FR 2879605 A1 20060623 FR 0413433 A 20041216 Production de formats d'anticorps et applications immunologiques de ces formats L'invention se rapporte à la production de formats d'anticorps et à leurs applications immunologiques, plus particulièrement en immunothérapie et en immunodiagnostic. On rappelle que les molécules d'anticorps sont des immunoglobulines (Ig) appartenant à 5 classes: IgM, IgG, IgD, IgE et IgA. De manière générale, ces molécules comprennent une chaîne lourde (H) et une chaîne légère (L) qui est soit la chaîne kappa (K), soit la chaîne lambda (k). Chaque classe d'immunoglobulines comporte un type propre de chaîne H: chaîne pour l'IgM, y pour l'IgG, 8 pour l'IgD, c pour l'IgE et a pour l'IgA. Chaque chaîne est formée de domaines, chacun possédant une liaison disulfure interne. Une chaîne L possède deux domaines et une chaîne H, 4 domaines. La séquence du domaine comprenant l'extrémité aminée de chaque chaîne est variable (régions VH et VL), celle des autres domaines est constante (CH1, CH2 et CH3 de la chaîne H, et CL de la chaîne L). Les régions variables V comportent des régions de séquences hypervariables appelées CDR dont l'ensemble détermine la complémentarité. Dans les chaînes H, les deux premiers domaines (VH-CHI) sont suivis d'une région charnière. Dans une immunoglobuline, la chaîne L est reliée à la chaîne H par une liaison disulfure pour former un hétérodimère. Cet hétérodimère est relié au même hétérodimère par plusieurs liaisons disulfures au niveau de la région charnière pour former l'immunoglobuline. Par clivage à l'aide d'une protéase au niveau de la charnière, on obtient deux fragments: le fragment Fab (domaine fixant l'antigène, composé des domaines VL-CL et VH-CH1) et le fragment Fc (domaine effecteur, composé des domaines (CH2-CH3)2). L'invention concerne plus spécialement des fragments d'anticorps et différents formats d'anticorps élaborés à partir de ces fragments, en particulier des formats d'anticorps chimérisés ou humanisés, multispécifiques et/ou multivalents. Les formats d'anticorps tels que visés par l'invention correspondent à différentes combinaisons des domaines et régions des types mentionnés ci-dessus. Par anticorps chimérisé , on entend un domaine VH d'origine animale fusionné aux régions constantes d'une immunoglobuline humaine. Par anticorps humanisé . on entend un domaine VH humain sur lequel on a greffé les régions hypervariables (CDRs) d'un VH d'origine animale, fusionné aux régions constantes 10 d'une Ig humaine. Ces anticorps reconnaissent les épitopes de cibles correspondant à une molécule donnée. Ces épitopes peuvent être différents, et appartenir à des cibles différentes ou à la même cible. Ainsi, anticorps bispécifique désigne un format possédant deux VH différents liant deux cibles différentes; anticorps biépitopique correspond à un format possédant deux VH différents liant deux épitopes différents sur la même cible. La valence correspond au nombre de fois où le même VH se trouve sur le fragment considéré. La spécificité de reconnaissance des anticorps pour atteindre une cible déterminée a été exploitée pour le diagnostic et la thérapie de différentes pathologies, et tout particulièrement dans le cas de l'oncologie, où la cible peut être un antigène associé aux tumeurs, un récepteur de facteur de croissance, un produit d'oncogène ou de gène "suppresseur de tumeur" muté, voire une molécule liée à l'angiogenèse ou une molécule exprimée également sur les cellules non tumorales, mais absente des cellules progénitrices (comme dans le cas du CD20). Après plus de 20 années de travaux expérimentaux, l'immunociblage des tumeurs par des anticorps monoclonaux connaît actuellement un développement important. Ainsi, les résultats de différentes études cliniques ont démontré, récemment, les possibilités thérapeutiques de certains anticorps et ont conduit à leur approbation par la FDA et à l'obtention d'AMM européenne. Cette progression est due pour beaucoup à l'utilisation d'anticorps recombinants dits de seconde génération : - anticorps humanisés, comme l'Herceptine, un anticorps anti-HER2/Neu utilisé en association avec la chimiothérapie dans certains carcinomes du sein, - anticorps chimériques comme le Rituximab, un anticorps anti-CD20 utilisé dans le traitement de lymphomes B folliculaires. Grâce à l'ingénierie génétique. il est en effet possible de greffer les régions variables ou hypervariables d'anticorps de souris sur des molécules d'Ig humaines. De nouvelles techniques permettent désormais d'obtenir des anticorps entièrement humains soit par sélection de domaines variables humains exprimés sur des phages (technique dite du Phage display ), soit en utilisant des souris transgéniques produisant des anticorps humains. Par ailleurs, pour stimuler le système immunitaire et favoriser ainsi le contact entre la cellule cible tumorale et une cellule effectrice, on a utilisé le concept d'anticorps bi-spécifiques. Il s'agit donc de construire un anticorps doté d'une double spécificité : cet anticorps doit être capable de fixer une molécule produite à la surface des cellules tumorales (telles que le CEA, HER2/Neu, le GD2...) et une molécule exprimée à la surface de cellules effectrices de l'immunité, cellules NK, lymphocytes T tueurs ou CTL, polynucléaires neutrophiles, monocytes et macrophages (telles que les récepteurs Fe...). Une variante à cette stratégie consiste à construire un anticorps liant une molécule produite à la surface de la cellule tumorale et une molécule présentant des propriétés directes ou indirectes de cytotoxicité (radio-élément, toxine, pro-drogue). Jusqu'à présent la plupart des anticorps bi-spécifiques étaient développés en couplant 2 fragments d'anticorps par voie biochimique. Cette technique est cependant rarement développée à l'échelle industrielle. Quelques anticorps bispécifiques ont été développés par voie génétique, tels que les anticorps bi-spécifiques de type scFv ( diabodies ). Mais ils restent difficiles à produire dans E. coli sous forme soluble et ils sont de plus très peu efficaces en termes d'ADCC. Dans le cadre de la recherche d'anticorps candidats pour générer des formats d'anticorps pour l'immunothérapie et disposer notamment d'anticorps multi-spécifiques, les inventeurs ont orienté leurs travaux vers des anticorps particuliers, dépourvus de chaîne légère, identifiés chez les camélidés (chameau, dromadaire, lama) (Hamers-Casterman et al., 1993). Des domaines variables d'anticorps simple chaîne lourde de camélidés (VHH), reconnaissant spécifiquement un type d'antigènes, ont été sélectionnés à partir d'animaux immunisés et ont permis de concevoir divers formats d'anticorps chirnérisés ou humanisés pouvant être produits à partir de constructions plasmidiques. Il s'est avéré que les différents formats étaient compatibles pour permettre la production de n'importe quel autre VHH ou VHH humanisé, ou VH humain. L'invention a pour but de fournir des formats d'anticorps comportant une partie ou la totalité des domaines de VHH ou de VHH humanisés, ou de VH humains, ayant les propriétés de 15 reconnaissance de cibles et d'épitopes recherchés. Elle a également pour but de fournir un procédé de production de ces différentes constructions. Selon encore un autre aspect, l'invention vise les applications immunothérapeutiques et immunodiagnostiques des différents formats rendus accessibles. L'invention a ainsi pour objet les formats d'anticorps comprenant une partie ou la totalité des domaines de VHH de camélidés, notamment de lamas et/ou de VH humains. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, les formats d'anticorps sont de type Fab et sont caractérisés par l'association de deux domaines VHH ou de deux domaines VH humains, identiques ou différents, ou deux domaines VH humains sur lesquels sont greffés les CDRs des VHH, l'un des domaines étant fusionné à la région constante Cx ou CX d'une immunoglobuline humaine, l'autre à la région constante CHI d'une immunoglobuline humaine. Ces formats d'anticorps chimérisés ou humanisés sont de type monospécifique/bivalent, bispécifique/monovalent et biépitopique/monovalent. Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, les formats d'anticorps sont de type F(ab')2 et sont caractérisés par l'association de deux formats de type Fab tels que définis ci-dessus. Ces formats d'anticorps chimérisés ou humanisés possèdent une région charnière H, "Hinge" d'une immunoglubuline humaine et permettent les combinaisons monospécifique / tétravalent, bispécifique/bivalent et biépitopique/bivalent. Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, les formats d'anticorps sont de type F(ab')2 et sont caractérisés par l'association de deux Fab obtenus par réduction des formats de type F(ab')2 ci-dessus. Ces formats d'anticorps chimérisés ou humanisés possèdent une région charnière H "Hinge" d'une immunoglobuline humaine et permettent les combinaisons de monospécifique / tétravalent à tétraspécifique / monovalent ou tétraépitopique / monovalent, incluant toutes les possibilités intermédiaires. Selon un quatrième mode de réalisation de l'invention, les formats d'anticorps sont de type (HCH2CH3)2 (H, représentant la région charnière "Hinge" d'une immunoglobuline humaine, CH2 et CH3, représentant le second et troisième domaine constant d'une chaîne lourde d'une Ig humaine, et sont caractérisés par l'association de deux VHH ou de deux VH humains, identiques ou de deux VH humains sur lesquels sont greffés les régions hypervariables des VHH, chacun étant fusionné à la région H-CH2-CH:3 d'une Ig humaine. Ces formats d'anticorps chimérisés ou humanisés permettent les combinaisons monospécifique/bivalent. Selon un cinquième mode de réalisation de l'invention, les formats d'anticorps sont de type mAb* et sont caractérisés par l'association de deux VHH ou de deux VH humains, identiques ou différents, ou de deux VH humains sur lesquels sont greffés les régions hypervariables des VHH, l'un étant fusionné à la région CK ou CX humaine, l'autre à la région CH1H-CH2-CH3 d'une Ig humaine. Ces formats d'anticorps chimérisés ou humanisés permettent les combinaisons de type 5 monospécifique/tétravalent et bispécifique/bivalent et bi-épitopique / bivalent. Dans ces différents formats, l'immunoglobuline est une IgG, correspondant à une isoforme IgGI, IgG2, IgG3 ou IgG4 humaine, ou une IgA humaine correspondant à une isoforme IgAI, IgA2, ou toute autre Ig humaine. Les VHH peuvent être remplacés par des VH humains ou des VHH humanisés par greffage des CDRs des VHH