FR 2868319 A1 20051007 FR 0403430 A 20040401 La présente invention est relative à un antigène Tat dimérique et à ses applications pour la vaccination anti-VIH. Le syndrome de 1'immunodéficience acquise (SIDA) est une maladie sexuellement transmissible provoquée par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH de type 1 (VIH-1) ou de type 2 (VIH-2)). Cette maladie est en progression constante et à ce jour plus de 42 millions de personnes sont infectées dans le monde. C'est pourquoi la mise au point d'un vaccin représente une urgence absolue pour lutter contre cette pandémie. De nombreuses approches vaccinales ont été développées depuis près de vingt ans sans aboutir à la mise au point d'un vaccin efficace. Cependant, la connaissance toujours plus approfondie du cycle infectieux et des protéines virales responsables de la progression vers le stade SIDA a ouvert la voie vers l'utilisation de nouvelles cibles vaccinales prometteuses: les protéines régulatrices du VIH. Ces protéines, qui avaient tout d'abord été délaissées, font depuis quelques années l'objet de nombreux travaux en raison de leur rôle dans la réplication virale. Parmi ces protéines, le régulateur transcriptionnel Tat de VIH, représente une cible vaccinale particulièrement intéressante, dans la mesure où l'absence de progression vers le stade SIDA est corrélée à la présence d'anticorps anti-Tat de haut titre et de cellules cytotoxiques spécifiques (Zagury et al., J Hum Virol 1998,1: 282-292; Re et al., J Clin Virol, 2001, 21: 81-89; Van Baalen et al., J Gen Virol 1997, 78: 1913-1918). Tat est un facteur de transcription essentiel à la réplication virale, (Fisher et al., Nature, 1986, 320:367-371) qui peut à la fois activer le VIH latent et déréguler l'expression d'autres gènes cellulaires, dans la mesure où il possède la particularité d'être libéré par les cellules infectées et incorporé dans d'autres cellules infectées ou non (transport transcellulaire; Ensoli et al., J Virol, 1993, 67:277-287; Chang et al., Aids, 997, 11:1421-1431). Il a été montré que Tat a des effets toxiques in vitro. Ces effets comprennent: la dérégulation des signaux cellulaires impliqués dans l'apoptose, la dérégulation de l'expression de parties de gènes du système immunitaire tel que le gène de l'interleukine 2 et de l'interféron alpha, ou des gènes codant pour les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et de classe II, et/ou l'induction d'angiogénèse. Ainsi, Tat possède de nombreuses activités biologiques et pourrait jouer un rôle, tant dans la dissémination virale que dans la pathogenèse: progression vers le stade SIDA et pathologies associées au SIDA, comme le sarcome de Kaposi. Le gène Tat comprend 2 exons codant pour une protéine de 99 à 103 acides aminés selon les souches de VII-I. L'exon 1 qui code pour les 72 premiers acides aminés, possède une activité de transactivation totale, et comprend 5 domaines: (1) le domaine N-terminal riche en résidus acides (positions 1 à 21), qui est important pour l'interaction avec des protéines cellulaires, (2) le domaine riche en cystéines (positions 22 à 37) contenant 7 résidus de cystéine fortement conservées (positions 22, 25, 27, 30, 31, 34 et 37), impliqué dans la transactivation, (3) le domaine central (core) correspondant aux positions 38 à 48, également impliqué dans la transactivation, (4) le domaine basique (positions 49 à 57), qui comprend les séquences impliquées dans la localisation nucléaire, le transport transcellulaire et la liaison à l'élément de réponse TAR (Trans-activation response) du LTR viral, et qui est également impliqué dans la liaison de Tat à l'héparine, et (5) le domaine riche en glutamines (positions 50 à 72). L'exon 2 de taille variable, code pour le domaine C-terminal (positions 73 à extrémité C-terminale) qui ne possède pas d'activité de transactivation mais contient le motif RGD (arginine-glycine-aspartate; positions 78 à 80), nécessaire pour la liaison de Tat aux récepteurs de l'intégrine. Outre, la protéine Tat de 99 à 103 acides aminés, il existe également une protéine tronquée de 86 acides aminés, produite in vitro par génération d'un codon stop en position 87, du fait de la mutation du VIH, lors du passage en culture cellulaire. Il a été montré qu'une protéine Tat biologiquement active (Cafaro et al., Nat. Med., 1999, 5, 643-650 et Demande Internationale PCT WO 99/27958)) ou une protéine Tat dont l'aptitude à transactiver la transcription du génome viral et éventuellement l'effet suppresseur sur la prolifération des cellules T ont été préalablement inactivés, peuvent contribuer à la mise en place d'un vaccin anti-VIH efficace. En particulier, un dérivé de Tat inactivé par substitution des cystéines 22 et 37 par des sérines est immunogène (Caselli et al., J. Immunol., 1999, 162, 5631-5638) et un dérivé de Tat inactivé par carboxyméthylation des cystéines à l'aide de groupements hydrophiles est immunogène et capable d'induire un ralentissement de la progression de la maladie chez le singe (Pauza et al., P.N.A.S., 2000, 97, 3515-3519). Toutefois, la structure moléculaire de Tat capable d'induire une immunité protectrice, et ce de façon reproductible n'est pas connue. En effet, il a été montré que la protéine Tat recombinante ou synthétique, isolée et purifiée, s'associe en solution pour former des oligomères (dimères et trimères) très stables, particulièrement résistants à la dénaturation et à la réduction (100 mM DTT; Tosi et al., Eur. J; Immunol. , 2000, 30: 1120-1126). Ainsi, les préparations de Tat sont hétérogènes et comprennent un mélange de monomères, de dimères et de trimères (Demande de Brevet US 2003/0158134). Néanmoins, la nature exacte des interactions impliquées dans la formation des oligomères de Tat n'est pas connue; l'existence de ponts disulfures impliquant notamment la cystéine en position 37 ou d'autres interactions chimiques fortes, impliquant notamment des cations polyvalents, de préférence divalents (zinc, cadmium) a été suggérée (Battaglia et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 201, 701, 708; Frankel et al., Science, 1988, 240: 70-73). En outre, le rôle relatif des différentes formes de Tat dans l'infection virale n'a pas été élucidé et leur rôle dans l'immunité anti-virale n'a pas été étudié. En effet, il semblerait que les oligomères de Tat ne possèdent aucune activité biologique dans la mesure où, d'une part la protéine Tat extracellulaire produite à partir de cellules de mammifère est monomérique et que, d'autre part l'inhibition de l'activité transactivatrice de Tat à l'aide d'anticorps reconnaissant spécifiquement les différentes forme de Tat, indique que seul le monomère est capable d'entrer dans les cellules et de transactiver le LTR viral (Rice et al., Virology, 1991, 185: 451-454; Tosi et al., précité). Les Inventeurs ont montré que de façon surprenante un dérivé de