FR 2864089 A1 20050624 FR 0314988 A 20031219 2864089 1 DERIVES CARBOXY-REDUITS DE LA CHONDROÏTINE SULFATE, LEUR PREPARATION, LEUR APPLICATION COMME MEDICAMENT ET LES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES RENFERMANT La présente invention concerne de nouveaux Glycosaminoglycanes ainsi que leurs sels d'addition pharmaceutiquement acceptable et plus précisemment des dérivés carboxy-réduits et chemiosélectivement O-sulfatés de la Chondroïtine sulfate, isolés ou en mélange, leur application à titre de médicament et les compositions pharmaceutiques les contenant. Les Glycoaminoglycanes (GAGs) sont essentiellement formés de motifs alternés acide uronique-sucre aminé (ou l'inverse), du type de ceux rencontrés dans les chaînes oligo ou polysaccharidiques de GAGs naturels biologiquement actifs comme l'héparine, l'heparanesulfate, le dermatansulfate, les chondroitines, les chondroitines sulfates ou l'acide Hyaluronique. Les motifs acides uronique répondent plus spécialement à la structure acide D-glucoronique ou L-iduronique et les 20 motifs sucres aminés à celle de la D-galactosamine. Les GAGs naturels présentent des activités thérapeutiques en tant qu'inhibiteurs de la Thrombine. Ils présentent donc une activité antithrombotique et anticoagulante et sont utilisés dans les pathologies cardiovasculaires dans lesquelles il y a un risque de thrombose. Des dérivés sulfatés de la Chondroltine sulfate sont décrits pour leurs propriétés anticoagulantes dans la demande de brevet FR2584728. Par ailleurs, des dérivés O-persulfatés de la Chondroïtine sulfate ont été décrits et étudiés pour 2864089 2 leurs propriétés dans l'arthrite rhumatoïde dans la demande internationale W09213541-Al. La demanderesse a mis au point un nouveau procédé mettant en uvre une étape de carboxy-réduction et une étape de sulfatation permettant d'obtenir de nouveaux dérivés de la Chondroïtine sulfate présentant des propriétés avantageuses permettant de traiter ou de prévenir des désordres qui affichent une activité accrue d'au moins une des métalloprotéinases de matrice. Les dérivés carboxy-réduits et chemiosélectivement O-sulfatés de la Chondroïtine sulfate de formule (I) possèdent une structure polymérique très régulière avec des degrés de pureté de l'ordre de 90 %. Il en résulte des propriétés biologiques reproductibles et inattendues. Dans l'état pathologique de l'ostéoarthrose, la dégradation de l'aggrécan, le protéoglycane principal du cartilage articulaire, représente un événement très précoce et crucial. La perte pathologique de l'aggrécan est provoquée par des clivages protéolytiques dans son domaine interglobulaire. Les analyses de séquences d'acides aminés des métabolites de protéoglycanes isolés à partir du liquide synovial des patients souffrant de dommages articulaires, d'ostéoarthrose ou de désordre inflammatoire des articulations, ont montré qu'il existe un clivage protéolytique entre les acides aminés Glu373 et A1a374 dans le domaine interglobulaire de l'aggrécan humain (Lohmander, et al., Arthritis Rheum., 36. 1214- 1222 (1993)). L'activité protéolytique responsable de ce clivage est dénommée "aggrécanase" et peut être attribuée à la superfamille des métalloprotéinases (MP) ou métalloprotéinases de matrice (MMP). Le zinc est un élément essentiel dans le centre catalytiquement actif des métalloprotéinases. Les MMP 2864089 3 clivent le collagène, la laminine, les protéoglycanes, l'élastine ou la gélatine dans des conditions physiologiques. Donc, elles jouent un rôle important dans le tissu osseux et conjonctif. Un grand nombre de différents inhibiteurs des MMP sont connus (voir, par exemple, EP 0 606 046 WO94/28889). Toutefois, les inhibiteurs connus des MMP ont fréquemment un désavantage significatif. Ils manquent de spécificité pour toute classe particulière de MMP. Au contraire, la plupart des inhibiteurs de MMP inhibent simultanément une pluralité de MMP. Par conséquent, il existe un besoin d'inhibiteurs de MMP ayant des spécificités plus étroitement définies afin de mieux traiter ou de prévenir des désordres spécifiques. L'invention a tout particulièrement pour objet les dérivés carboxyréduits et sulfaté de la Chondroïtine sulfate de formule (I) : dans laquelle R1, R2, R3 et R4 identiques ou différents, représentent H ou SO3M, étant entendu que l'un au moins des substituants R1, R2, R3 et R4 représente un groupement SO3M, n est un entier compris entre 0 et 200, M est un métal alcalin, les dits dérivés étant sous la forme d'un composé isolé ou sous forme de mélanges, ainsi que leurs diastéréoisomères. 2864089 4 En particulier, l'invention a pour objet les dérivés carboxyréduits de la Chondroitine sulfate selon la formule (I) caractérisé en ce que le M est choisi parmi sodium, calcium, magnésium et potassium et en particulier Sodium. De préférence, dans la formule (I), n est un entier compris entre 100 et 200. L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés carboxyréduits de la chondroïtine sulfate tels que décrits plus haut caractérisés en ce que R1, R2, R3 et R4 représentent SO3Na. L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés carboxyréduits de la chondroïtine sulfate tels que décrits plus haut caractérisés en ce que R1i R2 et R4 représentent SO3Na et R3 représente H L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés carboxy- réduits de la chondroïtine sulfate tels que décrits plus haut caractérisés en ce que R1 représente H ou SO3Na, R2 représente SO3Na et R3 et R4 représentent H. L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés carboxy-réduits de la chondroïtine sulfate tels que décrits plus haut caractérisés en ce que R1 représente H ou SO3Na, R2 et R3 représentent SO3Na et R4 représente H. Ces polysaccharides comportent ainsi un nombre pair de 25 saccharides. De manière générale, les mélanges de polysaccharides selon l'invention peuvent être préparés d'une part par carboxy-réduction de la chondroïtine sulfate ou de ses dérivés, suivie d'une sulfatation chemiosélective ou inversement par sulfatation suivie d'une carboxyréduction. 2864089 5 L'invention a donc pour objet le procédé de préparation des dérivés carboxy-réduits et sulfatés de la chondroïtine sulfate tels que définis plus haut mettant en oeuvre les étapes suivantes: -Carboxy-réduction de la chondroïtine sulfate - Soit a) au moyen d'un dérivé de carbodidiimide pour former un adduit activé) et en présence d'un agent réducteur, - Soit b)par estérification, la chondroïtine sulfate ayant le cas échéant été préalablement transsalifiée par un sel d'ammonium quaternaire, suivie d'une réduction du dérivé intermédiaire d'ester correspondant par action d'un agent réducteur, - Le cas échéant trans-salification du dérivé carboxy-15 réduit par un sel d'ammonium quaternaire, - Sulfatation en milieu organique suivie d'une salification, Le schéma réactionnel suivant illustre la présente invention: 1- EDCI I H2O 2- NaBH, R1= H, R2 = SO3Na ou R1= SO3Na, R2 = H R1 = H, R2 = SO,Na ou R1 = SO3Na, R2 = H Chondroitine sulfate Sel de Sodium R1 = H, R2 = SO3Na ou R1 = SO3Na, R2 = H 1- Py-S03/ DMF 2- AcONa / McOH R1= H, R2 = S03Hy ou R1= S03Hy, R2 = H Dérivés Carboxy- réduits et O-sulfatés de la Chondroitine Sulfate De manière alternative, les dérivés carboxy-réduits chemiosélectivement O-sulfatés de la chondroïtine sulfate peuvent être obtenus par sulfatation d'un sel d'ammonium quaternaire de la chondroïtine sulfate en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la trimethylamine, suivie d'une carboxy-réduction au moyen d'un dérivé de carbodiimide tel que le chlorhydrate de 1- (3-diméthyl aminopropyl)-3-éthylcarbodiimide en présence d'un agent réducteur tel que le borohydrure de sodium ou au moyen d'un dérivé ester, tel que l'ester de méthyle, en présence d'un agent réducteur tel que le borohydrure de sodium. 