FR 2882150 A1 20060818 FR 0501425 A 20050211 PROCÉDÉ DE DÉTECTION ET/OU DE MESURE À HAUT DÉBIT D'UNE ACTIVITÉ LIPASIQUE -------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------- La présente invention a pour objet un procédé de détection et/ou de mesure in vitro à haut débit d'une activité lipasique, ainsi que ses applications. L'élaboration de méthodes analytiques pour la détection et le dosage des lipases a fait l'objet de travaux depuis de nombreuses années (Beisson F., Tiss A., Rivière C. and 10 Verger R. (2000) Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2: 133-153). Des triglycérides naturellement fluorescents pour détecter de très faibles activités lipasiques ont été utilisés dans le but de caractériser les propriétés cinétiques et énantiosélectives des lipases générées par la technique du "phage display" (Beisson F., Ferté N., Nari J., Noat G., Arondel V. and Verger R. (1999). Use of naturally fluorescent triacylglycerols from Parinari glaberrimum to detect low lipase activities from Arabidopsis thaliana seedlings. J. Lipid Res. 40: 2313- 2321). Le principe de cette méthode repose d'une part sur la présence dans l'huile de parinarium d'un acide gras naturellement fluorescent (acide parinarique) qui possède quatre doubles liaisons conjuguées et par conséquent absorbe la lumière dans le domaine ultraviolet et la réémet par un phénomène de fluorescence. Sous l'action hydrolytique des lipases, l'acide parinarique est libéré du triglycéride d'origine pour être solubilisé dans une phase micellaire. Ce changement de phase (d'une phase émulsifiée vers une phase micellaire) s'accompagne d'une variation d'émission spectrale de fluorescence que nous avons mise à profit pour suivre, avec une grande sensibilité, l'évolution au cours du temps de la réaction d'hydrolyse. Une des limitations de cette méthode fluorescente est liée à l'oxydabilité par l'oxygène atmosphérique des quatre doubles liaisons conjuguées de l'acide parinarique. C'est pour cela que les Inventeurs ont transposé le même principe de mesure à une huile extraite du bois de Chine (Tung oil) et utilisée depuis l'antiquité dans la fabrication des laques chinoises. Cette huile contient une très grande proportion d'acide a-éléostéarique qui lui possède seulement trois doubles liaisons conjuguées et n'est pas fluorescent mais absorbe la lumière ultraviolette. Cet acide est également beaucoup moins oxydable que l'acide parinarique. C'est ainsi que les Inventeurs ont utilisé d'une part les propriétés d'absorption ultraviolette de l'acide alpha-éléostéarique et d'autre part, le changement de phase décrit précédemment (d'une phase émulsifiée vers une phase micellaire) pour mettre au point une méthode dite en émulsion décrite dans l'article de Pencreac'h G., Graille J., Pina M. and Verger R. (2002) An ultraviolet spectrophotometric assay for measuring lipase activity using long-chain triacylglycerols from Aleurites fordii seeds. Anal. Biochem. 303: 17-24. Dans le cadre du développement de ces travaux, les Inventeurs ont utilisé les triglycérides purifiés de l'huile de tung pour tapisser d'un film très mince (équivalent à quelques centaines de couches monomoléculaires) les puits de plaques de microtitration (constitués d'une matière plastique non absorbante dans l'ultraviolet). Les Inventeurs ont démontré que ce film mince de triglycérides reste parfaitement adsorbé sur les parois des puits, même après rinçage par différents tampons aqueux. Sous l'action hydrolytique (à l'interface huile-eau) de différentes lipases, comme précédemment décrit, l'acide aéléostéarique est libéré et solubilisé en phase micellaire. Par conséquent, son spectre d'absorption ultraviolet est modifié et d'autre part, le chemin optique est considérablement augmenté par suite du passage de l'état adsorbé à l'état soluble, ce qui constitue un avantage significatif pour la technique par revêtement ou coating . La présente invention résulte de la mise en évidence par les Inventeurs du fait que cette nouvelle technique par