FR 2824335 A1 20021108 FR 0106039 A 20010504 pour évaluer l'effcacité d'un traitement ou soin amincissant appliqué à un sujet. 1 2824335 La présente invention concerne un procédé de fragmentation et de marquage d'ADN ainsi que les applications de ce procédé en particulier dans le domaine du diagnostic. L'état de la technique montre que de nombreuses méthodes existent pour marquer des acides nucléiques. Une première méthode consiste à fixer le marqueur sur la base, que celle-ci soit naturelle ou modifiée. Une deuxième méthode propose de fixer le marqueur sur le sucre, là encore qu'il soit naturel ou modifié. Une troisième méthode a pour objet la fixation du marqueur sur le phosphate. Le marquage sur la base a été notamment utilisé dans l'approche de marquage des acides nucléiques par incorporation de nucléotides directement marqués. Le marquage sur le sucre est souvent utilisé dans le cas des oligonucléotides préparés par synthèse chimique. Le marquage sur le phosphate a été aussi utilisé pour introduire des bras fonctionnalisés et des marqueurs lors de la synthèse chimique des oligonucléotides. En fait l'homme du métier, qui doit effectuer un marquage d'un nucléotide, ou d'un analogue de nucléotide ou d'un acide nucléique, est enclin à effectuer cette fixation sur la base ou sur le sucre qui lui offrent plus de commodité et d'alternatives. C' est d'ailleurs ce qui ressort de l'étude de nombreux documents, tels que EP-A-0.329.198, EP-A-0 302.175, EP-A-0.097.373, EP-A-0.063.879, US-A-5,449,767, US-A ,328,824, WO-A-93/16094, DE-A-3.910.151, EP-A-0.567.841 pour la base ou EP-A 0 286.898 pour le sucre La fixation du marqueur sur le phosphate est une technique plus complexe que la so technique consistant à fonctionnaliser la base ou le sucre et a été bien moins utilisée notamment à cause de la faible réactivité du phosphate (voir par exemple Jencks W P. et 2 2824335 al J. Amer. Chem Soc., 82, 1778-1785, 1960). De méme dans la revue de O'Donnel et Mc Laughlin (" Reporter groups for the analysis of nucleic acid structure ", p 216-243, dans "Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids", Ed Hecht S.M., Oxford University Press, 1996) portant sur les méthodes d'introduction de sondes dans les fragments d'oligonucléotides, 1'alkylation effcace du phosphodiester internucléotidique est considérée comme étant impossible. Un deuxième problème se pose pour le marquage d'acides nucléiques spécialement pour les acides nucléiques de grande taille, c'est à dire de plus de 100 nucléotides, qui doivent 0 s'hybrider avec des sondes nucléiques. Ce problème est lié à la gêne stérique ou au manque de spécificité entre l'acide nucléique et la sonde nucléique. Cela se traduit pas une perte de sensibilité en détection. La géne stérique peut être le fait, non seulement, de la longueur de l'acide nucléique, mais également de 1'existence ou de la conservation de structures secondaires. La fragmentation permet de détruire ces structures et ainsi d' optimiser l' hybridation. Cette géne stérique joue un rôle particulièrement important dans le cas de l'hyDridation sur des surfaces contenant des sondes de capture à forte densité, par exemple les puces à ADN mises au point par la société Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High Density DNA arrays", M. Shee et al., Science, 274, 610-614. "Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA sequence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026). En ce qui concerne la fragmentation d es acides nucléiques, de nombreu se s métho des 2s sont décrites dans l'état de la technique. Premièrement, la fragmentation peut être enzymatique, c'est-à-dire que la fragmentation des acides nucléiques peut 8tre réalisée par des nucléases (DNases). Deuxièmement, la fragmentation peut être chimique. Par exemple dans le cas de l'ADN, on peut effectuer la dépurination ou la dépyrimidination de l'ADN, qui est alors fragmenté en présence d'une base par un mécanisme dit de ",-élimination". La 3 2824335 fragmentation de l'ADN peut être réalisée par des mécanismes d'oxydation, d'alkylation, d'addition de radicaux libres entre autres. Enfin la fragmentation peut être physique, par exemple par sonication ou par voie photochimique. La diffculté consiste en fait à associer ces deux étapes de fragmentation et de marquage. Le brevet WO 99/65926 décrit un procédé de marquage d'un acide ribonucléique (ARN) de synthèse ou naturel qui consiste à fragmenter l'ARN et à marquer au niveau du phosphate terminal. Ce document décrit un certain nombre de fonctions réactives o pouvant être utilisées pour le marquage en liaison avec la fragmentation. Ces fonctions permettent de marquer les ARN mais il faut associer une étape de fragmentation pour avoir un marquage effcace car ce marquage se produit sur le phosphate libéré lors de la fragmentation. De plus, il faut ajouter un excès important de réactif de marquage par rapport à l'ARN pour obtenir un marquage effcace ce qui induit des problèmes de bruit i5 de fond généré par le marqueur en excès. Enfin cette méthode n'est pas applicable à l'ADN. Il existe donc un besoin pour une technique de marquage de l'ADN simple et effcace qui permette un bon rendement de marquage et donc une bonne sensibilité, qui soit spécifique au niveau de la position de marquage et en particulier qui n'affecte pas les propriétés d'hybridation des bases impliquées dans la formation de la double hélice par l'intermédiaire des liaisons hydrogènes et enfin qui permette la fragmentation de l'ADN dans le but d'hybrider ces fragments d'ADN marqués sur des sondes nucléiques, et en particulier sur des sondes nucléiques fixés sur un support solide. La présente invention décrit un procédé de marquage et de fragmentation d'un acide désoxyribonucléique (ADN) simple ou double brin comprenant les étapes suivantes: - fragmenter l'ADN en créant au moins un site abasique sur ledit ADN, - attacher un marqueur sur au moins un des fragments par l'intermédiaire d'un réactif de marquage, ledit réactif se couplant de manière covalente et majoritaire sur au moins un phosphate dudit fragment. 4 2824335 La fragmentation et le marquage s'effectuent en une étape ou en deux étapes et le marquage peut s'effectuer indifféremment avant, après ou simultanément avec la fragmentation. Avantageusement, le marquage s'effectue après la fragmentation. De préDérence, le marquage et/ou la fragmentation s'effectue(nt) en solution homogène sensiblement aqueuse De préférence, le marquage et la fragmentation s'effectuent o simultanément c'est à dire que les réactifs nécessaires à ces deux étapes sont mis ensemble dans une solution sensiblement aqueuse avec l'acide nucléique par exemple. C'est notamment le cas pour la fragmentation chimique ou enzymatique. Dans le cas de la fragmentation mécanique par un moyen physique, marquage et fragmentation s'effectuant simultanément, signifie que le moyen physique est appliqué à une solution contenant au moins les acides nucléiques et le réactif de marquage. Par solution sensiblement aqueuse on entend une solution contenant au moins 50% d'eau. Cette solution contient de préDérence des sels comme une solution tampon. Par solution homogène, on entend une solution monophasique telle qu'une solution eau/DMSO par opposition à une solution biphasique telle qu'une solution eau/chloroforme. La fragmentation de l'ADN par l'intermédiaire de la création d'un site abasique s'effectue par voie euzymatique, chimique ou physique. La fragmentation par voie chimique de l'ADN est réalisée en mettant en présence l'acide nucléique avec un moyen chimique de création de site abasique. Des exemples de conditions de fragmentation chimique par l'intermédiaire d'un site abasique de 1'ADN sont donnés dans G. Pratviel et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 34, p746-769, 1995; G. Pratviel et al., Adv. Inorg. Chem.,45, p251-312, 1998; D. S. 2824335 Sigman et al. Chem. Rev., 93, p2295-2316, 1993, J. Lhomme et al., Biopolymers (Nucleic Acid Sciences), 52, p65-83, 1999 Un site abasique est créé quand la liaison N-glycosidique reliant la base modifiée au désoxyribose est hydrolysée, laissant la liaison phosphodiester intacte. Ce phénomène est appelé dépurination (dans le cas des purines) ou dépyrimidination (dans le cas des pyrimidines). La dépurination est beaucoup plus fréquente que la dépyrimidination. Des agents chimiques tels que le pH acide, les agents oxydants ou les agents alkylants 0 peuvent induire le phénomène de dépurination et donc la formation de sites abasiques. Ces agents alkylants sont constitués d'espèces électrophiles qui réagissent avec les sites nucléophiles d'un fragment d'ADN. L'atome d'azote en position 7 de la guanine est le site principal d'alkylation de l'ADN. En plus de la protonation des purines, I'alkylation est 1'une des modifications chimiques susceptibles de rendre la liaison N-glycosidique plus labile. o OH O H Site abasique L'oxydation de l'ADN peut également générer des lésions abasiques dites " alcalilabiles ", qui conduisent à la fragmentation de l'ADN en présence d'une base. Par exemple le résidu ribonolactone peut être généré par réaction du radical hydroxyle (OH) avec le carbone C 1'. 6 2824335 o o O H Rib o nol act one Le site abasique est très instable. Sous sa forme aldéhydique il peut subir facilement une ,-élimination du phosphodiester fixé en position 3', ce qui conduit à la fragmentation du brin de l'ADN. Il en est de même pour le site désoxyribonolactone. La dépurination est spontanée dans des conditions physiologiques (pH 7,4 à 37 C) mais la vitesse de la réaction est très faible de l'ordre de 3.10- ' dépurination par seconde o c'est à dire inutilisable pour une fragmentation efficace. Pour augmenter la vitesse de réaction, on utilise des agents alkylants qui fragilisent la liaison N-glycosidique ou des euzymes comme des ADN glycosylases. Un mode préDéré de réalisation de la fragmentation est obtenu par l'utilisation d'un pH acide c'est à dire un pH inférieur à 5. Avantageusement le pH est d'environ 3. Un tampon formiate de sodium à pH 3 permet de fragmenter de manière efficace pour la présente invention. Ce tampon est compatible avec les conditions de marquage en une étape comme cela sera démontré dans les exemples. Dans un mode particulier de la présente invention et dans le but d'augmenter encore la fragmentation, l'acide désoxyribonucléique contient au moins une base modifiée susceptible de générer un site abasique plus facilement. Diverses bases modifiées sont utilisables comme les N7-alkyl purines, les N3-alkyl purines, les 06-alkylpurines, les 8-bromopurines, les 8-thiopurines, les 8- alkylthiopurines, les 8 azidopurines ou les 8-alkylsulfonylpurines. 7 2824335 Dans le cas ou l'acide nucléique à marquer est généré par une technique d'amplification enzymatique comme la PCR, I'utilisation d'une 8bromopurine permet d'avoir une incorporation effcace dudit nucléotide pendant l ' amplification ce qui facilite d' autant le procédé de fragmentation et marquage selon l'invention tout en conservant une sensibilité excellente pour 1'étape d'amplification enzymatique. Une 8méthylthiopurine est également incorporée sans gêner l'effcacité d'amplification et d' incorporation par PCR. Une fois incorporée, la base thioéther est oxydée par un peracide ou un dérivé de monopersulLate comme le peroxymonosulLate de potassium par exemple, en sulphonyle correspondant qui est très labile. Il a été démontré que le temps de demi- vie o correspondant à l'hydrolyse d'une 8-méthylsulLonylguanosine est inférieur à 2 minutes alors que le temps de demi-vie pour son homologue naturel est de 1000 heures. Par marqueur, on entend au moins un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs suit: les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la B- galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants, les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leur propriété électrique comme la conductivité, 1'ampérométrie, la voltamétrie, I'impédance, les groupements détectables, par exemple dont les molécules sont de tailles suffsantes pour induire des modifications détectables de leurs caractéristiques physiques et/ou chimiques, cette détection peut étre réalisée par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation de surface, la variation d'angle de contact ou des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, I'effet tunnel, les molécules radioactives comme le 32p, le 35S OU le 25I De préPérence, le marqueur n'est pas un marqueur radioactif pour éviter les problèmes de sécurité liés à ces marqueurs. 