FR 2824076 A1 20021031 FR 0105737 A 20010427 d'huiles. METHODE DE DETECTION DE COMPOSES ACTIVATEURS OU INHIBITEURS DES RECEPTEURS DE LA FAMILLE DU RECEPTEUR DE L'INSULINE AU MOYEN D'UN RECEPTEUR CHIMERE ISOLE. La présente invention a pour objet une méthode de détect ion de composés act ivateurs ou inhibiteurs de récepteurs hétérotétramériques constitués de deux hétérodimères p, dont la sous-unité comporte un domaine tyrosine kinase, tels que les récepteurs appartenant à la famille de récepteurs de l'insuline. Ladite méthode met en _uvre une molécule chimère du récepteur dont l'une des sous-unités comporte un élément bioluminescent et l'autre sous-unité comporte un élément fluorescent. Les interactions des composés activateurs ou inhibiteurs avec ledit récepteur chimère induisent des changements conformationnels qui permettent un transfert d'énergie détectable, entre la sous-unité comportant l'élément bloluminescent et la sous-unité comportant l'élément fluorescent et qui reflètent fidèlement l'état d'activation du récepteur. Dans le cas du récepteur de l'insuline l'hétérotétramère est composé de deux sous-unités alpha extracellulaires qui lient l'insuline et de deux sous unités béta qui possèdent une activité tyrosine kinase. La liaison de l'insuline à son récepteur entraîne l'autophosphorylation du récepteur sur des réaidus tyrosines. Cette activité tyrosine kinase est ainsi indispensable à la transmission des effets biologiques de l'insuline. Dans les situations de résistance à l'insuline, cette activité tyrosine kinase est diminuée. Les mécanismes cellulaires responsables de cette diminution d'activité tyrosine kinase restent mal compris. A l'état basal, le site actif du récepteur est occupé par une tyrosine indibitrice, la tyrosine 1162. La liaison de l'insuline entraîne un changement de conformation du récepteur, qui doit permettre de faire sortir du site actif cette tyrosine inhibitrice. Il y a alors liaison de l'ATP et transphosphorylation d'une sous-unité béta par l'autre sous-unité béta, ce qui stabilise l'activité tyrosine kinase du récepteur, qui peut alors phosphoryler d'autres protéines intracellulaires et transmettre ainsi les effets de l' hormone. La liaison de l'insuline à son récepteur induit l'auto-phosphorylation du récepteur sur des résidus tyrosine et de ce fait stimule son activité tyrosine kinase envers les substrats intracellulaires, tels qu'IRS1 et Shc, qui jouent un rôle essentiel dans la transmission du signal. (White MF, Kahn CR (1994) The insulin signaling system. J. Biol. Chem. 269: 1-4); White MF (1997) The insulin signalling system and the IRS proteins. Diabetologia: S2-17. Virkamaki A, Ueki K, Kahn CR (1999) Protein-protein interaction in insulin signaling and the molecular mechanisms of insulin resistance. J Clin Invest 103: 931-943.). Des altérations dans la phosphorylation de la tyrosine du récepteur de l'insuline ont été décrites dans les situations de résistance à l'insuline, telles que le diabète et l'obésité (Combettes-Souverain M, Issad T (1998) Molecular basis of insulin action. Diabetes Metab 24: 477-489.) Il est connu que la phosphorylation des tyrosines 1158, 1162 et 1163 localisées dans le domaine kinase du récepteur de l'insuline jouent un rôle critique dans la réqulation de l'activité kinase du récepteur (Ellis L, Clauser E, Morgan DO, Edery M, Roth RA, Rutter WJ (1986) Replacement of insulin receptor tyrosine residues 1162 and 1163 compromises insulinstimulated kinase activity and uptake of 2-deoxyglucose. Cell 45: 3s 721732.; White MF, Shoelson SE, KeuLmann H. Kahn CR (1988) A cascade of tyrosine autophosphorylation in the beta-subunit activates the phosphotransferase of the insulin receptor. J Biol Chem 263: 2969-2980). La détermination de la structure cristalline du domaine tyrosine kinase du récepteur de l'insuline humain a fourni une meilleure compréhension du mécanisme moléculaire impliqué dans la stimulation de l'activité kinase dudit récepteur. Au stade non-phosphorylé, la Tyr 1162 est localisée dans le site actif de l'euzyme et joue un rôle auto-inhibiteur en concurrençant la liaison avec les protéines substrats. (Hubbard SR, Wei L, Ellis L, Hendrickson WA (1994) Crystal structure of the tyrosine kinase domain of the human insulin receptor. Nature 372: 746-754). A l'état basal cette tyrosine demeure sous forme non-phosphorylée, du fait que d'autres résidus de la boucle d' activation empêchent également la liaison à l'ATP. La cristallisation de la forme tri-phosphorylée du domaine kinase a montré que l'auto-phosphorylation de ces trois tyrosines conduit à un changement de conformation important de la boucle d'activation. (Hubbard SR (1997) Crystal structure of the activated insulin receptor tyrosine kinase in complex with peptide substrate and ATP analog. Embo J 16: 5572-5581). Ce changement de conformation permet l'accès, sans restriction, de l'ATP 2s et des substrats protéiques au site actif. Il a été considéré que les changements conformationnels induits par la liaison du ligand rapprochent étroitement les deux sous- unités béta du domaine kinase du récepteur et permettent par conséquent la trans-phosphorylation de la tyrosine 1162 et des tyrosines adjacentes dans la boucle d' activation. La découverte d'agents pharmacologiques qui stimulent spécifiquement l'activité tyrosine-kinase du 3s récepteur de l'insuline peut être d'une grande importance dans le traitement de patients résistants à l'insuline. Actuellement, les industries pharmaceutiques développent un nombre très important de molécules qui pourraient avoir des effets bénéfiques sur l'activité fonctionnelle des récepteurs ayant une strucuture hétérotetramérique transmembranaire et présentant une activité tyrosine kinase comme ceux de l'insuline. Les industries pharmacéutiques développent également des inhibiteurs de l'activité du récepteur de l'IGF-1 qui joue un rôle important dans des nombreux cancers (Grimberg A. et al. J.Cell.Physiol. 2000 vol. 183 pages 1-9; Khandwaia HM et al. Endocr.Rev. 2000 vol 21, pages 215-244; Brodt, P. et al. Biochem.Pharmacol. 2000 vol 15, pages 1101-1107). Il est également intéressant d'étudier l'activité de récepteurs tel que l'IRR (insulin receptor relates receptor) dont la structure moléculaire est très proche de celle du récepteur de l'insuline et présente un domaine tyrosine kinase. (BerChold H.J, et al. Horm. Metab.Research 1999 Feb-Mar; vol. 31 pages 477-79). A ce jour, on ne connaît pas de ligands de ce récepteur considéré de ce fait comme un récepteur orphelin (OR). Cependant on sait que le récepteur IRR est impliqué dans la réqulation de la masse cellulaire de cellules béta pancréatiques (Hirayama, I. et al. Diabetes 1999 Jun; vol. 48 (6) pages 1237-12444) et qu'il est également impliqué dans le développement de certaines tumeurs, tels que les neuroblastomes (Emlimger M.W. et al. Requl Pept. 1999 Octobre 22, Vol.84 (1-3) pages 37 42. Des méthodes permettant étudier l'activité de ce récepteur orphelin IRR et d'analyser ses ligands éventuels doivent permettre d'élucider ses mécanismes d' activation. Egalement, d'un point de vue pharmacologique il est important de pouvoir détecter des composés susceptibles de modifier l'activité dudit récepteur IRR et de les utiliser pour la préparation de médicaments utiles pour le traitement de pathologies pancréatiques ou tumorales. D'autre part, des méthodes permettant d'étudier l'activité du récepteur IGF-l (insulin-like growth factor-I receptor) qui possède également une structure moléculaire proche de celle du récepteur de l'insuline et comporte un domaine tyrosine kinase, peuvent être mis en _uvre pour la détection de molécules ayant une activité de facteur de croissance utiles pour les cultures cellulaires, ou pour la préparation de médicaments pour le traitement de tissus lésés. Cependant, les méthodes utilisées pour analyser l'effet de ces molécules sur le récepteur de l'insuline ou sur les différents membres de cette famille de récepteurs, impliquent un traitement assez laborieux des échantillons sur lesquels ces tests sont réalisés, tels que la nécessité de mesurer le niveau de phosphorylation des récepteurs par des techniques immunologiques à l' aide d'anticorps capables de reconnaître la forme active du récepteur, (anticorps anti-phosphoUyrosine). Ces techniques impliquent que les récepteurs soient immobilisés sur un support solide. Après traitement avec les différentes molécules testées, les récepteurs doivent être incubés avec différents anticorps primaires, subir un certain nombre de cycles de lavages, puis éventuellement être à nouveau incubés avec des anticorps secondaires capables de révéler la quantité d'anticorps primaire fixé sur le récepteur. Un nouveau cycle de lavages doit alors être réalisé. L'activité du récepteur peut également être déterminée en mesurant sa capacité à phosphoryler un substrat artificiel. Dans tous les cas, le procédé utilisé implique plusieurs étapes et nocessite donc une procédure longue et complexe. Afin de résoudre ces problèmes, les s inventeurs ont développé