FR 2840992 A1 20031219 FR 0207492 A 20020618 joint soude (1) a controler. 1 2840992 PROCEDE DE DENOMBREMENT ET/OU D' IDENTIFICATION MORPHOLOGIQUE DE LEUCOCYTES EN PHASE SOLIDE. La presente invention se rapporte a un procede de detection et/ou de comptage et/ou d/identification morphologique de leucocytes en phase solide. La reduction des leucocytes residuels dans les produits sanguine, notamment dans des produits sanguine labiles (PSL) comprenant notamment, le plasma et les cellules sanguines et leurs derives, ci-apres designee leucoreduction, est une des priorites dans le monde de la transfusion sanguine et elle est devenue une technologie bien etablie, pratiquee par les centres de transfusion sanguine du monde entier. On entend par produit sanguin, toute preparation issue du fractionnement du sang, comprenant ou non des composants cellulaires, a titre d'exemple, on entend par produit sanguin les concentres des globules rouges ou de plaquettes, mais aussi les preparations plasmatiques ou seriques. Dans le domaine de la transfusion sanguine, il a ete montre que l'utilisation de derives sanguine ayant un taux de leucocytes reduit permet de diminuer la frequence de complications severes liees a la transfusion sanguine, incluant l 'apparition de reactions febriles, la formation d'alloanticorps, la transmission de virus ou encore la maladie de Creutzfeldt-Jacob. On constate dans les modeles experimentaux d'encephalite spongiforme transmissible que l'infectiosite sanguine est essentiellement associee (90% des cas) aux leucocytes. (Rapport de Fevrier 2002 de l'Agence Francaise 2 2840992 De Securite Sanitaire Des Produits De Sante (AFSSAPS): >) et que de ce fait la leucoreduction contribue a diminuer les risques potentials lies a l' agent causal de la BSE. Ainsi, dans le but de securiser le sang les organismes charges de la securite des produits sanguine recommandent une reduction significative des concentrations de ces cellules dans les plasmas, en utilisant, par exemple, des filtres ecran. Les concentrations acceptables de leucocytes dans le plasma vent d'environ 106 cellules par litre, ce seuil sera certainement abaisse a environ 104 cellules par litre, soit environ 10 cellules/ml. Les normes europeennes recommandent un controle de qualite sur 1% des produits sanguine avec un minimum de controles/mois/produit sanguin. Ces normes vent satisfaites si 90% des unites d'echantillonnage se trouvent dans les fourchettes de valeurs indiquees. (Guide pour la preparation, l'utilisation et l' assurance qualite des composants sanguine -7eme edition-2001-Editions du Conseil de ['Europe). I1 apparalt que la mise a disposition des etablissements charges de controler la securite des produits sanguine, de procedes gables et sensibles de detection et comptage de leucocytes residuels dans lesdits produits sanguine, presente un interet certain. 3 2840992 A ce jour, deux techniques vent utilisees couramment pour le denombrement de leucocytes residuals, toutes les deux vent des techniques en phase liquide, il s'agit du comptage par cytometric de flux (CF) et du comptage avec un hematocytometre comme par exemple la Chambre de Nageotte. Des etudes visant a comparer ces deux techniques, et a mettre en lumiere leurs avantages et inconvenients font etat d'une meilleure fiabilite pour les procedes de denombrement mettant en uvre la CF, car elle presente une variabilite moindre. Parmi les publications qui mentionnent l'interet de la leucoreduction, on peut citer l' article du Pr. Maurice Masse (Transfus Clin Biol 2001 Jun; (3):297-302 >) Les auteurs font reference au besoin d'optimisation des methodes de reduction des concentrations leucocytaires, non senlement dans les globules rouges, ou les plaquettes, mais aussi dans les plasmas pour ['amelioration de la securite transfusionnelle. Aussi les auteurs font clairement allusion au besoin du developpement de techniques elaborees de detection et comptage des leucocytes residuals. Le but etant d'atteindre des sensibilites elevees, generalement par concentration prealable de ltechantillon. Cette concentration prealable permet d'atteindre des sensibilites elevees avec une limite de detection de l'ordre de 10 cellules leucocytes/ml pour les globules rouges (GR) ou les plaquettes et de 0,5 cellules leucocytes /ml pour le plasma. 