FR 2863270 A1 20050610 FR 0314391 A 20031209 La présente invention concerne un procédé de préparation de polysaccharides, des polysaccharides nouveaux et l'utilisation de polysaccharides. La présente invention porte sur la méthode de production, de modification et les applications de polysaccharides naturels présentant certaines propriétés physicochimiques similaires à la gélatine d'origine animale. Ces polysaccharides naturels sont des macromolécules de nature glucidique synthétisées par des organismes vivants et qui présentent des propriétés physicochimiques reliées à des fonctions biologiques. La protection contre un environnement hostile, la mise en réserve de glucides utilisables ultérieurement, la lo protection contre d'autres organismes vivants sont autant de fonctions biologiques permettant un avantage sélectif entre les êtres vivants. Ces polysaccharides naturels, notamment ceux produits par les organismes procaryotes, ont fait l'objet de nombreuses études aboutissant à une meilleure compréhension de leur rôle pour l'organisme qui les produit. Cette connaissance permet ainsi de détourner et de mieux valoriser le rôle premier de ces molécules au profit d'applications industrielles dans des secteurs aussi variés que la cosmétique, la pharmacie ou le domaine agroalimentaire. La présente invention concerne les modifications chimiques et physiques d'un polysaccharide produit par un microorganisme bactérien déposé sous le numéro I- 1809 à la CNCM de l'Institut Pasteur, dont la structure chimique de l'unité répétitive est la suivante: (A B C D E-)- F G -4}-gGfcM1.4}gGlc{1,4)-fGle{1,e}oGle-{ I.4}acati1--pGal-(1,$)-BGaH1,8) J6 Pytwate Ce polymère contient 7 sucres dont 1 acide glucuronique (A), 3 résidus glucose (B, C et D), 3 résidus galactose (E, F et G), un groupement pyruvate et 1 à 3 groupements acétyle non localisés, n est compris entre 228 et 3750, ce qui correspond à un poids moléculaire compris entre 300 000 et 5.106 g/mol. Le polysaccharide natif présente des propriétés physicochimiques ne permettant pas son utilisation comme agent gélifiant comme la gélatine animale couramment utilisée dans l'industrie. Le but de cette invention est de modifier par des traitements physiques et chimiques 1 a structure du polymère afin de 1 ui faire acquérir des propriétés rhéologiques proches de la gélatine animale. L'avantage majeur de cette invention réside dans le fait d'obtenir un io mélange de molécules d'origine biotechnologique exempt de toute molécule d'origine animale et présentant des propriétés similaires à la gélatine provenant de l'extraction d'organismes vertébrés supérieurs. La gélatine provenant des animaux est utilisée dans de nombreux secteurs d'activité, notamment dans l'industrie cosmétique, alimentaire ou pharmaceutique comme enveloppe des gélules à enveloppes dures. Les molécules, telle la gélatine animale ou ses substituts chimiques, doivent suivre un cahier des charges précis pour permettre une bonne utilisation de cette forme galénique. Le produit susceptible de remplacer la gélatine animale doit répondre à un certain nombre de critères, il faut en effet: É La possibilité de dissoudre le polymère dans l'eau à des concentrations massiques supérieures à 10 % (mlm) soit 100 g/L, É Une viscosité comprise entre 300 et 1000 mPa.s sur le 1er plateau newtonien (contraintes de cisaillement comprises entre 0,1 et 10 s-') à une température de 50 C et avec une concentration comprise entre 20 à 40 % en masse, É L'obtention de films clairs non cassants pour une épaisseur de 100pm, É Une solubilisation rapide (quelques minutes) des films à une température de 37 C dans des solutions de pH=7 à pH=1. L'invention a pour objet un procédé de préparation de polysaccharides, caractérisé en ce que: 20 25 a) Pour préparer un polysaccharide traité thermiquement et hydrolysé, É un polymère traité thermiquement peut être obtenu en cultivant un microorganisme bactérien déposé sous le numéro 1-1809 auprès de la CNCM à l'Institut Pasteur sur un milieu riche en glucose et en matière azotée pour obtenir un moût de fermentation, en diluant le moût de fermentation entre 1 et 1/20 en volume par de l'eau et en le chauffant entre 70 et 130 C, puis en le centrifugeant ou en le soumettant à une filtration tangentielle pour obtenir un surnageant, en soumettant le surnageant à une filtration à 0,22 im pour obtenir un filtrat, en concentrant le filtrat et en le mettant en contact avec un premier solvant (par exemple de l'éthanol) pour obtenir un premier précipité, en séparant