FR 2805742 A1 20010907 FR 0002786 A 20000303 PREPARATION INCOLORE COMPRENANT DES CAROTENOÏDES DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne des préparations incolores comprenant des caroténoïdes. Ces préparations peuvent être utilisées dans la production d'aliments, de cosmétiques, ainsi que d'un nombre varié de médicaments, etc...Cette invention concerne également une méthode de production de caroténoïde incolore. ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION Les caroténoïdes sont des pigments produits par des micro-organismes, des champignons et des plantes. Les caroténoïdes les plus communs dans la préparation d'aliments, médicaments et cosmétiques sont le p-carotène et le lycopène. Le p-carotène et le lycopène comme la majorité des caroténoïdes sont sensibles à la lumière et à l'oxydation, deux propriétés qui limitent considérablement leurs emplois et qui racourcissent la date limite de validité des produits qui la contiennent (dans: Caroténoïdes, Chimie et Biologie, Krinski, N.I., Matthews-Roth, M.M., Taylor, R. F., (Eds), Planum Press, New York, Londres, 1989). En plus, le p-carotène et le lycopène ont une couleur orange qui limite leurs utilisations dans bons nombres de produits cosmétiques et alimentaires. Le phytoène (7,8, 11, 12, 7', 8', 11', 12'-octahydro-y,y-carotène) est lui aussi un caroténoïde (chaîne isoprénoïque en C40 ) et est l'un des précurseurs de la voie biosynthétique menant à la production de p-carotène, lycopène et d'autres caroténoïdes (le phytoène est le premier précurseur spécifique de la voie de synthèse des caroténoïdes). Le brevet d'Application Japonais No. 90-40520, a révélé que l'introduction d'une séquence de ADN produisant du phytoène dans certaines cellules cancéreuses transfectées bloque leur croissance et inhibe l'activation par le virus Epstein Barr. (EBV). RESUME DE L'INVENTION D'après la présente invention, il a été montré que le phyotène possède des propriétés anti-oxydantes et qu'en plus, il absorbe la lumière ultra-violette (UV). En plus de ces propriétés, le phytoène est beaucoup plus stable à l'oxydation que, par exemple, le p-carotène. Ces découvertes indiquent que le phytoène peut être utile à la prévention de certains types de dégats provoqués par l'environnement. Donc, d'après cette invention, il existe une composition comprenant du phyotène et qui intervient contre les dégâts provoqués par l'oxydation et par l'exposition à la lumière UV. D'après cette invention, le terme "dégâts" doit être interprété comme des dégâts provoqués par toute une gamme d'agents oxydants, tels que l'oxygène luimême, le radical hydroxyle, le peroxide d'hydrogène, d'autres radicaux libres, l'ozone etc., ou par n'importe quelle radiation UV délétère. Les dégâts dépendent du type d'application de cette préparation. Par exemple, lorsque cette préparation est destinée à être appliquée sur la peau, les dégâts peuvent être des brulûres, des ampoules ou des lésions semblables à celles provoquées par une exposition chronique au soleil, c'est à dire, le vieillissement prématurée de la peau, etc. Lorsque cette préparation est destinée à être utilisée pour préserver des aliments, les dégâts peuvent se traduire par une diminution de la stabilité du produit ou une modification chimique ayant comme conséquence, par exemple la rancidité, ou le viellissement accéléré de l'aliment, etc. L'invention concerne une composition comprenant une quantité de phytoène efficace pour prévenir les dégats provoqués par l'oxydation ou par l'exposition à la lumière UV. Selon une disposition avantageuse de l'invention, la composition topique qui protège la peau contre les dégats de l'environnement, contient du phytoène en quantité agir contre l'oxydation et les effets UV sur la peau. Le terme "dégats de l'environnemenf' est en rapport avec n'importe quel agent nuisible de l'environnement, tel que les radiations UV et les agents oxydants. Le terme "quantité efficace" doit être compris comme un dosage de phytoène adéquat aux résultats souhaités. Dans la composition de cette invention, le phytoène peut être sous la forme trans et/ou cis. L'une des nouveautés de ces compositions concernées par l'invention est que, quoique possédant les propriétés citées ci-dessus, le phyotène est incolore. Le fait que la composition est incolore permet que le caroténoïde n'aura pas d'effet sur les propriétés