FR 2873819 A1 20060203 FR 0507782 A 20050721 DETECTION DE LA TUBERCULOSE ET DE L'INFECTION PAR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS A L'AIDE DE HBHA La présente invention porte sur des méthodes de détection in vitro de l'infection par Mycobacterium tuberculosis chez les mammifères et des méthodes de distinction in vitro entre des mammifères infectés par Mycobacterium tuberculosis pour lesquels la maladie est déclarée (forme active) et des mammifères infectés mais asymptomatique pour la tuberculose (forme latente), ainsi qu'une méthode de distinction in vitro I o entre des mammifères présentant une forme active de tuberculose et des mammifères ne présentant pas de tuberculose ou présentant une forme latente de tuberculose. La présente invention rapporte aussi des kits de détection et de distinction entre des mammifères infectés et présentant les symptômes de la tuberculose et des mammifères infectés et n'ayant pas développé la maladie, et un kit de distinction entre des mammifères présentant une forme active de tuberculose et des mammifères ne présentant pas de tuberculose ou présentant une forme latente de tuberculose. La tuberculose est une maladie bactérienne qui touche principalement les poumons (tuberculose pulmonaire) bien que d'autres parties du corps puissent également être touchées, telles que les ganglions lymphatiques, la plèvre (espace pleural), les articulations, les os, le tractus génitourinaire, les méninges, le péritoine, le tractus gastro-intestinal, le système nerveux central, les surrénales ou le péricarde (tuberculose extrapulmonaire). La tuberculose est transmise par voie aérienne, par exposition aux germes présents dans la salive et les expectorations pulmonaires (par exemple lors de toux ou éternuements) d'un mammifère porteur de la maladie ou par contact avec les lésions. Les symptômes de la tuberculose sont la fièvre, les sueurs nocturnes, la fatigue, la perte de poids, la perte d'appétit et une toux persistante. En 2004, la tuberculose représente toujours un problème majeur de santé publique puisqu'elle est responsable de plus de deux millions de décès par an dans le monde et qu'un tiers de la population mondiale est infecté par l'agent responsable, Mycobacterium tuberculosis, couramment dénommé bacille de Koch ou BK. La tuberculose est ainsi la deuxième cause de mortalité par maladie infectieuse, juste derrière l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (1). Pour cette raison, tant l'Organisation Mondiale de la Santé que la Communauté Européenne ont fait de la recherche dans ce domaine une de leur priorité. Trois objectifs principaux ont été définis: a) la prévention par la mise au point d'un vaccin qui serait plus protecteur que le vaccin actuel, le BCG (bacille de Calmette et Guérin); b) l'amélioration des moyens de diagnostic rapide de la tuberculose, et c) la découverte de traitements de moins longue durée facilitant l'administration et évitant ainsi le développement de souches de 20 bactéries multi-résistantes. La détection inadéquate des nouveaux cas de tuberculose a été identifiée comme raison majeure de l'augmentation mondiale du nombre de cas de tuberculose (2). L'examen microscopique et la culture des expectorations sont reconnus comme deux bons moyens de diagnostic de la tuberculose pulmonaire. Cependant, le résultat des cultures de mycobactéries n'est interprétable qu'après 6 à 8 semaines, et les pays en voie de développement n'ont pas toujours accès aux infrastructures nécessaires pour cette technique, ce qui limite fortement l'utilité de la culture comme test diagnostique de première intention (3). La mise en 3o évidence dans les expectorations de bacilles acido-résistants reste donc le test le plus utile pour un diagnostic rapide de tuberculose pulmonaire, mais l'identification n'est malheureusement positive que dans 50 à 60 % des cas de tuberculose pulmonaire, et ceci est en partie lié au fait qu'il faut 5.000 à 10.000 bacilles par pl d'expectoration pour que ce test soit positif (3). Le diagnostic de la tuberculose pulmonaire est encore plus difficile chez l'enfant qui, lorsqu'il est jeune, expectore rarement, et chez qui une aspiration gastrique est fréquemment collectée. Cependant, l'examen direct de ces échantillons est positif chez moins de 20 % des enfants ayant une tuberculose prouvée, ce qui est encore beaucoup plus faible que les résultats obtenus chez l'adulte (4). Enfin, le diagnostic de la tuberculose I o extra-pulmonaire, plus fréquent chez l'enfant que chez l'adulte, est toujours difficile à poser. II est souvent en grande partie basé sur l'examen anatomo-pathologique de biopsies. L'aspect histologique classique de la tuberculose est la présence de granulomes avec nécrose caséeuse. Le granulome est constitué d'histiocytes, de cellules épithélioides et/ou de cellules géantes de type Langerhans. Cependant, tant au niveau des ganglions lymphatiques que des prélèvements pulmonaires, un certain nombre de diagnostics différentiels sont à évoquer comme des infections (mycobactéries non tuberculeuses, mycose,...), ou des maladies non infectieuses (sarcoïdose, maladie de Wegener,...) (5). Pour valider le diagnostic de tuberculose, il faut compléter l'examen histologique par la réalisation de colorations spéciales comme la coloration de Ziehl-Nielsen qui utilise les propriétés alcoolo-acidorésistantes de M. tuberculosis. Mais une quantité de 106 organismes par millimètre de tissu est nécessaire pour obtenir une coloration de Ziehl-Nielsen positive (6). Finalement, le diagnostic est encore souvent basé sur l'ensemble des données cliniques, radiologiques et sur les résultats du test cutané d'hypersensibilité retardée à la tuberculine (purified protein derivative ou PPD). Ce dernier test ne permet cependant pas aisément de différencier les individus infectés par M. tuberculosis de ceux qui ont été 3o vaccinés par le BCG, et les réactions croisées avec des mycobactéries de l'environnement le rendent peu spécifique. Ce test, qui est basé sur la mise en évidence d'une réponse d'immunité cellulaire, a par ailleurs une faible sensibilité chez les personnes immunodéficientes. Enfin, si dans une population de personnes non vaccinées, il permet d'identifier les personnes qui sont infectées par M. tuberculosis, malheureusement, il ne permet pas _ de différencier les individus présentant une tuberculose latente (sans symptômes) de ceux qui présentent une pathologie active. En effet, seuls 5% à 10 % des individus infectés par M. tuberculosis développent une maladie alors que les autres sont protégés contre la maladie même s'ils sont infectés (7). L'utilité pratique de ce test est donc extrêmement limitée. w Plus récemment, des techniques de biologie moléculaire ont été développées afin de mettre en évidence la présence de M. tuberculosis par des techniques de PCR (polymérase chain reaction). Ces techniques ont une bonne sensibilité (95 %), mais ceci est surtout vrai sur des échantillons d'expectoration dont l'examen direct est positif. Leur spécificité est par contre excellente (98 %) ce qui permet de distinguer M. tuberculosis d'autres mycobactéries. Cette technique est cependant fort onéreuse limitant son application. II apparaît dès lors urgent de développer de nouveaux moyens de diagnostic rapide de la tuberculose. L'une des voies d'approche possible consiste à tirer partie des différences de réponses immunitaires susceptibles d'exister entre sujets non infectés et individus infectés, selon qu'ils sont malades ou non. Différents tests qui se basent sur l'étude de la sécrétion d'IFN-y induite dans les lymphocytes circulants par des antigènes mycobactériens ont ainsi été rapportés dans la littérature (8). L'analyse de la sécrétion d'IFN-y, induite par la tuberculine, mélange complexe d'antigènes mycobactériens, présente cependant les mêmes limitations que son utilisation pour des tests cutanés. En effet, tous les individus sensibilisés, qu'ils soient malades ou non ainsi que les personnes sensibilisées aux antigènes présents dans certains mycobactériens _,o atypiques ou simplement dans le BCG vont répondre. L'avantage de ce test par rapport aux tests cutanés est que l'analyse de la réponse lymphocytaire en parallèle à un témoin positif (la phytohémagglutinine) permet de détecter les patients qui ne répondent pas à la PPD du fait d'une immunodéficience sévère. Des antigènes spécifiques de M. tuberculosis ont ensuite été isolés et utilisés dans des tests de sécrétion d'IFN-y in vitro et la spécificité de ces tests était évidemment nettement supérieure. On peut retenir parmi ces antigènes essentiellement l'ESAT-6 et le CFP10, mais il faut cependant constater que la discrimination obtenue par ces antigènes entre sujets infectés malades ou non est toujours loin d'être parfaite (9). L'étude des réponses immunitaires de l'homme à l'égard de la "heparin binding haemagglutinin" (HBHA) apporte une excellente discrimination entre les personnes infectées, malades et non malades. La HBHA est une adhésine qui exprimée à la surface des bactéries faisant partie du Mycobacterium complex, et non à la surface des bactéries non pathogènes telles que M. smegmatis (10). Cette protéine est sécrétée par M. tuberculosis et est responsable de la dissémination de l'infection (11). La HBHA possède un domaine C-terminal méthylé et exprimé en surface alors que la partie N-terminale, non méthylée, sert à l'ancrage de l'adhésine dans la paroi mycobactérienne (12). Cette méthylation est importante non seulement pour l'induction des réponses immunitaires chez l'homme mais aussi pour l'induction d'une réponse immunitaire protectrice