FR 2876004 A1 20060407 FR 0410416 A 20041001 L'invention concerne l'utilisation de macroalgues rouges soumises à des conditions extrêmes de température et de luminosité, ou d'extraits issus de telles algues, comme antioxydant. L'invention trouve notamment application dans les domaines nutritionnel, diététique et nutraceutique. La valeur alimentaire des algues est connue de longue date puisque, depuis des siècles, les populations de pays du Sud-Est asiatique en consomment (Nisizawa K.et al., Hydrobiol. (1987), vol.151/1542, pp.5-29), notamment pour leurs saveurs et souvent comme "sea vegetable" ou légume d'accompagnement issu de la mer. Dans les pays occidentaux, les algues sont essentiellement utilisées comme source de phycocolloïdes, principalement pour l'obtention d'alginates, de carraghénanes ou d'agars aux propriétés épaississantes, gélifiantes ou stabilisantes largement reconnues (Mc Huhh D., Hydrobiol. (1991), vol.221, pp.19-29). L'intérêt nutritionnel des algues est cependant bien établi avec une richesse à la fois en minéraux, fibres, protéines, acides aminés essentiels et vitamines (Burtin P., Electron. J. Environ. Agric. Food Chem. (2003), vol. 2(4) ISSN: 1579-4377; Jimenez-Escrig et al., Arch. Latinoam. de Nutr. (1999), vol.49, pp.114-120; Carbini L. et al., Riv. Sci. Aliment. (1998), vol.27, pp.169-173). Par ailleurs aujourd'hui, il est admis qu'il nous faut lutter au mieux, dans notre vie quotidienne, contre les facteurs environnementaux qui induisent un stress oxydant (UV, pollution, etc) à effet délétère sur notre organisme, tel une trop grande production de radicaux libres ou d'espèces réactives oxygénées. Une supplémentation en antioxydants constitue de ce fait actuellement l'une des plus vives recommandations nutritionnelles ("Des antioxydants pour nous aider à vieillir en bonne santé", Nutranews, Décembre 2001). C'est en outre une des principales revendications des fabricants de compléments ou suppléments alimentaires, ou d'alicaments dans l'industrie nutraceutique, avec la mise sur le marché de produits aux multiples vertus, notamment antioxydantes, les "multi-nutriments" ("Les mufti- nutriments, des suppléments nutritionnels essentiels", Nutranews, Avril 2003). Le potentiel antioxydant des algues est largement documenté dans l'état de la technique. L'activité antioxydante de macroalgues fraîches ou séchées fait ainsi l'objet d'une récente étude (Jimenez-Escrig A. et al., J. Sci. Food Agric. (2001), vol.81, pp.530-534) où il est conclu, d'une part, à une corrélation entre le pouvoir antioxydant et la richesse de l'algue en substances polyphénoliques que sont les phloroglucinols, et, d'autre part, au potentiel antioxydant des algues brunes supérieur à celui des algues rouges. Il est à noter dans cet article, pour l'espèce rhodophyte Chondrus crispus de qualité usuelle (ou standard), la non détection d'une activité antioxydante. La demande de brevet FR-A-2 655 268 décrit l'utilisation d'extraits d'algues brunes, rouges ou vertes pour la préparation de compositions, notamment alimentaires, à activité anti-radicalaire. Il est mentionné que les algues brunes présentent l'activité anti-radicalaire la plus importante. Nulle information n'est divulguée quant à la nature des substances responsables de cette activité d'origine algale. Par ailleurs, il est à souligner que les algues rouges de qualité usuelle, généralement exploitées pour leur richesse en phycocolloïdes, sont récoltées ordinairement et classiquement en phase de prolifération. Le métabolisme qu'elles présentent est donc tout à fait différent de celui de l'algue encore au stade végétatif. Par exemple, dans le cas particulier de l'algue Chondrus crispus, un examen de sa