FR 2854069 A1 20041029 FR 0304956 A 20030423 PROCEDE D'OBTENTION D'UN PRINCIPE ACTIF A PARTIR DU SOJA, AYANT DES PROPRIETES ANTI-VIEILLISSEMENT, COMPOSITIONS ET UTILISATIONS DE CES COMPOSITIONS A VISEE COSMETIQUE La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un principe actif à partir du soja qui présente des propriétés anti-vieillissement. L'invention couvre les compositions utilisant ce principe actif ainsi que les utilisations de ces compositions à visée cosmétique. L'espérance de vie augmente et le vieillissement conduit à une peau plus fine, sèche et surtout moins élastique. Ceci se traduit de façon très visible par l'apparition sur le visage de rides qui correspondent ente autres à des changements de structure du derme. Des études ont montré que les rides peuvent être liées à une rigidification de la 10 peau et à un relâchement du derme profond. En effet, la peau est un organe complexe qui est constituée de trois couches essentielles - l'épiderme, épithélium stratifié de surface, constitué principalement de kératinocytes. - le derme, tissu conjonctif, est constitué de fibroblastes. Le derme comprend une matrice extra cellulaire, MEC, synthétisée à partir de protéines dont les principales sont les collagènes essentiellement de type I et III, les glycoprotéines autres que les collagènes, l'élastine et les protéoglycanes. Les interactions spécifiques entre ces différentes classes de protéines donnent naissance à ce tissu fonctionnel. La MEC doit ses propriétés mécaniques essentiellement au réseau fibreux des collagènes. Ces collagènes fibrillaires sont synthétisés à partir de collagènes 5 sous forme de précurseurs longs, les procollagènes I et II, qui sont en suite transformés en molécules de collagène par coupure des Npropeptides et Cpropeptides par des protéases spécifiques telles que les lysyl oxydases ou les carboxypeptidases. La présence de rides est donc essentiellement induite par un niveau réduit de 10 précurseurs des fibrilles de collagène, ce qui diminue la quantité de collagène, par un niveau réduit d'élastine et enfin une diminution de fibroblastes. bes études ont montré que le processus de vieillissement est à l'origine non seulement d'une diminution de la capacité de prolifération des fibroblastes mais aussi d'une réduction de l'activité métabolique. Il est à noter aussi que, entre le derme et l'épiderme, se trouve la jonction dermo-épidermique JbE qui assure la liaison des deux couches, cette JbE contribuant fortement à la modulation de la peau en surface. Ainsi, lorsque les fibroblastes présentent une activité métabolique réduite, ils perdent leur capacité d'adhésion aux fibres de collagène rendant la JbE moins 20 efficace. On sait aussi que l'âge et/ou les expositions répétées au soleil conduisent à des dommages et des altérations du derme en modifiant les liaisons entre les fibroblastes et la MEC, essentiellement constituée de collagène. Enfin, il est à noter qu'une autre dégradation du réseau dermique provient d'une 25 perturbation des interactions entre les collagènes et les protéoglycanes, versican, décorine, biglycan et hyaluronane. - l'hypoderme, constitué essentiellement de cellules graisseuses. On sait, et de nombreux travaux l'ont montré, que l'aspect extérieur de la peau est le reflet de l'organisation de ces différentes couches. Le procédé d'obtention selon la présente invention permet d'obtenir un principe actif qui, formulé dans une composition galénique adaptée, permet d'agir sur - la synthèse des collagènes I et III, - la synthèse de carboxypeptidase, - la synthèse de la décorine, - le pouvoir contractile des fibroblastes, - l'altération de la matrice dermique, - les propriétés biomécaniques de la peau. Des tests sur les études des propriétés anti-vieillissement, notamment les tests anti-rides et l'étude des propriétés biomécaniques de la peau sur des volontaires qui permettent de vérifier les résultats tangibles obtenus par application des compositions incluant le principe actif obtenu par le procédé selon l'invention. L'invention est maintenant décrite en détail selon un mode de réalisation particulier, non limitatif, à travers un procédé, la caractérisation du principe actif obtenu et les compositions permettant par application d'obtenir les résultats cosmétiques recherchés. Des figures sont annexées pour montrer les résultats visibles obtenus. 