FR 2848670 A1 20040618 FR 0216012 A 20021217 Micro-composant étalon pour le calibrage ou l'étalonnage d'équipements de mesure de fluorescence et biopuce le comportant. Domaine technique de l'invention L'invention concerne un micro-composant étalon pour le calibrage et l'étalonnage d'équipements de mesure de fluorescence comprenant un substrat sur lequel est disposée au moins une couche mince, comportant des 10 composants fluorescents définissant un premier niveau de fluorescence. Etat de la technique Un micro-composant étalon connu (figure 1) comporte un substrat 1 en verre, non fluorescent, sur lequel est déposée une couche 2 en matériau organique fluorescent, de 3 microns d'épaisseur. Il comporte également des ouvertures 3 formées dans la couche 2 par gravure. Ce type de micro-composant permet d'obtenir un niveau de fluorescence correspondant à celui de la couche 2. 20 Cependant les ouvertures 3 ont approximativement une largeur de 4 microns et sont espacées les unes des autres de 8 microns, ce qui n'est pas satisfaisant pour le calibrage des instruments généralement employés. Le document W00159503 décrit un micro-composant étalon comportant une 25 couche fluorescente déposée sur un substrat. Il est généralement utilisé pour établir une base de référence entre différents microscopes et pour caractériser une qualité d'image, par exemple en termes de résolution, de contraste, de profondeur de champ et de distorsion. La couche est recouverte par un masque fin, comportant des ouvertures et non fluorescent. Le masque et la couche fluorescente sont plaqués l'un sur l'autre, ce qui nécessite trois opérations de fabrication:la réalisation de la couche, la réalisation du masque et leur assemblage. De plus, le masque et la couche étant réalisés en deux matériaux différents, ils ne peuvent pas être placés sur le même plan optique, au risque de déformer l'image optique de la zone observée. Objet de l'invention io L'invention a pour but un micro-composant étalon ne présentant pas les inconvénients des micro-composants étalons de l'art antérieur et facile à réaliser. Selon l'invention, ce but est atteint par le fait que la couche mince comporte au moins une zone insolée de manière à définir au moins un deuxième niveau de fluorescence inférieur au premier niveau de fluorescence. Selon un développement de l'invention, la couche mince comporte des ouvertures définissant un troisième niveau de fluorescence inférieur aux premier 20 et second niveaux de fluorescence. Selon un mode de réalisation préférentiel, la couche mince comporte une pluralité de zones insolées de manière à définir une pluralité de niveaux de fluorescence différents. Selon une autre caractéristique de l'invention, le micro-composant étalon comporte une pluralité de couches minces superposées, de manière à définir une pluralité de niveaux de fluorescence. L'invention a également pour objet une biopuce comportant, sur un même substrat, au moins une sonde biologique et au moins un micro-composant étalon tel que décrit ci-dessus. L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un microcomposant étalon comprenant le dépôt sur un substrat d'au moins une couche mince fluorescente définissant un premier niveau de fluorescence, et l'insolation d'au moins une zone de la couche mince. Description sommaire des dessins D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention donnés à titre d'exemples non limitatifs et représentés aux dessins annexés, 15 dans lesquels: La figure 1 est une représentation schématique d'un micro-composant étalon selon l'art antérieur. La figure 2 représente schématiquement un premier mode de réalisation d'un 20 micro-composant étalon selon l'invention. Les figures 3 et 4 représentent un second mode de réalisation d'un microcomposant étalon selon l'invention, respectivement avant et après gravure d'une seconde couche mince. La figure 5 est une représentation schématique d'une biopuce comprenant un 25 micro-composant étalon selon l'invention. Les figures 6 et 7 représentent des troisième et quatrième modes de réalisation d'un micro-composant étalon comportant une couche mince de protection selon l'invention. Description de modes particuliers de réalisation. Sur la figure 2, un micro-composant étalon 4 destiné au calibrage ou à l'étalonnage d'équipements de mesure de fluorescence, tels que les 5 microscopes