FR 2834295 A1 20030704 FR 0216171 A 20021219 déLinie dens la revindication 46. 1 2834295 La présente invention concerne des formes cristallines de glucokinase d'une taille et d'une qualité suffisantes pour permettre d'obtenir des données structurelles par cristallographie par diffraction des rayons X et des méthodes de culture de ces cristaux. La glacokinase (GK) est une des quatre hexokinases que l'on trouve chez les mammifères (Colowick.S.P. dans The Enzymes, vol 9 (P.Boyer. ed.) Academic Press, New York, NY, pages 1-48, 1973). Les hexokinases catalysent la première étape du métabolisme du glucose, c'est-à-dire la conversion du glucose en glucose-6-phosphate. La glucokinase a une distribution cellulaire limitée, étant o trouvée principalement dans les cellules p-pancréatiques et les cellules parenchymales du foie. En outre, la glucokinase est un euzyme contrôlant la vitesse du métabolisme du glucose dans ces deux types de cellules qui sont connues pour jouer des r81es importants dans 1'homeostase du glucose dans l'ensemble du corps (Chipkin, S.R., Kelly, K.L. et Ruderman, N.B. dans JoslintsDiabetes (C.R. Khan et G.C. Wier, eds.), Lea et Febiger, Philadelphie, PA, pages 97-115, 1994). La concentration de glucose pour laquelle la glucokinase démontre une activité semi-maximale est approximativement de 8mM. Les trois autres hexokinases sont saturces de glucose à des concentrations très inférieures ( Granner, D.K., dans Ann Rev. Nutrition Vol 13 (R.E. Olson, D.M. Bier, et D.B. McCormick, eds), Annnal Review, Inc., Palo Alto, CA, pages 463-496, 1993). Ces constatations ont contribué il y a plus de dix ans à l'élaboration de l'hypothèse selon laquelle la glucokinase fonctionne comme un détecteur de glucose dans les cellules,B et les hépatocytes (Meglasson,M.D., et Matschinsky, F.M., Amer J. Physiol. 246, E1-E13, 1984). Ces dernières annces, des études effectuées chez des animaux transgéniques ont confirmé que la glucokinase joue effectivement un rôle important dans l'homéostase du glucose dans l'ensemble du corps. Les animaux qui n'expriment pas de glucokinase meurent dans les quelques jours suivant leur naissance avec des diabètes graves tandis que les animaux sur-exprimant de la glucoLinase ont une tolérance au glucose améliorée (Grupe A, Hultgren, B., Ryan, 2 2834295 A. et al, Cell 83, 69-78, 1995; Ferrie,T., Riu, E., Bosch, F et al, FASEB. J. 10 1213-1218, 1996). Une augmentation de l'exposition au glucose est couplée par l'intermédiaire de la glucokinase dans les cellules-3 à une sécrétion d'insuline accrue et dans les hépatocytes, à un dépôt de glycogène accru et peut-étre à une production de glucose diminuée. La constatation selon laquelle des diabètes de début de maturité de type II du jeune (MODY -2) sont provoqués par une perte de fonction due à des mutations de dans le gène de la glucokinase donne à penser que la glucokinase fonctionne également comme un détecteur de glucose chez les humains (Liang,Y., 0 Kesavan,P., Wang,L. et al., Biochem. J. 309, 167-173, 1995). Une preuve supplémentaire confortant l'idée d'un rôle important de la glucokinase dans la régulation du métabolisme du glucose chez les humains a été apportée par l'identifcation de patients qui expriment une forme mutante de glucokinase avec une activité enzymatique accrue. Ces patients présentent une hypoglycémie à jeun associée à un taux élevé inapproprié d'insuline dans le plasma (Glaser,B. Kesavan, P., Heyman,M., et al, New England J. Med 338, 226-230, 1998). Tandis que des mutations du gène de la glucokinase ne sont pas constatées chez la majorité des patients présentant des diabètes de type II, les composés qui activent la glucokinase et, par conséquent augmentent la sensibilité du système détecteur de la glucokinase, seront encore utiles dans le traitement de l'hyperglycémie caractéristique de tous les diabètes de type II. Les activateurs de la glucokinase augmenteront le flux de métabolisme du glucose dans les cellules-3 et les hépatocytes, qui sera couplé à une sécrétion d'insuline accrue. Ces agents seraient utiles pour le traitement des diabètes de type II. Dans un effort pour élucider les mécanismes qui sous-tendent l'activation de la kinase, on cherche souvent à déterminer la structure cristalline de ces protéines. Les structures cristallines de plusieurs hexokinases ont été indiquées; voir, par exemple,A.E. Aleshin, C.Zeng, G.P..Bourenkov, H.D. Bartunik, H. J. Fromm & R.B. Honzatko "Le mécanisme de la régulation de l'hexokinase: 3 0 nouvelles connais sances sur la structure cri stal line de l 'hexokinase du c erve au humain recombinante complexée avec du glucose et du glucose6-phosphate" Structure 6, 39-50 (1998); W.S. Bennett, Jr. & T.A. Steiz " Structure d'un complexe entre l'hexokinase A de la levure et le glocose I. Détermination et 3 2834295 affinement de la structure à une résolution de 3,5 A, J. Mol. Biol. 140, 183-209 (1978) et S.Ito, S.FushinoDu, I.Yoshioka, S.Koga, H. Maatsuzawa & T. Wakagi "Base Structurelle pour la Spécificité-ADP d'une Nouvelle Glucokinase à partir d'un Archaéon Hyperthermophile" Structure 9, 205-214 (2001). Malgré ces s rapports, les chercheurs sachant comment obtenir des cristaux d'hexokinases apparentées ont cherché à obtenir des cristaux de glucokinase de mammifères, sans succès. Les demandeurs ont découvert des protocoles qui permettent la cristallisation de glucokinase de mammifere avec ou sans ligand allostérique lié. o La structure cristalline a été résolue par cristallographie par diffraction des rayons X à une résolution de 2,7 