FR 2882147 A1 20060818 FR 0501471 A 20050214 i Dispositif d'imagerie de fluorescence par réflexion à deux longueurs d'onde Domaine technique de l'invention L'invention concerne un dispositif d'imagerie de fluorescence par réflexion comportant au moins une première source de lumière d'une première longueur d'onde correspondant sensiblement à une longueur d'onde d'excitation d'un o fluorophore de marquage présentant une longueur d'onde d'émission principale, la longueur d'onde d'excitation et la longueur d'onde d'émission principale délimitant un intervalle prédéterminé, le dispositif comportant une caméra. État de la technique L'imagerie par réflexion à fluorescence ( FRI: Fluorescence Reflecl:ion Imaging ) est une technique largement utilisée pour la fluorescence in vivo. Elle consiste à effectuer une imagerie de fluorescence de zones marquées c'un fluorophore couplé le plus souvent à un anticorps qui se fixe spécifiquement sur des tissus ou organes malades par exemple des tissus cancéreux. La technique FRI est également utilisée pour l'imagerie in vitro, par exemple pour la lecture de biopuces. Les domaines concernés sont aussi bien la biologie végétale qu'animale. Par exemple, la technique FRI peut être mise en oeuvre pour suivre la progression de virus marqués d'un fluorophore dans les plantes. Par ailleurs, des techniques utilisant plusieurs marqueurs ont été proposées. Pour l'imagerie in vitro, par exemple la lecture de biopuces, les lecteurs traditionnels sont des microscopes à épi-illumination munis de caméras de type CCD et adaptés généralement à des champs de vision de faible taille de l'ordre de quelques millimètres carrés. Pour l'imagerie in vivo, on trouve généralement deux approches. Une première approche, typiquement utilisée pour l'imagerie du petit animal (souris, rat, etc...), consiste à utiliser une caméra de type CCD munie d'un dispositif annexe d'éclairage, par exemple d'éclairage annulaire ou d'éclairage sous incidence. Les appareils correspondants sont généralement encombrants. Une deuxième approche, destinée à l'utilisation dans le corps humain, consiste à utiliser un endoscope à l'extrémité duquel sont connectés une caméra et un système d'éclairage. Les endoscopes sont généralement limités à des longueurs d'onde dans la gamme du visible, le proche ultraviolet et le proche infrarouge étant à leur limite de transrnission. II existe de nombreux dispositifs qui permettent de visualiser un champ opératoire, en particulier des dispositifs utilisant différents bandes spectrales pour obtenir deux images qui sont superposées par la suite. Par exemple, une lumière d'excitation d'un fluorophore qui marque des tissus biologiques et une lumière blanche pour avoir une vision réaliste du champ opératoire. Les méthodes utilisées présentent généralement des problèmes de mise en forme du faisceau d'éclairage et d'auto-fluorescence. Le document US2001/007920, par exemple, décrit un système d'endoscopie comportant une unité d'illumination comportant une source de lumière blanche et une source laser de lumière d'excitation utilisée pour exciter une image de fluorescence d'un corps vivant. Le système comporte, de plus, une unitEi de détection d'images de fluorescence, comportant un détecteur du type CCC), et une unité de détection d'images classiques, comportant un détecteur du 1:ype CCD. Les deux images sont superposées par l'intermédiaire de moyens de superposition. Les deux sources de lumière sont activées en alternance, provoquant chacune l'exposition du détecteur associé par la lumière correspondante. Le document US6537211, par exemple, décrit un système d'imagerie d'une surface de tissus cancéreux comportant une source de lumière blanche pour exciter une image de réflexion et une source de lumière UV pour exciter une image de fluorescence. Les deux images sont détectées alternativement par une caméra de type CCD commune et affichées sur un écran commun. La lumière d'excitation de fluorescence est bloquée lorsque la lumière blanche est utilisée pour l'illumination et vice versa. Lorsqu'on détecte une cible marquée par un fluorophore, on est généralement gêné par l'autofluorescence des tissus et par la diffusion de lumière due aux tissus, en particulier lorsque les cibles sont disposées à une profondeur