FR 2857450 A1 20050114 FR 0308486 A 20030710 DÉTERMINATION DE L'ORIGINE GÉOGRAPHIQUE DES FÈVES DE CACAO ET DE LEURS PRODUITS DÉRIVÉS L'invention concerne la détermination de l'origine géographique des fèves de cacao et de leurs produits dérivés. Savoir différencier des fèves de cacao en fonction de leur origine géographique ou des traitements appliqués à l'étape de fermentation, de séchage, de torréfaction, est d'une extrême importance. Les principales raisons, mais sans exclusivité, sont les suivantes: 1) Origine géographique du cacao: La qualité gustative et aromatique du chocolat dépend en particulier de l'origine géographique des fèves de cacao. Pour des raisons commerciales, il peut être important aussi d'avoir le moyen de vérifier de manière précise l'origine de ces fèves, 2) Contrôle des traitements appliqués aux fèves de cacao: Les différents processus de transformation des fèves de cacao sur les lieux de récolte (fermentation, séchage) avant l'achat d'un lot de production, par exemple, torréfaction, traitement alcalin...) ont un impact direct sur les qualités du futur chocolat. 3) Contrôle des traitements appliqués aux poudres de cacao et aux chocolats: De même, les diverses technologies employées sur les poudres de cacao et chocolats (torréfaction, traitements alcalins, ...), qui diffèrent d'un pays à l'autre(4), ont un impact direct sur les qualités gustatives et sensorielles du chocolat. Cependant, ceci n'a de valeur qu'à la seule condition d'outils fiables et performants pour établir ces appréciations. Cela fait apparaître plusieurs nécessités qui ne sont pas réunies aujourd'hui. 10 15 20 25 30 35 40 1) Nécessité de disposer de moyens de contrôle de l'origine géographique du cacao. 2) Nécessité de disposer de moyens de contrôle des traitements appliqués aux fèves de cacao. 3) Nécessité de disposer de moyens de contrôle des traitements appliqués aux poudres de cacao et aux chocolats. L'invention a pour objet l'identification de la variété et de l'origine géographique de l'espèce Theobroma cacao, de leurs fruits (cabosses) et de leurs graines y compris des fèves de cacao issues du traitement postrécolte (fèves marchandes). Elle couvre aussi la détermination de l'origine géographique des produits qui en dérivent: chocolat, masse, poudre de cacao, boissons cacaotées... É Par variété, on entend les divers cultivars utilisés pour la production des différentes qualités de cacao: Criollo, Forastero, É Par origine géographique, on entend le pays producteur de cacao, mais aussi les régions à l'intérieur d'un même pays et, possiblement, les diverses plantations à l'intérieur d'une même région. L'invention a également pour objet la traçabilité des divers traitements post-récolte appliqués aux fèves et produits de cacao. É Par traçabilité, on entend le suivi du devenir des produits végétaux concernés: par quelles étapes sont-ils passés et pendant quelle durée les ont-ils subies ? É Par traitement post-récolte, on entend les diverses étapes telles que: fermentation, séchage, torréfaction, traitement alcalin des poudres de cacao, extraction, Plusieurs auteursw-(') ont tenté de mettre au point des méthodes d'analyse en vue de déterminer l'origine géographique des fèves de cacao et/ou leur état de transformation. 10 15 20 25 30 35 Ils considèrent pour cela divers types de molécules, qui pourraient être représentatives d'une origine géographique et d'un état de transformation donné : - Les composés volatiles du cacao (aldéhydes, alkylpyrazines et phénols) (i)-(3) - Le beurre de cacao (4)-(5) - Des éléments minéraux (Cu, Zn, Fe, Mg, Mn) (6) - Les gènes (') Ces auteurs utilisent des méthodes d'analyse diverses adaptées à chaque type de composés (chromatographie gazeuse couplée à une masse ou à une détection UV, spectrométrie d'absorption atomique de flamme, RMN faible résolution, RAPD). Cependant, il n'a pas été possible jusqu'à présent de réaliser un modèle qui représente fidèlement les fèves de cacao en fonction de leur pays d'origine, ce qui amène à se poser la question de savoir si les composés étudiés jusqu'à présent contiennent l'information de l'origine géographique d'un pays donné. Des indices de fermentation sont attribués à partir de la couleur des fèves de cacao. Mais cet indice est subjectif puisqu'il dépend de l'appréciation de la couleur par une personne. Aucune étude n'a été envisagée dans le but de modéliser les fèves de cacao au cours de l'étape de fermentation et de séchage. Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont amené à prendre en compte les éléments suivants. De nombreux composés du chocolat n'ont pas été retenus par les auteurs pour ce type d'étude. Les polyphénols sont des substances présentes dans la plupart des végétaux. Les polyphénols sont des métabolites secondaires exclusifs du monde végétal et les plantes sont capables de les élaborer différemment en fonction, tout d'abord, de leur patrimoine génétique, mais également en fonction de facteurs environnementaux qui varient selon des apports du sol, des agressions extérieures, du climat et donc de l'origine géographique. Les polyphénols pourraient être des indicateurs de l'origine géographique des fèves de cacao et des produits qui en dérivent. Aussi, au cours des divers traitements appliqués aux graines de cacao, les polyphénols subissent des modifications chimiques irréversibles. Ces modifications chimiques sont telles qu'il serait possible, de par la variation qualitative du contenu polyphénolique, de différencier jour après jour les fèves de cacao au cours de ces divers traitements postrécolte: fermentation, séchage, torréfaction, alcalinisation.... Les