A, voir les figures 3 et 4. Ainsi, la présente invention concerne une forme cristalline de glucokinase et une forrne cristalline d'un complexe de glucokinase et d'un ligand allostérique. La présente invention concerne en outre une méthode de formation de cristaux de glocokinase, avec ou sans ligand allostérique lié. - la figure 1 représente des co-cristaux de glucokinase présentant une symétrie P6(5)22, - la figure 2 représente la séquence d'acides aminés d'une glucokinase exprimée utilisée pour la cristallisation, - la figure 3 représente un schéma en forme de rub an de la structure de glucokinase montrant les hélices-a et les feuillets-p, - la figure 4 représente les ligands de structure atomique pour la glucokinase lice au 3-cyclopentyl-2pyridin-4-yl-N-thiazol-2-yl-proplonamide, La présente invention concerne des formes cristallines de glucokinase de mammifères, avec ou sans ligand lié au site allostérique, o les cristaux sont d'une qualité et d'une taille suffisantes pour permettre la détermination de la structure tridimensionnelle par diffraction des rayons X à une résolution d'environ 2, 0 À à environ 3,5 . La présente invention concerne également des méthodes de préparation et de cristallisation de la glucokinase. Les formes cristallines de glucoLinase, ainsi que l'information dérivée de leurs structures cristallines peuvent étre utilisoes pour analyser et modifier l'activité la glucokinase ainsi que pour identifier des composés qui entrent en interaction avec le site allostérique. 4 2834295 Les cristaux de la présente invention comprennent des apo-cristaux et des co-cristaux. Les apo-cristaux de la présente invention comprennent généralement de la glucokinase substantiellement pure. Les co-cristaux comprennent généralement de la glucokinase substantiellement pure avec un ligand lié au site allostérique. Il doit être entendu que les glucokinases cristallines de la présente invention ne sont pas limitées à des glucokinases naturelles ou natives. En fait, les cristaux de la présente invention comprennent des mutants des glucokinases natives. Les mutants des glucokinases natives sont obtenus en remplaçant au 0 moins un résidu d'acide aminé dans un domaine de glucokinase native par un résidu d'acide aminé différent, ou en ajoutant ou en retirant des résidus d'acide aminé à l 'intéri eur du polyp epti de nati f ou sur l a terminai son N- ou C- du polypeptide natif, et ont substantiellement la même structure tridimensionnelle que celle de la glucokinase native de laquelle le mutant est dérivé. 1S On entend par l'expression "ayant substantiellement la même structure tridimensionnelle" le fait d'avoir un ensemble de coordonces de structure atomique issus d'un apo-cristal ou d'un co-cristal qui présentent une déviation moyenne inférieure ou égale à environ 2 À lorsqu'on les superpose aux coordonées de structure atomique de la glucokinase native de laquelle le mutant est dérivé lorsqu'au moins environ 50 % à environ 100% des atomes de carbone alpha de la glucokinase native sont inclus dans la superposition. Dans certains cas, il peut être particulièrement avantageux ou pratique de substituer, retirer et/ou ajouter des résidus d'acide aminé à un domaine de glucokinase native en vue de produire des sites de clonage appropriés dans l'ADN c codant le polypeptide, pour faciliter la purification du polypeptide, etc. Ces substitutions, délétions et /ou additions qui ne modifient pas substantiellement la structure tridimensionnelle de la glucoLinase native apparâîtront évidents à l'homme du métier. Il faut noter que les mutants dont il est question ici n'ont pas besoin de présenter une activité glucokinase. En fait, les substitutions, additions ou enlèvements d'acides aminés qui interfèrent avec l'activité kinase de la glucokinase mais qui ne modifient pas notablement la structure tridimensionnelle du domaine sont spécifiquement envisagés par la présente invention. De tels 2834295 polypeptides cristallins, ou les coordonées de structure atomique obtenus de ces derniers, peuvent être utilisés pour identifier des composés qui se lient au domaine natif. Ces composés peuvent affecter l'activité du domaine natif. Les cristaux dérivés de la présente invention comprennent généralement un polypeptide de glucokinase cristallin en association covalente avec un ou plusieurs atomes de métaux lourds. Le polypeptide peut correspondre à une glucokinase native ou mutée. Les atomes de métaux lourds utiles pour produire des cristaux dérivés comprennent, par exemple et sans limitation, l'or et le mercure. De façon alternative, des cristaux dérivés peuvent être formés à partir de o protéines qui comportent des atomes lourds incorporés dans un ou plusieurs acides aminés, tels que les substitutions de séléno-méthionine à la place de la méthionine. Les co-cristaux de la présente invention comprennent généralement un polypoptide de glucokinase cristallin en association avec un ou plusieurs composés sur un site allostérique du polypeptide. L'association peut être covalente ou non covalente. Les polypeptides de glucokinase native et mutée décrits ici peuvent être isolés de sources naturelles ou produits par des méthodes bien connues de l'homme du métier dans le domaine de la biologie moléculaire. Les vecteurs d'expression à utiliser peuvent contenir une séquence codante de polypeptide de glucokinase native ou mutée et des signaux de contrôle transcriptionnels et /ou de traduction appropriés. Ces méthodes comprennent des techniques avec ADN recombinant in vitro, des techniques synthétiques