FR 2807659 A1 20011019 FR 0004779 A 20000413 COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES CONTENANT DU 5HYDROXYOXINDOLE ET LEUR UTILISATION. La présente invention concerne des compositions pharmaceutiques contenant comme principe actif du 5hydroxyoxindole, ses conjugués, ses précurseurs ou un mélange de ceux-ci. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques ou alimentaires contenant des micro-organismes de la flore intestinale humaine produisant des précurseurs du 5-hydroxyoxindole. Les travaux réalisés dans le cadre de l'invention ont mis en évidence des effets du 5-hydroxyoxindole comme myorelaxant, anti-dépresseur, anti-cancéreux. Les compositions de l'invention sont donc utiles pour le traitement de pathologies très diverses et plus particulièrement pour le traitement des cancers, ou le traitement des états d'anxiété, d'hyperactivité, d'insomnies, des dépressions ou encore le traitement des douleurs musculaires. Le 5-hydroxyoxindole est une molécule naturelle dont la présence a été décrite dans l'urine de rongeurs (King L. J. et al., Biochem. J., 1966, 98 : 266-277), d'ovins (brevet français N 96. 08941), de bovins (brevet français N 96. 08941) et chez l'homme (Yamaguchi M. and Matsukawa S., Wakayama Med. Rept., 1971, 15: 127-134). Le 5-hydroxyoxindole et ses formes conjuguées (sulfatées, glucuronées ou autres) sera aussi désigné ci-après Marqueur T . L'augmentation du taux de Marqueur T dans l'urine a été associée à certaines maladies neurodégénératives comme l'encéphalite spongiforme transmissible, la maladie d'Alzheimer et, par conséquent, prônée comme marqueur utile au diagnostic de ces maladies neurodégénératives (brevet français N 96.08941). Ces travaux antérieurs rapportent que la concentration circulante sérique de la forme libre chez le mammifère sain est de 0,2 à 1 nanogramme par ml et au moins 100 fois supérieure pour les formes conjuguées soit une concentration totale submicromolaire. L'origine et les voies de biosynthèse du 5hydroxyoxindole chez les mammifères ne sont pas encore toutes connues, mais une voie de synthèse a été identifiée chez le rat, à partir d'indole, transformé en oxindole puis en 5-hydroxyoxindole (King L. J. et al., Biochem. J., 1966, 98 : 266-277 ; Beckett A.H. and Morton D. M., Biochem. Pharmacol., 1966, 15 : 937-946). Toutefois, la voie majoritaire du métabolisme de l'indole chez le rat passe par la formation de l'indoxyl et du 2-3-dioxindole (également nommé Isatine) (King L. J. et al., Biochem. J. , 1966, 98 : 266-277). Une voie de synthèse, propre aux mammifères et indépendante du métabolisme de l'indole bactérien n'est cependant pas exclue, une synthèse tissulaire en particulier cérébrale est même fortement probable pour l'isatine (Sandler M. et al., J. Neurochem., 1991,57: 1074-1075). Le rôle physiologique et les implications physiopathologiques de ces molécules naturelles à noyau oxindole ne sont pas totalement élucidés et l'art antérieur ne décrit aucune propriété particulière du 5hydroxyoxindole. Par contre, certaines propriétés de l'oxindole ont pu être mises en évidence. Ainsi, il a été montré que l'oxindole est susceptible d'exercer des effets sédatifs, myorelaxants (Orcutt J.A., Arch int Pharmacodyn, 1964, 15 : 121-), d'induire des comas (Carpenedo R. et al., J Neurochem, 1998, 70: 1998-2003), et d'abaisser l'excitabilité neuronale (Mannaioni G. et al., Br J Pharmacol., 1998, 125: 1751-60). Les mécanismes impliqués ne sont pas connus et notamment la présence de récepteurs ne semble pas avoir été décrite à ce jour. Les taux circulants physiologiques de l'oxindole sont de l'ordre de 0,1 à 1 M et les effets sédatifs ou le coma sont obtenus à des doses de 10 à 100 fois supérieures (Moroni F in Advances in cirrhosis, hyper-ammonemia and hepatic encephalopathy, eds Felipo O.V. & Grisolia S Plenum Press NY, 1997) . Des molécules de synthèse à noyau oxindole, mais non dérivées de l'oxindole ni du 5-hydroxyoxindole, ont été décrites comme présentant des propriétés d'inhibition des récepteurs aux tyrosines kinases (brevets US 5,576,330 ; 5,792,783 ; 5,834,504 ; 5,849,710 ; 5,880,141 ; 5,883, 113 ; 5, 883,116 ; 5,886, 020 ; International Patents WO 93/01182 et WO 95/01349). Ainsi, l'isatine induit in vivo des effets comportementaux chez des rats et des souris. A faible dose (15-20 mg/kg), l'isatine est anxiogène et proconvulsante (Bhattacharya S.K. et Chakrabarti A., 1998, 36 : 118-21). A forte dose (jusqu'à 300 mg/kg), l'isatine a des propriétés sédatives et anticonvulsives (Von Muller M Med. Exp., 1962, 7 : Medvedev AE, Biochem. Pharmacol., 1996, 52 : 385-91). L'isatine a également la capacité in vitro d'interférer avec le récepteur type A du peptide natriurétique (Medvedev A.E. et al., Life Sciences, 1998, 62 : 2391-8) mais elle inhibe aussi les activités enzymatiques monoamine oxydase A et B (MAO A et B) (Glover V. et al., J Neurochem, 1988, 51 : 656-659). Ainsi, les deux molécules oxindole et isatine présentent des propriétés très différentes entre elles. Il est donc impossible de prédire si des molécules présentant des structures similaires auront des propriétés biologiques similaires. On connaît même de nombreux exemples dans lesquels des molécules très voisines peuvent avoir des effets très différents, comme la sérotonine et la mélatonine, voire radicalement opposés. Aucune activité du 5-hydroxyoxindole n'a