FR 2867384 A1 20050916 FR 0402633 A 20040315 La présente invention concerne des compositions cosmétiques ou dermatologiques à activité dépigmentante. L'invention vise plus particulièrement le domaine des compositions destinées à la dépigmentation de la peau ou à l'éclaircissement du teint. La présente invention découle de la découverte faite par les inventeurs de la remarquable activité mélanolytique d'un microorganisme fongique, le champignon Sporotrichum pruinosum. Ce champignon s'est avéré en outre cultivable de manière particulièrement rapide et à l'échelle industrielle. Il a une aptitude particulièrement marquée à la dégradation de la mélanine, et tout particulièrement de la mélanine humaine. La mélanine, pigment naturel de la peau produit dans les mélanocytes, joue un rôle important au niveau de la photoprotection 15 cutanée. Il arrive aussi que la mélanine soit responsable, dans certains cas d'hyperpigmentation, de taches cutanées. Ces manifestations cutanées donnent à la peau un aspect inesthétique, mais peuvent également revêtir un caractère pathologique, ce qui nécessite alors un traitement thérapeutique. Par ailleurs, il arrive que certaines personnes cherchent des préparations qui ont pour effet de diminuer le taux naturel de mélanine dans le but d'éclaircir leur peau. Divers agents dépigmentants comme notamment l'acide kojique, l'acide azélaïque, et leurs dérivés sont bien connus pour remédier à ces manifestations cutanées mais ces derniers peuvent présenter des effets secondaires également bien connus liés à une certaine toxicité. En général, l'action de ces composés permet d'inhiber la synthèse de la mélanine en intervenant au niveau de son métabolisme. 2 2867384 Une autre approche permettant, elle aussi, de modifier la pigmentation de la peau consiste à agir directement sur la mélanine en la dégradant. C'est une voie de ce type qui a été empruntée par les inventeurs dans la présente invention. Ainsi, la présente invention concerne des compositions cosmétiques ou dermatologiques à activité dépigmentante ainsi que leurs utilisations dans le domaine de la cosmétique et de la dermatologie, notamment pour dépigmenter la peau ou éclaircir le teint. Plus précisément, selon un premier aspect, l'invention concerne une composition cosmétique ou dermatologique, notamment destinée à la dépigmentation de la peau ou à l'éclaircissement du teint, caractérisée en ce qu'elle contient, à titre de principe actif à activité dépigmentante, un extrait du surnageant de culture en milieu liquide du champignon Sporotrichum pruinosum, ledit extrait étant incorporé dans un véhicule cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable, compatible avec une application topique sur la peau. Par ailleurs, une souche particulièrement active de l'espèce Sporotrichum pruinosum a fait l'objet d'un dépôt le 17 février 2003 dans la collection de l'Institut Pasteur. Elle porte le n CNCCM 1-2981. C'est cette souche qui est utilisée dans les exemples figurant ci-après. Les milieux utilisés pour la préparation des extraits de l'invention sont des milieux de culture liquides classiques de champignons microscopiques selon des méthodes connues de l'homme de l'art. Ces milieux contiennent en particulier différents éléments classiquement utilisés dans des milieux de culture de champignons. Ils contiennent, de préférence, au moins un cation choisi dans le groupe constitué du magnésium, du calcium, du zinc, du manganèse et du cuivre. Le milieu de culture contient, de préférence, au moins un des cations précités à une concentration comprise entre 0,1 mmol/L et 1,2 mmol/L. D'une façon générale, l'extrait de surnageant est obtenu dans 5 un procédé comprenant les étapes de: - culture du champignon Sporotrichum pruinosum, dans un milieu de culture liquide, - récupération du surnageant de culture, par filtration, - traitement dudit surnageant consistant à le purifier en vue 