FR 2880803 A1 20060721 FR 0500389 A 20050114 - 1 - L'invention concerne un lyophilisat de cellules d'algues brunes, son procédé d'obtention, une composition cosmétique le contenant, un complément alimentaire le contenant et les utilisations de ceux-ci. Domaine de l'invention La classe des algues brunes, encore appelées fucophycées ou phéophycées, fait partie de l'embranchement des chromophytes ou "algues colorées" souvent appelées chrysophytes. Cet embranchement rassemble les algues dont les cellules contiennent des pigments caroténoïdes "surnuméraires", comme la fucoxanthine, en plus des pigments chlorophylliens: chlorophylle a et c. La classe des algues brunes comprend les ordres des: Ascoseirales, Chordariales, Cutlériales, Desmaréstiales, Dictyosiphonales, Dictyotales, Durvilléales, Ectocarpales, Fucales, Laminariales, Nothéiales, Scytosiphonales, Sphacélariales, Sporochnales, Syringodermatales, Tiloptéridales. Tous les organismes photosynthétiques utilisent des pigments pour capturer l'énergie de la lumière, habituellement une forme de chrorophylle. La chlorophylle standard est la chlorophylle a et elle est essentielle pour le transfert de l'énergie capturée de la lumière aux molécules qui vont utiliser cette énergie. La plupart des organismes chlorophylliens ont d'autres pigments pour capturer plus de lumière mais l'énergie capturée doit toujours être transférée à une molécule de chlorophylle a. Les algues brunes utilisent plusieurs tels pigments surnuméraires comme la chlorophylle c et les caroténoïdes. Les phéophycées présentent de grandes quantités de caroténoïdes dans leurs plastides et ce sont ces pigments bruns et jaunes qui leur donnent cette couleur brune caractéristique. Le pigment caroténoïde le plus important chez les algues brunes est la fucoxanthine qui tire son nom du Fucus. La fucoxanthine absorbe les longueurs d'onde de 500 à 580 nm. - 2 - Les pigments caroténoïdes possèdent une structure aliphatique ou alicyclique. Ils sont liposolubles, ce qui favorise leur intégration directe dans certaines membranes. De ce fait, leur solubilité dans l'eau ne peut se produire que lorsqu'ils sont liés à d'autres molécules. C'est également pourquoi leur métabolisme est le plus souvent directement lié au métabolisme des lipides. Les caroténoïdes sont également appelés pigments accessoires puisqu'ils doivent transférer l'énergie qu'ils capturent à la chlorophylle a. Ces pigments sont connus du grand public par le carotène qui a donné son nom à cette famille de pigments. Les animaux et l'homme en particulier ont pour seule source de caroténoïdes leur alimentation. Les caroténoïdes ont une fonction antioxydante dans le plasma humain, notamment vis-à-vis des lipides circulants. Cette fonction s'exprime également au niveau des membranes des cellules où ils sont incorporés. Les caroténoïdes ont un rôle direct sur la coloration 20 de la peau (jaune-orangé) imitant le bronzage naturel. Art antérieur Le carotène est utilisé en complément alimentaire, à prendre quelques jours avant et pendant l'exposition au soleil, pour accélérer le bronzage. Le beta-carotène est le précurseur de la vitamine A. La prise de beta-carotène retarde l'apparition de l'érythème solaire. La vitamine A augmente la quantité de mélanine produite sous l'effet d'un rayonnement bleu. De plus, la vitamine A a un rôle protecteur anti- oxydant. Les vitamines A et E évitent la dénaturation oxydative de la mélanine sous l'effet des UV. Le carotène est associé dans les compléments alimentaires connus à la vitamine C, la vitamine E ou des flavonoïdes. L'inconvénient de l'utilisation du carotène pour colorer la peau est que la couleur obtenue est beaucoup plus orangée que celle d'un bronzage naturel. De plus, il est rapidement dégradé en vitamine A. - 3 L'astaxanthine a été montrée être un puissant antioxydant. La demande US 6,433,025 décrit son utilisation par voie orale pour prévenir et retarder les coups de soleil. La canthaxanthine, autre pigment caroténoïde, a été utilisée en complément alimentaire pour colorer la peau et la protéger des rayons UV (GB 1 323 800). Cependant, cette application de la canthaxanthine est interdite en France pour risque de cécité alors qu'elle est toujours commercialisée aux Etats-Unis (Canthorex, Laboratoires DELTA ). Le cancer de la peau ou mélanome sera le plus fréquent dans les prochaines années en France et l'est déjà aux USA avec environ 800 000 cas/an. Il est le plus souvent la conséquence d'une prolifération intempestive de cellules de la peau suite à des mutations de l'ADN provoquées par les rayons ultraviolets (UV). Les populations prennent peu à peu conscience de ces risques et veulent se protéger du soleil. Cependant, une peau bronzée reste une caractéristique avantageuse et recherchée répondant aux critères esthétiques actuels. Les fabricants de préparations cosmétiques et pharmaceutiques sont donc constamment à la recherche de principes actifs pour pigmenter artificiellement la peau et la protéger des effets néfastes des UV. Résumé de l'invention La Demanderesse a découvert de manière surprenante et inattendue qu'un lyophilisat de cellules d'algues brunes, en particulier de gamétophytes, enrichi en fucoxanthine permet d'atteindre cette combinaison d'effets recherchée: il pigmente l'épiderme avec une parfaite innocuité en stimulant la mélanogenèse, même sans irradiation UV, tout en le protégeant par une activité anti-radicalaire et stimulant sa régénération. En effet, les algues brunes ont un cycle complexe digénétique. Chez les Laminariales (voir Figure 1), on peut observer l'alternance entre un sporophyte diploïde - 4 - développé en thalle macroscopique et des gamétophytes mâles et femelles haploïdes microscopiques. Les gamétophytes ne sont dans ce cas qu'un ensemble de cellules issu de différentes mitoses de la spore. Le gamétophyte est fugace dans le temps et n'est que le stade de production des gamètes. Comme il n'est pas développé en véritable thalle, il fait peu de photosynthèse et renferme un taux maximum de pigments protecteurs: la fucoxanthine, par rapport aux véritables pigments photosynthétiques que sont les chlorophylles. La Demanderesse a donc sélectionné ce stade gamétophyte pour obtenir un lyophilisat de cellules d'algues brunes extrêmement enrichi en fucoxanthine, facilement et à faible coût par rapport à une extraction de fucoxanthine classique, à partir d'une biomasse disponible à volonté et toute l'année. Description détaillée de l'invention L'objet premier de la présente invention est donc un lyophilisat de cellules d'algues brunes enrichi en fucoxanthine, en particulier qui comprend au moins 1 % de fucoxanthine. Lesdites cellules d'algues brunes sont de préférence des spores ou des gamétophytes, de façon particulièrement préférée des gamétophytes. Le second objet de la présente invention est un procédé d'obtention d'un lyophilisat de cellules de gamétophytes d'algues brunes qui comprend les étapes suivantes. - récolte des sporophytes matures - émission des spores in vitro germination des spores in vitro - récolte des cellules de gamétophytes lyophilisation des cellules de gamétophytes obtenues On appelle "sporophyte mature" un sporophyte qui comprend des spores dans des réceptacles particuliers, par exemple des sores. Le troisième objet de la présente invention est une préparation cosmétique à usage topique qui comprend un - 5 - lyophilisat selon l'invention en tant que principe actif, de préférence en une quantité se trouvant dans la gamme de 0,2 à 5% en poids, de manière particulièrement préférée, de 1 à 2% en poids. Le quatrième objet de la présente invention est un complément alimentaire qui comprend un lyophilisat selon l'invention en tant que principe actif. La préparation cosmétique selon l'invention peut être utilisée pour pigmenter la peau, pour préparer la peau à une exposition aux rayons UV, pour protéger la peau du stress oxydatif provoqué par les rayons UV et/ou pour protéger la peau contre le vieillissement cellulaire. Le complément alimentaire selon l'invention peut être utilisé pour préparer la peau à une exposition aux rayons UV. Légende des Figures Figure 1: cycle de reproduction des Laminariales Figure 2: coupes d'épidermes traité/non traité colorés à l'HES Exemple 1: Obtention de gamétophytes d'algues brunes laminariales Des cellules de gamétophytes ont été obtenues pour les espèces suivantes Laminaria saccharina, Laminaria hyperborea, Alaria esculenta, Undaria pinnatifida. On récolte des thalles sporophytes fertiles matures présentant des sores (voir Figure 1) à JO sur les côtes françaises bretonnes entre octobre et février. On les nettoie à l'eau de mer filtrée et on les découpe en morceaux de 5 à 10 cm2 que l'on trempe successivement dans de l'eau de mer filtrée, dans de l'eau de javel à 0,2% pendant 20 à 30 secondes, dans deux bacs d'eau de mer filtrée. Ensuite, on sèche les morceaux de thalle sur du papier absorbant, on les répartit par 30 sur une feuille de papier absorbant et on roule les feuilles de papier absorbant. Les feuilles de papier absorbant roulées renfermant les - 6 - morceaux de thalles sont incubées pendant 12 h à 15 C. Ensuite, on les place dans de l'eau de mer filtrée et les spores sont alors émises. On incube les spores dans un milieu de culture défini contenant 0, 1% de solution de Provasoli (voir Tableau 1) dans un ballon en présence de lumière (1800-2000 lux, 24h/24) sous agitation douce. La température est augmentée d'un demi degré par jour jusqu'à 22 C. Le milieu est renouvelé tous les 15 jours. Les spores germent au bout de 6 à 20 jours de culture et les gamétophytes sont récoltés au bout de 10-12 jours après la germination (voir Tableau 2) . Tableau 1: composition de la solution de Provasoli pour 1L EDTA 3 g Fe(Cl) 0,08 g Mn(Cl) 0,12 g Zn(Cl) 0,015 g Co(Cl) 0,003 g Ca(So4) 0, 0012 g B(H3BO3) 0,6 g Mo (Na2MoO4) 0,05 g Tableau 2 Espèce Temps de Obtention des germination en gamétophytes à jours Laminaria 9 J19-J21 saccharina Laminaria 11-20 J21-J32 hyperborea Alaria esculenta 6-7 J16-J19 Undaria 7 J17-J19 pinnatifida - 7 - Exemple 2: Obtention d'un lyophilisat de cellules de gamétophytes d'algues brunes Inhibition du gamétophyte par un milieu dépourvu en sulfate de kanamycine et dioxyde de germanium pour empêcher la 5 germination de la plantule. On filtre la culture sur tamis, on rince les cellules à l'eau de mer et on les lyophilise dans un lyophilisateur à plaques. Pour titrer la fucoxanthine par HPLC, on fait une extraction à l'éthanol à raison de 0,05% de produit lyophilisé pour 10 ml d'éthanol à 70%, agitation 6 h à l'obscurité puis filtration. L'analyse par HPLC se fait sur colonne Adsorbsphere (Alltech) avec pour solvant/gradient: A = Acétate d'ammonium/méthanol (20:80) B = Acétonitrile à 90% C = Acétate d'éthyle Exemple 3: Préparation du produit BB On prépare selon l'Exemple 2 un lyophilisat de gamétophytes de l'algue Undaria pinnatifida (Laminariacées). Afin d'utiliser ce lyophilisat de façon appropriée sur culture de peau, le lyophilisat est remis dans le milieu de culture des gamétophytes) . Ce mélange est soniqué puis filtré. Le résultat de ce produit filtré est appelé produit BB . Exemple 4 Evaluation de la tolérance muqueuse d'un lyophilisat de cellules de gamétophytes d'algues brunes par 30 étude de la cytotoxicité sur cornée reconstituée SKINETHIC 1- Protocole expérimental On utilise des kératinocytes de la lignée TR 146, transformée spontanément amplifiée par culture cellulaire en milieu défini MCDB 153 modifié. Lorsqu'ils sont cultivés à l'interface air/liquide en milieu défini, ces kératinocytes humains forment un épithélium pluristratifié sans couche cornée ressemblant à la cornée humaine. - 8 - On applique le produit à étudier, ici le produit BB selon l'Exemple 3, à raison de 30 L sur la surface de huit cultures équivalentes à l'aide d'une micro-pipette. Ces cultures sont ensuite incubées à 37 C, 5% de CO2, pendant 10 minutes, 1 heure, 3 heures et 24 heures, à raison de deux cultures par temps d'incubation. Les contrôles négatifs (solution saline tamponnée) et positifs (SDS 0,5% et 1%) sont préparés stérilement et déposés de la même manière sur deux cultures, respectivement. Ces cultures sont ensuite incubées à 37 C, 5% de CO2, pendant 1 heure et 24 heures, à raison de deux cultures par temps d'incubation. 2- Evaluation de la viabilité cellulaire La viabilité cellulaire est ensuite mesurée qualitativement après marquage par un colorant vital. Le système MTT mesure l'activité déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes. La composante clef est le bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-2,5-diphényl tétrazolium ou MTT. Les solutions salines tamponnées de MTT, en absence de rouge de phénol, sont de couleur jaune. Les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes coupent le cycle tétrazolium, induisant ainsi la formation de cristaux pourpres de formazan, insolubles dans les solutions aqueuses. Les cristaux formés par les cellules viables sont piégés dans les filtres polycarbonate servant de support aux cultures épithéliales. Les cultures deviennent uniformément de couleur bleu/pourpre intense lorsqu'elles sont viables, mais restent de couleur blanche/jaune si il y a mortalité cellulaire. Les résultats sont comparés par rapport aux substances 35 contrôles négatif et positif. 