FR 2876702 A1 20060421 FR 0410886 A 20041014 2876702 1 PROCEDE DE PREPARATION D'UNE MACROMOLECULE D'ORIGINE BACTERIENNE, MACROMOLECULE AINSI OBTENUE ET UTILISATION DE LADITE MACROMOLÉCULE POUR PREVENIR ET TRAITER LES RHUMATISMES INFLAMMATOIRES La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'une macromolécule d'origine bactérienne, à la macromolécule ainsi obtenue et à l'utilisation de ladite macromolécule pour la prophylaxie et le traitement des rhumatismes inflammatoires. De nombreux rhumatismes inflammatoires comme la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante ou les rhumatismes post-infectieux ont pour dénominateur commun la présence de bactéries ou de signaux bactériens (ADN, ARN, peptidoglycanne-polysaccharides) au niveau du liquide synovial ("RT-PCR analysis of bacterial rRNA for detection and characterization of bacterial species in arthritis synovial tissue"- Kempsell K.E., Cox C.J., Hurle M., Wong A., Wilkie S., Zanders E.D., Gaston J.S., Crowe J.S. in Infect. Immun. 2000, 68(10): 6012-26; "Investigation of infectious agents associated with arthritis by RT-PCR of bacterial rRNA", Cox C.J., Kempsell K.E., Gaston J.S. in Arthrites Res. Ther. 2003, 5(1) : R1-8). Ces bactéries proviennent pour une grande partie du tube digestif. Elles passent la barrière intestinale (translocation bactérienne) et sont transportées par les macrophages et les cellules dendritiques au site synovial. Comme l'articulation des sujets sains est habituellement stérile et dépourvue de résidus bactériens, la présence de bactéries et de leurs composants dans les synovies inflammatoires est considérée comme participant à la pathogenèse du rhumatisme. Les traitements actuels s'attaquent aux effets des états rhumatismaux et visent à diminuer l'inflammation réactionnelle, soit en bloquant les cytokines pro-inflammatoires (infliximab, enbrel, anakinra), soit en diminuant le renouvellement des cellules de l'immunité productrices de 2876702 N 0410886 cytokines pro-inflammatoires (léflunomide). Cependant, ces traitements ont des effets secondaires indésirables, tels que infections (opportunistes sévères, tuberculose), anticorps anti-ADN et lupus, risque de démyélinisation du système nerveux central, neutropénie, attaque cardiaque congestive. L'antibiothérapie appliquée aux patients présentant un état rhumatismal réduit le nombre de certaines bactéries de la flore intestinale et contribue à la diminution de l'inflammation; cette méthode de traitement ne peut cependant être utilisée à long terme, étant donné le risque d'émergence de bactéries résistantes. La présente invention permet de pallier les inconvénients présentés par les méthodes de traitement des rhumatismes inflammatoires, existantes. Le but de la présente invention est de proposer une autre approche du traitement des rhumatismes inflammatoires, basée sur l'utilisation d'une macromolécule d'origine bactérienne, capable de réguler la flore intestinale et la translocation bactérienne et, par voie de conséquence, de diminuer l'inflammation réactionnelle qui accompagne les rhumatismes inflammatoires. Selon un premier aspect, l'invention a trait à un procédé de préparation d'une macromolécule produite par des bactéries appartenant à la souche Bifidobacterium breve I-2219 qui a été déposée selon le Traité de Budapest, le 31 mai 1999 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) tenue par l'Institut Pasteur, 25 rue du docteur Roux à Paris. Ledit procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: i) l'ensemencement et l'incubation, en conditions aérobies ou anaérobies et à une température comprise entre 30 C et 40 C environ, d'une souche de Bifidobacterium breve I-2219, dans un milieu de culture présentant un pH régulé ou non régulé et comprenant comme ingrédients, une fraction de protéines de lactosérum enrichie en lactalbumine native (non dénaturée) et du lactose; ii) séparation desdites bactéries dudit milieu de culture, après une 2876702 N 0410886 période d'incubation comprise entre 16 et 48h; iii) l'ultrafiltration sur des membranes de