10 d'améliorer son activité mélanolytique. Il est apparu que le filtrat obtenu par filtration du surnageant de culture contenait, entre autres, des produits de type polysaccharide qui ne constituent pas des produits à activité mélanolytique. Même si ces polysaccharides ne sont pas particulièrement gênants pour la préparation des compositions cosmétiques ou dermatologiques de l'invention, il est cependant avantageux de les éliminer au moins partiellement. Cette élimination peut être réalisée en particulier par précipitation, de préférence à froid. Le filtrat débarrassé au moins partiellement de ces 20 polysaccharides est ensuite avantageusement soumis à au moins une étape de concentration et/ou de lyophilisation destinée à concentrer l'extrait en produit actif à activité mélanolytique. Les compositions de l'invention contiennent avantageusement de 10-3 à 5%, de préférence de 10-2 à 1%, en poids d'extrait de 25 surnageant rapporté à l'extrait sec. Ces compositions peuvent en outre contenir différents autres principes actifs, en particulier des principes actifs classiquement utilisés dans des compositions destinées à la dépigmentation de la peau ou à l'éclaircissement du teint, notamment au moins une substance inhibant la synthèse de la mélanine. A titre d'exemple de telles substances inhibitrices de la synthèse de la mélanine, on citera: l'hydroquinone, l'acide ascorbique, et leurs dérivés, des extraits placentaires, l'acide kojique, l'arbutine, les iminophénols, les associations carnitine/quinone, les dérivés amides d'amino-phénol, les dérivés de benzothiazole, la vitamine PP et ses dérivés. Ces substances sont souvent utilisées, pour leur action inhibitrice sur la tyrosinase, dans le traitement des hyperpigmentations locales, comme les taches pigmentaires de sénescence (lentigo actiniques), les hyperpigmentations accidentelles comme la cicatrisation post-lésionnelle, ou certaines leucodermies telles que le vitiligo (pour uniformiser localement le teint ici) et seront donc avantageusement associées aux extraits utilisés selon la présente invention. Selon une deuxième caractéristique essentielle, l'invention concerne l'utilisation d'un extrait de surnageant d'une culture de Sporotrichum pruinosum, tel que défini précédemment, comme agent destiné à dépigmenter la peau, dans la préparation d'une composition pharmaceutique ou cosmétique destinée à dépigmenter la peau ou éclaircir le teint. Selon une autre caractéristique essentielle, l'invention concerne également un procédé de traitement cosmétique de la peau destiné à diminuer localement la pigmentation de la peau ou à éclaircir le teint, caractérisé en ce qu'il comprend l'application sur la partie du corps concernée d'une composition cosmétique telle que définie précédemment. L'intérêt de l'utilisation des compositions cosmétiques ou dermatologiques de l'invention contenant des extraits tels qu'ils ont été définis précédemment, dans ces deux types d'application est qu'elles permettent aussi bien l'éclaircissement de peaux naturellement foncées que le soin ou le traitement de peaux présentant des zones d'hyperpigmentation. Ainsi, l'utilisation de compositions contenant les extraits de l'invention permet le traitement ou le soin aussi bien de peaux caucasiennes présentant des taches de sénescence que de peaux plus foncées présentant des taches liées à la cicatrisation. Les compositions de l'invention permettent en particulier d'obtenir une uniformisation du teint en atténuant ou en supprimant les taches pigmentaires telles que les taches de sénescence ou les taches d'hyperpigmentation notamment dues à des cicatrices. Les exemples qui suivent sont donnés à titre illustratif de l'invention et portent respectivement sur: Exemple I: la préparation d'un extrait utile selon l'invention, - Exemple II: la mise en évidence de l'activité mélanolytique, Exemple III: des compositions cosmétiques de