FR 2806626 A1 20010928 FR 0003673 A 20000322 UTILISATION DE SUBSTANCES MODULATRICES DE L'EXPRESSION OU DE LA FONCTION D'UNE PROTEINE IMPLIQUEE DANS LE CYCLE CELLULAIRE POUR LE TRAITEMENT OU LA PREVENTION DES LESIONS NEURALES AIGUES. La présente invention concerne le domaine du traitement et de la prévention de maladies neurodégénératives liées à des lésions neurales aiguës. L'invention s'intéresse tout particulièrement au traitement et à la prévention de l'épilepsie et de l'ischémie cérébrales. L'invention est fondée sur la compréhension de mécanismes moléculaires impliqués dans la mort neuronale liée au phénomène d'excitotoxicité. La mort neuronale liée à l'excitotoxicité est due à une libération excessive de glutamate qui va entraîner des lésions. La mort associée à l'excitotoxicité peut provoquer une mort de type programmée pouvant mettre en jeu l'activation de produit de gènes. Cette mort de type programmée peut s'associer, d'un point de vue morphologique, au cours de l'excitotoxicité et de l'ischémie cérébrale à des aspects morphologiques diverses de nécrose, d'apoptose, d'autophagocytose voire d'aspects mixtes (apoptose/nécrose). On rencontre ce phénomène au cours de l'ischémie et de l'épilepsie et dans de nombreuses maladies neurodégénératives, comme les maladies de Parkinson, d'Huntington, la sclérose latérale amyotrophique. Les inventeurs se sont intéressés tout particulièrement aux lésions neurales aiguës caractéristiques de l'épilepsie et de l'ischémie cérébrale, alors que les maladies neurodégénératives de type Alzheimer ou Parkinson sont des maladies chroniques avec une mort neuronale progressive sur plusieurs années. Dans le cas de l'épilepsie et de l'ischémie cérébrale, la mort neuronale est aiguë et deux types de lésions neurales sont observés: - la mort des neurones, des astrocytes et des oligodendrocytes, - la prolifération des astrocytes et de la microglie qui a un effet délétère sur la mort cellulaire. Il est connu dans l'art antérieur que les cyclines sont des molécules clefs du cycle cellulaire impliquées dans la phosphorylation de la molécule Rb de façon à permettre la poursuite du cycle cellulaire. Leurs propriétés mitotiques nécessitent qu'elles soient associées aux CDKs (kinases cyclines dépendantes) pour former les complexes responsables de la phosphorylation de la molécule Rb. Les cyclines D peuvent aussi agir indépendemment des cdk comm el'on montré des travaux récents de Zwijsen et al. (1997). Or, les inhibiteurs de CDK sont connus pour leur propriété antimitotique et ont déjà été proposés comme anticancéreux ou pour prévenir et traiter la dégénération tissulaire notamment l'apoptose des cellules neuronales. Ainsi, plusieurs demandes de brevet internationales PCT WO 99 43 676 et WO 99 43 675 proposent des inhibiteurs de CDK en tant qu'inhibiteur de la progression du cycle cellulaire pour une utilisation dans le traitement ou la prévention de l'apoptose neuronale par exemple pour les maladies cérébrovasulaires. On a également déjà proposé dans l'art antérieur l'utilisation d'inhibiteur de la GSK3 pour protéger les neurones (Maggirwar, S. B. et al., 1999, J. Neurochem. 73, 578-586). Le rôle des cyclines dans l'ischémie cérébrale et l'excitotoxicité est sujet à débat. Certains auteurs pensent que la cycline D1 est associée à la réparation neuronale, d'autre qu'elle pourrait être impliqué dans la mort neuronale. In vivo, Wiessner et al. (1996) ont mis en évidence la cycline Dl dans la microglie mais pas dans les neurones après ischémie cérébrale globale. Li et ai (1997) ont observé que la protéine cycline Dl étaient augmentée dans les neurones et les oligodendrocytes après ischémie focale. Comme ces cellules n'étaient pas en dégénérescence les auteurs ont proposé que la cycline Dl pourrait être impliquée dans la réparation de l'ADN dans des neurones non touchés de manière irrémédiable. In vitro, Small et al. (1999) ont étudié l'expression de la cycline D1 sur une