une nouvelle méthode de détection des changements conformationnels du récepteur de l'insuline, qui, contrairement aux méthodes précédemment utilisées et mentionnées ci-dessus, permet de détecter directement l'effet des composés à analyser sur l' activation des récepteurs hétérotétramériques de la famille de l'insuline. Ainsi l' invention met en _uvre des molécules hybrides, conservant ou non l'activité du domaine tyrosine kinase du récepteur, constituées d'une protéine chimère dont l'un des deux hétérodimères alpha-béta qui constituent le récepteur est associé à un élément bioluminescent ou fluorescent et l'autre hétérodimère alpha-béta est associé à un élément fluorescent, ci-après désignées [ap.BIOL]-[ap.FLUO] ou [ap.FLUO]-[ap.FLUO, puis a étudier le changement conformationnel induit sur lesdites molécules hybrides par des composés activateurs ou inLibiteurs de l'activité tyrosine kinase du récepteur en utilisant soit une technique de transfert résonant 2s d'énergie bioluminescente (Bioluminescence resonance energy transfer (BRET), soit une technique de transfert résonant d'énergie fluorescente (FRET) La technique de transfert résonant d'énergie de bioluminescence (Bioluminescence resonance energy transfer (BRET)) a récemment été décrite comme une méthodologie qui permet l'étude des interactions protéine-protéine (Xu Y. Piston DW, Johnson CH (1999) A bioluminescence resonance energy transfer (BRET) system: 3s application to interacting circadian clock proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 151156.; Angers S. Salahpour A, Joly E, et al. (2000) Detection of beta 2adrenergic receptor dimerization in living cells using bioluminescence resonance energy transfer (BRET). Proc Natl Acad Sci U S A 97: 3684-3689.) et qui a fait l'objet d'une demande de brevet internationale PCT N WO 99/66324. La bioluminescence BRET est un phénomène s naturel qui résulte du transfert d'énergie entre une protéine donneur luminescente et une protéine réceptrice fluorescente. La dépendance stricte dudit phénomène de la proximité moléculaire entre les donneurs et les accepteurs d'énergie en font un système de choix pour l'étude des changements dans l' interaction entre deux protéines. Le FRET (transfert résonant d'énergie de fluorescence) correspond à un transfert non-radiatif d'énergie entre deux fluorophores. I1 dépend des spectres d' émission et d'excitation du donneur et de l' accepteur: pour qu'un transfert d'énergie ait lieu, il faut que le spectre d'émission du donneur recouvre suffisamment le spectre d'excitation de l'accepteur. I1 faut en outre que la distance entre le donneur et l'accepteur soit inférieure à 100 . Le fluorophore donneur est excité avec de la lumière à une longueur d'onde située dans le spectre d' excitation du donneur. Si les deux fluorophores sont suffisamment proches et correctement orientés, le transfert d'énergie du donneur vers l'accepteur entraîne l'émission de fluorescence par l'accepteur, que l'on pourra détecter à une autre longueur. Les fluorophores peuvent être des moléaules chimiques greffées directement ou indirectement sur les protéines purifiées que l'on étudie, ou alors des mutants de la GFP, telles que la CFP (cyan fluorescent protein, (Clontech) ) et la YFP (yellow fluorescent protein), ou d'autres mutants qui sont également sur le marché tel que la dSRed (Clontech). 3s La méthode de détection de composés activateurs et/ou inhibiteurs de l'activité tyrosine kinase du récepteur mise en _uvre dans le cadre de la présente invention est donc basée sur l'étude des interactions entre deux protéines partenaires, en l' occurrence les deux hétérodimères [a0BIOL] et [aFLUO] du récepteur de l'insuline participant au domaine tyrosine kinase de celui-ci. s Définitions Dans le cadre de la présente invention on entend par: récepteur: une molécule hétérotétramérique comportant deux hétérodimères aP liés par des ponts disulfure et ayant une activité tyrosine kinase portée par les sous-unités 0, ainsi que les variantes desdites molécules comme par exemple celles comportant des épissages alternatifs. - récepteur chimère: une molécule d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline, y compris tous ses variantes naturelles, telles que celles comportant des épissages alternatifs, des mutations ou des polymorphismes ainsi que ses variantes artificielles comportant des mutations, des délétions, troncations, etc., dont la structure hétérotetramérique comporte deux hétérodimères ap dont au moins un hétérodimère ap est associé à un premier élément de réponse et un second 2s hétérodimère ap est associé à un second élément de réponse différent du premier. On entend également par récepteur chimère un récepteur tel que celui décrit ci-dessus dépourvu de son domaine transmembranaire. - élément de réponse: Toute molécule susceptible d'effectuer un transfert d'énergie lorsqu'elle est activée. Les éléments de réponse peuvent être des éléments fluorescents ou luminescents et peuvent être insérés aux extrémités mais également à différents endroits à l'intérieur de la séquence codante de ces récepteurs, par exemple, dans le domaine juxUa membranaire, en amont du domaine kinase, en aval du domine kinase, à la place du domaine kinase, etc. - récepteur isolé: un récepteur isolé de la cellule dans laquelle il est exprimé. Cet isolement est effectué par tout moyen connu de l'homme du métier, soit par rupLure de la cellule, le récepteur restant alors fixé sur sa membrane cellulaire, soit par extraction en milieu détergent, le récepteur est alors extrait de la membrane cellulaire, soit par purification partielle après extraction, comme par exemple par chromatographie d'affinité sur une colonne de Lectine de germe de blé couplée à de la Sépharose, soit par purification par chromatographie d'affinité au moyen d'un anticorps spécifique du récepteur ou au moyen de l'insuline immobilisée. - variante d'un récepteur: ses variants naturels comportant des epissage alternatifs, des mutations naturelles ou des polymorphismes ainsi que ses variants artificiels obtenues par des mutations, délétions, troncations, etc. - récepteur témoin: un récepteur chimère comme défini ci-dessus, dont les deux hétérodimères ap sont associés au premier élément de réponse. - élément bioluminescent BIOL: toute protéine ou fragment de celle-ci capable d'émettre une énergie bioluminescente en présence d'un substrat adéquat. - élément fluorescent FLUO: Toute molécule, telle que des biomoléaules comme des protéines ou des fragments de celles-ci, ou encore des composés chimiques, susceptibles d'émettre une énergie fluorescente lorsqu'elle est soumise à une excitation à une longueur d'onde adéquate. Il a été constaté, qu'après avoir mis en contact ces récepteurs chimères avec leur ligand, l'insuline, et après y avoir ajouté un substrat spécifique qui active l'élément bioluminescent, un transfert d'énergie se produit alors entre l'élément bioluminescent activé et l'élément fluorescent lequel émet à son tour un signal détectable, prouvant qu'un rapprochement des deux molécules a été effectivement induit par le changement conformationnel subséquent à l' activation du récepteur. Les mesures du signal fluorescent émis permettent ainsi de suivre in vitro les changements conformationnels des récepteurs chimères [ap.BIOL] [ap. FLUO] ou [ap. FLUO]-[ap. FLUO] Il apparaît que la méthode selon l' invention permet de mesurer très rapidement l'effet d'une molécule sur l'état d' activation du récepteur. De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que l'utilisation de récepteurs chimères isolés conduit à une meilleure détection de composés susceptibles de modifier l'activité tyrosine kinase desdits récepteurs, par rapport à l'utilisation de cellules vivantes exprimant les récepteurs chimères sur leurs membranes. Cet isolement peut être effectué, par exemple, par simple extraction des récepteurs à partir des cellules, au moyen d'un détergent. Des récepteurs semi-purifiés peuvent être obtenus par chromatographie d'affinité des récepteurs extraits, sur une colonne de lectine de germe de blé couplée à de la Sépharose (Sepharose-LGB) ou par tout moyen de purification de récepteurs connu de l'homme du métier. La préparation de récepteurs chimères [ap.BIOL]-[ap.FLUO] ou [ap.FLUO][ap.FLUO] isolés, purifiés ou semi-purifiés selon l'invention autorise leur conservation à long terme, par exemple par congélation ou s par lyophilisation et permet de constituer des stocks importants desdits récepteurs chimères. Les récepteurs chimères isolés, purifiés ou semi-purifiés obtenus dans le cadre de la présente invention, présentent aussi l'avantage de pouvoir être solubilisés, ils peuvent donc être utilisés pour revêtir tout support solide tel que des microsphères, des particules de polymères organiques ou des particules métalliques, des membranes naturelles ou artificielles et utilisés ainsi dans la méthode de détection de l' invention et en particulier, ils peuvent être aisément distribués dans des plaques de 96 à 384 puits et de ce fait sont particulièrement