FR 2880272 A1 20060707 FR 0500042 A 20050104 L'invention a pour objet une préparation pour la libération prolongée in vivo d'un principe actif, qui comprend des microparticules d'un polymère insoluble dispersées en milieu liquide et portant des groupements fonctionnels formant une liaison ionique avec le principe actif;, ainsi que son utilisation en tant que médicament. Selon un mode préféré, les microparticules sont encapsulées par coacervation en milieu aqueux. L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'une telle préparation. L'utilisation de sels de polypeptides très peu solubles ou insolubles dans l'eau pour la réalisation de formes à libération programmée de peptides et de protéines a déjà été décrite dans la littérature (brevet américain publié sous le numéro US 4,010,125, Schally et al., mars 1977; US 5,776,885, Orsolini et al., juillet 1998; US 6,087, 324, Igari et al., juillet 2000). Des demandes de brevets relatives à des complexes ioniques entre des polypeptides et des macromolécules ont été déposées. Un des exemples concerne une composition comprenant un polyester, de préférence un homoou copolymère de l'acide lactique et glycolique, contenant un ou plusieurs groupements COOH libres formant une liaison ionique avec un polypeptide comprenant une amine où au moins 50% en poids du polypeptide présent dans la composition est conjugué ioniquement au polyester (brevet américain publié sous le numéro US 5,672,659, Shalaby et al., septembre 1997). Le second exemple porte sur des formes à libération programmée insolubles dans l'eau comprenant un complexe associant un peptide, de préférence un analogue de la LHRH, et une macromolécule anionique de type carboxyméthylcellulose (CMC), dans lesquelles la teneur en peptides dans le complexe est comprise entre 57% et 80% en poids (brevet américain publié sous le numéro US 6,180,608, Gefter et al., janvier 2001). La méthode de fabrication du complexe implique obligatoirement que la macromolécule soit soluble dans un solvant aqueux. Elle est basée sur une coprécipitation du peptide et de la macromolécule. De même, la demande de brevet internationale publiée sous le numéro WO 00/47234 (Asta Medica, août 2000) décrit l'obtention d'un complexe ionique insoluble par coprécipitation d'une macromolécule solubilisée et d'un peptide. Cette demande décrit également l'ajout d'une résine échangeuse d'ions pour contrôler la réaction chimique. Cette résine est ensuite filtrée et éliminée. Au final, il ne reste que le complexe, ou coprécipité. Dans ces exemples, le ratio macromolécule/peptide/complexe dans la formulation finale n'est pas connu. Dautre part, les interactions physico-chimiques entre les polypeptides et les résines échangeuses d'ions ont été largement étudiées dans le domaine de la chromatographie d'échange d'ions, la chromatographie de gel et la chromatographie liquide haute pression pour le dosage et la détermination de puretés peptidiques. Les techniques de chromatographie de type préparatif ont également participé à une meilleure compréhension de ces interactions. En chromatographie, une colonne remplie avec une résine possède certaines caractéristiques qui permettent, grâce à l'emploi de différents solvants, de séparer les principes actifs qui la traversent. Les différentes manières d'interagir avec les polypeptides sont les suivantes: l'adsorption, la partition, l'échange d'ions, l'affinité, la filtration de gel. La chromatographie d'échange d'ions (IEC) est applicable à la séparation de la plupart des molécules chargées, de grosses protéines à de petits nucléotides et acides aminés. Elle est fréquemment utilisée pour les peptides et les protéines sous des conditions variées. L'utilisation en tant que principe actif ou comme excipient des résines échangeuses d'ions administrées par voie orale est connue. Des avantages, comme la stabilisation de substances fragiles (parfums), la protection de la muqueuse gastrique vis-à-vis de substances agressives comme les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), la modification de la libération de médicaments par un effet retard de type gastro-résistant ou le masquage de goût pour les principes actifs amers, ont été décrits dans la littérature. Une liste non exhaustive d'applications commerciales de résines échangeuses d'ions est donnée ci-après: En tant que principes actifs: le sodium polystyrène sulfonate pour le traitement de l'hyperkaliémie et la cholestyramine pour le traitement de l'hypercholestérolémie, En tant qu'excipients: les gommes de nicotine (Nicoretté , Pfizer, France), stabilisation de la vitamine B12, masquage de goût de la paroxétine (Paxil , GlaxoSmithKline, Grande-Bretagne), libération prolongée du diclofénac (Voltarene , Novartis, France), du chlorphéniramine (Tussionex , Celltech Pharmaceuticals, USA), du dextrométorphan (Delsym , Celltech Pharmaceuticals, USA), du bétaxolol (Betoptic, Alcon Laboratories, USA) et du repaglinide (Novonorm , Novo Nordisk, Danemark). La majorité des médicaments à base de résinates décrits dans la littérature sont fabriqués avec des substances actives chimiques de type petite molécule qui agissent à relativement fortes doses et sont administrés par voie orale. La notion de libération retardée avec les résinates n'est pas nouvelle. Elle a été décrite par exemple en chargeant des principes actifs sur des résines échangeuses d'ions (voir Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed. 1975). Cette prolongation d'action est présumée être le résultat d'une diminution de la vitesse de déplacement des ions par d'autres ions lorsque le complexe est en contact avec les fluides physiologiques du tractus digestif. La fixation d'un principe actif sur une résine échangeuse d'ions est considérée comme la résultante d'une interaction électrostatique (Jenquin et al., Int. J. of Pharmaceutics 101 (1994) 23-34). Cependant, les complexes obtenus provoquent un effet retard relativement court et un faible contrôle du niveau de libération du médicament car les paramètres de contrôle sont limités à la variation de taille des particules de résines et au taux de réticulation de la résine utilisée. Des essais pour réduire la vitesse de libération par des techniques d'enrobage ont été étudiées, mais ont montré une relative inefficacité du fait que le complexe formait un gel très rapidement après sa mise en contact avec les milieux physiologiques. Cette propriété peu exploitée à l'heure actuelle est particulièrement intéressante par voie parentérale. De nombreuses propositions comme l'incorporation de solvants tel que le polyéthylène glycol, des alcools aliphatiques ou des éthers de cellulose incorporés directement dans la matrice polymérique n'ont pas donné des résultats plus probants (voir les brevets américains publiés sous les numéros US 4, 221,778 et 4,861,598) et la publication de Feely et al. (Int. J. Pharmaceutics 44 (1988) 131-139). D'autres numéros de publication de brevets américains qui décrivent des améliorations des taux de libération de médicaments sont donnés ci-après: 4,996,047; 5,186,930; 4,894,239; 4, 859,462; 4,959,219; 4,762,709; 4,999,189; 4,859,461; et 5,368,852. La libération contrôlée d'un principe actif pour une utilisation dans le tractus gastro-intestinal a été décrite dans le brevet US 4,221, 778 (Raghunathan, septembre 1980). La méthode donnée pour préparer les formes à libération modifiée est basée sur un procédé en trois étapes (i) préparation du complexe résine-médicament; (ii) traiter ce complexe avec un agent d'imprégnation convenable; et (iii) enrober les particules du complexe traité avec une barrière de diffusion perméable à l'eau. L'utilisation d'agents d'imprégnation est faite pour prévenir du gonflement ou de la rupture de la barrière d'enrobage. L'utilisation d'un enrobage gastro-résistant pour retarder l'absorption jusqu'à la sortie du produit de l'estomac est bien connue, et est notamment décrite dans le brevet américain publié sous le numéro US 5,851,579. Cependant, la nature des substances actives chimiques rentrant dans la composition des résinates, en particulier, la quantité de principe actif qui est relativement importante pour un comprimé ou une gélule, est responsable d'une libération rapide du principe actif à partir du résinate, suivi par une phase de réduction graduelle de la libération conjointe à une baisse de la concentration en substance active. A cause de cela, il a été difficile dans les différentes formulations décrites dans la littérature, d'assurer une libération constante, prolongée ou retardée. Par conséquent, les applications de la technologie des résinates pour la délivrance de substances chimiques classiques par voie orale sont restées relativement limitées dans l'industrie pharmaceutique. Par voie parentérale, les résines échangeuses d'ions ont été utilisées comme vecteurs de principes actifs (doxorubicine, cisplatine) pour des traitements antitumoraux de chimio-embolisation (Chan et al., J