FR 2884257 A1 20061013 FR 0503616 A 20050412 La présente invention concerne une méthode de diagnostic in vitro d'une sensibilité accrue au 5-fluorouracile, ladite méthode comprenant la réalisation sur un ou plusieurs prélèvements, dont au moins un prélèvement sanguin, de la combinaison d'au moins deux tests in vitro. Elle concerne également une méthode de diagnostic in vitro de la prédisposition d'un sujet au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5-fluorouracile et/ou ses prodrogues. Elle concerne en outre des kits permettant la mise en uvre desdites méthodes. Les cancers colorectaux, tumeurs solides, représentent avec les cancers du sein et du poumon l'une des premières causes de mortalité par cancers. En effet, ils sont la cause de 16 000 décès par an en France. En outre, chaque année, environ un million de nouveaux cas de cancer colorectal sont diagnostiqués dans le monde (environ 150000 aux Etats-Unis et 36000 en France), dont la moitié des patients présenteront une forme métastatique. Ceci pose donc un véritable problème de santé publique dans les pays occidentaux. L'un des agents anti-cancéreux les plus utilisés depuis plusieurs années dans le cadre du traitement de ces pathologies est le 5-fluorouracile (5FU). Ce médicament entre dans la composition de plus de 50% des protocoles de chimiothérapie et est utilisé dans les cancers métastatiques mais aussi en situation adjuvante, c'est à dire chez des patients potentiellement guéris. Le 5-FU, un antimétabolite de la famille des fluoropyrimidines, est un analogue des bases pyrimidiques. Son mécanisme de cytotoxicité implique sa conversion en nucléotides actifs (voie anabolique), qui vont bloquer la synthèse d'acide désoxyribonucléique (ADN). Cependant, il existe un équilibre entre l'activation enzymatique du 5-FU et son élimination (voie catabolique). L'enzyme initiale et limitante du catabolisme de cet anticancéreux est la Dihydropyrimidine Deshydrogénase (DPD). Cette enzyme ubiquitaire est un facteur majeur de la biodisponibilité du 5-FU puisque plus de 80 % de l'agent anti-cancéreux administrés sont catabolisés par cette dernière en 5 dihydrofluorouracile. Seuls 20% du 5-FU administré est donc normalement disponible pour la voie anabolique nécessaire à son action cytotoxique. Cependant, l'activité de cette enzyme est soumise à un polymorphisme génétique, et à ce jour, il a été découvert plus de 30 mutations sur le gène codant pour la DPD (situé sur le chromosome lp22), dont certaines entraînent un déficit enzymatique. Or, il a été montré qu'un déficit partiel ou total en DPD engendre chez des patients traités par du 5-FU des toxicités souvent sévères, voire mortelles. La plupart des épisodes de toxicité dus au 5-FU surviennent principalement au niveau des tissus à renouvellement rapides, comme la moelle osseuse (toxicité hématologique: neutropénie, thrombopénie, anémie), les muqueuses de l'appareil digestif (nausées et vomissements, mucites, ulcérations de la muqueuse oropharyngée, diarrhées sévères) et les cellules de la peau (alopécies, dermatites, érythrodermie palmo-plantaire ou syndrome mains -pieds ) (Diasio R.B., et al. 1988. J. Clin. Invest. 81, 47-51). Une toxicité oculaire ou neurologique peut également apparaître. Les différentes toxicités sont échelonnées selon différents grades numérotés de 0 à IV définis par l'OMS. Les toxicités graves au 5-FU ne sont pas rares. Une étude récente portant sur l'analyse rétrospective de 1219 patients atteints de cancers colorectaux traités par du 5-FU montre que 31 à 34 de ces patients ont présenté une toxicité de grade III à IV, et 0, 5 % une toxicité mortelle (Van Kuilenburg et al. 2004. European Journal of Cancer 40, 939-950). Il serait donc très utile de disposer d'une méthode permettant de diagnostiquer à partir d'un échantillon biologique d'un patient si celuici possède un déficit partiel ou total en DPD engendrant chez ce patient une sensibilité accrue au 5-FU et donc une prédisposition au développement d'une toxicité suite à un traitement comprenant du 5-FU. Une telle méthode permettrait alors d'adapter la dose de 5-FU à administrer à chaque patient. Différents paramètres ont été décrits comme des indicateurs de l'activité enzymatique de la DPD. En particulier, la concentration en uracile plasmatique a été rapportée comme pouvant être élevée dans les déficits en DPD. Cependant, aucune véritable corrélation n'a été rapportée, et aucune valeur seuil permettant de déterminer la présence ou l'absence d'un risque de toxicité n'a été déterminée à ce jour. De même, le rapport des concentrations plasmatiques en dihydrouracile et en uracile (rapport UH2/U) a été corrélé avec la clairance plasmatique du 5-FU, qui est ellemême corrélée avec le risque de développer une toxicité. Cependant, aucune valeur seuil n'a encore été rapportée. Enfin, certaines mutations dans le gène codant pour la DPD ont été décrites chez des patients traités au 5-FU et ayant présenté des toxicités importantes. Jusqu'à présent, 39 mutations dont certaines ont été corrélées à un déficit en DPD, ont été répertoriées dans la phase codante et au niveau du promoteur de ce gène (Van Kuilenburg et al. 2004. European Journal of Cancer 40, 939--950). Il s'agit principalement de substitutions et de délétions. Cependant, aucune étude de grande envergure n'a réellement permis de déterminer parmi toutes ces mutations décrites quelles sont celles réellement corrélées avec une sensibilité accrue au 5-FU, et d'estimer quelle est leur fréquence dans la population. Les inventeurs ont réalisé pour la première fois une étude de grande envergure afin de déterminer la pertinence des différents paramètres décrits ci-dessus (concentration plasmatique en uracile, rapport UH2/U, polymorphisme génétique) vis-à-vis d'un diagnostic d'une sensibilité accrue au 5-FU. Leurs résultats montrent de façon surprenante que, bien qu'aucun de ces paramètres ne permette seul d'établir un diagnostic suffisamment sensible et spécifique, la combinaison d'au moins deux de ces paramètres, pour lesquels des valeurs seuils ont été déterminées, permet en revanche un diagnostic à la fois sensible et spécifique de la présence ou de l'absence d'une sensibilité accrue au 5-FU, et donc d'une prédisposition au développement de toxicités suite à un traitement comprenant du 5-FU. La présente invention a donc pour objet une méthode de diagnostic in vitro d'une sensibilité accrue au 5- fluorouracile, ladite méthode comprenant la réalisation sur un ou plusieurs échantillons biologiques, dont au moins un prélèvement sanguin, de la combinaison d'au moins deux tests in vitro choisis dans le groupe constitué de: - la détermination de la présence ou de l'absence d'une 5 mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, - la mesure de la concentration en uracile plasmatique, et - la mesure du rapport des concentrations plasmatiques 10 dihydrouracile/uracile. Par "sensibilité accrue" d'un sujet au 5-fluorouracile, on entend toute augmentation par rapport à un sujet contrôle de la proportion de 5-FU métabolisée par la voie anabolique. Chez un "sujet contrôle", 20% du 5-FU administré sont métabolisés par la voie anabolique. De manière avantageuse, chez un sujet présentant une sensibilité accrue au 5-FU, au moins 40%, au moins 60%, au moins 80%, au moins 90%, ou au moins 95% du 5FU administré sont métabolisés par la voie anabolique. Par "échantillon biologique", on entend tout échantillon prélevé sur un sujet, par exemple un prélèvement sanguin, un prélèvement d'organe (biopsie par exemple), un prélèvement de moelle osseuse, etc. Pour la mesure de la concentration en uracile plasmatique ou du rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/ uracile, l'échantillon est de préférence un prélèvement sanguin ou un échantillon de plasma. Pour la détermination de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, l'échantillon biologique peut être tout type d'échantillon biologique provenant dudit sujet contenant des cellules nucléées, par exemple un prélèvement sanguin, un prélèvement d'organe (par exemple des cellules isolées à partir d'un ganglion potentiellement métastasé retiré au patient). De préférence, l'échantillon biologique est un prélèvement sanguin. Une "mutation" dans un gène signifie ici toute modification dans la séquence nucléique dudit gène. Une telle modification peut notamment être choisie dans le groupe comprenant les substitutions, aussi bien les transversions que les transitions, les délétions et les insertions. L'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro de la prédisposition d'un sujet au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5-fluorouracile, ladite méthode comprenant la réalisation sur un ou plusieurs échantillons biologiques, dont au moins un prélèvement sanguin, de la combinaison d'au moins 2 tests in vitro choisis dans le groupe constitué de: - la détermination de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, la mesure de la concentration en uracile plasmatique, et la mesure du rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile. Par "prédisposition", on entend la tendance générale d'un sujet à être, plus particulièrement que d'autres, affecté par tel ou tel syndrome. Dans le cadre de l'invention, un sujet prédisposé aura une probabilité plus forte de développer une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5-fluorouracile. Un sujet non prédisposé possède une probabilité de l'ordre de 6% de développer une toxicité précoce aiguë sévère dès la première administration de 5-fluorouracile. De préférence, la probabilité de développer une toxicité d'un individu prédisposé est au moins 5 fois, de préférence au moins 10 fois, voire au moins 15 fois supérieure à celle d'un individu non prédisposé. La probabilité de développer une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5-fluorouracile d'un patient prédisposé est donc de manière avantageuse d'au moins 30 au moins 60%, voire au moins 90%. Par "développement d'une toxicité", on entend la survenue de troubles physiologiques indésirables, gênants et/ou dangereux, induits par l'administration d'un traitement comprenant du 5-fluorouracile. La toxicité peut notamment consister en une toxicité hématologique (neutropénie, thrombopénie, anémie), digestive (nausées et vomissements, mucites, ulcérations