FR 2824141 A1 20021031 FR 0105574 A 20010425 branche dudit pont de Wheatstone. MÉTHODE DE DÉTECTION DE LA TRANSFORMATION D'UN SUBSTRAT PAR MESURE D'UN CHANGEMENT DE pM, LES PRODUITS MIS EN _ W RE ET DÉTECTÉS SELON LADITE MÉTHODE. La présente invention concerne un procédé de détection d'une transformation chimique d'un substrat mettant en _uvre un détecteur chimique chélateur d'ions métalliques en solution, consistant à transformer un substrat en un produit présentant un pouvoir chélatant différent de celui du substrat. Le développement de nouveaux catalyseurs, en particulier d'enzymes, est en augmentation du fait de l'utilisation des méthodes de criblage combinatoires et évolutives dans lesquelles les tests sensibles de catalyse jouent un rôle essentiel (1, 2, 3). La plupart des tests enzymatiques sont basés sur la mise en oeuvre de substrats chromogènes ou fluorescents (1, 4, 5). Il est toutefois utile dans de nombreux cas de mesurer la réaction d'un substrat d'intérêt bien spécifique et non pas celle d'un dérivé chromagène ou fluorescent. Cette détection directe peut être réalisée par des méthodes instrumentales comme la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) ou la spectrométrie de masse (6), ou en utilisant des tests sophistiqués basés sur la reconnaissance spécifique substrat-protéine ou produit-protéine, comme les tests cat ELISA (7) ou QUEST (8). Plus simplement, il est aussi possible de mesurer par spectrophotométrie un paramètre physico-chimique qui correspond à l'évolution de la réaction, comme la température par thermographie-IR (9), ou, pour les réactions libérant des acides ou des bases, le pH du milieu réactionnel en utilisant des indicateurs de pH (10). Dans les techniques de l'art antérieur: - soit un substrat modifié est utilisé et dans le cas d'un criblage enzymatique, cet inconvénient peut induire de faux-positis et des faux-négatifs, ou - soit des substrats spécifiques sont utilisés et dans ce cas, ces techniques sont complexes et lourdes à mettre en _uvre pour du criblage à haut déLit. La présente invention vise à palier ces inconvénients en offrant une méthade de suivi d'une transformation chimique mettant en oeuvre des ions métalliques dont le changement de pM permet de détecter ou mesurer la transformation d'un substrat. Ce but est atteint grâce à une méthade de détection de la transformation chimique d'un substrat (S) en un produit (P), consistant à mesurer par tout moyen approprié un changement de pM résultant de la différence de pouvoir chélatant entre le substrat (S) et le produit (P) vis-à-vis d'un ion métallique. Ainsi, on entend par détection, la mesure de la transformation chimique et plus particulièrement la mesure d'une différence de pouvoir chélatant entre P et S. Cette mesure consiste en la mesure d'un pM, o le pM = log[M], [M] correspondant à la concentration en ions métalliques libres. Cette mesure peut être réalisoe par tout moyen approprié. Avantageusement, la méthode de l' invention est mise en _uvre avec un détecteur chimique (L), aussi désigné ligand (L), dont on suit les modifications des propriétés spectrales. L' invention se rapporte donc plus particulièrement à une méthode de détection de la transformation d'un substrat (S) en un produit (P), consistant à mesurer le changement des propriétés spectrales d'un détecteur chimique (L), chélateur d'un ion métallique, résultant d'échanges d'ions métalliques: - entre le produit (P) et le détecteur chimique (L,) lorsque le produit (P) présente un pouvoir chélatant supérieur à celui du substrat (S) (figure 2), ou - entre le substrat (S) et le détecteur chimique (L), lorsque le substrat (S) présente un pouvoir chélatant supérieur à celui du produit (P) (figure 1). Cet échange d'ions métalliques consiste: - en ce que le détecteur chimique (L) entre en compétition avec le substrat (S) pour l' ion métallique lorsque le substrat (S) possède un pouvoir chélatant plus fort que le produit (P) (figure 1), ou - en ce que le produit (P) entre en compétition avec le détecteur chimique (L) pour l'ion métallique lorsque le produit (P) possède un pouvoir chélatant plus fort que le substrat (S) (figure 2). Ainsi, le substrat (S) et le produit (P) présentent des pouvoirs chélatant différents. On peut alors distinguer: - Le cas o le substrat (S) a un pouvoir chélatant supérieur à celui du produit (P), et notamment le cas o le produit (P) n'a pas de pouvoir chélatant (figure 1). Dans cette forme de mise en _uvre de la méthode de l' invention, le ligand (L) entre en compétition avec le substrat S pour la chélation des ions métalliques. - Le cas o le produit (P) a un pouvoir chélatant supérieur à celui du substrat (S) et notamment, le cas o le substrat (S) n'a pas de pouvoir chélatant (figure 2). Dans cette forme de mise en _uvre de la méthode de l'invention, le produit (P) entre en compétition avec le ligand (L) pour la