l'invention. Les figures illustrent les résultats de mise en évidence de l'activité mélanolytique obtenue selon l'exemple II. Plus précisément, les figures 1A, 1B et 1C donnent les résultats d'observation microscopique de différents échantillons d'épiderme traité par un témoin négatif (figure 1A), par un témoin positif (figure 1B) et par un extrait selon l'invention (figure 1C). Les figures 2A, 2B et 2C donnent les résultats d'un examen microscopique destiné à étudier l'inhibition de l'activité Dopa-oxydase par un témoin négatif (figure 2A), un témoin positif (figure 2B) et un extrait de l'invention (figure 2C). Les figures 3A et 3B donnent les résultats d'une observation microscopique de la mélanine dans les cornéocytes pour un échantillon traité par un témoin négatif (figure 3A) et par un extrait selon l'invention (figure 3B). La figure 3C illustre les résultats de l'analyse statistique correspondante pour un échantillon traité et non traité. EXEMPLES EXEMPLE I: PREPARATION D'UN PRODUIT ACTIF CI-APRES DESIGNE PAR L'EXTRAIT , PRODUIT DIRECTEMENT UTILISABLE DANS UNE COMPOSITION COSMETIQUE OU PHARMACEUTIQUE: Le microorganisme utilisé est le champignon Sporotrichum pruinosum. La souche utilisée dans les exemples ci-dessous a fait l'objet d'un dépôt auprès de la collection de l'Institut Pasteur, le 17 février 2003. Elle porte le numéro CNCM 1-2981. Le milieu de culture est le suivant: Glucose 10 g/l Extrait de levure 0,2 g/l Alcool vératrylique 0,07 g/l Acide tartrique 3,0 g/l Tween 80 1 g/I KH2PO4 0,2 g/I CaCl2.2H20 0,1457 g/I (NH4)2HPO4 0,157 g/I MgSO4.7H20 0,05 g/I ZnSO4.7H20 0,0425 g/I MnSO4. H20 0,0338 g/I 1,5 mmol/l (K+) 1,0 mmol/l (Ca2+) 1,2 mmol/l (NH4) 0,2 mmol/l (Mg2+) 0,15 mmol/l (Zn2+) 0,2 mmol/l (Mn2+) CoCl2.6H2O 0,007 g/I 0,03 mmol/l (Co2+) CuCl2.2H2O 0,007 g/I 0,04 mmol/l (Cu2+) FeCl3 0,00054 g/l 0,003 mmol/l (Fe3+) NaCl 0,0009 g/l 0,015 mmol/l (Na+) Tous les ingrédients du milieu sont dissous dans de l'eau distillée, le pH est ajusté à une valeur de 4,5 avec de la soude. Des fractions de 100 ml du mélange ci-dessus sont placées dans des Erlenmeyer de 500 ml puis stérilisées à l'autoclave à 121 C pendant 20 mn à une pression d'environ 120 kPa. On inocule ensuite avec 7.10' spores/100 ml de milieu. La culture est réalisée dans des flacons Erlenmeyer munis d'un système d'agitation fonctionnant à 90 tr/min, à 30 C pendant 10 jours. Le produit est ensuite récupéré à partir du surnageant de culture, selon les étapes suivantes: Tout d'abord, on filtre sur papier le bouillon de culture à température ambiante à l'aide d'une pompe à vide afin de récupérer le surnageant en éliminant les filaments de mycélium présents. Ce surnageant est ensuite traité par le froid à -18 C pendant 24h pour éliminer la majorité des polysaccharides par précipitation. On le soumet ensuite après décongélation à une première filtration sur papier afin d'éliminer le précipité issu de la congélation, puis à une seconde filtration dite fine à 0,22 pm à l'aide d'une membrane d'acétate de cellulose. Le surnageant est ensuite soumis à une concentration par ultra-filtration en utilisant un système de filtration Viva Flow 200 de la société Vivascuence du groupe Sartorius. L'ultrafiltration est réalisée à l'aide d'une membrane en polyéthersulfone (seuil 10 kDa). Cette étape d'ultrafiltration est réalisée à froid à une température comprise entre 0 et 4 C. Afin d'éliminer les sels, le surnageant maintenant concentré est soumis à une dialyse à 4 C pendant 6 à 8h (12 kDa) avec un changement d'eau toutes les 2h. Le surnageant, ainsi concentré et dialysé, est ensuite gelé dans l'azote liquide avant d'être lyophilisé sous vide à l'aide d'un appareil Micro Modulyo de la société Edwards. Ce lyophilisat est ensuite stocké à -18 C et constitue le produit actif ou Extrait SP utilisé dans les exemples ci-dessous. EXEMPLE II: MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE MELANOLYTIQUE 