FR 2865278 A1 20050722 FR 0400543 A 20040121 1 2865278 La présente invention concerne un procédé de mesure de la photoprotection apportée aux cheveux par des produits de soins capillaires. Les cheveux sont principalement constitués de protéines fibreuses, les kératines, et de pigments. La kératine est un polymère à haut poids moléculaire formé par l'association de différents acides aminés reliés par une liaison provenant de la réaction entre un groupement aminé d'une molécule d'acide aminé et le groupement acide carboxylique d'une molécule voisine. La kératine est donc une chaîne polypeptidique. On a déterminé que cette chaîne polypeptidique comprenait les acides aminés suivants: alanine, valine, leucine, isoleucine, sérine, thréonine, phénylalanine, tyrosine, tryptophane, proline, acide aspartique, acide glutamique, lysine, arginine, histidine, cystine et méthionine. Le terme kératine en lui-même comprend un certain nombre d'entités chimiques différentes. Ainsi, dans les cheveux, coexistent plusieurs types de kératines, ayant des proportions et des distributions d'acides aminés différentes, et donc un comportement chimique différent. La cohésion entre les chaînes polypeptidiques de la kératine est notamment assurée par des ponts disulfures entre les cystéines, pour former des cystines, par des interactions coulombiennes entre les acides aminés, par des liaisons hydrogènes et par des interactions hydrophobes. Une rupture d'une ou de plusieurs de ces liaisons peut altérer la stabilité de la kératine. Les ponts disulfures sont les interactions les plus fortes et ils sont caractéristiques de la structure de la kératine. Ils représentent également le point le plus faible de cette structure car ils sont très sensibles aux attaques chimiques, en particulier par des agents oxydants ou réducteurs (C. Zviak, R.P.R. Dawber, The science of hair care, Marcel Dekker, New-York, 14-32, 1986). La détérioration des cheveux dépend notamment de leur pigmentation ainsi que de la quantité et de l'intensité des rayonnements solaires auxquels ils sont exposés. Les rayonnements ultraviolets A (UVA) et visibles de la lumière du soleil sont ceux qui détériorent le plus les cheveux. Toutefois, les rayonnements ultraviolets B (UVB) et infrarouges (IR) les abîment également. Les cheveux bruns sont en partie protégés des 2 2865278 rayonnements par leurs pigments alors que les cheveux blonds sont plus sensibles à la photodégradation. Ainsi, le rayonnement ultraviolet (UV) est responsable de certaines agressions subies par la fibre capillaire. En effet, sous l'effet cumulé des expositions aux rayons du soleil, le film hydrolipidique à la surface du cheveu est altéré, laissant le cheveu à nu et non protégé. Les écailles se soulèvent alors, puis cassent, endommageant de manière plus ou moins profonde la fibre capillaire. Le cheveu est fragilisé, cassant et fourchu. Comme la peau, les cheveux ont donc besoin d'une protection solaire spécifique à base de filtres solaires, sous forme d'huile capillaire, de mousse, de spray, .... Plusieurs techniques, référencées dans la littérature, ont été mises au point pour déterminer la dégradation des cheveux après exposition aux rayons solaires, principalement aux rayonnements ultraviolets et ainsi pour évaluer la protection apportée par un produit de soin capillaire. Elles peuvent généralement être classées selon deux catégories: les méthodes biophysiques et les méthodes physico-chimiques. Comme exemples de méthodes biophysiques, on peut citer les mesures morphométriques dans lesquelles les dommages physiques provoqués par l'irradiation due aux ultraviolets peuvent être visualisés au microscope électronique et un traitement numérique de l'image permet de déterminer la protection apportée par un produit de soin capillaire. On peut également citer les méthodes de décoloration des cheveux, dans lesquelles un appareil photométrique, utilisé habituellement pour les textiles, mesure la décoloration des cheveux. On peut aussi citer les méthodes de résistance à la traction dans lesquelles le