FR 2837833 A1 20031003 FR 0204015 A 20020329 mm, avec un écart type logO de 0,02 à 0,3 de préférence de 0,05 à 0,1. - L'invention concerne un procédé de cultures en masse de la diatomée Haslea ostreuria Simonsen, ( également appelée "navicule bleue", ou algue bleue) et les utilisations des cultures obtenues par le procédé. L'Haslea ostreuria est connue principalement pour son action de verdissement des huAtres de la catégorie "fines de claires". On peut estimer un développement potentiel intéressant par l'utilisation de la masse algale produite et plus spécifiquement des pigments dans le domaine des aromes, des produits alimentaires et cosmétiques, etc.. mais sa présence aléatoire à l'état 0 naturel n'avait pas, jusqu'à ce jour, permis beaucoup de travaux dans cette direction. Haslea ostreuria appartient à la classe des Diatomées, algues unicellulaires, dont déjà quelques espèces sont cultivées en aquaculture. La culture et l'exploitation des algues unicellulaires marines a longtemps porté et porte encore sur un nombre restreint d'espèces dont on conna^t bien la physiologie et dont la culture est relativement aisée: cellules de petite taille, mobiles, vivant en suspension dans le milieu, à paroi mince, faciles à traiter. L'essor des biotechnologies marines et de l'aquaculture se trouve donc limité en l'état actuel à un certain nombre d'espèces qui se multiplient sans difficulté et dont on extrait un certain nombre de composés tels que pigments, protéines, vitamines, acides gras, etc. mais aucune de ces espèces ne permet le verdissement des hu^tres. On ressent donc vivement le besoin d'un procédé de culture d'un nouveau type qui permettrait la production en masse de cette algue, en vue en particulier de son exploitation directe pour le verdissement des hu^tres. L'industrie est donc à la recherche d'une telle production en masse de manière à satisfaire des demandes de plus en plus pressantes d'algues marines. L' invention a donc pour but de fournir un procédé de culture de l'algue blene dans des volumes de milieu de plusieurs m3 pour mieux répondre à une exploitation à la fois de type industriel et également lié à l'ostréiculture. Cette production est obtenue en milieu protégé, ou non, nécessitant des précautions rigoureuses lices à l'environnement. La présente invention, relative aux cultures ainsi obtenues, permet, soit: - d'ensemencer des bassins, en terre ou en bêton permettant ainsi, d'accroître considérablement les volumes d' algues produites, et de ce fait, d' envisager une production industrielle, à vocation d' affinage d'hu^tres par verdissement. ( Résultat de l' action, sur les branchies des mollusques, du pigment libéré par l'algue: la marennine) - de procèder, par centrifugation et ou filtration, à la récupération de la biomasse produite et de l'eau des cultures, à des fins industrielles. o A cet effet, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que: on prépare un milieu de culture constitué d'eau salée ayant une salinité comprise entre 20 et 40 /OO et une concentration en ammoniaque inférieure à 150!1M/ dm3, des concentrations en éléments minéraux majeurs telles que: - azote total (nitrique et ammoniacale): entre 40 et 400 lldm3 phosphore: entre 2 et 30 M/dm3 - silicium: entre 40 et 600 Mfdm3 - des concentrations en oligo-éléments métalliques telles que: - cuivre:entre 2.109et 6.108M/dm3 -fer: entre 5 10-8 et20.10-6M/dm3 -zinc: entre 6108etl2.108M/dm3 -nickel: entre 1.1 o-6 et 2.10 8 M/dm3, - on filtre ou non le milieu de culture - on ramène le pH du milieu à une valeur supérieure ou égale à 6,8 - on choisit des algues issues de clones isolés et mis en culture en laboratoire, dans des récipients en verre à une température de l'ordre de 18 C, avec un éclairement d'au moins so 3000 lux, soit en continu, soit a un rythme alterné lumière / obscurité, pendant une durée supérieur ou égale à 5 jours, i, - on