FR 2850026 A1 20040723 FR 0300495 A 20030117 La présente invention concerne un ligament prothétique biomimétique ainsi que son procédé d'obtention. Les ligaments artificiels pour le remplacement de ligaments articulaires biologiques, et notamment ceux du 5 genou, sont dans certains cas spécifiques préférés aux techniques de suture directe ou de reconstitution par greffe autogène. En effet, la qualité de ces ligaments tant sur le plan mécanique que celui de la biocompatibilité s'est considérablement améliorée ces vingt dernières 10 années. Ainsi par exemple, on connaît par le brevet français FR-96.14263, un ligament prothétique en PET dit à " fibres orientées ". Ce ligament est constitué d'une laize roulée ou pliée sur elle-même, laquelle laize comporte deux 15 parties extrêmes intra-osseuses et une partie intermédiaire intra-articulaire constituée par un écheveau de fils de trame actifs longitudinaux, adjacents et non liés entre eux transversalement. Au montage du ligament, on donne une torsion longitudinale à chaque fil actif, aboutissant à un 20 ligament dextrogyre ou lévogyre reproduisant le vrillage naturel des ligaments en flexion. Ce type de ligament en PET, matériau dont la biocompatibilité est bien connue, présente une résistance extrêmement élevée aux efforts de traction, flexion et torsion, laissant présumer une 25 espérance de vie supérieure à celle des ligaments connus. Toutefois, malgré ces énormes progrès sur le plan biomécanique, on constate encore chez les patients des ruptures de ces ligaments artificiels. Des études menées sur les causes de ces échecs ont mis en évidence une 30 mauvaise repousse des fibroblastes après implantation. En effet, la distribution de ces cellules est inhomogène à la surface du ligament, les fibroblastes ne se développant pas dans les zones prothétiques intra-osseuses et se groupant en amas sur les fibres dans la zone intra-articulaire. En 35 outre, ces fibroblastes présentent une morphologie arrondie anormale, avec peu de points d'ancrage à la surface du ligament. La sécrétion de collagène par ces cellules est de fait désordonnée et entraîne une individualisation des fibres de la zone intraarticulaire avec accumulation de tissus fibreux entre l'enveloppe et la partie centrale des prothèses, contribuant ainsi à leur défaillance. La présente invention vise donc à remédier à ces problèmes en proposant un procédé de fonctionnalisation biomimétique de ligaments, notamment, procédé leur conférant notamment la capacité de mimer les matériaux vivants afin d'améliorer leur intégration biologique. A cet égard et conformément à l'invention, il est proposé un procédé de fonctionnalisation biomimétique de prothèses en polyéthylène, et notamment en polyéthylène téréphtalate (PET) remarquable en ce qu'il comporte au moins une étape de greffage de polymères ou copolymères 15 biologiquement actifs à la surface en polyéthylène desdites prothèses, laquelle étape de greffage consiste à réaliser une peroxydation de la surface par ozonation suivie d'une étape de polymérisation radicalaire d'une solution d'au moins un monomère. On notera que par prothèse en 20 polyéthylène, on entend toute prothèse constituée de fibres de PET ou de dérivé de polyéthylène donnant des performances convenables pour son utilisation dans des ligaments ainsi que toute prothèse présentant à sa surface ou celle de ses fibres une couche de polyéthylène et 25 notamment de PET. On comprend bien qu'en créant à la surface d'un ligament fabriqué selon le brevet FR-96.14263 susmentionné un " tapis " de polymères biologiquement actifs, on lui confère ainsi des propriétés d'adhérence et de 30 prolifération cellulaire favorables à une réhabitation fibroblastique normale et homogène. Par ailleurs, on peut améliorer ces propriétés en procédant, selon une autre caractéristique de l'invention, à une étape supplémentaire de préparation de la surface en 35 polyéthylène en milieu solvant seulement, ou en milieu solvant puis en milieu aqueux, qui précède l'étape de greffage. Ces deux variantes de cette étape de préparation contribuent considérablement à améliorer l'efficacité de l'étape