filtration ayant un seuil de coupure de 2 KDa à 50 KDa, conduisant à l'obtention d'un rétentat concentré ; iv) enrichissement en macromolécule par lavage avec un volume de 5 à 25 fois le volume de rétentat concentré v) la déshydratation dudit rétentat concentré enrichi; vi) la purification de la macromolécule par passage sur résine échangeuse d'anions; vii) la récupération de la fraction éluée par NaCl 0,15-0,6M, de préférence 0,3M, qui comprend la macromolécule bactérienne. Selon diverses réalisations, le procédé de préparation de ladite macromolécule d'origine bactérienne présente les caractères suivants, le cas échéant combinés: - l'ensemencement des bifidobactéries dans ledit milieu de culture se fait à partir d'un concentré congelé ou d'une pré-culture de 16-24h, qui permettent la prolifération des bactéries; les bactéries sont ensemencées dans ledit milieu de culture à raison de 105-1010 unités formant colonies par ml de milieu; - les ingrédients du milieu de culture sont présents dans les quantités suivantes: - fraction de protéines de lactosérum enrichie en lactalbumine native non dénaturée: 0,01 à 1 g/I de milieu; - lactose: 30-70 g/litre de milieu; - le pH dudit milieu de culture n'est pas régulé ; - le pH dudit milieu de culture est maintenu entre 4 et 6 unités environ. Selon un deuxième aspect, l'invention se rapporte à une macromolécule d'origine bactérienne produite par des bactéries appartenant à la souche Bifidobacterium breve I-2219 et préparée par la mise en oeuvre 2876702 4 du procédé de l'invention. Les tests effectués par le demandeur ont montré que la dite macromolécule possède une activité anti-arthritique chez la souris, dans un modèle d'arthrite induite au collagène. Cette activité antiarthritique a été évaluée à travers plusieurs paramètres, notamment: la protection vis-à-vis de l'effet arthrogène du collagène II chez la souris; - les propriétés de régulation de la flore intestinale et de la translocation bactérienne. Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation de ladite macromolécule d'origine bactérienne pour la préparation de médicaments destinés à la prophylaxie ou au traitement des rhumatismes inflammatoires. Les médicaments comprenant ladite macromolécule peuvent être utilisés comme adjuvant des thérapeutiques utilisées actuellement pour le traitement des rhumatismes inflammatoires (léflunomide, anticorps monoclonaux, anti-inflammatoires) ou remplacer ces médicaments, dont les effets secondaires sont bien connus. Les médicaments comprenant ladite macromolécule peuvent être administrés per os ou par injection sous-cutanée; ils ont pour effet la régulation de la flore intestinale et de la translocation bactérienne, et, par conséquent, diminuent la réaction inflammatoire qui accompagne les rhumatismes inflammatoires. Ces effets les recommandent tant pour la prophylaxie des maladies rhumatismales (dans le cas des malades provenant des familles à risque), que pour le traitement de différentes formes de rhumatismes inflammatoires, notamment la polyarthrite rhumatoïde et la spondylarthrite ankylosante. Les médicaments comprenant ladite macromolécule d'origine bactérienne préparé selon l'invention peuvent être conservés à une température de 35 C à + 4 C pour les formes liquides et jusqu'à +40 C pour les formes sèches pendant 3 ans. Lesdits médicaments ne donnent pas 2876702 5 de réaction secondaire. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va être faite en référence aux exemples de réalisations suivants. Exemple 1. Préparation d'une macromolécule obtenue par culture de Bifidobacterium breve On prépare un milieu de culture contenant les ingrédients suivants: - préparation enrichie en lactalbumine, correspondant à 0,01-0,05 g de lactalbumine / litre de milieu préparé 0,3 g/I de chlorhydrate de cystéine; 2,15 g/I de dihydrogénophosphate de potassium; - 62,5 g/I de lactose. La préparation enrichie en lactalbumine est réalisée en faisant précipiter une solution de protéines de lactosérum (par exemple Vitalarmor alpha 607 distribué par ARMOR PROTEINES) à pH 4,1 pendant 