fait incuber les algues dans des bacs de 500 à 6000 dm3, voire plus, de manière à maintenirlatempératureentrel2 C et 25 C, en éclairement artificiel, sans agitation, en milieu calme, pendant un minimum de 5 jours. Dans ces conditions, on atteint dans les bacs, ici de 6 000 dm3, une biomasse allant de 20 à 130.106 cellules /dm3, avec une couleur bleu-vert caractéristique de la production par 1'algue du pigment bleu surnuméraire. Cette biomasse représente une masse frache d'algues de 6 g pour 100 dm3 de culture, avec une teneur en eau comprise entre 70 et 90 % après concentration par centrifugation La production de l'algue peut 8tre effectuée dans des conditions d'homogénéité et de o reproductibilité parfaitement contrôlées, par la mise en _uvre de cultures en réacteurs clos. L'avantage de ces derniers, appelés photobioréacteurs ou chémostats, est de permettre, dans un contexte de production en continue, un meilleur contr81e des paramétres de croissance et de production. Selon une forme de mise en _uvre du procédé selon l'invention, le milieu de culture est constitué d'eau salée possédant les qualités requises pour obtenir la concentration en azote voulue. (Selon la qualité de l'eau salée, il pourra étre ajoutés des nutriments et ou, des oligo éléments traces, pour optimiser la croissance.) De préférence la concentration en ammoniaque du milieu de culture est inférieure ou égale à o 150,u M/dm3. Avantageusement, la salinité du milieu de culture est comprise entre 28 et 32 0l Selon une forme de mise en oeuvre, les concentrations en éléments minéraux essentiels sont: -azote nitrique: environ 100!1 MIdm3 phosphore: environ 4!lMJdm3 -silicium: environ 100!1 M/dm3. Ces concentrations sont citées à titre d 'exemple. Avantageusement, les concentrations en oligo-éléments métalliques sont: cuivre: environ: 4.106M/dm3 -fer: environ: 12.10-6 M/dm3 -zinc: environ: 8.10-6 M/dm3 -nickel: environ: 1,5.10-6 M/dm3. Ces conce7,trations sont citées à titre d 'exemple. La culture de la diatomée Haslea ostreuria Simonsen, ainsi effectuée, conformément à l'invention, se caractérise par la production du pigment bleu qui diffuse en partie dans le milieu de culture, ce qui lui donne cette couleur bleu-vert caractéristique. La concentration en pigment bleu dans le milieu de culture, après séparation des algues par filtration ou centrifugation ou autre moyen de séparation, pour des cultures de 6000 dm3, (à titre d'exemple) est de l'ordre de quelques mg/dm3. L'eau verte ainsi produite peut 8tre utilisée dans le domaine de la cosmétologie, l'agroalimentaire, le médical, ou le verdissement o d'hu^tres (processus qui s'effectue naturellement dans l'affinage des hu^tres " fines de claires ").; La présente invention, consiste également à utiliser la production en tant qu'inoculum pour ensemencer des claires ou bassins Dans cette hypothèse d'utilisation, les cultures produites s sont envoyées, par des moyens hydrauliques, vers des bassins aux fins d'un développement amplifié. Elles conduisent alors au verdis sement de s hu^1tres immergée s, en des duré es variant, suivant les saisons, de 48 heures à 20 jours, pour une proportion d'environ 1 hu^tre/7,5 dm3 d'eau, les cultures peuvent ensuite servir au verdissement d'autres lots d'hu^tres. Pour ce faire, on procède, dans des bassins constitués de sédiments ou de béton, de superficies variables, ( ici, de 60, 250 et 400 m2), à un traitement préalable et spécifique à ceux-ci, consistant en: -un rincage, -une mise à sec d'une durée variable, (fonction des conditions atmosphériques). -un traitement spécifique, selon leur nature, ceci afin d'éliminer les organismes compétiteurs de l' algue, présents, tant dans l' atmosphère, qu'accumulés dans les fissures et inégalités du terrain. Lorsque les algues produites, ont atteint leur stade exponentiel de croissance, elles sont utilisées, en tant qu'inoculum, pour ensemencer