FR 2811765 A1 20020118 FR 0009067 A 20000711 DISPOSITIF ET PROCEDE DE DETECTION MOLECULAIRE L'objet de la presente invention est d'obtenir un signal qualitatif et quantitatif,de la presence,de quelques molecules d'analytes recherchées dans un echantillon quelconque (fluides biologiques,vegetaux ou ecologiques,frottis de muqueuse,biopsie de i0 tissus biologiques ou vegetaux,tumeurs solides,etc).L'extrême sensibilté de la technique qui va être decrite plus loin,permet la detection et le suivi de maladies virales,bacteriennes,cancers,comme tous les autres domaines de la biologie classique mais surtout,elle ouvre la voie à la detection de nouvelles substances,inconnues jusqu'à une periode très recente du fait qu'elles circulaient à des taux indetectables par les methodes classiques tels que automates de laboratoire ou la RIA (Radio immuno assay).Parmi ces substances jusque là inconnues,on peut citer à titre indicatif et non limitatif,les proteomes (produits par un genoome modifié dans les OGM: organismes genetiquement modifiés), les nouvelles generations de marqueurs tumoraux (peptides indetectables mais hautement specifiques de cancers (ex:vessie), differents des anciens marqueurs qui etaient peu specifiques et peu fiables, les produits de translation genique spontanée: substances intracellulaires produites par un ADN qui a subi une perte ou un remplacement d'un ou plusieurs acides aminés d'origine hereditaire(cancer du sein ou maladie d'alzheimer),toxique (tabac, pollution,amiante) ou medicamenteuse(suvi du pharmacogenome).Enfin les puces à ADN donnent en quelques secondes des milliers de renseignements d'ordre genetique que seuls des logiciels puissants sauront interpreter: des oncogènes ont été identifié par les puces à ADN ces derniers mois mais la proteine produite par ces oncogènes est indetectable: la presente invention,capable de detecter des traces de proteine de niveau moleculaire aussi vite que la puce à ADN en detecte le gène correspondant accompagnera donc ce progrès. Il va de soi que si l'affection consiste plutôt en une absence de la proteine ou de l'analyte concernés,cette absence sera aussi detectée ( pertes de gènes dans certaines affections ou après certains traitements) Le terme de proteome,inventé par Friedrich en 1996 (Nat.Biotechnologies 14:1234-1237) est defini par Keith L. Williams et t121 2811765 Denis F.Hochstrasser dans leur livre " Proteome Research " (Ed.Springer 1997): c'est la PROTEine exprimée par un genOME. Il existe près de 100.000 gènes dans le genome humain qui sera entièrement sequence vers 2005.Chaque gène code pour une à trois proteines differentes dont la majorité n'est pas encore identifiée en structure ni en fonction. Des programmes de bioinformatique ont commencé à identifier et repertorier ces proteines et d'ici quelques années des banques de données telle la Database Swiss 2D Page,auront listé la totalité des 1o proteines du corps humain.11 est permis de rêver qu'en face de chaque gène figurera la ou les proteines correspondantes ainsi que les lesions possibles au niveau de chaque gène, mais surtout quelle proteine anormale est alors produite par cette anomalie genique.L'interêt est immense: la moindre anomalie genique sera detectée,identifiée puis ciblée par des therapeutiques adequates.Comment la detecter sans avoir à sequencer la totalité des gènes du patient concerné?: en detectant son proteome. R.Strohman (1994) dans Bio/Technology 12:156-164, estime que seulement 2% des maladies humaines resultent d'un defaut au niveau d'un gène (absence de production d'une proteine ou presence d'une proteine altérée).ll ajoute que la severité de ces maladies est fonction du patrimoine genetique de l'individu concerné.C'est le cas du p53,du RB ou WT1 qui sont des gènes de type anti-oncogènes bien identifiés.La perte germinale de l'un des allèles de ces gènes,predispose au cancer;la perte ulterieure du second allèle provoque l'émergence du cancer. La plus recente decouverte proteomique concerne les travaux du professeur Ben Zeev de l'Institut Weizmann en Israel,publiés dans Proceedings Natl. Acad.Sciences - 1 1 Mai 1999 - page 5222: son equipe est parvenue à reconstituer le puzzle conduisant à la cancerisation d'une cellule du colon: une mutation de l'ADN de cette cellule produit un proteome: la beta-cathenine dont le rôle demontre est de stimuler fortement l'expression d'un gène codant pour la cycline D1.Dans la cellule normale, la cycline D1 gère les divisions cellulaires selon un programme harmonieux.L'elevation brutale de cycline D1 va provoquer la proliferation incontrôlée des cellules cancereuses du colon. Ceci est d'un interêt diagnostic: la detection de betacathenine associée à la detection de l'elevation du taux de cycline D1 signent sans le moindre doute la naissance d'un cancer du colon au stade infra-clinique; mais aussi d'un interêt therapeutique: le ciblage therapeutique par des 4) inhibiteurs de la cycline ou de la betacathenine,au stade precoce de la maladie,offrira au patient un confort de vie (sans chimiotherapie ni metastases) et des economies substantielles dans les budgets de la 2) 2811765 santé;enfin d'un interêt de suivi de l'affection: detection de rechutes, evaluation des resultats de chaque traitement pour proposer la drogue ideale,contrôle mensuel à coût très reduit,etc L'interêt reside egalement en une forte specificité et une forte sensibilité des proteomes produits, ce qui est une nouveauté dans le domaine des marqueurs du cancer.Jusqu'à present,ces derniers n'offraient qu'une faible sensibilité (ne voient leur taux grimper que dans 50 % des cancers) et une faible specificité (taux augmenté alors qu'il n'y a pas de cancer: cas des femmes enceintes, des gros fumeurs,etc).Les proteomes io produits par une anomalie genique, n'existent pas chez une personne saine.Leur apparition signe avec certitude l'anomalie genique. Le problème majeur est qu'ils sont indetectables au stade precoce de l'affection: il n'est plus question ici de nanogrammes (comme pour les marqueurs tumoraux anciens) ou de picogrammes (pour les nouveaux s5 marqueurs plus specifiques ou les cytokines) par milliltre,mais de nombre de molecules par millilitre d'echantillon ou par fragment de biopsie. Le procédé objet de la presente invention est parvenu à detecter la presence de quelques molecules dans un micro-echantillon.C'est mieux ou aussi sensible que les techniques d'hybridation par la Polymerase Chain Reaction mais c'est infiniment plus simple,plus rapide (resultat instantané) et moins coûteux que la PCR. DESCRIPTION DU DISPOSITIF(Planche I Figures 1 et 2) Un filtre (1) en materiel poreux quelconque (papier,cellulose,nylon, nitrocellulose,acetate de cellulose,etc) est preparé selon le mode decrit plus loin puis inseré entre: D'une part un support superieur (4) plat rigide perforé d'un trou (5) de quelques millimetres de diametre, supportant un entonnoir (7) destiné à recevoir I'echantillon et les fluides du test qui vont migrer à l'interieur du filtre. Et d'autre part, un support inferieur (2) perforé à l'extremité opposée d'un trou (3) de plusieurs millimetres de diametre.La face inferieure du filtre à cet endroit est imbibée de reactifs (substrat chromogène si le traceur est un enzyme par exemple) destinés à se colorer pour emettre un signal visible à travers le trou 3 en retournant le dispositif à la fin du test. L'ensemble sera de preference emballé en milieu opaque,sous vide avec un dessicant. DESCRIPTION DU PROCEDE Principe: (Planche Il - Figures 1 et 2) en prenant comme exemple un système de detection d'un antigène. Un reactif (R1) est fixé à l'endroit precis (sites NH2 ou epitopes) d'un anticorps servant à la detection d'un antigène dans l'echantillon testé alors qu'un autre reactif (R3) est fixé à l'autre extremité de l'anticorps (site Fc). Planche IIl Figures 1 et 2:Le reactif RI peut se lier instantanément à un 1o reactif R2 correspondant solidement (liaison covalente) fixé sur le filtre,immobilisant ainsi sur place l'anticorps en absence d'antigène.Figure 2. Si l'anticorps rencontre dans l'echantillon,l'antigène (Ag) recherché,ce dernier masque,occulte le reactif R1 qui ne se liera donc pas au reactif R2: I'anticorps va alors continuer sa migration dans le filtre. Un peu plus loin sur ce dernier,est disposée une ligne de reactif R4 (enzyme si le systeme est immunoenzymatique) qui se lie par une de ses extremités,au filtre par un mecanisme de simple attraction (forces de Van der Waals).L'autre extremité de R4 peut reagir et se lier avec le reactif 2o R3 (fixé sur le site Fc de l'anticorps ayant echappé au reactif R2) pour migrer vers l'extremité du filtre o va se colorer un substrat chromogène specifique de l'enzyme R4.: Figure 3 Un exemple decrit dans le mode operatoire ci dessous,illustre le procédé: des groupements R1 et R3 (qui ne sont pas des traceurs) (Planche II - Figure 1) sont fixés sur un anticorps monoclonal puis filtrés par chromatographie;des groupements R2 sont fixés au debut du filtre et une enzyme R4 est deposée plus loin sur ce filtre.(Planche I - Figure 2) n Planche 3 Figures 1 à 3: La gouttelette d'echantillon est deposée en (5) sur le filtre (1) au fond de l'entonnoir (7).Puis on depose une solution d'anticorps supportant R1 et R3.Si I'echantillon est negatif (absence d'antigène) R1 (figure 2) est piégé par R2.Le reactif R3 n'ira donc pas decrocher R4 et les fluides arrivant dans la zone chromogène ne donneront aucune coloration. Si I'echantillon est positif,le groupement R1 est occulté spatialement par la molecule d'antigène,echappe donc à R2,continue à migrer avec les fluides.Le groupement R3,vient decrocher le reactif R4 pour aller colorer la zone chromogène.