FR 2798385 A1 20010316 FR 9907855 A 19990621 L'invention concerne un procédé de recherche d'une résistance du virus VIH- 2 à un traitement par une anti-protéase, chez un patient contaminé par le VIH-2, ainsi que des sondes nucléotidiques utilisables dans une telle recherche. Deux virus sont la cause du syndrome d'immunodéficience acquise (sida): VIH-1 et VIH-2. VIH-1 est présent dans le monde entier alors que VIH-2 est présent principalement en Afrique de l'Ouest. Des traitements antiviraux efficaces sont largement utilisés depuis 1996 dans les pays développés o le virus présent est VIH-I. Le coût de ces traitements ne permet pas leur utilisation dans les pays en voie de développement o le VIH-2 est présent. Les traitements anti-rétroviraux sont répartis en 3 classes: antiprotéase (In- dinavir, Ritonavir, Saquinavir, Nelfinavir et Amprenavir), inhibiteurs nucléosidique, de transcriptase inverse, dite RT (Zidovudine, Didanosine, Zalcitabine, Lamivudine, Stavu- dine, Abacavir, FTC et Adefovir) et inhibiteurs non nucléosidiques de RT (Nevirapine Delavirdine et Efavirenz). Ces traitements sont souvent effectués conjointement; on parle alors de multithérapies. Les anti-protéases induisent des mutations primaires qui confèrent un degré élevé de résistance mais altèrent la capacité de réplication du virus. Il est nécessaire pour le virus de sélectionner des mutations secondaires pour être à la fois résistant et capable de se répliquer activement. Par ailleurs, des mutations de la transcriptase inverse ont été décrites dans le cas d'utilisation conjointe d'inhibiteurs nucléosidique de la RT. Pendant le traitement de l'infection à VIH-I, notamment si la concentration circulante des agents traitants est insuffisante, la réplication virale n'est pas suffisamment inhibée ou remonte au-dessus du seuil de détection des techniques de charge virale dispo- nibles (la "charge virale" est la mesure de la quantité des génomes de virus circulants). Du fait du taux d'erreur élevé de la transcription inverse, cela se traduit par l'apparition de mutations dans les gènes qui sont la cible des traitements: la protéase' et la transcrip- tase inverse. Certaines mutations entraînent l'apparition de résistances, à des degrés divers, aux antiviraux. On aboutit à des situations d'échec virologique chez 20 à 40 % des patients traités par les multithérapies mises en pratique actuellement. La mise en évidence de virus résistants à une ou plusieurs molécules chez un patient avant traitement ou lors d'une réaugmentation de la charge virale permet de choi- sir la meilleure association de molécules pour traiter le VIH- 1. -2- Il n'y a pas actuellement de données publiées concernant la présence de mu- tations dans le génome du VIH-2, dues à l'utilisation d'anti-protéases. Les traitements par les agents anti-protéases, actifs pour VIH-1, le sont aussi pour VIH-2. Cependant, aucune méthode n'est disponible pour aider le clinicien à déter- miner la résistance aux traitements par anti-protéases chez les patients contaminés par le VIH-2. La séquence d'acides aminés de la protéase de VIH-2 est connue. Dans la pré- sente demande, la numérotation des acides aminés de cette séquence peut être déduite de celle décrite dans Human Retroviruses and Aids, 1997, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico, Chapitre II, pp. B 10 et B 1. Le premier acide aminé de la sé- quence de la protéase, qui est considéré comme la position I dans la présente demande, est la proline en position 86 de la polyprotéine PoL de la souche ROD. On a maintenant découvert que les traitements aux anti-protéases sont sus- ceptibles de faire apparaître des mutations aux positions 45, 54, 64, 84 et 90 de la protéa- se de VIH-2, et que les souches virales mutées ainsi apparues sont généralement résistantes à l'un au moins des agents anti-protéases utilisés. L'objet de la présente invention est donc un procédé de recherche d'une ré- sistance éventuelle d'une souche virale VIH-2 à un traitement par un agent anti-protéase. Dans une phase préliminaire de recherche, il s'agit d'un procédé dans lequel: a) on recherche, selon les méthodes connues, la présence d'au moins une mutation à l'une de positions 45, 54, 64, 84 et 90 de la séquence protéique de la protéase de ladite souche virale provenant d'un échantillon biologique prélevé sur un patient con- taminé par VIH-2, b) on sélectionne, parmi les mutations trouvées en a), celles qui, après clo- nage dans un virus VIH-2, n'empêchent pas le clone viral obtenu de se multiplier en cul- ture en présence dudit agent anti-protéase, et c) dans le cas o au moins une mutation est sélectionnée à l'étape b), on con- clut à l'existence d'une résistance audit agent anti-protéase mentionné en b). On sélectionne, parmi les mutations trouvées en a), celles qui, lorsqu'elles sont présentes dans un gène cloné dans un virus VIH-2, confèrent au clone viral la pro- priété de ne pas être affecté significativement dans sa capacité à se multiplier en présence dudit agent anti-protéase. Pour mettre en oeuvre l'étape b), on peut opérer comme indiqué -3 - ci-après. Les mutations à tester sont introduites individuellement dans un clone de virus par mutagénèse dirigée selon la méthode décrite dans l'article de Kemp