Pharm Pharmacol 1992; 44:211-7 et Codde JP et al., Anticancer Res 1990; 10:1715-8). L'effet recherché dans ce cas est une diffusion locale d'agents anti-cancéreux doublée par une anoxie de la tumeur par blocage du flux sanguin la nourrissant. Les concepts matriciels de la libération modifiée d'un principe actif ont été développés depuis de nombreuses années, et peuvent être très bénéfiques pour l'administration de polypeptides. En protégeant le polypeptide, il est possible d'augmenter le temps durant lequel la concentration plasmatique de la substance active est entre une limite haute définie par les propriétés toxicologiques de la molécule et une limite basse définie par son efficacité. Dans le cas des polypeptides administrés principalement par voie parentérale sous forme d'implants ou de microsphères, des durées d'action de plusieurs mois sont maintenant maîtrisées après une seule injection, par voie sous-cutanée ou intramusculaire. Des formulations à base de polymères biodégradables de type polyesters ou polyanhydrides sont commercialisées dans des domaines thérapeutiques variés comme le cancer de la prostate, le cancer du sein, les tumeurs endocrines digestives, l'acromégalie, la puberté précoce. Le concept de libération de ces formes de première génération est lié à l'incorporation de particules ou de solutions de polypeptides dans une matrice polymérique qui se dégrade progressivement avec le temps dans les fluides physiologiques. On peut citer comme exemples de produits commercialisés le leuprolide (Lupron Depot , TAP Pharmaceutical Products, USA), l'octréoide (Sandostatin LAR , Novartis, France), la somatropine (Nutropin Depot , Genentech, USA) ou la triptoréline (Trelstar Depot , Pharmacia & Upjohn, USA) qui sont sous forme de microsphères dont le polymère biodégradable est le copolymère de l'acide lactique et glycolique (PLGA), ou encore la carmustine (Gliadel sous forme wafer poly [bis(p- carboxyphénoxy)propane:acide sébacique] dans un ratio molaire 20:80, Guilford Pharmaceuticals, USA)), la goséréline (Z oladex sous forme rod , PLGA, Astra Zeneca, USA) et la doxycycline (Atridox sous forme de gel, PLGA, CollaGenex Pharmaceuticals). Dans la présente invention, des sels de polypeptides insolubles dans l'eau ont été mis au point, qui permettent une libération prolongée in vivo de polypeptides dans les milieux physiologiques. Ces sels sont constitués par des microparticules d'un polymère échangeur d'ions sur lequel est fixé de manière réversible par une liaison ionique un polypeptide. Ils induisent une meilleure protection du polypeptide, une meilleure biodisponibilité et un effet de libération contrôlée quand la formulation est administrée à des mammifères par voie parentérale ou par toutes voies d'administration conventionnelles. Par rapport aux formes matricielles de l'état de la technique, la préparation selon l'invention, également désignée dans la présente demande sous l'expression sels de polypeptides ou résinates de polypeptides , peut être utilisée directement pour la libération prolongée in vivo et présente un certain nombre d'avantages qui sont résumés comme suit: - Les résinates (de polypeptides) sont applicables à tous les peptides et protéines ionisés. L'aspect physique et/ou macroscopique du polypeptide n'est pas un paramètre critique de fabrication; - Les résinates permettent une fabrication simple, économique et aseptique de formes galéniques applicables à tous types de peptides ou protéines ionisés; - L'utilisation de la radiostérilisation peut être évitée; - Les résinates permettent la libération prolongée après administration parentérale sur une période de temps allant de quelques jours à quelques mois selon les besoins thérapeutiques spécifiques liés à chaque peptide ou protéine. En effet, la préparation selon la présente invention permet d'éviter l'effet de pic initial de libération ( burst effect ) inhérent à la technologie d'encapsulation matricielle dans les polymères; - Les résinates permettent une protection et une libération programmée dans le tractus gastro-intestinal, assurant ainsi une biodisponibilité élevée et reproductible, ce qui apporte un avantage thérapeutique en terme de sécurité et d'efficacité pour les patients. En effet, la préparation selon l'invention permet de protéger le peptide ou la protéine que l'on souhaite administrer des attaques enzymatiques et chimiques au niveau de l'estomac, et de libérer le peptide au niveau de l'intestin où il pourra être absorbé; - La composition de la préparation selon l'invention est différente de celle des prodrugs (dans une prodrug , il existe une liaison covalente entre le polypeptide et la macromolécule) qui favorisent la stimulation du système immunitaire et la formation d'anticorps neutralisants délétères pour l'activité thérapeutique du polypeptide. Contrairement aux sels insolubles de l'art antérieur, la présente préparation correspond à un sel insoluble qui forme une entité unique: le polymère et le polypeptide, ou tout autre principe actif comme défini cidessous, sont mélangés en quantités stoechiométriques lors de la préparation du sel; après fixation du principe actif sur le polymère par des liaisons ioniques, la quantité non fixée de principe actif qui reste en solution est éliminée. En outre, le présent inventeur a découvert que si l'on injecte directement les sels de polypeptides selon l'invention, le temps de libération des polypeptides est augmenté. Il semblerait que dans l'organisme, un échange d'ions progressif entre les ions présents in vivo (ions sodium, chlorure, ...) et les polypeptides ionisés (ou chargés ) se produise, les ions présents in vivo déplaçant les polypeptides. En effet, les polymères utilisés ne peuvent être dégradés dans ce laps de temps en raison de leur haut poids moléculaire. De surcroît, l'utilisation d'une très faible quantité de polypeptide fixée sur le polymère (de l'ordre du milligramme voir du nanogramme) induit après administration par voie parentérale, un effet de protection du polypeptide vis-à-vis des fluides physiologiques et entraîne un effet de libération prolongée. Ainsi, selon un premier aspect, l'invention a pour objet une préparation pour la libération prolongée in vivo d'un principe actif, ladite préparation comprenant des microparticules d'un polymère insoluble, biologiquement acceptable et portant des groupements fonctionnels formant une liaison ionique avec le principe actif, lesdites microparticules étant dispersées dans un liquide biologiquement acceptable. Le polymère susceptible d'être utilisé dans le cadre de la présente invention doit répondre à deux critères: il doit être insoluble et biologiquement acceptable. Par l'expression polymère biologiquement acceptable on entend désigner dans la présente demande un polymère biocompatible, c'est-à-dire bien toléré in vivo et qui ne provoque pas de réaction de rejet, de réaction toxique, ou de lésion sur les fonctions biologiques d'un organisme vivant, et biodégradable, c'est-à-dire dégradable in vivo en éléments simples qui ne s'accumulent pas et qui participent aux cycles naturels. De préférence, le polymère est pharmacologiquement acceptable, c'est-à-dire qu'il consiste en un polymère biologiquement acceptable adapté pour être utilisé à des fins pharmaceutiques comme vecteur d'administration d'un principe actif. Le terme insoluble signifie dans la présente demande que le polymère n'est pas soluble ou très faiblement soluble aussi bien dans le tampon de préparation du sel de polypeptide selon l'invention que dans le liquide biologiquement acceptable auquel il se trouve associé dans la préparation finale. La solubilité d'un polymère dépend de plusieurs critères, notamment du type de molécules (monomère) dont il est constitué, de son degré de polymérisation (monomères répétés n fois), et de sa masse moléculaire (MM). Plus la MM du polymère est élevée, moins le polymère est soluble. De même, lorsque le polymère est réticulé, sa solubilité sera fonction du degré de réticulation. Comme exemples de polymères insolubles et biologiquement acceptables on peut citer, sans toutefois s'y limiter, les polysaccharides (dextran et dérivés, poly dextrose, agarose, polymères à base de carbohydrates, dérivés de chitine, chitosan, amidon et ses dérivés), les alcools poly aliphatiques, tels que l'oxyde de polyéthylène et dérivés incluant les PEG (poly éthylène glycol), les PEG-acrylates, les imines de polyéthylène, les polymères de poly vinyle, les alcools de poly vinyle, la poly vinyle pyrrolidone, le poly vinyle phosphate, l'acide poly vinyl phosphonique et dérivés, et les acétates de poly vinyle et dérivés, les acides poly acryliques et dérivés, les poly acrylamides, les poly esters et poly ortho esters, les poly anhydrides, les acides poly organiques tels que les acides poly maléiques et dérivés, les poly aminoacides et les poly iminoacides et dérivés, le poloxamer 407 ou Pluronic L-101 TM, les tert-polymères et dérivés, les