été reportée à ce jour et la présente invention décrit pour la première fois des propriétés de cette molécule permettant de l'utiliser dans des applications thérapeutiques et pharmacologiques dont l'intérêt est augmenté par la possibilité d'obtenir des effets en modifiant le taux circulant endogène de cette molécule naturellement présente chez les mammifères. Les travaux de recherche réalisés par les inventeurs ont permis d'obtenir des données physiologiques originales (exemple 1). Il a en effet été établi que la molécule de 5-hydroxyoxindole a un taux sanguin circulant stable au cours de la journée (exemple 1 (a)) et, dans les tissus, ce taux est comparable au taux sanguin à l'exception de la glande pituitaire et des muscles squelettiques qui en contiennent une quantité environ 5 à 10 fois supérieure (exemple l(b)). L'injection intraveineuse indique que sa demi-vie sérique est de l'ordre de 5 minutes (exemple l(c)). Une recherche des sites spécifiques de liaison (exemple 2) a permis de mettre en évidence l'existence de sites de liaison saturables et d'affinité micromolaire (exemple 2(b)). Les sites de liaison sont très denses dans l'adénohypophyse et dans certaines zones cérébrales (exemple 2(a)) : organes circum-ventriculaires, plexus choroïdes ainsi que dans la vascularisation méningée. La rate et le foie présentent également la capacité de fixer cette molécule (exemple 2(a)). L'étude de la spécificité pharmacologique des sites de liaison du 5-hydroxyoxindole (exemple 2(c)) indique que la sérotonine déplace la liaison de la molécule radiomarquée avec une efficacité comparable à celle du 5-hydroxyoxindole non radiomarqué. Par contre, la mélatonine est deux fois moins efficace, alors que ni l'oxindole ni l'isatine n'interfèrent avec la liaison du 5hydroxyoxindole radiomarqué. Ces résultats indiquent que le 5hydroxyoxindole se fixe sur des sites communs avec ceux de la sérotonine. Bien que ce récepteur n'ait pas encore été totalement identifié, il semble peu probable qu'il soit un récepteur déjà connu, car la localisation de ces sites au niveau du cerveau ne correspond pas exactement à des territoires caractéristiques d'un type donné de récepteurs de la sérotonine ni de la mélatonine. Afin d'étudier les effets pharmacologiques du 5-hydroxyoxindole, les inventeurs ont entrepris d'augmenter son taux circulant (exemple 3) par plusieurs méthodes, soit en administrant de l'indole et de l'oxindole par voie orale (exemple 3(a)), soit directement par injection intrapéritonéale d'isatine et de 5-hydroxyoxindole (exemple 3(b)). Des effets comportementaux (exemple 4) ont été observés dans tous les cas : un effet sédatif et un effet myorelaxant qui s'expriment globalement par une activité locomotrice réduite proportionnellement à la dose circulante de 5-hydroxyoxindole (exemple 4(a)). Ces effets comportementaux sont réversibles. Les effets sur le muscle ont été précisés par des techniques de mesure de la contraction musculaire chez le rat (exemple 4(b)). Une modification des paramètres de la contraction tétanique du muscle EDL (muscle squelettique rapide) est obtenue en quelques minutes après une injection unique intraveineuse de 20 mg/kg (concentration sérique estimée chez un rat de 250g : 3mM). L'effet porte sur l'amplitude et la synchronisation de la contraction musculaire et dure au moins lh30. Dans une autre série d'expériences, les inventeurs ont étudié les propriétés du 5-hydroxyoxindole sur l'activité de l'enzyme MonoAmine Oxydase (MAO). Chez le rat, une injection intra-péritonéale de 2,5 mg/kg induit, après 2 heures, une diminution de l'activité MAO cérébrale (exemple 4(c)). Afin de préciser les observations réalisées in vivo sur l'inhibition des MAO, une étude in vitro a été entreprise (exemple 5) et a permis de conclure que le 5hydroxyoxindole est un inhibiteur préférentiel de l'activité MAO-A mitochondriale cérébrale (concentrations efficaces à 50% : 80 uM pour la MAO-A contre 1 mM pour la MAO-B). Dans une dernière série d'expériences, les inventeurs ont étudié les effets du 5-hydroxyoxindole sur la croissance cellulaire et ont montré que le 5hydroxyoxindole inhibe la prolifération cellulaire et l'activité MAP kinases (exemple 6). Ainsi les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention montre que le Marqueur T interfère avec le fonctionnement du Système Nerveux de façon biphasique. A fortes doses, on observe un effet sédatif et myorelaxant. A faibles doses, le Marqueur T est inhibiteur de l'activité MAO cérébrale et par là même, potentiellement excitant. En conséquence, l'invention concerne des compositions pharmaceutiques contenant comme principe actif du 5-hydroxyoxindole, un de ses conjugués ou précurseurs, ou un mélange de ceux-ci, ou encore un micro-organisme purifié présent dans la flore intestinale humaine et produisant un desdits précurseurs ou un micro-organisme génétiquement modifié pour produire le 5-hydroxyoxindole lui-même, un de ses conjugués ou précurseurs, associé dans ladite composition avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Le 5-hydroxyoxindole, ses conjugués ou précurseurs ou un micro-organisme de la flore intestinale humaine étant des produits naturels, ils peuvent être administrés par une approche nutritionnelle. On entend donc aussi par composition pharmaceutique des compositions alimentaires. Le 5-hydroxyoxindole de poids moléculaire 