FR 2879623 A1 20060623 FR 0413423 A 20041216 2879623 1 La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide comprenant une séquence de formule (I) : - TGACCTNOGGGCT- , dans laquelle N représente n'importe quel base nucléotidique naturelle ou de synthèse et O représente une base A, T ou U, caractérisée en ce que ladite séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) permet l'interaction sélective dudit polynucléotide avec un ou plusieurs éléments constitutifs du complexe de transcription PPARa. PPAR (en anglais:"Peroxisome Proliferator Activated Receptor"), désigne une famille de facteurs de transcription appartenant à la classe des récepteurs aux hormones stéroïdes. Les récepteurs aux hormones stéroïdes régulent l'expression de nombreux gènes dont ceux impliqués dans la différenciation cellulaire et dans le métablolisme énergétique de la cellule. En particulier, ils régulent des voies de signalisation essentielles à la vie cellulaire, en assurant un certain équilibre des taux de lipides et de glucides circulant dans l'organisme [Berger J. and Moller DE (2002) Ann. Rev. Med. 53:409-35]. L'alimentation, ou plus précisément les nutriments peuvent modifier la transcription des gènes de différentes manières. Certains acides gras, tel l'acide linoléique, se lient directement aux facteurs de transcription en tant que ligands capable de réguler l'activité de PPAR. Certains glucides agissent au contraire de manière indirecte via des intermédiaires hormonaux, comme par exemple la production d'insuline, qui modifient PPAR et activent de ce fait la transformation du glucose en glycogène au niveau du foie par activation de l'expression de la glucokinase hépatique. PPAR est présent dans le corps humain sous forme de plusieurs structures protéiques. On distingue trois types de structures: PPAR alpha (foie, tractus digestif, reins...), PPAR gamma (tissu adipeux et macrophage...) et PPAR bêta ou delta (exprimés de façon ubiquitaire). Les facteurs de transcription de type PPAR, pour exercer leur activité transactivatrice, agissent sous forme d'un complexe hétérodimèrique PPARIRXR qui recrute d'autres protéines dont des co- activateurs. Sous l'influence de ligands plus ou moins spécifiques, le complexe PPARIRXR est activé. Le complexe PPARIRXR se fixe sur des séquences d'ADN particulières, 2879623 2 nommées PPRE (peroxysome proliferator activated receptor responsive element). Ces séquences font partie du promoteur des gènes cibles régulés par PPAR. La fixation de PPAR sur les séquences PPRE a pour effet de modifier la structure de la chromatine, ce qui déclenche la machinerie transcriptionnelle , autrement dit la transcription en ARN des gènes cibles de PPAR. Les séquences promotrices des gènes transcrits spécifiquement par les complexes PPARa, PPARy ou indifféremment par PPAR ou PPARy, sont qualifiées respectivement, dans le présent mémoire, de séquences PPREa, PPREy ou PPREa/y (séquences capables d'interagir à la fois avec PPARa et PPARy). A ce jour, les séquences PPRE décrites dans les banques de données fixent indifféremment tous les isoformes de PPAR [Berger J. and Moller DE (2002) Ann. Rev. Med. 53:409-35]. La spécificité d'action semble donc provenir essentiellement du ligand, du taux d'expression tissulaire des différentes composantes du complexe de transcription et de celui de ses éventuels partenaires (co-activateurs, co-répresseurs...). Des ligands permettant d'activer préférentiellement les complexes de transcription PPARa et PPARy, d'origines synthétiques ou naturelles, ont pu être identifiés et utilisés en tant qu'hypolipémiants et hypoglycémiants dans le traitement de certaines maladies métaboliques telles que les hypertryglycéridémies et le diabète de type Il. [Kersten S, Desvergne B, Wahlie W (2000) Nature 405:421-4]. On peut ainsi citer les ligands suivants: PPARa: fibrates tels que le fénofibrate et le bézafibrate (ligands de synthèse); PPARy: thiazolidinediones, telles que la rosiglitazone et la troglitazone (ligands de synthèse); En outre, certains polluants environnementaux, tels que les phtalates, les pesticides dérivés de l'acide phénoxyacétique, ont été identifiés pour être des ligands potentiels de facteurs de transcription de type PPAR [Maloney EK, Waxman DJ (1999) Toxicol. Appl. Pharmacol. 161:209-18]. L'identification de telles substances revêt donc une certaine importance dans le domaine de la toxicologie. 2879623 3 Concernant les ligands synthétiques de PPAR, il est essentiel de savoir si une nouvelle molécule en cours de développement est un agoniste spécifique de PPARa, PPARy, ou PPAR et PPARy. En effet, on considère à l'heure actuelle dans l'industrie pharmaceutique que les molécules à la fois agonistes de PPARa et de PPARy pourraient être d'un intérêt thérapeutique majeur puisqu'elles diminueraient d'une part le taux de triglycérides circulant (activation de PPARa) et d'autre part la résistance périphérique à l'insuline (activation de PPARy). De telles molécules pourraient s'opposer aux deux perturbations métaboliques majeures rencontrées, par exemple, dans le diabète de type II. Cependant, les premières molécules testées possédant ces propriétés présentent une toxicité trop importante. A ce jour, pour évaluer quel est le ou les isoformes de PPAR mis en jeu dans la réponse pharmaco-toxicologique d'une nouvelle molécule en développement, il est nécessaire de mettre en oeuvre toute une série d'expérimentations telles que: - Microarrays ou puces à ADN Expériences de liaison (en anglais: "binding") - Techniques de Gènes rapporteurs utilisant la séquence PPRE canonique... La technique des puces à ADN, permet de déterminer quels sont les gènes affectés après exposition à une molécule donnée. Après extraction des ARNm, ceux ci sont transformés en ADNc marqués. Ces derniers sont mis en contact sur une puce où ont été fixées des cibles spécifiques d'un certain nombre de gènes. Cette technique a pour avantage de s'adapter au screening, par contre elle demeure coûteuse et ne permet de mettre en évidence que des actions marquées (facteur deux d'induction ou d'inhibition) sans toute fois accéder à une connaissance des mécanismes moléculaires sous-jacents. Les expériences de liaison (en anglais: "binding"), quelle que soit la méthodologie utilisée, permettent d'analyser la fixation d'une molécule sur sa cible moléculaire et de déterminer son affinité. Ces expériences bien qu'applicables au screening, ne permettent pas de déterminer si la molécule se comporte comme un agoniste, un agoniste inverse, un agoniste antagoniste ou au contraire un antagoniste de la cible. 