FR 2846007 A3 20040423 FR 0213061 A 20021018 PROCEDE PERFECTIONN DE TRANSFERT G NIQUE DANS UNE PLANTE PAR CHOC ELECTRIQUE La présente invention concerne une technique de 5 transfert génique, et plus particulièrement, un procédé de transfert génique dans une plante par choc électrique et injection dans l'ovaire. Une voie classique pour effectuer un transfert génique dans une plante comprend les étapes suivantes (1) clonage du gène ou des gènes provenant de sources appropriées et recombinaison du ou des gènes clonés avec un vecteur d'ADN approprié (plasmide) utilisé comme porteur de gène; (2) transfert du porteur d'ADN abritant le ou les gènes 15 clonés dans des cellules végétales par des méthodes appropriées de façon à former des cellules transgéniques, lesdites méthodes comprenant la méthode de bombardement au pistolet à particules, la méthode à médiation par Agrobacterium, la micro-injection, 20 l'électroporation, la méthode à médiation par un virus et la méthode au PEG (méthode au polyéthylène glycol), etc. (3) les méthodes mentionnées ci-dessus nécessitent toutes l'aide d'une culture de tissu végétal pour transférer 25 les cellules transgéniques au moyen d'une régénération dans des plantes transgéniques ayant des racines, des tiges et des feuilles; (4) examen et triage des plantes transgéniques réussies et bonnes. Les méthodes mentionnées cidessus ont toutes leurs propres caractéristiques; cependant, elles ont également certains inconvénients communs qui ne sont pas prêts d'être surmontés. L'un des inconvénients est que le rendement de transfert n'est pas toujours satisfaisant. 35 Habituellement, un procédé transgénique est plus susceptible d'être réussi si une technique de culture de tissu avec un rendement de régénération élevé est disponible. Malheureusement, dans beaucoup de cas, la technique de culture de tissu n'est pas encore bien établie à ce jour. Ceci est l'une des principales raisons faisant 5 que le succès du transfert génique est si rare dans de nombreuses récoltes. De ce point de vue, une nouvelle approche de procédé transgénique étant capable d'augmenter le rendement de transfert et ne reposant pas sur le recours à une culture de tissu sera de grande valeur. L'objectif de la présente invention est atteint par les opérations consistant à: (1) à un intervalle de temps approprié après la pollinisation, injecter l'ADN contenant le ou les 15 gènes exotiques dans la loge d'un ovaire de plante conformément à une série d'étapes opératoires pour faire en sorte que l'ADN entoure le ou les ovules à l'intérieur de la loge; (2) utiliser un dispositif de commande pour appliquer un choc électrique à l'ovaire avec une tension, une intensité et une durée contrôlées, de façon à former un champ électrique temporaire dans l'ovaire, l'électrode négative étant au centre et l'électrode 25 positive se distribuant à l'extérieur autour de la paroi de l'ovaire. L'ADN injecté qui chargé négativement par nature se déplacera vers l'extérieur à partir de la loge centrale en direction de la paroi de l'ovaire de façon à augmenter l'opportunité de 30 pénétrer dans l'ovule et ensuite dans la cellule d'oosphère. Ceci rend possible la recombinaison d'ADN entre l'ADN exotique et les chromosomes de l'oosphère fécondée (c'est-à-dire le transfert génique). Ainsi, le rendement du transfert génique peut être augmenté. 35 La présente invention a donc pour objet un procédé de transfert génique dans une plante, le transfert étant réalisé par choc électrique et les étapes suivantes étant conduites: - le stigmate est coupé après que la fleur soit pollinisée et que les tubes polliniques se soient proprement développés; - un passage est défini entre le style et l'ovaire - de l'ADN exotique est ensuite injecté par le passage 10 dans l'ovaire pour remplir la loge; - une pièce conductrice de l'électricité est insérée par le passage profondément dans la loge et est utilisée comme électrode négative, alors qu'une couche conductrice de l'électricité est placée de façon à 15 entourer étroitement la paroi de l'ovaire et est utilisée comme électrode positive; - un champ électrique est ensuite produit par un dispositif électrique avec une tension, une intensité et une durée appropriées de telle sorte que le choc 20 électrique amène l'ADN exotique à se déplacer vers l'extérieur, c'est-à-dire à partir de la loge centrale vers la paroi de l'ovaire, de façon à augmenter la possibilité pour l'ADN de pénétrer l'oosphère à l'intérieur de l'ovule, et, par suite, d'augmenter la 25 possibilité de recombinaison de l'ADN exotique avec les chromosomes de l'oosphère fécondée, c'est-à-dire le transfert génique. L'oosphère fécondée transgénique deviendra alors une 30 graine transgénique par