FR 2823675 A1 20021025 FR 0105319 A 20010419 permet de fabriquer des cales et pivots d'arthrodèse. 1 2823675 Biomatériaux avec recouvrements bioactifs L' invention concerne des biomatériaux comportant un noyau recouvert de couches alternces de polyélectrolyLes qui servent dTancrage pour fixer des molécules biologiquement actives. Le revêtement de matériaux à l' aide de multicouches de polyclectrolyLes permet dTélaborer des nanoarchitectures d'intérét pour fixer des molécules biologiquement actives. Ces constructions présentent l'avantage dTêtre faciles à élaborer et leur fabrication peut être adaptée, pratiquement, à tout type de surface, quelle que soit sa forme, dès lors qu'elle présente au moins quelques charges. On a ainsi rapporté la fixation dTanticorps sous deux bi-couches de sulfonate de polystyrène/polyallylamine et observé un malntien de la réactivité vis-à-vis d'antigènes (voir référence bibliographique (1) en fin de description). D'autres travaux rapportent la fixation d'enzymes (2). Il S T agi-t toutefois de molécules de poids moléaulaire élevé et chargé. Ainsi, alors que l'art antérieur rapporte l'intégration de molécules chargées, de poids moléaulaire élevé, allant par exemple de 12400 (cytochrome) à 240000 environ (catalase), les inventeurs ont montré que des molécules de petite taille, le cas échéant non chargées pouvaient être fixées ou incluses dans des multicouches, tout en conservant leur activité. Les travaux réalisés ont permis d'établir que des cellules en culture pouvaient répondre à de petites molécules biologiquement actives, telles que des hormones, immobilisoes à la surface ou incorporées dans les multicouches de polyélectrolytes. Il est apparu que ces molécules, lorsqu'elles sont lices à la couche de surface des polyélectrolytes, conservent la même activité biologique que celle observée avec la moléaule libre. De plus, l'activité à long terme est maintenue, lorsque la molécule est noyée à 2 2823675 l'intérieur de l' architecture multicouche, et ce même en dessous de 50 couches, son activité à court terme dépendant de la profondeur dTintégration. L T invention a donc pour but de fournir de nouveaux biomatériaux recouverts de multicouches de polyélectrolyLes/ avec une ou plusieurs molécules biologiquement actives ancrces, de manière irréversible, aux couches de polyélectrolytes, dont 1 T activité peut être contrôlée et qui, généralement, peuvent être stockés sous forme sèche tout en conservant leur activité. L T invention vise également un procédé d T obtention de tels biomatériaux, de mise en _uvre aisée. LTinvention a aussi pour objet la mise à profit de ces biomatériaux dans le domaine médical avec 1 T avantage, notamment, de pouvoir contrôler leur activité biologique dans une application donnée. Les travaux réalisés ont montré que les cellules répondent de manière spécifique aux petites molécules. Les biomatériaux de 1 T invention comportant un noyau, par exemple un support solide inerte ou de type gel, recouvert de couches alternées de polyélectrolyLes de charges opposées, et sont caractérisés en ce quTils comprennent une ou plusieurs molécules biologiquement actives, de poids moléculaire inférieur à 10 000 Da environ, cette ou ces molécules étant fixces à une ou plusieurs couches de polyclectrolyLes. De manière inattendue, comme illustré dans les exemples donnés ci-après, les cellules en contact avec ces recouvrements bioactifs peuvent interagir avec les molécules situées à la surface et/ou ncyées dans les multicouches. L' invention vise des biomatériaux dans lesquels les moléaules sont fixces à la surface. En variante, les biomatériaux de l' invention comportent les molécules biologiquement actives ancrées à l'intérieur des multicouches et éventuellement également présentes en surface. 