FR 2803600 A1 20010713 FR 0000237 A 20000110 PROMOTEUR DE PLANTE FRUIT SPÉCIFIQUE. La présente invention concerne une séquence d'ADN possédant une activité de promoteur transcriptionnel dirigeant l'expression du ou des gènes placés sous son contrôle dans les fruits d'une plante. L'invention concerne également une molécule d'acide nucléique recombinant comme un vecteur comprenant ledit promoteur, ainsi que des cellules de plantes et des plantes transgéniques ayant incorporé dans leur génome ce promoteur. Les progrès réalisés en matière d'ingénierie génétique ont permis d'introduire des gènes exogènes dans le génome de plantes. Grâce à ce procédé de transformation génétique, désigné aussi transgenèse, il est actuellement possible de produire des plantes avec des caractéristiques agronomiques bien déterminées. Les fruits et légumes présentant un secteur d'une grande importance économique et sociale, l'optimisation des qualités gustative (arômes, texture), nutritionnelle (vitamines, teneur en sucres et fibres) et esthétique (calibre, forme, couleur) des fruits est une des priorités actuelles. La transgenèse appliquée aux espèces fruitières permet à un niveau fondamental, de mieux comprendre les mécanismes moléculaires associés aux processus de maturation, et à un niveau plus appliqué, de moduler certaines propriétés du fruit. Cette modulation peut s'effectuer au niveau de l'expression de certains gènes dont les fonctions sont impliquées dans la qualité du fruit. Il est important de cibler la régulation de ces gènes dans l'organe concerné, en l'occurrence le fruit, car une dé-régulation dans la plante entière peut avoir des répercutions néfastes tant au niveau physiologique (développement, résistance aux maladies, etc...) qu'au niveau de la productivité du plant. La régulation de l'expression des gènes est contrôlée notamment par les promoteurs qui sont des régions régulatrices inhérentes aux gènes. Ainsi, afin de mieux comprendre mais aussi d'améliorer la qualité des fruits par une approche moléculaire, il s'avère indispensable d'isoler des promoteurs qui dirigent l'expression de gènes spécifiquement dans le fruit et à un moment précis de leur développement. Quelques promoteurs ont été isolés chez la tomate, le fruit le plus communément étudié, présentant chacun des caractéristiques bien spécifiques. On peut citer par exemple : - le promoteur 2A11 (6,7) décrit dans la brevet US No. 4,943,674 , qui dirige l'expression de gènes lors des premiers stades de développement du fruit avec une efficacité réduite, - les promoteurs TFM7 et TFM9, décrits dans le brevets US No. 5,608,150, qui dirigent fortement l'expression des gènes au cours des premiers stades de développement du fruit, - les promoteurs E4 (4), E8 (5) et le promoteur de la polygalacturonase (1) qui dirigent l'expression au cours du développement tardif du fruit et de manière spécifique. Il apparaît donc utile de disposer d'autres promoteurs avec des caractéristiques différentes et notamment des promoteurs qui dirigent l'expression de gènes de manière spécifique dans le fruit, de manière efficace, et à un moment précis du développement. Il convient aussi de réguler l'expression de gènes dès les premiers stades de maturation, car c'est pendant cette phase de transition que certains processus moléculaires en liaison avec la qualité du fruit se mettent en place. Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont précisément permis d'isoler un nouveau promoteur à partir du génome de fraise sauvage (Fragaria vesca cv Reine des vallées) présentant des propriétés remarquables de spécificité dans le fruit, d'efficacité, d'inductibilité dés les premiers stades de maturation du fruit, ainsi que d'adaptabilité à d'autres espèces fruitières, comme la tomate ou le raisin. En conséquence, l'invention a pour objet un promoteur qui dirige sélectivement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits de plantes, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence No. 1 de la liste de séquence en annexe, son brin complémentaire ou un dérivé de celles-ci. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à la séquence de promoteur comprise entre les nucléotides aux positions 1 et 1393, son brin complémentaire ou un dérivé de celles-ci présentant une activité de promoteur qui dirige sélectivement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits de plantes. On entend par dérivé d'une séquence de promoteur selon l'invention, les séquences ci-dessus modifiées par délétion, substitution ou insertion d'un ou plusieurs nucléotides, et conservant une activité de promoteur orientant sélectivement l'expression des séquences d'ADN placées sous leur contrôle dans les fruits de plantes. Il s'agit par exemple de séquences ayant au moins 60 % et de préférence au moins 80 % d'homologie avec la séquence No. 1 de la liste de séquence en annexe. De tels dérivés sont plus particulièrement les séquences des promoteurs d'autres rosacées homologues à celui du génome de fraise sauvage (Fragaria vesca cv Reine des vallées) isolé dans le cadre de la présente invention. L'homme du métier est à même de déterminer, à partir de tests du type de ceux rapportés dans la partie expérimentale ci-après, si lesdits dérivés présentent une activité de promoteur orientant sélectivement l'expression des séquence d'ADN placées sous leur contrôle dans les fruits de plantes conformément à la présente invention. Un promoteur selon l'invention ouvre des perspectives très importantes dans le domaine Industriel par la création de nouvelles variétés mais aussi dans le domaine de la Recherche tant fondamentale qu'appliquée. Dans le domaine de la recherche, la création de fraisiers transgéniques portant la construction de ce promoteur associé à un gène soit d'intérêt agronomique soit de fonction mal définie, permet de comprendre le rôle de ces gènes dans les processus de maturation des fruits. C'est le seul outil actuel qui permette de comprendre le rôle de gènes et de leur produit in vivo et leurs effets sur la maturation des fruits. Au niveau industriel, les gènes connus pour influencer les qualités organoleptiques des fruits (perte de fermeté, évolution de la couleur, dégagement d'arômes, acquisition de la saveur) peuvent être intégrés dans des fraisiers en aval de ce promoteur afin d'exacerber (gène en position sens) ou de réduire (gène en position anti-sens) les effets associés à ces gènes. Des gènes supposés influer la qualité sont actuellement connus et leur impact sur les processus de maturation peuvent être analysé in vivo comme certaines hydrolases pariétales impliquées dans la perte de fermeté des fruits (cellulase, Pectine Methyl Transferase, Polygalacturonase, P-galactosidase, expansines, etc...), des enzymes de biosynthèse des caroténoïdes et d'anthocyanes (phytoène synthase, zeaxantine oxydase, etc ...), des enzymes intervenant dans le métabolisme des sucres (invertase, sucrose phosphate synthase, sucrose synthase, etc...) etc.... Ainsi, le promoteur selon l'invention permet de cibler l'expression d'un gène de manière spatio-temporelle dans le fruit dès le stade tournant (correspondant au déclenchement des processus de maturation) et de manière progressive au cours de la maturation. Il diffère des promoteurs actuellement utilisés comme : - le promoteur 35S CAMV qui dirige l'expression des gènes de manière constitutive dans la plante, ou - certains promoteurs de tomate qui dirigent l'expression des gènes dans les stades précoces ou tardifs du développement du fruit et parfois avec un rendement faible. Ces différences sont fondamentales car le promoteur selon l'invention dirige l'expression des gènes dans le fruit à un stade commercialisable (stade tournant jusqu'au stade mûr). L'invention concerne donc aussi une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant une séquence de promoteur comme défini précédemment lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant un ou plusieurs gènes, éventuellement un gène de sélection placé sous le contrôle de son propre promoteur ou du même promoteur que ladite séquence d'acide nucléique, et avantageusement une séquence de terminateur placé en aval de ladite séquence d'ADN. Le ou lesdits gène(s), autre que le gène de sélection, sont avantageusement des gènes, en position sens ou antisens, codant une protéine d'intérêt agronomique. Comme indiqué précédemment, il s'agit par exemple de protéine capable d'influencer les qualités organoleptiques des fruits, de préférence des fraisiers. Une molécule d'acide nucléique recombinant selon l'invention peut être une cassette ou un vecteur pour l'expression d'un ou plusieurs gènes d'intérêt dans une cellule végétale. Un vecteur utile pour la transformation d'un hôte de type plante comprend : - un ou plusieurs gènes qui code(nt) pour une ou plusieurs protéines d'intérêt, placé(s) sous le contrôle du promoteur de l'invention, - un gène pour une sélection génétique dans des cellules de plante, placé sous le contrôle du même promoteur ou d'un promoteur