FR 2840531 A1 20031212 FR 0207137 A 20020611 tester. La presente invention se rapporte a une composition cosmetique pour lutter contre la canitie comprenant au moins un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase (TRP-2). s Le follicule pileux est une invagination tubulaire de l'epiderme qui s'enfonce jusqu'aux couches profondes du derme. La partie inferieure, ou bulbe pileux, comporte elle-meme une invagination dans laquelle se trouve la papille dermique. La partie inferieure du bulbe est une zone de proliferation cellulaire ou se trouvent les precurseurs des cellules keratinisees constituent le chevou. Les cellules en ascension issues de ces precurseurs se keratinisent progressivement dans la partie superieure du bulbe, et cet ensemble de cellules keratinisees formera la tige pilaire. La couleur des cheveux et des polls repose notamment sur la presence en quantites et ratios variables de deux groupes de melanines: les eumelanines (pigments bruns et lS noirs) et les pheomelanines (pigments rouges et jaunes). La pigmentation du cheveu et des polls requiert la presence de melanocytes au niveau du bulbe du follicule pileux. Ces melanocytes vent dans un etat actif, c'est-a-dire qu'ils synthetisent des melanines. Ces pigments vent transmis aux keratinocytes destines a former la tige pilaire ce qui conduira a la pousse d'un chevou ou d'un poll pigmente. Cette structure est appelee ci apres Chez les mammiferes, la melanogenese implique au moins trots enzymes: la tyrosinase, la DOPAchrome tautomerase (TRP-2, pour Tyrosinase Related Protein 2) et la DHICAoxydase (TRP-1, pour Tyrosinase Related Protein 1). s La tyrosinase est ['enzyme qui initie la biosynthese des melanines. Wile est egalement decrite comme etant ['enzyme limitant de la melanogenese. La TRP-2 catalyse la tautomerisation du DOPAchrome en acide 5,6Dibydroxyindole-2- carboxylique (DHICA). En ['absence de TRP-2, le DOPAchrome subit une decarboxylation spontanee pour former le 5,6-dihydroxyindole (DHI). DHICA et DHI vent tous deux des precurseurs de pigments, TRP-1 oxyde les molecules de DHICA pour former des derives de quinones (Pawelek JM and Chakraborty AK. The enzymology of melanogenesis. In: Nordlund JJ, Boissy RE, Hearing VJ, King RA, Ortonne J-P. The Pigmentary System: Physiology and Pathophysiology. New York: Oxford university press; 1998. p. 391-400). 3s Les trots enzymes, tyrosinase, TRP-2 et TRP-1, apparaissent specifiquement impliquees dans la melanogenese. De plus, I'activite de ces trots enzymes a ete decrite comme necessaire a l'activite maximale de biosynthese des eumelanines. L'expression de TRP-2 a ete observee dans les polls de souris noires, a la fois dans les melanocytes actifs du bulbe et dans les melanocytes quiescents de la gaine epitheliale externe. De plus, il est connu que l'activite DOPAchrome tautomerase est augmentee s pendant la phase anagene chez la souris noire. Cependant aucune correlation claire n'a ete etablie entre ['expression de TRP-2 et l'intensite de la pigmentation (Sturm et al. 1995). Par ailleurs, TRP-2 a egalement ete decrite comme conferant aux melanocytes qui l'expriment une resistance a des agents endommageant l'ADN tel que le cis o diamminedichloroplatinum(ll) (Chu et al. 2000 et Pak et al. 2000). Ces resultats suggerent que TRP-2 serait aussi impliquee dans une fonction independante de la meianogenese, ['enzyme pourrait jouer un role cytoprotecteur. Le cheveu et le poll subissent un cycle. Ce cycle comprend une phase de croissance (phase anagene), une phase de degenerescence (phase catagene) et une phase de repos (phase telogene) a la suite de laquelle une nouvelle phase anagene se developpera. En raison de ce cycle pilaire, I'unite folliculaire de pigmentation doit egalement etre cycliquement renouvelee. Ce processus a ete recemment decrit chez l'homme (Commo S. et Bernard B., 2000, Pigment Cell Res. 13:253-259). II a plus particulierement ete montre qu'au cours de la transition telogene-anagene, une partie des melanocytes inactifs contenus dans la capsule telogene prolifere, se positionne autour de la papille dermique du bulbe naissant et commence a exprimer des enzymes necessaires a la synthese de melanines. En parallele, I'autre partie des melanocytes reste inactive dans la region superieure du follicule pileux. Ces enzymes melanogenes seront exprimees dans les melanocytes du bulbe pendant toute la duree de la phase anagene mais ne seront plus exprimees pendant les phases catagene et telogene. Le cycle normal des melanocytes dans le follicule pileux humain requiert la presence de melanocytes quiescents dans la region superieure du follicule pileux qui seront cycliquement actives pour regenerer ['unite folliculaire de pigmentation. 11 est admis que la canitie (blanchissement naturel des cheveux) est associee a une diminution de melanine dans la tige pilaire. La cause de cette diminution n'est pas a ce jour elucidee. Plusieurs hypotheses vent avancees, elle pourrait etre liee a une diminution de l'activite melanogene, une alteration du transfert des melanines ou une diminution du nombre de melanocytes dans le bulbe (Tobin et Paus, 2001). Jusqu'a present, on pensait que des melanocytes quiescents etaient presents dans les follicules pileux de cheveux blancs (Takada et al. 1992, Horikawa et al. 1996, Jenner et Randall 2000). Or, la Demanderesse a constate que la progression de la canitie est associee a une diminution du nombre de melanocytes dans les bulbes pileux, qui, bien qu'en nombre restraint, synthetisent et transferent les melanines. La Demanderesse a egalement observe de fagon inattendue et surprenante que la population de melanocytes o quiescents de la region superieure du follicule pileux humain est egalement diminuee au cours du processus de canitie, les cheveux blancs ne possedant plus que quelques - voire plus aucun - melanocytes, contrai rem ent a l' infundibul um et l'epiderme avoisinant ces chevoux blancs. Cette disparition affecte prematurement et specifiquement les melanocytes contenus dans les cheveux. 