FR 2878853 A1 20060609 FR 0452893 A 20041207 PROCEDE D'OBTENTION D'UN COMPLEXE FLUORESCENT, COMPLEXE OBTENU ET UTILISATION La présente invention a trait un procédé d'obtention d'un complexe fluorescent comportant un fluorochrome et une cyclodextrine. L'invention couvre également le conjugué fluorochrome- cyclodextrine obtenu par 5 ce procédé et son utilisation. Les fluorochromes prennent une place de plus en plus importante dans de nombreux domaines appliqués aux sciences de la vie. Leur utilisation en tant que marqueurs biomoléculair'es devient en particulier incontournable en matière de diagnostic in vitro. Un fluorophore ou fluorochrome est une molécule fluorescente qui possède la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse et de la restituer rapidement sous forme de lumière fluorescente. Un fluorophore peut être soit couplé à un marqueur spécifique, soit utilisé pour ses propriétés chimiques de reconnaissance d'un site cellulaire défini. Il existe de nombreux f luorophores qui permettent d'identifier, de suivre et/ou de quantifier des biomolécules spécifiques à l'aide de techniques d'imagerie cellulaire, telles que la cytométrie en flux, la microscopie confocale ou encore l' immunofluorescence. Dans leur grande majorité, les fluorophores sont très peu solubles et ont tendance à former des agrégats en milieu aqueux. Cette caractéristique, directement liée à leur structure chimique, provoque une forte diminution de la fluorescence et une mauvaise visualisation des structures ciblées. Pour pouvoir exploiter les propriétés de ces molécules fluorescentes et éviter leur précipitation, on passe habituellement par la constitution d'une solution stock en milieu organique. Les solvants organiques les plus couramment employés pour solubiliser les fluorochromes sont le diméthylformamide (DMF), le diméthylsulfoxide (DMSO) , l'éthanol ou le méthanol. Toutefois, l'utilisation de ces solvants impose de nombreuses contraintes, les protocoles opératoires étant relativement longs et compliqués. De plus, ces solvants sont souvent cytotoxiques et leur présence perturbe les propriétés de fluorescence du marqueur. Ils sont également généralement volatiles ce qui provoque au cours du temps des variations de concentration, et par conséquent, une fluctuation de la fluorescence. L'emploi de solvants entraîne donc des difficultés d'utilisation, une certaine cytotoxicité et une mauvaise reproductibilité des résultats. Plusieurs voies essayant d'augmenter la nature hydrophile des molécules 15 fluorescentes ont déjà été décrites. On peut citer à cet effet la demande US-5 268 486 qui propose d'ajouter des groupements sulfonates à la structure des fluorochromes, ou encore la demande WO 98/49176 qui préconise l'ajout de résidus hydrates de carbone. On connaît également la demande de brevet WO-98/26287 qui mentionne l'utilisation de cyclodextrines pour limiter les phénomènes d'agrégation des fluorophores sur les protéines. On connaît encore la demande EP-0 946 870 qui décrit un conjugué fluorescent composé à la fois d'un fluorochrome, d'une cyclodextrine et d'une molécule porteuse, cette dernière servant principalement au marquage d'autres molécules. La cyclodextrine permet de faire le lien entre le fluorochrome et la molécule porteuse. Ces différentes techniques ne donnent pas de résultats probants et ne fonctionnent qu'avec très peu de molécules. De plus, ces méthodes connues nécessitent l'emploi de fluorochromes à des concentrations élevées, entraînant un effet cytotoxique qui peut perturber les effets analysés. La présente invention a donc pour objectif d'obtenir des entités fluorescentes solubles en milieu aqueux, directement utilisables sur des préparations cellulaires, et peu toxiques. Elle a également pour but d'optimiser les propriétés de fluorescence des fluorophores tout en conservant leur affinité avec les structures biologiques qui leur sont spécifiques. Pour cela, l'invention propose un procédé d'obtention d'une entité fluorescente qui consiste à complexer un fluorochrome avec une cyclodextrine en milieu 10 aqueux. Par