3 2823675 Des biomatériaux spécialement avantageux renferment ces molécules biologiquement actives à des profondeurs différentes dans l' architecture multicouche, ce qui permet leur libération con-trôlée dans le temps et également leur protection. On notera que la réponse à court terme des cellules peut alors être modulée en faisant varier la position des molécules biologiquement actives dans les multicouches. L' invention vise ainsi des recouvrements bioactifs dans lesquels les poptides blologiquement actifs ont un poids moléculaire inférieur à 5000 Da, voire à 2000 Da, ou même à 1000 Da. Dans ces différents modes de réalisation de l' invention, les moléaules peuvent être identiques ou différentes. I1 s'agit plus spécialement de peptides ou de polypeptides, comme des hormones peptidiques, des cytokines, des facteurs de croissance, ou encore de dérivés dacides aminés permettant en particulier le greffage sur les polyélectrolytes. Des résultats particulièrement satisfaisants sont obtenus avec des moléaules de poids moléculaire de moins de 200 Da comme la O-méthylsérotonnine. La fixation des moléaul es biologiquement act ive s s'effectue par couplage cavalent ou, lorsque la molécule est chargée, par association. Les polyélectrolyLes des multicouches sont choisis selon la biocompatibilité souhaitée pour une application donnée, le temps de demivie des multicouches. Ces polyélectrolyLes peuvent être blodégradables ou non-biodégradables. Ils sont par exemple constitués de couches alternées de polylysine et d'acide polyglutamique. De manière avantageuse, ces biomatériaux peuvent être stockés plusieurs semaines tout en conservant leur activité. On procèdera avantageus ement à l eur séchage au pré al able et à un traitement W. Les recouvrements selon l' invention sont avantageusement obtenus selon les techniques classiques utilisées pour effectuer des architectures multicouches de polyélectrolyLes. Les biomatériaux de l' invention sont particulièrement précieux pour des applications dans le domaine médical. Ils permettent en particulier d'élaborer des systèmes de modulation cellulaire complexes à la surface des biomatériaux. L' invention vise ainsi des systèmes dans lesquels des séquences d'adhésion spécifiques sont incorporces afin de cibler certains types cellulaires, de manière à induire les passages souhaités de transduction de signal, et la diEférenciation cellulaire comme la mélatonine et simultanément d'empêcher lTadhésion dTorganismes indésirés et de réduire des inflammations avec des peptides anti-bactériens 1S ou des facteurs inhibiteurs de l'adbésion de micro-organismes. L' invention vise également des constructions avec un réscau biomatériau matrice extracellulaire après pénétration des cellules dans les multicouches par extension de processus cellulaires utilisables en thérapies localisses, par exemple sous forme de paCchs, ou de manière générale d'implants, afin de relarguer les produits thérapeutiquement actifs comme les hormones ou autres. Les recouvrements bioactifs selon l' invention présentent également un grand intérét pour fabriquer des tissus in vi tro, qui seront ensuite implantés. I1 est ainsi possible de reconstruire un tissu sur un support biodogradable, tel qu'un matériau solide inerte ou un gel. Des facteurs de différenciation sont ajoutés si nécessaire et les cellules cultivées. 