FR 2877445 A1 20060505 FR 0411647 A 20041102 UTILISATION DE MARQUEURS DE FLUORESCENCE POUR LA MICROSCOPIE A RAYONS X DOMAINE TECHNIQUE La présente invention a trait à de nouveaux marqueurs utilisables en microscopie à rayons X. De tels marqueurs sont par ailleurs des marqueurs de fluorescence, c'est à dire visualisables en microscopie de fluorescence. Par conséquent, ceux-ci peuvent être utilisés pour marquer un échantillon susceptible d'être observé, simultanément ou en différé, par ces deux méthodes de microscopie tout à fait complémentaires. ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE La microscopie à rayons X connaît actuellement un développement remarquable. En effet, l'utilisation, dans cette technologie, de longueurs d'onde beaucoup plus courtes que celles de la lumière visible ou ultra-violette (de l'ordre de 100 fois), permet d'accéder à des résolutions spatiales très améliorées. En effet, la résolution ultime, limitée par la diffraction, est de l'ordre du nanomètre. Par ailleurs, la tomographie offre la possibilité de restituer des images tridimensionnelles. La microscopie à rayons X est principalement étudiée dans les centres de rayonnement synchrotron, car cette technologie nécessite des sources de très grande brillance. Cependant, des appareils de laboratoire sont actuellement à l'étude et devraient être disponibles dans un futur proche. Un domaine particulièrement intéressant, mais non limitatif, pour l'exploitation de la microscopie à rayons X est la "fenêtre de l'eau". Cette fenêtre correspond à la gamme d'énergie des rayons X mous, située entre le seuil K du carbone (284 eV; 4,4 nm) et le seuil K de l'oxygène (543 eV; 2,3 nm). Dans cette bande, les matériaux organiques, dont le carbone (présent dans les protéines, les lipides,...) est l'élément prépondérant, sont 10 à 20 fois plus absorbants que l'eau. De plus, la pénétration du rayonnement dans l'eau est de l'ordre de 10 m à 500 eV. Ainsi, cette technique d'observation se situe entre la microscopie optique, qui permet l'observation d'organismes vivants mais avec une résolution fondamentalement limitée à 0,3 m, et la microscopie électronique par transmission, de résolution nanométrique, mais pratiquable uniquement sur des tranches d'épaisseur voisine de 0.1 m, préparées selon un protocole très lourd, qui altère la structure de l'organisme observé. En utilisant des rayons X dans la "fenêtre de l'eau", il est maintenant possible de pratiquer de la microscopie haute résolution plein champ, en transmission, sur des cellules entières dans leur milieu naturel. Dans ces conditions, on obtient un bon contraste intrinsèque entre les structures carbonées des organelles, le cytoplasme plus chargé en eau, et le milieu environnant contenant peu de carbone. Par ailleurs, la préparation des échantillons pour cette microscopie respecte les structures natives, puisque les cellules restent entières et en milieu aqueux. Aujourd'hui, les microscopies ne visent plus seulement à observer des caractères morphologiques, mais principalement à mettre en évidence des processus biochimiques au moyen de marqueurs spécifiques. En effet, il est devenu possible de localiser, avec la résolution intrinsèque du microscope, des phénomènes se produisant à l'échelle moléculaire. Cette dernière application a connu un développement spectaculaire dans le domaine de la microscopie confocale ou classique, grâce aux marqueurs de fluorescence. Actuellement, la majorité des marqueurs fluorescents sont des molécules organiques, non détectables par les rayons X. Plus récemment sont apparus dans le domaine de la microscopie de fluorescence, deux familles de nanocristaux utilisables en tant que marqueurs: É des nanocristaux ("Quantum dots" ou Qdots en anglais) utilisés et commercialisés depuis quelques années pour le marquage spécifique en microscopie de fluorescence, ou même pour une observation macroscopique in vivo en imagerie optique de fluorescence. Ces cristaux de semi- conducteur, le plus souvent de formule CdS ou CdSe, sont caractérisés par: - une absorption très large: différents nanocristaux, émettant dans le visible/proche Infra-Rouge, peuvent être excités par une même longueur d'onde il est donc aisé de séparer spectralement l'excitation de l'émission; - une bande d'émission fine, qui dépend de la taille du nanocristal: à titre d'exemple, pour des particules de CdSe, l'émission va de 480 nm (pour des particules de 2.1 nm de diamètre) à 730 nm (4.6 nm de diamètre). De manière générale, plus la nanoparticule est grosse, plus l'émission se déplace vers le rouge. En outre, il est possible de fonctionnaliser ces nanocristaux de sorte qu'ils puissent se fixer spécifiquement sur des cibles choisies. É Par ailleurs, il existe de nombreux composés fluorescents, excitables en ultra-violet ou en visible, de