cheveu est étiré et les paramètres d'élasticité ainsi que la charge à la rupture sont mesurés et les méthodes de mesure du diamètre, de la surface de la coupe transversale et du gonflement du cheveu en présence de soude à l'aide d'un micromètre laser. Comme exemples de méthodes physico-chimiques, on peut citer les méthodes de mesures par complexation du cuivre. En effet, une augmentation de la complexation du cuivre indique un plus grand nombre de groupements acides, donc la destruction de la chaîne polypeptidique et par conséquent une diminution de la stabilité de la fibre capillaire. En dosant le cuivre non complexé, on peut estimer l'état des dommages subis par le cheveu. On peut aussi citer les méthodes de quantification des acides aminés, basées principalement sur l'étude de la formation d'acide cystéique, produit d'oxydation de la cystine après irradiation par des doses UV très importantes. Par exemple, le brevet 3 2865278 JP9173301 décrit un procédé de mesure des acides aminés libérés sous l'action des rayonnements ultraviolets. Ce brevet décrit l'utilisation d'un détecteur à fluorescence pour mesurer le signal émis par les acides aminés aromatiques des kératines. Ce signal serait proportionnel au degré d'altération des kératines irradiées. De même, la demande de brevet JP8271515 décrit un procédé de dérivatisation des fonctions thiols des résidus cystéines des kératines irradiées. Dans ce cas, l'irradiation doit être suffisamment intense pour oxyder les ponts disulfures en acide sulfonique et induire ainsi la libération du motif thiol dosé par fluorescence. Dans cette demande de brevet, la molécule utilisée pour la dérivatisation des motifs thiols est le N-(diméthylamino-4-méthyl-3- coumaryl) maléimide (DACM). Cependant, ce procédé de mesure n'est pas suffisamment sélectif, à cause des interactions importantes entre certains constituants des produits de soin et les réactifs de dosage. Enfin, on peut également citer les méthodes de mesure par microspectroscopie infrarouge à transformée de Fourier. Cette technique mesure l'état d'oxydation des ponts disulfures. En effet, une augmentation de la bande de vibration des liaisons S-O caractéristiques de l'acide cystéique (à 1040 cm-I) est observée lorsque les cheveux sont irradiés au soleil. Toutefois, ces techniques de mesure sont peu sensibles et nécessitent généralement l'équivalent de 30 jours d'irradiation pour qu'il soit possible d'observer des différences significatives de signal entre la mèche de cheveux irradiée et la mèche de référence. De plus, leur mise en oeuvre est le plus souvent délicate et demande parfois de investissements importants en équipement. Le but de l'invention est de proposer un procédé de mesure qui permette une mesure simple et sensible de l'agression que subit la fibre capillaire vis-à-vis des rayonnements ultraviolets. Un autre but de l'invention est de proposer un procédé de mesure précis permettant de quantifier la photoprotection apportée par les produits solaires capillaires. Ainsi, la présente invention concerne un procédé de mesure de la photoprotection apportée aux cheveux par un traitement capillaire, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes: a) on applique un agent de traitement capillaire photoprotecteur sur une mèche de cheveux; 4 2865278 b) on irradie aux ultraviolets la mèche de cheveux photoprotégée obtenue à l'étape a) afin de provoquer l'oxydation des ponts disulfures des résidus cystine de la kératine capillaire en disulfure de monoxyde et éventuellement en disulfure de dioxyde; c) on plonge entièrement la mèche de cheveux irradiée obtenue à l'étape b) dans une solution basique de façon à réaliser une attaque nucléophile par action des ions OHS sur les groupes disulfure de monoxyde, et éventuellement disulfure de dioxyde, de façon à obtenir des ions thiolates; d) on récupère la solution basique obtenue à l'étape c) ; et e) on dose la quantité d'ions thiolates dissous dans la solution basique obtenue à l'étape d). La cystine est un acide aminé, comportant un pont disulfure, formé