FR 2876453 A1 20060414 FR 0452335 A 20041011 Procédé de diagnostic d'exclusion in vitro des syndromes coronariens aigus La présente invention a pour objet un procédé de diagnostic d'exclusion in vitro des syndromes coronariens aigus (SCA), communément appelés infarctus du myocarde (IDM), chez des patients présentant des douleurs thoraciques et suspectés être à risque, selon lequel on associe la quantification de la concentration d'au moins un marqueur cardiaque, choisi parmi troponine, CK-MB et myoglobine, et la quantification de la concentration en D-dimères, à partir d'un échantillon. L'infarctus du myocarde est le plus souvent dû à une thrombose occlusive brutale d'une artère coronaire conduisant à une nécrose ischémique d'une zone plus ou moins étendue du muscle cardiaque. Cette occlusion coronaire aiguë par un thrombus est le plus souvent liée à une fissuration ou à une rupture d'une plaque d'athérome. L'infarctus du myocarde est une maladie avec un risque fatal important à court ou moyen terme et constitue une urgence cardiologique absolue dont l'incidence est encore très élevée dans le monde. L'infarctus du myocarde se manifeste le plus souvent la nuit ou au repos par une douleur d'apparition brutale et intense au niveau de la poitrine, en arrière du sternum. Cette douleur ressemble à celle de l'angine de poitrine. En pratique, les patients souffrant d'une douleur thoracique aiguë doivent être transportés dans les meilleurs délais dans des centres d'urgence ou ED, selon la terminologie anglo-saxonne pour Emergency Department , dans lesquels est effectuée, lors de l'admission du patient, une série d'examens et d'analyses incluant l'étude de l'historique clinique du patient, l'électrocardiogramme et le dosage de marqueurs cardiaques, tels que troponine et/ou CK-MB et/ou myoglobine. Toutefois, le dosage des enzymes cardiaques, CK-MB et myoglobine, présente l'inconvénient de ne pas être spécifique de la pathologie et les praticiens sont amenés à pratiquer d'autres examens spécialisés, tels que l'électrocardiogramme continu, les techniques d'imagerie, telles que l'échographie cardiaque Doppler et la coronographie, avant de poser un diagnostic. De tels examens spécialisés ne sont pas disponibles dans tous les hôpitaux et rarement 24 heures sur 24. Concernant le dosage de la troponine, comme plusieurs heures peuvent s'écouler lors d'un infarctus du myocarde avant l'élévation de la concentration en troponine et que cette dernière n'est détectable au niveau sanguin que six heures après le début des douleurs thoraciques, un nouveau dosage de la troponine est requis dans les quatre à six heures suivant le premier dosage de troponine pour exclure un infarctus du myocarde chez des patients présentant un électrocardiogramme normal, conformément aux recommandations de la NACB [ NACB Laboratory Medecine Practice Guidelines: Characteristics & Utilization of Biochemical Markers in ACS and Heart Failure, CLINICAL: ACUTE CORONARY SYNDROMES - Chapter 1, 2004 ]. Il existe donc aujourd'hui un réel besoin d'établir une stratégie très précoce pour exclure les patients suspectés de syndrome coronarien aigu lors de leur admission au centre d'urgence. Une nouvelle stratégie permettrait de limiter les dosages enzymatiques additionnels et/ou les examens complémentaires qui représentent un coût supplémentaire, éviter les pertes de temps, améliorer le confort du patient et l'orienter éventuellement en fonction de sa pathologie vers le service adéquat. En effet, plus le diagnostic est précoce, meilleure sera la prise en charge du patient. Dans une telle approche, la sensibilité et la valeur de prédiction négative sont les paramètres les plus importants. De manière surprenante, la Demanderesse a trouvé que l'association de la quantification de la concentration d'au moins un marqueur cardiaque choisi parmi troponine, CK-MB et myoglobine et de la quantification de la concentration en D-dimères, à partir d'un échantillon liquide d'un patient présentant une douleur thoracique, permet d'exclure le diagnostic d'un syndrome coronarien aigu avec une haute sensibilité et une valeur de prédiction négative élevée, pouvant atteindre jusqu'à environ 100%, ce qui permet à la fois une réduction des coûts d'investigation, du