FR 2868311 A1 20051007 FR 0450671 A 20040402 2868311 1 PROCEDE D'OBTENTION D'UN PRINCIPE ACTIF AGISSANT SUR LA DIFFERENCIATION ADIPOCYTAIRE ET SUR L'ACTIVITE LIPOLYTIQUE La présente invention couvre un procédé d'obtention d'un principe actif de différenciation adipocytaire combinant deux principes actifs issus de plantes de la famille des Amarantacae, spécifiquement Celosia cristata et de la famille des Labiées spécifiquement Prunella vulgaris. L'objectif du principe actif combiné selon la présente invention est de lutter contre les désordres dans le tissu adipeux et contre les mécanismes de formation de la cellulite. Ce principe actif permet ainsi de conférer audit principe actif des propriétés amincissantes. La cellulite, terme utilisé pour caractériser un phénomène d'accumulation de 10 graisse résultant d'une transformation affectant l'hypoderme. Cette couche de graisse de réserve est rattachée à la partie inférieure du derme par des expansions de fibres de collagène et de fibres élastiques. Le corps humain normal est composé pour 15 à 20% de son poids de tissu adipeux. Ces cellules adipeuses proviennent de cellules précurseurs ou préadipocytes dont sensiblement 40% sont différenciés dans l'hypoderme. De fait, ces préadipocytes qui sont des fibroblastes spécifiques sont capables de se multiplier et de se différencier en adipocytes. Ce tissu adipeux remplit de nombreuses fonctions et notamment le stockage et la mise à disposition de l'énergie grâce aux adipocytes qui, par leur caractéristique d'extensibilité, augment ou diminue de volume en fonction du volume de graisse contenu. Ainsi, pour lutter contre la formation de cellulite qui affecte nécessairement la silhouette, la présente invention propose de lutter contre I'adipogénèse. Or les facteurs de transcription qui participent à cette différenciation, sont notamment les PPAR-y (Peroxysome ProliferatorActivated Receptors gamma), spécifiques du tissu adipeux et éléments de l'adipogénèse. La présente invention propose de limiter l'expression de ces molécules grâce au principe actif obtenu par le procédé selon la présente invention. Un autre facteur sur lequel il est possible d'agir est l'équilibre entre les deux voies métaboliques de lipogenèse, qui correspond à la formation de triglycérides, et la lipolyse, qui correspond à la mise à disposition de ces triglycérides pour l'organisme. Le principe actif selon la présente invention vise à agir sur la lipolyse en la stimulant, limitant ainsi l'accumulation de triglycérides. Une voie pour y parvenir est d'activer certains systèmes enzymatiques qui transforment les triglycérides en acides gras et en glycérol, par exemple I'adénylate cyclase qui active la biosynthèse des AMP cycliques, régulateurs de l'hydrolyse des triglycérides. La présente invention concerne ainsi un procédé d'obtention un principe actif issu de plantes qui présentent de telles propriétés, le principe actif ainsi obtenu, son utilisation à visée cosmétique dans un rôle d'amincissant et les produits cosmétiques susceptibles de l'intégrer. La présente invention est maintenant décrite en détail pour permettre de mieux appréhender les résultats obtenus à travers des essais et des mesures récapitulés dans les figures qui suivent: - figure 1: tableau du degré de polymérisation des sucres du principe actif selon l'invention, figure 2: Tableau regroupant les résultats relatifs au taux d' AGNE, figure 3: Tableau récapitulatif du taux des PPARy, - figure 4: Tableau des résultats concernant l'activité lipolytique, - figure 5: Tableau des résultats concernant le tour de cuisse, - figure 6: Tableau des résultats concernant le tour de ventre, - figure 7: Résultats concernant les analyses thermographiques de contact, - figure 8A: Tableau des résultats concernant les évolutions de l'élasticité de la peau, - figure 8B: Tableau des résultats concernant les évolutions du tonus cutané. 1/ Procédé d'obtention du principe actif selon l'invention: Le procédé consiste en l'obtention d'un premier et d'un second principes actifs primaires. 1-1/ Obtention du premier actif primaire: - solubilisation d'une poudre de Celosia cristata à raison d'au moins 50 g/l 15 dans de l'eau, préférentiellement les sommités fleuries. - hydrolyse(s) enzymatique (s) simultanée(s) ou successive(s) en présence d'au moins une carbohydrase, - séparation des phases soluble et insoluble, - conservation de la phase soluble, - inactivation de l'activité enzymatique dans cette phase soluble par exemple par traitement thermique, et - clarification et concentration de la fraction polyphénolique active de cette phase soluble constituant ainsi le premier principe actif. 