FR 2838430 A1 20031017 FR 0204445 A 20020410 l'intérieur de l'appareil à la vue de l'utilisateur. 1 2838430 La présente invention concerne la préparation et l'utilisation de supports chromatographiques pour le dédoublement de composés racémiques. Le sélecteur chiral est un dérivé de polysaccharide que l'on rend insoluble dans les solvants habituels de la chromatographie liquide- solide par une réaction de pontage. Ce résultat est obtenu à l'aide d'un réactif polytonctionnel capable de réagir avec les groupes -OH résiduels du dérivé de polysaccharide. L' insolubilisation résulte de la formation d' un réseau tridimensionnel de chanes osidiques. La réaction de pontage se fait en une seule étape et à sec après dépôt sur un support du dérivé de polysaccharide et du réactif polytonctionnel. Dans le domaine des médicaments et des produits à usage agricole, I'activité des divers stéréoisomères d'un composé chiral peuvent être différentes. Par exemple, il est connu que l'utilisation d'un médicament sous sa forme racémique peut avoir des conséquences dramatiques. D'o la nécessité de séparer les isomères des composés racémiques. Si le dédoublement des composés racémiques se fait souvent par cristallisation de diastéréoisomères, les techniques chromatographiques sur support chiral connaissent depuis quelques années un grand essor justifé par leur grande efficacité et la possibilité de séparer directement les énantiomères sans traitement préalable. S' il existe actuellement un grand choix de supports chiraux pour dédoubler par chromatographie un composé racémique à l'échelle analytique, il n'en est pas de même à l'échelle préparative. Dans ce dernier cas, ce sont essentiellement des supports dont le sélecteur chiral est un dérivé de polysaccharide qui sont utilisés. La cellulose en 1967 puis d'autres polysaccharides natifs ont été utilisés pour le dédoublement de composés racémiques. Leur énantiosélectivité est cependant médiocre et en 1973 Hesse et Hagel ont montré qu'un dérivé de polysaccharide, en l'occurrence le triacétate de cellulose, conduisait à un support chiral de meilleures performances que le polysaccharide non dérivatisé. Les dérivés de polysaccharides purs présentent un inconvénient lorsqu'ils sont utilisés comme support chiral dans une colonne chromatographique. Il s'agit principalement de leurs mauvaises propriétés mécaniques et leur gonilement par les solvants. Cet inconvénient est devenu rédhibitoire avec la généralisation de la chromatographie liquide haute performance qui requiert l'emploi de colonnes sous pression. Pour pallier cet inconvénient, en 1984 Okamoto et al. (J. Am. Chem. Soc. 106 (1984) 5347) ont montré que l'on pouvait obtenir d'excellents supports chromatographiques chiraux en déposant sur de la silice des dérivés de cellulose et d'amylose et notamment des triphénylcarbamates. Les phases stationnaires chirales selon Okamoto ont été commercialisées et connaissent toujours un grand succès. Elles présentent cependant un inconvénient: la solubilité du dérivé de polysaccharide dans de nombreux solvants habituels en chromatographie, ce qui oblige à n'utiliser comme éluants que des solvants compatibles avec la stabilité des phases stationnaires. En fait des hydrocarbures tels que l'hexane et des alcools à petit nombre d'atomes de carbone. Or, dans le domaine des médicaments qui est le champ d' application le plus vaste de la chromatographie chirale, de nombreux composés racémiques à dédoubler sont très peu solubles dans les solvants compatibles avec la stabilité des phases stationnaires dans lesquelles le dérivé de polysaccharide est simplement déposé sur un support. Cela oblige à injecter dans la colonne chromatographique des solutions très diluées du composé racémique à dédoubler afn d'y éviter sa précipitation et donc à utiliser de grandes quantités de solvant. Pour pallier cet inconvénient, plusieurs voies, certaines très complexes, ont été proposées pour immobiliser le dérivé de polysaccharide sur le support: Okamoto et al. (J. Liq. Chromatogr. 