FR 2847256 A1 20040521 FR 0214348 A 20021115 NOUVEAU PROCEDE D'OBTENTION D'ACIDE CHONDROITINE SULFURIQUE ET SES UTILISATIONS La présente invention se rapporte au domaine de la chimie et plus particulièrement à celui de la chimie thérapeutique. Elle concerne plus précisément un procédé de production et de purification de dérivés polyglucuroniques permettant d'aboutir dans des conditions avantageuses à des produits biologiques de haut degré de pureté. Elle se rapporte également aux sous-produits formés au cours de ce procédé qui trouvent une utilisation dans la préparation de milieux de culture bactériologiques. Ces sous-produits permettent également d'obtenir des aminoacides qui trouvent une large utilisation dans l'alimentation, en diététique et pour des réactifs de laboratoire. L'invention a spécifiquement pour objet un procédé de production et de purification d'acide chondrotine-sulfurique à partir de tissus d'origine animale et principalement d'origine porcine ou bovine, qui consiste à soumettre des tissus cartilagineux et notamment des trachées-artère de ces animaux congelées, à un broyage puis à une hydrolyse enzymatique par une hydrolase spécifique puis à une filtration et ensuite à une ou plusieurs dialyses contre de l'eau, séparation des acides aminés et des petits peptides et enfin précipitation par un alkanol pour obtenir l'acide chondroitine-sulfurique purifié sous forme de sel de sodium. Les phases les plus importantes du procédé selon l'invention, se situent donc d'une part dans l'hydrolyse enzymatique, et d'autre part dans la succession d'opérations de dialyse. L'hydrolyse enzymatique est effectuée à l'aide d'une protéase alcaline du type serine obtenue à partir de cultures de Bacillus licheniformis et plus particulièrement à partir d'une souche sélectionnée de Bacillus licheniformis commercialisée sous la dénomination PROLYVE 1000 par la société LYVEN. La protéase produite à partir de cette souche est active et stable en solution sur une vaste zone de pH s'étendant de 8,0 à 11,0. Toutefois son activité optimale se situe entre 9,0 et 10,5. Sa température optimale d'activité se situe entre 550 C et 60 C suivant la durée de l'hydrolyse. L'enzyme est totalement inactivée après 10 à 15 minutes de chauffage à 900 C. A côté de son activité endopeptidasique cet enzyme de Bacillus licheniformis présente une action estérasique prononcée qui permet l'hydrolyse de substrats synthétiques. Les agents chelatants sont sans effet sur l'enzyme de Bacillus licheniformis qui est par ailleurs, inhibé par des agents d'acylation comme le fluorure de phénylméthane sulfonyle et le disipropyl phosphofluoridate. L'enzyme de Bacillus licheniformis n'est pas inhibé par l'inhibiteur trypsique de soja mais il est sensible à l'inhibiteur de la pomme de terre et à l'inhibiteur de certaines céréales. L'enzyme de Bacillus licheniformis manifeste une forte activité endopeptidasique. Il a déjà de larges applications dans le domaine de l'hydrolyse des protéines animales ou végétales. Son activité conduit surtout à la formation de petits peptides solubles dans l'eau. Au contraire, il ne produit que de faibles concentrations en acides aminés libres. L'optimum d'action se situe comme indiqué vers 10 suivant le type de protéine à hydrolyser. Il a été nécessaire cependant dans le cas précis à considérer, d'ajuster le pH pour trouver l'optimum d'action pour le substrat considéré. Dans le cas de cartilages de trachée artère selon l'invention, cet optimum de pH se situe entre 8 et 9 et de préférence à 8, 5. La température d'hydrolyse enzymatique se situe vers 600 C pour parfaire l'hydrolyse des protéines tout en évitant que l'acide chondroitine sulfurique ne soit attaqué. Après hydrolyse enzymatique, on procède à une thermolyse de l'enzyme à pH 6,0 et à 970 C pendant 20 à 60 minutes, de préférence pendant 30 minutes. Du fait de conditions physiques modérées, l'acide chondrotine sulfurique ne subit pas de dégradation. La