FR 2857978 A1 20050128 FR 0309127 A 20030725 i La présente invention concerne un extrait peptidique obtenu par hydrolyse de spiruline, comprenant 70 à 80% en poids de peptides par rapport au poids total de l'extrait, ainsi qu'un procédé d'obtention dudit extrait peptidique de spiruline. Au sens de la présente invention, on entend par les termes extrait peptidique un extrait protéique hydrolysé. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, on entend par les termes extrait peptidique de spiruline un extrait peptidique de spiruline obtenu suite à l'hydrolyse des protéines de la spiruline. La spiruline est une microalgue bleue (cyanophycée) de type procaryote. Elle se présente comme un filament bleu-vert plus ou moins spiralé d'une longueur de 0,1 mm environ. Elle vit dans les eaux douces, légèrement alcalines et chaudes. On la retrouve à l'état sauvage sur tout le bandeau tropical de la planète mais elle est surtout cultivée en bassins d'eau douce. Cette microalgue, notamment la souche spirulina platensis ou spirulina maxima, est très riche en protéines, environ 60% à 70% en poids par rapport au poids total de la microalgue, et elle comprend l'ensemble des acides aminés essentiels pour l'organisme humain ou animal. Elle contient en outre 1% en poids d'acides gras polyinsaturés, tels que l'acide linoléique, l'acide gamma linolénique, des vitamines, notamment les 20 vitamines E, C, K, B1, B2, B3, B6, B9, B5 et surtout B12, et des pigments, notamment de la phycocyanine (15% en poids), de la chlorophylle (1% en poids), et des caroténoides (0,5% en poids). La demande de brevet Chinois CN 1204651 décrit un procédé de préparation 25 d'oligopeptides de spiruline, obtenus par hydrolyse des protéines de spiruline. Aucune étape de délipidation n'est mentionnée dans le procédé décrit dans cette demande de brevet. De plus, les applications décrites sont essentiellement thérapeutiques, en particulier pour traiter des affections de type cardiovasculaires, et par voie orale ou entérique, aucunement par voie topique à des fins dermatologiques ou cosmétiques. La demande de brevet internationale WO 01/47473 décrit un extrait aqueux ou hydroalcoolique non hydrolysé d'algue bleue contenant au moins 10% en poids de magnésium. Cet extrait stimule la synthèse D'ATP, la matrice protéique et la différentiation des kératinocytes. Le brevet FR 2 609 246 décrit un procédé de préparation d'un hydrolysat de spiruline par extraction éthanol-acétone puis éthanol-eau, puis hydrolyse acide. L'extrait de 5 spiruline n'est pas soumis à une hydrolyse enzymatique. L'extrait a un effet de restauration et de conservation de la teneur en eau de la couche cornée de la peau. La Protuline est un actif cosmétique commercialisé par la Société Exsymol, qui correspond à l'extraction de protéine de spiruline. Cet extrait stimule la prolifération des fibroblastes et améliore la cicatrisation, notamment via une augmentation des 10 faisceaux de collagène et des fibres élastiques. L'Aosaine est un actif cosmétique commercialisé par la société Secma, qui correspond à un hydrolysat de protéines d'ulve (peptides d'algue verte). La Demanderesse a découvert un nouveau procédé qui permet de valoriser les 15 protéines, sous forme d'hydrolysat, et les lipides, acides gras essentiels, de la spiruline. En effet, ce procédé permet d'améliorer les performances biologiques de l'extrait de spiruline. Dans un premier temps, la Demanderesse a réussi à extraire et à purifier les peptides et les lipides de la spiruline en utilisant un procédé original, qui optimise le rendement 20 d'extraction. Dans un deuxième temps, la Demanderesse a montré que, de façon surprenante, ces peptides de spiruline, obtenus suite à l'hydrolyse des protéines, présentent des activités stimulantes sur les cellules du derme, notamment une activité anti-ride, et que le nouveau procédé utilisé confère aux extraits peptidiques obtenus des performances 25 biologiques, notamment nutraceutiques et cosmétiques. Enfin, de façon originale, la Demanderesse a fabriqué un lait de spiruline en émulsionnant l'extrait peptidique et les lipides, susceptibles d'être obtenus par le procédé selon la présente invention. La présente invention a ainsi pour objet un procédé d'obtention d'un extrait peptidique de spiruline, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes successives suivantes: a) séparation des lipides et des protéines de la spiruline en soumettant des microalgues de spiruline, sous forme de poudre séchée (disponible sur le marché), à une extraction de la phase lipidique au moyen d'un solvant d'extraction approprié, choisi parmi les solvants polaires et les 5 huiles de synthèse ou végétales, et récupération de la phase lipidique d'une part et de la phase contenant les protéines d'autre part; puis b) la phase contenant les protéines issue de l'étape a) est soumise à une hydrolyse enzymatique, qui conduit à l'obtention d'un extrait peptidique; et c) éventuellement, purification de l'extrait peptidique obtenu suite à l'étape b). Les microalgues de spiruline sont avantageusement des souches Spirulina platensis ou Spirulina maxima. Selon une variante avantageuse de l'invention, le rapport en poids spiruline/solvant 15 d'extraction, de l'étape a), est compris entre 10/90 et 50/50 (p/p). Deux types de solvants sont particulièrement appropriés pour l'extraction des lipides de la spiruline. Les huiles, de synthèse ou végétales, permettent une extraction spécifique des lipides de la spiruline, notamment peu de pigments de la spiruline sont extraits. Les solvants polaires sont des solvants d'extractions moins spécifiques, 20 notamment des quantités plus importantes de pigments sont extraites, mais les rendements d'extractions sont supérieurs