FR 2871379 A1 20051216 FR 0406405 A 20040614 La présente Invention est relative à l'utilisation de certains dérivés polysaccharidiques hautement sulfatés et de faible masse molaire obtenus à partir d'un polysaccharide d'origine bactérienne pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la modulation de l'angiogenèse, utilisable notamment pour accélérer la réparation de l'endothélium vasculaire lors d'accidents thrombotiques et ce avec un risque hémorragique faible. L'héparine, polysaccharide sulfaté extrait de la muqueuse de mammifères, est l'agent anti-thrombotique le plus utilisé dans la prévention et le traitement de la thrombose veineuse. Cependant, au cours des traitements par l'héparine, il peut survenir des effets secondaires tels qu'une réaction allergique ou une complication hémorragique (due à sa forte activité anticoagulante). De plus, l'héparine s'est révélée peu active dans la prévention et le traitement de la thrombose artérielle. A cause des limites d'utilisation thérapeutique de l'héparine, il est important de pouvoir disposer de nouveaux polysaccharides (par exemple fucanes, chondroïtine sulfate fucosylé, exopolysaccharides, etc...), d'origine non mammalienne (pour éviter tout risque potentiel de transmission d'agents non conventionnels), de faible activité anticoagulante (afin de diminuer le risque hémorragique) et efficaces dans la lutte contre la thrombose artérielle. Les objectifs sont de prévenir ou de traiter la thrombose artérielle et ses conséquences. En effet, lors d'une lésion vasculaire artérielle, l'absence d'une monocouche de cellules endothéliales déclenche une agrégation plaquettaire suivie de la formation d'un thrombus. Ce thrombus artériel peut obstruer la lumière du vaisseau sanguin et ainsi empêcher toute oxygénation du tissu en aval susceptible d'entraîner une nécrose. Face à ce risque, il serait intéressant de pouvoir favoriser la réparation de l'endothélium vasculaire et de stimuler la formation d'une circulation vasculaire collatérale, deux événements cellulaires provenant de la stimulation de l'angiogenèse. L'angiogenèse est un processus complexe, physiologiquement régulé, qui aboutit à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau vasculaire pré-existant. C'est lors des situations pathologiques précédemment décrites (lésion de l'endothélium vasculaire ou hypoxie) que la quantité de certains facteurs angiogènes tels que le facteur de croissance fibroblastique basique (FGF-2) ou le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF) devient bien plus importante dans l'environnement péri-vasculaire. En effet, le FGF-2 est principalement libéré après lésion de l'endothélium vasculaire alors que le VEGF est principalement synthétisé par les cellules en situation d'hypoxie. Ces deux facteurs FGF-2 et VEGF déclenchent le processus d'angiogenèse en agissant sur les cellules endothéliales, ce qui se traduit par une stimulation des trois étapes principales de l'angiogenèse: la migration, la prolifération et la différenciation des cellules endothéliales pour former des néo-vaisseaux (Folkman J., Nat. Med., 1995, 1, 27-31; Detillieux K.A. et al., Cardiovasc. Res., 2003, 57, 8-19; Heilmann C. et al., Cardiovasc. Surg., 2002, 10, 570-578; Mc Neil P.L. et al., J. Cell Biol., 1989, 109, 811-822; Heba G. et al., J. Vase. Res., 2001, 38, 288-300 et Marti H.H. et Risau W. et al., Thromb. Haemost., 1999, 82 (Suppl. 1), 44-52). Des études antérieures ont montré que des polysaccharides sulfatés (tels que l'héparine ou le fucane) ou non sulfatés (tels que par exemple l'acide hyaluronique) peuvent, selon les conditions expérimentales, moduler l'angiogenèse induite par un facteur de croissance angiogène. Ces polysaccharides sont riches en groupements chimiques de charge négative (groupements sulfate et carboxylique) leur permettant d'interagir avec un grand nombre de protéines de charge positive dont certaines protéines matricielles (membrane basale, matrice extracellulaire), certains facteurs de la coagulation, facteurs de croissance (tels que par exemple le FGF-2 et le VEGF) et leurs récepteurs de haute affinité qui sont des protéines connues pour intervenir dans l'angiogenèse (Giraux J.L. et al., Eur. J. Cell Biol., 1998, 77, 352-359; Matou S.et al., Thromb. Res., 2002, 106, 213-221; Chabut D. et al., Mol. Pharmacol., 2003, 64, 696-702; Luyt C.E. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003, 305, 24-30). Ces facteurs de croissance appartiennent à la famille des facteurs de croissance pouvant se fixer à l'héparine ("Heparin-Binding Growth Factor" ou HBGF). Ces polysaccharides solubles polyanioniques peuvent moduler l'interaction du facteur angiogène avec ses récepteurs de haute affinité (induisant la transduction du signal) ou de basse affinité (cofacteur des récepteurs de haute affinité), présents à la surface des cellules endothéliales. Ainsi, le polysaccharide peut potentialiser l'effet du facteur angiogène en catalysant la fixation de plusieurs molécules aux récepteurs de haute affinité, ce qui amplifie la dimérisation de ces derniers. Cette dimérisation des récepteurs déclenche la transduction du signal stimulant ainsi l'expression des gènes impliqués dans la migration, la prolifération et la différenciation des cellules endothéliales. Dans ce cas de figure, le polysaccharide sulfaté agit comme cofacteur tout comme le protéoglycane à héparane sulfate membranaire (site de basse affinité) (Rusnati M.et Presta M., Int. J. Clin. Lab. Res., 1996, 26, 15-23; Soker S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 203, 1339-47). A l'inverse, le polysaccharide sulfaté peut interférer dans la fixation du facteur angiogène au protéoglycane à héparane sulfate par compétition de charge empêchant ainsi l'induction d'une réponse cellulaire. L'exopolysaccharide (EPS) dénommé GY 785 est un polysaccharide produit par la bactérie Alteromonas infernus qui est décrit dans le Brevet FR 2 755 142 ainsi que dans l'article de Raguenes G. et al.,. J. Appl. Microbiol., 1997, 82, 422-30). L'EPS GY 785 est constitué d'une population hétérogène de molécules de masse molaire moyenne élevée, c'est- à-dire de masse molaire supérieure à 1.106 g/mol. L'EPS GY 785 est faiblement sulfaté (taux de sulfate inférieur à 10 % en poids) ; il est constitué d'oses neutres (glucose et galactose majoritairement) et