FR 2855173 A1 20041126 FR 0305961 A 20030519 i L'invention concerne des marqueurs membranaires chiraux à couplage excitonique pour l'observation de cellules en microscopie de second harmonique. La microscopie non-linéaire, ou multiphotonique, en champ large ou à balayage utilise des techniques qui offrent à l'utilisateur un pouvoir séparateur plus grand 5 que celui fourni par la microscopie optique conventionnelle. En outre, elle permet une imagerie cellulaire en trois dimensions et contrairement au microscope électronique, elle peut s'appliquer à des préparations cellulaires vivantes afin d'en étudier la morphologie ou l'évolution sur de longues périodes. Les microscopies non-linéaires utilisent un éclairage cohérent séquentiel. La 10 concentration de la lumière sur une zone très petite en un temps donné, réduit l'éclairage des zones non éclairées directement. Le pouvoir de résolution, le contraste optique et le balayage séquentiel sont à l'origine des performances remarquables de ces techniques d'observation. Combinées à toute une gamme de colorants spécialisés dans le marquage des cellules, couramment désignés par 15 chromophores, ces techniques permettent l'étude de différents paramètres associés aux tissus vivants. Couramment, le faisceau d'éclairage balaie le champ d'observation pour explorer toutes les zones de l'échantillon dans le plan focal, ce qui permet une imagerie en deux dimensions. Le déplacement du plan focal dans l'épaisseur de l'échantillon fournit la troisième dimension. L'éclairage cohérent permet une excitation à deux photons des chromophores présents dans les membranes cellulaires. Deux photons de longueur d'onde;. simultanément absorbés créent une transition vers un état électronique normalement excité par l'absorption d'un seul photon de longueur d'onde; /2. Cette excitation à deux photons est rendue possible par la concentration du 25 faisceau laser d'éclairage véhiculant une impulsion brève d'une centaine de femtosecondes de durée. La fluorescence associée à la désexcitation des chromophores se produit à des longueurs d'onde plus grandes que;/2. L'excitation à deux photons constitue une façon élégante de différencier par un détecteur quadratique la lumière de fluorescence de la lumière excitatrice. Il existe 30 une telle différence de longueur d'onde entre les deux lumières que des filtres sélectifs passifs suffisent à observer quelques photons de fluorescence dans un environnement lumineux fortement éclairé par la diffusion des photons incidents. La technique associée à l'excitation à deux photons est désignée par TPEF, acronyme pour l'expression anglo-saxonne: Two Photon Excited Fluorescence. L'article de W. Denk, J.H. Strickler & W.W. Webb (Two-photon laser scanning fluorescence microscopy, Science, 248, 73 (1990)) expose les bases de cette technique. L'utilisation de techniques non-linéaires cohérentes peut fournir un signal encore plus sélectif que la technique TPEF. En effet, le fort éclairement délivré instantanément par l'impulsion laser peut favoriser la création du second harmonique au sein des chromophores introduits dans les membranes cellulaires. 10 Les photons émis ont alors une longueur d'onde rigoureusement égale à la moitié de la longueur d'onde excitatrice. En général, la bande spectrale de l'harmonique est plus étroite que la bande spectrale de la fluorescence observée en TPEF. Le phénomène de création des photons de second harmonique est un phénomène non-linéaire d'ordre 2, ce qui signifie que la polarisation diélectrique (ou moment 15 dipolaire) du milieu possède couramment une dépendance au carré du champ électrique présent. Une condition sine qua non à la génération du second harmonique (acronyme SHG pour l'expression anglo-saxonne: Second Harmonic Generation), impose que le milieu interagissant avec le champ électromagnétique de l'onde incidente ne possède pas de centre de symétrie. Sinon, les règles de 20 symétrie annulent le terme de dépendance et le signal lumineux de second harmonique disparaît. Par ailleurs, le phénomène répond à la conservation d'énergie (l'énergie du photon créé est strictement la somme des énergies des deux photons incidents) et dans les milieux cristallins massifs, au meilleur accord de phase (le vecteur d'onde du photon créé est la somme géométrique des 25 vecteurs d'onde des deux photons incidents). On retrouvera dans le livre de F. Zernike & J.E. Midwinter, les concepts de base du phénomène (Applied Nonlinear Optics. A Wiley-lnterscience Publication John Wiley & Sons New-York). Couramment, les chromophores efficaces pour la microscopie de second harmonique sont implantés dans les membranes cellulaires dont l'épaisseur est 30 très inférieure à la longueur d'onde du faisceau