4 2840992 L' article de Rebulla P. et al. (Transfusion 1993 Feb;33(2):128-33 >) evalue la reduction de globules blancs a partir de preparations de leucocytes, par filtration sur differents filtres commerciaux. En meme temps, les auteurs de cette publication comparent trots procedes de denombrement de leucocytes residuels: soit dans une Chambre de Burke (CB), soit dans une chambre de Nageotte (CN), soit par cytometric de flux (CF). Alors qu'aucun leucocyte n'est detecte avec la CB, les courbes d'etalonnage obtenues avec la CN et par CF avec des echantillons contenant des concentrations connues en globules blancs, allant de 1 a 1000 cellules par microlitre, montrent que les deux derniers procedes detectent en moyenne 67% des globules blancs presents dans les echantillons Le procede utilisant la CF montre une faible variabilite, (rendement de 61-70%) pour les differents niveaux de globules blancs alors que la variabilite avec le procede utilisant la CN est plus importante (rendement de 39-91%). Cette variabilite plus importante empeche la correction des denombrements en CN par un facteur simple et illustre les difficultes d'une standardisation de la technique. Il apparalt cependant que les besoins en securite dans ce domaine necessitent des procedes de denombrement plus gables, presentent moins de variabilite, et plus sensibles. Afin de resoudre ce probleme de manque de sensibilite des procedes de denombrement de leucocytes 2840992 precedemment cites, la demanderesse a mis en muvre un procede de denombrement et/ou d' identification de leucocytes residuels dans les fluides biologiques presentant une sensibilite accrue et realisable dans des delais plus courts. Dans le cadre de la presente invention, l entend par fluide biologique tout fluide issu d'un organisme vivant, comme par exemple: le plasma, le fait, la salive, les larmes, la sueur, l' urine ou le liquide cephalorachidien, mais aussi les produits issus du fractionnement du sang, comprenant ou non des composants cellulaires, ainsi que les preparations plasmatiques ou . s erlques. Ce procede est particulierement bien adapte au denombrement des leucocytes dans le plasma. Le procede de denombrement de leucocytes de l 'invention comprend une detection en phase solide des leucocytes residuels sur une membrane de filtration et ne necessite pas d'etape de concentration prealable des cellules. De plus, l' identification secondaire des sous populations leucocyLaires (polynucleaires, lymphocytes, monocytes) sur une base morphologique est realisable par observation au microscope a epifluorescence de la membrane de filtration. Plus precisement, l' invention a pour objet un procede de denombrement de leucocytes eventuellement presents dans un fluide biologique caracterise en ce qu'il comprend les etapes suivantes: 6 2840992 a) l' incubation d'un echantillon audit fluide biologique avec un agent permeabilisant des membranes cellulaires, b) l' incubation de l'echantillon obtenu a l'etape (a) avec un marqueur des leucocytes, c) la filtration de l'echantillon obtenu a l'etape (b) sur une membrane non autofluorescente, susceptible de retenir les leucocytes, pour obtenir une preparation en phase solide des leucocytes marques, eventuellement presents dans ledit echantillon, d) l'analyse de la preparation en phase solide de ladite membrane non autofluorescente de ltetape (c) pour denombrer les leucocytes marques eventuellement presents sur celle-ci. L' invention a egalement pour objet un procede d'identification morphologique des leucocytes eventuellement presents dans un produit sanguin caracterise en ce qu'il comprend les etapes (a) a (c) du procede precedemment decrit suivies d'une etape (e) d'observation visuelle au microscope des preparations obtenues a l'etape ( c) Cette observation visuelle de la phase solide permet l' identification morphologique de polynucleaires, lymphocytes et/ou