polyphénols pourraient être des indicateurs d'un état de transformation. L'invention repose alors sur une méthode qui vise à obtenir des informations (données) précises qui soient les plus discriminantes- de l'origine géographique et/ou de l'état de transformation des graines de cacao et des produits qui en dérivent. Il a ainsi été établi que l'identification de l'origine géographique et/ou le suivi de l'état de transformation de l'espèce Theobroma cacao ou d'un produit issu de ce végétal (son fruit, ses graines ou des produits dérivés) sont possibles, avec la plus grande fiabilité connue jusqu'ici, en partant de données issues de mesures bidimensionnelles (2D) de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) hétéro nucléaire entre les protons et les carbones (1H- 13C). Ces mesures de RMN doivent être réalisées, dans des conditions bien particulières, sur des extraits particuliers que l'on peut préparer et qui sont spécifiques de leur contenu polyphénolique . L'ensemble des données RMN (données qualitatives et quantitatives) recueillies a subi une analyse de données. Ces dernières analyses fourniront les données caractéristiques de l'origine géographique et/ou de l'état de transformation des fèves de cacao. L'invention repose donc sur l'utilisation des composés polyphénoliques pour établir une empreinte de l'origine géographique de l'espèce Theobroma cacao (et des produits dérivés) et de l'état de transformation des fèves de cacao au cours des divers traitements post-récolte. La méthode de caractérisation de l'origine géographique et/ou de l'état de transformation des graines de cacao et des produits dérivés qui fait l'objet de l'invention, repose essentiellement sur: 1) la préparation d'un extrait de métabolites secondaires le plus spécifique possible; 2) l'utilisation de ces extraits spécifiques pour créer une base de données qui s'est avérée devoir renforcer au maximum cette spécificité pour être pertinentes. Ces deux points ne sont utiles qu'à la condition que soit garantie la reproductibilité des méthodes d'extraction et d'analyse. Pour cette raison, la préparation des extraits polyphénoliques et les analyses doivent être effectuées dans des conditions très strictes qui assurent au maximum la spécificité du caractère polyphénolique des données qui seront utilisées ensuite. Ainsi, les données restent constantes pour un matériau donné, il est alors possible de construire une banque de données constituant une empreinte de l'origine géographique et/ou de l'état de transformation du matériau étudié. Le matériau pouvant être le fruit, les graines, les graines au cours des divers traitements post-récolte, les produits dérivés ou la plante de l'espèce Theobroma cacao. Dans un premier temps, on prépare un extrait polyphénolique spécifique contenant l'information à la fois sur l'origine géographique et sur l'état de transformation du matériau considéré. Cet extrait est appelé extrait polyphénolique spécifique . Les extraits polyphénoliques spécifiques sont soumis à une analyse RMN hétéro-nucléaire 1H-13C: l'expérience RMN bidimensionnelle mise en uvre dans ces travaux est celle établissant des corrélations entre protons et carbones, distants 45 de deux ou trois liaisons, par le biais de leurs couplages scalaires (HMBC) et utilisant l'amélioration du rapport signal/bruit que permettent les gradients de champ z G1 à G3 20 25 30 35 40 (GAS). C'est la technique qui donne le plus grand nombre d'informations sur la structure chimique des molécules (polyphénols) présentes dans l'extrait. Mais par rapport à tout ce qui était connu jusqu'ici, on utilise, conformément à l'invention, des ajustements particuliers des délais d2 et d6 qui correspondent au "filtre passe-bas" (d2) et à l'évolution des couplages "longue distance" (d6). Les valeurs retenues sont assez différentes de celles habituellement utilisées pour ces mesures qui pour des carbures ordinaires font état de constantes de couplage 1J de 125 Hz (soit d2 = 4 ms) et 2'3J de 7 Hz (soit d6 = 70 ms). Les conditions qui ont apporté une réponse d'authentification des origines géographiques particulièrement satisfaisante utilise ainsi un délai d2 de 3,45 ms (pour 1J de 145 Hz) et d6 de 62 à 65 ms (pour 2'3J de 8 Hz). Ces valeurs se rapprochent de celles des composés aromatiques (carbones sp2) et permettent donc de magnifier les corrélations spécifiques des polyphénols. Les informations générées dans ces conditions sont ainsi davantage celles liées aux composés polyphénoliques des extraits au détriment de celles dues aux autres catégories de métabolites secondaires qui ne sont pas caractéristiques des origines géographiques. L'information contenue dans les cartes RMN à deux dimensions, de chaque extrait polyphénolique spécifique, est ensuite traduite en données numériques par le calcul du volume de chaque pic de corrélation (intégration), en utilisant un système informatisé. Les données obtenues font ensuite l'objet d'une analyse statistique multidimensionnelle. L'analyse statistique multidimensionnelle comporte plusieurs étapes. Parmi celles-ci, le tri des variables par la méthode pas à pas de Carlier a été mis au point spécifiquement pour des cartes RMN des extraits polyphénoliques spécifiques et il permet de sélectionner les polyphénols les plus informatifs (de l'origine géographique et/ou de l'état de transformation). Le protocole opératoire comprend les étapes suivantes: I Préparation de l'extrait polyphénolique spécifique II Analyse RMN des extraits polyphénoliques III Intégration des données de l'analyse RMN et analyse statistique multidimensionnelle des résultats. Le