FR 2863620 A1 20050617 FR 0314745 A 20031216 UTILISATION D'AU MOINS UN CETOSE DE 3 A 5 ATOMES DE CARBONE COMME SUBSTITUT D'AGENTS RETICULANTS DE PROTEINES La présente invention est relative à l'utilisation d'au moins un cétose de 3 à 5 atomes de carbone comme substitut d'agents réticulants de protéines et plus particulièrement d'agents réticulants choisis dans le groupe constitué par les tannins minéraux, les tannins synthétiques et les tannins aldéhydiques. lo L'invention concerne également la réticulation, par au moins un cétose de 3 à 5 atomes de carbone, de protéines destinées à l'alimentation des animaux, à la fabrication de compositions filmogènes pour revêtements, enrobages ou adhésifs et à la préparation de matériaux protéiques biodégradables ou renouvelables. Au sens de l'invention, on entend par cétose de 3 à 5 atomes de carbone , un cétose choisi dans le groupe constitué par la dihydroxyacétone (ou la 1,3-dihydroxy-2-propanone), l'érythrulose, le xylulose et le ribulose. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation de la dihydroxyacétone pour la réticulation de protéines. On entend également par agents réticulants ou agents de tannage des protéines, des composés susceptibles de former des liaisons hydrogènes, coordinatives, covalentes ou ioniques avec lesdites protéines de manière à en réduire la digestibilité et la solubilité dans l'eau. Trois familles principales d'agents réticulants de protéines sont généralement décrites. La première famille est constituée par les tannins minéraux, tels les sels de cations di, tri ou polyvalents comme les sels de chrome, d'aluminium, de fer, de zinc, de cuivre, de cobalt, de titane, de zirconium, de silicium et de césium. Les tannins minéraux sont surtout efficaces en milieu alcalin. Sous leur forme basique, ces sels de métaux polyvalents se lient de façon stable avec les fonctions carboxyliques libres de certains acides aminés des protéines. Leur domaine d'application est en particulier celui du tannage de matériaux protéiques biodégradables ou renouvelables, notamment celui de la fabrication du cuir par tannage du collagène constituant le derme de la peau des animaux. Cette opération a pour but de transformer la peau en cuir, c'est-à-dire de transformer une matière putrescible en une matière imputrescible, en ôtant aux microorganismes la possibilité de s'attaquer aux fibres du collagène. Dans le cas du tannage au chrome qui représente environ 90 % des peaux tannées dans le monde, les composés de chrome se fixent sur les protéines en formant des complexes: - soit avec les groupes carboxyliques libres des chaînes aminées desdites protéines, - soit par l'intermédiaire de groupes sulfates, formiates ou oxalates, avec les fonctions amines libres des chaînes aminées desdites protéines. Une réticulation, i.e. une liaison de deux ou plusieurs chaînes peptidiques, par l'intermédiaire des composés du 20 chrome, a alors lieu. Ces tannins minéraux sont particulièrement efficaces, mais génèrent de grandes quantités de déchets préjudiciables pour l'environnement. Les tannins minéraux sont parfois également utilisés dans le domaine du tannage des protéines destinées à l'alimentation animale, sous la forme de sels de zinc ou d'autres cations. Une consommation excessive de telles protéines tannées est à éviter car elle peut conduire à des effets toxiques pour l'animal. La deuxième famille de tannins est constituée par les tannins synthétiques tels les résines épichlorhydrines, les résines polyamideamine-épichlorhydrines, les résines polyéthylène-imines et les résines isocyanates comme le méthylènediphényl diisocyanate. Leur domaine d'application est en particulier celui des colles ou des adhésifs, notamment des colles à bois ou des colles pour carton ondulé. La troisième famille de tannins est constituée par les tannins aldéhydiques, plus particulièrement le formaldéhyde, le glyoxal (éthanedial) ou le glutaraldéhyde, et l'ensemble de leurs dérivés commerciaux vendus sous forme de condensats divers. Les tannins aldéhydiques se lient aux protéines par le biais de liaisons covalentes en générant principalement des produits de condensation. Une réaction de double condensation peut également conduire à la formation de produits réticulés. Ces produits de condensation sont généralement issus de la réaction de formation d'imines par condensation de la fonction carbonyle de l'agent réticulant avec la fonction amine libre de certains acides aminés de ladite protéine (notamment la fonction c-aminée de la lysine). Les tannins aldéhydiques sont en particulier utilisés dans trois principaux domaines d'application. Le premier domaine d'application est celui de la préparation de matériaux protéiques, par exemple des cuirs, des pièces moulées, des fibres textiles, des capsules pharmaceutiques ou alimentaires, des films photographiques, des pièces automobiles et des boutons, à partir de caséines de lait, de zéines, de collagènes, de protéines de soja, de sang d'abattoir, de gélatines, réticulées le plus souvent au formaldéhyde. Pour les cuirs, le tannage par les agents aldéhydiques consolide la structure du collagène en créant des liaisons entre des groupements du tannin aldéhydique et au moins deux groupements appartenant à la chaîne peptidique. Des cuirs particuliers peuvent être ainsi obtenus. Le deuxième domaine d'application est celui du tannage des protéines destinées à la fabrication de compositions 35 filmogènes pour revêtements, enrobages ou adhésifs. On utilise par exemple couramment pour le collage de papiers, de cartons, de particules, de bois ou d'autres matériaux, des colles préparées à partir de gélatine, de protéines de sang, de protéines de poisson, de caséines de lait et de protéines végétales, dans lesquelles est ajouté généralement du formaldéhyde ou du glyoxal, afin d'améliorer la résistance à l'eau et à l'humidité du joint de colle ainsi que ses caractéristiques adhésives. Le troisième domaine d'application est celui du tannage des protéines destinées à l'alimentation notamment des ruminants, pour la fabrication de protéines dites résistantes . Les protéines