et la recombinaison / recombinaison génétique in vivo. Voir, par exemple, les techniques décrites dans Maniatis et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Mannal, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; et Ansubel et al, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY. Toute une variété de systèmes de vecteurs d'expression-hôtes peut être utilisée pour exprimer la séquence codante de la glucokinase. Ceux-ci comprennent, mais sans être limités à, des microorganismes tels que des bactéries transformées avec des vecteurs d'expression d'ADN bactériophage recombinant, d'ADN plasmide ou d'ADN cosmide contenant la séquence codante de la glucokinase; de la levure transformée avec des vecteurs d'expression de levure 6 2834295 recombinante contenant la séquence codante de glucokinase; des systèmes de cellules d'insectes infectées avec des vecteurs d'expression de virus recombinants (par exemple baculovirus) contenant la séquence codante de la glucokinase; des systèmes de cellules végétales infectées avec des vecteurs d'expression de virus recombinants ( par exemple virus mosaïque du chou-fleur, CaMV; virus mosaïque du tabac, TMV) ou transformés avec des vecteurs d'expression plasmides recombinants (par exemple le plasmide Ti) contenant la séquence codante de la glucokinase; ou des systèmes de cellules animales. Les éléments d'expression de ces systèmes varient dans leur force et leurs spécifcités. Suivant o le système hôte/vecteur utilisé, on peut utiliser un élément quelconque parmi un certain nombre d'éléments de transcription et de traduction appropriés, y compris des promoteurs constitutifs et inductibles tels que pL du bactériophage 1l, plac, ptrp, ptac (promoteur hybride ptrp-lac) et autres; lorsqu'on procède à un clonage dans des systèmes de cellules d'insectes, des promoteurs tels que le promoteur de polyhédrine de baculovirus peuvent être utilisés; lorsqu'on procède à un clonage dans des systèmes de cellules végétales, des promoteurs dérivés du génome de cellules végétales (par exemple promoteurs de choc thermique; le promoteur pour la petite sous-unité de RUBISCO; le promoteur pour la protéine de fixation a/b de la chlorophylle) ou de virus de végétaux (par exemple le promoteur ARN 35 S de CaMV; le promoteur de protéine de couverture de TMV) peuvent être utilisés; lorsqu'on procède à un clonage dans des systèmes de cellules de mammifères, des promoteurs dérivés du génome de cellules de mammifères (par exemple promoteur de métallothioncine) ou de virus de mammifères (par exemple le promoteur tardIF d'adénovirus; le promoteur 7, 5K du virus vaccinia) peuvent être utilisés; lorsqu'on génère des lignées de cellules qui contiennent des copies multiples de la séquence codante de la glucokinase, des vecteurs à base SV40, BPV - et EBV- peuvent être utilisés avec un marqueur sélectionnable approprié. Les apo-cristaux, cristaux dérivés et co-cristaux de la présente invention, peuvent être obtenus par des techniques bien connues dans le domaine de la cristallographie des protéines, y compris les méthodes discontinue, de pont liquide, dialyse, diffusion de vapeur et goutte en suspension (voir, par exemple, McPherson, 1982; Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley, NY; McPharson, 1990, Eur. J. Biochem. 189: 1-23; Weber, 1991, Adv. Protein 7 2834295 Chem. 41: 1-36; Crystallization of Nucleic Acides and Protéins, édité par Arnaud Ducruix and Richard Giege, Oxford University Press; Protéin Crystallization Techniques Stategies and Tips, Edité par Terese Bergfors, International; University Line 1999). Généralement, les apo-cristaux ou les co-cristaux de la présente invention sont cultivés en plaçant un polypeptide de glucokinase substantiellement pur dans un tampon aqueux contenant un précipitant à une concenkation juste inférieure à celle nécessaire pour précipiter la protéine. De l'eau est ensuite enlevée de la solution par évaporation contrôlée pour produire des conditions de cristallisation, qui sont maintenues jusqu'à ce que la croissance des o cristaux cesse. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, les apo cristaux ou les co-cristaux sont cultivés par diffusion de vapeur. Dans cette méthode, on laisse la solution de polypeptide/précipitant s'équilibrer dans un conteneur fermé avec un réservoir aqueux plus grand présentant une concentration de précipitant optimale pour produire des cristaux. Généralement, on mélange moins d'environ 10,ul de solution de polypeptide substantiellement pure avec un volume égal de solution réservoir, ce qui donne une concentration de précipitant représentant environ la moitié de celle requise pour la cristallisation. Cette solution est mise en suspension sous forme de gouttelette en dessous d'un couvercle qui est scellé sur le haut d'un réservoir. Le conteneur scellé est laissé au repos, d'un jour à un an, habituellement pendant environ 2 à 6 semaines, jusqu'à ce que des cristaux se développent. Pour les cristaux de la présente invention, il a été constaté que des gouttes contenant environ 2-5',11 de glucokinase (9-22 mg/ml dans 20 mM de tris pH 7,1 mesurés à température ambiante, 50 mM de NaCl, 50mM de glucose, 10 mM de DTT et éventuellement 0,2 mM de EDTA) et une quantité égale de solution réservoir (16 - 25 % poids/volume de polyéthylène glycol d'un poids moléculaire moyen d'environ 8000 à environ 10000 daltons, 0,1 0,2 M de tampon tris, bistris, Hepes ou de phosphate d'ammonium, pH 6,9 7,5, 8 -10 mM de DTT, 0 - 30% de glocose saturé), mises en suspension sur 0,5 à 1,0 mL