le précipité et en le séchant. É on ajuste le pH d'une solution de polymère traité thermiquement à 10g/L entre 1 et 3 par addition d'un acide et on agite la solution de polymère traité thermiquement pendant une durée suffisante entre 70 et 95 C pour obtenir une solution finale d'une viscosité comprise entre 1 et 6 mPa.s à 25 C et à 10 g/L, É on utilise de préférence une quantité d'acide chlorhydrique permettant de porter le pH à 2,2 et la durée de l'hydrolyse est comprise entre 60 et 240 minutes. É on met la solution finale en contact avec un deuxième solvant alcoolique pour obtenir un deuxième précipité que l'on sépare et que l'on sèche pour obtenir le polysaccharide traité thermiquement et hydrolysé ; La production du polysaccharide traité thermiquement suit un procédé de fermentation industriel composé de deux étapes. Dans un premier temps, un polymère natif est produit par fermentation, puis dans un second temps celui-ci est modifié par la chaleur pour obtenir le polymère traité thermiquement. Exemple de production du polymère traité thermiquement: Une croissance de cellules bactériennes est réalisée à partir d'un milieu de préculture stérilisé 20 minutes à 121 C à l'autoclave dont la composition 5 est la suivante: Tableau I Type de milieu de culture: PRECULTURE Glucose 11 g/L Extrait de levure 3 g/L Glucose/Extrait de levure 3,3 Solution minérale 70 mL/L Solution minérale Solution éléments MgSO4, 7H20 2 g/L H3B03 2,8 g/L CaC12, 2 H2O 0* - 2 g/L MnSO4, H20 1, 3 g/L FeSO4, 7 H2O 0,44 g/L Na2MoO4, 2 H20 0, 75 g/L EDTA Titriplex II 0* - 0,4g/L ZnSO4, 7 H2O 0,43 g/L Solution éléments 20mL/L CoSO4, 7 H2O 70 mg/L CuSO4, 7 H2O 22,5 mg/L On inocule le milieu p réalablement refroidi avec la souche d éposée sous le numéro 1-1809 à la CNCM de l'institut Pasteur, cette préparation est incubée à 30 C pendant 16 heures pour atteindre une quantité de cellules telle que la mesure de la densité optique à 600 nm (Hitachi U2000 spectrophotometer, Japan) atteint 3,25. On transfert ensuite cette préculture dans un fermenteur de 450 litres (SGI, Toulouse) contenant 300 litres de milieu de préculture préalablement stérilisé par vapeur. Les paramètres de fermentation sont: agitation 150 tours par minute, aération 11 m3lh, pression de couverture du fermenteur 1 bar, pH au cours de la fermentation régulé entre 6,5 et 7 par ajout de NaOH (2N), température de culture 30 C. Après 18h30 de culture, on transfert cette préculture d'une densité optique mesurée à 600nm de 4,32 dans un fermenteur de 40 m3 (Chemap) contenant 30 m3 de milieu de production préalablement stérilisé par vapeur. Avant transfert, un contrôle bactériologique est effectué par une observation microscopique en contraste de phase à un grossissement de 100 fois (Microscope Axioskop 2 plus Cari Zeiss Germany). Le milieu de production a la composition suivante: Tableau Il Type de milieu de culture: PRODUCTION Glucose 25 g/L Extrait de levure 3 g/L Glucose/Extrait de levure 11,1 Solution minérale 70 mL/L Les paramètres de fermentation sont: agitation 50 tours par minute, aération 1 500 m3lh, pression de couverture du fermenteur 1 bar, pH au cours de la fermentation régulé entre 6,5 et 7 par ajout de NaOH (5N), température de culture 30 C. Après une durée de 42h00 on stoppe la fermentation par arrêt de l'aération et de l'agitation. Le moût contient 12,58 g/L de polymère natif prêt à être traité thermiquement. Les résultats des différentes étapes, préculture et fermentation proprement dites sont résumés dans le tableau suivant: Tableau III Matériel Erlen3L Erlen3L Fermenteur Fermenteur Fermenteur Fermenteur 450 L 450 L 40m3 40m3 Temps TO T Final TO T Final TO T Final Durée (en h) - 16h - 18h30 - 42h00 DO (600 nm) 0,080 3,250 0,051 4,323 0,044 12,85 PH 6,63 5,54 6,56 6,60 6,59 4,91 Glucose (en 11 - 10 5,55 25,6 2,10 g/L) Viscosité (en - - - - - 2100 mPa.