FR 2872290 A1 20051230 FR 0406944 A 20040624 METHODE D'ANALYSE HAUTEMENT PARALLELE DE REACTIONS ENZYMATIQUES ET SES APPLICATIONS L'invention se rapporte à une nouvelle méthode pour l'analyse en parallèle d'une pluralité de réactions enzymatiques. L'invention vise en particulier les domaines du diagnostic et du criblage à haut débit de substances actives dans une réaction enzymatique, notamment du criblage d'enzymes, de substrats, d'inhibiteurs ou de régulateurs d'enzymes. L'invention est notamment relative à un procédé comprenant: a. l'obtention d'un support solide comprenant une matrice de zones hydrophiles, chaque zone hydrophile étant délimitée par une zone hydrophobe la séparant des autres zones hydrophiles, b. le dépôt ou la fixation dans chaque zone hydrophile d'au moins un substrat capable de réagir dans une réaction enzymatique, c. la mise en oeuvre d'une pluralité de réactions enzymatiques réalisées en parallèle dans des volumes réactionnels constitués par les gouttes de solution aqueuse confinées dans chaque zone hydrophile du support et contenant les réactifs et tampons appropriés. Les enzymes de la famille des protéases ont pour fonction le clivage de certaines liaisons peptidiques, et elles jouent un rôle clé dans la cellule. Elles sont en effet impliquées dans d'importants processus biologiques tels que la maturation et la dégradation des protéines, la signalisation cellulaire, la différenciation, l'apoptose... La production de ces enzymes, leur fonctionnement anormal est associé à de nombreuses pathologies (réactions inflammatoires, cancers, infections par des agents pathogènes et maladie d'Alzheimer), ce qui en fait à la fois des cibles thérapeutiques et des marqueurs diagnostiques d'intérêt ([1] Leung, D.; Abbenante, G.; Fairlie, D. P. Protease Inhibitors: Current Status and Future Prospects, J Med Chem 43: 305 (2000). & [2] Weissleder, R.; Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets Nat. Med. 9: 123 (2003)). 20 Plus généralement, la détection de l'activité spécifique des enzymes, et notamment les protéases, ou le criblage de molécules actives sur ces enzymes présente un intérêt évident dans les domaines du diagnostic médical ou de la recherche pharmaceutique pour la découverte de nouvelles substances actives. Pour déterminer l'activité spécifique d'une enzyme, il est nécessaire de mesurer l'activité de l'enzyme étudiée sous différentes conditions, et notamment en faisant varier les conditions de concentrations en enzyme et en substrat, et éventuellement en co-facteur. De même, il est nécessaire lors de la recherche de molécules actives, par exemple de molécules interférant avec l'activité d'enzymes, d'observer l'effet d'un grand nombre de molécules, notamment d'inhibiteurs, en général plusieurs centaines, à diverses concentrations. Idéalement, toutes ces conditions devraient être testées simultanément et en utilisant les volumes les plus faibles possibles afin d'obtenir un résultat rapide tout en minimisant les coûts associés à de telles méthodes de criblage. Une méthode réunissant toutes ces caractéristiques serait donc particulièrement utile. Aujourd'hui, il existe de nombreuses méthodes macroscopiques in vitro développées pour l'enzymologie. On citera en particulier les méthodes décrites dans la demande de brevet WO 02074997 (QTLBiosystems) et dans la demande de brevet WO 0194332. Schématiquement, on peut diviser en quatre groupes, les méthodes macroscopiques actuelles de détection d'activité protéolytique: a) celles utilisant un substrat protéique analysé sur gel d'électrophorèse (PAGE), b) celles utilisant un substrat peptidique analysé par chromatographie HPLC, c) celles utilisant un substrat peptidique chromogène analysé à l'aide d'un spectrophotomètre avec éventuellement un lecteur de microplaques, d) celles utilisant un substrat peptidique fluorogène analysé à l'aide d'un scanner 30 de fluorescence ou d'un spectrofluorimètre avec éventuellement un lecteur de microplaques. Les deux premières méthodes ne se révèlent pas adaptées aux exigences des criblages à haut débit. Les méthodes utilisant des substrats chromogènes ou fluorogènes pour mettre en évidence l'activité de l'enzyme sont utilisées avec les systèmes actuels de criblage à haut débit (plaques 96 ou 384 puits). Ces systèmes ne sont toutefois pas encore satisfaisants. En particulier, ils sont coûteux, encombrants et nécessitent de manipuler des quantités de produit importantes. Les volumes pour chaque réaction enzymatique en micro-plaque sont au moins égaux à 100 nL, voire largement supérieurs. Des dispositifs miniaturisés, regroupés sous le terme générique de puces à protéines , ont été récemment développés, plus particulièrement pour l'analyse d'interactions de protéines avec des ligands, tels que le dispositif décrit dans le brevet US 6,630,358 (Zyomyx). Ces dispositifs se révèlent toutefois inadaptés pour l'enzymologie du fait de l'immobilisation des enzymes qui perturbe leur conformation active. La demande de brevet WO2004039487 décrit un système amélioré où des protéines sont emprisonnées dans une matrice de type sol-gel. Le dispositif développé par Biacore permet l'analyse d'interactions moléculaires (protéines-protéines ou protéines-ligands) (WO2004/038415 Al) à partir de faibles volumes, toutefois il n'est pas adapté pour l'analyse en parallèle d'un grand nombre de réactions enzymatiques. De même, des systèmes d'analyse de réactions enzymatiques, fondés sur l'utilisation de la microfluidique