cyclodextrines on entend toutes cyclodextrines naturelles ou modifiées. De façon avantageuse on utilise des cyclodextrines modifiées, et plus particulièrement la Mono-3,6-anhydro- cyclomaltoheptaose (Mono-anhydro-R-cyclodextrine) décrite dans le brevet FR-2 714066, la 6'-(N'-méthylthiouréïdo)- 6'-désoxy-cyclomaltoheptaose (Méthyl thiouréido-l3-cyclodextrine ou MTU-13-CD) décrite dans le brevet FR-2 746103, l'Heptakis-6-éthanolamino-6-desoxycyclomaltoheptaose (Peréthanolamine-13-cyclodextrine) décrite dans le brevet FR-2 714067, la 6'-(propane-1,3-diamine)-6'-désoxy-cyclomaltoheptaose (Propanediamine-(3cyclodextrine) décrite dans le brevet FR-2 714067 ou encore l'Heptakis [2, 6-di-O-méthyl] cyclomaltoheptaose (biMEB). Le procédé d'obtention de complexes fluorochromes-cyclodextrines selon l'invention est basé sur une interaction entre la partie hydrophobe de la molécule fluorescente et l'intérieur de la cavité de la cyclodextrine. Le fluorochrome est alors inclus dans la cyclodextrine qui possède une surface externe hydrophile. Le complexe ainsi formé est donc soluble dans l'eau. Le complexe fluorescent obtenu selon la présente invention est donc soluble en milieu aqueux et par conséquent directement utilisable sur des préparations cellulaires. Ainsi, le complexe obtenu selon la présente invention est simple d'utilisation et peut se présenter sous forme de solution aqueuse exempte de solvants organiques prête à l'emploi. De même le complexe obtenu selon l'invention n'a pas ou peu d'effet cytotoxique sur les échantillons analysés puisque le procédé de complexation selon l'invention nécessite une concentration moindre en fluorochrome, la présence de cyclodextrines permettant son maintien sous forme monomérique, conférant ainsi une meilleure sensibilité aux techniques de mesures mises en oeuvre. Le complexe selon la présente invention permet également d'obtenir des résultats reproductibles. En effet, le procédé de marquage utilisant le complexe obtenu selon la présente invention est réalisé sans solvant organique. Il n'y a donc pas d'évaporation et la concentration en fluorochrome reste stable. Avantageusement, le procédé d'obtention selon la présente invention permet de conserver voire d'optimiser les propriétés intéressantes des fluorochromes. Ainsi le complexe obtenu selon la présente invention conserve l'affinité péri- ou intracellulaire du fluorochrome avec les structures biologiques qui lui sont spécifiques. En outre, le complexe obtenu selon la présente invention possède des propriétés de fluorescence améliorées comparées à celles du fluorochrome seul. Finalement, le procédé de complexation selon la présente invention permet de conserver le complexe fluorophore-cyclodextrine sous forme lyophilisée pendant plusieurs mois, ou dans un milieu aqueux sans précipitation pendant plusieurs semaines. Le procédé de complexation selon l'invention s'applique à tous les fluorochromes. 25 De façon avantageuse, les fluorochromes utilisés sont des carbocyanines ou des styryls. Les complexes obtenus selon l'invention peuvent être utilisés pour révéler et/ou quantifier des cellules ou des molécules spécifiques à l'aide de techniques 2878853 5 d'imagerie cellulaire. Plus particulièrement, les complexes obtenus selon la présente invention présentent un intérêt pour les méthodes permettant le diagnostic in vitro, à savoir la cytométrie en flux, la microscopie confocale, la spectrofluorimétrie ou encore l'épifluorométrie. L'invention est maintenant décrite en détail en regard des figures annexées sur lesquelles: - la figure 1 représente une microphotographie de cellules HeLa (cellules de carcinome utérin) incubées avec 1pM de DiIC18 préparé dans du méthanol, et - la figure 2 représente une microphotographie de cellules HeLa (cellules de carcinome utérin) incubées avec lpM de DiICl8 complexé avec une biMEB en phase aqueuse. 