procédé d'identification de la variété et de l'origine géographique de l'espèce végétale Theobroma cacao,ou d'un matériau choisi parmi ses fruits (cabosses), ses graines, y compris les fèves de cacao issues du traitement post-récolte (fèves marchandes), et identification de l'origine géographique des produits qui en dérivent, comme le chocolat, masse, poudre de cacao, boissons cacaotées, est donc caractérisé en ce qu'il comprend: - la préparation d'un extrait polyphénolique spécifique à partir du matériau utilisé - l'analyse par RMN hétéro-nucléaire multidimensionnelle des extraits polyphénoliques spécifiques et son enregistrement en prenant un délai d6 = 65 ms en vue de magnifier les signaux des polyphénols, - l'analyse statistique multidimensionnelle, après un tri des variables par la méthode pas à pas de Carlier, des données quantitatives obtenues à partir de l'intégration des cartes RMN précédemment obtenues pour sélectionner celles qui sont les plus pertinentes, afin d'obtenir des données caractéristiques,de l'origine géographique du matériau considéré. Le procédé, selon l'invention, de traçabilité et de suivi des divers traitements post-récolte appliqués aux graines et produits dérivés de cacao, est caractérisé par les étapes suivantes. un extrait polyphénolique spécifique est préparé à partir du matériau utilisé - une analyse par RMN hétéro-nucléaire multidimensionnelle des extraits polyphénoliques spécifiques est enregistrée en prenant 45 un délai d6 = 65 ms en vue de magnifier les signaux des polyphénols, - les données quantitatives obtenues à partir de l'intégration des cartes RMN précédemment obtenues sont soumises à une analyse statistique multidimensionnelle, après un tri des variables par la méthode pas à pas de Carlier pour sélectionner celles qui sont les plus pertinentes, afin d'obtenir des données caractéristiques de l'état de transformation des graines ou produits de cacao au cours des divers traitements postrécolte. Les paramètres d'acquisition de l'expérience RMN, les fenêtres spectrales, la fréquence d'excitation dans la dimension carbone, la fréquence d'excitation dans la dimension proton, le délai de transfert des couplages à longue distance (d6), sont identiques pour chaque analyse. Le résultat de l'expérience représenté par un interférogramme (FID) est multiplié par une fonction sinusoïdale carrée, afin d'augmenter le rapport signal / bruit, avant de lui appliquer une transformée de Fourier en magnitude. Les taches de corrélation sont ensuite intégrées afin d'obtenir des données quantitatives (variables pour l'analyse statistique) , qui serviront ultérieurement pour l'analyse statistique multidimensionnelle. L'ensemble des taches de corrélation sont intégrées car elles sont toutes potentiellement informatives. Les variables (taches de corrélation intégrées dans l'analyse précédente) sont soumises à une analyse statistique multidimensionnelle qui se décompose en plusieurs étapes: une analyse de variance, tri des variables, une AFD, un test de validation (à un seul individu et avec partition). Parmi les variables intégrées (taches de corrélation intégrées évoquées ci-dessus, le tri de celles-ci par la méthode pas à pas de Carlier permet de sélectionner les variables les plus pertinentes. La préparation des extraits polyphénoliques spécifiques de l'espèce végétale Theobroma cacao, de leurs fruits (cabosses) et de leurs graines y compris les fèves de cacao issues du traitement post-récolte (masse, poudre de cacao, chocolat, boissons cacaotées...) doit être faite dans les mêmes conditions. É 2857450 Les résultats des analyses statistiques multidimensionnelles sur les extraits polyphénoliques spécifiques, permettent de créer un référentiel par accumulation des résultats d'analyses effectuées dans les conditions définies ci-dessus, en reproduisant rigoureusement et dans les mêmes conditions les expériences à partir des matériaux précédemment définis. Le contrôle de l'origine géographique de l'espèce Theobroma cacao ou d'un de ses matériaux est caractérisé en ce que l'on soumet un extrait polyphénolique spécifique de cette espèce végétale ou d'un de ses matériaux, à une analyse par RMN hétéro nucléaire à deux dimensions de corrélation 1H-13C à longue 15 distance (avec un délai d6 = 65 ms), suivi d'un traitement des données comme défini dans les précédentes revendications (tri spécifique des variables). Le résultat est ensuite comparé aux données d'un référentiel correspondant à l'origine géographique et/ou à l'état de transformation auquel l'élément à analyser est supposé appartenir. L'invention permet donc de fournir une banque de données, élaborée à partir du contenu polyphénolique, de l'origine géographique de l'espèce Theobroma cacao et des produits dérivés, mais également, de l'état de transformation des fèves de cacao au cours des différents traitements post-récolte. 