11 appara'^t done necessaire de lutter contre la disparition des melanocytes des follicules pileux humains, processus affectant a la fois les melanocytes actifs des bulbes et les melanocytes quiescents de la region superieure des follicules pileux, pour lutter contre la canitie. Par ailleurs, la Demanderesse a egalement constate que ['enzyme TRP-2 n'est pas exprimee dans les melanocytes des follicules pileux humains pigmentes (bruns, noirs et roux) chez l'individu caucasien, asiatique et africain. Cette enzyme n'est detectee ni dans les melanocytes actifs du bulbe, ni dans les melanocytes quiescents de la region superieure du follicule pileux humain alors qu'elle est exprimee dans l'epiderme et l'infundibulum de l'individu caucasien, africain et asiatique. L'absence de TRP-2 est associee a la disparition precoce des melanocytes qui ne l'expriment pas, c'est-a-dire, les melanocytes quiescents de la region superieure du follicu le pi leux et les melanocytes actifs du bulbe. La Demanderesse a identifie un moyen de maintenir la population de melanocytes du follicule pileux responsables de la pigmentation des cheveux, en effet, elle a montre qu'il etait possible de mimer lactivite TRP-2, elle a ainsi mis au point un moyen pour prevenir eVou limiter eVou stopper le developpement de la canitie et meme dtinduire la pigmentation des chevoux eVou des polls gris ou blancs. Ainsi un premier objet de ['invention se rapporte a une composition cosmetique pour lutter contre la canitie comprenant dans un milieu cosmetiquement acceptable au moins un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase (TRP-2). On entend par agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase un compose capable de reproduire les effets de la DOPAchrome tautomerase sur le metabolisme et la survie des melanocytes. L'agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase (TRP-2) pourra etre notamment choisi parmi les composes suivant: - molecules synthetiques mimetiques de SOD (Metaphore), par exemples, les complexes de manganese tels que decrits dans US 5637578, 5610293, 5874421; - composes anti-oxydants: tels que des derives de tetrahydro-5,6,7,8- naphtaneol-1, en particulier ceux decrits dans le brevet EP 0404640, des derives benzoheterocyles oxygenes (voir le brevet EP 0 685 473), des derives de cyclodextrines (voir le brevet EP 0 778287), des composes silices derives d'acide ascorbique (voir le brevet WO01/30784), de la pyrrolidone carboxylate de Iysine ou d'arginine (voir le brevet EP0511 118), des derives de benzylidene camphre ter-butyle (voir le brevet US 4, 952,391), des derives de benzylidene cyclanone (voir le brevet FR 2636531) , des o diorganopolysiloxanes modifies (voir le brevet EP 0 370 868), des derives lipophiles du benzylidene camphre (voir le brevet EP 0 390 681), des derives hydrophile du benzylidene cam ph re (voir le brevet EP 0 390 682), des derives de benzyl-cyclanone (voir le brevet EP 0 390 683), des polymeres anti-oxydants tels que decrits dans le brevet US4,281,192, des associations de mono- et diester d'acide cinnamique et de vitamine C (voir le brevet EP 0 664 290), des polyamines, telles que putrescine, spermidine, spermine, Di-amines, Tri-amines, Tetra-amines; le propyl gallate, la quercetine, le trolox, l'histidine, le tryptophane, la methionine, des chelateurs de metaux (21-aminosterodes), le complexe salen-manganese (par exemple: EUK-8), I'a-phenyl ter-butyl nitrol (PBN) (et composes derives) ou l'ebselen; - composes non anti-oxydants, tel que le MIF et ses analogues (Marcophage Migration Inhibiting Factor, voir Rosengren et al. Mol. Med., 1996, 2(1):143-9). La composition selon ['invention comprend une quantite d'agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase comprise entre 0.001 % et 10 % en poids par volume. La composition selon ['invention peut etre administree par vole vale ou appliquee sur la peau (sur toute zone cutanee du corps) eVou le cuir chevelu. Par vole vale, la composition selon ['invention peut contenir, le ou les agents mimetiques de l'activite de la DOPAchrome tautomerase composes actifs en solution s dans un liquide alimentaire tel qu'une solution aqueuse ou hydroalcoolique, eventuellement aromatisee. Ils peuvent egalement etre incorpores dans un excipient solide ingerable et se presenter par exemple sous forme de granules, de pilules, de comprimes ou de dragees. Ils peuvent egalement etre places en solution dans un liquide alimentaire conditionne lui-meme eventuellement dans des capsules ingerables. Selon le mode d'administration, la composition de ['invention peut se presenter sous toutes les formes galeniques normalement utilisees, particulierement en cosmetologie. Une composition preferee de ['invention est une composition cosmetique adaptee a une application topique sur le cuir chevelu eVou la peau. Pour une application topique, la composition utilisable selon ['invention peut etre notamment sous la forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse ou de dispersion du type lotion ou serum, d'emulsions de consistence liquide ou semi-liquide du type fait, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou de suspensions ou emulsions de consistence moue du type creme ou gel aqueux ou anhydres, ou encore de microcapsules ou microparticules, ou de dispersions vesiculaires de type ionique eVou non ionique. Wile peut ainsi se presenter sous forme d'onguent, de teinture, de creme, de pommade, de poudre, de timbre, de tampon imbibe, de solution, d'emulsion ou de dispersion vesiculaire, de lotion, s de gel, de spray, de suspension, de shampooing, d'aerosol ou de mousse. Wiles peuvent etre anhydres ou aqueuses. Wile peut egalement consister en des preparations solides constituent des savons ou des pains de nettoyage. Ces compositions vent preparees selon les methodes usuelles. La composition utilisable selon ['invention peut en particulier etre une composition pour veins capillaires, et notamment un shampooing, une lotion de mise en plis, une lotion traitante, une creme ou un gel coiffant, une composition de teintures (notamment teintures d'oxydation) eventuellement sous forme de shampooings colorants, des lotions restructurantes pour les cheveux, de masque. 