laser incident. Dans cette situation, la représentation de la propagation du champ électromagnétique sur l'épaisseur des membranes perd son intérêt et la notion d'accord de phase disparaît. La génération du second harmonique est alors localement autorisée sur une épaisseur voisine de X/10 dans l'approximation dipolaire électrique si le milieu ne possède pas de centre de symétrie. Or la plupart des chromophores, en solution liquide, constituent des milieux centro-symétriques. Cependant, les chromophores qui s'implantent dans les membranes, constituent un arrangement 5 organisé aux interfaces des membranes. La physique des interfaces indique une rupture de symétrie et autorise la SHG. Malheureusement, les chromophores s'implantent, soit naturellement soit sous l'effet de l'excitation lumineuse, têtebêche des deux côtés des membranes; ils reconstituent un arrangement centrosymétrique qui provoque l'extinction du signal SHG. Une littérature scientifique 10 traite du sujet, notamment dans les articles de l'équipe de J. Mertz (www.physio.espci.fr/shg.pdf), particulièrement la publication co-écrite par L. Moreaux, O. Sandre & J. Mertz (Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy, J. Opt. Soc. Am., B1 7, 1685 (2000)). L'invention a pour but d'améliorer l'imagerie cellulaire en microscopie de second 15 harmonique en utilisant des marqueurs non-linéaires chiraux à couplage excitonique aptes à créer le second harmonique de la lumière incidente cohérente. Les différents objets et caractéristiques de l'invention apparaîtront plus clairement dans la description qui va suivre, faite à titre d'exemple non limitatif, ainsi que dans les figures annexées. La chiralité désigne le fait d'exister sous deux formes inverses optiques dont l'une est l'image de l'autre dans un miroir comme le sont les deux mains d'un individu. La chiralité moléculaire peut être due à un centre asymétrique, par exemple un carbone substituant d'un chromophore non-linéaire. Ce type de chiralité est dit à un chromophore. Un autre type de chiralité peut s'instruire dans un édifice 25 moléculaire comportant deux chromophores non coplanaires couplés mais sans échange électronique. Chacun d'entre eux possède un dipôle électrique. Les deux dipôles disposés de manière non centro-symétrique l'un par rapport à l'autre interagissent. Le couplage résultant, qualifié de couplage excitonique, induit un dipôle magnétique dans la direction du produit vectoriel des deux dipôles. Tous les 30 ingrédients d'une activité optique sont présents dans la molécule. La chiralité moléculaire induit de nouvelles composantes dans le signal SHG. Ces composantes spécifiques sont fondamentalement différentes pour les deux types de chiralité décrits ci-dessus (cf F. Hache, H. Mesnil and M.-C. Schanne-Klein, Application of classical models of chirality to surface second harmonic generation, J. Chem. Phys. 115, 6707-6715 (2001)). Elles sont d'origine dipolaire magnétique, ou plus généralement multipolaire, pour une chiralité à un chromophore, et de ce fait, elles sont très faibles et de plus répondent à des règles de symétrie 5 spécifiques des effets multipolaires. A l'opposé, pour un couplage excitonique, ces composantes du signal SHG spécifique de la chiralité moléculaire ont une origine dipolaire électrique comme les autres composantes. Si par ailleurs, ces molécules chirales sont implantées sur les deux faces d'une membrane cellulaire, elles ne constituent plus un arrangement centro-symétrique et le signal SHG généré sur 10 l'une des faces de la membrane s'ajoute à celui généré sur l'autre face à condition qu'il soit d'origine dipolaire électrique. Seules les molécules chirales à couplage excitonique présentent donc une chiralité efficace pour l'imagerie de membrane cellulaire par génération de second harmonique. L'invention concerne l'utilisation de marqueurs membranaires nonlinéaires 15 chiraux pour la microscopie de second harmonique présentant une chiralité efficace pour la génération du second harmonique en microscopie non-linéaire à balayage. L'imagerie cellulaire fait appel à l'ingénierie en matériaux moléculaires pour concevoir des marqueurs appropriés, non toxiques. Notamment, le Laboratoire de Chimie de l'École Normale Supérieure de Lyon (www.ens20 lyon.fr/STIM/) conçoit des molécules pour l'optique non-linéaire et la limitation optique. Ainsi, tous les marqueurs chiraux constitués de molécules à couplage excitonique propice à la génération du second harmonique, offrent un intérêt certain en imagerie cellulaire, notamment s'ils comportent deux chromophores non- coplanaires et non-linéaires ou s'ils sont constitués par une base de Trôger 25 substituée par deux chromophores non-linéaires. La première