FR 2866571 A1 20050826 FR 0401700 A 20040220 Descriptif La présente invention se rapporte à l'utilisation d'un mélange de différents composants polysaccharidiques individuellement présents dans la matrice extracellulaire et utilisés pour la fabrication d'un médicament à activité cicatrisante, ainsi qu'à un biomatériau de reconstruction osseuse comprenant ce mélange. Il s'agit d'un mélange de polysaccharides issus de la matrice extracellulaire comme l'acide hyaluronique, la chondroïtine 6 et 4 sulfate, le dermatane (chondroïtine sulfate B) et de l'héparine de haut poids moléculaire (et ce en fonction des cas cliniques) qui permet d'obtenir une reconstitution complète de lésions osseuses dont la taille a été définie comme critique. Problématique L'intérêt de la présente invention réside dans le fait que les pertes de substance osseuse sont lentes à cicatriser et lorsque la perte d'os dépasse une dimension critique, il ne peut y avoir de cicatrisation spontanée (J.P. SCHMITZ et al., Acta Anat., 1990, 138, 185-192). Des matériaux de comblement osseux, qui conduisent ou induisent la cicatrisation, doivent alors être utilisés afin de restaurer la continuité entre les deux berges de la perte osseuse. Les techniques de greffe les plus anciennes consistent à utiliser de l'os complet frais, qui comprend, de façon inhérente, des protéines capables d'initier et de favoriser les mécanismes biologiques de la reconstruction osseuse, telles que les BMP ou Bone Morphogenetic Proteins , l'ostéocalcine, l'ostéopontine et l'ostéogénine.Les autogreffes présentent l'avantage d'être de parfaite tolérance immunitaire. Toutefois, le stock osseux est limité chez un individu et l'intervention chirurgicale supplémentaire qui en découle entraîne des risques de complications. Quant aux allogreffes ou xénogreffes, elles présentent des risques de transmission d'agents pathogènes et peuvent entraîner des phénomènes de rejet. Par les insuffisances des greffes osseuses, les recherches se sont orientées vers des matériaux substitutifs de l'os. Ces matériaux de comblement peuvent être ostéoinducteurs ou ostéoconducteurs. Les matériaux ostéoinducteurs permettent une régénération de la perte tissulaire selon un mécanisme d'activation cellulaire par les protéines ou les peptides du matériau d'apport et ils sont capables d'induire une ossification en site ectopique, c'est-à-dire extra-osseux. On peut citer parmi les substances et les matériaux ostéoinducteurs autres que l'os: - les hormones et les facteurs de croissance (notamment les cytokines, BMPs, les IGF ou Insulinlike Growth Factors et les FGF ou Fibroblast Growth factors ), dont il a été montré qu'ils favorisent la reconstruction osseuse (P.A. HILL et al., Endocrinology, 1995,136(1),124-131; P. CUEVAS et al., Surg. Neural., 1997, 47, 242-246; G.L. BARNES et al., Journal of Bone and Minerai Research, 1999, 14(11), 1805-1815). M. ISOBE et al. (Journal of Biomédical Materials Research, 1996, 32, 433-438).Leurs effets systémiques, c'est à dire non limités aux sites d'implantation, présentent des risques de diffusion de BMP dans les tissus voisins du site lésé et de calcification locale en site non-osseux (CINOTTI et al., J. Bone Joint Surg., 2004, 86-B :135-142). En dehors des BMP, il existe de nombreux autres matériaux qui présentent une activité cicatrisante reconnue dans la littérature : -les dérivés de dextrane portant des fonctions choisies parmi le carboxyméthyle, le benzylamide, le sulfate et le sulfonate (nommés CMDBS ) (MEDDAHI et al., Path. Res. Pract., 1994, 190, 923928). -les héparanes sulfates, qui fixent les facteurs de croissance présents au niveau de la lésion en les protégeant des dégradations enzymatiques (D. A VIEZER et al., The Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(1), 114-121 ; F.BLANQUAERT et al., Journal of Biomédical Materials Research, 1999, 44, 63-72; M.L. COLOMBIER et al., Journal de Parodontologie et d'Implantologie Orale, 1998, 17(4), 403-413 ; M. TARDIEU et al., Journal of Cellular Physiology, 1992, 150, 194203). -Ces composés nécessitent néanmoins un vecteur, tel que le collagène, pour être utilisés (A. MEDDAHI et al., Diabetes & Metabolism, 1996, 22, 274-278; A. MEDDAHI et al., Path. Res. Pract., 1994, 190, 923-928). A. MEDDAHI et al. (1994, ibM) ont démontré qu'un dérivé de dextrane particulier, dénommé CMDBS K (comprenant 83% de groupes carboxyméthyles, 23% de groupes