FR 2871169 A1 20051209 FR 0405945 A 20040602 Procédé pour déterminer la sensibilité ou la résistance d'isolats de rétrovirus aux traitements thérapeutiques rétroviraux à base d'inhibiteurs de la protéase virale. L'invention concerne un procédé pour déterminer la sensibilité ou la résistance de rétrovirus tel que le VIH aux traitements thérapeutiques à base d'inhibiteurs de la protéase virale, par l'utilisation de levures. Autrement dit, l'invention vise l'utilisation de la levure pour déterminer la résistance ou la sensibilité de la protéase virale aux molécules chimiques utilisées dans le cadre des protocoles thérapeutiques. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention permet de déterminer rapidement et à bas coût, le phénotype de résistance de la protéase du VIH-2 chez des patients infectés. Le procédé selon l'invention permet également une recherche à "haut débit" de nouvelles molécules chimiques ayant une activité inhibitrice de la protéase virale, en vue de la mise au point de nouveaux traitements thérapeutiques. Les agents étiologiques du SIDA sont les virus de l'immunodéficience humaine du type 1 et 2. Ces virus, qui partagent certaines caractéristiques cliniques et biologiques, présentent des différences majeures, notamment en ce qui concerne les modalités de l'infection de l'hôte. Ainsi, l'infection par le VIH-2 est plus difficile que celle par le VIH-1 (Ancelle, R., O. Bletry, A. C. Baglin, F. Brun- Vezinet, M. A. Rey, and P. Godeau, 1987, Long incubation period for H1V-2 infection. Lancet. 1:688-9; Marlink, R., P. Kanki, 1. Thior, K. Travers, G. Eisen, T. Siby, 1. Traore, C. C. Hsieh, M. C. Dia, and E. H. Gueye. 1994. Reduced rate of disease development after HIV-2 infection as compared to HIV-1. Science. 265:1587-90;. Adjorlolo-Johnson, G., K. M. De Cock, E. Ekpini, K. M. Vetter, T. Sibailly, K. Brattegaard, D. Yavo, R. Doorly, J. P. Whitaker, and L. Kestens. 1994. Prospective comparison of mother-to-child transmission of HIV-1 and HIV-2 in Abidjan, lvory Coast. JAMA. 272:462-6; Marlink, R. 1996. Lessons from the second AIDS virus, HIV--2. AIDS. 10:689-99.), la charge virale plasmatique des individus infectés par le VIH-2 est moins élevée que celle des individus infectés par le VIH-1 (Andersson, S., H. Norrgren, Z. da Silva, A. Biague, S. Bamba, S. Kwok, C. Christopherson, G. Biberfeld, and J. Albert. 2000. Plasma viral load in HIV-1 and HIV-2 singly and dually infected individuals in Guinea-Bissau, West Africa: significantly lower plasma virus set point in HIV-2 infection than in HIV-1 infection. Arch. Intern. Med. 160:3286-93; Popper, S. J., A. D. Sarr, K. U. Travers, A. Gueye-Ndiaye, S. Mboup, M. E. Essex, and P. J. Kanki. 1999. Lower human immunodeficiency virus (HIV) type 2 viral load reflects the difference in pathogenicity of HIV-1 and HIV-2. J. Infect. Dis. 180:1116- 21.), et les individus infectés par le VIH-2 présentent une évolution vers la maladie plus lente (Vittinghoff, E., S. Scheer, P. O'Malley, G. Colfax, S. D. Holmberg, and S. P. Buchbinder. 1999. Combination antiretroviral therapy and recent declines in AIDS incidence and mortality. J. Infect. Dis. 179:717-20; Blanco, R., Carrasco, L., and Ventoso, 1. 2003. Cell killing by HIV-1 protease. J. Biot. Chem. 278:1086- 93; Liu,H., Krizek,J. and Bretscher,A. 1992. Construction of a GAL 1- regulated yeast cDNA expression library and its application to the identification of genes whose overexpression causes lethality in yeast. Genetics 132:665-673). Le VIH-2 a été identifié pour la première fois en Afrique de l'Ouest en 1986 (Clavel, F., D. Guetard, F. Brun-Vezinet, S. Chamaret, M. A. Rey, M. O. Santos-Ferreira, A. G. Laurent, C. Dauguet, C. Katlama, and C. Rouzioux. 1986. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science. 233:343-6). Dans cette région, la prévalence d'infections à VIH-2 varie entre 1% et 10% (Langley, C. L., E. Benga-De, C. W. Critchlow,1. Ndoye, M. D. Mbengue-Ly, J. Kuypers, G. Woto-Gaye, S. Mboup, C. Bergeron, K. K. Holmes, and N. B. Kiviat. 1996. HIV--1, HIV-2, human papillomavirus infection and cervical neoplasia in high-risk African women. AIDS. 10:413-7; Poulsen, A. G., B. Kvinesdal, P. Aaby, K. Molbak, K. Frederiksen, F. Dias, and E. Lauritzen. 1989. Prevalence of and mortality from human immunodeficiency virus type 2 in Bissau, West Africa. Lancet. 1:827-31; Wilkins, A., D. Ricard, J. Todd, H. Whittle, F. Dias, and A. Paulo Da Silva. 