résistantes sont alors des protéines modifiées de telle manière à ce qu'elles soient moins dégradées 15 par certaines enzymes microbiennes dans le rumen. Cependant, après passage dans le rumen, ces protéines retrouvent une digestibilité satisfaisante quand elles arrivent dans la caillette et dans l'intestin grêle. Le pH acide et les enzymes de la digestion libèrent en effet les protéines et les rendent ainsi à nouveau disponibles. Cette opération de tannage autorise donc une meilleure assimilation de la ration alimentaire par les ruminants, conduisant à de meilleures performances zootechniques (amélioration des productions de viande et de lait). Cependant, l'inconvénient majeur des tannins aldéhydiques utilisés dans ces trois domaines d'application, est leur forte toxicité. L'un des aldéhydes les plus couramment utilisés, parce que très réactif, est le formaldéhyde (encore appelé formol sous son nom d'usage technique). Or, cet agent chimique est parmi les plus toxiques et les plus dangereux des tannins aldéhydiques à manipuler, car il est à l'état gazeux à température ambiante. Dans le domaine de l'alimentation des ruminants, pour remédier à cet usage de substances actives, mais trop toxiques, il a été proposé par exemple dans le brevet EP 284.548 de mettre en uvre une réaction de tannage au moyen d'une catégorie particulière d'aldéhydes, e.g. les aldoses. Il s'agit ici du xylose, du ribose, du mannose, du lactose et du glucose. Ces molécules sont non toxiques, contrairement aux tannins aldéhydiques classiquement utilisés. Cependant, l'enseignement de ce brevet révèle qu'il est nécessaire de contrôler finement la réaction de tannage de manière à obtenir ce que les auteurs de ce brevet appellent un produit de condensation de Maillard précoce plutôt qu'un produit de Maillard intermédiaire . Il est en outre indispensable de sélectionner un aliment qualifié d'orthodoxe , i.e. contenant un groupe de protéines à fonction amine libre présent dans l'aliment dans un rapport 1,5 à 1 par rapport aux protéines totales. Il faut enfin hydrolyser le produit de condensation à un pH inférieur à 4, et en limiter le pourcentage de sucres réducteurs. Le procédé décrit dans le brevet EP 284.548 est donc bien trop lourd à mettre en uvre. A côté des aldoses proposés dans le brevet EP 284.548, un seul cétose est évoqué dans ladite demande de brevet. Il s'agit du fructose. Cependant, ce cétose à 6 atomes de carbone n'est considéré qu'en raison de son pouvoir réducteur intermédiaire entre ceux du glucose et du mannose. Ce brevet EP 284.548 ne fait que citer ce cétose sans le recommander véritablement. Aucun autre cétose n'est mis en oeuvre dans le procédé décrit. Par ailleurs, à la meilleure connaissance de la société Demanderesse, les potentialités et les réactivités chimiques d'autres sucres porteurs d'une fonction cétone n'ont jamais fait l'objet d'une exploration pour les domaines d'activité concernés par la présente invention. Le cétose le plus simple de la série des sucres est la dihydroxyacétone (ou DHA), également appelée 1,3-dihydroxy-2-35 propanone, qui est un composé de formule CH2OH-CO-CH2OH. A côté de son utilisation dans le secteur de la cosmétique, mais en applications externes pour ses propriétés de coloration de l'épiderme de la peau (effet auto bronzant ) - utilisée seule ou associée à l'érythrulose - la DHA est surtout connue pour ses propriétés antioxydante, inhibitrice d'odeur et biocide (effet antibactérien et effets antibactérien et antifongique). La DHA est surtout préconisée en mélange avec l'acide pyruvique, notamment pour assurer le contrôle métabolique du contenu en lipides du foie et des adipocytes. Il est alors possible de contrôler par ce biais la balance lipides / protéines chez les mammifères. Cette utilisation est par exemple décrite dans le brevet US 4.351.835 par l'administration orale de pyruvate et de DHA afin d'éviter la prise de poids chez les mammifères, ou dans le brevet US 4.415.575, où leur administration favorise la concentration en protéines chez les animaux. Pour illustrer une autre propriété connue de la DHA, i.e. son effet inhibiteur d'odeurs indésirables, il est décrit dans la demande de brevet JP 50.7803 l'utilisation de la DHA dans la prévention de la résurgence des odeurs d'huiles et de graisses. L'effet biocide de la DHA est quant à lui par exemple décrit dans le brevet CA 1.054.434. Elle est utilisée comme additif alimentaire, notamment pour la préservation d'aliments (poissons, viandes, fruits, légumes...) par mise en contact à température ambiante de l'aliment avec de la DHA. Quant aux cétoses à 4 ou 5 atomes de carbone (i.e. érythrulose, ribulose ou xylulose), contrairement à la DHA, il ne semble pas selon la littérature qu'ils aient fait l'objet de travaux d'étude de leurs propriétés intrinsèques. Ces dernières molécules sont à la connaissance de la société Demanderesse seulement utilisées aujourd'hui comme intermédiaires de synthèse de produits à valeur ajoutée, tels leurs produits d'hydrogénation correspondants (érythritol, ribitol, arabitol et xylitol). De tout ce qui précède, il résulte qu'il existe un besoin non satisfait de disposer d'un substitut d'agents réticulants, notamment d'un substitut des tannins minéraux, de tannins synthétiques et de tannins aldéhydiques, simple à produire et à mettre en uvre, d'une efficacité équivalente, voire améliorée, par rapport aux agents de tannage classiques. La société Demanderesse a donc eu le mérite, au terme de recherches longues et fastidieuses, de proposer d'utiliser au moins un cétose de 3 à 5 atomes de carbone comme substitut d'agents réticulants de protéines. Rien ne suggérait dans l'état de la technique, que l'utilisation d'un cétose de 3 à 5 atomes de carbone puisse convenir au tannage des protéines, et remplacer tout ou partie des agents réticulants habituels des protéines, notamment dans des domaines aussi variés que le tannage de protéines destinées à l'alimentation des animaux, la fabrication de compositions filmogènes pour revêtements, enrobages ou adhésifs et la préparation de matériaux protéiques biodégradables ou