FR 2869801 A1 20051111 FR 0404814 A 20040505 2869801 1 La présente invention concerne un procédé de préparation de microsphères, les microsphères ainsi obtenues et leur utilisation en thérapeutique. Le Système Nerveux Central (SNC) est physiologiquement isolé du reste de l'organisme par deux barrières cellulaires: la barrière hématoencéphalique (BHE) qui isole le sang du tissu nerveux central et la barrière hémo-méningée (BHM) qui isole le sang du liquide céphalo-spinal (LCS). Cette double barrière rend difficile tout traitement par voie conventionnelle (parentérale ou orale). Certaines voies d'administration permettent d'atteindre les structures du SNC par effraction au travers de la BHM. Il s'agit des voies intrathécale (i.t), intracérébroventriculaire (i.c.v) ou intracérébrale (i.c); une administration épidurale peut également être envisagée pour atteindre les structures du SNC par diffusion à travers la BHM. Ces voies d'administration ne sont toutefois pas anodines, et restent pratiquées en milieu hospitalier par du personnel spécialisé. Elles présentent cependant des particularités. Lorsqu'une forme médicamenteuse est injectée par effraction au travers de la BHM par une des voies susmentionnées, elle est introduite dans un espace restreint dans lequel elle ne se distribue pas de façon homogène. Le volume du LCS est faible (40 à 70 mL), et son flux en terme de vitesse ou de débit diffère selon les différentes zones du rachis considérées. La 2869801 2 circulation du LCS, associée à un mélange incomplet, tend à générer des zones où le principe actif ou les excipients seront en concentration plus fortes, potentiellement toxiques. Le volume de liquide injectable en sous- arachnoïdien est très faible ( Contrairement à d'autres voies d'administration, augmenter la dose ne peut se faire ni en augmentant le volume injecté, ni en augmentant la concentration à cause des risques de souffrance tissulaire. Volume et concentration conditionnent donc le choix des excipients, qui doivent être bien tolérés et permettre une solubilisation excellente des principes actifs. Leurs produits de dégradation doivent aussi être non toxiques, ce qui est parfois une condition difficile à remplir pour les polymères. De nombreux principes actifs peuvent se fixer sur des cibles localisées derrière la BHM. Ces drogues sont en particulier des antalgiques administrés au long cours, à l'aide de pompes implantées, pour traiter des douleurs chroniques, consécutives à des cancers ou à un dysfonctionnement médullaire tumorale ou non. Le ciblage des structures de la moelle épinière peut se révéler très utile en thérapeutique. Le traitement médicamenteux des douleurs chroniques sévères et invalidantes a été totalement révolutionné grâce à l'administration intrathécale d'opioïdes puissants ou de substances apparentées (morphine, D-Ala-D-Leu- 2869801 3 enképhaline, [3-endorphine, octréotide, clonidine). En réalité, il existe de nombreuses substances intéressantes à administrer par voie intrathécale en dehors des analgésiques centraux: il s'agit d'anesthésiques locaux (lidocaïne, bupivacaïne, ropivacaïne), d'analogues de neuromédiateurs, d'anticancéreux (méthotrexate, cytarabine), d'interleukines, de facteurs de croissance (TRH, CTNF, BDNF, GDNF, NGF), de cytokines ou autres protéines ayant des potentialités thérapeutiques. Actuellement, la seule technique d'injection directe intrathécale au long cours réside dans l'emploi des pompes programmables implantées dans le corps du patient, et reliées à un cathéter. L'utilisation de ces pompes est limitée aux patients les plus atteints car ce type de traitement est cher, non dénué d'incidents, de complications mécaniques, et présente également un risque d'infection non négligeable par l'intermédiaire du cathéter, à l'origine d'interruptions temporaires ou définitives du traitement. A ce jour, seuls la morphine et le baclofène ont été autorisés pour une administration par voie intrathécale aux Etats-Unis, puis en Europe, pour le traitement des douleurs chroniques et de la spasticité. Le baclofène est un analogue de l'acide gamma-25 aminobutyrique (GABA), dont le site d'action est médullaire. Il se fixe sur les récepteurs GABA-B insensibles à l'action de la bicuculine. Ces récepteurs sont difficiles à atteindre lorsque le 30 baclofène est administré par voie orale, du fait d'un mauvais passage de la BHM. 2869801 4 Pour obtenir des taux suffisants dans l'espace sousarachnoïdien, il est nécessaire d'administrer des doses importantes par voie orale, ce qui se traduit par des effets secondaires notables de type, somnolence, nausées et confusion mentale dus à une distribution intracérébrale du baclofène. L'injection intrathécale permet une distribution médullaire préférentielle, qui conduit à des taux efficaces pour des doses plus de 1 000 fois inférieures à la voie orale et