FR 2852967 A1 20041001 FR 0303700 A 20030326 L'invention concerne un procédé d'obtention de cellules Tr1 à partir de cellules T grâce à des cellules dendritiques spécialisées, qui sont également objets de l'invention. L'induction d'une tolérance spécifique est cruciale pour le maintien de l'homéostasie immunitaire et la prévention des réactions auto-immunes. Il existe plusieurs mécanismes non redondants et non exclusifs par lesquels le système immunitaire distingue le soi du non-soi ou les antigènes étrangers banals des antigènes nocifs. Dans le thymus, la tolérance centrale est un mécanisme bien établi qui implique une délétion des cellules T autoréactives après interaction avec des cellules dendritiques (DC) dérivées de la moëlle osseuse. A la périphérie, les mécanismes impliqués sont l'induction de la mort cellulaire, le développement d'un état de non-réactivité (anergie) des cellules T, et une suppression active par les cellules T régulatrices (Tr) (Groux et al., 1997, Nature 389, 737-742). Toutefois, les mécanismes par lesquels les cellules Tr se forment in vivo et exercent leurs effets immunorégulateurs restent à définir et font l'objet d'intenses recherches. Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules présentatrices d'antigènes (CPA) "professionnelles", spécialisées dans la capture, le traitement et le transport de l'antigène vers les organes lymphoïdes, où elles sensibilisent les cellules T spécifiques "naïves" (n'ayant jamais rencontré l'antigène). Les DC ont également un rôle important dans le contrôle de la réponse immune adaptive, étant donné que des sous-ensembles distincts de DC, selon leur phénotype et leur maturation fonctionnelle, induisent des réponses Th différentes. Elles sont capables d'activer des cellules auxiliaires CD4+ et des cellules tueuses CD8+ in vivo. Toutefois, compte tenu de la diversité des DC localisées au sein d'un même organe lymphoïde, l'on ne sait toutefois pas quelles sont les populations de DC qui sont capables d'induire ou de participer au mécanisme de tolérance immunitaire. Les inventeurs ont précédemment montré que les cellules T CD4+ humaines et murines, stimulées de façon réitérée en présence d'IL-10, se différencient en un nouveau sous-ensemble de cellules T CD4+, appelées cellules Tri (T regulatory 1) (WO 97/42324). Ces cellules T ont une faible réponse proliférative, sont fortement sécrétrices d'IL-10 et régulent les réponses Thl et Th2 in vitro et in vivo. Ces cellules Tri sont particulièrement intéressantes pour le traitement de maladies autoimmunes et/ou inflammatoires, lorsque l'on désire moduler le système immunitaire. Les maladies auto-immunes sont dues à une dérégulation du système immunitaire, qui se traduit par une réponse immune indésirable d'un organisme vis- à-vis de ses propres antigènes. On a tenté de manipuler les antigènes à l'origine de ces pathologies ou les cellules T agressives spécifiques de ces antigènes, mais les résultats obtenus ont souvent été très limités notamment par l'absence d'une connaissance de tous les antigènes impliqués dans la pathologie concernée. En effet, les auto antigènes proprement dits, ou les antigènes responsables des désordres inflammatoires et auto-immuns ne sont pas toujours connus, ou peuvent être différents d'un individu à l'autre (part de l'héritage génétique). Les traitements utilisés actuellement dans ces maladies sont soit des traitements palliatifs (insuline dans le cas du diabète, anti-histaminique dans le cas des désordres allergiques) soit des traitements systémiques par des antiinflammatoires (AINS) et/ou des immunosuppresseurs (glucocorticoïdes, cyclosporine, anticorps...). Il y a donc clairement un besoin pour un traitement immunosuppresseur puissant mais limité à l'organe atteint ou plus précisément à la zone d'hyperactivité du système immunitaire. Parmi les nombreux agents impliqués dans la régulation de la réponse immune, on citera les lymphocytes T CD4+, également dénommés lymphocytes T auxiliaires (T helpers). On distingue classiquement 2 types principaux de lymphocytes T auxiliaires : lymphocytes Thl, impliqués dans le développement de la réponse immune cellulaire, produisent des cytokines pro-inflammatoires telles que l'interleukine-2 (IL-2) et l'interféron gamma (IFNy) et présentent des effets activateurs des macrophages ; lymphocytes Th2, qui produisent des cytokines telles que les interleukines IL-4, IL-6, IL-10 et IL-13, favorisent la sécrétion d'anticorps. Les cellules Tri, lorsqu'elles sont re-stimulées par l'antigène utilisé pour leur induction, ne prolifèrent que faiblement, produisent des quantités très élevées d'IL-10, de très faibles quantités d'IL-2, et ne produisent pas d'IL-4. Lorsque des cellules Tr1 activées sont cultivées en présence d'autres cellules T CD4+ elles suppriment la prolifération de celles-ci en réponse à un antigène ; effet résulte de la sécrétion de cytokines, et notamment d'IL-10, par les lymphocytes Tr, et non d'une action directe de ceux-ci sur les cellules T CD4+ ; peut donc être obtenu sans avoir à connaître l'antigène responsable de la prolifération de ces cellules. Ceci présente un avantage important dans le cas de maladies auto-immunes, dont on peut ainsi envisager le traitement sans qu'il soit nécessaire de connaître l'antigène exact contre lequel sont dirigées les cellules pathogéniques. Il a ainsi été observé, dans un modèle expérimental de maladie de Crohn chez la souris dans lequel les cellules pro-inflammatoires sont dirigées contre des bactéries commensales de la flore digestive, que l'administration aux animaux des cellules Tr1 dirigées contre l'ovalbumine, accompagnée de l'administration d'ovalbumine dans la nourriture, permettait de prévenir l'instauration d'une inflammation chronique du colon. D'autre part, dans des travaux sur différents modèles animaux de maladie de Crohn, de sclérose en plaques, ou de réaction du greffon contre l'hôte, les inventeurs ont montré que les cellules inhibitrices Tri étaient capables non seulement de prévenir, mais aussi de guérir ces différentes pathologies. Des cellules Tri obtenues à partir des cellules T d'un patient sont donc potentiellement utilisables dans le cadre d'une thérapie cellulaire pour réguler la réponse immunitaire chez ce patient. Elles sont ainsi utilisables notamment pour prévenir ou soigner, non seulement les maladies auto-immunes et inflammatoires mentionnées ci-dessus, mais également toute autre pathologie caractérisée par une réponse inflammatoire aberrante, comme le diabète, le psoriasis, l'athérosclérose, la polyarthrite rhumatoïde ou l'asthme ; sont également utilisables dans le traitement des rejets de greffe ou de la réaction du greffon contre l'hôte. Ainsi, parmi les maladies auto-immunes dans lesquelles des cellules Tri peuvent être utilisées, on cite les maladies choisies dans le groupe constitué de l'hépatite active chronique, la maladie d'Addison, le syndrome anti-phospholipide, l'allergie atopique, la gastrite atrophique auto-immune, l'achlorhydrie autoimmune, la maladie céliaque, la maladie de Crohn, le syndrome de Cushings, la dermatomyosite , le diabète de type I, le lupus discoïde, l'érythématose, le syndrome de Goodpasture, la maladie de Grave, la thyroïdite d'Hashimoto, l'atrophie adrénale idiopathique, le diabète insulinodépendant, le syndrome de Lambert-Eaton, l'hépatite lupoïde, certains cas de lymphopénie, la sclérose en plaques, le pemphigus vulgaris ou foliacé, le pemphigoïde bulleux, l'anémie pernicieuse, l'uvéitite phacogénique, la polyarthrite, la cirrhose biliaire primaire, la cholangite sclérosante primaire, le psoriasis, le syndrome de Reiter, la polychondrite, l'arthrite rhumatoïde, le syndrome de Schmidt, la sclérodermose, le syndrome de Sjogren, le Lupus Erythémateux Systémique, l'artérite de Takayasu, l'artérite temporaire, la thyrotoxicose, la résistance à l'insuline de type B , la colite ulcérative, la granulomatose de Wegener, la myasthénie gravis, la maladie de Guillain-Barré, l'uréite auto-immune, l'anémie auto-immune hémolytique, la thrombocytopénie auto-immune, l'oophorite auto-immune, la maladie de Behcet, la dermatite herpétiforme, la polymyosite, la dermatomyosite, les spondyloarthropathies comme la spondylite ankylosante, le vitiligo. La méthode d'obtention des lymphocytes Tr1 qui est décrite dans la publication d'un inventeur (Groux et al, Nature, 389,737-742, 1997), nécessite une stimulation répétée des cellules T avec l'antigène en présence d'IL-10. Cette méthode est relativement lourde à mettre en #uvre, et ne permet pas d'obtenir rapidement, à partir d'un patient, une population de lymphocytes Tr1 utilisable dans le cadre d'un traitement thérapeutique. On recherche ainsi toujours des procédés d'obtention de cellules Tr1 en quantité importante des cellules Tr1. L'invention vise ainsi à obtenir in vitro, ou in vivo, des cellules Tri actives. On connaît différents procédés d'obtention de cellules dendritiques à partir de moelle osseuse. Par exemple le brevet US 5,851,756 décrit l'obtention de cellules dendritiques à partir de cellules précurseurs en présence de GM-CSF, de MCSF, de TNF-alpha, d'IL3, d'IL-1alpha, d'IL-6. Mais cette demande