de tampon réservoir pendant environ 3 - 4 semaines à 4 - 6 C, donnaient des cristaux appropriés pour une détermination de structure par diffraction des rayons X de haute résolution. Les conditions particulièrement préférées étaient: une quantité d'environ 2,5 pI de 8 2834295 glucokinase (10 mg/ml dans 20 mM de tris pH 7,1 mesurés à température ambiante, 50 mM de NaCl, 50 mM de glucose, 10 mM de DTT et éventuellement 0,2 mM d'EDTA) et une quantité égale de solution réservoir (22,5 % poids/volume de polyéthylène glycol d'un poids moléculaire moyen d'environ s 10000 daltons, 0,1 M tris pH 7,08, 10 mM de DTT, 20 % de glucose) ont été mises en suspension sur 0,5 à 1,0 mL de tampon réservoir pendant environ 3 - 4 semaines à 4 - 6 C. La procédure optimum pour la culture de cristaux suffisamment gros pour permettre de collecter des données à partir de ces derniers comprenait d'abord l'étalement en forme de stries de 3-4 pI de solution de protéine sur le couvercle, suivi de l'étalement en forme de stries de 3-4,ul de solution du puits à travers la gouttelette allongée de protéine, formant ainsi une gouttelette en forme de "X"; Avant la découverte de cette technique de la gouttelette en croix, la plupart des gouttelettes donnaient des "pluies" de petits cristaux qui n'étaient pas suffisamment gros pour la collecte de données. Les gouttelettes en croix permettent à des gradients de protéine et d'agent de précipitation de se former pendant que les deux solutions se mélangent lentement, et les cinétiques résultantes de nucléation et de croissance des cristaux sont optimales pour l'obtention d'un petit nombre de gros cristaux dans chaque gouttelette en croix. Le fait de simplement mélanger les solutions de protéine et de précipiter ensemble dans une gouttelette ronde unique, a souvent produit une surabondance de germes qui n'ont atteint qu'une dimension finale trop petite pour permettre la collecte de données. Les cristaux apparaissaient habituellement en l'espace de 5 jours. Les cristaux se développent sous la forme de bipyramides hexagonales, atteignant typiquement des dimensions de 0,2 x 0,2 x 0,4 mm, bien que des cristaux plus gros soient souvent observés. La figure 1 montre des cristaux cultivés. Les cristaux peuvent être congelés avant la collecte des donnces. Les cristaux ont été cryo-protégés avec soit (a) du glucose saturé à 20 - 30 % présent dans le dispositif de cristallisation, (b) de l'éthanol ajouté à raison de 15-20 %, (c) de l'éthylène glycol ajouté à raison de 10 - 20 % et du PEG 10000 porté à 25 % ou (d) du glycérol ajouté à raison de 15 %. Les cristaux ont été soit brièvement irumergés dans le cryo-protecteur soit trempés dans le cryo-protecteur pendant des périodes pouvant atteindre un jour. La congélation a été effectuce par immersion 9 2834295 du cristal dans un bain d'azote liquide ou en plaçant le cristal dans un courant d'azote à 100 K. L'étalement en forme de mosaïque des cristaux congelés peut parfois être réduit par recuit au cours duquel le courant d'azote froid est brièvement bloqué, ce s qui permet au cristal congelé de décongeler momentanément avant de recongeler dans le courant d'azote. Une autre technique qui était parfois très utile dans la collecte de données consistait à centrer une des extrémités de la bi-pyramide hexagonale dans le faisccau de rayons X, plutôt que la partie médiane du cristal. L'étalement en forme de mosaIque pouvait parfois être réduit par cette technique. Des données de diffraction s'étendant typiquement jusqu'à 2,7 A ont été collectées, à partir des cristaux congelés sur la ligne de faisceau de synchrotron X8C de la National Synchrotron Light Source in Brookhaven, New-York. Dans des conditions optimales, des données s'étendant jusqu'à 2,2 À ont été enregistrées. Voir les figures 3 et 4 pour la solution. Le groupe spatial des cristaux a été déterminé comme étant P6(5)22 pendant la solution de la structure des cristaux. Les cristaux ont des dimensions de cellules unitaires a = b = 79,62 +/- 0,60 A, c = 321,73 +/- 3,70 A, ccy = = 90 , = 120 . Les cristaux se trouvent dans un système hexagonal de symétrie P6(5)22. Naturellement, l'homme du métier reconna1tra que l'on peut faire varier les conditions de cristallisation décrites ci-dessus; Ces variations peuvent étre appliquces seules ou en combinaison, et comprennent des solutions de polypeptides contenant des concentrations de polypeptides entre 1 mg/mL et 60 mg/mL, tous systèmes de tampons du commerce qui peuvent maintenir le pH d'environ 6,5 à environ 7,6, des concentrations de tris-HCI entre lO mM et 200 2s mM, des concentrations de dithiothréitol entre O mM et 20 mM, de préférence entre 8 et 10 mM, le remplacement de dithiothréitol par du bêta-mercapto-éthanol ou d'autres équivalents reconnus dans la technique, des concentrations de glucose entre 0 % poids/volume et 30 % poids/volume, ou le remplacement du glucose par d'autres sucres connus pour se lier à la glucokinase; et des solutions réservoirs contenant des concentrations entre environ 10 % et environ 30 % de polyéthylène glycol (PEG) de poids moléculaire moyen entre environ 1000 et environ 20000 daltons, tous systèmes de tampons du commerce capables de maintenir le pH d'environ 6,5 à environ 7,6, des concentrations de dithiothréitol entre 0 mM et 20 i0 2834295 mM, le remplacement du dithiothréitol par du bêta-mercapto-éthanol ou d'autres équivalents contenant le groupe -SH reconnus dans la technique, ou le remplacement du glucose par d'autres sucres connus pour se lier à la glucokinase, et une plage