FR 2864968 A1 20050715 FR 0400191 A 20040109 "Procédé de production de caroténoïdes et bactéries mises en oeuvre." La présente invention est relative à un procédé de synthèse de caroténoïdes, en particulier, de caroténoïdes non photosynthétiques, par des bactéries photosynthétiques, en particulier, par Rhodopseudomonas palustris et aux bactéries mises en oeuvre dans le procédé. Plus de 600 caroténoïdes ont été identifiés dans la nature. Ils sont répandus chez de très nombreux organismes vivants mais ne sont synthétisés de novo que par un nombre restreint d'organismes (plantes, bactéries, levures). Certains de ces caroténoïdes (lycopène, 3-carotène, canthaxanthine, astaxanthine) sont utilisés de façon intensive et très diverse dans l'industrie agro-alimentaire pour leur propriété colorante (rouge pour le lycopène, jaune pour le 13-carotène, orange pour la canthaxanthine, rose-orange pour l'astaxanthine). On retrouve en particulier l'utilisation de l'astaxanthine et de la canthaxanthine en aquaculture pour l'élevage des saumons et des truites afin de renforcer la couleur rose- orange de la chair du poisson et en aviculture pour accentuer la couleur jaune-orange des ufs qui, dans les 2 cas, est appréciée par les consommateurs. De plus, de par leurs propriétés antioxydantes et leur rôle de photo protection, ils sont utilisés dans l'industrie pharmaceutique et cosmétique pour l'obtention entre autre de crème solaire protectrice et de produits bronzants. Il existe déjà dans certains pays toute une série de produits dérivés de la canthaxanthine, du I3-carotène et du lycopène, commercialisés dans les instituts de beauté et de body-building. Ces caroténoïdes ont également été décrits comme possédant des propriétés anti-cancéreuses. En effet, ces molécules peuvent réduire l'activité des radicaux libres, supposés contribuer à la formation de cellules cancéreuses. La synthèse actuelle de ces caroténoïdes est principalement réalisée par voie chimique. Etant donné la tendance du consommateur à préférer les produits ayant une origine naturelle, il existe donc un marché potentiel pour des caroténoïdes de provenance végétale ou microbienne. De plus, il apparaît que les configurations isomériques de certains caroténoïdes produits par voie chimique ne correspondent pas aux principaux isomères retrouvés dans la nature. Cette différence peut s'avérer très importante car elle est susceptible d'entraîner une bio-assimilation supérieure des caroténoïdes d'origine naturelle par rapport à ceux issus de la synthèse chimique. La voie de biosynthèse de ces 4 principaux caroténoïdes (lycopène, 8carotène, astaxanthine, canthaxanthine) est présentée dans la figure 1. Le lycopène synthétisé grâce à l'action successive des enzymes CrtE, CrtB et Crtl est un intermédiaire commun aux 3 autres caroténoïdes. La synthèse du 3-carotène peut être ainsi réalisée à partir du lycopène grâce à l'enzyme CrtY, celle de la canthaxanthine grâce aux enzymes CrtY et CrtW et celle de l'astaxanthine grâce aux enzymes CrtY, CrtW et CrtZ. Plusieurs bactéries ont été décrites pour leur capacité à produire l'un de ces 4 caroténoïdes (Brevibacterium, Agrobacterium auriantiacum, Erwinia uredovora, Erwinia herbicola, Myxococcus xanthus, Flavobacterium, Alcaligenes, Bradyrhizobium...). En particulier, des travaux antérieurs des inventeurs, qui ont fait l'objet d'un dépôt aux Etats-Unis sous le numéro US 60/297,247, ont porté sur la souche Bradyrhizobium ORS278. Ces travaux ont démontré l'existence d'un cluster de gènes (crtE, crtY, crtl, crtB, crtW) intervenant dans la voie de biosynthèse de la canthaxanthine. Ces différents gènes, une fois introduit chez E. co1i, se sont avérés fonctionnel. À l'exception de Bradyrhizobium, qui synthétise une faible quantité de photosystème, ces bactéries sont généralement des bactéries nonphotosynthétiques qui accumulent de faibles quantités de produits et qui ont bien souvent un taux de croissance limité. La nature de la souche productrice constitue donc un obstacle majeur pour assurer une productivité suffisamment intéressante pour un industriel. Par ailleurs, ces bactéries ne produisent en général qu'un seul de ces 4 caroténoïdes. Ceci implique pour un industriel voulant produire un panel de ces 4 principaux caroténoïdes d'utiliser différentes souches bactériennes qui vont chacune exiger des conditions bien particulières de culture et de production. D'autre part, la culture de différentes souches sur un même site peut entraîner de nombreuses difficultés logistiques liées aux problèmes de contamination. Enfin, les caroténoïdes sont des composés hydrophobes qui ne peuvent être stockés dans la cellule que dans un environnement lipophilique, généralement des compartiments membranaires. Les bactéries produisant des caroténoïdes d'intérêt industriel possèdent en général une membrane interne faiblement développée. Cette propriété, qui limite donc la quantité de caroténoïdes que l'on peut accumuler dans ces cellules, constitue l'un des problèmes majeurs pour une utilisation industrielle de ces bactéries. Les travaux des inventeurs les ont donc amenés à rechercher une bactérie pouvant synthétiser suivant les conditions de cultures et/ou suivant les gènes caroténoïdes introduits dans celle-ci, l'ensemble de ces 4 principaux caroténoïdes et ceci en palliant les défauts des autres bactéries. Les bactéries photosynthétiques présentent des avantages majeurs: une vitesse de croissance