FR 2843199 A1 20040206 FR 0209714 A 20020731 1/ Domaine technique d'intervention: La présente invention concerne une méthode de dosage de la Progestérone dans le lait spécialement conçu pour être réalisé par l'éleveur dans sa ferme pour l'aider dans la gestion de la reproduction de son troupeau de vaches laitières. Pour bénéficier du progrès génétique et sanitaire apporté par l'insémination artificielle, l'éleveur laitier doit repérer les vaches en chaleurs du troupeau pour les faire inséminer. Ce repérage se fait en observant le comportement d'oestrus des vaches en chaleurs, ce qui ne manque pas d'amener à des situations de doute. Certaines vaches ont des comportements ambigus ou mal interprétés qui amènent une insémination à un mauvais moment, abaissant ainsi la fécondité du troupeau. D'autres vaches gestantes manifestent des comportements également ambigus, laissant croire qu'elles sont en chaleurs, et sont donc inséminées, ce qui met en danger la survie de leur embryon, car l'acte d'insémination se fait en traversant le col de l'utérus. Devant ces situations douteuses, l'éleveur a besoin pour connaître l'état sexuel de sa vache et prendre la bonne décision, d'un test d'aide à la décision, d'un cot abordable, praticable à la ferme, et donnant immédiatement un résultat clair. 2/ Etat actuel des techniques disponibles:11 existe des techniques qui aident au repérage du comportement de chaleurs, spécialement en repérant le chevauchement,par un dispositif placé sur la croupe de la vache. EP0995408A1 décrit un dispositif ou l'alerte est donnée par des signaux lumineux. Ces dispositifs ne répondent pas totalement aux problèmes posés par la surveillance du comportement oestral. Il existe des dosages de progestérone dans le lait:EP0031926 décrit un procédé radioimmunologique utilisant un isotope de l'iode,qui n'est donc utilisable qu'en laboratoire spécialisé.GB2354069 décrit un procédé utilisant le dosage de la progestérone dans du lait prélevé 4 à 6 jours après l'insémination,quelque soit la méthode de dosage utilisée,pour prédire une gestation ou améliorer les taux de gestation par un traitement progestagène.WOO1 14887 décrit un procédé automatisé de dosage de la progestérone du lait destiné à être couplé à un robot de traite et à 1 'ordinateur rassemblant les données du troupeau. Les dosages sont réalisés automatiquement tout au long du cycle oestral de la vache;ledit dosage est réalisé en ajoutant des anticorps anti-progestérone dans le récipient contenant l'échantillon de lait,ledit récipient ayant ses parois tapissées de progestérone. La lecture se fait en se fondant sur la différence de poids entre la progestérone et les anticorps utilisés. Les dosages répétés permettent de situer la vache dans son cycle oestral. EP0857974 décrit un test Elisa dosant la progestérone dont l'étape de révélation colorée est caractérisée par un préchauffage à la température de 330Celsius. US5063151 décrit un procédé utilisant un anticorps anti-progestérone combiné avec la protéine A de la bactérie Staphylococcus aureus pour constituer un complexe immobilisé dans une matière poreuse;le dosage est réalisé en déposant l'échantillon de liquide à doser sur un disque poreux et en faisant apparaître une coloration par un procédé de type Elisa; la lecture se fait à l'oeil nu.US4720455 décrit un procédé de dosage de la progestérone de type Elisa utilisant un bâtonnet sensibilisé par des anticorps monoclonaux Jle procédé demande 7 étapes avant l'étape de lecture et utilise comme référence deux échantillons calibrés lors de chaque dosage. La lecture se fait à l'oeil nu en comparant la couleur obtenue par l'échantillon à doser à la couleur des 2 échantillons de référence.W08902076 décrit un dosage prévu pour être réalisé à la ferme