revêtement ou c:oating de lipides (triglycérides naturels ou esters de synthèse) présente par rapport à la technique en émulsion précédente, les avantages suivants: une meilleure conservation au cours du temps des substrats lipidiques adsorbés (ou coatés ) dans les puits des plaques de microtitration, une activité des lipases plus élevée sur le substrat caaté que sur le substrat 25 en émulsion, une meilleure reproductibilité des expériences avec le substrat coaté , un rapport signal/bruit plus favorable dû à l'augmentation du chemin optique par suite du passage de l'état adsorbé à l'état soluble. Ainsi, la présente invention a pour but de fournir une nouvelle méthode de mesure de l'activité lipasique qui est plus spécifique, quantitative et sensible, que les méthodes décrites jusqu'à ce jour dans ce domaine, et qui permet de mesurer de très faibles activités lipolytiques (équivalentes à une quantité minimale d'environ 2 ng pour la Lipase de Thermomyces lanuginosus, TLL ), en utilisant un substrat naturel des lipases. La présente invention a également pour but de fournir une nouvelle méthode de mesure de l'activité lipasique permettant de cribler à haut débit les nombreux mutants des lipases susceptibles d'être générés grâce à la technique du "phage display". L'invention a aussi pour but de fournir une nouvelle méthode de mesure de l'activité lipasique à haut débit pour sélectionner des mutants et des lipases énantiosélectives, à l'aide des esters chiraux, d'intérêt pharmaceutique et biotechnologique, contenant de l'acide alphaéléostéarique. Ces mutants ainsi sélectionnés pourront servir de catalyseurs enzymatiques pour la synthèse asymétrique de molécules d'intérêt pharmaceutique et agro-alimentaire. L'invention a également pour but de fournir une nouvelle méthode de mesure de l'activité lipasique utilisable en clinique humaine, pour la mesure de la lipasémie plasmatique, lors du diagnostic précoce de diverses affections pancréatiques. L'invention concerne un procédé de détection et/ou de mesure in vitro d'une activité lipasique caractéristique d'une lipase d'origine naturelle ou synthétique dans un échantillon susceptible de contenir cette lipase, caractérisé en ce qu'il comprend: l'addition de l'échantillon susmentionné susceptible de contenir ladite lipase en solution aqueuse, dans les puits de plaques de microtitration revêtus d'une couche d'environ 0,5 à environ 5 m, et de préférence d'environ 1 m d'épaisseur d'un substrat lipidique pouvant être hydrolysé par ladite lipase en libérant de l'acide a-éléostéarique qui se solubilise en phase micellaire dans ladite solution aqueuse, la détection et/ou la mesure de l'activité lipasique par spectrophotométrie dans le spectre d'absorption UV de l'acide a-éléostéarique libéré lors de l'étape précédente. Par lipase d'origine naturelle ou synthétique on entend toute lipase de mammifères ou de microorganismes (bactéries, champignons...), le cas échéant modifiée par mutation d'un ou plusieurs acides aminés, et dont l'activité lipasique peut être classiquement mesurée selon les méthodes décrites notamment dans Beisson et coll. (Beisson F., Tiss A., Rivière C. and Verger R. (2000) Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur. J. Lipid Sei. Teclmol. 2: 133-153). L'invention concerne plus particulièrement un procédé tel que défini cidessus, caractérisé en ce que le substrat lipidique pouvant être hydrolysé par ladite lipase en libérant de l'acide a-éléostéarique, est un lipide choisi parmi des molécules d'intérêt industriel et/ou pharmaceutique sur lequel sont liés de façon covalente des groupes aéléostéarates, et est notamment choisi parmi: les triglycérides purifiés de l'huile de tung de formule générale CH2-COO-R1 1 CH-COO-R2 5 1 CH2-COO- R3 où R1, R2, R3 représentent des résidus d'acides gras identiques ou différents, comprenant d'environ 12 à 20 atomes de carbone, et de préférence comprenant 18 atomes de carbone, et présentant éventuellement une ou plusieurs insaturations, les di- et monoglycérides, ou des