20 1/ PROCEbE b OBTENTION DU PRINCIPE ACTIF SELON LA PRESENTE INVENTION Le procédé consiste à associer deux produits A et B, obtenus tous les deux à partir du soja. Ces deux produits sont obtenus chacun par la succession des étapes suivantes: Produit A - solubilisation de tourteau de soja à raison d'au moins 50 g/I en poids, dans de l'eau à pH acide, - hydrolyses enzymatiques simultanées ou successives en présence de protéases, 5 filtration, décantation ou centrifugation afin de séparer la phase solubilisée et les produits insolubles, et - concentrations successives de la phase active par filtration, ultrafiltration, osmose ou nanof i Itration. Produit B - solubilisation de fibres de soja dans de l'eau à pH basique, au moins une hydrolyse enzymatique à l'aide d'au moins une protéase, filtration, décantation ou centrifugation afin de séparer la phase solubilisée et les produits insolubles, et - concentrations successives de la phase active par filtration, ultrafiltration, osmose ou nanofiltration. On procède ensuite à l'association des deux produits A et B. Plus particulièrement, on associe au produit A au moins 10% du produit B. 2/ CARACTERISATION DU PRINCIPE ACTIF OBTENU 2-1/ Matière sèche: Le taux de matière sèche est obtenu par passage de 10 9 de produit placés à l'étuve à 105 C, jusqu'à obtention d'un poids constant. Les résultats donnent un poids de 30 à 150 g/I plus particulièrement 60 à 90 g/I. 25 2-2/ pH: Le pH est mesuré par la méthode potentiométrique, à température ambiante et les résultats donnent une valeur comprise entre 4, 0 et 8,0, plus particulièrement entre 6,3 et 7,3. 2-3/ Taux de protéines: Le taux de protéines est obtenu par la méthode de Lowry. Les résultats donnent une teneur en protéines de 15 à 90 g/1, plus particulièrement 35 à 55 g/I. 2-4/ Couleur du produit: La couleur du principe actif obtenu est ambrée. 3/ EFFET DU PRINCIPE ACTIF SUR LES COLLAGENES I ET III: 3-1/ Protocole: Les collagènes concernés sont plus particulièrement les collagènes de type I et III qui représentent les composants majeurs du derme ainsi qu'indiqué dans le préambule. L'étude porte sur des fibroblastes humains normaux et des fibroblastes spécifiques prélevés par biopsie au fond d'une ride frontale. Les tests concernant le principe actif selon l'invention sont effectués en comparaison avec la vitamine C dont on sait qu'elle a un effet favorable sur la synthèse des collagènes concernés. Après ensemencement et incubation de fibroblastes dans un milieu adapté, on traite les fibroblastes en présence de 0,5 %/ 1,0 %/. ; 2,0 % de principe actif ou 20 en présence de 0,05 et 0,10.g/ml de vitamine C diluée dans le milieu de culture. Des témoins sont réalisés. Après incubation, on récupère les surnageants cellulaires pour un dosage ELISA des collagènes. 3-2/ Résultats: 3-2-1/ Fibroblastes humains normaux / Collagène I: Synthèse collagène I (ng/ml) Variation en % Collagène I / témoin Témoin 101 + 35 Principe actif 0,5% 102 + 38 + 1 Principe actif 1,0% 164 + 48 + 62 Principe actif 2,0% 278 + 64 + 175 Vitamine C 0,05 pg/ml 116 + 41 + 15 Vitamine C 0,10 //ml 261 + 85 + 158 On note que la synthèse de collagène I de fibroblastes humains normaux est augmentée de façon plus importante avec le principe actif selon l'invention qu'avec la vitamine C au plus fort des deux dosages. La synthèse de collagène I est augmentée de 175 % avec le principe actif à 2% et 158 % avec la vitamine C à 0,10 pc/ml. 3-2-2/ Fibroblastes humains de fond de rides / Collagène I: Synthèse collagène I (ng/ml) Variation en % Collagène I/ témoin Témoin 34 + 10 Principe actif 0,5% 34 + 12 Principe actif 1,0% 66 + 15 + 94 Principe actif 2,0% 94 + 19 + 176 Vitamine C 0,05 pg/ml 36 + 12 + 6 Vitamine C 0,10 pg/ml 72 + 16 + 112 Les résultats précédents sont encore meilleurs dans le cas des fibroblastes issus de fond de rides. On arrive à une augmentation de 176 % de la synthèse de collagène I des fibroblastes de fond de rides avec le principe actif selon la présente invention alors que pour la vitamine C, au plus fort dosage, l'augmentation est limitée à 112 %. 