monocytes eventuellement presents dans le fluide biologique. Par agent permeabilisant des membranes, on entend tout compose susceptible de modifier la structure des membranes cellulaires et de laisser ainsi passer vers l'interieur de la cellule des composes tels que des marqueurs, comme les marqueurs fluorescents ou des molecules couplees a un fluorochrome, de maniere a ce que 7 2840992 ceux-ci puissent atteindre le cytoplasme et/ou le noyau cellulaire et se fixer a des elements intracellulaires. Parmi les agents permeabilisants des membranes cellulaires, on peut citer des produits detergents et des fixateurs. Par membrane nonautofluorescente on entend toute membrane qui ntemet pas de la fluorescence, ni par elle-meme, ni en presence de fluorochromes, ni sous lteffet des excitations lumineuses de l'analyseur, de telle maniere qu'elle n' interfere pas avec les mesures de fluorescence effectuees par l'analyseur. Lors de differents travaux menes par la demanderesse pour la mise en muvre de ['invention, il a ete constate qu'une detection optimale est obtenue avec des concentrations allant de 1 a 50000 leucocytes par preparation en phase solide. Ainsi, lorsque la concentration en leucocytes est trop elevee, l'echantillon de ltetape (a) est prealablement dilue avec un tampon osmotiquement compatible avec les leucocytes, avant son incubation avec le detergent. Ce tampon de dilution osmotiquement compatible avec les leucocytes est choisi parmi le groupe comprenant: du PBS a pH 7,4, du TRIS a pH 7,4, du tampon Tyrode a pH 7,4 ou du serum physiologique (NaCl a 0,9%). Parmi les detergents que lton peut utiliser, seuls ou en melange, lors de ltetape (a) on peut mentionner ceux du groupe comprenant: Triton X-100, saponine, n 8 2840992 ocLyl-glucopyranoside, Tween 20, Tween 80, sodium dodecyl sulfate. Le detergent, ou le melange de detergents, incube avec l'echantillon a l'etape (a) vent utilises a une concentration finale comprise entre 0,05% et 5%, de preference entre 0,01% et 2% et tout preferentiellement a une concentration de 0,1% pour le Triton X-100, de 1% pour le n-ocLyl glucopyranoside, le Tween 20, le Tween 80 et le sodium dodecyl sulfate, de 0,2% pour la saponine. La duree dtincubation de l'echantillon avec le detergent a ltetape (a) est comprise entre 5 minutes et 45 minutes, de preference entre 10 et 20 minutes et tout preferentiellement elle est de 15 minutes. Selon de modes preferes de mise en xuvre du procede de ['invention, le marqueur des leucocytes utilise a l'etape (b) est choisi parmi le groupe comprenant: un colorant, un fluorochrome, un marqueur d'acides nucleiques. De preference, le marqueur de leucocytes utilise a l'etape (b) est un marqueur d'acides nucleiques choisi parmi le groupe comprenant: orange d'acridine, Picogreen@, cyanine asymetrique (SYTO), cyanine monomere (YOPRO), cyanine dimere, SYBRO et Iodure depropidium. La duree dtincubation de l'echantillon avec le marqueur a l'etape (b) peut etre comprise entre 5 et 45 minutes, de preference entre 10 et 20 minutes et tout preferentiellement elle est de 15 minutes. 9 2840992 Selon un mode particulier de mise en uvre du procede de l' invention, la membrane non autofluorescente mise en uvre a l'etape (c) est une membrane noire. De preference ladite membrane noire est une membrane en en polyester ou polycarbonates ou polyether sulfone de diametre 25 mm. La taille des pores de la membrane mise en muvre a l'etape (c) peut-etre comprise entre 0,05,um et 2,um, de preference elle est comprise entre 0,1, um et 1,um et preferentiellement elle est de 0,4 um. Eventuellement, le procede de l' invention peut comporter une etape supplementaire de ravage, apres la filtration de l'etape (c) par filtration d'un volume de tampon. Ce ravage permet d'eliminer un eventuel bruit de fond sur la membrane provoque par des traces du marqueur. L'analyse de la membrane a l'etape (d) du procede peut etre effectuee au moyen d'un analyseur capable de detecter des evenements marques et en particulier au moyen d'un analyseur laser a balayage et/ou d'un microscope a epifluorescence. Le procede de