FR 2868841 A1 20051014 FR 0403782 A 20040409 2868841 1 METHODE D'IDENTIFICATION DE COMPOSÉS ACTIFS SUR LA RÉPLICATION DU VIRUS HIV. La présente invention concerne le domaine du criblage de composés pour leur activité sur la réplication d'un virus du type VIH. Le VIH est un rétrovirus de la famille des lentivirus. Le génome viral du VIH est composé d'un ARN de 9KB codant pour les trois protéines essentielles précurseurs communes à tous les rétrovirus, Gag, Pol, Env, et pour de nombreuses protéines régulatrices, spécifiques du VIH (Figure 1). Le VIH est le plus complexe des rétrovirus et au total le génome viral code pour 13 protéines dont 8 essentielles et 5 de régulation. L'ARN viral messager est épissé pour donner un ARN de 4KB et un ARN de 2KB. L'ARN de 4KB servira de matrice pour synthétiser la Gp120, la Gp4l et trois protéines de régulation, Vif, Vpr et Vpu. L'ARN de 2KB est à l'origine de trois autres protéines régulatrices, TAT, Rev et Nef. Les protéines virales essentielles: Membrane (env) : gp120 gp4l Protéines de structure (gag) : Matrice p17, Capside p24, Nucléocapside Ncp7 Enzymes virales (pol) : RT p66, Intégrase INT p32, Protéase p9 Les protéines de régulation: Tat, Rev, Vpu, Nef, Vpr, Vif Les lentivirus se différencient des autres rétrovirus par leur capacité à infecter des cellules non multipliantes (monocytes, macrophages). Cette capacité infective nécessite entre autres que le matériel viral compétent pour assurer le processus 2868841 2 d'intégration (complexe de préintégration) puisse franchir la membrane nucléaire. Cette aptitude à la translocation cytoplasme-noyau est due aux propriétés de certaines protéines virales, notamment de Vpr qui semble jouer un rôle clé dans ce processus. Vpr est une protéine basique de 14 kDa et de 96 amino acides qui confère un avantage réplicatif significatif pour les virus qui l'expriment. Cet effet, négligeable dans les cellules en voie de multiplication active, devient important dans les monocytes et macrophages en phase Go. Les virions exprimant Vpr présentent un cycle réplicatif plus rapide et la production de particules est elle-même légèrement augmentée. Cette augmentation de production est nettement prononcée pour HIV-1 et HIV-2 dans les macrophages. Parmi toutes les protéines accessoires, Vpr est la seule qui soit incorporée dans le virion, probablement par une interaction avec le précurseur Gag p55 via son domaine c-terminal et la protéine p6 (Lu et al., 1995). L'association de Vpr avec le virion indique clairement son niveau d'intervention dans les étapes précoces du cycle viral. On envisage que Vpr pourrait agir au niveau des étapes de transcription inverse, de translocation ou d'intégration en stabilisant les structures de type ADN-ARN ou ADN-ADN. Un effet de Vpr au niveau de l'étape de préintégration a été suggéré en l'identifiant comme composant participant avec la protéine de matrice Gag p17 et l'intégrase (IN) au transport vers le noyau du complexe de préintégration (PIC) dans les macrophages à l'état stationnaire (Heinzinger et al., 1994) . Comme montré sur la figure 2 Vpr semble faire partie intégrante du complexe de translocation composé des protéines du PIC, dont certaines présentent 2868841 3 un NLS classique, de l'alpha importine et de nucléporines. Ce complexe semble être compétent pour la translocation cytoplasme-noyau via le pore nucléaire. Par ailleurs, un nouveau concept permettant d'expliquer l'entrée du PIC dans le noyau a été proposé par Segura-Totten et Noronha (Segura-Totten et Wilson, 2001; Noronha et al, 2001). Le modèle suggère que Vpr, détaché du CPI, entre dans le noyau par les pores nucléaires et désorganise la structure filamenteuse de la lamina présente sous l'enveloppe nucléaire. Cet événement induirait la décondensation de la chromatine et la rupture momentanée de l'enveloppe nucléaire permettant ainsi au PIC de pénétrer dans le noyau. Il est remarquable de constater que dans les cellules infectées, Vpr a une localisation essentiellement nucléaire. Vpr semble interagir spécifiquement avec une protéine cellulaire et est transportée vers le noyau selon un mécanisme différent de celui observé en présence