FR 2857970 A1 20050128 FR 0309181 A 20030725 i PROCEDE DE PRODUCTION DE CHITOSANE DE HAUT POIDS MOLECULAIRE TOTALEMENT DESACETYLE La présente invention se rapporte au domaine des biopolymères, plus particulièrement à celui des chitosanes; elle porte sur un procédé de désacétylation hétérogène de la chitine et/ou du chitosane, basé sur un traitement thermo- mécano-chimique, afin d'obtenir du chitosane de haut poids moléculaire totalement désacétylé. La chitine est, avec la cellulose, le polysaccharide le plus répandu dans la nature. La chitine est un copolymère constitué d'unités de répétition Dglucosamine et N-acétyl D-glucosamine liées 13,(1->4). Elle présente un degré d'acétylation (DA, qui représente le pourcentage en nombre, ou fraction molaire, des résidus N-acétyl glucosamine dans le polymère), généralement supérieur à 80%, ce qui lui confère la propriété d'être complètement insoluble en milieu aqueux. Industriellement, la chitine est extraite d'exosquelettes d'arthropodes tels que le homard, le crabe, la crevette (dans ce cas, il s'agit de la chitine c), ou de l'endosquelette de céphalopodes tels que le calamar (dans ce cas il s'agit de la chitine >). La chitine, semi-cristalline, est constituée d'un réseau de fibres organisées. La chitine existe principalement sous deux formes allotropiques: - la chitine ca, dont les chaînes polysaccharidiques sont disposées de façon antiparallèle entre plans de chaîne successifs, ce qui donne naissance à de nombreux ponts hydrogène, et, par conséquent, à une rigidité importante et une faible réactivité de la chitine cc vis à vis de la désacétylation; la chitine ac n'est pas soluble dans les solvants aqueux et ne gonfle que très faiblement en milieu aqueux; - la chitine À, dont les chaînes polysaccharidiques sont toutes parallèles entre elles; les ponts hydrogène y sont moins nombreux, ce qui confère à la chitine 3 une meilleure réactivité et hydrophilie: elle présente ainsi la capacité de gonfler fortement dans l'eau. Le chitosane, dérivé désacétylé de la chitine, est un copolymère linéaire de D-glucosamine et N-acétyl D-glucosamine liés P,(1->4). Il est obtenu par désacétylation partielle de la chitine et présente la particularité, par définition, d'être soluble dans les acides dilués, ceci contrairement à la chitine. Cette propriété est acquise, lors d'une désacétylation hétérogène, pour un DA inférieur à 40 %. Le chitosane possède donc un nombre beaucoup plus important de groupes amine libres que la chitine. A l'état cristallin, le chitosane ne possède, de plus, qu'une seule variété allotropique. Le chitosane est utilisé à l'échelle industrielle dans des domaines variés: traitement des déchets, transformation des aliments, cosmétologie, médecine, biotechnologie. Grâce à ses propriétés de biodégradabilité, biorésorbabilité, biocompatibilité et de non toxicité, il est utilisé largement dans de nombreuses applications pharmaceutiques: comme excipient dans des dispositifs pharmaceutiques conventionnels; comme système de libération contrôlée de médicaments; comme principe actif: hypocholestérolémiant, bactériostatique, cicatrisant des plaies. L'efficacité des chitosanes est fonction de leur poids moléculaire et de leur degré d'acétylation, étant due plus particulièrement à la présence de groupes amine réactifs. Le chitosane utilisé dans l'industrie pharmaceutique doit être caractérisé d'une manière rigoureuse en termes de: qualité, propriétés intrinsèques (pureté, poids moléculaire, degré de désacétylation), forme physique. Le poids moléculaire et le degré de désacétylation du chitosane pourront influencer un bon nombre de facteurs tels que sa solubilité en milieu aqueux, sa capacité de gonflement et sa vitesse de dégradation enzymatique. Ces paramètres influencent non seulement les propriétés physico-chimiques du chitosane, mais aussi: sa biodégradabilité, son activité immunologique et ses propriétés mécaniques ou rhéologiques. Dans le cas de nombreuses applications en pharmacie et en cosmétologie, un taux de désacétylation voisin de 100% est nécessaire. L'intérêt d'obtenir un chitosane totalement désacétylé se rapporte également à d'autres propriétés du chitosane, notamment à ses propriétés électrostatiques, qui sont à la base de nombreuses interactions. Aussi, I'utilisation du chitosane totalement désacétylé permet entre autre de préparer des séries homogènes de chitosane, de même distribution moléculaire; dans ce cas, le