chélation des ions métalliques. Le pouvoir chélatant du détecteur chimique (L) est choisi de manière à ce que le produit (P) puisse entrer en compétition avec le ligand (L) ou que le ligand (L) puisse entrer en compétition avec le substrat (S) pour les ions métalliques, suivant respectivement que le produit (P) ou le substrat (S) possède le pouvoir chélatant le plus fort. Avantageusement, le pouvoir chélatant du détecteur chimique (L) est supérieur à celui du substrat (S) ou du produit (P) de facon à réaliser la méthode de l' invention avec des quantités faibles de détecteur chimique (L). Ainsi, il peut être envisagé lorsque le détecteur chimique (L) est plus chélateur que le substrat (S) ou le produit (P), que la concentration en substrat (S) ou en produit (P) est plus importante que celle du détecteur chimique, avantageusement 10 à 200 fois supérieure, de préférence 50 à 100 fois supérieure et tout préférentiellement 10 fois supérieure à celle du détecteur chimique (L). / La concentration en ion métallique (M) est de préférence comprise entre la concentration en détecteur chimique (L) et la concentration en substrat (S). La concentration en ion métallique correspond avantageusement à 0,5 à 50 fois la concentration en détecteur chimique, préférentiellement de 2 à 10 fois et tout spécialement de 2 à 5 fois. I1 convient de remarquer que les ions métalliques sont présents en concentration beaucoup plus faible (par exemple de l'ordre de 4 micromolaire) que la composante chélatante (par exemple de l'ordre de 1 à 10 millimolaires)ou que la composante non chélatante (par exemple de l'ordre de 0,1 à 3 millimolaires). Ainsi, l'ion métallique, même s'il chélate le substrat (S) ou le produit (P), il ne séquestre pas ceux-ci de manière significative, puisque 98% de S ou P au moins reste libre en solution. La méthade de l' invention est remarquable en ce qu'elle s'applique à toute transformation chimique o une différence de pouvoir chélatant envers un ion métallique existe entre le substrat (S) et le produit (P) de la transformation. Ainsi, selon la méthode de l' invention, ni le substrat (S), ni le produit (P), ne sont directement détectés. La transformation de S en P est détectée grâce au détecteur chimique (L), avec lequel (S) et/ou (P), suivant leur pouvoir chélatant échange des ions métalliques suivant l'équilibre suivant: ML _ (MP et/ou MS) + L O: S représente un substrat, qui peut être toute molécule chimique, dont le pouvoir chélatant est différent de celui du produit résultant de la transformation chimique du substrat. Il s'agit notamment de substrat spécifique, comme l'acide phytique pour les phyLases ou des protéines entières pour les protéases. Ce substrat peut présenter des propriétés énantiosélectives. Les substrats n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les produits correspondants. P représente le produit issu de la transformation chimique de S et présentant un pouvoir chélateur différent de S. Comme les substrats, les produits nont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les substrats correspondants. L représente un détecteur chimique, aussi désigné " sensor pM ", correspondant à tout ligand capable de chélater les ions métalliques en solution tel que chélation du métal par le détecteur chimique donne un changement de pM mesurable par toute méthode appropriée comme par exemple un changement de propriété spectrale du détecteur. Le sensor pM possède un pouvoir chélatant tel qu'il puisse y avoir des échanges d'ions métalliques entre le produit (P) et le ligand (L) ou le substrat (S) et le ligand (L) selon respectivement que le produit (P) ou le substrat (S) possède le pouvoir chélatant le plus fort. Comme indiqué précédemment, le pouvoir chélatant du détecteur chimique (L) est avantageusement supérieur à celui du substrat (S) ou du produit (P) de façon à réaliser f la méthode de l' invention avec des quantités faibles de détecteurs chimiques. Le détecteur chimique (L) peut correspondre à un dérivé de fluorecoine ou tout autre ncyau fluorescent substitué par un groupement chélatant. ML représente le complexe métal-ligand présentant des propriétés spectrales différentes de L. MS représente le complexe métal-substrat. MP représente le complexe métal-produit. Lesdits complexes ML, MS et MP n'ont pas forcément une stochiométrie de 1/1. On entend par transformation, toute(s) réaction(s) spontanée(s) ou non capable(s) de transformer un substrat (S) en un produit (P) posséJant un pouvoir chélatant différent de (S). Ainsi, la transformation peut être réalisée au moyen de plusieurs réactions chimiques séquentielles, simultanées ou non. La transformation est avantageusement effectuée par un réactif chimique ou un catalyseur comme une enzyme. A titre d'exemple d'enzymes capables de catalyser la transformation détectée par la méthode de l' invention, on peut citer les amidases, les acylases, les