FR 2845693 A1 20040416 FR 0311983 A 20031014 On connaît différents virus de type herpès qui se distin- guent par leur génome ainsi que par leurs caractéristiques biologiques. Une sous famille de ces virus correspond aux alpha herpès virus parmi lesquels on peut nommer les virus herpès simplex humain de 5 type 1 et de type 2 (HSV-1 et HSV-2), le virus de la maladie d'Aujeszky ou Pseudorabies virus (PRV) et l'herpès virus bovin de type 1 (BHV-1). Tous ces virus présentent la particularité d'être neurotropes et d'avoir un cycle de réplication très bref et un large spectre d'hôte. L'infection par ces virus provoque des lésions de l'épiderme, 10 se situant en règle générale au niveau des muqueuses, suivies d'une pro- pagation du virus au système nerveux pouvant y entraîner des inflamma- tions aiguës, ainsi que des infections latentes. Parmi les alpha herpès virus entraînant les ravages les plus importants, on peut citer le virus PRV qui est un agent pathogène d'une 15 importance économique majeure en production porcine tant par le coût direct des pathologies induites que par celui des moyens de lutte mis en oeuvre . Ce virus est largement présent dans la plupart des régions de forte production porcine (Europe, Amérique du Nord, Asie). 20 Il existe actuellement plusieurs vaccins contre le virus PRV qui représentent un marché important à l'échelle mondiale. Une telle vaccination n'est cependant pas sans inconvé- nients compte tenu en particulier du coût entraîné par la nécessité de vacciner une large proportion des animaux d'un troupeau et les problèmes 25 pratiques liés à cette nécessité qui rendent cette opération particulière- ment incommode, ce d'autant plus qu'il est en général nécessaire de faire plusieurs injections. Le coût et les contraintes de cette opération peuvent en li- miter l'usage et par là même également l'efficacité. 30 Des stratégies d'éradication du virus sont également utili- sées avec des résultats variables mais toujours fragiles. Le virus BHV-1 responsable de la rhinotrachéite infectieuse bovine provoque lui aussi des ravages très importants dans les élevages. Ce virus est en effet très contagieux tant chez les veaux 35 nouveaux nés que chez les animaux plus âgés ; il peut provoquer une in- flammation au niveau de la cavité nasale, du larynx, des lésions oculaires et des affections respiratoires, mais également se localiser au niveau du cerveau en provoquant des encéphalites ou encore prendre des formes gé- nitales. Ces différentes affections qui sont fréquemment fatales chez le veau nouveau né entraînent des pertes très importantes pour les éle- 5 veurs ; de plus, chez les vaches laitières, on peut observer une chute dra- matique de la production de lait. Il existe également plusieurs vaccins contre le virus BHV-1, mais la vaccination présente les mêmes inconvénients que la vaccination contre le virus PRV dans les élevages porcins. 10 De plus des vaccins contre le virus BHV-1 injectés par voie intra musculaire ont été considérés comme responsables d'avortements chez les vaches gestantes. L'éradication du virus a également été proposée notamment dans certains pays européens, mais elle se révèle particulièrement difficile 15 en raison du caractère latent du virus qui peut demeurer longtemps inac- tif au sein d'un organisme avant de se manifester, notamment sous l'effet d'un stress. Par suite, la conception d'un procédé permettant d'engendrer des lignées de porcs transgéniques constitutivement résis- 20 tants au virus PRV ou encore des lignées de bovins transgéniques consti- tutivement résistants au virus BHV-1 aurait un intérêt économique considérable. L'invention a pour objet de proposer un tel procédé. Celui-ci a pu être conçu grâce à des recherches préalables 25 effectuées sur un modèle souris, qui tout comme le porc ou le bovin est sensible à certains alpha herpès virus et en particulier aux virus HSV1et PRV. Il est connu que les alpha herpès virus se lient aux cellules d'abord grâce à l'interaction d'une glycoprotéine virale gC, entrant dans la 30 constitution de la membrane du virion et de l'héparane sulfate présent à la surface des cellules, alors que la fusion ultérieure entre l'enveloppe du virion et la membrane cellulaire fait, quant à elle, intervenir d'autres gly- coprotéines (gB, gD, gH et gL). De nombreux travaux ont porté sur l'étude de récepteurs 35 potentiels des alpha herpès virus présents à la surface des cellules de mammifères hôtes ayant une capacité de fixation de la particule virale et pouvant éventuellement neutraliser ainsi son pouvoir infectieux. Quatre protéines récepteurs des alpha herpès virus ont été identifiées à ce jour à savoir : - le HVEM ou HveA qui est un médiateur d'entrée des virus HVS1 et HVS2 mais pas du virus PRV (Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum 5 B. J., and Spear, P.G. (1996). Herpes simplex virus-1entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell 87, 427-436). - trois membres de la superfamille des immunoglobulines (HveB ou nec- tin-2 ; HveC ou nectin-1et HveD) 10 (Cocchi, F., Menotti, L., Mirandola, P., Lopez, M., and Cam- padelli-Fiume, G. (1998). The ectodomain of a novel member of the immu- noglobulin subfamily related to the poliovirus receptor has the attribute of a bona fide receptor for herpes simplex virus types 1 and 2 in human cells. J. VIrol. 72, 9992-10002 ; 15 Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Eisenberg, R. J., Cohen G. H., and Spear, P. G. (1998) Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor related protein 1 and poliovirus receptor. Science 280, 1618-1620 ; Shukla, D., Liu, J., Blaiklock, P., Shworak, N. W., Bai, X., 20 Esko, J. D., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Rosenberg, R. D., and Spear, P. G. (1999). A novel role for 3-O-sulfate heparan sulfate in herpes simplex virus entry. Cell 99, 13-22 ; Warner, M. S., Martinez, W., Geraghty, R. J., Montgomery, R. I., Witbeck, J. C., Xu, R., Eisenberg, R ; J., Cohen, G. H., and Spear, P. 25 G. (1998). A cell surface protein with herpesvirus entry activity (HveB) confers susceptibility to infection by herpes simplex virus type 2, mutants of herpes simplex virus type 1 ans pseudorabies virus. Virology 246,179- 189. Selon les publications Spear, P. G. (1993). Entry of alpha- 30 herpesviruses into cells. Semin. Virol. 4, 167-180 ; Campadelli-Fiume, G., Arsenakis, M., Farabegoli, F., and Roizman, B. (1988). Entry of herpes simplex virus 1 in BJ cells that constitutively express viral glycoprotein D is by endocytosis and results in degradation of the virus. J. Virol. 