à ceux obtenus lorsque le solvant d'extraction est une huile. On peut également envisager d'utiliser un mélange de solvant polaire anhydre et d'eau. Les solvants polaires sont avantageusement choisis dans le groupe constitué par 25 l'éthanol, l'isopropanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle, sous forme anhydre ou en mélange aqueux. Comme exemple d'huile végétale appropriée pour l'extraction des lipides de la spiruline, on peut notamment citer l'huile d'olive. Avantageusement, les huiles appropriées sont des huile de synthèses, telles que le 30 DEPG (mélange du diester de propylène glycol et des acides caprylique et caprique). Selon une variante avantageuse de l'invention, l'extraction de la phase lipidique comprend de une à trois extractions, avantageusement deux extractions. De plus, chaque extraction dure au moins une heure, à une température comprise entre 4 et 80 C, avantageusement à température ambiante. Cette étape a) d'extraction correspond à une délipidation des microalgues de spiruline. Au sens de la présente invention, on désigne indifféremment l'étape b) par les expressions hydrolyse enzymatique ou hydrolyse protéique . Au sens de la présente invention, on entend par hydrolyse enzymatique une réaction 10 biologique, qui consiste à la scission des protéines en peptides réalisée par une enzyme (catalyseur biologique protéinique) de type hydrolase. Avantageusement, l'étape b) d'hydrolyse protéique comprend au moins les étapes suivantes: i) double hydrolyse protéique des protéines obtenues suite à l'étape a); 15 ii) dénaturation thermique de l'enzyme; et iii) le cas échéant, centrifugation. L'hydrolyse protéique est réalisée au moyen d'une protéase, avantageusement d'une protéase basique. L'hydrolyse protéique, de l'étape i), est avantageusement réalisée à une température comprise entre 50 et 60 C, encôre plus avantageusement à 55 C, à un 20 pH compris entre 6 et 11, encore plus avantageusement à pH = 8 et pendant 2 à 6 heures, encore plus avantageusement pendant 4 heures. La quantité d'enzyme est comprise entre 0,5% et 2 % en poids, avantageusement 1% en poids, par rapport au poids total de la phase contenant les protéines. Cette hydrolyse est répétée deux fois. L'étape ii) de dénaturation thermique de l'enzyme est réalisée à une température 25 supérieure à 50 C, avantageusement, à une température d'environ 90 C. Avantageusement, l'étape ii) de dénaturation thermique de l'enzyme est limitée à 15 minutes, encore plus avantageusement à 10 minutes. L'homme du métier sait adapter la durée et les conditions opératoires de l'étape éventuelle de centrifugation, en fonction notamment du matériel utilisé et de la 30 quantité d'échantillon. Cette étape de centrifugation permet de séparer d'une part les peptides solubles et d'autre part les protéines insolubles et les polysaccharides. Dans le cadre de la présente invention, l'extrait peptidique obtenu suite à l'étape b) peut aussi être dénommé hydrolysat. Selon une variante avantageuse de l'invention, l'extrait peptidique obtenu suite à 5 l'étape b) est purifié par ultrafiltration et concentré par nanofiltration ou par évaporation. Cette ultrafiltration permet de filtrer l'extrait peptidique en fonction de la taille de ses constituants et, permet ainsi l'élimination des insolubles, notamment de l'enzyme, des protéines et des polysaccharides. Avantageusement, on réalise une ultrafiltration à 10 000 Da, c'est-à-dire que toutes les molécules ayant une taille 10 supérieure à 10 000 Da restent dans le rétentat et sont ainsi éliminées. Le cas échéant, l'extrait peptidique obtenu suite à l'étape b) ou c) est décoloré et désodorisé, par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier, notamment par passage sur charbon actif. Dans le cas d'une décoloration et désodorisation par passage sur charbon actif, on ajoute avantageusement 10% en poids de charbon actif 15 par rapport au poids de la matière sèche. L'extrait peptidique est ensuite conditionné dans un conditionnement stérile. Avantageusement, des conservateurs sont ajoutés à l'extrait peptidique. Selon une variante avantageuse de l'invention, la phase lipidique, obtenue suite à 20 l'étape a), est purifiée ou stabilisée avant d'être conditionnée. Si le solvant d'extraction est une huile de synthèse ou végétale, la phase lipidique est notamment purifiée ou stabilisée par passage sur charbon actif, on ajoute alors avantageusement 3% en poids de charbon actif par rapport à la masse totale d'huile. Si le solvant d'extraction est un solvant polaire, les pigments de la phase lipidique, 25 notamment la chlorophylle, sont stabilisés par ajustement du pH et ajout de CuCl2. Ensuite, le solvant polaire est évaporé et la phase lipidique est redissoute dans une huile synthétique, telle que le DEPG, ou végétale, telle que l'huile d'olive. Au sens de la présente invention, on désigne par huile de spiruline selon l'invention la phase lipidique obtenue suite à l'extraction lipidique de l'étape a), 30 éventuellement purifiée ou stabilisée avant conditionnement. Le procédé d'extraction de l'huile de spiruline, c'est-à-dire l'étape a), doit être réalisé avant celui d'hydrolyse des peptides (étape b)) car il permet de rendre les protéines de spiruline plus disponibles au procédé d'hydrolyse enzymatique. D'autre part il permet également de protéger les acides gras et les vitamines de la dénaturation s'ils subissaient l'étape de chauffage lors de l'hydrolyse protéique. Le procédé selon l'invention permet l'obtention d'un extrait peptidique comprenant des peptides et des acides aminés libres mieux assimilables par la peau et l'organisme humain ou animal. Le procédé selon l'invention permet ainsi d'améliorer la biodisponibilté des protéines 10 de