1/ PROCEDE D'OBTENTION DE COMPLEXE FLUOROCHROME-CYCLODEXTRINE Le procédé de complexation selon l'invention consiste en la succession des étapes suivantes: - pesées des cyclodextrines et des fluorochromes, -mise en contact des cyclodextrines et des fluorochromes sous forme poudre- poudre, poudre-liquide ou liquide-liquide, reprise en solution aqueuse si nécessaire, - agitation du complexe (à vitesse, température, pH et durée dépendants 20 des propriétés physico-chimiques de la cyclodextrine et du fluorochrome utilisés), - extraction de la fraction soluble, par exemple par ultracentrifugation ou filtration, et analyse quantitative par chromatographie haute performance de la cyclodextrine et du fluorochrome, et - en fonction des résultats précédents, conditionnement sous forme liquide par dilution dans une solution aqueuse, ou solide, par exemple par lyophilisation ou encore par atomisation. 2/ CARACTERISATION DU COMPLEXE FLUOROCHROME-CYCLODEXTRINE Le complexe obtenu est caractérisé par un rapport molaire cyclodextrine/fluorochrome compris entre 1 et 100. Ce rapport est dépendant des propriétés physico-chimiques de la cyclodextrine et du fluorochrome utilisés. 3/ EXEMPLES 3-1/ Exemple de complexation du DiOC6 Le DiOC6 est une sonde potentiométrique de la famille des carbocyanines qui présente la caractéristique de s'insérer dans les bicouches lipidiques. L'intensité de fluorescence du DiOC6 est directement proportionnelle à la différence de potentiel du système membranaire dans lequel il est inséré ce qui le rend particulièrement apte à la visualisation des mitochondries. Le DiOC6 est très peu soluble en milieu aqueux. Dans cet exemple on complexe le DiOC6 avec une cyclodextrine, la MTU-13-CD, pour pouvoir ensuite l'utiliser en spectrofluorimétrie, en cytométrie de flux, et 15 en microscopie confocale. a - Procédé de complexation DiOC6/MTU-f3-CD Le procédé de complexation du DiOC6 avec la MTU-(3-CD consiste en la succession des étapes suivantes peser entre 10mg et 1g de DiOC6, - ajouter entre 400mg et 46g de MTU-(3-CD, - mélanger dans 15 ml à 1,51 d'eau et agiter de 12 à 72 heures, - prélever un aliquote du mélange de complexation et extraire la fraction soluble par ultracentrifugation ou microfiltration (porosité 0,45 m) diluer cet aliquote dans une phase aqueuse et réaliser un dosage quantitatif de la concentration en DiOC6, ajuster la concentration en DiOC6 de la solution stock à la concentration désirée, - prélever un nouvel aliquote et le traiter comme précédemment afin de mesurer la concentration en DiOC6, - ajuster la concentration en DiOC6 de la solution stock si nécessaire, - répartir la solution précédente dans des flacons teintés en fractions de 5 à 100 I, selon la concentration finale en DiOC6 désirée (H2O qsp 1000 à lml), - congeler le contenu des flacons ainsi que les reliquats des solutions stocks et intermédiaires, et - lyophiliser et sceller les contenants. Le contenu des flacons peut ensuite être directement utilisé sur les échantillons à analyser en fonction des protocoles de marquage spécifiques aux techniques de mesure de fluorescence utilisées. b - Mesures de fluorescence en spectrofluorimétrie On dispose en triplicat sur plaque 96 puits, 200 pl de chacune des solutions ci- dessous: H20 biOC6 8,6 pM Complexe DiOC6 8,6 pM / MTU-13-CD 8,6 pM - Complexe DiOC6 8,6 pM / MTU-13-CD 17,2 pM - Complexe DiOC6 8,6 pM / MTU- [3-CD 172 pM Complexe DiOC6 8,6 pM / MTU-13-CD 860 pM La plaque 96 puits est ensuite placée dans un spectrofluoromètre avec une longueur d'onde d'excitation Aexc=465nm et une longueur d'onde d'émission Aem=530nm. 10 On obtient les résultats présentés dans le tableau suivant: Intensité de fluorescence (U.A.) H20 5800 biOC6 8,6 pM 14200 Complexe DiOC6 8,6 pM / MTU-13-CD 8,6 pM 29 000 Complexe DiOC6 8,6 pM / MTU-F3-CD 17,2 pM 40 000 Complexe biOC6 8,6 pM / MTU-F3-CD 172 pM 44 000 Complexe biOC6 8,6 pM / MTU-(3-CD 860 pM 50 000 c - Marquaqe de cellules JY en cytométrie en flux Les cellules JY sont des cellules de lymphocytes B transformées par le 5 virus d'Epstein Barr(EBV). L'intensité du biOC6 est proportionnelle à la différence de potentiel provoquée par un déséquilibre ionique de part et d'autre du système membranaire dans lequel il est inséré. Pour évaluer l'efficacité et l'affinité du marquage