composition révèle une consommation très rapide d'un dipeptide accumulé en phase végétative, le dipeptide citrullinylarginine, dès le retour du printemps et de conditions favorables à la croissance de la plante (Laycock M.V. et al., Can J. Biochem. (1981), vol.59, pp.522-527). D'une manière générale, il est observé, lors de la croissance d'une algue, à la fois une augmentation de la teneur en phycocolloides et une diminution de celle en composés à valeur énergétique puisque ces derniers sont activement consommés. Dans le cas de l'algue Chondrus crispus, ceci pourrait expliquer la faible valeur nutritionnelle accordée par les auteurs en conclusion d'une étude sur l'effet de régimes algaux sur la croissance de mollusques marins (Mai K. et al., Aquaculture (1994), vol.128, pp.115-130) . La littérature rapporte que certaines macroalgues rouges peuvent, lors de conditions hivernales avec une température de l'eau basse et un minimum d'intensité lumineuse, capter l'azote (ions nitrate, nitrite, ammonium) des eaux côtières et le stocker sous forme de petits peptides ou/et divers aminoacides libres (gigartinine, citrulline, arginine, ornithine, etc) variables selon l'espèce. Lesdites algues rouges naturellement identifiées avec un tel profil au sortir de l'hiver ont été successivement Grateloupia turuturu (Miyazawa K. et al., Bulletin of the Japonese Society of Scientific Fisheries (1974), vol.40, pp.815-818), Ahnfe/tia plicata, Gracilaria sp., Petrocel/s middendorfii, Polyides rotundus, Polysiphonia lanosa, Rhodomela confervoides (Laycock M. V. et al., Can J. Biochem. (1977), vol.55, pp.27-30) et Chondrus crispus (Laycock M.V. et al., Can J. Biochem. (1981), vol.59, pp.522- 527). Cette modification métabolique au sein de l'algue a été exploitée pour des applications en dermatologie. Ainsi, la demande de brevet européen EP 1 350 517 Al (déposée par la demanderesse) décrit l'utilisation dermatologique, comme agents de soin et de traitement pour la peau et de phanères, de molécules chimiques analogues du dipeptide citrullinylarginine et d'un extrait enrichi en polypeptides contenant ce dipeptide. En poursuivant ses recherches, la demanderesse a constaté que les macroalgues rouges soumises à des conditions extrèmes de température et de luminosité, ainsi que certaines fractions issues de l'extraction de telles algues, présentent un fort caractère antioxydant, et ce, de manière inattendue au regard de l'absence d'une telle caractéristique pour les mêmes algues rouges mais récoltées en pleine croissance (dites "algues standards") ou pour les fractions obtenues à partir desdites algues. La demanderesse a noté en outre, lors d'études comparatives avec des antioxydants de référence et une réplique chimique du dipeptide citrullinylarginine, que ce caractère antioxydant ne pouvait être expliqué par la seule accumulation du dipeptide dans l'algue soumise à des conditions extrêmes de température et de luminosité. Elle en a conclu que d'autres constituants accumulés dans cette qualité d'algue lors de la période hivernale contribuent également au pouvoir antioxydant, et a identifié certains de ces constituants. Ainsi, selon un premier aspect, l'invention a pour objet l'utilisation nutritionnelle, diététique ou nutraceutique, de macroalgues rouges soumises à des conditions extrêmes de température et de luminosité, ou d'extraits issus de telles algues, comme agent antioxydant. De préférence, les macroalgues rouges sont choisies parmi les espèces Grateloupia turuturu, Ahnfe/tia pl/cata, Gracilaria sp., Petrocel/s middendonii, Polyides rotundus, Po/ys/phonia /arrosa, Rhodome/a confervoides, Gymnogongrus devoniensis, Callophy/lis crassifo/ia, Ça//ophy/lis crenu/ata, Callophy/lis