d'oses acides (acide glucuronique et acide galacturonique) ; il ne comprend pas d'osamines et de substituants acétate, lactate, pyruvate et succinates; sa teneur en protéine est environ de 4 % en poids (Guezennec J., Ind. Microb. Biotech., 2002, 29, 204-208). L'EPS GY 785 est difficilement utilisable sous sa folme native en thérapeutique, à cause de sa masse molaire élevée et de son hétérogénéité en taille qui entraînent une mauvaise solubilité et qui rendent très difficile la caractérisation des préparations actives et leur obtention reproductible. Lors de travaux précédents, les Inventeurs ont mis au point un procédé de préparation de dérivés sulfatés et de faible masse molaire, comprenant une première étape de sulfatation de l'EPS GY 785 puis une deuxième étape de dépolymérisation de l'EPS GY 785 sur-sulfaté, par hydrolyse acide ou par dépolymérisation radicalaire pour obtenir des dérivés dépolymérisés présentant un taux de sulfate de 20 ou de 40 % en poids (Guezennec J. et al., Carbohydr. Polym., 1998, 37, 19-24). Contrairement au produit natif, les dérivés obtenus après modification chimique de l'EPS GY 785 présentent des activités anticoagulantes (Colliec-Jouault S. et al., Biochim. Biophys. Acta 1528, 2001, 141-151). Les Inventeurs ont également montré que la dépolymérisation radicalaire, obtenue par action du peroxyde d'hydrogène en présence d'acétate de cuivre, conduit en une seule étape à des dérivés de faible masse molaire, généralement inférieure à 25 000 g/mol, de composition constante (faible polydispersité de masse molaire) et avec des rendements bien supérieurs à ceux obtenus avec le procédé de dépolymérisation par hydrolyse acide. La réaction procède par la formation de radicaux libres, issus de la réaction d'un ion métallique (Cu2+ ou Fe3+) avec le peroxyde d'hydrogène (Van Dedem G. et Nielsen J.I., Pharmeuropa, 1990, 3, 202-218). Ces radicaux libres sont très réactifs et susceptibles de dégrader, à pH neutre, les polysaccharides plus efficacement que l'hydrolyse acide. Les Inventeurs ont en particulier précédemment montré que la sulfatation par voie chimique, réalisée d'après les conditions de T. Nishino et T. Nagumo (Carbohydr. Res., 1992, 229, 355-362), conduit à des dérivés présentant une teneur en sulfate supérieure à celle de l'EPS GY 785 natif (20 à 40 % en poids de sulfate contre 10 % en poids de sulfate, respectivement). L'activité anticoagulante augmente en fonction de la teneur en sulfate et cette activité disparaît si la teneur en sulfate est inférieure à 20 % en poids. Les Inventeurs ont maintenant découvert que certains dérivés de polysaccharides sulfatés et dépolymérisés de l'EPS GY 785 (obtenus selon un procédé de préparation comportant une première étape de sulfatation de l'EPS GY 785 natif pour obtenir un dérivé sur-sulfaté de l'EPS GY 785 présentant un taux de sulfate inférieur ou égal à 45 % en poids, puis une deuxième étape de dépolymérisation radicalaire du dérivé de l'EPS GY 785 sur-sulfaté obtenu à l'étape précédente, pour conduire à un dérivé de polysaccharide présentant une masse molaire inférieure ou égale à 25 000 g/mol) ont une activité sur la modulation de l'angiogenèse. Les Inventeurs ont en particulier démontré que de tels dérivés ont une activité sur la modulation de l'angiogenèse, supérieure à celle des dérivés obtenus en mettant en oeuvre un procédé de préparation dans lequel l'étape de dépolymérisation radicalaire est effectuée avant l'étape de sulfatation. La présente Invention a ainsi pour premier objet l'utilisation de dérivés polysaccharidiques sulfatés présentant une masse molaire inférieure ou égale à 25 000 g/mol, un indice de polydispersité inférieur à 2 et un taux de substitution en groupements sulfates inférieur ou égal à 45 %, et de préférence compris entre 30 et % inclusivement, lesdits dérivés étant obtenus selon un procédé de préparation comprenant au moins les étapes suivantes: - une première étape de sulfatation chimique, comprenant: a) une première sous étape de dissolution, dans un solvant anhydre, d'un polysaccharide lyophilisé GY 785 produit par la bactérie marine Alterornonas infernus et b) une deuxième sous étape d'addition, à une température comprise entre 45 et 60 C, d'au moins un agent de sulfatation chimique en une quantité suffisante pour conduire à un polysaccharide sulfaté présentant un taux de substitution en groupements sulfates inférieur ou égal à 45 % en poids par rapport au poids total du polysaccharide GY 785 sulfaté ; - une deuxième étape de dépolymérisation radicalaire du polysaccharide sulfaté obtenu à l'étape précédente pour conduire à un polysaccharidique sulfaté présentant une masse molaire inférieure ou égale à 25 000 g/mol et un indice de polydispersité inférieur à 2, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la modulation de l'angiogenèse. Les dérivés polysaccharidiques sulfatés obtenus selon le procédé utilisé conformément à l'Invention présentent une bonne homogénéité en taille (indice de polydispersité : I(Mp/Mn) Lors de la première étape, l'EPS GY 785 lyophilisé peut être utilisé à l'état natif ou sous forme de sel d'addition avec une base, faible ou forte, pouvant par exemple être choisie parmi la pyridine, la triéthylamine, la tributylamine, l'hydroxyde de tétrabutylammonium et la soude. Selon une forme de réalisation préférée du procédé utilisé conformément à l'Invention, l'EPS GY 785 mis en oeuvre lors de la première étape est de préférence sous la forme d'un sel lyophilisé d'addition avec une base. Ce sel lyophilisé peut par exemple être préparé par élution d'une solution aqueuse d'EPS GY 785 à une concentration comprise entre 1 et 8 mg/ml sur une colonne de résine échangeuse d'ions telle que par exemple celles vendues sous la dénomination Dowex par la société Dow Chemical; l'EPS GY 785 est mis sous forme H+. L'éluat est collecté tant que le pH reste acide puis le pH est ensuite ajusté à environ 6,5 avec la base désirée telle que définie ci-dessus. L'EPS GY 785 sous forme de sel est alors ultrafiltré et lyophilisé. Les solvants anhydres pouvant être utilisés lors de la première étape sont de préférence choisis parmi le diméthylformamide (DMF), le diméthylsulfoxyde (DMSO) et le formamide. La quantité d'EPS GY 785 présente au sein du solvant anhydre peut être comprise entre 1 et 10 mg/ml environ, de