renouvelables. De préférence, les agents réticulants substitués totalement ou partiellement sont choisis dans le groupe des tannins minéraux, des tannins synthétiques et des tannins aldéhydiques. Le cétose de 3 à 5 atomes de carbone selon l'invention est choisi dans le groupe constitué par la dihydroxyacétone, l'érythrulose, le ribulose et le xylulose, et est préférentiellement la dihydroxyacétone. La société Demanderesse a trouvé que la réactivité du cétose de 3 à 5 atomes de carbone utilisé comme substitut d'agents réticulants est fonction de son poids moléculaire (i.e. de son nombre de carbone). Les cétoses choisis peuvent ainsi être classés de l'espèce la plus réactive (DHA à 3 atomes de carbone) à l'espèce la moins réactive (xylulose et ribulose à 5 atomes de carbone). Le choix de l'un ou l'autre cétose sera donc fonction du degré de réticulation souhaité ou du domaine d'application visé. Selon un premier mode d'utilisation d'un cétose de 3 à 5 atomes de carbone, la société Demanderesse a démontré qu'un tel cétose pouvait convenir efficacement et être recommandé pour réticuler des protéines destinées à l'alimentation des animaux. Celles-ci peuvent être choisies en particulier dans le groupe constitué par les protéines animales, de céréales, de protéagineux, d'oléagineux et de tubercules, comme notamment les tourteaux de soja, les tourteaux de colza, les protéines du lait, les protéines du pois, de la luzerne, les protéines du tournesol, du lupin, des arachides, du coton, de l'orge, du millet, du sorgho, les protéines du maïs, du blé (notamment le gluten) et du riz, les protéines de la pomme de terre et du manioc. 1l peut être utilisé de manière indifférenciée chacun des quatre cétoses de 3 à 5 atomes de carbone comme agents de substitution des tannins aldéhydiques. La société Demanderesse recommande cependant d'utiliser préférentiellement la DHA comme substitut du formol pour le tannage des protéines destinées à l'alimentation des animaux, notamment des ruminants ou des animaux de compagnie, ou en aquaculture. Le choix de la DHA comme substitut d'un agent de tannage aldéhydique est en soi remarquable, car à la meilleure connaissance de la société Demanderesse, la DHA n'a jamais été décrite pour le tannage des protéines destinées à l'alimentation du bétail. En effet, la réticulation des protéines vise ici l'obtention de protéines résistantes, de protéines moins solubles et moins biodisponibles dans le rumen, alors que la DHA n'est jusqu'à présent utilisée que pour ses propriétés auto-bronzantes. Par rapport aux protéines natives à partir desquelles elles sont préparées, la société Demanderesse a démontré que les condensats de protéines résistantes obtenues par un traitement par la DHA présentent un contenu en acides aminés modifié, plus particulièrement en certains de leurs acides aminés à fonction amine libre, telles la lysine, l'arginine, la glutamine et l'asparagine. La société Demanderesse a trouvé que les acides aminés se retrouvent dans la protéine sous la forme de produits modifiés de condensation simple, voire double avec la DHA. La DHA se condense préférentiellement par exemple avec la 10 lysine et l'arginine en formant des imines. Une double condensation peut conduire à des produits réticulés. Par ailleurs, la société Demanderesse a démontré que la présence du groupement hydroxylé en alpha de la fonction carbonyle de la DHA conduit à ce que l'imine obtenue par condensation sur un acide aminé terminal puisse se cycliser avec la fonction carboxylique de cet acide pour former une 8-lactone. Des études comparatives menées par la société Demanderesse sur la modification des protéines par le formol ont montré également que parmi tous les acides aminés constitutifs desdites protéines, c'est plutôt la tyrosine qui est modifiée par les réactions de condensation avec le formol, alors que le contenu en lysine et en arginine n'est pas modifié. Sans être lié par une quelconque théorie, il apparaît que c'est cette condensation des cétoses sur la fonction amine libre des acides aminés notamment de type lysine et arginine (pour les tourteaux de colza et de soja), de type glutamine (pour le gluten de blé) qui permet d'expliquer la résistance que présentent les condensats de protéines conformes à l'invention aux attaques enzymatiques et microbiennes subies par lesdites protéines par exemple dans le rumen. En effet, la condensation sur ces acides aminés peut empêcher l'accessibilité des enzymes de dégradation aux 35 protéines, par encombrement stérique ou par modification locale de la configuration desdites protéines. Les protéines choisies dans le groupe constitué par les tourteaux de soja, les tourteaux de colza, les protéines du lait, les protéines du pois et du blé (gluten) se prêtent particulièrement bien au tannage par la DHA. Selon un deuxième mode d'utilisation des cétoses de 3 à 5 atomes de carbone, la société Demanderesse a montré qu'il est possible de substituer avantageusement les réticulants habituels des protéines utilisées pour la préparation de compositions filmogènes pour revêtements, enrobages ou adhésifs. Ces protéines peuvent alors être choisies dans le groupe constitué par les protéines de céréales, de tubercules, d'oléagineux, de protéagineux, de lait, de sang et de tissus animaux, préférentiellement la caséine, la gélatine, la zéine, et les isolats de protéagineux. La société Demanderesse recommande également d'utiliser préférentiellement la DHA. En effet, la DHA présente de remarquables effets insolubilisants et réticulants de protéines, même à température ambiante, que ce soit à pH neutre ou alcalin, comme il sera exemplifié ci- après. Elle permet de ce fait d'améliorer les propriétés mécaniques des films protéiques, tout en ajustant leur résistance à l'eau. La société Demanderesse tient également à insister sur l'intérêt du caractère progressif dans le temps de l'effet réticulant de la DHA, caractère qu'elle a démontré. La DHA convient donc tout particulièrement aux domaines d'application visés, contrairement au formol dont le caractère réticulant instantané induit une prise trop rapide de