à une diminution très significative des effets secondaires. Depuis les premières injections en 1984, le rapport bénéfice/risque du baclofène est clairement évalué. Le baclofène est le traitement médicamenteux de référence de toutes les formes de spasticité. La mise sur le marché de cette molécule est autorisée depuis 1995 en France par voie intrathécale pour les formes les plus sévères de spasticité, résistantes au traitement par voie orale (autorisé depuis 1974). Aux Etats-Unis, le baclofène intrathécal est autorisé depuis 1992 dans le traitement des spasticités d'origine spinale et depuis 1996 dans le traitement des spasticités d'origine cérébrale. La spasticité est un désordre moteur caractérisé par une exagération vitesse-dépendante du réflexe d'étirement associée à une exagération des réflexes tendineux et résultant d'une hyper excitabilité réflexe; il s'agit d'un symptôme parmi d'autres constituant le syndrome du neurone moteur supraspinal (upper motor neurone syndrome) . Cette définition, admise par la majorité des cliniciens, est souvent considérée comme trop restrictive en pratique. Certains, en effet, y incluent tous les 2869801 5 signes positifs du syndrome pyramidal ou y ajoutent encore l'exagération des réflexes de flexion après lésion médullaire. La spasticité n'est responsable que d'une partie 5 seulement de la gêne fonctionnelle liée aux lésions des voies descendantes, mais c'est actuellement le seul de ces symptômes qui soit accessible aux thérapeutiques médicamenteuses. Dans ce contexte, encapsuler du baclofène sous une 10 forme galénique parvenant à contrôler la libération du principe actif sur plusieurs mois de façon continue, progressive et spécifiquement au niveau de ces récepteurs médullaires permet de remédier aux inconvénients de l'administration par cathéter des pompes implantables 15 jusqu'alors disponibles, en y apportant les améliorations telles que: - une réduction des coûts de suivi et d'implantation permettant d'élargir l'utilisation de la molécule qui possède un réel intérêt thérapeutique dans le traitement des spasticités sévères; un gain en sécurité et en confort pour le patient; un élargissement éventuel des indications du produit à des formes moins sévères de spasticité, au traitement des spasmes caractéristiques du syndrome de l'homme raide (Stiff-man syndrom) ou dans le traitement des rigidités tétaniques, au traitement précoce dans certains cas de traumatismes crâniens ou encore à d'autres domaines thérapeutiques tels que les douleurs chroniques résistantes aux opioïdes ou le traitement de la dépendance pharmacologique aux amphétamines, à l'héroïne et à l'alcool. 2869801 6 Bien entendu, les avantages liés aux coûts de traitement et au confort du patient ne sont pas uniquement limités au baclofène, mais peuvent être élargis à tout principe actif présentant une problématique similaire dans le domaine de l'administration à travers la BHM. L'utilisation d'une structure poreuse pour augmenter la surface d'échange d'un dispositif permettant la libération d'un principe actif est connue. Les brevets US 5,980,927 et 6,214,370 portent sur des implants pour l'administration contrôlée d'analgésiques vers le neuraxe par la voie intrathécale à l'aide de matrices polymères, et en particulier des implants non biodégradables en polyuréthane ou silicone chargés avec du fentanyl. Ces implants qui peuvent se former in situ permettent d'obtenir des cinétiques de libération d'ordre 0, avec une augmentation de la vitesse de libération en début de contact avec le milieu extérieur. Des systèmes ont également été développés pour la voie injectable, présentant l'avantage de moduler la libération de ce type, et en particulier de limiter l'effet de décharge ou libération immédiate (burst effect), tout en permettant une localisation et un retrait facile au cas de problème. Par ailleurs, la demande de brevet WO 02/28386 décrit un procédé d'encapsulation de principes actifs solubles dans l'eau, par extraction de solvant, sous la forme de microsphères de poly(D,L-lactide-co- glycolide), ou de poly(D,L-lactide) (PLAGA ou PLA). Cependant, ces microsphères ne permettent une libération que pendant une durée de 5 à 50 jours, avec une libération immédiate (burst) à 24 heures de 15 à 45%. 