très rapide et une très forte capacité photosynthétique. Les caroténoïdes chez les bactéries photosynthétiques sont associés aux photosystèmes et jouent un rôle essentiel dans son fonctionnement. La forte activité photosynthétique est accompagnée de la synthèse en grande quantité de caroténoïdes photosynthétiques associée à la mise en place de membranes intracytoplasmiques en abondance constituant une zone de stockage importante pour les caroténoïdes. Néanmoins, ces bactéries ne synthétisent en général qu'un seul pigment, la spirilloxanthine ou le sphéroïdène, qui ne présentent pas, à l'heure actuelle, d'intérêt industriel. Afin d'obtenir un microorganisme producteur de lycopène, 8-carotène, canthaxanthine ou astaxanthine, les inventeurs ont exploité le potentiel que présentent les bactéries photosynthétiques en détournant la voie de synthèse endogène du caroténoïde photosynthétique vers la synthèse de caroténoïdes non photosynthétiques c'est à dire non associé au photosystème, chez ces bactéries: R-carotène, canthaxanthine ou astaxanthine. La présente invention est donc relative à un procédé de synthèse de caroténoïdes non photosynthétiques choisis parmi le [3-carotène, la canthaxanthine ou l'astaxanthine mettant en uvre des bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le lycopène, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: i. Délétion, chez les bactéries, d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, ii. Insertion des gènes suivants: - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le 13-carotène, soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le [3-carotène, - soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l'astaxanthine ou le 13-carotène, iii. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées, et, iv. Extraction du ou des caroténoïde(s) contenu(s) dans les bactéries. De manière surprenante, il a été constaté qu'une bactérie synthétisant un caroténoïde photosynthétique (c'est-à-dire impliqué dans la photosynthèse) restait photosynthétique lorsque la voie de synthèse endogène dudit caroténoïde était détourné vers la synthèse de caroténoïdes non photosynthétiques. En effet, la bactérie continue de synthétiser de manière résiduelle du lycopène, caroténoïde photosynthétique, qui permet à celle-ci de maintenir son activité de photosynthèse en remplaçant dans le photosystème le caroténoïde photosynthétique synthétisé de manière endogène. Les gènes à déléter au moins partiellement sont en général, les crtC, crtD et/ou crtF. De préférence, les gènes crtC et crtD seront au moins partiellement délétés. Ces gènes sont en effet les premiers à être mis en uvre dans la synthèse de la spirilloxanthine à partir du lycopène. (voir figure 1) En outre, il peut également être nécessaire de déléter dans certaines bactéries le crtA. Ce sera le cas pour les bactéries synthétisant du lycopène-2-one. (voir figure 1) De préférence, les bactéries photosynthétiques sont les suivantes: Rubrivivax gelatinosus, Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum moliscianum, Rhodospirillum salinarum, Rhodospirillum mediosalinum, Rhodospirillum sodomense, Rhodocista centenaria, Rhodospira trueperi, Rhodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas acidophila, Rhodopseudomonas julia, Rhodopseudomonas cryptolactis, Rhodomicrobium vannielii, Rhodoplanes roseus, Rhodoplanes elegans, Rhodobium orientis, Rhodobium marinum... Plus particulièrement, le procédé selon l'invention propose des conditions de culture assurant une production à un niveau satisfaisant de ces différents caroténoïdes. En particulier, il s'agit d'un procédé de synthèse de canthaxanthine ou d'astaxanthine, caractérisé en ce que les conditions de la mise en culture des bactéries sont séquentielles et comportent les étapes suivantes: a. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées dans un premier temps en anaérobiose sous éclairement, b. Puis, dans un second temps en aérobiose ou en microaérobiose, à l'obscurité. En effet, chez les bactéries photosynthétiques, les gènes photosynthétiques, incluant les gènes crtE, crtB, et crtl de la voie de biosynthèse du lycopène sont sous le contrôle de l'oxygène et de la lumière. En particulier, chez certaines souches ces gènes ne s'expriment pas à l'obscurité et sont inhibés par la présence d'oxygène (> à 8%). Cette répression par l'oxygène résulte d'un facteur de transcription appelé PpsR qui à forte pression partielle en oxygène se fixe sur les régions promotrices des gènes photosynthétiques, dont les gènes crt, empêchant ainsi leur transcription. En revanche, l'absence de dioxygène est défavorable à la production de la canthaxanthine ou de l'astaxanthine. En effet, la réaction enzymatique catalysée par les enzymes CrtW (13-carotene kétolase) ou CrtZ (3-carotène hydroxylase) intervenant dans la voie de biosynthèse de ces 2 caroténoïdes nécessite de l'oxygène (voir Figure 1). Il est donc nécessaire pour permettre la synthèse de canthaxanthine et d'astaxanthine de trouver un compromis au niveau des conditions de culture afin d'assurer d'une part la synthèse de l'intermédiaire lycopène et d'autre part sa transformation en canthaxanthine ou en astaxanthine. Avantageusement, les étapes a et b des conditions de culture permettant d'obtenir préférentiellement de la canthaxanthine ou de l'astaxanthine sont réitérées successivement. Une telle itération permet l'accumulation des caroténoïdes dans les cellules. Alternativement, le procédé selon l'invention permet la production de Rcarotène si l'on modifie les conditions de culture. Ces conditions photosynthétiques de mise en culture sont alors les suivantes: a. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées en anaérobiose sous éclairement. En effet, le fonctionnement de l'enzyme CrtY (lycopène cyclase) qui permet la transformation de lycopène en 3-carotène n'étant pas oxygènedépendante, l'absence de l'étape b des conditions de culture pour la canthaxanthine ou l'astaxanthine permet d'arrêter la synthèse au stade du R-carotène. Une seule bactérie permet donc de synthétiser à la fois du lycopène et préférentiellement, soit du (3-carotène, soit de la canthaxanthine ou de l'astaxanthine selon les gènes introduits et les conditions de culture. Alternativement, les conditions de culture permettant d'obtenir préférentiellement de la canthaxanthine ou de l'astaxanthine peuvent être réalisées en conditions de microaérobiose sous éclairement en une seule étape. En condition de microaérobiose, le pourcentage de dioxygène est de préférence compris entre 1 et 10%, plus particulièrement, 3 à 8%, bornes incluses. Afin de s'affranchir des limitations dues à la régulation de la synthèse par le dioxygène, l'invention propose également un procédé de synthèse de caroténoïdes non photosynthétiques choisis parmi le (3-carotène, la canthaxanthine ou l'astaxanthine, mettant en uvre des bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le lycopène, caractérisé en ce que le procédé comporte les étapes suivantes: i. Mise en uvre de mutants de bactéries photosynthétiques dont la photosynthèse n'est plus réprimée par le dioxygène, ii. Délétion, chez les bactéries, d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, iii. Insertion des gènes suivants: - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le (3-carotène, - soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le I3-carotène, soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l'astaxanthine ou le (3-carotène, vii. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées en aérobiose ou microaérobiose afin de synthétiser de la canthaxanthine ou de l'astaxanthine ou mise en culture en condition d'anaérobiose afin de synthétiser du 13--carotène, et, viii. Extraction du ou des caroténoïde(s) contenu(s) dans les bactéries. Les mutants dont la photosynthèse n'est plus réprimée par le dioxygène sont obtenus en particulier par délétion du gène codant pour le facteur de transcription PpsR, ledit facteur réprimant l'expression de certains gènes crt à forte pression partielle en dioxygène. Avantageusement, les bactéries mises en uvre dans le procédé sont du genre Rhodopseudomonas, de préférence de l'espèce, Rhodopseudomonas palustres. Certaines bactéries ne synthétisent pas de lycopène, mais un intermédiaire plus en amont dans la voie de synthèse des caroténoïdes. Il est alors possible de modifier ces bactéries de manière à les faire synthétiser du lycopène. Les bactéries photosynthétiques du procédé selon l'invention sont alors obtenues à partir de bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le phytoène, le phytofluène, le ç-carotène ou le neurosporène, lesdites bactéries ayant subi éventuellement une délétion ou disruption du gène crtI endogène, suivie d'une insertion d'un gène crtI exogène codant pour une phytoène désaturase assurant 4 étapes successives de désaturation du phytoène. Les bactéries sont préférentiellement: Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter veldkampii, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter azotoformans, Rhodobacter blasticus, Rhodovulum sulfidophilum, Rhodovulum adriaticum, Rhodovulum euryhalinum, Rhodovulum strictum... Dans une telle hypothèse, les gènes à déléter sont identiques à ceux cités précédemment. En effet, les dérivés du sphéroïdène sont obtenus à partir du neurosporène (le crtI endogène code pour une phytoène désaturase assurant seulement 3 étapes successives de désaturation du phytoène). Les gènes codant pour les premières enzymes mises en oeuvre par la suite sont le crtC, le crtD et/ou le CrtF. (voir figure 1) En outre, il peut également être nécessaire de déléter 25 dans certaines bactéries le crtA. Ce sera le cas pour les bactéries synthétisant du - carotène-2-one ou du neurosporène-2-one. (voir figure 1) De manière avantageuse, l'insertion des gènes crtY, crtZ et/ou crtW du procédé selon l'invention est réalisée dans la 30 zone des gènes au moins partiellement délétés. Alternativement, les gènes crtY, crtZ et/ou crtW peuvent également être insérés dans un plasmide. L'invention couvre également ' les bactéries photosynthétiques produisant, de manière alternative ou concomitante, au moins du lycopène, du 13carotène et de la canthaxanthine ou de l'astaxanthine, caractérisées en ce que lesdites bactéries sont susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'invention. En particulier, ces bactéries photosynthétiques synthétisant au moins un caroténoïde dont l'intermédiaire de synthèse est le lycopène, sont caractérisées en ce qu'elles comportent les mutations suivantes: i. Délétion d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, ii. Insertion des gènes suivants: soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le [3-carotène, - soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le 13-carotène, - soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l'astaxanthine