mega/ocarpa, Callophyllis pinnata et Chondrus crispus, cette dernière espèce étant particulièrement préférée. Par "macroalgues rouges soumises à des conditions extrêmes de température et de luminosité", il faut comprendre des algues au stade végétatif qui ont été exposées à une eau froide et une luminosité réduite permettant la formation de constituants antioxydants, mais aussi énergétiques. Ces conditions particulières peuvent être soit des conditions naturelles hivernales, soit des conditions artificielles avec un procédé de culture en bassin reproduisant les conditions naturelles ci-dessus. Les paramètres "sensibles" pour de telles conditions artificielles sont notamment décrites pour l'espèce Chondrus crispus (Laycock M.V. et al., Can J. Biochem. (1981), vol.59, pp.522-527). Quel que soit l'environnement "hivernal" retenu, naturel ou reproduit, une caractéristique importante de l'invention est que la qualité d'algue recherchée n'est obtenue que lorsque l'algue est exposée aux conditions suivantes: - une étape de récolte de l'espèce algale à la fin de la saison hivernale (hiver septentrional), de préférence entre Mars et début Avril; - une "exposition" de l'espèce algale à une eau froide comprise entre 0 et 8 C, de préférence entre 0 et 4 C; - une "exposition" de l'espèce algale à une luminosité réduite, de préférence à une intensité lumineuse comprise entre 40 et 120 langley.da- 1 PAR; - une "exposition" de l'espèce algale à une eau contenant des ions nitrate et ammonium, de préférence une eau contenant des ions nitrate à la teneur de 1 à 6 pmole; - une "exposition" de l'espèce algale à une eau de faible salinité, de préférence une eau de salinité comprise entre 10 et 30 pour mille. Ces conditions sont celles que l'on trouve dans des zones subarctiques (au nord du 45 parallèle N). Les côtes de la Nouvelle Ecosse au Canada constituent par exemple un biotope particulièrement favorable à l'obtention de la qualité d'algue recherchée. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, une biomasse "unialgale" d'algue rouge, par exemple de Chondrus crispus, est tout d'abord obtenue après une sélection rigoureuse d'une qualité d'algue dépourvue de toute algue "parasite". Elle est ensuite placée en bassin (fin automne/début d'hiver) puis maintenue en eau de mer filtrée pendant tout l'hiver, sans agitation ni oxygénation, dans les conditions indiquées cidessus. Elle est alors récoltée en fin de période végétative (Mars/Avril), avant que l'algue ne passe en phase proliférative. Cette algue est finalement soigneusement lavée, puis séchée. L'algue "exposée" est caractérisée par une teneur élevée en constituants antioxydants et énergétiques, et elle comprend notamment: - le dipeptide citrullinylarginine, - les aminoacides libres taurine et citrulline et/ou leurs dérivés, - des aminoacides "mycosporine-like", - les ions zinc et/ou sélénium, - le floridoside. Les dérivés de la taurine peuvent être la N-diméthyl-taurine et la Ntriméthyl- taurine, et ceux de la citrulline les aminoacides lividine, grateloupine, gigartinine et gongrine. Préférentiellement, l'algue "exposée" comprend: - de 2 à 10 % de citrullinylarginine en poids de matière sèche, - de 6 à 30 mg de taurine dans 1 g d'algue sèche, - de 6 à 30 mg de citrulline dans 1 g d'algue sèche, - de 0,7 à 1,5 mg d'aminoacides "mycosporine-like" dans 1 g d'algue sèche, 5 - de 20 à 80 ppm de zinc et de 5 à 40 ppm de sélénium, - de 3 à 6 % de floridoside en poids de matière sèche, alors que sa teneur en azote, d'environ 4%, est indicative d'une teneur en protéines/peptides/aminoacides libres tous confondus. Les macroalgues rouges soumises à des conditions extrêmes de température et 10 de