FR 2824323 A1 20021108 FR 0106040 A 20010504 R3 R2 -Y-X: R N2 1 2824323 La présente invention concerne de nouveaux réactifs de marquage de molécules biologiques, un procédé de synthèse desdits marqueurs ainsi que des applications pour le marquage de molécules biologiques en particulier dans le domaine du diagnostic par sondes nucléiques. s L'état de la technique montre que de nombreuses méthodes existent pour marquer des nucléotides, des oligonucléotides ou des acides nucléiques. Une première méthode consiste à fixer le marqueur sur la base, que celleci soit naturelle ou modifiée. Une deuxième méthode propose de fixer le marqueur sur le sucre, là encore qu'il soit naturel ou modifié. Une troisième méthode a pour objet la fixation du 0 marqueur sur le phosphate. Le marquage sur la base a été notamment utilisé dans l'approche de marquage des acides nucléiques par incorporation de nucléotides directement marqués. Le marquage sur le sucre est souvent utilisé dans le cas des sondes nucléiques préparées par synthèse chimique. Le marquage sur le phosphate a été aussi utilisé pour introduire des bras fonctionnalisés et des marqueurs lors de la synthèse chimique des oligonucléotides. En fait l'homme du métier, qui doit effectuer un marquage d'un nucléotide, ou d''un analogue de nucléotide ou d'un acide nucléique, est enclin à effectuer cette fixation sur la base OT sur le sucre qui lui offrent plus de commodité et d ' alternatives. C ' est d'ailleurs ce qui ressort de 1'étude de nombreux documents, tels que EP-A-0.329.198, EP-A-0.302.175, EP-A-0.097.373, EP-A-0.063.879, US-A-5,449,767, US-A ,328,824, WO-A-93/16094, DE-A-3.910.151, EP-A-0.567.841 pour la base ou EP-A 0.286.898 pour le sucre. La fixation du marqueur sur le phosphate est une technique plus complexe que la technique consistant à fonctionnaliser la base ou le sucre et a été moins utilisée notamment à cause de la faible réactivité du phosphate (voir par exemple Jencks W.P. et al J. Amer. Chem Soc., 82, 1778-1785, 1960). De méme dans la revue de O'Donnel et Mc Laughlin (" Reporter groups for the analysis of nucleic acid structure ", p 216-243, dans "Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids", Ed Hecht S.M., Oxford University Press, 1996) portant sur les méthodes d'introduction de sondes dans les fragments 2 2824323 d'oligonucléotides, I'alkylation efficace du phosphodiester internucléotidique est considérée comme étant impossible. Le brevet WO 99/65926 décrit un procédé de marquage d'un acide ribonucléique (ARN) de synthèse ou naturel qui consiste à fragmenter l'ARN et à marquer au niveau du phosphate terminal. Ce document décrit un certain nombre de fonctions pouvant être utilisées pour le marquage en liaison avec la fragmentation comme les fonctions hydroxyle, amine, hydrazine, alcoxyamine, halogénure d'alkyle, halogénure d'alkyle de type benzylique et en particulier le dérivé 5-(bromométhyl)fluoresccine. Ces fonctions o permettent de marquer les acides nucléiques mais il faut associer une étape de fragmentation pour avoir un marquage efficace, car ce marquage se produit sur le phosphate libéré lors de la fragmentation. De plus, il faut ajouter un excès important de réactif de marquage par rapport à l'ARN pour obtenir un marquage effcace ce qui induit des problèmes de bruit de fond généré par le marqueur en excès. Enfin, cette méthode ne fonctionne pas sur ADN. Il existe donc un besoin pour de nouveaux réactifs qui soient effcaces du point de vue du rendement de marquage, qui soient spécifiques au niveau de la position de marquage et en particulier qui n'affectent pas les propriétés d'hybridation des bases impliquées dans la formation de double hélice par 1'intermédiaire des liaisons hydrogènes, qui soient utilisables à la fois pour l'ADN et l'ARN et enfin qui permettent de marquer indifféremment des nucléotides, des oligonucléotides, des acides nucléiques naturels ou préparés par amplification enzymatique. La présente invention décrit de nouveaux marqueurs qui répondent aux conditions précitées et qui utilisent la fonction diazométhyle comme fonction réactive pour le marquage. La fonction diazométhyle (de formule C(N2)-) a déjà été utilisée pour 1'alkylation des groupements phosphates, mais un certain nombre de problèmes se posent. D'une part, les dérivés diazo en général sont instables eux mémes, ce qui pose des problèmes pour l'utilisation des ces réactifs de marquage dans un kit de marquage et d'autre part, le 3 2824323 produit de couplage est instable ce qui est rédhibitoire si le produit marqué a pour fonction de mettre en évidence la présence d'une molécule cible biologique dans un échantillon quelconque Enfin les dérivés portant la fonction diazométhyle sont insolubles dans l'eau ce qui conduit à utiliser des conditions biphasiques pour le couplage avec des molécules biologiques, qui ne sont solubles et stables que dans l'eau ou des tampons aqueux, mais ces conditions ralentissent la vitesse de réaction et donc nuisent à l'efficacité du couplage Les nouveaux réactifs de marquage de l'invention résolvent aussi ces problèmes techniques La présente invention décrit un réactif de marquage stable à la température de formule (1) R3 R2 (L)n-Y-X"R N2 dans laquelle: R' représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchamement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, o R3 et R4 représentent indépendamment 1'un de 1'autre: H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CON, COOR avec R= alkyle ou aryle, -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH20-, -CH2S 4 2824323 Avantageusement le réactif stable à la température est de formule (2) D3 R2 (L)n-C-NH,R N2 dans laquelle: Rt représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d' au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1, R3 et R4 représentent indépendamment 1'un de 1'autre: H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle. Avantageusement le réactif stable à la température est de formule (3) R3 R2 (L)n-NH-C 4t,R] N2 Dans laquelle: R représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchânement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1, R3 et R4 représentent indépendamment 1'un de 1'autre: H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R= alkyle ou aryle. 2824323 Avantageusement le réactif stable à la température est de formule (4) R3 R2 (L)n-CH2-0, R N2 Dans laquelle: Rt représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d' au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, R3 et R4 représentent indépendamment 1'un de 1'autre: H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle. Dans les formules ci-dessus (1) à (4), avantageusement R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre: H. NO2, OCH3. Ainsi, un composé préLéré selon la formule (4) est de formule (4'): NO2 R2 (L)-CH2-04,,Rt N2 Dans laquelle: R représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1 6 2824323 Ou un composé préféré selon la formule (2) est de formule (2'): R2 (L)n-CNH, N2 Dans laquelle: R représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d' au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1 Avantageusement dans la formule (2') le substituant portant la fonction diazométhyle est lo en ortho ou en méta Par marqueur détectable, on entend au moins un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs suit: - les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la B- galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, - les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants, - les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leur propriété électrique comme la conductivité, I'ampérométrie, la voltamétrie, I'impédance, - les groupements détectables, par exemple dont les molécules sont de tailles suffisantes pour induire des modifications détectables de leurs caractéristiques physiques et/ou chimiques, cette détection peut être réalisée par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation de surface, la variation d'angle de contact ou des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, I'effet tunnel, - les molécules radioactives comme le 32p, le 35S OU le 25I. 7 2824323 De préférence, le marqueur n'est pas un marqueur radioactif pour éviter les problèmes .,., de securte les a ces marqueurs. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention le marqueur est détectable électrochimiquement et en particulier le marqueur est un dérivé d'un complexe de Fer comme un ferrocène. Des systèmes indirects peuvent étre aussi utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Les couples ligand/anti-ligand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants: biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, lo sucre/lectine, polyaucléotide/complémentaire du polynucléotide. Dans ce cas, c'est le ligand qui porte la fonction réactive diazométhyle. L'anti-ligand peut être détectable directement par les marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être lui-même détectable par un autre couple ligand/antiligand. Ce système d'empilement est illustré dans les exemples. Un autre exemple de systèmes indirects utilise une liaison covalente spécifique entre le ligand et l'anti-ligand par exemple le couple méthylcétone et alcoxyamine comme fonctions réactives. Des exemples de ce système sont décrits dans WO 00/40590 et WO 98/05766. Ces systèmes de détection indirects peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal et 1'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR 2781802 et WO 95/08000 pour des exemples d'amplification chimique en utilisant des polymères ou à la demande PCT/IB99/02072 pour les systèmes d'amplification chimique par empilement. Dans un mode particulier de l'amplification de signal, au moins deux marqueurs sont présents sur le réactif de marquage. 8 2824323 En particulier un réactif qui permet de mettre en oeuvre l'amplification de signal selon la présente invention possède une structure R2-(L)n- de formule (5) ci dessous: -Oq: R2 -0, R2 NH NH R2-HN N m-1 s Dans laquelle: R2 représente un marqueur détectable, m est un nombre entier compris entre 1 et 100, de préférence compris entre 1 et 20, p est un nombre entier compris entre 1 et 10, avantageusement 2 à 6, de préférence 4 o Cette structure de R2-(L)n s'applique indifféremment aux formules (1) à (4) précédentes. Un autre réactif de marquage prétéré pour l'amplification de signal est le réactif de formule (6): lNl 2 R2_ (L)n-Y-X C; y_ X-(L)n-R2 Dans laquelle: R2 représente un marqueur détectable, R3 représente H,NO2, Cl, Br, F. I, OR,SR,NR2,R,NHCOR,CONHR,COOR avec R = alkyle ou aryle, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, -Y-X- représente -CONH-,-NHCO-,-CH20-,-CH2S-. 9 2824323 Avantageusement le réactif pour l'amplification de signal a la formule (7) N2 R2_ (L)-C-NH C;: NH-C-(L)n-R2 Dans laquelle: R2 représente un marqueur détectable, R3 représente H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle, de préPérence R3 représente H. NO2 ou OCH3., L est un bras de liaison comportant un enchanement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1 0 Dans un mode préDéré de l'invention, le traceur est un composé fluorescent de faible encombrement stérique comme la fluorescéine, le dansyl, les chromophores du type IR (Li-COR Inc. Lincoln NE, USA), des dérivés cyanines comme le Cy5 et le Cy3 (Randolph J.B. and al, Nucleic Acids Res., 25(14), p2923-2929, 1997) et en particulier les dérivés du Cy5 ou bien le traceur est un haptène de faible encombrement stérique comme la biotine ou un dérivé de l'abiétane (voir la demande WO 00/07982) Par faible encombrement stérique, on entend un poids moléculaire inférieur à 1000 g/mole. Dans le cas d'un fluorophore, il est préférable de travailler avec des fluorophores dont la longueur d'onde d'excitation est supérieure à 450 nm, de prétérence supérieure à 600 nm. Dans le cas o le traceur est un haptène qui ne produit pas de signal par lui même comme par exemple la biotine, la détection est réalisé par la reconnaissance d'un anti-ligand marqué comme décrit plus haut. Dans le cas de la biotine, on utilise de préférence de la streptavidine ou un anticorps anti-biotine couplé à un composé fluorescent comme la fluorescéine, Cy5 ou la Phycoérythrine. Dans le cas de l'abiétane, on utilise un anticorps monoclonal comme décrit dans WO 00/07982. En particulier les réactifs de marquage de l'invention sont solubles dans des solvants polaires comme le DMF, le DMSO, CH3CN, THF, DMA (diméthylacétamide), NMP (N-méthylpyrrolidone), DME (diméthoxyéthane). 2824323 De préférence les réactifs de marquage sont solubles dans le DMSO ou l'eau, ou dans le mélange DMSO/eau. Par solvant miscible à l'eau, on entend un solvant qui est miscible dans une proportion d'au moins 5% en volume avec de 1'eau ou un tampon aqueux contenant des sels. Avantageusement dans les formules précédentes, le bras L comprend un motif éthylène glycol ou polyéthylène glycol pour augmenter la solubilité du réactif dans l'eau. Ces réactifs peuvent ainsi se fixer en phase homogène sur les molécules biologiques, la phase homogène étant constituée d'une solution sensiblement aqueuse c'est à dire contenant au moins 50% d'eau. lo Par molécule biologique on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. A titre d'exemple on peut citer comme molécules biologiques les acides nucléiques, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes. Le terme " acide nucléique " signifie un enchâînement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyoridine ou toute autre base modifiée permettant 1'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les H- phosphonates, les alkyl-phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides ( FR 2 607 507) ou les PNA (M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 114, 1895-1897, 1992 ou les 2' O-alkyl ribose. Le polynucléotide peut être également un LNA " Locked Nucleic Acid " (Wengel, J. et al., Bioorg, Med. Chem. Lett. 9(11), p.935-938, 2001). L'acide nucléique peut être naturel ou synthétique; un oligonucléotide, un polynucléotide un fragment d'acide nucléique, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique telle que: 11 2824323 - la PCR (Polymerase Chain Reaction), décrite dans les brevets US 4 683 195, US 4 683 202 et US 4 800 159, et sa dérivée RT-PCR (Reverse Transcription -PCR), notamment dans un format en une étape tel que décrit dans le brevet EP 569 272. - la LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP 201 184, - la RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO 90/01069, - la 3SR (Self Sustained Sequence Replication) décrite dans la demande de brevet WO /06995, - la NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) décrite dans la demande de o brevet WO 91/02818 et - la TMA (Transcription Mediated Amplification) décrite dans le brevet US 5 399 491. On parle alors d'amplicons pour désigner les acides nucléiques générés par une technique d' amplification enzymatique. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison pour peu qu'au moins un phosphate soit présent dans 1'acide nucléique. Par " polypeptide " on entend un enchâînement d'au moins deux acides aminés. Par acides aminés, on entend les acides aminés primaires qui codent pour les protéines, les acides aminés dérivés après action enzymatique comme la trans-4-hydroxyproline et les acides aminés naturels mais non présents dans les protéines comme la norvaline, la N méthyl-L leucine, la staline (voir Hunt S. dans Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett G.C., ed., Chapman and Hall, London, 1985), les acides aminés protégés par des fonctions chimiques utilisables en synthèse sur support solide ou en phase liquide et les acides aminés non naturels. Le terme "haptène" désigne des composés non immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnues par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptène protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à 2000 Da et peuvent être par exemple des peptides 12 2824323 glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines ou divers médicament s, l es nucléo sides et nucléoti des. Le terme "anticorps" inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique, et des fragments d'anticorps tels que des fragments Fab ou F(ab)2 Le terme " antigène " désigne un composé susceptible de générer des anticorps. Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires sous leur forme conformationnelle o caractéristique. Avantageusement la molécule biologique possède un groupe phosphate, c'est à dire ayant au moins un motif: O O 1 1 -O-P-O- ou -0-P-O 11 11 O O qui est soit présent naturellement dans la molécule biologique soit peut étre introduit par exemple par modification chimique ou enzymatique. Des exemples de modification chimique pour les protéines sont données dans " Chemistry of protein conjugation and cross linking ", S.S. Wong, CRC Press, 1991. De préférence, la molécule biologique est un acide nucléique. Certains réactifs avantageux de l'invention sont: a) de formule (8): R2_(L)"-C-NH )= N2 R 13 2824323 Dans laquelle: R représente H ou un groupe alkyle ou aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchânement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1 b) de formule (9): R2_ (L)n C-NH> Rl N2 o Dans laquelle: R représente H ou un groupe alkyle ou aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1 c) de formule (10) R2 (L)n--NHNz Dans laquelle: R représente H ou un groupe alkyle ou aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1 14 2824323 De préDérence, le réactif de marquage à la: a) formule (11) o HN HN HE C-NH aim Dans laquelle: Ret représente un groupe méthyle ou un phényle. b) formule (12): o HN HN HHC-NH>,' R1 N2 Dans laquelle: Ri représente un groupe méthyle ou phényle. c) formule (13): o HN HN HUH C-NH R 2824323 Dans laquelle: R représente un groupe méthyle ou phényle. s D'autre réactifs préDérés selon l'invention ont: a) la formule (14): NO2 R2 (L)n C-NH N2 Dans laquelle: R2 représente un marqueur détectable o L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1 b) la formule (15) : À NO2 R2_ (L)n C-NH 1T -12 Dans laquelle: R2 représente un marqueur détectable. L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1 C'est un autre objet de la présente invention que de décrire un procédé de synthèse d'un réactif de marquage ainsi que les réactifs de marquage, stables à la température, susceptibles d'être obtenus par ledit procédé comprenant les étapes suivantes: 16 2824323 a) On dispose d'un dérivé de formule (16): 0: R R3 R4 Dans laquelle: R représente H ou un groupe alkyle ou aryle ou aryle substitué, R3 et R4 représentent indépendamment 1'un de l'autre: H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NRz, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle, R6 représente COOH, NH2, OH ou SH. b) On dispose d'un marqueur ou d'un précurseur de marqueur possédant une 0 fonction réactive R7 complémentaire de R6. c) On fait réagir ensemble la fonction complémentaire dudit marqueur ou précurseur de marqueur avec la fonction R5 du dérivé de formule (16) en présence d'au moins un agent de couplage pour former une liaison covalente. d) On fait réagir un dérivé de l'hydrazine ou l'hydrazine sur la fonction cétone ou aldéhyde pour former une hydrazone. e) On transforme l 'hydrazone en fonction diazométhyle à l' aide d 'un traitement approprié. Si la fonction R6 est COOH, la fonction complémentaire R7 est NH2. S i la foncti on R6 est NH2, la fonction comp lémentaire R7 est C O OH. Si la fonction R6 est OH, la fonction complémentaire R7 est choisie parmi: halogénure d'alkyle, sultonate comme le tosylate. Si la fonction R6 est SH, la fonction complémentaire R7 est choisie parmi: halogénure d'alkyle, maléimide, sulfonate. Dans le cas o le R6 est OH ou SH, l'agent de couplage est une base telle la potasse ou le carbonate de potassium. 17 2824323 Dans le cas o le R6 est COOH ou NH2, 1'agent de couplage est choisi par exemple parmi les agents de couplage utilisé en synthèse peptidique. On pourra se reporter à l'ouvrage " Peptide Chemistry, a practical textbook " de M. Bodansky, ed Springer Verlag, Berlin, 1988, chapitre V, pages 55- 73 s Par dérivé de l'hydrazine on entend une molécule possédant la fonction NH2-NH-. Le tosylhydrazine est un exemple d'un tel dérivé. La transformation de l'hydrazone en diazométhyle est réalisée par les méthodes usuelles, en particulier l'oxydation par MnO2. D'autres méthodes sont utilisables comme décrites dans X. Creary, Organic Syntheses, 0 Wiley: New York, Coll. Vol. VII, p438-443, 1990; H. Zollinger, Diazo Chemistry II, VCH, Weinheim, p34-47, 1995; T. L. Holton and H. Shechter, J. Org. Chem., 60, 4725 4729, 1995. Dans le cas de l'utilisation d'un dérivé tosylhydrazine, la méthode est décrite dans X. Creary, Organic Syntheses; Wiley: New York, Coll. Vol. VII, p438-443, 1990. Un procédé préDéré selon l'invention est un procédé o: a) On dispose d'un dérivé de formule (17): 0: R NH2 Dans laquelle: R représente H ou un groupe alkyle ou aryle ou aryle substitué, b) On dispose d'un marqueur ou d'un précurseur de marqueur possédant une fonction acide carboxylique. c) On fait réagir ensemble la fonction carboxylique dudit marqueur ou précurseur de marqueur et la fonction amine primaire du dérivé de formule (17) en présence d'au moins un agent de couplage pour former une liaison amide. d) On fait réagir de l'hydrazine sur la fonction cétone ou aldéhyde provenant du dérivé de formule (17) pour former une hydrazone. 18 2824323 e) On oxyde ladite hydrazone en présence de MnO2 pour former une fonction diazométhyle. Avantageusement le groupe alkyle est un groupe linéaire ou ramifié en C-C4 et le groupe aryle est un groupe phényle éventuellement substitué. De préférence R est un méthyle ou un phényle c'est à dire que le dérivé de formule (17) est l'acétophénone ou la beuzophénone substitué par l'amine en position ortho, méta ou para. La fonction amine du dérivé (17) est en position orho méta ou para en fonction du 0 produit final désiré, de préférence en position ortho ou méta. L'agent de couplage est choisi parmi les agents de couplage notamment utilisé en synthèse peptidique comme décrit précédemment et par exemple ibuOCOCI en présence d'une base comme la N-méthylmorpholine. Par précurseur de marqueur, on entend un composé ayant au moins une fonction réactive éventuellement protégée différente de la fonction diazométhyle et compatible avec ladite fonction qui permet la fixation d 'un marqueur ultérieurement, c' est à dire après l'une quelconque des étapes du procédé et en particulier avant l' étape d' oxydation par MnO2. Un exemple de stratégie utilisant un précurseur de marqueur est donnée ci dessous dans le cas de 1' amplification de signal mais d' autres variantes sont possibles en utilisant les différents groupements protecteurs qui sont bien connus de l'homme du métier. Dans le cas de l'amplification de signal le procédé de synthèse est similaire. Le précurseur du marqueur a la formule (18) ci-dessous. GP-NH-(CH2)p COOH GP2-NH 19 2824323 Dans laquelle: GP et GP2 représentent deux groupements protecteurs de fonction amine identiques ou différents et p est un nombre entier compris entre 1 et 10, avantageusement 2 et 6 de préférence 4. Avantageusement, GP et GP2 sont différents pour pouvoir additionner plusieurs motifs comme cela est expliqué ci-dessous. Des exemples de groupement protecteurs GP1 ou GP2 utilisables dans la présente invention sont données dans T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ee édition, John Wiley and Sons, New York, 1991, préférentiellement ceux couramment utilisés en synthèse peptidique comme Boc (tertioDutyloxycarbouyle), Fmoc (9-fluorénylméthylèneoxycarbonyle), Cbz (carboxybenzyle) ou Alloc (allyloxycarbonyle). En particulier GP1 et GP2 sont respectivement les groupements protecteurs Boc et Fmoc. La réaction entre ce précurseur qui possède une fonction carboxylique et le dérivé de formule (17) a lieu en présence d'un agent de couplage pour former laliaison amide. Après déprotection dans des conditions usuelles d'un des deux groupements protecteurs, p ar exemple Fmo c avec une base telle que la pip éri dine, la foncti on amine libérée est utilisée pour coupler une autre molécule de formule (18). Ce processus est répété autant de fois que nécessaire pour obtenir une multitude de fonctions NH2 protégé par un groupement protecteur par exemple une fonction Boc. Le motif est additionné entre 1 et 100 fois, de préDérence entre 1 et 20 fois. Puis après déprotection de la fonction amine portant le groupement Boc, un traceur, par exemple une biotine activée par un groupement Nhydroxysuccinimide, est couplé sur les fonctions amines. On fait réagir de l'hydrazine sur la fonction cétone provenant du dérivé phénylcétone pour former une hydrazone puis on oxyde en présence de MnO2 pour former un résidu diazométhyle. On obtient ainsi un réactif de formule (5). C'est un autre objet de la présente invention que décrire un procédé ainsi que les produits obtenus par ce procédé pour le marquage d'une molécule biologique, en particulier un acide nucléique, comprenant la mise en contact en solution, dans une 2824323 solution homogène sensiblement aqueuse, d'une molécule biologique et d'un réactif de marquage selon l'invention. Par solution sensiblement aqueuse on entend une solution contenant au moins 50% d'eau. Cette solution contient de préDérence des sels comme une solution tampon. Par s solution homogène, on entend une solution monophasique telle qu'une solution eau/DMSO par opposition à une solution biphasique telle qu'une solution eau/chloroforme. Les conditions particulières pour les réactions de marquage varient en fonction des molécules biologiques et du marqueur. En ce qui concerne les acides nucléiques, un pH compris entre 5 et 8 permet un marquage effcace. En particulier, un lo pH compris entre 5,5 et 7,0 est préféré pour 1'ensemble des réactifs de 1'invention. Avec le réactif de formule (11) dans laquelle R1=CH3, la gamme de pH est plus large pour le marquage. Une bonne effcacité de marquage est obtenue pour un pH compris entre 3 et 8 pour ce réactif. Si R1 est le groupe phényle, le pH optimum est 3. En particulier, le procédé de marquage et de fragmentation d'un acide nucléique simple ou double brin comprend les étapes suivantes dans un ordre quelconque: - fragmenter l'acide nucléique, - attacher un marqueur sur au moins un des fragments par l'intermédiaire d'un réactif de marquage choisi parmi les composés de formule (19): R\ z, C= N2 Dans laquelle: R représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué. Z comprend un marqueur détectable. Iedit réactif se couplant de manière covalente et majoritaire sur au moins un phosphate dudit fragment. Z et/ou R sont choisis pour stabiliser la fonction diazométhyle, c'est à dire au moins un des deux groupes Z ou R a un noyau phényle. La liaison entre le réactif de marquage et l'acide nucléique est covalente mais il a été précédemment décrit que des interactions non covalentes pouvaient être utilisées notamment dans les systèmes d'empilement ou dans le cas o le marqueur est détectable indirectement. Le terme " attacher " couvre donc ces différentes possibilités. De préférence, le réactif de marquage est choisi parmi les composés de formule (20): R\ 2 C=N2 R-(L)r-Z' Dans laquelle: R représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 est un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchamement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n est égal à 0 ou 1, et Z est choisi parmi: y X R:3 R ou 43} R3 ou -C-NH- ou -C- Dans lequel: R3 et R4 représentent indépendamment 1'un de 1'autre: H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R= alkyle ou aryle, -Y-X- représente-CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-. Dans un mode particulier selon la formule (19), Z a la structure suivante: et Ri est H. Dans ce cas, le réactif de marquage est le PDAM. Bien que ce marqueur soit fluorescent, la longueur d' onde d' excitation est trop proche de celles des acides nucléiques. Une détection indirecte par l'utilisation d'un anticorps monoclonal dirigé contre le motif pyrène est préDérée. Le mode d'obtention de cet anticorps est bien connu de l'homme du métier (voir par exemple WO 00/07982). o Les autres nouveaux réactifs selon l'invention qui sont décrits par les formules (1) à (15) ainsi que les réactifs susceptibles d'être obtenus par les procédés de synthèse selon l' invention sont aussi des réactifs préférés selon le procédé de fragmentation et de marquage décrit ci-dessus. Ce procédé de marquage et de fragmentation est particulièrement utile dans le cas o l'acide nucléique marqué doit s'hybrider avec une multitude d'acides nucléiques, notamment oligonucléotides, fixés sur le support solide à une position prédéterminée pour former une puce à ADN. Par "puce à ADN", on entend un support solide de dimension réduite o sont fixées une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées. En effet, la densité des acides nucléiques fixés sur le support solide impose des contraintes stériques importantes lors de l'hybridation, et la fragmentation permet d'améliorer cette étape d'hybridation. Des exemples de ces puces à ADN sont donnés par exemple dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, p40-44, 1998, F. Ginot, Human Mutation, 10, pl-10, 1997, J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1(3), pl83-200, 1996, 23 2824323 T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 22(15), p2915-2921, 1994, J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 16, p541 -546, 1998. La fragmentation et le marquage s'effectuent en une étape ou en deux étapes et le marquage peut s'effectuer indifféremment avant, après ou simultanément avec la fragmentation. Avantageusement, le marquage s'effectue après la fragmentation. De préDérence, le marquage et la fragmentation s'effectuent simultanément c'est à dire que les réactifs nécessaires à ces deux étapes sont mis ensemble en solution homogène 0 sensiblement aqueuse avec 1'acide nucléique par exemple. C'est notamment le cas pour la fragmentation chimique ou enzymatique. Dans le cas de la fragmentation mécanique par un moyen physique, marquage et fragmentation s'effectuant simultanément, signifie que le moyen physique est appl iqué à une solution homogène sen sib l ement aqueu se contenant au moins les acides nucléiques et le réactif de marquage. La fragmentation de l'acide nucléique s'effectue par voie enzymatique, chimique ou physique. La fragmentation par voie enzymatique de l'acide nucléique est réalisée par exemple par des nucléases. La fragmentation par voie physique de l'acide nucléique est réalisée par exemple par sonication ou par radiation. La fragmentation par voie chimique, si l'acide nucléique est un ARN, est réalisce par les méthodes usuelles (voir par exemple Chem. Rev, 98, 961990, 1998 de Oivanen M. et al). Les complexes de métaux tels que décrits dans la revue de G. Pratviel et al, Adv. Org. Chem., 45, p251-312, 1998 ou la revue G. Pratviel et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 34, p746-769, 1995 sont utilisables pour la fragmentation de 1'ADN ou l'ARN. Dans un premier mode de réalisation, la fragmentation chimique d'ARN est réalisée par des cations métalliques associés ou non à un catalyseur chimique. Dans ce cas, les cations métalliques sont des ions Mg2+, Sr2+, Ba2+, Pb2+, Zn2+, Cd2+, Mn, Fe, Co, Ni2, Ru3, Ce3, Eu3+, Tb3+, Tm3+, Yb3+ ou Lu3+, le catalyseur chimique est constitué par de l'imidazole, un analogue substitué, par exemple le N-méthyl imidazole, ou toute molécule chimique ayant une affnité pour l'ARN et portant un noyau imidazole ou un analogue substitué. Les conditions de fragmentation à l'aide de métaux sont bien décrites dans le brevet WO 99/65926. Avantageusement, les métaux sont Mg2+ , Mn2+, Zn2+, Tb3+ ou Ce3+, de préDérence Mg 2+, Mn2+, Zn2+. Des conditions effcaces de fragmentation sont obtenues avec une concentration en cation métallique comme Mn++ entre 2 et l OO mM, une concentration en imidazole entre 2 et lOOmM. Des conditions spécialement effcaces sont obtenues avec une concentration en cation o comme Mn++ entre 3 et 15 mM et une concentration en imidazole entre 20 et 50 mM, en particulier 30 mM. Le pH de la réaction, doit étre compris entre 5 et 8. Avantageusement, le pH est compris entre 5,5 et 6,5 de préférence le pH est de 6. Le pH de 6 représente donc un compromis très intéressant pour réaliser la combinaison marquage et fragmentation avec de l'ARN (voir discussion précédente sur le marquage). Dans un deuxième mode de réalisation, la fragmentation chimique de l'ARN est réalisée par action d'une polyamine comme la spermine, la putrescéine ou la cadavérine. Des concentrations de 5 à 100 mM permettent la fragmentation. Celle-ci est totale à partir de 10 mM de polyamine. Dans un troisième mode de réalisation, la fragmentation chimique de l'ARN est réalisée par action d'une nocléase artificielle (voir G. Pratviel et al., Adv. Inorg. Chem.,45, p251-312, 1998, D. S. Sigman et al. Chem. Rev., 93, p2295-2316, 1993) comme le 1,10-phénanthroline associé à un cation métallique comme le cuivre, le zinc ou le fer. Ces cations proviennent de FeSO4 ou CuCl2 ou ZnCI2 en solution. Des concentrations entre 2 et 50 mM de 1,10-phénanthroline sont utilisées pour la fragmentation d'ARN en particulier entre 4 et 10 mM à une température de 60 C. La fragmentation par voie chimique de l'ADN est réalisée en mettant en présence l'acide nucléique avec un moyen chimique de création de site abasique. La formation d'un site so abasique résulte de la coupure de la liaison N-glycosidique qui lie le sucre 2-désoxy ribose à la base nucléique Il s'agit d'un dépurination pour la perte d'un purine (guanine, adénine) ou d'une dépyrimidination pour les pyrimidiques (cytosine, thymine). Cette dépurination est spontanée dans des conditions physiologiques (pH 7, 4 à 37 C) mais la vitesse de la réaction est très faible de l'ordre de 3. 