2879623 4 Les techniques de gènes rapporteurs consistent à évaluer l'activité régulatrice d'une séquence nucléique par son action sur l'expression d'un gène dit rapporteur. Ce gène rapporteur, n'est pas exprimé dans l'organisme étudié et son expression est facilement analysable et quantifiable. Cette technologie permet de savoir si une nouvelle molécule active la séquence étudiée. En revanche, elle ne permet pas de connaître spécifiquement le facteur de transcription impliqué. Toutes ces expériences prises isolément n'apportent aucune information directe sur la spécificité d'action que le nouveau ligand est capable 10 de conférer à PPAR. Les mécanismes par lesquels les ligands sont capables de conférer une spécificité aux complexes de transcription PPAR restent largement inexpliqués. Les séquences promotrices des gènes transcrits par PPAR sont pour la plupart connues et répertoriées [base de données GeneCards: http://bioinfo.weizmann.ac.il/cards/index.shtml}. Cependant, il est apparu que ces éléments ne permettaient par la différenciation des complexes de transcription PPARa et PPARy. Les inventeurs dans le cadre de la présente invention sont allés plus loin et se sont intéressés à des domaines secondaires des régions promotrices, distincts des éléments caractéristiques mentionnés ci-dessus. De manière inattendue, les inventeurs ont identifié de courtes séquences d'ADN dont le consensus est donné par la formule (I) - TGACCTNOGGGCT-, dans laquelle N représentant n'importe quelle base nucléotidique et O représentant une base A, T ou U, lesquelles séquences sont capables d'interagir plus spécifiquement avec le complexe de transcription PPARa, qu'avec le complexe PPARy. II est même apparu que ces courtes séquences étaient essentielles à la transcription de certains gènes cibles de PPARa, et qu'elles pouvaient être utilisées pour discriminer l'activité de transcription du complexe PPARa par rapport à PPARy. Sur la base de ces résultats, il est apparu que des polynucléotides 2879623 5 incluant la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) tels que décrits ci-après, pouvaient être utilisés dans des procédés et des kits permettant de caractériser l'activité de transcription de PPAR. Ces utilisations permettent en particulier d'identifier de nouveaux composés (séquences d'ADN ou ligands) capables d'interagir avec PPAR, et améliorent ainsi le diagnostique et le traitement des maladies métaboliques liées à une modification de l'activité de PPAR. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un polynucléotide comprenant i) une séquence de formule générale (I) : - TGACCTNOGGGCT- dans laquelle A, C, G et T désignent respectivement les bases adénine, cytosine, guanine et thymine, N représente une base nucléotidique naturelle ou synthétique quelconque et O représente une base qui est A (adénine), T (thymine) ou U (uracile); ou ii) une séquence complémentaire de (I) telle que définie sous i), ladite séquence (I) ou complémentaire de (I) permettant l'interaction sélective 20 dudit polynucléotide avec un ou plusieurs éléments constitutifs du complexe de transcription PPARa, ladite utilisation a pour but d'évaluer directement l'activité de transcription de PPAR, en particulier lorsqu'il se trouve sous la forme PPARa, et indirectement l'activité de transcription de PPARy. On entend par activité de transcription le fait que la séquence codante d'un gène soit transcrite sous forme d'ARN. Dans le cas présent, la transcription s'effectue grâce à un complexe de transcription, lequel comprend le facteur de transcription PPAR associé à un certain nombre d'éléments annexes constitutifs, tels que des protéines auxiliaires et des ligands. Ces éléments annexes déterminent la spécificité, voire la sélectivité, du complexe de transcription. PPARa correspond à une isoforme de la famille PPAR. Celui-ci a 2879623 6 la capacité d'activer, au sein du complexe de transcription PPARa, la transcription d'un ensemble de gènes qualifiés de "gènes sous contrôle de PPARa". Une séquence de formule (I) préférée selon l'invention est celle 5 présentée dans le présent mémoire sous la référence SEQ ID N 1 (SEQ ID N 1) 5' TGACCTCAGGGCT 3' Un polynucléotide est utilisable selon l'invention également lorsqu'il comprend la séquence inverse complémentaire de (I) dans les deux orientations possibles (5'->3' ou 3'->5'), c'est le cas par exemple la SEQ ID N 2 suivante qui est la séquence complémentaire inverse de SEQ ID N 1: (SEQ ID N 2) 5' AGCCCTGAGGTCA 3' De manière préférentielle, on utilisera aux fins de l'invention un polynucléotide correspondant à l'une des séquences nucléotidiques suivantes SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, SEQ ID N 6, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 17 et SEQ ID N 18: GGCCTTCCGGCCCCGTGACCTCAGGGCTGGGGTCGCAG (SEQ ID N 3) CCGGAAGGCCGGGGCACTGGAGTCCCGACCCCAGCGTC (SEQ ID N 4) GGCCTTCCGGCCCCGTGACCTCTGGGCTGGGGTCGCAG (SEQ ID N 5) CCGGAAGGCCGGGGCACTGGAGACCCGACCCCAGCGTC (SEQ ID N 6) TCCGGCCCCGTGACCTCAGGGCTGGGGTCGCAG (SEQ ID N 7) AGGCCGGGGCACTGGAGTCCCGACCCCAGCGTC (SEQ ID N 8) TCCGGCCCCGTGACCTCTGGGCTGGGGTCGCAG (SEQ ID N 9) AGGCCGGGGCACTGGAGACCCGACCCCAGCGTC (SEQ ID N 10) GGCCTTCCGGCCCCGTGACCTCAGGGCTGGGGTCGCAGC (SEQ ID N 17) GCTGCGACCCCAGCCCTGAGGTCACGGGGCCGGAAGGCC (SEQ ID N 18) On entend par "interaction sélective" le fait qu'un rapprochement physique de la séquence d'ADN de formule (I) avec un ou plusieurs éléments 2879623 7 du complexe de transcription PPAR, permet une modulation de la transcription affectant exclusivement la transcription des gènes habituellement régulés par PPARa. On parle également d'interaction sélective lorsqu'un polynucléotide tel que défini ci-dessus se fixe avec ou retient physiquement directement ou indirectement un ou plusieurs éléments constitutifs du complexe de transcription PPARa, ou un ligand de celui-ci. Certaines expériences ont permis d'établir que la séquence de formule (I), en particulier SEQ ID N 1, agissait en tant qu'élément de type "enhancer", c'est-à-dire un élément permettant d'augmenter l'intensité de la transcription via PPAR. Ce type d'élément interagit positivement avec un ou plusieurs éléments fonctionnels du complexe de transcription et ce indépendamment de sa localisation précise par rapport au site d'initiation de la transcription. La séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) peut ainsi se trouver ou être insérée théoriquement à n'importe quel endroit d'un polynucléotide, quelque soit sa taille et son orientation. Le polynucléotide selon l'invention peut être un ADN mono brin ou pluricaténaire. En général, un polynucléotide selon l'invention compte au moins 13 nucléotides, de préférence au moins 20, et plus préférentiellement au moins 30 nucléotides. Un polynucléotide utilisable selon l'invention peut comprendre, en plus de la séquence de formule (I) et complémentaire de (I), d'autres séquences nécessaires à la mise en évidence d'une activité de transcription [Biologie Moléculaire et Médecine, Kaplan JC et Delpech M, Ed Médecine-Sciences Flammarion ISBN: 2-257-12488-X], tel qu'un site d'initiation de la transcription (promoteur basique). Ainsi, le polynucléotide dont l'utilisation est décrite plus haut, peut comprendre, en plus de la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I), une séquence supplémentaire de type PPRE, c'est-à-dire une séquence d'ADN capable d'interagir avec un complexe de transcription de type PPAR, en particulier une séquence de type PPREa ou PPREa/y. Ledit polynucléotide peut également comprendre, la séquence 2879623 8 d'un gène dont la transcription est habituellement placée sous le contrôle de PPAR, ou bien seulement la séquence promotrice de ce gène. Ledit polynucléotide peut également comprendre la séquence d'un gène rapporteur. La transcription de la séquence codante dudit gène rapporteur peut, selon les cas, se trouver placée sous contrôle d'une séquence de type PPREa ou PPREa/y ou bien en fusion avec le promoteur d'un gène sous contrôle de PPARa, PPARy ou PPARa/y. Selon une utilisation préférée de l'invention, la transcription de la séquence codante du gène rapporteur se trouve sous contrôle total ou partiel d'un polynucléotide comprenant une séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) telle que décrite précédemment. En général, le complexe de transcription PPAR interagit avec la séquence (I) ou complémentaire de (I) en présence d'un ligand spécifique de celui-ci. De préférence la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) se trouve à une distance