de greffage, en augmentant la qualité de la surface greffée ainsi que la quantité de (co) polymères greffés. Elles jouent également un rôle non négligeable dans le caractère biocompatible du ligament ainsi traité. D'autres avantages et caractéristiques ressortiront mieux de la description qui va suivre, de la variante d'exécution complète, donnée à titre d'exemple non limitatif, du procédé de fonctionnalisation selon 10 l'invention. Le procédé selon l'invention est ici appliqué à des prothèses ligamentaires déjà formées ou encore aux trames de tissu en polyéthylène entrant dans la fabrication desdites prothèses; le procédé se décompose selon les étapes suivantes Etape 1: Préparation de la surface en polyéthylène lA) En milieu solvant: Cette étape dite de désensimage est nécessaire afin 20 d'éliminer les graisses et impuretés incorporées lors de la fabrication de la trame en polyéthylène servant de structure au ligament. Elle permet ainsi d'éviter des réactions pathologiques de type synovite aiguÙ lors de l'implantation chez le patient. En outre, cette étape 25 permet d'assurer une croissance des fibroblastes sur cette surface de polyéthylène ainsi nettoyée, croissance non observée sur des surfaces non nettoyées. On distingue deux variantes de cette préparation en milieu solvant, selon la nature du solvant choisi. Variante 1 Désensimage sans gonflement de la surface: On applique un minimum de 12 cycles d'extraction dans un appareil de SOHXLET et un contrôle des résidus de corps gras après le 12ème cycle de nettoyage à l'hexane. On fait 35 suivre ces cycles de nettoyage à l'hexane par des cycles de lavage à l'éther éthylique (RPE), trois lavages minimum avec contrôle des résidus après le troisième lavage. Variante 2 Désensimage avec un solvant apte à gonfler la surface en polyéthylène: L'utilisation d'un solvant apte à gonfler la surface du polyéthylène offre l'avantage d'améliorer le greffage en 5 augmentant le nombre de peroxydes sur la surface traitée lors de l'étape d'ozonation. Un tel solvant a pour caractéristique d'avoir une constante diélectrique supérieure à 30. De préférence, ce solvant est de type éther cyclique ou aliphatique. En 10 outre, on le choisira dans le groupe de solvant suivant tétrahydrofuranne (THF), diméthylsulfoxyde (DMSO), N, Ndiméthylformamide (DMF), N,N-diméthylacétamide (DMA), Nméthylpyrrolidone (NMP) . Ces solvants ont l'avantage de présenter une toxicité faible ou nulle et permettent ainsi 15 une utilisation facile en milieu industriel. Le traitement se fait par immersion du polyéthylène dans le solvant pendant une durée de l'ordre de 5 minutes à une heure environ, de préférence en 10 à 25 minutes. Ainsi, à titre d'exemple, on choisira une durée de 15 minutes à 20 température ambiante pour une immersion dans du tétrahydrofuranne (THF). 1B) En milieu aqueux Le but de cette étape optionnelle de préparation de 25 la surface en milieu aqueux est d'éliminer les résidus de fabrication du polyéthylène présent à sa surface, tels que l'acide téréphtalique pour le PET. On obtient ainsi une surface parfaitement apprêtée avant ozonation. Le traitement consiste à laver le polyéthylène dans 30 une solution de carbonate de sodium (Na2CO3) à 5% en poids dans l'eau distillée. Ce lavage est effectué à chaud, c'est-à-dire à plus de 60'C et moins de 120'C et de préférence à légère ébullition, soit 1000C 50C, pendant une dizaine de minutes. Bien entendu, tout autre carbonate 35 alcalin ou alcalino-terreux tel que K2CO3 ou CaCO3 peut être utilisé. Le lavage est suivi de rinçages successifs à l'eau distillée jusqu'à ce que le pH de l'eau de rinçage soit revenu à 7. lC) Nettoyage Quelles que soient les étapes précédemment effectuées (variante 1 ou 2 de l'étape lA, puis l'étape 1B, ou seulement l'étape lA), le produit en polyéthylène est 5 ensuite nettoyé, par exemple par un rinçage à l'éthanol absolu ou au tétrahydrofuranne (THF) suivi d'un séchage en étuve d'une durée de 30 minutes, par exemple. Etape 2: Greffage de polymères ou de copolymères biologiquement actifs sur la surface en polyéthylène 2A) Choix et préparation des monomères: Les monomères utilisés