de la muqueuse oropharyngée, diarrhées sévères), cutanéo- muqueuse (alopécies et des dermatites, érythrodermie palmoplantaire ou syndrome mains - pieds ), oculaire ou neurologique. Selon leur sévérité et leur durée, les toxicités dues au 5-fluorouracile peuvent être hiérarchisées selon quatre grades définis par l'OMS. Dans un mode de réalisation avantageux, une des méthodes décrites cidessus comprend la combinaison de la détermination de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase et de la mesure de la concentration en uracile plasmatique. De manière encore plus avantageuse, ladite méthode comprend la combinaison de la détermination de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, de la mesure de la concentration en uracile plasmatique, et de la mesure du rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile. L'invention concerne également une méthode d'évaluation in vitro à partir d'un ou plusieurs échantillons biologiques, dont au moins un prélèvement sanguin, de la dose de 5-fluorouracile adaptée à un patient atteint d'une maladie qui peut être traitée avec du 5-fluorouracile, de préférence un cancer, ladite méthode comprenant les étapes suivantes: (a) la collecte des résultats de la détermination de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, de la mesure de la concentration en uracile plasmatique, et éventuellement de la mesure du rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile; et (b) la détermination de la dose de 5fluorouracile adaptée au patient en fonction des résultats obtenus à l'étape (a). Ladite méthode d'évaluation in vitro à partir d'un ou plusieurs échantillons biologiques, dont au moins un prélèvement sanguin, de la dose de 5-fluorouracile adaptée à un patient atteint d'une maladie qui peut être traitée avec du 5-fluorouracile peut en outre comprendre les étapes suivantes: (c) la mesure à partir d'au moins un prélèvement sanguin de la concentration plasmatique en 5- fluorouracile en fin d'injection et au cours des heures et/ou jours suivant l'injection de 5- fluorouracile, et (d) la détermination de la dose suivante de 5- fluorouracile adaptée au patient en fonction du résultat de l'étape (c). Une dose de 5-fluorouracile "adaptée à un patient" est définie comme une dose de 5-fluorouracile suffisamment forte pour obtenir l'effet thérapeutique désiré, par exemple une cytotoxicité vis-à-vis de cellules tumorales, et suffisamment faible pour ne pas provoquer le développement d'une toxicité de grade supérieur ou égal à III. De préférence, une dose adaptée ne provoque pas de toxicité de grade supérieur ou égal à II. Le diagnostic in vitro d'une sensibilité accrue au 5-fluorouracile, de la prédisposition d'un sujet au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5-fluorouracile, et/ou la détermination de la dose de 5-fluorouracile adaptée au patient sont réalisés par comparaison des résultats des au moins 2 tests in vitro réalisés avec une liste de mutations significatives du gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase et des valeurs de référence ou valeurs seuils pour la concentration en uracile plasmatique et pour le rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile. Une mutation significative dans le gène codant pour la DPD est définie comme une mutation dont la présence génère une modification de l'activité enzymatique de la DPD, de préférence une diminution de son activité enzymatique. De préférence, une "mutation significative" dans le gène codant pour la DPD entraîne une diminution d'au moins 50%, au moins 60%, au moins 75%, au moins 80% ou au moins 90% de l'activité enzymatique de la DPD. De manière avantageuse, la liste des mutations significatives du gène codant pour la DPD comprend les mutations I560S, IVS14+1G>A, D949V, L155Stop, R21Stop, Del TCAT295, Del T812, Del TG1039, E386Stop, et Del C1897. De manière également avantageuse, une valeur seuil pour la concentration en uracile plasmatique est 15 g/L, et des valeurs seuils pour le rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile sont 1; 3; et/ou 6. Dans un mode de réalisation avantageux, le diagnostic in vitro d'une sensibilité accrue au 5-fluorouracile, de la prédisposition d'un sujet au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5fluorouracile, et/ou la détermination de la dose de 5-fluorouracile adaptée au patient est réalisé grâce à un algorithme de décision prenant en compte les résultats obtenus pour les au moins 2 tests in vitro réalisés. Un "algorithme de décision" est défini comme un ensemble d'instructions permettant, à partir d'un jeu de données connues, et uniquement par le suivi automatique de ces instructions, de déterminer la conduite à tenir pour ledit jeu de données particulier. Un tel algorithme peut se présenter soit sous la forme d'une liste d'instructions dépendantes et/ou indépendantes aboutissant à une décision recommandée en fonction du jeu de données, soit sous la forme d'un programme informatique qui, à partir de l'entrée du jeu de données, retourne la décision fournie par l'algorithme. De préférence, l'algorithme de décision comprend les étapes suivantes (voir Figure 1) : (a) En cas d'absence de mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase parmi celles recherchées et si la concentration en uracile plasmatique est inférieure à 15 pg/L, ou d'absence de mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase parmi celles recherchées et si la concentration en uracile plasmatique est supérieure à 15 pg/l mais que le rapport UH2/U est supérieur ou égal à 6, le sujet ne possède pas de sensibilité accrue au 5fluorouracile, n'est pas prédisposé au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5-fluorouracile, et le traitement peut avoir lieu aux doses standard de 5-fluorouracile, (b) Dans tous les autres cas, c'est-à-dire, en cas: - d'absence de mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase parmi celles recherchées, si la concentration en uracile plasmatique est supérieure ou égale à 15 pg/L, et UH2/U inférieur à 6, - de présence de mutation significative hétérozygote ou homozygote dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, sans augmentation de la concentration en uracile plasmatique, - de présence de mutation significative hétérozygote ou homozygote dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, et d'augmentation de la concentration en uracile plasmatique, le sujet possède une sensibilité accrue au 5-fluorouracile, est prédisposé au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5fluorouracile, et le rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile est calculé pour confirmer le déficit et déterminer la dose de 5-FU à administrer. Si celui ci est: (i) supérieur à 6: la dose initiale de 5-fluorouracile est diminuée de 30% par rapport à la dose standard. (ii) compris entre 3 et 6: la dose initiale de 5-fluorouracile est réduite de 50% par rapport à la dose standard et une mesure de la concentration plasmatique en 5-fluorouracile au cours des jours/heures suivant l'injection d'une dose de 5-fluorouracile est réalisée. (iii) compris entre 1 et 3: la dose initiale de 5-fluorouracile est réduite de 70% par rapport à la dose standard et une mesure de la concentration plasmatique en 5-fluorouracile au cours des jours/heures suivant l'injection d'une dose de 5- fluorouracile est réalisée (iv) inférieur à 1: le traitement par le 5-fluorouracile est déconseillé, même à doses réduites. Si le traitement doit malgré tout être mis en uvre, la dose initiale est réduite de 80% et une mesure de la concentration plasmatique en 5-fluorouracile au cours des jours/heures suivant l'injection d'une dose de 5-fluorouracile est indispensable. De plus, en cas de mutation significative homozygote du gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, 10 15 30 d'une concentration en uracile plasmatique supérieure à 100 pg/L, et/ou d'un rapport dihydrouracile/uracile inférieur à 1, des précautions particulières de surveillance sont mises en place, même à doses réduites. Une dose standard de 5-fluorouracile est définie comme étant la dose recommandée dans le protocole en fonction de la localisation, une telle dose recommandée étant connue de l'homme du métier. Dans les cancers colorectaux, différents protocoles sont couramment utilisés: -protocole LV5FU2 standard: IV bolus de 5-FU à 400mg/m2, puis une perfusion de 22 heures de 5-FU à 600 mg/m2 à J1 puis J2 tous les 15 jours. - protocole LV5FU2 simplifié : IV bolus de 5-FU à 400 mg/m2 à J1, puis une perfusion continue de 46 heures de 5-FU à 2400 mg/m2 tous les 15 jours. - protocole 5-FU hebdomadaire: 5-FU à 1200, 1800, ou 2600 mg/m2 en perfusion de 4 heures, 8 heures ou 24 20 heures respectivement. Dans les cancers ORL, oesophagien ou en cas d'association avec une radiochimiothérapie, un protocole couramment utilisé est: 5-FU à une dose de 800 à 1000 mg/m2 en perfusion continue de 24 heures pendant 4 à 5 jours toutes les 3 semaines. Dans les cancers du sein, un protocole courant est: IV bolus de 5-FU à 500 mg/m2 toutes les 3 semaines. Un traitement est dit déconseillé lorsque la toxicité qu'il peut induire met en jeu le pronostic vital du patient avec une probabilité supérieure à 90%. Dans un mode de réalisation avantageux des méthodes de diagnostic et/ou d'évaluation de dose adaptée in vitro selon l'invention, la mutation dans le gène de la Dihydropyrimidine Déshydrogénase est choisie dans le groupe comprenant: - I560S, - IVS14+1G>A, - D949V, - Ll55Stop, - R21Stop, Del TCAT295, - Del T812, - Del TG1039, - E386Stop, et - Del C1897. Les caractéristiques précises de ces mutations sont 15 décrites dans le Tableau 1 qui suit. Tableau 1. Caractéristiques des mutations 1560S, IVS14+1G>A, D949V, Ll55Stop, R2lStop, Del TCAT295, Del T812, Del TG1039, E386Stop, et Del C1897. Mutation Position Conséquence au niveau Conséquence au niveau de la dans le du gène protéine gène R2lStop exon 2 Substitution d'une Protéine tronquée avant les (=C61T) cytosine par une thymine en position 61 principaux sites de liaison aux co-enzymes et au substrat, pas d'activité Del exon 4 Délétion de 4 bases en Codon stop prématuré, pas TCAT295 position 295 d'activité Ll55Stop exon Substitution d'une Codon stop en position 155, thymine par une adénine en position 464 (=T464A) protéine tronquée, inactive Del