FR 2859786 A1 20050318 FR 0350556 A 20030917 Dispositif destiné à détecter des ruptures de chaîne du froid d'un produit La présente invention concerne un dispositif destiné à détecter des ruptures de chaîne du froid d'un produit. Le dispositif est caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une étiquette comprenant des bactéries destinées à provoquer une opacification de l'étiquette en cas de franchissement d'un seuil déterminé de température de conservation du produit. L'étiquette est notamment destinée à être apposée sur un code barres associé au produit. Ainsi, l'opacification de l'étiquette rend illisible le code barres du produit. 1. DESCRIPTION DU PRODUIT TRACEO est une étiquette adhésive qui indique par une réaction colorée les ruptures de chaîne du froid et plus précisément l'épuisement du capital fraîcheur d'un produit. - TRACEO est un indicateur microbiologique. Des bactéries alimentaires sont emprisonnées à l'intérieur de l'étiquette (contenant un milieu de culture) et se multiplient plus ou moins rapidement en fonction de la température de conservation. TRACEO# simule donc le développement des micro-organismes responsables de la dégradation des produits et informe sur l'état de fraîcheur des produits. - Le code barre est utilisé comme support du contrôle de fraîcheur. L'étiquette TRACEO est apposée directement sur le code barre du produit. Si le code barre est lisible, le produit est consommable. Si l'aliment a subi une rupture de la chaîne du froid ou si sa date limite de consommation (DLC) est dépassée, la prolifération des bactéries présentes dans le film va entraîner une réaction du témoin rendant impossible la lecture du code barre. 2. LE FONCTIONNEMENT a. Généralités La coloration repose sur le suivi du développement de microorganismes alimentaires qui modifient progressivement le milieu sur lequel ils évoluent. C'est l'activité biochimique de ces microorganismes qui va affecter le milieu sur lequel on se trouve et qui sera mise en évidence par un révélateur approprié. Ces deux ans de développement ont permis à CRYOLOG de valider la faisabilité technique de la simulation de l'évolution du capital fraîcheur des produits alimentaires et ont permis à CRYOLOG de définir avec précision : - le choix des souches bactériennes ; - le choix du milieu ; - la mise au point d'un système d'activation. b. Le choix de la souche bactérienne Les critères de sélection de ces micro-organismes sont : - Caractère alimentaire reconnu, - Large spectre de température de croissance [0 C ; 45 C] : bactéries psychrotrophes, susceptibles de simuler la croissance des bactéries susceptibles de contaminer ou d'altérer le produit. - L'existence d'activités enzymatiques ou biochimiques aisément caractérisables, - Stabilité des lignées bactériennes dans le temps. La famille des bactéries lactiques a été choisie pour intégrer TRACEO#. i. Les bactéries lactiques sont des bactéries alimentaires En effet, grâce à leur souplesse d'adaptation, les bactéries lactiques peuvent coloniser des milieux très différents du point de vue physico-chimique et biologique. La plupart des bactéries lactiques ont des activités utiles, assurant soit la conservation des matières premières alimentaires, soit une protection efficace contre les affections intestinales de l'homme et des animaux. La transformation, par fermentation, de la plupart des produits alimentaires s'effectue grâce à la microflore lactique, qui, par son activité acidifiante et aromatisante, participe à la structure, au goût, et la saveur des principaux aliments fermentés (fromages, laits fermentés, saucissons sec...). Ces bactéries interviennent aussi dans la conservation de beaucoup d'aliments (choux, olives, riz...) en les rendant plus digestibles et plus sains. Dans les milieux naturels, les bactéries lactiques exercent une action irremplaçable