FR 2884925 A1 20061027 FR 0504163 A 20050426 L'invention concerne un kit de diagnostic et une méthode de diagnostic comprenant une première étape de sélection de patients à l'aide du kit in vitro, puis une seconde étape d'imagerie in vivo des patients sélectionnés lors de la première étape. L'imagerie médicale diagnostic est désormais une pratique courante en clinique. Les examens d'imagerie médicales sont effectués avec ou sans produit de contraste, ces produits de contraste permettant d'améliorer significativement l'examen dans environ 30 à 50 % des examens pratiqués couramment. L'imagerie médicale permet d'identifier des zones pathologiques ou à risque pathologique. On connaît déjà le principe et des kits de sélection dans le domaine thérapeutique. C'est le cas par exemple du kit Herceptest de l'herceptine , qui permet de sélectionner des patients qui vont recevoir un traitement médicamenteux dont le coût est très élevé. Le kit est destiné à sélectionner les patients qui ont un intérêt significatif à recevoir le traitement thérapeutique. Les kits connus utilisent en général des anticorps ou des séquences génétiques dont le taux d'expression est modifié chez les patients. Ces kits de sélection ne sont par contre, à la connaissance du demandeur, pas utilisés dans le domaine diagnostic. Le coût d'un examen d'imagerie médicale est en effet en général nettement moins élevé que le coût de traitement thérapeutique, mais l'utilisation d'un kit de pré-diagnostic pourrait être très utile pour évaluer l'opportunité d'un examen postérieur d'imagerie médicale, notamment pour améliorer le confort des patients et limiter les dépenses de santé. Afin de réussir un repérage et/ou criblage de patients à risque accru, grâce à un pré-diagnostic in vitro, le demandeur a étudié une méthode et un kit de diagnostic in vitro, destiné à sélectionner des patients pour lesquels un examen diagnostic d'imagerie médicale in vivo sera approprié. Ce kit utilise des réactifs appropriés sur un échantillon prélevé sur le patient. Le prélèvement d'échantillon est effectué de manière préalable au protocole d'imagerie médicale in vivo qui sera à effectuer éventuellement par la suite. La technique de prélèvement et le type de tissu ou de cellules prélevées dépendent de la pathologie étudiée; il s'agit par exemple d'un prélèvement de fluide biologique ou d'une biopsie sur tumeur ou d'une zone tumorale suspecte ou d'un extrait tissulaire ou cellulaire d'une zone pathologique ou à risque pathologique (i.e. que l'on suspecte de présenter une pathologie). Selon un mode de réalisation préféré, ce kit est décidé à mesurer le taux d'expression d'un ou de plusieurs marqueurs d'une pathologie, permettant ainsi d'évaluer si un patient a intérêt à subir un examen IRM. Cette sélection est particulièrement utile pour éviter des examens d'imagerie pour des patients qui ne sur-expriment pas un marqueur dont on sait qu'il est étroitement corrélé à un état pathologique. La méthode développée comprend donc: une première étape de prédiagnostic in vitro, destinée à présélectionner des patients à risque pour lesquels une imagerie in vivo est conseillée une seconde étape de diagnostic par imagerie médicale in vivo. Cette méthode se distingue donc aussi de méthodes qui incluent une première étape de prédiagnostic in vivo suivie le cas échéant d'une seconde étape de diagnostic in vivo. Plus précisément, la méthode de prédiagnostic in vitro est une méthode de diagnostic in vitro du risque pathologique justifiant une étape ultérieure d'imagerie de diagnostic in vivo chez un sujet comprenant: 1) la mesure in vitro du niveau d'expression d'au moins un marqueur biologique (non génétique) associé à la pathologie dont on diagnostique le risque dans au moins un échantillon du sujet comprenant une quantité suffisante du marqueur, 2) la comparaison des résultats avec un témoin. Avantageusement, la méthode de diagnostic in vitro comprend: - le prélèvement d'au moins un échantillon chez un sujet, l'échantillon comprenant une quantité suffisante d'au moins un marqueur biologique non génétique, associé à une pathologie la mesure in vitro du niveau d'expression du marqueur la comparaison des résultats avec un témoin de manière à déterminer un risque pathologique chez le sujet justifiant une étape ultérieure d'imagerie de diagnostic in vivo. De