FR 2817117 A1 20020531 FR 0015240 A 20001124 La présente invention est relative à des mammifères non-humains transgéniques ou recombinants, dans lesquels l'expression du gène codant pour une protéine associée aux microtubules (MAP) est modifiée (inactivation ou surexpres- sion) et à leurs applications dans le criblage de médicaments utiles dans l'anxiété, la schizophrénie, les désordres schizoaffectifs, la paranoïa ou la dépression. Les microtubules des cellules de mammifères sont soumis à une régulation: lors de l'interphase, ils organisent l'espace intracellulaire et sont respon- sables du transport intracellulaire d'organelles; lors de la mitose, ils se réorganisent pour former le fuseau mitotique, responsable de la répartition des chromosomes entre les deux cellules filles. Les microtubules, assemblés in vitro à partir de solutions de tubuline purifiée, sont labiles et rapidement dépolymérisés par l'exposition au froid. Des comportements semblables sont observés in vivo, mais sont, dans ce cas, régulés par le métabolisme cellulaire. Par exemple, la dépolymérisation des microtubules est favorisée par la phosphoprotéine stathmine, qui lie et séquestre les dimères de tubuline, alors que la stabilisation des microtubules est médiée par les protéines associées aux microtubules (MAPs), qui s'associent aux polymères. Les neurones contiennent des quantités massives de microtubules et ceuxci sont en quasi-totalité stables au froid. A partir de préparations de microtubules stables neuronaux, une protéine calmoduline-régulée capable de stabiliser totalement les microtubules (c'est-à-dire apte à supprimer leur activité dynamique et à les rendre résistants au froid) a été isolée; il s'agit de la protéine STOP (pour Stable Tubulin Only Polypeptide). La nature moléculaire de cette protéine est longtemps restée énigmatique. Un pas décisif a été franchi en 1996 lorsque l'ADNc codant pour cette protéine STOP a été cloné (Christophe Bosc et al., P.N.A.S., 1996, 93, 2125-2130). La protéine STOP, qui peut bloquer de manière réversible la dyna- mique des microtubules en abolissant complètement la sensibilité des microtubules neuronaux au froid et aux drogues dépolymérisantes, comporte deux domaines répétés remarquables: un domaine central composé de cinq répétitions quasi-parfaites d'un motif de 46 acides aminés et un domaine carboxyterminal formé de vingt huit répéti- tions imparfaites d'un motif de 11 acides aminés. Ces deux domaines répétés sont séparés par une séquence contenant en abondance des résidus lysine et arginine (domaine KR) et par une séquence de liaison ou séquence linker. Le domaine N-termrninal de la protéine STOP contient des séquences riches en proline qui consti- tuent des sites de liaison potentiels avec des domaines SH3 (src homology domain 3). La structure en exons du gène STOP de souris a été élucidée (Eric Denarier et al., B.B.R.C., 1998, 243, 791-796). Cette structure correspond à la struc- ture en domaines de la protéine: l'exon 1 code pour le domaine N-terminal y compris le domaine répété central, l'exon 2 code pour la séquence linker, l'exon 3 code pour le domaine KR et l'exon 4 code pour la région répétée carboxy-terminale. La distribution et le rôle de la protéine STOP dans les neurones ont été récemment caractérisés (Laurent Guillaud et al., Cell Biol., 1998, 142, 1, 167-179). La distribution de la protéine a été étudiée au niveau ultrastructural dans des cellules neuronales embryonnaires, les cellules DRG (Dorsal Root Ganglia),qui peuvent se différencier in vitro et a révélé l'existence d'isoformes de cette protéine. Une isoforme majeure (protéine E-STOP) a été caractérisée: cette isoforme apparaît plus tôt dans le développement que la protéine STOP standard ou protéine N-STOP et est majoritaire dans le cerveau embryonnaire. La protéine E-STOP diffère de la protéine N-STOP par la délétion des séquences carboxy-terminales répétées, codées par l'exon 4; il s'agit donc d'un variant d'épissage de la protéine STOP. Une autre isoforme, la protéine F- STOP a été observée dans des fibroblastes de souris (cellules 3T3). Cette protéine, de masse moléculaire apparente de 45 kDa, est beaucoup plus petite que la protéine N-STOP (115 kDa) ou que la protéine E-STOP (88 kDa) . Le clonage et le séquençage de l'ADNc correspondant (Eric Denarier et al., P.N.A.S., 1998, 95, 6055-6060) ont montré que les séquences codées par les exons 3 et 4 (KR et répétitions carboxy- terminales) sont absentes dans la protéine F-STOP. De plus, la majeure partie du domaine N-terminal de la protéine N-STOP, située en amont des répétitions centrales et codée par l'exon 1, est absente dans la protéine F-STOP. La protéine F-STOP comprend donc les séquences codées par l'exon 2 et une partie de celles correspondant à l'exon 1, incluant les répétitions centrales. Malgré de multiples délétions, la protéine F-STOP a les mêmes propriétés fonctionnelles de base que la protéine N-STOP: la protéine F-STOP se lie à la calmoduline et a la capacité d'induire une stabilisation au froid des microtubules, in vitro et in vivo. Contrairement à la protéine N-STOP qui semble presque en permanence associée aux microtubules, la protéine F-STOP reste dans la phase soluble dans les cellules en interphase et ne s'associe aux microtubules que lors de l'exposition au froid. Apparemment, des mécanismes de régulation empêchent la protéine F-STOP d'interagir avec le cytosquelette microtubulaire en interphase, permettant ainsi une dynamique microtubulaire