de température entre 4 et 20 C. Des cristaux dérivés de la présente invention peuvent être obtenus en trempant des apo-cristaux ou des co-cristaux dans une liqueur-mère contenant des sels de métaux lourds selon des procédures connues de l'homme du métier dans le domaine de la cristallographie par diffraction des rayons X. Les co-cristaux de la présente invention peuvent êke obtenus en trempant o un apo-cristal dans une liqueur-mère contenant un ligand qui se fixe au site allostérique, ou peuvent être obtenus par cocristallisation du polypeptide de glucokinase en présence d'un ou plusieurs ligands qui se fixent au site allostérique. De préLérence, les co-cristaux sont formés avec un activateur de glucokinase décrit dans le brevet US n 6.320.050; la demande de Brevet US 09/532.506 déposée le 21 mars 2000; la demande de brevet US. 09/675 781 déposoe le 28 septembre 2000; la demande de brevet US. 09/727 624 déposée le ler décembre 2000; la demande de brevet US 09/841.983 déposoe le 25 avril 2001; la demande de brevet US 09/843 466 déposée le 26 avril 2001; la demande de brevet US 09/846 820 déposée le ler mai 2001; la demande de brevet US 09/846 821 déposée le ler mai 2001; la demande de brevet US 09/905 152 déposoe le 13 juillet 2001; demande de brevet US 09/924 247, déposée le 8 août 2001; la demande de brevet US provisoire 60/251 637, déposoe le 6 décembre 2000 ou la demande de brevet US provisoire 60/318 715, déposée le 13 septembre 2001, chacun et chacune étant incorporés ici par réLérence. Les méthodes d'obtention de la structure tridimensionnelle des glucokinases cristallines décrites ici ainsi que des coordonnées de structure atomique sont bien connues dans la technique (voir, par exemple, D.E. McRee, Cristallographie Pratique des Protéines, publié par Academic Press, San Diego (1993, et références citées ici). Les cristaux de la présente invention, et particulièrement les coordonnces de structure atomique obtenus à partir de ces derniers, ont une grande variété d'utilisations. Par exemple, les cristaux et les coordonnées de structure décrits ici sont particulièrement utiles pour identifier les composés qui activent les 1 1 2834295 glucokinases en tant qu'approche en direction du développement de nouveaux agents thérapeutiques. Un de ces composés est le 3-cyclopentyl-2-pyridin4-yl-N- thiazol-2-yl-propionamide et ses sels pharmaceutiquement acceptables. Les compositions pharmaceutiques desdits composés peuvent être développées, et s lesdits composés peuvent être utilisés pour la fabrication d'un médicament comprenant ledit composé pour le traitement de l'hyperglycémie dans les diabètes de type II. Les coordonnées de structure décrites ici peuvent être utilisées comme modèles de phasage dans la détermination des structures cristallines de o glucokinases natives ou mutées supplémentaires, ainsi que des structures de co- cristaux de telles glucokinases avec des inhibiteurs ou activateurs allostériques liés. Les coordonnces de structures, ainsi que les modèles des structures tridimensionnelles obtenus à partir de ces dernièress, peuvent aussi être utilisés pour faciliter l'élucidation de structures à base de solution de glucokinases natives ou mutées telles que celles obtenues par RMN. Ainsi, les cristaux et les coordonnées de structure atomique de la présente invention fournissent un moyen pratique p our l 'élocidati on des structures et foncti ons des glucokinas es. Dans un souci de clarté et de discussion, les cristaux de la présente invention vont être décrits en réLérence à des apo-cristaux et des cocristaux spécifiques illustrant la glucokinase. L'homme du métier notera que les principes décrits ici sont applicables d'une façon générale aux cristaux de toute glucokinase de mammifère, y compris, mais sans que ce y être limités, à la glucokinase de la figure 2. Tel qu'il est utilisé ici, le terne "site allostérique" désigne en général tout 2s site de fixation de ligand sur une glucokinase de mammifère autre que le site actif de l'enzyme. Tel qu'il est utilisé ici, le terme "apo-cristal " désigne des cristaux de glucokinase de mammifère formés sans ligand allostérique lié. Tel qu'il est utilisé, le terme" ligand allostérique" désigne toute molécule qui se lie spécifiquement à un site allostérique sur une glucokinase de mammifère. 12 2834295 EXEMPLES Exemple 1: expression et purification de la glucokinase Expression de la glucokinase La glucokinase (GK) a été exprimée en tant que protéine de fusion s gluthation S-transférase (GST) dans Escherichia Coli. La séquence d'acides aminés de cette protéine de fusion est indiquée dans la figure 2. La construction de l'expression est basce sur le vecteur pGEX- 3X de Pharmacia, tel que décrit dans Y Liang, P. Kesavan, L. Wang, K. Niswender,Y. Tanizawa, M.A. Permutt, M.A. Magnuson, F.M. Matschinsky, Biochem J. 309, 167 (1995). La construction o code pour un des deux isozymes du foie de la glucokinase humaine. Le marqueur gluthation S- transférase se trouve au niveau du N-terminal de la construction et est séparé de la séquence codante pour la glucokinase par un site de clivage de facteur Xa. Après la purification de la protéine de fusion gluthation S-transférase, le marqueur de fusion gluthation S-transférase a été enlevé avec le facteur Xa protéase, qui enlève également cinq résidus de l'extrémité N-terminale de la glucokinase. Purification de la glucokinase Les cellules de E.Coli exprimant la gluthation S-transférase -glucokinase ont été mises en suspension dans un tampon de lyse ( 50 mM de tris, 200 mM de