30 Grâce aux dispositions de l'invention, il est possible de déterminer l'état de transformation ou l'origine géographique d'un lot de fèves de cacao inconnu, mais référencé dans la banque de données. Ceci est essentiel dans le sens où à la fois l'état de transformation et l'origine géographique prédisent la qualité (odeur, amertume, fruité...) du futur chocolat. Des modes avantageux de réalisation de l'invention sont donnés ci-après, avec référence aux figures 1 à 6, qui représentent respectivement, Figure 1. Carte RMN 2D d'un extrait polyphénolique spécifique de fèves de cacao 10 25 Figure 2 Agrandissement de la carte RMN 2D (fig.l) pour réaliser le canevas, définition de secteurs (ROI) Figure 3 Représentation AFD des trois premiers axes discriminants sur la population totale de fèves de cacao en cours de fermentation, réalisée sur les variables sélectionnées pour le paramètre "jourssas" Figure 4 Tests de validation à un seul individu et avec partition, réalisés sur des modélisations AFD à partir de bases de données différentes (obtenues à partir de la réduction du nombre de variables sélectionnées après l'étape de filtration) Figure 5 Représentation AFD des trois premiers axes discriminants sur la population totale de fèves de cacao d'origine géographique différente, réalisée sur les variables sélectionnées pour le paramètre pays Figure 6: Modélisation AFD sur la population totale de fèves de 25 cacao d'origine géographique différente, réalisée sur les variables sélectionnées pour le paramètre continent I - Préparation de l'extrait polyphénolique spécifique Les extraits préparés permettent de sélectionner les molécules polyphénoliques les plus informatives sur les conditions de croissance des graines de cacao de l'espèce Theobroma cacao et sur l'état de transformation des graines de cacao au cours des divers traitements post- récolte. g de fèves de cacao sont broyés en poudre fine, puis délipidés par 150 mL d'éther de pétrole sous agitation durant 1 heure. Après filtration sur fritté n 4, la poudre est séchée puis mise à macérer dans une colonne (0 35 mm) dans 300 mL d'un mélange 70/30 éthanol/eau, durant 15 heures. La phase alcoolique obtenue après lixiviation, est réduite de manière à obtenir 150 mL de phase aqueuse (après ajout d'eau). Cette dernière est délipidée par 150 mL d'éther de pétrole, puis extraite trois 10 15 fois par 150 mL d'acétate d'éthyle. Ces trois dernières phases organiques sont rassemblées, séchées sur du sulfate de sodium (Na2SO4), filtrées sur fritté n 4 puis concentrées et lyophilisées. Chacun des extraits polyphénoliques est préparé trois fois. II - Analyse RMN des extraits polyphénoliques de fèves de cacao 120 mg d'extrait polyphénolique spécifique est dissous dans 880 L d'un mélange: 72,7/18,2/9,1: CD3COCD3/H2O/TFA, puis filtré sur un filtre CLHP à 0,45 m (membrane PTFE Titan ). Cette étape de filtration nous permet de retirer les insolubles non spécifiques. L'extrait est ensuite placé dans un tube RMN de 5 mm de diamètre. Ces extraits sont ensuite analysés par RMN 2D (figure 1). Trois expériences de RMN hétéro nucléaire (HMBC-GAS) entre les protons et les carbones (1H-13C) sont enregistrées pour chaque extrait. On obtient: - Le spectre du proton par projection sur l'axe horizontal - Le spectre du carbone 13 par projection sur l'axe vertical - Les corrélations entre ces deux noyaux (taches de corrélation de la carte 2D) par le biais de leur couplage 30 mutuel. Cette analyse RMN 2D donne les corrélations hétéro nucléaires (1H-13C) à longue distance (2Jc_H et 3Jc_H). Cette expérience donne 35 le plus de signaux pour des composés polyphénoliques. La séquence d'impulsion utilisée pour cette mesure RMN est celle d'une HMBC-GAS: erience RMN "3C longue Significations distance (2D) Programme de Inv4gplplrnd 2048 points de signal digitalisé en F2 (1H) pulse (logiciel 2048 x 256 xwinnmr Brücker) Taille de la matrice et 256 points dans la dimension F1 (13C) d'acquisition (F2/F1) dO 3 ps Délai incrémenté dl 1,5 s Délai de relaxation: 1 à 5T1 (1/2' 45 Dé'_âi du filtre nass e bas" pour supprimer 3, ms d6- (1/2 62 à 65 s les corrélations proton-carbore -, dépend du couplage proton carbone 1 1 moye Hz) Délai de transfert des couplages à longue Pl 5,2 ps distance ? r_o' en 8 Hz) Pulse à 90 dans la dimension 1H p2 10, 4 ps Pulse à 180 dans la dimension 1H p3 10,1 ps Pulse à 90 dans la dimension 13C p16 = G1 1 ms Pulse sinusoïdale de gradient de champ p16 = G2 1 ms d'intensité relative 5 Pulse sinusoïdale de gradient de champ p16 = G3 1 ms d'intensité relative 3 Pulse sinusoïdale de gradient de champ SF01 500,1321224 d'intensité relative 4 Fréquence d'excitation dans la dimension 1H SF02 MHz Fréquence d'excitation dans la dimension L3C SW(Fl) MHz Largeur spectrale observée dans la dimension 8, 5594 ppm 1H SW(F2) 222,0951 ppm Largeur spectrale observée dans la dimension 13C Nombre de scans 16 Nombre de balayages par expérience Fonction de Qsine(n/2) Multiplication des données par une fonction fenêtre 2048 x 1024 "sinus-carré" décalée de n/2, avant Taille de la transformation de Fourier Application d'un triple "zero-filling" dans matrice de Magnitude la dimension F1, dans le but d'avoir une transformation (mc) matrice de 2048x1024 qui correspond aux (F2/Fl) QF points de données réels Traitement Calcul du spectre (transformation de Mode Fourier) en mode "magnitude" Détection en quadrature d'enregistrement G1 G2 G3 1H dl 90 x d2 d0 4 > t dO détection 90 x pl p2 180 x 90 x 90 x 13C d6 p3 p3 p3 G: impulsion gradient p16 dans la direction du champ B o Synoptique de la séquence impulsionnelle de l'HMBC-GAS On prend un délai d2 = 3,45 ms, car il nous permet de supprimer plus efficacement pour des polyphénols les taches de corrélation entre carbones et protons directement liés. On prend un délai d6 = 65 ms, car il permet de magnifier les 25 taches de corrélation longue distance spécifiques des polyphénols. Le temps d'acquisition d'un spectre RMN hétéro-nucléaire est de 2 heures environ. Ces expériences sont enregistrées à 303 K. Le 30 spectromètre est équipé d'un système de régulation de la température, ce qui évite des perturbations sur les cartes RMN. III - Intégration des données de l'analyse RMN et analyse 35 statistique multidimensionnelle des résultats A. Intégration des données de l'analyse RMN: Le résultat de cette expérience RMN est une visualisation