8 2824335 Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention le marqueur est détectable électrochimiquement et en particulier le marqueur est un dérivé d'un complexe de Fer comme un ferrocène. Des systèmes indirects peuvent être aussi utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Les couples ligand/antiligand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants: biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. Dans ce cas, c'est le o ligand qui porte la fonction réactive. L'anti-ligand peut étre détectable directement par les marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être luiméme détectable par un autre couple ligand/anti-ligand. Un autre exemple de systèmes indirects utilise une liaison covalente spécifique entre le ligand et l'anti-ligand par exemple méthylcétone et alcoxyamine. Des exemples de ce système sont décrits dans WO 00/40590 et WO 98/05766. Dans le procédé de la présente invention, la liaison entre le réactif de marquage et l'acide nucléique est covalente mais il est décrit ci-dessus que des interactions non o covalentes peuvent étre utilisées notamment dans les systèmes d'empilement ou dans le cas o le marqueur est détectable indirectement. Le terme " attacher " couvre donc ces différentes possibilités. Ces systèmes de détection indirects peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR-2 781 802 et WO 95/08000 de la demanderesse pour des exemples d'amplification chimique en utilisant des polymères ou à la demande PCT/IB99/02072 pour les systèmes d' amplification chimique par empilement. Dans un mode particulier de l' amplification de signal, au moins deux marqueurs sont présents sur le réactif de marquage. 9 2824335 Dans un mode préféré de l'invention, le traceur est un composé fluorescent de faible encombrement stérique comme la fluorescéine, le dansyl, les chromophores du type IR (Li-COR Inc. Lincoln NE, USA), les dérivés cyanines comme le Cy5 et Cy3 (Randolph J.B. and al, Nucleic Acids Res, 25(14), p2923-2929, 1997) et en particulier les dérivés du Cy5 ou bien le traceur est un haptène de faible encombrement stérique comme la biotine ou un dérivé de l'abiétane (voir la demande WO 00/07982). Par faible encombrement stérique, on entend un poids moléculaire inférieur à 1000 g/mole. Dans le cas d'un fluorophore, il est préférable de travailler avec des fluorophores dont la 0 longueur d'onde d'excitation est supérieure à 450 nm, de préférence supérieure à 600 nm. Dans le cas o le traceur est un haptène qui ne produit pas de signal par lui même, comme par exemple la biotine, la détection est réalisée par la réaction d'un anti-ligand comme décrit plus haut Dans le cas de la biotine, on utilise de préférence de la streptavidine ou un anticorps anti-biotine couplé à un composé fluorescent comme la fluorescéine, Cy5 ou la Phycoérythrine. Dans le cas de l'abiétane, on utilise un anticorps monoclonal comme décrit dans WO 00/07982. Le terme " acide désoxyribonucléique" ou ADN signifie un enchamement d'au moins 2 o désoxyribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Cet ADN peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les Hphosphonates, ies alkyl-phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides ( FR 2 607 507) ou les PNA (M Egholm et al, J Am Chem Soc, 114, 1895-1897, 1992. L'ADN est naturel ou synthétique, et/ ou sous la forme de fragment L'ADN est simple ou double brin 2824335 En particulier l'ADN est obtenu par une technique d'amplification enzymatique telle que la - PCR (Polymerase Chain Reaction), décrite dans les brevets US 4 683 195, US 4 683 202 et US 4 800 159, et sa dérivée RTPCR (Reverse Transcription -PCR), notamment dans un format en une étape tel que décrit dans le brevet EP 569 272. - LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP 201 184, - RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO 90/01069. 0 On parle alors d'amplicons pour désigner l'ADN généré par une technique d'amplification enzymatique L'ADN peut aussi comprendre des ribonucléotides en faible proportion, par exemple inférieur à 10%. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison pour peu qu'au moins un phosphate soit présent dans 1'ADN. Le réactif de marquage comprend, comme fonction réactive, un motif choisi parmi: diazométhyle; halogénure d'alEyle; nitrosourée; spirocyclopropane; aziridine; époxyde, trifluorométhanesulLonate. 11 2324335 Les fonctions réactives sont décrites ci-dessous: o diazométhyle \ C= N2 nitrosourée _ N-C-NHRs NO halogénure d'alkyle- CH2X spirocyclopropane H2C-CH2 O-CH2 époxyde X aziridine HN-CH2 \/ O /\ Trifluorométhane-CH2O-S-CF3 sulfonate È Pour la fonction réactive halogénure d'alkyle, X signifie Br, Cl ou I Avantageusement le réactif de marquage est la 5-(bromométhyl) fluorescéine. Pour la fonction réactive nitrosourée, R5 est un alkyle ou H. La fonction diazométhyle a déjà été utilisée pour l'alkylation des groupements o phosphates, mais un certain nombre de problèmes se posent. D'une part, les dérivés diazo en général sont instables eux mêmes, ce qui pose des problèmes pour l'utilisation des ces réactifs de marquage dans un kit de marquage et d'autre part, le produit de couplage est instable ce qui est rédhibitoire si le produit marqué a pour fonction de mettre en évidence la présence d'une molécule cible biologique dans un échantillon quelconque, ou si c'est la cible marquée que 1'on souhaite détecter Enfin les dérivés portant la fonction diazométhyle sont insolubles dans l'eau ce qui conduit à utiliser des conditions biphasiques pour le couplage avec des acides nucléiques, qui ne sont solubles et stables que dans l'eau ou des tampons aqueux, mais 12 2824335 ces conditions ralentissent la vitesse de réaction et donc nuisent à l'efficacité du couplage. Dans un mode préDéré du procédé selon l' invention, le réactif de marquage est choisi s parmi les composés de formule (1): R\ C=N2 dans laquelle o R' représente H ou un groupe alkyle, alkyle substitué, aryle ou aryle substitué, Z comprend un marqueur détectable. Z et/ou R' sont choisis pour stabiliser la fonction diazométhyle, c' est à dire au moins un des deux groupes Z ou R a un noyau phényle. 1: De préférence, le réactif de marquage est choisi parmi les composés de formule (2): R\ R2-(L)n_ z'C = N2 o dans laquelle R' représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 est un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d' au moins 2 liaisons covalentes et n est égal à O ou 1, 13 2824335 et Z est choisi parmi: y X R: 3 R3 ou R3 ou -C-NH- ou -C- s dans lequel R3 et R4 représentent indépendamment 1'un de 1'autre: H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R= alkyle ou aryle -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S o Dans un mode particulier selon la formule (1), Z a la structure suivante: Dans ce cas, le réactif de marquage est le PDAM. Bien que ce marqueur soit fluorescent, la longueur d'onde d'excitation est trop proche de celles des acides nucléiques. Un détection indirecte par l'utilisation d'un anticorps monoclonal dirigé contre le motif pyrène est préférce. Le mode d'obtention de cet anticorps est bien connu de l'homme du métier (voir par exemple WO 00/07982). 14 2824335 Dans un mode pr6rd de riahsaLon du procd6, le rdacf de marquage es1 de rmule (3) Y-X dans laqueHe Ri reprdsente U ou un groupe 1 k ou ale ssb1u6, R reprdsen1e un marqur ddiec1le, L es1 un bras de liaison compodan1 un encbemem hndaLe d'su moins 2 liaons covulentes e1 n un nore emier 6gal 0 ou 1, 0 e1 reprdsemen1 indipenda-en1 l'un de [re: 8, NO,, Ct. B[, F. I, O SR, , CO CO COOR avec = alle ou ale, -Y- reprdseme un marqueur d61ectable, L es1 un bras de liaison compoa un encbemen1 [ndaire d'au moins 2 liaisons covalentes e1 n un nore entier al 0 ou 1, e1 reprdsenten1 ind6pend_e [un de Lautre: 8, NO" Ct Br, F, I, OR, SR, ,^ C COORR=e- 2824335 Avantageusement le réactif est de formule (S): R2 (L)n-NH-C R1 N2 dans laquelle R représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchânement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1, R3 et R4 représentent indépendamment 1'un de 1'autre: H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle. o Avantageusement le réactif est de formule (6): R3 R2 4-CH2-O N2 dans laquelle RJ représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, R3 et R4 représentent indépendamment 1'un de 1'autre: H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle. Dans les formules ci-dessus (3) à (6), avantageusement R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre: H. NO2, OCH3. Ainsi, un composé préféré selon la formule (6) est de formule (6'): NO2 R2 (L)l,-CH2-O,R N2 dans laquelle R' représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, 16 2824335 R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1 Ou un composé préféré selon la formule (4) est de formule (4'): o R2 (L)n-C-NH: N2 dans laquelle R représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, o L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1 Dans un mode particulier du procédé o l' on veut amplifier le signal, au moins deux marqueurs sont présents sur le réactif de marquage. En particulier un réactif qui permet de mettre en oeuvre l' amplification de signal selon la présente invention possède une structure R2(L)n de formule (7) ci dessous: o:,R2 -OqwR2 NH NH R2_ HN1 NH m-1 dans laquelle R2 représente un marqueur détectable, m est un nombre entier compris entre 1 et 100, de préférence compris entre 1 et 20, p est un nombre entier compris entre 1 et 10, avantageusement 2 à 6, de préDérence 4 17 2824335 Cette structure de R2-(L)n s'applique indifféremment aux formules (2) à (6) précédentes. Un autre réactif de marquage préféré pour l'amplification de signal est le réactif de formule (8): N2 R2_ (L)n-Y-X Y-X-(L)n-R2 dans laquelle R2 représente un marqueur détectable, R3 représente H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CON, COOR avec R 0 = alkyle ou aryle, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d' au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1, -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-. Avantageusement le réactif pour l' amplification de signal a la formule (9) N2 R2_ (L)n-C-NH C- NH-C-(L)n-R dans laquelle R2 représente un marqueur détectable, R3 représente H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle, de prétérence R3 représente H. NO2 ou OCH3, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1 18 2824335 Certains réactifs avantageux de l'invention sont: a) de formule (10): R2 (L)n C-NH )E= N2 R dans laquelle: Rt représente H Ou un groupe alEyle ou aryle ou aryle substitué, RZ représente un marqueur détectable. L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1 o b) de formule (11): R2 (L)n C-NH R N2 dans laquelle: R représente H ou un groupe alkyle ou aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable. L est un bras de liaison comportant un enchâmement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1 c) de formule (12) R2_ (L)n-C-NH 19 2824335 L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d' au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1. De prétérence, le réactif de marquage a la: a) structure o HN HN H H \:J: dans laquelle R représente un groupe méthyle ou un phényle. b) ou la structure: o HN HN HHC-NH N2 dans laquelle R représente un groupe méthyle ou phényle. c)ou la structure: o HN I N C-NHN dans laquelle R' représente un groupe méthyle ou phényle. 2824335 D'autre réactifs préDérés selon l'invention ont la formule (13): C; R2_ (L)n-C-NH [) NO2 dans laquelle R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d' au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1. En particulier les réactifs de marquage selon le procédé de l' invention sont solubles dans o des solvants polaires miscibles à l'eau comme le DMF, le DMSO, CH3CN, THF, DMA (diméthylacétamide), NMP (N-méthylpyrrolidone), DME (diméthoxyéthane). De prétérence les réactifs de marquage sont solubles dans le DMSO ou l'eau. Par solvant miscible à l'eau on entend un solvant qui est miscible dans une proportion d'au moins 5% en volume avec de 1'eau ou un tampon aqueux contenant des sels. Avantageu sement dans les formul es p récéd entes, le bras L comp rendmotif éthylène glycol ou polyéthylène glycol pour augmenter la solubilité du réactif dans l'eau. C es réactifs p euvent ainsi se fixer en phase homogène sur l es acides nucléique s, la phase homogène étant constituée d'une solution sensiblement aqueuse, c'est à dire contenant au moins 50% d'eau. 2i 2324335 Un objet de la présente invention est de décrire un procédé de détection d'un acide désoxyribonucléique cible (ADN) simple ou double brin comportant les étapes suivantes: a) Fragmenter et marquer lesdits ADN selon l'un quelconque des procédés décrits précédemment, b) Hybrider les fragments marqués sur au moins une sonde nucléique suffsamment spécifique de l'acide nucléique cible, c) Détecter l'hybride formé par l'intermédiaire du marqueur. o Comme cela sera démontré dans les exemples, la dénaturation de l'ADN avant hybridation permet d' augmenter la sensibilité. Cette étape de dénaturation a lieu après la fragmentation et le marquage. Dans un mode particulier du procédé, une étape d'amplification enzymatique a lieu avant la fragmentation et le marquage. L' étape d' amplification enzymatique génère des amplicons ADN à partir d'un acide nucléique cible ADN mais aussi à partir d'un acide nucléique