NaCI, 5 mM de EDTA, 5 mM de DTT, 1% de NP-40, pH 7,7) en présence d'inhibiteurs de protéase, incubées avec du Iysozyme à 200,u/ml pendant 30 minutes à la température ambiante, et traitées aux ultrasons 4 x 30 sec. à 4 C. Après centrifugation pour éliminer la matière insoluble, la couche surnageante a été chargée sur du gluthation-Sepharose, lavée avec un tampon de lyse puis avec 2s un tampon de Iyse moins NP-40. La gluthation S-transférase -glucolynase a été éluée avec un tampon de Iyse (moins NP40) contenant 50 mM de glucose-D et 20 mM de gluthation. La protéine éluée a été concentrée et dialysce dans 20 mM de 13 2834295 tris, 100 mM de NaCl, 0,2 mM de EDTA, 50 mM de glucose-D, lmM de DTT, pH 7,7. Le facteur Xa a été ajouté à un rapport de protéine de 1/100 gluthation S transférase -glucolynase suivi de l'addition de CaCl2 à 1 mM, et l'échantillon a été incubé à 4 C pendant 48 heures. L'échantillon a été ajouté à du gluthation Sépharose et la fraction non fixce a été collectée et concentrée. L'échantillon a ensuite été incubé avec du benzamidine Sépharose pour éliminer le facteur Xa, et la fraction non liée a été collectée et chargée sur une colonne de Sépharose Q équilibrée avec 25 mM de bis-tris-propane, 50 mM de NaCl, 5 mM de DTT, 50 mM de glucose-D et 5% de glycérol (pH 7,0). La protéine a été éluce avec un 0 gradient de NaC1 de 50-400 mM. Les fractions contenant la glucokinase purifiée ont été regroupées et concentrées puis filtrées. Exemple 2: Formation d'apo-cristal 4 pl de glucokinase et 4 pl de précipitant ont été mélangés et équilibrés par rapport à la solution de précipitant à 4 C. La solution de glucokinase était constituée de 22 mg/ml de glucokinase préparée dans l'exemple 1 dans 20 mM d'hepes pH 7,5, 50 mM de NaCl, 10 mM de DTT, et 50 mM de glucose. Le précipitant était constitué de 22,5 % de PEG10000, 0,1 mM de tris pH 7,08, 10 mM de DTT, 20 % de glucose; la solution de précipitant contenait des cristaux de semence en vue de micro-ensemencer les gouttelettes. Les cristaux sont apparus dans les gouttelettes après qu'elles ont quitté les plaques de cristallisation à 4 C. Exemple 3: Formation de Co-cristal avec le 3-Cyclopentyl-2-pyridin-4-yl-N thiazol-2-yl-proplonamide 3(a) 4,ul de glucokinase et 4 tll de précipitant ont été mélangés et équilibrés par 2s rapport à la solution de précipitant à 4 C. La solution de glucokinase était constituée de 13 mg/ml de glucokinase préparée dans l'exemple 1 dans 20 mM de tris pH 7,0, 50 mM de NaCl, 10 mM de DTT, et 50 mM de glucose, et l'activateur 14 2834295 de glucokinase 3-Cyclopentyl-2-pyridin-4-yl-N-thioazol-2-yl-propionamide à une concentration représentant S fois celle de la protéine. Le précipitant était constitué de 22,5 % de PEG10000, 0,1 mM de tris pH 7,08, 10 mM de DTT, 20 % de glucose. Les cristaux sont apparus dans les gouttelettes après qu'elles ont quitté les s plaques de cristallisation à 4 C. 3(b) De façon alternative, des cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: au lieu de 4 pl de glucokinase et 4 pl de précipitant, on a utilisé 2!ll de chaque. La solution de glucokinase contenait 11 o mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,O8 au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait 0,2 rnM de EDTA; à la place de 22,5 % de PEG10000 comme précipitant, on a utilisé 18 % de PEG 8000; la solution de précipitant contenait des cristaux de semence en vue de micro-ensemencer les gouttelettes. 3(c): -5 Dans une autre alternative, des cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: à la place de 4 p1 de glucokinase et 4,ul de précipitant, on a utilisé 2 p1 de chaque. La solution de glucokinase contenait 11 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,08 au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait 0, 2 mM de EDTA; à la place de 22,5 % de PEG10000 comme précipitant, on a utilisé 20 % de PEG 8000; la solution de précipitant contenait des cristaux de semence en vue de micro-ensemencer les gouttelettes. 3(d) Dans une autre alternative encore, des cristaux ont été cultivés comme 2s dans 1'exemple 3(a) avec les changements suivants: à la place de 4 1ll de glucokinase et 4 1ll de précipitant, on a utilisé 2 l de chaque. La solution de 2834295 glucokinase contenait 12 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,08 au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait 0,2 mM de EDTA; à la place de 22,5 % de PEG10000 comme précipitant, on a utilisé 16 % de PEG 10000; le glucose n'était pas présent comme composant du précipitant; la solution de précip itant contenait des cri staux de sem enc e en vue de mi cro - ens emenc er l es gouttelettes. 3(e) Dans encore une autre alternative, des cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: la solution de glucokinase o contenait 11 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,1au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait 0,2 mM de EDTA; à la place de 22,5 % de PEG10000 comme précipitant, on a utilisé 25 % de PEG 10000. 3(f): Dans encore une autre alternative, les cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: la solution de glucokinase contenait 11 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,1 au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait 0,2 mM de EDTA; on a utilisé, à la place de 22,5 % de PEG10000 comme précipitant, 21,25 % de PEG 10000; à la place du tris tamponné à pH 7,08 dans le précipitant, on a utilisé du tris tamponné à pH 7,52. 