2869801 7 La demande de brevet WO 00/66085 décrit une composition permettant la libération d'un principe actif sous une forme prolongée, ladite composition comprenant deux phases polymères, une première phase discontinue sous la forme de microparticules de polymères biodégradables comprenant le principe actif, et une seconde phase continue sous la forme d'un gel biocompatible. Les microparticules biodégradables se trouvent emprisonnées au sein de la matrice gel . Une variante préférée consiste à utiliser pour la phase continue, un polymère thermo-réversible. La composition est administrée sous la forme d'une suspension de microparticules dans une solution gélifiante du polymère thermoréversible. Le gel se forme alors in situ et se solidifie dans la cavité d'injection, emprisonnant alors les microparticules biodégradables. Toutefois ce type de composition n'est envisagé, pour la voie parentérale, que pour une administration, intramusculaire, intra- péritonéale, intra-abdominale, sous-cutanée, et éventuellement intra-artérielle ou intraveineuse. Or la Demanderesse a découvert qu'une telle composition, sous forme de microparticules de polymère(s) dispersées, de façon homogène dans une solution de polymère biocompatible qui est capable de former un gel in situ dans l'organisme après administration se révèle particulièrement adaptée à une administration intrathécale, épidurale, intracérébroventriculaire ou intracérébrale. En effet, outre une limitation de l'effet de décharge ou libération immédiate ( burst effect ) équivalent à celui décrit pour les formes implantables précédemment citées, une telle forme galénique permet de remédier aux 2869801 8 inconvénients des pompes implantables explicités précédemment, et présente les avantages suivants: - une surface d'échange plus importante se traduisant par une distribution plus large du principe actif et donc une zone traitable plus importante; - une dose injectée mieux adaptée extemporanément à chaque cas clinique, puisqu'il suffit de calculer le volume de suspension à injecter pour administrer la dose désirée; - une libération prolongée du principe actif, permettant de maintenir des taux efficaces dans le LCS pendant au moins 100 jours, de préférence pendant une durée supérieure à 120 jours; - une libération du principe actif présentant un phénomène de libération immédiate ( burst effect ) limité, moins de 10% en poids du principe actif étant libéré à 24 heures après l'administration, puis une cinétique d'ordre 0 pendant le reste de la période d'administration; - une tolérance améliorée; - un système totalement biocompatible. La présente invention porte donc sur un procédé de préparation de microsphères comprenant du poly(D,L- lactide-co-glycolide), du poly(D,L-lactide) (PLAGA ou PLA) ou leurs mélanges, solubles dans l'acétate d'éthyle, encapsulant au moins une substance active insoluble dans l'acétate d'éthyle, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: (a) préparation à température ambiante d'une phase organique comprenant: 2869801 9 une suspension homogène de la ou des substance(s) active(s) sous forme microparticulaire dans de l'acétate d'éthyle, le polymère ou les polymères dissous dans cette suspension d'acétate d'éthyle, (b) émulsification de ladite phase organique par addition d'une solution aqueuse froide de surfactif, sous agitation vigoureuse avec un taux de cisaillement constant compris entre 600 s-1 et 2500 s-1, (c) extraction contrôlée de l'acétate d'éthyle de cette émulsion par addition lente et continue d'un premier volume d'eau, dans un ratio volumique émulsion/eau supérieur à 0,3, sous la même agitation vigoureuse qu'à l'étape (b), puis d'un deuxième volume d'eau dans une quantité suffisante pour extraire tout l'acétate d'éthyle, ce qui conduit à la formation des microsphères, (d) filtration sous pression du mélange obtenu en (c) et récupération des microsphères, (e) éventuellement, lyophilisation des microsphères. On entend par substance active sous forme microparticulaire toute microparticule de substance active dont la taille moyenne en volume est comprise 25 entre 0,5 et 10 micromètres, de préférence entre 2 et 5 micromètres. Dans un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, le polymère a une masse molaire moyenne en poids comprise entre 55 000 g/mole et 120 000 g/mole, de 30 préférence comprise entre 70 000 g/mole et 100 000 g/mole. 2869801 10 On peut citer à titre d'exemple les PGLA 50/50, 65/35, 75/25, 85/15 et les PLAmo, ainsi que leurs mélanges. Dans un autre mode de réalisation avantageux du 5 procédé de l'invention, le taux de cisaillement est compris entre 900 s-1 et 1400 s-1. La température de la solution aqueuse de surfactif utilisée pour réaliser l'émulsification est avantageusement comprise entre 0 et 10 C et l'agitation vigoureuse peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier; elle est effectuée à une vitesse avantageusement comprise entre 500 et 2000 tours/min. Dans un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, le ratio volumique émulsion/eau du premier 15 volume d'eau ajouté à l'étape (c) est supérieur à 0,45. L'ajout du deuxième volume d'eau de l'étape (c) durant l'extraction de l'acétate d'éthyle est effectué sous agitation à une vitesse avantageusement comprise entre 500 t/min et 2000 t/min. Le cisaillement constant utilisé à l'étape (b) permet d'obtenir une émulsion stable avant extraction du solvant, ce qui conduit à un meilleur taux d'encapsulation et à une distribution de tailles de particules plus étroite. Ainsi, le rendement d'encapsulation du procédé selon l'invention est supérieur à 50%. Par ailleurs, les coefficients de variation sur le taux d'encapsulation (ou taux de charge) et le rendement d'encapsulation sont inférieurs à 5%. Le procédé de l'invention permet en outre d'obtenir 30 des microsphères présentant une distribution resserrée de la taille des particules. 