base a été synthétisée en 1887 par Trôger, mais sa structure a été élucidée en 1935 par Spielman & Wagner. Les bases de Trôger utilisées pour la génération du second harmonique sont améliorées, par exemple par allongement de la structure délocalisée. La figure 1 présente une gamme particulière de marqueurs membranaires nonlinéaires et chiraux. Il s'agit de marqueurs constitués par une base de Trôger comportant deux molécules acridines (1) placées de part et d'autre d'un pont diazocine (2) en couplage excitonique. L'acridine comporte deux cycles benzéniques accolés de part et d'autre d'un cycle pyridine (en positions dites 2,3 et 5,6). Ce chromophore est connu pour ses propriétés d'intercalation de l'ADN: c'est dans ce contexte que la molécule de la figure 1 a été synthétisée à l'origine en tant que bis- acridine chirale (voir Tatibouêt A., Demeunynck M., Andraud C., 5 Collet A. and Lhomme J, Synthesis and study of an acridine substituted Trôger's base: preferential binding of the (-)-isomer to B-DNA., Chem. Commun. 161- 162 (1999)). Le pont diazocine interdit le passage d'électrons entre les deux chromophores placés en position chirale. La gamme inclut les bases améliorées, par exemple par allongement du système conjugué ou par substitution d'un 10 groupement NO2 plus accepteur que NH2 (3). Cette gamme de marqueurs nonlinéaires et chiraux présente une forte propension à la fluorescence excitée à deux photons; ceci permet avec les mêmes préparations de faire simultanément une imagerie avec la technique de fluorescence à deux photons et une imagerie avec la technique du second harmonique en utilisant deux voies de réception séparées 15 sur le microscope. Cette gamme particulière de marqueurs est relativement peu soluble dans l'eau. Cette hydrophobicité donne à cette gamme une excellente faculté de traceur membranaire. On constate pour ces marqueurs, que leur solubilité dans l'eau est améliorée par la présence de sucre ou de toute autre molécule permettant la formation de complexes d'inclusion, notamment par la 20 présence de glucose dans le cas de la base de Trôger de la figure 1. Par ailleurs, de nombreux essais réalisés en laboratoire ont démontré que ces marqueurs sont stables, y compris sous une excitation lumineuse intense, et ne présentent pas de toxicité avérée. La figure 2 propose un schéma du principe d'observation de génération de second 25 harmonique. La membrane cellulaire (1) a une épaisseur d'environ 5 nm et les molécules chirales (2) s'implantent sur les faces internes et externes de la membrane. Le signal incident (3) est constitué d'une impulsion d'une centaine de femtosecondes de durée issue par exemple, d'un laser saphir dopé par l'ion titane et dont la longueur d'onde moyenne d'émission est de 800 nm. Le faisceau est 30 focalisé avec un objectif de forte ouverture numérique. Le col du faisceau (5) est localisé dans le plan focal de l'objectif et l'éclairement lumineux exprimé en W/cm2 varie extrêmement vite dans la zone de focalisation pour atteindre sa valeur maximale au niveau du col. La longueur d'onde du signal de second harmonique (4) est de 400 nm. Pour certains marqueurs, le meilleur signal est observé dans une ou plusieurs directions privilégiées, par exemple dans la direction du faisceau incident. De même, I'efficacité de la génération du second harmonique est améliorée par une polarisation particulière du champ électrique incident, 5 notamment une polarisation circulaire peut être préférée à une polarisation linéaire. La technique SHG possède en commun avec la TPEF les avantages des microscopies non-linéaires. La pénétration dans les tissus est augmentée (faible valeur du coefficient d'absorption à la longueur d'onde incidente) . La dépendance 10 du signal au carré du champ électrique incident fournit une observation avec une résolution spatiale intrinsèque dans la profondeur de champ du microscope, équivalente à celle obtenue en microscopie confocale. Les avantages de la technique SHG par rapport à la technique TPEF sont nombreux. Avec la SHG, les marqueurs chiraux non-linéaires facilitent l'imagerie 15 cellulaire sans contribution directe au bruit de fond, en ne révélant que les membranes des cellules et en diminuant la photo- toxicité (peu d'énergie est absorbée). La technique TPEF absorbe une énergie importante du faisceau incident dont une part non négligeable est restituée au milieu de façon non radiative; ceci favorise l'accumulation de chaleur. Avec la TPEF, les marqueurs 20 qui ne s'implantent pas dans les membranes, séjournent dans l'environnement et fournissent malgré tout un signal de fluorescence contribuant directement à l'augmentation du bruit de fond. De ce point de vue, le signal du second harmonique n'est