poly ethers, tels que les poly (tetra méthylène éther glycol) et dérivés, les polymères naturels tels que le zein et le pullulan et dérivés, les poly imides, tels que les poly tris (hydroxy methyl) methyl methacrylates et dérivés, les surfactants, tels que les poly oxy éthylène sorbitan et dérivés, les polymères branchés ou cycliques tels que les PEG branchés et les cyclodextrines et dérivés, les poly aldéhydes, tels que les poly (perfluoropropylene oxyde-b-perfluoroformaldehyde) et dérivés. Les polymères de type poly styrène (type Amberlité ,...) ne sont pas appropriés pour une utilisation dans le cadre de la présente invention. En effet, de tels polymères ne sont pas biocompatibles. Il en va de même pour certains poly vinyles comme les chlorures de polyvinyles. Comme exemple de poly ester on peut citer les homo ou copolymères de l'acide poly lactique ou glycolique (PLGA) qui, bien qu'ils ne soient pas réticulés, sont insolubles dans l'eau lorsqu'ils possèdent une MM suffisante. De préférence, la MM du PLGA est supérieure ou égale à5 Kdaltons. On peut également citer en tant que polymère de type polysaccharide insoluble dans l'eau, des dérivés de la cellulose (EC: éthyl cellulose, HERCULES, Allemagne), qui, comme le PLGA, sont des polymères non réticulés. Comme autre exemple de polymère de type polysaccharide préférentiellement utilisé dans le cadre de la présente invention, on citera le dextran, nom générique donné à une grande famille de polysaccharides d'origine microbienne qui sont assemblés ou polymérisés en dehors des cellules par des enzymes appelées dextran sucrases. Cette classe de polysaccharides est composée de monomères de glucose et est stockée comme une source d'énergie par les levures et les bactéries. Les dextrans sont produits par fermentation ou conversion enzymatique du sucrose, un produit de l'industrie de la canne à sucre ou des betteraves. Les dextrans et dérivés sont en général solubles dans les tampons aqueux à au moins 10mg/ml. Leur solubilité décroît quand la MM augmente. Le maximum de solubilité est de 100mg/ml pour un dextran de 3000 daltons, 50 mg/ml pour un dextran de 10000 daltons, de 25 mg/ml pour un dextran de 70000 daltons et 5-10 mg/ml pour des dextrans compris entre 500000 et 2000000 daltons. Pour une plus grande vitesse de biodégradation, des MM inférieures à 2000000 daltons sont préférées pour une utilisation des résinates de polypeptides par voie parentérale. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la préparation selon l'invention est caractérisée en ce que le polymère est une résine polymérique de nature polysaccharidique. De préférence, la résine polymérique de nature polysaccharidique est du type dextran. De manière encore préférée, le dextran possède une masse moléculaire comprise entre 3 Kdaltons et 2000 Kdaltons, de préférence entre 50 Kdaltons et 1000 Kdaltons, de manière encore plus préférée entre 100 Kdaltons et 500 Kdaltons, et de manière préférée entre toutes entre toutes entre 100 Kdaltons et 200 Kdaltons. Le polymère insoluble et biologiquement acceptable tel que défini dans cette invention porte des groupements fonctionnels. Dans la présente demande, ces groupements fonctionnels sont ionisables. Ainsi, lorsque le polymère qui porte ces groupements, ou polymère modifié , est mis en présence d'un tampon de préparation tel que de l'eau pour préparation injectable (eau ppi), du sérum physiologique ou un tampon à pH contrôlé (Tris (hydroxy méthyl) amino méthane,...), ces groupements vont s'ioniser ( se salifier ), mais le polymère ne va pas se solubiliser pour autant. Ainsi, on parlera par exemple de dextran modifié, d'agarose modifié, de PLGA modifié, d'amidon modifié, ou d'EC modifiée. Les groupements fonctionnels ionisés peuvent être fortement acides comme par exemple l'acide sulfonique ou l'acide phosphorique, faiblement acides comme par exemple l'acide carboxylique, faiblement basiques comme par exemple les amines primaires, fortement basiques comme par exemple un ammonium quaternaire ou une combinaison de groupements acides et basiques. Dans la présente demande, on désignera de manière indifférente sous les expressions résine échangeuse d'ions ou résine polymérique échangeuse d'ions le polymère selon l'invention qui porte ces groupements, ou polymère modifié . En effet, le polymère modifié ou résine échangeuse d'ions, est caractérisé par sa capacité à échanger des ions. Cette caractéristique est quantifiée par la capacité d'échange d'ions mesurée par le nombre équivalent d'un ion qui peut être échangé et qui est exprimé par rapport à la masse de polymère capacité en masse ou par rapport au volume de résine capacité en volume . Une unité fréquemment utilisée pour les capacités en masse est le milliéquivalent de capacité d'échange par gramme de résine sèche, soit en abréviation meq/g . La résine échangeuse d'ions, lorsqu'elle est réticulée, forme une matrice poreuse, et consiste en un réseau tri dimensionnel. Ce type de résine est particulièrement insoluble. Ainsi, de préférence, la résine échangeuse d'ions est réticulée; on peut citer en tant qu'exemple de résine échangeuse d'ions réticulée le dextran réticulé commercialisé sous le nom Sephadex, habituellement utilisé comme gel de filtration hautement spécialisé et milieu de chromatographie, en particulier, les résines échangeuses d'ions composées de billes microscopiques. Dans ce cas, les chaînes polymériques organiques sont réticulées pour donner un réseau tri-dimensionnel ayant des groupements fonctionnels ioniques attachés par des liaisons covalentes aux unités de glucose des chaînes de polysaccharides. On peut également citer la spécialité appelée Deflux (Q-MED, Suède) , approuvée aux USA par la FDA (Deflux a également été approuvé en Europe en 1998). Cette spécialité est un gel contenant des microparticules qui est injecté dans la paroi de la vessie à l'endroit où les uretères entrent dans la vessie. Le gel est constitué de deux polysaccharides bien connus, le dextranomer et l'acide hyaluronique. Les dextranomers sont des molécules de dextran réticulées présentées sous forme de microparticules avec un diamètre de 40 à 120 gin. Le dextranomer est un 2-(diethylamino) éthyl Sephadex , et peut être considéré comme une résine échangeuse anionique faible. Les deux substances sont parfaitement tolérées par les tissus et sont biodégradables sur une durée de plusieurs mois. Le dextranomer est utilisé depuis plus de trente ans comme agent de traitement des blessures et des ulcères (Debrisan, Pharmacia & Upjohn, USA) et ne présente pas d'effets secondaires. Le dextranomer ou DEAESephadex est une résine échangeuse d'ions chargée positivement qui est capable de réagir avec un polypeptide ionisé. La taille des microparticules du dextranomer évolue de 40 gm à 120 m. Les Sephadex, en particulier Sephadex SP C50 et QAE (Aldrich Chemical, USA), font partie des résines échangeuses d'ions réticulées qui sont préférentiellement utilisées dans le cadre de la présente invention. Les résines échangeuses d'ions peuvent être acides en nature (dans ce cas la résine est une échangeuse de cations) ou basiques (échangeuse d'anions). Dans les résinates de cette invention, les particules insolubles de résine chargée (ionisée) sont liées de manière réversible aux polypeptides, ou tout autre principe actif, qui sont chargés positivement ou négativement en fonction du pH et des acides aminés qui les composent. Des petits ions fortement chargés sont utilisés pour réaliser les élutions c'est-à-dire la capacité d'échanger un ion par un autre: Cl HO-, Na+, H+... Les résines échangeuses d'ions cationiques ou anioniques peuvent être classées en faibles ou fortes résines échangeuses d'ions en fonction de la nature des groupements fonctionnels chargés liés (de façon covalente) au support polymérique optionellement réticulé de la résine. Les microparticules du polymère selon l'invention doivent être de taille appropriée pour leur administration in vivo. De préférence, le diamètre des microparticules est compris entre environ 0.1 m et environ 2000 m, de préférence entre environ 20 pmet200 m. Par principe actif on entend désigner dans la présente demande tout composé ionisable possédant des propriétés curatives (antibiotiques, anti-cancéreux, anti-VIH,...) ou préventives (vaccins,...) à l'égard des maladies humaines ou animales, ainsi que tout composé pouvant être administré à l'homme ou à l'animal, en vue d'établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger, ou modifier leurs fonctions organiques. Le principe actif peut être un polypeptide, un acide nucléique, ou tout autre molécule organique, chimique ou biochimique, ainsi que leurs dérivés et analogues. Les termes peptide, polypeptide et protéine sont utilisés de manière indifférente dans la présente demande pour désigner une séquence d'acides aminés ou, pour leurs dérivés (glycoprotéines, lipoprotéines), contenant une séquence d'acides aminés. On peut citer à titre d'exemple et sans aucune limitation les cytokines, les récepteurs cellulaires, les anticorps, les antigènes, les toxines et les allergènes. La longueur de la séquence d'acides aminés peut être de deux à plusieurs centaines d'acides aminés. De préférence, la longueur est comprise entre 2 et 100 acides aminés, de préférence entre 8 et 50 acides aminés, et de manière encore préférée entre 8 et 25 acides aminés. Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner une séquence de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin ou un ADNc qu'à des produits de transcription desdits ADN (ARN, ARN d'interférence ou siRNA pour small interfering RNA , etc..). Comme exemples d'autres molécules organiques on peut citer, sans s'y limiter, les hydrates de carbone, les composés de nature lipidique et tous les composés naturels 1.5 ou pouvant être obtenus par synthèse chimique. On peut citer par exemple les principes actifs suivants (cette liste de principes actifs n'est pas limitative, et peut être complétée par d'autres principes actifs qui ont une activité biologique suffisante) : l'insuline, la pro-insuline, le glucagon, l'hormone parathyroïde, la calcitonine, la vasopressine, l'érythropoiêtine (EPO), la rénine, la prolactine, l'hormone de croissance humaine (hGH), l'hormone de stimulation de la tyroïde (TSH), la corticotropine, l'hormone de stimulation des follicules (FSH), l'hormone de lutéinisation (LH), la gonadotropine chorionique, les peptides atrial, l'interféron, l'activateur du plasminogène tissulaire (tPA), la gammaglobuline, l'urokinase, la streptokinase, les lymphokines telles que les interleukines et les facteurs de stimulation des colonies (CSF), - le facteur de libération de l'hormone de croissance (GHRF), le facteur de libération de la corticotropine (CRGHRF), l'hormone de libération de l'hormone de lutéinisation (LHRH), la somatostatine, la calcitonine, l'hormone de libération de la thyrotropine (TRH), le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP), le glucagon-like peptide (GLP), l'hormone parathyroide et le peptide lié à l'hormone parathyroïde (PHRP), leurs agonistes, antagonistes et analogues, une transférase, une hydrolase, une isomérase, une protéase, une ligase, une oxydoréductase, une estérase, et une phosphatase, la streptokinase, la fibrinolysine, la déoxyribonucléase, et 1'asparaginase, un agoniste endogène opioide tel que l'enképhaline ou l'endorphine, une hormone hypothalamique telle que la gonadolibérine, la mélanostatine, la mélanolibérine, la somatostatine, la thyrolibérine, la substance P, et la neurotensine, une hormone adénohypophyséale telle que la corticotropine, la lipotropine, la mélanotropine, la lutropine, la thyrotropine, la prolactine et la somatotropine, une hormone neurohypophyséale, une hormone calcitropique telle que la parathyrine et la calcitonine, un facteur thymique tel que la thymosine, la thymopoïétine, le facteur de circulation thymique (CTF) et le facteur humoral thymique (THF), une hormone pancréatique telle que la somatostatine, une hormones gastro-intestinale telle que la gastrine, la cholécystokinine, la sécrétine, le polypeptide inhibiteur gastrique (GIP), le peptide vaso-intestinal et la motilline, une hormone chorionique telle que la choriogonadotropine et la choriomammotropine, une hormone ovarienne telle que la relaxine, une hormone vaso-active telle que l'angiotensine et la bradykinine, un facteur neurotrophique tel que le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF), le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et le facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales (GDNF), un facteur de croissance tel que le facteur de croissance du tissu nerveux (NGF), le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur de croissance des fibroblastes (FGF), le facteur de croissance insulinomimétique (IGF), le facteur de nécrose tumorale (TNF) et le facteur de croissance transformant (TGF), la somatomédine et l'urogastrone, un facteur de la coagulation tel que les facteurs VIII et IX, un peptide artificiel ou pseudo-peptide tel que la déféroxamine, et un analogue de la somatostatine tel que l'octréotide et le lanréotide, un analogue de la LHRH tel que la nafaréline, la buseréline, la leuproréline, la goseréline, la desloréline, la gonadoréline, la triptoréline, et l'histréline, des peptides artificiels ou pseudo-peptides, tels que la déféroxamine, Plus généralement, les peptides et les protéines adaptés à la présente invention sont décrits dans le livre de Johannes Meienhofer, "Peptide and Protein Hormones", Burger's Medicinal Chemistry, 4th ed., (part II), Wolff, Ed., John Wiley and Sons (1979). Selon un mode de réalisation préféré, la préparation selon l'invention est caractérisée en ce que le principe actif est un polypeptide. De préférence, le polypeptide est une hormone, un facteur de coagulation, un facteur neurotrophique ou un facteur de croissance. De manière encore préférée, le polypeptide est l'hormone de libération de l'hormone de lutéinisation (LHRH) ou l'un de ses analogues. Dans la présente demande, on entend désigner par le terme analogue d'un polypeptide un agoniste ou un antagoniste de ce polypeptide. De préférence, la libération prolongée in vivo est une libération chez un mammifère, de préférence l'homme. La présente préparation peut être administrée selon tout mode approprié tel que l'administration par voie orale, vaginale, rectale, ou par voie parentérale, telle que l'injection sous-cutanée ou intramusculaire. Selon un mode de réalisation particulier, la préparation selon l'invention est destinée à être utilisée en tant que médicament. En général, les principes actifs de la présente invention seront administrés en une quantité thérapeutiquement efficace par l'un quelconque des modes acceptés d'administration. Les gammes de posologies appropriées sont typiquement de 1 à 500 mg par jour, de préférence de 1 à 100 mg par jour, et de manière encore préférée de 1 à 30 mg par jour. Toutefois, la préparation selon l'invention permet également d'administrer de façon très avantageuse de très faibles quantités de principe actif, de l'ordre du microgramme, voire du picogramme. Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation de la préparation selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter une maladie choisie dans le groupe constitué par le cancer, notamment le cancer de la prostate, le cancer de l'ovaire ou le cancer du sein, le diabète, la sclérose en plaque, l'hépatite virale, la cachexie, l'ostéoporose, le retard de croissance, les tumeurs endocrines digestives, ou tout autre maladie susceptible d'être traitée par un principe actif selon l'invention. La présente invention a pour objet une méthode de traitement ou de prévention d'une maladie par administration de la préparation selon l'invention. La maladie peut être le cancer, notamment le cancer de la prostate, le cancer de l'ovaire ou le cancer du sein, le diabète, le retard de croissance, les tumeurs endocrines digestives, ou tout autre maladie susceptible d'être traitée par un principe actif selon l'invention. 1.5 La préparation selon l'invention se présente de manière générale sous forme hydratée. Dans certains cas elle forme un gel aqueux. En effet, après que celle-ci a été préparée, elle se trouve dans le tampon de préparation. En général, le tampon de préparation est aussi le liquide biologiquement acceptable dans lequel se trouve la préparation lorsqu'elle doit être administrée. La préparation est donc directement administrable, en particulier par voie parentérale. Ainsi, le tampon de préparation ou le liquide biologiquement acceptable peut être tout liquide qui permet l'ionisation des groupements fonctionnels portés par le polymère et qui est biocompatible, c'est-àdire bien toléré in vivo et qui ne provoque pas de réaction de rejet, de réaction toxique, ou de lésion sur les fonctions biologiques d'un organisme vivant. Comme exemple de tampon de préparation, ou liquide biologiquement acceptable, on peut citer, sans s'y limiter l'eau pour préparation injectable, (eau ppi, COOPER, France), du sérum physiologique (COOPER, France)ou un tampon à pH contrôlé (les tampons sont fabriqués à façon), par exemple le tampon tris (hydroxy méthyl) amino méthane à 0,5M ou le tampon d'acétate de sodium à 0,5M. Toutefois, on peut envisager de remplacer le tampon de préparation à la fin du procédé de fabrication par un autre tampon biologiquement acceptable. Cela est notamment le cas lorsqu'on déshydrate la préparation pour la stocker et qu'on la réhydrate ultérieurement dans un liquide biologiquement acceptable pour son administration. Lorsque la préparation, initialement sous forme de gel (microparticules dispersées), est déshydratée, elle se présente en général sous forme solide. La déshydratation peut être partielle ou totale. La préparation selon l'invention sous forme déshydratée peut également être administrée. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la préparation est soit hydratée, soit déshydratée. La déshydratation est de préférence réalisée par lyophilisation ou séchage à l'étuve. De préférence, la préparation selon l'invention est administrée par voie parentérale, orale, rectale ou vaginale. La préparation selon l'invention peut se présenter sous forme de poudre, de comprimé, de pilule, de capsule, de cachet, de suppositoire ou de granule dispersible. Les procédés d'obtention de ces formes galéniques sont bien connus de l'homme du métier. Selon un autre mode de réalisation, les microparticules sont incorporées dans une matrice d'un polymère biodégradable et biocompatible de type microsphère ou implant. De préférence, la préparation est administrée par voie parentérale (injection). Selon un mode de réalisation alternatif, les microparticules sont recouvertes d'une enveloppe d'un polymère biodégradable et biocompatible et forment des microcapsules. De préférence, la préparation est administrée par voie parentérale (injection). De manière encore préférée, les microcapsules sont obtenues par coacervation aqueuse. Le polymère biodégradable et biocompatible permettant d'obtenir la préparation selon l'invention sous forme de microsphères, d'implants ou de microcapsules peut être tout type de polymère approprié biocompatible comme des poly esters ou des poly anhydrides, qui est bien connu de l'homme du métier. De préférence, le polymère est un poly ester de type de homo ou copolymère de l'acide lactique et/ou glycolique, de manière encore préférée un copolymère de l'acide lactique et glycolique (PLGA), et de manière encore plus préférée, le PLGA 50/50 (BOEHRINGER INGELHEIM, Allemagne). L'homme du métier connaît les procédés de fabrication des formes microsphères, implants ou microcapsules, et sait les adapter à la préparation selon l'invention. 5 Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet une préparation pour la libération prolongée in vivo d'un principe actif, ladite préparation comprenant des microparticules d'un polymère insoluble, biologiquement acceptable, et portant des groupements fonctionnels formant une liaison ionique avec le principe actif, lesdites microparticules étant dispersées dans un liquide biologiquement acceptable, caractérisée en qu'elle est susceptible d'être obtenue par le procédé comprenant les étapes suivantes: optionellement, stérilisation du polymère, addition d'un tampon de préparation à un polymère, ledit polymère étant 15 insoluble dans le tampon de préparation, ionisation d'un principe actif dans de l'eau distillée ou dans un tampon aqueux, formation de la préparation par mise en présence du principe actif et du polymère lorsque le pH du tampon de préparation est inférieur au point isoélectrique (IpH) du principe actif, par fixation du principe actif dont la charge de surface globale est positive sur le polymère dont les groupements fonctionnels sont négatifs, ou lorsque le pH du tampon de préparation est supérieur au point isoélectrique (IpH) du principe actif, par fixation du principe actif dont la charge de surface globale est négative sur le polymère dont les groupements fonctionnels sont positifs, et - optionellement, lavage de la préparation. De préférence, le procédé comprend en outre, après l'étape de formation de la préparation, une étape de coacervation aqueuse par mise en présence de la préparation avec un poly ester de type de homo- ou copolymère de l'acide lactique et/ou glycolique, de préférence dissous dans un solvant polaire de type PEG 400. De préférence, le poly ester de type de homo- ou copolymère de l'acide lactique et/ou glycolique est un copolymère de l'acide lactique et glycolique (PLGA). Selon encore un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé de fabrication d'une préparation pour la libération prolongée in vivo d'un principe actif, ladite préparation comprenant des microparticules d'un polymère insoluble, biologiquement acceptable, et portant des groupements fonctionnels formant une liaison ionique avec le principe actif, lesdites microparticules étant dispersées dans un liquide biologiquement acceptable, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: optionellement, stérilisation du polymère, addition d'un tampon de préparation à un polymère, ledit polymère étant insoluble dans le tampon de préparation, ionisation d'un principe actif dans de l'eau distillée ou dans un tampon aqueux, formation de la préparation (ou salification ) par mise en présence du principe actif et du polymère lorsque le pH du tampon de préparation est inférieur au point isoélectrique (IpH) du principe actif, par fixation du principe actif dont la charge de surface globale est positive sur le polymère dont les groupements fonctionnels sont négatifs, ou lorsque le pH du tampon de préparation est supérieur au point isoélectrique (IpH) du principe actif, par fixation du principe actif dont la charge de surface globale est négative sur le polymère dont les groupements fonctionnels sont positifs, et optionellement, lavage de la préparation. La stérilisation du polymère peut être obtenue par tout procédé approprié connu de l'homme du métier, notamment par autoclavage. De préférence, la stérilisation du polymère est obtenue par autoclavage à une température comprise entre 100 C et 20 25 150 C, de préférence entre 110 C et 130 C, et manière encore préférée à 121 C, pendant environ 30 minutes. D'autre part, la solution de principe actif est de manière optionnelle préalablement filtrée sur une membrane poreuse, de préférence ayant une porosité comprise entre 0,1 m et 2 m, de manière encore préférée entre 0,2 am et 0,5 m, et de manière préférée entre toutes de 0. 22 m. Un polypeptide possède une charge globale due aux acides aminés chargés qui le composent en fonction du pH du milieu (voir Tableau N I ci-dessous). L'IpH est le pH pour lequel le polypeptide a une charge nette égale à 0. Par exemple, à pH 7.0, la charge de l'acide aminé aspartate (pK: 3.9) est négative, la charge de la cysteine (pK: 8.3) est neutre et la charge de l'arginine (pK: 12.5) est positive. Tableau N I: Charge des acides aminés ionisables à pH 7 Acides aminés chargés pK Charge à pH 7.0 Aspartate 3.9 Négative Glutamate 4.2 Négative Histidine 6.0 Neutre Cystéine 8.3 Neutre Tyrosine 10.1 Neutre Lysine 10.5 Positive Arginine 12.5 Positive Au regard des charges ioniques de polypeptides existants, 85% des polypeptides à pH 7.0 sont chargés négativement et inversement 15% des polypeptides à pH 7.0 sont chargés positivement. D'une manière générale, un polypeptide se fixera à une résine échangeuse de cations chargée négativement si le pH du milieu de préparation est plus bas que le point iso électrique (IpH) du polypeptide, et se fixera à une résine échangeuses d'anions chargée positivement si le pH est supérieur au IpH. Le pH de stabilité optimal d'un polypeptide est au environ de pH 7.0. Quand la préparation selon l'invention (ou résinate de polypeptides ) est exposée aux fluides physiologiques, le principe actif est libéré du résinate par un mécanisme d'échange d'ions. Le taux de libération du principe actif de la préparation selon l'invention dépend de plusieurs facteurs, comme par exemple, mais la liste n'est pas limitative, la taille des microparticules, le pK des groupements fonctionnels ionisés du polymère, le cas échéant, la nature et le degré de réticulation des chaînes polymériques de la résine échangeuse d'ions, la solubilité du principe actif dans les fluides physiologiques, la liaison ionique (qui peut être partielle ou totale), le pH des fluides physiologiques, le pK du principe actif, la MM du polymère et celle du principe actif. La propriété d'un polypeptide qui gouverne son adsorption sur une résine échangeuse d'ions est sa charge nette de surface (voir Figure 2). Comme la charge de surface est la résultante des groupements fonctionnels acides et basiques du principe actif l'adsorption sur la résine est hautement pH sensible. En partant d'un faible pH vers un pH élevé, la charge nette du polypeptide varie d'une charge positive à une charge négative. La connaissance du point isoélectrique (IpH) du polypeptide est donc absolument nécessaire dans la conception des méthodes de préparation des résinates de polypeptides. Les résinates de polypeptides ainsi formés sont lavés et conditionnés pour leur utilisation. A aucun moment du procédé, les résines échangeuses d'ions sont solubilisées dans le milieu de préparation. De préférence, les microparticules du polymère sont préalablement stérilisées par autoclavage à 121 C pendant 30 minutes dans de l'eau distillée ou dans un tampon. Choix de la résine échangeuse d'ions en fonction de la nature du polypeptide Les polypeptides sont fixés sur la résine échangeuse d'ions quand les groupements fonctionnels de la résine portent des charges opposées au polypeptide. La fixation du polypeptide sur la résine est réversible. Par exemple, l'IpH de la