149,15 répond à la formule (I) donnée à la figure 1. On entend tout particulièrement par précurseurs du 5-hydroxyoxindole, l'indole de formule (II), l'oxindole de formule (III) ou l'isatine de formule (IV) données à la figure 1. Des exemples de formes conjuguées du 5hydroxyoxindole sont les suivants : - monosulfates, notamment de poids moléculaire de 229,21 et de formules (V), (VI) et (VII) représentées à la figure 2, - bisulfates, notamment de poids moléculaire de 309,27 et de formules (VIII), (IX) et (X) représentées à la figure 2, - trisulfate, notamment de poids moléculaire de 389,32 et de formule (XI) représentée à la figure 2, - monosulfates monoglucuronés, notamment de poids moléculaire de 405,33 et de formules (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI) et (XVII) représentées à la figure 3, - disulfates monoglucuronés, notamment de poids moléculaire de 485,39 et de formules (XVIII), (XIX) et (XX) représentées à la figure 3, Il peut s'agir également de conjugués du 5hydroxyoxindole en sa forme oxydée de formules (XXI), (XXII) et (XXIII) représentées à la figure 4 et respectivement de poids moléculaire de 147,147 et de 227. A titre d'exemple de tels conjugués on peut citer le glucuronate de 5-hydroxyoxindole en sa forme oxydée de poids moléculaire de 323 et de formule (XXIV) représentée à la figure 4. Parmi les micro-organismes purifiés présents dans la flore intestinale humaine, l'invention envisage tout particulièrement des bactéries présentes dans la flore intestinale produisant un précurseur du 5-hydroxyoxindole, comme les colibacilles produisant de l'indole. De telles bactéries peuvent être sélectionnées par des techniques connues d'isolement et de ciblage pour leur capacité à produire un tel précurseur. L'invention envisage aussi la mise en #uvre de bactéries génétiquement modifiées pour produire le 5-hydroxyoxindole, un ou plusieurs de ses précurseurs, ou des conjugués du 5-hydroxyoxindole. De telles bactéries sont préparées par des techniques connues de génie génétique consistant à introduire dans la bactérie un ou plusieurs gènes codant une ou plusieurs enzymes, comme une oxydase et/ou une hydroxylase, impliquées dans la voie de synthèse du 5-hydroxyoxindole. Avantageusement, il s'agit de bactéries produisant un précurseur du 5hydroxyoxindole modifiées génétiquement de manière à exprimer les activité enzymatiques leur permettant de produire à partir de ce précurseur un autre précurseur plus avantageux ou, bien entendu, le 5-hydroxyoxindole lui-même. Comme indiqué précédemment, les travaux réalisés dans le cadre de l'invention ont mis en évidence des effets du 5-hydroxyoxindole comme myorelaxant, antidépresseur, anti-cancéreux permettant d'utiliser les compositions de l'invention pour le traitement de pathologies très diverses. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation du 5-hydroxyoxindole, un de ses conjugués ou précurseurs, ou un mélange de ceux-ci, ou encore un micro-organisme purifié présent dans la flore intestinale humaine et produisant un desdits précurseurs ou un micro-organisme génétiquement modifié pour produire le 5-hydroxyoxindole lui-même, un de ses conjugués ou précurseurs, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des cancers, des états d'anxiété, d'hyperactivité, d'insomnies, des dépression ou encore de souffrances musculaires. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent rapportant les travaux effectués dans le cadre de la présente invention et il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : - la figure 1 présente la structure du 5hydroxyoxindole de poids moléculaire 149,15 (formule I) et celles de ses précurseurs l'indole (formule II), l'oxindole (formule III) et l'isatine (formule IV) ; - la figure 2 présente la structure de formes conjuguées du 5-hydroxyoxindole monosulfates de formules (V), (VI) et (VII) ; bisulfates de formules (VIII), (IX) et (X) ; trisulfate de formule (XI) ; - la figure 3 présente la structure de formes conjuguées du 5-hydroxyoxindole monosulfates monoglucuronés de formules (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI) et (XVII) et de formes disulfates monoglucuronés de formules (XVIII), (XIX) et (XX) ; - la figure 4 présente la structure de conjugués du 5-hydroxyoxindole en sa forme oxydée de formules (XXI), (XXII), (XXIII) et (XXIV) ; - la figure 5 montre les taux sériques de 5hydroxyoxindole (forme libre) et de corticostérone dosés chez des rats au cours de la journée ; - la figure 6 montre le taux sérique et le taux tissulaire de 5-hydroxyoxindole (forme libre) dosés chez des rats ; - la figure 7 montre le taux sérique du 5hydroxyoxindole radiomarqué au tritium dosé chez les souris à différents temps après l'injection intraveineuse de 50 l de 5-hydroxyoxindole radiomarqué ; - la figure 8 montre les taux sérique et tissulaire du 5-hydroxyoxindole radiomarqué au tritium dosés chez les souris 5 min après l'injection intraveineuse de 50 l de 5-hydroxyoxindole radiomarqué et exprimés en pourcentage du 5-hydroxyoxindole injecté ; - la figure 9 montre les images correspondant aux autoradiogrammes numériques obtenus après incubation des coupes de cerveaux de rats avec le 5-hydroxyoxindole radioactif à la concentration de 0,3 M durant 1h, Cx est mis pour organes circum-ventriculaire, VS pour vascularisation méningée et PCh pour plexus choroïdes ; - la figure 