FR 2871475 A1 20051216 FR 0505753 A 20050606 i DESCRIPTION Titre de l'invention METHODE DE CONDITIONNEMENT DE FORMULATIONS MICROBIENNES Domaine technique Formulation et conditionnement' de mloro-organismes, notamment!es bactéries favorisant l; la croissance des plantes (BFCP) destinés la constitution d'inocula pour les grandes cultures État de la techniqu ri roceoi-a, rés Les coûts relativement élevés associés à. la fermentation, la formulation et le conditionnement d'inooula stables (\VOO1&9501ôAl.VVO2O04X]22O31)ontbeaucoup à voir avec cet état de fait. En effet. de par sa nature la production des grandes cultures non-Le9umrnosea requiert des intrants dont le col:d est suffisamment faible pour rendre économique leur utilisation dans ce contexte de production primaire, secteur où les bénéfices nets et les marges de production sont plutôt faibles par rapport' aux secteurs secondaire (industriels) etiou tertiaire (services). ou encore le secteur biomédicale. pour favoriser oe développement il serait avantageux de contribuer a réduire les coûts de fermentation: de formulation et de conditionnement en combinant autant que possible ces étapes en un seul procédé de fabrication. La présente invention propose donc une méthode de conditionnement en deux parties amovibles et initialement indépendantes tune de l'autre de façon a permettre dans un premier temps la production de la biomasse microbienne par voie de multiplication cellulaire et sa formulation à l'état solide. Cette notion de bio-réacteurs autonomes et constitués de parties amovibles afin de faciliter la manutention de microorganismes existe (WO 97/12029 Al) elle n'a jamais cependant été appliquée à la production industrielle d'un inocula dans le sens de la présente invention. L'étape de production-formulation a déjà été décrite pour l'essentiel dans notre précédente demande de brevet déposée auprès de l'Opic le 31 mai 2004 (Claude 2004 CAZ468.378)Dans un deuxième temps l'invention permet de combiner à cette première partie de l'invention un contenant pour le conditionnement définitif' de Iiinoculum microbien. L'intégration de la production et de la formLriatiorr. ainsi que la possibilité de réutiliser le contenant pour le conditionnement définitif contribue à réduire d'autant plus les coûts de production. Bien que la notion d'intégration de bio procédés comme mesure d'économie n'est pas en soi nouvelle (US 5.047.332) elle na jamars été appliquée à la production d'inocula microbien destinés aux grandes cultures. liquide_fLtforrgula.t.igns non miscibles Dans une précédente demande de brevet (Claude 2004 CA 2,468,376) nous avons décrit un procédé de fermentation et de formulation à l'état solide (FFES) de compositions pour la 6acténsatond'engrais organiques (EO)granulés et/ou d'engrais orgaoo'minénaux(EOW1) applicables en tant qu'engrais de démarrage. Ür, i/ serait aussi avantageux de pulvériser les bactéries favorisant la croissance des plante, ou BFCP, que contiennent ces inocula directement sur des résidus de cultures en les re-suspendant en phase liquide (aqueuse) i la pré bouillie i0 inoculante ainsi constituée peut par la suite être diluée et pulvérisée à l'aide d'un pulvérisateur agricole conventionnel. La présente invention propose un mode de conditionnement permettant la re-suspension et pulvérisation de cette formulation à l'état solide non miscible à l'eau (phase aqueuse). En effet, et malgré les avantages que procure cette technologie FFES, la formulation microbienne qui en résulte reste néanmoins non miscible à l'eau et donc ne peut en soi être pulvérisée en tant que liquide. Par exemple, elle contient des cellules bactériennes favorisant la croissance des plantes, ou BFCP, qui doivent être préalablement resuspendues dans un volume limité d'eau non distillée mais potable et non bactéricide et par la suite versées dans un volume plus important pouvant, lui, être pulvérisé au champ. Ce faisant, les composantes non miscibles à l'eau propres