1. Visualisation de l'activité de l'extrait sur la mélanine d'épiderme séparé a, Principe Une plastie mammaire congelée de phototype V a été sélectionnée. L'épiderme a été séparé par incubation dans une solution aqueuse 2N de bromure de sodium pendant 1h45 à 37 C et découpé en 3 parties. Chaque échantillon d'épiderme a été ensuite mis en contact avec: - Echantillon d'épiderme 1: tampon PBS pH 7,2 (Témoin négatif) Echantillon d'épiderme 2: Trio de Kligman pur (Témoin positif) Plus précisément, le trio de Kligman est une association d'actifs dépigmentante bien connue (A.M Kligman, I. Wilis, Arch Dermatol 1975, 111 (1), 40-48). Cette association, choisie ici comme témoin positif, comprend: - 40.0 mg/mL d'hydroquinone - 0.40 mg/mL d'acide rétinoïque - 8.0 mg/mL d'hydrocortisone. - Echantillon d'épiderme 3: Extrait SP obtenu selon l'exemple I, à 50 g/ mL dans du tampon PBS. Les épidermes sont ensuite mis à incuber au bain-marie à 37 C pendant 24 heures. Ils sont rincés et montés entre lame et lamelle avec du liquide de montage. L'observation est réalisée en microscopie optique avec un objectif (x10), grossissant 10 fois. Les résultats sont donnés sur les figures 1A, 1B et 1C 10 correspondant respectivement aux échantillons d'épidermes 1, 2 et 3. b, Résultats Il apparaît que l'échantillon d'épiderme 1 (Figure 1A) pris à titre de témoin négatif présente une forte coloration due à une présence importante de mélanine. Quant aux échantillons d'épiderme 2 (Figure 1B) et d'épiderme 3 (Figure 1C), respectivement échantillon témoin positif (trio de Kligman) et échantillon traité selon l'invention, l'observation microscopique montre bien une coloration beaucoup plus claire, ce qui démontre une activité dépigmentante remarquable. 2. Dosage de l'activité Dopa-oxydase sur épiderme séparé Le mécanisme de formation de la pigmentation cutanée suit un mécanisme complexe de synthèse des mélanines qui fait intervenir schématiquement les étapes suivantes: Tyrosine > Dopa > Dopaquinone > Dopachrome > Mélanines Les agents inhibant la synthèse de la mélanine, tels que l'acide kojique, sont d'une façon générale connus pour inhiber la tyrosinase dont l'une des activités est l'activité Dopa-oxydase. a, Principe L' épiderme provenant d'une plastie mammaire congelée est séparé par incubation dans une solution aqueuse 2N de bromure de sodium pendant 1h45 à 37 C puis découpé en trois parties équivalentes. Les trois échantillons sont ensuite mis en contact avec l'extrait à tester et de la L-Dopa (vol/vol) et mis à incuber au bain-marie à 37 C pendant 24 heures. Solutions testées: ^ PBS pH 7.2 / L-Dopa ( Témoin négatif) ^ Acide Kojique 0.015% / L-Dopa ( Témoin positif) ^ Extrait à 50 pg/mL / L-Dopa Après incubation, les échantillons sont rincés et montés entre lame et lamelle avec du liquide de montage. L'observation a été réalisée en microscopie optique avec un objectif au grossissement x10. Les clichés obtenus représentés sur les figures 2A, 2B et 2C correspondent respectivement au témoin négatif, au témoin positif et à l'Extrait SP selon l'invention. b. Résultats L'examen des clichés microscopiques montre qu'il n'existe aucune différence significative de décoloration entre l'échantillon témoin négatif (Fig 2A) et l'échantillon traité par l'Extrait SP selon l'invention (Fig 2C), tandis que l'échantillon témoin positif (Fig 2B) apparaît très clair. Il en ressort que l'extrait selon l'invention n'a aucune action sur la DOPA-oxydase, et donc qu'il n'agit pas comme inhibiteur de la synthèse de mélanine. L'effet dépigmentant observé dans le test précédent ne peut en conséquence s'expliquer que par une action de dégradation de la mélanine déjà formée. 