FR 2878253 A1 20060526 FR 0412309 A 20041119 Moyens pour améliorer les capacités fermentaires de levures actives et leurs applications L'invention concerne des moyens pour améliorer les capacités fermentaires de levures actives. Elle a plus particulièrement pour objet des levures sèches actives (LSA en abrégé) ou des levures actives réhydratées, à teneur élevée en stérols et leur obtention. L'invention a également pour objet les applications de ces levures dans des processus de fermentation alcoolique, en particulier pour la fabrication de boissons alcooliques fermentées. Les stérols sont des constituants importants de la membrane cellulaire des levures. La concentration en stérols doit être optimale pour assurer l'intégrité membranaire, garantie de l'activité des protéines membranaires, telles que les perméases. En conditions fermentaires, si certaines de ces perméases ne fonctionnent plus, on observe une chute de la viabilité cellulaire, pouvant entraîner la mort de la cellule. La composition en stérols des levures exerce donc un rôle primordial sur leur 20 capacité fermentaire. Pour augmenter les concentrations en stérols des levures, on a proposé d'incorporer des stérols exogènes pendant la, croissance des levures. Mais leur caractère insoluble en milieu aqueux constitue un facteur limitant. Pour pallier cet inconvénient, on a préconisé l'utilisation d'agents tensio-actifs pour les solubiliser, ce qui limite les possibilités d'addition directe de stérols dans le milieu de culture. Dans les cas de carences en facteurs lipidiques, l'ajout de bourbes fines au moût de fermentation a été recommandé afin d'apporter au milieu des nutriments tels que des stérols et des acides gras insaturés sous forme complexe. Un tel ajout n'est toutefois pas toujours facile à réaliser dans des caves. Les inventeurs ont constaté que ces inconvénients pouvaient être surmontés avec des levures à teneur élevée en certains types de stérols, soit naturellement, soit par enrichissement, en utilisant des compositions de stérols sous forme soluble. Il s'est en effet avéré que l'addition de telles compositions dans le milieu de réhydratation des levures ou dans le moût de fermentation, permet de stabiliser les stérols et de disposer de formes solubles capables d'être incorporées efficacement par les levures. De manière surprenante, les capacités fermentaires de telles levures sont particulièrement élevées, notamment pendant la phase stationnaire de la fermentation, la durée de la fermentation étant généralement plus courte. L'invention a donc pour objet des levures sèches actives ou des levures actives réhydratées avec des capacités fermentaires améliorées. Elle vise également un procédé de mise en oeuvre aisée pour leur obtention. L'invention vise en outre la mise à profit des propriétés fermentaires de ces levures actives pour la fabrication de boissons fermentées alcooliques, en particulier de vins, de bières et d'alcools forts comme la vodka ou le whisky. L'invention vise ainsi des LSA utilisables en réhydratation et/ou en fermentation alcoolique, ou des levures actives réhydratées utilisables en fermentation, ou des levures utilisables en fermentation, ayant une teneur en stérols présentant au moins deux doubles liaisons conjuguées au niveau du cycle B d'au moins 200 pg/g de poids sec. Par levures utilisables en fermentation , on entend la crème de levures issue 15 de leur production ou les levures congelées. Il s'agit plus spécialement de levures oenologiques ou de levures de brasserie, ou encore de levures de distillerie, ce qui inclut des levures du genre Saccchromycesou du genre non Sacchhromyces. On citera en particulier des Saccharomyces appartenant aux espèces cerevisiae, uvarum et bayanus Selon un mode de réalisation de l'invention, l'enrichissement de LSA en stérols est obtenu avantageusement par addition dans leur milieu de réhydratation ou dans le moût de fermentation de levures inactivées, ayant elles-mêmes une teneur en stérols présentant au moins deux doubles liaisons conjuguées au niveau du cycle B d'au moins 200 pg/g de poids sec. De telles levures inactivées sont des levures naturellement riches en stérols ou des levures enrichies en stérols, notamment en ergostérol, et/ou en zymostérol, et/ou ergosta 5-7 diénols, avantageusement selon les techniques connues de l'homme ou métier. De préférence, les levures utilisées ont avantageusement une teneur en stérols possédant deux doubles liaisons conjuguées au niveau du cycle B, de 200 à 1 250 pg/g de 35 poids sec, de préférence de 900 pg/g. Les quantités de levure inactivées ajoutées dans le milieu de réhydratation sont de l'ordre de 20 à 5008/I, de préférence de 100 à 200 g/l, notamment de l'ordre de 150g/I. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'enrichissement des levures en stérols est obtenu par addition à des LSA dans leur milieu de réhydratation ou à des LSA ajoutées à des moûts de fermentation d'une composition lipidique renfermant une fraction de stérols comprenant de l'ergostérol et du zymostérol, un complexe de lipopolysaccharides protéines précipitables par l'éthanol. Ces compositions renferment avantageusement de 10 à 70 % en poids sec d'ergostérol et de 10 à 70% en poids sec de zymostérol, à raison de 10 à 20 mg de stérols totaux par g. et de 500 à 1000 mg/g de complexe lipopolysaccharides-protéines. Avantageusement la fraction stérolique comprend en outre un ou plusieurs stérols tels que le fécostérol, le lanostérol, les ergosta - 5 -7 diénols. La composition lipidique telle qu'utilisée dans le procédé ci-dessus constitue un produit nouveau et, à ce titre, entre également dans le champ de l'invention. Pour obtenir un effet tensio-actif maximal des stérols, les compositions ci-dessus sont utilisées à raison de 1,5 à 3 g/I, de préférence de 2g/l de milieu de réhydratation ou de 20 à 100g/hecto de moût de fermentation Les levures à teneur élevée en stérols, telles qu'obtenues par enrichissement pendant leur phase de réhydratation ou de fermentation, par transfert des stérols à partir des levures inactivées, ou par incorporation desdites compositions lipidiques, présentent un grand intérêt dans les processus fermentaires compte tenu de leurs capacités fermentaires élevées durant la phase stationnaire des fermentations. En outre, cette teneur élevée en stérols diminue la production d'acides volatiles, ce qui permet d'améliorer les propriétés organoleptiques des produits de fermentation. Ces levures sont alors avantageusement utiles pour la production de boissons 25 fermentées alcooliques, en particulier de vins ou encore de bières, ou d'alcools de type whisky, vodka et autres. L'invention vise donc également un procédé de production de telles boissons comportant l'addition de levures enrichies en stérols comme défini ci-dessus, à raison de 100 à 200 g/I de milieu de fermentation, de préférence 150g/l. Ces levures sont soit des levures naturellement riches en stérols, réhydratées ou non, soit des levures enrichies comme défini ci-dessus, à savoir des levures actives réhydratées ou des LSA. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les 35 exemples qui suivent. Dans ces exemples, il sera fait référence aux figues 1 et 2, qui représentent, respectivement, - la figure 1 la réhydratation d'une LSA en présence de préparations de stérols selon l'invention, à teneurs différents en stérols; et - la figure 2, l'incorporation de stérols par des LSA pendant une phase de 40 réhydratation en utilisant une préparation de stérols selon l'invention. l0 Exemple 1: Formulation de stérols stabilisés sous forme soluble On soumet 10 ml de suspension dans l'eau d'un échantillon de levures inactivées, à une concentration de 150 g/I de poids sec, à une étape d'incubation, sous agitation, à 37 C, 5 pendant 30 min. Par centrifugation de la préparation à 11 300g, 15 min., on obtient un surnageant 1 et un culot 1. Le surnageant 1 est soumis à une étape d'ultracentrifugation à 85 000 g, 3h, à 4 C. On obtient un culot 2 un surnageant 2 et un colloïde blanc en surface. La fraction colloïdale blanche est lyophilisée pour donner la préparation de stérols stabilisés sous forme soluble (environ 20 mg). Exemple 2: Effet de la formulation de stérols selon l'exemple 1 sur le profil de fermentation d'un moût synthétique 1g de levure sèche active LALVIN EC1118 est réhydraté dans 10m1 d'un milieu de réhydratation constitué par l'eau additionnée de 50g/l de glucose. Les réhydratations sont effectuées à 37 C pendant 30 min, en présence de 12 ou de 24mg de la formulation de stérols de l'exemple 1, et à titre de contrôle, en l'absence de formulation de stérol. Deux fermentations ont été conduites en parallèle et en duplicata sur un moût synthétique M5300-stigmastérol correspondant à un moût riche en azote (300 mg d'azote/l), carencé en stérols et contenant 200g/l de sucres fermentescibles. Quatre fermenteurs contenant 1.11 de moût synthétique M5300-stigmastérol sont inoculés avec 2.2m1 de solution de réhydratation. La température est maintenue à 24 C. La production de CO2 est relevée en fonction du temps. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 1. L'examen de cette figure montre que les fermentations conduites par les levures réhydratées en présence de formulation de stérols utilisée se terminent avant les fermentations témoins. Globalement, les cinétiques observées pour les fermentations conduites par les levures réhydratées en présence de la formulation de stérols stabilisés sous forme soluble sont plus rapides dès l'entrée en phase stationnaire. Exemple 3: Effet de la formulation de stérols selon l'exemple 1 sur l'activation de l'incorporation de stérols par les L5A On opère comme dans l'exemple 1, mais on effectue la réhydratation en présence de 2 pl de [4-14C] cholestérol (50-60 mCi/mMol (Amersham CFA 128)), solubilisé dans 20 mpl de mélange tergitol/éthanol (v/v) en présence ou non de 24mg de la formulation de stérols de l'exemple 1 pour la fabrication de boissons fermentées alcooliques. On mesure la radioactivité incorporée au cours du temps par les L5A en procédant comme suit: On filtre 300 pl de milieu sous vide partiel sur filtre en fibres de verre Whatman GF/C, on rince par 3ml d'eau distillée à 4 C, on sèche et compte par scintillation liquide sur compteur Beckman L5 6500, après ajout de 20m1 de liquide scintillant Fluoransafe 2 (BDH). Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure 2. On constate que pendant la réhydratation, la présence de la formulation de stérols selon l'invention permet une 45 incorporation plus efficace des stérols du milieu par les L5A. Exemple 4: Enrichissement en stérols de levures inactivées Les souches de levure sont cultivées sous une aération constante et forte. La température des propagations est de l'ordre de 15 à 40 C, de préférence de 25 à 35 C. La culture des levures est effectuée par apport constant de sources de carbone et de sources d'azote, ainsi que par un apport intermittent en facteurs de croissance essentiels. Les sources de carbone dérivent généralement de molasses et peuvent être des molasses de sucre, de betterave ou leur mélange à des concentrations variables. La source d'azote peut provenir de divers dérivés ammoniaque, comme l'hydroxyde d'ammoniaque, le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le phosphate de di-ammonium ou d'extraits protéiques bruts. La propagation de la levure est réalisée selon un programme comportant des variations des vitesses de croissance. Les vitesses de croissance maximales sont de 0.05/h à 0.25/h, de préférence de 0.15 à 0. 2/h. L'enrichissement de la levure en stérols peut être effectué en modifiant de manière spécifique les sources de carbone et d'azote afin de réduire le taux total d'azote par rapport à celui du carbone. Il est également possible d'ajouter des précurseurs de stérols spécifiques de manière contrôlée. Des sources de précurseurs de stérols préférées comprennent l'éthanol, l'acide acétique, le squalène ou le lanostérol. Ces précurseurs peuvent être ajoutés sous forme purifiée ou brute. Exemple 5: Compositions lipidiques utilisées comme additifs dans des milieux de réhydratation de levures et/ou dans des moûts de fermentation Ces compositions sont obtenues par un procédé comprenant les étapes: d'incubation sous agitation d'une suspension dans l'eau de levures oenologiques inactivées dans des conditions permettant l'obtention de micelles formées de fractions spécifiquement enrichies en stérols incorporés dans des complexes de lipides - protéines, de séparation des fractions micellaires, suivie de lyophilisation. L'étape de séparation, après l'incubation, des fractions micellaires est plus spécialement réalisée par centrifugation. Le surnageant recueilli est soumis alors à une étape d'ultracentrifugation pour augmenter l'enrichissement de la fraction en micelles de stérols, la fraction colloïdale qui surnage est isolée et lyophilisée. Les compositions obtenues renferment une fraction de stérols composés de 10 à 70 %, notamment de 20 à 25% en poids sec d'ergostérol, de 10 à 70 %, notamment de 20 à 25 % en poids sec de zymostérol à raison de 10 à 20 mg de stérols totaux par g, et un complexe de lipopolysaccharides-protéines précipitables par l'éthanol à 80% (v/v), d'un poids moléculaire moyen de l'ordre de 120 kba, à raison de 600 à 800 mg/g. La fraction stérolique comprend en outre un ou plusieurs stérols, tels que le fécostérol, le lanostérol, et les ergostastérols 5-7 diénols. Dans le complexe de lipolysaccharides - protéines, les polysaccharides, les lipides et les protéines sont avantageusement présents à raison de à 34%, notamment de 27% pour les polysaccharides, . 55 à 70% notamment 61% pour les lipides, et 5. 10 à 15%, notamment 12% pour les protéines. Des polysaccharides préférés ont un PM de 23 kba et contiennent du mannose du glucose et de l'inositol. Des proportions respectives appropriées correspondent à . 55 à 707o, notamment 61% pour le mannose, 10. 