rapide, et ces régulations sont inhibées dès que les cellules sont exposées à des températures basses. Dans les cellules mitotiques, la protéine F-STOP est associée aux fuseaux de microtubules, à température physiologique. Ainsi, une seule et même classe de protéines, les protéines STOP, est responsable de la stabilisation des microtubules dans plusieurs types cellulaires différents. Les formes N, E et F de la protéine STOP ne sont pas les seules iso- formes existantes; en effet, les protéines STOPs sont présentes dans de nombreux tissus, en particulier dans les poumons qui contiennent une isoforme spécifique. De même, la forme F-STOP paraît présente dans des tissus variés. Par contre, les protéines N-STOP et E-STOP sont, semble-til, strictement neuronales (C. Bosc et al., Cell Struct. Function, 1999, 24, 393-399). Les Inventeurs ont trouvé, de manière inattendue, que l'invalidation des différentes isoformes de la protéine STOP permet d'obtenir des animaux et notamment des souris particulièrement utiles pour le criblage des médicaments psychoactifs. La présente invention a en conséquence pour objet un mammifèere nonhumain recombinant, porteur d'au moins un allèle modifié du gène codant une protéine STOP. On entend par gène STOP modifié, aussi bien un gène altéré (animaux knockin), qu'un gène inactivé totalement ou partiellement, inhibé ou tronqué (animaux knock-out). De manière avantageuse, lesdits animaux recombinants ou trans- géniques sont susceptibles d'être obtenus par recombinaison homologue dans une cellule souche embryonnaire: - soit par insertion d'au moins un codon STOP ou d'une séquence anti-sens, - soit par délétion d'une partie ou de tout le gène natif (région codante ou régions non codantes, promoteur, séquences régulatrices en 3', activa- teurs), - soit par substitution de séquence. De manière plus précise, une construction conforme à l'invention est avantageusement sélectionnée dans le groupe constitué par: - des constructions contenant une séquence codant pour une protéine STOP antisens, qui va bloquer l'expression de la séquence STOP native, - des constructions comprenant la région du promoteur STOP (posi- tions 1-3400 de la figure 2) en combinaison avec un gène reporter ou avec la région codante STOP. Des marqueurs de sélection positive ou négative peuvent avantageu- sement être inclus, tel que lacZ, dont la régulation de l'expression entraînera la détec- tion d'un changement du phénotype. Un gène reporter préféré est le gène de la GFP (green fluorescent protein). - des constructions comprenant au moins une portion du gène STOP (région codante ou régions non codantes, promoteur, séquences régulatrices en 3', activateurs) incluant la/les modifications souhaitées (délétions, mutations etc..); de manière avantageuse, les constructions d'ADN utilisées pour une intégration ciblée doivent inclure une région présentant une homologie avec la séquence cible (gène STOP), pour induire une recombinaison. - des constructions comprenant au moins une portion du gène STOP, liée de manière opérationnelle à un promoteur, qui peut être constitutif ou inductible et à d'autres séquences régulatrices nécessaires pour l'expression dans l'animal hôte. Par lier de manière opérationnelle, on entend qu'une séquence d'ADN et une séquence régulatrice sont associées de telle manière qu'elles permettent l'expression du gène lorsque les molécules appropriées, par exemple les protéines activatrices transcrip- tionnelles, sont liées aux séquences régulatrices. On entend par gène STOP, au sens de la présente invention, les gènes STOP obtenus à partir de n'importe quel mammifère tel que rat, souris, boeuf ou homme, ou du poulet ou du poisson fugu ainsi que les différentes formes mutées dudit gène STOP; il inclut également les différents cadres ouverts de lecture, les exons, les introns, les régions non-codantes en 3' et en 5' impliquées dans la régulation de l'expression de ce gène, jusqu'à environ 4 kb de part et d'autre de la région codante, le promoteur et les activateurs. De manière préférée, les constructions sont sélectionnées parmi les constructions suivantes: - des constructions qui incluent un fragment de la séquence génomique codant pour une protéine STOP comprise entre le codon d'initiation et le codon STOP (C. Bosc et al., E. Denarier et al., L. Guillaud et al. précités), incluant notamment tous les introns normalement présents dans le chromosome natif Elle peut inclure les régions non traduites en 3' et en 5' retrouvées dans l'ARNm mature. Elle peut, en outre, inclure des séquences de régulation de la transcription ou de la traduc- tion (promoteur, activateur...), incluant environ 4 kb, des régions génomiques flanquantes en 3' ou en 5'. - des constructions ne comprenant pas la région comprise entre les positions 4118 et 5131 de la séquence génomique codant pour une protéine STOP - des constructions comprenant 4,1 kb du gène STOP (correspondant aux positions 1-4118 de la figure 2), le gène codant pour la [3galactosidase, placé sous le contrôle du promoteur STOP endogène, un gène de résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur PGK, 1,57 kb de séquence du gène STOP (correspondant aux positions 5131-6701 de la séquence de la figure 2) et enfin le gène de la thymidine kinase, sous le contrôle du promoteur PGK. Conformément à l'invention, les animaux transgéniques obtenus constituent deux groupes, les animaux knock-out et les animaux knock-in. Dans le cadre de la présente invention: - les animaux