préférence entre 1 et 5 mg/ml environ et encore plus préférentiellement cette quantité est de 5 mg/ml environ. Lors de la sous étape a), la dissolution de l'EPS GY 785 dans le solvant anhydre est de préférence réalisée, sous agitation, à température ambiante pendant 1 à 2 heures environ puis à une température comprise entre 40 et 50 C, de préférence à une température d'environ 45 C pendant environ 2 heures sous argon avec du tamis moléculaire. Le ou les agents de sulfatation chimique utilisés lors de la sous étape b) peuvent être additionnés à la solution d'EPS GY 785 sous forme sèche ou sous la forme d'une solution dans le même solvant anhydre que celui utilisé pour dissoudre l'EPS GY 785. Les agents de sulfatation chimique sont de préférence choisis parmi les complexes de pyridine sulfate (libre ou couplée à un polymère), de triéthylamine sulfate, et de triméthylamine sulfate. Lors de la sous étape b), le ou les agents de sulfatation chimique sont ajoutés à la solution d'EPS GY 785 en une quantité pondérale représentant de préférence de 4 à 6 fois environ et encore plus préférentiellement 5 fois environ la masse de l'EPS GY 785 en solution. La réaction de sulfatation chimique est alors de préférence conduite sous agitation pendant une durée comprise entre 2 et 24 heures environ selon le degré de sulfatation souhaité. Lorsque le degré de sulfatation désiré est atteint, la réaction de sulfatation est arrêtée, après refroidissement du milieu réactionnel: soit par addition d'eau dans une proportion de préférence égale à 1/10 du volume réactionnel et ajustement du pH du milieu réactionnel à 9 avec un agent alcalinisant tel que par exemple de la soude (3 M) ; - soit et de préférence, par précipitation en présence d'acétone saturé en chlorure de sodium ou de méthanol puis dissolution du précipité en eau. Selon une forme de réalisation particulière du procédé conforme à l'Invention, la solution d'EPS GY 785 sulfaté est de préférence ensuite dialysée pour éliminer les différents sels puis lyophilisée. La deuxième étape de dépolymérisation par voie radicalaire de l'EPS GY 785 sulfaté obtenu à l'issue de la première étape est de préférence réalisée par addition au mélange réactionnel comprenant l'EPS GY 785 sulfaté en présence d'un catalyseur métallique, d'une solution d'un agent oxydant, de préférence choisi parmi les peroxydes tels que le peroxyde d'hydrogène et les peracides tels que l'acide peracétique et l'acide 3chloro-perbenzoïque; ladite addition étant effectuée en continu et sous agitation pendant une durée comprise entre 30 minutes et 10 heures; le mélange réactionnel étant de préférence maintenu à un pH compris entre 6 et 8 par ajout continu d'un agent alcalinisant tel que la soude, et à une température comprise entre 30 et 70 C environ pendant toute la durée de la réaction dépolymérisation radicalaire. Lors de cette étape, l'agent oxydant est de préférence une solution de peroxyde d'hydrogène (H2O2). Dans ce cas, la solution d'agent oxydant est de préférence ajoutée à un débit compris entre VI/1000 et V 1/1 0 ml/minute, V1 étant le volume du milieu réactionnel contenant le dérivé sulfaté d'EPS GY 785 dans lequel est additionné la solution d'agent oxydant. Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente Invention, la solution d'agent oxydant utilisée lors de la deuxième étape est une solution de peroxyde d'hydrogène qui présente une concentration comprise entre 0,1 % et 0,5 % en poids environ, de préférence de l'ordre de 0,1 à 0,2 % en poids et qui est ajoutée au mélange réactionnel à un débit compris entre V1/50 et V1/500 ml/minutes, de préférence de l'ordre de V1/100 ml/minutes. Lors de cette deuxième étape de dépolymérisation, et selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, l'EPS GY 785 sulfaté est présent dans le mélange réactionnel à une concentration comprise entre environ 2 et 10 mg/ml de mélange réactionnel. Les catalyseurs métalliques utilisables lors de l'étape de dépolymérisation sont de préférence choisis parmi les ions Cu ++ Fe ++ Cr +++ et l'anion Cr2O72- tels que décrits notamment dans la demande de brevet EP-A-O 221 977. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente Invention, le catalyseur métallique est présent dans le mélange réactionnel à une concentration comprise entre 10-3 M et 10-1 M environ, et encore plus préférentiellement à une concentration comprise entre 0,001 et 0,05 M environ. Lorsque la réaction est terminée, le procédé utilisé conformément à l'Invention peut, en outre, comprendre une étape supplémentaire de réduction des dérivés polysaccharidiques obtenus, à l'aide d'un agent réducteur, de façon à stabiliser les chaînes dont les extrémités réductrices sont très réactives et notamment pour éviter une hydrolyse des chaînes par la réaction dite de "peeling". La nature des agents réducteurs utilisables à cet effet n'est pas critique. I1 peut notamment s'agir du borohydrure de sodium. Lorsque les réactions sont terminées, les dérivés polysaccharidiques résultant de la dépolymérisation peuvent être recueillis par toute technique appropriée bien connue de l'homme du métier telle que par exemple par ultrafiltration sur membrane. Le procédé de dépolymérisation radicalaire conforme à l'Invention et tel que décrit ci-dessus permet d'obtenir, en une seule étape, sans fractionnement préparatif par chromatographie d'exclusion stérique, et avec un bon rendement, des dérivés polysaccharidiques sulfatés très homogènes, de masse molaire inférieure ou égale à 25 000 g/mol. Dans le cadre de l'exposé de la présente Invention, on entend par "dérivé homogène", un dérivé qui, en chromatographie d'exclusion stérique haute performance, présente un seul pic principal représentant une population majoritaire de chaînes polysaccharidiques homogènes en taille caractérisée par une Mc = masse chromatographique ou masse au pic proche de 20 000 et un indice de polydispersité (calculé en prenant le rapport Mp/Mn) inférieur à 2 et de préférence compris entre 1,5 et 2. Ainsi que cela est démontré dans les exemples qui suivent, les dérivés ainsi obtenus, comparativement aux dérivés obtenus selon un procédé dans lequel la réaction de dépolymérisation radicalaire précède la réaction de sulfatation chimique, présentent une activité de modulation de l'angiogenèse. Ils permettent en particulier