à la FFES, notamment les substrats cellulosiques et les fines particules de sol, doivent être retenus dans un volume d'eau!imité. une pré bouillie. afin de ne pas interférer avec le mécanisme de pulvérisation une fois cette pré bouillie combinée à volume d'eau plus important, disons environ 2 à 300 L pour fin d'application au champ et/ou sur les résidus de culture au sol. Pour ce faire nous avons donc COdÇLI 1- innovation technique suivante. Divulgation de l'invent on L'utilisation de formuiauons de BFCP. produites, formulées et conditionnées à l'état solides et du coup non miscible à l'eau est donc problématique. En effet les supports et substrats carbonés solides, parties intégrantes desdits productions, formulations et conditionnements ne peuvent ce dissoudre dans l'eau le moment venue de re-suspendre en milieux aqueux les BFCP qu'ils contiennent. Cette non dissolution (non miscibilité à !'eau) nuie à la formation d'une bouillie 3.5 (suspension liquide) pouvant être facilement pulvérisée en situations agronomiques au moyen de matéhel agricole pour la pulvérisation liquide. A ce jour, les préparations de micro-organismes, destinées ou non à l'agriculture, sont soit formulées à l'état liquide, ce qui pose des problèmes liés aux délais limité de consen/ation de ces préparations, soit formulées à l'état solide par voie de lyophilisation (*/OO1132G35A1). et/ou par des procédés assimilés (US 4,647537 i WC) 2004/022031; VVO01/37856 A2). Ainsi la production de ce type de fonnu! tionà l'état solide pose de sérieux problèmes de coûts de fabrication lorsque lesdits inocula sont destinés à un usage agronomique. Enfin, et en d'autres mots. le problème technique est donc que ces formulations de BFCP produites et formulées à l'état solide sont peu ou pas miscibles à l'eau et ne peuvent être dissoutes pour fin de pulvérisation aqueuse. Nous proposons donc de retenir à [aide d'une membrane inerte poreuse et résistante les constituants pailleux et teiluriques de cette formulation au moment de l'aout d'une quantité d'eau suffisante pour permettre a ne-suspension des cellules BFCP qu'ils abritent !0 Méthode de conditionnernent multifonctionnelle et partiellement réutilisable pour formulations non miscibles à Feaud'uiocuia microbiens destinés à la production végétale. Lesdits inocula sont retenus. hors de la phase aqueuse à l'aide d'une membrane inerte et poreuse permettant cependant de resuspendre dans la phase aqueuse qui ui est immédiate les micro- organismes ainsi produits et formulé à l'état solide. En ce yens, nous avons déjà mis au point un procédé de fermentation et formulation à l'état solide, ou FFE8. (Claude 2004; CA 2,408.378) permettant de combiner les étapes de production et de formulation de biomasses microbiennes, avantageusement de type bactérien i en principe, cette combinaison est source d'économies en terme de coûts de fabrication. La présente invention elle, permet de contenir ladite formulation non miscible à l'eau ainsi produite et formulée et de re-suspendre les micro- organismes qu'elle oontienti la formulation microbienne non miscible à !'eau (phase aqueuse) devient donc versable et est ultimement pulvérisable. En ce sens, l ' a c t i v i t é propre à l'invention repose sur quatre faits o Intégration de la fermentation, la formulation et le conditionnement des inocula microbiens desbmésà l'agriculture. Cette intégration favorisera ia réduction des coûts de production dans son ensemble. Possibilité de verser, dans le réservoir d'un pulvérisateur conventionnel par exemple, des cellules bactériennes sans avoir à dissoudre préalablement un co-formulant inerte. Cette dissolution pourrait dans bien des cas provoquer chez les bactéries en question un choc osrnolytique et un.fort taux de mortalité, Ne pas avoir à recourir a la lyophilisation etlou à unque!conquoséohagoàv/de. procédés de déshydratations normalement associées à une certaine mortalité cellulaire, souvent de l'ordre de plus 90% des cellules initialement présentes. La FFES permet d'induire et d'assurer la compétence édaphique de cellules bactériennes favorisant la croissance des plantes, ou BFCE. isolées selon notre précédent brevet (FR 2. 