(figure 3) DOSAGES SEMI-QUANTITATIFS Principe: il s'agit de ne pas colorer la zone signal si le taux d'antigène est inferieur ou egal à au taux normal,et de la colorer si ce taux est depassé (cas des anciens marqueurs tumoraux ou de certaines hormones par exemple) Methode adoptée: L'echantillon n'est plus deposé directement dans le filtre mais dans un petit tube associé au dispositif et contenant des anticorps non preparés (pas de R3 notemment pour ne pas decrocher de R4) en quantité capable de se lier à la quantité d'antigène limite de la normale,les antigènes eventuellement en excès resteront donc libres i0 dans cette solution qui va alors être deposée sur le filtre.Les anticorps normalement preparés sont ensuite deposés dans le filtre. Hypothèse normale: Il n' y a pas d'excès d'antigène: les premiers anticorps (sans R3) complexés aux antigènes dans la première etape, migrant avec les seconds anticorps dûment preparés (RI +R3) ne decrochent pas les groupes enzymatiques R4.Les seconds anticorps,n'ayant plus trouvé d'antigène,sont arrêtés par R2 et ne donneront pas de coloration. Hypothèse pathologique: excès d'antigène: tous les anticorps sont saturés: les premiers et les seconds qui donnent donc la coloration. ORIGINE DE LA GRANDE SENSIBILITE DU PROCEDE: Les reactifs R4 (Planche IV Figure 1) sont des molecules de traceur (enzyme si système immunoenzymatique) deposées simplement sur le filtre en aval de la zone R2 et sur lesquelles ont été fixés deux types de radicaux chimiques: I'un R4.2 peut se lier au groupe R4.1 du reactif R4 voisin. R4.1 est conçu pour se lier rapidement au reactif R3 des anticorps qui ont echappé aux reactifs R2 du filtre en amont.C'est une liaison cette fois-ci covalente, qui va decoller du filtre l'ensemble R4. Mais un anticorps ne decrochera qu'une molecule de R4.Pour augmenter la sensibilité,il faudrait que la même molecule d'anticorps decroche plusieurs molecules de R4.Lorsque le reactif R3 de l'anticorps se lie à R4.1,il detache le complexe R4.1-R4-R4.2.Ce dernier groupe R4.2,dans sa migration,se lie à un groupe R4.1 voisin pour entrainer tout le complexe R4.1-Enzyme- R4.2 et ainsi de suite(Planche IV - Figure 2).Ce qui fait que pour une molecule d'antigène trouvée par un anticorps,ce dernier va entrainer derrière lui un cortège de dizaines de molecules d'enzyme qui vont arriver à la zone signal pour y delivrer une puissante coloration du substrat chromogène.(Planche IV- Figure 2). 6It 2811765 Le système complet de reactifs utilisés est identique quelque soit l'affection recherchée.Seul variera l'anticorps depose à la suite de l'echantillon,puisqu'il sera specifique de ce qu'on recherche.Le procédé est donc universel en ce sens que les deux cartes enserrant le filtre seront identiques d'un test à l'autre.Une ampoule en polypropylène,bien etiquettée,contenant la solution d'anticorps specifique,accompagnera dans un emballage separé,le dispositif et elle sera differente d'un test à l'autre. Enfin,ce système,contrairement aux differents predecesseurs de l'art anterieur,donne une reponse quasi instantanée (quelques secondes) Par comparaison,le système Elisa met 3 heures,l'immuno-PCR: 3 jours L'exemple choisi pour expliquer le mecanisme du procédé concerne donc une detection immunologique d'un antigène par un anticorps.Mais ce procédé s'applique en fait à toute reaction mettant en jeu la reconnaissance d'une molecule par une autre: detection de brins d'ADN par sondes marquées par un reactif du type R1,detection de recepteurs membranaires par la cytokine correspondante,detection d'une sous-unité de proteine par la sous-unité correspondante,etc.Le procédé decrit n'est 2() donc pas limitatif.De plus,à l'interieur d'une même application,un grand nombre de variantes apportent chacune un avantage selon les necessités de la detection.Elles seront decrites plus loin mais il pourra s'agir par exemple d'amplifier encore plus la reaction colorimetrique du substrat:l'union de R3 avec R4 peut provoquer la formation d'un premier composé (X1) en un turn over rapide (1000 molecules par seconde) qui reagirait avec une seconde ligne supportant un reactif R5 pour produire 1000 molecules par seconde d'un deuxième composé (X2) à partir d'une molecule de X1.Ce sera finalement 1.000.000 de molecules de X2 qui vont colorer le substrat et non la molecule de R4 qui les a engendrés en amont. Dans une variante interessante,R4 peut être fixe et R3 produit le premier composé X1 à raison de 1000 molecules par seconde uniquement en passant au niveau de R4.Les fluides migrant entrainent ce premier composé X1 vers un autre reactif R5 qui peut aussi être fixe.Le contact R5 avec X1 produit un second composé X2 à raison de 1000 molecules par seconde.Ce qui fait que pour une molecule d'antigène decouverte,c'est 1 Million de composés X2 qui vont reagir avec le substrat ou fournir une mesure si le système comporte un appareillage de mesure des composés X2.Exemple de signal amplifié R3: Glucose Oxydase R4 = D-Glucose X1 = H202 R5 = Peroxydase X2 = ions H+ Chromogène = 3-3'-5-5' TetraMethyl Benzidine (TMB) incolore à l'etat reduit (noyau cyclique sans doubles liaisons) ou coloré en bleu plus ou moins intense selon le taux de X2 (ions H+) qui arrivent: formation instantanée de 1 (bleu clair) ou 2 ou 3 (bleu très foncé) doubles liaisons dans le noyau cyclique de TMB L'exemple du système Glucose oxydase Peroxydase est valable pour le système NBT-NCIP- Phosphatase alcaline ou tout autre système enzymatique. Sachant que le substrat chromogène est preparé de telle sorte qu'il reagisse fortement et très vite (concentration elevée des composants du substrat),ou que des appareillages de mesure extrêmement performants existent (rayon laser identique à celui des lecteurs de glycemie ou 0o electrode numerique) il apparaît donc que ce système atteint une sensibilité exceptionnelle. DETECTION D'ANTICORPS SERIQUES Le procédé est identique sauf que les marquages R1 et R3 se font sur la molecule d'antigène dont on recherche l'anticorps correspondant dans l'echantillon.Si elle detecte cet anticorps,elle echappera dans le filtre, au reactif R2(le reactif R1 etant occulté) et elle ira reagir par l'intermediaire de son reactif R3 avec le reactif R4 du filtre pour produire le signal plus loin.Un exemple de detection d'anticorps est decrit plus loin. L'ART ANTERIEUR Le brevet français No 90-12661 (PCT/FR91/00891) decrit une phase selective universelle capable de pieger tout anticorps marqué de souris par l'intermediaire d'immunoglobulines anti-idiotypes de souris,lorsque I 'anticorps ne s'est pas complexé à un antigène.Alors que les complexes antigène-anticorps marqués migrent vers la zone signal. C'est un dispositif immunologique (un anticorps piège un autre anticorps) pur ne faisant pas intervenir le piegeage des anticorps arrivant par des reactfs non immunologiques greffés sur l'anticorps et sur le filtre.D'o ses faibles performances en sensibilité. Le brevet US 4,948,726 du 14 Aout 1990 (Inventeur: Claude C. Longoria) decrit un dispositif vertical contenant une membrane horizontale chargée electrostatiquement: en versant un melange anticorps-antigène sur cette membrane,ces derniers sont retenus alors que les anticorps seuls traversent la membrane.C'est un système g 2811765 immuno-enzymatique de filtration verticale de faible performance et source de bruits de fond considerables. Le brevet français No 98/09599 du 28 Juillet 1998 decrit un dispositif d'electrodes separées par un filtre inerte.L'electrode superieure est perforée pour y deposer l'échantillon puis la solution d'anticorps marqués,l'ensemble anticorps-antigène migrant vers la zone-signal sans être capté par les electrodes,alors que les anticorps sans antigène sont captés par les electrodes.C'est un système immuno-enzymatique io (l'anticorps est marqué de façon traditionnelle par une enzyme) performant (detecte le picogramme par ml). Le procédé objet de la presente invention en diffère par: 1: le traceur est dans la phase selective et non sur I'anticorps 2: la phase selective n'est pas constituée d'electrodes mais d'un filtre poreux sur lequel ont été fixés des reactifs qui piègent de façon chimique et covalente les anticorps sans antigène. 3: la grande difference par rapport au brevet français 98/09599 est que cette phase selective en piegeant l'anticorps quand il est libre d'antigène,entraîne egalement mais plus loin sur le filtre,la non- migration du traceur. 4: son extrême sensibilité: ici,pour une molecule d'antigène detectée,des dizaines de molecules de traceur parviennent à la zone signal;ce qui permet de detecter moins du millipicogramme par millilitre d'échantillon alors que le brevet français detectait le picogramme. L'art anterieur dans la detection de proteomes concerne des techniques très anciennes dont la plus representative est l'electrophorèse bi- dimensionnelle sur gel: un cocktail de proteines migre verticalement à l'interieur d'un gel sous l'effet d'un champ electrique et les proteines se groupent en spots successifs selon leur poids moleculaire,puis chaque spot migre horizontalement selon le pH pour produire une succession de petits spots.Sachant à l'avance que telle proteine a un tel pH et un tel poids moleculaire connus,elle est attendue à un certain endroit du gel.Le spot est ensuite coloré ou revélé de diverses manières.C'est une methode efficace mais longue,coûteuse et très peu sensible: pour lire un spot à l'oeil nu,il faut des quantités considerables de proteines. Des ameliorations techniques ont été apportées pour ameliorer la sensibilité: la detection fluorescente s'est avérée plus efficace mais elle parasite les charges et le pH des molecules proteiques marquées. Hochstrasser et Merril,en 1988,dans Appl.Theor. Electrophor. 