3s La composition cosmetique selon ['invention sera preferentiellement une creme, une lotion capillaire, un shampooing ou un apres-shampooing. Les quantites des differents constituents des compositions utilisables selon ['invention vent celles classiquement utilisees dans les domaines consideres. Lorsque la composition utilisable selon ['invention est une emulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5% a 80% en poids, et de preference de 5% a 50% en poids par rapport au poids total de la composition. Les huiles, les cires, les emulsionnants et o les coemulsionnants utilises dans la composition sous forme d'emulsion vent choisis parmi ceux classiquement utilises dans le domaine cosmetique. L'emulsionnant et le co emulsionnant vent presents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3% a % en poids, et de preference de 0,5 a 20% en poids par rapport au poids total de la composition. L'emulsion peut, en outre, contenir des vesicules lipidiques. Lorsque la composition utilisable selon ['invention est une solution ou un gel huileux, la phase grasse peut representer plus de 90% du poids total de la composition. Dans uns variante de ['invention, la composition sera telle que ['agent mimetique de I'activite de la DOPAchrome tautomerase est encapsule dans un enrobage tel que des microspheres, des nanospheres, des oleosomes ou des nanocapsules, ltenrobage sera choisi selon la nature chimique de ['agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase. s A titre d'exemple, les microspheres pourront etre preparees selon la methode decrite dans la demande de brevet EP 0 375 520. Les nanospheres pourront se presenter sous forme de suspension aqueuse et etre preparees selon les methodes decrites dans les demandes de brevet FR 0015686 et FR 0101438. Les oleosomes consistent en une emulsion huile dans eau formee par des globules huileux pourvus d'un enrobage cristal iiquide lamellaire disperse dans une phase aqueuse (voir les demandes de brevet EP 0 641 557 et EP 0 705 593). L' agent m i m etiq ue de l'activite de la D O PAch rom e tautomerase pou rra au ssi etre encapsule dans des nanocapsules consistent en un enrobage lamellaire obtenu a partir d'un tensio-actif silicone (voir la demande de brevet EP 0 780 115), les nanocapsules pourront egalement etre preparees a base de polyesters sulfoniques hydrodispersibles s (voir la demande de brevet FR 0113337). L'agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase pourra egaiement etre complexe a la surface de globules huileux cationiques, quelques soit leur taille (voir les demandes de brevet EP 1 010 413, EP 1 010 414, EP 1 010 415, EP 1 010 41 6, EP 1 013 338, EP 1 016 453, EP 1 018 363, EP 1 020 219, EP 1 025 898, EP 1 120 101, EP 1 120 102, EP 1 129 684, EP 1 160 005 et EP 1 172 077). L'agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase peut enfin etre complexe a la surface de nanocapsules ou nanoparticules pourvues d'un enrobage lamellaire (Voir S EP 0 447 318 et EP 0 557 489) et contenant un tensio-actif cationique a la surface (voir les references citees precedemment pour les tensio-actifs cationiques). En particulier, on preferera une composition telle que l'enrobage dans lequel ['agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase a un diametre inferieur ou egale a 10,um. Lorsque l'enrobage ne forme pas une vesicule spherique, on entend par diametre la dimension la plus grande de la vesicule. De fa,con connue, la composition selon ['invention peut contenir egalement des adjuvants habituels dans le domaine cosmetique, tels que les gelifiants hydrophiles ou lipophiles, les additifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvents, les parfums, les charges, les filtres, les absorbeurs d'odeur et les matieres colorantes. Les quantites de ces differents adjuvants vent celles classiquement utilisees dans le domaine cosmetique, et par exemple de 0, 01% a 10% du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent etre introduits dans la phase o grasse, dans la phase aqueuse eVou dans les spherules lipidiques. Comme huiles ou cires utilisables dans ['invention, on peut citer les huiles minerales (huile de vaseline), les huiles vegetales (fraction liquide du beurre de karite, huile de tournesol), les huiles animales (perhydrosqualene), les huiles de synthese (huile de Purcellin), les huiles ou cires siliconees (cyclomethicone) et les huiles fluorees ss (perfluoropolyethers), les cires d'abeille, de carnauba ou paraffine. On peut ajouter a ces huiles des alcools gras et des acides gras (acide stearique). Comme emulsionnants utilisables dans ['invention, on peut citer par exemple le stearate de glycerol, le polysorbate 60 et le melange de PEG6/PEG-32/Glycol Stearate vendu sous la denomination de Tefose 63 par la societe Gattefosse. Comme solvents utilisables dans ['invention, on peut citer les alcools inferieurs, notamment ['ethanol et l'isopropanol, le propylene glycol. Comme gelifiants hydrophiles utilisables dans ['invention, on