3. Visualisation de la mélanine dans des cornéocytes a. Principe Le prélèvement des cornéocytes de 6 panélistes de phototype III et IV est réalisé de la manière suivante à une température d'environ 22 C pour une hygrométrie d'environ 50% : Dans un premier temps, 2 échantillons de squames sont prélevés sur les avant-bras à l'aide d'un squamètre (société GIAP) à une pression de 300 gf/cm2 pendant 10 secondes. Puis dans une seconde étape, les cornéocytes sont prélevés à l'aide d'adhésifs Dsquames de la société CUDERM. Les D-squames ainsi obtenus sont ensuite disposés sur micro plaques et placés en incubation au bain-marie à 37 C pendant 24 heures en contact respectivement avec: ^ 2 mL d'Extrait SP à une concentration de 200 pg/mL dans du tampon PBS. (pour l'essai de l'invention) ^ 2 mL de tampon PBS à pH 7,2 (pour le témoin négatif) La visualisation de la mélanine est réalisée successivement par imprégnation à l'argent selon la méthode de Masson, variante de Fontana décrite notamment par Houlot R., 1984, Techniques d'histopathologie et de cytopathologie, Maloine éditeur, Paris, p 19-21 et 225-227, suivie d'une coloration au nitrate de méthénamine qui révèle les grains de mélanine. On visualise puis on quantifie les grains de mélanine par analyse d'images sur la base de photographies à l'aide du logiciel visilog 5.4. Les D-squames sont observés en microscopie photonique avec un grossissement x63. Les clichés correspondant sont représentés aux figures 3A et 3B correspondant respectivement au traitement par le témoin négatif et par l'extrait de l'invention. Les observations ont été réalisées sur toute la surface des D- squames pour observer la répartition de la mélanine dans les cornéocytes. Le rapport, surface totale des grains de mélanine sur surface totale du cornéocyte, a été calculé par analyse d'images. Une étude statistique (analyse de variance ANOVA) a été réalisée à l'aide du logiciel statistique STATGRAPHICS PLUS sous windows NT. Selon cette méthode d'analyse, a représente le risque et p la significativité du test. On considère qu'un test est significatif avec a= 0,05 si p est inférieur à 0.05. b, Résultats b1. Observation microscopique L'observation microscopique d'un épiderme séparé montre une nette diminution de la présence de mélanine. En effet, on peut observer que le nombre de grains de mélanine a nettement chuté. b2. Etude statistique L'analyse statistique montre que le rapport entre la surface des grains de mélanine et la surface totale du cornéocyte est significativement plus faible dans le cas d'un épiderme traité par l'Extrait SP que dans le cas du témoin négatif. On voit ici encore que le traitement selon l'invention entraîne une diminution importante de la quantité de mélanine présente. Cette étude dont les résultats sont donnés sur la figure 3C montre donc bien une diminution significative de la quantité de mélanine contenue dans les cornéocytes. 4. Conclusion Les différentes expériences ont permis de démontrer É qu'un extrait de surnageant de culture en milieu liquide de Sporotrichum pruinosum est capable de décolorer un épiderme fortement pigmenté (phototype V) ^ que son activité n'est pas liée à une inhibition de la Dopa- oxydase (enzyme clé de la synthèse de la mélanine) É qu'il est capable de dégrader la mélanine présente dans des cornéocytes sans détruire ces derniers. Cet extrait présente donc une activité de dégradation de la mélanine humaine (action mélanolytique). Ainsi, les extraits de surnageant selon l'invention peuvent avantageusement être utilisés comme agents actifs dépigmentant dans des compositions cosmétiques ou dermatologiques dépigmentantes, destinées notamment à traiter les hyperpigmentations, pathologiques ou non, ou à éclaircir le teint. III. COMPOSITIONS COSMETIQUES: LES DIFFERENTES PROPORTIONS SONT EXPRIMEES EN POURCENTAGE EN POIDS 1. Gel dépigmentant 3 Glycol Polyacrylamide/C13-14 isoparaffine/laureth-7 (Sepigel 305) 3 Huile de ricin hydrogénée (Cremophor CO 60) 2 Polyéthylèneglycol (Pluriol E 1505) 1.5 Conservateur 0.5 Concentré de parfum 0.3 Eau 89.2 Extrait SP 0.5 2. Emulsion dépigmentante Stéareth-21 (Brij 721) Glycéryl