viscosité. La réactivité lente de la DHA permet de ce fait d'envisager l'emploi de la DHA dans la formulation de compositions destinées à préparer des films d'emballage, de protection, d'enrobage et de surfaçage, plus ou moins solubles dans l'eau. Il peut s'agir de compositions destinées au domaine de la détergence (enrobage de poudres de parfums, d'enzymes...), du traitement de surfaces papetières (papiers, cartons...) de la métallurgie (tôles...), de la construction (enrobage de ciments ou de pigments, films antigraffitis...), de l'agriculture (enrobage de semences, formes retard d'engrais ou de produits phytosanitaires...), vétérinaire (enrobage de vitamines, d'oligoéléments...), pharmaceutique (enrobage ou encapsulation d'actifs) et alimentaire (films barrière, films comestibles, enrobage de produits alimentaires, notamment produits de charcuterie et produits de confiserie) . Il peut s'agir également de compositions destinées à préparer des colles nécessitant une très bonne tenue à l'eau et/ou une excellente adhésivité (liant d'agglomération de particules minérales ou organiques, liant de pigments, colle papiers peints, colle d'étiquetage, colle pour bois, liège, matériaux fibreux). Les compositions filmogènes pour revêtements, enrobages ou adhésifs obtenues selon l'invention peuvent comprendre entre autres, différents additifs tels que des plastifiants, des agents conservateurs, antioxygène, hydrophobes, anticorrosion, des colorants, des parfums ainsi que des principes actifs. Selon un troisième mode d'utilisation des cétoses de 3 à 5 atomes de carbone, la société Demanderesse a démontré la possibilité de réticuler des protéines destinées à la préparation de matériaux protéiques biodégradables ou renouvelables, tels que des films plastiques, des cuirs, des fibres textiles, des gélules, des capsules, ou des compositions protéiques alimentaires. Les protéines peuvent alors être avantageusement choisies dans le groupe constitué par les protéines de céréales, de tubercules, d'oléagineux, de protéagineux, de lait, de sang et de tissus animaux, préférentiellement le collagène, la caséine, la gélatine, la zéine, et les isolats de protéagineux. Il peut s'agir de compositions destinées à l'industrie de l'emballage (films protéiques), l'industrie photographique, l'industrie pharmaceutique (capsules et gélules), l'industrie du caoutchouc (additifs pour pneus), l'industrie textile (fibres protéiques) et à la plasturgie (objets protéiques moulés ou extrudés). Par ailleurs, la société Demanderesse recommande tout particulièrement d'utiliser la DHA comme substitut de tannins minéraux, tel le chrome, ou de tannins aldéhydiques, tel le formol, pour le tannage du cuir. Les autres cétoses de 4 et 5 atomes de carbone sont également utilisables bien que moins réactifs. Pour réticuler les protéines à l'aide d'un cétose de 3 à 10 5 atomes de carbone selon l'invention, on réalise la succession des étapes suivantes qui consiste à : 1) mettre en contact les protéines et au moins un cétose de 3 à 5 atomes de carbone, à une concentration en poids sec du cétose de 0,5 à 20 %, de préférence de 0,5 à 10 % et plus préférentiellement de 0,5 à 5 % par rapport au poids sec des protéines brutes à traiter, 2) maintenir le contact entre les protéines et le cétose pendant une durée supérieure à quelques minutes, de préférence comprise entre 10 minutes et 60 minutes, de préférence pendant 30 minutes, à une température comprise entre 20 et 105 C, de préférence comprise entre 35 et 105 C, 3) et récupérer les protéines réticulées ainsi obtenues. Ce procédé de base est valable quelle que soit la nature du cétose de 3 à 5 atomes de carbone choisi, la protéine à traiter et le domaine d'application visé. La société Demanderesse recommande cependant de faire varier le couple temps / température en fonction du cétose choisi en regard du degré de réticulation visé, comme il sera décrit et exemplifié ci-après. Pour la réticulation à la DHA de protéines destinées à l'alimentation des animaux, la société Demanderesse recommande, dans la première étape du procédé, de mettre en contact les protéines et par exemple la DHA à une concentration en poids sec de DHA de 0,5 à 10 % et plus préférentiellement de 0,5 à 5 % par rapport au poids sec de la protéine brute à traiter. Les protéines ainsi mises en contact sont particulièrement choisies dans le groupe constitué des tourteaux de soja, les tourteaux de colza, les protéines du pois, le gluten soluble, le gluten de blé natif et le lactosérum, comme il sera exemplifié ci-après. La température de mise en contact dans un mélangeur ou un pétrin à retenir est alors plus particulièrement de 45 à 100 C pendant 30 minutes. Les protéines tannées à la DHA ainsi obtenues pour ce domaine sont analysées selon l'invention en termes de: - contenu en azote soluble / azote total, exprimé en %/ sec qui traduit la part de protéines qui n'a pas réagi avec la DHA, par la méthode décrite dans l'article de R. VERITE et C. DEMARQUILLY intitulé Qualité des matières azotées des aliments pour ruminants, dans la revue La vache Laitière, publication INRA 1978, p 154, - composition en acides aminés totaux, déterminée par une méthode mise au point par la société Demanderesse. Cette méthode de détermination de la composition en acides aminés totaux consiste en une hydrolyse acide de 24 heures des protéines et analyse des acides aminés libérés par chromatographie liquide haute pression sur résine échangeuse d'ions Pour l'hydrolyse des protéines, on calcule tout d'abord 25 la pesée d'échantillon qui doit contenir 2,8 mg d'azote dans 14 ml d'HCl 6N. On ajoute ensuite à ladite pesée 14 ml d'HCl 6 N et place sous vide pendant 5 minutes. Après fermeture du tube, on le place à 115 C pendant 30 24 h. On ajoute ensuite 1 ml de Norleucine 10 mM (commercialisée par la société SIGMA) qui servira de témoin d'élution, et filtre la solution refroidie sur fritté. On récupère le filtrat dans un ballon de 250 ml et évapore à sec à + 4 C. On lave le résidu avec 100 ml d'eau et évapore à sec, puis reproduit le lavage deux fois avec 50 ml d'eau et sèche à nouveau. On