peut citer les polymeres carboxyvinyliques (carbomer), les copolymeres acryliques tels que les copolymeres 0 d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides tels que l'hydroxypropylcellulose, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gelifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiees comme les bentones, les sels metalliques d'acides gras comme les stearates d'aluminium et la silice hydrophobe, ethylcellulose, polyethylene. Les compositions utilisables selon ['invention peuvent associer au moins un agent mimetique de l'activite de TRP-2 a d'autres agents actifs. Parmi ces agents actifs, on peut citer a titre d'exemple: - les agents modulant la differenciation et/ou la proliferation eVou la pigmentation des cellules de la peau tels que le retinol et ses esters, la vitamine D et ses derives, les oestrogenes tels que ltoestradiol, les modulateurs de l'AMPc tels que les derives de POMC, I'adenosine, ou la forskoline et ses derives, les prostaglandines et leurs derives, la triiodotrionine et ses derives; - des extraits de vegetaux tels que ceux d'lridacees ou de soja, extraits pouvant alors contenir ou non des isoflavones; - des extraits de micro-organismes; - les agents anti-radicaux libres tels que l'a-tocopherol ou ses esters, les superoxyde dismutases ou ses mimetiques, certains chelatants de metaux ou l'acide ascorbique et ses esters; - les anti-seborrheiques tels que certains acides amines soufres, I'acide 1 3-cis retinoque, I'acetate de cyproterone; - les autres agents de lutte contre les etats desquamatifs du cuir chevelu comme le zinc pyrithione, le disulfure de selenium, le climbazole, I'acide undecylenique, le Ketoconazole, la piroctone olamine (octopirox) ou la ciclopiroctone (ciclopirox); 3s en particulier, il pourra s'agir d'actifs stimulant la repousse et/ou favorisant le ralentissement de la chute des cheveux, on peut plus particulierement citer a titre non limitatif: - les esters d'acide nicotinique, dont notamment le nicotinate de tocopherol, le nicotinate de benzyle et les nicotinates d'alkyles en C1-C6 comme les nicotinates de methyle ou d'hexyle; s - les derives de pyrimidine, comme le 2,4-diamino 6-piperidinopyrimidine 3-oxyde ou "Minoxidil" decrit dans les brevets US 4,139,619 et US 4,596,812; - les agents inhibiteur de la lipoxygenase ou inducteur de la cyclooxydase favorisant la repousse des cheveux comme ceux decrits par la Demanderesse dans la demande de brevet europeen EP 0 648 488; - les agents antibacteriens tels que les macrolides, les pyranosides et les tetracyclines, et notamment l'Erythromycine; - les agents antagonistes de calcium, comme la Cinnarizine, la Nimodipine et la Nifedipine; - des hormones, telles que l'estriol ou des analogues, ou la thyroxine et ses sels; - des agents antiandrogenes, tels que l'oxendolone, la spironolactone, le diethylstilbestrol et la flutamide; - des inhibiteurs sterodiens ou non sterodiens des 5-x-reductases tels que coux decrits par la Demanderesse dans les demandes de brevet europeen EP 0 964 852 et EP 1 068 858 ou encore le finasteride; o - des agonistes des canaux potassiques dependent de l'ATP tels que la cromakalim et le nicorandil. En particulier, I'utilisation selon ['invention d'un agent mimetique de l'activite DOPAchrome tautomerase est destinee a maintenir la population de melanocytes quiescents des follicules pileux. En particulier, I'objet de ['invention concerne l'utilisation d'un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase pour prevenir eVou limiter eVou arreter le developpement de la canitie. L'objet de ['invention se rapporte aussi a l'utilisation d'un agent mimetique de i'activite de la DOPAchrome tautomerase pour favoriser la pigmentation naturelle des cheveux eVou des polls grist 3s Un autre objet de la presente invention se rapporte a un procede de traitement cosmetique de la canitie caracterise en ce qu'on applique sur la zone a traiter une composition comprenant au moins un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase. L'invention se rapporte aussi a un procede de traitement cosmetique destine a favoriser la pigmentation naturelle des cheveux eVou des polls gris ou blancs caracterise en ce qu'on applique sur la zone a traiter une composition comprenant au moins un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase: Les procedes de traitement de la canitie et de pigmentation des cheveux eVou des polls gris ou blancs peuvent egalement consister en ['ingestion d'une composition comprenant au moins un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase. Les zones a traiter peuvent etre, par exemple et sans aucune limitation, le cuir chevelu, les sourcils, la moustache eVou la barbe. Plus particulierement, les procedes de traitement cosmetique de la canitie et de pigmentation naturelle des cheveux eVou polls gris ou blancs consistent a appliquer une composition comprenant au moins un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase choisi parmi: molecules synthetiques mimetiques de SOD (Metaphore), par exemples, les complexes de manganese tels que decrits dans US 5637578, 5610293, 5874421; - composes anti-oxydants: tels que des derives de tetrahydro-5,6,7,8naphtaneol-1, en particulier ceux decrits dans le brevet EP0404 640, des derives benzoheterocyles oxygenes (voir le brevet EP 0 685 473), des derives de cyclodextrines (voir le brevet EP 0 778 287), des composes silices derives d'acide ascorbique (voir le brevet WO01/30784), de la pyrrolidone carboxylate de Iysine ou d'arginine (voir le brevet EP0511 118), des derives de benzylidene camphre ter-butyle (voir le brevet US 4, 952,391), des derives de benzylidene cyclanone (voir le brevet FR 2636531) , des diorganopolysiloxanes modifies (voir le