FR 2882063 A1 20060818 FR 0501495 A 20050215 Méthode de préparation de fragments synthétiques d'acides nucléiques bicaténaires La présente invention concerne une méthode de préparation d'un fragment synthétique d'acides nucléiques dans laquelle on prépare un grand premier fragment d'ADN synthétique double brin de séquence déterminée comprenant un enchaînement dans un ordre déterminé d'une pluralité de n deuxièmes petits fragments d'ADN synthétiques contigus. L'utilisation accrue des techniques de biologie moléculaire tant pour le diagnostic, que comme outil d'analyse des mécanismes cellulaires, nécessite la fabrication de sondes très spécifiques et souvent chimères entre plusieurs espèces moléculaires. La présente invention fournit une méthode qui permet d'aligner sur un même fragment d'acide nucléique des cibles moléculaires d'origines différentes (virales, bactériennes, végétales, humaines), ainsi que des signaux de traduction, de transcription, de destination, de restriction enzymatique, etc Ce fragment peut être inséré dans un vecteur plasmidique par exemple, afin d'être cloné. Ce vecteur recombinant, ou le fragment qu'il contient, peut être utilisé comme standard de quantification dans des réactions de type PCR, ou encore en tant que sonde spécifique marquée utilisable pour les hybridations in situ, les hybridations ADN/ADN ou ARN/ADN ou encore comme témoin positif dans des tests de détection et/ou quantification d'ADN d'une pluralité de cibles moléculaires, ou encore comme plasmide de transfection, notamment afin d'analyser les processus de régulation de la croissance cellulaire. La réaction de quantification peut avantageusement être réalisée par PCR en temps réel. La présence de plusieurs cibles moléculaires sur le même fragment nucléique permet de quantifier ou de détecter des cibles différentes dans un même échantillon, par exemple en utilisant des sondes marquées par des fluorochromes ou autres marqueurs différents. Un tel fragment peut être utilisé pour la mise en évidence d'une co-infection (par exemple: HIV1-HCV; HIV2-HCV; HIV1-HBV; HIV2-HBV) .Et, la quantification en utilisant la même gamme d'étalonnage de plusieurs espèces moléculaires, permet la comparaison de l'efficacité des différentes réactions de PCR. Une grande quantité de cibles moléculaires identiques peut être produite par clonage afin de fournir des témoins positifs sans risque de contamination par l'utilisation de l'agent infectieux (cultivables ou non) , et sans avoir à purifier spécifiquement l'ADN ou l'ARN des gènes d'intérêt. Il est, toutefois, évident que cet outil ne peut être utilisé que pour détecter des cibles de séquence connue. De plus, l'insertion, de ces fragments d'acides nucléiques chimères, dans un plasmide permet la production d'une grande quantité de cible et la construction d'une gamme de quantification à large échelle (de 109 copies à 1 copie par essai). La présence de cibles moléculaires différentes au sein du même fragment nucléotidique permet la co-quantification d'au moins deux cibles dans le même essai. On connaît différentes méthodes pour construire un grand fragment d'ADN chimère combinant plusieurs fragments, notamment d'origine 20 diverses. Dans certaines méthodes, les dits fragments sont insérés dans un plasmide et clonés en utilisant des sites de restriction pour l'orientation des fragments. Ces techniques sont éprouvées mais elles présentent l'inconvénient que si plusieurs doivent être mis bout à bout, l'ordre et l'orientation ne peuvent être contrôlés qu'en créant aux extrémités des sites de restrictions uniques, ce qui alourdit considérablement la manipulation. Dans une autre approche, les différents oligonucléotides sont liées entre eux, en utilisant une ligase qui va permettre, en utilisant les sites de restriction, d'obtenir un seul fragment, puis on effectue l'insertion de cette construction dans un plasmide. Cette méthode est, elle aussi, assez laborieuse à réaliser. Le but de la présente invention est de fournir une nouvelle méthode 5 de préparation de fragments d'acides nucléiques améliorée, facile rapide et fiable. Pour ce faire, la présente invention fournit une méthode de préparation d'un fragment synthétique d'acides nucléiques dans laquelle on prépare un grand premier fragment d'ADN synthétique double brin de séquence déterminée comprenant un enchaînement dans un ordre déterminé d'une pluralité de n deuxièmes petits fragments d'ADN synthétiques contigus, consistant essentiellement dans la dimérisation d'une pluralité de n oligonucléotides par amplification enzymatique à l'aide d'une enzyme polymérase thermorésistante comprenant: - une première étape de réaction d'amplification d'acides nucléiques de type PCR en présence d'une dite enzyme polymérase, d'une série de n oligonucléotides de séquences déterminées, sans amorces exogènes, comprenant une série de cycles dans des conditions de températures permettant l'hybridation des dits oligonucléotides,suivie d'une élongation du complexe obtenu, destinée à mettre bout à bout dans un ordre déterminé les dits oligonucléotides, les séquences desdits oligonucléotides correspondant successivement et alternativement aux séquences sens et anti-sens des différents dits deuxièmes fragments synthétiques, et chaque dit oligonucléotide contenant dans ses régions 5' et 3' des séquences complémentaires de celles des oligonucléotides suivant et précédent, le cas échéant, et - une deuxième étape d'amplification à l'aide d'amorces spécifiques des extrémités 5' et 3' du dit brin directe dudit grand premier fragment synthétique à préparer, permettant de produire des copies identiques dudit 30 grand premier fragment. Cette technique est donc basée sur l'utilisation et la maîtrise d'un artefact de la PCR, qui consiste en l'hybridation des amorces entre elles (dimérisation des amorces). Ce phénomène est observé dans le cas où les conditions de PCR, notamment de température, sont modifiées, et que les amorces contiennent des séquences partiellement complémentaires. La technique de construction consiste donc, à partir des séquences cibles, à choisir les séquences des oligonucléotides, avec une alternance d'oligonucléotides de séquences directes ( sens ) ou inverses (encore dénommées reverses ou anti-sens ). Afin de rendre possible la mise bout à bout de ces oligonucléotides, on prend soin d'introduire en 3' de la séquence d'un. oligonucléotide une séquence de nucléotides complémentaires des premiers nucléotides de l'oligonucléotide suivant. Ces oligonucléotides seront hybridés par leur parties complémentaires, et grâce à une alternance d'hybridation des parties 5'et complémentaires des oligonucléotides et à l'activité polyrnérasique, par exemple de la Taq polymérase, une synthèse de 5' en 3' se réalise afin d'obtenir des fragments doubles brins Le fragment final (assemblé) est synthétisé par PCR en utilisant un couple d'amorces directe et inverse correspondant aux séquences des extrémités du premier grand fragment d'ADN synthétique bicaténaire désiré. Plus précisément, la présente invention fournit une méthode de préparation d'un fragment synthétique d'acides nucléiques par dimérisation d'oligonucléotides et amplification enzymatique à l'aide d'une enzyme polymérase thermorésistante dans laquelle on prépare un grand premier fragment d'ADN synthétique double brin comprenant un enchaînement dans un ordre déterminé d'une pluralité de n deuxièmes fragments d'ADN synthétiques contigus, comprenant un brin directe 5' 3' comprenant respectivement les n séquences polynucléotidiques seg1, seq2, seg3, segn desdits deuxièmes fragments successivement dans cet ordre, caractérisé en ce que 1). On réalise un mélange équimolaire des n oligonucléotides suivants comprenant: -si n=2p - p oligonucléotides 01, 03i.... 2p_1 comprenant respectivement 5 des séquences identiques à celles des oligonucléotides d'ordre impair seg1, seq3,...seq 2p_1 dudit brin direct, et - p oligonucléotides 02i 04, 0,p comprenant respectivement les séquences des brins anti-sens complémentaires des oligonucléotides d'ordre pair seq2, seq4,....seq2p, et -si n=2p+1 -p+1 oligonucléotides 01, O3,.... 