T812 exon 8 Délétion d'une thymine Codon stop prématuré, pas en position 812 d'activité Del TG1039 exon 10 Délétion de 4 bases en Codon stop prématuré, pas position 1039 d'activité E386Stop exon 11, Substitution d'une Codon stop prématuré, pas codon 386, guanine par une thymine d'activité en position 1156 (=G1156T) 15605 exon 13, Substitution d'une Faux sens, site FAD' thymine par une guanine interférence avec la (=T1679G) fixation du cofacteur, pas d'activité en position 1679 Del C1897 exon 14 Délétion d'une cytosine Mutation nonsens, codon stop avant le site de fixation du substrat en position 1897 Substitution d'une délétion complète de l'exon IVS14+1G>Aintron 14 guanine par une adénine 14 dors de l'épissage (perte de la zone de en début d'intron fixation du substrat) D949V exon 22 Substitution d'une Mutation faux sens, adénine par une thymine interférence directe avec la fixation du cofacteur ou le transport d'électrons, (=A2846T) en position 2846 fonction [4Fe-4S] altérée Dans un mode de réalisation avantageux des méthodes de diagnostic et/ou d'évaluation de dose adaptée in vitro selon l'invention, le protocole de détermination à partir des cellules d'un échantillon provenant du sujet de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase comporte les étapes suivantes: - l'extraction de l'ADN génomique, ou l'extraction de l'ARN total et sa rétrotranscription en ADN complémentaire, - l'amplification en parallèle ou en multiplex d'un ou plusieurs fragments du gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, et - la détermination de la taille du produit d'amplification, où la taille du produit d'amplification indique la présence ou l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase. Dans un autre mode de réalisation avantageux des méthodes de diagnostic et/ou d'évaluation de dose adaptée in vitro selon l'invention, le protocole de détermination à partir des cellules d'un échantillon provenant du sujet de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase comporte les étapes suivantes: - l'extraction de l'ADN génomique, - l'amplification en parallèle ou en multiplex d'un ou plusieurs fragments du gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, et - le séquençage des fragments amplifiés permettant l'identification de la présence ou de l'absence d'une variation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase. Dans un autre mode de réalisation encore plus avantageux des méthodes selon l'invention, le protocole de détermination de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase est une combinaison des deux protocoles précédemment décrits. L'extraction à partir des cellules d'un échantillon du sujet de l'ADN génomique ou de l'ARN total peuvent être réalisées par toutes techniques connues de l'homme du métier, ou par l'utilisation de tout kit d'extraction d'ADN génomique ou d'ARN total disponible dans le commerce. L'ARN peut être rétrotranscrit en ADN complémentaire (ADNc) par toute technique connue de l'homme du métier. De même, l'amplification des fragments d'intérêt peut être réalisée par tout technique décrite dans la littérature scientifique, notamment, l'amplification sera réalisée par PCR. Quand plusieurs fragments sont amplifiés simultanément, l'amplification peut être réalisée soit "en parallèle", c'est-à-dire que les différents fragments sont amplifiés simultanément mais dans des réactions distinctes, soit en multiplex , c'est-à-dire que les différents fragments sont amplifiés simultanément dans une même réaction. La détermination de la taille des produits amplifiés peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par électrophorèse en présence de marqueurs de taille, la révélation des produits de PCR étant réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment l'utilisation d'un agent intercalant de l'ADN. Le séquençage des fragments amplifiés peut aussi être réalisé par toute technique connue de l'homme du métier. De manière avantageuse, la technique de séquençage utilisée est le pyroséquençage (ou miniséquençage luminométrique). Le pyroséquençage est une méthode de séquençage par détection de l'incorporation des nucléotides sur une matrice spécifique. Elle est basée sur un système de cascade enzymatique utilisant quatre enzymes (ADN polymérase, ATP sulfurylase, luciférase et apyrase) et deux substrats spécifiques (APS, lucifér.ine). Le principe de cette technique ainsi que différentes améliorations du protocole de base ont été publiées (Ronaghi M, et al. 1996. Anal Biochem 242: 84-89; Ronaghi M. 2001. Genome Research, 3-11.) et les différentes étapes de cette technique sont détaillées sur la Figure 2: après amplification et dénaturation du fragment d'intérêt, un des deux brins est hybridé à une amorce de séquence et mis en présence du milieu réactionnel comprenant les quatre enzymes et les substrats. Pour l'analyse de chaque nucléotide, quatre étapes sont nécessaires pour obtenir une succession de pics appelée un pyrogrammeTM. La lecture de ce pyrogramme permet ensuite de déterminer la séquence nucléotidique obtenue et d'identifier le génotype. Une amélioration du protocole consiste à employer dans les dNTP du déoxyadénosine alpha-thio triphosphate (dATPaS) à la place du dATP naturel car il peut être utilisé par l'ADN polymérase, mais n'est pas reconnu par la luciférase. Ainsi, même si la dégradation par l'apyrase est incomplète, seul le signal provenant de l'ATP généré à l'étape 2 (Figure 2) est quantifié par l'ATP sulfurylase. Cette technique permet non seulement la détection de mutations telles que substitutions, délétions et insertions, mais également le séquençage de courts fragments (maximum 70 nucléotides). Elle cumule les avantages d'être rapide, reproductible, peu onéreuse et facilement adaptable à tout type de mutation. L'intérêt du pyroséquençage réside également dans sa compatibilité avec une utilisation en routine. 500pL de sang total sont suffisants pour extraire l'ADN leucocytaire servant au génotypage. Après amplification par PCR et une étape de dénaturation et de lavage desfragments d'intérêt, l'analyse d'une plaque contenant 96 échantillons est effectuée en 20 min. D'autres modifications peuvent être apportées au protocole pour améliorer la sensibilité et la fiabilité de cette technique. Dans un mode de réalisation avantageux, au moins une des amorces de séquences utilisées pour le pyroséquençage contient un ou plusieurs nucléotides modifiés en ce qu'ils contiennent un pont méthylène 2'O-4'C les maintenant dans une conformation bicyclique rigide. La présence d'un tel nucléotide induit la base ADN adjacente à adopter la même conformation, ce qui aboutit à une structure thermodynamiquement plus stable (Singh SK, et al. 1998. J. Org. Chem. 63: 6078-6079; Nielsen KE, et al. 2000. Bioconjug. Chem. 11: 228-238). Une amorce de pyroséquençage peut comporter 100% de nucléotides modifiés ou alors un mélange de nucléotides modifiés et non modifiés. De manière avantageuse, les amorces utilisées pour l'amplification par PCR sont choisies dans le groupe constitué de SEQ ID NO: 3, 4, 9, 10, 15 à 20, 23 à 28, 31, 32, 37 et 38. De même, les amorces utilisées pour le pyroséquençage des fragments d'intérêt sont de préférence choisies dans le groupe constitué de SEQ ID NO: 40, 43, 47, 49, 50, 53 à 55, 57 et 60. Dans l'ensemble des méthodes décrites précédemment, la mesure de la concentration en uracile et/ou en dihydrouracile plasmatique peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier. De manière avantageuse, la mesure de la concentration en uracile et/ou en dihydrouracile plasmatique est réalisée par chromatographie liquide haute performance avec détection UV, en utilisant une colonne possédant une phase stationnaire composée de particules de carbone sphériques totalement poreuses de type HypercarbTM fournie par Thermo Electron (Courtaboeuf, France). Chacune des méthodes selon l'invention telle que décrite précédemment est de manière avantageuse mise en oeuvre sur un ou plusieurs échantillons biologiques, dont au moins un prélèvement sanguin, d'un patient atteint d'une maladie qui peut être traitée avec du 5-fluorouracile. Les maladies qui peuvent être traitées avec du 5-fluorouracile comprennent notamment les cancers, plus particulièrement le cancer du sein, les cancers ORL, le cancer de l'ovaire, de la prostate, du pancréas, de l'estomac, du rein, du colon, du rectum, les tumeurs carcinoïdes, les kératoses solaires malignes, la maladie de Bowen, le condylome acumine, et le cholangiocarcinome. La présente invention concerne également un kit de diagnostic in vitro d'une sensibilité accrue au 5-fluorouracile ou d'une prédisposition d'un sujet au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5-fluorouracile, ledit kit comprenant au moins deux réactifs choisis dans le groupe constitué de: - réactifs permettant la mesure de la concentration en uracile plasmatique, - réactifs permettant la mesure du rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile, et réactifs permettant la détermination de la présence ou l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase. La présente invention concerne aussi un kit de diagnostic in vitro permettant la détermination de la dose de 5-fluorouracile adaptée à un patient atteint d'une maladie qui peut être traitée avec du 5fluorouracile, de préférence un cancer, ledit kit comprenant: - au moins deux réactifs choisis dans le groupe constitué des réactifs permettant la détermination de la présence ou l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, la mesure de la concentration en uracile plasmatique, et la mesure du rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile; et - des instructions permettant la détermination de la dose de 5-fluorouracile adaptée audit patient. Les kits de diagnostics décrits précédemment peuvent notamment comprendre comme réactifs une colonne possédant une phase stationnaire composée de particules de carbone sphériques totalement poreuses, une solution d'acétonitrile concentrée permettant d'optimiser la séparation de l'uracile et du dihydrouracile par chromatographie liquide haute performance avec détection UV, et/ou des réactifs permettant la détection de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, comme par exemple des réactifs permettant l'extraction d'ADN génomique, l'amplification