FR 2867197 A1 20050909 FR 0402235 A 20040302 La présente invention permet la production à large échelle de séquences linéaires d'acides nucléiques, transfectables et compatibles avec leur intégration dans un acide désoxyribonucléique (ADN) hôte, pour le transfert de gènes dans des cellules et tout particulièrement les cellules souches hématopoiétiques (CSH), et pour la thérapie génique. Au cours de leur réplication, les virus appartenant à la famille des retroviridae doivent impérativement intégrer leur propre matériel génétique à celui de la cellule hôte. L'intégration est catalysée par une enzyme virale, l'intégrase, qui reconnaît les extrémités de l'acide nucléique reverse transcrit ou ADN complémentaire (ADNc) en des sites particuliers des séquences terminales répétées long terminal repeated sequences (LTR). Les vecteurs viraux basés sur les caractéristiques biologiques des rétrovirus, ont permis de délivrer efficacement et de manière stable, des constructions d'ADN dans des cellules. La troisième génération de vecteurs dérivés du virus de l'immunodéficience humaine (VIH), la plus aboutie dans le domaine de la thérapie génique, a montré la capacité à transduire efficacement 15 les cellules souches du système hématopoïétique (CSH) et de corriger diverses maladies génétiques, monogéniques, autosomales, récessives, chez la souris (1, 2, 3, 4, 5). Toutefois, ces vecteurs, dérivés des lentivirus souffrent de plusieurs problèmes: a) leur production reste un processus long, avec des méthodes extensives difficilement automatisables, conduisant en routine à des titres de 106 unités de transduction/ml de 20 surnageant, qui doit impérativement être concentré. b) les quantités totales de vecteur nécessitées par les essais cliniques peuvent difficilement être atteintes par une production artisanale , dans les laboratoires classiques universitaires, ou même à l'hôpital. c) la production de ces vecteurs reste onéreuse, car elle nécessite de la culture cellulaire, 25 des laboratoires de sécurité biologique de niveau 2, et du matériel cher telles des ultracentrifugeuses. d) la capacité d'encapsidation des vecteurs dérivés des lentivirus est limitée. Les titres viraux chutent de manière semi-logarithmique avec la taille de l'acide ribonucléique (ARN) à encapsider, dû probablement à une diminution de l'efficacité d'encapsidation en fonction de la taille de l'ARN viral, rendant ces vecteurs inaptes à fournir des titres compatibles avec des applications de thérapie génique pour des constructions supérieures à 11000 paires de bases (6). e) En dépit d'améliorations, concernant la sécurité de ces vecteurs, obtenues avec la troisième génération des vecteurs dérivés des lentivirus, la survenue d'un virus auto- répliquant dans la lignée cellulaire d'encapsidation, ne peut être formellement écartée. Différentes méthodes existent pour transfecter un acide nucléique dans une cellule et son noyau. Toutefois, la co-transfection d'une intégrase virale et des séquences nucléiques bordées de chaque côté par des LTR, ne permet pas une intégration efficace, dû à des structures secondaires qui franchissent difficilement les membranes biologiques. La défmition de séquences dérivées des LTR qui évitent ces structures secondaires, tout en gardant leur capacité à être reconnues par l'intégrase, ainsi que la maturation des extrémités 3', peut permettre l'intégration d'un acide nucléique que ces séquences encadrent. Insérées dans un plasmide, et encadrant un site multiple de clonage, ces séquences minimales optimisées, dérivées des LTR, permettent la production de constructions nucléiques par l'action d'enzymes de restriction, l'extension d'amorce, l'amplification par la réaction de polymérisation en chaîne polymerase chain reaction (PCR). Ces techniques de production d'ADN sont classiques dans les laboratoires. Elles nécessitent peu de matériel, et souvent bon marché (kits d'extraction à partir de gel d'agarose, machines PCR), et fournissent le matériel nucléique désiré en quelques heures seulement. L'utilisation d'enzymes de restriction peut fournir efficacement des microgranunes de produit, et ne connaît pas de limites dans la taille de la construction qui peut être excisée à partir du plasmide d'origine. La PCR préparative, en utilisant des enzymes possédant la double activité de lecture-vérification, permet la production à partir d'un plasmide de constructions supérieures à 15000 paires de base. L'amplification par PCR peut facilement être incrémentée pour fournir des milligrammes de produit, et permettre la transfection avec un meilleur rapport construction ADN/cellule cible qu'aucune transduction effectuée avec des vecteurs dérivés des lentivirus, même avec les meilleurs multiplicités d'infection. Finalement, indépendamment de la technique utilisée pour produire la construction d'ADN, c'est-à-dire, amplification par PCR, extension d'amorce, utilisation d'enzyme de restriction, la méthode permet la production de grandes constructions d'ADN compatibles avec de nouveaux protocoles de thérapie génique, c'est-à-dire des protocoles mettant en oeuvre de plus grandes constructions et/ou de plus grands gènes thérapeutiques, et ce