comprise entre 40 et 300 paires de bases, plus préférentiellement entre 50 et 150, en amont d'un site d'initiation de la transcription. La séquence de formule (I) et/ou complémentaire de (I) peut être insérée dans la partie promotrice d'un gène afin que la transcription de ce gène soit placé sous contrôle du complexe PPARa. La séquence promotrice du gène acquiert dans ce cas les propriétés d'une séquence de type PPREa. Un autre objet de l'invention consiste en un vecteur d'expression comprenant au moins une séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) telle que définie précédemment et un gène rapporteur. Un autre objet de l'invention consiste en une cellule hôte transformée à l'aide d'un des vecteurs définis ci-dessus. Une telle cellule hôte peut servir de système biologique d'évaluation qualitative et quantitative de l'activité de transcription de PPAR. Les gènes rapporteurs utilisés, selon la cellule hôte choisie pour leur expression, peuvent être par exemple: - le gène de la Chloramphénicol Acétyl Transférase; 2879623 9 le gène de la Luciférase; le gène de la Green Fluorescent Protein; le gène de la f3-galactosidase; Le gène SEAP (SEcreted Alkaline Phosphatase); Le gène ZsGreen; Le gène GAL 4 (dans le cas d'un système indirecte GAL4-UAR dans des cellules eucaryotes) Parmi les vecteurs pouvant être employés aux fins de transfécter ce système rapporteur dans des cellules procaryotes ou eucaryotes, on peut citer: des plasmides tel que psG3, psG5, pBLCAT2, pCATpromoter, pSEAP2-control, pEGFP-1, pHRed1-1, pECFP-1, pCMV-DsRed- Express - des phages tel que le phage lambda; des adénovirus tel que pDNR- CMV, pShuttle2 ou pTRE-Shuttle2; des rétrovirus tel que Plp-LNCX... Différents modèles cellulaires peuvent être envisagés en tant que cellules hôtes. Certaines cellules comme les procaryotes et les levures n'expriment pas naturellement PPAR et RXR. Il est donc nécessaire, au préalable, de les transformer avec les ADNc codant pour PPAR et RXR. Les bactéries pouvant être utilisées à cet effet sont par exemple deux clones d'Escherichia coli BL21 et JM83, et, pour ce qui concerne les levures, divers clones de Saccharomyces cerevisiae. Certains insectes expriment RXR (gène Usp) mais pas PPAR, il est donc nécessaire dans ce cas de les transfécter avec les ADNc codant pour PPAR. Parmi les cellules d'insectes pouvant convenir, on peut citer par exemple, les lignées cellulaires de Drosophila melanogaster S2 et Sf21. Les cellules de mammifères, notamment de rongeurs (préadipocyte murin 3T3-L1...), expriment à la fois PPARa et RXRa. Cependant, la spécificité de ligand pour PPAR peut varier en fonction des espèces. Il faudra donc au préalable la vérifier, avant d'extrapoler les résultats à l'homme. Les cellules d'origine humaine sont des hôtes de choix, 2879623 10 notamment celles exprimant à des taux importants PPARa telles que les adipocytes (cellules en culture primaire...) et les entérocytes (CaCo-2, HT29...). La transfection de ces cellules par de l'ADNc codant pour PPARa permet d'augmenter la sensibilité. Dans le cadre d'une application pour le criblage haut débit, il est recommandé d'utiliser préférentiellement des cellules adhérentes cultivées dans des plaques multi-puits. Un polynucléotide utilisable selon l'invention peut être obtenu de différente manière. A l'origine, la séquence SEQ ID N 1 a été caractérisée à partir d'un gène humain. Les polynucléotides selon l'invention peuvent cependant être reproduits par synthèse chimique directe et programmée ou bien clonés dans un vecteur afin d'être répliqué dans une cellule hôte transformée. Un autre moyen d'obtenir un polynucléotide selon l'invention est d'amplifier une séquence PPREa d'intérêt par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) à partir d'une préparation d'ADN. La présente invention, se base sur les propriétés d'interaction particulières que possède la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) pour le complexe PPARa, en particulier des propriétés de liaison physique. Ces propriétés non décrites auparavant permettent de caractériser une activité de transcription de type PPAR, et plus particulièrement permettent de discriminer une activité de transcription de type PPARa par rapport à PPARy. Une utilisation selon l'invention permet ainsi de différencier une activité de transcription de type PPARa, en présence d'autres types d'activité transcriptionnelle. Une utilisation selon l'invention permet ainsi de détecter une activité de transcription de type PPARa dans un milieu biologique donné. Cela permet en outre de pouvoir caractériser de nouvelles séquences de type PPRE, lesquelles peuvent avoir été identifiées, par exemple, dans une préparation d'ADN génomique. L'évaluation de l'activité de transcription de PPAR peut être réalisée selon l'invention, suivant différentes modalités décrites ci- après: Un polynucléotide tel que décrit plus haut est utilisable selon l'invention en tant que sonde d'hybridation, par exemple, dans le but de détecter 2879623 11 de nouvelles séquences PPRE dans une préparation d'ADN, contenant en particulier de nouvelles séquences PPREa. De même, un polynucléotide tel que décrit plus haut peut être utilisé selon l'invention pour diagnostiquer des anomalies génétiques pouvant être à l'origine de maladies métaboliques, en particulier de maladies liées à une dérégulation de l'expression de gènes sous contrôle de PPAR, et plus particulièrement de maladies liées à une modification de l'activité transcriptionelle de PPAR, telle que l'hypertryglycéridémie, le diabète de type II ou des lipodystrophies. Un polynucléotide tel que défini plus haut peut être utilisé pour doser un complexe de transcription PPAR, de préférence PPARa, ou un de ses éléments constitutifs, dans un échantillon biologique, en utilisant plus particulièrement les propriétés d'adhésion rencontrées entre ledit complexe et la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I). Le dosage peut s'effectuer de la manière suivante: 1) fixation sur une phase solide d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1; 2) mise en contact d'un échantillon dans lequel PPARa ou un élément constitutif du complexe PPARa est à quantifier; 3) quantification de PPARa ou de l'élément constitutif du complexe PPARa retenu par lesdits polynucléotides par une méthode d'analyse conventionnelle. Par "méthode conventionnelle d'analyse", on entend une méthode usuelle connue de l'homme du métier, lui permettant de déterminer la quantité 25 et le degré de pureté des composés fixés par le polynucléotide de l'invention, telle que, par exemple la chromatographie d'affinité. Plusieurs types de supports solides peuvent être envisagés tels que des microplaques, des billes magnétiques ou en polystyrène, des microparticules, des gels de chromatographie. Une technique de fixation préférée consiste à fixer les polynucléotides sur une microplaque à l'aide une liaison streptavidine/biotine. Selon les conditions expérimentales, il est possible de retenir des 2879623 12 composés capables de se lier avec le polynucléotide de l'invention. Une élution dans les conditions adaptées, permet la récupération des fractions les plus spécifiques et leur purification en vue d'identifier de nouveaux composés capables de prendre part potentiellement au complexe de transcription PPAR. Plus particulièrement, un polynucléotide tel que défini plus haut peut être utilisé pour identifier un ligand capable d'activer ou d'inhiber sélectivement le complexe de transcription PPARa. L'invention peut consister, par exemple, en un