sur les équilibres microbiens. Leur action inhibitrice vis-à-vis des microorganismes nuisibles en fait un moyen biologique efficace de préservation des qualités hygiéniques des aliments (De Roissard, 1994). Leur présence dans l'intestin s'avère essentielle pour assurer un bon fonctionnement des organes de la digestion, confirmant le caractère alimentaire de la grande majorité des bactéries de cette famille. ii. Les bactéries lactiques produisent de l'acide D'un point de vue plus microbiologique, les bactéries lactiques sont des bactéries à Gram-positif, généralement immobiles, asporulées, anaérobies mais aérotolérantes, ne possédant pas de catalase. Toutes les bactéries lactiques ont un métabolisme strictement saccharolytique qui à partir de glucide produit de l'acide lactique (ou de l'acide lactique et de l'acide acétique) ce qui entraîne en abaissement du pH du milieu, activité biochimique caractérisable au sein du milieu TRACEO. iii. Les bactéries lactiques proches des bactéries d'altération Les travaux réalisés en collaboration avec l'Institut Pasteur de Paris, et plus précisément avec le laboratoire Interaction Bactérie-Cellule de Pascale COSSART, spécialiste internationale de Listeria monocytogenes, ont confirmé non seulement le caractère psychotrophe des bactéries lactiques que CRYOLOG avait retenues mais également des propriétés de croissance de ces bactéries très proches de celles de Listeria monocytogenes, bactérie pathogène particulièrement dans le collimateur des pouvoirs publics français et européens : Nous avons ensuite orienté nos recherches plus particulièrement sur les souches alimentaires du genre Lactobacillus qui se révèlent proche des Listeria confirment Messieurs DUSSURGET et CABANES ainsi que Mme COSSART dans leur rapport d'activité de conseil pour la société CRYOLOG. iv. Les bactéries lactiques sont des lignées stables Comme indiqué précédemment, les bactéries lactiques constituent une flore technologique de choix et entrent dans la composition de nombreux produits alimentaires industriels, ce qui confirme deux caractéristiques très intéressantes des bactéries lactiques : - La stabilité des lignées dans le temps, caractéristique nécessaire à tout processus industriel ; - La faible sensibilité de ces bactéries à une contamination extérieure : les bactéries lactiques sont à ce titre très généralement utilisés comme flore de compétition pour prévenir le développement d'autres bactéries au sein d'un produit. v. Le travail de screning des souches de bactéries lactiques Les souches ont été sélectionnées à partir d'un travail de screening sur 114 souches de lactobacillus a priori sélectionnées pour avoir un comportement analogue à celui des flores se développant dans les produits alimentaires réfrigérés et notamment une aptitude à se développer dans la même plage de température que Listeria monocytogenes, c'est-à-dire entre 0 C et 45 C. A l'issu de cette phase de screening CRYOLOG a travaillé plus précisément sur les souches suivantes : LC265 Lactobacillus case/ Ht003 Weisella halototérans 89L319 La 235M8"' iacfoBaciîfus dàs'ei * \ 503M5 Carnobacterium piscicola 31OT9 LeûmhWtoc'ciïreum '.. CIPA159 Lactobacillus plantarum CIP 1 0'4"37TT ISSSS19en~S [A^ CIP 103709 Lactobacillus casei C(PY 103158T" WeJsella vitidescens vi. vii. Des souches très prometteuses Sur cette base des essais complémentaires ont été réalisés et ont permis d'isoler plus spécifiquement deux bactéries sur lesquels CRYOLOG a axé son développement : Souches Identification ARN16s 503M 10 Carnobacterium piscicola 503M5 Carnobacterium piscicola L'identification précise de ces deux souches est synthétisée dans les documents suivants : - ANNEXE 1 : IDENTIFICATION ARN 16S des souches 503M5 et 503M10 ; - ANNEXE 2 : Identification des souches 503M5 et 503M10 par la méthode rep- PCR ; - ANNEXE 3 : Profil API des