benzylamides et 13% de groupes sulfonates), imbibé dans un tampon de collagène permet de combler partiellement, après trois semaines, des défauts osseux de 3 mm de diamètre réalisés dans des calvaria de rats.Ces résultats ne peuvent toutefois pas être extrapolés à des lésions de taille critique, le diamètre critique de référence pour une telle durée étant de 5 à 8 mm. Par ailleurs, les matériaux ostéoconducteurs, comme leur nom l'indique, ne font que conduire la cicatrisation, sans induire de formation osseuse proprement dite: Ils servent de support aux phénomènes biologiques de cicatrisation osseuse et sont destinés à être résorbés au bout d'un certain temps et remplacés par le tissu osseux néoformé. A titre d'exemples de matériaux ostéoconducteurs, on peut citer: -l'os naturel sous toutes ses formes déprotéinisées et/ou céramisées, d'origine humaine ou bovine par exemple (F.A. PAPAY et al., The Journal ofCraniofacial Surgery, 1996, 7(5), 347-351) -les phosphates de calcium synthétiques ou naturels tels que le phosphate de calcium tricalcique, le phosphate de calcium biphasique, l'hydroxyapatite, les coraux (F.A. PAPAY et al., ibid; N. B.-A.NAAMAN et al., The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants, 1998, 13(1), 115-120; M. TRECANT et al., Clinical Materials, 1994, 15, 233-240) -les biovitrocéramiques, les bioverres. Solutions Au vu des insuffisances et des inconvénients de cet état de la technique en matière de reconstruction osseuse, les Inventeurs se sont donc donnés pour but de pourvoir à un biomatériau, utilisable en reconstruction osseuse, qui soit adapté à la reconstruction de grandes pertes de substances osseuses, c' est à dire de défauts dont la dimension est supérieure à la taille critique. Ce biomatériau doit être biocompatible, non-immunogénique et résorbable en fin ou en cours de reconstruction osseuse. Les Inventeurs ont découvert que ces buts sont atteints en utilisant un mélange subtil de polysaccharides particuliers, à savoir un mélange physique de différentes molécules telles que l'acide hyaluronique, la chondroïtine sulfate (4 ou 6) le dermatane sulfate (chondroïtine sulfate B) et de l'héparine de haut poids moléculaire.Dans le cas où de l'héparine serait ajoutée au mélange, il est à ce moment souhaitable d'utiliser ce mélange sur des plaies non ouvertes et de rajouter en plus aux autres ingrédients du collagène ou un hémostatique naturel quelconque, mais impérativement bio résorbable. L'invention a pour objet l'utilisation d'un mélange, obtenu par une simple mise en commun des différents composants -sans nécessité de créer au préalable de liaisons chimiques entre les différents composants- polysaccharidiques rencontrés dans les matrices extracellulaires et dont la plupart ont des activités cicatrisantes reconnues dans la littérature. L'intérêt de l'invention que nous revendiquons ici tient dans le fait que cette composition originale permet une activité cicatrisante en synergie de ses différents composants et montre une activité réparatrice sur les tissus osseux que nous avons démontrée par nos expérimentations cliniques. Le mélange utilisé contient 49% d'acide hyaluronique sous forme de sel sodique, 49% de chondroïtine 6 sulfate et 2% de chondroïtine sulfate B (dermatane sulfate), le tout formant un gel homogène par l'adjonction de 2.5 ml de chlorure de sodium à 9%. Le second mélange découlant du premier contient en plus 25000 UI d'héparine, en respectant la même notion de mélange purement physique ne recherchant aucune liaison chimique entre les différents composants. Pour éviter un saignement abondant, lors de l'utilisation sur une plaie ouverte, il est utile de rajouter à ce mélange un hémostatique biorésorbable tel du collagène ou un alginate. De façon particulièrement avantageuse, les mélanges de polysaccharides définis ci-dessus peuvent être utilisés pour la préparation d'un revêtement d'un implant endo osseux ou d'un matériau de comblement ostéoconducteur.Des matériaux de comblement ostéoconducteurs ou des implants endoosseux (tels que des prothèses dentaires endo-osseuses en titane ou des prothèses ostéoarticulaires en titane sans ciment orthopédique) revêtus d'un tel polysaccharide peuvent en effet s'intégrer très rapidement dans l'os receveur. L'invention a également pour objet un implant endo-osseux, caractérisé en ce qu'une partie au moins de sa surface est revêtue d'un mélange de