2869801 11 Le procédé selon l'invention peut être utilisé pour tout principe actif insoluble dans l'acétate d'éthyle, sous la forme d'une base ou d'un de ses sels. A titre d'exemple non limitatif, on peut citer les analgésiques, notamment locaux, les opioïdes, les anticancéreux, les interleukines, les facteurs de croissance et les cytokines. Le procédé peut être en particulier utilisé pour l'encapsulation de principes actifs utiles dans le traitement de la spasticité, comme le baclofène, le ziconotide, et les agonistes alpha(2)-adrénergiques, notamment la clonidine et la tizanidine, La présente invention a également pour objet des microsphères susceptibles d'être obtenues par le procédé décrit précédemment caractérisées en ce qu'elles: - comprennent un polymère poly(D,L-lactide-coglycolide) ou poly(D,L- lactide) (PLAGA ou PLA) ou leurs mélanges, soluble dans l'acétate d'éthyle et ayant une masse molaire moyenne en poids comprise entre 55 000 g/mole et 120 000 g/mole, comprennent au moins une substance active sous forme microparticulaire, insoluble dans l'acétate d'éthyle, - sont dépourvues de solvant organique chloré, - permettent la libération in vivo de la substance active sur une période d'au moins 100 jours. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, ladite substance active permet de traiter la spasticité, et est choisie de préférence parmi le baclofène, le ziconotide et les agonistes alpha(2)adrénergiques, notamment la clonidine et la tizanidine. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites microsphères contiennent au moins 2869801 12 une substance active choisie parmi les analgésiques, notamment locaux, les opioïdes, les anticancéreux, les interleukines, les facteurs de croissance, les cytokines. Les microsphères selon l'invention présentent une 5 taille moyenne en volume comprise entre 10 micromètres et 100 micromètres. Le taux de charge en substance active est compris entre 1 et 30% en poids, de préférence entre 5% et 15% en poids. La présente invention a également pour objet une composition pour la libération prolongée d'au moins une substance active, comprenant les microsphères précédemment décrites dispersées de façon homogène dans au moins une solution de polymère biocompatible qui est capable de former un gel in situ dans l'organisme après administration. En effet après administration de la suspension de microparticules, les caractéristiques du milieu dans lequel la suspension est injectée provoque l'augmentation de viscosité de ladite suspension de microparticules pour former une phase gel in situ, dans laquelle les microparticules se trouvent dispersées de façon homogène. Les compositions de la présente invention se présentent avant administration au sujet traité sous la forme d'une suspension liquide, peu visqueuse, de microparticules biodégradables dans une solution de polymère(s) biocompatible(s). Les compositions de la présente invention se présentent après administration au sujet traité sous la forme d'un gel visqueux, dans lequel sont dispersées de façon homogène les microparticules biodégradables précédemment décrites. 2869801 13 Selon l'invention, le gel est avantageusement un gel thermosensible ayant une température de gélation comprise entre 27 et 37 C. Il est choisi avantageusement parmi les gels thermosensibles, les gels cellulosiques et les gels de polysaccharides. Comme exemple de gel thermosensible, on peut citer notamment les gels Poloxamer, comme le Poloxamer 407, tel que le Lutrol PF-127. Comme exemple de gel de polysaccharide, on peut citer les gels de chitosan. De manière avantageuse, le gel a une viscosité comprise entre 4 et 2000 mPa.s-1, mesurée à 37 C. La concentration des microsphères dans le gel est avantageusement comprise entre 10 et 500 mg/mL. Les compositions selon l'invention permettent la 15 libération in vivo de la substance active sur une période d'au moins 100 jours. Les microsphères et les compositions décrites ci-dessus peuvent être utilisées pour la préparation d'un médicament destiné à traiter la spasticité et apte à être administré par voie intrathécale ou épidurale. Dans cette indication, la substance active encapsulée dans les microsphères est choisie parmi le baclofène, le ziconotide et les agonistes alpha(2)-adrénergiques, notamment la clonidine et la tizanidine. Les microsphères et les compositions précédemment décrites peuvent également