temps et l'accélération des démarches pour éclaircir le diagnostic différentiel. La présente invention a donc pour objet un procédé pour le diagnostic in vitro d'exclusion d'un syndrome coronarien aigu à partir d'un échantillon liquide d'un patient suspecté comme présentant un risque, selon lequel: on quantifie la concentration d'au moins un 20 marqueur cardiaque, choisi parmi troponine, CK-MB et myoglobine, dans ledit échantillon, -on quantifie la concentration en D-dimères dans ledit échantillon, - on compare la concentration du ou desdits 25 marqueur(s) cardiaque(s) de l'échantillon par rapport à une concentration seuil prédéterminée, - on compare la concentration en D-dimères de l'échantillon par rapport à une concentration seuil de D-dimères prédéterminée, et -on détermine si la concentration du ou desdits marqueur(s) cardiaque(s) et la concentration en D-dimères de l'échantillon sont respectivement inférieures à la concentration seuil du ou desdits marqueur(s) cardiaque(s) prédéterminée et à la concentration seuil de D-dimères prédéterminée; - étant entendu que la quantification de la concentration du ou desdits marqueur(s) cardiaque(s) et la quantification de la concentration en D- dimères sont effectuées, soit séquentiellement et indépendamment de l'ordre, soit simultanément, comme explicité plus en détails ci-dessous, à partir de l'exemple de la quantification de la concentration en troponine et de la quantification de la concentration en D-dimères. Dans un mode de réalisation de l'invention, - on quantifie la concentration en troponine dans ledit échantillon, -on quantifie la concentration en D-dimères dans ledit échantillon, - on compare la concentration en troponine de l'échantillon par rapport à une concentration seuil de troponine prédéterminée, -on compare la concentration en D-dimères de l'échantillon par rapport à une concentration seuil de D-dimères prédéterminée, et - on détermine si la concentration en troponine et la concentration en D- dimères de l'échantillon sont respectivement inférieures à la concentration seuil de troponine prédéterminée et à la concentration seuil de D-dimères prédéterminée. Selon le procédé de l'invention, on peut exclure le diagnostic d'un SCA, à partir d'un échantillon liquide d'un patient présentant une douleur thoracique, avec une sensibilité et une valeur de prédiction négative supérieures aux performances du dosage initial isolé de la troponine lors de la présentation du patient au centre d'urgence. En effet, à ce jour, bien que la performance des nouvelles générations de tests de troponine se soit améliorée, les sensibilités et les valeurs de prédiction négatives n'atteignent pas des valeurs avoisinant 100%. L'échantillon liquide est choisi parmi le sérum, le plasma et le sang. La quantification de la concentration du ou desdits marqueur(s) cardiaque(s) est, de préférence, effectuée en utilisant au moins un anticorps spécifique du ou desdits marqueur(s) cardiaque(s), ou au moins un fragment d'anticorps spécifique du ou desdits marqueur(s) cardiaque(s). De préférence, au moins un anticorps monoclonal est utilisé, tel que, par exemple, un anticorps monoclonal anti-troponine. La quantification en Ddimères est effectuée, de préférence, en utilisant au moins un anticorps anti-D-dimères ou au moins un fragment d'anticorps anti-D-dimères. De préférence au moins un anticorps monoclonal anti-D-dimères est utilisé. Par fragment d'anticorps on entend notamment les fragments F(ab)2, Fab, Fab', sFv [Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159: 5821-5833 et Bird et al., 1988, Science 242: 423-426] d'un anticorps natif. Dans le reste de la description qui va suivre et dans les revendications, on utilisera le terme générique d'anticorps pour désigner indifféremment un anticorps monoclonal, un anticorps polyclonal monospécifique ou un fragment d'anticorps. Dans un mode de réalisation du procédé de l'invention on quantifie la concentration en troponine dans l'échantillon puis on quantifie la concentration en D-dimères dans l'échantillon. Dans un second mode de réalisation du procédé de l'invention on quantifie la concentration en D-dimères dans l'échantillon puis on quantifie la concentration en troponine dans l'échantillon. Dans un