des fragments d'intérêt, la détermination de la taille des produits amplifiés ou leur pyroséquençage. De préférence, les kits de diagnostic contiennent entre autres au moins une des amorces pour l'amplification et/ou le pyroséquençage des fragments amplifiés ayant pour séquence nucléique SEQ ID NO: 3, 4, 9, 10, 15 à 20, 23 à 28, 31, 32, 37, 38, 40, 43, 47, 49, 50, 53 à 55, 57 ou 60. Les différents réactifs peuvent être présentés soit sous la forme d'une unité globale contenant tous les réactifs, soit sous la forme de plusieurs entités distinctes contenant des réactifs différents (en particulier si certains réactifs doivent être conservés à température ambiante et d'autres sous forme congelée). Les instructions permettant la détermination de la dose de 5fluorouracile adaptée audit patient peuvent se présenter sous différentes formes. Elles comprennent de préférence une liste des mutations significatives du gène codant pour la DPD ainsi que des valeurs de références ou valeurs seuils permettant la mise en oeuvre du diagnostic, et auxquelles peuvent être comparées les valeurs éventuellement mesurées de la concentration en uracile plasmatique et/ou du rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile. De manière avantageuse, la liste des mutations significatives du gène codant pour la DPD comprend les mutations I560S, IVS14+1G>A, D949V, L155Stop, R2lStop, Del TCAT295, Del T812, Del TG1039, E386Stop, et Del C1897; une valeur seuil pour la concentration en uracile plasmatique est 15 g/L; et des valeurs seuils pour le rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile sont 1; 3; et/ou 6. Dans un mode de réalisation avantageux, les instructions contenues dans lesdits kits comprennent également un algorithme de décision. De préférence l'algorithme de décision est celui décrit précédemment. La présente invention concerne également une méthode de traitement d'un patient souffrant d'une maladie qui peut être traitée par du 5fluorouracile, de préférence un cancer, ladite méthode comprenant: (a) la collecte des résultats de la détermination de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, de la mesure de la concentration en uracile plasmatique, et éventuellement de la mesure du rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile; et (b) l'injection d'une dose de 5-fluorouracile adaptée 15 au patient en fonction des résultats obtenus à l'étape (a). Une telle méthode de traitement peut également comprendre les étapes suivantes: (c) la mesure à partir d'au moins un prélèvement 20 sanguin de la concentration plasmatique en 5- fluorouracile au cours des jours/heures suivants une injection de 5-fluorouracile, et (d) l'adaptation éventuelle de la dose suivante de 5-fluorouracile injectée au patient en fonction du 25 résultat de l'étape (c). L'invention concerne encore l'utilisation d'au moins une amorce dont la séquence nucléique est l'une des SEQ ID NO: 3, 4, 9, 10, 15 à 20, 23 à 28, 31, 32, 37 et 38 pour l'amplification de fragments du gène codant pour la 30 DPD. L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une amorce dont la séquence nucléique est l'une des SEQ ID NO: 40, 43, 47, 49, 50, 53 à 55, 57 et 60 pour le pyroséquençage de fragments du gène codant pour la DPD. Les avantages de la présente invention sont illustrés plus clairement dans les figures 1 et 2 et les 5 exemples ci-après. Figure 1. Algorithme de décision pour l'évaluation d'une dose de 5-FU adaptée à un patient. DS: dose standard (1) : sensibilité accrue: non, prédisposition au développement d'une toxicité : non (2) sensibilité accrue: oui, prédisposition au développement d'une toxicité : oui NB: attention particulière en cas d'uracile plasmatique > 100 pg/L et/ou de mutation significative homozygote et 15 ou de rapport UH2/U Figure 2. Principe de la technique de pyroséquençage. Figure 3. Localisation des différentes mutations étudiées 20 sur le gène de la DPD. Fe-S: sites catalytiques apportant les électrons nécessaires aux réactions d'oxydoréductions, FAD: site de liaison au flavine adénine dinucléotide (FAD), NAPDH: site de liaison au nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) Les mutations significatives sont indiquées en gras. EXEMPLE 1: Patients étudiés et toxicités au 5-FU Les différents paramètres (mutation significative, concentration plasmatique en uracile, rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile) ont d'abord été étudiés sur 250 patients. Dans certains cas, une étude à plus grande échelle a ensuite été réalisée. Ces 250 patients étaient traités pour des cancers colorectaux avec des protocoles comprenant du 5- fluorouracile (LV5FU2 simplifié ou perfusion hebdomadaire de 4 heures, tel que décrit précédemment). Les éventuelles toxicités induites par le traitement au 5-FU ont été analysées après une première ou deuxième cure, afin de dépister les patients à risques de toxicités immédiates graves au 5-FU. Tous les résultats présentés dans les exemples suivants concernent donc des toxicités développées suite à une première ou deuxième cure de 5-FU. Les toxicités de type hématologique, cutanées, les diarrhées et les vomissements ont été relevés, et leur importance a été quantifiée selon un grade de 0 à IV. La signification des différents grades de toxicité au 5-FU tels que définis par l'OMS est présentée dans le Tableau 2. Tableau 2. Définition OMS des différents grades de toxicité selon les régions atteintes. Type de toxicité Grade 0 Grade I Grade II Grade III Grade IV Hématologiques >11 9,5-10,9 8 - 9,4 6,5 - 7,9 4 3,0 3,9 2,0 - 2,9 1,0 - 1,9 2 1,5 1,9 1,0 - 1,4 0,5 - 0,9 _100 75 99 50 74 25 - 49 2 jours Intolérable requérant Déshydratation jours un traitement / diarrhée hémorragique Vomissements Aucun Un épisode 2-5 épisodes 6-10 épisodes > 10 épisodes En 24 h en 24 h en 24 h en 24 h ou nécessité de perfusion EXEMPLE 2: Concentration en uracile plasmatique et 5 déficit enzymatique de la DPD 2.1 Mesure de la concentration en uracile et dihydrouracile plasmatique Une méthode de dosage des concentrations en uracile et en dihydrouracile plasmatique par chromatographie liquide haute performance avec détection UV (barrettes de diodes) a été développée. On utilise une colonne HypercarbTM dont la phase stationnaire est composée de particules de carbone sphériques totalement poreuses. Sur ce type de colonne, plus l'analyte est polaire, plus son interaction avec la phase stationnaire est forte, conduisant ainsi à un temps de rétention supérieur à celui obtenu avec les autres types de colonnes. Avec une telle colonne, l'utilisation d'une phase mobile contenant de l'acétonitrile à différents pourcentages permet d'optimiser la séparation de l'uracile et du dihydrouracile des autres composés présents dans l'extrait plasmatique. La pureté des pics chromatographiques a été vérifiée à l'aide du détecteur à barrette de diodes. La méthode développée est fiable, reproductible et linéaire sur les gammes de concentrations testées: de 6,25 à 100 g/L pour l'uracile et de 12,5 à 200 g/L pour le dihydrouracile. Les limites de quantification déterminées à 1,25 et 0,625 respectivement pour l'uracile et le dihydrouracile sont inférieures aux concentrations physiologiques. 2.2. Résultats Une grande variabilité interindividuelle des concentrations plasmatiques d'uracile a été observée. Les deux patients ayant présenté les plus fortes toxicités (ayant conduit au décès du patient dans un cas et à 40 jours d'hospitalisation dans l'autre cas) présentaient des taux d'uracile très supérieurs aux autres patients (230 et 28 fois supérieurs à la médiane). De plus, nous avons pu mettre en évidence l'existence d'une corrélation significative entre la toxicité et la concentration d'uracile plasmatique (p Cependant, tous les patients possédant une concentration élevée d'uracile n'ont pas présenté de toxicité, suggérant ainsi que cette concentration n'est pas uniquement dépendante du catabolisme des pyrimidines. Ainsi, l'approche consistant à quantifier l'uracile plasmatique ne permet pas à elle seule de déterminer les patients susceptibles de présenter une toxicité au 5-FU. Une diminution systématique de dose à la première cure pour ces patients entraînerait un sous-dosage chez plusieurs d'entre eux, induisant une diminution de l'efficacité du traitement. Cependant, le dosage de l'uracile plasmatique pourrait permettre d'effectuer une première évaluation des risques de toxicité du patient. En effet, les patients possédant un taux d'uracile faible (inférieur à 15) ont un risque très réduit de présenter une toxicité sévère. Une diminution de dose de 5-FU ne semble donc pas nécessaire dans ce cas. Pour les autres patients, une étude plus approfondie des capacités métaboliques du patient semble indispensable. Les différents résultats sont synthétisés dans le Tableau 3. Tableau 3. Concentration en uracile plasmatique et développement d'une toxicité sévère après traitement avec du 5-FU. Concentration en Nombre de Nombre de patients % de patients avec % de patients uracile plasmatique patients avec une toxicité de une toxicité de sans toxicité de grade III-IV grade III-IV grade III-IV 15 g/L 86 15 17,44 82,55 EXEMPLE 3: Rapport dihydrouracile/uracile plasmatique et 10 déficit enzymatique de la DPD 3. 