FR 2862303 A1 20050520 FR 0313414 A 20031117 HO OR2 PREPARATIONS COLORANTES HYDROSOLUBLES JAUNES DERIVEES DES DIHYDROCHALCONES, LEUR PROCEDE. DE PREPARATION, ET LEURS UTILISATIONS --------------------------------------------------------------------------------------------------------- La présente invention a pour objet de nouvelles préparations colorantes hydrosolubles jaunes dérivées des dihydrochalcones, leur procédé de préparation, et leurs utilisations, notamment dans des compositions alimentaires, pharmaceutiques, ou cosmétiques. L'industrie agroalimentaire et cosmétique dispose de peu de solution en matière de pigments jaunes fortement hydrosolubles. Les pigments les plus utilisés sont le plus souvent la tartrazine (E102) et la curcumine (E100). La tartrazine résulte d'une synthèse chimique et présente un certain pouvoir allergène. Elle est actuellement interdite en Autriche et en Norvège. La curcumine est, quant à elle, faiblement hydrosoluble. La phloridzine est un polyphénol naturel et spécifique de la pomme, dont l'oxydation enzymatique a déjà fait l'objet de travaux publiés (Raa et Overeem, 1968; Oszmianski et Lee, 1991, Ridgway et al., 1997), sans toutefois que ces travaux aient abouti ni à l'isolement ni à l'élucidation de la structure chimique des pigments formés. En outre, la phloridzine est également connue pour son activité antioxydante (Miller et al., 1998). Un des principaux buts de la présente invention est de fournir un nouveau composé utilisable en tant que colorant jaune hydrosoluble alimentaire, et présentant l'avantage: - de ne pas être issu de la synthèse chimique, mais dérivé de la phloridzine par un 25 procédé enzymatique et correspondant à une fraction de la coloration naturelle d'un jus de pomme, - de ne pas être cytotoxique (tests in vitro) - d'être librement soluble dans l'eau, et donc facilement lavable à l'eau, - de présenter une grande capacité de coloration, - d'apporter une couleur jaune stable pour un pH inférieur à 5-6, ce qui correspond à la plupart des produits agro-alimentaires, et orange pour les pH supérieurs, - de permettre de conserver une grande luminosité au produit à colorer, - de permettre d'obtenir des couleurs vertes (type sirop de menthe verte) en mélange avec des colorants bleus. L'invention a également pour but de fournir des compositions alimentaires contenant un tel colorant, ainsi que des compositions pharmaceutiques et cosmétiques contenant à titre de principe actif ce composé et/ou des composés précurseurs de ce colorant, présentant un intérêt pour leur activité antioxydante ou pigmentaire. L'invention a également pour objet de fournir des composés alkylés dérivés des composés susmentionnés, conservant une capacité colorante et dont le caractère hydrosoluble est, le cas échéant, modifié par rapport à celui du composé colorant susmentionné. L'invention a également pour but de fournir des composés susmentionnés pour la 10 préparation de médicaments à activités antiradicalaire, antioxydante. L'invention a pour objet les composés de formule (I) suivante: HO O R2 dans laquelle: É n est égal à 0 ou 1, É RI représente: un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, É R2 représente: un atome d'hydrogène, un groupe glucose, ou un groupe xyloglucose, et dans laquelle: lorsque n = 1, la liaison a n'existe pas, les liaisons b et d sont des doubles liaisons, et les liaisons c et e sont des liaisons simples, les composés correspondants étant désignés composés de formule I-a, lorsque n = 0, les liaisons a, b et d sont des liaisons simples, et les liaisons c et e sont des doubles liaisons, les composés correspondants étant désignés composés de formule I-b. L'invention concerne plus particulièrement les composés définis ci-dessus, 5 répondant à la formule (I-a) suivante: HO dans laquelle R1 et R2 sont tels que définis ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet les composés définis cidessus, répondant à la formule (I-b) suivante: HO â O 4 O (I-b) R2 0 dans laquelle R1 et R2 sont tels que définis ci-dessus. L'invention concerne plus particulièrement les composés de formule (I-a ou I-b) définis ci-dessus, dans laquelle R1 représente H, un groupe méthyle CH3, un groupe éthyle CH2-CH3, un groupe propyle (CH2)2-CH3, un groupe isopropyle CH(CH3)-CH3, un groupe butyle (CH2)3-CH3, un groupe hexyle (CH2)5-CH3, ou un groupe octyle (CH2)7-CH3. L'invention a également pour objet un procédé de préparation des composés susmentionnés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en présence de phloridzine, pure ou sous forme d'extrait brut de végétaux, notamment de pomme ou de pommier (feuilles, rameaux, ou racines), avec une polyphénol oxydase (PPO) à activité crésolase et catécholase en présence d'oxygène de l'air ou d'une atmosphère enrichie en oxygène, suivie le cas échéant d'une étape de purification du composé de formule (I-a ou I-b) dans laquelle R1=H ainsi obtenu, et le cas échéant d'une étape de traitement de ce dernier composé avec un alcool de formule R-OH dans laquelle R représente un groupe alkyle tel que défini ci-dessus, pour obtenir un composé de formule (I-a ou I-b) dans laquelle Rl représente un groupe alkyle tel que défini ci-dessus, cette étape de traitement étant effectuée avant ou après l'étape de purification susmentionnée, et le cas échéant, une étape de purification du composé de formule (I-a ou I-b) dans laquelle RI représente un groupe alkyle tel que défini ci-dessus obtenu lors de l'étape précédente. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la PPO utilisée est un extrait enzymatique de végétaux comestibles, notamment de pomme, tel qu'obtenu par: - broyage des tissus végétaux apprêtés ou non dans un milieu permettant d'éviter toute oxydation, - éventuellement tamisage de la pulpe obtenue lors de l'étape précédente de manière à éliminer les particules de taille supérieures à 50 gm et obtenir une suspension homogène, micro-filtration tangentielle de la suspension susmentionnée afin de concentrer la PPO, lavage de la suspension concentrée en cours de microfitration tangentielle par addition de tampon additionné d'acide ascorbique jusqu'à élimination des substrats de la PPO, - lavage de la suspension concentrée en cours de microfitration tangentielle par addition de tampon non additionné d'acide ascorbique jusqu'à élimination de l'acide ascorbique, - récupération du rétentat de micro-filtration tangentielle, centrifugation, refroidissement et, le cas échéant, congélation dans l'azote liquide. La phloridzine utilisée dans le cadre du procédé susmentionné est sous forme pure (phloridzine commerciale) ou sous la forme d'un extrait de pomme riche en phloridzine, par exemple l'extrait Pomactiv HDH décrit ci-après. L'invention concerne également un procédé tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce que la purification des composés de formule I-a ou I-b, est effectuée par chromatographie liquide haute performance, avantageusement en phase inverse, ou par des procédés comprenant des étapes de filtration, centrifugation, et de chromatographie frontale basse pression. L'invention a également pour objet toute composition contenant le composé de formule (I-a ou I-b) susmentionnée dans laquelle R1=H, telle qu'obtenue par mise en présence d'un extrait de pomme ayant une activité PPO tel qu'obtenu selon la méthode décrite ci-dessus, avec un extrait de phloridzine de pomme ou de pommier, en présence d'oxygène de l'air ou d'une atmosphère enrichie en oxygène. L'invention concerne plus particulièrement toute composition contenant un composé de formule I-a ou I-b susmentionnée dans laquelle R1 représente un groupe alkyle tel que défini ci-dessus, ladite composition étant telle qu'obtenue par traitement de la composition susmentionnée contenant le composé de formule I-a ou I-b dans laquelle R1=H, avec un alcool de formule R-OH dans laquelle R représente un groupe alkyle tel que défini ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet toute composition telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que la proportion en poids des composés de formule I-a ou I-b dans ladite composition est d'environ 15% à environ 50%. L'invention concerne également toute composition alimentaire caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé de formule (I-a ou I-b) susmentionnée, ou une composition telle que définie ci-dessus. L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un composé de formule (I-a ou I-b) susmentionnée, avantageusement de formule (I-b), ou d'une composition telle que défraie ci-dessus, en tant que colorant de couleur jaune à orange, notamment dans le cadre de l'alimentation humaine ou animale. L'invention concerne également toute composition pharmaceutique ou nutraceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé de formule (I-a ou I-b) susmentionnée, ou une composition telle que définie ci-dessus, le cas échéant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. L'invention a plus particulièrement pour objet toute composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme administrable par voie orale, notamment sous forme de suspension buvable, ou de gélules ou comprimés. L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un composé de formule (I-a ou I-b) susmentionnée, ou d'une composition telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un médicament à activité antioxydante et antiradicalaire, destiné notamment à la prévention ou au traitement du stress oxydatif et des pathologies liées au stress oxydatif, intervenant notamment dans la diminution du risque d'apparition de maladies cardiovasculaires et de cancers. L'invention concerne également toute composition cosmétique caractérisée en ce s qu'elle comprend au moins un composé de formule (I-a ou I-b) susmentionnée, ou une composition telle que définie ci-dessus. Avantageusement, les compositions cosmétiques susmentionnées se présentent sous forme de crèmes, ou de gels. L'invention a également pour objet toute méthode de traitement esthétique, 10 caractérisé en ce qu'elle comprend l'application sur la peau d'un individu d'une composition cosmétique susmentionnée. L' invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la préparation de nouveaux colorants jaunes orangés issus de l'oxydation enzymatique de la phloridzine, à savoir de l'acide 3(4'-hydroxy-2'-glucosyl-4,5-dioxo-3,6-dihydro2H-dibenzofuran-2-yl)-propionique ou POP de formule (I-b) dans laquelle R1 = H, et de ses dérivés de formule (I-b) dans laquelle Rl représente un groupe alkyle tel que défini ci-dessus. L'invention sera aussi illustrée par la mise en évidence et la caractérisation structurale des composés de formule I-a à savoir l'acide 3-(4,5,4',6'-tetrahydroxy-2'-glucosylbiphenyl-2-yl)-propionique qui est un précurseur du colorant de formule Ib. Comme cela avait déjà été observé par Oszmianski et Lee (1991), l'oxydation enzymatique de la phloridzine présente un temps de latence avant l'apparition de la couleur correspondant aux produits jaunes de formule I-b. L'oxydation enzymatique de la phloridzine semble se faire de façon quasiment séquentielle. L'oxydation de la phloridzine forme d'abord la 3-hydroxy-phloridzine (étape limitante) qui est rapidement consommée pour former le composé I-a. Celui-ci est ensuite réoxydé une nouvelle fois pour former le produit I-b plus lentement. Il semble que le produit I-b ait donc une affinité plus faible pour l'activité catécholase de l'extrait PPO que la 3-hydroxyphloridzine. A partir de ce constat plusieurs solutions techniques permettent de produire une préparation plus ou moins riche en composés colorants de formule I-b, ou en son précurseur direct de formule I-a: - limiter le temps de réaction à environ 2h dans les conditions décrites ci-après permet d'accumuler les composés I-a avant qu'ils soient de nouveau oxydés en I-b. - l'ajout d'acide ascorbique dans le milieu réactionnel permet d'accumuler à la fois de la 3-hydroxy-phloridzine, et les composés I-a, en ralentissant la dernière étape d'oxydation par son pouvoir réducteur. Le composé POP (I-b) présente un intérêt en tant que colorant jaune naturel. Il peut être obtenu dans un milieu réactionnel biotechnologique, en contrôlant l'oxydation enzymatique de la phloridzine catalysée par l'activité polyphénoloxydase (PPO), telle qu'elle se déroule naturellement dans la production d'un jus de pomme: Préparation de l'extrait enzymatique de PPO: Le parenchyme végétal, par exemple la pulpe de pomme, est broyé dans un milieu permettant d'éviter toute oxydation (pH acide, froid, acide ascorbique). Les particules solides de taille supérieure à 50 m sont alors éliminées par tamisage afin d'obtenir une suspension homogène. Celle-ci est ensuite soumis à une micro-filtration tangentielle sur membrane (0,45 m) avec apport d'une solution tampon additionnée d'acide ascorbique pour éliminer les substrats polyphénoliques de la PPO. Enfin, le rétentât récupéré est lavé à l'aide d'un tampon sans acide ascorbique, puis centrifugé. Le culot de centrifugation est dispersé dans un minimum de tampon. Cette préparation enzymatique de PPO doit alors être conservée au froid en vue d'une utilisation rapide ou être congelée dans l'azote liquide puis conservée à -25 C pour une utilisation ultérieure. Mécanisme de formation: Un extrait de phloridzine mis en présence de cet extrait de PPO. L'activité crésolase, permet la formation de 3hydroxyphloridzine. Ce dernier composé est oxydé (par l'activité catécholase de la PPO) puis réagit immédiatement de façon intramoléculaire puis avec l'eau pour former une nouvelle structure (composé I- a). Cette dernière molécule est à nouveau oxydée par la PPO pour conduire au composé jaune final (composé I-b). Spécificités de structure: La formule chimique présente une forte originalité structurale par la présence d'une fonction acide carboxylique qui confère à la molécule un caractère fortement hydrophile. Cette fonction est aisément estérifiable par divers groupements chimiques pour donner de nouvelles structures plus ou moins hydrosolubles, ou pouvant apporter de nouvelles fonctionnalités, sans affecter les propriétés colorantes. Contrairement au principal colorant jaune hydrosoluble alimentaire actuellement utilisé - la tartrazine (E102) qui est issue de synthèse chimique, le colorant en question est dérivé de la phloridzine par un procédé enzymatique et correspond à une partie de la coloration naturelle d'un jus de pomme. 5- II existe d'autres colorants jaunes naturels tels que la curcumine ou la quercétine, cependant leur solubilité limite leur utilisation en milieu aqueux (logP positif, avec P coeff de partage [n-octanoUeau]), rendant nécessaire leur inclusion dans des complexes hydrosolubles (13cyclodextrines, EP0612814). Au contraire le colorant POP est librement soluble dans l'eau (logP négatif). De plus, cette mauvaise solubilité des colorants actuels les rend tachants (WO 01191585A2) alors que le colorant POP est facilement lavable à l'eau. D'une part le colorant POP présente une grande capacité de coloration comme en témoigne son coefficient d'extinction molaire c=17 400 DO.mol".L2.cm 1 à pH 3, et cette capacité augmente avec le pH. Une solution à 20 ppm de POP est jaune intense. D'autre part, des mesures colorimétriques avec un spectrophotomètre Minolta montre que le colorant POP: - apporte une couleur jaune stable (teinte CIE = 10) pour un pH inférieur à 5-6, ce qui correspond à la plupart des produits agro-alimentaires, et orange (teinte CIE = -50) pour les pH supérieurs, - permet de conserver une grande luminosité au produit à colorer, la luminosité de l'eau distillée fixée à 100 ne diminue pratiquement pas, pour des concentrations de POP allant jusqu'à 