chez la souris (13). II a été précédemment montré que la sécrétion d'IFN-y induite dans les lymphocytes circulants par une stimulation in vitro par la HBHA était différente selon que les personnes infectées par M. tuberculosis étaient malades ou non (14). Alors que l'IFN-y est sécrété par les lymphocytes périphériques de la plupart des patients non malades en réponse à la HBHA, seule une minorité de patients tuberculeux répondent à cet antigène par une sécrétion d'IFN-y. Cependant, la discrimination entre ces deux groupes d'individus sur la base de ce paramètre était tout à fait insuffisante pour en faire un test diagnostique. Un objet de la présente invention est de fournir des méthodes de détection in vitro de Mycobacterium tuberculosis chez les mammifères. Un autre objet de la présente invention est de fournir des méthodes de distinction in vitro entre les mammifères infectés par Mycobacterium tuberculosis dans lesquels la maladie est déclarée et les mammifères infectés mais ne développant pas la tuberculose, ainsi qu'une méthode de distinction in vitro entre des mammifères présentant une forme active de tuberculose et des mammifères ne présentant pas de tuberculose ou présentant une forme latente de tuberculose Iii Enfin, un autre objet de l'invention est de fournir des kits qui contiennent tous les éléments nécessaires à la détection de M. tuberculosis et permettant de distinguer les patients infectés qui expriment la maladie (tuberculose active) des patients infectés et asymptomatiques (tuberculose latente) et un kit de distinction entre des mammifères présentant une forme active de tuberculose et des mammifères ne présentant pas de tuberculose ou présentant une forme latente de tuberculose L'invention a aussi pour objet l'utilisation de HBHA, dans sa forme native ou recombinante dans un test pour détecter l'infection par Mycobacterium tuberculosis et pour distinguer entre des patients présentant une forme latente de tuberculose et des patients présentant tous les symptômes de la tuberculose et étant malades. Ces objets et autres objets sont concrétisés par la présente invention, comme démontré dans le résumé de l'invention, la description des modes de réalisation préférés et les revendications. Résumé de l'invention La présente invention décrit une méthode in vitro permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose latente d'un mammifère présentant une tuberculose active, ladite méthode comprenant (a) obtenir un échantillon biologique dudit mammifère, (b) mesurer la quantité d'anticorps (IgG) dirigés contre deux formes distinctes de la protéine HBHA, et contenus dans le dit échantillon biologique et (c) comparer les titres d'anticorps obtenus pour les deux formes de la protéine Ici HBHA, dans laquelle la comparaison des titres d'anticorps obtenus pour les deux formes distinctes chez le mammifère présentant une tuberculose latente est différente de celle obtenue chez le mammifère présentant une tuberculose active. Entre également dans le champ de l'invention, un kit permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose latente d'un mammifère présentant une tuberculose active, ledit kit comprenant deux formes distinctes de HBHA choisies parmi le groupe constitué de (a) l'HBHA native et I'HBHA recombinante, ou (b) le fragment rHBHAAC et le fragment C terminal méthylé de l'HBHA, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique entre les anticorps contenus dans l'échantillon biologique dudit mammifère et les formes distinctes de HBHA et les réactifs permettant la détection des complexes immunologiques formés lors de la susdite réaction immunologique. L'invention concerne également une méthode in vitro permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose latente d'un mammifère présentant une tuberculose active, ladite méthode comprenant (a) obtenir un échantillon biologique dudit mammifère, (b) mettre en contact, de façon indépendante, ledit échantillon biologique avec la forme native de HBHA et avec ESAT-6, (c) mesurer la sécrétion d'IFN-y spécifique de HBHA et spécifique de ESAT-6 et (d) calculer le rapport entre la sécrétion d'IFN-y spécifique de HBHA, et la sécrétion d'IFN-y spécifique de ESAT-6, dans laquelle ledit rapport obtenu chez un mammifère présentant une tuberculose latente est supérieur au rapport obtenu chez un mammifère présentant une tuberculose active. Fait également partie de l'invention, un kit permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose latente d'un mammifère présentant une tuberculose active, ledit kit comprenant la forme native de HBHA et de l'ESAT-6, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la mise en contact, de façon indépendante, des cellules présentes dans l'échantillon biologique dudit mammifère avec l'HBHA native et l'ESAT-6 et les réactifs permettant la détection de la sécrétion d'IFN-y, suite à la mise en contact. L'invention porte également sur une méthode in vitro permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose active d'un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente, ladite méthode comprenant (a) obtenir un échantillon biologique issu des sites locaux d'infection dudit mammifère, (b) mettre en contact ledit échantillon biologique avec la forme native ou recombinante de HBHA et (c) mesurer l'effet de cette mise en contact sur ?u l'IFN-y spécifique de HBHA, dans laquelle l'effet sur l'IFN-y spécifique de HBHA est plus important chez un mammifère présentant une tuberculose active que chez un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente. L'invention définit également un kit permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose active d'un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente, ledit kit comprenant la forme native ou recombinante de HBHA, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la mise en contact des cellules présentes dans l'échantillon biologique 0 dudit mammifère avec I'HBHA et les réactifs permettant la détection de l'IFN-y, suite à la mise en contact. 9 DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 concerne des titres en IgG spécifiques de la nHBHA chez les patients tuberculeux (TB) et les sujets présentant une tuberculose latente (PI). Les rectangles représentent les 25emes et 75emes percentiles. Les lignes verticales représentent les valeurs maximales. Aucune différence significative n'a été observée entre ces deux populations (p > 0,05). Io La figure 2 représente le comparatif des titres en IgG spécifiques de nHBHA versus rHBHA chez les patients tuberculeux (TB) et les sujets présentant une forme latente de tuberculose (PI). La figure 2A montre que chez les sujets présentant une tuberculose latente, les lgG reconnaissent mieux la forme native méthylée de la HBHA que la forme recombinante (rHBHA) (p = 0,0015) alors que chez les patients tuberculeux (figure 2B), cette différence n'est pas significative (p > 0,05). La figure 3 illustre le comparatif des titres en IgG spécifiques de rHBHAAC versus fragment C de HBHA (C-peptide) chez les patients tuberculeux (TB) 2o et les sujets présentant une forme latente de tuberculose (PI). La figure 3A montre que les patients tuberculeux ont des IgG qui reconnaissent préférentiellement la forme recombinante tronquée (rHBHAAC), alors que les IgG des sujets présentant une tuberculose latente ne reconnaissent pratiquement pas cette forme (p = 0,0052). A l'inverse, figure 3B, les IgG des patients tuberculeux ne reconnaissent pas le fragment C-peptide contrairement aux sujets présentant une tuberculose latente (p = 0,0478). La figure 4 illustre la sécrétion d'IFN-y en réponse à la nHBHA chez des; oo sujets contrôles (ctrl; n = 12), les sujets présentant une tuberculose latente récente ( La figure 5 illustre la sécrétion d'IFN-y en réponse à l'ESAT-6 chez les sujets présentant une tuberculose latente (PI) et les patients tuberculeux (TB). Chez les sujets présentant une tuberculose latente, la sécrétion d'IFN-y spécifique induite par l'ESAT-6 est significativement plus importante que celle induite chez les patients tuberculeux. Les médianes se situent à 42, 50 pg/ml d'IFN-g pour l'ESAT-6 chez les patients PI et à 4072 pg/ml d'IFN7 chez les patients TB (p = 0,02). La figure 6 représente le rapport nHBHA/ESAT-6 chez les patients tuberculeux et les sujets présentant une tuberculose latente. Les médianes se situent respectivement à 0,1 pg/ml et à 146,2 pg/ml. Ce ratio est nettement en faveur des sujets présentant une tuberculose latente (p=0,001) et offre une bonne discrimination entre sujets infectés malades et infectés mais non-malades de la tuberculose. La figure 7 illustre l'effet des anticorps bloquant anti-Transforming Growth Factor beta 1, 2, 3 (anti-TGFR) sur la sécrétion d'IFN-y en réponse à la nHBHA par les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) chez les patients tuberculeux. L'IFN-y a été dosé dans les surnageants de culture. Test pairé (Wilcoxon - p = 0,0161; n = 15 paires). La figure 8 représente la comparaison de la sécrétion d'IFN-y en réponse à la nHBHA et à la PPD par les cellules mononucléées du liquide pleural prélevé chez des patients présentant un épanchement pleural d'origine tuberculeuse ou d'une autre origine. L'IFN-y a été dosé dans les 3o surnageants de culture. Les lignes horizontales représentent les médianes. La figure 9 illustre la proportion de lymphocytes T CD3+CD4+ issus de PBMC (PBMC nHBHA) comparés aux lymphocytes T CD3+CD4+ pleuraux (Lympho. Pleuraux nHBHA) et contenant de l'IFN-y intracytoplamsique en réponse à la nHBHA, exprimée en pourcentage de cellules exprimant l'IFN- après stimulation par la