procédé permettant de mettre en évidence une interaction physique entre des facteurs de transcription et un polynucléotide tel que décrit plus haut. Ce procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: 1) marquage d'un polynucléotide utilisable selon l'invention; 2) mise en contact de PPARa/RXR et du polynucléotide marqué 3) détection des complexes moléculaires formés autour du polynucléotide marqué à l'aide de méthodes conventionnelles d'analyse, telles que, par exemple, le retard sur gel, ou bien à l'aide d'un Kit selon l'invention, décrit plus loin. Inversement la protéine PPARa peut être marquée, ainsi que les molécules qui lui sont associées afin de caractériser des séquences de type PPRE. L'invention peut alors consister en un procédé de détermination de la spécificité d'une séquence nucléotidique de type PPRE, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: 1) marquage du complexe formé par les protéines PPAR-RXR; 2) mise en contact du complexe PPAR-RXR marqué avec un polynucléotide tel que défini dans l'invention fixé sur un support; 3) ajout dans la phase libre d'une concentration de la séquence nucléotidique de type PPRE dont on cherche à déterminer la spécificité; 4) détection des complexes moléculaires formés autour du complexe PPAR-30 RXR marqué. Le marquage du polynucléotide, de PPAR (ou des protéines associées à PPAR), aux fins de la détection, peut être radioactif (32P, 33P...), 2879623 13 immuno-enzymatique (sondes froides...), chimique (Bromure d'éthidium...) ou être encore réalisé selon toute autre technique connue de l'homme du métier. On considère ici qu'un composé est susceptible d'interférer avec l'activité de transcription de PPAR lorsqu'il se lie à la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) ou bien lorsqu'il se lie à un des éléments constitutifs du complexe de transcription de PPAR. Une méthode conventionnelle préférée pour évaluer les complexes formés autour de PPAR est la technique de retard sur gel, (en anglais EMSA: Electrophoretic Mobility Shift Assay) [Biologie Moléculaire et Médecine, Kaplan JC et Delpech M, Ed Médecine-Sciences Flammarion ISBN: 2257-12488-X]. La technique de gel retard consiste à faire migrer en électrophorèse les complexes formés ou non entre les facteurs de transcription et les séquences d'ADN cible, de sorte à pouvoir les comparer en fonction de leur distance électrophorétique sur un gel. Cette technique est utilisée idéalement pour des polynucléotides de 15 à 80 nucléotides, de préférence entre 20 et 50 nucléotides. La présence d'un site PPREa unique et un micro environnement permet de minimiser au maximum les interférences possibles avec d'autres facteurs de transcription. Il est possible, pour améliorer un des procédés décrits ci-dessus, de pratiquer, en outre, des tests immunologiques, et notamment d'utiliser des anticorps anti-PPARa. Ces tests permettent de confirmer la nature des éléments interagissant avec les polynucléotides utilisables selon l'invention. Pour l'ensemble des procédés décrits ci-dessus, il est recommandé d'utiliser en tant que témoin un polynucléotide, dans lequel la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) a été mutée ou a subi une délétion. Un polynucléotide témoin selon l'invention peut consister, par exemple, en les séquences SEQ ID N 11, SEQ ID N 12, SEQ ID N 19 et SEQ 30 ID N 20. De même, il peut être utile d'utiliser à titre de comparaison des polynucléotides présentant une spécificité différente pour le complexe PPAR, 2879623 14 consistant, par exemple, en des séquences de type PPREy ou PPREa/y. Les propriétés d'activation de la transcription conférées par la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) permettent d'évaluer l'activité de transcription de PPAR, plus particulièrement de PPARa, en présence de certains composés ou mélange de composés. L'invention peut ainsi consister en un procédé de mise en évidence, via une cellule-hôte, de composés capables d'augmenter ou de diminuer l'activité de transcription de PPARa, consistant à placer un gène rapporteur sous le contrôle d'une ou plusieurs séquences PPRE, en particulier PPREa et de comparer les profils d'expression obtenus en présence de différents composés ou mélange de composés. Cette technique permet, par exemple, de tester l'incidence d'un composé ou d'un mélange de composés sur l'interaction de PPAR sur lesdites séquences de type PPRE. L'invention peut également consister à mettre en évidence des composés capables d'augmenter ou de diminuer l'activité de transcription de PPARa à l'aide d'un système d'expression comprenant un gène rapporteur. Ceprocédé consiste en les étapes suivantes: 1) transformation d'une cellule hôte à l'aide d'un polynucléotide utilisable selon l'invention comprenant une séquence PPREa et un gène rapporteur; 20 2) mise en culture de la cellule hôte obtenue à l'étape 1); 3) mise en contact de la cellule hôte cultivée à l'étape 2) avec le composé ou le mélange de composés à tester; 4) détection de l'expression du gène rapporteur. De préférence, le gène rapporteur est placé sous le contrôle de PPARa, mais il est possible également d'utiliser un système à deux composants de type GAL4/UAR dans lequel le gène rapporteur est indirectement placé sous le contrôle de PPARa. L'expression du gène rapporteur est détecté selon la technique la mieux adaptée (dosage enzymatique, quantification de protéine, dosage immunologique etc...), en fonction de la nature du produit exprimé. Selon que le niveau d'expression du gène rapporteur est élevé ou faible, il est établi si le composé ou le mélange de composé exerce une influence positive ou négative 2879623 15 sur le complexe PPAR et si cette influence présente un caractère sélectif, par exemple, vis-à-vis de PPARa. En complément de ce procédé, une cellule hôte témoin peut être transformée à l'aide d'un polynucléotide de contrôle tel que défini précédemment, incapable d'interagir avec PPAR, du fait que la séquence de formule (I) a été mutée, ou a subi une délétion. Il est alors possible de comparer les résultats obtenus entre la cellule hôte témoin et la cellule hôte sensible à PPARa. Un tel procédé comprend les étapes suivantes: 1) transformation d'une cellule hôte à l'aide d'un polynucléotide utilisable selon l'invention comprenant une séquence PPREa et un gène rapporteur; 2) transformation d'une cellule hôte témoin à l'aide d'un polynucléotide témoin tel que défini plus haut, c'est-à-dire un polynucléotide utilisable selon l'invention, dans lequel la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) a été mutée ou a subi une délétion; 3) mise en culture des cellules hôtes obtenues aux étapes 1) et 2); 4) mise en contact des cellules hôtes cultivées avec le composé ou le mélange de composés à tester; 5) détection de l'expression du gène rapporteur; II est en outre possible de moduler une activité de transcription de manière hétérologue en insérant un polynucléotide utilisable selon l'invention au niveau du promoteur d'un gène dans un vecteur ou bien un organisme transgénique, Cette insertion doit permettre de placer la transcription dudit gène sous le contrôle du complexe PPARa. La séquence promotrice ainsi créée présente alors les caractéristiques principales d'une séquence de type PPREa telle que définie plus haut. II est à noter que les polynucléotides correspondants à SEQ ID N 7, 8, 9 et 10 sont utilisés plus préférentiellement pour les procédés de retard sur gel ou utilisant un support solide et que les polynucléotides correspondants à SEQ ID N 3, 4, 5 et 6 sont utilisés plus