FR 2835058 A1 20030725 FR 0200676 A 20020121 ,. PROCEDE DE DETECTION D'AU MOINS UN PARAMETRE CARACTERISTIQUE DE MOLECULES SONDES FIXEES SUR AU MOINS UNE ZONE ACTIVE D'UN CAPTEUR La présente invention a pour objet un procédé de détection d'au moins un paramètre représentatif de molécules sondes fixées sur des zones d'un capteur. On connat déjà un procédé de détection de l'hybridation de séquences d'ADN à l'aide d'un transistor à effet de champ, tel qu'il a été o décrit dans l'article de E. SOUTEYRAND et collaborateurs intitulé Direct Detection of the hybridization of synthetic Homo-Oligomer DNA Sequences by Field Effect >> paru en 1997 dans le J. Phys. Chem. B1997,101, pages 2980 à 2985. Un transistor de type ISFET ( ) utilisable dans ce type d'application a été décrit dans l'article de s Piet BERGVELD > paru dans Nucleid Acid Research 2000, volume 28, n 14, s pages i à vi. Deux procédés de fixation des molécules sondes sur la surface sont notamment utilisables dans le cadre de la présente invention. Le premier consiste en une synthèse directe sur solide, telle que décrite par exemple dans l'article de S.P.A. Fodor et Collaborateurs intitulé " Light o directed, spatially adressable parallel chemical synthesis >' paru dans Science 251, pages 767 à 773 (1991). Le deuxième est la fixation des molécules à partir d'une dilution. Dans le cas des capteurs comportant une pluralité de zones actives, par exemple les puces à ADN, ou les puces à protéines, il n'existe s pas actuellement de technique disponibie permettant de contrôler facilement et de manière relativement rapide sur quelies zones des molécules sondes ont été fixées effectivement. La présente invention a ainsi pour but un procédé de détection d'au moins un paramètre représentatif de molécules sondes fixées sur au moins une zone d'un capteur, notamment en vue de contrôler le dépôt et la fixation locales des molécules sondes, pour permettre en particulier de remédier au moins partiellement aux problèmes que posent les variations expérimentales importantes qui sont fréquemment rencontrées en pratique. La présente invention concerne ainsi un procédé de détection o d'au moins un paramètre représentatif de molécuies sondes fixées sur au moins une zone active d'un capteur, caractérisé en ce q ue lad it capteur est constitué par un réseau de transistors à effet de champ dont chacun présente une région de source, une région de drain, et une région de porte qui constitue une dite zone active sur laquelle ledit paramètre représentatif des molécules sondes doit être détecté et en ce qu'il comporte les étapes suivantes: _) mettre en contact certaines desUites zones avec des molécules sondes pour réaliser leur fixation, b) baigner dans une solution d'électrolyte au moins ces zones zo qui ont été mises en contact avec des molécules sondes, c) mesurer au moins un point de ia caractéristique courant de drain/tension source-porte / tension sourcedrain d'au moins deux des transistors d'un premier groupe correspondant à des zones mises en contact avec des molécules sondes, par exempie en appliquant à ces transistors du premier groupe dont le drain et la source ont été polarisés, une tension donnée par exemple constante entre la porte et la source ou bien un courant de drain donné par exemple constant, pour en déduire au moins un dit paramètre représentatif par comparaison entre au moins deux des mesures obtenues pour deux différentes zones. Ladite comparaison est so préférentiellement réalisée à l'aide d'une mesure différentielle. Le paramètre représentatif peut être une détection de la fixation de molécules sondes. Entre les étapes _ et b, il peut être prévu un rinçage. Selon un mode particulier de mise en _uvre, le procédé est caractérisé en ce qu'il comporte après a) et avant b) les étapes suivantes: a1) rinçage a2) ajout d'une solution contenant des molécules cibles susceptibles d'interagir spécifiquement avec les molécules sondes, par exemple de s'hybrider avec celles-ci dans le cas o les molécules sondes sont de l'ADN, éventuellement suivi d'un rinçage. Selon un autre mode particulier de mise en _uvre, le procédé est caractérisé en ce qu'il comporte après c, les étapes suivantes: d) ajout d'une solution d'électrolyte contenant des molécules cibles susceptible d'interagir spécifiquement avec les molécules sondes, par exemple de s'hybrider dans le cas o les molécules sondes sont de l'ADN. o e) mesurer au moins un point de la caractéristique courant de drain/tension source-porte / tension source-drain d'au moins deux des transistors d'un deuxième groupe correspondant à des zones mises en contact avec des molécules sondes et avec des molécules cibles, par exemple