10 montre les images correspondant aux autoradiogrammes numériques obtenus après incubation des coupes de tissus de rats avec le 5-hydroxyoxindole radioactif à la concentration de 0,3 uM durant lh ; - la figure 11 montre l'analyse des courbes de saturation réalisée après incubation de coupes d'hypophyse de rat avec des doses croissantes de 5-hydroxyoxindole radioactif ; - la figure 12 montre le taux sérique et le taux cérébral de 5-hydroxyoxindole dosés chez les rats après gavage par des doses croissantes d'indole ; - la figure 13 montre le taux sérique et le taux cérébral de 5-hydroxyoxindole dosés chez les rats après gavage par des doses croissantes d'oxindole ; - la figure 14 montre le taux de 5hydroxyoxindole dosé chez les rats après l'injection intrapéritonéale de doses croissantes de 5-hydroxyoxindole et d'isatine ; - la figure 15 montre l'effet sur l'activité locomotrice de rats de l'injection intra-péritonéale de doses croissantes de 5-hydroxyoxindole ; - la figure 16 montre l'effet sur la contraction du muscle extenseur des doigts de la patte arrière du rat (EDL) d'une injection unique intraveineuse de 20 mg/kg de 5-hydroxyoxindole ; - la figure 17 montre l'effet sur les activités MAO-A et MAO-B cérébrales de rats mesurées ex vivo, 2 heures après l'injection intra-périnotéale de 5hydroxyoxindole ; - la figure 18 montre l'effet du 5hydroxyoxindole sur l'activité MAO cérébrale de rats in vi tro ; - la figure 19 montre l'effet du 5hydroxyoxindole sur l'activité des MAP kinases p44/p42 étudié sur la lignée N1E-115 ; - la figure 20 montre l'effet proapoptotique du 5-hydroxyoxindole sur la lignée N1E-115 ; - la figure 21 montre la coloration nucléaire de cellules N1E-115 cultivées sans (A) ou avec 20uM de 5hydroxyoxindole (B) par le colorant spécifique de l'ADN Hoechst 33258. Exemple 1 données physiologiques (rats, souris). Les expériences de physiologie ont été réalisées sur des rats mâles de 250-270 g de souche Wistar (élevage Iffa Crédo - France) et des souris mâles de 50-60 g de souche Swiss (élevage Iffa Crédo - France) disposant de nourriture (aliment entretien) et d'eau de boisson à volonté. Conditions d'animalerie : éclairage 8h-20h, température 21 C. a) Rythme circadien (rats). i) Protocole de sacrifice . Les rats ont été sacrifiés par décapitation. En période obscure, les sacrifices ont été réalisés sous lumière inactinique. 3 rats par point. ii) Protocole de préparation des sérums : Le sang a été collecté en tube plastique et laissé à température ambiante pendant lh. Une fois la coagulation achevée, le sérum est prélevé dans un tube propre et centrifugé à froid (600 g, 4 C) durant 20 minutes afin d'éliminer les hématies isolées. Le sérum est prélevé, aliquoté et stocké à -20 C jusqu'au jour du dosage du 5hydroxyoxindole. iii) Protocole de dosage du 5-hydroxyoxindole (forme libre) : - Méthode de dosage : pour toutes les quantifications de 5-hydroxyoxindole, un système par HPLC avec une détection électrochimique (ECD) a été développé. HPLC-ECD est un modèle Kontrom, la pompe quaternaire est un modèle WellChrom Maxi-Star K-1000 avec un injecteur automatique Midas équipé d'un contrôleur de température à 4 C et d'un four à colonne à 29 C Knauer, Berlin, Germany). L'ECD est composé de 8 électrodes (Coularray) à -200,500, 1000,-200, 500,600, 700 et 800 mV. Les signaux électrochimiques sont enregistrés et traités par le logiciel intégré du Coularray (ESA Inc. Chemsford MA, USA) et comparés à des taux de 5-hydroxyoxindole standards. Pour l'analyse chromatographique, la séparation est réalisée en utilisant une colonne Symmetry-Shield Rpl8 phase-reverse (250 x 4,6 mm I.D., dp 5 m) protégée par une colonne Sentry (3,9 x 30 mm, Waters Assoc.). Le volume injecté est de 20 l. La phase mobile est composée de tampon phosphate de sodium 0,13 M, d'acétonitrile 4 %, de sulfonate de dodécyl de sodium et d'acide nitrilotriacétique ; le pH est ajusté à 3,35 avec de l'acide phosphorique. Le débit de la phase mobile est de 1 ml/min. Après chaque élution, le système est lavé avec une seconde phase mobile, de même composition avec 50 % d'acétonitrile. L'évaporation sous flux d'azote est réalisée dans un concentrateur Dri-Block DB-3 (Techne, USA) . - Extraction en phase solide du sérum : pour éliminer les interactions ioniques du 5-hydroxyoxindole avec les autres composants du sérum, 300 ul de H2SO4 1 M par 300 ul de sérum ont été ajoutés à tous les échantillons. Les échantillons dilués ont été homogénéisés, conservés à 4 C avant l'extraction. Des cartouches d'extraction Oasis HLB (Waters Ass.) ont été utilisées avec un vide de 5 Hg de pression. Chaque échantillon a été transféré dans le haut de la cartouche, préalablement activée par 1 ml de méthanol et 1 ml d'eau. 1 ml de méthanol 5 % a été ajouté et le vide a été appliqué à la cartouche. L'éluat a été évaporé sous azote à 30 C. Le résidu a été reconstitué par 100 l de la phase mobile, filtré à travers un filtre de 0,22 um (Ultrafree-MC, Millipore, Ass) et transféré sur l'injecteur automatique. iv) Résultats : Comme le montre la figure 5, il n'y a pas de rythme circadien des taux sériques de 5hydroxyoxindole (forme libre) alors que l'élévation du taux de corticostérone en fin d'après-midi confirme la "normalité circadienne" des animaux utilisés. b) Taux tissulaires et sériques (rats). i) Protocole de sacrifice : Les rats ont été sacrifiés