833 016). Elle combine donc production, et assurance et contrôle de la qualité (AQCQ) dans un seul procédé. d'où une certaine réduction des coûts de production dans son ensemble. l0 L'invention à l'avantage de permettre le conditionnement et l'application au champ et par pulvérisation liquide d'une préparation microbienne inoculante formulée à l'état solide et pourtant pour l'essentiel non miscible à !'eau En effet: étant donné que la pulvérisation aux champs de divers intrants à la production agricole tel que les herbicides et les fongicides est fréquemment utilisée, est avantageux de pouvoir faire de même avec des formulations microbiennes, notamment es formulations de bacteries favorisant la croïssance des plantes, ou BFCP. En effet, la pulvérisation d'une phase aqueuse à l'avantage de favoriser le contact intime entre lesdites !0 cellules bactériennes et le ou les substrats qui leur sont destinées. Les préparations inoculantes versables et donc pulvérisables sont généralement formulées à l'état liquide, ce qui en facilite effectivement I utilisation, mais réduit aussi considérablement leurs délais de conservation étant donné la présence d'eau favorable à l'activité métabolique des micro-organismes. Les formulations ë l'état solide obtenues par séchage et/ou!yophi!isadon, bien que avantageuses en terme de délais de conservation, de miscibilité et de manipulation (stockage) sont cependant hors de prix en ce qui concerne l'application de tels inocula au champs, notamment directement sur des résidus de cultures. La onnci pale utilité de invention consiste donc à. permettre la resuspension, le versement et éventuellement la pulvérisation liquide de la formulation non miscible à l'eau de micro' organismes, .formulation avantageusement produite par fermentation à l'état solide. Elle permet aussi de combiner partiellement les étapes de production (fermentation et formulation) et de conditionnement, contribuant ainsi à une certaine économie en termes de coûts de fabrication. Le design bipartite (cf Dessina) de l'invention lui aussi confer effectivement certains avantages i 2 o réduction des volumes tant au niveau de la production (Le. pourquoi occuper une aire de production avec un volume à 80%- dédié à recevoir la phase aqueuse qu' ultimement introduite par l'utilisateur finale; u réduction des coûts de conditionnement puisque la partie servant qu'au conditionnement està usage multiple et neoyr!ab!edirectament par l'utilisateur final qui n'a pas à la racheter à chaque fois - la cor'nposante protection de l'environnement est en sens non négligeable u il n'est plus nécessaire d'assurer la fixation de la membrane poreuse sur la paroi d'un contenant unique après y avoir introduit la formulation à 'état 'état solide des microorganismes puisque celle-ci est intégrée soit à !a partie du bas dédiée à !a FFES (Type 2) soit constituée par le sachet immersible (Type il), 3.5 u l'invention permet d'assurer l'essentiel de la multiplication cellulaire du produit inoculant déjà sous sa forme quasi définitive dans!e contenant même conçu pour son conditionnement. Cela o pour avantage de réduire apprécablernent les étapes pré conditionnement et post productions normalement prévues pour ce type de produit. u l'invention permet de reconstituer séparément une bouillie concentrèe sans mortalité appréciable des cellules BFCP par effet d'osrnolvse, dans la mesure où le concentré est Introduit dans ie ré ':r'oN Fu pulvérisateur. En ce sens: ii est avantageux di introduire environ 1010 p/p de glycérol au moment du conditionnement. u l'Invention évite d'avoir a introduire un sachet perméable contenant la formulation inoculante directement dan le réservoir du pulvérisateur, ce qui est impossible dans la plupart des cas étant donnée