à deux dimensions d'une carte RMN à trois dimensions tronquée à un certain niveau. Les taches de corrélation observées sur le spectre RMN représentent les courbes de niveau d'un pic. La position sur la carte de chacune des taches de corrélation est déterminée par la nature des protons et des carbones qui lui donne naissance et par la structure de la molécule à laquelle ils appartiennent. L'intensité d'un pic de corrélation est proportionnelle à la concentration dans l'extrait de la molécule à l'origine de ce pic. Une analyse par RMN est un outil analytique utilisé pour la caractérisation structurale de molécules isolées à l'état pur. Cette analyse utilisée sur un extrait polyphénolique spécifique ne nous permet pas d'accéder à la composition précise de cet extrait. Des informations quantitatives (intensité des pics) et 15 qualitatives (coordonnées des taches de corrélation proton/carbone) sur la totalité des composés de l'extrait sont contenues dans chacune des cartes RMN 2D. L'information - de chaque carte RMN 2D est donc traduite numériquement par le calcul des volumes de chaque pic de corrélation. Dans cet objectif, des secteurs sont délimités autour de chaque tache de corrélation (ROI: Region of Interest) et le volume est calculé en additionnant tous les points présents dans le secteur (figures 1 et 2). L'association de ces secteurs forme un canevas . Ce canevas a été complété au fur et à mesure sur l'ensemble des cartes acquises pour chacun des extraits polyphénoliques de cacao. Le canevas finalement obtenu regroupe 880 surfaces d'intérêt et la totalité des coordonnées des zones à intégrer. Il a été utilisé pour réaliser l'intégration de l'ensemble des spectres RMN acquis. Il faut noter que l'ensemble des taches de corrélation est intégré car elles sont toutes potentiellement informatives. Les données les plus pertinentes parmi celles-ci sont ensuite triées (par la méthode pas à pas de Carlier). Les secteurs, précédemment définis, sont affectés d'un numéro et correspondent aux variables qui seront utilisées par la suite lors de l'analyse statistique des données RMN. On dispose d'autant de secteurs que de variables, et le numéro affecté a un secteur correspond au numéro de la variable qu'il engendre. La valeur de la variable est la valeur du volume calculé pour le 10 secteur associé. Le résultat est une matrice de 880 variables et n individus (où n est égal au nombre de cartes RMN 2D acquises). Le nombre d'individus sera explicité plus tard dans chacun des exemples. La matrice ainsi obtenue fait ensuite l'objet d'une analyse statistique multidimensionnelle. L'échelle de variation des résultats recueillis après intégration des ROI est très étendue (de 0 à 108). Une fonction logarithmique a été appliquée à la matrice de façon à diminuer cette échelle. Les variations des valeurs d'intégration sont ainsi privilégiées par rapport à la valeur d'intégration en elle-même. E. Analyse statistique multidimensionnelle (ou analyse de données) . Les termes couramment employés au cours d'une analyse de données sont définis ci-dessous (8) : Population: Ensemble concerné par une étude statistique. - Echantillon: Sous-ensemble de la population sur lequel sont effectivement réalisées les observations. - Individu: Tout élément de la population (par exemple: un lot de fèves de cacao). - Groupe: Ensemble d'individus de même nature (par exemple: toutes les fèves de cacao de Côte d'Ivoire regroupant plusieurs lots). Variable: Caractéristique définie sur la population et observée sur l'échantillon. Par exemple, une tache de corrélation définie par un secteur est représentée dans notre analyse statistique par une variable. La valeur de la variable correspond à la valeur du volume du signal intégré pour le secteur considéré. Il y a autant de secteurs définis que de variables. - Paramètre: Variable qualitative définissant des groupes 45 d'individus (par exemple le paramètre Afrique définit 9 groupes: Tanzanie, Madagascar, Nigeria, Togo, Sao Tome, Cameroun, Ghana, Zaïre, Côte d'Ivoire). 10 35 40 L'analyse par RMN donnant un nombre considérable de variables (880 variables) par rapport aux populations des fèves de cacao (comprenant 153 individus pour l'étude des fèves de cacao en cours de fermentation et 306 individus pour l'étude des fèves de cacao d'origine géographique différente), il s'est avéré nécessaire de diminuer le nombre de ces variables pour ne garder que les variables apportant des informations sur nos populations et faciliter ainsi la création du modèle statistique. Une analyse de variance permet de sélectionner les variables les plus représentatives, autrement dit les taches de corrélation qui sont les plusriches en informations. Cette étape permet de filtrer les variables. Un facteur F, proportionnel au rapport de la variance calculée tous groupes confondus sur la somme des variances calculées à l'intérieur de chaque groupe prédéfini, est calculé. Une variable pour laquelle le facteur F est élevé (autrement dit la variance entre les groupes est supérieure à la variance à l'intérieur du groupe) est représentative de la séparation de la population en groupes. À cet opérateur F, est associée une probabilité Pr(F) qui teste la probabilité pour que la mesure de F observée soit due au hasard. Les variables sélectionnées dans ce travail sont celles pour lesquelles F est le plus grand possible et Pr(F) est inférieur à 1 %. L'analyse spectroscopique RMN est capable dans la plupart des cas, de donner différents signaux pour un seul analyte. Il en résulte une redondance de l'information. Réciproquement, un pic de corrélation en RMN peut provenir