HBHA pendant 16 heures moins le pourcentage de cellules produisant l'IFN-y sans stimulation par la HBHA chez des patients tuberculeux (n = 7). Les médianes se situent respectivement à 0, 04 % et 1,23 % respectivement (p = 0,0156; Wilcoxon). La figure 10 représente la proportion de lymphocytes T CD3+CD4+ contenant de l'IFN-y intracytoplasmique en réponse à la nHBHA en cas de tuberculose pleurale (n = 7; médiane = 1,23 %) et en cas d'épanchements pleuraux d'origine non tuberculeuse (n = 2; médiane = 0,18 %). La figure 11 représente la proportion de lymphocytes T CD3+CD4+ (Figure 11A) et celle de CD3+CD8+ (Figure 11B) contenant de l'IFN-y en réponse à une stimulation par la nHBHA. La figure représente des cellules lymphocytaires alvéolaires (alvéole), issu 20 de liquide de lavage brocho-alvéolaire, ou des cellules mononucléées du sang périphérique (sang). Les liquides de lavage broncho-alvéolaire ont été obtenus, soit de patients présentant une tuberculose pulmonaire (TB), soit de sujets contrôles, notamment des sujets présentant une tuberculose latente. Concernant toutes les figures décrites ci-dessus, NS indique que les différences ne sont pas significatives, * indique que les différences sont significatives avec 0,01 Description des modes de réalisation préférés Dans le cadre de la présente demande, le terme "mammifère" désigne tout animal à sang chaud qui est recouvert de pelage ou fourrure, allaite et porte ses petits. Le terme "mammifère" inclut, mais n'est pas limité, à l'humain, les éléphants, les cochons, les chiens, les chats, le bétail, les cervidés, les singes... Bien que Mycobacterium tuberculosis infecte principalement un hôte humain, d'autres mammifères peuvent aussi être atteints par cette maladie bactérienne. Dans ce cas, l'infection par la tuberculose chez les mammifères autres que l'homme est appelée zoonose inverse puisque Mycobacterium tuberculosis peut être transmis de l'homme à l'animal. L'abréviation HBHA signifie "heparin-binding hemagglutinin adhesion" et est une protéine de surface impliquée dans l'adhésion aux cellules épithéliales (numéros d'accession Genbank AF074390 et AAC26052.1). L'identification de la protéine HBHA, sous sa forme native est décrite dans Menzozzi et al. (J. Exp. Med. 184;993-1001 (1996)). HBHA est une protéine de 199 acides aminés dont la partie C terminale, riche en répétitions lysine, contient le site de fixation à l'héparine. Cette protéine est requise pour la dissémination extrapulmonaire de M. tuberculosis (Pethe et al Nature 412:190-194 (2001). La protéine HBHA recombinante (rHBHA) est décrite dans le brevet français FR 01 14953, qui rapporte que contrairement à la protéine HBHA native (nHBHA), la protéine HBHA recombinante n'est pas méthylée sur ses résidus lysines dans la partie C terminal. Le fragment rHBHAAC est décrit dans Pethe et al. (2000 Journal of biological chemistry 275(19): 14273-14280). Ce fragment est dérivé de la protéine HBHA recombinante, pour laquelle les acides aminés 161-199 ont été délétés 3o Le fragment C terminal méthylé comprend les acides aminés 161 à 199 de séquence suivante: KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK (SEQ ID No. 1). Toutes les références citées ci-dessus sont incorporées ici par référence. Dans le cadre de la présente demande, l'abréviation PBMC signifie "peripheral blood mononuclear cells" ou cellules mononucléées du sang périphérique. Les PBMC décrites ici peuvent être obtenues par toute méthode connue dans la littérature. Dans un mode de réalisation de Io l'invention, les PBMC sont obtenues par centrifugation en gradient de densité à partir d'échantillons sanguins veineux en utilisant une solution d'environ 9,1 % (w/v) de diatrizoate sodium et une solution d'environ 5,7 cYo de polysaccharide. Cette solution a une densité d'environ 1,077 0,001 g/ml et une osmolalité de 280 15 mOsm. Cette solution est connue sous le I nom de LymphoprepTM. Les termes tuberculose latente ou Mycobacterium tuberculosis latent ou forme de tuberculose latente sont utilisés dans la présente demande de façon interchangeable, et signifient que le mammifère est infecté par la bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis mais est asymptomatique c'est-à-dire ne développe aucun symptôme de la tuberculose. De plus, le mammifère infecté ne peut propager la tuberculose à d'autres mammifères puisque aucun germe de tuberculose n'est présent dans les expectations. En d'autres termes, le mammifère est infecté mais ne développe pas la maladie. Les différentes formes de tuberculose sont classées comme suit: TBO: pas d'exposition à l'agent de la tuberculose, pas d'infection; 3o TB1: exposition à Mycobacterium tuberculosis, statut d'infection inconnu; TB2: infection par l'agent de la tuberculose, pas de développement de symptômes (réaction positive au test cutané de la tuberculine: PPD positif) ; TB3: forme active de la tuberculose, diagnostic complété ; TB4: forme cliniquement inactive de la tuberculose, forme traitée de façon adéquate ou guérison, et TB5: tuberculose possible, diagnostic en cours ("rule out" TB). Les méthodes et kits décrits dans le cadre de la présente invention permettent de distinguer la forme TB3 de la forme TB2, ainsi que la forme TB3 de la forme TBO, de la classification ci-dessus. L'abréviation PPD signifie "tuberculin protein-purified derivative". Le diagnostic habituel de la tuberculose est généralement réalisé par un test qui implique une exposition intracutanée à la PPD. Ce test est considéré comme positif à la tuberculose, si la réaction cutanée, au lieu d'exposition de la PPD, est supérieure à une certaine taille, par exemple 10 mm ou plus. Le terme "échantillon biologique" tel que défini ici englobe des échantillons respiratoires et non respiratoires. Sont inclus dans les échantillons respiratoires les aspirations bronchiques, les lavages broncho- 2o alvéolaires (LBA), les tubages gastriques et les expectorations. Des exemples d'échantillons non-respiratoires qui peuvent être utilisés dans les procédés de la présente invention incluent des échantillons de liquides d'épanchement tels que liquides pleuraux, d'ascite et articulaires, les liquides cérébraux-spinaux, céphalo-rachidiens, synoviaux, péritonéaux, péricardiaux et autres fluides corporels, des biopsies ganglionnaire, transbronchique, pleurale et hépatique, des ponctions médullaire et lombaire, des échantillons d'urine ou sanguins (PBMC ou cellules mononucléées du sang périphérique), des aspirations de pus... Le terme "à partir du site d'infection" englobe tout échantillon biologique prélevé à partir d'un site d'infection tuberculeuse et englobe tous les prélèvements biologiques mentionnés ci-dessus, et autres. Les méthodes de la présente invention permettent d'une part de détecter in vitro une réponse immune du mammifère infecté à la protéine HBHA de M. tuberculosis, signe d'une infection par cet agent pathogène, et d'autre part de distinguer in vitro, éventuellement en complément de méthodes de diagnostic existantes, les formes latente et active de la tuberculose, en d'autres termes respectivement les formes non-infectieuse et infectieuse. I r) La présente invention concerne une méthode in vitro permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose latente d'un mammifère présentant une tuberculose active, ladite méthode comprenant: a. obtenir un échantillon biologique dudit mammifère b. mesurer la quantité d'anticorps (IgG) dirigés contre deux formes distinctes de la protéine HBHA, et contenus dans le dit échantillon biologique, dans des conditions appropriées permettant la formation de l'interaction anticorps-HBHA, c. comparer les titres d'anticorps obtenus pour les deux formes de la protéine HBHA, dans laquelle la comparaison destitres d'anticorps obtenus pour les deux formes chez le mammifère présentant une tuberculose latente est différente de celle obtenue chez le mammifère présentant une tuberculose active. Cette méthode permet à partir d'un échantillon biologique de mammifère et en utilisant les caractéristiques des réponses immunes dirigées contre la protéine HBHA de M. tuberculosis, spécifiques des différentes formes de tuberculose (active versus latente) de distinguer les mammifères infectés malades ou non. Ainsi, les mammifères présentant une forme de tuberculose latente et ceux présentant une forme de o tuberculose active possèdent des réponses immunes, et notamment une réponse humorale, différentes visà-vis de la protéine HBHA. Les anticorps, tels que les immunoglobulines G (IgG), provenant des mammifères présentant forme de tuberculose latente et ceux présentant une forme de tuberculose active reconnaissent des parties distinctes de la protéine HBHA. Il est alors possible de moduler la structure de la protéine HBHA pour obtenir des formes distinctes de HBHA et permettre de distinguer les formes de tuberculose. Par forme distincte de HBHA on entend, toute modification de la structure de la protéine HBHA dans le nombre (délétion ou addition) et/ou la nature (substitution d'acides Iii aminés de taille, charge, encombrement identique ou différent) de ses résidus d'acides aminés, et/ou toute modification post-traductionnelle telle que l'acétylation, amidation, biotinylation, carboxylation, hydroxylation, méthylation, phosphorylation ou sulfatation ou par l'ajout de lipides (isoprénylation, palmitoylation et myristoylation), de glucides (glycosylation) ou de polypeptides (ubiquitination). Dans le cadre de l'invention, les deux formes sont dites distinctes lorsqu'elles sont reconnues de façon différente par des anticorps de mammifères présentant une forme latente et des