de fluorescence confocale ou non, comporte un substrat 1, nonfluorescent, sur lequel est disposée au moins une couche mince 2. Le substrat 1 est, de préférence, constitué par un matériau choisi parmi le silicium, la silice, le quartz, les plastiques et les verres. La couche mince 2 comporte des composants fluorescents définissant un premier niveau de fluorescence. Elle peut être réalisée en matériau fluorescent ou comporter des particules ou des molécules fluorescentes. Ainsi, elle peut être constituée par une résine photosensible, fluorescente ou comportant des particules fluorescentes, telles que la Duramide 7505 commercialisée par la 15 société OLIN Microelectronic Material. La couche mince 2 est déposée sur le substrat 1, par tout type de procédé connu. A titre d'exemple, elle peut être déposée par un procédé de dépôt chimique en phase vapeur, sous basse pression dit procédé LPCVD (" Low 20 Pressure Chemical Vapor Deposition "), ou sous plasma aussi appelé procédé PECVD (" Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition "). La couche mince 2 peut également être réalisée par un dépôt de tetraethoxysilane (Si(OC2H5)4 ou TEOS), par un procédé de dépôt par centrifugation d'une couche de photorésine connu sous les termes anglo-saxon de " spin-coating ", par un dépôt localisé de 25 résine (procédé " lift-off "), par évaporation, par pulvérisation ou par trempageétirage. La couche mince 2 comporte, de préférence, au moins une ouverture 3 libérant la surface du substrat 1. Sur la figure 2, sept ouvertures 3 sont formées dans la couche mince 2 et elles définissent un second niveau de fluorescence correspondant au niveau de fluoresecence du substrat 1. Le niveau de fluorescence du substrat est au moins 10 fois inférieur au premier niveau de fluorescence de la couche mince 2, et préférentiellement 100 inférieur au 5 premier niveau de fluorescence. L'ensemble des ouvertures 3 forme des motifs et elles sont réalisées par tout type de moyens connus. Elles sont, par exemple, formées par gravure, par photolithographie, par photolithographie suivie d'une gravure (procédé " lift-off >"). Ainsi, pour une couche mince 2 en résine photosensible, les ouvertures 3 sont, de préférence, réalisées par une étape de 10 photolithographie classique (insolation puis révélation chimique). La couche mince 2 comporte au moins une zone 2a insolée par une source lumineuse 5, qui est, par exemple, une lampe à vapeur de mercure. Deux zones 2a insolées sont représentées sur la figure 2. L'insolation des zones 2a de la 15 couche mince 2 engendre une oxydation des composants fluorescents réduisant leur caractéristique de fluorescence. Ce phénomène plus connu sous le nom anglo-saxon de " bleaching " est généralement considéré comme néfaste. Malgré ce préjugé, ce phénomène est, selon l'invention, utilisé pour diminuer, de manière contrôlée, les caractéristiques de fluorescence de la couche mince 2 au 20 niveau des zones 2a, et donc le niveau de fluorescence des zones 2a. Les zones 2a ont alors un niveau de fluorescence intermédiaire, inférieur au premier niveau de fluorescence de la couche mince 2 non insolée et, dans l'exemple décrit, supérieur au second niveau de fluorescence des ouvertures 3. 25 Le choix des paramètres tels que la longueur d'onde, la puissance et la période de temps du rayonnement lumineux émis par la source lumineuse 5 déterminent le niveau de fluorescence intermédiaire, pour qu'il soit inférieur au premier niveau de fluorescence de la couche mince non insolée et supérieur au second niveau de fluorescence, c'est-àdire, le plus souvent, non nul. Ces paramètres sont ajustés en fonction du type de matériau constituant la couche mince ainsi que de l'épaisseur de celle-ci. A titre d'exemple, le niveau de fluorescence d'une couche mince en résine Duramide 7505 d'environ 10 microns d'épaisseur peut être réduit de moitié en insolant la couche mince avec une lampe à vapeur de 5 mercure, avec une puissance de 14500W/m2 et une durée d'insolation de 240 minutes. Le micro-composant étalon 4, tel que décrit ci-dessus, présente l'avantage d'être facile à réaliser. En effet, les techniques de mise en oeuvre sont des 10 techniques usuelles en micro-électronique qui permettent d'atteindre des dimensions de motifs de l'ordre de 0,3,um. Elles permettent de fabriquer collectivement un grand nombre de