esthétiques de la préparation le contenant. En plus, l'absence d'absortion de lumière dans le visible (qui se manifeste par le fait qu'il n'a pas de couleur), le rend stable à une éventuelle dégradation à la lumière du jour. La préparation peut, selon une disposition avantageuse de l'invention, être utilisée comme un cosmétique pour la peau ou comme préparation pharmaceutique pour protéger la peau contre les agressions de l'environnement, telles que celles décrites ci-dessus, y-compris les radiations UV ou les dégâts qui peuvent être provoqués par toute une gamme d'agents oxydants. Une composition pour la peau selon cette invention, peut être sous forme de gel, d'émulsion , huile dans eau ou eau dans huile, de pommade, d'onguent, etc. D'après un autre objet de l'invention, cette composition peut être utilisée comme additif dans la préparation d'aliments, par exemple pour préserver les aliments contre l'oxydation de plusieurs ingrédients utilisés dans la production alimentaire, tel que les huiles, les graisses . Elle peut également être utilisée dispersée comme par exemple dans des yaourts ou de manière plus générale comme complément alimentaire. Parfois, la composition de cette invention peut comprendre des élements supplémentaires qui ne changent pas substantiellement ses charactéristiques de base. L'un d'eux est, par exemple, le zetacarotène (7,8,7',8'-tetrahydro-y,ycarotene) ou le phytofluène (15Z,7,8,11,12,7',8'-hexahydro-y,y,-carotène). La composition de cette invention peut, évidemment selon le but recherché, comprendre d'autres ingrédients, tels que des véhicules cosmétiques ou pharmaceutiques acceptables, d'autres anti-oxydants, des agents conservateurs, plusieurs ingrédients pharmaceutiques ou cosmétiques actifs, tels que des médicaments actifs par voie topique, etc. Selon une caractéristique intéressante de l'invention, la composition peut comprendre aussi un véhicule hydrophobique, choisi parmi des huiles utilisées couramment dans les industries cosmétiques, pharmaceutiques ou alimentaires, tels que les huiles végétales, minérales ou synthétiques. Le phytoène peut être obtenu à partir de différentes sources. Il peut être tiré d'organismes qui produisent des caroténoïdes, tels que de nombreuses plantes, plusieurs algues et particulièrement les micro-algues Dunaliella sp, qui en sont un exemple représentatif. De très faibles quantités de (ugs) phytoène ont été produites par des organismes producteurs de ss-caroténoïdes. Cette invention fournit une méthode qui permet aux organismes producteurs de caroténoïdes de produire des quantités substantielles de phytoène. Le terme "quantité substantielle" correspond à une quantité de phytoène oscillant entre environ 0.1 mg/l de culture à environ 50 mg/l de culture, typiquement de environ 1 mg/l à environ 20 mg/l de culture. Quand l'organisme qui produit les caroténoïdes est l'algue Dunaliella sp., la quantité typique de phytoène qui peut être produite varie entre 1 mg/l à 15 mg/l. D'après la méthode décrite dans cette invention, l'organisme producteur de caroténoïdes, typiquement les algues, peut être cultivé dans différentes conditions. Selon une disposition avantageuse de la présente invention, les organismes producteurs de caroténoïdes sont cultivés à l'air libre, comme dans le cas, par exemple de Dunaliella sp. qui est cultivée dans des piscines extérieures, avec un milieu de culture comprenant de l'eau de mer et de l'eau salée recyclée, à une température de 10 C à 40 C environ. Les organismes peuvent être cultivés à la lumière directe du jour, entre 80% d'ombre et jusqu'en plein soleil. Dans une disposition avantageuse de la présente invention, les organismes producteurs de caroténoïdes sont cultivés à la lumière du jour, entre 40% d'ombre et jusqu'en plein soleil. Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne aussi, les organismes producteurs de caroténoïdes lorsqu'ils sont cultivés dans un milieu de culture typiquement à l'intérieur d'un fermenteur et à température ambiante. Dans ce cas là, le milieu de culture comprend typiquement plusieurs associations possibles de sels et minéraux (voir l'exemple 1. 