FR 2823998 A1 20021031 FR 0105545 A 20010425 arbra (109), MATRICE DE BIOCAPTEURS ET SON PROCEDE DE FABRICATION. La présente invention concerne une matrice de biocapteurs utilisant l'effet piézorésistif ou bien l'effet piézoélectrique pour la détection d'interaction moléculaire spécifique. Elle concerne également son procédé de fabrication. Il a déjà été proposé, par exemple dans les brevets des Etats-Unis US-5,719,324 et US-6,054,277 de mettre en oeuvre un biocapteur intégré sur une puce semi-conductrice, le blocapteur comprenant un ou plusieurs leviers encastrés à une extrémité. 0 L'évolution de la technique impose de réaliser un grand nombre de mesures et par conséquent de disposer d'un grand nombre de biocapteurs. Or, les techniques connues ne permettent de réaliser que des blocapteurs individuels, ce qui conduit à des coûts de fabrication élevés qu'il est hautement souhaitable de rébuire. A cet effet, I'invention propose une technique permettant d'intégrer sur un méme substrat semi-conducteur un grand nombre de biocapteurs. L'invention concerne ainsi une matrice de biocapteurs comprenant un substrat en matériau semiconducteur, caractérisée en ce 2 0 qu'elle présente une surface principale plane ainsi que des cavités, ménagées à partir d'une surface opposée à ladite surface plane, définissant entre le fond desUites cavités et la surface principale plane des structures déformables qui comportent au moins un élément sensible piézorésistif ou piézoélectrique. Selon un mode de réalisation préféré, au moins une structure déformable est une membrane. Alternativement, une structure déformable peut comporter au moins une poutre encastrée à une ou de préférence à deux extrémités, par exemple par mise en oeuvre d'une attaque superficielle localisée. Avantageusement, au moins une structure déformable présente une pluralité dedits éléments sensibles montés en pont. Le substrat peut être en siliclum, et préférentiellement être d'un type présentant une couche enterrée en SiO2 (substrat SOI). Selon une première variante, au moins une structure déformable intègre au moins un élément sensible piézorésistif. Selon une deuxième variante, au moins une structure déformable présente au moins un élément sensible piézoélectrique déposé sur le substrat. 0 Afin de permettre un raccordement électrique, notamment par multiplexage des éléments sensibles, la surface plane présente avantageusement des métallisations. L'invention concerne également un procédé de fabrication d'une matrice de blocapteurs du type précité, caractérisé en ce qu'il met en _uvre: a) la réalisation de dits éléments sensibles en des premiers endroits localisés de la surface principale plane du substrat, b) la réalisation de dites cavités à partir de deuxième(s) endroits localisés d'une deuxième surface du substrat qui est opposée à la surface principale, pour obtenir des structures déformables comportant au moins un dit élément sensible. Le procédé peut étre caractérisé en ce que lesdits éléments sensibles sont piézorésistifs, en ce que le substrat est en silicium et comporte une couche enterrée en silice (SiO2), surmontée d'une couche superficielle monocristaline, en ce que a comporte: a,) le dépôt d'une couche de masquage sur la couche superficielle monocristalline, a2) la réalisation d'ouvertures en des premiers endroits localisés de la couche de masquage, a3) I' implantation d' ions en vue de la réalisation desdits éléments sensibles piézorésistifs, et en ce que b comporte: b,) le dépôt d'une couche de masquage sur la deuxième surface du substrat, b2) la réalisation d'ouvertures dans les deuxièmes endroits localisés de la couche de masquage, b3) la réalisation par attaque chimique desdites cavités, I'attaque étant poursuivie jusqu'à la couche de SiO2 qui forme une couche 1 o d'arrêt. Avantageusement, I'étape a3 met en oeuvre: - a3) une implantation d'ions contenant du bore par exemple du fluorure de bore; - a32) un recuit thermique. L'étape a3, est préférentiellement précédée d'une préamorphisation de la surface du substrat auxdits premiers endroits localisés de la couche de masquage, par exemple par implantation de germanium. Avantageusement, le procédé met en oeuvre la réalisation d'électrodes de prise de contact électrique pour les éléments sensibles 2 o piéxorésistifs. Selon une autre variante, les éléments sensibles sont piézoélectriques et l'étape a comporte le dépôt sur lesdits premiers endroits localisés d'une couche piézoélectrique suivi d'un recuit de cristallisation. Le procédé met avantageusement en oeuvre la réalisation 2 5 d'électrodes de prise de contact électrique pour les éléments sensibles piézoélectriques. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention appara^'tront mieux à la lecture de la description qui va suivre donnée à titre d'exemple non limitatif, en liaison avec les dessins dans lesquels: - les figures 1a, et 1b illustrent un exemple de réalisation d'une matrice selon l'invention, la figure 1 b étant un agrandi d'un détail de la figure 1a; les figures 2a à 2e illustrent le procédé de fabrication d'une matrice présentant des éléments sensibles piézorésistifs; et - la figure 3 illustre un procédé de réalisation de l'invention dans lesquels les éléments sensibles sont piézoélectriques. L'invention concerne le domaine de la génomique, de la protéomique (puces à ADN, puces à protéines) et plus généralement les 0 blopuces. Elle concerne un dispositif permettant la détection d'interactions spécifiques, d'oligonucléotides (ADN/ADN; ADN/ARN) ou de protéines (ADN/protéines) ou d'antigènes-anticorps. Un tel système permet de s'affranchir des techniques de marquage des sondes et donc des systèmes de détection externes par fluorescence ou radioactivité. Le principe de détection proposé peut être comparé à celui des microbalances à cristal de quartz dans lesquels une variation de la masse induit une variation de la fréquence de résonance eVou de l'amortissement de .. Ia structure en résonance. Toutefois, la mise en oeuvre dans le cadre de l'invention d'éléments sensibles de faible épaisseur de type piézoélectrique ou préférentiellement piézorésistif permet d'améliorer les performances et notamment la sensibilité par rapport aux microbalances à cristal de quartz, pour lesquels nécessitent le facteur de qualité Q doit être très élevé pour que la sensibilité soit suffisante. Dans le cadre de l'invention, les variations de masse à détecter sont consécutives à l'appariement d'ADN cibles (ou d'ARN, de protéines ou tout type d'interaction entre molécules) avec les sondes d'ADN présentes sur l'élément sensible. La technique selon l'invention permet de mettre en oeuvre sur un même substrat une multitude de structures résonantes indépendantes de dimensions réduites, par exemple quelques microns, et non plus un seul dispositif comme c'est le cas dans l'art antérieur. Cette approche est possible, car les techniques d'élaboration de piézorésistances ultraminces ou de couches piézoélectriques ultraminces sont compatibles avec des technologies silicium, ce qui permet de fabriquer des microstructures résonantes de manière collective et à faible coût. D'autre part, la réduction des dimensions de ces o microstructures, permet de réduire leur masse. Ainsi, plus la masse des structures résonantes est faible, plus l'ajout d'une masse modifie la réponse de ladite structure, et on augmente ainsi la sensibilité du système. Dans le cadre de la présente invention, on utilise préTérentiellement les éléments sensibles piézorésistifs, en particulier des membranes. Ceci présente deux avantages: 1/ En mode statique, lors de la phase d'élaboration de la puce à ADN durant laquelle le matériel blologique est déposé par contact sur les microdispositifs piézorésistifs grâce à un système de dépôt automatisé, les membranes déformables perrnettent de contrôler très précisément la force d'appui ainsi que la durée durant laquelle cette force est appliquée, ce qui assure un contrôle de la quantité de solution déposée sur le microdispositif. Ce type de contrôle n'est pas possible avec des structures de type poutre encastrée à une extrémité qui sont utilisées dans certains cas pour la détection d'interactions, par exemple une poutre telle que décrite dans le brevet US-5,807,758. Le système proposé permet de plus, en statique lors de la phase de dépôt, si on utilise des systèmes de dépôt par contact, de connartre la force et le temps d'appui des aiguilles sur les dispositifs o s'effectuent les dépôts. Si on utilise un système de dépôt sans contact (système microlluidique avec éjection de gouttes), le système selon 1'invention permet de conna^'tre la quantité de liquide déposé, la