FR 2847818 A1 20040604 FR 0214979 A 20021128 La présente invention a pour objet une composition pharmaceutique à base d'acide hyaluronique présentant une activité thérapeutique vis-à-vis notamment des affections respiratoires des voies aériennes supérieures. L'intégrité de l'épithélium de la muqueuse respiratoire tapissant l'arbre trachéo-bronchique dépend d'un équilibre entre les facteurs d'agression et les nombreux mécanismes de défense dont cet épithélium dispose. Ces mécanismes comprennent une première ligne de défense constituée par du mucus et le système mucociliaire et une seconde ligne de défense constituée par les complexes jonc10 tionnels des cellules épithéliales qui forment une barrière physique vis-à-vis des aérocontaminants. Le mucus forme à la surface des cellules épithéliales respiratoires un film protecteur mobilisé par l'activité ciliaire. L'efficacité d'un tel système dépend non seulement des propriétés de viscosité du mucus mais aussi des forces interfaciales 15 muqueuse-mucus et/ou air-mucus. Les propriétés de surface sont donc extrêmement importantes à considérer et à préserver dans les mécanismes de protection de la muqueuse respiratoire. Au cours des phénomènes inflammatoires bronchiques, aigus ou chroniques, la muqueuse bronchique et le mucus sont exposés à de multiples agressions 20 telles que celles provoquées par des protéases d'origine bactérienne et d'origine inflammatoire qui entraînent une modification des propriétés hydriques du mucus liée à une absorption accrue de l'eau extracellulaire, une fréquente exfoliation des cellules épithéliales et une modification de la composition biochimique du mucus. Dans le but de se protéger de l'action délétère des agents pathogènes et de 25 la réaction inflammatoire, la muqueuse respiratoire réagit en augmentant la sécrétion de mucus. Cette hypersécrétion s'accompagne fréquemment d'une hyperviscosité et d'une modification des propriétés d'adhérence du mucus: ceci a notamment pour conséquence une diminution de l'épuration muco-ciliaire et une stase du mucus qui provoque une obstruction bronchique et des troubles de la fonction respi30 ratoire. Jusqu'à présent, les thérapeutiques visant à corriger l'hypersécrétion du mucus et ses anomalies physico-chimiques se sont développées en partant du concept que l'hypersécrétion et l'obstruction bronchique étaient liées à une hyperviscosité. Ceci a donné naissance à la mise au point et la mise sur le marché de très nombreuses molécules à activité mucolytique afin de normaliser l'hyperviscosité du mucus. En fait, au cours des infections respiratoires, les sécrétions adhèrent fortement à la muqueuse respiratoire et leur élimination n'est que rarement améliorée 5 par la simple prescription d'un agent mucolytique. En partant de cette observation, il est apparu que les problèmes de déshydratation et de lubrification étaient à considérer en priorité et que la protection de la muqueuse respiratoire, de même que l'efficacité du transport du mucus étaient conditionnées par les propriétés d'interface mucus-muqueuse respiratoire (Zahm JM et aI, Biorheology 1989, 26: 747-752). 10 Une altération de l'efficacité du transport mucociliaire, en relation avec l'inhalation de nombreux agents infectieux ou non infectieux (pollution atmosphérique ou professionnelle), peut induire une altération de l'intégrité de la barrière épithéliale et entraîner des lésions plus ou moins importantes de l'épithélium respiratoire. Ces lésions peuvent aller depuis la perte de la jonctionnalité de la barrière 15 épithéliale jusqu'à une desquamation épithéliale complète. La réparation de la surface de l'épithélium respiratoire après une lésion est, dans un premier temps, dépendante de l'étalement et de la migration des cellules autour de la zone lésée (Zahm et ai, Am J Respir Cell Mol Biol 1991, 5: 242-248; Hérard et ai, Am J Respir Cell Mol Biol 1996, 15: 624-632). Parmi les facteurs favo20 risant la migration des cellules au cours du processus de ré-épithélialisation, il a pu être montré que certaines protéines de la matrice extracellulaire (fibronectine) et des facteurs de croissance [facteur de croissance épidermique (epidermal growth factor), facteur de croissance d'hépatocytes (hepatocyte growth factor)] étaient capables de stimuler la migration des cellules et par conséquent de favoriser la ré25 épithélialisation de la muqueuse respiratoire (Zahm et ai, Wound Rep Reg 1993, 1: 175-180; Hérard et ai, Am J Physiol 1996, 271:L726-733; Zahm et ai, J Cell Physiol, 2000, 185: 447-453). L'utilisation de molécules pouvant jouer ce rôle régénérant constitue donc un atout majeur dans le rétablissement de la fonction de barrière de la muqueuse respiratoire. Aussi, un des buts de la présente invention est-il de fournir une composition pharmaceutique, ou destinée à l'hygiène, qui permet de modifier les propriétés de surface du mucus respiratoire afin de favoriser son transport par l'activité ciliaire et/ou par la toux. Un autre but de l'invention est de fournir une telle composition qui permet la 35 