troisième mode de réalisation du procédé de l'invention on quantifie simultanément la concentration en troponine et la concentration en D-dimères dans l'échantillon. Dans ce mode de réalisation (i) au moins un anticorps antitroponine et au moins un anticorps anti-D-dimères, répondant aux définitions données cidessus, sont fixés sur une même phase solide, ladite phase solide pouvant être constituée par un tube, une bandelette, un cône (voir par exemple le principe du test VIDAS @ HIV DUO (référence 30 114) commercialisé par la Demanderesse) ou (ii) au moins un anticorps anti-troponine est fixé sur une phase solide et au moins un anticorps anti-D-dimères est fixé sur une autre phase solide, lesdits anticorps répondant aux définitions données ci dessus et la phase solide pouvant être constituée par un tube, une bandelette, un cône ou une particule. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un réactif pour la quantification de la concentration d'au moins un marqueur cardiaque, choisi parmi troponine, CK-MB et myoglobine, dans un échantillon liquide et d'un réactif pour quantification de la concentration en D-dimères dans un échantillon liquide, lesdits réactifs étant destinés à une utilisation pour le diagnostic in vitro de l'exclusion d'un syndrome coronarien aigu. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit réactif pour la quantification de la concentration du ou desdits marqueur(s) cardiaque(s) est au moins un anticorps répondant aux définitions données précédemment, et ledit réactif pour la quantification de la concentration en D-dimères est au moins un anticorps répondant aux définitions données précédemment. De préférence, un des réactif est un anticorps anti-troponine et l'autre réactif est un anticorps anti-D-dimères. L'échantillon liquide est choisi parmi le sérum, le plasma et le sang. La troponine est un des composants protéiques du muscle strié. Elle est formée de trois sous-unités I, T et C qui interviennent dans la contraction musculaire. La troponine I et la troponine T permettent de différencier une nécrose myocardique d'une atteinte musculaire squelettique. L'une des trois isoformes de la troponine, la troponine le présente une spécificité cardiaque sans réaction croisée. Dans le procédé de l'invention on quantifie la concentration en troponine T ou la concentration en troponine I et de préférence la concentration en troponine Ic. Les D-dimères sont des produits de la dégradations de la fibrine, fragments solubles de composition très hétérogènes, résultant de deux phénomènes simultanés: - la coagulation du fibrinogène en fibrine stabilisée, après action de la thrombine et du facteur XIIIa - la digestion du caillot de fibrine par la plasmine en fragments solubles libérés dans la circulation sanguine. Les produits terminaux de la lyse du caillot sont les D- dimères. Parmi tous les marqueurs des états thrombotiques, les D-dimères sont les seuls qui attestent réellement de la présence de fibrine stabilisée. Le ou lesdits marqueurs(s) cardiaque(s), en particulier la troponine, et les D-dimères peuvent être quantifiés en utilisant différents principes d'immunoessais qui sont bien connus de l'homme du métier, tels que ELISA, ELFA, agglutination de latex, turbidimétrie, turbidimétrie avec des particules, néphélométrie, néphélométrie avec des particules ou autres méthodes appropriées. Ces principes et autres méthodes sont par exemple décrits dans Labor und Diagnose , ed. L. Thomas, TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Francfurt, 1998, chapter 60 ou dans Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, - An introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques ed. T. Chard, Elsevier, Amsterdam, 1987. Ainsi, la quantification de la concentration du ou desdits marqueur(s) cardiaque(s), en particulier de la troponine, et la quantification de la concentration en D-dimères dans l'échantillon sont indépendamment l'une de l'autre effectuées par un immunoessai, sur la base d'un test choisi parmi ELISA, ELFA, turbidimétrie, néphélométrie, turbidimétrie avec des particules, néphélométrie avec des particules et agglutination de latex. Les valeurs de concentration seuil peuvent être définies par l'homme du métier, individuellement pour la