développement naturel, et une plante transgénique peut être produite par la graine par germination et croissance végétative. La pièce conductrice de l'électricité utilisée comme 35 électrode négative peut être un fil de platine. Selon un mode de réalisation de l'invention, un dispositif de commande électronique est connecté à l'électrode positive et à l'électrode négative, et un champ électrique est créé au moyen d'une tension, d'une intensité 5 et d'une durée spécifiques, l'électrode négative étant à proximité du centre de l'ovaire et l'électrode positive étant à la périphérie de l'ovaire, de telle sorte que l'ADN qui est chargé négativement par nature se déplace vers l'extérieur, de façon à augmenter l'opportunité de 10 transfert génique au cours du processus de fécondation. Conformément à un premier mode de réalisation, le passage est défini par pénétration d'une aiguille d'injection à partir de la position de coupe sur le style vers la loge à l'intérieur de l'ovaire et l'aiguille est 15 ensuite retirée. Conformément à un second mode de réalisation, le passage est défini par pénétration d'une aiguille d'injection à partir de la position de coupe du style vers la loge, en poursuivant la pénétration à travers toute la 20 paroi de l'ovaire, et l'aiguille est ensuite retirée. La présente invention porte également sur - une semence transgénique obtenue à partir de l'oosphère transgénique fécondée obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus; - une plante transgénique obtenue à partir de la semence transgénique telle que définie ci-dessus, et toute partie de ladite plante transgénique; et - un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini ci-dessus comprenant: - un moyen pour couper les stigmates; - un moyen pour définir un passage dans l'ovaire ledit moyen pouvant être une aiguille; - un moyen pour injecter l'ADN exotique, choisi notamment parmi une seringue et un dispositif 35 d'injection pour analyse par chromatographie en phase gazeuse; et - un dispositif pour effectuer un choc électrique comportant une pièce conductrice de l'électricité tel qu'un fil de platine, comme électrode négative et une couche conductrice de 5 l'électricité susceptible d'entourer étroitement la paroi de l'ovaire, comme électrode positive, et un dispositif de commande pour effectuer un choc électrique. Un procédé perfectionné de transfert génique dans une plante par choc électrique est donc proposé. Tout d'abord, le stigmate est coupé à un moment de temps approprié après pollinisation, en particulier pas à plus de 32 heures de la pollinisation. Un minuscule passage d'ADN 15 est ensuite défini par pénétration de l'aiguille d'injection de position de la coupe au niveau du style et vers la loge à l'intérieur de l'ovaire, ou en pénétrant davantage à travers la paroi de l'ovaire jusqu'à proximité du réceptacle. L'aiguille est ensuite retirée et l'ADN 20 exotique (acide désoxyribonucléique) contenant le ou les gènes à transférer est injecté dans la loge par le passage. Après injection, l'ovule à l'intérieur de l'ovaire est entouré par l'ADN exotique dans la loge. L'ovule dans la loge est alors entouré par l'ADN exotique. Une pièce conductrice de l'électricité est introduite par le passage profondément dans la loge et est utilisée comme électrode négative, et une couche conductrice de l'électricité est amenée à entourer la paroi de l'ovaire et est utilisée comme électrode positive. Les électrodes positive et négative sont connectées à un dispositif de commande électronique qui produit un champ électrique, le centre de l'ovaire étant négatif et la périphérie positive. L'ADN qui est chargé négativement par nature se déplacera vers l'extérieur dans un tel champ électrique. Par une bonne maîtrise du temps, le traitement de choc électrique permettra à l'ADN injecté d'avoir une plus grande aptitude à pénétrer dans l'ovule et à rencontrer l'oosphère se fécondant. Ceci augmentera la possibilité de la recombinaison d'ADN, c'est-à-dire le transfert génique, entre l'ADN exotique et les chromosomes d'oosphère 5 fécondée. L'oosphère fécondée transgénique se développera alors naturellement en une graine transgénique. Finalement une plante transgénique entière peut être obtenue à partir d'une graine transgénique par germination et croissance végétative. Le mode opératoire entier est simple et facile 10 'à effectuer, et ne nécessite pas le recours à une culture de tissu. Le procédé de cette invention a une valeur élevée et un potentiel élevé pour l'amélioration génétique dans de nombreuses récoltes, étant donné qu'il est très simple, peu coteux, avec un rendement élevé de transfert 15 génique et qu'il est bénéfique pour la sécurité de l'environnement. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante en liaison avec les dessins annexés qui montrent, à des fins d'illustration 20 seulement, un mode de réalisation préféré conformément à la présente invention. BR VE DESCRIPTION DES DESSINS - la Figure 1 est un diagramme des étapes du procédé de la présente invention; - la Figure 2 montre des parties d'une fleur d'une plante; et la Figure 3 montre les étapes de coupe, de pénétration 30 et d'injection; et - La Figure 4 montre une autre manière d'effectuer l'étape de pénétration; et - la Figure 5 montre d'insertion, d'enfermement de la paroi de l'ovaire et de conduction électrique de la 35 présente invention. Si l'on se réfère aux Figures 2 à 5, on peut voir que le procédé perfectionné du transfert génique dans une plante, selon la présente invention, comprend six étapes qui sont: - étape de coupe 10: couper le stigmate à un intervalle de temps approprié après pollinisation (généralement pas plus de 32 heures après la pollinisation); - étape de pénétration 20: former un minuscule passage ou tunnel à l'aide d'une aiguille d'injection pour 10 pénétrer du style vers la loge; - étape d'injection 30: injecter de l'ADN de l'extérieur dans la loge de l'ovaire par le passage; - étape d'insertion 40: insérer une pièce conductrice de l'électricité dans le passage à utiliser comme 15 électrode négative; étape d'enfermement 50: enfermer la paroi de l'ovaire par une couche conductrice de l'électricité de façon à former une électrode positive; étape de conduction 60: connecter les électrodes 20 positive et négative à un dispositif électrique et former un choc électrique pour créer un champ électrique spécial. Les six étapes sont effectuées en continu. Pour l'étape de coupe 10, on se référera à la 25 Figure 2 qui montre la fleur de la plante et comprend le stigmate 11, le style 12, l'ovaire 13, la loge 131, l'ovule 132, le placenta 133, la tige florale 14, le réceptacle 15, le calice 16, le pétale 17 et l'étamine 18. Après pollinisation, lorsque les tubes polliniques atteignent le 30 ou les ovules, on utilise un outil pour couper le stigmate il à la position du style 12 comme représenté. Pour l'étape de pénétration 20, un minuscule passage 21 est défini entre le style 12 et la loge 131 à l'aide d'une aiguille d'injection pour pénétrer dans 35 l'emplacement de la coupe du style 12 et vers l'ovaire 13 jusqu'à la loge, comme représenté sur la Figure 3, ou en allant plus loin à travers la loge 131 pour pénétrer dans la paroi de l'ovaire et réaliser une ouverture 34 sur celle-ci comme représenté sur la Figure 4, puis on retire l'aiguille pour définir le minuscule passage 21. Pour l'étape d'injection 30, l'ADN 31 est injecté dans la loge 131 par une aiguille 33 du dispositif d'injection 32 par le passage 21 pour permettre à l'ADN 31 d'entourer l'ovule 132. Si le passage 21 est défini par pénétration comme représenté sur la Figure 4, un peu d'ADN 10 31 pourrait s'écouler hors de l'ouverture 34, mais ceci ne fait pas obstacle à l'obtention du résultat du transfert génique, ce qui a été montré par des essais répétés. Pour l'étape d'insertion 40, on introduit une pièce 41 conductrice de l'électricité, tel qu'un fil de 15 platine, dans le passage 21 afin de former l'électrode négative. Pour l'étape d'enfermement 50, une couche 51 conductrice de l'électricité vient entourer l'ovaire 13, afin de constituer une électrode positive circulaire. Pour l'étape de conduction électrique 60, on connecte les électrodes positive et négative telles que définies aux étapes 40 et 50 à un dispositif de commande électronique spécial 61 qui donnera un choc électrique afin de former un champ électrique spécial déterminé par la 25 combinaison d'une tension, d'une intensité et d'une durée. L'ADN 31 est chargé négativement de par sa nature chimique et se déplacera vers l'électrode positive dans le champ électrique. En d'autres termes, dans ce cas, les molécules d'ADN à l'intérieur de la loge se déplaceront du 30 centre vers l'extérieur. L'opportunité pour l'ADN de pénétrer dans la cellule d'oosphère à l'intérieur de l'ovule 132 est accrue, en particulier lorsque la fusion oosphère-anthérozode (sperme) (c'est-à-dire la fécondation) a lieu si la maîtrise du temps est bien faite. 