100 ppm, permet d'obtenir des couleurs vertes (type sirop de menthe verte) en mélange avec des colorants bleus, de la même façon que la tartrazine. Obtention, structure et quelques propriétés du colorant POP A. Principes généraux de l'obtention du pigment POP: Le pigment jaune, dénommé POP (i. e. Produit d'Oxydation de la Phloridzine) est produit par oxydation enzymatique de la phloridzine, composé phénolique naturellement présent dans la pomme et spécifique de ce fruit. L'enzyme impliquée est la polyphénoloxydase, également présente naturellement dans la pomme mais dans un compartiment cellulaire (plastes) différent de celui de la phloridzine et des autres substrats phénoliques (vacuoles). Pour l'obtention d'une composition contenant une concentration significative 5 en POP, il est avantageux: - d'utiliser comme substrat de départ la phloridzine à l'état purifié ou tout au moins une préparation hautement concentrée en phloridzine. Les préparations utilisées dans le cadre de la présente invention contiennent de préférence plus de 40% de phloridzine. Une préparation particulièrement avantageuse utilisée dans le cadre de la présente invention, dénommée ci-après Pomactiv HDH, contient 51 % de polyphénols dont: * 96% de dihydrochalcones, à savoir 73% de phloridzine, 2% de xyloglucoside de phlorétine, et 21% de phlorétine, * 1% d'acides hydroxycinnamiques, * 3% de flavonols. - d'utiliser une préparation enzymatique de type polyphénoloxydase (PPO) riche en activité crésolase. En fait, la polyphénoloxydase se décompose en une activité crésolase (permettant l'hydroxylation de la phloridzine) et une activité catécholoxydase (permettant l'oxydation de la phloridzine hydroxylée). Un procédé d'obtention d'une préparation de PPO particulièrement avantageuse est décrit ci-après. L'obtention proprement dite de la préparation riche en pigment POP peut être réalisée de deux façons: 1. à partir de phloridzine commerciale purifiée: dans ce, cas, le pigment POP peut constituer plus de 50 % de la préparation obtenue, les autres constituants correspondant à un pool d'autres produits d'oxydation dont des composés de formule I-a n'ayant pas ou peu de capacité colorante, 2. à partir de Pomactiv HDH mis en incubation avec la préparation PPO en solution et avec agitation à l'air. La procédure permet d'obtenir une oxydation quasi totale de la phloridzine avec une conversion en pigment POP supérieure à 50 %. Les autres constituants de cette préparation correspondent pour une part aux composés autres que la phloridzine initialement présents dans Pomactiv HDH et d'autre part aux intermédiaires réactionnels semblables aux précédents. La purification de la molécule de pigment I-b peut être réalisée par chromatographie liquide haute performance en phase inverse. Le détail du protocole est exposé ci-après. B. Production d'un extrait enzymatique avec une activité crésolase A titre d'exemple la méthode d'extraction de PPO à partir de pulpe végétale a été appliquée à la pulpe de pomme comme indiquée ci-dessous: L'activité crésolase de la PPO de pomme a été extraite de 4 kg de pomme Idared, placés dans 20 L d'eau additionnée d'acide ascorbique à 20 mM, soit 3,5 g. L-1 (cf schéma 1 suivant). La compote obtenue par broyage fin, a ensuite été tamisée, micro-filtrée, rinçée puis centrifugée et reprise dans 50 mL d'eau. Ainsi l'activité crésolase de l'enzyme peut-être récupérée à partir de pommes (commerciales issues de chambre froide), sans précaution particulière au niveau de l'ajustement du pH. Schéma 1. Pommes entières 4 kg, 7-8 C Eau + Ac. ascobique 20 mM L, 7-8 C É Broyeur Stephan É Broyeur Colloïdal Compote grossière É Tamisage: 1: tamis 250!am 2: tamis 63 m Suspension L'oxydation a été conduite dans un volume de 1,37 L d'eau contenant env. 1 mM de phloridzine, placé dans un fermenteur de microbiologie avec un bullage d'air comprimé et une agitation avec une double hélice marine à 250 rpm. L'ensemble ainsi réglé permet au système de rester saturé en air. L'oxydation a été menée pendant 15 h à 30 C. La solution a été clarifiée par centrifugation puis lyophilisée. Bilan de l'oxydation: É Récupération de matière: 90 %. Conversion de la phloridzine en POP: 50 % (en masse) ; 47 % en moles A ce stade, le lyophilisat correspond à une préparation colorante contenant 26 % de la molécule POP. D. Purification du pigment POP par Chromatographie liquide à l'échelle semi-préparative. Echantillon: 200 mg du lyophilisat issu de l'oxydatiop (cf ≈C ci-dessus) sont 25 solubilisés dans l'eau acidifiée (2,5 % acide acétique) à la concentration de 20 g.L-1. Système chromatographique haute performance: système de pompage à gradient constitué de 2 pompes Dynamax SD 200 avec débit maximum de 100 mL.min-1; solvant A: acide acétique dilué (2.5 % v/v) ; solvant B: acétonitrile pur. - débit: 35 mL.min-1, - une colonne Novapack C18, 6 m de dimension 25 x 100 mm avec une précolonne de 25 x 20 mm; - gradient: initial: 3 % B; puis 3 min: 3% B; puis 5 min: 8% B; puis 10 min: 15 % B, puis 12 min: 90 % B; puis 14 min: 90 % B; et enfin 16 min: 3% B, - un détecteur UV-visible réglé sur 400 nm (détection dans le jaune). Injections: 3 injections de 3 ml de la solution ont été effectuées (soit 3 x 60 mg de