2p+1 comprenant respectivement les séquences identiques à celles des séquences d'ordre impair seg1i seg3,,...seg2p+1du dit brin direct,et -p oligonucléotides O2, O4,...O2p comprenant respectivement les 15 séquences du brin anti-sens complémentaires des séquences d'ordre pair seq2, seq 4 seg2p, et comprend à son extrémité 3' une séquence d'hybridation complémentaire de la séquence de l'extrémité 3' de 02m, et apte à s'y hybrider, et -02m comprend à son extrémité 3' une séquence d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 3' de O2m_1 et apte à s'y hybrider, et à son extrémité 5' une séquence complémentaire de celle de l'extrémité 5' de O2m+,,et apte à s'y hybrider, -02m+1 comprend à son extrémité 5' une séquence d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 5' de 02m, et apte à s'y hybrider, et à son extrémité 3' une séquence d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 3' de 02m+2, et - On comprend à son extrémité 5' une séquence d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 5'de On_, et apte à s'y hybrider si n=2p+1, ou Or comprend à son extrémité 3' une séquence terminale d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 3' de On_, et apte à s'y hybrider si n=2p -n étant un entier supérieur ou égal à 2, , de préférence de 2 à 8; et m étant des nombres entiers supérieurs ou égaux à 1, et 2m+1 étant inférieur à n - les dites séquences terminales d'hybridation comprenant au moins 10, de préférence de 10 à 20, et chaque dite séquence d'hybridation étant une séquence constituant respectivement la séquence de l'extrémité de la séquence d'ordre impair.seg2,n+, correspondante ou la séquence d'extrémité de la séquence complémentaire de la séquence d'ordre pair seg2n, correspondante, et/ou une séquence exogène rajoutée à l'extrémité de la séquence d'ordre impair.seg2,n+, ou de la séquence complémentaire de la séquence d'ordre pair seg2,n correspondante, - chaque dite séquence d'hybridation ne se retrouvant nulle part ailleurs dans les séquences identique ou complémentaire à l'une quelconque des différentes séquences seq p, et 2) on réalise une première réaction d'amplification d'acides nucléiques de type PCR en présence d'une dite enzyme polymérase thermorésistante, sans amorce exogène, comprenant une série de cycles, de préférence au moins 40, comprenant: 2.1) une étape d' hybridation desdits oligonucléotides entre eux dans des conditions de température permettant la totalité des hybridations possibles entre les dites séquences d'hybridation complémentaires, de préférence à une température inférieure ou égale à 40 , de préférence encore de 37 à 40 C, et 2.2) une étape d'élongation par la dite enzyme polymérase dans les conditions de température et de durée permettant la polymérisation des acides nucléiques de 5' en 3' par la dite enzyme polymérase pour construire un fragment double brin, de préférence à une température d'au moins 60 C, de préférence encore 72 C, et 2.3) une étape de dénaturation du fragment double brin obtenu à l'étape 2.2), et 2.4) chaque brin servant de matrice à un nouveau cycle d'étapes 2.1) à 2.3) de dite première amplification à l'aide des dits oligonucléotides, puis 2.5) de préférence, lors du dernier cycle, on s'arrête à l'étape d'élongation 2.2) que l'on prolonge pour une durée totale au moins double de celle des étapes 2.2) de la série de cycles précédent, de préférence une durée d'au moins 5 minutes, et 3) on réalise une seconde réaction d'amplification de type PCR à partir du produit de la réaction d'amplification de l'étape 2.5, après dénaturation du produit d'amplification de l'étape 2.5), comprenant une série de cycles, de préférence au moins 40 dans lesquels on met en oeuvre un jeu d' amorces de séquences, de préférence de 15 à 25 nucléotides, de préférence au moins 17 nucléotides correspondant respectivement pour l'une à celle de l'extrémité 5' et pour l'autre à une séquence complémentaire de l'extrémité 3' dudit brin directe du dit grand premier fragment à préparer et on réalise l'étape d'hybridation à la température optimale d'hybridation des dites amorces, que l'on choisit de préférence à 58 C, et 4) on termine par une étape d'élongation pour obtenir ledit grand premier fragment: bicaténaire, et 5) de préférence, on analyse la séquence et/ou la taille du fragment obtenu pour vérifier si elle correspond à celle attendue pour le dit premier grand fragment. On comprend donc que la séquence de l'oligonucléotide O = seq 5 (incluant dans ce cas la séquence terminale d'hybridation à son extrémité) ou O =seq +séquence terminale d'hybridation exogène. On comprend que chaque dite séquence terminale d'hybridation ne se retrouve nulle part dans Op excepté le cas échéant à l'extrémité d'une dite séquence segp lorsque ladite séquence terminale d'hybridation constitue l'extrémité de la dite séquence seg2m+, (c'est-à-dire lorsque p=2m+1) ou de la séquence complémentaire de la séquence d'ordre pair seg2m correspondante (c'est-à-dire lorsque p=2m), ladite séquence terminale de Op étant identique à la séquence complémentaire constituant l'extrémité correspondante des oligonucléotides 0p+, ou Op_, le cas échéant. A l'issue de l'étape 2.1) on obtient un complexe d'hybridation comprenant un brin direct discontinu constitué des oligonucléotides O2p+, comprenant les séquences identiques aux séquences d'ordres impair seg2p+, et un brin indirecte (ou anti-sens) discontinu constitué des oligonucléotides OZp comprenant des séquences complémentaires aux séquences seg2p. A l'étape 2.2), la température dépend de l'enzyme Taq polymérase mise en oeuvre.Le plus généralement, les enzymes sont opérantes dans des températures d'ail moins 60 C, les plus répandues à 72 C. La durée de cette étape 2.2) est en fonction de la taille du fragment à polymériser et est comprise en général entre 1 et 2 minutes. A l'étape 2.2), les différents oligonucléotides servant à la fois de matrice et d'amorce les uns par rapport aux autres successivement, et les extrémités 3' des différents oligonucléotides O discontinus servent d'amorces d'élongation dans le sens 5'--3' et, à l'issue de l'étape 2.2), on obtient un fragment continu comprenant les séquences seq contiguës ou espacées par desdites séquences terminales d'hybridation. Dans la seconde réaction d'amplification les séquences des amorces correspondent à : -la séquence de l'extrémité 5' de l'oligonucléotide O, et la séquence inverse complémentaire de l'extrémité 3' de l'oligonucléotide O .si n=2p+1, ou -la séquence de l'extrémité 5' de l'oligonucléotide O et la séquence de l'extrémité 5' de l'oligonucléotide O,.si n=2p. Dans un mode de réalisation particulier, ladite séquence terminale d'hybridation de Op est une séquence exogène rajoutée à l'extrémité de la séquence d'ordre impair.seg2m+1 ou de la séquence complémentaire de la séquence d'ordre pair seg2m correspondante, mais correspondant à la séquence complémentaire constituant l'extrémité correspondante de Op+, ou Op_, correspondante. Ainsi, plus précisément: - ladite séquence d'hybridation de l'extrémité 5' de 02m+1 peut être une séquence exogène rajoutée à l'extrémité 5'de la séquence d'ordre impair.seg2m+1, ruais complémentaire de la séquence constituant l'extrémité 5' correspondante de O2mi et/ou -ladite séquence d'hybridation de l'extrémité 3' de 02m+1 peut être une séquence exogène rajoutée à l'extrémité 3' de la séquence d'ordre impair seg2m+i, mais complémentaire de la séquence constituant l'extrémité 3' de 02m+2, et/ou ladite séquence d'hybridation de l'extrémité 3' deO2m peut être une séquence exogène rajoutée à l'extrémité 3' de la séquence d'ordre pair seg2m, mais complémentaire de la séquence constituant l'extrémité 3' de la séquence constituant l'extrémité 3'correspondante de O2m_1, et/ou ladite séquence d'hybridation de l'extrémité 5' deO2,,, peut être une séquence exogène rajoutée à l'extrémité 5' de la séquence d'ordre pair seg2m, mais complémentaire de la séquence constituant l'extrémité 5' de la séquence constituant l'extrémité 5 correspondante de 02,,,+1É Avantageusement, la taille desdits deuxièmes fragments ou oligonucléotides O,, est d'au moins 60 nucléotides. Cette taille de 60 nucléotides correspond à des fragments incluant au moins une séquence sonde spécifique de 10 à 25 nucléotides encadrée de séquences amorces en 3' et 5' de 15 à 25 nucléotides, permettant ainsi la détection desdites séquences spécifiques dans une méthode d'amplification du type PCR telle que décrite ci-après. Plus particulièrement, n est d'au moins égal à 3, plus particulièrement encore de 3 à 6. La méthode selon l'invention est particulièrement utile pour obtenir facilement des dits grands premiers fragments comprenant au moins 180 paires de bases le cas échéant,alors que les synthétiseurs chimiques ne permettent pas d'obtenir des tailles au-delà de 180 nucléotides de façon fiable. La méthode selon l'invention permet aussi de préparer un dit grand fragment synthétique comprenant au moins une région 3' que l'on peut transcrire en AR.N, à partir d'un dit grand premier fragment synthétique d'ADN obtenu à partir desdits oligonucléotides O1-O d'ADN dans lesquels on introduit un site de fixation d'une ARN polymérase à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide Op dont on retrouve la séquence identique ou complémentaire à l'extrémité 5' de la dite région, et on réalise une étape de transcription en ARN avec la dite ARN polymérase, du dit grand fragment synthétique d'ADN. Plus particulièrement, pour obtenir un dit grand premier fragment entièrement constitué d'ARN, on insère un site de fixation de l'ARN polymérase à l'extrémité 5' de O,. Comme mentionné précédemment, avantageusement, lesdits grands 5 fragments d'ADN synthétiques obtenu par la méthode selon