10- dépurination par seconde c'est à dire inutilisable pour une fragmentation effcace. Pour augmenter la vitesse de réaction, on utilise des agents alkylants qui fragilisent la liaison N glycosidique ou des enzymes comme des ADN glycosylase en particulier l'uracile ADN glycosylase. Le site abasique obtenu par dépurination ou dépyrimidation est très instable. La o fragmentation au niveau de ce site est obtenue à température ambiante en milieu * basique. En milieu acide, la température élevée accélère également cette fragmentation. L'utilisation de molécules capables d'initier le phénomène de,élimination accélère aussi la fragmentation. Un mode préDéré de réalisation de la fragmentation est obtenu par l'utilisation d'un pH acide c'est à dire un pH inférieur à 5. Avantageusement le pH est 3. Un tampon formiate de sodiu.m à pH 3 permet de fragmenter de manière effcace pour l'invention. Ce tampon est compatible avec les conditions de marquage en une étape comme cela sera démontré dans les exemples. Dans un mode particulier de la présente invention et dans le but d'augmenter encore la fragmentation, I'acide désoxyribonucléique contient au moins une base modifiée susceptible de générer un site abasique plus facilement. Diverses bases modifiées sont utilisables comme les N7-alkyl purines, les N3-alkyl purines, les 06-alkyl purines, les 8-bromopurines, les 8thiopurines, les 8 alkylthiopurines, les 8-azidopurines ou les 8-alkylsulfonylpurines. Dans le cas o l'acide nucléique à marquer est généré par une technique d'amplification enzymatique comme la PCR, I'utilisation d'une 8bromopurine permet d'avoir une incorporation effcace pendant 1'amplification ce qui facilite d'autant le procédé de 26 2824323 fragmentation et marquage selon l'invention tout en conservant une sensibilité excellente pour l'étape d'amplification enzymatique. La présente invention décrit une molécule biologique marquée et en particulier un acide nucléique marqué, susceptible d'étre obtenu par 1'un quelconque des procédés selon l'invention. La présente invention concerne aussi un kit de détection d'une molécule biologique en particulier un acide nucléique cible comprenant un réactif de marquage selon l'invention. o En fonction des applications du kit, d'autres éléments comme par exemple, des moyens de Iyse (microorganismes et/ou cellules) et/ou des moyens de concentration (comme de la silice ou des particules magnétiques) et/ou des moyens d'amplification enzymatique sont incorporés dans le kit. L'invention concerne l'utilisation d'une molécule biologique marquée en particulier un acide nucléique marqué, tel que défini ci-dessus, comme sonde de détection d'une molécule biologique cible et en particulier d'un acide nucléique cible. L'invention concerne enfin l'utilisation d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, comme cible marquée pouvant se fixer sur une sonde de capture. Pour permettre la détection et/ou la quantification et/ou la purification de la molécule biologique cible, la molécule biologique marquée est capable de former un complexe avec la molécule biologique cible. A titre d'exemple, pour la mise en évidence d'une molécule cible de type acide nucléique, I'acide nucléique marqué est suffisamment complémentaire de la cible pour s'hybrider spécifiquement en fonction des conditions de réaction et notamment la température ou la salinité du milieu réactionnel. Le procédé de détection est applicable pour le séquençage, le profil d'expression des ARN messagers ou le criblage de mutations à des fins de recherche ainsi que le criblage de drogues dans l'industrie pharmaceutique, le diagnostic de maladies infectieuses ou génétiques, le contrôle alimentaire ou industriel. La tendance en matière de diagnostic et notamment pour les maladies infectieuses (S IDA ou Tub erculo se par exemple) est de b aisser le niveau de sensib i l ité j u squ 'à la détection d'une molécule unique dans un échantillon qui peut représenter plusieurs millilitres dans le cas d'un prélèvement liquide type sang ou urine ou LCR. Ce niveau de sensibilité ne peut être obtenu que si toutes les étapes, depuis le prélèvement de l'échantillon jusqu'au rendu de résultat, sont optimisées. Les différents moyens de 1'invention permettent cette optimisation sans diffculté car les réactifs, méthodes et procédés de l'invention sont applicables de manière très large à différentes molécules biologiques. En particulier dans le cas o une étape d'amplification enzymatique est nécessaire pour obtenir la sensibilité nécessaire (infection virale ou bactérienne comme VIH, VHC ou Tuberculose), un procédé de marquage et/ou fragmentation comme lo décrit dans la présente invention permet de ne pas affecter la sensibilité de la technique d'amplification soit parce qu'il n'est pas nécessaire de remplacer les désoxyribonucléotides ou les ribonucléotides utilisés dans la technique d'amplification enzymatique, soit parce ce que les ribonucléotides ou désoxyribonucléotides incorporés n'altèrent pas la sensibilité. La chimie de greffage décrite dans la présente invention possède des caractéristiques telles du point de vue réactivité et spécificité que d'autres applications sont décrites ci apres: Dans un premier mode de réalisation, cette chimie de greffage est appliquée à la fixation covalente d'acides nucléiques sur un support solide. Dans une première variante du procédé, un précurseur de la fonction diazométhyle (tel une cét one ou hydrazine comme décrit p récédemment) est introduit p end ant la synthèse chimique et la fonction diazométhyl e est introduite sur les acid es nu cl éi qu es d ans une deuxième étape. Dans une deuxième variante prétérée du procédé, les fonctions diazométhyles sont introduites sur le support solide et les acides nucléiques sont fixés sur le support solide par l'intermédiaire des phosphates des acides nocléiques et en particulier des phosphates terminaux (5' ou 3'). L'introduction de phosphate à l'extrémité 3' ou 5' des acides nucléiques est bien connue (voir " Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties " édité par S. Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey). Dans un mode de réalisation particulier d'un tel support solide, un réactif de marquage portant un ligand, en particulier un haptène comme la biotine ou l'abiétane, est fixée sur le support solide sur lequel est fixé de manière covalente ou par adsorption un antiligand, comme la streptavidine ou un anticorps par exemple. Ces supports solides sont bien connus dans l'état de la technique et sont méme commercialement disponibles (plaque de microtitration-streptavidine ou latexstreptavidine par exemple). La fonction du marqueur n'est plus dans ce cas de permettre la détection mais de permettre la fixation du réactif de marquage sur le support solide. La fonction diazométhyle est alors o disponible pour réagir sur des acides nucléiques. Les dérivés de formule (l l), (12), (13) ou le dérivé PDAM sont des exemples de réactifs utilisables pour la fabrication d'un tel support solide. La technique des anticorps monoclonaux permet de préparer des anticorps contre un grand nombre de marqueur comme la fluorescéine ou un dérivé du CyS ou d'autres. L'homme du métier peut mettre en _uvre un support solide avec les réactifs de marquage de la présente invention sans diffculté excessive par ce mode de préparation indirect du support solide dans lequel une réaction ligand/antiligand est utilisée pour fixer la fonction diazométhyle sur le support solide. Un deuxième mode de réalisation du support solide concerne les supports particulaires comme les latex. Différents modes de polymérisation peuvent étre utilisés pour préparer les particules portant une fonction diazométhyle à partir d'un monomère fonctionnel polymérisable portant soit une fonction diazométhyle soit préDérentiellement une fonction précurseur de la fonction diazométhyle comme un aldéhyde ou une cétone et notamment: s Polymérisation à réacteur fermé appelée "batch": les monomères sont introduits dans le réacteur avant le début de réaction avec les autres ingrédients et sans ajout ultérieur. En raison de la différence de réactivité des monomères, ce procédé conduit souvent à l'apparition d'une dérive de composition. Celleci se manifeste par l'obtention de macromolécules ayant des compositions qui varient considérablement en fonction de la conversion. Cette méthode est peu efficace pour l'incorporation en surface car une partie importante du monomère fonctionnel risque d'être perdue soit à 29 2824323 I'intérieur des particules, soit sous forme de polymère hydrosoluble. Lorsque la copolymérisation est effectuée en " batch " avec des monomères de nature polaire, on obtient des particules plus petites, en grand nombre, mais avec une conversion limitée. Ce comportement est lié à l'importante solubilité dans l'eau de ces monomères, et il est attribué à la prépondérance du mécanisme de nucléation homogène. Polymérisation en semi-continu: une partie au moins des monomères est introduite dans le réacteur sur une période comprise entre le début de la réaction et la fin de celle-ci. Ce rajout peut être effectué à une vitesse fixe ou bien suivant un profil o donné. Le but est de contrôler l'addition du mélange de monomères de façon à obtenir un copolymère de composition contrôlée (contrôle de la composition de l'interface); c'est ainsi qu'on se place souvent dans des conditions d'addition telles que la vitesse de polymérisation soit plus grande que celle d'addition. Polymérisation par addition différée appelée " shot ": une fois que la réaction de polymérisation est en cours,!e monomère fonctionnel seul, ou en présence du monomère de base, est introduit dans le système d'une façon contrôlée. Le succès de l'opération dépend donc du degré de connaissance préalable de la cinétique de copolymérisation. C'est une méthode efficace pour favoriser l'incorporation superficielle. La sélection des conditions expérimentales (degré de conversion au moment de l'addition, composition et concentration du mélange des monomères) permet d'optimiser les rendements de surface. Polymérisation sur semence: elle consiste à introduire le monomère fonctionnel dans le système contenant un latex déjà constitué et parfaitement caractérisé. Le monomère fonctionnel peut être additionné seul ou en mélange avec le monomère de base de la semence, en une étape ou en semi-continu. Les techniques de polymérisation sur semence, polymérisation par addition différée, polymérisation en semi-continu sont prétérées car elles conduisent à un maximum d'incorporation du dérivé portant le précurseur de la fonction diazométhyle en surface. 2824323 Des exemple de particules portant des fonctions aldéhydes sont donnés par exemple dans B. Charleux et al, Die Makromolecular Chem., 193, p 187 et p. 205, 1992 ou dans le brevet EP 350 407. Un tel support solide comprenant au moins une fonction diazométhyle, en particulier un support solide sur lequel est fixé indirectement un réactif de marquage de l' invention, est aussi un objet de la présente invention ainsi que le support solide comprenant des acides nucléiques fixés sur le support solide par l'intermédiaire des fonctions diazométhyles. 0 Une première application d'un tel support solide est la fabrication de puces à ADN. Des méthodes existent pour répartir des acides nucléiques sur le support solide en des positions discrètes et prédéterminées Le brevet US 6,110,426 propose une méthode pour réaliser ces puces à ADN à l'aide d'un capillaire que l'on met en contact sur une surface solide pour délivrer un volume contrôlé de liquide. Un contact effectif a lieu entre l'extrémité du capillaire et le support solide pour que la goutte se dépose par capillarité. De méme, le brevet US 6,083,763 décrit un ensemble de capillaires coulissant dans un dispositif de façon à compenser les différences de hauteur de chacun d'eux. Ils sont amenés au contact d'une surface plane pour le dépôt par capillarité d'oligonucléotides spécifiques. Le brevet US 6,083,762 propose un système de répartition de gouttes comprenant un microdispenseur couplé à un transducteur piézo-électrique pour éjecter des volumes de goutte inférieurs au nanolitre sur une surface solide. Un résultat semblable est obtenu en appliquant une source chaude sur la paroi d'un capillaire pour former une bulle qui éjecte un volume défini de solution (voir T. Okamoto et al., Nature Biotechnology, 18, 2s p438-441, 2000). La foncti on diazométhyle p ermet ainsi d e greffer de mani ère covalente le s acid es nucléiques sur le support Le greffage est simple, la liaison est stable, par rapport à l'adsorption notamment, et la sélectivité de la réaction par rapport au phosphate terminal permet de réaliser un couplage orienté de l'acide nucléique sur le support solide, ce qui facilite d'autant les étapes d'hybridation ultérieures en diminuant l'encombrement stérique. Une deuxième application d 'un support solide selon l' invention est la purification des acides nucléiques. Dans le cas de la purification, cette purification est soit directe (le support solide porteur de fonctions diazométhyle réagit avec les acides nucléiques à purifier) soit indirecte (des acides nucléiques de capture sont fixés sur le support solide). Ces acides nucléiques de capture sont suffsamment complémentaires de la cible à capturer pour s'hybrider avec le degré de spécificité souhaité et c' est le complexe " acides nucléiques de capture/support solide " qui permet la purification des acides nucléiques cibles. o Le support solide est de préférence sous forme dispersée pour l'utilisation en purification comme des particules de latex, par exemple des particules magnétiques. Par étape de purification, on entend notamment la séparation entre les acides nucléiques des micro-organismes et les constituants cellulaires relargués dans l'étape de Iyse qui précède la purification des acides nucléiques. Ces étapes de Iyse sont bien connues à titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de Iyse telles que décrites dans les demandes de brevet: - WO 00/60049 sur la Iyse par sonication, - WO 00/05338 sur la Iyse mixte magnétique et mécanique, - WO 99/53304 sur la Iyse électrique, et - WO 99/15621 sur la Iyse mécanique. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de Iyse bien connues telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les traitements par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (brevet US 5 234 809). Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques (voir à ce sujet les brevets US 4 672 040 et US 5 750 338), et ainsi purifier les acides nucléiques, qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces 32 2824323 p arti cul es magnétiques est d écrit dans les demand es de brevet WO 9 7/4 5 2 02 et WO 99/35500. Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur s lesquels peut être fixé un acide nucléique. Des matériaux de synthèse, ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose, ou le dextran; des polymères, des copolymères, notamment à base de lo monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques; des latex; des particules magnétiques; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane, d'une particule ou d'une plaque sensiblement plane de verre ou silicum ou dérivés. Les figures et exemples cijoints représentent des modes particuliers de réalisation, et ne peuvent pas étre considérés comme limitant la portée de la présente invention. La figure 1 représente les formules développées des différents réactifs utilisés dans la présente invention ainsi que l'abréviation les désignant (o- signifie orfho, m- méla et p- para). Les figures 2A à 2I représentent les profils en fonction du temps, analysés par électrophorèse capillaire du couplage covalent de différents réactifs portant une fonction diazométhyle sur l'uridine 3'-monophosphate (3'-UMP) selon l'exemple 6.1. PDAM figure 2A DPDAM à 2 mM figure 2B o DPDAM à 20 mM figure 2C PMDAM figure 2D 33 2824323 NPDAM figure 2E BioDPDAM figure 2F m-BioPMDAM figure 2G p-BioPMDAM figure 2H s o-BioPMDAM figure 2I Les figure 3A à 3D représentent les profils en fonction du temps, analysés par électrophorèse capillaire de la réaction du meta-BioPMDAM sur 4 nucléotides 3'- monophosphate selon l'exemple 6.2 0 3'-CMP en série ribonucléotide figure 3A. 3'-AMP en série ribonucléotide figure 3B. 3'-GMP en série ribonucléotide figure 3C. 3'-TMP en série désoxyribonucléotide figure 3D. La figure 4 représente les profils en fonction du temps, analysés par électrophorèse capillaire de la réaction du mét.a-BioPMDAM sur un dinucléotide 5'-ApUp selon l'exemple 6.3. Les figures 5A à 5D représentent le spectre RMN du proton dans D20 des différents conjugués entre le réactif méta-BioPMDAM et 4 ribonucléotides 3'-monophosphate selon l'exemple 6.4. 3'-GMP figure 5A. 3'-AMP figure 5B. 3' CMP figure 5C. 3' UMP figure 5D. La figure 6 représente un schéma de synthèse d'un réactif de marquage portant 2 biotines pour l'amplification chimique du signal. La figure 7 représente le mécanisme de fragmentation en milieu acide par la formation de site abasique. La figure 8 montre selon 1'exemple 16.1 la cinétique de dégradation à pH acide pour différents nucléosides modifiés (8-bromo-2'-désoxyadénosine (8BrdA) et la 5-bromo 2'-désoxyoxycytidine (5-BrdC))ainsi que les 4 nucléosides naturels (dA, dC, dG et dT). s Les résultats sont représentés sous forme de pourcentage d'hydrolyse du nucléoside de départ (en ordonnée) par rapport au temps de réaction en minutes (en abscisse). La figure 9 représente selon 1'exemple 19.2 la cinétique de marquage en fonction du temps à une température de 60 C avec le réactif PDAM sur un ODN synthétique 5' 0 phosphate. Les résultats sont représentés sous forme de pourcentage de marquage par rapport au temps de réaction exprimé en minutes (en abscisse). La figure 10 représente selon 1'exemple 19.3 le pourcentage de marquage en fonction de la température de réaction. Les résultats sont présentés sur la figure 10 avec en ordonnée le pourcentage de marquage et en abscisse la température de réaction en C. La figure 11 représente une voie de synthèse pour un réactif selon la formule (4') en utilisant le réactif commercial 5-Nitrovanilline. La fonction aldéhyde permet d'obtenir la fonction diazométhyle par formation de l'hydrazone puis oxydation de l'hydrazone par MnO2. 2824323 Exemple 1: svathèse de réactifs avec la biotine Schéma général de synthèse R I N-méthylmorpholine o HHH + O iBuOCOCI HN NH S,OH NH2 DMF H., NH D-Biotine 1a: R = CH3, substituant méta 1 b: R = CH3, substituant para 1c: R = CH3, substituant ortho 1d: R = Ph. substituant méta 1 N2H4-H2O R R - iN2 MnO2 N,NH2 HN NH J H NH J 114 ( H 1 ( H l ,,NH 3a: R = CH3, substituant méta 2a: R = CH3, substituant méta 3b: R = CH3, substituant para 2b: R = CH3, substituant para 3c: R = CH3, substituant ortho 2c: R = CH3, substituant ortho 3d: R = Ph. substituant méta 2d: R = Ph. substituant méta 1) Synthèse du méta-BioPMDAM Composé biotine mélaacétophénone la: On solubilise la D-biotine (1,0 g, 4,1 mmol) dans 45 mL de DMF anhydre à chaud. On refroidit à 0 C sous argon, puis on ajoute successivement la N-méthylmorpholine (590 1L, 5,33 mmol) et le chloroformiate d'isobutyle (840 pL, 6,60 mmol). On laisse sous agitation pendant 30 min. puis on ajoute la 3-aminoacétophénone (824 mg, 6,10 mmol) et la N-méthylmorpholine (480 pL, 4,35 mmol) dans 10 mL de DMF. La solution est maintenue sous agitation à O C pendant 2 h, puis on évapore à sec. On reprend le résidu dans 3 mL de MeOH, puis on ajoute 50 mL d'eau. Le précipité obtenu est filtré, lavé avec de l'eau, du CH2CI2 et de 1'éther pour donner 1,2 g (80 /O) de produit la brut. Une recristallisation dans le couple MeOH-H2O donne la (1,01 g, 70 %) sous forme d'une poudre blanche s F 145 C. - IR (KBr): 3280, 2931, 2857, 1691, 1590,1540, 1487, 1434, 1298, 1266 cm - RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) = 1,3-1, 7 (m, 6 H); 2,33 (t, J= 8 Hz, 2 H), 2,55 (s, 3 H); 2,58; (d, J= 12 Hz, 1 H); 2,83 (dd, J= 12 et 5 Hz, 1 H); 3,13 (m, 1 H); 4,15 (m, 1 H); 4,31 (m, 1 H); 6,34 (s, 1 H); 6,41 (s, 1 H); 7,44 (t, J= 8 Hz, 1 H); 7,64(d,J=8 Hz, 1H);7,85(d,J=8Hz,1H);8,17(s, 1H);10,05(s, 1H).