d'un recouvrement ou d'une superposition de signaux caractéristiques de différents analytes. Lors de la formalisation mathématique du jeu de données, les variables redondantes seront colinéaires entre elles, empêchant la réalisation de certains calculs statistiques. Le tri des variables par la méthode pas à pas de Carlier permet de choisir parmi plusieurs variables fortement corrélées entre elles, celle qui apporte le plus d'informations 45 pour la construction des groupes. Une sélection itérative est réalisée: à chaque pas, les corrélations partielles de la partition sont calculées, la variable la plus corrélée est 40 sélectionnée et toutes les variables redondantes qui lui sont linéairement corrélées sont rejetées. Ce tri a été mis au point spécifiquement pour des cartes RMN de polyphénols. Il permet de sélectionner un seul signal par molécule polyphénolique. L'analyse de variance et le tri des variables ont permis de sélectionner les variables indépendantes qui contiennent le plus d'informations. L'analyse des extraits polyphénoliques par RMN permet la création d'un espace à nxp dimensions (n étant le nombre d'individus et p le nombre de variables). Dans cet espace, les individus sont définis par leurs coordonnées (une coordonnée = volume d'un pic de corrélation) sur chacun des vecteurs qui composent la base de cet espace (un vecteur de la base = une case intégrée). Afin de discriminer de manière optimale des groupes d'individus possédant des caractéristiques identiques, une analyse factorielle discriminante (AFD) est réalisée. Pour cette analyse, une définition préalable des groupes qui doivent être séparés est nécessaire. Lors de l'analyse factorielle discriminante, l'individu n'est considéré que comme appartenant à un groupe. Un espace de dimension: nombre de groupes -1 (degré de liberté) est créé. Les axes définissant cet espace 30 (axes discriminants) sont construits de façon à maximiser le facteur F (les barycentres des groupes prédéfinis sont les plus éloignés les uns des autres). L'AFD permet à la fois une représentation et une modélisation de la population. I1 est nécessaire de tester statistiquement la fiabilité et le pouvoir de classification des fonctions discriminantes, pour valider une modélisation. Deux tests de validation ont été 40 appliqués au cours de notre étude: Le test Validation à un seul individu : Un individu est retiré de la population initiale, puis une AFD est effectuée sur les individus restants et un nouveau modèle est recréé à partir de ce nouveau jeu de données. Les coordonnées de l'individu retiré sont alors calculées à partir du nouveau modèle et ce dernier est attribué au groupe d'individus dont les coordonnées 10 20 25 sont les plus proches. Successivement, chaque individu est retiré de la population initiale (avec remise à chaque fois). La méthode est validée lorsque le pourcentage d'individus correctement classé est fort. Le test Validation avec partition : la population est divisée en X partitions. La somme des individus formant ces partitions est égale à la population totale. Chaque partition est créée à partir de la population de départ (avec remise à chaque fois). Tous les individus d'une partition sont enlevés du jeu de données et le modèle est recréé à partir des données restantes. Ce modèle sert à prédire l'appartenance de chaque individu de la partition à un groupe. Ce travail est renouvelé pour chaque partition De même que pour le test de validation à un seul individu, un pourcentage de bon classement est donné. Exemple 1: Les polyphénols du cacao comme indicateurs d'un état de fermentation et de séchage Tous les traitements appliqués aux graines de cacao permettent le développement des précurseurs de l'arôme du chocolat et/ou le développement de l'arôme. C'est au cours des étapes de fermentation et de séchage (étapes les plus longues 5 à 6 jours et 2 jours respectivement) que les polyphénols du cacao 30 subissent le plus grand nombre de transformations. Dans les premiers jours de la fermentation, une forte activité enzymatique est responsable de l'oxydation des polyphénols. Les polyphénols se polymérisent, se complexent avec des protéines. En même temps, on constate un développement de l'acidité dans les fèves de cacao. En fin de fermentation et au cours du séchage, les polyphénoloxydases sont inactivées, et la diminution du contenu polyphénolique s'expliquerait par une oxydation non enzymatique des polyphénols. D'un point de vue sensoriel, les polyphénols sont connus pour être amers et astringents. Au cours de la fermentation on constate une 45 diminution de l'amertume et de l'astringence laissant penser à une diminution du contenu polyphénolique. Ainsi une fève de cacao sous-fermentée sera plus amère et astringente et aura pour 10 25 40 résultat de développer par la suite un chocolat avec très peu d'arôme. > Présentation des échantillons Tous les échantillons de fèves de cacao proviennent d'une même origine, la Côte d'Ivoire. Nous avons deux lots de fèves de cacao comprenant sept échantillons chacun. Chaque lot de fèves contient des échantillons qui ont été récoltés après 0 jour, 1 jour, 2 jours, 3 jours, 4 jours, 5 jours, et 6 jours de fermentation. Un lot comporte des échantillons qui ont subi, en plus, une étape de séchage après chaque récolte journalière 15 (noté jour as ) et le second lot contient des échantillons qui ont été congelés directement après récolte (noté jour ss ). En ce qui concerne l'échantillon noté ci , les fèves de cacao sont des fèves marchandes, c'est-à-dire qu'elles ont subi une étape de fermentation complète (6 jours) et une étape de séchage de deux jours environ. Trois extraits par échantillon ont été préparés et trois expériences RMN 2D par extrait. Nous avons donc au total 153 individus. 