conséquent par principe qu'aux interfaces et le bruit de fond est minimisé. Le signal de second harmonique possède également une dépendance 25 au champ statique trans-membranaire issu du potentiel de membrane Vm de la figure 2, essentiel dans les études biologiques. Les publications des équipes de J. Mertz et de A. Lewis traitent du sujet, notamment l'article co-écrit par L. Moreaux, T. Pons, J. Mertz, V. Dambrin & M. Blanchard-Desce (Electro-optic response of second-harmonic generation membrane potential sensors, Optics Letters, 28, 625 30 (2003)) et l'article co-écrit par G. Peleg, A. Lewis, M. Linial & L.M. Loew (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 6700 (1999)). Ainsi, les marqueurs chiraux nonlinéaires contribuent à la mesure du potentiel de membrane par la qualité sélective du signal de second harmonique observé. Les marqueurs membranaires non-linéaires chiraux à couplage excitonique sont synthétisés par ingénierie moléculaire pour augmenter l'efficacité du signal de second harmonique et pour améliorer l'imagerie cellulaire en microscopie nonlinéaire à balayage. La microscopie de second harmonique obtenue avec les 5 marqueurs non-linéaires chiraux à couplage excitonique trouvera naturellement son utilité dans les produits développés par différentes firmes commerciales, telles que, par exemple, Zeiss (www. zeiss.de), Olympus (www.cf.olympus-europa.com) ou Biorad (www.bio-rad.com) . REVENDICATIONS 1. Marqueurs membranaires non-linéaires chiraux pour la microscopie de second harmonique caractérisés en ce qu'ils sont constitués par une base de Trôger substituée par deux chromophores non-linéaires en couplage excitonique. 2. Marqueurs membranaires non-linéaires chiraux pour la microscopie de 5 second harmonique, selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par une base de Trôger substituée par deux chromophores noncoplanaires et qu'ils présentent une chiralité efficace pour la génération du second harmonique. 3. Marqueurs membranaires non-linéaires chiraux pour la microscopie de 10 second harmonique, selon la revendication 1 et 2, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par une base de Trôger comportant deux molécules acridine placées de part et d'autre d'un pont diazocine, en couplage excitonique. 4. Utilisation de marqueurs membranaires non-linéaires chiraux pour la microscopie de second harmonique, selon les revendications 1 à 3, caractérisés en 15 ce que le phénomène de fluorescence excitée à deux photons est également observable. 5. Utilisation de marqueurs membranaires non-linéaires chiraux pour la microscopie de second harmonique, selon les revendications 1 à 3, caractérisés en ce que, dans l'eau et en présence de sucre ou de toute autre molécule permettant la 20 formation de complexes d'inclusion, leur solubilité est améliorée. 6. Utilisation de marqueurs membranaires non-linéaires chiraux pour la microscopie de second harmonique, selon les revendications I à 3, caractérisés en ce que, soumis à une excitation lumineuse intense, leur stabilité n'est pas altérée. 7. Utilisation de marqueurs membranaires non-linéaires chiraux pour la 25 microscopie de second harmonique, selon les revendications I à 3, caractérisés en ce que leur présence dans les membranes des cellules ne provoque aucune toxicité avérée. 8. Utilisation de marqueurs membranaires non-linéaires chiraux pour la microscopie de second harmonique, selon les revendications 1 à 3, mis en oeuvre 30 dans les applications des techniques de fluorescence à deux photons et de second harmonique qui peuvent être appliquées simultanément en utilisant deux voies de réception séparées sur le microscope. 9. Utilisation de marqueurs membranaires non-linéaires chiraux pour la microscopie de second harmonique, selon les revendications de 1 à 3, caractérisés en ce qu'une polarisation particulière du champ électrique incident améliore l'efficacité de la génération du second harmonique. 10. Utilisation de marqueurs membranaires non-linéaires chiraux pour la microscopie de second harmonique, selon les revendications de 1 à 3, caractérisés en ce qu'il existe une ou plusieurs directions privilégiées pour observer le meilleur signal. 11. Utilisation de marqueurs membranaires non-linéaires chiraux pour la 10 microscopie de second harmonique, selon les revendications de 1 à 3, appliqués à l'imagerie cellulaire, sans contribution directe au bruit de fond, et ne révélant que les membranes des cellules tout en diminuant la photo-toxicité. 12. Utilisation de marqueurs membranaires non-linéaires chiraux pour la microscopie de second harmonique, selon les revendications de 1 à 3, caractérisés 15 en ce que le signal de second harmonique varie avec le potentiel de membrane.