1 ci-dessous). D'après cette réalisation, les organismes se cultivent sous une lumière à large spectre (une lumière qui comporte une portion substantielle de lumière visible de type " lumière du jour') avec une énergie supérieure à 10 W/m 2 environ et qui peut varier de 10 W/m2à 200 W/m2 environ. La méthode conforme à la présente invention permet de produire des quantités substantielles de phytoène après plusieurs jours de culture de ces organismes (c'est à dire, entre 4 et 10 jours). Le phytoène est extrait dans des conditions qui favorisent son accumulation, dans les cellules des organismes, typiquement, en faisant croître un organisme producteur de p-carotène en présence d'inhibiteurs de biosynthèse des caroténoïdes, qui sont des inhibiteurs des stades de réaction subséquents de la voie biochimique de la production de caroténoïdes. Un exemple d'inhibiteur de caroténoïdes qui peut être utilisé d'après cette invention est le 4-chloro- 5(methylamino)-2-(3- (trifluorométhyl) phényl)-3(2H)-pyridazinone (dorénavant: "l'inhibiteur chloro-4"). Quand la source de phytoène est la micro algue Dunaliella, l'inhibiteur chloro-4 est typiquement inclus dans ce milieu de croissance en concentration d'environ 0.4 M (Ben-Amotz et al., Plant Physiol. 86 :1286, 1988). D'autres inhibiteurs peuvent être utilisés, par exemple le J334, (Ben-Amotz et al. Supra) Sandoz H 6706 (Kümmel, H. W. et al., Z. Naturforsch 30c, 333,1975), diphenyl-amine (DPA) (Foppen F. H., Ann. Ist. Super. Sanita, 439,1969) et la nicotine (Shaish et al, Plant Cell Physiolo 31 :689, (1990)). Selon une disposition avantageuse de l'invention, une méthode pour la préparation d'une composition contenant du phytoène comprend les stades suivants : (a) incubation d'un organisme producteur de caroténoïdes avec un milieu de culture et sous lumière artificielle à large spectre (du type "lumière du jour'), d'une intensité supérieure à 10 W/m2 avec un ou plusieurs inhibiteurs de synthèse de caroténoïdes. (b) croissance des dits organismes producteurs de caroténoïdes jusqu'à ce que le niveau de phytoène atteigne environ 0,1 mg/l de culture à 50 mg/l de culture environ, et (c) séparation des dits organismes de la culture dont ils sont issus. Selon une autre disposition avantageuse de l'invention une méthode est fournie pour la préparation d'une composition contenant du phytoène comprenant les stades de: (i) incubation en extérieur d'un organisme producteur de caroténoïdes, à l'intérieur d'un milieu de culture à la lumière directe du soleil allant de 80% d'ombre jusqu'en plein soleil avec un ou plusieurs inhibiteurs de synthèse de caroténoïdes; (ii) croissance des dits organismes producteurs de caroténoïdes jusqu'à un niveau de phytoène d'environ 0,1 mg/l de culture et jusqu'à environ 50 mg/l de culture avantageusement entre 1 mg/l et 50 mg/l; et (iii) séparation des dits organismes de la culture dont ils sont issus. Selon une caractéristique intéressante avantageuse de l'invention, le phytoène provenant des organismes, peut être employé directement sans être séparé de la matière sèche de ces organismes . Cependant, d'après une disposition avantageuse de l'invention, après la séparation de l'organisme producteur de caroténoïdes de la culture, une autre préparation peut être réalisée à partir des organismes contenant du phyotène. Typiquement, cette préparation est un extrait qui peut être réalisé à partir d'organismes producteurs de caroténoïdes par n'importe quelle méthode d'extraction courante dans ce domaine, comme, par exemple, par extraction, par exemple à l'aide d'un mélange éthanolhexane. Selon une caractéristique intéressante de l'invention, les auteurs ont découvert que l'extraction ou la séparation de phyotène d'autres substances éventuellement présentes dans la culture se réalise avantageusement en ajoutant du charbon actif à la culture ou en l'ajoutant pendant l'extraction du caroténoïde. Le charbon est utilisable lorsqu'on se sert d'un inhibiteur, aussi bien que lorsqu'il n'est pas utilisé. Le charbon est ensuite séparé du milieu de culture par centrifugation ou filtration. En plus de l'exposé ci-dessus, et selon une disposition avantageuse de l'invention, le phytoène de la composition peut être synthétisé par n'importe quelle des méthodes chimiques et biochimiques connues ou par des méthodes de recombinaison génétique. Chimiquement, le phytoène peut être synthétisé à partir de deux pyrophosphates de géranylgéranyl (C-20) par une réaction qui peut être catalysée par la phytoène synthase . Le géranylgéranyl pyrophosphate peut être obtenu directement par la conversion d'acide mévalonique ou par la