FR 2800384 A1 20010504 FR 9913506 A 19991028 Composition de marquage d'un produit solide ou liquide et procédé de fabrication d'une telle composition L'invention concerne une composition de marquage d'un produit solide ou liquide et le procédé de fabrication d'une telle composition. L'invention concerne plus particulièrement une composition de marquage d'un produit solide ou liquide, comprenant des microsphères et des molécules fluorescentes, permettant une traçabilité secrète de produits. Il est connu dans l'art antérieur de marquer des produits liquides ou solides, io par l'intermédiaire de microsphères ou microperles chargées de fluorescence, afin de permettre d'identifier et/ou de contrôler les mouvements des produits. Le brevet WO 94 04918 concerne une méthode de marquage de matériau, plus particulièrement de liquide, en ajoutant au liquide un additif comprenant des particules telles que des microsphères qui sont reconnues par des moyens de détection. Les microsphères sont constituées de matériaux polymères présentant un diamètre compris entre 0, 05 et 100 pm. Les moyens de détection peuvent être constitués par des composés fluorescents incorporés dans les microsphères et des molécules d'ADN liées par une liaison covalente aux microsphères. Les composés fluorescents, utilisés comme marqueurs, permettent d'observer par microscopie les microsphères qui demeurent invisibles à l'oeil nu et les microsphères servent à localiser les molécules d'ADN et de support à l'ADN, les molécules d'ADN servant de traceur. Ainsi des microsphères chargées de molécules fluorescentes peuvent être additionnées à un liquide tel qu'un hydrocarbure, un vernis ou une encre par exemple. Un échantillon de liquide peut être prélevé et observé par un microscope sous une source de lumière pour permettre de dépister la fluorescence et ainsi de localiser les microsphères. Lorsque les microsphères sont localisées, les molécules d'ADN peuvent être prélevées et être amplifiées par la technologie PCR 2 2800384 (Polymerise Chain Reaction) par l'intermédiaire de la clé moléculaire complémentaire des séquences des brins afin d'identifier les séquences et par conséquent le produit marqué. De telles microsphères fluorescentes invisibles à l'oeil nu permettent ainsi de tracer secrètement les produits. L'incorporation des molécules fluorescentes dans les microsphères peut être effectuée lors de la polymérisation des microsphères. De telles microsphères présentent une faible fluorescence et nécessitent des moyens très précis pour la détecter. Une autre méthode consiste à mélanger dans un solvant les microsphères avec les molécules fluorescentes, les microsphères se dilatant, sous l'effet du solvant ou d'une augmentation de la température, s'imprègnent de molécules fluorescentes. Une baisse de température ou l'évaporation du solvant permet ensuite d'emprisonner les molécules fluorescentes à l'intérieur des microsphères. Pour présenter un intérêt dans le domaine du marquage de produits, is les microsphères doivent préserver leur fluorescence dans le temps. Or, Il s'avère que lorsque ces microsphères sont placées dans un milieu agressif tel qu'un milieu solvant, les microsphères perdent leur fluorescence. Selon la nature du solvant, la nature du polymère utilisé et éventuellement les conditions de température, les microsphères se dilatent et libèrent les composés fluorescents. Les molécules fluorescentes n'étant plus associées aux microsphères, les microsphères ne peuvent plus être localisées et ne remplissent plus leur rôle de marquage. Dans certains cas, les microsphères sont totalement détruites par le solvant. Les différentes techniques d'accroche des fluorescences sur les sphères ne permettent pas à ce jour d'assurer le marquage de certains produits. D'autre part, hormis le fait que ces microsphères fluorescentes ne peuvent être utilisées dans les environnements agressifs, les différentes molécules fluorescentes utilisées à ce jour dans le domaine du marquage de produits ne permettent pas d'obtenir un marquage durable, la fluorescence ne tenant pas dans le temps. 3 2800384 Par ailleurs, la société Molecular Probes commercialise sous la marque "ALEXA" des fluorescences stables présentant une terminaison succinimidyl ester qui réagit avec une amine primaire d'une protéine. Cette gamme de fluorescences est utilisée dans le domaine de la biologie. Un but de l'invention est de proposer un procédé de fabrication d'une composition de marquage de produits solides ou liquides, basée sur l'utilisation de microsphères fluorescentes, dont la fluorescence tient dans le temps et dans les environnements agressifs tels que les solvants. Ce but est atteint par le fait que le procédé comporte les caractéristiques de la revendication 1. D'autres particularités sont définies dans les caractéristiques des revendications 2 à 10. Un autre but