cible ARN comme un ARN messager, un ARN de transfert ou un ARN ribosomal. La technique de RT-PCR par exemple est un moyen connu pour amplifier l'ARN. De préférence, les étapes de fragmentation, marquage et dénaturation ont lieu en même temps aussi bien dans le cas d'un acide nucléique cible naturel que dans le cas d'un acide nucléique cible obtenu par une technique d' amplification euzymatique. La fragmentation par création d'un site abasique implique la perte d'une base. Dans les procédés de détection d'acide nucléique cible et en particulier dans les procédés de génotypage c'est à dire dans les procédés ou l'acide nucléique cible présente un polymorphisme réparti sur sa séquence, il est nécessaire d'identifier une pluralité de modifications de séquences dont certaines représentent la modification d'une seule base entre la cible et les sondes nucléiques dont la fonction est d'identifier cette modification (sondes de capture). La spécificité est donc essentielle dans ce contexte. De manière 22 2824335 surprenante, la présente invention démontre que cette perte d'une base n'affecte en rien la spécificité de l'hyDridation pour un acide nucléique marqué et fragmenté selon I'invention. La présente invention a aussi pour objet un procédé de mise en évidence d'un polymorphisme réparti en des positions prédéterminées ou non d'un acide nucléique cible par la présence d'une pluralité de délétions et/ou insertions et/ou mutations dans la séquence dudit acide nucléique cible par rapport à une séquence dite de rétérence comportant les étapes suivantes: o a) Disposer d ' un ADN cible comportant l' ensemble du polymorphisme à étudier, ledit ADN étant éventuellement généré par une technique d' amplification enzymatique. b) Fragmenter et marquer ledit ADN par un des procédés décrits précédemment. c) Hybrider lesdits fragments sur une pluralité de sondes nucléiques dites sondes de capture, la pluralité de sondes de capture étant fixées sur un support solide et la pluralité de sondes de capture couvrant dans son ensemble au moins le polymorphisme à étudier. d) Détecter les hybrides formés entre les fragments marqués et au moins une partie des sondes nucléiques par l'intermédiaire du marqueur et en déduire le polymorphisme de l'ADN cible. Comme indiqué précédemment une étape de dénaturation après l'étape de fragmentation et marquage permet d'améliorer la sensibilité du procédé et cette étape est réalisée de prétérence simultanément avec l'étape de marquage et de fragmentation. Le procédé de fragmentation et de marquage selon l'invention est particulièrement utile dans le cas o 1'ADN marqué et fragmenté doit s'hybrider avec une multitude d'acides nucléiques, notamment oligonucléotides, fixés sur le support solide à une position prédéterminée pour former une puce à ADN. Par "puce à ADN", on entend un support solide de dimension réduite o sont fixées une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées. Par multitude on entend un support solide comportant au moins 10 sondes nucléiques de séquences différentes, avantageusement au moins 400, de prétérence au moins 1000. 23 2824335 En effet, la densité des acides nucléiques fixés sur le support solide imposent des contraintes stériques importantes lors de l'hybridation et la fragmentation permet d'améliorer cette étape d'hybridation Des exemples de ces puces à ADN sont donnés par exemple dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, p40-44, 1998; F. Ginot, Human Mutation, 10, pl-10, 1997; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1(3), pl83-200, 1996; T. Livache et al, Nucleic Acids Rescarch, 22(15), p2915- 2921, 1994; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 16, p541-546, 1998. Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut étre fixé un acide nucléique. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, o d'une membrane, d'une particule ou d'une plaque sensiblement plane. L'invention concerne l'utilisation d'un ADN marqué, tel que défini cidessus, comme sonde de détection d'un acide nucléique cible. Pour permettre la détection et/ou la quantification et/ou la purification de l'acide nucléique cible, I'ADN marqué est capable de former un complexe d'hybridation avec une sonde nucléique. A titre d'exemple, I'acide nucléique marqué est suffsamment complémentaire de la cible pour s'hybrider spécifiquement en fonction des conditions de réaction et notamment la température ou la salinité du milieu réactionnel. Le procédé de détection est applicable pour le séquençage, le profil d'expression des ARN messagers ou le criblage de mutations à des fins de recherche ainsi que le criblage de drogues dans l'industrie pharmaceutique, le diagnostic de maladies infectieuses (aussi bien en bactériologie, virologie, parasitologie) ou génétiques, le contrôle alimentaire ou industriel. De nombreuses publications décrivent ce type dapplications: Antoine de Saizieu et al, Nature Biotechnology, 16, p44-48, 1998;Thomas R. Gingeras et al Genome Research, 8, p435-448, 1998; David J. Lockhart et al, Nature Biotechnology, 14, pl675-1680, 1996; Daniel D. Shoemaker et al, Nature Genetics, vol 14, p450-456, 1996; R.J. Lipshutz et al; BioTechniques, 19(3), p442-447, 1995; David G. Wang et al, Science, 24 2824335 280, p 1077- 1082, 1998; Kevin L. Gunderson et al; Genome Research, 8, p 1142- 1152, 1998; Joseph G. Hacia et al; Nature Genetics, vol 14, p441-447, 1996. La tendance en matière de diagnostic et notamment pour les maladies infectieuses (S IDA ou Tuberculose par exemple) est de baisser le niveau de sensibilité j usqu'à la détection d'une molécule unique dans un échantillon qui peut représenter plusieurs millilitres dans le cas d'un prélèvement liquide type sang ou urine ou LCR. Ce niveau de sensibilité ne peut étre obtenu que si toutes les étapes depuis le prélèvement de l'échantillon jusqu'au rendu de résultat sont optimisées. En particulier dans le cas o une 0 étape d' amplification enzymatique est nécessaire pour obtenir la sensibilité nocessaire (infection virale ou bactérienne comme VIH, VHC ou Tuberculose), un procédé de marquage et/ou fragmentation comme décrit dans la présente invention permet de ne pas affecter la sensibilité de la technique d' amplification soit parce qu ' il n' est pas nécessaire de remplacer les désoxyribonocléotides utilisés dans la technique d' amplification euzymatique, soit parce ce que les désoxyribonucléotides incorporés n'altèrent pas la sensibilité. Les figures et exemples cijoints représentent des modes particuliers de réalisation et ne peuvent pas être considérés comme limitant la portée de la présente invention. La figure 1 représente les formules développées des différents réactifs utilisés dans la présente invention ainsi que l'abréviation les désignant.(o- signifie ortho, m- méta et p- para) 2s Les figures 2A à 2I représentent les profils en fonction du temps analysés par électrophorèse capillaire du couplage covalent de différents réactifs portant une fonction diazométhyle sur l'uridine 3' monophosphate (3'-UMP) selon l'exemple 6.1. PDAM figure 2A DPDAM à 2 mM figure 2B DPDAM à 20 mM figure 2C PMDAM figure 2D 2824335 NPDAM figure 2E BioDPDAM figure 2F m-BioPMDAM figure 2G p-BioPMDAM figure 2H o-BioPMDAM figure 2I Les figure 3A à 3D représentent les profils en fonction du temps analysée par électrophorèse capillaire de la réaction du meta-BioPMDAM sur 4 nucléotides 3'- monophosphate selon l'exemple 6.2 lo 3'-CMP en série ribonucléotide figure 3A. 3'-AMP en série ribonucléotide figure 3B. 3'-GMP en série ribonucléotide figure 3C 3'-TMP en série désoxyribonucléotide figure 3D. La figure 4 représente les profils en fonction du temps analysée par électrophorèse capillaire de la réaction du méta-BioPMDAM sur un dinucléotide S'-ApUp selon l'exemple 6.3. Les figures SA à SD représentent le spectre RMN du proton dans D20 des différents conjugués entre le réactif méta-BioPMDAM et 4 ribonucléotides 3'-monophosphate selon l'exemple 6.4. 3'-GMP figure SA. 3'-AMP figure SB. 3' CMP figure SC. 3' UMP figure SD. La figure 6 représente un schéma de synthèse d'un réactif de marquage portant 2 biotines pour l'amplification chimique du signal. La figure 7 représente le mécanisme de fragmentation en milieu acide par la formation de site abasique. 26 2824335 La figure 8 montre selon 1'exemple 8.1 la cinétique de dégradation à pH acide pour différents nucléosides modifiés (8-bromo-2'-désoxyadénosine (8BrdA) et la S-bromo 2'-désoxyoxycytidine (5-BrdC))ainsi que les 4 nucléosides naturels (dA, dC, dG et dT). Les résultats sont représentés sous forme de pourcentage d'hydrolyse du nucléoside de départ (en ordonnée) par rapport au temps de réaction en minutes (en abscisse). La figure 9 représente selon 1'exemple 11.2 la cinétique de marquage en fonction du temps à une température de 60 C avec le réactif PDAM sur un ODN synthétique S' o phosphate. Les résultats sont représentés sous forme de pourcentage de marquage par rapport au temps de réaction exprimé en minutes (en abscisse). La figure 10 représente selon 1'exemple 11.3 le pourcentage de marquage en fonction de la température de réaction. Les résultats sont présentés sur la figure 10 avec en ordonnée le pourcentage de marquage et en abscisse la température de réaction en C. La figure 11 représente une voie de synthèse pour un réactif selon la formule 4' en utilisant le réactif commercial 5-Nitrovanilline. La fonction aldéhyde est le précurseur de la fonction diazométhyle. * Exemple 1: synthèse de réactifs avec la biotine Schéma général de synthèse R L N-méthylmorpholine jo HN NH O iBuOCOC] HN NH) |i ( H ll-) ( H . OH NH2 DMF O O D-Biotine 1a R = CH3, substituant méta 1 b: R = CH3, substituant para 1c: R = CH3, substituant ortho 1d: R = Ph. substituant méta 1 N2H4-H2O R R -:N2 MnO2 -N'NH2 HN NH) H NH 114 ( H IF) ( H l , , NH O O 3a: R = CH3, substituant méta 2a: R = CH3, substituant méta 3b: R = CH3, subsfituant para 2b: R = CH3, subsfituant para 3c: R = CH3, substituant ortho 2c: R = CH3, substituant ortho 3d: R = Ph. subsfituant méta 2d: R = Ph. substituant méta 1) Synthèse du méta-BioPMDAM À Composé biotine méta-acétophénone la: 0 On solubilise la D-biotine (1,0 g, 4,1 mmol) dans 45 mL de DMF anhydre à chaud. On refroidit à 0 C sous argon, puis on ajoute successivement la N-méthylmorpholine (590 I1L, 5,33 mmol) et le chloroformiate d'isobutyle (840 pL, 6,60 mrnol). On laisse sous agitation pendant 30 min. puis on ajoute la 3-aminoacétophénone (824 mg, 6,10 mmol) et la N-méthylmorpholine (480 1uL, 4,35 mmol) dans 10 mL de D. La solution est maintenue sous agitation à O C pendant 2 h, puis on évapore à sec. On reprend le résidu dans 3 mL de MeOH, puis on ajoute 50 mL d'eau. Le précipité obtenu est filtré, lavé 28 2824335 avec de l'eau, du CH2CI2 et de 1'éther pour donner 1,2 g (80 %) de produit la brut. Une recristallisation dans le couple MeOH-H2O donne la (1,01 g, 70 %) sous forme d'une poudre blanche. s F 145 C. - IR (KBr): 3280, 2931, 2857, 1691, 1590,154O, 1487, 1434, 1298, 1266 cm -RMNIH(300MHz,DMSO-d6)o= 1,3-1,7(m,6H), 2,33 (t,J=8Hz,2H);2, 55 (s, 3 H), 2,58; (d, J= 12 Hz, 1 H); 2,83 (dd, J= 12 et 5 Hz, 1 H); 3, 13 (m, 1 H); 4,15 (m, 1 H), 4,31 (m, 1 H); 6,34 (s, 1 H); 6,41 (s, 1 H); 7,44 (t, J= 8 Hz, 1 H); 7,64 (d, J= 8 Hz, 1 H); 7,85 (d, J= 8 Hz, 1 H), 8, 17 (s, 1 H); 10,05 (s, 1 H). - MS 0 (FAB/glycérol), m/z: 362 [M+H]. À Composé méta-hydrazone 2a: Une solution de la (500 mg, 1,38 mmol) et d'hydrazine monohydrate (200 1L, 4,15 mmol) dans de 1'éthanol absolu (8 mL) est chauffée à reflux pendant 2 h. Après refroidissement à température ambiante, le précipité blanc est filtré, lavé avec de l'eau, puis avec de l'éther et séché On obtient ainsi 385 mg (74 %) de produit 2a sous forme d'une poudre blanche. F 185 C. - IR (KBr): 3298, 2931, 2857, 1698, 1665, 1626, 1541, 1494, 147O, 1446, 1330, 1265 cm. - RMN IH (300 MHz, DMSO-d6) = 1,3-1,7 (m, 6 H), 1, 98 (s, 3 H); 2,26(t,J=8Hz,2H);2,56;(d,J=12Hz, lH);2,81(dd,J=12et5Hz, lH); 3,11 (m, 1 H); 4,13 (m, 1 H); 4,29 (m, 1 H); 6,39 (s, 3 H), 6,42 (s, 1 H), 7,22 (m, 2 H); 7,50 (d, J= 8 Hz, 1 H); 7,84 (s, l H); 9,82 (s, 1 H). - MS (FAB/glycérol), m/z: 376 [M+H] À Composé méta-diazométhane 3a: On solubilise 2a (180 mg, 0.48 mmol) dans 2 mL de DMF. On ajoute alors MnO2 (340 mg, 3,9 mmol). Après 30 minutes d'agitation à température ordinaire, le mélange est filtré à travers un entonnoir fritté contenant de la célite (épaisseur: 0,5 cm) et des tamis 29 2824335 moléculaires en poudre 3 A (0,5cm). Le mélange réactionnel est concentré jusqu'à un volume d'environ 0,5 mL, puis 5 mL d'éther sont ajoutés. Le précipité résultant est filtré, lavé à l'éther puis séché. Le composé 3a (170 mg, 95 %) est obtenu sous forme d'une poudre rose. F 160 C. - IR (KBr): 3278, 2935, 2859, 2038, 1704, 1666, 1605, 1577, 1536, 1458, 143O, 1263 cm. - RMN IH (300 MHz) = 1,3-1,7 (m, 6 H); 2,11 (s, 3 H) ; 2,28 (t, J= 8 Hz, 2 H); 2,57; (d, J= 12 Hz, 1 H); 2,81 (dd, J= 12 et 5 Hz, 1 H); 3,11 (m, 1 H); 4,13 (m, 1 H); 4,29 (m, 1 H); 6,33 (s, 1 H); 6, 41 (s, 1 H); 6,60 (m, 1 H); 7,25 (m, 3 H); 9,84 (s, 1 H).). 