par décapitation (n = 6). ii) Protocole de préparation des extraits tissulaires : Les organes sont collectés rapidement, pesés et homogénéisés à l'ultra-turax dans de l'éthanol absolu dans un rapport de 20 g de tissu pour 100 ml d'éthanol. L'homogénat est centrifugé à 48 400 g, 25 minutes à 4 C. Le surnageant est prélevé puis le culot est relavé dans le même volume d'éthanol et centrifugé une deuxième fois. Les deux surnageants sont rassemblés et centrifugés à 100 000 g, 20 minutes à 4 C. Le surnageant est évaporé à sec et le culot résiduel stocké à -80 C, sous argon, jusqu'au jour du dosage. iii) Protocole de préparation des sérums : identique à celui de l'exemple 1-a. iv) Protocole de dosage du 5-hydroxyoxindole (forme libre) : identique à celui de l'exemple 1-a. v) Résultats : Comme le montre la figure 6, pour les organes étudiés, le taux de 5-hydroxyoxindole tissulaire est sensiblement identique au taux sérique excepté dans l'hypophyse et le muscle squelettique où il est bien plus important. c) Demi-vie sérique et tissulaire (souris). i) Protocole d'injection : Les souris (mâles Swiss, élévage Iffa Credo) anesthésiées à l'éther ont reçu une injection intraveineuse (veine jugulaire) de 50 l de 5-hydroxyoxindole radiomarqué au tritium (procédure propriété Sib. Tech Inc., Newington CT 06111 USA). Il a été injecté 2 x 106 cpm de traceur dilué dans du sérum physiologique stérile (préparation injectable laboratoires Meram) ce qui correspond à une dose de 5-hydroxyoxindole inj ectée de 20 nmoles. Les souris ont été sacrifiées par décapitation à des temps variables post-injection (de 5 minutes à 24 h). ii) Protocole de liquéfaction des tissus : Les organes ont été prélevés, pesés, coupés en menus morceaux et traités par du soluène 350 (Packard Instrument) dans la proportion de 5 ml par g de tissu excepté pour l'hypophyse qui a été traitée par 500 ul de soluène pour 10 mg. iii) Protocole de comptage de la radioactivité dans les organes et le sérum : Un aliquote de 25 ul (sérum), 50 l (organes), et 200 l (hypophyse) a été prélevé et la radioactivité a été mesurée (compteur Wallac 1209 rackbeta) dans 4 ml de liquide scintillant (Optiphase "hisafe 3" Wallac). iv) Résultats . Comme le montre la figure 7, la radioactivité sérique diminue très rapidement au cours du temps et est excrétée par le rein. Comme le montre la figure 8, cinq minutes après l'injection de 5hydroxyoxindole radiomarqué, 17% de la dose injectée est retrouvée dans le sérum contre 30 % dans le rein. La demivie sérique du 5-hydroxyoxindole est donc très courte ( Exemple 2 liaison du 5-hydroxyindole radiomarqué sur coupes de tissus (rats). Les expériences de liaison ont été réalisées, ex vivo, sur coupes de tissus. La cartographie et la quantification de la radioactivité spécifiquement fixée ont été réalisées avec un radio-imageur (beta-imager, Biospace, France) . a) Localisations centrales et périphériques (rats) . i) Protocoles des expériences de liaison d'un traceur radioactif sur coupes d'organes. - 5-hydroxyoxindole radiomarqué : Comme dans l'exemple 1 (c). - Expériences de liaison selon protocole publié dans Histochem J 28: 801-809 (1996). ii) Imagerie : les images correspondent à des autoradiogrammes numériques obtenus après incubation des coupes de tissus avec le 5-hydroxyoxindole radioactif à la concentration 0,3 uM durant lh. Tous les marquages sont spécifiques (la liaison non spécifique a été étudiée par la co-incubation du 5-hydroxyoxindole radiomarqué avec un excès de 5-hydroxyoxindole froid-500 fois plus en concentration-). L'acquisition des images a duré 24h (contre 2 mois pour une image sur film autoradiographique). iii) Résultats . Comme le montre les figures 9 et 10, les sites spécifiques de liaison du 5hydroxyoxindole tritié ont été localisés, au niveau du cerveau ainsi que dans l'hypophyse, la rate et le foie. Au niveau du cerveau, les sites de liaison ont été observés dans les organes circum-ventriculaire, la vascularisation méningée et les plexus choroïdes. b) Caractérisation biochimique (rats). i) Protocole des expériences de saturation : L'incubation des coupes a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus mais avec des doses croissantes de radioactivité (0,2 à 3,8 uM). La quantité de radioactivité liée est exprimée en coups par mm2 et par heure et les résultats analysés par relation non linéaire (binding isotherm, logiciel GraphPad PRISM) sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous : Tableau 1 Tissus (rat) Affinité ( M) Liaison maximale (cph/mm2) Plexus choroïde 0,38 0,14 51 15 Hypophyse 0,89 0,26 215 43 Rate 0,91 0,32 100 9 Foie 0,50 0,17 36 7 ii) Résultats : L'analyse des courbes de saturation tel l'exemple figure 11 montre qu'il existe une seule classe de sites d'affinité micromolaire pour le 5hydroxyoxindole tritié. Le plus grand nombre de sites est retrouvé dans l'hypophyse, la rate et les plexus choroïdes. c) Spécificité pharmacologique (rats). i) Protocole des expériences de compétition. L'incubation des coupes a été réalisée selon le protocole ci-dessus soit avec 0,3 M de 5-hydroxyoxindole tritié soit co-incubées avec 0,3 uM de radioligand et 1,5 uM de diverses molécules structurellement apparentées. Les résultats sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 Composés non marqués Efficacité de la compétion (%) avec (1,5 M) le 3H-5-hydroxyoxindole marqué (0,3 