selon l'invention sont des monomères susceptibles de polymérisation et de copolymérisation radicalaire donnant naissance à des 15 polymères bio- compatibles stimulant la prolifération et la différenciation cellulaire et plus particulièrement celle des fibroblastes. De tels monomères contenant des groupes carboxylate, phosphate, sulfonate et sulfate sont, par exemple, décrits dans le brevet US 6.365.692 et peuvent 20 être utilisés selon l'invention seuls ou en mélange. On pourra, par exemple, utiliser de l'acide méthacrylique et du styrène sulfonate, ainsi que leurs mélanges. Avant de les utiliser pour la polymérisation, ces monomères seront purifiés au préalable. Ainsi par exemple, pour du styrène 25 sulfonate de sodium, on le purifie par recristallisation dans un mélange d'eau bidistillée/alcool (10/90,v:v), puis on le dissout à 70'C dans cette solution. On le filtre ensuite sous vide avec un disque en verre fritté d'indice de porosité 3 et on le conserve à 40C. Les cristaux de 30 sulfonate de sodium formés sont récupérés par filtration et le solide obtenu est séché sous vide à 500C jusqu'à l'obtention d'un poids constant. 2B) Ozonation: Les prothèses ou les trames en polyéthylène constitutives de ces prothèses préalablement traitées selon l'étape 1 sont introduites dans un dispositif d'ozonation tel que classiquement utilisé. Par exemple, on pourra utiliser un réacteur tubulaire de 500 cm3 contenant 100 cm3 d'eau bidistillée, lequel réacteur est muni d'un tube plongeur d'alimentation en ozone. On pourra, par exemple, utiliser un flux gazeux 5 équivalent en ozone à 50 g/m3 d'oxygène. Pour une telle quantité d'ozone, la durée optimale d'ozonation du PET est de 20 à 90 minutes. Les mesures du taux de peroxyde montre que le taux optimal est obtenu entre 30 et 60 minutes d'ozonation, toujours pour ce même flux d'ozone. On notera 10 également qu'une durée d'ozonation supérieure à 90 minutes dégrade fortement la surface en PET. On relèvera par ailleurs l'apport de la variante 2 de l'étape lA. En effet, l'utilisation d'un solvant apte à gonfler la surface augmente le taux de peroxyde d'un 15 facteur 5, par rapport à l'utilisation d'un solvant sans gonflement. Une fois l'ozonation terminée, les prothèses ou les trames en polyéthylène introduites dans le dispositif d'ozonation sont rincées et nettoyées, par exemple selon le protocole suivant: rincer trois fois à l'eau bidistillée, 20 puis trois fois à l'alcool absolu, puis trois fois au tétrahydrofuranne (THF) . Ensuite, sécher à l'étuve à vide pendant 30 minutes à 250C. 2C) Polymérisation: Le ou les monomères choisis et préparés selon l'étape 2A sont mis en solution dans de l'eau, de préférence bidistillée. On peut choisir toute concentration compatible avec la mise en oeuvre de la réaction de polymérisation radicalaire avec un minimum de 5% en poids. On choisira 30 avantageusement des concentrations proches de la solubilité limite du ou des monomère(s)dans la solution, avec un milieu visqueux favorisant ainsi des réactions de propagation polymérique radicalaire par rapport à des réactions de terminaison. Cela revient à choisir une 35 concentration pondérale k = s - g, ou s est la solubilité limite et E vaut 1 à 7% en poids. Ainsi par exemple, dans le cas du polystyrène sulfonate dont la limite de solubilité est de 20% en poids, on choisira une concentration de 15%. La durée de l'étape de polymérisation dépend de la nature du monomère. Elle est estimée au temps nécessaire à la gélification du milieu à la température de réaction. Ainsi, par exemple, on retiendra pour le polystyrène 5 sulfonate qu'à 70'C, la polymérisation durera 1 heure et qu'à 650C, elle durera 1 heure 30. La réaction de polymérisation est conduite dans une enceinte hermétiquement fermée et débarrassée de tout oxygène, par exemple, en réalisant un bullage à l'argon. On 10 introduit dans cette enceinte la solution de monomères ou de comonomères que l'on veut faire réagir et les prothèses ou bandes de tissus en polyéthylène préalablement ozonées. Le récipient hermétiquement fermé est chauffé au bain-marie à la température et à la durée déterminées comme