masse de la goutte induisant une variation de la contrainte et donc une variation de la piézorésistance (ou un effet piézoélectrique). Il s'agit d'un point important, car il est ainsi possible d'identifier un défaut d'alignement entre les différentes aiguilles utilisées pour réaliser un dépôt collectif, une usure éventuelle des aiguilles ou bien encore les disparités concernant les temps de contact des différentes pointes, ou bien encore les disparités dans la taille des gouttes, qui existent très souvent dans le cas de systèmes à éjection de gouttes. do Cette possibilité de détection est importante car elle conditionne la qualité des dépôts (volume et donc concentration déposée, et la fiabilité des résultats). Ce système est compatible avec un contrôle actif du dépôt avec boucle de contre-réaction permettant de corriger les erreurs en fonction de la force et du temps de contact lors du dépôt. Alternativement, le procédé peut être utilisé pour calibrer les systèmes de dépôt par contact par réglage de la hauteur des pointes, vérification de l'usure et des effets de dérive mécanique du système ou bien encore les effets d'interaction parasites comme les vibrations, ou bien pour 2 o calibrer les systèmes de dépôt sans contact pour régler la fréquence d'éjection des gouttes ou bien encore la distance entre la zone d'éjection et la surface du microdispositif. Un tel dispositif de calibration peut être utilisé avant ou après une série de dépôts dans le cas d'un système avec contact, et après dépôt dans le cas d'un système sans contact. 2/ En mode dynamique, lors de la phase de détection, les membranes permettent d'assurer un découplage mécanique efficace entre les différents monodispositifs résonants. Ceci permet d'éviter de possibles interactions parasites via le substrat entre les différents modes de résonance de chaque microdispositif. Un tel phénomène est susceptible d'apparatre si les microdispositifs sont disposés à même le substrat de départ. Ce mode dynamique peut être également utilisé pour la phase de dépôt de la même manière que décrit précédemment sous le point 1/ pour contrôler la qualité des dépôts. Nous reprenons maintenant la question du procédé de fabrication. D'un point de vue technologique, il s'agit de fabriquer des membranes (ou des poutres) de dimensions les plus réduites possibles, ce qui suppose de réduire en conséquence l'épaisseur des piézorésistances. A o cet effet, I'invention met en oeuvre une préamorphisation localisée du substrat suivie d'une implantation de bore ou de fluorure de bore à très faible énergie, par exemple 15keV, associée à un recuit thermique rapide. Par exemple un recuit pendant 1 à 10 secondes entre 900 et 1100 C permettent d'obtenir les résultats recherchés. s On obtient ainsi des jonctions p+/n ultraminces qui présentent un caractère piézorésistif. Cette technique présente l'avantage de conduire à des poutres piézorésistives qui présentent une sensibilité très nettement amélioré par rapport à celles obtenues-par les techniques classiques d'implantation de bore qui conduisent à des valeurs de profondeur de jonction plus importantes. Cette amélioration vient du fait que la combinaison des deux techniques précitées (préamorphisation et implantation) associées à des techniques de recuit thermique rapide permet de parfaitement confiner la zone piézorésistive à la surface du dispositif ou la contrainte mécanique est maximale lors de la déflection, que ce soit en mode statique ou dynamique. L'intérêt de la technique de l'invention est d'obtenir des piézorésistances ayant une profondeur de jonction très faible, par exemple nm avec un substrat de départ dopé à 107 par cm3 dans lequel bore est implanté avec une énergie de 15keV. Par comparaison, une implantation de bore suivi d'un recuit classique peut donner des profondeurs de jonction de O,3 à O,41lm. Cette technique d'élaboration de piézorésistrance ultramince, combinant une préamorphisation une implantation de bore ou de BF2 à basse énergie associée à un recuit thermique rapide peut être utilisé pour la fabrication aussi bien de membranes que de leviers piézorésistifs dans le cadre de la présente invention (parfaitement adapté également à la microscopie à force atomique). On notera cependant qu'il est nettement plus intéressant dans 0 le cadre de l'application envisagée