FR 2874264 A1 20060217 FR 0408907 A 20040816 Procédé et dispositif de détermination de biomasse dans un milieu, notamment d'un milieu contenant des cellules biologiques, et appareil de mesure mettant en oeuvre ce procédé La présente invention concerne un procédé de détermination de biomasse dans un milieu, notamment un milieu contenant des cellules biologiques. Elle vise également un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé, ainsi qu'un appareil de mesure mettant en oeuvre ce procédé, pouvant être utilisé pour une mesure de biomasse. Il s'agit d'un procédé de détermination de caractéristiques diélectriques, qui permet d'une part la correction des principales sources d'erreurs rencontrées dans les mesures d'impédance appliquées aux milieux conducteurs, d'autre part l'obtention des paramètres caractérisant la dispersion p des suspensions de cellules biologiques. Etat de l'art Les mesures d'impédance électrique, et en particulier de permittivité diélectrique, peuvent être utilisées pour obtenir de manière non-destructive des informations sur la composition ou la structure des milieux étudiés. La mesure de la concentration de biomasse dans les milieux de fermentation est une application exemplaire de cette technique. Cette mesure, devenue aujourd'hui pratiquement une mesure de routine, est issue d'un développement en deux phases. Une première phase, jusqu'à la fin des années 1970, a permis aux scientifiques d'étudier les propriétés électriques des milieux biologiques et des suspensions de cellules, et de montrer la relation entre concentration de cellules et permittivité diélectrique. On sait depuis les travaux de chercheurs tels que par exemple Fricke (1953, "Relation of the permittivity of biological cell suspensions to fractional cell volume" paru dans Nature, 172, 4381, 731-732) et Schwann, (1957, "Electrical properties of tissues and cell suspensions" paru dans Adv. Biol. Med. Phys., 5, 147-209), qu'il existe une corrélation forte entre permittivité, mesurée dans le domaine des fréquences radio et fraction volumique de cellules (levures, hématies...) dans le milieu étudié. En effet, lorsqu'une cellule vivante est soumise à un champ électrique, le déplacement des ions à l'intérieur de la cellule est limité par la membrane cytoplasmique, ce qui induit un phénomène de polarisation. Chaque cellule se comporte alors comme un petit condensateur. L'ampleur de cette polarisation, qu'on peut évaluer par mesure de la permittivité diélectrique (ou de la capacitance) du milieu, dépend de la fréquence du champ électrique appliqué. A fréquences relativement élevées, de l'ordre de 10 MHz et - t - au delà, la polarisation est faible. La permittivité diélectrique (et la capacitance) correspond alors sensiblement à celle du milieu dépourvu de cellules. Au contraire, à fréquences relativement faibles, de l'ordre de 0.1 MHz, les cellules sont complètement polarisées, et la permittivité diélectrique (et la capacitance de la suspension) est plus élevée. Ce phénomène, qui concerne donc les mesures réalisées dans le domaine des fréquences dites "radio", est décrit dans la littérature scientifique sous le nom de dispersion R. La forme de cette dispersion est caractéristique, comme l'illustre la figure 1, la permittivité diminuant progressivement depuis un plateau à fréquence basse jusqu'à un plateau à fréquence élevée, suivant une courbe en S inversé. La relation mathématique entre biovolume et permittivité diélectrique a été établie. Pour des cellules sphériques, l'incrément diélectrique AE, établit en faisant la différence entre la permittivité El mesurée à basse fréquence et celle eh mesurée à fréquence plus élevée, est proportionnel au produit P.r.Cm, expression dans laquelle P est la fraction volumique occupée par la biomasse, r est le rayon des cellules, supposées sphériques, et Cm est la capacitance membranaire, selon la relation Q_9prCm 4co Comme le volume cellulaire est à peu près proportionnel à la masse cellulaire, il est ainsi possible, grâce à deux mesures réalisées à deux fréquences de part et d'autre du domaine de la dispersion (3, d'évaluer simplement la concentration de microorganismes (bactéries, levures, cellules animales...) dans un milieu de culture. Siugura et al., dans l'article Dielectric behavior of yeast cells in suspension , paru dans J.Gen.App.Microbiol., 10, 2, 163-174 (1964), ont ainsi présenté sans ambiguïté la relation expérimentale linéaire entre l'incrément diélectrique, mesuré dans un domaine de fréquence correspondant explicitement à la dispersion (3, et la fraction volumique de suspensions de Saccharomyces. Jusqu'à la fin des années 70, les travaux publiés ne concernaient le plus souvent que l'étude de suspensions "modèles" de cellules dans des milieux "idéaux", eau ou solutions salines à faibles concentrations. En effet, les mesures, qui utilisaient le plus souvent des ponts capacitifs à ajustement manuel et des électrodes en platine platiné, étaient fastidieuses et difficiles, empêchant ainsi tout développement pratique hors des laboratoires de recherche. Une des difficultés principales, dont nous reparlerons plus loin, rencontrées par les expérimentateurs était la polarisation de surface des électrodes, susceptible de gêner considérablement les mesures de capacitance. Malgré cela, Gencer et Mutharasan ont montré, dans l'article. "Determination of biomass concentration by capacitance measurement" paru en 1979 dans la revue Biotechnol. Bioeng., 21, 6, 1097-1103, l'intérêt des mesures de capacitance appliquées au suivi in situ et en temps réel des fermentations. La deuxième phase commence à la fin des années 70, grâce aux progrès de l'électronique et au développement d'appareil automatisés, en particulier par la société Hewlett-Packard, qui changent alors radicalement la situation en simplifiant la mise en oeuvre des mesures de capacitance, permettant ainsi leur popularisation. (T. Ichino (HP) and H. Ohkawara (HP) and N. Sugihara (HP). Vector impedance analysis to 1000 MHz. Hewlett-Packard Journal: technical information from the laboratories of Hewlett-Packard Company, 31 (1), pp. 22-31, January 1980; Y. Narimatsu (HP) and K. Yagi (HP) and T. Shimizu (HP). A versatile low-frequency impedance analyzer with an integral tracking gain-phase meter. HewlettPackard Journal: technical information from the laboratories of HewlettPackard Company, 32 (9), pp. 22-28, September 1981). Clarke et al., dans l'article Sensors for bioreactor monitoring and control a perspective, publié dans J. Biotechnol, 1, 135- 158 , sont parmi les premiers à citer explicitement l'intérêt de la technique pour la détermination de la concentration de biomasse en fermentation, et proposent un dispositif permettant, à partir d'une mesure de la permittivité, le suivi de la croissance de cultures microbiennes. Le EP0282532 décrit une méthode de mesure de la biomasse qui permet, à partir d'une mesure de capacitance réalisée à une fréquence unique, choisie dans la domaine de fréquences basses de la dispersion f3, d'obtenir un signal représentatif du biovolume. Cette méthode permet d'éviter les mesures à des fréquences multiples, nécessaires pour estimer l'amplitude de la dispersion (3. En revanche, ainsi qu'indiqué par l'inventeur lui-même (Yardley, Kell et al., 2000. On-line, real-time measurements of cellular biomass using dielectric spectroscopy, publié dans Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, vol.17, 2000, Pages 3-35), il faut disposer d'une mesure de référence obtenue avant le début de la fermentation, pour pouvoir évaluer la variation de la capacitance. L'inconvénient principal de cette méthode est donc sa sensibilité aux erreurs liées aux variations des capacitances parasites, en fonction du temps, de la fréquence et de la conductivité du milieu, dues à la polarisation des électrodes ou à différentes imperfections des matériels utilisés. Le EP0281602, déposé conjointement au brevet précédent, présente un appareil de mesure de la capacitance d'un milieu de fermentation, qui utilise une technique de mesure d'amplitude du signal, démodulé en quadrature et en phase; Le EP0620919 décrit une méthode de mesure de la rétention gazeuse avec un appareil fonctionnant selon les principes décrit dans le brevet EP0281602, qui utilise deux mesures d'intensité du courant réactif à une fréquence élevée, l'une réalisée avant la fermentation, l'autre pendant la fermentation, le résultat étant utilisé pour corriger la mesure de biomasse; Si le principe de la mesure est simple, sa mise en oeuvre est rendue complexe en raison de l'influence de plusieurs variables, qui agissent non seulement sur l'amplitude de l'incrément diélectrique, mais aussi sur la forme générale de la courbe de dispersion 13. L'expression généralement retenue pour décrire cette dispersion est la suivante E 1+ 1 asna 2 c Le point d'inflexion de cette courbe, situé à mi-hauteur entre les deux plateaux, correspond à une fréquence appelée fréquence caractéristique fc, comme l'illustre la figure 1. La pente de la tangente au point d'inflexion dépend de la superposition de plusieurs dispersions, de fréquences caractéristiques voisines, induites par exemple par une variation de la taille des cellules autour d'une valeur moyenne. Le coefficient a, qui permet de prendre ce phénomène en compte, est un paramètre empirique connu sous le nom de facteur de dispersion a de Cole-Cole. L'article de Yardley et col. (précédemment cité) passe en revue l'ensemble des problèmes que pose la mesure. Par exemple, les contraintes techniques font que les mesures ne peuvent généralement être réalisées ni à fréquence suffisamment basse, ni à fréquence suffisamment élevée, ce qui fait que les plateaux de part et d'autre de la zone de dispersion 13 ne peuvent pas être atteints. On n'arrive donc pas à mesurer l'incrément diélectrique en totalité. La fréquence caractéristique fc se déplace sous l'influence des variations de la conductivité du milieu am et de la conductivité intracellulaire oc, de la taille cellulaire r et de la capacitance membranaire Cm, selon la relation fc 2inrCm, + ac 2 am ce qui entraîne des variations de la mesure de capacitance si les mesures ne peuvent être E=sh+ 1+ 2(1 a)+2 1 asinaf c fc 2 réalisées sur les plateaux. Enfin, la pente de la courbe de dispersion, autour de la fréquence caractéristique fc, est elle-même variable, en fonction de la valeur du facteur de dispersion a, ce qui peut induire des variations de la capacitance mesurée, indépendantes des variations de la concentration cellulaire. Il est ainsi souhaitable d'évaluer l'incrément diélectrique (ou capacitif) à partir de mesures réalisées à plusieurs fréquences, de manière à reconstituer, en extrapolant éventuellement, l'intégralité de la courbe de dispersion 13. On parle alors de spectroscopie d'impédance. En raison de la forme de la fonction mathématique décrivant la dispersion f3, l'obtention des descripteurs mathématiques de la courbe de dispersion (As, fc, a) demande généralement la mise en oeuvre de techniques mathématiques d'ajustement dites "non-linéaires", l'une des plus connues étant la méthode itérative de Levenberg-Marquard. Ces techniques sont coûteuses en termes de puissance (ou de temps) de calcul. Par ailleurs, il est généralement nécessaire de fournir une valeur de départ aux différents paramètres pour que le processus itératif converge vers une solution convenable. Ces techniques ne peuvent donc pas être mises en oeuvre économiquement dans des systèmes de mesure à base de microcontrôleur, tels qu'on les rencontre dans de nombreux appareils de mesure commerciaux. A ces difficultés s'ajoute celle liée à la polarisation de surface des électrodes. En effet, dans les systèmes de mesure d'impédance utilisant des électrodes en contact direct avec le milieu, la mesure des caractéristiques propres au milieu est perturbée en particulier par l'accumulation de charges à la surface des électrodes, qui provoque un phénomène de polarisation systématique. La capacitance qui en résulte vient s'ajouter à celle du milieu et évolue avec la conductivité ionique du milieu. Une deuxième source d'erreur est liée à l'adsorption de composés en solution sur les électrodes. Cette adsorption provoque une modification des propriétés électriques de l'interface métal-milieu liquide, qui se traduit, selon le type de molécules adsorbées, par une variation de la