Tat monomérique non immunogène peut devenir immunogène en l'absence d'adjuvant, à condition de former un dimère, indiquant que la propriété auto-adjuvante de Tat résulte de son oligomérisation, médiée, notamment par un pont disulfure. Ces résultats pourraient notamment expliquer l'effet protecteur de Tat en l'absence d'adjuvant, précédemment observé dans un essai de vaccination chez le singe (Cafaro et al., précité). En outre, les Inventeurs ont montré que la propriété auto-adjuvante de Tat est indépendante de son activité de transactivation. Ainsi, plusieurs dérivés de Tat dépourvus d'activité de transactivation sont immunogènes en l'absence d'adjuvant. De telles caractéristiques, sont en particulier retrouvées chez un dimère dérivé d'une protéine Tat. Par conséquent la forme dimérique de Tat, représente un vaccin potentiellement plus efficace que les vaccins de l'art antérieur, dans la mesure où il ne contient que la forme immunogène de Tat mais pas le monomère qui est inactif en l'absence d'adjuvant. En outre, le dimère de Tat représente un vaccin homogène et parfaitement défini, permettant d'obtenir des résultats reproductibles. La présente invention a en conséquence pour objet, une composition vaccinale anti-VIH comprenant un antigène Tat, caractérisée en ce que ledit antigène est constitué d'un homo- ou hétéro-dimère de protéine(s) Tat et/ou ou de fragment(s) d'au moins 20 acides aminés desdites protéines. Définitions É antigène Tat On entend par antigène Tat, une protéine Tat ou un fragment de cette protéine d'au moins 20 acides aminés, capable d'induire une réponse humorale et/ou cellulaire spécifique chez un mammifère humain ou animal; ledit antigène Tat est, soit biologiquement actif, soit inactivé par: (i) mutation de la séquence du gène Tat, notamment par substitution en sérine(s), de résidu(s) de cystéine de la région riche en cystéines (Demandes Internationales WO 95/31999, WO 03/057885 et WO 99/27958, Caselli et al., précité), (ii) traitement physique (irradiation) ou chimique (action d'une aldéhyde, oxydation), (Demandes Internationales WO 96/27389), WO 99/33872, Demande US 20030215797 et Cohen et al., P.N.A.S., 1999, 96, 10842- 10847), (iii) purification de la protéine Tat recombinante par un procédé permettant l'élimination de l'ARN et de l'endotoxine contaminants (Demande Internationale WO 03/073984). L'invention englobe les compositions vaccinales comprenant un antigène Tat dimérique dérivé d'une protéine Tat ou d'un fragment de Tat, modifiés 30 par: - substitution et/ou suppression, et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence de la protéine Tat, - modification d'au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique de Tat, notamment par remplacement par une liaison différente de la liaison -CO-NH- (méthylène amino, carba, cétométhylène, thioamide... .) ou par introduction d'une liaison de type rétro ou rétro-inverso, et/ou, substitution d'au moins un acide aminé de la chaîne peptidique de Tat, par un résidu d'acide aminé non protéinogénique. Par résidu d'acide aminé non protéinogénique, on entend tout acide aminé n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel, notamment tout acide aminé dont le carbone portant la chaîne latérale R, à savoir le groupe CHR-, situé entre -CO- et -NH- dans la chaîne peptidique naturelle, est remplacé par un motif n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel. A titre d'exemple non-limitatif, on peut citer la Norleucine (Nle) et la cyclohexylalanine (CHA). - modification d'acides aminés de la séquence de Tat: les résidus d'acides aminés de Tat ou du fragment de Tat qui sont modifiés possèdent une chaîne latérale comprenant une fonction réactive: -OH [sérine (S), thréonine (T) ou tyrosine (Y)], -SH [cystéine (C)], -NH2 [lysine (K) ou arginine (R)], -COOH [acide aspartique (D) ou acide glutamique (E)]. É Dimère de Tat On entend par dimère de Tat, un homo- ou hétéro-dimère formé de 20 l'association de monomères de Tat (protéines et/ou fragments) identiques ou différents entre eux, par une ou plusieurs liaisons covalentes et/ou non covalentes. - liaison covalente Les dimères covalents résultent notamment de la formation d'une des liaisons suivantes: (i) un pont disulfure, (ii) une liaison pseudo-peptidique, par exemple oxime ou acylhydrazone, (iii) une Iiaison amide ou thio-éther, formée par exemple à l'aide d'un réactif hétéro-bifonctionnel tel que le N-(alphamaléimidoacétoxy) succimide ester. De manière générale, le dimère covalent peut résulter de l'action de réactifs homo- ou hétéro-bifonctionnels connus de l'Homme du métier. En outre, le groupement sulfhydrile de chacune des deux molécules de Tat qui permet la formation du pont disulfure intermoléculaire est situé, soit sur une cystéine présente dans la séquence en acides aminés de Tat, soit sur une cystéine ou un dérivé de cystéine introduit dans ladite séquence, notamment par addition ou par substitution d'un acide aminé de ladite séquence en cystéine ou en dérivé de cystéine ou par modification d'une cystéine en dérivé de cystéine, ou bien encore sur un autre résidu d'acide aminé qui est modifié par un réactif homo- ou hétéro- bifonctionnel. - liaison non-covalente Les dimères non-covalents peuvent être formés par l'intermédiaire de motifs du type leucine-zipper ou de cations polyvalents, de préférence divalents, comme le zinc ou le cadmium. protéine Tat On entend par protéine Tat (ou Tat), la protéine Tat de n' importe quelle souche de VIH (VIH-1 ou VIH-2), correspondant à une séquence d'environ 86 à 103 acides aminés, selon les souches. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, le dimère de Tat est formé par l'association covalente de protéine(s) Tat et/ou de 15 fragments) desdites protéines. De préférence le dimère de Tat comprend au moins une liaison disulfure intermoléculaire. De manière préférée, ladite liaison disulfure intermoléculaire implique des résidus de cystéine (identiques ou différents) desdites protéines Tat et/ou desdits fragments, de préférence lesdits résidus de cystéine sont choisis parmi ceux situés en position 22, 25, 27, 30, 31, 34, et 37 de la séquence en acides aminés de Tat, de manière préférée parmi les résidus de cystéine en position 22, 34 et 37. Conformément à l'invention, les résidus de cystéine de Tat qui ne sont pas impliqués dans ladite liaison disulfure intermoléculaire sont, soit bloqués par une liaison, notamment avec un groupement S-tertio-butyle, ou bien par une interaction, notamment avec des cations polyvalents, de préférence divalents, soit substitués par un autre résidu d'acide aminé ne comprenant pas de groupement sulfhydrile, notamment une sérine. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite 30 composition, le dimère de Tat est formé par l'association non-covalente de protéine(s) Tat et/ou de fragment(s) desdites protéines. De préférence, ladite association non-covalente est formée par l'intermédiaire de cations polyvalents, de préférence divalents comme notamment le zinc ou le cadmium. Selon une disposition avantageuse des modes de réalisation précédents de ladite composition, lesdites protéines Tat et les fragments desdites protéines sont préalablement inactivés, notamment par substitution d'au moins un des résidus de cystéine en position 22, 25, 27, 30, 31, 34 et 37, en sérine; de préférence au moins un des résidus de cystéine en position 25, 27, 30 et 31 est substitué en sérine. Par exemple, le dimère est formé de l'association par un pont disulfure entre les résidus de cystéine en position 34, de protéine(s) Tat et/ou ou de fragment(s) desdites protéines incluant la substitution des six résidus de cystéine en position 22, 25, 27, 30, 31 et 37, en sérines. Alternativement, le dimère est formé de l'association par un pont disulfure entre les résidus de cystéine en position 22, de protéines Tat et/ou ou de fragments desdites protéines incluant la substitution des six résidus de cystéine en position 25, 27, 30, 31, 34 et 37, en sérines. Selon une autre disposition avantageuse des modes de réalisation précédents de ladite composition, ladite protéine Tat est la protéine Tat de 86 acides aminés. Selon une autre disposition avantageuse des modes de réalisation 20 précédents de ladite composition, ledit fragment de Tat inclus au moins un épitope B et un épitope T immunodominants. De préférence, ledit épitope B immunodominant est situé dans le domaine Nterminal (positions 1 à 21) et/ou ledit épitope T immunodominant est situé dans le domaine central (positions 38 à 48). En outre, lorsque le dimère de Tat est constitué par l'association non-covalente de fragment(s) de Tat ou d'un fragment de Tat avec une protéine Tat, par l'intermédiaire de cations polyvalents, de préférence divalents, le ou lesdit(s) fragment(s) incluent également le domaine riche en cystéines (positions 22 à 37). Selon une autre disposition avantageuse des modes de réalisation 30 précédents de ladite composition, ledit fragment de Tat comprend de 20 à 50 acides aminés, de préférence entre 25 et 35 acides aminés. De préférence, Iedit fragment de Tat est le fragment 1 à 48. Selon encore une autre disposition avantageuse des modes de réalisation précédents de ladite composition, ledit antigène Tat dimérique dérive de la protéine de séquence SEQ ID NO: 1 et/ou d'un fragment d'au moins 20 acides aminés de cette séquence, tel que défini ci-dessus. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition vaccinale, elle comprend au moins un autre antigène du VIH, notamment Rev, Nef, Gag, Env ou un fragment d'au moins 11 acides aminés desdits antigènes. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition vaccinale, elle est constituée par un antigène Tat dimérique tel que défini ci-dessus, un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et/ou une substance porteuse, et éventuellement un autre antigène du VIH, tel que défini ci-dessus. La composition vaccinale selon l'invention est immunogène en l'absence d'adjuvant. Elle se présente sous une forme galénique adaptée à une administration par voie parentérale (sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse), entérale (orale, sublinguale), ou locale (rectale, vaginale). Les véhicules pharmaceutiquement acceptables et les substances porteuses sont ceux classiquement utilisés. Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par: les liposomes unilamellaires ou multilamellaires, les ISCOMS, les virosomes, les particules de type viral (virus-like particles), les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactide-co-glycolide)) ou aurifère, et les nanoparticules. La présente invention a également pour objet un antigène Tat dimérique tel que défini ci-dessus, comme vaccin destiné à la prévention et/ou au 25 traitement d'une infection par le VIH chez l'Homme. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un antigène Tat dimérique tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention et/ou au traitement d'une infection par le VIH chez l'Homme. La présente invention a également pour objet un dimère de Tat isolé, sélectionné dans le groupe constitué par: a) un hétérodimère de protéines Tat ou de fragments desdites protéines, tel que défini ci-dessus, b) un homodimère de fragments de Tat, tel que défini ci-dessus, à l'exclusion du dimère non-covalent du fragment 1-86 de HIV formé par l'intermédiaire de zinc ou de cadmium, et c) un homodimère de protéines Tat ou un hétérodimère d'une protéine Tat et d'un fragment de Tat, associés par un pont disulfure entre les résidus de cystéine en position 22 ou 34, chacune desdites protéines et desdits fragments incluant la substitution en sérines, des six résidus de cystéine, respectivement en position 25, 27, 30, 31, 34 et 37, et en position 22, 25, 27, 30, 31 et 37. La protéine Tat et ses fragments, ainsi que les dimères de Tat dérivés 10 des précédents, tels que définis ci-dessus, sont préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier. De manière plus précise: - la protéine Tat et ses fragments peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149-) (1964) et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse, - la protéine Tat et ses fragments peuvent également être produits à partir des ADNc correspondants, obtenus par tout moyen approprié connu de l'homme du métier; l'ADNc est cloné dans un vecteur d'expression eucaryote ou procaryote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules hôtes modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d'affinité, - les dimères covalents de Tat sont préparés par oxydation des résidus de cystéine d'une préparation de protéine(s) Tat et/ou de fragment(s) desdites 25 protéines tels que définis ci-dessus, et - les dimères non-covalents de Tat sont préparés par mise en contact d'une préparation de protéine(s) Tat et/ou de fragment(s) desdites protéines tels que définis ci-dessus, avec des cations polyvalents, de préférence divalents comme le zinc et le cadmium, à pH d'environ 6 ä 9. Les antigènes Tat dimériques selon l'invention présentent les avantages suivants par rapport aux antigènes de I'art antérieur: - ils sont immunogènes en l'absence d'adjuvant, - ils sont homogènes (préparation par des procédés reproductibles) et bien définis. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'antigène Tat dimérique de la présente invention, ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels: - la figure 1 illustre la réponse en anticorps anti-Tat de souris BALB/c immunisées en présence d'adjuvant. Des groupes de quatre souris ont été immunisés par voie sous-cutanée avec la protéine Tati 01 émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund ou de l'hydroxyde d'alumine. 