de l'invention est de proposer une composition de marquage de produits solides ou liquides dont la fluorescence tient dans le temps et dans les environnements agressifs tels que les solvants. Ce but est atteint par le fait que la composition comporte les caractéristiques de la revendication 11. D'autres particularités sont définies dans les caractéristiques des revendications 12 à 17. Selon une autre particularité, la composition de marquage selon l'invention est utilisée pour le marquage de vernis ou d'encres. Selon une autre particularité, la composition de marquage, selon l'invention, est utilisée pour le marquage de matériaux polymères ou de colle. Selon une autre particularité, le procédé de fabrication consistant à créer une liaison covalente entre des molécules fluorescentes et des microsphères est utilisé pour l'étude comportementale de molécules fluorescentes. D'autres particularités et avantages de la présente invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description ci-après faite en 4 2800384 référence au dessin annexé dans lequel la figure unique représente une réaction de couplage selon l'invention d'une microsphère avec une molécule fluorescente. La composition de marquage, selon l'invention, comprend des microsphères ou microperles et des molécules fluorescentes reliées entre elles par des liaisons covalentes, par exemple de type amide. Cette liaison chimique entre les molécules fluorescentes et les microsphères est obtenue en faisant réagir des microsphères présentant des terminaisons amines (NH2) avec des molécules fluorescentes présentant des terminaisons io réactives aux amines primaires. Cette liaison chimique assure une liaison stable quel que soit l'environnement. La désignation "molécules fluorescentes" représente toutes molécules dont la fluorescence peut être observée par un moyen de détection tel qu'un microscope à épifluorescence. Les microsphères, dont la taille peut varier de 0,05 pm à 100 pm, peuvent être de natures différentes organiques ou minérales. Selon un mode de réalisation, les microsphères sont constituées de microsphères poreuses de silice greffées d'amines primaires. La porosité des microsphères peut bien entendu varier. La surface active des microsphères, définie par le nombre de sites amines, est fonction de la porosité de celle-ci. A titre d'exemple, les microsphères poreuses de silice sont de type "Uptisphères NH2" commercialisées par la société InterChim ou de type "Exsil Amino" commercialisées par la société YMC, ces microsphères étant traditionnellement utilisées dans les colonnes de chromatographie. Elles présentent par exemple une porosité de l'ordre de 100 à 120 A. Afin d'assurer une réaction de marquage optimale, les microsphères doivent être parfaitement propres. Les molécules fluorescentes utilisées dans la présente invention peuvent être observées au moyen d'un microscope à lampe à vapeur de mercure ou xénon en utilisant un jeu de filtres adapté aux longueurs d'ondes d'excitation et d'émission de la molécule fluorescente. Ce jeu de filtres 2800384 permet de mettre en évidence les molécules fluorescentes en améliorant le contraste entre la sphère et l'environnement dans lequel se trouve la sphère. Afin d'assurer l'efficacité du produit de marquage, les molécules fluorescentes utilisées doivent résister à une exposition prolongée à la s lumière du jour de 30 jours minimum et à une exposition minimum de 3 minutes à la source d'excitation constituée par la lampe de mercure ou xénon montée sur un microscope. Les molécules fluorescentes se dissolvent dans l'eau ou tout autre solvant afin de permettre la réaction de marquage ou couplage entre les molécules fluorescentes et les microsphères. A titre d'exemple, la gamme de molécules de la société Molecular Probes, commercialisée sous la marque "ALEXA", peut être utilisée. La gamme "ALEXA" comprend des molécules fluorescentes à terminaison succinimidyl ester de différentes longueurs d'onde d'excitation et d'émission à la vapeur de mercure. Ces molécules sont conditionnées sous forme déshydratée dans des tubes de polypropylène et actuellement commercialisées dans des kits de marquage de protéines. Ces molécules fluorescentes, utilisées dans le domaine du marquage de protéines, présentent une fluorescence stable qui tient dans le temps. La terminaison succinimidyl ester de cette molécule fluorescente permet de former une liaison carboxamide entre la microsphère et la molécule fluorescente selon la réaction illustrée à la figure 1, sur laquelle - "A" représente une microsphère greffée d'amine primaire (NH2), - "B" représente la molécule fluorescente présentant une terminaison succinimidyl ester, "R." étant le groupement fluorescent de la molécule, - "C" représente la microsphère fluorescente, et - "D" représente le composé secondaire de la réaction. Suivant la nature de la