-MS (FAB/glycérol), m/z: 362 [M+H]. À Composé méla-hydrazone 2a: Une solution de la (500 mg, 1,38 mmol) et d'hydrazine monohydrate (200 pL, 4,15 mmol) dans de l'éthanol absolu (8 mL) est chauffée à reflux pendant 2 h. Après reDroidissement à température ambiante, le précipité blanc est filtré, lavé avec de l'eau, puis avec de l'éther et séché. On obtient ainsi 385 mg (74 %) de produit 2a sous forme d'une poudre blanche. F 185 C. - IR (KBr): 3298, 2931, 2857, 1698, 1665, 1626, 1541, 1494, 1470, 1446, 1330, 1265 cm. - RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) = 1,3-1,7 (m, 6 H); 1, 98 (s, 3 H); 2,26(t,J=8Hz,2H);2,56;(d,J= 12Hz, lH);2,81 (dd,J= 12et5Hz, 1 H);3,11 (m, 1 H); 4,13 (m, 1 H); 4,29 (m, 1 H); 6,39 (s, 3 H); 6,42 (s, 1 H); 7,22 (m, 2 H); 7,50 (d, J= 8 Hz, 1 H); 7,84 (s, 1 H); 9,82 (s, 1 H). MS (FAB/glycérol), m/z: 376 [M+H]. À Composé méla-diazométhane 3a: On solubilise 2a (180 mg, 0.48 mmol) dans 2 mL de DMF. On ajoute alors MnO2 (340 mg, 3,9 mmol). Après 30 minutes d'agitation à température ordinaire, le mélange est filtré à travers un entonnoir fritté contenant de la célite (épaisseur: 0,5 cm) et des tamis moléculaires en poudre 3 A (0,Scm). Le mélange réactionnel est concentré jusqu'à un volume d'environ 0,5 mL, puis 5 mL d'éther sont ajoutés. Le précipité résultant est filtré, lavé à l'éther puis séché. Le composé 3a (170 mg, 9S %) est obtenu sous forme d'une poudre rose. F 160 C. - IR (KBr): 3278, 2935, 2859, 2038, 1704, 1666, 1605, 1577, 1536, 1458, 1430, 1263 cm. - RMN 1H (300 MHz) = 1,3-1,7 (m, 6 H), 2,1 1 (s, 3 H); 2,28 (t, J= 8 Hz, 2 H); 2,57; (d, J= 12 Hz, 1 H); 2,81 (dd, J= 12 et 5 Hz, 1 H); 3,1 1 (m, 1 H); 4,13 (m, 1 H); 4,29 (m, 1 H); 6,33 (s, 1 H); 6,41 (s, 1 H); 6,60 (m, 1 H); 7,25 (m, 3 H);9,84(s, 1H)) 2)Synthèse du para-BioPMDAM À Composé biotinepara-acétophénone lb: On solubilise la Dbiotine (1 g, 4,1 mmol) dans 45 mL de DMF anhydre à chaud. On refroidit à 0 C sous argon puis on ajoute successivement la N-méthylmorpholine (590 pL, 5,33 mmol) et chloroformiate d'isobutyle (840 pL, 6,60 mmol). On laisse sous agitation pendant 30 min. puis on ajoute la 4-aminoacétophénone (824 mg, 6,10 mmol). 2s La solution est maintenue sous agitation à O C pendant 2 h puis on évapore à sec. On reprend le résidu dans 50 mL d'eau. Le précipité obtenu est filtré, lavé avec de l'eau puis avec 50mL de MeOH à chaud. Le précipité blanc est dissous dans du DMF en chauffant puis la solution obtenue est filtrée et lavée au MeOH. Le filtrat est récupéré et évaporé à sec pour donner 888 mg de lb (2,46 mmol, 60 %). F 260 C. - IR (KBr): 3260, 2930, 2358, 1706, 1673, 1610, 1526, 1401, 1380, 1322, 1257, 1150 cm. - RMN IH (200 MHz, DMSO-d6) = 8,82 (s, 1H, NH-CO); 7,57 (d, 2H, J= 9 Hz, Ar-H); 6,83 (d, 2H, J= 9 Hz, Ar-H); 6,40 (s large, 1H, NH-CO-NH), 6,32 (s large, 1H, NH-CO-NH); 4,28 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4, 12 (m, 1H, CH-CH NH); 3,11 (m, IH, CH-S); 2,80 et 2,55 (système ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3J,y = 12 Hz, JBX = 0 Hz, CH2-S); 2,35 (t, 2H, J= 8 Hz, CH2CO); 2,10 (s, 3H, CH3); 1,60-1,34 (m, 6H, (CH2)3). À Composépara-hydrazone 2b: Le composé lb (870 mg, 2,4 mmol) est dissous à chaud dans 1'éthanol (99 %, 8 mL) puis l'hydrazine monohydrate (995 L, 19,5 mmol) est ajoutée. La solution est chauffée à reflux pendant 3h. Le précipité blanc obtenu est filtré, lavé avec de l'eau glacée. On obtient ainsi 820 mg (90 %) de produit 2b sous forme d'une poudre blanche. F305 C.-IR(KBr):3281,3183,2930,2857, 1698, 1658, 1593, 1521, 1459, 1401, 1325, 1263, 1187 cm. - RMN IH (200 MHz, DMSO-d6) = 9,68 (s, 1H, NH-CO); 7, 52 (s, 4H, J= 9 Hz, Ar-H); 6,43 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s large, 1H, NH CO-NH); 6,21 (s, 2H, NH2) 4,29 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4,12 (m, 1H, CHCH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,81 et 2,56 (système ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JA,Y = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2,32 (t, 2H, J= 8 Hz, CH2-CO); 1,97 (s, 3H, CH3); 1,63-1,36 (m, 6H, (CH2)3). À Composépara-diazométhane 3b: On solubilise 2b (200 mg, 0,53 mmol) dans 10 mL de DMF. On ajoute alors 800 mg de MnO2. Après 10 minutes d'agitation, le mélange est filtré à travers une couche mixte Célite (0,5 cm)-tamis moléculaire(0,5 cm en poudre). Le mélange réactionnel est évaporé à sec puis lavé à l'éther et séché. Le composé 3b (190 mg, 96 %) est obtenu sous forme d'une poudre rose. 39 2824323 F 180 C (dec). - IR (KBr): 3257, 2930, 2857, 2032, 1698, 1597, 1524, 1510, 1455, 1404, 1307, 1259, 1180 cm. - RMN lH (200 MHz, DMSO-d6) = 10,18 (s, 1H, NH CO); 7,88 (d, 2H, J= 6 Hz, Ar-H); 7,7 (d, 2H, J= 6 Hz, Ar-H); 6,41 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,34 (s large, 1H, NH-CO-NH), 4,28 (m, 1H, CH2CH-NH); 4,12 (m, 1H, CH-C_-NH); 3,11 (m, 1H, CH-S); 2,80 et 2,55 (système ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JA,y=12Hz,3JBx=OHz,CH2-S),2,35(t,2H,J=8Hz,CH2-CO);2, 10(s,3H, CH3); 1,60-1,34 (m, 6H, (CH2)3). 0 3) Synthèse de l'ortho-BioPMDAM À Composé biotine ortho-acétophénone lc: On solubilise la D-biotine (1 g, 4,1 mmol) dans 45 mL de DMF anhydre à chaud. On refroidit à 0 C sous argon puis on ajoute successivement la Nméthylmorpholine (590 uL, 5,33 mmol) et chloroformiate d'isobutyl (840 '1L, 6,60 mmol). On laisse sous agitation pendant 30 min. puis on ajoute la 2-aminoacétophénone (824 mg, 6,10 mmol). La solution est maintenue sous agitation à température ambiante pendant 3 h 30 puis on évapore à sec. On reprend le résidu dans 50 mL d'eau. Le précipité obtenu est filtré, lavé avec de 1'eau puis avec 50mL de MeOH à chaud Le précipité obtenu est filtré, lavé avec de l'eau. Une recristallisation est faite en dissolvant le produit dans du MeOH à chaud et en reprécipitant par addition d'eau. Le précipité est filtré, lavé à l'eau, puis à l'éther pour donner 1,1 g (2,95 mmol, 72 %) de produit 1c brut. F 150 C. - IR (KBr): 3248, 2930, 2857, 2359, 1691, 1669, 1651, 1582, 1528, 1448, 1354, 1310, 1245, 1161 cm. - RMN lH (200 MHz, DMSO-d6) ô = 11,24 (s, 1H, NH CO);8,33(d, 1H,J=8,5Hz,Ar-H);7,97(d,2H,=8Hz,Ar-H);7,57(t, 1H, =7 Hz, Ar-H), 7,18 (t, 1H, J= 7 Hz, Ar-H); 6,44 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s large, 1H, NH-CO-NH); 4,30 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4,14 (m, 1H, CH-CH- NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,80 et 2,55 (système ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JAx = 12 Hz, 31Bx = 0 2824323 Hz, CH2-S); 2761 (s, 3H, CH3); 2,37 (t, 2H, J= 8 Hz, CH2-CO); 1,62-1,38 (m, 6H, (CH2)3) À Composé ortho-hydrazone 2c: Le composé 1c (500 mg, 1,38 mmol) est dissous à chaud dans l'éthanol (99 %, 8 mL) puis l'hydrazine monohydrate (572,uL, 11,1 mmol) est ajoutée. La solution est chauffée à reflux pendant 50 minutes. La solution est évaporée à sec. Le précipité blanc obtenu est filtré, lavé avec de l'eau puis séché à l'éther. On obtient ainsi 416 mg (11,1 mmol, 80 0 %) de produit 2c sous forme d'une poudre blanche. F 161 C. - IR (KBr): 3412, 3240, 2930, 2857, 2351, 1706, 1677, 1604, 1590, 1531, 1463, 1444, 1372, 1303, 1270, 1169 cm - RMN H (200 MHz, DMSO-d6) =11,97 (s, 1H, NH-CO); 8,35 (d, 1H, J= 8 Hz, Ar-H); 7,45 (d, 1H, J= 7 Hz, Ar-H); 7,19 (t, 1H, J= 7,5 Hz, Ar-H); 7,04 (t, 1H, J= 7 Hz, Ar-H); 6,61 (s, 2H, NH2); 6,42 (s large, 1H, NH-CO-NH), 6,35 (s large, 1H, NH-CO-NU); 4,32 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4,14 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1X CH-S); 2,81 et 2,56 (système ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2,31 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 2,09 (s, 3H, CH3); 1,63-1,36 (m, 6H, (CH2)3). À Composé ortho-diazométhane 3c: On solubilise 2c (200 mg, 0,53 mmol) dans 10 mL de DMF. On ajoute alors 800 mg de MnO2. Après 15 minutes d'agitation, le mélange est filtré à travers une couche mixte 2s Célite(0, 5cm)-tamis moléculaire(0,5cm en poudre). Le mélange réactionnel est évaporé à sec puis lavé à l'éther et séché. Le composé 3c (130 mg, 65 %) est obtenu sous forme d'une poudre rose. F 110 C. - IR (KBr): 3248, 2930, 2857, 2367, 2342, 2038, 1699, 1521,1456 cm. RMN 'H (200 MHz, DMSO-d6) = 9,37 (s, 1H, NH-CO); 7,26-7,00 (m, 4H, Ar-H); 1 2824323 6,43 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s large, 1H, NH-CO-NU); 4,30 (m, 1H, CH2 CH-NH), 4,15 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,82 et 2,54 (système ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2,24 (t, 2H, J= 8 Hz, CH2 CO); 2,12 (s, 3H, CH3); 1,63-1,37 (m, 6H, (CH2)3). 4) Synthèse du méta-BioDPDAM À Composé méta-couplage ld: On solubilise la D-biotine (500 mg, 2,05 mmol) dans 23 mL de DMF anhydre à chaud. On refroidit à 0 C sous argon, puis on ajoute successivement la Nméthylmorpholine (295 pL, 2,67 mmol) et le chloroformiate d'isobutyle (420 pL, 3,28 mmol). On laisse sous agitation pendant 30 min. puis on ajoute la 3-aminobenzophénone (605 mg, 3,07 mmol) et la N- méthylmorpholine (240 I1L, 2,17 mmol) dans 7 mL de DMF. La solution est maintenue sous agitation à O C pendant 2 h, puis on évapore à sec. On reprend le résidu dans 1 mL de MeOH, puis on ajoute 25 mL d'eau. Le précipité obtenu est filtré, lavé avec de l'eau, puis avec de l'éther pour donner 810 mg (93 %) de produit la brut. Une recristallisation dans le couple MeOH-H2O donne la (630 mg, 72 %) sous forme d'une poudre blanche. RMN tH (200MHz, DMSO-d6) =10,10 (s, 1H, NH-CO); 8-7,39 (m, 9H, Ar-H); 6, 43 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s large, 1H, NH-CO-NH); 4,27 (m, 1H, CH2-CH NH); 4,13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,84 et 2,55 (système ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2, 31 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 1,59-1,36 (m, 6H, (CH2)3). 42 2824323 À Composé méta-hydrazone 2d: On solubilise la (350 mg, 0,83 mmol) dans 5, 5 mL d'éthanol absolu puis on ajoute l'hydrazine monohydrate (140 I1L, 2, 48 mmol). La solution est chauffée à reflux pendant une nuit. Après évaporation, le produit est repris dans 1 mL d'éthanol et de l'eau. Le précipité blanc est recristallisé: on le dissout dans un minimum d'éthanol à chaud et l'on ajoute de l'eau jusqu'à apparition d'un léger trouble. Après retroidissement, le précipité obtenu est lavé à l'eau puis séché à l'éther. On obtient ainsi 264 mg (73 %) de produit 2d sous forme d'une poudre blanche. RMN IH (200 MHz, DMSO-d6) 0 = 9,99 (s, 1H, NH-CO); 9,80 (s, 2H, NH2); 7, 54 6,88 (m, 9H, Ar-H); 6,26 (s large, 1H, NH-CO-N; 6,21 (s large, 1H, NHCO-NH); 4,28 (m, 1H, CH2-CH-NH); 4,13 (m, 1H, CH-CH-NH); 3,12 (m, 1H, CHS); 2,78 et 2,59 (système ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2,27 (t, 2H, J = 8 Hz, CH2-CO); 1,57-1,36 (m, 6H, (CH2)3). À Composé méla-diazodiphényl 3d: On solubilise 3d (50 mg, 0,11 mmol) dans 1 mL de THF. On ajoute alors 80 mg de MnO2 activé. Après 5 minutes d'agitation à température ambiante, le mélange est filtré à travers une couche mixte Célite (0,5 cm) -tamis moléculaire (0,5 cm en poudre). Le mélange réactionnel est évaporé à sec. Le composé 3d (47 mg, 100 %) est obtenu sous forme d'une huile violette. RMN H (200 MHz, DMSO-d6) c = 9,95 (s, 1H, NH-CO); 7,60-6,9 (m, 9H, Ar-H); 6,42 (s large, 1H, NH-CO-NH); 6,35 (s large, 1H, NH-CO-NH); 4,28 (m, 1H, CH2 CH-NH); 4,14 (m, 1H, CH-C_-NH); 3,12 (m, 1H, CH-S); 2,83 et 2,59 (système ABX, 2H, 2JAB= 5 Hz, 3JAX = 12 Hz, 3JBX = 0 Hz, CH2-S); 2,27 (t, 2H, J= 8 Hz, CH2 CO); 1,58-1,35 (m, 6H, (CH2)3). 43 2824323 Exemple 2: rénctif de marquage avec le CY5 CY5PMDAM + PhHN NHPh - N 4 1 5 6 Ac2O Q=ô 1 OH Br Cy5-COOH + Br' OH fOH 10 o 7 8 9 ClCOOBu È NH2NH2 NNH2 MnO2 Cil, r o Cy5 NH Cy5 N. H Cy5 N H NH2 (NJ O X O C! O C' Me 11 12 13 - " gOH -!.;, "= À: N Cy5-CooH À Composé Iodure de 2-[4-(N-acétyl-Nphénylamino)buta-1,3-diényl]-1,2,3,3 tétraméthyl[3H] indolium 6. Le mélange du monochlorhydrate de malonaldehyde-bis(phénylimine) 5 (18,3 g, 70,0 0 mmole), de NaOAc (9,0 g; 110 rnmole) et de 1'iodure de 1,2,3,3 tétraméthyl[3H]indolium 4 (4,25 g, 14,1 mmole) dans de l'anhydride acétique (75 mL) est chauffé à 110 C pendant 20 min. Après reDroidissement, on ajoute de l'éther (350 mL) et le solide brun précipité est filtré, lavé avec de l'éther (3 x 100 mL) Le solide est redissout dans 150 mL de CH2CI2, filtré (élimination des sels minéraux) puis évaporé 1S pour donner un solide brun (6,0 g, 90 %). 44 2824323 RMNH(CDCl3):o=8,64 (d; 1H;J= 12Hz; 1-H);8,14(t; IH;J= 16; 12Hz; 3-H); 7, 63-7,19 (m; 9H); 6,90 (d; 1H;J= 15 Hz; 4-H); 5,82 (t; IH;J= 12; 13 Hz;2-H);4,06(s;3H;NCH3);(2,16(s;3H;-COCH3); 1,74(s;6H;CH3). - À Composé Bromure de 1-(S-carboxypentyl)-2,3,3-triméthyl[3H]indolium 9. On mélange le 2,3,3-triméthylindole 7 (10,0 g; 62,8 mmole) et 1'acide 6 0 bromohexanoïque 8 (12,3 g; 62,8 mmole) sans solvant et chauffe à 110 C pendant 12 h sous argon. Le mélange réactionnel pâteux rouge-violet est lavé avec de l'acétate d'éthyle (2 x 60 mL, on triture la pâte avec la spatule et on décante le surnageant), puis avec de l'acétone (50 mL, la pâte solidifie). Le solide rose est filtré puis séché sous vide (16,0 g; 73 %). À Composé CySCOOH 10. Le mélange de l'iodure 6 (6,0 g; 12,7 mmole), du bromure 9 (4,5 g; 12,7 mmole) et de NaOAc (2,6 g; 32 mmole) dans de 1'anhydride acétique (35 mL) est chaué à 110 C pendant 20 min. Après refroidissement, on ajoute de l'éther (150 mL) et le précipité est filtré et lavé avec de l'éther (3 x 50 mL). Le solide est dissout dans 100 rnL de CH2C12, filtré et purifié par chromatographie sur colonne de SiO2 (éluant: MeOH 5-10 %/CH2CI2). On obtient 3,4 g (44 %). RMN tH (CDCI3): 0 = 8,03 (t; 2H; J= 10; 11 Hz, 2-H, 4-H); 7,38-6,91 (m; 9H; Ar-H,3-H);6,41 (d; lH;J=14Hz; 1-H);6,31(d; lH;J=13Hz;5-H);4,07(t; 2H, J= 7;7Hz;oc-CH2);3,68(s;3H;NCH3);2,47(t;2H,J= 7;7Hz;s-CH2); 1,71 (m, 1 8H; CH3,,B, et 6-CH2). Composé de couplage de la 3-aminoacétophénone avec le Cy5COOH 10 (produit 11). À une solution de CySCOOH 10 (1,19 g; 1,9 mmole) dans 12 mL de CH2CI2 on ajoute N-méthylmorpholine (360,uL; 3,2 mmole). La solution est refroidie avec un bain de s glace, puis on ajoute le chloroformiate d'isobutyle (480,uL; 3,7 mmole). Après 5 min d'agitation, on additionne la 3aminoacétophénone (488 mg; 3,6 mmole). On agite le mélange à température ambiante pendant 3 h. En ajoutant 250 mL d'éther, on obtient un solide pâteux. Après agitation, on laisse reposer le solide au fond de ballon et décante le surnageant. On ajoute de nouveau 50 mL d'éther et on triture avec une spatule pour 0 obtenir un solide. Celui-ci est filtré, lavé avec de l'eau, de l'éther, puis séché sous vide. Le produit (iodure) est ensuite dissous dans de l'éthanol, passé sur colonne d'amberlite IRA900 (Cl-; 1S g). La solution éthanolique recueillie est évaporée à sec. puis passée sur colonne de SiO2. On obtient 0,93 g (77 %) de solide bleu. Composé CyS-hydrazone 12. On ajoute à une solution de l'acétophénone 11 (0,93 g; 1,46 mmole) dans S mL d'éthanol absolu l'hydrazine monohydraté (180 pL; 3,1 mmole) que 1'on agite à température ambiante pendant 7 h. On ajoute 50 mL d'éther et le précipité est filtré et lavé avec de 1'éther. On dissout le produit brut dans 50 mL de CH2CI2, la solution est filtrée puis concentrée à 10 mL. Le produit est précipité par ajout de 100 mL d'éther, filtré, lavé à l'éther et séché sous vide. On obtient 540 mg de produit 12 (57 %). Composé CySPMDAM 13. 2s À une solution de 100 mg d'hydrazone 12 dans 2 mL de DMF, on ajoute 300 mg de MnO2 et l'on agite vigoureusement pendant 10min. On filtre la suspension à travers une couche du célite et lave avec DMF (3xS00 pL). On ajoute 50 mL d'éther et l'huile déposée est triturée avec une spatule et le surnageant est décanté. On répète l'opération de lavage 3 fois avec 25 mL d'éther et le solide ainsi obtenu est filtré, séché. On obtient mg (65 %) de produit 13. La pureté du produit est d'environ 80-85 % (RMN H). Exemple 3:Autres réactifs svnthétisés 3.1: Synthèse deparanitrophényldiazométhane (NPDAM) Le 4-nitrobenzaldéhyde hydrazone est commercialement disponible (référence 28,118-2, Aldrich, France). On travaille donc sur 600 mg (3,64 mmole) de ce produit que 1'on dissout dans 9 rnL de THF. La solution est laissée sous agitation pendant 5 minutes puis 1,26 g (4 équivalent, 14,56 mmole) de MnO2 sont additionnés avec précaution. Le mélange est laissé sous 0 agitation pendant 10 minutes, puis filtré. Le filtrat récupéré est évaporé à sec. Après lavage au pentane, le composé para-nitrodiazométhane est obtenu sous forme d'une poudre orange vif avec un rendement de 79 % (468 mg, 2,87 mmole). F 80-82 C. - RMN H (300 MHz, DMSO-d6) = 8,11 (d, 2H, J = 9 Hz, Ar-H); 7, 18 (d, 2H, J= 9 Hz, Ar-H,); 6,06 (s, 1H, CH-N2). 3.2: Synthèse du phénylméthyldiezométhane (PMDAM) Hydrazone de l'acétophénone: On dilue l'acétophénone (2,0 g, 16 mmole) dans 16 mL d'éthanol absolu puis on ajoute 1'hydrazine (2,3 mL, 48 mmole). On porte au reflux. Après 2 h, on évapore le solvant et on reprend le résidu dans de 1'éther (150 mL). On lave avec de l'eau (lOOmL). Après séchage sur Na2SO4, on évapore 1'éther. On obtient l'huile jaune pale (1,5 g, 11 mmole, 69 %). Phénylméthyldiazométhane (PMDAM): On dissout l'hydrazone (150 mg, 1,1 mmole) dans 3 mL de THF. On ajoute le MnO2 (480 mg, 5,5 mmole). On agite pendant 30 min à température ambiante. Le milieu se colore en rouge. On filtre et on évapore le solvant. On obtient l'huile rouge (145 mg, 100 %). Ce réacifest utilisé sans purification. 