troponine et les D-dimères sur la base de procédures bien connues. A titre d'exemple, la procédure suivante peut être appliquée pour les D-dimères: les échantillons d'un nombre de patients diagnostiqués SCA positifs, par exemple par imagerie, et un nombre d'échantillons d'individus SCA négatifs sont dosés pour la concentration en D-dimères; les résultats obtenus sont évalués sur la base de différentes valeurs seuil et les valeurs de concentration seuil qui permettent d'exclure les SCA négatifs et qui ne permettent pas d'exclure les SCA positifs sont retenues. Les valeurs de concentration seuil pourront varier en fonction de la technique et de la trousse utilisées pour le dosage des D-dimères. Pour la troponine, le seuil est déterminé conformément aux recommandations internationales et doit correspondre au 99ei1e percentile d'une population contrôle de référence [ NACB Laboratory Medecine Practice Guidelines: Characteristics & Utilization of Biochemical Markers in ACS and Heart Failure, CLINICAL: ACUTE CORONARY SYNDROMES - Chapter 1, 2004 ]. Les valeurs de concentration seuil pourront varier également en fonction de la technique et de la trousse utilisées pour le dosage de la troponine. Un mode de réalisation préféré, mais non limitatif, de la présente invention est le procédé pour le diagnostic in vitro d'exclusion d'un syndrome coronarien aigu chez un patient suspecté comme présentant un risque, tel que décrit ci-dessus, dans lequel la troponine, de préférence la troponine Ic, est testée en utilisant une méthode immunoenzymatique sandwich sur un appareil, tel que l'instrument VIDAS , en appliquant une valeur de concentration seuil de 0,1 g/l. Un autre mode de réalisation préféré, mais non limitatif, de la présente invention est le procédé pour le diagnostic in vitro d'exclusion d'un syndrome coronarien aigu chez un patient suspecté comme présentant un risque, tel que décrit ci-dessus, dans lequel les D-dimères sont testés en utilisant une méthode immunoenzymatique sandwich sur un appareil, tel que l'instrument VIDAS , en appliquant une valeur de concentration seuil de 250 ng/ml. Le procédé pour le diagnostic in vitro d'exclusion d'un SCA, décrit cidessus, a été validé par une étude prospective, pendant six mois, sur 119 patients d'un centre d'urgence souffrant de douleurs thoraciques. Le procédé de l'invention a permis d'exclure le diagnostic d'une nécrose du muscle cardiaque avec une sensibilité très élevée et une valeur prédictive négative très élevée, supérieures aux performances du dosage de la troponine seule lors de la présentation du patient au centre d'urgence. Le procédé selon l'invention est décrit plus en détails ci-dessous. Aucun de ces détails ne peut être considéré comme limitant l'invention d'une quelconque manière que ce soit. Matériels et méthodes: 119 patients (88 hommes et 31 femmes) consécutifs présentant une douleur thoracique ont été sélectionnés dans le centre d'urgence. La moyenne d'âge était de 59 ans plus ou moins treize ans dans l'étude. Un électrocardiogramme a été réalisé pour tous les patients. Des échantillons de plasma frais collectés chez ces patients ont été testés avec la trousse VIDAS D-Dimer New (bioMérieux) et avec la trousse VIDAS Troponin I (TNI) (bioMérieux) à des temps différents, sur l'appareil VIDAS @ (bioMérieux). Dans l'étude le temps TO correspond à l'apparition de la douleur thoracique, le temps Tl correspond au recueil du premier échantillon à l'arrivée du patient au centre d'urgence et le temps T2 correspond à Tl plus 6 heures. Une valeur seuil de 0,1 g/1 a été fixée pour la troponine I, conformément aux nouvelles recommandations internationales (99ème percentile d'une population normale) pour exclure un infarctus du myocarde. La valeur seuil optimale pour les D-dimères a été déterminée pour exclure l'infarctus du myocarde. Une courbe ROC ( Receiver Operating Characteristics , pour les D-dimères, pour prédire un infarctus du myocarde a été établie en utilisant le logiciel Analyse-It. La courbe ROC pour exclure l'infarctus du myocarde pour les D-dimères donne une valeur seuil optimale à 250 ng/ml (Index de Youden: 14,3%, Sensibilité : 88,5% et Spécificité : 25,8% ; Aire sous la courbe 0,60). L'algorithme suivant a été utilisé pour évaluer