souches 503M5 et 503M10 ; - ANNEXE 4 : Valeurs cardinales des souches 503M5 et 503M10 ; viii. Des voies en cours d'approfondissement Compte tenu des résultats obtenus sur le screening des souches, CRYOLOG a poursuivi son travail d'investigation sur les souches de Carnobacterium, pour lesquels il a été montré au cours des travaux : - que ces bactéries ont des caractéristiques de pousse proche de celles de Listeria monocytogenes. - que ces bactéries pourraient être utilisées comme flore technologique pour prévenir la croissance de listeria monocytogenes. La famille des Carnobacterium est aujourd'hui à l'étude pour compléter le pool de souches utilisées par CRYOLOG dans le cadre du développement d'un indicateur microbiologique de ruptures de chaîne du froid ou d'un témoin fraîcheur des produits, véritable Date Limite de Consommation dynamique des produits. c. La définition du milieu de culture i. La composition de base du milieu Le milieu MRS est couramment utilisé pour la culture des bactéries lactiques. C'est la raison pour laquelle CRYOLOG est parti de ce milieu comme base pour élaborer la composition finale du milieu TRACEO#. Les constituants du milieu TRACEO de base sont décrits dans le tableau suivant : Tryptone (Oxoid) 10 g/L Extrait de levure (Oxoid) 5 g/L Tween 80 (Merck 8221871500) 1.08 g/L Phosphate dipotassique (Merck) 2.6 g/L Sulfate de magnésium (Merck) 0.222 g/L Sulfate de manganèse (Merck) 0.055 g/L Glucose (Oxoid) 20 g/L Caséine (caséinate de sodium) 50g/L Ces composants sont dissous dans l'eau et le milieu est ajusté à pH 6,2. ii. Le rôle des humectants dans le paramétrage de TRACEO Afin d'améliorer le milieu MRS et de jouer sur la composition du milieu pour obtenir des taux de croissance différents dans le but de simuler les différentes dates limites de consommation, l'équipe de R&D a travaillé sur différents composants et additifs et notamment sur la concentration plus ou moins importante en glycerol qui permet de jouer sur l'activité de l'eau aw. Plus la concentration en glycerol est importante et plus la valeur de l'aw est basse. L'aw, appelé activité de l'eau exprime la disponibilité de l'eau dans un milieu. Il est important de distinguer l'eau libre, chimiquement non liée (totalement disponible pour participer aux réactions) et l'eau liée (non disponible notamment pour les microorganismes). L'aw est inversement proportionnelle à la pression osmotique d'un composé. Ainsi, elle est affectée par la présence plus ou moins importante d'humectants (NaCI (sels), glycérol, mannitol, sorbitol...) dissous dans l'eau. La disponibilité de l'eau présente dans un milieu ou dans une substance intervient dans la croissance bactérienne. L'abaissement de l'aw ralentit l'activité enzymatique ; il augmente la durée de la phase de latence des microorganismes et diminue leur vitesse de croissance. Jouer sur la concentration en glycerol ou tout autre humectant pour faire varier la valeur de l'aw est intéressant et permet de modifier et maîtriser les temps de croissance des bactéries. Aw Pourcentage de glycérol Pourcentage de NaCI dans dans le milieu (en g) le milieu (en g) 0. 995 0 0 0. 990 3 1 0. 985 6 2.5 0. 980 10 3.5 0. 975 13.5 4.5 0. 970 ~ ~ 15 5 0. 960 20 6. 5 Aw correspondant au pourcentage de Nacl ou de Glycérol présent dans le milieu d. La réaction colorée Afin d'empêcher la lecture du code-barres, le milieu contenu dans TRACEO, doit changer de couleur (et prendre une teinte complémentaire de celle rouge des lecteurs de code-barres) ou s'opacifier sous l'effet de la chute de pH. La réaction devait, d'après le cahier des charges que CRYOLOG avait rédigé avec différents industriels et distributeurs agroalimentaires, être une réaction brutale de coloration pour que le changement de couleur n'intervienne que dans les dernières heures de la vie du produit. Ce choix a été fait afin de