0 De telles surfaces bioactives modulables constituent des outils permettant de réaliser des matériaux d' implants, en particulier pour des applications orÉhopédique ou des utilisations vasculaires, qui peuvent étre adaptées au site d'intégration. s 2823675 D'autres caractéristiques et avantages de l' invention sont donnés dans les exemples qui suivent, qui portent, à titre illus-tratif, sur l'activité de 2 analogues de synthèse de 1'-mélanocortine ou -MSH, sur un modèle constitué par des cellules de mélanome murin. L'-MSH est un stimulateur puissant de la mélanogénèse chez les mélanocytes de mammifères et dans les cellules de mélanome. Dans les mélanocyLes ou les mélanomes, 17-MSH se lie à un récepteur spécifique à la surface cellulaire, le récepteur de mélanocortine-1 (MC1-R) et induit l' activation de la tyrosinase, enzyme clé pour la formation de mélanine, par stimulation d'adénylate cyclase et de protéine kinase A. L'-MSH est aussi un puissant agent antiinflammatoire dans le cerveau et dans la périphérie et se fixe sur le récepteur de 1: mélanocortine des macrophages ou monocyLes. L'a-MSH constitue ainsi une moléaule d'intérêt comme modèle pour l'étude des effets de transduction de signal de l'AMP cyclique jusqu'au produit final, constitué dans ce cas par la mélanine, pigment quantifiable. Les 2 analogues sont le CP1 et le CP2. I1 s'agit des dérivés de [Nle4,D-Phe7]-MSH (1-13) et de [Nle4,D-Phe7]--MSH (4-10), obtenus par greffage de la séquence HS-CH2- CH2-CO. Ces dérivés d'-MSH sont liés par cevalence à de la polylysine (PLL) dans une architecture de multicouches 2i alternées de polylysine et d'acide polyglutamique (PGA). Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à , qui représentent, respectivement, la figure 1: l' image AFM dTune multicouche de (PEI- PSS/PAH) 2 PGA/PLL-CP1-(PGA/PLL)- sur une surface de silice. Cette image a été obtenue sur un Nanoscope III (Digital Instruments, Santa BarLara, Californie) équipé d'un cantilever en nitrure de silicTum (Modèle MLCT-AUHW Park Scientific, Sunnyvale, Californie), ayant une constante de ressort de 0,03 6 2823675 N/m. LTAFM est effectué en mode de contact de force constant et le scan de la surface est effectué avec soln en appliquant la force la plus petite possible pour éviter d T endommager les différents échantillons. Une vitesse de scan entre 2 et 4 Hz a été appliquce, avec une résolution plxel des images de 512 x 512 pixels. La taille des images est de 8 x8,um2 et l T échelle z est de 50 nm2. Les rms des valeurs z sur une surface de 25,um2 est typiquement de 6 nm. - la figure 2: la teneur totale en cAMP dans les cellules B16-F1 cultivées sur des pellicules de multicouches contenant 1 T analogue CP2 de a-MSH. Les cellules sont déposoes sur des plaques à 24 puits (Nunc) sur des pellicules de multicouches à une densité de 40 000 cellules/puits. 2 heures après l T ensemencement, les cellules sont détachées et la teneur totale en cAMP est mesurée par un essai immunoenzymatique. Les résultats sont des moyennes de trois déterminations d T une expérience représentative. Cette expérience est répétée 2 fois avec des résultats très similaires. a: plastique + [NDP] - -MSH; b: plastique; c: PEI (PSS/PAH)2 -(PGA/PLLCP2); d: PEl-(PSS/PAH) 2- (PGA/PLL-CP2) (PGA/PLL)1o; e: PEl-(PSS/PAH) 2(PGA/PLL-CP2)-(PGA/PLL) 25; f: PET-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)-(PGA/PLL)1o; g: PET-(PSS/PAH) 2 (PGA/PLL)-(PGA/PLL)25. 2: La figure 3: la production de mélanine dans des cellules B16-F1 en contact avec des pellicules multicouches contenant un analogue de a-MSH. Les cellules sont déposces sur des plaques à 24 puits (Nunc) sur des pellicules en multicouches à une densité de 25 000 cellules/puits. La teneur en mélanine (exprimoe en unité arbitraire) a été mesurée 4 j ours après. Les recouvrements a à g sont comme indiqués ci-dessus en rapport avec la figure 2. 