l'utilisation combinée de la troponine le et des D-dimères. Si la concentration en troponine le est supérieure à 0,1 g/1 au temps Tl et si la concentration en D-dimères est inférieure à 250 ng/ml au temps Tl l'infarctus du myocarde ne peut être exclu. Si la concentration en troponine le est inférieure à 0,1 gg/l au temps Tl et si la concentration en D-dimères est inférieure à 250 ng/ml au temps Tl l'infarctus du myocarde est exclu. Résultats obtenus avec l'algorithme: Patients présentant douleur thoracique 119 patients Troponine T1: Positive 19 patients Troponine T1: Negative patients DDi T1: Positive 17 patients DDi T1: Negative 2 patients DDi T1: Positive patients DDi T1: Negative patients Diagnostic final MI: 10 UA+SA: 6 Normal: 1 Diagnostic final MI:2 UA+SA:O Normal: 0 Tnl T2: Positive Tnl T2: Negative Tnl T2: Positive 14 patients 61 patients 0 patient Diagnostic final Diagnostic final Diagnostic final Diagnostic final MI: 13 MI:O MI:O Ml:1 UA+SA: 1 UA+SA:43 Normal: 0 Normal: 18 UA+SA: 0 UA+SA:14 Normal: 0 Normal: 10 DDi = D- dimères, TnI = troponine I, MI = infarctus du myocarde, UA = angine instable, SA = angine stable. TnI T2: Negative patients 12 Sensibilité et spécificité : D-dimères Troponine Troponine + Troponine (250 ng/ml) (0,1 g/1) D-dimères Temps T1 T1 T1 T2 Sensibilité 88,5% 46, 2% 96,2% 96,2% Spécificité 25,8% 92,5% 25,8% 91,4% Discussion: 26 patients (22%) sont diagnostiqués IDM positifs. Parmi ces patients un seul a une troponine et un D-dimères négatifs au temps Tl. Mais, comme pour les autres 25 patients troponine et D-dimères négatifs à Tl, sa troponine reste négative à T2. Avec l'algorithme défini ci-dessus, 21% (25/119) de la population peut être exclue des centres d'urgence pour un IDM dès l'obtention des résultats des dosages pour la troponine et les D- dimères effectués au temps Tl. Un résultat D-dimères négatif ( L'association des dosages de troponine et de D-dimères est une combinaison qui permet une exclusion très précoce des patients suspectés présenter un risque d'IDM dans les centres d'urgence, avec une sensibilité et une valeur de prédiction négative très élevées. REVENDICATIONS 1. Procédé pour le diagnostic in vitro d'exclusion d'un 5 syndrome coronarien aigu à partir d'un échantillon liquide d'un patient suspecté comme présentant un risque, selon lequel: on quantifie la concentration d'au moins un marqueur cardiaque, choisi parmi troponine, CK-MB et 10 myoglobine, dans ledit échantillon, on quantifie la concentration en Ddimères dans ledit échantillon, on compare la concentration du ou desdits marqueur(s) cardiaque(s) de l'échantillon par rapport à 15 une concentration seuil prédéterminée, - on compare la concentration en D-dimères de l'échantillon par rapport à une concentration seuil de D-dimères prédéterminée, et on détermine si la concentration du ou desdits marqueur(s) cardiaque(s) et la concentration en D-dimères de l'échantillon sont respectivement inférieures à la concentration seuil du ou desdits marqueur(s) cardiaque(s) prédéterminée et à la concentration seuil de D-dimères prédéterminée. 2. Procédé selon la revendication 1, selon lequel: - on quantifie la concentration en troponine dans ledit échantillon, - on quantifie la concentration en D-dimères dans 30 ledit échantillon, - on compare la concentration en troponine de l'échantillon par rapport à une concentration seuil de troponine prédéterminée, - on compare la concentration en D-dimères de l'échantillon par rapport à une concentration seuil de D-dimères prédéterminée, et - on détermine si la concentration en troponine et la concentration en D- dimères de l'échantillon sont respectivement inférieures à la concentration seuil de troponine prédéterminée et à la concentration seuil de D-dimères prédéterminée. 3. Procédé selon la revendication 2, selon lequel: on quantifie la concentration en troponine dans ledit échantillon, puis on quantifie la concentration en D-dimères dans ledit échantillon, on compare la concentration en troponine de l'échantillon par rapport à une concentration seuil de troponine prédéterminée, - on compare la concentration en D-dimères de l'échantillon par rapport à une concentration seuil de D-dimères prédéterminée, et - on détermine si la concentration en troponine et la concentration en D- dimères de l'échantillon sont respectivement inférieures à la concentration seuil de troponine prédéterminée et à la concentration seuil de D- dimères prédéterminée. 