FR 2838133 A1 20031010 FR 0204177 A 20020403 31. Procéd é de détection rapid e de micro-o rganism es su r un CD et dispositif de mise en _uvre sur un lecteur de CD-ROM ou DVD Description La détection de micro-organismes corume les bactéries, met en _uvre traditionnellement des techniques de cultures sur substrat nutritif. Ces techniques présentent deux déLauts majeurs: - le temps nécessaire pour de telles mesures qui va de 24 heures à plusieurs jours, - la mauvaise sensibilité qui peut conduire à une sous-estimation dangereuse pour la santé publique dans le cas de très faibles concentrations ou de microorganismes stressés. D'autres techniques ont vu le jour récemment, comme la cytométrie, la PCR (polymerase chain reaction) ou les techniques de fluorescence et qui tentent d'éviter ces problèmes, mais la limitation à certains microorganismes et surtout le coût prohibitif de ces appareils les rendent difficiles d'emploi. En effet, ces techniques font appel à des procédures complexes utilisant de multiples réactifs et à des systèmes optiques à positionnement très précis. Plus récemment encore, un procédé (EPO1119769) utilisant ces techniques de fluorescence est en cours de développement avec le système de laser d'un simple lecteur de CD d'ordinateur, mais elle fait appel à des puces ADN qui présentent des dimensions importantes (20,um) qui ne permettent donc pas de travailler sur de très faibles concentrations et de tirer profit pleinement des capacités d'un tel lecteur de CD voire de l'utiliser tel quel avec ses possibilités de focalisation du laser sur moins de 1 1lm ou 0,3 m pour les lasers bleus (voire moins pour les lasers W). Le procédé de détection objet de la présente demande consiste à recueillir les micro- organismes à analyser, marqués par un traceur optique (préalablement ou non), sur un disque compact appelé communément CD, spécialement fabriqué pour la circonstance (CD spécialement formaté ou micro-poreux) et à mesurer la modification de réflexion et/ou d' absorption d'un rayon laser d'un simple lecteur de CD-ROM, par les dits micro organismes déposés à la surface du disque CD. Trois phases importantes sont donc utilisées: - la fabrication et/ou formatage du CD, - le marquage et le recueil (ou vice versa) des microorganismes sur le CD dans des conditions o on évite toute contamination etlou erreur, - la détection dans le lecteur de CD-ROM grâce à un logiciel spécifique. A) La fabrication et/ou formatage du CD Le formatage consiste à créer une série d'évènements spécifiques (on entend par évènement le passage d'une zone de réflexion à une zone de non-réflexion du laser donnant ainsi un bit d'information) de sorte qu'un micro-organisme qui se trouve sur ou à côté de 1'un de ces évènements, soit détecté et bien positionné sur le disque compact par gestion des bits à l'aide d'un logiciel spécifique. Les évènements peuvent étre des trous (ou cuvettes) ou des marques (zone cristaline ou amorphe, zone réfléchissante ou non..). Le positionnement précis des micro-organismes présente plusieurs avantages: - en cas de relecture, il est possible de retrouver le microorganisme très rapidement et de vérifier éventuellement s'il y a eu évolution, - d'effectuer une autre lecture dans un lecteur de CD avec un laser de longueur d'onde éventuellement différente pour analyser et différencier d'autres corps. Le disque compact spécialement fabriqué peut se présenter suivant différentes techniques: Première technique: Le CD a les mémes dimensions qu'un CD classique mais est constitué d'un support micro-poreux avec des pores calibrés (en diamètre et en position) recouvert d'une fine couche (de 0,01,um à 1 1lm) de marqueur optiquement transparent. Les pores doivent avoir une taille inférieure à celle des microorganismes à analyser (par exemple, des pores de 0,2,um seront préférés pour des micro-organismes de plus de 0,3,um) pour permettre leur recueil (par filtration par exemple dans le cas o les micro- organismes à analyser se trouvent dans un fluide, air ou liquide). Les pores peuvent avantageusement étre réalisés par les techniques de micro-lithographie ou par laser pour permettre en outre de les agencer de façon régulière à 1'image des cuvettes gravées sur les CD conventionnels. Deuxième technique: Le CD est un disque compact conventionnel préalablement formaté pour permettre de positionner les micro-organismes analysés. Par formatage on entend une sectorisation du CD pour limiter la taille des zones à explorer et une création d'une suite logique de cuvettes permettant de dherminer la position exacte d'un bit. Cela peut étre un simple comptage de bits comme cela peut 8tre un positionnement en temps dans un même