en écartant définitivement le risque de la contamination d'un lot clinique de vecteur viral, par un virus autorépliquant. Les virus appartenant à la famille des retroviridae ont leur information génétique sous forme d'acide ribonucléique (ARN). L'étape de transcription inverse est une étape indispensable pour l'accomplissement du cycle viral. L'enzyme virale Transcriptase Inverse accomplit la transcription de l'ARN viral en ADN complémentaire (ADNc) bicaténaire. L'étape suivante dans le cycle viral normal, est l'intégration dans l'ADN génomique de la cellule hôte, de l'ADNc viral néosynthétisé, bordé par les séquences terminales répétées, ou LTRs. Ces LTRs possèdent des extrémités à bouts francs qui sont produites au cours de l'étape de transcription inverse. Ces extrémités sont reconnues et clivées selon un motif précis pour chaque type de virus, par une enzyme, l'intégrase. Le clivage terminal des extrémités, côté 3', encore appelé maturation en 3' des extrémités, conduit à la formation de di-nucléotides non appariés côté 5', par l'excision du di-nucléotide complémentaire réalisée côté 3' sur chaque brin d'ADN monocaténaire. L'extrémité 3' du LTR, ainsi mûrie , forme une liaison covalente avec l'ADN de la cellule hôte, via une attaque nucléophile, impliquant le résidu 3' hydroxyle libre de l'ADN viral, et un phosphate de l'ADN génomique de la cellule hôte (7). L'excision des di-nucléotides 5' non appariés, ainsi que la réparation des cassures occasionnées dans le brin de l'ADN génomique, sont effectuées par des enzymes cellulaires appartenant à la machinerie de réparation de l'ADN (8,9,10). Un motif général ATT est reconnu au sein de la famille des retroviridae, conduisant à l'excision d'un di-nucléotide TT. Un motif CAGT est impliqué dans la reconnaissance par l'intégrase du VIH, ainsi que la maturation 3', conduisant à l'excision d'un di- nucléotide GT. Les motifs GACA et CACA sont respectivement impliqués dans l'intégration des spumarétrovirus humain et simien (HFV, SFV). L'intégrase du VIH, ou P32, est une protéine de 32 kilo Dalton (KD) codée par le génome viral, possédant un motif D, D-35-E dans le domaine du corps catalytique central, comme beaucoup d'autres intégrases et transposases (11). P32 fait partie du complexe de pré-intégration (CPI) avec d'autres protéines virales, RT, MA, Vpr, NC (12,13, 14). L'intégrase du HIV est responsable à elle seule de la maturation des extrémités 3' et du transfert de brin du résidu 3' hydroxyle libre généré après le clivage. Des enzymes cellulaires excisent les di-nucléotides non appariés et réparent les cassures de l'ADN (8, 9, 10). Le LTR du HIV est long de 630 paires de bases (pb) et possède des structures secondaires permettant l'initiation de la transcription en fixant la protéine virale Tat à la séquence tar localisée à la frontière U3/R du LTR 5' (15). Ces structures secondaires sont des séquences de faible efficacité de transduction, quelque soit la méthode utilisée. Il existe plusieurs méthodes pour transfecter un acide nucléique dans une cellule. Ces méthodes sont physiques (électroporation, microinjection, gene-gun, ultrasons), chimiques (liposomes, précipités de phosphate de calcium, polycations, molécules photosensibilisantes) ou virales par l'utilisation de particules virales défectives pour la réplication. L'intégrase du HIV est un des éléments du CPI, et est normalement adressée dans le noyau de la cellule. La modification de la séquence de cette enzyme, peut concourir à augmenter sa demi-vie dans la cellule. Des séquences peuvent être introduites dans la séquence de 1' intégrase, pour permettre des modifications chimiques qui aideraient cette protéine à franchir des membranes biologiques. L'introduction de signaux de localisation nucléaire, ou l'usage d'anticorps spécifiques, permettraient de mieux diriger 1'intégrase vers le noyau de la cellule, seule ou en tant qu'élément du CPI. L'intégrase de HIV reconnaît des séquences spécifiques pour la reconnaissance de son substrat ADN. L'asymétrie entre les séquences LTR5' et LTR 3', comme celle observée dans la situation normale, du VIH autorépliquant, offre la meilleure efficacité d'intégration en présence d'intégrase, in vitro (16). Des séquences minimales peuvent être définies, avec les 80 premiers nucléotides de la région U3 du LTR 5' proviral, et les 90 derniers nucléotides de la région U5 du LTR 3' proviral, de telle sorte que les structures secondaires ainsi que les sites de liaison des facteurs cellulaires sont évités, et que la reconnaissance par la P32, ainsi que la maturation 3' et le transfert de brin soient toujours assurés. Les séquences minimales optimisées des LTR contenant SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, peuvent être insérées dans un plasmide, encadrant un site multiple de clonage permettant l'insertion d'une cassette de n'importe quel type, et servir de base à la production de l'insert. De grands fragments peuvent être produits par des enzymes de restriction comme XmnI, ou Scal, étant donné qu'il n'existe pas, avec cette technique, de limitation concernant la taille du fragment qui peut être excisé à partir d'un plasmide. Des jeux d'amorces