dialyse ou l'ultrafiltration est précédée d'une étape de filtration. Elle conduit à l'élimination des acides aminés et des oligo-peptides formés lors de l'hydrolyse des protéines, qui passent dans l'ultrafiltrat. L'acide chondrotine sulfurique ainsi obtenu est isolé par précipitation en milieu acide (pH 3,0) et éthanolique à l'aide d'un éthanol de titre éthanolique de l'ordre de 96 % (w/v). Le produit est finalement séché sur un appareil de séchage industriel. Le procédé est parfaitement reproductible, quelles que soient les variations dans la qualité des matériaux de départ. Le procédé a été essayé sur 17 lots, 14 lots d'origine bovine et 3 lots d'origine porcine et a conduit à des lots d'acide chondrotine-sulfurique de très haute pureté se situant en règle générale au dessus de 97 % en acide chondrotine-sulfurique en sec pour cent grammes. L'acide chondroitine-sulfurique, sel de sodium (ACSNa) est un polymère dont les monomères, en proportions non définies, sont les sels disodique des isomères 4 ou 6 de l'acide chondroitine sulfurique, disaccharide constituée d'acide f glucuronique et de N10 acétylgalactosamine (liaison 3 1 > 3). L'ACSNa est donc constitué des esters sulfuriques en 4 ou 6 de la N-acétylgalactosamine du monomère, il est dihydraté et répond à la formule C14HI9014N Na2S, 2H20. La structure du monomère se définit comme suit: " COONa H COR2 ", H HH NHCOH3,' H OH R, = SO3Na R2= H R, =H R2= SO3Na Le produit est un mélange de deux polysaccharides dont les monomères sont: l'acide ^-D GLUCURONIQUE et la NACETYL GALACTOSAMINE 4-SULFATE liés en f (1 3) Dans les tissus, les polymères de l'acide chondroitine-sulfurique sont liés d'une manière covalente à des chaînes protéiques pour former des protréoglycanes. La littérature enseigne déjà que l'acide chondroitine sulfurique peut être obtenu à partir de matières premières d'origines variées comme des cartilages d'animaux tel que les bovins, les ovins, les porcins, les chevaux, les requins, les poissons et même les baleines ou les écailles de poissons. Une des sources principales d'acide chondrotine est l'extraction d'organes cartilagineux d'origine bovine ou porcine et notamment de trachées d'origine bovine et porcine. Cependant des développements récents, relatifs en particulier à des contaminations par des virus ou des prions, ont soulevé des problèmes d'innocuité et ont conduit à envisager d'autres sources de matière premières, d'origine aviaire, c'est-à-dire exempts de toute maladie propre aux bovins. Cette considération largement décrite dans le brevet français 2.756.828 s'est sensiblement estompée et ne présente plus le même problème d'acuité. Le procédé selon l'invention vise par une hydrolyse enzymatique spécifique à débarrasser l'acide chondrotine sulfurique des glycoprotéines auxquelles il est associé à l'état naturel. L'enzyme responsable de cette hydrolyse doit présenter une activité spécifique empêchant l'attaque de la molécule d'acide chondrotine sulfurique ou de ses polymères, de manière à éviter le fractionnement irréversible de la molécule. La littérature fournit déjà un certain nombre de références relatives à la production de l'acide chondroitine sulfurique à partir des différentes matières premières animales. C'est ainsi qu'un certain nombre de brevets décrit un procédé d'hydrolyse enzymatique utilisant des protéases (CTPP brevet français 2.804.022, Hokkado JP 2000/273102, Pierre Fabre BF2.756. 828, Biomed Research USP 4.302.577, Agency of Ind-Sci and Technology USP 6.342. 367). La littérature décrit également des procédures d'ultrafiltration utilisant des membranes variées (Hokkado JP2000/273102, Pierre Fabre 2. 