FR 2885139 A1 20061103 FR 0504426 A 20050429 L'invention concerne un procédé de préparation d'un complexe soluble protéine N protéine P tronquée d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, les complexes ainsi préparés, ainsi que les protéines N solubles susceptibles d'être isolées à partir de ces complexes. L'invention concerne également des compositions vaccinales comprenant ces complexes protéine N protéine P tronquée ou des protéines N de Paramyxoviridae. De manière préférentielle, la protéine P tronquée est un fragment Cterminal de la protéine P. En France, comme dans la plupart des pays, le virus respiratoire syncytial (VRS) bovin est le principal agent responsable de maladies respiratoires graves chez le veau (bronchiolites, pneumonies) dans plus de 70 % des exploitations et chez environ 70% des veaux au cours de la première année (Perrin et al., 1979; Ames, 1993; Elvander, 1996). La mortalité peut atteindre 20% (Wellemans, 1992). C'est un véritable fléau pour les éleveurs qui ne peuvent qu'assister impuissants chaque année, en hiver, à l'apparition de cette maladie de façon systématique. Il y a donc une forte demande des éleveurs à ce sujet pour la mise au point d'une prophylaxie efficace. Des vaccins sont commercialisés, mais ils sont en réalité peu ou pas efficaces. Il existe la même maladie chez l'homme: c'est l'agent responsable de la bronchiolite du nouveau-né (voir revue Virologie Vol.7 numéro spécial octobre 2003: infections à virus respiratoire syncytial en pédiatrie). Les données concernant la maladie humaine sont plus précises. Comme pour les bovins, en France, chez l'homme, c'est une maladie épidémique d'hiver. Pendant la première année de la vie, 70% des nourrissons sont infectés par le VRS, et 100% au cours des deux premières années. Ceci représente 500 000 enfants atteints chaque année en France. Une maladie des voies respiratoires basses (bronchiolite) survient chez 20% des nourrissons atteints, et le taux d'hospitalisation varie de 2 à 5% en France, pour une durée de 8 à 9 jours, de 10 à 25% chez les prématurés, 14 à 45% en cas de dysplasie pulmonaire, 15 à 25% en cas d'anomalie cardiaque congénitale. Environ 10% des patients hospitalisés doivent être traités dans une unité de soins intensifs. La mortalité avoisine 0,1 %. Selon un récent rapport de l'Organisation Mondiale de la Santé, il a été estimé que 64 millions de personnes sont infectées chaque année dans le monde, et 160 000 décès seraient dus au VRS. Chaque année aux Etats-Unis, on compte de 18000 à 75000 hospitalisations et près de 2000 morts directement et 17000 indirectement (Magon and Barik, 2004). Le VRS serait également responsable d'un tiers des symptômes grippaux chez l'adulte. En réalité il a été estimé le VRS tuerait quatre fois plus les personnes âgées que les enfants. En tout, le VRS emporterait de 3 à 5 millions de vies par an. De plus, cette maladie semble augmenter les risques de développer de l'asthme chez l'adulte lorsqu'elle est contractée au plus jeune âge (avant 4 mois), par des mécanismes immunologiques complexes encore mal compris. Même si les VRS humain et bovin sont deux virus distincts, ils sont très proches que ce soit sur le plan structural, moléculaire, antigénique, la maladie qu'ils induisent (tableau clinique, saisonnalité des infections, infection du jeune), et par le fait qu'il n'existe pas de vaccin efficace ni d'antiviraux, en dehors d'un anticorps monoclonal extrêmement coûteux et donc rarement utilisé et d'un antiviral peu efficace et assez toxique qui en réalité déplète les cellules en ATP. Dans les années soixante, des essais de vaccination ont été réalisés aux Etats-Unis sur des jeunes enfants avec du virus fixé au formol. Les résultats furent catastrophiques, les enfants vaccinés ayant développé des symptômes exacerbés lors de l'infection naturelle par le virus quelques mois plus tard, et entraînant même la mort de plusieurs d'entre eux. Suite à ces essais malheureux, il n'existe toujours pas de vaccin contre cette maladie pour l'homme, et les vaccins commercialisés pour les bovins sont d'une efficacité plus que douteuse, même s'il n'y a pas d'étude sérieuse en France faite sur ce sujet. Plusieurs vaccins ont cependant été retirés du commerce après des accidents post-vaccinaux chez des bovins. La difficulté de mettre au point un vaccin contre le VRS peut s'expliquer par les raisons suivantes: (1) l'infection naturelle ne confère pas une immunité protectrice contre une réinfection, car la mémoire immunitaire locale contre le VRS est de courte durée; (2) l'induction d'une immunité cellulaire et humorale forte est associée avec une augmentation de la sévérité de la maladie (sensibilisation par la vaccination) ; (3) Il n'existe pas d'adjuvant ou de stratégie vaccinale permettant de 5 vacciner efficacement par voie mucosale; (4) Les nouveau-nés (moins de deux mois) sont la cible principale de la vaccination, or leur système immunitaire répond mal aux vaccins classiques; (5) La présence d'anticorps maternels dans le sang qui n'empêchent pas l'infection; (6) La variabilité des souches virales circulantes. Des vaccins sous-unitaires sont en cours de développement, pour certains sur la base de la protéine de surface G. De nouveaux types de vaccins obtenus par génétique inverse, (c'est-à-dire par atténuation de souche par modification génétique) sont en développement depuis de nombreuses années, pour le VRSH comme pour le VRSB. Pour l'instant aucune utilisation de souche atténuée n'a été validée pour l'homme. Ceci est probablement dû au fait que les souches atténuées déclenchent une réponse immunitaire faible. Des vaccins ADN basés sur les protéines de membrane F et G du VRSH ou du VRSB sont en cours de développement y compris chez le veau (Taylor et al. 2005, Martinez et al. 1999). Ce type de vaccin confère une immunité protectrice associée pour certaines études à une immunopathologie. L'efficacité de ces vaccins reste à améliorer. Le VRS est un virus enveloppé possédant un génome à ARN simple brin de polarité négative. Cet ARN code pour 11 protéines et est encapsidé par la protéine de nucléocapside (N) et associé au complexe polymérase composé de deux protéines, L (large) ou polymérase et le co-facteur P (phosphoprotéine) (Figure 1). Cette molécule joue un rôle essentiel dans le fonctionnement de la polymérase: P permet à L de reconnaître l'ARN génomique. II existe en plus deux co-facteurs pour le VRS, M2-1 et M2-2 qui jouent un rôle de processivité (M2-1) et de régulation de la balance transcription/réplication (M2-2). Sur la surface de la particule virale on trouve deux protéines majeures, F et G. La protéine F permet la fusion de l'enveloppe virale avec les membranes cellulaires et est impliquée dans la formation de syncytia. La protéine G permet l'attachement du virus à la surface cellulaire. La protéine M (matrice) sert d'intermédiaire entre l'enveloppe virale et le complexe Polymérase/génome. Les deux protéines de surface F et G sont les protéines immunogènes majeures du VRS car elles sont les cibles des anticorps neutralisants. Cependant les études réalisées chez la souris ont montré que la protéine G est impliquée dans l'induction des réponses vaccinales immunopathologiques de type Th2 (production d'IL-4 et d'IL-5 et recrutement d'éosinophiles) (Sparer et al. 1998). Par contre chez le bovin, aucune de ces deux protéines n'a été associée à des réponses immunopathologiques et les deux permettent l'établissement de réponses protectrices (Taylor et al. 1997). A l'heure actuelle les recherches de nouveaux candidats vaccins restent majoritairement orientées sur les protéines F et G. Cependant chez l'homme et le bovin, l'immunité à médiation cellulaire et en particulier la réponse T cytotoxique est une composante cruciale de la protection contre le VRS. Hors chez l'homme comme chez le bovin, la protéine N est le support principal des réponses T cytotoxiques (Goulder et al., 2000). Le veau est un modèle pertinent pour la vaccination contre le VRS. Il a été montré que l'utilisation de vaccine recombinante exprimant la protéine N du VRS générerait une réponse de type cellulaire (Th1) permettant de rééquilibrer la réponse immunitaire (Taylor et al., 1997; Gaddum et al., 2003). L'ensemble des travaux actuels plaident donc en faveur d'un vaccin anti-VRS constitué par l'association de plusieurs protéines, en particulier des protéines de surface F et G et de la protéine interne N. La protéine N est la protéine la plus exprimée dans la cellule infectée et une des plus importantes sur le plan quantitatif dans les particules virales (Collins et al., 2001). Elle entoure le génome viral constitué d'un ARN simple brin, formant des structures hélicoïdales de grande taille. Lorsqu'elle est exprimée seule sous forme recombinante, la protéine N polymérise sur les ARN cellulaires de façon non spécifique. Elle forme alors des structures hélicoïdales (ARN/N) très grosses, insolubles et non purifiables, ressemblant aux nucléocapsides observées dans les cellules infectées (Méric et al., 1994; Bhella et al., 2002). Cette protéine N est capable d'interagir avec la protéine P du VRS, cofacteur de la polymérase virale L. Des études de cartographie des domaines d'interaction utilisant essentiellement le double hybride et la coimmunoprécipitation ont été menées par différentes équipes, le crible étant négatif (perte d'interaction). Le domaine C-terminal de la protéine P du virus humain ou bovin était suspecté jouer un rôle important dans l'interaction avec la protéine N (Garcia Barreno et al., 1996; Mallipeddi et al., 1996; Slack and Easton, 1998; Khattar et al., 2001a, 2001b). Cependant il a été avancé que le système double hybride ne refléterait pas la nature réelle des interactions entre les protéines N et P (Khattar et al., 2001a). En outre, la nature exacte des complexes P-N (nombre de chaque molécule ou stoechiométrie, structure) n'était pas décrite et les domaines d'interaction pas démontrés ni caractérisés. Des études menées sur des virus proches appartenant à la famille des Paramyxoviridae (virus de Sendai, Rougeole ou Measle virus) ont conduit à l'idée que la protéine P formerait un complexe soluble avec la protéine N, noté N P, l'empêchant de se fixer de façon non spécifique aux ARNs cellulaires (Kolakofsky et al., 2004). La protéine P serait également capable de reconnaître la nucléocapside formée de l'ARN encapsidé par la protéine N, puisque P agit comme co-facteur de L, lui permettant de trouver son substrat. Pour les Paramyxoviridae, deux domaines d'interaction ont été trouvés sur P. Le premier, situé en position C-terminale de la protéine, constituerait le domaine reconnaissant le complexe N-ARN, celui situé en position N-terminale permettant la formation de complexes N P (Kolakowsky et al., 2004). Pour le VRS, ces complexes n'ont pas été clairement identifiés, et le rôle du domaine C-terminal de la protéine P interagissant avec N n'a pas été clairement défini. Jusqu'à présent le développement d'un