brevet EP 0 370 868), des derives lipophiles du benzylidene camphre (voir le brevet EP 0 390 681), des derives hydrophile du benzylidene camphre (voir le brevet EP 0 390 682), des derives de benzyl-cyclanone (voir le brevet EP 0 390 683), des polymeres anti-oxydants tels que decrits dans le brevet US4,281,192, des associations de mono- et diester d'acide cinnamique et de vitamine C (voir le brevet EP 0 664 290), des polyamines, telles que putrescine, spermidine, spermine, Di-amines, Tri-amines, Tetra-amines; le propyl gallate, la quercetine, le trolox, l'histidine, le tryptophane, la methionine, des chelateurs de metaux (21-aminosterodes), le complexe salen-manganese (par exemple: EUK-8), I'[phenyl- ter-butyl nitrol (PBN) (et composes derives) ou l'ebselen; - composes non anti-oxydants, tel que le MIF et ses analogues (Marcophage Migration Inhibiting Factor, voir Rosengren et al. Mol. Med., 1996, 2(1):143-9). Les procedes de traitement cosmetique pour lutter contre la canitie et/ou pour stimuler la pigmentation naturelle des cheveux eVou des polls gris ou blancs peut par exemple consister a appliquer la composition sur les cheveux et le cuir chevelu, le soir, garder la composition toute la nun' et eventuellement effectuer un shampooing le matin ou laver les cheveux a ['aide de cette composition et a laisser a nouveau en contact quelques minutes avant de rincer. La composition conforme a ['invention s'est revelee particulierement interessante lorsqu'elle est appliquee sous forme de lotion capillaire, eventuellement rincee ou meme sous forme diun shampooing. Dans un autre de ses objets, la presente invention se rapporte a une methode d'identification d'un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase consistent a determiner la capacite d'un compose a diminuer ['induction d'une mort cellulaire dans des melanocytes n'exprimant pas la DOPAchrome tautomerase en reference a une population de melanocytes qui expriment la DOPAchrome tautomerase, o la methode comprend les etapes suivantes: a- mise en pre-culture d'une population de melanocytes; b- separation en deux populations de la population de melanocytes obtenue a ['issue de l'etape (a), appelees respectivement MelA et Mel-B, mise en culture de Mel-A dans un milieu A ou les melanocytes n'expriment pas la DOPAchrome tautomerase et de Mel-B dans un milieu B contenant un facteur favorisant ['expression de la DOPAchrome tautomerase; c- exposition de la population Mel-A a une condition induisant l'apoptose ou la senescence en culture en presence (population Mel-A(+)) ou en ['absence (population Mel-A(-)) d'un compose pour lequel on souhaite tester l'activite mimetique de la DOPAchrome tautomerase; d- exposition de la population Mel-B a une condition induisant l'apoptose ou la senescence en culture identique a la condition choisie a l'etape (c) en ['absence du compose pour lequel on souhaite tester l'activite DOPAchrome tautomerase; e- comparaison des reponses apoptotique ou senescente de la population Mel-A(+) avec Mel-A(-) et de Mel-A(+) avec Mel-B; f- selection des composes pour lesquels la reponse est telle que la cytotoxicite observee dans l'essai Mel-A(+) est moindre que celle observee dans l'essai Mel-A(-), et la cytotoxicite observee dans l'essai Mel-A(+) est proche de celle observee dans l'essai Mel-B. Dans un mode de realisation particulier selon ['invention, les melanocytes vent mis en culture a l'etape (a) dans du milieu M2 (PromoCell, Heidelberg, D). La mise en culture de l'etape (a) peut etre realisee selon differentes modalites: - dans un systeme de culture monocouche ou les cellules vent ensemencees a meme le 0 plastique; - les cellules peuvent aussi etre ensemencees sur un ou plusieurs composes de matrice extra-cellulaire, tels que collagene, elastine, fibronectine, laminine; - les cellules peuvent etre cultivees dans un systeme tridimensionnel, tel qu'un cheveu disseque, un cheveu arrache, une peau reconstruite in vitro. Cette etape a est mise en ceuvre pendant un temps compris entre 2 et 18 heures necessaire a ['adherence des cellules. Pour la realisation des etapes suivantes, le milieu de culture de l'etape (a) est ensuite remplace par un milieu approprie au test: - pour l'etape (b)' il s'agit d'un milieu ne favorisant pas ['expression de TRP-2 ou bien d'un milieu contenant un facteur reprimant ['expression de la DOPAchrome tautomerase pour la population Mel-A, ce facteur pouvant etre un facteur neutralisant les ARN messagers codant pOur la TRP2 (methode anti-sens, siRNA) a ['aide de sequences nucleotidiques appropriees. - pour l'etape (c), il s'agit d'un milieu favorisant ['expression de TRP2, ce milieu peut egalement contenir un facteur induisant ['expression de la DOPAchrome tautomerase. Par exemple, ce facteur peut etre choisi parmi: I'Hexamethylene Bisacetamide (HMBA), la glycyrrhizine, diethylstilbestrol, estradiol, lL1cc. L'expression de TRP2 peut aussi etre obtenue apres transfection de la region codante du gene humain de TRP-2 (par exemple tel que decrit dans genebank n S69231, n NM_001922, n AJ000503) dans n'importe quei vecteur approprie (exemple: pcDNA Vector, invitrogen, Groningen, CH, N). Dans ce cas le test peut-etre realise sur melanocytes ou sur tout autre type de cellules de mammiferes (exemple: fibroblastes, keratinocytes). Pour la realisation des etapes (d) et (e), les populations Mel-A et Mel-B vent exposees a une condition induisant l'apoptose ou la senescence en culture, il pourra s'agir, par exemple, d'un facteur pro-apoptotique (TNF a), de ['absence d'un facteur de survie (IGF- 1), d'un traitement par le cis-platine (Pak B.J. et al., 2000, Melanoma Res. 10:499-505) OU l'oxaliplatine, d'un agent toxique (cyclophosphamide), d'une exposition aux rayonnements