contenant, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, peuvent être définis pour l'amplification par PCR de l'insert à partir du plasmide contenant les séquences minimales optimisées des LTR, et fournissant un ADN double brin terminé par des extrémités à bouts francs, et contenant la séquence de l'insert. De grands fragments, jusqu'à 15000 pb, bordés des séquences minimales optimisées des LTR, peuvent être générés par PCR en grandes quantités, jusqu'à des milligrammes de produits, en utilisant des enzymes possédant la double activité de lecture/vérification. Les acides nucléiques produits par la technique précitée possèdent des extrémités à bouts francs, comme celles obtenues à la fin de l'étape de trancription inverse des virus appartenant aux sous familles suivantes; Oncovirinae, Lentivirinae, Spumavirinae. De plus, l'extension d'amorce, ou l'amplification par PCR des plasmides décrits auparavant, s'effectue avec les mêmes amorces, et donc les mêmes températures d'appariement, quelque soit la séquence interne à amplifier, ce qui permet de réduire les temps de mise au point. Les virus associés aux Adénovirus (VAA) appartiennent à la famille des parvoviridae. Les VAA peuvent établir une infection latente en culture cellulaire, qui implique l'intégration du génome viral en un site précis du chromosome 19 humain (17, 18, 19, 20). Cette intégration ciblée est basée sur la reconnaissance de séquences terminales répétées inversées inverted terminal repeated sequences, ITR , et de séquences d'insertion dans l'ADN génomique de la cellule hôte. Les ITR possèdent des séquences répétées formant des structures secondaires semblant être impliquées dans le processus d'intégration qui est réalisé par des enzymes cellulaires, alors que les protéines virales Rep68/78 semblent être impliquées dans la spécificité du site d'intégration au sein de l'ADN cible (21, 22). Les séquences optimisées des ITR contenant SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, peuvent être insérées dans un plasmide servant comme donneur à l'excision/intégration réalisée par la protéine Rep (23). Alternativement, les plasmides précédemment décrits et contenant les séquences optimisées des ITR des VAA peuvent être utilisés pour générer une cassette bordée par ces séquences. Un jeu d'amorce, contenant au moins la séquence SEQ ID NO: 9 peut être défini pour l'amplification par PCR d'une cassette d'ADN bordée par les séquences minimales optimisées des ITR des VAA. De plus, il est possible d'insérer dans un plasmide la séquence (131-289) des VAA (SEQ ID NO: 10) encore appelée élément p5 d'efficacité d'intégration p5 intégration efficiency element, p5IEE . Cette séquence a été décrite comme suffisante pour l'intégration ciblée réalisée par la protéine Rep, d'un plasmide contenant la p5IEE des VAA dans une région précise du chromosome 19 humain (24). Il est possible de définir une amorce, contenant au moins SEQ ID NO: 9 permettant l'extension d'amorce d'une cassette bordée par les séquences optimisées des ITR des VAA. Il est à noter que l'extension d'amorce ou l'amplification par PCR des plasmides 30 précédemment décrits se fait avec les mêmes amorces et donc avec les mêmes températures d'appariement, quelque soit la séquence interne amplifiée, ce qui permet de réduire le temps de mise au point. En résumé, les techniques précédemment décrites permettent la production en quelques heures, et avec des moyens peu onéreux, de grandes quantités de séquences d'acides nucléiques, transfectables et compatibles avec une intégration dans l'ADN génomique d'une cellule humaine. Les paragraphes suivants illustrent un mode de réalisation de l'invention: Le terme miniprep mentionné ci-après, signifie une extraction classique de l'ADN par lyse alcaline, suivie d'une extraction par le phénol et le chloroforme, suivies d'une précipitation à l'éthanol absolu. L'ADN ligase T4, est utilisée dans les conditions recommandées par le fabricant Les enzymes de restriction sont utilisées avec les tampons suivants: Tampon 1; Tris-HC1 10mM, MgC12 10mM, NaCl 50mM, dithiothréitol lmM, pH7.9 à 25 C. Tampon 2; Tris-HC1 50mM, MgC12 IOmM, NaCl 100mM, dithiothréitol 1mM, pH7.9 à 25 C. Tampon 3; Tris-acétate 20mM, Mg(CH3COO)2 10mM, KCH3COO 50 mM, dithiothréitol lmM, pH7.9 à 25 C. Partie A. génération du plasmide revendiqué Etape A) 180 g de plasmide Blue script pBSK SK sont digérés par 20 unités de Sacl, dans le tampon 1, une heure à 37 C. Le plasmide linéarisé est chargé sur un gel d'agarose à 1.5% et migré constamment à 70V pendant 30 min. Le plasmide linéarisé est extrait du gel et purifié au moyen d'un kit d'extraction à partir de gel d'agarose. Etape B) En parallèle, 180 pg de plasmide Blue script pBSK SK sont digérés par 20 unités de KpnI, dans le tampon 1, une heure à 37 C. Le plasmide linéarisé est chargé sur un gel d'agarose à 1.5% et migré constamment à 70V pendant 30 min. Le plasmide linéarisé est extrait du gel et purifié au moyen d'un kit d'extraction à partir de gel d'agarose. Etape C) Chaque oligonucléotide lyophilisé est repris dans l'eau distillée à une 25 concentration finale de 1 mM Oligonucléotide 1: 5'TGTGGAAAATCTCTAGCAGTACTAGCT-3' (27 