sur des VH humains. Dans des exemples des modes de réalisation de l'invention ci- dessus, les VHH correspondent ou comprennent des fragments d'anticorps VHH de camélidés, notamment de lamas. Il s'agit en particulier de fragments caractérisés en ce qu'il s'agit d'une partie ou de la totalité de fragments anti-antigène carcinoembryonnaire (anti-CEA en abrégé) ou anti-récepteur FcyRIII (anti-CD 16 en abrégé). Les fragments d'anticorps anti-CEA répondent plus particulièrement à une séquence en acides aminés choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID N 72, SEQ ID N 73, SEQ ID N 74 et SEQ ID N 75. Les fragments d'anticorps anti-CD16 répondent de manière préférée à une séquence en acides 25 aminés choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID N 76, SEQ ID N 77, SEQ ID N 78 et SEQ ID N 79. Ces fragments constituent des produits nouveaux et à ce titre entrent également dans le champ de l'invention. L'invention vise aussi les CDRs de ces fragments VHH. L'invention vise également un procédé de production d'anticorps chimérisés ou humanisés, multispécifiques et/ou multivalents pour l'immunothérapie ou l'immunodiagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation de formats d'anticorps définis ci-dessus. L'invention vise notamment un procédé lesdits formats comprennent des VHH de camélidés, notamment de lamas, anti-C EA et anti-CD 16. Il s'agit plus spécialement des domaines variables de VHH anti-CEA et anti- CD16 avantageusement produits selon un protocole comprenant l'immunisation de camélidés, notamment de [amas avec, comme immunogène, un CEA ou un CD16, - la purification des lymphocytes B récupérés à partir du sang, - la construction de banque de VHH, et - l'isolement des VHH à partir de la banque. La construction de la banque comprend - l'extraction des ARN totaux des lymphocytes B, - la transcription inverse des ARN pour obtenir les ADNc correspondants, - l'amplification par PCR des gènes codant pour les régions variables des anticorps simple chaîne lourde anti-CD 16 et anti-CEA, - la ligation de fragments d'ADN VHH obtenus par coupure, par des enzymes, des ADN amplifiés avec un phagemide. Les VHH sont isolés à partir des banques par la technique de phage display et purifiés. Lesdits domaines variables de VHH anti-CEA et anti- CD16 sont avantageusement produits selon un protocole comprenant - l'immunisation de camélidés, notamment de lamas avec, comme immunogène, un CEA ou un CD16. - la purification des lymphocytes B récupérés à partir du sang, - la construction de banque de VHH, et - l'isolement des VHH à partir de la banque. De manière avantageuse, la construction de la banque comprend l'extraction des ARN totaux des lymphocytes B, - la transcription inverse des ARN pour obtenir les ADNc correspondants, - l'amplification par PCR des gènes codant pour les régions variables des anticorps simple chaîne lourde anti-CD16 et anti-CEA, - la ligation de fragments d'ADN VHH, obtenus par coupure par des enzymes des ADN 10 amplifiés, avec un phagemide. Les VHH sont isolés à partir des banques par la technique de phage display et purifiés. Les différents VHH ont été validés en termes de spécificité et d'affinité comme illustré par les 15 exemples. Conformément à l'invention, les gènes des VHH sélectionnés ont ensuite été introduits dans des vecteurs d'expression, notamment des plasmides, pour produire différents formats d'anticorps chimérisés multi spécifiques et/ou multivalents (anti-CEA/anti-CD16), capables de se lier aux cellules tumorales exprimant le CEA à leur surface et de recruter les cellules effectrices du système immunitaire (monocytes, macrophages, NK, polynucléaires neutrophiles...) qui expriment le CD16. L'invention vise également les vecteurs d'expression des formats d'anticorps définis ci-25 dessus. Elle vise plus spécialement des vecteurs d'expression, notamment des plasmides renfermant entre deux sites uniques d'enzymes de restriction les promoteurs, les séquences signal, les séquences nucléotidiques capables de coder pour les domaines VHH définis ci-dessus, les régions constantes d'une Ig humaine, ou pour des domaines VH humains, les régions CDRs d'un VHH, les régions constantes d'une Ig humaine. Les plasmides selon l'invention sont capables d'exprimer en quantités élevées les formats d'anticorps définis ci-dessus. sous des formes solubles dans des bactéries et les régions codant pour les domaines d'anticorps peuvent être facilement transférées dans d'autres systèmes d'expression procaryotes ou encore eucaryotes. L'invention vise ainsi les plasmides pCKCH1yl-TAG et pCKCH1y1 permettant la production des anticorps de type Fab selon le premier mode de réalisation de formats d'anticorps défini ci-dessus. Ces plasmides sont plus spécialement caractérisés par l'insertion des séquences nucléotidiques codant pour la région légère CK, et la région constante lourde CH1 d'une Ig dans le plasmide p55Flag/RBS/35cmyc6HisGS. L'invention vise également les plasmides pCKCH]IH41-TAG et pCKCH1Hy1 permettant la production des anticorps de type F(ab') selon le deuxième mode de réalisation de formats d'anticorps défini ci-dessus. Ces plasmides sont plus spécialement caractérisés par l'insertion des séquences nucléotidiques codant pour de la chaîne lourde CHI et la région Hinge (H) d'une Ig dans p55CKFlag/RBS/35cmyc6HisGS. L'invention vise encore les plasmides pHCH2CH3-TAG et pHCH2CH3 permettant la production des anticorps de type (HCH2CH3)2 selon le quatrième mode de réalisation de formats d'anticorps défini ci-dessus. Ces plasmides sont plus spécialement caractérisés par l'insertion des séquences nucléotidiques codant pour la région Hinge (H) et les régions constantes CH2 et CH3 d'une Ig dans p55Flag/RBS/35cmyc6HisGS. L'invention vise aussi le plasmide pCxCH1HCH2CH3y1 permettant la production des anticorps de type mAb* selon le cinquième mode de réalisation de l'invention. Ce plasmide est plus spécialement caractérisé par l'insertion des séquences nucléotidiques 5 codant pour la région constante lourde CH1, la région Hinge et les régions constantes CH2 et CH3 d'une Ig dans p55CxFlag/RBS/35CHlylcmyc6HisGS. Les schémas de ces plasmides sont illustrés sur les figures 8B et 9. Les plasmides intermédiaires utilisés pour la construction des plasmides ci-dessus entrent également dans le champ de l'invention. Il s'agit plus spécialement des plasmides p35PhoA', p55PhoA6HisGS/N, p55/MCS1, p55Flag/RBS/35, p55Flag/RBS/35cmyc6HisGS et p55CkFlag/RBS/35cmyc6HisGS construits pour développer les plasmides définis plus haut. Les domaines CHI, CH2, CH3, H d'une Ig dans ces plasmides appartiennent à IgGI, IgG2, 15 IgG3 ou IgG4, ou encore à IgA, ou toute autre Ig. Les gènes codant pour les VHH ou les VH humains sont introduits entre les sites uniques dans les différents plasmides. Ces gènes peuvent être remplacés par des gènes codant pour des VHH humanisés par greffage des CDRs des VHH sur des VH humains. De façon plus générale, les plasmides utilisés selon l'invention peuvent être conçus pour renfermer des séquences nucléotidiques codant pour d'autres VHH que les VHH anti-CEA ou anti-CD16, ou pour d'autres VH humains, ou pour d'autres VHH humanisés, capables de se fixer à n'importe quelle molécule. L'invention vise encore le plasmide p55/PhoA6HisGS"/NAB- caractérisé en ce qu'il comprend les séquences nucléotidiques pour produire des domaines VH humains fusionnés à la phosphatase alcaline selon le schéma des figures 8A et 9. Une méthode pour sélectionner les fragments variables humains des chaînes lourdes d'immunoglobulines (VH) et isoler les clones les mieux produits et les mieux sécrétés a été développée. De manière avantageuse, ces VH humains servent de matrice pour y greffer les CDR des VHH précédemment sélectionnés afin d'humaniser les régions variables. Les formats d'anticorps définis ci-dessus présentent un grand intérêt en immunothérapie et pour l'immunodiagnostic. Ils sont en effet capables de reconnaître des molécules différentes ou de lier deux épitopes différents sur une même molécule, et permettent en outre d'avoir accès à de nouveaux épitopes non reconnus par les anticorps conventionnels. Ils peuvent être aisément humanisés, ce qui ouvre des perspectives avantageuses, pour disposer d'anticorps de faible immunogénécité après injection chez l'homme. Leur obtention sous une forme soluble constitue une caractéristique additionnelle d'intérêt pour ces anticorps. Leurs applications en immunodiagnostic et en immunothérapie font donc également partie de l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 11, qui représentent, respectivement, Les figures 1 et 2, les séquences en acides aminés (SEQ ID N 72 à 75) et en nucléotides (SEQ ID N 80 à 83) de 4 clones de VHH anti-CD16 et les séquences en acides aminés (SEQ ID N 76 à 79) et en nucléotides (SEQ ID N 84 à 87) de 4 clones anti-CEA isolés selon l'invention, les figures 3 et 4, les résultats par FACS montrant la spécificité de 8 VHH analysés, la figure 5, les résultats d'essais de compétition entre 2 VHH anti-CD16 et des anticorps monoclonaux anti-CD 16, la figure 6, les profils de compétitions sur cellules de 2 VHH anti-CD16 et des anticorps monoclonaux anti-CD 16, la figure 7, les résultats d'activation du CD 16A par 2 VHH anti-CD16, les figures 8A et 8B, des constructions de plasmides selon l'invention, la figure 9, les séquences de plasmides de l'invention, les figures 10 et 10A, des foiuiats d'anticorps de type Fab et F(ab')2, la figure 1 l,des Western blots de fragments d'anticorps de type Fab. Exemple 1: Immunisation des lamas, titration des sérums et purification des lymphocytes B. Un lama femelle a été immunisé avec la région extracellulaire du récepteur FcyRIIIB humain recombinant (CD16B) (décrit dans la publication: Teillaud C et al., 1993).REF Un lama mâle a été immunisé avec la région extracellulaire de l'antigène carcinoembryonnaire humain recombinant (CEA) (décrit dans la publication: Terskikh et al., 1993, et dans le brevet: Terskikh A et al., 1993).REF Les animaux ont été immunisés tous les mois avec 500 gg de chacun des immunogènes. Cent ml de sang ont été prélevés 15 jours après chaque immunisation. Pour chacun des échantillons prélevés, une titration des sérums et des anticorps purifiés (IgGl, 2 et 3) a été réalisée pour détecter la présence d'anticorps contre les différents immunogènes. Les lymphocytes B ont ensuite été purifiés sur gradient de Ficoll (histopaque-1077, Sigma-Aldrich), puis lavés 2 fois avec du PBS. Construction des banques de VHH: purification des ARN