anticorps de mammifères présentant une forme active de tuberculose. La titration, c'est à dire la détermination de la quantité, des anticorps (dosages sérologiques) reconnaissant chaque forme d'HBHA est réalisée de manière indépendante, par toute technique connue de l'homme du métier telle que I'ELISA, direct ou indirect (Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay) ou par dosage radio-immunologique (RIA pour radioimmunoassay), en permettant la mise en contact des anticorps contenus dans l'échantillon biologique avec les formes distinctes d'HBHA. De manière indépendante signifie qu'une partie de l'échantillon est mis en contact avec une forme de la protéine HBHA, et qu'une autre partie de l'échantillon est mis en contact avec une seconde forme de la protéine HBHA. La réalisation de la mise en contact entre les anticorps présents 3o dans l'échantillon et les formes d'HBHA permettant leur interaction, ainsi que la détection de cette interaction est réalisée dans des conditions appropriées, connues de l'homme du métier. Ainsi, pourront être modifiées, à titre d'exemple, la technique de couplage de l'antigène (HBHA) sur le support, les dilutions de l'échantillon biologique, les concentrations des formes distinctes de HBHA, la température et la durée de la mise en contact, éventuellement la nature et la concentration des anticorps secondaires, ainsi que les paramètres permettant la détection de l'interaction tels que la réduction du bruit de fond, le choix du marquage (radioactivité, fluorochrome), le temps d'acquisition du signal de détection. A titre d'exemple pour un protocole d'ELISA, les formes Io distinctes de HBHA sont diluées dans un tampon approprié (coating) à une concentration comprise entre 1 et 10 pg/ml et incubés (50 à 200 pI) dans des puits de microplaques, 1 à 6 heures à température ambiante (RT) ou sur la nuit à 4 C. Des solutions tamponnées communément utilisées sont le carbonate de sodium 50 mM, pH 6,9; le Tris-HCI 20 mM, pH 8,5 ou le PBS 10 mM pH 7,2-7, 4. La plaque est ensuite lavée avec une solution de lavage (200 à 300 pl) comprenant du PBS 0,1M ou du TBS pH 7,4 avec un détergent tel que du Triton ou du Tween 20 (0,01 à 0,05% en concentration finale). Une solution de saturation (200 à 300pl), telle que du PBS contenant de la poudre de lait écrémé, de la caséine ou de la gélatine, est ensuite appliquée pour bloquer les interactions non-spécifiques pendant 30 à 60 minutes à 37 ou à température ambiante, puis l'excédent est éliminé après plusieurs lavages. L'échantillon biologique (100 à 200 pI) dilué (du 1 /10eme au 1 /1000ème) est incubé de 30 minutes à 2 heures à 37 C ou à température ambiante ou sur la nuit à 4 C, suivi de plusieurs lavages. On ajoute ensuite les anticorps secondaires (environ 100 pI) dilués dans la solution de saturation, pendant 30 minutes à 2h, à température ambiante ou 37 C. L'excédent est éliminé après plusieurs lavages. Si nécessaire un substrat (100 pl) est ajouté pendant 1 à 5 minutes à l'obscurité à température ambiante puis une solution stop. o Le résultat des titrations permet de comparer les deux valeurs obtenues pour les deux formes distinctes chez un même mammifère. De 2873819 18 telles comparaisons réalisées simultanément chez un ou des mammifère(s) présentant une forme de tuberculose latente et chez un ou des mammifère(s) présentant une forme de tuberculose active donnent des résultats très différents du fait du comportement spécifique de la réponse immune qui a eu lieu dans les mammifères infectés. Il a été précédemment montré dans le brevet français (FR 01 14953) que la protéine HBHA native (nHBHA) se trouvait méthylée sur ses résidus lysines dans la partie C terminal. En revanche, la protéine HBHA recombinante (rHBHA) présentait un statut de méthylation différent puisqu'elle ne possédait pas de telles modifications post-traductionnelles. Ainsi, l'utilisation des formes native et recombinante a montré que les échantillons biologiques de mammifères présentant une forme de tuberculose active contiennent une quantité comparable d'anticorps dirigés contre les formes active et recombinante montrant donc que chez ces mammifères, il y a reconnaissance de la même partie de la protéine (partie N terminale). En revanche, les échantillons biologiques de mammifères présentant une forme de tuberculose latente montrent un titre des anticorps dirigés contre la forme native supérieure au titre des anticorps dirigés contre la forme recombinante, indiquant que chez ces mammifères il y a préférentiellement reconnaissance de la forme native méthylée. Ces résultats permettent donc de distinguer les formes latente et active, par la comparaison des titres d'anticorps dirigés contre les formes native et recombinante. Deux autres formes distinctes de HBHA, utilisées dans le cadre de la présente invention sont le fragment rHBHAAC, représentant la partie N terminale de la protéine (acides aminés 1 à 160), et un fragment C terminal méthylé. La comparaison des titres d'anticorps, issus de 3o l'échantillon biologique, a révélé que chez les mammifères présentant une forme latente de tuberculose, on observe une prédominance des anticorps reconnaissant le fragment C terminal méthylé, tandis que chez les mammifères atteints d'une forme active de tuberculose, on observe une prédominance des anticorps reconnaissant le fragment rHBHAAC. Une telle méthode comprenant la titration des anticorps peut être réalisée sut tout échantillon biologique contenant des IgG. Selon un autre aspect de l'invention, cette méthode est réalisée sur des prélèvements sanguins. L'invention fournit également un kit permettant de détecter et Io de différentier un mammifère présentant une tuberculose latente d'un mammifère présentant une tuberculose active, ledit kit comprenant: - deux formes distinctes de HBHA, telles que décrite ci-dessus, d'une part l'HBHA native et l'HBHA recombinante, et d'autre part le fragment rHBHAAC et le fragment C terminal méthylé de l'HBHA, - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique entre les anticorps contenus dans l'échantillon biologique dudit mammifère et les formes distinctes de HBHA; ces réactifs englobent tout composé nécessaire aux interactions entre l'anticorps et les formes distinctes de HBHA, ainsi que tout composé qui peut augmenter, améliorer ces interactions ou les rendre plus spécifiques, - les réactifs permettant la détection des complexes immunologiques formés lors de la susdite réaction immunologique. Ces réactifs comprennent tout composé permettant de révéler ou détecter la réaction entre l'anticorps et les formes distinctes de HBHA mentionnée ci-dessus. Sont ainsi compris dans ces réactifs, des anticorps secondaires, éventuellement marqués radioactivement ou couplés à des fluorochromes, ainsi que toute molécule permettant d'intensifier ou de moduler le signal de détection. Le kit comprend de façon optionnelle un ou plusieurs tissu(s) ou échantillon(s) biologique(s) de référence, pouvant être utilisé(s) comme témoin négatif (échantillon provenant d'un mammifère non infecté ; stade TBO) ou comme témoin positif (stades TB2 et/ou TB3). L'invention concerne une seconde méthode in vitro permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose latente d'un mammifère présentant une tuberculose active, ladite méthode comprenant: a. obtenir un échantillon biologique dudit mammifère b. mettre en contact, de façon indépendante, ledit échantillon biologique avec la forme native de HBHA et avec ESAT-6, dans des conditions appropriées permettant la sécrétion d'IFNy, c. mesurer la sécrétion d'IFN-y spécifique de HBHA et spécifique de ESAT-6, d. calculer le rapport entre la sécrétion d'IFN-y spécifique de HBHA, et la sécrétion d'IFN-y spécifique de ESAT-6, dans laquelle ledit rapport obtenu chez un mammifère présentant une tuberculose latente est supérieur au rapport obtenu chez un mammifère présentant une tuberculose active. Cette méthode comprend la mise en contact d'un échantillon biologique avec la forme native de HBHA, et de façon indépendante avec ESAT-6 (Early Secreted Antigen Target 6). L'expression de façon indépendante signifie que l'échantillon est mis en contact avec HBHA, et de façon séparée dans l'espace, avec ESAT-6. L'ajout de ces deux molécules à l'échantillon biologique va stimuler les cellules présentes dans ?