FR 2842911 A1 20040130 FR 0209365 A 20020724 l 2842911 L'invention est relative aux méthodes d'analyse d'un échantillon par Résonance Magnétique Nucléaire RMN, haute résolution. Elle décrit une nouvelle technique d'investigation d'un échantillon par RMN. La technique est fondée sur la réalisation d'une expérience de RMIN, suivie d'un traitement des données expérimentales enregistrées. Un ensemble de noyaux, possédant chacun un moment magnétique de spin, soumis à un chanp magnétique statique Bo, seront animés d'un mouvement de précession autour de B0 avec une vitesse augulaire, dite précession de Larmor. L'emsemble des moments magétiques des différents spins peut être remplacé par une grandeur macroscopique notée M , et qu'on appelle aimantation du système de spins. C'est cette aimantation qu'on observe en RMN. Pour pouvoir observer l'aimanatation M on lui applique un champ radiofréquence B1(t) polarisé dans le plan transversal au champ statique Bo, et appliqué sous forme forme d'un créneau. Le champ radiofréquence fera basculer l'aimantation Mo dans le plan horizontal, et on observe alors un signal de précession libre de l'ensemble des noyaux; signal qu'on nome " Free Iduction Decay" (FID). La valeur du champ magnétique Bo ressenti au niveau du noyau n'est pas nécessairement la valeur appliquée, à cause de l'effet d'écran du nuage électronique local autour du noyau considéré. La fréquence de résonance de ce dernier est alors déplacée (shiftée) d'une quantité qui dépend de l'environnement électonique du noyau, donc de la nature du groupement chimique auquel il appartient. Cet effet est connu sous le nom de déplacement chimique. Les spins nucléaires intéragissent par l'intermédiaire des électrons des liaisons mises en jeux. Cette interaction, de nature scalaire est le couplage scalaire, ou couplage J. Il est, avec le déplacement chimique, à l'origine de la structure fine observée dans les spectres RMN. Le couplage J est indépendant de l'orientation des noyaux dans l'espace. Il est également indépendant du champ magnétique appliqué, et peut être positif ou négatif. décroît rapidement rapidement en fonction du nombre de liaisons entre les noyaux. On estime qu'au-dela de trois liaisons, ce couplage devient très faible et donc difficilement observable. La connaissance du couplage J est d'une importance considérable dans la détermination des structures moléculaires. Elle permet de déterminer, entre autre, le nombre de liaisons mises en jeux, la distance entre les noyaux, l'angle entre les liaisons des noyaux adjacons....La mesure de la constante de couplage J sur un spectre RMN est particulièrement délicate lorsque sa valeur est du même ordre de grandeur que la largeur de raie à mi-hauteur. Récemment, quelques techniques RMN ont été proposées pour mesurer la constante J dans de telles situations, mais elles sont contraingnantes et atteignent rapidement leurs limitations. Dans certains systèmes de spins, pris dans des conditions données, hydrogène dans un mélange d'eau et d'alcool, par exemple) peuvent s'échanger entre les 2 2842911 molécules d'eau et le groupement hydroxyle de l'alcool. Un noyau H dans une position A (dans l'eau par exemple) effectue un saut soudain et rapide vers une position B (dans l'alcool). Cette échange peut se produire d'une molécule à une autre, ou au sein d'une même molécule. Ce phénomène de déplacement des noyaux est appelé échange chimique. temps moyen pendant lequel un noyau reste dans une position donnée, avant d'effectuer un saut vers une autre position est appelé dure de vie T-C La présence de ce phénomène d 'échange modifie l'aspect du spectre RMIN observé. Dans l'exemple de l'eau et de l'alcool, à cause de l'échange chimique, le multiplet du H dans la molécule de l'alcool est réduit à un seul pic, assez large. En présence d'un échange chimique il est est donc assez difficile, voir même impossible d'observer la structure fine du spectre, et donc de pouvoir mesurer le couplage scalaire J. Il n'existe actuellement