1 Evaluation de la stabilité du rapport dihydrouracile/uracile plasmatique Le prélèvement sanguin n'étant pas toujours effectué dans la même structure que l'analyse de l'échantillon, la première étape a consisté à évaluer la stabilité du rapport dihydrouracile/uracile dans différentes conditions: le délai entre le prélèvement et la centrifugation de l'échantillon sanguin, la température de conservation du plasma, et l'heure et le jour de prélèvement de l'échantillon sanguin. Les résultats obtenus montrent que le rapport dihydrouracile/uracile: 1. n'est pas modifié quelque soit le délai de 0 à 8h 25 entre le prélèvement et la centrifugation de l'échantillon sanguin, 2. est stable si le plasma est conservé à -20 C, mais diminue au cours du temps si le plasma est conservé à +4 C ou à température ambiante, 3. varie peu d'un jour à l'autre mais en fonction de l'heure du prélèvement. Au vu de ces résultats, l'analyse qui suit a été réalisée sur des échantillons sanguins prélevés entre 8 et 10 heures du matin et dont le plasma a été conservé à -20 C. 3.2 Résultats L'étude de la distribution du rapport dihydrouracile/uracile (UH2/U) a montré qu'il existait une grande variabilité interindividuelle des rapports, avec une moyenne de 7,6 2,7 [0,002 - 17,3]. Afin d'évaluer la pertinence du rapport UH2/U comme facteur prédictif de la toxicité au traitement, la corrélation du rapport avec la toxicité et la clairance plasmatique du 5-FU a été étudiée. Concernant la clairance plasmatique du 5-FU, aucune corrélation avec le rapport UH2/U n'a pu être mise en évidence dans la totalité de la population, quelque soit le protocole étudié. Par contre, lorsque seuls les rapports inférieurs à la médiane (7,3) sont pris en compte, une corrélation significative a été retrouvée, (r=0,301; p=0,016). L'évaluation de la corrélation entre le rapport UH2/U U et la toxicité est concluante. En effet, une corrélation significative a été mise en évidence avec la toxicité (p Les différents résultats sont synthétisés dans le Tableau 4. Tableau 4. Rapport dihydrouracile/uracile plasmatique et 15 développement d'une toxicité sévère après traitement avec du 5-FU. Rapport Nombre de patients Nombre de patients % de patients avec % de patients sans UH2/U avec une toxicité de une toxicité de toxicité de grade grade III-IV grade III-IV III-IV 6 186 3 1,6 98,4 EXEMPLE 4: Polymorphisme génétique dans le gène codant 20 pour la DPD et déficit enzymatique de la DPD 4.1 Mutations connues dans le gène de la DPD Bien que la majorité des mutations identifiées à ce jour sur le gène de la DPD résultent en un changement d'acides aminés dans la phase codante, toutes ces mutations ne sont pas spécifiquement retrouvées chez des patients présentant une activité diminuée en DPD (Ridge et al. 1998. Br. J. Clin. Pharmacol., 1998, 46(2), 151-156; Milano et al. 2000. European journal of cancer 36, 37-42). C'est pourquoi une méthode de génotypage a été mise au point par les inventeurs pour les 22 principales mutations susceptibles d'être liées à un déficit en DPD. La Figure 3 représente l'emplacement de ces mutations sur le gène de la DPD. Les caractéristiques et les conséquences avérées ou 10 possibles de ces 22 mutations sont résumées dans le Tableau 5. Tableau 5. Caractéristiques des mutations étudiées Mutation Position Fréquence Conséquence connue ou présumée Publication dans le gène hétérozygote associée estimée (%) T-1590C promoteur activité nulle en DPD ? R21Q exon 2, ND A priori, pas de conséquence sur l'activité 2 (=G62A) codon 21 enzymatique de la DPD C29R exon 2, 29 à 33% A priori, pas de conséquence sur l'activité 3 (=T85C) codon 29 enzymatique de la DPD P86L exon 4, ND Changement conformationnel complet => un 4 (=C257T) codon 86 déficit complet en DPD. Del exon 4, ND Codon stop prématuré => déficit complet ? 5 TCAT295 nucléotides 295-298 S201R exon 6, ND Perturbation du site enzymatique => déficit 4 (=A601C) codon 201 complet en DPD. Y211C exon 6, ND Changement conformationnel déstabilisant 4 (=A632G) codon 211 l'enzyme => déficit partiel? R235W exon 7, ND Protéine mutante a une activité résiduelle de 1% 3 (=C703T) codon 235 chez E. Coli Del T812 exon 8, ND codon stop => une protéine tronquée inactive 6 nucléotide V335L exon 10, 25 Modification du site de liaison au NADPH. 7 (=G1003T) codon 335 Activité résiduelle chez E. coli de 15% Del TG1039 exon 10, ND codon stop prématuré => activité nulle 8 nucléotides 1039- 1042 E386Stop exon 1 1, ND codon stop prématuré => activité nulle 1 (=G1156T) codon 386 S492L exon 12, ND changement conformationnel de la protéine => 4 (=C1475T) codon 492 déficit complet en DPD ? S534N exon 13, 0,8 activité enzymatique réduite ? 1 (=G1601A) codon 534 I560S exon 13, ND changement conformationnel =_> déficit partiel 1 (=T1679G) codon 560 ou complet exon 14, codon stop au niveau du site de liaison au Del C1897 nucléotide ND substrat => déficit complet chez un patient 3 IVS14+1G> délétion complète de l'exon 14 lors de la intron 14 1,5 transcription de l'ARN pré-messager (perte de 9 A 165 pb) => déficit complet R886H exon 21, activité enzymatique résiduelle de 25% che E. 3 (=G2657A) codon 886 ND coli. D949V exon 22, ND diminution très probable de l'activité de la DPD 4 (=A2846T) codon 949 H978R exon 23, ND déficit complet ? 4 (=A2933G) codon 978 V995F exon 23, ND changement conformationnel de la DPD=> ] 0 (=G2983T) codon 995 activité enzymatique nulle ? Références: 1. CollieDuguid et al., 2000. Pharmacogenetics 10, 217-223. 2. Van Kuilenburg et al., 2003. Ann Oncol 14, 341-342 3. Vrecken et al., 1997. Hum. Genet. 101, 333-338 4. Van Kuilenburg et al., 2002. Biochem. J. 364, 157-163. 5. Vrecken et al.,1997. Hum. Genet. 100, 263-265. 6. Yamaguchi et al. en 2001. Jpn. J. Cancer Res. 92, 337-342. 7. Dobritzsch et al., 2001. The EMBO journal 20, 650-660 8. Van Kuilenburg et al., 2000. Adv Exp Med Biol. 486:247-50. 9. Wei et al., 1996. The journal of clinical investigation 98, 610-615. 10. Van Kuilenburg et al., 1999. Hum Genet.104(1):1-9. 4.4 Recherche de nouvelles mutations La liste des mutations décrites dans la littérature 15 n'est pas exhaustive. D'autres mutations encore inconnues sur le gène de la DPD et susceptibles d'engendrer un déficit enzymatique peuvent être présentes. C'est pourquoi d'autres mutations éventuelles ont été recherchées chez des patients ne présentant pas les mutations testées préalablement et ayant néanmoins présenté un épisode de toxicité aiguë au 5-FU. Deux stratégies de recherche ont été utilisées: l'amplification puis séquençage classique des 23 exons du gène de la DPD. - L'utilisation d'un test fonctionnel dit "test de la protéine tronquée". Le test de la protéine tronquée a pour but de rechercher des mutations engendrant un codon stop, donc une protéine anormalement tronquée. Son principe consiste principalement en la synthèse de la protéine. En effet, lorsqu'une partie importante de la séquence codante peut être amplifiée par PCR sur l'ARN messager, ou sur un exon de grande taille, un premier criblage peut être effectué par transcription et traduction in vitro de la protéine. Cette technique se déroule en 3 grandes étapes: - l'extraction des ARNs messagers codant pour la protéine à synthétiser, - la synthèse et amplification de l'ADN complémentaire, et - la synthèse de la protéine. Afin de synthétiser la protéine, l'ADNc total ou une partie de ce dernier est cloné dans un vecteur d'expression. Les protéines ainsi synthétisées sont ensuite déposées dans un gel SDS-PAGE. La révélation du gel peut se faire par western blot ou par coloration au bleu de Coomassie. Le test de la protéine tronquée a permis de mettre en évidence une mutation susceptible d'être corrélée avec une altération de l'activité enzymatique de la DPD et le développement de toxicités graves après traitement au 5-FU: la mutation L155Stop (=T464A), puisque cette mutation provoque une protéine tronquée 4.2 Analyse de la présence ou l'absence de ces mutations 4.2.1 Isolement des leucocytes L'analyse a été réalisée à partir de prélèvements sanguins. A 500 pL de sang total est ajouté 1 ml de solution de lyse (Red blood oeil lysis buffer, ROCHE, Mannheim, Allemagne). Cette solution permet la lyse sélective des globules rouges. Le tube est homogénéisé par retournement pendant 10 minutes à 45 rpm (tours par minute), puis centrifugé 5 minutes à 1300 g à température ambiante. Un culot blanc de leucocytes est alors observé au fond du tube. Après élimination du surnageant, ce culot est repris avec 500 pL de solution de conservation des acides nucléiques (RNA/DNA stabilization reagent for blood/bone marrow, ROCHE, Mannheim, Allemagne). Cette dernière solution permet également la lyse des globules blancs. Ce tube numéroté et identifié, est ensuite conservé à - 20 C. 4.2.2 Extraction de l'ADN génomique Cette étape d'extraction est réalisée à l'aide du 25 kit "DNA isolation Kit for blood/bone marrow/tissue " (Roche, Allemagne). 4.2.3 Préparation de l'ADN complémentaire L'extraction des ARNs messagers totaux est réalisée à l'aide du kit High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Allemagne). L'ADN complémentaire (ADNc) est ensuite synthétisé par transcription inverse par le protocole suivant: à 12 pL d'ARNs totaux sont ajoutés 1 pL d'amorces aléatoires (2,65 pg/pL). Ce mélange est ensuite incubé à 70 C pendant 5 minutes afin d'éliminer les structures secondaires des ARNs, et plongé immédiatement après à 4 C afin d'empêcher la renaturation des brins d'ARNs. Puis un milieu réactionnel composé de tampon 1 X (50 mM Tris-HC1, 75 mM KC1, 3 mM MgC12, 10 mM DTT; Promega, Madison, USA), 0,25 mM de chaque dNTP, ljL d'inhibiteur des ribonucléases (RNasin 40 pg/pL; Promega, Madison, USA) et de la rétrotranscriptase M-MLV RT (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase, 200 U/pL; Promega, Madison, USA). Le tout est incubé pendant 1 heure à 37 C. 4.2.4 Amplification par PCR L'amplification des fragments d'intérêt a été réalisée selon un protocole standard de PCR. Le Tableau 6 récapitule les amorces utilisées pour les différents fragments, ainsi que la taille attendue des produits amplifiés. 2884257 37 Tableau 6. Amorces utilisées pour l'amplification des différents fragments d'intérêt Mutation Amorce sens Amorce anti-sens * Taille du produit amplifié T-1590c atccaggactctccccagat atccaggactctccccagat 203 (SEQ ID NO: 1) (SEQ II) NO: 2) R21stop gtctttagagtatcctggcttt tcttatcaggatttcttttccaatg 110 (SEQ ID NO: 3) (SEQ II) NO: 4) R21Q gtctttagagtatcctggcttt tcttatcaggatttcttttccaatg 110 (SEQ ID NO: 3) (SEQ II) NO: 4) C29R cctggctttaaatctcgaa tcttatcaggatttcttttccaatg 100 (SEQ ID NO: 5) (SEQ II) NO: 6) P86L gagatgcctgaaatgtgc(SEQ ttgtttgcaatacttgtgatg 150 ID NO: 7) (SEQ II) NO: 8) Del TCAT295 tgtcagaagagctgtccaa ttgtttgcaatacttgtgatg 62 (SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 10) S201R ccacagatcagaaatccttc accaccaacatattcttgttt 175 (SEQ ID NO: Il) (SEQ 1D NO: 12) Y211C ccacagatcagaaatccttc accaccaacatattcttgttt 175 (SEQ ID NO: Il) (SEQ ID NO: 12) R235W acttctgaaattcctcagttc ctttacaccaaggtccttca 77 (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO:14) Del T812 agataatttgcggtaaaagc agcagctttgtagccttttt 90 (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 16) V335L agataatttgcggtaaaagc agcagctttgtagccttttt 90 (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 16) De1TG1039 cctgtcactctccattgc tcctcagggacagctcttat 200 (SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18) E386Stop tggaacttgctaaggaagaaaaï aaccaaaggcactgatgacc 204 (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 20) S492L gtatttgcaggtggtgatgt ctgtacgtatttgtgaatgtacc 101 (SEQ ID NO: 21) (SEQ ID NO: 22) S534N aatatggagcttccgtttct gagagaaagttttggtgagg 204 (SEQ ID NO: 23) (SEQ ID NO: 24) I560s aatatggagcttccgtttct gagagaaagttttggtgagg 204 (SEQ ID NO: 23) (SEQ ID NO: 24) Del C1897 ctttcatcaggacattgtga caccaacttatgccaattct 222 (SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 26) IVSI4+IG>A atcagtgagaaaacggctgc taaacattcaccaacttatgcca 150 (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 28) R886H tctgacctaacatgcttc aggccttttggggataaaac 200 (SEQ ID NO: 29) (SEQ ID NO: 30) D949V aagcactgcagtaccttggaa tcatgtagcatttaccacagttga 107 (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 32) H978R ccctctatttctgtttgcag agggtacgcctctctttggt 175 (SEQ ID NO: 33) (SEQ ID_NO: 34) V995F ccctctatttctgtttgcag agggtacgcctctctttggt 175 (SEQ ID NO: 35) (SEQ ID NO: 36) Llssstop Ttatggagctgctaagatga atcatacatacctcagtagcaaa 200 (SEQ ID NO: 37) (SEQ ID NO: 38) * Dans le cas où le produit amplifié est ensuite analysé par pyroséquençage, alors l'amorce anti-sens utilisée pour l'amplification est biotinylée en 5'. 