10 (1987) 1613) déposent d'abord sur une y - aminopropylsilice de la cellulose tritylée. Suit l'hydrolyse des groupes trityle ce qui a pour objet de régénérer la cellulose à la surface de la silice. Cela fait, la cellulose est fixée au support à 1'aide d'un diisocyanate qui réagit avec ses fonctions alcool et la fonction amine de la silice modifiée. Le polysaccharide ainsi fixé au support est enfn traité par un phénylisocyanate qui vient réagir avec ses groupes -OH. Cette méthode est longue et ne permet pas un conhôle aisé des diverses étapes et réactions mises en oeuvre. En 1994 Kimata et al. (US Pat. 5 302 633) copolymérisent un dérivé de cellulose et une silice portant chacun une double liaison activée. Ils utilisent une tri(4- vinylbenzoyl)cellulose et une N-acryloyl--aminopropylsilice. Cette méthode de fixation d'un dérivé de polysaccharide à un support présente deux inconvénients. D'abord, le groupe que l'on souhaite fixer sur le polysaccharide peut étre d'accès difficile par le fait de la présence obligatoire d'une double liaison activée dans sa molécule. Ensuite, le grand nombre de doubles liaisons activées portées par le dérivé de polysaccharide fait que les points de réticulation et de fxation au support seront nombreux ce qui affecte la structure secondaire du dérivé polysaccharidique. Or, il est connu que cela nuit aux performances de la phase stationnaire. En 1994 Oliveros et al. (EP 0 738 284 B1, J. Liq. Chromatogr. 18 (1995) 1521) décrivent la préparation de phases stationnaires dont le sélecteur chiral est un dérivé polysaccharidique qui présente l'originalité d'être substitué par deux groupes différents: l'un sélectionné pour les qualités énantiosélectives qu'il confère au polysaccharide qui le porte, I'autre, en petite proportion et qui renferme une double liaison carbone-carbone aliphatique non activée, est destiné à la fixation du dérivé de polysaccharide sur le support. Cette fixation peut se faire par copolymérisation entre ledit dérivé et le support si celui-ci est fonctionnalisé 3 2838430 comme par exemple l'allylsilice ou encore par réticulation de ce méme dérivé sur des supports inertes tels que la silice vierge, l'alumine, le graphite, etc. L'importance de la réticulation peut ici étre contrôlée par le nombre de groupes destinés à la fixation que l'on introduit dans la châîne du polysaccharide. En 1996 Enamoto et al. (Anal. Chem. 68 (1996) 2798) fixent sur de la silice et par deux méthodes différentes de l'amylose obtenue par polymérisation enzymatique d'un nombre déterminé d'unités d'a-D-glucose-1phosphate. Cette amylose, fixée au support, est traitée par le 3,5diméthylphénylisocyanate ce qui conduit au support chromatographique recherché. Les bonnes performances de ces phases stationnaires peuvent s'expliquer par la grande liberté conformationnelle de la châîne du dérivé d'amylose qui n'est fxé au support que par une de ses exkémités. Une difficulté de cette méthode est la polymérisation enzymatique des unités glucose et qui plus est ne peut conduire qu'à l'amylose. En 1998 Duval et al. (EP 0 864 586 A2) décrivent la préparation de silices greffées de dérivés polysaccharidiques mais les exemples donnés ne diffèrent de ceux des publications de Oliveros et al. citées ci-dessus que par la présence d'un pont oxygène dans la châîne du substituant destiné à la fixation desdits dérivés. En 1996 et 1997, Francotte et al. décrivent trois méthodes pour fixer des dérivés de polysaccharides sur des supports. Dans la première (WO 96/27615) le dérivé de polysaccharide portant un groupe photopolymérisable est déposé sur de la silice puis irradié avec une lampe à vapeur de mercure pendant environ 16 heures. Dans la seconde (WO 97/04011) le dérivé de polysaccharide ne porte plus de groupe photopolyrnérisable. Comme précédemment, le dérivé de polysaccharide est déposé sur le support et soumis à une irradiation ultraviolette pendant environ 20 heures. Dans la troisième (WO 97/49733) le dérivé de polysaccharide et un initiateur de radicaux libres (l'oc,oc'- azobisisobutyronitrile ou AIBN) sont déposés sur le support puis