de favoriser la réparation de l'endothélium vasculaire avec un faible effet anticoagulant. La composition pharmaceutiques contenant les dérivés polysaccharidiques obtenus conformément à l'Invention peut en outre être utilisée en association avec un ou plusieurs facteurs de croissance présents au sein de ladite composition pharmaceutique ou présents au sein d'une composition pharmaceutique distincte qui sera alors administrée de façon séparée, c'est-à-dire avant, en même temps ou après l'administration de la composition pharmaceutique renfermant les dérivés polysaccharidiques. De tels facteurs de croissance peuvent en particulier être choisis parmi le FGF, le VEGF, le HGF ("Hepatocyte Growth Factor") et le PGF ("Placenta Growth Factor"). Compte tenu de leurs propriétés de modulation de l'angiogenèse, les dérivés polysaccharidiques tels que définis précédemment peuvent être utilisés pour la préparation d'une composition pharmaceutique à activité pro-angiogène, plus particulièrement destinée à la thérapie cardiovasculaire, ladite composition permettant notamment de favoriser la revascularisation et le remodelage vasculaire et de prévenir et/ou de traiter l'ischémie. Les compositions pharmaceutiques obtenues conformément à l'invention sont préférentiellement destinées à être administrées par voie générale (orale, sous-cutanée ou intra-veineuse). Elles peuvent également être administrées localement, sous formes de gels, crèmes, pommades, lotions, etc... Elles peuvent également être administrées in situ par l'intermédiaire de substrats, de dispositifs résorbables ou non, tels que par exemple, des supports à libération différée, ou des éponges à délitement lent. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, et qui se réfère (i) à un exemple de préparation de dérivés polysaccharidiques sulfatés à partir de l'EPS GY 785 (EPS SDR) produit par la bactérie marine d'origine hydrothermale Alteromonas infernus, en mettant en oeuvre le procédé tel que défini précédemment, (ii) à un exemple concernant l'effet d'un dérivé EPS SDR sur la prolifération des cellules endothéliales induites par le FGF-2, (iii) à un exemple concernant l'effet d'un dérivé EPS SDR sur la prolifération des cellules endothéliales induites par le VEGF, (iv) à un exemple de mise en évidence de l'effet de l'EPS SDR sur la migration des cellules endothéliales induite par le FGF-2 ou le VEGF, (v) à des exemples étudiant l'effet de l'EPS SDR sur la différenciation des cellules endothéliales induite par le FGF-2 ou le VEGF. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1: PREPARATION D'UN DERIVE DE L'EPS GY 785 HAUTEMENT SULFATE ET DE FAIBLE MASSE MOLAIRE 1) Sulfatation chimique de l'EPS GY 785 500 mg de lyophilisat d'EPS GY 785 produit par la bactérie marine d'origine hydrothermale Alteromonas infernus selon le procédé décrit à l'exemple 1 du brevet FR 2 755 142, ont été dissous dans 100 ml de DMF anhydre sous agitation douce (250 tours/min) pendant 2 heures à température ambiante, puis pendant 2 heures à une température de 45 C. Lorsque la dissolution est complète, 2,5 g de complexe de pyridine-S03 vendu sous la référence 84737 par la société Fluka (soit 5 fois la masse du polysaccharide GY 785) ont été ajoutés au milieu réactionnel. La température du mélange a ensuite portée et maintenue à 45 C pendant 2 heures sous agitation. Le mélange réactionnel a été transféré dans un bécher. La réaction a alors été stoppée par addition de 40 ml d'eau, puis le pH a été amené à 9 avec de la soude 3 M. Le mélange réactionnel a alors été dialysé sur un boudin de dialyse présentant un seuil de coupure compris entre 12000 et16 000 Da contre de l'eau du robinet (1 nuit avec de l'eau courante) puis 3 fois pendant 24 heures contre de l'eau Milli-Q. Après dialyse, la solution contenant l'EPS GY 785 sulfaté a été congelée et lyophilisée. Il 2) Dépolymérisation radicalaire et réduction au borohydrure de sodium 400 mg d'EPS GY 785 sulfaté obtenu ci-dessus à l'étape précédente ont été dissous dans 95 ml d'eau. Après dissolution, on a ajouté 2 ml d'une solution catalytique contenant 36 mg d'acétate de cuivre monohydraté (103 M). La température du réacteur est alors portée à 60 C et le pH est ajusté à 7,5 par addition de soude 1 M. Une solution à 0,115 % (v/v) de peroxyde d'hydrogène a alors été ajoutée à un débit de 1 ml par minute, et le pH a été régulé autour de 7,5 par addition de soude 1 M. La réaction a été arrêtée au bout de 1 heure. La réduction est réalisée en fin de dépolymérisation par addition dans le réacteur de borohydrure de sodium (270 mg de Na BH4 dissous dans 10 ml d'eau). La réduction se déroule sous agitation pendant 2 heures à température ambiante. La réduction est stoppée par addition d'acide acétique 10 N qui permet d'éliminer l'excès de Na BH4 restant sous forme de dégagement gazeux d'hydrogène. La solution a ensuite été filtrée sur Büchner avec des filtres en microfibres de verre (porosité 3 m). La solution filtrée a été éluée sur une colonne CHELEX 20 (BIORAD) afin d'éliminer le cuivre résiduel. La solution décontaminée est ensuite ultrafiltrée sur cassette (seuil de coupure 1 000 Da) puis lyophilisée. 3) Caractérisation du dérivé sulfaté et dépolymérisé de l'EPS GY 20 785 (EPS SDR) ; comparaison avec l'EPS GY 785 natif Les masses molaires (Mc: Masse molaire chromatographique déterminée au sommet du pic; Mp et Mn) et la polydispersité (I = Mp/Mn) du dérivé sulfaté et dépolymérisé de l'EPS GY 785 obtenu ci-dessus ont été déterminées par chromatographie d'exclusion stérique haute performance (HPSEC) sur une chaîne Kontron, dans l'acétate d'ammonium aqueux 0,1 M à un débit de 0,5 ml/min en utilisant une colonne Superdex 200 (PHARMACIA). La colonne a été calibrée avec des étalons polysaccharidiques suivants: pullulanes: 853 000-5 800 g/mol (Polymer Laboratories, Interchim), dextrane: 1 500 g/mol; mélézitose: 522 g/mol (FLUKA), sucrose: 342 g/mol; glucose: 180 g/mol (SIGMA). Les résultats sont analysés en utilisant le logiciel Aramis (JMBS Développement, Le Fontanil, France). La teneur en oses neutres a été déterminée par la méthode de Tillmans et Philippi (Analyt. Chem., 1929, 28, 350-) modifiée par Rimington (Biochem. J., 1931, 25, 1062-1071). La teneur en acides uroniques a été établie en utilisant une modification de la méthode m-hydroxydiphényle-H2SO4 (Filisetti-Cozzi et Carpitta, Anal. Biochem., 1991, 197, 157-162) et en utilisant l'acide glucuronique comme étalon. L'interférence d'hexoses neutres a été évitée en utilisant du sulfamate de potassium et en procédant à des contrôles comprenant tous les réactifs à l'exception du m-hydroxydiphényle. Les teneurs en oses neutres et acides ont été déterminées par chromatographie en phase gazeuse. L'analyse des résidus glycosidiques sous forme de dérivés triméthylsilylés a été réalisée selon la méthode de Kamerling et al. (Biochem. J., 1975, 151, 491-495) et modifiée par Montreuil et al. (Glycoproteins In: Carbohydrate analysis, a practical approach, 1986, Chaplin M.F. and Kennedy J.F. (eds), IRL Press, Oxford, 143-204). Les contenus en sulfates totaux (libres plus liés au dérivé sulfaté et dépolymérisé de l'EPS GY 785 et de l'EPS GY 785 natif) ont été déterminés par analyse élémentaire du soufre (S %), et en appliquant la relation suivante: pourcentage de groupes sulfate (%) = 3,22 x S %. Le taux de sulfates libres est quantifié par chromatographie échangeuse d'ions sur un système Dionex DX-500 relié à un conductimètre et suivant la méthode décrite par le fabricant Dionex. Le résultat obtenu permet de calculer le taux de sulfates réellement liés au dérivé d'EPS qui est égal au taux de sulfate totaux (obtenu par analyse élémentaire) mois le taux de sulfates libres (obtenu par chromatographie échangeuse d'ions). La spectroscopie Infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) a étéréalisée sur un Vector 22 possédant une résolution de 4 cm-'. Les spectres infrarouges des polysaccharides ont été réalisés en pastilles de KBr (2 mg de polysaccharide sont mélangés à 200 mg de KBr sec), tous les spectres infrarouges ont été enregistrés entre 4000 et 400 cm-I. Les activités anticoagulantes du dérivé sulfaté et dépolymérisé de l'EPS GY 785 et de l'EPS GY 785 natif ont été déterminées par mesure du Temps de Céphaline Activée (TCA) en utilisant le kit TCA (Organon Teknika). Pour ce faire, pl d'un tampon de contrôle, ou de dilutions du dérivé sulfaté et dépolymérisé de l'EPS GY 785 ou de l'EPS GY 785 natif (0 à 100 pg/ml), sont mélangés avec 100 id de plasma pauvre en plaquettes (PPP) et 100 l de réactif TCA. L'ensemble est incubé pendant 3 minutes à 37 C. Le temps de formation du caillot est mesuré après 5 l'addition de 100 pl d'une solution de CaCl2 à 25 mM. 4) Résultats Les résultats obtenus ont été rassemblés dans le tableau I ci-après: TABLEAU 1 Caractéristiques Dérivé sulfaté et EPS GY 785 natif dépolymérisé de l'EPS GY 785 (EPS SDR) Rendement (%) 70 - Oses totaux (g/100 g) 1 31 58 Oses acides (g/100 g)' 20 29 Rhamnose 2 1, 7 2,7 Mannose 2 1,6 2,8 Fucose 2 0,5 1,3 Xylose 0,2 0,3 Galactose 2 7, 3 12,7 Glucose2 9,4 17 Acide Galacturonique 2 1,5 3,2 Acide Glucuronique 2 2,3 6 -SO3Na total (g/100 g) 3 40 10 SO3Nalié(g/100g)4 37 - Mc (g/mol) 22430 >106 Mp (g/mol) 20240 - Mn (g/mol) 11240 - I (Mp/Mn) 1,8 - Activité anticoagulante5 10-20 inactif Dosages colorimétriques 2: Dosage par chromatographie en phase gazeuse 3 Dosage par analyse élémentaire 4' Dosage par chromatographie échangeuse d'ions 5: Quantité de polysaccharide en ggml de plasma humain nécessaire pour doubler le temps de coagulation contrôle, TCA (temps contrôle = 40 secondes). Ces résultats montrent que le dérivé sulfaté et dépolymérisé de l'EPS GY 785 est obtenu avec un bon rendement et que les teneurs en oses sont proportionnellement équivalentes entre le dérivé sulfaté et l'EPS natif naturellement peu sulfaté. La teneur en soufre du produit sur-sulfaté est 4 fois supérieure à celle du produit natif. Par dépolymérisation radicalaire, on obtient en 1 heure un dérivé de masse molaire (Mc et Mp) égale à 20 000 g/mol, homogène en taille (1 106 g/mol). Seul le dérivé sulfaté et dépolymérisé de l'EPS GY 785 est anticoagulant; il double le temps de coagulation contrôle pour une concentration proche de 15 g/ml. A titre comparatif, dans les mêmes conditions il faut 4 11g/ml d'héparine de bas poids moléculaire et 1,5 g/ml d'héparine non fractionnée pour obtenir ce doublement. Ainsi le dérivé sulfaté et dépolymérisé de l'EPS GY 785 est respectivement 4 et 10 fois moins anticoagulant qu'une héparine de bas moléculaire ou qu'une héparine non fractionnée. EXEMPLE 2: EFFET DU DERIVE DE L'EPS GY 785 HAUTEMENT SULFATE ET DE FAIBLE MASSE MOLAIRE SUR LA PROLIFERATION DES CELLULES ENDOTHELIALES INDUITE PAR LE FGF-2 L'effet du dérivé sulfaté et de faible masse molaire de l'EPS GY 785 (EPS SDR) conforme à l'Invention et tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1 sur la prolifération des cellules endothéliales extraites de la veine de cordon ombilical humain (HUVEC) a été comparé à celui du dérivé natif dépolymérisé (EPS DR) ainsi qu'à celui d'un dérivé dépolymérisé et sulfaté de l'EPS GY 785 (EPS DRS) ne faisant pas partie de l'Invention, c'est-à-dire ayant été obtenu selon un procédé de préparation comprenant une première étape de dépolymérisation radicalaire et une seconde étape de sulfatation chimique. a) Préparation de l'EPS DR et de l'EPS DRS Ces dérivés ont été préparés à partir de lyophilisat d'EPS GY 785 produit par la bactérie marine Alteromonas infernus selon le procédé décrit à l'exemple 1 du brevet FR 2 755 142. L'EPS DR a été préparé selon un procédé ne mettant en oeuvre que l'étape de dépolymérisation radicalaire telle que décrite ci-dessus au paragraphe 2) de l'exemple 1. L'EPS DRS a été préparé selon un procédé comportant une première étape de dépolymérisation radicalaire selon le protocole décrit ci-dessus au paragraphe 2) de l'exemple puis une seconde étape de sulfatation chimique selon le protocole décrit ci-dessus au paragraphe 1) de l'exemple 1. Les caractéristiques des dérivés EPS DR et EPS DRS ont été déterminées selon les méthodes décrites ci-dessus à l'exemple 1 et sont résumées dans le Tableau II ci-après: TABLEAU II Caractéristiques EPS DR EPS DRS Oses totaux (g/100 g) ' 51 nd Oses acides (g/100 g) ' 38 nd -SO3Na total (g/100 g) 2 10 42 Mc (g/mol) 7800 13000 Mp (g/mol) 17300 23600 Mn (g/mol) 6000 8800 I (Mp/Mn) 2,8 2,7 Activité anticoagulante 3 inactif 7 : Dosages colorimétriques 2: Dosage par analyse élémentaire 3 Quantité de polysaccharide en g/ml de plasma humain nécessaire pour doubler le temps de coagulation contrôle, TCA (temps contrôle = 