par l'union de deux molécules de cystéine. Les ponts disulfures des résidus cystine constituent la cible principale du rayonnement UV émis par le soleil. Ces résidus responsables du maintien de la cohésion des filaments de kératines représentent environ entre 15 et 17% des acides aminés constitutifs de ces kératines. Les ponts disulfures peuvent, sous l'action des ultraviolets, être oxydés facilement en sulfure-oxydes. Ces oxydations se font généralement en deux étapes. Lors de la première étape, l'espèce disulfure est oxydée en disulfure de monoxyde puis lors de la deuxième étape le disulfure de monoxyde est oxydé en disulfure de dioxyde. Cette deuxième oxydation est bien plus lente que la première. O R S S R' R S S R' Il R S S R' O O disulfure disulfure de monoxyde disulfure de dioxyde Dans les formules précédentes et suivantes, R représente le groupement de formule: O R1 CH2 R2 dans laquelle R1 et R2 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un ou plusieurs acides aminés issus des fragments kératiniques. Dans les formules précédentes et suivantes, R' représente le groupement de formule: 2865278 o /--, ,.CH2 (5 dans laquelle R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un ou plusieurs acides aminés issus des fragments kératiniques. Ainsi R-S-S-R' représente le résidu cystine de la kératine capillaire de formule: O O R3 R4 R1 R2 R3 La plupart des liaisons S-S de type disulfures ne sont pas suffisamment réactives pour subir des attaques nucléophiles. La polarisation de la liaison S=O dans le disulfure de monoxyde et de la liaison O=S=O dans le disulfure de dioxyde favorise une attaque nucléophile sur l'atome de soufre correspondant. Ainsi, en milieu basique, l'atome de soufre plus électrophile subit l'attaque nucléophile de l'anion hydroxyle. Les ions thiolates R'-S libérés peuvent alors être dosés par simple électrode sélective. Les schémas réactionnels sont les suivants: R S O + HS R' I O O R S 0 + HS R' O R' S + H2O R'-Se représente l'ion thiolate dosé, de formule: O R4SC) R3 dans laquelle R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un ou plusieurs acides aminés issus des fragments kératiniques. Selon une variante avantageuse de l'invention, dans l'étape e), les ions thiolates sont dosés par une méthode potentiométrique à courant nul en utilisant une électrode à membrane R S S R' + 00 O O I I R S S R' + OFF I I O HS R' + OF-p 6 2865278 spécifique des ions thiolates, avantageusement au moyen d'un cristal en sulfure d'argent combiné à une électrode de référence (membrane Ag2S, électrode de référence Ag/Ag+). Selon une autre variante avantageuse de l'invention, dans l'étape e), les ions thiolates sont dosés par des capteurs ampérométriques à potentiel contrôlé spécifiques des ions thiolates. Les capteurs ampérométriques à potentiel contrôlé peuvent être rendus spécifiques des ions thiolates grâce à des modifications de surface. La solution basique de l'étape c) a avantageusement un pH compris entre 11 et 14, encore plus avantageusement de 12,5. La durée de l'étape c) est avantageusement d'au moins 60 minutes à température ambiante. Lors de l'étape b), la mèche est irradiée dans un simulateur solaire, tel que par exemple un simulateur Suntest CPS + (commercialisé par la société ATLAS). Dans le cadre de l'analyse de la photoprotection de produits capillaires destinés au marché européen, la mèche de cheveux est avantageusement soumise lors de l'étape b) à une irradiation correspondant à des valeurs moyennes obtenues pour une journée d'été ensoleillée dans le sud de l'Europe. La mèche de cheveux est donc avantageusement soumise à une irradiation de 100 à 120 J/cm2, dans le domaine de UV, pour un équivalent jour. La mèche de cheveux est irradiée dans un simulateur solaire dont le ratio UVA/UVB est avantageusement compris entre 14 et 20. Le simulateur solaire permet l'irradiation simultanée uniforme de la mèche de cheveux. Les doses délivrées peuvent être contrôlées par un spectroradiomètre. Par exemple, la durée de l'exposition afin d'obtenir l'équivalent d'une