15 minutes au bain-marie à 60 C. On récupère alors le surnageant après centrifugation. Une première solution est reconstituée avec le lactose seul. Une deuxième solution est reconstituée avec le reste des ingrédients. Les deux solutions sont autoclavées pendant 30 minutes à 115 C. Fermentation discontinue à pH régulé Le pH du milieu est ajusté à une valeur de 5,8, une fois que le milieu est versé dans le fermenteur. Le milieu de culture est ensemencé avec 6,67% (v/v) (100 ml d'inoculum pour 1500 ml de milieu) d'un inoculum de 24 heures, contenant entre 1x106 et 2x108 unités formant colonies (UFC) de bifidobactéries par ml de milieu de culture. Les bifidobactéries sont cultivées sous agitation, sans aération du milieu, à une température de 37 C. Le pH est maintenu à 5,8 par ajout de soude 3N. La fermentation dure environ 20 heures et la population de Bifidobacterium breve en fin de culture est comprise entre 1x109 et 1x1010 UFC par ml de milieu de culture. La 2876702 6 croissance des bactéries correspond à une augmentation moyenne d'un facteur 10 de la population. Fermentation discontinue à pH non régulé, Le pH du milieu n'est pas ajusté lorsque le milieu est versé dans le fermenteur. Le milieu de culture est ensemencé avec 6,67% (v/v) (100 ml d'inoculum pour 1500 ml de milieu) d'un inoculum de 24 heures, contenant entre 1x106 et 2x108 UFC de bifidobactéries par ml de milieu de culture. Les bifidobactéries sont cultivées sans agitation, sans aération du milieu, à une température de 37 C. La fermentation dure environ 20 heures. 1 0 Dans une variante de réalisation, l'ensemencement des bifidobactéries dans ledit milieu de culture se fait à partir d'un concentré congelé, contenant 108 à 1012 UFC de bifidobactéries par g de concentré. Aspects quantitatifs Lors d'une fermentation à pH régulé, le rendement en produit récupéré après ultrafiltration est de 700-1000 mg de poudre sèche par litre de milieu fermenté. La quantité de protéines, déterminée par la méthode de Lowry, est de 275 mg/g de poudre sèche. La quantité de sucres, déterminée par la méthode de Dubois, est de 220 mg/g de poudre sèche. A pH non régulé, le rendement en produit récupéré après ultrafiltration est de l'ordre de 70-170 mg de poudre sèche par litre de milieu fermenté. La quantité de protéines, déterminée par la méthode de Lowry, est de l'ordre de 71 mg/g de poudre sèche. La quantité de sucres, déterminée par la méthode de Dubois, est de 615 mg/g de poudre sèche. En fin de culture, les bactéries sont éliminées par centrifugation pendant 30 minutes à 8000 g. Le surnageant est ultrafiltré à température ambiante sur un appareil AMICON Proflux M12 équipé d'une cartouche spiralée AMICON type S10Y10, d'un seuil de coupure de 10 kDa. Dans un premier temps, le surnageant est concentré au maximum 10 fois, puis lavé en continu avec 15 litres d'eau osmosée. A la fin du lavage, le rétentat est concentré à un volume de 500 ml. Il est alors conservé sous forme congelée ou lyophilisée. La macromolécule contenue dans le rétentat est ensuite purifiée par passage sur résine échangeuse d'anions de la solution concentrée de rétentat ou d'une solution de rétentat reconstituée (résine DEAESépharose fast flow distribuée par Amersham Biosciences, équilibrée dans un tampon Tris-HCI 50mM, pH 8,0; l'élution est effectuée par le même tampon auquel est ajoutée une concentration de NaCI allant de 0 à 1M). La macromolécule bactérienne est récupérée dans la fraction éluée par NaCl 0,15-0,6M (préférentiellement 0,3M). Cette fraction est dessalée puis lyophilisée. La macromolécule ainsi produite est constituée d'oligosaccharides de masse moléculaire comprise entre 5 et 30 kDa et d'une protéine d'origine bactérienne de masse moléculaire comprise entre 50 et 70 kDa. Exemple 2. Détermination des propriétés anti-rhumatismales de la macromolécule issue de la souche Bifidobacterium breve I-2219 Les effets anti-rhumatismaux de la macromolécule d'origine bactérienne préparée selon l'invention (constituant la fraction purifiée obtenue selon le procédé décrit à l'exemple 1) ont été évalués dans un modèle expérimental de polyarthrite rhumatoïde, à savoir l'arthrite induite au collagène Il chez de souris mâles DBA 1. 