liaison, une solution tampon peut être ajoutée lors de la réaction de marquage afin d'ajuster les conditions de pH et optimiser la réaction. Dans le cas d'une terminaison succinimidyl ester, le pH du mélange doit être compris entre 7,8 et 8,5. Le pH est augmenté par 6 2800384 l'addition d'une solution tampon dépourvue d'ions ammonium ou d'amines primaires afin d'éviter toutes réactions parasites. A titre d'exemple, une solution de bicarbonate de sodium peut être utilisée comme solution tampon. Un exemple de réaction de marquage selon l'invention va à présent être décrit. Dans cet exemple, la réaction consiste à faire réagir des microsphères poreuses de silice aminée avec des molécules fluorescentes de type "ALEXA", pour obtenir des microsphères de silice fluorescentes. Le procédé de fabrication comprend les étapes suivantes: - dans un bêcher, par exemple de 40 ml, mettre 0,2 g de microsphères déshydratée dans 3 ml d'eau déminéralisée; - additionner 0, 5 ml de bicarbonate de sodium à 1 M pour obtenir un pH de l'ordre de 8, 3 (+/-0, 1); - amener un tube contenant 0,1 mg de molécule fluorescente à température ambiante; - mettre 1 ml d'eau déminéralisée dans le tube contenant les molécules fluorescentes, fermer le tube et le renverser plusieurs fois pour bien dissoudre les molécules fluorescentes - verser le contenu du tube dans le bécher, rincer le tube avec 1 ml d'eau déminéralisée et verser l'eau de rinçage dans le bécher; - agiter magnétiquement avec une barre d'agitation pendant approximativement une heure à température ambiante; - évaporer l'eau. Ce procédé permet ainsi d'obtenir des microsphères de silice fluorescentes déshydratées. Le contrôle du marquage des microsphères peut être effectué par observation au microscope à épifluorescence. Une répartition homogène des molécules fluorescentes sur les microsphères est obtenue par un bon dosage de la quantité de fluorescence utilisée par gramme de microsphères. Ce dosage, qui peut être défini de façon empirique, est fonction de la réactivité des microsphères et des molécules fluorescentes. Le dosage 7 2800384 dépend ainsi de plusieurs paramètres. Ces paramètres sont la densité et la porosité des microsphères, le nombre de sites amines (NH2) disponibles par microsphère, l'activité des molécules fluorescentes, la masse molaire de la molécule fluorescente et le volume de la réaction. Une réaction d'hydrolyse de la terminaison succinimidyl ester peut venir diminuer l'activité des molécules fluorescentes. Cette réaction secondaire, dépendante du volume de la réaction, reste relativement lente pour un pH inférieur à 9. Quantitativement le marquage se caractérise par le rapport R du nombre de molécules fluorescentes dépensées par gramme de microsphères marquées. Dans l'exemple décrit précédemment, le rapport R est de l'ordre de 0,5 o/00. Pour leur conservation, les microsphères de silice fluorescente seront protégées de la lumière, par exemple dans un flacon de polypropylène ambré, conservé à une température de l'ordre de 4 C. Les microsphères, conservées sous forme de poudre, peuvent être utilisées telles quelles dans différentes applications. Pour le marquage ou la traçabilité secrète de liquides, tels que des hydrocarbures, vernis ou boues, les microsphères sont mises en solution dans un solvant miscible au liquide que l'on désire marquer. Des additifs tels que des mouillants ou dispersants peuvent être ajoutés pour assurer une dispersion homogène des microsphères fluorescentes de silice dans les différentes solutions. Suivant la concentration en molécules fluorescentes, I'observation d'un échantillon d'un produit liquide marqué peut être précédée d'une étape de concentration ou de récupération des microsphères fluorescentes, par exemple, par un procédé de centrifugation ou un procédé de récupération magnétique basé sur l'utilisation de microsphères magnétiques. Les microsphères fluorescentes selon l'invention peuvent être insérées dans une encre ou vernis. L'encre ou le vernis peuvent ensuite être appliqués sur différents supports, tels que des emballage, afin de marquer ledit support et les produits qu'il contient. A titre d'exemple, les microsphères peuvent être 8 2800384 mises en solution dans un solvant alcool/ester pour le marquage d'encres d'héliogravure ou de flexographie. Un solvant (cyclohexanone/ Ethoxypropylacetate) peut être utilisé pour la traçabilité des encres et vernis de tampographie. D'autres types de solvant peuvent être utilisés pour le marquage d'encres et vernis utilisés dans les procédés "offset" ou de sérigraphie. Les microsphères sont mises en solution dans l'eau pour le marquage de systèmes aqueux. Les microsphères fluorescentes selon l'invention peuvent également être insérées dans des produits lors de leur fabrication, tels que dans la résine utilisée pour la fabrication de contre- plaqués. Les microsphères