0,15 ml de milieu de culture contenant 10% vol/vol de solution MTT sont pipetés sous chacun des filtres/support de culture. Après une incubation de 30 min à température - 9 - ambiante, la couleur des différentes cultures est observée. Les cultures contrôles négatifs doivent être de couleur bleue/pourpre intense, preuve de la viabilité de la muqueuse après 24 heures de contact. Les cultures contrôles positifs doivent être de couleur blanche, preuve de la mortalité cellulaire dès la lère heure de contact. 3- Résultats 10 Tableau 3 Couleur des deux cultures PRODUIT 10 min 1 h 3 h 24h TOXICITE BB bleu bleu bleu blanc NI Contrôle négatif bleu bleu bleu bleu NI SDS 0,5% bleu blanc blanc / I SDS 1% blanc blanc / / TI NI = non irritant I = irritant TI = très irritant 4- Conclusion Dans les conditions expérimentales retenues, le produit BB selon l'Exemple 3, étudié pur, est non irritant vis-à-vis des cellules constituant le modèle SKINETHIC de muqueuse reconstituée in vitro. Exemple 5 Evaluation de la tolérance cutanée d'un lyophilisat de cellules de gamétophytes d'algues brunes par étude de la cytotoxicité sur épiderme reconstitué SKINETHIC 1- Protocole expérimental Des kératinocytes d'origine humaine sont ensemencés sur des filtres en polycarbonate de 0,63 cm' dans un milieu défini (MCDB 153 modifié) et supplémenté. Les cellules sont cultivées pendant 10 jours à l'interface air/liquide, le - 10 - milieu de culture étant changé tous les deux jours. Les épidermes ainsi formés ont été utilisés pour la réalisation de l'étude à partir du 14ème jour de culture. L'essai a été conduit en triplicate après 24 heures d'incubation du produit, à raison de 2 l par épiderme. Des épidermes témoins ne reçoivent pas de produit. Les épidermes fixés dans une solution de formaldéhyde 10 % ont été inclus dans des blocs en paraffine. Les coupes verticales de 4 microns ont été colorées à l'HES (hématoxyline/éosine/safran) et photographiées sous un microscope optique. Si le produit n'est pas toxique, les cultures doivent présenter des couches cellulaires basales, spineuses, granuleuses et cornées intactes orthokératosique, et la stratification épidermique doit être régulière et normale. Les cellules de la couche basale doivent être polarisées verticalement. De nombreux grains de kératohyaline doivent être visibles (en violet) dans la couche granuleuse juste sous la couche cornée. 2- Résultats cf. Figure 2 3- Conclusion Dans les conditions expérimentales retenues, le produit BB selon l'Exemple 3, étudié pur, s'est révélé non cytotoxique vis-à-vis des épidermes reconstitués SKINETHICe. Exemple 6: Tests de pigmentation 1- Matériel et Méthodes Le produit BB est dilué dans l'éthanol puis incorporé dans une formulation cosmétique. Les produits testés sont: a- le produit BB incorporé en formulation à 0, 05% b- le produit BB incorporé en formulation à 0,15% c-le produit BB incorporé en formulation à 0,30% Ils sont conservés à 4 C jusqu'à leur utilisation. - 11 - 2- Evaluation biochimique A la fin de l'incubation, la mélanine contenue dans les lysats cellulaires a été quantifiée par une méthode spectrophotométrique. Une gamme de mélanine a été réalisée en parallèle du dosage. Les résultats sont donnés sous la forme de g de mélanine par ml de lysat des tapis cellulaires (moyennes +/- la déviation standard SD). La significativité statistique des différences observées entre les conditions traitées et témoins a été évaluée par une analyse de la variance à un facteur (One Way ANOVA) suivie d'un test de Bonferroni ttest (* :p Tableaux 4, 5 et 6: quantification biochimique du contenu mélanique d'épidermes humains reconstruits mélanisés traités/non traités: SANS UV Milieu a-MSH ETOH BB seul 100 nM 0, 05 0, 15 0, 3 0, 15 sans réapplication Mélanine 47,3 70,3 56,6 59,9 69,1 70,3 ( g/ml) 67,3 86,9 58,7 60,5 77,2 69,0 75,8 85 56,1 66,1 56 58,5 Moyenne 57,3 80,7 57,1 62,2* 73, 1** 69,6* S.D. 14,1 9,1 1,3 3,4 5,7 0,9 % milieu 100 141 100 108 128 122 seul % ETOH BB 100 108,8 128 121,9 + WA Milieu a-MSH ETOH BB seul 100 0, 05 0,15 0,3 0,15 sans nM ré- application Mélanine 57,4 95,6 69,7 63,5 64, 7 61,2 ( g/ml) 73,9 84,7 66,3 64,1 66,3 66,3 - 12 - 73,4 107,9 57,3 65,7 Moyenne 68,2 96,1 64,5 64,4 65,5 62,6 S.D. 9,4 11,6 6,4 1,2 1,2 3,3 % milieu 100 141 94 94 96 92 seul + WB Milieu a-MSH ETOH BB seul 100 nM 0, 05 0,15 0,3 0,15 sans ré- application Mélanine 82,6 99,5 60,7 64,6 40,1 44,8 ( g/ml) 91,4 115,5 65,8 66,1 30,9 65,3 75,3 104,6 67,1 70,5 38,7 64, 5 Moyenne 83,1 106,5 64,5 67,1 36,6 58,2 S.D. 8 8,2 3,4 3,1 5 11,6 % milieu 100 128 78 81 44 70 seul 3- Evaluation histologique Les épidermes ont été fixés dans du formaldéhyde dès la fin de l'incubation, puis inclus dans des blocs de paraffine. Des coupes de 4 m d'épaisseur ont alors été réalisées. La mélanine présente dans les coupes de peau a été mise en évidence par une coloration spécifique appelée Fontana Masson . Dis clichés par condition ont été réalisés au grossissement x400. La mélanine visualisable sur ces clichés a été quantifiée par analyse d'images en utilisant le logiciel ImageJ. Les résultats sont donnés sous la forme de surface occupée par la mélanine (nombre de pixels dont le niveau de gris est compris entre 0 et 100; 0 = noir/255 = blanc) dans chacun des clichés (moyenne +/- la déviation standard, SD). La significativité statistique des différences observées entre les conditions traitées et les témoins a été évaluée par un test de Student (* : p - 13 - Tableau 7: quantification du contenu mélanique d'épidermes humains reconstruits mélanisés traités/non traités par analyse d'images: SANS UV Milieu a-MSH ETOH BB seul 100 nM 0,05 0,15 0,3 0,15 sans ré-application 24131 38565 22754 29849 22821 22036 17119 25757 16628 15245 15368 19500 Surface 30306 42233 16392 36248 20144 25949 occupée 13966 55615 12954 7678 19722 16277 par 9673 51363 22308 6990 21260 11746 la 19100 43652 7362 10329 18916 19408 mélanine 13226 44188 4473 10212 20203 42503 (pixels) 20874 44053 17132 22152 25844 19002 26733 22738 17195 25753 17680 30479 18715 34614 9717 15909 17895 14747 Moyenne 19384,3 40277,8 14691,5 18036,5 19985,3* 22164,7* S.D. 6370,9 10308,4 6034,9 10055,1 2911, 3 8944,6 % milieu 100 208 76 93 103 114 seul % ETOH BB - -100 122,8 136 150,9 3Résultats La formulation "ETOH BB 0,15" augmente significativement le contenu en mélanine d'épidermes humains reconstruits mélanisés, non exposés aux UVA ou aux UVB, sans ré-application (+22% par analyse biochimique, +51% par analyse d'images). La formulation "ETOH BB 0,3" augmente significativement le contenu en mélanine d'épidermes humains reconstruits mélanisés, non exposés aux UVA ou aux UVB (+28% par analyse biochimique, +36% par analyse d'images). - 14 - Exemple 7: effets sur le transport des macromolécules: 7.1Evaluation de la vitesse du transport des macromolécules (glucides, lipides et protéines) dans un système de microsomes isolés. Effet direct du produit B.B. sur les microsomes isolés: Les microsomes de kératinocytes humains constituent une fraction membranaire obtenue par centrifugation différentielle à haute vitesse d'un homogénat de cellules. Cette préparation de microsomes nécessite l'ajout de cofacteurs exogènes tels que le NADPH. 