62,159- 167, il a été suggéré que, outre la liaison initiale avec l'héparane sulfate, 35 c'est l'interaction de la glycoprotéine gD de l'alpha herpès virus avec un récepteur présent à la surface de la cellule qui permet l'entrée du virus sous une forme infectieuse et que dans certains types de cellules, les virus HSV-1, PRV et BHV-1 peuvent utiliser un récepteur commun de la glyco- protéine gD pour entrer dans la cellule. Il a ainsi été prouvé que la protéine HVEM peut permettre l'entrée des virus HSV1et HSV2 dans des cellules non permissives, mais 5 pas celle du virus PRV. En revanche, il a été démontré que la protéine HveC, et no- tamment celle du porc se comporte comme un récepteur fonctionnel non seulement du virus HSV.1 mais également des alpha herpès virus ani- maux PRV et BHV-1(Milne, R. S. B., Connolly, S. A., Krummenacher, C., 10 Eisenberg, R. J., and Cohen, G. H. (2001). Porcine HveC, a member of the highly conserved HveC/nectin 1 family, is a functional alphaherpesvirus receptor. Virology 281, 315-328 ; Cocchi, F., Menotti, L., Mirandola, P., Lopez, M., and Campadelli-Fiume, G. (1998). The ectodomain of a novel member of the immunoglobulin subfamily related to the poliovirus recep- 15 tor has the attribute of a bona fide receptor for herpes simplex virus types 1 and 2 in human cells. J. Virol. 72,9992-10002 ; Geraghty, R. J., Krum- menacher, C., Eisenberg, R. J., Cohen G. H., and Spear, P. G. (1998) En- try of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor related protein 1 and poliovirus receptor. Science 280,1618-1620). 20 Les capacités de liaison à la glycoprotéine virale gD sont plus particulièrement attribuées au domaine V pour HveC et aux deux premiers domaines riches en cystéine ( CRD ) pour HVEM (Structure- Based Analysis of the Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Binding Site Present on Herpesvirus Entry Mediator HevA (HVEM). Connolly SA, Land- 25 sburg DJ, Carfi A, Wiley DC, Eisenberg RJ, Cohen GH ; virol 2002, Nov 1 ; 76 (21) : 10894-10904). Cependant il a été montré dans la publication Martinez WM, Spear PG, Amino acid substitutions in the V domain of nectin-1 (HveC) that impair entry activity for herpes simplex virus types 1 and 2 30 but not for Pseudorabies virus or bovine herpesvirus 1, J Virol. 2002 Jul ; 76(14) : 7255-62, que les capacités de liaison avec la glyco protéine virale gD de la protéine HveC pouvaient être altérées significativement sans oblitérer les capacités de cette protéine à déclencher la fusion des mem- branes cellulaires et virales et permettre ainsi l'entrée des virus PRV et 35 BHV-1dans la cellule sous une forme infectieuse. Il a également été montré dans la publication Campadelli- Fiume G, Cocchi F, Menotti L, Lopez M. the novel receptors that mediate the entry of herpes simplex viruses and animal alphaherpesviruses into cells Rev Med Virol. 2000 Sep-Oct ; 10 (5) : 305-19, que la protéine HveC exprimée par la souris peut jouer un rôle de médiateur de l'entrée des al- pha herpès virus PRV, BHV-1 et HSV indépendamment d'une interaction détectable avec la glycoprotéine gD. 5 Il a de surcroît globalement été conclu dans l'étude Ge- raghty RJ, Fridberg A, Krummenacher C, Cohen GH, Eisenberg RJ, Spear PG, use of chimeric nectin-1 (HveC)-related receptors to demonstrate that ability to bind alphaherpesvirus gD is not necessarily sufficient for viral entry, Virology. 2001 Jul 5 ; 366-75, que l'interaction de la pro- 10 téine HveC avec la glycoprotéine gD n'était pas suffisante pour permettre l'entrée du virus dans la cellule et que les caractéristiques de la protéine HveC responsables de ses propriétés de médiateur de l'entrée des virus HSV, PVR et BHV1dans les cellules cibles ne pouvaient être réduites à ses capacités de liaison avec la glycoprotéine gD. 15 Il est en outre à noter que la protéine HveC possède une sé- quence polypeptidique remarquablement bien conservée entre les espèces de mammifères ; à titre d'exemple, 97 % des acides aminés sont communs entre la protéine HveC exprimée par le porc et la protéine HveC exprimée chez les bovins, ce qui implique une forte identité de structure et de fonc- 20 tion chez ces deux espèces. Selon la publication INOBE MANABU et al Functional analysis of HVEM, a member of TNFR family, by using a transgenic mice expressing soluble form of HVEM (Biosciences information Service, Phi- ladelphia, PA - US - 2001. 03.07), on a créé dans un but expérimental, des 25 lignées de souris génétiquement modifiées, en introduisant dans le gé- nome de ces souris un transgène codant pour une protéine chimérique constituée du domaine extracellulaire de la protéine HVEM et de la portion cristallisable Fc de l'immunoglobuline IgG, ce pour étudier l'implication de la protéine HVEM dans la régulation du système immunitaire. 30 Il a été ainsi confirmé que l'expression d'une forme soluble de HveM, membre de la famille du récepteur du TNFalpha, produit un ef- fet immunosuppresseur. A partir de ces connaissances préalables, il est proposé conformément à l'invention un procédé pour produire un mammifère ap- 35 partenant à une espèce non humaine rendu résistant par transgénèse germinale à une infection par un alpha herpès virus pour lequel le poly- peptide HveC ou nectin 1 constitue un récepteur fonctionnel, caractérisé en ce que l'on introduit par insertion ou recombinaison homologue dans le génome des cellules constituant la lignée germinale du mammifère ou de l'un de ces ancêtres un transgène permettant l'expression d'une protéine chimérique constituée d'une part du domaine extracellulaire de la nectin - 1 ou HveC ou de l'une de ses parties et d'autre part du fragment cristalli- 5 sable d'une immunoglobuline, notamment d'une immunoglobuline de type gamma, dans un système d'expression approprié. L'idée à la base de l'invention a donc consisté à utiliser par- tiellement les capacités de médiateur de la protéine HveC vis-à-vis de l'entrée du virus visé, mais ce d'une façon inoffensive pour la cellule (en 10 isolant son domaine cellulaire ou l'une de ses parties) de façon à inhiber finalement l'entrée de ce virus dans la cellule et à favoriser son élimina- tion, ce par un processus qui reste encore à déterminer. Le mécanisme d'action de la protéine chimérique exprimée pourrait notamment comprendre, grâce à la capacité de fixation de celle-ci 15 à la fois pour la particule virale et le récepteur cellulaire Fc, une augmen- tation des capacités de phagocytose et de destruction des virions par les macrophages et cellules dendritiques et une activation des lymphocytes cytotoxiques NK. Il pourrait également comprendre la formation de récep- 20 teurs membranaires des alpha herpès virus, sous la forme de multimères fonctionnellement altérés par incorporation d'une ou plusieurs unités de la protéine chimérique, permettant la fixation des particules virales à la surface de la cellule mais pas leur entrée dans le cytoplasme sous une forme infectieuse. 