2864089 7 Le dérivé persulfaté ou 6 O-sulfaté carboxy-réduit de la chondroïtine sulfate peut ensuite être trans-salifié par un sel d'ammonium quaternaire puis éventuellement sulfaté sur la fonction hydroxy en position 6' ainsi générée par action d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la trimethylamine. L'invention a donc également pour objet un procédé de préparation des dérivés carboxy-réduits de la chondroïtine sulfate tels que définis plus haut en mettant en oeuvre successivement les étapes suivantes: Trans-salification de la chondroïtine sulfate par un sel d'ammonium quaternaire, - Sulfatation en milieu organique suivie d'une salification, - Carboxyréduction de la chondroïtine sulfate persulfatée - Soit a) au moyen d'un dérivé de carbodiimide ( pour former un adduit activé) en présence d'un agent réducteur, - Soit b) par estérification, la chondroïtine sulfate persulfatée ayant le cas échéant été préalablement trans-salifiée par un sel d'ammonium quaternaire, puis réduction du dérivé intermédiaire d'ester correspondant par action d'un agent réducteur, - Le cas échéant trans-salification du dérivé persulfaté carboxyréduit par un sel d'ammonium quaternaire puis resulfatation suivie d'une salification. Le schèma réactionnel suivant illustre la présente invention: R1 = H, R2 = SO3Na ou R1 = SO3Na, R2 = H Chondroitine Sulfate Sel de Sodium Transsalification Chlorure de benzethonium OH OH R1 = H, R2 = SO3Hy ou R1 = SO3Hy, R2 = H 1- EDCI / H20 2- NaBH4 OH COONa ^-- Na 0 OSO, OSO,N OSO,Nr NHAc OH Chondroitine O-sulfaté Carboxy-réduite OSO,Na Na Trans-salification Chlorure de benzethonium OH OH Chondroitine carboxy-réduite Persulfatée Les procédés selon la présente invention sont caractérisés par la forte chemiosélectivité des réactions de carboxy-réduction et de sulfatation. Les produits qui en résultent sont remarquablement homogènes et conduisent 2864089 9 à des polymères vrais. Les dérivés de la chondroïtine sulfate carboxy- réduite possèdent des puretés de l'ordre de 90%. Cette homogéneité est déterminée par analyse structurale RMN et Infrarouge. Il en résulte des propriétés biologiques reproductibles et inattendues. Les réactions de persulfatation s'effectuent de préférence en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine. Elles sont suivies en général par une réaction de salification par exemple par action d'acétate de sodium. De manière générale, le dérivé carboxy-reduit ou non de la chondroïtine sulfate peut être trans-salifié par un sel d'ammonium quaternaire puis chémiosélectivement O-sulfaté sur les positions hydroxyle 6 et 6' uniquement ou persulfaté par réaction avec un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la trimethylamine Pour une chemiosélectivité optimale des réactions de persulfatation du chondroïtine Sulfate Carboxy-réduite ou non, il est préférable de mettre en oeuvre un sel de benzéthonium en présence de 10 à 30 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique par fonction hydroxyle à sulfater. Pour la même raison, les réactions doivent être réalisées préférentiellement à des températures comprises entre -15 et 70 C. Lors de la persulfatation du sel de benzéthonium de la chondroïtine sulfate carboxy-réduite ( composé de formule (I) avec R1=H / R2=SO3Na ou R1=SO3Na / R2=H et R3=R4=H), on opère de préférence à des températures comprises entre 50 et 70 C. Ceci est illustré à l'exemple 1. 2864089 10 Pour une chemiosélectivité optimale de la 6, 6' 0-sulfatation de la chondroïtine sulfate carboxy-réduite, sel de benzéthonium ( composé de formule (I) avec R1=H / R2=SO3Na ou R1=SO3Na / R2=H et R3=R4=H), on opère en présence de 5 à 15 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique, à des températures comprises entre -15 et 5 C. Ceci est illustré à l'exemple 2. La persulfatation de la Chondroïtine Sulfate sel de Benzéthonium, s'effectue quant à elle a des températures comprises entre 50 et 70 C. Ceci est illustré à l'exemple 3. De même, pour une chemiosélectivité optimale de la 6-0 sulfatation de la Chondroïtine Sulfate, sel de benzéthonium, il est préférable de travailler en présence de 5 à 15 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique, à des températures comprises entre -15 et 5 C. Encore plus préférentiellement, il faut travailler en présence d'environ 10 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique à une température voisine de 0 C. Ceci est illustré à l'exemple 4. Lors de la (re)sulfatation du dérivé persulfaté carboxyreduit, sel de benzéthonium de la chondroïtine sulfate composé de formule (I) avec R1=R2=R4=SO3Na et R3=H), on opère de préférence en présence de 10 à 30 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique, à des températures voisines de 20 C. Ceci est illustré à l'exemple 5. Pour une chemiosélectivité optimale de la 6'-O sulfatation de la chondroïtine sulfate 6-0 sulfatée carboxy-réduite, sel de benzéthonium ( composé de formule (I) avec R1=H/SO3Na R2=SO3Na et R3=R4=H), il est préférable de travailler en présence de 5 à 15 2864089 11 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique, à des températures comprises entre -15 et 5 C. Encore plus préférentiellement, il faut travailler en présence d'environ 10 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique à une température voisine de -10 C. Ceci est illustré à l'exemple 6. Les dérivés carboxy-réduits de chondroïtine sulfate peuvent être obtenus par carboxy-réduction de la chondroïtine sulfate ou de ses dérivés, selon les conditions opératoires décrites par exemple par R. L. Taylor et H. E. Conrad, Biochemistry, 11 (8), 1383-1388, (1972). La chondroïtine sulfate est mise en réaction avec un dérivé de carbodiimide soluble en phase aqueuse tel que le chlorhydrate de 1-(3-diméthyl aminopropyl)-3éthylcarbodiimide pour former un adduit activé qui est réduit par un agent réducteur tel que le borohydrure de sodium. Par dérivés de la chondroïtine sulfate, on entend en particulier la chondroïtine sulfate sel de sodium, le sel de benzéthonium de la chondroïtine sulfate, les dérivés sulfatés de la chondroïtine sulfate, ainsi que les dérivés sulfatés sels de benzéthonium de la chondroïtine sulfate. Selon une méthode alternative, les dérivés carboxy- réduits de la chondroïtine sulfate peuvent également être obtenus par carboxy-réduction d'un ester de chondroïtine sulfate ou de ses dérivés chémiosélectivement O-sulfatés. A titre d'exemple, on peut utiliser des esters méthyliques de chondroïtine sulfate ou de ses dérivés chémiosélectivement O-sulfatés et les réduire au moyen d'un agent réducteur tel que le borohydrure de sodium. 