3-2-3/ Fibroblastes humains normaux / Collagène III: Synthèse collagène III (ng/ml) Variation en % Collagène III / témoin Témoin 5,6 + 2,1 Principe actif 0,5% 11,9 + 3,8 + 113 Principe actif 1,0% 13,1 + 5,1 + 134 Principe actif 2,0% 17,3 + 4,7 + 209 Vitamine C 0,05 p/ml 5,9 + ,9 + 5 Vitamine C 0,10 p//ml 10,25 + 3,3 + 83 La synthèse de collagène III est augmentée de 209 % avec le principe actif à 2% selon la présente invention alors que la vitamine C ne conduit qu'à une augmentation de 83 %. 3-2-4/ Fibroblastes humains de fond de rides / Collagène III: Synthèse collagène III (ng/ml) Variation en % Collagène h III / témoin Témoin 0,4 + 0,21 Principe actif 0,5% 0,4 + 0,25 Principe actif 1,0% 0,52 + 0,31 + 130 Principe actif 2,0% 1,29 + 0,26 + 273 Vitamine C 0,05 pg/ml 0,40 + 0, 24 Vitamine C 0,10 j/ml 0,48 + 0,25 + 120 Les résultats sur les fibroblastes de fond de rides montrent une augmentation de la synthèse de collagène III de 273 % comparés aux 120 % obtenus en présence de vitamine C. Conclusion: On peut constater que le principe actif selon la présente invention favorise la synthèse des deux fibres de collagène I et III, majoritaires dans le derme, et tend à restaurer l'activité métabolique des fibroblastes de fond de rides. 4/ EFFET bU PRINCIPE ACTIF SUR LA SYNTHESE bE CARBOXYPEPTIbASE: La carboxypeptidase est une protéase permettant la transformation du procollagène en collagène par coupure des chaines. L'étude porte sur l'évaluation de l'effet du principe actif sur l'expression des 10 ARN messagers de la carboxypeptidase. Pour cela, des fibroblastes humains sont incubés en présence de 1%; 2 % de principe actif selon l'invention ou de 5 p//ml de vitamine C. Les cellules sont récupérées et les ARN totaux sont extraits. On détermine les ARNm de la carboxypeptidase et les ARNm du témoin interne, la 13- actine. 15 Les résultats se trouvent regroupés dans le tableau: Taux d' ARNm de la carboxypeptidase (%) Témoin 100 Principe actif 1% 115 + 6 Principe actif 2 % 121 + 5 Vitamine C 5 jl/ml 113 + 5 Ainsi le principe actif selon la présente invention favorise l'expression des ARNm de la carboxypeptidase de 21 %, ce qui permet d'augmenter la transformation des procollagènes en collagènes et d'améliorer la structure du 20 derme. 5/ EFFET DU PRINCIPE ACTIF SUR LA SYNTHESE bE DECORINE: La décorine est une protéoglycane essentielle à l'organisation de la matrice extracellulaire. Les tests sont effectués également en comparaison avec la vitamine comme précédemment. Les résultats sont regroupés dans le tableau suivant: Taux d'ARNm de la décorine (%) Témoin 100 Principe actif 1 % 110 + 3 Principe actif 2 % 131 + 9 Vitamine C 5 p/ml 116 + 7 Le principe actif selon la présente invention, à une concentration de 2 %, conduit à une augmentation de l'expression des ARNm de la décorine de 31%, ce qui 10 favorise l'amélioration de l'organisation structurale du derme. 