40 secondes) ; nd: non déterminé Comme le dérivé EPS SDR, le dérivé EPS DRS est fortement sulfaté (> 40 %). En revanche l'analyse HPSEC indique que le dérivé EPS DRS est moins homogène en taille que le dérivé EPS SDR avec une polydispersité de 2,7 contre 1,8. Les chaînes polysaccharidiques composant le dérivé EPS DRS sont majoritairement plus petites (Mc = 13000) que celles du dérivé EPS SDR (Mc = 22430). L'activité anticoagulante du dérivé EPS SDR est deux fois moins importante que celle du dérivé EPS DRS, cependant ces deux dérivés présentent des activités anticoagulantes inférieures à celles des héparines. b) Protocole Les cellules HUVEC sont ensemencées dans des puits recouverts de gélatine à 0,5 %. Après 24 heures d'incubation, le milieu de culture est changé : milieu contrôle seul (milieux de culture M199 (1 volume) + RPMI 1640 (1 volume) vendus par la société Gibco-BRL, Cergy- Pontoise, France, supplémenté par 5 % de sérum de veau foetal vendu par la société ATGC, Noisy-le-Grand, France) ou enrichi en FGF-2 à 5 ng/ml (vendu par la société AbCys SA, Paris, France) ou en dérivés d'EPS seuls (10 pg/ml) ou en FGF-2 à 5 ng/ml) + dérivés d'EPS (1 ou 10 g/ml). Le milieu est renouvelé tous les 2 jours. Après 3 jours de traitement, les cellules sont détachées et comptées à l'aide d'une cellule de Malassez. c) Résultats Les résultats sont présentés dans le Tableau III ci-après: TABLEAU III Facteurs de croissance et/ou Augmentation de la prolifération polysaccharides cellulaire (en % par rapport au FGF-2) Contrôle (sans FGF2) 66,8 5,3 **** FGF-2 100 FGF-2 + EPS SDR (1 g/ml) 107,3 1,4 FGF-2 + EPS SDR (10 gg/ml) 120,9 5,2 * FGF-2 + EPS DRS (1 g/ml) 6 109,1 3,0 FGF-2 + EPS DRS (10 g/ml) 6 110,3 5,6 FGF-2 + EPS DR (1 g/ml) 6 89,6 2,9 FGF-2+EPSDR(10pg/ml)6 112,8 6,9 6: polysaccharides ne faisant pas partie de l'Invention * : p Ces résultats montrent que, comparativement au contrôle (absence de facteur de croissance et de polysaccharide) et à l'ajout de FGF-2 seul, on observe une augmentation significative de la prolifération cellulaire en présence de FGF-2 et d'EPS SDR à la concentration de 10 gg/ml. EXEMPLE 3: EFFET DU DERIVE DE L'EPS GY 785 HAUTEMENT SULFATE ET DE FAIBLE MASSE MOLAIRE SUR LA PROLIFERATION 5 DES CELLULES ENDOTHELIALES INDUITE PAR LE VEGF L'effet du dérivé de l'EPS GY 785 tel que synthétisé cidessus à l'exemple 1 sur la prolifération des cellules endothéliales induite par le VEGF (vendu par la société AbCys SA, Paris, France) a également été étudié selon le même protocole que celui utilisé ci-dessus à l'exemple 2. Dans cet exemple, le VEGF a été utilisé à une concentration de 10 ng/ml et les cellules HUVEC ont été détachées et comptées après 6 jours de traitement. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau IV ci-après: TABLEAU IV ** : p Dans le Tableau IV ci-dessus, chaque valeur représente la moyenne l'écart type de 4 déterminations. Pour chaque expérience, les résultats sont exprimés en %, 100 % correspondant aux cellules traitées par le VEGF seul à 10 ng/ml. EXEMPLE 4: MISE EN EVIDENCE DE L'EFFET DE L'EPS SDR SUR LA MIGRATION DES CELLULES ENDOTHELIALES INDUITE PAR LE FGF-2 OU LE VEGF 1) Protocole Dans cet exemple le dérivé EPS SDR tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1 a été utilisé. Les facteurs de croissance angiogènes tels que le FGF-2 et le VEGF exercent un effet chimio-attracteur sur les cellules endothéliales, ce qui déclenche leur migration. Un système qui met en évidence la migration orientée des cellules Facteurs de croissance ou polysaccharide Augmentation de la prolifération cellulaire (en % par rapport au VEGF) Contrôle (sans VEGF) 59,5 + 4,9 **** VEGF 100 VEGF + EPS SDR (10 pg/ml) 137,6 + 10,7 ** endothéliales induite par le facteur angiogène a été utilisé par les Inventeurs. Il s'agit du système de la chambre de Boyden. Ce système comprend deux compartiments: une chambre supérieure ou insert contenant un milieu de culture (milieu de culture identique à celui qui a été décrit en b) de l'exemple 2 ci-dessus) pauvre en facteurs angiogènes (FGF-2: 1 ng/ml; et VEGF: 1 ng/ml) et une chambre inférieure ou puits contenant un milieu de culture identique à celui de la chambre supérieure mais riche en facteurs angiogènes (FGF-2: 10 ng/ml; et VEGF: 10 ng/ml), ces deux chambres étant séparées par une membrane poreuse. Des cellules endothéliales sont déposées sur la face supérieure de membrane poreuse séparant les deux chambres. Sous l'effet du gradient de concentrations en facteur angiogène ainsi créé entre les deux compartiments, les cellules endothéliales sont attirées vers le compartiment le plus concentré en facteur angiogène (chambre inférieure). Ajoutés ou non dans les deux compartiments de la chambre de Boyden, l'effet du dérivé EPS SDR à 10 gg/ml, sur la migration orientée des cellules endothéliales, a été évalué. Grâce à cette migration orientée et après 6 heures d'incubation, une partie des cellules est localisée sur la face inférieure de la membrane. Chaque condition a été testée 3 fois en "duplicata" à chaque fois. Seules les cellules qui ont migré (localisées sur la face inférieure) sont fixées et colorées en vue d'un comptage au microscope optique. 2) Résultats En présence de facteurs de croissance seuls (FGF-2 ou VEGF), c'est-à-dire sans dérivé d'EPS SDR, la migration des cellules est augmentée significativement de 40 % (p EXEMPLE 5: EFFET DE L'EPS SDR SUR LA DIFFERENCIATION DES CELLULES ENDOTHELIALES INDUITE PAR LE FGF-2 COMPARAISON AVEC L'EPS DR ET L'EPS DRS Dans cet exemple, on a utilisé l'EPS SDR tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1, ainsi que l'EPS DRS et l'EPS DR tels que préparés ci-dessus à l'exemple 2. 