4.2.5 Détermination de la taille des produits amplifié Tous les produits d'amplification (8 pl) sont séparés sur gel d'agarose 2% (Invitrogen, USA) par migration électrophorétique en présence de bromure d'éthidium (0, 5pg/mL) (Sigma-Aldrich , USA). L'amplification et la taille des fragments sont alors visualisées sous U.V. et comparées à un marqueur de poids moléculaire (Step Ladder 50pb ou Lamba DNA BSTEII, Sigma-Aldrich , USA). 4.2.6 Pyroséquençage des produits amplifiés Le principe de la technique de pyroséquençage est décrit sur la Figure 2. Après l'amplification des fragments d'intérêt avec les amorces antisens biotinylées en 5', les produits sont préparés pour la réaction de pyroséquençage proprement dite. La préparation se fait grâce à un système de filtration par le vide développée par Biotage AB. 20 pL de produit de PCR sont immobilisés sur des billes de sépharose recouvertes de streptavidine (Streptavidin Sepharose' High Purity, Amersham Biosciences, Suède). En présence d'un tampon de fixation (10mM Tris Base, 2M NaCl, 1mM EDTA, 0,1% Tween20) à pH 7,6, l'affinité avidine/biotine permet la fixation et l'immobilisation du produit biotinylé sur les billes. Ce complexe insoluble peut alors être aspiré sur des filtres par le système de vide permettant un lavage des échantillons. Cet ADN est ensuite dénaturé par une solution de soude 0,2M puis lavé dans une solution de Tris 10mM, pH 7,6. Seul le brin contenant la biotine reste fixé sur les billes. Le complexe ADN simple brin/sépharose est alors remis en suspension dans 50 pL de tampon d'hybridation auquel sont ajoutées 15 pmol d'amorce de séquence. 2 min à 80 C sont nécessaires afin d'éliminer les éventuelles structures secondaires de l'ADN et permettre une meilleure fixation de l'amorce. La réaction de séquençage est effectuée à 28 C dans un appareil de type PSQ 96MATM (Biotage AB, Suède). Les enzymes sont ajoutées à l'ADN, puis les substrats et ensuite les nucléotides un à un de manière automatique par une cartouche de distribution. Les volumes sont déterminés selon le nombre d'échantillons à analyser. Il faut compter par échantillon: 5 pL d'enzymes et 5 pL de substrats + 50 pL de volume mort. Pour les nucléotides, 0,2 pL de chaque nucléotide par base à tester sont ajoutés aux 50 pL de volume mort. L'ordre d'ajout des nucléotides est déterminé selon la position de l'amorce, la séquence du brin complémentaire et la mutation à détecter. Cette séquence ne dépasse pas en règle générale 10 à 15 nucléotides. Dans tous les cas, la séquence d'ordre d'ajout des nucléotides commence par un nucléotide contrôle n'ayant pas son complémentaire sur le fragment pyroséquencé. Ce dernier sert de témoin négatif, aucun pic ne doit apparaître. Ensuite, les nucléotides correspondant à la séquence complémentaire au fragment amplifié sont ajoutés un à un. Au niveau de la mutation, les deux nucléotides correspondant aux deux génotypes possibles sont ajoutés successivement. Le pyrogrammeTM obtenu permet alors de déterminer quel est le génotype de l'individu (homozygote 1, hétérozygote ou homozygote 2). Si une deuxième mutation doit être détectée, un autre nucléotide contrôle n'ayant pas son complémentaire sur le fragment pyroséquencé est ajouté avant de passer à la suite de la séquence. Par exemple, pour le pyroséquençage de la mutation IVS14+1G>A, la séquence analysée est CAAC(G/A)TAA. L'ordre de distribution des dNTPs pour cette mutation est alors G, C, A, C, G, A, C, T, A. En effet, le premier nucléotide G est un nucléotide contrôle, les cinq nucléotides suivants (C, A, C, G, A) permettent de détecter ou non la présence de la substitution G>A, le nucléotide C suivant est un nucléotide contrôle, et les deux derniers nucléotides T et A permettent de séquencer les trois nucléotides suivants de la séquence à analyser (voir Tableau 6). Le choix de l'amorce de séquence est très important pour la détection des mutations par la méthode de pyroséquençage. Pour une meilleure séquence, cette amorce ne doit pas être placée à plus de 5 bases de la mutation et le complexe entre le brin d'ADN à séquencer et l'amorce de séquence doit posséder une stabilité thermodynamique suffisante. La température de la réaction ne pouvant être changée, des oligonucléotides modifiés ont été utilisés pour le pyroséquençage de certains fragments. Ces oligonucléotides modifiés comprennent au moins un nucléotide contenant un pont méthylène 2'O-4'C qui permet de maintenir ledit nucléotide dans une conformation bicyclique rigide. Les amorces de séquence finalement retenues et utilisées sont présentées dans le Tableau 7. Tableau 7. Récapitulatif des amorces utilisées pour le pyroséquençage. Mutation Amorce de pyroséquençage Séquence à analysera Ordre d'injection des dNTPsb T-1590C atttgcaaaggtaagatact T(T/C)AACCAC CTCGACAC (SEQ ID NO: 39) _ R21Stop cctggctttaaatcct (C/T) GAACAC GCTCGATCAC (SEQ ID NO: 40) R21Q cctggctttaaatcct C(G/A)AACAC GCTCGATCAC (SEQ ID NO: 40) _ C29R caaactcatgcaactctg (T/C)GTTCC GTCAGTC (SEQ ID NO: 41) P86L aatgtgcagatgccc (C/T) GTGTC GCTCGTGTC (SEQ ID NO: 42) Del aactaatcttgatattaa A[TCAT]TCATCACAA GATCATCATCA TCAT295 (SEQ ID NO: 43) S201R tgggcctgcaagtata (A/C) GTTGTG TACTGTGTG (SEQ ID NO: 44) Y211C ttggctcgattgggg T (A/G) CTCT GTAGTCTCT (SEQ ID NO: 45) R235W gaaattcctcagttc (C/T)GGCTGCC GCTCGCTGC (SEQ ID NO: 46) Del T812 aatgaaatgactcttagcac TT[T]GAAAG CTCGAG (SEQ ID NO: 47) _ V335L tcgatacggggagtc (G/T) TGATCG CGTCGATCG (SEQ ID NO: 48) Del TG1039 Gagacactgcctttgac [TG]TGCAAC GTGTGTCAC (SEQ ID NO: 49) E386Stop tgctaaggaagaaaagtgt (G/T)AATTTC CGTCATC (SEQ ID NO: 50) S492L ggctaacactacagtggaat (C/T)GGTG GCTCGTG (SEQ ID NO: 51) S534N tattgatctggtggacatta (G/A)TGTA CGACTGTA (SEQ ID NO: 52) I560S ccagccaccagcacatcaa TGA(T/G)TCG CTGAGTGCG (SEQ ID NO: 53) _ Del C1897 CCAACTAATCTTGATATTAA CTTT[C]CAG GCTCTAG (SEQ ID NO: 54) IVS14+1G>A aggctgactttccaga C_AAC (G/A) TAA GCACGACTA (SEQ ID NO: 55) R886H ttggaccttatctggaa CAGC (G/A) CAAG ACAGCGATCAG (SEQ ID NO: 56) D949V gcaagttgtggctatga TTG (A/T) TGAAG ATGATCGAG (SEQ ID NO: 57) H978R acagtttgatccagaaaccc (A/G) CCTGCCC TAGACTGC (SEQ ID NO: 58) _ V995F gctgtactctgtgtctcagt (G/T) TTTGCCC CGTCGCT (SEQ ID NO: 59) _ L155Stop cccattaatattggt GGAT(T/A)GCA CGATATGCA (SEQ ID NO: 60) a Les substitutions sont indiquées en gras entre parenthèses, le nucléotide sauvage en premier, le nucléotide muté en second. Pour les délétions, la partie absente en cas de délétion est indiquée en gras entre crochets b Les nucléotides contrôles, n'ayant pas de base complémentaire sur le fragment pyroséquencé, sont indiqués en gras 4.2.7 Réalisation de témoins négatifs et positifs Afin de valider la réaction de mini-séquençage luminométrique, des témoins ont été construits pour les mutations les plus recherchées. Pour les mutations pour lesquelles un ou plusieurs patients hétérozygotes ont été détectés, les témoins positifs et négatifs ont été obtenus par clonage dans pGEM-T. Les clones ont ensuite été séquencés par mini-séquençage luminométrique afin de discriminer les homozygotes pour la mutation et les sauvages. En effet, lors du clonage chacun des 2 allèles est incorporé dans un clone différent. De cette manière, les témoins sauvages et homozygotes mutés sont obtenus. Le témoin hétérozygote muté est construit en mélangeant en quantité équimolaire les plasmides sauvages et homozygotes mutés. Les témoins des mutations pour lesquelles aucun individu n'a été retrouvé muté ont été obtenus par mutagénèse dirigée. 4.3 Corrélation entre la présence de ces mutations et le développement de toxicités graves après traitement au 5-FU. Seules les toxicités apparues après les fers et 2èmes cycles de chimiothérapies ont été prises en compte afin de dépister les patients à risques de toxicités immédiates graves au 5-FU. 4.3.1 Etude de 10 mutations principales Dans un premier temps, l'étude a porté essentiellement sur 9 mutations décrites dans la littérature et sur la nouvelle mutation Ll55Stop mise en évidence par les inventeurs. La présence ou l'absence de ces mutations et leur corrélation éventuelle avec une altération de l'activité enzymatique de la DPD et le développement de toxicités graves après traitement au 5-FU a d'abord été analysée sur 250 patients. Les résultats en terme de nombre de patients, de fréquences et de retentissements cliniques et plus particulièrement toxiques, sont représentés dans le Tableau 8. La gradation selon la classification OMS est utilisée, le grade IV mettant en jeu le pronostique vital du patient. Tableau 8. Récapitulatif des résultats obtenus après génotypage et étude clinique des 9 mutations recherchées en priorité. Mutation Nombre de % de Nombre de % de % de patients patients patients avec une avec une sans une patients patients toxicité toxicité toxicité de grade de grade de grade III-Iv III-Iv III-Iv Hsa 247 98,8 15 6 93,9 IVS14+1G>A hb 250 3 1,2 2 67 33 HmC 0 0 ND ND ND Hs 242 96,8 12 4,96 95 D949V h 250 8 3,2 5 62,5 37,5 H 0 0 ND ND ND Hs 247 98,8 17 6,88 93,2 T-1590C h 250 3 1,2 0 0 100 H 0 0 ND ND ND Hs 249 99,6 16 6,4 93,6 I560S h 250 1 0,4 1 100 0 H 0 0 ND