capacitance dont le sens et l'amplitude ne sont pas prévisibles, et que nous appellerons polarisation aléatoire. En pratique, l'amplitude de la polarisation aléatoire est nettement plus faible que celle de la polarisation systématique. Ces problèmes sont bien connus, et plusieurs méthodes ont été proposées, en particulier par Schwan en 1963 dans son article "Determination of biological impedances", publié dans "Physical techniques in Biological research", vol 6, Nastuk ed., Academic Press, pp. 323-407, soit pour limiter l'ampleur de la polarisation (modification de l'état de surface des électrodes, systèmes à 4 électrodes, électrodes liquides), soit pour évaluer l'ampleur de la polarisation (variation de la distance interélectrodes), soit pour évaluer et corriger par le calcul la contribution de la polarisation des électrodes. Au plan théorique, cette dernière opération est possible parce que la polarisation de surface des électrodes diminue rapidement avec la fréquence de mesure. En réalisant quelques mesures à basses fréquences, on peut évaluer la capacitance de polarisation aux fréquences supérieures, sous réserve que l'on connaisse sa loi de variation avec la fréquence. Une loi du type Cpol = C0polÉ f k est généralement utilisée, dans laquelle k est un coefficient expérimental généralement compris entre 1 et 2. On peut alors corriger les mesures de capacitance en leur soustrayant cette estimation de la capacitance de polarisation. Ainsi, Sugiura et al. décrivent, dans l'article Dielectric behavior of yeast cells in suspension , J.Gen.App.Microbiol., 10, 2, 163-174 (1964), une correction de la capacitance mesurée sur une suspension de levures, dans laquelle on utilise des mesures réalisées à basse fréquence pour corriger celles réalisées à fréquences plus élevées. Bordi et al. ont proposé, dans l'article Reduction of the contribution polarization effects in the radiowave dielectric measurements of highly conductive biological cell suspension , Biolectrochemistry 2001, une méthode globale d'ajustement non-linéaire qui permet l'élimination de la contribution de la capacitance des électrodes. Le document EP0282532 (Kell) divulgue une méthode équivalente, dite méthode 2f, qui utilise le rapport des mesures de capacitance réalisées à deux fréquences dans la partie basse de la dispersion (3, domaine de fréquence où l'influence de la polarisation des électrodes est prédominante par rapport à celle de la capacitance de la suspension cellulaire. L' inconvénient de cette dernière méthode est qu'elle suppose explicitement que la polarisation des électrodes suit une loi unique figée, indépendante de la conductivité du milieu, et surtout qu'elle ne prend pas en compte les erreurs dues aux imperfections des matériels utilisés. Position du problème A partir de 1993, la société Fogale a entrepris le développement d'un système de mesure avec pour but de résoudre les problèmes principaux posés par les mesures de capacitances en fermentation. L'objectif principal était le développement d'un système capable de réaliser les mesures de concentration de biomasse dans des milieux de conductivité électrique élevée, par exemple supérieure à 50 mS/cm, que l'on rencontre en conditions de fermentations industrielles. C'est le cas, lorsque les milieux de culture sont préparés à partir de mélasse de betterave, ou lorsque des acides organiques sont excrétés par les microorganismes cultivés comme lors des fermentations lactique, citrique ou gluconique. Un deuxième objectif était de parvenir à une géométrie de capteur permettant une utilisation non seulement en milieu industriel, mais également en laboratoire. Il fallait ainsi que la sonde de mesure ait un faible diamètre, pour s'adapter sur les ports standard de 12 mm, rencontrés sur tous les fermenteurs de petite taille, ce qui interdisait en pratique l'implantation de circuits actifs dans la sonde de mesure, au voisinage immédiat des électrodes, ainsi que pratiqué dans d'autres systèmes. Le brevet FR2812725 décrit ainsi un dispositif permettant d'atteindre ces objectifs, et de concevoir des sondes de mesure de grande longueur. Le brevet FR2835921 décrit une application à la mesure de biomasse de bactéries lactiques, en milieu fortement conducteur. Plus spécifiquement, un appareil de mesure de biomasse tel que celui décrit dans le document FR2812725 présente des effets de ligne extrêmement élevés, qui viennent s'ajouter à la capacitance liée à la polarisation de surface des électrodes. L'erreur capacitive globale peut atteindre 150 pF/cm, ce qui est très largement supérieur aux valeurs correspondant spécifiquement à la biomasse présente dans les milieux de fermentation (typiquement 0.1 à 10 pF/cm). Les méthodes de correction de polarisation en ligne citées précédemment ne tiennent pas compte de ces effets électroniques car les inventeurs de ces méthodes utilisaient des appareils conçus dans les règles de l'art, c'est à dire pourvus d'une électronique au plus près des électrodes (quelques mm) afin de minimiser les effets de lignes. Pour pouvoir utiliser un appareil de mesure de biomasse tel que celui décrit dans le document FR2812725, il est donc nécessaire de corriger non seulement les effets des polarisations systématique et aléatoire de la surface des électrodes, mais aussi les effets des autres sources d'erreur. Le but de la présente invention est de proposer un procédé de détermination de biomasse dans un milieu, notamment un milieu comprenant des cellules en suspension dans un fluide, qui procure une correction efficace des erreurs observées dans les dispositifs de mesure existants. Cet objectif est atteint avec un procédé de détermination de biomasse, obtenu à partir d'une différence entre un premier signal de capacitance (C' 1) dudit milieu, mesuré à une première fréquence, et un second signal de capacitance (C'2) dudit milieu, mesuré à une seconde fréquence. Suivant l'invention, le procédé comprend une correction séparée de chacun des signaux mesurés, selon au moins un niveau de correction, ce premier niveau de correction comprenant une correction desdits signaux mesurés selon un modèle dépendant de la conductance du milieu auxdites première et seconde fréquences. Le procédé de détermination selon l'invention peut en outre avantageusement comprendre un second niveau de correction comprenant une correction desdits premier et second signaux de capacitance corrigés, à partir d'une troisième mesure de capacitance réalisée à une troisième fréquence, elle-même corrigée par une mesure de conductance réalisée à ladite troisième fréquence. Lorsqu'il est mis en oeuvre pour un milieu comprenant des cellules en suspension dans un milieu, le procédé de détermination selon l'invention comprend en outre un troisième niveau de correction utilisant un modèle de comportement de la dispersion (3 dans ledit milieu. Dans le procédé selon l'invention, les erreurs de capacitance dues à la polarisation aléatoire sont corrigées séparément de celles dues à la polarisation systématique et de celles dues à l'électronique, et en ce qu'il comprend en outre: - une modélisation globale de la polarisation systématique et des erreurs de capacitance dues aux erreurs globales de l'électronique, sous la forme d'une équation commune Ccai(G, f), fonction de la conductance du milieu et de la fréquence d'excitation des électrodes conductrices, de sorte que cette équation permet d'éliminer également le produit de l'effet combiné de la polarisation systématique et des erreurs globales de l'électronique au sein de l'appareil, et, une détermination d'une valeur de capacitance Cm cor(G, f) corrigée, en comparant chaque mesure de capacitance brute Cm(G, f) provenant de l'appareil et effectuée à une fréquence prédéterminée, à la valeur de ladite équation commune du modèle Ccai(G, f) à ladite fréquence prédéterminée. Ce procédé a été conçu pour être utilisé en ligne sur un appareil de mesure de biomasse tel que divulgué dans le document FR2812725 au nom du présent déposant, mais il peut cependant être appliqué à n'importe quel instrument de mesure d'impédance utilisant un capteur muni d'électrodes conductrices immergées dans un milieu diélectrique. Le procédé selon l'invention corrige également les erreurs capacitives de l'électronique, les erreurs capacitives des effets de lignes du capteur, et les erreurs capacitives du capteur (les effets inductifs entre autres). L'équation commune du modèle Cca1(G, f) peut être de forme polynomiale, par exemple d'ordre 3 ou 4, et présenter des coefficients calculés pour une pluralité de fréquences prédéterminées utilisées par l'appareil, ou peut être approximée par un polynôme. Les erreurs de capacitance corrigées par l'équation commune du modèle Ccai(G, f) peuvent comprendre des erreurs capacitives fonction de la conductance et de la fréquence. Les erreurs de capacitance corrigées par l'équation commune du modèle Ccai(G, f) peuvent comprendre des erreurs liées à des effets de ligne. Les erreurs de capacitance corrigées par l'équation commune du modèle Cca1(G, f) peuvent comprendre des erreurs liées à des imperfections du capteur. Le modèle de correction d'équation commune Ccai(G, f) peut en outre être agencé pour éliminer l'incertitude sur la pente d'évolution de la polarisation systématique en fonction de la fréquence d'excitation. Le modèle de correction d'équation commune Cca1(G, f) peut en outre être agencé pour éliminer le produit de l'effet combiné de l'aération du milieu et des erreurs globales de l'électronique au sein de l'appareil. Les coefficients du modèle de correction Ccai(G, f) peuvent être déterminés à partir d'une opération de calibration dans un milieu de référence ne contenant pas de cellules biologiques et dont la conductance est modifiée de façon à parcourir la pleine échelle de la gamme de conductance de l'appareil. La détermination de l'erreur de capacitance due à la polarisation aléatoire peut être effectuée à une fréquence prédéterminée f1 choisie la plus basse possible de sorte que la détermination de l'erreur de capacitance de polarisation aléatoire soit peu influencée par la capacitance du milieu. Lorsque le procédé selon l'invention est mis en oeuvre pour une mesure sur une suspension de cellules biologiques, la fréquence prédéterminée f1 utilisée pour la détermination de l'erreur de capacitance due à la polarisation aléatoire peut être choisie inférieure ou égale à 100 kHz. La capacitance de polarisation aléatoire Cm_cor(G, f1) peut être calculée à la fréquence f1 par différence entre la mesure de capacitance brute issue de l'appareil et le modèle de correction Ccal(G, f1). Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre une détermination de la 5 capacitance des caractéristiques diélectriques du milieu à une deuxième fréquence prédéterminée f2. Lorsque le procédé selon l'invention est mis en oeuvre pour une mesure sur une suspension de cellules biologiques, la deuxième fréquence prédéterminée f2 peut être choisie proche de la fréquence caractéristique fc de ladite suspension, caractéristique de la dispersion 13 des cellules en suspension. La capacitance des caractéristiques diélectriques du milieu Cm_cor(G, f2) peut être calculée à la fréquence f2, par différence entre la mesure de capacitance brute issue de l'appareil et le modèle de conductance Ccal(G, f2). Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre une modélisation de la 15 polarisation aléatoire selon un modèle de comportement tel que aaiea. P. G2, dans lequel: G est la conductance du milieu, - aalea est une constante prédéfinie, - p est la pente de la polarisation. La détermination de la capacitance du milieu diélectrique peut implémenter un modèle de correction résultant d'une combinaison: - de la mesure de capacitance de la polarisation aléatoire Cm_cor(G, f1), estimée à la première fréquence prédéterminée f1, - de la mesure de capacitance du milieu Cm cor(G, f2), estimée à la deuxième fréquence 25 prédéterminée f2, - et du modèle de comportement de la polarisation aléatoire aa1. fP. G2. Lorsque le procédé selon l'invention est mis en oeuvre pour la mesure de suspensions de cellules biologiques suivant un modèle de comportement du type capacitance Cx(G, f) = ACceii X 1 / (1 + (f/ff)2) où fc est la fréquence caractéristique du milieu, cette fréquence caractéristique fc peut être soit prédéterminée à partir d'un abaque, soit déterminée en ligne par une méthode de détermination des paramètres caractéristiques de la dispersion 13. Le diélectrique mesuré à la première fréquence prédéterminée fl est de préférence sensiblement identique au diélectrique mesuré à la seconde fréquence prédéterminée f2. Dans une mise en oeuvre particulière du procédé selon l'invention pour la mesure d'un milieu contenant des cellules biologiques, ce procédé comprend en outre une détermination d'une erreur de capacitance Cm cor(G, f3) due à la dérive thermique de l'offset de l'électronique et à des variations de la capacitance du milieu diélectrique de suspension, à une troisième fréquence prédéterminée f3. L'erreur de capacitance Cm cor(G, f3) peut être calculée à la troisième 10 fréquence prédéterminée f3, par différence entre la mesure de capacitance brute issue de l'appareil et le modèle de correction Ccal(G, f3). Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre une correction de mesures de capacitances brutes ou corrigées, entachées d'erreurs dues à la dérive thermique de l'offset de l'électronique et à des variations de capacitance du milieu de suspension, en soustrayant de ces mesures l'erreur de capacitance Cm cor(G, f3). Il peut aussi comprendre une conversion des valeurs de capacitance et de conductance du milieu en des valeurs de permittivité et de conductivité, par multiplication desdites valeurs de capacitance et de conductance par un facteur de sonde k. qui est déterminé à partir d'une division de la valeur de conductivité d'une solution liquide de conductivité connue par une valeur de mesure de conductance de ladite solution. Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre une détermination d'un facteur de sonde ka lié à l'aération du milieu, à une quatrième fréquence prédéterminée f4 La quatrième fréquence prédéterminée peut être choisie de sorte que le diélectrique est le plus stable quelque soient les changements de paramètres d' environnement. Le facteur de sonde ka représente avantageusement une modification géométrique apparente du capteur lorsque des bulles sont présentes dans le milieu diélectrique. Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre une détermination de la capacitance Cm_cor(G, f4) liée au facteur ka à la fréquence f4, par comparaison de la mesure de capacitance brute au modèle de conductance Ccal(G, f4). Le facteur de sonde ka. est par exemple calculé en rapportant la variation de capacitance Cm cor(G, f4) à une valeur de capacitance d'un milieu de référence non aéré. - 12 - Le facteur de sonde ka peut être utilisé pour déterminer lapermittivité du milieu diélectrique corrigée des effets d'aération sur la mesure de capacitance, et pour déterminer la conductivité du milieu en corrigeant les effets d'aération sur la mesure de conductance. Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre une détermination de la concentration de biomasse du milieu, en multipliant la permittivité mesurée à la seconde fréquence prédéterminée f2 par un coefficient prédéterminé y qui peut être déterminé soit à l'aide d'un abaque de paramètres physiques caractéristiques des cellules biologiques, soit à l'aide d'un étalonnage préalable dans un milieu de suspension dont la concentration est connue. On peut aussi avantageusement prévoir que le procédé selon l'invention, comprenne en outre une détermination de paramètres caractéristiques d'une dispersion diélectrique sur des milieux contenant des cellules biologiques, en utilisant au moins trois fréquences prédéterminées f5, f6, f7, ainsi qu'une détermination de capacitances liées à la dispersion Cm cor(G, f5), Cm_cor(G, f6), Cm_cor(G, f7), aux au moins trois fréquences prédéterminée f5, f6, f7, en comparant des mesures de capacitance brute provenant de l'appareil aux modèles de conductance aux fréquences correspondantes Ccal(G, f5), Ccal(G, f6), et Ccal(G, f7). La détermination des paramètres caractéristiques de la dispersion diélectrique 20 peut comporter: - une mesure d'un nombre n de valeurs de capacitance corrigée Cm_cor(G, f5 à m) avec m = 5 + n -1, à n fréquences réparties sur le domaine de fréquence correspondant à celui de la dispersion diélectrique étudiée, n étant supérieur ou égal à 3, - un ajustement d'une fonction multilinéaire dépendant de la fréquence et comportant n 25 coefficients variables pour approcher au mieux les n valeurs de capacitance corrigée mesurées, - un calcul des paramètres caractéristiques de la dispersion diélectrique à partir des coefficients de la fonction multilinéaire. La fonction multilinéaire dépendant de la fréquence peut être constituée par un polynôme de degré n-1. Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre un calcul d'une évaluation de la concentration de biomasse du milieu, à partir des valeurs des coefficients du polynôme de degré n-1, ainsi qu'un calcul de l'évaluation de la taille des microorganismes dans le milieu, à partir des coefficients du polynôme de degré n-1. - 13 - Suivant un autre aspect de l'invention, il est proposé un dispositif pour déterminer des caractéristiques d'un milieu diélectrique, mettant en oeuvre le procédé selon l'invention, comprenant des moyens pour corriger un signal de capacitance provenant d'un appareil générant un signal de capacitance et de conductance, cet appareil étant relié à un capteur ayant des électrodes conductrices en contact direct avec le milieu diélectrique à mesurer, ce signal de capacitance étant entaché d'erreurs de capacitance dues à une polarisation aléatoire et d'erreurs de capacitance dues à une polarisation systématique. Suivant l'invention, les moyens de correction du signal de capacitance sont agencés pour corriger séparément d'une part les erreurs de capacitance dues à la polarisation aléatoire et d'autre part les erreurs dues à la polarisation systématique, et comprennent: - des moyens pour modéliser la polarisation systématique et des erreurs de capacitance incluant des erreurs dues à la polarisation systématique, sous la forme d'une équation commune Ccai(G, f), fonction de la conductance du milieu et de la fréquence d'excitation des électrodes conductrices, cette équation étant agencée pour éliminer le produit de l'effet combiné de la polarisation et des erreurs globales de l'électronique au sein de l'appareil, et, des moyens pour déterminer une valeur de capacitance Cm cor(G, f) corrigée, en comparant chaque mesure de capacitance brute Cx(G, f) provenant de l'appareil et effectuée à une fréquence prédéterminée, à la valeur de ladite équation commune du modèle Ccai(G, f) à ladite fréquence prédéterminée. Ce dispositif peut aussi en outre comprendre des moyens pour déterminer l'erreur de capacitance due à la polarisation aléatoire à une première fréquence prédéterminée fi choisie la plus basse possible de sorte que la détermination de l'erreur de capacitance de polarisation aléatoire est peu influencée par la capacitance du milieu., ainsi que des moyens pour déterminer la capacitance des caractéristiques diélectriques du milieu à une deuxième fréquence prédéterminée f2 choisie proche de la fréquence caractéristique fc du milieu, caractéristique de la dispersion b des cellules en suspension. Les moyens pour déterminer la capacitance des caractéristiques diélectriques du milieu peuvent implémenter un modèle de correction résultant d'une combinaison: - d'une mesure de capacitance de la polarisation aléatoire Cmcor(G, f1), estimée à la première fréquence prédéterminée f1, - d'une mesure de capacitance du milieu Cm_cor(G, f2), estimée à la deuxième fréquence prédéterminée f2, - et d'un modèle de comportement de la polarisation aléatoire aalea. f P. G2. Le dispositif selon l'invention, mis en oeuvre pour la mesure d'un milieu contenant des cellules biologiques, peut en outre comprendre des moyens pour déterminer une erreur de capacitance Cm cor(G, f3) due à la dérive thermique de l'offset de l'électronique et à des variations de la capacitance du milieu diélectrique de suspension, à une troisième fréquence prédéterminée f3, ainsi que des moyens pour déterminer une capacitance Cm_cor(G, f4) liée à un facteur de sonde ka lié à l'aération du milieu, à une quatrième fréquence prédéterminée f4. Il peut aussi comprendre des moyens pour déterminer des paramètres caractéristiques d'une dispersion diélectrique sur des milieux contenant des cellules biologiques, en utilisant au moins trois fréquences prédéterminées f5, f6, f7. Dans une version particulière de l'invention, le dispositif comprend en outre des moyens pour déterminer des paramètres caractéristiques de la dispersion diélectrique, comportant: - des moyens pour mesurer un nombre n de valeurs de capacitance corrigée Cm_cor(G, f5 à n,) à n fréquences réparties sur le domaine de fréquence correspondant à celui de la dispersion diélectrique étudiée, n étant supérieur ou égal à 3, - des moyens pour ajuster une fonction multilinéaire dépendant de la fréquence et comportant n coefficients variables pour approcher au mieux les n valeurs de capacitance corrigée mesurées, et - des moyens pour calculer des paramètres caractéristiques de la dispersion diélectrique à partir des coefficients de la fonction multilinéaire. Suivant encore un autre aspect de l'invention, il est proposé un appareil pour mesurer une biomasse d'un milieu biologique, mettant en oeuvre un procédé de détermination de diélectrique selon l'invention, et/ou incluant un dispositif de détermination de diélectrique selon l'invention. Il est aussi proposé dans le cadre de la présente invention un appareil de mesure d'impédance, agencé pour fournir une mesure de la partie réelle d'une impédance et de la capacitance correspondant à cette impédance, incluant un dispositif de mesure de caractéristiques d'un milieu diélectrique selon l'invention. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à l'examen de la description détaillée d'un mode de mise en oeuvre nullement limitatif, et des dessins annexés sur lesquels: -la figure 1 représente un modèle de comportement de cellules biologiques avec une dispersion 13; la figure 2 illustre un modèle électrique conventionnel des effets de polarisation d'électrodes; - la figure 3 illustre une évolution d'une capacitance de polarisation mesurée sans ligne, en fonction de la fréquence; -les figures 4, 5 et 6 représentent, à différentes fréquences les erreurs capacitives respectivement dues aux imperfections de l'électronique, du capteur et aux effets de ligne; -la figure 7 représente sur un même graphe une courbe de polarisation absolue (polarisation systématique + polarisation aléatoire) et une courbe de polarisation systématique; - la figure 8 illustre un ajustement d'une fonction polynomiale d'ordre n sur une courbe de dispersion dans sa partie au-delà de la fréquence caractéristique, mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention; et - la figure 9 illustre un ajustement d'une fonction polynomiale d'ordre n sur une courbe de dispersion dans sa partie en deçà de la fréquence caractéristique, mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention. Description de l'invention On va tout d'abord décrire de façon détaillée les principes physiques à la base du procédé de détermination, en présentant une analyse des différentes sources d'erreur de capacitance rencontrées dans un appareil de mesure de biomasse du type de celui décrit dans le document FR2812725. Le procédé selon l'invention propose une correction globale des effets parasites de l'électronique et des effets de polarisation d'électrode. Les erreurs capacitives typiquement rencontrées dans un appareil de mesure de biomasse sont les suivantes: - des erreurs de l'électronique de mesure, telles qu'illustrées en figure 4. Ces erreurs, dont l'amplitude peut atteindre la dizaine de pF/cm, varient en fonction de la conductance G et de la fréquence. Elles sont générées par un nombre très important de composants, ce qui la rend difficile à corriger de façon théorique. Parmi les facteurs principaux intervenant dans ces erreurs, on peut citer les erreurs en phase des composants, les effets inductifs des pistes, et les erreurs non-linéaires des composants; - des erreurs du capteur, telles qu'illustrées en figure 7. En dehors de l'effet de polarisation, les erreurs sur le capteur sont principalement de nature inductive, peuvent atteindre 30 pF/cm, et varient en fonction de la fréquence; - des erreurs d'effet de ligne, telles qu'illustrées