M) Cerveau Foie 5-hydroxyoxindole 100 100 Isatine 0 0 Oxindole 0 0 Melatonine 50 50 Serotonine 100 100 5-HIAA 50 Tryptophane 0 0 ii) Résultats : L'analyse des expériences de compétition montre que la liaison du 5-hydroxyoxindole radiomarqué est totalement déplaçable par un excès de sérotonine. La mélatonine utilisée à la même concentration (1,5 uM) n'inhibe que 50 % de la liaison. Les autres oxindoles endogènes, oxindole et isatine, sont sans effet sur la liaison du 5-hydroxyoxindole tritié. En conclusion, le 5-hydroxyoxindole pourrait interagir avec des récepteurs de la sérotonine. L'identification de ces récepteurs est en cours. Exemple 3 : Modifications expérimentales des taux circulants de 5-hydroxyindole chez le rat. a) Expériences de gavage (rats). i) Protocole de gavage : Les rats (n = 16) ont été gavés d'indole ou d'oxindole à l'aide d'une sonde adaptée (fabrication, Professeur H. Brugère Ecole vétérinaire Maisons-Alfort). L'indole a été solubilisé dans de l'huile d'arachide et l'oxindole émulsionné dans le même véhicule. Les animaux témoins ont ingéré 500 l d'huile ou 500 pl d'huile contenant 10, 25 et 38 mg d'indole ou d'oxindole. Le sacrifice par décapitation a eu lieu 2h après le gavage. ii) Protocole de préparation des sérums : identique à celui de l'exemple 1 (a). iii) Protocole de préparation des extraits de cerveau : identique à celui de l'exemple 1 (b). iv) Résultats :L'augmentation du taux sérique et cérébral de 5-hydroxyoxindole est obtenue de façon dosedépendante après ingestion d'indole (figure 12) comme d'oxindole (figure 13). Le facteur maximal d'augmentation est obtenu avec l'oxindole, il est de 100 dans le sérum et de 50 dans le cerveau. b) Injections intra-péritonéales (rats). i) Protocole d'injection I.P. : Le 5hydroxyoxindole et l'isatine ont été solubilisés dans du DMSO (Sigma) à raison de 5 à 50 mg/ml et injecté en intrapéritonéale à raison de 500 l par 250 g de poids corporel. ii) Protocole de préparation des sérums : identique à celui de l'exemple 1-a (1 rat par point). iii) Résultats : Comme le montre la figure 14 l'injection intra-péritonéale de 5-hydroxyoxindole comme d'isatine provoque une augmentation dose-dépendante du taux sérique de la molécule. A la dose maximale injectée (100 mg/kg), l'augmentation du taux sérique de 5-hydroxyoxindole est, 2h post-injection, de 40 fois le taux endogène moyen pour l'injection de 5-hydroxyoxindole. NB : la dose létale, éventuelle, n'a pas encore été recherchée pour le 5-hydroxyoxindole comme pour l'isatine. Exemple 4 : Effets comportementaux induits par injection de 5-hydroxyoxindole chez le rat. Il avait été noté que les rats traités par l'indole, l'oxindole et le 5-hydroxyoxindole étaient particulièrement calmes et faciles à manipuler. Leur tonus musculaire semblait abaissé. a) Effets sur l'activité locomotrice après injections (rats). i) Protocole d'injection I.P. : identique à l'exemple n 3-b (3 rats par point pour les traités par le 5-hydroxyoxindole, 9 rats pour les témoins DMSO). ii) Protocole de mesure de l'activité locomotrice : Les rats injectés de 5-hydroxyoxindole ou de DMSO ont été placés, durant 2h, en cages individuelles munies d'un actimètre photoéléctrique (d'après J.R. Boissieu, Apelex, France). iii) Résultats . Comme le montre la figure 15, l'activité locomotrice est fortement diminuée pour les rats traités par 30,40 et 60 mg/kg de 5-hydroxyoxindole. A plus petites doses, l'activité est égale sinon supérieure à celle des témoins et pourrait être rapportée à la propriété MAO inhibitrice du 5-hydroxyoxindole (cf. exemple n 4-c). b) Effets sur la contraction musculaire (rats). i) Protocole de préparation de l'EDL (muscle squelettique rapide) : La préparation a été réalisée sur rats anesthésiés par injection intrapéritonéale (lOOul/lOOg de poids corporel) avec du pentobarbital sodique (Sanofi). Le muscle extenseur des doigts de la patte arrière du rat (EDL : Extensor Digitorum Longus) a été "isolé" par section du nerf sciatique qui l'innerve d'une part et section du tendon qui relie le muscle aux doigts de la patte d'autre part. ii) Protocole d'étude de la contraction musculaire : La contraction musculaire est provoquée par stimulation électrique du nerf sciatique : stimulation supramaximale et tétanique. L'enregistrement de la contraction musculaire est réalisée grâce à la fixation du tendon à une jauge de contrainte. Le tracé des contractions musculaire est obtenu sur écran d'ordinateur grâce au logiciel PCS32 interface Bellman. Le 5-hydroxyoxindole solubilisé dans le DMSO a été injecté en intraveineuse (jugulaire). iii) Résultats . Comme le montre la figure 16, une modification de la contraction tétanique du muscle EDL a été obtenue en quelques minutes après injection unique intraveineuse de 20mg/kg de 5-hydroxyoxindole. Les effets se traduisent par une diminution de l'amplitude de la contraction (amplitude de départ et amplitude de fin de contraction) et une désynchronisation de la contraction. L'effet est maximal 20 min post-injection. Il a été vérifié qu'il n'y avait aucun effet propre du DMSO. La récupération des paramètres de départ de la contraction survient dans l'heure qui suit l'injection. c) Effet inhibiteur, in vivo, de l'activité MAO cérébrale (rats). i) Traitements : Les rats ont reçu une injection intra-péritonéale de 10 ou 60 mg/kg de 5hydroxyoxindole solubilisé dans 500 ul de DMSO. Les cerveaux ont été prélevés 2h post-injection (sacrifice par décapitation). ii) Protocole de préparation des mitochondries cérébrales : Les cerveaux débarrassés de leurs méninges ont été homogénéisés à l'aide d'un broyeur Potter. Les mitochondries cérébrales ont été purifiées selon la méthode de M. J. Lopez-Perez (Methods Enzymol. 