d'un signal de localisation classique. Vpr pourrait enfin agir également en transactivant modérément le LTR et augmenter ainsi le niveau de l'expression des gènes viraux. Cette transactivation serait suffisante pour promouvoir l'activité du LTR immédiatement après l'intégration et avant la synthèse de la protéine Tat (Hrimech et al., 1999; Sawaya et al., 2000; Vanitharani et al., 2001). L'interaction de Vpr avec certains facteurs de transcription comme TFIIB et Spl serait à la base de ce mécanisme (Agostini et al., 1999 et Wang et al., 1995). Vpr semble par ailleurs interférer avec les processus de multiplication cellulaire. Cette découverte découle de l'observation selon laquelle, des cellules de rhabdomyosarcome (TE671 et RD) et 2868841 4 d'osteosarcome (D17) infectées par le VIH entraient dans un processus de différenciation accompagné d'un blocage de la multiplication (Levy et al, 1993). Il a aussi été montré que cette protéine indépendamment de tout contexte viral bloque le cycle cellulaire en G2. Une des hypothèses émises à ce jour est que Vpr, en s'associant à la Ser/Thr-protéine phosphatase PP2A, qui ellemême intervient dans la régulation de la PKC, pourrait bloquer le cycle cellulaire. A noter incidemment que PP2A est la cible de l'acide okadaique, une toxine produit par le dinoflagellé Prorocentrum lima. En fait l'action de Vpr tant sur le plan de son implication dans l'infectivité du VIH que sur celui de la perturbation du cycle cellulaire reste énigmatique. Toutefois, il est important de remarque que: - Vpr semble jouer un rôle prépondérant dans l'infection par le VIH des cellules quiescentes ce qui est cohérent avec son action présumée de facilitation de la translocation du complexe de préintégration du cytoplasme vers le noyau. De ce point de vue, la perturbation de cette activité fonctionnelle représente une approche thérapeutique possible. - Introduit dans une cellule, en dehors de tout contexte viral, Vpr induit clairement le blocage du cycle cellulaire. Sur le plan théorique, cela peut être mis à profit dans un objectif d'action antiproliférative en cancérologie. Il a maintenant été observé que des cellules infectées par le VIH montrent d'une manière constante des modifications structurales du réseau 2868841 5 d'actine, notamment au niveau périnucléaire. Ces modifications sont caractérisées par la formation d'invaginations d'actine au niveau de la membrane nucléaire dont l'apparence est celle de filopode La croissance des filopodes intervenant habituellement au niveau des membranes cellulaires est le résultat d'un processus de polymérisation de l'actine G qui donne naissance à de long filament d'actine F. La polymérisation de l'actine est sous le contrôle d'un certain nombre de protéines cellulaires dont certaines sont capables d'induire sa polymérisation. C'est notamment le cas de la protéine WASp qui interagit et est activée par Cdc42-GTP, et peut ensuite stimuler la polymérisation des filaments d'actine en activant le complexe nucléateur Arp2/3. C'est également le cas de la zyxine qui contribue à la structuration de l'ensemble du cytosquelette et intervient dans les processus de motilité. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont ainsi permis de montrer que la protéine Vpr pourrait moduler la dynamique de polymérisation de l'actine expliquant ainsi les modifications structurales des réseaux d'actine périnucléaire et éventuellement la perturbation du cycle cellulaire. Il a également été mis en évidence que l'éventuel effet inhibiteur de PP2A pourrait également aller dans le sens d'une facilitation de la polymérisation de l'actine dans la mesure où ces phosphatases se trouvent être des modulateurs de la LIM kinase qui elle-même intervient dans l'inhibition de la cofiline, protéine impliquée dans la déstructuration de l'actine F. Ainsi, 2868841 6 l'inhibition de la phosphatase induit l'activation de la Lim kinase, elle-même induisant l'inhibition de la cofiline. A ce jour, le ou les mécanismes responsables de l'effet de Vpr sur la dynamique de l'actine ne sont pas connus. La très forte augmentation de la constante de vitesse de polymérisation ainsi que la valeur très élevée de la concentration d'actine F à l'état stationnaire, observée en présence de Vpr, suggère un mécanisme différent de celui de la phalloïdine, qui en se fixant préférentiellement sur l'actine F stabilise la forme polymérisée. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont donc permis de mettre en évidence que Vpr exerce in vitro une forte augmentation de la cinétique de polymérisation de l'actine cellulaire présente dans des extraits de fibroblastes. Cet effet est considéré comme une activité fonctionnelle de Vpr impliquée dans le processus de translocation cytoplasme-noyau du complexe de préintégration du VIH-1 dans les cellules quiescentes infectées par le virus. En conséquence, les agents inhibiteurs de la polymérisation d'actine induite par Vpr peuvent être considérés comme des inhibiteurs de la fonction de Vpr ayant potentiellement un effet inhibiteur du cycle réplicatif du VIH-1 agissant au niveau de la translocation cytoplasmenoyau du PIC. La présente invention a donc pour objet une méthode d'identification de composés capables d'agir sur la réplication d'un virus du type VIH, caractérisée en ce que l'on analyse la polymérisation de l'actine induite par la protéine vpr, un fragment ou 2868841 7 un dérivé de celle-ci sur une cellule ou un extrait cellulaire comprenant de l'actine, en présence dudit composé. Les composés mis en évidence grâce à la méthode de l'invention constituent des candidats pour le développement d'inhibiteurs de la réplication des virus et donc pour le traitement du SIDA. Avantageusement, la méthode de l'invention comprend l'analyse de la polymérisation de l'actine en présence et en absence de Vpr. Ainsi, la mise en uvre du test comprend la mesure de la dynamique de la polymérisation de l'actine cellulaire d'une part en présence de 5 pM de Vpr et d'autre part en absence de Vpr (contrôle). Selon une forme de réalisation particulière de la méthode de l'invention, le démarrage de la polymérisation d'actine est obtenu par l'introduction dans le milieu réactionnel d'un tampon contenant 500 pM d'ATP et 1 mM de MgC12. La méthode de l'invention peut être mise en uvre avec des concentrations fixes ou des concentrations variables du composé à tester. Celui-ci est ajouté dans le milieu réactionnel de préférence avant l'induction de la polymérisation d'actine par Vpr. La cinétique de polymérisation de l'actine des extraits cellulaires est mesurée par l'augmentation de l'anisotropie de fluorescence (AF) d'actine G-alexa utilisée comme traceur et ajoutée dans les extraits cellulaires. 2868841 8 La variation d'anisotropie est mesurée en continu par exemple dans un appareil BEACON 2000 (PanVera). Le paramètre de la dynamique de polymérisation d'actine mesuré dans la méthode de l'invention est de préférence la valeur d'anisotropie de fluorescence au plateau (état stationnaire). Dans les conditions de mesures standard, le plateau de polarisation de fluorescence (anisotropie) est obtenu après 2 à 5 minutes d'incubation et reste stable pendant plusieurs dizaines de minutes. Dans un souci de standardisation, les valeurs d'anisotropie sont évaluées 10 minutes après l'induction de la réaction. Les mesures effectuées sont alors les suivantes: - Valeur de l'AF au plateau en présence de Vpr. - Valeur de l'AF au plateau en présence de Vpr et du composé à tester. - Valeur de l'AF au plateau en absence de Vpr. - Valeur de l'AF au plateau en absence de Vpr et en présence du composé à tester Cela permet de discriminer un effet inhibiteur de polymérisation d'actine, d'un effet inhibiteur de Vpr (polymérisation de l'actine Vprdépendante). L'actine cellulaire est par exemple obtenu par la préparation d'extraits de fibroblastes de souris. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention ont également consisté à caractériser le processus d'activation de la 2868841 9 polymérisation de l'actine par Vpr en identifiant les domaines peptidiques responsables de cet effet. Ainsi, un fragment actif de la protéine Vpr susceptible d'être mis en uvre dans la méthode de criblage de la présente invention est choisi dans le groupe comprenant les fragments 52-96 et 60-80 ou un sous- fragment de ceux-ci. La séquence du fragment 52-96 est donnée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.4. La séquence du fragment 60-80 est donnée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.5 Un fragment actif de la protéine Vpr préféré est constitué ou comprend le domaine de l'hélice alpha 3 de ladite protéine ou une partie de celui-ci. Ainsi, un fragment tout préféré est le fragment 55-75 du domaine de l'hélice alpha 3 de la protéine Vpr. En effet, les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention ont tout particulièrement mis en évidence que le sous-domaine 55-75 de l'hélice alpha 3 de la protéine Vpr, vectorisé dans des cellules malignes induit une réapparition des filaments d'actine et une restauration des interactions intercellulaires, ce qui correspond à une réversion du phénotype tumoral. La séquence du fragment 55-75 est donnée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.6. La méthode décrite ci-dessus pour identifier les fragments actifs de la protéine peut également être utilisée pour identifier des dérivés de la protéine Vpr ou de ses fragments entrant dans le 2868841 10 cadre de la présente invention. On entend en effet par dérivés, des protéines ou peptides dont la séquence est obtenue à partir celle de la protéine Vpr ou de ses fragments, en supprimant, ajoutant ou modifiant un ou plusieurs acides aminés. Il peut aussi s'agir de modifications chimiques opérées à l'une ou l'autre des extrémités de la protéine ou du fragment ou au niveau de la chaîne latérale d'un ou plusieurs des acides aminés. A titre d'exemple de tels dérivés, on peut citer les formes cyclisées. La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en uvre de la méthode décrite précédemment. Un tel kit comprend: - un extrait ou lysat cellulaire contenant de l'actine, - de l'actine marqué, par exemple par un fluorophore, par exemple ALEXA 488, - un tampon de polymérisation de l'actine, - un tampon général d'actine (tampon G: tampon de dilution de l'extrait ou lysat cellulaire contenant de l'active), - la protéine vpr purifiée, un fragment ou dérivé de celle-ci, - avantageusement un mode opératoire. D'autres avantages et caractéristiques de la méthode de l'invention apparaîtront des exemples de qui suivent. 1) Identification des domaines peptidiques actifs sur la polymérisation de l'actine. 20 25 2868841 11 La figure 3 représente la structure tridimentionnelle complète de Vpr obtenue par RMN (Wecker et al.Eur. J. Biochem. 269, 3779-3788 (2002). Cette structure relativement symétrique entre les domaine N et C terminal avec trois hélices alpha structurées bien caractérisées. La structure tertiaire, en forme de trapèze semble également bien stabilisée par la présence des deux "tours" en 34-36 et 52-54 malgré la présence des zones flexibles adjescentes (foncées). Les hélices sont amphiphatiques et se caractérisent par une alternance d'acides aminés hydrophiles et hydrophobes. Cette architecture induit une répartion dissymétrique des résidus hydrophiles et hydrophobes comme indiqué dans la figure 4. Il convient de noter que certains domaines ont un caractère hydrophobe marqué, telle l'hélice alpha 3 qui présente dans sa séquence 11 leucines ou isoleucines. Afin d'obtenir des informations sur les domaines de Vpr responsables de la polymérisation de l'actine, les fragments peptidiques de Vpr ci- dessous ont été synthétisés: Vpr (1-96) : SEQ ID NO.l Vpr (1-51) : SEQ ID NO.2 Vpr (70-96) : SEQ ID NO.3 Vpr (52-96) : SEQ ID NO.4 Vpr (60-80) : SEQ ID NO.5 Vpr (55-75) : SEQ ID NO.6 L'effet de ces différents fragments peptidiques a ensuite été testé sur la polymérisation de l'actine endogène des cellules 3T3 EF. Le paramètre retenu est la valeur de la quantité d'actine F présente à l'état stationnaire. 25 30 2868841 12 Il convient de remarquer que la protéine virale de nucléocapside NCp7 qui est également une protéine virale basique présente dans le complexe de préintégration, exerce un effet plus faible que Vpr, mais significatif sur la dynamique de l'actine. 