en figure 6. En dehors de l'effet de polarisation, ce sont les erreurs les plus élevées rencontrées dans un appareil de mesure de biomasse du type de celui décrit dans le document FR2812725. Elles peuvent atteindre 150 pF/cm. Elles varient principalement en fonction de la fréquence et de la conductance G. Le résultat de la mesure de permittivité dans un milieu diélectrique est la conséquence de l'ensemble des phénomènes électroniques présentés, auxquels s'ajoutent les phénomènes de polarisation de la surface des électrodes. Tous ces phénomènes ont chacun leur propre comportement en fonction de la conductance et de la fréquence et parfois ont un comportement non-linéaire comme dans le cas de l'électronique. Il est donc nécessaire de développer une méthode pour extraire l'information "permittivité du milieu" du signal global de capacitance. Pour la mesure de biomasse, la difficulté d'extraction de la mesure "permittivité de la biomasse" est encore plus grande. Les cellules biologiques ont leur propre réponse fréquentielle, qui vient s'ajouter aux différentes réponses spectrales du matériel et de la polarisation du capteur. Il existe déjà des méthodes de calcul en ligne, qui pour la plupart ne corrigent que les erreurs de polarisation. En effet, les systèmes de mesure de biomasse sont généralement dotés d'une électronique disposée au plus près des électrodes, conformément aux règles de l'art. Les effets de lignes sont alors beaucoup moins élevés que ceux observés dans un système où l'électronique se trouve déportée par rapport aux électrodes, et de ce fait, ne requièrent pas une méthode combinant correction de polarisation et de l'effet de ligne. On connaît déjà une méthode de détermination de biomasse, développée par Bordi et al. (précité), qui utilise une formule générale qui est le résultat de la combinaison de modèles de fonctionnement physique, chimique, biologique et électronique. Cependant, il en résulte une utilisation très lourde car il est nécessaire de déterminer tous les coefficients provenant de ces modèles. De plus, une méthode de régression doit être mise en place afin de comparer la formule globale au spectre de mesure de capacitance. Le spectre doit comporter un nombre élevé de fréquences pour identifier tous les paramètres. Le procédé selon l'invention permet de déterminer la permittivité d'un milieu diélectrique à partir d'un signal de capacitance et d'un signal de conductance, contenant les erreurs capacitives de l'électronique, des effets de lignes, du capteur et de la polarisation d'électrode. De manière simplifiée, le procédé selon l'invention consiste à corriger les mesures de capacitance en utilisant les mesures de conductance réalisées simultanément par l'appareil. En effet, nous avons montré, à partir de considérations théoriques et de mesures expérimentales, que toutes les erreurs, qu'il s'agisse des erreurs de polarisation ou des erreurs liées aux imperfections de l'appareil, pouvaient être exprimée en fonction de la conductance du milieu. On corrige donc chaque mesure de capacitance en lui soustrayant une valeur de correction calculée à partir de la conductance, à l'aide d'une équation établie à l'issue d'un étalonnage préalable. Un deuxième niveau de correction permet ensuite d'éliminer les erreurs résiduelles pour conduire à une valeur de capacitance calculée qui ne dépend plus que des propriétés diélectriques du milieu étudié. Ces signaux de mesures et les erreurs de l'électronique s'écrivent de la façon suivante: Cm(G, f) = Cx(G, f) + Celec ampli(G, f) + Celect lin(G, f) + Celec sens(G, f) + Cpol_syst(G, f) + Cpol_aléa (G, f) (1) avec: Cm(G, f) : signal de capacitance brute Cx(G, f) : capacitance propre du milieu diélectrique (biomasse) Celec ampli(G, f) : capacitance de l'électronique de mesure Celect lin(G, f) : capacitance de l'effet de ligne Celec sens(G, f) : capacitance du capteur - Cpol_syst(G, f) : capacitance de polarisation systématique - Cpol_aléa(G, f) : capacitance de polarisation aléatoire. On va maintenant décrire, en référence aux figures précitées, les principales étapes de réalisation du procédé de détermination selon l'invention. Premier niveau de correction: élimination des erreurs liées à l'électronique et à la polarisation systématique Etape 1: modèle global de l'électronique Le modèle global de l'électronique a été élaboré à la suite d'une étude sur les erreurs électroniques d'un appareil de mesure de biomasse, montrant que les courbes des erreurs capacitives (électronique, effets de ligne et erreurs liées au capteur) ont des formes en fonction de la conductance qui restent inchangées quel que soit le milieu diélectrique mesuré. Par contre, ces courbes varient avec la fréquence utilisée. Il en résulte que, pour s'affranchir des effets globaux de l'électronique et avant tout autre traitement, il convient de corriger le signal brut de capacitance, en lui soustrayant une valeur Celec mod(G, f), calculée à partir d'un modèle de comportement global, fonction de la conductance (2), et ce, pour chacune des fréquences de mesure utilisées. Celec mod(G, f) = Celec ampli(G, f) + Celect lin(G, f) + Celec sens(G, f) (2) Les erreurs capacitives du capteur et des effets de ligne sont principalement dues à des erreurs de type inductif (selfique). De façon théorique, on démontre que ce type d'erreur génère sur la mesure de capacitance une erreur proportionnelle à -L.G2 (L: valeur de la self inductance, et G: valeur la conductance qui charge la self inductance). Ce modèle permet de corriger un pourcentage très élevé (typiquement 90%) des erreurs de l'électronique de l'appareil de mesure de biomasse. Afin de corriger l'erreur résiduelle et les erreurs de non-linéarité de l'électronique, on utilise en pratique une équation polynomiale d'ordre 3 ou 4, fonction de la conductance (3), calculée par la méthode des moindres carrés, selon une procédure qui sera décrite un peu plus loin. On pourrait envisager d'utiliser un polynôme d'ordre différent ou d'autres types de modèles, fonctions de la conductance. L'expression utilisée pour la première étape de correction est donc la suivante: Celec mod(G, f) = e1 0 + ef, 1. G + ef, 2. G2 + e1; . G3 (3) avec: ef, i: coefficients prédéterminés pour une fréquence donnée - G: conductance du milieu Etape 2: modèle global corrigeant l'effet de polarisation systématique et les erreurs globales de l'électronique Cette seconde étape de correction utilise un modèle corrigeant la polarisation systématique séparément de la polarisation aléatoire. La polarisation absolue Cpol_abso(G, f) est la somme des deux polarisations, respectivement systématique et aléatoire, en référence à la figure 7. Cpol_abso(G, f) = Cpol_syst(G, f) + Cpol_alea(G, f) (4) La polarisation systématique Cpol_syst(G, f) est la polarisation que l'on observe dans un bain de référence qui ne contient pas de cellules biologiques et dans lequel on fait varier la conductance en vue d'un étalonnage de l'appareil. Cette opération n'est effectuée qu'une seule fois. La polarisation aléatoire Cpol_alea(G, f) est la modification de polarisation que 15 l'on observe à un instant donné, par rapport à la polarisation systématique. Cette modification est imprévisible dans le temps. Le modèle électrochimique de la polarisation systématique est le modèle connu de la double couche de Nernst. Son schéma électronique équivalent est présenté sur la figure 2, avec: rpol: résistance de polarisation Cpol: capacitance de la polarisation de la double couche Cx: capacitance du milieu Gx: conductance du milieu En calculant l'effet de la capacitance de polarisation Cpol sur la mesure Cx à 25 partir de ce modèle électrochimique, on trouve: Cpol_syst(G, f) = asys. P. G2 (5) avec: G: conductance du milieu asys: constante prédéfinie (en général égale à 1/capacitance de polarisation 30 systématique) p: constante correspondant à la pente de la polarisation (en général égale à -2) Comme pour les erreurs d'électronique, on observe que pour une fréquence fixe, l'effet de polarisation ne varie qu'en fonction de la conductance. On a donc combiné les 35 deux types d'erreurs, ce qui permet l'utilisation d'un modèle commun d'erreur de - 20 - capacitance en fonction de G, qui regroupe l'erreur globale de l'électronique et l'erreur de polarisation systématique. Ccal(G, f) = Celec mod(G, f) + Cpol_syst(G, f) (6) Ccal(G, f) = ef, o + ef, . G + (asys. fp + ef, 2) . G2 + ef, 3. G3 (7) on obtient alors un polynôme de la forme: Ccal(G, f)=afo+af l. G+af2 É G2+af3. G3 (8) avec: afi: coefficients prédéterminés pour une fréquence donnée G: conductance du milieu On pourrait envisager d'utiliser un polynôme d'ordre différent ou un autre type de modèle de conductance. Un modèle non-linéaire pourrait être utilisé si par exemple l'électronique ou la polarisation avaient un comportement non-linéaire en fonction de la conductance. Cette méthode a l'avantage d'éliminer également les effets de second ordre comme le produit de l'effet combiné de la polarisation et des erreurs globales de l'électronique, comme l'incertitude sur la valeur de la pente (fixée à -2) de la polarisation systématique, et comme le produit de l'effet combiné de l'aération du milieu avec les erreurs globales de l'électronique. Les coefficients du modèle (8) doivent être déterminés expérimentalement pour chaque fréquence de mesure utilisée par l'appareil de mesure de biomasse. Ceci est réalisé par une opération d'étalonnage dans un milieu de référence ne contenant pas de cellules biologiques et dans lequel on fait varier la conductance du milieu sur toute la gamme de l'appareil. Les valeurs de conductance et de capacitance obtenues permettent de calculer les coefficients du modèle (8). Si la permittivité de ce milieu de référence est connue, alors elle peut être soustraite des mesures de capacitance avant le calcul des coefficients. Cela permet d'obtenir un modèle de correction, fonction de la conductance et exempt de la capacitance du milieu de référence. Dans le cas contraire, les opérations de corrections conduiront à des valeurs de capacitance relatives à celle du milieu de référence. On va maintenant décrire le principe de traitement des signaux de capacitance brute mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention. Pour la suite de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on utilisera le principe suivant pour traiter les signaux de capacitance brute: On soustrait au signal de capacitance brute mesuré Cm_(G, f), la valeur calculée à partir du modèle Ccal(G, f) (8). On obtient une mesure de capacitance corrigée Cm_cor(G, f) Cm cor(G, f) = Cm(G, f) - Ccal(G, f) (9) Nous rappellerons que cette opération permet de corriger 90 % des erreurs dues à la fois à la polarisation systématique et aux erreurs liées aux imperfections matérielles. Après combinaison des équations (1), (2), (4) et (6) on obtient: Cm cor(G, f) = Cx(G, f) + Cpol_alea(G, f) (10) La mesure de capacitance corrigée est donc égale à la somme de la capacitance 10 du milieu diélectrique étudié et de l'erreur de polarisation aléatoire. Deuxième niveau de correction: correction de l'erreur de polarisation aléatoire Etape 3: détermination de la polarisation aléatoire à la fréquence fi La capacitance de polarisation aléatoire est déterminée à une seule fréquence de mesure. Elle est obtenue en soustrayant à la mesure de capacitance effectuée à basse fréquence fi une valeur calculée à partir du modèle de calibration Ccal(G, f) (8) suivant le principe de traitement des mesures de capacitance brute (cf. figure 7). Dans le cas d'un milieu contenant des cellules biologiques, cette soustraction ne conduit qu'à une estimation de la polarisation aléatoire, car la quantité de biomasse 20 contenue dans le milieu Cx(G, fl) influe également sur ce résultat. On obtient: Cpol_alea(G, fi) = Cm_cor(G, fi) - Cx(G, f1) (11) Si on considère que la polarisation aléatoire résulte de l'adsorption de composés qui modifient dans un sens ou dans l'autre l'épaisseur de la double couche ionique de Nernst, responsable de la polarisation systématique, on démontre aisément que la variation de la polarisation aléatoire en fonction de la fréquence de mesure et de la conductance du milieu est proportionnelle à G2/f2. (5). Cette hypothèse de comportement de polarisation aléatoire a été confirmée à partir d'expérimentations réalisées avec un appareil de mesure de biomasse du type