35 Aux alentours de la période de fécondation, une partie de la paroi de cellule de l'oosphère est mince et la cellule de l'oosphère est quelque peu semblable à un protoplaste. Cette caractéristique permet à l'ADN 31 d'entrer facilement dans la paroi de la cellule, en particulier au moment o la fécondation a lieu. Il en résulte que l'opportunité de la recombinaison entre l'ADN exotique et les chromosomes de l'oosphère fécondée, c'està-dire le transfert génique, peut également être accrue. L'oosphère fécondée transgénique deviendra alors une graine transgénique par un développement naturel, et une plante 10 transgénique peut être obtenue à partir de la graine transgénique par germination et croissance végétative. La totalité du procédé ne nécessite pas d'avoir recours à une culture de tissu. Il va de soi que, dans ce procédé, l'apparition 15 de transfert génique dépend de cinq facteurs principaux comprenant: 1 - l'existence de l'ADN injecté 31 qui contient le ou les gènes exotiques; 2 - les cellules d'anthérozode se déplaçant vers 20 l'oosphère à l'intérieur des tubes polliniques qui s'étendent après pollinisation; 3 - une ou des cellules d'oosphère à l'intérieur du ou des ovules 132; 4 - l'apparition d'une fusion d'oosphère-anthérozode 25 (c'est-à-dire fécondation) à l'intérieur de l'ovule et - le traitement par choc électrique qui augmente le mouvement de l'ADN 31 à l'intérieur de la loge. Pour traiter tous ces facteurs de façon à rendre 30 le transfert génique capable de se produire avec une plus grande possibilité, une maîtrise précise des étapes dans le temps est très importante pour toutes les étapes dans le procédé de la présente invention. La présente invention non seulement permet 35 d'atteindre l'objectif du transfert génique, mais également présente les cinq avantages suivants - 1 - Augmenter le taux de succès du transfert génique dans une plante: l'ADN est injecté dans l'ovaire à un intervalle de temps approprié après la pollinisation, puis traité par choc électrique pour augmenter de 5 façon significative le taux de succès du transfert génique. 2 - Réduire les cots de réalisation dans la recherche de génie génétique: la présente invention adopte la voie 10 naturelle du processus de reproduction de la plante pour parvenir à l'objectif du transfert génique. Il est simple et facile à faire. De plus, on trouve qu'à l'aide de ce procédé, le rendement est supérieur aux voies classiques utilisées pour transférer un ou des 15 gènes dans les plantes. Ce mode opératoire ne nécessite pas d'avoir recours à une culture de tissu pour produire une plante transgénique complète à partir d'une cellule transgénique. Une telle caractéristique est tout à fait de valeur et utile 20 pour économiser du temps et des frais, en particulier pour les espèces de plantes pour lesquelles la technique de culture de tissu n'a pas encore été bien établie. 3 Bénéficier à la sécurité de l'environnement le procédé de la présente invention ne nécessite pas de technique de culture de tissu et ne repose pas sur une médiation par une bactérie dans la totalité du procédé de transfert génique, d'o il résulte que le problème 30 de contamination et de pollution de l'environnement peut être fortement réduit. 4 - Facile à pratiquer et à effectuer à l'aide du procédé de la présente invention, la pratique et la 35 compétence du transfert génique est facile à apprendre et à enseigner. Une fois que la technique pour une Il plante spécifique a été bien déterminée et établie, y compris le moment de l'injection de l'ADN et les conditions de choc électrique, l'expérience de transfert génique pourrait devenir un travail de 5 routine et être facilement effectuée par un assistant, même non spécialisé dans les domaines de la génétique et de la biologie moléculaire. La partie principale du travail expérimental peut être réalisée dans les champs ou dans des serres à l'aide simplement d'une 10 seringue de dimension appropriée (ou un dispositif d'injection initialement mis au point pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse) et d'un dispositif induisant une choc électrique. Il n'est pas nécessaire d'avoir recours à des instruments et 15 des équipements coteux. - Particulièrement approprié et utile pour les plantes ayant de multiples graines produites dans un fruit, si le fruit est issu d'une simple fleur pollinisée, telle 20 que la tomate et la pastèque: étant donné que l'ovaire est l'unité de base à traiter dans ce procédé, celui-ci est particulièrement utile et de valeur pour les plantes présentant des graines multiples produites dans un fruit issu d'une simple 25 fleur. Apparemment le taux de succès peut être augmenté si de multiples graines peuvent être obtenues à partir d'un seul traitement expérimental. On peut s'attendre à un taux de succès d'autant plus élevé que davantage de graines peuvent être obtenues à partir 30 d'un ovaire traité (fleur). En agriculture, il existe de nombreuses récoltes qui portent des fruits contenant des graines multiples qui se développent à partir d'une simple fleur pollinisée. Leurs espèces se répartissent en différentes familles taxonomiques, 35 comprenant