knock-out ont une perte de fonction partielle ou complète dans un ou les deux allèles du gène codant pour une protéine STOP endo- gène; un tel gène modifié n'induit plus d'expression de la protéine STOP corres- pondante. Les animaux knock-out selon l'invention incluent également des animaux knock-out conditionnels: (i) modification du gène codant pour une protéine STOP qui n'intervient qu'après exposition de l'animal à une substance qui induit la modification dudit gène, (ii) introduction d'une enzyme qui induit la recombinaison au niveau d'un site du gène codant pour une protéine STOP (Cre dans le système Cre-lox, par exemple) ou (iii) autre méthode qui induit une modification du gène codant pour une protéine STOP après la naissance. - les animaux knock-in présentent un transgène qui altère le gène endogène codant pour une protéine STOP. Un animal knock-in correspond à une alté- ration dans les cellules de l'hôte qui entraîne une expression modifiée ou une fonction modifiée du gène STOP natif Une expression augmentée ou diminuée peut être ainsi obtenue par introduction d'une copie additionnelle du gène STOP ou par insertion opérationnelle d'une séquence de régulation qui produit une expression significative- ment augmentée d'une copie endogène du gène STOP. Ces changements peuvent être soit constitutifs, soit conditionnels, en fonction de la présence d'un activateur ou d'un répresseur. Le gène exogène est soit obtenu à partir d'une espèce différente de celle de l'animal hôte ou est modifié au niveau de sa séquence codante ou non codante. Le gène introduit peut être un gène du type sauvage ou une séquence manipulée, par exemple présentant des délétions, des substitutions ou des insertions dans les régions codantes ou non codantes. Les deux méthodes peuvent être combinées: dans un premier temps le gène d'origine est invalidé, puis dans un deuxième temps, une forme modifiée dudit gène est introduite dans ledit animal. Les animaux recombinants ou transgéniques ainsi obtenus compren- nent une séquence d'acide nucléique exogène, présente, soit sous la forme d'un élé- ment extra-chromosomique, soit intégrée de manière stable dans tout ou une partie des cellules dudit animal, plus particulièrement les cellules germinales. De manière surprenante, les souris homozygotes viables obtenues par croisement d'animaux hétérozygotes, présentent des troubles majeurs du compor- tement comprenant un défaut complet de maternage, une profonde anxiété, une inca- pacité à reconnaître les objets et des interactions sociales anormales. Les mâles homozygotes sont incapables de se reproduire, alors que les femelles sont, quant à elles, fertiles; toutefois, aucun nouveau-né issu de femelles homozyotes (-/-) n'a survécu. En effet, les femelles homozygotes se révèlent inca- pables de maternage: elles ne construisent pas de nid, ne s'occupent pas des nouveaux-nés et ne les allaitent pas. La présente invention a également pour objet l'utilisation dudit mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant pour une protéine STOP modifié, pour la sélection ou le criblage de produits psy- choactifs. La présente invention a également pour objet des séquences nucléiques issues du gène STOP, modifiées telles que définies ci-dessus (notamment les séquences inactivées) et leurs fragments (substitution, délétion ou insertion au niveau d'un domaine ou d'un exon). Les séquences STOP selon l'invention sont notamment obtenues par mutation, de différentes manières connues en elles-mêmes, pour générer les modifica- tions ciblées recherchées: substitutions, insertions ou délétions, qui conduisent à l'expression d'une protéine STOP inactivée ou à l'absence d'expression de protéine STOP. Les délétions peuvent inclure des modifications importantes: délétion d'un domaine ou d'un exon (exon 1 notamment). Les fragments desdites séquences sont avantageusement obtenus par synthèse chimique d'oligonucléotides, par digestion enzymatique ou par amplification PCR par exemple. Lesdits fragments comprennent au moins 15 nucléotides, de préfé- rence environ 18 nucléotides et de manière préférée au moins 50 nucléotides. De tels fragments sont utiles comme amorces de PCR ou pour le criblage par hybridation, des clones ES recombinants ou des animaux recombinants. Lesdites amorces ou sondes de criblage de clones ES recombinants ou d'animaux recombinants sont caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par des fragments d'un gène STOP comprenant au moins 15 nucléotides, de préférence environ 18 nucléotides et de manière préférée au moins 50 nucléotides. De telles amorces ou sondes permettent de cribler des cellules ou des animaux comprenant l'une des séquences modifiées, telles que définies cidessus. De manière préférée, les amorces suivantes sont utilisées pour le criblage: 30. oligonucléotide A4080: positions 4067-4095 de la figure 2 (SEQ ID NO:3); oligonucléotide 770: positions 4488-4515 de la figure 2(SEQ ID NO:4); oligonucléotide AS2: positions 6680-6701 de la figure 2 (SEQ ID NO:5). Des fragments plus importants (plus de 100 nucléotides) sont utiles pour la production des protéines STOP. Les séquences homologues aux séquences STOP clonées sont identi- fiées par différentes méthodes connues de l'Homme du métier. La similarité des séquences d'acides nucléiques est détectée par hybridation dans des conditions de faible stringence, par exemple à 50 C et 10 x SSC (0,9 M de tampon salin et 0,09 M de citrate de sodium). Lesdites séquences restent associées