supérieure à 1 mm. Ces problèmes sont d'autant plus importants que la mesure est effectuée à des longueurs d'onde courtes, par exemple dans le bleu, et moins importants dans l'infrarouge. Cependant, dans l'infrarouge, le rendement des détecteurs est faible et le choix de fluorophores est restreint. Ainsi; on travaille essentiellement dans une bande d'excitation comprise entre 480nrn et 780nm avec une bande d'émission comprise entre 520nm et 800nm. Par ailleurs, le signal parasite de diffusion et de l'autofluorescence n'est pas du tout stationnaire. Objet de l'invention L'invention a pour but de remédier à ces inconvénients et, en particulier: de permettre la localisation rapide et précise de cellules marquées dans des tissus biologiques. Selon l'invention, ce but est atteint par le fait que le dispositif d'imagerie comporte au moins une seconde source de lumière d'une seconde longueur d'onde décalée par rapport à la première longueur d'onde, de manière à ce que la seconde longueur d'onde soit en dehors dudit intervalle prédéterminé, le décalage entre les première et seconde longueurs d'onde étant compris entre 30nm et 100nm, la caméra comportant des moyens de filtrage au moins des première et seconde longueurs d'onde, les moyens de filtrage étant transparent o à la longueur d'onde d'émission principale et à des longueurs d'ondes sensiblement supérieures à la plus élevée des première et seconde longueurs d'onde, le dispositif comportant des moyens de synchronisation des première et seconde sources de lumière et de la caméra, pour activer alternativement l'une des première et seconde sources de lumière et faire acquérir à la caméra alternativement une image de fluorescence et une image de bruit de fond. Selon deux modes de réalisation particuliers de l'invention, le dispositif comporte des moyens de soustraction de l'image de fluorescence et de l'image du bruit de fond et des moyens de division de l'image de fluorescence par l'image du bruit de fond. Les moyens de filtrage peuvent comporter un filtre passe-haut, ayant une longueur d'onde limite disposée entre la première longueur d'onde el la longueur d'onde d'émission principale, et un filtre de type coupe-bande correspondant à la seconde longueur d'onde. L'invention a également pour but un procédé de visualisation d'un objet utilisant un dispositif d'imagerie selon l'invention et comportant une étape de marquage de cellules par le fluorophore de marquage et alternativement une première étape d'activation de la première source de lumière et d'acquisition d'une image de fluorescence, et une seconde étape d'activation de la seconde source de lumière et d'acquisition d'une image du bruit de fond. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, le procédé comporte l'adaptation d'une image de fluorescence et d'une image du bruit de fond. de manière à ce qu'une zone d'image correspondant à une zone prédéterminée non-marquée par le fluorophore de marquage présente une même luminosité sur l'image de fluorescence et sur l'image du bruit de fond. Description sommaire des dessins D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement do la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention donnés à titre d'exemples non limitatifs et représentés aux dessins annexés, dans lesquels: Les figures 1 et 2 représentent respectivement une partie en vue de côté et une 20 autre partie en vue de dessus d'un mode de réalisation particulier d'un dispositif selon l'invention. Les figures 3 et 4 représentent respectivement les courbes de transmission de deux modes de réalisation particuliers d'un filtre en fonction de la longueur d'onde X. La figure 5 illustre la synchronisation des temps d'activation de la première source de lumière, de la seconde source de lumière et de la caméra en fonction du temps. Description de modes particuliers de réalisation Sur la figure 1, le dispositif d'imagerie comporte une caméra 1 munie d'un objectif 2 et d'un filtre 3. Dans le mode de réalisation particulier représenté à la figure 2, de la lumière est amenée à la caméra 1 par une fibre optique principale 4 qui est reliée à une pluralité de fibres optiques 5 rattachées à un diffuseur 6 de lumière en forme d'anneau, permettant d'illuminer uniformément un objet disposé sur un support 