mer) Oligonucléotide 2: 5'AGTACTGGAAGGGCTAATTCACTGTAC-3' (27 mer) Oligonucléotide 3: 5'AGTACTGCTAGAGATTTTCCACAAGCT-3' (27 mer) Oligonucléotide 4: 5'AGTGAATTAGCCCTTCCAGTACTGTAC-3' (27 mer) Etape D) 5 nmol de l'oligonucléotide 1 sont mélangées à 5 nmol de l'oligonucléotide 3 dans de l'eau distillée, à une concentration final de 50 M, et est appelé Mélange 1. nmol de l'oligonucléotide 2 sont mélangées à 5 nmol de l'oligonucléotide 4 dans de l'eau distillée, à une concentration final de 50 M, et est appelé Mélange 2. Chaque mélange est chauffé 10 min à 95 C, et est progressivement ramené à température 'ambiante dans le block de chauffage pour permettre l'appariement des séquences complémentaires. Etape E) 100 ng de plasmide pBSK SK linéarisé par Sacl obtenu après purification à la fin de l'étape A, sont placés en présence d'un excès de 100 fois, soit 91 ng, du Mélange 1 obtenu après refroidissement à la fin de l'étape D. La ligation est réalisée en présence de 400 unités d'ADN ligase T4, dans un volume final de 20 l, pendant 80 min à température ambiante. Comme contrôle, 100 ng de plasmide sont soumis à la ligation en absence de l'insert, soit le mélange 1, qui est remplacé par le même volume d'eau distillée. Le produit de la ligation est transformé en bactéries compétentes DH5a, et après 12 heures de cultures à 37 C, les clones sont repiqués et cultivés en dans 2 ml de milieu liquide de culture, additionné d'ampicilline à la concentration finale de 100 g.ml"1. Etape F) Afin de vérifier la présence de l'insert dans les clones obtenus à la fin de Etape E, l l de la miniprep est co-digéré par 10 unités de Sacl, et 10 unités de)(mal, dans le tampon 1 durant 1 heure à 37 C. Les produits de digestion sont chargés sur un gel d'agarose à 1.5%, et migrés constamment à 70V pendant 30 min. Les clones positifs sont linéarisés par Xmnl. Pour vérifier l'orientation de l'insert, les clones positifs sont co-digérés par 10 unités de Scal, et 10 unités de Kpnl pendant une heure à 37 C dans un volume final de 20 pl. Les produits de digestion sont chargés sur un gel d'acrylamide 10%, et migrés constamment à 100V pendant 30 min. Les clones montrant un fragment de 122 pb sont considérés comme positifs et sélectionnés. Etape G) 100 ng de plasmide pBSK SK linéarisé par Kpnl obtenu après purification à la fin de l'étape B, sont placés en présence d'un excès de 100 fois, soit 91 ng, du Mélange 2 obtenu après refroidissement à la fin de l'étape D. La ligation est réalisée en présence de 400 unités d'ADN ligase T4, dans un volume final de 20 l, pendant 80 min à température ambiante. Comme controle, 100 ng de plasmide sont soumis a la hgation en absence de l'insert, soit le mélange 2, qui est remplacé par le même volume d'eau distillée. Le produit de la ligation est transformé en bactéries compétentes DH5a, et après 12 heures de cultures à 37 C, les clones sont repiqués et cultivés en dans 2 ml de milieu liquide de culture, additionné d'ampicilline à la concentration fmale de 100 g.m1"1. Etape H) Afin de vérifier la présence de l'insert dans les clones obtenus à la fin de Etape G, 1111 de la miniprep est co-digéré par 10 unités de Kpnl, et 10 unités de Xmnl, dans le tampon 1 durant 1 heure à 37 C. Les produits de digestion sont chargés sur un gel d'agarose à 1.5%, et migrés constamment à 70V pendant 30 min. Les clones positifs sont linéarisés par XmnI. Pour vérifier l'orientation de l'insert, les clones positifs sont co-digérés par 10 unités de Scal, et 10 unités de Sacl pendant une heure à 37 C dans un volume final de 20 l. Les produits de digestion sont chargés sur un gel d'acrylamide 10%, et migrés constamment à 100V pendant 30 min. Les clones montrant un fragment de 122 pb sont considérés comme positifs et sélectionnés. Etape I) 2 l de miniprep des clones positifs obtenus à la fin de l'étape F, sont co-digérés par 10 unités de XmnI, et 10 unités de Xhol dans le tampon 1 dans un volume final de 20 tl pendant une heure à 37 C. Les produits de digestion sont chargés sur un gel d'agarose à 1.5%, et migrés constamment à 70V pendant 30 min. Le fragment supérieur de 1977 pb est extrait et purifié au moyen d'un kit d'extraction à partir de gel d'agarose. Etape J) 2 l de miniprep des clones positifs obtenus à la fin de l'étape H, sont co-digérés par 10 unités de XmnI, et 10 unités de Xhol dans le tampon 1 dans un volume final de 20 l pendant une heure à 37 C. Les produits de digestion sont chargés sur un gel d'agarose à 1.5%, et migrés constamment à 70V pendant 30 min. Le fragment inférieur de 1011 pb est extrait et purifié au moyen d'un kit d'extraction à partir de gel d'agarose. Etape K) L'ossature obtenue à la fin de l'Etape I, c'est-à-dire le fragment de 1977 pb, est ligué àÏ'msert obtenu à la fin 'de l'Etape J, c'est-à-dire le fragment de 1011 pb, dans un rapport ossature/insert de 2/1, en présence de 400 unités d'ADN ligase T4, dans un volume final de 20 l, durant 2 heures à température ambiante. Comme contrôle la même quantité d'ossature est soumise à la ligation en absence d'insert, qui est remplacé par le même volume d'eau distillée. Le produit de la ligation est transformé dans des bactéries compétentes DH5a, et après 