lorsqu'elles sont soumises à un lavage à 55 C dans un tampon 1 x SSC. L'identité des séquences peut être déterminée par hybridation dans des conditions stringentes, par exemple à 50 C au plus et 0,1 x SSC (9 mM de tampon salin/0,9 mM de citrate de sodium). La présente invention a également pour objet des sondes de détec- tion et de criblage de l'ADN génomique par hybridation des clones ES recombinants ou des animaux recombinants, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par un fragment du même gène STOP, situé en dehors (amont ou aval) de la séquence du gène STOP issue du vecteur de recombinaison mis en ceuvre (zone de recombinaison homologue). De manière avantageuse, ladite sonde correspond aux positions 700- 1881 de la figure 3 (SEQ ID NO:6). La présente invention a également pour objet un procédé de criblage et de sélection de molécules utiles dans l'anxiété, la schizophrénie, les désordres schizoaffectifs, la paranoïa ou la dépression, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend: - l'extraction de cellules ou de tranches d'organes, de préférence neuronales ou cérébrales, à partir d'au moins un mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle modifié du gène codant pour une protéine STOP; - la mise. en contact in vitro dudit échantillon biologique avec au moins une substance à cribler; - la mesure de l'action de ladite substance à cribler sur lesdites cellules ou tranches d'organes et - la comparaison des valeurs obtenues avec celles des cellules ou des tranches d'organes d'un échantillon biologique obtenu à partir d'un mammifèere non- humain du même type, porteur de deux allèles sauvages du gène codant pour une protéine STOP. Les substances testées sont notamment obtenues à partir de banques de substances (naturelles ou synthétiques). Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ladite mesure est effectuée à l'aide d'un test de liaison protéine-protéine; dans un tel cas, une ou plusieurs des molécules mises en oeuvre peuvent être marquées par un marqueur; ledit marqueur peut fournir un signal détectable soit directement, soit indi- rectement. Parmi les marqueurs utilisables, on peut citer par exemple, les radioisotopes, les molécules fluorescentes, chemiluminescentes, les enzymes, les molécules de liaison spécifique, des particules telles que des particules magnétiques, etc... Des molécules de liaison spécifique incluent des paires de molécules telles que la biotine et la streptavidine, la digotoxine et l'antidigoxine, etc... Pour les membres de liaison spécifique, le membre complémentaire sera marqué avec une molécule adaptée à la détection conformément aux méthodes connues. Beaucoup d'autres réactifs peuvent être utilisés dans un tel test de criblage; il inclut par exemple des sels, des protéines neutres telles que l'albumine, des détergents, etc..., qui sont utilisés pour faciliter une liaison protéine-protéine opti- male et/ou réduire les interactions non-spécifiques ou de bruit de fond. Les réactifs qui améliorent l'efficacité de l'essai, tels que les inhibi- teurs de protéases, les inhibiteurs de nucléases, les agents antimicrobiens peuvent également être utilisés. Le mélange de composants est ajouté dans n'importe quel ordre, de manière à permettre la liaison recherchée. Les incubations sont réalisées à température convenable, usuelle- ment entre 4 et 40 C. Les périodes d'incubation peuvent varier; elles sont habituellement comprises entre 0,1 et 1 h et sont optimisées dans cette gamme de temps, notamment pour faciliter un criblage rapide. Les anticorps spécifiques des polymorphismes des protéines STOP peuvent être utilisés dans des immunoessais de criblage, plus particulièrement pour détecter la liaison de substrat ou de protéine STOP ou pour confirmer l'absence ou la présence d'une protéine STOP dans une cellule ou un échantillon, tel qu'un échantil- lon biologique. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ladite mesure est effectuée par détection de la variation d'intensité d'un signal électrique; en effet, on peut observer en ce qui concerne les cellules nerveuses des animaux recombinants selon l'invention, une altération de l'organisation de la synapse (positionnement et transport de neurorécepteurs) chez les animaux recombinants selon l'invention. La présente invention est également relative à un procédé de criblage et de sélection de molécules utiles dans l'anxiété, la schizophrénie, les désordres schizoaffectifs, la paranoïa ou la dépression, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend: - l'administration à au moins un mammifère non-humain recombi- nant porteur d'au moins un allèle modifié du gène codant une protéine STOP d'au moins une substance à cribler; et - l'étude comportementale dudit mammifère par rapport à une série d'animaux témoins et/ou la détermination de la localisation des médicaments après leur administration. De tels animaux peuvent avantageusement servir de modèles pour le criblage de molécules psychoactives, présentant une faible toxicité chez l'homme. La présente invention a également pour objet un vecteur de recom- binaison homologue d'un gène codant STOP, caractérisé en ce qu'il comprend une Il séquence nucléotidique issue d'un gène codant pour une protéine STOP inactivée, de préférence tronquée au niveau d'au moins l'un des exons, notamment l'exon 1. La présente invention a également pour objet une méthode de production de mammifères non-humains recombinants porteurs d'au moins un allèle du gène codant