3(g): Dans encore une autre alternative, les cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: la solution de glucokinase contenait 12 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,08 au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait 0,2 mM de EDTA; on a utilisé, à la place du tris tamponné à pH 7,08 dans le précipitant, de l'hepes tamponné à pH 16 2834295 6,89; à la place de 20% de glucose dans le précipitant, on a utilisé 200 mM de glucose. 3(h) Dans encore une autre alternative, les cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: la solution de glucokinase contenait 12 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,08 au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait O, 2 mM de EDTA; on a utilisé, à la place de O,lM de tris tamponné à pH 7,08 dans le précipitant, 0,2 M de phosphate d'ammonium tamponné à pH 7,03, à la place de 20% de glucose dans le 0 précipitant, on a utilisé 200 mM de glucose. 3(i) Dans encore une autre alternative, des cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: la solution de glucokinase contenait 10 mg/ml de glucokinase dans le tampon de tris à pH 7,08 au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait 0,2 mM de EDTA; on a utilisé, à la place de 22,5 % de PEG10000 comme précipitant, on a utilisé 20 % de PEG10000; à la place du tris tamponné à pH 7,08 dans le précipitant, on a utilisé du tris tamponné à pH 7,05, à la place de 10 mM de DTT dans le précipitant, on a utilisé 8 mM de DTT. Le glucose n'était pas présent comme composant du précipitant. ) Dans encore une autre alternative, des cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: la solution de glucokinase contenait 12 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,08 au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait 0,2 mM de EDTA; on a utilisé, à la place de 22,5 % de PEGlOOOO comme précipitant, 22 % de PEG8000; le glucose 17 2834295 n'était pas présent comme composant du précipitant; la solution de précipitant contenait des cristaux de semence en vue de micro-ensemencer les gouttelettes. 3(k) Dans encore une autre alternative, des cristaux ont été cultivés comme s dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: la solution de glucokinase contenait 11 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,1 au lieu de 7,0; la solution de glocokinase contenait 0,2 mM de EDTA; on a utilisé, à la place de 20% de glucose dans le précipitant, 30 % de glucose. Exemple 4: Formation de Co-crystal avec le N-(5-Bromo-pyridin-2-yl)-2-(3 0 chloro-4-méthansulfouyl-phényl)-3-cyclopentyl-propionamide Des cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: la solution de glucokinase contenait 9 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,1 au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait 0,2 mM de EDTA; à la place de l'activateur de glucokinase 1S de l'exemple 3(a), la solution de glucokinase contenait 1'activateur de glucokinase N-(5-Bromo-pyridin-2-yl)-2-(3 -chloro-4-méthanesulfonylphényl)-3-cyclopentyl propionamide; à la place de 20 % de glucose dans le précipitant, on a utilisé 200 mM de glucose. Exemple 5: Formation de Co-crystal avec le 2-(3-Chloro-4 méthanesulfoUylphényl)-3-cycopentyl-N-(5-trifluorométhyl pyridin-2-yl)-propionamide. Des cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: la solution de glucokinase contenait 1 0 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,1 au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait 0,2 mM de EDTA; à la place de l'activateur de glucokinase de l'exemple 3(a), la solution de glucokinase contenait l'activateur de glucokinase 18 2834295 2-(3 -Chloro-4-méthanesulfonyl-phényl)-3 -cyclopentyl-N-(5trifluorométhyl pyridin-2-yl)-propionamide; à la place de 22,5 % de PEG10000 comme précipitant, on a utilisé 21,25 % de PEG10000. Exemple 6: Formation de Co-cristal avec l'ester méthylique de l'acide (2S) 2-(3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichloro-phényl)propioDylamino) - thiazole-4-carboxylique. Des cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: la solution de glucokinase contenait 10 mg/ml de glucokinase dans un tampon tris à pH 7,1 au lieu de 7,0; la solution de o glucokinase contenait 0,2 mM de EDTA; à la place de l'activateur de glucokinase de l'exemple 3(a), la solution de glucokinase contenait 1'activateur de glucokinase ester méthylique de l'acide (2S)-2-(3Cyclopentyl-2-(3,4-dichloro phényl)propiouylamino)-thiazole-4carboxylique; à la place de 22,5 % de PEG10000 comme précipitant, on a utilisé 21,25 % de PEG10000; à la place du tris tamponné à pH 7,08 dans le précipitant, on a utilisé du bistris tamponné à pH 7,0. Exemple 7: Formation de Co-cristal avec l'ester éthylique de l'acide (2S)-2 (3Cyclopentyl-2-(3,4-dichloro-phényl)propiouylamino)-thiazol -yl)-oxo acétique. Des cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: la solution de glucokinase contenait 10 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,1 au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait 0,2 mM de EDTA; à la place de l'activateur de glucokinase de l'exemple 3(a), la solution de glucokinase contenait l'activateur de glucokinase ester éthylique de l'acide (2S)-2(3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichloro phényl)propiouylamino)-thiazol-5-yl)-oxoacétique,; à la place de 22,5 % de PEG10000 comme précipitant, on a utilisé 21,25 % de PEG10000. 