10 25 jour Ojas 1 jour 1 ljas 2 jours 1 2jas 3 jours 1 3jas 4 jours 1 4jas jours 1 5jas 6 jours 1 6jas Fèves marchandes 3 ci Tableau 1: Lot de fèves de cacao non séchées 0 jour 1 Ojss 1 jour 1 ljss 2 jours 1 2jss 3 jours 1 3jss 4 jours 1 4jss jours 1 5jss 6 jours 1 6jss Tableau 2: Lot de fèves de cacao séchées É Fèves de cacao séchées et non séchées L'étude réalisée qui prend en compte la totalité de la population: les. fèves sèches et les fèves non séchées (90 + 63). Dans cette étude, on recherche un modèle qui permettrait de' modéliser la population en prenant en compte le 20 degré de fermentation, jour après jour, mais également en considérant le paramètre sans séchage ( ss ) ou avec séchage ( as ). Une filtration et un tri des variables ont été réalisés et 743 variables ont été retenues lors de la première étape pour le paramètre jourssas (considérant à la fois le paramètre jour et les paramètres ss et as ). A la seconde étape, 138 variables significatives ont été retenues pour ce même paramètre. Paramètr, o; Nombre d'Individus 153 Nombre de variables 880 Nombre de variables après filtration 743 Nombre de variables après tri 138 Tableau 3: Nombre de variables sélectionnées après la filtration et le tri des variables pour le paramètre jourssas pour les échantillons de fèves de cacao en cours de fermentation Une modélisation par AFD a été réalisée. Celle-ci permet de regrouper les individus par groupes sans chevauchement. Les premiers axes discriminants, qui contiennent le plus d'informations nous montrent une séparation nette des individus (figure 3). 10 15 30 35 40 45 Afin de valider ce modèle les tests de validation ont été appliqués à un seul individu et avec partition. Le test de validation à un seul individu sur le paramètre jourssas , donne un taux de bon classement de 85 % seulement. La méthode a alors été adaptée en réduisant le nombre de variables sélectionnées par le tri et en retirant celles qui sont le moins informatives. Ces variables ont été enlevées une à une et un nouveau modèle a été recréé à chaque étape. Ces modèles ont été testés par le test de validation à un seul individu. Lorsque 18 variables ont été retirées, le modèle a donné 100 % de bon classement. Ce nouveau modèle est réalisé avec 120 variables. Le test avec partition n'a pu être réalisé à partir de ce modèle. Il a alors été choisi de continuer à diminuer le nombre de variables en éliminant les moins informatives. Entre 120 et 90 variables, aucun calcul n'est possible. Un classement correct de 100 % des individus a pu être fait avec 90 variables. La figure 4 représente le taux de bon classement, par les tests de validation à un seul individu et avec partition, en fonction du nombre de variables sélectionnées pour la réalisation du modèle (pour le paramètre jourssas ). Ces résultats montrent qu'il est possible de différencier les fèves de cacao en fonction de leur état de transformation. Les polyphénols contenus dans l'extrait spécifique contant une information renforcée suffisamment par la méthode de mesure de RMN hétéro-nucléaire pour caractériser un lot de fèves en fonction de son état de fermentation et de séchage. Exemple 2: Détermination de l'origine géographique des fèves de cacao Les différences du contenu polyphénolique spécifique, qualitatives et quantitatives, des fèves de cacao de même nature (même état de transformation), mais d'origine géographique différente sont moins ténues que les différences générées par les divers traitements. Ces expériences ont été réalisées avec 34 échantillons de fèves de cacao de 19 origines différentes. Les fèves de cacao sont toutes des fèves de cacao marchandes. Les extraits polyphénoliques spécifiques (comme décrit ci-dessus)ont été préparés et on a vérifié que ces extraits étaient spécifiques d'une origine géographique donnée. > Présentation de la population de fèves de cacao Le tableau 4 décrit la population de fèves de cacao utilisée pour l'étude sur l'authentification des fèves de cacao en fonction de leur origine géographique. Origine géographique Abréviations Nombre des fèves de cacao d'échantillons Java j v Sabah sa 1 Sumatra su 1 Papouasie p 1 Cameroun ça 2 Côte d'Ivoire ci 3 Ghana g 3 Madagascar m 2 Nigeria n 2 Sao Tome st 3 Tanzanie ta 1 Togo to 2 Zaïre z 2 Venezuela Cuba v 1 cu 1 Bahia b 2 Equateur e 1 Saint Domingue sd 2 Jamaïque jm 1 Tableau 4: Description de la population des fèves de cacao marchandes d'origine géographique différente a. Détermination du pays d'origine Trois régions du monde sont représentées dans cet échantillonnage: l'Amérique, l'Afrique, et l'Asie/Océanie (carte 1). Les extraits polyphénoliques spécifiques de cacao ont été préparés de la même manière que pour l'étude précédente, et chaque extrait a été préparé trois fois. Trois expériences RMN 2D hétéro- nucléaires de corrélation proton carbone à longue distance ont été enregistrées pour chaque extrait ce qui amène à (3x3) 9 individus par échantillon soit une population finale de 306 individus (9x34) pour 880 variables. Dans un premier temps, une filtration a été réalisée, puis un tri des données. 