chauffés à sec à 120 C pendant plusieurs heures. Il n'est pas dit, dans cette dernière publication, comment le dérivé de polysaccharide se fixe au support. Probablement que cela résulte de réactions de pontage entre châînes polysaccharidiques par l'intermédiaire de radicaux libres provenant de ruptures radicalaires de certaines liaisons sous l'action de la chaleur et de l'initiateur de radicaux libres utilisé en très grande quantité puisque sa proportion par rapport au dérivé de polysaccharide est en général dans le rapport 1/1. Dans ces kois dernières méthodes, on note, outre des temps de réaction très longs, que les quantités de solvant utilisées par rapport à la quantité de phase stationnaire traitée sont très importantes. En outre, chacune d'elles nécessite une contraignante extraction au soxhlet de plusieurs heures afin d'éliminer le dérivé de polysaccharide non fïxé au support. 4 2838430 L'importance de phases stationnaires chirales pour le dédoublement de composés racémiques à l'échelle préparative est toujours grande. De novelles méthodes ou techniques chromatographiques comme par exemple celle dite à lit mobile simulé (ou SMB de simulating mobil bed) sont aptes à produire d'importantes quantités d'énantiomères optiquement purs à partir d'un composé racémique. Pour ce faire, il est souhaitable que les phases stationnaires chirales utilisées présentent une grande capacité, soient particulièrement stables et supportent toute s sortes de solvants afin de travail l er aux c onditi ons optim al e s sans co ntrainte s autres que celles propres à la séparation elle-même. Or, la capacité et l'énantiosélectivité des phases stationnaires dont le sélecteur chiral est un dérivé de polysaccharide sont grandes. Il s'ensuit que la recherche de phases stationnaires de ce type stables et d'obtention aisée est touj ours d'actualité. On décrit ici une méthode particulièrement simple de fixation sur des supports divers des dérivés de polysaccharides. La fixation est obtenue par l'insolubilisation du dérivé de polysaccharide à la surface du support par pontage à l ' aide d' un réactif polytonctionnel qui réagit avec les fonctions -OH résiduelles généralement toujours présentes dans les dérivés de polysaccharides. La présente invention concerne l'insolubilisation par pontage de dérivés polysaccharidiques dont 1,5 à 2,95 fonctions H par unité osidique ont été transformées en esters -O-CO-R ou en carbamates - CO-NH-R ou en esters et en carbamates. Dans ces formules, le groupe R représente généralement un groupe alkyle ou un groupe aryle ou un groupe arylalkyle ou un groupe alkylaryle. Lorsque R est un groupe aryle ou un groupe arylalkyle ou un groupe alkylaryle, les noyaux beuzéniques peuvent être substitués par un ou plusieurs atomes ou groupes identiques ou différents choisis parmi les atomes d'halogène, les groupes alkyle linéaires ou ramifiés et les groupes alkoxy linéaires ou ramifiés. De prétérence le groupe R est alors phényle ou phényléthyle, substitués ou non sur le noyau benzénique. Lorsque R est un groupe alkyle il peut être ramifié ou non et substitué par un ou plusieurs atomes ou groupes identiques ou différents choisis parmi les atomes d'halogène et les groupes alkoxy. De préférence le groupe R est alors le groupe méthyle. Les dérivés de polysaccharides selon l'invention ont un degré de polymérisation compris entre 5 et 2000 et de préférence de 10 à 500. Généralement, les dérivés de polysaccharides selon l'invention sont des dérivés de la cellulose, de l'amylose, du chitosan et de l'amylopectine. 