FR 2845690 A1 20040416 FR 0212725 A 20021014 DISPOSITIF POUR ETUDIER LE TRANSPORT TRANSMEMBRANAIRE DE COMPOSES XENOBIOTIQUES La présente invention concerne un dispositif pour étudier le 5 transport à travers des membranes biologiques de composés xénobiotiques et de nutriments, et plus particulièrement de médicaments. L'invention concerne en général les études de transport à travers des membranes, notamment des perfectionnements aux appareils pour effectuer ces études. L'étude du transport à travers les membranes biologiques de composés tels que des médicaments ou d'autres molécules est importante pour les études de ces médicaments ou autres composés sur les muqueuses biologiques. Ces études de transport ont été effectuées en utilisant un dispositif connu sous le nom de chambre d'Ussing. Une 15 chambre d'Ussing de la technique antérieure est décrite dans le document WO 96102627, publié le 1er février 1996 et déposé par BEECHAM CORPORATION. Une telle chambre comprend deux parties séparables entre lesquelles on place un tissu vivant, par exemple un morceau d'intestin de rat. Le tissu sépare la chambre en deux moitiés dont chacune 20 contient une solution tampon en contact avec le tissu. On fait circuler la solution tampon dans chaque moitié de chambre et on maintient la température à une valeur constante. Il est nécessaire de déterminer si la membrane est vivante et si elle réagit au produit xénobiotique. On sait qu'une membrane cellulaire peut maintenir une différence 25 de potentiel de part et d'autre de la membrane. On utilise à cet effet une technique électrique qui permet de constater s'il existe une différence de potentiel (DDP) entre l'extérieur et l'intérieur de la membrane. Si la DDP est égale à zéro, cela signifie que la cellule est morte. On utilise une première paire d'électrodes qui sont reliées à un multimètre pour 30 déterminer la DDP spontanée du tissu. Cette première paire d'électrodes de mesure de DDP est telle que les extrémités des électrodes de mesure sont situées dans la chambre et au voisinage de la membrane. Les électrodes d'une seconde paire ont leurs extrémités dans les moitiés respectives de la chambre et les électrodes sont reliées à une source de courant réglable en série avec un microampèremètre. Au moyen d'un 5 circuit électrique on peut maintenir la tension mesurée à une valeur quelconque. L'appareil électrique comprenant le circuit électrique permettant le maintien de la tension à une valeur donnée est appelé "blocage de tension" ou "clamp de tension". On mesure d'abord la DDP à travers la membrane en mesurant la tension entre la première paire d'électrodes pendant que le courant entre la seconde paire d'électrodes est nul. Puis, on applique un courant entre les électrodes de la seconde paire d'électrodes selon une direction opposée à la DDP entre la membrane. Le courant nécessaire pour 15 amener la DDP mesurée à zéro est enregistré comme courant de "courtcircuit". On peut ainsi déterminer la résistance électrique transmembranaire. Dans un tel dispositif il est nécessaire de faire respirer les cellules pour les maintenir en vie. Il est donc nécessaire de faire barboter de 20 l'oxygène dans le milieu liquide des deux moitiés de chambre et qui baigne la membrane de part et d'autre, comme une solution tampon, et d'homogénéiser la solution tampon avec un composé xénobiotique, comme un médicament. Il est encore nécessaire de chauffer et de maintenir les chambres de perméation à une température prédéterminée. 25 Les dispositifs de la technique antérieure comprennent donc une première paire d'électrodes qui permettent de mesurer la DDP d'une membrane, une deuxième paire d'électrodes pour mesurer le courant et un système de bain- marie circulant pour maintenir la membrane à une température donnée. On connaît également un appareil pour effectuer une pluralité de tests pour obtenir des données concernant des propriétés électrophysiologiques de récepteurs dans des membranes biologiques de sujets. Un tel appareil est décrit entre autres dans le document WO 01/71312 publié le 27 septembre 2001 et déposé par ABBOTT LABORATORIES. Cet appareil comprend: (a) une pluralité de stations d'enregistrement pour maintenir une pluralité