spiruline, et donc notamment leur digestibilité , via une hydrolyse de ces protéines en peptides. Le procédé selon l'invention permet d'améliorer les performances biologiques des protéines de l'extrait de spiruline qui sont hydrolysées en peptides. Ces performances biologiques correspondent notamment à une activité biologique de l'extrait peptidique 15 sur la prolifération des fibroblastes, évaluée par un test au MMT, sur la synthèse du collagène, évaluée en dosant l'hydroxyproline, et sur la synthèse des glycosaminoglycanes, évaluée par une méthode colorimétrique. La présente invention a également pour objet un extrait peptidique de spiruline 20 susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend 70 à 80 % en poids de peptides, 4 à 5 % en poids de sucres et 1 % en poids de chlorure de sodium, par rapport au poids total de l'extrait. Avantageusement, les peptides présentent la même composition en acides aminés, qualitativement et au moins sensiblement quantitativement, que la microalgue spiruline 25 initiale. Avantageusement, au moins 70 % des peptides ont un degré de polymérisation inférieur à 10 et présentent une masse molaire inférieure à 1 250 Da. Le tableau 1 suivant montre le profil de masses molaires des peptides de l'extrait peptidique de spiruline. Tableau 1 Masses molaires Masse molaire Degrés de Degré de Pourcentage (g/mol) moyenne (g/mol) polymérisation polymérisation moyen La présente invention a également pour objet une composition nutraceutique, notamment une composition de produits alimentaires diététiques, comprenant un extrait peptidique tel que décrit ci-dessus. L'hydrolyse des protéines de la spiruline permet d'améliorer les performances biologiques de l'extrait peptidique obtenu, voire de générer une activité biologique. Cet extrait peptidique comprend des peptides et des acides aminés libres, qui sont plus facilement assimilables par l'organisme. L'extrait peptidique de spiruline selon l'invention peut donc être utilisé dans une composition alimentaire ou en tant que 15 complément alimentaire. L'extrait selon l'invention peut notamment être utilisé dans une composition de produits alimentaires diététiques en raison de leur biodisponibilité améliorée et de leur haute teneur en acides aminés. La présente invention a aussi pour objet une composition cosmétique comprenant un 20 extrait peptidique de spiruline selon l'invention et un support cosmétiquement acceptable. L'hydrolyse des protéines de la spiruline permet d'améliorer les performances biologiques de l'extrait peptidique de spiruline obtenu, voire de générer une activité biologique. Eventuellement, la composition cosmétique peut en outre comprendre une huile de spiruline, susceptible d'être obtenue par le procédé selon la présente invention. g Avantageusement, l'huile de spiruline correspond à la phase lipidique, éventuellement conditionnée, obtenue suite à l'étape de délipidation (étape a)). Selon une variante avantageuse de la présente invention, la composition cosmétique comprend entre 10 et 80 % en poids d'extrait peptidique et entre 5 et 40 % en poids 5 d'une huile de spiruline, avantageusement d'une huile de spiruline selon l'invention, par rapport au poids total de la composition. L'huile de spiruline selon l'invention comprend des acides gras essentiels, notamment l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide oléique, l'acide linoléique, de la vitamine E, des caroténoides dont du bêta carotène. La peau humaine est riche en lipides cutanés (acides gras, phospholipides, sphingolipides et stérols). Cette barrière lipidique de la peau est à l'origine de l'imperméabilité de la couche cornée et contribue à réguler la desquamation. La peau est riche en acides gras, de 14 à 24 atome de carbone, avec une prédominance des chaînes en C16 et C18. L'absorption dans la nourriture de certaines huiles 15 contenant des acides gras essentiels (acide gamma linoleique) et polyinsaturés est indispensable au bon état de la peau. Une carence alimentaire de certains acides gras entraâîne un épaississement anormal de la peau, une desquamation anormale et une augmentation de la perméabilité cutanée. L'huile de spiruline selon l'invention est composée d'acides gras essentiels, comme l'acide linoléique et l'acide palmitique, qui 20 assurent le maintien de l'intégrité de la peau. L'application de l'huile de spiruline selon l'invention permet de restructurer la couche lipidique en améliorant la barrière cutanée. En émulsionnant les peptides de spiruline selon l'invention et une huile de spiruline, avantageusement l'huile de spiruline selon l'invention, on obtient un lait de spiruline présentant les activités biologiques combinées des peptides et de l'huile de spiruline. La composition cosmétique selon l'invention peut en outre comprendre d'autres principes actifs hydratants, raffermissants et anti-rides. La présente invention a également pour objet une utilisation cosmétique d'une composition cosmétique telle que décrite ci-dessus, pour stimuler la prolifération des 30 fibroblastes et/ou pour stimuler la synthèse du collagène et/ou pour stimuler la synthèse des glycosaminoglycanes. Avantageusement, la composition cosmétique selon la présente invention permet la restructuration de la barrière cutanée. Avantageusement, la composition cosmétique selon la présente invention permet également le raffermissement et/ou l'hydratation de la peau. Avantageusement, la composition cosmétique selon la présente invention permet aussi de prévenir et/ou retarder le vieillissement de la peau. La composition cosmétique selon la présente invention est avantageusement administrée par voie topique. La composition qui permet la mise en oeuvre de l'invention comprend un support cosmétiquement