FR 2857874 A1 20050128 FR 0401197 A 20040206 i La présente invention consiste en l'utilisation dans des produits cosmétiques de principes actifs en vue de réguler la prolifération et la différenciation des kératinocytes de l'épiderme et d'ainsi modifier l'expression des marqueurs de la différenciation épidermique. L'épiderme est une structure dynamique de la peau humaine. Il est majoritairement constitué d'une famille cellulaire: les kératinocytes. Ceux-ci, produits par une couche de cellules souches à la base de l'épiderme, se différencient dans l'épaisseur de l'épiderme: initialement quasi-cubiques, ils deviennent polyédriques puis s'aplatissent et aboutissent en surface à la production d'une couche 10 cornée, plus ou moins épaisse. L'épiderme est donc à la fois le siège d'une multiplication cellulaire (couche basale) et une zone de différenciation cellulaire (couche intermédiaire) qui conduit à la formation d'une structure protectrice bien différenciée (couche cornée). La division des cellules souches est régulée par des cytokines et des facteurs de 15 croissance, comme le facteur de croissance épidermique ou EGF (Epidermal Growth Factor). Au cours de la différenciation de l'épiderme, l'expression de certaines protéines est modifiée: à titre d'exemples, certaines cytokératines exprimées dans les kératinocytes de la couche basale de l'épiderme (CK4) sont moins exprimées ou 20 totalement absentes dans les couches suprabasales, tandis que certaines cytokératines absentes des kératinocytes basaux sont exprimées dans les kératinocytes des couches suprabasales (CK1, CK10). De même, l'expression de certaines protéines d'adhésion varie au cours de la différenciation, comme les desmoplakines (DSP), les desmogléines (DSG), les desmocollines (DSC). Certaines protéines à activité 25 enzymatique sont exprimées au cours de la différenciation, et participent activement à la transformation des kératinocytes en cornéocytes, comme par exemple la transglutaminase de type 1 (TGM 1). Parmi les substances susceptibles de réguler la prolifération et la différenciation des kératinocytes, on connaît l'acide rétinoique (AR) et ses dérivés (rétinoides) qui 30 sont déjà utilisés depuis plusieurs années. Ils ont cependant le désavantage d'être tératogènes et de présenter une intolérance cutanée. L'application d'acide rétinoïque sur la peau diminue l'expression de protéines habituellement exprimées au cours de la différenciation des cellules épidermiques, notamment la cytokératine 1 (CK1), la transglutaminase 1 (TGM1) et les desmoplakines (DP). Le problème à la base de l'invention est de proposer une substance régulant la prolifération et la différenciation des kératinocytes et qui ne présente pas les effets indésirables de l'acide rétinoïque. Le problème est résolu par la découverte selon laquelle l'augmentation de 5 l'expression des béta-endorphines par les kératinocytes de la peau a pour effet une modification de l'expression des marqueurs de la différenciation épidermique. Ainsi l'utilisation de substances qui augmentent cette expression a pour effet de réguler la prolifération et la différenciation des kératinocytes. On a pu montrer que de telles substances n'avaient pas les effets mentionnés ci-dessus concernant l'acide rétinoique. 10 On rappelle que les béta-endorphines sont des peptides initialement connus pour être produits et relargués par les cellules nerveuses (neurones) et sont en conséquence des neuropeptides. Le nom d'endorphine est la contraction de endomorphine. Le peptide peut être à son tour clivé en alpha- endorphine (résidus 1 à 16) ou en gammaendorphine (résidus 1 à 17) qui possèdent des actions comparables. Les béta-endorphines sont produites à partir d'un précurseur de plus grande taille: la pro-opiomelanocortine (POMC). Sous l'action d'enzymes spécifiques de type sérine-protéinase présente dans l'hypothalamus, la chaîne polypeptidique est clivée en petits peptides, notamment en peptide N-terminal (111 acides aminés), en hormone adénotropique (ACTH, 39 acides aminés) et en lipotropine béta (béta-LPH, 20 91 acides aminés). L'ACTH est clivé en hormone chargée de stimuler les mélanocytes (alpha-MSH) et en peptide intermédiaire corticotropin-like (CLIP), tandis que la bétaLPH est clivée en gamma-LPH (59 acides aminés) et en béta- endorphine (31 acides aminés). La séquence en acides aminés de la béta-endorphine est la suivante: TyrGly25 Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-LysAsn-AlaIle-Ile-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly-Glu. L'action connue de la béta-endorphine est de diminuer la