de sujets à tester; (b) des moyens pour fournir au moins un matériau à tester dans chacune des stations d'enregistrement; (c) des moyens pour contrôler (a) et (b). On connaît en outre un appareil pour relier automatiquement une électrode à une cellule. Un tel dispositif est décrit dans le document WO 98/50791, publié le 12 novembre 1998 et déposé par OLESEN. Cet appareil comprend une chambre pour maintenir des cellules, une électrode pouvant être positionnée de manière adjacente à la chambre, 15 des moyens de positionnement pour maintenir et positionner l'électrode à des positions désirées en liaison avec la chambre, des moyens de mesure pour la détermination d'un paramètre électrique et reliés électriquement à l'électrode et la chambre et formant un circuit électrique comprenant l'électrode et la chambre, et un dispositif de contrôle pour contrôler les 20 moyens de positionnement en réponse aux déterminations de paramètres de manière que l'électrode puisse être reliée automatiquement à la cellule choisie. L'objet de la présente invention est de mettre à disposition un dispositif complet pour étudier le transport trans- membranaire des 25 xénobiotiques comme des médicaments. Ce dispositif devrait être simple, rapide et le moins coteux possible. A cet effet, l'invention concerne un dispositif pour étudier le transport trans-membranaire de produits xénobiotiques comprenant (a) au moins une chambre de perméation de type Ussing ou 30 analogue, (b) un réservoir chauffant électrique à contrôle numérique, (c) au moins une électrode au calomel miniature de mesure de la DDP, (d) des moyens de prélèvement, de distribution et de collecte automatiques d'au moins un échantillon de la solution physiologique en contact de part et d'autre avec la membrane biologique, (e) des moyens pour imposer des paramètres électriques directement audit au moins un échantillon de membrane biologique et enregistrer lesdits paramètres électriques générés par la membrane, notamment la conductance et/ou la résistance. La chambre de perméation 10 (a) est constituée de deux blocs de matière isolante électriquement un premier bloc comportant une première demi chambre recevant le liquide séreux, c'est-à-dire le liquide physiologique en contact avec le côté sanguin du tissu, un second bloc comportant une seconde demi chambre recevant le liquide muqueux, c'est-à-dire le liquide physiologique en 15 contact avec la muqueuse et donc contenant le produit xénobiotique dont on veut étudier l'action, une membrane biologique étant placée entre les deux demi chambres et l'ensemble étant fixé par des moyens de fixation, comme par exemple des.vis, un premier ensemble de deux électrodes de mesure de la DDP à travers la membrane et un second ensemble de deux 20 électrodes reliées à une source de courant réglable permettant d'appliquer un courant à travers la membrane. Le second ensemble de deux électrodes appliquant un courant est constitué par deux électrodes en platine traversant le premier et le second blocs, une extrémité de chacune des deux électrodes du second ensemble plongeant respectivement dans 25 le liquide séreux ou dans le liquide muqueux et l'autre extrémité de chacune des deux électrodes du second ensemble étant reliée à un appareil électrique fournissant une source de courant. A l'aide de ces deux électrodes du second ensemble on peut selon l'invention lire et appliquer un courant électrique directement dans la préparation 30 physiologique. Ainsi selon l'invention, on applique directement un courant dans la préparation physiologique à l'aide des électrodes de platine ou autres. Les électrodes inoxydables sont incluses directement dans la matière même de la chambre de perméation. On supprime ainsi des liaisons par des ponts d'agar ou autres et on simplifie de ce fait le dispositif. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les électrodes du second ensemble sont en un métal résistant à la corrosion et à l'oxydation, plus particulièrement en platine. Selon la présente invention, le premier ensemble de deux 10 électrodes de mesure de la DDP à travers la membrane est tel que la première électrode de mesure de la DDP est connectée à la première demi chambre et la seconde électrode de mesure de la DDP est connectée à la seconde demi chambre par un pont d'Agar. Chaque pont Agar plonge respectivement dans le liquide physiologique séreux ou dans 15 le liquide physiologique muqueux. Les première et seconde électrodes du premier ensemble sont des électrodes au calomel en miniature constituées chacune d'un réservoir cylindrique en matière isolante, de préférence en matière plastique comprenant un premier réservoir contenant du mercure et du calomel 20 (chlorure mercureux) et d'un second réservoir contenant une solution de chlorure de potassium. Une extrémité de chaque électrode de mesure de la DDP est reliée par le pont d'Agar à une demi chambre de perméation et l'extrémité opposée est reliée au moyen d'une fiche, par exemple une fiche banane, à l'appareil électrique fournissant une source de courant. 25 L'appareil électrique qui comprend un circuit de retour pouvant contrôler la source de courant en réponse à la tension mesurée par le multimètre est en général appelé "clamp de tension" ou "clamp électronique", tel que mentionné plus haut. Chaque électrode au calomel miniature dispose à son extrémité terminale d'une ouverture munie d'un bouchon à pas de vis 30 ou autre, que l'on peut enlever et fermer facilement selon les besoins d'utilisation. Selon l'invention, on prévoit en outre un réservoir chauffant électrique permettant de chauffer les chambres de perméation à une température prédéterminée et de les maintenir à cette température. Ce module est constitué d'une plaque chauffante électrique et d'un moniteur 5 de contrôle électronique qui permet de régler et de lire les consignes de chauffage et les températures du liquide physiologique en contact avec le tissu et disposé à l'intérieur des demi chambres. Le contrôle de tout le système est effectué de manière numérique. En outre, le clamp électronique est relié à un ordinateur qui permet 10 le contrôle du système électrique. L'ordinateur permet d'imposer des tensions et des courants de différentes intensités aux tissus via le clamp électronique, en mesurant en même temps les paramètres électriques générés par le tissu, c'est-à-dire la conductance et/ou la résistance du tissu, entre autres. Le clamp électronique peut également servir seulement 15 comme une interface entre l'ordinateur qui contrôle le système électrique et les chambres de perméation. Le multimètre (ou clamp électronique) permet d'imposer le courant et la tension à la membrane biologique, et en même temps de mesurer les paramètres électriques générés par la même membrane biologique et de 20 calculer et de donner directement la valeur de la conductance et/ou la résistance de la membrane biologique. En outre un module auto-programmable à pompe à électrovannes peut être connecté au moins à une chambre permettant de prélever directement des échantillons du mélange de la solution physiologique d'au 25 moins une chambre et de l'introduire directement dans un système d'analyse comme une chaîne HPLC ou autres. La description suivante, en regard des dessins annexés à titre d'exemples non limitatifs, permettra de mieux comprendre comment l'invention peut être mise en pratique. La figure 1 est une vue schématique d'un mode de réalisation de la chambre de perméation du dispositif selon la présente invention; La figure 2A est une vue schématique de face d'un autre mode de réalisation de la chambre de perméation du dispositif selon la présente invention; La figure 2B est une vue de côté de la chambre de perméation de la figure 2A sans représentation de l'intestin; La figure 3 est une vue schématique de face d'encore un autre mode de réalisation de la chambre de perméation du dispositif selon la présente invention; La figure 4 est une vue schématique d'une électrode au calomel 10 miniature utilisée pour la mesure de la DDP dans le dispositif de la présente invention; La figure 5 est une vue schématique de face du réservoir chauffant du dispositif pour étudier le transport transmembranaire de produits xénobiotiques selon la présente invention; La figure 6 est une vue de dessus du réservoir chauffant de la figure 1. Sur la figure 1, on a représenté une chambre de perméation (a) comprenant un premier bloc 1 et