1993. The epidemiology of HIV infection in a rural area of Guinea-Bissau. AIDS. 7:1119-22). La majorité des cas d'infections par le VIH-2, en dehors de l'Afrique occidentale, se trouve dans les pays européens et plus particulièrement au Portugal où les individus infectés par le VIH-2 représentent 13% de la population infectée par les virus de l'immunodéficience humaine (Soriano, V., P. Gomes, W. Heneine, A. Holguin, M. Doruana, R. Antunes, K. Mansinho, W. M. Switzer, C. Araujo, V. Shanmugam, H. Lourenco, J. Gonzalez-Lahoz, and F. Antunes. 2000. Human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) in Portugal: clinical spectrum, circulating subtypes, virus isolation, and plasma viral load. J. Med. Virol. 61:111-6). En France il a été estimé que 1% de la population infectée par le VIH l'est par le virus du type 2. Dans les pays développés, les individus infectés par le VIH-1 et/ou par le VIH-2 sont traités par une thérapie chimique, composées de molécules ayant une activité inhibitrice pour l'une ou l'autres des deux enzymes virales: la Transcriptase Inverse et la Protéase. Bien que ce traitement ait contribué significativement à réduire la morbidité et la mortalité causée par l'infection à VIH (Pale/la, F. J., Jr., K. M. Delaney, A. C. Moorman, M. O. Loveless, J. Fuhrer, G. A. Satten, D. J. Aschman, and S. D. Holmberg. 1998. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV Outpatient Study Investigators. N. Engl. J. Med. 338:85360; Vittinghoff, E., S. Scheer, P. O'Malley, G. Colfax, S. D. Holmberg, and S. P. Buchbinder. 1999. Combination antiretroviral therapy and recent declines in AIDS incidence and mortality. J. Infect. Dis. 179:717-20), certains cas d'échec thérapeutique ont été observés. La possibilité d'amplifier, à partir de l'ARN plasmatique ou de l'ADN cellulaire des individus infectés par le VIH-1 et en échec thérapeutique, a permis de comprendre au niveau moléculaire, l'inefficacité spontanée ou progressive des traitements thérapeutiques. La détermination notamment de la séquence nucléique des deux enzymes virales Transcriptase Inverse et Protéase, a montré l'apparition d'un certain nombre de mutations. Les résultats obtenus lors des études in vitro, dans lesquelles une souche virale sauvage (donc sensible aux traitements) portait lesdites mutations, ont clairement démontré l'implication de ces mutations dans la résistance du virus aux traitements. Les chercheurs ont donc mené un certain nombre de travaux sur ces mutations ainsi que sur les résistances qu'elles génèrent, afin d'orienter et guider le choix du traitement thérapeutique et d'optimiser son efficacité. Malheureusement, les stratégies économiques des laboratoires ont conduit la plupart du temps au désintéressement général de la communauté scientifique quant au traitement des patients infectés par le VIH-2 (les populations les plus touchées par le VIH-2 étant principalement celles des pays en voie de développement), ou ont conduit à des solutions inadaptées: traitements, tests et analyses trop coûteux, diagnostics trop longs ou impossibles à mettre en oeuvre sur place, absence de structures compétentes dans le pays concerné, etc. Ainsi, les résultats obtenus lors des différentes études menées sur le VIH-2, ne sont pas suffisamment consistants pour permettre de formuler une corrélation entre une mutation particulière de la protéase du VIH-2, et un phénotype de résistance. Par ailleurs, la progression de la maladie étant plus lente chez les individus 30 infectés par le VIH-2 que chez ceux infectés par le VIH-1, le décomptage de cellules T CD4, ainsi que la détermination de la charge virale plasmatique ne rendent pas compte d'une manière rapide de l'émergence de souches résistantes chez les patients sous traitement. II existe aujourd'hui trois compagnies qui fournissent le profil de résistance d'une souche de VIH isolée d'un patient infecté. Conceptuellement les trois tests se ressemblent. La première étape consiste à isoler le fragment d'ADN codant pour la protéase virale, par la technique de PCR (réaction en chaine de polymérisation), à partir d'un échantillon de sang du patient. Par la suite, une lignée cellulaire d'origine humaine (en général) est transfectée avec ce fragment d'ADN et un pseudo-virus qui est délété de la protéase. Les transfectants sont mis en culture en présence de différents inhibiteurs de la protéase virale et la lecture de l'inhibition de l'activité protéasique se fait par mesure d'un seule cycle de réplication du virus créé, en général par un test colorimétrique. Les