totaux, transcription inverse, PCR1, PCR2 et clonage dans le phagemide pHenl. Construction des banques de VHH: 20 Purification des ARN totaux Les ARN totaux des lymphocytes B sont extraits selon la méthode utilisant l'isothiocyanate de guanidium (Chomczynski et Sacchi, 1987) REF. Après des extractions phénol/chloroforme en milieu acide, les ARN totaux sont précipités à l'éthanol. La qualité des ARN et leur quantification sont évaluées sur gel d'agarose 1%. Ils sont ensuite convertis en ADNc par transcription inverse. Transcription inverse et PCR: Séquences SEQ ID Na 1 à 9 des oligonucléotides utilisés: 3' CH2FORTA4 SEQ ID N 1: CGCCATCAAGGTACCAGTTGA 3'CH2-2 SEQ ID N 2: GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC 3' RC-IgG2 SEQ ID N 3: GGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG ç 3' RC-IgG3 SEQ ID N 4: TGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT 5'VHl-Sfi SEQ ID N 5: CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCT 10 GG 5'VH2-Sfi SEQ ID N 6: CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCACCTTGAAGGAGTCT GG 5'VH3-Sfi SEQ ID N 7: CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC TGG 5' VH4-Sfi SEQ ID N 8: CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC GGG 3'VHHNot SEQ ID N 9: CACGATTCTGCGGCCGCTGAGGAGAC(AG)GTGACCTGGGTCC Cinq g d'ARN total sont hybridés avec 1 pmole d'oligonucléotide 3' CH2FORTA4 (Arbabi Ghahroudi et al., 1997)REF ou CH2-2 spécifique du domaine CH2 des IgG simple chaîne lourde de lama rétrotranscrits avec 150 U de superscript II (BRL) pendant 30 min à 50 C. Les oligonucléotides spécifiques des régions charnières des IgG 2 et 3, 3' RC-IgG2 et 3' RCIgG3, peuvent aussi être utilisées. Les ADNc simples brins sont purifiés sur billes (BioMagR Carboxyl Terminator, Polyscience Inc) et élués avec 17 l de 10 mM Trisacétate pH 7,8. Conditions de PCRI: Quatre pl d'ADNc sont amplifiés par PCR avec 0, 5 U de Dynazyme Extend DNA polymerase (Finnzymes), 10 pmoles de la même amorce 3' CH2FORTA4 ou CH2-2 et 10 pmoles des 4 amorces 5' V H 1-4 Sfi spécifiques du domaine VH des IgG humaines, dans un volume de 50 pl. (94 C, 3 min; 94 C, 1 min; 60 C, 1 min; 72 C, 1min; 37 cycles puis 72 C, 10 min). Trois fragments d'ADN sont amplifiés: un fragment d'environ 900 pb codant pour les domaines VH-CH 1-CH2 des IgG l; et 2 fragments d'environ 600 bp codant pour les domaines VHH-CH2 des IgG2 et 3. Conditions de PCR2: Les fragments de 600 pb sont purifiés sur gel d'agarose 1% ( kit Qiaquick gel extraction , Qiagen) puis amplifiés par PCR avec 1 U de Deep Vent (Biolabs) et 10 pmoles des 4 amorces 5'VH1-4 Sfi spécifiques du domaine VH des IgG humaines et 10 pmoles de l'amorce 3' VHH-NotI. (94 C, 3 min; 94 C, 45 sec; 65 C, 45 sec; 72 C, 45 sec; 15 cycles, puis, 94 C, 45 sec; 60 C, 45 sec; 72 C, 45 sec; 15 autres cycles, puis 72 C, 10 min). Les fragments d'environ 400 ph codant pour les VI-1H sont purifiés sur gel d'agarose 1% ( kit Qiaquick gel extraction . Qiagen) rassemblés et précipités par l'éthanol. Ils sont ensuite coupés par les enzymes de restriction Ncol et Notl, ou BglI et NotI (Biolabs) pour être clonés dans le phagemide pHenl (Hoogenboom et al., 1991) REF aux sites NcoI et NotI ou Sfi1 et NotI. Préparation du vecteur: Vingt pg de phagemide pHenl sont digérés dans un volume de 300 pl avec 50 U de Sfi1 en présence de BSA, à 50 C, 16 h; ou avec 50 U de NcoI en présence de BSA, à 37 C, 16 h. Le phagemide linéarisé est purifié sur gel d'agarose 0,7% (kit Qiaquick gel extraction , Qiagen). L'ADN élué est ensuite coupé par 50 U de NotI à 37 C dans un volume de 200 pl, 16 h. L'enzyme est détruite par la chaleur 15 min à 65 C et l'ADN est extrait au phénol/chloroforme et précipité à l'éthanol. Le pHenl coupé est contrôlé sur gel d'agarose 0,7%, quantifié et ajusté à 200 ng/ l. Préparation des fragments d'ADN VHH: Cinq g de fragments VHH sont coupés dans un volume de 300 l avec 50 U de Bgll et Notl en présence de BSA, à 37 C, 16 h; ou avec 50 U de Ncol et Notl en présence de BSA, à 37 C, 16 h. Les enzymes sont dénaturées à 65 C, 15 min; puis les ADN sont extraits au phénol/chloroforme et précipités à l'éthanol en présence de 10 g de glycogène (Roche). Les fragments VHH coupés par Ncol et NotI sont purifiés sur gel d'agarose 1% puis contrôlés sur gel d'agarose 2%, quantifiés et ajustés à 100 ng/ l. Ligature Cent cinquante ng de pHen l digérés par SfiI et Notl sont ligaturés avec 60 ng de fragment VHH digéré par Bgll et NotI dans un volume de 20 l avec 2000 U de T4 DNA ligase (Biolabs) à 16 C, 17 h. La ligase est inactivée à 65 C. 15 min, et le produit de ligature est coupé par 20 U de Xhol (Biolabs) pour éliminer le vecteur résiduel non ligaturé, 37 C, 4 h. Six ligatures sont ainsi réalisées. Les produits de ligature sont ensuite rassemblés en 2 tubes et extraits au phénol/chloroforme, précipités en présence de 10 g de glycogène et repris dans 2 x 18 1.11 H20 ultrapure. Deux pl sont utilisés par électroporation. La banque de VHH du lama mâle (réf.: 080101) représente 5,4 106 clones et la banque de VHH du lama femelle (réf. : 010301) 106 clones. Isolement des VHH à partir des banques par la technique de phage- display. Sélection des VHH anti-CEA et anti-CD16: Les différents VHH ont été isolés par la technique du phage-display. Production des banques de phages: Dix l du stock d'une banque 080101 ou 010301 (cellules TG1 transformées avec les phagemides) sont inoculés dans 50 ml de (2TY, 100 g/ml d'ampicilline, 2% glucose) et incubés à 37 C jusqu'à une DO600 égale à 0,5. Cinq ml de la culture sont alors infectés avec 5 ml de M13KO7 à 1013 pfu/ml, 30 min, 37 C, sans agitation. Après centrifugation, le culot de phages est repris dans 25 ml de (2TY, 100 pg/ml d'ampicilline, 25 pg/ml kanamycine). La culture est incubée 16 h à 30 C avec agitation. Les phages sont ensuite précipités avec 1/5 vol de 2,5 M NaCl / 20% PEG 6000 et concentrés 25 fois dans du PBS. Sélection des VHH. Deux cents pl de billes recouvertes de streptavidine (Dynabeads M- 280, Dynal) sont équilibrés avec 1 ml de lait 2%/PBS pendant 45 rnin àtempérature ambiante avec agitation sur une roue. 10'2 phages de la production précédemment décrite sont aussi équilibrés avec du lait 2%-PBS dans un volume final de 500 pl pendant 60 min à température ambiante avec agitation sur une roue. Les billes sont compactées avec un aimant, re-suspendues avec 250 pl de lait 2%/PBS et incubées avec 200 pl d'antigène biotinylé pendant 30 min à température ambiante sur une roue. 150, 75 et 25 nM final d'antigène biotinylé sont utilisés au ter, 2ème et 3ème tour, respectivement. Aux 450 pl de billes/antigène-biotine on rajoute les 500 pl de phages pendant 3 h à température ambiante avec agitation sur une roue. Le mélange billes / antigène-biotine / phages est lavé 5 fois avec 800 pl de lait 4%-PBS puis transféré dans un nouveau tube eppendorf. Cinq autres lavages sont réalisés avec 800 pi de PBS-Tween 0,1% puis le mélange est transféré dans un nouveau tube eppendorf. Enfin, 5 lavages sont réalisés avec 800 pl de PBS. Les phages anticorps fixés sur les billes/antigène-biotine sont resuspendus avec 200 pl de PBS et incubés 30 min à 37 C. sans agitation, avec 1 ml de TG1 rendues compétentes pour la fixation des phages au pili (cellules compétentes: à partir d'une culture de TG1 en 2YT sur la nuit, on réalise une dilution au 1/100 et on inocule 50 ml de 2YT à 37 C sous agitation jusqu'à une D0600 proche de 0,5). A chaque sélection, les phages sont comptés et amplifiés pour un nouveau tour de sélection. Comptage des sélections: On réalise des dilutions de l pl de cellules TG1 transfectées avec les phages (voir ci-dessus) 30 de 10-2 à 10-s avec du 2YT. Un, 10 et 100 pl de chaque dilution sont étalés sur boîte de Petri (2YT / ampiciline 100 pg/ml / glucose 2%). Les boîtes sont incubées 16 h à 30 C. 17 Etalement de la sélection pour 1 'isolement des colonies: On centrifuge les 5 ml de TG 1 transfectées pendant 10 min à 3000 g pour concentrer les cellules et on reprend le culot avec 1 ml de 2YT. Deux cent cinquante l sont étalés par boîte de Petri (12 cm x 12 cm) (2TY / ampicilline 100 g/ml / glucose 2% et incubées 16 h à 30 C. Les VHH suivants ont été isolés par cette méthode: quatre VHH anti- CEA (CEA3, CEA17, CEA25, CEA43) et quatre VHH anti-CD16 (C13. C21, C28, C72) ont été obtenus dont les séquences en acides aminés et en nucléotides sont indiquées dans les Figures 1 et 2. Reclonage, production et purification des VHH. Clonage des VHH: Les VHH ont été clonés dans le plasmide p55PhoA/NAB" (construction décrite dans le paragraphe 1.3.6, voir Figure 8A et 9) entre les sites de restriction Sf1 et HindIII. Conditions de PCR: Cinquante ng de VHH ont été amplifiés par PCR avec 1 U de Deep Vent (Biolabs), 10 pmoles des amorces 5' pJF-VH3-Sfi et 3' cmyc-6His/HindI11 dans un volume final de 50 l. (94 C, 3min; 94 C, 45 sec; 52 C, 45 sec; 72 C, 45 sec; 30 cycles puis, 72 C, 5 min). Les séquences SEQ ID N 10 et SEQ ID N l1 des oligonucléotides utilisés sont les 20 suivantes: 5' pJF-VH3-Sfi SEQ ID N 10: CTTTACTATTCTCACGGCCATGGCGGCCGAGGTGCAGCTGGTGG 3'cmyc-6His/HindIll SEQ ID N 11: CCGCGCGCGCCAAGACCCAAGCTTGGGCTA(GA)TG(GA)TG(GA)TG(GA)TG(GA)T G (GA) TGTGCGGCCCCATTCAGATC Les produits de PCR sont purifiés sur gel d'agarose 1% ( kit Qiaquick gel extraction , Qiagen) et coupés avec 20 U de Bg1I et 20 U de HindII1 (Biolabs) 16 h à 37 C. Dix g de p55PhoA/NAB" sont coupés d'abord avec 50 U de Sfil 16 h à 50 C, puis avec 20 U de HindIII 12 h à 37 C. Les produits de digestion (vecteur et fragments de PCR) sont précipités à l'éthanol. Les ADN sont re-suspendus dans 20 pl d'H20 et quantifiés sur un gel d'agarose 0,7%. La ligature est effectuée avec 200 U de T4 DNA ligase (50 ng de p55PhoA/NAB- coupés par SfiI et HindIIl et 10 ng de fragment PCR coupés par Bgll et Hindlll dans un volume de 20 l, 16h à 16 C. Après inactivation de la T4 DNA ligase 15 min à 65 C, le vecteur non recombinant est éliminé par digestion enzymatique avec 10 U de XhoI, 2h à 37 C. Après transformation de la ligature et analyse de quelques colonies recombinantes, les VHH d'intérêt sont produits chez E. coli. Production des VHH: Une colonie isolée est inoculée dans 3 ml de 2YT / ampicilline 100 g/ml / 2% glucose et incubée à 37 C avec agitation. Cinquante ml de 2YT / ampicilline 100 g/ml / 2% glucose sont ensuite ensemencés avec une dilution de la culture précédente et incubés 16 h à 30 C avec agitation. Quatre cents ml de 2YT/ ampicilline 100 pg/m1 sont inoculés avec l'équivalent de 0,1 unité DO600, et incubés à 30 C avec agitation, jusqu'à