ne pas induire en erreur le consommateur en lui apportant une réponse binaire à la question : Puis-je consommer ? . i. La Précipitation de la Caséine La coloration de TRACEO repose sur la précipitation de la caséine. La caséine est l'une des principales protéines du lait. Elle est constituée de 3 fractions : [alpha]s, ss et X. Plus de la moitié de ses acides aminés portent des groupements ionisables libres. Elle peut ainsi se complexer à différents ions pour se retrouver sous forme de caséinate (caséinate de sodium, caséinate de calcium). Dans le lait, la caséine se trouve dans un complexe salin à l'état micellaire. Une chute du pH provoque une précipitation de la caséine. Elle précipite totalement vers un pH de 4.7. Si l'acidification se développe progressivement dans le milieu du fait d'une fermentation lactique, il se forme un coagulum homogène, comme dans le yaourt (Alais, 1984). caséinate-Ca+ 2 CH3-CHOH-COOH => caséine + (CH3-CHOH-COO)2 Ca (acide lactique) (insoluble) Cette réaction est très utilisée en agroalimentaire, lors du caillage du lait pour la formation du fromage frais puis du fromage salé et affiné. Une précipitation de la caséine provoquée par une acidification du milieu par les bactéries lactiques rend ainsi l'indicateur TRACEO# opaque et le code barre illisible. îRjfjli I iy ive "SZ ;:a zozo eue . . ;..tel!il!;iiliiii ,.... #> ..-â -673?-?10100 's' #'#' K:7aP'. 'S",r aia7 bzz s:. Plusieurs concentrations de caséinate ont été testées : 5g/L, 20g/L, 50 g/L et 100 g/L de gélose. En milieu liquide, la caséine commence à précipiter sous forme de petits flocons à un pH de 5.20, la précipitation opacifie le milieu qui devient blanc à un pH de 5.10. Tracéo+eau+50 g/L caséinate ajusté pH 6.2 avec HCI -7 # 6,5 Caséine soluble g ~ ~~ ~ -##################### 5,5 - ~~~,~~~~~~~~-~~L Zone de précipitation de a 5 II#...,-#,.......#....--.# -,,..,,.-~--~-~~~~---~----î la caséine 4,5 Caséine précipitée 4 3,5 3 - -################################# 0 2 4 6 8 10 12 [acide lactique] gli Figure 14: Zone de pH de précipitation de la caséine ii. Les indicateurs de pH Chaque indicateur de pH possède une zone de pH dans laquelle sa couleur change. La zone de virage de l'indicateur devra être comprise entre pH=6 (pH initial du milieu) et pH=4 (acidification maximale). De plus sa couleur en milieu acide doit pour pouvoir masquer le code barre, le jaune est donc à éviter. Trois indicateurs ont été retenus : le Rouge Congo, le Rouge de Méthyle et l'Indicateur Mixte 5. pH de virage: Rouge congo r..:~"rj.: . ~ . ~~~~~~~~ ~ WBJSSm, Rouge Congo: entre 3 et 5.2 Rouge de methyle |M~B|~B 1 1 1 1 1 Rouge de Méthyle: entre 4.4 et 6 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~ lnrlïrafir ir 4 Ji, , Indicateur Mixte entre 4.4 et 5.8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 n L'indicateur Mixte 5 (Merck) est incorporé à la gélose à des concentrations de 1%, 2% et 4%. Le Rouge Congo (Sigma) est préparé à 20 g/L (dissolution dans de l'eau distillée). Sa concentration dans la gélose est égale à 0.40 g/L et 0. 20 g/L. Le Rouge de Méthyle est dissous dans un mélange alcool absolu et eau distillée (1. 5 volume d'alcool pour 1 volume d'eau) à une concentration de 2 g/L. Dans la gélose, sa concentration est de 0.04 g/L et 0.08 g/L. D'autres indicateurs ayant un pH de virage autour de 5 sont à l'étude et notamment parmi les indicateurs listés en annexe 5. Ces indicateurs présentent un intérêt utilisé seul mais présente également un intérêt utilisé en complément de la précipitation de la caséine. Cela permet en effet de parfaire le message à adresser au client final en associant à l'opacification du codebarres et du témoin consommateur un code couleur quasi universel : Acide Basique Après épuisement du capital fraîcheur du Avant épuisement du capital fraîcheur du produit produit NON CONSOMMABLE CONSOMMABLE Ce système permettrait d'entrevoir d'autres applications tels que des sytèmes à double détente permettant une opacification en deux temps : 1. Opacifaction du code barres : pour bloquer la vente en caisse X jours avant la Date Limite de Consommation. 