vaccin de sous-unité basé sur la protéine N a été rendu impossible par la difficulté à isoler la protéine N sous forme soluble. Récemment les inventeurs ont développé un système de coexpression des protéines P et N en bactérie, en choisissant comme modèle de Paramyxoviridae le RSV (Castagné et al., 2004). La protéine P a été fusionnée à la glutathione-S-transferase (GST) dans un plasmide portant la résistance à l'ampicilline: la protéine N a été clonée dans un plasmide portant la résistance à la kanamycine. La co-expression de ces plasmides dans les mêmes bactéries a permis de purifier la protéine de fusion GST-P et d'entraîner avec la protéine N. Toutefois, sans doute en raison de problèmes de solubilité subsistant, les rendements de production de protéine N sous forme soluble restent largement insuffisants pour envisager une mise en pratique de ce système à l'échelle industrielle. Les inventeurs ont mis en évidence que la co-expression de mutants de délétion N-terminale de la protéine P avec la protéine N du RSV permet de purifier des grandes quantités de protéine N largement supérieure à celle obtenue avec la protéine P entière. Définitions La famille des Paramyxoviridae regroupe les sous-familles des Paramyxovirinae et des Pneumovirinae. Les Paramyxovirinae incluent les Respirovirus, dont le virus prototype est le virus de Sendai, et les Rubulavirus (notamment le virus des oreillons), et les Morbilivirus tels que le virus de la rougeole. Chacun des genres Respirovirus et Rubulavirus regroupe des souches du virus parainfluenza. La sous-famille des Pneumovirinae regroupe deux genres, les Pneumovirus et les Metapneumovirus, ce dernier incluant le Metapneumovirus humain. Le virus respiratoire syncytial (VRS) humain constitue le virus prototype du genre Pneumovirus appartenant à la sous-famille des Pneumovirinae. Les Pneumovirus incluent également les souches bovine et murine du VRS. Sans autre précision, par virus respiratoire syncytial on entend d'une manière générale le VRS, quelle que soit la forme (humaine, bovine.. .), le sous-groupe (par exemple les sous-groupes A, B et S identifiés chez le VRS humain) ou la souche considérée. L'expression protéine P désigne la Phosphoprotéine ou protéine P faisant partie du complexe Polymérase d'un virus de la famille des Paramyxoviridae. La protéine P est un co--facteur de la polymérase (réplicase/transcriptase) virale et peut être phosphorylée. Les séquences de protéines P de Paramyxoviridae sont connues de l'homme du métier. Par exemple la protéine P du VRS humain souche Long présente une séquence de 241 acides aminés qui a été déposée dans la base de données Swissprot sous le numéro d'accès P12579. Cette séquence est montrée dans la séquence SEQ ID No.l. La protéine P du VRS bovin comporte également 241 acides aminés (SEQ ID No.23). Une protéine P du virus de Sendai (souche Harris), du virus de la rougeole (Souche Edmonston B), du virus de oreillons (souche SBL-1), et du Metapneumovirus humain (souche 00-1) sont également décrites dans la base de données Swissprot sous les numéros d'accès PO4859 (SEQ ID No.2), CAA91364 (SEQ ID No.3), P19717 (SEQ ID No.4) , et Q91KZ5 (SEQ ID No.5), respectivement. L'expression protéine P peut désigner une protéine P entière, une protéine P tronquée ou un fragment de la protéine P. La protéine P des Paramyxoviridae forrne des homo-oligomères, en particulier des homo-tétramères par exemple chez le virus de Sendai ou le VRS. Pour le VRS, un domaine de la protéine P capable de s'oligomériser (oligomérisation P-P) a été cartographié au niveau des acides aminés 120 à 150 de cette protéine (Castagné et al., 2004). Ainsi, par exemple, le fragment constitué par les acides aminés 161 à 241 de la protéine P du VRS ne forme pas d'oligomères. Le domaine d'oligomérisation de la protéine P du virus de Sendai a été décrit par Tarbouriech et al. (2000) comme étant constitué par les résidus 320 à 446 de la protéine P. D'autre part, la région d'oligomérisation P à été identifiée au niveau des acides aminés 304-376 pour la protéine P du virus de la rougeole (Johansson et al., 2003). L'expression protéine P tronquée désigne une protéine P dans laquelle une ou plusieurs séquences d'acides aminés contigus ont été supprimées. Il peut s'agir de la troncature d'une séquence C-terminale, d'une séquence N-terminale, d'une séquence interne par rapport à la séquence primaire de la protéine P, ou d'une combinaison de ces troncatures. Les protéines P tronquées selon l'invention ne contiennent pas le domaine d'oligomérisation P et sont capable d'interagir avec la protéine N. Comme le domaine d'interaction de la protéine P des Paramyxoviridae avec la protéine N a été cartographié au niveau de l'extrémité C-terminale, des exemples de protéine P tronquée incluent préférentiellement un fragment Cterminal de la protéine P, ou une protéine P chimère constituée par la fusion d'un fragment C-terminal de la protéine P (capable d'interagir avec la protéine N) avec au moins une autre séquence d'acides aminés contigus de la protéine P. Ledit fragment C-terminal et ladite autre séquence de la protéine P ne sont pas eux-mêmes naturellement contigus, et ne présentent pas de recouvrement de séquence entre eux. Par exemple, une protéine P tronquée du VRS peut avoir la séquence constituée par les acides aminés 1 à 121 et 161 à 241 de la protéine P native.Un fragment d'un polypeptide de référence désigne n'importe quelle séquence d'acides aminés contigus trouvés dans la séquence du polypeptide de référence. Par fragment de la protéine P ou PA on entend un polypeptide dont la séquence comprend un enchaînement d'acides aminés de la protéine P, un ou plusieurs acides aminés consécutifs de la protéine P ayant été supprimés à partir de l'extrémité N-terminale et(ou C-terminale. Par fragment C-terminal de la protéine P ou PAN on entend une protéine P dans laquelle un ou plusieurs acides aminés consécutifs ont été supprimés à partir de l'extrémité N-terminale. De préférence, un fragment C- terminal de la protéine P désigne un enchaînement d'acides aminés positionnés dans la moitié C-terminale de la séquence primaire de la protéine P (lorsque le nombre d'acides aminés de la séquence est impaire, on peut attribuer arbitrairement un acides aminé supplémentaire à la moitié C-terminale de la protéine par rapport à la moitié N- terminale). Par exemple, pour la protéine P du VRS qui comprend 241 acides aminés, PL 161 N désigne un fragment C- terminal constitué par les acides aminés 161 à 241 de la protéine P. Par exemple également, pour la protéine P du virus de la rougeole (souche Edmonston B) qui comprend 507 acides aminés, PA386N désigne un fragment C-terminal constitué par les acides aminés 386 à 507 de la protéine P. Par fragment N-terminal de la protéine P ou PCC on entend une protéine P dans laquelle un ou plusieurs acides aminés consécutifs ont été supprimés à partir de l'extrémité C-terminale. Par fragment interne de la protéine P ou PL NC on entend une protéine P dans laquelle un ou plusieurs acides aminés consécutifs ont été supprimés à partir de l'extrémité N-terminale et un ou plusieurs acides aminés consécutifs ont été supprimés à partir de l'extrémité C- terminale. Par protéine N on désigne la protéine de nucléocapside des Paramyxoviridae qui forme des structures hélicoïdales pour entourer le génome viral. La protéine N du VRS humain souche Long présente une séquence de 391 acides aminés qui est décrite dans la séquence SEQ ID No. 6. La protéine N du VRS bovin comporte également 391 acides aminés (voir SEQ ID No. 24). Une protéine N du virus de Sendai (souche Hamamatsu), du virus de la rougeole (Souche Edmonston B), du virus de oreillons (souche SBL-1), et du Metapneumovirus humain (souche 00-1) sont également décrites dans la base de données Swissprot sous les numéros d'accès Q9DUE3 (SEQ ID No.7) , Q89933 (SEQ ID No.8), P21277 (SEQ ID No.9), et Q91F57 (SEQ ID No.10), respectivement. Les séquences des protéines P et N décrites ci-dessus ont un caractère illustratif, ces séquences étant susceptibles de présenter des variations en fonction de la souche particulière considérée pour un virus donné. Ainsi, les positions d'acides aminés mentionnées dans la suite de la demande sont indiquées par rapport à ces séquences de référence. L'homme du métier est tout à fait à même d'identifier les domaines correspondants dans des souches de virus autres que celles exemplifiées. Les séquences codantes de ces protéines N et P de virus de la famille des Paramyxoviridae sont également connues de l'homme du métier. Par protéine étiquette , aussi appelée protéine tag , on désigne une protéine qui est utilisée en fusion avec une protéine d'intérêt pour en faciliter la purification. Des protéines étiquettes sont connues de l'homme du métier. Des exemples de protéines étiquette incluent la gluthation-S-transférase (GST) ou les tag histidine qui sont des séquences comprenant généralement un enchaînement de 4 à 10 résidus histidine. Dans le contexte de l'invention, le terme homologue a trait à la relation existant entre des protéines qui possèdent une même origine évolutive, par exemples des protéines homologues appartenant à différentes espèces, ou dans le cas de virus, de souches virales. De telles protéines (et leurs gènes codant), présentent des homologies de séquence, reflétées par leur similarité de séquences, que ce soit en terme de pourcentage de similitude ou en terme de présence de résidus ou motifs spécifiques au niveau de postions conservées. L'expression similarité de séquences désigne le degré d'identité entre des séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés de protéines qui peuvent ou non partager une même origine évolutive. De manière usuelle, on utilise indistinctement les termes homologie ou similarité. Deux séquences d'acides aminés sont essentiellement homologues lorsque leurs acides aminés sont identiques à au moins 80%, ou similaires (c'est-à-dire fonctionnellement identiques) à au moins 90 %. Des séquences similaires ou homologues peuvent être identifiées par alignement, en utilisant par exemple les programmes BLAST ou FASTA. Procédé de préparation de complexe soluble protéine N protéine P tronquée Les inventeurs ont précédemment montré (Castagné et al., 2004) que la co-expression de plasmides codant respectivement une fusion de la protéine P avec la GST et la protéine N d'un Paramyxoviridae, permettait de recueillir la protéine de fusion GST-P en entraînant la protéine N. Les rendements de production de complexes N-P sont toutefois faibles au point de ne pas être conciliables avec une production à l'échelle industrielle de ces complexes. Les inventeurs ont caractérisé des mutants de délétion de la protéine P en déterminant leur capacité à interagir avec la protéine N. Ils ont ainsi mis en évidence que certains de ces mutants sont à la fois capables d'interagir avec la protéine N sous forme de complexe ARN-N ou ribonucléocapside (RNP), mais aussi de permettre la préparation de