2) Cellules et préparation des extraits. Les fibroblastes 3T3 sont cultivés selon les techniques courantes. Les cellules sont lavées dans un tampon usuel. Les membranes cellulaires sont ensuite rompues en utilisant les procédés usuels. Les extraits bruts sont centrifugés à 10 000 g pendant 30 min, puis le surnageant est filtré avec un filtre à 0,45 m. Le surnageant est complété avec du sucrose à 150 mM final, de l'ATP et du DTT. Le surnageant est aliquoté et conservé à -80 C. 3) Composition des milieux réactionnels standard. Extraits de cellules de fibroblastes 3T3: 0,20 mg/ml de protéines Actinealexa 500 pM (G-acti-alexa 488, molecular probes) ATP: 500 pM MgCl2: 1 mM Vpr: 5 pM Molécule à tester: 5 pM pour un test robotisé. Concentrations variables (max 5 pM) pour un test manuel. 4) Expérience contrôle sans Vpr. Pour le test manuel, la réaction se déroule dans une cuvette du Beacon 2000. 25 2868841 13 Dans un aliquote d'extrait cellulaire est ajouté 1 mM d'actinealexa. La réaction de polymérisation est induite par l'addition d'un volume égal à celui de l'extrait d'un tampon contenant ATP 1 mM, MgCl2 2 mM. La variation d'anisotropie de fluorescence est mesurée automatiquement toutes les 30 secondes. 5) Expérience contrôle avec Vpr. La séquence des opérations est identique à celle précédemment décrite en présence d'une concentration finale de Vpr de 5 pM. La protéine Vpr est ajoutée avant l'addition du tampon de polymérisation. 6) Expérience en présence de molécule à tester. Les conditions expérimentales et la séquence des opérations sont identiques aux expériences contrôles en présence de concentrations variables de molécules à tester (ajouter avec Vpr avant l'induction de la polymérisation d'actine). 7) Test robotisé. Le test est adaptable à la robotisation en utilisant des plaques de 96 puits. Dans ce cas, les molécules testées sont ajoutées à la concentration finale de 5 pM. 8) Test de criblaqe d'inhibiteurs de Vpr a) Rappel Vpr exerce in vitro une forte augmentation de la cinétique de polymérisation de l'actine cellulaire présente dans des extraits de fibroblastes. 30 2868841 14 Cet effet est considéré comme une activité fonctionnelle de Vpr impliquée dans le processus de translocation cytoplasme-noyau du complexe de préintégration du VIH-1 dans les cellules quiescentes infectées par le virus. Les agents inhibiteurs de la polymérisation d'actine induite par Vpr peuvent par conséquent être considérés comme des inhibiteurs de la fonction de Vpr ayant potentiellement un effet inhibiteur du cycle réplicatif du VIH-1 agissant au niveau de la translocation cytoplasmenoyau du PIC. b) Principe du test L'actine cellulaire est obtenue par la préparation d'extraits de fibroblastes de souris. La cinétique de polymérisation de l'actine des extraits cellulaires est mesurée par l'augmentation de l'anisotropie de fluorescence d'actine Galexa utilisée comme traceur et ajoutée dans les extraits cellulaires. Pour la mise en uvre du test, la dynamique de la polymérisation de l'actine cellulaire est mesurée d'une part en présence de 5 pM de Vpr et d'autre part en absence de Vpr (contrôle). Le démarrage de la polymérisation d'actine est obtenu par l'introduction dans le milieu réactionnel d'un tampon contenant 500 pM d'ATP etl mM de MgC12. La molécule à tester est ajoutée à concentration fixe ou à concentration variable dans le milieu réactionnel avant l'induction de la polymérisation d'actine. La variation d'anisotropie est mesurée en continue dans un appareil BEACON 2000 (PanVera). 2868841 15 Le paramètre de la dynamique de polymérisation d'actine mesuré dans le test est la valeur d'anisotropie de fluorescence au plateau (état stationnaire). Dans les conditions de mesures standard, le plateau de polarisation de fluorescence (anisotropie) est obtenu après 2 à 5 minutes d'incubation et reste stable pendant plusieurs dizaines de minutes. Dans un souci de standardisation, les valeurs d'anisotropie seront évaluées 10 minutes après l'induction de la réaction. Les mesures effectuées sont les suivantes: Valeur de l'AF au plateau en présence de Vpr Valeur de l'AF au plateau en présence de Vpr + la molécule à tester Valeur de l'AF au plateau en absence de Vpr Valeur de l'AF au plateau en absence de Vpr + la molécule à tester Cela