ont été décrits, notamment dans le brevet US6,632,629 (Caliper): La réaction enzymatique se fait alors dans un canal où les flux de réactifs se rencontrent. Cependant, dans un seul canal, on ne peut faire les réactions qu'en série et la parallèlisation des canaux est très difficile. Cette approche ne permet donc pas de suivre simultanément plusieurs centaines à plusieurs milliers de réactions enzymatiques. Des systèmes d'analyse hautement parallèle utilisant des micropuits de faibles volumes ont été décrits par Alderman J.C. et al (WO 03059518). Un système permettant de mettre en contact une matrice de protéines et de produits chimiques est décrit par Brennan T.M (US 6,210,894). Ces deux approches ont deux limitations en commun: - la matrice est fermée par un capot; l'alignement des capots avec les matrices peut constituer une difficulté lors de leur mise en place, - une fois le capot mis en place, il est impossible d'ajouter un autre réactif par la suite. Il existe par conséquent un réel besoin de développer de nouvelles méthodes microtechnologiques pour mesurer l'activité d'une enzyme et l'influence de composés sur cette activité, et analyser en parallèle un grand nombre de réactions enzymatiques utilisant de très faibles volumes réactionnels, qui soient économiques, automatisables et faciles à mettre en oeuvre. Schaack et al. ont décrit un système de culture cellulaire en puits virtuels utilisant un support solide comportant des zones hydrophiles délimitées par une zone hydrophobe, de sorte qu'un milieu de culture cellulaire déposé sur une zone hydrophile du support forme une goutte confinée dans la zone hydrophile. Un tel support permet de réaliser en parallèle des milliers de cultures cellulaires dans de très faibles volumes. A la connaissance de la Demanderesse, l'utilisation d'un tel support n'a jamais été décrite ni suggérée pour la mise en oeuvre d'un grand nombre de réactions enzymatiques. Par rapport aux procédés de l'état de la technique, le procédé de l'invention présente de nombreux avantages, et permet notamment: - de travailler sur une surface réduite dans plusieurs centaines à plusieurs milliers de gouttes séparées. - de réaliser des réactions enzymatiques indépendantes les unes des autres dans chacune des gouttes, - de mesurer l'activité enzymatique (ou son inhibition) dans toutes les gouttes simultanément. Plus particulièrement, il permet de tester en parallèle différentes conditions: - différentes enzymes - différentes concentrations d'enzymes et de substrats - différents inhibiteurs, de régulateurs ou de substrats d'enzymes (peptides, dérivés de peptides, petites molécules) différentes concentrations d'inhibiteurs de régulateurs ou de substrats d'enzymes. Le procédé de l'invention permet également de réaliser des mesures dynamiques, pour déterminer l'évolution de l'activité enzymatique au cours du temps. 10 L'invention a donc pour objet un procédé de mise en oeuvre d'une pluralité de réactions enzymatiques en parallèle dans des volumes réactionnels séparés, ladite méthode comprenant: a) l'obtention d'un support solide comprenant une matrice de zones hydrophiles, chaque zone hydrophile étant délimitée par une zone hydrophobe la séparant des autres zones hydrophiles, les zones hydrophiles et hydrophobes étant caractérisées en ce qu'une solution aqueuse déposée au niveau d'une zone hydrophile forme une goutte confinée par la tension de surface dans ladite zone hydrophile, b) le dépôt ou la fixation dans chaque zone hydrophile d'au moins un substrat d'une réaction enzymatique, c) la mise en oeuvre d'une pluralité de réactions enzymatiques en parallèle dans un volume réactionnel constitué d'une goutte de solution aqueuse confinée dans chaque zone hydrophile du support et contenant les réactifs et tampons appropriés. Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, celuici comprend en plus une étape d. consistant à détecter en parallèle l'activité enzymatique dans chaque volume réactionnel et de façon préférée à la mesurer. La mesure de l'activité enzymatique peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier; notamment par détection de substrats chromogènes avec un spectrophotomètre associé à un lecteur de microplaques, par immuno détection, par résonance plasmonique de surface ou SPR (Danielson, Eur J Pharm Sci. 2001 May, 13(2) :203-12) avec éventuellement une légère modification du support. En particulier, l'étape d. est mise en oeuvre par détection au cours de la réaction enzymatique et/ou à la fin de ladite réaction de la quantité d'un composé dont la fluorescence est révélée ou éteinte par la réaction enzymatique. De tels composés incluent notamment les substrats fluorogènes de type P'1fluorophore (J Am Chem Soc 2002 Dec 18, 124(50) : 14868-70; J Org Chem 2002 Feb 8 67(3) : 910-5; PNAS USA 2000 Jlu 5; 97(14) : 7754-9), FRET (Biopolymers, 2002, 66:93-100; Nat Biotechnol. 