culture de neurones corticaux exposés au glutamate. Les auteurs observent une perte d'expression de la cycline D1 après expositions de ces neurones au glutamate et concluent que la cycline D1 joue plutôt un rôle dans la résistance neuronale à l'ischémie Dans un modèle d'ischémie globale, Timsit et al. (1999), ont montré que l'expression de l'ARNm et de la protéine cycline D1 étaient augmentées dans les neurones destinés à mourir mais aussi dans des neurones résistants. Ces auteurs ont proposé alors que la cycline D1 puisse être un modulateur de la mort programmée, mais n'ont pu trancher de manière formelle entre un effet délétère ou bénéfique. Les récents résultats in vitro obtenus par les Inventeurs suggèrent que la cycline D1 et ses partenaires pourraient avoir un effet délétère sur la mort neuronale. Les inventeurs ont ainsi montré une augmentation de l'expression de cyclines, plus particulièrement de cycline Dl, dans les neurones lors de l'ischémie ou de l'épilepsie (Timsit, S. et al., 1999, Eur. J. Neurosci. 11:263-278). Cette observation in vivo a été confirmé sur un modèle de mort neuronale in vitro par excitotoxicité mis au point pour cette étude. Cet enseignement semble toutefois contradictoire avec plusieurs articles de l'art antérieur o il est considéré que la cycline D1 n'est pas impliquée dans l'apoptose. Les inventeurs ont maintenant montré sur le modèle défini ci-dessus que l'utilisation de substances inhibitrices de CDKs permettait de diminuer la mort neuronale aiguë excitotoxique. Or, dans le cas des lésions chroniques rencontrées par exemple dans le Parkinson ou l'Alzheimer, le médicament comprenant une substance inhibitrice de CDKs est administré de façon chronique avec des effets secondaires sur les cellules en division. Au contraire, dans le cas de lésions aiguës rencontrées dans l'ischémie cérébrales et l'épilepsie, un médicament est administré pendant une période courte donc avec peu d'effet secondaire sur la division cellulaire. L'invention a donc pour objet l'utilisation d'une substance modulatrice de l'expression ou de la fonction d'une protéine impliquée dans le cycle cellulaire pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des lésions neurales aiguës. On entend par protéine impliquée dans le cycle cellulaire, toute protéine qui joue un rôle dans le cycle cellulaire sur certains types cellulaires. Par cycle cellulaire, on entend la phase Gl, la phase S, la phase G2 mais aussi la phase GO. Ainsi, on entendu plus particulièrement par protéine impliquée dans le cycle cellulaire, une protéine qui joue un rôle dans la progression du cycle cellulaire, c'est à dire dans la passage d'un phase à l'autre. Il s'agit de protéine qui peuvent être produite par un type cellulaire qui ne se divise plus. Par exemple, un neurone différencié ne se divise pas, néanmoins il peut exprimer certaines molécules du cycle cellulaire sans toutefois que ces molécules entrainent une division cellulaire. En outre, une protéine impliquée dans la progression du cycle cellulaire d'un type de cellule peut être produite par un autre type de cellule. On entend par substance modulatrice de l'expression, toute substance capable de modifier la quantité d'ARNm produite, la quantité de protéine produite ou de modifier la demi-vie d'un ARNm ou d'une protéine par exemple en modifiant la dégradation de l'ARNm ou la dégradation de la protéine. Cette modulation peut être positive ou négative, c'est à dire qu'elle peut augmenter la quantité de protéine active ou la diminuer. On entend pas substance modulatrice de la fonction d'une protéine toute substance capable de modifier l'activité d'une protéine ou d'un complexe protéique sur une cible. L'invention envisage plus particulièrement, un substance capable de moduler la phosphorylation d'une cible, en l'augmentant ou l'inhibant. A titre d'exemple préféré, l'invention concerne une substance capable de moduler le degré de phosphorylation de Rb par une