chitosane sera réacétylé à des degrés d'acétylation différents, rigoureusement caractérisés, ceci étant particulièrement utile et important dans les applications pharmaceutiques mais aussi dans de nombreuses autres applications. Il existe plusieurs méthodes pour déterminer le degré de désacétylation du chitosane: - la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire RMN; - la titration potentiométrique linéaire (titration volumétrique); - la spectrophotométrie UV (ultra-violet) à partir de la dérivée première; - la spectroscopie IR (infra-rouge) à transformée de Fourrier; - le dichroisme circulaire; - l'analyse élémentaire; - la chromatographie en phase gazeuse. La précision des valeurs obtenues par ces différentes méthodes est, cependant, très variable (comme rapporté par plusieurs auteurs, par exemple T. A. Khan et al. dans J. Pharm. Pharmaceut Sci. 5(3) :205-212, 2002). A titre d'exemple, le seuil de détection de la méthode de mesure du degré de désacétylation est proche de 1% pour la spectroscopie IR, alors qu'il est inférieur à 0,1% dans le cas de la spectroscopie RMN du proton. De même, l'estimation du poids moléculaire moyen du chitosane dépend de la méthode de mesure utilisée. Le poids moléculaire moyen d'un polymère peut être mesuré par une des méthodes suivantes - la chromatographie d'exclusion stérique; - la viscosimétrie; - la photométrie de diffusion de la lumière laser à l'aide d'un détecteur laser mlultiangles. Le chitosane de haut poids moléculaire présente des propriétés mécaniques et rhéologiques nouvelles: viscosité élevée, capacités améliorées de former des films, des fils ou des hydrogels physiques, utiles notamment pour les applications du chitosane en médecine et dans les biotechnologies. La désacétylation de la chitine peut être réalisée à l'aide d'enzymes appelés chitine-désacétylases, avec de bons rendements. Cependant, cette méthode est limitée à l'échelle du laboratoire en raison du coût élevé des chitines-désacétylases et de leur faible productivité. De ce fait, la transformation de la chitine en chitosane par désacétylation chimique s'impose, grâce à son coût plus réduit et une mise en oeuvre plus simple. La désacétylation chimique de la chitine et/ou du chitosane a lieu au cours d'une réaction en milieu basique (par exemple, avec de la soude concentrée), dont la conséquence est la rupture de la liaison entre le groupe acétyl et le groupe amine lié à l'atome C-2. Une grande variété de techniques de désacétylation chimique a été testée, afin d'obtenir un degré élevé de désacétylation, avec une dégradation du polymère réduite au minimum. En effet, des conditions expérimentales trop agressives peuvent entraîner une forte dépolymérisation, au cours de laquelle la liaison glycosidique 3,(1->4) est rompue. Ces techniques font varier le nombre de traitements, la température du traitement, la durée du traitement, les étapes de lavage et séchage intercalées entre les étapes de traitement, I'utilisation de solvants organiques miscibles à l'eau comme milieu réactionnel, etc. Les conditions habituellement utilisées: solutions de soude à 35-60% (en poids), températures comprises entre 80 et 140 C, temps de traitement allant de trente minutes à plusieurs jours, atmosphère inerte ou présence de composants qui fixent l'oxygène, bien que permettant d'obtenir des degrés de désacétylation élevés, conduisent cependant à une altération importante de la structure macromoléculaire du chitosane. Le demandeur a constaté que, de manière surprenante, il était possible d'obtenir du chitosane présentant un degré de désacétylation pratiquement de 100%, comme mesuré par RMN 'H et un poids moléculaire très élevé (supérieur à 4,5 x 105 g/mol), comme mesuré par chromatographie d'exclusion stérique, dans des conditions de traitement thermique plus douces: températures inférieures ou égales à 100 C, temps de cuisson compris de préférence entre 20 et 30 min, si chaque étape de cuisson était précédée de plusieurs cycles de congélation-décongélation, au cours desquels une suspension de chitine et/ou de chitosane dans une solution de soude concentrée était congelée, dégazée puis décongelée sous vide à température ambiante. L'invention concerne un procédé de désacétylation au moins partielle de la chitine et/ou du chitosane, caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs étapes de cuisson, d'une suspension de chitine et/ou chitosane, dans une solution de