1:35-40 produisent une polymerisation du gel de polyacrylamide pour la detection de proteines par marquage à l'argent. Jonscher KR,Yates JR 3rd (1997) dans AnaI.Biochem 244:1-15 (The quadrupole ion trap mass spectrometer - a small solution to a big challenge) s'inspirent d'un travail de Wilm et Mann en 1996 (Analytical properties of the nano electrospray ion source -Anal Biochem 66:1-8) pour analyser des echantillons sousmis à un puissant champ electrostatique pour dissocier par refraction d'un rayon laser,les elements 0o proteiques selon leur charge. Wilkins MR,Hochstrasser D et Sanchez JC en 1997 (Electrophoresis 18: 403408) dans Protein Identification with N- and C- Terminal sequence tags in Proteome projects pratiquent la greffe de fragments d'ADN sur les sequences N et C terminales des proteines recherchées,afin de mieux les visualiser à des doses infinitesimales. MODE PREPARATION D'UN DISPOSITIF COMPLET En prenant comme exemple un système ultrasensible de detection de la proteine de surface du virus de l'hepatite B (Antigène HBs) par un anticorps sur lequel est greffé SMCC (R1) et avidine (R3).Sur le filtre R2 sera SPDP et R4: Biotine - peorxydase.La revelation untilisera le potentiel Glucose oxydase-D-Glucose = H202 et TMB.Tous ces reactifs sont decrits ci dessous. A: PREPARATION DE LA SOLUTION D'ANTICORPS: A.1: Greffage du reactif R1 A.2: Greffage de R3 A.3: Mise en ampoule polypropylène et etiquetage B: PREPARATION DU FILTRE B.1: Fixation de R2 B.2: Depose de R4 B.3: Depose du substrat C: ELEMENTS PHYSIQUES C.1: Carte superieure C.2: L'entonnoir C.3: Carte inferieure D: MONTAGE - ENSACHAGE -- ETIQUETTAGE 4) lo- 2811765 A: PREPARATION DE LA SOLUTION D'ANTICORPS A.1: L'anticorps est une IgG1 monoclonale de Chèvre dirigée contre la sous-unité Ad de la molecule de surface du virus de I'hepatite B (HBs/Ad de Virostat-USA).Le reactif R1 est le N-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate que nous nommerons par commodité pour la suite: SMCC. Pour fixer le SMCC sur le site epitopique NH2 de I'anticorps,il faut io introduire des groupements thiols (-SH) à cet endroit precis de I'anticorps.il existe de nombreux acides aminés à la surface de toute la molecule d'lgG possedant des liaisons disulfures -S-S- Au niveau du site NH2 seul un residu Cystine possède une liaison -S-S- C'est donc à ce niveau qu'il faut provoquer un clivage (formation d'un groupe sulfhydryl libre) pour y fixer la molecule de SMCC et pas ailleurs. Pour cliver le pont disulfure -S-S- du residu cystine du site NH2 on incube pendant 2 Heures à 37 C 100 microlitres (10 mg/ml) de la solution d'anticorps dans 10 mM 2-mercaptoethylamine in 0,1 M sodium phosphate buffer, pH 6,0 et contenant 5mM d'EDTA. Après 20 minutes d'incubation à temperature ambiante,l'on confirme la presence de groupes thiols -SH en mesurant l'adsorbance à 324 nm utilisant une absorption molaire de 19.800 mol-l.cm-1. Il existe de nombreuses autres methodes de reduction-clivage de residus cystine (DTT ou S-acetylmercaptosuccinic anhydre prealablement dilué dans N,N-dimethylformamide pendant 30 minutes à temperature ambiante) Celle retenue ici est de loin la meilleure car elle ne provoque pas de polymerisation des anticorps et le caractère monomerique est ici indispensable (sinon chute dramatique de la sensibilité: seuls quelques sites NH2 seront libres).Elle s'inspire de Ishikawa,Yoshitake,lmagawa, Sumiyoshi (Ann. N.Y. Acad.Sci. U.S.A.,78,5807,1981) Le reactif R1 (SMCC) est ensuite mis en contact avec la solution d'anticorps preparée ci dessus en 0,1 M Sodium phosphate buffer pH6 contenant 2,5 mM EDTA à 4 C pendant 20 heures ou à 30 C pendant 1 heure.Cette solution est ensuite purifiée sur LKB Ultrogel AcA 44 pour eliminer les anticorps qui n'ont pas fixé de SMCC et les molecules libres de SMCC. A.2 GREFFAGE DE R3 -1 1 2811765 A.2.1: Thiolation de l'avidine: en solution de S-acetyl mercaptosuccinic anhydre dissous en N,N-dimethylformamide et PBS 0.2 M pH7 30 minutes à 30 C.Les groupes thiols sont alors generés par 0,2 M hydroxylamine - HCI et 5mM EDTA pH7: rendement: 1,6 groupes thiols par molecule d'avidine:. Elle est choisie ici car elle ne reagit qu'avec la biotine (en R4) et pas avec le SMCC deja fixé sur l'anticorps. A.2.2 Mise en contact avec l'anticorps (site COOH) et passage rapide en colonne preparative LKB Ultrogel pour eliminer l'avidine restée libre. A. 3 La solution d'anticorps ainsi preparée avec R1 et R3 est diluée dans une solution de tampon,d'antibiotiques,antifongiques,de proteine ballast type BSA 1 mg/ml pour atteindre la dose necessaire pour le test (5 nanogrammes/ml) B - PREPARATION DU FILTRE Le filtre est un materiau poreux quelconque,inerte cellulose, hydroxycellulose, papier,etc Il est possible d'utiliser des materiaux poreux plus nobles: nitrocellulose,acetate de cellulose,nylon,etc qui ont une porosité beaucoup plus petite mais pour lesquels il faut terminer la preparation du filtre par un blocking proteique (BSA,gelatine,etc) ou chimique (PVP,PEG,etc). Dans ce modèle,le filtre est un rectangle de cellulose de 30 mm de long sur 12 mm de large et 0,7 mm d'epaisseur. Bi 1: DEPOSE DE R2. Planche Figure 3() Il s'agit du seul produit reagissant avec R1 (non masqué par antigène) pour immobiliser l'anticorps en cas de resultat negatif.; le SPDP: (N-succinimidyl 3 - (2- pyridyldithio)propionate.Pour le fixer sur le filtre qui ne contient pas de radical chimique reactif,il faut le lier à une proteine presentant un groupe sulfhydryl SH (elles sont nombreuses: ricine,gelatine,etc).La fixation au filtre se fera en solution à chaud.Après refroidissement la proteine est immobilisée et insoluble dans le filtre.Le depôt de R2 se fera sur le filtre à 5 mm en aval du lieu o la solution d'anticorps reagira avec l'echantillon avant qu'elle ne migre vers le lieu de depose de R2.En l'absence d'antigène dans l'echantillon,R1 (SMCC) sera piégé par R2 l1 (SPDP).Par contre en presence d'antigène,R1 sera occulté et neutralisé et l'anticorps poursuivra sa migration vers R4 B2: DEPOSE DE R4: Il s'agit d'une solution de Peroxydase Biotine preparée de la façon suivante: B2.1 Biotinylation de la peroxydase par Biotinyl-N- hydroxysuccinimide ester B2.2: puis bain de 0,2% v/v de glutaraldehyde en 0,1 M PBS pH6,8 pendant 2H à temperature ambiante.Pour proteger la peroxydase on ajoute des ions (ZnCI2 - MgCI2 - CaCI2 0,01 M de chaque,des antibiotiques,un ballast proteique (serum de veau foetal 10 mg/ml) et un anti trypsine-chymotrypsine: lI'aprotinine.Dans ce melange,la peroxydase survit sous vide,au noir,plus de deux ans à temperature ambiante.. La solution est deposée à froid,à 5 mm en aval de R2 sous forme d'un trait sur le filtre dans le sens de la largeur,sur la route des fluides arrivants.Elle sera delicatement sechée à 25-30 C Si les fluides qui arrivent de R2 ne contiennent pas d'anticorps (puisque piegé par R2 en amont),aucun reactif ne se liera à la biotine et la peroxydase ne se decrochera pas. Si les anticorps arrivent,le reactif R3 (avidine) hautement specifique de la biotine,s'y lie et entraîne la peroxydase avec elle.En fait une molecule d'avidine peut se lier à de nombreuses moiecules de biotine-peroxydase ce qui augmente la sensibilité. Une variante permet d'amplifier considerablement la sensibilité après avoir biotinylé la peroxydase,on fixe à nouveau,mais en moindre quantité et dans des conditons differentes (tampon,pH,etc),des molecules d'avidine de telle sorte qu'une molecule de peroxydase possède un pôle biotine et un pôle opposé avidine.Ce qui permet au groupe (peroxydase - biotine fixée à R3 - avidine libre) d'entrainer par ce pôle avidine libre,un nouveau groupe biotine-peroxydase-avidine et ainsi de suite pour former un cortège ou une polymerisation lineaire de très nombreuses molecules de R4 qui vont colorer le substrat pour une seule molecule d'antigène detectée par l'anticorps. B3: DEPOSE DU SUBSTRAT A 5 mm en aval de R4,on trace un trait de Glucose oxydase 500 UI/ml dansle sens de la largeur.Puis un mm encore en aval,un -d 5 2811765 trait de D-Glucose 1 M puis à 5 mm en aval on depose à la pipette pl de 3-3'-5-5' Tetra methyl benzidine (TMB) à 100 mg/ml.(cette depose de 10 pl forme un rond de TMB de 8 mm de diametre sur la face inferieure du filtre) Le melange peroxydase (quand les anticorps passent) + glucose oxydase + DGlucose aboutit à la formation d'ions H+ en très grande quantité qui colorent le TMB en bleu C: ELEMENTS PHYSIQUES C.1.: ELEMENT SUPERIEUR: Planche I Fig 1 -2 Il s'agit d'un materiau rigide quelconque (carton etanche,plastique PVC,etc).ll sera recouvert à sa face inferieure d'un adhesif double face très fin puis perforé d'un trou de 4 mm de diametre Cet element superieur vient recouvrir le filtre de telle sorte que le trou soit à quelques mm du bord proximal du filtre, au milieu de la largeur. C.2.: L'ENTONNOIR.(7) Planche I Figure 1 Est un element en plastique moulé de 10 mm de diametre et 1 mm d'epaisseur avec un trou de 4 mm de diametre en son milieu.ll sera collé sur l'element superieur de telle sorte que son trou corresponde bien au trou de l'element superieur. C.3: L'ELEMENT INFERIEUR 2) Figure 1 et 2 A partir du même materiau rigide,sa face superieure cette fois,est recouverte de l'adhesif double face et perforé d'un trou de 6 mm de diametre en regard de l'extremité du filtre,à l'endroit precis o sera depose le TMB.Un carré de plastique transparent de 1 OmmX1 Omm vient recouvrir ce trou afin que le filtre ne reste pas à l'air (risque de coloration sponrtanée du TMB) En retournant le dispositif à la fin du test,on pourra voir le resultat à travers cet orifice. Il n'est pas souhaitable que cet orifice soit sur l'element superieur pour les raisons suivantes: - certains tests demanderont des filtres beaucoup plus courts: le trou de depose risquera alors d'être trop près de l'orifice du signal - de nombreux lecteurs,à l'image des lecteurs de glycemie,ont une source lumineuse (laser) qui lit le signal par sa face inferieure alors que la goutte de sang a été deposée sur la face superieure - après la depose de l'echantillon et des reactifs,il est preferable de couvrir cette face superieure par un adhesif ou en la remettant dans un etui afin d'eviter tout contact avec des elements dangereux de l'echantillon.Si le trou du signal etait sur cette face superieure,on ne pourrait plus le lire alors que la face inferieure,non recouverte laissera visible le trou du signal qui est de toutes façons protégé par le carré de plastique Dans une configuration avantageuse,les elements superieur et inferieur peuvent avoir les dimensions d'une carte de credit. Une autre configuration est très interessante: le filtre est enserré entre deux bandes longues par exemple de 50 mm sur 15 mm de large. Il n'y a pas d'entonnoir. Le patient depose sa gouttelette d'echantillon sur le filtre puis plonge ce dernier dans un tube contenant la solution d'anticorps. D: MONTAGE On pose l'element inferieur sur un plan de travail.Puis un carré de plastique transparent fin de 1 OX10 mm sur le trou de 6 mm de diametre afin que le filtre qui va être deposé dessus ne soit pas à lI'air. Puis le filtre avec la zone imbibée de TMB bien en regard du trou-signal. Comme le filtre a une epaisseur de 0,7 mm il est preferable d'ajouter un element intermediaire rigide et perforé de 30X12 mm afin que l'element superieur qui vient se coller au filtre ne soit gondolé