compagnies sont: Viralliance (France), qui produit PhenoscriptTM, Virco (Belgique) qui produit AntiviogramTM, et Virologic (Etats Unis) qui produit PhenoSenseTM. Dans les trois cas, le test est un service qui est fourni par et chez la compagnie productrice (il semblerait qu'un profil complet coûterait actuellement entre 800 et 1000 euros par échantillon). Le délai existant entre le moment où le matériel biologique arrive aux Laboratoires et le moment où le profil de résistance est établi, varie, pour chaque souche de VIH-1, entre deux et trois semaines. Les informations sur ces tests se trouvent aux adresses internet suivantes: http://www.vircolab.com http:/Iwww.phenosense. com/professional/213a.htmI http://www.viralliance.com/html/phenoscriptl. html Dans ces conditions, la mise sur le marché d'un test fidèle, rapide, simple à mettre en oeuvre et peu onéreux est devenue impérative. Un tel test permettrait d'aider les médecins traitant à suivre l'apparition de souches résistantes chez les patients notamment infectés par le VIH-2, et en particulier pour les populations démunies. Par ailleurs, ce test pourrait également être utilisé pour une recherche à "haut débit" de nouvelles molécules ayant une activité inhibitrice de la protéase du rétrovirus. L'invention propose de répondre à cette exigence en permettant la définition rapide et à bas coût du phénotype de résistance de la protéase du VIH-2 chez les patients infectés, grâce à l'utilisation de la levure. Le procédé mis au point dans cette invention peut aussi être mis en oeuvre pour définir le phénotype de résistance de la protéase du VIH-1, ou de la protéase de tout autre rétrovirus. Un article scientifique apparu en 2003 avait démontré que l'expression de la protéase du VIH-1 par la levure Saccharomyces cerevisiae induisait la mort de celle-ci par un mécanisme encore méconnu, ayant pour conséquence la lyse cellulaire de la levure en question (Blanco, R., Carrasco, L., and Ventoso, I. 2003. Cell killing by HIV-1 protease. J. Biol. Chem. 278:1086-93). Nous avons démontré dans notre laboratoire, que le même phénomène se produisait quand les levures exprimaient la protéase du VIH-2. En conséquence, en inhibant l'activité enzymatique virale avec les principes actifs utilisés dans les différents traitements antirétroviraux et ciblant la protéase virale, nous avons réussi à empêcher l'apparition de cet événement cellulaire. Cette inhibition étant dose dépendante, nous avons pu mesurer d'une manière quantitative la sensibilité et la résistance de la protéase d'individus infectés aux différentes molécules inhibitrices. Le procédé selon invention permet donc de déterminer, dans le contexte cellulaire de la levure, le phénotype de sensibilité de la protéase virale de rétrovirus tel que le VIH-2, aux drogues à activité inhibitrice. Autrement dit, il permet de déterminer la sensibilité ou la résistance d'isolats de rétrovirus tel que le VIH (virus de l'immunodéficience humaine), aux molécules chimiques ayant une activité inhibitrice sur la protéase virale ou aux traitements thérapeutiques à base d'inhibiteurs de la protéase virale, caractérisé par l'utilisation à cette fin, d'au moins une levure dont la lyse cellulaire est induite par l'expression de la protéase du rétrovirus. Les buts, caractéristiques et avantages ci-dessus du procédé selon l'invention ressortiront mieux encore de la description qui suit. De façon schématique, le procédé selon l'invention comporte un vecteur d'expression, le choix du système cellulaire, le mode d'expression de protéases d'individus infectés et le test de susceptibilité aux drogues. Il comprend les étapes suivantes: - extraction des acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir de cellules (sanguines ou autres) prélevées sur l'individu ou l'animal infecté par le rétrovirus, par tout moyen approprié amplification des séquences codant pour la protéase du rétrovirus à étudier recombinaison du fragment d'ADN, produit final de l'amplification, et d'un vecteur d'expression permettant l'expression de la séquence codant pour la protéase du rétrovirus à étudier sous contrôle d'un promoteur inductible connu, et co- transformation du vecteur recombiné avec au moins une cellule de levure dont la lyse cellulaire est induite par l'expression de la protéase du rétrovirus culture de la ou des cellules de levure co-transformées afin d'obtenir un nombre de transformants suffisant pour effectuer les tests de sensibilité ou de résistance, et récupération