ne décrit ni ne suggère la capacité de certaines CD à induire la différenciation de cellules T en cellules Tr1. Or, précisément, de manière surprenante et avantageuse, les inventeurs ont réussi à démontrer que des cellules dendritiques obtenues à partir de cellules précurseurs de moelle osseuse, sont capables d'induire la différenciation de cellules T en cellules Tr1, et de les obtenir ainsi en quantité suffisante pour un traitement thérapeutique. Ainsi, selon un premier aspect, l'invention concerne ainsi un procédé d'obtention in vitro d'une population de cellules dendritiques humaines capables d'induire la différenciation de cellules T humaines en cellules Tr1, à partir de cellules progénitrices humaines capables de se différencier en cellules dendritiques comprenant : - la culture desdites cellules progénitrices en présence d'IL-10 (interleukine 10), pour obtenir ladite population de cellules dendritiques. L'invention se rapporte également à un procédé de différentiation in vitro de cellules T humaines en cellules Tr1, comprenant : - la mise en #uvre du procédé d'obtention in vitro d'une population de cellules dendritiques capables d'induire la différenciation de cellules T en cellules Tr1, pour obtenir une population de cellules dendritiques, - la mise en présence desdites cellules T avec ladite population de cellules dendritiques. De préférence, un antigène est présent lors de la seconde étape. De préférence, lesdites cellules progénitrices sont des cellules issues de la moelle osseuse. L'homme du métier connaît les protocoles permettant d'isoler des cellules progénitrices de cellules dendritiques de la moelle osseuse, et on peut notamment se référer à Inaba et al. (1992, J Exp Med 176, 1693). Dans un autre mode de réalisation, lesdites cellules progénitrices sont directement issues de la circulation périphérique. Dans un mode préféré de réalisation, le milieu de culture comprend en outre du GM-CSF (granulocyte/macrophage colony stimulating factor, facteur stimulateur de colonies de granulocytes-macrophages) et/ou une cytokine choisie parmi l'interleukine 4 (IL-4) ou l'interleukine 13 (IL-13).. Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, le milieu de culture comprend les quantités suivantes de facteurs de croissance : GM-CSF : 5 à 50 ng/ml, IL-4 ou IL-13 : 2 à 5 ng/ml, IL-10:300à600ng/ml. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir une population de cellules dendritiques spécifiques, qui induisent une tolérance périphérique des cellules T. Ces cellules dendritiques présentent un phénotype différent des cellules dendritiques obtenues par maturation de cellules progénitrices en l'absence d'IL-10. Ainsi, le procédé selon l'invention peut également être caractérisé en ce que plus de 15 %, de préférence plus de 20 %, de façon plus préférée plus de 22 %, ou 25 % des cellules dans ladite population de cellules dendritiques est CMH II-CD80CD86low. Une cellule est dite CMH II-CD80-CD86 W lorsqu'elle présente un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II, de CD80 et CD86 inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10. On envisage en particulier une densité de ces molécules, à la surface des cellules, 5 fois moins importantes chez les cellules selon l'invention, de façon préférée 10 fois moins importante que sur les cellules obtenues en l'absence d'IL-10 Le procédé selon l'invention permet également d'obtenir une population de cellules dendritiques telle que plus de 15 %, de préférence plus de 20 %, de façon plus préférée plus de 22 %, ou 25 % des cellules dans ladite population présente un faible niveau d'expression de CD 11 c, CD 11 b, CD 14, une non expression de CD4 et pTa (par rapport aux cellules maturées en l'absence d'IL-10, lorsque ces molécules sont présentes sur les DC). Plus précisément, les cellules dendritiques obtenues par le procédé selon l'invention présentent une morphologie plasmacytoïde, la faible expression des molécules CMH II, et de faibles niveaux d'expression de molécules de costimulation, même après une activation in vitro avec du LPS. En particulier, les cellules obtenues secrètent des niveaux élevés d'IL-10 après activation. Des expériences chez la souris ont permis de déterminer que l'on peut trouver les DC obtenues en grand nombre par le procédé selon l'invention dans la rate et les ganglions de souris normales, et qu'elles sont en quantité accrue dans la rate de souris transgéniques pour l'Il- 10 (ILIO-Tg). Notons que chez la souris, ces DC sont CD45+RB hi et présentent un faible niveau d'expression de CDl lc, CDllb, Dec205, une absence de CD8alpha et de B220. Ces cellules dendritiques CD45+RB hi sont matures et stables (conservant le phénotype mature pendant au moins trois jours lorsqu'elles sont cultivées en absence de cytokines). Le procédé selon l'invention permet d'obtenir un nombre suffisant de cellules dendritiques matures permettant la différentiation in vitro de cellules T en cellules Tr1. L'invention se rapporte aussi à une population de cellules dendritiques matures ou immatures, susceptibles d'être obtenues par un procédé selon l'invention, caractérisée en ce que plus de 15 %, de préférence plus de 20 %, de façon plus préférée plus de 22 %, ou 25 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II, de CD80 et CD86 inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10. Ladite population est bien entendu une population isolée de cellules, c'est-àdire qu'elle n'est pas dans son environnement naturel. Les inventeurs ont pu observer que les cellules dendritiques présentant une faible expression des molécules CMH II et CD 86 n'évoluent pas lorsqu'elles sont stimulées avec le LPS (lippopolysaccharide). Notamment, alors que l'ajout de cette molécule induit une augmentation d'expression des molécules de présentation d'antigène et des molécules co-stimulatrices des cellules T pour les cellules dendritiques obtenues en l'absence d'IL-10, les cellules dendritiques obtenues par le procédé selon l'invention ne réagissent pas. Ainsi, dans un autre mode de réalisation, l'invention se rapporte à une population de cellules dendritiques matures ou immatures, susceptibles d'être obtenues par un procédé selon l'invention, caractérisée en ce que plus de 15 %, de préférence plus de 20 %, de façon plus préférée plus de 22 %, ou 25 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II et CD86, après stimulation par le LPS, inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10, et stimulées par le LPS. D'une façon plus générale, l'invention se rapport à une population de cellules dendritiques immatures ou matures, caractérisée en ce que plus de 15 %, de préférence plus de 20 %, de façon plus préférée plus de 22 %, ou 25 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II et CD86 inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10. L'invention se rapporte ainsi à une population de cellules dendritiques matures ou immatures, caractérisée en ce que plus de 15 %, de préférence plus de 20 %, de façon plus préférée plus de 22 %, ou 25 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II et CD86, après stimulation par le LPS, inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10, et stimulées par le LPS. L'invention se rapporte également à un procédé d'obtention in vitro de cellules Trl à partir de cellules T, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en présence desdites cellules T avec une population de cellules dendritiques selon l'invention Dans un mode de réalisation préféré, lesdites cellules sont d'origine humaine. L'invention se rapporte également à l'utilisation de cellules Tr1 obtenues in vitro par un procédé selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à être utilisé dans le traitement d'une maladie autoimmune ou inflammatoire. Une liste de maladies auto-immune a été donnée plus haut ; les maladies inflammatoires sont des maladies dans lesquelles on observe une infiltration de cellules mononucléaires, une prolifération de fibroblastes et de nouveaux vaisseaux sanguins, menant à une augmentation des tissus connectifs, et une destruction tissulaire. On note notamment les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. L'invention se rapporte également à l'utilisation d'une population de cellules selon l'invention, pour la préparation d'un médicament capable d'induire in vivo la différenciation de cellules T en cellules Trl actives pour le traitement d'une maladie autoimmune ou inflammatoire. Enfin, l'invention se rapporte à l'utilisation d'une population de cellules selon l'invention, lesdites cellules étant pulsées avec un antigène reconnu par des cellules du système immunitaire, en particulier des cellules T dans une maladie auto-immune ou inflammatoire, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ladite maladie auto-immune ou inflammatoire. En particulier, on peut utiliser un peptide de gliadine pour la maladie de Crohn, un antigène provenant de la myéline pour la sclérose en plaques. L'invention se rapporte également à une composition pharmaceutique contenant les cellules dendritiques selon l'invention, éventuellement avec un excipient pharmaceutiquement approprié. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'invention se rapporte à l'administration des cellules dendritiques selon l'invention chez un patient in vivo de manière à obtenir des cellules Trl différenciées, pour traiter une maldie autoimmune ou inflammatoire. L'invention concerne ainsi également un procédé d'obtention de cellules Trl chez un patient in vivo comprenant l'administration d'IL-10 audit patient, et éventuellement de GM-CSF et de TNF alpha, en quantité et pendant une durée suffisantes pour obtenir des cellules dendritiques CMH II-CD80-CD86Iow capables d'induire la différenciation des cellules T en cellules Trl. Enfin, l'invention concerne aussi une méthode de traitement d'une maladie autoimmune ou inflammatoire comprenant l'étape d'administration à un patient de cellules dendritiques selon l'invention, ou de cellules Trl obtenues in vitro à partir de cellules dendritiques selon l'invention. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : L'IL-10 induit la différenciation des cellules dendritiques CDl lc "CD45RB+ A) Des cellules de moëlle osseuse ont été cultivées avec du GM-CSF et du TNF-a en présence ou en l'absence d'IL-10 (50 ou 500 ng/ml) comme indiqué pendant 6 jours, puis activées pendant 24 h avec du LPS. Les cellules dendritiques de moëlle osseuse ainsi générées ont été colorées avec un anticorps anti-CD 11c biotinylé, puis avec un conjugué de streptavidine-peroxydase (PE). Les cellules ont ensuite été conjuguées à un anticorps anti-CD45RB couplé au FITC et analysées par cytométrie de flux. Les données représentent les résultats d'une étude représentative sur sept. B) Les cellules dendritiques ont été triées en fonction de l'expression de CDllc et de CD45RB, comme indiqué sur la figure lA. Les cellules triées indiquées ont été centrifugées et colorées au May Gründwald Giemsa. 1 - cellules dendritiques CD1 lclowCD45RB+ après 6 jours de différenciation, 2 - cellules dendritiques CDllclowCD45RB+ après activation par le LPS, 3 - cellules dendritiques CDllchlghCD45RB" après 6 jours de différenciation, 4 - cellules dendritiques CD1 lch''CD45RB+ après activation par le LPS. C) Les cellules dendritiques obtenues après différenciation in vitro en présence de GM-CSF et de TNF-a avec ou sans IL-10, ont été triées en fonction de l'expression de CD le et de CD45RB, comme indiqué sur la figure 1 A. Les cellules triées ont été colorées avec les anticorps marqués au FITC indiqués, et réanalysées au FACS ; elles ont également été stimulées par le LPS (1 g/ml) pendant 24 h, colorées avec les ACm indiqués et réanalysées. Les histogrammes hachurés représentent les cellules colorées avec les ACm témoins d'isotype correspondant. Les données représentent les résultats d'une expérience représentative sur trois. Figure 2 : des cellules dendritiques dérivées de l'IL-10 in vivo. A) Des cellules dendritiques (DC) spléniques de souris BALB/c ou C57B1/6 transgéniques pour l'IL-10, IL-10 -/- et normales ont été isolées, enrichies par déplétion cellulaire avec un cocktail d'anticorps (ACm anti-B220, Grl et CD3) et l'expression de surface du marqueur spécifique CD 11 a été analysée par cytométrie de flux. B) Des préparations de DC enrichies par déplétion cellulaire avec un cocktail d'anticorps (ACm anti-B220, Grl et CD3) ont été isolées de la rate de souris BALB/c ou C57B1/6 transgéniques pour l'IL-10, IL-10 -/- et normales et analysées pour l'expression de CDllc-cy5 et de CD45RB-PE afin de distinguer deux populations de DC séparées. Les pourcentages dans les différents quadrants sont indiqués. Les résultats - de plus de 10 expériences - sont typiques. Aucune différence n'a été observée entre les souris BALB/c non transgéniques et les témoins. C) Les cellules CD11clow CD45RB+ (1) et CD 11 ch'CD45RB- (3) triées isolées de la rate de souris BALB/c ont été centrifugées et colorées au MayGrünwald-Giemsa. Les cellules CD 11 c "'CD45RB+ (2) et CDl1chighCD45RB- (4) triées ont également été stimulées avec du LPS (1 g/ml) en présence de GM-CSF pendant 24 h, centrifugées et colorées au May-Grunwald-Giemsa. D) Des préparations enrichies de DC de souris BALB/c ou C57B1/6 IL-10 Tg ou témoins ont été colorées avec du CD 11 c-cy5 et du CD45RB-PE. Les cellules ont été triées au FACS en fonction de l'expression du CDllc WCD45RB+ ou du CD 11 ch''CD45RB- et réanalysées comme présenté. Les cellules triées ont ensuite été colorées avec le troisième marqueur couplé au FITC et analysées par cytofluorométrie (Histogrammes vides). Les DC triées ont également été stimulées avec du LPS (1 g/ml) en présence de GM-CSF pendant 24 h, colorées avec les ACm indiqués et réanalysées (histogrammes pleins). Les histogrammes hachurés représentent les ACm témoins d'isotype correspondant. Figure 3 : Caractérisation phénotypique et sécrétion de cytokines du sous- ensemble de cellules dendritiques CDllc "CD45RB+8220A) ) Pour comparer les cellules dendritiques CD 11 cl W CD45RB+ aux cellules plasmocytoïdes précédemment décrites exprimant faiblement le CD11c mais pas les marqueurs B220 et Grl, une analyse a été conduite sur des préparations de cellules dendritiques enrichies par déplétion cellulaire avec un cocktail d'anticorps contenant (ACm anti-CD19 et CD3). Les cellules dendritiques isolées de la rate de souris BALB/c ou C57B1/6 normales ont été analysées pour l'expression de CD11c-cy5 et de B220-PE. B) Des préparations enrichies de cellules dendritiques de souris BALB/c ou C57BL/6 ont été colorées avec le CDllc-cy5 et le B220-PE et marquées avec des anticorps couplés au FITC comme indiqué. Les cellules ont été triées en fonction de l'expression de CD 11 c WCD45RB+ (histogrammes pleins) ou de CD 1 I ch''CD45RB- (histogrammes vides, lignes droites) et la coloration pour le troisième marqueur a été analysée sur les différentes populations. Les histogrammes hachurés représentent les ACm témoins d'isotype correspondant. C) Des préparations de cellules dendritiques isolées de souris BALB/c, enrichies par un cocktail d'ACm anti-CD3, CD 19, ont été colorées avec du CD 11 c- cy5 et du B220-PE. Les cellules ont été triées au FACS en se basant sur l'expression de CDllclowB220+, CD 11 ch''B220- ou CDllchi. Les cellules triées ont ensuite été colorées avec le troisième marqueur couplé au FITC et analysées par cytofluorométrie (Histogrammes vides). Les cellules dendritiques triées ont également été stimulées par le CpG (luM) en présence de GM-CSF pendant 24 h, colorées avec les ACm indiqués et réanalysées (histogrammes pleins). Les histogrammes hachurés représentent les ACm témoins d'isotype correspondant. D-E) Profil de cytokines des différentes sous-populations de cellules dendritiques D) Dans une première série d'expériences, les sous-ensembles de cellules dendritiques CD 11 chghCD45RB (histogrammes vides) et CDllclowCD45RB+ (histogrammes pleins) ont été triés en fonction de l'expression de CD1 le et CD45RB à partir de cellules dendritiques spléniques enrichies avec un cocktail d'ACm anti-CD3, B220 et Grl . Les cellules CDllchighCD45RB- (histogrammes hachurés blancs) et CDllc WCD45RB+ (histogrammes hachurés noirs) triées ont également été stimulées avec du LPS (1 g/ml) en présence de GM-CSF pendant 24 h. Une RT-PCR quantitative en temps réel a été effectuée sur les différents échantillons et comparée à un témoin négatif pour chaque produit de transcription donné analysé. Les valeurs sont exprimées en facteurs d'augmentation de l'expression par rapport à un témoin négatif et représentent les moyennes ET de trois échantillons distincts. E) Une population de cellules dendritiques a également été préparée avec un cocktail contenant des ACm anti-CD3 et CD 19 et triée en fonction de l'expression de CDllc et B220. Les cellules ont été stimulées avec du LPS ou du CpG pendant 24 ou 48 h et le surnageant a été analysé comme indiqué, pour mesurer la sécrétion éventuelle d'IFN-a ou d'Il-10. Figure 4 : Les cellules dendritiques CDllc "CD45RB+ induisent la différenciation des cellules régulatrices Tr1 in vitro. A) Les cellules CDllc wCD45RB+ traitent et présentent l'antigène in vitro Des cellules T DO11-10 CD4+ ont été stimulées avec des DC CDllchi CD45RB- and CD1 lclow CD45RB+ triées en présence de peptide OVA (0.6 m) ou de protéine OVA (500 ou 250 g/ml comme indiqué). La réponse proliférative ou la sécrétion d'IFN-y a été analysée à J3 ou 48 h après stimulation, respectivement. Les résultats représentent la moyenne de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml pour l'IFN-y. Les données sont représentatives de 2 expériences distinctes avec des résultats similaires. B) Analyse des cytokines sécrétées par des populations de cellules T CD4+activées avec des cellules dendritiques triées ex vivo Des cellules T transgéniques DO11-10 OVA TCR "vierges" ont été différenciées pendant 3 semaines avec des DC triées CDllcCD45RB' (barres blanches) ou CDllclowCD45RB+ (barres noires), en présence de peptide OVA. Les cellules dendritiques ont été isolées de souris BALB/c normales à différents rapports DC/T comme indiqué. Après trois semaines de culture, les cellules T ont été récoltées et stimulées avec des splénocytes BALB/c irradiés et du peptide OVA (0,3 M). Quarante-huit heures plus tard, les