polysaccharides tel que défini ci-dessus. Cette invention peut aussi être utilisée pour les fusions spinales et le traitement de lésions osseuses non critiques. Les polysaccharides utilisés dans l'invention peuvent également se présenter sous une forme hydratée, par exemple sous la forme d'un hydrogel à base de sérum physiologique soit après une lyophilisation du mélange qui aboutit à un polymère d'apparence d'apparence fibreuse. On pourrait également envisager d'utiliser un tel polysaccharide sous la forme d'une membrane ou d'une structure alvéolée tridimensionnelle solide. Pour compléter la présentation des différentes formes d'utilisation, le mélange de polysaccharides utilisé dans l'invention peut être associé à un matériau ostéoconducteur et/ou ostéoinducteur. Un tel matériau ostéoconducteur peut notamment être sélectionné dans le groupe constitué par l'os déprotéinisé et/ou céramisé, les phosphates de calcium synthétiques ou naturels (tels que le phosphate de calcium tri calcique de forme, le phosphate de calcium biphasique, hydroxyapatite ou les coraux), les biovitrocéramiques et les bioverres. Quant au matériau ostéoinducteur susceptible d'être associé au polysaccharide utilisé dans l'invention, il peut s'agir d'une hormone ou d'un facteur de croissance, notamment les BMP. L'association dudit mélange de polysaccharides à un matériau ostéoinducteur permettrait d'augmenter la vitesse de la cicatrisation, par exemple par un apport de BMP directement au niveau du site lésé. Il faut préciser qu'à ce moment l'invention ne sert pas de vecteur aux BMP mais n'utilise celle-ci que comme un élément potentialisateur de l'activité cicatrisant du substitut de matrice extracellulaire qu'il constitue. La présente invention a également pour objet un biomatériau de reconstruction osseuse, caractérisé en ce qu'il comprend un mélange de polysaccharides tel que défini dans l'invention ainsi qu'un matériau ostéoconducteur et/ou ostéoinducteur, par exemple tels que ceux décrits ci-dessus. Outre les dispositions qui précèdent. Cette invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'utilisation du mélange de polysaccharides à base d'acide hyaluronique de chondroïtine 6 sulfate, de dermatane sulfate et parfois en présence d'héparine en cicatrisation osseuse. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation tant dans la composition du mélange de polysaccharide dont les pourcentages pondéraux sont susceptibles de varier de 1% à 99% d'acide hyaluronique en modulant les masses de chondroïtine sulfate (4 ou 6) et de dermatane sulfate et en conséquence ainsi que de l'héparine. EXEMPLE 1 Création d'un mélange particulier de 4 polysaccharides. On procède à la mise en commun de 1 gramme d'acide hyaluronique sous sa forme sodique lyophilisée, de 1 gramme de chondroïtine 6 sulfate et de 50 mg de dermatane sulfate (chondroïtine sulfate B). Dans le premier cas on rajoute à ce mélange 2,5 ml de sérum physiologique dans lesquels ont été dissous 25000UI d'héparine de haut poids moléculaire (20.000 Da). On homogénéise le mélange jusqu'à obtenir un mélange sans grumeau et translucide. Dans le second cas on ne rajoute que 2.5 ml de sérum physiologique en omettant de mettre de l'héparine. EXEMPLE 2 Utilisation in vivo du mélange de polysaccharides défini par l'invention en tant que biomatériau de reconstitution osseuse. a) Protocole. Nous avons utilisé 40 rats mâles WISTAR âgés de 6 à 7 semaines et pesant de 275 à 299 g. Les rats sont anesthésiés l'aide de Nesdonal (0,1 ml/100 g, Specia Rhône Poulenc Rorer, Montrouge, France). Des forages de 5 mm de diamètre ont été réalisés dans les calvaria des rats, au niveau des deux lobes osseuses pariétaux, de part et d'autre de la suture sagittale médiane, selon le protocole décrit par P. CUEVAS et al. (Surg. Neurol., 1997, 47, 242-6) ou par C. BOSCH et al. (Cleft Palate Cranofacial Journal, 1995,32(4), 3115 317). les crânes des animaux ont été rasés. La désinfection pré- et post-opératoire du site chirurgical est faite avec de la Bétadine dermique à 10 % (Asta Medica, Mérignac, France). Une incision médiane est pratiquée sur environ 20 mm et les tissus cutanés de même que le périoste sont réclinés. Les forages, sont effectués sous irrigation continue de sérum physiologique, avec des fraises boules diamantées de référence 801.104.018, d'un diamètre de 1,8 mm (Komet, France). Un orifice est pratiqué sur le pariétal