7.1.1-Transport des glucides (glucose) L'essai a été conduit en triplicate après traitement direct des microsomes. - Lot 1: témoin négatif ne recevant aucun produit. -Lot 2: témoin positif (phloretine, 0,25 mM) - Lots 3-5 traités par le produit à l'étude (3 concentrations) - Lots 6-8: traités par la phloretine 0,25 mM et par le produit à l'étude (3 concentrations) Les microsomes obtenus à partir de kératinocytes humains en culture ont été rincés 3 fois avec un tampon PBS sans glucose puis pré-incubés dans 1 ml du même tampon pendant 30 minutes à 37 C. Cette solution a été ensuite éliminée et les microsomes ont été mis dans le tampon PBS sans glucose contenant du 3 - 0 -Méthyl glucose (MG) et du [3H] 3-0-MG sous agitation dans un bain marie à 37 C. La capture du 3-0-MG est arrêtée par l'ajout de 1 ml de PBS froid contenant de la cytochalasine B. La cinétique d'incubation a été réalisée entre 30 et 120 secondes. Les microsomes ont ensuite été rincés 2 fois avec du PBS puis dissous dans NaOH (1M) à 4 C pendant une nuit. La radioactivité a été déterminée à l'aide d'un compteur à scintillation. Les traitements des microsomes par le produit B.B. seul ou en présence de la phloretine ont été réalisés en même temps - 15 - que l'introduction du [3H] 3-0-MG dans le milieu d'incubation. Le dosage des protéines a été réalisé selon la méthode de BRADFORD. L'augmentation de l'absorbance à 595 nm, déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre, est proportionnelle à la concentration en protéines. Résultats: Capture du [3H]3-0-MG (nmol/mg de protéines) s 60 s 90 s 120 s Témoin négatif 9 15 19 21 BB 1/10 10 14 20 22 BB 1/5 9 15 20 22 BB 1/2 11 16 21 21 Phloretine (0,25 4 6 8 8 mM) BB 5 11 17 19 (1/10)+ Phloretine BB (1/5)+Phloretine 6 12 18 21 BB (1/2)+Phloretine 7 14 18 22 Les résultats obtenus, après traitement direct des microsomes de kératinocytes par le produit B.B. aux concentrations retenues ne montrent aucune inhibition de la vitesse de transport du glucose. La cinétique de la capture du glucose dans les conditions physiologiques est quasi- - 16 -identique entre les microsomes témoins et les microsomes traités par le produit B.B. aux 3 concentrations retenues. Le traitement direct des microsomes par la phloretine inhibe fortement la vitesse de transport du glucose. Le traitement des microsomes par le produit B.B. aux 3 concentrations en même temps que la phloretine rétablit significativement la vitesse du transport du glucose. La cinétique de capture du glucose, dans les conditions d'inhibition est parfaitement rétablie par le produit B.B. aux 3 concentrations retenues. 7.1.2-Transport des lipides L'essai a été conduit en triplicate après traitement direct des microsomes. - Lot 1: témoin négatif ne recevant aucun produit. 15 -Lot 2: témoin positif (Diphenhydramine 1 mM) - Lot 3-5 traité recevant le produit à l'étude (3 concentrations) - Lot 6-8: traité par la Diphenhydramine 1 mM et par le produit à l'étude (3 concentrations) Les microsomes obtenus à partir de kératinocytes humains en culture ont été rincés 3 fois avec un tampon Tris 25 mM puis pré-incubés dans 1 ml du même tampon pendant 30 minutes à 37 C. Cette solution a été ensuite éliminée et les microsomes ont été mis dans le tampon Tris 25 mM contenant du [3H] Choline sous agitation dans un bain marie à 37 C. La capture de la choline a été arrêtée par l'ajout d'un tampon de lyse contenant (50 mM de Tris, 140 mM NaCl, 1,5 mM MgSO4, 0,5% Igepal-Ca-630, 0,2% SDS).La cinétique d'incubation a été réalisée entre 30 et 120 secondes. Les microsomes ont été ensuite rincés 2 fois avec du PBS puis dissous dans NaOH (1M) à 4 C pendant une nuit. La radioactivité a été déterminée à l'aide d'un compteur à Scintillation. - 17 - Les traitements des microsomes par le produit B.B. seul ou en présence de la Diphénhydramine (DPA) ont été réalisés en même temps que l'introduction de [3H]Choline dans le milieu d'incubation. Le dosage des protéines a été réalisé selon la méthode de BRADFORD. L'augmentation de l'absorbance à 595 nm, déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre, est proportionnelle à la concentration en protéines. Résultats: Capture de [3H]choline (pmol/mg de protéines) s 60 s 90 s 120 s Témoin 155 201 261 301 négatif BB 1/10 175 212 268 310 BB 1/5 163 210 277 321 BB 1/2 194 240 289 312 DPA (1 mM) 74 105 132 142 BB (1/10)+ 100 121 153 183 DPA BB (1/5)+ DPA 113 131 168 199 BB (1/2)+ DPA 125 140 189 223 Les résultats obtenus, après traitement direct des microsomes de kératinocytes par le produit BB aux concentrations retenues ne montrent aucune inhibition de la - 18 - vitesse de transport des lipides. La cinétique de la capture de la choline dans les conditions physiologiques est quasi- identique entre les microsomes témoins et les microsomes traités par le produit B.B. aux 3 concentrations retenues. Les résultats obtenus montrent que le traitement direct des microsomes par la Diphénhydramine inhibe fortement la vitesse de transport des lipides. Le traitement des microsomes par le produit B.B. aux 3 concentrations en même temps que la Diphénhydramine rétablit la vitesse du transport des lipides. La cinétique de capture de la choline, dans les conditions d'inhibition est moyennement rétablie par le produit BB aux 3 concentrations retenues. 