être utilisées pour la préparation d'un médicament destiné à traiter la douleur chronique et apte à être administré par voie épidurale, intrathécale ou intracérébrale. Dans cette indication, la substance active est choisie parmi les analgésiques, notamment locaux, les agonistes alpha(2)-adrénergiques, notamment la clonidine 2869801 14 et la tizanidine, les opioïdes, les anticancéreux, les interleukines, les facteurs de croissance et les cytokines. Les exemples 1 à 3 et les figures 1 à 5 qui suivent 5 illustrent l'invention. La figure 1 représente le profil de libération in vitro en cellules à flux continu, du baclofène à partir de préparation de microsphères en PLAGA 85/15 chargées à 11%. Les résultats sont présentés en pourcentage de dose totale libérée (symboles vides) ou bien en dose moyenne quotidienne libérée (symboles pleins). Les lignes pointillées représentent les limites de 25 pg et 75 pg de baclofène libéré par jour. La figure 2 illustre l'effet du milieu de suspension 15 sur la libération in vitro de baclofène microencapsulé au cours des premières heures. Le tableau 1 donne la vitesse moyenne de libération du baclofène mesurée in vitro à partir de suspension de microsphères dans différents milieux: tampon PBS, CMC 1%, gel de Lutrol PF-127 21% et gel de chitosan. La figure 3 illustre le suivi des concentrations de baclofène dans le LCS chez la chèvre après implantation intrathécale d'une suspension de microsphères chargées à 11% en suspension dans divers milieux: Ringer lactate, carboxyméthylcellulose (CMC) 1% ou 0,5% ou gel de PF-127 à 21%. Données normalisées pour une dose injectée de 10 mg de baclofène encapsulé. La figure 4 illustre le suivi des concentrations de baclofène dans le plasma chez la chèvre après implantation intrathécale d'une suspension de microsphères chargées à 11% en suspension dans divers 2869801 15 milieux: carboxyméthylcellulose (CMC) 0,5%, CMC 1% et gel de PF-127 21%. La figure 5 illustre le suivi des concentrations de baclofène dans le LCR chez la chèvre pendant un mois suite à l'implantation intrathécale de microsphères chargées à 11% et suspendues dans de la carboxyméthylcellulose (CMC) (symboles pleins) ou un gel de PF-127 à 21% (symboles vides). Exemple 1: Préparation et caractérisation de microsphères de PLAGA chargées en baclofène 1.1. Matériels et méthodes Les microsphères sont préparées en utilisant des polymères de la série des poly (DL-lactide-co glycolide), Medisorb Alkermes: 50/50 (Mt, 74000 g/mole, viscosité spécifique 0,75 dL/g) ou 85/15 (My, 95 000 g/mole, viscosité spécifique 0, 63 dL/g), de l'alcool polyvinylique 88% hydrolysé, Rhodoviol 4/125, et de l'acétate d'éthyle. La poudre de baclofène micronisée provient de la société Heumann (Allemagne). 1.2. Préparation des microsphères Les microsphères (MS) sont préparées à l'aide d'un nouveau procédé d'émulsion/extraction de solvant, dans lequel on utilise de l'acétate d'éthyle et où l'extraction de l'acétate d'éthyle est parfaitement contrôlée. Le baclofène est tout d'abord broyé à l'aide d'un broyeur planétaire à boulets pendant 20 minutes à vitesse maximale pour obtenir des cristaux de taille inférieure ou égale à 5}am. Une quantité pesée de ces cristaux (100 mg ou 150 mg) est alors suspendue dans 4 mL d'acétate d'éthyle à l'aide d'un homogénéiseur Ultra- 2869801 16 Turrax à 22 000 tours par minutes pendant 2 minutes. Le polymère (400mg) est alors dissous dans cette suspension organique de baclofène pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation magnétique. La suspension résultante est ensuite émulsionnée dans 40 mL d'une solution aqueuse d'alcool polyvinylique à 5% maintenue à 4 C dans un réacteur de 250 mL sous agitation forte (1000 tours par minute), produisant un cisaillement constant de 1200 s-1. Le flacon contenant la suspension est rincée avec 2 mL d'acétate d'éthyle qui sont ajoutés à l'émulsion en cours de formation. Après 2 minutes, la précipitation du polymère sous forme de microparticules par extraction de l'acétate d'éthyle est initiée par ajout de 100 mL d'eau à 20 C en une minute, directement sur l'émulsion en cours de formation. L'extraction du solvant organique est finalisée par transfert rapide de l'émulsion dans 2 L d'eau à 20 C sous agitation pendant 5 minutes. Les microsphères sont alors isolées par filtration sur membrane d'éthylcellulose, sous pression d'azote en 30 secondes et rincées deux fois avec un litre d'eau par ce même procédé. Finalement les microparticules sont lyophilisées, puis conditionnées sous vide et stérilisées aux rayons gamma à la dose de 20 kGy. 1.3. Caractérisation des microsphères 1.3.1. Méthode de caractérisation La distribution de taille est évaluée à l'aide d'un analyseur de particules de type Multisizer (Coultronics), en utilisant une sonde de 100 pm de diamètre et en comptant au moins 100 000 particules. 