esters de cholestérol contenant 1 ou 2 chaînes d'a-éléostéarate en position adéquate selon le type de régiosélectivité des lipases recherchées, l'a-éléostéarate de citronellol de formule suivante: O ou des esters d'acide a-éléostéarate avec d'autres alcools ou molécules prochirales ou chirales d'intérêt pharmaceutique comme le propanolol, le sotalol ou le carvedilol utilisés comme (3-bloquants, ou avec des molécules d'intérêt industriel comme le menthol (dérivé terpénique d'intérêt aromatique). Dans l'huile de tung, les acides gras en quantité importante sont: l'acide aéléostéarique (70-80%), l'acide oléique (10 /o) et l'acide linoléique (15 %), comme décrit notamment dans Radunz et coll. (A. Radunz, P. He and G. H. Schmid, Analysis of the seed lipids ofAleurites montana. Z. Naturforsch. 53 (1998), pp. 305 310). L'invention concerne également un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement à l'addition de l'échantillon susceptible de contenir la lipase dans les puits de plaques de microtitration, une étape d'ajout aux puits des plaques de microtitration revêtus du substrat lipidique, d'une solution tampon constituée de Tris et de sels biliaires (NaTDC) et, le cas échéant de (3cyclodextrine, notamment dans les proportions suivantes: NaTDC (4 mM) et (3-Cyclodextrine (3 mg/mL). L'invention a également pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que les plaques de microtitration revêtues du substrat lipidique sont telles qu'obtenues par: addition d'une composition comprenant le substrat lipidique en solution dans un solvant approprié susceptible de pouvoir être évaporé sous vide, tel que l'hexane ou l'éther de pétrole, cette addition étant le cas échéant effectuée après lavage des puits desdites plaques avec ledit solvant, évaporation sous vide dudit solvant jusqu'à la formation d'un revêtement dudit substrat lipidique d'environ 0,5 à environ 5 m, et de préférence d'environ 1 m d'épaisseur sur les parois des puits des plaques de microtitration. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, de mesure in vitro de la lipasémie plasmatique chez l'homme ou l'animal, caractérisé en ce que l'échantillon contenant la lipase est un échantillon sanguin prélevé sur l'homme ou l'animal. A ce titre, l'invention concerne également l'application d'un procédé tel que défini ci-dessus, au diagnostic in vitro de pathologies liées à une augmentation du taux plasmatique de lipase chez l'homme ou l'animal, par rapport aux taux plasmatiques de cette lipase chez un individu sain. L'invention concerne plus particulièrement l'application susmentionné d'un procédé tel que défini ci-dessus, au diagnostic in vitro: d'affections pancréatiques telles que la pancréatite aiguë, pancréatite chronique, caractérisées par une augmentation du taux plasmatique de lipase chez l'homme ou l'animal, par rapport aux taux plasmatiques de cette lipase chez un individu sain, ou de l'insuffisance rénale, les traumatismes de l'abdomen (ischémie, infarctus mésentérique, perforation ou occlusion intestinale). L'invention concerne également un procédé de préparation de plaques de microtitration comprenant des puits revêtus d'un substrat lipidique pouvant être hydrolysé par une lipase en libérant de l'acide aéléostéarique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: addition aux puits desdites plaques d'une composition comprenant le substrat lipidique en solution dans un solvant approprié susceptible de pouvoir être évaporé sous vide, tel que l'hexane ou l'éther de pétrole, cette addition étant le cas échéant effectuée après lavage des puits desdites plaques avec ledit solvant, évaporation sous vide dudit solvant jusqu'à la formation d'un revêtement dudit substrat lipidique d'environ 0,5 à environ 5 m, et de préférence d'environ 1 gm d'épaisseur sur les parois des puits des plaques de microtitration. L'invention a également pour objet les plaques de microtitration comprenant des puits revêtus d'un substrat lipidique pouvant être hydrolysé par une lipase en libérant de l'acide a-éléostéarique, telles qu'obtenues par le procédé susmentionné, le revêtement dudit substrat lipidique sur les parois des puits des plaques de microtitration étant d'environ 0,5 à environ 5 m, et de préférence d'environ 1 m. d'épaisseur. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation des plaques de microtitration susmentionnées comprenant des puits revêtus d'un substrat lipidique, pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection et/ou de mesure in vitro d'une activité lipasique tel que défini ci- dessus, ou pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage d'inhibiteurs d'enzymes lipolytiques comprenant une étape de mesure de leur éventuelle capacité à inhiber lesdites enzymes grâce au procédé de détection et/ou de mesure in vitro d'une activité lipasique selon l'invention. LÉGENDE DES FIGURES La Figure 1 représente les protocoles de préparation des microplaques: "Coating" versus émulsion. Le substrat lipidique est adsorbé dans chaque puits de la microplaque ("Coating") ou préparé en émulsion puis déposé dans la microplaque (Emulsion). Les Figures 2a et 2b représentent la stabilité du substrat lipidique adsorbé ou 20 émulsifié. Dans la Figure 2a, la microplaque a été préparée par "coating" du S citronellol-aéléostéarate ester (80 g/ puits) et conservée plusieurs jours à 4 C. La stabilité du coating a été étudiée par dosage de l'activité lipolytique de la lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL) (10 nM finale) à différents jours de "coating" de l'ester dans un tampon Tris 10 mM pH 8.0, CaCl2 6 mlv1, EDTA 1 mM, BHT 0.001% et (3-cyclodextrine 3 mg/mL. La Figure 2a représente l'activité enzymatique relative (%) pendant plusieurs jours de "coating". Dans la Figure 2b, des émulsions à 20 g/mL d'a-éléostéarate de S citronellol ont été réalisées et distribuées (200 L) dans chaque puits de la plaque de microtitration. La 30 stabilité des émulsions est testée en mesurant l'activité de la TLL à différents temps après l'émulsification, comme décrit ci-dessus pour la Figure 2a. La Figure 3 représente la reproductibilité des activités de la TLL dosées sur le S citronellol-a-éléostéarate ester coaté ou en émulsion. L'activité de la TLL (4 nM) a été testée sur le S citronellol-aéléostéarate ester adsorbé (80 gg/puits) ou en émulsion (20 gg/mL) en microplaque dans un tampon Tris 10 mM pH 8.0, CaC12 6 mM, EDTA 1 mM, BHT 0.001% et (3-cyclodextrine 3 mg/mL. Les vitesses sont exprimées en milliunités d'absorbance apparues par minute (mAU/min). La variabilité des résultats a été calculée sur 8 expériences pour chacune des conditions expérimentales. L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la mise en oeuvre d'une méthode de mesure d'une activité lipase à l'aide des plaques de microtitration selon l'invention (méthode dite de coating ), par comparaison avec une méthode de mesure dite par émulsion . Cette étude a été réalisée en menant en parallèle l'étude de l'activité lipasique soit par coating de lipides (triglycérides naturels ou esters de synthèse) soit sur des émulsions réalisées au préalable dans un tube, avant répartition d'échantillons dans les puits de la microplaque (Figure 1). L'étude comparée coating versus émulsion en utilisant des esters énantiomériques (a-éléostéarate de R ou S citronellol) montre clairement que le coating de ces substrats sur la microplaque présente plusieurs avantages: 1. Meilleure conservation au cours du temps des substrats coatés Une solution d'a-éléostéarate de citronellol a été coatée (80 g/puits) dans les 96 puits d'une microplaque. L'activité de la lipase de Thermonryces lanuginosus (TLL) (10 nM, concentration finale) a ensuite été testée à différents jours après le coating . La microplaque a été conservée à 4 C, avec ou sans tampon dans les puits. Sur le graphe de la figure 2, on peut remarquer que l'activité de la lipase demeure constante au cours du temps, indiquant que la fixation du substrat sur la microplaque est reproductible et stable au moins pendant 20 jours. En parallèle, des