adaptés pour la réalisation de criblages à haut débit de molécules d'intérêt. Les récepteurs chimères isolés, purifiés ou semi-purifiés sont mis en présence des différentes molécules à tester. La détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimère p résultant de l' interaction éventuelle de ladite molécule à tester avec le récepteur ou partie de récepteur est effectuée par mesure de la réponse du second élément de réponse à un signal émis par le premier élément de réponse lorsqu'il est activé. Après un temps de préincubation nécessaire pour que l' interaction entre la moléaule d'intérêt et le récepteur se fasse, l' état d' activation du récepteur est mesuré en quelques minutes dans un luminomètre 3s /fluorimètre. Ce test se prête donc parfaitement à une automatisation et permet de cribler, avec un très haut débit, des moléaules, mélanges de molécules ou extraits biologiques, pour rechercher des agents stimulateurs ou inhibiteurs de l'activité du récepteur ayant une activité tyrosine kinase su récepteur, ainsi que des molécules activatrices ou inhibitrices issues de l' expression d'une banque d'ADNc. La méthode de détection selon l' invention présente en outre l'avantage que le rapport des énergies émises mesurées à deux longueurs d'onde différents et servant à détecter un composé actif est indépendant de la quantité de récepteur isolé mis en jeu lors de la réalisation de la méthode. En effet, les inventeurs ont pu vérifier cette invariabilité lors de ses travaux expérimentaux. Elle est due au fait que le signal détecté est issu d'un transfert d'énergie intramoléaulaire. Cette caractéristique est particulièrement intéressante pour le développement de tests automatisés à grande échelle car les variations de la quantité de récepteur chimère isolé mise en jeu n'ont pas d' incidence sur le rapport final des énergies mesurées. Plus précisément l' invention a pour objet une méthode de dét ect ion de mol éaul es suscept ibles de modifier l'activité tyrosine kinase dun récepteur, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur purifié comprenant un premier hétérodimère ap associé à un premier élément de réponse et un second hétérodimère ap associé à un second élément de réponse différent du premier, ledit premier élément de réponse étant capable d'agir sur le second élément de réponse lorsque ceux-ci sont rapprochés, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères aR résultant de l' interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la réponse du second élément de réponse à un signal émis par le premier élément de réponse lorsqu'il est activé. s Ainsi, la méthode de l' invention fondée sur le rapprochement des deux éléments de réponses permet de détecter non seulement le rapprochement mais aussi un changement de conformation des deux hétérodimères ap. Avantageusement, la méthode selon l' invention comprend les étapes suivantes: a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur comprenant un premier hétérodimère ap associé à un premier élément bioluminescent ou fluorescent et un second hétérodimère ap associé à un second élément fluorescent différent du premier, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères ap résultant de l' interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la fluorescence émise par le second élément fluorescent en réponse à un signal émis par le premier élément de réponse lorsqu'il est activé. 2s Selon un première mise en _uvre particulière, la méthode de l' invention comprend les étapes suivantes: a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur comprenant un premier hétérodimère ap associé à un élément bioluminescent et un second hétérodimère ap associée à un élément fluorescent, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères ap résultant de l' interaction éventuelle de ladite moléaule 3s avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la fluorescence émise par l'élément fluorescent en réponse à un signal émis par l'élément bioluminescent lorsqu'il est activé. Avantageusement la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères a0, lorsque le premier hétérodimère ap est associé à un s élément de réponse bioluminescent, est mesurée en mettant en contact à l'étape (b) le récepteur avec un substrat dudit élément bioluminescent. Selon une deuxième mise en oeuvre particulière, la méthode de l' invention comprend les étapes suivantes: a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur comprenant un premier hétérodimère ap associée à un premier élément fluorescent et un second hétérodimère ap associée à un second élément fluorescent différent du premier, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères ap résultant de l' interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la fluorescence émise par le second élément fluorescent en réponse à un signal émis par le premier élément fluorescent lorsqu'il est activé. Avantageusement, la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères ak, lorsque chacun d'entre eux est associé à un élément de réponse fluorescent, est mesurée en exposant à l'étape (b) le récepteur à une source lumineuse spécifique du premier élément fluorescent. Selon un mode particulier de réalisation de la méthode selon l'invention, le premier et/ou le second hétérodimère ap du récepteur chimère est/(sont) délétée(s) du domaine tyrosine kinase ou d'une partie ou de la totalité du domaine intracellulaire et/ou transmembranaire du récepteur. Selon une autre mode particulier de réalisation de la méthode selon l'invention, le premier et/ou le second hétérodimère ap comprennent un domaine tyrosine kinase. La méthode selon l'invention peut comporter une étape de comparaison de la mesure obtenue à l'étape (b) avec celle obtenue en réalisant la dite méthode dans l'une au moins des conditions suivantes - en l' absence de la molécule à tester, - avec une molécule témoin, en présence ou en absence de la molécule à tester, - avec un excipient, en présence ou en absence de la moléaule à tester, - avec un récepteur témoin à la place du récepteur ou partie de récepteur isolé. Avantageusement, l'élément de réponse bioluminescent mis en _uvre dans la méthode de l' invention est la luciférase ou un fragment bioluminescent de celle-ci. Avantageusement, l'élément fluorescent mis en 2s _uvre dans la méthode de l' invention est choisi parmi des protéines fluorescentes ou des composé chimiques fluorescents. De préférence, la protéine fluorescente est choisie parmi dans le groupe comprenant la Protéine verte fluorescente (GFP) et ses variantes comme la Protéine jaune fluorescente (EYFP), la Protéine Bleue fluorescente (EBFP), la Protéine cyano fluorescente (ECFP) ou d'autres protéines fluorescentes tel le la Ds Red ou des fragments 3s de celles-ci. De manière préférentielle, le composé chimique fluorescent mis en _uvre dans la méthode de l' invention est choisi parmi l'Europium, l'allophycocyanine, etc. Avantageusement la molécule susceptible de s modifier l'activité tyrosine kinase du récepteur détectable par la méthode de l'invention est un activateur dudit récepteur. Avantageusement la molécule susceptible de modifier l'activité tyrosine kinase du récepteur détectable par la méthode de l' invention est un inhibiteur dudit récepteur. Avantageusement la molécule susceptible de modifier l'activité tyrosine kinase du récepteur est un ligand, un agoniste ou un antagoniste dudit récepteur. Selon une mise en _uvre particulière de la méthode de l' invention, les molécules à analyser sont présentes dans un milieu biologique naturel et sont mises en contact avec le récepteur chimérique isolé, dans ledit milieu naturel. Selon un mode de réalisation préférée de la méthode de l' invention, les molécules à analyser sont issues de l' expression d'une banque d'ADNc. Avantageusement, la détection de la fluorescence émise lors de l'étape (c) de la méthode selon l' invention est effectuée au moyen d'un luminomètre/fluorimètre. De manière tout à fait préférentielle, la méthode selon l' invention met en _uvre un récepteur ayant un domaine tyrosine kinase choisi parmi le récepteur de l'insuline, le récepteur IGF- l, le récepteur IRR ou des variantes de ceux-ci. L' invention a également pour objet un récepteur comportant deux hétérodimères a0, dont l'un des deux hétérodimères ap est associé à un élément bioluminescent ou un premier élément fluorescent et l'autre hétérodimère ap est associé à un second élément fluorescent différent du premier. Avantageusement l'hétérodimère ap du récepteur de l' invention est choisi parmi un hétérodimère ap du récepteur de l'insuline, du récepteur IGF-1 ou du récepteur IRR. Avantageusement, l'élément bioluminescent et/ou l'élément fluorescent associés à l'un ou l'autre des hétérodimère ap du récepteur de l' invention sont des protéines ou des fragments de celles-ci. De manière préférentielle, l' association entre l' hétérodimère ap et l' élément bioluminescent du récepteur de l' invention est obtenue par la fusion de l'ADNc codant pour ledit hétérodimère ap et l'ADNc codant