d'obtenir une membrane continue, ce qui fait que la face plane du substrat reste étanche et que celui-ci peut être utilisé comme une lame de verre classique, sans qu'il y ait besoin de procéder à des opérations de nettoyage particulières entre deux utilisations successives de la blopuce. L'invention sera décrite ci-après pour l'obtention d'une matrice de biocapteurs comprenant des membranes par exemple d'épaisseur 5 microns intégrant quatre piézorésistances montées en ponts de WHEATSTONE Sur chaque dispositif peut être disposé un plot d'or, par exemple de 200 microns de diamètre isolé de manière appropriée des prises de contact électriques, qui permet de localiser les interactions moléculaires (interaction chimique sur l'or avec une chimie de greffage spécifique pour l'or). Les résonances mécaniques à vide (mode fondamental) des microdispositifs peuvent être mesurés électriquement via les variations des piézorésistances. Un protocole d'étalonnage permet d'effectuer la mesure de la variation de fréquence de résonance consécutivement à l'appariement de brins d'ADN complémentaires, à l'interaction antigène anticorps, ADN/protéines, etc... Une matrice de biocapteurs selon l'invention est représentée à la figure 1a. Elle présente un réseau à deux dimensions de biocapteurs dont chacun est composé d'une membrane 2 et d'une pluralité d'éléments sensib les piézo résistifs ou piézoélectriq u es. Com me le montre p l us particulièrement la figure 1 b, les éléments sensibles référencés 3" 32, 33 et 34 sont disposés de manière à permettre une détection lorsqu'ils sont connectés en pont de WHEATSTONE. Chacune des membranes 2 est délimitée entre la face principale plane référencoe 4 du substrat 1 et le fond 9 de la cavité réalisée dans le substrat (voir la figure 2e). Le procédé de fabrication pour la mise en oeuvre d'éléments sensibles piézorésistifs sera maintenant décrit en liaison avec les figures 2a à 2f. 0 Le substrat de départ 1 présente une couche enterrée 5 en SiO2 surmontée d'une couche superficielle 6 dont l'épaisseur est de quelques microns (pour un substrat de type SOI), et qui peut être inférieure à un micron pour un substrat de type SIMOX. A la figure 2b, on dépose à la surface du substrat une couche d'oxyde 41 dans laquelle on ménage des ouvertures 45 qui vont permettre de réaliser les piézorésistances. On réalise tout d'abord une première implantation (optionnelle) de germanium pour préamorphiser localement la couche superficielle 6. Ensuite, on implante du bore B ou du BF2 à une densité de 104 par cm2 (par exemple). On réalise ensuite, par exemple à I'aide d'une lampe allogène, un recuit thermique rapide (RTA) d'une durée de quelques secondes à quelques dizaine de secondes entre 900 et 1100 C, ce traitement rapide étant éventuellement suivi d'un recuit classique à plus basse température, par exemple pendant 20 minutes à 800 C, I'association de ces traitements permettant d'activer électriquement les atomes de bores (ou de BF2) implantés et de réduire les défauts créés lors de l'implantation ionique. Le substrat est ensuite passivé (figure 2c) par dépôt d'une couche d'oxyde 42, par exemple un dépôt à froid de type chimique en phase vapeur sous plasma ("PECVD" ou "LPCVD"). Une métallisation d'aluminium est ensuite réalisée pour former des conducteurs électriques 43 et 432 pour prendre les contacts 44 sur les éléments sensibles piézorésistifs (figure 2d). Ensuite, comme représenté à la figure 2e, on réalise à partir de la face arrière 10 du substrat 1 des cavités 8 par gravure ionique sèche profonde après masquage par une couche de résine épaisse 11. On peut également réaliser une gravure humide de type TMAH (hydroxyde d'ammonium tétraméthyl), KOH ou EDP (éthylène diamine pyrocatechol), mais dans ce cas une couche de nitrure 11 est utilisée comme couche de masquage. Dans l'un et l'autre cas, la couche d'oxyde de silicium interfaciale 5 du substrat 1 sert de couche d'arrêt à la gravure. 