acceptable, c'est à dire un support compatible avec la peau et peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées pour une application topique, notamment sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse, d'une émulsion huiledans-eau ou eau-dans-huile ou multiple, d'un gel aqueux ou 15 huileux, d'un produit anhydre liquide, pâteux ou solide, d'une dispersion d'huile dans une phase aqueuse à l'aide de sphérules, ces sphérules pouvant être des nanoparticules polymériques telles que les nanosphères et les nanocapsules ou mieux des vésicules lipidiques de type ionique et ou nonionique, d'un dispositif trans-dermique ou sous toute autre forme pour application topique. Cette composition peut être plus ou moins fluide et avoir l'aspect d'une crème blanche ou colorée, d'une pommade, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d'une pate, d'une mousse ou d'un gel. Elle peut éventuellement être appliquée sur la peau sous forme d'aérosol. Elle peut également se présenter sous forme solide, et par exemple sous forme de stick. Elle peut 25 aussi être appliquée au moyen d'un patch. Avantageusement, le milieu cosmétiquement acceptable est une solution huileuse, une émulsion eau-dans-huile, une émulsion huile-dans eau, une microémulsion, un gel huileux, un gel anhydre, une dispersion de vésicules, de microcapsules ou de microparticules, un dispositif transdermique. La composition selon l'invention peut contenir également les adjuvants habituels dans le domaine cosmétique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les épaississants, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les agents chélateurs, les absorbeurs d'odeur, des filtres chimiques ou minéraux, des pigments minéraux, les tensioactifs, les polymères, les huiles de silicone et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés, et par exemple de 5 0,01 à 20% du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse, dans les vésicules lipidiques et ou dans les nanoparticules. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5 à 80% en poids, et de préférence de 5 à 50% du poids total de la 10 composition. Les huiles, les émulsionnants et les coémulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. L'émulsionnant et le coémulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3 à 30% en poids, et de préférence de 0,5 à 20% du poids total de la composition. Comme huiles utilisables dans les compositions permettant de mettre en oeuvre l'invention, on peut citer les huiles minérales, les huiles d'origine végétale, les huiles d'origine animale, les huiles de synthèse, les huiles siliconées et les huiles fluorées (perfluoropolyéthers). On peut aussi utiliser comme matières grasses des alcools gras (alcool cétylique), des acides gras, des cires (cilre d'abeilles). Comme émulsionnants et coémulsionnants utilisables dans l'invention, on peut citer par exemple les esters d'acide gras et de polyéthylène glycol tels que le stéarate de PEG-40, le stéarate de PEG-100, les esters d'acide gras et de polyol tels que le stearate de glycéryle et le tristéarate de sorbitane. Comme gélifiants hydrophiles, on peut citer en particulier les polymères 25 carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras, la silice hydrophobe et les polyethylenes. Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques optimales des composés et compositions selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement cosmétique, de Il préférence dermatologique, adapté à un patient comme par exemple le degré d'hydratation de la peau du patient, la tolérance au traitement, le type de peau. Les exemples suivants illustrent la présente invention sans en limiter la portée. Exemple 1: procédé d'extraction et de purification de l'extrait peptidique et de l'huile de spiruline: a) séparation des lipides et des protéines de la spiruline: Un mélange 40/60 (p/p) de microalgues de spiruline, sous forme de poudre séchée, et de DPEG est laissé sous agitation une nuit à température ambiante. Le mélange est ensuite filtré. Le filtrat, ainsi récupéré, correspondant à la phase lipidique, est dénommé huile. Le gâteau, qui correspond à la phase contenant les 15 protéines, est lavé par le DEPG. Le rendement massique d'extraction des lipides (soit des acides gras, des pigments et des vitamines) est de 30% sur matière sèche. L'huile est purifiée par décoloration par le charbon actif: on ajoute 3% de charbon actif ENO (commercialisé par la société CECA) par rapport à la masse totale d'huile. La solution est laissée 1 heure sous agitatioir à température ambiante puis elle est 20 filtrée (filtration à 1 jtm). Enfmin, l'huile est conditionnée. b) hydrolyse enzymatique: Le gâteau est rincé à l'acétone puis séché. Il est ensuite soumis à une double hydrolyse par la Prolyve 1000 , 1% (p/p), à 55 C, à pH=8 pendant 4 heures, dans l'eau 25 déminéralisée. L'enzyme est ensuite dénaturée par un chauffage à 90 C, pendant 10 minutes. L'hydrolysat est ensuite soumis à une centrifugation à 2000g pendant 2 minutes. Le rendement massique en matière sèche de l'étape d'hydrolyse des protéines est de 80% c) purification: L'hydrolysat est soumis à une ultrafiltration à 10 000 Da, qui permet l'élimination des insolubles. Il est ensuite décoloré et désodorisé par le charbon actif: on ajoute 10% en poids de 5 charbon actif ENO (commercialisé par la société CECA) par rapport au poids total de la matière sèche. La solution est laissée 1 heure sous agitation à température ambiante puis elle est filtrée (filtration à 1 gim). L'hydrolysat purifié, décoloré et désodorisé est ensuite conditionné dans un conditionnement stérile. On ajoute des conservateurs: Phénonip (0,4 %) et sorbate de 10 potassium (0,3 %) et on filtre à 0,21tm. Le