complexes N-P avec des rendements de préparation très nettement supérieurs à ceux obtenus avec la protéine P entière. Ces mutants particuliers correspondent à des fragments de la protéine P comprenant la partie C-terminale de la molécule et dans lesquels le domaine d'oligomérisation P est absent. La coexpression de ces mutants de la protéine P avec la protéine N permet donc de préparer de la protéine N sous forme de RNP soluble, notamment sous forme de complexes protéine N-protéine P tronquée, en particulier fragment C-terminal de P, en grandes quantités. L'invention concerne donc un procédé de préparation d'un complexe soluble protéine N protéine P tronquée d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) coexprimer une protéine N d'un virus de la famille des Paramyxoviridae avec une protéine P tronquée du même virus de la famille des Paramyxoviridae, ladite protéine P tronquée ne contenant pas le domaine d'oligomérisation P et étant capable d'interagir avec la protéine N; b) recueillir les complexes solubles protéine N protéine P tronquée ainsi formés. La protéine P tronquée comprend préférentiellement un fragment C-terminal de la protéine P. Le domaine d'interaction de la protéine P des Paramyxoviridae avec la protéine N, éventuellement sous forme de complexe N-ARN, est en effet localisé du côté C-terminal de la protéine P. La protéine P tronquée peut être une protéine P chimère constituée par la fusion d'un fragment C-terminal de la protéine P avec au moins une autre séquence d'acides aminés contigus de la protéine P, comme défini plus haut. De préférence la protéine P tronquée est un fragment C-terminal de la protéine P. L'invention concerne alors un procédé de préparation d'un complexe soluble protéine N fragment C-terminal de la protéine P ("complexe N-PAN") d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) coexprimer une protéine N d'un virus de la famille des Paramyxoviridae avec un fragment C-terminal de la protéine P du même virus de la famille des Paramyxoviridae, ledit fragment C-terminal de la protéine P ne contenant pas le domaine d'oligomérisation P et étant capable d'interagir avec la protéine N; b) recueillir les complexes solubles N-PAN ainsi formés. Ledit virus de la famille des Paramyxoviridae peut être un Paramyxovirinae ou un Pneumovirinae. En particulier, le virus peut être sélectionné dans le groupe constitué du virus des oreillons, du virus de la rougeole, du Metapneumovirus humain et du virus parainfluenza. De préférence, le virus est un Pneumovirus tel que le virus respiratoire syncytial (VRS), humain ou bovin. L'homme du métier connaît ou est à même de déterminer des protéines P tronquées, ou plus spécifiquement des fragments C-terminaux de la protéine P, qui sont capables d'interagir avec la protéine N. Par exemple, dans le cas du VRS, les inventeurs ont utilisé la stratégie de co- expression des protéines N et P chez E. col/ précédemment décrite (Castagné et al., 2004) pour cartographier le domaine d'interaction entre P et N. Pour cela, la protéine N a été coexprimée avec des mutants de délétion de P fusionnés avec la GST. Les inventeurs ont ainsi mis en évidence que le domaine d'interaction de P avec N est localisé au niveau de l'extrémité C-terminale de la protéine P (Figure 1). Les inventeurs ont plus particulièrement montré que des fragments C-terminaux de P, jusqu'à un oligopeptide constitué par les 9 acides aminés C-terminaux de la protéine P du VRS (acides aminés 233 à 241), sont capables d'interagir avec la protéine N. Il a d'autre part été décrit, par exemple, que le domaine d'interaction de la protéine P du virus de Sendai, avec la protéine N sous forme de complexe ARN-N ou RNP, appelé X-domain ou XD, est défini par les acides aminés 473 à 568 (Kolakofsky et al. 2004). Pour les autres Paramyxoviridae, le cas échéant, l'homme du métier est à même d'identifier sur la protéine P le domaine d'interaction avec la protéine N sous forme de nucléocapside en utilisant la stratégie décrite par les inventeurs. Les inventeurs ont également mis en évidence que certains fragments Cterminaux de la protéine P du VRS, notamment le fragment PL161 N (acides aminés 161 à 241), permettaient de préparer de grandes quantités de protéine N, comparativement à la protéine P entière qui, en pratique, ne permet pas d'obtenir des rendements suffisants à une échelle industrielle. Les mutants de délétion plus petits, jusqu'à PL233N (acides aminés 233 à 241) qui ne contient plus que 9 acides aminés, permettent d'obtenir des rendements comparables à ceux de P0161 N. Ces fragments plus petits que PL161 N correspondent à des fragments de la protéine du VRS capables d'interagir avec la protéine N et qui ne sont plus capables de s'oligomériser, donc ne contiennent plus le domaine d'oligomérisation P. Le domaine minimum d'oligomérisation P du VRS serait en effet défini par environ les acides aminés 120 à 150 de la protéine P. Cette même stratégie a permis aux inventeurs de montrer qu'un fragment C-terminal de la protéine P du virus de la rougeole, constitué par les résidus d'acides aminés 386-507 (PL386N), interagissait avec la protéine N de ce virus etpermettait sa purification. En revanche une délétion de la partie Nterminale de la protéine P, jusqu'à hauteur du résidu 456 (inclus; fragment PM457N), ne permet pas de purifier la protéine N. La structure de la région C-terminale de la protéine P interagissant avec la ribonucléocapside a été déterminée par Johansson et al. (2003). La région d'oligomérisation P a été déterminée par délétions et prédiction comme étant définie par les acides aminés 304-376. L'utilisation de fragments C-terminaux de la protéine P qui contiennent le domaine d'interaction avec la protéine N sous forme de RNP mais dans lesquels le domaine d'oligomérisation P a été délété permet donc à la fois l'interaction des fragments de P avec N et la formation de complexes solubles N-PAN, et la production de ces complexes avec un rendement élevé. Sans vouloir se lier à un mécanisme particulier, il est supposé que l'absence du domaine d'oligomérisation P évite des problèmes d'insolubilité des complexes N-APN liés à des interactions entre protéines P de ces complexes. Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de préparation de complexe N-PAN implique l'expression d'un fragment C-terminal de la protéine P du VRS qui comprend les 9 derniers acides aminés C-terminaux de la protéine P du VRS et qui ne comprend pas au moins les 119, de préférence, les 149, de préférence encore les 160 acides aminés N- terminaux de la protéine P du VRS. Plus spécifiquement, dans le procédé selon l'invention on peut coexprimer avec la protéine N du VRS: a) un fragment C-terminal de la protéine P du VRS qui comprend la séquence d'acides aminés 233 à 241 de la protéine P du VRS humain souche LONG telle que montrée dans SEQ ID No. 1, et qui s'étend en direction N- terminale jusqu'à un résidu d'acide aminé compris entre les positions 233 et 120, de préférence 150, de préférence encore 161, de la séquence de la protéine P du VRS telle que montrée dans SEQ ID No.1, ou b) un fragment C-terminal, homologue du fragment défini en a), d'une protéine P issue d'une autre souche du VRS humain ou d'une souche du 20 VRS bovin. Le fragment C-terminal de la protéine P du VRS peut par exemple être sélectionné dans le groupe constitué de PAl20N (acides aminés 120 à 241 de P), PA150N (acides aminés 150 à 241 de P), PA161 N (acides aminés 161 à 241 de P), PA180N (acides aminés 180 à 241 de P), PA200N (acides aminés 200 à 241 de P), PA220N (acides aminés 220 à 241 de P), PA230N (acides aminés 230 à 241 de P) et PA233N (acides aminés 233 à 241 de P). L'invention concerne également un procédé dans lequel on coexprime avec la protéine N du VRS une protéine P tronquée comprenant un fragment Cterminal de la protéine P du VRS tel que décrit ci-dessus, qui comprend les 9 derniers acides aminés C-terminaux de la protéine P du VRS et qui ne comprend pas au moins les 119, de préférence, les 149, de préférence encore les 160 acides aminés N-terminaux de la protéine P du VRS. Par exemple la protéine P tronquée comprenant un fragment C-terminal de la protéine P peut être constituée par la fusion des 122 derniers acides aminés N-terminaux avec les 80 derniers acides aminés C-terminaux de la protéine P du VRS; elle peut par exemple être constituée par l'enchaînement des acides aminés 1 à 121 et 161 à 241 de la protéine P du VRS humain souche LONG telle que montrée dans SEQ ID No.1. Selon un autre mode de réalisation, le Paramyxoviridae est le virus de la rougeole et le procédé de préparation de complexe N-PAN implique l'expression d'un fragment C-terminal de la protéine P du virus de la rougeole comprenant au plus, ou constitué de, les 122 acides aminés Cterminaux de la protéine P. En particulier, il peut s'agir d'un fragment C-terminal constitué par les acides 386 à 507 de la protéine P (PA386N) du virus de la rougeole souche Edmonston B, telle que montrée dans SEQ ID No.3, ou d'un fragment C-terminal, homologue à celui défini pour protéine P de la souche Edmonston, d'une protéine P issue d'une autre souche de virus de la rougeole. Pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention n'importe quelle technique conventionnelle de biologie moléculaire, microbiologie ou d'ADN recombinant peuvent être employées. De telles techniques sont à la portée de l'homme du métier et ont été décrites, notamment dans Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ("Sambrook et al., 1989") ; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and Il (D.N. Glover ed. 