condensation de pyruvate et de glycéraldéhyde-3-phosphate. Les méthodes de recombinaison comprennent, par exemple, la mutagénese des enzymes situées en aval du phytoène. Les phytoènes ainsi synthétisés ont une activité équivalente aux activités du phytoène obtenus d'organismes qui produisent des caroténoïdes comme décrit ci-dessus. La stabilité des phytoènes dans la composition de cette invention est testée en exposant la composition de caroténoïde àla lumière et/ou à des agents oxydants. L'effet de ces traitements sur les caroténoïdes dans les compositions de cette invention, est moindre que l'effet de ces traitements sur d'autres caroténoïdes de référence, comme par exemple, le (3-carotène. L'art antérieur montre qu'un nombre important de caroténoïdes, soumis à ces traitements se dégradent rapidement, ce qui se manifeste, par exemple, par une modification de l'absorption de la lumière dans le visible, c'est à dire, en un changement de leur couleur. L'effet anti-oxydant de la composition de cette invention peut-être déterminé, par exemple, en mesurant l'effet de protection de l'ADN face àune agression par des oxydants (Salles et al., Anal. Biochem., 232:37, 1995). L' invention est illustrée ci-dessous par des exemples donnés à titre non limitatif et conformément à l'invention. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS Afin de comprendre l'invention et comment elle est mise en oeuvre concrètement, une réalisation est donnée ci-dessous, sous la forme d'exemple non limitatif, avec le shéma suivant dans lequel: Fig. 1 montre l'absorption du spectre de UV d'une composition comprenant du phytoène extrait de Dunaliella sp. cultivé avec l'inhibiteur chloro-4. MATERIELS ET METHODES 1.Milieu de Croissance Les milieux de croissance suivants ont été utilisés: 1. 1 Un milieu de croissance contenant: MgS04, 5 mM; CaCl2, 0. 2 mM ; KH2P04, 0. 2 mM ; FeCI3 + Na2EDTA, 2uM+5 M; MnCI2, 7 M; CuCI2, 1 (M; ZnCl2, 1 (M; CoCI2, 1 M; (NH4)6MO7O24, 1 M; NaCI, 1 M; NaHC03, 50 mM; KCI, 5 mM. Ce milieu de croissance est utilisé typiquement pour la culture d'organismes producteurs de caroténoïde en intérieur, sous conditions artificielles. 1. 2 Un milieu de croissance contenant un mélange d'eau de mer et de l'eau salée recyclée ayant un degré de salinité de 2M environ. Ce moyen est utilisé typiquement dans la culture de caroténoïdes à l'extérieur, au soleil. Le pH final des milieux de croissance est compris entre 7. 0 et 8.0. 2. Produits L'inhibiteur de la biosynthèse p-carotène peut être le 4-chloro- 5(methylamino)-2- (3-(trifluoro-methyl)phenyl)-3(2H)-pyridazinone. L'inhibiteur chloro-4 est employé pour la production de phytoène. La concentration de l'inhibiteur chloro-4 varie entre 0.07 M et 1 M environ. Du charbon actif non-traité est utilisé pour séparer le phyotène d'autres caroténoïdes. Le charbon est séparé de l'extrait par filtration pendant les derniers stades de la préparation de l'extrait. Plusieurs huiles commerciales naturelles, minérales ou synthétiques sont utilisées pour dissoudre le phytoène. 3. Croissance de Dunaliella sp. Les algues Dunaliella sp sont cultivés dans les conditions suivantes: 3. 1 Dans le milieu de croissance décrit dans 1. 1 ci dessus, à l'intérieur d'un fermenteur, à température ambiante, sous une lumière artificielle variant d'une intensité faible (de 1 W/m2) à une intensité vive (au dessus de 10 W/m2), typiquement sous une lumière de plus de 10 W/m2, variant entre 10 W/m2 et 200 W/m2. 3. 2 Dans des piscines en extérieure à une température variant de 10 C à 40 C environ, sous des conditions d'éclairage variant entre 80% d'ombre et jusqu'en plein soleil, typiquement entre 40% d'ombre et le plein soleil. 4. Méthode d'extraction des Caroténoïdes Le phyotène est produit par inhibition de la synthèse de p-carotène dans les algues Dunaliella sp. , par l'inhibiteur chloro-4 à une concentration de 0.07 M à 1.0 M. Les algues sont collectées après quatre à dix jours de croissance, soit à l'intérieur ou à l'extérieur, comme décrit ci-dessus et extraites avec un mélange l' éthanol:hexane (1:2) v/v. L'éthanol est d'abord utilisé dans une proportion algues-éthanol de 1 :10. ce stade une hydrolyse basique des liaisons esters est réalisée en rajoutant 0.5MNaOH, en agitant pendant 30 minutes, minimum. La phase de séparation éthanol:hexane est réalisée en rajoutant du NaC1 en quantité adéquate. La fraction hexane est analysée spectrophotométriquement. 