récupère enfin le résidu sec dans 50 ml du tampon lithium Li 280 (commercialisé par la société LC Tech). Les analyses chromatographiques en CLHP sont effectuées sur colonne échangeuse de cations (colonne référencée 0353150 de la société PICKERING) . l'étalonnage de la colonne est effectué avec 100 l d'une solution standard d'acides aminés (commercialisée par la société SIGMA sous la référence AAS18) et 20 gl de la solution de Norleucine. l de la solution des protéines hydrolysées sont ensuite injectés sur ladite colonne, et les acides aminés sont élués à l'aide d'une solution de ninhydrine à 0,3 ml/min. Les acides aminés détectés par UV à 570 nm sont identifiés et quantifiés sur le chromatogramme obtenu. Comme il sera exemplifié ci-après, la détermination des compositions en acides aminés totaux est effectuée sur des tourteaux de soja traités ou non à la DHA, en les comparant à la composition en acides aminés totaux des mêmes tourteaux de soja traités au formol. Quant à l'utilisation possible des autres cétoses de 4 à 5 atomes de carbone comme substituts d'agents tannants des protéines destinées à cette même application, elle est illustrée par la détermination de la réactivité du xylulose et du ribulose sur la lysine, à une température de 80 C, comme il sera également exemplifié ci-après. Pour la réticulation à la DHA de protéines destinées à la préparation de films, notamment pour la réticulation de caséine, de gélatine ou isolats de protéagineux, la société Demanderesse recommande, dans la première étape du procédé, de mettre en contact la protéine et la DHA à une concentration en poids sec de DHA de 1 à 10 % et plus préférentiellement de 1 à 5 % par rapport au poids sec de la protéine brute à traiter. La mise en contact s'effectue à température ambiante pendant quelques minutes, et les protéines tannées ainsi obtenues sont analysées en termes de viscosité de colles, d'effet insolubilisant, de propriétés des films obtenus (en particulier de résistance mécanique), comme il sera exemplifié ci-après. Pour la préparation de cuirs tannés avec de la DHA, la succession des étapes 1 à 3 décrites plus haut convient également. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples non limitatifs décrits ci-dessous. Exemple 1 On élabore 6 condensats de protéines tannées à la dihydroxyacétone à partir de tourteaux de soja (commercialisés par la société UNEAL), detourteaux de colza (produits par les MOULINS DELSALLE), de protéines de pois (commercialisées par la société COSUCRA sous le nom de marque PISANE HD), de gluten soluble (commercialisé par la société Demanderesse sous le nom de marque VITEN CWS), de gluten de blé natif (commercialisé par la société Demanderesse sous le nom de marque VITEN) et de protéines du lactosérum (commercialisées par la société ARMOR PROTEINES sous le nom de marque PROTARMOR 865). La DEA peut-être utilisée pure (commercialisée par la société SIGMA) ou utilisée directement sous la forme d'un surnageant de fermentation de microorganismes en produisant à partir de glycérol coproduit du diester (DHA dite technique ). Si l'on choisit de la DHA pure, on procède dans un premier temps à la dilution de ladite DHA dans un volume d'eau calculé de manière à ce que le rapport DHA / Protéines en final correspondent à la valeur souhaitée. Il s'agit généralement d'une solution de 10 à 25 % de matière sèche. On attend 30 minutes afin de stabiliser la solution de DHA sous forme de monomères. On rectifie le pH à 6 avec de la soude 0,1 N. On préchauffe les protéines à 100 C dans un pétrin pendant 30 minutes. La DHA est ajoutée, le mélange est homogénéisé et on réalise la mise en contact proprement dite des protéines avec la DHA à la température de 95 à 100 C pendant encore 30 minutes. Les résultats du tableau I suivant permettent d'estimer les propriétés insolubilisantes de la DHA, par la détermination des rapports azote soluble / azote total des 6 condensats de protéines après tannage à la DHA aux doses de 1, 2,5 et 5 % en poids sec/ sec de protéines traitées. Tableau I Soja Colza Pois VITEN' VITEN' Lactosérum CWS Départ 18 21 22 67 8,4 98 1% DHA 5 14 8 52 3 24 2,5 % DHA 3 5 3 53 1 16 5% DHA 3 6 5 Nd 1 10 1 % 5 Nd Nd Nd nd nd formaldéhyde Le rapport azote soluble / azote total diminue d'autant 15 plus que la dose en DHA est élevée, mais un effet significatif est déjà obtenu à la dose de 1 %. L'essai comparatif de tannage des tourteaux de soja avec le formol montre que l'effet d'insolubilisation des protéines réalisé par traitement à la DHA à la dose de 1% est équivalent à celui obtenu avec le formol à la dose de 1 %. La DHA est donc un substitut du formol tout à fait efficace pour le tannage des protéines destinées à l'alimentation des ruminants, de quelque nature qu'elles puissent être. Des essais en parallèle ont été menés sur tourteaux de colza et tourteaux de soja pour étudier l'effet de la température et du temps de contact. Il est ainsi montré que la réaction s'effectue facilement, même à température ambiante, avec un résultat significatif dans les 10 premières minutes de contact. Il a été également noté que le soja est plus réactif que le colza. Le tableau II suivant présente le bilan en acides aminés déterminé sur protéines natives (colza et soja pris comme exemple), puis sur protéines traitées avec 1 % en DHA. Tableau II Soja Colza Soja Acides aminés Natif + DHA Natif + DHA Natif + formol Asp 11,8 11,9 8 8,2 11,8 12 Thr 4,2 4,1 5,1 5,2 3,95 3,8 Ser 5,3 5,4 4, 8 5,2 5,3 4,9 Glu 19,9 20,2 20,1 20,5 19,9 20,2 Gly 4,4 4,6 5,7 5,8 4,4 4, 45 Ala 4,4 4,4 4,8 5,1 4,4 4,45 Val 5,1 5,1 5,7 6,3 5,1 5,3 Ile 4,8 4,9 4, 5 4,5 4,85 5,1 Leu 8,1 8,3 8 8,3 8,1 8,2 Tyr 3,9 4,1 3,4 3,5 4 3,5 Phe 5, 3 5,4 4,5 4,5 5,3 5,3 Lys 6,5 5,8 6,4 5,6 6,5 6,4 His 2,7 2,7 3,1 3,1 2, 8 2,7 Arg 8,1 7,3 8,3 6,9 8,1 8,2 Pro 5,5 5,8 7,6 7,3 5,5 5,5 AA totaux 100 100 100 100 100 100 Le tannage des protéines des tourteaux de soja et de colza avec 1 % de DHA conduit à une diminution de la teneur en lysine de l'ordre de 10,8 % (cas du soja) et de l'ordre de 12,7 % (cas du colza), et à une diminution de la teneur en arginine de l'ordre de 