journée d'irradiation à 0,46 mW/cm2 en UVB et à 6,53 mW/cm2 en UVA est de 4 heures et 25 minutes. Selon une variante de l'invention, la mèche de cheveux a un poids compris entre 0,5 et 10 g, avantageusement compris entre 1 et 1,5 g. La quantité d'agent de traitement capillaire photoprotecteur appliqué sur la mèche de cheveux à l'étape a) est avantageusement de 45 à 65% en poids, encore plus avantageusement entre 50 et 55% en poids, de la masse de la mèche de cheveux. Une fois que les produits de soin sont appliqués, la mèche de cheveux est à nouveau pesée afin de déterminer la quantité exacte de produit appliquée sur les cheveux. La mèche de cheveux est plongée dans un volume de solution basique tel que la concentration de cheveux soit avantageusement comprise entre 35 et 40 mg/ml de solution basique. Encore plus avantageusement, on a 4 mL de solution basique pour 150 mg de 7 2865278 cheveux. Lorsque la mèche de cheveux a un poids compris entre 1 et 1,5 g, cette mèche est plongée dans un volume de solution basique compris entre 25 et 40 mL. La quantification peut être effectuée par étalonnage externe avec de la cystéine commerciale (fournisseur Sigma). Ainsi, la droite étalon peut par exemple être déterminée à partir de solutions en cystéines de 0,1; 0,5; 1; 5 et 10 mg/ml et en prenant le potentiel de l'électrode en fonction du logarithme de la concentration. L'électrode spécifique répond d'une manière équivalente aux ions R'-S libérés dans la solution basique correspondant aux ions thiolates de la cystéine dans le cas de l'étalonnage et à des fragments de kératine contenant des résidus cystéines au niveau des chaînes latérales dans le cas de l'expérimentation sur la mèche de cheveux. Afin de pouvoir comparer les préparations testées, l'invention propose de les classer selon un pourcentage de pouvoir protecteur de la kératine du cheveu représenté par une valeur comprise entre 0 et 100. Cet indice appelé Keratin Sun Protector Index (KSPI), indice de protection solaire kératinique, se calcule à partir des pentes de la manière suivante: KSPI = (1 - a2/al) x 100 Avec al: pente de la réponse à l'irradiation pour les échantillons capillaires non protégés; a2: pente de la réponse à l'irradiation pour les échantillons protégés. Selon cette expression, un produit très protecteur (a2 0) aura un KSPI de 100 et un 20 produit non efficace (a2 = al) aura un KSPI voisin de 0. Cette méthode, qui ne prend en compte que la pente des réponses, permet de limiter les variations importantes entre les échantillons observées avant irradiation. Toutefois, l'hétérogénéité des échantillons capillaires ainsi que d'autres paramètres expérimentaux (quantité de produit appliqué, étalement) affectent la reproductibilité de la mesure. Aussi, tous les échantillons capillaires doivent provenir de la même origine. L'analyse devant porter sur un minimum de trois essais, la linéarité de la réponse doit être assurée pour que le test soit validé, c'est-à-dire que l'on doit avantageusement avoir des coefficients de détermination, de la régression linéaire, supérieurs à 0,95 (R2>0,95). Le procédé selon l'invention permet de quantifier le pouvoir protecteur de soins capillaires dans la prévention des altérations des cheveux suite à l'irradiation solaire, et ainsi permet d'optimiser la formulation de ces soins par comparaison des formules entre elles. 8 2865278 Par rapport aux techniques connues pour déterminer la dégradation des cheveux après exposition aux rayons solaires, le procédé selon l'invention permet une évaluation des effets du rayonnement sur la cible principale de ceux-ci, à savoir les ponts disulfures des kératines. De plus, ce procédé est une méthode très sensible et facile à mettre en oeuvre, qui ne nécessite pas un investissement dans des appareils coûteux. Enfin, le procédé selon l'invention est un procédé électrochimique de mesure qui permet d'éviter les interférences avec les constituants des produits finis contrairement aux méthodes colorimétriques de dérivatisation. La présente invention sera illustrée par