3.3: Synthèse du diphényldiazométhane (DPDAM) La Benzophénone hydrazone est commerciale (réDérence B 960-2 Aldrich, France). 47 2824323 On travaille donc sur 196 mg (1,0 mmole) que 1'on dissout dans 5 mL de THF. 435 mg (5 éq, 5,0 mmole) de MnO2 sont additionnés, le mélange est laissé sous agitation pendant 10 minutes, puis filtré. Le filtrat récupéré est évaporé à sec. On obtient 193 mg (0,99 mmole). Ce réactif est utilisé sans purification. 3.4 Synthèse du NVDAM NO2 NO2 H O /É O 1) NH2-NH2, EtOH J r C 3 2)MnO2, THF CH3O OCH3 OCH3 NVDAM 0 La synthèse est réalisée selon le protocole décrit précédemment à partir de 6 nitrovératraldéhyde (Aldrich, référence 27,960-9). Exemple 4: Svnthèse du dérivé biotinvlé à partir du NPDAM (selonref) 2 hydrazine //0 NO2 2. Na2S, reflux NH2 3. MnO2 Biot O2NCHO - - - - - - - - O2NCHO - - - - - - - - - -' O2NCHN2 M. E. Wall et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 2689. Le dérivé 2-amino-4-nitro benzaldéhyde est préparé selon la méthode de ME Wall et al ,. reterencé c-dessus. La préparation du diazométhane NPDAM est identique à celle décrite dans l'exemple 1. *48 2824323 Exemple S: Préparation des acides nucléiques ARN et ADN. 5.1 Préparation des amplicons ADN Les amplicons ADN sont générés par PCR à partir de cible ADN génomique s Mycobacteri'm tu16erculosis 16S (1OE+4 copies comme cibles de départ) en utilisant le kit Fast Start de Roche, 0, 2 mM de chaque désoxyriDonucléotide (d-ATP, d-CTP, d GTP, d-TTP), 0.3 M d'amorces et 0,4 pL d'enzyme. Les paramètres de la PCR sont les suivants: - 95 C: 4 min puis 35 cycles (95 C: 30 sec; 55 C: 30 sec. 72 C: 30 sec) puis 4 C. o Les amplicons sont analysés qualitativement par électrophorèse sur gel d'agarose (1,5%, TBE 0,5X). Le volume déposé est de 5,uL et la migration s'effectue durant 20 min à lOOV. La visualisation des produits PCR est réalisée sous lampe UV après coloration au bromure d'éthidium. Les conditions pour la culture, I'extraction des Mycobactéries ainsi que les amorces d'amplification sont données dans le brevet WO 99/65926. 5.2 Préparation des ARN transcrits Les transcriptions sont réalisées à partir de cible PCR (fragment de l'ARN 16S de Mycabacterium tberculosis) en utilisant le kit MEGAscript d'Ambion: 7,5 mM chaque nucléotide (ATP, CTP, GTP et UTP) et 2 I1L d' enzyme (ARN polymérase). Le temps d'incubation est de 3h à 37 C. Les amorces d'amplification de la PCR portent un promoteur de polymérase T3 ou T7 comme décrit dans WO 99/65926 ou J. Clin Microbiol. 37(1), p 49-55, 1999, ce qui permet de réaliser la transcription. Les transcrits sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (1,5%, TBE 0,5X). Le volume déposé est de 5,uL et la migration s'effectue durant 20 min à lOOV. La visualisation des transcrits est réalisée sous lampe UV après coloration au bromure d'éthidium. Des résultats identiques du point de vue de l'invention peuvent être obtenus en utilisant d'autres techniques d'amplification comme la NASBA ou TMA qui génèrent directement des amplicons ARN. 49 2824323 Exemple 6: Réactivité des réactifs de marquage sur des nucléotides modèles La synthèse des réactifs de marquage est décrite dans les exemples 1 à 4. Le PDAM décrit dans la présente invention est commercialement disponible (référence P1405, Molecular Probes, Eugene, OR) 6.1: Marquage des monomères UMP 3'-phosphate La réactivité des réactifs de marquage portant une fonction diazométhyle a été étudiée 0 pour contrôler la spécificité de la réaction. Un protocole a été mis au point qui consiste à étudier cette réactivité par électrophorèse capillaire sur un composé modèle le 3'-UMP (Uridine 3'monophosphate, référence U1126 Sigma) dans les conditions standards suivantes: 3'-UMP O,04 mM; H3BO3 2,O mM, Marqueur 2,O mM [ajouté avec un solvant organique approprié (THF, AcOEt ou DMSO)]; Solvants H20 - CH3CN Solvant organique (rapport: 1/3/1) On répartit cette solution en dix fractions de 250 pL que l'on chauffe à 60 C. Après une durée définie, chaque fraction est traitée avec 250 L de dichlorométhane. Après agitation, on élimine la phase organique (phase inférieure). On répète cette opération encore deux fois. Après centrifugation (5 min. 5000 rpm), la phase aqueuse est analysée par électrophorèse capillaire. Les conditions de l'électrophorèse capillaire (EC) sont les suivantes: I'analyse EC a été effectuée par l'appareil Beckman P/ACE 5000. Un capillaire de silice fondue non traité (75 m x 50 cm) a été utilisé. Le voltage appliqué est de 30 kV (polarité normale) et la température du capillaire a été maintenue à 23 C. Les électrophorégrammes ont été enregistrés à 254 nm. La solution tampon borate (O. 1 M, pH 8,3) a été préparée à partir de 1'acide borique en ajustant le pH avec une solution NaOH et filtrée à travers un filtre O,2 m. Les échantillons ont été injectés sous pression (O,5 psi, 5 sec). Chaque analyse est précédée de la régénération du capillaire par passages successifs d'une solution de NaOH (O. 1 M, 2 min), eau (2 min) et de tampon borate (2 min) sous pression (20 psi). so 2824323 La réaction est effectuée en faisant varier le temps de réaction entre 0 et 4 heures comme indiqué sur chaque figure et les résultats sont présentés pour chaque réactif testé sur les figures 2A à 2I avec la concentration en réactif utilisée. Le temps de réaction est indiqué sur chaque électrophérogramme. Avec tous les réactifs testés, on obtient la formation exclusive d'un produit monoalkylé, ce qui prouve la spécificité de la réaction. La réactivité, c'est à dire le temps de demi réaction du réactif sur le 3'-UMP, peut être ainsi calculée, par comparaison de la hauteur des pics, et les résultats sont présentés 0 dans le tableau ci-dessous (conditions standards décrites ci-dessus): N2 C=N2 C=N2 PDAM DPDAM PMDAM NPDAM Réactivité 5 min 20 h 30 min 4 h obO'iN2 Bjo; 2 o O O BioDPDAM m- BioPMDAM p-BioPMDAM o-BioPMDAM * Réactivité 10 h 15 min 5 min I min * Avec le o-BioPMDAM, la réactivité est estimée car dans les conditions de concentration de 2 mM en réactif de marquage, la réaction est complète en moins de 5 min. La figure 2I utilise donc une concentration de 0,2 mM. On peut néanmoins noter que, la réaction étant très spécifique et ne conduisant pas à des sous produits pour tous les réactifs testés, il est possible d'augmenter la concentration du réactif de marquage sans conséquence du point de vue sélectivité sur le marquage. Ainsi pour le réactif DPDAM, si l'on augmente la concentration à 20 mM (voir figure 2C), la réactivité (temps de demi-réaction) est de 2 heures. Le même résultat est obtenu avec le BioDPDAM (figure 2F) o la réactivité est de 45 min à une concentration de 30 mM. 6.2 Test de différents nacléotides 3'-monophosphate. De manière à éviter toute erreur d'interprétation, une étude complémentaire sur le marqueur méta-BioPMDAM, pris à titre d'exemple significatif, a été effectuée avec les autres nucléotides 3'-monophosphate. 0 Les nucléotides testés sont les suivants: 3'-AMP (référence 85,194-9 Aldrich), 3'-GMP (réDérence 151214 ICN), 3'-CMP (réDérence C1133 Sigma), 3'-TMP (série désoxyribo) (référence T 1008 Sigma). Les électrophorégrammes obtenus avec les différents nucléotides sont représentés sur les figures 3A à 3D. Les temps de réaction indiqués sur la figure 3A sont identiques pour les figures 3B à 3D. Quel que soit le nucléotide de départ (série ribo ou désoxyrito), nous observons la formation exclusive et complète du produit alkylé en 130 min à 60 C. II est important de noter que dans le cas de la guanine (base la plus réactive avec les réactifs alkylants usuels), seul le produit alkylé au phosphate est observé prouvant la très grande sélectivité de la réaction. Cette étude permet également de vérifier que la vitesse de la réaction ne dépend pas de la nature de nucléotide en tant que substrat. 6.3 Etude d'un dinacléotide: L'alkylation du dinucléotide ApUp (réPérence A4298, Sigma) a été effectuée avec le méta-BioPMDAM afin de vérifier la sélectivité de la réaction vis-à-vis du phosphate terminal par rapport au phosphate internucléotidique. Le suivi de la réaction par électrophorèse est représenté sur la figure 4. Les conditions sont les conditions standards de 1'exemple 6.1. s2 2824323 La formation exclusive d'un seul produit est observée montrant une bonne sélectivité du réactif méta-BioPMDAM vis-à-vis du phosphate terminal par rapport au phosphate internucléotidique. 6.4 Caractérisation des adduits avec les 4 nacléotides 3'-monophosphates Pour s'assurer que les produits obtenus provenaient bien d'une alkylation au phosphate, la synthèse des adduits des monophosphates 3'-UMP, 3'-CMP, 3'-GMP et 3'-AMP avec 0 le réactif méta-BioPMDAM a été effectuée. La réaction d'alkylation est réalisée à l'échelle préparative comme indiqué ci-dessous. Les adduits, obtenus avec des rendements de l'ordre de 70 % sont purifiés puis étudiés par RMN du proton et du phosphore Protocole de préparation: On dissout le 3'-UMP (sous forme de sel disodique; 9,3 mg; 21,1 mol) dans 2 mL d'une solution aqueuse 0,1 M de H3BO3, puis on ajoute successivement 2 mL de CH3CN, 6 mL de MeOH puis le réactif méta-BioPMDAM (75 mg; 0,20 mmol). La réaction est réalisée pendant 2, h à température ambiante. Elle est suivie par électrophorèse capillaire. On ajoute 3 mL d'eau, puis l'excès du réactif est éliminé par extraction avec CH2CI2. La phase aqueuse est évaporée. Le résidu est dissout dans une petite quantité d'eau et purifié par passage sur une colonne de gel de silice en phase inverse (Lichroprep RP-18, Merck; élution MeOH/H2O (20/80)). On obtient 10 mg (69 %) de l'adduit du 3'-UMP. Les spectres de RMN du proton obtenus pour les adduits du 3'-NMP (N= G. U. C, A) sont présentés sur les figures SA à 5D. L'identification des adduits a été réalisé par des expériences de RMN à deux dimensions H/H (COSY). Deux diastéréoisomères pour chacun de ces adduits dans un rapport 1/1 sont présents. Un seul pic est présent pour la RMN du phosphore vers 0 ppm (300 MHz, D20) . Ces expériences démontrent que la réaction est bien spécifique, qu'un seul adduit est observé et que le marquage a bien lieu sur le phosphore. Il n'y a pas de réaction secondaire d'alkylation sur les bases. Les produits de marquage sont donc particulièrement adaptés pour une étape d'hybridation. Exemple 7: Etude de stabilité Exemple 7.1 Stabilité des réactifs de marquage à la température Tous les dérivés du diazométhane ci-dessous sont conservés à l'état solide dans le congélateur à -20 C pendant au moins 3 mois et aucune perte de réactivité n'est observée. o La stabilité à température ambiante sur la paillasse a été déterminée par RMN 'H pour les deux réactifs NPDAM et méfa-BioPMDAM. Nous n'avons observé aucune décomposition en laissant le NPDAM pendant un mois sur la paillasse à température ambiante, sans précaution particulière. Nous observons environ 50% de décomposition en laissant le méla-BioPMDAM sur la paillasse pendant 25 jours La stabilité à la température du réactif de marquage est une caractéristique essentielle. En effet, la destination finale d'un tel réactif pour une application industrielle est un kit de marquage. Un réactif qui n'est pas stable au moins pendant 15 jours à - 20 C, de préDérence 1 mois est invendable. Même s'il existe des moyens de stockage et d'envoi jusqu'à -110 C, il existe une relation entre la stabilité à -110 C et à -20 C et c'est pourquoi la valeur de 15 jours à - 20 C, de préférence 1 mois à -20 C est un minimum industriel. Au delà de - 11 0 C, les laboratoires ne disposent pas des équipements nécessaires (congélateur) pour stocLer ces réactifs (du point de vue de l'utilisateur et du fabricant) et il n'y a pas de moyen simple type carboglace pour les expédier (du point de vue du fabricant). En ce qui concerne la stabilité à température ambiante, une stabilité de quelques heures, de préférence 1 jour, est suffisante pour permettre à 1'utilisateur d'effectuer le marquage N C=N' ICC=H2C=N2 N2 Blab'NH PDAM DPDAM PMDAMNPDAM BioDPDAM iN2 H3C4N2 Blo>'NH 9io>NH O mBioPMDAM p-BioPMDAM o-BioPMDAM s Exemple 7.2: Hydrolyse de différents conjugués Nucléotide 3'-UMPmarqueurs. Nous avons testé la stabilité des conjugués [3'-UMP-marqueur] en milieu basique. Le mécanisme d'hydrolyse peut étre représenté de la manière suivante: 011 bl 13 1 J OH,0 OH OH,o 0=0 - 'P\ (IP-OH ( IP-OH NaO - _ O ONa NaO 3' UMP ONa R2 Hô Dérivé alcool Les différents conjugués utilisés ont été synthétisés selon le protocole suivi pour I'alkylation du monophosphate 3'-UMP (série ribonucléotide) par le méta-BioPMDAM Les différents réactifs de marquage testés avec le 3'UMP sont méta-BioPMDAM. ss 2824323 ortho-BioPMDAM. paraBioPMDAM. DPDAM PDAM Mode Opératoire On prépare une solution à 20 mM du réactif de marquage dans le DMSO. Pour la réaction, on mélange: - 20 pL de cette solution - 40 pL de NaOH 1N - 10 I1L de produit de rétérence à 40mM - 130 pL de H20. Cette solution est chauffée à 60 C et des prélèvements à temps précis sont effectués. Pour les prélèvements, on opère de la façon suivante: - 10 pL de la solution chauffée - 40 pL de H3BO3 0,5M - 150 pL de H2O. On injecte alors 15 '1L de cette solution finale par électrophorèse capillaire, ceci pour chaque prélèvement. o La vitesse de la réaction d'hydrolyse a été déterminée par électrophorèse capillaire en étudiant la diminution de la quantité de conjugué en fonction du temps (mesure de la surface du pic comparée à celle d'un étalon interne: acide 3,5-diaminobenzoïque ou acide naphtoïque). De cette façon, nous avons pu comparer la stabilité des différents conjugués. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous: Réactif de marquage couplé Temps de demi vie du au 3'-UMP conjugué exprimé en minutes méta-BioPMDAM. 197 ortho-BioPMDAM. 3 0 para-BioPMDAM. 8 DPDAM 54 PDAM 16 1 Ainsi, nous avons trouvé que le conjugué avec le méta-BioPMDAM présentait un temps de demi-vie de 197 min. soit un temps 25 fois supérieur à celui du dérivé para BioPMDAM, 7 fois supérieur à celui du dérivé DPDAM et 4 fois supérieur à celui du dérivé ortho-BioPMDAM. Les dérivés ortho et méta permettent de mieux stabiliser le conjugué ce qui permet une meilleure détection dans le cas d'un test diagnostic. Exemple 8: Marquage des ARN transcrits par le dérivé méta-bioPMDAM (3a! Marquage: HN;NH N2 H-H S/' /\/NH méta-bioPMDAM (3a) 57 2824323 Le dérivé méta-bioPMDAM (3a) a été obtenu selon le schéma réactionnel décrit dans l'exemple 1 Les cibles ARN ont été préparées par transcription post-PCR selon la procédure décrite dans l'exemple 5.2. A 50 1L d'une solution contenant des ARN transcrits, 9,uL d'eau pure (Sigma) 9 I1L d'imidazole à O,lM et 9 I1L de MnCI2 à 1M ont été ajoutés. La concentration de l'imidazole et du MnCI2 est de 6mM et 60mM respectivement. Avant l'incubation, de la solution contenant la cible ARN et le tampon nécessaire pour la fragmentation, 3 pL de méta-bioPMDAM (3a) à lOOmM dans le DMSO ont été ajoutés. La concentration finale o en marqueur méta-bioPMDAM est de 2mM. Après avoir complété la solution à 150 pL avec de l'eau pure, le mélange réactionnel est homogénéisé est incubé 30 min à 60 C. Après 30 min d'incubation et addition de 1'EDTA (lOOmM finale), l'excès de marqueur est él iminé par purification sur co l onnes QIAVAC_ (Q iagen, Hil d en, Al l emagne) en utilisant les tampons et le proto co le du fourni sseur. Hyhridation: Après l'étape de marquage pendant la fragmentation, les fragments obtenus sont hybridés sur les puces à ADN conçues pour l'analyse de la région 213-415 de la séquence M20940 " Genbank " de l'ARN 16S de Mycohacterium tu16erc?10sis. Cette puce à ADN est décrite dans A. Troesch et al, J. Clin Microbiol, 37(1), p49-55, 1999. Les étapes d'hybridation ont été réalisées sur les stations fluidiques (Affymetrix, Santa Clara, CA) en utilisant le protocole d'hybridation et les tampons décrits dans A. Troesch et al, J. Clin Microbiol., 37(1), p4955, 1999. Une étape supplémentaire est nécessaire pour révéler la biotine (détection indirecte). Les fragments biotinylés hybridés sur les sondes de capture à la surface de la puce à ADN sont révélés par l'introduction d'une streptavidine marquée par la phycoérythrine (excitation: 488nm) et par un Cy5 (excitation: 650nm) en utilisant les conditions suivantes: 300,uL d'eau pure; 300 pL de tampon Tris 100 mM pH 7 / NaC1 1M/ tween O,05% / Antimousse O,005%, 6 pL de BSA (50 mg/mL), 6 1L de streptavidine marquée. (200 g / mL). g 2824323 Streptavidine-Phycoérythrine: référence R0438, Dako, Danemark. Streptavidine-CY5: référence C0050 Dako Danemark. Antimousse référence M5-575, Ultra Additives Inc. Tween référence P-7949, Sigma. Lecture de la puce à ADN: La lecture de la fluorescence émise à la surface de la puce à ADN après marquage et hybridation ainsi que la génération des données en termes d'intensité du signal et du pourcentage d'homologie sont réalisés par les systèmes de lecture et le logiciel fournis par Affymetrix (GeneChip() Instrument System et GeneChip() Information System, o Santa Clara CA) Le système de lecture fournit des intensités en signal et bruit de fond exprimées en RFU (" relative fluorescence unit "). Le pourcentage d'homologie est donné par rapport à une séquence référence qui dans ce cas est la séquence de Mycobacterium tuberculosis. Les résultats en termes d'intensité moyenne du signal (I), du bruit de fond (B) et du pourcentage d'homologie (%) sont donnés dans le tableau cidessous: De manière générale, on considère qu'un pourcentage d'homologie supérieur à 90% est un résultat satisfaisant bien que l'on cherche en général un résultat supérieur à 95%. Au dessus de 95%, les valeurs ne sont plus indiquées car elles ne sont pas significatives dans le cas de la puce à ADN Mycobactéries. Une intensité élevée avec un bruit de fond faible est le deuxième résultat recherché dans les exemples qui suivent. Dans tous les résultats, le bruit de fond B est déduit de l'intensité moyenne I. Marqueur % d'homologie I (rfu) B (rfu) Phycoérythrine >95% 2358 397 6,9 CyS >95% 4688 72 66,3 Avec les deux marqueurs, le pourcentage d'homologie est supérieur à 95%. Les intensités des signaux en rfu sont supérieures à celles obtenues par les techniques de marquage standards. 