ou le 13-carotène. Alternativement, il s'agit d'un mutant de bactéries photosynthétiques synthétisant au moins un caroténoïde dont l'intermédiaire de synthèse est le lycopène, dont la synthèse du photosystème n'est plus réprimée par le dioxygène, produisant de la canthaxanthine ou de l'astaxanthine, caractérisé en ce qu'il comporte les mutations suivantes: i. Délétion d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, ii. Insertion des gènes suivants: - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le R-carotène, - soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le R-carotène, - soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l'astaxanthine ou le R-carotène. Ces bactéries ou mutants peuvent être obtenus à partir de bactéries ou de mutants produisant au moins un caroténoïde dont l'un des intermédiaires de synthèse est le phytoène, le phytofluène, le q-carotène ou le neurosporène, lesdites bactéries ou mutants ayant subi éventuellement une délétion ou disruption du gène crtI endogène, suivie d'une insertion d'un gène crtI exogène codant pour une phytoène désaturase assurant 4 étapes successives de désaturation du phytoène. De manière surprenante, il a été constaté que ces bactéries ou mutants de bactéries photosynthétiques, bien qu'ayant leur voie de synthèse du caroténoïde photosynthétique endogène détournée vers la synthèse d'un caroténoïde non photosynthétique d'intérêt ont leur activité photosynthétique maintenue. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples avec références aux figures suivantes: - la figure 1 représente le schéma de synthèse des 25 différents caroténoïdes visés par l'invention, - la figure 2 présente le schéma de synthèse de la stratégie de construction du plasmide pJQ200mp18/crtDC:. crtY::crtW::apha3 - la figure 3 présente le schéma de synthèse de la 30 stratégie de construction du plasmide pJQ200mp18/crtDC::crtY::crtZ::crtW::apha3, et, - la figure 4 est une analyse par HPLC des caroténoïdes synthétisés par la souche mutante R. palustres CEAOOlAcrtDC::crtY::crtW sous différentes conditions de culture. Exemple 1: construction d'une souche mutante de Rhodopseudomonas palustris produisant du lycopène La séquence du cluster de gènes crt de R. palustris impliqué dans la synthèse de la spirilloxanthine est accessible sur Internet à l'adresse suivante http://www.ncbi.nlm.nih.gov (Acc Number: BX572597). Comme dans Bradyrhizobium 0RS278, les gènes crtE, crtl, crtB, crtC, crtD, crtF sont présents et organisés en 3 opérons La stratégie générale de construction de cette souche mutante va consister à disrupter les gènes crtD et crtC en y 15 insérant une cassette codant un gène de résistance à la kanamycine (gène apha3). gère étape: isolement et clonage des gènes crtDC de R. palustris,: Une région correspondant à une partie des gènes crtDC de R. palustris a été amplifiée à l'aide du couple d'amorces: crtD.R.palu.XhoI. f: GAGCTCGAGTTCGCCGGCATCGGCCTGAACTTCTC (SEQ ID N 1) CrtC.R.palu.XhoI.r: CTGCTCGAGAGGAGTATTACGGACTGATCGAAC (SEQ ID N 2) Les amorces ont été conçues de façon à insérer un site de restriction XhoI de part et d'autre du produit de PCR. Les amplifications sont réalisées avec une ADN polymérase haute fidélité commercialisée par Invitrogen (Platinium Pfx 30 DNA Polymerase). Les conditions d'amplification sont les suivantes: après une étape initiale de dénaturation de l'ADN à 95 C pendant 5 min, 35 cycles de PCR sont effectués (94 C pendant 15s puis 55 C pendant 30s puis 68 C pendant 3 min), suivis d'une étape finale d'élongation (68 C pendant 7 min) au cours de laquelle lpl de Taq polymérase classique (GoTaq, Promega ) est rajouté dans le tube de PCR afin d'insérer un résidu de déoxyadénosine aux extrémités 3' des fragments d'amplification (cette étape est indispensable pour permettre le clonage dans le vecteur pGEM-T utilisé ultérieurement). Le produit de PCR ainsi obtenu est cloné dans le vecteur de clonage pGEMT (commercialisé par la société Promega ) suivant le protocole du fournisseur. Le plasmide obtenu est nommé pGEM-T/crtDC.XhoI). 21ème étape: Construction du plasmide pJQ200mpl8/crtDC La région correspondant aux gènes crtDC de R. palustres est libérée par digestion Xhol du plasmide pGEM-T/crtDC.XhoI puis ligaturée dans le vecteur suicide pJQ200mp18 linéarisé par digestion Sall. Ce plasmide contient le gène suicide sacs qui permet de sélectionner sur saccharose les clones pour lesquels un événement de double crossing over a bien eu lieu (Quandt, J. & Hynes, M. F. Versatile suicide vectors in gramwhich allow direct selection for gene replacement negative bacteria ; Gene 127, 15-21, 1993). 3ième étape: Construction du plasmide pJQ200mp18/crtDC: : aphA-3 Le gène aphA-3 codant une résistance à la kanamycine est libéré du plasmide pUC4K commercialisé par la société Amersham par digestion avec l'enzyme Sall. Il est alors inséré dans le plasmide pJQ200mp18/crtDC linéarisé par Sali. Il est à noter que cette dernière digestion Sall entraîne une délétion d'un fragment de 618pb correspondant à l'extrémité 5' du gène crtD et l'extrémité 3' du gène crtC. Le plasmide pJQ200mp18 /crtDC: :aphA-3 est enfin transféré par électroporation dans la souche conjugative Escherichia coli S17.1. 