12 heures de culture à 37 C, les clones sont repiqués et cultivés dans 2 ml de milieu liquide additionné d'ampicilline à la concentration fmale de 100 pg.ml-1. Etape L) Une digestion analytique est réalisée sur 1111 de la miniprep par 10 unités de Scal dans le tampon 1 durant 1 heure à 37 C. Les produits de digestion sont chargés sur un gel d'acrylamide 10%, et migrés constamment à 100V pendant 30 min. Les clones présentant un fragment de 146 pb sont considérés comme positifs et sélectionnés. A ce stade, un plasmide provenant de pBSK SK et contenant les deux séquences minimales optimisées mimant les LTR du VIII, dans l'orientation adéquate, et encadrant un site multiple de clonage, est généré. Ce plasmide est revendiqué comme un outil pour l'insertion d'une cassette d'ADN de n'importe quel type, via le site multiple de clonage. Dans l'exemple qui suit, le gène codant la GFP green fluorescent protein sous le contrôle du promoteur EF 1 a elongtion factor 1 a a été introduit dans le site multiple de 10 clonage via les sites de restriction Clal et SacII. Les clones positifs obtenus à la fm de l'étape L sont transformés dans une souche Dam- de bactéries compétentes. Les minipreps de plasmide sont soumises à une double digestion par 10 unités de CM et 10 unités de SacII, dans le tampon 3 durant 1 heure à 37 C. Les produits de digestion sont chargés sur un gel d'agarose à 1.5%, et migrés constamment à 70V pendant 30 min. Le fragment de 2935 pb est excisé et purifié au moyen d'un kit d'extraction à partir de gel d'agarose. Le plasmide ouvert par Clal et SaclI est ligué à un excès d'insert de 2 fois, contenant le gène de la GFP sous le contrôle du promoteur EF1a, suivi des séquences de régulation post transcriptionnelle du virus de l'hépatite de la marmotte, et terminé par les mêmes demi sites Clal et SacII, en présence de 400 unités d'ADN ligase T4 pendant 1 heure à température ambiante. Le produit de la ligation est transformé dans des bactéries compétentes DH5a, et après 12 heures de cultures à 37 C, les clones sont repiqués et cultivés dans 2 ml de milieu liquide additionné d'ampicilline à la concentration finale de 100 p.g.ml' 1. Les digestions analytiques sont réalisées comme suit: Les minipreps sont digérées a) par 10 unités de Sacll dans le tampon 1 pendant 30 min à 37 C dans un volume final de 10 pi. Dix unités de Sali sont ajoutées, ainsi que 2 l de tampon 2 concentré dix fois, dans un volume final de 20 pl durant 60 min supplémentaires à 37 C, ou b) par 10 unités pour chaque enzyme, Sall et Scal durant 1 heure à 37 C dans le tampon 2 dans un volume final de 20 l. Les produits de digestion sont chargés sur un gel d'agarose à 1.5%, et migrés constamment à 70V pendant 30 min. Les clones positifs ont été amplifiés à nouveau et ont servi à la préparation de plasmide. Des aliquots de ces clones ont été gardés en stocks glycérol. Partie B. Production de séquences linéaires d'acides nucléiques bordées par les séquences minimales optimisées mimant les séquences des LTR. Le plasmide obtenu à la fin de l'exemple précédent possède les caractéristiques suivantes; le plasmide est long de 4569 pb et contient le gène codant la GFP, sous le contrôle du promoteur EF1a, suivi des séquences de régulation post transcriptionnelles du virus de l'hépatite de la marmotte, cette cassette étant encadrée par les deux séquences minimales optimisées mimant les LTR, dans l'orientation appropriée. Partie B. Méthode 1, action d'enzymes de restriction. 35 tg du plasmide de 4569 pb sont digérés par 35 unités de Scal, dans le tampon 2 pendant 90 min à 37 C, dans un volume final de 50 l. Les produits de digestion sont chargés et migrés de manière constante sur un gel d'agarose 1.5 % à 70V pendant 30 min. Le fragment approprié, contenant le gène sous le contrôle du promoteur, et les deux séquences optimisées, long de 1700 pb dans l'exemple précité, est extrait du gel et purifié au moyen d'un kit d'extraction à partir de gel d'agarose. La purification est réalisée en accord avec les recommandations du fabricant pour obtenir le meilleur degré de pureté. Dans ces conditions, il est possible d'obtenir en routine 10 gg d'une séquence d'acide nucléique linéaire double brin, terminé par les séquences minimales optimisées, avec des extrémités à bouts francs, comme celles de l'ADNc proviral obtenu à la fin de l'étape de transcription inverse qui à lieu durant le cycle normal de réplication viral. Partie B. Méthode 2, amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) Le plasmide obtenu à la fin de la partie A, est soumis à l'amplification par PCR comme suit; Le cocktail de PCR contient: dNTP 200 itM, concentration fmale pour chaque dNTP Tampon 10X de réaction de l'ADN polymérase Pfu clonée, concentration finale 1X. 25 2.5 Unités d'ADN polymérase PfuTurboTM (marque déposée). Amorce 1: 5'ACTGGAAGGGCTAATTCACTG-3' concentration finale 0.5 M Amorce 2: 5'ACTGCTAGAGATTTTCCACAAGC-3' concentration finale 0.5 M 10 ng de plasmide à amplifier Eau distillée La réaction est réalisée dans un volume final de 100 l, avec les cycles suivants; Etapel: 95 C 3 min 1 cycle Etape 2: 94 C 45 sec 55 C 105 sec 72 C 60 sec 30 cycles Etape 3: 72 C 5 min 1 