2838430 Le réactif de pontage porte ou est capable de donner naissance à au moins deux fonctions susceptibles de réagir avec les groupes -OH libres du dérivé de polysaccharide. Il peut étre représenté par les forrnules générales Ia et Ib: X /CO\ Ia A Ib A /O Y CO Dans lesquelles: a) X et Y. identiques ou différents, représentent chacun une fonction capable de réagir avec des groupes OH libres d'un dérivé de polysaccharide. De prétérence -X et -Y représentent les groupes fonctionnels suivants: -N=C=0 ou -SO2Cl ou COCI ou -CO2H ou époxyde b) A est un groupe alkyle ou un groupe aryle ou polyaryle ou un groupe arylalkyle ou un groupe alkylaryle pouvant porter des substituants identiques ou différents choisis parmi les atomes d'halogène, les groupes alkyle, les groupes alkoxy, les groupes acyl, les groupes ester. La dérivatisation des polysaccharides que l ' on souhaite utiliser selon l ' invention se fait par les méthodes classiques décrites dans la littérature. De préférence le dérivé de polysaccharide est fixé par pontage sur un support minéral tel que la silice, modifiée ou non, I'alumine, I'oxyde de titane, I'oxyde de zirconium, le graphite ou des matériaux cornme le papier ou d'autres macromolécules naturelles ou synthétiques. La quantité de dérivé de polysaccharide fixé par pontage sur le support est comprise entre 5 et 40% en masse par rapport au support et de préférence entre 5 et 25% Selon l'invention, le pontage du dérivé de polysaccharide se fait à chaud en absence de solvant comme suit: a) Si l'on utilise un support, celui-ci est introduit dans une solution du dérivé de polysaccharide et du réactif de pontage. Le solvant est ensuite évaporé et le produit résultant est chauffé vers 120 C pendant 1 à 2 heures. Le produit obtenu est lavé par du chloroforme à reflux. b) Si le dérivé de polysaccharide est pur sous forme de microbilles ou de feuilles, il est introduit dans une solution du réactif de pontage dont le solvant ne dissout pas le dérivé de polysaccharide. La suite du traitement est la même que ci dessus en a). Les dérivés de polysaccharides selon l'invention sont caractérisés en ce que la réaction de pontage les rend insolubles dans les solvants organiques comme par exemple le chloroforme, le toluène, l'acétate d'éthyle ou 1'acétone. Les dérivés de polysaccharides insolubilisés selon la présente invention sont utiles pour la séparation d'un produit chimique d'un mélange, le dédoublement de composés racémiques et plus généralement la séparation de composés chiraux. Les méthodes utilisces pour ce faire sont essentiellement chromatographiques: en phase liquide, solide, super ou subcritique, en lit mobile simulé ou encore par diffusion énantiosélective à travers d'une membrane. Exemple 1: 2,6 grammes de silice de diamètre des particules 5 m et de porosité 100 angstroms sont introduits dans un ballon renfermant une solution de 0,5 gramme de triacétylcellulose commercialisée par la société Fluka de masse molaire 37000 et dont le dogré de substitution est de 2,48 et 0,4 gramme d'anhydride diacétyltartrique dans 50 mL de pyridine. Laisser sous agitation pendant quelques minutes et évaporer lentement le solvant sous pression réduite à C. Chauffer à sec au bain d'huile vers 120 C pendant environ 1,5 heure. Laisser retroidir et reprendre par 50 mL de chloroforme sous agitation magnétique à la température ambiante pendant environ 2 heures et terminer en portant à reflux pendant 2 heures. Filtrer sur verre fritté, laver sur filtre d'abord avec du chloroforme puis avec de l'acétone. Sécher; on obtient environ 3 grammes de support. Analyse centésimale: C 10,19%. Si cette silice est ensuite lavée de nouveau avec de la pyridine à la température ambiante pendant 2,5 heures sous agitation magnétique, filtrée et lavée sur filtre avec du chloroforme et de l'éther diéthylique, I'analyse centésimale indique alors 9,60% de carbone. Exemple 2: On procède comme dans l'exemple 1 mais en partant d'une yaminopropylsilice (analyse centésimale: C 5,35%, H 1,68% et N 1,88%) obtenue à partir de la même silice vierge que celle utilisée dans 1'exemple 1. Analyses centésimales: Après traitement par le chloroforme à ébullition: %C =14,62; suivi par un lavage à la pyridine: %C=12,55. On note à partir de ces deux exemples: - Que le dérivé de polysaccharide a bien été rendu insoluble dans des solvants énergiques tels que le chloroforme et l'acétone par une réaction de pontage. - Que si l'on tient compte du pourcentage de carbone dans la silice aminopropyle de départ, le taux de fixation du dérivé de cellulose sur le support est sensiblement le même sur l'aminopropylsilice que sur la silice vierge. Ce qui tend à démontrer que l'insolubilisation du dérivé de polysaccharide est bien due essentiellement au pontage de ses châînes. 