des transformants issus de la cellule cotransformée, sur tout support approprié incubation des transformants en présence de concentration croissante de chaque inhibiteur de protéase virale à tester - comptage des cellules vivantes Description détaillée d'un exemple préféré de mise en oeuvre du procédé selon l'invention: 1- Préparation du vecteur d'expression: Nous avons créé une version modifiée du vecteur pRS316-Gall/10, qui comporte le promoteur inductible Gall/10 en position 5' du site de clonage du gène à exprimer (Liu,H., Krizek,J. and Bretscher,A. 1992. Construction of a GAL 9-regulated yeast cDNA expression library and ifs application to the identification of genes whose overexpression causes lethality in yeast. Genetics 132:665-673). De ce fait, le gène est exprimé quand les cellules transformées avec ce vecteur sont en présence de Galactose, et le gène n'est pas exprimé lorsque les cellules transformées sont en présence de Glucose comme source de carbone. Le but de la modification est de pouvoir sous-cloner le gène de la protéase de chaque individu étudié et de transformer la levure avec le plasmide obtenu par une procédure simple et rapide ( a single step procedure ). Pour réaliser la version modifiée du vecteur d'expression pRS316-Gal 1/10, 30 nous avons échangé le fragment BamHl-Sacl de ce site par un autre fragment d'ADN encadré lui aussi par les sites de restriction BamHI-Sacl qui contient (de 5' à3'): É le site de restriction BamHl, unique dans le vecteur, suivi par É les 39 nucléotides de la séquence du VIH-2 situés juste en amont de la 5 protéase, suivis par É un site de restriction Notl, unique dans le vecteur, suivi par É les 37 nucléotides de la séquence du VIH-2 situés juste en aval de la protéase, suivis par É le site de restriction Sacl, unique dans le vecteur. La séquence de ce fragment est la suivante: 5'GGATCCGGAGACACCATACAGGGAGCCACCAACAGCGGCCGCAGTAG AGCCAATAAAAATAATGCTAAAGCGAGCTC 3' 2- Choix du système cellulaire Toute souche sauvage de laboratoire de levures avec les marqueurs d'auxothrophie nécessaires afin de permettre la sélection du transformant 20 exprimant la protéase virale, et de préférence toute souche sauvage de laboratoire de Saccharomyces cerevisiae. 3- Sous-clonage des protéases d'individus infectés par le rétrovirus, et transformation de levures dans un seul step . La séquence d'ADN codant la protéase du VIH-2 est amplifiée par la technique de PCR, deux fois. La première a pour objet de produire une quantité suffisante d'ADN. Cette réaction se fait à partir d'ADN extraits de lymphocytes du sang périphérique d'individus infectés. Les amorces nucléotidiques utilisées sont: É Amorce sens: 5'GAAAGAAGOOCCGCAACTTC3' É Amorce antisens: 5'GGGATCCATGTCACTTGCCA3' La deuxième amplification a pour objet d'encadrer la protéase d'un codon d'initialisation de la transcription (ATG) ainsi que d'un codon de terminaison de la transcription (TAA) et ajouter de part et d'autre les séquences d'environ quarante nucléotides que nous avons apportées au vecteur lors de sa modification. Cette réaction de PCR se fait sur le produit de la première PCR avec les amorces suivantes: É Amorce sens: 5'CGAGGATCCGGAGACACCATACAGGGAGCCACCAACAGC GGCCGCGCCATGCCTCAATTC3' É Amorce antisens: 5'GCGGAGCTCGCTTTAGCATTATTTTTATTGGCTCTACTG CGGCCGCTTAA GATT3' La cotransformation du vecteur pRS316-Gall/10 clivé par l'enzyme de restriction Notl avec le produit de la deuxième PCR permet, par l'événement de recombinaison homologue qui a lieu dans la cellule, d'obtenir une cellule de levure transformée, portant la séquence de la protéase du VIH-2 sous contrôle du promoteur inductible Gal (figures 1 et 2) 4- Le test On prélève un échantillon de sang périphérique de l'individu infecté par le VIH-2. Les lymphocytes issus de ce prélèvement sont purifiés et leur ADN extrait par les méthodes connues. Cet ADN subi les deux réactions de PCR précitées afin de créer le fragment d'ADN, portant la séquence de la protéase, compatible avec le vecteur d'expression pour induire le phénomène de recombinaison homologue dans la cellule transformée. Après purification du produit de la deuxième PCR une souche de levure ayant un génotype ura3 est co-transformée avec le vecteur pRS316GaI1/10 linéaire (par son site Notl). Les transformants produisant potentiellement la protéase sont récupérés sur tout support approprié, tel que par exemple la gélose, composée d'agar, d'un milieu synthétique carencé en uracile et en Glucose comme source de carbone. Environ 