FR 2834998 A1 20030725 FR 0200608 A 20020118 revendication 9. La présente invention a pour objet un procédé de contrôle de la présence de micro-organismes dans un milieu gazeux comprenant du peroxyde d'hydrogène, ainsi que des cassettes contenant un milieu de culture gélosé pouvant être mises en _uvre dans ce procédé. Il est bien connu que, pour la mise en _uvre de certains procèdés industriels, en particulier dans l'industrie pharmaceutique, des actes ou manipulations doivent être réalisés dans des zones de préparation confinées, telles que des isolateurs, séparées du monde extérieur et rendues aseptiques. Il est courant, pour contrôler l'asepsie du milieu gazeux, généralement de l'air, régnant dans ces zones confinées, de prélever un échantillon gazeux pouvant contenir des micro-organismes, des bactéries, levures ou moisissures, de les déposer sur une couche de gélose contenue dans un récipient ou cassette, pour ensuite mettre ce récipient à incuber à la température, pendant un temps prédéterminé, de sorte à ce que ces microorganismes forment des colonies visibles à l'_il nu. On peut ainsi visualiser, compter, et, le cas échéant, identifier les colonies de micro-organismes présents dans l'air analysé. Pour procéder à la stérilisation de ces zones confinées, on peut notamment utiliser du peroxyde d'hydrogène sous forme gazeuse. Le peroxyde d'hydrogène, introduit dans un milieu gazeux aux fins d'asepsie, sera dénommé, dans la description qui suit, " peroxyde d'hydrogène exogène " Ainsi, en particulier pour ce qui concerne la stérilisation des isolateurs, on procède généralement en trois étapes: À une étape de déshumidification destinée à sécher l'air ambiant de l'isolateur, pendant une période d'environ 15 à 20 minutes; une étape de gazage pour la mise en contact d'une certaine quantité de peroxyde d'hydrogène avec l'environnement interne de l'isolateur, et À une étape d'aération, qui permet d'éliminer le peroxyde d'hydrogène. A l'issue de ce cycle de stérilisation, un contrôle du taux de micro- organisme est réalisé par prélèvement d'air à l'intérieur de l'isolateur pour s'assurer de sa stérilité. Toutefois, malgré les précautions prises, notamment au cours de I'étape d'aération, la demanderesse a pu constater que ce milieu gazeux peut contenir des quantités résiduelles significatives de peroxyde d'hydrogène, pouvant fausser les résultats du contrôle du taux de micro-organismes et conduire alors à des faux négatifs. La demanderesse a alors cherché à mettre au point un procédé pour résoudre le problème du contrôle de la présence eVou du taux de micro- organismes dans une zone confinée, en présence d' une quantité sign ificative de peroxyde d'hydrogène, pour éviter tout risque de faux négatifs. Il est par ailleurs connu que des micro-organismes ayant subit un stress, peuvent entrer dans un état o ils sont toujours actifs, mais incapables de se multiplier sur un milieu de culture. En effet, ces micro-organismes perdent, en raison du stress, leur activité catalase et superoxide dismutase. Alors, quand ils sont placés sur un milieu nutritif riche, ils ne disposent plus des moyens pour éliminer les peroxydes, en particulier le peroxyde d'hydrogène, qu'ils produisent eux-mêmes quand ils sont mis en culture ou qui sont formés par réaction photochimique ou par autooxydation de certains composés présents dans le milieu de culture. Dans la description qui suit, on appellera " peroxyde d'hydrogène endogène ", un tel peroxyde d'hydrogène formé par les micro organismes eux-mêmes ou suite à des réactions impliquant les composés constitutifs du milieu de culture. Certains auteurs ont proposé d'ajouter aux milieux de culture des composés connus pour dégrader le peroxyde d'hydrogène endogène, comme les catalases, ou des composés non-enzymatiques comme l'acide acétoglutarique, I'acide 3,3'-thiodipropionique et le pyruvate de sodium, en vue