Cdk. On entend par lésions neurales, des lésions pouvant détruire tous les types cellulaires du système nerveux et plus particulièrement les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes, la microglie mais aussi leurs précurseurs dans le système nerveux y compris les cellules souches pouvant donner des astrocytes, des oligodendrocytes, des neurones et de la microglie. Ces lésions sont celles rencontrées spécifiquement dans l'ischémie ou la crise d'épilepsie. Elles sont dues, au moins en partie, au phénomène d'excitotoxicité. Elles font donc référence à des phénomènes pathologiques bien connus en pathologie humaine et non à des aspects morphologiques. Les aspects morphologiques peuvent êtres proches d'aspect de nécrose, d'apoptose, d'aspects mixtes nécrose/apoptose et de mort par autophagocytose. Parmi les lésions de nécrose on décrit les paleurs cellulaires (pale cell change), les modifications ischémiques cellulaires (ischemic cell change) et les cellules fantômes (ghost cells). Enfin de récentes revues évoque la possibilité de passage entre différents formes de mort: nécrose et apoptose (Lipton et al.;Physiological review 1999; 79:1432-1532. On entend par lésions aiguës toutes lésions qui se produisent en moins de 7 jours qui sont dans ce contexte dues à l'ischémie cérébrale ou aux crises d'épilepsie. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation d'une substance modulatrice de l'expression ou de la fonction d'une cycline, et plus particulièrement d'une cycline D, d'une cdk ou leur complexe pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des lésions neurales aiguës. On entend aussi par substance modulatrice de l'expression ou de la fonction d'une cycline, d'une cdk ou leur complexe, toute substance modulatrice de l'expression ou de la fonction de tout complexe impliquant la cycline, la cdk, ou les deux. Des exemples de complexes sont: cycline/autre protéine ou complexe de protéines; cdk/autre protéine ou complexe de protéines; cycline/cdk/autre protéine ou complexe de protéines. L'invention concerne plus particulièrement une substance modulatrice de l'expression ou de la fonction de la cycline D1 et/ou de la cdk5 et/ou du complexe cycline Dl/Cdk5 Ces substances présentent un effet sur l'excitotoxicité neuronale et donc sur la mort neuronale, mais aussi sur la mort des astrocytes et des oligodendrocytes et sur l'effet délétère indirect lié à la prolifération des astrocytes et de la microglie impliquée dans le phénomène d'excitotoxicité. L'invention concerne donc tout particulièrement, le traitement ou la prévention de l'ischémie cérébrale et l'épilepsie. En effet, les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis de montrer qu'une substancemodulatrice de l'expression ou de la fonction des cyclines, des cdk ou de leur complexe permet diminuer l'étendue des lésions provoquées par l'ischémie ou l'épilepsie. Les cellules cibles qui sont visées dans l'utilisation selon l'invention sont, d'une part les neurones et éventuellement les autres cellules qui meurent telles que les astrocytes, les oligodendrocytes et la microglie, et d'autres part, les cellules qui prolifèrent et qui ont un effet délétère sur l'étendue des lésions. L'invention se rapporte donc à une méthode de traitement ou de prévention de l'ischémie cérébrale ou de l'épilepsie comprenant l'administration a un patient d'une quantité efficace sur les lésions neurales aiguës d'une ou plusieurs des substances modulatrices de l'expression ou de la fonction d'une protéine impliquée dans le cycle cellulaire. L'invention envisage à titre de substance modulatrice de l'expression ou de la fonction d'une protéine impliquée dans le cycle cellulaire, une substance choisie parmi: - les inhibiteurs de l'expression des cyclines, les inhibiteurs de kinases cyclines dépendantes, comme les analogues de purines par exemple les dérivés de l'olomoucine et roscovitine, les paullones, les indirubines, l'hymenisaldisine, le