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984) ; Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)] ; Transcription and Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)] ; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)] ; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)] ; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) ; F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994). Exprimer ou expression signifient permettre ou faire en sorte que l'information contenue dans un gène ou une séquence d'ADN devienne manifeste, par exemple en produisant une protéine par activation des fonctions cellulaires impliquées dans la transcription et la traduction de la séquence génétique ou ADN correspondante. On parle de coexpression lorsque l'information contenue dans deux gènes ou séquences d'ADN est exprimée dans un même hôte cellulaire. Une séquence codante désigne une séquence nucléotidique qui, lorsqu'elle est exprimée, résulte en la production d'un ARN, d'un polypeptide, d'une protéine, etc. Une séquence codante d'une protéine contient généralement un codon d'initiation (ATG) et un codon stop. Une séquence codante est sous le contrôle de ou associée de manière fonctionnelle avec des séquences de contrôle transcriptionnelles et É 10 traductionelles lorsque une ARN polymérase transcrit la séquence codante en ARN, en particulier en ARNm, qui peut ensuite être épissé s'il contient des introns, et traduit en la protéine codée par la séquence codante. Les expressions vecteur , vecteur de clonage et vecteur d'expression désignent le véhicule par lequel une séquence d'ADN ou d'ARN (par exemple un gène hétérologue) peut être introduite dans une cellule hôte de manière à transformer la cellule hôte et à promouvoir l'expression de la séquence introduite. Des exemples de vecteurs incluent les plasmides, les phages, les virus. Les vecteurs les plus communs sont les plasmides qui sont des unités de réplication autonomes, en général d'origine bactérienne, et qui peuvent être sous forme d'ADN double brin. Les plasmides peuvent intégrer facilement une séquence d'ADN exogène qui peut alors être facilement introduite dans un hôte approprié. Un vecteur plasmide contient généralement une séquence d'ADN codante, une séquence d'ADN promotrice et présente un ou plusieurs sites de restriction permettant d'introduire un ADN exogène. Des exemples non limitatifs de plasmides incluent les plasmides pKK (Clonetech), pUC et pET (Novagen, Inc., Madison, WI), pRSET ou pREP (Invitrogen, San Diego, CA), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), ou pGEX-4T-3 (Pharmacia). Par cellule hôte ont entend n'importe quelle cellule ou organisme qui est sélectionné, modifié, cultivé ou manipulé, pour la production d'une substance par la cellule, par exemple l'expression par la cellule d'un gène, d'une séquence ADN ou ARN, d'une protéine ou d'une enzyme. Un système d'expression désigne une cellule hôte et un vecteur compatible utilisés dans des conditions appropriées pour produire une protéine codée par un ADN exogène porté par le vecteur et introduit dans la cellule hôte. Des systèmes d'expressions usuels incluent des cellules hôte E. col/ et des vecteurs plasmides, des cellules d'insecte et des vecteurs Baculovirus ou encore des cellules de mammifère et des vecteurs. Le système d'expression selon le procédé de l'invention est avantageusement un système d'expression bactérien, en particulier dans E. col/, avec par exemple comme vecteur pGEX-4T-3. Les systèmes bactériens sont en effet les systèmes d'expression qui permettent généralement d'obtenir les rendements de production les plus élevés. Avantageusement la protéine P tronquée, et en particulier le fragment Cterminal de la protéine P, est exprimé sous forme de fusion avec une protéine facilitant la purification des complexes N-protéine P tronquée, notamment une protéine utilisable en chromatographie d'affinité. Il peut s'agir d'une protéine étiquette telle que la gluthation-S-transférase (GST), auquel cas la protéine de fusion protéine P tronquée-GST peut être isolée par chromatographie sur un support solide couplé au glutathion. D'autres étiquettes ou Tag peuvent être utilisés comme le polyhistidine ou His-Tag . On obtient ainsi des complexes N-protéine P tronquée-protéine étiquette (GST ou autre protéine étiquette en fusion avec la protéine P tronquée, en particulier le fragment PAN), dans lesquels la protéine étiquette peut être éliminée par clivage enzymatique. Par exemple, la GST peut être éliminée par clivage à la thrombine, ou par tout autre enzyme appropriée lorsque la fusion comprend une protéine autre que la GST. Des exemples spécifiques de construction de vecteurs permettant de mettre en oeuvre le procédé selon l'invention sont décrits dans les exemples cidessous. Complexes solubles N-protéine F' tronquée Le procédé de préparation d'un complexe soluble protéine N protéine P tronquée, en particulier fragment C-terminal de la protéine P, tel que décrit ci-dessus permet aisément d'obtenir des complexes N-protéine P tronquée sous forme isolée ou purifiée. L'invention concerne donc également un complexe soluble protéine N protéine P tronquée d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, susceptible d'être obtenu par un procédé de préparation selon l'invention. De préférence, la protéine P tronquée comprend ou est un fragment Cterminal de la protéine P. L'invention concerne plus particulièrement un complexe soluble protéine N fragment C-terminal de la protéine P ("complexe N-PAN") d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, susceptible d'être obtenu par un procédé de préparation selon l'invention. Ledit virus de la famille des Paramyxoviridae peut être un Paramyxovirinae ou un Pneumovirinae. En particulier, le virus peut être sélectionné dans le groupe constitué du virus des oreillons, du virus de la rougeole, du Metapneumovirus humain (HMPV) et du virus parainfluenza. De préférence, le virus est un Pneumovirus tel que le virus respiratoire syncytial (VRS), par exemple humain ou bovin. Selon un mode de réalisation, le virus Paramyxoviridae est le virus respiratoire syncytial (VRS) et ledit fragment C-terminal de la protéine P comprend les 9 derniers acides aminés C-terminaux de la protéine P du VRS et ne comprend pas au moins les 119, de préférence, les 149, de préférence encore les 160 acides aminés N-terminaux de la protéine P du VRS. Plus spécifiquement ledit fragment C-terminal de la protéine P peut comprendre a) la séquence d'acides aminés 233 à 241 de la protéine P du VRS humain souche LONG telle que montrée dans SEQ ID No.1, et s'étendre en direction N-terminale jusqu'à un résidu d'acide aminé compris entre les positions 233 et 120, de préférence 150, de préférence encore 161, de la séquence de la protéine P du VRS telle que montrée dans SEQ ID No.1, ou b) un fragment C-terminal, homologue du fragment défini en a), d'une protéine P issue d'une autre souche du VRS humain ou d'une souche du VRS bovin. II peut s'agir en particulier d'un fragment C-terminal de la protéine P sélectionné dans le groupe constitué de PAl20N, PA150N, PA161 N, PA180N, PA200N, PA220N, PA230N et PA233N. L'invention concerne également un complexe soluble contenant une protéine P tronquée du VRS comprenant un fragment C-terminal de la protéine P du VRS tel que décrit ci-dessus, qui comprend les 9 derniers acides aminés Cterminaux de la protéine P du VRS et qui ne comprend pas au moins les 119, de préférence, les 149, de préférence encore les 160 acides aminés Nterminaux de la protéine P du VRS. Par exemple la protéine P tronquée du VRS comprenant un fragment Cterminal de la protéine P peut être constituée par la fusion des 122 derniers acides aminés N-terminaux avec les 80 derniers acides aminés Cterminaux de la protéine P du VRS; elle peut par exemple être constituée par l'enchaînement des acides aminés 1 à 121 et 161 à 241 de la protéine P du VRS humain souche LONG telle que montrée dans SEQ ID No.1. Selon un autre mode de réalisation, le virus Paramyxoviridae est le virus de la rougeole et ledit fragment de la protéine P est un fragment Cterminal de la protéine P qui comprend au plus, ou est constitué de, les 122 acides aminés C-terminaux de la protéine P. Plus spécifiquement, ledit fragment C-terminal de la protéine P du virus de la rougeole peut être constitué par les acides 386 à 514 de la protéine P (PA386N) du virus de la rougeole souche Edmonston B, telle que montrée dans SEQ ID No. 3, ou être un fragment C-terminal, homologue à celui défini pour protéine P de la souche Edmonston, d'une protéine P issue d'une autre souche de virus de la rougeole. Dans le complexe N-PAN, la protéine PAN peut éventuellement être présente sous forme de fusion avec une protéine étiquette, par exemple la GST, un tag histidine, ou tout autre protéine appropriée facilitant la purification des complexes N-PAN. L'analyse au microscope électronique des complexes produits pour le VRS a révélé qu'ils étaient composés d'anneaux contenant 10 molécules de protéine N, ces anneaux solubles contenant également un petit ARN d'environ bases, visible par électrophorèse en gel d'agarose (Figure 3). Dans ces complexes, on trouve une quantité similaire de protéines N et de protéines PLN-GST. L'ARN ne peut être dissocié de l'anneau de protéine N sans dénaturation de cette protéine. Ainsi, l'invention a trait également à un complexe isolé soluble protéine N - fragment C-terminal de la protéine P du virus respiratoire syncytial (VRS), comprenant 10 molécules de protéine N, chacune, ou la majorité d'entre elles, étant associées à un fragment C-terminal de la protéine P, dans lequel ledit fragment C-terminal de P comprend les 9 derniers acides aminés C-terminaux de la protéine P du VRS et ne comprend pas au moins les 160 acides aminés N-terminaux de la protéine P du VRS, comme défini ci-dessus. Ce complexe N-PAN du VRS comprend en outre un ARN d'environ 70 bases. Procédé de préparation de protéine N solubles A partir de ces complexes N protéine P tronquée, ou plus spécifiquement N-PAN, la protéine N soluble peut être aisément isolée sous forme d'anneaux, avec leur ARN, par exemple par chromatographie d'exclusion de taille (gel filtration). Cette séparation peut être mise en oeuvre, le cas échéant, après séparation, par clivage enzymatique, de la protéine P tronquée, et de la protéine étiquette à laquelle la protéine P tronquée est éventuellement fusionné. L'invention concerne donc en outre un procédé de préparation de protéines N solubles d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) préparer un complexe soluble protéine N protéine P tronquée par un procédé tel que défini plus haut; et b) séparer les protéines N solubles des complexes solubles N-protéine P tronquée. Préférentiellement, la protéine P tronquée comprend ou est un fragment Cterminal de la protéine P. L'invention concerne plus particulièrement un procédé de préparation de protéines N solubles d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) préparer un complexe soluble protéine N -fragment C-terminal de la protéine P ("complexe N-PAN") par un procédé tel que défini plus haut; et b) séparer les protéines N solubles des complexes solubles N-PON. Ledit virus de la famille des Paramyxoviridae peut être un Paramyxovirinae ou un Pneumovirinae. En particulier, le virus peut être sélectionné dans le groupe constitué du virus des oreillons, du virus de la rougeole, du Métapneumovirus humain et du virus parainfluenza. De préférence, le virus est un Pneumovirus tel que le virus respiratoire syncytial (VRS), par exemple humain ou bovin. Les protéines N solubles d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, susceptibles d'être obtenues par le procédé ci-dessus font également partie de l'invention. Dans le cas du VRS, la protéine N a une masse apparente de 450 kDa alors que le plus grand des fragments C-Éterminaux de la protéine P utilisable (PM61N) a une masse de 15 kDa. Les anneaux de protéine N peuvent donc être séparés des fragments C-terminaux de protéine P par exemple par chromatographie sur colonne Sephadex comme décrit dans l'exemple 3 cidessous (et Figure 2). Selon un mode de réalisation, l'invention propose donc des protéines N du VRS solubles, lesdites protéines N étant associées en anneaux ayant un diamètre d'environ 7 nm et contenant 10 sous-unités. Toutefois on ne peut exclure que certains anneaux soient partiels et contiennent moins de 10 sous-unités. Les anneaux contiennent en outre un ARN d'environ 70 bases. Compositions vaccinales La protéine N du VRS, et plus généralement des Paramyxoviridae, est un antigène intéressant pour la vaccination, mais, jusqu'à présent, personne n'avait réussi à la purifier sous forme soluble. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir facilement et en grandes quantités des protéines N structurées en anneaux, très pures et très homogènes. Afin d'évaluer les propriétés immunogènes de la protéine N en anneaux, les inventeurs ont immunisé des souris avec un complexe N-PAN de Paramyxoviridae selon l'invention. Pour une utilisation vaccinale, les protéines N et PAN peuvent éventuellement être séparées mais cette opération n'est pas nécessaire, la présence de PAN n'ayant pas d'effet négatif. Les inventeurs ont plus spécifiquement immunisé des souris avec le 5 complexe N-PA161 N du VRS et utilisé le polypeptide PM161 N du VRS comme témoin. Compte tenu de la spécificité de ce virus pour les voies respiratoires, deux voies d'immunisation ont été comparées: la voie sous-cutanée, qui est une voie classique de vaccination parentérale, et la voie nasale, qui permet d'induire une immunité locale au niveau de la muqueuse respiratoire et des tissus lymphoïdes associés. Comme il est difficile d'obtenir une réponse immunitaire contre une protéine recombinante soluble en l'absence d'adjuvant de vaccination, les inventeurs ont également utilisé la lymphotoxine détoxifiée de E. Coli, LT(R192G) (donnée par Dr. J.D. Clements, USA) dont les propriétés adjuvantes par voie mucosale ont été bien décrites (McNeal et al. 2002, Freytag et Clements 2005). Les paramètres de la réponse immunitaire qui ont été suivis sont (i) la production d'anticorps sériques et muqueux (par lavages bronchoalvéolaires) et (ii) la réponse cellulaire via la production d'IFN-y par des lymphocytes T mémoires isolés de la rate ou du poumon. En présence de l'adjuvant LT(R192G), la protéine N (complexe NPM161 N) induit une forte production d'anticorps sériques quelle que soit la voie d'administration (nasale ou sous-cutanée) (Figure 4A). Cette réponse est détectable après la première immunisation (J14) et est amplifiée après le rappel (J28). L'adjuvant permet aussi d'induire après rappel une production d'anticorps contre PM161 N. De façon tout à fait remarquable, l'administration du complexe NPM161 N sans adjuvant par voie nasale et sous-cutanée génère une forte production d'anticorps sériques dès la première imrunisation. Dans les mêmes conditions PM161 N n'induit pas de réponse. Un profil de réponse comparable est observé pour la production des anticorps muqueux, Ig totales (Figure 4B). 2885139 23 Par contre, seule la protéine N (complexe N-PA161 N) administrée par voie nasale en présence de LT(R192G) permet la production d'IgA au niveau de la muqueuse respiratoire (Figure 4B). La réponse cellulaire a été mesurée par la capacité de leucocytes de la rate ou du poumon à produire de l'IFN-y in vitro en présence de N-PA161 N ou PM161 seul. L'IFN-y est une cytokine produite par les lymphocytes T CD4 et CD8. Des lymphocytes T CD4 et CD8 mémoires peuvent être réactivés in vitro en présence de l'antigène dont ils sont spécifiques. L'IFN-y est produit par les lymphocytes Th1 et les lymphocytes T cytotoxiques, qui sont les effecteurs majeurs des défenses anti-virales. Les réponses les plus fortes sont obtenues après restimulation avec le complexe N-PM161 N (Figure 5). Comme pour les anticorps, l'administration de N-PA161 N par voie nasale ou cutanée stimule une immunité cellulaire périphérique (rate) spécifique de N. De façon remarquable, N administrée avec adjuvant par voie nasale génère une immunité cellulaire locale (poumon) (Figure 5). En conclusion, la protéine N structurée en anneau se révèle très immunogène, y compris pour stimuler une réponse locale (muqueuse respiratoire). L'invention propose donc une composition vaccinale comprenant des protéines N solubles d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, lesdites protéines N solubles étant dans un véhicule pharrnaceutiquement acceptable. Ces protéines N solubles sont en particulier susceptibles d'être obtenues par un procédé de séparation de protéines N solubles à partir des complexes solubles N - protéine P tronquée, en plus spécifiquement N-PLN, tel que décrit plus haut. Comme expliqué plus haut, les protéines N solubles peuvent être utilisées en vaccination sous forme de complexe avec la protéine P sans effet défavorable. En conséquence, une composition vaccinale selon l'invention peut comprendre un complexe soluble protéine N protéine P d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 2885139 24 Pour des questions de rendement de production de ces complexes, l'invention porte préférentiellement sur une composition vaccinale comprenant un complexe soluble protéine N protéine P tronquée d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ladite protéine P tronquée ne contient pas le domaine d'oligomérisation P et est capable d'interagir avec la protéine N. De préférence, la protéine P tronquée comprend ou est un fragment C-terminal de la protéine P. L'invention concerne ainsi plus particulièrement un complexe soluble protéine N fragment C-terminal de la protéine P d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit fragment Cterminal de la protéine F' ne contient pas le domaine d'oligomérisation P et est capable d'interagir avec la protéine N. Ledit virus de la famille des Paramyxoviridae peut être un Paramyxovirinae ou un Pneumovirinae. En particulier, le virus peut être sélectionné dans le groupe constitué du virus des oreillons, du virus de la rougeole et du virus parainfluenza. De préférence, les protéines N solubles d'un virus de la famille des Paramyxoviridae sont des protéines N solubles du virus respiratoire syncytial (VRS), par exemple humain ou bovin. Selon un mode de réalisation, le virus Paramyxoviridae est le virus respiratoire syncytial (VRS) et ledit fragment C-terminal de la protéine P est un fragment C-terminal (PAN) qui comprend les 9 derniers acides aminés C-terminaux de la protéine P du VRS et ne comprend pas au moins les 119, de préférence, les 149, de préférence encore les 160 acides aminés N-terminaux de la protéine P du VRS. Plus spécifiquement, dans ladite composition, le fragment C-terminal de la protéine P du VRS peut être: a) un fragment C-terminal qui comprend la séquence d'acides aminés 233 à 241 de la protéine P du VRS humain souche LONG telle que montrée dans SEQ ID No.1, et qui s'étend en direction Nterminale jusqu'à un résidu d'acide aminé compris entre les positions 233 et 120, de préférence 150, de préférence encore 161, de la séquence de la protéine P du VRS telle que montrée dans SEQ ID No.1, ou b) un fragment Cterminal, homologue du fragment défini en a), d'une protéine P issue d'une autre souche du VRS humain ou d'une souche du 5 VRS bovin. II peut s'agir en particulier d'un fragment C-terminal de la protéine P du VRS sélectionné dans le groupe constitué de Pà120N, PM150N, PM61N, Pi180N, PL200N, PA220N, P0230N et PL 233N. L'invention concerne également une composition dans laquelle la protéine P tronquée du VRS comprend un fragment C-terminal de la protéine P du VRS tel que décrit ci-dessus, qui comprend les 9 derniers acides aminés Cterminaux de la protéine P du VRS et qui ne comprend pas au moins les 119, de préférence, les 149, de préférence encore les 160 acides aminés Nterminaux de la protéine P du VRS. Par exemple la protéine P tronquée du VRS qui comprend un fragment Cterminal de la protéine P peut être constituée par la fusion des 122 derniers acides aminés N-terminaux avec les 80 derniers acides aminés Cterminaux de la protéine P du VRS; elle peut par exemple être constituée par l'enchaînement des acides aminés 1 à 121 et 161 à 241 de la protéine P du VRS humain souche LONG telle que montrée dans SEQ ID No.1. Selon un autre mode de réalisation, le virus Paramyxoviridae est le virus de la rougeole et ledit fragment de la protéine P est un fragment Cterminal de la protéine P qui comprend au plus, ou est constitué de, les 122 acides aminés C-terminaux de la protéine P. Plus spécifiquement, ledit fragment C-terminal de la protéine P du virus de la rougeole peut être constitué par les acides 386 à 514 de la protéine P (PL386N) du virus de la rougeole souche Edmonston B, telle que montrée dans SEQ ID No. 3, ou être un fragment C-terminal, homologue à celui défini pour protéine P de la souche Edmonston, d'une protéine P issue d'une autre souche de virus de la rougeole. Par véhicule pharmaceutiquement acceptable , on entend tout solvant, milieu de dispersion, agents retardant l'absorption etc, qui ne produisent pas de réaction secondaire, par exemple allergique, chez l'humain ou l'animal. Avantageusement, la composition vaccinale selon l'invention peut en outre comprendre un adjuvant. Un adjuvant désigne un produit qui augmente, stimule, active, renforce, ou module la réaction immunitaire au niveau cellulaire ou humoral dirigée contre un antigène administré simultanément. Des exemples d'adjuvants classiques incluent des adjuvants contenant des antigènes bactériens, tels que l'adjuvant complet de Freund, le LPS et ses dérivés, les toxines bactériennes (choléra toxine et entérotoxine) et leurs mutants détoxifiés (par exemple LT(R192G)), des séquences oligonucléotidiques contenant des motifs CpG, des adjuvants minéraux tels que l'hydroxyde d'aluminium (Alum), le phosphate de calcium ou le phosphate de potassium, des émulsions huileuses et agents émulsifiants (saponines, par exemple QS21), des cytokines. Les compositions vaccinales selon l'invention permettent de conférer une protection vis-à-vis d'une infection par un virus de la famille des Paramyxoviridae, c'est-à-dire une réduction de la gravité des effets d'une telle infection par rapport à un sujet non immunisé avec la composition vaccinale. L'invention concerne également l'utilisation d'une composition vaccinaletelle que définie plus haut dans une méthode de vaccination. L'invention porte donc sur une méthode de vaccination comprenant au moins une administration d'une composition vaccinale selon l'invention à un sujet. De préférence, la méthode de vaccination comprend une première administration à un sujet d'une composition vaccinale, et une administration de rappel de ladite composition vaccinale au même sujet. Les administrations de rappel, en réexposant le patient à l'antigène, induisent une réponse immunitaire secondaire plus forte. L'expression sujet désigne un humain ou un animal non-humain, par exemple un oiseau ou une mammifère tel qu'un bovin, un rongeur, un chien, un chat, un porc, un singe, exposé ou susceptible d'être exposé à une infection par un virus Paramyxoviridae. Préférentiellement un sujet au sens de l'invention est un humain ou un bovin. La composition vaccinale est avantageusement administrée en une quantité