secteur. B! Le marquage et le recueil des microorganismes Le marquage des micro-organismes peut étre réalisé avant dépôt sur le CD ou directement sur le CD suivant la technique retenue. Dans le cas d'un CD micro-poreux, celui-ci est recouvert d'une feuille étanche jusqu'au moment du recueil des micro-organismes pour éviter toute rayure ou poussière ou contamination micro-biologique. Après avoir recueilli les micro-organismes sur le CD micro-poreux, un nouveau film étanche et optiquement transparent est déposé sur le CD pour éviter là aussi toute contamination ultérieure. L'épaisseur de cette feuille est avantageusement choisie pour que les poussières et rayures ou autre contamination ultérieures ne soient pas détectées du fait de la focalisation du faisceau laser qui s'opère à la surface du CD et non pas de la feuillerajoutée. Dans le cas d'un CD conventionnel, les micro-organismes à analyser sont préalablement marqués puis recueillis sur une membrane micro-poreuse dont les pores sont inférieurs à la taille des micro-organismes à analyser (par exemple, des pores de 0,2m seront prétérés pour des micro-organismes de plus de 0,3m). De telles membranes sont couramment employées en microbiologie, mais on les choisira transparentes. -3- La membrane, qui est optiquement transparente, est ensuite déposée sur le disque compact côté germes sur la face du CD. Le CD est ensuite analysé dans un lecteur de CD-ROM conventionnel. Pour mettre en évidence les micro-organismes avec un rayon laser d'un simple lecteur de CD-ROM, il est nécessaire que ceux-ci présentent soit des propriétés de réflexion, d' absorption, de réfraction ou de diffusion et donc d'introduire ce que l' on peut dénommer des marqueurs. Ces marqueurs ont donc pour but de modifier la structure optique des micro-organismes. Ces marqueurs seront différents suivant les types de micro-organismes: cas des micro-organismes qui absorbent des minéraux et les transforment en microcristaux ou cristallites, - cas des micro-organismes qui génèrent une estérase avec des produits fluorescents, - cas des micro-organismes qui présentent une enveloppe ayant des propriétés optiques variables en fonction du milieu (réflexion, réfringence...). Ces marqueurs doivent être choisis en fonction du micro-organisme à analyser. Ce sera soit une substance fluorescente soit un élément chimique choisi parmi les alcalins, les alcalino-terreux, les métaux de transition ou les terres rares, de sorte que seul le micro-organisme que l'on veut analyser réagisse avec ce marqueur. C) La détection dans le lecteur de CD-ROM grâce à un logiciel spécifique Plusieurs procédés de détection (réflexion, absorption, diffusion) et de mise en évidence des micro-organismes peuvent être employés de façon combinée en fonction des micro organismes que l'on veut détecter: - le micro-organisme absorbe le rayon laser et le logiciel va interpréter l' absence d ' un bit comme la présence d'un micro-organisme, - le microorganisme réfléchit le rayon laser et le logiciel va interpréter ce bit comme la présence d'un micro-organisme, - le micro-organisme diffuse le rayon laser (ou le transforme en rayon incohérent) et le logiciel va interpréter l' absence d'un bit comme la présence d'un micro-organisme. Comme ce micro-organisme aura réagit spécifiquement en fonction du marqueur utilisé, on saura de quel micro-organisme il s'agit. Ce logiciel spécifique permet donc d'analyser les bits masqués par les micro-organismes à analyser ou les nouveaux bits générés par le micro-organisme marqué. Bien entendu, le logiciel de gestion des bits ne comprend pas les différentes méthodes de codage et de modulation qui sont utilisées par l'industrie audiovisuelle pour permettre de ne pas lire certains défauts (bits détectueux) comme les rayures et autres poussières . vore pour empêcher toute cope. Bien au contraire, le logiciel de gestion des bits permet d'analyser tous les bits. C'est en fait le procédé même de protection du CD par un film étanche ôté au dernier moment et d'un film optiquement transparent, déposé sur le CD juste après avoir déposé les germes sur le dit CD (directement sur un CD micro-poreux ou par l'intermédiaire -4 d'une membrane micro-poreuse sur un CD conventionnel) qui va permettre de s'affranchir de tous les problèmes de rayures et/ou de poussières. Les éventuels problèmes de rayore ou de poussières seront ainsi éliminés d'une part parce que le disque aura été protégé la quasi-totalité du temps mais aussi parce qu'une fois recouvert par le film optiquement transparent, toute rayure ou poussière ou contamination micro-biologique ne pourra pas être lue compte tenu de l' altitude de focalisation du faisceau