2864089 12 La réaction avec le dérivé carbodiimide est réalisée préférentiellement en présence de 5 à 20 équivalents de réactif et à un pH compris entre 4 et 5. Encore plus préférentiellement, la réaction avec le dérivé carbodiimide est réalisée en présence de 7 à 13 équivalents de réactif et à un pH compris entre 4,3 et 4,9. La réduction proprement dite est réalisée par un agent de réduction connu de l'homme du métier et en particulier avec un borohydrure de métal alcalin. A titre d'exemple, il est possible d'utiliser le borohydrure de sodium. La réduction proprement dite de l'adduit activé du dérivé de la chondroïtine sulfate est réalisée avec 10 à 300 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 70 C. Plus préférentiellement, la réduction de l'adduit sus mentionné est réalisée en présence de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 30 C. Tout particulièrement, l'invention a pour objet le procédé mettant en oeuvre les étapes suivantes: - soit a) Carboxy-réduction de la chondroïtine sulfate sel de sodium au moyen du chlorhydrate de 1-(3diméthyl aminopropyl)-3-éthylcarbodiimide en présence 25 du borohydrure de sodium, - soit b) estérification par action du iodure de méthyle sur le dérivé de la chondroïtine sulfate préalablement trans-salifié par le chlorure de Benzéthonium puis réduction du dérivé ester méthylique correspondant par le borohydrure de sodium puis, 2864089 13 Trans-salification du dérivé carboxy-réduit par le chlorure de Benzéthonium - Sulfatation du sel de benzéthonium de la chondroïtine sulfate en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine, suivie d'une salification par l'acétate de sodium. Alternativement l'invention a tout particulièrement pour objet le procédé mettant en oeuvre les étapes suivantes: - Trans-salification de la chondroïtine sulfate sel de sodium par le chlorure de Benzéthonium, Sulfatation du sel de Benzéthonium de la Chondroïtine sulfate en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine, suivie d'une salification par l'acétate de sodium puis, - soit a) Carboxy-réduction de la chondroïtine sulfate au moyen du chlorhydrate de 1-(3-diméthyl aminopropyl)-3- éthylcarbodiimide en présence du borohydrure de sodium, soit b) estérification par action du iodure de méthyle sur la Chondroïtine Sulfate préalablement trans-salifiée par le chlorure de Benzéthonium puis réduction du dérivé ester méthylique correspondant par le borohydrure de sodium, - puis, le cas échéant trans-salification du dérivé persulfaté carboxy- réduit par le chlorure de benzéthonium puis resulfatation par le complexe d'anhydride sulfurique - base organique suivie d'une salification par l'acétate de sodium. 2864089 14 Au cas où l'on désire obtenir des dérivés isolés à partir du mélange de dérivés carboxy-réduits de la chondroitine sulfate tels qu'obtenus selon le procédé décrit plus haut, le procédé suivant doit ensuite être appliqué au mélange: - Fractionnement du mélange par chromatographie sur des colonnes remplies de gel de type polyacrylamide agarose ou un gel de polyacrylamide. Le mélange est élué par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium. De préférence, la solution d'hydrogénocarbonate de sodium est une solution de 0,1 à 1 mole/l. Encore plus préférentiellement, la séparation est réalisée à une concentration de 1 mole/l. La détection est réalisée par réfractometrie. L'invention a également pour objet les dérivés carboxyréduits et chemiosélectivement O-sulfatés de la chondroltine sulfate, isolés ou en mélange tels que définis plus haut susceptibles d'être obtenus selon le ou les procédés tels que définis précédemment. Les polysaccharides de formule (I), isolés ou en mélanges sont utilisables à titre de médicaments. Ces polysaccharides présentent en particulier une forte activité inhibitrice de certaines métalloproteases de matrice. Ces inhibiteurs sont particulièrement indiqués pour le traitement d'états pathologiques où une forte augmentation de l'activité des métalloproteinases de matrice est constatée. Les états pathologiques auxquels la présente invention fait référence implique une augmentation de l'activité d'au moins une des métalloproteinases de matrice 2864089 15 suivante: la neutrophile élastase, la Matrisilyne (MMP-7), l'aggrecanase, l'hADAMTSl et la gélatinase A (MMP-2). Les composés peuvent donc être utilisés, pour la prévention et le traitement de maladies telles que les désordres joint dégénératifs (tels que l'ostéoarthrose), les spondyloses, les chondrolyse associéees avec les joint Trauma ou les immobilisations prolongées jointes (souvent suite à une blessure du ménisque ou patellar ou les ruptures de ligaments), les désordres liés à des blessures (healing), les désordres periodontique, les désordres chronique du système locomoteur ( tels que arthritides chronique ou aigues inflammatoires, immunologique ou du métabolisme), les arthropathies, ou les désordres liés au métabolisme osseux. L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques renfermant les composés de formule (I) isolés ou en mélange ainsi qu'un ou plusieurs excipients, véhicule ou additifs pharmaceutiquement acceptable. Un autre aspect de l'invention est un procédé de préparation des compositions pharmaceutiques renfermant les composés de formule (I) caractérisés en ce qu'on mélange une quantité correspondant à un dosage désiré d'un composé de formule (I) avec un ou plusieurs excipients, véhicule additifs pharmaceutiquement acceptable. Les composés de formule (I) peuvent être administrés par différente voie. Elles peuvent inclure sans être limité aux injections par voie subcutanée, intraarticulaire, intrapéritonée ou intraveineuse. L'administration peut également être rectale, orale, par inhalation, ou encore par voie transdermique. Dans le cas de solutions pour injection (par exemple sous forme d'ampoule) , les doses peuvent s'échelonner de 5 gg à environ 200 mg de composé de formule (I) et de préférence de 10 gg à 40 mg. Le dosage quotidien indiqué pour le traitement d'un patient adulte d'environ 70 kg est de 10 gg à 500 mg d' ingrédients actifs généralement de 20 mg à environ 100 mg. Cependant selon les circonstances des doses quotidiennes plus hautes ou plus basses peuvent être appropriées. Ces doses peuvent être administrées une fois par jour sous la forme d'une seule unité de dosage. Alternativement, les doses peuvent être administrées dans une pluralité de doses plus petites données de manière 15 répétées à des intervalles définis au cours du temps. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Chondroïtine Sulfate La chondroïtine sulfate utilisée pour la préparation des composés illustrant cette invention présente une masse moléculaire de 85,2 kDalton. Elle est produite à partir de cartilage de poisson, et est constituée par un mélange de chondroïtine A et chondroïtine C dans des proportions 50 / 50. Sa structure chimique peut être décrite par la formule (I) avec les groupements R1 = SO3M et R2 = R3 = R4 =H ou RI = H, R2 = S03M, R3 = R4 = H. EXEMPLE 1: Préparation de la chondroïtine sulfate carboxyréduite et persulfatée, sel de sodium (Composés de formule (I) avec les groupements R1 = R2 = R3 = R4 = SO3Na) OH NHAC OH HAc R1 = H, R2 = SO3Na ou R1 = SO3Na, R2 = H OH R1 = H, R2 = SO3Na ou R1 = SO3Na, R2 = H 1- EDCI / H20 2- NaBH4 R1 = H, R2 = SO3Na ou R1 = SO3Na, R2 = H Trans- salification Chlorure de benzethonium OH 1- Py-S03/ DMF 2- AcONa / MCOH OH NHAC OH HAc _n R1 = H, R2 = SO,Hy ou R1 = SO,Hy, R2 = H OH - a) Preparation de la chondroïtine sulfate carboxyréduite, sel de sodium A une température voisine de 20 C, 1 g de chondroïtine sulfate, sel de sodium sont mis en solution dans 150 ml d'eau. Le pH de la solution est ajusté à une valeur de 4,7 0,1 par addition d'une solution d'acide chlorhydrique 0,1 N. 3,45 g de chhorhydrate de 1-éthyl-3(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide sont ajoutés et le mélange obtenu est agité en maintenant le pH à une valeur de 4,7 0,1 par addition d'une solution d'acide chlorhydrique 0,1 N. Lorsque le pH est stabilisé à une valeur voisine de 4,7, 1,8 g de borohydrure de sodium sont ajoutés par petites portions. Le milieu réactionnel 2864089 18 est agité environ 20 heures à une température voisine de 20 C. Après refroidissement à une température voisine de 10 C, le milieu réactionnel est neutralisé par addition d'acide chlorhydrique concentré (10 N) à un pH voisin de 7. 600 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol sont ajoutés. Le solide obtenu est filtré, puis dissout dans 50 ml d'eau. 150 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le méthanol sont ajoutés à la solution obtenue. Le solide obtenu est filtré, puis dissout dans 50 ml d'eau. La solution obtenue est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 26 heures. Le contenu des membranes est lyophilisé pour fournir 0,682g de chondroïtine sulfate carboxy-réduite, sel de sodium sous forme d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est de 73 %. Spectre proton dans D20, 400 MHz, T = 333 K (8 en ppm - Mélange des chondroïtines A et C) : 2,0 (3H, s), 3,30 (1H, m), entre 3,4 et 3,65 (4H, m), entre 3,7 et 4,05 (3H + 1/2H, m), 4,18 (2H, s), entre 4,4 et 4,6 (2H, m), 4,81 (1/2H, s). - b) Preparation de la chondroitine sulfate carboxyréduite, sel de benzéthonium Une solution de 1,6 g de chlorure de benzéthonium dans 12 ml d'eau est ajoutée à la solution de 0,685 g de chondroïtine sulfate carboxy-réduite, sel de sodium dans 10 ml d'eau. La suspension obtenue est filtrée. Le gateau est lavé à l'eau puis séché à 40 C sous pression réduite (6 kPa) pour fournir 1,25 g de chondroitine sulfate carboxyréduite, sel de benzéthonium sous forme d'un solide crème. Le rendement obtenu est de 96 %. 2864089 19 - c) Preparation de la chondroltine sulfate carboxyréduite et persulfatée, sel de sodium A une température voisine de 60 C et sous atmosphère inerte, 0,2 g de chondroïtine sulfate carboxy-réduite, sel de benzéthonium sont mis en solution dans 6 ml de diméthylformamide anhydre. Après dissolution totale, une solution de 2,08 g de complexe pyridine anhydride sulfurique dans 15 ml de diméthylformamide anhydre est ajoutée à la solution précédente. Après 1 heure 30 d'agitation à une température voisine de 60 C, le milieu réactionnel est refroidi à une température voisine de 10 C. 6 ml d'eau, puis 90 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le méthanol sont ajoutés. La suspension obtenue est filtrée. Le gâteau est dissout dans 30 ml d'eau puis précipité par addition de 90 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le méthanol. La suspension obtenue est filtrée. Le gâteau est lavé par du méthanol (2 fois 5 ml) puis dissout dans 50 ml d'eau. La solution obtenue est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 30 heures. Le contenu de la membrane est lyophilisé pour fournir 0,148 g de chondroitine sulfate carboxy-réduite et persulfatée, sel de sodium sous forme d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est de 74 %. Spectre proton dans D20, 400 MHz, T = 298 K (8 en ppm - Mélange des chondroitines A et C) : 2,05 (3H, s), 3,85 (1H, m), entre 3,92 et 4,05 (3H, m), entre 4,12 et 4,3 (5H, m), 4,58 (1H, s), 4,65 (1H, s), 4,75 (1H, m), 4,95 (1H, s), 5,0 (1H, s). EXEMPLE 2: Préparation de la chondroïtine sulfate carboxy-réduite et 6, 6' 0-sulfatée, sel de sodium ( Composés de formule (I) avec les groupements R1 = H I SO3NaR2=R3=SO3NaetR4=H) 1-EDCl/H,0 OH -2- NaBH4 OH OH NHAc OH n HAc R1 = H, R2 = SO3Na ou R1 = SO3Na, R2 = H R1 = H, R2 = SO3Na ou R1 = SO3Na, R2 = H R1 = H, R2 = SO3Na ou R1 = SO3Na, R2 = H R1 = H, R2 = S03Hy ou R1 = S03Hy, R2 = H Trans-salification Chlorure de benzethonium OH OH NHAC OH NHAc _n R1 = H, R2 = SO3Hy ou R1 = SO3Hy, R2 = H 1- PySO3 / DMF 2- AcONa / MoOH OSO,Na OSO'Na OSO,Na OH NHAC OH HAc R1 = H ou SO3Na OH - a) Preparation de la chondroïtine sulfate carboxyréduite, sel de sodium. La chondroïtine sulfate carboxy-réduite, sel de sodium est préparée selon l'exemple 1-a. - b) Preparation de la chondroïtine sulfate carboxy-10 réduite, sel de benzéthonium. La chondroïtine sulfate carboxy-réduite, sel de benzéthonium est préparéeselon l'exemple 1-b. - c) Preparation de la chondroïtine sulfate carboxyréduite et 6, 6' Osulfatée, sel de sodium A une température voisine de 20 C et sous atmosphère inerte, 0,13 g de chondroïtine sulfate carboxy-réduite, 2864089 21 sel de benzéthonium sont mis en solution dans 10 ml de diméthylformamide anhydre. Après dissolution totale, une solution de 0,2 g de complexe pyridine anhydride sulfurique dans 5 ml de diméthylformamide anhydre est ajoutée à la solution précédente, à une température voisine de -10 C. Après 2 heures 30 d'agitation à une température voisine de -10 C, 2 ml d'eau, puis 60 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée 30 minutes, laissée à sédimenter une nuit puis filtrée. Le gâteau est lavé par 5 ml de méthanol, dissout dans 20 ml d'eau puis précipité par addition de 60 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le méthanol. La suspension obtenue est filtrée. Le gâteau est lavé par du méthanol (2 fois 5 ml) puis dissout dans 10 ml d'eau. La solution obtenue est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 5 jours. Le contenu de la membrane est lyophilisé pour fournir 0,074 g de chondroïtine sulfate carboxy-réduite et 6,6' O-sulfatée, sel de sodium sous forme d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est de 83 %. Spectre proton dans D20, 400 MHz, T = 333 K (S en ppm - Mélange de 4 chondroîtines, sulfatées ou non en C4 (Gal 2N6S), épimérisée ou non en C5 (G1u6S)) . 