décrit dans le document FR2812725. On obtient alors expérimentalement la relation: Cpol_alea(G, f) = aalea. fa. G2 (12) Avec: - G:conductance du milieu aalea: constante prédéfinie (en général égale à 1/capacitance de polarisation aléatoire) p: constante correspond à la pente de la polarisation (en pratique très proche de la valeur théorique égale à -2) La fréquence de mesure de la polarisation aléatoire doit être choisie très basse pour que, grâce au terme en 1/f2 (12), la valeur mesurée soit la plus élevée possible devant la capacitance de la biomasse du milieu. En pratique, une fréquence de mesure de 100 Khz permet une excellente détermination de la capacitance de polarisation aléatoire. On peut alors écrire que: Cpol_alea(G, f1) Cm_cor(G, fi) (13) Etape 4: estimation de la capacitance du milieu à la fréquence f, Une mesure de capacitance, caractéristique du milieu diélectrique étudié, est effectuée à une deuxième fréquence f2. Elle est obtenue en soustrayant à la mesure de capacitance une valeur calculée à partir du modèle de calibration Ccal(G, f) (8) suivant le principe de traitement des mesures de capacitance brute. Dans le cas de mesures sur des cellules biologique, cette fréquence est choisie de préférence près de la fréquence caractéristique fc de la cellule, selon le modèle proposé par Pauly et Schwan. Cette soustraction donne la valeur de la capacitance caractéristique du milieu diélectrique étudié, à laquelle s'ajoute encore la valeur de capacitance de polarisation aléatoire à fréquence f2: Cmcor(G, f2) = Cx(G, f2) + Cpolalea(G, f2) (14) Etape 5: correction de la polarisation aléatoire sur la mesure de capacitance à fréquence f, Les équations de la capacitance de polarisation aléatoire (11) et de l'estimation de la capacitance caractéristique du milieu diélectrique étudié (14) sont ensuite combinées. Les valeurs de la capacitance de polarisation aléatoire (12) aux deux fréquences fi et f2 sont: Cpolalea(G, fi) = aalea. ftp. G2 Cpol_alea(G, f2) = aaieaÉ f2P. G2 En divisant ces deux équations on trouve: Cpol_alea(G, f2) = Cpol_alea(G, f1) . (f2, fl)P (15) - 23 - La combinaison des équations (11), (14) et (15) conduit à l'expression suivante: Cx(G, f2) = Cm_cor(G, f2) - (f2, fl)P. [Cm_cor(G, fi) ] + [Cx(G, fi) ] .(f2, fi)P (16) La combinaison des équations (9) et (15) conduit à une équation (17) exprimée ci-après qui fournit la formule de calcul de la capacitance du milieu diélectrique étudié, corrigée de tous les effets de polarisation et d'électronique. Ce résultat est appelé dans la suite méthode de correction FG . Formule générale de la méthode de correction FG: Cx(G, f2) = Cm_(G, f2) Ccal(G, f2) - (f2, fl)P. [Cm_(G, fi) - Ccal(G, fi)] + [Cx(G, fi) ] .(f2, fl)P (17) avec: Cx(G, f2) Cm (G, f2) Ccal(G, f2) la fréquence f2 Cm (G, fl) Ccal(G, f1) : capacitance fonction de G mesurée dans un milieu de référence à la fréquence f, Cx(G, fi) fi f2 diélectrique p égale à -2) Dans cette formule (17), le terme [Cx(G, fi) ], introduit une erreur car il n'est pas connu. Ce terme peut être rendu négligeable par un choix de fréquence de mesure de polarisation fi le plus bas possible, comme expliqué précédemment. Une fréquence de 100 KHz donne de très bons résultats. Par exemple une fréquence de mesure f2 = 1000 KHz divise par 100 ce terme d'erreur grâce au terme en facteur (f2, f1)P. Les avantages de cette méthode de correction FG sont donc: capacitance du milieu diélectrique à la fréquence f2 capacitance brute mesurée à fréquence f2 capacitance fonction de G, mesurée dans un milieu de référence à capacitance brute mesurée à la fréquence fi capacitance du milieu diélectrique à la fréquence fi fréquence où est estimée la capacitance de polarisation aléatoire fréquence de mesure de la capacitance caractéristique du milieu constante correspondant à la pente de la polarisation (en général de corriger globalement les erreurs de l'électronique et les effets de polarisation systématique et aléatoire, de corriger également les effets de second ordre, tels que le produit de l'effet combiné de la polarisation avec les erreurs globales de l'électronique, l'incertitude sur la valeur de la pente (fixée à -2) de la polarisation systématique, et le produit de l'effet combiné de l'aération du milieu avec les erreurs globales de l'électronique, d'utiliser une méthode de calibration qui permette de déterminer en une seule fois les paramètres d'un modèle de correction global, intégrant les effets de l'électronique et de la polarisation systématique, cette méthode de calibration étant effectuée, de manière automatisable, dans un milieu de référence sans cellules biologiques, de corriger la polarisation absolue à la fréquence f2 de façon plus précise que les méthodes numériques existantes; la correction est moins influencée par une erreur sur la pente de la polarisation p ou une dérive des fréquences fl ou f2, car le modèle électrochimique de type a.fP.G2 n'est appliqué qu'à la polarisation aléatoire, laquelle ne présente qu'une proportion relativement faible (environ 10 % au maximum) de la polarisation absolue; de mettre en oeuvre une formule de correction (17) qui n'utilise que des opérateurs simples etdonc facilement implantables dans un système embarqué, et de n'utiliser qu'une seule fréquence pour déterminer la capacitance de polarisation aléatoire. Des améliorations de la qualité de cette méthode de correction peuvent être envisagées. Nous allons montrer que la formule de la méthode de correction FG (17) peut être modifiée suivant le type de diélectrique que l'on souhaite mesurer, en présentant deux exemples non limitatifs de mise en oeuvre de la méthode de correction FG. Exemple 1: Si la capacitance du milieu diélectrique mesuré ne varie pas en fonction de la fréquence, alors: Cx(G, f2) = Cx(G, f1) La formule (17) se simplifie alors, en Formule de la méthode de correction FG B: CX_FG_B (G, f2) = [Cm_(G, f2) - Ccal(G, f2) - (f2, f,)P. [Cm(G, f,) - Ccal(G, f,)] ]/ [1-(f2, f,)"] (18) Tous les termes de cette formule FG B sont connus explicitement. Exemple 2: Si le milieu diélectrique à mesurer est une suspension de cellules biologiques, la formule de la méthode de correction FG (17) peut se mettre sous la forme: Cx(G, f2).[1- (f2, f,)P.Cx(G, fi)/Cx(G, f2)] = Cm (G, f2) - Ccal(G, f2) - (f2, f,)P. [Cm_(G, f,) - Ccal(G, f,)] (19) En utilisant le modèle de Pauly et Schwann et en considérant que la capacitance du milieu est négligeable devant la capacitance mesurée, on a: Cx(G, f1) = ACceii / (1 + (fi/ff)2) Cx(G, f2) = ACce11 / (1 + (f2/fc)2) avec fc: fréquence caractéristique de la cellule biologique En divisant ces deux équations, on trouve que: Cx(G, f1) / Cx(G, f2) = (1 + (f2/ff)2) / (1 + (fi/fc)2) (20) La combinaison des équations (19) et (20) et d'une pente égale à -2 conduit à une 20 formule de méthode de correction FG _C : CX_FG_C (G, f2) = (1 + f,2/f,2) . 1/(1 - f,2/f22) [ Cm_(G, f2) - Ccal(G, f2) - (f2, f,)" . [Cm (G, f,) - Ccal(G, f,) ] ] (21) Cette formule, adaptée aux milieux biologiques, est significativement plus efficace que la méthode FG de base (17). Le terme de correction principal pour le milieu biologique est en pratique 1/(1 - f12/f22). Il correspond à l'hypothèse d'égalité de valeur pour les deux capacitances mesurées à fréquence f1 et f2, comme dans l'exemple précédent. Le terme (1 + f12/f,2) apporte une correction moins significative. Il peut être remplacé par 1 dans la majorité des cas. Une autre solution est de lui donner une valeur indicative. Pour les cas où il serait utilisé pour affiner la mesure, il est nécessaire de connaître la fréquence fc caractéristique du milieu utilisé, - soit en la calculant à partir de l'équation théorique fc = 1/(4.n.r.Cm. (1/6c - 1/o-m)) dans laquelle o-m est la conductivité du milieu, déterminée à partir de la conductance G mesurée par l'appareil, les autres paramètres Cm et 6c sont estimés à partir de la littérature scientifique (respectivement 1 F/cm et 3 mS/cm), et r est le rayon des cellules biologiques étudiées, supposées sphériques. soit par une méthode en ligne permettant l'évaluation de fc à partir de mesures à différentes fréquences, corrigées par la méthode FG. Les mesures de capacitance et l'évaluation de fc peuvent alors être affinées en quelques itérations. Troisième niveau de correction: correction des dérives d'offset et des variations de capacitances du milieu (hors biomasse) Etape 6: Suppression de la dérive d'offset de l'électronique Une fois que le signal de capacitance est corrigé par la méthode FG, il subsiste une légère dérive thermique de ce signal qui est due à la dérive d'offset de l'électronique. Cette erreur est corrigée à l'aide de la mesure de capacitance faite à une troisième fréquence. On utilise pour cela la fréquence la plus élevée de l'appareil (par exemple, 10 MHz) car, dans ce cas, elle offre l'avantage de supprimer également toute variation de capacitance du milieu diélectrique qui serait liée à une évolution du milieu de suspension des cellules biologiques. Suivant le principe de traitement des mesures de capacitance brute, on obtient le 20 terme corrigé : Cm cor(G, f3) = Cm(G, f3) - Ccal(G, f3) Ce terme de correction doit être soustrait de la méthode de correction FG que l'on souhaite utiliser. Par exemple, à partir de la méthode de correction FG_C (21), on aboutit à la méthode de correction FG CO: ACX(G, f2) = (1 + f,2/ff2) . 1/(1 - f, 2/f22) [ Cm_(G, f2) - Ccal(G, f2) - (f21 f,)" . [Cm (G, fi) - Ccal(G, f,)] ] (Cm_(G, f3) - Ccal(G, f3)) (22) avec: - ACx(G, f2) : incrément capacitif du milieu diélectrique à la fréquence f2 - Cm (G, f2) : capacitance brute mesurée à fréquence f2 - Ccal(G, f2) : capacitance fonction de G, mesurée dans un milieu de référence à la fréquence f2 Cm_(G, fi) : capacitance brute mesurée à la fréquence fi - 27 - Ccal(G, f1) : capacitance fonction de G mesurée dans un milieu de référence à la fréquence fi Cx(G, fi) : capacitance du milieu diélectrique à la fréquence fi fi: fréquence où est estimée la capacitance de polarisation aléatoire f2: fréquence de mesure de la capacitance caractéristique du milieu diélectrique P égale à -2) : constante correspondant à la pente de la polarisation (en général f3: fréquence où est mesurée la dérive thermique de l'offset électronique et la capacitance du milieu diélectrique (hors cellules) : fréquence caractéristique (Pauly et Schwann) du milieu biologique étudié Cette formule de méthode de correction FG CO a été implantée dans un appareil 15 de mesure de biomasse du type de celui décrit dans le document FR2812725. Cette formule permet de corriger: - l'ensemble des erreurs de capacitance, fonctions de la fréquence et de la conductance, de l'électronique, des effets de ligne, et du capteur, les erreurs de polarisations systématiques et aléatoires, la dérive thermique de l'offset de l'électronique, la variation de la capacitance du milieu diélectrique (hors cellules biologiques). Etape 7: détermination de la permittivité et de la conductance du milieu diélectrique Les valeurs de capacitances et de conductances mesurées sont converties respectivement en permittivité absolue et en conductivité en multipliant les valeurs de capacitance et les valeurs de conductance par un facteur de sonde k. s=C.k et o=G.k (23) Ce facteur k est constant pour une géométrie donnée de capteur. Il est égal à LIS dans le cas d'un condensateur plan ayant une surface S d'électrode et une distance L inter électrodes. Dans le cas de l'appareil de mesure de biomasse du type décrit dans le document FR2812725, le facteur k est déterminé expérimentalement à l'aide d'une solution d'eau salée de conductivité connue. La détermination du facteur k est obtenue en divisant la valeur de conductivité de la solution par la conductance mesurée par l'appareil. Ce facteur de sonde k peut être appliqué aux mesures de conductance et de capacitance avant ou après la correction de ces mesures par la méthode de correction FG. Appliqué à la valeur de ACX(G, f2) obtenue précédemment (Equation 22), il permet d'obtenir l'incrément de permittivité A avec Os = ACX(G, f2) . k (24) Etape 8: détermination de la concentration de biomasse L'amplitude de la dispersion f3, pour des cellules supposées sphériques, tant que la fraction volumique P n'est pas trop forte (comme c'est le cas dans la plupart des fermentations) est donnée par la relation classique: s- rCmP 4 (25) dans laquelle A représente