et al, J. Virol., 72(6), p 5093-5098, 1998. Les clones ainsi obtenus sont mis en culture avec comme réfé- rence un clone sauvage de virus, c'est à dire non muté, en présence des différentes dro- gues anti-protéases susceptibles d'agir contre le virus VIH2. Une mesure du CI50, par exemple avec un test colorimétrique (voir publication de Kemp citée ci-dessus), permet de déterminer l'importance de la mutation (mineure ou majeure) vis-à-vis des différentes drogues testées. On peut ainsi sélectionner les mutations qui permettent au virus de se multiplier en présence d'un agent anti-protéase, ces mutations donnant naissance à des souches résistantes à cet anti-protéase. Bien entendu, dans le cas prévu en c), on doit envisager le traitement du pa- tient, dans le futur, avec un agent anti-protéase différent de celui pour lequel l'existence d'une résistance a été ainsi révélées chez le patient considéré. Dans le cas o l'étape b) n'a pas permis de sélectionner une mutation trouvée à l'étape a), on peut conclure que la mutation considérée n'a pas induit une résistance du virus VIH-2 à l'agent anti-protéase testé, chez le patient considéré. Il est évident que, lorsque l'étape b) a permis d'identifier une mutation qui en- gendre une résistance à un agent anti-protéase donné, il n'y a pas lieu de mettre en oeuvre ultérieurement l'étape b) du procédé décrit ci-dessus. Dans ce cas, l'étape a) suffit puis- que, le lien entre la mutation et la résistance à l'agent anti-protéase ayant été établi, une fois pour toutes, il est possible de passer directement à l'étape c) et de conclure à l'exis- tence d'une résistance à l'agent anti-protéase étudié. L'invention concerne notamment un procédé de recherche d'une résistance éventuelle d'une souche virale VIH-2 à un traitement par un agent antiprotéase, dans le- quel on recherche la présence d'au moins une mutation choisie parmi les mutations sui- vantes: K 45 R, 1 54 M, 1 64 V, I 84 L, L 90 M, dans la séquence protéique de la protéase de ladite souche virale, et dans lequel on con- clut à l'existence de ladite résistance en cas de présence de ladite mutations ou desdites mutations. La représentation conventionnelle utilisée dans la présente demande pour dé- crire une mutation est la suivante: le nombre indique la position sur la séquence d'acides -4- aminés de la protéase de VIH-2. La première lettre indique l'acide aminé de la souche sauvage selon la classification internationale, avec le code à une lettre. La deuxième lettre indique l'acide aminé, selon la même classification, qui résulte de l'apparition de la mu- tation. Par "souche" sauvage, l'on entend une souche de virus n'ayant pas muté suite à un traitement avec une anti-protéase. Pour rechercher une mutation de la séquence protéique de la protéase de la souche virale considérée, on opère de préférence en recherchant une mutation correspon- dante sur la séquence nucléotidique du gène de ladite protéase. La recherche de ces mu- tations peut se faire sur l'ADN ou l'ARN. On peut effectuer cette recherche selon les méthodes connues, en particulier par les techniques d'hybridation ou de séquençage. Dans un premier mode de réalisation de l'invention, une méthode d'hybridation à l'aide de sondes spécifiques est mise en oeuvre pour la recherche de la ou des mutations. Un mode d'exécution particulier utilisant une méthode d'hybridation consiste à obtenir un polynucléotide contenant tout ou partie du gène de la protéase, et comprenant la séquence d'intérêt correspondant à la région contenant la mutation à rechercher. Un tel polynucléotide peut être obtenu notamment par amplification enzymatique. La méthode utilisée comprend alors les étapes consistant à mettre en contact ledit polynucléotide avec une sonde nucléotidique, fixée ou susceptible de se fixer sur un support solide, et capable de s'hybrider spécifiquement avec un tel polynucléotide uniquement dans le cas o le polynucléotide comporte la mutation étudiée; puis à révéler, selon les méthodes connues, la présence éventuelle du polynucléotide, fixé au support solide notamment par l'intermé- diaire d'une la sonde de capture. Pour cela, on peut soumettre le support solide à une étape de lavage, après quoi on révèle la présence du polynucléotide, à l'état fixé sur le support, soit par une méthode physique, soit à l'aide d'un marqueur approprié. La fixation de la sonde peut être réalisée directement par adsorption ou par covalence. La fixation peut aussi être réalisée indirectement par l'intermédiaire d'une réaction du type ligand/antiligand comme le couple biotine/streptavidine ou hap- tène/anticorps, l'antiligand étant fixé par exemple sur le support solide et le ligand étant fixé sur la sonde. Le polynucléotide peut aussi être marqué pendant l'étape d'amplification en- -5- zymatique, par exemple en utilisant un nucléoside triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le nucléotide marqué sera un désoxyribonucléotide dans les systèmes d'amplification générant un ADN, comme la PCR, ou un ribonucléotide dans les techni- ques d'amplification générant un ARN, comme les techniques TMA ou NASBA. Le polynucléotide peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich dé- crite dans le document WO 91/19812. Un mode particulier de