> le dit échantillon et provoquer la sécrétion de cytokines, telles que l'IFN-y. La mise en contact de l'échantillon avec HBHA et ESAT-6 est réalisée dans des conditions appropriées permettant la sécrétion d'IFN-y. Ainsi, le choix du milieu, le pH et la température du milieu pour la mise en contact, la durée de mise en contact, la dilution de l'échantillon biologique, les concentrations des protéines HBHA pourront être modifiées par l'homme du métier en fonction notamment de la nature de l'échantillon. La sécrétion d'IFN-y est mesurée, par toute technique connue de l'homme du métier telle que l'ELISA, l'ELISPOT, la cytométrie de flux (FACS), la RT-PCR quantitative, suite à la mise en contact de l'échantillon avec HBHA, appelée respectivement IFN-y spécifique de HBHA, et celle suite à la mise en contact de l'échantillon, IFN-y spécifique de ESAT-6. Des modifications pourront être apportées par l'homme du métier concernant notamment les paramètres permettant de détecter la sécrétion d'IFNy, tels que les anticorps, leurs marquages et les conditions d'interaction. Les conditions d'ELISA sont les mêmes que celle décrite ci-dessus, la solution tamponnée contenant un anticorps anti-IFN-y, au lieu de protéines distinctes de HBHA. Un anticorps secondaire dirigé contre l'IFN- y est également utilisé. Le calcul du rapport entre l'IFN-y spécifique de HBHA et l'IFN-y spécifique de ESAT-6 permet de distinguer la forme latente de la forme 1 active de la tuberculose. Ainsi, chez les mammifères atteints de la forme latente, on obtient un rapport très élevé, supérieur à 1, supérieur à 50, supérieur à 100, supérieur à 200 ou supérieur à 300. Ainsi, un rapport compris entre 100 et 400 confirme une forme latente de tuberculose. En revanche, chez les mammifères atteints de la forme active, ce même rapport est très peu élevé et inférieur à 1, inférieur à 0,75 ou inférieur à 0,5. Ainsi, un rapport nul ou inférieur à 0,5 confirme une forme active de tuberculose. Cette seconde méthode sera réalisée sur tout échantillon biologique communément utilisé dans le cadre du diagnostic de la tuberculose tel que des aspirations bronchiques, des lavages bronchoalvéolaires (LBA), des tubages gastriques, des expectorations, des échantillons de liquides d'épanchement tels que liquides pleuraux, d'ascite et articulaires, des liquides cérébraux-spinaux, céphalo-rachidiens, 3oo synoviaux, péritonéaux, péricardiaux et autres fluides corporels, des biopsies ganglionnaire, transbronchique, pleurale et hépatique, des ponctions médullaire et lombaire, des échantillons d'urine ou sanguins et des aspirations de pus. Dans un mode de réalisation de l'invention, cette méthode sera réalisée avec des lymphocytes extraits par toute méthode connue de l'homme du métier de prélèvement sanguin. Dans un autre mode de réalisation, les PBMC sont extraits du sang périphérique. Dans un autre mode de réalisation, la méthode décrite ci-dessus comprend, après l'obtention de l'échantillon biologique et avant la mise en contact dudit échantillon, l'étape supplémentaire de mise en culture de l'échantillon biologique. La culture sera adaptée à la nature de w l'échantillon biologique. La présente invention concerne également un kit permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose latente d'un mammifère présentant une tuberculose active, ledit kit l; comprenant: - la forme native de HBHA et de l'ESAT-6; - les réactifs pour la constitution du.milieu propice à la réalisation de la mise en contact, de façon indépendante, des cellules présentes dans l'échantillon biologique dudit mammifère avec I'HBHA native et l'ESAT-6; 2(i les réactifs englobent ceux décrits ci-dessus dans le kit précédent; - les réactifs permettant la détection de la sécrétion d'IFN-y, suite à la mise en contact. L'IFN-y sécrété sera mesuré par toute technique connue, et peuvent être fournis dans le kit des anticorps primaires spécifiques de l'IFN-y, éventuellement marqués, ou des anticorps secondaires, éventuellement marqués, capables de reconnaître l'anticorps primaire, ainsi que toute molécule permettant d'amplifier ou de moduler le signal de détection. De façon optionnelle, le kit peut comprendre également un ou plusieurs tissu(s) ou échantillon(s) biologique(s) de référence, pouvant être o utilisé(s) comme témoin négatif (échantillon provenant d'un mammifère non infecté ; stade TBO) ou comme témoin positif (stades TB2 et/ou TB3). Dans un autre mode de réalisation, le kit comprend un milieu de culture et tout composé participant à la mise en culture de l'échantillon, avant sa mise en contact avec I'HBHA native ou l'ESAT-6. La présente invention se rapporte également à une troisième méthode in vitro permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose active d'un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente, ladite méthode comprenant: a. obtenir un échantillon biologique issu des sites locaux d'infection dudit mammifère b. mettre en contact ledit liquide biologique avec la forme native ou recombinante de HBHA, dans des conditions appropriées permettant l'obtention d'un effet sur l'IFN-y, c. mesurer l'effet de cette mise en contact sur l'IFN-y spécifique de HBHA, dans laquelle l'effet sur l'IFN-y spécifique de HBHA est plus important chez un mammifère présentant une tuberculose active que chez un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente. Dans le cadre de l'invention, l'expression sites locaux d'infection englobe tout site dans lequel s'établit le pathogène M. tuberculosis et y provoque une infection. Ainsi entrent dans cette définition les poumons, les ganglions lymphatiques, la plèvre (espace pleural), les articulations, les os, le tractus génito-urinaire, les méninges, le péritoine, le tractus gastro-intestinal, le système nerveux central, les surrénales ou le péricarde. Dans cette méthode, tout échantillon d'origine sanguine, ainsi que les PBMC sont exclus. Cette méthode comprend la mise en contact d'un échantillon biologique avec la forme native ou recombinante de HBHA entraînant la 3() stimulation des cellules de cet échantillon. Par HBHA de forme recombinante dans cette troisième méthode, on entend la forme entière de HBHA, non méthylée, telle que celle purifiée à partir de la souche E. col/ (BL21(DE3)(pET-HBHA). L'effet de cette stimulation sur l'IFN-y est ensuite déterminé. Par effet sur l'IFN-y , on entend toute modification quant à l'expression, aussi bien au niveau trancriptionnel (ARNm) ou traductionnel (protéine) de l'IFN-y, quant à sa dégradation, sa maturation (telle que la glycosylation) ou sa sécrétion. La mise en contact de l'échantillon issu de sites locaux d'infection avec HBHA est réalisée dans des conditions appropriées I O permettant l'obtention d'un effet sur l'IFN-y, qui pourront être modifiées par l'homme du métier, telles que le choix du milieu, le pH et la température du milieu pour la mise en contact, la durée de mise en contact, la dilution de l'échantillon biologique, les concentrations de la protéine HBHA. Dans un mode de réalisation de l'invention, on mesure la quantité d'IFN-y sécrétée, à l'aide de toute technique connue pour mesurer la quantité d'un composé, telle que l'ELISA, l'ELISPOT, la cytométrie de flux (FACS), la RT-PCR quantitative. Ainsi, la quantité d'IFN-y spécifique de HBHA sécrété, à partir :0 de l'échantillon biologique d'un mammifère présentant une tuberculose active est supérieure à 1000, supérieure à 2000 pg/mI, supérieure à 5000 pg/ml ou supérieure à 10000 pg/mI. Ainsi, une quantité comprise entre 5000 et 45000 pg/ml, ou entre 10000 et 45000 pg/ml confirme une forme active de tuberculose. En revanche, une quantité d'IFN-y spécifique de 2:,- HBHA sécrété, à partir de l'échantillon biologique d'un mammifère présentant une tuberculose, nulle ou inférieure à 100, 400 ou 1000 pg/ml confirme l'absence de tuberculose ou une forme latente de tuberculose. Dans un autre mode de réalisation, on quantifie la proportion 3o de cellules positives pour le marquage de l'IFN-y, par la différence entre le pourcentage de cellules exprimant l'IFN-y après stimulation par la HBHA 2873819 25 pendant 16 heures et le pourcentage de cellules produisant l'IFN-y sans stimulation (sécrétion spontanée). Ce calcul est réalisé sur des cellules de l'échantillon biologique, ciblées pour le protocole de quantification, telles que les lymphocytes, les cellules CD4+ , ou toute autre sous-population de lymphocytes. Ce marquage s'effectue par tout moyen connu pour le marquage intracellulaire d'un composé, et qui peut utiliser des agents de perméabilisation, tels que la saponine (0, 01 à 0,1%), le triton (0,1%), la digitionine et/ou des agents de fixation des cellules tels que le paraformaldéhyde 2%, et des anticorps, éventuellement marqués II) radioactivement ou couplés à des fluorochromes. Après la mise en contact de l'échantillon avec HBHA, de la bréfeldine A est ajoutée (10 pg/ml) avec l'échantillon pendant 3 à 5 heures à 37 C ou température ambiante pour bloquer toute sécrétion des cellules contenues dans l'échantillon. Les cellules sont ensuite fixées avec un agent de fixation tel que ceux cités ci-dessus pendant 15 à 30 minutes à 4 C, puis perméabilisées avec des agents de perméabilisation, tels que ceux cités ci-dessus, 15 à 30 minutes à température ambiante, à l'obscurité. Les anticorps primaires et secondaires seront dilués dans une solution de perméabilisation (10 mg/ml) et ajoutés pour une incubation de 15 à 30 minutes à 4 C. Les antigènes de surface, tels que CD4 ou CD8, sont marqués soit avant la fixation par l'agent de fixation pour ceux qui y sont sensibles, soit après la perméabilisation pour ceux qui sont résistants à la fixation. Les cellules marquées sont ensuite analysées par cytométrie de flux. Ainsi, la proportion de cellules obtenue à partir de l'échantillon biologique d'un mammifère présentant une tuberculose active est supérieure à 0,3 %, supérieure à 0,5 %, supérieure à 0,75 % ou supérieure à 1 %. Des valeurs de 5%, 10% et jusqu'à 15% peuvent être obtenues. En revanche, la proportion de cellules obtenue à partir de l'échantillon 3oo biologique d'un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente est nulle ou inférieure à 0,2 ou 0,3%. 2873819 - Cette méthode permet de mettre en évidence chez un mammifère la forme active de tuberculose. En revanche, une faible sécrétion d'IFN-y ou une faible quantité d'IFN-y intracytoplasmique, dans les valeurs telles que citées ci-dessus, révèle un absence de forme active de tuberculose, et peut être interprétée soit comme l'absence d'infection par M. tuberculosis, soit comme une forme latente de tuberculose. De façon optionnelle une étape est ajoutée dans cette méthode, entre l'obtention de l'échantillon biologique et la mise en contact dudit échantillon, consistant à la mise en culture dudit échantillon biologique. Dans un mode de réalisation, l'échantillon biologique est choisi dans le groupe constitué des aspirations bronchiques, des lavages bronchoalvéolaires (LBA), des tubages gastriques, des expectorations, des échantillons de liquides d'épanchement tels que liquides pleuraux, I d'ascite et articulaires, des liquides cérébraux-spinaux, céphalorachidiens, synoviaux, péritonéaux et péricardiaux, des biopsies ganglionnaire, transbronchique, pleurale et hépatique, des ponctions médullaire et lombaire, des échantillons d'urine et des aspirations de pus. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules 20 utilisées pour cette méthode sont des lymphocytes T tels que des lymphocytes T CD3+ CD4+. L'invention concerne également un kit permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose active d'un 2 mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente, ledit kit comprenant: - la forme native ou recombinante de HBHA; - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la mise en contact des cellules présentes dans l'échantillon 3U biologique dudit mammifère avec I'HBHA native ou recombinante; les réactifs englobent ceux décrits ci-dessus dans les kits précédents. - les réactifs permettant la détection de l'IFN-y, suite à la mise en contact. L'IFN-y, sécrété ou intracytoplasmique, sera mesuré par toute technique connue, et pourront être fournis des anticorps primaires spécifiques de l'IFN-y, éventuellement marqués, des anticorps secondaires, éventuellement marqués, capables de reconnaître l'anticorps primaire, ainsi que toute molécule permettant d'amplifier ou de moduler le signal de détection. De façon optionnelle, le kit peut comprendre également un ou plusieurs tissu(s) ou échantillon(s) biologique(s) de référence, pouvant être Io utilisé(s) comme témoin négatif (échantillon provenant d'un mammifère non infecté ; stade TBO) ou comme témoin positif (stades TB2 et/ou TB3). Dans un autre mode de réalisation, le kit comprend un milieu de culture et tout composé participant à la mise en culture de l'échantillon, avant sa mise en contact avec HBHA. Les exemples suivants sont donnés pour illustrer la présente invention, et ne limite en aucun cas le cadre de l'invention. EXEMPLES Exemple 1: Origine des prélèvements sanguins Les prélèvements sanguins ont été obtenus de patients tuberculeux et de sujets primo-infectés, après avoir obtenu leur consentement. Les patients tuberculeux ont été sélectionnés sur la base d'un examen direct positif et/ou d'une culture positive pour M. tuberculosis. Tous les sujets ont été enrôlés avant la fin des trois premières semaines de traitement. Les sujets présentant une forme latente de tuberculose ont été sélectionnés sur la base d'un test positif d'hypersensibilité retardée à la tuberculine (diamètre de l'induration supérieur à 10 mm). Une forme active de tuberculose a été exclue sur base d'une radiographie de thorax normale. _;o Tous les patients étaient séronégatifs pour le VIH et aucun ne recevait de traitement immunosuppresseur. Tous les sujets vivaient en Europe au moment du recrutement. Exemple 2: autres prélèvements Le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) est prélevé, par fibroscopie, après injection d'environ 200m1 d'eau physiologique. Le volume ainsi prélevé est ensuite centrifugé (environ 10 ml). Les liquides pleuraux, articulaires, péritonéaux, céphalo-rachidiens et autres sont collectés dans des seringues stériles et sont Io centrifugés dès leur arrivée au laboratoire. Pour les ganglions ou autres masses suspectes, une exérèse chirurgicale est pratiquée. A son arrivée au laboratoire, le fragment anatomique recueilli est morcelé et incubé dans du milieu de culture pour permettre la libération progressive des cellules à partir du tissu. Exemple 3: Les antigènes La forme native de la HBHA (nHBHA) est purifiée à partir de M. bovis BCG par chromatographie Héparine-Sépharose suivie d'une chromatographie en phase liquide (HPLC) comme décrit ailleurs (14). Un chromatogramme HPLC et une analyse par SDS-PAGE après coloration par bleu de Coomassie permettent de démontrer que la préparation ne présente pas de contamination protéique. Aucune trace de glycolipides n'a été mise en évidence par chromatographie en phase gazeuse. Le test de la limule démontre une concentration de lipopolysaccharide inférieure à ?> 10pg/ml. La forme recombinante non méthylée (rHBHA) est purifiée à partir de la souche E. coli (BL21(DE3)(pET-HBHA). Le statut de méthylation de la protéine recombinante comparé à celui de la protéine native est décrit dans le brevet français FR 01 14953, La forme recombinante tronquée de la partie C-terminale (rHBHAAC) est purifiée au départ de la souche E. coli BL21(DE3)(pET-HBHAAC). Cette forme tronquée rHBHAAC est décrite dans Pethe et al. (2000 Journal of Biological Chemistry 275(19): 14273-14280, incorporé dans la présente description par référence) et est dérivé de la protéine HBHA recombinante, pour laquelle les acides aminés 161 à 199 ont été délétés. Le peptide C-terminal isolé, synthétisé par combinaison d'acides aminés préalablement méthylés, correspond aux acides aminés 161 à 199 de la protéine HBHA, et présente la séquence suivante KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK (SEQ ID No 1) (12;13). Pethe et al. (froc. Natl Acad. Sci 2002; 99: 10759-10764) et 1() Temmerman et al. (submitted) sont incorporés ici par référence. Exemple 4: Détection des IgG spécifiques de la HBHA La technique ELISA est utilisée pour la détection des IgG antinHBHA, -rHBHA, rHBHAAC et Cpeptide (peptide C-terminal isolé). De manière détaillée, des plaques de 96 puits en polystyrène (Maxisorp Nunc) sont incubées une nuit à 4 C avec 50pL/puit d'une solution de 1,5pg/L d'antigène dilué dans du PBS (nHBHA, rHBHA, rHBHAAC ou C-peptide). Les plaques sont lavées trois fois avec du PBS-tween 20 (0,05 %) et saturées par une solution de caséine 1 % dans du PBS pendant 1 h à 2i1 37 C. Après lavage, les sera des patients, dilués dans une solution de PBS-Tween 20 (0,05 %) (dilutions de 1:50 à 1:12800),sont disposés 30 min dans les puits à température de la pièce et sous agitation. Des anticorps de chèvre anti-IgG humaines couplées à la biotine diluées 250 fois dans du PBS-Tween 20 (0,05 %) sont les anticorps secondaires 2> utilisés (biotinylated goat anti-human IgG Southern Biotechnologies Associates Birmingham USA 2040-08), leur présence est révélée par 50 pl/puit d'une solution de peroxydase (extravidine peroxydase-conjugated E2886 Sigma) diluée à 1:1000 (caséine 0,5 %). 50 pL d'une solution substrat (0,1 mg/ml 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidine et 1 pL/ml de 30 % de r) peroxyde d'hydrogène dans 0,1 M de citrate de sodium à pH 5) sont rajoutés après lavage pour une durée de 10 à 30 minutes à l'abri de la lumière. La réaction est arrêtée par 25 pL/puit d'acide chlorhydrique (2mMol/L). Le titre des anticorps est exprimé par la dernière dilution de sérum qui est considérée positive par rapport à un pool de sera négatifs. Exemple 5: Sécrétion d'interferon-gamma par les PBMC en réponse à la nHBHA/ESAT-6(ELISA) Les PBMC sont obtenus par centrifugation en gradient de densité des échantillons de sang périphérique (lymphoprep Nycomed Pharma). Ces PBMC sont resuspendus à une concentration de 2.106 W cellules/ml dans le milieu de culture (RPMI complet: RPMI 1640 (BioWhittaker) supplémenté avec 40 pg/ml de gentamycine, 50 pM de 2mercapto-ethanol, 1X d'acides aminés non essentiels (Life Technologies) et 10 % de sérum de foetus de voeu (FCS)). Les cellules sont stimùlées par 2 pg/mL de nHBHA et en parallèle par 5 pg/ml d'Early-Secreted-Antigen- 1 Target-6 (ESAT-6) (Statens Serum Institut, Denmark) pour une durée de 96 heures dans une atmosphère à 37 C et 5 % 002. Dans certaines expériences, des anticorps bloquants ont été ajoutés à une concentration de 5 pg/ml: anti-TGF-(3 1,2,3 (IgG1 de souris, R&D System), et les résultats ont été comparés à ceux obtenus en présence d'anticorps contrôles (IgG1 de souris; R&D System). Les surnageants ont été collectés après 4 jours de culture pour la mesure de l'IFN-y sécrété par ELISA (IFN- y Cytoset, Biosource). Exemple 6:Réponse locale en interféron-gamma Exemple 6a: Liquides biologiques et pièces anatomiques Les liquides biologiques analysés sont les liquides pleuraux, articulaires et péritonéaux. Les pièces anatomiques analysées sont les biopsies-exérèse de ganglions ou de masses suspectes diverses. L'isolement des éléments nucléés au départ des liquides biologiques passe par une première filtration (tamis cellulaire, nylon 100 pm Falcon 352360) suivie d'une centrifugation à 2300 tpm durant 15 minutes. Les globules rouges présents dans le culot cellulaire sont lysés si nécessaire. Les cellules sont ensuite resuspendues dans une solution de RPMI complet. Les éléments nucléés des pièces anatomiques sont isolés par morcelage de ces pièces et incubation pour la nuit dans une solution de RPMI complet à 37 C et dans une atmosphère à 5 % de 002. Les surnageants sont récupérés et les pièces rincées pour récupérer les éventuelles cellules encore accessibles. Ces liquides récoltés sont ensuite centrifugés à 2300 tpm pendant 15 minutes. Les globules rouges sont lysés si Io nécessaire. Le culot cellulaire est resuspendu dans une solution de RPMI complet. Exemple 6b: Stimulation antigénique Lorsque le nombre de cellules isolées est suffisant (liquides pleuraux), elles sont stimulées in vitro de la même façon que les PBMC et les concentrations d'IFN-y sécrétées sont mesurées dans les surnageants de culture après 96 heures de stimulation in vitro par la HBHA. L'analyse de la synthèse d'IFN-y par ces cellules peut également, comme pour les PBMC, être réalisée par cytométrie