pour une protéine STOP inactivée, caractérisée en ce que: - l'on tronque un allèle du gène codant pour une protéine STOP; - l'on introduit ladite séquence modifiée dans un segment de l'ADN génomique d'un mammifèere non-humain du même type, associé à un marqueur approprié, de manière à obtenir une séquence marquée M, contenant ledit allèle modi- I0 fié; - l'on intègre ladite séquence M, in vitro, dans les cellules souches de lignées germinales d'embryons d'un mammifère non-humain par transfection et on sélectionne les cellules ayant ledit allèle par des évènements de recombinaison homologue; puis - l'on réinjecte lesdites cellules souches sélectionnées à un embryon réimplanté chez un mammifèere non-humain du même type afin d'obtenir des animaux chimériques; et - l'on obtient à la génération F1 des mammifèeres non-humains recombinés hétérozygotes et à la génération F2 des mammifères non-humains recom- binés homozygotes STOP -/-, reconnaissables à la présence du marqueur et des souris dites sauvages (+/+). La présente invention a également pour objet l'utilisation des substances sélectionnées à l'aide du procédé de criblage tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un médicament utile dans l'anxiété, la schizophrénie, les désordres schizoaffectifs, la paranoïa ou la dépression. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfèere à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, avec réfé- rence aux dessins annexés dans lesquels: - la figure 1 illustre l'organisation génomique du gène STOP au niveau de l'exon 1 et l'établissement de souris knock-out pour le gène STOP [souris STOP KO (-/)] par altération de l'exon 1. A: carte de restriction d'un fragment du gène STOP (allèle sauvage) utilisé pour la production d'un fragment génomique d'homologie, structure du vecteur de recombinaison homologue ou vecteur de ciblage ptSTOP, et structure prédite de l'allèle mutant. B: profils Southern blot du gène STOP chez des souris sauvages (+/+; 8 kb) et hétérozygotes (+/-; 5,3 kb), - la figure 2 représente la séquence du gène STOP au niveau de l'exon 1 (positions 3333-5150) (clone génomique de 7,2 kb); les fragments utilisés pour l'établissement des souris STOP KO (-/-), sont les suivants: séquence homo- logue en 5': 4,118 kb, positions 1-4118; séquence homologue en 3': 1,57 kb, posi- tions 5 13 1 à 6701. - la figure 3 illustre la séquence génomique du gène STOP, située en ' par rapport à la séquence de la figure 2; la sonde utilisée pour le criblage est un fragment EcoR V-EcoR I (positions 701-1881 sur la figure 3). - la figure 4 illustre les troubles du comportement maternel des souris STOP KO (-/-). A: la survie des nouveaux-nés, issus de mères primipares, portant l'allèle STOP sauvage (+/+) ou muté (-/-), est analysée au deuxième jour après la naissance. B et C: la manifestation d'un comportement maternel est analysée chez les jeunes femelles primipares et les jeunes mâles KO STOP -/-, par comparaison avec les souris sauvages STOP +/+, - la figure 5 illustre l'état d'anxiété des souris STOP KO (-/-) , évalué par le test de lumière et d'obscurité. A: le temps passé dans la boîte éclairée et B: le nombre de passages entre les deux boîtes sont respectivement enregistrés sur une durée de 5 minutes, à partir de la première entrée des animaux dans la boîte obscurcie. Les souris sauvages (+/+) sont utilisées comme témoins. Les valeurs correspondent à valeur moyenne + erreur standard à la moyenne (s.e.m). Les différences entre les souris KO et les souris témoins sont indiquées avec un risque p - la figure 6 illustre les troubles de la mémoire à court terme des souris STOP KO (-/-), évalués par le test de reconnaissance d'un objet. Les souris sauvages (+/+) sont utilisées comme témoins. Les résultats sont exprimés par l'indice de reconnaissance (RI): les valeurs de RI significativement supérieures à 50% correspondent à un test de reconnaissance positif. Les valeurs correspondent à la valeur moyenne + erreur standard à la moyenne (s.e.m). - la figure 7 illustre le comportement social des souris KO (--); les souris sauvages (+/+) sont utilisées comme témoins: figure 7a: évaluation du temps passé par un mâle à l'investigation sociale, vis-à-vis d'un intrus (n=l I pour les souris sauvages et n=13 pour les souris STOP -/-);figure 7b: agression inter-mâle; les tests d'agression sont réalisés pendant deux jours consécutifs (n=l 1 pour les souris sauvages et n=10 pour les souris STOP -/-); le nombre d'agressions et le temps passé à combattre (moyenne + erreur standard à la moyenne (s.e.m)) sont enregistrés le deuxième jour; *: p Exemple 1: Etablissement de souris "Knock out"(KO) dans lesquelles io le gène STOP est inactivé: souris STOP KO (--) 1- Matériels et méthodes 1-1 Construction du fragment génomique d'homologie et du vecteur de recombinaison homologue (vecteur de ciblage). Les fragments d'ADN génomique, utilisés pour construire le vecteur de recombinaison homologue sont issus d'une banque d'ADN génomique de souris de souche 129 clonée dans le phage Pl et criblée par hybridation avec un ADNc du gène STOP ou une sonde d'ADNc dudit gène. Le fragment génomique d'homologie du gène STOP est construit à partir du clone de 7,2 kb dont la séquence est présentée à la figure 2, selon les étapes suivantes: un fragment de 1012 pb, contenant les séquences répétées de la région codante du gène STOP qui s'étend des positions 4118 à 5131 de la séquence présentée à la figure 2, a été délété et remplacé par une cassette d'expression contenant le gène de résistance à la néomycine (néo) sous le contrôle du promoteur PGK et le gène de la P-galactosidase (lacZ) sous le contrôle transcriptionnel du promoteur STOP endo- gène. En outre, un site EcoRV a été introduit en 5' du gène lacZ. Le vecteur de recombinaison homologue (ptSTOP) est obtenu par clonage du fragment d'homologie du gène STOP précédemment décrit dans le vecteur pGKTK. Le vecteur pGK-TK dérive du vecteur pPNT construit par Tybulewicz et al. (Cell, 1991, 65, 1153-1163) par insertion du gène de la thymidine kinase du virus de l'Herpès simplex (HSV) sous le contrôle du promoteur de la phosphoglycérate kinase (PGK). 