des bassins extérieurs, préalablement traités, aux fins d'y faire verdir des hu^tres ou de récupérer les algues produites. so Les quantités d'inoculum utilisées varient entre 3 et 15 x 10 î cellules, pour un bassin de 60 m2. n est ajouté un volume d'eau salée dans des proportions pouvant varier de à 90% du volume total de la culture. Après obtention d'une production intense d'algues, (la " claire" est dite "verte") entre 2 et 20 jours, suivant les conditions saisonnières et atmosphériques. n est alors procédé à l'immersion de lots d'hu^tres, posés sur des tables, à raison d'environ une hu^tre pour 7,5 dm3 de culture; l'on obtient le verdissement de celles-ci, suivant les saisons et les conditions atmosphériques, entre deux et vingt jours. Après constat de verdissement d'un premier lot d'huîtres, on peut, ou non, laisser reposer les cultures d'algues, pendant deux à trois jours, sans agitation et après contrôle de l'obtention d'une densité de cellules convenable, il est possible de procéder à l' immersion, pour o verdissement, d'un second lot d'hu^tres. ÉN S: Le procédé de culture en masse selon l'invention permet d'obtenir simultanément, si l'on procède à la centrifugation, ou filtration, des cultures obtenues: i5 - de l'ea?1 de mer pigmentée, dite " eau bleue ", pour une utilisation dans le domaine de la cosmétologie, ou du paramédical. - et en masse: des algues, lesquelles peuvent étre conservées, par congélation ou lyophilisation, ou peuvent étre traitées, en particulier pour en extraire le pigment bleu, à des fins agroalimentaires ou autres. (des études, en cours d'exécution, par des laboratoires spécialisés, ont mis en évidence les propriétés raffermissantes et anti-irritantes de l'Algue, des tests, ont montrés que la poudre d'Algue n'avait pas d'effet irritant pour la peau et les yeux; sur des cobayes: qu'elle ne présentait pas de toxicité et n'était pas mutagène); I1 est intéressant de constater que le procédé d'ensemencement, tel que décrit dans l'invention, permet d' améliorer considérablement la production d' algues, par rapport à la ^75 production en rnilieu protégé. -I1 permet également, de procéder à l'ensemencement de bassins spécifiques, ou après développement contrôlé des algues ensemencées, il est procédé à l'affinage, par verdissement, de lots d'hu^tres immergés. Suivant les conditions atmosphériques et les saisons, la durée de vie des algues en bassins est variable et peut permettre le verdissement de plusieurs lots d'hu^tres. REVENDICATIONS 1- Procédé de culture en masse de la diatomée Haslea osreuria Simonsen caractérisé en ce que le milieu de culture est constitué d'eau salée, possédant des concentrations en oligo-éléments traces et en nutriments majeurs nécessaires. 0 2- Procédé selon la revendication 1, - On prépare un milieu de culture constitué d'eau salée ayant une salinité comprise entre 20 et 40 / et une concentration en ammoniaque inférieure à 150!lM/dm3, des concentrations en éléments minéraux majeurs telles que: -azote total (nitrique+ammoniacale): entre 40 et 400, M/dm3 -phosphore: entre 2 et 30 M/dm3 -silicium: entre 40 et 600 Mldm3 des concentrations en oligoéléments métalliques telles que: -cuivre: entre 2.10-9 et 6. l0-8 M:/dm3 fer: entre 5 10-8 et 20.10-6 M/dm3 -zinc: entre 6.10-8 et 12.10-8 M/dm3 nickel: entre 1.10-6 et 2.10-8 M/dm3, - On filtre, ou non, le milieu de cultures, - On ramène le pH du milieu à une valeur supérieure ou égale à 6,8, - On choisit des algues issues de clones isolés et mis en culture en laboratoire dans des récipients en verre à une température de ltordre de 18 C, avec un éclairement d'au moins 3000 lux à un rythme continu ou alterné, pendant un minimum de 5 j ours On fait incuber les algues. 3- Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'incubation des algues s'effectue dans des bacs pouvant aller jusqu'à 10000 dm3(voire plus), de manière à maintenir la température entre 12 C et 25 C, en éclairement artificiel ou non, sans agitation, en milieu calme, pendant au moins 5 jours. 4- Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l'incubation des algues s'effectue en continu, par utilisation de chémostat ou de photobioréacteurs. S- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les concentrations en éléments minéraux essentiels sont: - azote total: environ 100 M/dm3 - phosphore: environ 4 M/dm3 - silicium: environ 100 M/dm3. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les concentrations en oligo-éléments métalliques sont: - cuivre: environ4 10-6 MUdm3 - fer: environ12 106M/dm3 - zinc: environ8 1o-8 M/dm3 - nickel: environ1,5.10-8 M/dm3. 7- Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'on utilise les algues produites selon les revendications 1 à 6, en tant qu' " inoculum ", pour ensemencer des bassins extérieurs et obtenir, ainsi, avec un rendement nettement supérieur, une production, destinée: soit à l'industrie, - soit, pour obtenir le verdissement des huA'tres, après immersion de celles-ci. 8- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on sépare, par centrifugation, filtration ou autre moyen de séparation, les algues produites d'avec l'eau enrichie de pigments bleus, pour obtenir, d'une part: - un concentré d'algues sous forme de " masse algale frache ", d'autre part, une eau enrichie de pigments, dite " eau bleue " Ces deux produits étant à vocation d'utilisation industrielle ( médicale et cosmétologie ou agroalimentaire) et pour le second, potentiellement, pour verdir les hu^tres. 9- Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que l' on procède, dans des bassins constitués de sédiments ou de béton, de superficies variables, ( ici, de 60, 250 et 400 m2), à un traitement préalable et spécifique à ceux-ci, consistant en: -un rinçage, -une mise à sec d'une durée variable, (fonction des conditions atmosphériques). -un traitement spécifique, selon leur nature, ceci afin d'éliminer les organismes compétiteurs de l'algue, présents, tant dans l'atmosphère, qu'accumulés dans les fissures et inégalités du terrain. c g - Procédé selon les revendications 1 à 7 et 9, caractérisé en ce qu'on utilise les algues produites selon les revendications 1 à 6, lorsqu'elles ont atteint leur stade exponentiel de croissance, en tant qu'inoculum, pour ensemencer des bassins extérieurs, suivant la revendication 7 et préalablement traité suivant la revendication 9, aux fins d'y faire verdir des hu^tres, ou de récupérer les algues produites. o 11- Procédé selon les revendications 7,9 ou 10 caractérisé en ce que: - les quantités d'inoculum utilisées varient entre 3 et 1S x 10 cellules, pour un bassin de 60 rn2. - il est ajouté un volume d'eau salée dans des proportions pouvant varier de 20 à 90% du volume total de la culture. 12- Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que: l'on obtient une production intense d'algues ( la " claire " est dite " verte "), entre 2 et 20 jours, suivant les conditions saisonnières et atmosphériques. 13- Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que: après immersion de lots d'hu^tres, posés sur des tables, à raison d'environ une hu^,tre pour 7,5 dm3 de culture, l' on obtient le verdissement de cellesci suivant les saisons et les conditions atmosphériques, entre deux et vingt jours. 14- Procédé suivant les revendications 12 et 13, caractérisé en ce que: Après constat de verdissement d'un premier lot d'hu^tres, on peut, ou non, laisser reposer les cultures d'algues, pendant deux à trois jours, sans agitation et après contrôle de l'obtention d'une densité de cellules convenable, il est possible de procéder à l'immersion, pour verdissement, d'un second lot d'hu^'tres. - Atgue de l'espèce Haslea ostrearia Simonsen, caractérisée en ce que, l'Algue ainsi obtenue, par le procèdé selon l'une des revendication 1 à