droit, un autre sur le pariétal gauche, en prenant soin de ne pas léser la duremère.Une fois les deux forages réalisés, le mélange (sous forme de gel ou lyophilisé) de polysaccharides obtenu dans l'exemple 1 (entre 1 et 2 mg) est positionné dans la cavité pratiquée dans le pariétal droit, alors que la seconde cavité, dans le pariétal gauche, n'est pas traitée et servira de contrôle. Les sutures périostées sont effectuées avec un fil résorbable Vicryl 3.0 (Johnson & Johnson Intl., Bruxelles, Belgique) et les sutures des plans cutanés avec un matériau non résorbable. Les animaux sont ensuite mis dans des cages et sacrifiés par injection de Pentobarbital (Doléthal , Vétoquinol, Lure, France) au bout de 21 jours. Les calvaria sont prélevées, fixées au formaldéhyde et déminéralisées avant leur étude histologique (coloration au trichrome de Masson). b) Résultats. Le mélange de polysaccharides décrit dans l'exemple 1 permet une cicatrisation osseuse en comblant, pour tous les animaux testés, les cavités réalisées dans les calvaria des rats autant dans le côté ayant reçu l'invention que du côté qualifié de témoin qui n'a reçu aucun matériau. Ce fait a déjà été décrit par Zanchetta et all, 2003 (Calcif Tissue Int. 2003 Sep;73(3):232-6). Du point de vue histologique, on ne note pas de réactions inflammatoires, le mélange de polysaccharide utilisé n'est plus décelable et l'os néoformé en 21 jours est parfaitement structuré: les fibres collagènes sont orientées, les ostéoblastes recouvrent les surfaces osseuses, des ostéocytes sont présents. Cet os est histologiquement normal et des structures lamellaires encadrent l'os trabéculaire cicatriciel.On observe également que la néovascularisation est très marquée et que le tissu conjonctif cutané n'a pas proliféré de façon anarchique. En outre, les cicatrices cutanées sont d'excellente qualité, sans phénomène prolifératif. c) Expériences comparatives. Les propriétés cicatrisantes du mélange de polysaccharides objet de la présente invention ont été comparés à ceux d'un polysaccharide bactérien excrété par la bactérie Vibrio diabolicus breveté auprès de l'INPI sous la dénomination HE 800 et dont l'inventeur du présent brevet est co-inventeur. Ont été comparées également les propriétés cicatrisantes de cinq polysaccharides dénommés acide hyaluronique, chondroïtine 6 sulfate, dermatane sulfate, héparine et collagène, dans le tableau 1 qui suit. Pour l'appréciation de l'activité cicatrisante des cinq polysaccharides, un protocole chirurgical identique à celui décrit au point a) ci-dessus a été utilisé. La quantification des résultats a été-réalisée en comparant la superficie de l'os néoformé par rapport à celle des orifices pratiqués à l'origine, comparaison traduite en terme de pourcentage de comblement des orifices. Dans les tableaux comparatifs 1 et 2 ci-dessous figurent le nombre d'animaux pour lesquels on observe un comblement des orifices nul (0%), faible jusqu'à 25%), moyen jusqu'à 50%), élevé de 75 à 99%) ou complet (100%). Il nous est apparu important de mentionner le taux de pertes d'animaux per-opératoire par arrêt cardiorespiratoire lors des interventions. Tableau 1 (résultats donnés du côté ayant reçu l'invention ou les matériaux de contrôle) Tableau 2 (résultats donnés du côté n'ayant reçu ni l'invention ni les matériaux de contrôle et qualifié de côté témoin) D'après cette comparaison, il apparaît donc que, parmi les différents polysaccharides testés, seul le mélange de polysaccharides, objet de la présente invention permet une cicatrisation complète des orifices formés dans les calvaria des rats. Il convient de noter que le taux de mortalité per-opératoire est incomparablement plus faible que lors de l'utilisation d'exopolysaccharides bactériens et que la cicatrisation osseuse à lieu tout autant dans le défaut osseux qui a reçu le mélange cicatrisant que dans celui qui est considéré comme le côté témoin comme le montre le tableau 2. Résumé Cette invention se rapporte à l'utilisation d'un mélange de polysaccharides composé d'acide hyaluronique de chondroïtine 6 sulfate, de dermatane sulfate et parfois d'héparine (en fonction des situations cliniques) formant un gel pour la fabrication d'un médicament à activité cicatrisante, notamment à activité sur la cicatrisation osseuse. L'invention se rapporte également à un biomatériau de reconstruction osseuse qui comprend un tel mélange de polysaccharides