2000 18:1071-4; Chem Commun 2002 21: 2092-3), SQ (Molecular Probes & Neoplasia 2002 4: 228-36 et DA (Anal. Chem. 2004, 76, 1429-1436 (PerkinElmer), PNAS USA 2004, 101: 7511-5; Epub 2004 May 10 (QTL Biosystem)). En particulier, les substrats P'-1 fluorophores sont constitués de la partie P liée à une molécule qui a la particularité de devenir fluorescente lorsqu'elle est séparée de la molécule par une enzyme de clivage (par exemple une protéase dans le cas d'une liaison peptidique). Le principe est similaire pour les substrats DA (Donneur-Accepteur) et FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfert): une molécule est fixée sur la partie P et elle n'émet pas de fluorescence tant qu'elle est au voisinage d'une deuxième molécule fixée à la deuxième partie P' liée à la partie P. Lorsque les parties P et P' sont séparées par action de l'enzyme, la molécule fixée sur P devient fluorescente. En ce qui concerne les substrats SQ (Self-Quenched), les deux molécules mises en jeu sont identiques, et une grande densité de substrat (accrochés à un polymère par exemple) permet d'obtenir une diminution de la fluorescence. Après clivage, la fluorescence augmente à nouveau. Ce type de substrat SQ est aussi utilisable en solution dans le cas de substrats protéiques marqués avec une molécule fluorescente en quantité importante. Parmi les substrats utilisables pour révéler une activité de type protéase, on utilisera les substrats suivants: DQ Gelatin (Molecular Probes), les substrats peptidiques fluorogènes commercialisés par Bachem ou Molecular probes. D'autres exemples de substrats fluorogènes adaptés pour les hélicases, phosphatases et protéases sont décrits dans Anal. Chem. 2004, 76: 1429-1436. II existe également des substrats fluorogènes adaptés pour les estérases, différents types d'oxydase, des enzymes participant au métabolisme des sucres (galactosidase, amylase...) ; des enzymes participant au métabolisme du phosphore (kinase, phosphatases...) ; des enzymes du complexe cytochrome P450, etc... (commercialisés par exemple par Molecular Probes, http://www.probes.com). En présence de l'enzyme et du milieu réactionnel, la transformation du substrat, détectée par émission ou extinction de fluorescence, permet ainsi de mettre en évidence l'activité des enzymes spécifiques des substrats. Naturellement, le dispositif de détection sera déterminé en fonction du mode de révélation de l'activité enzymatique choisi par l'homme du métier. Dans un mode de mise en oeuvre du procédé utilisant des composés fluorogènes, la quantité de fluorescence émise dans chaque volume réactionnel peut aisément être détectée à l'aide d'un scanner, tel que ceux couramment utilisés avec les méthodes utilisant les puces à ADN ou les puces à protéines (par exemple un appareil GeneTAC LSIV (PerkinElmer). On quantifie ensuite la fluorescence pour chaque zone hydrophile avec un logiciel adapté (par exemple Genepix Pro 4.0 Axon). On traite ensuite les données par un tableur (exemple Excel) permettant d'obtenir des valeurs et des graphiques. Si on désire effectuer des mesures cinétiques, il est possible de retirer le support à des temps donnés et de mesurer la fluorescence. On peut ainsi quantifier 25 l'évolution de la fluorescence au cours du temps. Le support solide utilisé dans le procédé de l'invention est constitué par une plaque dont la surface est sensiblement plane, qui peut être en silicium, en verre ou en polymère, comme par exemple en polyuréthane, en nylon, en polyester, en polyéthylène, en polypropylène, en polyfluorocarbone, en polyméthylacrylate (PMMA), en polycarbonate, en chlorure de polyvinlyle (PVC), en polydiméthylsiloxane (PDMS) ou en polysulfone. Selon l'invention, le support utilisé contient une matrice de zones hydrophiles délimitées par une zone hydrophobe, cette dernière pouvant être composée de plusieurs parties. Le terme matrice signifie que les zones hydrophiles sont disposées sur le support à des positions déterminées, par exemple en réseau normé, notamment orthonormé (formant des lignes et des colonnes). Les zones hydrophiles et hydrophobes sur le support sont caractérisées en ce qu'une solution aqueuse déposée au niveau d'une zone hydrophile forme une goutte confinée par la tension de surface dans ladite zone hydrophile. Un exemple d'un tel support est présenté à la figure 1. La goutte formée dans la zone hydrophile remplit tout ou partie de ladite zone hydrophile et y demeure confinée. De préférence, chaque zone hydrophile consiste en des zones de la surface sensiblement plane du support d'une taille allant de 5 m2 à 10mm2, de préférence de 100 m2 à 5 mm2. Selon un mode préférentiel, le support contient au moins 10 zones hydrophiles, par exemple au moins 100 zones hydrophiles, par exemple entre 10 et 10000, notamment entre 300 et 3000 zones hydrophiles, chaque zone hydrophile étant susceptible de contenir un volume réactionnel constitué d'une goutte de solution aqueuse d'un volume compris entre 0,1 et 5000 nl, de préférence de 1 à 500 nI, par exemple entre 10 et 100 nl. En particulier, plusieurs centaines à plusieurs milliers de gouttes peuvent être réparties sur une lame de verre de dimensions standards (proche de 75 mm x 25 mm). Selon un autre mode préférentiel, le support utilisé dans le procédé de l'invention est un support solide en verre, en silicium, en plastique ou en métal, par exemple or ou argent, dont la surface est traitée pour obtenir une matrice de zones hydrophiles délimitées par une zone hydrophobe, les zones hydrophiles et hydrophobes étant caractérisées par leur différence d'angle de goutte supérieure à 40 . Pour conférer un caractère hydrophobe ou hydrophile à la surface plane du support, celle-ci est préférentiellement recouverte d'un matériau hydrophobe ou hydrophile, tel que les silanes hydrophobes ou hydrophiles, ou d'une couche de polymère hydrophobe, par exemple du téflon. Une matrice de zones hydrophiles sur fond hydrophobe (Fig la) peut être obtenue par exemple par application d'un masque sur la surface du support (éventuellement prétraitée, par exemple avec un mélange