FR 2825089 A1 20021129 FR 0114337 A 20011106 / CH3 H3C: (CH2-CH2-CH2-CH(CH3))3-CH3 R-CO- 0/ CH3 1 2825089 La présente invention se rapporte au procédé de préparation du ylinolénate d'a tocophéryle de formule générale 1, par réaction d' estérification du dérivé halogéné de l'acide gras avec le tocophérol. CH3 H3C,:O CH3 11 1 (CH2-CH2-CH2-CH(CH3))3-CH3 R-CO- O/ CH3 (1) o dans laquelle R est le reste de la chane aliphatique de 1' acide ylinolénique. Le composé de formule générale I selon l'invention est obtenu par un procédé qui consiste à transformer l'acide y-linolénique en halogénure d'acide. La réaction d'estérification proprement dite est réalisée avec 1' a-tocophérol en solution dans la pyridine. On peut activer la réaction en ajoutant une base tertiaire comme la triéthylamine ou la 4-diméthyl aminopyridine. Comme halogénure d'acide gras mono ou poly insaturé on pourra citer le chlorure, le bromure ou l'iodure; le chlorure est le réactif préféré. On pourra également utiliser un anhydride d'acide ou un anhydride mixte avec un carbodilmide. o La méthode de purification utilisoe a été la chromatographie liquide sur colonne de gel de silice. Le y-linolénate d'a tocophéryle a déjà été décrit dans la littérature et on peut trouver des informations sur un mode de préparation, en particulier dans le brevet FR s 2.633.926 qui décrit spécifiquement des esters aromatiques ou aliphatiques de 1'acide y-linolénique. L'exemple V figurant dans ce document décrit la préparation du y-linolénate d'a tocophéryle par transestérification en milieu acide entre le y-linolénate de méthyle et l'acétate d'a tocophéryle. o Ce produit est uniquement caractérisé par son Rf en chromatographie en couche mince.On soulignera que ce brevet ne fournit aucune indication sur les propriétés 2 2825089 pharmacologiques du y-linolénate d'a tocophéryle, ni non plus sur le degré de pureté obtenu par ce procédé de transformation d'esters. L' ester obtenu selon le procédé de la présente invention a été analysé par s spectrométrie Infra rouge. Des bandes caractéristiques du ylinolénate d'a tocophéryle ont été déterminés: 3010 cm= alcène ou alcane selon qu' on a une bande intense ou fine 2926 cm'= alcène ou alcane selon qu'on a une bande intense ou fine o 2859 cm= alcène ou alcane selon qu' on a une bande intense ou fine 1756 cm= carbonyle de la fonction ester (bande intense) 1460/ 1376 cm4 =CH 3-CH bande intense/ moyenne 1136/ 1109 cm4 2 bandes intenses avec une différence de 30 cm-1 = éther/ éther aromatique s 920 cm= alcène 734 cm= alcène Le y-l i nolénate d 'a-tocop h éryle obte n u sel on le procédé de l' i nventi on peut être également caractérisé par son temps de rétention en HPLC. L' invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques, cosmétiques eVou diététiques, ayant une utilité chez l'Homme ou l'animal, et renfermant comme principe actif 1' ester d'acide gras non saturé de tocophérol de formule générale I avec des excipients ou des véhicules appropriés. Ces compositions ont pour objet l'utilisation en application topique du ylinolénate d'a tocophéryle pour autant qu'il ait été obtenu selon le procédé de l'invention. L'ester selon l'invention peut donc se trouver sous la forme libre ou sous forme encapsulée ou sous forme de liposome pour une meilleure diffusion. Les compositions de la présente invention sont particulièrement aptes à l'application locale notamment sous la forme de gel, de crème H/E ou E/H, d'émuision, de lotions, de pommade, de poudre, de lotion capillaire, de spray, d'ampoule, de sérum ou de patches. 