lyophilisat). Collecte: le pigment est détecté en sortie de colonne entre 400 et 550 secondes d'élution; la fraction d'éluât correspondante a été collectée pour chacune des 3 injections. Les volumes des 3 collectes ont été rassemblés. Évaporation et lyophilisation: la fraction collectée a été traitée à l'évaporateur en pression réduite afin d'éliminer le solvant organique (i. e. acétonitrile). La fraction aqueuse résiduelle a été congelée, lyophilisée puis pesée. Bilan: 51 mg de POP purifié ont été obtenus soit un rendement de purification de 15 28,3 %. E. Analyse structurale de POP L'analyse structurale a permis de démontrer que POP correspondait à une 20 structure originale (I-a et I-b) notamment par la présence d'une fonction acide carboxylique initialement absente de la phloridzine. F. Dérivatisation (estérification) de POP par divers alcools. Mode opératoire: - pesée précise de 1 à 2 mg de la fraction POP non purifiée (26 % de molécule POP) telle que décrite au ≈C sont incubés avec l'alcool acidifié par HC1 (0,5N final) à 50 C pendant 1 h. Le volume d'alcool est ajusté de façon à avoir une concentration finale en fraction POP de 1 g.L- 1. Les alcools suivants ont été testés: méthanol, propanol-1, propanol-2, butanol-1, butanol-3, hexanol-1, octanol-1. Confirmation de la conversion en esters: la formation des esters correspondant a été montrée par HPLC couplée à la spectrométrie de masse en mode négatif et avec également en série une détection à 420 nm (jaune). Les rendements de conversion ont été calculés sur la base des chromatogrammes à 420 nm en effectuant le rapport des aires du pic de l'ester sur celle du pic du composé POP dans les mêmes conditions de concentration (voir Tableau I). Tableau I: Temps de rétention chromatographique, ions pseudo-moléculaire et rendements de conversion du composé POP et de ses dérivés estérifiés. Composé Temps de Ion [M-H]" Rendement** de DO 420 nm (jaune) Rétention* (min) conversion en du milieu réactionnel ester (%) dilué à 0,1 g/1 POP 13,5 465 - 0,973 Ester méthylique de POP- 17,9 479 100 0,922 Ester propylique 23,9 507 95 0,945 Ester isopropylique 23,9 507 32 0,890 Ester butylique 26,8 521 100 0,978 Ester hexylique 32,0 549 44 0,615 Ester octylique*** 37,1 577 16 0,230 * en HPLC en phase inverse avec gradient d'acétonitrile; ** estimé sur la base de l'aire du pic chromatographique de l'ester à 400 nm par rapport à l'aire du pic du composé POP à 400 nm dans les mêmes conditions; La fraction POP n'était que partiellement soluble dans cet alcool, en conséquence, les valeurs de rendements et de DO sont vraisemblablement affectées par ce phénomène. Conclusion: on remarque que les temps de rétention sont d'autant plus longs que l'alcool utilisé est lourd traduisant de ce fait la formation d'un pigment d'autant plus apolaire. L'estérification de POP par une série d'alcools aliphatiques se fait avec des rendements qui varient de 16 à 100 % en conservant généralement la capacité colorante (voir DO 420 nm). Il est donc aisément possible de convertir le colorant POP en d'autres pigments moins hydrosolubles pour d'autres applications (cosmétiques...). G. Capacité antioxydante in vitro, La capacité antioxydante de la molécule POP et/ou de la fraction POP non purifiée est mesurée en utilisant une ou deux méthodes différentes (Randox et/ou FRAP). H. Paramètres de couleur et stabilité de la couleur en fonction du pH Le coefficient d'extinction molaire du pigment a été estimé à 17400 mol-l.cm t ( 420 nm à pH 3). Le spectre UV-visible d'une solution de préparation POP a été mesuré pour différents pH entre 2 et 8 (voir figure 1). Des mesures de couleur (chromamètre Minolta) ont également été réalisées dans cette zone de pH. Les résultats détaillés des paramètres colorimétriques sont consignés ci-après. 2862303 14 Paramètres Colorimétriques du colorant POP Les paramètres de coloration du pigment POP par rapport à de l'eau distillée (référence) ont été mesurés en solution dans un tampon de M Ilvaine (citrate- phosphate) à différents pH (2,2 à 8) et ce, pour plusieurs concentrations. Les mesures ont été réalisées à l'aide d'un spectrophotomètre Minolta CM3600d (1998 Minolta Co., Ltd. Japon) avec la plaque de calibration (Minolta n 13171008). Le spectrophotomètre équipé d'un logiciel de retraitement SpectraMagic V 3.60G (Cyberchrome Inc Minolta Co. Ltd), a été paramétré pour utiliser l'espace colorimétrique CIE L*a*b (Figure 2), avec l'illuminant D65-10 (D65-A-F2), et l'observateur moyen normalisé 10 CIE 1964 (sensibilité d'un oeil moyen). A partir des valeurs a* et b* nous avons calculé les coordonnées polaires C * = J(a*)2+(b*)2 et h = tan g-'/a ''x 180 \,b*) Pi Dans la suite du texte nous exploiterons principalement ces coordonnées polaires C* et h, car elles ont chacune une signification colorimétrique: C* est la distance au centre de l'espace et correspond à la saturation de la couleur alors que h est un angle (exprimé ici en degré) qui définit la teinte. A titre indicatif pour la couleur rouge la teinte se situe au voisinage de 0 , pour le jaune environ 90 , pour le vert 180 et pour le bleu 270 . La valeur L* est utilisée telle quelle et exprime la clarté. Effet du pH sur la coloration Tableau II: Paramètres colorimétriques de