14 jours plus tard, les animaux ont reçu une seconde injection constituée de Tat émulsifiée dans de l'adjuvant incomplet de Freund (en blanc) ou de l'hydroxyde d'alumine (en gris). Des échantillons de sang on été prélevés 11, 21, 33 et 70 jours après la seconde injection et la présence d'anticorps anti-Tat dans les sérums a été analysée en ELISA. Les valeurs indiquées correspondent à l'inverse des titres en anticorps. - la figure 2 illustre la réponse en anticorps anti-Tat de souris BALB/c, immunisées en présence ou en l'absence d'adjuvant. Des groupes de quatre souris ont été immunisés avec Tati 01, soit dans du PBS (Tati 01), soit émulsifiée dans de l'hydroxyde d'alumine (Tati01/alum). Les animaux ont reçu deux injections à 14 jours d'intervalle, soit par voie sous-cutanée, soit par voie intrapéritonéale. Des échantillons de sang on été prélevés 14, 28, 45 et 60 jours après la seconde injection et la présence d'anticorps anti-Tat dans les sérums a été analysée en ELISA. Les valeurs indiquées correspondent à l'inverse des titres en anticorps. - la figure 3 illustre la réponse cellulaire T de souris BALB/c immunisées avec Tati01. Des souris BALB/c ont été immunisées par deux injections par voie sous-cutanée, à 14 jours d'intervalle, de Tati01 dans du PBS. Dix jours après la seconde injection, les rates ont été récoltées et les splénocytes ont été éprouvés par des dilutions en série de Tat ou de lyzozyme d'oeuf de poule (HEL). Après une période de culture de 24 heures: (A) chaque surnageant a été testé pour sa capacité à stimuler l'incorporation de 3H thymidine par des cellules CTLL dépendantes de VIL2, et (B) la prolifération des splénocytes a été mesurée après 3 jours de culture, suivis de 18 heures d'incubation avec de la 3H thymidine. - la figure 4 illustre la cartographie des épitopes B de la protéine Tati 01. Dix huit peptides chevauchants de Tati01, d'une longueur de 15 acides aminés chacun, ont été adsorbés sur Ies puits d'une plaque ELISA. La capacité des sérums, dilués au 1/120, à se fixer sur ses peptides a été mesurée en ELISA, après une nuit d'incubation à 4 C. Les sérums testés sont les suivants: sérum dirigé contre Tati 01 dans du PBS (A), sérum dirigé contre Tatl01 émulsifiée dans de l'hydroxyde d'alumine (B), ou de l'adjuvant de Freund (C), et sérum contrôle (D). - la figure 5 illustre l'identification des déterminants moléculaires impliqués dans la propriété auto-adjuvante de Tati01. La figure 5A représente la séquence en acides aminés de Tat101 (type sauvage) et les substitutions effectuées dans les cinq dérivés de Tati 01. Les figures 5B et 5C représentent la réponse en anticorps anti-Tat, mesurée par l'inverse des titres en anticorps en ELISA, chez des souris BALB/c immunisées avec (B), Tat101, Tati 01 C(22-37)S, Tati 01 RGD,KGE et Tati01polyQ et (C) Tati01, Tat101core et TatiO1D5I,P6L. Dans chacun des cas, les souris ont reçu deux injections, par voie sous-cutanée, à 14 jours d'intervalle, et des échantillons de sang ont été prélevés 14 et 28 jours après la seconde injection. - la figure 6 illustre le rôle des résidus de cystéine de Tati 01 dans l'induction de la réponse humorale. Des groupes de quatre souris BALB/c ont été immunisés par voie sous-cutanée avec Tatl01, Tati01C(25,27)S, Tat101C(30,31)S ou Tat101c(22,34,37)s. Les souris ont reçu deux injections à 14 jours d'intervalle, des échantillons de sang ont été prélevés 14 et 28 jours après la seconde injection et la présence d'anticorps anti-Tat a été analysée en ELISA. - la figure 7 illustre le rôle des oligomères de Tat formés par des liaisons disulfures dans la réponse en anticorps anti-Tat, en l'absence d'adjuvant. La figure 7A illustre l'électrophorèse de Tat101 et Tatl Ol C(22-37)S après dénaturation, et de Tati01 après dénaturation en présence ou en l'absence d'agent réducteur. La figure 7B représente la réponse anticorps anti-Tat après immunisation de souris BALB/c avec Tat10l, Tatl01C(22-37)S ou Tat101C(22-31; 37)S,C34dimère, en l'absence d'adjuvant. Les souris ont reçu deux injections, par voie sous-cutanée, à 14 jours d'intervalle et des échantillons de sang ont été prélevés 14 et 28 jours après la seconde injection. - la figure 8 illustre l'absence de corrélation entre l'activité transactivatrice et la propriété auto-adjuvante de Tati 01. Une lignée de cellules Hela transfectée de façon stable avec un plasmide rapporteur codant pour la protéine fluorescente verte EGFP sous le contrôle du promoteur du LTR de VIH-1, a été transfectée de façon transitoire avec des plasmides codant pour Tati01 ou ses dérivés Tati 01 C(22-37)S, Tati OIRGD,KGE, Tati 01polyQ, Tati 01 C(25,27)S, et Tati 01 C(30,31)S, Après 45 heures d'incubation, les cellules ont été trypsinées et l'expression de l'EGFP a été mesurée sur les cellules vivantes, par cytométrie de flux. Exemple 1: Préparation de Tat et de ses dérivés La protéine Tat correspond à celle de l'isolat NDK du VIH-1 (Groenink et al., J. Virol., 1991, 65, 1968-1975), qui représente la séquence consensus obtenue à partir de 66 séquences d'isolats primaires de VIH-1 rapportées dans les bases de données SWISSPROT et TrEMBL entre 1999 et 2000. En outre, dans cette séquence, la méthionine N-terminale qui peut-être oxydée de façon spontanée au cour des étapes de purification, a été remplacée par une Norleucine qui est isostérique et non-oxydable. Cette protéine, dénommée ci-après Tati 01, correspond à la séquence SEQ ID NO: 1 dans la liste de séquences jointe en annexe. 1) Synthèse chimique de Tat et de ses dérivés La synthèse chimique de Tat et de ses dérivés est réalisée en phase solide sur un appareil APPLIED BIOSYSTEMS 433A, en utilisant la stratégie Fmoc/tert-butyle connue de l'Homme du métier. Les sept résidus de cystéine de la région riche en cystéines sont protégés par un groupement S-tertio-butyle (S(tBu)). Brièvement, l'échelle de synthèse est de 1 mM, soit 500 mg de résine FmocAsp(OtBu)-PAL-PEG-PS à 0,2 mmol/g pout Tati 01 et 1 mM de chaque acide aminé protégé est utilisé à chaque cycle de couplage. L'activation de chaque acide aminé Fmoc est réalisée en utilisant le couple dicyclohexylcarboiimide/1-hydroxy-7azabenzotriazole; le couplage est réalisé en présence de 0,25M diisopropyléthylamine/N-méthyle pyrrolidone. L'incorporation du résidu de glutamine (Gln54) a été réaliséemanuellement, à deux reprises, de la manière suivante: 1 mmole de Fmoc Gln54(Trt)- OH et 522 gl de diisopropyléthylamine (3 mmoles) dans 2 ml de diméthylsufoxyde anhydre ont été ajoutés à la résine, puis 1 mmole de 2-(1-hydroxy-7- azabenzotriazol- 1-yl)-1,1,3,3 tétraméthyluronium hexafluorophosphate dans 2 ml de N- méthyle pyrrolidone, et le couplage a été réalisé une heure à température ambiante. Le clivage de la résine et la déprotection (1 h et 30 min) sont réalisés en mélangeant la résine séchée (sous vide pendant une nuit), à 10 ml d'une solution d'acide trifluoroacétique (TFA: 9,5)/triisopropylsilane (0, 25)/eau (0,25; V/V/V). Après filtration sur fritté, le mélange réactionnel est précipité deux fois dans 100 mI d' éther tertio-butyle méthylique refroidi (4 C), centrifugé 15 minute à 2500 tours/min. Le solide obtenu est dissous dans 50 ml d'une solution aqueuse d'acide acétique à 15 %, puis lyophilisé. Le brut de synthèse obtenu est purifié par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse, sur une colonne semi-préparative C4 (21 x 250 mm, 5 M, 300 À JUPITER). La fraction homogénéisée pour chaque dérivé synthétisé protégé par S(tBu) est caractérisée par sa composition en acides aminés et par spectrométrie de masse. La déprotection des cystéines bloquées a été réalisée en incubant, à température ambiante, 1 mg de protéine Tat dans 1 ml de tampon phosphate de sodium dégazé à 0,1 M, pH 8,5, contenant 6M urée et du dithiothréitol (50 équivalents de dithiothréitol par résidu de cystéine). L'avancement réactionnel est suivi par chromatographie liquide haute performance (CHLP) en phase inverse, sur une colonne semi-préparative C4 (21x 250 mm, 5 M, 300 À JUPITER). Après 2 heures, la réaction apparaît quantitative, le mélange réactionnel est acidifié jusqu'à pH 2,2 avec une solution aqueuse de TFA/H2O (50/50; V/V), puis diluée avec une solution aqueuse de TFA/H2O (1/999; V/V) dans un volume final de 50 ml. Le mélange réactionnel est alors purifié par chromatographie liquide haute performance (CHLP) en phase inverse, sur une colonne semi-préparative C4 (21x 250 mm, 5 M, 300 À JUPITER). La fraction homogénéisée pour chaque dérivé synthétisé est caractérisée par sa composition en acides aminés et par spectrométrie de masse. Des fractions aliquotes ont été préparées et la protéine a été lyophilisée et conservée à -20 C. Une stratégie similaire a été utilisée pour produire les dérivés suivants de Tati 01: Tati 01 C(22-37)S, Tati 01 RGD,KGE et Tatl0lpolyQ, Tati 01 core et Tat101 D5I,P6L Tati 01 C(25,27)S, Tati 01 C(30,3 I)S, Tati 01 C(22,34,37)S et Tati 01 C(22-31; 37)S,C34dimère, ainsi que les 18 peptides de acides aminés de longueur, avec un chevauchement de 5 acides aminés, représentant la séquence de Tati 01. 2) Construction de plasmides recombinants d'expression de la protéine Tat et des mutants dérivés La séquence nucléotidique de la protéine Tat (Tati 01) ou des mutants dérivés Tat101C(22-37)S, Tat101RGD,KGE et Tat101polyQ, Tati 01 C(25,27)S et Tati 01 C(30,31)S a été reconstituée à partir de 8 amorces nucléotidiques synthétiques chevauchantes, représentant la séquence de la totalité du gène Tat codant pour l'une des protéine précitées, flanquée des sites de restrictions Nco I et Hind III. Les amorces ont été hybridées par Ieurs régions complémentaires puis le produit d'hybridation obtenu a été amplifié par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), à l'aide des amorces ci-dessus, correspondant aux extrémités 5' et 3' du gène Tat, flanquées des sites de restrictions Nco I ou Hind III. Le fragment d'amplification PCR a ensuite été digéré par Nco I et Hind III et le fragment de retriction de 304 pb ainsi obtenu a été cloné aux mêmes sites du vecteur d'expression pTriEx-1 (NOVAGEN) pout donner le plasmide recombinant dénommé p3X-TAT. Ce vecteur permet l'expression de Tat dans E. coli, dans des cellules d'insectes ou des cellules de mammifères, sous le contrôle, respectivement, du promoteur T7, du promoteur p10, et d'un promoteur hybride entre l'activateur du promoteur précoce du cytomégalovirus et le promoteur de la ss-actine de poulet. 3) Préparation de dimères de Tat Les dimères covalents de Tat sont préparés par oxydation des résidus de cystéine en tampon phosphate de sodium 50 mM, pH 8, à température ambiante (environ 20 C). Les dimères non-covalents de Tat sont préparés par mise en contact d'une préparation de la protéine Tat ou d'un fragment de ladite protéine tel que défini ci-dessus, avec des cations polyvalents, de préférence divalents comme le zinc et le cadmium, à pH d'environ 6 à 9. Exemple 2: Immunogénicité de Tat 1) Méthodes a) Immunisation des souris Pour évaluer la réponse humorale, des souris BALB/c de 6 à 8 semaines (IFFA CREDO) ont reçu, soit par voie intrapéritonéale, soit par voie souscutanée à la base de la queue, 100 l d'une solution contenant 5 p.g de Tati 01, ou d'un dérivé de Tat, préparés comme décrits à l'exemple 1. Les protéines ont été préalablement dissoutes dans du PBS juste avant la préparation des émulsions avec de l'adjuvant de Freund ou de l'hydroxyde d'alumine (référence 77120, PIERCE). Une seconde injection a été réalisée après 14 jours et des échantillons de sang ont alors été prélevés à différents intervalles après cette immunisation. Pour les injections réalisées avec de l'adjuvant de Freund, Tat a d'abord été injecté dans une émulsion d'adjuvant complete puis dans une émulsion d'adjuvant incomplet. Pour évaluer la réponse cellulaire T en l'absence d'adjuvant, les souris BALB/c ont reçu deux injections à 14 jours d'intervalle de Tati 01 dans du PBS, par voie sous-cutanée à la base de la queue Les rates ont été prélevées 10 jours après l'immunisation des souris. b) Titrage des anticorps en ELISA La protéine Tat101 ou l'un de ses dérivés, préparés comme décrit à l'exemple 1, ont été adsorbés sur une plaque ELISA, pendant une nuit à +4 C, à raison de 0,1 g/puits dans du tampon phosphate 0,05 M, pH 7,4. Les plaques ont ensuite été saturées avec du tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4, contenant 0,3 % de sérum albumine bovine (BSA). Les antisérums ont été dilués en série dans le même tampon contenant 0,1 % de BSA et incubés dans les puits toute la nuit à 4 C. La fixation des anticorps est mesurée en utilisant un anticorps de chèvre anti-souris conjugué à la péroxidase et de 1'ABTS comme substrat. Les titres sont définis par la plus forte dilution de sérum pour laquelle la valeur d'absorbance est supérieure d'au moins 0,6 à celle du contrôle négatif constitué d'un mélange de sérums prélevés avant l'immunisation des souris. c) Test de stimulation des cellules T Les rates des souris immunisées ont été prélevées et dilacérées. Les splénocytes ont été mis en suspension dans un milieu de prolifération contenant 1% de sérum de veau foetal. Les cellules (5x105 cellules/puits) ont été cultivées à 37 C dans une atmosphère humide avec 7% de CO2, en présence de dilutions en série des différents antigènes. La présence d'IL-2 dans les surnageants de culture a été déterminée après une période de 24 heures en mesurant la prolifération d'une lignée de cellules T cytotoxiques dépendante de l'IL- 2 (CTLL), en utilisant de la thymidine tritiée ([3H] TdR, 5 Ci/mmole, AMERSHAM). La prolifération des cellules a été mesurée après 3 jours de culture, suivis d'une incubation de 18 heures en présence de méthyl 3H thymidine. Les données sont exprimées en coups par minutes (cpm). 