aucune technique d'analyse par RMN, permettant d'acceder au couplage scalaire, aux déplacements chimiques des différentes entités présentes dans l'échantillon,..., dans les situations o le couplage scalaire est très faible, inférieur à 2 Hz (cas des couplages dits longue distance), et o de surcroît l'échantillon est le siège de phénomène d'échange chimique. L'invention propose pour la première fois une technique d'investigation par RMN, assez précise, simple à mettre en oeuvre et rapide (ce qui est un grand avantage dans des applications industrielles). Nous présenterons plus loin le spectre RMN de l'eau enrichie en Deutérium, o on observe pour la première fois, la structure fine des multiplets H20 et HOD, et o on peut mesurer le couplage Proton Deutéérium. Pour étudier les proriétés des molécules d'intéret biologique médical... (protéines, graisses,....) on procède habituellement à des investigations réalisées directement sur ces molécules. L'originalité de cette nouvelle technique d'investigation est de déterminer les propriétés en étudiant leurs interactions avec un solvant dans lequel elles sont dissoutes, en l'occurence d'eau enrichie deutérée. En déterminant la structure de cette dernière, par mesure des constantes de couplage scalaire, les variations des déplacements chimiques des multiplets correspondant aux molécules HOD, H20, D20, les variations des largeurs de raies en fonction du facteur d'agrandissement apparent des constantes de couplage J par cette methode, on extrait des informations sur la molécule soluté. La technique est réalisé en deux étapes. La première étape consiste à réaliser une simple expérience de RMN appelée " one pulse" (la Figure 1. montre le chronogramme de la séquence d'impulsion utilisée dans cette expérience), sur une solution, composé d'un certain de D20 et de de H20 à des pourcentages différents. Les valeurs des pourcentages, n'ont pas d'influence sur le résultat final, mais il est plus judicieux et conseillé de choisir un pourcentage en D20 plus important que celui de H20 pour avoir suffisemment de molécules HOD dans la solution (après le mélange), et donc un signal importan sur le spectre résultant, 3 2842911 obtenu à l'issu des deux étapes de l'investigation. Le mélage des deux volumes de D20 et de H20 doit être préparé au moins 24 Heures avant la réalisation de l'expérience de RMN, afin de laisser un temps suffisent aux transfert des noyaux entre les deux molécules (H20, et H20). L'expérience "one pulse" doit être réalisée avec un nombre de points (TD) important. Il doit être d'au moins 32 k points. Le signal obtenu (FID) ne doit pas être tronqué. La Figure 2. montre l'aspect que doit avoir la FID enregistrée lors de l'expérience. La deuxième étape de cette technique d'analyse consiste à traiter (à l'aide de programmes informatiques conçus pour cet objectif) les données expérimentales enregistrées lors de l'expérience RMN "one pulse". A partir de la FID, une série de signaux sont reconstitués de la manière suivante: - Tous les signaux contiennent le même nombre de points (N) tel que N - Le début du premier signal coincide avec celui de la FID. Les données des N premiers points de cette dernière, consituent le premier signal, qui sera sauvegardé dans un fichier. Les données des N points du deuxième signal sont pris à partir de l'instant r = pdc9, o p est un entier, choisi par l'expérimentateur, dw est la période d'échantillonnage de la FID. Ceci revient à prendre ces données à partir du (p+l)'èm point de la FID (Fig. 1). Les données sont également sauvegardées dans un fichier et constituent le deuxième signal de la série. - De manière analogue, le troisième signal est constitué des données de N points de la FID, pris à partir de l'instant 2v = 2pdw. Ainsi de suite, les signaux de la série sont gérérés de la même manière. Leurs débuts coincident avec les instants kr, k est étant un entier positif. Pour que le spectre résultant, obtenu à l'issue de du traitement soit bien définit et résolue, la série générée doit contenir au moins une trentaine de signaux (bien que la technique peut être mise oeuvre avec moins de signaux). Les signaux reconstitués ont alors pour expression: G(t, T) = g(t) exp(-)((l + /3) exp(/3.