Orchidaceae, Cucurbitaceae, Leguminosae, Solanaceae, Rosaceae, Cruciferae, Rutaceae, Myrtaceae, Liliaceae, Passifloracae, Oxalidaceae, Vitaceae, Actinidiaceae et Caricaceae, etc.. Nous estimons qu'environ 2/3 des récoltes horticoles sont de ce type, et la plupart de ces récoltes manquent encore de 5 bonnes recherches de culture de tissu. En fait, les recherches de culture de tissu n'ont même pas encore été commencées dans beaucoup de ces récoltes, et de même le travail de génie génétique. Par conséquent, le procédé de cette invention va avoir un potentiel 10 très important pour l'application dans l'amélioration génétique de nombreuses récoltes. Alors que nous avons présenté et décrit le mode de réalisation selon l'invention, il apparaîtra à l'homme du métier que d'autres modes de réalisation peuvent être 15 réalisés sans s'écarter du domaine de la présente invention. REVENDICATIONS 1 - Procédé de transfert génique dans une plante, caractérisé par le fait qu'on réalise ce transfert par choc électrique en conduisant les étapes suivantes: - le stigmate (11) est coupé après que la fleur soit pollinisée et que les tubes polliniques se soient proprement développés; - un passage (21) est défini entre le style (12) et l'ovaire (13); - de l'ADN exotique (31) est ensuite injecté par le passage (21) dans l'ovaire (13) pour remplir la loge (131); - une pièce (41) conductrice de l'électricité est 15 insérée par le passage profondément dans la loge (131) et est utilisée comme électrode négative alors qu'une couche (51) conductrice de l'électricité est placée de façon à entourer étroitement la paroi de l'ovaire (13) et est utilisée comme électrode positive, - un champ électrique est ensuite produit par un dispositif électrique (61) avec une tension, une intensité et une durée appropriée, de telle sorte que le choc électrique amène l'ADN exotique à se déplacer vers l'extérieur, c'est-à-dire à partir de la loge 25 centrale vers la paroi de l'ovaire, de façon à augmenter la possibilité pour l'ADN de pénétrer l'oosphère à l'intérieur de l'ovule, et, par suite, d'augmenter la possibilité de recombinaison de l'ADN exotique avec les chromosomes de l'oosphère fécondée, 30 c'est-àdire le transfert génique. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la pièce (41) conductrice de l'électricité utilisée comme électrode négative est un fil de platine. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 35 2, caractérisé par le fait qu'un dispositif de commande électronique (61) est connecté à l'électrode positive et à l'électrode négative et qu'un champ électrique est créé au moyen d'une tension, d'une intensité et d'une durée spécifiques, l'électrode négative étant à proximité du centre de l'ovaire et l'électrode positive étant à la 5 périphérie de l'ovaire, de telle sorte que l'ADN qui est chargé négativement par nature se déplace vers l'extérieur, de façon à augmenter l'opportunité de transfert génique au cours du processus de fécondation. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, 10 *caractérisé par le fait que le passage (21) est défini par pénétration d'une aiguille d'injection (33) à partir de la position de coupe du style (12) vers la loge (131) à l'intérieur de l'ovaire (13) et l'aiguille (33) est ensuite retirée. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le passage (21) est défini par pénétration d'une aiguille d'injection (33) à partir de la position de coupe du style (12) vers la loge (131) et par pénétration à travers toute la paroi de l'ovaire (13), et 20 que l'aiguille (33) est ensuite retirée. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que le stigmate (11) est coupé par plus de 32 heures après la pollinisation. 7 - Semence transgénique obtenue à partir de 25 l'oosphère transgénique fécondée obtenue par le procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 6. 8 - Plante transgénique obtenue à partir de la semence transgénique telle que définie à la revendication 7, et toute partie de ladite plante transgénique. 9 - Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 6 comprenant: - un moyen pour couper les stigmates (11); - un moyen pour définir un passage (21) dans l'ovaire (13), 35 ledit moyen pouvant être une aiguille (33); - un moyen pour injecter l'ADN exotique (31), choisi notamment parmi une seringue et un dispositif d'injection pour analyse par chromatographie en phase gazeuse; et - un dispositif pour effectuer un choc électrique 5 comportant une pièce (41) conductrice de l'électricité tel qu'un fil de platine, comme électrode négative, et une couche (51) conductrice de l'électricité susceptible d'entourer étroitement la paroi de l'ovaire, comme électrode positive, et un dispositif de commande (61) pour 10 'effectuer un choc électrique.