différent de celui ci-dessus. L'invention concerne donc également des cellules végétales dans le génome desquelles est incorporé de façon stable une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant le promoteur défini précédemment lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi exprimé seulement sous le contrôle du promoteur. L'invention concerne encore une plante ayant incorporé de manière stable dans son génome une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant le promoteur défini précédemment lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi exprimé seulement dans les fruits de la plante. Des plantes transgéniques selon l'invention peuvent être préparées de façon classique en transformant une cellule végétale avec ladite molécule d'acide nucléique puis en régénérant une plante a partir de la cellule transformée. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant l'isolement du promoteur de l'invention désigné FPl et la transformation de plantes avec des constructions le contenant, et où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : - la figure 1 représente l' expression du gène lié au promoteur FP1 au cours du développement de la fraise sauvage et de la fraise commerciale (technique de northern- blot), - la figure 2 représente la présence du gène lié au promoteur FP1 chez la fraise sauvage et chez d'autres espèces fruitières (technique de Southern-blot). 1) Isolement du promoteur spécifique de fruit FP1. Un criblage différentiel d'une banque d'ADNc de fraise mûre a été réalisé avec des sondes d'ADNc issus de fraises vertes ou mûres. Les ADNc présents en abondance chez la fraise mûre et aucunement chez le fruit vert ont été sélectionnés. L'expression des gènes associés à ces ADNc a été analysée sur des populations d'ARN totaux (technique de Northern-blot) issus de 3 stades de développement du fruit. Parmi ces clones, un correspond à un gène qui s' exprime de manière progressive et abondante au cours de la maturation du fruit. L'analyse de la séquence de l'ADNc avec les banques de données ne montre aucune homologie avec des séquences connues. L'isolement du gène et de la région promotrice a été effectué par PCR inverse. Le gène présente 3239 pb avec 2 exons de 810 et 558 pb intercalés d'un intron de 230pb et terminé par une région 3' de 220 pb. La région promotrice est constitué de 1421 pb. 2) Expression fruit-spécifique (technique de Northern-blot). L'expression de ce gène a été analysée au cours du développement de la fraise et dans divers tissus de la plante-mère. Comme le montre la figure 1, les messagers s' accumulent dans le fruit dés le stade tournant ( fraise blanche) et sont abondamment présents pendant les phases de maturation. Aucune expression du gène n'est détectée dans divers tissus de la plante comme la feuille, la tige, la fleur, la racine et les graines de la fraise (les achènes). Ce gène est exprimé de manière similaire chez la fraise commerciale comme il est illustré dans la figure 1. 3) Présence du gène chez la fraise et d'autres espèces. La technique de southern-blot a mis en évidence l'existence de deux gènes chez la fraise sauvage. Cette technique appliquée à d'autres espèces fruitières a montré que ce gène est conservé chez d'autres rosacées (pommier, abricotier, pêcher). La figure 2 présente les résultats du southern-blot dont les bandes d'hybridation intenses (par rapport au bruit de fond) révèlent la présence de gènes homologues. 4) Fusion de promoteur FP1 et du gène gus. La transformation génétique s'effectue par le biais d'Agrobacterium tumefaciens et de vecteurs binaires contenant la construction chimérique du promoteur fusionné avec le gène gus. Le gène gus a la propriété de coder pour l'enzyme (3-glucuronidase dont l'activité est facilement détectable soit par coloration directe des tissus (technique histochimique), soit par enzymologie (technique de dosage fluorimétrique). Le plasmide binaire utilisé est le plasmide pBi101, dérivé du vecteur pBIN19 (2). Ce vecteur possède (i) une origine de réplication RK2 à faible nombre de copies, (ii) un gène nptll permettant la sélection des bactéries transformées sur kanamycine, (iii) les bornes RB et LB assurant le transfert de l'ADN placé entre ces bornes. Cet ADN de transfert est constitué d'un gène nptII encadré du promoteur et terminateur NOS (NOS-Pr et NOS-Ter) permettant la sélection des plantes transformées, d'un gène gus de 1,87 Kb sans promoteur (gène issu du plasmide pRAJ260) inséré au site KpnI dans la région de