cytokines ont été analysées par ELISA dans les surnageants de culture. Les résultats représentent la moyenne de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml pour l'IL-10 et l'IFN-y et en pg/ml pour l'IL-4. Les données sont représentatives de 5 expériences distinctes avec des résultats similaires. B) Cytokines sécrétées par des populations de cellules T CD4+ différenciées avec des cellules dendritiques dérivées in vitro Les cellules dendritiques ont été obtenues par culture de cellules de moëlle osseuse en présence de GM-CSF, de TNF-a et IL-10. Elles ont ensuite été triées en deux sous-ensembles: CDllchighCD45RB' et CDllclowCD45RB+. Les cellules dendritiques triées ont été utilisées pour différencier des cellules T CD4+ DO11-10 "vierges", dans un rapport DC/T de 1/20, en présence de peptide OVA (0,6 M). Au bout d'une semaine, les cellules T ont été récoltées et stimulées avec des CPA spléniques irradiées et du peptide OVA (0,3 M). Quarante-huit heures plus tard, les cytokines ont été analysées par ELISA dans les surnageants de culture. Les résultats représentent la moyenne de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml. Les données sont représentatives de deux expériences distinctes avec des résultats similaires. C) Dosage des cytokines intracellulaires de cellules T DO11-10 "vierges" stimulées avec du peptide OVA et des DC triées CDl l cl "'CD45RB+ ou CDl l ch'ghCD45RBLes cellules dendritiques CD 11 clowCD45RB+ et CD 11 chighCD45RB- ont été isolées de souris BALB/c normales, triées sur FACS et mises en co-culture avec des cellules T DO11-10 "vierges" en présence de peptide OVA. Sept jours plus tard, les cellules ont été récoltées et stimulées pendant 6 h avec des ACm anti-CD3 et CD28 réticulés. De la monensine a été ajoutée pendant les 4 dernières heures de culture. Les cellules ont ensuite été fixées et colorées pour le dosage des cytokines intracellulaires par ACm spécifiques couplés au FITC ou à la PE, comme indiqué. On présente ici une expérience représentative sur trois. D) Fonction régulatrice des cellules T différenciées avec des cellules dendritiques CD11clowCD45RB+ Dans le compartiment inférieur d'un système transwell, des cellules T CD4+ purifiées isolées de souris BALB/c normales ont été stimulées avec des splénocytes BALB/c irradiés et des ACm anti-CD3 (barres blanches). Dans le compartiment supérieur, des cellules T CD4+ différenciées par une stimulation unique avec des cellules dendritiques CD lclowCD45RB+ ou CD 11 ch'CD45RB- ont été stimulées par le peptide OVA et des splénocytes irradiés. Des expériences de co-culture ont également été conduites en présence d'ACm de souris anti-IL-10 (10 g/ml) (barres hachurées blanches), d'ACm de souris anti-TGF-B (40 g/ml) (barres noires) ou des deux (barres grises). Trois jours plus tard, le panier a été retiré et la réponse proliférative des cellules T CD4+ spectatrices a été mesurée après un pulse avec 0,5 Ci de 3H-thymidine pendant les 12 dernières heures de la culture de 72 h. Les résultats représentent les moyennes ET de trois mesures d'une expérience représentative sur trois. E) La sécrétion d'IL-10 n'est pas requise pour la différenciation des cellules Trl par les cellules dendritiques CDllclowCD45RB+ Des cellules T DO11-10 CD4+ "vierges" ont été différenciées pendant une semaine avec des cellules dendritiques CD 1 1 clowCD45RB+ en présence ou en l'absence de cellules T anti-ILlOR. Au bout d'une semaine, les cellules ont été récoltées et stimulées avec des splénocytes BALB/c irradiés et du peptide OVA (0,3 M). Quarante-huit heures plus tard, les cytokines ont été analysées par ELISA dans les surnageants de culture. Les résultats représentent la moyenne de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml pour l'IL-10 et l'IFN-y et en pg/ml pour l'IL-4. Les données sont représentatives de 5 expériences distinctes avec des résultats similaires. De même, des cellules T CD4+ "vierges" isolées de souris C57B1/6 ont été différenciées avec un ACm anti-CD3 soluble et des cellules dendritiques CDl1clowCD45RB+ triées isolées de souris IL-10-/- ou C57B1/6. Au bout d'une semaine, les cellules ont été récoltées et stimulées avec des splénocytes C57B1/6 irradiés et un ACm anti-CD3 soluble (10 g/ml). Quarante-huit heures plus tard, les cytokines ont été analysées par ELISA dans les surnageants de culture. Les résultats représentent la moyenne de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml pour l'IL-10 et l'IFN-y et en pg/ml pour l'IL-4. Figure 5 : Les cellules dendritiques CDllcl wCD45RB+ induisent la différenciation des cellules Trl in vivo. Des cellules dendritiques CDl lci wCD45RB+ ou CD 11 Chi triées isolées de souris BALB/c normales ont été chargées in vitro avec du peptide OVA et injectées par voie intraveineuse à des souris préalablement reconstituées avec des cellules T spécifiques du peptide OVA. Une semaine plus tard, la réponse proliférative (A) et la production de cytokines (B) des cellules T CD4+ spléniques stimulées par le peptide OVA (0,3 M) et les CPA spléniques irradiés ont été testées. La réponse proliférative a été mesurée par l'incorporation de 3H-thymidine pendant les 12 dernières heures d'une culture de 72 h. Pour les dosages de cytokines, les résultats représentent les moyennes de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml. Les données sont représentatives de trois expériences distinctes avec des résultats similaires. Figure 6 : Les cellules dendritiques CDllclowCD45RB+ induisent une tolérance in vivo Des cellules dendritiques CDllclowCD45RB+ ou CD 11 ch' triées, isolées de souris BALB/c normales ou différenciées in vitro comme indiqué, ont été chargées in vitro avec du peptide OVA et injectées par voie intraveineuse à des souris préalablement reconstituées avec des cellules T spécifiques du peptide OVA. Une semaine plus tard, les animaux ont été immunisés avec de l'OVA/alun, du TT/alun ou de l'OVA/CFA, avec une injection "de rappel" deux semaines plus tard. Les analyses ont été effectuées quatre semaines après la première immunisation. A) Les IgE et IgGl spécifiques de l'OVA ont été dosées par ELISA sur un pool de sérums de chaque groupe de 5 souris et les résultats exprimés en moyennes de trois mesures. Les résultats présentés sont ceux d'une expérience représentative sur trois. B) Des cellules T CD4+ spléniques purifiées, isolées de souris reconstituées et immunisées, ont été stimulées in vitro avec le peptide OVA (0,3 M) (barres blanches) ou la protéine OVA (250 g/ml) (barres noires). La réponse proliférative a été mesurée par l'incorporation de 3H-thymidine pendant les 12 dernières heures d'une culture de 72 h. Les données sont représentatives de trois expériences distinctes. C) 48 heures après la restimulation, comme décrit en B, les surnageants de culture ont été recueillis et les cytokines dosées par ELISA. Les résultats représentent les moyennes de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml. Les données sont représentatives de trois expériences distinctes avec des résultats similaires. Figure 7 : Lescellules T CD4+ isolées de souris rendues tolérantes par des cellules dendritiques CDllc '"CD45RB+ sont capables de transférer la tolérance à l'antigène Des souris BALB/c reconstituées avec des cellules T OVA-spécifiques "vierges" ont été traitées par des cellules dendritiques CD 11 c "'CD45RB+ pulsées avec du peptide OVA. A titre de contrôle, certaines souris ont reçu des cellules T "vierges" seules. Une semaine après la reconstitution, des cellules T CD4+ spléniques purifiées des souris reconstituées ont fait l'objet d'un transfert adoptif à des souris BALB/c normales. Comme indiqué, les animaux non traités ou ayant reçu les cellules T CD4+ purifiées ont ensuite été immunisés avec de l'OVA/alum. Une injection "de rappel" a été pratiquée deux semaines plus tard et les souris ont été analysées quatre semaines après la première immunisation. A) Les IgGl spécifiques de l'OVA ont été dosées par ELISA sur un pool de sérums de chaque groupe de 5 souris et les résultats sont exprimés en moyennes de trois mesures. Les résultats présentés sont ceux d'une expérience représentative sur trois. B) Des cellules T CD4+ spléniques purifiées de souris reconstituées et immunisées ont été stimulées in vitro par la protéine OVA (250 g/ml) (barres noires) ou le milieu seul (barres blanches). La réponse proliférative a été mesurée par l'incorporation de 3H-thymidine pendant les 12 dernières heures d'une culture de 72 h. Les données sont représentatives de trois expériences distinctes. C) 48 heures après la restimulation, comme décrit en B, les surnageants de culture ont été recueillis et les cytokines dosées par ELISA. Les résultats représentent les moyennes de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml. Les données sont représentatives de trois expériences distinctes avec des résultats similaires. Figure 8 : de cellules dendritiques humaines tolérogènes (TDC) A) on a supprimé les cellules T et B de cellules mononucléaires périphériques sanguines (PBMC) avec des anticorps et des billes magnétiques et la population restante a été analysée pour l'expression de CD11c et CD4 par cytométrie. Les carrés