rendement massique de l'ultrafiltration est de 85% sur la matière sèche, le rendement étant calculé par rapport à l'étape précédente. Le rendement massique de la décoloration est de 90% sur la matière sèche, le rendement étant calculé par rapport à l'étape précédente. Globalement le rendement massique en matière sèche est de 60% sur matière sèche, c'est à dire qu'on obtient au final 60% de la matière sèche initiale Exemple 2: procédé d'extraction et de purification de l'extrait peptidique et de 20 l'huile de spiruline: a) séparation des lipides et des protéines de la spiruline: Un mélange 25/75 (p/p) de microalgues de spiruline, sous forme de poudre séchée, et d'éthanol est laissé sous agitation une heure à température ambiante. Le mélange est 25 filtré et le gâteau est soumis de nouveau à une extraction dans l'éthanol à 25% pendant une heure à température ambiante. Le mélange est ensuite filtré. Le rendement massique d'extraction des lipides (acides gras, pigments et vitamines) est de 90% sur matière sèche. Les filtrats, ainsi récupérés, sont regroupés, ils correspondent à la phase lipidique. Le 30 gâteau, qui correspond à la phase contenant les protéines, est séché. Stabilisation des pigments: le pH de la phase lipidique est ajusté à pH=3 par ajout d'acide sulfurique. La solution est laissée sous agitation pendant une heure puis on ajoute du CuCl2. Après une heure d'agitation, la solution est neutralisée par ajout de soude. La phase lipidique est ensuite incorporée dans une huile de synthèse, le DEPG, puis l'éthanol est évaporé. b) hydrolyse enzymatique: Le gâteau, une fois séché, est soumis à une double hydrolyse par la Prolyve 1% (p/p), à 55 C, à pH=8 pendant 4 heures dans l'eau déminéralisée. L'enzyme est ensuite dénaturée par un chauffage à 90 C, pendant 10 minutes. 10 L'hydrolysat est dilué par 2 (plp) dans l'eau déminéralisée. L'hydrolysat est ensuite soumis à une centrifugation à 2000g pendant 2 minutes. Le rendement massique sur matière sèche de l'étape d'hydrolyse des protéines est de 80%. c) purification: L'hydrolysat est soumis à une ultrafiltration à 10 000 Da, qui permet l'élimination des insolubles, notamment de l'enzyme, des protéines et des polysaccharides. Il est ensuite décoloré et désodorisé par le charbon actif: on ajoute 10% en poids de charbon actif ENO (commercialisé par la société CECA) par rapport au poids total de 20 la matière sèche. La solution est laissée 1 heure sous agitation à température ambiante puis elle est filtrée (filtration à 1 1m). L'hydrolysat purifié décoloré et désodorisé est ensuite conditionné dans un conditionnement stérile: le taux de matière sèche est ajusté à 5% en poids, le pH est ajusté à pH=5, des conservateurs, Phénonip (0,4 %) et sorbate de potassium (0,3 %), 25 sont ajoutés et on filtre à 0,2pim. Le rendement massique global de l'extraction des peptides est de 60% sur matière sèche. 2857978 14 Exemple 3: Bénéfice apporté par l'hydrolyse des protéines sur le rendement du procédé selon l'invention Le tableau 2 suivant présenteles rendements du procédé en fonction de la présence ou de l'absence de l'étape b) d'hydrolyse enzymatique. Tableau 2 avec hydrolyse enzymatique sans hydrolyse enzymatique Re n d o 80 % de rendement sur 30 % de rendement sur Rendement dextraction.. Renem a)et det o matière sèche* matière sèche* Etapes a) et b) Rendement d'ultrafiltration et 75 % de rendement sur 40 % de rendement sur traitement par le charbon matière sèche* matière sèche* actif matlmatire sehe *matiere sbche* actif Etape c) Rendement total du 60% de rendement sur 12% de rendement sur procédé matière sèche* matière sèche* Filtration stérilisante Solution filtrable Solution colmatante Pureté du produit final 76 % de protides sur matière 62 % de protides sur Puret6 du produit finalsèhmairsce Aspcturodit-inlLmpsèche matière sèche Aspect du produitfinal Limpide et clair Trouble et foncé * le calcul du rendement est fait à partir de l'étape précédente Les bénéfices apportés par l'utilisation d'une hydrolyse enzymatique sont: - une augmentation du rendement du procédé, qui est multiplié par 5; - une amélioration du procédé d'ultrafiltration; - une augmentation de la pureté du produit: +14% en poids de protéines sur matière sèche. Exemple 4: Composition d'un extrait peptidique de spiruline: Extrait peptidique de spiruline: 70%-80% de peptides 4%-5% de sucres 1% de chlorure de sodium Le tableau 3 suivant présente la composition en acides aminés de l'extrait peptidique selon l'invention et des protéines totales, non hydrolysées, de spiruline. Tableau 3: composition en acides aminés Extrait peptidique de Spiruline Protéines totales de Spiruline Isoleucine 6,0 % 5,3 % Leucine 9,1 % 8,2 % Lysine 4,5 % 4,4 % Méthionine 2,5 % 2,2 % Phénylalanine 4,1 % 4,4 % Thréonine 5,8 % 4,7 % Tryptophane non dosé 1,4 % Valine 6,6 % 6,2 % Alanine 8,0 % 7,8 % Arginine 6,3 % 7,9 % Acide Aspartique 11,1% 12,1% Cystine 1,0 % 0,9 % Acide Glutamique 14,6 % 14,2 % Glycine 5,1% 5,3 % Histidine 1,3 % 2,5 % Proline 4,2% 4,1 % Sérine 4,8% 4,4 % Tyrosine 5,0% 4,0 % TOTAL 100,0)-% 100,0 % Les extraits peptidiques présentent la même composition en acides aminés que la microalgue spiruline brute initiale. Exemple 5: Profil de masses molaires des peptides de spiruline: Extrait peptidique de Spiruline Le tableau 4 suivant présente la répartition en masse des peptides de spiruline selon l'invention. Tableau 4 Masses molaires Masse molaire Degrés de Degré de Pourcentage (g/mol) moyenne (g/mol) polymérisation polymérisation moyen 1250 - > 10 - 23% maximum: 7250 maximum: 58 70% des peptides ont un degré de polymérisation inférieur à 10 et présentent une taille inférieure à 1000 Da. Exemple 6: Mise en évidence d'un effet stimulant sur la prolifération des fibroblastes de l'extrait peptidique hydrolysé selon la présente invention: Principe: La prolifération des fibroblastes est évaluée par un test au MTT( 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide). Ce sel de tetrazolium est clivé par les déshydrogénases mitochondriales. Le substrat jaune pâle est transformé en bleu foncé par les cellules vivantes et non par les cellules mortes ou le milieu de culture. 