1-2/ Obtention du second actif primaire: - solubilisation d'une poudre de Prunella vulgaris à raison d'au moins 50 g/I dans de l'eau, préférentiellement les parties aériennes, - hydrolyse chimique et/ou hydrolyse enzymatique en présence d'au moins une carbohydrase, séparation des phases soluble et insoluble, - conservation de la phase soluble, - inactivation de l'activité enzymatique dans cette phase soluble par traitement thermique, et - élimination de certains composés polyphénoliques dans cette phase soluble, constituant ainsi le second principe actif. 1-3/ Obtention du principe actif selon l'invention: A partir de ces deux principes actifs primaires, on réalise un mélange par introduction en volume d'au moins 4 du second principe actif primaire dans au plus du premier principe actif primaire. On réalise une clarification et une stabilisation si nécessaire ainsi qu'une filtration stérilisante. 2/ Caractérisation du principe actif selon l'invention: 2-1/ Matière sèche: On mesure le taux de matières sèches par passage à l'étuve à 105 C d'un échantillon de poids initial donné jusqu'à obtention d'un poids constant. Le taux de matières sèches est compris entre 5 et 200 g/l, plus particulièrement entre 30 et 45 g/l. 2-2/ Mesure du pH: Le pH mesuré par la méthode potentiométrique conduit à des valeurs comprises entre 3,5 et 6,5, plus particulièrement entre 4,5 et 5,5. 2-3/ Mesure du taux de sucres: La mesure est obtenue par la mise en oeuvre de la méthode de DUBOIS. (Dubois M. & al, (1956), Analytical chemistry, 28, 3, 350-356). En effet, en présence de phénol et d'acide sulfurique concentré, les sucres réducteurs donnent un composé coloré jaune-orangé. Par comparaison avec une gamme étalon, composée de 1/3 de mannose, 1/3 de glucose et 1/3 de galactose, on peut déterminer directement la teneur en sucres totaux. Pour le principe actif selon la présente invention, on obtient des valeurs de sucres totaux comprises entre 1 et 70 g/I plus particulièrement 8 à 16 g/I. Si l'on souhaite caractériser les sucres simples présents dans le principe actif selon la présente invention, on constate par rapport à une gamme étalon de sucres synthétiques que le taux de chaque sucre simple présent dans le principe actif selon la présente invention, après deux heures d'hydrolyse, est compris: - entre 60 et 80% de glucose, plus particulièrement 70%, et - entre 15 et 21% de fructose, plus particulièrement 18%, et - entre 5 et 19% de xylose, plus particulièrement 12%. La détermination du degré de polymérisation donne les résultats du tableau de la figure 1. On constate que la fraction glucidique est composée essentiellement de glucose de xylose et de fructose, présents sous forme de monosaccharides, de disaccharides d'oligosaccharides et de polysaccharides, 88%. 2-4/ Dosage des composés phénoliques Les composés phénoliques forment en présence de ferricyanure de potassium des composés colorés, l'intensité de cette coloration étant proportionnelle à la quantité de composés phénoliques. En se rapportant à une gamme étalon d'acide gallique, en l'occurrence de 40 à 120 mg/I, on peut déduire la quantité de composés phénoliques. Les résultats donnent 0,04 à 2,00 g/I et plus particulièrement 0,25 à 0, 50 g/I. Ces composés peuvent être caractérisés. La chromatographie liquide haute pression donne comme composition en polyphénols - de 15 à 25% de composés hydroxycinnamiques, plus particulièrement 20%et - de 75 à 85% de flavonols, plus particulièrement 80%. On peut aussi déterminer la fraction active du principe actif vis -à-vis de l'activité lipolytique des adipocytes. L'activité lipolytique des adipocytes est déterminée par le taux d'AGNE (Acides Gras Non Estérifiés) exprimé en pM d'un témoin. A des cultures d'adipocytes, on ajoute de 1% de principe actif selon l'invention ou 1% de principe actif traité préalablement par un composé assurant la précipitation des poyphénols. Le taux d'AGNE est évalué à 169 pM en présence du principe actif selon la présente invention, comparé à 45 pM pour le témoin et à 40 pM lors de l'ajout de du principe actif traité préalablement par un composé assurant la précipitation des phénols. La fraction active du principe actif pour l'activité lipolytique est donc constituée 15 des composés phénoliques. La comparaison des analyses chromatographiques du principe actif et du principe actif additionné du composé assurant la précipitation des polyphénols montre une perte de 78% des composés hydroxycinnamiques et de 90% des flavonols, soit plus de 90% de la fraction phénolique totale. 