ici l'incrément de permittivité calculé en faisant la différence entre permittivité à fréquence basse et permittivité à fréquence élevée, de part et d'autre de la dispersion f3. Cette relation est également valable lorsque la permittivité "basse" est prise à une fréquence quelconque au dessous de la fréquence haute, dans le domaine de la dispersion 13, et en particulier à la fréquence f2, telle que définie précédemment. Pour une biomasse microbienne, on peut considérer qu'il y a proportionnalité entre la concentration de biomasse X et la fraction volumique P, en faisant l'hypothèse que la capacitance membranaire Cm et le rayon r sont des constantes. On obtient ainsi la relation X=y.Ac (26) avec: y: coefficient de cellule biologique; ce coefficient peut être déduit à partir d'un étalonnage dans une suspension de biomasse dont la concentration est connue; A$ : variation de permittivité calculée selon l'équation (24) Etape 9: correction des effets d'aération sur les mesures de permittivité et de conductance Dans un milieu aéré, le facteur de sonde k (k=L/S dans le cas d'un condensateur plan S surface d'électrode, L distance inter électrodes) augmente car la surface apparente des électrodes est réduite par la présence des bulles. La longueur du parcours des lignes de champs inter-électrodes est quant à elle augmentée, mais de façon moins significative. Pour un milieu diélectrique de permittivités et de conductivité a, la capacitance 5 et la conductance mesurées sont exprimées, respectivement sans aération et avec aération, de la façon suivante: sans aération: Co(Go, f) = s / k et Go= a / k (27) avec aération: Ca(Ga, f) = s / ka et Ga = a / ka (28) La combinaison des équations (27) et (28) donne: ka = k. Co(Go, f) / Ca(Ga, f) = k. Go / Ga (29) En choisissant une fréquence prédéterminée f4 où la valeur des caractéristiques diélectriques du milieu est la plus stable quels que soient les changements de paramètres d'environnement, il possible de déterminer une variation de capacitance liée uniquement au changement du taux d'aération. Pour un milieu contenant des cellules biologiques en suspension, cette fréquence est à choisir nettement au-dessus de la fréquence fc, typiquement entre 10 et 100 MHz. Cette variation de capacitance est alors obtenue en soustrayant à la mesure de capacitance effectuée à la fréquence f4, la valeur calculée à partir du modèle de calibration Ccal(G,f4) (8), suivant le principe de traitement des mesures de capacitance brute Cm_cor(G,f4). Cm_cor(Ga, f4) = Ca(Ga, f4) - Co(Go, f4) (30) La combinaison des équations (26) et (27) donne le facteur de sonde en milieu aéré : ka = k / [1+ (Cm_cor(Ga, f4) / Co(Go, f4) )] (31) avec: - k: facteur de sonde d'un milieu de référence non-aéré - Co(G, f4) capacitance du milieu de référence non-aéré et à la fréquence f4. Cette valeur prédéterminée est obtenue, soit par un abaque de permittivité des matériaux diélectriques et en utilisant le facteur de sonde k, soit en mesurant la capacitance du milieu de référence non aéré suivant le principe de traitement des mesures de capacitance brute Cm_cor(Go, f4). En général, la permittivité ou la capacitance du milieu de référence est celle de l'eau. Le facteur de sonde en milieu aéré ka est ensuite utilisé pour déterminer la permittivité du milieu diélectrique, corrigée des effets d'aération sur la mesure de capacitance (32). La conductivité du milieu est également déterminée en corrigeant les effets de l'aération sur la mesure de conductance (33). La combinaison des équations (25) et (28) donne la permittivité du milieu à toutes les fréquences de l'appareil: = Cm_cor(Ga, f) . k / [1+ (Cm_cor(Ga, f4) / Co(Go, f4) )] (32) La conductivité du milieu à toutes les fréquences de l'appareil est exprimée de la façon suivante: 6 = Ga. k / [1+ (Cm_cor(Ga, f4) / Co(Go, f4) )] (33) avec: E: permittivité déterminée à la fréquence f et corrigée des effets d'aération o: conductivité déterminée à la fréquence f et corrigée des effets d'aération Cm cor(G, f) : capacitance mesurée suivant le principe de traitement des mesures de capacitance, affectée de l'aération et mesurée la fréquence f Cm_cor(G, f4) : capacitance mesurée suivant le principe de traitement des mesures de capacitance, affectée de l'aération et mesurée à la fréquence de détermination d'aération f4 Co(Go, f4) : Capacitance du milieu de référence dans des conditions de non-aération et à la fréquence f4 Ga: conductance du milieu affectée de l'aération et mesurée à fréquence f4 Go: conductance du milieu du milieu de référence dans des conditions de non-aération Les valeurs de capacitances et conductances corrigées de l'aération peuvent être déterminées avec l'équation (27). Etape 10: Détermination des paramètres caractéristiques d'une dispersion diélectrique La méthode la plus souvent utilisée pour l'évaluation de la biomasse, qui consiste à mesurer la capacitance du milieu à une ou deux fréquences prédéfinies, ne permet pas en réalité une évaluation directe du biovolume. C'est en fait le produit P.r.Cm, grandeur complexe, qui est évaluée par l'incrément Ag, qui dépend simultanément de la conductivité du milieu, de la taille et de la distribution de taille des cellules, ainsi que de leur état physiologique. Pour évaluer avec plus de vraisemblance le biovolume, il est nécessaire d'extraire de la courbe de dispersion suffisamment d'information pour identifier le plus grand nombre possible de variables. La courbe de dispersion f3 peut être obtenue en appliquant la méthode de correction des mesures de capacitances précédemment décrite. On expose ici, dans le cadre de la présente invention, une méthode permettant de retrouver les descripteurs mathématiques de la dispersion f3, en utilisant pour cela une technique d'ajustement linéaire, alors que les autre méthodes proposées utilisent des techniques d'ajustement nonlinéaires, potentiellement plus précises, mais beaucoup plus lourdes à mettre en oeuvre, en particulier si elles doivent être implantées dans des systèmes à base de microcontrôleurs. On utilise un polynôme d'ordre n pour représenter la courbe Cx = f(fréquence). On peut écrire: Cx=P(f)=a0+al. f+ a2. f2+a3. f3 + an. fn Un fait remarquable est qu'à partir d'un ordre n égal ou supérieur à 2, la fonction polynomiale peut être ajustée sur la courbe de dispersion (3, de part et d'autre de la fréquence fc, comme l'illustre la figure 8. En effet, l'inflexion de la courbe de dispersion n'existe qu'en coordonnées semi-logarithmiques. Du coté des fréquences élevées, le polynôme présente toujours une branche parabolique, qui tend vers l'infini (+). En principe, ce type de fonction ne peut donc pas être appliqué directement à l'étude du domaine des fréquences les plus élevées, largement supérieures à fc. En revanche, il est impératif que les mesures encadrent bien cette fréquence caractéristique, puisque c'est elle qui conditionne la détermination du point d'inflexion de la courbe de dispersion f3. Le polynôme décrit très bien le domaine des fréquences basses et peut en particulier être calculé en f = 0, où Cx (f=o) = a0 On calcule ainsi aisément la valeur de l'incrément capacitif. On va maintenant décrire de manière détaillée la procédure à appliquer pour le calcul des différents coefficients du polynôme. On se bornera ici à la présentation du cas où n = 2. Il s'agit d'identifier les trois coefficients de la fonction: Cx = a0 + al f+ a2 f2 On a donc besoin d'au moins trois mesures réalisées à trois fréquences réparties autour de la fréquence caractéristique typique de la dispersion P. Les données publiées dans la littérature scientifique montrent que cette fréquence caractéristique est souvent comprise entre 0.5 et 2 MHz. Puisque la mesure doit être extrapolée à f=0, il est souhaitable de fixer une fréquence de mesure à la plus faible valeur techniquement envisageable (typiquement 0.1 à 0.3 MHz), afin de limiter l'erreur liée à l'extrapolation. D'autre part, on a observé que la fonction polynomiale représentait mal le domaine des fréquences élevées. On utilisera donc le plus souvent une fréquence haute égale à 2 ou 3 MHz. Cependant, dans le cas de cellules de petite taille (bactéries par exemple), pour lesquelles la fréquence caractéristique est plus élevée, il faudra choisir une fréquence de mesure également plus élevée. Le domaine de fréquence pourrait être étendu en utilisant une fonction polynomiale d'ordre supérieur, au prix d'une complexité plus importante et d'une réduction de la "robustesse" de la méthode. La méthode se ramène ainsi à la résolution d'un système de trois équations (les trois mesures) à trois inconnues (les trois paramètres). Sous forme matricielle, le problème s'écrit: [C]= [F] x [Coeffs], qui se résout en [Coeffs] = [F] -1.0 Les coefficients de la matrice inverse F-1, qui ne dépendent que des valeurs des 20 fréquences utilisées, sont calculés au préalable. La méthode se ramène donc au calcul d'une série de multiplications. Ainsi, par exemple pour des fréquences de mesure de 0.300, 1 et 3 MHz, les valeurs numériques des différents éléments des tableaux sont les suivantes: a0 1.5873 -0.6429 0.0556 Cx(f5) al = -2.1164 2.3571 -0.2407 x Cx(f6) a2 0.5291 -0.7143 0.1852 Cx(f7) Afin d'améliorer la robustesse de la méthode, on peut être amené à réaliser un nombre plus grand de mesures, à des fréquences supplémentaires. On utilise alors une méthode similaire, dans laquelle la matrice inverse est remplacée par une matrice dite "pseudo-inverse", dont les coefficients sont également pré-calculés. La dispersion est observée en faisant le changement de variable z = Ln f, soit f = eZ. Cx = a0 + al eZ + a2 e2z + a3 e3' +...+ an en' - 33 - On trouve la fréquence caractéristique fc en cherchant la position du point d'inflexion. On a: dCx/dz = ao + al ez + a2 e2z + a3 e3z +...+ an enz d2Cx/dz2 = al ez + 4 a2 e2z + 9 a3 e3z +...+ n2 an enZ Le point d'inflexion est trouvé lorsque la dérivée seconde est nulle, ce qui conduit à: d2Cx/dz2 = 0 = al + 4 a2 eZ + 9 a3 e2z +...+ n2 an e(n-1)z En effectuant le changement de variables inverse, on obtient: 0 = al + 4 a2 fc + 9 a3 fc2 +...+ n2 an fc(n-l) Pour un polynôme P(f) de degré 2, la relation se ramène à : 0 = al + 4 a2 fc, soit fc = -al/(4 a2) Il faut impérativement que la concavité du polynôme de degré 2 soit orientée vers le bas, c'est à dire que le coefficient a2 soit positif. Dans le cas contraire, la fréquence correspondant au point d'inflexion est négative, c'est à dire que la fréquence caractéristique est en fait trop élevée par rapport au domaine de fréquences de mesure pour qu'une parabole puisse être ajustée aux mesures. Alternativement, on peut utiliser un polynôme P(f) de degré 3. Le calcul est à peine plus engagé : on obtient par dérivation 0 = al + 4 a2 fc+ 9 a3 fc2, équation du second degré qui conduit à A' = 4 a22 9 al a3, d'où on tire fc = [- 2a2 (4 a22 9 al a3)"2]/(9 a3) En revanche, pour des polynômes de degré supérieur, il serait nécessaire de réaliser une résolution numérique, par exemple en utilisant la méthode de NewtonRaphson. Se poserait alors le problème du repérage de la solution pertinente. La recherche de la position du point d'inflexion repose sur un processus itératif tel que fi+l = fi - Pi/P'i On dérive donc une fois de plus le polynôme. On obtient P'i = 4 a2 + 18 a3 fc +...+ (n-1) n2 an fc(n-2) Pour un polynôme de degré 3, la formule d'itération se ramène à : fi+l=fiPi/P'i=fi-(a1+4a2fi+9a3fi2)/(4a2+18a3fi) La solution est généralement atteinte avec une précision acceptable en trois itérations. Le problème principal est de déterminer des conditions initiales suffisamment proches de la solution vers laquelle on doit converger. On peut démarrer de la fréquence - 34 - de mesure la plus basse utilisée fmin (0.3 MHz), mais dans certains cas (fc élevé), l'algorithme converge alors vers un point d'inflexion situé à fc Le coefficient a du milieu diélectrique, est obtenu en calculant la pente de la courbe de dispersion au voisinage de la fréquence caractéristique fc. A partir de la relation de Cole-Cole, la pente au point d'inflexion est donnée par la relation: (dCx/df) fc = -a0 (1- J3) / (2 fc (1+ sin (ma/2) ) Cette relation n'est pas inversible, c'est à dire qu'on ne.peut pas obtenir analytiquement une valeur de a. Pour y parvenir, une autre approche consiste à montrer que la fonction de dispersion en fonction de la fréquence établie empiriquement par Cole et Cole peut être avantageusement remplacée par la fonction: Cx = Cxhigh + ACx / (1 + (f/fc)20- b)) dans laquelle le coefficient J3 est compris entre 0 et 1. Cette nouvelle relation n'est pas intrinsèquement meilleure ou moins bonne que celle de Cole et Cole, puisqu'elle est également empirique. Il n'est cependant pas possible de discerner expérimentalement une relation de l'autre. Cette nouvelle relation permet le calcul analytique du coefficient R. On a en effet la relation suivante: (dCx/df)ff = - a0 (1-f3) / (2 fc) = al + 2 a2 fc + 3 a3 fc2 +...