FR 2859222 A1 20050304 FR 0310126 A 20030825 2859222 1 La présente invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro de l'efficacité d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique ou d'une ou plusieurs étapes d'un tel procédé pour l'élimination d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC). Cette méthode met en oeuvre des titrages amont et aval de l'ATNC considéré utilisant des lignées cellulaires transgéniques. Les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) regroupent un ensemble de maladies génétiques ou acquises caractérisées par une dégénérescence du système nerveux central (SNC), connues chez l'être humain comme étant, entre autres, la maladie de Creutzfeld-Jacob (MCJ) et affectant également de nombreux mammifères, particulièrement les ovins et les bovins (tremblante du mouton et encéphalite spongiforme bovine). Les propriétés de l'agent étiologique de ces maladies le classent dans ce que l'on appelle les "agents transmissibles non conventionnels" (ATNC). L'agent causal n'est pas connu. Mais la signature de la maladie est la présence d'une protéine extracellulaire, appelée protéine prion (PrP), qui est transformée au cours de la maladie en une forme insoluble, résistante aux protéases telles que la protéinase K, et qui s'accumule dans les cellules, provoquant la mort de celles-ci. Cette forme anormale pathogène de la PrP, appelée PrPsc, résulte d'une modification de la conformation de la protéine prion PrP. Il n'a pas été mis en évidence de modification de l'expression du gène codant pour la PrP, ni d'altération de sa traduction (P. Brown, Transfusion, 41, 4333-436, 2001 et D. Vôlkel et ai, Transfusion, 41, 441-448, 2001). La transgénèse in vitro ou in vivo contribue largement à la connaissance des EST. Ainsi, les souris dont le gène codant pour la PrPsc a été inactivé sont très fortement résistantes à l'infection expérimentale. Inversement, des souris et des cultures cellulaires exprimant (ou surexprimant) des transgènes pathologiques, clonés à partir du 2859222 - 2 gène de la PrP de sujets souffrant d'EST familiale, ou des xeno-gènes, miment les maladies héréditaires correspondantes ou sont sensibles à un innoculum provenant de sujets infectés appartenant à la même espèce que les transgènes. Les lignées cellulaires transgéniques sont également utilisées comme modèle in vitro pour la recherche de molécules interagissant avec la trans-conformation de la PrP en PrPsc. Les données actuellement disponibles ne permettent pas de démontrer que l'agent transmissible responsable des EST se trouve sous une forme infectante dans le sang et les dérivés sanguins (voir référence précédente à P. Brown). Toutefois, on ne peut conclure à son absence, cette incertitude résultant, d'une part, de la probable concentration très faible dans le sang et, d'autre part, de la très longue période d'incubation de la maladie, lorsqu'elle est installée. En outre, la surprenante résistance de l'ATNC empêche le recours à des procédés d'inactivation classiquement mis en oeuvre, tels que le traitement solvant/détergent Tween-TNBP, qui ont fait la preuve de leur efficacité pour réduire la charge virale des dérivés sanguins, tels que les protéines cryoprécipitables du plasma (facteur VIII, facteur von Willebrand etc.). Ceux-ci se verraient en effet complètement détruits par les procédés connus pour réduire l'infectiosité, par exemple en présence de NaOH 1M. Etant donné que l'obtention ou le traitement de produits biologiques, tels que les protéines plasmatiques de la coagulation, nécessite une élimination virale pour un usage thérapeutique, l'industrie pharmaceutique des médicaments dérivés du sang cherche aujourd'hui à évaluer le risque théorique de transmission du variant de la MJC par les produits dérivés du sang. Il est donc nécessaire de mettre au point une méthode de titrage sensible, spécifique et rapide à mettre en oeuvre pour évaluer le. degré d'élimination de l'ATNC que peut 2859222 - 3 apporter une étape ou une succession d'étapes mises en oeuvre dans le cadre d'un procédé de purification de produits biologiques. Actuellement, la méthode classiquement mise en oeuvre utilise un titrage in vivo avec une lignée sensible de hamsters dorés, par injection intracérébrale de différentes dilutions d'un produit à tester chargé en prion pathogène. Selon le nombre d'animaux atteints dans les différents groupes correspondant aux dilutions effectuées, on peut calculer un titre infectieux et établir le quotient de réduction d'un procédé donné à partir d'une référence non traitée. Cependant, cette méthode présente l'inconvénient d'être longue, coûteuse et peu compatible avec un développement à l'échelle industrielle dont on veut connaître rapidement l'efficacité vis-à-vis de l'élimination du prion. Par ailleurs, il est souvent nécessaire d'introduire