exposé 15 précédemment. En fin de réaction, les éléments en polyéthylène qui ont été greffés sont extraits du réacteur. On peut ensuite laver ces matériaux greffés afin d'éliminer notamment des résidus de monomère(s) qui n'ont pas réagit. Par exemple, 20 on peut laver la surface fonctionnarisée plusieurs fois avec un solvant adéquat du ou des monomère(s), de l'eau bidistillée par exemple, et on peut optionnellement finir le lavage avec tout solvant adéquat, de l'éthanol absolu par exemple, afin d'éliminer d'éventuelles traces de 25 polymères non greffés. Etape 3: Imprégnation avec des agents biochimiques Cette étape est optionnelle. Elle vise à renforcer la capacité d'intégration biologique du ligament auquel on a 30 précédemment greffé des polymères biomimétiques tel qu'exposé aux étapes 1 et 2. Ainsi, l'imprégnation de la prothèse par un ou plusieurs agents biochimiques vise à augmenter ces propriétés d'adhérence et de prolifération cellulaire. Ces agents biochimiques favorisant la 35 colonisation par des fibroblastes sont une protéine de la famille des fibronectines et/ou du collagène de type I et/ou III. On utilisera avantageusement un mélange des précédentes protéines, c'est-à-dire un mélange de LSS-FR-4-texte issu de la réponse aux notifications fibronectines et collagène de type I et/ou III: on observe un effet synergique sur l'adhérence des fibroblastes. L'imprégnation de la prothèse par ces agents pourra, par exemple, être effectuée par trempage dans un bain contenant du collagène. Il va de soi que cette étape d'imprégnation ne suit pas forcément l'étape de greffage et qu'elle peut s'insérer et s'intercaler entre d'autres étapes de préparation du ligament en fonction de son stade de fabrication. En outre, 10 on fera avantageusement suivre cette étape d'imprégnation par une étape de stérilisation du ligament. Afin de mesurer l'efficacité du procédé qui vient d'être décrit, des essais comparatifs ont été menés sur des 15 portions de tissus en fibres de PET tricotées, le polyéthylène téréphtalate étant semi-cristallin, avec un taux de cristallinité de 40% C + 5% et une température de fusion proche de 2600C 50C. Ces tissus en fibre sont constitutifs de ligaments artificiels tels que fabriqués et 20 commercialisés par la demanderesse. On a ainsi préparé des fibres de PET témoin non greffées et deux types de fibres de PET greffées par du poly(styrène sulfonate de sodium) et greffées également par un mélange équipondéral d'acide méthacrylique (AM) et de styrène sulfonate de sodium 25 (SSNa). On trouvera au tableau 1 les différentes conditions de préparation. Tableau 1: Préparation des échantillons Préparation de la Ozonation Greffage surface Fibre PET Hexane et éther non greffées éthylique;Na2CO3 à 5 % Solution de SSNa 15% Fibres THF 15 min; Na2CO3 60 min à en poids; 1h30 à greffées (1) 5% 50g 03/m3 02 e o C 650C Solution à 15%SSNa Fibres THF 15 min; Na2CO3 60 min à et 15% AM (en greffées (2) 5% 50g 03/m3 02 poids) ; lh30 à 65 C On a ensuite procédé à différents tests d'évaluation biologique et notamment de cultures de fibroblastes et d'adhérence de fibroblastes sur ces différentes surfaces et les résultats obtenus figurent dans le tableau ci-après: Tableau 2:Evaluation biologique Polyéthylène non Polyéthylène greffé Paramètres greffé (1) et (2) Nombre de cellules à confluence (culture dans i.105 cellules/puit 1. 105cellules/puit des plaques de 24 puits) Répartition en amas Répartition homogène Développement des inhomogène le long sur toute la surface fibroblastes des fibres du tissu Forme allongée et Morphologie Forme arrondie étalée Force d'adhérence (unité 1 5-8 relative) Adsorption de collagène de type I (proportions 100 143 relatives en ng/cm2) On observe donc que le greffage de polymères biomimétiques à la surface de ligaments permet un développement normal et homogène des fibroblastes à la surface. On relèvera en outre que la surface traitée présente une affinité plus élevée vis-à-vis des protéines 15 ce qui permet d'avoir une meilleure adsorption de collagène et d'autres facteurs biochimiques favorisant la colonisation par des fibroblastes. On comprend donc