ultraviolets, d'un stress oxydatif (H2O2, diethylmaleate) (voir Vaux D.L. & Strasser A., 1996, Proc.Natl.Acad.Sci. 93:2239-2244). Pour la realisation de l'etape (f), on pourra utiliser les methodes de revelation de 0 I'apoptose ou de senescence suivantes: - la reponse apoptotique peut etre determinee par toute methode permettant de reveler l'apoptose cellulaire, par exemple, identification de la fragmentation de l'ADN apres electrophorese sur gel d'agarose, marquage des fragments d'ADN par la methode du "TUNEL" (Gavrieli Y et al. J Cell Biol 1992; 119:493-501), revelation de l'anexine V l5 (ApoAlert Annexin V Apoptosis Kit (i996) CLONTECHniques Xl(3):9-11 (BD Biosciences, Belgium mesure de l'activite de caspase (ApoAlert Caspase Assay Kit (BD Biosciences, Belgium). - la reponse senescente peut etre determinee par toute methode permettant de reveler la senescence cellulaire, par exemple, determination d'un raccourcissement des telomeres, mesure de l'activite de la telomerase (TRAPeze kit, Intergen), determination de la diminution du taux de cycline E, determination de la diminution du taux de proteine P105 Rb phosphorylee (Bandyopadhyay D et al. Experimental Gerontology 2001; 36:1265-1275), mesure de l'activite beta-Galactosidase (Dimri GP et al. PNAS 1995;92:9363-9367) L'invention se rapporte aussi a l'utilisation d'un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase susceptible d'etre identifie par la methode decrite ci-dessus dans un procede de traitement cosmetique pour prevenir eVou limiter eVou arreter le developpement de la canitie eVou pour favoriser la pigmentation naturelle des cheveux eVou des polls gris ou blancs. L'invention se rapporte enfin a l'utilisation d'un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase susceptible d'etre identifie par la methode decrite ci-dessus pour la preparation d'une composition cosmetique destinee a prevenir eVou limiter eVou arreter le developpement de la canitie eVou a favoriser la pigmentation naturelle des chevoux eVou des polls gris ou blancs. Fioums: FIoure 1: cUe 1igure mssamble d#1Arntes photogrsphies raprAsontant IB disthbuton da mAlanocas dans la 1011iculO pilOux lors da Is phase sragAna vlsualisAa au mroscopa. LAgandas: (A) ast una sAria da clichAs da la gsina AplthAliala aarna grossia 40 fois, (B) ast una sAda da cHchAs da la gaina dphANsla aarna (cantrds sur la tige) grossle 20101s et (C) -__d. o (1) reprAsanta un chaveu hAs foncA, (2) un chavau moddrAmant gment6, (3) (5) des chevoux de dlUArentes nuances de ghs et (6) un chevou anc. Fioure 2: Ces photographs permeMent de suaNser [expression de TRP-2 dans s mblanoces de l'Aplderme du chevou (gaine dpithAllale eerne et bulbe pileu. Rude immunohilue anal6e en mms=e =-ca ser Floure 3: Ces photographies reprdsentent les rdsu#sts obtenus sprds Is mise en uvre des essais da Waarn Blot dAcrits I'exempla 2B. ExemDIe 1 - rvAlation ImmunchiochEmioue des mAlanoces dens les 1011icules olleux diMArents s1ndes de blanchisseme. nar marousue de la jro16ine nel us da l us ux il r da -as lu 8 donnaum 71 srs ont AtA dtudiAs. A - Protocole d'isolemen1 des 1011icules Dlleux entlers (Commo S and Bernard BA Pmen1 CeM Res 2000;13:253-259) ]o Des 1ragments de ops son1 incubAs dans la dpase (2,4 U/ml, BoehNnger annheim, D) Is nuR +04 C. Les chavaux vent ansu#a olAs rsa da pincas sous binoculalras. B - Protocole d'immunomarouaoe sur follicules Dlleux entiers (Commo S and Bernard BA 3 Pment Ce" Res 2000;13:253-25g) Les chevcux enDers son1 f6s dans l'hanol O'C pcodan1 10 mu10s. Chaque 61spe des procAdures de fxshon e1 de mauage est suio de vages au tampon phosphe (pH 7,4 (PBS)een20 0,06. Sau1 prA3sn, 10utes s Atapes se 10nt tempArature ambiante. Les pAmdases endogAnes de l'dchantHon son1 neutraRsdes en cuban1 FAchanDRon dans une so1n de pAroxyde dydrogAne OJ pendant 10 minutes. Pour bloquer les sltes de 1ix10n non spAclTiques, I'dchan11110n e incubA avec du laR AcrAmA 1, 15 minutes. L'anDcorps (Ac) pdmre NKl-beteb reconnaissan1 spAcTuement k'p-e pkdeLl7 (donosan, Pads, F) est duA au 1/40 dans du PBS - Tween 0,059t, con10nan1 10}S de sArum norm (X0907, DAKO, Trappes, F). Ac o pmre est incubA 18 heures sur les chevoux +04 C. LAc socondake coupld la blohne (E-433, DAKO, Trappes, F) es1 6 au 1400 e1 locubA 30 minu1es. Le cheveu es1 ensu#e cubA en prdsence de reptav1ne-bioline-pAmdase (K- Oj77, DAKO, Trappes, F), e1 1inalemen1 llmmunomarquage es1 rAvAld en prAnce de 3amino-g- 61hylcarbazole (AEC) (AEC kib101, Sigma, Ssin1 Ouentin Fallavier, F). En comparsn1 les dhAs (B1) (BS) de Dgure 1, on conste que Is dimlnuton de pigmen110n du chevou os1 sssocid uno diminution do mAlanino dans le bulbe o1 d une muDon de mAlanoces dans bue ok C1 CS). Le cheveu snc don1 la tge es1 dApouue de mAlane (B6) ne conDen1 pas de md!snocp dans le bue (C6) . Les cheveux gHs e1 snQ conDennont uno qusnttA vahab de md#snocytes dans psle hauto do Is galne AplthAllale eorno, coUe quanti16 pouvan1 mAmo 61ro nullo dans css du chevou snc (A3 6) Is diMAronce dos chevoux gmen1As (A1 e1 2). : Exemole 2 - mlse en idence de l'exoresslon diM6ren1lelle de le DOPhrome 1au10mArase dans Ies mAlanoces de follicules olleux de l'6niderme chez l'lndlvidu caucaslen. A- Uudo lmmunohls1010gioue snslvsde on microscopic con10calo Issor 30. A. 1 - Oen110n de coupes conQeldes de folllcule Dileux (Commo S sod Bernard BA Pment CeM Res 2000;13:253-25g) Un 1ragment de biopsle de scalp contenan1 des 10111culds plleux es1 lnclus dans du tssue-Tek-OC1 (ls, NspeiHo, IL, USA) et ensuLo congold sur do la carbo-glaco. La biopsio congelde e onsuite coupAe (7 pm) I'aide d'uno costst (C3050, Lolcs, Ruell-slmsison, F). A.2 - Protocole d'isolement des follicules nileux entiers et des lambeaux enitheliaux de ceau (Commo S and Bernard BA