flavopiridol, etc... - les inhibiteurs du complexe cycline/kinases cyclines dépendantes. Des inhibiteurs de l'expression des cyclines sont par exemple: - La rapamycine qui agit sur l'ARNm de la cycline D1 et sur la stabilité de la protéine. (Hashemolhosseini et al., 1998). Par ailleurs, il a été montré que la rapamycine pouvait diminuer la taille des infarctus cérébraux. - La glycogene synthase kinase, comme la GSK3, qui régule la protéolyse de la cycline D1. (Diehl et al., 1998) - Les statines, et en particulier la lovastatine qui modifie l'expression de la cycline D1 (Oda et al. 1999; Rao et al., 1999; Muller et al., 1999) via des protéines inhibitrices telles que p21. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront de la description qui suit concernant l'effet du kaïnate sur la mort neuronale, et le rôle d'inhibiteurs des cdk sur cette mort neuronale. I - Matériel et méthode. 1) Culture primaire de cellules de l'hippocampe. Les cultures cellulaires ont été préparées à partir de rats Wistar âgés de 2 jours. Les hippocampes ont été disséqués dans du PBS sans calcium, ni magnésium. Les tissus ont été coupés en petit morceau et incubés en présence de protéases et de Dnase. L'action des protéases a été stoppée par l'action d'un sérum. Les cellules ont été ensuite dissociées mécaniquement. puis resuspendues dans un milieu de culture. Des cellules cultivées pendant 10-12 jours furent utilisées pour les expériences. 2) Exposition au kaïnate et étude de la mortalité cellulaire. Les cultures cellulaires de l'hippocampe ont été exposées à du kaïnate (20 - 75 FM) pendant des temps différents (2 - 22 heures). Le kaïnate a été dilué dans de l'eau afin de préparer une solution stock de 20 mM. La quantité adéquate de la solution stock a été ensuite ajoutée à 200 gl de milieu conditionné provenant de la culture cellulaire. Les expériences contrôles ont été conduites dans les mêmes conditions sauf le stock de kaïnate qui été remplacé par de l'eau stérile. La mort neuronale a été analysée par microscopie en contraste de phase et l'utilisation de deux marqueurs de mort: l'iodure de propidium et la coloration Hoechst (Bisbenzimide). Le comptage a été réalisé sur des cultures d'hippocampes exposées à du kaïnate 20tM. Deux boîte par condition ont été au moins évaluées. L'iodure de propidium (7,5 pM) a été ajouté à la culture 1 heure avant le comptage cellulaire. Les cellules marquées ont été comptées à l'aide d'un microscope à fluorescence avec un grossissement faible à partir de champs choisis au hasard. Au moins 5 champs dans deux boîtes ont été comptés par conditions sur trois cultures indépendantes. Les résultats ont été exprimés en pourcentage du nombre total de neurones observés en microscopie avec contraste de phase. Le marquage par le Hoechst (Bisbenzimide) a été réalisé après fixation des cellules au paraformaldehyde 4%. Les cellules brillantes à noyau condensées ont ensuite été comptés. Au moins 5 champs dans deux boîtes ont été comptés par conditions sur une ou trois cultures indépendantes. Les résultats ont été exprimés en pourcentage du nombre total de neurones observées en microscopie avec contraste de phase. 3) Immunocytochimie et coloration Hoechst (Double marquage). Les cellules hippocampiques sur des lamelles de verre ont été fixées dans le paraformaldéhyde 4% pendant 20 minutes puis lavées en PBS et perméabilisées en PBS - 0,2% gelatin - 0,2 % Triton X-100. Un anticorps monoclonal dirigé contre la cycline Dl (Santa Cruz, California, USA) dilué au 1/400, un anticorps polyclonal de lapin (Dako A/S Danemark) dirigé contre la GFAP dilué au 1/800 ont été incubés toute la nuit à 4 C dans le PBS 0.2% gélatine 0,2% Triton X-100. Après lavage, un anticorps de cheval anti-souris dilué au 1/400 (adsorbé chez le rat) (Vector, Burlingame, USA) a été utilisé pendant 1 heure à température ambiante. Après lavage, un complexe avidine-fluorescéine (1/400) a été utilisé en même temps qu'un anticorps