POP (env. 20 mg/L) dans un tampon de Mc Ilvaine en fonction du pH (L* : luminosité ; a* : axe vert-rouge; b* : axe bleu-jaune; 25 C* : saturation) Coordonnées L*a*b* L* a* b* C* h Teinte CIE Référence: H2Od 100,0 0,0 0, 0 0,0 0,0 POP à pH 2,2 98,7 -13,5 40,7 42,9 108,4 11,2 POP à pH 3 98,5 13,4 41,1 43,2 108,1 11,0 POP à pH 4 98,4 -13,2 42,3 44,3 107,3 10,2 POP à pH 5 97,5 -11,4 46,7 48,1 103,8 5,9 POP à pH 6 93,5 -0,1 57,7 57,7 90, 1-20,5 POP à pH 7 88,1 16,3 71,4 73,2 77,2 -63,5 POP à pH 8 87,1 19,5 72, 2 74,8 74,9 -71,8 Les coordonnées du colorant POP mesurées par rapport à l'eau distillée sont regroupées dans le tableau II. Pour les pH acides ( Les valeurs de h comprises entre 75 et 110 indiquent que la teinte jaune (*) est largement majoritaire avec des nuances légèrement vertes pour les pH les plus acides, et tend vers l'orange pour les pH supérieurs à 6. Il faut remarquer cependant une grande constance de la teinte entre pH 2.2 et pH 5 c'est à dire dans la plage de pH ou se situent la majorité des produits alimentaires. Une augmentation du pH a également pour effet d'accentuer la saturation de la couleur simultanément à la modification de teinte. L'effet du pH sur le spectre UV-visible du colorant POP en absorbance, est représenté sur la figure 1. L'effet du pH sur le spectre visible du colorant POP en % dé transmittance, est représenté sur la figure 3. Effet de la concentration sur la coloration Une étude colorimétrique comparable a été effectuée à pH 3 pour des concentrations variables (Tableau III). Tableau III: Paramètres colorimétriques de POP dans un tampon de Mc Ilvaine à pH 3 en fonction de la concentration (L* : luminosité ; a* : axe vert-rouge; b* : axe bleu-jaune; C* : saturation) POP à pH 3 L* a* b* C* Teinte CIE H20d 100,0 0,0 0,0 0,0 - 0,0 POP 5 mg/L 99,6 -4, 6 11,5 12,4 111,7 3,5 POP 10 mg/L 99,3 -8,5 22,8 24,3 110,4 6,7 POP 20 mg/L 98,7 -13,6 41,5 43,7 108,1 11,1 POP 40 mg/L 97,9 -17,7 67,1 69,4 104, 8 14,3 POP 100 mg/L 96,5 -17,8 96,0 97,6 100,5 10,4 De la même façon que lors de la variation de pH, la luminosité des solutions du colorant POP ne diminue que très faiblement en fonction de la concentration. La teinte reste dans les jaunes quelle que soit la concentration avec une légère diminution des nuances vertes lorsque la concentration augmente. La saturation de la couleur est bien corrélée avec la concentration de colorant POP jusqu'à la concentration de 20 mg.L-1 (Figure 4), Au-delà de 40 mg.L-1, le détecteur sature, l'absorbance de la solution atteignant valeur de 3 à 400 nm (Figure 5). Cette corrélation permet d'affirmer qu'une augmentation de 1 mg.L-1 de POP en solution à pH 3 équivaut à un gain d'environ 2 points de saturation. Conclusion: Le spectre UV-visible est relativement stable pour des pH compris entre 3 et 5 (ce qui correspond à la majorité des aliments). Pour des pH supérieurs, la couleur devient plus orangée tandis qu'elle devient jaune pâle avec une légère nuance verte pour un pH inférieur à 3. En conclusion, la couleur de POP en solution est au moins aussi stable sinon supérieure à celle de la tartrazine. 1. Solubilité dans l'eau La remise en solution de la fraction POP non purifiée (telle que décrit au ≈C.) s'avère soluble librement dans l'eau à des concentrations pouvant aller jusqu'à 100 g.L-1. Pour des concentrations aussi élevées la couleur obtenue est noire, avec des reflets oranges. Cette forte capacité à la solubilisation en solution aqueuse confirme l'estimation par le calcul de coefficients de partage (octanoUeau) négatifs, indiquant que la forte hydrosolubilité du colorant POP. J. Précurseur de pigmentation cutanée Shoji et de ses collaborateurs en 1997 ont montré que la phloridzine est lentement oxydée par la tyrosinase de la peau pour former un pigment jaune-orange probablement de structure similaire aux composés de formule I-b, constituant un protecteur contre les radiations UV. Leur formation en cosmétologie au niveau cutané permet donc d'utiliser la phloridzine comme un substrat autobronzant. Comme nous avons pu le constater expérimentalement, l'étape limitante de la chaîne réactionnelle d'oxydation reste l'hydroxylation de la phloridzine par l'activité crésolase. Une préparation contenant les composés de formule I-a constitue un substrat direct de l'activité catécholase de la tyrosinase de la peau, et permet donc le développement d'une pigmentation beaucoup plus rapidement qu'à partir de la phloridzine de départ. Au cours des réactions présentées précédemment il est possible de favoriser la formation de composés de formule I-a en arrêtant l'oxydation par filtration (élimination de l'extrait insoluble de PPO après 2h), ou en apportant un pouvoir réducteur au milieu réactionnel par ajout d'acide ascorbique (5 à 20 mM). La structure de base des composés de formule I-a peut en outre, être estérifiée par des alcools lourds (Rl), déglycosylée (R2) par une hydrolyse acide ménagée, la rendant ainsi plus apolaire, ce qui la rend plus apte à pénétrer la barrière cutanée. Dans le cas d'une formulation cosmétique comprenant uniquement des extraits naturels tels qu'il peut s'en former dans un jus de pomme, la structure de base I-a avec R1 = H et R2 = glucose, doit être formulée dans une émulsion