6/ EFFET DU PRINCIPE ACTIF SUR LE POUVOIR CONTRACTILE DES FIBROBLASTES: 6-1/ Protocole: Pour déterminer la capacité des fibroblastes à adhérer au réseau de collagène et 15 à maintenir un réseau tridimensionnel du derme, on analyse in vitro la capacité des fibroblastes à contracter de façon visible un gel de collagène. On teste en parallèle des fibroblastes normaux, des fibroblastes de fond de rides, ces deux types étant ou non soumis à des irradiations UVA. Les fibroblastes des deux types soumis et non soumis aux UVA sont ajoutés à un 20 gel de collagène I. On détermine le diamètre des gels ainsi formés après incubation en présence du principe actif ou de la vitamine C. 6-2/ Résultats: Capacité de contraction (%) Fibroblastes humains Fibroblastes humains normaux de fond de rides Témoin 44 + 2 15 + 1 SANS Vitamine C 45 + 6,5 22 + 0,5 UVA Principe actif 2% 47 + 4,5 25 + 7 Témoin 17 + 3,5 0 AVEC Vitamine C 25 + 4,5 2 + 2 UVA Principe actif 2 % 37 + 7,5 13 + 3 On constate que le principe actif permet d'améliorer la contraction des fibroblastes humains normaux, de restaurer la capacité des fibroblastes de fond 5 de rides et de limiter l'altération par les UVA de ce pouvoir contractile des deux types de fibroblastes. 7/ CAPACITE DU PRINCIPE ACTIF A LIMITER LA FIBROSE SUR LA MATRICE DERMIQUE: Cette étude est conduite sur des explants qui sont exposés à des irradiations 10 d'UVA, traités ou non avec le principe actif selon l'invention. Les explants sont irradiés à 8 joules/cm puis traités avec 5 mg/cm2 de principe actif formulé à 3% dans une émulsion ou avec 5 mg/cm2 de vitamine C à 1% dans la même émulsion. Ce traitement est reconduit 1 fois par jour pendant cinq jours consécutifs. On réalise des coupes de 4 /pm par les techniques connues de coupe d'échantillons congelés. Ces échantillons sont colorés et les images sont analysées avec un logiciel adapté. Les figures 1 à 6 montrent les résultats obtenus. il On constate une limitation de l'altération des fibres de collagène d'explants traités avec le principe actif soumis à des irradiations d'UVA répétitives. 8/ EFFET bU PRINCIPE ACTIF SUR LES PROPRIETES BIOMECANIQUES bE LA PEAU: On étudie l'efficacité du principe actif contre placebo sur les propriétés biomécaniques de la peau. Le test consiste à mesurer la déformation de la peau traitée avec le principe actif à 4 % et contre placebo pendant 28 jours par application biquotidienne. Une sonde permet de mesurer la déformation de la peau obtenue au cours d'une 10 mesure faisant intervenir plusieurs aspirations successives d'une durée donnée. On peut alors déterminer à partir des courbes obtenues: la déformation instantanée, la rétraction immédiate, l'élongation totale et la déformation résiduelle. L'élasticité est le rapport de la déformation résiduelle sur l'élongation totale. Si 15 ce rapport augmente, l'élasticité augmente. La tonicité est déterminée par la différence de l'élongation totale moins la rétraction immédiate. Les résultats suivants sont significatifs selon le test de Student sur données appariées. Principe actif selon l'invention Elasticité 3 % Tonicité - 8 % 9/ EFFET DU PRINCIPE ACTIF SUR LES RIDES: L'analyse porte sur l'observation d'empreintes par un profilomètre muni d'un analyseur d'images. Ces empreintes sont en polymère silicone et réalisées au niveau des pattes d'oie sur des volontaires répartis par groupes A, rides légères traités avec le principe actif selon l'invention, B, rides prononcées traitées avec le principe actif selon la présente invention et C, rides prononcées traitées avec de la vitamine C dosée à 0,5%. La formulation galénique est une émulsion. On mesure alors la surface totale ridée, la longueur totale des rides et le nombre de rides. Les résultats sont récapitulés dans le tableau suivant Principe actif selon l'invention Vitamine C Groupe A | Groupe B Groupe C Surface totale ridée - 26% - 30% - 26% Nombre de rides - 21% - 22% - 13% Longueur des rides - 25% - 21% - 20% Ces résultats sont significatifs selon le test de Student sur données appariés. Sur les figures 7 à 12, on a représenté les différents résultats. Sur les figures 7 et 8, les images de la peau des volontaires du groupe A, avant et après traitement avec le principe actif selon l'invention dosé à 4%. Sur les figures 9 et 10, les images de la peau des volontaires du groupe B avant et après traitement avec le principe actif dosé à 4 %. Sur les figures 11 et 12, les images de la peau des volontaires du groupe C avant et après traitement