sur les bords. Dans une configuration très avantageuse, la solution d'anticorps peut être integrée au dispositif: Planche 1 - Figure 3: un reservoir de solution d'anticorps (1) est integré à un couvercle (2).Après la depose de l'echantillon dans le trou (5) du dispositif initial,on rabat le couvercle.Un système d'autoperforation (6)à la fermeture provoque la vidange du reservoir (1) ce qui evite d'utiliser une pipette ou de manipuler des solutions d'anticorps.Si l'echantillon est du sang total prelevé à un doigt,il suffira de deposer la goutte de sang et de fermer pour voir le resultat. -4 5 2811765 ENSACHAGE dans un sachet plastique noir ou aluminium,opaque,etanche avec une plaque de dessicant de quelques cm2 qui recouvre le dispositif avant la soudure du sac. ETIQUETTAGE prealable du dispositif,du sachet.Impression d'un mode d'emploi et des precautions d'usage. MODE OPERATOIRE io En gardant l'exemple de la detection de l'antigène HBs du virus de l'hepatite B. 1 - Prelever 10 microlitres de serum et les deposer au fond de l'entonnoir sur le filtre 2 - Pipetter 100 pI de la solution d'anticorps et les deposer dans l'entonnoir.lls vont être absorbés doucement,en quelques secondes Après 10 secondes,retourner le dispositif:on voit le filtre s'impregner des fluides qui arrivent puis se mouiller completement.Si un antigène HBs 2o etait present dans ce serum, une coloration bleue se serait produite en quelques secondes après l'impregnation totale du filtre. Un serum etalonné de l'Institut national de la Transfusion Sanguine de Paris,contenant 1000 nanogrammes d'antigène HBs, a été testé puis dilué 10 fois,puis 100 fois,1000 fois,...jusqu 'à 1 Milliard de fois (10 puiss 9) soit un millipicogramme/ml dans du serum negatif verifié en PCR Les resultats suivants ont été observés de façon repetitive: !Log de l 1 og de1 3 4 5 6 7 8 9 10 dilution Intensité +++ +++ +++ +++ ++ ++ + O coloration Le dispositif utilisé ne contenait pas le reactif R4 bipolaire biotine-avidine repute augmenter la sensibilité.Un essai est donc refait avec un dispositif ultra-sensible et une comparaison est faite avec la technique PCR. Les dilutions se font à nouveau mais plus loin: jusqu'à 10 puissance 12 (1 micropicogramme/ml ou femogramme/ml).Chaque tube de dilution est divisé en deux tubes.L'un est adressé à la PCR et l'autre est testé avec la version ultra-sensible de ce dispositif. Resultats obtenus: d, 6 2811765 Log 1 3 5 7 9 10 11 12 13 dilution Intensité +++ +. ++ +++ ++.+. +++.. ++ 0 O coloration PCR positif Positif Positif Positif Neg Neg Neg Neg Neg La PCR n'a rien detecté à partir du tube n 9 contenant 1 millipicogr/ml Le dispositif present s'est fortement coloré jusqu'au facteur de dilution 11 avant de s'eteindre totalement et brusquement: explication: en appliquant la règle des molarités/nombre d'Avogadro et en partant du tube initial qui contenait 1000 ng/ml d'antigène,sachant que le poids moleculaire de l'antigène HBs est de 50. 000 daltons, il ne restait plus suffisemment de molecules d'HBs (20 molecules par millilitre) dans la dilution de facteur 11 pour avoir au moins une molecule dans les io quelques microlitres deposes dans le dispositif.La forte coloration de la dilution 10 et son interruption brutale en dilution 11 confirme bien qu'un ruban de plusieurs dizaines de reactifs R4 s'est formé à la suite de l'anticorps qui a detecte quelques molecules d'HBs. DETECTION D'ANTICORPS SERIQUES Exemple: Detection d'anticorps anti p24 du virus HIV Mode operatoire: des molecules p24 de virus HIV (temoins inactivés de contrôle +) et des anticorps polyclonaux anti p24 sont fournis par Virostat (USA) pour servir à " positiver " serologiquement des serums negatifs moins dangereux à manipuler. Sur les molecules de p24 on applique le protocole decrit plus haut: greffage de SMCC (R1) sur les sites epitopiques antigeniques de la proteine (contenant des ponts disulfures) et d'Avidine (R3) sur un autre pôle non concerné par la liaison aux anticorps. Sur le filtre sont normalement greffés R2 (SPDP) et plus loin R4 (biotine- peroxydase).Le dispositif ne necessite pas d'amplification du signal car les anticorps seriques circulent très tôt à des doses considerables. Une gouttelette de serum negatif est deposée sur le filtre puis on verse pl de la solution de p24 preparée: la fenêtre signal se mouille sans se colorer. Puis on prepare les serums positifs en ajoutant aux serums negatifs des doses decroissantes d'anticorps polyclonal anti p-24 Le dispositif se colore même aux dilutions très avancées. t1 * 2811765 DETECTION DE BRINS D'ADN Principe: une sonde nucleique capable de reconnaître un brin d'ADN correspondant est preparée à l'avance sur le même principe que les anticorps: greffage de R1 sur les sites de liaisons au brin recherché,et greffage de R3 en bout de sonde.Sur le filtre,R2 est un reactif qui se lie à R1 et fixe l'ensemble R3-R1-sonde qui n'a pas rencontré le brin recherché.Plus en aval,un reactif R4 sera entrainé par R3 si la sonde qui io s'est couplé au brin correspondant trouvé dans I'echantillon,a echappé à R2 (R1 etant occulté par le brin).L'option R4 avidine biotine,source d'extrême sensibilité,trouve ici tout son intêret car les brins d'ADN recherchés sont parfois au nombre de un brin par test (prelevements de cheveux,d'empreintes,de traces de sang ou autres vieilles parfois de plusieurs années,etc en medecine legale). MULTIDETECTION (SCREENING) à partir d'une SEULE gouttelette d'echantillon Principe: Plutôt que de rechercher affection par affection,il est possible de proceder à une detection simultanée de nombreux antigènes differents (le total peut atteindre la trentaine en augmentant legerement la taille du dispositif) à partir de la même goutte d'echantillon. Au lieu d'utiliser et de preparer un seul anticorps,l'on associe dans la même solution d'anticorps preparés,plusieurs anticorps differents.Si le test se colore c'est qu'au moins une des affections est presente.ll convient alors de faire test par test pour determiner laquelle est presente. Exemple: en centre de transfusion: screening de l'Hepatite A,hepatite B, Hepatite C et HIV (proteine p24) Un anticorps monoclonal est preparé pour chacune des affections avant de les associer dans la même solutin qui va être deposée à la suite de l'echantillon. Si le test se colore c'est qu'au moins une des affections est presente. DISPOSITIF MULTITEST Dans une même carte sont insérés plusieurs dispositifs identiques mais chacun devant être utilisé avec un anticorps different. Exemple: sur une carte de 4 tests identiques on depose 4 gouttelettes de sang ou de serum.Sur le premier dispositif on depose ensuite une solution d'anticorps anti Hepatite A antigène,sur le dispositif suivant on f1 d" 2811765 depose une solutin d'anticorps anti HBs,le suivant,un anticorps anti Hepatite C et enfin sur le quatrième,un anticorps anti p24 (HIV) Si le test du paragraphe precedent s'etait coloré,ce test permettra de dire quelle est l'affection presente. Ce système est aussi valable pour un groupe de marqueurs tumoraux ou pour un ensemble de bacteries,etc DISPOSITIF DE MONITORING QUOTIDIEN Dans un, dispositif long pouvant contenir jusqu'à 30 tests,il est possible de faire un test par jour ou par semaine.Le medecin qui prescrit un traitement peut être interesse par le resultat (disparition de l'antigène causal) ou par l'apparition d'un effet secondaire detectable (lyse hepatocellulaire, anomalie pharmacogenomique,etc) ou par l'evolution d'un marqueur tumoral au fil du traitement. DETECTION PAR BIOPSIE Le dispositif present (depose du materiel à tester dans l'entonnoir puis au même endroit une solution d'anticorps specifique de la substance recherchée dans la biopsie,absorptoin immediate de cette solution par le filtre et signal quelques secondes après) presente tous les atouts pour completer harmonieusement l'anatomo-pathologie de façon pratique et abordable,permettant des biosies per operatoires à resultat instantané au lieu de laisser attendre le patient anesthesié pendant de longs moments,les prelevements locaux (gorge,genitaux,etc) plus faciles. Exemple choisi: frottis cervical chez une femme presentant des lesions ulcereuses dysplasiques saignotantes du col uterin,examen pratiqué pendant la consultation gynecologique au cabinet du medecin qui pose quatre hypotheses diagnostiques possibles: deux MST (Chlamydiae - Syphillis) une mycose (Candida albicans) un virus (Papilloma virus).Les traitements respectifs de ces affections sont fondamentalement differents, voire même opposés (un antibiotique peut aggraver une mycose) et le medecin est souvent confronté à une impasse therapeutique dans l'ignorance de l'agent causal. 1 2811765 Materiel: Un ecouvillon sterile et quatre dispositifs separés ou sur la même carte.Quatre solutions d'anticorps differents specifiques de ces agents infectieux. Mode operatoire: Le prelevement de mucosités cervicales par ecouvillon est depose par une simple touche au contact du filtre au fond de chacun des quatre entonnoirs avant d'y verser l'anticorps different pour chacun des tests.Le test coloré correspondra au diagnostic. L'apport au medecin en termes de gains de temps,d'argent,de depistage 1o precoce,de guerison,de confort,est enorme.Auparavant,la patiente devait rentrer chez elle sans traitement precis,continuer à souffrir et attendre parfois des semaines ses resultats. Cette methode de depose d'echantillons solides avant de verser 1s l'anticorps correspondant,ne se limite pas à l'anatomo-pathologie humaine; elle s'applique naturellement aux prelevements systematiques veterinaires (moelle,cerveau,visceres,dans l'ESB),ecologiques (detection d'hydrocarbures,de dioxines) agroalimentaires (salmonnelloses,listeria, rotavirus des gastroenterites,etc) epidemiques et endemiques (virus Ebola en Afrique,Malaria,fievre jaune,paludisme bilharzioses des pays en voie de developpement).Les domaines sont vastes. DETECTION DE PATHOLOGIES INFECTIEUSES La revue Impact Medecin (No 1053 du 5 Mai 1997) classant les 10 affections les plus meurtrières dans le monde,ont placé 7 maladies infectieuses.En terme de nombre de victimes,les infections viennent largement en tête: 21,7 Millions de decès par an (contre 7,2 pour les cardiopathies coronariennes, 6,3 pour les cancers et 4,6 pour