(t + r)) + (rV, -1) exp(-/3n(t + r)) ) (1) 2zv/1r,, T2 o: /3 1 2 (2) (3) T2 T2 T, g(t) = M exp((z T2: est le temps de relaxation transversale du noyau considéré. 4 2842911 Dans cette expression, la phase du déplacement chimique à l'origine du temps est 0( = is)5T Pour supprimer cette phase, chaque signal est multiplié par exp(-ia,5r), pour la valeur correspondante de r. Le but de cette multiplication est de garder le déplacement chimique à sa fréquence habituelle dans le spectre résultant. L'expression des signaux devient alors: G(t, r) = g(t ((1 + f,f T) exp((r + t)fiffrV) + (/lfrT - 1) exp((r + t),3 r,") (5) 29,/Jr, * Dans le cas d'un échange chimique rapide (1 "7J), cette expression se réduit à: G(t,r) = M'exp(-) exp((iws5 ---)t) (6) T2 T2 Dans les situations o l'échange chimique est lent, 1 est petit, comparé à I1, et on peut écrire 3 = (j)2 iiZJ. les signaux reconstitués sont décrits par: G(t, r) = M exp(-) exp((i )8 -)t) CoS(7ZJ(t + r)) (7) T2 T2 * Deux cas d'échange chimique intermédiaires sont également à considérer: A- Cas o - irJ. L'expression des signaux s'écrit dans ce cas: 1 15 G(t, T) = g (t) exp(-Ir)(ch(z,8(t + T)) +1s h(z,(t + T))) (9) T2 /31r, L'ensemble des signaux générés vont ensuite être utilisés par un programme d'intégration, suivant la méthode de D'Alembd) pour évaluer l'expression du signal résultant, définit par la double intégrale suivante: G(t) = | fG(t, r)exp(iv(,r-nt))drdv (10) o 2842911 O v est un couplage fictif, exprimé en Hz. n est un reel positif. T est la valeur maximale du délai variable r. La somme de l'équation (10) sera calculée dans chacun des cas de l'échange chimique, discutés auparavant. - Dans le cas d'un échange rapide, l 'évaluation de G(t), (equation (10)), ne permet pas de mesurer la constante de couplages. En effet le calcul montre que ceci ne fait que multiplier le spectre normal par une constante. Le couplage scalaire J, ne peut être mesuré dans ce cas. Lorsque l'échange chimique est lent (signaux donnés par l'équation (7)) le calcul de l'intégrale G(t) donne: G (t) = M0exp(i(vôt) exp(-t /r,) exp(-(n + 1)t /T2) cos(zJ(n + 1)t) (11) G(t) donne, après Transformation de Fourier, un spectre o le couplage apparent, mesuré directement sur le spectre résultant, est donné par j,,p,=(n+1)J. Le couplage reel J a donc été multiplié par (n+l), ce qui permet de le visualiser et donc dele mesurer avec précision, connaissant n. La technique fait apparaître la structure fine des multiplets du spectre. Les techniques actuelles de RMN, même sur les spectromètres récents o on peut obtenir une assez bonne résolution digitale et une dispersion spectrale satisfaisante, ne permettent pas de faire apparaître une telle structure fine lorsque le couplage scalaire est très faible et en présence d'un échange chimique, qui élargie davantage les raies du spectre. i - Dans le cas o la vitesse de l'échange est telle que - Par transfoamation de Fourier G(t) donne un spectre o le couplage apparent est cette fois- ci donné par JPp, =(n + 1),f. Connaissant n et la valeur de Jappt mesurée sur le spectre résultant, on déduit f'. Pour extraire la valeur du couplage reel J, nous avons besoin de la valeur de la durée de vie moyenne TV,. Elle sera mesurée à partir des largeurs de raies à mi- hauteur dans le triplet du deutérium. En effet la largeur à mi-hauteur de la raie centrale de ce dernier est donnée par: i Ro =;7T2 (14) La largeur à mi-hauteur des raies extérieures du triplet s'écrit: 1 1 n+1 Ri=-(-+) U TV T2 (15) De ces deux équations on en déduit l'expression de rT en fonction de n: I =Z(R - (n + l)Ro) (16) Le couplage reel J, peut alors être calculé, à partir de l'expression de fi', d'o 2 A i = fi + (17) - En fin le dernier cas d'échange chimique qui se présenter lors de l'analyse de la solution