en appliquant une tension par exemple constante entre la porte et la s source de ces transistors du deuxième groupe dont le drain et la source ont été polarisés ou un courant donné par exemple constant à la source de ces transistors du deuxième groupe, pour obtenir par comparaison au moins un dit paramètre représentatif. Le procédé peut mettre en _uvre une pluralité de dites mesures d'au moins un point de la caractéristique, qui sont espacées au cours du temps. Ceci permet une mesure doublement comparative, dans l'espace et dans le temps. Selon une première variante, la comparaison, notamment par mesure différentielle, est réalisée entre au moins deux transistors s correspondant à des zones qui sont baignées par une solution d'électrolyte, après avoir été mises en contact avec des molécules sondes. Selon une deuxième variante préférée, cette comparaison, notamment par mesure différentielle, est réalisée entre au moins un transistor correspondant à une zone qui est baignée par une dite solution d'électrolyte so après avoir été mise en contact avec des molécules sondes et au moins un transistor correspondant à une zone qui est baignée par ladite solution d'électrolyte sans avoir été préalablement mise en contact avec des molécules sondes. Les molécules sondes sont par exemple des molécules as d'ADN, d'ARN ou de protéines. Le procédé selon l' invention est compatible avec u ne détection classique d'interaction moléculaire par fluorescence. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparatront mieux à la lecture de la description ci-après, en liaison avec les s dessins annexés dans lesquels: -- la figure 1 représente deux transistors à effet de champ d'une puce de détection comprenant une pluralité de tels transistors organisés suivant un réseau bidimensionnel de transistors; - la figure 2 représente en vue de dessus un détail d'une puce o de détection et l'agencement des zones actives correspondant chacune à un transistor à effet de champ; - la figure 3 illustre les connexions électriques de drain des transmissions du réseau bidimensionnel, la figure 4 représentant la résistance des différentes connexions électriques de drain, la courbe A représentant les valeurs calculées et la courbe B les valeurs mesurées, I'écart entre les courbes étant dû pour l'essentiel à la résistance de canal qui est constante. - la figure 5 représente un dispositif de dé?cse de la solution sur des zones actives sélectionnées; - la figure 6 illustre la détection de présence d'ADN silanisé et o de poly-L-lysine avec USG et USD constants, par variation du courant de drain ISD; et - la figure 7 illustre la détection de présence d'ADN silanisé et de poly-L-lysine avec ISD et USD constants, par détection de la variation de la tension USG Les figures 1 à 3 illustrent un capteur présentant un réseau de transistors à effet de champ sur un substrat en silicium. Un transistor T. ou T2 représenté en coupe à la figure 1 est pourvu d'une région de source S et d'une région de drain D qui présentent chacune un contact électrique et qui sont surmontées d'une couche isolante respectivement 1 et 2, par exemple un oxyde thermique de SiO2. La région active 3 entre la source S et le drain D forme la région de porte G du transistor et présente une couche isolante 4 d'épaisseur rébuite, par exemple une couche de SiO2 thermique. Il est également possible de ne pas disposer d'oxyde sur cette région active. La surface active est alors délimitée par une portion 4' du substrat qui est mise ànu. Des molécules sondes, par exemple des molécules d'ADN simple brin, sont fixées par un procédé connu sur au moins certaines des surfaces actives 4 ou 4'. Pour l'ADN, on utilise de préférence des transistors à effet de champ à canal n à appauvrissement (pour lesquels les porteurs de charge sont Ies électrons, plus mobiles d'o une augmentation de la sensibilité) avec une polarisation de porte négative (c'est-à-dire que l'électrolyte est polarisé négativement par rapport au semi-conducteur), I'ADN se chargeant négativement (pour un éiectrolyte de pH neutre). L'application d'une tension source-drain USD entre la source S o et ie drain D (USD' pour T', et USD2 pour T2) et d'une tension porte-source UGS entre l'électrolyte 6 et la source S (par exemple par une électrode E unique Ag/AgCI) induit un gaz bidimensionnel de porteurs de charges à l'interface Si/SiO2, ou à l'interface Si/électrolyte de chaque transistor. Il en résulte un courant de drain ID qui, pour chaque transistor, dépend de façon sensible de s la charge à l'interface SiO2/électrolyle ou Si/électrolyte. On appelle surface active cette interface qui fait face au canal entre la source S et le drain D. Le