fluorescentes peuvent être utilisées pour le marquage de colle ou de matériaux polymères, tels que PE, PP ou PVC. Pour le marquage, par exemple, de produits en matériau plastique obtenus par injection ou extrusion, les microsphères fluorescentes peuvent être mises en solution dans un solvant adéquat, et déposées avec les granulés de matériau plastique avant l'étape d'injection ou d'extrusion. Les microsphères peuvent également être insérées en tant qu'additif lors de l'étape de polymérisation du matériau polymère. La nature physique des microsphères peut être choisie en fonction de l'utilisation qui en sera faite. Les microsphères de silice seront de préférence utilisées pour le marquage de produits très agressifs, ou destinés à être portés à haute température. Les températures de fabrication de produit en matériau polymère étant souvent élevées, I'utilisation de microsphères de silice peut être particulièrement utile pour le marquage de produits en matériau polymère. Des microsphères constituées de polymère ou de copolymère, présentant des terminaisons amines, peuvent bien entendu être envisagées. Bien entendu différents types de liaison covalentes peuvent être envisagés entre la microsphère et la molécule fluorescente. Dans le cas de liaison de type amide, des fluorescences présentant des terminaisons isothiocyanate ou chlorure de sulfonyle peuvent être utilisées pour former respectivement des liaisons thio-urée et sulfonamide. 9 2800384 Le choix de la taille des microsphères est effectué en fonction de leur application. Dans le cas de l'insertion de microsphères fluorescentes dans une encre opaque destinée à être appliquée sur des produits pour leur marquage, la taille des microsphères sera fonction de l'épaisseur de la couche d'encre déposée. Afin d'éviter qu'un grand nombre de microsphères fluorescentes ne soient perdues dans la masse d'encre déposée et que seules les microsphères fluorescentes de surface soient visibles au microscope, la taille des microsphères est sensiblement égale à l'épaisseur de la couche d'encre opaque. Selon le procédé d'application de l'encre, la io couche peut atteindre une épaisseur de 30 à 100 pm ou être de l'ordre de 1,5 à 2 pm, obtenue, par exemple, par un procédé d'héliogravure. Dans le cas de vernis déposés sur des produits ou de matériaux polymères translucides, la taille des microsphères a peu d'importance étant donné que la fluorescence des microsphères comprises dans la masse pourra être observée à travers le vernis ou le matériau polymère. Dans le cas du marquage de liquides tels que des hydrocarbures ou des boues, la taille des microsphères peut être fonction du procédé de concentration utilisé. Dans le cas de produit en matériau polymère opaque, seules les microsphères de surface du produit ou d'un échantillon de matériau polymère découpé peuvent être observées. Selon un mode de réalisation, les microsphères fluorescentes selon l'invention sont associées à un traceur, de type ADN, pour assurer l'inviolabilité du marquage. Les molécules d'ADN synthétiques peuvent être déposées en même temps que les microsphères sur les produits à marquer, les microsphères servant alors uniquement à localiser les brins d'ADN. Pour le marquage de liquides, des brins d'ADN peuvent être liés chimiquement aux microsphères fluorescentes en utilisant les terminaisons amines des microsphères dans le cas de microsphères de silice aminée. Les brins d'ADN seront liés par une liaison de type amide aux microsphères. Cette réaction peut être effectuée avant ou après la réaction de marquage des 2800384 microsphères avec les molécules fluorescentes décrites précédemment. Dans le cas de microsphères de polymères ou copolymères, des liaisons covalentes de différentes natures peuvent être envisagées. La composition de marquage, selon l'invention, permet de réaliser un marquage efficace et durable d'un grand nombre de produits qui demeurait impossible par les techniques d'accroche entre les microsphères et les molécules fluorescentes de l'art antérieur. De plus, le procédé de fabrication selon l'invention, consistant à créer une liaison covalente entre les molécules fluorescentes et les microsphères, peut être utilisé pour faciliter l'étude des comportements de molécules fluorescentes, tels que la durée de vie de la fluorescence. Dans le cas, par exemple, de molécules fluorescentes destinées au marquage de protéines, il est plus facile d'étudier le comportement de la molécule sur un support tel qu'une microsphère que sur une protéine. La présence d'une liaison covalente stable entre la molécule fluorescente et la microsphère permet d'assurer une étude comportementale efficace de la molécule fluorescente. Dans le cas de molécules fluorescentes destinées aux protéines, l'étude sur microsphère selon l'invention est d'autant plus réaliste que les accroches entre la molécule fluorescente et la microsphère et entre la molécule fluorescente et la protéine sont de même nature, constituées chacune par une liaison covalente. D'autres modifications à la portée de l'homme de métier font également partie de l'esprit de l'invention. l 2800384 REVENDICATIONS 1. Procédé de fabrication d'une composition de marquage de produits solides ou liquides, comprenant des microsphères et des molécules fluorescentes, caractérisé en ce qu'il consiste à créer une liaison covalente entre les molécules fluorescentes et les microsphères. 