réparation de l'épithélium respiratoire. Ces buts, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints par une composition pharmaceutique ou destinée à l'hygiène contenant de l'acide hyaluronique, en association avec tout autre excipient approprié et présentant une activité thérapeutique vis-à-vis notamment des affections respiratoires des voies 5 aériennes supérieures, laquelle composition est, selon la présente invention, caractérisée par le fait que l'acide hyaluronique présente un poids moléculaire d'au plus 105 Da. De préférence, l'acide hyaluronique présente un poids moléculaire d'au plus 5.104 Da. Avantageusement, la concentration en acide hyaluronique dans la composition est comprise entre 0,01 et 10 mg/ml. De préférence, l'acide hyaluronique utilisé est d'origine animale ou biotechnologique; il est avantageusement hydrolysé par voie chimique ou enzymatique pour obtenir un poids moléculaire d'au plus 105 Daltons. L'acide hyaluronique, polysaccharide de haut poids moléculaire, est distribué ubiquitairement dans les espaces extracellulaires. Parmi ses fonctions biologiques, grâce aux propriétés physico-chimiques qu'il possède, l'acide hyaluronique semblerait être impliqué dans l'homéostasie hydrique et dans la lubrification des tissus (TC Laurent and JR Fraser. Faseb J. 6 1992, 6, 2397-2404). Au niveau pulmonaire, 20 l'acide hyaluronique a été localisé dans la membrane baso-latérale des cellules épithéliales bronchiques (SJ Green et ai, J. Cell Sci. 1988, 89, 145-156) Il a été mis en évidence par les inventeurs le rôle de l'acide hyaluronique dans les modifications des propriétés de surface du mucus respiratoire et dans sa capacité à favoriser la réparation de l'épithélium respiratoire. Pour ce qui concerne la modification des propriétés de surface du mucus respiratoire, trois solutions d'acide hyaluronique d'origine biotechnologique et de poids moléculaire différent (106 Da, 8 x 104 Da et 4 x 104 Da) ont été étudiées dans une solution aqueuse à une concentration de 0,1% en poids, selon le protocole cidessous. Pour produire de l'acide hyaluronique d'un poids moléculaire conforme à la présente invention, on réalise une hydrolyse d'un acide hyaluronique du commerce, qui, jusqu'à présent, est d'origine animale (crête de coq, cordon ombilical) ou a été obtenu par voie fermentaire à partir de substrats d'origine végétale. Le poids moléculaire d'un tel acide hyaluronique est en général compris entre 20.000 et 50.000 Da. Cette hydrolyse est réalisée en dissolvant cet acide hyaluronique du commerce dans de l'eau jusqu'à obtenir une solution à 10 g/I d'acide hyaluronique. Puis, on ajoute à cette solution de l'acide chlorhydrique pour obtenir un pH compris entre 1 et 2, de préférence de l'ordre de 1,8. On chauffe à une température 5 d'environ 80'C sous agitation et ce jusqu'à ce que la viscosité de la solution n'évolue plus. On ajuste le pH à une valeur de 6, 5 par un ajout de soude avant de précipiter l'acide hyaluronique hydrolysé selon la succession d'étapes ci-après: - on ajoute du chlorure de sodium (Na Cl) de façon à obtenir une concentration de 35 g/I de chlorure de sodium; - on ajoute sous agitation de l'éthanol 960 jusqu'à l'obtention d'un titre alcoolique final compris entre 50 et 600; - on laisse décanter et on élimine le surnageant qui ne comprend pas d'acide hyaluronique; - on lave le précipité ainsi obtenu, pour le remettre en suspension, avec un 15 volume correspondant à celui de la solution d'acide hyaluronique hydrolysé (1 litre pour 1 litre) avec un mélange alcool-eau à 700; puis on laisse décanter et on élimine le surnageant; - on remet en solution le précipité obtenu comme décrit à l'étape précédente mais avec un mélange éthanol-eau à 85 ; puis on laisse décanter 20 et on élimine le surnageant; - on répète cette opération avec un mélange éthanol-eau à 960; - on élimine l'éthanol par filtration et on sèche l'acide hyaluronique à l'étuve sous vide à 40'C pendant 6 heures. L'acide hyaluronique, ainsi obtenu présente un poids moléculaire d'environ 25 30.000 Daltons. Douze échantillons de mucus respiratoire lyophilisés, provenant de patients bronchitiques chroniques, ont été reconstitués à différentes concentrations dans l'eau. Le travail d'adhésion des échantillons de mucus a été déterminé, en présence ou non d'acide hyaluronique, à partir de la mesure de la tension de surface et de 30 l'angle de contact du mucus, selon des techniques développées par les inventeurs (Zahm JM et ai, Biorheology 1989, 26: 747-752.) Un modèle expérimental a permis de simuler in vitro le phénomène de toux (M King et aI, J. Appl. Physiol., 1985, 58, 1776-1782). L'échantillon de mucus, déposé sur un support, est transporté par un débit d'air instantané. La solution d'acide hyaluronique est placée à l'interface entre 35 le mucus et le support. Le transport du mucus par la toux simulée correspond à la distance parcourue par l'échantillon sous l'effet du débit d'air. Le palais de grenouille, ayant une muqueuse comparable à la muqueuse respiratoire humaine, a été utilisé pour