FR 2824568 A1 20021115 FR 0106234 A 20010511 - 1 - L' invention concerne un procédé de préparation de concentrés d'immunagloLulines humaines à usage thérapeutique, à partir de plasma ou d'une fraction de plasma humain. Le procédé permet d'obtenir des concentrés d'immunogloLulines G tIgG), d'immunogloLulines A (IgA) et dimmunoglobulines M (IgM). L'utilisation de fractions de plasma humain enrichies en immunogloLulines pour le traitement de diverses infections ou déLiciences congénitales est connue depuis la mise au point du procédé de précipitation à l'éthanol par Cohn (CoUn et al. 1946, J. Am. Chem. Soc. 68, 459; Oncley et al. 1949, J. Am. Chem. Soc. 71, 541). Les indications thérapeutiques des immunoglabulines sétant multipliées, il existe un besoin de produit touj ours plus performant et plus pur. La complexité de la structure des immunogloLulines (quatre chalnes polypeptidiques réunies par des ponts disulfure), la variété des anticorps présents dans le mélange du plasma de plusieurs milliers de donneurs ne sont pas actuellement des facteurs favorisant le développement biotechnologique des immunoglabulines. Bien que des anticorps monoclonaux soient produits par ingénierie génétique, leur extrême spécificité constitue un inconvénient pour les applications thérapeutiques o une polyréactivité semble nécessaire. De plus, de nombreuses pathologies, en particulier dorgine autoimmune, sont actuellement traitées par des concentrés d'IgG. Cette large utilisation a engendré une situation de pénurie en Europe et aux EtatsUnis, au cours des dernières années. Par ailleurs, dans ces mémes pathologies, l'efficacité de préparations enrichies en IgM a été récemment démontrce (Hurez et al. Blood 90, 1997, 4004-4013), mais il n'existe pas de préparation à usage thérapeutique suffisamment purifiée et concentrée en IgM. C'est pourquoi la Demanderesse s'est attachée à la mise au point d'un nouveau procédé de préparation d'immunogloLulines humaines. Le procédé peut s'appliquer à un "pool" de sérums (d'au moins 10000 donneurs) ce qui as sure la présence de tous les anti corps normalement présents dans l'ensemble de la population d'une contrse choisie, ou à des sérums hyperimmuns sélectionnés pour leur contenu en immunoglobulines spécifiques. Le procédé permet en outre de préparer des concentrés d'IgA et d'IgM. De nombreuses variantes du procédé original de Cohn ont été décrites. Elles proposent, outre la précipitation sélective des protéines à l'éthanol, divers traitements additionnels comme la précipitation au polyéthylène glycol, le traitement ménagé aux enzymes protéolytiques..., destinés à éliminer les agrégats de polymères d'immunogloLulines (susceptibles d'activer le système du complément et de provoquer des réactions anaphylactiques). Une voie alternative à la précipitation par l'éthanol a été décrite par Steinbuch et al. (Rev. Franc. Et. Clin. et Biol. 1969, XIV, 1054) qui fait appel à une précipitation par l'acide octanoïque. Celui-ci précipite la plupart des protéines du plasma et laisse dans le surnageant les immunoglobulines. La purification de ces immunogloLulines est poursuivie par adsorption (en "batch") sur un échangeur d'anlons, la DEAE-cellulose, qui laisse également les immunaglobulines dans le surnageant. Celui-ci est ensuite concentré. Divers procédés ont également été mis au point pour augmenter la pureté des produits par la mise en oeuvre de séparations chromatographiques. Les plus performants (notamment EP 0 703 922, WO 99/64462) comprennent au moins deux étapes successives de chromatographie, l'une par échange d'anlons, l'autre par échange de cations. La spécificité de ces procédés est apportée par la propriété des échangeurs d'anions de ne pas retenir les immunoglobulines G. dans les conditions classiques de mise en oeuvre, mais de fixer la plupart des autres protéines co purifiées au cours des étapes de prépurification. Diverses préparations d'IgG purifiées sont donc déjà disponibles mais leurs procédés de préparation posent encore - des problèmes de rendement et de lourdeur de mise en oeuvre à l'échelle industrielle. Ces problèmes sont