7.1.3-Transport des protéines (albumine) L'essai a été conduit en triplicate après traitement direct des microsomes. -Lot 1: témoin négatif ne recevant aucun produit. - Lot 2: témoin positif (Nocodazole, 6 mg/ml) - Lots 3-5 traités recevant le produit à l'étude (3 20 concentrations) - Lots 6-8: traités par le Nocodazole 6 mg/ml et par le produit à l'étude (3 concentrations) Les microsomes obtenus à partir de kératinocytes humains en culture ont été rincés 3 fois avec un tampon" puis pré- incubés dans 1 ml du même tampon pendant 30 minutes à 3-C. Cette solution a été ensuite éliminée et les microsomes ont été mis dans le tampon HBSS contenant du l'albumine-FITC sous agitation dans un bain marie à 37 C. La capture de l'albumine est arrêtée par l'ajout d'une solution de Ringer contenant (122,5 mM NaCl; 5,4 mM KC1; 1,2 mM CaC12; 0,8 mM MgC12; 0,8 Na2HPO4; 0,2 NaHPO4; 5,5 mM glucose; 10 mM HEPES, pH 7,4). Les microsomes ont été ensuite traités avec du Triton X-100 à (0,1% v/v dans du 3- (Nmorpholino) acide propanesulfonique, 20 mM, pH 7,4). La - 19 fluorescence a été quantifiée à l'aide d'un spectrophotomètre (excitation 480 nm: émission 520 nm). La cinétique d'incubation a été réalisée entre 30 et 120 secondes. Les traitements des microsomes par le produit B.B. seul ou en présence deNocodazole, (ND) ont été réalisés en même temps que l'introduction du l'albumine-FITC dans le milieu d'incubation. Le dosage des protéines a été réalisé selon la méthode de BRADFORD. L'augmentation de l'absorbance à 595 nm est proportionnelle à la concentration des protéines déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre. Résultats: Capture de l'albumine-FITC ( g/mg de protéines) s 60 s 90 s 120 s Témoin 0,32 0,45 0,55 075 négatif BB 1/10 0,3 0,47 0,59 0,74 BB 1/5 0,37 0,5 0,62 0,76 BB 1/2 0,4 0,55 0,67 0,8 ND (6 mg/ml) 0,11 0,29 0,34 0, 43 BB (1/10)+ND 0,12 0,3 0,33 0,41 BB (1/5)+ND 0,19 0,33 0,38 0,49 BB (1/2)+ND 0,23 0,38 0,44 0,57 - 20 - Les résultats obtenus, après traitement direct des microsomes de kératinocytes par le produit B.B. aux concentrations retenues ne montrent aucune inhibition de la vitesse de transport des protéines. La cinétique de la capture de l'albumine dans les conditions physiologiques est quasi-identique entre les microsomes témoins et les microsomes traités par le produit B.B. aux 3 concentrations retenues. Les résultats obtenus montrent que le traitement direct des microsomes par le Nocodazole inhibe fortement la vitesse de transport des lipides. Le traitement des microsomes par le produit B.B. aux concentrations 1/5 et 1/2 en même temps que le Nocodazole rétabli moyennement la vitesse du transport des lipides. Aucun effet n'a été observé à la concentration 1/10. 7.2-Evaluation de la vitesse du transport des macromolécules au niveau des kératinocytes humains normaux La méthode utilisée a été celle des explants permettant d'obtenir à partir d'une biopsie de peau humaine, des primo-cultures de kératinocytes. Les essais ont été réalisés sur des kératinocytes entre le 2ème et le 4ème passage afin d'assurer une reproductibilité entre les différentes expériences. Les kératinocytes ont été répartis dans des plaques multipuits (6 puits) à raison de 105 cellules par puits dans 1 ml de milieu de culture SKINETHIC supplémenté par de l'insuline et de l'hydrocortisone. Les cellules ont été incubées en présence et en absence du produit à l'étude. 7.2.1-Transport des glucides (glucose) L'essai a été conduit en triplicate sur des kératinocytes humains en culture normaux. - Lot 1: témoin négatif ne recevant aucun produit. - Lot 2: témoin positif (Phloretine, 0,25 mM) - Lot 3: traité recevant le produit à l'étude - 21 - -Lots 6-8: traité par la phloretine 0,25 mM et par le produit à l'étude (3 concentrations) Le traitement des kératinocytes par le produit B.B. en présence et en absence de la phloretine (0,25 mM) a été réalisé pendant 20 minutes à 37 C. Les microsomes membranaires ont été séparés par centrifugation différentielle. Le même protocole de capture de [3H] 3-0-Methyl-Glucose a été adopté pour la détermination de la vitesse du transport 10 du glucose. (cf. 6.1.1) Résultats: Capture du [3H]3-O-MG (nmol/mg de protéines) s 60 s 90 s 120 s Témoin négatif 6 12 15 19 BB 1/10 7 10 16 17 BB 1/5 8 13 17 18 BB 1/2 10 14 18 20 Phloretine (0,25 6 8 9 10 mM) BB 6 10 15 18 (1/10)+ Phloretine BB (1/5)+Phloretine 7 13 16 19 BB (1/2)+Phloretine 8 13 17 18 Les résultats obtenus, après traitement des kératinocytes 15 normaux par le produit B.B. préalablement à la séparation - 22 - des microsomes ne montrent aucune inhibition de la vitesse de transport du glucose. La cinétique de la capture du glucose dans les conditions physiologiques est quasi-identique entre les microsomes des kératinocvtes témoins et les microsomes des kératinocytes traités par le produit B.B. aux 3 concentrations retenues. Le traitement des kératinocytes normaux par la phloretine préalablement à la séparation des microsomes inhibe fortement la vitesse de transport du glucose. Le traitement des kératinocytes normaux par le produit B.B. aux 3 concentrations en même temps que la phloretine rétabli significativement la vitesse du transport du glucose. La cinétique de capture du glucose, dans les conditions d'inhibition est parfaitement rétablie par le produit B.B. aux 3 concentrations retenues. 7.2.2-Transport des lipides L'essai a été conduit en triplicate sur des kératinocytes humains en culture normaux. - Lot 1: témoin négatif ne recevant aucun produit. 20 -Lot 2: témoin positif (Diphenhydramine 1 mM) - Lot 3-5 traité recevant le produit à l'étude (3 concentrations) - Lot 6-8: traité par la Diphenhydramine 1 mM et par le produit à l'étude (3 concentrations) Le traitement des kératinocytes par le produit B.B. en présence et en absence de la Diphenhydramine 1 mM a été réalisé pendant 120 minutes à 37 C. Les microsomes membranaires ont été séparés par centrifugation différentielle. Le même protocole de capture de [3H] Choline a été adopté pour la détermination de la vitesse du transport de la choline (cf. 6.1.2) - 23 Résultats: Capture de [3H]choline (pmol/mg de protéines) s 60 s 90 s 120 s Témoin 142 173 202 215 négatif BB 1/10 151 163 198 223 BB 1/5 162 178 207 227 BB 1/2 174 191 218 231 DPA (1 mM) 92 115 143 156 BB (1/10)+ 112 128 159 174 DPA BB (1/5)+ DPA 119 132 165 179 BB (1/2)+ DPA 127 139 174 191 Les résultats obtenus, après traitement des kératinocytes normaux par le produit B.B. préalablement à la séparation des microsomes ne montrent aucune inhibition de la vitesse de transport des lipides. La cinétique de la capture de la choline dans les conditions physiologiques est quasi- identique entre les microsomes des kératinocytes témoins et les microsomes des kératinocytes traités par le produit B.B. aux 3 concentrations retenues. Le traitement des kératinocytes normaux par la Diphenhydramine préalablement à la séparation des microsomes inhibe modérément la vitesse de transport des lipides. Le traitement des kératinocytes normaux par le produit BB aux 3 concentrations en même temps que la Diphenhydramine rétablit la vitesse du transport des lipides. La cinétique de capture de la choline, dans les - 24 - conditions d'inhibition est moyennement rétablie par le produit BB aux 3 concentrations retenues. 