l' invention est particulierement utile pour le controle de qualite des preparations de plasmas et derives. Il peut egalement etre utilise pour le controle de qualite des filtres de leucocytes et en controle qualite dans des barques de sang pour le controle des procedes de leucoreduction. D'autres avantages et caracteristiques de l 'invention apparaltront a la lecture des exemples qui suivent et des figures en annexe dans lesquelles - La figure 1 est un schema illustrant les etapes pour la preparation des leucocytes a analyser, selon un modele experimental pour obtenir une gamme de concentrations de leucocytes dans du plasma et etablir la limite de detection et la sensibilite du procede. - la figure 2 montre un schema du procede de denombrement de leucocytes de l' invention en cytometric en phase solide et de la validation des resultats obtenus par lecture au microscope des phases solides analysees. La membrane filtre non autofluorescente (noire) (1) introduite dans l'analyseur (2) est balayee ligne par ligne avec un laser Argon (3) et ['emission de fluorescence verse est traduite en un nombre d'evenements fluorescents dont la position sur le filtre est visualisee sur ltecran de l'ordinateur(4). L'analyseur a balayage laser est connecte avec un microscope a epifluorescence qui permet la confirmation des resultats obtenus et l' identification morphologique des soul-populations leucocyLaires. - la figure 3 illustre la linearite de la methode. Wile illustre le denombrement de leucocytes effectue avec le procede de l' invention pour des dilutions en serie de leucocytes dans du plasma filtre sur un filtre de porosite 0,22 um. - la figure 4 illustre le denombrement de leucocytes effectue avec un compteur de cellules pour des dilutions en serie de leucocytes dans du plasma filtre avec un filtre de porosite 0,22 um. - la figure 5 illustre l' etude comparative entre le denombrement de leucocytes obtenu avec le procede de l' invention et celui obtenu avec un compteur de cellules. - la figure 6 illustre le denombrement de leucocytes avec le procede de ['invention, en duplicate, sur deux echantillons differents A et B. avant leucoreduction du plasma frais congele a usage therapeutique. - la figure 7 illustre le denombrement de leucocytes avec le procede de ['invention, en duplicate, sur deux echantillons differents A et B. apres leucoreduction du plasma frais congele a usage therapeutique. PARTIE EXPERIMENTALE- EXEMPLES I - DETERMINATION DU SEUIL DE DETECTION DES LEUCOCYTES L'objet de cette etude est de determiner la capacite du procede de denombrement de leucocytes en phase solide pour detecter de faibles nombres de leucocytes dans du plasma. Pour effectuer cette etude, un modele experimental a ete defini: une serie de dilutions en cascade de leucocytes issus de couche leucoplaquettaire a ete realisee dans du plasma, filtre sur un filtre de porosite 0,22,um, exempt de cellules. I.1 Materiel À Produits sanguine: À Plasma frais congele, prepare selon les normes en place a l'EFS, ( >, recommendation n R (95) 15, 7eme edition, Janvier 2001, Editions du conseil de l' Europe) À Sang total preleve sur anticoagulant CPD (citrate- phosphate-dextrose) À Tampon phosphate (PBS pH 7,4) 12 2840992 À Unites de filtration de 0.22 um. À Membranes filtres noires en polyester de diametre 25 mm et de porosite 0,4,um. À Triton X-100 5. À Sous membrane noire en ester de cellulose ou polyether sulfone de diametre 25 mm. À Acridine orange, solution mere a 5 mg/ml dans du DMSO. À Analyseur en phase solide a balayeur laser et microscope a epifluorescence. À Appareil dthematologie MICRO 60-OT (Abx) de numeration /formule des cellules sanguines À Hemocytometre de Malassez I.2 Methode 1.2.1 Obtention des leucocytes En premier lieu, on procede a la preparation, d'une part, de plasma depourvu de leucocytes contaminants et d'autre part d'une couche leucoplaquettaire, egalement designee > ou BC, constituee par la couche mince jaunatre de leucocytes recouvrant les cellules rouges compactees apres avoir centrifuge le sang. Preparation de la couche leucoplaquettaire: Dix millilitres de sang total vent centrifuges durant 15 minutes a 4000 tours par minute. Le surnageant (plasma) est elimine. La couche leucoplaquettaire est transferee dans un autre tube et le culot de globules rouges est elimine. 