7 d'objet, par exemple un échantillon biologique. L'objet peut également être un champ opératoire. L'objet est marqué par un fluorophore o de marquage. La caméra détecte la lumière émise par l'objet par l'intermédiaire du filtre 3 et transmet des signaux représentatifs d'images à une unité de traitement, par exernple un micro-ordinateur 8. Sur la figure 2 sont représentées une première source de lumière 9 et une seconde source 10 de lumière. La première source de lumière 9 émet un premier faisceau 11 de lumière ayant une première longueur d'onde i1 correspondant sensiblement à une longueur d'onde d'excitation XEx du fluorophore de marquage. Le fluorophore de marquage présente une longueur d'onde d'émission XEm principale. La longueur d'onde d'excitation XEx et la longueur d'onde d'émission XEm principale de fluorescence délimitent un intervalle àEm prédéterminé. La seconde source 10 de lumière produit un second faisceau 12 d'une seconde longueur d'onde i2 décalée par rapport à la première longueur d'onde i1. Le décalage M2 (figures 3 et 4) entre la seconde longueur d'onde i2 et la première longueur d'onde i1 est compris entre 30nri et 100nm. La seconde longueur d'onde i2 est alors relativement proche do la première longueur d'onde i1. Ainsi, la lumière de la seconde source 10 de lumière permet de provoquer l'autofluorescence de l'objet illuminé dans les mêmes conditions, quasiment, que la lumière de la première source 9 de lumière, sans pour autant provoquer la fluorescence du fluorophore de marquage, dont le décalage AEm est inférieur à 30 nm. Les deux longueurs d'onde provoquent donc quasiment le même signal d'autofluorescence, qui lui constitue un bruit de fond du signal de fluorescence du fluorophore de marquage. Les premier et second faisceaux de lumière 11 et 12 sont dirigés, de préférence, sur l'entrée d'un filtre réglable acousto-optique 13 ( AOTF: Acousto-Optic Tunable Filter ), permettant de sélectionner la longueur d'onde d'un faisceau de sélection 14 orienté vers une entrée 15 de la fibre optique 4. Ainsi, le faisceau de sélection 14 a une longueur d'onde bien déterminée, notamment soit la première longueur d'onde X,1, soit la seconde longueur d'onde X2. Le f Itre réglable acousto-optique 13 est contrôlé par une unité de contrôle, par exemple constitué par le microordinateur 8 servant également au traitement d'image. Sur la figure 2, des première et seconde photodiodes 17 et 18 permettent de détecter l'intensité de faisceaux de référence 19 et 20 correspondant respectivement aux première et seconde longueur d'onde X,1 et X2. En effet, lorsque la longueur d'onde du faisceau de sélection 14 est la première longueur d'onde X,1, un premier faisceau de référence 19 correspondant à l'ordre zérc du filtre 13 AOTF est incident sur la première photodiode 17 et permet de déterminer l'intensité émise par la première source de lumière 9. Un second faisceau de référence 20 correspondant à l'ordre zéro de la seconde longueur d'onde X2 est détecté par la seconde photodiode 18 et permet, ainsi, de déterminer l'intensité émise par la seconde source de lumière 10. Dans le mode de réalisation particulier correspondant à la figure 3, la seconde longueur d'onde X2 est supérieure à la première longueur d'onde La seconde longueur d'onde X2 doit être en dehors de l'intervalle AEm prédéterminé, délimité par la longueur d'onde d'excitation a,Ex et la longueur d'onde d'émission XEm principale du fluorophore de marquage. Comme illustré par la courbe de transmission A du filtre 3 représentée à la figure 3, le filtre est opaque aux première (X1) et seconde (X2) longueurs d'onde, ce qui permet de filtrer la rétro-diffusion de la lumière d'excitation. Le filtre 3 est transparent à la longueur d'onde d'émission XEm principale. Le filtre 3 doit être transparent à des longueurs d'ondes sensiblement supérieures à la plus élevée des première et seconde longueurs d'onde X,1 et X2, c'est-à-dire à la seconde longueur d'cnde o X2, dans le mode de réalisation correspondant à la figure 3. Les longueurs d'ondes supérieures à la plus élevée des première et seconde longueurs d'onde 1 et X2 correspondent notamment à des signaux parasites d'autofluorescence de l'objet. A titre d'exemple, les première et seconde longueurs d'onde et X2 peuvent