2. Changement de couleur du Témoin Consommateur pour indiquer que la Date Limite de Consommation du produit est dépassée, c'est-à-dire que le produit n'est plus frais. iii. Les autres indicateurs de croissance des bactéries - Le X-gal Cette technique est utilisée lors d'une transfection bactérienne afin de détecter les bactéries transfectées. Les bactéries possédant l'enzyme 3-galactosidase peuvent hydrolyser un substrat artificiel contenu dans le milieu : le X-gal, composé incolore. Cette hydrolyse libère du galactose et le produit X (5-Br,4-CI-indol) coloré en bleu. Cette réaction permet d'obtenir un milieu coloré en bleu par la présence des colonies. Le X-gal (Sigma) est préparé à 25 g/L dans un mélange éthanol 95% et NaOH, N (5 volumes d'éthanol pour un volume de NaOH). Sa concentration dans la gélose est égale à 0.08 g/L. - Le Bleu de Chine La gélose lactosée au Bleu de Chine est un milieu non inhibiteur utilisé pour le dénombrement et la différenciation des bactéries dans les produits laitiers. Le Bleu de Chine sert d'indicateur de pH pour différencier les germes qui fermentent le lactose de ceux qui ne le fermentent pas. Les colonies qui fermentent le lactose sont colorées en bleu. 3. LES RESULTATS a. Influence de l'Aw sur la précipitation de la caséine L'activité de l'eau (Aw), agit sur le taux de croissance bactérien. En général, pour des Aw faible la croissance est ralentie. Ainsi pour modifier et maîtriser le temps de réaction de TRACEO, l'Aw du milieu est diminuée pour ralentir la croissance bactérienne et donc la production d'acide lactique. II faudra plus de temps pour atteindre le pH de précipitation de la caséine. L'Aw d'un milieu peut être modifiée par ajout de NaCI ou de glycérol ou d'autres humectants. Il est important de savoir si le milieu TRACEO réagit différemment si son Aw est modifiée. Le pH de précipitation de la caséine en fonction de différentes Aw est donc mesuré. milieu mesurée départ précipitation Tracée eau 0,995 6,12 5,20-5,10 Tracéo eau 0,989 5,92 5,00-4,90 NaCi NACI racéo eau 0,985 5,80 4,85-4,75 NaCI 2% NaCI ' 5,80 4,85-4,75 Tracéo eau 0,970 5,63 4,80-4,70 % NaCI 4,80-4,70 racéo eau0 gg2 6,36 5,30-5,25 4% glycérol l6'36 M0'5'25 Glycérol Tracéo eau 0,984 6,34 5,35-5,25 Tracéo eau 15% 0,971 6,34 5,30-5,15 glycérol pH de précipitation de la caséine en fonction de l'Aw Une Aw plus basse par addition de NaCI diminue le pH de précipitation de la caséine. Ce phénomène n'est pas observé lors d'une modification de l'Aw du milieu par ajout de glycérol. Dans un milieu où l'Aw (obtenue par addition de NaCI) est faible, le temps de précipitation sera donc plus long, la croissance bactérienne étant plus faible et le pH de précipitation plus bas. b. Généralités sur le Calcul des Dates Limites de Consommation L'objectif est de d'utiliser ces résultats de recherche afin de donner à TRACEO le rôle d'un témoin fraîcheur, véritable Date Limite de Consommation Dynamique. Cela signifie que : - si les conditions de conservation sont correctement respectées, le témoin changera de couleur à la Date Limite de Consommation prévue ; - si des ruptures de chaîne du froid surviennent durant le process de distribution, le témoin changera de couleur avant la Date initialement prévue. CRYOLOG s'est attaché à valider des Dates Limites de Consommation dans les conditions de la norme expérimentale AFNOR XP V01-003, dans laquelle la Date Limite de Consommation des produits est calculée selon le protocole suivant : - 1/3 du temps de la durée de vie microbiologique à la température de consigne (par exemple 4 C ). - 2/3 du temps de la