protéases, les phyLases. Ainsi, la méthode de l' invention permet de détecter la transformation du substrat (S) en produit (P) par un catalyseur de ladite transformation contenu dans un échantillon. Cet échantillon peut correspondre à un prélèvement susceptible de contenir un réactif chimique ou un catalyseur. Cet échantillon peut être d'origine procaryote ou eucaryote. Il peut être d'origine animale, végétale, virale ou humaine. Avantageusement, cet échantillon correspond à un prélèvement ou à un isolement microbiologique susceptible de contenir des bactéries ou des champignons ou des microalgues. Cet échantillon pourra être traité par des techniques connues du blologiste moléculaire, comme le traitement adéquat pour obtenir une banque génomique. On entend par détection, la mesure de la transformation chimique et plus particulièrement la mesure d'une différence de pouvoir chélatant entre P et S grâce au détecteur chimique. Cette mesure est avantageusement réalisoe en suivant les modifications des propriétés spectrales du détecteur chimique (L). Avantageusement, le détecteur chimique (L) est fluarescent ou absorbe dans l' W et dans le visible. Il peut s'agir par exemple d'un détecteur chimique fluorescent choisi dans le groupe comprenant: la quinacridone, la calcéine, la calcéine blue, ou leurs dérivés. Un première forme de mise en _uvre en une seule étape de la méthade de l' invention consiste: a) à mélanger le substrat (S) avant sa transformation en produit (P) avec le détecteur chimique (L) et un ion métallique qui sera chélaté par ladit substrat (S) ou ledit détecteur chimique (L)lors du mélange, dans des conditions permettant la transformation du substrat (S) en produit (P). Au cours de la transformation, l' ion métallique pourra être chélaté par le substrat (S) ou le produit (P) ou encore le détecteur chimique (L) en fonction de leur pouvoir chélatant. Cette forme de mise en uvre en une seule étape ou en temps réel est réalisée en ajoutant le métal en solution dans un solvant à un échantillon susceptible de contenir un réactif chimique ou un catalyseur permettant la transformation du substrat, le détecteur chimique et (iii) le substrat. L'équilibre de chélation est très rapide puisque la chélation du métal libre se fait très rapidement en solution. L'homme du métier est à même de définir les conditions particulières de réalisation de la transformation, notamment en utilisant un cosolvant pour le détecteur chimique ou le substrat, étant entendu que ce cosolvant ou le tampon est compatible avec les ions métalliques et ltactivité responsable de la transformation. I1 convient bien entendu de s' assurer que le détecteur chimique et le métal n'ont pas d'effet dinLibition sur lactivité responsable de la transformation. La vitesse de réponse du détecteur chimique pM (chélation/déchélation) limite les vitesses maximales observables. Si on fait une étude de la cinétique sur une euzyme connue, la concentration d'euzyme doit être assez faible de façon à ce que l'échange d' ions métalliques soit plus rapide que la transformation du produit (S) en produit (P). Ces conditions peuvent être vérifiées facilement par la seconde forme de mise en _uvre de l' invention ci-dessous. Cette seconde forme de mise _uvre en deux étapes ou par mesure au point final consiste: a) à aj outer, après la transformation du substrat (S) en produit (P), le détecteur chimique (L) et un ion métallique qui sera chélaté par ledit produit (P), ladit détecteur (L) ou ledit substrat (S) s'il n'est pas épuisé, en fonction de leur pouvoir chélatant respectif. Ainsi, la transformation du substrat (S) en produit (P) est effectuée, dans cette deuxième forme de mise en _uvre de la méthode de l' invention: - soit en l'absence du détecteur chimique et de lion métallique, - soit en l 'absence du détecteur chimique ou de lion métallique, de facon à ce que la détection soit réalisée après la transformation de (S) en (P), en ajoutant respectivement: - soit le détecteur chimique et l'ion métallique, - soit le détecteur chimique ou l'ion métallique qui était absent. Cette seconde forme de mise en _uvre est réalisée (i) par la transformation, puis (ii) après un temps de réaction, soit en ajoutant une partie du volume de la réaction à une solution du détecteur chimique et de l' ion métallique, soit en ajoutant une solution du détecteur chimique et de l'ion métallique au mélange de la réaction. Dans les deux formes de mise en _uvre ci dessus, en une ou deux étapes, on enregistre les changements spectraux du détecteur chimique par rapport à la situation à t=0 qui aura été déterminée au préalable dans une mesure test, par exemple par prélèvement au départ de la réaction ou au cours de la réaction. Dans le cas o le détecteur chimique est un détecteur fluorescent, la méthade de l' invention comprend dans les deux modes de réalisation cidessus, après l'étape (a), les