être respectivement 488nm et 532nm (décalage Al2=44nm) lorsque le fluorophore utilisé est de la fluorescéine, 540nm et 600nm (décalage Al2=60nm) lorsque le fluorophore utilisé est du Cy3, et 633nm et 690nm (décalage M 2=57nm) lorsque le fluorophore utilisé est du Cy5. Le filtre 3 correspondant à la figure 3 comporte, de préférence, un filtre passe-haut, ayant une longueur d'onde limite a,L (figure 3) disposée entre la première longueur d'onde X,1 et la longueur d'onde d'émission XEm principale. Lorsque: le fluorophore utilisé est de la fluorescéine, la longueur d'onde limite X,L est, par exemple 500nm. De plus, dans le mode de réalisation illustré à la figure 3, le filtre 3 comporte un filtre de type coupe-bande bloquant une bande spectrale étroite (par exemple un filtre holographique de type notch ), correspondant notamment à la seconde longueur d'onde X2. Le filtre de type coupe-bande est superposé au filtre passe-haut. Les sources de lumière présentant toujours une certaine largeur d'émission, l'écart entre la première longueur d'onde X,1 et la longueur d'onde limite Xl doit être sensiblement supérieure à la largeur d'émission de la première source de lumière 9 pour assurer que la lumière de diffusion correspondante soit filtrée par le filtre 3. Pour la même raison, la bande spectrale bloquée par le filtre de i:ype coupe-bande doit être supérieure à la largeur d'émission de la seconde source de lumière 10. Dans le mode de réalisation particulier correspondant à la figure 4, la seconde longueur d'onde X2 est inférieure à la première longueur d'onde Comme dans le mode de réalisation décrit précédemment, la seconde longueur d'onde X2 doit être en dehors de l'intervalle AEm prédéterminé, délimité par la longueur d'onde d'excitation XEx et la longueur d'onde d'émission XEm principale du fluorophore de marquage. Comme illustré par la courbe de transmission B du filtre 3 représentée à la figure 4, le filtre 3 est, comme précédemment, opaque aux première (X,1) et seconde (X2) longueurs d'onde et transparent à la longueur d'onde d'émission,Em principale. Le filtre 3 est transparent à des longueurs d'ondes sensiblement supérieures à la plus élevée des première et seconde longueurs d'onde X1 et X2, c'est-à-dire à la première longueur d'onde Xl dans le mode de réalisation correspondant à la figure 4. Le filtre 3 correspondant à la figure 4 comporte, de préférence, un filtre passe-25 haut ayant une longueur d'onde limite disposée entre la première longueur d'onde Xl et la longueur d'onde d'émission X,Em principale. L'écart entre la première longueur d'onde X1 et la longueur d'onde limite XL doit, comme précédemment, être sensiblement supérieure à la largeur d'émission de la première source de lumière 9 pour assurer que la lumière de diffusion correspondante soit filtré par le filtre 3. Selon l'invention, les première (9) et seconde (10) sources de lumière et la caméra 1 sont synchronisés de manière à activer alternativement l'une des première (9) et seconde (10) sources de lumière et faire acquérir à la caméra 1 alternativement une image de fluorescence et une image du bruit de fond. o L'image de fluorescence comporte le signal de fluorescence émis par le fluorophore de marquage, d'une part, et des signaux parasites dus à l'autofluorescence, d'autre part, tandis que l'image du bruit de fond comporte essentiellement des signaux dus à l'autofluorescence des tissus et aux fluorescences parasites (filtres, optiques diverses, support de l'objet lorsqu'il s'agit de lecture in vitro). La synchronisation peut être effectuée par l'intermédiaire du microordinateur 8 (figures 1 et 2) et du filtre réglable acousto-optique 13. Ainsi, comme représenté à la figure 5, la première source 9 de lumière est activée (la courbe S1 prend alors la valeur I à la figure 5) pendant que la seconde source 10 de lumière est désactivée (la courbe S2 prend alors la valeur O à la figure 5) et vice versa, tandis que la caméra 1 est activée (la courbe C prend la valeur I) respectivement pour l'acquisition d'images de chacune des sources. Entre deux acquisitions d'images, la caméra est désactivée (la courbe C prend la valeur O) pendant une durée très courte, de l'ordre de la microseconde. Les temps d'intégration de chaque type d'image, image de fluorescence