105 cellules, issues d'un seul transformant, sont déposées et répartis dans douze puits d'une plaque à 96 puits, et incubées en galactose en présence de 11 concentrations croissantes de chaque inhibiteur à tester. Le douzième puits ne contient pas d'inhibiteur. Après 48 heures à 30 C, les cellules vivantes sont dénombrées par une 20 lecture densitométrique à 600nm (figure 3). La dose nécessaire pour inhiber de moitié la croissance cellulaire dans ces conditions, par rapport à la croissance cellulaire en absence de drogues et en présence de glucose (IC50) définie la susceptibilité ou résistance de cette souche spécifique. L'intervalle de temps entre la prise de sang et la définition du profil de résistance est seulement d'une semaine. 12 REVENDICATIONS 1. Procédé pour déterminer la sensibilité ou la résistance d'isolats de rétrovirus tel que le VIH (virus de l'immunodéficience humaine), aux molécules chimiques ayant une activité inhibitrice sur la protéase virale ou aux traitements thérapeutiques à base d'inhibiteurs de la protéase virale, caractérisé par l'utilisation à cette fin, d'au moins une levure dont la lyse cellulaire est induite par l'expression de la protéase du rétrovirus 2. Procédé pour déterminer la sensibilité ou la résistance d'isolats de rétrovirus tel que le VIH, aux molécules chimiques ayant une activité inhibitrice sur la protéase virale ou aux traitements thérapeutiques à base d'inhibiteurs de la protéase virale, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: extraction des acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir de cellules (sanguines ou autres) prélevées sur l'individu ou l'animal infecté par le rétrovirus, par tout moyen approprié - amplification des séquences codant pour la protéase du rétrovirus à étudier recombinaison du fragment d'ADN, produit final de l'amplification, et d'un vecteur d'expression permettant l'expression de la séquence codant pour la protéase du rétrovirus à étudier sous contrôle d'un promoteur inductible connu, et co-transformation du vecteur recombiné avec au moins une cellule de levure dont la lyse cellulaire est induite par l'expression de la protéase du rétrovirus culture de la ou des cellules de levure co-transformées afin d'obtenir un nombre de transformants suffisant pour effectuer les tests de sensibilité ou de résistance, et récupération des transformants issus de la cellule cotransformée sur tout support approprié incubation des transformants en présence de concentration croissante de chaque inhibiteur de protéase virale à tester comptage des cellules vivantes déduction du phénotype de résistance 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'amplification des séquences codant pour la protéase du rétrovirus à étudier consiste en: a. une première amplification par la technique de PCR à partir d'ADN extraits de lymphocytes du sang périphériques d'individus infectés, en utilisant les 10 amorces nucléiques suivantes: É Amorce sens: 5'GAAAGAAGOOCCGCAACTTC3' É Amorce antisens: 5'GGGATCCATGTCACTTGCCA3' b. une seconde amplification par la technique de PCR à partir des produits de la première amplification, en utilisant les amorces nucléiques suivantes: 15 É Amorce sens: 5'CGAGGATCCGGAGACACCATACAGGGAGCCACCAACAGC GGCCGCGCCATGCCTCAATTC3' É Amorce antisens: 5'GCGGAGCTCGCTTTAGCATTATTTTTATTGGCTCTACTG 20 CGGCCGCTTAA GATT3' 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce que le vecteur d'expression utilisé est le plasmide pRS316-Gall/10 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que le vecteur d'expression utilisé est le plasmide pRS316-Gall/10 dans lequel le fragment BamHl-Sacl est remplacé par un autre fragment d'ADN consistant en (de 5' à 3') : É le site de restriction BamHl, unique dans le vecteur, suivi par É les 39 nucléotides de la séquence du retrovirus situés juste en amont de la 30 protéase, suivis par É un site de restriction Notl, unique dans le vecteur, suivi par É les 37 nucléotides de la séquence du rétrovirus situés juste en aval de la protéase, suivis par É le site de restriction Sacl, unique dans le vecteur. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que la levure utilisée est du genre Saccharomyces cerevisiae 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6 caractérisé en ce que le milieu de culture des cellules de levure co-transformées est carencé en glucose 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7 caractérisé en ce 15 que l'incubation des transformants est en galactose