une DO600 de 0,5 à 0,7. La culture est ensuite induite avec 400 pl d'IPTG (isopropyl-(3-D-thiogalactopyranoside) 0,1 mM final et cultivée à 30 C pendant 16h. Extraction de la fraction soluble du périplasme: La culture est centrifugée à 4200 g, 4 C, 40 min Le culot repris dans 4 ml de TES glacé (0,2 M Tris-HC1 pH 8,0; 0,5 mM EDTA; 0,5 M sucrose). On ajoute ensuite 160 pl de lysozyme (10 mg/ml dans du TES, fraîchement préparé) puis 24 ml de TES froid dilué au 1/2 dans H2O. Le mélange est incubé 30 min dans la glace. Après centrifugation à 4200 g, 4 C, 40 min, on récupère le surnageant (correspondant à la fraction périplasmique) et on ajoute 150 pl de DNAse (10 mg/ml) et 5 mM final de MgC12, 30 min à température ambiante. La solution est dialysée 16 h contre le tampon d'équilibre (acétate de sodium 50mM, NaCl 0, l M pH 7,0). Purification des VHH: La colonne (BD TALONTM Metal affinity, BD Biosciences Clontech) est équilibrée avec le tampon d'équilibre (acétate de sodium 50mM, NaCl 0,1M, pH 7,0). La fraction périplasmique est déposée sur la colonne. Après lavage de la colonne avec 5 volumes de tampon d'équilibre, le VHH est élué par gradient de pH ou d'imidazole (gradient entre le tampon d'équilibre pH 7,0 et la solution acétate de sodium 50mM pH 5,0 ou la solution d'imidazole 200 mM). Chaque fraction est contrôlée sur un gel SDS/PAGE (acrylamide 15%) après coloration au bleu de coomassie. Les fractions d'intérêt sont rassemblées et dialysées contre du PBS. Le VHH est concentré sur membrane (Amicon Ultra 5000MWCO, Millipore). Il est ensuite déposé sur une colonne de Sephadex 75. Les fractions contenant le VHH sont rassemblées, concentrées et dosées par la méthode colorimétrique de Lowry à l'aide du kit Biorad Protein Assay. Caractérisation fonctionnelle des VHH par ELISA, Biacore, immunofluorescence (cytométrie de flux, FACS) et par test d'activation du CD16. Caractérisation des anticorps anti-CEA et anti-CD16 par ELISA: ELISA des phages- VHH: Cinq g/ml d'antigène biotinylé (CEA ou CD16) sont fixés sur une plaque streptavidine (BioBind Assembly Streptavidin Coated, ThermoLabsystems) préalablement saturée en lait 2%-PBS. Cinq 1010 phagesanticorps sont mis en contact avec l'antigène. La liaison antigène/anticorps est détectée grâce à un ELISA à 2 étages composé d'un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine P8 du phage (HRP/anti-M13 monoclonal conjugate, Pharmacia) et d'un anticorps polyclonal de chèvre dirigé contre les IgG de souris couplé à la peroxidase (ref 55556, ICN). L'ajout du substrat, 10 mg ABTS (2,2'-azino bis (3-ethylbenzothiazoline-6sulphonic acid, diammonium salt) à 20 ml tampon de révélation (18 ml PBS, 1ml acide citrique 1 M, 1 ml citrate de sodium 1 M, 10 ml H2O2 30%), permet de lire la réaction à 405 nm (Tecan). ELISA des VHH: Cinq gg/ml d'antigène biotinylé sont fixés sur une plaque streptavidine (BioBind Assembly Streptavidin Coated, ThermoLabsystems) préalablement saturée en lait 2%-PBS. Chaque VHH (gamme de 0,001 g/ml à 1 g/ml) est lié à l'antigène adsorbé dans les micropuits. La liaison est révélée avec un anticorps monoclonal dirigé contre l'étiquette c-myc (Santa Cruz Biotechnology, Inc) dilué au 1/1000 et un anticorps polyclonal de chèvre dirigé contre les IgG de souris couplé à la peroxidase dilué au 1/5000 (ref 55556, ICN) en présence d'ABTS.(2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazoline sulfonate)diammonium sait, Roche). Constantes d'affinité des anticorps anti-CEA et anti-CD16 par Biacore: Le BIACORE utilise le principe de la résonance plasmonique de surface (SPR) pour suivre en temps réel les interactions entre molécules sans marquage de celles-ci. L'un des partenaires de l'interaction est immobilisé de façon covalente sur un biocapteur alors que 1 'autre est injecté dans un flux continu. Le principe de détection par SPR permet de suivre les changements de masse à la surface du biocapteur dus à la formation puis à la dissociation des complexes moléculaires. La réponse, quantifiée en unité de résonance (RU) est une indication directe du taux de fixation de l 'analyte par la mesure de la variation de 1 'indice de réfraction. L'enregistrement du signal (un sensorgramme) est traité de façon mathématique pour obtenir les constantes de vitesse d'association, ka, de dissociation kd et les constantes d'association KA (KA = ka/kd) et de dissociation à l'équilibre KE, (KD = kd/ka). Les interactions entre le CEA ou le CD16 et les VHH (qui possèdent une étiquette c-myc reconnue par l'anticorps monoclonal 9E10, Santa Cruz Biotechnology, Inc) ont été étudiées sur un BIACORE 3000 muni d 'un biocapteur de type CM5 sur lequel l'anticorps monoclonal 9E10 a été immobilisé de façon covalente suivant 1a procédure standard de couplage par les amines proposée par BIACORE (activation par NHS/EDC). Le VHH (en tampon: 10 mM HEPES; 150 mM NaCl; 3 mM EDTA; 0,005% surfactant P20) est alors injecté puis une gamme de CEA ou de CD16 est injectée sur le VHH immobilisé sur le 9E10. En parallèle, les injections sont réalisées sur un canal contrôle qui a subi la même chimie de couplage mais sans injection de protéine. Les affinités sont indiquées dans le Tableau 1 ci- dessous. 21 Tableau 1 VHH ka x10' (1/Ms) kd x10-3 (1/s) KA x107 (1/M) KD x10"9 (M) Anti- CEA3 1,24+0.014 1,68+0,002 7,38 13,6 Anti-CEA17 1,56+0,014 1,3+0,002 12 8, 3 Anti-CEA25 1,13+0,014 3,6+0,004 3,15 31,7 Anti-CEA43 1,78+0,019 1,83+0, 002 9,72 10,3 Anti-C 13 0,53+0,07 5,67+0,02 0,94 100,6 Anti-C21 2,86+0, 02 2,79+0,006 10,3 9,7 Anti-C28 0,42+0,03 3,45+0,006 1,22 81,9 Anti-C72 0, 39+ 0,02 3,7+0,006 1,06 94,6 Analyse de la spécificité des VHH anti-CEA et anti-CD16 par FACS: VHH anti-CEA: (Pour que l 'immunociblage soit efficace, il est primordial que les anticorps anti-CEA ne reconnaissent pas le NCA, molécule très homologue au CEA qui est exprimée à la surface des granulocytes.) La mise en évidence de la liaison antigène-anticorps est effectuée sur la lignée non transfectée MC38 (lignée cellulaire d'un cancer du colon murin), les lignées transfectées avec le CEA (MC38/CEA+) ou le NCA (MC38/NCA+), la lignée tumorale humaine LS174T (lignée cellulaire d'adénocarcinome colique humain exprimant le CEA à sa surface) et les granulocytes qui expriment à leur surface le NCA. Les granulocytes sont extraits à partir de sang frais en présence d'héparine, sur gradient de 15 ficoll à deux densités (histopaque 1119 et 1077). Les granulocytes se trouvent à l'interface des 2 histopaques. Anticorps utilisés pour la fixation aux cellules: - 35A7, anticorps monoclonal anti-CEA(spécifique du CEA). - 192, anticorps monoclonal anti-CEA (qui croise avec le NCA). 20 - 7.5.4, anticorps monoclonal anti-CD16. - VHH anti-CEA (CEA3, CEA17, CEA25, CEA43). - VHH anti-CD16 (C28). Anticorps utilisés pour la révélation: - 9E10, anticorps monoclonal de souris anti-cmyc (200 gg/ml, utilisé au I/l0') se fixant à l'étiquette c-myc des VHH purifiés. - AP326F, anticorps polyclonal de mouton anti-IgG de souris couplé au FITC (Silenus, utilisé au 1 / 100ème). 0,5 x 106 cellules sont utilisées par essai. Les VHH et anticorps monoclonaux sont dilués dans 100 p.l de PBS-1% BSA. 0,5 x 106 cellules (mesure autofluorescence des cellules) 0,5 x 106 cellules + anti IgG de souris-FITC 20 lug/ml 0,5 x 106 cellules + anti-9E 10 20 g/ml, puis anti IgG de souris-FITC 20 gg/ml 0,5 x 106 cellules + VHH anti-CEA ou anti-CD16 1 à 5 g/ml, puis 9E10 20 g/ml, puis anti IgG de souris-FITC 20 gg/ml 0,5 x 106 cellules + anticorps monoclonaux (35A7, 192, 7.5.4) 20 g/ml, puis anti IgG de souris-FITC 20 g/ml A chaque étape les échantillons sont incubés 45 min, 4 C, dans l'obscurité. Entre chaque réaction, on effectue un lavage avec 2 ml de PBS / 1% BSA. A la dernière étape les cellules sont reprises avec 0,5 ml de PBS. Les résultats par FACS montrent la spécificité des 4 VHH analysés. Ils sont spécifiques du CEA et ne croisent pas avec le NCA (Figure 3). VHH anti-CD16: Pour une reconnaissance efficace des cellules effectrices du système immunitaire, les anticorps anti-CD16 sélectionnés à partir du CD16B doivent aussi reconnaître le CD16A. De plus ils ne doivent pas présenter de réaction croisée avec le CD32 (RFcyIIA et RFcyIIB). Les expériences sont réalisées avec des cellules Jurkat (cellules d'une lignée de lymphome T humain; ATCC TIB-152) transfectées ou non avec le gène qui code le CD16A (lignée stable exprimant le CD16A à leur surface; Vivier et al., 1992), des granulocytes qui expriment le CD16B, des cellules K562 qui n'expriment que le CD32A et des cellules IIA 6huIIB1 qui n'expriment que le CD32B. Anticorps utilisés pour la fixation aux cellules: - 3G8, anticorps monoclonal anti-CD16 (RFcyIIIA/IIIB humain), anticorps anti-site reconnaissant un épitope conformationnel et bloquant la liaison des IgG aux CD16A et CD 16B. - 7.5.4, anticorps monoclonal anti-CD16 (RFcyIIIA/IIIB humain), anticorps reconnaissant un épitope linéaire, localisé hors site de liaison des IgG du CD16 et n'affectant que faiblement cette liaison à fortes concentrations dans des tests de compétition (Vély et al., 1997). - AT10 anticorps monoclonal anti-CD32 (RFcyIIA/EIB) humain. - IV.3, anticorps monoclonal anti-CD32 (RFcyIIA) humain. - VHH anti-CD16 (C13, C21. C28, C72). - VHH anti-CEA (CEA3, CEA 17, CEA25, CEA43). - 35A7, anticorps monoclonal anti-CEA - 192, anticorps monoclonal anti-NCA (qui croise avec le CEA) Anticorps utilisés pour la révélation: - 9E10, anticorps monoclonal de souris anti-cmyc (200 gg/ml, utilisé au 1/10ème) se fixant à l'étiquette c-myc des VHH purifiés. - Fab'2 anticorps de chèvre anti-souris couplé au FITC utilisé à 20 g/ml (Jackson Immunoresearch Lab. Inc., 1 15-096-003). 