d'identifier et/ou compter les micro-organismes présents dans un milieu, malgré tout phénomène de stress. Ainsi, R. M. Lee et al, in Joumal of Food Protection, Vol.52, Feb. 1989, pp 119-121, ont décrit l'ajout de teneur croissante de pyruvate de sodium à un milieu de culture gélosé, pour augmenter la récupération des coliformes d' échanti llons de prod uits alimentaires et d 'eau. J. P. Calabrese et al., in Can. J. MICROBIOL., Vol. 36, 1990, pp 544-550, ont montré que l'ajout de catalase, de pyruvate de sodium ou de leur combinaison, permettaient d'augmenter la récupération des coliformes stressées par des eaux acides. S. Czechowicz et al., in Infemational Joumal of Food Microbiology 33 (1996), pp 275-284, et Y. Mizunoe et al., in Arch Microb. (1999) 172: 63-67, ont utilisé des catalases, I'acide o-cétoglutarique, I'acide 3,3'- thiodiproplonique et le pyruvate de sodium pour augmenter la récupération d'Escherichia coli dégradées soit par la privation de nourriture, soit par un stress thermique. En vue de résoudre le problème qu'elle s'était posé, tel que mentionné ci-dessus, la demanderesse a envisagé, dans un premier temps, de mettre en oeuvre un milieu de culture gélosé, supplémenté en catalase. Toutefois, elle a alors rencontré une diffculté, que les auteurs des articles précités ne semblent pas avoir connue, et qui para^'t être spécifique au problème du contrôle de la présence et du taux de microorganismes dans un milieu gazeux comprenant du peroxyde d'hydrogène exogène. Ainsi, à l'instar de certains des auteurs précités, la demanderesse a dans un premier temps ajouter une catalase au milieu de culture mis en _uvre. Mais, il s'est avéré que la dégradation du peroxyde d'hydrogène par la catalase conduisait à la formation de quantité importante de bulles d'oxygène en surface et dans la masse de la gélose du milieu de culture gélosé. Or, ces bulles rendaient très diffcile la visualisation des colonies de micro-organismes. Par ailleurs, la mise en _uvre de catalase en des teneurs allant jusqu'à 8000 Ul/plaque (c'est à dire par milieu de culture gélosé), n'a permis d'obtenir qu'un taux de recouvrement des microcrganismes, tel que défini ci-après, relativement faible, de l'ordre de 60%. Des teneurs plus importantes en catalase n'ont pas été envisagées par la demanderesse. En effet, il a été considéré que cela aurait entrané la formation de bulles d'oxygène en une quantité telle que la visualisation des colonies de microorganismes aurait été rendue plus difficile encore, voire impossible. En outre, les catalases sont des produits onéreux, de sorte que leur utilisation en des quantités trop importantes serait rédUibitoire d'un point de vue économique, sans garanti que cela puisse améliorer le taux de recouvrement. La demanderesse a poursuivi ses recherches et a pu résoudre le problème évoqué plus haut au moyen du procédé constituant un premier objet de cette invention. Ainsi, I'invention consiste en un procédé de contrôle de la présence de micro-organismes dans un milieu gazeux comprenant du peroxyde d'hydrogène, caractérisé en ce qu'on met en _uvre les étapes suivantes: (i) on met en contact le milieu gazeux comprenant du peroxyde d'hydrogène avec un milieu de culture gélosé, comprenant un sel de l'acide pyruvique; (ii) on dispose le milieu de culture dans un environnement favorisant le développement de colonies de micro-organismes; (iii) on détermine la présence de colonies de micro-organismes qui se sont éventuellement développées au cours de l'étape (ii). Le sel de l'acide pyruvique permet d'effectuer le contrôle de la présence de micro-organismes présents dans un milieu gazeux, sans risque de faux négatif. En outre, et contrairement à ce qui a pu être observé par la mise en _uvre de la catalase, le sel de l'acide pyruvique ne gêne pas la détermination des colonies de micro-organismes et permet un taux de recouvrement