de chèvre anti-lapin couplé à la rhodamine (Chemicon, Temecula, USA) pour une incubation de 1 heure. Après lavage, les cellules ont été colorées par le Hoechst Bisbenzimide 33.258 (Sigma, St Louis, USA) à lmg/ml. Les lamelles de verre sont ensuite montées. Les expériences contrôles ont été réalisées en omettant les premiers anticorps, soit la cycline D1 soit la GFAP, soit les deux. Pour les doubles marquages cycline D1/cdk5, un anticorps monoclonal anticycline Dl dilué au 1/100 (Santa Cruz, California, USA) ainsi qu'un anticorps polyclonal de lapin anti-cdk5 dilué au 1/200 ont été utilisés. Après lavage, un anticorps biotinylé anti-lapin dilué au 1/400 (Vector, Burlingame, USA) a été utilisé pendant 1 heure à température ambiante. Après lavage, un anticorps de chèvre anti-souris couplé au TRITC (1/400) (Sigma, St Louis, USA) et un complexe avidine-fluoresceine (1/400) (Vector, Burlingame, USA) ont été utilisés à température ambiante pendant 30 minutes. Les expériences contrôles ont été réalisées en omettant les premiers anticorps, soit la cycline Dl soit la cdk5, soit les deux. Un autre type de contrôle a été réalisé en neutralisant l'anticorps anticdk5 par un excès de 10 fois (poids/poids) de peptide immunisant pendant 30 minutes à 30 C. 4) Western blot. Après exposition des cellules hippocampiques aukaïnate, les cellules étaient lavées en PBS puis lysées dans un tampon de Laemli. Les échantillons ont été soumis à sonication et chauffés à 100 C pendant 5 minutes. Une électrophorèse avec un gel SDS-polyacrylamide de 12 % était ensuite réalisé. Les protéines ont été ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose et incubées soit avec un anticorps monoclonal anti-cycline D1 soit avec un anticorps polyclonal anti-cdk5 (Santa Cruz, California, USA), ou enfin un anticorps monoclonal anti-3 tubuline classe III (Sigma, St Louis, USA), un marqueur spécifique neuronal. Le marquage a été réalisé en utilisant l'anticorps anti-lapin ou l'anti- corps antisouris couplés à la peroxydase du raifort en utilisant le kit ECLTM (Amersham Corp., England). Les expériences contrôles ont été réalisées en omettant les premiers anticorps. 5) Immunoprécipitations et analyse en Western- Blot. Les cerveaux de rat ont été broyés dans un tampon RIPAE (PBS contenant 1 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 5 mM EDTA, 1 % aprotinine et 1 % sodium deoxycholate). Les lysats clarifiés ont été ensuite incubés pendant 2 heures dans la glace avec un anticorps anti-cdk5 en présence ou en absence du peptide bloquant correspondant. Les complexes immuns obtenus furent ensuite récupérés par précipitation avec la protéine sépharose A (Pharmacia), lavés 3 fois avec le tampon RIPAE. Les protéines immunoprécipitées ont été ensuite éluées en les faisant bouillir dans du tampon de Laemmli, puis fractionnées sur un gel de SDS-polyacrylamide et tranférées sur une membrane (Immobilon-P, Millipore Corp.) Les membranes ont été ensuite saturées par une solution bloquante (5% lait écrémé dans 20 mM Tris-HC1, pH 7,6, 0,9% NaCl, 0.2% Tween-20), puis incubées avec soit l'anti-cycline Dl (1/200), soit l'anti-cdk5 (1/2000) pendant toute la nuit à 4 C. L'immuno-marquage a été réalisé avec des anticorps couplés à la peroxydase du raifort en utilisant le kit ECLTM (Amersham Corp.). 6) Traitement par inhibiteur de cdk (ML-1437). Les cultures hippocampiques ont été exposées à du kaïnate (20 WM) dans du DMSO pendant 5 heures en présence ou en absence d'un inhibiteur de cdk, un analogue de la roscovitine. L'inhibiteur de cdk a été utilisé à différentes concentrations: 2 pM, 5 M et 10 pM. La mortalité cellulaire a été déterminée en utilisant l'iodure de propidium comme décrit ci-dessus. II - Résultats. 