et image du bruit de fond, ne sont pas nécessairement les mêmes. La caméra peut être pilotée en temps d'intégration variable, soit de façon programmée, soit 2882147 Il manuellement, par exemple, par le médecin. Par exemple, sur la figure 5, le temps d'illumination de la seconde source 10 de lumière (S2) est plus long que le temps d'illumination de la première source 9 de lumière (Si) et, ainsi, le temps d'intégration de la caméra associé à l'image du bruit de fond est plus long que le temps d'intégration associé à l'image de fluorescence. L'image du bruit de fond et l'image de fluorescence peuvent, par exemple, être affichées simultanément sur un même écran. Toute combinaison de l'imago du bruit de fond et de l'image de fluorescence peut également être déterminée et affichée, par exemple par l'intermédiaire de l'ordinateur 8. Dans un mode de réalisation particulier, l'image du bruit de fond est soustraite de l'image de fluorescence correspondante. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'image de fluorescence est divisée par l'image du bruit de fond correspondante. Par ailleurs, l'image du bruit de fond permet de visualiser l'ensemble de l'objet illuminé, par exemple d'un champ opératoire. Un procédé de visualisation d'un objet utilisant le dispositif selon l'invention comporte une étape de marquage de cellules par le fluorophore de marquage. Le procédé comporte ensuite, alternativement, une première étape El d'activation de la première source 9 de lumière et d'acquisition d'une image de fluorescence, et une seconde étape E2 d'activation de la seconde source 1 CI de lumière et d'acquisition d'une image du bruit de fond, comme illustré à la figure 5. Même si la seconde longueur d'onde a,2 est relativement proche de la première longueur d'onde X1, le signal d'autofluorescence des zones nonmarquées par le fluorophore de marquage n'a pas forcément la même intensité. Dans un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, on adapte des durées des première El et seconde E2 étapes, de manière à ce que une zone d'image correspondant à une zone prédéterminée non-marquée Fm' le fluorophore de marquage présente une même luminosité sur une image de fluorescence et sur une image du bruit de fond. Ainsi, lorsqu'on soustrait une image du bruit de fond d'une image de fluorescence, on obtient une image représentant essentiellement le signal dû au fluorophore de marquage. Lorsqu'on divise l'image de fluorescence par l'image du bruit de fond, on obtient une représentation accentuée des zones marquées par le fluorophore. C'est donc notamment le signal d'autofluorescence à des longueurs d'ondes supérieures à la plus élevée des première et seconde longueurs d'onde X1 et X2 qui permet de caractériser le signal d'autofluorescence qui est détecté à la longueur d'onde d'émission XEm et qui ne peut pas être filtré sans diminuer le signal de fluorescence à la longueur d'onde d'émission XEm. L'adaptation des durées des première El et seconde E2 étapes peut, par exemple, être effectuée par acquisition d'une image de fluorescence et d'une image du bruit de fond avec la même durée d'acquisition et calcul d'histogrammes de luminosité sur une portion d'image prédétermirée, correspondant à une zone non-marquée. Ensuite, les maximums des histogrammes permettent de déterminer automatiquement un rapport des durées des première El et seconde E2 étapes d'acquisition d'image, permettant d'obtenir la même luminosité sur une image de fluorescence et sur une image du bruit de fond. On peut également adapter, par l'intermédiaire du filtre réglable acoustooptiue 13, l'intensité du faisceau de sélection 14 pour chacune des première et seconde longueurs d'onde, de manière à ce que une zone d'image correspondant à une zone prédéterminée non-marquée par le fluorophore de marquage présente une même luminosité sur une image de fluorescence et sur une image du bruit de fond. L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation représentés. En particulier, plusieurs premières et plusieurs secondes sources de lumière peuvent être utilisées, par exemple, quatre sources ayant respectivement des longueurs d'onde de 488nm et de 532nm, d'une part, et de 633nm et de 690nm, d'autre part, les fluorophores utilisés étant la fluorescéine et le