acide sulfuriqueleau oxygénée) suivie par une modification chimique. Ce masque peut être un polymère (par exemple photoresist), une solution visqueuse (par exemple contenant du glycérol). Le masque peut être dispensé sur la surface à l'aide d'un spotter ou être créé par photolithographie (notamment par les méthodes décrites dans les brevets US 5,985,551, US 5, 474,796 et WO 0216023). La protection de la surface avec un masque permet la modification différentielle de la surface: d'abord des zones non protégées par exemple avec un silane hydrophobe (perfluorosilanes, alkylsilanes...) ou avec une couche mince de polymère hydrophobe (par exemple téflon liquide) et ensuite, après l'enlèvement du masque, des zones déprotégées avec un autre composé (par exemple un silane hydrophile tel que 2 [methoxypolyethylenoxy]propyltrimethoxysilane, APTES, bis[2-hydroxyethyl]-3-am inopropyltriethoxysilane). Ainsi, selon un mode de réalisation préféré du procédé, le support utilisé est caractérisé en ce que la matrice de zones hydrophiles est obtenue au moyen d'une modification chimique de la surface, notamment par le dépôt localisé de silanes hydrophobes ou hydrophiles, ou le dépôt localisé d'une couche de polymère hydrophobe tel que le téflon, dans les zones hydrophobes ou hydrophiles. En particulier, la modification chimique de la surface est réalisée après formation d'un masque obtenu par spottage, par photolithographie ou par altération de la couche hydrophobe par laser ou par plasma. D'autres exemples de production de support contenant une matrice de zones hydrophiles sont notamment décrits dans le brevet FR 0209326 (Schaack et al.) Etant donné que le support permet de confiner les microgouttes dans la matrice de zones hydrophiles, il n'est pas nécessaire de fixer les substrats sur le support, le substrat de chaque réaction enzymatique est alors en solution dans le volume réactionnel. Cependant, dans certaines conditions, il peut s'avérer avantageux de fixer le substrat sur la surface du support ou bien à un gel ou à un hydrogel, notamment afin de pouvoir effectuer des lavages avant l'analyse, et de mesurer l'activité enzymatique dans des conditions diverses. Enfin, le simple dépôt de substrats dans un gel ou un hydrogel emplissant les zones hydrophiles est aussi possible. Dans un mode de mise en oeuvre particulier du procédé de l'invention, le substrat de chaque réaction enzymatique est fixé à la surface du support. De préférence, le substrat est lié à la surface, via un espaceur, soit de façon covalente, soit par adsorption. L'espaceur est greffé ou adsorbé à la matrice hydrophile, et permet de maintenir les composés à distance de la surface tout en présentant les substrats aux enzymes. Des exemples d'espaceurs utilisables sont notamment des polymères artificiels 20 tels que le polyéthylène glycol ou les polyacrylamides ou des polymères naturels tels que les protéines, les sucres ou les acides nucléiques. En particulier, il est possible de fixer sur cet espaceur de façon covalente ou par adsorption des substrats dits fluorogènes. On citera en particulier les quatre types de substrats fluorogènes P'1-Fluorophore, FRET, SQ et D-A qui ont été définis précédemment. La fixation des substrats au support permet avantageusement de laver le support après mise en oeuvre des réactions enzymatiques et de conserver l'empreinte sur la plaque de la modification enzymatique des substrats fixés sur la plaque. La plaque ainsi modifiée peut être analysée ultérieurement et les résultats comparés par rapport à une image de référence. Le dépôt de tous les réactifs dans chaque zone hydrophile se fait au moyen de système automatisé approprié, notamment les robots de dispense piézo-électrique Sciflexarrayer de la société Scienion et Nano-plotter de la compagnie Gesim. Les substrats déposés dans chaque zone hydrophile peuvent être identiques ou différents d'une zone hydrophile à l'autre. Le cas échéant, au moins deux substrats différents sont déposés dans une même zone hydrophile. Selon un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, les gouttes de solution aqueuse contenant le substrat sont déposées au niveau de chaque zone hydrophile à l'aide d'un robot à système d'éjection piezoélectrique, par contact ou trempage. Ce robot permet de déposer, à des endroits précis, dans les zones to hydrophiles choisies du support solide, des quantités connues de substrats. Ce même robot peut également déposer l'ensemble des réactifs et tampons nécessaires à la mise en oeuvre des réactions enzymatiques. Le procédé de l'invention permet en particulier la détection d'une activité enzymatique dans plusieurs échantillons en parallèle, notamment plusieurs échantillons biologiques, notamment au moins 10, par exemple entre 10 et 10000, notamment entre 300 et 3000 échantillons. Dans cette application, le mélange réactionnel de chaque goutte contient un échantillon susceptible de présenter l'activité enzymatique à détecter. Les échantillons sont déposés dans chaque zone hydrophile à l'aide d'un dispositif approprié, par exemple, un robot à injection piezo-électrique, indépendamment du substrat, ou concomitamment. Afin de limiter l'évaporation, on peut ajouter du glycérol (de 1 à 25% en volume) aux échantillons contenant les réactifs. On peut également abaisser la température de la surface de dépôt et des réactifs et/ou augmenter le taux d'humidité dans l'enceinte du dispositif utilisé pour le dépôt des échantillons. Le contrôle de l'évaporation