les affections cerebrovasculaires) Mais en dehors de l'aspect infectieux dangereux en lui même,l'univers bacterien interesse fortement depuis quelques années le monde medical.Une relation est aujourd'hui etablie entre de nombreuses affections anciennement considérées comme non- infectieuses et un agent causal bacterien.L'on sait aujourd'hui que l'ulcus gastro-duodenal est dû à la presence dans l'estomac,d'une bacterie: Heliobacter Pylorii. Des preuves s'accumulent de jour en jour pour impliquer indirectement des agents infectieux dans la pathologie cardio-vasculaire par augmentation sensible de la C Reactive Proteine.Plus precisément,le professeur Ridckler (Boston) et son equipe ont demontré dans une etude ZO 2811765 cross-sectionnelle portant sur 233 patients ( 37% femmes et 63% hommes âge moyen 57 ans) recrutés au NIH et dont 158 (68%) avaient des lesions coronariennes prouvées en angiographie,qu'il y avait une correlation entre la seropositivité pour certains agents pathogènres (Chamydia pneumoniae,CMV, herpes HSV1 et 2 et virus hepatite A) et la presence d'une coronoropathie authentifiée.Seuls 3% des patients n'avaient jamais été infectés par aucun de ces agents alors que 70% l'avaient été à au moins deux agents.Mais le plus interessant est que la prevalence passe à 85% pour les patients ayant contracté cinq agents pathogènes.Aussi interessant,la CRP suit la même courbe avec 1 mg/ml chez les sujets sains, 7 mg/ml pour les porteurs de deux agents et depassant les 10 mg/ml chez ceux infectés par plus de quatre agents. Le present dispositif permet d'apporter une forte contribution à la lutte contre le fleau infectieux à l'echelle mondiale: 1 - en terme de prevention (examens systematiques plus simples,rapides,très peu coûteux) 2 - en terme de traitement precoce: le medecin qui fait un prelevement gastrique au cours d'une gastro-fibroscopie peut avoir la reponse immediate de recherche de l'Heliobacter Pylorii ce qui lui permettra de mettre en place aussitôt le traitement devenu spectaculairement efficace de l'ulcus par des antibiotiques alors qu'auparavant il fallait attendre le resultat de l'anatomo-pathologie. EXEMPLE: DETECTION DE L'ANTIGENE LPS du CHLAMYDIAE Un anticorps monoclonal de haute affinité et specifique de l'antigène LPS du Chlamydiae Trachomatis est marqué avec R1 (SMCC) et R3 (avidine) L'echantillon est un prelèvement vaginal sur ecouvillon sterile immediatement deposé sur le dispositif. Les methodes anterieures necessitaient un traitement special de l'éechantillon par un detergent particulier: le Chaps (Protocole de Diagnostics Pasteur- Marne la Coquette - France) puis un vortexage intense et long afin de lyser les cellules infectées et liberer ainsi de grandes quantités de particules bacteriennes de chlamydiae dont l'antigène LPS qui n'aurait pu être dectecté autrement Dans le cas ptesent le dispositif est suffisemment sensible pour detecter les traces d'antigène LPS dans le prelèvement (eclatement spontané des cellules infectées) sans avoir besoin de lyser toutes les cellules du prelevement. 1 2811765 Après avoir deposé le prelèvement sur le dispositif,on depose 100 pl de la solution d'anticorps anti-LPS qui est absorbée en quelques secondes.On retourne le dispositif pour lire le resultat: la coloration bleue signifie la presence de Chlamydiae Trachomatis dans le s prelèvement. Cette methode peut s'appliquer à toutes les MST (Maladies sexuellement transmissibles) mais aussi à la detection du papillomavirus au niveau du col uterin en cas de dysplasie suspecte,ou la detection de germes dans les salpyngites ou autres infections annexielles (tuberculose uro- genitale io par exemple) EXEMPLE D'UNE HORMONE:SUIVI DE L'HORMONE HCG (Hormone chorioniaue aonadotrophiaue) DANS UN CANCER DE TESICULE Un homme jeune est suivi et traité pour cette affection qui a été opérée trente jours auparavant (J30).Les resultats du test ont été comparés aux resultats du laboratoire de ville auquel a été confié le patient. Duurée d J30 |J60 J70 J80 J90 J120 suM ______J30____________J60____ Coloration du ++ ++ ++ + 0 0 test Resutats 50UI/ml 6 Ut/ml s'il avait été arrêté sur la base des données du laboratoire de ville. 2 ú 2811765 CARDIOLOGIE La detection de la troponine I serique libérée par les cellules myocardiques necrosées au decours d'un infarctus aigu a fait l'objet d'une publication len 1995 dans le JAMA;273;1279-1282 par Elliott M. Altmann et David B.Sacks: Evaluation of a rapid bedside assay of detection of serum cardiac Troponin T Le système utilisé etait basé sur la migration sur une bande,d 'anticorps marqués aux sels d'or qui s'agglutinent sur une ligne pourpre plus ou io moins visible selon le taux de troponine T detectée.Cette ligne n'apparaît (faiblement visible) qu'à partir de 0,2 ng/ml et en 20 minutes.Ce qui fait que la detection n'a pu se faire dans les toutes premières heures: le tableau suivant montre la faible sensibilité de cette methode (33% les 2 premieres heures, 50% entre 2 et 4 heures,75 % entre 4 et 8 heures et 86% au delà de 8 heures. Etant donné l'extrême sensibilité du système objet de la presente invention,la detection aurait été faite dans les premières minutes comme le prouve l'essai suivant pratiqué avec des doses infinitesimales de troponine TnTc (troponine provenant du myopcarde à la difference de la troponine ds muscles squelettiques),en comparaison du test rapide d'Elliott Altmann portant sur 100 personnes admises en urgences cardiologiques pour syndrome infarctus. Le système objet de la presente invention a utilisé des anticorps hautement specifiques de la TnTc ne croisant pas avec la troponine squelettique,ainsi que de la Troponine TnTc purifiée pour etalonner des serums negatifs.L'ensemble anticorps et troponine TnTc a ét fournipar le laboratoire Boerhinger.Les marquages n'ont pas été maxiamaux (R1: SMCC R2: SPDP R3 Avidine R4: Biotine peroxydase non polymerisée (sans avidine)) Le dispositif est simple: 26X10 mm et Signal Glucose oxydase DG TMB. Resultats Temps 0-15 mn 16-30 31-60mn 1 -4 H 4-8 H > 8 H ecoulé mn Nombre cas 5 7 13 23 10 42 Detectés par0 1 7 18 8 36 Elliott Altman TnTc 0,2 ng/ml Comparaison avec le système present: 2,3 2811765 Serums negatifs 0,01 0,1 picog/ml 1 picog/ml 10 picog/ml 1 nanogr/ml positives à: picog/m_ Nombre tubes10 10 10 10 10 Resultats 10 10 10 10 10 positifs La troponine a été choisie pour illustrer la sensibilité de cette technique mais surtout pour son excellente specificité.Les autres enzymes cardiaques sont peu specifiques: CKMB massive,CK,LDH,ASAT CANCEROLOGIE 1o Un chapitre important sera consacré à ce domaine plus loin dans la partie genomique et proteomique dans laquelle sera decrite l'implication du present système dans la relation entre genes,produits de genes translatés ainsi que l'accompagnement possible des puces à ADN. Les marqueurs tumoraux classiques decouverts à partir de 1990 gardent s15 encore un certain interêt diagnostique (calcitonine dans le cancer medullaire de la thyroïde,hCG dans les tumeurs placentaires ou testiculaires) ou de suivi de l'affection au cours du traitement (CA 15-3 dans le cancer du sein,CA125 dans celui de l'ovaire,PSA pour la prostate, AFP et ACE pour le foie,CA 19-9 pour le pancreas,NSE pour le poumon,etc) Tout recemment des equipes internationales ont demontré le rôle du virus d'Epstein Barr dans de nombreux cancers et le rôle de la telomerase qui favorise la cancerisation de cellules porteuses d'oncogènes (l'inhibition de la telomerase entraine la mort de cellules cancereuses - Dr Robert Weinberg " Nature Medicine,Octobre 99 pp 1164 et 1129) Le dispositif et procédé objets de la presente invention peuvent tout à fait detecter des doses infinitesimales de telomersase ou de son excès,des traces de virus Einstein Barr et d'une manière generale tous les oncogènes internes et externes au corps humain susceptibles de canceriser la cellule normale. (oncogènes mutés tels RAS ou p53,proteines virales comm e le papillomavirus) Il est possible d'utiliser un dispositif simple pour suivre un marqueur mais egalement l'option multitest ou multidetection (plusieurs tests differents sur la même carte ou plusieurs marqueurs à partir de la même goutte d'echantillon).L'option hypersensible ne s'impose guère ici puisqu'au contraire c'est du semi-quantitatif pur (ces marqueurs existent chez les sujets sains et c'est leur excès qui traduit l'etat pathologique). Par contre,dans le chapitre consacré plus loin à la cancerologie en genomique-proteomique,la sensibilité sera l'atout de ce système puisque les produits de translation genique par exemple,au debut d'une affection maligne,sont actuellement indetectables par les methodes courantes.De plus,l'analyse de microechantillons par les puces à ADN detecte des molecules d'ADN translaté recherché et le present système accompagnera harmonieusement la puce à ADN pour la detection de 0o proteine cancerigène correspondante.I est même permis comme on le verra plus loin d'imaginer un système dans lequel la même goutte sera lue par la puce à ADN avant d'être absorbée par le dispositif present * preparé pour detecter jusqu'à 10 proteines dont l'ADN est recherché. DETECTION DE RECEPTEURS MEMBRANAIRES ET DES CYTOKINES Principe: de nombreux ligands circulants extracellulaires se lient à leur recepteur propre sur la membrane des cellules.Cette union produit I'emission d'un signal tel que la polarisation d'un radical Tyrosine dans la partie intracellulaire du recepteur,ou l'activation d'une proteine G et la transformation d'AMPcyclique en ATP ainsi que bien d'autres reactions intracellulaires.Le principe est donc qu'au lieu d'utiliser des anticorps pour detecter le recepteur,on utilise son ligand preparé selon la même methode que les anticorps (R1 sur les sites de liaisons,R3 plus loin,R2 et R4 sur le filtre) Le present système permet donc le dosage de tout le reseau des cytokines (Interleukines,facteurs de croissance, hormones telles oestrogenes (cancer du sein),ou l'insuline qui ont des recepteurs bien indentifiés.Ce dosage apporte souvent une indication de pronostic et guide I etraitement. Il en est de même des recepteurs membranaires dont l'importance est à present demontrée dans la reconnaissance de proteines dangereuses (virus, proteines tumorales,etc),induisant ainsi les