élevé. Ceci n'était pas attendu dans la mesure o, certains des auteurs mentionnés plus haut, en vue de permettre la croissance des colonies de micro- organismes en présence de peroxyde d' hyd rogène end ogène, uti lisent indifféremment un milieu de culture additivé avec une catalase ou du pyruvate de sodium. L' invention va à p résent être décrite en détai l au regard de la description qui suit et des figures. La figure 1 représente un histogramme montrant l'effet, sur le taux de recouvrement des micro-organismes, d'une concentration de 0,3 ppm de peroxyde d'hydrogène. La figure 2 représente un histogramme montrant l'effet, sur le taux de recouvrement des micro-organismes, de pyruvate de sodium en présence de 8 ppm de peroxyde d'hydrogène. La figure 3 représente un histogramme montrant l'effet, sur le taux de recouvrement des micro-organismes, du pyruvate de sodium après stérilisation par rayon gamma. La figure 4 représente un histogramme montrant l'effet, sur le taux de recouvrement des micro-organismes, d'une catalase, en concentration croissante, en présence de 3 ppm de peroxyde d'hydrogène. Au sens de la présente invention, on entend par l'expression " taux de recouvrement des micro-organismes ", le rapport entre, d'une part, le nombre de colonies de micro-organismes formées (cfu) sur un milieu de culture gélosé préalablement exposé à un milieu gazeux déterminé, sur lequel on a appliqué une suspension aqueuse contenant un nombre connu de micro-organismes (cfu), et, d'autre part, le nombre de colonies de microorganismes formées (cfu) sur un milieu de culture gélosé après application d'une même suspension aqueuse de micro-organisme, le milieu de culture gélosé ayant été préalablement conservé sous atmosphère stérile et n'ayant pas été exposé audit milieu gazeux déterminé, toute chose étant égale par ailleurs. Habituellement, le milieu gazeux comprenant le peroxyde d' hyd rogène, est l'air amb iant, en particulier l' air ambiant présent dans u ne zone confinée, telle un isolateur. La teneur en peroxyde d'hydrogène dans le milieu gazeux peut être comprise entre 0,1 ppm (partie par million) et 20 ppm, plus généralement entre 0,2 ppm et 10 ppm. Un ppm de peroxyde d'hydrogène correspond à 1,4 mg de peroxyde d'hydrogène /m3. Le milieu de culture gélosé peut comprendre, outre de la gélose, un produit de digestion enzymatique d'une protéine, telle que la caséine, une farine végétale ou des extraits de levure. Le milieu de culture gélosé peut consister en un milieu TSA (Tryptic Soy Agar) comportant: * un produit de digestion pancréatique de la caséine 15 g * un produit de digestion par la papane de la farine de soja 5 g * chlorure de sodium 5 g * gélose 15 g * eau qs 1000 ml Un milieu de culture gélosé TSA pouvant convenir est commercialisé par la société DIFCO sous la référence 236950. Le milieu de culture gélosé peut comprendre de 0,1 à 3 % en poids, de préférence de 0,5 % à 1,5 % en poids, d'au moins un sel d'acide pyruvique. Le sel de l'acide pyruvique pouvant être mis en _uvre dans le cadre de la présente invention peut être un sel d'un métal alcalin, comme le sodium ou le potassium, un sel d'un métal alcalino-terreux, comme le calcium ou le magnésium ou un mélange de deux ou plusieurs de ces sels. De préférence, on met en _uvre du pyruvate de sodium. Le milieu de culture gélosé présente de préférence une épaisseur comprise entre 1 et 20 mm, de préférence entre 5 et 8 mm. Le milieu de culture peut être préparé de manière connue de l'homme du métier, par simple mélange de ses constituants. Selon le procédé de l'invention, on met avantageusement en contact la surface du milieu de culture gélosé avec un flux contrôlé dudit milieu gazeux comprenant du peroxyde d'hydrogène, ledit flux présentant un débit substantiellement constant. En mettant en contact un flux ainsi contrôlé pendant un laps de temps prédéterminé, on peut choisir le