l'invention, sont insérés dans un plasmide. La présente invention fournit une technique de construction générique d'un fragment nucléotidique synthétique. Elle permet la mise en contiguïté de plusieurs cibles moléculaires d'intérêt. Il s'agit d'une méthode totalement originale, simple à mettre en oeuvre, rapide et fiable, et ne nécessitant pas un équipement lourd et coûteux. Les utilisations en sont multiples: sondes marquées pour la détection d'un ADN ou d'un ARN, cibles moléculaires pour la détection ou la quantification d'un agent infectieux, fragments intégrés dans un plasmide de transfection afin d'étudier la régulation d'un gène, la liste des utilisations possible de cette méthode de construction est non exhaustive. Son intérêt essentiel est pouvoir grouper sur le même fragment nucléotidique des cibles totalement hétérologues qui pourront être codétectées ou co-quantifiées dans un même essai. La seule limite est que l'on ne peut s'adresser qu'à des cibles de séquence connue, mais dont la fonctionnalité n'est pas obligatoirement établie. Comme mentionné ci-dessus, le fragment nucléotidique néosynthétisé selon l'invention est avantageusement utilisé pour la détection et/ou la quantification d'agents infectieux. La présente invention a en effet également pour objet l'utilisation d'un fragment d'acide nucléique préparé par une méthode selon l'invention ou d'un plasmide en comprenant, comme standard de quantification, témoin positif ou sonde spécifique dans une méthode de détection et/ou quantification de l'ADN d'une cible moléculaire d'ADN correspondant à au moins l'un des dits deuxièmes fragments. La présente invention fournit en particulier une méthode de détection de la présence et/ou quantification d'ADN d'un organisme vivant ou microorganisme, tel que de préférence un agent pathogène bactérien, parasitaire, de levure ou viral dans un échantillon contenant de l'ADN à tester, dans laquelle on met en oeuvre une réaction d'amplification enzymatique d'ADN du type PCR, de préférence quantitative, de - l'ADN extrait dudit échantillon à tester et - d'un fragment d'ADN synthétique préparé par une méthode selon l'invention comprenant au moins un dit deuxième fragment comprenant une séquence spécifique dudit agent, dans un échantillon témoin positif et/ou dans un échantillon standard servant au calibrage de la quantification. Plus particulièrement, dans un mode de réalisation, - on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent pathogène appartenant à un groupe d'une pluralité d'agents pathogènes, de préférence de3 à 8, et/ou on quantifie le dit ADN provenant d'un dit groupe d'agents pathogènes, et - on utilise comme dit fragment synthétique d'ADN témoin positif et/ou standard de quantification, un grand premier fragment d'ADN synthétique obtenu par une méthode de préparation selon l'invention regroupant desdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant chacun une séquence spécifique respectivement de chacun desdits agents dudit groupe. Plus particulièrement, de façon connue, ladite séquence spécifique comprend une séquence sonde encadrée par des séquences aptes à servir comme amorce clans une réaction d'amplification du type PCR des dites séquences spécifiques. Dans ces méthodes de détection et/ou quantification d'ADN, comme mentionné ci-dessus, il est important de savoir si une réaction positive n'est pas due à une contamination par le plasmide recombinant utilisé comme standard de quantification ou comme témoin positif. Pour résoudre ce problème, un site de coupure par un enzyme de restriction est avantageusement introduit dans chacune des cibles moléculaires. Ce site étant absent sur la séquence naturelle. Donc, par coupure enzymatique et analyse du fragment amplifié sur gel d'agarose, ou en utilisant une sonde de PCR en temps réel qui reconnaît spécifiquement le site de restriction, on peut ainsi détecter la présence éventuelle du plasmide contaminant. Le dit grand fragment comprend donc, en outre avantageusement, au moins une séquence exogène comprenant, de préférence encore, un site de clivage par une enzyme de restriction, ledit site n'étant pas présent dans l'une quelconque desdites séquences spécifiques authentiques desdits agents du dit groupe. Ainsi, on peut mettre en oeuvre plus particulièrement, les étapes suivantes dans lesquelles: 1- on réalise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'au moins une dite séquence spécifique d'au moins un desdits agents, dans l'ADN extrait desdits échantillons à tester et dans l'ADN de l'échantillon témoin positif, à l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte à amplifier à la fois au moins ladite séquence spécifique authentique et ledit deuxième fragment comprenant ladite séquence spécifique modifiée, 2- on vérifie si les amplifias éventuels de l'ADN extrait desdits 25 échantillons à tester, comprennent une dite séquence spécifique, et 3- on détecte les faux positifs éventuels provenant de contaminations éventuelles desdits échantillons à tester par de l'ADN provenant de l'échantillon de témoin positif, par l'une au moins des étapes suivantes: - 3a-.on réalise une digestion enzymatique du produit de PCR obtenu avec une enzyme correspondant au site de clivage et analyse sur gel d'agarose du produit de digestion en comparaison avec le produit de PCR non digéré par l'enzyme de restriction. Si le fragment digéré provient de l'amplification de la cible moléculaire insérée dans le plasmide témoin, il contient le site de restriction, et il sera d'une taille inférieure au fragment non digéré. - 3b-On réalise une réaction de type PCR en temps réel avec des amorces directes et inverses de l'une des cibles moléculaires (ou dit deuxième fragment ), et une sonde spécifique de la dite séquence exogène contenant le site de restriction. Seul un fragment provenant du plasmide témoin et contenant la séquence exogène pourra être amplifié. La technique de PCR en temps réel consiste en une PCR classique en utilisant une amorce de séquence directe et inverse, et une sonde dite d'hydrolyse apte à être hydrolysée par la Taq polymérase. Ladite sonde est marquée par un fluorophore en 5' et un agent bloquant en 3' permettant quand la sonde est hydrolysée une émission de fluorescence qui est proportionnelle aux nombres d'amplifiats. Le principe de la PCR en temps réel repose sur la capacité de la Taq polymérase pendant l'étape d'élongation d'hydrolyser une sonde hybridée sur l'ADN à copier. Cette hydrolyse permet la libération de la fluorescence et ainsi peut permettre une quantification.Au cours de la même réaction, on peut quantifier deux cibles différentes, en introduisant dans le mélange réactionnel deux amorces et une sonde dirigées contre une première cible, et deux amorces et une sonde dirigées contre l'autre cible. Les deux sondes étant marquées avec un fluorophore différent. Avantageusement et plus particulièrement,on met en oeuvre une pluralité de réactions d'amplifications enzymatiques PCR simultanées de 30 chacune desdites séquences spécifiques des agents dudit groupe, à l'aide d'une pluralité de différents jeux d'amorces spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacun desdits agents, les séquences des différentes amorces ne se croisant pas entre les différents dits agents et lesdites amorces pouvant être mises en oeuvre dans une réaction d'amplification enzymatique réalisée selon le même protocole et, notamment, à la même température d'hybridation. Selon une caractéristique avantageuse de ['invention, le dit grand premier fragment contient parmi les dits deuxième fragments, un dit deuxième fragment comprenant une séquence spécifique d'un agent de quantification de l'échantillon à tester apte à permettre la quantification de la réaction d'amplification tel que une séquence spécifique de l'albumine. L'albumine est en effet présente uniquement en 2 copies dans les cellules humaines et la mesure du signal de cette séquence permet donc la quantification du nombre de cellules initiales. Plus particulièrement encore, le dit grand premier fragment comprend le fragment des positions 16280-16425 de l'exon 12 du gène de l'albumine humaine de référence Genebank M12523 de séquence du listage de séquence suivante: SEQ.ID.n 1 =5'-GTTGCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCAT CGT(CTCGAG) TTAAGAGTAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACA AATCTCTCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAA CCAGCAGCTCCCATGAGTTTGG-3' Dans un mode de réalisation particulier visant à illustrer l'application de l'invention, ledit grand premier fragment comprend de l'ADN provenant d'un agent viral appartenant au groupe des virus HIV-1, HIV-2 et HCV. Plus particulièrement, lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents, à partir desquelles sont obtenus des dits deuxièmes fragments comprenant des séquences spécifiques modifiées comprennent: - pour le virus HIV 1,:le fragment des positions 522-642 