5. Séparation du Phytoène Afin d'assurer qu'il ne reste pas de résidu d'autres caroténoïdes après l'extraction, les stades suivants de séparation sont avantagesement ajoutés à la méthode d'extraction : (1 ) La concentration de beta-carotène est mesurée dans l'extrait d' hexane. (2) Le charbon actif est ajouté dans une proportion comprise entre 0,01 mg et 0,07 mg (idéalement 0,02mg) de charbon actif par g beta-carotène. Le mélange est agité pendant 30 minutes. (3) La concentration de beta-carotène est de nouveau mesurée. (4) Le charbon actif est ajouté dans une proportion comprise entre 0.1mg et 0,3mg (idéalement 0,2mg) de charbon actif par g de beta-carotène. Le mélange est remué pendant 10 minutes. (5) Les stades 3 et 4 sont répétés. (6) Le charbon actif est séparé de l'extrait d'hexane par filtration, au travers de filtre 1.0u, suivis de filtre 0.2u. (7) L'hexane est partiellement évaporé sous vide et le phytoène est maintenu alors concentré à l'intérieur de l' hexane, ou bien l' hexane est totalement évaporé et le phytoène est re-dissous de l'huile. 6. Analyse Spectrophotométrique Le spectre d'absorption de l'extrait de phytoène est déterminé en utilisant un spectrophotomètre Hewlett Packard 8452A . 7. Stabilité du phytoène dans des conditions aérobiques sous lumière UV et à plusieurs températures d'incubation. # La stabilité du phytoène à différentes températures est déterminée par exposition à différents temps dans plusieurs types d'huile et de solvants, à 4 C, 23 C, 30 C et 60 C. La quantité de phytoène restante est déterminée spectrophotométriquement. Le pourcentage de phytoène restant (% PH restant) est calculé de la manière suivante: Phytoène après traitement (mg/ml) X 100 Phytoène avant traitement (mg/ml) # Détermination de stabilité sous lumière UV (254 nm, 365 nm, 254 + 365 nm), pendant 30 minutes. à 300/310 w/cm2. 8. Stabilité du phytoène dans des conditions aérobies et à la lumière du jour: La stabilité du phytoène à la lumière est mesurée en pleine lumière (à midi, en plein été à Rehovot, Israel), filtrée à travers un filtre de type "hot miror' (Andover Corporation, Salem, NH, filtre de transmitance 400-650nm). Les spécimens sont dissous à l'éthanol, exposés à la lumière pendant 30-150 minutes et ensuite extraits dans l'hexane après l'hydrolyse basique (d'après la méthode d'extraction ci-dessus). Les quantités de phytoène et de beta-carotène ont été mesurés spectrophotométriquement et le pourcentage des caroténoïdes restants a été calculé d'après la section 7 ci-dessus. 9. Activité antiradicalaire 9. a Décomposition du radical hydroxyle: La capacité de l'extrait à décomposer les radicaux hydroxyles ( OH) a été mesurée par la Résonance Paramagnétique Electronique (RPE), en comparant l'intensité du signal avec ou sans le composé. Les radicaux hydroxyles sont générés par décomposition du peroxide d'hydrogène par le fer [(FeS04). Réaction de Fenton], le OH est piégé par le DMPO afin de fournir un adduit DMPO-OH , qui présente un signal caractéristique en RPE. Le composé, comprenant du phytoène a été rajouté au système en trois dilutions 1/20, 1/50 and 1/200 (pré-addition). Vu que plusieurs substances peuvent réduire le signal, non pas en piégant le OH, mais en ajoutant un adduit DMPO-OH, il est nécessaire d'évaluer le signal lorsqu'on ajoute le produit, après la réaction de Fenton (post-addition). La capacité de piéger le radical hydroxyl est évaluée théoriquement par la différence entre la valeur du signal, RPE est enregistrée lors de la pré-addition du produit et la valeur du signal enregistrée au moment de la post-addition du produit. 9. b Protection de l'ADN par effet anti-oxydant : La protection de l'ADN par effet anti-oxydant est examinée, sur la base de la méthode de Salles et al. (Supra). L'effet protecteur du composé contre les ROS (Reactive Oxygen Species), générant des dégâts oxydatifs sur l'ADN est mesuré par une quantification de l'inhibition de formation de lésions du ADN. L'ADN utilisé est de nature plasmidique. II. RESULTATS Exemple 1 Production de phytoène Les phytoènes sont produits à partir des algues Dunaliella sp. en les cultivant en présence d'un inhibiteur chloro-4 (0. 