3 2825089 Elles sont également adaptées pour l'administration, notamment par voie orale, sous forme de solution buvable ou de capsule. Dans ces compositions, la teneur en principe actif de formule générale I peut varier de s 0,001 % à 15 % et plus particulièrement de 0,01 à 5% en fonction du mode d' administration ou du mode d'application de ces compositions. Elles renferment en outre des agents solubilisants, des polymères épaississants, des huiles de silicone, des agents stabilisants, des agents émuisionnants. D'une manière préférée, on utilisera des supports destinés à être dilués ou incorporés dans des préparations telles que des crèmes ou des gels. La phase huileuse contenant éventuellement des agents tensioactifs non ioniques et/ou des silicones est ensuite additionnée d'une phase aqueuse contenant éventuellement un agent gélifiant ou un agent épaississant. Après agitation prolongée, on obtient ainsi une émuision que l'on incorpore dans une base cosmétique, grasse ou non grasse, pour réaliser une crème ou un gel. On procèdera de manière semblable pour les préparations à phase continue huileuse. o La phase huileuse contient éventuellement des agents tensioactifs non ioniques eVou des silicones. On pourra également utiliser l'ester d'acide gras de tocophérol dans la glycérine, I'incorporer dans une solution de polyéthylèneglycol contenant un agent dispersant ou s tensioactif, et l'additionner d'une huile de silicone pour réaliser une émuision fluide que l'on peut, si désiré, colorer et/ou parfumer à l'aide d'une essence de fleurs ou de plantes naturelle ou bien encore avec une substance oboriférante comme une ionone le lavendulol ou un parfum. so Les compositions peuvent ainsi contenir un agent émuisionnant comme un stéarate d'éthylène glycol, un stéarate de sorbitol et le polysorbate 60, le PEG-20 sesquistéarate de méthyl glucose, le PEG-30 dipoly hydroxy stéarate + sorbitol et esters de glycérol, ou encore le cétyl dimethicone copolyol. 4 2825089 Parmi les polymères que l'on peut adjoindre, on citera en particulier les agents épaississants comme les polymères d'éthylène glycol comme le PEG 40O, le PEG 600 ou des dérivés de la cellulose comme la p- hydroxy éthyl cellulose ou l'hydroxypropyl méthyl cellulose ou la méthyl cellulose. Parmi les solubilisants, on peut adjoindre à la préparation soit des huiles polaires telles que l'huile de jojoba, des triglycérides d'acide caprylique ou caprique, de 1' huile de macadamia, de 1' huile de cameline, de 1' huile de lin ou de 1' huile de kiwi, soit des carbures apolaires comme l'isohexadécane, de l'huile minérale, du squalane soit o encore des huiles siliconées comme la diméthicone, la cyclométhicone, la phenyl triméthicone, le mélange de cyclopentasiloxane et de diméthycone copolyol. Comme gélifiants on peut citer à titre d'exemple les carbomères tels que les acrylates/ C10-30 alkoyl acrylate de polymère croisé 1,2 et 3 ou des gels naturels comme la gomme xanthane ou les alginates tels que l'alginate de sodium, un mélange de polyacrylamide et de C13-14 isoparaffine et de laureth-7 polysaccharide. Les compositions peuvent être employées plus efficacement que les compositions de I'art antérieur qui utilisent une simple association d'acide gras polyinsaturé et d'a-toco- phérol, notamment en ce qui concerne: * I'influence sur la synthèse des constituants du derme comme le collagène, I'élastine, I'acide hyaluronique et les protéoglycanes. * I'influence sur la synthèse des lipides cutanés de type céramides et sur les métallo protéases et protéines kinases. * I'action anti-vieillissement * I'action anti-radicalaire HX/XO et anti UVB. * I'action anti-inflammatoire * I'effet stimulant sur la capacité respiratoire des mitochondries. 