type oxydes, oxysulfures et sulfures de métaux lourds, dopés, le plus souvent par des terres rares. Ceux-ci ont une émission selon un spectre caractéristique du dopant, souvent constitué d'un petit nombre de raies. En particulier, des composés dopés à l'Europium (Eu) trivalent (Gd2O2S:Eu, Y203:Eu, Lu203:Eu) sont bien connus pour leur bon rendement de fluorescence dans le rouge, vers 620 nm. Ces composés sont maintenant susceptibles d'être obtenus sous forme de cristaux de dimension nanométrique, ce qui permet d'envisager leur fonctionnalisation pour les rendre sélectifs d'une cible biologique. Le potentiel de la microscopie à rayons X ne peut donc être pleinement exploité que si des marqueurs identifiables en rayons X sont disponibles. Or actuellement, le seul marqueur fiable utilisable dans cette microscopie consiste en des nanobilles d'or. Hormis le coût de ce marqueur, celui-ci n'est pas observable en lumière visible et ne peut donc être localisé que sous rayons X. Par ailleurs, la fonctionnalisation de ces nanobilles reste délicate en raison de l'inertie chimique de l'or. Or, outre le besoin de marqueurs spécifiques identifiables pour la microscopie à rayons X, autres que les marqueurs à base de billes d'or, il existe également le besoin de marqueurs 25 pouvant être conjointement visualisés par des microscopies moins lourdes. En effet, l'obtention d'images en rayon X est relativement longue et fastidieuse, surtout pour des images tridimensionnelles, et ne permet de couvrir qu'un champ très limité. Il est donc souhaitable de pouvoir identifier les régions d'intérêt à faible grossissement par une technique rapide comme la microscopie optique, avant de lancer l'acquisition d'une image tridimensionnelle. Il existe certes des architectures qui permettent de greffer simultanément sur un même chassis, une molécule active capable de se lier à une cible et plusieurs molécules repérables (radio-isotopes, fluorochromes, ou nano-billes (l'or). Si ce principe permet théoriquement de construire des molécules-sondes, spécifiques d'une cible donnée et reconnaissables aussi bien en fluorescence qu'en rayons X, la synthèse complexe de telles molécules. de design unique pour chaque cas, reste dissuasive. EXPOSE DE L'INVENTION Pour la première fois, le Demandeur a mis en évidence que des marqueurs de fluorescence étaient aptes à absorber des rayons X et donc utilisables en tant que marqueurs pour la microscopie en rayons X. De la sorte, la présente invention propose les premiers marqueurs de microscopie à rayons X, alternatifs aux nanobilles d'or, qui en outre sont observables en microscopie de fluorescence. Ces marqueurs permettent donc de combiner l'efficacité et la simplicité de la localisation par microscopie de fluorescence à la résolution spatiale de la microscopie à rayons X. Des marqueurs de fluorescence particulièrement adaptés à l'invention, sont des nanocristaux 15 minéraux contenant un élément lourd. Avantageusement, l'élément lourd correspond à un élément de numéro atomique élevé mais inférieur ou égal à 49. Sont ainsi préférés les nanocristaux contenant du Cadmium, par exemple de formule CdS ou CdSe, ou bien de l'Yttrium, du Gadolinium ou du Lutécium, dopés ou non avec de l'Europium ou du Terbium. La fonctionalisation d'un tel marqueur permet son adressage à une cible spécifique sur un échantillon. La fonctionnalisation des nanocristaux est connue de l'homme du métier. D'une manière avantageuse, le marqueur selon l'invention présente une dimension inférieure à 20 nm, compatible avec l'épaisseur des nanocristaux et l'absorption des rayons X. Selon un premier aspect de l'invention, un échantillon marqué à l'aide d'un marqueur selon l'invention peut être observé uniquement à l'aide de la microscopie en rayon X. Ainsi, la présente invention concerne un procédé d'observation d'un échantillon, comprenant les étapes suivantes: le marquage à l'aide d'un marqueur de fluorescence, apte à absorber les rayons X, de l'échantillon à observer; l'observation de l'échantillon grâce à la microscope à rayons X. On entend par échantillon tout objet dont l'observation à un fort grossissement présente un intérêt. Plus particulièrement, dans le cadre de l'invention, il s'agit d'un échantillon biologique, par exemple des cellules. Selon un second aspect de l'invention, le même échantillon marqué est observé, simultanément ou en différé, à l'aide d'un microscope à fluorescence. Préférentiellement, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre comme suit: - dans un premier temps, la microscopie à fluorescence permet de localiser la zone d'intérêt dans l'échantillon; - puis, la microscopie à rayons X permet de visualiser avec une haute résolution cette zone d'intérêt. On entend par microscopie à fluorescence, aussi bien la microscopie en transmission