représentent les deux populations définies comme DC1 et DC2 par Siegal et al, 1999, Science, 281,1835-7 . Un carré montre la population de DC tolérogènes (TDC). B) des cellules progénitrices CD34+ ont été différentiées in vitro avec du GM-CSF (800 U/ml) et de l'IL-4 (1000 U/ml) en présence ou en absence d'IL-10 (200 u/ml) comme indiqué dans l'exemple 8. on a entouré les populations de TDC et DC 1. C) Les cellules TDC et DC1 ont été riées par FACS selon l'expression de CDl lc et analysées par cytofluorométrie pour l'expression de HLA-DR, CD80 et CD86. Les résultats montrent que les TDC expriment de niveaux de ces molécules plus bas que les cellules DC1. D) Les cellules TDC et DC1 ont été triées par FACS selon l'expression de CD1 le et stimulées par le LPS pendant 24 h. Les surnageants ont alors été analysés par ELISA pour la présence d'IL-10 et d'IL-12. Figure 9 : induisent la differentiation de cellules Tr1 sécrétant de haut niveaux d'IL-10 A) Analyse des cytokines secretes par les populations de cellules T CD4+ activées avec les cellules dendritiques triées. Les cellules T CD4+ humaines ont été stimulées pendant trois semaines avec des cellules triées allogéniques DC1(colonnes blanches) ou TDC (colonnes noires). Les DCs ont été isolées à partir de cultures in vitro en présence (TDC) ou en absence (DC1) d'IL-10 et utilisées à différents ratios DC/T comme indiqué. Après la culture pendant trois semaines, les cellules T ont été récoltées et stimulées avec des PBMC irradiés, et un anticorps monoclonal anti-CD3 (10 ug/ml). Après 48 heures, les cytokines dans les surnageants de culture ont été analysées par ELISA. Les résultats représentent les moyennes de trois déterminations ey sont exprimés en ng/ml. B) Fonction régulatrice des cellules T différentiées avec les TDC. Dans le compartiment inférieur d'un système transwell des cellules humaines T CD4+ purifiées ont été stimulées par des PBMC irradiés et un anticoprs monoclonal anti-CD3 (colonnes blanches). Dans le compartiment supérieur, des cellules T CD4+ différentiées avec des cellules TDC ou DC1 allogéniques comme indiqué ont été stimulées avec des PBMC allogéniques irradiés. Les expériences de coculture ont aussi été mise en oeuvre en présence d'anticorps monoclonal de souris bloquant anti-IL-10 (10 g/ml) (colonnes hachées), anticorps monoclonal anti-TGF- ss (40 g/ml) (colonnes noires) ou des deux (colonnes grises). Après trois jours, on a récupéré le récipient et la réponse proliférative des cellules T CD4+ a été mesurée par ajout de 0,5 Ci de 3H-thymidine pendant les 12 dernières heures de la culture de 72 h. EXEMPLES Exemple 1 : procédures expérimentales Souris Les souris BALB/cAnN ont été obtenues auprès du CERJ (Le Genest Saint Isle, France), les souris DO11-10 homozygotes nous ont été généreusement données par le Dr S. D. Hurst (DNAX Research Institute, Palo Alto, CA). Les souris transgéniques BALB/c IL-10 ont été obtenues en utilisant l'ADNc hIL-10 sous le contrôle du promoteur 1 0 du CMH de classe II Ea. Tous les animaux ont été élevés dans les conditions aseptiques courantes, dans notre animalerie. Toutes les souris étaient des femelles âgées de 4 à 8 semaines au début de chaque expérience. Milieu, anticorps et réactifs Le milieu utilisé pour les cultures de cellules T était le milieu Yssel (Yssel et al., 1984). Les cellules dendritiques ont été cultivées dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% de SVF (Roche, Meylan, France), 2 mM de L-glutamine, 1% de pyruvate de sodium, 2 x 10-5 M de p2-mercaptoéthanol (tous d'Invitrogen). Pour la purification des cellules dendritiques, nous avons utilisé du milieu HBSS sans Ca++ et Mg++ contenant 2 mM d'EDTA (tous d'Invitrogen) et de la collagénase D (Roche, Meylan, France). Le GM-CSF, le TNF-a et l'IFN-y recombinants de souris venaient de R&D Systems, Abington, R-U. L'IL-10 et l'IL-4 recombinantes de souris ont été généreusement offertes par le Dr R. L. Coffinan, DNAX Research Institute, Palo Alto, CA. La purification et la caractérisation des DC ont été effectuées au moyen d'anticorps anti-CD3 (17A2), anti-CD4 (GK1.5) anti-CD8 (53-6.7), anti-CDllb (Ml/70), anti-CDllc (HL3), CD28 (37.51) anti-I-Ad (AMS-32.1), anti-CD62L (Mel-14), anti-CD80 (16-10A1), anti-CD86 (GL1), anti-B220 (RA3-6B2), CD45RB (16A), anti-Grl (RB6-8C5) (Tous de Pharmingen Becton Dickinson) et de DEC-205 (NLDC-145) (Serotec, R-U.). Les dosages de cytokines ont été effectués au moyen d'anticorps anti-IL-4- PE ou-FITC (11B11), anti-IFN-y-PE (XGM1.2), anti-IL-10-FITC (JES-16E3), anti-IL-4 (11B11) et anti-IL-10 (2A5) purifiés, anti-IFN-y (XGM1.2) et d'anti-IL-4 (24G2), d'anti-IL-10 (SXC1), d'anti-IFN-y (R4-6A2) biotinylés (Tous de Pharmingen Becton Dickinson). Les anticorps anti-IgE (R35-72) et anti- IgGl (A85-1) utilisés pour l'analyse des IgG sériques spécifiques de l'OVA étaient de Pharmingen Becton Dickinson. Le tampon de lyse, la métrizamide, le LPS, le peptide OVA 323-339' l'ovalbumine et l'alun étaient de Sigma, Saint Quentin Fallavier, France. Cytométrie de flux L'analyse phénotypique des sous-ensembles de DC a été effectuée par double ou triple coloration avec des anticorps biotinylés anti-CDllc, suivis de streptavidine-Cy-Chrome, d'anti-CD45RB couplés à la PE et d'un troisième anticorps couplé au FITC. Toutes les étapes de coloration ont été conduites à 4 C dans du tampon PBS avec 0,1% de SAB et 0,02 mM de NaN3. Après trois lavages, les cellules marquées ont été analysées sur un FACScan (Becton Dickinson). Coloration des cytokines intracellulaires L'analyse des cytokines intracellulaires par cytométrie de flux a été effectuée comme décrit (Groux et al., 1997). Les cellules (106/ml) ont été activées pendant 6 h avec des ACm anti-CD3 et anti-CD28 immobilisés. La monensine a été ajoutée à 10 g/ml et, 4 h plus tard, les cellules ont été récoltées, lavées et fixées dans du formaldéhyde à 2%. Pour la coloration intracellulaire, les cellules ont été incubées avec les ACm suivants : anti-IL-4-FITC ou -PE, anti-IFN-y-PE et anti-IL-10-FITC, ou des anticorps témoins d'isotype correspondant, tous à 5 g/ml. Les échantillons ont été analysés sur un FACScan (Becton Dickinson). Cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (DC-MO) Les DC-MO ont été générées à partir de progéniteurs médullaires, comme décrit précédemment, avec quelques modifications (Inaba et al., 1992). En bref, la moelle osseuse a été extraite par rinçage de tibias et de fémurs avant d'éliminer les globules rouges avec 0,83 % de chlorure d'ammonium. Les cellules ont été cultivées à 37 C, sur des plaques à 24 puits (Becton Dickinson) (106 cellules/ml/puits), dans du milieu RPMI complet supplémenté avec 10 ng/ml de GM-CSF recombinant murin et 2,5 ng/ml de TNF-a, recombinant murin, avec ou sans IL-10 recombinante murine (500 ng/ml). Les DC-MO ont été récoltées à J6. Purification des cellules dendritiques spléniques Des rates ont été découpées en menus fragments qui ont été digérés par la collagénase D (1 mg/ml) dans du HBSS pendant 20 mn à 37 C, sous agitation constante. Les fragments digérés ont été filtrés sur grille de 0,7 m (BectonDickinson) et la suspension cellulaire a été lavée deux fois dans le milieu de purification. Les cellules ont alors été déposées en couche sur un gradient de métrizamide et centrifugées à 600 g pendant 10 min. Les cellules concentrées à l'interface ont été récupérées, lavées une fois et remises en suspension dans le milieu de purification, pour dissocier les DC des lymphocytes. Les différentes lignées de cellules T, les cellules B et les granulocytes ont été déplétées en traitant les cellules de basse densité récupérées, pendant 30 min à 4 C, avec un mélange d'anticorps monoclonaux composé d'anti-CD3, d'anti-B220 et d'anti-GR-l. Les cellules positives ont été récupérées magnétiquement, après incubation pendant 1 h à 4 C avec des billes magnétiques recouvertes d'Ig anti-rat, dans un rapport de 10 billes pour 1 cellule. Préparation des cellules T transgéniques TCR "vierges" Des cellules T spléniques de souris DO 11.10 transgéniques OVA TCR ont été préparées comme décrit ailleurs (Groux et al., 1997). En bref, des cellules T CD4+ ont été enrichies par sélection négative au moyen de billes magnétiques avec un mélange d'ACm anti-CD8, anti-B220 et anti-CDllb. Les cellules T CD4+/Me114bright ont ensuite été triées par cytométrie de flux en utilisant des anticorps anti-CD4-PE et anti-CD62L-FITC (Mell4). Les populations de cellules T triées étaient typiquement positives à 99 % pour les deux marqueurs. Différenciation des cellules T transgéniques TCR par les cellules dendritiques Les essais in vitro de différenciation des cellules T ont été effectués dans du milieu Yssel. Les cultures primaires de stimulation ont été établies en procédant à une activation de cellules T CD4+ "vierges" purifiées (2,5 x 105) par des populations de cellules dendritiques triées, pulsées avec le peptide OVA 323-339 (0,6 M) dans un volume total de 1 ml, sur des plaques de 24 puits (Becton Dickinson). Les cellules ont été multipliées, récoltées à J7, lavées trois fois, comptées et restimulées par des populations de cellules dendritiques fraîchement triées + 0,3 M de peptide