des gouttes peut être assuré (en plus de la présence 30 de glycérol dans les microgouttes) par l'utilisation d'une enceinte permettant de conserver un taux d'humidité élevé pendant plusieurs jours. Selon un mode préférentiel de mise en oeuvre, le procédé permet la détection en parallèle d'une activité enzymatique dans une pluralité d'échantillons biologiques susceptibles de présenter une activité enzymatique détectable par le procédé de l'invention. Par échantillon biologique , il faut comprendre tout matériel biologique et en particulier, un échantillon de cellules, un extrait protéique de cellules, un échantillon de tissus, d'organes, de fluides biologiques tels que le sang, l'urine, la salive ou encore le liquide céphalo-rachidien. L'échantillon biologique peut être préparé à partir de cellules d'un organisme biologique, et notamment d'un prélèvement de tissus ou de fluides biologiques tels que le sang, le liquide céphalo-rachidien, l'urine ou la salive. Le prélèvement peut être réalisé sur un animal, (en particulier un mammifère et de préférence un homme) ou une plante. Le prélèvement peut en particulier être réalisé sur un individu sain ou un patient atteint d'une pathologie. La pathologie peut notamment être un cancer, une pathologie neuro-dégénérative, une pathologie infectieuse et en particulier une pathologie virale, bactérienne ou parasitaire. L'échantillon biologique peut être également prélevé d'une culture de cellules eucaryotes ou procaryotes, de bactéries, de champignons ou de levures. Il peut aussi être prélevé d'un produit agro-alimentaire, et notamment des graines, des fruits, des céréales ou des aliments cuisinés. Au sens de l'invention, on entend également par le terme échantillon , toute composition susceptible de produire une réaction enzymatique détectable par le procédé de l'invention en présence d'un substrat approprié. Un échantillon peut notamment contenir une enzyme purifiée dans un tampon approprié et le cas échéant, un ou plusieurs autres réactifs nécessaires (co-facteurs, co- substrat, catalyseurs...). L'échantillon peut contenir des composés chimiques synthétiques ou naturels. Le procédé de l'invention permet notamment la détection de toute activité enzymatique détectable au moyen de substrats fluorogènes, par une émission ou une extinction de fluorescence. Notamment, il permet la détection d'activité enzymatique des enzymes de réparation de l'ADN, les enzymes impliquées dans le métabolisme et les cycles énergetiques (ATPase) , ou même la détection des réactions enzymatiques en cascades (telles que le système de protéolyse ubiquitine-dépendant), de type kinase, phosphorylase, notamment celles impliquées dans des voies de signalisation. Dans un mode de mise en oeuvre préféré, le procédé de l'invention permet de détecter une activité enzymatique de type protéase. Les protéases détectées selon le procédé sont notamment des protéases virales, bactériennes, métalloprotéases ou des métalloprotéases de la matrice extracellulaire (MMPs). Le procédé de l'invention présente des applications plus particulièrement dans les domaines du diagnostic médical. Dans un mode de mise en oeuvre préféré, le ou les échantillons susceptibles de présenter une activité enzymatique sont des échantillons biologiques prélevés sur un individu, de préférence chez l'homme, et la détection d'une activité enzymatique dans l'échantillon permet le diagnostic le pronostic et/ou le suivi de l'évolution d'une pathologie ou d'une infection virale, parasitaire ou bactérienne ou permet le suivi du traitement administré à un patient. Au sens de l'invention, on entend par pathologie, tout trouble ou dysfonctionnement du corps humain ou animal. La mesure de l'activité enzymatique peut être associée à la présence d'une pathologie, notamment d'une infection (diagnostic) ou également associée à un niveau d'évolution (pronostic) d'une pathologie, notamment d'une pathologie d'origine virale ou d'un cancer. Le procédé de l'invention permet par exemple de déterminer si une substance active inhibe ou non l'activité de protéases impliquées dans des pathologies spécifiques. Des exemples de protéases impliquées dans des pathologies spécifiques sont notamment donnés dans le tableau 1 de la page 307 de la revue Journal of Medicinal Chemistry, 2000, Vol. 43, No 3. Le procédé de l'invention permet en particulier de détecter l'activité enzymatique de protéases impliquées dans une infection par un virus de type VIH, HBS, par exemple dans une pathologie telle que l'hépatite C ou le cancer, l'activité enzymatique de ces protéases étant utilisée comme marqueur diagnostique. En outre, on peut l'utiliser dans la recherche d'inhibiteurs d'enzymes produites lors du développement de ces pathologies et qui favorisent leur établissement ou leur développement. En particulier, on peut rechercher des inhibiteurs de la protéase NS3 du virus de l'hépatite C ou pour observer l'activité des métalloprotéases de la matrice extracellulaire dont certaines sont liées au développement de cancers. Plus généralement, l'invention porte sur l'utilisation du procédé tel que défini plus haut, pour le diagnostic d'une pathologie ou d'une infection virale, bactérienne ou 10 parasitaire. Le procédé de l'invention présente également des applications plusparticulièrement dans les domaines du criblage à haut débit pour la recherche de substances actives. Ce type de criblage intéresse principalement l'industrie pharmaceutique. L'invention vise en particulier un