+ n an fco"-1) d'où on tire ensuite J3: f3= 1+ 2 fc (al + 2 a2 fc + 3 a3 fc2+...+ nanfc(r-1 /a0 Une relation empirique permet, si cela était nécessaire, de recalculer la valeur du coefficient a à partir de celle de P. On a établi en effet aisément la relation approchée suivante: a = (0.627314 J32 - 0.061700 f3 + 0.439407) f3 expression qui, pour des valeurs de a comprises entre 0 et 0.5, domaine habituel de variation, peut être affinée en a = (0.495698 (32 - 0.062162 (3 + 0.413456) (3 Alternativement, en raison du caractère symétrique de la dispersion f3 autour du point d'inflexion correspondant à la fréquence caractéristique fc, il est possible d'utiliser les fréquences les plus élevées, toujours en encadrant la fréquence fc. Il faut alors effectuer un changement de variables, en posant h = 1/f et hc = 1/fc. Le traitement - 35 - mathématique est ensuite réalisé comme exposé précédemment, mais conduit à trouver Cfhigh, en extrapolant le polynôme utilisé à h = O. On obtient fc en inversant la valeur de hc trouvée. Cette variante est particulièrement intéressante parce que les erreurs associées aux polarisations systématiques et aléatoires n'affectent que très peu les mesures de capacitances réalisées aux fréquences élevées. Par ailleurs, on constate expérimentalement que le bruit de mesure est également plus réduit, ce qui permet d'obtenir des valeurs des descripteurs également moins bruitées. On a ainsi obtenu la valeur des trois descripteurs caractérisant la dispersion (3. On peut maintenant utiliser cette information pour améliorer la mesure de biomasse. En effet, nous avons vu que la mesure de capacitance renvoyait une valeur proportionnelle au produit P.r.Cm, qui est donc dépendante de la taille des cellules. Nous avons vu également que la valeur de fc est inversement proportionnelles au produit r.Cm. En effectuant le produit C.fc, on élimine donc les variables inconnues r et Cm, et on obtient une valeur indépendante de la capacitance membranaire et surtout de la taille, qui peut varier dans des proportions fortes. On obtient: P DEfc?C 6c+26m Dans cette expression, la fraction volumique de biomasse P ne dépend plus que d'une seule variable inconnue oc, puisque am peut être mesurée par l'appareil de mesure de biomasse en même temps que la capacitance. Comme 6c est une variable qui est métaboliquement régulée, et qu'il a été montré expérimentalement qu'elle était remarquablement insensible aux variations de la conductivité mn du milieu, on peut ainsi parvenir à une évaluation de la fraction volumique P nettement améliorée par rapport à la simple mesure de l'incrément diélectrique. Bien sûr, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits et de nombreux aménagements peuvent être apportés à ces exemples sans sortir du cadre de l'invention. En particulier, le procédé de détermination selon l'invention peut être mis en oeuvre dans d'autres appareils de mesure de biomasse que celui décrit dans le document FR2812725. -36 REVENDICATIONS 1. Procédé de détermination de biomasse dans un milieu, notamment un milieu comprenant des cellules en suspension dans un fluide, la biomasse (X) étant obtenue à partir d'une différence entre un premier signal de capacitance (C' 1) dudit milieu, mesuré à une première fréquence, et un second signal de capacitance (C'2) dudit milieu, mesuré à une seconde fréquence, caractérisé en ce qu'il comprend une correction séparée de chacun des signaux mesurés, selon au moins un niveau de correction, ce premier niveau de correction comprenant une correction desdites signaux mesurés selon un modèle dépendant de la conductance du milieu auxdites première et seconde fréquences. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un second niveau de correction comprenant une correction desdits premier et second signaux de capacitance corrigés, à partir d'une troisième mesure de capacitance réalisée à une troisième fréquence, ellemême corrigée par une mesure de conductance réalisée à ladite troisième fréquence. 3. Procédé selon la revendication 2, mis en oeuvre pour un milieu comprenant des cellules en suspension dans un milieu, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un troisième niveau de correction utilisant un modèle de comportement de la (3-dispersion dans ledit milieu. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les mesures de capacitance et de conductance sont effectuées au moyen d'un appareil comprenant des électrodes en contact avec le milieu et des moyens électroniques de traitement des signaux de capacitance et de conductance prélevés à partir desdites électrodes, ce signal de capacitance étant entaché d'erreurs de capacitance dues à une polarisation aléatoire, d'erreurs de capacitance dues à une polarisation systématique, et d'erreurs de capacitances dues aux erreurs globales provenant des moyens électroniques, caractérisé en ce que les erreurs de capacitance dues à la polarisation aléatoire sont corrigées séparément de celles dues à la polarisation systématique et de celles dues à l'électronique, et en ce qu'il comprend en outre: - 37 - une modélisation globale de la polarisation systématique et des erreurs de capacitance dues aux erreurs globales de l'électronique, sous la forme d'une équation commune Ccai(G, f), fonction de la conductance du milieu et de la fréquence d'excitation des électrodes conductrices, et, - une détermination d'une valeur de capacitance Cm cor(G, f) corrigée, en comparant chaque mesure de capacitance brute Cm(G, f) provenant de l'appareil et effectuée à une fréquence prédéterminée, à la valeur de ladite équation commune du modèle Ccaj(G, f) à ladite fréquence prédéterminée. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'équation commune du modèle Ceai(G, f) est de forme polynomiale ou peut être approximée par une forme polynomiale. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'équation commune du 15 modèle Ccal(G, f) de forme polynomiale est d'ordre 3 ou 4. 7. Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'équation commune du modèle Cj(G, f) présente des coefficients calculés pour une pluralité de fréquences prédéterminées utilisées par l'appareil. 8. Procédé selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que les erreurs de capacitance corrigées par l'équation commune du modèle Ccai(G, f) comprennent des erreurs capacitives fonction de la conductance et de la fréquence. 9. Procédé selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que les erreurs de capacitance corrigées par l'équation commune du modèle Ccai(G, f) comprennent des erreurs liées à des effets de ligne. 10. Procédé selon l'une des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que les erreurs de 30 capacitance corrigées par l'équation commune du modèle Ccaj(G, f) comprennent des erreurs liées à des imperfections du capteur. 11. Procédé selon l'une des revendications 4 à 10, caractérisé en ce que le modèle de correction d'équation commune Ccai(G, f) élimine l'incertitude sur la pente d'évolution 35 de la polarisation systématique en fonction de la fréquence d'excitation. 12. Procédé selon l'une des revendications 4 à 11, caractérisé en ce que le modèle de correction d'équation commune Ccai(G, f) élimine le produit de l'effet combiné de l'aération du milieu et des erreurs globales de l'électronique au sein de l'appareil. 13. Procédé selon l'une des revendications 4 à 12 et la revendication 8, caractérisé en ce que les coefficients du modèle de correction Ccai(G, f) sont déterminés à partir d'une opération de calibration dans un milieu de référence ne contenant pas de cellules biologiques et dont la conductance est modifiée de façon à parcourir la pleine échelle de la gamme de conductance de l'appareil. 14. Procédé selon l'une des revendications 4 à 13, caractérisé en ce que la détermination de l'erreur de capacitance due à la polarisation aléatoire est effectuée à une fréquence prédéterminée fi choisie la plus basse possible de sorte que la détermination de l'erreur de capacitance de polarisation aléatoire soit peu influencée par la capacitance du milieu. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la capacitance de polarisation aléatoire Cm_cor(G, fi) est calculée à la fréquence fi par comparaison entre la mesure de capacitance brute issue de l'appareil et le modèle de correction Ccal(G, f,). 16. Procédé selon l'une des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une détermination de la capacitance du milieu diélectrique à une deuxième fréquence prédéterminée f2. 17. Procédé selon la revendication 16, mis en oeuvre pour une mesure sur une suspension de cellules biologiques, caractérisé en ce que la deuxième fréquence prédéterminée f2 est choisie proche de la fréquence caractéristique fc de ladite suspension, caractéristique de la dispersion 3 des cellules en suspension. 18. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que la capacitance du milieu diélectrique Cm_cor(G, f2) est calculée à la fréquence f2, par comparaison entre la mesure de capacitance brute issue de l'appareil et le modèle de conductance Ccal(G, f2). 2874264 -39 19. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une modélisation de la polarisation aléatoire selon un modèle de comportement tel que aalea. fr. G2, dans lequel: 5- - G est la conductance du milieu, - aalea est une constante prédéfinie, - p est la pente de la polarisation. 20. Procédé selon les revendications 14, 16 et 19, caractérisé en ce que la détermination 10 de la capacitance du milieu diélectrique implémente un modèle de correction résultant d'une combinaison: - de la mesure de capacitance de la polarisation aléatoire Cm cor(G, f1), estimée à la première fréquence prédéterminée f1, - de la mesure de capacitance du milieu Cm cor(G, f2), estimée à la deuxième fréquence 15 prédéterminée f2, - et du modèle de comportement de la polarisation aléatoire aaieaÉ fDÉ G2. 21. Procédé selon la revendication 20, mis en oeuvre pour la mesure de suspensions de cellules biologiques suivant un modèle de comportement du type Acapacitance Cx(G, f) = A ^ Ce x 1 / (1 + (f/fc)2) où ff est la fréquence caractéristique du milieu. 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la fréquence caractéristique ff est prédéterminée à partir d'un abaque. 23. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la fréquence caractéristique ff est déterminée en ligne par une méthode de détermination des paramètres caractéristiques de la dispersion P. 24. Procédé selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que le diélectrique mesuré à la première fréquence prédéterminée fi est sensiblement identique au diélectrique mesuré à la seconde fréquence prédéterminée f2. 25. Procédé selon l'une des revendications 21 à 24, mis en oeuvre pour la mesure d'un 35 milieu contenant des cellules biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une détermination d'une erreur de capacitance Cm_cor(G, f3) due à la dérive thermique de l'offset de l'électronique et à des variations de la capacitance du milieu diélectrique de suspension, à une troisième fréquence prédéterminée f3. 26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'erreur de capacitance Cm_cor(G, f3) est calculée à la troisième fréquence prédéterminée f3, par comparaison entre la mesure de capacitance brute issue de l'appareil et le modèle de correction Ccal(G, f3). 27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une correction de mesures de capacitances brutes ou corrigées, entachées d'erreurs dues à la dérive thermique de l'offset de l'électronique et à des variations de capacitance du milieu de suspension, en soustrayant de ces mesures l'erreur de capacitance Cm_cor(G, f3). 28. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 27, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une conversion des valeurs de capacitance et de conductance du milieu en des valeurs de permittivité et de conductivité, par multiplication desdites valeurs de capacitance et de conductance par un facteur de sonde k. 29. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une détermination du facteur de sonde k, à partir d'une division de la valeur de conductivité d'une solution liquide de conductivité connue par une valeur de mesure de conductance de ladite solution. 30. Procédé selon l'une des revendications 28 ou 29, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une détermination d'un facteur de sonde ka lié à l'aération du milieu, à une quatrième fréquence prédéterminée f4 31. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que la quatrième fréquence prédéterminée est choisie de sorte que le diélectrique est le plus stable quels que soient les changements de paramètres d'environnement. 32. Procédé selon l'une des revendications 30 ou 31, caractérisé en ce que le facteur de sonde ka représente une modification géométrique apparente du capteur lorsque des bulles sont présentes dans le milieu diélectrique. 33. Procédé selon l'une des revendications 30 à 32, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une détermination de la capacitance Cm cor(G, f4) liée au facteur ka à la fréquence f4, par comparaison de la mesure de capacitance brute au modèle de conductance Ccal(G, f4). 34. Procédé selon la revendication 33, caractérisé en ce que le facteur de sonde ka. est calculé en rapportant la capacitance Cm cor(G, f4) à une valeur de capacitance d'un milieu de référence non aéré. 35. Procédé selon l'une des revendications 30 à 34, caractérisé en ce que le facteur de sonde ka est utilisé pour déterminer la permittivité du milieu diélectrique corrigée des effets d'aération sur la mesure de capacitance, et pour déterminer la conductivité du milieu en corrigeant les effets de l'aération sur la mesure de conductance. 36. Procédé selon l'une des revendications précédentes et l'une des revendications 21 à 23 et l'une des revendications 16 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une détermination de la concentration de biomasse du milieu, en multipliant la variation de permittivité mesurée à la seconde fréquence prédéterminée f2 par un coefficient prédéterminé y. 37. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une détermination du coefficient prédéterminé y à l'aide d'un abaque de paramètres physiques caractéristiques des cellules biologiques. 38. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une 30 détermination du coefficient prédéterminé y à l'aide d'un étalonnage préalable dans une suspension de biomasse dont la concentration est connue. 39. Procédé selon l'une des revendications 30 à 38, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une détermination de paramètres caractéristiques d'une dispersion diélectrique sur des milieux contenant des cellules biologiques, en utilisant au moins trois fréquences prédéterminées f5, f6, f7. 40. Procédé selon la revendication 39, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une détermination de capacitances liées à la dispersion Cm_cor(G, f5), Cm_cor(G, f6), Cm_cor(G, f7), aux au moins trois fréquences prédéterminée f5, f6, f7, en comparant des mesures de capacitance brute provenant de l'appareil aux modèles de conductance aux fréquences correspondantes Ccal(G, f5), Ccal(G, f6), et Ccal(G, f7). 41. Procédé selon l'une des revendications 39 ou 40, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une détermination des paramètres caractéristiques de la dispersion diélectrique, comportant: - une mesure d'un nombre n de valeurs mesurées de capacitance corrigée Cm_cor(G, f5 à) à n fréquences réparties sur le domaine de fréquence correspondant à celui de la 15 dispersion diélectrique étudiée, n étant supérieur ou égal à 3, - un ajustement d'une fonction multilinéaire dépendant de la fréquence et comportant n coefficients variables pour approcher au mieux les n valeurs de capacitance corrigée mesurées, et - un calcul des paramètres caractéristiques de la dispersion diélectrique à partir des 20 coefficients de la fonction multilinéaire. 42. Procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que la fonction multilinéaire dépendant de la fréquence est constituée par un polynôme de degré n-1. 43. Procédé selon la revendication 42, caractérisée en ce qu'il comprend en outre un calcul d'une évaluation de la concentration de biomasse du milieu, à partir des valeurs des coefficients du polynôme de degré n-1. 44. Procédé selon l'une des revendications 42 ou 43, caractérisé en ce qu'il comprend 30 en outre un calcul de l'évaluation de la taille des microorganismes dans le milieu, à partir des coefficients du polynôme de degré n-1. 45. Dispositif pour déterminer une biomasse dans un milieu, notamment un milieu comprenant des cellules en suspension dans un fluide, mettant en oeuvre le procédé 35 selon l'une des revendications précédentes, comprenant des moyens pour corriger un - 43 signal de capacitance provenant d'un appareil générant un signal de capacitance et de conductance, cet appareil étant relié à un capteur ayant des électrodes conductrices en contact direct avec le milieu diélectrique à mesurer, ce signal de capacitance étant entaché d'erreurs de capacitance dues à une polarisation aléatoire et d'erreurs de capacitance dues à une polarisation systématique, caractérisé en ce que les moyens de correction du signal de capacitance sont agencés pour corriger séparément d'une part les erreurs de capacitance dues à la polarisation aléatoire et d'autre part les erreurs dues à la polarisation systématique, et comprennent: - des moyens pour modéliser la polarisation systématique et des erreurs de capacitance incluant des erreurs dues à la polarisation systématique, sous la forme d'une équation commune Ccai(G, f), fonction de la conductance du milieu et de la fréquence d'excitation des électrodes conductrices, cette équation étant agencée pour éliminer le produit de l'effet combiné de la polarisation et des erreurs globales de l'électronique au sein de l'appareil, et, - des moyens pour déterminer une valeur de capacitance Cm cor(G, f) corrigée, en comparant chaque mesure de capacitance brute Cx(G, f) provenant de l'appareil et effectuée à une fréquence prédéterminée, à la valeur de ladite équation commune du modèle Ccai(G, f) à ladite fréquence prédéterminée. 46. Dispositif selon la revendication 45, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens pour déterminer l'erreur de capacitance due à la polarisation aléatoire à une première fréquence prédéterminée fi choisie la plus basse possible de sorte que la détermination de l'erreur de capacitance de polarisation aléatoire est peu influencée par la capacitance d'un milieu biologique. 47. Dispositif selon la revendication 46, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens pour déterminer la capacitance du milieu diélectrique à une deuxième fréquence prédéterminée f2 choisie proche de la fréquence caractéristique fc du milieu, caractéristique de la dispersion 13 des cellules en suspension. 48. Dispositif selon la revendication 47, caractérisé en ce que les moyens pour déterminer la capacitance du milieu diélectrique implémentent un modèle de correction résultant d'une combinaison: - d'une mesure de capacitance de la polarisation aléatoire Cm_cor(G, fi), estimée à la première fréquence prédéterminée f1, - d'une mesure de capacitance du milieu Cm_cor(G, f2), estimée à la deuxième fréquence prédéterminée f2, et d'un modèle de comportement de la polarisation aléatoire aaleaÉ fi'. G2. 49. Dispositif selon la revendication 48, mis en oeuvre pour la mesure d'un milieu contenant des cellules biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens pour déterminer une erreur de capacitance Cm_cor(G, f3) due à la dérive thermique de l'offset de l'électronique et à des variations de la capacitance du milieu diélectrique de suspension, à une troisième fréquence prédéterminée f3. 50. Dispositif selon la revendication 49, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens pour déterminer une capacitance Cm_cor(G, f4) liée à un facteur de sonde apparent ka lié à l'aération du milieu, à une quatrième fréquence prédéterminée f4. 51. Dispositif selon la revendication 50, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens pour déterminer des paramètres caractéristiques d'une dispersion diélectrique sur des milieux contenant des cellules biologiques, en utilisant au moins trois fréquences prédéterminées f5, f6, f7. 52. Dispositif selon l'une des revendications 45 à 51, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens pour déterminer des paramètres caractéristiques de la dispersion diélectrique, comportant: - des moyens pour mesurer un nombre n de valeurs de capacitance corrigée Cm_cor(G, f5 à m) avec m = 5 + n -1, à n fréquences réparties sur le domaine de fréquence correspondant à celui de la dispersion diélectrique étudiée, n étant supérieur ou égal à 3, - des moyens pour ajuster une fonction multilinéaire dépendant de la fréquence et comportant n coefficients variables pour approcher au mieux les n valeurs de capacitance corrigée mesurées, et - des moyens pour calculer des paramètres caractéristiques de la dispersion diélectrique à partir des coefficients de la fonction multilinéaire. 53. Appareil pour mesurer une biomasse d'un milieu biologique, mettant en oeuvre un 35 procédé de détermination de biomasse selon l'une quelconque des revendications 1 à 44, prévu pour générer un signal de capacitance et un signal de conductance, comprenant une électronique de mesure reliée à un capteur pourvu d'électrodes conductrices en contact direct avec le milieu à mesurer, caractérisé en ce qu'il inclut un dispositif de détermination de biomasse comprenant des moyens pour corriger ledit signal de capacitance, ce signal de capacitance étant entaché d'erreurs de capacitance dues à une polarisation aléatoire et d'erreurs de capacitance dues à une polarisation systématique, lesdits moyens de correction du signal de capacitance étant agencés pour corriger séparément d'une part les erreurs de capacitance dues à la polarisation aléatoire et d'autre part les erreurs dues à la polarisation systématique, et comprenant: - des moyens pour modéliser la polarisation systématique et des erreurs de capacitance incluant des erreurs dues à la polarisation systématique, sous la forme d'une équation commune CcÀG, f), fonction de la conductance du milieu et de la fréquence d'excitation des électrodes conductrices, cette équation étant agencée pour éliminer le produit de l'effet combiné de la polarisation et des erreurs globales de l'électronique de mesure, et, des moyens pour déterminer une valeur de capacitance Cm cor(G, f) corrigée, en comparant chaque mesure de capacitance brute Cx(G, f) effectuée à une fréquence prédéterminée, à la valeur de ladite équation commune du modèle Ccai(G, f) à ladite fréquence prédéterminée. 54. Appareil de mesure d'impédance, agencé pour fournir une mesure de la partie réelle d'une impédance et de la capacitance correspondant à cette impédance, caractérisé en ce qu'il inclut un dispositif de détermination de biomasse comprenant des moyens pour corriger ladite mesure de capacitance, cette mesure de capacitance étant entachée d'erreurs de capacitance dues à une polarisation aléatoire et d'erreurs de capacitance dues à une polarisation systématique, lesdits moyens de correction du signal de capacitance étant agencés pour corriger séparément d'une part les erreurs de capacitance dues à la polarisation aléatoire et d'autre part les erreurs dues à la polarisation systématique, et comprenant: - des moyens pour modéliser la polarisation systématique et des erreurs de capacitance incluant des erreurs dues à la polarisation systématique, sous la forme d'une équation commune Cca1(G, f), fonction de la conductance du milieu et de la fréquence d'excitation des électrodes conductrices, cette équation étant agencée pour éliminer le produit de l'effet combiné de la polarisation et des erreurs globales de l'électronique de mesure dudit appareil, et, - des moyens pour déterminer une valeur de capacitance Cm_cor(G, f) corrigée, en comparant chaque mesure de capacitance brute Cx(G, f) effectuée à une fréquence prédéterminée, à la valeur de ladite équation commune du modèle Ccai(G, f) à ladite fréquence prédéterminée.