durée de vie microbiologique à la température de 8 C, correspondant à la Température constaté dans le réfrigérateur des utilisateurs. c. Simulations de Date Limite de Consommation L'équipe de développement de CRYOLOG a cherché à valider dans un premier des scénarios classiques de Dates Limites de Consommation en attendant de commencer des études plus spécifiques avec des clients. Ont été validées les DLC à 7 jours, à 15 jours et à 21 jours, pour des produits devant être conservés à 4 C, selon la norme expérimentale AFNOR. DLC à 7 jours : virage de l'indicateur entre 6,7 et 7,2 jours. DLC à 15 jours : virage de l'indicateur entre 14,7 et 15,8 jours. DLC à 21 jours : virage de l'indicateur entre 20,7 et 21,4 jours. Les valeurs intermédiaires de Dates Limites de Consommation peuvent être obtenues en faisant varier les valeurs de l'Aw, c'est-à-dire en jouant sur le choix et la concentration de l'humectant. On peut tamponner le milieu pour ralentir la croissance des bactéries avec une solution de tampon phosphate 0,1M, pH 5,7. La caractéristique d'une solution tampon réside dans la faible variation de son pH lors d'addition de petites quantités d'acide ou de base. Le milieu tamponné permettra donc une chute de pH (due à la production d'acide lactique) moins brutale au début de la croissance bactérienne. ANNEXE 1 : IDENTIFICATION ARN 16S des souches 503M5 et 503M 10 Souches Identification ARN16s 503M10 Carnobacterium piscicola 503M5 Carnobacterium piscicola Séquences de l'ADNr16S de la souche 503M10 893pb AGTCgAACGCACGAAGTTGAAGAGCTTGCTCTTTaaccaGTGAGTGGCGGACGGG TGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATTAGAGGGGGATAACATTCGGAAACGG ATGCTAATACCGCATAGTTTCAGGAATCGCATGATTCTTGAAGGAAAGGTGGCT TCGGCTACCACTAATGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAT GGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACT GGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCC GCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCG GATCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGCTCATCC CCTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCA GGCGGTTCTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCAT TGGAAACTGGAGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGC GGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGG TCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATAC CCTGGTAGTCCACGCCGTanaCGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCC TTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGgngAgTACGGCCGCAAG GCTgaaaCTCaaagGAATTGACGGGgacccgCACAAGC Séquences de l'ADNr16S de la souche 503M5 900pb CGAAGTTGaaGAGCTTGCTCTTTAACCAAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACA CGTGGGTAACCTGCCCATTAGAGGGGGATAACATTCGGAAACGGATGCTAATAC CGCATAGTTTCAGGAATCGCATGATTCTTGAAGGAAAGGTGGCTTCGGCTACCA CTAATGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAA GGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGA CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACG AAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAA CTCTGTTGTTAAAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGCTCATCCCCTGACGGTA TTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG GTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTT TAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGG AGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGC GTAGATATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTG ACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC CACGCCGTanaCGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTG CAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTAcggccgcaaGGCTGAAACTCAA AGGAATTGACGgggAcCCGCAcaAgcggtggagcATGTggttt z99 99 3 ? -0 M 0 n correlation (Opt5.00 CR - 100 -! (0 .-, ;0 z H8iiilflïSW>i CD 0' 0. es souches 5 iode rep-PCR . .50 . .50 CD (il CD t 5 3M10 es ré (n S- o (D 8. 