2825089 L'exemple I suivant illustre l'invention sans toutefois la limiter. s Exemple l: Dans un ballon de 250 ml équipé d'un réfrigérant ascendant, d'une agitation mécanique et purgé par un flux d'azote, on dissout 10,32 g (37 mmoles) d'acide y-linolénique à 99% dans 70 ml de CH2CI2 puis on ajoute en une portion 11ml (144 mmoles) de chlorure de thionyle. On porte à reflux pendant 90 minutes. L'excès de chlorure de o thionyle et le solvant sont chassés sous vide. On obtient une huile incolore à laquelle on incorpore 4 ml ( 49mmoles) de pyridine et 50 ml de CH2CI2. Une solution de 15,4 g de dl-a -tocophérol à 98 % dans 50 ml de CH2CI2 est ajoutée goutte à goutte en 30 minutes. Le milieu est porté à reflux pendant 60 minutes et un solide blanc, floconneux appara^t en suspension. Après une nuit de repos, le milieu est neutralisé par 75 ml d'une solution d'acide chlorhydrique 0.67 N. Après décantation et extraction par 3 x 30 ml d'éther isopropylique, les phases organiques réunies sont séchées sur MgSO4, filtrées et évaporées à sec pour donner une huile jaune pâle qui est chromatographiée sur une colonne (hauteur 55 mm, diamètre 190mm) de gel de silice (70-200'um), par un mélange éluant éther isopropylique/hexane 1: 9 (Rf 0, 28). On recueille 16.8 g d'une o huile très légèrement colorée en jeune (Rdt 66%) constituée essentiellement de y linolénate d'a-tocophéryle. Le y-linolénate d'a-tocophéryle peut être différencié des autres dérivés du tocophérol par son temps de rétention en HPLC. Une colonne de silice de type Nucléosil 8,um (300 mmx 4,6 mm) peut-être utilisée. Le y- linolénate d'a-tocophéryle est dilué dans l'acétone à 1 %. La phase mobile est le THF 2% / Hexane 98%. Le débit est fixé à 1 ml/min; Le y-linolénate d'a-tocophéryle a un temps de rétention de 4,06 minutes. De la même façon, en utilisant la même quantité d'un autre acide gras mono ou polyinsaturé de la série o'3 ou 6 et selon le même mode opératoire, on pourra obtenir les autres esters de tocophérol d'acide gras mono ou polyinsaturé. Des exemples non limitatifs de compositions selon l'invention sont présentées ci dessous: 6 2825089 Formulation 1: Crème y-linolénate d'a tocophéryle 0.5 % Glycérine 5% Poly propylène de glycérol-26-butyreth-26 4% Poly éthylène glycol-40 dans l'huile de ricin hydrogénée 4% eau qsp 100 Formulation 2: Capsule ylinolénate d'a tocophéryle 2 % Is Huile de cameline 1000 mg pour une capsule Formulation 3: Crème Alcool cétéarylique et ceteareth-20 3,5 % Acool cétylique 3,5 % Palmitate d'octyle 9% y-linolénate d'a tocophéryle 0.5 % Caséine- Gomme xanthane 1% eau qsp 100 Formulation 4: Emuision huile dans /'eau Phase A Glycérol 4 % Carbomère 1 Phase B Eau désionisée qsp100 7 2825089 Phase C PEG-78-glyceryl cocoate 1 y-linolénate d'a tocophéryle 0.5 % Huile essentielle d'orange amère 0,1 Phase D Conservateur (s) O,7 Phase E NaOH diluée à 10% qsp pH=6 Additionner la phase A dans la Phase B. Sous agitation additionner la Phase C. Puis ajouter la phase C sous forte agitation Une fois homogénéisation complète, ajouter D. Stabiliser le pH à 5 -6 par de la soude diluée. ETUDE PHARMACOLOGIQUE DES COMPOSES DE FORMULE I 1. Etude d'un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polvinsaturé, sur l'activité de la tyrosine kinase sur des mélanocytes humains. - Préparation des cellules Les mélanocytes humains sont ensemencées à la densité de 50 000 cellules/cm2 dans des plaques multipuits. Les cellules sont incubées à 37 C en atmosphère humide contenant 5% (v/v) de CO2. Le milieu de culture est le MCDB 153 supplémenté par l'EGF (5 ng/mL) (Sigma), I'insuline (5 g/mL)(Sigma), I'hydrocortisone (5 ng/mL)(Sigma),du sérum de veau f_tal (SVF) à 5 % (v/v)( Gibco). Le milieu de culture est remplacé après 24 heures de culture et supplémenté par des antibiotiques (Peni-Strepto)(Gibco) à 1% (V/v) contenant les différentes concentrations d'un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé ( 1, 10 et 100 g/mL). Ce sont des concentrations non cytotoxiques qui ne modifient pas la croissance cellulaire. 