2)Synthèse du para-BioPMDAM À Composé biotinepara-acétophénone lb On solubilise la D-biotine (1 g, 4,1 mmol) dans 45 mL de DMF anhydre à chaud. On refroidit à 0 C sous argon puis on ajoute successivement la Nméthylmorpholine (590 I1L, 5,33 mmol) et chloroformiate d'isobutyle (840, uL, 6,60 mmol). On laisse sous agitation pendant 30 min. puis on ajoute la 4-aminoacétophénone (824 mg, 6,10 mmol). La solution est maintenue sous agitation à O C pendant 2 h puis on évapore à sec. On reprend le résidu dans 50 mL d'eau. Le précipité obtenu est filtré, lavé avec de l'eau puis avec 50mL de MeOH à chaud. Le précipité blanc est dissous dans du DMF en chauffant puis la solution obtenue est filtrée et lavée au MeOH. Le filtrat est récupéré et évaporé à sec pour donner 888 mg de lb (2,46 mmol, 60 %). 2s F 260 C. - IR (KBr): 326O, 293O, 2358, 1706, 1673, 161O, 1526, 1401, 138O, 1322, 1257, 1150 cm. - RMN IH (200 MHz, DMSO-d6) ô = 8,82 (s, 1H, NH-CO); 7,57 (d, 2H, J= 9 Hz, Ar-H); 6,83 (d, 2H, J= 9 Hz, Ar-H); 6,40 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,32 (s large, 1H, NH-CO-NU); 4,28 (m, 1H, CH2-CHNH); 4,12 (m, 1H, CH-CH NH); 3,11 (m, 1H, CH-S); 2,80 et 2,55 (système ABX, 2H, 27= 5 Hz, 3J = 12 Hz, 2824335 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2,35 (t, 2H, J= 8 Hz, CH2-CO); 2,10 (s, 3H, CH3); 1, 60-1,34 (m, 6H, (CH2)3). À Composé para-hydrazone 2b: Le composé lb (870 mg, 2,4 mmol) est dissous à chaud dans 1'éthanol (99 %, 8 mL) puis l'hydrazine monohydrate (995 I1L, 19,5 mmol) est ajoutée. La solution est chauffée à reflux pendant 3h. Le précipité blanc obtenu est filtré, lavé avec de l'eau glacée. On obtient ainsi 820 mg (90 %) de produit 2b sous forme d'une poudre blanche. F305 C.-IR(KBr):3281,3183,293O,2857, 1698, 1658, 1593,1521, 1459,1401, 1325, 1263, 1187 cm. - RMN H (200 MHz, DMSO-d6) = 9,68 (s, 1H, NH-CO), 7, 52 (s, 4H, J= 9 Hz, Ar-H); 6,43 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s large, 1H, NH CO-NU); 6,21 (s, 2H, NH2) 4,29 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4,12 (m, 1H, CHCH-NH); 1) 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,81 et 2,56 (système ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2,32 (t, 2H, J= 8 Hz, CH2-CO); 1,97 (s, 3H, CH3); 1,63-1,36 (m, 6H, (CH2)3). À Composépara-diazométhane 3b: On solubilise 2b (200 mg, O,53 mmol) dans 10 mL de DMF. On ajoute alors 800 mg de MnO2. Après 10 minutes d'agitation, le mélange est filtré à travers une couche mixte Célite(O,5 cm)-tamis moléculaire(O,5 cm en poudre). Le mélange réactionnel est évaporé à sec puis lavé à l'éther et séché. Le composé 3b (190 mg, 96 %) est obtenu sous forme d'une poudre rose. F 180 C (dec). - IR (KBr): 3257, 2930, 2857, 2032, 1698, 1597, 1524, 151O, 1455, 1404, 1307, 1259, 1180 cm. - RMN H (200 MHz, DMSO-d6) = 1O,18 (s, 1H, N_ CO);7,88(d,2H,J=6Hz,Ar-H);7,7(d,2H,J=6Hz,Ar-H);6,41 (slarge, 1H, N_-CO-NH); 6,34 (s large, 1H, NH-CO-NH); 4,28 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4,12 (m, 31 2824335 1H, CH-CH-NH); 3,11 (m, 1H, CH-S); 2,80 et 2,55 (système ABX, 2H,2JAB= 5 Hz, 3JAY= 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2,35 (t, 2H, J= 8 Hz, CH2-CO); 2,10 (s, 3H, CH3); 1,60-1,34 (m, 6H, (CH2)3). 3) Synthèse de l'oho-BioPMDAM À Composé biotine ortho-acétophénone lc: On solubilise la D-biotine (1 g, 4,1 mmol) dans 45 mL de DMF anhydre à chaud. On 0 refroidit à 0 C sous argon puis on ajoute successivement la Nméthylmorpholine (590 I1L, 5,33 mmol) et chloroformiate d'isobutyl (840 pL, 6,60 mmol). On laisse sous agitation pendant 30 min. puis on ajoute la 2-aminoacétophénone (824 mg, 6,10 mmol). La solution est maintenue sous agitation à température ambiante pendant 3 h 30 puis on évapore à sec. On reprend le résidu dans 50 mL d'eau. Le précipité obtenu est filtré, lavé avec de 1'eau puis avec 50mL de MeOH à chaud. Le précipité obtenu est filtré, lavé avec de l'eau. Une recristallisation est faite en dissolvant le produit dans du MeOH à chaud et en reprécipitant par addition d'eau. Le précipité est filtré, lavé à l'eau, puis à l'éther pour donner 1,1 g (2,95 mmol, 72 %) de produit lc brut. F 150 C. - IR (KBr): 3248, 2930, 2857, 2359, 1691, 1669, 1651, 1582, 1528, 1448, 1354, 1310, 1245, 1161 cm. - RMN 'H (200 MHz, DMSO-d6) = 11,24 (s, 1H, NH CO); 8,33 (d, 1H, J= 8,5 Hz, Ar-H); 7,97 (d, 2H, J= 8 Hz, Ar-H); 7, 57 (t, 1H, J= 7 Hz, Ar-H); 7,18 (t, 1H, J= 7 Hz, Ar-H); 6,44 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s large, 1H, NH-CO-N_); 4,30 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4,14 (m, 1H, CH-C_-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,80 et 2,55 (système ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JA.,Y = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2,61 (s, 3H, CH3); 2,37 (t, 2H, J= 8 Hz, CH2-CO); 1,62-1,38 (m, 6H, (CH2)3) 32 2824335 À Composé ortho-hydrazone 2e: Le composé le (500 mg, 1,38 mmol) est dissous à chaud dans l'éthanol (99 %, 8 rnL) puis l'hydrazine monohydrate (572 I1L, 11,1 mmol) est ajoutée. La solution est chauffée s à reflux pendant 50 minutes La solution est évaporée à sec. Le précipité blanc obtenu est filtré, lavé avec de l'eau puis séché à l'éther. On obtient ainsi 416 mg (11,1 mmol, 80 %) de produit 2e sous forme d'une poudre blanche. F 161 C. - IR (KBr): 3412, 3240, 2930, 2857, 2351, 1706, 1677, 1604, 1590, 1531, 1463, 1444, 1372, 1303, 1270, 1169 cm.- RMN H (200 MHz, DMSO-d6) =11,97 (s, 1H,NH-CO);8,35 (d, lH,J=8Hz,Ar-H);7,45 (d, lH,J=7Hz,Ar-H);7, 19(t, 1H, J= 7,5 Hz, Ar-H); 7,04 (t, 1H, J= 7 Hz, Ar-H); 6,61 (s, 2H, NH2) ; 6,42 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s large, 1H, NH-CO-NH); 4,32 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4,14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,81 et 2,56 (système ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2,31 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 2,09 (s, 3H, CH3); 1,63-1,36 (m, 6H, (CH2)3). À Composé ortho-diazométhane 3e: On solubilise 2e (200 mg, 0,53 mmol) dans 10 mL de DMF. On ajoute alors 800 mg de MnO2. Après 15 minutes d'agitation, le mélange est filtré à travers une couche mixte Célite(0, Scm)-tamis moléculaire(0,Scm en poudre). Le mélange réactionnel est évaporé à sec puis lavé à l'éther et séché. Le composé 3e (130 mg, 65 %) est obtenu sous forme d'une poudre rose. 2s F 110 C. - IR (KBr): 3248, 2930, 2857, 2367, 2342, 2038, 1699, 1521,1456 cm. RMN H (200 MHz, DMSO-d6) = 9,37 (s, 1H, NH-CO); 7,26-7,00 (m, 4H, Ar-H); 6,43 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s large, 1H, NH-CO-NH); 4,30 (m, 1H, CH2 CH-NH); 4,15 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,82 et 2,54 (système 33 2824335 ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2,24 (t, 2H, J= 8 Hz, CH2 CO); 2,12 (s, 3H, CH3); 1,63-1,37 (m, 6H, (CH2)3). 4) Synthèse du méta-BioDPDAM À Composé méta-couplage ld: On solubilise la D-biotine (50 mg, 0,11 mmol) dans 23 mL de DMF anhydre à chaud. On refroidit à 0 C sous argon, puis on ajoute successivement la Nméthylmorpholine 0 (295 pL, 2,67 mmol) et le chloroformiate d'isobutyle (420 pL, 3,28 mmol). On laisse sous agitation pendant 30 min. puis on ajoute la 3-aminobenzophénone (605 mg, 3,07 mmol) et la Nméthylmorpholine (240 '1L, 2,17 mmol) dans 7 mL de DMF. La solution est maintenue sous agitation à O C pendant 2 h, puis on évapore à sec. On reprend le résidu dans 1 mL de MeOH, puis on ajoute 25 mL d'eau. Le précipité obtenu est filtré, lavé avec de 1'eau, puis avec de 1'éther pour donner 810 mg (93 %) de produit la brut. Une recristallisation dans le couple MeOH-H2O donne la (630 mg, 72 %) sous forme d'une poudre blanche. RMN H (200MHz, DMSO-d6) =10,10 (s, 1H, NH-CO); 8-7,39 (m, 9H, Ar-H); 6,43 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s large, 1H, NH-CO-NU); 4,27 (m, 1H, CH2CH NH); 4,13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S), 2,84 et 2,55 (système A13X, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2, 31 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 1,59-1,36 (m, 6H, (CH2)3). À Composé méta-hydrazone 2d: On solubilise la (350 mg, 0,83 mmol) dans 5, 5 mL d'éthanol absolu puis on ajoute l'hydrazine monohydrate (140 pL, 2, 48 mmol). La solution est chauffée à reflux pendant une nuit. Après évaporation, le produit est repris dans 1 mL d'éthanol et de l'eau. Le précipité blanc est recristallisé: on le dissout dans un minimum d'éthanol à chaud et 1'on 34 2824335 ajoute de l'eau jusqu'à apparition d'un léger trouble. Après reDroidissement, le précipité obtenu est lavé à l'eau puis séché à l'éther On obtient ainsi 264 mg (73 %) de produit 2d sous forme d'une poudre blanche. RMN tH (200 MHz, DMSO-d6) â = 9,99 (s, 1H, NH-CO); 9,80 (s, 2H, NH2), 7, 54 6,88 (m, 9H, Ar-H); 6,26 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,21 (s large, 1H, NH-CO-NH); 4,28 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4,13 (m, 1H, CH-C_-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,78 et 2,59 (système ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JAY = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2,27 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 1,57-1,36 (m, 6H, (CH2)3). À Composé méta-diazodiphényl 3d: On solubilise 3d (500 mg, 0,53 mmol) dans 1 mL de THF. On ajoute alors 80 mg de MnO2 activé. Après 5 minutes d' agitation à température ambiante, le mélange est filtré à travers une couche mixte Célite (0,5 cm) -tamis moléculaire (0,5 cm en poudre). Le mélange réactionnel est évaporé à sec. Le composé 3d (47 mg, 100 %) est obtenu sous forme d'une huile violette. RMN 'H (200 MHz, DMSO-d6) = 9,95 (s, 1X N_-CO); 7,60-6,9 (m, 9H, Ar-H); 6, 42 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s large, 1H, NH-CO-NH); 4,28 (m, 1H, CH2 CH-NH); 4,14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,83 et 2,59 (système ABX,2H,2JAg=5Hz,3JAx=12Hz'3JBx=OHz'CH2-S);227(t,2HtJ=8Hz'CH2 CO); 1,58-1,35 (m, 6H, (CH2)3). 2824335 Exemple 2: réactif de marquage avec le CY5: CYSPMDAM + PhHN NHPh - _ N 4 5 6 Ac2O = (: + Br OH,OH - 10 OH 7 8 9 CH3 ClCOOiBuCH3 CH3 +O O NH2NH2 óiN NH2 MnO2 HN2 O Cy5 NH _Cy5 NH Cy5 NH _ NH2 N] OX O Cl O C Me 11 12 13 R N2 I_ OH NH2 X- >NH O ' O 1û Cy5-COOH À Composé Iodure de 2-[4-(N-acétyl-N-phénylamino)buta-1,3diényl]-1,2,3,3 tétraméthyl[3H] indolium 6 Le mélange du monochlorhydrate de malonaldehyde-bis(phénylimine) 5 (18,3 g; 70,0 0 mmole), de NaOAc (9,0 g, 110 mmole) et de 1'iodure de 1,2,3,3 tétraméthyl[3H]indolium 4 (4,25 g, 14,1 mmole) dans de 1'anhydride acétique (75 mL) est chauffé à 110 C pendant 20 min. Après refroidissement, on ajoute de l'éther (350 mL) et le solide brun précipité est filtré, lavé avec de l'éther (3 x 100 mL). Le solide est redissout dans 150 mL de CH2CI2, filtré (élimination des sels minéraux) puis évaporé pour donner un solide brun (6,0 g, 90 %). 36 2824335 RMN IH (CDCI3): 0 = 8,64 (d; 1H; J= 12 Hz; 1-H); 8,14 (t; 1H; J= 16; 12 Hz; 3-H); 7,63-7,19 (m; 9H); 6,90 (d; 1H;= 15 Hz; 4-H); 5,82 (t; 1H;= 12; 13 Hz;2-H);4,06(s;3H;NCH3);(2,16(s;3H;-COCH3); 1,74(s;6H;CH3). À Composé Bromure de 1-(5-carboxypentyl)-2,3,3-triméthyl[3H]indolium 9. On mélange le 2,3,3-triméthylindole 7 (10,0 g; 62,8 mmole) et 1'acide 6 bromohexanoque 8 (12,3 g; 62,8 mmole) sans solvant et chauffe à 110 C pendant 12 h sous argon. Le mélange réactionnel pâteux rouge-violet est lavé avec de l'acétate o d'éthyle (2 x 60 mL, on triture la pâte avec la spatule et on décante le surnageant), puis avec de l'acétone (50 mL, la pâte solidifie). Le solide rose est filtré puis séché sous vide (16,0 g, 73 %). À Composé Cy5COOH 10. Le mélange de l'iodure 6 (6,0 g; 12,7 mmole), du bromure 9 (4,5 g; 12,7 mmole) et de NaOAc (2,6 g; 32 mmole) dans de 1'anhydride acétique (35 mL) est chauffé à 110 C pendant 20 min. Après refroidissement, on ajoute de l'éther (150 mL) et le précipité est filtré et lavé avec de l'éther (3 x 50 mL). Le solide est dissous dans 100 mL de CH2C12, filtré et purifié par chromatographie sur colonne de sio2 (éluant: MeOH 5-10 %/CH2CI2). On obtient 3,4 g (44 %). RMN H (CDCI3): = 8,03 (t; 2H; J= 10; 11 Hz, 2-H, 4-H); 7,38-6,91 (m; 9H; Ar-H, 3-H); 6,41 (d; 1H;1= 14 Hz; 1-H); 6,31 (d; lH; J= 13 Hz; 5-H); 4,07 (t; 2H, J= 7; 7 Hz; (x-CH2); 3,68 (s; 3H; NCH3); 2,47 (t; 2H, J= 7; 7 Hz; ú-CH2); 1,7 1 (m; 1 8H; CH3,,B, et o-CH2). Composé de couplage de la 3-aminoacétophénone avec le Cy5COOH 10 (produit 11). À une solution de Cy5COOH 10 (1,19 g; 1,9 mmole) dans 12 mL de CH2CI2 on ajoute N-méthylmorpholine (360,uL; 3,2 mmole). La solution est retroidie avec un bain de glace, puis on ajoute le chloroformiate d'isobutyle (480 I1L; 3,7 mmole). Après 5 min d'agitation, on additionne la 3aminoacétophénone (488 mg; 3,6 mmole). On agite le mélange à température ambiante pendant 3 h. En ajoutant 250 mL d'éther, on obtient un solide pâteux. Après agitation, on laisse reposer le solide au fond de ballon et décante le surnageant. On ajoute de nouveau 50 mL d'éther et on triture avec une spatule pour obtenir un solide. Celui-ci est filtré, lavé avec de l'eau, de l'éther, puis séché sous vide. Le produit (iodure) est ensuite dissous dans de l'éthanol, passé sur colonne d'amberlite IRA900 (Cl-; 15g). La solution éthanolique recueillie est évaporée à sec puis passée sur colonne de sio2. On obtient 0,93 g (77 %) de solide bleu. 0. Composé Cy5-hydrazone 12. On ajoute à une solution de l'acétophénone 11 (0,93 g; 1,46 mmole) dans 5 mL d'éthanol absolu l'hydrazine monohydraté (180 1L, 3,1 mmole) que l'on agite à température ambiante pendant 7 h. On ajoute 50 mL d'éther et le précipité est filtré et lavé avec de 1'éther. On dissout le produit brut dans 50 mL de CH2CI2, la solution est filtrée puis concentrée à 10 mL. Le produit est précipité par ajout de 100 mL d'éther, filtré, lavé à l'éther et séché sous vide. On obtient 540 mg de produit 12 (57 %). Composé Cy5PMDAM 13. A une solution de 100 mg d'hydrazone 12 dans 2 mL de DMF, on ajoute 300 mg de MnO2 et 1'on agite vigoureusement pendant 10min. On filtre la suspension à travers une couche du célite et lave avec DMF (3x500 ',1L). On ajoute 50 mL d'éther et l'huile déposée est triturée avec une spatule et le surnageant est décanté. On répète l'opération de lavage 3 fois avec 25 rnL d'éther et le solide ainsi obtenu est filtré, séché. On obtient mg (65 %) de produit 13. La pureté du produit est d'environ 80-85 % (RMN H). 