$) Préculture Culture Les résultats de la fermentation 40 m3 sont les suivants: Tableau IV Durée 42 h Biomasse (X) en g/L 4,94 Vitesse de croissance (dX/dt) en g/l.h-' 0,119 Taux spécifique de croissance (p) en h-' 0,304 Glucose consommé (S) en g/L 23, 50 Vitesse de consommation du glucose (dS/dt) en 0,564 g/I.h-' Viscosité (V) en mPa.s 2100 Polysaccharide produit (P) en gIL 12,58 Vitesse de production (dP/dt) en g/l.h-' 0,302 Rendement Yp,s 53,5% Rendement Yxws 21,0% Le moût de fermentation ainsi produit est chauffé à une température de 121 C par injection directe de vapeur sur une durée de 20 minutes, centrifugé pour éliminer les cellules puis filtré par filtration frontale avec un seuil de coupure de 0,45pm. Ce milieu débarrassé de cellules et contenant le polymère traité thermiquement est ensuite refroidi, pour atteindre une température de 20 C à 30 C. Une quantité variable de NaCl est ensuite ajoutée pour atteindre une concentration > o finale d e NaCl de 40 g IL dans le milieu débarrassé d es cellules b actériennes et contenant le polymère traité thermiquement. Par exemple, pour 500 kg de milieu précédemment obtenu, on ajoute 20 kg de NaCl. Ce milieu salé et contenant le polymère traité thermiquement est ensuite précipité p ar l'ajout d'une masse d'éthanol par masse de m ilieu salé. L e 15 polymère précipite puis décante. Le surnageant est retiré puis le décantat est lavé par ajout d'un mélange hydroalcoolique (un mélange éthanol/eau) présentant des titres volumétriques alcooliques de 70 (300 kg), 85 (300 kg), et 96 (100kg, 50kg) puis enfin, le polymère sous forme de poudre en milieu alcoolique est déshydraté par rinçage avec de l'éthanol ayant un titre de 99 (50kg). Le polymère est ensuite séché sous vide à 45 C pendant une durée comprise entre 1 et 8 heures et préférentiellement 6 heures. La poudre obtenue contient le polymère qui est ainsi prêt pour subir le traitement de désacétylation et d'hydrolyse. Ce dernier présente un poids moléculaire compris entre 300.000 et 5.000.000 g/mol qui correspond à un nombre n d'unité de monomère comprise entre 228 et 3750. i0 15 b) pour préparer un polysaccharide traité thermiquement et désacétylé ( Ptd): É on dissout à une concentration comprise entre 0,2 et 60 g par litre du polymère traité thermiquement dans une première solution où on ajoute 0, 01N d'une base par gramme de polymère dans la solution en agitant pendant au moins 10 minutes pour obtenir une solution de polysaccharide traité thermiquement et désacétylé, É on met la solution de polysaccharide traité thermiquement désacétylé en contact avec un premier acide jusqu'à obtention d'un pH compris entre 4,5 et 6,5 pour obtenir u ne solution de polysaccharide traité thermiquement et désacétylé, et É on met la solution de polysaccharide traité thermiquement et désacétylé en contact avec un troisième solvant alcoolique pour obtenir un troisième précipité que l'on sépare et que l'on sèche pour obtenir le polysaccharide traité thermiquement et désacétylé ; c) pour préparer un polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé (Pthd): É On dissout du polysaccharide traité thermiquement et hydrolysé à une concentration comprise entre 0,2 et 60 g par litre dans une deuxième solution aqueuse ou on neutralise la solution de polymère traité thermiquement et hydrolysé obtenue en a) par l'ajout d'une base pour amener le pH de la solution entre 5 et 7, É On ajoute 0,01N d'une base par gramme de polymère dans la solution en agitant pendant au moins 10 minutes pour obtenir une solution de polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé, É on met la solution de polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé en contact avec un deuxième acide jusqu'à obtention d'un pH compris entre 4,5 et 6,5 pour obtenir une solution de polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé, 30 35 É on met la solution de polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et d ésacétylé e n contact avec u n quatrième solvant alcoolique pour obtenir un quatrième précipité que l'on sépare et que l'on sèche pour obtenir le polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé. La viscosité d'une solution de ce nouveau polysaccharide est comprise entre 300 et 1000 mPa.s à 50 C et une concentration comprise entre 200 et 400 g/L. Le polymère traité thermiquement et ayant subi une désacétylation présente un poids moléculaire compris entre 290 000 et 4 800 000 g/mol correspondant à un nombre de motif respectivement de 228 et 3750 Après le traitement d'hydrolyse et de désacétylation, le polymère présente un poids moléculaire compris entre 20 000 et 60 000 g/mol ce qui 15 correspond à un nombre de motif compris entre 15 et 46. On dispose ainsi de quatre types de polysaccharides. Molécule a: le polymère traité thermiquement (Pt). Le polymère traité thermiquement adopte en solution une conformation ordonnée de type réseau mettant en jeu des interactions intra et inter chaînes de polymères. La structure du réseau formé par les différentes chaînes de polymère confère aux solutions de molécule traitée thermiquement des propriétés gélifiantes. Ces dernières pouvant être augmentées par l'ajout de cations. Molécule b: le polymère