utilisant une technique immuno-enzymatique caractérisée en ce que: -le procédé est réalisé en 6 étapes de remplissage ou de vidanges avant la lecture -le prélèvement du lait est réalisé dans un tube sensibilisé devant être conservé dans un réfrigérateur qui est rarement disponible près de la salle de traite des vaches. -la lecture est réalisée par un colorimètre en comparant la couleur de l'échantillon à tester à celle obtenue avec une solution de référence. -ladite solution de référence se comporte comme un lait contenant 5ng/ml à 1 Ong/ml de progestérone,c'est à dire un seuil élevé par rapport à la concentration en progestérone du lait de vaches en chaleurs. Ce seuil de référence élevé fait que des vaches ayant un taux de progestérone compris entre 2ng/ml et 5ng/ml vont être classées " en chaleurs " par ce test. Si on se réfère aux travaux de Henriksen et coll(seminaire à Freising, septembre30-octobre2,1981,p.277281,1982/Martinus Nijhoff-The Hague, Netherlands),les vaches dans cette situation ne sont pas en chaleurs et montrent une mauvaise fécondité si on les insémine ce jourlà. Il existe donc des dosages de progestérone dans le lait de la vache construits pour être utilisés à la ferme, mais leur exécution à la ferme par l'éleveur, pose un ou plusieurs des problèmes suivants: -Le prélèvement de lait doit se faire dans un tube spécial à conserver dans un réfrigérateur rarement disponible prés de l'étable. -Le test nécessite un tube- témoin dans lequel il faut conduire les mêmes opérations que pour l'échantillon à tester, doublant ainsi les cots et les manipulations lorsque l'on teste un seul échantillon. -Il faut réaliser, avant l'étape de lecture, plus de 4 opérations de remplissage ou de vidange, avec plus de deux réactifs dans le matériel et le test demande souvent plus de 10 minutes pour l'effectuer. Le résultat du test est lu en comparant les couleurs de l'échantillon testé à celle du témoin, à l'oeil nu, ce qui mène beaucoup d'erreurs de lecture ou des résultats jugés douteux pour l'éleveur. Beaucoup de tests sont bâtis pour réaliser un diagnostic de gestation et leur seuil est élevé(supérieur à 3ng/ml), ce qui ne permet pas de l'utiliser valablement pour la confirmation d'oestrus avec comportements douteux. Il manquait donc un test de dosage de la progestérone dans le lait évitant tous les écueils précédemment évoqués::Le prélèvement doit se faire dans un tube conservé près de l'étable. Supprimer le tube témoin simplifie les manipulations et baisser les cots. Le test doit être réalisable en 4 opérations avec seulement 2 réactifs avant l'étape de lecture. Le test doit être lu par un colorimètre qui donne une réponse de type oui ou non. Le test doit être bâti avec un seuil bas ( comportements de chaleurs équivoques. 3/ Exposé de l'invention 3/1 Principe du dosage =Le procédé de dosage utilise une réaction immuno-enzymatique de type Elisa par compétition dont les principales étapes sont illustrées dans les figures 1 et 2: Le lait à tester peut être riche en progestérone ( Figure 1) ou pauvre en progestérone. ( Figure 2). Etape 1 ( Figure 1-let figure 2-1):Une première incubation de l'échantillon de lait (1) dans le tube met la progestérone (4) de l'échantillon en présence d'anticorps anti-progestérone(2),fixés au tube-test (3).Cette première incubation dure 2 minutes. Etape 2 ( Figure 1-2 et figure2-2):On ajoute dans le tube une progestérone marquée (5), en quantité fixe, qui va aller se fixer sur les sites anticorps restés libres après la 1 ère incubation. Ces sites anticorps restés libres sont peu nombreux si l'échantillon à tester était riche en progestérone (Figure 1-2), ils sont nombreux si l'échantillon à tester était pauvre en progestérone (Figure 2 -2).Cette deuxième incubation dure 2 