2869801 17 La teneur en baclofène (ou taux de charge) est déterminée par chromatographie liquide associée à deux spectromètres de masse en tandem (LC/MSMS), après dissolution d'une prise d'essai de 10 mg de microsphères dans 1 mL de chloroforme et extraction liquide/liquide par 3 mL d'eau. Le profil de libération du baclofène in vitro est déterminé à 37 C, en circuit ouvert, en tampon phosphate, dont le pH a été fixé à 7,35 0,05, à l'aide de cellules à flux continu (Sotax ) connectées à une pompe péristaltique qui assure un flux de tampon de débit 85 pL/min au travers du lit de microparticules. 1.3.2. Résultats Ils sont rassemblés dans la figure 1. Cinq lots de microsphères ont été produits pour chaque type de polymère et pour différents taux d'encapsulation théoriques. Dans le cas du PLAGA 85/15 et pour un taux théorique de 20,8% le taux d'encapsulation obtenu (déterminé par LC/MSMS) est de 10,83% 0,54% soit un rendement d'encapsulation de 52,61% 2,48%. Pour un taux de charge théorique plus important (28,2%) le taux d'encapsulation obtenu est de 15,30% 25 0,43%, ce qui correspond à un rendement d'encapsulation de 55,04% 1,89%. Dans le cas du PLAGA 50/50, pour un taux de charge théorique de 20,7%, le taux d'encapsulation obtenu est de 13,09% 0, 44% correspondant à un rendement d'encapsulation de 62,69% 2,59%. 2869801 18 Les coefficients de variation obtenus sur 5 lots pour les taux de charge réels et les rendements d'encapsulation sont donc toujours inférieurs ou égaux à 5 o. Pour les lots préparés avec les PLAGA 85/15, les tailles moyennes en volume sont de 30,05}gym 1,76 pm et 29,21 pm 1,81 pm avec moins de 7 % des particules présentant une taille supérieure à 60 pm. Pour les lots réalisés à partir de PLAGA 50/50, la taille moyenne est de 34,52 pm 1,95 pm. Selon les lots, la libération du baclofène à partir des microparticules produites peut être maintenue in vitro pendant une durée de six mois. Les libérations les plus lentes sont obtenues avec des taux théoriques plus faibles et des polymères 85/15 (Figure 1). Après une libération immédiate ( burst ) de 16% sur les premières 24 heures, la libération du baclofène est relativement constante (40 pg par jour en moyenne, pour 100 mg de microparticules). Pendant une période de trois semaines, entre le 45ème jour et le 66ème jour, la libération est toutefois plus importante et atteint 150pg/jour (Figure 1). Les quantités de baclofène libérées sont compatibles avec un effet thérapeutique dans le cadre de traitement de la spasticité par voie intrathécale chez l'homme, la dose moyenne administrée étant de 160 pg/jour avec une fourchette de 50 à 800 pg/jour environ, obtenue enimplantant jusqu'à 500 mg de microparticules dans l'espace sousarachnoïdien. 2869801 19 Exemple 2: Utilisation d'un milieu de suspension limitant l'effet de libération immédiate ( burst ) Les microsphères sont produites par le procédé décrit dans l'exemple 1. Un milieu de suspension qui présente des propriétés de gélification lorsqu'il est placé dans un environnement de température supérieure à 30 C est ensuite préparé. Les microsphères sont ensuite dispersées dans ce milieu pour atteindre une concentration de 50 mg/mL. 2.1. Modes opératoires 2.1.1. Préparation d'un gel thermosensible Une solution aqueuse de 21% de Poloxamer 407 (Lutrol PF-127) est préparée par dissolution dans de l'eau 15 stérile à 2 C. La solution est laissée une nuit à 4 C. 2.1.2. Détermination de la viscosité selon la température La viscosité et le comportement rhéologique de la solution de PF-127 sont déterminés en utilisant un viscosimètre de type Couette (RV1, Haake) à différentes températures. 2.1.3. Evaluation de la vitesse de libération in vitro mg de microsphères sont suspendus dans 1 mL de différents milieux (tampon PBS, solution visqueuse de carboxymethylcellulose (CMC) 1%, gel de chitosan 2% ou gel thermosensible de Poloxamer 407 (Lutrol PF-127 21%) et placés dans des sacs de dialyse de pores 10 000 g/mole. Ces sacs sont placés dans des cellules à flux continu. Le test de libération est ensuite réalisé comme dans l'exemple 1. 2.2. Résultats Ils sont rassemblés dans la figure 2 et dans le tableau 1. A 37 C, les quantités de baclofène libérées sur les 24 premières heures sont divisées par au moins un facteur deux, lorsque les microsphères sont suspendues dans la CMC ou le gel de PF-127 par rapport aux lots suspendus dans le tampon phosphate. Les vitesses moyennes de libération du baclofène pour une quantité normalisée de microsphères montrent que la réduction maximale de libération est obtenue avec le gel de PF-127. L'étude rhéologique montre que la solution de PF-127 à 21% présente une température de gélification de 28,3 C. Le comportement à 37 C est plastique avec un seuil d'écoulement de 48,5 Pa et une viscosité mesurée à 50 s-1 de 1219 mPa.s. Exemple 3: Etude pharmacocinétique chez la chèvre 20 3.1. Mode opératoire Cette étude est conduite sur de gros animaux pour évaluer les concentrations atteintes in vivo suite à une administration intrathécale de 100 mg de microsphères préparées avec du PLAGA 85/15 selon l'exemple 1 et chargées à 11 % en baclofène. Ces microsphères sont suspendues juste avant injection dans 2 mL de solution visqueuse de PF-127 à 21% ou de CMC 1% ou 0,5 % ou d'un soluté pour injection (Ringer Lactate). Le suivi des concentrations a lieu par ponction à l'aide de cathéters implantés dans l'espace intrathécal et laissés à demeure pendant toute la durée de l'étude. 