multiclonage, le terminateur NOS de 260pb cloné SstI-EcoRI dans la région de multiclonage (2). Suivant la taille des promoteurs à insérer dans cette cassette et la conservation du cadre de lecture ouvert du gène gus, 3 plasmides pBI101 ont été construit distincts de 1 pb (pBI101.1, pBilOl.2, pBi101.3). Le plasmide pBi101.2 a été utilisé pour réaliser la fusion entre le promoteur FP1 et le gène gus. La séquence promotrice a été amplifiée avec des amorces spécifiques auxquelles ont été ajoutées les séquences des sites de restriction : - amorce 5', où le site SmaI est souligné: AAACCCGGGCCTTGGTTCAGTGTTCTG, - amorce 3', où le site EcoRV est souligné : AAAGATATCCATACGATGGAGGAGTGA). Cet ADN amplifié de 1511pb correspond à 1393 pb de la région promotrice et à 118 pb du premier exon. La ligation de cet ADN dans la cassette du plasmide s'est effectuée à partir de bouts francs générés par la digestion SmaI du plasmide pBi101.2 et après digestion de l'ADN par SmaI et EcoRV rendu bouts francs. Le plasmide ainsi obtenu est appelé pBiFP1 et contient entre les bornes LB et RB: - le fragment d'ADN de 1511 pb dont 1393 pb du promoteur FP1 et 118 pb du premier exon - le gène gus et NOS-Ter - le gène nptII encadré de NOS-Pr et NOS-Ter. 5) Virulence des Agrobactéries C58GV2260 et AGL1. Quatre souches d'agrobactéries, AGL1, C58GV2260, C58pMP90 et LBA4404 ont été testées pour leur virulence sur fraisiers. Deux souches, AGL1 et C58GV2260, ont donné des rendements d'infection et de transfert d'ADN considérables et ont été sélectionnées pour être transformées par la construction plasmidique décrite précédemment . AGL1 . chromosome C58 (résistance à la Rifampicine), plasmide Ti de la souche B0542 (résistance à l'ampicilline). C58GV2260 : chromosome C58 (résistance à la Rifampicine), plasmide Ti de la souche B6806 (résistance à l'ampicilline). Une fois transformées par le vecteur, les souches ont été dénommées A et B respectivement. 6) Transformation de fraisiers avec la construction chimérique. Un protocole efficace de transformation génétique par Agrobacterium tumefaciens a été mis au point sur le fraisier sauvage. Des explants foliaires d'environ 0,5 cm2 sont découpés à partir de feuilles âgées d'environ 6 à 8 semaines sur des plants de fraisiers cultivés in vitro. Ils sont transférés sur un milieu de régénération (milieu Murashige et Skoog, 3% de sucrose, 0.1% vitamine de Gamborg (B5), 18 uM de Benzyle Amino Purine, 2.5uM d'Acide Indol-3 butyrique). Vingtquatre heures après, les explants sont mis au contact des solutions d'Agrobactéries (A ou B). La concentration des Agrobactéries est évaluée à 1.109 cellules/ml. La co-culture est réalisée à 28 C pendant 1 heure avec agitation à 100 rpm. Les explants sont ensuite égouttés sur du papier filtre stérile et disposés sur le milieu de régénération en présence de 100 uM d'acétosyringone. Quarante huit heures après, les explants sont transférés sur le milieu de régénération avec 500mg/1 de timentin. Les explants présentant des boursouflements et des formations calleuses sont repiqués toutes les 3 semaines sur du milieu de régénération neuf avec 500mg/l de timentin. Les premières pousses apparaissent 2 mois après transformation et sont repiquées individuellement sur du milieu d'élongation (milieu Murashige et Skoog, 3% de sucrose, 0,1% vitamine de Gamborg (B5), 2,5 uM de Benzyle Amino Purine, 1,25 M d'Acide Indol-3 butyrique) en présence de 500 mg/1 de timentin et 25 mg/1 de kanamycine. Six semaines plus tard, les pousses suffisamment développées sont disposées sur un milieu d'enracinement (milieu MS/2, 3% de sucrose, 0,1 % vitamine de Gamborg (B5)) en présence de 100 mg/1 de timentin et 25 mg/1 de kanamycine. Les plantes transformées produisent des racines environ 2 à 4 semaines après repiquage. Les plantules présentant de racines longues d'environ 2 cm sont acclimatées dans des pots avec du terreau dans des chambres de culture à 22 C avec une photopériode de 18 heures de lumière et 6 heures d'obscurité avant leur transfert dans des serres. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1) Atkinson RG, Bolitho KM, Wright MA, iturriagagoitia-Bueno T, Reid SJ, Ross GS. Apple ACC- oxidase and polygalacturonase : ripening-specific gene expression and promoter analysis in transgenic tomato. Plant Mol Biol 38 : 449-460 (1998) 2) Bevan M, Barnes WM, Chilton MD. Structure and transcription of the nopaline synthase gene region of T-DNA. Nucleic Acids Res. 11 (2) : 369-385 (1983) 3) Bevan M. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Res.12 (22) 8711-8721 (1984). 4) Cordes S, Deikman J, Margossian LJ, Fisher RL. Interaction of a developmentally regulated DNA-binding factor with sites flanking two différent fruit-ripening genes from tomato. Plant Cell 1 (10):1025-1034 (1989) 5) Deikman J, Fisher RL : Interaction of a DNA binding factor with the 5'-flanking region of an ethylene- responsive fruit ripening gene from tomato. EMBO J 7 (11) : 3315-3320 (1988) 6) Van Haaren MJ, Houck CM. Strong negative and positive regulatory elements contribute to the high-level fruit-specific expression of the tomato 2A11 gene. Plant Mol Biol.17 (4) : 615-630 (1991) 7) Van Haaren MJ, Houck CM. A functional map of the fruit-specific promoter of the tomato 2A11 gene. Plant Mol Biol 21 (4):625-640 (1993) LISTE DE SÉQUENCES Institut National de la Recherche Agronomique Séquence de promoteur de plante fruit spécifique 1010 6572 Demande de brevet 1 Logiciel word 1 pb ADN fraise PromoteurFP1 1... 1393 1 ccttggttca gtgttctggt tttgtgtacg tacgagagtt gaaatgtgat ctctagtatc 60 ggtaaagaga aatgttctaa ccatgctagt gttagtaatt tatcttctaa agttgtttga 120 gtactttact ctcttacttt actaactaag cataggaaat aacgacctaa actacctgat 180 tttcgttagt gcttgtaaac acgaaaattc ctgtaacgaa taacagaaag acatgtgtac 240 aaaataatat atttgtattg attgaatttg cgggttacaa tctctatggg tattctttta 300 acaagaatgt cctctgattc gatgtccgat cttgatttga tccaagggtg acaagcactt 360 gatcttgaat tgaactgttg tagtttgaac ttcttattgt gttgacgatt tgtagaagga 420 agttgacctt gggccataga ggcttgatct tggtcgaata tgggccgcga gaggtgtcac 480 gtggtgaacg ttcttcgact tgatagcgga tgaatcggca cgtgtgtttg gtacttgttg 540 attctccacg aggttgttga agaacttggt agaagttttg atttgttgaa agacttgaag 600 acgagggttg atcaagggcc gtagaggctt gacgttgatc gagtttgggc cgagcagttc 660 cacatggtgg ttgctcttca tcttgtagtt ggtgaagatg tcaactattt ggcaacttgg 720 gactcttcgg gatttgacaa cctataggct tgaggttgat gaagaatcaa ctatttggca 780 gcttgatgat tcttcaaggg ttttgggaga attctaaact ctcgggagta atttttctct 840 cttgtctgaa agtcgtcctc tagatatgag agggggtatt tatagtgtta atgctcctcc 900 gtaaatggaa tgcattgaag tcacagcttt aattatattt ccttaatgat ataattaaat 960 caatcacttt tgattgattg attcaattat tcaatttccc ataattaaat caatcagtctl020 taattgatcg atttagttat gatcgataag gtatttcact aatttgatta aattccgactl080 tccttttcga taattgattt gatttgattg atgtttgatt atcgattgac atttaatattll40 ttattttagt tgggattgat gattttgttg tcgaccgacc attcacacgc cgccacgtgt1200 tattttcgaa gacttttcaa ctttgctgac tcacgagcca cgtatgcacg agacttttca 1260 atgtctctaa tttacatagt aattgacgca atttggccga actgtttcta aacacactaa 1320 gcttcagttc tatatatacc gcgtaccaca tgtttcatca agtgtcagat aatacagaac 1380 ctacttcgcc aaaatggaga aaattgaggt cagtataatt tccaaacaca ccatcaaacc 1440 atcaacttcc tcttcaccac ttcagcctta caagcttacc ctgctcgacc agctcactcc 1500 tccatcgtat g 1511 REVENDICATIONS 1) Un promoteur qui dirige sélectivement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits des plantes, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence No. 1 de la liste de séquence en annexe, son brin complémentaire ou un dérivé de celles-ci. 2) Un promoteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence comprise entre les nucléotides aux positions 1 et 1393 de la séquence No. 1 de la liste de séquence en annexe, son brin complémentaire ou un dérivé de celles-ci. 3) Une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant un promoteur selon l'une des revendications 1 ou 2 lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant un ou plusieurs gènes, éventuellement un gène de sélection placé sous le contrôle de son propre promoteur ou du même promoteur que ladite séquence d'acide nucléique, et avantageusement une séquence de terminateur placé en aval de ladite séquence d'ADN. 4) Une molécule d'acide nucléique selon la revendication 3, caractérisée en ce que le ou lesdits gène(s), autre que le gène de sélection, sont des gènes, en position sens ou antisens, codant une protéine ou plusieurs protéines d'intérêt agronomique. 5) Une cellule végétale dans le génome de laquelle est incorporé de façon stable une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant un promoteur selon l'une des revendications 1 ou 2 lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi exprimé seulement sous le contrôle dudit promoteur. 6) Une plante ayant incorporé de manière stable dans son génome une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant le promoteur selon l'une des revendications 1 ou 2 lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi exprimé seulement dans les fruits de la plante.