un second bloc 2 qui sont en matière isolante électriquement. Ces blocs sont par exemple en matière plastique 20 translucide. Le premier bloc 1 et le second bloc 2 sont maintenus par deux vis 3 et 4. Entre le premier bloc 1 et le second bloc 2, on place un morceau d'intestin 5, par exemple un morceau d'intestin de rat. Le morceau d'intestin 5 est placé de manière que le côté séreux soit en contact avec le réservoir séreux 6 et que le côté muqueux soit en contact 25 avec le réservoir muqueux 7. Le liquide séreux provenant du réservoir séreux 6 parvient dans la chambre 8 du premier bloc 1 en suivant un trajet représenté par la flèche FI tandis que le liquide muqueux provenant du réservoir muqueux 7 parvient dans la chambre 9 du second bloc 2 en suivant le trajet de la flèche F2. Les deux chambres 8 et 9 sont séparées 30 par le morceau d'intestin 5. Le liquide séreux est du côté du sang, tandis que le liquide muqueux est du côté de la muqueuse. Le liquide muqueux M provenant du réservoir muqueux 7 contient le produit xénobiotique dont on veut étudier l'action. On suppose dans cet exemple que le produit xénobiotique est avalé par l'animal et donc qu'il se trouve dans le liquide muqueux pour passer dans le sang en traversant l'intestin. Comme on l'a mentionné plus haut, du fait que les cellules de la paroi de l'intestin sont vivantes, il existe une différence de potentiel ou DDP entre les deux liquides de part et d'autre de la membrane biologique. Cette DDP est mesurée à l'aide d'un premier ensemble de deux électrodes comportant des ponts d'agar 10 et 11. Un second ensemble de 10 deux électrodes 12 et 13 reliées à une source de courant réglable permet d'appliquer un courant s'opposant à la DDP à travers la paroi intestinale. En outre, on introduit des micro-bulles d'oxygène pour maintenir les cellules en vie au moyen d'une aiguille creuse 14. Selon l'invention, le second ensemble de deux électrodes est tel 15 que les électrodes 12 et 13 du second ensemble d'électrodes appliquant un courant s'opposant à la DDP traversent le premier et le second blocs 1 et 2. Les électrodes 12 et 13 ont leurs extrémités 15 et 16 reliées à une source de courant (non représentée) et leurs extrémités opposées 17 et 18 qui plongent respectivement dans le liquide physiologique. Selon 20 l'invention, on peut donc grâce à ces électrodes 12 et 13 appliquer directement un courant électrique dans le liquide biologique. Le liquide muqueux est une préparation physiologique qui comprend une solution saline tamponnée, par exemple la solution de Ringer, mais avec en outre un produit comme un médicament, et le liquide 25 séreux comprend la même solution. Selon l'invention, on applique directement un courant dans les solutions physiologiques et on supprime ainsi les liaisons électriques. On obtient une simplification du dispositif. Les électrodes 12 et 13 sont de préférence en un métal résistant à 30 la corrosion et à l'oxydation, par exemple en platine. Sur les figures 2A et 2B on a représenté un autre mode de réalisation d'une chambre de perméation selon la présente invention. Les chambres de liquide séreux et de liquide muqueux sont séparées par un morceau d'intestin 20 et une première série d'électrodes 5 10,11 est reliée à un multimètre 21 pour déterminer la DDP spontanée entre le liquide séreux et le liquide muqueux. Une seconde série d'électrodes 15,16 est reliée à une source de courant 22 réglable en série avec un microampèremètre 23. Des tubes 14a, 14b permettent d'introduire un mélange d'oxygène et de dioxyde de carbone (02: C02 = 95: 5) dans 10 le liquide séreux et le liquide muqueux. La figure 3 représente une chambre d'Ussing modifiée selon l'invention. Cette chambre d'Ussing comporte un réservoir séreux 24 et un réservoir muqueux 25, des bouchons de réservoir séreux et de réservoir muqueux, respectivement 26 et 27, des aiguilles 28 et 29 pour faire 15 barboter de l'oxygène et du dioxyde de carbone respectivement dans le réservoir séreux 24 et le réservoir muqueux 25, des ponts d'agar 30 et 31 pour les électrodes de mesure de la DDP, des électrodes de platine 32 et 33 et des fiches bananes femelles 34, 35. Selon l'invention, les première et seconde électrodes du