D20 plus H20, est celui o - > zJ. Dans cas le calcul de G(t) (de l'équation (10)), conduit à l'expression suivante: G (t) = 2MOexp(iaôt)exp(-( +)t)(ch(i(n + )t) + i sh(i(n + I)t" ri7 T2 flI7rv (18) La transformée de Fourier de G(t)' est un spectre contenant une seule raie lorentzienne bien 7 2842911 élagie par les pénomènes d'échange chimique. Le traitement de la série de signaux reconstitués, pour différentes valeurs de n, donnera toujours une seule raie dont la largeur diminue lorsque n augmente. La raie du spectre est une combinaison des deux raies données par les termes exp(4z,(n + I)t) et exp(-7t/(n + 1)t) des fonctions cosinus et sinus hyperboliques. Une déconvolution du signal obtenu après traitement, permet de séparer les deux raies. Les largeurs à mi-hauteur respectives de ces deux raies sont données par: R= -(-+ (n + 1)( + -)) (19) 7T Tv T2 et R2 =-(-+ (n + 1)(--1)) (20) f7TV T2 La somme et la différence de RI et R2 s'écrivent respectivement: Ri+R2 =-(-+) (21) Ir TV T2 Ri - R2 = 2,/(n + 1) (22) En mesurant RI et R2 pour différentes valeurs de n, on mesure aisément la durée de vie moyenner et le facteur /3. Connaissant la valeur de ce dernier, on en déduit celle du couplage scalaire J (utilisant l'équation (2)). La figure 1. montre le chronogramme de la séquence d'impulsion RMIN utilisée dans une expérience "one pulse". La figure 2 illustre la manière dont les signaux sont reconstruits à partir du signal de la FID, enregistrée lor de l'expérience "one pulse". Les données des N points de chaque signal sont sauvegardés dans un fichier. Un shift de p points est efféctué à chaque fois, avant de prendre les données des N points suivants. Les débuts des signaux correpondent aux instants: 0, r, 2rr..... nr. La figure 3 montre les spectres proton obtenus lors d'une investigation faite sur une solution 0,7 ml composée de D20 à 80 % et de 20 % de H20. L'expérience RMN a été réalisée sur un spectromètre opérant à un champ magnétique de 7 Tesla. La Figure 3A. est obtenue en réalisant une expérience "one pulse". La FID a été enregistrée avec 64 k ponints pour 3, 93 s, et une période d'échantillonnage de 60 ILs. La Figure 3B montre le spectre obtenu à 8 2842911 l'issue du traitement d'une série de 90 signaux, reconstitués à partir de la FID enregistrée précédemment. Le paramètre p est de 200 et le pas du paramètre r est pris égale à 0,012 s. n est pris égal à 3. La figure 3C montrent le spectre obtenu effectuant le même traitement dans une solution de 70 % de D20 et 30 % de H20. n est pris égal à 3. Résultat Expérimental La nouvelle technique décrite dans ce brevet à été appliquée à une solution de 0,7 ml, contenant 80 % de D20 et 20 % de H20, 24 heures après avoir réalisé le mélange des deux volumes de D20 et de H20. L'expérience "one pulse" a été réalisée sur un spéctromètre opérant à un champ de 7 Tesla, à 25 'C. Le signal a été enregistré avec 64 k points, une période d'échantillonnage de 60 ps et pour 3,93 s. La deuxième étape de cette technique a été réalisée en reconstituant 90 signaux à partir de la FID du "one pulse". Chaque signal contient 8 k points. Le paramètre p étant de 200. Le pas du délai variable r est donc de 0,012 s. Chacun des signaux reconstitués est ensuite multiplié par exp(-iwô'r), pour la valeur de r correspondante, (pour supprimer la phase à l'origine du déplacement chimique). Après la suppression de cette phase, l'expression des signaux est donnée par l'équation (5). La série des signaux est alors utilisée par un programme d'intégration, pour évaluer la somme définie par l'équation (10). En choisissant le paramètre n égale à 3 dans la phase d 'intégration, nous obtenons le spectre proton de la figure 3B. Le traitement fait apparaître une structure fine du multiplet, avec le triplet de la molécule HOD centré à 205 4,76 ppm. Les intensités des trois raies sont dans les rapports 1.1.1. Le spectre résultant montre également le pic de la molécule H20 à 4,806 ppm. Le couplage apparent est de 12, 207 Hz. Il est donné