une étape de concentration de l'agent infectieux de façon à augmenter la sensibilité des méthodes de titrage. Or, toutes les procédures de concentration d'agents infectieux responsables de l'EST co-purifient de la PrPsc. Des méthodes connues sont disponibles pour le titrage des agents infectieux des EST. Elles consistent en la détection de la PrPsc par la technique de Western-Blot (Ironside J.W. et al, J. of Thrombosis and Haemostasis, 1, 1479-1486, 2003) ou d'ELISA. Ces techniques nécessitent une digestion préalable de l'échantillon à analyser par la Protéinase K, ou une dénaturation par des agents chaotropiques pour distinguer la protéine pathologique (PrPsc) de la protéine normale (PrP). Une autre méthode de titrage a récemment été développée basée sur l'utilisation des anticorps spécifiques de la PrPsc ne reconnaissant pas la PrP. Les titrages d'infectiosité liés aux ATNC s'effectuent par inoculation intracérébrale d'animaux de laboratoire, tels que des rongeurs qui ont préalablement permis 2859222 - 4 l'adaptation de souches d'EST infectant d'autres espèces animales, de souris transgéniques, ou par mise en contact avec des lignées cellulaires transgéniques mais ces titrages présentent l'inconvénient de ne pas pouvoir fournir des données sur l'infectiosité du prion. Certains auteurs ont comparé la limite de détection des techniques immunochimiques de détection de la PrPsc à celle des techniques in vivo et in vitro (inoculation de cultures cellulaires transgéniques), dans un but de diagnostic. A titre d'exemple, on peut citer le brevet US 6 150 583 où sont prévus des animaux transgéniques exprimant la PrP épitope marquée. Dans le cas des virus classiques, les techniques de détection des agents infectieux peuvent se faire de manière directe, tel que le titrage de l'infectiosité in vitro et in vivo, et de manière indirecte par les étapes d'amplification en chaîne par polymérase de génomes viraux, inoculation in vivo suivie de la mise en évidence de séroconversions vis-à-vis d'agent viraux caractérisés, et détection immuno- 2 0 chimique ou moléculaire de marqueurs associés à une pathologie. L'évaluation de techniques directes par rapport aux techniques indirectes est un pré-requis à leur utilisation expérimentale à des fins réglementaires. Ainsi, on distingue les virus pertinents dont le titrage d'infectiosité in vitro est validé (une souche virale adaptée sur une lignée cellulaire continue sensible et permissive), des virus modèles, plus proches parents d'un agent pathogène dont la propagation in vitro n'est pas reproductible. A ce jour, la validation expérimentale, à l'égard des ATNC, des étapes d'inactivation virale incluses dans des procédés d'obtention ou de purification de produits biologiques, ne peut être effectuée que de façon directe in vivo par inoculation intracérébrale par exemple de rongeurs de laboratoire ou de souris transgéniques, ou de façon indirecte in vitro par détection immuno-chimique de la 2859222 - 5 PrPsc. En effet, aucun acide nucléique n'est présent dans le matériel infectieux et la PCR ne peut donc être utilisée. De plus, la protéine anormale in vivo ne provoque pas la formation d'anticorps spécifiques. Il faut donc recourir à des anticorps monoclonaux. Pour pallier les inconvénients des méthodes précédentes de détection et de titrage d'ATNC dans des produits biologiques, la Demanderesse a montré de manière surprenante que l'utilisation de lignées cellulaires transgéniques supportant la réplication d'ATNC permet la mise au point d'une méthode de titrage d'un ATNC à des fins de validation de l'efficacité vis-à-vis de l'élimination de l'ATNC considéré de procédés d'obtention ou de traitement de produits biologiques, telles que, par exemple, les protéines issues du fractionnement du plasma sanguin, les aliments, les produits cosmétiques ou par ceux présentant un risque pour l'environnement (farines animales). L'invention concerne donc une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un agent transmissible non conventionnel (ATNC), caractérisée en ce qu'à une étape amont du procédé, on introduit, dans le produit biologique, un mélange d'un matériel infectieux contenant l'ATNC et d'une lignée cellulaire transgénique supportant la réplication de l'ATNC, on effectue un titrage de mesure amont de la quantité d'ATNC présent dans le mélange, et, à une étape aval du procédé, on effectue un titrage de mesure aval de la quantité résiduelle d'ATNC. Par comparaison entre les deux mesures, on détermine le degré d'élimination ou le facteur de réduction de l'ATNC. Ainsi, la mise en oeuvre de la méthode permet d'évaluer et/ou de contrôler l'efficacité d'un procédé (ou d'une partie d'un procédé) d'obtention ou de traitement, voire de purification, de tout produit biologique, susceptible d'être contaminé par un ATNC, dans l'élimination de cet