procédé de criblage à haut débit d'inhibiteurs ou de régulateurs d'une activité enzymatique, comprenant la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention tel que décrit plus haut, dans lequel le mélange réactionnel de chaque goutte contient un réactif susceptible de présenter une activité enzymatique en présence d'un composé candidat dont l'activité inhibitrice ou régulatrice est recherchée. Plus généralement, l'invention concerne l'utilisation du procédé de mise en oeuvre d'une pluralité de réactions enzymatiques tel que défini plus haut, pour le criblage à haut débit d'enzymes, d'inhibiteurs ou de régulateurs d'une activité enzymatique ou de substrats d'enzymes. L'invention porte également sur une méthode d'obtention d'un support approprié pour la mise en oeuvre des procédés de l'invention, ladite méthode comprenant: a) le dépôt sur un support solide hydrophile d'un masque à base de glycérol, comprenant un mélange glycérollsucroseleau dans des proportions telles que la solution obtenue est compatible avec la dispense piezoélectrique, notamment en terme de viscosité, et b) le dépôt d'une couche de silanes hydrophobes par co-évaporation avec du pentane en atmosphère inerte, dans des conditions permettant la formation d'une couche de silanes hydrophobes dans la zone hydrophobe; c) éventuellement, la stabilisation thermique ou la déshydratation sous vide de la couche de silanes hydrophobes. Selon un mode de réalisation particulier, le support solide hydrophile est une lame de verre nettoyée au piranha ou de silicium oxydée en surface. L'invention porte également sur un support comprenant une matrice de zones hydrophiles, chaque zone hydrophile étant délimitée par une zone hydrophobe la séparant des autres zones hydrophiles, les zones hydrophiles et hydrophobes étant définies en ce qu'une solution aqueuse déposée au niveau d'une zone hydrophile forme une goutte confinée par la tension de surface dans ladite zone hydrophile, ledit support étant caractérisé en ce qu'au moins un substrat d'une enzyme est fixé à sa surface dans chacune des zones hydrophiles. De préférence, le substrat est lié à la surface du support par l'intermédiaire d'un espaceur comme décrit plus haut. En particulier, le substrat est un substrat peptidique fluorogène et permet la détection par fluorescence d'une activité de type protéase. Un tel support est utilisable notamment dans le procédé de mise en oeuvre d'une pluralité de réactions enzymatiques selon l'invention. Les exemples qui suivent permettent d'illustrer certains modes de réalisation préférés du procédé de l'invention et de comprendre plus aisément sa mise en oeuvre, sans toutefois limiter la portée de l'invention. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1: La figure 1 présente un exemple de support utilisable dans le procédé de l'invention. A. Exemple de disposition des zones hydrophiles en réseau orthonormé. B. Exemple de modification chimique de la surface du support à l'aide de silane perfluoré C. Exemple de modification chimique de la surface à l'aide d'une mince couche de Teflon. Figure 2: La figure 2 est une photographie des supports sur lesquels sont déposés les gouttes de volume réactionnel à l'aide d'un robot à injection piezoélectrique. Figure 3: La figure 3a montre la disposition des gouttes sur le support pour l'analyse en parallèle de l'activité d'une protéase. La figure 3b est un graphe représentant pour chaque groupe de gouttes abritant la même réaction, l'intensité de fluorescence détectée en fonction du temps. Figure 4: La figure 4 est un graphe représentant l'effet de différentes concentrations en substrat sur le signal fluorescent mesuré (respectivement, 10 mg/ml, 100 mg/ml, 250 mg/ml et 500 mg/ml) en fonction du temps (40, 60, 80, 120, 160, 200, 240 min) et avec ou sans inhibiteur. Figure 5: La figure 5 est un graphe représentant l'effet de différentes concentrations en protéase sur sur le signal fluorescent obtenu (respectivement, 10mg/ml, 100mgIml, 250mg/ml et 500mglml) en fonction du temps (40, 60, 80, 120, 160, 200, 240 min) et avec ou sans inhibiteur. EXEMPLES Exemplel: Préparation d'un support approprié pour le procédé de l'invention comprenant une matrice de zones hydrophiles La matrice de zones hydrophiles sur fond hydrophobe s'obtient par l'utilisation d'un masque à base de glycérol, suivi d'un dépôt de silanes hydrophobe en phase gazeuse sous atmosphère inerte. La méthode utilisée comprend les étapes suivantes: 1. Dépôt d'un masque constitué d'un mélange glycérol/sucrose/eau (par exemple 15% en poids de glycérol, 25% en poids sucrose, complété avec de l'eau) sur un support solide hydrophile (lame de verre nettoyée au piranha constitué d'un mélange 1:1 d'acide sulfurique-eau oxygéné, silicium oxydé en surface...) 2. Dépôt d'une couche de silanes hydrophobes (par exemple, perfluorooctyltriéthoxysilanes) par co-évaporation avec du pentane en atmosphère inerte (dessiccateur sous argon par exemple). 3. Passage à l'étuve à 115 C pendant environ 2 heures. 