OVA 323-339 pour la seconde différenciation. La même procédure a été appliquée pour le troisième cycle de différenciation. Après la différenciation, les cellules T ont été récoltées, lavées et restimulées avec 0,3 M d'OVA 323-339 et des CPA spléniques irradiées. La prolifération des cellules T a été mesurée par l'incorporation de 3H-thymidine au cours des 12 dernières heures de l'incubation de 72 h. La production d'IL-4, d'IL-10 et d'IFN-y a été mesurée par ELISA dans les surnageants recueillis 48 h après la restimulation des cellules T. Expériences transwell Dans le compartiment inférieur d'un système transwell (0,4 m CostarDutscher, Brumath, France), 106 cellules T CD4+ purifiées isolées de souris BALB/c normales ont été stimulées avec 106 splénocytes irradiés de souris BALB/c et des ACm anti-CD3 (10 g/ml). Dans le compartiment supérieur, des cellules T CD4+ différenciées par une stimulation unique avec des cellules dendritiques ont été stimulées avec 0,3 M d'OVAp et 106 splénocytes irradiés. Trois jours plus tard, le panier a été retiré et les cellules T des puits inférieurs ont été transférées (en triple) dans des plaques à 96 puits. La réponse proliférative a été analysée par l'incorporation de 3H-thymidine au cours des 12 dernières heures de culture. Cytologie Les DC CD 11 c WCD45RB+ et CD Il chJghCD45RB- triées, générées in vitro ou isolées de rates de souris BALB/c, ont été incubées pendant 24 h avec du LPS (1 g/ml) en présence de GM-CSF (10 ng/ml). Les DC fraîchement triées ou stimulées ont été centrifugées (Cytospin2, Shandon) et colorées au May-Grünwald-Giemsa. Dosage par RT-PCR quantitative en temps réel L'ARN total des sous-ensembles de DC triées (1 x 106; pureté >99%) a été préparé avec du TRIZOL (Life Technologies), comme décrit ailleurs (Cottrez et al., 1994), et toute trace éventuelle d'ADN chromosomique contaminant a été digérée par la DNase I, en suivant les instructions du fabricant (Gene Hunter, Nashville, TX). Puis l'ARN a fait l'objet d'une transcription inverse avec un oligo(dT)12-18 et la transcriptase inverse Superscript II (Life Technologies), comme décrit ailleurs (Cottrez et al., 1994). La PCR quantitative en temps réel a été effectuée avec la trousse SYBR Green PCR Core Reagents Kit, sur des plaques de microtitrage spéciales, à 96 puits (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France) dans un appareil ABI PRISM 5700 Séquence Détection System (Applied Biosystems), en suivant les instructions du fabricant. Les signaux de fluorescence ont été générés pendant chaque cycle de PCR par incorporation directe du SYBR Green dans la chaîne d'ADN bicaténaire, pour donner des informations quantitatives en temps réel. Des amorces (MWG Biotech, Ebersberg, Allemagne) englobant les jonctions exons-introns ont été conçues pour éviter l'amplification de l'ADN génomique et donner des amplicons de 100 à 150 pb, afin d'accroître l'efficacité de l'amplification par PCR. Toutes les amorces ont été utilisées dans des conditions qui ont évité la formation de dimères, et la fidélité des produits d'amplification a été vérifiée par électrophorèse et cartes de restriction enzymatique. Tous les ADNc ont été titrés sur la valeur de l'expression moyenne de 4 différents gènes ordinaires (housekeeping). Les conditions expérimentales de la PCR étaient les suivantes : 10 mn à 94 C, et 40 cycles de 30 s à 94 C, 30 s à 60 C et 30 s à 72 C pour chaque amplification, dans un volume final de 20 l. L'expression des gènes cibles a été mesurée, après normalisation des concentrations d'ARN, avec les 4 gènes ordinaires et les valeurs sont exprimées en facteurs d'augmentation de l'expression par rapport à un témoin négatif. Immunisation et transfert adoptif de cellules T OVA-specifiques CD4+ et de sous-ensembles DC 2,5x106 cellules T OVA-spécifiques "vierges" de souris ont été transférées par voie intraveineuse à des souris BALB/c ; 3x105 DC CDllclowCD45RB+ ou CD 11 ch''CD45RB- triées, générées in vitro ou isolées de rates de cellules BALB/c, ont été incubées avec le peptide OVA323-339 à 4 C pendant 2 heures, lavées et injectées par voie intraveineuse aux souris ayant reçu les cellules T transférées. Ces souris ont été immunisées par injection intrapéritonéale, à J7, de 50 g d'OVA/alun par animal. Deux semaines plus tard, un "rappel" a été effectué en injectant 25 g d'OVA/alun par animal. La tolérance induite par les DC a été analysée d'après la prolifération et la sécrétion de cytokines de cellules T CD4+ spléniques purifiées stimulées par des splénocytes irradiés (2500 rad) et l'OVA (250 ug/ml) ou le peptide OVA323-339 (0,3 M). Les anticorps anti-OVA ont été mesurés par ELISA sur les sérums recueillis chaque semaine après la première immunisation. Transfert de la tolérance Les cellules T CD4+ spléniques de souris témoins ou rendues tolérantes ont été purifiées par déplétion négative avec des billes magnétiques. Puis, 106 cellules ont été transférées par voie intraveineuse dans des souris BALB/c normales. Cellesci ont ensuite été immunisées avec de l'OVA/alun comme décrit plus haut. Les taux d'anticorps anti-OVA, la prolifération des cellules T spléniques et la sécrétion des cytokines ont été analysés comme précédemment. Dosages des cytokines L'IL-4, l'IL-10 et l'IFN-y ont été dosés par une méthode ELISA en sandwich, comme décrit ailleurs (Cottrez et al., 2000). En bref, des plaques ELISA (Polylabo, France) ont été recouvertes d'ACm anti-cytokines appropriés en tampon carbonate et incubées à 4 C pendant une nuit. Les réactions ont été bloquées pendant 30 min à température ambiante avec 150 l de PBS/SVF à 20% dans chaque puits ; 50 l de surnageants dilués des cellules T CD4+ stimulées in vitro ont ensuite été ajoutés aux puits, avant d'incuber les plaques à 4 C pendant une nuit. Après une étape de lavage, 50 l de l'anticorps biotinylé de la seconde étape ont été ajoutés dans chaque puits. Les plaques ont été incubées pendant 1 h à température ambiante et lavées. Le conjugué enzymatique (streptavidine-peroxydase) a ensuite été ajouté dans chaque puits. Les plaques ont été incubées à température ambiante pendant 1 h, lavées, et 100 l de substrat (ABTS, 1 mg/ml) ont été ajoutés par puits. Les plaques ont été lues sur un lecteur ELISA à 405 nm, après formation de la couleur (Labsystems iEMS reader, Helsinki, Finlande). Analyse des I gE sériques anti-OVA Le taux d'IgE anti-OVA a été mesuré par ELISA en sandwich à deux étapes, comme décrit (Cottrez et al., 2000). Les sérums ont été ajoutés, à différentes dilutions, dans les puits recouverts d'ACm anti-IgE (R35-72, Becton Dickinson, Mountain View, CA). Les IgE spécifiques de l'OVA ont été révélées par de l'OVA couplée à la digoxigénine (préparée en suivant les instructions du fabricant, Roche) et du fragment Fab-anti-digoxigénine couplé à la peroxydase (Roche). Après une incubation finale de 1 h, 50 l de substrat ont été ajoutés à chaque puits. Analyse des IgGl sériques anti-OVA Les plaques ELISA ont été incubées une nuit à 4 C avec 100 g/ml d'ovalbumine (Sigma) dans du PBS. Les sérums ont été ajoutés, à différentes dilutions, aux plaques pendant une nuit. Pour détecter les IgGl, nous avons utilisé un ACm biotinylé de rat (A85-1, Becton Dickinson) à 2 g/ml. Après incubation et lavage, le conjugué streptavidine-peroxydase a été ajouté dans les puits. Enfin, les plaques ont été développées comme décrit ci-dessous. Les étalons pour IgGl spécifiques de l'OVA étaient des sérums poolés de souris BALB/c hyperimmunisées. La concentration d'IgGl spécifiques de l'OVA a été estimée par comparaison avec un étalon d'IgGl mesuré en parallèle sur les plaques recouvertes d'anti-IgGl. Exemple 2 : L'IL-10 induit la différenciation d'un sous-ensemble distinct de DC. On sait que l'IL-10 induit la différenciation des cellules Tr1 par un effet indirect (Wakkach et al., 2001). Etant donné que les DC sont des acteurs essentiels dans la différenciation des cellules T, nous avons analysé l'effet de l'IL-10 sur la différenciation des DC à partir de cellules progénitrices de la moëlle osseuse cultivées en présence de GM-CSF et de TNF-a (les expériences préliminaires ont montré que la présence de TNF-a n'influence pas le phénotype et la fonction des DC, mais aide toutefois à augmenter le rendement et la viabilité des populations de cellules dendritiques [données non présentées]). L'addition d'IL-10 au jour 0 de la culture a induit la différenciation d'une population de DC avec une faible expression de CDllc et une forte expression de CD45RB (figure lA). En revanche, en l'absence d'IL-10, l'addition de GM-CSF et de TNF-a a induit la différenciation de DC exprimant de fortes concentrations de CD 11 (figure lA) (Inaba et al., 1992). Après triage des cellules au FACS en fonction de l'expression spécifique de CD le et de CD45RB, les DC CDllclowCD45RB+ différenciées in vitro présentaient une morphologie plasmocytoïde, avec une membrane plasmique lisse et un noyau excentrique (figure 1B-1). D'autre part, les DC CD11chigh avaient une morphologie différente, avec présence de petites dendrites (figure 1B-3). Après une nouvelle maturation avec le LPS, les deux populations ont acquis une morphologie de DC pleinement