2869801 21 Les animaux, des chèvres de 54 à 80 kg, sont tout d'abord anesthésiés par voie liquide (mélange kétamine xylazine), puis par voie gazeuse à l'aide d'halothane, puis un cathéter en silicone est introduit par une aiguille de Tuohy de 15G dans l'espace intrathécal. Le dispositif est ensuite ancré à l'animal par quelques points réalisés à l'aide de sutures non résorbables. Les suspensions de microsphères sont injectées par l'aiguille de Tuohy directement dans l'espace intrathécal au niveau de la 5ème vertèbre lombaire, juste avant le passage du cathéter qui est guidé en direction crâniale jusqu'à la troisième vertèbre lombaire. La dose de baclofène encapsulée injectée est de 1,5 mg/kg. Les prélèvements de LCS sont réalisés de manière aseptique par une seringue de 1 mL. Un volume de 150}iL correspondant à deux fois le volume mort du cathéter est rejeté à chaque ponction, 150 pL sont ensuite prélevés et gardés pour analyse en LC/MSMS comme décrit dans l'exemple 1. 3.2. Résultats Ils sont rassemblés dans les figures 3 à 5. La libération sur les deux premiers jours est très dépendante du milieu de suspension des microsphères 25 (figure 3). L'utilisation de solutions visqueuses permet de diminuer par un facteur d'au moins 10 le taux de baclofène obtenu dans le LCS les deux premiers jours. La différence d'effet sur la vitesse de libération observée in vivo par rapport au données in vitro, suggère que le milieu de suspension a aussi un effet sur la distribution des microsphères dans le canal rachidien. La 2869801 22 viscosité des milieux de suspension contribue à limiter la répartition des microsphères dans le canal rachidien ce qui diminue les taux mesurés localement à distance de la zone implantée du fait de la diffusion limitée du baclofène dans le LCS. Le suivi des concentrations atteintes dans le plasma après implantation dans l'espace sous-arachnoïdien (Figure 4) confirme la faculté des milieux de suspension visqueux à diminuer l'effet de libération immédiate (burst), puisque les concentrations maximales atteintes sont diminuées d'un facteur deux par rapport au Ringer lactate. Les meilleurs résultats sont obtenus avec le gel de PF-127. Deux groupes de chèvres ayant reçu des microsphères chargées en baclofène et suspendues dans du gel de PF-127 ou de la CMC 1% ont été suivis pendant un mois avec des cathéters implantés. Après une période de trois jours correspondant à la phase de libération rapide du baclofène à partir des microsphères, les taux de baclofène se stabilisent dans le LCS (Figure 5). 23 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de microsphères comprenant du poly(D,L-lactideco-glycolide), du poly(D,L-lactide (PLAGA ou PLA) ou leurs mélanges, solubles dans l'acétate d'éthyle, encapsulant au moins une substance active insoluble dans l'acétate d'éthyle, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: (a) préparation à température ambiante d'une phase organique comprenant: - une suspension homogène de la ou des substance(s) active(s) sous forme microparticulaire dans de l'acétate d'éthyle, - le ou les polymère(s) dissous dans cette suspension d'acétate d'éthyle, (b) émulsification de ladite phase organique par addition d'une solution aqueuse froide de surfactif, sous agitation vigoureuse avec un taux de cisaillement constant compris entre 600 s-1 et 2500 s-1, (c) extraction contrôlée de l'acétate d'éthyle de cette émulsion par addition lente et continue d'un premier volume d'eau, dans un ratio volumique émulsion/eau supérieur à 0,3, sous la même agitation vigoureuse qu'à l'étape (b), puis d'un deuxième volume d'eau dans une quantité suffisante pour extraire tout l'acétate d'éthyle, ce qui conduit à la formation des microsphères, (d) filtration sous pression du mélange obtenu en (c) et récupération des microsphères, (e) éventuellement, lyophilisation des microsphères. 2869801 24 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère a une masse molaire moyenne en poids comprise entre 55 000 g/mole et 120 000 g/mole, de préférence comprise entre 70 000 g/mole et 100 000 g/mole. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère est choisi parmi les PLAGA 50/50, 65/35, 75/25, 85/15 et les PLAloo, ainsi que leurs mélanges. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le taux de cisaillement est compris entre 900 s-1 et 1400 s-1. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la température de la solution aqueuse de surfactif est comprise entre 0 et 10 C. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'agitation vigoureuse est effectuée à une vitesse comprise entre 500 et 2000 tours/min. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le ratio volumique émulsion/eau du premier volume d'eau est supérieur à 0,45. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 30 à 7, caractérisé en ce que l'ajout du deuxième volume d'eau durant l'extraction de l'acétate d'éthyle est 2869801 25 effectuée sous agitation à une vitesse comprise entre 500 t/min et 2000 t/min. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la taille moyenne en volume des microparticules de substance active est comprise entre 0,5 et 10 micromètres, de préférence entre 2 et 5 micromètres. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le coefficient de variation pour le taux de charge et le rendement d'encapsulation est inférieur à 5%. 11. Microsphères susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisées en ce qu'elles: comprennent un polymère poly(D,L-lactide-coglycolide)ou poly(D,L- lactide) (PLAGA ou PLA) ou leurs mélanges, solubles dans l'acétate d'éthyle et ayant une masse molaire moyenne en poids comprise entre 55 000 g/mole et 120 000 g/mole, - comprennent au moins une substance active sous forme microparticulaire, insoluble dans l'acétate d'éthyle, 25 -sont dépourvues de solvant organique chloré, -permettent la libération in vivo de la substance active sur une période d'au moins 100 jours. 12. Microsphères selon la revendication 11, caractérisées en ce qu'elles contiennent une substance active permettant de traiter la spasticité. 2869801 26 13. Microsphères selon la revendication 12, caractérisées en ce que la substance active est choisie parmi le baclofène, le ziconotide et les agonistes alpha(2)-adrénergiques, notamment la clonidine et la tizanidine. 14. Microsphères selon la revendication 11, caractérisées en ce qu'elles contiennent une substance active choisie parmi les analgésiques, notamment locaux, les agonistes alpha(2)-adrénergiques, notamment la clonidine et la tizanidine, les opioïdes, les anticancéreux, les interleukines, les facteurs de croissance, les cytokines. 15. Microsphères selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisées en ce que leur taille moyenne en volume est comprise entre 10 micromètres et 100 micromètres. 16. Composition pour la libération prolongée d'au moins une substance active comprenant les microsphères selon l'une quelconque des revendications 11 à 15 dispersées de façon homogène dans une solution de polymère biocompatible capable de former un gel in situ après administration dans l'organisme. 17. Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce que les microsphères sont dispersées de façon homogène dans un gel thermosensible ayant une température de gélation comprise entre 27 et 37 C. 2869801 27 18. Composition selon la revendication 16 ou 17, caractérisée en ce qu'elle permet la libération in vivo de la substance active sur une période d'au moins 100 jours. 19. Composition selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisée en ce que le gel est choisi parmi les gels thermosensibles, les gels cellulosiques et les gels de polysaccharides. 20. Composition selon la revendication 19, caractérisée en ce que le gel thermosensible est un gel Poloxamer, de préférence un gel Poloxamer 407. 21. Composition selon la revendication 19, caractérisée en ce que le gel polysaccharide est choisi parmi les gels de chitosan. 22. Composition selon l'une quelconque des revendications 16 à 21, caractérisée en ce que le gel a une viscosité comprise entre 4 et 2000 mPa. mesurée à 37 C. 23. Composition selon l'une quelconque des revendications 16 à 22, caractérisée en ce que la concentration des microsphères dans le gel est comprise entre 10 et 500 mg/mL. 24. Utilisation des microsphères selon l'une quelconque des revendications 12 et 13, ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 16 à 23 pour la préparation d'un médicament destiné à traiter la 2869801 28 spasticité et apte à être administré par voie intrathécale ou épidurale. 25. Utilisation selon la revendication 24, caractérisée en ce que la substance active encapsulée dans les microsphères est choisie parmi le baclofène, le ziconotide, et les agonistes alpha(2)-adrénergiques, notamment la clonidine et la tizanidine. 26. Utilisation des microsphères selon la revendication 14, ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 16 à 23 pour la préparation d'un médicament destiné à traiter la douleur chronique et apte à être administré par voie épidurale, intrathécale ou intracérébrale. 25