1-2 Recombinaison homologue dans les cellules ES et génotypage Le vecteur ptSTOP est linéarisé par l'enzyme Notl et électroporé dans des cellules ES (R1, Naguy et al.). Ensuite, les cellules ES électroporées sont ensemencées sur une couche de fibroblastes et sélectionnées en présence de généticine (G418) et de gancyclovir. Le génotype des clones résistant au G418 et au gancyclovir est vérifié par analyse en Southern blot de l'ADN génomique digéré par EcoRV et hybridé avec une sonde spécifique du gène STOP, située dans la région 5' flanquant la région de recombinaison homologue (voir figure 3) et correspondant aux positions 698-1875, après digestion EcoRV-EcoRI de la figure 3. La taille des fragments de restriction est de 8 kb pour l'allèle sauvage et de 5,3 kb pour l'allèle muté (Figure lB). 1-3 Microinjection des cellules ES et obtention de souris trans- géniques homozygotes pour l'allèle muté du gène STOP [souris STOP KO -/-)] . Les cellules ES portant l'allèle muté sont microinjectées dans des embryons de souris OF1 au stade morula, puis les embryons injectés sont réimplantés dans l'utérus de la mère porteuse pour donner naissance à des souris chimères. Le croisement de ces chimères avec des souris BalB/c ou 129/sv produit des descendants F 1 hétérozygotes, dans lesquels la transmission de la mutation du gène STOP est véri- fiée par analyse en Southern blot de l'ADN génomique provenant d'un échantillon de queue. Les descendants F1 sont croisés entre eux pour donner des descendants F2 homozygotes, dans lesquels l'absence d'expression d'isoformes de la protéine STOP est vérifiée par analyse en Western blot d'extraits de différents tissus. 2- Résultats Le profil génotypique du mutant homozygote STOP (-/-) montre la présence d'un fragment de 5,3 kb (figure lB) qui indique la délétion du fragment de 1012 pb contenant les séquences répétées de la région codante du gène STOP. On obtient un phénotype nul; les souris portant l'allèle muté à l'état homozygote n'expriment pas de protéine STOP, avec les anticorps testés (Bosc et al., 1999, précité; Guillaud et al., 1998, précité). L'analyse des différents croisements hétérozygotes montre que l'allèle STOP muté est transmis de manière mendélienne. Les souris homozygotes STOP(-/-) qui apparaissent en bonne santé présentent cependant des troubles du comportement. Exemple 2: Analyse des troubles du comportement des souris KO STOP -/- 1- Matériels et méthodes 1-1 Tests du comportement materne (maternage) Tests effectués chez les mères primipares ou multipares Le comportement maternel est apprécié par la réalisation des gestes suivants 1. préparer un nid 2. réinstaller les nouveaux-nés dans le nid. Tests effectués chez les femelles nullipares et chez les mâles Pendant respectivement 2 et 3 jours, de jeunes femelles nullipares et de jeunes mâles sont mis en présence de 3 nouveaux-nés. Ensuite, les nouveaux-nés sont placés chacun dans un des coins de la cage et on évalue le nombre de souriceaux réinstallés au nid. 1-2 "Test de lumière et d'obscurité" Le test du choix entre la lumière et l'obscurité, dénommé "test de lumière et d'obscurité", est utilisé pour révéler un état d'anxiété provoqué par un stimulus générateur d'anxiété. Ce procédé, validé par Misslin et al. (1990, Neuroreport, 1, 267-270), repose sur la tendance naturelle des rongeurs à préférer un environnement sombre, et permet d'évaluer la réponse émotionnelle des animaux soumis à un stress constitué par la lumière. Les animaux sont entretenus dans des cages individuelles placées dans un incubateur possédant une température comprise entre 21 C et 22 C et un cycle inversé lumière/obscurité de 12h/12h, avec de l'eau et de la nourriture, dispo- nibles à volonté. Toutes les expériences sont réalisées conformément aux directives institutionnelles relatives à l'expérimentation animale. Le dispositif consiste en deux boîtes de polyvinylcarbonate (20 cm x cm x 14 cm) recouvertes de plexiglas. L'une des boîtes est obscurcie et l'autre boîte est éclairée à l'aide d'une lampe de bureau de 100 W placée à une distance de 15 cm (4400 Ix). Un tunnel opaque en plastique (5 cm x 7 cm x 10 cm) sépare la boîte obscurcie de la boîte éclairée. Les animaux sont placés individuellement dans la boîte éclairée avec la tête dirigée vers le tunnel. Le temps passé dans la boîte éclairée (TLB) et le nombre de passages entre les deux boîtes sont enregistrés sur une durée de 5 minutes, à partir de la première entrée des animaux dans la boîte obscurcie. L'analyse globale des résultats est réalisée en utilisant le test U de Mann et Whitney. Le risque (p) est fixé à p valeur moyenne + erreur standard à la moyenne (s.e.m). 