Pigment Cell Res 2000;13:253259) Des fragments de biopsie vent incubes dans la dispase (2,4 U/ml, Boehringer Mannheim, D) la nun' a +04 C. Le compartiment epithelial est separe du derme a ['aide de pieces sous binoculaire. Les structures epitheliales vent ensuite micro-dissequees pour separer les follicules pileux et l'epiderme, puis triees. A.3 - Protocole d'immunomarquane sur follicules pileux entiers. Iambeau de neau et coune conaelee Les cheveux entiers, les lam beaux epitheliaux de peau et les coupes congelees vent fixes dans ['ethanol a-20 C pendant 10 minutes. Chaque etape des procedures de fixation et de marquage est suivie de iavages au tampon phosphate (pH 7,4 (PBS)) Tween20 0,05%. Sauf precision, toutes les etapes se font a temperature ambiante. Les peroxydases endogenes de l'echantillon vent neutralisees en incubant l'echantillon dans une solution de peroxyde d'hydrogene a 0,1% pendant 10 minutes. Pour bloquer les sites de fixation non specifiques, I'echantillon est incube avec du fait ecreme 1%, 15 minutes. Les anticorps (Ac) primaires vent dilues dans du PBS - Tween 0,05%, contenant 10 % de serum normal (X0907, DAKO, Trappes, F). Les Ac primaires NK1 beteb reconnaissant specifiquement la proteine pMel-17 (1/40, Monosan, Paris, F), et aPEP8h (1/2000, Dr VJ.Hearing, NIH, Bethesda, MD, USA) reconnaissant specifiquement la proteine TRP2 humaine (Virador et al. 2001) vent incubes simultanement 18 heures a +04 C sur les cheveux entiers et les lambeaux epitheliaux de peau, et 30 minutes a temperature ambiante sur les coupes congelees. L'Ac secondaire de chevre dirige contre les immunoglobulines (Ig) G2b couple a la Cy3 (M32410, TEBU, le Perray en Yveline, F) est dilue au 1/80, et l'Ac secondaire dirige contre les Ig couple a la Cy5 (111-175-144, Jackson Immunoresearch Lab. Inc. West Grove, PA, USA) est dilue au 1/500 vent incubes simultanement 30 minutes sur les echantillons. Les immunomarquages vent analyses en microscopic confocale laser (LSM510, Carl Zeiss, Oberkochen, D). Conclusion des observations: on constate sur la figure 2 la presence de TRP-2 dans les melanocytes de l'epiderme, en revanche, cette enzyme n'est exprimee ni dans les melanocytes de la gaine epitheliale du follicule pileux, ni dans les melanocytes du bulbe pileux. B - etude biochimioue par analvse en Western Blot B.1 - Protocole d'extraction de proteine de follicules nileux humains et de melanocvtes (Commo S et al. Differentiation 2000;66:157-164) - Extraction proteique a partir de bulbes pileux: les follicules pileux vent isoles apres traitement de biopsies de scalp a la dispase (2,4 U/ml, Boehringer Mannheim, D) la nun' a +04 C. Apres isolement, les follicules pileux vent micro-disseques pour isoler la partie du bulbe pileux. 80 bulbes pileux ainsi isoles vent places dans un tampon de Iyse approprie pour extraction proteique et analyse en western blot. o - Extraction proteique a partir de culture de melanocytes: Les melanocytes cultives en milieu M2 (PromoCell, Heidelberg, D) vent Iyses avec un meme tampon de Iyse approprie pour extraction proteique et analyse en westem blot. Le Westem blot (voir protocole dans Maniatis et al.) est realise avec les anticorps suivants: aPEP8h, anticorps polyclonal specifique de la TRP-2 humaine donne par Dr VJ Hearing (NIH, Bethesda, USA), et T311, anticorps monoclonal specifique de la tyrosinase humaine (Novocastra, New Castle, UK). On observe (figure 3) que la tyrosinase est detectee dans les extraits de bulbe pileux. o L'enzyme n'est pas detectee dans les extraits de gaine epitheliale externe. L'expression de la tyrosinase est regulee. Cette enzyme n'est pas ou peu exprimee dans les melanocytes inactifs (ne produisant pas de melanine), c'est le cas des melanocytes contenus dans le scalp inter folliculaire d'individu caucasien. Par ailleurs, la DOPAchrome tautomerase (TRP-2) n'est detectee ni dans les extraits de bulbe ni dans les extraits de gaine epitheliale externe. L'expression de la TRP-2 ne suit pas celle de la tyrosinase et ['induction de la melanogenese, elle n'est pas exprimee dans les melanocytes actifs des bulbes pileux. ExemnIe 3 - Comnositions - lotion caPillaire Agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase 0,5 g Propylene glycol 20 g Ethanol 95 30 g Eau qsp 100 g Cette lotion est appliquee quotidiennement sur les zones a traiter et de preference sur ['ensemble du cuir chevelu pendant au moins 10 jours et preferentiellement 1 a 2 mois. s On constate alors une diminution de ['apparition des cheveux blancs ou gris et une repigmentation des cheveux grist - shampooina traitant Agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase 1,5 g Polyglyceryl 3hydroxylarylether 26 g Hydroxy propyl cellulose vendue sous la denomination de Klucell G par la societe Hercules 2 g Conservateurs ps Ethanol 95 50 g Eau qsp 100 g Ce shampooing est utilise a chaque ravage avec un temps de pose d'environ d'une minute. Un usage prolonge, de ltordre de deux mods, conduit a la repigmentation o progressive des cheveux grist Ce shampocing peut egalement etre utilise a titre preventif afin de retarde le blanchiment des cheveux. - Gel traitant Agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase 0,75 g Huiles essentielles d'Eucalyptus 1 g Econozole 0,2 g Lauryl polyglyceryl 6 cetearyl glycoether 1,9 g Conservateurs qs Carbopol 934P vendu par la societe BF Goodrich Corporation 0,3 g Agent de neutralisation qs pH 7 Eau qsp 100 g Ca gel fist applique sur les zones Cager dGux 10 par Tour (main at sob) sac On masso rmlnsL Apes Dais mom dppcion, on obsess uno mpigmclon dos pods ou chovoux de zonotmlt6G. REVENDICATIONS 1. Composition cosmetique pour lutter contre la canitie comprenant dans un milieu s cosmetiquement acceptable au moins un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase. 2. Composition selon la revendication 1, caracterisee en ce que ['agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase est choisi parmi des molecules synthetiques to mimetiques de SOD, des composes anti-ou des composes non anti-oxydants. 