1994 ; 228 : 403- 411). iii) Protocole de dosage des activités MAO-A et MAO-B : les activités MAO-A et MAO-B ont été déterminées en utilisant les substrats : 5-hydroxytryptamine créatinine sulfate (5-HT, substrat spécifique de la MAO-A) et phénylethylamine (PEA, substrat spécifique de la MAO-B). Cinquante ug de suspension mitochondriale ont été incubés 30 min à 37 C avec 20 uM de 5-HT ou 10 uM de PEA dans 250 l de tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4. La réaction a été arrêtée par ajout de 250 l d'HCl 3N et les produits oxydés ont été extraits par 6 volumes de toluène. Après agitation, la phase organique a été séparée par congélation à -40 C et la radioactivité d'un aliquot de 1 ml a été mesurée. iv) Résultats : Comme le montre la figure 17, un effet inhibiteur de l'activité enzymatique mitochondriale cérébrale est observé 2h après injection I. P. de 10 mg/kg de 5-hydroxyoxindole mais pas après injection de 60 mg/kg. A cette dose de lOmg/kg, il n'y a pas d'effet sédatif, l'activité locomotrice des animaux est semblable à celle des témoins. En revanche, après injection de 60 mg/kg les animaux sont très calmes et peu actifs et l'activté MAO a été trouvée semblable à celle des témoins. Il existe donc un effet biphasique du 5-hydroxyoxindole au niveau central. Exemple 5 : Effet inhibiteur, in vitro, du 5hydroxyoxindole sur l'activité MAO cérébrale (rats). i) Protocole de préparation mitochondriale et dosage de l'activité MAO : identiques à l'exemple 4 (c). ii) Résultats : Comme le montre la figure 18, le 5-hydroxyoxindole est un inhibiteur préférentiel de l'activité MAO-A. Exemple 6 : Effets inhibiteurs, in vitro, du 5hydroxyoxindole sur la prolifération cellulaire. a) Effets sur la prolifération de différentes lignées. i) Conditions de culture cellulaire : Les cellules adhérentes (NlE-115, Balb/c3T3, BBC) ont été cultivées en milieu de Eagle modifié (DMEM, Gibco BRL, Cergy-Pontoise, France) supplémenté par 10 % de sérum de veau f#tal décomplémenté (SVF), 2 mM de glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 ug/ml de streptomycine à 37 C sous une atmosphère humide à 7 % de C02. Les cellules ont été trypsinées tous les 4 jours. ii) Test de prolifération cellulaire : Les cellules ont été traitées pendant 20 h par un ajout de 5hydroxyoxindole ou d'autres molécules dans le milieu DMEM complémenté en 1 % SVF. Les cellules ont été ensuite incubées pendant 4h avec 1 pCi/point de thymidine radiomarquée (méthyl-3H-thymidine ; ICN-Orsay, France). L'incorporation a été arrêtée par aspiration du surnageant. Après fixation des cellules par de l'acide trichloroacétique à 10 %, la radioactivité incorporée dans l'ADN a été récupérée par traitement à la soude 3 M et mesurée au compteur micro-beta (Wallac, Turku, Finlande). Les concentrations efficaces à 50 % ont été calculées selon une analyse de régression non-linéaire. Ces résultats sont rapportés dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 EC50 ( M) Composés NIE-115 BALB/c3T3 BBC 5-hydroxyoxindole 21,2 3,71 15,0 3,2 19,4 3,5 Isatine 47,2 4,6 a 24,3 11,1 37,2 6,6 a Melatonine 158,5 21,3 b 104,9 73,5 b 257,8 52,9 b 5- 184,8 72,9 b 133,9 22,9 b Linéaire hydroxytryptophane Serotonine 400,5 102,2 b 395,0 117,3 b Linéaire b Acide acétique 5- 1332,5 830,1 b 1495,5 545,9 b 1445,4 122,2 b hydroxyindole Oxindole Linéaire b Linéaire b Tryptophane Linéaire b Linéaire b Les valeurs d'EC50 ont été déterminées par analyse des courbes dose-réponse de la figure 11. Les résultats sont des moyennes SEM de 3 expériences séparées réalisées en triplicates. Les lettres a et b indiquent les différences significatives entre le traitement par le 5hydroxyoxindole versus les autres composés (a : p des molécules testées n'a présenté la même efficacité. Il est à noter que l'oxindole n'a aucune propriété antiproliférative. b) Effet inhibiteur sur l'activité MAP kinases p44/p42 (lignée NlE-115). i) Conditions de culture cellulaire : Les cellules ont été carencées 18h en 0% SVF. ii) Protocole de mesure des activités MAP kinases : Les cellules ont été pré-traitées avec le 5hydroxyoxindole pendant 5 min puis stimulées par 1% de SVF pendant 5 min, puis rincées dans du tampon phosphate 0. 1 M pH 7,4 froid et grattées dans 70 ul de tampon glycérophosphate 40 mM pH 7,3 contenant de l'EGTA (10 mM), du MgCl2 (10 mM) , de l'orthovanadate de sodium (1 mM) , du ssmercaptoethanol (1 mM), du NP-40 (0,5 %, vol/vol), du fluoride de phenylmethylsulfonyl (1 mM) et de la leupeptine (1 ug/ml). Le matériel insoluble a été éliminé par centrifugation (12 000 g pendant 20 min à 4 C). Le surnageant contenant l'activité MAP kinases a été aliquoté et conservé à -80 C jusqu'au jour du dosage de l'activité enzymatique. Une quantité de 5 g de protéines a été incubée pendant 20 min à 37 C avec 0,1 uCi [32P][gamma]ATP (4000 Ci/mmol., ICN-Orsay, France), 1 mg/ml d'inhibiteur de protéines kinases A et C, et 25 ug d'un substrat synthétique (APRTPGGRR) correspondant aux acides aminés 95- 98 de la protéine basique de la myéline bovine (Calbiochem, Meudon, France). La réaction a été arrêtée en ajoutant de l'acide trichloracétique (3% poids/vol) et en centrifugeant à 12 000 g pendant 15 min à 4 C. Le complexe radiomarqué a été fixé sur des papiers P81-Wathman et lavé dans un bain d'acide acétique (30% vol/vol) et d'ATP froid (3 mM) pendant 2h à 4 C. Les papiers ont été rincés dans un mélange éthanol/éther (50/50, vol/vol), puis dans l'éther et la radioactivité a été comptée. iii) Protocole d'expériences de western-blot Les cellules ont été pré-traitées avec le 5-hydroxyoxindole pendant 5 min puis stimulées par 1% de SVF pendant 5 min. Après rinçage dans du tampon phosphate 0. 