7.2.3- Transport des protéines (albumine) L'essai a été conduit en triplicate sur des kératinocytes 5 humains en culture normaux. -Lot 1: témoin négatif ne recevant aucun produit. - Lot 2: témoin positif (Nocodazole, 6 mg/ml) - Lot 3-5 traité recevant le produit à l'étude (3 concentrations) -Lot 6-8: traité par la Nocodazole, 6 mg/ml et par le produit à l'étude (3 concentrations) Le traitement des kératinocytes par le produit B.B. en présence et en absence du Nocodazole, 6 mg/ml a été réalisé pendant 120 minutes à 37 C. Les microsomes membranaires ont été séparés par centrifugation différentielle. Le même protocole de capture de l'albumine-FITC a été adopté pour la détermination de la vitesse du transport de l'albumine (cf. 3.1.4.2) Résultats: Capture de l'albumine-FITC ( g/mg de protéines) s 60 s 90 s 120 s Témoin 0,25 0,39 0,45 0,61 négatif BB 1/10 0,24 0,40 0,48 0,63 BB 1/5 0,28 0,44 0,52 0,67 BB 1/2 0,31 0,46 0,54 0,73 ND (6 mg/ml) 0,09 0,22 0,26 0,37 - 25 - BB (1/10)+ND 0,1 0,24 0,26 0,39 BB (1/5)+ND 0,12 0,27 0, 30 0,41 BB (1/2)+ND 0,16 0,29 0,36 0,47 Les résultats obtenus, après traitement des kératinocytes normaux par le produit B.B. préalablement à la séparation des microsomes ne montrent aucune inhibition de la vitesse de transport des protéines. La cinétique de la capture de l'albumine dans les conditions physiologiques est identique entre les microsomes des kératinocytes témoins et les microsomes des kératinocytes traités par le produit B.B. à la concentration 1/10. Une faible augmentation de la vitesse du transport des protéines est observée aux concentrations 1/2 et 1/5. Le traitement des kératinocytes normaux par le Nocodazole préalablement à la séparation des microsomes inhibe la vitesse de transport des protéines. Le traitement des kératinocytes normaux par le produit B.B. aux 2 concentrations en même temps que le Nocodazole rétablit moyennement la vitesse du transport des protéines. Aucun effet n'a été observé à la concentration 1/10. 7.3- Evaluation de la vitesse du transport des macromolécules au niveau des kératinocvtes humains en sénescence La sénescence est un phénomène de vieillissement cellulaire, où les cellules sont bloquées en phase G1 du cycle cellulaire et ne rentrent jamais dans la phase de synthèse conduisant à la division cellulaire. Les cellules sénescentes sont caractérisées par leur métabolisme lent au niveau de la synthèse et du transport des macromolécules. - 26 - Les cellules en culture privées de sérum, arrêtent de croître, mais continuent de traverser le cycle cellulaire jusqu'à ce qu'elles atteignent la phase G1. La méthode utilisée a été celle permettant d'obtenir, à partir d'une biopsie de peau humaine, des primo-cultures de kératinocytes. Les essais ont été réalisés sur des kératinocytes, entre le 8ème et le 10ème passage, afin d'assurer la présence des cellules sénescentes au niveau des cellules témoins. Les kératinocytes ont été ensemencés dans des plaques multipuits (6 puits) , à raison de 105 cellules par puit dans 3 ml de milieu de culture SKINETHIC supplémenté par l'EGF,l'hydrocortisone, l'insuline et la gentamicyne. Ils ont été ensuite maintenus pendant 5 jours en étuve à CO2. 7.3.1-Transport des glucides (glucose) L'essai a été conduit en triplicate sur des kératinocytes humains en sénescence. - Lot 1: témoin négatif ne recevant aucun produit. 20 -Lot 2: témoin positif (Phloretine, 0,25 mM) - Lot 3: traité recevant le produit à l'étude - Lots 6-8: traités par la phloretine 0,25 mM et par le produit à l'étude (3 concentrations) Le traitement des kératinocytes par le produit B.B. en présence et en absence de la phloretine (0,25 mM) a été réalisé pendant 20 minutes à 37 C. Les microsomes membranaires ont été séparés par centrifugation différentielle. Le même protocole de capture de [3H] 3-0-Methyl-Glucose a 30 été adopté pour la détermination de la vitesse du transport du glucose (cf. 6. 1.1). - 27 - Résultats: Capture du [3H]3-O-MG (nmol/mg de protéines) s 60 s 90 s 120 s Témoin négatif 3 5 10 11 BB 1/10 4 8 12 12 BB 1/5 6 8 13 13 BB 1/2 7 10 14 15 Phloretine (0,25 1 3 5 7 mM) BB 3 5 7 8 (1/10)+ Phloretine BB (1/5)+Phloretine 5 8 9 11 BB (1/2)+Phloretine 6 10 12 13 Les résultats obtenus montrent que la vitesse de transport du glucose est nettement faible aux niveaux des kératinocytes en sénescence par rapport aux kératinocytes normaux. Le traitement des kératinocytes en sénescence par le produit B.B., préalablement à la séparation des microsomes, montre une augmentation de la vitesse de transport du glucose par rapport aux cellules témoins non traitées. La cinétique de la capture du glucose dans les conditions physiologiques est supérieure au niveau des microsomes des kératinocytes traités par le produit B.B. par rapport aux microsomes des kératinocytes témoins. Ce résultat est obtenu aux différents temps d'incubations (30, 60, 90 et 120 secondes). 2880803 - 28 - Le traitement des kératinocytes en sénescence par la phloretine préalablement à la séparation des microsomes inhibe fortement la vitesse de transport du glucose. Le traitement des kératinocytes normaux par le produit B.B. aux 2 concentrations (1/5 et 1/2) en même temps que la phloretine rétablit significativement la vitesse du transport du glucose. Un faible effet est observé avec la concentration 1/10. 7.3.2- Transport des lipides L'essai a été conduit en triplicate sur des kératinocytes humains en sénescence. - Lot 1: témoin négatif ne recevant aucun produit. - Lot 2: témoin positif (Diphenhydramine 1 mM) - Lot 3-5 traité recevant le produit à l'étude (3 15 concentrations) - Lot 6-8: traité par la Diphenhydramine 1 mM et par le produit à l'étude (3 concentrations) Le traitement des kératinocytes par le produit B.B. en présence et en absence de la Diphenhydramine 1 mM a été réalisé pendant 120 minutes à 37 C. Les microsomes membranaires ont été séparés par centrifugation différentielle. Le même protocole de capture de [3H] Choline a été adopté pour la détermination de la vitesse du transport de la 25 choline (cf. 6.1.2) -29 - Résultats: Capture de [3H] choline (pmol/mg de protéines) s 60 s 90 s 120 s Témoin 114 132 164 181 négatif BB 1/10 110 135 166 173 BB 1/5 113 143 188 194 BB 1/2 121 153 187 201 DPA (1 mM) 55 79 106 119 BB (1/10)+ 52 69 110 125 DPA BB (1/5)+ DPA 67 87 132 141 BB (1/2)+ DPA 77 104 137 148 Les résultats obtenus, montrent que la vitesse de transport des lipides est nettement faible au niveau des kératinocytes en sénescence par rapport aux kératinocytes normaux. Le traitement des kératinocytes en sénescence par le produit B.B., préalablement à la séparation des microsomes, ne montre aucune inhibition de la vitesse de transport des lipides par rapport aux cellules témoins non traitées. La cinétique de la capture des lipides dans les conditions physiologiques est comparable entre les microsomes des kératinocytes traités par le produit B.B. et les microsomes des kératinocytes témoins. - 30 - Le traitement des kératinocytes en sénescence pàr la Diphenhydramine, préalablement à la séparation des microsomes, inhibe fortement la vitesse de transport des lipides. Le traitement des kératinocytes en sénescence par le produit B.B. aux 2 concentrations (1/5 et 1/2) en même temps que la Diphenhydramine rétablit significativement la vitesse du transport des lipides. Aucun effet n'a été observé avec la concentration 1/10. 