la taille de la dose hectare et. les dimension dudit réservoir. Brève description des dessins La méthode de conditionnement comprend deux parties Dune; dite partie du bas (Type 2 Figure 2), ou sachet (Type 1 Figure 1), contenant l'inocula microbien produit et formulé à l'état solide, et l'autre, dite partie du haut, contenant éventuellement et au moment de l'utilisation final de produit, la phase aqueuse, avantageusement de l'eau potable non bactéricide. La partie comprenant l'inocula microbien formulé à l'état solide et non miscible dans l'eau ou toute autres phases aqueuses non bactéricides, peut être de deux types 1) un sachet libre et non fixé introduit postérieurement un peu à la façon dune sachet de thé dans une théière (Type 1 Figure 1), ou 2) un compartiment vissable >>, dit la partie du bas u, à la partie du haut devant servir à recevoir la phase aqueuse (Type 2 Figure 2) ; la partie du bas comprend un grille rigide (a) capable de soutenir une membrane poreuse (b) capable de laisser filtrer les microorganismes. Nous considérons que ce dernier type (i.e. Type 2) est le plus avantageux dans la plupart des cas envisagés. Afin de permettre d'actionner le mécanisme du pas de vis l'ensemble des deux parties est avantageusement circulaire et cylindrique (Figure 3), bien qu'en principe l'invention est applicable à d'autres mécanismes de fixation des parties des deux parties. Il est cependant avantageux de disposer le bec verseur de façon décentré (Figure ' ) pour faciliter le versement de la pré constituée une, fois la phase aqueuse ajoutée et les micro-organismes resuspendus (Figure 4). Comme de raison, la phase aqueuse ne peut être ajoutée qu'une fois les deux parties réunies. La partie contenant la phase aqueuse est avantageusernet conçue d'une matière inerte et plastifiée, non bactéricide et pouvant donc être réutilisée par l'utilisateur ultime; la partie du bas, ou le sachet dans le cas du Type 1, contenant la formulation à l'état solide est en principe jetable après utilisation. La partie contenant l'inocula microbien produit et formulé à l'état solide peut servir de bio réacteur pour la production de l'inocula par voie de FFES (Claude 2004. CA 2,468,376). La membrane poreuse permettant de laisser filtrer les cellules microbiennes, avantageusement des BFCP, tout en retenant les substrats carbonés et énergétiques ainsi que l'essentiel des fines particules de sol, peut être fixer au sommet de cette partie du bas (figure 3b), combinant ainsi les étapes de production et de formulation a l'état solide; l'installation de la partie du haut devant contenir la phase aqueuse au dessus de cette partie du bas permet enfin de combiner l'étape de conditionnement à cet ensemble bipartite et trifonctionnel. Les dimensions produites au Figures 1 à 4 sont qu'indicatives. Cela dit. l invention est ?i' avantageusement réalisée en conditionnements de 1 à 10 L de phase aqueuse. Meilleur mode de réalisation de l'invention Deux variations de cette invention sont présentées (1) retenir au sein d'un sachet, non fixé (libre) à l'intérieur du contenant à la façon du sachet de thé, les 300 g de formulation non miscible à l'eau !aa0OO m! d'au potable non stérile étant ajoutés par après (Type 1., figure 1). (2) retenir au fond d un contenant les 300 o de formulation les 900 mi d'eau potable non stérile sont ajoutés et le contenant agité pendant quelques minutes afin de permettre la re- suspension desdites cellules (Type 2. figure 2) ; Comme de raison, le bec verseur et l'orifice qui lui est propre doivent dans ce cas-ci être dimensionnés de façon à permettre facilement l'introduction dudit sachet. Enfin, il est avantageux dans les deux cas de placer, au niveau du bec verseur du flacon, une membrane poreuse filtrante grossière afin de retenir d'éventuels débris. De part sa conception, l'invention permet d'intégrer au sein d'un seul procédé de fabrication les étapes de (1) production des biomasses microbiennes par fermentation