sur les spermatozoïdes. Les essais ont d'abord porté sur une semence diluée dans un milieu protecteur comportant de l'Optidyl seul (témoin = T) ou dans un milieu protecteur d'essai comportant de l'Optidyl et un antioxydant (N = 8mercaptoéthanol 5 mM). Après congélation, chaque semence a d'abord été décongelée, puis centrifugée. La semence a ensuite été colorée au Hoechst 33342 par incubation pendant une heure dans un dilueur d'incubation. Les dilueurs d'incubation utilisés étaient du milieu protecteur témoin (T) ou d'essai (N). Dans le tableau 8, la semence diluée avant congélation dans un milieu protecteur témoin, puis diluée dans un milieu protecteur d'essai lors de la coloration est notée TN . La semence diluée avant congélation dans un milieu protecteur d'essai, puis diluée dans un milieu protecteur témoin lors de la coloration est notée NT . Enfin les semences diluées deux fois avec le milieu protecteur témoin ou deux fois avec le milieu protecteur d'essai sont notées TT et NN , respectivement. Après coloration, les semences sont sexées. La mobilité, la qualité du mouvement et la viabilité sont mesurées tout au long du processus de sexage: après décongélation, après lavage par centrifugation de la semence décongelée, après coloration au Hoechst 33342 , c'est-à-dire juste avant le tri, et enfin après tri par cytométrie. Les résultats sont résumés dans le tableau 8. Tableau & Après Viabilité (%) Après sexage décongélation Après Après H-33342_ centrifugation 58 58 51,1 15,4 51 _ 17,4 68,5 67,4 61,2 _ 39,2 60,7 22,4 Mobilité (%) Après Après Après H- 33342 Après sexage décongélation centrifugation 60 35 0 5 60 45 30 15 Après Mouvements (note) Après sexage décongélation Après Après H-33342 centrifugation 2,5 2,5 2 0 2 1 3 3 3 1,5 2,5 1 La mobilité, la qualité du mouvement et la viabilité des spermatozoïdes congelés avec l'antioxydant N sont plus élevées que celles du témoin T, aussi bien avant qu'après le tri, avec un effet plus marqué sur l'aptitude à résister au tri. De plus, l'addition de l'antioxydant N au cours du processus de tri améliore la qualité de la semence après tri quelles que soient les conditions de congélation (T ou N). Les essais ont ensuite porté sur une semence fraîche conservée en Bioxcell avec un antioxydant (N = R-mercaptoéthanol 5 mM) ou sans (témoin = T). Les résultats sont résumés dans le tableau 9. La semence de dix taureaux a été collectée, diluée en Bioxcell (IMV) supplémenté ou pas avec du p-mercaptoéthanol (N) 5 mM, conservée 5 heures à 4 C et soumise au processus de tri des spermatozoïdes. La viabilité et la mobilité des spermatozoïdes ont été mesurées avant et après le tri dans les deux conditions expérimentales (avec ou sans R-mercaptoéthanol 5 mM tout au long du processus). TT TN NN NT TT TN NN NT TT TN NN NT L'antioxydant R-mercaptoéthanol à 5 mM améliore la mobilité, la viabilité et la qualité du mouvement des spermatozoïdes frais conservés en dilueur Bioxcell à 4 C avant et après le tri par cytométrie. Tableau 9 Antioxydant ajouté T avant tri N avant tri T après tri N après tri Pourcentage de spermatozoïdes vivants 79,4 84, 7 66,2 69,3 Pourcentage de spermatozoïdes mobiles 69,0 78, 5 _ 48,5 61,5 Qualité du mouvement (note) 2,6 3,0 2,1 2,5 En outre, l'utilisation de l'antioxydant pmercaptoéthanol à 5 mM a permis d'améliorer significativement les taux de fécondation et de développement embryonnaire lors d'une production in vitro (Tableau 10). Dans ces essais préliminaires, des taux de développement jusqu'au stade blastocyste de 17% ont été obtenus après mise en présence de la semence avec l'antioxydant avant le tri alors que ce taux n'est que de 7% avec la semence triée témoin . Tableau 10 Témoin avant tri Ajout de p-mercaptoéthanol à 5 mM avant tri Nombre d'ovocytes inséminés 70 68 Nombre 42 (58%) 49 (72%) et pourcentage d'ovocytes fécondés Nombre 5 (7%) 12 (17%) et pourcentage de blastocystes Quatrième série d'essais Dans une quatrième série d'essais, l'effet des antioxydants sur l'aptitude des spermatozoïdes d'une semence fraîche à supporter une conservation par 15 simple réfrigération à 4 C a été évaluée. Le recours à la semence fraîche dans la politique de production de semence revêt en effet une importance stratégique pour certaines unités de sélection. A