à la vitamine C formulée à 0,5 %. On constate une amélioration des différents paramètres, ceci que les rides 20 soient légères ou prononcées. Le principe actif est introduit dans une composition galénique adaptée pour permettre une application sur la peau dans des conditions optimisées. On peut citer comme forme galénique un gel, un gel émulsionné, un lait, une émulsion, une lotion, un onguent ou une poudre. Ces résultats ont été confirmés par l'étude anti-rides du principe actif sur la ride du lion (ride frontale). L'étude a porté sur deux groupes de volontaires l'un 5 testant une émulsion placebo, l'autre l'émulsion contenant le principe actif formulé à 4%. La technique de prise des empreintes et d'analyse est identique à celle décrite précédemment. Ces résultats sont significatifs selon le test de Student sur données appariées. Ride du lion Surface totale ridée - 29% Nombre de rides - 35% Longueur des rides - 27% REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un principe actif ayant des propriétés antivieillissement, anti-rides et raffermissantes, caractérisé en ce qu'il consiste à préparer deux produits A et B à partir du soja, ces deux produits étant obtenus par la succession des étapes suivantes Produit A solubilisation de tourteau de soja à raison d'au moins 50 g/I en poids, dans de l'eau à pH acide, - hydrolyses enzymatiques simultanées ou successives en présence de protéases, - filtration, décantation ou centrifugation afin de séparer la phase solubilisée et 10 les produits insolubles, et - concentrations successives de la phase active par filtration, ultrafiltration, osmose ou nanofiltration, Produit B solubilisation de fibres de soja dans de l'eau à pH basique, - au moins une hydrolyse enzymatique à l'aide d'au moins une protéase, - filtration, décantation ou centrifugation afin de séparer la phase solubilisée et les produits insolubles, et - concentrations successives de la phase active par filtration, ultrafiltration, osmose ou nanofiltration, et à associer ces deux produits A et B. 2. Procédé d'obtention d'un principe actif ayant des propriétés anti- rides selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on associe au produit A au moins 10% de produit B. 3. Principe actif obtenu à partir du procédé selon la revendication 1 ou 2, 25 caractérisé en ce qu'il présente les paramètres suivants: - taux de matière sèche compris entre 30 à 150 g/I - pH compris entre 4,0 et 8,0,. - taux de protéines compris entre 15 à 90 g/I, et - couleur ambrée du principe actif obtenu. 4. Principe actif selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il présente les paramètres suivants: - taux de matière sèche compris entre 35 à 55 g/I - pH compris entre 6,3 et 7,3 - taux de protéines compris entre 60 à 90 g/I, et 10 - couleur ambrée du principe actif obtenu. 5. Utilisation du principe actif selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle permet de favoriser la synthèse des deux fibres de collagène I et III, majoritaires dans le derme. 6. Utilisation du principe actif selon la revendication 3 ou 4, caractérisée 15 en ce qu'elle permet une augmentation de l'expression des ARNm de la décorine, ce qui favorise l'amélioration de l'organisation structurale du derme. 7. Utilisation du principe actif selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle favorise l'expression des ARNm de la carboxypeptidase, ce qui permet d'augmenter la transformation des procollagènes en collagènes et 20 d'améliorer la structure du derme. 8. Utilisation du principe actif selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle permet d'améliorer la contraction des fibroblastes et de limiter l'altération par les UVA du pouvoir contractile des fibroblastes. 9. Composition incluant de 0,1 à 10 % de principe actif selon l'une des 25 revendications 3 ou 4, dans une composition galénique adaptée telle qu'un gel, un gel émulsionné, un lait, une émulsion, une lotion, un onguent ou une poudre.