0,5 x 106 cellules sont utilisées par essai. Les VHH et anticorps monoclonaux sont dilués dans 100 l de PBS-1% BSA. 0,5 x 106 cellules (mesure autofluorescence des cellules) 0,5 x 106 cellules + Fab'2/FITC anti IgG de souris-FITC 20 p.g/ml 0,5 x 106 cellules + anti-9E 10 20 g/ml, puis Fab'2iFITC anti IgG de souris-FITC 20 g/ml 25 0,5 x 106 cellules + VHH l à 5 iag/ml, puis 9E10 20 g/ml, puis Fab'2/FITC anti IgG de souris-FITC 20 g/ml 0,5 x 106 cellules + anticorps monoclonaux ( 35A7, 192, 3g8,7.5.4, AT10, IV.3) 20 puis Fab'2/FITC anti IgG de souris-FITC 20 gg/ml. A chaque étape les échantillons sont incubés 45 min, 4 C, dans l'obscurité. Entre chaque réaction, on fait un lavage avec 2 ml de PBS / 1% BSA. A la dernière étape les cellules sont reprises avec 0.5 ml de PBS Les résultats par FACS montrent la spécificité des 4 VHH analysés. Ils sont spécifiques du CD16A et B et ne croisent pas avec le CD32 (Figure 4). Essai de compétition entre les VHH anti-CD16 et les anticorps monoclonaux 3G8 et 7.5.4: ELISA: Cinq g/ml de VHH biotinylé (C21, C28) sont fixés par puits d'une plaque adsorbée avec de la streptavidine (BioBind Assembly Streptavidin Coated, ThermoLabsystems) préalablement saturée en lait 2%-PBS. Le CD16B à une gamme de concentration de 0,07 à 20 g/ml est ensuite ajouté. Dans un deuxième temps, l'anticorps monoclonal (3G8 ou 7.5.4) à la concentration constante de 5 g/ml est ajouté. La liaison CD16B-anticorps monoclonal est révélée avec un F(ab')2 de chèvre anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline (Southern Biotechnology, 1030-04) en présence de p-nitrophenylphosphatase (Sigma, N9389). Les courbes de compétitions en ELISA sont montrées dans la Figure 5. Le VHH C21 est 15 déplacé par l'anticorps monoclonal 7.5.4. Le VHH C28 est déplacé par l'anticorps monoclonal 3G8. Immunofluorescence indirecte (FACS) . Cinq 105 cellules Jurkat- CD16A sont incubées pendant 30 min, dans du PBS-BSA 5% dans la glace, en présence des VHH C21 ou C28 (de 1 à 100 tg/ml). Les cellules sont ensuite incubées avec 0,1 g/ml de 3G8 ou 1 tg/ml de 7.5.4 pendant 30 min dans les mêmes conditions, puis lavées en PBS-BSA 5%. La fixation de 3G8 ou 7. 5.4 est alors détectée en incubant les cellules avec du F(ab')2 chèvre anti-IgG de souris (H+L) marqué au FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA, cat n : 115- 096-003) pendant 30 min dans la glace. Après plusieurs lavages, l'immunofluorescence est analysée par cytométrie de flux avec un FACScalibur 4CA (Becton Dickinson, Mountain View, California, USA) en utilisant le programme Cell Quest Pro. Les profils de compétitions sur cellules sont montrés dans la Figure 6. Le VHH C21 est déplacé par l'anticorps monoclonal 7.5.4. Le VHH C28 est déplacé par l'anticorps 30 monoclonal 3G8. Activation par les VHH anti-CD16 des cellules Jurkat CD16+: Les expériences sont réalisées avec des cellules Jurkat (ATCC TIB-152) transfectées avec le gène qui code le CD16A. Les cellules sont cultivées en RPMI 1640 complémenté avec 10% de FCS, 100 U/ml penicilline. 100 g/ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, 0,5 mg/ml G418. Cinq x 10' cellules sont ensuite incubées 18 h dans des puits de microplaques (250 l de RPMI contenant 10% FCS. 1% PS, 0,5 mg/ml G418). Dix ng/ml de phorbol myristate acetate (PMA) (concentration n'induisant pas per se la production et la sécrétion d'IL2, mais nécessaire comme " second signal " à cette production) sont ensuite ajoutés, suivis par l'addition de 0,01 à 0,1 g/ml de VHH biotinylé et de 10 g/ml de streptavidine (permettant le pontage des VHH). L'IL2 humaine produite dans les surnageants cellulaires est mesurée par ELISA en utilisant les anticorps du kit R&D (Duoset Human IL2; référence: DY202) et de la streptavidine couplée à la phosphatase alcaline (DAKO, DO396) en présence de p-nitrophenylphosphate (Sigma, cat 104-405). Les résultats d'activation du CD16A (production et sécrétion d'interleukine 2) sont montrés dans la Figure 7. Les deux VHH anti-CD16 activent la production d'IL2. Des quantités supérieures de C28 sont nécessaires pour obtenir une induction de la production et de la sécrétion d'IL2 comparable à celle induite par le C21. Construction des différents plasmides (voir Figures 8A, 8B, 9, 10A et 10B). - Tous les protocoles non détaillés sont décrits dans Sambrook, Fritsch et Maniatis, Molecular cloning a laboratory manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - Les digestions avec les enzymes de restriction sont réalisées selon les recommandations des fournisseurs. - Gènes d'origine humaine insérés: Les gènes codant pour les régions Cx, CH1, H, CH2 et CH3 correspondent respectivement: aux domaines de gènes codant pour la région constante d'une chaîne légère kappa d'immunoglobuline humaine, pour la première région constante, pour la région charnière, pour la deuxième région constante et pour la troisième région constante d'une chaîne lourde d'immunoglobuline IgGl humaine. Ces gènes ont été obtenus par RT-PCR à partir d'une poche de l'EFS (Etablissement Français du Sang). Ce matériel souscrit aux autorisations légales pour être utilisé pour les expériences décrites. - La séquence de chaque plasmide est réalisée sur séquenceur ABI 310 en utilisant les oligonucléotides: EcoRI-90 de séquence SEQ ID N 12: GCGCCGACATCATAACGGTTCTGGC HindIII+88:CGCTACTGCCGCCAGGC - Tous les vecteurs sont conçus pour permettre l'introduction entre 2 sites uniques d'enzymes de restriction de: différents promoteurs, différentes séquences signal de type PelB (ou autres), différentes séquences RBS, n'importe quel domaine VHH ou VHH humanisé, n'importe quel domaine 0), ou domaines CHI, H, CH2 et CH3 de n'importe quel type d'immunoglobulines.) pMCSPhoA' (Figure 8A) La construction de ce plasmide est décrite dans Le Calvez et al. (1995).REF Ce plasmide code pour la forme mature de la Phosphatase Alcaline (PhoA) démarrant au sixième résidu (Proline) qui est précédé par la séquence en acides aminés SEQ ID N 13: MAMAADPRELPGCS. p35PhoA' (Figure 8A) La construction de ce plasmide est décrite dans Le Calvez (1996). Un fragment de gène (formé par des oligonucléotides dégénérés sur la troisième base des codons 2 à 14 codant pour la séquence signal de PelB) est inséré entre les sites Ndel et Eagl du plasmide pMCSPhoA'. Les clones (1 à 60) présentant la meilleure activité phosphatase alcaline ont ensuite été ensuite sélectionnés. 27 p35PhoA'/N (Figures 8A et 9) Suppression du site Ncol dans le gène phoA. Une PCR de chevauchement est réalisée à partir de pMCSPhoA' avec les oligonucléotides: 5 amont-RsrII, NcoI-sup, Ncol-inf et aval-EcoNI. Séquences SEQ ID N 14 à 17 des oligonucléotides utilisés: amont- RsrII SEQ ID N 14: GGCACATGTGACCTCGCGC NcoI-sup SEQ ID N 15: GCAACGTACCACGGCAATATCG NcoI-inf SEQ ID N 16: CGATATTGCCGTGGTACGTTGC avalEcoNI SEQ ID N 17: GCCATCTTTGGTATTTAGCGCC Conditions des PCR 1 et PCR 2: Un l de plasmide (5 ng). 10 pmoles de chaque oligonucléotides (amontRsrII et Ncol-inf pour la PCR 1 et Ncol-sup et aval-EcoNI pour la PCR 2), 0,5 U Dynazyme (94 C, 3 min; 94 C, 45 s; 60 C, 45 s; 72 C, 45 s; pendant 25 cycles puis 72 C, 10 min) dans un volume final de 50 pl. Les produits de PCR sont purifiés à partir d'un gel d'agarose 2% (gel extraction Kit Quiagen, volume final 50 pi). Conditions de la PCR 3 de chevauchement: Un l de chacune des PCR 1 et 2 et 0,5 U Deep Vent, dans un volume final de 50 l. Après 5cycles (94 C, 3 min; 94 C, 1 min; 60 C, 1 min; 72 C, 1,5 min) on ajoute 10 pmoles de chaque oligonucléotides (amont-RsrII et aval-EcoNI) et la PCR est poursuivie pendant 35 cycles puis 72 C, 10 min. Le produit de la PCR 3 est purifié. à partir d'un gel d'agarose 2% (gel extraction Kit Quiagen, volume final 50 l). La séquence du fragment de PCR est réalisée sur séquenceur ABI 310 en utilisant l'oligo 5' EcoRI-90. Clonage du fragment de PCR 3 dans le plasmide p35PhoA'É Trente cinq l du fragment de PCR 3 et 5 l (2,5 g) de p35PhoA' sont digérés par 10 U de RsrII et EcoNI. Après 16 h d'incubation les enzymes sont détruites 10 min à 65 C. Chaque ADN est ensuite précipité et resuspendu avec 20 l. d'H20. La ligation est réalisée 16 h à 16 C avec 5 pl de fragment de PCR, 0,5 pl de vecteur et 3 U Weiss de T4 DNA ligase Biolabs dans un volume final de 10 l. Des bactéries TG1 compétentes (technique CaCl2) sont transformées avec 5 pl de ligation. p55PhoA6HisGS/N-10 (Figures 8A et 9) Insertion du motif 6HistidineGly-Ser. Une PCR est réalisée à partir de p35PhoA'/N- en utilisant les oligonucléotides XhoI-Sacl et 6HisGS/HindIII. Séquences SEQ ID N 18 et 19 des oligonucléotides utilisés: XhoI- SacI SEQ ID N 18: CCATGGCGGCCGATCCTCGAGAG 6HisGS/HindIII SEQ ID N 19: CATGCAGTCCCAAGCTTATTAGCTCCCGTGATGGTGATGATGATGTTTCAGCCCC 20 AGAGCGGCTTTC Conditions de PCR: Une PCR est réalisée avec 5 ng de vecteur p35PhoA'/N-, 10 pmoles de chaque oligonucléotides et 0,5 U Dynazyme (94 C, 3 min; 94 C, 1 min; 70 C, 1 min; 72 C, 1 min; 25 35 cycles puis 72 C, 10 min) dans un volume final de 50 l. Le produit de PCR est purifié à partir d'un gel d'agarose 1% (gel extraction Kit Quiagen, volume final 50 l). Clonage du fragment Xhol-HindIll: Vingt l du fragment de PCR et 5 1_11 (2,5 g) de vecteur p55PhoA' (Le Calvez et al. Gene 1996, 170, 51-55) sont digérés par 10 U de XhoI et HindIll en présence de BSA. Après 16 h d'incubation, les enzymes sont détruites 10 min à 65 C. Chaque ADN est ensuite précipité et resuspendu avec 20 l d'H2O. La ligation est réalisée 16 h à 16 C avec 5 gl de fragment de PCR, 0,5 l de vecteur et 3 U Weiss de T4 DNA ligase Biolabs dans un volume final de 10 l. Des bactéries TG1 compétentes (technique CaC12) sont transformées avec 5 gl de ligation. p55PhoA6HisGS/NAB- (Figures 8A et 9) Suppression des sites Apal et BstEII de p55PhoA6HisGS/N-. Une PCR de chevauchement est réalisée à partir de p55PhoA6HisGS/N- avec les oligonucléotides: amont-EcoRV, ApaI-BstEII-sup, BstEII-ApaI-inf et AvaI-MluI. Séquences SEQ ID N 20 à 23 des oligonucléotides utilisés: 15 amont-EcoRV SEQ ID N 20: CATGAGCTGTCTTCGGTATC ApaI-BstEII-sup SEQ ID N 21: TAATGGTCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGATGACCCA BstEII-ApaI-inf SEQ ID N 22: TGGGTCATCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGACCATTA aval-M1uI SEQ ID N 23: GAACGAAGCGGCGTCGAAG Conditions des PCR 1 et PCR 2: Un l (5 ng) de plasmide p55PhoA6HisGS/N-, 10 pmoles de chaque oligonucléotides (amontEcoRV et BstEII-ApaI-inf pour PCR 1 et ApaI-BstEII-sup et aval-Mlul pour PCR 2), 0,5 U Dynazyme (94 C, 3 min; 94 C, 45 s; 60 C, 45 s; 72 C, 45 s; 25 cycles puis 72 C, 10 min. Les produits de PCR sont purifiés à partir d'un gel d'agarose 2% (gel extraction Kit Quiagen, volume final 50 l). Conditions de la PCR 3 de chevauchement: Un pl de chacune des PCR 1 et 2 et 0,5 U Deep Vent, dans un volume final de 50 l. Après 5cycles (94 C, 3 min; 94 C, 1 min; 60 C, 1 min; 72 C, 1,5 min) on ajoute 10 pmoles de chaque oligonucléotides (amont-EcoRV et aval-M1uI) et la PCR est poursuivie pendant 35 cycles puis 72 C, 10 min. Le produit de la PCR 3 est purifié à partir d'un gel d'agarose 2% (gel extraction Kit Quiagen, volume final 50 pl). La séquence du fragment de PCR est réalisée sur séquenceur ABI 310 en utilisant l'oligo 5' EcoRI-90. Clonage du fragment de PCR 3 dans le plasmide p55PhoA6HisGS/1V: Trente cinq pl du fragment de PCR 3 et 5 pl (2,5 g) de p55PhoA6HisGS/N- sont digérés par 10 U de EcoRV et MIuI. Après 16 h d' incubation les enzymes