pouvoir fécondant identique, la semence fraîche d'un taureau peut en effet contenir trois à cinq fois moins de spermatozoïdes que la semence congelée de ce même taureau. Le nombre de paillettes de semence fraîche qu'il est possible de fabriquer à partir d'un éjaculat de taureau est donc trois à cinq fois plus grand que le nombre de paillettes de semences congelées. Pour le propriétaire d'un taureau d'élite notamment, l'utilisation de semence fraîche est ainsi d'une importance économique considérable. La semence de sept taureaux adultes hébergés dans un centre de production a été collectée pendant trois semaines consécutives à raison d'un éjaculat hebdomadaire par animal. Le prélèvement avait lieu le lundi (JO) afin de disposer de l'ensemble de la semaine pour réaliser les examens de semence jusqu'au vendredi (J4). La totalité des éjaculats a été recueillie à l'aide de vagins artificiels selon les techniques habituelles en vigueur. Chacun des 21 éjaculats collectés a été divisé en trois fractions équivalentes. Chaque fraction de semence a été diluée à température ambiante dans un Erlenmeyer identifié de façon à obtenir une concentration finale de 5 millions de spermatozoïdes totaux par paillette. Les trois fractions de chacun des 21 éjaculats ont été diluées chacune dans un dilueur différent, à savoir respectivement l'Optidyl ( lot témoin ), un mélange d'Optidyl et de (3-mercaptoéthanol à la concentration de 1 mM ( lot 1 ), et un mélange d'Optidyl et de 3-mercaptoéthanol à la concer d ation de 5mM ( lot 2), respectivement. Chaque lot a ensuite été placé dans une vitrine réfrigérée à 4 C pour atteindre cette température en une heure environ. Un temps d'équilibration d'au moins deux heures a ensuite été respecté. Après équilibration, les lots de semence ont alors été mis en paillettes dans la vitrine réfrigérée puis conservés horizontalement pour éviter tout risque de sédimentation des spermatozoïdes. Une lettre-code inscrite sur les paillettes à la suite de la référence éjaculat permettait d'identifier les lots et de réaliser les examens en aveugle. Toutes les fractions d'un même éjaculat ont été traitées de façon rigoureusement identique. L'évolution de la qualité de la semence a été suivie du lundi (JO) au vendredi (J4) pendant les trois semaines cle l'essai. Evaluation du pourcentage de spermatozoïdes mobiles. Chaque semaine pendant les trois semaines de test, des mesures du pourcentage de spermatozoïdes mobiles ont été effectuées sur des échantillons obtenus à partir des éjaculats prélevés chaque lundi (JO) sur les sept taureaux. Pour un lot et un taureau déterminé, une mesure était effectuée les lundi (JO), mardi (J1), mercredi (J2), jeudi (J3) et vendredi (J4). Chaque jour une mesure était ainsi effectuée sur sept échantillons (un par taureau) provenant du lot témoin, sept échantillons provenant du lot 1 et sept échantillons provenant du lot 2. Chaque échantillon était constitué par mélange de deux paillettes d'un 10 même lot pour un même taureau. La moyenne, sur les trois semaines, de l'ensemble des mesures sur les sept échantillons d'un lot effectuées un jour J0-J4 donné, correspond à un point sur la figure 1 en annexe. On observe qu'à JO et J1, le pourcentage de cellules mobiles est sensiblement identique quel que soit le traitement. Les différences apparaissent à partir de J2. A J4, 40% des cellules présentent encore une mobilité lorsqu'elles sont conservées en présence d'antioxydant à 1mM (lot 1). Ce pourcentage n'est que de 20 % à la concentration de 5mM (lot 2) et chute à 13 % en l'absence d'antioxydant (lot témoin). A J4, le pourcentage de cellules mobiles est encore jugé acceptable pour une utilisation sur le terrain. Evaluation de la qualité du mouvement des spermatozoïdes. La qualité du mouvement suit exactement la même évolution que celle de la mobilité représentée sur la figure 1 (données non présentées). A J4, les spermatozoïdes dilués avec la solution à 1 mm présentent encore une note de 2,6 alors que le témoin n'est plus qu'à 1. A J4, la qualité du mouvement est encore jugée acceptable pour une utilisation sur le terrain. Evaluation de la fertilité La fertilité a été évaluée à partir des taux de non retour 4-24 jours (TNR4-24) après insémination artificielle première (IAP) calculés pour deux taureaux pendant le dernier mois de la campagne de semence. fraîche dans l'une des coopératives de mise en place (CMP) de l'Union ayant participé aux essais. Le taux de non retour 4-24 désigne le pourcentage de vaches qui, après insémination, ne retournent pas en chaleur entre les quatrième et vingtquatrième jours suivant l'insémination. Ce taux indique donc le pourcentage de vaches qui sont gestantes suite à (insémination. La concentration en (i-mercaptoéthanol dans le dilueur était de 1 mM. Pour des raisons pratiques, il n'a pas été possible de travailler avec des éjaculats fractionnés. Pour l'analyse de l'effet de l'antioxydant sur la fertilité, les TNR4-24 calculés pendant le mois expérimental ont été comparés à ceux enregistrés pour les mêmes taureaux et la même CMP pendant le mois précédent avec le même dilueur mais sans additif. Les résultats obtenus avec des semences fraîches inséminées à JO et à JI (c'est-à-dire après conservation à 4 C pendant une journée) ont été comparés. Tableau 11: Différence TNR4-24 à JO TNR4É-24 à JI sans antioxydant avec antixcxydant 1 mM Taureau 1 13,8 3,6 Taureau 2 3,9 ti,9 Le tableau 11 démontre que la différence entre le taux de non retour 4-24 jours (TNR424, en pourcentage) à JO et à JI, diminue avec un milieu protecteur comportant du (3-mercaptoéthanol (1 mM). Cela est particulièrement net pour les résultats du taureau 1 qui, sans ajout d'antioxydant, chutent d'environ 14 points d'un jour à l'autre alors que la baisse est réduite à 3,5 points grâce au milieu protecteur selon l'invention. L'addition de 6-mercaptoéthanol se traduit donc avantageusement par une réduction de la perte de fertilité de la semence entre JO et JI. Le tableau 12 fournit les données brutes de fertilité (TNR4-24) et le nombre d'inséminations artificielles premières (NIAP) correspondant par jour d'utilisation de la semence pour les deux taureaux concernés en fonction de la présence (lignes traité ) ou non (lignes témoin ) de p mercaptoéthanol dans le dilueur. Tableau 12 JO J1 moyenne NIAP TNR NIAP TNR NIAP TNR Taureau 1 Témoin 197 85,3 340 71,5 537 76,56 Traité 258 80, 6 400 77 658 78,41_ Taureau 2 Témoin 139 82 228 78,1 367 79,58 Traité 146 78,1 263 77,2 409 77,52 Cumul Témoin 336 83,93 568 74, 15 904 77,79 Traité 404 79,7 663 77,08 1067 78,07' L'addition de 13 mercaptoéthanol dans un dilueur semble se traduire par une dégradation du TNR4-24 à JO. Pour une utilisation du dilueur à JO, il serait donc préférable de ne pas ajouter d'antioxydant. Dès JI cependant, le TNR4-24 de la semence diluée dans un milieu protecteur selon l'invention rejoint, voire dépasse le TNR4-24 de la semence diluée dans le milieu protecteur témoin. Un milieu protecteur selon l'invention s'avère donc présenter une meilleure tenue dans le temps. Cela est particulièrement vrai pour les taureaux dont la semencesubit des phénomènes oxydatifs donc dégénératifs forts au cours du temps (taureau 1). L'addition de (3-mercaptoéthanoll à la semence fraîche permet donc avantageusement une conservation prolongée de celte-ci. Les résultats obtenus avec la semence fraîche permettent d'envisager une 2G optimisation de leur utilisation. En effet, jusqu'à ce jour, la chute brutale à J2 des TNR contraignait les utilisateurs des semences fraîches à ne travailler qu'à JO et JI. II en résultait des difficultés logistiques importantes pour approvisionner les inséminateurs dans des délais très restreints, et donc des coûts élevés. De plus, la durée d'utilisation des semences était également très réduite. L'addition d'un antioxydant selon l'invention dans un dilueur permettrait avantageusement de maintenir la fertilité jusqu'à J3 contre JI aujourd'hui. Le domaine d'utilisation de semence fraîche est ainsi avantageusement considérablement étendu. Cinquième série d'essais Dans une cinquième série d'essais, l'effet des antioxydants sur l'aptitude des spermatozoïdes d'une semence à supporter une séquence de congélation / décongélation a été évaluée. L'excédent de doses disponibles par rapport aux besoins pour les examens en semence fraîche de la quatrième série d'essais a été congelé dans un congélateur programmable (Digitcool 53000, IMV technologies, l'Aigle, France) en vue de compléter les essais en semence fraîche