30 à 40%, notamment 33% pour le glucose, 0.5 à 1%, notamment 0.85% pour l'inositol. La fraction lipidique comprend de préférence des acides gras C17:1, C16:0 et C18:0. Cette fraction lipidique est liée aux polysaccharides par l'intermédiaire d'un 15 groupe phosphatidylinositol. Le restant de la préparation est formé de fragments membranaires solubles dans l'éthanol) 80% (v/v). Les compositions lipidiques obtenues possèdent les propriétés physicochimiques suivantes: elles correspondent à une forme colloïdale amphiphile sans solubilité vraie en suspension dans de l'eau pure à 4 C, elles ne peuvent pas traverser des membranes de filtrations d'un seuil de 25 coupure de 0.2pm, elles présentent un effet tensio-actif qui ne se manifeste qu'au-dessus d'une concentration de 0.5g/l en poids sec en phase aqueuse, elles ont la propriété de s'auto agréger au-dessus d'une concentration de 0.05 g/I en poids sec en phase aqueuse pour former des agrégats micellaires d'un diamètre moyen d'environ 380 nm (valeur obtenue par mesure de la diffraction de lumière laser) par technique PCS (Photo Correlation 5petroscopy). REVENDICATIONS 1/ Levures sèches actives utilisables en réhydratation et/ou en fermentation alcoolique, ou des levures actives réhydratées utilisables en fermentation, ou des levures utilisables en fermentation, ayant une teneur en stérols présentant au moins deux doubles liaisons conjuguées au niveau du cycle B d'au moins 200 pg/g de poids sec. 2/ Levures sèches actives utilisables en réhydratation et/ou en fermentation alcoolique, ou des levures actives réhydratées utilisables en fermentation, ou des levures utilisables en fermentation, selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'il s'agit de levures oenologiques ou de levures de brasserie ou encore de levures de distillerie, incluant des levures du genre Saccharomyces ou du genre non Saccharomyces 3/ Levures sèches actives utilisables en réhydratation et/ou en fermentation alcoolique, ou des levures actives réhydratées utilisables en fermentation, ou des levures utilisables en fermentation, selon la revendication 2 caractérisées en ce qu'elles appartiennent au genre Sacchoromyces, en particulier des espèces cerevisiae, uvarum et bayanus. 4/ Procédé d'obtention de levures actives utilisables en réhydratation et/ou en fermentation alcoolique, ou des levures actives réhydratées utilisables en fermentation, ou des levures utilisables en fermentation, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que l'enrichissement en stérols des levures sèches actives est réalisé par addition dans leur milieu de réhydratation ou dans le moût de fermentation de levures inactivées, ayant elles-mêmes une teneur en stérols présentant au moins deux doubles liaisons conjuguées au niveau du cycle B d'au moins 200 pg/g de poids sec. 5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdites levures inactivées sont des levures naturellement riches en stérols ou des levures enrichies en stérols, notamment en ergostérol, et/ou en zymostérol, et/ou ergosta 5-7 diénols. 6/ Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que lesdites levures inactivées ont une teneur en stérols possédant deux doubles liaisons conjuguées au niveau du cycle B, de 200 à 1 250,ug/g de poids sec, de préférence de 900 pg/g. 7/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que les quantités de levures inactivées ajoutées dans le milieu de réhydratation sont de l'ordre de 20 à 500g/I. 8/ Procédé d'obtention de levures sèches actives utilisables en réhydratation et/ou en fermentation alcoolique, ou des levures actives réhydratées utilisables en fermentation, ou des levures utilisables en fermentation, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'enrichissement des levures en stérols est réalisé par addition dans leur milieu de réhydratation ou à des LSA ajoutées à des moûts de fermentation d'une composition lipidique renfermant une fraction de stérols comprenant de l'ergostérol et du zymostérol et 40. un complexe de lipopolysaccharides - protéines précipitables par l'éthanol. 9/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les compositions lipidiques renferment de 10 à 70 % en poids sec d'ergostérol et de 10 à 70% en poids sec de zymostérol, à raison de 10 à 20 mg de stérols totaux par g. et de 500 à 1000 mg/g de complexe lipopolysaccharides-protéines. 10/ Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que la fraction stérolique comprend en outre un ou plusieurs stérols tels que le fécostérol, le lanostérol, les ergosta - 5 - 7 diénols. 11/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé par l'addition desdites compositions, à raison de 1,5 à 3 g/I, de préférence de 2g/l de milieu de réhydratation ou de 2Oà 1OOg/hl de moût de fermentation 12/ Procédé de production de boissons fermentées alcooliques, caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation d'au moins une levure sèche active ou d'une levure active réhydratée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou telle qu'obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 11. 13/ Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend l'addition de la ou desdites levures à raison de 100 à 200 g/I de milieu de fermentation, de préférence 150 g/I. 14/ Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13 à la 25 production de vins, de bières, ou d'alcools de type whisky, vodka ou autres.