Cy5. Ainsi, le filtre 3 est opaque à ces quatre longueurs d'onde et transparent aux deux longueurs d'onde d'émission des fluorophores et à des longueurs d'ondes sensiblement supérieures à la plus élevée des premières et secondes longueurs d'onde, c'est-à-dire au-dessus de 690nm. Revendications 1. Dispositif d'imagerie de fluorescence par réflexion comportant au moins une première source (9) de lumière d'une première longueur d'onde (M) correspondant sensiblement à une longueur d'onde d'excitation (XEx) d'un fluorophore de marquage présentant une longueur d'onde d'émission (XEm) principale, la longueur d'onde d'excitation (XEx) et la longueur d'onde d'émission (XEm) principale délimitant un intervalle (AEm) prédéterminé, le dispositif comportant une caméra (1), dispositif caractérisé en ce qu'il comporte au mains w une seconde source (10) de lumière d'une seconde longueur d'onde 1:X2) décalée par rapport à la première longueur d'onde (a,1), de manière à ce qLe la seconde longueur d'onde (a,2) soit en dehors dudit intervalle (0 Em) prédéterminé, le décalage (M2) entre les première (M) et seconde (X2) longueurs d'onde étant compris entre 30nm et 100nm, la caméra (1) comportant des moyens de filtrage (3) au moins des première (M) et seconde (X2) longueurs d'onde, les moyens de filtrage (3) étant transparents à la longueur d'onde d'émission (XEm) principale et à des longueurs d'ondes sensiblement supérieures à la plus élevée des première (X,1) et seconde (X2) longueurs d'onde, le dispositif comportant des moyens de synchronisation (8, 13) des première (9) et seconde (10) sources de lumière et de la caméra (1), pour activer alternativement l'une des première (9) et seconde (10) sources de lumière et faire acquérir à la caméra (1) alternativement une image de fluorescence et une image de bruit de fond. 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de soustraction (8) de l'image de fluorescence et de l'image du bruit de fond. 3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte Jes moyens de division (8) de l'image de fluorescence par l'image du bruit de fond. 4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la seconde longueur d'onde (a,2) est supérieure à la première longueur d'onde (Xl). 5. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que les moyens de filtrage (3) comportent un filtre passe-haut, ayant une longueur d'onde limite (X2L) disposée entre la première longueur d'onde (M) et la longueur d'onde d'émission (XEm) principale, et un filtre de type coupe- bande correspondant à la seconde longueur d'onde (a,2). 6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la seconde longueur d'onde (X2) est inférieure à la première longueur d'onde (Xl). 7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que les moyens de filtrage (3) comportent un filtre passe-haut ayant une longueur d'onde limite (XL) disposée entre la première longueur d'onde (X1) et la longueur d'onde d'émission (XEm) principale. 8. Procédé de visualisation d'un objet utilisant un dispositif d'imagerie de fluorescence par réflexion selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de marquage de cellules pa' le fluorophore de marquage et alternativement une première étape (El) d'activation de la première source (9) de lumière et d'acquisition d'une image de fluorescence, et une seconde étape (E2) d'activation de la seconde source (10) de lumière et d'acquisition d'une image du bruit de fond. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte l'adaptation d'une image de fluorescence et d'une image du bruit de fond, de manière à ce qu'une zone d'image correspondant à une zone prédéterminée non-marquée par le fluorophore de marquage présente une même luminosité sur l'image de fluorescence et sur l'image du bruit de fond. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'adaptation d une image de fluorescence et d'une image du bruit de fond comporte l'adaptation de durées des première (El) et seconde (E2) étapes. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérise en 15 ce qu'il comporte la soustraction de l'image de fluorescence et de l'image du bruit de fond. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérise en ce qu'il comporte la division de l'image de fluorescence par l'image du bruit de 20 fond.