volume d'air, ou d'un autre milieu gazeux, que l'on veut appliquer à la surface du milieu de culture gélosé et rend re ai nsi reprod uctible le procédé de l' invention. Un tel flux contrôlé peut être réalisé au moyen d'un appareil de prélèvement comprenant des moyens d'aspiration d'air, comme une pompe, ainsi que des moyens pour maintenir une cassette dans laquelle on a coulé le milieu de culture gélosé, de sorte à permettre la mise en contact de l'air avec la surface de la gélose. Un tel dispositif est décrit dans les demandes de brevet français N 98 07299 et 98 05166, au nom de Millipore S.A., auxquelles il est fait référence dans la présente description. Un tel dispositif est aussi commercialisé par la société Millipore, sous la marque M Air T Isolator. La mise en culture du milieu gélosé ayant été mis en contact avec le milieu gazeux peut être réalisée dans tout dispositif adapté, tel une étuve thermostatée. Généralement, à l'issue de l'étape (iii) du procédé de l' invention, on dénombre les colonies formées et/ou on identifie la nature des micro-organismes qui composent ces colonies, par des moyens connus de l'homme du métier. Pour faciliter le dénombrement des colonies, on peut mettre en _uvre des cassettes quadrillées, que l'on remplit avec le milieu de culture gélosé. Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci consiste en une cassette munie de moyens de fixation à un appareil de prélèvement d'air ou d'un autre milieu gazeux, tel que décrit ci-dessus, et dans laquelle est coulé un milieu de culture gélosé comprenant un sel de l'acide pyruvique. Une telle cassette, comprenant un milieu de culture gélosé conventi onnel le, est co nnue en elle-même. Elle est commercialisée par la société Millipore sous la marque M air T. Une cassette conforme à l'invention peut être mise en _uvre dans le procédé décrit plus haut. Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer la présente invention. Exemple 1 (non conforme à l'invention) Afin de vérifier l'influence de traces de peroxyde d'hydrogène gazeux (vhp) sur la formation de colonies de différents micro-organismes, on a tout d'abord prélevé 1 m3 d'air dans une hotte à flux laminaire faisant office d'environnement stérile et dépourvu de peroxyde d'hydrogène. L'air ainsi prélevé a été impacté à la surface d'un milieu de culture gélosé TSA, commercialisé par la société DiFCO sous la référence 236950. On a étalé à la surface du milieu de culture, une suspension aqueuse comprenant un nombre prédéterminé de micro-organismes. On a placé ensuite les milieux de culture TSA dans une étuve thermostatée pour permettre la croissance des colonies de microorganismes. On a répété cet essai, mais en mettant en _uvre un milieu de culture gélosé TSA impacté par 1 m3 d'air comprenant 0,3 ppm de peroxyde d'hydrogène. Les résultats obtenus sont représentés à la figure 1, o l'axe des abscisses représente la nature des micro-organismes qui se sont développés à la surface du milieu de culture gélosé et l'axe des ordonnées représente le taux de recouvrement, à savoir le rapport entre le nombre de cfu déterminé en présence de peroxyde d'hydrogène et le nombre de cfu déterminé en environnement stérile. Les résultats obtenus montrent qu'une faible teneur de peroxyde d'hydrogène peut conduire à l'inhibition de la formation des colonies de micro organismes et donc conduire à des faux négatifs. Exemple 2 On a reproduit l'exemple 1 mais en utilisant 1 m3 d'air comprenant 8 ppm de peroxyde d'hydrogène (au lieu de 0,3 ppm) que l'on a impacté, dans un premier temps, sur le milieu de culture TSA, puis, dans un second temps, sur le milieu TSA additivé par 1% en poids de pyrovate de sodium. Les résultats obtenus sont représentés à la figure 2, o l'axe des abscisses rep résente la natu re des m icro-org an ismes et l' axe des o rdo n nées représente le taux de recouvrement. On constate que le pyruvate