de flux après une courte stimulation in vitro par la HBHA, comme décrit ci- dessous pour les liquides de lavage broncho-alvéolaire, liquides articulaire ou péritonéal, ganglions... Les cellules isolées (2.106/ml) sont stimulées in vitro par de la HBHA à une concentration de 10 pg/ml pour une durée de 16 à 18 heures. Les sécrétions cytokiniques des cellules sont ensuite bloquées par une incubation de 4 heures en présence de Brefeldin A (10 pg/ml-Brefeldin A Sigma) et la présence d'IFN-y à l'intérieur des cellules est analysée par cytométrie de flux après avoir fait un marquage de ces cellules. Après fixation des cellules, elles sont perméabilisées (Fix and Perm; Oeil permeabilization kit Caltag Laboratories), lavées, puis incubées à l'obscurité pendant 30 min. en présence d'anticorps couplés à des 3o fluorochromes (anti-CD3 PerCP, anti-CD4 APC, asti-IFN-y PE, tous obtenus auprès de Becton, Dickinson). Le pourcentage de cellules 2873819 32 positives est ensuite analysé par un cytomètre FACSCalibur, en ciblant d'abord les lymphocytes sur la base de leur taille et de leur granularité, et ensuite les différentes sous-populations lymphocytaires en fonction de l'expression de marqueurs de surface. Exemple 7: Analyses statistiques Pour les données non pairées, le test non-paramétrique U de Mann-Whithney ou le test non-paramétrique de Kruskall-Wallis suivi de comparaisons post-test par les tests de Dunn ont été utilisés. Les données l O pairées ont été analysées par le test de Wilcoxon ou le test de Friedman. RESULTATS Réponse humorale Des IgG spécifiques de la nHBHA ont été détectés dans le sérum d'environ 40 % des sujets infectés par M. tuberculosis, qu'ils soient en bonne santé (sujets primo-infectés ou forme latente) ou qu'ils soient malades et présentent une tuberculose (forme active). Les titres d'anticorps trouvés dans ces deux groupes de sujets ne sont pas différents (Figure 1). 2O Cependant, la comparaison des titres d'anticorps dirigés contre la forme native méthylée de la HBHA (nHBHA) avec ceux dirigés contre la forme recombinante non méthylée (rHBHA) a fait émettre l'hypothèse que les anticorps sont différents selon que les patients infectés par M. tuberculosis sont malades (forme active) ou non (forme latente). En effet, comme illustré dans la Figure 2, les titres d'IgG anti-nHBHA sont significativement plus élevés que les titres d'IgG anti-rHBHA (p=0,0015) chez les sujets primo-infectés (Figure 2A), alors que les différences sont non significatives chez les patients tuberculeux (Figure 2B). Nous avons dès lors dosé les IgG dirigées, d'une part, contre une forme recombinante () tronquée de la HBHA composée uniquement du domaine N-terminal de la molécule (rHBHAAC), et, d'autre part, ceux dirigés contre le peptide Cterminal méthylé. Ces résultats, repris dans la Figure 3, indiquent que les IgG anti-HBHA présentes dans le sérum des patients tuberculeux reconnaissent la rHBHAAC (Figure 3A), alors que les anticorps des sujets primo-infectés reconnaissent le peptide C terminal méthylé (Figure 3B). Selon le type d'anticorps présents dans le sérum des sujets infectés par M. tuberculosis, ceux-ci peuvent donc être classés en deux groupes, primoinfectés ou malades, selon que les IgG sont dirigées contre la partie Nterminale non méthylée de la HBHA, ou au contraire contre le peptide C terminal méthylé. IU Sécrétion d'IFN-y par les lymphocytes circulants Nous avons montré précédemment que la sécrétion d'IFN-y en réponse à la forme native de la HBHA par les PBMC est significativement plus importante chez les sujets primo-infectés que chez les patients tuberculeux. La discrimination obtenue n'est cependant pas suffisante pour pouvoir être utilisée à des fins diagnostiques. Une augmentation du nombre de sujets testés à permis de sélectionner parmi les sujets primo-infectés ceux dont la date présumée de l'infection remontait à moins de cinq ans. Les résultats repris dans la Figure 4 ?u montrent que la discrimination entre les deux groupes est légèrement meilleure mais toujours insuffisante. A l'inverse, il est rapporté dans la littérature que les patients tuberculeux sécrètent de l'IFN-y en réponse à l'ESAT-6, contrairement aux sujets primo-infectés, mais à nouveau, la discrimination n'est pas parfaite comme représenté dans la Figure 5. Nous montrons ici que le calcul du rapport entre la sécrétion d'INF-y spécifique de la nHBHA et celle induite par l'ESAT-6 permet d'offrir un excellent moyen de discrimination entre sujets primo-infectés non malades et patients tuberculeux (p=0,0003; n=8) (Figure 6). 3ro L'ajout d'un anticorps bloquant anti-TGF-(3 permet dans de nombreux cas de démontrer que l'absence de sécrétion périphérique d'IFN- en réponse à une stimulation lymphocytaire par la HBHA résulte bien d'une infection par M. tuberculosis chez le patient malade et n'est pas due à l'absence d'infection. En effet, comme illustré sur la Figure 7, en présence d'un anti-TGF-f3, les sécrétions d'IFN-y des PBMC des patients tuberculeux augmentent de façon significative (p=0,01). Cela n'est pas observé chez les sujets primo-infectés. Sécrétion locale d'IFN-y en réponse à la nHBHA Chez les patients tuberculeux, contrairement à l'absence de sécrétion d'IFN-y par les PBMC en réponse à la nHBHA, la stimulation des cellules issues des sites locaux d'infection tels que les liquides pleuraux, alvéolaires, péritonéaux et articulaires permet d'observer une importante 1; réponse IFN-y en réponse à une stimulation par la nHBHA ou la rHBHA, au contraire des sujets contrôles non infectés par M. tuberculosis mais présentant des signes cliniques et radiologiques tout à fait comparables à ceux d'une tuberculose. Lorsque le volume de l'échantillon prélevé localement permet d'isoler un nombre suffisant de lymphocytes, ces 2() cellules sont stimulées par la HBHA native et la quantité d'IFN-y présente dans les surnageants de culture est mesurée ensuite par la technique ELISA. Les résultats illustrés dans la Figure 8 montrent que les concentrations d'IFN-y sécrétées par les cellules pleurales après stimulation par la HBHA sont beaucoup plus élevées que celles sécrétées par les cellules provenant de sujets contrôles, primo-infectés ou autres. La discrimination entre patients tuberculeux et contrôles est nettement moins bonne si un autre antigène, comme la PPD, est utilisé pour stimuler les cellules pleurales in vitro (Figure 8). 2873819 35 La synthèse d'IFN-y induite par la HBHA par les cellules pleurales des patients qui présentent un épanchement pleural d'origine tuberculeuse peut aussi être mise en évidence par une analyse des lymphocytes par cytométrie de flux. Cette technique permet de mesurer les pourcentages de lymphocytes qui contiennent de l'IFN-y intracellulaire dont la synthèse a été induite par une courte stimulation in vitro par la HBHA. Cette technique a l'avantage d'être extrêmement rapide, la durée de la stimulation par la HBHA étant limitée à une nuit, si bien qu'un résultat peut être fourni en 24 heures. Les résultats illustrés sur les Figures 9 et 10 I r montrent qu'une proportion importante de lymphocytes CD4+ du liquide pleural contient de l'IFN-y après stimulation par la HBHA alors que ce n'est pas le cas pour les cellules pleurales provenant d'épanchements qui ne sont pas d'origine tuberculeuse, c'est à dire d'individus non-infectés par M. tuberculosis (Figure 10). L'étude de la sécrétion d'IFN-y induite par la HBHA I peut être simplifiée en limitant l'analyse à la fenêtre lymphocytaire sélectionnée sur la base de leur taille et de leur granularité. Dans les cas de tuberculose pulmonaire (sans atteinte pleurale), un diagnostic peut être posé en étudiant les lymphocytes du liquide de lavage broncho-alvéolaire. En effet, après une courte stimulation in vitro avec la HBHA (une nuit), une proportion élevée de lymphocytes CD4+ locaux (provenant de sites locaux d'infection) contient de l'IFN-y en intracellulaire, au contraire des lymphocytes de patients contrôles (Figure 11). La discrimination entre patients tuberculeux ou non est meilleure lorsqu'on cible les cellules CD4+ locaux plutôt que les cellules CD8+ locaux (Figure 11), et l'analyse pourrait également se limiter à la fenêtre lymphocytaire. Lors d'une tuberculose articulaire, un pourcentage élevé des lymphocytes isolées à partir de l'épanchement (culture BK positive sur le liquide) synthétise de l'IFN-y après une courte stimulation in vitro par la _) HBHA, contrairement aux lymphocytes locaux prélevés chez des individus contrôles présentant un épanchement d'origine non tuberculeuse (Table 1). Enfin, dans un cas de péritonite d'origine tuberculeuse, 31 % des lymphocytes présents dans ce liquide contiennent de l'IFN-y en intracellulaire après une courte stimulation in vitro par la HBHA. Dans un cas d'adénopathie d'origine tuberculeuse, 1,8 % des lymphocytes répondent à la HBHA en synthétisant de l'IFN-y, ce qui permet à nouveau un diagnostic de l'origine tuberculeuse de l'affection en moins de 24 heures (Table 1). TABLEAU I: Pourcentage de lymphocytes T CD4+ CD3+ contenant de 1() l'IFNy, après stimulation par la nHBHA de lymphocytes isolés sur le site de l'infection tuberculeuse versus contrôles. Conditions de stimulation Type d'échantillon - PPD nHBHA Liquides articulaires (LA) LA BK+ 3,90 16,00 8,96 i LA ctrl 1 0,10 0,20 0,20 LA ctrl 2 0,22 0,63 0,11 LA ctrl 3 0,05 0,09 0,09 LA ctrl 4 0,05 1,03 0,10 Liquide péritonéal BK+ n.d. n.d. 31.360 Adénopathie tuberculeuse 0,72 1,99 1,82 - : sans stimulation; n.d. : non déterminé ; BK+ : positif au bacille de Koch 37 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Frieden T.R., Sterling T.R., Munsiff S.S. et al. Lancet 2003; 362: 887- 99. 