sont détruites 10 min à 65 C. Chaque ADN est ensuite précipité et resuspendu avec 20 pl d'H2O. La ligation est réalisée 16 h à 16 C avec 5 l de fragment de PCR, 0,5 l de vecteur et 3 U 15 Weiss de T4 DNA ligase Biolabs dans un volume final de 10 pl. Des bactéries TG1 compétentes (technique CaC12) sont transformées avec 5 pl de ligation. p55PhoA6HisGS'INAB-(Figures 8A et 9) Déphasage du gène PhoA au niveau du site Eagl. Ce déphasage crée un site unique Fsel. Cinq pl (2,5 g) de p55PhoA6HisGS/NAB- sont digérés par 10 U de Eagl. Après 16 h d'incubation l'enzyme est détruite 10 min à 65 C. Le mélange réactionnel est ensuite précipité et resuspendu avec 20 pl d'H20. On ajoute un mélange équimolaire de dGTP et dCTP (33 M final) et 2,5 U de fragment Klenow exo- (Biolabs) dans un volume final de 50!Il, 15 min à 25 C. On arrête la réaction avec 2 pl d'EDTA à 500 mM, 20 min à 75 C. Le mélange réactionnel est précipité à l'éthanol, repris avec 5 pl d'H2O et ligaturer avec 3 U Weiss de T4 DNA ligase Biolabs dans un volume final de 10 l. Des bactéries TG1 compétentes (technique CaC12) sont transformées avec 5 pl de ligation. Ce plasmide permet le clonage et la sélection des fragments d'anticorps VH humains les mieux sécrétés. p55/MCS1 (Figures 8A et 9) Insertion du MCSI dans p55PhoA6HisGS/NAB" entre les sites Ncol et HindlIl en utilisant les oligonucléotides appariés 5' MCS1 et 3' MCS1. Séquences SEQ ID N 24 et 25 des oligonucléotides utilisés: 5' MCS1 SEQ ID N 24: CATGGCCCAGGTCACCGTCTCCTCAAACCGCGGACTCGAGGCGGCCCAGCCGGC CATGGCCGCTAGCGCGGCCGCTCTAGATTA 3' MCSI SEQ ID N 25: AGCTTAATCTAGAGCGGCCGCGCTAGCGGCCATGGCCGGCTGGGCCGCCTCGAG TCCGCGGTTTGAGGAGACGGTGACCTGGGC Cinq l (2,5 g) de vecteur p55PhoA6HisGS/NAB- sont digérés 16 h par 10 U de chaque enzyme Ncol et Hindlll. Dix pmoles de chacun desoligonucléotides 5' MCSI et 3' MCSI sont incubés 5 min à 80 C, puis la solution est redescendue lentement à température ambiante. Ligaturer 5 pl de vecteur avec 1,2 l de la cassette hybridée (5' MCSI + 3' MCSI) en présence de 3 U Weiss deT4 DNA ligase Biolabs 1 h à température ambiante. La ligase est détruite en incubant 10 min à 65 C. On rajoute un mélange réactionnel (2 h) de 90 l, contenant 10 U de EagI pour détruire le vecteur d'origine. Ce mélange est précipité à l'ethanol et repris avec 10 pl d'H2O. Des bactéries TG1 compétentes (technique CaC12) sont transformées avec 5 l de mélange. D.2.4.1.3.6.8) p55Flag/RBS/35 (Figures 8A et 9) Insertion du motif Flag/RBS/PeIB35 dans p55/MCS1 entre les sites SfiI et Sac2 en utilisant les oligonucléotides appariés 5' Flag/RBS/35-sup et 3' Flag/RBS/35-inf. Séquences SEQ ID N 26 et 27 des oligonucléotides utilisés: 5' Flag/RBS/35-sup SEQ ID N 26: GGAGAGTGTGCAGGTGATTACAAAGACGATGACGATAAGTAATAAACAGGAAA CAGAAGTCCATATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACT 10 CGCGGCCCAGC 3' Flag/RBS/35-inf SEQ ID N 27: GGGCCGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTGCCGTAGGCAATAGGTATTTCATAT GGACTTCTGTTTCCTGTTTATTACTTATCGTCATCGTCTTTGTAATCACCTGCACA 15 CTCTCCGC Le clonage s'effectue exactement selon les conditions décrites précédemment pour l'insertion du MCSI. Après ligature le mélange réactionnel est digéré par 10 U d'enzyme XhoI. p55Flag/RBS/35cmyc6HisGS (Figures 8B et 9) Insertion du motif cmyc-6HisGS dans p55Flag/RBS/35 entre les sites NotI et HindIII en utilisant les oligonucléotides appariés 5' c-myc-6HisGS et 3' c-myc6HisGS. Séquences SEQ ID N 28 et 29 des oligonucléotides utilisés: 5' cmyc-6HisGS SEQ ID N 28: GGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGTACATCA CCACCATCACCATGGGAGCTA SEQ ID N 29: 3'c-myc-6HisGS AGCTTAGCTCCCATGGTGATGGTGGTGATGTACGGCCCCATTCAGATCCTCTTCT GAGATGAGTTTTTGTTCTGC Le clonage s'effectue exactement selon les conditions décrites précédemment pour l'insertion du MCSI. Le mélange de ligature est digéré par 10 U d'enzyme XbaI. p55CKFlag/RBS/35cmyc6HisGS (Figures 8B et 9) Insertion de la région constante légère Ckappa d'une immunoglobuline dans p55Flag/RBS/35cmyc6HisGS. Séquences SEQ ID N 29 ET 30 des oligonucléotides utilisés: 5' Cx SEQ ID N 29: GGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGTACCGTGGCTGCACCATCTGT 15 CTTC 3' Cx SEQ ID N 30: CGTCATCGTCTTTGTAATCACCTGCACACTCTCCGCGGTTGAAGCTCTTTGTCACC G Amplification du domaine Cic_ Des lymphocytes B humains sont purifiés par gradient de Ficoll à partir de la poche fournie par l'EFS. L'ARN total est ensuite préparé selon le protocole décrit au paragraphe 1. 3.2. Hybridation: Un l d'ARN total est préincubé avec 1 pmole d'oligonucléotide 3' Cx pendant 10 min à 70 C dans un volume final de 8 O. La température est diminuée lentement (45 min) jusqu'à 37 C. Transcription inverse: Aux 8 l, on ajoute 0,5 l de RNAsine (20 U), 3 pi de tampon 5X (SuperScriptll, Invitrogen), 1 l DTT, 100 mM, 2 pl dNTP 10 mM et on incube 10 min à 50 C. On ajoute ensuite 0,75 pl de SuperScript (150 U) et l'incubation est poursuivie 30 min à 50 C et 15 min à 70 C. L'ADNc obtenu est purifié sur billes (BioMag Carboxyl Terminated, Polysciences) selon les recommandations du fournisseur. L'élution finale est réalisée avec 15 pi de Tris-acétate 10 mM pH 7,8. l0 Conditions de PCR 1 et 2: La PCR1 est réalisée avec 1 pl d'ADNc, 10 pmoles de chaque oligonucléotides 5' Cx et 3' Cx, 0,5 U Dynazyme (94 C, 3 min; 94 C, 1 min; 60 C, 1 min; 72 C, 1,5 min; 30 cycles puis 72 C, 10 min) dans un volume final de 50 l. La PCR2 est faite à partir de l pl de PCR1 en utilisant 0,5 U de Deep-Vent, (94 C, 3 min; 94 C, 45 s; 60 C, 45 s; 72 C, 45 s; 25 cycles puis 72 C, 5 min) dans un volume final de 50 pl. Le produit de PCR est purifié à partir d'un gel d'agarose 2% (gel extraction Kit Quiagen, volume final 50 pl). Le fragment de PCR est séquencé avant clonage sur ABI310 avec les oligonucléotides 5' Cx et 3' Cx. Le clonage du domaine Cx est effectué entre les sites BstEII et SacIl de p55Flag/RBS/35cmyc6HisGS: pl du fragment de PCR 2 et 5 pl (2,5 g) de p55Flag/RBS/35cmyc6HisGS sont digérés par 10 U de BstEII et Sacll. Après 16 h d'incubation les enzymes sont détruites 10 min à 65 C. Chaque ADN est ensuite précipité et resuspendu avec 20 pl d'H2O. La ligature est réalisée 16 h à 16 C avec 5 pl de fragment de PCR 2, 0,5 pl de vecteur et 3 U Weiss de T4 DNA ligase Biolabs dans un volume final de 10 l. Des bactéries TG1 compétentes (technique CaCl2) sont transformées avec 5 pl de ligation. p55CxFlag/RBS/35CH1y1 cmyc6HisGS (pCKCKI yl -TA G) (Figures 8B et 9) Insertion de la région constante lourde CHI d'une immunoglobuline de type IgGl dans 5 p55CKFlag/RBS/35cmyc6HisGS. Séquences SEQ ID N 31 à 34 des oligonucléotides utilisés: 5' CHlyl SEQ ID N 31: CTCGAGGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGG 3'CHlyl SEQ ID N 32: AAGCTTAATCTAGAGCGGCCGCACAAGATTTGGGCTCAACTTTC BstEll-sup SEQ ID N 33: CCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCC BstEII-inf SEQ ID N 34: GGAGGGCACGGTCACTACGCTGCTGAGGG L'amplification du domaine CHlyl est réalisée par PCR de chevauchement pour détruire le 20 site BstEII. La transcription inverse est réalisée exactement comme décrite ci- dessus pour la Cx, mais en utilisant l'oligonucléotide 3' CH I yl. La PCR 1 après RT est réalisée avec 1 l d'ADNc, 10 pmoles de chaque oligonucléotides 5' CH1 yl et 3' CHI yl, 0,5 U de Dynazyme (94 C, :3 min; 94 C, 1 min; 60 C, 1 min; 72 C, 25 1,5 min; 30 cycles puis 72 C, 10 min) dans un volume final de 50 l. La PCR 2a est réalisée à partir de 1 l la PCR 1, avec les oligonucléotides 5' CH1 yl et BstEII-inf en utilisant 0,5 U de Dynazyme (94 C, 3 min; 94 C, 45 s; 60 C, 45 s; 72 C, 45 s; 25 cycles puis 72 C, 5 min) dans un volume final de 50 l. La PCR 2b est réalisée à partir de 1 pl la PCR 1, avec les oligonucléotides BstE1I-sup et 3' 30 CHI yl en utilisant 0,5 U de Dynazyme (94 C, 3 min; 94 C, 45 s; 60 C, 45 s; 72 C, 45 s; 25 cycles puis 72 C, 5 min) dans un volume final de 50 l. La PCR 3 est réalisée à partir d'un l de chaque PCR 2a et PCR 2b, avec les oligonucléotides 5' CHIyl et 3' CHlyl, en utilisant 0,5 U de Deep-Vent (94 C, 3 min; 94 C, 45 s; 60 C, 45 s; 72 C, 45 s; 25 cycles puis 72 C, 5 min) dans un volume final de 50 pl. Le produit de PCR 3 est purifié à partir d'un gel d'agarose 2% (gel extraction Kit Quiagen, volume final 50 l). La séquence du fragment de PCR 3 est réalisée sur séquenceur ABI 310 en utilisant les oligonucléotides: 5' CH1y1 et 3' CHly1. Le clonage est réalisé comme décrit pour le domaine CK mais entre les sites Sfil et Notl de p55CKFlag/RBS/35cmyc6HisGS. Le plasmide résultant est appelé plus communément: pCKCHly1-TAG, il permet la production de fragments d'anticorps de type Fab dont chaque chaîne possède une étiquette (Figure 10A). p55CKFla g/RBS/35CH 1 Hy 1 cmy c6HisGS (pCKCH1Hy1-TAG) (Figures 8B et 9) Insertion de la région constante lourde CHI et de la région Hinge (H) d'une immunoglobuline de type IgGI dans p55CKFlag/RBS/35cmyc6HisGS. Les PCR1, 2a, 2b et 3 sont réalisées exactement comme pour l'amplification du domaine CHI décrite ci-dessus en remplaçant l'oligonucléotide 3' Cyl par l'oligonucléotide 3' CH1Hy1 dont la séquence SEQ ID N 35 est indiquée ci-dessous: 3' CHIHyl SEQ ID N 35: AAGCTTAATCTAGAGCGGCCGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCACA AGATTTGGGCTCAACTTTC Le clonage est réalisé comme décrit pour le domaine CHly1 entre les sites SfiI et Notl de 25 p55CKFlag/RBS/35cmyc6HisGS. Le plasmide résultant est appelé plus communément: pCKCHIHy1-TAG, il permet la production de fragments d'anticorps de type F(ab')2 dont chaque chaîne possède une étiquette (Figure 10A). p55Cx/RBS/35CH1y1 (pCKCH1y1) (Figures 8B et 9) Elimination des étiquettes Flag et c-myc-6hisGS du plasmide p55CxFlag/RBS/35 CH1y cmyc6HisGS par remplacement du fragment d'ADN compris entre SacIl et Sfi1 par une nouvelle cassette en utilisant les oligonucléotides appariés 5' RBS/35-sup et 3' RBS/35-inf. Séquences SEQ ID N 36 et 37 des oligonucléotides utilisés: 5' RBS/35-sup SEQ ID N 36: GGAGAGTGTTAATAAACAGGAAACAGAAGTCCATATGAAATACCTATTGCCTAC GGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGC 3' RBS/35-inf SEQ ID N 37: GGGCCGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTGCCGTAGGCAATAGGTATTTCATAT GGACTTCTGTTTCCTGTTTATTAACACTCTCCGC Le clonage s'effectue exactement selon les conditions décrites pour l'insertion du MCSI. Le plasmide résultant intermédiaire est appelé : p55Cx/RBS/35CH1y1cmyc6HisGS. Le motif c-myc-6HisGS est enlevé en reclonant le domaine CHlyl dans 20 p55Cx/RBS/35CHIylcmyc6HisGS. Une PCR est utilisée en amplifiant à partir de 5 ng de plasmide p55CxFlag/RBS/35CH1y1cmyc6HisGS le domaine CH1y1 avec les oligonucléotides 