4ième étape: Construction d'une souche mutante de R. palustris contenant la cassette apha3 au niveau des gènes crtD,crtC. Le plasmide précédent pJQ200mp18 /crtDC: : aphA-3 est délivré dans la souche sauvage de R. palustris (CEA001) par conjugaison avec la souche précédente E. coli S17.1 contenant la contruction. Les clones conjuguants sont sélectionnés sur milieu Hutner (R. K. Clayton Towards the isolation of a photochemical recation center in Rhodopseudomonas sphaeroides ; Biochim. Biophys. Acta 75: 312-318, 1963) contenant de la kanamycine l50pg/ml et de la carbenicilline 50pg/ml. Les clones double recombinants sont sélectionnés après repiquage des clones conjuguant sur milieu Hutner contenant du saccharose 5% et de la kanamycine (150gg/ml). Une vérification par PCR est effectuée sur plusieurs clones recombinants afin de s'assurer que l'insertion de la cassette apha3 au niveau des gènes crtD et crtC de R. palustris. La production de lycopène en grande quantité a été constatée chez les bactéries ainsi mutées. Par ailleurs, le caractère photosynthétique de la bactérie est conservé. Exemple 2: Construction d'une souche mutante de Rhodopseudomonas palustris produisant du L3-carotène ou de la 25 canthaxanthine Schéma de construction La stratégie de construction de cette souche mutante est résumée dans la figure 2. Dans cette figure, les légendes des étapes sont les 30 suivantes. mère étape: Amplification des gènes crtY et crtW de Bradyrhizobium ORS278, ainsi que des gènes crtDC de R. palustris. Clonage des produits de PCR dans le plasmide p-GEMT (Promega). 2ième étape: Libération par SalI de la cassette apha3 du plasmide puc4K commercialisé par Amersham. Insertion au niveau du site Xhol unique présent en aval de crtW. 3ième étape: Libération des gènes crtW et apha3 par 5 Kpnl/EcoRI. Insertion dans le plasmide pGEM-T/crtY linéarisé par les mêmes enzymes. 4ième étape: Libération des gènes crtY, crtW et apha3 par BgllI/EcoRI. Insertion dans le plasmide pGEM-T/crtDC linéarisé par les mêmes enzymes. 5ième étape: Libération des gènes crtDC, crtY, crtW et apha3 par Xbal. Insertion dans le plasmide pJQ200mp18 linéarisé par la même enzyme A. Stratégie de Construction La stratégie globale pour construire une souche mutante de R. palustris produisant soit du 3-carotène soit de la canthaxanthine a consisté à disrupter les gènes crtD, crtC de R. palustris en y insérant les gènes crtY et crtW de Bradyrhizobium 0RS278 ainsi qu'un gène aphA-3 codant pour une résistance à la kanamycine. Suivant les conditions d'oxygénation de la culture (voir exemple 3) l'enzyme CrtW transformant le I3-carotène en canthaxanthine est fonctionnelle ou pas, ce qui conduit au choix à une accumulation de 3carotène ou de canthaxanthine. lere étape: isolement et clonage des gènes crtDC de R. palustres, crtY et crtW de Bradyrhizobium ORS278: Une région correspondant à une partie des gènes crtDC de R. palustris a été amplifiée à l'aide du couple d'amorces: crtD.R.palu.Xbal.f: GAGTCTAGATTCGCCGGCATCGGCCTGAACTTCTC (SEQ ID N 3) CrtC.R.palu.Xbal.r: CTGTCTAGAAGGAGTATTACGGI- 'CTGATCGAAC (SEQ ID N 4) Les amorces ont été conçues de façon à insérer un site de restriction Xbal de part et d'autre du produit de PCR. Le gène crtY de Bradyrhizobium ORS278 a été amplifié à l'aide du couple d'amorces suivant: crtY.278.f: TGAGATCTGGAGGCTGTCGTCATGAGTCGAGATGCCGACGTCATCGTC (SEQ ID N 5) crtY.278.r: GTTGAATTCCTGGTACCTCATGGGGTCTTGAAGGCGCTCGCCTCA (SEQ ID N 6) Les amorces ont été conçues de façon à insérer un site de fixation du ribosome RBS et un site de restriction BglII en 5' ainsi qu'un site de restriction Kpnl et EcoRI en 3' du produit de PCR. Le gène crtW de Bradyrhizobium ORS278 a été amplifié à l'aide du couple d'amorces suivant: crtW.ORS278.f: CGGTACCGGGAGCTTTGCCAATGCATGCAGCAACCGCCAAGGCTAC (SEQ ID N 7) crtW.ORS278. r: GTGAATTCCATGCTCGAGCGGGTTTAGTCACGCCTTTCCAG (SEQ ID N 8) Les amorces ont été conçues de façon à insérer un site de fixation du ribosome RBS et un site de restriction Kpn I en 5' ainsi qu'un site de restriction Xho I et EcoR I en 3' du produit de PCR. Les amplifications sont réalisées avec une ADN polymérase haute fidélité commercialisée par Invitrogen (Platinium Pfx 25 DNA Polymerase). Les conditions d'amplification sont les suivantes: après une étape initiale de dénaturation de l'ADN à 95 C pendant 5 min, 35 cycles de PCR sont effectués (94 C pendant 15s puis 55 C pendant 30s puis 68 C pendant 3 min), suivi d'une étape finale d'élongation (68 C pendant 7 min) au cours de laquelle 1111 de Taq polymérase classique (GoTaq, Promega ) est rajouté dans le tube de PCR afin d'insérer un résidu de déoxyadénosine aux extrémités 3' des fragments d'amplification (cette étape est indispensablepour permettre le clonage dans le vecteur pGEM-T utilisé ultérieurement). Les 3 produits de PCR ainsi obtenus sont clonés dans le vecteur de clonage pGEM-T (commercialisé par la société Promega ) suivant le protocole du fournisseur. Les plasmides obtenus sont nommés pGEM-T/crtDC. XbaI; pGEM-T/crtY; pGEMT/crtW 2ième étape: Construction du plasmide pGEM-T/crtW: :aphA-10 3 Le gène aphA-3 codant une résistance à la kanamycine est libéré du plasmide pUC4K commercialisé par la société Amersham par digestion avec l'enzyme SalI. Il est alors inséré dans le plasmide pGEM-T/crtW linéarisé par Xhol. 3ième étape: Construction du plasmide pGEMT/crtY: :crtW: : aphA-3 La construction précédente contenant les gènes crtW et aphA-3 est libérée par double digestion Kpnl/EcoRI puis insérée dans le plasmide pGEM-T/crtY linéarisé par le même couple d'enzymes de restriction. 