cycle Etape 1; 1 cycle, Etape 2; 30cycles, Etape 3; 1 cycle Cette méthode offre la possibilité d'incrémenter la production des acides nucléiques, en augmentant le nombre de tubes soumis à l'amplification par PCR. Les produits de PCR peuvent être directement utilisés, ou préalablement purifiés au moyen d'un kit de purification de produits PCR. Remarque 1: La séquence de l'oligonucléotide 1 contient seq ID N 1 La séquence de l'oligonucléotide 2 contient seq ID N 2 Remarque 2: 1 pg d'ADN linéaire double brin long de 1700 pb, comme le fragment décrit dans l'exemple, représente 5.45 x 1011 molécules Remarque 3: Quelque soit la méthode utilisée pour produire les séquences d'acide nucléique terminées par les séquences minimales optimisées mimant les LTR, c'est-à-dire Partie B méthode 1 ou partie B méthode 2, la dite séquence d'acide nucléique linéaire double brin, à des extrémités à bouts francs similaires à celles de l'ADNc proviral obtenu à la fin de l'étape de transcription inverse qui à lieu au cours du cycle normal de réplication viral. Remarque 4: La séquence de l'amorce 1 contient seq ID N 2 La séquence de l'amorce 2 contient seq ID N 3 Remarque 5: Il est possible de se procurer les enzymes de restriction ainsi que la T4 DNA ligase auprès, par exemple, de New England Biolabs, INC. (New England Biolabs, INC. 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915-5599). Il est possible de se procurer lesoligonucléotides et les amorces auprès, par exemple, de Genospher Biotechnologies. (Genospher Biotechnologies, 2 rue des Gravilliers, 75003 Paris-France). Il est possible d'effectuer la réaction de PCR, décrite dans la Partie B. méthode 2, par exemple, dans une machine PCR de type Hybaid HBMBS02220 (Hybaid, Thermo Life Sciences, BP-249 Eragny Parc, Cergy Pontoise, 95615- FRANCE). Remarque 6: Les exemples donnés précédemment, c'est à dire Partie A suivie de Partie B. méthode 1, ou Partie A suivie de Partie B. méthode 2, sont inclus pour illustrer un mode de réalisation préférentiel de l'invention. Il doit être noté et compris par les personnes compétentes dans les domaines de la biologie moléculaire et la thérapie génique, que les techniques présentées dans les exemples, le sont, pour représenter des techniques estimées par l'inventeur comme fonctionnant bien pour la mise en oeuvre de l'invention, et constitue de fait un mode préférentiel de l'utilisation de l'invention. Toutefois les personnes compétentes dans les domaines précités, à la lumière de cette remarque, doivent noter qu'il est possible d'apporter des modifications au mode de réalisation décrit, en obtenant toujours un résultat comparable et/ou similaire, sans pour autant s'écarter de l'esprit et du champ d'application de la présente invention. En relation directe avec ce point, il est tout spécialement à noter: a) l'utilisation d'autres enzymes de restriction, avec des sites de reconnaissance différents, mais produisant également des extrémités à bouts francs compatibles avec la reconnaissance par une intégrase virale, ou produisant des extrémités à bout cohésifs mimant des fragments ayant subis une maturation 3'. b) l'utilisation de séquences d'acides nucléiques modifiées, mutées, dégénérées, comparées à celles décrites dans l'invention, et des oligonucléotides plus longs que ceux mentionnés dans les exemples. Remarquez: Les séquences linéaires d'acides nucléiques produites par la méthode décrite sont destinées à leur transfert dans la cellule eucariote. Toutefois il est envisageable d'étendre l'application de la méthode à la cellule procariote. Par ailleurs l'ADN cible, c'est-à-dire l'acide nucléique dans le quel l'acide nucléique d'intérêt peut s'intégrer, peut être l'ADN génomique de la cellule procariote, l'ADN génomique de la cellule eucariote, ou l'ADN de l'un des organites de la cellule eucariote, c'est-à-dire l'ADN de la mitochondrie, ADN mitochondrial, ou l'ADN du chloroplaste, ADN chloroplastique. Enfin, l'ADN cible peut être un plasmide, ADN circulaire plasmidique, ou une séquence d'ADN linéaire. Remarque 8: Les virus associés aux Adénovirus appartiennent à la sousfamille virale des Dependovirus. La famille virale des Retroviridae est organisée en trois sous-familles virales; 30 Lentivirinae, Oncovirinae, Spumavirinae. Remarque 9: L'expression du produit final d'un gène dans une cellule, la protéine mature, peut être stable ou transitoire selon que le gène luimême est transfecté, ou intégré au génome de la cellule par une technique de transduction. Une intégrase virale, ou la protéine Rep des virus associés aux Adénovirus, peut être co-transfectée avec un acide nucléique dans une cellule, c'est-à-dire transfectée de concert avec un acide nucléique dans la cellule. La méthode est applicable industriellement avec le développement d'un kit destiné au transfert de gènes et à la thérapie génique, permettant la production de séquences linéaires d'acides nucléiques, transfectables et compatibles avec leur intégration dans un ADN cible, et contenant les éléments suivants: a) un plasmide contenant les séquences minimales optimisées mimant les séquences répétées terminales des virus (LTR), encadrant un site multiple de