minutes. Etape 3 (Figure 1-3et figure 2-3): Des vidanges (6) à l'eau, suivies de rinçages successifs, libèrent complètement le tube de la progestérone marquée restée en suspension car non fixée aux anticorps sur la paroi. Etape 4(Figl-4 ET 2-4):On ajoute dans le tube un substrat (7), qui vient spécifiquement réagir avec la progestérone marquée liée aux anticorps (2) attachés à la paroi du tube;cette étape 4 dure 2 minutes. Si le substrat (7)trouve peu de progestérone marquée, il se produira peu de couleur. Cela indique que l'échantillon (4)à tester est riche en progestérone (Fig 1-1).Si le substrat (7) trouve beaucoup de progestérone marquée, il y aura beaucoup de couleur. Cela indique que l'échantillon(l) à tester était pauvre en progestérone (Fig2-1). 3/2Caractéristiques techniques propres à l'invention: L'invention réunit plusieurs procédés qui s'adaptent bien à l'objectif fixé au dosage: Le prélèvement se fait dans un tube ordinaire qui peut être conservé près de l'étable, en dehors du réfrigérateur. Un seul tube est utilisé par dosage ( pas de tube témoin) car la concentration des réactifs, les quantités de lait, les quantités de réactifs et les temps d'incubation sont calibrés pour s'en référer 1 0 à une couleur -- "seuil" mesurée par le colorimètre. Les étapes l et 2 se succèdent sans vidange entre elles. L' étape 4 se fait avec un seul réactif. Le colorimètre fourni utilise une source lumineuse de longueur d'onde définie couplée à une photodiode réceptrice spécifique de cette longueur d'onde. Le colorimètre fourni, contient une résistance qui joue un rôle de seuil, calibré pour correspondre au seuil de progestérone visé, lui permettant de donner une réponse claire, sans résultat ininterprétable.Le seuil de progestérone a été fixé suffisamment bas pour caractériser spécifiquement les vaches en chaleurs en période oestrale en dessous de ce seuil, excluant ainsi les vaches cyclées en phase lutéale ou les vaches gestantes. 3/3 Description détaillée:L'invention produit tout le nécessaire à la réalisation d'un dosage de progestérone en dehors d'un laboratoire. 3/3/1/Les tubes de prélèvements:Jl s'agit de tubes en plastique munis d'un bouchon dont l'ouverture est suffisamment large pour prélever quelques jets de lait à la mamelle avant la traite. 3/3/2/ Les tubes- tests sont choisis pour permettre une bonne adhésion des anticorps monoclonaux. Nous avons préféré utiliser les tubes Nunc Startube Maxisorp à ailettes. Ces tubes ont la particularité de posséder 6 ailettes obtenues par moulage. Ces ailettes confèrent 3 avantages: - La surface disponible pour la fixation des immunoglobulines est plus importante et permet de travailler avec des volumes faibles (inférieure à l ml) avec une sensibilité élevée. - La présence des ailettes correspond à une diminution importante des distances moyennes " molécules- parois ", autorisant pour des résultats identiques, une réduction sensible des temps d'incubation. - Si l'on agite doucement les tubes, les ailettes provoquent un brassage doux qui permet une diminution des temps d'incubation en élevant parallèlement la reproductibilité. 3/3/3/ Les anticorps monoclonaux sont fixés à la paroi intérieure du tubetest:Nous avons sélectionné de préférences les anticorps monoclonaux dirigés contre la progestérone -1 la-HMS5 BSA, clone BGN/6-5E-3F (IgGl) fourni par Biogenesis (UK) La concentration utilisée doit permettre une sensibilité de détection avec un seuil de l'ordre de 2 ng/ml de progestérone naturelle. 