ND ND L155Stop Hs 249 99,6 16 6,4 93,6 (nouvelle h 250 1 0,4 1 100 0 mutation) H 0 0 ND ND ND Non Mutés Hs 250 238 95,2 9 3,8 96,2 De1TCAT295, Hs 250 100 ? ? ? E386Stop, h 250 0 0 ND ND ND R886H, V995F H 0 0 ND ND ND aHs: homozygote sauvage bh: hétérozygote Sm: homozygote muté Ces résultats montrent que la présence des mutations IVS14+1G>A, D949V, L155Stop et I560S est corrélée avec le développement d'une toxicité sévère après une première ou deuxième cure de 5-FU. En revanche, les 6 autres mutations testées en priorité ne semblent pas avoir d'impact sur le développement d'une toxicité sévère après une première ou deuxième cure de 5-FU. Ces résultats ont été confirmés lors d'études portant sur un plus grand nombre de patients (voir Tableau 9) Tableau 9. Résultats obtenus après génotypage et étude clinique des 4 mutations impliquées dans une toxicité. Mutation Nbre de Fréquence % Tox III-IV patients IVS141G>A h 1678 19 1, 13 62, 5 Hm 1 _ 100 D949V h 1678 27 1, 6 60 Hm 1560S h 761 3 0, 4 100 Hm L155Stop h 944 1 0,1 100 Hm' Pas de SNP Hs 1678 1627 96,96 ND Hs: homozygote sauvage h: hétérozygote Hm: homozygote muté Bien que la mutation L155Stop n'ait été détectée que chez un patient sur les 944 testés, le patient en question a été hospitalisé 1 semaine après une première cure de 5-FU pour cause de mucite grade IV, aplasie grade IV, syndrome mains-pieds de grade III, et de diarrhées profuses entraînant une déshydratation sévère. Son état s'est aggravé vers une insuffisance rénale et a abouti à un coma, puis au décès de ce patient. De plus, le test de la protéine tronquée avait permis de mettre en évidence que cette mutation provoque une protéine tronquée, suggérant que bien que de faible fréquence, cette mutation est corrélée avec une altération de l'activité enzymatique de la DPD et le développement de toxicités graves après traitement au 5-FU. 4.3.2 Etude des 13 autres mutations chez les patients non mutés pour les mutations précédentes. Seuls les patients non mutés pour les mutations précédentes et ayant présenté un épisode de toxicité aïgue au 5-FU ont été génotypés pour les 13 autres mutations. Une trentaine de patients a donc été génotypée pour les mutations P86L, S201R, R235W, S492L, S534N, H978R, Del C 1897, F632F, R21Stop, R21Q, Y211C, delT812, délétion TG 1039-1041, et V335L. Le Tableau 10 présente les résultats en terme de 15 nombre de patients, de fréquences et de retentissements cliniques et plus particulièrement toxiques. Tableau 10. Récapitulatifs des résultats obtenus après génotypage et étude clinique pour les 13 mutations supplémentaires analysées. % de $ de Nombre de % de Nombre de patients patients patients avec une sans une Mutation avec une patients patients toxicité de toxicité de toxicité de grade III- grade III- grade III-IV IV IV P86L, S201R, R235W, Hsa 33 100,0 33 100 0 S492L, S534N, H978R, Del hb 33 0 0,0 0,0 0,0 0,0 C1897, R21Stop, R21Q, Y211C, De1T812, Del Hmc 0 0,0 0,0 0,0 0,0 TG1039, V335L a Hs: homozygote sauvage b h: hétérozygote c Hm: homozygote muté D'après ces résultats, aucun patient n'a été retrouvé muté pour au moins une de ces mutations. 4.6 Conclusion concernant les mutations significatives Ces différents résultats montrent que les 4 mutations IVS14+1G>A, D949V, I560S, et Ll55Stop sont corrélées avec une altération de l'activité enzymatique de la DPD et le développement de toxicités graves après traitement au 5-FU. Par conséquent, le dépistage de la présence d'une de ces mutations indique un risque élevé de développement d'une toxicité suite à une première ou deuxième cure de 5-FU (voir Tableau 10). EXEMPLE 5: Combinaisons des différents paramètres 5.1 Comparaison de la sensibilité et de la spécificité des différents paramètres et de leurs combinaisons. La combinaison de plusieurs des trois paramètres a également été analysée pour le diagnostic d'une sensibilité accrue au 5-FU et donc d'une prédisposition au développement de toxicités graves après traitement au 5FU. Les caractéristiques en terme de sensibilité et de spécificité de ces trois paramètres, et de différentes combinaisons de ces paramètres, sont synthétisées dans le Tableau 11. Tableau 11. Sensibilité et spécificité des différents paramètres. Paramètre Sensibilité Spécificité (% faux (% faux négatifs) positifs) [U] 5,5 76 Rapport UH2/U 6, 6 69 Mutation significative 8 10 [U] + mutation 1, 27 10 significative Rapport UH2/U + mutation 1,08 18,2 significative [U] + Rapport UH2/U + 0,7 10 mutation significative Ces résultats montrent que la combinaison d'au 20 moins deux des paramètres étudiés précédemment de manière isolée permet un diagnostic avec une meilleure sensibilité et une meilleure spécificité que chacun de ces paramètres pris individuellement. 5.3 Mise en place d'un algorithme de décision Les résultats précédents ont conduit à la mise en place d'un algorithme de décision pour le diagnostic in vitro d'une sensibilité accrue au 5-fluorouracile, de la prédisposition d'un sujet au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5-fluorouracile, et/ou la détermination de la dose de 5-FU adaptée à un patient. Cet algorithme prend en compte les résultats déterminants des trois paramètres, à savoir: - pour la concentration en uracile plasmatique: pour une concentration inférieure à 15 ng/mL, le risque de développer une toxicité sévère est très réduit ( - pour le rapport dihydrouracile/uracile plasmatique: 20 un rapport inférieur à 6 est fortement corrélé avec un risque accru de développer une toxicité sévère. - pour la détection de la présence ou de l'absence d'une mutation significative dans le gène codant pour la DPD: la présence d'une mutation significative entraîne un risque fort de développer une toxicité sévère (60 à 100 en fonction de la mutation ou du génotype hétéro ou homozygote). A partir de ces résultats, l'algorithme de décision suivant a été mis en place (voir Figure 1) : (a) En cas - d'absence de mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase parmi celles recherchées et si la concentration en uracile plasmatique est inférieure à 15 pg/L (cette situation correspond à 65.2 % des patients), ou d'absence de mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase parmi celles recherchées et si la concentration en uracile plasmatique est supérieure à 15 pg/l mais que le rapport UH2/U est supérieure ou égal à 6 (cette situation correspond à 13.6 des patients), le sujet ne possède pas de sensibilité accrue au 5- fluorouracile, n'est pas prédisposé au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5fluorouracile, et le traitement peut avoir lieu aux doses standard de 5fluorouracile (b) Dans tous les autres cas, c'est-à-dire, en cas: d'absence de mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase parmi celles recherchées, si la concentration en uracile plasmatique est supérieure ou égale à 15 pg/L, et UH2/U inférieur à 6, de présence de mutation significative hétérozygote ou homozygote dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, sans augmentation de la concentration en uracile plasmatique, - de présence de mutation significative hétérozygote ou homozygote dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, et d'augmentation de la concentration en uracile plasmatique, le sujet possède une sensibilité accrue au 5fluorouracile, est prédisposé au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5-fluorouracile, et le rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile est calculé pour confirmer le déficit et déterminer la dose de 5-FU à administrer. Si celui ci est: (i) supérieur à 6 la dose initiale de 5- fluorouracile est diminuée de 30% par rapport à la dose standard. (ii) compris entre 3 et 6: la dose initiale de 5-fluorouracile est réduite de 50% par rapport à la dose standard et une mesure de la concentration plasmatique en 5-fluorouracile au cours des jours/heures suivant l'injection d'une dose de 5-fluorouracile est réalisée. (iii) compris entre 1 et 3: la dose initiale de 5-fluorouracile est réduite de 70% par rapport à la dose standard et une mesure de la concentration plasmatique en 5-fluorouracile au cours des jours/heures suivant l'injection d'une dose de 5-fluorouracile est réalisée (iv) inférieur à 1: le traitement par le 5- fluorouracile est déconseillé, même à doses réduites. Si le traitement doit malgré tout être mis en oeuvre, la dose initiale est réduite de 80% et une mesure de la concentration plasmatique en 5-fluorouracile au cours des jours/heures suivant l'injection d'une dose de 5-fluorouracile est indispensable. De plus, en cas de mutation significative homozygote du gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, d'une concentration en uracile plasmatique supérieure à 100 pg/L, et/ou d'un rapport dihydrouracile/uracile inférieur à 1, des précautions particulières de surveillance sont mises en place, même à doses réduites. Appliqué aux patients analysés rétrospectivement, cet algorithme aurait pu permettre de décider une diminution de la dose de 5-FU pour 98, 8% des patients ayant subi une toxicité sévère (grade supérieur ou égal à 5 III) au cours des deux premières cures. Pour les patients n'ayant pas présenté de toxicité sévère au cours des deux premières cures, l'application de l'algorithme n'aurait conduit à l'administration d'une dose réduite de 5-FU lors de la première cure que chez 8% d'entre eux. En outre, à la suite de l'adaptation clinique de dose, ou au mieux de la surveillance pharmacocinétique mise en place pour tous les patients considérés comme à risque, la dose de 5-FU aurait pu être augmentée pour la deuxième cure, ce qui aurait évité un traitement inefficace de ces patients. 5.4 Conclusion Les résultats montrent que la combinaison d'au moins deux des paramètres étudiés permet de façon surprenante d'obtenir une sensibilité et une spécificité de diagnostic meilleures que la sensibilité ou la spécificité la meilleure des trois paramètres pris isolément. La mise en uvre de l'invention pourrait donc permettre d'éviter en grande partie la survenue de toxicités sévères lors des premières cures de 5-FU administrées a des patients, notamment par la détermination d'une dose adaptée de 5-FU si une sensibilité accrue au 5-FU a été diagnostiquée. REVENDICATIONS 1. Méthode de diagnostic in vitro d'une sensibilité accrue au 5fluorouracile, ladite méthode comprenant la réalisation sur un ou plusieurs échantillons biologiques, dont au moins un prélèvement sanguin, de la combinaison d'au moins deux tests in vitro choisis dans le groupe constitué de: - la détermination de la présence ou de l'absence 10 d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, la mesure de la concentration en uracile plasmatique, et - la mesure du rapport des concentrations plasmatiques 15 dihydrouracile/uracile. 