2. Procédé de fabrication d'une composition de marquage de produits solides ou liquides, comprenant des microsphères et des molécules fluorescentes, caractérisé en ce qu'il consiste à créer une liaison covalente entre les molécules fluorescentes et les microsphères en faisant réagir des microsphères présentant des terminaisons amines primaires avec des molécules fluorescentes présentant des terminaisons réactives avec les amines primaires. 3. Procédé selon la revendication 2, la réaction consiste à faire réagir des microsphères poreuses de silice, présentant à la surface des greffes d'amines primaires, avec des molécules fluorescentes présentant des terminaisons réactives avec les amines primaires. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la molécule fluorescente présente une terminaison succinimidyl ester réagissant avec les greffes d'amines des microsphères de silice pour former des liaisons carboxamide. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la molécule fluorescente est une molécule commercialisée sous la marque "ALEXA". 6. Procédé selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que les microsphères sont de type "Uptisphères NH2" commercialisées par la société InterChim ou de type "Exsil Amino" commercialisées par la société YMC. 12 2800384 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de mise dans un solvant de microsphères déshydratées; - une étape d'addition d'une solution tampon pour obtenir un pH déterminé; - une étape de mise en solution dans un solvant de molécules fluorescentes déshydratées; - une étape de mélange et d'agitation pendant un temps déterminé de la solution de molécules fluorescentes et des microsphères, à une io température déterminée; - et une étape d'évaporation du solvant. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de mise dans de l'eau déminéralisée de microsphères poreuses de silice, déshydratées; - une étape d'addition d'une solution tampon pour obtenir un pH compris entre 7, 8 et 8,5; - une étape de mise en solution dans de l'eau déminéralisée de molécules fluorescentes déshydratées présentant une terminaison succinimidyl ester; - une étape de mélange et d'agitation pendant approximativement une heure, de la solution de molécules fluorescentes et des microsphères, à température ambiante; - et une étape d'évaporation du solvant. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'addition d'un traceur constitué par des brins d'ADN. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de couplage des brins d'ADN avec les microsphères. 13 2800384 11. Composition pour le marquage de produits liquides ou solides caractérisée en ce qu'elle comprend des microsphères présentant des liaisons covalentes avec des molécules fluorescentes. 12. Composition de marquage selon la revendication 11, caractérisée en ce que les molécules fluorescentes sont liées aux microsphères par des liaisons de type amide. 13. Composition de marquage selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend des microsphères présentant des liaisons carboxamide avec des molécules fluorescentes. 14. Composition de marquage selon la revendication 13, caractérisée en ce que les microsphères sont des microsphères poreuses de silice présentant des greffes d'amines (NH2) assurant l'établissement de liaison carboxamide avec les molécules fluorescentes. 15. Composition de marquage selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend des traceurs constitués de brins d'ADN. 16. Composition de marquage selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisée en ce que des traceurs, constitués de brins d'ADN, sont liés par une liaison covalente aux microsphères. 17. Composition de marquage selon l'une des revendications 10 à , caractérisée en ce qu'elle comprend des microsphères de 0,05 à 100 microns. 18. Utilisation d'une composition de marquage selon l'une des revendications 11 à 17 pour le marquage d'un vernis ou d'une encre. 19. Utilisation d'une composition de marquage selon l'une des revendications 11 à 17 pour le marquage de matériaux polymères ou de colle. 20. Utilisation du procédé de fabrication consistant à créer une liaison covalente entre des molécules fluorescentes et des microsphères 14 2800384 selon l'une des revendications I à 10, pour l'étude comportementale de molécules fluorescentes.