1.2.2 Preparation du plasma filtre À On decongele le plasma frais congele au Bain Marie a 37 C. 13 2840992 À On aspire le plasma dans une seringue de 5 ml. À On positionne une unite de filtration de 0,22 um sur ltembout de la seringue À On fait passer le plasma sur l 'unite de filtration en recueillant le filtrat dans un tube (Plasma filtre). 1.2.3 Preparation de l'acridine orange On pipette dans un tube, 15 ul d'acridine orange a 5 mg/mL et on ajoute 1, 485 ml de tampon PBS pour obtenir une solution de travail de 50 ug/ml. I.2.4. Preparation des series de dilution des leucocytes Cent microlitres de la couche leucoplaquettaire (BC) vent dilues avec 900 ul de plasma filtre (dilution 10 1) Cent microlitres de la dilution 10-1 vent dilues avec 900 ul de plasma filtre (dilution 10-2), et ainsi de suite jusqu'a une dilution 10-6. 1.2.5 Denombrement des leucocytes a) en phase solide avec l'analyseur a balayage laser. - On preleve 220 ul de l'echantillon contenant eventuellement les leucocytes. - On dilue ledit echantillon par addition de 220 ul de tampon PBS. - On additionne 9 ul de Triton-X 100 5% pour obtenir une concentration de 0.1% final en Triton-X 100 dans l'echantillon dilue. - On incube le melange echantillon-detergent durant 15 minutes a temperature ambiante. 14 2840992 - On marque les leucocytes eventuellement presents dans l'echantillon par addition de 45,ul de la solution de travail d' Orange d'acridine. - On incube l'echantillon dilue contenant les leucocytes et le marqueur durant 15 minutes a temperature ambiante. - On filtre 500 ul de l'echantillon comprenant les leucocytes marques sur une membrane filtre noire en polyester de 0.4um de porosite non autofluorescente, - On filtre ensuite 500,ul de tampon PBS pour laver la membrane. - En tent que temoin, on utilise 220 ul de plasma filtre sur un filtre de porosite 0,22 um a la place des 220,ul de l'echantillon initial. b) avec un compteur de cellules Selon le protocole decrit dans le manuel de procedures de l'appareil Micro 60 de la societe Abx. Le principe de la mesure repose sur la variation d'impedance engendree par le passage des cellules a travers un micro-orifice calibre. L' etude de la distribution volumetrique des Globules blancs (Gs) permet de denombrer les trots sous populations leucocyLaires suivantes: lymphocytes, monocytes et granulocytes. Le principe de l'analyse repose sur l' etude volumetrique des leucocytes apres ['action d'un reactif lytique. À On presente chaque tube correspondent a une dilution de la serie au niveau de la sonde d' aspiration. À L'appareil preleve 10,ul de suspension cellulaire. À Le resultat est obtenu dans un delai d' environ une minute et la zone de linearite est comprise entre 0,5 et 80 x 106 leucocytes/ml. c) avec un hemocytometre: À On effectue une dilution 1/10 de la couche leucoplaquettaire (BC) dans du plasma filtre. À On distribue 20ul dans l'hemocytometre de Malassez. À On denombre les cellules au microscope. I.3 Resultats Les resultats des differents denombrements effectues vent indiques dans les tableaux 1, 2 ci-dessous. Le tableau 1 indique les resultats du denombrement en phase solide effectue selon le procede de ['invention, a partir des 220 pl d'echantillon de depart. Tableau 1 Denombrement de leucocytes en phase solide Resultats apres Resultats validation (*) (leucocytes x 103/ mL) (leucocytes/membrane) Controle Negatif: O O Plasma Filtre O O Dilution de 13272 60 leucocytes: 10- 3 15930 72 Dilution de 1305 5,9 leucocytes: 10-9 1101 4,9 Dilution de 150 0,68 leucocytes: 1O-s 90 0,4 Dilution de 4 0,02 leucocytes: 10- 6 O O (*) Les resultats apres validation se referent a la validation effectuee au microscope sur un nombre de champs representatifs (> 50 champs) pour definir le nombre de leucocytes par membrane c'est-a-dire dans 220 ul de preparation. Il apparalt que les concentrations en leucocytes vent bien