deux étapes suivantes: b) on mesure tout changement dans le spectre fluorescent dudit détecteur chimique (L) de manière à détecter la transformation du substrat (S) en produit (P) en fonction de l'état de chélation du détecteur (L). L'homme du métier est à même d'adapter les concentrations en ions métalliques, en substrat (S) et en détecteur chimique (L) ainsi que les pouvoirs chélatants de S. P et L, tels que l'on puisse mesurer le changement de pM résultant de la différence de pouvoir entre le substrat (S) et le produit (P) vis-à-vis d'un ion métallique. Une calibration ou une mise au point des concentrations en ligand (L), substrat (S), produit (P) et en ion métallique est de préférence réalisée comme montré à la figure 5 en annexe. Les concentrations sont choisies en fonction de la courbe obtenue, soit dès que l'on atteint un maximum de fluorescence. La méthode de l' invention peut être réalisée avec divers ions métalliques comme ceux choisis dans le groupe comprenant les ions des métaux suivants Cu. Ni, Co, Zn, Mg, Ca, Na, K, tel que la chélation du métal par le détecteur chimique (L) permet de mesurer une variation du degré de chélation entre le substrat (S) et le produit (P). On préfère les ions métalliques du cuivre, du nickel et du cobalt. Avantageusement, l'ion métallique est le cuivre et le détecteur chimique est la calcéine. La méthode de l' invention est remarquable en ce qu'elle permet également l' identification et l'isolement de nouveaux réactifs chimiques ou catalyseurs susceptibles de transformer le substrat (S) en produit (P). En conséquence, linvention a également pour objet l'utilisation de la méthode de détection d'une transformation chimique, comme décrit précédemment, pour l' identification de nouveaux réactifs chimiques ou de nouveaux catalyseurs ou de l'activité nouvelle d'un catalyseur connu. Pour la blocatalyse, il est indispensable de cribler des enzymes répondant au mieux aux impératifs industriels notamment de rendements, dénantiosélectivité, de coût, etc. I1 est donc indispensable de disposer de tests de criblage permettant d'utiliser directement le substrat spécifique d'intérêt et non un dérivé de celui-ci. La méthode de l' invention peut être utilisée pour le criblage, notamment à haut déLit, d'un catalyseur à partir d'une banque d' expression in vivo ou in vi tro. Ces banques peuvent par exemple être préparéss à partir de microorganismes ou de microalgues présentant préférentiellement des propriétés extrêmophiles. La méthade de l' invention peut également être utilisée pour identifier des catalyseurs présentant une activité différente par rapport à une activité de départ. Ces catalyseurs seront par exemple des produits de mutagénèse dirigée ou d'évolution dirigée. La méthode de l' invention permet d'identifier de nouveaux catalyseurs comme des enzymes ou l'activité nouvelle d'un catalyseur connu. L' invention a donc pour objet un nouveau catalyseur identifié par la méthode de l' invention. L' invention est aussi utile pour détecter un substrat (S) en détectant sa transformation en produit (P). Cette utilisation est tout particulièrement destinée à suivre la formation d'un substrat (S) à partir d'une substance ou d'un mélange de substances initiales. L' invention a donc pour objet un procédé de détection d'un substrat (S) consistant à détecter sa transformation en produit (P). A titre, d'exemple, la méthode de linvention permet de détecter la transformation de la N-acetyl-L méthTonine en L-méthionine par une acylase, la transformation de la L-leucinamide en L-leucine par une aminopeptidase et l'acylation de la L-méthionine. D'autres avantages et caractéristiques de l' invention apparaîtront dans les exemples de mise en _uvre du procédé de l' invention qui suivent o il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels: La figure 3 représente le principe général d'un test euzymatique fluorescent utilisant un détecteur fluarescent orange (3) obtenu à partir de quinacridone (1). La figure 4 représente des réactions enzymatiques testées en utilisant un détecteur fluorescent orange (3). La figure 5 rapporte la réponse fluerescente du détecteur 3 (1 M) en présence d'ions métalliques à partir de la simulation de la conversion des substrats suivants S: () N-acétyl-L-méthTonine (10 mM) en L- méthionine comme produit P. avec 2 M Cu2+ dans 5 mM de bis-tris pH 7,2, eau/DMSO 60/40; () L-leucinamide (5 mM) en L leucine comme produit P. avec 2 M Cu2+ dans 5 mM tris pH 9,0, eau/DMSO 60/40; (a) comme () avec 4 M Ni2+ à la place du cuivre. Mesures effectuées à 26 C avec em = 580 + nm (\ex = 485 + 20 nm). La figure 6 représente le test de fluarescence de l'acylase à pH 7,2. L'hydrolyse de N-acétyl-L-méthionine en L-méthionine par acylase I (aux concentrations indiquées en g.mL1) est suivie avec le ligand 3 en présence de Cu2+. Courbe principale: augmentation de la fluorescence au cours