préférentiellement pour les procédés décrits ci-dessus utilisant un gène rapporteur. Un autre aspect de l'invention consiste en un kit utilisant les 2879623 16 propriétés d'interaction entre les polynucléotides tels que décrits plus haut et le complexe PPAR, en particulier PPARa, permettant notamment de caractériser les interactions entre des séquences polynucléotidiques de type PPRE et les complexes de transcription de type PPAR. Un kit selon l'invention utilise au moins un polynucléotide tel que défini dans l'invention, et de manière optionnelle, à une ou plusieurs séquences polynucléotidiques de type PPREy et PPREa/y, permettant ainsi de comparer de manière simultanée les différents types d'interactions pouvant exister entre les différents types de séquences de type PPRE et PPAR. Le principe général d'un kit selon l'invention est de mettre en contact les polynucléotides précités avec une préparation de protéines purifiées PPAR et RXR, puis de détecter les complexes formés préférentiellement entre lesdites protéines et les séquences polynucléotides définies plus haut. Selon un mode préféré de kit selon l'invention, les polynucléotides sont fixés sur un support pouvant se présenter, pour les besoins du criblage haut débit, sous la forme de puits, de tube ou de billes. Selon un autre mode préféré au moins une des protéines PPAR et RXR ou séquence nucléotidique présente dans le kit peut être marquée pour les besoins d'une détection des complexes d'interaction formés. On entend par "complexe d'interaction" l'ensemble formé par le complexe de transcription PPAR et le polynucléotide auquel il se trouve fixé (PPAR+PPRE). Une variante préférée d'un kit selon l'invention consiste en un kit de criblage haut débit permettant de mettre en évidence la fixation d'un ligand 25 spécifique de PPAR. Selon une variante du kit, les polynucléotides fixés sur un support et les protéines PPAR-RXR sont mises en contact en présence d'un substrat spécifique marqué du complexe PPARa, PPARy ou PPARa/y. On entend par substrat spécifique une molécule chimique naturelle ou de synthèse qui est connue comme étant ligand d'un ou de plusieurs des membres de la famille PPAR. Lorsque les complexes d'interaction PPAR-PPRE et le substrat 2879623 17 spécifique marqué se sont formés, une molécule à tester, de préférence un ligand potentiel de PPAR, est introduite dans le milieu réactionnel. Si cette molécule est de nature à agir en tant que ligand d'une forme particulière de PPAR, comme PPARa, il se produit alors un déplacement par la molécule à tester de l'équilibre de liaison existant entre le substrat spécifique marqué et les protéines PPAR-RXR au sein du milieu réactionnel. La quantification de la molécule marquée dans la phase libre ou liée du système reflète le degré d'interaction de la molécule à tester avec le complexe PPAR/RXR. Selon une autre variante du kit, l'activité de PPAR peut être déterminée, par exemple, dans un extrait de protéines extraites du noyau d'une cellule préalablement traitée. Les protéines PPAR et RXR sont mises en contact avec au moins un polynucléotide, comme précédemment décrit (PPAR ou RXR étant de préférence marquée), dans les conditions permettant la fixation de PPAR-RXR sur les séquences des polynucléotides, plus particulièrement une séquence de formule (I) ou complémentaire de (I). Différentes dilutions de l'extrait de protéines nucléaires à tester sont alors incubées en présence des complexes d'interaction formés. Selon que les protéines contenues dans l'extrait sont capables de se lier à une séquence nucléotidique de type PPRE, comme par exemple PPREa, il se produit ou non un déplacement partiel ou total du complexe PPAR/RXR marqué vers les séquences de formule (I). La quantification du marquage libre ou lié permet d'indiquer si l'extrait nucléaire contient des PPAR capables de se fixer sur une séquence particulière PPRE, telle PPREa. Selon une autre variante du kit, il est possible d'établir si une séquence PPRE est de type PPREa, PPREy ou PPREa/y. Des séquences PPRE de spécificité connue, telles que des polynucléotides comprenant une séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) sont mises en contact avec une préparation de protéines PPAR-RXR préalablement marquées, de sorte à former des complexes PPRE/PPAR-RXR. La séquence PPRE potentielle dont on cherche à tester la spécificité est alors ajoutée dans le milieu réactionnel. Le principe est de mettre la séquence PPRE de spécificité inconnue en compétition avec les séquences de PPRE de spécificité connue, dans leur 2879623 18 liaison avec PPAR. Si l'affinité des protéines PPARRXR pour la séquence PPRE testée dans le milieu est importante, l'équilibre de liaison initial apparu, par exemple, entre le complexe PPARa et les polynucléotides de type PPREa se modifie. II est dans ce cas établi, que la séquence PPRE présente une affinité supérieure ou équivalente pour PPARa à la séquence connue de type PPREa utilisée. Comme pour les autres variantes du kit, le marquage d'une des protéines du kit permet de détecter les modifications au sein des complexes d'interaction. Ainsi, un kit selon l'invention comprend généralement au moins: une préparation d'au moins un polynucléotide utilisable selon l'invention, liant sélectivement PPARa; une préparation des protéines purifiées PPARRXR dont un des membres au moins est marqué; - un moyen de détection des complexes moléculaires marqués On entend par moyen de détection des complexes d'interaction toute possibilité technique permettant de mettre en évidence une variation des interactions entre les polynucléotides utilisés et les protéines PPAR-RXR et entre les protéines PPAR-RXR et un ligand. Cette possibilité technique passe, par exemple, par la fourniture dans le kit de molécules marquées radioactivement ou chimiquement, de substrats, de réactifs ou d'enzymes permettant de révéler le marquage des molécules présentes dans les complexes d'interaction, de produits permettant la séparation physique des molécules tels que des gels d'électrophorèse, des gels de chromatographie, des billes magnétiques ou des réactifs de précipitation. Un kit selon l'invention peut comporter en outre un polynucléotide témoin tel que défini plus haut dans lequel la séquence de formule (I) est mutée ou a subi une délétion, ainsi que des séquences de type PPREy ou de type PPREa/y, utiles à la caractérisation de l'activité du complexe de transcription de type PPAR. Un kit selon l'invention peut comprendre, en outre, un moyen de 2879623 19 support des polynucléotides précités, tels que des cupules, des puits, des tubes ou des billes. Un kit selon l'invention peut comprendre également un ou plusieurs substrats spécifiques des différents isoformes de PPAR et/ou de RXR, et différentes séquences spécifiques ou non des différents isoformes de PPAR. Selon un autre aspect de l'invention, un polynucléotide tel que défini plus haut peut encore être utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une maladie métabolique, plus particulièrement une maladie liée à une modification de l'activité de PPAR, telle que l'hypertryglycéridémie et le diabète de type II ou des lipodistrophies. Un tel médicament peut comprendre, en particulier des polynucléotides utilisables selon l'invention en tant qu'ADN anti-sens ou sous la forme de siRNA (une structure dite en épingle à cheveu sera alors recommandée), ayant pour effet d'inhiber l'interaction de PPAR avec la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) ou bien servir de leurre pour PPARa. Les figures et exemples qui suivent