microcomposants étalons sur un même substrat et le nombre d'étapes de réalisation est limité. Selon une première variante de réalisation, la couche mince 2 peut comporter une pluralité de zones insolées, de manière à définir une pluralité de niveaux intermédiaires de fluorescence différents. Les niveaux de fluorescence intermédiaires sont déterminés en fonction des caractéristiques locales globales d'insolation (puissance et durée d'insolation). Ces caractéristiques globales sont 20 obtenues au cours d'une ou plusieurs insolations successives, indépendantes ou complémentaires. Selon une autre variante de réalisation, le micro-composant étalon peut comporter en plus, une pluralité de couches minces superposées, pouvant être 25 totalement, partiellement ou non insolées, de manière à définir une pluralité de niveaux de fluorescence. Chaque couche mince comporte au moins une ouverture 3 et les ouvertures 3 d'au moins deux couches peuvent être superposées. Ceci présente l'avantage de réaliser un micro-composant étalon ayant des dimensions équivalentes à celles des objets que le lecteur, dont on souhaite le calibrage ou l'étalonnage, lit. En particulier, l'épaisseur du matériau fluorescent constituant les motifs est proche de celle des zones à mesurer sur des biopuces, par exemple. Ceci permet de calibrer le lecteur dans des conditions optiques équivalentes à celles de lectures usuelles. L'épaisseur du 5 microcomposant étalon est, de préférence, inférieure à 50 microns, voir 10 microns. Ainsi, sur la figure 3, une seconde couche mince 6 est déposée par tout type de moyen approprié sur le micro-composant étalon 4 comportant une première 10 couche 2 telle que celle décrite à la figure 2. La seconde couche 6 recouvre alors les ouvertures 3, la première couche mince 2 et les zones 2a insolées. Les première et seconde couches 2 et 6 ont des caractéristiques de fluorescence distinctes, soit par la nature des composants fluorescents respectifs qu'elles comportent, soit par leurs concentrations respectives en composants 15 fluorescents. Une partie de la seconde couche 6 est ensuite retirée (figure 4) par tout type de moyen approprié, de manière à former des zones 6a, 6b et 6c, recouvrant respectivement une partie des zones 2a de la première couche mince 2, une 20 partie des ouvertures 3 et une partie de la couche mince 2. Les zones 6b définissent un troisième niveau de fluorescence correspondant à la caractéristique de fluorescence de la seconde couche mince 6. L'accumulation de plusieurs couches minces fluorescentes l'une sur l'autre augmentant d'autant le niveau de fluorescence, les zones 6a et 6c, respectivement superposées aux 25 zones 2a et à la couche mince 2, définissent un quatrième et un cinquième niveaux de fluorescence. Les quatrième et cinquième niveaux de fluorescence sont supérieurs au niveau de fluorescence le plus élevé des première et seconde couches 2 et 6 non insolées. Le micro-composant étalon 4 selon la figure 4, comporte alors 5 niveaux de fluorescence différents. Le micro-composant étalon peut être réalisé sur un substrat, sur lequel sont ensuite réalisées des sondes biologiques. Ainsi, sur la figure 5, une biopuce 7 comporte un substrat 1, sur lequel sont déposés des sondes biologiques 8 et le micro-composant étalon 4. Il est alors possible de réaliser des biopuces 5 comportant, sur un même substrat, au moins un micro-composant étalon et au moins une sonde biologique. Les niveaux de fluorescence du micro-composant étalon peuvent également être stabilisés dans le temps, en disposant, après insolation, au moins une 10 couche mince de protection, sur au moins une partie des couches minces du micro-composant étalon. La couche mince de protection permet d'isoler, du milieu extérieur, au moins une partie des couches minces. A titre d'exemple représenté sur la figure 6, un micro-composant 4 du type 15 représenté sur la figure 2, comporte un substrat 1 non- fluorescent, sur lequel est disposée au moins une première couche mince 2 structurée. La couche mince 2 peut également être constituée de molécules biologiques marquées par des particules ou des molécules fluorescentes. Dans ce cas, cette couche est réalisée et définie par tout type de procédés connus dans le domaine des 20 biopuces (fonctionnalisation, hybridation, adsorption...). Le micro-composant comportant ce type de couche mince