4. Lavage du masque à l'eau Cette méthode possède l'avantage d'être rapide et facile à mettre en oeuvre par rapport aux méthodes utilisant des matériaux de type photoresist . Exemple 2: Exemple de mise en oeuvre du procédé de l'invention pour la détection d'une activité protéolytique en présence de différentes concentrations d'inhibiteurs Nous avons utilisé dans cet exemple, le procédé par photolithographie développé par Butler et al (Am. Chem. Soc., 2001, 123: 8887) pour créer un support constitué d'une lame de verre comprenant une matrice de spots hydrophiles liés à une surface perfluoré (voir Figures 1A et 1B). Les différences de tension de surface sont telles qu'une solution aqueuse déposée dans une zone hydrophile reste confinée dans la zone hydrophile définie. Des supports présentant entre 300 et 3000 spots hydrophiles (d'environ 500 p.m de diamètre) ont été utilisés dans la présente méthode de détection de l'activité protéase (voir Figure 2) Des gouttes d'environ 20 nI contenant les réactifs ont été déposées à la surface des lames de verre. Un robot (Sciflexarrayer, société Scienion) a été utilisé pour déposer les réactifs sur les lames de verre au niveau d'un spot hydrophile défini, de sorte que les supports permettent de tester un grand nombre de conditions différentes en une seule réaction. On a procédé comme suit: La protéase, le substrat fluorogénique, ici de la gélatine Self-Quenched (notée gélatine SQ) (DQ Gelatin, Molecular Probes), dans un tampon contenant 10% de glycérol et le cas échéant, l'inhibiteur de protéase (ici la 1,10-phénantroline) sont mélangés directement dans les gouttes déposées à l'aide du robot à injection piezo- électrique sur le support selon le schéma de dépôt préétabli. Le tampon de réaction a la composition suivante: 0.05M Tris-HCI, 0.15 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.2 mM NaN3, pH 7.6. En particulier, différentes concentrations de protéase ont été testées, ainsi que la présence d'un inhibiteur. Au total, 40 conditions de réactions enzymatiques (mesurées sur 400 gouttes) ont été testées en parallèle. L'évolution des réactions au cours du temps est suivie par libération de la fluorescence après clivage du substrat par la protéase. La fluorescence est mesurée à l'aide d'un scanner de fluorescence Genetac LSIV. On excite le fluorophore à 488 nm et on mesure l'émission à 512 nm. Le figure 3a présente le type d'image obtenue. Après quantification et traitement des données à l'aide du logiciel Genepix Pro 4.0., la cinétique de la protéolyse peut être précisément établie. La cinétique de la protéolyse et l'effet de l'inhibiteur ont pu être déterminés en parallèle pour chaque goutte individuelle. Après traitement des données, les valeurs moyennes de fluorescence et les écart-types déduits pour chaque type de réaction ont été rassemblées sur le graphe présenté à la figure 3b. On observe en particulier, l'activité de la protéase grâce à la variation de fluorescence au cours du temps. Cette activité augmente avec la concentration en protéase. Les effets de la concentration en substrat ont été analysés (Figure 4), ainsi que les effets de la concentration en protéase (Figure 5). Cet exemple montre que le procédé de l'invention fournit une méthode rapide et 10 simple à mettre en oeuvre pour analyser en parallèle de nombreuses réactions enzymatiques dans différentes conditions. REVENDICATIONS 1. Procédé de mise en oeuvre d'une pluralité de réactions enzymatiques en parallèle dans des volumes réactionnels séparés, ladite méthode comprenant: a. l'obtention d'un support solide comprenant une matrice de zones hydrophiles, chaque zone hydrophile étant délimitée par une zone hydrophobe la séparant des autres zones hydrophiles, les zones hydrophiles et hydrophobes étant caractérisées en ce qu'une solution aqueuse déposée au niveau d'une zone hydrophile forme une goutte confinée par la tension de surface dans ladite zone hydrophile, b. le dépôt ou la fixation dans chaque zone hydrophile d'au moins un substrat capable de réagir dans une réaction enzymatique, c. la mise en oeuvre d'une pluralité de réactions enzymatiques en parallèle dans des volume réactionnels constitués par les gouttes de solution aqueuse confinées dans chaque zone hydrophile du support et contenant les réactifs et tampons appropriés. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape d. consistant à détecter, en parallèle l'activité enzymatique des réactions enzymatiques conduites dans chaque volume réactionnel, et de préférence à la mesurer. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la mesure de l'activité enzymatique est obtenue au moyen de la détection au cours de la réaction enzymatique de la quantité d'un composé dont la fluorescence est révélée ou éteinte par la réaction enzymatique. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé ce que la quantité de fluorescence émise dans chaque volume réactionnel est détectée à l'aide d'un scanner de fluorescence. 5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la mesure de l'activité enzymatique des réactions enzymatiques est réalisée à différents temps au cours de la réaction enzymatique. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le support solide contient une matrice d'au moins 10 zones hydrophiles, par exemple de 10 à 10000, notamment entre 300 et 3000 zones hydrophiles, chaque zone hydrophile étant susceptible de contenir un volume réactionnel constitué d'une goutte de solution aqueuse d'un volume compris entre 0,1 et 5000 nI, de préférence de 1 à 500 nl, par exemple entre 10 et 100 nl. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le support est un support solide en verre, en silicium, en plastique ou en métal, par exemple or ou argent, dont la surface est modifiée pour obtenir une matrice de zones hydrophiles délimitées par une zone hydrophobe, les zones hydrophiles et hydrophobes étant caractérisées par leur différence d'angle de goutte supérieure à 40 . 