FR 2863164 A1 20050610 FR 0350968 A 20031204 PROCEDE D'OBTENTION D'UN PRINCIPE ACTIF A PARTIR DE Pimpinella anisum, PRINCIPE ACTIF OBTENU ET APPLICATION COSMETIQUE La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un principe actif à partir de Pimpinella anisum ainsi que le principe actif obtenu. La présente invention concerne aussi l'application cosmétique de ce principe pour la mise en oeuvre d'un mécanisme destiné à lutter contre les rides d'expression 5 du visage. Le visage traduit les émotions par des expressions du visage plus ou moins marquées: sourire, grimace, plissement du front, froncement des sourcils plus ou moins marquées. Ces expressions mettent en mouvement de façon plus ou moins prononcée suivant les personnes, les zones correspondantes du visage. Chaque jour, 15 000 mouvements des muscles du visage induisent des forces de tension modifiant au cours du temps le derme favorisant l'apparition des rides et ridules dites d'expression. On connaît des formules cosmétiques qui visent à lutter contre ces marques de vieillissement en stimulant la synthèse de molécules agissant sur la réorganisation des fibres de collagène et/ou en améliorant le renouvellement cellulaire. Des formules plus récentes agissent directement sur les muscles impliqués dans le contrôle des mouvements des yeux, de la bouche et/ou du nez en recourant à 20 des substances actives sur la communication nerf/muscle. La contraction des muscles fait intervenir différents acteurs: l'acétylcholine, le calcium et l'adénosine triphosphate (ATP). 2863164 2 Le mécanisme de contraction est amorcé par l'influx nerveux qui provoque par un mécanisme complexe de libération successive d'ions calcium, une libération de l'acétylcholine qui induit la libération d'ions sodium et potassium jusqu'à une augmentation soudaine de la concentration en calcium dans le cytoplasme de la cellule musculaire qui favorise l'interaction entre les filaments d'actine et les filaments de myosine responsables de l'hydrolyse de l'ATP qui fournit l'énergie nécessaire à la contraction musculaire. On comprend que pour agir sur les contractions musculaires, les modes d'action sont les suivants: - limiter l'entrée du calcium dans les cellules nerveuses par compétition avec d'autres ions magnésium ou manganèse, et/ou - limiter l'entrée de sodium dans les cellules musculaires et/ou - bloquer la libération de l'acétylcholine et/ou limiter la fixation de l'acétylcholine. La toxine botulique, protéine de poids moléculaire de 150 kl a, est sécrétée par une bactérie Clostridium botulinum. Cette toxine, sous forme purifiée, est utilisée pour diminuer la contractilité des muscles dans le cas de certaines affections. Cette toxine botulique agit en limitant la libération de l'acétylcholine qui est le messager porteur de l'ordre de contraction vers la cellule musculaire. Ce relargage de l'acétylcholine provoque la paralysie temporaire du muscle équivalent à une relaxation. De fait, utilisée en faibles quantités, elle peut diminuer la contraction de certains muscles du visage réduisant ainsi les rides induites par ces muscles. C'est ainsi qu'elle est utilisée pour des applications aux rides du cou du décolleté ainsi que les rides horizontales du front, les rides verticales inter-sourcillières, les rides de la patte d'oie ou du creusement du sillon naso-génien. 2863164 3 Néanmoins, l'application doit être réalisée de façon très précise et malgré cela dans certains cas, il peut se produire des effets secondaires sur certains autres muscles situés à proximité. Dans le cas des rides liées dites de la patte d'oie, à l'angle extérieur des yeux, si 5 la toxine diffuse plus loin le sourcil peut descendre. Dans le cas des rides du lion entre les sourcils, il peut se produire une chute des paupières. Dans certains cas mal dosés, l'injection peut figer l'expression du regard ou du sourire. On peut citer aussi comme effet secondaire des maux de tête persistants. De fait, la présente invention propose un procédé d'obtention d'un actif d'origine naturelle, à partir de Pimpinella anisum, dont l'application en cosmétique favorise la relaxation des muscles d'expression et corrige ainsi les rides induites par les mouvements du visage. Le procédé selon la présente invention est maintenant décrit en détail ainsi que 15 les caractéristiques relatives au principe actif obtenu et les applications concernées. 1/ Procédé d'obtention du principe actif: Le procédé consiste à réaliser la succession d'étapes suivantes: - solubilisation en milieu aqueux de poudre de Pimpinella anisum à raison d'au moins 100 g/l, - hydrolyse(s) enzymatique(s) en présence d'une ou plusieurs enzymes de manière successive ou simultanée, préférentiellement des enzymes de la famille des protéases, - inactivation des enzymes par traitement thermique ou chimique, - séparation des phases soluble et insoluble par décantation, filtration ou centrifugation, et - concentration de la phase active soluble. 