8 2825089 Une série " témoin positif" est constituée de cellules traitées à l'hydroquinone à 1 ug/m L. 11- Evaluation de l'activité tvrosine kinase. Les cellules sont incubées pendant 72 heures à 37 C en atmosphère humide contenant 5% (v/v) de CO2. A la fin de la période d'incubation, le milieu de culture est prélevé et la couche cellulaire rincée deux fois avec du PBS. 450 pL de Triton X100 à 1% (v/v) dans le PBS sont o ajouté dans chaque puits. On agite pendant 10 minutes puis on ajoute 50,uL de L Dopamine à 10 mM dans du PBS sans Ca+ + ni Mg ++ On laisse incuber pendant 1 heure à 37 C à l'abri de la lumière, puis on mesure l'absorption à 475 nm au spectrophotomètre. Tableau1 témoin hydroquinone 1 g/mL 10,ug/mL 100,ug/mL moyenne absorbance 0.044 + 0.002 0.024 + 0.001 0.046 + 0.000 0.052 + 0.003 0.050 + 0.002 à 475 nm Résultats Un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé à la concentration de ,ug/mL exerce une stimulation de la tyrosinase de l'ordre de 18 %. 2. Etude d'un ester de tocophéryle avec un acide aras mono ou polvinsaturé sur l'activité anti-inflammatoire sur une préparation de monocytes/macrophages humains activés ou non par les LPS (lipopolysaccharides). a) Préparation des monocouches de monocvtes/macrophanes humains. 9 2825089 Les monocytes/macrophages sont purifiés à partir d'une poche de sang. Le " Buffy coat " est prélevé stérilement et dilué 7 fois dans un tampon PBS-EDTA. Une solution de Percoll (Pharmacia) est préparée extemporanément: solution A: 9 mL de Percoll + 1 mL de NaCI 1,5 M - solution B: 6 mL de solution A + 4 mL de NaCI 1,5 M 24 tubes sont préparées ( 7 mL de " Buffy coat " dilué + 4 mL de solution B. centrifugés 800 G pendant 30 minutes à température amblante. L'interface contenant les cellules mononuclées est prélevée et rincée 2 fois avec du PBS-EDTA ( 5mM) puis avec du milieu Ham F12 (Gibco) supplémenté avec du sérum o de veau f_tal (SVF) à 10 % inactivé par la chaleur. Le culot est suspendu dans du milieu Ham F12 supplémenté par de la Lglutamine (2mM) et du SVF à 20%. On obtient une suspension à 4 x 106 cellules/m L. Les cellules sont ensemencées à la densité de 4 x 106 cellules/puits dans des plaques s multipuits. Les cellules sont incubées à 37 C en atmosphère humide contenant 5% (v/v) de CO2 pendant 2 heures de façon à obtenir une population cellulaire adhérente de 110 000 à 000 cellules/cm2 composée à 95 % de monocytes/macrophages. Le milieu est ensuite remplacé par du Ham F12 supplémenté par du SVF à 5 % et de la Lglutamine à 2 mM. Une série " témoin positif" est constituée de cellules traitées au phénol à 640 g/mL. L'étude est réalisée avec différentes concentrations d'un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé (1, 10, 50,100 et 500 ug/mL). Deux séries de tubes sont supplémentés par 1 et 5 ug/mL de LPS. Les monocytes/macrophages sont incubés pendant 24 heures à 37 C en atmosphère o humide contenant 5% (v/v) de CO2. Le milieu de culture est prélevé (mis à -80 C). Une seconde incubation de 24 heures est effectuée dans les conditions identiques. La couche cellulaire est incubse en présence de trypsine-EDTA. Les cellules détachées sont centrifugées puis mises en suspension dans 300 pL d'eau distillée. 2825089 Les IL-1a sont dosées à l'aide du Kit Immunotech dans le compartiment intracellulaire (0-48 heures) et dans le compartiment milieu de culture (0-24 heures et 24-48 heures). Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 2. Tableau 2 o compartiment intracellulaire (0-48 heures) ug/mL IL-1a (pg/puits) IL-1a (pg/10 cellules) Témoin 26 7 82i22 500 71 i 24 250 i 83 65i9 229 i31 43 + 5 145 i 17 40i8 135i27 1 35i3 123i9 LPS 1 958 i 85 3199 i 284 LPS 5 1651 i 62 5393 i201 ug/mL IL-1a (pg/puits) IL-1a (pg/10 6cellules) Témoin 51,6 8,9 176 30 500 + LPS1 362,1 91,4 1213 i 306 + LPS1 464,1 2O,2 1543 67 + LPS1 506,0 78,5 1721 + 267 + LPS1 324,5 i 87,3 1053 i 283 1 + LPS1 444,8 i 87,1 1389 i 272 LPS1 468, 5 i 122,9 1570 i 412 g/m L I L- 1 a (pg/pu its) I L- 1 a (pg/10 6 cellu les) Témoin 51,6 i 8,9 175,7 i 304,4 500 + LPS 5 372,9i 47,3 1399,7i 176,2 + LPS 5 498,3 67,9 1677,9+ 228,6 + LPS 5 585,4+ 64,3 1903,7+ 209,1 + LPS 5 696,0+ 50,1 2188,5+ 157,6 1 + LPS 5 1253 + 4540 + LPS 5 1208,1 + 25 4216,6 + 87,2 Résultats s 11 n'y a pas de variation significative du taux d' IL-1a de base en présence d'un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé à une concentration de 1 à 500 gim L. Pour une concentration de LPS à 1 et 5,ug/mL en absence d'un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé, le taux d' IL-1a est respectivement multiplié o par 39 et 66, ce qui démontre une bonne réactivité du système test. - Un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé à une concentration de 1 à 500,ugimL n'a pas d'effet significatif sur le taux intracellulaire des IL-1a des monocytes/ macrophages humains activés par des LPS à 1,ug/mL. - Un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé exerce une inhibition dose-dépendante maximum pour 500,ug/mL (- 67%) sur le taux intracellulaire des IL-1a des monocytes/ macrophages humains activés par des LPS à 5 g/mL. Tableau 3 compartiment milieu de culture (0-24 heures) 2s ug/mL IL-1a (pglpuits) Témoin 99 + 4 500 157 + 28 94 + 4 12 2825089 116 9 107 + 4 103 6 Résultats Les résultats sont exprimés en pg/puits (il n'y a pas de comptage cellulaire pour ce temps d'incubation). Il n'y a pas de variation significative du taux d' IL-1a de base en présence d'un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé à une concentration allant de 1 à o 500 g/mL. Tableau 4 compartiment milieu de culture (24-48 heures) log/mL IL-1 a (pg/puits) IL1 a (pg/10 b cellules) Témoin 99 + 3 311 9 500 71 + 4 250 + 14 103 19 362 68 86 + 18 287 + 59 67+4 228+ 12 1 75 + 3 263 + 9 LPS 1 334 + 35 1116 + 116 LPS 5 668 + 70 2181 + 227 Témoin 35,9 + 5,3 122 + 18 500 + LPS1 239,6 + 74,0 803 248 + LPS1 125,5 + 18,0 417 + 60 + LPS1 156,1 23,3 531 79 13 2825089 + LPS1 124,8 + 26,9 405 + 87 1 + LPS 1 99.5 _ 42,1 1389 + 272 LPS1 112., + 24,3 376 + 82 ug/mL IL-1a (pg/puits) IL-1a (pg/10cellules) Témoin 36 + 5 122 i 18 500+ LPS5 412+51 1534+184 + LPS 5 164 + 21 551 + 71 + LPS 5 173 + 50 561 + 164 + LPS 5 129 + 32 404 + 10 1 +LPS5 178+5 647+16 LPS 5 225 + 24 787 + 83 - Un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé à une concentration de 1 à 100 g/mL n'a pas d'effet significatif sur la sécrétion des IL-1a par des monocytes/ macrophages humains activés par des LPS à 1,ug/mL. Par contre à une concentration de 500,ug/mL en ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé on observe une augmentation (x2) du taux d' IL-1a dans le milieu de culture. Conclusion Un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé exerce un potentiel de régulation de l'inflammation observé sur la sécrétion des IL-1a par des monocyles/ macrophages humains activés par des LPS à 5,ug/mL. 3- Etude d'un ester de tocophéryle avec un acide pras mono ou polvinsaturé sur la synthèse de l'élastine et du collagène par des fibroblastes humains. - Préparationdescellules 14 2825089 Les cellules sont ensemencées à la densité de 50 000 cellules/cm2 dans des plaques multipuits. Les cellules sont incubées à 37 C en atmosphère humide contenant 5% (v/v) de CO2. Le milieu de culture est