2,0 (3H, s), 3,30 (1H, m), entre 3,5 et 4,25 (11H, m), entre 4,4 et 4,7 (2H, m), entre 4,75 et 4,92 (1/2H). EXEMPLE 3: Préparation de la chondroïtine sulfate persulfatée carboxyréduite, sel de sodium ( Composés de Formule (I) avec les groupements R1 = R2 = R4 = SO3Na et R3 = H) Trans-salification COOHy Chlorure de benzéthonium O OH R1 = H, R2 = SO3Na ou RI = SO3Na, R2 = H R1 = H, R2 = S03Hy ou R1 = SO3Hy, R2 = H OH 1- Py-S03 / DMF 2-AcONa/MeOH OH OSO,N n NHAc OH R1 = H, R2 = SO3Hy ou R1 = S03Hy, R2 = H OH - a) Preparation de la chondroïtine sulfate, sel de benzéthonium Une solution de 113 g de chlorure de benzéthonium dans 560 ml d'eau est ajoutée à la solution de 50 g de chondroïtine sulfate, sel de sodium dans 715 ml d'eau. La suspension obtenue est agitée pendant 1 heure à une température voisine de 20 C puis laissée à sédimenter pendant une nuit. Le surnageant est éliminé par décantation puis remplacé par le même volume d'eau. La suspension est de nouveau agitée pendant une heure puis laissée à sédimenter. L'opération décrite précédemment est répétée 3 fois. La suspension est ensuite filtrée. Le gâteau est lavé à l'eau puis séché à 40 C sous pression réduite (6 kPa) pour fournir 123,4 g de chondroïtine sulfate, sel de benzéthonium sous forme d'un solide blanc. Le rendement obtenu est de 94 %. - b) Preparation de la chondroïtine sulfate persulfatée, sel de sodium 2864089 23 A une température voisine de 60 C et sous atmosphère inerte, 5 g de chondroïtine sulfate, sel de benzéthonium sont mis en solution dans 100 ml de diméthylformamide anhydre. Après dissolution totale, une solution de 26,5 g de complexe pyridine anhydride sulfurique dans 250 ml de diméthylformamide anhydre est ajoutée à la solution précédente. Après 1 heure 30 d'agitation à une température voisine de 60 C, le milieu réactionnel est refroidi à une température voisine de 10 C. 100 ml d'eau, puis 1350 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le méthanol sont ajoutés. La suspension obtenue est filtrée. Le gâteau est lavé par du méthanol (50 ml), dissout dans 400 ml d'eau puis précipité par addition de 1200 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol. La suspension obtenue est filtrée. Le gâteau est lavé par du méthanol (20 ml) puis dissout dans 200 ml d'eau. La solution obtenue est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 4 jours. Le contenu de la membrane est lyophilisé pour fournir 2 g de chondroïtine sulfate persulfatée, sel de sodium sous forme d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est de 66 %. Spectre proton dans D20, 400 MHz, T = 298 K (8 en ppm - Mélange des chondroitines A et C) . 2,05 (3H, s), 4,0 (3H, m), 4,1 (1H, s) , 4,23 (2H, m), 4,4 (2H, m), 4,7 (1H, m), 4,82 (1H, d, J=3Hz), 4,87 (1H, s), 4,95 (1H, s). - c) Preparation de la chondroïtine sulfate persulfatée carboxy-réduite, sel de sodium A une température voisine de 20 C, 0,5 g de chondroïtine sulfate persulfatée, sel de sodium sont mis en solution dans 45 ml d'eau. Le pH de la solution est ajusté à une 2864089 24 valeur de 4,7 0,1 par addition d'une solution d'acide chlorhydrique 0,1 N. 1,1 g de chhorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide sont ajoutés et le mélange obtenu est agité en maintenant le pH à une valeur de 4,7 0,1 par addition d'une solution d'acide chlorhydrique 0,1 N. Lorsque le pH est stabilisé à une valeur voisine de 4,7, 4,44 g de borohydrure de sodium sont ajoutés par petites portions. Le milieu réactionnel est agité pendant environ 20 heures à une température voisine de 20 C. Après refroidissement à une température voisine de 10 C, le milieu réactionnel est neutralisé par addition d'acide chlorhydrique concentré (10 N) à un pH voisin de 7. Le milieu réactionnel est chargé dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mis en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 65 heures. 600 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le méthanol sont ajoutés au contenu des membranes. Le solide obtenu est filtré, puis dissout dans 200 ml d'eau. La solution obtenue est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 28 heures. Le contenu des membranes est lyophilisé pour fournir 0,28 g de chondroïtine sulfate persulfatée carboxy-réduite, sel de sodium sous forme d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est de 59 %. Spectre proton dans D20, 400 MHz, T = 323 K (5 en ppm - Mélange des chondroitines A et C) : 2,0 (3H, s), 3,65 (3H, m), 3,89 (3H, m), 3,96 (1H, m), 4,05 (1H, s), 4,2 (2H, s), 4,7 (2H, m), 4,89 (1H, s), 4,93 (1H, s). EXEMPLE 4: Préparation de la chondroïtine sulfate 6 0-sulfatée carboxyréduite, sel de sodium ( Composés de 2864089 25 Formule (I) avec les groupements RI = H / SO3Na R2 = SO3Na et R3 = R4 =H) Trans-salification Chlorure de benzethonium RI = H, R2 = SO3Na ou RI = SO3Na, R2 = H RI = H, R2 = S03Hy ou R1 = SO3Hy, R2 = H OH R1 = H, R2 = SO3Hy ou RI = SO3Hy, R2 = H R1 = H ou SO3Na OH 1- EDCI 1 H2O 2- NaBH4 R1 = H ou SO3Na OH R1 = H ou SO3Na OH - a) Preparation de la chondroïtine sulfate, sel de 5 benzéthonium La chondroïtine sulfate, sel de benzéthonium est préparée selon l'exemple 3a. - b) Preparation de la chondroïtine sulfate 6 O-sulfatée, sel de sodium A une température voisine de 0 C et sous atmosphère inerte, 10 g de chondroïtine sulfate, sel de benzéthonium sont mis en solution dans 200 ml de diméthylformamide anhydre. Après dissolution totale, une solution de 10,6 g de complexe pyridine anhydride sulfurique dans 100 ml de diméthylformamide anhydre est ajoutée à la solution précédente. Après 2 heure 30 d'agitation à une température voisine de 0 C, 150 ml d'eau, puis 1600 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le méthanol 2864089 26 sont ajoutés. La suspension obtenue est filtrée. Le gâteau est dissout dans 500 ml d'eau puis précipité par addition de 1500 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le méthanol. La suspension obtenue est filtrée. Le gâteau est lavé par du méthanol (20 ml) puis dissout dans 200 ml d'eau. La solution obtenue est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 24 heures. Le contenu de la membrane est lyophilisé pour fournir 2,89 g de chondroïtine sulfate 6 0-sulfatée, sel de sodium sous forme d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est de 69 %. Spectre proton dans D20, 400 MHz, T = 323 K (S en ppm - Mélange des chondroïtines A et C) : 2,0 (3H, s), 3,35 (1H, m), 3,55 (1H, m), entre 3,62 et 4,38 (3H + 1/2H, m), entre 3,4 et 4,1 (2H, m), 4,2 (2H, m), 4,45 (1H, m), 4,55 (1H, m), 4,78 (1/2H, s). - c) Preparation de la chondroïtine sulfate 6 O-sulfatée 20 carboxyréduite, sel de sodium A une température voisine de 20 C, 2 g de chondroïtine sulfate 6 0-sulfatée, sel de sodium sont mis en solution dans 250 ml d'eau. Le pH de la solution est ajusté à une valeur de 4,7 0,1 par addition d'une solution d'acide chlorhydrique 0,1 N. 6,5 g de chhorhydrate de 1- éthyl - 3 - (3-diméthylaminopropyl)carbodiimide sont ajoutés et le mélange obtenu est agité en maintenant le pH à une valeur de 4,7 0,1 par addition d'une solution d'acide chlorhydrique 0,1 N. Lorsque le pH est stabilisé à une valeur voisine de 4,7, 25,8 g de borohydrure de sodium sont ajoutés par petites portions. Le milieu réactionnel est agité pendant environ 20 heures à une température 2864089 27 voisine de 20 C. Après refroidissement à une température voisine de 10 C, le milieu réactionnel est neutralisé par addition d'acide chlorhydrique concentré (10 N) à un pH voisin de 7. Le milieu réactionnel est chargé dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mis en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 50 heures. 