2863164 4 2/ Caractéristiques du principe actif obtenu: 2-1/ Taux de matière sèche: La matière sèche est obtenue par passage à l'étuve d'une quantité de matière à l'étuve portée à 105 C jusqu'à obtention d'un poids constant. Le taux de matière sèche est compris entre 10 g/I et 120 g/I plus particulièrement entre 40 g/I et 60 g/I. 2-2/ Détermination du taux des cendres: 10g pesés précisément du principe actif sont placés dans un creuset puis portés à 550 C dans un four électrique en vue de leur calcination. La calcination est poursuivie jusqu'à obtention de cendres blanches. Les cendres après refroidissement dans un dessiccateur sont pesées. La teneur en cendres, exprimées en pourcentage conduit pour le présent principe actif à des valeurs comprises entre 15 % et 25 %. 2-3/ Mesure du pH: Cette mesure est effectuée au moyen de la méthode potentiométrique, à température ambiante. Les valeurs de pH sont comprises entre 3,0 et 7,0 plus particulièrement entre 4,5 et 5,5. 2-4/ Détermination des protéines La teneur en protéines est déterminée par la méthode de LOWRY ( Lowry & al, Protein measurement with folin reagent, Journal Biol. Chem., 193,265). La teneur en protéines de ce principe actif se situe dans des plages de 3 g/l à 36 g/l plus précisément de 10g/l à 18 g/I. 2-5/ Caractérisation des carbohydrates Cette analyse est réalisée par HPLC (High Performance Liquid Chromatography) avant et après hydrolyse acide, le solvant utilisé étant de l'eau. L'analyse est faite à 280 nm. L'analyse des chromatogrammes montre la présence de: 2863164 5 - galactose - glucose, et - fructose 2-6/ Caractérisation des composés phénoliques Cette analyse est également réalisée par HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Par contre, la colonne est différente et on utilise un gradient avec les solvants acétonitrile et une solution d'acide formique à 0,05%, la détection étant effectuée à 280 nm. L'analyse des chromatogrammes montre la présence de: - - composés hydroxycinnamiques, - - flavones 2-7/ Dosage des minéraux Le calcium, le sodium et le potassium ont été dosés dans le principe actif. Les résultats sont le suivants: Calcium mg/l Potassium mg/l Sodium mg/l Principe actif 1200 à 1700 3000 à 4000 500 à 700 3/ Identification de la fraction active du principe actif selon l'invention Dans ce but, on réalise une composition minérale modèle ayant la même composition en minéraux sodium, potassium et calcium que le principe actif selon la présente invention. Cette composition minérale modèle est la suivante: Calcium (CaCl2, 2H20) 1560 mg/l Potassium (KCI) 3250 mg/I Sodium (NaCI) 600 mg/l 2863164 6 On réalise parallèlement une déminéralisation d'un échantillon du principe actif de l'invention. Pour le test on utilise un modèle de co-culture nerf/muscle. Il s'agit de cellules musculaires striées humaines innervées par des expiants de moelle épinière d'embryons de rats. On peut ainsi observer au microscope des contractions spontanées des fibres musculaires. Ces contractions peuvent être comptées pendant un temps donné, induisant ainsi 10 une fréquence. On ajoute le principe actif issu de Pimpinella anisum à raison de 3% de l'invention, sous sa forme déminéralisée, ainsi que la composition minérale modèle, tandis qu'un témoin positif est préparé par ajout de carisoprodol à 10-3M qui présente une activité myorelaxante connue. On compte de nouveau pendant ce même temps la fréquence de contraction pour déterminer le pourcentage d'inhibition des contractions musculaires. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant. Inhibition des contractions (%) Carisoprodol 10-3M 100 Principe actif à 3% naturel 100 Principe actif à 3% déminéralisé 0 Composition minérale modèle 3% 97 Le principe actif déminéralisé ne conduit pas une diminution des contractions musculaires. 2863164 7 Le principe actif à 3% entraîne lui une inhibition des contractions musculaires donc une action décontractante. La composition modèle entraîne une inhibition des contractions musculaires, les minéraux constitutifs du principe actif constituent donc la fraction active 5 4/ Effets du principe actif selon la présente invention: 4-1/ Activité myorelaxante: L'objectif de cet essai est de montrer l'influence du principe actif sur la fréquence des contractions des cellules musculaires. A cet effet, on utilise également un modèle de co-culture nerf/muscle décrit précédemment. On ajoute le principe actif issu de Pimpinella anisum à raison de 1%, 2% ou 3% tandis que le témoin positif est préparé par ajout de carisoprodol qui présente une activité myorelaxante connue. On comptabilise la fréquence des contractions après ajout des ces composés. Les résultats sont regroupés dans le tableau suivant, en pourcentage d'inhibition des contractions musculaires: Inhibition des contractions (%) Témoin avec ajout de carisoprodol à 10-3M 100 Principe actif selon l'invention 1% 27 Principe actif selon l'invention 2% 86 Principe actif selon l'invention 3% 100 On constate que le principe actif présente une action relaxante de 100% à 3%, inhibant ainsi les contractions musculaires. 