grasse constituée de liposomes. K. Test de cytotoxicité sur modèle cellulaire SYSTEME D'ESSAI Cellules TC7 (sous clone de caco-2) cultivées sur nacelles (membrane en polyéthylène téréphtalate), utilisées à 21 jours de confluence, fournie par Bioprédic International Emploi des cellules au passage 21. PREPARATION DES PRODUITS A L'ESSAI Produit "POP" purifié, obtenu tel que décrit précédemment (paragraphe D) : solubilisé directement dans le tampon apical, testé à 20, 100, 200, 1000 et 2000 M pour le test de 25 cytotoxicité. Pas de solvant utilisé pour la solubilisation des produits à l'essai. PROTOCOLE D'INCUBATION Système réactionnel: cultures de cellules TC-7 incubées en présence des produits 30 à l'essai aux différentes concentrations citées ci-dessus. Temps d'incubation: 2 heures. Ho H2 t: incubation des produits à l'essai v: évaluation des effets Replicate: 5 par concentrations. Température d'incubation: 37 C. -5 Autres conditions: atmosphère humide contenant 5 % de CO2. Témoin: correspondant aux cellules incubées en absence de produit à l'essai Ho H2 Replicate: 10 EVALUATION DES EFFETS Viabilité cellulaire mesurée selon la méthode du rouge neutre après incubation avec les produits à l'essai: - incubation en présence de rouge neutre pendant 3 heures - lyse des cellules et lecture de la densité optique avec un spectrophotomètre à 540 nm (la densité optique du rouge neutre est proportionnelle au nombre de cellules vivantes). TRAITEMENT DES DONNEES Expression des résultats: en unités arbitraires de D.O.(densité optique) par échantillon et en pourcentage de variation par rapport au groupe témoin. RESULTATS EFFET DE POP SUR LA VIABILITE CELLULAIRE DES CELLULES TC-7 Témoin Produit POP purifié ( M) 200 1000 2000 100 0,456 0,485 _ 0,441 0,432 0,407 0,438 0,442 0,479 0,473 _ 0,477 0,519 0,460 0,521 0,436 DO 0,483 0,476 _ 0,517 0, 480 0,518 0,458 0,501 _ 0,480 0,524 _ 0,517 0,533 0,495 0,535 0,476 0,469 0,519 0,510 0,518 0,495 0,509 0,429 Moyenne 0,484 _ _ 0,467 0,504 0, 448 0,489 0,504 Ecart type 0,022 0,031 0,041 0,037 0,038 0,019 % Témoin 100 101 104 96 104 93 Aux concentrations testées, le produit POP purifié n'a pas eu d'effet sur la viabilité cellulaire des cellules TC-7. Aucun effet inhibiteur de rférence n'a été noté jusqu'à 200.tM. A une concentration de 1000 M, une légère diminution de la viabilité cellulaire a été mise en évidence. Légende des figures Figure 1: Effet du pH sur le spectre UV-visible du colorant POP (longueur d'onde en nm en abscisse) en absorbance (en ordonnée). Figure 2: Espace colorimétrique CI K L*a*b* Figure 3: Effet du pH sur le spectre visible du colorant POP (longueur d'onde en nm en abscisse) en % de transmittance (en ordonnée). Figure 4: Corrélation de la saturation (en ordonnée) avec la concentration de colorant POP (en abscisse). Figure 5: Effet de la concentration en colorant POP sur l'absorbance (en 20 ordonnée) dans le visible (longueur d'onde en nm en abscisse). Bibliographie Frerichs H., Bail E.G. (1964). Studies on the metabolisrn of Adipose Tissue. XVI. 25 Inhibition by phlorizin and phloretin of the insulin-stimulated uptake of glucose. Biochemistry. 3, 7, 981-985 Lea, A. G. H. (1984). Farb- und gerbstoffe in englischen rnostapfeln. Flüssiges Obst, 8, 356-361. Miller N. J. (1998). Flavonoids and phenylpropanoids as contributors to the antioxidant activity of fruit juices in Flavonoids in health and disease etd Catherine Rice Evans and Lester Packer, Marcel Dekker Inc. chap 16, 387-403 Oszmianski J. et Lee C.Y. (1991). Enzymatic oxidation of phloretin glucoside in model system. Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 39, 1050-1052. Raa, J. and J. C. Overeem (1968). "Transformation reactions of phloridzin in the 5 presence of apple leaf enzymes." Phytochemistry. 7: 721-731. Ridgway T., G. Tucker, H. Wiseman. (1997). "Novel bioconversions for the production of designer antioxidant and colourant flavonoids using polyphenol oxidases." Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 14: 165-190. Ridgway, T., J. O'reilly, et al. (1996). "Potent antioxidant properties of novel apple-derived flavonoids with commercial potential as food additives." Biochemical Society Transactions 24(3): 391S. Ridgway, T., G. Tucker (1999). Procedure for the partial purification of apple leaf polyphenol oxidase suitable for commercial application. Enzyme Microb. Technol. 25, 225-231 Ridgway, T. (1999). Colourants, antioxidants and phytoestrogens from apple. J 20 Chem. Technol. Biotechnol. 74, 377 Shoji T., KoboriM., Shinmoto H., Tanabe M., Tsusshida T., Progressive effects of phloridzin on melanogenesis in B16 melanoma cells. Biosci. Biotech. Biochem. 1997, 61, 12, 1963-1967. 21 REVENDICATIONS 1. Composés de formule générale (I) suivante: (I) OR2 dans laquelle: É n est égal à 0 ou 1, É RI représente: un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, É R2 représente: un atome d'hydrogène, un groupe glucose, ou un groupe xyloglucose, et dans laquelle: lorsque n = 1, la liaison a n'existe pas, les liaisons b et d sont des doubles liaisons, et les liaisons c et e sont des liaisons simples, les composés correspondants 25 étant désignés composés de formule I-a, lorsque n = 0, les liaisons a, b et d sont des liaisons simples, et les liaisons c et e sont des doubles liaisons, les composés correspondants étant désignés composés de formule I-b. 2. Composés selon la revendication 1, de formule (I-a) suivante: ORI (I-a) HO OH Rz O dans laquelle RI et R2 sont tels que définis dans la revendication 1. 