7 2838430 REVENDICATIONS 1. Dérivé de polysaccharide dont 1,5 à 2,95 fonctions -OH par unité osidique ont été transformées en ester-OCO-R ou carbamate-O-N=CO-R ou en ester et carbamate caractérisé en ce que, soluble au départ dans les solvants organiques comme par exemple le chloroforme, le toluène, l' acétate d' éthyle ou l ' acétone, il est rendu insoluble dans ces mêmes solvants par une réaction de pontage interchanes par action d'un réactif polyfonctionnel qui réagit avec des fonctions -OH libres présentes dans ledit dérivé. 2. Dérivé de polysaccharide selon la revendication 1 caractérisé en ce que le syrnbole R des groupes ester et carbamate représente un groupe alkyle ou aryle ou arylalkyle ou alkylaryle dans lesquels les châînes alkyle peuvent être linéaires ou ramifées et les noyaux aromatiques substitués ou non par un ou plusieurs atomes ou groupes identiques ou différents choisis parmi les atomes d'halogène, les groupes alkyle linéaires ou ramifiés et les groupes alkoxy. 3. Dérivé de polysaccharide selon les revendications précédentes caractérisé en ce que la réaction de pontage se fait à l'aide d'un réactif polyfonctionnel capable de réagir et d'établir au moins deux liaisons avec des groupes -OH libres du dérivé de polysaccharide que l'on souhaite insolubiliser. 4. Dérivé de polysaccharide selon les revendications précédentes caractérisé en ce que la ou les fonctions portées par le réactif polyfonctionnel utilisé pour son insolubilisation par pontage sont anhydride d'acide carboxylique, chlorure d'acide carboxylique, acide carboxylique, chlorure d'acide sulfonique, isocyanate ou époxyde. 5. Dérivé de polysaccharide selon les revendications précédentes caractérisé en ce qu'il s'agit d'un dérivé de cellulose, d'amylose, d'amylopectine ou de chitosan dont le degré de polymérisation est compris entre 5 et 2000. 6. Méthode d'obtention d'un dérivé de polysaccharide selon les revendications précédentes dont les étapes sont: - Dissolution d'un dérivé de polysaccharide dont 1,5 à 2,95 fonctions -OH par unité osidique ont été transformées en ester-OCO-R ou carbamate-O-N=CO-R ou en ester et carbamate avec R tel que défini dans la revendication 2, et un réactif polyfonctionnel tel que défini dans les revendications 3 et 4 dans un solvant organique approprié et imprégnation d'un support chromatographique, minéral ou organique, naturel ou synthétique. 8 2838430 - Evaporation du solvant, chauffage vers 120 C du produit résultant pendant environ 1,5 heure et terminer par un lavage avec du chloroforme à reflux. 7. Méthode d'obtention d'un dérivé de polysaccharide selon les revendications 1 à 5 dont les étapes sont: - Des microbilles ou feuilles obtenues à partir d'un dérivé de polysaccharide dont 1,5 à 2,95 fonctions -OH par unité osidique ont été transformées en ester -OCO-R ou carbamate -O-N=COR ou en ester et carbamate avec R tel que défini dans la revendication 2, sont imprégnées d'une solution d'un réactif polytonctionnel tel que défini dans les revendications 3 et 4 dans un solvant organique dans lequel le dérivé de polysaccharide n'est pas soluble. - Evaporation du solvant, chanffage vers 120 C du produit résultant pendant environ 1,5 heure terminer par un lavage au chloroforme à reflux. 8. Phase stationnaire pour la séparation de composés chiraux par chromatographie selon les revandications 1 à 6 caractérisée en ce que le support est choisi parmi la silice, la silice modifiée, l'alumine, I'oxyde de zirconium, le graphite ou des matériaux comme le papier ou d'autres macromolécules naturelles ou synthétiques. 9. Phase stationnaire pour la séparation de composés chiraux par chromatographie selon les revandications 1 à S et 7 caractérisce en ce que le dérivé de polysaccharide est utilisé sous forme de microbilles. 10. Membrane pour la séparation de composés chiraux selon les revandications 1 à 5 et 7