peut, alors, servir de biopuce de référence. La première couche mince 2 est recouverte d'une couche mince de protection 9, destinée à isoler la première couche mince 2 du milieu extérieur dans lequel se 25 trouve le micro-composant 4. Le milieu extérieur est généralement de l'air. Ainsi, la couche de protection 9 évite l'oxydation des composants fluorescents contenus dans la couche mince 2, ce qui rend les composants fluorescents stables dans le temps. La couche de protection peut être opaque ou semi-transparente, lorsque la lecture du micro-composant est réalisée à travers le substrat. Le susbstrat est, alors, transparent aux signaux optiques de lecture et qui peut être, par exemple, en verre, en silice ou en plastique. Au contraire, dans le cas o la lecture du 5 micro-composant est réalisée du côté opposé au substrat, la couche de protection 9 doit être transparente aux signaux optiques de lecture reçus et renvoyés par la première couche mince 2. Ceci permet d'exciter et d'observer le phénomène de fluorescence, sans le perturber. La couche mince de protection 9 est réalisée par tout type de procédé approprié aux exigences de la couche de protection 9. A titre d'exemple, elle peut être réalisée par un procédé LPCVD, PECVD, par évaporation, par pulvérisation ou par spin-coating. Avantageusement, la couche de protection 9 peut être structurée par tout type de moyens connus dans la microélectronique, de 15 manière à recouvrir, par exemple, au moins une partie des zones fluorescentes. Selon une variante de réalisation, la couche mince 2 peut être recouverte par une pluralité de couches minces de protection superposées. De plus, la ou les couches minces de protection peuvent être utilisées pour renforcer les 20 caractéristiques de fluorescence de la couche mince 2. Dans ce cas, les couches minces de protection peuvent être du type des couches minces décrites dans le document WO-A-0248691. En particulier, le matériau formant la couche mince de protection peut être choisi parmi les matériaux suivants: TiO2, Ta2OQ, HfO2, ZrO2, MgO, SiC2, Si3N4, MgF2, et YF3 A1203, ZrO4Ti, Y203, le 25 diamant et les oxynitrures. De plus, l'épaisseur de la couche mince de protection ou de chaque couche mince de protection est, de préférence, calculée à partir de la formule suivante: n.e = k. X / 4, dans laquelle n est l'indice de réfraction du matériau composant la couche mince de protection pour une longueur d'onde X du signal optique de lecture reçu par la première couche mince, e est l'épaisseur optique de la couche de protection et k est un entier impair. L'épaisseur optique correspond au produit de l'indice de réfraction n avec l'épaisseur de la couche mince considérée, pour la longueur d'onde considérée. Comme représenté à la figure 7, le micro-composant étalon peut, comme sur la figure 4, comporter une pluralité de couches minces 2 et 6 superposées, de manière à définir une pluralité de niveaux de fluorescence. Après structuration de la couche mince 6, la couche mince de protection 9 est déposée sur le microcomposant 4, de manière à recouvrir, par exemple, totalement les couches 2 et 10 6 et les parties découvertes du substrat 1. Le micro-composant 4, notamment destiné à l'étalonnage ou au calibrage des équipements de mesure de la fluorescence, comporte alors plusieurs niveaux de fluorescence protégés contre le milieu extérieur. L'emploi d'une couche mince de protection permet de réaliser des microcomposants, tels que les puces étalons ou micro-composants étalons, ayant des caractéristiques de fluorescence stables dans le temps, ce qui permet de réaliser des comparaisons entre plusieurs mesures étalées dans le temps ou entre différents appareils de mesure, par rapport à une référence invariant dans 20 le temps. L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits ci-dessus. Ainsi, au moins une partie de la seconde couche mince 6 peut également être insolée, en même temps que les zones 2a, avant ou après, avec des paramètres 25 d'insolation, tels que la longueur d'onde, la durée ou la puissance d'insolation, différents ou identiques. Revendications 1. Micro-composant étalon pour le calibrage et l'étalonnage d'équipements de mesure de fluorescence comprenant un substrat (1) sur lequel est disposée au 5 moins une couche mince (2, 6), comportant des composants fluorescents définissant un premier niveau de fluorescence, caractérisé en ce que la couche mince (2, 6) comporte au moins une zone (2a) insolée de manière à définir au moins un deuxième niveau de fluorescence inférieur au premier niveau de fluorescence. 