5' CHlyl et 3' CHlyl-STOP. Séquence SEQ ID N 38 de l'oligonucléotide utilisé : 3' CHI yl - STOP SEQ ID N 38: CATGCAGTCCCAAGCTTAACAAGATTTGGGCTCAACTTTC Le clonage du fragment de PCR est réalisé comme décrit pour le domaine Cx mais entre les sites SfiI et et HindI1I du plasmide p55Cx/RBS/35CHlylcmyc6HisGS. Le plasmide résultant est appelé plus communément: pCKCHlyl, il permet la production de fragments d'anticorps de type Fab (Figure 10A). p55CKIRBS/35CHIHy1 (pCKCH1Hy1) (Figures 8B et 9) Elimination des étiquettes Flag et c-myc-6hisGS du plasmide p55CKFlag/RBS/35CHlHy1cmyc6HisGS par remplacement du fragment d'ADN compris entre SacII et SfiI par une nouvelle cassette en utilisant les oligonucléotides appariés 5' RBS/35-sup et 3' RBS/35-inf décrits précédemment. Le clonage s'effectue exactement selon les conditions décrites pour l'insertion du MCSI. Le plasmide résultant intermédiaire est appelé : p55CKIRBS/35CHlHylcmyc6HisGS. Le motif c-myc-6HisGS est enlevé en reclonant le domaine CHIHy1 dans p55Cx/RBS/35CH1Hylcmyc6HisGS. Une PCR est utilisé en amplifiant à partir à partir de 5 ng de plasmide p55CKFlag/RBS/35CHlHylcmyc6HisGS le domaine CH1Hy1 avec les oligonucléotides 5' CHlyl et 3' CH1Hy1-STOP. Séquence SEQ ID N 39 de l'oligonucléotide utilisé : 3' CH1Hy1-STOP SEQ ID N 39: CATGCAGTCCCAAGCTTATGGGCACGGTGGGCATGTGTG Le clonage du fragment de PCR est réalisé entre les sites SfiI et HindlIl comme décrit précédemment mais à partir du plasmide p55Cx/RBS/35CHlHylcmyc6HisGS. Le plasmide résultant est appelé plus communément: pCKCH1Hy1, il permet la production de fragments d'anticorps de type F(ab')2 (Figure 10A) . p55CKIRBS/35CH1HCH2CH3y1 (pMAbyl*) (Figures 8B et 9) Insertion de la région constante lourde CH1, de la région Hinge (H) et des régions constantes 5 CH2 et CH3 d'une immunoglobuline de type IgGI dans p55CKFlag/RBS/35CH 1 y1 cmyc6HisGS. Les PCR1, 2a, 2b et 3 sont réalisées exactement comme pour l'amplification du domaine CHI décrite ci-dessus en remplaçant l'oligonucléotide 3' CHlyl par l'oligonucléotide 3' HindlIl/H-CH2-CH3 dont la séquence SEQ I D N 40 est indiquée ci-dessous: 3' Hindlll/H-CH2- CH3 SEQ ID N 40: CCGCCAAAACAGCCAAGCTTATTTACCCGGAGACAGGGAG Le clonage est réalisé comme décrit pour le domaine CHI y entre les sites SfiI et HindIII de p55CxFlag/RBS/3 5CH 1 y l cmyc6HisGS. Le plasmide résultant est appelé plus communément: pMAbyl *, il permet la production de fragments d'anticorps de type mAb* (Figure 10B). p55HCH2CH3ylcmyc6HisGS (pHCH2CH3y1-TAG) (Figures 8B et 9) Insertion de la région Hinge (H) et des régions constantes CH2 et CH3 d'une immunoglobuline de type IgGl entre les sites BstEII et Notl de p55Flag/RBS/35cmyc6HisGS. La transcription inverse est réalisée exactement comme décrite pour la Cx, mais en utilisant l'oligonucléotide 3' Notl/H-CH2-CH3. Séquences SEQ ID N 41 et 42 des oligonucléotides utilisés: 5' BstE2/H-CH2-CH3 SEQ ID N 41: CCGGCCATGGCCCAGGTCACCGTCTCCTCAGACAAAACTCACACATGCCC 3' NotI/H-CH2-CH3 SEQ ID N 42: AAGCTTAATCTAGAGCGGCCGCTTTACCCGGAGACAGGGAG La PCR après RT est réalisée avec 1 gl d'ADNc, 10 pmoles de chaque oligonucléotides 5' BstE2/H-CH2-CH3 et 3' Notl/H-CH2-CH3, 0,5 U de Dynazyme (94 C, 3 min; 94 C, 1 min; 60 C, 1 min; 72 C, 1,5 min; 30 cycles puis 72 C, 10 min) dans un volume final de 50 l. Le plasmide résultant est appelé plus communément: pHCH2CH3y1-TAG, il permet la production de fragments d'anticorps de type HCI:[2CH3 avec une étiquette à l'extrémité de CH3 (Figure 10B). p55HCH2CH3 (pHCH2CH3) (Figures 8B et 9) Insertion de la région Hinge (H) et des régions constantes CH2 et CH3 d'une immunoglobuline de type IgGI entre les sites BstEII et HindIII de p55Flag/RBS/35cmyc6HisGS. La transcription inverse est réalisée exactement comme décrite pour la Cx, mais en utilisant l'oligonucléotide 3' Hindlll/H-CH2-CH3. Séquences SEQ ID N 43 et 44 des oligonucléotides utilisés: 5' BstE2/H-CH2-CH3 SEQ ID N 43: CCGGCCATGGCCCAGGTCACCGTCTCCTCAGACAAAACTCACACATGCCC 3' Hindlll/H-CH2-CH3 SEQ ID N 44: CCGCCAAAACAGCCAAGCTTATTTACCCGGAGACAGGGAG La PCR après RT est réalisée avec 1!al d'ADNc, 10 pmoles de chaque oligonucléotides 5' BstE2/H-CH2-CH3 et 3' Hind111/H-CH2-CH3, 0,5 U de Dynazyme (94 C, 3 min; 94 C, 1 min; 60 C, 1 min; 72 C, 1,5 min; 30 cycles puis 72 C, 10 min) dans un volume final de 50 ul. Le plasmide résultant est appelé plus communément: pHCH2CH3y1, il permet la production de fragments d'anticorps de type HCH2CH3 (Figure 10B) . Clonage des VHH Dans les différents formats n'importe quel VHH peut être introduit entre les sites uniques. En amont de la Ck: entre EcoRI et BstEll (ou Kpnl) En amont de CHI: entre S fi I et Nhel 5 En amont de H: EcoRI et BstEII A cet effet, on amplifie par PCR les différents VHH avec les couples d'oligonucléotides 5' et 3' décrits ci -dessous: Séquences SEQ ID N 45 à 51 des oligonucléotides utilisés: 5' EcoRl-Pe1B55-Pe1BPHen SEQ ID N 45: CGACACCGGAATTCCATATGAAATACCTATTACCAACAGCAGCAGCTGGGTTATT ATTGCTCGCTGCGCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTG 5'VHl-Sfi SEQ ID N 46: CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCT GG 5'VH2-Sfi SEQ ID N 47: CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCACCTTGAAGGAGTCT 20 GG 5'VH3-Sfi SEQ ID N 48: CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC TGG 5'VH4-Sfi SEQ ID N 49: CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC GGG 3' BstEll/Kpnl 30 SEQ ID N 50: GGTGCAGCCACGGTACCTGAGGAGACGGTGACCTG 3' BstE2/Nhel SEQ ID N 51: GGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCTG Production, purification et caractérisation des anticorps bio-spécifiques La production et la purification des différents fragments d'anticorps possédant l'étiquette 6HisGS sont réalisées comme décrit en 1.3.4. Pour la purification des fragments d'anticorps sans étiquette, l'étape de chromatographie sur talon est remplacée par une colonne échangeuse d'ions dont les caractéristiques (anions ou cations) dépendent des caractéristiques du fragment d'anticorps. Un Western Blot est montré dans la Figure 11. Méthode pour isoler les VH humains et construction des vecteurs. Le principe de la méthode consiste à cloner des domaines VH humains (isolés par RT-PCR à partir de la poche de l'EFS) dans le plasmide p55PhoA6HisGS-/NABW (Figures 8A, 9). Ce plasmide possède le gène codant pour la phosphatase alcaline dans une phase de lecture ne permettant pas son expression. Le clonage des VH restaure la phase de lecture de la phosphatase alcaline et permet la production des VH fusionnés en amont de la phosphatase alcaline (banque VH-PhoA clonée dans des bactéries TG1). Les différents clones sont ensuite produits en microplaques 96 puits et la cinétique de croissance des différents clones est mesuré toutes les 30 min (DO 620 nm) directement à partir des microplaques. On sélectionne ainsi les clones dont la croissance n'est pas altérée par la présence des VH. Les clones des microplaques sont répliqués et conservés à -80 C. Après 2 heures d'induction à 37 C, ou 16 heures d'induction à 30 C, 24 C, voire 18 C, la croissance est arrêtée et l'activité phosphatase est directement mesurée à partir des surnageants des milieux de culture. L'activité phosphatase est ensuite directement corrélée au nombre de bactéries présentes dans chaque puits de microplaques. La phosphatase alcaline West active que si elle est sécrétée dans le périplasme bactérien, sous forme de dimère avec ses ponts disulfures correctement formés. Cette approche permet donc de sélectionner les clones produisant la plus grande quantité de protéine fusion VH-PhoA sécrétée dans le milieu de culture bactérien. Il est ainsi possible de sélectionner les VH qui sont correctement repliés et dont le pont disulfure est correctement formé, donc solubles. Les VH sélectionnés serviront de matrice pour échanger les CDR des VH humains par les CDR des VHH de lamas précédemment décrits. Le choix du VH sera réalisé en choisissant le VH dont les acides aminés des jonctions des CDR sont équivalents à ceux des VHH. Conditions de RT-PCR et PCR: Hybridation: Un l d'ARN total (purification décrite dans le paragraphe 1.3.2) est préincubé avec 1 pmole d'oligonucléotides (mélange de: 3' JH1-4-5; 3' JH2; 3' JH3 et 3' JH6) pendant 10 min à 70 C 10 dans un volume final de 8 l. La température est diminuée lentement (45 min) jusqu'à 37 C. Transcription inverse: Aux 8 pi, on ajoute 0,5 pl de RNAsine (20 U), 3 l de tampon 5X (SuperScriptll, Invitrogen), 1 pl DTT, 100 mM, 2 l dNTP 10 mM et on incube 10 min à 50 C. On ajoute ensuite 0,75 l de SuperScript (150 U) et l'incubation est poursuivie 30 min à 50 C et 15 min à 70 C. L'ADNc obtenu est purifié sur billes (BioMag Carboxyl Terminated, Polysciences) selon les recommandations du fournisseur. L'élution finale est réalisée avec 15 gl de Tris-acétate 10 mM pH 7,8. La PCR1 est réalisée avec l l d'ADNc (obtenu par RT-PCR), 10 pmoles d'oligonucléotides 5' (0,625 pmole de chaque oligonucléotides 5' dont les séquences sont indiquées ci-dessous) et 3' (2,5 pmoles de chaque oligonucléotides 3' dont les séquences sont indiquées ci-dessous), 0,5 U de Dynazyme (95 C, 3 min; puis 95 C, 1 min; 58 C, 1 min; 72 C, 1 min; pendant 35 cycles puis 72 C, 10 min). Les produits de PCR sont déposés sur un gel d'agarose 2% et les bandes correspondant aux VH sont purifiées (gel extraction Kit Qiagen). La PCR2 est faite à partir de 1 pl de PCR1 diluée au 1/1000éme, la même quantité d'oligonucléotides décrits précédemment, 0,5 U Deep-Vent pour un volume final de 50 pl. (94 C, 3 min; puis 94 C, 1 min, 70 C, 1 min; 72 C. 1,5 min; pendant 40 cycles puis 72 C, 10 min). Les fragments sont purifiés à partir de gel d'agarose 2% comme précédemment décrit. Séquences SEQ ID N 52 à SEQ ID N 71des oligonucléotides utilisés: 5' VHIa SEQ ID N 52: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG 5' VHIb SEQ ID N 53: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GT(CT) CAG CT(GT) GTG CAG TCT GG 5' VHIc SEQ ID N 54: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC (CG) AG GTC CAG CTG GTA CAG TCT GG 5' VHId SEQ ID N 55: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CA(GA) ATG CAG CTG GTG CAG TCT GG 5' VH2a SEQ ID N 56: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTC ACC TTG AAG GAG TCT GG 15 5' VH2b SEQ ID N 57: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG ATC ACC TTG AAG GAG TCT GG 5' VH3a SEQ ID N 58: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG 5' VH3b SEQ ID N 59: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAA GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG 5' VH3c SEQ ID N 60: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG 5' VH3d SEQ ID N 61: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG GTG GAG (AT) C(TC) (GC)G 30 5' VH4a SEQ ID N 62: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GG 5' VH4b SEQ ID N 63: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG CTG CAG CTG CAG GAG TC(GC) GG 5' VH4c SEQ ID N 64: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG 5' VH5a SEQ ID N 65: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GA(GA) GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG 5' VH6a SEQ ID N 66: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG) GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG 5' VH7a SEQ ID N 67: CG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAA TCT GG 3' JH1-4-5 SEQ ID N 68: GTC TAG ACG TCC CCC CGG GGA GGA GAC GGT GAC CAG GG 3' JH2 SEQ ID N 69: GTC TAG ACG TCC CCC CGG GGA GGA GAC AGT GAC CAG GG 3' JH3 SEQ ID N 70: GTC TAG ACG TCC CCC CGG GGA AGA GAC GGT GAC CAT TG :3' JH6 SEQ ID N 71: GTC TAG ACG TCC CCC CGG GGA GGA GAC GGT GAC CGT GG Les différents fragments de PCR purifiés sont digérés par 10 U de NcoI et XmaI et insérés (Jans le vecteur de clonage p55/PhoA6HisGS-/NAEr par ligature. Le mélange de ligature est digéré par FseI avant transformation des bactéries. La transformation est réalisée par électroporation avec de bactéries TG1 électrocompétentes. Les clones possédant un domaine VH inséré restaure l'activité phosphatase (colonies bleues). 