du gène LTR de HIV1 de référence Genebank k:03455 - pour le virus HIV2, le fragment des positions 56-144 du gène LTR de HIV2 de référencez Genebank M15390: -pour le virus HCV,le fragment des positions 145-211 de la région UTR 5' du virus HCV de référence genebank AY 460204 Plus particulièrement, lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant des séquences spécifiques modifiées segp de HIV1, HIV2 et HCV, incluant des séquences sondes(soulignées) et un site de clivage Alu 1 (entre parenthèses) encadrées par des séquences amorces (en gras) et se terminant le cas échéant par une dite séquence d'hybridation endogène (en italiques) ou exogène (en italiques et gras),comprennent les séquences suivantes du listage de séquences incluant ainsi que les séquences complémentaires - pour HIV 1: SEQ.ID. n 2 = 5'-CACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTT GAG(AGCT) TCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTA ACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC AGTGGCGCCCGAACAGGGACCT-3' pour HIV 2: SEQ. ID. n 3 = 5'-GAACAGGGACCTAGCAGGTAGAGCCTGGGT GTTCCCTGCT(AGCT)CACTTGGCCGGTGCTGGGCAGACGCCCCACG CTTGCTTTGCTTAAA-3' - pour HCV: SEQ.ID n 4 = 5'-AGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAA TTGCCAGGAACGACC(AGCT) CCTTTCTTGGATTAACCCGC-3' Plus particulièrement, le dit grand premier fragment comprenant des séquences spécifiques de HIV1, HIV2 et HCV présente la séquence suivante du listage de séquence incluant des séquences sondes (soulignées) et un site de clivage (entre parenthèses) encadrées par des séquences amorces (en gras) et une dite séquence d'hybridation endogènes (en italiques) ou une séquence complémentaire: SEQ AD. n 5 = 5'-CACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTT GAG(AGCT) TC_AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTA ACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC AGTGGCGCCCGAACAGGGACCTAGCAGGTAGAGCCTGGGTGTTCC CTGCT(AGCT) CACTTGGCCGGTGCTGGGCAGACGGCCCCACGCTTG CTTTGCTTAAAGAGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTG CCAGGAACGACCAGCTCCTTTCTTGGATTAACCCGCTCAA-3' Dans un autre mode de réalisation illustrant l'invention, ledit grand premier fragment comprend de l'ADN provenant d'un agent viral appartenant à un groupe comprenant au moins 2, de préférence au moins 3, virus parmi les virus HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, et HPV 45. Plus particulièrement, lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents, à partir desquelles sont obtenus des dits deuxièmes 20 fragments comprenant des séquences spécifiques modifiées comprennent: - pour le virus HPV 16, le fragment des positions 24-159 du gène E6 de référence Genebank NC 001526- - pour le virus HPV 18,le fragment des positions 472-576 du gène E7 de référence Genebank AY262282, - pour le virus HPV 31, le fragment des positions 474-554 du gène E6 de référence Genebank J04253, - pour le virus HPV 33, le fragment des positions 487- 552 du gène E6 de référence Genebank PPH33CG, - pour le virus HPV 45, le fragment des positions 496-565 du gène E6 e référence Genebank X74479. Plus particulièrement encore, lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant des séquences spécifiques modifiées seq p de HPV16, HPV18, HPV31, HPV33 et HPV45, incluant des séquences sondes(soulignées) encadrées par des séquences amorces(en gras), le cas échéant des séquences d'hybridation endogènes (en italiques) et exogène (en italiques et gras) et un site de clivage Xho 1(entre parenthèses), comprennent les séquences suivantes du listage de séquences ainsi que les séquences complémentaires - pour HPV16: SEQ.ID. n 6 = 5'GTTAGTATACTAAGGGCGTAACCGAAATCG GTTGACTCGAGACCGGTTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACCA AAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAG TTACCACAGTTATGCACAGAGCT-3' - pour HPV18: SEQ.ID. n 7 = 5'-GCACAGAGCTAAAAACGACGATTTCACAAC CATAGCTGGGCACTCTCGAGGCCAGTGCCATTCGTGCTGCAACCGA GCACGACAGGAACGACTCCAACGACGCAGAG-3' - pour HPV31: SEQ.ID. n 8 = 5'TGGATAAAAAGAAACGATTCCACAACATAG GAGGACAGGTGGACAGGACGTTGCATAGCATGTTGGAGAAGACCT CGTACTGAAACCCAAGTGTAGTTAGTATAA-3' - pour HPV33: SEQ.ID. n 9 = 5'GATTTCATAATATTTCGGGTCGTTGGGCAG GGCGCTGTGCGGCGTGTTGGAGGTCCCGACGTAGAGAAACTGCA-3 - pour HPV45: SEQ.ID. n 10 = 5'-GACAGTACCGAGGGCAGTGTAATACATGT TGTGACCAGGCACGGCAAGAAAGACTTCGCAGACGTAGGGAATGG A TAAAAA G- 3' Avantageusement, le dit grand premier fragment comprenant des séquences spécifiques modifiées de HPV16, HPV18, HPV31, HPV33 et HPV45 et du gène de l'albumine avec une dite séquence exogène d'hybridation comprend la séquence suivante du listage de séquence incluant des séquences sondes (soulignées) et un site de clivage (entre parenthèses) encadrées par des séquences amorces (en gras)et des dites séquences d'hybridation endogènes (en italiques), ou une séquence complémentaire SEQ. ID. n 11 = 5'GATTTCATAATATTTCGGGTCGTTGGGCA GGGCGCTGTGCGGCGTGTTGGAGGTCCCGACGTAGAGAAACTGCA CTTGGACAGTACCGAGGGCAGTGTAATACATGTTGTGACCAGGCAC GGCAAGAAAGACTTCGCAGACGTAGGGAATGGATAAAAAGAAACG ATTCCACAACATAGGAGGACAGGTGGACAGGACGTTGCATAGCAT GTTGGAGAAGACCTCGTACTGAAACCCAAGTGTAGTTAGTTAGTAT AACTAAGGGCGTAACCGAAATCGGTTGA(CTCGAG)ACCGGTTAGTA TAAAAGCAGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAG GACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAG CTAAAAACGACGATTTCACAACCATAGCTGGGCACT(CTCGAG)GCC AGTGCCATTCGTGCTGCAACCGAGCACGACAGGAACGACTCCAACG ACGCAGAGGTTGCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGT(CTC GAG) TTAAGAGTAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTC TCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGC AGCTCCCATGAGTTTGG-3' La méthode selon la présente invention est une méthode totalement originale, simple à mettre en oeuvre, rapide, fiable, et ne nécessitant pas un 30 équipement lourd et coûteux. D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre de différents exemples de réalisation en référence aux figures 1 à 8, dans lesquelles: -la figure 1 représente le schéma du principe général de construction 5 d'un fragment nucléotidique chimère à partir de trois oligonucléotides; -la figure 2 représente le schéma de construction du fragment de l'exemple 3; - la figure 3 est une photo de l'analyse par électrophorèse sur gel d'agarose BET 1,5% du produit de la deuxième PCR pour la construction 10 HPV16, HPV18, Albumine de l'exemple 3; - les figures 4 et 5 représentent les courbes de détection et quantification de HPV 18 et la figure 6 celle de l'Albumine à l'exemple 4; - les figures 7 et 8 montrent la linéarité des réactions en HPV 16 ou 18 de l'exemple 4. Dans les exemples qui suivent le principe général de la construction d'un fragment nucléotidique chimère à partir de trois oligonucléotides comprend les étapes 1) à 3) suivantes illustrées sur la figure 1: 1) Choix des oligonucléotides: Les séquences sont choisies selon les besoins de l'utilisateur. Quand le nombre et la nature des cibles moléculaires sont identifiés, le nombre d'oligonucléotides à faire synthétiser va dépendre de la longueur du fragment nucléotidique désiré. Les sociétés commerciales ne peuvent synthétiser de façon fiable que des oligonucléotides dont la longueur n'excède pas 180 nucléotides. Les séquences sont déterminées, en établissant une alternance d'oligonucléotides en séquence directe (11 et 31) ou inverse (21). La séquence des oligonucléotides est établie en positionnant à l'extrémité 3' du premier oligonucléotide (11) une séquence (41) de dix nucléotides complémentaires des 10 derniers nucléotides (51) de l'extrémité 3' de l'oligonucléotide antisens suivant (21) (en gris), qui contient dans son extrémité 5' dix nucléotides complémentaires (6,) des 10 premiers nucléotides (7,) de l'extrémité 5' de l'oligonucléotide sens suivant (3,), et ainsi de suite. Il faut également faire synthétiser des amorces de PCR directe (8,) et inverse (91) ayant un température de fusion (Tm) entre 60 C et 62 C, dont la séquence. correspond à celle des extrémités 5' et 3' de la construction finale ( en gris). 2) Mise en continuité des oligonucléotides (PCR n 1 figure 1): Une première réaction de PCR est réalisée en introduisant dans le milieu réactionnel classique avec une Taq polymérase traditionnelle, tous les oligonucléotides (1,, 21, 31, 81, 91), nécessaires à la construction du fragment, en équimolarité. Une température d'hybridation de 37 C favorise une dimérisation des oligonucléotides par (2A) hybridation des parties complémentaires des oligonucléotides (séquences en gris de dix nucléotides complémentaires dans les régions 5' et 3' de chacun d'eux 41- 51-, 6,-71). Puis (2B) une réaction d'élongation par polymérisation de 5' en 3' permet de synthétiser le fragment sens complet (voir schéma). 