38 2824335 Exemple 3:Autres résctifs svnthétisés Exemple 3.1: Synthèse deparanitrophényldiazométhane (NPDAM) s Le 4-nitrobenzaldéhyde hydrazone est commercialement disponible (référence 28,118-2, Aldrich, France). On travaille donc sur 600 mg (3,64 mmole) de ce produit que 1'on dissout dans 9 mL de THF. La solution est laissée sous agitation pendant 5 minutes puis 1,26 g (4 équivalent, 14,56 mmole) de MnO2 sont additionnés avec précaution. Le mélange est laissé sous 0 agitation pendant 10 minutes, puis filtré. Le filtrat récupéré est évaporé à sec. Après lavage au pentane, le composé para-nitrophényldiazométhane est obtenu sous forme d'une poudre orange vif avec un rendement de 79 % (468 mg, 2,87 mmole). F 80-82 C. - RMN H (300 MHz, DMSO-d6) = 8,11 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-_:), 7, 18 (d, 2H, J= 9 Hz, Ar-H'); 6,06 (s, 1H, CH-N2). Exemple 3.2: Synthèse du phénylméthyldiazométhane (PMDAM) Hydrazone de l'acétophénone: On dilue l'acétophénone (2,0 g, 16 mmole) dans 16 mL d'éthanol absolu puis on ajoute l'hydrazine (2,3 mL, 48 mmole). On porte au reflux. Après 2 h, on évapore le solvant et on reprend le résidu dans de l'éther (150 mL). On lave avec de l'eau (lOOmL). Après séchage sur Na2SO4, on évapore l'éther. On obtient l'huile jaune pâle (1,5 g, 11 mmole, 69 %). Phénylméthyldiazométhane (PMDAM): On dissout l'hydrazone (150 mg, 1,1 mmole) dans 3 mL de THF. On ajoute le MnO2 (480 mg, 5,5 mmole). On agite pendant 30 min à température ambiante. Le milieu se colore en rouge. On filtre et on évapore le solvant. On obtient l'huile rouge (145 mg, 100 %). Ce réactif est utilisé sans purification. Exemple 3.3: Synthèse du diphényldiazométhane (DPDAM) La Benzophénone hydrazone est commerciale (référence B 960-2 Aldrich, France). 39 2824335 On travaille donc sur 196 mg (1,0 mmole) que 1'on dissout dans 5 mL de THF. 435 mg (5 éq, 5,0 mmole) de MnO2 sont additionnés, le mélange est laissé sous agitation pendant 10 minutes, puis filtré. Le filtrat récupéré est évaporé à sec. On obtient 193 mg (0,99 mmole). Ce réactif est utilisé sans purification. Exemple 3.4 Synthèse du NVDAM NO2 NO2 0 1) NH2-NH2, EtOH \N2 CH3O/V 2) MnO2, THFCH3O/ OCH3 OCH3 NVDAM La synthèse est réalisée selon le protocole décrit précédemment à partir de 6 nitrovératraldéhyde (Aldrich, réDérence 27,960-9). Exemple 4: Svnthèse du dérivé biotinYIé à partir du NPDAM (selon ref.) 1 Couplage 1. HOCH2CH2OH, TsOH 2 hydrazine /, NO2 2. Na2S, reflux NH2 3. MnO2 siot y O2NCHO - O2NCHO - - - - - - - - - -0 O2NCHN2 M. E. Wall et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 2689. Le dérivé 2-amino-4-nitro benzaldéhyde est préparé selon la méthode de ME Wall et al ... reference c-dessus. La préparation du diazométhane NPDAM est identique à celle décrite dans l'exemple 1. 2824335 Exemple 5: Préparation des acides nacléiques ADN. 5.1: Préparation des amplicons ADN. Les amplicons ADN sont générés par PCR à partir de cible ADN génomique Mycobacterium t?berculosis 16S (1OE+4 copies comme cibles de départ) en utilisant le kit Fast Start de Roche, 0,2 mM de chaque désoxyribonucléotide (d-ATP, d-CTP, d GTP, d-TTP), 0.3 1M d'amorces et 0,4 1L d'enzyme. Les paramètres de la PCR sont les suivants: - 95 C: 4 min puis 35 cycles (95 C: 30 sec; 55 C: 30 sec; 72 C: 30 sec) puis 4 C. 0 Les amplicons sont analysés qualitativement par électrophorèse sur gel d'agarose (1,5%, TBE 0,5X). Le volume déposé est de 5 pL et la migration s'effectue durant 20 min à V. La visualisation des produits PCR est réalisée sous lampe W après coloration au bromure d'éthidium. Les conditions pour la culture, I'extraction des Mycobactéries ainsi que les amorces d' amplification sont données dans le brevet WO 99/65 926. Exemple 6: Réactivité des réactifs de marquage sur des nacléotides modèles La synthèse des réactifs de marquage est décrite dans les exemples 1 à 4. Le PDAM décrit dans la présente invention est commercialement disponible. (référence P1405, Molecular Probes, Eugene, OR) 6.1: Marquage des monomères UMP 3'-phosphate La réactivité des réactifs de marquage portant une fonction diazométhyle a été étudiée pour contrôler la spécificité de la réaction. Un protocole a été mis au point qui consiste à étudier cette réactivité par électrophorèse capillaire sur un composé modèle le 3'-U (Uridine 3'monophosphate, réDérence U1126 Sigma) dans les conditions standards suivantes: 41 2824335 3'-UMP O,04 mM; H3BO3 2,0 mM; Marqueur 2,0 mM [ajouté avec un solvant organique approprié (THF, AcOEt ou DMSO)]; Solvants H20 - CH3CN -Solvant organique (rapport: 1/3/1). On répartit cette solution en dix fractions de 250 L que l'on chauffe à 60 C. Après une durée définie, chaque fraction est traitée avec 250 L de dichlorométhane. o Après agitation, on élimine la phase organique (phase inférieure). On répète cette opération encore deux fois. Après centrifugation (5 min. 5000 rpm), la phase aqueuse est analysée par électrophorèse capillaire. Les conditions de l'électrophorèse capillaire (EC) sont les suivantes: I'analyse EC a été effectuée par l'appareil Beckman P/ACE 5000. Un capillaire de silice fondue non traité (75 m x 50 cm) a été utilisé. Le voltage appliqué est de 30 kV (polarité normale) et la température du capillaire a été maintenue à 23 C. Les électrophorégrammes ont été enregistrés à 254 nm. La solution tampon borate (0,1 M, pH 8,3) a été préparée à partir de 1'acide borique en ajustant le pH avec une solution NaOH et filtrée à travers un filtre 0,2 m. Les échantillons ont été injectés sous pression (0,5 psi, 5 sec). Chaque analyse est précédée de la régénération du o capillaire par passages successifs d'une solution de NaOH (0,1 M, 2 min), eau (2 min) et de tampon borate (2 min) sous pression (20 psi). La réaction est effectuée en faisant varier le temps de réaction entre O et 4 heures comme indiqué sur chaque figure et les résultats sont présentés pour chaque réactif testé sur les figures 2A à 2I avec la concentration en réactif utilisée. Le temps de réaction est indiqué sur chaque électrophérogramme. Avec tous les réactifs testés, on obtient la formation exclusive d'un produit monoalkylé, ce qui prouve la spécificité de la réaction. 42 2824335 La réactivité, c'est à dire le temps de demi réaction du réactif sur le 3'-UMP, peut étre ainsi calculée, par comparai son de la hauteur d es pi c s, et les résultat s so nt p résentés dans le tableau ci-dessous (conditions standards décrites ci-dessus): N2 C=N, C=N2 c PDAM DPDAM PMDAM NPDAM: Réactivité 5 min 20 h 30 min 4 h N2 1iN2 HC; N2 q Blo min. La figure 2I utilise donc une concentration de 0,2 mM. On peut néanmoins noter que, la réaction étant très spécifique et ne conduisant pas à des sous produits pour tous les réactifs testés, il est possible d' augmenter la concentration du réactif de marquage sans conséquence du point de vue sélectivité sur le marquage. Ainsi pour le réactif DPDAM, si l'on augmente la concentration à 20 mM (voir figure 2C), la réactivité (temps de demi réaction) est de 2 heures. Le méme résultat est obtenu avec le BioDPDAM (figure 2F) o la réactivité est de 45 min à une concentration de 30 mM. 43 2824335 6.2 Test de différents nacléotides 3'-monophosphate. De manière à éviter toute erreur d'interprétation, une étude complémentaire sur le marqueur méta-BioPMDAM, pris à titre d'exemple significatif, a été effectuée avec les autres nucléotides 3'monophosphate. Les nucléotides testés sont les suivants: 3'-AMP (référence 85,194-9, Aldrich), 3'-GMP (réDérence 151214, ICN), 3'-CMP (référence C1133, Sigma), 3'-TM1P (série désoxyriDo) (référence T1008, Sigma). Les électrophorégrammes obtenus avec les o différents nucléotides sont représentés sur les figures 3A à 3D. Les temps de réaction indiqués sur la figure 3A sont identiques pour les figures 3B à 3D. Quel que soit le nucléotide de départ (série ribo ou désoxyribo), nous observons la formation exclusive et complète du produit alkylé en 130 min à 60 C. Il est important de noter que dans le cas de la guanine (base la plus réactive avec les réactifs alkylants usuels), seul le produit alkylé au phosphate est observé prouvant la très grande sélectivité de la réaction. Cette étude permet également de vérifier que la vitesse de la réaction ne dépend pas de la nature de nucléotide en tant que substrat. 6.3 Etude d'un dinacléctide: L'alkylation du dinucléotide ApUp (référence A4298, Sigma) a été effectuée avec le méfa-BioPMDAM afin de vérifier la sélectivité de la réaction vis-à-vis du phosphate terminal par rapport au phosphate internucléotidique. Le suivi de la réaction par électrophorèse est représenté sur la figure 4. Les conditions sont les conditions standards de l'exemple 6.1. La formation exclusive d'un seul produit est observée montrant une bonne sélectivité du réactif méta-BioPMDAM vis-à-vis du phosphate terminal par rapport au phosphate internucléotidique. 44 2824335 6.4 Caractérisation des adduits avec les 4 nacléotides 3'-monophosphates Pour s'assurer que les produits obtenus provenaient bien d'une alkylation au phosphate, la synthèse des adduits des monophosphates 3'-UMP, 3'-CMP, 3'-GMP et 3'-AMP avec le réactif méta-BioPMDAM a été effectuée. La réaction d'alkylation est réalisée à l'échelle préparative comme indiqué ci-dessous. Les adduits, obtenus avec des rendements de l'ordre de 70 % sont purifiés puis étudiés par RMN du proton et du phosphore. 0 Protocole de préparation: On dissout le 3'-UMP (sous forme de sel disodique; 9,3 mg; 21,1 mol) dans 2 mL d'une solution aqueuse 0,1 M de H3BO3, puis on ajoute successivement 2 mL de CH3CN, 6 mL de MeOH puis le réactif méta- BioPMDAM (75 mg, 0,20 mmol). La réaction est réalisée pendant 2, 5 h à température ambiante. Elle est suivie par électrophorèse capillaire. On ajoute 3 mL d'eau, puis l'excès du réactif est éliminé par extraction avec CH2CI2. La phase aqueuse est évaporée. Le résidu est dissous dans une petite quantité d'eau et purifié par passage sur une colonne de gel de silice en phase inverse (Lichroprep RP-18, Merck; élution MeOH/H2O (20/80)). On obtient 10 mg (69 %) de l'adduit du 3'-UMP. Les spectres de RM:N du proton obtenus pour les adduits du 3'-NMP (N= G. U. C, A) sont présentés sur les figures 5A à 5D. L'identification des adduits a été réalisé par des expériences de RMN à deux dimensions 'H/ 'H (CO SY). Deux diastéréoisomères pour chacun de ces adduits dans un rapport 1/1 sont présents. Un seul pic est présent pour la RMN du phosphore vers 0 ppm (300 MHz, D20) . Ces expériences démontrent que la réaction est bien spécifique, qu'un seul adduit est observé et que le marquage a bien lieu sur le phosphore. Il n'y a pas de réaction secondaire d'alkylation sur les bases. Les produits de marquage sont donc particulièrement adaptés pour une étape d'hybridation. 2824335 Exemple 7: Etude de stabilité 7.1 Stabilité des réactifs de marquage à la température Tous les dérivés du diazométhane ci-dessous sont conservé à l'état solide dans le congélateur à -20 C pendant au moins 3 mois et aucune perte de réactivité n'est observée. La stabilité à température ambiante sur la paillasse a été déterminée par RMN H o pour les deux réactifs NPDAM et méta-BioPMDAM. Nous n'avons observé aucune décomposition en laissant le NPDAM pendant un mois sur la paillasse sans précaution particulière. Nous observons environ 50% de décomposition en laissant le méla BioPMDAM sur la paillasse pendant 25 jours. La stabilité à la température du réactif de marquage est une caractéristique essentielle. En effet, la destination finale d'un tel réactif pour une application industrielle est un kit de marquage. Un réactif qui n'est pas stable au moins pendant 15 jours à -20 C, de préférence 1 mois est invendable. Même s'il existe des moyens de stockage et d'envoi jusqu'à -110 C, il existe une relation entre la stabilité à 110 C et à -20 C et c'est pourquoi la valeur de 15 jours à -20 C, de préférence 1 mois à -20 C est un minimum industriel. Au delà de -1 1 0 C, les laboratoires ne disposent pas des équipements nécessaires (congélateur) pour stocker ces réactifs du point de vue de l'utilisateur et du fabricant et il n'y a pas de moyen simple type carboglace pour les expédier du point de vue du fabricant. En ce qui concerne la stabilité à température ambiante, une stabilité de quelques heures, de préférence 1 jour, est suffisante pour permettre à 1'utilisateur d'effectuer le marquage. 