7.3.3-Transport des protéines (albumine) L'essai a été conduit en triplicate sur des kératinocytes humains en sénescence. - Lot 1: témoin négatif ne recevant aucun produit. - Lot 2: témoin positif (Nocodazole, 6 mg/ml) -Lot 3-5 traité recevant le produit à l'étude (3 concentrations) -Lot 6-8: traité par la Nocodazole, 6 mg/ml et par le produit à l'étude (3 concentrations) Le traitement des kératinocytes par le produit B.B. en présence et en absence de Nocodazole, 6 mg/ml a été réalisé pendant 120 minutes à 37 C. Les microsomes membranaires ont été séparés par centrifugation différentielle. Le même protocole de capture de l'albumine-FITC a été adopté pour la détermination de la vitesse du transport de l'albumine (cf. 6.1.3) Résultats: Capture de l'albumine-FITC ( g/mg de protéines) s 60 s 90 s 120 s Témoin 0,17 0,29 0,35 0,49 négatif - 31 - BB 1/10 0,18 0,34 0, 39 0, 52 BB 1/5 0,18 0,36 0,41 0,54 BB 1/2 0,2 0,37 0,43 0,55 ND (6 mg/ml) 0,06 0,11 0,19 0,3 BB (1/10)+ND 0,05 0,12 0,22 0,33 BB (1/5)+ND 0,09 0,14 0,27 0,38 BB (1/2)+ND 0,1 0,19 0,3 0,43 Les résultats obtenus, montrent que la vitesse de transport des protéines est nettement faible aux niveaux des kératinocytes en sénescence par rapport aux kératinocytes normaux. Le traitement des kératinocytes en sénescence par le produit B.B. préalablement à la séparation des microsomes ne montre aucune inhibition de la vitesse de transport des protéines par rapport aux cellules témoins non traitées. La cinétique de la capture de l'albumine dans les conditions physiologiques est comparable entre les microsomes des kératinocytes traités par le produit B.B. et les microsomes des kératinocytes témoins. Le traitement des kératinocytes en sénescence par le Nocodazole préalablement à la séparation des microsomes inhibe la vitesse de transport des protéines. Le traitement des kératinocytes en sénescence par le produit B.B. aux 2 concentrations (1/5 et 1/2), en même temps que le Nocodazole, rétablit significativement la vitesse du transport des protéines. Un faible effet est observé avec la concentration 1/10. Exemple 8: effet sur la respiration et la synthèse d'ATP 8.1-Etude de l'effet du produit sur la respiration cellulaire et mitochondriale -32 La quantité d'oxygène dissout dans une solution peut être déterminée à l'aide d'une électrode de Clark. L'oxygène diffusant à travers un film de téflon va être réduit au niveau de la cathode de platine polarisée à -0.8 Volt. Dans ces conditions, le courant passant entre cette cathode et l'anode d'argent est proportionnel à la concentration en oxygène dans la solution. Le pont ionique entre les deux électrodes est assuré par une solution de KC1 saturée. L'acquisition et le traitement des mesures sont faits sur un microordinateur (IBM-PC) en temps réel. Un programme permet de visualiser en continu la quantité d'oxygène dans la cuve ainsi que la dérivée instantanée correspondant à la vitesse de consommation d'oxygène qui est calculée en temps réel. Cinq concentrations ont été testées et les déterminations ont été effectuées en triplicate. Cette étude est réalisée selon deux conditions différentes: 8.1.1 Effet du produit sur la respiration cellulaire: Mesure de la respiration basale Effet sur la vitesse de respiration basale sur cellules non perméabilisées en présence de glucose. Les kératinocytes ont été cultivés, en étuve à co,, à raison de 106 par run dans un milieu de culture DMEM supplémenté par l'hydrocortisone, l'EGF et le SVF (10%). Ce protocole a été réalisé par application directe du produit sur les cellules dans la cuve de l'oxygraphe. Les cellules (kératinocytes), à la concentration de 106 cellules/ml, sont mises en suspension dans un "tampon respiratoire" (Hanks-Hepes glucose 20 mM), dans la cuve de l'oxygraphe thermostatée à 30 C et équipée d'une électrode de Clark (1 ml de tampon respiratoire contenant dans ces conditions 480 atomes d'oxygène). Dans ces conditions, une vitesse de consommation d'oxygène (respiration basale des cellules) peut être mesurée. - 33 - L'ajout de différentes quantités du produit (concentrations finales: 1/10; 1/5 et 1/2) dans la cuve de l'oxygraphe permet de mettre en évidence une éventuelle stimulation ou inhibition de cette respiration. L'ensemble des déterminations est résumé dans le tableau ci-dessous. Produit testé (BB) Contrôle 1/10 1/5 1/2 Vitesse de 3,64 3,72 4,26 4,75 respiration 0,37 0,31 0,25 0,50 (nAtom O/min/106 cellules) n=3 % de respiration 100 6 102 4 117 3 130 5 basale n=3 Dans les conditions expérimentales retenues et au vu des résultats obtenus, le produit au contact des kératinocytes induit une augmentation significative de la vitesse de respiration basale aux concentrations (1/5 et 1/2). 8.1.2. Effet du produit sur la respiration mitochondriale: Effet sur la vitesse de la respiration des cellules perméabilisées en présence du substrat respiratoire, pyruvate-malate, pour évaluer la respiration mitochondriale. Les kératinocytes ont été cultivés, en étuve à CO2, à raison de 106 cellules par run dans un milieu de culture - 34 - DMEM supplémenté par l'hydrocortisone, l'EGF et le SVF (10%). Ce protocole a été réalisé par application directe du produit sur les cellules dans la cuve de l'oxygraphe. Les cellules (kératinocytes), à la concentration de 106 cellules/ml, sont mises en suspension dans un "tampon respiratoire" (Hanks-Hepes glucose 20 mM), dans la cuve de l'oxygraphe thermostatée à 30 C et équipée d'une électrode de Clark (1 ml de tampon respiratoire contenant dans ces conditions 480 atomes d'oxygène). Les cellules sont perméabilisées à l'aide de digitonine. L'ajout d'un substrat respiratoire (pyruvate 10 mM et malate 10 mM) permet d'observer une vitesse de consommation d'oxygène (état 2 selon Chance). L'ajout de différentes quantités du produit (concentrations finales: 1/10; 1/5 et 1/2) dans la cuve de l'oxygraphe permet de mettre en évidence une éventuelle stimulation ou inhibition de cette respiration. L'ensemble des déterminations est résumé dans le tableau ci-dessous. Produit testé (BB) Contrôle 1/10 1/5 1/2 Vitesse de 2,67 2,83 3,25 3,52 respiration 0,21 0,15 0,11 0,09 (nAtom O/min/106 cellules) n=3 % de respiration 100 2 106 4 122 3 132 5 basale n=3 Dans les conditions expérimentales retenues et au vu des résultats obtenus, le produit au contact des kératinocytes humains en culture induit une augmentation significative de la vitesse de respiration mitochondriale aux concentrations - 35 - (1/5 et 1/2). 