1 M pH 7,4 froid, les cellules ont été grattées dans 70 l de tampon Laemmli (d'après Laemmli U.K., 1970, Nature, 227, 680-685) contenant du Tris 10 mM pH 6,8, du sulfonate de dodécyl de sodium 0,5%, du P-mercaptoéthanol 1%, du bleu de bromophénol et du glycérol 20%. Les échantillons (25 ug de protéines) ont été séparés sur un gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) à 10%. Les protéines ont été transférées sur une membrane de PVDF (Millipore, Saint-Quentin, Yvelines, France). Les membranes ont été saturées dans 3% d'albumine dans un tampon TBS contenant 50 mM Tris pH 7,2,150 mM NaCl et du polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween 20,0,1% vol/vol). Les membranes ont été immunoblottées toute la nuit à 4 C avec l'anticorps monoclonal de souris antiphospho-P44/42 MAP kinases (New England Biolabs, Inc.Beverly, US). Après rinçage par du tampon TBS, les membranes ont été traitées avec l'anticorps secondaire chèvre anti-souris couplé à la péroxydase pendant lh et l'activité péroxydase a été détectée avec un réactif chimioluminescent (Borrhinger- Mannheim, Germany). iv) Résultats : Comme le montre la figure 19, l'inhibition de l'activité MAP Kinases totale (p42 + p44) par le 5-hydroxyoxindole est évidente à la concentration de 60 uM mais l'inactivation de la p42 est évidente dès 10 M. c) Effets proapoptotiques sur un neuroblastome (N1E-115). i) Conditions de culture cellulaire : identique à l'exemple 6-a. ii) Test de la viabilité cellulaire : Les cellules ont été traitées pendant 24,48 et 72h avec des concentrations de 10 à 100 M de 5-hydroxyoxindole. Après chaque temps d'étude, le bromide de (3, [4,5dimethylthiazol-2-yl-]diphényltetrazolium (MTT, Sigma, saint-Quentin Fallavier, France) a été ajouté pendant 2h sur les cellules en culture. Le milieu de culture a été retiré et les cellules ont été rincées avec du tampon phosphate 0,1 M pH 7,4. Les cellules vivantes métabolisent le MTT jaune en cristaux de formazan violets, qui ont été solubilisés dans le DMSO et quantifiés par absorption à 590 nm comme un index du nombre relatif de cellules vivantes. iii) Mise en évidence des cellules apoptotiques : Les cellules traitées durant 72h par 20 uM de 5-hydroxyoxindole ont été rincées dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,4, fixées par une solution de paraformaldéhyde à 4 % et marquées avec 10 pg/ml de sonde nucléaire Hoechst 33258 (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France) pendant 10 min. à 37 C. Après lavage dans l'eau, les cellules ont été observées, sans montage préalable, à 365 nm de longueur d'onde d'excitation au microscope inversé à fluorescence. iv) Résultats : La figure 20 montre qu'à la concentration de 20 pM, le Marqueur T n'entraîne aucune mort cellulaire durant 24h. La mort cellulaire est dosedépendante et la mort par apoptose n'apparaît qu'après 48h de culture (illustration figure 21b). L'effet proapoptotique du 5-hydroxyoxindole est dose-dépendant. En conclusion, le Marqueur T possède des cibles cellulaires qui lui permettent d'interférer avec la voie de la prolifération cellulaire comme avec le catabolisme des neurotransmetteurs (activité MAO). REVENDICATIONS 1) Composition pharmaceutique contenant comme principe actif du 5-hydroxyoxindole, un de ses conjugués ou précurseurs, ou un mélange de ceux-ci, ou encore un microorganisme purifié présent dans la flore intestinale humaine et produisant un desdits précurseurs ou un micro-organisme génétiquement modifié pour produire le 5-hydroxyoxindole lui-même, un de ses conjugués ou précurseurs, associé dans ladite composition avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 2) Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que le précurseur du 5hydroxyoxindole est choisi parmi l'indole, l'oxindole, l'isatine. 3) Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que le conjugué du 5hydroxyoxindole est choisi parmi les monosulfates, les bisulfates, les trisulfates, les monosulfates monoglucuronés, les disulfates monoglucuronés, les conjugués du 5-hydroxyoxindole en sa forme oxydée. 4) Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que le micro-organisme purifié est une bactérie présente dans la flore intestinale humaine ou un bactérie génétiquement modifiée. 5) Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour le traitement ou la prévention des cancers. 6) Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour le traitement ou la prévention des états d'anxiété, d'hyperactivité, d'insomnies. 7) Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour le traitement ou la prévention des dépressions. 8) Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour le traitement ou la prévention des souffrances musculaires.