25 Selon l'invention, la protéine HveC ou nectin-1 et/ ou l'immunoglobuline appartiennent de préférence à l'espèce homologue. On pourra également n'utiliser qu'une partie de la nectin-1 ou HveC, ou même, le cas échéant des formes mutées de ces parties, sé- lectionnées pour leur capacité de liaison avec le virus visé. 30 La première étape du procédé conforme à l'invention correspond donc à la préparation du transgène qui peut être effectuée en mettant en #uvre des méthodes bien connues des spécialistes et abon- damment décrites dans la littérature constituant à cloner : D'une part, soit l'ADN complémentaire de l'ARN transcrit 35 pour le gène du récepteur cellulaire, à partir d'une préparation d'ARN ex- traite d'un prélèvement de tissu pris sur un mammifère, soit la région chromosomique (ensemble des exons et introns) constituant le gène de ce récepteur à partir d'une préparation d'ADN génomique extraite également d'un prélèvement de tissu réalisé sur un mammifère, soit une construc- tion chimérique constituée pour partie de l'ADNc et pour la partie restante de la chaîne polypeptidique du fragment génomique correspondant ( minigène ). 5 Dans tous les cas, on utilisera seulement la partie corres- pondant au domaine extracellulaire de ce récepteur, ou dans une autre version du procédé, une sous partie de ce domaine ou même le cas échéant une séquence polypeptidique essentiellement dérivée de ce do- maine extracellulaire. 10 D'autre part, soit l'ADNc complémentaire de l'ARN transcrit pour l'un des gènes de chaîne lourde pour la classe et la sous-classe d'immunoglobuline choisie (par exemple Gl), à partir d'une préparation d'ARN extraite d'un prélèvement de tissu pris sur un mammifère, soit la région chromosomique (ensemble des exons et introns) constituant ce 15 gène de chaîne lourde à partir d'une préparation d'ADN génomique ex- traite également d'un prélèvement de tissu réalisé sur un mammifère, soit une construction chimérique constituée pour partie de l'ADNc et pour la partie restante de la chaîne polypeptidique du fragment génomique correspondant ( minigène ). La construction réalisée retiendra avanta- 20 geusement les régions codant pour les domaines Hinge, CH2 et CH3 uni- quement de la chaîne lourde d'immunoglobuline choisie (fraction cristallisable) . Un exemple d'une telle construction pour l'immunoglobuline humaine Gl est décrit dans la publication CTLA-4 Is a 25 Second Receptor for the B Cell Activation Antigen B7. By Peter S. Linsley, William Brady, Mark Urnes, Laura S. Grosmaire, Nitin K. Damle, and Jef- frey A. Ledbetter ; J. Exp. Med. # The Rockefeller University Press ; vo- lume 174, Septembre 1991, 561-569. Les opérations de clonage seront réalisées à partir des 30 connaissances préalables existantes relatives aux gènes utilisés, à savoir leur séquence, leur localisation chromosomique, ceci si possible dans l'espèce homologue, sinon en se basant sur les séquences connues pour ce gène chez d'autres mammifères. Ces opérations pourront être réalisées par une réaction de 35 polymérisation en chaîne (PCR) précédée d'une étape de transcription re- verse pour l'ADN complémentaire ou par la détection au sein de banques d'ADN génomique de l'espèce visée des clones susceptibles de s'hybrider avec une sonde spécifique ou de produire un amplicon PCR spécifique du gène recherché. Cette construction sera réalisée de façon à joindre les sé- quences codant pour le domaine extracellulaire de la nectin-1ou HveC ou 5 l'une de ses parties en 5' des séquences codant pour le fragment cristalli- sable de la chaîne lourde d'immunoglobuline (terminée par un codon stop) en respectant le cadre de lecture original des deux gènes, et éventuelle- ment la nature et l'efficacité des jonctions introns-extrons s'ils ont été in- clus, de façon à assurer, au final, l'expression d'une protéine chimérique 10 constituée pour sa partie amino terminale du polypeptide correspondant au domaine extracellulaire du récepteur cellulaire HveC ou à l'une de ses sous parties et pour sa partie carboxy terminale des domaines Hinge, CH2 et CH3 de la chaîne lourde d'immunoglobuline. Cette construction sera réalisée dans un vecteur 15 d'expression permettant une expression forte de la protéine chimérique dans un ou plusieurs compartiments biologiques de l'hôte où elle permet- tra la protection des cellules de manière à rendre l'hôte globalement ré- sistant à l'infection initiale ou à son développement. Le procédé consistera notamment à utiliser des systèmes d'expression actifs soit de façon cons- 20 titutive dans l'ensemble des cellules soit plus spécifiquement dans des tis- sus cibles de l'infection virale tels les tissus du système nerveux central ou les tissus épithéliaux (notamment ceux du système respiratoire). Le vecteur d'expression pourra comprendre une région promotrice, un signal de terminaison, des éléments stimulateurs de la 25 transcription, des séquences isolatrices du contexte chromatinien, d'autres unités de transcription, tous éléments susceptibles d'assurer l'expression souhaitée. Le procédé consistera avantageusement en l'emploi de sys- tèmes d'expression constitués à partir de séquences régulatrices clonées 30 chez l'espèce homologue, ou pour l'application à des animaux de rente, chez d'autres animaux d'élevage habituellement consommés par l'homme. La seconde étape du procédé conforme à l'invention consiste à introduire le transgène ainsi obtenu dans le génome des cellu- les constituant la lignée germinale du mammifère hôte visé par insertion 35 ou recombinaison homologue, là encore par une méthode bien connue des spécialistes de sorte que ce transgène s'intègre dans le patrimoine généti- que de ce mammifère. On pourra notamment utiliser à cette fin la micro injection pronucléaire du segment d'ADN encodant le transgène ou le transfert nu- cléaire de cellules transformées en culture par le transgène. L'invention concerne également un mammifère appartenant 5 à une espèce