3. Composition selon l'une quelconque des revendications precedentes, caracterisee en ce quielle comprend une quantite d'agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase comprise entre 0,001 et 10 % poids par volume. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 a 3, caracterisee en ce qu'elle est adaptee a une administration par vole vale. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 a 3, caracterisee en ce o qu'elle est adaptee a une application topique sur le cuir chevelu et/ou la peau. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 a 3 ou 5, caracterisee en ce qu'elle est une creme, une lotion capillaire, un shampoing ou un apresshampoing. s 7. Co mposition selon l' u ne qu elconq ue des reve ndications precede ntes, caracteri see e n ce que ['agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase est encapsule dans un enrobage tel que des microspheres, des nanospheres, des oleosomes ou des nanocapsules. 8. Composition selon la revendication 7, caracterisee en ce que l'enrobage dans lequel ['agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase est encapsule a un diametre inferieur ou egale a 10,um. 9. Utilisation d'un agent mimetique de l'activite DOPAchrome tautomerase pour 3s maintenir la population de melanocytes quiescents des follicules pileux. 10. Utilisation d'un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase pour prevenir eVou limiter eVou arreter le developpement de la canitie. 11. Utilisation d'un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase pour s favoriser la pigmentation naturelle des chevoux eVou des polls gris ou blancs. 12. Procede de traitement cosmetique de la canitie caracterise en ce qu'on applique sur la zone a traiter une composition comprenant au moins un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase. 13. Procede de traitement cosmetique destine a favoriser la pigmentation naturelle des cheveux eVou des polls gris ou blancs caracterise en ce qu'on applique sur la zone a traiter une composition comprenant au moins un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase. 14. Procede selon la revendication 12 ou 13, caracterise en ce que la composition comprend au moins un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase choisi parmi: - molecules synthetiques mimetiques de SOD (Metaphore); o - composes anti-oxydants: des derives de tetrahydro5,6,7,8-naphtaneol-1, des derives be nzoh eterocyles oxygen es, des de rives de cyclodextri n es, des composes sil ices derives d'acide ascorbique, de la pyrrolidone carboxylate de Iysine ou d'arginine, des derives de benzylidene camphre ter-butyle, des derives de benzylidene cyclanone, des diorganopolysiloxanes modifies, des derives lipophiles du benzylidene camphre, des derives hydrophile du benzylidene camphre, des derives de benzyl-cyclanone, des polymeres anti-oxydants, des associations de mono- et diester d'acide cinnamique et de vitamine C, des polyamines, telles que putrescine, spermidine, spermine, Di-amines, Tri- amines, Tetra-amines; le propyl gallate, la quercetine, le trolox, I'histidine, le tryptophane, la methionine, des chelateurs de metaux (21aminosterodes), le complexe salen-manganese (par exemple: EUK-8), I'aphenyl-ter-butyl nitrol (PBN) (et composes derives) ou l'ebselen; - composes non anti-oxydants, tel que le MIF et ses analogues. 15. Methode d'identification d'un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase comprenant les etapes suivantes: a- mise en preculture d'une population de melanocytes; b- separation en deux populations de la population de melanocytes obtenue a ['issue de l'etape (a), appelees respectivement Mel-A et Mel-B, mise en culture de Mel-A dans un milieu A ou les melanocytes n'expriment pas la DOPAchrome tautomerase et de Mel-B dans un milieu B contenant un facteur favorisant ['expression de la DOPAchrome tautomerase; c- exposition de la population Mel-A a une condition induisant l'apoptose ou la senescence en culture en presence (population Mel-A(+)) ou en ['absence (population Mel-A(-)) d'un compose pour lequel on souhaite tester l'activite mimetique de la DOPAchrome tautomerase; 0 d- exposition de la population Mel-B a une condition induisant l'apoptose ou la senescence en culture identique a la condition choisie a l'etape (c) en ['absence du compose pour lequel on souhaite tester l'activite DOPAchrome tautomerase; e- comparaison des reponses apoptotique ou senescente de la population Mel-A(+) avec Mel-A(-) et de Mel-A(+) avec Mel-B; f- selection des composes pour lesquels la reponse est telle que la cytotoxicite observee dans l'essai Mel-A(+) est moindre que celle observee dans l'essai Mel-A(-), et la cytotoxicite observee dans l'essai Mel-A(+) est proche de celle observee dans l'essai Mel-B. 16. Utilisation d'un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase susceptible identifie par la methode selon la revendication 15 dans un procede de traitement cosmetique pour prevenir eVou limiter eVou arreter le developpement de la canitie eVou pour favoriser la pigmentation naturelle des chevoux eVou des polls gris ou blancs. 17. Utilisation d'un agent mimetique de l'activite de la DOPAchrome tautomerase susceptible identifie par la methode selon la revendication 15 pour la preparation d'une composition cosmetique destinee a prevenir eVou limiter eVou arreter le developpement de la canitie eVou a favoriser la pigmentation naturelle des cheveux eVou des polls gris