façon avantageuse, le sujet est un mammifère, avantageusement un être humain. Avantageusement, la pathologie est une maladie cancéreuse, cardiovasculaire, inflammatoire ou neurodégénérative, de façon avantageuse, un cancer, en particulier choisi parmi le cancer du sein, de l'ovaire et du poumon. Selon une réalisation préférée, le marqueur est associé à une pathologie cancéreuse, notamment un cancer de l'ovaire ou du poumon. Le demandeur a relevé le document US A 20030187335 qui étudie une approche de présélection avant imagerie médicale mais ce document ne concerne que des marqueurs bien particuliers qui sont des séquences génétiques très spécifiques et clairement corrélés à certaines pathologies vasculaires. Le demandeur a étudié des marqueurs non génétiques et qui ne sont ni décrits ni suggérés dans ce document. L'invention est notamment utile dans plusieurs situations, non exclusives l'une de l'autre: on ne connaît pas de marqueur génétique (séquence génétique, modification d'expression d'une séquence génétique) clairement associé à une maladie un marqueur génétique n'est pas suffisamment pertinent pour obtenir des informations fiables du point de vue diagnostic, par exemple son niveau d'expression n'est pas associé à un risque pathologique ou de progression de la pathologie clairement établi. - on préfère étudier des marqueurs du type enzymes ou récepteurs qui 25 donnent des informations physiologiques fiables. Le demandeur a notamment étudié des marqueurs dont la visualisation ne fait pas appel à des techniques de fluorescence. Le kit et la méthode permettent de quantifier le niveau d'expression d'un ou de plusieurs marqueurs étudiés pour une pathologie donnée. Lorsque le niveau d'expression est modifié (typiquement quantifié par rapport à une grille de valeurs témoins), ce marqueur est considéré comme indicateur d'un risque pathologique ou d'un stade pathologique à analyser plus précisément par imagerie de diagnostic in vivo. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, on entend par risque pathologique justifiant une étape ultérieure d'imagerie de diagnostic in vivo toute apparition ou évolution d'un marqueur biologique non génétique associé à la pathologie dont on cherche à évaluer le risque et semblant indiquer une apparition ou une aggravation de la pathologie. Néanmoins, il est possible que dans certaines pathologies, le niveau d'expression du marqueur biologique non génétique soit corrélé à un niveau d'expression d'un marqueur génétique de cette pathologie susceptible d'être étudié par une méthode différente de l'invention. Parmi les marqueurs cibles dont le type ou le niveau d'expression sont modifiées dans une zone pathologique, on ciblera notamment des enzymes et des récepteurs intra ou extra cellulaires. Le kit pourra ainsi utiliser des molécules (ligands) capables de reconnaître spécifiquement ces marqueurs, telles que des anticorps, des peptides, des polypeptides, des peptidomimétiques, des oligosaccharides, des enzymes, des récepteurs cellulaires, de manière plus large un composant biologique de nature lipidique, protéique ou saccharidique. Avantageusement, le kit selon la présente invention est tel qu'un kit de diagnostic in vitro du risque pathologique justifiant une étape ultérieure d'imagerie de diagnostic in vivo chez un sujet caractérisé en ce qu'il comprend: a. au moins un échantillon biologique à analyser, b. au moins un ligand capable de mesurer le niveau d'expression d'au moins un marqueur de l'échantillon biologique, c. un moyen de lecture permettant de corréler le niveau d'expression mesurée à une préconisation d'effectuer une imagerie de diagnostic in vivo. Le demandeur a en particulier étudié les marqueurs indiqués dans le tableau 1 suivant qui présente pour chacun: le marqueur étudié, le ligand capable de reconnaître le marqueur, la pathologie concernée et la technique d'identification du marqueur. Marqueur biologique ligand pathologie Technique d'identification Récepteur de l'acide Acide folique et/ou Cancers de l'ovaire, Scintigraphie folique ou dérivés compétiteurs bronchique, du rein Protéine de liaison au folate (FBP) Récepteurs SST-2, -3 et Octréotide Tumeurs Scintigraphie SST-5 de la et (principalement somatostatine Dépréotide neuro-endocrines) et cancers du rein et du sein Phosphatidylsérine Annexine V (Tc99m - Cancer