7 2823675 - La figure 4: la production de mélanine dans des cellules B16-F1 en contact avec des multicouches prélavées avec du surnageant de cellules. - Avant le dépôt des cellules, les multicouches sont prélavées 24 h avec un surnageant de cellules B16-F1 cultivées pendant 2 h dans du MEM sans sérum contenant 0,2% de BSA. Les cellules sont déposées sur des plaques à, 24 puits, sur des multicouches, à une densité de 25 000 cellules/puits. - La teneur en mélanine (exprimée en unités artitraires) a été mesurée 4 j ours après. a: PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL-CP1); b: PEI-(PSS/PAH)2 (PGA/PLL-CP1)-(PGA/PLL) 5; c: PEl-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL-CP1)- (PGA/PLL)lo; d: PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL-CP1)-(PGA/PLL) 20 - la figure 5: la production de mélanine dans des cellules B16-F1 en contact avec des pellicules multicouches contenant un analogue de a-MSH recouvert de couches de (PSS/PAH). Les cellules sont déposées sur des plaques à 24 puits (Nunc) sur des pellicules en multicouches à une densité de 25 000 cellules/puits. La teneur en mélanine (exprimée en unité arUitraire) a été mesurce 4 jours après. a: plastique; b: PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL-CP1)- (PGA/PLL) 5; c: PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL-CP1)-(PGA/PLL)1o; d: PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)-(PGA/PLL)1o; e: PEI-(PSS/PAH)2- (PGA/PLL-CP1); f: PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL-CP1)-(PSS/PAH) 4 (PGA/PLL)2; g: PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL-CP1)-(PSS/PAH)- (PGA/PLL)2. Synthèse de conjugués PLL-peptide Les dérivés peptide-PLL sont préparés par conjugaison à 1 r aide de ponts disulLures. La PLL est tout dTabord fonctionnalisée avec un groupe thiol, en utilisant du succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP, Sigma) (rendement:90%), puis purifice en effec-tuant plusieurs précipitations avec de 1 T isopropanol. 8 2823675 On détermine le degré de modification en faisant réagir un aliquot avec un excès de dithiothréitol et en contrôlant la 2- thiopyridone à 343 nm. Les peptides contenant des groupes thiol (CP1 et CP2) sont ajoutés à une solution de PLL derivatisée avec de la dithiopyridine, et maintenus sous argon. On effectue des mesures d' absorption W de 2-thipyridone pour contrôler la réaction. Pour réduire la compétition avec la réaction de dimérisation du peptide, on ajoute 2 équivalents molaires de peptide renfermant contenant du thiol, par groupe dithiopyridine. On obtient les produits coujugués PLL-CP2 et PLL-CP1, avec des rendements respectifs de 0,43 et 0,76%. Les conjugués sont purifiés par plusieurs purifications avec de llisopropanol. Culture cellulaire Des cellules B16-F1 sont cultivoes dans un milieu de Eagle (MEM) avec des sels de Earle (Life Technologies) supplémenté avec 10% de sérum de veau f_tal inactivé à la chaleur (30 min. 56 C), 2mM de Lglutamine, 1% d'acides aminés non essentiels de mEM ((Life Technologies), 1,5% de solution de vitamine MEM (Gibco) et de la pénicilline (50 unités /ml)/streptomyaine (50 ug/ml; Gibco). La taille des cellules B16-F1 est typiquement de l T ordre de 10 x 100um2. Préparation de multicouches Les pellicules de multicouches de polyclectrolyLes sont préparces dans des plaques de 24 puits (Nunc), en procédant comme suit: On construit tout dTabord une pellicule préaurseur de (PEI-PSS/PAH) 2 PGA sur des lamelles en verre, prétraitées avec 1o 2 M SDS/ 0,12 N HCl, pendant 15 min à 100 C, par immersion alternce pendant 20 min dans des solutions de polyélectrolyLes 9 2823675 (300 ul), à des concentrations respectives de 5 mg/ml dans NaCl 1M pour PEI, PSS/PAH et 1 mg/ml pour PGA. On dépose ensuite du PLL ou PLL-CP1/2 sur la couche de PGA pendant 12h. On u-tilise une concentration en PLL-CP1/2 correspondant à 10-7 M de CP1 ou de CP2. Après aUsorption de PLL-CP1/2, on ajoute 300ul d'une solu-tion de 1 mg/ml (1M NaCl) de PLL non modifié à la solution de PLL-CP1/2, afin de saturer la surface avec du PLL. On construit alors n bicouches par dépôt alterné des polyclectrolyLes PLL et PGA (concentrations de 1 mg/ml dans NaCl 1M). Après le dépôt de chaque couche de polyélectrolyte (PEI, PSS, PAH, PGA, PLL), on