2. Méthode de diagnostic in vitro de la prédisposition d'un sujet au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5fluorouracile, ladite méthode comprenant la réalisation sur un ou plusieurs échantillons biologiques, dont au moins un prélèvement sanguin, de la combinaison d'au moins 2 tests in vitro choisis dans le groupe constitué de: - la détermination de la présence ou de l'absence 25 d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, la mesure de la concentration en uracile plasmatique, et - la mesure du rapport des concentrations plasmatiques 30 dihydrouracile/uracile. 3. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que ladite méthode comprend la combinaison de la détermination de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase et de la mesure de la concentration en uracile plasmatique. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que ladite méthode comprend la combinaison de la détermination de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, de la mesure de la concentration en uracile plasmatique, et de la mesure du rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/ uracile. 5. Méthode d'évaluation in vitro à partir d'un ou plusieurs échantillons biologiques, dont au moins un prélèvement sanguin, de la dose de 5fluorouracile adaptée à un patient atteint d'une maladie qui peut être traitée avec du 5-fluorouracile, de préférence un cancer, ladite méthode comprenant les étapes suivantes: (a) la collecte des résultats de la détermination de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, de la mesure de la concentration en uracile plasmatique, et éventuellement de la mesure du rapport dihydrouracile/uracile plasmatique; et (b) la détermination de la dose de 5-fluorouracile à injecter au patient en fonction des résultats obtenus à l'étape (a). 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre les étapes suivantes: (c) la mesure à partir d'au moins un prélèvement sanguin de la concentration plasmatique en 5-fluorouracile en fin d'injection et au cours des jours et/ou heures suivants l'injection de 5-fluorouracile, et (d) la détermination de la dose suivante de 5fluorouracile adaptée au patient en fonction du résultat de l'étape (c). 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le diagnostic in vitro d'une sensibilité accrue au 5fluorouracile, de la prédisposition d'un sujet au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5-fluorouracile, et/ou la détermination de la dose de 5-fluorouracile à injecter au patient est réalisé grâce à un algorithme de décision prenant en compte les résultats obtenus pour les au moins 2 tests in vitro réalisés. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'algorithme de décision comprend les étapes suivantes: (a) En cas -d'absence de mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase parmi celles recherchées et si la concentration en uracile plasmatique est strictement inférieure à 15 pg/L, ou - d'absence de mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase parmi celles recherchées et si la concentration en uracile plasmatique est supérieure ou égale à 15 pg/1 mais que le rapport UH2/U est supérieur ou égal à 6, le sujet ne possède pas de sensibilité accrue au 5-fluorouracile, n'est pas prédisposé au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5-fluorouracile, et le traitement peut avoir lieu aux doses standard de 5-fluorouracile (b) Dans tous les autres cas, c'est-à-dire, en cas: d'absence de mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase parmi celles recherchées, si la concentration en uracile plasmatique est supérieure ou égale à 15 pg/L, et UH2/U strictement inférieur à 6, - de présence de mutation significative hétérozygote ou homozygote dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, sans augmentation de la concentration en uracile plasmatique, - de présence de mutation significative hétérozygote ou homozygote dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, et d'augmentation de la concentration en uracile plasmatique, le sujet possède une sensibilité accrue au 5-fluorouracile, est prédisposé au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5- fluorouracile, et le rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile est calculé pour confirmer le déficit et déterminer la dose de 5-FU à administrer. Si celui ci est: (i) supérieur ou égal à 6: la dose initiale de 5- fluorouracile est diminuée de 30% par rapport à la dose standard. (ii) compris entre 3 inclus et 6 exclu: la dose initiale de 5fluorouracile est réduite de 50% par rapport à la dose standard et une mesure de la concentration plasmatique en 5-fluorouracile au cours des jours/heures suivant l'injection d'une dose de 5-fluorouracile est réalisée. (iii) compris entre 1 inclus et 3 exclu: la dose initiale de 5fluorouracile est réduite de 70% par rapport à la dose standard et une mesure de la concentration plasmatique en 5- fluorouracile au cours des jours/heures suivant l'injection d'une dose de 5-fluorouracile est réalisée (iv) strictement inférieur à 1: le traitement par le 5fluorouracile est déconseillé, même à doses réduites. Si le traitement doit malgré tout être mis en uvre, la dose initiale est réduite de 80% et une mesure de la concentration plasmatique en 5-fluorouracile au cours des jours/heures suivant l'injection d'une dose de 5-fluorouracile est indispensable. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la mutation dans le gène de la Dihydropyrimidine Déshydrogénase est choisie dans le groupe comprenant: I560S, - IVS14+ 1G>A, - D949V, L155Stop, - R21Stop, - Del TCAT295, - Del T812, - Del TG1039, - E386Stop, et - Del C1897. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le protocole de détermination à partir des cellules d'un échantillon provenant du sujet de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase comporte les étapes suivantes: - l'extraction de l'ADN génomique, ou l'extraction de l'ARN total et sa rétrotranscription en ADN complémentaire, - l'amplification en parallèle ou en multiplex d'un ou plusieurs fragments du gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, et - détermination de la taille du produit d'amplification, où la taille du produit d'amplification indique la présence ou l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le protocole de détermination à partir des cellules d'un échantillon provenant du sujet de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase comporte les étapes suivantes: - l'extraction de l'ADN génomique, l'amplification en parallèle ou en multiplex d'un ou plusieurs fragments du gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, et - le séquençage des fragments amplifiés permettant 5 l'identification de la présence ou l'absence d'une variation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase. 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le protocole de détermination de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase est une combinaison des protocoles selon les revendications 10 et 11. 13. Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que la technique de séquençage utilisée est le pyroséquençage (ou mini- séquençage luminométrique). 14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisée en ce que les amorces d'amplification utilisées sont choisies dans le groupe constitué de SEQ ID NO: 3, 4, 9, 10, 15 à 20, 23 à 28, 31, 32, 37 et 38. 15. Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que les amorces utilisées pour le pyroséquençage sont choisies dans le groupe constitué de SEQ ID NO: 40, 43, 47, 49, 50, 53 à 55, 57 et 60. 16. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la mesure de la concentration en uracile et/ou en dihydrouracile plasmatique est réalisée par chromatographie liquide haute performance avec détection UV, en utilisant une colonne possédant une phase stationnaire composée de particules de carbone sphériques totalement poreuses. 17. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que ladite méthode est mise en oeuvre sur un ou plusieurs échantillons biologiques, dont au moins un prélèvement sanguin, d'un patient atteint d'une maladie, de préférence un cancer, qui peut être traitée avec du 5-fluorouracile. 18. Kit de diagnostic in vitro d'une sensibilité accrue au 5fluorouracile ou d'une prédisposition d'un sujet au développement d'une toxicité à la suite d'un traitement comprenant du 5-fluorouracile, ledit kit comprenant au moins deux réactifs choisis dans le groupe constitué de: - réactifs permettant la mesure de la concentration en uracile plasmatique, - réactifs permettant la mesure du rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile, et réactifs permettant la détermination de la présence ou l'absence d'une mutation dans le gène codant pour 25 la Dihydropyrimidine Déshydrogénase. 19. Kit de diagnostic in vitro permettant la détermination de la dose de 5-fluorouracile adaptée à un patient atteint d'une maladie qui peut être traitée avec du 5-fluorouracile, de préférence un cancer, ledit kit comprenant: - au moins deux réactifs choisis dans le groupe constitué des réactifs permettant la détermination de la présence ou de l'absence d'une mutation dans le gène codant pour la Dihydropyrimidine Déshydrogénase, la mesure de la concentration en uracile plasmatique, et la mesure du rapport des concentrations plasmatiques dihydrouracile/uracile; et - des instructions permettant la détermination de la dose de 5-fluorouracile adaptée audit patient. 20. Utilisation d'au moins une amorce dont la séquence nucléique est l'une des SEQ ID NO: 3, 4, 9, 10, 15 à 20, 23 à 28, 31, 32, 37 et 38 pour l'amplification de fragments du gène codant pour la DPD. 21. Utilisation d'au moins une amorce dont la séquence nucléique est l'une des SEQ ID NO: 40, 43, 47, 49, 50, 53 à 55, 57 et 60 pour le pyroséquençage de fragments du gène codant pour la DPD.