59 2824323 Ces résultats montrent que la réaction de marquage pendant la fragmentation des ARN transcrits utilisant le dérivé méa-bioPMDAM permet de générer suffisamment de fragments marqués et détectables sur la puce à ADN. La fonction diazométhyle permet donc l'introduction du marqueur biotine dans la séquence d'ARN transcrit. Cette chimie ne modifie pas les propriétés d'interaction biotine-streptavidine. En effet, que ce soit avec le fluorophore phycoérythrine ou le Cy5, les niveaux d'intensités ainsi que le rapport signal sur bruit de fond (I/B) sont bons. Cette technique permet d'utiliser un fluorophore différent en fonction des applications voire de détecter à deux longueurs d'onde différentes (voir par exemple Nature Genetics volume 14, pages 441447, 1996). Exemple 9: Optimisation des conditions de marquage par le dérivé méta- bioPMDAM 9.1. Optimisation de la concentration en se1 de fragmentation (MnCl:) Le marquage des ARN transcrits a été réalisé selon le protocole décrit dans l'exemple en utilisant différentes concentrations en MnCI2. Le marquage, I'hybridation et la lecture ont été réalisés selon les procédures décrites dans l'exemple 8. Les résultats de marquage montrent que les intensités élevées sont obtenues avec des concentrations faibles en MnCl2. MnCI2: 0 mM, Intensité I: 3857 rfu, Homologie: 93,5% MnCI2: 5 mM, Intensité I: 3031 rfu, Homologie: 93,5% MnCI2: 10mM Intensité I: 2471 rfu, Homologie: 94,1% L'analyse de la fragmentation des transcrits ARN à différentes concentrations en MnCI2 montrent que la fragmentation est toujours efficace à 5 mM en métal et en incubant à C. Ceci montre que de très bons résultats de marquage peuvent étre obtenus en utilisant les réactifs de marquage dans les conditions optimales de marquage et de fragmentation. 2824323 9.2. Optimisation de la concentration en imidazole 4 tubes contenant 50, uL d'une solution d'ARN transcrits (Mycobactéries 16S) sont mis en présence de 4,5,uL ou 18 pL ou 36 L d'imidazole (lM dans l'eau pure) respectivement de manière à obtenir 3O, 120 et 240mM en concentration finale. 3 '1L de méta-bioPMDAM (lOOmM dans le DMSO) sont ensuite ajoutés et le volume total est ajusté à 150,uL avec de l'eau pure. Les solutions dans les 4 tubes sont mélangées au vortex et mis à incuber lO minutes à C. Purification L'élimination de l'excès de marqueur a été effectuée par purification des 4 solutions de réactions de marquage sur des colonnes QIAVAC_. Les étapes d'hybridation et de lecture sont celles de l'exemple 8 (détection streptavidine phycoérythrine). Les résultats en termes d'intensité du signal sont les suivants: Imidazole 30 mM intensité 3600 rfu. Imidazole 120 mM intensité 1600 rfu. Imidazole 240 mM intensité 1400 rfu. Le meilleur résultat en terme d'intensité de marquage et obtenu avec 30mM en imidazole. Il est probable que les concentrations élevées (120 et 240mM) engendrent des fragmentations excessives, et par conséquence, génèrent des fragments plus courts. Ceci montre aussi que la chimie de marquage basée sur la fonction diazométhyle peut être optimisée et adaptée aux conditions de marquage et à la cible à marquer. 6i 2824323 9.3. Effet de la concentration en marqueur méta-bioPlVIDAM 6 tubes contenant 50,uL d'une solution d'ARN transcrits (exemple 5.2) sont mis en présence de 4,5 I1L d'imidazole (1M dans l'eau pure) et de respectivement O,38, O,75, 1,5; 3, 4,5 et 7,5 uL de méta-bioPMDAM (100 mM dans du DMSO). Le volume total est ajusté à 150,uL avec de l'eau pure. Les solutions sont mélangées par vortex et mises à incuber 10 minutes à 60 C. L'élimination de l'excès de marqueur a été effectuée par purification des solutions de réactions de marquage sur colonnes selon le protocole décrit ci-dessus. o Les conditions d'hybridation et de lecture sont conformes à l'exemple 8. Les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous: Concentration en Marqueur Homologie I(rfu) B(rfu) I/B méta-bioPMDAM (%) 0,25mM PE 72, 4 193 786 0,2 Cy5 60,5 3263 487 6,7 0,5rnM PE 88,6 454 785 0,6 CyS 77, 3 7925 589 13,5 1,OmM PE 91,4 891 809 1,1 CyS 84,3 11194 662 16,9 2, 0mM PE 94,6 2361 787 3,0 CyS 91,4 15375 417 36,8 3,OrTLM: PE 95, 1 3944 797 5,0 Cy5 93,5 23248 222 104,8 ,0rnM PE 93,5 6112 820 7,5 CyS 92, 4 34794 479 72,6 Tableau récapitulatif des résultats de marquage en fonction des concentrations en marqueur bioPMDAM. Révélation sur puce ADN avec de la streptavidine- phycoérythrine (PE) et la streptavidine-CyS (Cy5) A partir de 2mM de méfabioPMDAM:, les pourcentages d'homologies et les intensités de marquage sont bons. Ceci est vrai dans le cas de la révélation de la biotine avec la 62 2824323 streptavidine portant la phycoérythrine et aussi dans le cas de la streptavidine liée au CyS. Au delà de cette concentration, le signal est augmenté et le pourcentage d'homologie n'est pas affecté. 9.4 Suppression de l'étape de purification post-marquage Dans le but de s'affranchir de l'étape de purification, différents volumes de la réaction de marquage sont hybridés sur puce à ADN sans purification préalable. A 50 pL d'une solution d'ARN transcrits (exemple 5.2), le tampon de marquage o pendant la fragmentation est ajouté, le mélange est ensuite incubé 30 min à 60 . Les conditions de marquage pendant la fragmentation sont: 30 mM imidazole (4,5 pL d'une solution d'imidazole à 1M dans l'eau pure), 10 mM MnCI2 (1,5 pL d'une solution de chlorure de manganèse à 1M dans l'eau pure) et 2 mM de méta-BioPMDAM (3 I1L d'une solution 100 mM dans le DMSO anhydre). Après incubation, différents volumes de la solution de marquage ont été hybridés sur la puce à ADN sans aucune purification préalable. Le protocole d'hybridation utilisé est décrit ci-dessus. Les fragments biotinylés hybridés sur les sondes de capture à la surface de la puce à ADN sont révélés par l'introduction d'une streptavidine marquée à la phycoérythrine (ex: 488nm) en utilisant les conditions de 1'exemple 8. La détection du marqueur phycoérythrine et l'analyse des résultats ont été aussi réalisés selon le protocole recommandé par Affymetrix et qui est décrit à l'exemple 8. 2s Les résultats sont donnés ci-dessous. Volume hybridé sur ia puce llomologie I (rfu) B(rfu) I/B a AI)N ('li) (%) 94,1 932 801 1,2 Réi?. >95 728 752 1,0 63 2824323 Réf*.: purification post-marquage sur colonnes du volume total de la réaction de marquage. Ces résultats montrent qu'avec 2mM en méta-BioPMDAM, il est possible de supprimer la purification si on n'hybride pas la totalité du volume réactionnel. Avec 20 '1L hyDridés sur la puce à ADN, les résultats en termes de pourcentage d'homologie et d'intensité du signal sont comparables à ceux obtenus avec le protocole standard utilisant une étape de purification. Les mêmes résultats sont obtenus avec des protocoles de marquage sans métal (MnCI). Les signaux sont plus importants Volume hybridé sur la Homologie I (rfu) B(rfu) puce à ADN L) (%) 93,5 2057 875 2,3 Dans cet exemple 9.4, les ARN transcrits utilisés sont dégradés, ce qui explique la faiblesse des signaux mais la référence utilisée permet la comparaison. lExemple 10: Autres agents de framentation utilisables pour le marquage d'ARN 10.1 Utilisation d'une chame polyamine Pour s'affranchir des problèmes de diminution du rendement de marquage en présence de sels, nous avons utilisé une polyamine " biogénique ", la spermine comme agents de fragmentation. En effet, cette châîne polyamine est connue pour son interaction avec les phosphates des acides nucléiques. 1L d'ARN transcrits (exemple 5' sont incubés 30 minutes à 60 C avec différentes concentrations de spermine (réDérence 13275-0010, Acros, FR, solution mère 0,5 M pH 7,5) et 2 mM méta-BioPMDAM (3 pL d'une solution de BioPMDAM 100 mM dans le DMSO anhydre) dans 150,aL final. 64 2824323 La purification, l'hybridation et la détection sur puce à ADN ont été réalisées selon le protocole décrit dans l'exemple 8 (détection streptavidine-phycoérythrine) . Résultats de marquage: Spermine (mM) Homologie ( /O) I (rfu) B(rfu) IIB 6 93,0 444 537 0,8 94,1 842 552 l 3,3 4 94,6 1884 461 4,1 1 94,6 2925 449 6,5 Les résultats de marquage pendant la fragmentation, pourcentage d'homologie et intensité du signal, avec la spermine comme agent de fragmentation sont satisfaisants. Les chanes polyamines peuvent donc étre utilisées pour fragmenter les cibles ARN lors de leur marquage par les réactifs de marquage portant une fonction diazométhyle. 10.2. Utilisation de dérivés phénanthrolines Essai 1: à 5 1L de transcrits ARN ( exemple 5.2) sont ajoutés 20 pL de phénanthroline-FeSO4 (référence P1929, Sigma, 25 mM) et 2 pL de méta-BioPMDAM (100 mM dans du DMSO). Le volume est ajusté à 100 pL. Le tube est incubé 60 min à 95 C. Essai: à 5,uL de transcrits ARN sont ajoutés 3 1L d'imidazole pH9.5 (1M dans eau pure), 0,5 uL de MnCI2 et 2 1L de méa-BioPMDAM (100 mM dans DMSO) . Le volume est ajusté à 100 I1L. Le tube est incubé 10 min à 60 C. Dans les deux cas, les échantillons sont hybridés, détectés et analysés sur puce à ADN. Les fragments biotinylés hybridés sur les sondes de capture à la surface de la puce à 2824323 ADN sont révélés par l'introduction d'une streptavidine couplée à un fluorophore, la phycoérythrine (excitation: 488nm), comme précédemment. Conditions Homologic I (rfu) B (rfu) I/B (%) mM phénanthroline FeSO4, 2 mM méta bioPMDAM min à 95 C >95 21821 633 34,5 mM Imidazole pH9,5, 10 mM MnCI2, 2 mM méta-bioPMDAM >95 10719 540 19,9 min à 60 C Les résultats obtenus avec la phénanthroline comme agent de fragmentation sont supérieurs à ceux obtenus avec le protocole standard utilisant le métal et l'imidazole. D'autres dérivés phénanthrolines compléxés avec d'autres métaux que le Fe+ + peuvent être utilisés. Par exemple Cu++, Zn++... 0 Exemple 11: Marquage et framentation en deux étapes d'ARN avec le méta- bioPMDAM pL d'une solution d'ARN transcrits obtenus selon le protocole décrit dans l'exemple 5.2 sont incubés 30 minutes à 60 C en présence du tampon de fragmentation: imidazole 30mM et MnCI2 lOmM. Le dérivé métabioPMDAM est alors ajouté à une concentration finale de 2 mM et incubé 5min supplémentaires à 60 C. Avant hybridation, les fragments d'ARN marqués sont purifiés sur colonne selon le protocole décrit précédemment (exemple 8). 66 2824323 Protocole utilisé Homologie (%) I (rfu) B(rfu) llB 1 Fragmentation puis marquage 81,1 44245 56,0 2.Marquage pendant la 91,9 20548 588 35,0 fragmentation Ici la comparaison doit être réalisée en tenant compte des intensités et du ratio I/B car les signaux obtenus dans le cas du protocole 1 (fragmentation puis marquage) sont trop forts. On observe une saturation du lecteur, ce qui conduit à des pourcentages d'homologie (81%) plus faibles en comparaison avec 91.9% obtenus avec le protocole de référence. Néanmoins, cet exemple montre que les étapes de fragmentation et de marquage peuvent étre séparées. Exemple 12: Amplification du sianal pour le marquage d'ARN avec le réactif méta-bioPMDAM. Le but de cette approche et d'amplifier le signal de fluorescence en introduisant plusieurs fluorophores par molécule de méta-bioPMI)AM. Réaction de marquage A 5,aL de transcrits (myco 16S), 89,L d'eau pure (sigma), 30,L d'imidazole (1M dans eau pure), 1pL de MnCI2 (1M dans eau pure) et 2 '1L de méta-bioPMDAM (100 mM dans DMSO) sont ajoutés. Les tubes sont agités par vortex puis incubés 10 minutes à 60 C La purification sur colonne et l'hybridation sur puce à ADN sont réalisées selon le protocole décrit dans l'exemple 8. 67 2824323 Sans amplification du sigral Les fragments biotinylés sont révélés par l'interaction avec de la streptavidine (marquée à la phycoérythrine: PE) avec le réactif de marquage mém-bioPMDAM. Le protocole d'addition de la streptavidine sur la puce à ADN est celui décrit dans s l'exemple 8. 4vec amplificatlon du signal lère étape: fixation de streptavidine (300 pL d'eau pure, 300 1L de tampon Tris 0 100 mM pH 7 / NaCl 1M / tween 0, 05% / Antimousse 0,005%; 6 '1L de BSA à 50 mg / mL, 4 pL de streptavidine à 1,5 mg / mL). 2ème étape: fixation d'anticorps anti-streptavidine biotinylé (300 IJL d'eau pure, 300,uL de tampon Tris 100 mM pH 7 / NaCI 1M / tween 0,05 /0 / Antimousse 0,005%; 6,aL de BSA à 50 mg / mL; 3 I1L d'anticorps antistreptavidine biotinylé à 1 mg / mL). 3èlne étape: fixation de streptavidine marquée la phycoérythrine (300 I1L d'eau pure, 300 1L de tampon Tris 100 mM pH 7 / NaCl 1M / tween 0.05% / Antimousse 0.005%; 6 pL de BSA à 50 mg / mL; 6 '1L streptavidine marquée la phycoérythrine à 300 g / mL). - Anti-streptavidine biotinylé: Référence 216-065-084, Jackson Immuno Research. - Streptavidine: référence S-888, Molecular Probes. La lecture des signaux sur la puce à ADN est effectuée selon le protocole décrit dans l'exemple 8. Les résultats en termes de pourcentage d'homologie et d'intensité de s marquage sont donnés dans le tableau cidessous Marquage post-hybridation llomologie (%) I (rfu) B(rfu) I/B Sans amplification du signal >95 2400 581 4,} Avec amplification du signal > 95 860 6,0 68 2824323 L' amplification du signal améliore considérablement la sensibilité de détection. Exemple 13: Marquage d'ARN par les dérivés ortho-bioPMDAM 3C! et parabioPMDAM (3b! Les deux réactifs ont été préparés selon le protocole décrit dans l'exemple 1 et ont été évalués dans l'approche de marquage pendant la fragmentation des ARN transcrits. Les ARN transcrits ont été obtenus selon le protocole décrit dans l'exemple 5.2. Le protocole de marquage, d'hybridation, d'introduction de la streptavidine marquée à la phycoérythrine et le protocole de purification sont ceux décrits dans l'exemple 8. Les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous: | Molécule utilisée Homologie (%) I(u)s(rfu) para-bioPMDAM >95 1665620 2,7 ortho- bioPMDAM >95 3657532 l 6,9 Ces résultats montrent que les substitutions en ortho, etpara donnent aussi des résultats intéressant en terme d'intensité de marquage et du pourcentage d'homologie. Exemple 14: Marquage des ARN transcrits par le dérivé BioDPDAM (3d) Le dérivé BioDPDAM (3d) a été préparé selon le protocole décrit dans 1'exemple 1. Les ARN transcrits ont été obtenus selon le protocole décrit dans l'exemple 5.2. Le procédé marquage et fragmentation est effectué en une étape en comparaison avec le 2s réactif méta-BioPMDAM dans les conditions décrites dans le tableau ci-dessous (volume de réaction 100 1L). Le protocole d'hybridation, d'introduction de la streptavidine marquée à la phycoérythrine et le protocole de purification sont ceux décrits dans l'exemple 8. 69 2824323 Les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous: Conditions de marquage Homologie (%) I (rfu) B(rfu) I/B Protocole de référence: mM Im pH 9,5; 5 mM MnC 2 mM méta-bioPMDAM (3a) min à 60 C 89,7 35519 528 67,2 mM Im pH 9,5; S mM MnCI2; 2 mM BioDPDAM (3d) min à 60 C >95 3252 446 7,3 mM Im pH 9,5; S rnM MnCI2; 2 mM BioDPDAM (3d) min à 60 C >95 4482 435 10, 3 mM Im pH 9,5; S mM MnC12; 2 mM BioDPDAM (3d) min à 60 C >95 6429 428 15, 0 Im =Imidazole Le dérivé 3d donne des bons résultats de marquage des ARN sur le phosphate. Ce résultat montre que des substitutions telle que le groupement phényle peuvent être utilisées pour moduler la réactivité et la stabilité des marqueurs portant la fonction diazométhyle. Exemple 15: Marquage d'ARN par le dérivé Cv5-PMDAM. (13) t N NH o CyS-PMDAM (13) Le marqueur CyS-PMDAM (13) a été préparé selon le protocole décrit dans 1'exemple 2. ,uL de transcrit ARN (exemple 5.2) sont marqués par le CySPMDAM dans différentes o conditions de fragmentation et de marquage. Les conditions générales sont les suivantes: - volume final de réaction 100 '1L - 30 mM d'imidazole pH 8 (3,uL d'une solution mère à I M) - 5 mM de MnCI2 (5 1L d'une solution mère à 0,1 M) - 3 mM du CyS-PMDAM (3,L d'une solution mère à 100 mM dans du DMSO anhydre). Dans un premier essai, le marquage pendant la fragmentation est réalisé en une seule étape. Dans un deuxième essai, le marquage et la fragmentation ont été réalisés en deux étapes: la fragmentation est réalisée avant le marquage. Après chaque incubation ayant contenue du MnCI2, le sel est neutralisé par addition de pL d'une solution à O,S M d'EDTA. L'incubation a été réalisée à 60 C pendant 30 min pour le marquage et la fragmentation en une étape. Pour le deuxième essai o le marquage et la fragmentation ont été réalisés en deux étapes, I'incubation, 15min d'incubation ont été utilisées pour *chaque étape. 