736.828) ou la dialyse (CTPP BF2.804.022, Sanrit Sutsu KK JP73/27632). Cette multiplication de techniques de production et surtout la description du brevet français 2.756.828 indique clairement qu'aucun des procédés actuellement décrits n'est pleinement satisfaisant ou conduit à des composés de qualité régulière ou satisfaisante. Selon le dernier brevet 2.756.828 l'acide chondroitine sulfurique obtenu se définit par un poids moléculaire compris entre 20 et 21.000 daltons. Les données de la littérature renseignent habituellement sur une valeur de 8.000 à 50.000. Les essais ont montré qu'il était difficile d'obtenir un acide chondrotine sulfurique de bonne qualité. Le procédé selon l'invention permet justement de résoudre ce problème. Le produit obtenu selon le procédé de la présente invention se caractérise par un poids moléculaire moyen s'échelonnant de 15.000 à 30.000 daltons. Les méthodes de dosage effectuées en routine permettent de définir les critères de pureté: - la description de l'aspect du produit, sa solubilité dans l'eau et la taille maximale des particules (97 % - la détermination de la teneur en ACSNa anhydre, rapportée au produit desséché. Un autre objet de l'invention réside dans l'obtention de peptones au cours de l'hydrolyse enzymatique. L'intérêt présenté par l'hydrolyse enzymatique réside dans le fait que les diverses protéines et en particulier les glycoprotéines sont dégradées en petites molécules telles que les peptones et même en amino acides. Les peptones sont des produits solides ou granuleux, de couleur blanc jaunâtre, de saveur légèrement amère. Ils sont solubles dans l'eau, insolubles dans l'alcool concentré. Les peptones sont constituées par des polypeptides de faible poids moléculaire et par des amino acides. Il peut être important de séparer les amino acides notamment par passage sur une résine échangeuse d'ions et élution par une solution ammoniacale. Les peptones trouvent un emploi comme source d'azote et élément nutritif pour les bouillons de culture, notamment la peptone gélosée. Les amino acides que l'on peut séparer consistent essentiellement en de l'argine, de la lysine et de la tyrosine. Après purification ils constituent des matières premières précieuses en diététique, en pharmacie ou en cosmétique. L'acide chondroitine sulfurique trouve une utilisation importante en thérapeutique dans le traitement de l'arthrose et dans le traitement des affections oculaires. Le procédé selon l'invention se définit comme suit à la lumière des exemples. Etape 1 Broyage des trachées congelées Les trachées utilisées sont collectées auprès d'abattoirs agréés. On procède à une vérification visuelle des trachées congelées puis on procède à un broyage dans un hachoir à couteaux. On utilise 3.000 kg par lot. Etape 2 Hydrolyse enzymatique On opère en cuve thermostatée à 60 C en introduisant les 3.000 kg de broyat de trachées et de l'eau (4.500 litres) puis une solution de protéase alcaline (Prolyve 1000) titrant plus de 3. 000 U/mg. On ajuste le pH à 8,5 par addition d'une solution d'hydroxyde de sodium 10 M. On laisse l'hydrolyse s'effectuer pendant 5 heures, à cette température. Etape 3 Thermolyse de l'enzyme On amène le pH du jus d'hydrolyse maintenu à 600 C, en ajoutant de l'acide chlorhydrique 12 M puis on chauffe 30 minutes à 970 C. Le chauffage produit en même temps que l'hydrolyse, une décontamination du milieu. Etape 4 Filtration et ultra filtration On laisse refroidir les jus d'hydrolyse thermolysés et on procède à une décantation, puis à une filtration sur filtre presse. On procède sur les jus filtrés à une ultra filtration sur membrane PW120 PO ayant un seuil de coupure d'environ 20.000 daltons. Cette opération permet de concentrer la solution en éliminant les acides aminés et les petits peptides. On peut effectuer dans ce cas au préalable, un traitement alcalin pour les trachées d'origine bovine. On maintient 1 heure entre 20 et 250 C. Le produit est envoyé par l'intermédiaire d'une canalisation dédiée jusqu'à la cuve de lancement. Le jus d'hydrolyse titre 12 % environ d'extrait sec. La température est de 60 C, le pH est de 9. On utilise un volume (Vi) de 5.000 litres. Concentration Cette étape permet de concentrer le produit tout en éliminant