9,9 % (cas du soja) et de l'ordre de 16,9 % (cas du colza), indiquant par la-même que les réactions de condensation de ces protéines avec la DHA ciblent plus particulièrement les fonctions amines libres de ces deux acides aminés constitutifs des chaînes peptidiques. En comparaison, les réactions de condensation du formol avec les protéines du soja se font principalement avec les résidus tyrosine des chaînes peptidiques. Il apparaît ainsi que la DHA, tout comme le formol se combine aisément avec les protéines destinées à l'alimentation des ruminants, avec une réactivité équivalente à celle du formol, la toxicité bien Io évidemment en moins. Exemple 2 On réalise la digestion des tourteaux de soja de 15 l'exemple 1 traités ou non à la DHA à l'aide d'une combinaison d'une a-amylase (Solvay Amylase LF60 commercialisée par la société SOLVAY ENZYMES), d'une cellulase (SPEZYME CP commercialisée par la société GENENCOR) et d'une pepsine (PEPSINE P-7000 commercialisée par la société SIGMA), afin de déterminer le degré de résistance des protéines ainsi obtenues. Ce test in vitro permet d'évaluer l'efficacité de la réaction de tannage et la disponibilité en protéines après le by-pass du rumen. Pour cette évaluation, deux séries de digestion sont 25 alors réalisées en parallèle: - une première série avec deux enzymes (protocole AC), i.e. a-amylase et cellulase, afin d'estimer l'efficacité de la réaction de tannage (protéines résistantes aux enzymes du rumen), - une deuxième série avec les trois enzymes (protocole ACP), i.e. a- amylase, cellulase et pepsine (la digestion à la pepsine traduisant la digestibilité des protéines tannées après le passage dans le rumen). La digestion enzymatique des protéines tannées ou non 35 s'effectue en suivant le protocole suivant: 1) on pèse 2,5 g de produit sec, 2) on ajoute 25 ml d'HCl 0.075 N à pH 4, 3) on agite pendant 1 h à température ambiante (ajuster le pH à 4 si nécessaire), 4) on ajoute 200 l d' a-amylase (à 60.000 MWU/ml.min) et 200 pl (à 90 GCU/ml) de cellulase, 5) on laisse sous agitation pendant 3 heures au bain-marie à 40 C, 6) on ajoute 25 ml d'HC1 0.075 N à pH 1,2, 7) on agite et vérifie le pH (ajuster le pH à 1,5 si nécessaire), 8) on ajoute à cette étape la pepsine (dans le cas du protocole ACP) à raison de 500 l de pepsine à la concentration de 5 g/1, préparée extemporanément, 9) on place alors au bain-marie à 40 C et agite 15 continuellement pendant 20 h, 10) on recueille le digestat, laisse décanter, prélève deux fois 15 ml du surnageant et centrifuge à 4000 rpm pendant 20 min, 11) on récupère le surnageant et peut le congeler pour stockage. La détermination du degré d'hydrolyse des protéines est réalisée par une méthode de dosage des groupements aminés primaires des protéines traitées avec l'acide trinitrobenzène sulfonique (TNBS). Cette méthode consiste à : - ajouter 250 gl de SDS à 5 % (Sodium Dodecyl Sulfate) à 250 il d'échantillon à analyser, - laisser 30 min à 50 C, ajouter 2 ml de tampon phosphate à pH 8,2, - ajouter 2 ml de TNBS à 1 %, placer au bain-marie à 50 C pendant 1 h, - ajouter 4 ml d'HC1 0,1 M, laisser 30 min à température ambiante, - prélever 250 l et lire sur spectrophotomètre à 340 nm. Une gamme étalon est réalisée avec une solution de leucine à 10 mM. Les résultats de digestion enzymatique sur les échantillons peuvent être exprimés en concentration en équivalent leucine (EL) exprimée en mMol/1 ou en % (baisse de la réponse TNBS par rapport à la protéine native). Le tableau III suivant présente les valeurs de digestibilité obtenues pour les tourteaux de soja traités avec des doses variables en DHA (1 et 2,5 %) suivant la mise en oeuvre décrite dans l'exemple 1. Tableau III Concentration Sans Protocole Protocole en DHA traitement AC ACP enzymatique EL % EL % EL % 0 2,40 100 3,17 100 17,03 100 1 % 1,49 62,2 1,97 62,0 14,61 85,8 2,5 % 0,53 22,1 0,68 21,4 9,79 57,5 On constate que plus la dose en DHA est importante, moins les tourteaux sont sensibles à la digestion par 1' a-amylase et la cellulase (traduisant ainsi une bonne protection dans le rumen), tout en permettant une bonne sensibilité à la pepsine qui traduit une biodisponibilité satisfaisante (après le by-pass du rumen). A la dose de 1 % en DHA, les protéines tannées ne sont pratiquement pas digérées (la valeur du % de réponse passe de 20 62,2 à 62 %). Cependant, l'ajout de la pepsine rend disponible de 2,5 % de DHA puisque après des protéines destinées à l'alimentation des ruminants. Des résultats équivalents sont obtenus avec les tourteaux de colza, comme l'indique le tableau IV suivant. plus de 85 % desdites protéines. Toutefois, il est à noter que la dose présente un effet protecteur important, traitement à la pepsine seulement 57,5 % disponibles. La dose de 1 % de DHA est donc à retenir pour le tannage des protéines sont Tableau IV Concentration Sans Protocole Protocole en DHA traitement AC ACP enzymatique EL % EL % EL % 0 1,60 100 2,13 100 8,40 100 1 % 1,32 82,8 1,87 87,7 7,36 87,6 2,5 % 0,81 50,9 1,16 54,4 5,16 61,4 On confirme ainsi que le procédé de tannage à la DHA est 5 plus efficace pour les tourteaux de soja que pour les tourteaux de colza (cf une des conclusions de l'exemple 1). Exemple 3 On évalue l'effet réticulant de la DHA vis-à-vis de la caséine de la manière suivante. On prépare tout d'abord des colles mères de caséine et on utilise ensuite lesdites colles pour la préparation de films par casting . 1) procédé de préparation des colles de caséine On prépare une solution aqueuse à 15 % de matière sèche de caséine H commercialisée par la société SVPC. La solubilisation totale est obtenue par ajustement du pH à 9 par ajout de soude à 200 g/1, chauffage à 50 C et agitation 20 à 1000 tours par minute pendant 20 min. On refroidit cette solution à température ambiante et on incorpore ou non de la DHA sous forme d'une solution à 50 % de matière sèche, en ajustant le pH à 7,5 ou à 9 (DHA de pureté de 97 %, telle que commercialisée par la société SIGMA). Les résultats des mesures de viscosité BROOKFIELD, en fonction du pH, sur les colles de caséine traitées ou non à la DHA (5 % d'une solution à 50 %, soit 2,5 % en sec par rapport à la caséine brute) sont présentés dans les tableau V et VI suivants. Tableau V. Evolution de la viscosité des colles en fonction du pH, sans DHA. PH 7 7,5 8 9 Viscosité BROOKFIELD 6000 4500 5200 5000 à 40 C (mPa.