defenses des cellules qui supportent ces recepteurs. En cancerologie,un interessant travail a été effectué par une equipe de l'Université de Californie sur les lymphocytes NK (Natural Killers) ou d'autres cellules immunitaires comme les CD8 tous deux porteurs du recepteur membranaire NKG2D. Dès qu'une cellule devient cancereuse elle produit des proteines tumorales reconnues par le recepteur NKG2D qui declenche les 1-25 2811765 defenses lymphocytaires: anticorps detruisant les cellules tumorales. ( Adelheid Cervanka et Lewis Lanier - Revue Immunity - Juin 2000) Malheureusement,chez certaines personnes ces defenses ne se mettent pas en place (deficit immunitaire,etc) et le cancer se developpe.L'interêt de ce travail est qu'un vaccin est possible en vaccinant les sujets à risque contre les proteines des cellules tumorales: ces dernières etant connues, identifiées.Malheureusement encore une fois,dans les cancers sevères,ces proteines tumorales ne sont pas exprimées et donc les lymphocytes NK n'ont pas de prise sur les cellules tumorales: il semble io que ces cancers sevères reduisent au silence leurs propres gènes codant pour ces proteines (comme par un incroyable reflexe de camouflage contre les lymphocytes tueurs NK).Un des objectifs est donc de " reveiller " ces gènes de cellules cancereuses codant pour les proteines tumorales et ainsi permettre aux defenses immunitaites Ly NK is et CD8 d'intervenir. La presente invention se propose donc de definir la situation immunologique du patient en detectant la presence ou l'absence de proteines tumorales tant sur un plan diagnostic que de suivi therapeutique. DETECTION DE PATHOLOGIES PLUS RECENTES Exemple 1: DETECTION DU PrP (PRION PATHOLOGIQUE) dans un homogeneisat de cerveau bovin Le materiel est gracieusement fourni par l'equipe de Monsieur Jacques Grassi du CEA (Commissariat à l'Energie de Saclay France) directeur du Laboratoire de biologie moleculaire des proteines. Materiel fourni: 1 - Un anticorps monoclonal: SF33 specifique du PrP recombinant 2 - Un tube de solution PrP recombinante à 1 mg/ml 3 - Un flacon d'homogeneïsat de cerveau bovin normal testé negatif en PCR Le but de la manipulation est de demontrer l'extrême sensibilité de la methode qui manque aux methodes classiques laissant echapper des animaux très faiblement ou recemment atteints mais neanmoins dangereux à la consommation.La comparaison est faite par rapport à Z.- 2811765 trois autres methodes: I'une classique: Elisa,la seconde: PCR classique et la troisième: ImmunoPCR mise au point par une equipe japonaise et utilisée par l'equipe du Professeur Hochstrasser à l'hopitall cantonnai de Genève-Suisse Les mesures,pour être coherentes sur le plan internatinal sont en Moles de PrP par litre d'homogenïsat. Cependant: il convient de preciser qu'il s'agit de detection de PrP recombinante diluée dans un homogeneïsat de cerveau normal et qu'il ne s'agit donc pas des conditions normales de cerveaux pathologiques " d'abattoir ".En effet,le prion existe sous deux formes:la forme classique ( 2 helices dans la structure quaternaire de la molecule) et la forme pathologique (1 helice).Les anticorps monoclonaux les plus perfectionnésne sont pas parvenus à faire la difference: ils les detectent indifferemment tous les deux.Une equipe europeenne a reussi à detruire le prion normal par un traitement puissant de l'homogeneïsat de cerveau à tester,par des detergents et Urée 3M.Le prion pathologique PrP resiste à ce traitement et est donc detecté par les anticorps monoclonaux. Mode operatoire: Après vortex intense,on depose sur un dispositif de 20 mmXO10 mm 10 pI de l'homogeneisat de cerveau normal.Puis 100 pl de solution d'anticorps monoclonal preparé avec R1 et R3.Au bout de quelques secondes la fenêtre du resultat est imbibée de fluides et ne se colore pas. On dispose 8 tubes sur un portoir,contenant chacun 100 pl d'homogeneïsat de cerveau normal numerotés de 1 à 8 La solution de PrP recombinant à 1 mg/ml ( soit 10 puiss-3 g / PM 10.000 =10 puiss - 7 Moles/ml ou 10 puiss- 10 Moles/L) est diluée 100 fois dans le tube 1 (1 pl de PrP dans les 100 pl d'homogeneïsat normal) puis de tube en tube pour avoir les molarités selon le tableau suivant: LoQarithme des molarités/litre Methode I -12 -15 -16 1 -17 1-18 -19 -20 1 -21M/I Elisa ++ 0 0 00 0 0 0 PCR Positif Positif0 0 0 0 0 0 ImmunoPCR Positif Positif positif 0 0 0 0 0O Dispositif +++ ++ + + ++ o+ 0 Present Exemple 2: SCLEROSE EN PLAQUES (SEP) C'est le français Hervé Perron (Directeur de l'Unité mixte CNRS- BioMerieux: UMR103 Lyon) qui a decouvert le retrovirus MSRV (Multiple Sclerosis Retro Virus) impliqué dans la Sclerose en plaques (Procced.Nat. Acad. of Sciences Juillet 97,vol 94 p 7583).11 s'agit d'un oncovirus de type C,retrouvé chez des patients atteints de SEP et à present identifié et sequencé.Comme tous les retrovirus,il s'insère dans l'ADN des monocytes du liquide cephalorachidien de patients en phase 0o active et transmet la sequence specifique MSRV pot à l'ARN cellulaire.Sa phylogenie le rapproche des retrovirus MuLV,MMTV, JSRV responsables chrez l'animal, de virions infectieux causant atteintes neurologiques,tumeurs solides, leucemies.Ces virions expriment des superantigènes endogènes circulant à des taux indetectables actuellement. H.Perron et son equipe ont travaillé sur des cultures de cellules du plexus choroïde de temoins sains et de patients,etude de l'activité retrovirale,clonage et sequençage, hybridation PCR,extraction de l'ARN, synthèse d'ADN et amplification PCR à partir d'echantillons plasmatiques: il a clairement etabli que le virus MSRV produit une proteine puissamment gliotoxique à partir de la cellule infectée,et responsable des lesions gliales cerebrales. La presence de materiel genetique de MSRV mais surtout de cette proteine dans le sang circulant a été prouvée mais à des taux indetectables par les methodes classiques,ce qui permet le diagnostic par le dispositif objet de la presente invention mais surtout la detection de survenues de crises " actives " de la maladie ainsi que le suivi du traitement. Cet exemple illustre les possibilités potentielles de detection dans les autres affections retrovirales (suivi des traitements du HIV,etc) GENOMIQUE ET PROTEOMIQUE Le sequençage du genome humain fin Juin 2000 a permis de mieux cerner la proteomique (etude des proteines correspondant à une sequence genetique, leur classement fonctionnel,leur structure,etc).La pharmacogenomique identifie les genes impliqués dans l'efficacité d'un produit ou au contraire ses effets indesirables.Or l'evaluation de ces données est techniquement impossible aujourd'hui: les proteomes recherchés circulent dans la gouttelette d'echantillon (dans une puce à ADN par exmple) à des doses infrabiologiques indetectables.Les methodes PCR sont très coûteuses et très longues.Quand on sait qu'une hybridation de deux sequences d'ADN prend plusieurs heures et que des milliards de sequences figurent dans le genome,on imagine le coût et les delais pour progresser dans la voie de la genomique. La presente invention se propose donc d'apporter son extrême rapidité et sensibilité pour accompagner les progrès de la biologie moleculaire et en particulier de la genomique sous tous ses aspects. EXEMPLE D'UN TEST DE DETECTION DE PROTEOMES DANS LES OGM (Organismes genetiquement modifiés) Pour lutter contre les substances toxiques pour les plantes et introduites par des virus,bacteries, champignons ou insectes,des resistances se creent au niveau des plantes elles mêmes qui produisent une molecule anti-toxine (proteome) à partir de leur patrimoine genetique propre. Les manipulations genetiques sont parvenues à inserer des sequences d'ADN,des genes,induisant la production de telles substances anti- toxines pour proteger les recoltes. Tacke E.,Salamini F et Rohde W (1996) dans Nat.Biotechnol. 14:1597- 1601 sont parvenus à inserer un gène de protection contre le virus de la pomme de terre. Il existe dans la nature un grand reservoir de producteurs de proteines toxiques pour les parasites: le seul Bacillus thuringiensis contient une centaine de genes codant pour ces proteines et certains de ces genes ont été greffés dans l'ADN de graines pour les defendre contre ces parasites. (Estruch et AI.1997- Nat.Biotechnol.1 5:137-141) L'exemple etudié concerne donc la detection de la proteine rP234 du B.Thuringiensis dans une pomme de terre dont la graine a été manipulée genetiquement pour produire cette proteine. Materiel: une pomme de terre non manipulée (NM) et une pomme de terre manipulée genetiquement (M).Un flacon de contrôle negatif et un flacon positif ainsi que l'anticorps polyclonal correspondant(Adgen - Scotland - GB) Mode operatoire: Des fragments de pomme de terre sont ecrasés et placés dans l'entonnoir avant la depose d'une solution d'anticorps preparé.La coloration bleue confirme la presence de la proteine rP234.Un test similaire a été pratiqué avec les temoins fournis par Adgen et ont donné le même resultat. t-} 2811765 Etude de la sensibilité: les fragments de pomme de terre sont vortexés energiquement dans 1 ml de NaCI 0,9%.Les dilutions du tube positif dans le negatif se font au 1/10 puis au 1/1000,etc La detection a eu lieu jusqu'à la dilution de logarithme 11 avant de disparaître LA MALADIE D'ALZHEIMER Deux arguments biologiques viennent aujourd'hui conforter le diagnostic cliniique de la Maladie d'Alzheimer: 1) la presence serique à un taux très faible d'apolipoproteine E4 due à la presence de 1 ou 2 allèles e4 du gène de l'apolipoproteine sur le chromosome 21 (alors que les porteurs d'allèles e2 ou e3 ne font jamais cette affection).