laser qui n'a lieu qu'à la surface du CD voir un peu en dessous pour les CD à plusieurs couches comme certains DVD. Ce type de CD multicouches pourra avantageusement être utilisé pour permettre une analyse de la position des micro organismes sur une couche indépendamment de la couche o se trouvent les dits micro- organismes. Pour mettre en _uvre le procédé de mise en évidence des microorganismes, il est donc nécessaire au préalable de préparer les dits micro-organismes. Dans le cas des micro-organismes qui peuvent former des microcristallites qui elles mêmes permettront une modification du rayon laser incident, il faut mettre les dits micro- organismes au contact des marqueurs (minéraux sous forme assimilable par les micro- organismes) à une température et pendant un temps suffisant. Dans le cas d'un compact disque micro-poreux, le fluide à analyser est filtré directement au travers du CD qui est lui-même recouvert d'une fine couche d'au moins un marqueur optiquement transparent (il peut étre par exemple sous forme amorphe mais sera rendu cristallin lors de sa diffusion dans le micro-organisme) Après recueil des micro-organismes et dépôt de la feuille de protection transparente, le disque compact micro- poreux peut être mis dans une petite étuve pour assurer les réactions nécessaires entre les micro-organismes et le marqueur. Dans le cas d'un CD conventionnel spécialement formaté, le fluide est donc préalablement filtré sur la membrane. Le marqueur pouvant être déposé indifféremment sur le CD ou la membrane. La membrane est ensuite disposée sur le CD, la face contenant les germes étant en contact avec le CD afin d'éviter de maintenir les germes en contact avec l'air, c'est à dire dans une situation de stress (séchage, UV...) Les étapes sont donc: Prélèvement de l'échantillon de fluide puis mise en contact avec le marqueur, - Recueil des micro-organismes par filtration sur la membrane ou le CD micro-poreux, - Dépôt de la membrane etlou de la feuille optiquement transparentes sur le CD, - Lecture du CD dans le lecteur de CD avec le logiciel de gestion des bits. Le dispositif de mise en _uvre pour le contrôle micro-biologique de fluides peut se présenter comme suit: - Cas 1 On utilise un lecteur de CD ou DVD, un disque compact spécialement formaté et protégé par une feuille étanche et un logiciel de reconnaissance des microorganismes. Une fine couche de marqueur spécifique au micro-organisme que l' on veut analyser, sous -5 forme amorphe et donc optiquement transparente, a été préalablement déposée soit sur le disque compact soit sur la membrane. Cette couche de marqueur peut aussi étre déposée sur le CD ou la membrane au dernier moment à l'aide par exemple d'une bombe aérosol. Pour recueillir les micro-organismes d'un fluide à contrôler (air ou liquide), celui-ci est filtré au travers d'une membrane, optiquement transparente et calibrée en fonction du micro-organisme à détecter (une membrane à 0,2,um sera utilisée pour des micro- organismes de plus de 0,3,um). Le flu i de p eut être au s si si mplement dép o sé pui s s éché sur la m embrane ou direct emen t sur le CD. La feuille de protection du CD est ensuite retirée dans une pièce propre. La membrane recouverte de micro-organismes est déposée sur le CD (germes contre le CD) . Une nouvelle feuille optiquement transparente peut étre déposée sur la membrane pour la protéger d'une éventuelle contamination ultérieure. Le disque CD avec les micro-organismes et sa feuille de protection peuvent ensuite étre introduits et analysé dans un lecteur de CD-ROM muni de son logiciel spécial (sans codage ni modulation). Pour permettre un repérage fiable le CD est préalablement formaté. Il comprend plusieurs zones de repositionnement (secteurs) en cas d'égarement du laser. Entre chaque zone de repositionnement, le logiciel compte les bits. Cas 2 On utilise toujours un lecteur de CD ou DVD et un logiciel de reconnaissance des micro organismes, mais à la place d'un CD formaté, on utilise cette fois un substrat qui a la forme d'un compact disque (CD) mais qui présente une micro-porosité adaptée à la taille des microorganismes à analyser (une porosité de 0,21lm sera utilisée pour des micro organismes de plus de 0,3m par exemple). Cette micro-porosité étant réalisée de façon à ce que les pores présentent en outre un ordre similaire à celui du formatage d'un CD. Un marqueur a été préalablement déposé, sous forme amorphe et donc optiquement transparent, sur le substrat et une feuille étanche protège le dit substrat de toute contamination et/ou rayure. Juste avant le recucil des micro-organismes, cette feuille étanche est retirée dans des conditions de grande propreté. Pour