1-0.5 g) de la biosynthèse de p-carotène, selon la description ci-dessus. Les cultures ont été extraites et l'extrait a été séché par évaporation et re-dissous dans l'hexane ou dans l'huile. Des éventuels résidus de l'inhibiteur chloro-4 n'ont pas été détectés dans les caroténoïdes extraits. Selon la Fig. 1, le principal pic d'absorption du phytoène a été identifiée à 286 nm (UVB). Comme prévu, le principal pic d'absorption du p-carotène est à 450 nm. La quantité de (3-carotène a été réduite en raison de l'inhibition de la synthèse, alors que la quantité de phytoène a été augmentée. Exemple 2 Exemple de la stabilité des extraits de phytoène sous lumière UV La stabilité des extraits de phytoène obtenus, comme démontré dans l'exemple 1 ci-dessus, est déterminée par analyse spectrophométrique. Le phytoène est dissous dans l'huile ou dans de l'hexane. L'absorption de la préparation est mesurée entre 220nm et 600nm et la quantité de phytoène dans chaque spécimen est calculée afin de déterminer le pourcentage de phytoène restant après l'irradiation de l'extrait (voir Matériels et Méthodes) La stabilité du phytoène est mesurée lorsque l'extrait est exposé à la lumière UVA (365 nm) ainsi qu'à la lumière UVB (254 nm) , ainsi qu'à un mélange d'irradiation UVA et UVB. Comme l'on observe sur la Table 1 ci-dessous, le phytoène dissous dans l'huile ou l'hexane est très stable après avoir été exposé des irradiations UVA, UVB ou UVA+B. Table 1 Stabilité PH sous irradiation UV (exposition: 30 minutes ) Obscurité 254 nm 365 nm 254nm+ 365nm PH restant' 100 92. 2 98. 7 92.4 (hexane) PH restant 100 100 100 101 (huile) Le pourcentage de pH restant équivaut à la quantité de matériel (mg/ml) mesuré après l'irradiation, divisé par la quantité de matériel mesurée avant le traitement et multiplié par 100. La stabilité du phytoène est mesurée sous différentes conditions de température (4 C, 23 C, 30 C et 60 C) dans l'hexane ou autres huiles commerciales. Les mesures ont été effectuées sur une période de quatre mois. Le phytoène a été stable à toutes les températures testées, sans effet notable du type d'huile dans lequel les caroténoïdes ont été dissous. Exemple 3 Stabilité à la lumière du jour du phytoène extrait La stabilité du phyotène est comparée à la stabilité du beta-carotène (comme expliqué dans Matériel et Méthode 8 ci-dessus) après exposition à la lumière du jour. L'absorption de cette préparation est déterminée à des longueurs d'onde comprises entre 220 nm et 600 nm. La quantité de chacun des caroténoïdes de chaque spécimen est calculée afin de déterminer le pourcentage des caroténoïdes restant après l'irraditation de l'extrait. (voir exemple 2 au-dessus). Comme montré sur la Table 2, une exposition à la lumière du jour provoque une plus grande dégradation du beta-carotène comparé au phytoène. Table 2 Stabilité PH sous lumière visible (exposition 15-150 min) Temps d'exposition Phytoène Beta-carotène (% (min) left) 0 100 100 30 54.46 25.00 90 20.33 11.36 120 15.70 9.47 150 13. 64 5.68 Exemple 4 Acivité antiradicalaire 4. a Décomposition des radicaux hydroxyles La décomposition des radicaux hydroxyles est mesurée par RPE, comme expliqué dans Matériel et Méthode 9 ci-dessus1. Les résultats obtenus (Table 3) montrent un effet dose dépendant du produit comprenant du phytoène sur les radicaux hydroxyles. Table 3 Concentration Intensité du signal Intensité du signal % de piège de finale du produit RPE (pré-addition) RPE (post- radicaux d'hydroxyl (mg/ml) addition) 0 2.82x106~0.07 0. 001 0.34x106~0.04 2.19x1060.13 66 0. 0004 0.58x106~0.02 1.94~106~0.05 48 0. 0001 1.26x106~0.10 2.19x106~0.13 24 Le produit est composé d'une concentration initiale de phytoène de 0.02 mg/ml. La valeur moyenne de chaque résultat correspond à trois mesures. 4. b Effet anti-oxydant La protection de l'ADN par l'effet d'anti-oxydation du phyotène est déterminée en s'appuyant sur la méthode de Salles (Supra), comme expliqué dans Matériel et Méthode, 9. b ci-dessus. Comme observé sur la Table 4 ci-dessous, le phytoène obtenu selon la description ci-dessus est capable de combattre les effets des radicaux hydroxyles. Table 4 Activité anti oxydante du phytoène Composé Concen- % % % Concentration d'inhibition d'inhibition d'inhibition tration sur g/ml en présence non spécifique 50% de de ROS spécifique l'activité Phytoène 100 89 16 76 10 63 8 55 7. 14 g/ml 1. 0 21 1 20 0. 