analysees par le marquage avec l' grange d'acridine et que l'on peut detecter moins de 10 leucocytes a partir de 220 microlitres de plasma. Tableau 2 Denombrement de leucocytes avec un compteur de cellules ("Micros 60") PREPARATION Leucocytes Controle Negatif 0 Plasma filtre Couche leucoplaquettaire (Buffy coat= BC) Saturation non diluee Dilution BC dilution 11 500 -1 Dilution BC dilution 1 200 -2 Dilution BC dilution 200 -3 Dilution BC dilution 100 -4 Controle Positif 400 Plasma non filtre La gamme de detection de leucocytes avec un compteur de cellules est comprise entre 5 x 1Os cellules/ml et 1Os cellules/ml. Le tableau 3 ci- dessous montre les resultats de cette etude comparative entre les trots procedes de denombrement de leucocytes pour mesurer le nombre de cellules dans la couche leucoplaquettaire: en phase solide, au moyen d'un compteur de particules (Micros 60) et au moyen d'un hemocytometre (Cellule de Malassez). 17 2840992 Tableau 3 Concentration estimee de la couche leucoplaquettaire (BC) Phase solide Compteur de Hemocytometre Procede de particules ['invention 4.8 107 cellules /ml 1.1 108 cellules /ml 1 108 cellules /ml Le procede de denombrement en phase solide est particulierement adapte et presente une meilleure sensibilite par rapport aux deux autres methodes pour les falbles nombres de leucocytes. II - VALIDATION DE LA METHODE DE DENOMBREMENT DE LEUCOCYTES EN PHASE SOLIDE. De maniere a valider le procede de denombrement de leucocytes de ['invention, avec des echantillons de plasma a usage therapeutique, des analyses desdits plasmas ont ete effectuees a partir de tubes scelles avant et apres avoir effectue une leucoreduction. II.1 Materiel - Echantillon de plasma (A) sous forme de tubulure prelevee a partir de la poche de plasma avant leucoreduction et apres leucoreduction. - Echantillon de plasma (B) sous forme de tubulure prelevee a partir de la poche de plasma avant leucoreduction et apres leucoreduction. Le volume des echantillons est d' environ 2 ml (30 cm de tubulure). - Orange d'Acridine, prepare a une concentration de 5 mg/ml dans du DMSO Tampon salin phosphate (PBS) a une concentration de 10 mM et pH 7.4 prepare dans de l'eau distillee - Des membranes filtres noires non autofluorescentes en polyester de diametre 25 mm et de porosite 0,4 um. - Sous membrane noire en ester de cellulose ou polyether sulfone de diametre 25 mm. - Du detergent Triton X100 Solution a une concentration de 5% dans du PBS. - Unites de filtration de porosite 0.22 um - Analyseur en phase solide a balayeur laser et microscope a epifluorescence. II.2 Methode - Preparation du controle negatif: Du plasma extrait du tube et filtre a travers un filtre de porosite 0.22um est utilise comme controle negatif, comme indique au paragraphe 1.2.2 ci-dessus. - Preparation de la solution de travail d' grange d'acridine. On prepare une solution d' Orange d'acridine a une concentration finale de 5Oug/ml dans du PBS, par dilution 1/100 de la solution mere d' Orange d'acridine (5 mg/ml dans du Pss). Procedure de marquage et analyse de l'echantillon. On preleve 100 ul d'echantillon (plasma filtre ou echantillon frais) On ajoute 100,ul de PBS On ajoute 4 ul de Triton X100 a une concentration de 5% (concentration finale: 0.1%) 19 2840992 On incube le melange 15 minutes a temperature ambiante. On ajoute 20,ul de la solution de travail d' Orange d'Acridine. On incube durant le melange echantillon-marqueur durant 15 minutes a temperature ambiante. On filtre la preparation ainsi obtenue sur une membrane filtre non autofluorescente (noire). On analyse la membrane avec un analyseur laser a balayage II. 3 Resultats Les resultats du denombrement des leucocytes a la suite de cette procedure de marquage et analyse vent presentes dans le tableau 4 ci- dessus pour chacun des deux echantillon A et B. avant et apres leucoreduction. Tableau 4 Denombrement de leucocytes en phase solide (a partir de 100,ul d'echantillon) Resultats apres Resultats (*) validation (**) (leucocytes/membrane) (leucocytes/mL) Echantillon avant leucoreduction A Plasma filtre sur 0.22 um 0 0 avant