3/3/4/ La mesure des volumes de lait et de réactif:Le volume de lait à introduire dans le tube est de 0,5 ml et il doit être mesuré avec une précision de +/- 0,05 ml (50 ffl). Les réactifs nl ( Progestérone marquée), et le réactif n02 ( substrat), sont utilisés respectivement avec un volume de 0,5 ml et de 1 ml, qui doit être mesuré avec une précision de +/- 0,05 ml (50 ffl). Nous avons sélectionné de préférence les flacons Nalgène avec compte goutte calibré (Précision 50 gil) 3/3/5/ La progestérone marquée:Nous avons sélectionné de préférence la progestéronel 1 marquée à la peroxydase. L'activité enzymatique est de 300 unités/mg (pyrogallol). La concentration utilisée doit permettre une sensibilité de détection avec un seuil de l'ordre de 2 ng/ml de progestérone naturelle. 3/3/6/ Le substrat:Nous avons sélectionné de préférence le Tétraméthyl benzidine utilisable en un seul temps. 3/3/7/Le colorimètre = Le colorimètre fonctionne selon le schéma de la figure 3:Une source lumineuse ( 1),constituée par une photodiode, envoie un pinceau lumineux sur un tube (3) et son échantillon(4) à évaluer. Une cellule détectrice (2),constituée par une photo résistance, placée de l'autre côté du tube par rapport à la source (1), mesure le flux lumineux reçu. La longueur d'onde de la source (1) est choisie de façon à correspondre exactement à la longueur d'onde absorbée par l'échantillon (4) de façon à avoir une sensibilité maximale avec le détecteur:Cette longueur d'onde a été choisie entre 600et 620nm. Après étalonnage, le flux lumineux mesuré dépend de l'absorption de la solution et donc de la concentration en progestérone de l'échantillon(4): Plus le taux de progestérone de l'échantillon à tester est élevé, plus la quantité de progestérone marquée restant dans le tube après vidange-rinçage est faible, moins la solution est absorbante. 3/3/8/ Un minuteur préréglé permet de mesurer les 3 temps d'incubation. REVENDICATIONS 1/ Procédé de type immuno-enzymatique permettant la mesure de la concentration en Progestérone dans du lait de mammifères réalisé en 4 étapes avant la lecture calorimétrique, sans échantillon de référence, caractérisé en ce qu'il comporte: -Etape -:Une première incubation du lait à -testeravec les anticorps anti-progestérone, -Etape2 Une mise en compétition directe du lait à tester avec une progestérone conjuguée à une enzyme, -Etape3 une étape de rinçage-vidange, -Etape4:Une révélation produisant une couleur par l'addition d'un substrat de ladite enzyme, Une lecture réalisée par un colorimètre utilisant un seuil,fixé dans le colorimètre, servant de référence pour la lecture qui est de type semi quantitative avec plusieurs niveaux de lecture, -Ledit seuil de référence pour la lecture correspond par étalonnage à une concentration de progestérone dans l'échantillon à tester inférieure à 2ng/ml. 2/ Procédé selon la revendication 1) caractérisé en ce que les 2 premières étapes consistent à mélanger dans un tube-test l'échantillon de lait à tester etla progestérone marquée.. 3/ Procédé selon les revendications 2) caractérisé en ce que le tube-test comporte un fond dont la surface interne, est munie d'ailettes facilitant la réaction immuno- enzymatique. 4) Procédé selon la revendication 1)caractérisé en ce que la 4eme étape du dosage se fait par l'addition dans le tube-test d'un seul réactif qui à lui seul permet l'apparition de la réaction colorée. ) Procédé selon les revendications 1), 2)et 4) caractérisé en ce que les étapes 1, 2et 4 du procédé durent chacune moins de 2,5minutes. 6) Procédé selon la revendication 1) caractérisé en ce que la lecture colorimétrique met en oeuvre une photodiode émettant une source lumineuse de longueur d'onde comprise entre 600 et 620 mn. 7)Procédé selon revendication6)caractérisé en ce que la mesure du flux lumineux transmis par la substance à tester est faite par une photo résistance. 8)Procédé selon la revendication 1) caractérisé en ce que plusieurs niveaux de lecture sont prédéfinis par un système de ponts de résistances électriques.