ont pour but d'illustrer l'invention, ils ne sauraient constituer une quelconque limitation des revendications. FIGURE 1: Comparaison de séquence PPREa entre diverses espèces (rat, homme, souris). Il s'agit des séquences promotrices du gène CYPA1 séquencées chez le rat, l'homme et la souris. Chacun de ces promoteurs comprennent une séquence de formule (I) indiquée en gras. Ces résultats montrent que les séquences de formule (I) ont été conservées d'une espèce à l'autre au cours de l'évolution. FIGURE 2: Procédé de mise en évidence d'un composé activant spécifiquement le complexe de transcription PPAR. Le procédé consiste à transformer une cellule hôte apte à exprimer un gène rapporteur avec un 2879623 20 vecteur comprenant ledit gène rapporteur placé sous la dépendance d'un promoteur PPAR-dépendant (construction N 2) ou bien d'un promoteur PPARa-dépendant comprenant un polynucléotide selon l'invention (construction N 1). Les résultats obtenus à l'aide des constructions N 1 et N 2 selon la spécificité du ligand testé (PPARa ou PPARa/y) sont rapportés dans le tableau 1 ci-dessous. La molécule X1 exerce son action via PPARa et/ou PPARy (absence de sélectivité du ligand X1) contrairement à la molécule X2 qui agit uniquement via PPARy (sélectivité du ligand pour PPARy). Construction Traitement Gène rapporteur N 1 Ligand de PPARa +++ N 2 Ligand de PPARa +++ N 1 Ligand de PPARy - N 2 Ligand de PPARy +++ N 1 X1 +++ N 2 X1 +++ N 1 X2 - N 2 X2 +++ FIGURE 3: Effet d'un ligand de PPARa ou PPARy sur l'induction de l'expression du gène CAT. Le promoteur d'un gène contenant à la fois les sites PPREa et PPRE consensus (a/y) a été traité par le WY-14643 à 200 pM. Ce promoteur a été muté au niveau du site PPREa (PPREamut) et/ou du site PPREconsensus (PPREconsmut). L'histogramme montre le niveau d'expression du gène rapporteur dans les différentes situations (et du témoin C). Cette expérience montre que le ligand utilisé est sélectif de PPARa. FIGURE 4: Expérience de retard sur gel impliquant une séquence PPRE consensus et une séquence PPREa correspondant à un polynucléotide utilisable selon l'invention. Les protéines PPARa et RXRa ont été préparées 2879623 21 selon le protocole décrit dans l'exemple 2. Selon la position de migration des complexes marqués sur le gel d'électrophorèse, il est possible de déduire si l'interaction est spécifique (S: Shift; SS: Super Shift) ou non spécifique (NS). Les interactions étudiées sont les suivantes: 1: PPRE consensus (témoin) 2: TNT (témoin) + PPRE consensus 3: PPRE consensus (témoin) + RXRa 4: PPREconsensus + PPARa 5: RXRa + PPARa + PPREconsensus 6: RXRa + PPARa + PPREconsensus + anticorps spécifique de PPARa 7: PPREa (témoin) 8: TNT + PPREa (témoin) 9: PPREa + RXRa 10: PPREa + PPARa 11: PPREa + PPARa + RXRa 12: PPREa + PPARa + RXRa + anticorps sélectif de PPARa Cette expérience comparative montre que le complexe PPARa se lie préférentiellement à la séquence PPREa utilisée selon l'invention. FIGURE 5: Expérience comparative de retard sur gel impliquant une séquence PPRE consensus marquée avec, en compétition, une séquence PPRE consensus non marquée, une séquence PPREa utilisable selon l'invention non marquée, des séquences PPREa/y et PPREa mutées, lesdites séquences non marquées étant utilisées à des concentrations représentant 50 ou 10 fois la concentration des séquences marquées. 1: PPRE marquée (témoin) 2: PPRE marquée + TNT (témoin) 3: PPRE marquée + RXRa (témoin) 4: PPRE marquée + PPARa (témoin) 5: PPRE marquée + RXRa + PPARa (témoin) 2879623 22 6: PPRE marquée + RXRa + PPARa + compétiteur PPRE consensus (50 fois) 7: PPRE marquée + RXRa + PPARa + compétiteur PPRE consensus (10 fois) 8: PPRE marquée + RXRa + PPARa + compétiteur PPRE a/y (50 fois) 9: PPRE marquée + RXRa + PPARa + compétiteur PPRE a/y (10 fois) 10: PPRE marquée + RXRa + PPARa + compétiteur PPREa (50 fois) 11: PPRE marquée + RXRa + PPARa+ compétiteur PPREa (10 fois) 12: PPRE marquée + RXRa + PPARa + compétiteur PPRE a/y muté (50 fois) 13: PPRE marquée + RXRa + PPARa + compétiteur PPREa muté (50 fois) 14: PPRE marquée + RXRa + PPARa + anticorps spécifique de PPARa Cette expérience montre que PPREa forme un compétiteur plus actif que PPREconsensus. FIGURE 6: Expérience de retard sur gel mettant en évidence la non fixation de PPARy sur la séquence PPREa. Les réactions testées consistent en les suivantes: 1: TNT + PPRE consensus 2: TNT + RXR + PPRE consensus 3: TNT + RXR + PPARa + PPRE consensus 4: TNT + RXR + PPARy + PPREconsensus 5: TNT+PPRE a/y 6: TNT + RXR + PPRE a/y 7: TNT + RXR + PPARa + PPRE a/y 8: TNT+ RXR+ PPARy+ PPRE a/y 9: TNT + PPREa 10: TNT + RXR + PPREa 11: TNT + RXR + PPARa + PPREa 12: TNT + RXR + PPARy + PPREa Cette expérience montre la sélectivité de séquences PPREa selon 30 l'invention vis-à-vis du complexe de transcription PPARa, par rapport à PPARy. 2879623 23 EXEMPLE 1 Utilisation d'un polynucléotide utilisable selon l'invention pour l'activation d'un gène rapporteur Le plasmide pRNH25c d'expression du gène rapporteur CAT est sous la dépendance du promoteur du gène CYP1A1 humain a été utilisé. Cette construction a été généreusement donnée par le Dr Hines (Hines RN, Mathis JM and Jacob CS; 1988, Carcinogenesis, vol 9, pages 1599-1605). Le promoteur du gène CYP1A1 humain contient la séquence caractérisée comme étant spécifique de PPARa comprenant la séquence de formule (I) (site PPREa). Des mutations de la séquence de formule (I) ont été réalisées à même le plasmide pRNH25c via une technique de mutagenèse dirigée permettant de modifier une ou plusieurs bases (Kit Quickchange Site- Directed Mutagenesis de Stratagene ) et modifier les sites PPREa et PPREa/y (commun aux différents membres de PPAR) présents sur le promoteur du CYPIA1. Le protocole utilisé est celui conseillé par le concepteur du kit: 1 Génération de la mutation par PCR 50 ng de pRNH25c 1,25 pl d'une solution à 100 ng/pl d'amorce oligonucléotidique sens contenant la mutation 1,25 pI d'une solution à 100 ng/pl d'amorce oligonucléotidique antisens contenant la mutation - 5pl de tampon 10 X reaction buffer 1 pI de Pfu Turbo DNA polymérase (2,5 unités par pl) H2Ogsp50pl Cycle de PCR: 1 cycle à 95 C pendant 3 minutes puis 18 cycles comprenant les étapes successives 95 C pendant 30 secondes 2879623 24 57 C pendant 1 minute 72 C pendant 15 minutes Les amorces utilisées pour la mutation du site PPREa sont les suivantes: PPREa mut sens: 5'GGCCTTCCGGCCCCGTGAATTCAGGGCTGGGGTCGCAGC3' (SEQ ID N 11) PPREa mut- antisens: 5'GCTGCGACCCCAGCCCTGAATTCACGGGGCCGGAAGGCC3' (SEQ ID N 12) Les amorces utilisées pour la mutation du site PPREa/y sont les suivantes: PPREa/y mut-sens: 5'GGACGGGCCGCCTGACCTCGATCCCCTAGAGGGATGTCG3' (SEQ ID N 13) PPREa/y mutantisens: 5'CGACATCCCTCTAGGGGATCGAGGTCAGGCGGCCCGTCC3' 15 (SEQ ID N 14) Dans les deux cas, les bases en gras et soulignées correspondent aux bases mutées. Dans un premier temps, le site PPREa, a été muté permettant d'obtenir la construction PPREa./y + PPREamut . Cette dernière construction a par la suite été mutée pour obtenir la construction PPREa/y mut + PPREa mut . 2 Diqestion du produit de PCR Le produit de PCR (50 pl) est alors soumis à une digestion enzymatique médiée par 1 pl de Dpn 1 (10 unités/pl). L'endonucléase Dpn I est spécifique de l'ADN méthylé et hemi- méthylé. Ainsi, cet enzyme digérera la matrice parentale par rapport à l'ADN néo-synthétisé par PCR (ADN non méthylé). 