15 Méthode: L'étude est réalisée sur une lignée de fibroblastes normaux provenant de biopsie (nombre de repiquage compris entre 4 et 8). Ils sont cultivés dans des flasques de cm2 avec le milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagles medium) complémenté 20 avec 10% de sérum de veau foetal et 1% de gentamycine (0lmg/ml) à 37 C en présence de 5% de CO2. Le milieu de culture est renouvelé tous les 2 ou 3 jours. A confluence, les cellules sont décollées sous l'action de la trypsine puis sont repiquées. Les fibroblastes sont cultivés, en présence et en absence de l'extrait peptidique de 25 spiruline dans des plaques 96 puits (5.103 cellules par puits à raison de 10 puits par dose). Après 24 et 48 heures de culture, les cellules sont incubées avec du MTT (Smglml) pendant 4 heures à 37 OC. Un tampon d'extraction est ensuite ajouté et les plaques sont incubées une nuit à 37 C pour dissoudre les cristaux bleu foncé formés. Les lectures d'absorbance de chaque 5 puits sont faites à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. L'absorbance à 570 nm est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Résultats: La figure 1 représente la lecture d'absorbance de chaque échantillon faite à 570 nm 10 après 24 et 48 heures de cultures et est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes L'extrait peptidique de spiruline stimule respectivement de 49%, 48% et 41% la prolifération des fibroblastes à 0,1%, 0,5% et 1% après 24 heures d'incubation. L'extrait peptidique hydrolysé de spiruline stimule respectivement de 43%, 43% et 15 38% la prolifération des fibroblastes à 0,1%, 0,5% et 1% après 48 heures d'incubation. Une cytotoxicité de l'extrait peptidique de la spiruline a été constatée lors des essais à 5%età 10%. Exemple 7: Mise en évidence d'un effet stimulant sur la synthèse du collagène de l'extrait peptidique selon la présente invention: Principe: L'hydroxyproline est exclusivement présente dans le collagène qui est le composant 25 majeur de la matrice extracellulaire des tissus conjonctifs. La structure primaire des différents types de collagène se caractérise par la répétition du triplet glycine, proline, hydroxyproline. Le métabolisme du collagène peut être étudié en dosant 1 'hydroxyproline. Réactifs: Chloramine T: 1,27g de chloramine T dans 20 ml d'isopropanol + 80 ml d'une solution acéto-citrique à pH=6,5. Réactif d'Ehrlich: 15 g de p-diméthylaminobenzaldéhyde dissous dans 100 mL d'un mélange isopropanol/acide perchlorique (2/1 v/v). Solution stock de L-4-hydroxyproline à 1 mg/ml dans de l'eau distillée. Méthode: Les fibroblastes sont cultivés en présence des extraits peptidiques de spiruline dans des boites de Pétri (4 105 cellules par boite) pendant 1, 2, 3 et 4 semaines. Une nouvelle dose d'extrait peptidique est ajoutée tous les 2 ou 3 jours à chaque changement de culture. Parallèlement des boites sans extrait servent de témoin. Après 1, 2, 3 et 4 semaines de culture, la couche cellulaire et le milieu sont récupérés, congelés à -80 C puis lyophilisés. Les échantillons sont hydrolysés à 120 C pendant 20 minutes avec une solution de NaOH 2N (libération de l'hydroxyproline). Ils sont ensuite incubés pendant 25 minutes 15 avec la chloramine T (oxydation pour former un groupe pyrrole) puis pendant 20 minutes à 65 C avec le réactif d'Ehrlich (développement d'un chromophore). L'absorbance de chaque échantillon est mesurée à 550 nm avec un spectrophotomètre. Résultats: La figure 2 représente la quantité (en!ig/ml) de collagène en fonction du temps de culture et illustre la stimulation de la synthèse du collagène par l'extrait peptidique de spiruline. Quelque soit la concentration utilisée l'extrait peptidique de spiruline stimule la synthèse de collagène. A 0,5 %, il augmente de 98% la quantité de collagène après 3 25 semaines de culture et de 96% après 4 semaines. Exemple 8: Mise en évidence d'un effet stimulant sur la synthèse des glycosaminoglycanes de l'extrait peptidique selon la présente invention: Principe: Les fibroblastes sont responsables de la biosynthèse des glycosaminoglycanes. Les GAGs sont des macromolécules complexes de grande taille qui composent la matrice extracellulaire et leur hydratation assure, en grande partie, la tonicité de la peau. Ces molécules sont formées d'une chaîne polypeptidique sur laquelle sont branchés, par l'intermédiaire de liaisons covalentes, des polymères de disaccharides formés de sucres 10 particuliers parfois aminés ou sulfatés. L'acide hyaluronique est un glycosaminoglycane de très haut poids moléculaire qui représente 50% des GAGs de la peau adulte. Les autres GAGs sont l'acide chondroitine 4 sulfate, le dermatane sulfate et l'héparine. Une méthode colorimétrique (Blyscan kit, Biocolor) est utilisée pour doser les GAGs: 15 - le réactif est le bleu 1,9-dimethyl-methylene qui se fixe spécifiquement sur les GAGs - le complexe formé est dissocié par un sel dissout dans une solution de propan-1-ol - la coloration bleue développée est mesurée grâce à un spectrophotomètre Méthode: Préparation des échantillons Les fibroblastes sont cultivés en présence d'extrait peptidique de spiruline dans des boites de Pétri de 60 mm de diamètre (4 105 cellules par boite) pendant 1, 2, 3 et 4 semaines, à raison de 5 boites par temps de culture. Les solutions à 5% et 10% 25 