protéine ovalbumine est de 4,5. Il faudra utiliser pour la réaction de fixation, une résine échangeuse d'anions chargée positivement à un pH supérieur au IpH, c'est- à-dire à partir de 5, où la protéine est chargée négativement. Dans ce cas, une résine échangeuse d'anions de type Sephadex QAE-50 est utilisable. La résine Sephadex QAE-50 possède des groupements fonctionnels aminés [ NH4] / [ Ni caractérisés par un pKa élevé de 12. A un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements fonctionnels de la résine se présenteront majoritairement sous forme ionisée [ NH+]. A un pH supérieur au pKa les groupements fonctionnels de la résine sont non ionisés. Le choix de la résine s'effectue en fonction de la stabilité du polypeptide aux conditions de pH de fixation et du type de formes à libération contrôlée souhaités. Avec cette même protéine, il est possible d'utiliser une résine échangeuse de cations chargée négativement mais à un pH de réaction inférieur au IpH, c'est-à-dire en dessous de 4. Dans ce cas une résine échangeuse de cations de type Sephadex SP C-50 est indiquée. La résine Sephadex SP C-50 possède des groupements fonctionnels sulfonates [ SO 3 -] / [ SO 3H] caractérisés par un pKa très bas de l'ordre de 2,5. A un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements fonctionnels de la résine se présenteront majoritairement sous forme non ionisée acide [ SO 3H]. A un pH supérieur au pKa les groupements fonctionnels de la résine sont ionisés. En résumé : - Si le polypeptide est plus stable en dessous de son IpH, il faudra utiliser en formulation une résine échangeuse de cations. - Si le polypeptide est plus stable au dessus de son IpH, il faudra utiliser en formulation une résine échangeuse d'anions. - Si le polypeptide est stable sur une large gamme de pH, tous les types de résines peuvent être utilisées. Choix du type de tampon pour la réaction de fixation du polypeptide sur la résine: Si les ions du tampon utilisé comme milieu de préparation du résinate possèdent une charge opposée à ceux des groupements fonctionnels de la résine, ils participeront au phénomène d'échange d'ions et provoqueront des variations locales de pH. Il est donc nécessaire d'utiliser des tampons contenant des ions de même charge, positive ou négative, que les groupements fonctionnels de la résine. Capacité de gélification des résines échangeuses d'ions: Les résines échangeuse d'ions de type Sephadex sont insolubles dans la plupart des solvants. Elles sont stables dans l'eau, les solutions salines, les solvants organiques, dans les solutions acides et basiques. Dans les solutions fortement basiques, une hydrolyse des liaisons glycosidiques peut se produire et donc en formulation, un pH d'utilisation au dessus de 2 est recommandé. L'exposition aux agents très oxydants ou à des dextranases doit être évitée. Les microparticules de résines seules ou les résinates de polypeptides sont susceptibles de gonfler en présence d'eau pour former des gels. Cette propriété est directement mise en application pour les formulations par voie parentérale. A cause de la présence de groupements fonctionnels chargés, la capacité de gélification varie en fonction de la force ionique et du pH du solvant de préparation. Les résines échangeuse d'ions de type Sephadex ne doivent pas être mises à gonfler dans de l'eau distillée car la structure des billes peut être brisée par les fortes interactions ioniques entre les molécules. Les résines Sephadex QAE et SP ont des propriétés de gélification indépendantes du pH car elles sont ionisées dans une très large gamme de pH. Le degré de gélification diminue quand la force ionique augmente. L'injection de ces gels grâce à des systèmes classiques de seringues et aiguilles est particulièrement facile, même par voie sous cutanée. Les résines échangeuse d'ions peuvent être stérilisées par autoclavage à 121 C pendant 30 minutes à pH neutre sans mise en cause de l'intégrité physique des billes microscopiques. Capacité de fixation du polypeptide en fonction de la nature de la résine échangeuse d'ions: Les résines échangeuses d'ions dérivées du Sephadex G-25 sont plus finement réticulées que celles basées sur le Sephadex G-50 et par conséquent vont moins gonfler et vont être plus rigides. Les résines dérivées du Sephadex G-50 sont plus poreuses et présentent une meilleure capacité de fixation pour les polypeptides de masse moléculaire importante (supérieure à 20000 daltons). Dans la littérature, une limite d'exclusion de 1 million de daltons est admise pour les résines échangeuse d'ions de type Sephadex. Application industrielle des résinates de polypeptides: libération in vivo du polypeptide à partir d'un résinate: Cas d'une administration par voie parentérale d'un peptide (IpH: 4,5) La forme pharmaceutique est un gel stérile aqueux plus ou moins compact ou un lyophilisat, injecté par voie sous cutanée ou intra musculaire. Le peptide est formé d'une dizaine d'acides aminés dont le IpH est d'environ 4,5. La résine échangeuse d'ions employée pour la préparation du résinate est une résine échangeuse d'anions de type QAE 50 qui possède des groupements fonctionnels aminés. Le résinate de peptide a été préparé dans une solution tampon aqueuse de Tris (hydroxy méthyl) amino méthane à force ionique 0,05 M à un pH compris entre 6 et 7,5 et de préférence à pH physiologique 7,2. Après injection dans le muscle, le gel va progressivement s'hydrater. Le pH du milieu est supérieur au IpH du peptide. Le peptide est chargé négativement et reste fortement fixé à la résine échangeuse d'anions chargée positivement. Le résinate de polypeptide gélifié reste sous forme d'un sel insoluble dans le milieu. Au cours du temps, les microparticules de résines qui agissent comme réservoir de principe actif vont permettre une dissociation du résinate qui va libérer le peptide par un mécanisme d'échange d'ions de manière programmée en fonction des paramètres de formulation (diamètre moyen, masse moléculaire, degré de réticulation,....). Selon un mode particulier de réalisation, le procédé de fabrication selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend en outre, après l'étape de formation de la préparation, une étape de coacervation aqueuse par mise en présence de la préparation avec un poly ester de type de homo- ou copolymère de l'acide lactique et/ou glycolique, de préférence dissous dans un solvant polaire de type PEG 400. De préférence, le poly ester de type de homo- ou copolymère de l'acide lactique et/ou glycolique est un copolymère de l'acide lactique et glycolique (PLGA). En effet, le présent inventeur a découvert qu'il est possible de former des microcapsules de manière extemporanée juste après l'obtention de la préparation. Du fait de l'insolubilité de la préparation selon l'invention ( résinate de polypeptide ), la coacervation en milieu aqueux est possible (voir Exemple 5). Les techniques de microencapsulation par évaporation de solvant ou de coacervation pour les peptides et les protéines habituellement très solubles dans l'eau sont réalisées en milieu organique au moyen d'un solvant apolaire de type acétone, chlorure de méthylène, acétonitrile, (Okada H. et al., J Pharm Exp Tech, 1988, 244:744-750; brevet US 4,673, 595, Debiopharm, 1991, Orsolini et al.). En plus d'être difficilement transposable industriellement et de la présence de solvants résiduels, ces techniques peuvent affecter la qualité des peptides et les protéines encapsulées (Sah H., P:rotein instability toward organic/water emulsification: implications for protein microencapsulated into microspheres , PDA, J Pharm Sci Technology, 53:310,1999). Dans la présente invention, les homo ou copolymères de l'acide lactique et/ou glycolique (PLGA) sont solubilisés dans un solvant polaire biocompatible de type PEG 400. Par simple mélange du gel aqueux des microparticules portant des groupements fonctionnels formant une liaison ionique avec le principe actif et la solution de PLGA dans le PEG 400, des microcapsules sont formées par coacervation aqueuse du PLGA, le PEG 400 étant miscible à l'eau. Les avantages de cette technique sont nombreux: Du fait de la liaison ionique forte entre le principe actif et les groupements fonctionnels des microparticules, l'efficacité de la microencapsulation dans l'eau est très significative (de plus de 80%). - Le burst effect classiquement observé avec les systèmes matriciels est réduit du fait de la liaison ionique. La préparation des microcapsules est extemporanée. Il n'y a pas besoin de matériel ou de réacteur de microencapsulation spécifique. Bonne injectabilité et tolérance de la préparation en majorité composée de solvant aqueux. Fabrication aseptique après stérilisation des matières premières. Les figures et exemples qui suivent permettent de mieux décrire l'invention, mais n'en limitent aucunement la portée. FIGURES Figures lA et 1B: Charges des résines échangeuses d'ions en fonction du pH du milieu. Les propriétés