1-3 Test de reconnaissance d'un objet La mémoire à court terme est évaluée par le test de reconnaissance d'un objet précédemment décrit (Ennaceur et al., 1988, Behav. Brain Res., 31, 47-59; Dodart et al., 1997, Neuroreport, 8, 1173-1178), qui repose sur la tendance naturelle des rongeurs à explorer un nouvel objet, de préférence à un objet familier. Les animaux sont entretenus dans les conditions telles que décrites à l'exemple 1-2. Le test de reconnaissance d'un objet est réalisé dans un espace ouvert en plexiglas (52 cm x 52 cm x 40 cm). Le sol est divisé en 9 carrés de taille égale. Les objets à distinguer sont une bille et un dé. Les animaux sont habitués au terrain ouvert pendant 30 min. Le jour suivant, ils sont soumis à une épreuve d'apprentissage de 10 min (première épreuve) pendant laquelle ils sont placés individuellement dans l'espace ouvert, en présence d'un objet A (dé ou bille). Pendant cette période, sont enregistrés: - l'activité locomotrice, évaluée par le nombre de carrés traversés, et - le temps passé par l'animal à explorer l'objet A, c'est-àdire le temps pendant lequel le nez de l'animal est dirigé à une distance de l'objet, inférieure à 1 cm. Trois heures plus tard, ils sont soumis à une épreuve de reconnais- sance de 10 min (deuxième épreuve). Pour cette épreuve, l'objet A et l'autre objet (B) sont placés dans l'espace ouvert et l'activité locomotrice, ainsi que la durée d'exploration de l'objet A (tA) et de l'objet B (tB) sont enregistrées. Ensuite, l'indice de reconnaissance (RI, en ordonnée à la figure 6) est calculé à partir de la formule suivante RI = tA/(tA + tB) x 100. Un test de reconnaissance est considéré comme positif si la valeur de l'indice de reconnaissance est significativement supérieure à 50 %. L'analyse globale des résultats est réalisée comme décrit à l'exemple 1-2. 1-4 Test de comportement social. test de l'intrus 1-4-1 Investigation sociale Le comportement social est évalué sur de jeunes mâles isolés pendant une semaine dans une cage (résident); un intrus mâle élevé en colonie est introduit dans la cage et le comportement d'investigation sociale (approche, renifle- ment, attitude sexuelle) du résident est évalué pendant 6 minutes. L'analyse des résultats est réalisée en utilisant le test U Mann et Whitney. Les résultats sont exprimés par la valeur moyenne - erreur standard *à la moyenne. 1-4-2 Agression inter-mâle Des mâles résidents sont isolés pendant un mois et un intrus (mâle élevé en colonie) est placé dans la cage. On mesure le nombre d'attaques et le temps passé à se battre des résidents sur une période de 5 minutes. L'analyse des résultats est réalisée en utilisant le test U Mann et Whitney. Les résultats sont exprimés par la valeur moyenne 4- une erreur standard à la moyenne. 2- Résultats 2-1 Comportement maternel des souris STOP KO (-/-) Les souris STOP KO (-/-) présentent des défauts majeurs du comportement maternel se traduisant par une absence totale d'intérêt pour leur progé- niture, comme le montrent les résultats présentés à la figure 4: - tous les nouveaux-nés, issus de mères primipares STOP KO (--) meurent dans les 24 h suivant la naissance par défaut d'attention de la mère (figure 4A). Par comparaison, on observe un taux de survie de 93 % chez les nouveauxnés issus de mère primipare portant l'allèle sauvage à l'état homozygote [souris sauvages (+/+)] qui présentent un comportement maternel normal. Il a également été montré que le comportement maternel des souris STOP KO n'était pas amélioré par des gestations répétées (mères multipares). - Des tests complémentaires, effectués chez les femelles nullipares et chez les jeunes mâles, montrent que le défaut de comportement maternel des souris STOP KO n'est pas spécifique des souris primipares ou multipares (figure 4B,et 4C). 2-2 Etat d'anxiété des souris STOP KO Les souris STOP KO sont effrayées par un stimulus générateur d'anxiété et les souris sauvages (+/+) ont un comportement normal, comme le montrent les résultats du test de stimulation par la lumière (test lumière-obscurité) présentés aux figures SA et 5B. En outre, il a été montré par des tests préalables, que l'activité locomotrice spontanée des souris mutantes (-/-) n'était pas modifiée compa- rativement aux souris sauvages (+/+). - la figure 5A montre que les souris sauvages (+/+) passent beaucoup plus de temps dans la boite éclairée que les souris STOP KO qui restent dans la boîte obscurcie pendant presque toute la durée du test. Les différences obser- vées entre les souris KO (-/-) et les souris sauvages (+/+) sont statistiquement signifi- catives: p - la figure 5B montre que les souris sauvages entrent plus fréquem- ment dans la boîte éclairée que les souris KO. Les différences observées entre les souris KO (-/-) et les souris sauvages (+/+) sont statistiquement significatives: p 0,01, test U Mann et Whitney. 2-3 Mémoire à court terme des souris KO STOP -/- Les souris STOP KO présentent des troubles de la mémoire à court terme comme le montrent les résultats du test de reconnaissance, présentés à la figure 6: - l'indice de reconnaissance, mesuré chez les souris sauvages (65 %) est significativement plus élevé que l'indice de 50% observé chez les souris KO (p = 0,004 pour les souris (+/+), test de Student).. - le temps d'exploration des objets A et B, enregistré lors de la deuxième épreuve (épreuve de reconnaissance) montre que les souris sauvages explorent le nouvel objet de préférence à l'objet familier. - les souris KO n'explorent aucun des objets pendant les deux épreuves (apprentissage et reconnaissance). Elles se déplacent dans l'espace ouvert mais ne sont pas intéressées par les objets. Ce comportement pourrait s'expliquer par leur état d'anxiété comme le montrent les résultats du test de la lumière et de l'obscurité (exemple 2-2-2). Cet état d'anxiété est révélé notamment par le fait que les souris se déplacent le long des murs et qu'elles ne traversent pas l'espace ouvert, car elles semblent effrayées par l'environnement et par les objets qui représentent un stimulus générateur d'anxiété. 