1530 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol sont ajoutés au contenu des membranes. Le solide obtenu est filtré, lavé par du méthanol puis dissout dans 100 ml d'eau. La solution obtenue est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 24 heures. Le contenu des membranes est lyophilisé pour fournir 0,758 g de chondroitine sulfate 6 O-sulfatée carboxy-réduite, sel de sodium sous forme d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est de 41 %. Spectre proton dans D20, 400 MHz, T = 298 K (S en ppm - Mélange des chondroitines A et C (1/3 4-OSO3H, 2/3 6- OSO3H)) : 2,0 (3H, s), 3,30 (1H, m), entre 3,4 et 3,90 (7H+ 1/3H, m), entre 3,92 et 4,05 (2H, m), 4,19 (4/3H, s), entre 4,4 et 4,6 (2H, m), 4, 88 (1/3H, s). EXEMPLE 5: Préparation de la chondroïtine sulfate carboxy-réduite et persulfatée, sel de sodium ( Composés de Formule (I) avec les groupements R1= R2 = R3 = R4 = SO3Na) Trans-salification Chlorure de benzethonium OH 1- PySO,/ DMF 2- AcONa / MeOH OH OH - a) Preparation de la chondroïtine sulfate persulfatée carboxy-réduite, sel de benzéthonium Une solution de 0,9 g de chlorure de benzéthonium dans 15 ml d'eau est ajoutée à la solution de 0,4 g de chondroïtine sulfate persulfatée carboxy-réduite, sel de sodium (préparé selon l'exemple 3) dans 15 ml d'eau. La suspension obtenue est agitée pendant 1 heure à une température voisine de 20 C, laissée à sédimenter pendant une nuit, puis filtrée. Le gâteau est lavé à l'eau (6 fois 50 ml), séché en dessicateur sous vide, puis à 80 C sous pression réduite (6 kPa) pour fournir 0,95 g de chondroïtine sulfate persulfatée carboxy-réduite, sel de benzéthonium sous forme d'un solide blanc. Le rendement obtenu est de 80 %. - b) Preparation de la chondroïtine sulfate carboxyréduite et persulfatée, sel de sodium A une température voisine de 20 C et sous atmosphère inerte, 0,95 g de chondroïtine sulfate persulfatée carboxy-réduite, sel de benzéthonium sont mis en solution dans 10 ml de diméthylformamide anhydre. Après dissolution totale, une solution de 1,27 g de complexe pyridine anhydride sulfurique dans 5 ml de diméthylformamide anhydre est ajoutée à la solution 2864089 29 précédente. Après 2 heure 30 d'agitation à une température voisine de 20 C, le milieu réactionnel est refroidi à une température voisine de 10 C. 7 ml d'eau, puis 60 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le méthanol sont ajoutés. La suspension obtenue est filtrée. Le gâteau est dissout dans 50 ml d'eau. La suspension obtenue est filtrée. Le filtrat est précipité par addition de 120 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol. La suspension obtenue est filtrée. Le gâteau est dissout dans 10 ml d'eau. La solution obtenue est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 26 heures. Le contenu de la membrane est lyophilisé pour fournir 0,17 g de chondroïtine sulfate carboxy-réduite et persulfatée, sel de sodium sous forme d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est de 48 %. Spectre proton dans D20, 400 MHz, T = 298 K (8 en ppm - Mélange des chondroïtines A et C) : 2,05 (3H, s), 3,85 (1H, m), entre 3,92 et 4,05 (3H, m), entre 4,12 et 4,3 (5H, m), 4,58 (1H, s), 4,65 (1H, s), 4,75 (1H, m), 4,95 (1H, s), 5,0 (1H, s). EXEMPLE 6: Préparation de la chondroïtine sulfate carboxy-réduite et 6, 6' 0-sulfatée, sel de sodium ( Composés de Formule (I) avec les groupements R1 = H / SO3Na R2 = R3 = SO3Na et R4 =H) RI = H ou SO3Na Ci R1 = H ou So3Hy OH OH HAc OH n NHAc Trans-salification Chlorure de benzethonium NHAc OH - n OH OH 1- PyS031 DMF 2- AcONa / MeOH R1 = H ou SO3Hy OH R1 = H ou SO3Na OH - a) Preparation de la chondroïtine sulfate 6 O-sulfatée carboxy-réduite, sel de benzéthonium Une solution de 1,9 g de chlorure de benzéthonium dans 30 ml d'eau est ajoutée à la solution de 0,8 g de chondroïtine sulfate 6 O-sulfatée carboxy-réduite, sel de sodium (préparé selon l'exemple 4) dans 30 ml d'eau. La suspension obtenue est agitée pendant 1 heure à une température voisine de 20 C, laissée à sédimenter pendant une nuit puis filtrée. Le gâteau est lavé à l'eau (5 fois 25 ml), séché en dessicateur sous vide, puis à 60 C sous pression réduite (6 kPa) pour fournir 1,64 g de chondroïtine sulfate 6 0-sulfatée carboxy-réduite, sel de benzéthonium sous forme d'un solide blanc. Le rendement obtenu est de 96 %. - b) Preparation de la chondroïtine sulfate carboxyréduite et 6, 6' Osulfatée, sel de sodium A une température voisine de 20 C et sous atmosphère inerte, 0,5 g de chondroïtine sulfate 6 O-sulfatée carboxyréduite, sel de benzéthonium sont mis en solution dans 8 ml de diméthylformamide anhydre. Après dissolution totale, une solution de 0,65 g de complexe pyridine anhydride sulfurique dans 4 ml de diméthylformamide 2864089 31 anhydre est ajoutée à la solution précédente, à une température voisine de -10 C. Le milieu réactionnel est agité à une température voisine de -10 C pendant 2 heure 30. 5 ml d'eau, puis 80 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le méthanol sont ajoutés. La suspension obtenue est filtrée. Le gâteau est lavé par du méthanol, dissout dans 20 ml d'eau, puis précipité par addition de 60 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le méthanol. La suspension obtenue est filtrée. Le gâteau est dissout dans 10 ml d'eau. La solution obtenue est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 26 heures. Le contenu de la membrane est lyophilisé pour fournir 0,22 g de chondroïtine sulfate carboxy-réduite et 6, 6' 0-sulfatée, sel de sodium sous forme d'un lyophilisat blanc. Le rendement obtenu est de 79 %. Spectre proton dans D20, 400 MHz, T = 333 K (b en ppm - Mélange de 4 chondroïtines, sulfatées ou non en C4 (Gal 2N6S), épimérisée ou non en C5 (Glu6S)) . 2,0 (3H, s), 3,30 (1H, m), entre 3,5 et 4,25 (11H, m), entre 4,4 et 4,7 (2H, m), entre 4,75 et 4,92 (1/2H). Test pharmacologique Effet des dérivés carboxy-réduits sur l'Aggrecanase des 25 fluides synoviaux ou sur des préparations de protéine recombinante ADAMTS. L'analyse est effectuée sur des plaques 96-puits. Avant l'analyse, des dilutions sérielles des composés de l'essai sont préparées dans une solution aqueuse 32 Digestion: Dans chaque puits, un volume fixe de fluide synovial ou d'activité aggrécanase générant une augmentation connue, entre 1,0 et 1,4 unités d'absorbance (405 nm) dans les conditions de l'analyse est mélangé avec 3 gl de solution de composé de l'étape de dilution respective. Le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) est ajouté à chaque puits pour fournir un volume final de 300 l. Ensuite, la plaque est incubée 1 heure à 37 C dans une atmosphère de dioxyde de carbone. Après un ajout de 5 gl d'une solution de 1 gg/ l de substrat recombinant Agglmut dans le DMEM à chaque puits (substrat tel que décrit par Bartnik E. et al., EP 785274, 1997), le mélange réactif est incubé pendant 4 heures à 37 C sous atmosphère de dioxyde de carbone. Préparation de la plaque d'analyse: Lors d'une première étape, la microplaque est enduite au moyen de 100 gl par puits d'un anticorps antisouris de chèvre IgG du commerce pendant 1 heure à température ambiante (5 gg/ml dans une solution saline de phosphate tamponnée pH 7,4 [Tampon PBS]). Après lavage avec le tampon PBS contenant 0,1% de Tween-20 (tampon de lavage), les puits sont bloqués par une étape d'une heure d'incubation au moyen de 100 pl par puits de 5% de sérum d'albumine bovin dans un tampon PBS contenant 0,05 % de Tween-20. A la suite d'un autre rinçage au moyen du tampon de lavage, chaque puits est incubé avec 100 i d'une solution diluée à 1:1000 d'anticorps BC-3 dans un tampon PBS contenant 0, 05% de Tween 20 et 0,5% d'albumine de sérum bovin à température ambiante pendant une heure. Cet anticorps reconnaît les fragments de clivage typiques de l'aggrécanase (Hughes C.E. et al., Biochem. J. 305 (3), 799804, 1995). 