efficace pour induire une réponse immune protectrice ou thérapeutique visà-vis d'une infection par un virus de la famille des Paramyxoviridae. La posologie dépend naturellement de l'actif considéré, du mode d'administration, de l'âge du sujet et de son état. La quantité de complexe N-P, N-APN, ou de protéine N par dose peut être comprise entre 0, 1 et 200 pg, et préférablement comprise entre 10 et 100 pg par dose vaccinale. La composition vaccinale peut être administrée par n'importe quelle voie, en particulier par voie mucosale (par exemple oculaire, intranasale, orale), ou par voie parentérale (par exemple sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, intraveineuse, ou intrapéritonéale). Les exemples et figures suivantes illustrent l'invention sans en limiter sa portée. FIGURES La Figure 1 montre la cartographie du domaine d'interaction P-N sur P. La protéine P a été fusionnée à la GST et co-exprimée chez E. coli avec la protéine N exprimée sur un autre plasmide. La Figure 2 montre le profil d'élution des complexes N-PM161 N en chromatographie d'exclusion de taille. (A) Profil d'élution à 220 nm en colonne TSK. (B) Analyse par électrophorèse en gel d'acrylamide des différentes fractions après coloration au bleu de Coomassie. Les fractions 17 à 22 ne contiennent que des anneaux ARN-N. La Figure 3 montre la structure des anneaux de protéine N du VRS. (A) Analyse au microscope électronique des anneaux N-ARN purifiés par P161241. (B) Reconstruction par cryomicroscopie. (C) Analyse de l'ARN présent dans les anneaux en gel d'agarose. La Figure 4 décrit les résultats de l'analyse de l'immunogénicité de la protéine N structurée en anneau par mesure de la production d'anticorps dirigés contre le complexe N-PA161 N. Des souris BALB/c ont été immunisées par voie intra-nasale (i.n.) ou sous-cutanée (s.c.) avec 20 pg de complexe N-P161AN ou PL161 N en présence ou non de l'adjuvant muqueux LT(R192G). Un rappel est réalisé après deux semaines (J14). Les animaux sont euthanasiés deux semaines après le rappel (J28). Pour la mesure des anticorps sériques, le sérum est collecté à J0, J14 et J28 (A). Pour la mesure des anticorps muqueux, les lavages broncho-alvéolaires sont réalisés à J28 (B). Le taux d'anticorps contre N-P161LN est mesuré par ELISA. Les données sont exprimées comme la moyenne erreur standard à la moyenne (n = 5) et représentées avec une échelle logarithmique. La Fiqure 5 décrit les résultats de l'analyse de l'immunogénicité de la protéine N structurée en anneau par mesure de la réponse cellulaire spécifique de PM161 N et N-PL161 N. Des souris BALB/c ont été immunisées par voie intra-nasale (i.n.) ou sous-cutanée (s.c.) avec 20 pg de complexe N-PM161 N ou de PA161 N en présence ou non de l'adjuvant muqueux LT(R192G). Un rappel est réalisé après deux semaines (J14). Les animaux sont euthanasiés deux semaines après le rappel (J28) pour prélever rates et poumons. Les cellules de la rate et du poumon sont mises en culture pendant 72h en présence de NPM161 N, PA161 N ou sans restimulation. La sécrétion d'IFN-y est mesurée par ELISA. Sans restimulation, le niveau basal d'IFN-y est inférieur à 15 pg/ml. Les données sont exprimées comme la moyenne erreur standard à la moyenne (n = 5). EXEMPLES Exemple 1: Construction des plasmides contenant la région C-terminale de la phosphoprotéine du VRS. La protéine P du VRS souche Long est composée de 241 résidus d'acides aminés. Séquences des amorces oligonucléotidiques (de 5' vers 3') utilisées pour amplifier la partie C-terminale de la protéine P du VRS (les sites de restriction BamHl sont soulignés; le codon start ATG du gène P est figuré en caractères gras) : LONG-PBam+ : GAGGGATCCATCATGGAAAAGTTTGCTCCTG (SEQ ID No.11) LONG-P- : CTGTTGGTGTTGTGTGTTGAAGTGCAG (SEQ ID No.12) P161 B+ : GAGGGATCCTCTGCTAGGGATGGTATAAGAG (SEQ ID No.13) P180B+ : GAGGGATCCAAAATCAGAACTGAAGCATTAATGACC (SEQ ID No.14) P201 B+ : GAGGGATCCGAGGAAAGTGAAAAGATGGCAAAAG (SEQ ID No.15) P221B+ : GAGGGATCCGAGAAATTGAACAACCTGTTGG (SEQ ID 10 No.16) P230NB+ : GATCCAATGATAGTGACAATGATCTATCACTTGAAGATTTCTGA (SEQ ID No.17) P230N- : TCAGAAATCTTCAAGTGATAGATCATTGTCACTATCATTG (SEQ ID No.18) L'ADNc du gène P du VRS souche Long a été amplifié par RT-PCR à partir de cellules Hep-2 infectées par la souche Long du VRS humain en utilisant les amorces LONGPBam+ et LONG-P- (Castagné et al., 2004). Le produit de PCR a été digéré par l'enzyme de restriction BamHl et cloné dans le plasmide pGEX-4T-3 (Pharmacia) aux sites BamHI-Smal en phase avec le gène codant pour la Glutathion-S-Transferase ou GST. Le plasmide s'appelle pGEX-P. É Clonaqe de P161-241 (PA161 N) La région C-terminale de P (acides aminés 161-241) a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pGEX-P dans les conditions suivantes: Amorces de PCR: P161 B+ et LONG-P- 100 ng chaque (1 pl chaque) ADN matrice pGEX-P: 10 ng (1 pl) Enzyme: Pfu Turbo marque Stratagene (unités par pl) : 1 pl dATP: 0.2 mM final dGTP: 0.2 mM final dCTP: 0.2 mM final dTTP: 0.2 mM final Tampon Pfu 1X final (Stratagene) Volume final: 100 pI La PCR a été réalisée dans les conditions suivantes: cycles: 15 secondes à 94 C, 2 minutes à 40 C, 1 minute à 72 C; 25 cycles: 15 secondes à 94 C, 1 minutes à 55 C, 1 minute à 72 C L'ADN amplifié a été extrait par un volume (100 pl) de phénol/chloroforme (1vol/1 vol), puis par un volume de chloroforme, enfin précipité par ajout d'un dixième de volume de NaCl 5M (10 pI) et deux volumes d'éthanol à 100% (200 pI). L'ADN a été centrifugé 20 minutes à 13000 g, lavé avec un volume d'éthanol à 70%, séché, resuspendu dans un volume d'eau de 90 pl. Après ajout de 10 pI de tampon 10X pour l'enzyme BamHl, l'ADN a été digéré 2 heures à 37 C en présence de 10 unités d'enzyme BamHl. L'ADN digéré a été déposé sur un gel d'agarose à 1,5 % dans du tampon Tris-Borate-EDTA (TBE) 1X en présence de bromure d'éthidium et mis à migrer par électrophorèse. La bande correspondant à l'ADN de P161-241 a été découpée et l'ADN extrait par électroélution. Il a été à nouveau extrait avec un volume de phénol-chloroforme, un volume de chloroforme et précipité à l'éthanol. Il a été ligué avec le vecteur pGEX-4T-3 digéré par BamHl et Smal après purification en gel d'agarose à 1% : ADN pGEX4T-3: 100ng ADN P161-241: 100 ng Tampon ligase 1X final Ligase (5U/pl) : 1 pI Volume final 20 pl L'ensemble a été incubé une nuit à 14 C. Le lendemain des bactéries DH5alpha TM (Life Technologies) compétentes ont été transformées avec 10 pI de produit de ligation et étalées sur boîte de Pétri contenant du milieu L-agar supplémenté avec 100 pg/ml d'ampicilline final. Les colonies de bactéries recombinantes ont été criblées par mini préparation de plasmide et digestion par les enzymes de restriction BamHl et Xhol. Les plasmides recombinants montrent alors deux bandes en gel d'agarose, une correspondant au vecteur (4,9 kb) et la seconde correspondant à la partie C-terminale de P (246 pb). Les plasmides recombinants ont été entièrement séquencés. É Clonaqe de P180-241, P201-241, P221-241 Les fragments de P correspondants aux parties d'acides aminés 10 180-241, 200-241, 220-241 ont été obtenus par PCR à partir du plasmide pGEX-P en utilisant les amorces suivantes: P180-241: amorces P180B+ et LONG-P P200-241: amorces P201 B+ et LONG-F'- P220-241: amorces P221 B+ et LONG-P- Ils ont été amplifiés et clonés de la même façon que P161-241 (voir au-dessus). É Clonaqe du qène codant pour la protéine de nucléocapside du VRS souche Long. Le gène codant pour la protéine N du VRS humain souche Long a été obtenu par RT-PCR à partir de cellules Hep-2 infectées par du virus. Les amorces utilsées étaient: LONG-Nbam+ : GAGGGATCCATGGCTCTTAGCAAAGTCAAGTTG (SEQ ID No.19) LONG-N- TTAACTCAAAGCTCTACATCATTATCTTTTGG (SEQ ID No.20) Les produits de PCR ont été digérés par BamHl et clonés dans le plasmide pGEX4T-3 aux sites BamHI-Smal. La région codant pour N (SEQ ID No.) a été sous-clonée par digestion du plasmide pGEX-N par BamHI-Xhol et sousclonée dans le plasmide pET28a+ (Novagen; SEQ ID No. et voir Figure). É Clonage de P231-241 Les amorces suivantes ont été dénaturées par chauffage à 94 C, pendant 5 minutes, refroidies à température ambiante: P231 NB+ GATCCGATAGTGACAATGATCTATCACTTGAAGATTTCTGA (SEQ ID No.21) P231NTCAGAAATCTTCAAGTGATAGATCATTGTCACTATCG (SEQ ID No.22) Après hybridation, 10 ng d'oligonucléoticles double brin ont été ligués avec 100 ng d'ADN de plasmide pGEX-4T-3 digéré par les enzymes BamHl et Smal et purifié par électrophorèse en gel d'agarose. Les plasmides recombinants ont été vérifiés par séquençage au niveau du gène N. Exemple 2: Expression et purification des complexes Les bactéries BL21 (DE3) (Novagen) compétentes ont été transformées avec 1 pg d'ADN pGEX-P et 1 pg d'ADN pET-N puis étalées sur boîte de Pétri contenant du milieu L-agar supplémenté avec 100 pg/ml final d'ampicilline et 50 pg/ml final de Kanamycine. Une colonie a été repiquée et mise à pousser une nuit à 37 C dans 2 ml de milieu LB contenant Ampicilline et Kanamycine à 100 pg/ml et 50 pg/ml respectivement. Le lendemain matin 1 ml de culture saturée a servi à ensemencer 1 litre de milieu LB additionné des antibiotiques et mis à pousser jusqu'au soir. Le soir, un volume de milieu frais LB contenat de l'IPTG (qui induit l'expression des protéines) à une concentration de 160 pg/ml est ajouté à la culture et le tout est mis à pousser sur la nuit à 28 C. Le lendemain, les bactéries sont centrifugées 15 minutes à 5000 rpm et le culot est repris dans 100 ml du tampon suivant: mM Tris pH 7,8 mM NaCl 2mMDTT 1 mM EDTA 4 mM Benzamidine Antiprotéases 1X (Complete EDTAfree protease inhibitor cocktail, ref. Roche n 11 873 580 001) soit une tablette pour 50 ml de tampon de lyse 0,1% Triton-X100 10 ml du même tampon additionné de Lysozyme à 10mg/ml (lmg/ml final) sont ajoutés. Les bactéries sont incubées 1 heure dans la glace (lyse). Quand le tout devient visqueux, l'ensemble est soniqué 3 fois 1 minute en utilisant une sonde plongeant dans le mélange, dans la glace en laissant reposer 5 minutes entre chaque sonication. L'ensemble est centrifugé 30 minutes à 10 000 g à 4 C puis le surnageant est récupéré. Le surnageant est recentrifugé 30 minutes à 10 000 g à 4 C puis le nouveau surnageant est récupéré. 