3-2/ Propriétés anti-rides: 2863164 8 Le test est conduit sur des volontaires présentant pour un premier groupe des rides au niveau de la patte d'oie, pour un deuxième groupe des rides sur la griffe du lion et pour un troisième groupe des rides au niveau du sillon naso- génien, avec une émulsion contenant 4 % de principe actif selon l'invention, contre l'émulsion placebo. On réalise des empreintes avant et après 28 jours de traitement biquotidien. On analyse au moyen d'un prof ilomètre les empreintes et les paramètres observés sont les suivants: - Surface totale ridée (5TR) - Longueur totale des rides (LTR), et - Nombre de rides (NbR) Le test statistique utilisé pour l'analyse des données est le test de Student sur données appariées pour le groupe présentant des rides sur les pattes d'oie et test de Student sur données non appariées pour les 2 autres groupes. STR (%) LTR (%) NDR (%) Rides de la patte d'oie - 40 - 34 -13 Rides de la griffe du lion - 20 - 21 - 18 Rides du sillon naso-génien - 22 - 20 - 17 On constate ainsi que les différents types de rides sont atténués par le traitement du principe actif, dans le cas de ce test introduit à 4% dans une émulsion. Testé in vitro sur un modèle nerf/muscle, le principe actif par sa richesse en minéraux, inhibe les contractions des cellules musculaires. On constate que le principe actif selon l'invention permet d'agir efficacement sur les zones cibles des rides d'expression des pattes d'oie, de la griffe du lion et du sillon naso-génien en diminuant significativement la surface totale ridée, la longueur des rides et le nombre des rides. Le principe actif selon la présente invention permet donc d'agir efficacement contre les rides d'expression du visage et pour ce faire, il peut être introduit dans une composition cosmétique adaptée choisie parmi les gels, les émulsions aqueuse ou grasse, les crèmes, les lotions, à raison de 0,1 à 207.. be préférence, les applications se feront de façon bi-quotidienne. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un principe actif permettant de lutter conter les rides d'expression du visage qui comprend la succession d'étapes suivantes: - solubilisation en milieu aqueux de poudre de Pimpinella anisum à raison d'au moins 100 g/I, - hydrolyse(s) enzymatique(s) en présence d'une ou plusieurs enzymes, de manière successive ou simultanée, préférentiellement des enzymes de la famille des protéases, - inactivation des enzymes par traitement thermique ou chimique - séparation des phases soluble et insoluble par décantation, filtration ou 10 centrifugation, et - concentration de la phase active soluble. 2. Principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé par les paramètres suivants: - taux de matière sèche compris entre 10 g/I et 120 g/I. - détermination du taux de cendres compris entre 15 % et 25 %. - pH compris entre 3,0 et 7,0. - teneur en protéines comprise entre 3 g/I à 36 g/I. - présence de carbohydrates de composés phénoliques et de minéraux. 3. Principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la 20 revendication 1, caractérisé par les paramètres suivants: - taux de matière sèche compris entre 40 g/I et 60 g/I. - détermination du taux de cendres compris entre 15 % et 25 %. - pH compris entre 4,5 et 5,5. - teneur en protéines comprise entre 10g/I et 18 g/I. - présence de carbohydrates sous forme de galactose, glucose et fructose. 2863164 11 - présence des composés phénoliques suivants: composés hydroxycinnamiques, f lavones. - minéraux présents sous forme de calcium entre 1200 et 1700 mg/l, de sodium entre 500 et 700 mg/I et potassium entre 3000 et 4000 mg/I. 4. Composition incluant de 0,1 à 20 % de principe actif selon la revendication 2 ou 3 dans une formulation galénique adaptée choisie parmi les gels, les émulsions aqueuse ou grasse, les crèmes, les lotions. 5. Utilisation de la composition selon la revendication 4 pour inhiber les contractions musculaires du visage afin de lutter contre les rides d'expression. 6. Utilisation de la composition selon la revendication 4 pour favoriser la relaxation des cellules musculaires