2-4 Comportement social Les souris STOP -/présentent des troubles d'investigation sociale (figure 7A, B, C). - La figure 7A montre que le temps passé par les résidents à explorer l'intrus est réduit de manière significative lorsque le résident est un mâle STOP -/- (p - La figure 7B montre que dans le test d'agression inter-mâle, le nombre d'attaques effectuées par les résidents STOP -/- est inférieur au nombre d'attaques effectuées par les mâles sauvages (p - La figure 7C montre que le temps passé à se battre par les résidents mâles STOP -/- est réduit en comparaison des mâles sauvages (p Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. 2817117 REVENDICATIONS 1 ) Mammifère non-humain recombinant, porteur d'au moins un allèle modifié du gène codant pour une protéine STOP. 2 ) Mammifère non-humain recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit allèle modifié est obtenu à partir d'une construction comprenant une séquence d'acide nucléique issue du même mammifère ou d'un mammifère différent de celui dans lequel ladite construction est insérée, laquelle construction est sélectionnée dans le groupe constitué par des constructions contenant une séquence codant pour une protéine STOP anti-sens, des constructions comprenant la région du promoteur STOP en combinaison avec un gène reporter ou avec la région codante STOP, des constructions comprenant au moins une portion du gène STOP incluant au moins une modification, des constructions comprenant au moins une portion du gène STOP lié de manière opérationnelle à un promoteur et éventuellement à d'autres séquences régulatrices nécessaires pour l'expression dans l'animal hôte. 3 ) Mammifère non-humain recombinant selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que lesdites constructions sont sélectionnées parmi les constructions suivantes: des constructions qui incluent un fragment de la séquence génomique codant pour une protéine STOP comprise entre le codon d'initiation et le codon STOP, des constructions ne comprenant pas la région comprise entre les positions 4118 et 5131 de la séquence génomique codant pour une protéine STOP, des constructions comprenant la région correspondant aux positions 1-4118 de la séquence génomique du gène STOP, le gène codant pour la 3galactosidase, placé sous le contrôle du promoteur STOP endogène, un gène de résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur PGK, la région correspondant aux positions 5131-6701 de la séquence génomique du gène STOP, et enfin le gène de la thymidine kinase, sous le contrôle du promoteur PGK. 4 ) Utilisation d'un mammifère non-humain recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la sélection ou le criblage de produits psychoactifs. 5 ) Séquence d'acide nucléique issue du gène STOP, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une substitution, délétion ou insertion au niveau d'un domaine ou d'un exon du gène STOP. 21 2817117 6 ) Amorces ou sondes de criblage de clones ES recombinants ou d'animaux recombinants, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par des fragments d'un gène STOP comprenant au moins 15 nucléo- tides, de préférence environ 18 nucléotides et de manière préférée au moins 50 nucléotides. 7 ) Amorces ou sondes selon la revendication 6, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par des fragments du même gène STOP, situé en dehors (amont ou aval) de la séquence du gène STOP issue du vecteur de recombinaison ou de criblage mis en oeuvre et les séquences (SEQ ID NO:3-6). 8 ) Procédé de criblage et de sélection de molécules utiles dans l'anxiété, la schizophrénie, les désordres schizoaffectifs, la paranoïa ou la dépression, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend: - la mise en contact in vitro d'un échantillon biologique préalablement extrait et sélectionné dans le groupe constitué par des cellules et des tranches d'organes, avec au moins une substance à cribler; - la mesure de l'action de ladite substance à cribler sur lesdites cellules ou tranches d'organes et - la comparaison des valeurs obtenues avec celles des cellules ou des tranches d'organes d'un échantillon biologique obtenu à partir d'un mammifère non- o humain du même type, porteur de deux allèles sauvages du gène codant pour une protéine STOP. 9 ) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite - mesure est effectuée à l'aide d'un test de liaison protéine-protéine. ) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite mesure est effectuée par détection de la variation d'intensité d'un signal électrique. 11 ) Vecteur de recombinaison homologue d'un gène codant pour une protéine STOP, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique d'un gène STOP codant pour une protéine STOP inactivée, de préférence tronquée au niveau d'au moins l'un des exons, notamment l'exon 1. 12 ) Utilisation des substances sélectionnées à l'aide du procédé de criblage selon l'une quelconque des revendications 8 à 1 1, pour la préparation d'un 22 2817117 médicament utile dans l'anxiété, la schizophrénie, les désordres schizoaffectifs, la paranoïa ou la dépression.