clonage, permettant l'insertion d'une cassette de n'importe quel type. b) un jeu d'amorce permettant l'amplification par PCR de la construction à partir du plasmide décrit au point a), et donnant naissance à une séquence d'acide nucléique double brin, terminée à chaque extrémité par les séquences minimales optimisées mimant les séquences répétées terminales des virus (LTR), et avec des extrémités à bouts francs. Ou c) des amorces permettant l'extension d'amorce d'une construction à partir du plasmide décrit au point a), donnant naissance à une séquence d'acide nucléique simple brin bordée à chaque extrémité par les séquences minimales optimisées dérivées des séquences terminales répétées des virus associés aux adénovirus. Bibliographie 1. May C, Rivella S, Chadburn A, et al. Successful treatment of murine beta-thalassemia intermedia by transfer of the human beta-globin gene. Blood. 2002;99(6):1902-8. 2. Otsu M, Steinberg M, Ferrand C, et al. Reconstitution of lymphoid development and function in ZAP-70-deficient mice following gene transfer into bone marrow cells. Blood. 2002;100(4):1248-56. 3. Ikawa M, Tergaonkar V, Ogura A, et al. Restoration of spermatogenesis by lentiviral gene transfer: offspring from infertile mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(11):7524-9. 4. Pawliuk R, Westerman KA, Fabry ME, et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 2001; 294(5550):2368-71. 5. Richard E, Mendez M, Mazurier F, et al. Gene therapy of a mouse model of protoporphyria with a self-inactivating erythroid-specific lentiviral vector without preselection. Mol Ther. 2001;4(4):331-8. 6. Kumar M, Keller B, Makalou N, et al. Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors. Hum Gene Ther. 2001;12(15):1893905. 7. Engelman A., k. Mizuuchi, and R Craigie. 1991. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA Strand transfer. Cell 67:12111221. 8. Brown PO, Bowerman B, Val-mus HE, et al. Retroviral integration: Structure of the initial covalent product and its precursor, and a role for the viral IN protein. Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86:2525-2529. 9. Fujiwara T, Mizuuchi K. Retroviral DNA integration: Structure of an integration intermediate. Cell 1988;54:497-504. 10. Roth MJ, Schwartzberg PL, Goff SP. Structure of the termini of DNA intermediates in the integration of retroviral DNA: Dependence on IN fonction and terminal DNA sequence. Cell 1989;58:47-54. 11. Kulkosky J, Jones KS, Katz RA, et al. Residues critical for retroviral integrative recombination in a region that is highly conserved among retroviral/retrotransposon integrases and bacterial insertion sequences transposases. Mol Cell Biol 1992;12:2331-2338. 12. Bukrinsky MI, Sharova N, McDonald TL et al. Association of integrase, matrix, and reverse 20 transcriptase antigens of human immunodeficiency virus type 1 with viral nucleic acids following acute infection. Proc Natl Acad Sci U S A 1993;90:6125-6129. 13. Gallay P, Swingler S, Aiken C, et al. HIV-1 infection of nondividing cells: C-terminal tyrosine phosphorylation of the viral matrix protein is a key regulator. Cell 1995;80:379-388. 14. Gallay P, Swingler S, Song J, et al. HIV nuclear import is governed by the phosphotyrosine- mediated binding of matrix to the core domain of integrase. Cell 1995; 83:569-576. 15. Feng S, Holland EC. HIV-1 tat trans-activation requires the loop sequence within tar. Nature 1988;334:165-167. 16. Brin E, Leis J. Changes in the mechanism of DNA integration in vitro induced by base substitutions in the HIV-1 U5 and U3 terminal sequences. J Biol Chem. 2002;277(13):10938-48. 17. Cheung AK, Hoggan MD, Hauswirth WW, Berns KI. Integration of the adeno-associated virusgenome into cellular DNA in latentlyinfected human Detroit 6 cells. J Virol 1980;33:739. 18. Kotin RM, Berns KI. Organization of adeno-associated virus DNA in latently infected Detroit 6 cells. Virology 1989;170:460. 19. Samulski RJ, Zhu X, Xiao X, et al. Targeted integration of adenoassociated virus (AAV) into human chromosome 19 [published erratum appears in EMBO J 1992;11:1228]. EMBO J 1991;10:3941. Linked to the slow skeletal muscle-specific gene troponin Ti (TNNTI) and the cardiac troponin I gene (TNNI3). 20. Dutheil N, Shi F, Dupressoir T, Linden RM. Adeno-associated virus site-specifically integrates into a muscle-specific DNA region.Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:4862. 21. Yang CC, Xiao X, Zhu X, et al. Cellular recombination pathways and viral terminal repeat hairpin structures are sufficient for adenoassociated virus integration in vivo and in vitro. J Virol 1997;71:9231. 22. McLaughlin SK, Collis P, Hermonat PL, Muzyczka N. Adeno-associated virus general transduction vectors: Analysis of proviral structures. J Virol 1988;62:1963. 23. Shelling AN, Smith MG. Targeted integration of transfected and infected adeno-associated virus vectors containing the neomycin resistance gene. Gene Ther 1994;1:165. 