du temps à em = 580 + 50 nm (\ex = 485 + 20 nm). Courbe insérée: représentation du taux maximal apparent en M.s-1 (portion la plus inclinée de chaque courbe après conversion des donnses de fluorescence en concentration de produit conformément aux courbes de calibrage de la figure 5) par rapport à la concentration en enzyme en g.mL1. Mesures effectuées à 26 C dans 5 mM tampon aqueux bis-tris pH 7,2 DMSO 40% v/v, et 1 M de 1'indicateur 3, 2 M CuC12, mM N-acétyl-L-méthionine. La figure 7 représente le test de fluorescence de l'aminapeptidase à pH 9. L'hydrolyse de L-leucinamide en L-leucine par l'aminopeptidase (aux concentrations indiquées en g.mL1) est suivie avec le ligand 3 en présence de CU2+. Courbe principale: augmentation de la fluorescence au cours du temps à em = 580 + 50 nm (\ex = 485 + 20 nm). Courbe insérée: représentation du taux maximal apparent en M.s-1 (portion la plus inclinée de chaque courbe après conversion des données de fluorescence en concentration de produit conformément aux courbes de calibrage de la figure 5) par rapport à la concentration en enzyme en g.mL1. Mesures effectuées à 26 C, em = 580 + 50 nm (XeX = 485 + 20 nm) avec 1 M de l'indicateur 3, 2 M CuCl2, 5 mM L-leucinamide, dans 5 mM tampon Tris pH 9, 0, DMF 40% v/v. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant le Ni2+ (4 M NiCl2) comme ion métallique rapporteur. La figure 8 représente un test de fluorescence pour l'acylase à pH 7,2 dans le cadre de lhydrolyse de N acéCyl-méthionine en L-méthTonine. La figure 9 représente un test par UV pour l'acylase à pH 7,2 dans le cadre de lhydrolyse de N acéCyl-méthionine en L-méthionine. La figure 10 représente un test de fluorescence pour l'amionopeptidase à pH 9 dans le cadre de lhydrolyse du L-leucinamide en L-leucine. La figure 11 représente un test de fluorescence pour les peptidases à pH 7,2 dans le cadre d'un test d'hydrolyse du sSA. La figure 12 représente un test de fluorescence en présence d' agents d'acéCylation à pH 8,8 dans le cadre de lacylation de la L-méthionine en une seule étape en présence de calccine et de Cu2+. EXEMPLE 1: Mise en _uvre de la méthode de l' invention avec un dérivé de la quinacridone. 1) Principe général de la figure 3. Le détecteur fluorescent orange 3 dérivé de la quinacridone, obtenu à partir de la quinacridone 1 via le dibromide 2, répond à la présence de faible concentrations en Cu2+ par une extinction quasi quantitative de sa fluorescence (\emmaX, = 558 nm). Cet effet peut être expliqué par la formation d'un chélate macrocyclique M3, durant laquelle l' extinction du transfert d'énergie survient en raison de la proximité de l'ion métallique et du fluorophore. Le complexe M3 contient un cycle à 17 atomes, et l'effet chélatant induit par un si large cycle devrait être faible. Or ce macrocycle est rapidement brisé par addition d'un excès d' ions métalliques, conduisant à la formation d'un complexe M23. Ceci suggère que d'autres métaux faiblement chélatant, comme des ligands bidentés, seraient capables d'entrer efficacement en compétition avec le détecteur fluorescent orange 3 pour la coordination du métal et d'induire une augmentation de la fluorescence proportionnelle à leur concentration. Cet effet permet de gérer la transformation catalysoe enzymatiquement d'un substrat non coordinant S en un produit faiblement chélatant P. 2) Matériel. Les réactifs et tampons ont été préparés dans de l'eau doionisée milliQ. Le ligand 3 a été dilué à partir d'une solution initiale à 1 mM de sel triflueroacétate dans une solution aqueuse contenant 50% d'acétonitile. La méthionine-N-acétyl et la L-méthionine, et la L-leucinamide et la Lleucine, ont été diluées à partir de solutions aqueuses initiales à 0,1M tamponnées respectivement à pH 7,2 et pH 9,0, qui correspondent au pH de l'activité optimale connue des euzymes. L'acylase I de rein de porc (Fluka 01821) a été diluée à partir d'une solution intiale à 1 mg/mL dans 5 mM bis-tris (bis(hydroxyethyl tris(hydroxymethyl)aminomethane) pH 7,2. L'aminopeptidase de la leucine du cytosol de rein de porc (Fluka 61860) a été diluée à partir d'une solution initiale à 1 mg/mL dans mM tris(tris(hydroxymethyl)aminomethane) pH 9,0. Les tests (0,1 mL) ont été réalisés à 26 C dans des puits individuels dans une plaque de microtitration 96 puits (costar) en utilisant un lecteur de plaque fluorescente Cytofluor II (Perepective Biosystems, filtres keX = 485 + 20 nm, kem = 580 + 50 nm, gain = 65). Les tests euzymatiques ont été initiés en ajoutant l'enzyme aux solutions suivantes: - acylase I: 5 mM Bis-Tris pH 7,2 dans eau/DMSO 60/40 contenant le ligand 3 (1 M), CuCl2 (2 M), N-acétyl-L-méthionine (lOmM). - aminopeptidase: 5 mM Tris (pH9) dans eau/DMF /40 contenant le ligand 3 (1 M), CuCl2 (2 M), NiC12 (4 M) L-leucinamide hydrochloride (5 mM) dans MgSO4 (0,1 mM). 