l'IMDM supplémenté par du sérum de veau f_tal (SVF) à 10 % s (vlv). Le milieu de culture est remplacé après 24 heures d'incubation et supplémenté par des antibiotiques (Peni-Strepto) à 0,2 % (V/v) contenant les différentes concentrations d'ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé ( 1, 5, 10,50 et 100 g/mL). o Le milieu de culture est supplémenté par de l'acide ascorbique à 50 g/mL. Une série " témoin positif" est constituée de cellules traitées par le TGF-p à 10 ng/mL. 11- Evaluation de la synthèse de l'élastine et du colla.aène Les cellules sont incubées à 37 C en atmosphère humide contenant 5% (v/v) de CO2 pendant 24 heures. o A la fin de la période d'incubation, le milieu de culture est prélevé et la couche cellulaire rincée deux fois avec du PBS supplémenté d'inhibiteurs de protéases afin d'obtenir les concentrations suivantes: EDTA 0,01 M, acide 6-amino hexanoque 0,1M, chlorure de benzaminidium 0,005 M, iodoacétamide 0,1mM. s La couche cellulaire est grattée dans 500,uL de PBS contenant les inhibiteurs de protéases puis est passée aux ultrasons (2x 20 sec à intervalles de 20 sec; 50Hz) Le dosage colorimétrique de l'élastine est réalisé à partir de la liaison spécifique du colorant 5,10,15,20 tétraphényl-21, 23 porphine sulphate (TPPS) (Kit fastin Elastin Assay) Résultats Matrice extracellulaire 2825089 Tableau 5 g/mL Elastine (,ug/puits) Elastine (lug/10 6 cellules) Témoin 38,5 + 4, 7 289 + 35 TGF-5 à 10 ng/mL 56,4 2,3 422 + 17 31,7 + 9,3 242 + 71 23,2 + 1,7 174 + 13 31,8 + 4,5 241 + 34 32,2 + 2,O 260 + 16 16,4+O,9 139+8 Tableau 6 lug/mL Collagène (g/puits) Collagène(lug/10 b cellules) Témoin 37,5 + 4, 4 281 + 33 TGF-p à 10 ng/mL 76,9 + 13,0 576 + 97 1 3O,2 + 15,5 230 + 118 29,8+1O,3 224+77 43,4 + 6,5 329 + 49 5O,4 + 15,9 407 129 39,4 8,6 336 + 73 Dans le milieu de culture 16 2825089 Tableau 7 g/mL Elastine (g/puits) Elastine ('ug/10 u cellules) Témoin 77,4 + 3, 7 580 + 28 TGF-p à 10 ng/mL 83,3 + 0,1 624 i 1 1 68,2+ 11,2 521 + 85 78,2 + 16,5 587 + 124 150,5 + 12,4 1140 + 94 145,5 5,8 1176 i 47 121,9 + 5,5 1037 + 47 Tableau [: ug/mL Collagène (g/puits) Collagène (g/10 u cellules) Témoin 47 + 12 355 + 91 TGF-, à 10 ng/mL 65 + 10 484 75 1 39 + 12 297 95 66 + 26 499 + 196 72 40 542 + 306 66 + 19 533 + 150 48 29 409 249 Les concentrations entre 10 et 100 ug/ml d'un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé stimulent significativement la synthèse de l'élastine et du o collagène. L'effet est maximum pour 50 ug/mL (+ 65% pour l'élastine et + 45% pour le collagène) avec une augmentation de la sécrétion de l'élastine dans le milieu de culture (+ 102%), alors que l'effet du TGF-p à 10 ng/mL se traduit principalement par une augmentation de la synthèse au niveau de la matrice extracellulaire (+ 46%). 4- Etude d'un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polvinsaturé sur l'action anti UVB. - Préparation des feuillets épidermiques Les kératinocytes humains sont ensemencoes à la densité de 100 000 cellules/cm2 s dans des inserts dont le fond est constitué d'une membrane en polycarbonate de porosité 0,4 um. Les cellules sont incubées à 37 C en atmosphère humide contenant 5% (v/v) de CO2 pendant 24 à 48 heures, en " situation immergée " dans le milieu de culture o MCDB/153 supplémenté par l'EGF (5 ng/mL), I'insuline (5 g/mL) , I'hydrocortisone (5 ng/mL), le BPE (70,ug/mL) Le milieu de culture est remplacé par le même milieu de culture supplémenté par 1 mM de Ca++ afin d'induire la stratification de la monocouche en " situation immergée " pendant 6 jours. Le milieu de culture est changé tous les 3 jours. Le feuillet épidermique est mis en " situation émergée " au 7èmr jour, c'est à dire qu'il n'est plus nourri que par l' intermédiaire des cell u les basales. Au 14ème jour d'incubation, le milieu de culture est changé. Différentes concentrations d'un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé ( 1, 5, 10, 50 et ug/mL), ou de vitamine E ( 150,uL) constituant le " témoin positif " sont appliquées sur un disque de papier Whatman couvrant la surface de la culture cellulaire. 