pour la protéine bioluminescente ou un fragment bioluminescent de celle-ci. De manière tout à fait préférentielle, l'ADNc codant pour ladit hétérodimère ap dans la protéine de fusion, est choisi parmi l'ADNc codant pour un hétérodimère ap du récepteur de l'insuline, du récepteur IGF-1 ou du récepteur IRR. De manière tout à fait préférentielle l'hétérodimère ap associé à l'élément fluorescent est obtenu par la fusion de l'ADNc codant pour ledit hétérodimère ap et l'ADNc codant pour une protéine fluorescente ou un fragment fluorescent de celle-ci Selon un mode de mise en _uvre particulier, l'élément bioluminescent associé au premier hétérodimère ap du récepteur selon l' invention est la luciférase de Renilla et l'élément fluorescent associé au second hétérodimère ap du récepteur selon l' invention est la Protéine Fluorescente Jaune. Selon un autre mode de réal i sat ion de l' invention, l'élément fluorescent est associé à l'un ou l'autre ou les deux hétérodimères ap du récepteur de l' invention par des liaisons covalentes ou non covalentes. L' invention concerne également une composition comprenant un récepteur chimère isolé comportant des hétérodimères ap associés à des éléments de réponse comme défini ci dessus. L, invention a également pour objet un ADNc comprenant 1'ADNc codant pour un hétérodimère ap ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour un élément bioluminescent. De préférence l'ADNc codant pour l'hétérodimère ap ou un fragment de celui-ci d'un 2s récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline ci dessus est choisi parmi l'ADNc codant pour l'hétérodimère ap du récepteur de l'insuline, l'ADNc codant pour l'hétérodimère ap du récepteur IFG-l ou l'ADNc codant pour l'hétérodimère ap du récepteur IRR. Tout préférentiellement l' invention concerne un ADNc comprenant l'ADNc codant pour l'hétérodimère ap ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour la Luciférase de Renilla identifié par la SEQ ID N l dans la liste de séquences en annexe. L'invention concerne aussi un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comporte un ADNc tel que celui défini précédemment. Tout préférentiellement l' invention a pour objet le vecteur d'expression identifié par la SEQ ID N 2 dans la liste de séquences en annexe. L' invention a également pour objet une protéine de fusion obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc défini précédemment. Plus particulièrement l' invention concerne la protéine de fusion obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc comprenant l,ADNc codant pour le récepteur de l'insuline et l,ADNc codant pour la Luciférase de Renilla identifiée par la séquence SEQ ID N 3 dans la liste de séquences en annexe. L' invention concerne également un ADNc comprenant l'ADNc codant pour un hétérodimère ap ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour un élément fluorescent De préférence l'ADNc codant pour un hétérodimère ap ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline ci-dessus est choisi parmi l'ADNc codant pour l'hétérodimère ap du récepteur de l'insuline, l'ADNc codant pour l'hétérodimère ap du récepteur IFG-l ou l'ADNc codant pour l'hétérodimère ap du récepteur IRR. Tout préférentiellement l' invention concerne un ADNc comprenant l'ADNc codant pour un hétérodimère ap ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour la protéine fluorescente jaune (EYFP) identifié par la SEQ ID N 4 dans la liste de séquences en annexe. l' invention a aussi pour objet un vecteur s d' expression d'une protéine de fusion par transfection dans une cellule comportant un ADNC tel que défini ci dessus. Tout préférentiellement l' invention a pour objet le vecteur d'expression identifié par la SEQ ID N dans la liste de séquences en annexe. L'invention concerne également une protéine de fusion obtenue par expression dans une cellule d'un ADNC tel que défini ci-dessus. Plus particulièrement l' invention a pour objet la protéine de fusion obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc comprenant 1' ADNc codant pour le récepteur de l'insuline et 1' ADNc codant pour protéine fluorescente jaune (EYFP) identifice par la séquence SEQ ID N 6 dans la liste de séquences en annexe. L' invention concerne aussi une cellule génétiquement modifiée par transfection soit avec un premier vecteur d' expression comportant la séquence d'un ADN c comprenant un ADNc codant pour un hétérodimère ap ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNC codant pour un premier élément de réponse soit avec un second vecteur d'expression comportant la séquence d'un ADNc comprenant l'ADNC codant pour un hétérodimère ap ou un fragment de celui- ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour un élément fluorescent soit avec ces deux vecteurs d'expression. De préférence, la cellule selon la l' invention est choisie parmi des cellules ovariennes de Hamster Chinois (CHO: Chinese Hamster Ovary cells), des cellules HEK 293 (Human Embryonic Kidney Cells - Cellules embryonnaires Humaines de Rein) ou des Cellules humaines HeLa. L'invention se rapporte enfin à l'utilisation de la méthode de détection ci-dessus pour le criblage à haut débit des molécules utiles pour la prévention et/ou le traitement de pathologies liées aux défaillances de l' action de l'insuline sur ses tissus cibles ou aux défaillances partielles ou totales de sécrétion d'insuline. L' invention a également pour objet l'utilisation de la méthode ci-dessus pour la détection de molécules utiles pour la prévention et/ou le traitement d'une pathologie choisie parmi le diabète, l'obésité, les pathologies liées à la résistance à l'insuline. Encore, un autre objet de l' invention se rapporte à un activateur d'un récepteur capable de se lier au récepteur de l' invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation des ses hétérodimères ap. L' invention concerne aussi l'utilisation d'un activateur d'un récepteur capable de se lier au récepteur de l' invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation de ses deux hétérodimères ap pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention du diabète. L' invention a aussi pour objet un inhibiteur d'un récepteur capable de se lier au récepteur de l' invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation des ses deux hétérodimères ap. Un autre objet de l' invention concerne à l'utilisation d'une molécule capable de se lier au récepteur de l' invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation de ses deux hétérodimères ap pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une pathologie humaine ou animale. L' invention se rapporte également à l'utilisation d'une molécule capable de se lier au récepteur chimère isolé de l' invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation de ses deux hétérodimères ap pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer. L' invention concerne encore l'utilisation d'une molécule capable de se lier au récepteur chimère de l' invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation de ses deux hétérodimères ap pour la préparation d'un médicament destiné à la régénération tissulaire. Lt invention a également pour objet l'utilisation d'une molécule capable de se lier au récepteur chimère de l' invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation de ses deux hétérodimères ap pour la préparation de facteurs de croissance pour la culture cellulaire. Enfin l' invention a également pour objet un support solide sur lequel est fixé un récepteur chimère 3s selon l'invention. Selon un mode de réalisation préféré, le récepteur est fixé sur ledit support solide par des liaisons covalentes ou non covalentes. De préférence, le support solide selon l' invention est choisi parmi le groupe de supports comprenant les supports inorganiques tels que le métal, le verre, le silicium et les supports organiques à base de polymères ou de co-polymères tels que le polystyrène, le polyéthylène, le polycarbonate, la polyacrylamide, le nylon ou le latex. Avantageusement le support solide selon l' invention est choisi parmi le groupe des supports sous forme de particules y compris des particules colloïdales, des bandelettes, de microplaques, des tubes. Préférentiellement le support solide de l'invention est sous une forme lyophilisée. Avantageusement le support solide de linvention est sous une forme congelée. Enfin l' invention concerne un kit pour la 2s détection d'activateurs ou d'inhibiteurs des récepteurs de la famille du récepteur de l'insuline comprenant au moins un support solide comme défini ci-dessus, éventuellement le substrat d'un élément bioluminescent, et une notice d'utilisation. D'autres avantages et applications de l' invention apparaîtront à la lecture des travaux expérimentaux et des résultats que les inventeurs ont effectués afin de vérifier que la méthode selon l' invention permet de suivre in vitro un changement conformationnel du récepteur chimère qui reflète fidèlement l'état d'activation du récepteur. Ces travaux sont illustrés par les figures jointes en annexe