et multiplication cellulaire, (2) de formulation à l'état solide à même les substrats carbonés et énergétiques et enfin, (3) de conditionnement définitive. En ce sens, et d n point de vue bic) industriel il est avantageux de séparer le contenant en deux parties. une partie servant à !a production et la formulation, la FFES en d'autre mots, et l'autre partie servant pour le conditionnement définitif de l'inoculum. Pout l'invention selon le Type 1, il s'agit de transférer la formulation produite par FFES (Claude 2004 0,4 2,466.376) vois un sachet fart d'une matière non biodégradable à court terme. le nylon par exemple, d'une maille suffisamment fine pour ne pas laisser passer librement les fines particules de sol. Ce sachet devra être de dimension suffisamment importante pour laisser libre cours à l'inocula et son support solide, un peu comme peut le faire du thé dans un sachet de thé conventionnel. Il faut sceller ce sachet, à l'aide d'un soudeur à matière plastique par exemple non exclusive, et y disposer si necessaire un oellet renforcé à l'une de ses extrémités ce sachet servira à infuser la bouillie inoculante à introduire dans le pulvérisateur peu avant le traitement plein champ des résidus de culture. Le sachet peut aussi être placé directement dans le pulvérisateur si aucun mécanisme d'agitation ne vient mettre en question son intégrité. Placer ce sachet dans une enveloppe de matière souple et étanche (plastique) et la sceller, awantsgeusementà l'aide d'un soudeur à matière plastique par exemple, sous vide ce sachet prêt à l'emploi peut être conservé einsi plus de 6 mois, préférablement dans un endroit frais t sec, tout en assurant. un titre cellulaire d'eu moins 10 cellules (azoto)bactériennes par gramme d'!nmnu!m ainsi constitué. Pour l'invention selon le Type 2, le contenant dans son ensemble est détachable de haut en bas. La partie dite du haut, une fois fixées sur celle dite du bes, est conçue pour revoir la phase aqueuse permettant de re-suspendre les micro-organismes, avantageusement des bactéries favorisant la croissance des plantes; cette partie est aussi /éuti!is b!e. La partie dite du bas est conçue pour permettre la production des biomasses microbiennes par voie de fermentation (multiplication cellulaire) et leur formulation à l'état solide, avantageusement selon un procédé dit de fermentation et formulation à !'état solde, ou FFES. tel que décrit dans Claude (2004, CA 2.488.376); cette partie, bien que recyclable, est conçue,pour usage unique. Nous considérons que le Type 2 est le design le plus avantageux dans la plupart des cas envisagés. Exemples d'applications industrielles et agronomiques Les formulations non miscibles sont, avantaQeusement, celles décrites dans notre précédente demande debrevet (Claude 2OD4.CA2.4OS.378) Les contenants peuvent être de différentes tailles: avantageusement de un à cinq!itres, voire 10 L. préférablement en plastiques non bactéricides. De cette façon, il est possible de pro6uire, de formuler et de conditronner indépendamment ces quantités d'inoculum, une peu comme on le ferait pour certains types de fromages produits en caves individuellement et en ce sens essentiellement pré conditionnés. Les membranes poreuses doivent laisser passer les cellules bactériennes tout en retenant l'essentiel des particules cellulosiques et de sol pouvant éventuellement nuire au fonctionnement du pulvérisateur, soit de tailles supeneures à 200 micromètres. L'eau servant à la te-suspension doit être potable et non bactéricide. Les conditions de pulvérisation peuvent par la suite être conventionnelles. Une fois la re-suspension des cellules réalisée, il est avantageux de la verser et d'effectuer la pulvérisation liquide dans les plus brefs délais. Il est avantageux de laisser la fermentybonà ''état sourie se poursuIvre usqu'a l'humidité relative de e composition soit d'environ 10à 15%. Les sachets (figure 1) et la partie du bas (figure 3b) peuvent avantageusement