non humaine rendu résistant par transgénèse germinale à une infection par un alpha herpès virus pour lequel le polypeptide HveC ou nectin-1 constitue une récepteur fonctionnel par l'effet de l'expression d'une protéine chimérique constituée d'une part du domaine extracellu- laire de la nectin-1 ou HveC ou de l'une de ses parties de préférence de 10 l'espèce homologue, et d'autre part du fragment cristallisable d'une im- munoglobuline, notamment d'une immunoglobuline de type gamma de préférence de l'espèce homologue. L'invention concerne également le descendant d'un tel mammifère, ayant hérité par descendance du transgène inséré dans le gé- 15 nome de la lignée germinale de l'un de ses parents. Selon l'invention, l'alpha herpès virus peut avantageuse- ment être le virus PRV et le mammifère appartenir à l'espèce porcine. Selon une variante de l'invention l'alpha herpès virus peut également être le virus BHV-1 et le mammifère appartenir à l'espèce bo- 20 vine. Il est essentiel conformément à l'invention que l'opération de transgénèse soit une transgénèse germinale de façon que les descen- dants du mammifère soient eux aussi susceptibles d'exprimer la protéine chimérique. 25 L'invention se rapporte également à un matériel génétique tel que des semences ou des ovocytes ou des embryons essentiellement dérivés de mammifères transgéniques du type susmentionné. Plusieurs exemples de séquences de protéines chimériques conformes à l'invention sont jointes en annexe. 30 Il s'agit de séquences en acides aminés qui comprennent le peptide signal à l'extrémité amino terminale qui sera processé lors de la maturation. Une protéine chimérique conforme à ce modèle est égale- ment décrite dans le document JP-2001-328430 dans le cadre d'une autre 35 application. La faisabilité du procédé conforme à l'invention a été confirmée par 1) des résultats expérimentaux obtenus dans le cadre de l'analyse in vivo de la résistance au virus herpes simplex humain de type 1 (HSV-1) de souris transgéniques exprimant une protéine chi- mérique Hvem - Ig. 5 Selon ces tests on a introduit par transgénèse germinale dans l'ADN de ces souris un transgène codant pour une protéine chiméri- que constituée du domaine extracellulaire du récepteur murin HVEM de ce virus et de la portion cristallisable Fc de l'immunoglobuline IgG-1 hu- maine. 10 Le domaine extracellulaire murin HveM a été cloné par RT PCR à partir d'une préparation d'ARN extraite de cellules de rate sti- mulées par la concavaline A, obtenues sur des souris de souche BALB/c. Les amorces utilisées pour la réaction RT PCR étaient 5'- TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3'et5'-TTAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT-3'. 15 L'ADNc a été inséré dans les sites de restriction Xhol et BamHl d'un plasmide portant la séquence du fragment cristallisable de l'immunoglobuline Gl humaine (comme décrit dans la publication Naka- gawa I., Murakami, M., Ijima, K., Chikuma, S., Saito, I., Kanegae, Y., Ishi- kura, H., Yoshiki, T., Okamoto, H., Kitabatake, A., and Uede, T. (1998). 20 Persistent and secondary adenovirus-mediated hepatic gene expression using adenovirus vector containing CTLA4IgG. Human Gene Therapy 9, 1739-1745). Le fragment XhoI/XbaI contenant l'ADN encodant la pro- téine chimérique HveMIg a été isolé de cette construction et inséré à son 25 tour, après mise en bouts francs des extrémités, dans le site de restriction SwaI du vecteur cosmidique pAxCAwt (distribué commercialement par la société TAKARA, Kyoto, Japon) sous le contrôle du promoteur CAG (pro- moteur de la (3 actin) connu pour permettre une expression constitutive élevée dans tout type de cellule (Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. 30 (1991). Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108,193-200). On a créé ensuite par micro injection du fragment Pmel/Sall de ce vecteur, contenant le facteur de stimulation de la trans- cription du gène viral CMV IE, le promoteur du gène Beta actin de la 35 poule, la séquence de la protéine HVEMIg et le signal de polyadénylation 3' du locus Beta globin de lapin, dans les pronucléi d'embryons fécondés de souris (génotype F1 C57 BL/6 X SJL) trois lignées A, B, C de souris trans- géniques chacune issue d'un fondateur indépendant exprimant cette pro- téine chimérique HVEM Ig. La présence de la protéine HVEMIg a été détectée comme bande spécifique révélée par un anticorps anti-HVEMIg (produit par hype- 5 rimmunisation sur lapin) par immunoélectrophorèse dans le sérum des trois lignées de souris transgéniques, avec un titre en moyenne plus faible pour les souris de la lignée B. La construction effectuée est représentée schématiquement sur la figure 1. 10 La concentration en protéine chimérique HVEMIg du sérum des souris des trois lignées transgéniques A B C est représentée sur les tableaux 1,2, 3 et 4 joints en annexe. Les souris transgéniques de trois lignées se sont dévelop- pées normalement et on n'a pas constaté de différences entre les poids de 15 ces souris et ceux de leurs homologues non transgéniques de la même portée. Pour déterminer si les souris transgéniques exprimant la protéine chimérique HVEMIg étaient effectivement protégées contre le vi- rus HSV-1, on a inoculé par voie intraveineuse et une dose de 109 ufc 20 correspondant à dix fois la dose létale (10 DL 50) de virus, des souris transgéniques et des souris non transgéniques de contrôle de la même portée. La DL 50 a été déterminée initialement chez la lignée de souris la moins sensible des deux ayant servi à la production des animaux 25 transgéniques hybrides. Selon les figures 2,3, et 4 on a dénombré les souris trans- géniques Tg respectivement des lignées A B et C et les souris non transgé- niques non Tg demeurées vivantes jusqu'à 14 jours après l'infection. On a ainsi pu constater que toutes les lignées de souris 30 transgéniques étaient résistantes au virus HSV-1. Plus précisément toutes les souris transgéniques des li- gnées A et C ont survécu à l'inoculation par le virus et sont restées en bonne santé pendant plusieurs mois après l'essai (tableaux 1 et 4). Seule une souris transgénique de la lignée B, est décédée 35 après l'inoculation par le virus tandis que les six autres ont survécu (ta- bleau 3), mais la lignée B est celle pour laquelle les taux sériques mesurés en HVEMIg étaient les plus faibles. En revanche, six des sept souris non transgéniques des mêmes portées que les souris transgéniques de la lignée A, 13 des 14 sou- ris non transgéniques des mêmes portées que les souris transgéniques de la lignée B et six des sept souris non transgéniques des mêmes portées 5 que les souris transgéniques de la lignée C ont développé des symptômes tels qu'une paralysie ou sont mortes dans les 14 jours qui ont suivi l'inoculation par le virus HSV-1. On a recherché l'expression du LAT du virus HSV-1 dans les ganglions trigéminaux des souris survivantes après l'inoculation par la 10 méthode décrite dans les publications. - Spivak, J. G., and Fraser, N. W. (1987). Détection of herpes virus type 1 transcripts during latent infections in mice. J. Virol., 61,3841-3847. - Stevens, J. G., and Cook, M. L. (1971). Latent herpes simplex virus in spinal ganglia of mice. Science 173,843-845. 