1) Protocoles a) Angiogenèse in vitro sur Matrigel A partir d'un modèle d'angiogenèse in vitro, il a été montré que le fucane (polysaccharide sulfaté d'algue brune), contrairement à l'héparine non fractionnée, potentialise l'effet angiogène du FGF-2 sur des cellules endothéliales humaines de macro-vaisseaux (Matou et al., 2002, précité). Le même système expérimental que celui utilisé dans l'article de Matou et al. a été utilisé dans cet exemple pour l'étude de l'effet des EPS vis-àvis du FGF-2. Ce système consiste, dans un premier temps, à traiter des cellules endothéliales HUVEC avec le FGF-2, en présence du dérivé d'EPS (EPS SDR, EPS DR ou EPS DRS), pendant 72 heures. Pour cela, les cellules sont ensemencées dans des puits recouverts de gélatine à 0,5 %. La concentration de FGF-2 utilisée est de 5 ng/ml, concentration la plus utilisée dans les modèles in vitro d'angiogenèse et celle des EPS est de 10 gg/ml. Puis, les cellules ainsi traitées sont détachées par du Versène (Gibco) et de la collagénase à 0,01 %, et déposées (en l'absence de polysaccharides et/ou du facteur angiogène) sur une membrane basale reconstituée appelée Matrigel (vendue par la société Becton Dickinson, Bedford, MA, USA) ; ce système permet d'évaluer l'effet de l'EPS testé sur la différenciation des cellules endothéliales induite par le FGF-2. Au contact de cette membrane basale, les cellules endothéliales vont (ou non) s'organiser en structure tubulaire, selon leur degré de différenciation. Après 18 heures d'incubation à une température de 37 C, les cellules sont fixées à la glutaraldéhyde puis colorées au Giemsa. La longueur des tubes vasculaires formés est quantifiée par analyse d'image grâce à un logiciel de mesure (Mesurim fourni par I'Université d'Amiens, http://www.ac-amiens.fr). Pour chaque puits, une numérisation de 5 champs (4 quadrants et le centre) est effectuée. b) Sur-expression des sous-unités d'intégrine a6 Il a été montré antérieurement que l'effet d'un polysaccharide sulfaté (famille des fucanes) sur la différenciation des HUVEC s'accompagnait de la surexpression de la sous-unité d'intégrine a6 (Matou et al, 2002, précité). La sur-expression de la sous-unité d'intégrine 6 a été quantifiée à la surface des cellules endothéliales HUVEC cultivées sur gélatine en l'absence ou en présence de FGF-2 et avec ou sans dérivé EPS SDR, et détachées comme décrit ci-dessus. La quantification a été faite par cytométrie de flux. Les cellules ont été incubées pendant 30 minutes à une température de 4 C avec l'anticorps anti-a6 (vendu par la société BD Biosciences & Pharmingen, San Diego, CA, USA sous la référence 555736). Puis les cellules ont été analysées par immunofluorescence sur un cytomètre de flux FACSCalibur (BD Biosciences). 2) Résultats Les résultats obtenus sont reportés dans le Tableau V ciaprès: TABLEAU V Facteurs de croissance et/ou Différenciation cellulaire induite par le polysaccharides FGF-2 (en % par rapport au FGF-2) Contrôle (sans FGF-2) Aucun tube formé FGF-2 100 FGF-2 + EPS SDR (10 gg/ml) 156,2 4,1 ** FGF-2 + EPS DRS (10 g/ml) 6 80,0 34,9 FGF-2 + EPS DR (10 gg/ml) 6 109,6 13,2 : Dérivé ne faisant pas partie de l'Invention ** : p Chaque valeur représente la moyenne l'écart type de 3 déterminations. Ces résultats montrent qu'en l'absence de facteur de croissance et de 25 dérivés d'EPS (contrôle), les cellules ne forment pas de tubes vasculaires après 18 heures sur MatrigelO. En présence de FGF-2 seul, les cellules s'organisent en tubes vasculaires pour former un réseau tridimensionnel vasculaire de type capillaire. Le FGF-2 et le dérivé EPS SDR ajoutés conjointement à la culture cellulaire permettent d'augmenter significativement la densité du réseau. En effet par addition d'un dérivé polysaccharidique obtenu conformément au procédé tel qu'utilisé selon la présente invention aux cellules traitées au FGF-2, la Iongueur totale des structures tubulaires est significativement augmentée de 56 % (p A titre comparatif, aucune augmentation significative de la formation des tubes vasculaires induite par le FGF-2 n'a été obtenue avec les dérivés EPS DR et EPS DRS obtenus selon des procédés ne faisant pas partie de l'Invention. En ce qui concerne l'expression des sous-unités d'intégrine a6, seul le dérivé d'EPS SDR obtenu selon le procédé mis en oeuvre selon l'Invention a été testé. Le traitement des cellules avec le FGF-2 seul induit une surexpression significative (p L'ensemble de ces résultats montre que seul le dérivé d'EPS SDR obtenu selon le procédé de préparation utilisé conformément à l'Invention, c'est à dire dans lequel l'étape de sulfatation chimique précède l'étape de dépolymérisation radicalaire, potentialise l'effet angiogène du FGF-2 de façon significative et reproductible. EXEMPLE 6: EFFET DE L'EPS SDR SUR LA DIFFERENCIATION DES CELLULES ENDOTHELIALES INDUITE PAR LE VEGF 1) Protocoles a) Angiogenèse in vitro sur Matrigel Le VEGF, autre facteur angiogène également très important, est connu pour être plus spécifique des cellules endothéliales que le FGF-2. Le système d'étude mis en place pour évaluer l'effet de FGF-2 sur la différenciation dés cellules endothéliales sur Matrigel et tel que décrit ci-dessus à l'exemple 5 ne permet pas d'observer une formation de tubes vasculaires en présence de VEGF. Le changement de support protéique a donc été envisagé et du collagène de type I (extrait de la queue de rat, vendu par la société Biogenesis, Poole, UK) a été choisi pour remplacer la gélatine du système décrit dans l'exemple 5. Dès le lendemain de l'ensemencement des cellules HUVEC, le milieu de culture est changé par du milieu enrichi ou non en VEGF (10 ng/ml) avec ou sans TEPS SDR à raison de 10 g/ml). Après 6 jours de ce traitement, Ies cellules sont détachées par du Versène (Gibco) et de la collagénase à 0,1 % puis déposées sur Matrige1 . Les structures tubulaires sont observées comme décrit dans l'exemple 5 ci-dessus. b) Sur-expression des sous-unités d'intégrine a6 Une quantification de la sous-unité d'intégrine a6 a été effectuée par cytométrie en flux comme décrit ci-dessus dans l'exemple 5. 