d'extrait peptidique de spiruline ne sont pas testées car les résultats précédents ont montré qu'à ces valeurs de concentrations l'extrait présente une cytotoxicité. Une nouvelle dose d'extraits peptidiques de spiruline est ajoutée tous les 2 ou 3 jours à chaque changement de milieu de culture. Parallèlement, des boites sans extrait servent de témoin. Après 1, 2, 3 et 4 semaines de culture, la couche cellulaire et le milieu sont récupérés, congelés à- 80 C puis lyophilisés. Préparation de la courbe standard Une gamme étalon (0 - 5 jg) a été réalisée en duplicate à partir d'une solution standard de GAGs (acide chondroitine 4 sulfate). Dosage Les échantillons à tester et ceux de la gamme étalon sont amenés à 100 pi avec de l'eau distillée. Ils sont incubés pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation avec 1 ml de bleu 1,9-dimethylmethylene. Ils sont ensuite centrifugés 10 minutes à 10 000 g. Les surnageants sont éliminés et les culots sont dissous dans I ml de réactif de dissociation. Une coloration bleue se développe en 10 minutes. 10 L'absorbance de chaque échantillon est mesurée à 656 nm avec un spectrophotomètre. Les résultats sont exprimés en Hg de GAGs par ml de milieu de culture. Résultats (n=5 pour chaque expérience) La figure 3 représente le taux de glycosaminoglycanes en fonction du temps de culture et illustre la stimulation de la synthèse des glycosaminoglycanes par l'extrait 15 peptidique de spiruline. L'extrait peptidique de spiruline stimule la synthèse des GAGs après 2 semaines de culture. A 1%, après quatre semaines de culture, il augmente la quantité de GAGs d'environ 1 Htg/ml (soit une augmentation de 25%). Conclusion: L'extrait peptidique de spiruline selon la présente invention présente des activités stimulantes sur la prolifération des fibroblastes et participe à la catalyse des composés de la matrice extracellulaire du derme (augmentation de la synthèse du collagène et des glycosaminoglycanes). Ces activités sont très intéressantes en cosmétologie puisque 25 cet extrait peut ainsi être utilisé dans des produits anti-rides, régénérants ou raffermissants et hydratants. Exemple 9: Bénéfice apporté par l'hydrolyse des protéines sur les activités biologiques: Amélioration de l'activité sur les fibroblastes Nous avons comparé les activités d'un extrait peptidique avec un extrait protéique (non 5 hydrolysé). Ces deux extraits ont été fabriqués par extraction de la phase lipidique et extraction de la phase protéique avec et sans hydrolyse, tel que décrit dans le procédé selon l'invention (étape a) avec et sans l'étape b), suivi de l'étape c)) Mise en évidence d'un effet stimulant sur la prolifération des fibroblastes: Le protocole est identique au protocole décrit dans l'exemple 5. Résultats: La figure 4 représente la lecture d'absorbance de chaque échantillon faite à 570 nm après 24 et 48 heures de cultures et elle illustre la prolifération cellulaire de chaque échantillon. Signification des abréviations: PRO sp: Extrait protéique de spiruline non hydrolysé PEP sp: Extrait peptidique de spiruline L'extrait protéique de spiruline non hydrolysé (PRO Sp) à 0,1% et 0,5% n'a pas d'effet significatif sur la prolifération des fibroblastes après 24 heures et 48 heures de culture. Un effet inhibiteur est observé avec la concentration 1% après 24 heures et 48 heures 20 de culture. L'extrait peptidique de spiruline (PEP Sp) à 0,1%, 0,5% et 1% stimule respectivement de 46%, 45% et 38% la prolifération des fibroblastes après 24 heures de culture et de 36%, 40% et 31% après 48 heures de culture. Mise en évidence d'un effet stimulant sur la synthèse du collagène: Le protocole est identique au protocole décrit dans l'exemple 6. Résultats: La figure 5 représente le taux de collagène en fonction du temps de culture et illustre la stimulation de la synthèse du collagène par l'extrait peptidique ou par l'extrait 30 protéique de spiruline. Signification des abréviations: PRO sp: Extrait protéique de spiruline non hydrolysé PEP sp: Extrait peptidique de spiruline Asc 2-P: acide ascorbique (1 mmol/1) L'extrait peptidique de spiruline (PEP Sp) stimule la synthèse de collagène. L'augmentation est remarquable après 2 semaines de culture mais elle reste inférieure à celle de l'acide ascorbique (à 3 semaines de culture: Asc 2-P à lmmol/l = 107% de stimulation / témoin; PEP Sp à 1% = 73% de stimulation / témoin). L'extrait protéique non hydrolysé (PRO Sp) ne stimule pas la synthèse de collagène, il 10 ne présente aucune activité. Mise en évidence d'un effet stimulant sur la synthèse des glycosaminoglycanes: Le protocole est identique au protocole décrit dans l'exemple 7. Résultats: La figure 6 représente la quantité (jig /ml) de glycosaminoglycanes en fonction du temps de culture et illustre la stimulation de la synthèse des glycosaminoglycanes par l'extrait peptidique ou l'extrait protéique de spiruline. L'extrait peptidique de spiruline (PEP Sp) stimule la synthèse des glycosaminoglycanes. L'augmentation est remarquable après 2 semaines de culture. Après trois semaines de culture les peptides à 1% stimule de 78% la synthèse des GAGs. Quelque soit la concentration utilisée, l'extrait protéique non hydrolysé de spiruline (PRO Sp) n'a pas d'effet sur la synthèse des glycosaminoglycanes. Conclusion: Cet extrait peptidique de spiruline stimule la prolifération des fibroblastes et la synthèse des composés de la matrice extracellulaire du derme (augmentation de la synthèse du collagène et des glycosaminoglycanes). En revanche les protéines de spiruline obtenues sans étape d'hydrolyse enzymatique, ne présentent pas d'activité 30 stimulante sur les cellules du derme. L'étape d'hydrolyse enzymatique est donc nécessaire à l'activité biologique de la