3) Production du fragment attendu (PCR n 2 figure 1): Le produit de la réaction précédente va servir de matrice pour une deuxième réaction de PCR classique dans laquelle les amorces (81, 9,) utilisées correspondent aux séquences 5' et 3' du fragment final. Pour cette réaction, il est intéressant d'utiliser une Taq polymérase Hotstart (enzyme dont le site actif est bloqué par un anticorps ou un ligand chimique: dans ce dernier cas, l'enzyme sera activé par chauffage à 95 C), la température d'hybridation et la température optimale d'hybridation des amorces est fixée à environ 58 C. Le produit final est analysé sur gel d'agarose: si sa taille correspond à la taille attendue, le fragment est purifié en utilisant le kit Qiaquick PCR purification kit Qiagen (Courtaboeuf France) . Il peut alors être séquencé directement ou cloné dans un plasmide. Dans le cas ou le fragment est cloné, les fragments insérés dans les plasmides recombinants sont amplifiés par PCR, et séquencés. Le clone recombinant qui contient le fragment de séquence attendue, peut être purifié et utilisé comme sonde en vue d'hybridation ultérieure. Cette technique a été utilisée pour la construction de plasmides de détection et de quantification de virus par PCR en temps réel utilisant des sondes fluorescentes: HIV1, HIV2, HCV, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV45. Exemple 1: Construction avec deux oligonucléotides: Plasmide permettant la détection et la quantification de virus à ARN: HIV1-HIV2-HCV. 1) Séquence des oligonucléotides: 1.1) Oligonucléotide HIV1 (sens) : gène LTR 522-642 référence K03455 SEQ. ID. n 2 = 5'CACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTT GAG(AGCT) TCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTA ACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC AGTGGCGCCCGAACAGGGACCT-3' En gras: amorce sens et antisens; en gris et double soulignement: 20 la sonde Taqman; entre parenthèses: le site de restriction Alu 1; en italiques: la séquence d'hybridation endogène des oligonucléotides. 1.2) Oligonucléotide HIV2-HCV (antisens) incluant les séquences inverses de SEQ.ID.n 3 et 4: -Pour HIV2 gène LTR 56-144 référence Genebank: M15390 - Pour HCV région 5'UTR 145-211 référence Genebank: AY460204 SEQ. ID. n 12 = 5'-TTGAGCGGGTTTATCCAAGAAAGG(AGCT) GGTCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCAGACCTCT TTAAGCAAGCAAGCGTGGGGCCGTCTGCCCAGCACCGGCCAAGTG( AGCT) AGCAGGGAACACCCAGGCTCTACCTGCTAGGTCCCTGTTC-3' En gras: amorces sens et antisens HCV; en double soulignement: la sonde Taqman HCV; en gras doublement soulignées: amorce sens et antisens HIV-2 en souligné, la sonde tagman HIV-2; entre parenthèses: les sites de restriction Alu 1. En italiques: séquence d'hybridation endogène des 2 oligonucléotides. 2) Séquence des amorces dites de construction: Amorces d'amplification pour la deuxième PCR Cons dir: CACTGCTTAAGCCTCAATAA Cons rev: TTGAGCGGGTTTATCCAAGA 3) Séquence finale du fragment néosynthétisé de 296 paires de bases SEQ.ID. n 5 = 5'-CACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAG(A GCT) TCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAG AGATCCCTCAGACCCTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGG CGCCCGAACAGGGACCTAGCAGGTAGAGCCTGGGTGTTCCCTGCT( AGCT) CACTTGGCCGGTGCTGGGCAGACGGCCCCACGCTTGCTTTG CTTAAAGAGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGG AACGACCAGCTCCTTTCTTGGATTAACCCGCTCAA-3' Exemple 2: Construction avec trois oligonucléotides Plasmide permettant la détection et la quantification des papillomavirus humains HPV 16 et 18 et du gène de l'albumine humaine. 1) Séquences des oligonucléotides: Dans les séquences suivantes sont représentées: -En italiques: les séquences d'hybridation des oligonucléotides. -En gras: les séquences des amorces directe et reverse pour la PCR en temps réel. -En souligné : la séquence de la sonde d'hydrolyse de type Taqman marquée FAM pour HPV16 et 18 et VIC pour l'albumine -Entre parenthèses: le site de restriction Xhol 1.1) Oligonucléotide HPV16 (sens) : gène E6 nucléotides 24 à159 référence Genebank: NC_001526 correspondant à SEQ. ID n 6 = 5'GTTAGTATAACTAAGGGCGTAACCGAAATCG GTTGA(CTCGAG) ACCGGTTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACC 10 AAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAA GTTACCACAGTTATGCACAGAGCT3' 1.2) Oligonucléotide HPV18 (antisens) gène E7 nucléotides 472- 567 référence Genebank: AY262282, inverse de SEQ. ID. n 7 = 5'CTCTGCGTCGTTGGAGTCGTTCCTGTCGTGCTC 15 GGTTGCAGCACGAATGGCACTGGC(CTCGAG) AGTGCCCAGCTATG TTGTGAAATCGTCGTTTTTAGCTCTGTGC-3' 1.3) Oligonucléotide Albumine sens: Exon 12 nucléotides 16280-16425 référence Genebank: M12523, SEQ. ID. n 13 (incluantSEQ.ID.n 1) = 5'-CGACGCAGAGGTTGCT GTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGT(CTCGAG)TTAAGAGTAAT ATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTGTTG TCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTT GG-3' 2.) Séquence du fragment de 388 paires de bases à obtenir: SEQ. ID. n 14 = 5'GTTAGTATAACTAAGGGCGTAACCGAAAT CGGTTGACTCGAGACCGGTTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCAC CAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAA AGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTAAAAACGACGATTTCACAACC ATAGCTGGGCACTCTCGAGGCCAGTGCCATTCGTGCTGCAACCGA GCACGACAGGAACGACTCCAACGACGCAGAGGTTGCTGTCATCTCT TGTGGGCTGTAATCATCGTCTCGAGTTAAGAGTAATATTGCAAAAC CTGTCATGCCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGA TGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTTGG-3' Exemple 3: Construction avec cinq oligonucléotides HPV 31-33-45-16-18-alb. Ce fragment a été construit selon la méthodologie décrite précédemment et dont le schéma de construction est présenté sur la 10 figure 2: 1) Séquences des oligonucléotides: 1.1) Séquence de l'oligonucléotide HPV 33 et 45 (sens): SEQ. ID. n 15 = 5'-GATTTCATAATATTTCGGGTCGTTGGGCA GGGCGCTGTGCGGCGTGTTGGAGGTCCCGACGTAGAGAAACTGCA CTTGGACAGTACCGAGGGCAGTGTAATACATGTTGTGACCAGGCAC GGCAAGAAAGACTTCGCAGACGTAGGGAATGGATAAAAA-3' 1.2) Séquence de l'oligonucléotide HPV 31 (antisens de SEQ.ID.n 8) = 5'TTATACTAACTACACTTGGGTTTCAGTACGAGGTC TTCTCCAACATGCTATGCAACGTCCTGTCCACCTGTCCTCCTATGTT GTGGAATCGTTTCTTTTTATCCA3' Les oligonucléotides qui contiennent les cibles moléculaires pour HPV16, HPV18 et l'albumine sont identiques à ceux précédemment décrits. 2) Séquence de 631 paires de bases du plasmide HPV 16, 18, 31, 33, 45 et Albumine: SEQ. ID. n 11 = 5'-GATTTCATAATATTTCGGGTCGTTGGGCA GGGCGCTGTGCGGCGTGTTGGAGGTCCCGACGTAGAGAAACTGCA CTTGGACAGTACCGAGGGCAGTGTAATACATGTTGTGACCAGGCAC GGCAAGAAAGACTTCGCAGACGTAGGGAATGGATAAAAAGAAACG ATTCCACAACATAGGAGGACAGGTGGACAGGACGTTGCATAGCAT GTTGGAGAAGACCTCGTACTGAAACCCAAGTGTAGTTAGTTAGTAT AACTAAGGGCGTAACCGAAATCGGTTGA(CTCGAG)ACCGGTTAGTA TAAAAGCAGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAG GACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAG CTAAAAACGACGATTTCACAACCATAGCTGGGCACT(CTCGAG) GCC AGTGCCATTCGTGCTGCAACCGAGCACGACAGGAACGACTCCAACG ACGCAGAGGTTGCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGT(CTC GAG) TTAAGAGTAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTC TCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGC AGCT C C CAT GAGTTT GG-3' 3) Mode opératoire général pour la construction de tous les types de fragments (figure 2): 12 = oligo HPV33-HPV45 22 = oligo HPV31 32 = oligo HPV16 42 = oligo HPV18 52 = oligo albumine 3.1) Première PCR: les oligonucléotides 12, 22, 32, 42, 52 sont introduits en équimolarité (0, 2mMol) dans un tampon de polymérase 1X MgC12 (1,5mMol), dNTP (0,2mMol), 0. 2 l de Taq polymérase (roche) à 5U/ l dans un volume réactionnel final de 501,il. Programme de PCR: 95 C 2min; puis 40 cycles 94 C 30s, 37 C 1min, 72 C 1min30s; 72 C 5min retour à 4 C. 3.2) Deuxième PCR: elle permet d'obtenir le fragment final 62 contenant bout à bout les cibles attendues. 1 l du produit d'amplification de la première PCR est ajouté au mélange réactionnel contenant les amorces sens 72 et antisens 82 (0,2 mMol) spécifiques des extrémités du fragment attendu, dans le tampon 1X de la taq polymérase MgC12 (1,5mMol), dNTP (0, 2mMol), 0.211 de Taq polymérase Hotstar (Qiagen) à 5U/111 dans un volume réactionnel final de 5O 1. Le programme d'amplification est: 95 C 15min (activation de la Taq polymérase); puis 40 cycles 94 C 30s., 58 C 1min, 72 C 1min30s; 72 C 5min retour à 4 C. Le produit de PCR est analysé sur gel BET agarose 1,5% dans du tampon TBE 0, 5X. La photo de l'analyse par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5% du produit de la deuxième PCR pour la construction HPV16, HPV18, 10 Albumine est représentée figure 3. Le fragment sera purifié (kit Qiaquick PCR purification kit Qiagen Courtaboeuf France). Ce fragment peut être séquencé directement ou mieux, inséré dans un plasmide pour être cloné. 3.3) Clonage du fragment: Le fragment obtenu est directement cloné dans le plasmide PGEMT easy on utilise le kit pGEM T Easy Vector System 2 (Promega , Madison, Wisconsin, USA). 