bien que des ligaments, dont la surface aura été traitée selon les étapes 1 et 2 du procédé, et auxquels on fait ensuite 20 subir l'étape 3 d'imprégnation par de tels facteurs biochimiques, verront encore leurs capacités à faire adhérer les fibroblastes et à orienter correctement leur développement, nettement améliorées. Enfin, il va de soi que le procédé de - 10 fonctionnalisation biomimétique selon l'invention peut être appliqué à tout type de prothèse en polyéthylène pour lesquelles on veut améliorer l'intégration biologique et que les exemples que l'on vient de donner ne sont que des 5 illustrations particulières en aucun cas limitatives des domaines d'application de l'invention. LSS-FR-4 - il REVENDICATIONS 1- Procédé de traitement de prothèses artificielles en polyéthylène, et notamment en polyéthylène téréphtalate, afin de leur conférer la capacité de mimer les matériaux vivants, dit procédé de fonctionnalisation biomimétique 5 caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape de greffage de polymères ou copolymères biologiquement actifs à la surface en polyéthylène desdites prothèses, laquelle étape de greffage consiste à réaliser une peroxydation de la surface par ozonation suivie d'une polymérisation 10 radicalaire d'une solution d'au moins un monomère. 2- Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le polyéthylène téréphtalate est semi-cristallin. 3- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que la durée d'ozonation pour une 15 teneur d'ozone de l'ordre de 50g/cm3 est comprise entre 20 et 90 min. 4- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la solution de monomères a une concentration en monomère(s) comprise entre 5% et k%, o k 20 est une concentration proche de la solubilité limite du ou des monomère(s)dans la solution. 5- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'étape de greffage est précédée par une étape supplémentaire de préparation de la 25 surface en polyéthylène en milieu solvant seulement, ou en milieu solvant puis en milieu aqueux. 6- Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le milieu solvant est constitué d'hexane et d'éther éthylique. 7- Procédé selon la revendication 6 5 caractérisé en ce que le milieu solvant est constitué par au moins un solvant apte à modifier la surface par gonflement. 8- Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le solvant apte à modifier la surface par gonflement 35 est du type éther cyclique ou aliphatique ayant une toxicité faible ou nulle. 9- Procédé selon l'une quelconque des revendications LSS-FR-4 1notificationtexte issu de la réponse aux notifications - - 12 9- Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8 caractérisé en ce que le solvant apte à modifier la surface par gonflement a une constante diélectrique supérieure à 30. 10- Procédé selon l'une quelconque des revendications 7, 8 ou 9 caractérisé en ce que le solvant apte à modifier la surface par gonflement est choisi dans le groupe de solvants suivants: tétrahydrofuranne (THF), diméthylsulfoxyde (DMSO), N,N-diméthylformamide (DMF), N,N10 diméthylacétamide (DMA), N-méthylpyrrolidone (NMP). 11- Procédé selon la revendications 5 caractérisé en ce que l'étape de préparation de la surface en milieu aqueux consiste à traiter la surface en polyéthylène à chaud avec une solution aqueuse de sels de carbonates 15 alcalins ou alcalino-terreux, comme par exemple Na2CO3 ou CaCO3, afin d'éliminer les résidus de fabrication du polyéthylène présents à sa surface, tels que des acides organiques de faible poids moléculaire. 12- Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 précédentes caractérisé en ce qu'il comporte une étape supplémentaire d'imprégnation de la prothèse après l'étape de greffage par un ou plusieurs agents biochimiques favorisant la colonisation par des fibroblastes. 13- Procédé selon la revendication 12 caractérisé en 25 ce que l'agent biochimique est une protéine de la famille des fibronectines et/ou du collagène de type I et/ou III. 14- Application du procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 13 à un ligament artificiel en fibres tissées ou tricotées de PET.