46 Production en microplaque 96 puits: Témoins: contrôle négatif milieu (2YT/ ampicilline 100 pg/ml), contrôle négatif du vecteur p55/PhoA6HisGS-/NAB", contrôle positif du vecteur p55PhoA6HisGS/NAB". Distribution de 150pl de milieu de culture (2YT/ ampicilline 100 g/ml) par puits (Nunclon Surface, Nunc). On inocule chaque puits avec une colonie isolée bleue avec un cure-dent ou un piqueur de cellule (Qpix) puis on scelle la plaque avec une feuille adhésive stérile. On fait pousser 16 h soit à 37 C ou 30 C dans un incubateur de plaques IEMS Thermo sous agitation à 900 rpm puis faire une réplique de la microplaque "mère" avec un réplicateur 96 puits dans une microplaque contenant 150 pl de 2YT/ ampicilline 100 p.g/ml puis sceller avec une feuille adhésive stérile (Après la réplique, on ajoute dans la microplaque mère 37,5 pl de glycérol 80% par puits et conserver à -80 C). Après 3 h de culture (environ DO 620nm 0,5) on induit 16 h avec 100 pM d'ITPG final. La DO à 620 nm est mesurée en fin d'induction. Dosage de l'activité phosphatase alcaline: Prendre 20 p.l de la culture totale (cellules + milieu de culture) et 20 gl de surnageant de culture (pour cela centrifuger 3 min à 910 g). A chaque échantillon on ajoute 130 pl Tris-HC1 IOmM pH 8,0 et on ajoute 50 pl de PNPP (paranitrophényl phosphate) à 1 mg/ml dans (diéthanolamine pH 9,8 (HCl); MgC12 0,5 mM). Après 30 min de réaction sous agitation, on mesure la DO à 405nm. L'activité phosphatase alcaline mesurée à 405 nm est ramenée au nombre de cellules (mesure DO 620 nm)contenues dans chaque puits en fin d'induction. Chaque activité phosphatase, des clones exprimant un VH fusionné à la phosphatase alcaline, est comparée à celle du contrôle positif (Phosphatase alcaline non fusionnée produite par p55PhoA6HisGS/NAB-). Seuls les clones présentant une activité égale ou supérieure au contrôle sont pris en considération et séquencés avec les oligonucléotides 5' EcoRI-90 et 3' inf-PstI+71 (séquence de l'oligonucléotide 3' inf-Pstl+71: GTTAAACGGCGAGCACCG). REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1- Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 1993; 363: 446-448. 2- Teillaud C, Galon J, Zilber MT, Mazieres N, Spagnoli R, Kurrle R, Fridman WH, Sautes C. Soluble CD16 binds peripheral blood mononuclear cells and inhibits pokeweedmitogen-induced responses. Blood, 1993, 82: 3081-3090). 3- Terskikh, A, Mach, JP, and Pèlegrin A. Marked increase in the secretion of a fully antigenic recombinant CEA obtained by deletion of its hydrophobic tail. Mol Immunol, 1993, 30:921-927. 4- Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162: 156-159. 5- Arbabi Ghahroudi M, Desmyter A, Wyns L, Hamers R, Muyldermans S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett, 1997, 414: 521-526. 6- Vivier E, Rochet N, Ackerly M, Petrini J, Levine H, Daley J, Anderson P. Signaling function of reconstituted CD16: zeta: gamma receptor complex isoforms. Int Immunol, 1992, 4: 1313-1323. 7- Vély F, Gruel N, Moncuit.I, Cochet O, Rouard H, Daré S, Galon J, Sautès C, Fridman WH, Teillaud J-L. A new set of monoclonal antibodies against human FcgammaRll (CD32) and FcgammaRlIl (CD16): characterization and use in various assays. Hybridoma, 1997, 16: 519-528. 8- Le Calvez H, Green JM, Baty D. Increased efficiency of alkaline phosphatase production levels in Escherichia coli using a degenerate Pe1B signal sequence. Gene, 1996, 170: 51-55. 48 REVENDICATIONS 1 - Formats d'anticorps, caractérisés en ce qu'ils comprennent tout ou partie des domaines de VHH ou de VHH humanisés ou de VH humains. 2 - Formats d'anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont de type Fab et comportent, en association, deux domaines VHH ou deux domaines Vh humains, identiques ou différents, ou deux domaines VH humains sur lesquels sont greffés les CDRs de VHH, l'un des domaines étant fusionné à la région constante Cx ou C?. humaine, l'autre à la région CH1 d'une immunoglobuline. 3 - Formats d'anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont de type F(ab')2 et comportent, en association, deux formats de type Fab tels que définis selon la revendication 2. 4 - Formats d'anticorps selon la revendication 3, caractérisés en ce qu'ils sont de type F(ab')2 et comportent, en association, deux Fab identiques ou différents obtenus par la réduction desdits formats de type F(ab') 2. 5 - Formats d'anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont de type (HCH2CH3)2, où H représente la région charnière "Hinge" d'une immunoglobuline humaine, CH2 et CH3 représentant le second et troisième domaine d'une Ig humaine et comportent, en association, deux VHH ou deux VH humains, identiques ou deux VH humains sur lesquels sont greffés les régions hypervariables des VHH, chacun étant fusionné à la région H-CH2-CH3 d'une IgG ou de toute autre Ig humaine. 6 - Formats d'anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont de type mAb* et comportent, en association, deux VHH ou deux VH humains, identiques ou différents, ou deux VH humains sur lesquels sont greffés les régions hypervariables des VHH, l'un étant fusionné à la région Ci 7 - Formats d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce que l'immunoglobuline est une IgG correspondant à une isoforme IgGI, IgG2, IgG3 ou IgG4 humaine ou une IgA humaine correspondant à une isoforme IgAI ou IgA2. 8 - Formats d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisés en ce que les VHH sont remplacés par des VH humains ou des VHH humanisés par greffage des CDRs des VHH sur des VH humains. 9 - Formats selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisés en ce qu'ils comprennent des fragments anti-CEA ou anti-CD16 répondant à une séquence en acides aminés choisie dans le groupe comprenant, respectivement, les séquences SEQ ID N 72, SEQ ID N 73, SEQ ID N 74 et SEQ ID N 75 ou SEQ ID N 76, SEQ ID N 77, SEQ ID N 78 et SEQ ID N 79. - Fragments d'anticorps VHH de camélidés, notamment de lamas, caractérisés en ce qu'il s'agit des fragments anti-CEA ou anti-CD 16 répondant à une séquence en acides aminés choisie dans le groupe comprenant, respectivement, les séquences SEQ ID N 72, SEQ ID N 73, SEQ ID N 74 et SEQ ID N 75 ou SEQ ID N 76, SEQ ID N 77, SEQ ID N 78 et SEQ ID N 79. 11 - Fragments d'anticorps selon la revendication 10, caractérisés en ce qu'il s'agit des CDRs des VHH. 12 - Procédé de production d'anticorps chimérisés ou humanisés, multispécifiques et/ou multivalents pour l'immunothérapie ou l'immunodiagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation de formats d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisés en ce que lesdits formats comprennent des VHH de camélidés, notamment de lamas, anti-CEA et anti-CD 16. 14 - Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que lesdits domaines variables de VHH anti-CEA et anti- CD 16 sont avantageusement produits selon un protocole comprenant - l'immunisation de camélidés, notamment de lamas avec, comme immunogène, un CEA ou un CD 16, - la purification des lymphocytes B récupérés à partir du sang, - la construction de banque de VHH, et - l'isolement des VHH à partir de la banque. 15- Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la construction de la banque comprend - l'extraction des ARN totaux des lymphocytes B, - la transcription inverse des ARN pour obtenir les ADNc correspondants, - l'amplification par PCR des gènes codant pour les régions variables des anticorps simple chaîne lourde anti-CD16 et antiCEA, - la ligation de fragments d'ADN VHH obtenus par coupure, par des enzymes, des ADN amplifiés avec un phagemide. 16- Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que les VHH sont isolés à partir des banques par la technique de phage display et purifiés. 17- Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que les gènes des VHH sélectionnés sont introduits dans des vecteurs d'expression, notamment des plasmides, pour produire des formats selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 18- Vecteurs d'expression, notamment plasmides, des formats d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisés en ce qu'ils renferment entre deux sites uniques d'enzymes de restriction les promoteurs, les séquences signal, les séquences nucléotidiques capables de coder pour lesdits fragments d'anticorps. 19- Plasmides pCKCHlyl-TAG et pCKCHlyl permettant la production des anticorps de type Fab selon la revendication 2. 20- Plasmides pCKCHIHyl-TAG et pCKCHIHyl permettant la production des anticorps de type F(ab') selon la revendication 3. 21- Plasmides pHCH2CH3-TAG et pHCH2CH3 permettant la production des anticorps de type (HCH2CH3)2 selon la revendication 5. 22- Plasmides pCKCHIHCH2CH3yl permettant la production des anticorps de type mAb* selon la revendication 6. 23- Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment au moins un 15 format d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 24- Méthode d'immunodiagnostic in vitro, caractérisée en ce qu'elle comprend l'utilisation de formats d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.