les deux exemples suivants, qui ne sont pas limitatifs. Dans les deux exemples qui suivent, on a utilisé le protocole expérimental suivant. a) préparation de la mèche de cheveux Les cheveux utilisés, préalablement lavés, sont organisés en mèches de 1 à 1,5 g. Afin d'obtenir des résultats représentatifs, on teste 3 mèches de cheveux. Les produits de soin sont appliqués à l'aide d'une brosse à dent pour permettre une répartition plus homogène du traitement protecteur. Les mèches sont à nouveau pesées pour déterminer exactement la quantité de produit appliquée sur les cheveux. Les mèches sont ensuite irradiées dans un simulateur solaire. L'appareil utilisé est un simulateur Suntest CPS + (ATLAS). Les énergies libérées dans les ultraviolets sont de 110J/cm2, ce qui correspond à des valeurs moyennes obtenues pour une journée d'été ensoleillée dans le sud de l'Europe. Le simulateur solaire permet une irradiation uniforme simultanée des trois mèches, à une température ne dépassant pas 30 C. Les doses délivrées sont contrôlées par un spectroradiomètre MSS 2040 (commercialisé par Elektronic GmbH). La durée de l'exposition afin d'obtenir l'équivalent d'une journée d'irradiation à 0,46 mW/cm2 en UVB et à 6,53 mW/cm2 en UVA est de 4 heures et 25 minutes. b) mesure des ions thiolates Chaque mèche de cheveux est placée dans une solution à 0,1 mol/L de soude (4 mL de solution pour 150 mg de cheveux). Après une heure d'agitation modérée à température ambiante, une aliquote de 15 mL de cette solution est ajoutée à 15mL d'une solution à 0,1 mol/L de soude comprenant en outre 4 mol/L d'urée et 12 mol/L de nitrate d'argent. 9 2865278 Cette dilution d'un facteur 2 permet un meilleur trempage de l'électrode et permet de restreindre l'étendue des valeurs mesurées. Les ions thiolates libérés sont détectés au moyen d'une électrode sélective (membrane Ag2S, électrode de référence Ag/Ag+). L'électrode est plongée dans la solution suivant un angle d'environ 30 afin d'éviter l'emprisonnement d'air sous la membrane et les mesures sont lues sur un voltmètre après stabilisation du signal. L'électrode est calibrée en utilisant une série de solutions en cystéines de 0,1; 0,5; 1; 5 et 10 mg/ml. Les mesures sont reportées sur un graphique en prenant le potentiel de l'électrode en fonction du logarithme de la concentration. Les mesures sont effectuées sous agitation modérée et standardisée afin d'éviter une dérive des résultats. Les résultats sont déterminés à la suite de 3 expériences indépendantes consécutives. Exemple de référence: mesure de l'agression solaire sur une mèche de cheveux non protégés: Les mèches de cheveux non protégés ont été irradiées à des doses correspondant à 2, 4 ou 6 jours d'irradiation lors d'une journée d'été ensoleillée dans le sud de l'Europe, soit respectivement 220 J/cm2, 440 J/cm2 et 660 J/cm2. Le tableau I donne les résultats obtenus pour une mèche non protégée et fait apparaître une augmentation proportionnelle du nombre de ponts disulfures rompus en fonction de la durée d'irradiation. La linéarité de la réponse obtenue (R2>0,99) montre que ce test est très adapté au suivi de l'altération des fibres capillaires sous l'effet du rayonnement UV. Mèche de cheveux non protégés 0 jour 2 jours 4 jours 6 jours 5,21 8,60 11,88 15,89 1,28 3,84 4,31 4,06 y = 3,5298x + 1,568; R2 = 0,9979 Tableau I Les valeurs numériques données (moyenne et écart-type) sont exprimées en équivalents cystéines, en mg/mL. Un équivalent de 1 mg/ml de cystéine correspond à 8,2 micromoles Moyenne Ecart-type 2865278 de cystéine dans 1 millilitre de solution. Un équivalent de 1 mg/ml de cystéine correspond à 8,2 micromoles/ml d'ions R'-Se libérés dans la solution basique. Exemple 1: mesure de l'agression solaire sur une mèche de cheveux non protégés ou protégés par une formulation capillaire contenat de l'éthylhexyl méthoxycinnamate: Le tableau II résume les résultats obtenus pour deux préparations capillaires testées, contenant 2,5% et 5% d'éthylhexyl méthoxycinnamate (Parsol MCX, filtre anti-UVB, fourni par Roche Vitamins