4 ième étape: Construction du plasmide pGEMT/crtDC: :crtY: : crtW: : aphA3 La construction précédente contenant les gènes crtY, crtW et aphA-3 est libérée par double digestion Bg1II/EcoRI puis insérée dans le plasmide pGEM-T/crtDC linéarisé par le même couple d'enzyme de restriction. La digestion de pGEMT/crtDC par Bglll/EcoRI entraîne une délétion d'un fragment de 1232 pb correspondant à une partie importante des gènes crtD et crtC. 5ième étape: Construction du plasmide pJQ200mp18 /crtDC: :crtY: . crtW: : aphA-3 La construction précédente contenant les gènes crtDC, crtY, crtW et aphA-3 est libérée par digestion Xbal puis insérée dans le plasmide suicide pJQ200mp18 linéarisé par Xbal. Le plasmide pJQ200mp18 /crtDC: :crtY: . crtZ::crtW: :aphA-3 est enfin transféré par électroporation dans la souche conjugative Escherichia coli S17.1. 6ième étape: Construction d'une souche mutante de R. palustris contenant les gènes crtY et crtW de Bradyrhizobium ORS278. Le plasmide précédent pJQ200mp18 /crtDC: :crtY: :crtW: . aphA-3 est délivré dans la souche de R. palustris CEA001 par conjugaison avec la souche précédente E. coli S17.1 contenant la construction. Les clones conjuguants sont sélectionnés sur milieu Hutner contenant de la kanamycine 150pg/ml et de la carbénicilline 50pg/ml. Les clones double recombinants sont sélectionnés après repiquage des clones conjuguant sur milieu Hutner contenant du saccharose 5% et de la kanamycine (15Opg/ml). Une vérification par PCR est effectuée sur plusieurs clones recombinants afin de s'assurer que les gènes crtY, et crtW ont bien été insérés au niveau des gènes crtD et crtC. Un mutant est retenu pour la suite des expériences: R. palustris CEAOOlAcrtDC::crY::crtW. B. Analyse des caroténoïdes produit par la souche mutante R. palustris CEAOO1AcrtDC::crY::crtW - essai dans différentes conditions de culture Afin de déterminer le potentiel de la souche mutante de R. palustris CEAOOlAcrtDC::crY::crtW à surproduire du 8- carotène et de la canthaxanthine, une série d'essais préliminaires a été réalisée dans laquelle différentes conditions de culture ont été testées. A: Flacon de 120 ml contenant 100 ml de milieu Hutner, 30 C - dégazé pour éliminer toute trace d'oxygène, et placé sous une lampe à incandescence de 100 Watts (conditions lumière, anaérobiose) B: Flacon de 250 ml rempli de 50 ml de milieu Hutner, 30 C - agitation 170 RPM - placé dans une atmosphère où la teneur en oxygène peut être ajustée à 1, 5, 8 % (Conditions lumière, microaérobiose) ou 21% (Conditions lumière, aérobiose) C: Après culture en anaérobiose pendant 2 jours suivant les conditions A, 50 ml sont transférés dans un erlenmeyer à baffles puis mis à agiter 170rpm à l'obscurité pendant une nuit pour fortement oxygéner la culture. Après 3 jours de culture dans les différentes conditions 15 testées, les caroténoïdes produits sont analysés par HPLC. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 suivant. Tableau 1: production de caroténoïdes selon les conditions de culture chez le mutant R. palustres CEAOOlAcrtDC::crY::crtW Conditions D0650 Lycopène B-carotène Canthaxanthine mg/L mg/L mg/L A 3, 7 2,7 4,7 0 B 1% 02 2, 9 0, 85 1, 13 0, 1 B 5% 02 2 0, 35 0, 19 0, 32 B 8% 02 2,4 0,46 0,16 0,41 B 21% 02 1,8 0,12 0,05 0,07 C 3, 7 2, 4 3, 8 0, 8 Il apparaît clairement que les conditions d'aération et de lumière ont des effets très importants sur la production des caroténoïdes et la croissance de la souche. De fortes quantités de 8-carotène peuvent être obtenues en anaérobiose sous lumière (4.7 mg/1), par contre seules de faibles concentrations de caroténoïdes (lycopène et B-carotène) sont obtenues lorsque la bactérie est cultivée en condition aérobie (21%) en raison de la répression de la synthèse de l'appareil photosynthétique par l'oxygène. La présence d'importantes quantités de B-carotène en conditions lumière, anaérobiose montre bien que le gène crtY d'ORS278 qui permet la transformation du lycopène en B-carotène est parfaitement fonctionnel. Par contre, on observe l'absence de production de canthaxanthine dans ces mêmes conditions. Ceci résulte du fait que l'enzyme CrtW qui permet la transformation du B-carotène en canthaxanthine est une oxygénase qui a donc besoin d'oxygène pour fonctionner. En accord avec cette explication, la concentration de canthaxanthine augmente progressivement (de 0,32 à 0,41 mg/1) lorsque la teneur en oxygène passe de 5 à 8% avec une baisse concomitante de B-carotène (tableau I). Cette expérience démontre, d'une part la nécessité de la présence d'oxygène pour la formation de canthaxanthine à partir de B-carotène, d'autre part que l'enzyme CrtW d'ORS278 est également fonctionnelle chez ce mutant. La transformation de B-carotène en canthaxanthine en fonction de la teneur en oxygène est aussi démontrée par le chromatogramme présenté sur la figure 4. Un autre argument en faveur d'une transformation du B-carotène en canthaxanthine de façon équimolaire en présence d'oxygène est présenté dans les conditions C, c'est- à-dire en oxygénant la culture après croissance en anaérobiose, où il est possible de transformer une partie de ce B-carotène en canthaxanthine. Ces premiers essais montrent bien qu'il est possible de produire de la canthaxanthine chez R. palustris. Par ailleurs, en jouant sur les conditions d'aération, la quantité de B-carotène transformable en canthaxanthine devrait être proche de 5mg/1 soit 6 fois plus que la quantité de canthaxanthine (0,8mg/l) obtenue en culture liquide avec la souche Bradyrhizobium ORS278. De plus, le temps de culture a été divisé par un facteur supérieur à 2 soit une augmentation du même rapport de la productivité. Exemple 3: Stratégie de construction d'une souche mutante 5 de Rhodopseudomonas palustris produisant de l'astaxaflthine Schéma de construction La stratégie de construction de cette souche mutante est résumée en figure 3. Dans cette figure, les légendes des étapes sont les 10 suivantes. lère étape: Amplification du gène crtZ de Pseudomonas putida. Clonage du produit de PCR dans le plasmide p-GEMT (Promega). 