soude concentrée, à une température inférieure ou égale à 100 C, pour une durée de préférence comprise entre 20 et 30 min, ladite cuisson étant réalisée dans un réacteur maintenu sous pression réduite et en l'absence de dioxygène, chaque étape de cuisson étant précédée par une succession d'au moins six cycles de gel-dégel, chacun de ces cycles comprenant les étapes suivantes: - a) immerger ledit réacteur dans un milieu réfrigérant jusqu'à congélation complète du milieu réactionnel - b) dégazer ledit réacteur, de façon à obtenir à l'intérieur une pression inférieure à la pression atmosphérique; - c) chauffer progressivement ledit réacteur jusqu'à décongélation complète de ladite suspension. Le procédé de l'invention comprend également les étapes suivantes - une étape de neutralisation de la soude du milieu réactionnel jusqu'à l'obtention d'un pH de 8,5 environ; - une étape de lavage à l'eau déminéralisée consistant en plusieurs lavages entrecoupés de centrifugations; - une étape de lyophilisation après congélation. La présente invention concerne un procédé de désacétylation hétérogène de la chitine et/ou du chitosane, dans des conditions plus douces que celles connues dans l'art antérieur: températures de cuisson moins élevées, temps de cuisson plus courts, nombres réduits de cuissons successives comparé à un procédé classique sous atmosphère inerte et à pression ambiante (pour des températures et des durées de réaction équivalentes). Le procédé de désacétylation de la chitine et/ou du chitosane conformément à l'invention consiste en une ou plusieurs étapes de cuisson d'une suspension de chitine dans une solution de soude concentrée, chaque étape étant précédée d'une succession de cycles de gel-dégel de ladite suspension. Les différentes étapes du procédé vont être analysées en détail ci-après. Cycles de gel-dégel Une suspension de chitine finement divisée et/ou de chitosane dispersée dans une solution de soude à 50% en poids, constituant le milieu réactionnel, est placée dans un réacteur. Ce milieu réactionnel est donc hétérogène. Chaque cycle de gel-dégel comprend les étapes suivantes: - le réacteur fermé est plongé dans un milieu réfrigérant, par exemple de l'azote liquide, jusqu'à congélation complète dudit milieu réactionnel; - la pression à l'intérieur du réacteur est réduite au moyen d'une pompe qui évacue l'air présent à l'intérieur du réacteur; la pression finale à l'intérieur du réacteur est inférieure à la pression atmosphérique et elle le restera jusqu'à la fin de la réaction; - le milieu réactionnel est chauffé progressivement par immersion dudit réacteur dans de l'eau à température ambiante jusqu'à sa décongélation complète. Le demandeur a constaté que, dans ces conditions, le réseau cristallin de la chitine est fortement modifié. Ce phénomène est d'autant plus marqué que le nombre de cycle est important. Un minimum de six cycles de geldégel est nécessaire et suffisant pour déstructurer le réseau cristallin de la chitine. Ce matériau amorphe devient ainsi plus sensible à l'action de la soude, au cours de l'étape de cuisson suivant le dernier cycle de gel-dégel. On peut donc caractériser les transformations subies par la chitine et/ou le chitosane au cours des cycles de gel-dégel comme étant dues à une action thermo-mécanique sur leur réseau cristallin. Cuisson La cuisson du milieu réactionnel se fait par étapes, chaque étape ou réaction de cuisson étant précédée d'une succession de cycles de gel-dégel (au minimum six), comme décrit plus haut. La réaction de cuisson a lieu à une température inférieure ou égale à 100 C, de préférence comprise entre 80 et 100 C. La durée d'une réaction de cuisson est de préférence comprise entre 20 et 30 min. Sans l'ouvrir, le réacteur est placé dans un bain d'huile chauffé à la température de cuisson désirée. La réaction de cuisson a lieu à une pression réduite et à une concentration en dioxygène faible. Ceci est particulièrement important, car, dans ces conditions de cuisson, le dioxygène intervient dans le mécanisme réactionnel ayant alors pour conséquence l'hydrolyse et la dégradation du polymère. Pendant toute la durée de la cuisson, le réacteur se trouve sous agitation. Au cours de la deuxième étape de cuisson et sous l'action de la soude, on passe de la structure cristalline de la chitine à la structure cristalline du chitosane, plus stable; c'est donc une action thermo- chimique qui s'exerce sur la chitine et/ou le