au biOC6, il est possible d'ajouter un découpleur CLCCP. Ce CLCCP est un agent protonophore, qui, en s'insérant dans la membrane, laisse passer les protons, et engendre ainsi une rupture du déséquilibre ionique. Il n'y a donc plus de différence de potentiel et par conséquent peu ou pas de fluorescence du biOC6. On compare la fluorescence sur cellules JY du biOC6 seul à 40nM ou 15 complexé à 40nM en présence ou non d'un découpleur CLCCP. On obtient les résultats présentés dans le tableau suivant: Intensité de fluorescence (U.A.) biOC6 40 nM 60 biOC6 40 nM + CLCCP 14 Complexe MTU-R-CD biOC6 40nM 162 Complexe MTU-R-CD DiOC6 40nM + CLCCP 36 On constate que l'intensité de fluorescence à concentration égale en biOC6 est trois fois plus élevée lorsque le fluorochrome est couplé à la MTU-13-Cb. Ainsi pour obtenir une intensité de fluorescence identique à celle induite par le biOC6 seule, il est possible d'utiliser 2 fois moins de biOC6 en le complexant avec une MTU-P-CD. Les résultats obtenus en présence du découpleur CLCCP montrent que cette augmentation de sensibilité se fait sans modifier les caractéristiques de marquage de la sonde. En effet on observe un rapport constant des intensités en présence et en absence du découpleur. 3-2/ Exemple de complexation du DiIC18 Le DiIC18 est une sonde potentiométrique de la famille des carbocyanines qui présente la caractéristique de s'insérer dans les membranes cellulaires au sein desquelles il peut diffuser Son intense émission de fluorescence et sa photostabilité en font un outil de choix pour marquer les membranes plasmiques. Comme le biOC6, le DiIC18 est très peu soluble en milieu aqueux. Dans cet exemple on complexe le DiIC18 avec une cyclodextrine, la DiMEB, pour pouvoir ensuite l'utiliser en cytométrie en flux et en microscopie 20 confocale. a - Procédé de complexation DiIC18/DiMEB Le procédé de complexation du DiIC18 avec la biMEB consiste en la succession des étapes suivantes peser entre 10mg et 1g de DiIC18 et dissoudre la poudre dans du méthanol, - mesurer la concentration en DiIC18 par lecture de densité optique à la longueur d'onde X. = 549 nm au spectrophotomètre - prélever un volume de la solution stock précédente tel que la concentration en DiIC18 finale soit comprise entre 50 M et 5mM, soit environ entre 150pg et 15 mg, et évaporer le méthanol, - peser entre 30mg et 3g de biMEB, et dissoudre la poudre dans environ 2 à 200 mL d'eau, - mélanger le DiIC18 avec la solution de biMEB et agiter de 3 à 8 jours, - prélever un aliquote de complexe et isoler le DiIC18 par 10 extraction à l'éther, - évaporer l'éther et reprendre le DiIC18 dans du méthanol, - mesurer la concentration par spectrophotométrie, - ajuster la concentration en DiIC18 du mélange de complexation entre 5 et 100 M, - répartir la solution précédente dans des flacons teintés, - congeler le contenu des flacons, et lyophiliser et sceller les contenants. Le contenu des flacons peut ensuite être directement utilisé sur les échantillons à analyser en fonction des protocoles de marquage spécifiques 20 aux techniques de mesure de fluorescence utilisées. b - Marquage de cellules JY en cytométrie en flux Les cellules JY sont des cellules de lymphocytes B transformées par le virus EBV. On compare la fluorescence sur cellules JY du DiIC18 seul ou en complexe à concentrations variables. On obtient les résultats présentés dans le tableau suivant Intensité de fluorescence (U.A.) DiICl8 50nM 25 Complexe DIMEB DiIC18 50nM 120 DiICl8 200nM 80 Complexe DIMEB DiIC18 200nM 180 DiIC18 600nM 250 Complexe DIMEB DiIC18 600nM 1380 DiIC18 800nM 400 Complexe DIMEB DiIC18 800nM 1580 DiIC18 1000nM 500 Complexe DIMEB DiIC18 1000nM 1780 On constate que l'intensité de fluorescence à concentration égale en DiIC18 est quatre fois plus élevée lorsque le fluorochrome est couplé à la biMEB. Ainsi pour' obtenir une intensité de fluorescence identique à celle induite par la DiIC18 seule, il est possible de diviser par quatre la concentration en DiIC18 en le complexant avec une biMEB. d - Observation en microscopie confocale de cellules HeLa