15 On a ainsi mis en #uvre la méthode de RT-PCR de façon à détecter l'expression du LAT. Celle-ci a été observée chez les souris non transgéniques ayant développé des symptômes et chez une seule souris transgénique de la lignée B n'ayant pas présenté de symptômes, mais n'a en revanche pas 20 été observée chez toutes les autres souris transgéniques testées ni chez les souris non transgéniques survivantes n'ayant pas développé de symptô- mes. Dans le cadre de cette étude on a également effectué un es- sai de contrôle dans le but de déterminer si les souris transgéniques ex- 25 primant la protéine chimérique HVEMIg étaient protégées contre le virus PRV ce alors que la protéine HVEM n'est pas un récepteur fonctionnel pour le virus PRV. A cet effet, on a inoculé par voie intraveineuse et par une dose correspondant à 10 fois la dose létale (10 LD 50) de virus PRV, des 30 souris transgéniques de la lignée A et des souris non transgéniques de la même portée (tableau 2 et figure 5). On a ainsi pu constater qu'à l'exception d'une souris trans- génique qui a survécu pendant 10 jours toutes les souris sont décédées dans les cinq jours suivant l'inoculation par le virus PRV. 35 Par suite les souris transgéniques exprimant la protéine chimérique HVEMIg ne se sont pas révélées protégées contre le virus PRV. Dans le cadre de cette étude, on a également cherché à dé- terminer si la résistance des souris transgéniques à l'inoculation par le virus HSV-1ayant pu être constatée in vivo s'accompagnait en parallèle d'une résistance des cellules de ces souris une fois isolées. A cet effet on a inoculé des cultures de fibroblastes em- bryonnaires de souris transgéniques ou de souris non transgéniques par 5 le virus HSV-1. On a ensuite dénombré les plages de lyse provoquées par le virus dans la culture cellulaire 5 jours après l'inoculation, et constaté que le nombre de ces plages était nettement plus important dans le cas des fibroblastes de souris non transgéniques que dans le cas de fibroblastes 10 de souris transgéniques (en moyenne 22 plaques par disque de culture pour les souris non transgéniques et 1 plaque par disque de culture pour les souris transgéniques). On a parallèlement effectué un test similaire pour le virus PRV en inoculant des cultures de fibroblastes embryonnaires issus de 15 souris transgéniques ou de souris non transgéniques par le virus PRV, sans constater de différences notables entre le nombre de plages de lyse observé chez les souris transgéniques et chez les souris non transgéni- ques. Ces résultats sont de nature à prouver que la protéine chi- 20 mérique HVEMIg exprimée par les fibroblastes des souris transgéniques intervient dans l'inhibition de l'adsorption du virus HSV-1par ces fibro- blastes embryonnaires. Dans un test complémentaire dont les résultats sont illus- trés sur le tableau 5 on a recherché si la protéine chimérique HVEMIg 25 présente dans le sérum de souris transgéniques pouvait inhiber l'infection de cultures cellulaires par les virus HSV-1ou PRV. Dans ce but, on a recueilli du sérum de souris transgéni- ques de la lignée C et incubé avec un inoculât de ce sérum le virus HSV-1 ou le virus PRV avant de le mettre en contact avec des cultures de cellules 30 Vero. On a ainsi pu établir que le sérum de souris transgéniques de la lignée C peut protéger des cellules Vero d'une contamination par le virus HSV-1 mais pas d'une contamination par le virus PRV. Un test de contrôle effectué avec du sérum de souris non 35 transgéniques n'a au contraire pas permis de constater d'activité antivi- rale. On a par ailleurs constaté que le sérum des souris transgé- niques de la lignée C ne présente plus d'activité antivirale après qu'il ait été mis en contact avec un sérum polyclonal anti-HVEMIg produit par hy- perimmunisation sur lapin pendant 30 minutes à température ambiante. Ce dernier résultat confirme que les capacités séroneutrali- santes du sérum des souris transgéniques sont à attribuer à l'expression 5 de la protéine chimérique. L'ensemble de ces résultats démontre que l'activité antivi- rale constatée provient de la protéine chimérique HVEMIg présente dans le sérum des souris transgéniques, mais sont également sans doute associés à l'expression de cette protéine chimérique à la surface des cellules de 10 l'hôte telles les fibroblastes embryonnaires évalués dans ces tests. Ces résultats confirment l'efficacité antivirale de l'expres- sion in-vivo d'une forme modifiée d'un récepteur membranaire des alpha- herpesvirus, ceci en dépit des propriétés immunosuppressives décrites dans le cas de la protéine HveM. 15 2) des résultats expérimentaux obtenus dans le cadre de l'analyse in vivo de la résistance au virus PRV de souris transgéni- ques exprimant une protéine chimérique Hvec-Ig. Selon ces tests on a introduit par transgénèse germinale dans l'ADN de ces souris un transgène codant pour une protéine chiméri- 20 que constituée du domaine extracellulaire du récepteur porcin HveC du virus PRV et de la portion cristallisable Fc de l'immunoglobuline IgG-1 humaine. Le domaine extracellulaire porcin HveC a été cloné par RT PCR à partir d'une préparation d'ARN extraite de cellules de porc. 25 Les amorces utilisées pour la réaction RT PCR étaient 5'- TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3' et 5'-TTAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT-3', comme il est décrit et en suivant les conditions proposées dans la publi- cation (Milne, R. S. B., Connolly, S. A., Krummenacher, C., Eisenberg, R. J., and Cohen, G. H. (2001). Porcine HveC, a member of the highly 30 conserved HveC/nectin 1 family, is a functional alphaherpesvirus recep- tor. Virology 281,315-32.). L'ADNc a été inséré dans les sites de restriction Xhol et BamHl