46 2824335 H-C C=N2 C=N2,[C=N2 3 N2 O2N N2 Blab'NH PDAM DPDAM PMDAM NPDAM BioDPDAM iN2 H2C;N2 Bio BloNH 0 Bioll,NH 0 m-BioPMDAM p-BioPMDAM o-BioPMDAM Exemple 8: Etude de la fragmentation de l'ADN 8.1 lI:ydrolyse de différents nacléosides en milieu acide Le but de cette étude est de démontrer la différence en terme de stabilité à pH acide entre les nucléosides naturels, les nucléosides modifiés ainsi que les nucléosides de type o puriniques et pyrimidiniques. Cette étude nous permettra également de mieux contrôler la fragmentation de l'ADN en tenant compte de sa composition en bases. NH2 NH2 0 0,1 O N H 2N N N NN) N N: HO HOJ HO OH OH OH 47 2824335 Deux nucléosides modifiés, la 8-bromo-2'-désoxyadénosine (8-BrdA) et la 5bromo-2'- désoxyoxycytidine (5-BrdC) ainsi que les 4 nucléosides naturels (dA, dC, dG et dT) on été utilisés dans cette étude. 50 nmol de chaque nucléosides sont incubées dans 50 mM de formiate de sodium pH 3 à C. Les temps d'incubation varient de O à 45 min. Après séchage sous vide et reprise par 20 pI d'eau pure, les échantillons (10 nmol) sont alors analysés par HPLC en phase inverse. Les résultats sont donnés sous forme de pourcentage d'hydrolyse du nucléoside de départ (en ordonnée) par rapport au temps d'incuDation en minutes (en abscisse) voir o figure 8. Les courbes de la figure 8 montrent que la modification de 1'adénine en position 8 par un atome de brome rend ce nucléoside moins stable que le nucléoside naturel. D'autre part, les résultats montrent que dans les conditions utilisées, la dépurination est beaucoup plus importante que la dépyrimidination. Cette étude montre que la fragmentation de l'ADN par la dépurination ou la dépyrimidination peut étre contrôlée en optimisant les conditions d'hydrolyse ou en incorporant des bases modifiées moins stables que les bases naturelles ou des bases pouvant étre modifiées et hydrolysées après leur incorporation. 8.2. Fragmentation de l'ADN double brin incorporant ou non un nacléotide modiflé. Trois amplifications PCR ont été réalisées en parallèle à partir de cible ADN génomique Mycobacterium tuberculosis 16S (1OE+4 copies de départ) en utilisant le kit Fast Start de Roche, O,2 mM de chaque désoxyribonucléotide (d-ATP, d-CTP, d-GTP, d-TTP), 0,3,uM d'amorces et 0,4 1L d'enzyme. Les paramètres de la PCR sont ceux de l'exemple 5. 4x 2824335 Dans le premier cas, le protocole est utilisé tel quel: cas de la PCR dite naturelle. Dans le deuxième cas, le protocole est modifié pour obtenir une PCR à 30 % de 8Br dATP. Ceci est réalisé en introduisant 0,2 mM de d-CTP, d-GTP et d-TTP. On introduit également 0,14 mM de d-ATP et 0,06 mM de 8-BrdATP. (La 8-BrdATP est commerciale (réDérence N-2005- 1, TriLink Biotechnologies, San Diego CA). Dans le troisième cas, le protocole est modifié pour obtenir une PCR à 50 % de 8 BrdATP Ceci est réalisé en introduisant 0,2 mM de d-CTP, d-GTP et d-TTP On 0 introduit également 0,1 mM de d-ATP et 0,1 mM de 8-BrdATP L'étude de la fragmentation seule de ces amplicons a été réalisée dans les conditions décrites ci-dessus: 50 mM de formiate de sodium pH 3 à 95 C L'analyse a été effectuée sur gel dénaturant de polyacrylamide (8 % polyacrylamide, 7 M urée, 1 X TBE) utilisant la coloration au bromure d'éthidium Après 15 min d'incutation à 95 C dans 50 mM de formiate de sodium pH3, aucune différence n'est visible entre les 3 cibles. Dans tous les cas, nous avons observé une fragmentation totale des amplicons PCR La dépurination des amplicons PCR a été également réalisée à différents pH et à différentes températures et temps d' incubation. L' analyse sur gel, dans les conditions ci dessus, montre qu'à pH 3, la fragmentation est totale après seulement 10 min 2s d'incubation à 95 C. A ce pH, la fragmentation est aussi totale à 60 C après 30 min d' incubation. A pH 4, 30 min d'incubation sont nécessaires pour 1'obtention d'une fragmentation totale des amplicons ADN même à 95 C. Ce résultat est très intéressant et montre que le site abasique généré à pH acide est instable et donc conduit à la fragmentation de la chaîne ADN sans aucun autre traitement particulier. 49 2824335 Exemple 9: Marquage et framentation de l'ADN par le dérivé méta-bioPMDAM (3a! en deux étapes Le dérivé méta-bioPMDAM (3a) a été obtenu selon le schéma réactionnel décrit dans l'exemple 1. Les amplicons ADN ont été préparés par amplification PCR selon le protocole décrit dans l'exemple 5.1. Marquage A 10,ul de PCR, 38 pL d'eau pure (SIGMA), 50 pL de formiate de sodium (100 mM dans l'eau pure) sont ajoutés. Le pH est ajusté à 3 et le mélange est incubé pendant 30 minutes à 60 C. Après incubation, 2 pI de méta-bioPMDAM (100 mM da le DMSO) sont ajoutés. La solution a été mélangée par vortex, puis incubée 15 min supplémentaires à 60 C. Les essais sont réalisés en duplicata afin de pouvoir analyser la fragmentation de l'ADN sur gel et l'efficacité de marquage par hybridation et lecture de la puce à ADN. Purification La purification est réalisée sur colonnes QIAQUICK_ (Nucleotide Removal kit, Qiagen, Hilden, Allemagne). Le protocole de purification utilisé est celui recommandé par le fournisseur. Après purification, I'éluat est transféré dans un tobe propre contenant 400 1L de tampon d'hybridation (1,75 mL 20X SSPE; 2,9 mL Bétaine 5M; 290 I1L DTAB 0,1M; pL Anti-mousse 30%) sont ajoutés. bétaine référence B-2754 Sigma. DTAB réDérence D-5047 Sigma. 2824335 La solution est mélangée par vortex et incubée lOmin à 95 C afin de séparer les brins d'ADN qui ne sont pas séparés lors de l'étape de marquage pendant la fragmentation (étape de dénaturation). Le tube est ensuite plongé dans un mélange eau-glace à 0 C avant hybridation sur puce à ADN. Hybridation sur chip Après l'étape de marquage pendant la fragmentation, les fragments obtenus sont hybridés sur les puces à ADN conçues pour l'analyse de la région 213-415 de la séquence M20940 " Genbank " de l'ARN 16S de Mycobacterium {uberculosis. Cette o puce à ADN est décrite dans A. Troesch et al, J. Clin Microbiol., 37(1), p49-55, 1999. Les étapes d'hybridation ont été réalisées sur les stations fluidiques (Affymetrix, santa Clara, CA) en utilisant le protocole d'hybridation et les tampons décrits dans A. Troesch et al, J. Clin Microbiol., 37(1), p4955, 1999. Une étape supplémentaire est nécessaire pour révéler la biotine (détection indirecte). L'hybridation est révélée par le couplage de la streptavidine marquée à la phycoérythrine (PE) qui interagit avec la biotine de la méta-BioPMDAM dans les conditions suivantes: 300 '1L d'eau pure; 300 '1L de tampon Tris 100 mM pH 7 / NaCl 1M / tween 0,05% / Antimousse 0,005%; 6 I1L de BSA (50 mg/mL); 6 pL de streptavidine-PE (300 ug / mL). Streptavidine-Phycoérythrine: réDérence R0438, Dako, Danemark. Streptavidine-CY5: référence C0050 Dako Danemark. * Antimousse rétérence M5-575, Ultra Additives Inc. Tween réDérence P-7949, Sigma. Lecture de la puce à ADN: La lecture de la fluorescence émise à la surface de la puce à ADN après marquage et hybridation ainsi que la génération des données en termes d'intensité du signal et du pourcentage d'homologie sont réalisés par les systèmes de lecture et le logiciel fournis par Affymetrix (GeneChipO Instrument System et GeneChip() Information System, Santa Clara CA). Le système de lecture fournit des intensités en signal et bruit de fond exprimées en RFU (" relative fluorescence unit ") Le pourcentage d'homologie est donné par rapport à une séquence référence qui dans ce cas est la séquence de Mycobacterim t'berculosis. Les résultats en termes d'intensité moyenne du signal (I), du bruit de fond (B) et du pourcentage d'homologie (%) sont donnés dans le tableau cidessous: De manière générale, on considère qu'un pourcentage d'homologie supérieur à 90% est un résultat satisfaisant bien que l'on cherche en général un résultat supérieur à 95%. Au dessus de 95%, les valeurs ne sont plus indiquées car elles ne sont pas significatives dans le cas de la puce à ADN Mycobactéries. Une intensité élevée avec un bruit de fond faible est le deuxième résultat recherché dans les exemples qui suivent. Dans tous les résultats, le bruit de fond B est déduit de l'intensité moyenne I. Analyse sur gel de polyacrylamide Les échantillons destinés à étre analysés sur gel sont séchés sous vide, repris par 10,uL d'eau pure et 10 pL de bleu formamide 2X. La migration est effectuée sur gel d'acrylamide 8%, dans du TBE 1X, lheure à 150V. Le pH acide a été utilisé pour la fragmentation de l'ADN. En effet à ce pH, le phénomène de dépurination engendre des sites abasiques très instables conduisant à une fragmentation presque immédiate des séquences ADN à température élevée. Ce type de fragmentation produit des fragments ADN-5' phosphate. L'analyse sur gel montre que l'incubation des amplicons PCR à 60 C pendant 30min en solution dans le tampons formiate (50 mM, pH3) conduit à une fragmentation totale de ces amplicons. Ceci nous a permis d'évaluer le marquage pendant la fragmentation des amplicons ADN en présence du marqueur méta-bioPMDAM. 52 2824335 Les résultats de marquage en termes de pourcentage d'homologie, d'intensité des signaux et du bruit de fond sont donnés ci-dessous. Conlitions de marquage des amplicons PCR Homologie (%) I (rfu) B(u) I/B Tampon: formiate pH3, 50 rnM Marqueur: 2 mM méta-bioPMDAM, 4456 593 7,5 Cet exemple montre que les dérivés de l'invention peuvent être utilisés pour le marquage des fragments ADN produits par amplification enzymatique dans un protocole en deux étapes. Ils peuvent être également utilisés pour le marquage de l'ADN naturel non amplifié. 0 Exemple 10: Marquage de l'ADN par le dérivé CY5-PMDAM (13! Le marquage de l'ADN par ce nouveau marqueur portant le fonction diazométhyle a été évalué en utilisant un fragment ADN synthétique. N 1/ NH o Cy5-PMDAM (13) Le réactif de marquage Cy5-PMDAM (13) est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2. Un oligodésoxyribonucléotide (ODN) 20 mers est préparé selon la méthode dite au phosphoramidite. On introduit un phosphate à l'extrémité 5' par un réactif de phosphorylation standard compatible avec la chimie au phosphoramidite. La séquence de 53 2824335 cet ODN est constituée de toutes les bases naturelles de l'ADN (séquence de l'ODN: '-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3'). Cette séquence est complémentaire de séquences de capture d'une puce à ADN dite " modèle " synthétisée selon la technologie Affymetrix. Cette puce à ADN contient des sondes de capture identiques en s séquence et qui sont réparties en damier sur sa surface. La lecture de cette puce à ADN donne des informations quant à la performance du marquage en terme d'intensité mais pas de résultat d'homologie. Marquage: à 50 pmoles de cet ODN, 10,aL de Cy5-PMDAM (100 mM dans le 0 DMSO) sont ajoutés. Le volume final est de 100,uL. Après homogénéisation, I'incubation est réalisée à 60 C pendant 30 minutes. La purification pour éliminer l'excès de réactif de marquage est réalisée selon l'exemple 9. Résultats: La moyenne des intensités de marquage (I) lue sur la puce à ADN est de 16 644 rfu pour un bruit de fonc (B) de 450 rfu. Ce niveau d'intensité est très élevé et montre que le réactif de marquage Cy5-PMDAM (13) est tout à fait compatible avec le marquage des fragments ADN sur le groupement phosphate. Exemple 11: Marquage et framentation de l'ADN par le réactif PDAM 11.1. Marquage par le 1-Pyrényldiazométhane (PDAM) : 1 -Pyrényldiazométhane j54 2824335 Le PDAM est obtenu chez Molecular Probes (Eugene, OR) et solubilisé dans du DMSO anhydre. Deux ODN de 20 mers ont été utilisés comme modèles ADN: un ODN de 20mer 5' hydroxyle et le même ODN de 20mer portant un phosphate à l'extrémité 5'. La séquence de l'ODN est décrite dans l'exemple 10. La réaction de marquage est réalisée dans un mélange à 50 % en DMSO et 1,5 mM en 1- Pyrényldiazométhane (PDAM) à 60 C pendant 30 minutes ou une heure L'efficacité du marquage a été évaluée par chromatographie sur couche mince (en phase 0 normale) dans un éluant isopropanol/ammoniac/eau 60/10/30. Après 30 minutes, le couplage est total sur l'ODN 5'-phosphate. Il faut une heure pour obtenir un couplage partiel sur l'ODN 5'-hydroxyle c'est à dire environ 50%. Les résultats de l'exemple 6 sont confirmés sur une séquence modèle de 20 bases en ce qui concerne le marquage très préférentiel des réactifs portant une fonction diazométhyle sur le phosphate terminal. Le marquage sur un phosphate intranucléotidique n'est pas un inconvénient rédhibitoire puisque cela peut conduire à une augmentation de la sensibilité par introduction de plus d'un marqueur sur le fragment d'acide nucléique. Néanmoins la sélectivité meilleure sur le phosphate terminal, est un avantage de l' invention car cela résout le problème de l' encombrementstérique du marqueur pendant l'hybridation " Ceci peut contribuer également à l'obtention de signaux uniformes pour les différents fragments marqués". Cela permet à l'acide nucléique de s'hybrider avec une bonne sensibilité sur la cible complémentaire tout en conservant une bonne spécificité d'hybridation. L'homme du métier par des réactions d'optimisation peut ainsi contrôler la spécificité du marquage, en jouant par exemple sur le réactif de marquage, le temps de réaction et la température, pour avoir un marquage exclusif sur le phosphate terminal. 