0 Cette couche 5 est ensuite éventuellement gravée par gravure sèche RIE en face arrière, qui est préconisée plutôt que l'utilisation d'une solution chimique d'acide fluoridrique qui peut endommager la face avant du dispositif. Chaque cavette 8 présente alors une membrane mince 40 intégrant des piézorésistances 3, à 34 (correspondant aux zones 44). La configuration proposée s'adapte à n'importe quel système robotisé de dépôt d'échantillons permettant de déposer des gouttes dont le volume n'excède pas quelques nanolitres. A titre d'exemple, des systèmes à dépôt par contact à l'aide de microaiguilles ou à l'aide de systèmes piézoélectriques conviennent. La matrice de biocapteurs permet de concevoir un système de détection intégré reposant sur la mesure fine de variation de masse consécutive à une hybridation ou à une interaction entre molécules blologiques à l'aide d'un système piézorésistif ou piézoélectrique disposé sur une membrane (ou sur une poutre). Ce dispositif permet d'obtenir d'un point de vue qualitatif la détection d'interactions entre molécules blologiques, et d'un point de vue quantitatif une mesure de la quantité de molécules ayant interagi, ainsi qu'un suivi de la cinétique de réaction, ceci sans avoir recours à des étapes de marquage des molécules biologiques à l'aide de marqueurs radioactifs ou fluorescents. L'utilisation de micro et nanotechnologie permet la production en masse et à faible coût de la matrice de biocapteurs. Compte-tenu du principe de mesure de variation de masse, les molécules ne nécessitent pas de marquage préalable. L'utilisation de ces capteurs permet une détection rapide et quantitative ainsi qu'un suivi en temps réel de la cinétique de la réaction intermoléculaire. La réduction de taille des dispositifs résonants que permet o d'obtenir la technique mise en oeuvre, autorise l'obtention d'une fréquence de résonance élevoe, typiquement de plusieurs MHz, avec un facteur de qualité élevé conduisant à une augmentation de la sensibilité. De plus, la faible masse de la partie active des microdispositifs les rend d'autant plus sensibles à la moindre variation de masse consécutive à l'appariement d'une espèce complémentaire. Les mesures peuvent être effectuées dans le vide, et dans ce cas on a recours à des étapes de lavage et de séchage après hybridation. Elles peuvent être également réalisées en milieu liquide, et dans ce cas, I'étape de séchage n'est pas effectuée. 2 o Dans le vide, on privilégie la mesure de variation de résonance ou d'impédance, et dans le liquide la mesure de l'amortissement visqueux. Du fait que la matrice de biocapteurs comprend un grand nombre de structures résonantes, il est possible d'effectuer une analyse statistique des données si le même dépôt est effectué sur chaque structure ou de travailler simultanément avec plusieurs types de dépôt. Les principaux avantages de la matrice de biocapteurs selon l'invention sont donc: 1) un faible coût de fabrication grâce à 1'utilisation d'une 3 o technique de fabrication collective (micro et nanotechnologies), 2) la possibilité de fabriquer de manière collective des structures résonantes, en réseau, de très petites dimensions, pour augmenter la sensibilité et la densité d'intégration, 3) la possibilité de travailler sur de faibles volumes utiles, ce s qui réduit le temps nécessaire à 1'analyse ainsi que le coût de fabrication de la puce, 4) la possibilité de suivre in situ la cinétique des réactions qui rentrent en jeu, ) la possi bi lité de détecter d es réaction s d'hyb rid atio n s sans o avoir recours à des techniques de marquage de type fluorescence ou de radioactivité, 6) la possibilité d'une réutilisation des structures par simple lavage ou par chauffage à température compatible avec la déshybridation (entre 50 et 60 C), 7) une automatisation de la lecture et un rendu de résultats ultra rapide L'invention peut également être mise en oeuvre en réalisant par un procédé connu en soi des éléments sensibles piézoélectriques 54 disposés en des endroits localisés de la surface principale du substrat (voir la figure 3). Les cavités 8 sont ensuite réalisées comme indiqué précédemment, pour constituer des structures déformables 40 (membrane, ou poutre encastrée à une ou deux extrémités) REVENDICATIONS 1. Matrice de biocapteurs comprenant un substrat en matériau semiconducteur, caractérisée en ce qu'elle présente une surface principale plane (4) ainsi que des cavités (8), ménagées à partir d'une surface (10) opposoe à ladite surface plane (4), définissant entre le fond (9) desdites cavités (8) et la surface principale plane (4) des structures déformables (40, ) qui comportent au moins un élément sensible piézorésistif (44) ou piézoélectrique (54). 