bronchique - 4,5-bis non à petites Scintigraphie (thioacetamido)cellules, lymphome pentanoyl- annexine V ou Apomate ) Récepteur pour le Anticorps Gliomes, cancer du Scintigraphie facteur de croissance monoclonal Mab528 sein, cancer épidermique (EGFR) bronchique Récepteur VPAC1 du I123 -VIP Adénocarcinomes Scintigraphie peptide vasointestinal intestinaux et (VIP) tumeurs neuro- endocrines (y compris les insulinomes) Récepteurs des mucines TAG 72 Cancer du colon Scintigraphie Antigène carcino ACE Cancer du colon Scintigraphie embryonnaire métastasé Antigène PSA PSA, Cancer de la prostate Scintigraphie On pourra utiliser un marqueur biologique cible identique ou différent pour le test in vitro et pour l'imagerie in vivo. En particulier on pourra cibler un marqueur in vitro facile d'utilisation et robuste sur le plan du risque présumé in vivo, puis utiliser in vivo des produits de contraste spécifiques d'un ou plusieurs marqueurs spécifiques d'une pathologie. Les modalités d'imagerie médicale pratiquées après l'utilisation du kit peuvent être très variées, en fonction de la maladie étudiée. On utilisera notamment parmi les techniques d'imagerie: l'IRM, le scanner, la médecine nucléaire et ses variantes (PET, SPECT, PET SCAN...), éventuellement en combinaison. Les modalités d'imagerie in vivo appropriées sont mises en oeuvre par le praticien en fonction de l'organe et de la pathologie, incluant notamment l'angiographie et l'imagerie de perfusion (cerveau, système cardiovasculaire...). Ces techniques permettront de préciser le diagnostic sur des zones suspectes d'après les résultats du test in vitro. Il est rappelé que cette imagerie in vivo est menée par des praticiens (radiologues, oncologues, cardiologues...) dont la compétence est nécessaire pour obtenir un diagnostic fiable grâce à une imagerie in vivo: ni l'imagerie in vitro, ni l'imagerie in vivo sans l'intervention du praticien ne permettent d'établir le diagnostic. Dans certaines situations, les résultats in vitro peuvent conduire le praticien vers une technique et des modalités d'imagerie in vivo déterminées, mais l'intervention du praticien est de toute façon requise pour l'interprétation de l'imagerie in vivo qui suivra et qui pourra donner lieu à des préconisations ou traitements thérapeutiques. En outre, le praticien reste libre de décider de réaliser une imagerie in vivo même si les résultats in vitro ne lui indiquent pas que cette imagerie in vivo soit nécessaire. Il est clair que l'homme du métier à la lecture de la présente demande, une fois le prédiagnostic in vitro établi, dispose des informations nécessaires pour le choix de la technique appropriée d'imagerie in vivo. L'art antérieur décrit en effet un très grand nombre de méthodes d'imagerie in vivo avec ou sans l'aide de produits de contraste: chélates de gadolinium (DOTA, DTPA, DTPA-BMA, DO3A, BOPTA, PCTA et dérivés très largement décrits dans l'art antérieur), produits spécifiques vectorisés par des biovecteurs (biovecteurs rappelés par exemple dans le document WO 2004/112839) utilisés en IRM ou en médecine nucléaire. Le demandeur a étudié tout particulièrement le cas du cancer du poumon et de l'ovaire. Le folate est le ligand naturel de la FBP (Folate Binding Protéine) . Cette protéine est présente naturellement à la surface des cellules, cependant dans certains cancers elle est présente en plus grande quantité, on dit alors qu'elle est surexprimée (comparativement au tissu sain). La présence du folate sur le produit de contraste va faire que celui-ci ne va se fixer que sur les récepteurs FBP. Si le patient est atteint par exemple d'un cancer et qu'il surexprime la protéine on aura donc un signal intense permettant de localiser la tumeur, dite primaire, et certainement les métastases qui en sont dérivées. Compte tenu de l'importance du cancer du poumon (incidence forte, mortalité élevée), l'intérêt d'un tel produit est avéré dans le bilan d'extension et le suivi de traitement des patients. Cependant, du fait du que tous les patients ne surexpriment pas le récepteur au folate dans le cancer du poumon, un test diagnostic in vitro sur biopsie est particulièrement avantageux pour sélectionner les patients susceptibles de bénéficier d'un examen IRM avec injection de produit de contraste à base de folate, pour la réalisation du bilan d'extension et du