leucoreduction 58 580 Plasma nonfiltre 50 530 apres leucoreduction O O Plasma filtre sur 0.22 pm 0 0 apres leucoreduction 1 10 Plasma non-filtre 1 10 Echantillon avant leucoreduction B Plasma filtre sur 0.22 um 0 0 avant leucoreduction 76 760 Plasma non-filtre 81 810 apres leucoreduction O O Plasma filtre sur 0.22 um 0 0 apres leucoreduction O O Plasma non- filtre O O 2 o 2840992 La concentration en leucocytes avant la leucoreduction est d' environ, 5X102 a 8X102 cellules/ml et elle est inferieure a 10 cellules /ml apres la leucoreduction. Ainsi, il apparalt que ce procede de denombrement des leucocytes en phase solide, apres leur marquage avec un colorant fluorescent, tel que l' grange d'acridine, permet leur detection dans le plasma de maniere gable. Les differents travaux experimentaux conduits par la demanderesse ont permis de verifier que la limite de detection du procede est inferieure a 10 cellules/ml. Wile est d' environ 1 leucocyte/ml de plasma (200 leucocytes/poche) avec environ 5 ml d'echantillon. Ce procede assure une detection de 100% des leucocytes residuels dans un echantillon de plasma, lorsqu'il est compare aux denombrements obtenus avec un hemocytometre tel qu'une cellule de Malassez. D' autres experiences ont ete conduites dans du plasma prepare pour des usages therapeutiques. La concentration en leucocytes avant leucoreduction etait d'environ 5X102 cellules/ml (superieur a 1O: cellules/poche), alors qu'apres leucoreduction cette concentration est inferieure a 10 cellules/ml (inferieur a 2 103 cellules/poche). Le procede de denombrement de leucocytes de l' invention est sur et les denombrements obtenus vent coherents avec ccux decrits dans la litterature.( Masse M., Transfus Clin Biol 2001 Jun;8(3):297- 302 2 1 2840992 leuLoreduction of cellular and plasma components: process control and performance of the leukoreduction process.>>) Cette etude montre que le procede de denombrement de leucocytes de ['invention permet la detection de leucocytes residuels dans le plasma et, compare aux procedes conventionnels de denombrement de leucocytes, il offre une plus grande exactitude. De plus, la sensibilite du procede de l 'invention peut etre optimisee aisement en augmentant le volume de l'echantillon. Un volume d'echantillon plus important conduira a une meilleure recuperation des leucocytes qui seront plus representatifs de l'echantillon. 22 2840992 REVEND I CAT I ONS 1) Procede de denombrement de leucocytes eventuellement presents dans un fluide biologique, caracterise en ce qu'il comprend les etapes suivantes: a) l' incubation d'un echantillon audit fluide biologique avec un agent permeabilisant des membranes cellulaires, b) l' incubation de l'echantillon obtenu a l'etape (a) avec un marqueur des leucocytes, c) la filtration de l'echantillon obtenu a l'etape (b) sur une membrane non autofluorescente, susceptible de retenir les leucocytes, pour obtenir une preparation en phase solide des leucocytes marques, eventuellement presents dans ledit echantillon, d) l'analyse de la preparation en phase solide de l'etape (c), pour denombrer les leucocytes marques eventuellement presents sur celle-ci. 2) Procede selon la revendication 1, caracterise en ce que l'echantillon de l'etape (a) est prealablement dilue avec un tampon osmotiquement compatible avec les leucocytes, avant son incubation avec l' agent permeabilisant des membranes. 3) Procede selon la revendication 2, caracterise en ce que le tampon de dilution est choisi parmi le groupe comprenant: du PBS, du TRIS, du tampon de Tyrode ou du serum physiologique. 4) Procede selon l'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que l' agent permeabilisant des membranes cellulaires est choisi parmi un detergent, et un agent de fixation. ) Procede selon la revendication 4, caracterise en ce que le detergent utilise a ltetape (a) est choisi parmi le groupe comprenant les detergents: Triton X-100, saponine, n-ocLyl-glucopyranoside, Tween 20, Tween 80, sodium dodecyl sulfate. 