ioniques des résines sont dépendantes du pH du milieu. Les résines doivent être suffisamment chargées pour fonctionner en échange d'ions et permettre une fixation réversible dans la gamme de pH de 4 à 8 où la majorité des polypeptides sont stables. Figure 2: Influence du pH sur la charge nette d'un polypeptide. Un polypeptide se fixera à une résine échangeuse d'ions cationiques chargées négativement dans un tampon si le pH du tampon est plus bas quele point isoélectrique (IpH) du polypeptide, et se fixera à une résine échangeuse d'anions chargées positivement si le pH est plus élevé que le IpH. Figure 3: Dosage du taux de testostérone chez le rat en mmolll après administration par voie sous-cutanée d'un résinate d'analogue de LHRH. Une castration chimique des rats est observée sur une période d'une semaine pour les animaux traités avec un phénomène de rebond après J 15. Figure 4: Fabrication des résinates de polypeptides Les polypeptides chargés négativement remplacent les contre-ions et se lient aux particules de polymère chargé positivement. Les contre-ions sont éliminés dans le tampon. Il y a ainsi formation d'un sel insoluble stable. Figures 5A et 5B: Photographies de particules de résine enrobées dans le coacervat de PLGA 50/50. Cf. Exemple 5. Figure 6: Principe de la coacervation aqueuse EXEMPLES Exemple 1 Il est important de montrer que le polypeptide se fixe sur la résine échangeuse d'ions en fonction des conditions de pH. La méthode suivante basée sur une technique de spectrophotométrie UV/visible a été développée. Le protocole de fixation du polypeptide sur une résine échangeuse d'ions a permis de sélectionner un pH optimal de préparation des résinates de polypeptide. Ce protocole est le suivant: Sélection d'une série de 10 tubes en verre de 15 ml, - Ajout dans chaque tube, de 100 mg de résine échangeuse d'ions puis 10 ml de solution tampon à 0,5M, - Le gel formé est équilibré dans chaque tube par un lavage avec la solution tampon à 0,5M, La résine échangeuse d'ions est laissée au repos pendant 1 heure (phase d'hydratation de la résine), Le gel formé est à nouveau équilibré dans chaque tube par un lavage avec une 15 solution tampon à 0,05 M. Le pH est ajusté dans chaque tube pour obtenir une gamme de pH compatible avec la formation du résinate de polypeptide. Une quantité connue de polypeptide est ajoutée dans chaque tube. - Les tubes sont agités de la même manière suivant un protocole déterminé et le 20 polypeptide est dosé par spectrophotométrie UV/visible à 280 nm dans le surnageant après la réaction de salification. La méthode de dosage suivante a été appliquée: La solution à analyser est placée dans une cuve en quartz de 1 cm et placée dans un spectrophotomètre UV/visible double faisceau (PERKIN ELMER). Les échantillons ont été préalablement filtrés sur des pré filtres membranes de type acétate de cellulose. Les absorbances sont utilisées pour calculer la concentration de polypeptide en fonction d'une gamme étalon préparée à partir de quantités connues d'échantillons. Les résultats de différents dosages effectués avec une protéine modèle, l'ovalbumine, sont donnés dans les exemples 2 et 3 suivants. Les résultats des expérimentations montrent clairement que les résines échangeuses d'ions fixent l'ovalbumine en fonction des conditions de pH du milieu. Les résultats sont exprimés en pourcentages d'ovalbumine fixés sur la résine échangeuse d'ions. Exemple 2 Fixation d'ovalbumine sur une résine échangeuse de cations Sephadex SP C-50. Le protocole de fixation de l'ovalbumine sur la résine échangeuse d'ions est celui décrit dans l'exemple 1. 0,lg de Sephadex SP C-50 sont déposés dans chaque tube en verre de 15ml. 10 ml de solution tampon acétate de sodium 0,5M @Ka: 4,6) sont ajoutés dans chaque tube. La résine échangeuse d'ions Sephadex SP C-50 est laissée au repos pendant 1 heure (phase d'hydratation de la résine). Le gel formé est équilibré dans chaque tube par élimination du surnageant et lavage avec une solution tampon acétate de sodium à 0,05 M. Le pH est ensuite ajusté dans chaque tube pour obtenir une gamme de pH partant de 3, 0 pour le tube N 1 à 7,5 pour le tube N 10 et variant de 0,5 en 0,5. Une même quantité d'ovalbumine soit 4mg, est ajoutée dans chaque tube. Le volume final de solution dans chaque tube est de l'ordre de 8ml. Les tubes sont mélangés au vortex 1 minute à 1400rpm sur un IKA MS2. Un gel floconneux est observé dans les tubes N 1, 2, 3 et dans une moindre mesure dans le tube N 4. Le surnageant de chaque tube après décantation du gel est prélevé par un système de seringue de 5ml (TERUMO) équipé d'aiguille 21G, 0,8x50. Les échantillons, complétés par la solution filtrée d'ovalbumine de départ à 2mg/ml dans le tampon (tube N 11) et la solution tampon filtrée d'acétate de sodium (tube N 12) sont dosés par spectrophotométrie UV/visible suivant la méthode décrite dans l'exemple N 1. Les résultats sont regroupés dans le tableau N II ci-dessous. Tableau N II: Pourcentages d'ovalbumine fixés sur la résine échangeuse de cations Sephadex SP C-50. N de tubes pH de la Absorbance à Pourcentage de baisse Fixation de solution 280 nm d'ovalbumine par tube l'ovalbumine après exprimé en mg / au sur la résine ajustement 4mg de départ Sephadex SP C-50 1 3,0 0,0725 77,9 Fixation 2 3,5 0,1065 67,5 Fixation 3 4,0 0,1125 65,6 Fixation 4 4,5 0,1419 56,7 Fixation 5,0 0,1943 40,7 Fixation partielle 6 5,5 0,2901 11,4 Pas de fixation 7 6,0 0,2935 10,4 Pas de fixation 8 6,5 0,2993 8,6 Pas de fixation 9 7,0 0,3275 0 Pas de fixation 7,5 0,3119 4,7 Pas de fixation 11 4,6 0,3150 3,8 - 12 4,6 0,0523 84 - Une fixation de l'ovalbumine en solution aqueuse est observée pour les pH où la protéine est chargée positivement (pH inférieur au IpH: 4,5) et la résine échangeuse d'ions est chargée négativement (pH supérieur au pKa de la résine soit 2,5). Exemple 3 Fixation d'ovalbumine sur une résine échangeuse d'anions Sephadex QAE-50. Le protocole de fixation de l'ovalbumine sur la résine échangeuse d'ions est celui 10 décrit dans l'exemple 1. 0,lg de Sephadex QAE-50 sont déposés dans chaque tube en verre de 15m1. 10 ml de solution tampon tris (hydroxy méthyl) amino méthane 0,5M (pKa: 8,3) sont ajoutés dans chaque tube. La résine échangeuse d'ions Sephadex QAE-50 est laissée au repos pendant 1 heure (phase d'hydratation de la résine). Le gel formé est équilibré dans chaque tube par élimination du surnageant et lavage avec une solution tampon tris (hydroxy méthyl) amino méthane à 0,05 M. Le pH est ensuite ajustée dans chaque tube pour obtenir une gamme de pH partant de 6,0 pour le tube N 1 à 10,5 pour le tube N 10 et variant de 0,5 en 0,5. Une même quantité d'ovalbumine soit 4mg, est ajoutée dans chaque tube. Le volume final de solution dans chaque tube est de l'ordre de 8m1. Les tubes sont mélangés au vortex 1 minute à 1400rpm sur un IKA MS2. Un gel floconneux est observé dans tous les tubes. Le surnageant de chaque tube après décantation du gel est prélevé par un système de seringue de 5m1(TERUMO) équipé d'aiguille 21G, 0,8x50. Les échantillons, complétés par la solution tampon filtrée de tris (hydroxy méthyl) amino méthane (tube N 11) et la solution filtrée d'ovalbumine de départ à 2mg/ml dans le tampon (tube N 12) sont dosés par spectrophotométrie UV/visible suivant la méthode décrite dans l'exemple N 1. Les résultats sont regroupés dans le tableau N III ci-dessous. Tableau N 111: Pourcentages d'ovalbumine fixés sur la résine échangeuse de cations Sephadex QAE-50. N de pH de la Absorbance à Pourcentage de Fixation de l'ovalbumine tubes solution 280 nm baisse d'ovalbumine sur la résine Sephadex SP après par tube exprimé en C-50 ajustement mg / au 4mg de départ 1 6,0 0,0739 81,0 Fixation 2 6,5 0,0763 80,3 Fixation 3 7,0 0,0729 81,2 Fixation 4 7,5 0,0692 82,2 Fixation 8,0 0,0663 82,9 Fixation 6 8,5 0, 0791 79,6 Fixation 7 9,0 0,0763 80,3 Fixation 8 9,5 0,0645 83,4 Fixation 9 10,0 0,0720 81,4 Fixation 10,5 0,0750 80,7 Fixation 11 8,3 0,0570 85,3 - 12 8,3 0,3883 0 Une fixation de l'ovalbumine en solution aqueuse est observée pour la gamme de pH où la protéine est chargée négativement (pH supérieur au IpH: 4,5) et la résine échangeuse d'ions est chargée positivement (pH inférieur au pKa de la résine soit 12). Exemple 4 Une étude in vivo chez le rat a été menée pour valider le concept de libération à partir d'un résinate de polypeptide. Un sel insoluble à base de Sephadex QAE et d'un analogue de la LHRH a été injecté à des rats mâles. Une diminution significative du taux de testostérone des animaux a été enregistrée sur une période d'une semaine. rats mâles Sprague-Dawley, Cr1 CD (SD) IGS BR, Caesarian Obtained, Barrier Sustained-Virus Antibody Free (COBS-VAF ), ont été achetés au Laboratoires Charles River, France. L'âge des animaux au début du traitement est de 12 semaines. Les rats sont acclimatés pendant 5 jours et groupés par 2 ou 3 par cage. Des conditions habituelles pour l'alimentation en eau et nourriture sont