fraction protéique. Exemple 10: composition d'un lait de spiruline à partir des peptides hydrolysés de spiruline et d'une l'huile de spiruline: Composition: 57,5% peptides de spiruline 26,05% eau 15% huile de spiruline 1% copolymère d'acrylates de sodium 0,45% gomme xanthane L'huile de spiruline comprend de la vitamine E, des carotéinoides dont 31% de bêta carotène et 0,4% en poids, par rapport au poids total de l'huile, d'acides gras essentiels: 0,1% C 14 acide myristique 0,1% C 16 acide palmitique 0, 1% C 18: 1 acide oléique 0,1% C18: 2 acide linoléique REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un extrait peptidique de spiruline, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes successives suivantes: a) séparation des lipides et des protéines de la spiruline en soumettant des microalgues de spiruline, sous forme de poudre séchée, à une extraction de la phase lipidique au moyen d'un solvant d'extraction approprié, choisi parmi les solvants polaires et les huiles de synthèse ou végétales, 10 et récupération de la phase lipidique d'une part et de la phase contenant les protéines d'autre part; puis b) la phase contenant les protéines issue de l'étape a) est soumise à une hydrolyse enzymatique, qui conduit à l'obtention d'un extrait peptidique; et c) éventuellement, purification de l'extrait peptidique obtenu suite à l'étape b). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les microalgues de spiruline sont des souches Spirulina platensis ou Spirulina maxima. 20 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que, dans l'étape a), le rapport en poids spiruline/solvant d'extraction est compris entre 10/90 et 50/50. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les solvants polaires, de l'étape a), sont choisis dans le groupe constitué par l'éthanol, l'isopropanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle, sous forme anhydre ou en mélange aqueux. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les huiles, de l'étape a), sont des huiles de synthèse, notamment le DEPG. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en l'extraction de la phase lipidique comprend de une à trois extractions, avantageusement deux extractions, chaque extraction durant au moins une heure, à une température comprise entre 4 et 80 C, avantageusement à temperature ambiante. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape b) d'hydrolyse peptidique comprend au moins les étapes suivantes: i) double hydrolyse des protéines obtenues suite à l'étape a); ii) dénaturation thermique de l'enzyme; et iii) le cas échéant, centrifugation. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'hydrolyse protéique 15 est réalisée à une température comprise entre 50 et 60 C, avantageusement à 55 C, à un pH compris entre 6 et 11, avantageusement à pH = 8 et pendant 2 à 6 heures, avantageusement pendant 4 heures. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en 20 ce que l'extrait peptidique obtenu suite à l'étape b) est purifié par ultrafiltration et concentré par nanofiltration ou par évaporation. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'extrait peptidique obtenu suite à l'étape b) ou c) est, le cas échéant, 25 décoloré et désodorisé, puis conditionné dans un conditionnement stérile. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la phase lipidique obtenue suite à l'étape a) est purifiée ou stabilisée avant d'être conditionnée. 12. Extrait peptidique de spiruline susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend 70 à 80 % en poids de peptides, 4 à 5 % en poids de sucres et 1 % en poids de chlorure de sodium, par rapport au poids total de l'extrait. 13. Extrait selon la revendication 12, caractérisé en ce que les peptides présentent 5 la même composition en acides aminés, qualitativement et au moins sensiblement quantitativement, que la microalgue spiruline. 14. Extrait selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que au moins 70 % des peptides ont un degré de polymérisation inférieur à 10 10 et présentent une masse molaire inférieure à 1 250 Da. 15. Extrait selon la revendication 14, caractérisé en ce que: - 12 à 25 % des peptides ont une masse molaire inféffeure à 25' g/mol et un degré de polymérisation inférieur ou égal à 2; 15 - 15 à 25% des peptides ont une masse molaire variant de 250 à 375 g/mol et un degré de polymérisation de 2 ou de 3; - 20 à 30 % des peptides ont une masse molaire variant de 375 à 875 g/mol et un degré de polymérisation variant de 3 à 7; - 15 à 20 % des peptides ont une masse molaire variant de 875 à 1 250 20 g/mol et un degré de polymérisation variant de 7 à 10; - 20 à 30 % des peptides ont une masse molaire variant de 1250 à 7250 g/mol et un degré de polymérisation variant de 10 à 58. 16. Composition nutraceutique comprenant un extrait peptidique selon l'une 25 quelconque des revendications 12 à 15. 17. Composition cosmétique comprenant un extrait peptidique selon l'une quelconque des revendications 12 à 15 et un support cosmétiquement acceptable. 18. Composition selon la revendication 17 comprenant en outre une huile de spiruline, susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 1. 19. Composition selon la revendication 18 comprenant entre 10 et 80 % en poids d'extrait peptidique et entre 5 et 40 % en poids d'une huile de spiruline. 20. Utilisation cosmétique d'une composition selon l'une quelconque des 5 revendications 17 à 19, pour stimuler la prolifération des fibroblastes, pour stimuler la synthèse du collagène, pour stimuler la synthèse des glycosaminoglycanes. 21. Utilisation cosmétique selon la revendication 20, pour restructurer la barrière 10 cutanée, pour raffermir et/ou hydrater la peau, pour prévenir et/ou retarder le vieillissement cutané.