sensation de douleur qui résulte d'une agression. Elle a donc un rôle dans la lutte contre le stress. Différents types de récepteurs aux béta-endorphines ont été mis en évidence: les récepteurs t 30 (sur lesquels la morphine végétale se fixe avec la plus grande affinité) qui modifient la perception de la douleur, les récepteurs ô (spécifiques des encéphalines) qui se situent dans le système limbique et seraient en relation avec le contrôle des émotions, et les récepteurs (spécifique de la béta- endorphine). On décrit ci-dessous des tests qui ont été effectués pour montrer in vitro les effets de la béta-endorphine sur l'expression des protéines de la différenciation des cellules de l'épiderme. Le protocole expérimentale de ces tests est le suivant: Des épidermes sont incubés pendant 24 heures à 37 C, puis les tissus sont 5 dissociés de leurs nacelles, immédiatement placés dans des tubes stériles RNAse-free et congelés à -80 C. Les acides ribonucléiques (ARN) sont extraits et purifiés selon des méthodes classiques, puis sont analysés par hybridation spécifique avec des sondes fixées sur une membrane (méthode dite des microarrays ). 10 Plus précisément, les étapes sont: - l'élimination de l'ADN par incubation en présence de Dnase I, - la vérification de la pureté par électrophorèse sur gel d'agarose, - la purification des ARN messagers (ARNm) par hybridation des extrémités poly(A) des ARNm à des amorces oligo(dT) biotinylées, et enfin 15 - la capture sélective sur billes de streptavidine. Des sondes ADN multiple marquées au 32p sont alors réalisées par réversetranscription des ARNm liés sur billes de poly(dT), à l'aide d'un pool de primers spécifiques des séquences immobilisées sur les arrays , en présence de [(z32P]-dATP. Des cDNAs immobilisés sur chaque membrane sont hybridés aux 20 sondes marquées correspondantes. Les filtres sont ensuite lavés en conditions stringentes (à 680C) et placés dans des sacs plastiques individuels pour analyse. Cette analyse a lieu par quantification directe de la radioactivité des spots. Les résultats sont exprimés en unités relatives (UR, radioactivité moyenne des points du double spot correspondant à chaque gène, corrigée du bruit de fond et des différences 25 d'intensité de marquage des sondes) . On notera que dans cette expérience, on a considéré de façon arbitraire qu'un gène était exprimé significativement lorsque son UR était supérieure ou égale à 1,5 (c'est-à-dire lorsque le doublet est visible sur les images). La moyenne des résultats de comptage de marqueurs de gènes housekeeping , 30 dont l'expression est généralement considérée comme stable, gènes dits housekeeping , est prise comme référence pour quantifier de façon relative l'expression des autres marqueurs, dans ces conditions expérimentales. On visualise à cet effet en tant que gènes de référence ( housekeeping ), l'ubiquitine et la glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (G3PDH). Les niveaux relatifs d'expression des gènes individuels sont donc corrigés de la différence d'intensité de marquage des sondes utilisées. Cette correction est réalisée sur la base des différences d'intensité de marquage des gènes de référence, entre les différentes sondes. Arbitrairement, la limite de significativité est fixée à - 50 % du contrôle non 5 traité pour un effet répresseur ( 150 %, up-regulation). On a comparé l'expression des protéines dans un épiderme témoin avec celle d'un épiderme traité par l'application topique d'une solution contenant des bétaendorphines à la concentration de 1 picogramme par millilitre (concentration 10 physiologique). Les résultats de ces deux séries d'expérience sont donnés dans le tableau ci-dessous. On peut remarquer que l'application des béta-endorphines ne provoque pas d'effet significatif sur l'expression des gènes de référence comme l'ubiquitine ou la G3PDH. Le traitement par les béta-endorphines a augmenté l'expression des gènes codant pour des protéines intracellulaires, comme par exemple les cytokératines de type 1 (+79%), ou des protéines de cohésion intracellulaire telles que la desmocolline 1 (+109%), la desmocolline 2 (+ 72%), la desmocolline 3 (+36%, non significatif), la desmogléine 1 (+38%, non significatif). Il augmente de façon significative l'expression de protéines de l'enveloppe cornée comme la filaggrine (+53%), et a tendance à augmenter l'expression des protéines comme l'involucrine (+35%), la loricrine (+22%) et la stratifin (+31%). Ces gènes sont généralement connus comme étant inhibés par l'acide rétinoique et ses dérivés. En revanche, le traitement par les béta-endorphines