96 % d'homologie entre les 2 souches avec le coeffic (D r-t- de Pearso ANNEXE 3 : Profil API des souches 503M5 et 503M10 RESULTATS D'IDENTIFICATION API 50 CHL TESTS |i[||.i| ! S I I 1 , 1 1 3 } ! i ! ' I 33 I S | 1 I f0 Q) 11 Z I Si t/7 O X 0 0 0 0 m -0 Mo 0 o6J ss IV ~~~~~~~~~~ [alpha] 503 M 10 + 1 -1 -1 ........ d + + + + + + + + 503 M 5± - + + +1 + ± - - JL~: ++++++++ RESULTATS D'IDENTIFICATION API 50 CHL (+: fermentation du sucre) TESTS 2 LO 503 M 10 + - + + - - - - - - + - - - - - - - - - - 503 M 5 l + 1 - I + 1 + 1 - | - I - l - I - l - | + l - | - | - I - l - l - | - l - | - |~ + = Test positif - = Test négatif ANNEXE 4 : Valeurs cardinales des souches 503M5 et 503M10 TEMPERATURES CARDINALES AW CARDINALES PH CARDINAUX CMI ACIDE LACTIQUE Souches T min T opt T max Aw min Aw opt Aw min Aw opt PH min PH opt CMI acide NaCI Nacl Glycérol Glycérol dissocié (mM) 503M5-2.72 35. 19 40. 25 0. 940 0. 995 0. 875 0. 992 4. 03 6. 17 5. 83 503M10 -4. 44 31. 21 36.99 0. 977 0. 992 0. 958 0.996 5.07 7.24 7.76 ANNEXE 5 : des indicateurs colorés ayant une zone de virage autour de pH=5 Indicateur pH Couleur Couleur pKa en en Basique Acide Alizarine 3.7-5.2 Jaune Violet Alizarine Sodium 3.7-5.2 Jaune violet Sulfonate HHhHI Alzarine Red 3. 8-5 Jaune Violet Benzopurpurin 1.3-5 (Pas Précis) Bleu Benzo Aurdmine G 5-5. 6 Bleu Jaune Benzoylethylauramine 4-5. 2 Jaune Bleu De Résorcine 4. 4-6.6 Bleu Bleu De 3.2-4.8 Jaune Bleu Bromochloro hénol Bromocresol Green 3. 8-5.4 Jaune 4.68 Bromophenol Blue 3-4.6 Jaune Bleu 3. 85 Carmine Acid 4.8-6.2 Jaune Violet 2,4-Dinitro henol 2-4. 7 Incolore Jaune 4-(4-Dimethylamino- 3.5-4.8 Violet Incolore 1-Naphtylazo)-3- #HImShI Methoxybenzenesulfonic HHhH Acid a-dinitrophénol 4.3-6.3 Incolore Jaune a-dinitro hénol 4.3-6.3 Incolore Jaune P-dinitrophénol 3.9-5.9 Incolore 1 ~ Jaune y-dinitro hénol 4-5. 8 Rose Jaune Disodium4,4- Bis(O- 4-5 Jaune Marron Tolytriazeno)-2,2'Stilbenedisulfonate Disodium4,4- Bis(P- 4-5. 4 Bleu Dimethylaminophenylazo) Violet -2,2'-Stilbenedisulfonate pgRzT JPHJBBHHJ 4-(P- 4.4-5.8 zur .. - . Ethoxyphenylazo)-M- HKIPlfT1 'wf|'?f#.;ri''Î3 Phenylene-Diamine HHraSrî "iÈiriilJïll! Monoh drochloride IpISiiiHiS? Mf11"!"- Ethyl Red 4-5. 8 Incolore Eth Orange 3. 4-4.8 Rouge Jaune Hexamethox Red 2.6-4.6 Jaune Incolore Hydroquinolsulphonap 1-5 #S'*' Jaune htalein Lacmoid 4. 4-6.2 Bleu Iodeosin 4-5 Lasmoid 4. 4-6.2 Bleu N,Ndimethyl-P-(M- 2. 6-4.8 Rouge Jaune* Tolylazo)Aniline B ff3 4'-Methoxy-2. 4- 4. 4-6.4 Rouge Jaune Diaminoazobenzene IhHHh Meth 1 Red 4.4-6.2 zizi ' - Jaune Methyl Red- 4. 6-4.8 Violet AI hazurin a-Nn h lamine 3.4-5 s 4 a-Naphtylaminoazo- 3. 7-5 Rouge Jaune Benzène ffiHiiH| Naphtyl Red 3. 7-5 jaune Oxime Blue 3.9-5.5 fiBBPI 11'illTlll 4.7 4'-Oxy-3'-Methyl-2.4- 3. 8-5.8 Rouge Jaune Diaminoazobenzene IHI|WS8m!IWIJ| 4'-Oxy- 3.4-5.4 Rouge Jaune 2.4diaminoazobenzène PSffiHiiin 4-Phenylazo-1- 4-5. 6 Rouge Jaune Na ht lamine HBBBHffllilll Parafuchsine-Hexa- 3.1-5 UJIJl'V1- HhHH AceticAcid Paranitro hénol 5 Incolore ||yfôii||t--' P-Ethox chr soidine 3. 5-5.5 Jaune Rouge P-Sulfo-O- 3.4-4.6 BKHBH "i'lljll"|ii llllll Methoxybenzeneazodime #"[#i'jiiiiïi - . thyl- aNa h lamine Rou e Con 3-5 Bleu Rouge Red Violet 3.6-6 !~~~-~-# b,, LmwBmia Resazurin 3. 8-6.4 Hft"" Rouge Na ht 3. 8-5 Jaune Tetrabromocresol 3-4.6 Jaune Bleu Tétraiodophenolsulfo 3-5 Jaune Violet hthalein Revendication 1. Dispositif destiné à détecter des ruptures de chaîne du froid d'un produit; ledit dispositif étant caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une étiquette comprenant des bactéries destinées à provoquer une opacification de ladite étiquette en cas de franchissement d'un seuil déterminé de température de conservation dudit produit ; ladite étiquette étant notamment destinée à être apposée sur un code barres associé audit produit ; (de sorte que l'opacification de l'étiquette rend illisible le code barres du produit).