11- Evaluation de la ctotoxicité ( Test au MTT) Les cellules sont incubées à 37 C en atmosphère humide contenant 5% (v/v) de CO2 pendant 24 heures, puis irradiées par les UVB (0,7 J/cm2, A= 314 nm) après avoir o enlevé les disques de papier Whatman. Les cellules sont incubées à 37 C en atmosphère humide contenant 5% (v/v) de CO2 pendant 24 heures, après avoir déposé sur la surface de la culture cellulaire les disques de papier Whatman imbibés des différentes concentrations d'un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé ou de vitamine E. 18 2825089 Après l'incubation, les milieux de culture sont utilisés pour le dosage des produits du clivage du MTT. Après l'incubation, les membranes portant le feuillet épidermique sont rincées 2 fois s avec du PBS, puis incubée 3 heures à 37 C, à l'obscurité, en présence de 2 mL de MTT (bromure de 3( 4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5 diphényl tétrazollum) à 0,5 mg/mL. Les cristaux violets de formazan produits par le clivage du MTT par les enzymes mitochondriaux sont dissous dans 2 mL de DMSO sous agitation douce pendant 2 heures à température ambiante. o On mesure l'absorption à 540 nm au spectrophotomètre. Tableau 9 compartiment intracellulaire témoin témoin + 1 g/mL 5,ug/mL 10 50 100 UVB g/mL g/mL g/mL moyenne absorbance 1,504 + 0.710 + 0.693 + 0.682 + 1, 049 + 0,698 + 0,809 + à 540 nrn 0.084 0.076 0.068 0.069 0.117 0.035 0.132 *Tableau 10 compartiment milieu de culture témoin témoin + 1 g/mL 5,ug/mL 10 50 100 UVB g/mL ug/mL moyenne absorbance 1,504 + 0.710 + 0.693 + 0.682 + 1,049 + 0,698 + 0,809 + a 540 nm 0.084 0.076 0.068 0.069 0.117 0.035 0.132 19 2825089 On observe une inhibition sensible de l'effet cytotoxique induit par l'irradiation, en présence d'une concentration en ester d'acide gras de tocophérol à 10,ug/m L. - Etude d'un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé sur I'activité mitochondriale de fibroblastes de derme humain. - Préparation des cellules o Les fibroblastes de derme humain sont ensemencées à la densité de 5000 cellules/cm2 dans 500,uL de milieu IMDM supplémenté par du SVF 10% pendant 24 heures en atmosphère humide contenant 5% (v/v) de CO2 Après 24 heures, les cellules sont mises en contact avec les différentes concentrations s d'un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé ( 10, 50 et 100 g/mL). Ce sont des concentrations non cytotoxiques qui ne modifient pas la croissance cellulaire. Une série " témoin positif" est constituce de cellules traitées à l'antimycine à 0,5,uM. 11- Evaluation de l'activité mitochondriale Principe: L'incorporation cellulaire de rhodamine 123 est la conséquence de la variation du potentiel transmembranaire mitochondrial. L'évaluation semi-quantitative de la respiration mitochondriale est basée sur l'intensité de la fluorescence à l'intérieur de la cellule. Les cellules sont incubées pendant 72 heures à 37 C en atmosphère humide contenant 5% (v/v) de CO2. A la fin de la période d'incubation, le milieu de culture est prélevé et la couche cellulaire rincée deux fois avec du milieu IMDM puis mise dans 500,uL de tampon phosphate pH s 7.2 contenant 0.1 mg/mL de rhodamine 123. 