3. Composés selon la revendication 1, de formule (I-b) suivante: 15 O ORI OH OH HO R2 O dans laquelle RI et R2 sont tels que définis dans la revendication 1 4. Composés selon l'une des revendications 1 à 3, de formule (I-a ou I-b) dans laquelle RI représente H, un groupe méthyle CH3, un groupe éthyle CH2-CH3, un groupe propyle (CH2)2-CH3, un groupe isopropyle CH(CH3)-CH3, un groupe butyle (CH2)3-CH3, un groupe hexyle (CH2)5-CH3, ou un groupe octyle (CH2)7-CH3. 5. Procédé de préparation de composés l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en présence de phloridzine, pure ou sous forme d'extrait brut de végétaux, en particulier, de pomme ou de pommier, ou d'une préparation contenant de la phloridzine, avec une polyphénol oxydase (PPO) à activité crésolase et catécholase en présence d'oxygène de l'air ou d'une atmosphère enrichie en oxygène, suivie le cas échéant, d'une étape de purification du composé de formule (I-a ou I-b) dans laquelle R1=H ainsi obtenu, et le cas échéant d'une étape de traitement de ce dernier composé avec un alcool de formule R-OH dans laquelle R représente un groupe alkyle tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4, pour obtenir un composé de formule (I-a ou I-b) dans laquelle R1 représente un groupe alkyle tel que défini ci-dessus, cette étape de traitement étant effectuée avant ou après l'étape de purification susmentionnée, et le cas échéant, une étape de purification du composé de formule (I-a ou I-b) dans laquelle R1 représente un groupe alkyle tel que défini ci-dessus obtenu lors de l'étape précédente. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisée en ce que la PPO utilisée est un extrait enzymatique de végétaux comestibles tels que la pomme et obtenu par: - broyage des tissus apprêtés ou non dans un milieu permettant d'éviter toute oxydation, - éventuellement tamisage de la pulpe obtenue lors de l'étape précédente de manière à éliminer les particules de taille supérieures à 50 m et obtenir une suspension homogène, micro-filtration tangentielle de la suspension susmentionnée afin de concentrer la PPO, - lavage de la suspension concentrée en cours de microfitration tangentielle par addition de tampon additionné d'acide ascorbique jusqu'à élimination des substrats de la PPO, - lavage de la suspension concentrée en cours de microfitration tangentielle par addition de tampon non additionné d'acide ascorbique jusqu'à élimination de l'acide ascorbique, - récupération du rétentat de micro-filtration tangentielle, centrifugation, refroidissement et, le cas échéant, congélation dans l'azote liquide. 7. Composition contenant le composé de formule (I-a ou I-b) selon la revendication 1, dans laquelle R1=H, telle qu'obtenue par mise en présence d'un extrait végétal ayant une activité PPO selon la revendication 6, avec un extrait de phloridzine, en présence d'oxygène de l'air ou d'une atmosphère enrichie en oxygène. 8. Composition contenant un composé de formule (I-a ou I-b) selon la revendication 7, dans laquelle R1 représente un groupe alkyle tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4, telle qu'obtenue par traitement de la composition selon la revendication 6, avec un alcool de formule R-OH dans laquelle R représente un groupe alkyle tel que défini dans la revendication 5. 9. Composition selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que la proportion en poids des composés de formule (I-a ou I-b) dans ladite composition est d'environ 15% à environ 50%. 10. Composition alimentaire caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé de formule (I-a ou I-b) selon la revendication 1 ou 2, ou une composition selon l'une des revendications 7 à 9. 11. Utilisation d'au moins un composé de formule I-b selon l'une des revendications 1 à 4, ou d'une composition selon l'une des revendications 7 à 9, en tant que colorant de couleur jaune, notamment dans le cadre de l'alimentation humaine ou animale. 12. Composition pharmaceutique ou nutraceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé de formule (I-a ou I-b) selon l'une des revendications 1 à 4, ou d'une composition selon l'une des revendications 7 à 9, le cas échéant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 13. Utilisation d'au moins un composé de formule (I-a ou I-b) selon l'une des revendications 1 à 4, ou d'une composition selon l'une des revendications 7 à 9, pour la préparation d'un médicament à activité antioxydante et antiradicalaire, destiné notamment à la prévention ou au traitement du stress oxydatif et des pathologies liées au stress oxydatif, notamment des cancers. 14. Composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé de formule (I-a ou I-b) selon l'une des revendications 1 à 4, ou d'une composition selon l'une des revendications 7 à 9. 15. Méthode de traitement esthétique, caractérisé en ce qu'elle comprend l'application sur la peau d'un individu d'une composition cosmétique selon la revendication 14.