3.4) Réaction d'insertion du fragment et de recircularisation du plasmide: 2 l du fragment précédemment obtenu (environ 100 ng) sont introduits dans le mélange réactionnel contenant 5 pd de tampon de la ligase, 1 l de T4 DNA ligase et 1 l. de plasmide PGEM T linéarisé et déphosphorylé. Le volume final est 10 ill. Le produit de ligation est incubé 25 à 15 C pendant une nuit. 3.5) Réaction de transformation: 7 l du mélange réactionnel précédent sont mélangés à 50 l de cellules compétentes (Escherichia Coli JM 109) et maintenues pendant 20 minutes dans la glace puis incubées pendant 1 minute à 42 C. Après ajout de 950 Ill de LB broth (USB , Cleveland, Ohio, USA), et incubation pendant 1h30 à 37 C, 500 et 250 l de ce milieu de culture sont étalés sur 2 boites de Pétri contenant du LB agar (USB , Cleveland, Ohio, USA) avec 100 pg/ml d'Ampicilline. Les boîtes sont incubées pendant une nuit à 37 C. Les colonies recombinantes sont déposées à la fois dans 50 pl d'eau distillée stérile et sur une boîte de LB agar Ampicilline. Les colonies prélevées sont analysées par PCR: on utilise 5 111 de suspension bactérienne dans l'eau distillée et le milieu réactionnel de PCR précédemment décrit, qui contient le couple d'amorces M13 (10 pm/pl) dont les séquences sont présentes de part et d'autre du polylinker du plasmide. Séquence de ces amorces. M13 direct: 5'CGCCAGGGTTTT000AGTCACGAC3' (2949-2972) M13 reverse: 5'TCACACAGGAAACAGTTATGAC3' (176-197) Le programme de PCR est identique à celui utilisé pour la deuxième étape de la construction. Les produits de PCR obtenus sont analysés sur un gel BET Agarose à 1,5 % dans du tampon TBE 0,5 X. Les fragments de la taille attendue sont purifiés en utilisant le kit QIAquick PCR Purification Kit 250 PCR Qiakit (Qiagen , Courtaboeuf, France). Ils sont ensuite séquencés en utilisant le Big Dye Terminator V1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems , Warrington, UK) et 3,2 pmol/ l d'amorces M13 directe et reverse, chromatographiées sur le séquenceur ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems ). La séquence obtenue est comparée à la séquence du fragment attendu (Figure IV) en utilisant par exemple les programmes auto assembler et Sequence Navigator (Applied Bisosytems ). Un des clones recombinants, dont la séquence du fragment inséré est conforme à la séquence attendue, va être produit en grande quantité dans 100 ml de LB BROTH Ampicilline et purifié selon le protocole High Speed Plasmid Midi Kit (Qiagen , Courtaboeuf, France). Le plasmide purifié est ensuite stocké à -20 C. La souche recombinante sélectionnée est congelée à - 80 C. La concentration plasmidique est déterminée par la mesure de la densité optique à 260 nm, le nombre de copies de plasmide donc de copies de cible pourra être Écalculé selon la formule suivante: Une unité de densité optique (DO) à 260 nm est estimée à 50 g/ml d'ADN double brin: DO 260 nm x 50 = A x10-6 g/ml de plasmide dans la 10 solution de plasrnide purifié. Taille du plasmide = Taille de PGEMT easy + Taille du fragment = B pb x 2 =C bases. La masse molaire d'un nucléotide est estimée à 330 Daltons (g/mole) . La masse molaire du plasmide sera: C x 330 = D mole /ml. La concentration du plasmide sera donc de A x10-6/D = E mole/ml x nombre d'Avogadro (6,023.1023) = Nombre de copies de plasmide /ml d'extrait. De cette valeur est déduite le nombre de copies de plasmide présent dans l'échantillon. Pour la construction de la courbe de quantification, on utilise comme point de départ, une dilution plasmidique correspondant à 10' copies/réaction. La gamme de dilution s'échelonne de 10' à 1 copie/réaction. Exemple 4: Utilisation d'un plasmide de détection et de quantification obtenu en utilisant la technique selon l'invention. Les résultats présentés concernent uniquement le plasmide qui contient les cibles pour HPV16,HPV18 et l'albumine humaine. Les résultats obtenus avec les autres constructions sont absolument identiques à ceux présentés ci-dessous. 1) construction HPV16/HPV18 et Albumine: On a utilisé une réaction de PCR en temps réel en double fluorescence afin, de détecter et de quantifier les virus au sein d'échantillon ainsi que le gène Albumine afin d'établir la relation entre la charge virale et le nombre de cellules infectées. Les sondes HPV 16 et 18 sont marquées avec le fluorochrome FAM alors que la sonde Albumine est marquée avec le fluorochrome VIC. Pour la mise au point de la réaction de PCR en temps réel en double fluorescence, on utilise la gamme plasmidique de quantification. On fait varier les quantités respectives d'amorces et de sonde, afin de conserver la même valeur de CT en mono-fluorescence et en double fluorescence. Les conditions expérimentales retenues sont celles pour lesquelles les valeurs de CT sont identiques en simple et double fluorescence. Les résultats sont présentés sur les figures 4 à 6. Sur la figure 4, on montre la détection de HPV18 et la comparaison entre les PCR en temps réel de trois échantillons contenant 10', 105,103 copies pour 5 l d'échantillon. En utilisant le mélange réactionnel contenant la sonde et les amorces pour détecter HPV16: courbes A3i C3 et E3; ou le mélange réactionnel contenant les sondes et les amorces permettant de détecter à la fois les gènes de HPV16 et de l'albumine humaine: courbes A4, C4 et E4. Sur la figure 5, on montre la détection de HPV18 et la comparaison entre les PCR en temps réel de trois échantillons contenant 10', 105,103 copies pour 5 l d'échantillon. En utilisant le mélange réactionnel contenant la sonde et les amorces pour détecter HPV18: courbes A2, C2 et E2; ou le mélange réactionnel contenant les sondes et les amorces permettant de détecter à la fois les gènes de HPV18 et de l'albumine humaine: courbes A7, C7 et E7. Sur la figure 6, on montre la détection du gène de l'albumine humaine et la comparaison entre les PCR en temps réel de trois échantillons contenant 107, 105, 103 copies pour 51.tl d'échantillon. En utilisant le mélange réactionnel contenant la sonde et les amorces pour détecter l'albumine: courbes A1, CI et E1; ou le mélange réactionnel contenant les sondes et les amorces permettant de détecter à la fois les gènes de HPV16 et 18 et de l'albumine humaine: courbes A4 et C7, A7 et E7, E4 et AI 2) Evaluation de la technique: On a mesuré les valeurs de CT ( Les valeurs de CT obtenues pour la gamme plasmidique d'étalonnage lors de manipulations différentes s'échelonnent entre 17 pour le point 10' copies et 37 pour le point 1 copie. La pente de la courbe standard varie de -2.8 à - 3.7 et le coefficient de corrélation de 0.96 à 0.99. 2.1) Résultats pour HPV 16 Valeur du CT Moyenne Minimum Maximum Coefficient Nombre* de variation (%) 107 17,142 16,840 17,570 1,7 8 106 19,839 19,180 20,460 1,9 8 21,558 21,090 21,910 1,1 8 É 104 24,887 24,430 25,350 1,3 8 103 28,185 27,650 28,680 1,3 8 o 102 31,428 30,930 31,860 0, 9 8 101 34,366 31,470 35,450 3,6 8 56 32,965 32,440 33,800 1,9 4 e 83 29, 325 28,570 30,280 2,9 4 É 87 20,771 20,464 21,176 1,5 4 É 126 31,590 30, 020 33,070 3,7 6 c,J 137 29,618 28,120 30,430 2,7 6 31,237 29,460 32,350 4 6 2.2) Résultats pour HPV 18 Valeur du CT Moyenne Minimum Maximum Coefficient Nombre* de variation (%) 10' 17,582 16,670 18,030 2,8 8 106 20,510 19,950 20,980 1,8 8 22,261 21,420 23,450 2,9 8 104 25,596 24,850 26,080 1,9 8 103 28,864 27,340 29,520 2,7 8 102 32,290 30,680 33,130 2,6 8 101 35,635 33,830 37,040 3,5 8 93 33,975 33,510 34,640 1,4 4 94 17,035 16,570 17,380 2,3 4 e 97 23,162 22,690 23,740 2,2 4 31,540 30,670 32,390 2,7 4 126 31,785 31,220 32,310 1,8 4 W 131 32,880 32,190 33,470 1,6 4 132 34,185 33,080 35,290 3,1 4 139 34,395 33,060 35,230 2,9 6 2.3) Résultats pour l'ALBUMINE Valeur du CT Moyenne Minimum Maximum Coefficient Nombre* de variation (%) 10' 17,044 16,850 17,240 0,7 8 É 106 19,729 19,330 20, 180 1,7 8 ^ 105 21,647 21,130 22,400 1,7 8 aA É 104 24,983 24,650 25,230 0,8 8 103 28,422 28,090 28,930 1 8 102 31,797 31,300 32,270 1,1 8 10' 33, 871 32,780 34,570 1,7 8 97 23,885 23,400 24,320 1,9 4 24,537 24,050 25, 100 2,1 4 CI) 126 26,453 25,680 26,940 1,8 8 o 130 20,508 20,260 20,950 1, 5 4 131 23,212 22,950 23,470 0,9 4 L) 137 25,097 25,060 25,180 0,2 4 138 23,055 22,680:23,240 1,1 4 28,828 28,420 29,250 1,2 6 * Nombre de points de gamme ou d'échantillons testés 2.4) Calcul du coefficient de variation pour chaque point de gamme 5 et quelques échantillons positifs. Ces calculs sont effectués à partir des valeurs en CT. La réaction est donc linéaire et son efficacité est maximale. Le seuil de détection peut être fixé à 5 copies soit un CT de 36. Cette technique permet d'évaluer la qualité de l'échantillon et de l'extraction de l'ADN grâce au dosage du gène de l'albumine (Le CT de l'albumine doit être Les résultats concernant la linéarité des réactions en HPV 16 ou 18 à partir d'un extrait d'ADN de cellules cervicales dilué selon un pas de raison dix les résultats sont présentés sur les figures 7 et 8. Les figures 7 et 8 présentent les valeurs des CT obtenus pour la 5 quantification de HPV 16 et respectivement HPV18 à partir d'un extrait d'ADN de cellules cervicales dilué 1 à 10-5 et testé en double. La linéarité de la réaction est bonne, puisqu'une dilution au 1/10e correspond à une augmentation du CT d'environ 3 unités et ceci jusqu'à une copie pour 5 d'échantillon. La reproductibilité est excellente: les coefficients de corrélation sont de 99.7 pour HPV 16 et 98.9 pour HPV 18. 