2ième étape: Libération par Kpnl du gène crtZ. Insertion 15 dans le site Kpnl unique du plasmide pGEM-T/crtY::crtW::apha3. 3ième étape: Libération des gènes crtY, crtZ, crtW et apha3 par Bglll/EcoRI. Insertion dans le plasmide pGEM-T/crtDC linéarisé par les mêmes enzymes. 4ième étape: Libération des gènes crtDC, crtY, crtZ, crtW 20 et apha3 par Xbal. Insertion dans le plasmide pJQ200mp18 linéarisé par la même enzyme Construction La stratégie générale consiste à insérer le gène crtZ de 25 Pseudomonas putida dans la souche mutante précédemment construite de R. palustris contenant les gènes crtY et crtW de Bradyrizobium 0RS278. L'insertion est faite au niveau du site unique de restriction Kpnl présent entre les gènes crtY et crtW. 1er étape: Construction du plasmide pGEM-T/crtZ Le génome de Pseudomonas putida a été entièrement séquencé. La séquence du gène crtZ est disponible dans les banques de gènes (Genbank ACC: NC_00297). Le gène est amplifié à partir de l'ADN génomique de Pseudomonas putida à l'aide du couple d'amorces: crtZ.Ps.putida.f: CCTTTTGGTACCGGAGGACCGTTCCATGCTGTTCAATCTCGCCATATT (SEQ ID N 9) crtZ.Ps. putida.r: GGGGTACCTCACGATTGGCTGCGCCTGCTGCGCAATTG (SEQ ID N 10) Les amorces ont été conçues de façon à insérer un site de fixation du ribosome RBS en 5'et un site de restriction Kpn I en 5' et en 3' du produit de PCR. L'amplification est réalisée avec une ADN polymérase haute fidélité commercialisée par Invitrogen (Platinium Pfx DNA Polymerase). Les conditions d'amplification sont les suivantes: après une étape initiale de dénaturation de l'ADN à 95 C pendant 5 min, 35 cycles de PCR sont effectués (94 C pendant 15s, puis 55 C pendant 30s, puis 68 C pendant 1 min), suivi d'une étape finale d'élongation (68 C pendant 7 min) au cours de laquelle 1111 de Taq polymérase classique (GoTaq, Promega ) est rajouté dans le tube de PCR afin d'insérer un résidu de déoxyadénosine aux extrémités 3' des fragments d'amplification (cette étape est indispensable pour permettre le clonage dans le vecteur pGEM-T utilisé ultérieurement). Le produit de PCR ainsi obtenu est cloné dans le vecteur de clonage pGEMT suivant le protocole du fournisseur. Le 25 plasmide obtenu est nommé pGEM-T/crtZ. 2 ième étape: Construction du plasmide pGEMT / crtDC: : crtY: : crtZ::crtW: : aphA-3 La construction précédemment obtenue pGEM-30 T/crtDC: :crtY: : crtW: : aphA-3 contenant les gènes crtW, crtY de Bradyrhizobium ORS278 et le gène de résistance à la kanamycine aphA-3 inséré dans les gènes crtDC de R. palustres est linéarisée par l'enzyme KpnI dont le site de restriction est situé entre les gènes crtW et crtY. Le gène crtZ cloné dans le vecteur pGEM-T/crtZ est libéré par Kpnl, puis inséré par ligation dans la construction précédente linéarisée. 3ième étape: Construction du plasmide pJQ200mp18 5 /crtDC. :crtY: : crtZ::crtW: : aphA-3 La construction précédente contenant les gènes crtDC, crtY, crtZ, crtW et aphA-3 est libérée par digestion Xbal puis insérée par ligation dans le plasmide suicide pJQ200 mpl8 linéarisé par Xbal. Le plasmide pJQ200mp18 /crtDC: :crtY: :crtZ::crtW: :aphA-3 est transféré par électroporation dans la souche conjugative Escherichia coli 517.1. 4ième étape: Construction d'une souche mutante de R. 15 palustris CEA001 contenant les gènes crtY et crtW de Bradyrhizobium ORS278 et crtZ de Pseudomonas putida. Le plasmide précédent pJQ200mp18 /crtDC: :crtY: :crtZ: :crtW: : aphA-3 est délivré dans la souche R. palustris CEA001 par conjugaison avec la souche précédente E. coli S17.1 contenant la construction. Les clones conjuguants sont sélectionnés sur milieu Hutner contenant de la kanamycine 150pg/ml et de la carbénicilline 50pg/ml. Les clones double recombinants sont sélectionnés après repiquage des clones conjuguants sur milieu Hutner contenant du saccharose 5% et de la kanamycine (150pg/ml). Une vérification par PCR est effectuée sur plusieurs clones recombinants afin de s'assurer que les gènes crtY, crtZ et crtW ont bien été insérés au niveau des gènes crtD et crtC. En condition de culture en microaérobiose (8% d'oxygène), 30 la production d'astaxanthine en grande quantité a été constatée chez les bactéries ainsi mutées. 24 REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse de caroténoïdes non photosynthétiques choisis parmi le R-carotène, la canthaxanthine ou l'astaxanthine mettant en oeuvre des bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le lycopène, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: i. Délétion, chez les bactéries, d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, ii. Insertion des gènes suivants: - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le 13-carotène, - soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le 13--carotène, - soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l'astaxanthine ou le R-carotène, vi. Mise en culture des bactéries ainsi modifiées, et, vii. Extraction du ou des caroténoïde(s) contenu(s) dans les bactéries. 