marquées au DiIC18 Les cellules HeLa sont des cellules de carcinome utérin. On incube des cellules HeLa: - soit en présence de liM de DiICl8 seul préparé avec du méthanol, - soit en présence de 1iM de DiICl8 complexé avec la biMEB en phase aqueuse. On réalise une microphotographie de ces deux préparations cellulaires 15 avec un objectif à immersion X60. Les résultats sont présentés sur les figures 1 et 2. En présence de DiIC18 complexé avec la DiMEB (figure 2), l'intensité de fluorescence est fortement augmentée avec une amélioration sensible de la netteté des structures révélées. De ce fait, on observe sur la figure 2 des prolongements cellulaires qui étaient invisibles sur la figure 1 avec le DiICl8 seul. Ainsi, à concentration équivalente en DiIC18 et pour des réglages identiques, l'association de la DiMEB au fluorophore augmente la spécificité et la sensibilité du marquage. 3-3/ Autre exemple de complexation Il est également possible de complexer selon l'invention un DiOC6 avec une DiMEB. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un complexe fluorescent, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - mise en contact de cyclodextrines et de fluorochromes, - agitation du complexe, et - extraction de la fraction soluble. 2. Procédé d'obtention d'un complexe fluorescent selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fraction soluble est conditionnée sous forme liquide par dilution dans une solution aqueuse. 3. Procédé d'obtention d'un complexe fluorescent selon la revendication 10 1, caractérisé en ce que la fraction soluble est conditionnée sous forme solide par lyophilisation ou atomisation. 4. Procédé d'obtention d'un complexe fluorescent selon l'une quelconque des précédentes revendications, caractérisé en ce que les fluorochromes utilisés sont des carbocyanines ou des styryls. 5. Procédé d'obtention d'un complexe fluorescent selon l'une quelconque des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cyclodextrines utilisées sont des cyclodextrines modifiées. 6. Procédé d'obtention d'un complexe fluorescent selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cyclodextrines utilisées sont de la forme 6'-(N'-20 méthylthiouréido)-6'-désoxy-cyclomaltoheptaose. 7. Procédé d'obtention d'un complexe fluorescent selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cyclodextrines utilisées sont de la forme Mono-3,6-anhydro-cyclomaltoheptaose. 8. Procédé d'obtention d'un complexe fluorescent selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cyclodextrines utilisées sont de la forme Heptakis-6-éthanolamino-6-desoxy-cyclomaltoheptaose. 9. Procédé d'obtention d'un complexe fluorescent selon la revendication 5 5, caractérisé en ce que les cyclodextrines utilisées sont de la forme 6'-(propane-1,3-diamine)-6'-désoxy-cyclomaltoheptaose. 10. Procédé d'obtention d'un complexe fluorescent selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cyclodextrines utilisées sont de la forme Heptakis [2,6-di-O-méthyl] cyclomaltoheptaose. 11. Complexe fluorescent soluble obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le rapport molaire cyclodextrine/fluorochrome est compris entre 1 et 100. 12. Complexe fluorescent soluble obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est constitué de 6'-(N'méthylthiouréïdo)-6'-désoxy-cyclomaltoheptaose et de DiOC6. 13.Complexe fluorescent soluble obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est constitué d'Heptakis [2,6-di-O-méthyl] cyclomaltoheptaose et de DiIC18. 14. Complexe fluorescent soluble obtenu par la mise en oeuvre du procédé 20 selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est constitué d'Heptakis [2,6-di-O-méthyl] cyclomaltoheptaose et de biOC6. 15. Utilisation du complexe fluorescent soluble selon l'une des revendications 11 à 14 pour révéler et/ou quantifier des cellules ou des molécules. 16. Utilisation du complexe fluorescent soluble selon la revendication 15 pour révéler et/ou quantifier des cellules ou des molécules en cytométrie en flux, en microscopie confocale, en spectrofluorimétrie ou en épifluorométrie.