a tendance a diminuer l'expression des protéines liant le calcium, comme la Calmoduline-like skin protein (CLSP), ou encore les calgranulines A et B, qui sont eux connus pour être habituellement fortement augmentées après un traitement par les rétinoides. La diminution d'expression de ces protéines liant le calcium pourrait être en 30 relation avec l'effet favorable des béta-endorphines sur l'expression des protéines d'adhésion qui sont dépendantes du calcium. L'application de béta-endorphines sur un épiderme tend à diminuer l'expression d'une protéine répondant à l'acide rétinoique nommée thymosine béta 10, dont l'expression est augmentée par les rétinoides, et pourrait être liée aux effets néfastes des rétinoïdes, notamment en stimulant l'apoptose cellulaire. Les béta-endorphines pourraient donc agir en diminuant les effets délétères d'une application d'acide rétinoique. Ces résultats montrent qu'une composition cosmétique ou pharmaceutique utilisant la béta-endorphine ou au moins une substance stimulant la production de la 5 béta-endorphine pourrait être destinée à limiter la desquamation par exemple due à des pathologies du type peau xérotique (peau très sèche) ou à des effets de traitement de la peau par des rétinoïdes ou des hydroxyacides. Le traitement par les béta-endorphines tend par ailleurs à augmenter l'expression d'une protéine répondant au facteur de croissance épidermique: l'EGF 10 response factor 1 (+45%). Ce résultat est en faveur d'un effet des béta-endorphines sur la capacité de division des kératinocytes. De plus, il modifie l'expression de protéines d'adhésion à la matrice extracellulaire, comme la laminine, qui ont un rôle dans l'adhésion des kératinocytes basaux à la membrane dermo-épidermique et donc dans le contrôle de la migration des 15 kératinocytes. Ces résultats montrent qu'une composition cosmétique ou pharmaceutique utilisant la béta-endorphine ou au moins une substance stimulant la production de la béta-endorphine pourrait être destinée à avoir une action de cicatrisation. Enfin, il tend à augmenter l'expression d'une enzyme à activité enzymatique qui 20 a un rôle important dans la protection contre le stress radicalaire provoqué par les radicaux libres oxygénés: la catalase (+37%). Une composition cosmétique ou pharmaceutique utilisant la béta-endorphine ou au moins une substance stimulant la production de la béta-endorphine pourrait également être destinée à avoir une action anti-vieillissement. 25 Tableau 1: expression relative des différents marqueurs par les épidermes reconstruits, effets du traitement par béta-endorphine. Valeurs en UR (unités relatives de signal) et en % du témoin non traité. Comparaison avec l'effet de l'acide rétinoïque. Nom des gènes Epiderme Epiderme traité par bétaexprimés témoin endorphines à 10 pg/ml UR UR % par rapport au témoin non témoin Ubiquitine 73,3 97,2 133 Phospholipase A2 1,5 1,5 100 G3PDH 300,5 330,6 110 HLA C de classe 1 40,4 45,7 113 Actine béta 114,6 146,4 128 Protéine ribosomale 79,6 72,8 91 40S Cytokératine 1 17,6 31,6 179 Desmocolline 1 2, 9 6,1 209 Desmogleine 1 7,1 9,7 138 Involucrine 19,7 24,6 125 Loricrine (LOR) 73,7 89,8 122 Stratifine (SFN) 64,1 84,3 131 Filaggrine (FLG) 26,5 40,5 153 Catalase 2,5 3,4 137 Laminine béta-2 7,2 11,2 155 Syndécane 4 1, 5 3,5 233 EGF response factor 6,5 9,5 145 Calgranuline A 51,2 33,8 66 Calgranuline B 156,0 134,3 86 Calmoduline like skin 51,2 26,4 52 protein (CLSP) Thymosine beta 10 157,9 122,8 78 REVENDICATIONS 1) Utilisation de P3-endorphine ou d'au moins une substance stimulant la production de P3-endorphine pour obtenir une composition cosmétique ou pharmaceutique destinée à modifier l'expression des marqueurs de la différenciation des kératinocytes de l'épiderme. 2) Utilisation de 3-endorphine ou d'au moins une substance stimulant la production de P3-endorphine pour obtenir une composition cosmétique ou pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à avoir une action anti-vieillissement. 10 3) Utilisation de P-endorphine ou d'au moins une substance stimulant la production de 03-endorphine pour obtenir une composition cosmétique ou pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à avoir une action de cicatrisation. 15 4) Utilisation de P3-endorphine ou d'au moins une substance stimulant la production de 13-endorphine pour obtenir une composition cosmétique ou pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à limiter la desquamation due à des pathologies du type peau xérotique (peau 20 très sèche) ou à des effets de traitement de la peau par des rétinoïdes ou des hydroxyacides.