matures, avec de longues dendrites (figure 1B-2 et 4). L'analyse de l'expression des molécules du CMH II et des costimulateurs a révélé de faibles niveaux d'expression du CD80, du CD86 et de l'I-A sur les DC CD1 lc'CD45RB (figure 1 C) par rapport aux DC CD11chigh. La maturation des cellules dendritiques avec le LPS n'a pas modifié le phénotype des DC CDllclowCD45RB+ (figure 1C), tandis qu'elle renforçait l'expression des molécules de CD80, CD86 et I-A sur les DC CD1 1chigh. Ces résultats montrent que l'IL-10 induit la différenciation d'un sousensemble distinct de DC caractérisées par l'expression spécifique de CD45RB, qui présentent un phénotype pseudo-immature qui ne peut être modifié par une stimulation avec le LPS. Exemple 3 : Isolement de l'équivalent naturel des DC dérivées par l'IL-10 Nous avons donc abordé la question de l'influence de l'IL-10 in vivo sur la différenciation des cellules dendritiques. Des DC spléniques enrichies isolées de souris Tg IL-10 non transgéniques ou de souris BALB/c ont été analysées pour l'expression du marqueur spécifique des DC murines CDllc (figure 2A). Chez les souris Tg IL-10, nous avons observé un plus grand nombre de DC exprimant faiblement le CD 11 par rapport aux souris BALB/c normales (figure 2A) ou aux témoins non transgéniques (données non présentées). Comme pour les DC CD 11 clow différenciées in vitro en présence d'IL-10, les DC spléniques Cl 11 clou exprimaient fortement le marqueur CD45RB (figure 2B). Par ailleurs, les DC dérivées in vitro et les DC CDllclowCD45RB+ spléniques ont toutes deux une morphologie plasmocytoïde (figure 2C-1), contrairement aux DC CD11chigh qui présentent de petites dendrites (figure 2C-3). Après une maturation complète avec le LPS, les deux populations de DC spléniques se différencient en DC pleinement matures avec longues dendrites (figures 2C-2 et 4). Nous avons ensuite étudié l'expression des molécules I-Ad du CMH et des costimulateurs CD80 et CD86 sur les DC spléniques CDllclowCD45RB+ et CDllchlghCD45RB" triées sur FACS, provenant de souris Tg IL-10 et de souris BALB/c témoins. Comme le montre la figure 2D, nous avons constaté que les DC CD11clowCD45RB+ purifiées ex vivo exprimaient faiblement les molécules du CMH de classe II, le CD80 et le CD86, par rapport aux DC CD 1 ch''CD45RB. Pour déterminer si les DC CD 11 c WCD45RB+ représentent un sous-ensemble distinct de DC et le produit d'une lignée développementale séparée, ou si elles représentent un stade immature de DC plus conventionnelles, nous avons induit la maturation in vitro des DC isolées par des cultures à court terme en présence de GM-CSF (afin d'augmenter la durée de vie et le taux de récupération) et de LPS. Dans ces conditions, après maturation in vitro avec le LPS, les DC CD11clowCD45RB+ conservaient toujours une faible expression des molécules du CMH de classe II et du CD86, ce qui suggère que leur phénotype pseudo-immature est stable, à l'exception de la surexpression du CD80. En revanche, après incubation in vitro avec le LPS, les DC CDllchlghCD45RB" montrent une maturation accrue, avec augmentation de l'expression des molécules du CMH de classe II et des deux costimulateurs (CD80 et CD86) (figure 2D). Globalement, ces résultats montrent que les DC CDllc WCD45RB+ isolées de la rate représentent des équivalents in vivo des DC dérivées par l'IL-10. Exemple 4 : Caractérisation phénotypique et sécrétion des cytokines du sousensemble de cellules dendritiques CD11clow CD45RB+ Pour mieux caractériser le sous-ensemble de DC CDllclowCD45RB+, nous avons analysé l'expression des différents marqueurs des cellules dendritiques sur les populations cellulaires CD 11 c WCD45RB+ et CD 11 ch'CD45RB- triées provenant de souris BALB/c (figure 3A). Les DC CD 11 c WCD45RB+ expriment faiblement le CDllb et le DEC 205 et pas du tout le CD8a, ce qui suggère qu'elles n'appartiennent pas à la lignée "classique" des DC myéloïdes (CD11bhigh) ou lymphoïdes (CD8a+) (Shortman and Liu, 2002). Par ailleurs, contrairement à une population de DC tolérogènes récemment décrite différenciée à partir d'un précurseur de cellule B, les DC CDllclowCD45RB+ sont négatives en B220 (Lu et al., 2001 ; et al., 2002). Enfin, ces cellules n'expriment pas les marqueurs spécifiques des cellules T (CD4 et CD2) (données non présentées). Une part importante de la fonction spécifique des DC est dictée par la sécrétion d'ensembles distincts de cytokines. Nous avons donc analysé, par RT-PCR quantitative, l'expression relative de plusieurs cytokines importantes sur des cellules dendritiques CDllclowCD45RB+ et CDllch'ghCD45RB- fraîchement triées ou activées par le LPS. Après activation par le LPS, les DC CDllclowCD45RB+ sécrétaient de l'IL-10 alors que les DC CDllch''CD45RB- sécrétaient de l'IL-12. Les deux populations montraient une sécrétion d'IL-1 (3, encore augmentée par l'activation par le LPS, mais ne sécrétaient pas d'IFN-a, même après 24 h d'activation par le LPS (figure 3B). Ces résultats montrent que les DC CDllclowCD45RB+ représentent un sous-ensemble distinct de cellules dendritiques qui sécrètent principalement de l'IL-10 après activation. Exemple 5 : Les DC CDllclow CD45RB+ différentient les cellules Tr1 in vitro Pour analyser l'influence des différents sous-ensembles de DC sur l'amorçage et la différenciation de cellules T spécifiques jamais exposées à l'OVA ("vierges") isolées de souris DO11-10, plusieurs cycles de stimulation des cellules T ont été établis avec des DC CDllclowCD45RB+ ou CD 11 ch'ghCD45RB- triées isolées de la rate de souris BALB/c (figure 4A) ou différenciées in vitro (figure 4B). Les cellules T CD4+ "vierges" purifiées ont été stimulées par l'OVA (0,6 M), à différents rapports DC/T, pendant une semaine. Puis les cellules T ont été récoltées, lavées et stimulées une nouvelle fois, dans les mêmes conditions, avec 0,3 M d'OVA. Après une troisième stimulation dans les mêmes conditions, les populations de cellules T polarisées ont été récupérées, lavées et restimulées avec des splénocytes irradiés de souris BALB/c et 0,3 M d'OVA pour analyser leur profil de cytokines (figure 4A). Nos résultats montrent que les DC CDllcl WCD45RB+ purifiées ex vivo ou différenciées in vitro, quel que soit le rapport DC/T utilisé, induisaient la différenciation de cellules Tr1 sécrétant fortement l'IL-10, faiblement l'IFN-y et pas d'IL-4 (ou alors en quantités négligeables) (Groux et al., 1997) (figures 4 A et B). Contrairement aux cellules dendritiques CDllclowCD45RB+, celles du sous-ensemble CDllchighCD45RB- amorçaient les cellules Thl qui sécrètent fortement l'IFN-y (figures 4A et B). Ces résultats sont corrélés au profil de cytokines de la sous-population de cellules dendritiques, c-à-d. CDllclowCD45RB+, qui différencient les cellules Tri, secrètent l'IL-10, alors que l'IL-12 sécrétée par les DC CDllchighCD45RB- induit la différenciation des cellules Th1. Par ailleurs, la différenciation spécifique des cellules Tr1 avec les DC CD1 lc WCD45RB+ a été observée après une stimulation unique, comme l'a montré l'analyse intracytoplasmique de la sécrétion de cytokines dans les différentes souspopulations de cellules T (figure 4C). Pour analyser les propriétés fonctionnelles des cellules T obtenues après une stimulation unique par les DC CDllclowCD45RB+, des expériences transwell ont été conduites. Les cellules T obtenues après stimulation par des DC CDllclowCD45RB+ de souris BALB/c ont inhibé la prolifération des cellules T CD4+ en attente (bystander) stimulées par des splénocytes irradiés et un anticorps monoclonal anti-CD3 (figure 4D). D'autre part, l'addition d'ACm inhibiteurs de souris anti-IL-10 et anti-TGF(3 a levé l'effet suppresseur de ces cellules T, confirmant la différenciation des cellules Tr1 au plan phénotypique et fonctionnel (figure 4D). A titre de contrôle, des populations de cellules Thl (induites par des DC CD 11 ch'gbCD45RB-) n'ont pas eu d'effet inhibiteur sur la prolifération des cellules T CD4+ en attente (figure 4D). Globalement, ces résultats montrent que les DC CDllclowCD45RB+ induisent la différenciation des cellules Tr1 in vitro. Exemple 6: Les DC CD11clowCD45RB+ induisent une tolérance antigénospécifique in vivo Pour analyser la fonction in vivo des DC CDllclowCD45RB+, nous avons utilisé un modèle chez la souris où des cellules T CD4+ spléniques OVAspécifiques "vierges" de souris DO 11-10 ont été transférées à des souris BALB/c normales. Ces souris ont ensuite été traitées avec des sous-ensembles purifiés de DC pulsées avec de l'OVA in vitro. Une semaine plus tard, nous avons mesuré la réponse proliférative et la sécrétion de cytokines en réponse à la stimulation par l'OVAp de cellules T CD4+ spléniques purifiées des souris ayant fait l'objet du transfert. Comme pour les résultats in vitro, la figure 5 montre que l'injection de DC CD Il cl"CD45RB+ chez les souris BALB/c induit in vivo la différenciation de cellules Tr1 OVAp-spécifiques. Ces cellules se caractérisaient par une faible réponse proliférative (figure 5A) et une forte sécrétion d'IL-10 (figure 5B). A titre de contrôle, l'injection de DC CD11chigh pulsées avec l'OVA a induit la différenciation de cellules T à forte réponse proliférative