2) Résultats a) Réponse humorale Dans un premier temps, la réponse en anticorps anti-Tat a été analysée chez des souris BALB/c immunisées avec la protéine Tati 01 préalablement émulsifiée avec de l'hydroxyde d'alumine ou de l'adjuvant de Freund. La figure 1 montre qu'une réponse anticorps anti-Tat est observée chez les souris immunisées avec le mélange contenant de l'hydroxyde d'alumine mais que les titres sont approximativement 10 fois plus élevés lorsque la protéine est injectée avec de l'adjuvant de Freund. Dans un deuxième temps, pour déterminer si Tat peut induire une réponse immunitaire en l'absence d'adjuvant, des souris BALB/c ont été immunisées avec la protéine Tati 01 dans du PBS, soit par voie intrapéritonéale, soit par voie sous- cutanée. Comme contrôle positif, deux autres groupes de souris ont été immunisées avec la protéine Tati 01 préalablement émulsifiés dans de l'hydroxyde d'alumine. La figure 2 montre qu'une réponse anticorps anti- Tat est observée lorsque Tati 01 est injectée en l'absence d'adjuvant. De façon surprenante, la réponse immunitaire la plus élevée a été obtenue lorsque Tati 01 est injectée seule par la voie sous-cutanée alors que cette voie est peu efficace lorsque la protéine est préalablement mélangée avec de l'hydroxyde d'alumine. Au contraire, les injections intrapéritonéales induisent des réponses en anticorps anti-Tat similaires, en présence ou en l'absence d'adjuvant. Ensuite, dans le but de comparer le pouvoir immunogène de Tat en l'absence d'adjuvant à celui d'autres antigènes protéiques, des souris BALB/c ont été immunisées avec Tati 01, du lysozyme d'oeuf de poule (HEL), de l'ovalbumine (OVA) ou de la glutathion-S-transférase (GST) Seule la protéine Tati 01 est capable d'induire une réponse en anticorps en l'absence d'adjuvant, indiquant que le pouvoir immunogène en l'absence d'adjuvant est une propriété particulière de Tat que ne possède pas d'autres antigènes protéiques. Enfin, pour évaluer la réponse en anticorps anti-Tat chez des souris nonconsanguines, deux groupes de quatre souris SWISS ont été immunisées avec 5 ou 50 g de Tati 01 dans du PBS. Un très faible titre en anticorps a été observé avec une injection de 5 g d'antigène Tat (1/60, 14 jours après la seconde immunisation), mais une réponse humorale significative a été observée lorsque 10 fois plus de protéine ont été utilisés (1/1650 et 1/850 à 14 et 28 jours). En conséquence, l'aptitude à induire une réponse immunitaire humorale en l'absence d'adjuvant n'est pas liée au fond génétique des souris utilisées. b) Réponse cellulaire T La capacité de Tat à induire une réponse cellulaire T en l'absence d'adjuvant a été analysée chez des souris BALB/c. Des souris BALB/c ont été immunisées par deux injections, par voie sous-cutanées, de Tati01 dans du PBS. Dix jours après la seconde injection, les rates ont été prélevées et la capacité des splénocytes à sécréter de l'IL-2 et à proliférer en présence de Tati 01 a été analysée. La figure 3 montre que les cellules de souris immunisées produisent de l'IL-2 lorsqu'elles sont incubées en présence de Tati 01 mais pas en présence de HEL. Au contraire, aucune sécrétion d'IL-2 n'a été observée avec les splénocytes de souris naïves. Bien qu'ils sécrètent de VIL-2, les splénocytes des souris immunisées avec Tat ne prolifèrent pas en présence de Tat (figure 3B). La raison de cette différence entre la production d'IL-2 et la prolifération reste inconnue. Cependant, les résultats indiquent que, en l'absence d'adjuvant, Tat peut induire des cellules T spécifiques qui sont fonctionnelles pour la sécrétion d'IL-2. Exemple 3: Cartographie des épitopes B de Tat en présence ou en l'absence d'adjuvant 1) Méthode Dix huit peptides synthétiques chevauchants de Tati 01 d'une longueur de 15 acides aminés chacun, préparés comme décrit à l'exemple 1, ont été adsorbés sur une plaque ELISA, pendant une nuit à + 4 C, à raison de 1 g/puits dans du tampon phosphate 0,05 M, pH 7,4. Les plaques ont ensuite été saturées avec du tampon phosphate 0,01 M, pH 7,4 contenant 0,3 % de BSA. Les antisérums prélevés chez les souris BALB/c immunisées avec Tati01 dans du PBS, dans de l'hydroxyde d'alumine ou dans de l'adjuvant de Freund, ont été dilués en série dans le même tampon contenant 0,1 % de BSA et incubés dans les puits, toute la nuit à 4 C. La fixation de l'anticorps a été mesurée à l'aide d'un anticorps de chèvre anti-souris conjugué à la peroxydase et de l'ABTS comme substrat. 2) Résultats La figure 4A montre que les sérums de souris immunisées avec Tat sans adjuvant lient principalement les peptides 1 et 2, et dans une moindre mesure le peptide 18, indiquant que la région 1-20 de Tati 01 est une région B immunodominante lorsque la protéine est injectée en l'absence d'adjuvant. La reconnaissance supplémentaire des peptides 15 et 16 par les sérums des souris immunisées avec Tat préalablement mélangée avec de l'adjuvant de Freund ou de l'hydroxyde d'alumine indique que d'autres sites antigéniques sont localisés dans la région 71-90 (Figure 4B et 4C). La mise en évidence d'autres épitopes dans la région 71-90 est peut-être en relation avec une dénaturation de l'immunogène par les adjuvants. Exemple 4: Identification des déterminants moléculaires de Tat impliqués dans sa capacité à induire une réponse immunitaire en l'absence d'adjuvant 1) Méthode Pour identifier les déterminants moléculaires impliqués dans la propriété auto-adjuvante de Tati 01, des mutations ont été introduites dans les régions de Tat responsables de certaines de ses propriétés biologiques et immunologiques. La plupart des activités de Tat impliquent des déterminants moléculaires localisés dans cinq régions distinctes de la molécule: la région N terminale (positions 1 à 9), la région riche en cystéine (positions 22-37), le core (postions 38-48), la région basique (positions 49-57) et la région de liaison aux intégrines (positions 78-80). Une série de cinq dérivés de Tat, chacun étant substitué dans l'une des régions précitées, a été préparée (figure 5A). L'acide aspartique en position 5 et la proline en position 6 ont été respectivement substitués par une isoleucine et une leucine dans le dérivé TatlO1D5I,P6L. Les 7 résidus de cystéines ont été substitués par 7 sérines dans le dérivé Tati 0 1 C(22-37)S. Les résidus chargés et hydrophobes du core ont été remplacés par des glutamines, tandis que les résidus de sérine et de thréonine ont été substitués par des alanines dans le dérivé Tati 01 core. Les 25 résidus de lysine et les 6 résidus d'arginine de la région basique ont été substitués par 8 glutamines dans le dérivé Tati 0lpolyQ. Enfin, la séquence RGD de liaison aux intégrines a été remplacée par une séquence KGE incapable de se lier aux intégrines, dans le dérivé Tati 01 RDG,KGE. Des groupes de quatre souris BALB/c ont ensuite été immunisées avec Tati01 ou ses dérivés dans du PBS, par deux injections à 14 jours d'intervalle, par voie sous-cutanée. La réponse en anticorps anti-Tat a été analysée en ELISA, à différents temps après la seconde injection. 