3) Calcul de la charge virale en HPV 16 et HPV 18 La charge virale de l'échantillon est déterminée en se référant à la gamme d'étalonnage qui est présente au sein de chaque plaque de dosage. Afin de comparer les échantillons entre eux, la charge virale est exprimée par million de cellules humaines nucléées présentes dans l'échantillon. La détermination du nombre de cellules humaines est rendue possible par la quantification du nombre de copie du gène de l'albumine présente dans l'échantillon d'ADN de cellules cervicales testé. Le calcul est le suivant: Charge virale (copies HPV / 10 6 cellules)= (nombre de copies d'HPV/0.5x nombre de copies d'albumine) x 106 Le facteur 0.5 est introduit afin de tenir compte de la présence de deux copies du gène de l'albumine par cellule nucléée du fait de leur 25 diploïdie. 4) Conclusion Si la PCR en temps réel est aujourd'hui la seule méthode qui permette de mesurer précisément les charges virales. La possibilité de construire des fragments chimères entre différents types ou sous-types de virus et entre différentes espèces permet de disposer sur une même construction de tous les témoins positifs adéquats, et de permettre une coquantification comme présentée dans l'exemple ci-dessus. Il peutégalement servir de standard de contrôle de qualité. Un dernier avantage et non des rnoindres apporté par cette invention est d'éviter l'utilisation de cellules infectées ou d'agents infectieux non cultivables ou dont la culture nécessite des équipements lourds. 37 Revendications 1. Méthode de préparation d'un fragment synthétique d'acides nucléiques par dimérisation d'oligonucléotides et amplification enzymatique à l'aide d'une enzyme polymérase thermorésistante dans laquelle on prépare un grand premier fragment d'ADN synthétique bicaténaire comprenant un enchaînement dans un ordre déterminé d'une pluralité de n deuxièmes fragments d'ADN synthétiques contigus, comprenant un brin directe 5' 3' comprenant respectivement les n séquences polynucléotidiques seq,, seq2, seg3, seq desdits deuxièmes fragments successivement dans cet ordre caractérisé en ce que: 1). On réalise un mélange équimolaire des n oligonucléotides suivants comprenant: -si n=2p -p oligonucléotides 0,, 03, ....02,_, comprenant respectivement 15 des séquences identiques à celles des oligonucléotides d'ordre impair seq seq3,... seq2,_, dudit brin direct, et -p oligonucléotides 02, 04, 2p comprenant respectivement les séquences des brins anti-sens complémentaires des oligonucléotides d'ordre pair seq2, seq4,....seq2p, et -si n=---2p+1 -p+l oligonucléotides 01, 03,....02,+, comprenant respectivement les séquences identiques à celles des séquences d'ordre impair seq,, seq 3,... seq2,, du dit brin direct, et -p oligonucléotides O2, O4,... 2p comprenant respectivement les 25 séquences du brin anti-sens complémentaires des séquences d'ordre pair seq2, seg4, seg2p, et O,m_1 comprend à son extrémité 3' une séquence d'hybridation complémentaire de la séquence de l'extrémité 3' de 02m, et apte à s'y hybrider, et - 02m comprend à son extrémité 3' une séquence d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 3' de 02,, .1 et apte à s'y hybrider, et à son extrémité 5' une séquence complémentaire de celle de l'extrémité 5' de 02m+1, et apte à s'y hybrider - 02,n+1 comprend à son extrémité 5' une séquence d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 5' de 02m, et apte à s'y hybrider, et à son extrémité 3' une séquence d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 3' de 02m+2, et - On comprend à son extrémité 5' une séquence d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 5'de O _1 et apte à s'y hybrider si n=-2p+1, ou On comprend à son extrémité 3' une séquence terminale d'hybridation complémentaire de celle de l'extrémité 3' de On_, et apte à s'y hybrider si n=2p - n étant un entier supérieur ou égal à 2, de préférence de 2 à 8; et m étant des nombres entiers supérieurs ou égaux à 1, et 2m 1 étant inférieur à n -lesdites seqûences terminales d'hybridation comprenant au moins 10, de préférence de 10 à 20 nucléotides, et - chaque dite séquence d'hybridation étant - une séquence constituant respectivement la séquence de l'extrémité de la séquence d'ordre impair seg2m+1 correspondante ou la séquence d'extrémité de la séquence complémentaire de la séquence d'ordre pair seg2m correspondante, et/ou - une séquence exogène rajoutée à l'extrémité de la séquence d'ordre impair seg2m+l ou de la séquence complémentaire de la séquence d'ordre pair seg2m correspondante, - chaque dite séquence d'hybridation ne se retrouvant nulle part ailleurs dans les séquences identique ou complémentaire à l'une quelconque des différentes séquences seq, et 2) on réalise une première réaction d'amplification d'acides nucléiques de type PCR en présence d'une dite enzyme polymérase thermorésistante, sans amorces exogènes comprenant, une série de cycles, de préférence au moins 40, comprenant: 2.1) une étape d' hybridation desdits oligonucléotides entre eux dans des conditions de température permettant la totalité des hybridations possibles entre les dites séquences d'hybridation complémentaires,de préférence à une température de inférieure à 40 ,de préférence encore de 37 à 40 C, et 2.2) une étape d'élongation par la dite enzyme polymérase dans les conditions de température et de durée permettant la polymérisation des acides nucléiques de 5' en 3' par la dite enzyme polymérâse, pour construite un fragment double brins, de préférence à une température d'.au moins 60 C, de préférence encore 72 C et 2.3) une étape de dénaturation du fragment double brin obtenu à l'étape 2.2), et 2.4) Chaque brin servant de matrice à un nouveau cycle d'étapes 2.1) à 2.3) de dite première amplification à l'aide des dits oligonucléotides, puis 2.5) de préférence, lors du dernier cycle, on s'arrête à l'étape d'élongation 2.2) que l'on prolonge pour une durée totale au moins double de celle des étapes 2.2) de la série de cycles précédent, de préférence une durée d'au moins 5 minutes, et 3) on réalise une seconde réaction d'amplification de type PCR à partir du produit de la réaction d'amplification de l'étape 2.5, après dénaturation du dit produit d'amplification de l'étape 2.5), comprenant une série de cycles, de préférence au moins 40 dans lesquels on met en oeuvre un jeu d' amorces de séquences, de préférence de 15 à 25 nucléotides, de préférence au moins 17 nucléotides correspondant respectivement pour l'une à celle de l'extrémité 5' et pour l'autre à une séquence complémentaire de l'extrémité 3' dudit brin directe du dit grand premier fragment à préparer et on réalise l'étape d'hybridation à la température optimale d'hybridation des dites amorces, que l'on choisit de préférence à 58 C, et 4) on termine par une étape d'élongation pour obtenir ledit grand premier fragment bicaténaire, et 5) de préférence, on analyse la séquence et/ou la taille du fragment 15 obtenu pour vérifier si elle correspond à celle attendue pour le dit grand premier fragment. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite séquence terminale d'hybridation de Op est une séquence exogène rajoutée à l'extrémité de la séquence d'ordre impair seq,,n+, ou de la séquence complémentaire de la sequence d'ordre pair seg2n, correspondante, mais correspondant à la séquence complémentaire constituant l'extrémité correspondante de Op+, ou Op_, correspondante. 3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que la taille des dits deuxièmes fragments ou oligonucléotides On est 25 d'au moins 60 nucléotides. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu' on prépare un dit grand fragment synthétique comprenant au moins une région 3' que l'on peut transcrire ARN, à partir d'un dit grand premier fragment synthétique d'ADN obtenu à partir de dits oligonucléotides 0,- On d'ADN dans lesquels on a introduit un site de fixation d'un ARN polymérase à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide Op dont on retrouve la séquence identique ou complémentaire à l'extrémité 5'de la dite région, et on réalise une étape de transcription en ARN avec la dite ARN polymérase, du dit grand fragment synthétique d'ADN. 5. Plasmide comprenant un fragment d'acide nucléique préparé par une méthode selon l'une des revendications 1 à 4. 6. Utilisation d'un fragment d'acide nucléique préparé par une méthode selon l'une des revendications 1 à 4 ou d'un plasmide en comprenant selon la revendication 5, comme standard de quantification, témoin positif ou sonde spécifique dans une méthode de détection et/ou quantification de l'ADN d'une cible moléculaire d'ADN correspondant à au moins l'un des dits deuxièmes fragments. 