traité thermiquement et hydrolysé (Pth). Le polymère hydrolysé en milieu acide est de faible masse molaire 30 (Mw 30 000 g/mole). Ce polymère n'a plus de conformation ordonnée. Les solutions sont très peu visqueuses et permettent la mise en solution à forte concentration. Molécule c: le polymère traité thermiquement et désacétylé (Ptd). Le polymère désacétylé n'a plus de conformation ordonnée, c'est une chaîne souple. Le polymère ne gélifie pas et n'a pas tendance à s'agréger. La désacétylation en conditions douces ne diminue pas les longueurs des chaînes des molécules. Molécule d: le polymère traité thermiquement hydrolysé et désacétylé (Pthd). Le polymère hydrolysé et désacétylé ne présente pas de structure ordonnée. Il est très peu visqueux, même à forte concentration, et ne forme pas d'agrégats. On analyse ci-dessous les spectres RMN proton du polysaccharide traité thermiquement (Figure 1), du produit sans pyruvate (hydrolysé) (Figure 2) et du produit traité thermiquement, désacétylé et dépyruvaté (hydrolysé) (Figure 3) et du produit traité thermiquement et désacétylé (Figure 6). Figure 1: le spectre est obtenu à 85 C dans D20 à 6 g/L sur un AC300; on trouve entre 5,5 et 4,4 ppm des massifs correspondant aux protons H-1 des différents sucres (voir le spectre 3 pour comparaison). A 2,25 ppm, l'étalon interne (succinate de sodium) qui permet de calculer les teneurs en groupements acétyle et pyruvate. A 2-2,2 ppm, on trouve les protons des méthyles du groupement acétyle (différents environnements correspondant à différents signaux). A 1,76 ppm, on trouve les acétyles libres venant de l'hydrolyse partielle des groupements acétyle du polymère. Enfin, à 1,33 ppm, il y a le signal des groupements pyruvyles. Figure 2: le spectre est obtenu sur un Varian 500, à 12 g/L, 85 C; on retrouve les signaux des groupements acétyle liés et ceux des acétates libres; entre 1,3 et 1,5 ppm, on retrouve les traces de groupements pyruvyles à environ 1,76 ppm, on trouve les acétates libres. Figure 3: ce spectre, obtenu à 85 C dans D20 à 7 g/L sur un Varian 500, correspond au polymère après hydrolyse acide et traitement basique; le polymère est donc à la fois désacétylé et dépyruvaté. On voit clairement les protons H-1 avec, à 5,40 ppm, le H-1 du galactose (unité E dans la formule), à 4,8 ppm, le H-1 du glucose (unité D dans la formule) ; entre 4,3 et 4,5 ppm, les H-1 des autres sucres, à 1,48 ppm le groupement pyruvyle partiellement hydrolysé et encore lié io au galactose (unité E dans la formule). Le pic à 1,8 ppm correspond au groupement acétates libres présents dans l'échantillon en raison d'un purification incomplète. Figure 6: ce spectre, obtenu à 85 C dans D2O à 7 g/L sur un Varian 500, correspond au polymère après traitement basique; le polymère est donc désacétylé. On voit clairement les protons H-1 avec, à 5,40 ppm, le H-1 du galactose (unité E dans la formule), à 4,8 ppm, le H-1 du glucose (unité D dans la formule) ; entre 4,3 et 4,5 ppm, les H-1 des autres sucres, à 1,48 ppm le groupement pyruvyle partiellement hydrolysé et encore lié au galactose (unité E lo dans la formule). Dans les Figures 4 et 5, on donne les spectres 13C du polymère dépolymérisé par l'acide, donc sans groupement pyruvate mais avec des groupements acétyle et celui du polymère sans substituant. Les spectres sont obtenus dans D2O à 70 C à la concentration de 50 mg/mL sur un AC300. Figures 4 et 4' : on trouve le spectre du polymère hydrolysé par voie acide. A 21 ppm, on retrouve les groupements acétyle et les différents C=0 vers 175 ppm (à 175,41; 175,16; 174,50; 174,28 et à 173,69). Tous les C-1 sont entre 99 et 105 ppm et les C-6 entre 60 et 62 ppm (à 60,93 et à 60,61). Figures 5 et 5' : ce spectre montre le C=0 de l'acide uronique à 175 ppm; entre 99 et 105 ppm, on retrouve les 7 autres carbones des sucres constitutifs du motif de répétition et les différents carbones C6 dans les conditions expérimentales choisies à 104,99; 103,86; 103,52; 103, 13; 101,02 et 99,358 et pour le C-6 à 61,86 et à 60,98. On donne ci-dessous la méthode de prétraitement des échantillons 25 pour faire la RMN: 1 Hydrolyse basique des substituants acétyle La désacétylation s'effectue sur le polysaccharide traité thermiquement purifié remis en solution à 10 g/L dans une solution à la concentration de 0,1 M en soude pendant 30 minutes à température ambiante. Pour désacétyler le YAS34 de faibles masses molaires, on hydrolyse à une concentration en polymère de 40 g/L en présence de 0,4 M en soude pendant 30 minutes, à température ambiante. La solution est ensuite neutralisée à pH=7,5 par ajout d'une solution d'acide chlorhydrique. A près ajout de N aCl, 1 e polymère est p récipité d e façon classique. La RMN 1H et la GPC permettent de vérifier le taux de 2863270 Il désacétylation et la non-hydrolyse du polymère par dégradation. 