7 2324323 Les fragments marqués ont été purifiés, hybridés et détectés selon le protocole décrit dans l'exemple 8. La seule différence réside dans le fait que lors de l'étape d'hybridation, I'addition de la streptavidine marquée n'est plus nécessaire car le marqueur est détecté de manière directe par un lecteur approprié (GMS 418 Array Scanner, Affymetrix, Santa Clara, CA). Les résultats de marquage sont donnés ci-dessous: Protocole de marquage Homologie (%) I (rfu) B(rfu) lIB Marquage pendant la >95 6612 352 17,3 fragmentation Fragmentation puis marquage 94, 1 8378 158 53,1 Le marquage sur le phosphate des ARN transcrits par un réactif de marquage (13) o donne des résultats très satisfaisants en termes d'intensité de marquage et du pourcentage d'homologie. Il est aussi important de noter que le rapport signal sur bruit de fond est très satisfaisant dans le cas de ce marqueur. En effet, les longueurs d'onde d'excitation et d'émission des dérivés cyanines sont éloignées de celles des molécules biologiques. Ces résultats montrent aussi que la fonction diazométhyle permet l'introduction d'autres marqueurs que la biotine au niveau des groupements phosphates des acides nucléiques. Exemple 16: Etude de la fragmentation de l'ADN 16.1 Hydrolyse de différents nacléosides en milieu acide Le but de cette étude est de démontrer la différence en terme de stabilité à pH acide entre les nucléosides naturels, les nucléosides modifiés ainsi que les nucléosides de type puriniques et pyrimidiniques. Cette étude permet également de mieux contrôler la fragmentation de l'ADN en tenant compte de sa composition en bases NH2NH2 o O 7; 'OiN OHOH OH NNNN H2N N IN N NN N HO HO JHO OH OHOH Deux nucléosides modifiés, la 8-bromo-2'-désoxyadénosine (8-BrdA) et la 5bromo-2'- désoxyoxycytidine (S-BrdC) ainsi que les 4 nucléosides naturels (dA, dC, dG et dT) on été utilisés dans cette étude. nmol de chaque nucléosides sont incubées dans 50 mM de formiate de sodium pH 3 à o 95 C Les temps d'incubation varient de O à 45 min. Après séchage sous vide et reprise par 20 pI d'eau pure, les échantillons (10 nmol) sont alors analysés par HPLC en phase inverse. Les résultats sont donnés sous forme de pourcentage d'hydrolyse du nucléoside de départ (en ordonnée) par rapport au temps d'incubation en minutes (en abscisse) voir figure 8. Les courbes de la figure 8 montrent que la modification de 1'adénine en position 8 par un atome de brome rend ce nucléoside moins stable que le nucléoside naturel. D'autre part, les résultats montrent que dans les conditions utilisées, la dépurination est beaucoup plus importante que la dépyrimidination. Cette étude montre que la fragmentation de l'ADN par la dépurination ou la dépyrimidination est contrôlée en optimisant les conditions d'hydrolyse ou en incorporant des bases modifiées moins stables que les bases naturelles ou des bases pouvant étre modifiées et hydrolysées après leur incorporation. 16.2. Fragmentation de l'ADN double brin incorporant ou non un nacléotide modifié. Trois amplifications PCR ont été réalisées en parallèle à partir de cible ADN génomique Mycobacferium therclosis 16S (10E+4 copies de départ) en utilisant le kit 1asf Sfarf de Roche, 0,2 mM de chaque désoxyribonucléotide (d-ATP, d-CTP, d-GTP, d-TTP), 0,3 1M d'amorces et 0,4 pL d'enzyme. 0 Les paramètres de la PCR sont ceux de l'exemple 5. Dans le premier cas, le protocole est utilisé tel quel: cas de la PCR dite naturelle. Dans le deuxième cas, le protocole est modifié pour obtenir une PCR à 30 % de 8Br dATP. Ceci est réalisé en introduisant 0,2 mM de d-CTP, d-GTP et d-TTP. On introduit également 0,14 mM de d-ATP et 0,06 mM de 8-BrdATP. (La 8-BrdATP est commerciale (référence N-2005-1, TriLink Biotechnologies, San Diego CA). Dans le troisième cas, le protocole est modifié pour obtenir une PCR à 50 % de 8 BrdATP. Ceci est réalisé en introduisant 0,2 mM de d-CTP, d-GTP et d-TTP. On introduit également 0,1 mM de d-ATP et 0,1 mM de 8-BrdATP. L'étude de la fragmentation seule de ces amplicons a été réalisée dans les conditions décrites ci-dessus: 50 mM de formiate de sodium pH 3 à 95 C. L'analyse a été effectuée sur gel dénaturant de polyacrylamide (8 % polyacrylamide, 7 M urée, 1 X TBE) utilisant la coloration au bromure d'éthidium. Après 15 min d'incubation à 95 C dans 50 mM de formiate de sodium pH3, aucune différence n'est visible entre les 3 cibles. Dans tous les cas, nous avons observé une fragmentation totale des amplicons PCR. La dépurination des amplicons PCR a été également été réalisée a différents pH et à différentes températures et temps d ' incubation. L' analyse sur gel, dans les conditions ci 74 2824323 dessus, montre qu'à pH 3 la fragmentation est totale après seulement 10 min d'incubation à 95 C. A ce pH, la fragmentation est aussi totale à 60 C après 30 min d' incubation A pH 4, 30 min d'incubation sont nécessaires pour 1'obtention d'une fragmentation totale des amplicons ADN même à 95 C. Ce résultat est très intéressant et montre que le site abasique généré à pH acide est instable et donc conduit à la fragmentation de la chame ADN sans aucun autre traitement particulier. o Exemple 17: Marquae et framentation de l'ADN par le dérivé méta- bioPMDAM (3a! en deux étapes Le dérivé méta-bioPMDAM (3a) a été obtenu selon le schéma réactionnel décrit dans l'exemple 1. Les amplicons ADN ont été préparés par amplification PCR selon le protocole décrit dans l'exemple 5.1. Marquage A 10 1ll de PCR, 38,uL d'eau pure (sigma), 50 pL de formiate de sodium (100 mM dans I'eau pure) sont ajoutés, le pH est ajusté à 3 et le mélange est incubé pendant 30 minutes à 60 C. Après incubation, 2 pL de méta-bioPMDAM (100 mM dans le DMSO) sont ajoutés. La solution a été mélangée par vortex, puis incubée 15 min supplémentaires à C. Les essais sont réalisés en duplicata afin de pouvoir analyser la fragmentation de l'ADN sur gel et 1'efficacité de marquage par hybridation et lecture de la puce à ADN. Purification La purification est réalisée sur colonnes QIAQUICK_ (Nucleotide Removal kit, Qiagen, Hilden, Allemagne). Le protocole de purification utilisé est celui recommandé par le fournisseur. 7s 2824323 Après purification, I'éluat est transPéré dans un tube propre contenant 400,uL de tampon d'hybridation (1,75 mL 20X SSPE; 2,9 mL Bétaine 5M; 290,uL DTAB 0, IM, pL Anti-mousse 30%) sont ajoutés. bétaine référence B-2754 Sigma. DTAB référence D-5047 Sigma. La solution est mélangée par vortex et incubée lOmin à 95 C afin de séparer les brins d'ADN qui ne sont pas séparés lors de l'étape de marquage pendant la fragmentation (étape de dénaturation). Le tube est ensuite plongé dans un mélange eau-glace à 0 C avant hybridation sur puce à ADN. Hybridation sur chip Les échantillons sont hybridés, détectés et analysés sur la puce à ADN de l'exemple 8. L'hybridation est révélée par le couplage de la streptavidine marquée à la phycoérythrine (PE) qui interagit avec la biotine de la méta-BioPMDAM dans les conditions suivantes: 300,uL d'eau pure; 300,uL de tampon Tris 100 mM pH 7 / NaCI 1M / tween 0,05% / Antimousse 0,005%, 6 I1L de BSA (50 mg/mL); 6,uL de streptavidine-PE (300 1lg / mL). Analyse sur gel de polyacrylamide Les échantillons destinés à être analysés sur gel sont séchés sous vide, repris par 10,uL d'eau pure et 10,uL de bleu formamide 2X La migration est effectuée sur gel d'acrylamide 8%, dans du TBE 1X, lheure à 150V. Le pH acide a été utilisé pour la fragmentation de l'ADN. En effet à ce pH, le phénomène de dépurination engendre des sites abasiques très instables conduisant à une fragmentation presque immédiate des séquences ADN à température élevée. Ce type de fragmentation produit des fragments ADN-5' phosphate L'analyse sur gel montre que l'incubation des amplicons PCR à 60 C pendant 30min en solution dans le tampon formiate de sodium (50 mM, pH3) conduit à une fragmentation totale de ces amplicons. Ceci nous a permis d'évaluer le marquage pendant la fragmentation des amplicons ADN en présence du marqueur méta-bioPMDAM. Les résultats de marquage en termes de pourcentage d'homologie, d'intensité des signaux et du bruit de fond sont donnés ci-dessous. Conlitions de marquage des amplicons PCR Homologie (%) I (rfu) B(du)1JB _ Tampon: formiate pH3, 50 mM Marqueur: 2 mM méta-bioPMDAM > 95 4456 5937,5 Cet exemple montre que les réactifs de l' invention peuvent étre utilisés pour le 0 marquage des fragments ADN produits par amplification enzymatique dans un protocole en deux étapes. lIs peuvent être également utilisés pour le marquage de l'ADN naturel non amplifié. Exemple 18: Marquage de I,ADN par le dérivé CYS PMDAM (13!. Le marquage de l'ADN par ce nouveau marqueur portant le fonction diazométhyle a été évalué en utilisant un fragment ADN synthétique. ,, _ 2 N2 I L:NH O CyS-PMDAM (13) Le réactif de marquage CyS-PMDAM (13) est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2. Un oligodésoxyritonucléotide (ODN) 20 mers est préparé selon la méthode dite au phosphoramidite. On introduit un phosphate à l'extrémité 5' par un réactif de phosphorylation standard compatible avec la chimie au phosphoramidite. La séquence de cet ODN est constituée de toutes les bases naturelles de l'ADN (séquence de l'ODN: s 5'- CTGAACGGTAGCATCTTGAC^3'). Cette séquence est complémentaire de séquences de capture d'une puce à ADN dite " modèle" synthétisée selon la technologie Affymetrix. Cette puce à ADN contient des sonde de capture identiques en séquence et qui sont réparties en damier sur sa surface. La lecture de cette puce à ADN donne des informations quant à la performance du marquage en terme d'intensité mais o pas de résultat d'homologie. Marquage: à 50 pmoles de cet ODN, 10 pL de Cy5-PMDAM (100 mM dans le DMSO) sont ajoutés. Le volume final est de 100 pL. Après homogénéisation, I' incubation est réalisée à 60 C pendant 3 0 minutes. La purification pour éliminer l'excès de réactif de marquage est réalisée selon l'exemple Résultats: La moyenne des intensités de marquage (I) lue sur la puce à ADN est de 16 644 rfu pour un bruit de fond (B) de 450 rfu. Ce niveau d'intensité est très élevé et montre que le réactif de marquage Cy5-PMDAM (13) est tout à fait compatible avec le marquage des fragments ADN sur le groupement phosphate. 2s 7s 2824323 Exemple 19: Marquage et fragmentation de l'ADN par le réactif PDAM 19.1 Marquage par le 1Pyrényldiazométhane (PDAM) "CH=N2 11 1 1 -Pyrényldiazométhane Le PDAM est obtenu chez Molecular Probes (Eugene, OR) et solubilisé dans du DMSO 0 anhydre. Deux ODN de 20 mers ont été utilisés comme modèles ADN: un ODN de 20mer 5'- hydroxyle et le même ODN de 20mer portant un phosphate à 1'extrémité 5'. La séquence de l'ODN est décrite dans l'exemple 18. La réaction de marquage est réalisée dans un mélange à 50 % en DMSO et 1,5 mM en 1Pyrényldiazométhane (PDAM) à 60 C pendant 30 minutes ou une heure. L'efficacité du marquage a été évaluée par chromatographie sur couche mince (en phase normale) dans un éluant isopropanol/ammoniac/eau 60/10/30. Après 30 minutes, le couplage est total sur l'ODN 5'-phosphate. Il faut une heure pour obtenir un couplage partiel sur l'ODN 5'-hydroxyle c'est à dire environ 50%. Les résultats de l'exemple 6 sont confirmés sur une séquence modèle de 20 bases en ce qui concerne le marquage très préférentiel des réactifs portant une fonction diazométhyle sur le phosphate terminal. Le marquage sur un phosphate intraoucléotidique n'est pas un inconvénient rédhibitoire puisque cela peut conduire à 2s une augmentation de la sensibilité par introduction de plus d'un marqueur sur le fragment d'acide nucléique. Néanmoins la sélectivité meilleure sur le phosphate terminal, est un avantage de l'invention car cela résout le problème de l'encombrement stérique du marqueur pendant l'hybridation. Cela permet à l'acide nucléique de s'hybrider avec 79 2824323 une bonne sensibilité sur la cible complémentaire tout en conservant une bonne spécificité d'hybridation. L'homme du métier par des réactions d'optimisation peut ainsi contrôler la spécificité du marquage, en jouant par exemple sur le réactif de marquage, le temps de réaction et la température, pour avoir un marquage exclusif sur le phosphate terminal. 19.2 Etude cinétique de la rénction de marquage par le PDAM. Cette étude a été réalisée en utilisant l'ODN 20mer 5'-phosphate dans les conditions précédentes en faisant varier le temps de réaction. Les rendements de marquage ont été 0 évalués par analyse CLHP en phase inverse dans les conditions suivantes: Phase inverse colonne Spheri-5 RP- 18 5 um, 220x 4,6 mm (Perkin Elmer). Les tampons et le gradient utilisés sont: Tampon A: 0,1 M TEAA, Tampon B = 50% Tampon A + 50 % CH3CN Gradient de 10 à 50 % de B en 30 min à 1 ml/min à température ambiante. Les résultats sont représentés sur la figure 9 avec en abscisse, le temps de réaction exprimé en minutes, et en ordonnée le pourcentage de marquage. Le rendement est proche de 90% après seulement 10 min d'incubation à 60 C. 19.3. Effet de la température sur le marquage au PDAM. Le marquage a été réalisé en utilisant l'ODN 20mer 5'-phosphate dans les conditions précédentes en faisant varier la température d ' incubation et avec un temps d ' incubation de 10 min dans chaque cas. Les rendements de marquage ont été évalués par analyse CLHP en phase inverse. Les résultats sont présentés sur la figure 10 avec en ordonnée le pourcentage de marquage et en abscisse la température de réaction en C Il est très important de noter que même à température ambiante (25 C), nous observons un marquage de l'ODN. Après lOmin d'incubation à 25 C, le rendement de marquage est environ 25%. A des températures supérieures à 50 C, des rendements supérieurs à so 80% peuvent être obtenus. Ceci montre l'effcacité et la flexibilité de cette chimie de marquage de l'ADN par les réactifs portant une fonction diazométhyle. Exemple 20: marquage et framentation des amplicons ADN obtenus par amplification PCR avec le réactif de marquage méta-bioPMDAM (3a! Le dérivé méta-bioPMDAM (3a) a été obtenu selon le schéma réactionnel décrit dans l'exemple 1. Les amplicons ADN ont été préparés par amplification PCR selon le protocole décrit dans l'exemple 5.1. 20.1. Comparaison du marquage avec et sans fragmentation a. Marquage dans les conditions de fragmentation: A 10 pL de PCR sont ajoutés 50 1L de formiate de sodium pH3 (50 mM) et 2 I1L de méta-BioPMDAM 100 rnM dans du DMSO). Le volume est ajusté à 100 '1L. La solution est incubée 30 min à 60 C. b. Marquage sansfragmentafion: A 10 pL de PCR sont ajoutés 2 IJL de méta-BioPMDAM (100 mM dans du DMSO). Le volume est ajusté à 100!1L. La solution est incubée 30 min à 60 C. Le reste du protocole est identique à celui de l'exemple 17. Résultats Protocole utilisé Ilomologie I (rfu) B (rfu) (%) a. Marquage dans les conditions de >95 3995 569 7,0 fragmentation b. Marquage sansiragmentation 94,1 500 542 0,9 Les résultats dans le tableau cidessus montre que sans fragmentation, la moyenne des intensités obtenues est au même niveau que le bruit de fond (500 rfu). Le marquage pendant la fragmentation donne un niveau d'intensité bien supérieur (environ 4000 rfu) g 2824323 et un très bon pourcentage d'homologie. La combinaison des deux étapes représente donc bien une amélioration significative pour la détection d'un acide nucléique. s 20.2. Effet de la dénaturation avant hybridation sur puce à ADN. Deux réactions de marquage ont été réalisées en parallèle dans 2 tubes séparés selon le protocole suivant: à 10 1L de PCR sont ajoutés 50 tlL de tampon formiate de sodium pH3 (50 mM) et 2 '1L de méta-bloPMDAM (lOOmM dans du DMSO). Le volume total est ajusté à 100 pL et incubé 30 min à 60 C. o Après purification sur colonne (exemple 17), la solution issue du premier tube est incubée 10 min à 95 C (afin de désapparier le double brin d'ADN), puis plongé dans un mélange eau-glace à 0 C jusqu'à l'hybridation sur la puce ADN. La solution issue du deuxième tube est hybridée sur la puce à ADN sans dénaturation préalable. Les fragments biotinylés hybridés sur les sondes de capture à la surface de la puce à ADN sont révélés par l' introduction d'une streptavidine marquée par la phycoérythrine en utilisant les conditions décrites dans l'exemple 17 Résultats Conditions utilisées Homologie (%) I (rfu) B (rfu) I I/B A vec dé?aturation >95 22812 5 70 40, 1 Sans dératuratio,,' 93,5 4795 681 7,0 Les résultats obtenus avec la dénaturation pré-hybridation sont supérieurs à ceux obtenus sans l'étape de dénaturation. Ceci montre que la dénaturation de l'ADN est nécessaire pour obtenir un bon niveau d'intensité. La fragmentation via les sites abasiques est un moyen pour faciliter la dénaturation d'un ADN double brin et renforcer l'hybridation sur les sondes de captures. Pour tester d'autres réactifs de marquage et compte tenu des résultats obtenus avec les différentes conditions ci-dessus, nous avons défini un protocole de référence utilisant la fragmentation au tampon formiate de sodium (SOmM, pH3) et un étape de dénaturation pré-hybridation. Exemple 21: Marquage et fragmentation des amplicons PCR par les réactifs biotinvlés dans un protocole en une étape Les dérivés méta-, ortho-, et para-bioPMDAM ont été préparés selon le protocole o décrit dans l'exemple 1. Ils ont été solubilisés dans du DMSO anhydre à une concentration de lOOmM Le protocole est identique à celui de l'exemple 20.2 (marquage et fragmentation en une étape puis étape de dénaturation pré-hybridation). Résultats Marqueur Homologie ( /0) I (rfu) B (rfu) I/B ortho-bioPM13AM > 95 25951 820 31,6 méta-bioPMDAM >95 22960 581 39,5 para-bioPMDAM 94, 1 43785 1205 36,3 Le protocole optimisé avec fragmentation et marquage en une étape donne d'excellents résultats avec différents réactifs de marquage avec la fonction réactive diazométhyle. Exemple 22: Marquage et fragmentation de l'ADN par le BioDPDAM Les amplicons ADN ont été préparés par amplification PCR selon le protocole décrit dans 1'exemple 5.1. La synthèse du réactif de marquage est décrite dans l'exemple 1. 83 2824323 Le protocole est identique à celui de l'exemple 20.2 y compris la dénaturation à 95 C avant l'étape d'hybridation. Résultats Marqueur utilisé Homologie (%) I (rfu) B (rfu) I/B BioDPDAM 93, 0 32359 3610 9, l Ce résultat montre que des substitutions aussi importantes que le groupement phényle peuvent être utilisées pour optimiser la réactivité des réactifs de marquage portant une fonction diazométhyle. Exemple 23: Marquage et framentation de l'ADN par la 5 (bromométhvl!fluoresccine. Les amplicons ADN ont été préparés par amplification PCR selon le protocole décrit dans l'exemple 5.1. A 10 pL de PCR sont ajoutés 50 pL de formiate de sodium pH3 (100 mM) et 2 11L de (bromométhyl)-fluoresceine (Molecular probes, Eugene, OR) (100 mM dans du DMSO). Le volume est ajusté à 100 pL. La solution est incubée 30 min à 60 C. Les conditions de purification sont conformes à celles de l'exemple 17. Une étape de dénaturation est effectuée comme décrit dans 1'exemple 20.2. Les autres conditions d'hybridation et de lecture sont identiques à celles décrites dans l'article de A. Troesch et al. J. Clin. Microbiol., 37(1), p 49-55 1999. La fluorescéine est directement détectable sur le lecteur. Protocole utilisé Homologie I (rfu) B (rfu) l/E} Marquage pendant la fragnlenfafion >95 855 183 4,7 des amplicons PCR avec la 5-(bromo méthyl) f luorescéine l Ce résultat montre que la fragmentation de l'ADN par la création de sites abasiques est tout à fait compatible avec un réactif de marquage portant une fonction réactive s halogénure d'alkyle. Ce protocole est réalisé en une étape (fragmentation et marquage). Exemple 24: Marquage et fragmentation des amplicons ADN en présence d'un autre agent chimique de fragmentation dérivé de la phénanthroline. Des amplicons ADN ont été préparés par amplification PCR selon le protocole décrit dans l'exemple 5 1. 