quantifier la capacité de transport du mucus respiratoire (E. Puchelle et al, Eur. J. Respir. Dis. 1983, 64, 293-303). Les échantillons de mucus, contenant s ou non de l'acide hyaluronique, sont déposés sur la muqueuse du palais de grenouille et la vitesse de transport de ces mucus est mesurée. Il a été ainsi constaté que l'acide hyaluronique induit une diminution du travail d'adhésion du mucus respiratoire. En présence d'acide hyaluronique de poids moléculaire (PM) égal à 8 x 104 et 4 x 104 Da, cette diminution est significative 10 (p Le transport mucociliaire du mucus respiratoire est augmenté significativement (p Le transport du mucus respiratoire par la toux est augmenté significative15 ment (p L'acide hyaluronique, par son action lubrifiante, améliore donc le transport du mucus respiratoire par l'activité ciliaire et par la toux. Cette action lubrifiante est d'autant plus efficace que le poids moléculaire de l'acide hyaluronique est faible. Le rôle potentiel de l'acide hyaluronique sur la réparation cellulaire a été analysé à partir de l'acide hyaluronique de PM 4x104 en solution dans un milieu de culture à 3 concentrations différentes: 0,01, 0,1 et 1 mg/ml. Un modèle in vitro de réparation de l'épithélium respiratoire a été utilisé: des explants d'épithélium respiratoire issus de polypes nasaux humains ont été mis en culture sur une matrice de 25 collagène selon une technique décrite par Chevillard et ai (Cell Tissue Research 1991, 264:4955). Après 3 jours de culture, des enregistrements en vidéomicroscopie de la croissances cellulaire formée à la périphérie des explants ont été effectués toutes les 24 heures pendant 3 jours. La mesure de l'évolution de la surface de la croissance en fonction des jours de culture a permis de calculer un index 30 de croissance, exprimé en mm2/j. L'index de croissance des explants témoins, mesuré en absence d'acide hyaluronique, est de 0,9 + 0,4 mm2/j. L'index de croissance est significativement augmenté (p Le modèle de réparation utilisé étant essentiellement caractérisé par une migration des cellules depuis l'expiant, il en est donc déduit que la présence d'acide 5 hyaluronique dans le milieu de culture favorise la migration des cellules épithéliales respiratoires d'une façon dosedépendante. Chez les patients dont l'épithélium respiratoire est altéré par diverses pathologies (asthme, mucoviscidose, broncho-pneumopathies obstructives chroniques, infections ou inflammations bronchiques ou ORL), le mucus est fréquemment 10 déshydraté et devient adhérant, d'une part, et l'intégrité de la barrière épithéliale peut être altérée, d'autre part. Au cours de ces pathologies, la clairance du mucus par l'activité ciliaire est diminuée et la clairance par la toux dont l'efficacité est directement dépendante des propriétés d'adhésivité du mucus, représente le principal mode d'élimination du mucus hors des voies respiratoires. De plus, la restaura15 tion de l'intégrité de la barrière épithéliale représente un enjeu important dans la fonction de protection de l'épithélium respiratoire. L'acide hyaluronique est donc un agent de traitement potentiel de toutes les affections respiratoires des voies aériennes supérieures et inférieures o il existe une hyper-adhésivité du mucus et/ou des lésions épithéliales: rhinites inflamma20 toires, infectieuses ou allergiques, bronchites inflammatoires aiguÙs (infectieuses, allergiques ou toxiques) ou chroniques, bronchiectasies, mucoviscidose, asthme. La composition pharmaceutique de l'invention contenant de l'acide hyaluronique, en association avec tout excipient approprié, peut donc être utilisée pour le traitement de ces affections. Cette composition pharmaceutique peut être 25 administrée par instillations ou sous forme de sprays pour les affections du domaine oto-rhino-laryngologique; elle peut l'être sous forme de sprays ou par nébulisation pour les pathologies bronchiques. La composition contient l'acide hyaluronique en solution dans des solvants (eau ou sérum physiologique). R E V E N D I C ATI O N S 1.- Composition pharmaceutique ou destinée à l'hygiène contenant de l'acide hyaluronique, en association avec tout autre excipient approprié et présentant une activité thérapeutique vis-à-vis notamment des affections respiratoires des voies aériennes supérieures, caractérisée par le fait que l'acide hyaluronique pré5 sente un poids moléculaire d'au plus 105 Da. 2.- Composition selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'acide hyaluronique présente un poids moléculaire d'au plus 5.104 Da. 3.- Composition selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que la concentration en acide hyaluronique est comprise entre 0,01 et 10 10 mg/ml. 4.- Composition selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que l'acide hyaluronique utilisé est d'origine animale ou biotechnologique. 5.- Composition selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que l'acide hyaluronique utilisé est hydrolysé par voie chimique ou enzy15 matique pour obtenir un poids moléculaire d'au plus 105 Daltons.