2 - Hydrolyse acide des substituants pyruvate La "dépyruvatation" s'effectue sur le polysaccharide traité thermiquement purifié remis en solution à - 5 g/L dans une solution de NaCI 0,1 M en présence d'acide oxalique 0,05 M pendant 4 h à 85 C. La solution ramenée à température ambiante est filtrée sur des membranes SARTORIUS de porosité 0,45 mm. La solution acide de polysaccharide traité thermiquement est additionnée io de sel (NaCl - 1M) et le polysaccharide traité thermiquement acide est précipité par ajout d'éthanol 60 % (v/v). La précipitation en milieu acide empêche une précipitation du sel d'oxalate de sodium. Le précipité est ensuite lavé de façon classique, puis remis en solution dans l'eau distillée. Cette solution est neutralisée par ajout de soude à un pH de 7,5. Le polymère est précipité, puis lavé une seconde fois. La RMN 1H permet de vérifier l'hydrolyse des substituants pyruvate. L'invention vise une composition qui comprend un mélange du polysaccharide traité thermiquement hydrolysé ou désacétylé, de préférence du polysaccharide traité thermiquement désacétylé, et du polysaccharide traité thermiquement hydrolysé et désacétylé, et notamment comprenant en poids entre 1 et 20 % de polysaccharide traité thermiquement désacétylé, et d'une manière correspondante entre 99 et 80 % du polysaccharide traité thermiquement hydrolysé et désacétylé, ainsi que l'utilisation d'une composition suivant l'invention comme substitut de la gélatine, notamment comme enveloppe de gélules. La composition suivant l'invention présente en chromatographie de perméation de gel, deux pics distincts correspondant à deux composés ayant des poids moléculaires moyens en poids (Mw) distincts, l'un entre 290 000 et 4 800 000 et l'autre entre 20 000 et 60 000 g/mol. L'invention vise aussi l'utilisation des polysaccharides suivant l'invention dans l'industrie alimentaire, cosmétique et pharmaceutique, notamment comme constituant d'une composition d'enveloppe de gélules. Les gélatines d'origine animale présentent des propriétés filmogènes spécifiques qui permettent la fabrication de capsules pouvant servir de vecteur à différentes substances actives. Afin d 'obtenir I es propriétés filmogènes désirées pour s e rapprocher de la gélatine animale, un mélange des types c et d des polymères obtenus précédemment est réalisé. Pour la suite des expérimentations, les différents types de polymères seront nommés: É Pt: polymère traité thermiquement É Ptd: polymère désacétylé É Pth: désigne le polymère hydrolysé É Pthd: désigne le polymère hydrolysé et désacétylé, É Pthd + X % Ptd: mélange de (100-X)% de Pthd et X % de Ptd Les proportions relatives en matière sèche des différentes poudres ainsi que leur propriété filmogène sont les suivantes: 97% Pthd + 3% Ptd propriétés filmogènes faibles 95% Pthd + 5% Ptd filmogène 90% Pthd + 10% Ptd filmogène 85% Pthd + 15% Ptd filmogène, viscosité limite 80% Pthd + 20% Ptd mélange trop visqueux Le respect des proportions des différentes polysaccharides de l'invention est analysé par chromatographie par perméation de gel sur une solution contenant les polysaccharides de l'invention à raison d e 2 0% de Ptd et 80% de Pthd (figure 7). (Température 30 C; Eluant: NaNO3 0,1M; 2 Colonnes Shodex OH pack; Equipement SEC à triple détection avec: Waters Alliance 2000 V (USA) associé à un appareil de diffusion de la lumière Wyatt (USA). L'analyse du spectre en diffusion de lumière (graphique 1) met en évidence 2 pics qui correspondent au profil des masses moléculaires des molécules de polymère traité thermiquement et désacétylé (pic 1) et traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé (pic 2). L'intensité du pic est reliée à la masse moléculaire à savoir plus l'intensité en importante, plus la masse moléculaire de la molécule est élevée. pic 1: Polymère traité thermiquement désacétylé ; Mw= 385.000g/mole; Mn= 315.000g/mole; pic 2: Polymère traité thermiquement désacétylé et hydrolysé ; Mw= 33 000g/mole; Mn= 17 000g/mole. Graphique 2, figure 7: spectre GPC en concentration du mélange de polymère traité thermiquement désacétylé et traité thermiquement hydrolysé et désacétylé. Masse totale injectée 100 pg, pic 1: masse calculée: 16 pg: pic 2: masse calculée: 81 pg. Ratio théorique 20/80 en Ptd/Pthd, ratio réel 16/81. Les 3 % de perte correspondent à la rétention du polymère Pthd sur le filtre d'injection. La préparation des films nécessaires à l'analyse des propriétés physicochimiques du mélange de molécules suit le protocole suivant: dissolution entre 10 et 150 grammes de polymère pour 1 litre s d'eau osmosée, chauffage des solutions à une température comprise entre 50 et 60 C jusqu'à homogénéisation complète du mélange, la préparation est ensuite versée dans une boite de Pétri d'un diamètre de 12 cm, - après 48 à 72 heures de séchage à température ambiante, les films sont décollés, - les films d'une épaisseur de 100 pm environ sont découpés à l'emporte- pièce sous forme d'éprouvette 10 mm x 4 mm (DIN 53504 S3a: ZWICK), les éprouvettes sont placées sous atmosphère contrôlée pendant au moins 5 jours. Les films résultant des différents mélanges ont été testés en comparaison avec de la gélatine animale ainsi qu'avec une molécule de cellulose 20 modifiée chimiquement l'Hydroxypropylméthyl cellulose. Les essais sont réalisés en conditions hygrométriques contrôlées (31% hr et 51% hr). Les essais de traction ont été réalisés sur un appareil Instrôn 4301, muni d'un capteur de force (cellule d e 1 00 N). La vitesse de déplacement de la rampe est maintenue constante, assurant une vitesse d'élongation stable de 2 mm/min. Les mesures se font à température ( 23 C) et humidité relative ambiante. Les éprouvettes sont stockées à température et degré d'humidité constants (31 % hr et 51 % hr). Elles sont s orties juste avant l'essai en traction; leur épaisseur est mesurée au moyen d'un Palmer (précision de mesure: 2 {gym). Les essais en traction sur les films se traduisent par une striction, c'est-à-dire une diminution de la largeur de l'éprouvette en forme d'haltère. En première approximation, on fait l'hypothèse que 1 a 1 argeur d e l'éprouvette (axe x) n e v arie pas, (faibles taux d'élongations ( 10 %) selon z). Les résultats obtenus sont les suivants: (Les lignes horizontales noires en gras représentent les limites de tolérance hautes et basses.) a a r a \ce G o\ Q G'ei \)Q \.a r ra ee Qx o\ e Seo 6è ZQ o\o Qr Qr Qra eb ce 140 Graphe 1 - Bilan des résultats en traction pour les films stabilisés à 31% rh-Allongement maximum (A) en % et force maximale (B) en MPa. A - 14 - 10!11^1 80 - - - 0 0- B e eQe \d,a \Qa wa Q,,a G \ (o s- wax x'J x \Q \P\Qgrar r,ca wa a a a a o G Q \ Q 'q \Q \Q \Q o\Q Q \r Q \Qx Qrax.,bxQraraxh (i\ e 0\o Graphe 2Bilan des résultats en traction pour les films stabilisés à 51% rh Allongement maximum (A) en % et force maximale (B) en MPa. Pour présenter des caractéristiques proches de celles de la gélatine, la présente composition doit présenter une solubilité supérieure à 100 g/L. La mise en solution à 20 C de 10 g de poudre dans 100 ml d'eau ne doit pas laisser s apparaître de dépôt au fond du récipient et doit présenter un aspect homogène. En outre, une viscosité mesurée à un très faible taux de cisaillement et à 50 C doit être comprise entre 300 et 1000 mPa.s (Rhéomètre TA instrument, géométrie cône acier de 60 mm angle 4 , température d'analyse 50 C, gamme de contraintes de cisaillement de 0,1 à 10 s-'). Les viscosités mesurées de solution présentant une Io proportion variable de molécules hydrolysées désacétylées / désacétylées. viscosité à faible contraintes de cisaillement et à 50 C sont respectivement: Tableau V. Mélange Hydrolysé Désacétylé / Désacétylé Viscsosité mPa.s Ces solutions après séchage, forment des films transparents et élastiques suivant la condition d'humidité relative de l'air ambiant. Les films sont préparés par la réalisation à 60 C d'une solution à 30% du polymère à tester, puis homogénéiser pendant 30 minutes jusqu'à l'obtention d'une solution homogène. Cette solution est ensuite dégazée par un passage sous vide à 60 C pendant une durée de 5 minutes. La solution est ensuite coulée à 60 C dans une boite de pétri en verre d'un diamètre de 12,0 cm. La masse de produit étalée est fonction de la surface du support. Elle suit la formule suivante: M = (e=S) / p où M: masse de la solution,. e: épaisseur désirée du film (100 pm) S: Surface du support et p: masse volumique du film (0,63cm3/g). Les films ainsi créés sont ensuite séchés sous atmosphère contrôlée (31% rH ou 51% rH) et à une température de 20 C pendant 48 à 72 heures. L'épaisseur des films est vérifiée grâce à une jauge d'épaisseur série 547 (broche à force de mesure constante 3,5N;capacité 12mm; lecture 