2. Micro-composant étalon selon la revendication 1, caractérisé en ce que la couche mince (2, 6) comporte au moins une ouverture (3) définissant un troisième niveau de fluorescence inférieur aux premier et second niveaux de fluorescence. 3. Micro-composant étalon selon la revendication 2, caractérisé en ce que le troisième niveau de fluorescence correspond au niveau de fluorescence du substrat. 4. Micro-composant étalon selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que le troisième niveau de fluorescence est au moins 10 fois inférieur au premier niveau de fluorescence. 5. Micro-composant étalon selon la revendication 4, caractérisé en ce que le 25 troisième niveau de fluorescence est 100 fois inférieur au premier niveau de fluorescence. 6. Micro-composant étalon selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la couche mince (2, 6) est constituée par un matériau fluorescent. 7. Micro-composant étalon selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la couche mince (2, 6) comporte une pluralité de zones insolées de manière à définir une pluralité de niveaux de fluorescence différents. 8. Micro-composant étalon selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 10 caractérisé en ce que la couche mince (2, 6) est constituée par une résine photosensible. 9. Micro-composant étalon selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le substrat (1) est constitué par un matériau choisi parmi 15 le silicium, la silice synthétique, le quartz, les plastiques et les verres. 10. Micro-composant étalon selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'au moins une partie de la couche mince (2, 6) est recouverte par une couche mince de protection (9). 11. Micro-composant selon la revendication 10, caractérisé en ce que la couche mince de protection (9) est transparente à des signaux optiques de lecture reçus et renvoyés par la couche mince (2, 6). 12. Micro-composant selon l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce que le micro-composant (4) comporte une pluralité de couches minces de protection (5) superposées. 13. Micro-composant selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que le matériau formant la couche mince de protection (9) est choisi parmi les matériaux suivants: TiO2, Ta205, HfO2, ZrO2, MgO, SiO2, Si3N4, MgF2, YF3, AI203, ZrO4Ti, Y203, le diamant et les oxynitrures. 14. Micro-composant selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que l'épaisseur de la couche mince de protection (9) est calculée à partir de la formule suivante: n.e = k. / 4, dans laquelle n est l'indice de réfraction du matériau composant la couche mince de protection (9) pour une longueur d'onde X du signal optique de lecture reçu par la couche mince (2, 6), e est l'épaisseur optique de la couche mirnce de protection (9) et k est un entier impair. 15. Micro-composant étalon selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le micro-composant étalon (4) c mporte une pluralité de couches minces (2, 6) superposées de manière à définir une pluralité de niveaux de fluorescence. 15 16. Micro-composant étalon selon la revendication 15, caractérisé en ce que les ouvertures (3) d'au moins deux couches minces (2, 6) sont superposées. 17. Biopuce caractérisée en ce qu'elle comporte, sur moins une sonde biologique et au moins un microcomp quelconque des revendications 1 à 16. un même substrat, au osant étalon selon l'une selon l'une quelconque substrat (1) d'au moins un premier niveau de 18. Procédé de fabrication d'un micro-composant étalor des revendications 1 à 16, comprenant le dépôt sur un une couche mince (2, 6) fluorescente définissant fluorescence, procédé caractérisé en ce qu'il consiste à insoler au moins une zone (2a) de la couche mince. 19. Procédé de fabrication d'un micro-composant étalon selon la revendication 5 18, caractérisé en ce qu'il comporte le dépôt, sur le substrat (1), d'une pluralité de couches minces superposées (2, 6). 20. Procédé de fabrication d'un micro-composant étalon selon l'une des revendications 18 et 19, caractérisé en ce qu'il comporte après insolation le 10 dépôt d'une couche mince de protection.