ATNC, tel que la prion protéine pathogène PrPsc, grâce à un titrage 2859222 6 utilisant des lignées cellulaires transgéniques spécifiques, favorisant la réplication de l'ATNC, mises en contact avec un matériel infectieux ou potentiellement infectieux contenant l'ATNC à tester, le mélange résultant étant placé dans le produit biologique. Le mélange représente aussi bien un mélange de lignées cellulaires transgéniques et d'un matériel infectieux en tant que tel, qu'un mélange de ces derniers après la mise en culture de ceux-ci. On mesure les quantités d'ATNC en amont et en aval du procédé (ou de la partie du procédé) dont on veut apprécier l'efficacité à l'égard de l'ATNC. Par comparaison des deux mesures, on détermine le degré d'élimination de l'agent pathogène. Ainsi, la mise en oeuvre de la présente méthode peut être effectuée au cours d'un procédé d'obtention d'un produit biologique ou dans le cadre d'un traitement d'élimination de l'ATNC suivant l'obtention du produit biologique. Dans le cadre de l'invention, le terme "ATNC" représente tout ATNC, tels que ceux responsables chez l'être humain de la MCJ familiale ou sporadique, de la maladie du Kuru ou du variant MCJ mis en évidence chez des sujets jeunes, ou bien encore ceux responsables chez les animaux de la Tremblante ou de l'encéphalopathie spongiforme bovine ou féline. Le choix spécifique d'une lignée cellulaire transgénique selon l'invention répondant également aux exigences et critères définis ciaprès, permet de répondre à la nécessité de quantifier l'infectiosité liée aux ATNC sur une gamme d'environ 4 log, c'est-à-dire de 1 à 10000 unités infectieuses in vitro, pour satisfaire aux critères de validation de l'efficacité des procédés d'obtention de produits biologiques vis-à- vis de l'élimination des ATNC. L'utilisation de telles lignées cellulaires transgéniques dans la méthode selon l'invention présente de nombreux avantages notamment celui de diminuer considérablement la durée de la quantification d'un ATNC présent dans le produit biologique avant et après le procédé. On obtient typiquement des résultats de titrage en 2859222 - 7 - environ 1 mois, alors que ceux de l'art antérieur utilisant les hamsters dorés par inoculation intracérébrale in vivo, sont obtenus en 1 an dans les cas les plus favorables et au prix d'examens histopathologiques fastidieux. Par ailleurs, ces lignées cellulaires offrent une réponse de mesure de titrage amplifiable, reproductible et la manifestation du pouvoir infectieux de l'ATNC qui n'est pas révélée par immuno-chimie. Elle présente aussi l'avantage d'être aisément applicable à tout type de procédé d'obtention ou de purification de produits biologiques, tels que les dérivés de plasma sanguins, utilisant par exemple les chromatographies décrites dans le brevet EP 0 359 593 et dans la demande de brevet WO 02092632 ou la nanofiltration et, enfin, celui d'éviter l'expérimentation sur de nombreux animaux et leur euthanasie. Les étapes amont et aval du procédé comprennent avantageusement les étapes suivantes: - établissement de lignées cellulaires transgéniques supportant la réplication d'un ATNC, - sélection des lignées cellulaires stables en présence de l'ATNC, - mise en contact des lignées transgéniques avec le matériel infectieux contenant l'ATNC, - mise en culture des cellules transgéniques infectées, 25 - mise en évidence de la réplication de l'ATNC, et - titrage de l'ATNC. L'établissement de la lignée cellulaire transgénique et la sélection de lignées stables selon l'invention, comme préalable au titrage, répondent aux exigences et critères suivants. Etant donné que les cellules nerveuses (neurones, cellules dendritiques) ne sont pas nécessairement les meilleurs substrats de transgénèse à des fins de titrage in vitro, du fait de leur mauvaise adaptation en culture in vitro, on établit des lignées cellulaires transgéniques par combinaison d'un type de cellules spécifiques et d'un - 8 transgène particulier, par des techniques connues, nécessaire pour fournir un environnement idéal à la réplication de la PrPsc. A titre d'exemple, les cellules spécifiques correspondent aux cellules épithéliales de lapin ou de tout autre espèce et représentent une lignée continue. Ainsi, l'expression contrôlée de la PrP exogène par l'ajout d'un gène de sélection dans le vecteur de transgénèse garantit son maintien lors de la période d'incubation nécessaire à l'accumulation de la PrPsc dans les cellules transgéniques mises en contact avec un matériel infectieux, comme décrit, par exemple, par Vilette et al.