3) Définition des conditions expérimentales. Deux réactions enzymatiques représentées à la figure 4 en annexe produisant des acides aminés libres comme produits chélatant (P) à partir de précurseurs amide non chélatant (S) ont été choisies pour illustrer la présente invention. I1 s'agit: - de lhydrolyse de la L-méthionine-Nacétyl en L-méthTonine par une acylase (11), et - de l'hydrolyse de la Lleucinamide en L leucine par une aminopeptidase (12). Tout d'abord, des profils simulés ont été réalisés pour convertir des substrats amide en les produits acide aminé correspondant en présence du ligand 3 et de Cu2+ ou Ni2+ comme ions métalliques rapporteurs. Dans tous les cas la solution non fluorescente du détecteur 3 contenant les ions métalliques a répondu à la conversion du substrat en produit par une forte augmentation de la fluorescence, comme montré à la figure 5, à partir de la complexation des ions métalliques par le produit de la réaction. 4) Tests euzymatiques rcels. La réaction de l'acylase I a été effectuée à pH 7,2 en présence du ligand 3 et de Cu2+. La réaction de laminopeptidase a été effectuce à pH 9,0 en utilisant à la fois Cu2+et Ni2+ comme ions métalliques rapporteurs, puisque 1 5 les deux métaux indui sent une ext inc ti on de fluorescence en complexant le ligand 3 à ce pH. Comme le montre les figures 6 et 7, dans tous les cas, une augmentation de la fluorescence dépendante du temps a été observée, indiquant que le détecteur était efficace en temps réel. Ainsi, le taux de la réaction apparente a augmenté proportionnellement avec la concentration euzymatique, indiquant que la réaction enzymatique elle-même était un processus taux limitant dans le test. Les tests ont aussi été réalisés en mélangeant des aliquots des enzymes de la réaction dans un tampon aqueux à des interval l es de temps déterminés avec le système de détecteur de l'invention, consistant en l' ion métallique rapporteur et le ligand 3 ensemble dans un solvant organique nécessaire à sa solubilisation. Dans ces conditions, l'acylase I et l'aminopeptidase ont été repectivement environ deux fois et dix fois plus actives que dans les tests en temps rcel. La différence d'activité est vraisemblablement due à la présence d'un co-solvant dans le test en temps réel, puisqu'il correspond à l'effet connu du cosolvant dans le cas de l'acylase I (11). Dans tous les cas, le test aliquoté, qui peut être appliqué en tant que point final de mesure pour le criblage à haut déLit, peut être utilisé généralement pour éviter les interférences entre lecosolvant/détecteur chimique et les euzymes qui sont testées. ) Conclusions. Les expériences ci-dessus rapportent un test de fluorescence pour des enzymatique libérant des ligands métalliques faibles comme des acides aminés comme produits de réaction. Le test est rendu possible par l'absence d'un fort effet chélatant dans le ligand tetradenté 3, qui permet à ces produits de réaction d'entrer efficacement en compétition pour la coordination du métal dans une gamme de concentration utile. Le ligand 3 peut être considéré comme détecteur chimique pM du fait de sa capacité de différentier les ions métalliques libres des ions métalliques faiblement chélatés. Le fait que la détection des produits intervient indirectement via le détecteur pM rend le test applicable à une grande variété de substrats, comme dans le cas des tests utilisant des indicateurs de pH. Le test de selon la présente invention détecte des changements structuraux difficiles à mesurer par les techniques de l'art antérieur, comme l'hydrolyse d'une amide carboxylique (-CONH2) en l'acide correspondant (-COOH). Les cinétiques d'échange de cuivre et de nickel par le ligand sont suffisamment rapides pour que le détecteur chimique pM réponde en temps réel à l'avancement de la réaction. Ainsi, les travaux rapporté ci-dessus illustrent l'utilité du procédé de l' invention car ils constituent les premiers tests de fluorescence d'une acylase et d'une aminopeptidase. EXEMPLE 2: Mise en _uvre de la méthode de l' invention avec la calcoine. La calcéine répond à la formule ci-dessous: 0 2H 0 2C NN O 2H 0 2C O 00 o 2H calcéine (Fluka no. 33170, 1g = 28.70 SFr.) 1) Hydrolyse de N-acéCyl-méthionine en L méthionine. La transformation en une seule étape de l N acéCyl-L-méthionine en L-méthionine par l'acylase est détectée à pH 7,2 en présence du ligand calcoine et de Cu2+. La figure 8 représente un test de fluorescence pour l'acylase à pH 7,2. L'hydrolyse du N-acétyl-L-méthTonine en L-méthionine par l'acylase (aux concentrations indiquées en g.mL1) est suivie avec le ligand calcéine en présence de Cu2+. Mesuré à 25 C dans 5mM aq. de tampon bis-tris pH 7,2 et 1 M calcéine, 5 M CuCl2, 10 mM N-acéCyl-L-méthionine avec kem = 450 50 nm (XeX = 530 25 nm). La réaction est aussi suivie par signal UV. La figure 9 représente un test par W pour l'acylase à pH 7,2. L'hydrolyse du N-acétyl-L-méthionine en L-méthionine par lacylase (aux