d'un plasmide portant la séquence du fragment cristallisable de l'immunoglobuline Gl humaine (comme décrit dans la publication Naka- 35 gawa I., Murakami, M., Ijima, K., Chikuma, S., Saito, I., Kanegae, Y., Ishi- kura, H., Yoshiki, T., Okamoto, H., Kitabatake, A., and Uede, T. (1998). Persistent and secondary adenovirus-mediated hepatic gene expression using adenovirus vector containing CTLA4IgG. Human Gene Therapy 9, 1739-1745). Le fragment XbaI/XbaI de ce plasmide contenant l'ADN enco- dant la fusion HveC-Ig a été isolé, mis à bouts francs et lié à des adapta- teurs Sali, ceci afin de l'insérer à son tour, après digestion par Xhol et Sali, dans le site de restriction Xhol du vecteur pCXN2 sous le contrôle 5 du promoteur CAG (promoteur de la ss actin) connu pour permettre une expression constitutive élevée dans tout type de cellule (Niwa, H., Yama- mura, K., and Miyazaki, J. (1991). Efficient sélection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108,193-200). Le plasmide recombinant ainsi obtenu a été désigné Pcxn2/pHvecIg. 10 On a créé par micro injection du fragment Sali/ Sali de ce plasmide, contenant le facteur de stimulation de la transcription du gène viral CMV IE, le promoteur du gène Beta actin de la poule, la séquence de la protéine HVEMIg et le signal de polyadénylation 3' du locus Beta globin de lapin, dans les pronucléi d'embryons fécondés de souris (souche 15 C57/BL6) six lignées #6, #22, #32, #33, #37, #45 de souris transgéniques chacune issue d'un fondateur indépendant exprimant cette protéine chi- mérique HveC-Ig. La construction effectuée est représentée schématiquement sur la figure 6. 20 Les souris transgéniques des six lignées se sont développées normalement et on n'a pas constaté de différences entre les poids de ces souris transgéniques et le poids des souris non transgéniques issues des mêmes portées. Epreuves virales par injections intra-péritonéales 25 Pour déterminer si les souris transgéniques exprimant la protéine chimérique HveC-Ig étaient effectivement protégées contre le vi- rus PRV, on a inoculé dans une première série d'épreuve par voie intrapé- ritonéale une dose de 500 u. f.p. correspondant à vingt fois la dose létale (20 DL 50) de virus, des souris transgéniques et des souris non transgéni- 30 ques de contrôle de la même portée. Selon le tableau 6 on a dénombré les souris transgéniques Tg respectivement des lignées #6, #22, #32, #33, #37, #45 et les souris non transgéniques non Tg demeurées vivantes jusqu'à 14 jours après l'infection. 35 On a ainsi pu constater que les 6 lignées de souris transgé- niques étaient résistantes au virus PRV dans cette épreuve réputée sévère, avec 100% de survie des animaux transgéniques, à l'exception d'un seul animal pour la lignée #33. En revanche, seules environ 9% des souris non transgéni- ques ont survécu, avec une variation selon les épreuves conduites pour chaque lignée. Ces épreuves ont été confirmées pour les lignées #22 et #32 5 dans une laboratoire indépendant en utilisant une souche différente de virus PRV. Epreuves virales par infection intranasale On a inoculé dans une deuxième série d'épreuve par voie intranasale une dose de 250 u. f.p. correspondant à dix fois la dose létale 10 (20 DL 50) de virus, des souris transgéniques et des souris non transgéni- ques de contrôle de la même portée. Selon le tableau 7 on a dénombré les souris transgéniques Tg respectivement des lignées #6, #22, #32, #33, #37 et les souris non transgéniques non Tg demeurées vivantes jusqu'à 14 jours après 15 l'infection. On a ainsi pu constater que les 5 lignées de souris transgé- niques étaient relativement résistantes au virus PRV dans cette épreuve réputée sévère, avec environ 70 % de survie des animaux transgéniques. En revanche, seules environ 10 % des souris non transgé- 20 niques ont survécu, avec une variation selon les épreuves conduites pour chaque lignée. Ces résultats démontrent une action protectrice efficace du transgène permettant l'expression de la protéine chimérique HveC-Ig dans le contexte d'une épreuve sévère chez la souris par voie intra nasale. 25 Globalement, l'ensemble de ces résultats montre l'efficacité in-vivo de la protection conférée à un mammifère par le procédé conforme à l'invention, basé sur l'inhibition de l'entrée d'un alphaherpesvirus dans la cellule cible. Cette efficacité n'est possible que parce que le procédé proposé permet probablement plusieurs niveaux d'action, dont les méca- 30 nismes ne sont pas tous entièrement élucidés : au delà des capacités de ligand des protéines virales gD connues pour les récepteurs HveM, HveC, l'utilisation du domaine extracellulaire seul permet d'isoler ses capacités de récepteur des fonctions biologiques complexes de ces protéines trans- membranaires dans leur entrée et notamment de leur aptitude à initier 35 des cascades de signalisation intracellulaires. Ceci permet a priori d'envisager la surexpression de ce do- maine protéique sans pour autant en amplifier la fonction physiologique et permet sans doute l'absence d'effets secondaires observés pour les ani- maux transgéniques exprimant la protéine chimérique. Ceci permet probablement dans le contexte d'une infection in vivo : 5- une compétition pour la fixation des particules virales infectantes des protéines chimériques en solution ou présentes à la surface des cellu- les avec les récepteurs membranaires fonctionnels du virus ; - la neutralisation des particules virales par opsonisation et augmenta- tion de la phagocytose par les macrophages et cellules dendridiques ; 10 - l'activation de l'immunité cellulaire par stimulation des lymphocytes NK. L'efficacité du procédé dans le cas des infections expéri- mentales par voie intra nasale ainsi que (pour HveMIg) la résistance des fibroblastes embryonnaires issus d'animaux transgéniques vont dans le 15 sens d'une inhibition efficace de l'entrée du virus dans les cellules cibles sensibles par la fraction membranaire de la protéine chimérique exprimée, au delà de la capacité séroneutralisante de la fraction soluble sécrétée dans le sérum. Cette inhibition de l'entrée du virus dans la cellule pourrait 20 être le fait de récepteurs membranaires du virus modifiés, selon un mode dominant, autorisant la fixation du virus à la surface des cellules cibles mais pas son entrée dans le cytoplasme sous une forme infectieuse. L'efficacité du procédé sur l'entrée du virus et les premiers résultats portant sur la latence virale après l'infection (dans le cas d'HveM 25 et HSV1) permettent de surcroît d'envisager l'absence de latence chez les animaux d'élevage ainsi protégés, ce qui n'est pas nécessairement le cas pour les stratégies vaccinales, et donc par là un contrôle plus efficace des phénomènes de résurgence de l'infection. 