rince les lamelles à 3 reprises, pendant 5 min. avec de l'eau distillée et de l'air sec. Toutes les pellicules sont stérilisées pendant 10 min par traitement W (254 nm), stockées à sec. à température ambiante et utilisces dans la semaine. Avant utilisation, on élimine par lavage toutes les multicouches avec des peptides non réticulés, si présentes, en les recouvrant de 2ml de MEM sans sérum. On change de milieu sans sérum après 3, 6, 9, 24 h, puis on ensemence les cellules. Par spectrométrie optique, avec guide d'ondes, on vérifie que le PLL-CP2 s'adsorbe sur les pellicules d'extrémité de PGA et qu'il peut être noyé dans les multicouches de PGA/PLL. La quantité de matériau déposé ainsi que l'épaisseur de la pellicule augmentent linéairement avec le nombre de bicouches en présence ou en l' absence de PLL-CP2 dans la moléaule. La quantité adsorbée et l' augmentation de l'épaisseur sont, respectivement, de l'ordre de 0, 04ug/cm2 et de 0,9 nm pour les couches de PGA et de PLL. Ces pellicules ne sont pas séchées durant la construction. L'uniformité, à l'échelle cellulaire, de la couche déposée est confirmée en réalisant les images AFM in situ, comme illustré sur la figure 1. 2823675 La production d'AMP cyclique (cAMP) et de mélanine a été utilisée pour vérifier que les analogues d'-MSH conservent leur activité biologique lorsqu'ils sont liés par covalence à PLL adsorbée ou noyée dans une multicouche. La production de cAMP peut être mesurce quelques minutes après l' activation, alors que la teneur en mélanine est mesurée après 4 j ours. Détermination de la production de cAMP Les cellules sont détachées d'un flacon de culture cellulaire avec 0,02% d'EDTA dans 5x10-3 M de PBS, 0,2M de NaCl, 2,7x10-3 M de KC1, comptées, lavées dans du MEM sans sérum et reprises dans du MEM contenant 25 mM de HEPES et 0,2% de BSA. On ensemence 400000 cellules/puits dans 1 ml du milieu décrit ci-dessus, en utilisant des plaques de culture tissulaire à 24 puits contenant les lamelles de verre recouvertes des pellicules. Après 2 h d'incuLation, on détermine la teneur totale en cAMP à 1'aide d'un kit BIOTRAK EIA (Amersham Pharmacia Biotech), en suivant les instructions du fabricant. Les expériences sont réalisces en l' absence d'inhibiteurs de phosphodiestérase. Les résultats sont donnés sur la figure 2. Les cellules de B16-F1 cultivées sur plastique et incubées avec du [NDP]--MSH libre sont utilisées comme témoins positifs et les multicouches fabriquées sans analogues d'hormone, comme témoins négatifs. Le CP2 lié à la couche extérieure de PLL apparaît complètement actif. On note que les cellules montrent une production significative de cAMP en réponse à CP2 même lorsque le peptide, lié par covalence à PLL, est noyé sous 10 bicouches de PGA/PLL. 11 2823675 La teneur totale en cAMP reste en fait pratiquement constante lorsque le CP2 se trouve jusqu T en dessous de 5 bicouches. On observe encore 15t de la réponse lorsque le CP2 est enfoui sous 25 bicouches de PGA/PLL. Essais avec la mélanine Ces essais permettent de déterminer la réponse à long terme des cellules au PLL-CP2 inclus dans l 7 architecture multicouche. 25 000 cellules sont ensemencces dans des plaques à 24 puits. Le milieu de culture cellulaire est supplémenté avec 0,3 mM de Ltyrosine. La teneur en mélanine est quantifiée en déterminant l T absorbance à 405 nm dans un lecteur de microplaques après 4 j ours d'incubation. 