2824335 11.2 Etude cinétique de la réaction de marquage par le PDAM. Cette étude a été réalisée en utilisant l'ODN 20mer 5'-phosphate dans les conditions précédentes en faisant varier le temps de réaction. Les rendements de marquage ont été s évalués par analyse CLHP en phase inverse dans les conditions suivantes: Phase inverse colonne Spheri-5 RP- 18 5 m, 220x 4,6 mm (Perkin Elmer). Les tampons et le gradient utilisés sont: Tampon A: 0,1 M TEAA; Tampon B = 50% Tampon A + 50 % CH3CN lo Gradient de 10 à 50 % de B en 30 min à l mL/min à température ambiante. Les résultats sont représentés sur la figure 9 avec en abscisse, le temps de réaction exprimé en minutes, et en ordonnée le pourcentage de marquage. Le rendement est proche de 90% après seulement 10 min d'incubation à 60 C. 11.3. Effet de la température sur le marquage au PDAM. Le marquage a été réalisée en utilisant l'ODN 20mer 5'-phosphate dans les conditions précédentes en faisant varier la température d 'incubation et avec un temps d 'incubation de 10 min dans chaque cas. Les rendements de marquage ont été évalués par analyse CLHP en phase inverse. Les résultats sont présentés sur la figure 10 avec en ordonnce le pourcentage de marquage et en abscisse la température de réaction en C Il est très important de noter que méme à température ambiante (25 C), nous observons un marquage de l'ODN. Après lOmin d'incubation à 25 C, le rendement de marquage est environ 25%. A des températures supérieures à 50 C, des rendements supérieurs à 80% sont obtenus. 56 2824335 Ceci montre l'effcacité et la flexibilité de cette chimie de marquage de l'ADN par les réactifs portant une fonction diazométhyle. Exemple 12: marquage et fragmentation des amplicons ADN obtenus par s amplification PCR avec le réactif de marquage méta-bioPMDAM (3a) Le dérivé méta-bioPMDAM (3a) a été obtenu selon le schéma réactionnel décrit dans l'exemple 1. o Les amplicons ADN ont été préparés par amplification PCR selon le protocole décrit dans l'exemple 5.1. 12.1. Comparaison du marquage avec et sans fragmentation a. Marquage dans les conditions de fragnentation: A 10,uL de PCR sont ajoutés 50 '1L de formiate de sodium pH3 (50 mM) et 2 '1L de méta-BioPMDAM 100 mM dans du DMSO). Le volume est ajusté à 100 1L. La solution est incubée 30 min à 60 C. b. Marquage sans fragmentation: A 10,uL de PCR sont ajoutés 2 I1L de métaBioPMDAM (100 mM dans du DMSO). Le volume est ajusté à 100 pL. La solution est incubée 30 min à 60 C. Le reste du protocole est identique à celui de l'exemple 9. 57 2824335 Résultats Protocole utilisé Homologie I (rfu) B (rfu) a. Marquage dans les conditions de >95 3995 569 7,0 fragmentation b. Marquage sans fragmentation 94, 1 500 542 0,9 Les résultats dans le tableau ci-dessus montre que sans fragmentation, la moyenne des intensités obtenues est au même niveau que le bruit de fond (500 rfu). Le marquage pendant la fragmentation donne un niveau d'intensité bien supérieur (environ 4000 rfu) et un très bon pourcentage d'homologie La combinaison des deux étapes représente donc bien une amélioration significative pour la détection d'un acide nucléique. 12.2. Effet de la dénaturation avant hybridation sur puce à ADN. Deux réactions de marquage ont été réalisées en parallèle dans 2 tubes séparés selon le protocole suivant: à 10,uL de PCR sont ajoutés 50 I1L de tampon formiate de sodium pH3 (50 mM) et 2,uL de méta-bioPMDAM (lOOmM dans du DMSO). Le volume total est ajusté à 100,uL et incubé 30 min à 60 C Après purification sur colonne (exemple 9), la solution issue du premier tobe est incubée min à 95 C (afin de désapparier le double brin d'ADN), puis plongé dans un mélange eau-glace à 0 C jusqu'à l'hybridation sur la puce ADN. La solution issue du deuxième tube est hybridée sur la puce à ADN sans dénaturation préalable. Les fragments biotinylés hybridés sur les sondes de capture à la surface de la puce à ADN sont révélés par l' introduction d ' une streptavidine marquée par la phycoérythrine en utilisant les conditions décrites dans 1'exemple 9. s8 2824335 Résultats Conditions utilisées Homologie (%) I (rfu) B (rfu) I/B | Avec dénaturation >95 22812 570 40,1 Sans dénafuration 93,5 479 681 7,0 Les résultats obtenus avec la dénaturation pré-hybridation sont supérieurs à ceux obtenus sans l'étape de dénaturation. Ceci montre que la dénaturation de l'ADN est nécessaire pour obtenir un bon niveau d'intensité. La fragmentation via les sites abasiques est un moyen pour faciliter la dénaturation d'un ADN double brin et renforcer l'hybridation sur les sondes de captures. o Pour tester d'autres réactifs de marquage et compte tenu des résultats obtenus avec les différentes conditions ci-dessus, nous avons défini un protocole de rétérence utilisant la fragmentation au tampon formiate de sodium (SOmM, pH3) et un étape de dénaturation pré-hybridation. Exemple 13: Marquage et fragmentation des amplicons PCR par les réactifs biotinvlés dans un protocole en une étape Les dérivés méta-, ortho-, et para-bioPMDAM ont été préparés selon le protocole décrit dans l'exemple 1. Ils ont été solubilisés dans du DMSO anhydre à une o concentration de 100mM. Le protocole est identique à celui de l'exemple 12.2 (marquage et fragmentation en une étape puis étape de dénaturation pré-hybridation). ss 2824335 Résultats Marqueur Homologie (%) I (rfu) B (rfu) I/B orthobioPMDAM >95 25951 820 31,6 méta-bioPMDAM >95 22960 581 39,5 parabioPlvIDAM 94,1 43785 1205 36,3 Le protocole optimisé avec fragmentation et marquage en une étape donne d'excellents résultats avec différents réactifs de marquage contenant la fonction réactive diazométhyle. Exemple 14: Marquage et fragmentation de l'ADN par le BioDPDAM o Les amplicons ADN ont été préparés par amplification PCR selon le protocole décrit dans l'exemple 5 1. La synthèse du réactif de marquage est décrite dans l'exemple 1. Le protocole est identique à celui de l'exemple 12 2 y compris la dénaturation à 95 C avant 1'étape d'hybridation Résultats r Marqueur utilise | Homologie (%) | I (rfu) | B (rfu) | I/B | BioDPDAM 1 93,0 1 32359 1 3610 1 91 1 Ce résultat montre que des substitutions aussi importantes que le groupement phényle peuvent être utilisées pour optimiser la réactivité des réactifs de marquage portant une fonction diazométhane 2824335 Exemple 15: Marquage et fragmentation de l'ADN par la S (bromométhvl) fluorescéine. Les amplicons ADN ont été préparés par amplification PCR selon le protocole décrit dans l'exemple 5.1. A 10 pL de PCR sont ajoutés 50,uL de formiate de sodium pH3 (100 mM) et 2 L de -(bromométhyl) fluorescéine (Molecular probes, Eugen, OR) ( 100 mM dans du DMSO). Le volume est ajusté à 100 '1L. La solution est incubée 30 min à 60 C. 0 Les conditions de purification sont conformes à celles de l'exemple 9. Une étape de dénaturation est effectuée comme décrit dans l'exemple 12.2. Les autres conditions d'hyDridation et de lecture sont identiques à celles décrites dans l'article de A. Troesch et al. J. Clin. Microbiol., 37(1), p 49-55 1999. La fluorescéine est directement détectable sur le lecteur. Protocole utilisé | Homologie I (rfu) B (rfu) I/B lIarquage pendant la > 95 855 183 4,7 les amplicons PCR avec la 5-fbromo métyl)f luorescéine Ce résultat montre que la fragmentation de l'ADN par la création de sites abasiques est tout à fait compatible avec un réactif de marquage portant une fonction réactive halogénure d'alkyle. Ce protocole est réalisé en une étape (fragmentation et marquage). Exemple 16: Marquage et fragmentation des amplicons ADN en présence d'un autre agent chimique de fragmentation dérivé de la phénanthroline. Des amplicons ADN ont été préparés par amplification PCR selon le protocole décrit dans 1'exemple 5.1. 61 2824335 Deux types de conditions sont utilisées: Conditons a: A 10 L de PCR sont ajoutés 20 pL de phénanthroline-FeSO4 1,10 phénanthroline iron (II) sulfate complex 0,025 M (p 1929, SIGMA - ALDRICH) et 2 L de méta BioPMDAM (100 mM dans DMSO). Le volume total est ajusté à 100 pL. Le mélange est incubé 30 min à 60 C. Conditions b: A 10 pL de PCR sont ajoutés 50 L de tampon formiate de sodium pH3 (100 mM dans eau pure) et 2 pL de de méta-BioPMDAM (100 mM dans DMSO). Le volume total est lo ajusté à 100 pL. Le mélange est incubé 60 min à 95 C. Les autres conditions du protocole sont identiques à celles de l'exemple 9. Conditions Ib''' Iu ' 1 (r' B (rfu) 1/B Phénanthroline FeS04(5 mM) > 95 2236 500 4,5 méta-bioPMDAM (2 mM) min à 95 C Tampon formiate (SOmM) pH3 >95 6786 565 12,0 méta-bioPMDAM (2 mM) min à 60 C Les deux conditions de fragmentation permettent un résultat satisfaisant. Le meilleur résultat est obtenu avec les conditions (b) utilisant la fragmentation à pH acide. 62 2824335 Exemple 17: Framentation des amplicons PCR marqués par incorporation du d- UTP-fluorescéine Incorporation du nucléotide marqué Une amplification PCR a été réalisée selon le protocole suivant afin générer des amplicons PCR marqués par la fluorescéine (marquage sur les bases). A partir de cible ADN génomique Mycobacterium tuberculosis 16S (1OE+4 copies) en utilisant le kit asf Start de Roche, 0,2 mM des désoxyribonucléotides d-ATP, d-CTP et d-GTP ainsi que 0,14 mM de d-TTP et 0,06 mM de dUTP-12-fluoresceine, 0,3 M lo d'amorces et 0,4 pL d' enzyme. Le pourcentage du nucléotide marqué par rapport à son homologue naturel dUTP est de 30%. C'est ce rapport qui est généralement utilisé dans les réactions de marquage des amplicons par incorporation de nucléotides marqués. La dUTP-12-fluoresceine est disponible commercialement chez Roche Diagnostics réDérence 1373242, Mannheim, Allemagne). Les paramètres de la PCR sont ceux de l'exemple 5.1. a Fragmentation des amplicons PCP marqués à 30% du d-UTP-fluorescéine: A 10 1L de PCR sont ajoutés 50 pL de tampon formiate de sodium pH3 (50 mM). Le volume est ajusté à 100,uL. La solution est ensuite incubée 30 min à 60 C. b. Marquage pendant la fragmentation des amplicons PCR contenant 30 de dUTP- fluorescéine: A 10 '1L de PCR sont ajoutés 50 pL de tampon formiate de sodium pH3 (50 mM) et 2 pL de méta-BioPMDAM (100 mM dans du DMSO). Le volume est ajusté à 100 pL. La solution est ensuite incubée 30 min à 60 C. Cet essai correspond à un protocole de réDérence qui permet de comparer les différentes stratégies de marquage en s' affranchissant de la variabilité due à l 'étape d' amplification. Une étape de purification sur colonne et une étape de dénaturation à 95 C sont effectuées dans tous les cas comme dans 1'exemple 9. 63 2824335 Profocole (al): Les acides nucléiques obtenus par fragmentation des amplicons marqués à la d-UTP fluorescéine (conditions a) sont hybridés sur puce à ADN et détectés dans un premier temps par lecture directe des signaux fluorescents émis par la fluorescéine comme décrit dans 1'exemple 15. Protocole fa2J: Une étape d'amplification du signal a été utilisée pour améliorer la sensibilité de marquage. L ' amplification du signal a été réalisée par l ' introduction, lors de l ' étape o d'hybridation, d'un anticorps anti-fluorescéine biotinylé (Molecular Probes, ref. A982, 1 mg/m2) puis d'une streptavidine marquée par la phycoérythrine en utilisant les conditions successives suivantes: 1 étape: 300 pL d'eau pure 300 pL de tampon Tris 100 mM pH 7 / NaCI 1M / tween 0.05% / Antimousse 0.005%, 2.4 pL de BSA (50 mg/mL), 1.2,uL d'anticorps anti-fluorescéine biotinylé. (lmg / mL). 