2. Procédé selon la revendication 1, de synthèse de canthaxanthine ou d'astaxanthine, caractérisé en ce que les conditions de mise en culture sont séquentielles et comportent les étapes suivantes: c. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées dans un premier temps en anaérobiose sous éclairement, 15 20 25 d. Puis, dans un second temps en aérobiose en obscurité. 3. Procédé selon la revendication 1 de synthèse de R-carotène, caractérisé en ce que les conditions de mise en 5 culture sont les suivantes: b. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées en anaérobiose sous éclairement. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les étapes a et/ou b sont réalisées en conditions de 10 microaérobiose sous éclairement. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'en conditions de microaérobiose, le pourcentage de dioxygène est compris entre 1 et 10%, de préférence, 3 à 8%, bornes incluses. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que l'on réitère les étapes a et b successivement. 7. Procédé de synthèse de caroténoïdes choisis parmi le (3-carotène, la canthaxanthine ou l'astaxanthine, mettant en uvre des bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le lycopène, caractérisé en ce que le procédé comporte les étapes suivantes: i. Mise en uvre de mutants de bactéries photosynthétiques dont la photosynthèse n'est plus réprimée par le dioxygène, ii. Délétion, chez les bactéries, d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, iii. Insertion des gènes suivants: - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le R-carotène, - soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le [3-carotène, soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l'astaxanthine ou le R-carotène, iv. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées en aérobiose ou microaérobiose afin de synthétiser de la canthaxanthine ou de l'astaxanthine ou mise en culture en condition d'anaérobiose afin de synthétiser du R-carotène, et, v. Extraction du ou des caroténoïde(s) contenu(s) dans les bactéries. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les mutants dont la photosynthèse n'est plus réprimée par le dioxygène sont obtenus par délétion du gène codant pour le facteur de transcription PpsR. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 précédentes, caractérisé en ce que les bactéries sont du genre Rhodopseudomonas, de préférence de l'espèce, Rhodopseudomonas palustres. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-8, caractérisé en ce que les bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le lycopène sont obtenues à partir de bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le phytoène, le phytofluène, le ç-carotène ou le neurosporène, lesdites bactéries ayant subi éventuellement une délétion ou disruption du gène crtI endogène, suivie d'une insertion d'un gène crtl exogène codant pour une phytoène désaturase assurant 4 étapes successives de désaturation du phytoène. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'insertion des gènes crtY, crtZ et/ou crtW est réalisée dans la zone des gènes au moins partiellement délétés. 12. Bactérie photosynthétique produisant, de manière alternative ou concomitante, au moins du lycopène, du R-carotène et de la canthaxanthine ou de l'astaxanthine, caractérisée en ce que ladite bactérie est susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 1 ou la revendication 9 dans son rattachement à la revendication 1. 13. Bactérie photosynthétique caractérisée en ce qu'elle est obtenue selon le procédé suivant: i. Mise en uvre d'une bactérie photosynthétique synthétisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'intermédiaire de synthèse est le lycopène, ii. Délétion d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, iii. Insertion des gènes suivants: - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le [3-carotène, - soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le R-carotène, soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l'astaxanthine ou le (3-carotène. 14. Mutant de bactérie photosynthétique caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé suivant: i. Mise en uvre d'un mutant de bactérie photosynthétique synthétisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont 20 l'intermédiaire de synthèse est le lycopène, dont la photosynthèse n'est plus réprimée par le dioxygène, produisant de la canthaxanthine ou de l'astaxanthine, ii. Délétion d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, iii Insertion des gènes suivants: - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le 0-carotène, - soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le 0-carotène, - soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l'astaxanthine ou le 0-carotène. 15. Bactérie selon les revendications 12 ou 13, ou mutant selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est respectivement obtenu à partir de bactérie ou de mutant produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le phytoène, le phytofluène, le c-carotène ou le neurosporène, lesdits bactérie ou mutant ayant subi éventuellement une délétion ou disruption du gène crtl endogène, suivie d'une insertion d'un gène crtl exogène codant pour une phytoène désaturase assurant 4 étapes successives de désaturation du phytoène. 15