permet de discriminer un effet inhibiteur de polymérisation d'actine d'un effet inhibiteur de Vpr (polymérisation de l'actine Vprdépendante). c) Réalisation pratique du test - Cellules et préparation des extraits: Les fibroblastes 3T3 sont cultivés selon les techniques courantes. Les cellules sont lavées dans du tampon Krebs pH 7.40 sans calcium. Les membranes cellulaires sont ensuite rompues en utilisant les procédés usuels. Les extraits bruts sont centrifugés à 10.000 g pendant 30 min. La concentration protéique du surnageant obtenu est ajustée à 0,40 mg/ml puis aliquotée et conservée à - 80 C. 20 2868841 16 - Composition des milieux réactionnels standards: Extraits de cellules de fibroblastes 3T3: 0,20 mg/ml de protéines Actine-alexa 500 pM (G-acti- alexa 488, molecular probes) ATP: 500 pM MgC12: 1 mM Vpr: 5 pM Molécule à tester: 5 gM pour un test robotisé Concentrations variables (max 5 pM) pour un test manuel d) Mesure de la dynamique de polymérisation - Expérience contrôle sans Vpr: Pour le test manuel, la réaction se déroule dans une cuvette du Beacon 2000. Dans un aliquote d'extrait cellulaire est 20 ajouté 1 mM d'actine-alexa. La réaction de polymérisation est induite par l'addition d'un volume égal à celui de l'extrait d'un tampon contenant ATP 1 mM, MgC12 2 mM. La variation d'anisotropie de fluorescence est mesurée automatiquement toutes les 30 25 secondes. - Expérience contrôle avec Vpr: La séquence des opérations est identique à celle précédemment décrite en présence d'une concentration finale de Vpr de 5 pM. La protéine Vpr est ajoutée avant l'addition du tampon de polymérisation. - Expérience en présence de molécule à tester: 10 2868841 17 Les conditions expérimentales et la séquence des opérations sont identiques aux expériences contrôles en présence de concentrations variables de molécules à tester (ajouter avec Vpr avant l'induction de la polymérisation d'actine). e) Test robotisé Le test est adaptable à la robotisation en utilisant des plaques de 96 puits. Dans ce cas, les molécules testées sont ajoutées à la concentration finale de 5 pM. 18 REVENDICATIONS 1) Méthode d'identification de composés capables d'agir sur la réplication d'un virus du type VIH, caractérisée en ce que l'on analyse la polymérisation de l'actine induite par la protéine vpr, un fragment ou un dérivé de celle-ci sur une cellule ou un extrait cellulaire comprenant de l'actine, en présence dudit composé. 2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on analyse la polymérisation de l'actine en présence et en absence de Vpr. 3) Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'on mesure la dynamique de la polymérisation de l'actine cellulaire d'une part en présence de 5 pM de Vpr et d'autre part en absence de Vpr (contrôle). 4) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le démarrage de la polymérisation d'actine est obtenu par l'introduction dans le milieu réactionnel d'un tampon contenant 500 pM d'ATP et 1 mM de MgC12. 5) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est mise en oeuvre avec des concentrations fixes ou des concentrations variables du composé à tester. 6) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le composé à tester est ajouté dans le milieu réactionnel de 2868841 19 préférence avant l'induction de la polymérisation d'actine par Vpr. 7) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la cinétique de polymérisation de l'actine des extraits cellulaires est mesurée par l'augmentation de l'anisotropie de fluorescence (AF) d'actine G-alexa utilisée comme traceur et ajoutée dans les extraits cellulaires. 8) Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que la variation d'anisotropie est mesurée en continu. 9) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le paramètre de la dynamique de polymérisation d'actine mesuré est la valeur d'anisotropie de fluorescence au plateau (état stationnaire). 10) Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que dans les conditions de mesures standard, le plateau de polarisation de fluorescence (anisotropie) est obtenu après 2 à 5 minutes d'incubation et reste stable pendant plusieurs dizaines de minutes.