être scellés sous vide afin de contribuer à optimiser le délais de conservation des préparations qu'ils contiennent. Enfin, i!avantmgeuxdeconoevoir!ea!otsdaproduchnnannueUemant.deedé!aisde conservations plus long étant souvent limitatifs. Les cellules micnmbiennes, notamment les cellules BFCP, doivent être resuapmndeb!es, une trop forte adhésion aux résidus de culture ou aux fines particules de sol nuira à resuspension. Cela dit, des titres cellulaires post-production par une telle FFES rapportés dans notre précédente demande de brevet (Claude 2004 CA 2,468,376) furent. effectivement déterminés par simple re-suspension aqueuse des bactéries ainsi produites or, ces titre cellulaires furent pour l'essentiel satisfaisant, laissant croire que lesdites cellules sont en effet détachables. Enfin, comme de raison un trop grand délai entre la re-suspension et la pulvérisation pourrait aussi provoquer une forte mortalité des cellules microbiennes l0 Références Claude. P-P. 2001. sNiouvelles biomasses bactériennes. leur protocole d'obtention, et leur utilisation pour la bactérisation de sols et de résidus de cultures. Brevet français FR 2 833 016. ti Claude, P-P. et L. Fiiiion 2004. Effet de rapport d'un inoculum bactérien aux résidus de culture de maïs-grain au soi sur le rendement et la qualité de blés d'hiver panifiables en France. Agrosol 15 i_ 1: 23-29. Claude, P-P. 2004. Compositions pour la bactérisation d'engrais organiques (EO) granulés et d'engrais or gano-mine aux (, EOM i destinés aux cultures agronomiques non-L.egu"rn r osea. Demande de 1 0 brevet canadien déposée auprès de l'Opic le 31 mai 2004, no. de dépôt: CA 2,468, 376. REVENDICATIONS Les réalisations de l'invention au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué sont définies comme il suit; 1 Méthode de conditionnement de formulations microbiennes caractérisée en ce qu'elle comprend i (a) unefonnulmLion (produite et) formulée à l'état solide et (b une contenant devant recevoir la phase aqueuse permettant de re-suspendre les micro-organismes contenus dans ladite formulation. i0 2 Méthode de conditionnement selon la revendication 1 caractérisée en ce que la formulation à l'état solide est non-miscible à l'eau. 3 Méthode de conditionnement selon l'une quelconque nevendabon 1 à 2 caractérisée en ce que la formulation est inorganique ou organique. 4. Méthode de conditionnement selon lune quelconque revendcation 1 à 3 caractérisée en !j ce que la co-formulation contient des fines particules de sols, ou leurs analogues. 5. Méthode de conditionnement selon la revendication 1 caractérisée en ce que le contenant comprend un volume suffisant pour permettre ladite resuspension des micro-organismes, avantageusement de 1 5ou1OL 6. Méthode de conditionnement selon la revendication 5 caractérisée en ce que le contenant 20 est soit fermé et intégrale, soit non-fermé et vissable n sur la parue du bas contenant ladite. 7. Méthode de conditionnement selon l'une quelconque revendication 1 à 6 caractérisée en ce que le contenant fermé contient un sachet: infusabio constitué d'une membrane poreuse adéquate et renfermant ladite formulation microbienne non-miscible à l'eau. 8. Méthode de conditionnement selon l'une quelconque revendication I à 6 caractérisé en ce que le contenant non-fermé est vissable sur la partie du bas contenant ladite formulation microbienne non-miscible à l'eau. 9. Contenant intégral contenant un sachet infusable permettant la resuspension d'une formulation microbienne non-miscible à l'eau ou toute phase aqueuse non-bactéricide. 10 Contenant amovible, non-fermé et vissable sur la partie du bas contenant ladite formulation mioro-biennenon-miscible à l'eau. 11 Méthode de condtionnement de formulation microbiennes permettant la pulvérisation!iquided'unepré'bouiUieisau*de!mre'nuspenoionaqueuoedomicrourganisrnosro' formu!éesurunsupport.subatratet/ouexpédientnon'miscib!eà eau et/ou toutes autres 31 solutions pulvérisables et non-bactéricides.