2) Résultats La figure 5B montre que les dérivés Tat101 polyQ et Tati 01 RDG,KGE, sont aussi immunogènes que Tati 01 de type sauvage, indiquant que la région basique et la séquence de liaison aux intégrines ne sont pas impliquées dans la propriété auto-adjuvante. Au contraire, la légère diminution de la réponse anticorps observée avec Tati 01 D5I,P6L, 14 jours après la seconde immunisation, et l'absence de réponse observée avec Tat1Olcore et Tati 01 C(22-37)S (figure 5B et 5C) indiquent que le phénomène implique principalement la région du core et la région riche en cystéines de la molécule, et dans une moindre mesure, la partie Nterminale de Tati 01. Exemple 5: Rôle des cystéines dans la propriété auto-adjuvante de Tat 1) Méthode a) Obtention de dérivés de Tat substitués au niveau des résidus de cystéine Afin de définir plus précisément le rôle des différentes cystéines dans la propriété auto- adjuvante de Tat, l'immunogénicité d'une autre série de 3 dérivés de Tat a été analysée de façon similaire à celle des dérivés de l'exemple 4. Dans le dérivé Tati 01 C(25,27)S, les cystéines 25 et 27, qui forment un motif de chimiokines CXC impliqué dans l'antagonisme de CXCR4 chez l'homme, ont été substituées par deux sérines. Dans le dérivé Tati 01 C(30,31)S, les cystéines 30 et 31 qui forment un motif de chimiokines CC impliqué dans le chimiotactisme des monocytes et des polynucléaires, on été remplacés par deux sérines. Dans le dérivé Tati 01 C(22,34,37)S, les trois cystéines on été substituées par trois sérines. b) Analyse électrophorétique de Tat et des dérivés de Tat La protéine Tat et ses dérivés ont été séparés par électrophorèse sur un gel constitué d'un polymère non-réticulé formant des pores dynamiques et analysés sur un bioanalyseur (Agilent 2100, AGILENT TECHNOLOGIES), à l'aide du kit Protein 50 Plus LabChip (AGILENT TECHNOLOGIES). Les puces ont été préparées selon le protocole fourni par le fabricant; les canaux de la puce ont été remplis avec le mélange de gel et de marqueur fluorescent utilisé pour la détection des protéines. Tati 01 et ses dérivés ont été dissous dans du tampon PBS, puis dénaturés en présence de SDS, à 95 C, pendant 7 minutes avant leur chargement sur la puce. En parallèle, une fraction de la solution de Tati01 a été incubée en présence d'un excès d'agent réducteur, puis en présence de SDS et de ss-mercaptoéthanol à 95 C pendant 7 minutes, et enfin chargée sur la puce. La puce a ensuite été chargée sur le bioanalyseur et chaque échantillon a été séparé dans le canal de séparation et détecté par mesure de la fluorescence (670 nm-700 nm) en 45 secondes. Les résultats obtenus sont présentés sous la forme d'un électrophorégramme avec le temps en abscisse et les unités de fluorescence en ordonnées. 2) Résultats La figure 6 montre que, les réponses en anticorps anti-Tat obtenues avec Tat 101 C(25,27)S et Tati 01 C(30,31)S ne sont pas significativement différentes de celle obtenue contre la protéine de type sauvage. A l'inverse, lorsque Tati 01 c(22,34,37)s est utilisée comme immunogène, la réponse en anticorps anti-Tat est significativement diminuée (p Etant donné que les cystéines s'oxydent spontanément et peuvent donc contribuer à la formation de ponts disulfures intra- ou intermoléculaires, la corrélation entre la propriété auto-adjuvante de Tati01 et la tendance de Tat à former des oligomères médiés par des ponts disulfures a été analysée. L'électrophorégramme de Tat sauvage et du dérivé Tati 01 C(22- 37)S substitué par des cystéines non immunogènes montre une relation entre la propriété auto-adjuvante et la présence de formse oligomériques de la molécule. Ainsi, Tati 01 C(22-37)S qui est dépourvu d'activité auto-adjuvante, est constitué d'une forme monomérique homogène (Figure 7A). En revanche, Tati01 est constitué d'une forme monomérique et de deux formes oligomériques (Figure 7A). De plus, ces formes oligomériques ne sont pas observées lorsque Tati01 est incubée en présence d'un excès d'agent réducteur, ce qui indique que les oligomères résultent de la formation spontanée de ponts disulfures intermoléculaires (Figure 7A). Pour corroborer l'hypothèse du rôle de l'oligomérisation médiée par des ponts disulfures dans la propriété auto-adjuvante, il a été vérifié que le dérivé Tati 01 C(22-37)S monomérique non immunogène pouvait devenir immunogène en l'absence d'adjuvant lorsqu'il devenait dimérique. Pour ce faire, le résidu de sérine 34 de Tati 01 C(22-37)S a été remplacé par une cystéine, dans le but de préparer un dimère médié par un pont disulfure (Tat101 C(22-31; 37)S,C34dimère). L'analyse en acides aminés et l'analyse par spectrométrie de masse montrent que le nouveau dérivé est totalement dimérique puisque Tati 01 C(22-31; 37)S,C34dimère migre en une seule bande correspondant à un dimère Tat (ligne 3, figure 7A), qui est réduite en présence d'un excès d'agent réducteur (ligne 6). L'immunogénicité de Tati 01, Tati 01 C(22-37)S et Tati 01 C(22-31; 37)S, C34dimère a ensuite été comparée chez des souris BALB/c. La figure 7B montre qu'aucune réponse en anticorps anti-Tat n'est observée avec Tati 01 C(22-37)S alors que Tati 01 C(22-31; 37)S,C34dimère induit une réponse humorale proche de celle observée avec la protéine Tat sauvage. En conséquence, un dérivé de Tat monomérique non immunogène peut devenir immunogène en l'absence d'adjuvant, à condition de former un dimère médié par un pont disulfure indiquant que la propriété auto-adjuvante de Tat résulte de son oligomérisation spontanée, médiée par un pont disulfure. Exemple 6: Analyse du rôle éventuel de la transactivation dans la propriété 25 auto-adjuvante de Tat101 1) Méthodes Un plasmide rapporteur, dénommé pLTR-G, comprenant le gène de la protéine fluorescente verte EGFP sous le contrôle transcriptionnel du LTR de VIH-1, a été construit et transfecté de façon stable dans des cellules Hela. De manière plus précise, la séquence du LTR de l'isolat AVR-2 du VIH-1 (Jones et al., Curr. Opin. Cell. Biol., 1993, 5, 461-468 et numéro d'accès GenBank K02007) couvrant les positions -137 à +58, relativement au site d'initiation de la transcription a été synthétisée selon la méthode décrite dans Stemmer et al., Gene, 1995, 164, 49-53. Le LTR synthétique ainsi obtenu a été été digéré par HindIll et SacII et cloné aux mêmes sites du plasmide pEGFP-1 (CLONTECH), en amont du gène EGFP dépourvu de promoteur, pour donner le plasmide pLTR-G. Des cellules Hela ont été transfectées de façon stable par le plasmide pLTR-G, clonées par dilution limite puis tranfectées de façon transitoire par un plasmide exprimant Tati 01. Le clone surexprimant le mieux LEGFP en présence de Tat101 a été sélectionné. La lignée de cellules Hela transfectées de façon stable par le plasmide