premier 20 ensemble sont des électrodes telles que représentées sur la figure 4. Ces électrodes sont chacune constituées d'un boîtier 36 en matière isolante, comme une matière plastique et comprennent un réservoir 37 contenant du mercure et du chlorure mercureux (Calomel) et un réservoir 38 contenant du KCI saturé. L'une des extrémités de l'électrode est munie 25 d'une petite fiche banane femelle 39 qui permet de la relier au clamp électronique, comme une fiche banane mâle 40. Comme on l'a mentionné plus haut, le clamp électronique est un dispositif électronique comportant une source de courant et de tension et un multimètre qui permettent de maintenir le courant et/ou la tension à une valeur donnée. Selon une autre caractéristique de la présente invention, on prévoit en outre un module qui permet de chauffer les chambres de perméation à une température prédéterminée et de les maintenir à cette température. Il est en effet indispensable que les chambres de perméation ainsi que les liquides physiologiques soient maintenu à une température constante pour permettre la survie des cellules. Sur les figures 5 et 6 on a représenté un mode de réalisation d'un tel module chauffant selon l'invention. Il comprend une plaque chauffante 41, une poignée de serrage 42 des chambres de perméation 46 à l'aide de la barre transversale 44, des pieds 43 de support du réservoir, une chambre de mesure de la température de la solution physiologique 45, un 10 support de maintien des chambres par le dessous 47. Le dispositif selon l'invention comprend en outre un collecteur automatique des échantillons. Ce module est un mini robot programmable muni d'un bras capable de faire les prélèvements, des préparations des échantillons et des injections des différents produits chimiques dans les 15 chambres de perméation ou directement dans les appareils d'analyses. Le pompe à électrovanne automatique d'échantillons peut être utilisée indépendamment et permet de prélever par exemple avec les tuyaux les échantillons directement dans les chambres de perméation et d'injecter des échantillons directement dans une chaîne HPLC. Ce 20 système est uniquement adapté pour des études de transport des médicaments et xénobiotiques dans les chambres de perméation Le dispositif selon l'invention comprend en outre un Clamp électronique qui est un appareil capable non seulement d'imposer des tensions et des courants électriques aux membranes biologiques, mais 25 également de lire les paramètres électriques générés par les membranes biologiques. Le Clamp électronique permet également d'exécuter les ordres venant de l'ordinateur, à savoir, appliquer aux bords du tissu la tension et le courant d'intensité prédéterminée. Dans ce cas, le clamp devient une interface entre l'ordinateur et les chambres de perméation. Ce 30 clamp permet de donner directement les valeurs de la résistance ou la conductance de tissu. il Le Clamp est d'utilisation facile et est formé de 4 boutons non limitatif: le bouton pour faire le zéro électrique, le bouton pour la compensation de la résistance du fluide, le bouton pour lire la tension ou le courant, le bouton poussoir pour appliquer le courant ou la tension au 5 tissu. Il joue alors l'interface entre l'ordinateur qui impose et lit, calcule, les valeurs des paramètres électriques et les chambres de perméation. REVENDICATIONS 1. Dispositif pour étudier le transport trans-membranaire de produits xénobiotiques caractérisé en ce qu'il comprend: (a) au moins une chambre de perméation de type Ussing ou analogue, (b) un réservoir chauffant électrique à contrôle numérique, (c) au moins une électrode au calomel miniature de mesure de la DDP, (d) des moyens de distribution, de mélange, de prélèvement et de collecte automatiques d'au moins un échantillon de la solution physiologique de part et d'autre de membrane biologique, (e) des moyens pour imposer des paramètres électriques audit au moins un échantillon de membrane biologique et enregistrer directement lesdits paramètres électriques générés par la membrane, notamment la conductance et/ou la résistance, la chambre de perméation (a) étant constituée de deux blocs (1,2) de matière isolante électriquement, un 20 premier bloc (1) comportant une première demi chambre (8) recevant le liquide séreux, un second bloc 2 comportant une seconde demi chambre (9) recevant le liquide muqueux, une membrane biologique (5) étant placée entre les premier et second blocs et l'ensemble étant fixé par des moyens de fixation, un premier ensemble de deux électrodes (10,11) de 25 mesure de la DDP à travers la membrane et un second ensemble de deux électrodes (12, 13) reliées à une source de courant réglable permettant d'appliquer un courant à travers la membrane, le second ensemble (12, 13) de deux électrodes appliquant un courant étant constitué par deux électrodes traversant le premier et le 30 second bloc, une extrémité de chacune des deux électrodes du second ensemble plongeant respectivement dans le liquide séreux ou dans le liquide muqueux et l'autre extrémité de chacune des deux électrodes du second ensemble étant reliée à un appareil électrique fournissant une source de courant. 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on lit et on applique un courant électrique directement dans la préparation physiologique grâce aux électrodes inoxydables et inamovibles incluses directement dans la matière même de la chambre de perméation. 3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que les électrodes du second ensemble (12, 13) sont en un métal résistant à la corrosion et à l'oxydation, plus particulièrement en platine. 4. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les première et 15 seconde électrodes du premier ensemble sont des électrodes au calomel miniature constituées chacune d'un réservoir cylindrique en matière isolante, comprenant un premier réservoir contenant du mercure et du calomel (chlorure mercureux) et un second réservoir contenant une solution de chlorure de potassium., 5. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que les électrodes au calomel disposent chacune à son extrémité terminale d'une ouverture munie d'un bouchon à pas de vis ou non, que l'on peut enlever et fermer selon les besoins d'utilisation. 6. Dispositif selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce qu'une extrémité ouverte de chaque électrode du premier ensemble peut être reliée par le pont d'Agar à une chambre de perméation et l'extrémité opposée est reliée au moyen d'une fiche, par exemple une fiche banane, 30 au clamp électronique. 7. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un réservoir chauffant électrique permettant de chauffer les chambres de perméation à une température prédéterminée et de les maintenir à cette température. 8. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que le réservoir chauffant est constitué d'une plaque chauffante électrique et d'un moniteur électronique qui permet de régler et de lire les consignes de chauffage et 10 les températures du liquide physiologique au contact avec le tissu, le contrôle de tout ce système étant effectué de manière numérique. 9. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte un circuit électrique de retour pouvant contrôler le courant 15 et la tension mesurée par un multimètre qui est en général appelé "clamp électronique", ledit clamp électronique étant relié ou non à un ordinateur qui permet d'imposer des tensions et des courants de différentes intensités aux tissus, et mesurer en même temps les paramètres électriques générés par le tissu, et notamment de calculer et d'afficher 20 directement les valeurs de la conductance et/ou la résistance du tissu. 10. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que le multimètre (ou clamp électronique) permet d'imposer le courant et la tension à la membrane biologique, et en même temps de mesurer les paramètres 25 électriques générés par la même membrane biologique et de calculer et de donner directement la valeur de la conductance et/ou la résistance de la membrane biologique. 11. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un module auto-programmable à pompe à électrovannes peut être connecté au moins à une chambre permettant de prélever directement des échantillons du mélange de la solution physiologique d'au moins une chambre et de 5 l'introduire directement dans un système d'analyse comme une chaîne HPLC ou autres.