$) Tableau VI. Evolution de la viscosité des colles à pH 7,5 ou à pH 9 avec 2,5 % de DHA. Temps 15 30 1 h 2 h 3 h 12 h min min Viscosité 6500 Nd* Nd Nd 25000 Nd BROOKFIELD à 40 C (mPa.$) Mesurée à pH 7,5 Viscosité 6500 7500 13000 150000 Nd > BROOKFIELD à 40 C 200000 (mPa.$) Mesurée à pH 9 *: Non déterminée L'addition de 5 % de DHA à 50 % de matière sèche (2,5 % en sec/caséine) se traduit, à un pH de 9, par une augmentation très nette mais progressive de la viscosité de la colle. A pH de 7, 5, la prise de viscosité est plus lente, mais notable. Par comparaison, l'addition d'une quantité équivalente de 15 formol s'est traduite par une prise en masse quasi-instantanée de la colle. Ces essais démontrent un effet de réticulation progressive au cours du temps de la caséine par la DHA, à température ambiante, et cela de façon plus rapide à pH 9 qu'à pH 7,5. 2) procédé de préparation des films de caséine obtenus par casting Les films de caséine sont préparés par casting (étalement sur support) à l'aide d'un appareillage SHEEN 1102 réglé à 700 m d'épaisseur, puis séchage lent en 24 h à 20 C et à 65 % d'humidité résiduelle. Les caractéristiques des films obtenus sont présentées dans le tableau VII suivant. Tableau VII Aspect des films sans DHA Aspect des films avec DHA pH 7,5 Films très fragiles, Films fragmentés et fragiles solubles dans l'eau en insolubles dans l'eau quelques minutes pH 9 Films très fragiles, Résistants et flexibles solubles dans l'eau en insolubles dans l'eau quelques minutes lo A pH 7,5 ou 9, avec 2,5 % de DHA en sec/caséine, la tenue à l'eau des films est particulièrement bonne, car les films restent intacts dans l'eau après plus d'une semaine, en présence d'un agent biocide. L'ajout de DHA confère ainsi une excellente tenue à l'eau tout en améliorant les propriétés mécaniques des films. A ce titre, il convient de dire qu'il est impossible de fabriquer de tels films avec addition de formol, en raison d'une trop forte augmentation instantanée de la viscosité des colles. Exemple 4 L'effet insolubilisant de la DHA sur la caséine est estimé par une méthode de détermination de la teneur en matières solubles développée par la société Demanderesse. Elle consiste à introduire 200 ml d'eau déminéralisée dans un bécher de 400 ml, y placer, sous agitation magnétique 5 g exactement de l'échantillon à analyser. On homogénéise pendant 15 minutes à l'aide de l'agitateur magnétique et on centrifuge ensuite pendant 15 minutes à 5500 tours/minute. On prélève 25 ml du liquide surnageant et les introduit 5 dans un cristallisoir taré. On place ledit cristallisoir dans un four à micro-ondes pendant 10 minutes à 600 watts et 5 minutes à 900 watts jusqu'à déshydratation complète de l'échantillon. On le place ensuite dans un dessicateur pour le refroidir à température ambiante. On repèse le cristallisoir et note la masse m de résidu. La teneur en matières solubles (Tms), exprimée en pourcentage en poids du produit, est donnée par la formule suivante: Tms = (m x 200 x 100)/ (25 x 5). Le tableau VIII suivant présente les résultats de solubilités de films de caséine préparés par casting à température ambiante, à partir de solution de caséine à 15 % de matière sèche, selon les conditions données dans l'exemple 3. Tableau VIII Dose de DHA Tms (%) en sec/caséine (%) 0 86 0,5 86 1,5 13,9 2,5 6,7 La solubilité aqueuse des films de caséine est abaissée par l'utilisation de DHA en quantité supérieure à 0,5 % en sec/caséine. La dose de 2,5% est préférée pour obtenir un film quasiment insoluble dans l'eau. Exemple 5 On réalise des essais d'enrobage de comprimés de mannitol (commercialisé par la société Demanderesse sous le nom de marque PEARLITOL DC) par des solutions aqueuses d'isolats de protéines de pois (commercialisés sous le nom de marque PISANE HD par la société COSUCRA). On prépare trois solutions aqueuses de protéines de viscosité voisine de 500 mPa.s à température ambiante (mesurée 5 sur viscosimètre BROOKFIELD): - la première, en dispersant 12 g sec de PISANE HD pour 100 g d'eau à 50 C et en ajustant en final le pH à 9,7 (solution A), - la seconde, en dispersant 12 g sec de PISANE HD et 10 1,2 g de solution aqueuse de DHA à 50 % de matière sèche, pour g d'eau à 50 C et en ajustant en final le pH à 9,7 (solution B), - la troisième, en dispersant 12 g sec de PISANE HD, 1,2 g de solution aqueuse de DHA à 50 % de matière sèche, et 2,4 g de glycérol pour 100 g d'eau à 50 C et en ajustant en final le pH à 9,7(solution C). Chacune de ces solutions est utilisée pour procéder à l'enrobage par pulvérisation de 200 g de comprimés de mannitol placés dans une turbine d'enrobage ERWEKA, tournant à une vitesse de 30 tours/minute, dans laquelle on introduit constamment de l'air sec pulsé à une température de 65 C. Le débit de la solution est tel que l'enrobage est effectué en 45 minutes. L'enrobage protéique final sec représente alors environ 9 % de la masse initiale des comprimés. On évalue la vitesse de fuite du mannitol au travers de l'enrobage protéique en plaçant, sous agitation mécanique, 7,5 g de comprimés dans 45,5 g d'eau déminéralisée, en mesurant la matière sèche (exprimée en brix) apparaissant dans l'eau au cours du temps. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau IX suivant. Tableau IX. Temps Comprimés Comprimés Comprimés Comprimés (min) de de de de PEARLITOI, PEARLITOL PEARLITOL PEARLITOL DC non DC enrobés DC enrobés DC enrobés enrobés avec la avec la avec la solution A solution B solution C 1 2,4 0,4 0,2 0,0 2 5,0 1,4 0,8 0,1 9,0 6,0 3,0 0,4 13,4 9,8 5,4 1,0 14,2 12,0 7,0 1,6 14,5 13,6 9,0 2,9 14,5 13,8 10,4 4,8 14,5 14,0 12,0 9,2 240 14,5 14,5 14,0 14,0 On constate que la fuite de mannitol par dissolution des comprimés est semblable entre les comprimés non enrobés et les comprimés enrobés avec la solution de protéines de pois PISANE HD sans DHA. En revanche, les comprimés enrobés avec les solutions B ou C comprenant de la DHA présentent une fuite en mannitol nettement inférieure, notamment lorsque l'enrobage contient de la DHA en combinaison avec du glycérol. Ces solutions B et C peuvent convenir à la préparation d'enrobage de produits alimentaires, de produits phytosanitaires (à base de pesticides, d'insecticides, d'herbicides, de fongicides...), de produits vétérinaires, de produits pharmaceutiques ou encore de produits industriels (à base d'enzymes, de colorants, de biocides...) pour obtenir des formes retard, des formulations protégées contre le vieillissement (UV, oxydation, température, hydrolyse...) ou des compositions présentant un aspect organoleptique amélioré (brillance, couleur...). Exemple 6 On estime les capacités tannantes du ribulose et du xylulose par le suivi de la réactivité de ces deux cétoses avec l'un des acides aminés les plus réactifs des protéines destinées à l'alimentation des ruminants: la lysine, en comparaison à l'acide glutamique. L'action tannante est normalement obtenue par la liaison de l'aldéhyde avec le groupe E-aminé de la lysine. On a alors la création d'une base de SCHIFF qui donne une couleur jaune aisément détectable. On réalise la mesure de la coloration du milieu réactionnel au cours du temps (mesure de la coloration ICUMSA) 15 de la manière suivante: - on prépare 10 ml de chaque solution mère 1 M de ribulose, de xylulose, de lysine et d'acide glutamique dans de l'eau déminéralisée, à un pH de 6, on ajoute dans un tube à essais 5 ml de l'acide aminé 20 et 5 ml du cétose à tester, - on homogénéise le mélange obtenu et le place à réagir dans un bain d'huile à 80 C, - on arrête la réaction à + 4 C. Le tableau X suivant présente la cinétique de condensation du ribulose et du xylulose avec la lysine et l'acide glutamique, en exprimant les résultats par l'absorbance à 420 nm, traduisant la coloration obtenue. En tant que produits témoins, on réalise en parallèle des essais comparatifs de condensation de la lysine avec le fructose, et des essais de condensation du ribulose et du xylulose avec un acide aminé témoin, l'acide glutamique. Tableau X Temps (min) 0 15 30 60 120 Ribulose Glu 0,033 0,170 0,495 1,252 10,535 Lys 0,086 1, 743 4,653 15,899 38,658 Xylulose Glu 0,096 0,666 0,922 1,930 3,021 Lys 0, 145 2,787 4,324 8,399 17,541 Fructose Glu 0,008 0,021 0,044 0,112 0,280 Lys 0,012 0,019 0,030 0,120 0,519 Il apparaît que le ribulose et le xylulose sont aussi de bons agents tannants pour la protection des protéines. Par ailleurs, il est à noter que la cinétique de complexation sur acide aminé libre est assez rapide, car de premiers produits de condensation apparaissant dans les 15 premières minutes de la réaction. Il apparaît également que le fructose est un mauvais 10 agent tannant et ne convient absolument pas aux domaines d'application visés par la présente invention. Les cétoses à 5 atomes de carbone sont donc suffisamment réactifs pour envisager un tannage efficace des protéines destinées à l'alimentation des animaux, à la préparation de compositions filmogènes, ou encore de matériaux biodégradables ou renouvelables. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins un cétose de 3 à 5 atomes de carbone comme substitut d'agents réticulants de protéines. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les agents réticulants sont choisis dans le groupe des tannins minéraux, des tannins synthétiques et des tannins aldéhydiques. 3. Utilisation selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que le cétose de 3 à 5 atomes de carbone est choisi dans le groupe constitué par la dihydroxyacétone, l'érythrulose, le ribulose et le xylulose, et est préférentiellement la dihydroxyacétone. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait que les protéines sont destinées à l'alimentation des animaux, et sont choisies dans le groupe constitué par les protéines animales, de céréales, de protéagineux, d'oléagineux et de tubercules, comme notamment les tourteaux de soja, les tourteaux de colza, les protéines du lait, les protéines du pois, de la luzerne, les protéines du tournesol, du lupin, des arachides, du coton, de l'orge, du millet, du sorgho, les protéines du maïs, du blé et du riz, les protéines de la pomme de terre et du manioc. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait que les protéines sont destinées à la préparation de compositions filmogènes pour revêtements, enrobages ou adhésifs, et sont choisies dans le groupe constitué par les protéines de céréales, de tubercules, d'oléagineux, de protéagineux, de lait, de sang et de tissus animaux, préférentiellement la caséine, la gélatine, la zéine, et les isolats de protéagineux. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait que les protéines sont destinées à la préparation de matériaux protéiques biodégradables ou renouvelables, tels que des films plastiques, des cuirs, des fibres textiles, des gélules, des capsules, ou des compositions protéiques alimentaires, et sont choisies dans le groupe constitué par les protéines de céréales, de tubercules, d'oléagineux, de protéagineux, de lait, de sang et de tissus animaux, préférentiellement le collagène, la caséine, la gélatine, la zéine, et les isolats de protéagineux. 7. Procédé de réticulation des protéines, caractérisé par le fait qu'il consiste à : 1) mettre en contact les protéines et au moins un cétose de 3 à 5 atomes de carbone, à une concentration en poids sec du cétose de 0.5 à 20 %, de préférence de 1 à 10 % et plus préférentiellement de 1 à 5 % par rapport au poids sec des protéines brutes à traiter, 2) maintenir le contact entre les protéines et le cétose pendant une durée supérieure à quelques minutes, de préférence comprise entre 10 minutes à 60 minutes, de préférence pendant 30 minutes, à une température comprise entre 20 et 105 C, de préférence comprise entre 35 et 105 C, 3) et récupérer les protéines réticulées ainsi obtenues. 8. Protéines réticulées par des cétoses de 3 à 5 atomes 20 de carbone susceptibles d'être obtenues selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.