émulsions à 20 gg/mL d'a-éléostéarate de S citronellol sont réalisées en injectant 12 L d'une solution d'ester (5 mg/mL en éthanol-BHT (Butylated HydroxyToluene) 0.001%) dans le tampon d'activité de la lipase (qsp 3 mL), créant ainsi un flash éthanolique. La solution est ensuite agitée avec un vortex pendant 2 minutes. La stabilité des émulsions est testée en mesurant l'activité de la TLL (10 nM) à différents temps après l'émulsification. L'activité de la lipase n'est pas constante et elle diminue significativement 30 minutes après la fabrication de l'émulsion (Figure 2). Ces résultats indiquent que les émulsions ne peuvent pas être conservées et donc doivent être utilisées immédiatement après leur fabrication. Ceci est un inconvénient majeur par rapport au coating des substrats en microplaque qui peut être réalisé plusieurs jours à l'avance. 2. Activité des lipases plus élevée sur le substrat coaté que sur l'émulsion L'activité de la lipase est plus élevée avec le substrat coaté qu'avec le substrat en émulsion (voir Figure 3). 3. Meilleure reproductibilité des expériences avec le substrat coaté La dispersion des résultats obtenue par le calcul des moyennes et des écarts-types sur 8 expériences est plus importante avec les substrats en émulsion (Figure 3). De plus, la fabrication des émulsions est difficile à obtenir de manière reproductible (cf. ci- dessus). En conclusion, le développement de ce test en microplaque est une méthode représentant un caractère innovant par rapport à toutes les méthodes précédentes (Beisson et coll., Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2000, 2: 133 153) pour le dosage rapide et continu des lipases avec des triglycérides naturels, reposant sur les propriétés spectrales dans l'UV de l'acide aéléostéarique. C'est un test sensible et reproductible. Le coating du substrat permet de préparer à l'avance une microplaque et de la conserver au moins deux semaines en chambre froide, sans précautions particulières. Par contre la technique d'émulsification, telle que publiée par Pencreac'h et collaborateurs (Anal Biochem. 2002; 303: 17-24), présente de nombreux inconvénients, à savoir instabilité des émulsions, activité lipolytique plus faible.... Par rapport à la publication précédente (Pencreac'h et coll.., Anal Biochem. 2002; 303: 17-24), la présente invention propose deux améliorations techniques importantes: - Haut débit: Adaptation du principe de la méthode publiée (Pencreac'h et coll., Anal Biochem. 2002; 303: 17-24) dans un système à haut débit (microplaque 96 puits). - Coating de substrats lipidiques dans les puits des plaques de microtitration avec une durée de conservation considérablement plus grande. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection et/ou de mesure in vitro d'une activité lipasique caractéristique d'une lipase d'origine naturelle ou synthétique dans un échantillon susceptible de contenir cette lipase, caractérisé en ce qu'il comprend: l'addition de l'échantillon susmentionné susceptible de contenir ladite lipase en solution aqueuse, dans les puits de plaques de microtitration revêtus d'une couche d'environ 0,5 à environ 5 m, et de préférence d'environ 1 m d'épaisseur d'un substrat 10 lipidique pouvant être hydrolysé par ladite lipase en libérant de l'acide a-éléostéarique qui se solubilise en phase micellaire dans ladite solution aqueuse, - la détection et/ou la mesure de l'activité lipasique par spectrophotométrie dans le spectre d'absorption UV de l'acide a-éléostéarique libéré lors de l'étape précédente. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en que le substrat lipidique pouvant être hydrolysé par ladite lipase en libérant de l'acide a-éléostéarique, est choisi parmi: les triglycérides purifiés de l'huile de tung de formule générale CH2-COO-R1 20 1 CH-COO-R2 1 CH2-COO-R3 où RI, R2, R3 représentent des résidus d'acides gras identiques ou différents, comprenant d'environ 12 à 20 atomes de carbone, et de préférence comprenant 18 atomes de carbone, et présentant éventuellement une ou plusieurs insaturations, les di- et monoglycérides, ou des esters de cholestérol contenant 1 ou 2 chaînes d'a-éléostéarate en position adéquate selon le type de régiosélectivité des lipases recherchées, l'aéléostéarate de citronellol de formule suivante: O ou des esters d'acide a-éléostéarate avec d'autres alcools ou molécules prochirales ou chirales d'intérêt pharmaceutique comme le propanolol, le sotalol ou le carvedilol, ou avec des molécules d'intérêt industriel comme le menthol. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement à l'addition de l'échantillon susceptible de contenir la lipase dans les puits de plaques de microtitration, une étape d'ajout aux puits des plaques de microtitration revêtus du substrat lipidique, d'une solution tampon constituée de Tris et de sels biliaires (NaTDC) et, le cas échéant, de 13-cyclodextrine. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les plaques de microtitration revêtus du substrat lipidique sont telles qu'obtenues par: addition d'une composition comprenant le substrat lipidique en solution dans un solvant approprié susceptible de pouvoir être évaporé sous vide, tel que l'hexane ou l'éther de pétrole, cette addition étant le cas échéant effectuée après lavage des puits desdites plaques avec ledit solvant, évaporation sous vide dudit solvant jusqu'à la formation d'un revêtement dudit substrat lipidique d'environ 0,5 à environ 5 m, et de préférence d'environ 1 gm d'épaisseur sur les parois des puits des plaques de microtitration. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, de mesure in vitro de la lipasémie plasmatique chez l'homme ou l'animal, caractérisé en ce que l'échantillon contenant la lipase est un échantillon sanguin prélevé sur l'homme ou l'animal. 6. Application d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 5, au diagnostic in vitro de pathologies liées à une augmentation du taux plasmatique de lipase chez l'homme ou l'animal, par rapport aux taux plasmatiques de cette lipase chez un individu sain. 7. Application selon la revendication 6 d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 5, au diagnostic in vitro: d'affections pancréatiques telles que la pancréatite aiguë, la pancréatite chronique, caractérisées par une augmentation du taux plasmatique de lipase chez l'homme ou l'animal, par rapport aux taux plasmatiques de cette lipase chez un individu sain, ou de l'insuffisance rénale, les traumatismes de l'abdomen (ischémie, infarctus mésentérique, perforation ou occlusion intestinale). 8. Procédé de préparation de plaques de microtitration comprenant des puits revêtus d'un substrat lipidique pouvant être hydrolysé par une lipase en libérant de l'acide a-éléostéarique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - addition aux puits desdites plaques d'une composition comprenant le substrat lipidique en solution dans un solvant approprié susceptible de:pouvoir être évaporé sous vide, tel que l'hexane ou l'éther de pétrole, cette addition étant le cas échéant effectuée après lavage des puits desdites plaques avec ledit solvant, évaporation sous vide dudit solvant jusqu'à la formation d'un revêtement dudit substrat lipidique d'environ 0,5 à environ i m, et de préférence d'environ 1 m 15 d'épaisseur sur les parois des puits des plaques de microtitration. 9. Plaques de microtitration comprenant des puits revêtus d'un substrat lipidique pouvant être hydrolysé par une lipase en libérant de l'acide aéléostéarique, telles qu'obtenues par le procédé selon la revendication 8, le revêtement dudit substrat lipidique sur les parois des puits des plaques de microtitration étant d'environ 0,5 à environ 5 m, et de préférence d'environ 1 tm d'épaisseur. 10. Utilisation des plaques selon la revendication 9, pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection et/ou de mesure in vitro d'une activité lipasique tel que défini dans l'une des revendications 1 à 7, ou pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage d'inhibiteurs d'enzymes lipolytiques.