chitosane pendant la réaction de désacétylation. En partant de la chitine ca on obtient, après la première réaction de cuisson, une chitine recristallisée présentant une structure cristalline différente de celle de la chitine ca et proche de la structure cristalline de la chitine 3. Cette technique de désacétylation de la chitine permet donc d'effacer les différences de réactivité qui existent entre la chitine ca et la chitine 3 vis à vis de la désacétylation en améliorant fortement l'efficacité de la réaction en ce qui concerne la chitine c. Ceci est très avantageux, compte tenu des propriétés plus intéressantes de la chitine P3, notamment sa capacité de gonfler dans l'eau, utile dans des applications galéniques et pour les dispositifs médicaux à base de chitine. Le chitosane totalement désacétylé obtenu selon ce procédé n'est pas complètement amorphe, car il recristallise partiellement à la fin de la cuisson et lors de son isolement. A la fin de la dernière étape de cuisson, le réacteur est immergé dans l'azote liquide, afin d'abaisser la température du milieu réactionnel à température ambiante, puis il est ouvert. Le procédé de désacétylation de la chitine et/ou du chitosane de l'invention comprend, en plus des étapes décrites ci-dessus, des étapes supplémentaires de neutralisation, lavage et de lyophilisation. Neutralisation Le produit final obtenu par le procédé de désacétylation décrit est soumis à une étape de neutralisation visant à réduire la concentration en soude dans le milieu réactionnel après son refroidissement en fin de réaction. Ceci est réalisé à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique de faible concentration (0,5 M). Le pH final à la fin de cette étape de lavage doit être proche de 8,5 pour éviter la solubilisation de l'échantillon. Lavages Une succession de lavages suit, ce qui a pour but d'éliminer les sels formés (acétate de sodium relargué lors de la désacétylation, et chlorure de sodium produit lors de la neutralisation). Ces lavages sont réalisés à l'aide d'eau distillée contenant de l'ammoniac, ceci afin de remonter le pH de l'eau de lavage à 8,5. Chaque lavage dure un minimum de 30 minutes et est suivi d'une centrifugation destinée à récupérer le produit désacétylé. Lyophilisation Le produit final présent dans une solution de pH 8,5 est soumis à une lyophilisation. On obtient ainsi du chitosane totalement désacétylé. Le procédé de désacétylation de la chitine et/ou du chitosane selon l'invention peut être arrêté après une ou plusieurs étapes de cuisson. Comme mentionné plus haut, en partant de la chitine c on obtient à la fin de la première réaction de cuisson un produit dont la structure ressemble à celle de la chitine P. Soumis aux étapes de neutralisation, lavage et de lyophilisation, ce produit se présente sous forme d'une éponge qui gonfle dans l'eau (alors que la matière première, la chitine ca, ne gonfle pas dans l'eau). Ceci permet donc de transformer la chitine c, qui se prête moins à des applications pharmaceutiques ou de biotechnologie, en une structure beaucoup plus ouverte et facilement destructurable ressemblant en ceci à la chitine P, qui possède des propriétés plus intéressantes, notamment la capacité de gonfler dans l'eau. Si, par contre, on souhaite obtenir un chitosane totalement désacétylé, on poursuit les réactions de cuisson selon le procédé décrit. Cinq étapes de cuisson sont nécessaires pour désacétyler complètement la chitine a ou la chitine P. Dans ce cas, l'étape de lyophilisation sera effectuée à la fin du procédé, permettant d'obtenir un chitosane totalement désacétylé. La technique de désacétylation de la chitine et/ou du chitosane de l'invention permet d'obtenir un chitosane avec un degré de désacétylation très élevé, pratiquement égal à 100%, comme mesuré par RMN 1H (quand l'échantillon peut être solubilisé dans D20), selon la technique décrite, par exemple, par Hirai, A, Odani, H. et Nakajima, A. dans Determination of degree of deacetylation of chitosan by 1H NMR spectroscopy Polym. Bull. 1991, 26, 87-94. Le seuil de détection de cette technique est en effet inférieur à celui de la méthode IR, par exemple, ce qui rend plus fiable le résultat obtenu dans le cadre de la présente invention. Le procédé décrit permet également d'obtenir un chitosane dont le haut poids moléculaire atteint des valeurs supérieures à 4,5 x 105 g.moli-, comme mesuré par chromatographie d'exclusion stérique selon la