0,001 pm; disponible chez LABO AND CO.). L'épaisseur des films doit être comprise entre 90 pm et 110 pm et préférentiellement 100pm. Un film produit par une solution de polymère à 300 g/L séchée à 50 C et ne dépassant pas 100pm d'épaisseur mesurée par pied à coulisse (broche à force de mesure constante 3,5N; capacité 12mm; lecture 0,001 pm; disponible chez LABO AND CO.), doit avoir une durée de solubilisation complète dans des 85/15 90/10 80/20 solutions aqueuses à des pH variant de 7 ou 1 et faiblement agitée pas barreau magnétique inférieure à 1 minute. II apparaît d'après l'analyse du pouvoir filmogène et des propriétés mécaniques des films obtenus que les mélanges suivants: 9 5% Pthd + 5% Ptd, 90% Pthd + 10% Ptd, 85% Pthd + 15% Ptd, possèdent un comportement mécanique proche de celui de la gélatine animale. II a pparaît clairement que I es mélanges d e molécules t els q u'ils o nt été définis précédemment, permettent d'obtenir des propriétés similaires à la gélatine d'origine animale. Cette nouvelle gélatine d'origine biotechnologique permet de s'affranchir des problèmes rencontrés lors d'utilisations de produits d'origine animale. Etant totalement maîtrisée et ne faisant pas intervenir de molécules issues du règne animal, mais des molécules issues du fractionnement du végétal et des microorganismes, cette gélatine végétale permet de garantir une parfaite innocuité contre les agents infectieux non conventionnels. i0 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de polysaccharide, caractérisé en ce que: a) pour préparer un polysaccharide traité thermiquement et hydrolysé, É on dissout dans de l'eau, à une concentration comprise entre 1 et 40 g par litre, un polymère traité thermiquement pouvant être obtenu en cultivant un microorganisme bactérien déposé sous le numéro 1-1809 auprès de la CNCM à l'Institut Pasteur sur un milieu riche en glucose et en matière azotée pour obtenir un moût de fermentation, en diluant le moût de fermentation entre 1 et 1120 en volume par de l'eau et en le chauffant entre 70 et 130 C, puis en le centrifugeant ou en le soumettant à une filtration tangentielle pour obtenir un surnageant, en soumettant le surnageant à une filtration à 0,22 tam pour obtenir un filtrat, en concentrant le filtrat et en le mettant en contact avec un premier solvant (par exemple de l'éthanol) pour obtenir un premier précipité, en séparant le précipité et en le séchant, pour obtenir du polymère traité thermiquement. É on ajuste le pH d'une solution de polymère traité thermiquement à 10g/L entre 1 et 3 par addition d'un acide et on agite la solution de polymère traité thermiquement pendant une durée suffisante entre 70 et 95 C pour obtenir une solution finale d'une viscosité comprise entre 1 et 6 mPa.s à 25 C et à 10 g/L, É on utilise de préférence une quantité d'acide chlorhydrique permettant de porter le pH à 2,2 et la durée de l'hydrolyse est comprise entre 60 et 240 minutes. É on met la solution finale en contact avec un deuxième solvant alcoolique pour obtenir un deuxième précipité que l'on sépare et que l'on sèche pour obtenir le polysaccharide traité thermiquement et hydrolysé ; b) pour préparer un polysaccharide traité thermiquement et désacétylé: s É on dissout à une concentration comprise entre 0,2 et 60 g par litre du polymère traité thermiquement dans une première solution où on ajoute 0, 01N d'une base par gramme de polymère dans la solution en agitant pendant au moins 10 minutes pour obtenir une solution de polysaccharide traité thermiquement et désacétylé, É on met la solution de polysaccharide traité thermiquement désacétylé en contact avec un premier acide jusqu'à obtention d'un pH compris entre 4,5 et 6,5 pour obtenir u ne solution de polysaccharide traité thermiquement et désacétylé, É on met la solution de polysaccharide traité thermiquement et désacétylé en contact avec un troisième solvant alcoolique pour obtenir un troisième précipité que l'on sépare et que l'on sèche pour obtenir le polysaccharide traité thermiquement et désacétylé ; c) pour préparer un polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé : É On dissout du polysaccharide traité thermiquement et hydrolysé à une concentration comprise entre 0,2 et 60 g par litre dans une deuxième solution aqueuse ou on neutralise la solution de polymère traité thermiquement et hydrolysé obtenue en a) par l'ajout d'une base pour amener le pH de la solution entre 5 et 7, É On ajoute 0,01N d'une base par gramme de polymère dans la solution en agitant pendant au moins 