par des tests en semence congelée à partir des mêmes animaux. Après décongélation au moins 30 secondes dans un bain-marie à 37 C, les doses de semence congelée ont été soumises aux mêmes examens que dans l'essai précédent. La viabilité des spermatozoïdes a été évaluée par cytométrie de flux après coloration vitale au SYBR/IP. L'effet de l'antioxydant R-mercaptoéthanol est illustré dans le tableau 13 suivant. Tableau 13 Témoin avec antioxydant avec antioxydant 1 mM 5mM la vivants après coloration de Hoechst 41,8 41,9 44,6 0/0 vivants après coloration SYBR14/IP 43,7 43,1 47,2 % mobiles examens directs 41,9 40,5 41,2 Avec la semence congelée, la dose la plus efficace pour l'antioxydant est de 5mM. A la dose de 1 mM, on ne met pas en évidence de différence significative avec le témoin. Par ailleurs, il apparaît que, sur le groupe de taureaux, la dose de 5mM donne des résultats plus constants que les deux autres fractions au cours du temps. Ces observations sont confirmées par les autres examens réalisés (pourcentages de spermatozoïdes mobiles, qualité du mouvement et coloration de Hoechst). Comme cela apparaît clairement à présent, l'addition, dans un milieu protecteur de semence, d'un antioxydant de la famille des thiols, en particulier de pmercaptoéthanol, de L-cystéine, de dithiotréitol, ou de glutathion réduit, améliore le pouvoir fécondant de cette semence in vivo et in vitro et le maintien de ce pouvoir fécondant dans le temps. La semence, en particulier la semence fraîche, peut ainsi être conservée plus longtemps, et donc être transmise à des centres d'insémination éloignés du lieu de sa production. En outre, la production de semence fraîche peut être favorisée aux dépens de la production de semence congelée qui présente un pouvoir fécondant plus faible. Il en résulte un avantage économique considérable. Enfin l'invention renforce la résistance des semences aux divers traitements qu'elfe peut subir, en particulier fa cbngéfatfon et le sexage. Bien entendu, l'invention n'est cependant pas limitée aux modes de réalisation décrits. En particulier, le milieu protecteur peut comporter du jaune d'oeuf ou pas. 15 D'autres milieux salins que le Tris sont également possibles. Le milieu protecteur peut également être utilisé pour protéger la semence lors d'autres traitements que la congélation et le sexage. REVENDICATIONS 1. Milieu protecteur pour semence comportant un antioxydant de la famille des thiols. 2. Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit antioxydant est choisi dans le groupe formé par le J3-mercaptoéthanol, la L-cystéine, le dithiotréitol, le glutathion réduit, et leurs mélanges. 3. Milieu protecteur selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit antioxydant est choisi dans le groupe formé par le 8mercaptoéthanol, la L- cystéine et leurs mélanges_ 4. Milieu protecteur selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration moléculaire dudit antioxydant est comprise entre 0,1 et 10 mM. 5. Milieu protecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que la concentration moléculaire dudit antioxydant est comprise entre 0,5 et 6 mM. 6. Milieu protecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration moléculaire dudit antioxydant est comprise entre 4 et 6 mM. 7. Milieu protecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que la concentration moléculaire dudit antioxydant est comprise entre 0,1 et 3 mM. 8. Paillette de semence destinée à l'insémination artificielle comportant un milieu protecteur selon rune quelconque des revendications précédentes. 9. Procédé de tri des spermatozoïdes d'une semence destinée à la fécondation in vitro ou in vivo, en particulier par insérnination artificielle, caractérisé en ce que, après une éventuelle décongélation, ladite semence est diluée au moins dans un milieu protecteur conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 7. 10. Utilisation d'un milieu protecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une paillette selon la revendication 8 pour protéger une semence d'un mammifère ou d'un oiseau. 11. Utilisation d'un milieu protecteur selon la revendication précédente, caractérisée 5 en ce que ledit mammifère est un bovin, un équin, un porcin, un ovin, un caprin, un rongeur ou un lagomorphe.