(Gertrude H - Sergiewsxy center,NY- USA dans New england Journal of Medicine,19 Fevrier 1998, p 506) 2)la presence intracerebrale de la proteine pathologique APP (Amyloïd Precursor Protein) responsable des depôts encephaliques de proteine Betaamyloïde caracteristique de la maladie.La production de cette proteine anormale est dûe à une mutation du gène APP (substitution de ILE pour VAL) sur le chromosome 21.De nombreuses publications prouvent la presence à des doses indetectables de proteine beta-amyloïde dans le sang ou même dans les tissus extra-cerebraux (un test de detection de cette proteine dans la biopsie d'un fragment dermique de l'avant-bras a été tout recemment presenté). L'allèle e4 offre une sensibilité de 70% (3 malades sur 10 n'avaient pas l'allèle e4 mais plutôt e2 ou e3) et une specificité de 70% (3 personnes saines sur 10 avaient l'allèle e4).Par contre le gène APP est present chez tous les malades (" Nature " du 21 Fevrier 1991,vol 349,n 6311 p 704-706 - Dr M-C Chartier-Harlin depart.Biochimie - St Mary's Hospital Medical School - London) PROTOCOLE: 1 - selection de dix patients porteurs de la maladie d'Alzheimer sur des bases cliniques sûres et de dix sujets du même âge sains 2 - phenotypage du gene apoE et du gène APP en etudiant leurs allèles sur le chromosome 21 3 - dosages biologiques classiques de l'apoE4 et de la proteine APP 4 Dosage par la presente methode en utilisant les mêmes serums que ceux utilisés par le laboratoire classique,des mêmes patients et au même instant.Les anticorps utilisés ont été fournis par Sigma 'bc& 2811765 Neurosciences Research (filiale Sigma-lsrael à Kiryat Weizmann).Le dispositif retenu mesure 26X10 mm.Etant données les quantités infinitesimales (10 puiss-19 moles/ml),le volume serique a été augmenté à 10 pi pour rehausser encore la sensibilité et le système d'amplification du signal utilise la chaîne avidine- peroxydase-biotine-avidineperoxydase-biotine-etc decrite plus haut.Une croix dans le tableau suivant est une coloration visible bleue rapide. Mode operatoire: o0 On depose une goutte de serum dans chacun des quatre systèmes installés sur la même carte puis on depose le contenu de la première solution (anticorps anti-proteine APP) dans le premier système, le contenu de la deuxième solution (anticorps anti apoE2) dans le second système,le contenu de la troisème solution (anti apoE3) dans le troisième système,le contenu de la quatrième solution (anti-apoE4) dans le quatrième système.On retourne la carte après quelques secondes Resultats obtenus I Tube: 11 12 13 14 15 16 17 18 9 10 Temoins sains Allèle4 + - + e2 Allèle3 + - e3 Allèle3 + - + + - + + + E4 Gene 0 + + + + + + APP _ ____ _ __ Dosage classique de la proteine ApoE2 4 - - - + - ApoE3 3 - + -.. ApoE4 3 + - + - + + APP 0 + + + + - - + + + Dosage par la presente methode ApoE2 4 - + - + - - ApoE3 3 + - - - - - - ApoE4 3 + - + - + + + + + APP O + + + + + + + + + Le dosage classique des proteines (Elisa) n'a pas detecté du tout le cas numero 5 (ni proteine apoE4 ni APP,pas l'APP dans les cas numero 6 et 8, pas I'apoE4 dans les cas 7 et 9 (probablement stades biologiques faibles ou precoces) Le present sytème a retrouvé l'apoE4 chez les 7 malades porteurs de l'allèle e4,1'APP chez tous les malades TABLEAU RECAPITULATIF COMPARATIF sur dix malades confirmés cliniquement SENSIBILITE SPECIFICITE PHENOTYPAGE e4 70% 70% Biol.classique apoE4 5 sur 7 porteurs e4 3 sains negatifs/3 SYSTEME PRESENT 7 sur 7 3/3 PHENOTYPAGE APP 100% 100% Bil.classique APP 70% 100 % SYSTEME PRESENT 100% 100% Conclusion: Une detection fine,fiable à 100% en sensibilité et specificité est possible dans la maladie d'Alzheimer avec le present système à partir d'une gouttelette de serum et probablement de sang total, plasma,salive,LCR ou tout fluide biologique ainsi qu'à partir d'une biopsie même microscopique du derme ou d'un organe en peroperatoire. La detection repose avec certitude sur la presence concomittante d'APP et d'apoE4.La presence d'APP seule demande une confirmation par phenotypage e4:si le gène est present,la certitude du diagnostic est acquise. L'absence totale d'APP ET d'apoE4 permet d'exclure,du moins provisoirement,une maladie d'Alzheimer et d'orienter les recherches vers d'autres causes (vasculaires, metaboliques,etc.En resumé: Detection APP apoE2 apoE3 apoE4 = + - - + Mal.Alzheimer + + - - Mal.Alzh.atypique + - + - Id + Sujet à risque + ou + - Negatlfsûr GENOMIQUE ET CANCEROLOGIE PROTEINE p53 Le gène p53 joue un rôle fondamental regulateur comme suppresseur de 1o tumeur et oriente la cellule vers la reparation ou la mort programmée (apoptose).Dans 50% des cancers,il est muté (sein,colon, poumon notemment) et la cellule ne reconnaît pas ses lesions,il n'y a ni reparation ni apoptose,le genome devient de plus en plus instable rendant la cellule cancéreuses puis metastatique.A un stade avancé le s5 gène muté p53 entraîne l'accumulation de son produit des anticorps anti p53 sont facilement detectables dans le serum. La presente invention se propose d'apporter son extrême sensibilité à la detection ultra precoce de proteine p53 mutante circulante afin de mettre en place des traitements rapides. D'autres genes jouent un rôle: MSH2, MLH1 ou encore le gene bax qui n'induit plus l'apoptose qand il est muté. LE GENE BRCA1 DANS LE CANCER DU SEIN Les mutations de ce gène sont responsables de la moitié des cancers hereditaires du cancer du sein et confèrent un risque accru des cancers de l'ovaire et de la prostate.La specificité de l'atteinte de ces organes est dûe à la presence d'oestrogenes (responsables de division cellulaire) et de leurs recepteurs.Le gène BRCA1 normal,inhibe l'activité du recepteur alpha pour les oestrogènes et inhibe donc la proliferation cellulaire en cas de stimulation oestrogenique.La mutation de BRCA1 le rend inoperant sur les recepteurs des tissus sensibles aux oestrogenes et la cellule prolifère. Le procédé objet de la presente invention,peut combiner la detection de p53 et de BRCA1 mutés circulant à des doses infinitesimales. LA BETA-CATENINNE Des chercheurs israeliens (Pro.Natl Acad Sci, 11 Mai 1999, p 5222) ont decouvert un mecanisme moleculaire intervenant dans le developpement de cancer colorectal: un regulateur des facteurs de transcription (la beta- catenine) en s'accumulant dans la cellule,active trop la transcription de la cycline D1 agent de proliferation cellulaire.La beta-catenine est connue pour son rôle structurel dans les jonctions intercellulaires en liant le squelette d'actine aux cadherines des recepteurs transmembranaires d'adhesion inter-cellulaire.Mais elle peut aller dans le noyau former des complexes avec les facteurs de transcription de la famille LEF-1 (Lymphoïd Enhancing Factor) pour y reguler l'expression de genes specifiques.La beta-catenine est ensuite degradée par un complexe formé de la molecule Tumor-suppressor APC (Adenomatous polyposis coli),de l'axine et du GSK-3 Beta (glycogène synthase kinase) 0o Soit par mutation du gène de la betacathenine (la nouvelle betacathenine n'est plus reconnue par le complexe qui la degrade en temps normal) soit par mutation du gène de ce complexe (surtout l'APC),une accumulation de beta- cathenine se produit dans la cellule (ceci a été constaté egelement dans le melanome malin) La cycline D1,regulateur majeur de la phase proliferative du cycle cellulaire,est anormalement elevée dans 30% des cas de cancer du colon mais son gène,paradoxalement est tout à fait normal,n'est pas muté alors qu'en règle generale,tous les oncogènes sont mutés.Son gène est en fait regulé par un promoteur contenant un site de fixation LEF-1.On a vu plus haut que la betacathenine se liait dans le noyau à un site LEF-1.L'accumulation de beta cathenine (pour cause de mutation ou par mutation des complexes qui la degradent en temps normal) provoque une stimulation permanente du site LEF-1 et donc la promotion continue du gène de la cycline D1 avec proliferation cellulaire.L'equipe israelienne a montré que la mutation " coupable " n'a pas besoin d'apparaître dans la proteine responsable mais dans d'autres molecules qui l'affectent indirectement. L'interêt est immense sur le plan therapeutique: il consiste à cibler les deux mecanismes: 1 - Restaurer la degradation de la betacathenine: si la mutation genique se fait sur le gène APC,l'introduction de gène APC normal,degradant la betacathenine,inhibe l'activation de la cycline D1. 2 - Amplifier le piegeage naturel de la betacathenine par des cadherines cytoplasmiques pour la detourner et l'empêcher d'aller stimuler les promoteurs nucleaires LEF-1 de la cycline D1 Mais l'interêt diagnostique est aussi important: la betacathenine et la cycline D1 ne circulent pas à l'exterieur de cellules normales.Les quantités sont à lechelle moleculaire et sont vite degradées par le complexe decrit plus haut (APC, etc).Lorsque la cellule subit la mutation du gène de la betacathenine ou des complexes de degradation,il y a accumulation intracellulaire mais certainement extracellulaire de 32À $2811765 betacathenine et cycline D1,neanmoins indetectables par des methodes classiques ou complexes,très coûteuses et très longues. La presente invention propose donc son extrême sensibilité et sa simplicité,pour la detection precoce du cancer du colon par un système unique utilisant les anticorps anti beta cathenine et anti cycline D1. Le système comprendra bien entendu une amplification importante du signal.1I sera particulièrement utile pour un depistage de masse en remplacement des recherches de sang dans les selles,peu fiables. 