de sodium permet la formation et le dénombrement des colonies de micro-organismes alors que le milieu de culture n'en comprenant pas, n'autorise pas la formation de colonies de micro- organismes. On constate encore que le taux de recouvrement est très bon puisqu'il est toujours d'au moins 80%, ce quel que soit le microorganisme considéré. Exemple 3 On a reproduit l'exemple 2 en prélevant 1 m3 d'air comprenant 8 ppm de peroxyde d'hydrogène que l'on a impacté, dans un premier temps, sur le même milieu de culture TSA additivé par 1% en poids de pyruvate de sodium, non stérilisé par l'action des rayons gamma. Puis, dans un second temps, on a répété le même essai mais, cette fois, sur le même milieu de culture stérilisé par l'action des rayons gamma. Les résultats obtenus sont représentés à la figure 3, o l'axe des abscisses rep résente la natu re des mi cro-o rg an ismes et l ' axe des ord on nées représente le taux de recouvrement. On constate que le pyruvate de sodium conserve son effet que le milieu de culture gélosé soit stérilisé ou non par des rayons gamma. Exemple 4 (non conforme à l'invention À On a reproduit l'exemple 1 mais en utilisant 1 m3 d'air comprenant 3 ppm de peroxyde d'hydrogène (au lieu de 0,3 ppm) que l'on a impacté cette fois sur des milieux de culture gélosé TSA additivé par des teneurs croissantes d'une catalase (de 0 à 8000 Ul/plaque). Le seul micro-organisme mis en _uvre était Staphylococcus aureus. Les résultats obtenus sont représentés à la figure 4, o l'axe des abscisses représente la teneur en catalase et l'axe des ordonnées représente le taux de recouvrement. On constate que la catalase, utilisé en des teneurs élevées (8000 Ul/plaque) permet un taux de recouvrement maximum de 60%, ce qui est bien inférieur aux résultats obtenus avec le procédé de l'invention, qui a conduit à un tsux de recouvremen1 de pros de 120 pour ce qui concerns Staphylococcus aureus. En outre, la catalase a provoqud +a formation de buues d'oxygAne Hi on Ins Dada numb den mu. REVENDICATIONS 1. Un procédé de contrôle de la présence de micro-organismes dans un milieu gazeux comprenant du peroxyde d'hydrogène, caractérisé ce qu'on met en _uvre les étapes suivantes: (i) on met en contact le milieu gazeux comprenant du peroxyde d'hydrogène avec un milieu de culture gélosé, comprenant un sel de l'acide pyruvique; (ii) on dispose le milieu de culture dans un environnement favorisant le développement de colonies de micro-organismes; (iii) on détermine la présence de colonies de microorganismes qui se sont éventuellement développées au cours de l'étape (ii). 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le milieu gazeux est l'air ambiant. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la teneur en peroxyde d'hydrogène dans le milieu gazeux est compris entre 0,1 ppm et 20 ppm, de préférence entre 0,2 ppm et 10 ppm. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu de culture gélosé comprend de 0,1 à 3 % en poids, de préférence de 0,5 % à 1,5 % en poids, d'au moins un sel d'acide pyruvique. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le sel de l'acide pyruvique est le pyruvate de sodium. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu de culture gélosé présente une épaisseur comprise entre 1 et 20 mm, de préférence entre 5 et 8 mm. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on met en contact la surface du milieu gélosé avec un flux dudit milieu gazeux comprenant du peroxyde d'hydrogène, ledit flux présentant un débit substantiellement constant. 8. Procédé selon rune des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'à, I'issue de l'étape (iii), on dénombre les colonies formées et/ou on identifie la nature des micro-organismes qui composent ces colonies. 9. Une cassette comprenant des moyens de fixation à un appareil de prélèvement d'air ou d'un autre milieu gazeux et dans laquelle est coulé un