les éléments non souhaités tels que les protéines, les sels minéraux... débit de l'ultra filtration environ 1.000-1.500 litres par heure le pH est maintenu à 9 et la température à 60 C Le volume final d'élution (VI) est de 3.000 litres. lère dialyse (Dialyse en automatique - dialyse grossière) On envoie de l'eau purifiée à 600 C en continu, tout en procédant à l'ultra filtration. Le volume de la cuve de lancement demeure constant. Volume total d'eau ajoutée: 3.600 litres. débit de l'ultra filtration: environ 1.500 litres par heure pH 9 Volume final (VI): 2.200 litres 2ème dialyse On effectue la dialyse sur la totalité des solutions aqueuses. Il s'agit donc d'une dialyse fine. On envoie de l'eau purifiée à 600 C en une seule fois pour favoriser une dilution importante, de façon à réaliser une viscosité plus faible et une meilleure dilution des électrolytes. Cette étape permet d'éliminer plus facilement les protéines. Volume total d'eau ajoutée: 3.600 litres. La température du milieu est de 500 C. Le débit de l'ultra filtration est de 1.500 à 2.000 litres par heure. La valeur du pH est de l'ordre de 9. Le volume final est de 2.200 litres 3ème dialyse On effectue la dialyse sur la totalité de l'éluat. On procède comme pour la 2ème dialyse. Volume total d'eau ajoutée: 2.000 litres. La température est de 500 C. Le débit de l'ultra filtration est de 1.500 à 2.000 litres par heure. La valeur du pH est de 9. Le volume final est de 2.000 litres. Le débit du produit d'ultra filtration est de 1.500 à 2.000 litres par heure. Le pH du milieu est de 9. Le volume final est de 2.200 litres. On procède ensuite à une précipitation par l'éthanol. On ajoute de l'acide chlorhydrique 12 M jusqu'à pH 3,0 puis du chlorure de sodium jusqu'à une concentration finale de 80 grammes par litre. Après filtration, on recueille une solution limpide dans une cuve de précipitation, on ajoute de l'éthanol à raison de 1,3 fois le volume de filtrat. On soutire le surnageant hydro25 alcoolique et le précipité d'acide chondroitine sulfurique est transféré dans une autre cuve. On décante et élimine le surnageant puis on recueille le précipité qu'on purifie par 3 lavages successifs à l'aide d'éthanol dilué, de concentrations croissantes progressives (70 , 750 et 800). Le produit est ensuite essoré et rincé 2 fois à l'éthanol. Le produit est ensuite séché dans un dessicateur équipé d'une pompe à vide et d'une régulation thermique jusqu'à obtention d'une perte à la dessication comprise entre 10 et 13 %. Le séchage est effectué à 60 C sous vide. L'acide chondroitine sulfurique obtenu dans ces conditions se présente sous forme d'une poudre blanche à blanc-cassé, soluble dans l'eau. La taille des particules obtenue par tamisage montre qu'il y a 97 % des particules Le pH en solution aqueuse à 1 % est de 5,5 à 7,5. Les données spectrales sont conformes à celles d'un témoin (spectre IR en pastilles de BrK comparable à celui d'un témoin, bandes caractéristiques à 930-920 cm-', 860-850cm-1 et 730-710cm'1 pour l'acide chondrotine 4sulfurique et à 1.660-1.600cm-' et 1.250-1270-cm-1 pour l'acide chondrotine 6-sulfurique). La teneur en soufre varie de 5,0 à 7,0 % rapporté au produit desséché. L'azote total varie de 2,5 à 4,5 % rapporte au produit desséché. Le taux de protéines est inférieur à 2 % déterminée par la méthode de Lowry. Les cendres sulfuriques varient de 20 à 30 %. Le dosage titrimétrique de l'acide chondrotine sulfurique indique une teneur de 95 à 102 % rapporté au produit desséché. La détermination de la contamination bactérienne indique un nombre de germes aérobies viables totaux inférieur à 1.000 CFU par gramme. Le tableau I suivant récapitule les normes obtenues sur 17 lots différents montrant la parfaite répétitivité des essais. TABLEAU Lot NO Date Taille Origine Perte pH Identifiec. Soufre Azote Protéines Cendres Chlorures Dosage Product. du Lot en des Dessiccat Sol. 1 % ABC / sec Total /sec Sul./ sec ACS / sec Kilogr. Trachées p. cent p. cent p. cent p. cent p.cent p. cent p. cent +.. 