appliquées. Le nombre de groupe d'animaux correspond à un groupe contrôle placebo et un groupe traité. Le nombre d'animaux est de 5 dans chaque groupe. N Groupe Groupes Produits Test Dose peptide pur Nombre d'animaux traités mg / rat 1 Contrôle Placebo 0 5 2 Traité G 001 1 5 Les formulations (suspensions stériles de résinate d'analogue de LHRH) ont été préparées la veille de l'injection et injectées par voie sous cutanée à la dose de 5 m1/kg. La teneur en analogue de la LHRH dans le résinate de décapeptide est de 2% (p/p). La mortalité, la morbidité, les signes cliniques à J1 et une fois par semaine ont été surveillé ainsi que la perte de poids et la consommation de nourriture. Des prélèvements de sang pour chaque animal (0,5m1) sont effectués par le sinus orbital sous anesthésie à l'Isoflurane dans des tubes héparinés au temps suivants: pré dose et J 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28. Les échantillons de plasma sont congelés à -20 C avant envoi à l' Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, pour analyse par radio immuno assay (Sorin). A la fin de la période d'observation, les animaux sont tués par dislocation cervicale sous anesthésie à 1'Isoflurane et le site d'injection est prélevé et les carcasses sont examinées. Les résultats sont regroupés dans le tableau suivant (la moyenne des taux de 5 testostérone enregistrée pour le lot placébo est de 8,83 nmol/L) : Jour 0 Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 7 Jour 14 Jour 21 Jour 28 G001 m 9,5 12,3 4,1 4,4 8,5 14,0 11,3 10,0 SEM 1,15 2,88 1,20 0,57 2,24 4,17 2, 47 2,55 Dosage de testostérone (nmoUL) Une castration chimique des rats est observée sur une période d'une semaine pour 10 les animaux traités avec un phénomène de rebond après J 15 (voir Figure 3). Exemple 5: Essai de micro encapsulation extemporanée d'une résine SEPHADEX SP C50 non chargée en peptide (placebo) à l'aide d'un copolymère de l'acide lactique et glycolique de type PLGA 50/50 (1) Préparation d'une solution de PLGA 50/50, PCAS, lot: 33101N009 dans le 20 PEG 400, ACROS ORGANICS, lot: A020487801 à une concentration de 10% (m/v). a. Pesée du PLGA 50/50: 1,01g b. Dissolution du PLGA dans l0ml de PEG 400 à chaud sous agitation magnétique jusqu'à dissolution complète du PLGA 50/50 qui forme un 25 liquide transparent et visqueux jaune clair. c. Temps d'agitation: 30 minutes, température inférieure à 120 C (2) Préparation du gel hydraté de résine échangeuse d'ions de type SEPHADEX SP C50, ALDRICH CHEMICAL, lot 08402DF. a. Pesée de la résine: 0,046g b. Hydratation de la résine dans 4m1 d'eau purifiée MILLIQ pour former une solution colloïdale homogène. La quantité théorique de résine échangeuse d'ions sèche pour salifier un analogue de LHRH est au minimum de 4mg (hypothèse d'un taux de charge de la résine de 100% et une teneur en peptide dans le sel de 50%). La dose de peptide pur à injecter est de 4 mg pour un mois de traitement. Trois essais de micro encapsulation placebo ont été réalisés avec deux volumes de gel hydraté différents avec ou sans surfactif: (1) Avec 0, 4 ml de gel hydraté de résine ajouté à 2ml de la solution de PLGA 50/50 dans le PEG 400. Il y a formation d'un latex (petites particules en suspension dans le mélange d'aspect laiteux. Pas de précipité massif mais l'essai d'injectabilité avec une seringue et aiguille TERUMO 20G xl, 0, 9x25 est non satisfaisant. Au microscope optique, observation d'agglomérats plus ou moins importants. (2) Avec 0,4 ml de gel hydraté de résine ajouté à 2ml de la solution de PLGA 50/50 dans le PEG 400 mélangé avec du polysorbate 80 (TWEEN 80). Il y a formation d'un latex homogène et stable (très petites particules en suspension dans le mélange d'aspect laiteux. Pas de precipité massif. L'essai d'injectabilité avec une seringue et aiguille TERUMO 20G xl, 0,9x25 est correct. (3) Avec 0,8 ml de gel hydraté de résine rajouté à 2m1 de la solution de PLGA 50/50 dans le PEG 400. Il y a formation d'un latex (très petites particules en suspension dans le mélange d'aspect laiteux. Pas de precipité massif. L'essai d'injectabilité avec une seringue et aiguille TERUMO 20G xl, 0,9x25 est bon mais plus difficile avec une aiguille TERUMO 21Gx2/0,8x50 plus fine. Le transfert du latex dans un bain d'eau MILLIQ et de TWEEN 80 (volume 20ml) aboutit à la formation des microbilles de résines enrobées de PLGA 50/50. Ces essais démontrent qu'il est possible de former des microcapsules de manière extemporanée directement dans le conditionnement final juste avant l'injection en SC ou IM. Le latex observé est du à une désolvatation du PLGA 50/50 à partir du PEG 400 qui forme un coacervat en suspension dans le mélange des deux solvants (le PEG 400 se mélange progressivement à l'eau purifiée). Les particules de résine sont entièrement enrobées par le coacervat de PLGA 50/50 (voir Figures 5A et 5B). Il est possible d'injecter directement le latex par voie SC ou IM. 2880272 35 Revendications 1. Préparation pour la libération prolongée in vivo d'un principe actif, ladite préparation comprenant des microparticules d'un polymère insoluble, biologiquement acceptable et portant des groupements fonctionnels formant une liaison ionique avec le principe actif; lesdites microparticules étant dispersées dans un liquide biologiquement acceptable. Préparation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polymère est une résine polymérique de nature polysaccharidique. Préparation selon la revendication 2, caractérisée en ce que la résine polymérique de nature polysaccharidique est du type dextran. Préparation selon la revendication 3, caractérisée en ce que le dextran possède une masse moléculaire comprise entre 3 Kdaltons et 2000 Kdaltons. Préparation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le principe actif est un polypeptide. Préparation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le polypeptide est une hormone, un facteur de coagulation, un facteur neurotrophique ou un facteur de croissance. Préparation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le polypeptide est l'hormone de libération de l'hormone de lutéinisation (LHRH) ou l'un de ses analogues. Préparation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la préparation est soit hydratée soit déshydratée. 2. 3. 1.5 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Préparation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les microparticules sont incorporées dans une matrice d'un polymère biodégradable et biocompatible de type microsphère ou implant. Préparation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que les microparticules sont recouvertes d'une enveloppe d'un polymère biodégradable et biocompatible et forment des microcapsules. Préparation selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que le polymère biodégradable et biocompatible est un poly ester de type de homoou copolymère de l'acide lactique et/ou glycolique. Préparation selon l'une quelconque des revendications précédentes destinée à être utilisée en tant que médicament. Préparation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est administrée par voie parentérale, orale, rectale, ou vaginale. Procédé de fabrication d'une préparation pour la libération prolongée in vivo d'un principe actif, ladite préparation comprenant des microparticules d'un polymère insoluble, biologiquement acceptable, et portant des groupements fonctionnels formant une liaison ionique avec le principe actif, lesdites microparticules étant dispersées dans un liquide biologiquement acceptable, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: - optionellement, stérilisation du polymère, addition d'un tampon de préparation à un polymère, ledit polymère étant insoluble dans le tampon de préparation, ionisation d'un principe actif dans de l'eau distillée ou dans un tampon 30 aqueux, formation de la préparation par mise en présence du principe actif et du polymère lorsque le pH du tampon de préparation est inférieur au point isoélectrique (IpH) du principe actif, par fixation du principe actif dont la charge de surface globale est positive sur le polymère dont les groupements fonctionnels sont négatifs, ou lorsque le pH du tampon de préparation est supérieur au point isoélectrique (IpH) du principe actif, par fixation du principe actif dont la charge de surface globale est négative sur le polymère dont les groupements fonctionnels sont positifs, et optionellement, lavage de la préparation. 15. Procédé de fabrication selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, après l'étape de formation de la préparation, une étape de coacervation aqueuse par mise en présence de la préparation avec un poly ester de type de homo- ou copolymère de l'acide lactique et/ou glycolique. 16. Procédé de fabrication selon la revendication 15, caractérisé en ce que le poly ester de type de homo- ou copolymère de l'acide lactique et/ou glycolique est un copolymère de l'acide lactique et glycolique (PLGA).