1: Les résultats sont donnés sur la figure 3. On n'observe pas de différence significative de quantité de mélanine produite lorsque PLL-CP2 est à la surface ou noyé jusque sous bicouches de PGA/PLL. On obtient des résultats similaires avec CP1 à la place de CP2. Pour vérifier que la diminution de la réponse des cellules selon la position de CP1 ou CP2 dans la pellicule ne résulte pas d'une dégradation des multicouches, on procède aux essais suivants. On pré-incube, pendant 12 h différentes multicouches contenant PLL-CP1 avec des surnageants cellulaires. Ces surnageants sont obtenus à partir de cellules de B16- F1, cultivées pendant 2 h dans du MEM sans sérum, contenant 0,2-c de BSA, à savoir les mêmes conditions que celles utilisées pour l'étude de la production de cAMP. Après plusieurs lavages des multicouches, les cellules B16-F1 sont cultivoes sur ces pellicules et la teneur en mélanine est évaluée après 4 j ours. Les résultats sont donnés sur la figure 4. On constate bien une production de mélanine lorsque PLL-CP1 est noyé 12 2823675 dans les multicouches. Au contraire, lorsque PLL-CPl constitue la couche extérieure, la production de mélanine décroît. Ainsi, il apparait clairement que l'incuLation avec les cellules de surnageant nTentraine pas d'élimination de s l'hormone lorsqu'elle est incuse dans les multicouches. Etude du processus de mise en contact des cellules avec l' hormone Il apparaîtrait que les cellules pénètrent dans la multicouches par extension et que 30 min environ sont suffisantes pour permettre aux cellules de pénétrer à travers ou même l0 bicouches de PGA/PLL Des essais concus pour éviter toute dogradation des pellicules ont été effectués. Ainsi, des polyélectrolyLes non biodégradables ont été incorporés dans les multicouches. Les résultats sont illustrés sur la figure 5 et montrent que l' insertion de 4 bicouches de sulphonate de polystyrène (PSS)/ polyallylamine (PAH) nTentraîne pas une réduction significative de production de mélanine. On observe que l T insertion de 8 bicouches de PSS/PAH entre PLL-CPl et la couche extérieure conduit à une réduction e 25: de la production de mélanine par les cellules de mélanome en contact avec ces surfaces. Ces résultats démontrent la capacité des cellules de trouver un passage dans les multicouches de polyclectrolyLes sans dégrader les pellicules. Les couches de PSS/PAH pourraient ainsi former une barrière selon l'épaisseur de la couche. 13 2823675 RE FERENCE S B I BL I OGRAPH I QUE S 1. Caruso et al, Langmulr 13, 3427-3433, 1997. 2. Lvov et al, J.Am.Chem.Soc. 117, 6117-6123, 1995 c 2323675 REVENDICATIONS 1. Biomatériaux comportant un noyau recouvert de couches alternées de polyélectrolytes de charges opposées, caractérisés en ce qu'ils comprennent une ou plusieurs molécules biologiquement actives, de poids moléculaire inférieur à 10 000 Da environ, cette ou ces molécules étant fixées à une ou plusieurs couches de polyélectrolytes. s 2. Biomatériaux selon la revendication 1, caractérisés en ce que les molécules sont fixées à la surface. 3. Biomatériaux selon la revendication 1, caractérisés en ce que les molécules biologiquement actives sont ancrées à l'intérieur des multicouches et éventuellement également présentes en surface. o 4. Biomatériaux selon la revendication 3, caractérisés en ce que les molécules biologiquement actifs sont à des profondeurs différentes dans l'architecture multicouche. 5. Biomatériaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que les molécules biologiquement actives sont identiques. 6. Biomatériaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que les molécules biologiquement actives sont différentes. 7. Biomatériaux selon l'une quelcouque des revendications I à 6, caractérisés en ce que les molécules biologiquement actives ont un poids moléculaire inférieur à 5000 Da, voire à 2000 Da, ou méme à 1000 Da. 8. Biomatériaux selon la revendication 7, caractérisés en ce que les molécules biologiquement actives sont des peptides, des polypeptides, ou des dérivés d'acides aminés. 9. Application des biomatériaux selon l'une quelconques des revendications 1 à 8 dans le domaine médical. 10. Biomatériaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, destinés à