4 ml de billes de sepharose 4B-glutathion (Amersham-Pharmacia) sont lavés en prélevant 8 ml de mélange billes tampon (vol/vol) avec le tampon de lyse. Les billes sont laissées dans un volume équivalent de tampon, ajoutées au lysat bactérien clarifié, et mises à tourner à 4 C sur la nuit. Le lendemain les billes sont centrifugées à 2000 rprn pendant 3 minutes, puis le surnageant est éliminé, et les billes lavées trois fois avec le tampon de lyse dépourvu d'antiprotéases, trois fois en tampon PBS 1X. Les billes son clivées au site thrombine en utilisant de la Thrombin biotinylée (Novagen) à raison d'1 pI (1U) de thrombin (Thrombin Cleavage Capture Kit, N 69022-3FRZ) pour 1 ml de billes. Les billes sont incubées sur la nuit à 20 C et, le lendemain, centrifugées 3 minutes à 2000 rpm, laissées à décanter 15 minutes pour récupérer le surnageant. Un volume équivalent de PBS 1X est ajouté sur les billes; le mélange est agité, laissé décanter. Le surnageant est à nouveau récupéré et rajouté au surnageant prélevé précédemment. Au surnageant récupéré sont ajoutées des billes d'agarose Streptavidine (Novagen ref. 69203) à raison de 16 pI de résine (soit 32 pl de mélange résine/tampon (vol/vol). Le mélange est laissé en agitation pendant une heure, puis centrifugé 3 minutes à 2000 rpm et le surnageant est récupéré. On obtient une concentration en protéines de 2 mg/ml. pI du surnageant contenant les produits de clivage sont dénaturés en tampon de Laemmli 1X, mis à bouillir et déposés sur un gel de polyacrylamide à 12% en tampon Tris-Glycine SDS 0,1%, puis colorés au bleu de Coomassie après électrophorèse pour visualiser les protéines. Exemple 3: Séparation de N et PA161 N (P161-241) et 5 purification des anneaux de N Les protéines présentes dans le surnageant peuvent être séparées par chromatographie d'exclusion de taille (gel filtration, Figure 2) en PBS 1X. La protéine N est exclue à une taille apparente de 450 000 Da et PA161 N avec une masse de 15 kDa. Une observation au microscope électronique de la fraction N issue de la chromatographie d'exclusion de taille montre que la protéine N se présente sous forme d'anneaux (Figure 3A) ayant un diamètre de 7 nm et contenant 10 sous-unités de N (Figure 3B). Les anneaux contiennent un ARN d'environ 70 pb (Figure 3C) Exemple 4: Evaluation des propriétés immunogéniques de la protéine N recombinante structurée en anneau É Une vaccination par voie nasale ou sous-cutanée est effectuée chez des souris, en présence ou non d'adjuvant: Souris: 30 souris BALB/c femelles de 10- 12 semaines, élevées à l'Unité Expérimentale Animalerie Rongeur (INRA, Jouy-en-Josas). Antigènes: P161-241 et complexe {P161-241 + N} solubles à une concentration de 1 mg/ml après séparation de la GST par clivage à la thrombine et élimination de la thrombine biotinylée par des billes couplées à la 25 streptavidine. Adjuvant: LT(R192G) lymphotoxine de E. Coli, 1 mg/ml (Choi et al., 2004). Prélèvements - à J0, J14 et J28, prise de sang dans le sinus rétroorbital 30 - à J28: É Lavage broncho-alvéolaire (LBA) avec 1,5 ml de milieu HBSS et EDTA 1 mM. É Dissection de la rate et du poumon en milieu RPMI plus antibiotiques (Penicillin 100 Ul/ml et Streptomycin 100 pg/ml, PS), sur la glace. Plan expérimental: traitements JO J14 Groupes primo- rappel J28 (5 souris) injection autopsie 1 Infra-nasale P161-241 P161-241 pg de protéines P161241 P161-241 2 10 pg de LT(R192G) LT(R192G) 3 LT(R192G), P161-241 + N P161-241 + N sous un volume de P161-241 + N P161-241 + N Sérum pl LT(R192G) LT(R192G) LBA Sous-cutanée P161-241 + N P161-241 + N Rate pg de protéines Poumon 10 pg de P161-241 + N P161-241 + N LT(R192G) , LT(R192G) LT(R192G) 6 sous un volume de pl É Production d'anticorps antiN Les sérums sont collectés à partir des prélèvements de sang (1 nuit d'exsudation à 4 C) puis congelés à -20 C. Les LBA sont centrifugés 5 min à 1700 rpm, les surnageant sont collectés (environ 1 ml) et congelés à -20 C. Les anticorps anti-N (Ig totales, IgG1, IgG2a et IgA) sont recherchés dans les sérums et les LBA par E.L.I.S.A: des plaques de 96 puits (Immulon 2HB, ThermoLabsystems) sont sensibilisées une nuit à 4 C avec le complexe P161-241+N (200 ng par puit) en tampon bicarbonate 0,1 M pH 9,5. Les plaques sont lavées 5 fois avec 200 pl par puit de PBS 0,05 % tween 20 (utilisation d'un automate Wellwash, Labsystems). Les plaques sont ensuite saturées pendant 1 h à 37 C avec 150 pI par puit de tampon PBS 0, 05 % tween 20 et 5 % sérum de veau foetal (PBS-T-SVF). Après 5 lavages, les échantillons à titrer sont dilués en PBS-T-SVF (sept dilutions successives de raison 3 en partant d'une première dilution au 30ème pour les sérums et au tiers pour les LBA). Les plaques sont incubées pendant 2 h à 37 C. Après 5 lavages, l'anticorps secondaire dilué en PBS-T-SVF est distribué à raison de 100 pI par puit. Les anticorps secondaires utilisés sont conjugués à la péroxydase et dirigés contre les immunoglobulines de souris: IgG totales (4000ème, P.A.R.I.S.), IgG1 (2000ème, BD biosciences), IgG2a (2000ème, BD biosciences) ou IgA (1000ème, Caltag). Les plaques sont incubées pendant 2 h à 37 C et lavées 5 fois. Les plaques sont ensuite incubées avec le substrat de la péroxydase (TMB, 100 pI par puit) pendant 10 min à l'obscurité. La réaction enzymatique est arrêtée par l'ajout de 50 pl de H3PO4 2M. Les densités optiques (DO) sont lues à 450 nm (lecteur Dynex). La courbe D0450=f(dilution) est modélisée par la courbe de régression y=(b+cx)/(1+ ax). Le titre en anticorps est déterminé comme la valeur de dilution donnant deux fois la DO450 d'un échantillon témoin (JO) à sa plus grande dilution. É Production d'IFN-v par des lymphocytes T spécifiques de P161-20 241 et N Les rates et les poumons prélevés sont traités selon le même protocole. Les rates sont traitées individuellement et les poumons sont groupés par lot expérimental (5 poumons par lot). Les tissus sont émincés puis broyés délicatement sur filtre (tamis cellulaire 100 pm, BD Falcon) en milieu RPMI et PS. La suspension cellulaire est centrifugée à 1700 rpm pendant 10 min à 4 C. Les cellules sont remises en suspension dans 1 ml de tampon de lyse des érythrocytes (tampon salin hypotonique) et incubées pendant 5 min à température ambiante. La réaction de lyse est arrêtée par ajout de 10 ml de RPMI complet (PS, 2 mM L-glutamine et 10 % SVF). Les débris membranaires sont décantés et les cellules sont lavées trois fois par centrifugation (1700 rpm pendant 10 min à 4 C). Les suspensions cellulaires sont dénombrées à l'aide d'une cellule de Malassez. Les cellules sont mises en culture dans des microplaques de 96 puits traitées pour la culture cellulaire (Falcon) à raison de 200000 cellules par puit dans 200 pI de milieu RPMI complet. Quatre conditions de culture sont testées en triplicat sur chaque suspension cellulaire: - PMA (Phorbol 12-myristate 13-acétate, Sigma) 10 ng/ml et ionomycine (Sigma) 1 pg/ml (témoin positif, activation polyclonale) - RPMI complet (témoin négatif) - P161-241 10 pg/ml - P161241+N 10 pg/ml Après 72h de culture à 37 C avec 5% CO2, les surnageants de culture sont collectés et congelés à -20 C jusqu'à titration de l'IFN- y par ELISA. ELISA IFN-y: des plaques de 96 puits (Immulon 2HB, ThermoLabsystems) sont sensibilisées une nuit à 4 C avec l'anticorps de capture anti-IFN-y de souris (BD Bioscience) à 4 pg/ml en tampon Bicarbonate 0,1 M pH 9,5 (100 pl/puit). Les plaques sont lavées 5 fois avec 200 pl par puit de PBS 0, 05% tween 20 (utilisation d'un automate Wellwash, Labsystems). Les plaques sont ensuite saturées pendant 2 h à 37 C avec 150 pI par puit de tampon PBS 0,05 % tween 20 et 2 % d'albumine sérique bovine (PBS-T-BSA). Après 5 lavages, la référence IFN-y de souris recombinant (R&D systems) et les échantillons à titrer sont dilués en PBS-T-BSA par dilutions successives au demi. La gamme IFN-y est diluée de 3312,5 pg/ml à 3,235 pg/ml. Quatre dilutions successives au demi sont réalisées sur les échantillons purs. La plaque est alors incubée pendant une nuit à 4 C. Après 5 lavages, l'anticorps de détection biotinylé (BD Biosciences) est distribué (1 pg/ml en PBS-T-BSA, 100 pl/puit) et incubé 3 h à 4 C. Après 5 lavages, le conjugué Streptavidine-Péroxydase (Pierce) est distribué (1 pg/ml en PBS-T-BSA, 100 pl/puit) et incubé 1 h à 4 C. Après 5 lavages, le substrat de la péroxydase (ABTS+H2O2) est distribué dans les puits. Après 45 minutes d'incubation, les densités optiques sont lues à 405 nm (Lecteur ELISA Dynex). Le calcul de la concentration en IFN-y dans les échantillons se fait par rapport à la gamme d ' I FN-y. RÉFÉRENCES Ames, T. R. 1993. The epidemiology of BRSV infection. Vet. Med. 881-884. Bhella, D., Ralph, A., Murphy L. B., & Yeo, R. P. 2002. Significant differences in nucleocapsid morphology within the Paramyxoviridae. Journal of General Virology; 83, 1831- 1839. Castagné, N., A. Barbier, J. Bernard, H. Rezaei, J.-C. Huet, C. Henry, B. Da Costa, and J.-F. Eléouêt. 2004. Biochemical characterization of the Respiratory Syncytial Virus P-P and P-N protein complexes and localization of the P protein oligomerization domain. Journal of General Virology; 85: 1643-1653. Choi et al., 2004, Protein Expression and Purification; 38, pp205 Elvander, M. 1996. Severe respiratory disease in dairy cows caused by infection with bovine respiratory syncytial virus. Vet. Rec. ; 138, 101105. Freytag, LC et Clements, JD. 2005. Mucosal adjuvants. Vaccine. ; 23(15):1804-13. Gaddum, R. M., R. S. Cook, J. M. Furze, S. A. Ellis & G. Taylor. 2003. Recognition of bovine respiratory syncytial virus proteins by bovine CD8a 20 T lymphocytes. Immunology; 108, 220 229; Goulder PJ, Lechner F, Klenerman P, McIntosh K, Walker BD. 2000. Characterization of a novel respiratory syncytial virus-specific human cytotoxic T-lymphocyte epitope. J Virol.; 74(16):7694-7. Johansson et al., 2003; Journal of Biological Chemistry vol. 278 p 25 44567-44573. Khattar SK, Yunus AS, Samal SK. 2001a. Mapping the domains on the phosphoprotein of bovine respiratory syncytial virus required for N-P and P-L interactions using a minigenome system. J Gen Virol.; 82(Pt 4):775-9. Khattar SK, Yunus AS, Collins PL, San-ial SK.. 2001 b. Deletion and substitution analysis defines regions and residues within the phosphoprotein of bovine respiratory syncytial virus that affect transcription, RNA replication, and interaction with the nucleoprotein. Virology. ; 285(2):253-69. Kolakofsky D, Le Mercier P, Iseni F, Garcin D. 2004. Viral DNA polymerase scanning and the gymnastics of Sendai virus RNA synthesis. Virology. ; 318(2):463-73. Review. Maggon K, Barik S. 2004. New drugs and treatment for respiratory syncytial virus. Rev Med Virol. 