2) Résultats Sur Matrige1 , les cellules non traitées au VEGF en présence ou non de dérivé d'EPS SDR ne forment pas de structure tubulaire. En présence de VEGF seul, les cellules forment un réseau tridimensionnel vasculaire partiel. L'ajout du dérivé EPS SDR au VEGF augmente la densité de ce réseau. Le traitement des cellules par le VEGF augmente significativement l'expression de la sous-unité d'intégrine a6 d'un facteur 2 (p L'ensemble de ces résultats montre que le dérivé EPS SDR obtenu selon un procédé de préparation dans lequel l'étape de sulfatation précède l'étape de dépolymérisation peut être utilisé pour la préparation d'un médicament destiné à moduler l'angiogenèse. REVENDICATIONS 1. Utilisation de dérivés polysaccharidiques sulfatés présentant une masse molaire inférieure ou égale à 25 000 g/mol, un indice de polydispersité inférieur à 2 et un taux de substitution en groupements sulfate inférieur ou égal à 45 %, lesdits dérivés étant obtenus selon un procédé de préparation comprenant au moins les étapes suivantes: - une première étape de sulfatation chimique, comprenant: a) une première sous étape de dissolution, dans un solvant anhydre, d'un polysaccharide lyophilisé GY 785 produit par la bactérie marine Alteromonas infernus et b) une deuxième sous étape d'addition, à une température comprise entre 45 et 60 C, d'au moins un agent de sulfatation chimique en une quantité suffisante pour conduire à des dérivés polysaccharidiques sulfatés présentant un taux de substitution en groupements sulfates inférieur ou égal 45 % en poids par rapport au poids total du polysaccharide GY 785 sulfaté ; - une deuxième étape de dépolymérisation radicalaire du polysaccharide sulfaté obtenu à l'étape précédente pour conduire à un polysaccharide sulfaté présentant une masse molaire inférieure ou égale à 25 000 g/mol et un indice de polydispersité inférieur à 2, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la modulation de l'angiogenèse. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que lors de la première étape, l'EPS GY 785 lyophilisé est utilisé à l'état natif ou sous forme de sel d'addition avec une base. 3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée par le fait que l'EPS GY 785 lyophilisé est utilisé sous la forme d'un sel d'addition avec une base forte ou faible choisie parmi la pyridine, la triéthylamine, la tributylamine, l'hydroxyde de tétrabutylammonium et la soude. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que le solvant anhydre est choisi parmi le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le formamide. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la quantité d'EPS GY785 présente au sein du solvant anhydre est comprise entre 1 et 10 mg/ml. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée par le fait que la quantité d'EPS GY785 présente au sein du solvant anhydre est comprise entre 1 et 5 mg/ml. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que lors de la sous étape a), la dissolution de l'EPS GY 785 dans le solvant anhydre est réalisée, sous agitation, à température ambiante pendant 1 à 2 heures puis à une température comprise entre 40 et 50 C, pendant 2 heures sous argon avec du tamis moléculaire. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que le ou les agents de sulfatation chimique utilisés lors de la sous étape b) sont choisis parmi les complexes de pyridine sulfate, de triéthylamine sulfate, et de triméthylamine sulfate. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que lors de la sous étape b), le ou les agents de sulfatation chimique sont ajoutés à la solution d'EPS GY 785 en une quantité pondérale représentant de 4 à 6 fois la masse de l'EPS GY 785 en solution. 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la réaction de sulfatation chimique est conduite sous agitation pendant une durée comprise entre 2 et 24 heures. 11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la réaction de sulfatation chimique est arrêtée, après refroidissement du milieu réactionnel: - soit par addition d'eau dans une proportion égale à 1/10 du volume réactionnel et ajustement du pH du milieu réactionnel à 9 avec un agent alcalinisant; - soit par précipitation en présence d'acétone saturé en chlorure de sodium ou de méthanol puis dissolution du précipité en eau. 12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la deuxième étape de dépolymérisation radicalaire est réalisée par addition au mélange réactionnel comprenant l'EPS GY 785 sulfaté en présence d'un catalyseur métallique, d'une solution d'un agent oxydant; ladite addition étant effectuée en continu et sous agitation pendant une durée comprise entre 30 minutes à I 0 heures. 13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée par le fait que le mélange réactionnel est maintenu à un pH compris entre 6 et 8 par ajout continu d'un agent alcalinisant, et à une température comprise entre 30 et 70 C pendant toute la durée de la réaction de dépolymérisation radicalaire. 14. Utilisation selon la revendication 12 ou 13, caractérisée par le fait que l'agent oxydant est choisi parmi les peroxydes et les peracides. 15. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée par le fait que l'agent oxydant est une solution de peroxyde d'hydrogène qui est ajoutée à un débit compris entre V1/1000 et V 1/1 0 ml/minute, VI étant le volume du milieu réactionnel contenant le dérivé sulfaté d'EPS GY 785 dans lequel est additionné la solution de peroxyde d'hydrogène. 16. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée par le fait que la solution d'agent oxydant utilisée Iors de la deuxième étape est une solution de peroxyde d'hydrogène qui présente une concentration comprise entre 0,1 % et 0,5 % en poids et qui est ajoutée au mélange réactionnel à un débit compris entre V1/50 et V1/500 ml/minutes. 17. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que lors de la deuxième étape de dépolymérisation, l'EPS GY 785 sulfaté est présent dans le mélange réactionnel à une concentration comprise entre 2 et 10 mg/ml de mélange réactionnel. 18. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, caractérisée par le fait que les catalyseurs métalliques utilisables lors de l'étape de dépolymérisation sont de préférence choisis parmi les ions Cu ++, Fe ++, Cr +++ et l'anion Cr2O72-. 19. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 12 à 18, caractérisée par le fait que le catalyseur métallique est présent dans le mélange réactionnel à une concentration comprise entre 10-3 M et 10-1 M. 20. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que le procédé de préparation comprend une étape supplémentaire de réduction des dérivés polysaccharidiques obtenus à l'aide d'un agent réducteur. 21. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la composition pharmaceutique est utilisée en association avec un ou plusieurs facteurs de croissance. 22. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la composition pharmaceutique présente une activité pro-angiogène et est destinée à la thérapie cardio-vasculaire. 23. Utilisation selon la revendication 22, caractérisée par le fait que ladite composition pharmaceutique est destinée à prévenir et/ou à traiter l'ischémie.