stéarate (Tegin 90) Alcool stéarylique Tricaprat / caprilate glycérol Butylène glycol Glycérol Conservateur Concentré de parfum Eau Extrait SP 3. Lotion dépigmentante Butylène glycol EDTA Solubilisant Concentré de parfum Alcool Eau Extrait SP 4. Poudre pour éclaircir le teint Talc Mica Séricite Pigments Poudre organique (Nylon) silice 2.5 1.1 0.5 0.5 64.9 0.5 0.1 0.3 90.4 0.2 8.75 Huile minérale ou silicone Extrait SP 5. Fond de teint éclaircissant Polyglycéryl-4 isostéarate/cetyldiméthicone/hexyllaurate 5.1 Cyclopentasiloxane/Cyclohexasiloxane 5.0 Cétyl diméthicone 1.0 Caprylic/capric triglycérides 2.2 Octyl Stearate 1.4 Huile minérale 6.5 Huile de ricin Hydrogénée 1.2 Cire d'abeilles 0.8 Polyméthacrylate de méthyle 1.1 FeO2 0.45 TiO2 5.2 Eau 68.85 NaCl 0.6 Extrait SP 0.5 Concentré de parfum 0.1 3 0.25 2867384 16 REVENDICATIONS 1. Composition cosmétique ou dermatologique, notamment destinée à la dépigmentation de la peau ou à l'éclaircissement du teint, caractérisée en ce qu'elle contient, à titre de principe actif à activité dépigmentante, un extrait du surnageant de culture en milieu liquide du champignon Sporotrichum pruinosum, ledit extrait étant incorporé dans un véhicule cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable, compatible avec une application topique sur la peau. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit champignon correspond à la souche déposée sous le n CNCM 1-2981 auprès de l'Institut Pasteur. 3. Composition selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite culture est réalisée dans un milieu de culture liquide contenant au moins un cation choisi dans le groupe du magnésium, du zinc, du manganèse, du calcium et du cuivre. 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit milieu de culture contient de 0,1 à 1,2 mmol/L d'au moins un des cations précités. 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit extrait est obtenu dans un procédé comprenant les étapes de: culture du champignon Sporotrichum pruinosum, dans un milieu de culture liquide, - récupération du surnageant de culture, par filtration, traitement dudit surnageant consistant à le purifier en vue d'améliorer son activité mélanolytique. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit traitement du surnageant comprend au moins une étape destinée à éliminer au moins partiellement les polysaccharides par précipitation. 7. Composition selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que le surnageant est en outre soumis à au moins une opération de concentration et/ou de lyophilisation. 8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle contient de 10-3 à 5%, de préférence de 10-2 à 1% en poids d'extrait de surnageant rapporté à l'extrait sec. 9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'il contient en outre au moins une substance inhibant la synthèse de la mélanine. 10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite substance inhibant la synthèse de la mélanine est choisie dans le groupe constitué de l'hydroquinone, de l'acide ascorbique, et de leurs dérivés, des extraits placentaires, de l'acide kojique, de l'arbutine, des iminophénols, des associations carnitine/quinone, des dérivés amides d'amino-phénol, des dérivés de benzothiazole, de la vitamine PP et de ses dérivés. 11. Utilisation d'un extrait de surnageant d'une culture en milieu liquide du champignon Sporotrichum pruinosum tel que défini dans l'une des revendications 1 à 7 comme agent destiné à dépigmenter la peau, dans la préparation d'une composition pharmaceutique ou cosmétique destinée à dépigmenter la peau ou à éclaircir le teint. 12. Procédé de traitement cosmétique de la peau destiné à diminuer localement la pigmentation de la peau ou à éclaircir le teint, caractérisé en ce qu'il comprend l'application sur la partie du corps concernée d'une composition cosmétique telle que définie dans l'une des revendications 1 à 10.