10 minutes pour obtenir une solution de polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé, É on met la solution de polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé en contact avec un deuxième acide jusqu'à obtention d'un pH compris entre 4,5 et 6,5 pour obtenir une solution de polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé 30 35 et désacétylé, É on met la solution de polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé en contact avec un quatrième solvant alcoolique pour obtenir un quatrième précipité que l'on sépare et que l'on sèche pour obtenir le polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé. 2. Polysaccharide traité thermiquement hydrolysé, caractérisé en ce qu'il est tel que celui qui peut être obtenu par le procédé suivant a) de la 10 revendication 1. 3. Polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé ayant le spectre de RMN proton sur un appareil Varian 500 à 12 gll et à 85 C dans D20 représenté à la figure 2, ayant notamment entre 1,3 et 1,5 ppm des signaux de moindre amplitude que entre 2 et 2,2 ppm des signaux correspondant aux protons des méthyles du groupement acétyle, à 4,4 ppm un signal correspondant au proton du glucose D et à 5,5 ppm un signal correspondant au proton du galactose E dans la formule générale (A B C D E--)- F G correspondant à la formule développée s}.13Gua{1.4) Gte (1,a} ic{t,O)-celc-{1,a}acal-el _E{1,3j-)Gal{1,e) 6 J Pyrwate 25 30 35 et ayant le spectre RMN de 13C obtenu dans D20 à 70 C à la concentration de mg/ml sur un appareil AC300 représenté aux figures 4 et 4' et ayant notamment à 21 ppm le signal correspondant aux groupements acétyle, vers 175 ppm les signaux correspondant aux différents groupes C=O, entre 99 et 105 ppm les signaux correspondant aux C-1. 4. Polysaccharide traité thermiquement, désacétylé, caractérisé en ce qu'il est tel que celui qui peut être obtenu par le procédé suivant b) de la revendication 1. io 5. Polysaccharide traité thermiquement, désacétylé ayant le spectre RMN du proton sur un appareil Varian à 6 g/litre dans D2O et à 85 C représenté à la figure 6, ayant notamment les signaux de pics à 5,36; 4, 83; 4,52; 4,49; 4,46; 4,39; 4,15; 4,09; 3,28 et 1,35. 6. Polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé, 15 caractérisé en ce qu'il est tel que celui qui peut être obtenu par le procédé suivant c) de la revendication 1. 7. Polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé ayant le spectre RMN du proton sur un appareil Varian 500 à 7 g/litre et à 85 C dans D2O représenté à la figure 3, ayant notamment les signaux correspondant aux protons H-1 avec à 5,35 ppm le H-1 du galactose (unité E), à 4,8 ppm le H-1 du glucose (unité D), entre 4,3 et 4,5 ppm les H-1 des autres sucres (unités A, B, C, F et G) dans le motif de formule générale (A B C D E-) - F G correspondant à la formule développée >Ge-(1s}-cat-(a,a) 4/ ; Pyrwate 35 et ayant le spectre RMN de 13C obtenu dans D20 à 70 C à la concentration de 50 mg/mL sur un appareil AC300 représenté aux figures 5 et 5', ayant notamment à 17,5 ppm le signal correspondant au C=0 de l'acide uronique et entre 99 et 105 ppm ceux correspondant aux C-1 des unités A, B, C, D, E, F et G (avec des signaux à 104,99; 103,86; 103,58; 101,02 et 99,36). 8. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange du polysaccharide traité thermiquement, désacétylé et du polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé en ayant un premier composé ayant un io poids molaire moyen en poids (Mw) compris entre 290 000 et 4 800 000 g/mol et un deuxième composé ayant un poids moléculaire moyen en poids compris entre 20 000 et 60 000 g/mol. 9. Composition suivant la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend, en poids, entre 1 et 99 % du polysaccharide traité thermiquement, désacétylé ou hydrolysé et entre 99 et 1 % du polysaccharide traité thermiquement, hydrolysé et désacétylé. 10. Composition suivant la revendication 8 o u 9, caractérisée e n ce 20 qu'elle comprend du polysaccharide traité thermiquement et désacétylé. 11. L'utilisation d'une composition suivant l'une des revendications 8 à 10 comme substitut de la gélatine, notamment dans l'industrie cosmétique, alimentaire et pharmaceutique, en particulier comme enveloppe de gélules. 12. L'utilisation d'un polysaccharide, tel que préparé à la revendication 1 ou tel que caractérisé aux revendications 2 à 7, dans l'industrie cosmétique, alimentaire et pharmaceutique, notamment comme constituant d'une composition d'enveloppe de gélule.