1) La mort neuronale après exposition au kainate est retardée et dose dépendante. Pour évaluer la mort neuronale après exposition au kaïnate deux approches ont été utilisées: - une analyse morphologique; - l'utilisation de marqueur de mort cellulaire: l'iodure de propidium et la coloration de Hoechst. i) L'analyse morphologique. L'analyse morphologique quantitative a été faite sur les neurones survivants à différents temps entre 1 heures et 27 heures Le comptage des neurones après exposition à 20 gM a montré une baisse très forte de la viabilité neuronale entre 1 heure et 5 heures. ii) Marqueurs de mort cellulaire. L'utilisation de l'iodure de propidium (Figure 1) à 2, 5 et 22 heures a confirmé les données d'observation morphologiques. La figure 1 représente la cinétique de la mort neuronal kaïnate dépendante révélée par l'iodure de propidum. Les cultures hippocampiques ont été exposées à différentes concentrations de kaïnate (20pM, 30 pM, 75 pM). Le pic de mortalité est à 5 heures après le début du traitement par kaïnate. * p Après exposition à 20 FM de kaïnate, le pourcentage de neurones en dégénérescence augmente progressivement avec un pic de mort à 5 heures. Après exposition des cellules par le kaïnate aux concentrations de à 75 pM, le pourcentage de neurones en dégénérescence augmente de manière dose dépendante avec une mortalité maximale à 5 heures. Seuls certains neurones étaient propidium positifs alors que les astrocytes étaient toujours propidium négatifs. Le marquage Hoechst a confirmé les données obtenues avec l'iodure de propidium. 2) La protéine cycline Dl est exprimée dans les neurones vulnérables après traitement au kaïnate. La figure 2 montre que la cycline D1 est exprimée dans des neurones vulnérables. Observation au microscope à contraste de phase et double ou triple marquage fluorescent à 22 heures (A-F) et 5 heures (G, H, I) après expositions à 20 pM de kaïnate, culture non exposée au kaïnate (J, K, L). Observation en contraste de phase (A, D): Iodure de propidium (B) et cycline Dl (C, F, I, L); marquage Hoechst (E, H, K); marquage GFAP (G, J). En A, B, C: Des neurones (A, flêches) iodure de propidium positifs (B) et cycline Dl positifs (C). En D, E, F: Des neurones (D, flêches) sont Hoechst positifs (E) et cycline D1 positifs (F). En G, H, I: un neurone est GFAP négatif (G) avec un noyau condensé (H) et cycline D1 positif (I). En J, K, L, un astrocyte est GFAP positif (J), avec un noyau non- condensé (K) et cycline Dl positif (L). Echelle: 1 cm = 3,33 gM La combinaison d'observations en immunofluorescence de la cycline Dl (Fig 2C, F) et de l'observation en contraste de phase (Fig 2A, D) a révélé que la cycline D1 était exprimée dans des neurones. Les doubles marquages cycline D1 (Fig 2C, F) d'une part et iodure de propidium (Fig 2B) ou coloration Hoechst (Fig 2E, H) d'autre part, a révélé que la plupart des neurones exprimant la protéine cycline D1 nucléaire présentait des signes de mort révélée par l'iodure de propidium ou la coloration Hoechst (Fig 2A-F). Dans les expériences contrôles seuls quelques neurones cycline Dl positifs étaient détectées. Par ailleurs quelques astrocytes exprimaient la cycline Dl. Mais les astrocytes (GFAP +) ne présentaient jamais de marquage iodure de propidium positif ou de fragmentation de chromatine (Hoechst). Les expériences contrôles sans premier anticorps ne montraient aucun marquage. 3) L'expression de la protéine cycline Dl est auqmentée après traitement au kaïnate. Des expériences de western blot ont été réalisées sur des extraits protéiques cellulaires exposées ou non au kaïnate. La figure 3 rapporte l'augmentation du taux normalisé de l'expression de la protéine cycline Dl après traitment par le kaïnate. La figure 3 représente l'analyse par Western Blots obtenus à partir d'extraits protéiques de cellules de l'hippocampe exposées au kaïnate en utilisant l'anticorps monoclonal anticycline Dl et l'anticorps anti f-tubuline classe III. En A, abscisse: temps d'expositon (h, heures) au kainate (754M). En ordonnée : taux moyen d'expession de cycline Dl, normalisé par la quantité de neurones, exprimée en pourcentage du contrôle. Il convient de noter l'augmentation