5,0 â 7,0 2,5 à 4,5 8A746 01/98 534,8 Bovine 11 5,5. . . 5,4 2,9 0,9 26 0,5 97 8B916 02/98 1000,0 Bovine 10 6,0 +.+ + 5,1 2,9 0,8 27 0,5 96 8B999 02/98 1010,6 Bovine 10 5,2 + +.+ 5,7 2,7 0,8 26 0,6 97 8C201 03/98 1007,0 Bovine il 6, 1. . . 5,6 3,3 1,1 27 0,5 98 8C359 03/98 1010,5 Bovine 12 6,5. . . 5,2 2, 8 1,4 27 0,3 96 8D569 04/98 1018,9 Bovine 12 7,3. . . 5,2 3,1 1,3 28 0,4 97 8E760 05/98 1033,5 Bovine 10 7,1. . . 5,2 3,0 1,3 28 0,5 99 SE833 06/98 400,0 Porcine 10 7,0. . . 5,0 3,1 1,7 26 0,7 98 8F926 06/98 1011,3 Bovine 11 6,1. . . 5,1 3,1 0,9 27 0,5 98 8G066 07/98 1005,7 Bovine 12 6,0. . . 5,0 3,0 1,9 27 0,5 98 8G098 07/98 1013,5 Porcine il 5,2. . . 5,0 3,2 1,4 26 0,6 98 8G166 07/98 1029,5 Bovine 10 5,6 +.+ + 5,5 3,2 2,3 25 0,4 97 8H300 08/98 1021,1 Bovine il 6,1. . . 5,1 3,2 1,4 26 0,2 100 8J425 09/98 1001,1 Porcine il 7,0. . . 5,1 3,3 1,6 24 0,3 99 8J454 09/98 1018,2 Bovine il 6,0. . . 5,4 3,2 1,7 25 0,2 98 8J578 10/98 1014,1 Bovine 10 6,7. . . 5,0 3,2 1,4 26 0,3 98 8K650 10/98 1012,6 Bovine 10 6,2. . . 5,1 3,2 1,4 26 0,3 99 REVENDICATIONS 1. Nouveau procédé de production et de purification de l'acide chondroitine sulfurique, procédé qui permet à la fois d'obtenir un produit de haute qualité en d'excellente reproductivité dans lequel on soumet des tissus cartilagineux d'origine animale à une hydrolyse enzymatique puis après neutralisation, à une ultrafiltration et à une dialyse et dans lequel on précipite l'acide chondroitine sulfurique par addition d'un alkanol soluble dans l'eau, caractérisé en ce qu'on effectue l'hydrolyse enzymatique des tissus cartilagineux d'origine bovine ou porcine au moyen d'une protéase alcaline extraite de Bacillus licheniformis puis la thermolyse de l'enzyme à chaud en milieu acide, la concentration de l'acide chondrotine sulfurique par ultrafiltration et dialyse et la précipitation de l'acide chondroitine sulfurique par addition d'un volume déterminé d'éthanol. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéase extraite de Bacillus licheniformis est le produit commercialisé sous la marque PROLYVE 1.000 par la société Lyven. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que pour le substrat considéré l'optimum de l'action enzymatique se situe à un pH compris entre 8 et9. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que l'optimum d'action se situe à un pH de 8,5. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'hydrolyse enzymatique est effectuée à une température voisine de 60 C. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel on effectue une thermolyse de l'enzyme à pH 6,0 et à 97TC. 7. Procédé selon la revendication 6 dans lequel la thermolyse est effectué pendant 20 à minutes. 8. Procédé selon les revendications 1, dans lequel on procède à 3 dialyses successives pour concentrer le milieu en acide chondroitine sulfurique répondant aux normes permettant l'obtention d'un produit présentant une pureté supérieure à 95 %. 9. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on précipite l'acide chondroitine sulfurique par addition d'un volume d'éthanol en quantité égale à 1,3 fois le volume de solution filtrée. 10. Procédé selon la revendication 1, dans lequel après purification et séchage on obtient un acide chondroitine sulfurique de qualité pharmaceutique. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel l'acide chondroitine sulfurique obtenu présente un poids moléculaire s'échelonnant de 15.000 à 30.000 Daltons. 12. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on sépare la fraction contenant des petits peptides constitués par des peptones et des acides aminés, après dialyse. 13. Utilisation des peptones selon la revendication 12, pour la fabrication de milieux de culture. 14. Utilisation des aminoacides obtenus selon le procédé de la revendication 12, en vue de la réalisation de préparations pharmaceutiques, cosmétiques ou diététiques.