2825089 On laisse incuber pendant 15 minutes à 37 C, puis on mesure la fluorescence de façon semi-quantitative à l'aide d'une échelle de cotation. s Résultats Tableau 11 Nombre ug/mL 4 3 2 1 O cellules observées Térnoin 12,3 + 2,1 25,7 + 3, 1 25,0 + 2,4 21,0 + 2,9 17,7 + 2,1 104,0 + 9 Témoin 10,7 + 2,5 13,3 + 2, 4 20,0 + 1,6 16,3 + 1,9 25,0 + 4,1 100 + 9 Antimycine 19,7+1,2 32,3+2,1 26,3+2,4 14,7+0,5 8,71,9 102,0+5 35,3 0,5 44,0 i 1,4 18,3 + 8,5 3,3 + 0,5 0,0 + 0,0 102,0 + 9 12,3+2,1 58,3+6,2 2O,3+O,5 9,3+0,5 0,0+0,9 100,0+9 Echelle de cotation (Intensité de fluorescence): 0: cytoplasme non fluorescent, 1: faible; 2: moyennement intense; 3: Importante; 4: Très importante, tout le cytoplasme est fluorescent. s La stimulation est maximale pour une concentration d'un ester de tocophéryle avec un acide gras mono ou polyinsaturé à 50,ug/mL; +65% par rapport au témoin. 2s 21 2825089 REVENDICATIONS 1.-Procédé de préparation du y-linolénate d'a-tocophéryle de formule générale 1, par l0 réaction d' estérification du dérivé halogéné de l'acide gras avec le tocophérol. CH H3C: 'O CH3 11 1 (CH2-CH2-CH2-CH(CH3))3-cH3 R-CO- O'\/ CH3 (I) dans laquelle R est le reste de la chane aliphatique de 1' acide ylinolénique. 2.- Procédé de préparation du y-linolénate d'a-tocophéryle selon la revendication 1, qui consiste en ce qu'on transforme l'acide ylinolénique en halogénure d'acide, puis on réalise la réaction d'estérification avec i' a-tocophérol en solution dans la pyridine et on isole l'ester formé. 3.- Le y-linolénate d'a-tocophéryle obtenu selon le procédé de la revendication 2, qui consiste en ce qu'on transforme l'acide ylinolénique en chlorure d'acide puis on le fait réag ir avec l'atocophérol en solution dans la pyrid ine pu is on l' isole par :5 chromatographie liquide. 4.- Compositions pharmaceutiques, cosmétiques eVou diététiques caractérisées en ce que l'ingrédient actif est le y-linolénate d'atocophéryle pour autant qu'il est obtenu par le procédé de la revendication 1 ou 2,en mélange ou dilué avec un excipient ou o un véhicule approprié pour un usage chez l'Homme ou l'animal. 22 2825089 - Compositions pharmaceutiques, cosmétiques eVou diététiques selon la revendication 4, caractérisées en ce qu'elles se trouvent adaptées pour l'administration par voie orale, sous la formes de capsule, de liposome ou bien de solution buvable. 6- Compositions pharmaceutiques, cosmétiques eVou diététiques selon la revendication 4, dans lesquelles on ajoute un agent émuisionnant choisi parmi le stéarate d'éthylène glycol, le stéarate de sorbitol et le polysorbate 60, le PEG-20 o sesquistéarate de méthyl glucose, le PEG-30 dipoly hydroxy stéarate + sorbitol et esters de glycérol, et le cétyl dimethicone copolyol. 7- Compositions pharmaceutiques, cosmétiques eVou diététiques selon la s revendication 4, dans lesquelles on ajoute un agent épaississant choisi parmi les polymères d'éthylène glycol ou les dérivés de cellulose comme la p- hydroxy éthyl cellulose ou l'hydroxypropyl méthyl cellulose ou la méthyl cellulose. 8- Compositions pharmaceutiques, cosmétiques eVou diététiques selon la o revendication 4, dans lesquelles on ajoute un agent solubilisant choisi parmi des huiles polaires telles que l'huile de jojoba, des triglycérides d'acide caprylique ou caprique, de 1' huile de macadamia, de 1' huile de cameline, de 1' huile de lin ou de 1' huile de kiwi, des carbures apolaires comme l'ischexadécane, de l'huile minérale, du squalane et des huiles de silicone comme la diméthicone, la cyclométhicone, la phenyl triméthicone, le mélange de cyclopentasiloxane et de diméthicone copolyol. 9- Compositions pharmaceutiques, cosmétiques eVou diététiques selon la revendication 4, dans lesquelles la teneur en ester de tocophéryle avec un acide gras polyinsaturé de formule générale I varie de 0,001 % à 15 % et plus o particulièrement de 0,01 à 5% en fonction du mode administration ou du mode