2 étape: 300 pL d'eau pure. 300 pL de tampon Tris 100 mM pH 7 / NaCI 1M / tween 0,05% / Antimousse 0, 005%; 6 pL de BSA (50 mg/mL); 6 L de streptavidine-PE. (300 g / mL). Dans ce protocole, la fluorescéine agit comme un haptène (traceur détectable indirectement par un anticorps marqué) et non pas comme un fluorophore. Prolocole fb) Les fragments biotinylés du cas (b) hybridés sur puce à ADN sont révélés par l'introduction d'une streptavidine marquée par la phycoérythrine en utilisant les conditions suivantes: 300 I1L d'eau pure 64 2824335 300 pL de tampon Tris 100 rnM pH 7 / NaCI 1M / tween O,05% / Antimousse 0, 005%; 6 I1L de BSA (50 mg/rnL), 6,uL de streptavidine marquée. (300 g / mL). La lecture de la fluorescence émise à la surface de la puce à ADN après marquage et hybridation ainsi que la génération des données en termes d'intensité du signal et du pourcentage d'homologie sont réalisés par les systèmes de lecture et le logiciel fournis par Affymetrix et il est important de noter que le système de lecture utilisé contient deux filtres permettant de détecter directement la fluorescéine dans le cas des amplicons marqués au dUTP-fluorescéine, ou bien la Phycoérythrine dans le cas des amplicons o marqués au dUTP-fluorescéine avec amplification du signal et celui o ces amplicons sans marqués pendant leur fragmentation par le méta-bioPMDAM. Dans les deux derniers cas (révélation phycoérythrine) I'utilisation d'un filtre permet de s'affranchir du signal généré par la fluorescéine et c'est bien le signal de la phycoérythrine qui est détecté. Résultats Protocole utilisé Marqueur Homologie I (rfu) B (rfu) I/B détecté (%) al. Fragmentation des amplicons PCR marqués Flu 81, 6 595 342 1,7 par la dUTP-fluorescéine a2. Fragmentation des amplicons PCR marqués PE >95 22107 3461 6,4 par la dUTP-fluoresccine Amplification du signal sur la puce à ADN par empilement b. Protocole de réjérence frénctif m-BioPMDAM PE >95 21700 1503 14,4 et tampon formiate acide) Fragmentation et marquage sur les mémes amplicons PCR modifiés par l 'dUTP-fluorescéine Flu =Fluorescéine et PE = Phycoérythrine 6s 2824335 Les résultats ci-dessus montrent que la fragmentation chimique utilisant la création de site abasique est compatible avec le marquage enzymatique des amplicons ADN et que le marquage peut avoir lieu avant la fragmentation. Les niveaux d'intensité ainsi que le pourcentage d'homologie obtenus avec ce protocole d'incorporation euzymatique du fluorophore sont faibles en comparaison de ceux obtenus avec le marquage pendant la fragmentation utilisant le réactif de marquage avec une fonction diazométhyle comme le méta-bioPMDAM (conditions (b)). Pour atteindre le niveau d'intensité obtenue avec le dérivé méta-bioPMDAM, une étape d' amplification du signal est nécessaire (conditions a2). Ceci montre bien l ' effcacité de o la fonction réactive diazométhyle par rapport à l'incorporation de traditionnelle de nucléotide modifiée comme le d-UTP fluorescéine (protocole de référence (b)). Exemple 18:framentation de l'ADN double brin par sonication Des amplicons ADN ont été obtenus en utilisant le protocole décrit dans l'exemple 5.1. Ces amplicons ont été fragmentés par sonication en présence et en absence du marqueur. a. Marquage des amplicons PCR pendant la sonication A 10 pL de réaction PCR sont ajoutés 2,uL de méta-BioPMDAM (100 mM dans DMSO). Le volume est ajusté à 100 pL par de l'eau pure. Le pH est ajusté à 6,5. Le mélange est incubé 30 min à 60 C dans un bain d'une cuve à ultrasons ( fréquence kHz, modèle T460-H, Bioblock, France). 2s b. Marquage pendant la fragmentation chimique des amplicons PCR (protocole de réjarence en une étape) A 10 pL de réaction PCR sont ajoutés 50 pL de formiate de sodium pH3 (50 mM) et 2 1L de méta-BioPMDAM (100 mM dans du DMSO). Le volume est ajusté à 100 pL. La solution est incubée 30 min à 60 C. 66 2824335 Les essais sont réalisés en duplicata afin de pouvoir analyser la fragmentation de l'ADN sur gel et l'efficacité de marquage par hybridation et lecture de la puce à ADN comme décrit précédemment (exemple 9 détection Phycoérythrine). Analyse sur gel L'analyse a été effectuée sur gel dénaturant de polyacrylamide (8 % polyacrylamide, 7 M urée, 1 X TBE) utilisant coloration au bromure d'éthidium. L'analyse sur gel montre que les amplicons ADN sont fragmentés par sonication à 60 C. o Résultats Conditions homologie I (rfu) B (rEu) l/B a Marquage pendant la 93, 2271 631 3,6 fragmenfation par sonication b. Marqzage pendant la >95 19639 i459 is,5 fragmentation chimique (conditions de réjorence) Les résultats de marquage pendant la sonication ( conditions a) sont satisfaisants. Ceci montre que la fragmentation physique par sonication des cibles ADN est compatible avec la chimie de marquage par des réactifs de marquage portant une fonction diazométhyle. Les faibles résultats de marquage dans le cas (a) sont certainement dus au fait que le marqueur se dégrade sous l'effet des ultrasons. Les résultats avec la fragmentation par o création de site abasique par action du pH acide sont meilleurs. 67 2824335 Exemple 19: Marquage fragmentation et dénaturation de l'ADN en une étape Le s amplicons ADN o nt été p réparé s par amplification P CR sel on le p roto col e décrit dans l'exemple 5.1. - Deux réaction de marquage ont été réalisées: a. Marquage, fragnenfution et dénaturation à 95 C en une seule étape. o A 10 L de PCR sont ajoutés 50 pL de tampon formiate de sodium pH4 (50 rnM) et 2 pL du marqueur méta-bioPMDAM (lOOmM dans du DMSO anhydre). Le volume final est ajusté à 100 I1L. La solution est ensuite incubée 30 min à 95 C. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été hybridé sur puce à ADN sans aucune dénaturation préalable b. Marquage eliragmentation à 60 C: A 10 pL de PCR sont ajoutés 50 pL de tampon forrniate de sodium pH3 (50 mM) et 2 pL du marqueur méta-bioPMDAM biotine (lOOmM dans du DMSO anhydre). Le volume final est ajusté à 100 pL. La solution est ensuite incubée 30 rnin à 60 C. Le mélange réactionnel a été ensuite purifié selon le protocole décrit auparavant. Dans ce protocole b et avant hybridation sur puce à ADN les fragments on été dénaturés selon le protocole décrit dans l'exemple 12.2. Résultats | Protocole utilisé Homologie (%) I (rfu) B (rfu) I/B a. Marquage, fragmentation et >95 5426 506 10,7 dénaturation à 95 C l l b. Marquage et fragmentation >95 7015 818 6,8 à 60 C puis dénaturation dans un deuxième temps à 95 C L'exemple 12 2 d6montrd lmponce de 1a dnatur10n de [ON double brig pour 1a senslbUltd de detection. Ces rdsults montrent qu'avec Lapproche augmentation par creation de she abaslque, le marquge, la Mention et 1a dnsturbon de 1'N 3 peuvent Etre rdbsÉes en une seule Tape ce qui represents une am61ioration notable du point de me de la simplicity et du tamps pour l'utHisateur et cela sans affecter la sensibiht6 de detection. REVENDICATIONS 1. Procédé de marquage et de fragmentation d'un acide désoxyribonucléique (ADN) simple ou double brin comprenant les étapes suivantes: s fragmenter l'ADN en créant au moins un site abasique sur ledit ADN, attacher un marqueur sur au moins un des fragments par l'intermédiaire d'un réactif de marquage, ledit réactif se couplant de manière covalente et majoritaire sur au moins un phosphate dudit fragment. 0 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que la fragmentation et le marquage sont effectués en deux étapes. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que la fragmentation et le marquage sont réalisés en une étape. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé par le fait que le site abasique est généré par action d'un milieu aqueux acide. 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé par le fait que le pH du milieu acide est inférieur à 5. 6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé par le fait que le milieu aqueux acide est un tampon formiate de sodium à pH d'environ 3. 2s 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé par le fait que l'ADN contient au moins une base modifiée susceptible de générer un site abasique. 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé par le fait que la base modifiée susceptible de générer un site abasique est choisi parmi les dérivés de la 8-bromo purine. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé par le fait que le site abasique est généré par un agent alkylant ou un agent oxydant. s 10. Procédé de marquage et de fragmentation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé par le fait que le réactif de marquage comprend, comme fonction réactive, un motif choisi parmi: diazométhyle; halogénure d'alkyle; nitrosourée; spirocyclopropane; aziridine; époxyde; trifuorosulfonates. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé par le fait que ledit réactif de marquage est la 5-(bromométhyl)fluorescéine. 12. Procédé selon la revendication 10 caractérisé par le fait que le réactif de marquage est choisi parmi les composés de formule (1): Rl C=N2 dans laquelle R représente H ou un groupe alkyle, alkyle substitué, aryle ou aryle substitué, Z comprend un marqueur détectable. 13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé par le fait que le réactif de marquage a la formule: N2 = CH D' 3 W 71 2824335 14. Procédé selon la revendication 12 caractérisé par le fait que le réactif de marquage est choisi parmi les composés de formule (2): R\ R2_ W#_ Z'C N2 dans laquelle s Rt représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 est un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchanement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n est égal à O ou 1, et Z est choisi parmi: y R3 43R3 ou -C-NH- ou -C- dans lequel R3 et R4 représentent indépendamment 1'un de l'autre: H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH20-, -CH2S 15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé par le fait que le réactif de marquage a la formule (3): R3 R2 (L)n-Y-X: "R N2 o dans laquelle: R représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d' au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1, R3 et R4 représentent indépendamment l'un de 1'autre: H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle, -Y-Xreprésente -CONH-, -NHCO-, -CH20-, -CH2S-. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15 caractérisé par le fait que R2 est un composé fluorescent ou un haptène. o 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 16 caractérisé par le fait que ledit réactif de marquage est soluble dans un solvant miscible à l'eau. 18 Procédé de détection d'un acide désoxyritonucléique cible (ADN) simple ou double brin comportant les étapes suivantes: Fragmenter et marquer lesdits ADN selon l'un quelconque des procédés selon les revendications 1 à 17. Hybrider les fragments marqués sur au moins une sonde nucléique suffisamment spécifique de l'acide nucléique cible. Détecter l'hybride formé par l'intermédiaire du marqueur. 19. Procédé de détection d'un acide désoxyribonucléique cible (ADN) double brin selon la revendication 18 comportant en outre une étape de dénaturation après la fragmentation et le marquage. 20. Procédé selon la revendication 19 caractérisé par le fait que la fragmentation, le marquage et la dénaturation sont réalisés en une seule étape. 21. Procédé de détection d'un acide nucléique cible comportant les étapes suivantes: Amplifier enzymatiquement l'acide nucléique cible pour générer une multitude d'amplicons ADN double brin. 73 2824335 Fragmenter et marquer lesdits amplicons ADN selon l'un quelconque des procédés selon les revendications 1 à 17. Hybrider les fragments marqués sur au moins une sonde nucléique suffisamment spécifique de l'acide nucléique cible Détecter l'hybride formé par l'intermédiaire du marqueur. 22. Procédé selon la revendication 21 comportant en outre une étape de dénaturation après l'étape de fragmentation et marquage. o 23. Procédé selon la revendication 22 caractérisé par le fait que la fragmentation, le marquage et la dénaturation sont réalisés en une seule étape. 24. Procédé de mise en évidence d'un polymorphisme réparti en des positions prédéterminées ou non d'un acide nucléique cible par la présence d'une pluralité de délétions et/ou insertions et/ou mutations dans la séquence dudit acide nucléique cible par rapport à une séquence dite de rétérence comportant les étapes suivantes: Disposer d'un ADN cible comportant l'ensemble du polymorphisme à étudier, ledit ADN étant éventuellement généré par une technique d'amplification enzymatique. Fragmenter et marquer ledit ADN par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17. Hybrider lesdits fragments sur une pluralité de sondes nuclélques dites sondes de capture, la pluralité de sondes de capture étant fixé sur un support solide et la pluralité de sondes de capture couvrant dans son ensemble au moins le polymorphisme à étudier. Détecter les hybrides formés entre les fragments marqués et au moins une partie des sondes nucléiques par 1'intermédiaire du marqueur et en déduire le polymorphisme de l'ADN cible. 25. Procédé selon la revendication 24 comportant en outre une étape de dénaturation après l'étape de fragmentation et marquage. 26. Procédé selon la revendication 25 caractérisé par le fait que la fragmentation, le marquage et la dénaturation sont réalisés en une seule étape. 27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 24 à 26 caractérisé par le fait que le support solide comporte au moins 10 sondes nucléiques de séquences différentes, avantageusement au moins 400, de préDérence au moins 1000. 28 Utilisation d'un fragment d'acide nucléique marqué selon le procédé de l'une quelconque des revendication 1 à 17 comme sonde de détection d'un acide