luminosité sont donc caractérisées par une teneur en protéines ou en peptides plus importante que les macroalgues rouges standards. Dans les algues soumises à des conditions extrêmes de température et de luminosité : - le dipeptide citrullinylarginine est ainsi particulièrement intéressant, car il constitue une source d'arginine, aminoacide semi-essentiel décrit pour participer au métabolisme énergétique de tissus sous forme de phosphoarginine et constituer un support à la glycolyse (Gâde G. et al., Comp. Biochem. Physiol. (1986), vol.83B, pp.255-272); la citrulline, issue du dipeptide ou celle libre accumulée dans l'algue, est susceptible de représenter elle aussi une valeur énergétique intéressante puisque c'est un 20 précurseur de l'ornithine, de l'acide glutamique et de la proline; - la taurine possède des propriétés antioxydantes intéressantes contre le phénomène de péroxydation lipidique via une affinité pour les phospholipides membranaires et une stabilisation des membranes cellulaires (Birdsall T.C., Alternative Med. Rev. (1998), vol.3, pp.128- 136); la taurine est communément utilisée en nutrition puisqu'une supplémentation en cet aminoacide constitue un apport énergétique dont l'origine serait également une capacité à moduler la glycolyse (3.B. Lombardini et al., Ed Plenum Press, N.Y. (1992)); - les aminoacides "mycosporine-like", tels la palythine, la shinorine et l'astérina, ont des propriétés protectrices contre le rayonnement ultraviolet démontrées 30 (Bandaranayake W.M., Nat. Prod. Rep. (1998), vol.15, pp.159-172); - les ions zinc sont connus pour leurs propriétés antioxydantes (Zago M.P. , Free Radic. Biol. Med. (2001), vol.31, pp.266-274), et le sélénium est un cofacteur nécessaire à l'activité de certaines enzymes antioxydantes (Tappel A.L., Curr. Top. Cell. Regul. (1984), vol.24, pp.87); - le 2-glycérol-galactopyranoside ou floridoside est un monosaccharide anti-stress (Simon-Colin C., J. Appl. Phycol. (2002), vol.14, pp.123-127). Par ailleurs, il est évident que d'autres constituants communément identifiés dans les macroalgues rouges (sels minéraux, fibres, etc) contribuent eux aussi à l'intérêt nutritionnel des algues soumises à des conditions extrêmes de température et de luminosité. L'invention concerne également les extraits, notamment les extraits alcooliques, hydroalcooliques ou hydroglycoliques, de ces macroalgues rouges exposées à des conditions extrèmes de température et de luminosité. Ces extraits sont obtenus selon des techniques bien connues de l'homme du métier, et comprennent les mêmes constituants antioxydants et énergétiques que ceux des macroalgues rouges "exposées", préférentiellement dans les quantités mentionnées ci-dessous: - au plus 15 % de citrullinylarginine en poids d'extrait, - au plus 45 mg de taurine dans 1 g d'extrait, - au plus 45 mg de citrulline dans 1 g d'extrait, - au plus 2,25 mg d'aminoacides "mycosporine-like" dans 1 g d'extrait, - au plus 120 ppm de zinc et au plus 60 ppm de sélénium, - au plus 9 % de floridoside en poids d'extrait. Les macroalgues rouges "exposées" selon l'invention, ou les extraits de telles algues, sont avantageusement utilisé(e)s comme ingrédient actif pour la préparation de compositions à fonction nutritive et antioxydante, telles des compositions nutritionnelles, diététiques ou nutraceutiques. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention concerne une composition nutritionnelle, diététique ou nutraceutique contenant une ou plusieurs espèces de macroalgues rouges soumises à des conditions extrèmes de température et de luminosité (ou un ou plusieurs extraits de ces algues). Généralement, les macroalgues rouges ou leurs extraits sont transformé(e) s en une poudre micronisée ou une pâte, puis mélangé(e)s avec les excipients couramment utilisés en nutrition, diététique ou nutraceutique pour former ladite composition. La composition de l'invention peut également contenir d'autres ingrédients actifs selon les besoins du domaine considéré. L'invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre purement indicatif. Exemple 1: détermination de l'activité antioxydante d'une fraction éthanolique issue de Chondrus crispus On a récolté des algues de l'espèce Chondrus crispus soumises à des conditions extrèmes de température et de luminosité selon le mode opératoire indiqué ci-dessus, puis on les a lavées et séchées. Il a été obtenu une fraction éthanolique selon le protocole d'extraction suivant: l'algue broyée est tout d'abord humidifiée par de l'eau à température ambiante. Elle est alors l'objet d'une extraction directe à l'aide d'éthanol ammoniacal sous agitation à température ambiante. Après filtration, l'extrait est successivement concentré, ajusté avec de l'eau, décoloré sur charbon actif, filtré, et à nouveau concentré. L'extrait ainsi obtenu présente la composition suivante: citrullinylarginine, taurine et dérivés méthylés, acides gras saturés, monosaccharides, floridoside, aminoacides "mycosporine-like", citrulline, zinc et sélénium. i) mesure de l'activité piégeur du radical hydroxyle (OH ) La méthode, décrite par Rehman, A. et coll. (British J. Pharmacol. (1997), vol.122, pp.1702-1706), est utilisée pour la mesure de la constante de vitesse de piégeage du radical hydroxyle Ks(OH ) L'extrait selon l'invention est comparé au mannitol (piégeur de référence), au dipeptide citrullinylarginine (produit de synthèse) et à l'acide ascorbique (piégeur de référence), dont le Ks(OH ) est mesuré selon Cabelli D.E., J. Phys. Chem. (1983), vol.87, pp.1809-1812). Le tableau 1 rassemble les valeurs moyennes obtenues à partir de 4 expérimentations indépendantes. Tableau 1 Antioxydant testé Ks(OH ) (109.M-1.s-l) Mannitol 2,39 0,38 Citrullinylarginine 5,16 0,78 Extrait éthanolique 6,01 0,44 Acide ascorbique 10,1 2,3 ii) mesure du pouvoir antioxydant 'global" Le système de production d'espèces réactives dérivées de l'oxygène xanthine oxydase / hypoxanthine + EDTA, décrit par Nowak D. et coll. (Biomed. Biochem. Acta (1991), vol.50, pp.265-272), a été utilisé pour déterminer le pouvoir antioxydant d'une fraction éthanolique issue de Chondrus crispus "exposé", Ce pouvoir antioxydant, caractérisé par la somme des effets contre l'anion superoxyde (02 -), le peroxyde d'hydrogène (H202), et OH , est exprimé par un pourcentage de protection d'une molécule "détectrice", le désoxyribose (tableau 2). Tableau 2 Antioxydant testé % de protection Extrait éthanolique (avec ajustement à 1mM en 19,5 2,5 taurine et dérivés) Taurine (1 mM) 8,7 2 Mannitol (1 mM) 21,1 2 Exemple 2: détermination de l'activité antioxydante d'une fraction hydroalcoolique issue de Chondrus crispus "exposé" On a récolté des algues de l'espèce Chondrus crispus soumises à des conditions extrèmes de température et de luminosité selon le mode opératoire indiqué ci-dessus, puis on les a lavées et séchées. Il a été obtenu une fraction hydroéthanolique (80 EtOH/20 H2O) selon le protocole d'extraction suivant: l'algue broyée est tout d'abord humidifiée par de l'eau à température ambiante. Elle est alors l'objet d'une extraction directe à l'aide d'une solution hydroéthanolique ammoniacale sous agitation à température ambiante. Après filtration, l'extrait est successivement concentré, ajusté avec de l'eau, décoloré sur charbon actif, filtré, et à nouveau concentré. L'extrait ainsi obtenu présente la composition suivante: citrullinylarginine, taurine, aminoacides "mycosporine-like", Lcitrulline, sels minéraux, floridoside, zinc et sélénium. i) mesure de l'activité piégeur du radical hydroxyle (OH ) Le protocole utilisé est celui décrit à l'exemple 1. Les résultats sont rasssemblés dans le tableau 3. Tableau 3 Antioxydant testé Ks(OH ) (109.M'l.s-l) Mannitol 2,39 0,38 Citrullinylarginine 5,16 0,78 Extrait hydroéthanolique 10,13 0,91 Acide ascorbique 10,1 2,3 ii) mesure du pouvoir antioxydant 'global" Le protocole utilisé est celui décrit à l'exemple 1. L'extrait selon l'invention est comparé au dipeptide citrullinylarginine et au mannitol. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 4. Tableau 4 Antioxydant testé % de protection Extrait hydroéthanolique (avec ajustement à 29,5 2,5 1mM en citrullinylarginine) Citrullinylarginine (1 mM) 5,3 2 Mannitol (1 mM) 21,1 2 REVENDICATIONS 1. Utilisation nutritionnelle, diététique ou nutraceutique, de macroalgues rouges soumises à des conditions extrêmes de température et de luminosité, ou d'extraits issus de telles algues, comme agent antioxydant. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les macroalgues rouges sont choisies parmi les espèces Grateloupia turuturu, Ahnfe/tia pl/cata, Graci/aria sp., Petrocel/s middendorfii/, Polyides rotundus, Po/ysiphonia lanosa, Rhodomela confervoides, Gymnogongrus devoniensis, Callophyll/s crassifolia, Callophyllis crenu/ata, Callophy//is mega/ocarpa, Callophyllis pinnata et Chondrus crispus. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les macroalgues 15 rouges sont de l'espèce Chondrus crispus. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les macroalgues rouges soumises à des conditions extrêmes de température et de luminosité, ou leurs extraits, comprennent les constituants suivants: - le dipeptide citrullinylarginine, - les aminoacides libres taurine et citrulline et/ou leurs dérivés, - des aminoacides "mycosporine-like", - les ions zinc et/ou sélénium, - le floridoside. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que lesdites macroalgues comprennent: - de 2 à 10 % de citrullinylarginine en poids de matière sèche, - de 6 à 30 mg de taurine dans 1 g d'algue sèche, 3o - de 6 à 30 mg de citrulline dans 1 g d'algue sèche, - de 0,7 à 1,5 mg d'aminoacides "mycosporine-like" dans 1 g d'algue sèche, - de 20 à 80 ppm de zinc et de 5 à 40 ppm de sélénium, - de 3 à 6 % de floridoside en poids de matière sèche. 6. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que lesdits extraits comprennent: - au plus 15 % de citrullinylarginine en poids d'extrait, - au plus 45 mg de taurine dans 1 g d'extrait, - au plus 45 mg de citrulline dans 1 g d'extrait, - au plus 2,25 mg d'aminoacides "mycosporine-like" dans 1 g d'extrait, - au plus 120 ppm de zinc et au plus 60 ppm de sélénium, - au plus 9 % de floridoside en poids d'extrait. 7. Utilisation selon l'une des revendications 4 à 6 caractérisée en ce que les aminoacides "mycosporine-like" sont choisis dans le groupe constitué par la palythine, la shinorine et l'astérina. 8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que lesdits extraits sont des extraits alcooliques, hydroalcooliques ou hydroglycoliques. 9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que lesdites 15 macroalgues rouges ou lesdits extraits se présentent sous la forme d'une poudre micronisée ou d'une pâte. 10. Composition nutritionnelle, diététique ou nutraceutique, qui comprend des macroalgues rouges soumises à des conditions extrêmes de température et de 20 luminosité, ou des extraits issus de telles algues. 11. Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que lesdites macroalgues rouges ou lesdits extraits sont tels que définis dans l'une des revendications 2 à 9.