d'expression de la protéine cycline Dl après 5 heures d'exposition au kainate. * p et l'anticorps anti-p-tubuline classe III. Comme le traitement par le kaïnate des cultures de l'hippocampe provoquent une mort neuronale et donc une perte neuronale, le taux de cycline Dl a été normalisé par le taux de C tubuline classe III, un marqueur spécifique des neurones. L'analyse quantitative a révélé que le niveau d'expression normalisé de cycline Dl augmentait de manière significative de 100% avant kainate à plus de 150% après exposition des cultures par le kainate 75 ptM. 4) La cycline D1 et Cdk5 sont co-exprimés dans les neurones en dégénérescence et interagissent dans le cerveau. Cdk5 est une cycline kinase dépendante (cdk) spécifiquement neuronale. Le double marquage cycline D1/Cdk5 a révélé que la cycline D1 et Cdk5 étaient présentes dans les neurones en dégénérescence. La figure 4 montre l'expression de cdk5 dans les neurones après exposition au kaïnate. Double ou triple marquage de neurones hippocampiques avant (contrôle en A) et après exposition à mM de kainate (B-I). Immunoréactivité Cdk5 (A, B, D, G); coloration Hoechst (C, F, I); Iodure de Propidium (E); Immunoréactivité cycline D1 (H). En A, des neurones (flêches) sont cdk5 positifs. En B, C des neurones (flêches) sont cdk5 positifs (B) avec un noyau condensé (C). En D, E, F, un neurone (flêche), Cdk5 positif (D), iodure de propidium positif (E) avec un noyau condensé (F). En G, H. I un neurone (flêche), Cdk5 positif (G), cycline Dl positif (H) avec un noyau condensé (I) Les études en western blot après immunoprécipitation de cdk5 révélèrent que la cycline D1 étaient associées à Cdk5. ) Effet d'inhibiteurs des cdk sur la mort neuronale après exposition au kainate. Afin d'étudier le rôle du complexe cycline D1/cdk5 dans la mort neuronale un inhibiteur des cdk très actif sur cdk5 a été utilisé sur des cultures hippocampiques exposées à 20 pM de kainate. La figure 5 montre qu'un inhibiteur de Cdk diminue la mort neuronale après exposition au kainate. La figure 5 concerne la culture d'hippocampes traitées 5 heures par du kaïnate et un inhibiteur de Cdk à différentes concentrations (2, 5, 10 pM) . La mortalité neuronale a été évaluée par la marquage à l'iodure de propidium avec observation au microscope à fluorescence. Il convient de noter que la mort neuronale est partiellement inhibée par l'inhibiteur de cdk aux concentration de 2 et 5 NM.* p Les contrôles ont été effectuées sur des culture avec ou sans kaïnate en combinaison ou non avec l'inhibiteur de Cdk. Sur les expériences contrôles avec kaïnate, en l'absence d'inhibiteur la mort neuronale était proche de 65 % avec une augmentation de la mort neuronale de 150 % par rapport aux cultures sans kaïnate. Au contraire, sur les cultures avec kaïnate en présence de concentration d'inhibiteur de cdk de 2 ou 5 pM la mort neuronale était proche de 45 %. Même avec des fortes doses d'inhibiteurs (10M), la mort neuronale reste élevée.III- Discussion. Les premiers travaux (Timsit et al., 1999) ont montré que l'expression de la cycline Dl était augmentée dans les neurones vulnérables in vivo mais aussi, à un niveau moindre dans des neurones résistants. Il n'était donc pas démontré que cette expression avait un effet délétère ou bénéfique. Les présents travaux in vitro ont confirmé l'augmentation d'expression de la protéine cycline D1 après exposition de cultures de neurones et d'astrocytes au kaïnate, un analogue du glutamate. De plus, l'étude en immunohistochimie a permis de montrer que ce sont les neurones en dégénérescence qui expriment la protéine cycline Dl dans leur noyau. Cette expression survient précocement avant la fragmentation de l'ADN comme l'avait déjà montré les travaux in vivo. L'étude par double marquage cycline D1/ Cdk5 a montré que les neurones en dégénerescence co- expriment ces 2 protéines suggérant qu'elles peuvent s'associer. L'étude en Western blot sur des cerveaux de rat normaux a confirmé la possibilité d'association entre la cycline D1 et la molécule Cdk5. Enfin l'utilisation d'inhibiteur de Cdk, préférentiellement actif sur Cdk5, a montré un effet protecteur de ce produit chimique aux doses situées entre 2 et 5gM. En revanche au dose de 10 pM ce produit ne s'est plus révélé protecteur. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES - Khrestchatisky M., Timsit S., Rivera S., Tremblay E. and Ben-Ari Y. (1996) Neuronal death and damage repair: roles of protoncogenes and cell cycle-related proteins. In J. Krieglstein (Ed.), Pharmacology of Cerebral ischemia. Medpharm Scientific Publishers, Stuttgart, pp 41- 56,. - Li Y., Chopp M., Powers C., Jiang N. (1997) Immunoreactivity of cyclin D1/cdk4 in neurons and oligodendrocytes after focal cerebral ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab., 17: 846-856. - Sherr C.J. (1993) Mamalian G1 cyclins. 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REVENDICATIONS 1) Utilisation d'une substance modulatrice de l'expression ou de la fonction d'une protéine impliquée dans le cycle cellulaire pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des lésions neurales aiguës. 2) Utilisation d'une substance modulatrice de l'expression ou de la fonction d'une protéine impliquée dans le cycle cellulaire pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des lésions neurales aiguës des neurones, des astrocytes, des oligodendrocytes, de la microglie mais aussi de leurs précurseurs dans le système nerveux y compris les cellules souches pouvant donner des astrocytes, des oligodendrocytes, des neurones et de la microglie 3) Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la protéine impliquée dans le cycle cellulaire est une protéine nécessaire à la progression du cycle cellulaire. 4) Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la protéine impliquée dans le cycle cellulaire est produite par une cellule apte ou non à se diviser. ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la substance modulatrice de l'expression ou de la fonction d'une protéine impliquée dans le cycle cellulaire est une substance capable de moduler la phosphorylation d'une cible, en l'augmentant ou l'inhibant. 6) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la substance modulatrice de l'expression ou de la fonction d'une protéine impliquée dans le cycle cellulaire est une substance modulatrice de l'expression ou de la fonction d'une cycline et plus particulièrement d'une cycline D1 ou d'une cdk. 7) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la substance modulatrice de l'expression ou de la fonction d'une protéine impliquée dans le cycle cellulaire est une substance modulatrice de l'expression ou de la fonction de la cycline D1 et/ou de la cdk5 et/ou du complexe cycline D1/Cdk5. 8) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la substance modulatrice de l'expression ou de la fonction d'une protéine impliquée dans le cycle cellulaire est choisie parmi: - les inhibiteurs de l'expression des cyclines, - les inhibiteurs de kinases cyclines dépendantes, - les inhibiteurs du complexe cycline/kinases cyclines dépendantes. 9) Utilisation selon la revendication 8, *caractérisé en ce que l'inhibiteur de l'expression des cyclines est choisi parmi la rapamycine, la glycogene synthase kinase, les statines. ) Utilisation selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'inhibiteur de kinases cyclines dépendantes est choisi parmi les analogues de purines par exemple les dérivés de l'olomoucine et roscovitine, les paullones, les indirubines, l'hymenisaldisine, le flavopiridol, etc... 11) Utilisation selon l'une quelconque des revencications 1 à 10, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des lésions neurales aiguës de l'ischémie cérébrale. 12) Utilisation selon l'une quelconque des revencications 1 à 10, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des lésions neurales aiguës de l'épilepsie.