2.1 Protection vis-à-vis de l'effet arthrogène du collagène de type II chez des souris mâles DBA 1 Les souris utilisées ont été divisées en deux groupes: - un groupe témoin: 15 souris (immunisées par le collagène II) ; un groupe essai: 5 souris (immunisées par le collagène II). Deux injections de collagène II sont effectuées à la base de la queue de souris mâles DBA 1. Les animaux sont âgés de 4-5 semaines à la première injection. Le rappel est effectué trois semaines plus tard. Dans les semaines qui suivent, des gonflements des articulations apparaissent. Un score d'arthrite est établi par animal et la lecture est effectuée plusieurs fois par semaine. Produits administré aux animaux testés: É témoin: à la place de l'eau de boisson, les animaux du groupe témoin reçoivent le milieu de culture non fermenté et traité par ultrafiltration à 10 kDa dans les conditions de préparation de la macromolécule d'origine bactérienne; É macromolécule: 1) Doses de charge: 100-150 microlitres par souris au début de l'expérience puis à 10, 16, 28, 38 et 56 jours post-immunisation (solution à 10 g/I exprimée en poids sec de produit) 2) Doses d'entretien: solution à 0,5-1,3 g/I (exprimé en poids sec de produit) donnée ad libitum aux animaux à la place de l'eau de boisson. La figure 1 illustre l'évolution des scores d'arthrite en fonction du temps pour les souris du groupe témoin comparativement aux souris du groupe essai; elle montre que l'administration de la macromolécule prévient l'apparition des signes d'arthrite, la différence entre les deux groupes, calculée à l'aide du test ANOVA, étant significative (p 2.2 Détermination des propriétés de régulation de la flore intestinale et de la 20 translocation bactérienne Outre les deux groupes d'animaux immunisés par le collagène II, des animaux recevant soit le milieu de culture (10 souris DBA1 mâles), soit la macromolécule (6 souris DBA1 mâles) sont inclus dans l'étude. Ils ne sont pas immunisés par le collagène II, mais sont répartis dans les cages des animaux immunisés. Ils ne développent pas d'arthrite. 2876702 N 0410886 A la fin de l'expérience (soit 58 à 68 jours après la première injection de collagène), la flore anaérobie et aéro-anaérobie facultative est dénombrée dans le caecum, les plaques de Peyer, le sang du coeur, le rein, la rate, le foie et le poumon. Les animaux sont sacrifiés au moins deux heures après la dernière prise alimentaire. Le tableau 1 présente les résultats concernant la flore intestinale totale, exprimés en moyenne et écart-type du log du nombre d'UFC/g de selles, n étant le nombre de souris pour chaque produit testé (comparaison ANOVA à deux facteurs). Flore caecale souris témoin essai ANOVA Immunisation - + - + (collagène) n 10 15 6 5 Flore Totale 8,6 0,8 9,3 0,3 8,6 0,5 8,8 0,9 0,037 Tableau 1 Chez les souris ayant développé une arthrite (groupe témoin immunisé), la flore caecale est plus importante que chez les animaux non immunisés (groupe témoin non immunisé) (p 2876702 lo Translocation bactérienne La translocation bactérienne d'origine intestinale est analysée dans les plaques de Peyer. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Chez les souris développant l'arthrite (groupe témoin immunisé), la flore totale n'augmente pas, mais la composition en bactéries change. On constate une plus forte contamination par les bacilles à Gram positif chez les souris immunisées témoins (ANOVA p=0,05). L'augmentation des bacilles n'est pas retrouvée dans le groupe immunisé traité par la macromolécule. La macromolécule participe donc à un meilleur contrôle de la translocation bactérienne spécifiquement favorisée par l'immunisation au collagène. Par ailleurs, la macromolécule réduit le passage des bactéries chez les animaux non immunisés. Contamination bactérienne des Plaques de Peyer souris témoin essai collagène - + - + n 10 15 6 5 Flore Totale 4,4 0,8a* 4,3 0,9 3,5 0, 6* 4,0 0,7 Entérocoques 4,0 1,0 (8) 3,5 1,2 (13) 