3) Des résultats expérimentaux obtenus dans le cadre de 30 l'analyse in vitro de la résistance au virus BHV-1 et PRV de lignées cellulaires transformées par des plasmides exprimant des protéines chimériques construites à partir du domaine extra cellulaire de la protéine HveC porcine et du fragment cristallisable de l'immunoglobuline Ig humaine. 35 Selon ce test on a préparé des lignées de cellules Vero transformées par des plasmides exprimant une forme soluble de la pro- téine HveC porcine inhibant l'entrée des virus BHV-1 et PRV puis on a analysé la résistance de ces lignées cellulaires à l'infection par ces virus pour déterminer les propriétés antivirales de la forme soluble de la pro- téine HveC porcine in vitro. Pour construire un plasmide exprimant une forme soluble de la protéine HveC porcine (PHveCIg) on a utilisé un vecteur d'expression 5 PCXN2 permettant la transcription d'un ARN messager codant pour le domaine extra cellulaire de la protéine HveC porcine joint au fragment cristallisable Fc de l'immuno globuline IgG humaine. Le domaine extracellulaire porcin HveC a été cloné par RTPCR à partir d'une préparation d'ARN extraite de cellules de porc. 10 Les amorces utilisées pour la réaction RT PCR étaient 5'- TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3' et 5'-TTAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT-3'. comme il est décrit et en suivant les conditions proposées dans la publi- cation (Milne, R. S. B., Connolly, S. A., Krummenacher, C., Eisenberg, R. J., and Cohen, G. H. (2001). Porcine HveC, a member of the highly 15 conserved HveC/nectin 1 family, is a functional alphaherpesvirus recep- tor. Virology 281, 315-32.). L'ADNc a été inséré dans les sites de restriction Xhol et BamHl d'un plasmide portant la séquence du fragment cristallisable de l'immunoglobuline Gl humaine (comme décrit dans la publication Naka- 20 gawa I., Murakami, M., Ijima, K., Chikuma, S., Saito, I., Kanegae, Y., Ishi- kura, H., Yoshiki, T., Okamoto, H., Kitabatake, A., and Uede, T. (1998). Persistent and secondary adenovirus-mediated hepatic gene expression using adenovirus vector containing CTLA4IgG. Human Gene Therapy 9, 1739-1745). Le fragment XbaI/XbaI de ce plasmide contenant l'ADN enco- 25 dant la fusion HveC-Ig a été isolé, mis à bouts francs et lié à des adapta- teurs SalI, ceci afin de l'insérer à son tour dans le site de restriction Xhol du vecteur pCXN2 sous le contrôle du promoteur CAG (promoteur de la (3 actin) connu pour permettre une expression constitutive élevée dans tout type de cellule (Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991). Efficient 30 selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108,193-200). Le plasmide recombinant ainsi obtenu a été désigné Pcxn2/pHvecIg. On a préparé par transfection avec le plasmide ainsi obtenu des lignées cellulaires transformées de manière stable. 35 Les lignées cellulaires ainsi transformées ont été cultivées dans des conditions permettant l'accumulation de la protéine chimérique dans le milieu à savoir 24 heures de cultures additionnelles après étale- ment à subconfluence. Ces cultures ont ensuite été inoculées par les virus PRV ou BHV-1 avec une multiplicité de 50 u. f.p. par boite de 35 mm de diamètre avec un temps d'incubation d'une heure suivi de deux rinçages au DMEM avant couverture avec du milieu DMEM 0,5 % d'agar. 5 On a ensuite dénombré les plages de lyse provoquées par le virus dans la culture cellulaire 4 jours après l'inoculation. On a constaté que dans les lignées cellulaires exprimant la protéine chimérique PHveCIg le nombre de plaques de lyse a été notablement réduit par comparaison avec des lignées cellulaires résistantes de contrôle et les lignées Vero qua- 10 tre jours après l'inoculation. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 8. Les lignées cellulaires transformées par le plasmide PCXN2/pHveC Ig sont clairement résistantes à l'affection par les virus PRV et BHV-1. 15 4) Des résultats expérimentaux obtenus dans le cadre de l'analyse in vitro de la résistance aux virus BHV-1 et PRV de lignées cellulaires transformées par des plasmides exprimant des protéines chimériques construites à partir du domaine extracellulaire de la pro- téine HveC porcine et du fragment cristallisable de 20 l'immunoglobuline gl du porc. Selon ce test on a préparé des lignées de cellules Vero transformées par des plasmides exprimant une forme soluble de la pro- téine HveC porcine inhibant l'entrée des virus BHV-1et PRV puis on a analysé la résistance de ces lignées cellulaires à l'infection par ces virus 25 pour déterminer les propriétés antivirales de la forme soluble de la pro- téine HveC porcine in vitro. Pour construire un plasmide exprimant une forme soluble de la protéine HveC porcine (PHveCIg) on a utilisé un vecteur d'expression pCXN2 permettant la transcription d'un ARN messager codant pour le 30 domaine extracellulaire de la protéine HveC porcine et le fragment cristal- lisable Fc de l'immunoglobuline IgG-1 porcine. Le domaine extracellulaire porcin HveC a été cloné par RT PCR à partir d'une préparation d'ARN extraite de cellules de porc. Les amorces utilisées pour la réaction RT PCR étaient 5'- 35 TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3' et 5'-TTAAGGATCCGAGGAG- CAGGTGGTGTCT-3', comme il est décrit et en suivant les conditions pro- posées dans la publication (Milne, R. S. B., Connolly, S. A., Krummena- cher, C., Eisenberg, R. J., and Cohen, G. H. (2001). Porcine HveC, a member of the highly conserved HveC/nectin 1 family, is a functionnal alphaherpesvirus receptor. Virology 281, 315-32.). L'ADN c ainsi obtenu a été lié en 5' d'un fragment d'ADN c codant pour le fragment cristallisable Fc de l'immunoglobuline Ig porcine 5 en respectant le cadre de lecture original des deux polypeptides. Le fragment d'ADN c d'immunoglobuline porcine a été cloné à partir d'une préparation d'ARN extraite de tissus lymphoides de porc d'une lignée de type Large White (FH025) par RT PCR en utilisant en tant qu'amorce TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3' et 5'-TTAAGGATCCGAGGAG- 10 CAGGTGGTGTCT-3' en suivant les conditions proposées dans la publication Simon Musyoka Mwangi, Thomas J. Stabel*, Marcus