qu'en réflexion. La microscopie à fluorescence en réflexion englobe la microscopie confocale et celle en épifluorescence. Ces différentes techniques microscopiques sont bien connues de l'homme du métier. A l'aide des données ainsi acquises, il est possible de restituer l'image de l'échantillon en 2 ou 3 dimensions (2D ou 3D). L'association des deux microscopies permet également de superposer ou de combiner les 20 images obtenues à l'aide de ces deux technologies complémentaires. Il apparaît que selon ce dernier mode de réalisation, un dispositif nouveau est nécessaire. Ainsi, l'invention concerne également un dispositif d'observation d'un échantillon, équipé d'un microscope à fluorescence, d'un microscope à rayons X, et d'un emplacement pour l'échantillon situé dans le champs d'observation des deux microscopes. Ce dispositif permet d'observer un même échantillon marqué à l'aide d'un marqueur unique, simultanément ou successivement, sans manipulation, à l'aide de deux techniques microscopiques distinctes et complémentaires. EXEMPLE DE REALISATION L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux de l'exemple de réalisation suivant, à l'appui de la figure annexée. Celuici n'est cependant en aucun cas limitatif. La figure 1 illustre schématiquement un dispositif permettant l'observation d'un échantillon en transmission et en épifluorescence, simultanée avec l'observation en rayons X. La figure 2 illustre schématiquement un dispositif permettant l'observation d'un échantillon en microscopie confocale de fluorescence, simultanée avec l'observation en rayons X. Le tableau présenté ci-dessous rapporte la capacité de divers nanocristaux à base de métaux lourds, présentant une épaisseur de 10 nm, à absorber les rayons X à différents niveaux d'énergie (300, 400 ou 500 eV) : Densité Absorption par une Absorption par un Absorption par une épaisseur de 10 nm épaisseur de 10 n épaisseur de 10 nm @ 300eV % @ 400eV % @ 500 eV % Au 19.3 26 25 21.5 CdS 4.8 6 4 9 CdSe 5. 8 8 5 9 Y2O3 5.0 12 9.5 6.5 Gd2O3 7.4 7.5 5.5 4.5 Lu2O3 9.4 13 11 9 Ce tableau révèle que des nanocristaux d'épaisseur de 10 nm présentent une absorption plus faible que l'or, mais néanmoins significative et suffisante pour fournir un contraste détectable dans les images en rayons X. Ainsi, quelques nanocristaux dans un voxel de 30x30x30 nm3 présentent une absorption propre de l'ordre de 5 %, visible sans ambiguïté dans des images comportant 1.000 à 2.000 photons par pixel. Dans le domaine des rayons X mous, on constate que l'absorption n'est pas directement proportionnelle au numéro atomique, car elle varie par sauts au voisinage des transitions L, M et N des éléments. Ceci explique que Y (numéro atomique 39) soit plus absorbant que Gd (numéro atomique 64). Par ailleurs, les nanocristaux contenant du cadmium sont particulièrement bien adaptés à la microscopie dans la fenêtre de l'eau au voisinage du seuil K de l'oxygène, par exemple à 500 eV, car le cadmium présente ses seuils M dans cette région. Plus généralement, les éléments de numéro atomique le plus élevé, mais inférieur ou égal à 49, sont particulièrement favorables. C'est aussi le cas de l'Yttrium. Selon l'invention, l'observation d'un échantillon d'intérêt peut donc s'effectuer comme suit: A) Marquage de l'échantillon à l'aide d'un marqueur tel que défini dans l'invention Il est possible d'utiliser des marqueurs spécifiques existants, par exemple des nanocristaux fonctionnalisés de CdSe ou de Lu203:Eu, en choisissant ceux qui présentent la plus forte absorption en rayons X. B) Installation d'un dispositif selon l'invention Les schémas représentés aux figures 1 et 2 illustrent des exemples de disposition possible, 10 basés sur les dimensions d'un objectif existant (MITUTOYO LWD 50x 0.55). Le système d'éclairage pour la microscopie optique est identique à celui d'un microscope classique: 1) en transmission: L'échantillon (1), mis en place sur son support (2), est observé en transmission, grâce à la lumière (3) introduite par la face arrière de l'échantillon (figure 1). 2) en épifluorescence: Avec une lame semi-transparente ou dichroïque (4), de la lumière à la longueur d'onde d'excitation du marqueur (visible ou proche UV; 3bis) est introduite à travers l'objectif (5) (figure 1). 