6) Procede selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caracterise en ce que le detergent utilise a l'etape (a) est utilise a une concentration finale comprise entre 0,05% et 5%, de preference entre 0,01% et 2 %. 7) Procede selon l'une quelconque des revendications 4 a 6, caracterise en ce que le detergent utilise a l'etape (a) est utilise a une concentration finale de 0,1% pour le Triton X-100, de 1% pour le n-ocLyl glucopyranoside, le Tween 20, le Tween 80 et le sodium dodecyl sulfate, de 0,2% pour la saponine. 8) Procede selon l'une quelconque des revendications precedentes caracterise en ce que la duree d' incubation entre l'echantillon et l' agent permeabilisant des membranes cellulaires a l'etape (a) est comprise entre 5 et 45 minutes, de preference entre 10 et 20 minutes et tout preferentiellement elle est de 15 minutes. 9) Procede selon l'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que le marqueur des leucocytes utilise a l'etape (b) est choisi parmi le groupe comprenant: un colorant, un fluorochrome, un marqueur d'acides nucleiques. ) Procede selon la revendication 9, caracterise en ce que le marqueur de leucocytes utilise a l'etape (b) est un marqueur d'acides nucleiques choisi parmi le groupe comprenant: orange d'acridine PicogreenO, cyanine asymetrique, cyanine monomere, cyanine dimere, SYBRO 11) Procede selon l'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que la duree d' incubation entre ltechantillon et le marqueur a l'etape (b) est comprise entre 5 et 45 minutes, de preference entre et 20 minutes et tout preferentiellement elle est de 15 minutes. 12) Procede selon l'une des revendications precedentes, caracterise en ce que la membrane non-autofluorescente mise en uvre a l'etape (c) est une membrane noire. 13) Procede selon l'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que la taille des pores de la membrane mise en uvre a l'etape (c) est comprise entre 0, 05,um et 2 um, tout preferentiellement entre 0,1 um et 1 m et preferentiellement elle est de 0,4 m. 14) Procede selon l'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que la membrane est une membrane en polyester, polyether sulfone ou polycarbonate. ) Procede selon l'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce quapres la 2840992 filtration de l'etape (c) on effectue un ravage de la membrane par filtration d'un volume de tampon. 16) Procede selon l'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que l'analyse de la preparation en phase solide a l'etape (d) est effectuee au moyen d'un analyseur a balayage laser. 17) Procede d'identification morphologique des leucocytes eventuellement presents dans un produit sanguin, caracterise en ce qu'il comprend les etapes (a) a (c) d'un procede selon l'une quelconque des revendications 1 a 15, suivies d'une etape (e) d' observation visuelle au microscope a epifluorescence des preparations obtenues a l'etape (c). 18) Utilisation d'un procede de denombrement de leucocytes selon l'une quelconque des revendications 1 a 16 ou d'un procede d' identification morphologique de leucocytes selon la revendication 17 pour le controle de qualite des preparations de plasma. 19) Utilisation d'un procede de denombrement de leucocytes selon l'une quelconque des revendications 1 a 16 ou d'un procede d' identification morphologique de leucocytes selon la revendication 17 pour le controle de qualite des filtres de leucocytes ) Utilisation d'un procede de denombrement de leucocytes selon l'une quelconque des revendications 1 a 16 ou d'un procede d'identification morphologique de leucocytes selon la revendication 17, pour le denombrement des leucocytes dans les fluides biologiques. 21) Utilisation d'un procede de denombrement de leucocytes selon l'une quelconque des revendications 1 a 16 ou d'un procede d'identification morphologique de leucocytes selon la revindication 17 pour l' identification morphologique des differences populations de leucocytes dens les fluides biologiques 22) Utilisation d'un procede de denombrement de leucocytes selon l'une quelconque des revendications 1 a 16 ou d'un procede d' identification morphologique de leucocytes selon la revendication 17 pour le controle des