concentrations indiquées en g.mLl) est suivie avec le ligand calcaine en présence de Cu2+. Mesuré à 25 C dans 5 mM aq. de tampon bis-tris pH 7.2 et 1 M calcéine, 5 M CuCl2, 10 mM N-acétyl-L-méthionine avec = 490 nm. 2) Hydrolyse du L-leucinamide en L-leucine. La détection de la transformation du L leucinamide en L-lencine par ltaminopeptidase en présence de calcéine et de Cu2+ est réalisoe en une seule étape. La figure 10 représente un test de fluorescence pour l'amionopeptidase à pH 9. L'hydrolyse de la L-leucinamide en L-leucine par l'aminopeptidase (aux concentrations indiquces en g.mLl) est suivie avec le ligand calcoine en présence de Cu2+. Mesuré à 25 C dans 5mM aq. de tampon tris pH 9 et 1 M calcéine, 10 M CuCl2, 5 mM L-leucinamide, 0. 103 mmol/l MgSO4 avec kem = 450 50 nm (\eX = 530 + 25 nm). 3) Test d'hydrolyse du BSA. La détection de lhydrolyse de la BSA en présence de calccine et de Cu2+ est réalisée en une seule étape. Un test enzymatique avec des pepdidases est alors effectué en présence de BSA (O. 5 mg/mL). Les tests ont étés contrôlés par gel SDS-PAGE. On observe une dégradation de la BSA en proportion du signal de fluorecence observé. C'est donc l'hydrolyse de la protéine par les peptiduses qui libère des acides aminés libres capable de chélater le cuivre qui provoque l 'augmentation de fluorescence. La figure 11 représente un test de fluarescence pour les peptidases à pH 7,2. L'hydrolyse du BSA par differentes enzymes (10 g.mLl) est suivie avec le ligand calcéine en présence de Cu2+. Mesuré à 25 C dans 5mM aq. de tampon bis tris pH 7,2 et 1 M calcéine, 5 M CuCl2, 0.5 mg BSA avec em = 450 + 50 nm (\ex = 530 25 nm). 4) Acylation de la L-méthionine en une seule étape en présence de calcéine et de Cu2+. Cet exemple démontre l'utilisation du senseur pM pour le cas o c'est le substrat S qui est l' agent le plus chélatant. Les conversions chimiques de la L méthionine (acide aminé libre, donc chélatant) en dérivé N acyl (acyl = MeCO ou Me3CCO), non chélatant, est suivie par la baisse du signal de fluarescence (dans cet exemple il n'y a pas d'enzyme). L'anhydride acétique donne un conversion presque immédiate à laquelle le senseur pM répond très rapidement, et il faudrait utiliser un appareil de type stopped flow pour obtenir la courbe cinétique de cette réaction. L'anhydride pivalique cause une conversion lente qu'on suit facilement sur une heure. L' acetate de vinyle ne donne aucune réaction. La figure 12 représente un test de fluorescence en présence d' agents d'acéCylation à pH 8,8. L'acétylation de la calcéine par differents réactifs (AA: anhydride acétique, AP: anhydride pivalique, AV: acétate de vinyle (2 ma) est suivie avec le ligand calcéine en présence de Cu2+. Mesuré à 25 C dans 20 ma at. de tampon borarate pH 8.8 et 1 REM calcéine, 5 RUM CuCl2, 1 ma L-méthionine avec lem = 450 nm (XeX = 530 25 nm). REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1) D. C. Demirjian, P. C. Shah, F. Moris Varas, Top. Curr. Chem. 1999, 200, 1; b) M. T. Reetz, K.-E. Jaeger, Top. Curr. Chem. 1999, 200, 31. 2) K. D. Shimizu, M. L. Snapper, A. H. Hoveyda, Chem. Eur. J. 1998, 4, 1885; b) A. H. Hoveyda, Chem. & Biol. 1998, 5, R187. 3) Demande de brevet internationals PCT publiée sons le No. WO 00/09679. 4) (a) L. E. Janes, A. C. Lowendahl, R. J. Kazlauskas, Chem. Eur. J. 1998, 4, 2324; (b) F. Badalassi, D. Wahler, G. Klein, P. Crotti, J.-L. Reymond, Angew. Chem. 2000, in press. 5) FRET substrates: (a) E. D. Matayoshi, G. T. Wang, G. A. Krafft, J. Erickson, Science 1990, 247, 954; (b) G. T. Wang, E. Matayoshi, H. J. Huffaker, G. A. Krafft, Tetrahedron Lett. 1990, 31, 6493; (c) A. Berekessel, R. Riedl, Angew. Chem. 1997, 109, 1518; d) A. Jenne, W. Gmelin, N. Raffler, M. Famulok, Angew. Chem. 1999, 111, 1383, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999, 38, 1300. 6) M. T. Reetz, M. H. Becker, H.-W. Klein, D. Stockigt, Angew. Chem. 1999, 111, 1872, Angow. Chem. Int. Ed. Engl. 1999, 38, 1758. 7) F. Taran, P. Y. Renard, C. Creminon, A. Valleix, Y. Frobert, P. Pradelles, J. Grassi, C. Mioskowski, Tetrahedron Lett. 1999, 40, 1887, 1891 and ref. cited therein. 8) S. M. Firestine, F. Salinas, A. E. Nixon, S. J. Baker, S. J. Benkovic, Nat. Biotechnol 2000, 18, 544. 9) (a) S. J. Taylor, J. P. Morken, Science 1998, 280, 267; (b) A. HolzwarCh, H.-W. Schmidt, W. F. Maier, Angew. Chem. 1998, 110, 2788, Angow. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 2647; (c) M. T. Reetz, M. H. Becker, M. Liebl, A. Furstner, Angew. Chem. 2000, 112, 1294, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2000, 39, 1236. ) (a) L. E. Janes, A. C. Lowendabl, R. J. Kazlauskas, Chem. Eur. J. 1998, 4, 2325; (b) G. T. Copeland, S. J. Miller, J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 4306; (c) F. Moris-Varas, A. Shah, J. Aikens, N. P. Nadkarni, J. D. Rozzell, D. C. Demirjian, Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 2183. 