et à forte sécrétion d'IFN- Nous avons donc analysé la capacité des DC CDllcl wCD45RB+ à induire une tolérance in vivo. Des DC CD 11 cl WCD45RB+ ou CD 11 cn' triées, isolées de la rate de souris BALB/c ou obtenus par différenciation in vitro, ont été pulsées avec du peptide OVA et injectées à des souris BALB/c à cellules T reconstituées OVAspécifiques "vierges". Une semaine plus tard, l'induction de la tolérance a été provoquée par deux immunisations, à 15 jours d'intervalle, avec la molécule d'ovalbumine intégrale dans de l'alun. Deux semaines après la dernière immunisation, l'analyse des IgE et IgG1 sériques spécifiques de l'OVA a montré une nette réduction de la réponse chez les souris traitées avec les DC CDllcl WCD45RB+ différenciées in vitro ou purifiées ex-vivo, par rapport aux souris immunisées témoins (figure 5A). L'induction de la tolérance a été confirmée par l'analyse de la réponse proliférative à l'ovalbumine de cellules T CD4+ isolées de la rate de souris immunisées. En fait, les cellules T CD4+ isolées de souris traitées avec les DC CDllclowCD45RB+ ont peu proliféré après stimulation par l'ovalbumine, comparées aux cellules T CD4+ isolées de la rate de souris immunisées préalablement traitées ou non traitées par des DC CD11chigh. Par ailleurs, l'induction de la tolérance était antigénospécifique, étant donné que les cellules T des différents groupes de souris proliféraient massivement en réponse à une stimulation par la ConA (données non présentées). Enfin, l'analyse de la sécrétion des cytokines par les cellules T CD4+ spléniques a confirmé l'induction d'une tolérance. L'immunisation de souris par l'ovalbumine dans l'alun s'est traduite par une réponse de type Th2, avec une forte sécrétion d'IL-4 et une faible sécrétion d'IFN-y. En revanche, chez les souris traitées par DC CDllclowCD45RB+, les cellules T sécrétaient de faibles quantités d'IFN-y et d'IL-4 et un peu d'IL-10. Fait intéressant, les souris traitées par DC CD11chigh se différentiaient in vitro et présentaient une réponse de type Thl, avec une sécrétion prédominante d'IFN-y. Exemple 7 : tolérance induite par les DC CD11clow CD45RB+ est transférable aux cellules T CD4+ spléniques Nos résultats tendent à prouver que les DC CDllclowCD45RB+ induisent une tolérance par la différenciation in vivo de cellules Tri antigénospécifiques. Par conséquent, nous avons ensuite évalué si des cellules T CD4+ spléniques isolées de souris exposées à des DC CDllclowCD45RB+ étaient capables de transférer la tolérance. Des DC CDllclowCD45RB+ isolées de la rate de souris BALB/c et pulsées avec du peptide OVA in vitro, ont été injectées à des souris à cellules T reconstituées OVA-spécifiques "vierges". Sept jours plus tard, les cellules T CD4+ spléniques ont été purifiées et transférées à des souris BALB/c. Pour évaluer l'induction d'une tolérance, les souris ayant reçu le transfert ont ensuite été immunisées deux fois avec de l'OVA/alun. La figure 7 montre que les souris ayant reçu les cellules T CD4+ isolées de souris traitées avec des DC CD 11 c "'CD45RB+ tolérogènes étaient incapables d'élaborer une réponse immune correcte contre la provocation antigénique, d'après les taux d'anticorps spécifiques anti-OVA dans le sérum et la faible réponse au rappel in vitro. En fait, les cellules T CD4+ isolées de ces animaux présentaient une faible réponse proliférative à la stimulation par l'antigène (figure 7B) et une modeste sécrétion d'IL-4 et d'IFN-y, par rapport aux souris témoins (figure 7C). Toutefois, les cellules T CD4+ isolées de souris tolérantes sécrétaient plus fortement l'IL-10 (figure 7C). Ces résultats montrent que les DC CD 11 cl "'CD45RB+ induisent la tolérance par la différenciation de cellules T régulatrices antigénospécifiques, capables de transférer la tolérance aux souris normales. Exemple 8 : cellules humaines Des cellules dendritiques ont été différentiées à partir de cellules progénitrices CD34+ avec du GM-CSF et de l'IL-4 en présence ou en absence d'IL- 10, comme indiqué. Après 6 jours, les cellules dendritiques ont été triées en fonction de l'expression de CD le et marquées avec les anticorps indiqués. Les cellules purifiées ont aussi été stimulées avec du LPS pendant 24 heures, puis analysées par cytofluorométrie. Les cellules dendritiques tolérogènes différentiées en présence d'IL-10 exprimaient de bas niveaux de CDl lc, et de bas niveaux des molécules HLA-DR, CD80 et CD86. L'activation avec le LPS n'a pas augmenté l'expression de HLA-DR et CD86 pour cette population, au contraire de l'effet du LPS sur les autres populations de DC testées. Tableau : effet de l'activation avec le LPS sur les populations de cellules dendritiques triées différentiées en présence ou absence d'IL-10. Pourcentage de cellules positives Stimulation- - LPS LPS - - LPS LPS Différentiation- - - IL-10 IL-10 IL-10 IL-10 CDllc CDllc CDllc CDllc CDllc CDllc CDllc CDllc low hi low hi low hi low hi CD14 12f3 144 z4 133 153 92 13t3 133 CD4 42 31 3f2 21 4f 53 52 32 CDllb 131 248 236 218 196 214 185 156 HLA-DR 7512 809 9115 8912 508 8512 526 9212 CD80 245 286 8013 7312 142 2611 4512 847 CD86 536 545 8515 79123 264 54f9 286 7311 CD40~~~~~819 942 9812 96t11 748 8115 82:LI3 95t11 Moyenne d'intensité de fluorescence Stimulation - - LPS LPS- - LPS LPS Différentiation- - - - IL-10 IL-10 IL-10 IL-10 CDllc CDllc CDllc CDllc CDllc CDllc CDllc CDllc low h1 low h1 low hi low hi CD14 250 320 210 350 210 350 250 390 130 110 150 :1:80 180 87 :1:130 1102 CD4 80 :L63 86 38 91 58 86 27 70 53 83 48 91 54 75 5 CD11b 370 350 367 357 324 360 357 354 356 56 98 41 ~293 55 ~297 91 LA-DR 470 590 890 981 310 5 0 350 846 570 350 480 10 ~150 350 ~218 5 0 CD80 134 90 357 481 102 198 283 435 10 130 150 13 ~80 97 ~110 115 CD86 400 595 813 789 254 587 312 834 70 600 370 483 ~130 480 ~178 4 0 CD40 3 0 580 680 710 367 539 340 730 30 56 69 97 ~260 00 ~264 60 REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention in vitro d'une population de cellules dendritiques humaines capables d'induire la différenciation de cellules T humaines en cellules Tr1, à partir de cellules progénitrices humaines capables de se différencier en cellules dendritiques comprenant : - la culture desdites cellules progénitrices en présence d'IL-10, pour obtenir ladite population de cellules dendritiques. 2. Procédé de différentiation in vitro de cellules T humaines en cellules Tr1, comprenant : - la mise en #uvre du procédé selon la revendication 1, - la mise en présence desdites cellules T avec ladite population de cellules dendritiques. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdites cellules progénitrices sont issues du sang périphérique ou de la moelle osseuse. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend en outre du GM-CSF et/ou une cytokine choisie parmi l'IL-4 et l'IL-13. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que plus de 20 % des cellules dans ladite population de cellules dendritiques est CMH II-CD80- CD86low, présentant un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II, de CD80 et CD86 inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d' IL-10. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit niveau d'expression est au moins cinq fois inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend les facteurs de croissance GM-CSF (5 à 50 ng/ml), IL-4 ou IL-13 (2 à 5 ng/ml) , IL10 (300 à 600 ng/ml). 8. Population de cellules dendritiques matures ou immatures, susceptibles d'être obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que plus de 20 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II, de CD80 et CD86 inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10. 9. Population de cellules dendritiques matures ou immatures, susceptibles d'être obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que plus de 20 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II et CD86, après stimulation par le LPS, inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10, et stimulées par le LPS. 10. Composition pharmaceutique comprenant une population de cellules selon la revendication 8 ou 9 et un véhicule pharmaceutique approprié. 11. Procédé d'obtention in vitro de cellules Tr1 à partir de cellules T humaines, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en présence desdites cellules T avec une population de cellules dendritiques selon la revendication 8 ou 9. 12. Utilisation de cellules Tr1 obtenues in vitro par un procédé selon l'une des revendications 2 à 7 ou 11, pour la préparation d'un médicament contre une maladie autoimmune ou inflammatoire. 13. Utilisation d'une population de cellules selon la revendication 8 ou 9, pour la préparation d'un médicament capable d'induire in vivo la différenciation de cellules T en cellules Tr1 actives, destiné au traitement d'une maladie autoimmune ou inflammatoire. 14. Utilisation d'une population de cellules selon la revendication 8 ou 9, lesdites cellules étant pulsées avec un antigène reconnu par des cellules du système immunitaire, en particulier par des cellules T actives dans une maladie auto- immune ou inflammatoire, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ladite maladie auto-immune ou inflammatoire.