7. Méthode de détection de la présence et/ou de quantification d'ADN d'un organisme vivant ou microorganisme, tel que de préférence un agent pathogène bactérien, parasitaire, de levure ou viral dans un échantillon contenant de l'ADN à tester, dans laquelle on met en oeuvre une réaction d'amplification enzymatique d'ADN du type PCR, de préférence quantitative, de - l'ADN extrait dudit échantillon à tester, e - d'un fragment d'ADN synthétique obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 4 comprenant au moins un dit deuxième fragment correspondant à une séquence spécifique dudit agent dans un échantillon témoin positif et/ou dans un échantillon standard servant au calibrage de la quantification. 8. Méthode selon la revendication 7 caractérisée en ce que: a/-on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent pathogène appartenant à un groupe d'une pluralité d'agents pathogènes, de préférence de 3 à 8, et/ou on quantifie ledit ADN provenant de dits agents pathogènes b/- on utilise comme dit fragment synthétique d'ADN témoin positif et/ou standard de quantification, un grand premier fragment d'ADN synthétique obtenu par une méthode de préparation selon l'une des revendications 1 à 4 regroupant desdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant chacun une séquence spécifique respectivement de chacun desdits agents dudit groupe. 9. Méthode selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu'on met en oeuvre une pluralité de réactions d'amplifications enzymatiques PCR simultanées de chacune desdites séquences spécifiques des agents dudit groupe, à l'aide d'une pluralité de différents jeux d'amorces spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacun desdits agents, les séquences des différentes amorces ne se croisant pas entre les différents dits agents et lesdites amorces pouvant être mises en oeuvre dans une réaction d'amplification enzymatique réalisée selon le même protocole et, notamment, à la même température d'hybridation. 10. Méthode selon l'une des revendications 7 à 9 caractérisée en ce que le dit grand premier fragment contient parmi les dits deuxième fragments, un dit deuxième fragment comprenant une séquence spécifique d'un agent de quantification de l'échantillon à tester apte à permettre la quantification de la réaction d'amplification tel que une sequence spécifique de l'albumine. 11. Méthode selon la revendication 10 caractérisée en ce que le dit grand premier fragment comprend le fragment des positions 16280-16425 due l'exon 12 du gène de l'albumine humaine de référence Genebank M12523 de séquence du listage de séquence suivante: SEQ. ID. n 1 = 5'GTTGCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCA TCGT(CTCGAG) TTAAGAGTAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACAC AAATCTCTCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGA ACCAGCAGCTCCCATGAGTTTGG3' 12. Méthode selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisée en ce que ledit grand premier fragment comprend de l'ADN provenant d'un agent viral appartenant au groupe des virus HIV-1, HIV-2 et HCV. 13. Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents, à partir desquelles sont obtenus des dits deuxièmes fragments comprenant des séquences spécifiques modifiées comprennent: - pour le virus HIV1: le fragment des positions 522-642 du gène LTR de HIV1 de référence Genebank K03455: - pour le virus HIV2, le fragment des positions 56-144 du gène LTR de HIV2 de référence Genebank M15390: - pour le virus HCV, le fragment des positions 145-211 de la région UTR 5'du virus HCV de référence Genebank AY 460204 14. Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant des séquences spécifiques modifiées seqp de HIV1, HIV2 et HCV, incluant des séquences sondes (soulignées) et un site de clivage Alu 1 (entre parenthèses) encadrées par des séquences amorces (en gras) et se terminant le cas échéant par une dite séquence d'hybridation, endogène (en italiques) ou exogène ( en italiques et gras), comprennent les séquences suivantes du listage de séquences incluant ainsi que les séquences complémentaires pour HIV 1: SEQ. ID. n 2 = 5'-CACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTT GAG(AGCT) TCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTA ACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC AGT GGCGCCCGAACAGGGACCT-3' - pour HIV 2: SEQ. ID. n 3 = 5'-GAACAGGGACCTAGCAGGTAGAGCCTGGGT GTTCCCTGCT(AGCT)CACTTGGCCGGTGCTGGGCAGACGCCCCACG CTTGCTTTGCTTAAA-3' - pour HCV: SEQ. ID. n 4 = 5'-AGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAA TTGCCAGGAACGACC(AGCT)CCTTTCTTGGATTAACCCGC-3' 15. Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit grand premier fragment comprenant des séquences spécifiques de HIV1, HIV2 et HCV présente la séquence suivante du listage de séquence incluant des séquences sondes (soulignées) et un site de clivage (entre parenthèses) encadrées par des séquences amorces (en gras) et une dite séquence d'hybridation endogènes (en italiques) ou une séquence complémentaire SEQ. ID. n 5 = 5'CACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTT GAG(AGCT) TCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTA ACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC AGTGGCGCCCGAACAGGGACCTAGCAGGTAGAGCCTGGGTGTTCC CTGCT(AGCT) CACTTGGCCGGTGCTGGGCAGACGGCCCCACGCTTG CTTTGCTTAAAGAGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTG CCAGGAACGACCAGCTCCTTTCTTGGATTAACCCGCTCAA-3' 16. Méthode selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisée en ce que ledit grand premier fragment comprend de l'ADN provenant d'un agent viral appartenant à un groupe comprenant au moins 2 de préférence au moins 3 virus parmi les virus HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, et HPV 45. 17. Méthode selon la revendication 16, caractérisée en ce que lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents, à partir desquelles sont obtenus des dits deuxièmes fragments comprenant des séquences spécifiques modifiées, comprennent: - pour le virus HPV 16, le fragment des positions 24-159 du gène E6 de référence Genebank NC 001526-- pour le virus HPV 18, le fragment des positions 472-576 du gène E7 de référence Genebank AY262282, - pour le virus HPV 31, le fragment des positions 474554 du gène E6 de référence Genebank J04253, - pour le virus HPV 33, le fragment des positions 487-552 du gène E6 de référence Genebank PPH33CG, pour le virus HPV 45, le fragment des positions 496-565 du gène 10 de référence Genebank X74479. 18. Méthode selon la revendication 17, caractérisée en ce que lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant des séquences spécifiques modifiées seq p de HPV16, HPV18, HPV31, HPV33 et HPV45, incluant des séquences sondes (soulignées) encadrées par des séquences amorces (en gras), le cas échéant des séquences d'hybridation endogènes (en italiques) ou exogènes (en italiques et gras) et un site de clivage Xho 1 (entre parenthèses), comprennent les séquences suivantes du listage de séquences ainsi que les séquences complémentaires - pour HpV16: SEQ. ID. n 6 = 5'-GTTAGTATACTAAGGGCGTAACCGAAATCG GTTGACTCGAGACCGGTTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACCA AAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAG TTACCACAGTTatGCACAGAGCT-3' - pour HPV18: SEQ. ID. n 7 = 5'-GCACAGAGCTAAAAACGACGATTTCACAAC CATAGCTGGGCACTCTCGAGGCCAGTGCCATTCGTGCTGCAACCGA GCACGACAGGAACGACTCCAACGACGCAGAG-3' - pour HPV31: SEQ. ID. n 8 = 5'TGGATAAAAAGAACGATTCCACAACATAGG AGGACAGGTGGACAGGACGTTGCATAGCATGTTGGAGAAGACCTC GTACT GAAACCCAAGT GTAGTTAGTATAA-3' - pour HPV33: SEQ.ID. n 9 = 5'GATTTCATAATATTTCGGGTCGTTGGGCAG GGCGCTGTGCGGCGTGTTGGAGGTCCCGACGTAGAGAAACTGCA-3 - pour HPV45: SEQ. ID. n 10 = 5'-GACAGTACCGAGGGCAGTGTAATACATGT TGTGACCAGGCACGGCAAGAAAGACTTCGCAGACGTAGGGAA TGG A TAAAAA G- 3' 19. Méthode selon la revendication 18, caractérisée en ce que le dit grand premier fragment comprenant des séquences spécifiques modifiées de HPV16, HPV18, HPV31, HPV33 et HPV45 et du gène de l'albumine avec une dite séquence exogène d'hybridation, comprend la séquence suivante du listage de séquence incluant des séquences sondes (soulignées) et un site de clivage (entre parenthèses) encadrées par des séquences amorces (en gras) et une dite séquence d'hybridation endogènes (en italiques) ou une séquence complémentaire: SEQ. ID. n 11 = 5'-GATTTCATAATATTTCGGGTCGTTGGGCA GGGCGCTGTGCGGCGTGTTGGAGGTCCCGACGTAGAGAAACTGCA CTTGGACAGTACCGAGGGCAGTGTAATACATGTTGTGACCAGGCAC GGCAAGAAAGACTTCGCAGACGTAGGGAATGGATAAAAAGAAACG ATTCCACAACATAGGAGGACAGGTGGACAGGACGTTGCATAGCAT GTTGGAGAAGACCTCGTACTGAAACC CAAGTGTAGTTA GTTAGTAT AACTAAGGGCGTAACCGAAATCGGTTGA(CTCGAG)ACCGGTTAGTA TAAAAGCAGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAG GACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAG CTAAAAACGACGATTTCACAACCATAGCTGGGCACT(CTCGAG)GCC AGTGCCATTCGTGCTGCAACCGAGCACGACAGGAACGACTCCAACG ACGCAGAGGTTGCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGT(CTC GAG) TTAAGAGTAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTC TCCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGC AGCTCCCATGAGTTTGG-3'