encore amplifiés par la nocessité dinclure dans le procédé une inactivation virale impliquant une étape additionnelle délimination des agents virucides utilisés. De plus, l' ensemble des procédés actuellement décrits ont été développés et optimisés pour la production des seules IgG. La Demanderesse a trouvé qu'il était possible de produire plusieurs concentrés d'immunogloLulines en combinant une étape de prépurification et une étape unique de chromatographie par échange dions et ainsi de mettre en oeuvre un procédé très simple, à haut rendement et compatible avec un traitement virucide au solvant/détergent. Ainsi le procédé selon la présente invention est applicable à du plasma sanguin ou à une fraction de plasma sanguin déjà enrichie en immunoglobulines et il comprend une prépurification par précipitation de contaminants lipidiques et protéiques et une chromatographie unique sur échangeur danions, effectuée à pH alcalin ce qui permet l 'adsorption des immunogloLulines sur le support chromatographique échangeur d' anions. La prépurification est effectuce au moyen d' agents précipitants connus tels que l'acide octanoïque, le phosphate tricalcique, la bentonite. Après cette étape de prépurification et avant la chromatographie, le procédé comprend un traitement d' inactivation virale, de préférence par solvant-détergent, selon une méthode connue. A la fin de ce traitement, le mélange du filtrat prépurifié et du solvantdétergent est soumis à une séparation chromatographique qui est effectuée sur un gel de polysaccharide réticulé ou de polymère vinylique, greffé de - 4 - ::, groupements DEAE, TMAE ou QAE. Cette étape de chromatograph e comprend - 1'atustement à un pH de 8, 9 à 9,1 de la solution ayant subi le traitement au solvan-t-détergent; - sa charge sur la colonne de chromatographie préalablement équilibrse en tampon à pH 8, 9 à 9,1 ce qui permet 1' adsorption des immunogloLulines et le passage des protéines non adsorbées dans 1' effluent; - un lavage par le méme tampon jusqu à élimination de toutes les protéines non adsorbées et du mélange solvant détergent; - et l ' élution des immunogloLulines par un tampon approprié. Cette élution peut être réalisée soit par du tampon phosphate à pH compris entre 4 et 7, et de prétérence à pH 1S 6, 2 pour éluer les immunogloLulines G. soit de manière séquentielle: - dans un premier temps comme ci-dessus pour éluer les immunoglobulines G; - - dans un deuxième temps, par le même tampon phosphate additionné de NaCl 100 à 175 mM, et de préférence 150, à un pH de 6, 1 à 6, 3, pour éluer une fraction contenant 1 es IgA et des IgG4. Le procèdé peut être encore poursuivi par une nouvelle élution par le même tampon ajusté à un pH de 6 à 7 et additionné de NaC1 250 à 350 mM, de préférence de 300 IrM pour éluer les IgM. Les irrmunoglobulines ainsi éluées sont récoltées, concentrées par ultrafiltration et soumises à une filtration stérilisante conventicnnelle puis à une filtration au travers de filtres nanamétriques de porosité décroissante de 100 à 15 nanam.étres, en 3 0 particulier sur trois filtres disposés en série et de seuils de rétention décroissants, de 100, 50 et 20 nanam.étres. Cette nanofiltration permet d' éliminer des virus résistants au traitement par solvant-détergent. La solution d' ilTmunoglobullnes concentréeet filtrée est additionnée d'un stabilisant phaceutiquementacceptable, puis - elle est conditionnée à l'étatde solution i, - 5 - stérile et éventuellement congelée et lyophilisce. Les exemples suivants illustrent l 'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple I On utilise comme matériau de départ 1 Kg de précipité "I+II+III" obtenu à partir de plasma traité à 1 r éthanol selon la méthode de Cohn (déjà cité) ou de Kistler et Nitschmann (1962, Vox Sang. 7, 414). Ce précipité est remis en suspension en tampon acétate (acétate de sodiumacide acétique) à pH 4,7-4,9, sous agitation, à 20 C. On y ajoute de 1'acide octanoïque jusqu'à une concentration finale de 20 g/1. L' addition doit être effectuée lentement, à température aTrbiante. Le mélange est additionné d'un adjuvant de filtration