24. Philpott NJ, Gomos J, Berns KI et al. A p5 integration efficiency element mediates Repdependent integration into AAVS1 at chromosome 19 Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:12381. Revendications 1. Méthode non virale de production à grande échelle de séquences linéaires d'acides nucléiques compatibles avec la transfection cellulaire et leur intégration dans un ADN cible, caractérisée par l'utilisation a) d'un plasmide contenant des séquences minimales optimisées mimant les séquences terminales répétées des virus, terminant les extrémités 5' et 3' des dites séquences d'acides nucléiques produites, et (b) d'amorces, ou d'enzymes de restriction permettant la production des dites séquences d'acides nucléiques, les dites séquences d'acides nucléiques étant générées par l'activité d'enzymes de restriction, par l'extension d'amorce, ou par l'amplification par polymérisation en chaîne (PCR). 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les séquences linéaires d'acides nucléiques, terminées aux extrémités 5' et 3' par les séquences minimales optimisées mimant les séquences terminales répétées des virus, sont transfectées ex vivo dans une cellule. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que la dite cellule est eucariote ou procariote. 4. Méthode selon la revendication 2, ou selon la revendication 3, caractérisée en ce que une intégrase virale, ou la protéine Rep originaire des virus associés aux Adénovirus, est cotransfectée avec les séquences linéaires d'acides nucléiques, ou transitoirement ou stablement exprimée dans la dite cellule. 5. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'ADN ciblé est l'ADN génomique de la cellule eucariote, l'ADN génomique de la cellule procariote, l'ADN mitochondrial de la cellule eucariote, l'ADN chloroplastique de la cellule eucariote, est de l'ADN circulaire plasmidique, est de l'ADN linéaire. 6. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les séquences minimales optimisées mimant les séquences terminales répétées des virus, sont originaires de virus appartenant aux sous familles virales; Lentivirinae, Oncovirinae, Spumavirinae, Dependovirus. 7. Méthode selon la revendication 1 ou selon la revendication 6, caractérisée en ce que les séquences minimales optimisées mimant les séquences terminales répétées des virus, sont sauvages, mutées, chimiquement modifiées, en comparaison de la séquence contenue dans les virus dont elles proviennent, c'est-à-dire les virus appartenant aux sous familles virales suivantes; Oncovirinae, Lentivirinae, Spumavirinae, Dependovirus. 8. Méthode selon la revendication 1 ou selon la revendication 3, caractérisée en ce que les séquences linéaires d'acides nucléiques transfectées, sont modifiées par quelque procédé physico-chimique visant à modifierr la nature chimique des résidus nucléosidiques des dites séquences, ainsi que l'addition de quelque composé chimique tel que, liposomes, précipité de phosphate de calcium, polycations, visant à faciliter l'entrée des dites séquences d'acides nucléiques dans la dite cellule ou une des ses organites, ou leur passage au travers d'une membrane biologique. 9. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que les complexes d'acides nucléiques transfectés/intégrase virale, ou acides nucléiques transfectés/protéine Rep des virus associées aux Adénovirus, se formant dans la dite cellule, sont modifiés par quelque procédé physico-chimique visant à modifier la nature chimique des résidus nucléosidiques ou des dits complexes acide nucléique/protéine formés, ainsi que l'addition de quelque composé chimique tel que, liposomes, précipité de phosphate de calcium, polycations, visant à faciliter l'entrée des dits complexes dans la dite cellule ou une des ses organites, ou leur passage au travers d'une membrane biologique. 10. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que il est ajouté aux dites séquences linéaires d'acides nucléiques, tout élément appartenant au complexe de pré-intégration (CIP) des virus appartenant à la famille des Retroviridae. 11. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les séquences minimales optimisées mimant les séquences terminales répétées des virus, encadrant un site multiple de clonage ou la séquence d'acide nucléique d'intérêt, contenues dans le plasmide utilisé pour générer par l'activité d'enzymes de restriction, par l'extension d'amorce, ou par l'amplification par polymérisation en chaîne (PCR), le matériel nucléique revendiqué dans la revendication 1, sont choisies au sein du groupe de séquences suivant; SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 10. 12. Méthode selon la revendication 1; caractérisée en ce que les, amorces comprenant les : , _:. , . séquences minimales optimisées mimant les séquences terminales répétées des virus, ou leurs séquences complémentaires, utilisées pour générer par l'extension d'amorce, ou par l'amplification par polymérisation en chaîne (PCR), le matériel nucléique revendiqué dans la revendication 1, sont choisies au sein du groupe de séquences suivant; SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 6, SEQ ID N 9. 13. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les séquences minimales optimisées mimant les séquences terminales répétées des virus, ne contiennent pas de sites de liaison de facteurs cellulaires, et ne conduisent pas à la formation de structures secondaires.