sans contraintes de modifications au niveau des pourcentage de composition pondérale , ainsi qu'à un dispositif chirurgical endoosseux dont la surface est revêtue d'un tel mélange de polysaccharide. d) Conclusion. Le mélange de polysaccharides développé par les inventeurs permet, de façon reproductible et en 21 jours environ (dans l'attente des résultats menés pour des laps de temps plus courts), le comblement de défauts osseux de taille critique (diamètre de 5 mm) dans les calvaria de rats. Les lésions critiques se reconstituent ad-integrum sans les effets incontrôlés observés avec l'utilisation de matériaux ostéoinducteurs tels que BMP. Cette activité cicatrisante se manifeste tant du côté traité que du côté normalement qualifié de contrôle. Le mélange de polysaccharides utilisé n'entraîne aucune réaction inflammatoire et est totalement résorbé par les tissus environnants car il s'agit d'éléments constitutifs de la matrice extracellulaire. La qualité des tissus néoformés est identique à celle de l'os originel sans aucun phénomène hyper prolifératif. Ce mélange de polysaccharides constitue donc un matériau de potentialisation de la cicatrisation osseuse, il ne s'agit pas d'un matériau ostéoinducteur mais ne se limite pas à être ostéoconducteur. En employant un néologisme on pourrait le qualifier d'ostéofavorisant. Son action est due à ses caractéristiques physico-chimiques et sa composition originales qui reproduisent la matrice extracellulaire à partir de laquelle se reconstitue le tissu osseux.Ce mélange original induit également, à près de 100% et sur le même intervalle de temps, la cicatrisation de l'orifice témoin par un effet systémique qui n'est pas sensé cicatriser si on utilise un autre matériau (tableau 2). REVENDICATIONS . 1.) Utilisation d'un mélange polysaccharides composé d'acide hyaluronique de chondroïtine sulfate de dermatane sulfate et d'héparine (selon les cas cliniques) formant un gel pour la fabrication d'un médicament à activité cicatrisante. 2.) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit médicament présente une activité sur la cicatrisation osseuse. 3.) Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ledit mélange de polysaccharides est utilisé pour la préparation d'un matériau de réparation ou de comblement osseux. 4.) Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ledit mélange de polysaccharides est utilisé pour la préparation d'un revêtement d'un implant endo-osseux ou d'un matériau de comblement ostéoconducteur. 5.) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit mélange de polysaccharides est susceptible d'être obtenu à partir d'un mélange d'acide hyaluronique de chondroïtine sulfate de dermatane sulfate et parfois d'héparine formant un hydrogel pour la fabrication d'un médicament à activité cicatrisante, sans contraintes de revendication en ce qui concerne leurs pourcentages pondéraux respectifs dans la composition. Ce mélange est obtenu en mettant en commun les différents composants sans chercher à créer de liaisons chimiques covalentes. 6.) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit mélange de polysaccharides a une activité cicatrisante constante sans rapport avec une variation sensible dans sa composition pondérale. 7.) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est associé à un matériau ostéoconducteur et/ou ostéoinducteur. 8 ) Utilisation du mélange de polysaccharides à base d'acide hyaluronique, chondroïtine sulfate, dermatane sulfate pour obtenir des fusion spinales avec ou sans matériau ostéoconducteur d'apport. 9 )Utilisation selon la revendication 7 et 9 caractérisée en ce que ledit matériau ostéoconducteur est sélectionné dans le groupe constitué par l'os déprotéinisé et/ou céramisé, les phosphates de calcium synthétiques ou naturels, les biovitrocéramiques et les bioverres. 10.) Biomatériau de reconstruction osseuse, caractérisé en ce qu'il comprend un mélange polysaccharides composé d'acide hyaluronique de chondroïtine sulfate de dermatane sulfate et parfois d'héparine (avec ou sans matériau favorisant l'hémostase) formant un hydrogel pour la fabrication d'un médicament à activité cicatrisante ainsi qu'un matériau ostéoconducteur et/ou ostéoinducteur ou un système chirurgical implantable. 11 [deg]) Implant endo-osseux ou tout système chirurgical invasif de durée temporaire ou définitive, dans l'une quelconque des revendications 1 à 7.