courant ID dépend de la fixation des molécules sondes, par exemple des molécules d'ADN sur la surface active 4 ou 4'. Comme le montrent les figures 2 et 3, n structures de type zo transistor à effet de champ sont intégrées dans un substrat de siliclum recouvert d'un isolant (SiO2 ou autre) et pourvu de connexions appropriées (métallisation ou de préférence régions conductrices dopées) par les prises de contact électrique de source 10 et de drain (D,... Dn). a la différence d'une structure de transistor MOS standard, il n'y a pas d'électrode métallique de porte. Ceci correspond à la structure de type ). On utilise de préférence un substrat de type SOI (siliclum sur isolant) qui procure une sensibilité plus élevée Les différentes structures sont à faible distance latérale l'une de l'autre et leurs surfaces actives sont en contact avec la même solution de so mesure. Une dimension latérale typique dans la micro-électronique actuelle est inférieure au,um. Dans la technologie des puces à ADN telle que mise en _uvre dans la présente invention, la dimension latérale est de 5-10 m pour une synthèse directe sur le solide et de 50-100 m dans le cas d'une fixation des molécuies à partir d'une dilution. ss Dans la présente configuration de mesure parallèle, plusieurs plots avec différents types de molécules sondes immobiliséss sont en contact avec la même solution de mesure et au moins une structure de transistor se situe en dessous de chaque plot. La mise en oeuvre de plusieurs transistors par plot est possible au vu des dimensions mentionnées cidessus et permet une redondance dans la détection. Une électrode E (Ag/AgCI, par exemple), est utilisée pour fixer le potentiel de la solution de mesure 6 (électrolyle) par rapport à la structure en siliclum qu'elle recouvre et pour fixer le point de travail des capteurs (transistors). Le potentiel de l'électrolyte 6 peut dans certains cas être égal à zéro. La solution de mesure 6 qui baigne les capteurs contient des o ions à une concentration qui donne une conductivité suffisante et qui ne donne pas lieu à un écrantage trop important au niveau des surfaces actives. Son pH est de préférence neutre. Le procédé de détection des reconnaissances moléculaires est basé sur une approche par comparaison, notamment différentielle. La s mesure est réalisée en utilisant plusieurs structures de transistor en parallèle. La mesure peut être différentielle par rapport aux différents types de molécules greffées et inclure éventuellement plusieurs transistors par type de molécuie. Il est également possible de comparer des signaux avant/après la réaction qui révèle la reconnaissance moléculaire (et/ou l'évolution pendant cette réaction). Le procédé selon l'invention permet de contourner les difficultés associées à la sensibilité d'un capteur individuel au pH et à la force ionique et celles associées à une variabilité d'un transistor individuel à l'autre (ceci inclut la structure de transistor et la qualité de la fixation des sondes). U n procédé se lo n u n mode de réalisation préfé ré met en _uvre les étapes suivantes: a) traitements homogènes de toute la surface isolante pour préparer la fixation des molécules sondes; b) greffage local de différents types de molécules sondes so sur au moins certaines des surfaces actives individuelles; c) rinçages homogènes; d) mesure électronique: ajouter l'électrolyte de mesure, plonger l'électrode et mesurer les transistors (par exemple un ou plusieurs points de la caractéristique ID en fonction de USD et de USG), et comparer les :35 résultats obtenus selon les transistors; e) rinçages homogènes; f) et éventuellement ajout de la solution de molécules cibles en présence d'électrolyte et réaction de reconnaissance; g) rincages homogènes; h) mesure électronique, comme (d). En cas de mise en _uvre des étapes f à h, il est possible d'omettre c et d, c'est-à-dire de ne faire qu'une mesure électronique. Certains transistors qui n'ont pas été mis en présence de molécules sondes (ou bien un seui transistor) peuvent servir de témoins. On mesure leurs caractéristiques après ajout de l'électrolyte de mesure qui par o exemple, baigne l'ensemble des transistors. Le greffage des molécules sondes est réalisé par dépôt de microgouttelettes de diamètre environ 100 sur les surfaces actives des transistors à l'aide de micro-plumes métalliques qui sont disponibles commercialement. s Comme le montre la figure 3, le réseau de n transistors (par exemple n = 96 transistors) présente n connexions de drain D, D2... Dn et 2 connexions (non représentées) équivalentes à la source commune. Les résistances série Rc associées à ces connexions ont des valeurs qui dépendent de