3 Liqation des produits de PCR La digestion réalisée, l'ADN néosynthétisé est soumis à une ligation au moyen de l'enzyme T4 DNA ligase selon le protocole suivant: 51 pl de produit de PCR digéré 6 pl de 10 X Ligase buffer - 2 pl de T4 DNA ligase - 1 pl H2O Ligation à 15 C durant 15 heures 4 Transformation bactérienne Le plasmide muté ainsi obtenu est utilisé pour transformer des bactéries Epicurial Coli XL1-Blue Supercompetent Cells fournies dans le Kit. l pl d'ADN digéré par Dpn 1 et ligué pl de bactéries le tout est mélangé délicatement Incubation de 30 minutes sur glace Incubation de 45 secondes à 42 C Incubation de 2 minutes dans la glace Ajout de 0,5 ml de milieu de culture NZY+ (composition décrite dans le Kit) Incubation pendant 1 heure à 37 C sous agitation (225 à 250 rpm) Dépôt de 250 pl de ces bactéries transformées sur une boite de gélose LBAmpiciline-Agar pendant 18 heures Pour chaque construction, un clone est sélectionné et amplifié dans 2 ml de milieu de culture NZY+ renfermant 50 pg/ml d'ampiciline. Vérification des clones bactériens ainsi obtenus: La préparation de l'ADN plasmidial muté a été réalisée au moyen 25 du Kit NucleoBond PC 20 (Macherey Nagel), en se conformant aux recommandations du fournisseur. Une vérification sommaire des constructions PPREa/y + PPREamut et PPREaIy mut + PPREa mut a été réalisée par digestion enzymatique en utilisant l'enzyme de restriction Eco RI. Cette enzyme permet 30 de sortir le fragment correspondant au promoteur du CYPIAI, générant ainsi deux bandes sur gel d'agarose à 1% de 1.8 et 4.3 Kb. 2879623 26 6 Amplification des constructions PPREa/y + PPREamut et PPREa/y mut + PPREa mut Les clones bactériens transformées avec les constructions PPREa/y + PPREamut et PPREa/y mut + PPREa mut sont mises en culture à 37 C pendant 18 h sous agitation (225 à 250 rpm) dans 150 ml de NZY+ renfermant 50 pg/ml d'ampicilline. Les ADN plasmidiaux sont ensuite extraits au moyen du kit NucleoBond PC 500 (Macherey Nagel) en suivant le protocole High Copy du fabricant. Après dosage spectrophotométrique, les constructions PPREa/y + PPREamut et PPREa/y mut + PPREa mut ont été séquencées afin de vérifier la spécificité des mutations. 7 Transfection transitoire par lipofection des cellules CaCo-2 et détermination 15 du taux de protéine CAT ( Cat Assay ) Brièvement, la lignée d'adénocarcinome colique humain CaCo-2 a été ensemencée dans des boites 6 puits et cultivée dans un milieu renfermant du DMEM, 15 % de sérum de veau foetal, 2 mM de L-glutamine, 1% d'acides aminés nonessentiels (solution de MEM 100X de la société Life Technologies), 100 UI/ml de pénicilline et 100 pg/ml de streptomycine; dans une atmosphère renfermant 9% de CO2. Lorsque les cellules ont atteint 40-60% de confluence, elles ont été transfectées transitoirement par lipofection au moyen de Lipofectine (Invitrogen) selon les recommandations du fournisseur et avec 1 pg de construction (pRNH25C, ou PPREa/y + PPREamut , ou PPREa/y mut + PPREa mut ). 48 heures après la transfection, les cellules ont été traitées pendant 48 h avec 200 pM de WY-14643 (agoniste spécifique de PPARa) dans un milieu dépourvu de sérum de veau foetal (car le sérum de veau foetal renferme des ligands de PPARa). Les cellules ont ensuite été rincées trois fois au PBS et le taux de protéine CAT a été déterminé au moyen du kit CAT-Elisa System (Roche Diagnostics) en suivant les recommandations du fournisseur. EXEMPLE 2 Mise en évidence de la fixation spécifique du complexe PPARa/RXRa sur un polynucléotide utilisable selon l'invention par la technique du gel retard Afin de prouver la fixation spécifique du complexe PPARa/RXRa par rapport au complexe PPARy/RXRa des expériences de retard sur gel (EMSA) ont été entreprises. 1 Synthèse in vitro des protéines PPARa, PPARy et RXRa Les protéines PPARa, PPARy et RXRa ont été obtenues par un système in vitro de transcription/traduction (TNT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System, Promega). Brièvement, 40 pl de TNT T7 quick master mix, 1 pl de méthionine 1 mM, 1 tag de plasmide (plasmide exprimant l'ADNc de PPARa, ou de PPARy, ou de RXRa) et de l'eau qsp 50 pl ont été incubés pendant 60 minutes à 30 C. 2 - Marquaqe des sondes Cinq sondes ont été marquées au P32 (sites PPRE soulignés, bases mutées en gras) : Sonde PPRE consensus: PPRE Consensus F: 5'CCGCCAAGCTTGCTCCGCCAGGTCACAGGTCACTAG3' (SEQ ID N 15) PPRE Consensus-R: 5'CTAGTGACCTGTGACCTGGCGGAGCAAGCTTGGCGG3' (SEQ ID N 16) Sonde PPREa: PPREa-F: 5'GGCCTTCCGGCCCCGTGACCTCAGGGCTGGGGTCGCAGC3' (SEQ ID N 17) PPREa-R: 5' GCTGCGACCCCAGCCCTGAGGTCACGGGGCCGGAAGGCC3' (SEQ ID N 18) Sonde PPREa muté : 2879623 28 PPREa muté-F: 5'GGCCTTCCGGCCCCGTGAATTCAGGGCTGGGGTCGCAGC3' (SEQ ID N 19) PPREa muté-R: 5'GCTCGACCCCAGCCCTGAATTCACGGGGCCGGAAGGCC3' (SEQ ID N 20) Sonde PPREa/y: PPREa/y-F: 5'GGACGGGCCGCCTGACCTCTGCCCC.CTAGAGGGATGTCG3' (SEQ ID N 21) PPREafy-R: 5'CGACATCCCTCTAGGGGGCAGAGGTCAGGCGGCCCGTCC3' (SEQ ID N 22) Sonde PPREa/y muté : PPREa/y muté-F: 5'GGACGGGCCGCCTGACCTCGATCCCCTAGAGGGATGTCG3' (SEQ ID N 23) PPREa/ymuté-R: 5'CGACATCCCTCTAGGGGATCGAGGTCAGGCGGCCCGTCC3' (SEQ ID N 24) Dans un premier temps, les oligonucléotides F et R ont été hybridés de la façon suivante: régénérer les oligonucléotides dans de l'eau à la concentration de 1 pg/ml; dans un tube ajouter 5 pl de l'oligonucléotide F, 5 pl l'oligonucléotide R, 5 pl de tampon d'hybridation 10X (Tris 0.5M à pH 8.0, MgCl2 100 mM) et 35 pl d'eau; chauffer 5 minutes à 100 C puis laisser redescendre à la température ambiante. Dans un deuxième temps, les sondes d'ADN double brin sont marquées au P32 au moyen de T4 polynucléotide kinase (Invitrogen) de la façon suivante: dans un tube ajouter 1 pl de sonde d'ADN double brin, 2 pl de forward buffer, 1.5 pl de P32 ATP (3000 Ci/mM, 10 mCi/ml), 4.5 pl d'eau et 1 pl de T4 polynucléotide kinase incuber à 37 C pendant 30 minutes rajouter au mélange 40 pl d'eau et 2 pl d'EDTA 0.5 M - purifier les sondes sur colonne ProbeQuant G-50 micro column (Amersham Biosciences) selon les recommandations du fournisseur diluer la solution de sonde jusqu'à obtenir 50000 cpm/pl 3 Gel retard Dans un premier temps, 2 pI de protéines (PPARa, ou PPARy, ou RXRa, ou PPARa+RXRa, ou PPARy+RXRa) ont été incubées 20 min à température ambiante avec 1 pI de sonde radiomarquée (50000 cpm/pl) dans un tampon renfermant 10 mM Tris Base (pH 8.0), 100 mM KCI, 10% glycérol, 1 mM dithiothréitol, 1 pg poly (dldC) et 0.5 pg de sperme de saumon, en présence ou en absence de 1 pl de compétiteur non marqué (utilisé à une concentration finale 10-fois ou 50- fois supérieure à celle de la sonde marquée, les solutions sont préparées dans le tampon d'hybridation décrit précédemment et ramenées à la concentration 1X avec de l'eau). Lors des expériences de supershift un anticorps anti-PPARa humain (anti human PPARa antibody N-19, Santa Cruz Biotechnology) a été rajouté au mélange (0.25 pI d'une solution d'anticorps à 200 pg/ml). Dans un deuxième temps, le mélange a été soumis à une électrophorèse en gel vertical de 4% de polyacrylamide (gels de #20 cm de longueur) en utilisant comme tampon de migration un tampon Tris Base 45 mM renfermant 45 mM d'acide borique et 1 mM d'EDTA. Après séparation, le gel a été séché et une autoradiographie a été réalisée en exposant le gel séché sur un film Kodak X-AR. Le cliché autoradiographique permet de visualiser les différentes positions occupées par les complexes PPAR sur le gel d'électrophorèse comme illustré dans les figures 4 à 6. Selon la position de migration, il est possible de déduire si l'interaction entre la séquence PPRE et PPARa est, dans les conditions données, non spécifique (NS) ou spécifique (Shift ou Super Shift lorsqu'un anticorps sélectif est utilisé). REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un polynucléotide comprenant i) une séquence de formule (I) - TGACCTNOGGGCT- dans laquelle A, C, G et T désignent respectivement les bases adénine, cytosine, guanine et thymine, N représente une base nucléotidique naturelle ou synthétique quelconque modifiée ou non et O représente une base qui est A, T ou U; ou ii) une séquence complémentaire de (I) telle que définie sous i), ladite séquence (I) ou complémentaire de (I) permettant l'interaction sélective dudit polynucléotide avec un ou plusieurs éléments constitutifs du complexe de 15 transcription PPARa, pour évaluer l'activité de transcription de PPAR. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence de formule (I) correspond à SEQ ID N 1. 3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence de formule (I) correspond à une séquence choisie parmi SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, SEQ ID N 6, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 17 et SEQ ID N 18. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit polynucleotide comprend en outre, une séquence 25 de type PPRE. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit polynucléotide comprend en outre la séquence d'un gène dont la transcription est placée sous le contrôle de PPAR. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, 30 caractérisé en ce que ledit polynucléotide comprend en outre la séquence d'un gène rapporteur. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, 2879623 31 dans laquelle l'élément fonctionnel interagissant avec la séquence (I) ou complémentaire de (I) est le complexe de transcription PPARa, en présence d'un ligand spécifique de celui-ci. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle permet de différencier une activité de transcription de type PPARy et PPARa. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle l'activité de transcription est dépendante de PPARa. 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle l'évaluation de l'activité de transcription de PPAR permet de caractériser de nouvelles séquences de type PPRE. 11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle permet de diagnostiquer une maladie liée à une dérégulation de l'expression de gènes sous contrôle de PPAR. 12. Utilisation selon la revendication 11, dans laquelle ladite maladie est une maladie liée à une modification de l'activité de PPAR, telle que l'hypertryglycéridémie et le diabète de type Il. 13. Un vecteur comprenant au moins une séquence nucléotidique de formule (I) ou complémentaire de (I) telle que définie dans la revendication 1, et un gène rapporteur. 14. Une cellule hôte contenant un vecteur tel que défini dans la revendication 13 ou un polynucléotide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 6. 15. Procédé de dosage de PPARy ou d'un élément constitutif 25 du complexe PPARa, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: 1) fixation sur une phase solide d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1; 2) mise en contact d'un échantillon dans lequel PPARa ou un élément constitutif du complexe PPARa est à quantifier; 3) détection de PPARy ou de l'élément constitutif du complexe PPARa retenu par lesdits polynucléotides. 16. Procédé de mise en évidence de composés susceptibles 2879623 32 d'interférer avec l'activité de transcription de PPAR, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: 1) marquage d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1; 2) mise en contact de PPARa et du polynucléotide marqué, en présence d'un ou plusieurs composés; 3) détection des complexes moléculaires marqués. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il permet de mettre en évidence des composés capables d'interagir sélectivement avec PPARa. 18. Procédé de détermination de la spécificité d'une séquence nucléotidique de type PPRE, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: 1) marquage du complexe formé par les protéines PPAR-RXR; 2) mise en contact du complexe PPAR-RXR marqué avec un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1, 2 ou 3 fixé sur un support; 3) ajout dans la phase libre d'une concentration de la séquence nucléotidique de type PPRE dont on cherche à déterminer la spécificité; 4) détection des complexes moléculaires formés autour du complexe PPARRXR marqué. 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, dans lequel on utilise un polynucléotide témoin n'interagissant pas avec PPAR, ledit polynucléotide témoin correspondant à un polynucléotide tel que défini dans les revendication 1, 2 ou 3 dans lequel la séquence de formule (I) ou complémentaire de (1) a été mutée ou a subi une délétion. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le polynucléotide témoin comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID N 11, SEQ ID N 12, SEQ ID N 19 et SEQ ID N 20. 21. Procédé de mise en évidence de composés capables d'augmenter ou de diminuer l'activité de transcription de PPARa, caractérisé en 30 ce qu'il comprend les étapes suivantes: 1) transformation d'une cellule hôte à l'aide d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 6, comprenant une séquence PPREa et un gène 2879623 33 rapporteur; 2) mise en culture de la cellule hôte obtenue à l'étape 1); 3) mise en contact de la cellule hôte cultivée à l'étape 2) avec le composé ou le mélange de composés à tester; 4) détection de l'expression du gène rapporteur. 22. Procédé de mise en évidence de composés, suivant la revendication 21, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: 1) transformation d'une cellule hôte à l'aide d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 6, comprenant une séquence PPREa et un gène rapporteur; 2) transformation d'une cellule hôte témoin à l'aide d'un polynucléotide témoin tel que défini dans les revendications 19 et 20; 3) mise en culture des cellules hôtes obtenues aux étapes 1) et 2); 4) mise en contact des cellules hôtes cultivées avec le composé ou le mélange de composés à tester; 5) détection de l'expression du gène rapporteur; 6) comparaison des résultats obtenus. 23. Procédé de préparation d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant 20 en 1) la synthèse chimique directe et programmée; ou 2) la réplication d'une séquence PPREa d'intérêt dans une cellule hôte; ou 3) l'amplification d'une séquence PPREa d'intérêt par PCR. 24. Kit de caractérisation des interactions entre séquences 25 polynucléotidiques de type PPRE et complexes de transcription de type PPAR, caractérisé en ce qu'il comprend au moins: une préparation d'au moins un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1, 2 ou 3; une préparation des protéines purifiées PPAR-RXR, dont un des membres au moins est marqué; un moyen de détection des molécules marquées. 25. Kit selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comprend, 2879623 34 en outre un polynucléotide témoin tel que défini dans la revendication 19 ou 20, et/ou une séquence de type PPREy et/ou une séquence de type PPREa/'y. 26. Kit selon l'une des revendications 24 et 25, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, un substrat spécifique marqué ou non marqué permettant d'incuber PPAR en présence d'un polynucléotide qui lui est spécifique. 27. Un médicament caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide tel que défini dans les revendications 1, 2 ou 3. 28. Utilisation d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une maladie liée à une modification de l'activité de PPAR, telle que l'hypertryglycéridémie, le diabète de type II ou les lipodystrophies.