dans lesquelles: - La figure 1 montre que les récepteurs de l'insuline chimères sont assemblés correctement dans les cellules HEK-293 transfectées avec les ADNc fusionnés - La figure 1A illustre le principe de la détection des changements conformationnels induits par l'insuline dans la molécule du récepteur de l'insuline en utilisant la méthodologie BRET. - la figure 1B montre que la transfection d'ADNC codant pour EYPF dans des cellules HEK-293 produit un signal fluorescent uniformément distribué dans la cellule, par contre, la transfection d'ADNc codant pour IR-EYFP ou la co-transfection d'ADNc codant pour IR-Rluc et IR-EYPF conduit à la localisation de la fluorescence dans la membrane plasmatique. - la figure 1C montre l'auto-phosphorylation sur les tyrosines du récepteur chimère détectée par immunoblot en utilisant un anticorps antiphospho tyrosine (4G10). L'immunoblot est effectué récepteurs chimères provenant de cellules HEK co-transfectées avec l'ADNc codant pour IR-Rluc seul, IR-EYPF seul ou les deux simultanément. Les cellules sont incubées durant 5 minutes en présence de 100 nM d'insuline. Les cellules ont été extraites et les récepteurs chimères ont été partiellement purifiés sur de la Sepharose LGB. - La figure 2 illustre l'effet de l'insuline sur le signal BRET. La figure 2A montre le signal basal et le signal induit par l'insuline mesurés soit sur des cellules intactes soit sur des récepteurs chimères partiellement purifiés selon décrit dans la section " Matériel et méthodes ". Les résultats sont exprimées comme la moyenne + sem de six expériences. - La figure 3 montre l'effet de l'insuline sur l'autophosphorylation et le signal BRET sur des récepteurs chimères partiellement purifiés. - la figure 3A montre que l'autophosphorylation des récepteurs chimères partiellement purifiés effectuée comme décrit dans la section " Matériel et méthodes ", en absence ou en s présence de lOO nM d'insuline. - la figure 3B montre l'effet de l'insuline sur l'autophosphorylation du récepteur chimère par analyse densitométrique. Les résultats représentent la moyenne + sem de 7 expériences. - la figure 3C montre les signaux BRET obtenus lorsque des récepteurs de l'insuline chimères partiellement purifiés ont été preincubés durant 45 minutes en absence ou en présence de lOO nM insuline et ensuite incubés durant 2 minutes en absence ou en présence de lOO M ATP. Le signal BRET a été mesuré comme décrit dans la section " Matériel et méthodes ". Les résultats correspondent à la moyenne + sem de 3 expériences. - Les figures 4A et 4B illustrent l'effet dose-réponse de l'insuline, l'IGFl et l'EGF sur les récepteurs chimères partiellement purifiés. La figure 4A montre les signaux BRET obtenus lorsque des récepteurs chimères partiellement purifiés ont été incubés durant 45 minutes en présence de doses croissantes d' insuline, d' IGFl ou d'EGF. Le signal BRET a été mesuré selon décrit dans la section n Matériel et méthodes ". Les résultats sont exprimés comme la moyenne + sem de trois à neuf expériences. La figure 4B montre l'autophosphorylation des récepteurs chimères partiellement purifiés qui est effectuce comme décrit dans la section n Matériel et méthodes " en présence de doses croissantes d'insuline, d'IGFl ou d'EGF. - Les figures 5A à 5D montrent l'effet d'anticorps anti-récepteur sur le signal BRET. - La figure 5A montre les signaux BRET obtenus lorsque des récepteurs chimères partiellement purifiés sont incubés durant 45 minutes en présence de nM insuline, d'un ng/pl d'anticorps monoclonal 83-14 ou des deux. Le signal BRET est mesuré selon décrit dans la section " Matériel et méthodes ". Les résultats sont exprimés comme la moyenne + sem de sept à neuf expériences. * P de Student). - la figure 5B illustre l'autophosphorylation des récepteurs chimères partiellement purifiés effectuée comme décrit dans la section n Matériel et méthodes " en présence de 100 nM d'insuline, d'un ng/pl d'anticorps monoclonal 83-14 ou des deux. - la figure 5C montre les signaux BRET obtenus lorsque des récepteurs chimères partiellement purifiés sont incubés durant 45 minutes en présence d'insuline (100 nM), de l'anticorps AK766 (200 ng/pl) ou des deux. Les signaux BRET ont été mesurés comme décrit dans la section " Matériel et méthodes. Les résultats représentent la moyenne + sem de trois expériences. * P AK766 (200 g/l) ou des deux. - Les figures 6A et 6B montrent les plasmides utilisés pour obtenir les protéines de fusion IR-EYFP et IR-Luc. I - MATERIEL ET METHODES Description générale: La fusion des séquences d'ADN codant pour le récepteur de l'insuline avec, d'une part, la séquence d'ADN codant pour la luciférase de Renilla (Construction IRRluc), et d'autre part avec la séquence codant pour la protéine fluorescente EYFP (Construction IR-EYFP) a été effectuée. Ces constructions sont transfectées ensemble ou séparément dans des cellules eucaryotes, (cellules HEK 293 par exemple) de fac,on à produire des molécules s hybrides constituées d'une protéine chimère alpha-béta luciférase associée à une protéine chimère alpha-béta EYFP. Après 48h d'expression dans des cellules HEK-293, les protéines cellulaires sont extraites. Les récepteurs de l'insuline sont isolés à partir des cellules transfectées, et éventuellement purifiés en utilisant les techniques classiques de chromatographie d'affinité sur des colonnes de lectine de germe de blé (Sepharose LGB). Le récepteur est élué dans un tampon contenant du N-acéCylglucosamine. Cette solution contenant le récepteur partiellement purifié est aliquotée et congelée. Les aliquots conservés à -80 C et peuvent étre décongelés et utilisés pour tester l'effet de l'insuline et de différentes molécules sur les changements de conformation du récepteur de l'insuline. I.l - Séquences d'ADNc. L'ADNc codant pour la séquence complète du récepteur de l'insuline correspondant à la séquence identifiée sous le numéro SEQ ID N l dans la liste de séquences en annexe sans son codon stop a été sous-cloné en phase, soit avec la variante jaune de la GFP (EYFP, Clontech), pour obtenir la séquence codante identifiée en annexe sous le numéro SEQ ID N 2 soit avec le gène de la Renilla Luciférase (Promega)pour obtenir la séquence codante identifiée sous le numéro SEQ ID N 3 dans la liste de séquences en annexe, dans un vecteur d'expression pCDNA3 (Invitrogen). Le séquence de la protéine de fusion obtenue entre la sous-unité ap du récepteur de l'insuline et la Protéine Fluorescente Janne est identifiée en annexe sous le numéro SEQ ID N 4. La séquence de la protéine de fusion obtenue entre la sous-unité ap du récepteur de l'insuline et la Luciférase de Renilla est identifise en annexe sous le numéro SEQ ID N 5. I.2 - Culture cellulaire, transfection et purification des protéines de fusion du récepteur de l'insuline. Des cellules HEK-293 maintenues dans du milieu DMEM supplémenté avec 4,5 g/1 de glucose et 10% sérum de veau (Gibco Life Science) ont été ensemencées à une densité de 1,2 x 106 cellules/boîte de diamètre 100 mm. La transfection transitoire est effectuce un jour plus tard en utilisant du FuGene 6(Roche), soit avec 0, 3 g d'ADNc d'IR-Rluc et 0,3 g du vecteur vide, soit avec 0,3 g d'ADNc d'IR-Rluc et 0,3 g d'ADNc d'IR-EYPF. Dans certaines expériences, (Figure 2A image de gauche) les mesures de BRET ont été effectuées sur des cellules intactes comme décrit précédemment (Angers S. Salahpour A, Joly E, et al. (2000) Detection of beta 2-adrenergic receptor dimerization in living cells using bioluminescence resonance energy transfer (BRET). Proc Natl Acad Sci U S A 97: 3634-3689). Dans la plupart des expériences, les mesures BRET ont été effectuées en utilisant des récepteurs de l'insuline chimères purifiés. Deux j ours après la transfection, les cellules ont été extraites dans un tampon contenant 1% (Poids/volume) de Triton X-100, 20 mM MOPS, 2,5 mM benzamidine, 1 mM EDTA, 1 mM AEBSF, et 1 g/ml de chacun des antiprotéases suivants: aprotinine, pepstatine, antipaïne et leupeptine (Sigma). Les récepteurs chimères sont partiellement purifiés par chromatographie sur de la lectine de germe de blé couplée à de la Sepharose comme décrit 3s précédemment (Tavaré,J.M. et Denton,R.M. Studies on the autophosphorylation of the insulin receptor from human placenta. Analysis of the sites phosphorylated by two dimensional peptide mapping. Biochem.J. 252, 607-615 *(1988)). Les extraits cellulaires sont centrifugés à 4 C pendant 5 min à 1000g pour éliminer d'éventuels débris insolubles. L'extrait cellulaire soluble (7,5 ml) est incubé avec 2,5 ml de billes de sépharose couplée avec de la lectine de germe de blé (LGB) pendant 2 h à 4 C sur une roue en rotation. Le mélange est ensuite tranevasé dans une colonne (2 cm de diamètre) et lavé avec 100 ml de tampon de lavage de colonne (identique au tampon d' extraction mais ne contenant que 0,1 de Triton X-100). Les glycoprotéines sont retenues sur la colonne alors que les protéines cellulaires non glycosylée sont éliminées lors du lavage. Les glycoprotéines sont ensuite éluées de la colonne