10 9 0 9 Contrôle 1000 88 9 79 positif 100 69 11 58 80 pg/ml 10 5 0 5 1 4 0 4 Exemple 5 Effets protecteurs de l'ADN par le phytoène Effet génotoxique La génotoxicité est mesurée comme une induction de l'activité de réparation de synthèse de l'ADN et est exprimée par le ratio (R). Lorsque R Relative émission lumineuse du spécimen R= Relative émission lumineuse du solvant seul Comme indiqué Table 5 , ci- dessous, le phytoène n'est pas génotoxique. Le paramètre R est significativement inférieur à 2 (effet protecteur) et beaucoup plus petit que le contrôle positif, qui est un composé génotoxique de référence. Table 5 Effet Génotoxicité du phytoène Composé Concentration (pg/ml) Génotoxicité (R) Phytoène 100 0.88 10 1.17 1. 0 1.20 0.10 1.05 MMS- 10 mM 6.26 (contrôle Positif) 2 mM 2.44 Exemple 6 Les composition suivantes fournissent des exemples pouvant être réalisées en accord avec cette invention: A- Emulsion gel H/E ( voie topique): - Carbopol 981 (commercialisé par Goodrich) ............ 0.6 g - Alcool éthylique ........................................................ 15 g - Huile de silicone volatile ...................................... 3 g - Huile de purcellin 7 g - Conservateur 0. 3 g Parfum...................................................................... 0. 4 g - Triéthanolamine ...................................................... 0. 2 g - Phytoène .................................................................. 0. 01 g - Eau déminéralisée qsp 100 g B - Gel anhydre ( voie topique): - Propylène glycol ....................................................... 25 g - Cellulose hydroxy-éthylée ........................................ 0. 8 g Polyéthylène glycol................................................... 12 g - Phytoène .................................................................. 1 g - Alcool absolu qsp..................................................... 100 g C- Emulsion H/E (voie topique): Paraffine liquide .......................................................... 6 g Lanoline liquide............................................................3 g Arlacel 165 (commercialisé par Atlas) ........................ 6 g Tween 60 (commercialisé par Atlas)...........................2 g Alcool cétylique...........................................................1.2 g Acide stéarique...........................................................2.5 g Huile de silicone volatile .........................................10 g Triéthanolamine .........................................................0.1 g Conservateur.............................................................. 0.3 g Antioxydants ............................................................... 0. 3 g Phytoène ....................................................................0.3 g Eau déminéralisée qsp ............................................... 100 g D - Crème aux liposomes ( voie topique): Huile de tournesol.......................................................35 g Alcool cétylique...........................................................4 g B-sitostérol..................................................................4 g Dicétyl phosphate ....................................................... 0.5 g Conservateur..............................................................0.3 g Parfum ........................................................................0.6 g Carbopol 981 (commercialisé par Goodrich) ..............0.2 g Triéthanolamine..........................................................0.2 g Sphingosine................................................................ 0.05 g Phytoéne .................................................................... 0.00001 g Eau déminéralisée qsp ............................................. 100 g E - Comprimé(voie orale): Talc............................................................................. 5 g Aérosil 200..................................................................5 g Stéarate de Zn............................................................5 g Phytoène ...................................................................0.0000015 g Lactose qsp ...............................................................400 g F - Emulsion E/O ( voie topique): Protégin (commercialisé par Goldschmidt) ...............19 g Glycérine ....................................................................3 g Huile de vaseline ........................................................8 g Phytoène ....................................................................0.5 g Sulfate de Mg ............................................................0.5 g Parfum .......................................................................0.8 g Conservateur.............................................................. 