rapporteur a ensuite été transfectée de façon transitoire, avec un plasmide d'expression, soit de la protéine Tat sauvage, soit pour l'un de ses mutants (300 ng de plasmide pour 2x104 cellules), tel que décrit à l'exemple 1. Après 45 heures d'incubation à 37 C, la fluorescence des cellules transfectées a été analysée en cytométrie de flux. 2) Résultats L'activité principale de Tat étant la transactivation du génome viral, la relation entre l'effet auto-adjuvant de Tat et l'activité de transactivation a été étudiée. La figure 8 montre que 1EGFP est surexprimée dans les cellules Hela transfectées avec les plasmides codant pour des molécules Tat immunogènes, Tati 01 et Tati 01 RGD,KGE, indiquant que ces cellules sont actives pour la transactivation. L'EGFP n'est pas exprimée dans les cellules transfectées avec le plasmide codant pour le dérivé non immunogène Tati 01 C(22-37)S mais aussi pour celui qui code pour les dérivés immunogènes Tati 01 C(25,27)S, Tati 01 C(30,31)S et Tati01polyQ. En conséquence, l'effet auto-adjuvant n'est pas lié ä l'activité de transactivation de Tat. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Composition vaccinale anti-VIH comprenant un antigène Tat, caractérisée en ce que ledit antigène est constitué d'un homo- ou hétérodimère de protéine(s) Tat et/ou ou de fragment(s) d'au moins 20 acides aminés desdites protéines. 2 ) Composition vaccinale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le dimère de Tat est formé par l'association covalente desdites protéines Tat et/ou desdits fragments. 3 ) Composition vaccinale selon la revendication 2, caractérisée en ce que le dimère de Tat comprend au moins une liaison disulfure intermoléculaire. 4 ) Composition vaccinale selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite liaison disulfure intermoléculaire implique des résidus de cystéine desdites protéines Tat et/ou desdits fragments. 5 ) Composition vaccinale selon la revendication 4, caractérisée en ce que lesdits résidus de cystéine sont choisis parmi ceux situés en position 22, 25, 27, 30, 31, 34, et 37 de la séquence en acides aminés de Tat, de préférence parmi les résidus de cystéine en position 22, 34 et 37. 6 ) Composition vaccinale selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisée en ce que les résidus de cystéine de Tat qui ne sont pas impliqués dans ladite liaison disulfure intermoléculaire sont bloqués par une liaison ou une interaction ou substitués par un autre résidu d'acide aminé ne comprenant pas de groupement sulfhydrile. 7 ) Composition vaccinale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le dimère de Tat est formé par l'association non-covalente de protéine(s) Tat 25 et/ou de fragment(s) desdites protéines. 8 ) Composition vaccinale selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite association non-covalente est formée par l'intermédiaire de cations polyvalents, de préférence divalents comme notamment le zinc ou le cadmium. 9 ) Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que lesdites protéines Tat et les fragments desdites protéines sont préalablement inactivés, notamment par substitution d'au moins un des résidus de cystéine en position 22, 25, 27, 30, 31, 34 et 37, en sérine, de préférence d'au moins un des résidus de cystéine en position 25, 27, 30 et 31. 10 ) Composition vaccinale selon la revendication 9, caractérisée en ce que, le dimère de Tat est formé de l'association par un pont disulfure entre les résidus de cystéine en position 34, de protéines Tat et/ou ou de fragments desdites protéines incluant la substitution des six résidus de cystéine en position 22, 25, 27, 30, 31 et 37, en sérines. Il') Composition vaccinale selon la revendication 9, caractérisée en ce que, le dimère est formé de l'association par un pont disulfure entre les résidus de cystéine en position 22, de protéines Tat et/ou ou de fragments desdites protéines incluant la substitution des six résidus de cystéine en position 25, 27, 30, 31, 34 et 37, en sérines. 12 ) Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ledit fragment de Tat inclus au moins un 15 épitope B et un épitope T immunodominants. 13 ) Composition vaccinale selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit épitope B immunodominant est situé dans le domaine N-terminal (positions 1 à 21) et/ou ledit épitope T immunodominant est situé dans le domaine central (positions 38 à 48). 14 ) Composition vaccinale selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisée en ce que lorsque le dimère de Tat est constitué par l'association non-covalente de fragment(s) de Tat ou d'un fragment de Tat avec une protéine Tat, par l'intermédiaire de cations polyvalents, de préférence divalents, tel que défini à la revendication 8, le ou lesdit(s) fragment(s) incluent également le domaine riche en cystéines (positions 22 à 37). 15 ) Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que ledit fragment de Tat comprend de 20 à 50 acides aminés, de préférence, entre 25 et 35 acides aminés. 16 ) Composition vaccinale selon la revendication 15, caractérisée 30 en ce que ledit fragment de Tat est choisi parmi: le fragment 1 à 86 et le fragment 1 à 48. 17 ) Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que ledit antigène Tat dimérique dérive de la protéine de séquence SEQ ID NO: 1 et/ou d'un fragment d'au moins 20 acides aminés de cette séquence. 18 ) Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un autre antigène du VIH, notamment Rev, Nef, Gag, Env ou un fragment d'au moins 11 acides aminés desdits antigènes. 19 ) Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un antigène Tat dimérique tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 17, d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et/ou d'une substance porteuse, et éventuellement d'un autre antigène du VIH, tel que défini à la revendication 18. 20 ) Antigène Tat dimérique tel que défini à l'une quelconque des 15 revendications 1 à 17 comme vaccin pour la prévention et/ou le traitement d'une infection par le VIH chez l'Homme. 21 ) Utilisation d'un antigène Tat dimérique tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 17, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention et/ou au traitement d'une infection par le VIH chez l'Homme. 22 ) Dimère de Tat isolé, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par: a) un hétérodimère de protéines Tat ou de fragments desdites protéines, tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 17, b) un homodimère de fragments de Tat, tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 17, à l'exclusion du dimère noncovalent du fragment 1-86 de HIV formé par l'intermédiaire de zinc ou de cadmium, et c) un homodimère de protéines Tat telles que définies à la revendication 10 ou 11 ou un hétérodimère d'une protéine Tat et d'un fragment de Tat, tels que définis à la revendication 10 ou 11.