11) H. K. Chenault, J. Dahmer, G. M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6354. 1512) S. Bory, J. Dubois, M. Gaudry, A. Parquet, L. Lacombe, S. Weinstein, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 1984, 475. REVENDI CAT IONS 1) Méthode de détection de la transformation d'un substrat (S) en un produit (P), caractérisée en ce que l'on mesure un changement de pM résultant de la différence de pouvoir chélatant du substrat (S) et du produit (P) vis à-vis d'un ion métallique. 2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on mesure le changement de pM en mesurant le changement des propriétés spectrales d'un détecteur chimique (L), chélateur d'un ion métallique, résultant d'échanges d' ions métalliques: - entre le produit (P) et le détecteur chimique (L) lorsque le produit P présente un pouvoir chélatant supérieur à celui du substrat (S), ou - entre le substrat (S) et le détecteur chimique (L) lorsque que le substrat (S) présente un pouvoir chélatant supérieur à celui du produit (P). 3) Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisce en ce que le substrat (S) à un pouvoir chélatant supérieur à celui du produit (P). 4) Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le produit (P) à un pouvoir chélatant supérieur à celui du substrat (S). ) Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que le détecteur chimique présente un pouvoir chélatant supérieur à celui du substrat (S) ou du produit (P). 6) Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que la concentration en substrat (S) ou en produit (P) sont supérieures à la concentration en détecteur chimique (L). 7) Méthode selon la revendication 6, caractérisoe en ce que la concentration en substrat (S) ou en produit (P) est avantageusement 10 à 200 fois supérieure, de préférence 50 à 100 fois supérieure et tout préférentiellement 10 fois supérieure à celle du détecteur chimique (L). 8) Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que la concentration en ion métallique (M) est comprise entre la concentration en détecteur chimique (L) et la concentration en substrat (S). 9j Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la transformation du substrat (S) en produit (P) est réalisée par un catalyseur comme une enzyme. ) Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que le catalyseur est contenu dans un échantillon. 11) Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisée en ce que le détecteur chimique (L) est fluorescent ou absorbe dans l'UV et dans le visible. 12) Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, caractérisee en ce qu'elle comprend: a) le mélange du substrat (S) avant sa transformation en produit (P) avec le détecteur chimique (L) et un ion métallique, dans des conditions permettant la transformation du substrat (S) en produit (P), ledit ion métallique étant chelaté par le substrat (S). 13) Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend: a) le mélange du substrat (S) avant sa transformation en produit (P) avec le détecteur chimique (L) et un ion métallique, dans des conditions permettant la transformation du substrat (S) en produit (P), ledit ion métallique étant chélaté par le produit (P). 14) Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend: a) le mélange du substrat (S) avant sa transformation en produit (P) avec le détecteur chimique (L) et un ion métallique, dans des conditions permettant la transformation du substrat (S) en produit (P), ledit ion métallique étant chélaté par le détecteur chimique (L). ) Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend: a) l'ajout, après la transformation du substrat (S) en produit (P), du détecteur chimique (L) et d'un ion métallique qui sera chélaté par ledit produit (P), ledit détecteur (L) ou ledit substrat (S) s'il n'est pas épuisé, en fonction de leur pouvoir chélatant respectif. 16) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'ion métallique est choisi parmi les ions métalliques du cuivre, du nickel et du cobalt. 17) Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 15, caractérisée en ce que l'ion métallique est le cuivre et le détecteur chimique est la calcéine. 18) Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour l' identification de nouveaux réactifs chimiques ou catalyseurs ou l' identification de l'activité nouvelle d'un réactif ou d'un catalyseur connu susceptibles de transformer le substrat (S) en produit (P). 19) Un réactif chimique ou un catalyseur susceptible de transformer un substrat (S) en un produit (P) présentant un pouvoir chélatant différent vis à vis d'un ion métallique, identifié par l'utilisation selon la revendication 18. ) Utilisation d'une méthode de détection de la transformation d'un substrat (S) en un produit (P) selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour détecter la formation d'un substrat (S) à partir d'une substance ou