2. Matrice selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins une structure déformable est une membrane (40, 50). 3. Matrice selon une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'au moins une structure déformable comporte au moins une poutre. 4. Matrice selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'au moins une structure déformable présente une pluralité de dits éléments sensibles (3" 34) montés en pont. 5. Matrice selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le substrat est en silicium. 6. Matrice selon la revendication 5, caractérisée en ce que le substrat présente une couche enterrée (5) en SiO2. 7. Matrice selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'au moins une structure déformable (40) intègre au moins un élément sensible piézorésistif (3" 32, 33, 34, 44). 8. Matrice selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'au moins une structure déformable (50) présente au moins un élément sensible piézoélectrique (54) déposé sur le substrat. 9. Matrice selon une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la surface principale plane (4) présente des métallisations (43" 432) permettant un raccordement électrique desdits 3 o éléments sensibles (44, 54). lO. Procédé de fabrication d'une matrice de biocapteurs selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il met en _uvre: a) la réal isation de d its éléme nts sen sib les (44, 54) en d es premiers endroits localisés de la surface principale plane du substrat, b) la réalisation de dites cavités (8) à partir de deuxième(s) endroits localisés d'une deuxième surface (10) du substrat qui est opposée à la surface principale plane (4), pour obtenir des structures déformables (40, ) comportant au moins un dit élément sensible (44, 54). o 11. Procédé selon la revendication lO, caractérisé en ce que lesdits éléments sensibles (44) sont piézorésistifs, en ce que le substrat est en silicium et comporte une couche enterrée (5) en silice, surmontée d'une couche superficielle monocristaline (6), en ce que a comporte: a,) le dépôt d'une couche de masquage (41) sur la couche superficielle monocristalline (6), a2) la réalisation d'ouvertures (45) en des premiers endroits locaiisés de la couche de masquage (41), a3) I' implantation d' ions en vue de la réalisation desUits éléments sensibles piézorésistifs (44), et en ce que b comporte: b,) le dépôt d'une couche de masquage (11) sur la deuxième surface (10) du substrat, b2) la réalisation d'ouvertures dans les deuxièmes endroits localisés de la couche de masquage, b3) la réalisation par attaque chimique desdites cavités (8), I'attaque étant poursuivie au moins jusqu'à la couche de silice qui forme une couche d'arrêt. 12. Procédé selon la revendication ll, caractérisé en ce que a3 met en _uvre: a3,) une implantation de bore ou de BF2 a32) un recuit thermique 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que a3 est précédé d'une préamorphisation de la surface du substrat auxdits premiers endroits localisés de la couche de masquage. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite préamorphistation est réalisée par implantation de Ge. 15. Procédé selon une des revendication 11 à 14, caractérisé en ce qu'il met en _uvre la réalisation d'électrodes (43, 432) de prise de contact électrique pour les éléments sensibles piézorésistifs (44). 1 o 16. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les éléments sensibles sont piézoélectriques et en ce que a comporte: le dépôt sur lesdits premiers endroits localisés d'une couche piézoélectrique (54) suivi d'un recuit de cristallisation. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il met en _uvre la réalisation d'électrodes de prise de contact électrique pour les éléments sensibles piézoélectriques. 18. Procédé d'utilisation d'une matrice de biocapteurs selon une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il met en _uvre: a) une étape préliminaire de contrôle, à l' aide desdits éléments sensibles, de la force d'appui exercée par un dispositif de dépose d'échantillon, sur chacun des biocapteurs et/ou de la durée durant laquelle une force d'appui est appliquée par ledit dispositif de dépose d'échantillons, b) une étape dynamique de détection au cours de laquelle on mesure les variations de masse des échantillons déposés sur chacun des