3/ Tests in vitro du principe actif selon l'invention: 3-1/ Evaluation de l'expression des ARNm codant pour les PPAR-'y. Les PPAR-'y sont des facteurs de transcription spécifique du tissu adipeux comme indiqué en préambule, qui entraînent le déclenchement du processus de différenciation adipocytaire. L'objectif de cette étude est d'évaluer la capacité du principe actif à limiter l'expression des ARNm codant les PPAR-y, afin d'inhiber le processus de différenciation des préadipocytes en adipocytes matures, responsables de la lipolyse. On utilise pour cela des préadipocytes placés dans un milieu permettant la différenciation des préadipocytes en adipocytes matures, auquel on ajoute 0,5%, 1% de principe actif selon la présente invention. On prépare un échantillon témoin positif en présence de TNF-a (Tumeur 5 Necrosis Factor) à 0,5 nM. Les résultats sont exprimés dans le tableau de la figure 3. On constate une limitation de l'expression des ARNm codant pour les PPARy en présence du TNF-a ou du principe actif. L' effet dès la présence de 1% de principe actif selon la présente invention 10 conduit à des résultats comparables à ceux du TNF-a. 3-2/ Observation du degré de différenciation adipocytaire: L'objectif est d'évaluer de nouveau la capacité du principe actif à inhiber la différentiation adipocytaire. bans ce but: - on mesure l'accumulation des lipides par coloration en l'occurrence en 15 utilisant le Oil Red O, - on quantifie le contenu lipidique intracellulaire par coloration des adipocytes en l'occurrence en utilisant du rouge nil, observable en fluorescence. Le protocole est identique à celui utilisé pour l'évaluation de l'expression des 20 ARNm codant pour les PPAR-y. Les préadipocytes sont ensemencés et incubés dans un milieu favorisant la différenciation adipocytaire, avec et sans le principe actif selon l'invention, et en présence de TGF-a ou de captopril pour obtenir deux témoins positifs. On réalise ensuite la coloration. be fait, les images ne pouvant être retranscrites dans la présente demande de façon significative, les résultats sont seuls indiqués. On constate que les préadipocytes traités par les témoins positifs ou le principe actif selon la présente invention sont peu différenciés. On peut ensuite passer à la seconde coloration quantifier le contenu des cellules en lipides intracellulaires en recourant à la fluorescence. Les résutats, regroupés sur la figure 4, montrent que le principe actif permet de diminuer l'accumulation des lipides dans les adipocytes, de manière comparable 5 aux molécules de référence TNF-a et captopril. Il y a donc, en l'absence de lipolyse, une diminution du liquide intracellulaire, donc une limitation du processus de différenciation des préadipocytes en adipocytes matures. 3-3/ Influence sur l'activité lipolytique: L'étude porte sur des préadipocytes et consiste à déterminer l'influence du principe actif sur l'activité lipolytique par mesure des acides gras non estérifiés (AGNE) après différenciation complète des préadipocytes en adipocytes. On prépare un échantillon témoin positif en présence de caféine (37,5 g/I) à 1%. Les préadipocytes sont traités suivant le même protocole que dans l'étude du point 3-1/ et les résultats sont regroupés dans le tableau de la figure 5. On constate que le principe actif stimule fortement l'activité lipolytique des adipocytes en favorisant l'hydrolyse des triglycérides présents dans les adipocytes. 4/ Tests in vivo du principe actif selon l'invention 4-1/ Mesure du tour de cuisse: L'étude porte sur des sujets qui sont déterminés de façon à présenter un indice de masse corporel compris entre 21 et 26 et un pourcentage de masse grasse par rapport au poids compris entre 26 et 35 %. Les essais sont conduits par application d'une émulsion contenant le principe actif formulé à 4% sur une cuisse pendant 28 jours contre l'émulsion placebo. Le tour de cuisse est mesuré par mesure centimétrique. Le tableau de la figure 6 regroupe les résultats obtenus qui montrent une diminution significative du tour de cuisse de - 0,4 cm pour celles qui ont été traitées par le principe actif et aucune variation significative pour les cuisses traitées par le placebo. 