et le précipité est séparé par filtration au moyen d'un filtre-presse. Le filtrat est récupéré, clarifié et concentré par ultrafiltration, puis il est soumis à une filtration stérilisante à 0,45,um et 0,2,um. I1 est ensuite soumis à un traitement d'inactivation virale par solvant/détergent comme décrit par Neurath et Horowitz (brevet US 4,764,369). On utilise un mélange Triton X 100 (octoxinol 10)/TnBP. Le mélange est ajusté à 64 g/1 de protéines, à pH 6,5. Le contact est maintenu pendant 4 à 6 heures, entre 4 et C. Ensuite le pH est ajusté à 9 (par NaOH). Le mélange est ensuite soumis à une chromatographie diéchange d' anions sur colonne. On utilise comme matériau échangeur d'anLons du TMAE Fractogelô9, chargé dans une colonne de chromatographie, équilibré en tampon glycine-NaC1 (glycine 0,676 g/1 - NaC1 0,526 g/1) à pH 9. Le mélange est chargé sur la colonne à raison de 50 g de protéines pour 1 litre de gel. - 6 Après la charge, la colonne est lavoe en tampon glycine - NaCl, pH 9 (le même que pour l'équilibrage). Le lavage est surveillé par la densité optique de l' effluent à 280 nm. Après retour à la ligne de base, la colonne est éluée avec du tampon phosphate à pH 6,2 (hydrogénophosphate disodique - dihydrogénophosphate de sodium). L'éluat, contenant les immunogloLulines G. est ajusté à pH 4,5 et soumis à une ultrafiltration sur cassettes. La solution est ensuite soumise à une filtration stérilisante à 0,22 m, puis à une filtration nanométrique sur trois filtres disposés en série et de seuils de rétention décroissants, de 100, 50 et 20 nanomètres. La filtration est suivie d'une ultrafiltration sur cassette pour concentrer la solution finale à 120-150 g/1. Les résultats d'analyse de trois lots pilotes sont présentés dans le tableau suivant. Tableau I.: LOTS PILOTES 00 ILP 043 PV 00 ILP 044 PV 00 ILP 045 PV Polymères (%) 0.19 0.19 O. 07 Dimères (%) 3.29 2.27 2.15 Monomères (%) 96. 52 97. S4 97.78 IgG (gl) 52.5- 50.4 50.8 IgG1 (g/1) 31.6 29.9 29.2 IgG2 (g/1) 17.1 15.3 13.1 IgG3 (g/1) 1.19 1.07 0.96 IgG4 (g/1) 0.52 0. 61 0.56 IgM (g/1) 310 459 1795 Anti-Hbs (UI/ml) 10.2 10.3 9.4 Exemple II On uilise comme matériau de départ 1670 g de "précipité II'' obtenu à partir de 80 litres de plasma traité - 7 - à l'éthanol selon la méthode de Cohn. Cette variante du procédé permet notamment de tirer parti de précipités II congelés et stockés en attente de traitement. Ce précipité est remis en suspension dans 9 kg d'eau NaCl. Le pH est ajusté à 6,2 par de l'acide acétique. On y ajoute, comme adsorbant (des contaminants de type lipidiques, kallikréine...), 15 g de phosphate tricalcique. Après une heure de contact, le mélange est additionné d'un adjuvant de filtration et le précipité est séparé par filtration au moyen d'un filtre-presse. Le filtrat est récupéré, est additionné de glycine (15 g/l) et ajusté à pH 4,8 par de l'acide acétique. On y ajoute, comme adsorLant (notamment des traces de facteurs de coagulation activés) 80 g de bentonite, sous agitation pendant 30 minutes. Le mélange est additionné d'un adjuvant de filtration et le précipité est séparé par filtration au moyen d'un filtre-presse. Le filtrat est réaupéré, concentré par ultrafiltration. Le procédé est poursuivi (par traitement au solvant/détergent et chromatographie) comme dans l'exemple Les résultats d'analyse de trois lots pilotes sont présentés dans le tableau suivant. - 8 - Tableau II: LOTS PILOTES. 286 287 321 Polymères (%) 0,5 0,5 Exemple III Le procédé est mis en oeuvre de la même manière que dans l'exemple I mais le matériau de départ est du plasma (non précipité à l'éthanol). Cette variante n'est pas avantageuse au point de vue du rendement mais elle présente un intérêt (par son nombre réduit détapes) pour le traitement de plasmas particulièrement riches en anticorps rares. Exemle IV Le procédé est mis en oeuvre de la même manière que dans l'exemple I mais la chromatographie est éluée de manière séquentielle: après la charge et le lavage de la colonne, celle-ci est éluée avec un premier tampon phosphate à pH 6,2 pour éluer les IgG comme dant lexemple I; ensuite elle est éluée