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la matrice de zones hydrophiles est obtenue au moyen d'une modification chimique de la surface, notamment par le dépôt localisé de silanes hydrophobes ou hydrophiles, ou le dépôt localisé d'une couche de polymère hydrophobe, par exemple du téflon, dans les zones hydrophobes ou hydrophiles. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la modification chimique de la surface est réalisée après formation d'un masque obtenu par spottage, par photolithographie ou par altération de la couche hydrophobe par laser ou par plasma. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le substrat de chaque réaction enzymatique est en solution dans le volume réactionnel. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le substrat de chaque réaction enzymatique est fixé à la surface du support. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le substrat de chaque réaction enzymatique est présent dans un gel ou un hydrogel emplissant les zones hydrophiles. 13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'une goutte d'une solution aqueuse contenant le substrat est déposée au niveau de chaque zone hydrophile à l'aide d'un robot à système d'éjection piezoélectrique, par contact ou trempage. 14. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le substrat est greffé ou adsorbé à la surface du support au moyen d'un espaceur, par exemple des polymères artificiels tels que le polyethylène ou le polyacrylamide ou des polymères naturels tels que les protéines, les sucres ou les acides nucléiques, ledit espaceur permettant de maintenir ledit substrat à distance de la surface. 15. Procédé de détection d'une activité enzymatique dans plusieurs échantillons en parallèle, notamment plusieurs échantillons biologiques, comprenant la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 14, dans lequel le mélange réactionnel de chaque goutte contient un échantillon susceptible de présenter l'activité enzymatique à détecter. 16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel l'activité enzymatique à détecter est une activité de type protéase. 17. Procédé selon la revendication 15 ou 16, dans lequel le ou les échantillons susceptibles de présenter une activité enzymatique sont des échantillons biologiques prélevés sur un individu, de préférence chez l'homme, et la détection d'une activité enzymatique dans l'échantillon permet le diagnostic ou le pronostic d'une pathologie ou d'une infection virale, bactérienne ou parasitaire. 18. Procédé de criblage à haut débit d'inhibiteur ou de régulateurs d'une activité enzymatique, comprenant la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 14, dans lequel le mélange réactionnel de chaque goutte contient un réactif susceptible de présenter une activité enzymatique en présence d'un composé candidat dont l'activité inhibitrice ou régulatrice est recherchée. 19. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 14, pour le diagnostic d'une pathologie ou d'une infection virale, bactérienne ou parasitaire. 20. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 14, pour le criblage à haut débit d'enzymes, d'inhibiteur ou de régulateurs d'une activité enzymatique ou de substrat d'enzymes. 21. Procédé de préparation d'un support approprié pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 18, comprenant: a. le dépôt sur un support solide hydrophile d'un masque à base de glycérol, comprenant un mélange glycérol/sucrose/eau dans des proportions telles que la solution obtenue est compatible avec la dispense piezoélectrique, notamment en terme de viscosité; et, b. le dépôt d'une couche de silanes hydrophobes par co-évaporation avec du pentane en atmosphère inerte, dans des conditions permettant la formation d'une couche de silanes hydrophobes dans la zone hydrophobe; c. le cas échéant, la stabilisation thermique ou la déshydratation sous vide de la couche de silanes hydrophobes. 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que le support solide hydrophile est une lame de verre nettoyée au piranha ou de silicium oxydée en surface. 23. Support comprenant une matrice de zones hydrophiles, chaque zone hydrophile étant délimitée par une zone hydrophobe la séparant des autres zones hydrophiles, les zones hydrophiles et hydrophobes étant définies en ce qu'une solution aqueuse déposée au niveau d'une zone hydrophile forme une goutte confinée par la tension de surface dans ladite zone hydrophile, ledit support étant caractérisé en ce qu'au moins un substrat d'une enzyme est fixé à sa surface dans chacune des zones hydrophiles. 24. Support selon la revendication 23, caractérisé en ce que le substrat est lié à la surface du support par l'intermédiaire d'un espaceur. 25. Support selon la revendication 23 ou 24, caractérisé en ce que le substrat est un substrat peptidique fluorogène et permet la détection par fluorescence d'une activité de type protéase. 26. Support selon l'une des revendications 23 à 25, approprié pour la mise en oeuvre d'une méthode selon la revendication 14. 27. Utilisation d'un support selon la revendication 26, pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 14 à 18. 28. Utilisation d'un support selon la revendication 26, pour le diagnostic d'une pathologie ou d'une infection virale, bactérienne ou parasitaire. 29. Utilisation d'un support selon la revendication 26, pour le criblage à haut débit d'enzymes, d'inhibiteur ou de régulateurs d'une activité enzymatique ou de substrat d'enzymes.