2 types de conditions sont utilisées: Co7ditions a: A 10,uL de PCR sont ajoutés 20 I1L de phénanthroline-FeSO4 (25 mM) et 2 pL de méta-BioPMDAM (100 mM dans DMSO). Le volume total est ajusté à 100,uL. Le mélange est incubé 60 min à 95 C Condifions b: A 10 pL de PCR sont ajoutés 50 pL de tampon formiate de sodium pH3 (100 mM dans eau pure) et 2 pL de de méta-BioPMDAM (100 mM dans DMSO). Le volume total est ajusté à 100 pL Le mélange est incubé 30 min à 60 C. Les autres conditions du protocole sont identiques à celles de l'exemple 17 ss 2824323 Conditions Homologie I (rfu) B (rfu) I/B (%) Phénanthroline FeS04(5 mM) >95 2236 500 4,5 méta-bioPMDAM (2 mM) min à 95 C Tampon formiate (:OmM) pH3 >95 6786 565 12,0 méta-bioPMDAM (2 mM) min à 60 C Les deux conditions de fragmentation permettent un résultat satisfaisant. Le meilleur résultat est obtenu avec les conditions (b) utilisant la fragmentation à pH acide. Exemple 25: liramentation des amplicons PCR marqués nar incorporation du o d-UTP-fluorescéine Incorporation du nucléotide marqué Une amplification PCR a été réalisée selon le protocole suivant afin générer des amplicons PCR marqués par la fluorescéine (marquage sur les bases) : A partir de cible ADN génomique Mycabacterium tuberculosis 16S (10E+4 copies) en utilisant le kit Fast Starf de Roche, 0,2 mM des désoxyribonucléotides d-ATP, d-CTP et d-GTP ainsi que 0,14 mM de d-TTP et 0,06 mM de d-UTP-12-fluorescéine, 0,3 M d'amorces et 0,4,uL d'euzyme. Le pourcentage du nucléotide marqué par rapport à son homologue naturel d-UTP est de 30%. C'est ce rapport qui est généralement utilis dans les réactions de marquage des amplicons par incorporation de nucléotides marqués. Le d-UTP-12-fluorescéine est disponible commercialement chez Roche Diagnostics (référence 1373242, Mannheim, Allemagne). Les paramètres de la PCR sont ceux de l'exemple 5.1. a. Fragmenfution des amplicons PCR marqués à 30% de d-UTP-fluorescéine: A 10,uL de PCR sont ajoutés 50 pL de tampon formiate de sodium pH3 (50 mM). Le volume est ajusté à lOO pL. La solution est ensuite incubée 30 min à 60 C. s b. Marquage pendant la fragmenfution des amplicons PCR contenant 30% de d-UTP- fluorescéine: A 10 ilL de PCR sont ajoutés SO I1L de tampon formiate de sodium pH3 (50 mM) et 2 uL de méta-BioPMDAM (100 mM dans du DMSO). Le volume est ajusté à 100 '1L. La solution est ensuite incubée 30 min à 60 C. Cet essai correspond à un protocole de o référence qui permet de comparer les différentes stratégies de marquage en s'affranchissant de la variabilité due à l'étape d'amplification. Une étape de purification sur colonne et une étape de dénaturation à 95 C sont effectuées dans tous les cas comme dans l'exemple 17. Protocole (al): Les acides nucléiques obtenus par fragmentation des amplicons marqués au d-UTP- fluorescéine (conditions a) sont hybridés sur puce à ADN et détectés dans un premier temps par lecture directe des signaux fluorescents émis par le fluorescéine comme décrit dans 1'exemple 23. Protocole (a2): Une étape d'amplification du signal a été utilisée pour améliorer la sensibilité de marquage. L' amplification du signal a été réalisée par l'introduction, lors de l'étape d'hybridation, d'un anticorps anti-fluorescéine biotinylé (Molecular Probes = ref. A982,1 mg/ml) puis d'une streptavidine marquée par la phycoérythrine en utilisant les conditions successives suivantes: lè'e étape: 300 '1L d'eau pure 87 2824323 300 pL de tampon Tris 100 mM pH 7 / NaC1 1M / tween 0.05%1 Antimousse 0. 005%, 2.4,uL de BSA (50 mg/mL), 1 2 '1L d'anticorps anti-fluoresceine biotinylé. (Img / mL) 2 étape: s 300 pL d'eau pure. 300 '1L de tampon Tris 100 mM pH 7 I NaC1 1M / tween 0,05% / Antimousse 0, 005%, 6 pL de BSA (50 mg/mL), 6 L de streptavidin-PE. (300,ug / mL). Dans ce protocle, la fluorescéine agit comme un haptène (traceur détectable indirectement par un anticorps marqué) et non pas comme un fluorophore. Protocole () Les fragments biotinylés du cas () hybridés sur puce à ADN sont révélés par l'introduction d'une streptavidine marquée par la phycoérythrine en utilisant les .. condtons suvantes: 300 '1L d'eau pure 300,uL de tampon Tris 100 mM pH 71 NaC1 1M / tween 0,05% 1 Antimousse 0, 005%; 6 pL de BSA (50 mg/mL); 6 pL de streptavidine marquée. (300,ug I mL). La lecture de la fluorescence émise à la surface de la puce à ADN après marquage et hybridation ainsi que la génération des données en termes d'intensité du signal et du pourcentage d'homologie sont réalisés par les systèmes de lecture et le logiciel fournis par Affymetrix et il est important de noter que le système de lecture utilisé contient deux filtres permettant de détecter directement la fluorescéi ne dans l e cas d es amp li co ns marqués au dUTP-fluorescéine, ou bien la Phycoérythrine dans le cas des amplicons 2s marqués au dUTP-fluorescéine avec amplification du signal et celui o ces amplicons sans marqués pendant leur fragmentation par le méta-bioPMI)AM. Dans les deux derniers cas (révélation phycoérythrine) I'utilisation d'un filtre permet de s'affranchir du signal généré par la fluorescéine et c'est bien le signal de la phycoérythrine qui est détecté. Résultats Protocole utilisé Marqueur:Elomologie I (rfo) B (rfu) détecté (%) al.Fragmentafion desampliconsPCR marqués Flu 81,6 595 342 1,7 parla dUTP-fluorescéine a2. Fragmentation des amplicons PCR marqués PE > 95 22107 3461 6,4 par la dUTP-fluorescéine Amplification du signal sur la puce à ADN par empilement b. Protocole de référence (rénctif m- BioPMDAM PE >95 21700 1503 14,4 et tampon formiate acide) Fragmentation et marquage sur les mémes amplicons PCR rvodifiés par la dU[P- fluorescéine Flu =Fluorescéine et PE = Phycoérythrine Les résultats ci- dessus montrent que la fragmentation chimique utilisant la création de site abasique est compatible avec le marquage enzymatique des amplicons ADN et que le marquage peut avoir lieu avant la fragmentation. Les niveaux d'intensité ainsi que le pourcentage d'homologie obtenus avec ce protocole o d'incorporation enzymatique du fluorophore sont faibles en comparaison de ceux obtenus avec le marquage pendant la fragmentation utilisant le réactif de marquage avec une fonction diazométhyle comme le méta-bioPMDAM (conditions (b)). Pour atteindre le niveau d'intensité obtenue avec le dérivé méta-bioPMDAM, une étape d'amplification du signal est nécessaire (conditions a2). Ceci montre bien l'efficacité de la fonction réactive diazométhyle par rapport à l'incorporation traditionnelle de base modifiée comme le dUTP fluorescéine (protocole de référence (b)), 89 2824323 Exemple 26:framentation de l'ADN double brin par sonication Des amplicons ADN ont été obtenus en utilisant le protocole décrit dans l'exemple 5.1. Ces amplicons ont été fragmentés par sonication en présence et en absence du marqueur. a. Marquage des amplicons PCR pendant la sonication A 10 I1L de réaction PCR sont ajoutés 2 pL de méta-BioPMDAM (lOO mM dans DMSO). Le volume est ajusté à 100 '1L par de l'eau puis le pH est ajusté à 6,5. Le mélange est incubé 30 min à 60 C dans un bain d'une cuve à ultrasons (fréquence o 35kHz, modèle T460-H, Bioblock, France). b. Marquage pendant la fragmentation chimique des amplicons RCR (protocole de réjérence en une étape) A 10 '1L de réaction PCR sont ajoutés 50 1L de formiate de sodium pH3 (50 mM) et 2 pL de méta-BioPMDAM (100 mM dans du DMSO). Le volume est ajusté à 100 pL. La solution est incubée 30 mir. à 60 C. Les essais sont réalisés en duplicata afin de pouvoir analyser la fragmentation de l'ADN sur gel et l'effcacité de marquage par hybridation et lecture de la puce à ADN comme décrit précédemment (exemple 17 détection Phycoérythrine) Analyse sur gel L'analyse a été effectuée sur gel dénaturant de polyacrylamide (8 % polyacrylamide, 7 M urée, 1 X TBE) utilisant coloration au bromure d'éthidium. L'analyse sur gel montre que les amplicons ADN sont fragmentés par sonication à 60 C. 2824323 Résultats Conditions homologie I (rfu) B (rfu) l/B a Marquage pendant 93, 8 2271 631 3,6 fragmentation par sonication b. Marqage pendant la > 95 19639 1459 13,5 fragr''entation chimique (conditions de rejerence) Les résultats de marquage pendant la sonication ( conditions a) sont satisfaisants. Ceci montre que la fragmentation physique par sonication des cibles ADN est compatible avec la chimie de marquage par des réactifs de marquage portant une fonction diazométhyle. Les faibles résultats de marquage dans le cas (a) sont certainement dus au fait que le marqueur se dégrade sous l'effet des ultrasons. Les résultats avec la fragmentation par o création de site abasique par action du pH acide sont meilleurs. Exemple 27: Marquage. framentation et dénaturation de l'ADN en une étape Les amplicons ADN ont été préparés par amplification PCR selon le protocole décrit dans l'exemple 5.1. Deux réactions de marquage ont été réalisées: a. Marquage, fragmentation et dénaturation à 95 C en une seule étape. A 10 uL de PCR sont ajoutés 50 pL de tampon formiate de sodium pH3 (50 mM) et 2 pL du marqueur méta-PMDAM (lOOmM dans du DMSO anhydre). Le volume final est ajusté à 100 pL. La solution est ensuite incubée 30 min à 95 C. Dans ce cas, le mélange réactionnel a été hybridé sur puce à ADN sans aucune dénaturation préalable. 91 2824323 b. Marquage etfragmenfation à 60 C: A 10,uL de PCR sont ajoutés 50 pL de tampon formiate de sodium pH3 (50 mM) et 2 uL du marqueur métadiazodiphényle biotine (lOOmM dans du DMSO anhydre). Le volume final est ajusté à 100 pL. La solution est ensuite incubée 30 min à 60 C. Le mélange réactionnel a été ensuite purifié selon le protocole décrit auparavant. Dans ce protocole b et avant hybridation sur puce à ADN les fragments on été dénaturés selon le protocole décrit dans l'exemple 20.2. Résultats Protocole utilisé Homologie (%) I (rfu) B (rfu) I/B a. Marquage, fragmentation et >95 5426 506 10,7 dénaturation à 95 C b. Marquage et fragmentation >95 7015 818 6,8 à 60 C puis dénaturation dans un deuxième temps à 95 C L'exemple 20. 2 a démontré l'importance de la dénaturation de l'ADN double brin pour la sensibilité de détection. Ces résultats montrent qu'avec l'approche fragmentation par création de site abasique, le marquage, la fragmentation et la dénaturation de l'ADN peuvent être réalisées en une seule étape ce qui représente une amélioration notable du point de vue de la simplicité et cela sans affecter la sensibilité de détection. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un réactif choisi parmi les composés de formules (19) R: C=N2 r7 (19) s dans laquelle R' représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué et Z comprend un marqueur détectable, pour le marquage et la fragmentation d'un acide nucléique simple ou double brin, ledit réactif se couplant de manière covalente et majoritaire sur au moins un phosphate dudit fragment. 2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que le réactif est choisi parrni les composés de formules (20): R: R2_ (L) _ z,C= N2 dans laquelle R' représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 est un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d' au moins 2 liaisons covalentes et n est égal à 0 ou 1, et Z est choisi parmi y 3R4 X O O :3 R ou: R3 ou -C-NH- ou -C dans lequel R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre: H. NO2, C1, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle -Y-X- représente -CONH-, NHCO-, -CH20-, -CH2S 3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que Z est le radical et R est H. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en o ce que le marquage et la fragmentation sont effectués en deux étapes. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'une fragmentation et le marquage sont effectués en une seule étape. 6. Utilisation selon l'un quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le marquage s'effectue en solution homogène sensiblement aqueuse. 7. Utilisation selon l'une quelcouque des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que la fragmentation s'effectue par voie enzymatique, physique ou chimique. 8. Réactif de marquage stable à la température de formule (1) R3 R2 (L)nY-X::,RI 2 (1) dans laquelle: R représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, 94 2824323 R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre: H. NO2, C1, Br, F. I, OR, SR, s NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R= alkyle ou aryle, -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-. 9. Réactif selon la revendication de formule (2): R2 (L)n-C-NHt,R 2 (2) 0 dans laquelle: R' représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d' au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre: H. NO2, C1, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle. 10. Réactif selon la revendication de formule (3): R2 (L)n-NH-CD'- 2 (3 dans laquelle R représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre: H. NO2, C1, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle. 1 l. Réactif selon la revendication 8 de formule (4): R3 R2_(L)n-CH2-O, Rl 2 dans laquelle R représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchanement linéaire d'au moins 2 liaisons 0 covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre: H. NO2, C1, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle. 12. Réactif selon l'une quelconque des revendications 8 à 1 l caractérisé par le fait que R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre: H. NO2, OCH3. 13. Réactif selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9 de formule (2'): R (L)n-C-NH=N2 R (2'y dans laquelle R' représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué. R2 représente un marqueur détectable. L est un bras de liaison comportant un enchanement linéaire d'au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1. 2s 96 2824323 14. Réactif selon l'une quelconque des revendications 8 à 13 dans laquelle la structure R2-(L),- est de formule (5): -O:'HR2 -oq'HR2 R2_HN-NH m-1 dans laquelle R2 représente un marqueur détectable, m est un nombre entier compris entre 1 et 100, p est un nombre entier compris entre 1 et 10. 15. Réactif selon la revendication 8 de formule (6): lNl 2 R2_(L)n-Y-XC-yX-(L)n-R dans laquelle R2 représente un marqueur détectable, R3 représente H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R = alkyle ou aryle, L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d' au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à O ou 1, -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH20-, -CH2S-. 16. Réactif selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9 de formule (14): ' 2824323 NO2 R2 (L)n C:-NH N2 (14) dans laquelle R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d' au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1. 17. Réactif selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9 de formule (15): NO2 R2 (L)n C-NH 2 (15) dans laquelle 0 R2 représente un marqueur détectable, L est un bras de liaison comportant un enchâînement linéaire d' au moins 2 liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1. 18. Procédé de synthèse d'un réactif selon l'une quelconque des revendications 8 à 17comprenant les étapes suivantes: a) On dispose d'un dérivé de formule (16) O Rl R3 R4 (16) dans laquelle R' représente H ou un groupe alkyle ou aryle ou aryle substitué, 98 2824323 R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre: H. NO2, Cl, Br, F. I, OR, SR, NR2, R. NHCOR, CONHR, COOR avec R= alkyle ou aryle, R6 représente COOH, NH2, OH ou SH. b) On dispose d'un marqueur ou d'un précurseur de marqueur possédant une s fonction réactive R7 complémentaire de R6. c) On fait réagir ensemble la fonction complémentaire dudit marqueur ou précurseur de marqueur avec la fonction R6 du dérivé de formule (16) en présence d'au moins un agent de couplage pour former une liaison covalente. d) On fait réagir un dérivé de l'hydrazine ou l'hydrazine sur la fonction 0 cétone ou aldéhyde pour former une hydrazone. e) On transforme l'hydrazone en fonction diazométhyle à l' aide d'un traitement approprié. 19. Procédé de synthèse d'un réactif de marquage selon la revendication 13 comprenant les étapes suivantes: a) On dispose d'un dérivé de formule (17): 0'Ri NH2 (17) dans laquelle R' représente H ou un groupe alkyle ou aryle ou aryle substitué, o b) On dispose d'un marqueur ou d'un précurseur de marqueur possédant une fonction acide carboxylique. c) On fait réagir ensemble la fonction carboxylique dudit marqueur ou précurseur de marqueur et la fonction amine primaire du dérivé de formule (17) en présence d'au moins un agent de couplage pour former une liaison amide. d) On fait réagir de l'hydrazine sur la fonction cétone ou aldéhyde provenant du dérivé de formule (17) pour former une hydrazone. e) On oxyde ladite hydrazone en présence de MnO2 pour former une fonction diazométhyle. 20. Procédé pour le marquage d'une molécule biologique, en particulier un acide nucléique, comprenant la mise en contact en solution homogène, dans un tampon sensiblement aqueux, d'une molécule biologique et d'un réactif scion l'une quelconque s des revendications à 17. 21. Molécule biologique marquée susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 20. o 22. Support solide sur lequel est fixé un réactif selon l'une quelconque des