8.2-Etude de l'effet du produit sur la synthèse d'ATP mitochondriale La mesure s'effectue à l'aide d'un appareil de type Luminoscan en utilisant l'ATP monitoring reagent (ATP Bioluminescence Assay Kit HS II) de Boehringer Mannheim. La quantité d'ATP présente dans cet aliquot peut être déterminée grâce à la réaction enzymatique suivante: Luciférase OXYLUCIFERINE + AMP + PPi + CO2 - Mg2+ L'intensité de la lumière émise lors de cette réaction peut être mesurée par un luminomètre (Luminoscan) qui la transcrit en RLU (unité relative de luminosité). Les RLU mesurées peuvent être converties en moles d'ATP en se référant à une gamme étalon d'ATP. La vitesse de synthèse d'ATP est exprimée en nmoles/min/106 cellules. Cinq concentrations ont été testées et les déterminations ont été effectuées en triplicate. Les kératinocytes ont été cultivés, en étuve à CO2, à raison de 106 par run dans un milieu de culture DMEM supplémenté par l'hydrocortisone, l'EGF et le SVF (10%). Ce protocole a été réalisé par application directe du produit sur les cellules dans la cuve de l'oxygraphe. Les cellules (kératinocytes), à la concentration de 106 cellules/ml, sont mises en suspension dans un "tampon respiratoire" (Hanks-Hepes glucose 20 mM), dans la cuve de l'oxygraphe thermostatée à 30 C. Les cellules sont perméabilisées à l'aide de digitonine. L'ajout d'un substrat respiratoire (pyruvate 10 mM et malate 10 mM) ATP + LUCIFERINE - 36 - permet d'observer une vitesse de consommation d'oxygène (état 2 selon Chance). Après l'ajout de différentes quantités du produit (concentrations: 1/10; 1/5 et 1/2) dans la cuve de l'oxygraphe et à intervalles réguliers, un aliquot est prélevé dans la cuve de l'oxygraphe pour y doser l'ATP selon la méthode décrite ci-dessus. L'addition de différentes quantités du produit dans la cuve de l'oxygraphe permet ainsi de mettre en évidence une éventuelle activation ou inhibition de la synthèse d'ATP. L'ensemble des déterminations est résumé dans le tableau ci-dessous. Produit testé (BB) Contrôle 1/10 1/5 1/2 Vitesse de synthèse 5,78 6,16 6,96 7,24 d'ATP 0,25 0,34 0,29 0,54 (nmol/min/106 cellules) n=3 % de synthèse d'ATP 100 3 107 5 120 8 125 6 n=3 Dans les conditions expérimentales retenues et au vu des résultats obtenus, le produit au contact des kératinocytes humains en culture induit une augmentation significative de la vitesse de synthèse d'ATP mitochondriale aux concentrations (1/5 et 1/2). 8.3-Etude de l'effet du produit sur le métabolisme 20 énergétique Evaluation de l'effet du produit au niveau du métabolisme énergétique par mesure des concentrations des nucléotides adényliques. Etude réalisée sur des primo-cultures de - 37 - kératinocytes humaines traitées pendant 5 jours avant l'étude. La quantité d'ATP, ADP et AMP contenue dans les cellules est mesurée par la technique de Chromatographie Liquide à 5 Haute Pression (HPLC). Sur un appareil Beckman, nous utilisons une colonne (10 x 0,46 cm) dont le support est le Sphérisorb NH2 de 5 m de granulométrie. Le solvant d'élution est une solution de phosphate de potassium; suivant la molarité et le pH de celui-ci, le temps de rétention des nucléotides est plus ou moins long. La vitesse d'élution est de 1 ml/min. Le profil d'élution est suivi par mesure d'absorbance à 254 nm en isocratique. Une gamme étalon est réalisée entre 0,1 et 1 nmole d'ATP, 15 d'ADP et d'AMP en mesurant la surface de l'aire sous les pics respectifs. Cinq concentrations ont été testées et les déterminations ont été effectuées en triplicate. Les concentrations d'ATP, ADP et AMP d'un extrait cellulaire (106 cellules/ml) sont dosées par HPLC. Elles sont exprimées en nmoles/min/mg protéines. La charge énergétique est calculée par la formule: ([ATP] + 1/2 [ADP]) / ( [ATP] + [ADP] + [AMP] ) Le calcul de la charge énergétique est effectué en 25 triplicate sur des lots témoins et des lots traités. L'ensemble des déterminations est résumé dans le tableau ci-dessous. Les concentrations en ATP, ADP et AMP sont exprimées en nmoles/mg protéines (n=3). Produit testé BB Contrôle 1/10 1/5 1/2 [ATP] 4214 4060 4554 4860 [ADP] 936 1103 1162 936 [AMP] 673 488 719 1178 - 38 - [ATP/ADP] 4,50 3,68 3,92 5,19 Somme 5823 5651 6434 6973 C.E. 0,804 0,816 0,798 0,764 Dans les conditions expérimentales retenues et au vu des résultats obtenus, le produit au contact des kératinocytes humains en culture n'induit aucune modification de la charge énergétique aux concentrations du produit utilisées. - 39 - REVENDICATIONS 1- Lyophilisat de cellules d'algues brunes enrichi en fucoxanthine. 2- Lyophilisat selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules d'algues brunes sont des 5 cellules de gamétophytes. 3- Lyophilisat selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 1% de fucoxanthine. 4- Procédé d'obtention d'un lyophilisat selon la 10 revendication 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - récolte des sporophytes matures - émission des spores in vitro - germination des spores in vitro - récolte des cellules de gamétophytes - lyophilisation des cellules de gamétophytes obtenues 5- Préparation cosmétique à usage topique caractérisée en ce qu'elle comprend un lyophilisat selon l'une des revendications 1 à 3 en tant que principe actif. 6- Préparation cosmétique selon la revendication 5, ledit lyophilisat se trouvant dans la gamme de 0,2 à 5% en poids. 7- Complément alimentaire caractérisé en ce qu'il comprend un lyophilisat selon l'une des revendications 1 à 25 3 en tant que principe actif. 8- Utilisation d'une préparation cosmétique selon la revendication 5 ou 6 pour pigmenter la peau. 9- Utilisation d'une préparation cosmétique selon la revendication 5 ou 6 pour préparer la peau à une exposition 30 aux rayons UV. 10- Utilisation d'une préparation cosmétique selon la revendication 5 ou 6 pour protéger la peau du stress oxydatif provoqué par les rayons UV. 11- Utilisation d'une préparation cosmétique selon la 35 revendication 5 ou 6 pour protéger la peau contre le vieillissement cellulaire. - 40 - 12- Utilisation d'un complément alimentaire selon la revendication 7 pour préparer la peau à une exposition aux rayons UV.