méthode décrite par C. Schatz et al. dans Typical physicochemical behaviors of chitosan in aqueous solution Biomacromolecules, 2003, 4(3): 641-648, qui fait état de la variation du dn/dC selon le degré d'acétylation. L'invention sera mieux comprise à la lecture de l'exemple de réalisation suivant qui l'illustre à titre non limitatif. Préparation de chitosane de haut poids moléculaire totalement désacétylé a) Désacétylation de la chitine Cycles de gel-dégel La chitine (0,45 g), finement divisée, est introduite dans un réacteur muni d'un bec de dégazage (semblable à un tube de Schlenk). La soude (NaOH 50% (w/v)) est ensuite ajoutée, à température ambiante. Le réacteur est ensuite fermé et immergé dans l'azote liquide jusqu'à solidification complète de la solution de soude/chitine. Grâce au bec de dégazage, on relie le réacteur à une pompe à palette et on tire sous pression réduite (temps de dégazage: 1 min). La pression à l'intérieur du réacteur devient ainsi inférieure à la pression atmosphérique et de l'ordre de 0.01 millibar et elle le restera jusqu'à la fin de la réaction. Le réacteur est ensuite immergé dans l'eau à température ambiante jusqu'au dégel total. Pour un deuxième cycle, on immerge le réacteur dans l'azote liquide comme décrit ci-dessus. Cuisson Après plusieurs cycles de gel-dégel (minimum six), on procède à la première étape de cuisson. Sans rouvrir le réacteur, on le place dans un bain d'huile chauffé à la température désirée et on agite pendant le temps souhaité. b) Neutralisation, lavages Pour arrêter la cuisson, le réacteur est immergé dans de l'azote liquide. Le réacteur est ensuite ouvert et le produit final qui s'y trouve est récupéré. La soude encore présente est neutralisée par une solution d'acide chlorhydrique 0,5 M. Ensuite, le produit final est lavé à l'eau déminéralisée dont le pH a été ajusté à 8, 5 grâce à de l'ammoniac jusqu'à retrouver la conductivité de l'eau déminéralisée (étapes de lavages alternant avec des centrifugations). c) Lyophilisation Le produit lavé puis congelé est enfin lyophilisé. il REVENDICATIONS 1. Procédé de désacétylation au moins partielle de la chitine et/ou du chitosane, caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs étapes de cuisson d'une suspension de chitine et/ou du chitosane dans une solution de soude concentrée, à une température inférieure ou égale à 100 C, pour une durée de préférence comprise entre 20 et 30 min, ladite cuisson étant réalisée dans un réacteur à pression réduite et en l'absence de dioxygène, chaque étape de cuisson étant précédée par une succession d'au moins six cycles de gel-dégel, chacun de ces cycles comprenant les étapes suivantes: - a) immerger ledit réacteur dans un milieu réfrigérant jusqu'à congélation complète du milieu réactionnel; - b) dégazer ledit réacteur de façon à obtenir à l'intérieur une pression inférieure à la pression atmosphérique; - c) chauffer progressivement ledit réacteur jusqu'à décongélation complète de ladite suspension. 2. Procédé de désacétylation de la chitine selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une seule étape de cuisson d'une suspension de chitine a dans une solution de soude concentrée. 3. Chitine obtenue selon le procédé de la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle présente une réactivité, vis à vis du procédé de désacétylation selon la revendication 1, proche de celle de la chitine P. 4. Procédé de désacétylation de la chitine et/ou du chitosane selon la revendication 1, caractérisé en ce que la pression à l'intérieur du réacteur est réduite au moyen d'une pompe jusqu'à une valeur de 0,01 milibar environ. 5. Procédé selon la revendication 1 pour la désacétylation complète de la chitine ca ou I, comprenant cinq étapes de cuisson, la mesure du degré de désacétylation étant réalisée par RMN 'H. 6. Procédé selon l'une des revendications 1-2 et 4-5, pour la désacétylation au moins partielle de la chitine et/ou du chitosane, comprenant les étapes suivantes additionnelles: - une étape de neutralisation de la soude du milieu réactionnel jusqu'à un pH de 8,5; une étape de lavage à l'eau déminéralisée consistant en plusieurs lavages entrecoupés de centrifugations; - une étape de lyophilisation après congélation. 7.Chitosane totalement désacétylé obtenu selon le procédé de la revendication 6, caractérisé par un poids moléculaire supérieur à 4,5 x 105 g/mol, comme déterminé par chromatographie d'exclusion stérique.