4-2/ Mesure du tour de ventre: l'étude porte sur des sujets qui sont sélectionnés de façon à présenter un indice de masse corporel compris entre 21 et 26 et un pourcentage de masse grasse par rapport au poids compris entre 26 et 35%. L'objectif de cette étude est d'évaluer in vivo, sur volontaires, l'effet 10 amincissant du principe actif formulé à 4% en émulsion par mesure centimétrique du tour de ventre. Les résultats sont récapitulés dans le tableau de la figure 7. On note une diminution non significative, selon le test de Student, du tour de ventre de 0,9 cm pour le placebo. Par contre les volontaires ayant appliqué l'émulsion contenant le principe actif présentent une diminution significative, en moyenne de 2,2 cm de leur tour de ventre, les volontaires ayant conservé leur poids initial. 4-3/ Analyse thermographique de contact: Une telle analyse permet de comparer l'effet drainant du principe actif en évaluant les variations thermiques existantes au niveau des zones cellulitiques. Les volontaires sont choisis avec les mêmes critères que précédemment pour une bonne corrélation des résultats. L'application du principe actif sous forme d'émulsion à 4% de principe actif est effectuée pendant 56 jours de façon biquotidienne contre placebo. L'application est effectuée sur une cuisse avec l'émulsion contenant le principe actif et sur l'autre cuisse avec l'émulsion placebo. Les plaques thermographiques de contact apposées sur les volontaires dans des conditions standardisées et reproductibles. Les plaques traduisent les variations thermiques. On peut classer les observations et en déduire les informations correspondantes. Stade 0: Une plaque uniforme montre une irrigation sanguine optimale des vaisseaux capillaires, une absence de zones hypothermiques (pas de nodules) et 5 une absence de zones hyperthermiques (stase sanguine). L'épiderme est lisse et aucune formation nodulaire n'est observée. Stade 1 en présence d'oedèmes, la plaque présente un aspect moucheté avec des taches hyperthermiques aux contours incertains. L'épiderme est légèrement inégal. Stade 2: oedème généralisé avec une image entièrement mouchetée. Présence de zones hyperthermiques et de zones plus froides donc moins irriguées. Stade 3 Peau de léopard avec de nombreuses taches hyperthermiques bien définies réparties dans une zone froide. Perte d'élasticité et du tonus jusqu'à flaccidité. Stade 4 Présence de surfaces noires ou marrons hypothermiques côtoyant des tâches hyperthermiques. Présence de nodules douloureux à la pression. L'analyse est effectuée visuellement par un groupe de personnes suivant un protocole établi. A JO, aucune différence significative n'a été observée entre les stades thermographiques auxquels se trouvent les sujets du groupe utilisant le principe actif et ceux traités avec le placebo. Les su jets sont considérés comme identiques à JO. Après 56 jours de traitement biquotidien avec le principe actif selon l'invention, 42% des volontaires présentant un tissu oedémateux à fortement oedémateu à JO, ont retrouvé un tissu normal voire légèrement oedémateux contre 27% des personnes ayant testé le placébo. 4-4/ Effet raffermissant: L'objectif de cette étude est de quantifier in vivo, sur volontaires, l'effet raffermissant du principe actif formulé à 4% en émulsion par évaluation des propriétés biomécaniques de la peau au niveau des cuisses au moyen d'un appareil commercialisé sous la dénomination "Cutomètre". Deux paramètres sont mesurés la tonicité Ur et l'élasticité Ur/Uf. Les résultats sont regroupés dans les tableaux des figures 8A et 8B. Le traitement avec le principe actif selon la présente invention permet d'améliorer de 7,5% l'élasticité cutanée et de 15,6% le tonus cutané. 5/ Composition cosmétique incluant le principe actif selon l'invention: La présente invention couvre aussi les compositions cosmétiques incluant le principe actif selon la présente invention dans différentes formes galéniques, crème, émulsion grasse ou aqueuse, onguent, gel, ou solution. Il convient alors d'analyser la stabilité des formes galéniques incluant le principe actif selon l'invention, ceci dans des proportions comprises entre 0,1 et 10 %. La stabilité est caractérisée par une absence de précipitation de l'actif, une absence de crémage et une absence de déphasage. On peut citer des formulations ayant montré une stabilité physique incluant 5% 20 de principe actif selon l'invention. Gel limpide: - Carbopol: 0,5% avec Triéthanolamine: qsp pH=6,5 - Phénonip: 0,7% - Eau: 93,8% Gel opaque: - 5épigel 305: 2,0% - Phénonip: 0,7% - Eau: 92,3% Gel émulsionné : - Montanov 202: 3,0% - Isopropyl palmitate: 12,0% Phénonip: 0,7% - 5épigel 305: 2,0% - Eau: 77,3% Emulsion anionique: Acide stéarique: 7,0% - Triéthanolamine: 3,5% - Isopropyl palmitate: 20,0% - Phénonip: 0,7% - Eau: 63,8% Emulsion non ionique: - Montanov 202: 3,0% 5imulsol 165: 2,0% - Isopropyl palmitate: 20,0% - Phénonip: 0,7% - Eau: 69,3% Emulsion non ionique: - Quaternium-82: 5,0% - Alcool cétylique: 3,0% - Isopropyl palmitate: 15,0% - Phénonip: 0,7% - Eau: 71,3% De plus, des tests ont montré la compatibilité du principe actif avec les matières premières utilisées en cosmétique. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un principe actif ayant une activité cosmétique amincissante et raffermissante, caractérisé en ce qu'il consiste à réaliser les étapes suivantes: Obtention d'un premier actif primaire: solubilisation d'une poudre de Celosia cristata à raison d'au moins 50 g/I dans l'eau, - hydrolyse(s) enzymatique (s) simultanée(s) ou successive(s) en présence d'au moins une carbohydrase, - séparation des phases soluble et insoluble, - conservation de la phase soluble, - inactivation de l'activité enzymatique dans cette phase soluble, et - concentration de la fraction polyphénolique active de cette phase soluble. Obtention d'un second actif primaire: - solubilisation d'une poudre de Prunella vulgaris à raison d'au moins 50 g/I dans de l'eau, - hydrolyse(s) enzymatique (s) simultanée(s) ou successive(s) en présence d'au moins une carbohydrase et/ou par hydrolyse chimique. - séparation des phases soluble et insoluble, - conservation de la phase soluble, - inactivation de l'activité enzymatique dans cette phase soluble, et - élimination de la fraction polyphénolique de cette phase soluble. Obtention d'un principe actif final par mélange avec introduction en volume d'au moins â du second principe actif primaire dans au plus 4 du premier principe actif primaire. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, en cas de trouble du mélange ainsi réalisé, on procède à une filtration. 3. Principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par les paramètres suivants: - matière sèche: taux compris entre 5 et 200 g/I. - mesure du pH: valeurs comprises entre 3,5 et 6,5. - mesure du taux de sucres: valeurs de sucres totaux comprises entre 1 et 70 g/I. - dosage des composés phénoliques: valeurs comprises de 0,04 à 2,00 g/I. 4. Principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par les paramètres suivants: - matière sèche: taux compris entre 30 et 45 g/l. - mesure du pH: valeurs comprises entre 4,5 et 5,5. - mesure du taux de sucres: valeurs de sucres totaux comprises entre 8 et 16 g/l. - dosage des composés phénoliques: valeurs comprises entre 0,25 et 0,50 g/l. 5. Principe actif selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que les sucres sont composés de: - entre 60 et 80% de glucose, plus particulièrement 70%, et - entre 15 et 21% de fructose, plus particulièrement 18%, et - entre 5 et 19% de xylose, plus particulièrement 12%. 6. Principe actif selon la revendication 5, caractérisé en ce que les sucres simples glucose et fructose sont présents sous forme de monosaccharides, de disaccharides, d'oligosaccharides et de polysaccharides. 7. Principe actif selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que les composés phénoliques ont une composition en polyphénols de: - 15 à 25% de composés hydroxycinnamiques, plus particulièrement 20%, et à 85% de flavonols, préférentiellement 80%. 8. Utilisation du principe actif selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que, appliqué sur les tissus adipeux constitués notamment de préadipocytes et d'adipocytes, il permet une limitation de l'expression des ARNm codant les PPAR-y (Peroxysome ProliferatorActivated Receptors gamma), facteurs de transcription qui entraînent le déclenchement du processus de différenciation adipocytaire. 9. Utilisation du principe actif selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que, appliqué sur les tissus adipeux, il permet une limitation de 10 la différenciation des préadipocytes en adipocytes matures. 10. Utilisation du principe actif selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que, appliqué sur les tissus adipeux, il permet une stimulation de l'activité lipolytique des adipocytes en favorisant l'hydrolyse des triglycérides présents dans les adipocytes. 11. Composition cosmétique incluant le principe actif selon l'une quelconques des revendications 3 à 7, caractérisée en ce qu'elle est formulée sous des formes galéniques choisies parmi: crème, émulsion grasse ou aqueuse, onguent, gel, ou solution.