avec le même tampon additionné de NaC1 150 mM, qui élue une fraction enrichie en IgA et en IgG4 i Les IgG4 semblent jouer un rôle dans la protection contre les infections parasitaires et contre les allergies aux pollens et aux acariens. De manière surprenante leurs propriétés biochimiques et leur comportement en échange d' ions les apparentent aux IgA. Exemle V Le procédé est mis en oeuvre de la même manière que dans l'exemple IV mais après la deuxième élution qui produit la fraction enrichie en IgA, le même tampon est additionné de NaC1 300 mM ce qui décroche les IgM. On obtient ainsi une fraction concentrée (à 80 %) d'IgM. Celles-ci sont concentrées et additionnces de stabilisants pharmaceutiquement accepables. Les résultats de production d'un lot d'IgM concentrées sont présentés dans le tableau suivant. Tableau III (Lot IgM 2000-97) Fraction Volume Ig IgM IgG IgAIgM (ml) Totales (mg) (%) (%)(%) (mg) prépurifiéeS 2190 39957 2037 92.6 2,2 5.1 Fraction non retenue sur 3800 566,8 REVEND I CAT I ON S 1.- Procédé de préparation de concentrés dimmunogloLulines humaines à usage thérapeutique à partir de plasma sanguin ou dune fraction de plasma enrichie en immunogloLulines, caractérisé en ce qu'il comprend une prépurification par précipitation de contaminants lipidiques et protéiques et une chromatographie unique sur échangeur d'anions, effectuée à pH alcalin ce qui permet l' adsorption des immunagloLulines sur le support chromatographique échangeur d' anions. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la prépurification est effectuée au moyen dr agents précipitants connus, tels que l'acide octanoïque, le phosphate tricalcique, la bentonite. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il comporte, après la prépurification et avant la chromatographie, un traitement d' inactivation virale, de préférence par solvant-détergent. 4.- Procédé selon l'une quelcouque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la chromatographie est effectuée sur un gel de polysaccharide réticulé ou de polymère vinylique, greffé de groupements DEAE ou TMAE ou QAE. 5.- Procédé selon lune quelcouque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la chromatographie comprend - l'utilisation de la solution ayant subi le traitement au solvant-détergent; - son ajustement à un pH de 8,9 à 9,1; - sa charge sur la colonne de chromatographie préalablement équilibrce en tampon à pH 8,9 à 9,1 ce qui permet l' adsorption des immunogloLulines et le passage des protéines non adsorbées dans l'effluent; - un lavage par le même tampon jusqu'à élimination de toutes les protéines non adsorbées et du mélange solvant- détergent; - et l'élution des immunagloLulines par un tampon approprié. 6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce - 11 que l'élution est réalisée en une étape, par du tampon phosphate à pH compris entre 4 et 7, et de préférence à pH 6,2, pour éluer les immunogloLulines G. 7.Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'élution est réalisée de manière séquentielle, - dans un premier temps, par du tampon phosphate à pH compris entre 4 et 7, et de préférence à pH 6,2, pour éluer les immmunogloLulines G; - dans un deuxième temps, par le même tampon phosphate additionné de NaCl 100 à 175 mM, et de préférence 150 mM, à un pH de 6 à 6,3, pour éluer une fraction contenant les IgA et des IgG4. 8.- Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, une élution par le même tampon ajusté à un pH de 6 à 7 et additionné de NaCl 250 à 350 mM, de préférence 300 mM pour éluer les IgM. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que, après l'élution des immunoglobulines, cellesci sont récoltées, concentrées par ultrafiltration et soumises à une filtration stérilisante conventionnelle puis à une filtration au travers de filtres nanométriques de porosité décroissante de 100 à nanomètres. 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la solution d'immunoglobulines concentrée et filtrée est additionnée d'un stabilisant pharmaceutiquement acceptable puis elle est conditionnée à l'état de solution stérile et éventuellement congelée et