suivi du traitement des patients atteints de cancer du poumon. Lorsqu'il y a suspicion de cancer du poumon le patient est automatiquement soumis à une fibroscopie bronchique, qui permet d'obtenir un prélèvement de la tumeur (biopsie). Ce prélèvement est ensuite examiné par un anatomo-pathologiste. Avec un kit standardisé le diagnostic du patient, concernant l'expression du récepteur au folate, ne prend pas beaucoup de temps à l'anatomo-pathologiste et on ne fait pas subir au patient d'examen supplémentaire. On peut utiliser par exemple, comme moyen d'étude du niveau d'expression 30 des folates, des anticorps (le Movl8 notamment), ou du folate tritié. Il existe une autre méthode basée sur l'expression de l'ARN messager en ayant recours à des techniques comme la PCR ou FISH. Cas d'un test avec un anticorps monoclonal spécifique de la FBP: après réaction avec cet anticorps (Mab) et lavage pour enlever les anticorps qui ne sont pas liés de façon spécifique, une seconde réaction est menée avec un anticorps secondaire marqué. Le marqueur est une substance qui peut générer un signal détectable tel qu'un élément radioactif ou fluorescent, une enzyme... . Dans la mesure où la liaison de l'anticorps révèle la présence de cellules malignes, la présence de cellules malignes peut être confirmée par la détection d'un signal. Une autre possibilité peut être l'utilisation d'un anticorps lié de façon covalente à un marqueur (peroxydase par exemple) qui permet la détection de cellules cancéreuses non seulement sur des coupes de tissus mais aussi dans le sputum ou les lavages bronchio-alvéolaires. On peut aussi utiliser le protocole peroxydase couplé à de la microscopie immunoélectronique décrit dans Boerman, O. C. et al. (1991). "Comparative immunohistochemical study of four monoclonal antibodies directed against ovarian carcinoma- associated antigen." Int. J of Gyn. Path. 10: 15-25. Dans le cas d'un test au folate tritié, on utilise par exemple la méthode suivante: les tissus sont émincés, homogénéisés puis solubilisés à l'aide d'une solution de Triton X-100 et enfin centrifugés. C'est le surnageant qui est ensuite utilisé pour les expériences de couplage avec le folate tritié. 9 REVENDICATIONS 1. Méthode de diagnostic in vitro du risque pathologique justifiant une étape ultérieure d'imagerie de diagnostic in vivo chez un sujet comprenant: 1) la mesure in vitro du niveau d'expression d'au moins un marqueur biologique non génétique associé à la pathologie dont on diagnostique le risque dans au moins un échantillon du sujet comprenant une quantité suffisante du marqueur, 2) la comparaison des résultats avec un témoin. 2. Méthode selon la revendication 1 dans laquelle l'échantillon est une biopsie d'une zone tumorale suspecte, un fluide biologique, un extrait tissulaire ou cellulaire d'une zone pathologique ou à risque pathologique. 3. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 dans laquelle la pathologie est une maladie cancéreuse, cardiovasculaire, inflammatoire ou neurodégénérative. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans laquelle le marqueur est un enzyme, un récepteur cellulaire, un anticorps ou un composant biologique de nature lipidique, protéique ou saccharidique. 5. Méthode selon la revendication 3 dans laquelle la pathologie est un cancer, avantageusement choisi parmi le cancer du sein, de l'ovaire et du poumon. 6. Méthode selon la revendication 5 dans laquelle le marqueur est la protéine de liaison au folate. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans laquelle l'imagerie de diagnostic in vivo est choisie parmi l'IRM, le scanner et la scintigraphie. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le sujet est un mammifère, avantageusement un être humain. 9. Kit de diagnostic in vitro du risque pathologique justifiant une étape ultérieure d'imagerie de diagnostic in vivo chez un sujet caractérisé en ce qu'il comprend: a. au moins un échantillon biologique à analyser, b. au moins un ligand capable de mesurer le niveau d'expression d'au moins un marqueur de l'échantillon biologique, c. un moyen de lecture permettant de corréler le niveau d'expression mesurée à une préconisation d'effectuer une imagerie de diagnostic in vivo. 10. Kit de diagnostic in vitro selon la revendication 9 dans lequel le marqueur est la protéine de liaison au folate.