4. Procédé selon la revendication 2, selon lequel: - on quantifie la concentration en D-dimères dans ledit échantillon, puis - on quantifie la concentration en troponine dans ledit échantillon, on compare la concentration en troponine de l'échantillon par rapport à une concentration seuil de troponine prédéterminée, on compare la concentration en D-dimères de l'échantillon par rapport à une concentration seuil de D-dimères prédéterminée, et on détermine si la concentration en troponine et la concentration en D-dimères de l'échantillon sont respectivement inférieures à la concentration seuil de troponine prédéterminée et à la concentration seuil de D-dimères prédéterminée. 5. Procédé selon la revendication 2 selon lequel: on quantifie simultanément la concentration en troponine et la concentration en Ddimères dans ledit échantillon, - on compare la concentration en troponine de l'échantillon par rapport à une concentration seuil de troponine prédéterminée, on compare la concentration en D-dimères de l'échantillon par rapport à une concentration seuil de D-dimères prédéterminée, et on détermine si la concentration en troponine et la concentration en D-dimères de l'échantillon sont respectivement inférieures à la concentration seuil de troponine prédéterminée et à la concentration seuil de D-dimères prédéterminée. 6. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel l'échantillon liquide est choisi parmi le sérum, le plasma et le sang. 7. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la quantification de la concentration du ou desdits marqueur(s) cardiaque(s) et la quantification de la concentration en D-dimères dans l'échantillon sont indépendamment l'une de l'autre effectuées par un immunoessai. 8. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la quantification de la concentration en troponine et la quantification de la concentration en Ddimères dans l'échantillon sont indépendamment l'une de l'autre effectuées par un immunoessai. 9. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la quantification de la concentration du ou desdits marqueur(s) cardiaque(s) et la quantification de la concentration en D-dimères dans l'échantillon sont indépendamment l'une de l'autre effectuées sur la base d'un test choisi parmi ELISA, ELFA, turbidimétrie, néphélométrie, turbidimétrie avec des particules, néphélométrie avec des particules et agglutination de latex. 10. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la quantification de la concentration en troponine et la quantification de la concentration en Ddimères dans l'échantillon sont indépendamment l'une de l'autre effectuées sur la base d'un test choisi parmi ELISA, ELFA, turbidimétrie, néphélométrie, turbidimétrie avec des particules, néphélométrie avec des particules et agglutination de latex. 11. Utilisation d'un réactif pour la quantification de la concentration d'au moins un marqueur cardiaque, choisi parmi troponine, CK-MB et myoglobine, dans un échantillon liquide et d'un réactif pour la quantification de la concentration en D-dimères dans un échantillon liquide destinés à une utilisation pour le diagnostic in vitro de l'exclusion d'un syndrome coronarien aigu. 12. Utilisation selon la revendication 11, d'un réactif pour la quantification de la concentration en troponine dans un échantillon liquide et d'un réactif pour la quantification de la concentration en Ddimères dans un échantillon liquide destinés à une utilisation pour le diagnostic in vitro de l'exclusion d'un syndrome coronarien aigu. 13. Utilisation selon la revendication 11, dans laquelle l'un des réactifs est au moins un anticorps d'au moins un marqueur cardiaque et l'autre des réactifs est au moins un anticorps anti-D-dimères. 14. Utilisation selon la revendication 12, dans laquelle l'un des réactifs est au moins un anticorps anti-troponine et l'autre des réactifs est au moins un anticorps anti-D-dimères. 15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 15 11 à 14, dans laquelle l'échantillon liquide est choisi parmi le sérum, le plasma et la sang.