avec 15 ml de tampon d'élution (identique au tampon de lavage, mais contenant 0,3 M de N-acéCylglucosamine). L'éluat est recuoilli en 15 fractions de 1 ml. La présence de récepteurs chimériques dans chacune de ces fractions est rapidement estimée par une mesure directe de BRET sur 50 1 d'éluat. Les trois fractions contenant la plus forte activité de signal BRET sont alors réunies et congelées à -80 C sous forme d'aliquots de 501 pour utilisation ultérieure. La concentration protéique dans les préparations de récepteurs partiellement purifiés est mesurée par un test de Bradford. I.3 - Essai BRET La mesure du signal BRET est effectuce en utilisant 4,5 pl d'éluat issu de la chromatographie sur lectine de Germe de Blé couplée à de la Sepharose (Sépharose-LGB) (contenant environ 2 g de protéine) preincubés dans des microplaques de 96 puits durant 45 minutes à 20 C dans un volume total de 60 1 contenant 30 mM MOPS, 1 mM de tétravanadate de sodium et des concentrations différentes de ligands. Sept p1 de coelenterazine (concentration finale 2,6 M) ont été ajoutés à la préparation et l' acquisition de l'émission de la lumière à 485 nm (fenêtre de filtre: 20 nm) et à 530 nm (fenêtre de filtre: 25 nm) est commencce immédiatement en utilisant l'appareil d'analyse des micloplaques Fusion (Hewlett Packard). Le rapport BRET s (Angers, S. et al. Detection of beta-2-adrenergic receptor dimerization in living cells using bioluminiscence resonance energy transfer (BRET). Proc.natl.Acad.Sci.U.SA. 96, 151-156 (1999), a été défini préalablement comme: [(émission à 530 nm) - (émission à 485 nm) x Cf] / (émission à 485 nm), o Cf correspond au quotient (émission à 530 nm/émission à 485 nm) pour la protéine de fusion Rluc seule dans les mêmes conditions expérimentales. Par exemple dans l'étude réalisée dans le cadre de la présente invention, ceci correspond à l'émission obtenue avec le récepteur chimère partiellement purifié à partir de cellules HEK-293 transfectés avec l'IR-Rluc seul. Afin de faciliter la lisibilité, les résultats sont exprimés en Unités milliBRET (mBU), une unité mBRET correspondant au rapport BRET multiplié par 1000. I.4 - Auto-phosphorylation des récepteurs de l'insuline chimères partiellement purifiés. Les récepteurs chimères de l'insuline partiellement purifiés (4,5 pl) ont été pre-incubés durant 45 minutes à 20 C dans un volume total de 60 l contenant 30 mM MOPS, 12 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 1 mM Na3VO4 et des différentes concentrations de ligands. La réaction d'auto-phosphorylation est déclanchée par addition de 5 1 d'ATP (concentration finale 100 M) durant 2 minutes et arrêtée par addition du tampon d'échantillon LaëmmliSDS-PAGE (Tavaré,J.M. et Denton,R.M. Studies on the autophosphoUylation of the insulin receptor from human placenta. Analysis of the sites phosphorylated by two dimensional peptide mapping. Biochem.J. 252, 607-615 (1988)). L'autophosphorylation des récepteurs chimères est vérifiée par Western Blot (Issad T., Combettes, M et Ferré,P. Isoproterenol inhibits insulin-stimulated tyrosine phosphorylation of the insulin receptor without increasing its serine/threonine phosphorylation. Eur.J.Biochem. 234, 108-115 (1995)), en utilisant l'anticorps anti phosphoUyrosine 4 G10 (UBI). I.5 - Auto-phosphorylation des réceteurs de l'insuline dans les cellules intactes. Quarante-huit heures après la transfection, des cellules HEK-293 ont été incubées durant 5 minutes en absence ou en présence d'insuline et extraites, comme décrit précédemment (Tavaré,J.M., O'Brien, R.M. Siddle,K. et Denton,R.M. Analysis of insulin receptor phosphorylation sites in intact cells by two dimensional phosphopeptide mapping. Biochem.J. 253, 783-788 (1988)). II - RESULTATS II.1 - Expression du récepteur de l'insuline fusionné avec Rluc et EYFP dans des cellules HEK-293. On considère que le changement conformationnel induit par l'insuline sur son récepteur entraîne un rapprochement des deux sous-unités béta et permet alors la phosphorylation sur tyrosines dune sous-unité par l'autre sous-unité. De manière à détecter ce changement conformationnel en utilisant la méthodologie BRET, la séquence codante du récepteur de l'insuline (SEQ ID N 1) a été fusionnée avec soit celle de Renilla Luciférase (SEQ ID- N 2) , soit celle de EYFP (SEQ ID N 3). La microscopie de fluorescence montre que les cellules HEK 293 transfectées avec l'ADNc codant pour IR-EYFP ou co transfectées avec l'ADNc codant pour IR-Rluc et IR-EYPF expriment la protéine fluorescente chimère sur la membrane plasmatique (Figure lb). Dans des cellules HEK-293 transfectées soit avec l'ADNc codant pour IRRluc soit avec l'ADNc codant pour IR-EYFP ou les deux, l'insuline stimule clairement la phosphorylation sur tyrosines d'une protéine ayant un poids moléaulaire apparent d' environ 125-130 Kd en accord avec la taille attendue de la sous-unité béta fusionnée avec Rluc ou EYFP. Ces résultats indiquent que ces récepteurs d'insuline chimères sont correctement exprimés sur la membrane plasmatique et ont conservé leur activité d'auto-phosphorYlation induite par l'insuline. II.2 - L'insuline stimule le transfert résonant d'énerqie de bioluminescence entre béta-IR-Rluc et béta-IR-EYFP in vitro. Les mesures par BRET effectuces sur des cellules HEK-293 intactes cotransfectées avec IR-Rluc et IR-EYFP montrent que l'insuline a peu d'effet sur le signal BRET, qui est à peine plus élevé que le niveau basal (Figure 2a). Le signal BRET basal mesuré sur des récepteurs chimères partiellement purifiés est de deux à trois fois inférieur à celui des cellules intactes. Un effet important de l'insuline sur le signal BRET est observé sur les récepteurs chimères partiellement purifiés. Bien que les raisons pour expliquer les différences dans les signaux BRET émis par les cellules intactes, et par les récepteurs partiellement purifiés soient inconnues à ce Jour, ces résultats indiquent que l'approche BRET peut-être utilisée pour le suivi in vitro des changements conformationnels du récepteur de l'insuline, induits par l'insuline. (Figure 2a). La co-transfection avec IR-Rluc et IR-EYFP peut théoriquement conduire à l'expression de trois populations de récepteurs chimères: [apRluc]2, [apEYFP]2 et des molécules hybrides [apRluc]-[apEYFP]. Par conséquent, un signal BRET peut en théorie, provenir d'un transfert d'énergie intramoléculaire à l'intérieur de la même moléaule [apRluc]-[apEYFP] ou d'un mécanisme intermoléculaire entre deux récepteurs chimères, par exemple, entre [apRluc]2 et [apEYFP]2. L' augmentation du volume de l'éluat issu de la chromatographie sur Sepharose-LGB, dans le mélange de réaction, de 2 gl à 10 l, correspondant à des concentrations du récepteur partiellement purifié allant de 15 ng/ml jusqu'à 75 ng/ml, n'altère pas le signal BRET.(Fig. 2b). Ceci indique que le signal BRET mesuré sur les récepteurs chimères partiellement purifiés est lO indépendant de la concentration protéique et reflète un transfertd'énergie intramoléculaire entre apRluc et apEYFP dans la même molécule du récepteur chimère. [apRluc] - [apEYFP]. De plus, aucun signal BRET n'a pu être détecté lorsque des éluats issus de la chromatographie sur lectine de germe de blé (éluats LGB) des cellules transfectées avec IR-Rluc seul sont mélangés avec des extraits LGB de cellules transfectées avec IR EYFP seul (résultats non-montrés). Ceci indique qu'aucun transfert d'énergie ne se produit entre [apRluc]2 et [apEYFP]2 et appuie la notion que le transfert d'énergie observé est un processus intramoléculaire qui reflète un changement conformationnel entre les sous-unités [apRluc] - [apEYFP] d'un même récepteur chimère. La figure 3a montre que l'insuline stimule l'auto-phosphorylation in vitro des récepteurs de fusion partiellement purifiés. L'effet de l'insuline sur l'auto-phosphorylation (Figure 3b) est du même ordre de magnitude (2,5 fois à 3 fois) que l'effet de l'insuline sur le signal BRET (Figure 3c). Ce résultat indique que le signal BRET peut être considéré comme une mesure représentative de l'état d'activation du récepteur de l'insuline. L'effet in vitro de l'insuline sur le signal BRET est indépendant de la réaction d'auto phosphorylation. En effet, un signal BRET équivalent est obtenu, que la réaction d'auto-phosphorylation soit effectuée ou non avant les tests BRET (Figure 3c). II.3 - Effets dose-réponse de l'insuline, IGF1, et EGF sur le siqnal BRET. L'effet de concentrations croissantes d'insuline sur le signal BRET est montré figure 4A. l'effet maximal est observé à une dose de 15 nM d'insuline. L'effet demimaximal (EC50) est observoe à une dose de 15 nM d' insuline. L' IGF1 montre également un signal BRET dose-dépendant avec un EC50 d'environ 200 nM. L'EGF n' aucun effet sur le signal BRET. Ces résultats sont en accord avec les propriétés pharmacologiques connues de ces ligands envers le récepteur de l'insuline. L'auto-phosphorylation des récepteurs chimères en réponse à ces ligands présente des profils dose-réponse similaires, indiquant que le signal BRET reflète en effet l'état d'activation du récepteur de l'insuline.