Incorporation). Non protégé Formule à 2,5% de Formule à 5% de Parsol Parsol MCX MCX 0 2 4 6 0 2 4 6 0 2 4 6 jour jours jours jours jour jours jours jours jour jours jours jours Moyenne 5,21 8,60 11,88 15,89 3,52 6,55 9,09 10,25 4,74 3,38 6,99 8,25 Ecart-type 1,28 3,84 4,31 4,06 1,72 2,15 3,90 4,68 2,00 2,60 3,36 4,32 al = 3,5298; R2 = 0,998 a2 = 2,283; R2 = 0,968 a2 = 1,214; R2 = 0,976 KSPI = 35 KSPI = 66 Tableau II Les valeurs numériques données (moyenne et écart-type) sont exprimées en équivalents cystéines, en mg/mL. Un équivalent de 1 mg/ml cystéine correspond à 8,2 micromoles 15 d'ions R'-S libérés par millilitre de solution basique. Les résultats montrent que le procédé selon l'invention permet une mesure avec une précision satisfaisante de la réponse linéaire de l'électrode à la quantité d'ions thiolates libérés, y compris dans le cas d'application d'une formulation capillaire de traitement. De plus, le procédé selon l'invention permet une mise en évidence directe de l'effet de protection obtenu avec la ou les formulation(s) capillaire(s) testée(s). Enfin, le procédé selon l'invention permet l'obtention, dans le domaine de concentrations utilisées en formulation(s) capillaire(s) de protection, d'une proportionnalité entre la quantité d'éthylhexyl méthoxycinnamate et l'indice de protection défini dans le cadre de la présente invention, KSPI. 2865278 11 Revendications 1. Procédé de mesure de la photoprotection apportée aux cheveux par un traitement capillaire, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes: a) on applique un agent de traitement capillaire photoprotecteur sur une mèche de cheveux; b) on irradie aux ultraviolets la mèche de cheveux photoprotégée obtenue à l'étape a) afin de provoquer l'oxydation des ponts disulfures des résidus cystine de la kératine capillaire en disulfure de monoxyde et éventuellement en disulfure de dioxyde; c) on plonge entièrement la mèche de cheveux irradiée obtenue à l'étape b) dans une solution basique de façon à réaliser une attaque nucléophile par action des ions OH sur les groupes disulfure de monoxyde et éventuellement disulfure de dioxyde de façon à obtenir des ions thiolates; d) on récupère la solution basique obtenue à l'étape c) ; et e) on dose la quantité d'ions sulfures dissous dans la solution basique obtenue à l'étape d). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans l'étape e) les ions thiolates sont dosés par une méthode potentiométrique à courant nul en utilisant une électrode à membrane spécifique des ions thiolates, avantageusement au moyen d'un cristal en sulfure d'argent combiné à une électrode de référence. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans l'étape e) les ions thiolates sont dosés par des capteurs ampérométriques à potentiel contrôlé spécifiques des ions thiolates. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la solution basique de l'étape c) a un pH compris entre 11 et 14, avantageusement de 12,5. 12 2865278 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la mèche de cheveux est soumise lors de l'étape b) à une irradiation de 100 à 120 J/cm2, dans le domaine de UV, pour un équivalent jour. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la mèche de cheveux est irradiée dans un simulateur solaire dont le ratio UVA/UVB est compris entre 14 et 20. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la mèche de cheveux a un poids compris entre 0,5 et 10g, avantageusement entre 1 et 1,5g. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la quantité d'agent de traitement capillaire photoprotecteur appliqué sur la mèche de cheveux à l'étape a) est de 45 à 65% en poids, avantageusement entre 50 et 55% en poids, de la masse de la mèche de cheveux. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la mèche de cheveux est plongée dans un volume de solution basique tel que la concentration de cheveux soit comprise entre 35 et 40 mg/ml de solution basique. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'étape c) est réalisée pendant au moins 60 minutes à température ambiante.