0.2 g Eau déminéralisée qsp ...............................................100 g REVENDICATIONS: 1. Une composition comprenant une quantité de phytoène efficace pour prévenir les dégâts provoqués par l'oxydation ou par l'exposition à la lumière UV. 2. Une composition selon la revendication 1, caractérisée comme étant une préparation topique qui protège la peau contre les dangers de l'environnement et comprenant du phytoène en quantité suffisante pour protéger la peau contre l'oxydation et les effets des UV. 3. Une composition selon la revendication 2, caractérisée comme étant une composition cosmétique ou pharmaceutique. 4. Une composition d'après revendication 1, caractérisée comme étant un additif ou un complément alimentaire. 5. Une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée comme étant incolore. 6. Une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée comme contenant un véhicule hydrophobique. 7. Une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée comme contenant du zetacarotène et/ou du phytofluène. 8. Une méthode pour la préparation d'une composition comprenant du phytoène, et caractérisée par les étapes suivantes: (a) incubation d'un organisme producteur de caroténoïdes dans un milieu de culture sous lumière à large spectre, d'intensité supérieure à 10 W/m2 et avec un ou plusieurs inhibiteurs de synthèse de caroténoïdes, (b) culture des dits organismes producteurs de caroténoïdes jusqu'à obtention de phytoène à une teneur minimale comprise entre 0.1 mg/l culture et 50 mg/l culture, et (c) séparation des dits organismes de la culture dont ils sont issus. 9. Une méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que la lumière citée a une intensité qui varie entre environ 10 W/m2 et environ 200 W/m2. 10. Une méthode pour la préparation d'une composition, comprenant du phytoène et caractérisée par les étapes suivantes: (i) incubation d'un organisme producteur de caroténoïdes en extérieur dans un milieu de culture et sous la lumière directe du soleil, variant entre 80% d'ombre et le plein soleil, en présence de un ou plusieurs inhibiteurs de synthèse de caroténoïdes; (ii) culture des dits organismes producteurs de caroténoïdes jusqu'à obtention de phytoène à une teneur minimale comprise entre 1 mg/l culture et 50 mg/l culture et ; (iii) séparation des dits organismes de la culture dont ils sont issus. 11. Une méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que la lumière varie entre 40% d'ombre et le plein soleil. 12. Une méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que les dits organismes sont cultivés en plein soleil. 13. Une méthode selon les revendications 8-12, caractérisée par l'étape supplémentaire suivante : (iv) réalisation d'une préparation comprenant du phytoène provenant des dits organismes ainsi séparés de leur milieu de culture. 14. Une méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que cette préparation est un extrait. 15. Une méthode, selon la revendication 14, caractérisée en ce que l'extrait a été réalisé à l'aide d'un solvant éthanol:hexane. 16. Une méthode selon l'une quelconque des revendications 8-15, caractérisée en ce que les organismes producteurs de caroténoïdes sont des micro algues. 17. Une méthode selon la revendication 16, caractérisée en ce que les micro algues citées sont du type Dunaliella sp. 18. Une méthode, selon les revendications 8-17, caractérisée en ce que l'inhibiteur de synthèse de caroténoïdes est le chloro-4--5(methylamino)-2-(3- (trifluoromethyl)phenyl)- 3(2H)-pyridazinone. 19. Une méthode selon les revendications 8-18, caractérisée en ce que le dit extrait ne contient aucune trace du dit inhibiteur. 20. Une méthode selon les revendication 8-15, caractérisée en ce que du charbon est rajouté à la dite culture lors de la préparation des dits caroténoïdes. 21. Une composition selon l'une quelconque des revendications 1-7, caractérisée en ce que le phytoène est préparé par synthèse chimique. 22. Une composition selon chacune des revendications 1-7, caractérisée en ce que le dit phytoène est préparé par méthodes de recombinaison génétique.