33 Mode opératoire de l'essai: Après un autre rinçage de la plaque d'analyse avec le tampon de lavage, le jeu complet des mélanges provenant de la digestion précédente est transféré puits par puits vers cette plaque et incubé à température ambiante pendant une heure. La plaque est à nouveau lavée tel que ci-dessus. Ensuite, 100 .l du second anticorps (anticorps anti-humain IgG, marqué à la peroxydase, 1:1000 dans du PBS contenant 0,5% de ASB et 0,05% de Tween-20) sont ajoutés à chaque puits, avec une incubation ultérieure à température ambiante pendant à nouveau une heure. A la suite d'un rinçage final avec le tampon de lavage, le développement de la couleur est initié par ajout de 100 l de solution de substrat ABTS (2mg/ml, 2,2'-azinobis (3 ethylbenzthiazoline sulfonic acid dans 40 mM de citrate de sodium plus 60 mM d'hydrogenophosphate disodique, ajusté à un pH 4,4 par ajout d'acide acétique; 0,25 l de peroxyde d'hydrogène à 35 % ajouté par ml immédiatement avant la mesure). La mesure est effectuée au moyen du mode de tamis à l'aide d'une détection à 405 nm par rapport à un filtre de référence (620 nm) avec des lectures automatiques à des intervalles de 5 secondes. Le développement est arrêté dès que le signal maximum (405 nm) dans la gamme d'absorbance de 1,0 à 1,4 est atteint. Tableau 1 % d'inhibition de la conversion du substrat par activité de l'aggrécanase dans le surnageant. Concentration % Conversion de glycosaminoglycan ( g/m1) 0,03 14,9 0,01 11, 6 0,003 69,2 0,001 95,1 0,0003 99,0 0,0001 100 L'IC50 estimée du produit de l'exemple 1 est de l'ordre de 0.004 g/ml Inhibition du facteur Xa Pour la calibration, un échantillon standard d'héparine de bas poids moléculaire (Enoxaparin) a été utilisé comme référence Les dilutions sérielles du composé de l'essai sont préparées dans un tampon de 0,046 M Tris pH 8,4 contenant 0,15 M NaCl, 0,007 M EDTA, 0,1% de Tween 80 et 0,12 IU/ml d'antithrombine humaine III. Les échantillons de 50 l des dilutions respectives sont incubés avec 50 l de facteur bovin Xa (13,6 U/ml) à 37 C pendant 80 secondes. Ensuite, 50 l de substrat chromogénique 1,1 mM S-2765 sont ajoutés. L'absorbance à 405 nm est mesurée dans un photomètre. L'activité du facteur débloqué Xa est indiquée par l'émission de p-nitroaniline à partir du substrat. 2864089 35 Comparés au composé d'héparine de référence (100 U/mg), les glycosamonoglycanes présentent un facteur Xa d'activité inhibitrice bien inférieur: Exemple 1:1.2 U/mg Effet du dérivé persulfate carboxy-réduit (exemple 1) des métalloproteases humaines MMP-2 (gelatinase-A) et MMP7 Des Kit ELISA commerciaux (comme ceux fournis par exemple par la société Amersham Biosciences, kits RPN2617 and RPN 2620) ont été respectivement utilisés pour la détermination de l'activité inhibitrice des enzymes MMP-2 et MMP- 7. Les concentrations des enzymes sont respectivement de 800 ng/ml pour MMP-2. Les tests ont été réalisés en accord avec les recommandations du fabricant en réalisant une série de dilutions du composé à étudier dans un tampon PBS pH 7.5. Les enzymes MMP-2 ont été inhibées de façon concentration -dépendante IC50 estimée: 0.4 gg/ml REVENDICATIONS 1. Dérivés carboxy-réduits et chemiosélectivement O-sulfatés de la Chondroïtine sulfate, isolés ou en mélange, ainsi que leurs sels. 2. Dérivés carboxy-réduits de la Chondroïtine Sulfate selon la revendication 1 de formule (I) : OH dans laquelle R1, R2, R3 et R4, identiques ou différents représentent H ou S03M, étant entendu que l'un au moins des substituants R1, R2, R3 et R4 représente un groupement S03M, n est un entier compris entre 0 et 200, M est un métal alcalin, les dits dérivés étant sous la forme d'un composé isolé ou sous forme de mélanges, ainsi que leurs diastéréoisomères 3. Dérivés carboxy-réduits de la chondroïtine sulfate selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que M est choisi parmi sodium, calcium, magnésium et potassium. 4. Dérivés carboxy-réduits de la chondroïtine sulfate selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce que M est un atome de sodium et n est un entier compris entre 100 et 200. 5. Dérivés carboxy-réduits de la chondroïtine sulfate selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que R1, R2, R3 et R4 représentent SO3Na. 2864089 37 6. Dérivés carboxy-réduits de la chondroïtine sulfate selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que R1, R2 et R4 représentent SO3Na et R3 représente H 7. Dérivés carboxy-réduits de la chondroïtine sulfate selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que R1 représente H ou SO3Na, R2 représente SO3Na et R3 et R4 représentent H 8. Dérivés carboxy-réduits de la chondroïtine sulfate selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisés en ce que R1 représente H ou SO3Na, R2 et R3 représentent SO3Na et R4 représente H. 9. Procédé de préparation des dérivés carboxy-réduits de la chondroïtine sulfate selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel on met en oeuvre successivement les étapes suivantes: -Carboxy-réduction de la chondroïtine sulfate - Soit a) au moyen d'un dérivé de carbodiimide ( pour former un adduit activé) en présence d'un agent 20 réducteur, - Soit b) par estérification, la chondroïtine sulfate ayant le cas échéant été préalablement transsalifiée par un sel d'ammonium quaternaire, suivie d'une réduction du dérivé ester correspondant par action d'un agent réducteur, - Le cas échéant trans-salification du dérivé carboxyréduit par un sel d'ammonium quaternaire - Sulfatation en milieu organique suivie d'une salification, 10. Procédé de préparation des dérivés carboxy-réduits de la chondroïtine sulfate selon l'une quelconque des 2864089 38 revendications 1 à 8, dans lequel on met en oeuvre successivement les étapes suivantes: - Trans-salification de la chondroïtine sulfate par un sel d'ammonium quaternaire, - Sulfatation en milieu organique suivie d'une salification - Carboxy-réduction de la chondroïtine sulfate sulfatée Soit a) au moyen d'un dérivé de carbodiimide pour former un adduit activé) en présence d'un agent réducteur, - Soit b) par estérification de la chondroïtine sulfate laquelle ayant le cas échéant été préalablement trans-salifiée par un sel d'ammonium quaternaire, suivie d'une réduction du dérivé ester correspondant paraction d'un agent réducteur, - Le cas échéant trans-salification du dérivé persulfaté carboxy-réduit par un sel d'ammonium quaternaire puis resulfatation suivie d'une salification 11. Procédé selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce que la sulfatation s'effectue en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine à une température comprise entre -15 et 70 C. 12. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que la sulfatation s'effectue à partir d'un sel de benzéthonium de la chondroïtine sulfate carboxy-réduite, ( composé de formule (I) avec R1=H / R2=SO3Na ou R1= SO3Na / R2=H et R3=R4=H) en présence de 10 à 30 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique par fonction 2864089 39 hydroxyle à sulfater, et à une température comprise entre 50 et 70 C afin d'obtenir un composé de formule (I) tel que défini à la revendication 5 (R1=R2=R3=R4=SO3Na) . 13. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que la sulfatation s'effectue à partir de la chondroïtine sulfatée carboxy-reduite, sel de benzéthonium telle que définie à la revendication 6 ( composé de formule (I) avec R1=R2=R4=SO3Na et R3=H) en présence de 10 à 30 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique, à environ 20 C afin d'obtenir un composé de formule (I) tel que défini à la revendication 5 (R1=R2=R3=R4=S03Na) . 14. Procédé de préparation selon la revendication 9 caractérisé en ce que la sulfatation s'effectue à partir de la Chondroïtine sulfate carboxy- réduite, sel de benzéthonium ( composé de formule (I) avec R1=H / R2=SO3Na ou R1= SO3Na / R2=H et R3=R4=H)), en présence de 5 à 15 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique, à des températures comprises entre -15 et 5 C afin d'obtenir un composé de formule (I) tel que défini à la revendication 8 avec R1=H / SO3Na R2=R3=SO3Na et R4=H. 15. Procédé de préparation selon la revendication 10 caractérisé en ce que la resulfatation s'effectue à partir de la chondroïtine sulfate carboxy-réduite 6-0-sulfatée, sel de benzéthonium ( composé de formule (I) avec R1=H/SO3Na R2=SO3Na et R3=R4=H) telle que définie à la revendication 7, en présence de 5 à 15 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique, à des températures comprises entre -15 et 5 C et en particulier en présence d'environ 10 équivalents de complexe pyridine anhydride sulfurique à environ -10 C afin d'obtenir des composés de formule (I) avec R1=H/SO3Na R2=R3=SO3Na et R4=H tels que définis à la revendication 8. 2864089 40 16. Procédé selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce que la carboxyréduction s'effectue au moyen de chlorhydrate de 1-(3-diméthyl aminopropyl)-3-éthylcarbodiimide en présence du borohydrure de métal alcalin tel que le borohydrure de sodium. 17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce qu'on utilise 5 à 20 équivalents de chlorhydrate de 1-(3-diméthyl aminopropyl)-3éthylcarbodiimide et à un pH compris entre 4 et 5 et en particulier entre 4,3 et 4,9. 18. Procédé selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce que la réduction de l'adduit activé du dérivé de la chondroïtine sulfate est réalisée avec 10 à 300 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 70 C et en particulier entre 10 et 30 C. 19. Procédé selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce que la carboxy-réduction s'effectue par réduction d'un ester méthylique en présence de borohydrure de métal alcalin tel que le borohydrure de sodium. 20. Procédé selon la revendication 9 mettant en oeuvre les étapes suivantes: - soit a) Carboxy-réduction de la chondroïtine sulfate sel de sodium au moyen du chlorhydrate de 1-(3- diméthyl aminopropyl)-3-éthylcarbodiimide en présence 25 du borohydrure de sodium, - soit b) estérification par action du iodure de méthyle sur le dérivé de la chondroïtine sulfate préalablement trans-salifié par le chlorure de Benzéthonium puis réduction du dérivé ester méthylique correspondant par le borohydrure de sodium puis, 2864089 41 - Trans-salification du dérivé carboxyréduit par le chlorure de Benzéthonium - Sulfatation du sel de benzéthonium de la chondroltine sulfate en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine, suivie d'une salification par l'acétate de sodium. 21. Procédé selon la revendication 10 mettant en uvre 10 les étapes suivantes: - Trans-salification de la chondroïtine sulfate sel de sodium par le chlorure de Benzéthonium, - Sulfatation du sel de Benzéthonium de la Chondroïtine sulfate en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine, suivie d'une salification par l'acétate de sodium puis, soit a) Carboxy-réduction de la chondroïtine sulfate au moyen du chlorhydrate de 1-(3-diméthyl aminopropyl)-3- éthylcarbodiimide en présence du borohydrure de sodium, - soit b) estérification par action du iodure de méthyle sur la chondroïtine Sulfate préalablement trans-salifiée par le chlorure de Benzéthonium puis réduction du dérivé ester méthylique correspondant par le borohydrure de sodium, - puis, le cas échéant trans-salification du dérivé persulfaté carboxy- réduit par le chlorure de benzéthonium puis resulfatation par le complexe d'anhydride sulfurique base organique suivie d'une salification par l'acétate de sodium. 2864089 42 22. Procédé d'obtention des dérivés isolés de la chondroïtine sulfate carboxy-réduits et chemiosélectivement O-sulfatés selon la revendication 1 à 8 à partir du mélange de dérivés carboxy-réduits de la chondroïtine sulfate tels qu'obtenus selon le procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 10 à 22, caractérisé en ce qu'on fractionne le mélange par chromatographie sur des colonnes remplies de gel de type polyacrylamide agarose ou un gel de polyacrylamide, le mélange étant élué par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium, notamment de 0,1 à 1 mole/1. 23. A titre de médicaments les composés tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 8 24. A titre de médicaments selon la revendication 23, les composés tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour traiter ou prévenir les désordres qui affichent une activité accrue d'au moins une des métalloprotéinases de matrice, telle que la collagénase élastase, la matrisyline (MMP-7), l'aggrécanase hADAMTS1 et la gélatinase A (MMP-2) . 25. A titre de médicaments selon la revendication 23 ou 24, les composés tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour traiter ou prévenir des désordres tels que la dégénérescence articulaire, la spondylose, la chondrolyse, associée à un traumatisme de l'articulation ou une immobilisation prolongée de l'articulation, les désordres des tissus conjonctifs, les troubles de la cicatrisation de plaie, les désordres parodontaux, les désordres chroniques du système locomoteur, les arthropathies, les myalgies, ou les désordres du métabolisme osseux. 2864089 43 26. les compositions pharmaceutiques renfermant un médicament tel que défini à l'une quelconque des revendications 24 à 25 et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. 27. Dérivés carboxy-réduits et chemiosélectivement 0-sulfatés de la chondroitine sulfate, isolés ou en mélange tels que définis selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 susceptibles d'être obtenus selon le procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 9 à 22.