861 variables sont retenues pour la première étape et 154 à la seconde étape. pays (figure 5). Pour des raisons de clarté seulement les trois premiers axes discriminants de l'AFD ont été représentés. Le test de validation à un seul individu a permis de reclasser chacun des lots de fèves de cacao étudiés, avec un taux de bon classement de 100 %. Un taux de bon classement de 100 % a été obtenu pour le test de validation avec partition après sélection des 50 variables les plus informatives. Dans cette modélisation, il doit être tenu compte du fait que les fèves de cacao utilisées sont des fèves marchandes. Or dans la littérature, il est décrit que la transformation des graines en fèves marchandes dépend du pays producteur cl) En d'autres termes, certains pays sous-fermentent leurs fèves, d'autres utilisent des séchoirs (pour l'étape de séchage des fèves), d'autres sèchent leurs fèves au soleil.... Il est impossible d'appréhender autant de paramètres. De plus toutes ces technologies et/ou méthodes employées induisent des 10 Nombre d'individus 306 Nombre de variables 880 Nombre de variables après filtration 861 Nombre de variables après tri 154 Tableau 5: Nombre de variables sélectionnées après la filtration et le tri des variables pour le paramètre origine pour les échantillons de fèves de cacao d'origine géographique différente L'AFD permet la modélisation de la population pour le paramètre ves marchai i divèrses origine: 25 modifications au sein même de la fève. Ainsi Hernandez (4) dans son étude sur le beurre de cacao réussit à modéliser des différences entre deux types de torréfacteurs utilisés. La modélisation effectuée pour l'authentification de l'origine géographique des fèves de cacao, peut être basée sur les différences de technologies (modifications chimiques des fèves de cacao post-récolte), employées par les différents pays ou et/ou sur l'origine géographique (les polyphénols comme représentatifs du patrimoine génétique de la plante. b. Détermination du continent d'origine Un nouveau paramètre: continent est étudié. Il est constitué de trois groupes: Amérique, Afrique et Asie/Océanie. Comme pour les études précédentes, une filtration et un tri des données ont été effectués. 53 variables ont été retenues pour réaliser la modélisation de la population pour le paramètre continent. èvès marchandes facteur ont i nent Nombre d'individus 306 Nombre de variables 880 Nombre de variables après filtration 610 Nombre de variables après tri 53 Tableau 6: Nombre de variables sélectionnées après la filtration et le tri des variables pour le paramètre continent pour les échantillons de fèves de cacao d'origine géographique différente Une AFD a été réalisée (figure 6). Elle permet la modélisation de la population de fèves de cacao pour le paramètre continent. Les deux tests de validation, à un seul individu et avec partition, ont pu être réalisés sur cette modélisation et un taux de bon reclassement de 100 % a été obtenu pour ces deux tests avec 53 variables sélectionnées. La modélisation par continent est parfaitement réalisée (100 % de bon classement). Or, les techniques de transformation, les technologies employées et les méthodes de fabrication sont I radicalement différentes d'un pays à un autre à l'intérieur d'un même continent. Les transformations du contenu polyphénolique au cours du processus de fermentation ne peuvent pas expliquer à elles seules les différences observées lors du reclassement des fèves par pays. Les polyphénols du cacao contiennent l'information sur les méthodes de transformation des graines en fèves de cacao marchandes. Ils apportent aussi l'information sur l'origine géographique des fèves. La méthode utilisant la RMN à deux dimensions sur les extraits polyphénoliques spécifiques de fèves de cacao, avec un délai d6 = 65 ms, permet avec un jeu de données unique de déterminer sans équivoque l'état de transformation des fèves de cacao, au cours des étapes de fermentation et de séchage, mais également l'origine géographique des fèves de cacao par continent et par pays. 30 35 40 Revendications 1 - Procédé d'identification de la variété et de l'origine géographique de l'espèce végétale Theobroma cacao,ou d'un matériau choisi parmi ses fruits (cabosses), ses graines, y compris les fèves de cacao issues du traitement post-récolte (fèves marchandes), et identification de l'origine géographique des produits qui en dérivent, comme le chocolat, masse, poudre de cacao, boissons cacaotées, caractérisé en ce qu'il comprend: la préparation d'un extrait polyphénolique spécifique à partir du matériau utilisé - l'analyse par RMN hétéro-nucléaire multidimensionnelle des extraits polyphénoliques spécifiques et son enregistrement en prenant un délai d6 = 65 ms en vue de magnifier les signaux des polyphénols, l'analyse statistique multidimensionnelle, après un tri des variables par la méthode pas à pas de Carlier, des données quantitatives obtenues à partir de l'intégration des cartes RMN précédemment obtenues pour sélectionner celles qui sont les plus pertinentes, afin d'obtenir des données caractéristiques de l'origine géographique du matériau considéré. 2 - Procédé de traçabilité et de suivi des divers traitements 25 postrécolte appliqués aux graines et produits dérivés de cacao, caractérisé par les étapes suivantes: - un extrait polyphénolique spécifique est préparé à partir du matériau utilisé - une analyse par RMN hétéro-nucléaire multidimensionnelle des extraits polyphénoliques spécifiques est enregistrée en prenant un délai d6 = 65 ms en vue de magnifier les signaux des polyphénols, - les données quantitatives obtenues à partir de l'intégration des cartes RMN précédemment obtenues sont soumises à une analyse statistique multidimensionnelle, après un tri des variables par la méthode pas à pas de Carlier pour sélectionner celles qui sont les plus pertinentes, afin d'obtenir des données caractéristiques de l'état de transformation des graines ou produits de cacao au cours des divers traitements post- récolte.