recueillir les micro-organismes d'un fluide à contrôler (air ou liquide), celui-ci peut- être filtré directement au travers du CD micro-poreux. Le finide peut étre aussi simplement déposé puis séché directement sur le CD. Après recueil des micro-organismes, une nouvelle feuille optiquement transparente est déposée sur le CD pour le protéger d'une éventuelle contamination ultérieure. Le disque CD avec les micro-organismes et sa feuille de protection peuvent ensuite étre introduits et analysé dans un lecteur de CD-ROM muni de son logiciel spécial. Ce procédé et le dispositif associé s'appliquent à l'analyse des microorganismes dans les salles propres telles que les blocs opératoires et les salles blanches (agroalimentaire, électronique...), ainsi qu'à à la détection de micro-organismes en vue d'un contrôle micro-biologique de 1'air, de 1'eau ou de produits alimentaires ou pharmaceutique. -6- Revendications -1- Procédé de détection rapide et sélective de micro-organismes caractérisé en ce que les dits micro-organismes sont détectés par l'analyse de la modification d'un faisceau laser nrojeté sur les dits micro-organismes préalablement recueillis sur un substrat doté de trous ou de marques de tailles inférieures à celles des dits micro-organismes et spécialement agencés pour permettre, grâce au dit laser, un positionnement précis des dits micro-organismes sur le dit substrat. -2- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat est protégé par un film étanche jusqu'au moment o les micro-organismes seront recueillis sur le dit substrat. -3- Procédé suivant les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le substrat est un compact disque (CD) préalablement formaté de façon spécifique sur lequel est déposée une membrane, optiquement transparente, à micro-porosité inférieure à la taille des micro-organismes à analyser pour pouvoir recueillir préalablement les dits micro- organismes, la dite membrane étant déposée sur le dit CD de sorte que les germes soient l 5 emprisonnés entre la partie gravée du CD et la dite membrane. -4- Procédé suivant les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le substrat est un compact disque micro-poreux, le dit compact disque micro-poreux présentant des pores de taille inférieure à la taille des micro- organismes à analyser, pour pouvoir recueillir préalablement les dits micro-organismes, la dite micro-porosité étant réalisée de façon à ce que les pores présentent en outre un ordre similaire à celui du formatage d'un CD, une feuille optiquement transparente étant ensuite déposée sur le CD micro-poreux de façon à emprisonner les dits micro-organismes après avoir été recueillis sur le CD. -5- Procédé suivant les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les micro-organismes sont préalablement à leur recueil, optiquement modifiés grâce à un changement de la structure des dits micro-organismes. -6- Procédé suivant les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les micro-organismes sont optiquement modifiés grâce à un changement de la structure des dits micro- organismes, directement lors de leur recueil sur la membrane ou le CD micro-poreux. -7- Procédé suivant les revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le changement de 3) structure des micro-organismes est obtenu par absorption d'éléments fluorescents par les dits micro-organismes -8- Procédé suivant les revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le changement de structure des micro-organismes est obtenu par absorption de minéraux et/ou formation de microcristaux. -9- Procédé suivant les revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le substrat est un CD double couche dont une couche est recouverte avec au moins un marqueur, I'autre -7 couche étant formatée pour permettre une localisation précise des micro-organismes indépendamment de l'autre couche sur laquelle sont déposés les dits microorganismes. -10- Procédé suivant les revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le les informations fournies par le laser du lecteur de CD, sont analysées par un logiciel permettant la discrimination entre les divers micro-organismes recherchés et les autres corps. -11- Procédé suivant les revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les minéra:x employés pour le marquage des bactéries sont les minéraux à base d' alcalins, d' al calino- terreux, de métaux de transition ou de terres rares. -12- Dispositif pour mettre en _uvre un procédé selon les revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le laser utilisé est celui d'un lecteur de compact disque muni d un logiciel spécial, dépourvu de système de codage et modulation couramment employé