l'index l...n du drain. zo Les valeurs de ces résistances Rc, réalisées par exemple par dopage du silicium, ne sont pas négligeables. A cet effet les résistances Rc de connexion de drain sont calculées à partir des longueurs et des sections géométriques des lignes dopées dont on connat la résistivité. Le calcul est comparé à une mesure de la résistance en fonction de l'index du drain en appliquant une tension continue (par exemple USD=0,1V et USG=2V). Ceci permet d'obtenir une courbe de compensation donnée à titre d'exemple à la figure 4. Une installation telle que celle représentée à la figure 5 peut être utilisée pour la mise en _uvre du procédé: sur une table 10, est o disposée une platine 12 incorporant un dispositif de commande à micro contrôleur pour une table 11 assurant un déplacement selon trois directions perpendiculaires X, Y. Z. Une puce 15 incorporant le réseau de n transistors est disposée sur un support 14. Une autre platine 20 comportant une table 21 assurant un déplacement selon les trois directions X, Y. et Z est mise en ss ceuvre pour déplacer un bras 22 portant une micro-plume ou une pipette 23 pour assurer le dépôt des microgouttelettes sur au moins certains des n transistors. Un objectif 17 et/ou une caméra couplée à un écran 19 permettent d'observer le dépôt des micro-gouttelettes et de contrôler les opérations. On effectue des mesures de courant de drain ID avec par exemple USG = 1 V et USD = 0,9V et un électrolyte de pH neutre déposé qui est s constitué de KCI à une teneur de 0,1 millimole par litre. Les transistors (canal p à accumulation) ayant leurs sources interconnectées, la tension de source ou la tension de porte peut servir de référence de tension (par exemple la tension de masse). Une mise en _uvre du procédé sera maintenant décrite en o liaison avec la figure 6. Avant ces mesures, on effectue un traitement global de la surface de la structure Si/SiO2 par incubation 1-2 minutes dans de l'acide sulfochromique et rinçage sous un courant d'eau délonisée puis incubation 3 à 5 minutes dans une solution de NaOH (60,ul NaOH 16N, 4201 d'éthanol et 220 pI d'eau), et enfin rinçage sous un courant d'eau délonisoe. La différence entre deux mesures effectuées avant dépôt local mais avant et après un rinçage à l'eau est présentée en petits carrés à la figure 6. Les croix représentent la différence entre une mesure effectuée après dépôt local de deux solutions différentes et une mesure faite avant le dépôt (la mesure faite avant le rinçage à l'eau). Avec une pointe commerciale 23 (Telechem SMP3B) montée sur le dispositif 22 présenté à la figure 5, on dépose une solution 1 sur les transistors 57 (avec un contact entre pointe et surface), les transistors 19-21 et les transistors 33-37 et une solution 2 sur les transistors 66-69, les transistors 76-79, et les transistors 87-89. Solution 1: 0,5 l oligonucléctide 20 mer modifiée thiol en 5' à 1 nmol/l, 9 pI sodium acétate 30 mM à pH 4,3, 0,5,ul mercaptosilane 5mM dans sodium acétate, que l'on laisse réagir une heure à température amblante, avant le dépôt. :;o Solution 2: Poly-L-lysine (0,01% poids/volume dans un tampon PBS 0,1X à pH 7. Après les dépôts locaux, I'échantillon est séché 15 minutes en atmosphère humide et ensuite 5 minutes à 50 C. La poly-L-lysine est positive dans l'électrolyle de mesure (pH neutre) à cause des g roupements am ines ion isés. La d im in ution d u cou rant observé sur les dépôts de poly-L-lysine est compatible avec l'adsorption d'une charge positive sur la surface. Pour la solution 1, la modification silane sur l'ADN réagit avec les groupements OH de SiO2 et l'ADN est chargé négativement en solution. Les solutions l et 2 donnent donc des signaux de signes opposés. Une autre mise en _uvre de procèdé sera maintenant décrite .. en lason avec la fgure 7. On mesure la différence de potentiel de surface AVSG o correspondant à la mesure avant/après dépôt. Pour déterminer AVSG on mesure la caractéristique bidimensionnelle par exemple ID(USD, USD) et on détermine les caractéristiques intrinsèques des 96 transistors en corrigeant numériquement en fonction des résistances Rc des lignes de drain en série. La modification de l'état de l'interface SO2 induit un changement de la s caractéristique intrinsèque qui correspond à un décalage AUSG à UDS et courant de drain ID constants. Ce décalage permet d'obtenir directement une mesure indépendante du point de travail du transistor, contrairement au changement de courant AID présenté dans la figure 6. La valeur AUSG permet en première approximation de quantifier le changement de l'interface o SO2/liquide induit par le dépôt local. Selon une variante, on fait varier UGS de façon à garder ID constant. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection d'au moins un paramètre représentatif de molécules sondes fixées sur des zones actives d'un capteur, caractérisé en ce que ledit capteur est constitué par un réseau de transistors à effet de champ (T, T2...)dont chacun présente une région de source (S), une région de drain (D), ainsi qu'une région de porte qui constitue une dite zone active (3) sur laquelle ledit paramètre représentatif doit être détecté et en ce qu'il comporte les étapes suivantes: o _) mettre en contact certaines desdites zones (3) avec des molécules sondes pour réaliser leur fixation, _) baigner dans une solution d'électrolyte (6) au moins ces zones qui ont été mises en contact avec des molécules sondes, c) mesurer au moins un point de la caractéristique courant de drain/tension source-porte/tension source-drain d'au moins deux des transistors d'un premier groupe correspondant à des zones (3) mises en contact avec des molécules sondes pour en déduire au moins un dit paramètre représentatif par comparaison entre au moins deux dites mesures obtenues pour deux différentes zones. o 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite mesure d'au moins un point de la caractéristique met en _uvre l'application d'une tension donnse (UDS) entre le drain et la source d'au moins lesdits deux transistors du premier groupe ainsi que l'application dans un premier cas d'une tension donnée (UGS) entre la porte et la source de ces transistors du premier groupe ou, dans un deuxième cas d'un courant de drain (ID)donné à ces transistors du premier groupe, 3. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente entre a et b une étape de rinçage. 4. Procédé selon une des revendications précédentes, so caractérisé en ce qu'il comporte après a) et avant b) les étapes suivantes: a1) rinçage a2) ajout d'une solution contenant des molécules cibles susceptibles d'interagir spécifiquement avec les molécules sondes. 5. Procédé selon une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte après c, les étapes suivantes: d) ajo ut d ' u ne solution d'é lectrolyle (6) co nte nant d es molécules cibles susceptibles d'interagir spécifiquement avec les molécules sondes. e) mesurer au moins un point de la caractéristique courant de drain/tension, source-porte / tension source-drain d'au moins deux des transistors d'un deuxième groupe correspondant à des zones (3) mises en contact avec des molécules sondes et avec des molécules cibles pour obtenir par comparaison au moins un dit paramètre représentatif. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que, au o point e, la mesure d'au moins un point de la caractéristique met en _uvre l'application d'une tension donnée (UDS) entre le drain et la source des transistors d'au moins lesUits deux transistors du deuxième groupe, et l'application dans un premier cas d'une tension donnée (UGS) entre la porte et la source de ces transistors du deuxième groupe ou dans un deuxième cas d'un courant de drain (ID) donné à ces transistors du deuxième groupe, 7. Procédé selon une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il met en _uvre une pluralité de dites mesures d'au moins un point de ia caractéristique, qui sont espacées au cours du temps. 8. Procédé selon une des revendications précédentes, o caractérisé en ce que ladite comparaison est réalisée par mesure différentielle. 9. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la comparaison est réalisée entre des mesures effectuées sur au moins deux transistors correspondant à des zones (3) qui sont baignées par une solution d'électrolyte (6) après avoir été mises en contact avec des molécules sondes. 10. Procédé selon une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la comparaison est réalisée entre des mesures effectuées sur au moins un transistor correspondant à une zone (3) qui est baignée par une o solution d'électrolyte (6) après avoir été mise en contact avec des molécules sondes en vue de leur fixation et sur au moins un transistor correspondant à une zone qui est baignée par ladite solution d'électrolyte (6) sans avoir été mise en contact avec des molécules sondes. 11. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que led it paramètre représentatif est u ne détection de la fixation de molécuies sondes sur une dite zone (3). 12. ProcAdA salon una des ravandicabons prAcAdantes, carac1AhsA an ca qua las molecules sondes song des molecules d'ADN, d'ARN ou da pro141nas. 13. ProcAdA salon la ravandicabon 12, carac14dsA an ca qua les molecules sondes song des molecules d'ADN et en ce que les bansls10rs eMe1 de champ song de type canal n appauvMssement avec une