(PNAS, Mars 2001, 98(7), 4055-4059) pour la lignée cellulaire Rov9. On recherche également d'autres critères pour qu'une lignée cellulaire transgénique soit avantageusement utilisée comme substrat pour le titrage in vitro d'ATNC. Ces critères sont les suivants: - l'adéquation entre la vitesse de réplication ou multiplication des cellules et la durée d'incubation nécessaire à la mise en évidence d'une augmentation de la PrPsc dans les cellules infectées; - la stabilité des cellules après leur mise en contact avec l'agent infectieux qui peut être mise en évidence par l'absence de cytotoxicité de l'accumulation de la PrPsc dans les cellules; - leur bonne sensibilité à l'infection, par exemple une multiplicité d'infection faible pour obtenir une accumulation de la PrPsc dans les cellules exposées à l'agent infectieux. Après avoir établi et sélectionné les lignées cellulaires transgéniques comme requis, celles-ci sont mises en contact, par des méthodes connues en soi, avec le matériel infectieux contenant un ATNC. Dans le cadre de l'invention, le matériel infectieux représente un matériel biologique infectieux provenant notamment d'extraits de cerveaux d'animaux infectés par un ATNC,-tels que de bovins ou d'ovins. Les lignées cellulaires transgéniques sont 2859222 - 9 également mises en contact avec des dilutions sériées ou successives du matériel infectieux dans une solution aqueuse biologiquement acceptable permettant ainsi de mesurer le degré d'infectiosité des lignées cellulaires en fonction des dilutions opérées. L'étape de mise en culture des lignées infectées précédentes, selon toute technique connue de l'homme du métier, est requise pour la réplication de ces cellules car la quantité en ATNC suffisante pour induire l'infection des lignées cellulaires précédentes n'est pas détectable par des méthodes conventionnelles (ELISA, Western-Blot). La mise en évidence de la réplication de l'ATNC est effectuée par détection de l'ATNC et son augmentation au cours des passages cellulaires. L'étape de titrage de l'agent pathogène, effectuée par toute technique connue en soi, par exemple par la méthode de Krber, permet la mesure du titre infectieux de tout produit biologique en amont ainsi qu'en aval d'un procédé d'obtention ou de traitement de celui-ci. L'application du titrage d'un ATNC tel que décrit précédemment, utilisant des lignées cellulaires transgéniques dans un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique, n'exclut pas sa mise en oeuvre dans un autre contexte pour s'en servir pour une détermination absolue du titre en ATNC présent dans une matrice biologique. - 10 - Revendications 1. Méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un agent transmissible non conventionnel (ATNC), caractérisée en ce qu'à une étape amont du procédé, on introduit, dans le produit biologique, un mélange d'un matériel infectieux contenant l'ATNC et d'une lignée cellulaire transgénique supportant la réplication de l'ATNC, on effectue un titrage de mesure amont de la quantité d'ATNC présent dans le mélange, et, à une étape aval du procédé, on effectue ui titrage de mesure aval de la quantité résiduelle d'ATNC. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce 15 que les étapes amont et aval du processus comprennent les étapes suivantes: établissement de lignées cellulaires transgéniques supportant la réplication d'un ATNC, - sélection des lignées cellulaires stables en présence 20 de l'ATNC, - mise en contact des lignées transgéniques avec le matériel infectieux contenant l'ATNC, - mise en culture des cellules transgéniques infectées, - mise en évidence de la réplication de l'ATNC, et 25 - titrage de l'ATNC. 8. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'ATNC correspond à une forme pathogène de la prion protéine PrPsc. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 30 3, caractérisée en ce que la lignée cellulaire transgénique représente des cellules épithéliales de lapin. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'étape de mise culture des cellules transgéniques infectées est effectuée en présence d'au moins une dilution du matériel infectieux dans une solution aqueuse biologiquement acceptable. 2859222 - 11 - 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'étape de mise en culture est mise en oeuvre pour effectuer une réplication de l'ATNC. 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que la mise en évidence de la réplication de l'ATNC est effectuée par détection de l'ATNC et son augmentation au cours des passages cellulaires. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le produit biologique susceptible d'être contaminé par un ATNC est choisi dans le groupe constitué par les produits sanguins et leurs dérivés, les aliments, les produits cosmétiques et par ceux présentant un risque pour l'environnement. 9. Application d'une méthode selon l'une quelconque des 15 revendications 1 à 8 à un procédé de purification de produits sanguins et de leurs dérivés. 10. Application selon la revendication 9, caractérisée en ce que le procédé de purification représente lés chromatographies ou la nanofiltration.