2,9 0,9 (5) 3,5 1,0 (3) Entérobactéries 5,5 (1) 3,3 0,4 (5) 0 3,8 (1) Bacilles Gram + 3, 3 1,1 (8) 4,1 0,9 (14) 3,0 0,8 3,5 0,6 Tableau 2 a: log UFC/PP (log unités formant colonies /plaques de Peyer) É p Les résultats portant sur la dissémination bactérienne, présentés dans le tableau 3, montrent que la majorité des souris témoins, immunisées ou non, hébergent des bactéries vivantes dans le foie et le rein. Contamination bactérienne des organes internes souris témoin essai collagène - + - + n 10 15 6 5 sang 4a (40)b 7 (47) 4 (67) 1 (20) rein 8 (80) 11 (73) 3 (50) 3 (60) rate 3 (30) 7 (47) 4 (67) 1 (20) poumon 6 (60) 7 (47) 2 (33) 2 (40) foie 8 (80) 12 (80)* 2 (33) 1 (20)* Tableau 3 a: nombre de souris hébergeant des germes dans l'organe considéré b: pourcentage de souris hébergeant des germes dans l'organe considéré 10 *p=0,029 test exact de Fischer L'isolement de bactéries vivantes dans le foie est plus rare chez les animaux immunisés traités par la macromolécule (p=0,029) La macromolécule permet donc un meilleur contrôle de la 15 contamination bactérienne au niveau du foie. 2876702 12 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une macromolécule produite par des bactéries appartenant à la souche Bifidobacterium breve I-2219 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: i) l'ensemencement et l'incubation, en conditions aérobies ou anaérobies et à une température comprise entre 30 C et 40 C environ, d'une souche de Bifidobacterium breve I-2219, dans un milieu de culture présentant un pH régulé ou non-régulé et comprenant comme ingrédients, une fraction de protéines de lactosérum enrichie en lactalbumine native (non dénaturée) et du lactose; ii) séparation desdites bactéries dudit milieu de culture, après une période d'incubation comprise entre 16 et 48 h; iii) l'ultrafiltration sur des membranes de filtration ayant un seuil de coupure comprise entre 2 kDa et 50 kDa, conduisant à l'obtention d'un retentât concentré ; iv) enrichissement en macromolécule par lavage avec un volume de 5 à 25 fois le volume de rétentat concentré ; v) la déshydratation dudit rétentat concentré enrichi; vi) la purification de la macromolécule par passage sur résine échangeuse d'anions; vii) la récupération de la fraction éluée par NaCl 0,15-0,6M, de préférence à 0,3M, qui comprend la macromolécule bactérienne. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'ensemencement des bifidobactéries dans ledit milieu de culture se fait à partir d'un concentré congelé ou d'une pré-culture de 16-24h. 3. Procédé selon les revendications 1 et 2 caractérisé en ce que les bactéries sont ensemencées dans ledit milieu de culture à raison de 105 à 1010 unités formant colonies par ml de milieu. 2876702 13 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les ingrédients du milieu de culture sont présents dans les quantités suivantes: - fraction de protéines de lactosérum enrichie en lactalbumine native non dénaturée: 0,01 à 1g/ litre de milieu; - lactose: 30- 70 g/ litre de milieu. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le pH dudit milieu de culture n'est pas régulé. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le pH dudit milieu de culture est maintenu entre 4 et 6 environ. 7. Macromolécule bactérienne produite par des bactéries appartenant à la souche Bifidobacterium breve I-2219, constituée d'oligosaccharides de masse comprise entre 5 et 30 kDa et d'une protéine d'origine bactérienne de masse moléculaire de 50 à 70 kDa et préparée par la mise en oeuvre du procédé selon les revendications 1 à 6. 8. Préparation à base de la macromolécule bactérienne selon la revendication 7 pour composition pharmaceutique destinée à la régulation de la flore intestinale et de sa translocation. 9. Préparation à base de la macromolécule bactérienne selon la revendication 7 pour composition pharmaceutique destinée à traiter la polyarthrite rhumatoïde. 10. Utilisation de la macromolécule d'origine bactérienne selon la revendication 7 pour la préparation de médicaments pour traiter ou prévenir les rhumatismes inflammatoires.