3) en confocale: Selon la configuration confocale, on éclaire (3) par le "cube dichroïque" traditionnel et une lame semi-transparente (4), et on détecte par un détecteur (9) la lumière reçue à travers un petit trou conjugué de la source (10) (figure 2). L'éclairage par transmission n'est alors pas nécessaire. La simultanéité des observations est rendue possible par la grande différence d'ouverture des objectifs: Les lentilles à zones de Fresnel ("Zone plate") (6) utilisées en rayons X ont une ouverture qui n'excède pas F/10 ou au mieux F/8, soit une ouverture numérique de 0.06; Les objectifs à grande distance frontale et de grandissement 20x ou 50x (5) ont des ouvertures numériques de 0.4 à 0.55. Il est donc possible d'éclairer et d'observer par des miroirs à 45 7) percés pour laisser passer le rayonnement en X (8) en perdant très peu de lumière, et en conservant la résolution des objectifs de microscope. Les figures 1 et 2 montrent que l'on peut trouver une disposition compatible avec les dimensions d'objectifs réels. C) Observation de l'échantillon par microscopie de fluorescence et en rayons X L'observation optimale à l'aide du dispositif représenté dans les figures comprend donc trois étapes: - la localisation, avec un grossissement moyen 200 à 500x, des zones d'intérêt, d'abord en éclairage normal par transmission (figure 1) ; - la localisation plus fine, par une observation en épifluorescence (figure 1), ou mieux en fluorescence confocale (figure 2), des régions où le marquage a été effectué dans les meilleures conditions; - une observation en rayons X, soit en transmission simple, soit en tomographie avec rotation de l'échantillon, faisant apparaître les marqueurs par leur absorption. On peut avantageusement combiner les images obtenues par les moyens optiques et les images 2D ou 3D fournies par le microscope à rayons X, de manière à faire coïncider des parties mieux résolues en rayons X avec leur environnement, qui peut se trouver plus contrasté en lumière visible. Avec ce dispositif, on peut également enregistrer, à travers l'objectif de microscope, l'image de fluorescence des marqueurs excités par les rayons X, si l'on a pris soin de supprimer toute lumière visible provenant de la source de rayons X, par exemple grâce à une feuille mince de béryllium placée devant le condenseur de rayons X. Cette image aurait évidemment une résolution limitée par l'optique, c'est à dire de l'ordre de 1 m, mais pourrait apporter un complément d'information par rapport à l'image obtenue par rayons X. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un marqueur de fluorescence, apte à absorber les rayons X, comme marqueur pour la microscopie en rayons X. 2. Utilisation d'un marqueur de fluorescence selon la revendication 1, caractérisée en ce que le marqueur de fluorescence est un nanocristal minéral contenant un élément lourd. 3. Utilisation d'un marqueur de fluorescence selon la revendication 2, caractérisée en ce que le nanocristal contient un élément de numéro atomique élevé, mais inférieur ou égal à 49. 4. Utilisation d'un marqueur de fluorescence selon la revendication 3, caractérisée en ce 15 que le nanocristal contient du Cadmium. 5. Utilisation d'un marqueur de fluorescence selon la revendication 4, caractérisée en ce que la formule chimique du nanocristal est CdS ou CdSe. 6. Utilisation d'un marqueur de fluorescence selon la revendication 3, caractérisée en ce que le nanocristal contient de l'Yttrium, ou du Gadolinium, ou du Lutécium. 7. Utilisation d'un marqueur de fluorescence selon la revendication 6, caractérisée en ce que la formule chimique du nanocristal est choisie dans le groupe comprenant: Y203, 25 Y203: Eu, Y203: Tb, Gd203, Gd203: Eu., Gd203:Tb, Lu203, Lu203: Eu, Lu203: Tb. 8. Utilisation d'un marqueur de fluorescence selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le marqueur est fonctionnalisé. 9. Utilisation d'un marqueur de fluorescence selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le marqueur présente une dimension inférieure à 20 nm. 10. Procédé d'observation d'un échantillon, comprenant les étapes suivantes: - marquage à l'aide d'un marqueur de fluorescence, apte à absorber les rayons X, 35 de l'échantillon à observer; observation de l'échantillon grâce à la microscope à rayons X. 11. Procédé d'observation d'un échantillon selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'échantillon marqué est observé simultanément ou en différé à l'aide d'un microscope à fluorescence. 12. Procédé d'observation d'un échantillon selon la revendication 11, caractérisé en ce que: - dans un premier temps, on met en oeuvre la microscopie à fluorescence, de telle sorte à permettre la localisation de la ou des zones d'intérêt au sein de l'échantillon; - puis, à mettre en oeuvre la microscopie à rayons X, de telle sorte à permettre la visualisation avec une haute résolution de cette ou de ces zones d'intérêt. 13. Procédé d'observation d'un échantillon selon l'une des revendications 11 et 12, caractérisé en ce que lors d'une étape ultérieure, l'image de l'échantillon est restituée en 2D ou en 3D. 14. Procédé d'observation d'un échantillon selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que lors d'une étape ultérieure, les images obtenues en microscopie à fluorescence et en microscope à rayons X, respectivement, sont superposées et combinées. 30