(Figure 4B). II.4 - Effet d'anticorps anti-récepteur sur le siqnal BRET. L'anticorps monoclonal 83-14 dirigé contre la sous-unité alpha du récepteur de l'insuline (Soos MA, Siddle K, Baron MD, et al. (1986) Monoclonal antiLodies reacting with multiple epitopes on the human insulin receptor. Biochem J 235: 199-208) a une activité similaire à celle de l'insuline (insulin-like) sur le métabolisme des adipocyLes humains (Taylor, R., Soos,M.A., Wells, A;, Argyari,M and Siddle, K. "Insulin like and insulin-inhibitory effects of monoclonal antibodies for different epitopes on the human insulin receptor. Biochem.J. vol 242, page 123-129, (1987)) et sur l'auto-phosphorylation du récepteur de l'insuline (O'Brien RM, Soos MA, Siddle K (1987) Monoclonal antibodies to the insulin receptor stimulate the intrinsic tyrosine kinase activity by cross-linking 3s receptor moleaules. Embo J 6: 4003-4010) De manière intéressante, cet anticorps active aussi complètement les récepteurs de l'insuline d'un patient insulino-résistant qui ne peuvent pas être activés par l'insuline comme conséquence d'une mutation qui empêche la liaison de 1'insuline. (Krook A, Soos MA, Kumar S. Siddle K, O'Rabilly S (1996) Functional activation of mutant human insulin receptor by monoclonal antiLody. Lancet 347: 1586-1590). Il a été suggéré que cette approche pouvait être une solution aux défaillances dans l'auto phosphorylation du récepteur induite par l'insuline chez un patient insulino résistant. (Krook A, Soos MA, Kumar S. Siddle K, O'Rahilly S (1996) Functional activation of mutant human insulin receptor by monoalonal antibody. Lancet 347: 1586-1590). Il apparaît que l'anticorps 83-14 stimule fortement le signal BRET (Figure 5a). Des travaux préalables montraient que de facon inattendue, l'effet maximal de l'insuline sur l'auto-phosphorylation pouvaient être augmenté par l'anticorps 83-14, conduisant à une activation supramaximale de l'auto-phosphorylation du récepteur de l'insuline lorsque les deux ligands sont présents ensemble. (O'Brien RM, Soos MA, Siddle K (1987) Monoclonal antibodies to the insulin receptor stimulate the intrinsic tyrosine kinase activity by cross-linking receptor molecules. Embo J 6: 4003-4010). De manière similaire, l'incutation combince du récepteur chimère selon l' invention avec l'insuline et avec l'anticorps 83-14 conduit également à un signal BRET qui est plus élevé que l'effet maximal obtenu avec l'insuline seule. Ces résultats indiquent que la méthode de l' invention détecte des changements conformationnels induits par un anticorps avec une activité qui mime celle de l'insuline. Il est également observé qu'un anticorps dirigé contre la portion intracellulaire complète du récepteur de l'insuline humain, l'anticorps anti-kinase AK766, qui inhibe l'auto-phosphorylation induite par l'insuline (Figure 5D), réduit clairement l'effet de l'insuline sur le signal BRET (Figure 5C) lorsqu'il est utilisé dans la méthode selon l' invention. Ceci est une preuve que les inhibiteurs de l'activité du récepteur de l'insuline peuvent également être détectés par cette méthodologie. Ainsi, ces deux anticorps, interagissent avec la sous-unité alpha (83-14) ou la sous-unité béta (AK766) du récepteur de l'insuline et sont également capables d'induire un changement d'activité du récepteur que l'on peut mettre en évidence avec la méthode de l' invention. III - Conclusion L'ensemble de ces résultats confirme que la méthode mise au point dans le cadre de l'invention permet de mesurer des changements de conformation induits soit par des activateurs soit par des inhibiteurs d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline. Cette méthode, basoe sur le transfert résonant d'énergie de bioluminescence permet le suivi des changements conformationnels dudit récepteur. Le signal BRET détecté dans ce test reflète fidèlement le stade d' activation du récepteur, et par conséquent il peut être utilisé pour étudier les effets stimulateurs ou inhibiteurs de molécules sur l'activité dudit récepteur. Cette méthode constitue un outil adéquat pour la recherche de molécules ayant des propriétés thérapeutiques vis-à-vis de pathologies liées à une diminution de l' action de ligands du récepteur sur ses tissus cibles. Par exemple dans le cas du récepteur de l'insuline il peut s'agir de pathologies liées à la résistance à l'insuline ou à une diminution, voire l' absence de la sécrétion pancréatique d'insuline. REVENDI CATI ONS 1) Méthode de détection de molécules susceptibles de modifier l'activité tyrosine kinase d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur isolé comprenant un premier hétérodimère ap associé à un premier élément de réponse et un second hétérodimère apassocié à un second élément de réponse différent du premier, ladit premier élément de réponse étant capable d'agir sur le second élément de réponse lorsque ceux-ci sont rapprochés, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères ap résultant de l' interaction éventuelle de ladite moléaule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la réponse du second élément de réponse à un signal émis par le premier élément de réponse lorsqu'il est activé. 2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur comprenant un premier hétérodimère ap associé à un premier élément bioluminescent ou fluorescent et un second hétérodimère ap associé à un second élément fluorescent différent du premler, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimère ap résultant de l' interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la fluorescence émise par le second élément fluorescent en réponse à un signal émis par le premier élément de réponse lorsqu'il est activé. 3) Méthode de détection de molécules susceptibles de modifier l'activité tyrosine kinase d'un récepteur selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur comprenant un premier hétérodimère ap associé à un élément bioluminescent et un second hétérodimère ap associé à un élément fluorescent, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères ap résultant de l' interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la fluorescence émise par l'élément fluorescent en réponse à un signal émis par l'élément bioluminescent lorsqu'il est activé. 4) Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères ap est mesurée en mettant en contact à l'étape (b) le récepteur avec un substrat de l'élément bioluminescent. ) Méthode de détection de molécules susceptibles de modifier l'activité tyrosine kinase d'un récepteur selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur comprenant un premier hétérodimère ap associé à un premier élément fluorescent et un second hétérodimère ap associé à un second élément fluorescent différent du premier, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères ap résultant de l' interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la fluorescence émise par le second élément fluorescent en :l - réponse à un signal émis par le premier élément fluorescent lorsqu'il est activé. 6) Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères ap est mesurée en exposant à l'étape (b) le récepteur ou partie de récepteur isolé à une source lumineuse spécifique du premier élément fluorescent. 7) Méthode selon l'une quelconque revendication 1 à 6, caractérisé en ce que le premier et/ou le second hétérodimère ap est/(sont) délétée(s) du domaine tyrosine kinase ou d'une partie ou de la totalité du domaine intracellulaire et/ou transmembranaire du récepteur. 8) Méthode selon l'une quelconque revendication 1 à 6, caractérisé en ce que le premier et/ou le second hétérodimère ap comprennent un domaine tyrosine kinase. 9) Méthode selon l'une quelconque revendication 1 à 8, caractérisée en ce que l' on compare la mesure obtenue à l'étape (b) avec celle obtenue en réalisant la dite méthode dans l'une au moins des conditions suivantes: en l' absence de la molécule à tester, - avec une moléaule témoin, en présence ou en absence de la molécule à tester, - avec un excipient, en présence ou en absence de la molécule à tester, - avec un récepteur témoin à la place du récepteur ou partie de récepteur isolé. ) Méthode selon l'une quelconque revendication 1 à 9, caractérisée en ce que l'élément bioluminescent est Ia luciférase ou un fragment bioluminescent de celle-ci. 11) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'au moins un élément fluorescent est choisi parmi une protéine fluorescente ou un composé chimique fluorescent. 12) Méthode selon la revendication 11, caractérisse en ce que la protéine fluorescente est choisie parmi dans le groupe comprenant la Protéine verte fluorescente (GFP) et ses variantes comme la Proteine jaune fluorescente (EYFP), la Protéine Bleue fluorescente (EBFP), la Protéine cyano fluarescente (ECFP) ou d'autres protéines fluorescentes telle la Ds Red ou des fragments de celles C1. 13) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisée en ce qu'au moins un élément fluorescent est choisi parmi l'Europium ou l'allophycocyanine. 14) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que la molécule susceptible de modifier l'activité tyrosine kinase du récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline est un activateur dudit récepteur. ) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la molécule susceptible de modifier l'activité tyrosine kinase du récepteur est un inhibiteur dudit récepteur. 16) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 caractérisée en ce que la molécule susceptible de modifier l'activité tyrosine kinase du récepteur est choisie parmi, un ligand, un agoniste ou un antagoniste dudit récepteur. 17) Méthode selon l'une quelconque des revendication précédentes caractérisée en ce que les molécules à analyser sont présentes dans un milieu biologique naturel et sont mises en contact avec le récepteur chimérique isolé dans ledit milieu naturel. 18) Méthode selon une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que les molécules à analyser sont issues de l' expression d'une banque d'ADNc. 19) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la détection de la fluorescence émise lors de l'étape (c) est effectuée au moyen d'un luminomètre/fluorimètre. 20) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline est choisi parmi le récepteur de l'insuline, le récepteur IGF 1, le récepteur IRR ou des variantes de ceux-ci. 21) Un récepteur chimère comportant deux hétérodimères aD, susceptible d'être mis en _uvre dans une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 caractérisé en ce que l'un des deux hétérodimères ap est associé à un élément bioluminescent ou un premier élément fluorescent et l'autre hétérodimère ap est associé à un second élément fluorescent différent du premier. 22) Un récepteur chimère selon la revendication 21 caractérisé en ce que ledit hétérodimère ap est choisi parmi un hétérodimère ap du récepteur de l'insuline, du récepteur IGF-1 ou du récepteur IRR. 23) Un récepteur chimère selon l'une quelconque des revendication 21 ou 22 caractérisé en ce que l'élément bioluminescent et/ou l'élément fluorescent sont des protéines ou des fragments de celles-ci. 24) Un récepteur chimère selon l'une quelconque des revendications 21 à 23 caractérisé en ce que l' association entre l' hétérodimère ap et l' élément bioluminescent est obtenue par la fusion de l' ADNC codant pour ledit hétérodimère ap et l' ADNc codant pour la protéine bioluminescente ou un fragment bioluminescent de celle-ci. ) Un récepteur chimère selon la revendication 24 caractérisé en ce que l' ADNC codant pour ledit hétérodimère ap est choisi parmi l' ADNc codant pour un hétérodimère ap du récepteur de l'insuline, du récepteur IGF-1 ou du récepteur IRR. 26) Un récepteur chimère selon l'une quelconque des revendications 24 ou 25 caractérisé en ce que l' association entre l'hétérodimère ap et l'élément fluorescent est obtenue par la fusion de l' ADNC codant pour ledit hétérodimère ap et l' ADNC codant pour une protéine fluorescente ou un fragment fluorescent de celle-ci 27) Un récepteur chimère selon l'une quelconque des revendications 21 à 26 caractérisé en ce que l'élément bioluminescent est la luciférase de Renilla et en ce que l'élément fluorescent est la Protéine Fluorescente Jaune. 28) Un récepteur chimère selon l'une quelconque des revendications 21 ou 22 caractérisé en ce que l'élément fluorescent est associé à l'un ou l'autre ou les deux hétérodimères ap par des liaisons covalentes ou non covalentes. 29) Un ADNC comprenant l' ADNC codant pour un hétérodimère ap ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de linsuline et un ADNc codant pour un élément bioluminescent. ) Un ADNC selon la revendication 29 caractérisé en ce que l' ADNc codant pour un hétérodimère ap ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline est choisi parmi l'ADNC codant pour l'hétérodimère ap du récepteur de l'insuline, l' ADNC codant pour l'hétérodimère ap du récepteur IFG-1 ou l' ADNC codant pour l'hétérodimère ap du récepteur IRR. 31) Un ADNC selon les revendications 29 ou 30 comprenant l' ADNc codant pour un hétérodimère ap ou un fragment de celuici d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNC codant pour la Luciférase de Renilla identifié par la SEQ ID N 1 dans la liste de séquences en annexe. 32) Un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comporte un ADNC défini aux revendications 29 à 31. 33) Un vecteur d'expression selon la revendication 32 identifié par la SEQ ID N 2 dans la liste de séquences en annexe. 34) Une protéine de fusion obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc défini à l'une des revendications 29 à 31. ) Une protéine de fusion selon la revendication 34 obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc comprenant l' ADNc codant pour le récepteur de l'insuline et l'ADNc codant pour la Luciférase de Renilla identifiée par la séquence SEQ ID N 3 dans la liste de séquences en annexe. 36) Un ADNc comprenant l' ADNc codant pour un hétérodimère ap ou un fragment de celui-ci dun récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour un élément fluorescent 37) Un ADNC selon la revendication 36 caractérisé en ce que 1' ADNC codant pour un hétérodimère ap ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline est choisi parmi l'ADNc codant pour l'hétérodimère ap du récepteur de l'insuline, l'ADN codant pour l'hétérodimère ap du récepteur IFG-1 ou l'ADNc codant pour l'hétérodimère ap du récepteur IRR. 38) Un ADNC selon les revendications 36 ou 37 comprenant l'ADNc codant pour un hétérodimère ap ou un fragment de celuici d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNC codant pour la protéine fluorescente jaune (EYFP) identifié par la SEQ ID N 4 dans la liste de séquences en annexe. 39) Un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comporte un ADNc défini à l'une quelconque des revendications 36 à 38. 40) Un vecteur d'expression selon la revendication 39 identifié par la SEQ ID N 5 dans la liste de séquences en annexe. 41) Une protéine de fusion obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc défini à l'une des revendications 36 à 38. 42) Une protéine de fusion selon la revendication 41 obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc comprenant l'ADNc codant pour le récepteur de l'insuline et l'ADNC codant pour protéine fluorescente jaune (EYFP) identifice par la séquence SEQ ID N 6 dans la liste de séquences en annexe. 43) Une cellule génétiquement modifiée par transfection avec soit un vecteur d'expression comportant la séquence d'un ADNC défini à l'une revendications 29 à 31 soit avec un vecteur d'expression comportant un ADNc défini -' à l'une quelcouque des revendications 37 à 38 pour exprimer un récepteur chimère soit avec ces deux vecteurs. 44) Une cellule selon la revendication 43 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi des cellules ovariennes de Hamster Chinois (CHO: Chinese Hamster Ovary cells), des cellules HEK 293 (Human Embryonic Kidney Cells Cellules embryonnaires Humaines de Rein) ou des Cellules humaines HeLa. ) Utilisation de la méthode selon l'une queleonque des revendications 1 à 2 0 pour le criblage à haut débit des molécules utiles pour la prévention et/ou le traitement de pathologies liées aux défaillances de l'action de l'insuline sur ses tissus cibles ou aux défaillances partielles ou totales de sécrétion d'insuline. 46) Utilisation selon la revendication 45 pour la détection de molécules utiles pour la prévention et/ou le traitement d'une pathologie choisie parmi le diabète, l'obésité, les pathologies lices à la résistance à l'insuline. 47) Un support solide caractérisé en ce qu'il comporte un récepteur chimère selon l'une quelconque des revendications 21 à 28. 48) Un support solide selon la revendication 47 caractérisé en ce que le récepteur chimère est fixé sur ledit support par des liaisons covalentes ou non covalentes. 49) Un support solide selon les revendications 47 ou 48, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe de supports comprenant les supports inorganiques tels que le métal, le verre, le silicium et les supports organiques à base de polymères ou de copolymères tels que le polystyrène, le polyéthylène, le polycarbonate, la polyacrylamide, le nylon ou le latex. ) Un support solide selon l'une quelconque des revendications 47 à 49, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe des supports sous forme de particules y compris des particules colloïdales, des bandelettes, de microplaques, des tubes. 51) Un support solide selon l'une quelconque des revendications 47 à 50, caractérisé en ce qu'il est sous une forme lyophilisée. 52) Un support solide selon l'une quelconque des revendications 47 à 50, caractérisé en ce qu'il est sous une forme congelée. 53) Un kit pour la détection d'activateurs ou d'inhibiteurs des récepteurs de la famille du récepteur de l'insuline comprenant au moins un support solide selon l'une quelconque des revendications 47 à 52, éventuellement le substrat d'un élément bioluminescent, et une notice d'utilisation.