théoriquement par J appt = (n + 1),/', puisqu'il s'agit d'un cas d'échange i chimique o - % de H20, en choisissant n = 3 donne le spectre de la figure 3C. La technique d'investigation décrite dans ce brevet, peut être utilisée dans des applications 215 industrielles concernant divers domaines. Nous citons quelques exemples o cette nouvelle 9 2842911 technique d'analyse apporte des informations d'une importance considérable, et s'adapte parfaitement à la nature et aux exigences des domaines d'application, par sa fiabilité, sa simplicité et surtout sa rapidité. - Dans l'industrie pharmaceutique, la technique peut être utilisée pour effectuer des tests de 220 controle de qualité: en étudiant les interactions de l'eau deutérée avec les médicaments (dissouts), il est possible de dire si ces derniers sont actifs; d'étudier leur évolution dans le temps, de comprendre leurs mode d'action. * La technique peut être utilisée aussi pour étudier les interactions des protéines avec l'eau, lors de l'étude des structures moléculaires. Les informations recueillies sont d'une 225 importance capitale dans l'extraction ou la sythèse de protéines (fabrication de vaccins). - Dans l'industrie cosmétique, il est possible d'utiliser cette technique pour mesurer le degré d'hydratation de la peau, après utilisation de crème. On peut également étudier les effets de divers produits de beauté sur la peau, par mesure des différents paramètres spectraux. Ceci peut être réalisé par spectroscopie RMN in vivo, et traitement des données expérimentales. 230 - Dans l'industrie agro-alimentaire, il est possible de déterminer par exemple l'origine du saumon: pouvoir dire s'il s'agit d'un saumon trans-génique; s'il s'agit du saumon de culture ou nom. Ceci peut être déterminer en analysant le spectre RMN de l'hydrogène et du Deutérium dans la graisse du saumon: mesure des variations des déplacements chimiques des différents entités présentes dans l'échantillon; mesures des constantes de couplage le 235 proton scalaire entre et le Deutérium dans les diverses graisses, études des variations de ces paramètres en fonction de la température, de la concentration.... * Il est possible également de déterminer la qualité d'un aliment avant et après sa congélation, étudier ces interactions avec les produits de conservation, déterminer les meilleures conditions de sa congélation et de sa décongélation. 240 - Dans l'industrie chimique, on peut par exemple suivre l'évolution du platre, étudier sa fermeté, étudier la variation de la quantité d'eau qu'il contient, étudier son vieillissement. 2842911 REVENDICATIONS 1) Une technique d'analyse d'un échantillon par RMIN consistant dans un premier temps, à enregistrer le signal FID lors d'une expérience de RMN, une série de signaux, contenant un certain nombre de points N, à partir des données du signal FID, le début du premier signal coincidant avec le début du signal FID, l'enregistrement des données du deuxième signal commençant au pième point du signal FID, à l'instant r = p dt, les données constituant le troisième étant prises à l'instant 2r = 2p dt et ainsi de suite, caractérisée en ce que le signal résultant, obtenu à l'issue du traitement des signaux générés, donne après une transformation de Fourier, un spectre en mode absorption pur, o tous les couplages scalaires sont multipliés simultanément par un facteur. 2) Une technique d'analyse selon la revendication 1 caractérisée en ce que le solvant utilisé pour étudier un soluté donné, est une solution d'eau enrichie en Deutérium. 3) Une technique d'analyse selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le paramètre spectral mesuré est la constante de couplage scalaire J en présence du phénomène d'échange chimique. 4) Une technique d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 caractérisée en ce que les variables, sur lesquelles porte le traitement des signaux est le délai variable r (figure 2) qui détermine la phase de chaque signal reconstruit, et un couplage fictif v.