2. Maher D., Chalet P., Spinaci S. t al. Treatment of tuberculosis: guidelines for national programmes. 2nd ed. Geneva: W.H.O. 1997. 3. Siddiqi K., Lambert M.L., Walley J. The Lancet Infect. Dis. 2003; 3: 288-296. 4. Strumpf I., Tsang A., Syre J. Am. Rev. Respir. Dis. 1979; 119: 599-602. 5. Travis W. et al. Mycobacterial pneumonias. In: West King D, ed. NonNeoplastic Disorders of the Lower Respiratory Tract, 1 st ed. Washington DC: AFIP; 2002: 579-87. H 6. Hruban RH, Hutchins GM. Mycobacterial infections. In: Dail DH, Hammar SP, eds. Pulmonary pathology, 2nd ed. New York: Springler Verlag; 1994: 331-50. _0 Dis. 1997; 176: 7. Kaufmann SH.: Nat. Rev. Immunol. 201; 1:20-30. 8. Converse PJ, Jones SL, Astemborski J et al. J. Infect. 144-50. 9. Andersen P., Munk M.E., Pollock J.M. et al. The Lancet 2000; 356: 1099-1104. 10. Pethe K., Ouech V., Daffe M. et al. Mol. Microbiol. 2001; 39: 89-99. 11. Pethe K., Alonso S., Biet F. et al. Nature 2001; 412: 190- 194. 12. Pethe K., Bifani P., Drobecq H. et al. Proc. Natl Acad. Sci 2002; 99: 10759-10764. 13. Temmerman S., Pethe K., Parra M. et al. submitted. 3o 14. Masungi C., Temmerman S., Van Vooren J.P. et al. J. Infect. Dis. 2002; 185: 513-520. REVENDICATIONS: 1. Méthode in vitro permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose latente d'un mammifère présentant une tuberculose active, ladite méthode comprenant: a. obtenir un échantillon biologique dudit mammifère, b. mettre en contact, de façon indépendante, ledit échantillon biologique avec la forme native de HBHA et avec ESAT-6, dans des conditions appropriées permettant la sécrétion d'IFNy, 1O c. mesurer la sécrétion d'IFN-y spécifique de HBHA et spécifique de ESAT-6 d. calculer le rapport entre la sécrétion d'IFN-y spécifique de HBHA, et la sécrétion d'IFN-y spécifique de ESAT-6 dans laquelle ledit rapport obtenu chez un mammifère présentant une tuberculose latente est supérieur au rapport obtenu chez un mammifère présentant une tuberculose active. 2. Méthode selon la revendication 1, pour laquelle le rapport des secrétions obtenu à partir de l'échantillon d'un mammifère présentant une tuberculose ?) latente est supérieur à 1. 3. Méthode selon la revendication 1, pour laquelle le rapport des secrétions obtenu à partir de l'échantillon d'un mammifère présentant une tuberculose latente est compris entre 100 et 400. 4. Méthode selon la revendication 1, pour laquelle le rapport des secrétions obtenu à partir de l'échantillon d'un mammifère présentant une tuberculose active est inférieur à 1. 2873819 39 5. Méthode selon la revendication 1, pour laquelle le rapport des secrétions obtenu à partir de l'échantillon d'un mammifère présentant une tuberculose active est inférieur à 0,5. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle l'échantillon biologique est choisi dans le groupe constitué des aspirations bronchiques, des lavages broncho-alvéolaires (LBA), des tubages gastriques, des expectorations, des échantillons de liquides d'épanchement tels que liquides pleuraux, d'ascite et articulaires, des liquides cérébraux- : u spinaux, céphalo-rachidiens, synoviaux, péritonéaux, péricardiaux et autres fluides corporels, des biopsies ganglionnaire, transbronchique, pleurale et hépatique, des ponctions médullaire et lombaire, des échantillons d'urine ou sanguins et des aspirations de pus. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle l'étape b. comprend la mise en contact, de façon indépendante, de la forme native de HBHA et de ESAT-6 avec des PBMC. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 comprenant 2u l'étape supplémentaire avant l'étape b. de mise en culture de l'échantillon biologique. 9. Kit permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose latente d'un mammifère présentant une tuberculose active, ledit kit comprenant: - la forme native de HBHA et de l'ESAT-6; - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la mise en contact, de façon indépendante, des cellules présentes dans l'échantillon biologique dudit mammifère avec l'HBHA native et l'ESAT-6; 3U -les réactifs permettant la détection de la sécrétion d'IFN-y, suite à la mise en contact. 10. Kit selon la revendication 9 qui comprend de plus, au moins un tissu ou un échantillon biologique de référence. 11. Kit selon l'une quelconque des revendications 9 à 10, qui comprend de plus un milieu de culture de l'échantillon biologique. I0 12. Méthode in vitro permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose active d'un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente, ladite méthode comprenant: a. obtenir un échantillon biologique issu des sites locaux 15 d'infection dudit mammifère b. mettre en contact ledit échantillon biologique avec la forme native ou recombinante de HBHA, dans des conditions appropriées permettant l'obtention d'un effet sur l'IFN-y, c. mesurer l'effet de cette mise en contact sur l'IFN-y spécifique de HBHA dans laquelle l'effet sur l'IFN-y spécifique de HBHA est plus important chez un mammifère présentant une tuberculose active que chez un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente. 13. Méthode selon la revendication 12 dans laquelle l'étape c. consiste à mesurer la quantité d'IFN-y sécrétée, suite à la mise en contact dudit échantillon biologique avec la forme native ou recombinante de HBHA. 14. Méthode selon la revendication 13, pour laquelle la quantité d'IFN-y 3o spécifique de HBHA sécrété est supérieure chez un mammifère présentant une tuberculose active par rapport à la quantité obtenue chez un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente. 15. Méthode selon la revendication 14, pour laquelle la quantité d'IFN-y spécifique de HBHA sécrété, à partir de l'échantillon biologique d'un mammifère présentant une tuberculose active est supérieure à 1000 pg/ml. 16. Méthode selon la revendication 14, pour laquelle la quantité d'IFN-y spécifique de HBHA sécrété à partir de l'échantillon biologique d'un Io mammifère présentant une tuberculose active est supérieure à 5000 pg/ml. 17. Méthode selon la revendication 14, pour laquelle la quantité d'IFN-y spécifique de HBHA sécrété à partir de l'échantillon biologique d'un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente est inférieure à 1000 pg/ml. 18. Méthode selon la revendication 14, pour laquelle la quantité d'IFN-y spécifique de HBHA sécrété à partir de l'échantillon biologique d'un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente est inférieure à 100 pg/ml. 19. Méthode selon la revendication 12 dans laquelle l'étape c. consiste à calculer la proportion de cellules, dudit échantillon biologique, contenant de l'IFN-y intracytoplasmique après la mise en contact de ces cellules avec l'HBHA parmi l'ensemble des lymphocytes ou une souspopulation de ceux-ci. 20. Méthode selon la revendication 19 pour laquelle ladite proportion de cellules chez un mammifère présentant une tuberculose active est 3o supérieure à celle obtenue chez un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente. 2873819 42 21. Méthode selon la revendication 19 pour laquelle ladite proportion de cellules obtenue à partir de l'échantillon biologique d'un mammifère présentant une tuberculose active est supérieure à 0,3 %. 22. Méthode selon la revendication 19 pour laquelle ladite proportion de cellules obtenue à partir de l'échantillon biologique d'un mammifère présentant une tuberculose active est supérieure à 0,5 %. 23. Méthode selon la revendication 19 pour laquelle ladite proportion de IO cellules obtenue à partir de l'échantillon biologique d'un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente est inférieure à 0,3 %. 24. Méthode selon l'une quelconque des revendications 12 à 23, I; comprenant l'étape supplémentaire avant l'étape b. de mise en culture de l'échantillon biologique. 25. Méthode selon l'une quelconque des revendications 12 à 24, dans laquelle l'échantillon biologique est choisi dans le groupe constitué des aspirations bronchiques, des lavages broncho-alvéolaires (LBA), des tubages gastriques, des expectorations, des échantillons de liquides d'épanchement tels que liquides pleuraux, d'ascite et articulaires, des liquides cérébraux-spinaux, céphalo-rachidiens, synoviaux, péritonéaux et péricardiaux, des biopsies ganglionnaire, transbronchique, pleurale et hépatique, des ponctions médullaire et lombaire, des échantillons d'urine et des aspirations de pus. 26. Méthode selon l'une quelconque des revendications 12 à 25, dans laquelle les cellules sont des lymphocytes T CD3+ CD4+. O 27. Kit permettant de détecter et de différentier un mammifère présentant une tuberculose active d'un mammifère ne présentant pas de tuberculose ou présentant une tuberculose latente, ledit kit comprenant: - la forme native ou recombinante de HBHA; - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la mise en contact des cellules présentes dans l'échantillon biologique dudit mammifère avec l'HBHA - les réactifs permettant la détection de l'IFN-y, suite à la mise en contact. 28. Kit selon la revendication 27 qui comprend de plus, au moins un tissu ou un échantillon biologique de référence. 29. Kit selon l'une quelconque des revendications 27 à 28, qui comprend I; de plus un milieu de culture de l'échantillon biologique. 30. Kit selon l'une quelconque des revendications 27 à 29, dans lequel les réactifs de détection permettent la quantification de la sécrétion d'IFN-y; 31. Kit selon l'une quelconque des revendications 27 à 30, dans lequel les réactifs de détection permettent la quantification de l'IFN-y intracytoplasmique. Io