E. Kehrli Jr, deve- lopment of a baculovirus expression system for soluble porcine tumor ne- crosis factor receptor type I and soluble porcine tumor necrosis factor receptor type I-IgG fusion protein, Veterinary Immunology and Immuno- 15 pathology 86 (2002) 251-254. L'ADN c résultant de la fusion code pour une protéine chi- mérique dont la séquence en acides aminés est jointe en annexe (séquence 4). L'ADN c résultant de la fusion a été inséré dans le site de 20 restriction Xhol du plasmide pCXN2 sous le contrôle du promoteur du gêne bêta actin de la poule associé au facteur de stimulation de la trans- cription du gène viral CMV IE et la séquence de polyadénylation de la bêta globin de lapin. Le plasmide résultant ainsi obtenu a été désigné 25 PCXN2/pVCC-pFc. Une version restreinte de ce plasmide désignée PCXN2/pV- pFc a été construite en utilisant seulement le domaine V de la protéine HveC et le fragment cristallisable Fc de l'immuno-globuline IgG de porc. La séquence en acides aminés de la protéine chimérique 30 ainsi obtenue est jointe en annexe (séquence 3). On a préparé par transfection avec le plasmide ainsi obtenu des lignées cellulaires transformées de manière stable. Les lignées cellulaires ainsi transformées ont été cultivées dans des conditions permettant l'accumulation de la protéine chimérique 35 dans le milieu à savoir 24 heures de cultures additionnelles après étale- ment à subconfluence. Ces cultures ont ensuite été inoculées par les virus PRV ou BHV-1 avec une multiplicité de 50 u.f.p. par boite de 35 mm de diamètre avec un temps d'incubation d'une heure suivi de deux rinçages au DMEM avant couverture avec du milieu DMEM 0,5 % d'agar. On a ensuite dénombré les plages de lyse provoquées par le virus dans la culture cellulaire trois jours après l'inoculation et effectué 5 les constatations rassemblées dans le tableau 9. Les lignées cellulaires transformées par les deux versions du transgène exprimant une protéine chimérique conforme à l'invention sont clairement résistantes à l'affection par les virus BHV-1et PRV. TABLEAU 1 Résistance des souris transgéniques de la lignée A à une inoculation par le virus HSV-1 TABLEAU 2 Sensibilité des souris transgéniques de la lignée A à une inoculation par le virus PRV TABLEAU 3 Résistance des souris transgéniques de la lignée B à une inoculation par le virus HSV-1 TABLEAU 4 Résistance des souris transgéniques de la lignée C à une inoculation par le virus HSV-1 Dans les tableaux 1 à 4 les animaux désignés par un * sont des animaux transgéniques alors que les animaux désignés par L sont des animaux non transgéniques de contrôle des mêmes portées. TABLEAU 5 Neutralisation du virus HVS-1 par la protéine chimérique HVEMlg dans le sérum de souris transgéniques de la lignée C. Inoculation de virus HSV1sur cellules VERO, après incubation avec des 5 concentrations variables de ce sérum Tableau 7 Epreuves par voie intra nasale (10 LD 50 ). 5 Tableau 8 Résistance de lignées cellulaires transformées aux alpha herpès virus PRV et BHV-1 10 * Dans ce tableau les lignées A6 et C1 sont des lignées cellulaires transformées par le plasmide pCXN2/pHveCIg et exprimant la protéine chimérique PHveCIg alors que la lignée C2 correspond à un témoin né- gatif de cette transformation n'exprimant pas le transgène et la lignée 15 Vero aux cellules initiales sensibles aux virus et utilisées pour la pro- duction des lignées transformées par les différents transgènes. Tableau 9 Résistance de lignées cellulaires transformées aux alpha herpès virus PRV et BHV-1 5 * Dans ce tableau la lignée 3-16 est une lignée cellulaire transformée par le plasmide p CXN2/ pVCC - pFc et la lignée V 110 est une lignée cellulaire transformée par le plasmide p CXN2/ pV - pFc alors que la lignée Vero correspond aux cellules initiales sensibles aux virus et uti- 10 lisées pour la production de cellules transformées par les différents transgènes. REVENDICATIONS 1 ) Procédé pour produire un mammifère appartenant à une espèce non humaine rendu résistant par transgénèse germinale à une infection par un alpha herpès virus, pour lequel le polypeptide HveC ou nectin-1 cons- 5 titue un récepteur fonctionnel, caractérisé en ce que l'on introduit par insertion ou recombinaison homologue dans le génome des cellules constituant la lignée germinale du mammifère, un transgène permettant l'expression d'une protéine chimérique constituée d'une part 10 du domaine extracellulaire de la nectin-1 ou HveC ou de l'une de ses par- ties et d'autre part du fragment cristallisable d'une immunoglobuline, dans un système d'expression approprié. 2 ) Procédé selon la revendication 1, 15 caractérisé en ce que l'immunoglobuline est une immunoglobuline de type gamma. 3 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que 20 la nectin-1 ou HveC et/ou l'immunoglobuline appartiennent à l'espèce homologue. 4 ) Mammifère appartenant à une espèce non humaine, caractérisé en ce qu' 25 il a été rendu résistant par transgénèse germinale à une infection par un alpha herpès virus pour lequel le polypeptide HveC ou nectin-1constitue un récepteur fonctionnel par l'effet de l'expression d'une protéine chiméri- que constituée d'une part du domaine extracellulaire de la nectin-1ou HveC, de préférence de l'espèce homologue, et d'autre part du fragment 30 cristallisable d'une immunoglobuline, notamment d'une immunoglobuline de type gamma, de préférence de l'espèce homologue. 5 ) Mammifère selon la revendication 4, caractérisé en ce que 35 le récepteur spécifique de l'alpha herpès virus est une sous partie du do- maine extracellulaire de la nectin-1 ou HveC. 6 ) Mammifère selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé en ce qu' il appartient à l'espèce porcine et l'alpha herpès virus est le virus PRV. 7 ) Mammifère selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé en ce qu' il appartient à l'espèce bovine et l'alpha herpès virus est le virus BHV-1. 8 ) Mammifère selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce qu' il renferme dans le génome de ses cellules, un transgène codant pour une protéine chimérique constituée d'une part du domaine extra cellulaire de la nectin-1 ou HveC ou de l'une de ses parties, et d'autre part du fragment cristallisable d'une immuno globuline, dans un système d'expression approprié, ce transgène ayant été inséré dans le génome de la lignée germinale de l'un de ses parents. 9 ) Semence ou ovocyte ou embryon dérivé du mammifère selon l'une quelconque des revendications 4 à 8.