14(3):149-68. Review. Mallipeddi SK, Lupiani B, Samal SK. 1996. Mapping the domains on the phosphoprotein of bovine respiratory syncytial virus required for N-P interaction using a two-hybrid system. J Gen Virol. ; 77 ( Pt 5):1019-23. Martinez X, Li X, Kovarik J, Klein M, Lambert PH, Siegrist CA. 1999. Combining DNA and protein vaccines for early life immunization against respiratory syncytial virus in mice. Eur J Immunol. ; 29(10):3390-400. Mavrakis M, Iseni F, Mazza C, Schoehn G, Ebel C, Gentzel M, Franz T, Ruigrok RW. 2003. Isolation and characterisation of the rabies virus N P complex produced in insect cells. Virology.; 305(2):406-14. McNeal MM, VanCott JL, Choi AH, Basu M, Flint JA, Stone SC, Clements JD, Ward RL. 2002. CD4 T cells are the only lymphocytes needed to protect mice against rotavirus shedding after intranasal immunization with a chimeric VP6 protein and the adjuvant LT(R192G). J Virol. ; 76(2) :560-8. Meric C, Spehner D, Mazarin V. 1994. Respiratory syncytial virus nucleocapsid protein (N) expressed in insect cells forms nucleocapsidlike structures.Virus Res. 31(2):187-201. Perrin, B., Dannacher, G., et Solsona, M. 1979. Mise en évidence des anticorps contre le virus respiratoire syncytial chez les bovins français. Rec. Med. Vet. 155, 465-471. Samal SK, Pastey MK, McPhillips TH, Mohanty SB. 1993. Bovine respiratory syncytial virus nucleocapsid protein expressed in insect cells specifically interacts with the phosphoprotein and the M2 protein. Virology. ; 193(1):470-3. Slack MS, Easton AJ. 1998. Characterization of the interaction of the human respiratory syncytial virus phosphoprotein and nucleocapsid protein using the two-hybrid system. Virus Res.; 55(2):167-76. Sparer TE, Matthews S, Hussell T, Rae AJ, Garcia-Barreno B, Melero JA, Openshaw PJ. 1998. Eliminating a region of respiratory syncytial virus attachment protein allows induction of protective immunity without vaccine-enhanced lung eosinophilia. J Exp Med; 187 (11): 1921-6. Tarbouriech, N., Curran, J., Ruigrok, R. W., & Burmeister, W. P. (2000). Tetrameric coiled coil domain of Sendai virus phosphoprotein. Nature Structural Biology 7, 777-781. Taylor G, Bruce C, Barbet AF, Wyld SG, Thomas LH. 2005. DNA vaccination against respiratory syncytial virus in young calves. Vaccine; 23(10):124250 Taylor, G. L. H. Thomas, J. M. Furze, R. S. Cook, S. G. Wyld, R. Lerch, R. Hardy and G.W. Wertz. 1997. Recombinant vaccinia viruses expressing the F, G or N, but not the M2, protein of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) induce resistance to BRSV challenge in the calf and protect against the development of pneumonic lesions. Journal of General Virology; 78, 3195-3206. Thompson W.W., D.K. Shay, E. Weintraub, L. Brammer, N. Cox, L.J. Anderson, K. Fukuda. 2003. Mortality associated with influenza and respiratory syncytial virus in the United States. JAMA. ; 289(2):179-86. Wellemans, G., and J. Leunen. 1975. Le virus respiratoire syncytial et les troubles respiratoires des bovins. Ann. Med. \/et. ; 119, 359-369. 41 2885139 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un complexe soluble protéine N protéine P tronquée d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) coexprimer une protéine N d'un virus de la famille des Paramyxoviridae avec une protéine P tronquée du même virus de la famille des Paramyxoviridae, ladite protéine P tronquée ne contenant pas le domaine d'oligomérisation P et étant capable d'interagir avec la protéine N; b) recueillir les complexes solubles protéine N protéine P tronquée ainsi formés. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite protéine P tronquée est un fragment C-terminal de la protéine P. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le virus de la famille des Paramyxoviridae est un Paramyxovirinae ou un Pneumovirinae. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le virus Paramyxoviridae est le virus respiratoire syncytial (VRS) humain ou bovin. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel ladite protéine P tronquée est un fragment C-terminal de la protéine P qui comprend les 9 derniers acides aminés C-terminaux de la protéine P du VRS et qui ne comprend pas au moins les 160 acides aminés N-terminaux de la protéine P du VRS. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel on coexprime: a) un fragment C-terminal de la protéine P du VRS qui comprend la séquence d'acides aminés 233 à 241 de la protéine P du VRS humain souche LONG telle que montrée dans SEQ ID No.1, et qui s'étend en direction N- terminale jusqu'à un résidu d'acide aminé compris entre les positions 233 et 161 de la séquence de la protéine P du VRS telle que montrée dans SEQ ID No.1, ou 42 2885139 b) un fragment C-terminal, homologue du fragment défini en a), d'une protéine P issue d'une autre souche du VRS humain ou d'une souche du VRS bovin. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le virus Paramyxoviridae est sélectionné dans le groupe constitué du Metapneumovius humain, du virus des oreillons, du virus de la rougeole et du virus parainfluenza. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le virus Paramyxoviridae est le virus de la rougeole et ladite protéine P est un fragment Cterminal de la protéine P qui comprend au plus les 122 acides aminés Cterminaux de la protéine P. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel on exprime un fragment C-terminal de la protéine P constitué par les acides 386 à 507 de la protéine P du virus de la rougeole souche Edmonston B, telle montrée dans SEQ ID No.3, ou un fragment C-terminal, homologue à celui défini pour protéine P de la souche Edmonston, d'une protéine P issue d'une autre souche de virus de la rougeole. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel ladite protéine P tronquée est exprimé sous forme de protéine de fusion avec une protéine étiquette. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel ladite protéine N et ladite protéine P tronquée sont coexprimées dans un système d'expression bactérien. 12. Complexe isolé soluble protéine N protéine P tronquée d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13. Complexe isolé soluble selon la revendication 12, dans lequel la protéine P tronquée est un fragment C-terminal de la protéine P. 43 2885139 14. Complexe isolé soluble selon la revendication 13, dans lequel le virus Paramyxoviridae est le virus respiratoire syncytial (VRS) humain ou bovin et ledit fragment C-terminal de la protéine P comprend les 9 derniers acides aminés C-terminaux de la protéine P du VRS et ne comprend pas au moins les 160 acides aminés N-terminaux de la protéine P du VRS. 15. Complexe isolé soluble selon la revendication 14, dans lequel ledit fragment C-terminal de la protéine P est a) un fragment C-terminal qui comprend la séquence d'acides aminés 233 à 241 de la protéine P du VRS humain souche LONG telle que montrée dans SEQ ID No.1, et qui s'étend en direction N-terminale jusqu'à un résidu d'acide aminé compris entre les positions 233 et 161 de la séquence de la protéine P du VRS telle que montrée dans SEQ ID No.1, ou b) un fragment C-terminal, homologue du fragment défini en a), d'une protéine P issue d'une autre souche du VRS humain ou d'une souche du VRS bovin. 16. Complexe isolé soluble selon la revendication 13, dans lequel le virus Paramyxoviridae est le virus de la rougeole et ledit fragment C- terminal de la protéine P comprend au plus les 122 acides aminés C- terminaux de la protéine P. 17. Complexe isolé soluble N-PiN selon la revendication 16, dans lequel ledit fragment C-terminal de la protéine P du virus de la rougeole est constitué par les acides 386 à .'.1-4 507 de la protéine P du virus de la rougeole souche Edmonston B, telle montrée dans SEQ ID No.3, ou est un fragment C-terminal, homologue à celui défini pour protéine P de la souche Edmonston, d'une protéine P issue d'une autre souche de virus de la rougeole. 18. Complexe isolé soluble protéine N - fragment C-terminal de la protéine P du virus respiratoire syncytial (VRS), comprenant 10 molécules de protéine N, et dans lequel ledit fragment C-terminal de P comprend les 9 derniers acides aminés C-terminaux de la protéine P du VRS et ne comprend pas au moins les 160 acides aminés N-terminaux de la protéine P du VRS. 44 2885139 19. Procédé de préparation de protéines N solubles d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) préparer un complexe soluble protéine N protéine P tronquée par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11; et b) séparer les protéines N solubles des complexes solubles protéine N protéine P tronquée. 20. Procédé de préparation de protéines N solubles selon la revendication 19, dans lequel ladite protéine P tronquée est un fragment C-terminal de la protéine P. 21. Protéines N solubles d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, susceptibles d'être obtenues par un procédé selon la revendication 19 ou 20. 22. Composition vaccinale comprenant des protéines N solubles d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 23. Composition vaccinale selon la revendication 22, dans laquelle les protéines N solubles d'un virus de la famille des Paramyxoviridae sont susceptibles d'être obtenues par un procédé selon la revendication 19 ou 20. 24. Composition vaccinale selon la revendication 22 ou 23, dans laquelle le virus de la famille des Paramyxoviridae est le virus respiratoire syncytial (VRS) humain ou bovin. 25. Composition vaccinale comprenant un complexe soluble protéine N protéine P tronquée d'un virus de la famille des Paramyxoviridae, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ladite protéine P tronquée ne contient pas le domaine d'oligomérisation P et est capable d'interagir avec la protéine N. 26. Composition vaccinale selon la revendication 25, dans laquelle ladite protéine P tronquée est un fragment C-terminal de la protéine P. 2885139 27. Composition vaccinale selon la revendication 25 ou 26, dans laquelle le virus de la famille des Paramyxoviridae est un Paramyxovirinae ou un Pneumovirinae. 28. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, dans laquelle le virus de la famille des Paramyxoviridae est le virus respiratoire syncytial (VRS) humain ou bovin. 29. Composition vaccinale selon la revendication 28, dans laquelle ladite protéine P tronquée est un fragment C-terminal de la protéine P qui comprend les 9 derniers acides aminés C-terminaux de la protéine P du VRS et qui ne comprend pas au moins les 160 acides aminés N-terminaux de la protéine P du VRS. 30. Composition vaccinale selon la revendication 29, comprenant a) un fragment C-terminal de la protéine P qui comprend la séquence d'acides aminés 233 à 241 de la protéine P du VRS humain souche LONG telle que montrée dans SEQ ID No.1, et qui s'étend en direction N-terminale jusqu'à un résidu d'acide aminé compris entre les positions 233 et 161 de la séquence de la protéine P du VRS telle que montrée dans SEQ ID No.1, ou b) un fragment C-terminal, homologue du fragment défini en a), d'une protéine P issue d'une autre souche du VRS humain ou d'une souche du VRS bovin. 31. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, dans laquelle le virus de la famille des Paramyxoviridae est sélectionné dans le groupe constitué du Metapneumovius humain, du virus des oreillons, du virus de la rougeole et du virus parainfluenza. 32. Composition vaccinale selon la revendication 31, dans laquelle le virus de la famille des Paramyxoviridae est le virus de la rougeole et ladite protéine P tronquée est un fragment C-terminal de la protéine P qui comprend au plus les 122 acides aminés C-terminaux de la protéine P du virus de la rougeole. 33. Composition vaccinale selon la revendication 32, dans laquelle ledit fragment C-terminal de la protéine P du virus de la rougeole est constitué par les acides 46 2885139 386 à Ç de la protéine P du virus de la rougeole souche Edmonston B, telle que montrée dans SEQ ID No.3, ou est un fragment C-terminal, homologue à celui défini pour protéine P de la souche Edmonston, d'une protéine P issue d'une autre souche de virus de la rougeole.