19 2834295 Exemple 8: Formation de Co-cristal avec l'ester méthylique de l'acide (2S) - 3-(3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichloro-phényl) propiouyl)uréldo)acétique. Des cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les s changements suivants: la solution de glucokinase contenait 9 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,08 au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait 0,2 mM de EDTA; à la place de l'activateur de glucokinase de l'exemple 3(a), la solution de glucokinase contenait 1'activateur de glucokinase ester méthylique de l'acide (2S)-3-(3cyclopentyl-2-(3,4-dichloro 0 phényl)propionyl)uréiodo)-acétique; à la place de 20% de glucose dans le précipitant, on a utilisé 200 mM de glucose. Exemple9: Formation de Co-cristal avec la (2S)-1-(3-Cyclopentyl-2-(3,4 dichloro-phényl)-proplouyl)-3((3-hydroxy-propyl)-urée. Des cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: la solution de glucoLinase contenait 14 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,08 au lieu de 7,0; la solution de glucokinase contenait O, 2 mM de EDTA; à la place de l'activateur de glucokinase de l'exemple 3(a), la solution de glucokinase contenait l'activateur de glucokinase (2S)-1 (3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichloro-phényl)propioDyl)-3(3-hydroXy-proDyl) urée; à la place de 20% de glucose dans le précipitant, on a utilisé 200 mM de glucose. Exemple 10: Formation de Co-cristal avec l'ester éthylique de l'acide (2S)-3 (3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichloro-phényl)-propioDyl)uréido) acétique. 2s Des cristaux ont été cultivés comme dans l'exemple 3(a) avec les changements suivants: la solution de glucokinase contenait 14 mg/ml de glucokinase dans un tampon de tris à pH 7,08 au lieu de 7,0; la solution de 2834295 glucokinase contenait 0,2 mM de EDTA; à la place de l'activateur de glucokinase de l'exemple 3(a), la solution de glucokinase contenait l'activateur de glucokinase ester éthylique de l'acide (2S)-3-(3-cyclopentyl-2-(3,4-dichloro- phényl)propionyl)-uréido-acétique,; à la place du tris tamponné à pH 7,08 dans le s précipitant, on a utilisé du tris tamponné à pH 7,05. Exemple 11: synthèse du 3-Cyclopentyl-2-pyridin-4-yl-N-thiazol-2-yl- propionamide. Le 3-cyclopentyl-2-pyridin-4-yl-N-thiazol-2-yl-propionamide peut étre préparé en utilisant des techniques de synthèse organique bien connues, selon le o schéma réactionnel suivant: a Formation d une a Alkylation | liaison amide I H N:/) N:/ Mg(OCH3)z N\S) disponible dans le I N corumerce i/ \\ \ -NH Le 3-cyclopentyl-2-pyridin-4-yl-N-thiazol-2yl-propionamide est utile en tant qu'activateur allostérique de glucokinase et pour aider à la formation de co cristaux de glacokinase. 2 2834295 REVENDICATIONS 1. Co-cristal de glucokinase de mammifère et ligand lié à un site allostérique de la glucokinase, caractérisé en ce que le co-cristal possède les dimensions de cellules unitaires suivantes: aetbsontde79, 02Aà80,22A; c est de 3 1 8,03 À à 325,03 ; a et [3 sont 90 ; et y est 120 ; et le co-cristal a une symétrie P6(5)22. o 2. Cristal de glucokinase de mammifère, caractérisé en ce que le cristal possède les dimensions de cellules unitaires suivantes: act bsontde79,02Aà80,22A; c est de 318,03 À à 325,03 ; a et sont 90 ; et y est l20 ; et le cristal a une symétrie P6(5)22. 3. Procédé de co-cristallisation de glucokinase de mammifère et d'un ligand allostérique de glucokinase, caractérisé en ce que le procédé comprend: la préparation d'une solution aqueuse tamponnée de 9 à 22 mg/ml de la glucokinase de mammifère; l'addition d'un excès molaire du ligand allostérique à la solution aqueuse de glacokinase de mammifère; et la culture de cristaux par diffusion de vapeur en utilisant une solution réservoir tamponnée entre environ 10 % et environ 30 % de PEG, entre environ 0% poids/volume et environ 30 % poids/volume de glucose, et entre 0 et mM de DTT, le PEG ayant un poids moléculaire moyen entre environ 1000 et environ 20.000. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'étape de culture de cristaux par diffusion de vapeur comprend: l'étalement en forme de stries de la solution aqueuse, tamponnée, de glucokinase de mammifère avec un ligand allostérique ajouté sur une surface pour former une gouttelette allongée de solution de protéine, et 22 2834295 l'étalement en forme de stries d'environ une quantité égale de la solution réservoir tamponnée à travers la gouttelette allongée de solution de protéine, formant ainsi une gouttelette combinée de forme semblable à la lettre "X". S. Cristal produit par le procédé selon la revendication 3 ou 4. 6. Composé identifié par analyse des ligands de structure du co crystal selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé est un ligand qui se lie au site allostérique du glucokinase. 7. Composé de formule "] N.,,: I S: et sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci. 8. Composition pharmaceutique comprenant le composé selon la revendication 6. 9. Composition pharmaceutique selon la revendication 8, caractérisé en ce que le composé est le composé de la revendication 7. 10. Utilisation du composé selon la revendication 6 pour la fabrication d'un médicament comprenant un composé selon la revendication 6 pour le traitement de l'hyperglycémie dans les diabètes de type II. 11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisé en ce que le composé est le composé selon la revendication 7. 12. Composé selon l'une quelcouque des revendications 6 ou 7, pour utilisation en tant que substance active thérapeutique, en particulier pour la réduction de l'hyperglycémie dans les diabètes de type II. 13. Cristaux, procédés, composés, compositions et utilisations nouveaux tels que ci-avant décrits.