0o La presence d'au moins un des deux doit declencher des explorations poussées (recherche du gene muté pour confirmation et surtout pour introduire une therapie genique avec des gènes reparés,fibro- coloscopie,recherche de sang dans les selles,enquête genetique familiale, etc) COUPLAGE PUCES ADN ET DETECTION DE PROTEINES La decouverte de produits directs de translation ou mutation genique (p53 mutée par exemple) ou de produits indirects (la cycline D1 ou la betacathenine si les gènes APC sont mutés) ne permettra d'affirmer la presence d'un cancer du colon que si la confirmation est donnée par la decouverte de gènes mutés. L'idée consiste donc à proposer un appareillage (Planche 5 Figure 1) qui associerait les deux techniques dans le même dispositif: le système objet de la presente invention sera inséré (1) dans l'appareillage à côté de la puce ADN (2).Une goutte d'echantillon sera deposée sur la puce ADN et une goutte sur le dispositif present.La reponse negative (absence de proteines anormales) evite d'utiliser en vain une puce ADN dont la lecture des resultats est fastidieuse.Un reponse positive exigera alors la confirmation par la puce d'ADN Mais inversement,la decouverte d'une nouvelle mutation inconnue d'ADN à l'aide d'une puce ADN,entrainera la recherche de la proteine mutée à l'aide du present dispositif,en faisant un screening parmi toutes les molecules suspectées.La decouverte de cette proteine entrainera alors la production de la therapie adequate mais surtout la surveillance de l'évolution de la maladie,la detection de rechutes,etc 355 2811765 LA PHARMACOGENOMIQUE Est la suite logique de ce qui precède: une fois etablie la cause exacte de l'affection de la cellule,des traitements vont cibler cette cause mais ils peuvent aussi provoquer des effets secondaires ou être inefficaces. Le present procédé apportera sa contribution en detectant la production, par ces traitements, de proteines anormales et dangereuses en signalant ainsi qu'une alteration genique s'est produite par les dits traitements.La puce ADN viendra apporter la confirmation. îo Inversement la decouverte systematique d'anomalies ADN par la puce, entrainera la recherche des proteines anormales qui en resulteraient. Associé aux puces ADN et au decollage de la proteomique- genomique,l'apport de la presente invention est immense en termes de: rapidité d'execution: quasi-instantanée -precocité de la detection: dès les premières molecules -survie des patients dans de meilleures conditions qu'actuellement -suivi therapeutique: ajustement precis des choix therapeutiques: bloquer des gènes,detourner une proteine nocive de son parcours malin,la pieger,la detruire,introduire des gènes " reparés ", .. la medecine moderne sait deja faire tout ça mais manque des moyens simples et sensibles pour être guidée. -detection d'effets secondaires des traitements sur le genome. -Et enfin participer à la mise en place d'une banque de données mondiale visant à mettre en face de chaque gène,la proteine correspondante,les diverses mutations possibles,les proteines anormales ainsi produites et les moyens pour y remedier. 3 6 2811765 REVENDICATIONS 1 - Procédé pour la détection dans un échantillon fluide ou solide,d'une substance analyte par réaction avec un ligand spécifique pour former un complexe détectable,le ligand étant porteur de groupements réactifs R1 et R3 sans pouvoir enzymatique ni traceur,destinés à réagir avec les groupements R2 et R4 fixés ailleurs sur un filtre intercalé entre deux i0 éléments solides,avant d'aller éventuellement réagir avec une zone-signal en aval du filtre et caractérisé en ce que l'on dépose un faible volume d'échantillon sur un dispositif dans un premier temps avant de le faire migrer dans un deuxième temps,dans le filtre à l'aide de la solution de ligand porteur de R1 et R3,vers les réactifs R2 et R4 fixés sur le filtre à lI'intérieur du dispositif;le réactif R1 est situé sur le site épitopique antigénique réactif du ligand de telle sorte qu'il est occulté physiquement et chimiquement si la substance analyte recherchée dans l'échantillon,s'est liée au ligand;le réactif R1 ne peut peut être piégé sur le filtre par R2 et l'ensemble R3+Analyte +R1 +ligand migre plus loin vers la zone-signal de révélation de la présence de l'analyte en réagissant avec R4 en bout de filtre juste avant la zone signal;en l'absence d'analyte dans l'échantillon,le réactif R1 fixé sur le ligand n'est pas occulté et est piégé dans le filtre par le groupement réactif R2,empêchant ainsi le réactif R3 fixé ailleurs sur le ligand,d'aller réagir avec R4. 2 - Procédé selon la revendication 1,caractérisé en ce que le signal fourni en bout de filtre provient d'un composé X1 né de la réaction du groupement réactif R3 fixé sur le ligand,avec le réactif R4 déposé sur le filtre en amont de la zone signal et produit à raison de 1000 molecules de X1 par seconde;ce composé X1 est quantifié par un lecteur ou réagit avec un substrat,excluant ainsi tous les autres réactifs (de R1 à R4) du processus interne du signal émis;l'ensemble de la réaction depuis la dépose de l'échantillon jusqu'à l'apparition du signal,ne dure que quelques secondes. 3 - Procédé selon la revendication 2,caractérisé en ce que la nature du composé X1 est fonction d'une part de la nature du réactif R3 et R4 qui le produisent,mais aussi fonction du signal avec lequel il va réagir: si Xl est un ion H+ il va oxyder un substrat incolore,si c'est un électron il va exciter une electrode,si c'est un traceur chimioluminescent,il va exciter un lecteur UV. 4 - Procédé selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce que la zone signal est en fait l'extrémité du filtre sur lequel une solution de substrat a été déposée pour réagir avec le composé XI dans le cas de réaction colorimétrique,ou sur lequel est en contact un lecteur quelconque susceptible de mesurer l'intensité du composé Xl qui est arrivé sur cette zone signal. - Procédé selon les revendications 2 à 4 caractérisé en ce que ce premier composé Xl peut réagir avec une substance supplémentaire R5 placée plus en aval que R4,pour produire un second composé X2 à raison de 1000 molecules par seconde à partir d'une molecule X1 elle même produite à raison de 1000 molecules par seconde à partir de la liaison R3-R4 initiale;ce qui fait que le signal émis par l'action de X2 sur la zone signal est 1 million de fois superieur à celui qu'aurait emis le is complexe initial R3-R4. 6 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il permet des dosages semi-quantitatifs si l'analyte est mis en contact au cours d'une première etape,avec une certaine quantité de ligands non traités par R1 ni R3,dans le but de neutraliser une certaine quantité seulement d'analyte;!'ensemble est ensuite déposé au cours d'une seconde étape sur le filtre avant de déposer au cours d'une troisième etape,la solution de ligands normalement préparés comme décrit plus haut;si le taux d'analyte est normalles complexes analyte+premiers ligands (non préparés) migrent dans le filtre sans être piégés par R2 mais ne donnant aucun signal du fait qu'ils ne possèdent pas le réactif R3.Les seconds ligands préparés normalement,ne trouvent plus d'analyte libre et sont piégés dans le filtre par R2;il n'y a donc aucun signal;si la taux d'analyte dépasse la normale,l'excès se complexe aux seconds ligands qui eux,dûment prepares échappent à R2 pour faire réagir R3 avec R4 et fournir un signal d'excès de l'analyte. 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que l'analyte est un antigène déterminé,le ligand un anticorps spécifique de cet antigène. 8 - Procédé selon les revendications 1 à 6 caractérisé en ce que l'analyte est un anticorps déterminé et que le ligand est un antigène spécifique de cet anticorps. 9 - Procédé selon les revendications 1 à 8 caractérisé en ce qu'un grand nombre de ligands différents mais préparés de façon identique par R1 et R3,peuvent être associés dans la même solution qui est déposée à la suite de l'échantillon dans lequel on recherche au moins un parmi les dizaines d'analytes correspondants aux dizaines de ligands associés;si 1o au moins un des analytes est présent dans l'échantillon,un signal est fourni;le signal est aussi proportionnel au nombre d'analytes différents détectés. - Procédé selon les revendications 5 à 8 caractérisé en ce que l'amplification importante du signal obtenu permet une sensibilité de detection à l'echelle moleculaire de tous les analytes. 11 - Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que cette extrême sensibilité lui permet de s'associer à la technologie dite des " puces à ADN " basées sur l'hybridation de séquences d'ADN pour détecter des gènes normaux ou mutés dans uné. 12 - Procédé selon les revendications 10 et 11 caractérisé en ce qu'il permet de diagnostiquer des affections malignes dûes à une translation ou mutation génique telles les cancers,la Maladie d'Alzheimer,ou des affections à très bas taux d'antigènes comme la betacathenine dans le cancer du colon,ou comme la Troponine TnTc au tout début d'un infarctus 13 - Dispositif pour la détection d'un analyte contenu dans un fluide ou un solide,susceptible d'être entraîné dans un fluide par reaction avec un ligand préparé à l'avance;l'ensemble ligand+analyte forme un complexe qui migre d'amont en aval dans un filtre poreux sur la longueur duquel ont été fixés ou déposés successivement des réactifs capables de piéger ou de laisser migrer un ligand selon qu'il est compléxé ou non à son analyte; l'extrémité de ce filtre constitue la zone-signal qui indique l'arrivée ou non du complexe ligand+analyte;le filtre est enserré entre deux elements plus rigides: - I'element superieur est perforé d'un trou au niveau de l'amont du filtre,permettant de deposer l'échantillon sur le filtre avant d'y deposer au même endroit la solution de ligands prepares; un 39 2811765 entonnoir est avantageusement associé au dessus de ce trou pour guider la depose des solutions de ligand prepare. - I'element median est un materiau rigide perforé d'un rectangle de la taille du filtre et destiné à eviter le gondolement des bords des éleménts supérieurs et inférieurs quand ils enserrent le filtre. - l'élément inférieur est du même materiau rigide mais perforé d'un trou ou une fenêtre carrée au niveau de l'extrémité en aval du filtre,là o est visible ou mesurable le signal provenant des réactions produites en amont dans le filtre. io Les éléments superieur,median et le filtre peuvent être amovibles après usage afin d'evacuer des fluides contaminants,ne laissant que l'element inferieur avec son spot de resultat. Ce dispositif est accompagné d'une pipette de prélèvement de l'échantillon et emballé,etiquetté,sous vide dans un sachet opaque,étanche avec une plaque de dessicant. 14 - Dispositif selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il est identique quel que soit l'analyte recherché mais il est accompagné pour chaque dosage,d'une solution de ligand spécifique de l'analyte recherché. - Dispositif selon les revendications 13 à 14 caractérisé en ce qu'il peut enserrer plusieurs filtres identiques juxtaposés, permettant soit de pratiquer tous les jours le même test soit de pratiquer simultanément des tests différents. 16 - Dispositif selon les revendications 13 à 15 caractérisé en ce qu'il s'associe à un appareillage d'identification par code-bar,de lecture et de quantification du résultat par rayon laser,et de télétransmission via une puce electronique,ainsi qu'à l'appareillage des puces à ADN pour détecter les protéines anormales de l'échantillon dans lequel la puce ADN a detecté la sequence genique anormale correspondante.