marquage de polynucléotides est décrit dans la de- mande FR 98 07870 de la demanderesse. En variante, on peut préparer le polynucléotide comprenant tout ou partie du gène de la protéase par amplification enzymatique, en procédant par élongation d'amorces comportant un ligand. Le polynucléotide obtenu, qui comporte donc le ligand, peut être fixé sur le support solide par interaction avec un antiligand correspondant. On met ensuite en contact le support solide, sur lequel est fixé le polynucléotide, avec au moins une sonde capable de se fixer sur le polynucléotide de façon spécifique, uniquement s'il con- tient la mutation étudiée ou recherchée. Dans le cas o cette mutation est présente, la sonde se trouve fixée au support solide par l'intermédiaire de l'hybride qu'elle forme avec le polynucléotide lui-même fixé. Il reste alors à révéler la présence de l'hybride ainsi for- mé, selon les méthodes connues. Dans un autre mode d'exécution, on utilise une méthode d'hybridation com- prenant les étapes consistant à amplifier enzymatiquement tout ou partie du gène de la protéase à l'aide d'amorces portant un ligand pour générer un polynucléotide comportant au moins un ligand, à fixer le polynucléotide sur un support solide par interaction avec un antiligand comme décrit précédemment, à mettre en contact ledit polynucléotide fixé avec au moins une sonde capable de s'hybrider spécifiquement avec celui- ci, et à révéler l'hybride éventuellement formé. La sonde ne doit s'hybrider que si le polynucléotide contient la mutation recherchée. D'autres méthodes de détection par hybridation sont envisageables comme décrit dans Kricka et al., Clinical Chemistry, 45(4), pp. 453-458, 1999 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, pp. 173249. Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur les- quels peut être immobilisé un polynucléotide. Des matériaux de synthèse, ou des maté- -6- riaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme sup- port solide, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellu- lose, ou le dextran; des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des cérami- ques; des latex; des particules magnétiques; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO 9412670, d'une particule ou d'une biopuce. Par "biopuce", on entend un support solide de dimension réduite o sont fixés une multitude de polynucléotides à des positions prédéterminées. Des exemples de ces biopuces sont donnés par exemple dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, pp. 40-44, 1998; F. Ginot, Human Mutation, , pp. 1-10, 1997; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1(3), pp. 183-200, 1996; T. Li- vache et al, Nucleic Acids Research, 22(15), pp. 2915-2921, 1994; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 16, pp. 541-546, 1998. La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristiques d'hybridations des sondes sur la cible et de permettre un bruit de fond minimum pour la méthode de détection. Un avantage des bio- puces est qu'elles simplifient l'utilisation de nombreuses sondes tenant compte du poly- morphisme du virus dans les zones voisines de la mutation à rechercher. Une biopuce permettant de vérifier la présence ou l'absence de mutations peut être réalisée en suivant la procédure décrite par Kozal M. et al. Nature Medicine, 2, pp.753-759, 1996 en fonc- tion des alignements des séquences connues pour les différentes souches du VIH-2. Par "marqueur", on entend un traceur capable d'engendrer un signal. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêtagalactosidase, la glucose-6phosphate déshydrogé- nase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants; les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation -7- d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force ato- mique, l'effet tunnel, etc.; les molécules radioactives comme 32p, 35S ou 1251. Des systèmes d'amplification du signal peuvent être utilisés comme décrit dans le document WO/95 08000 et dans ce cas, la réaction préliminaire d'amplification enzymatique peut ne pas être nécessaire. Le terme "amorce" désigne une séquence oligonucléotidique capable de s'hybrider à une séquence nucléique d'intérêt et de servir de point de départ à une réac- tion d'élongation enzymatique pour produire un fragment d'acide nucléique complémen- taire d'une cible d'intérêt, comme le gène de la protéase ou une partie de ce gène. L'amorce a une taille comprise par exemple entre 5 et 50 nucléotides, en particulier entre et 30 nucléotides. De préférence, les amorces seront choisies dans des régions conser- vées du virus VIH-2 pour permettre l'amplification de toutes les souches du virus sus- ceptibles d'être rencontrées chez un patient, et donc de faire face au polymorphisme inhérent au virus VIH-2. Les sondes permettant de mettre en évidence une mutation sur les positions et/ou 54 et/ou 64 et/ou 84 et/ou 90, en s'hybridant sur tout ou partie du gène de la protéase du virus VIH-2 présent dans un échantillon biologique, sont aussi un objet de la présente invention. Le terme "sonde" fait référence à une séquence oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement à une séquence nucléique d'intérêt. En l'occurrence, le but de la présente invention étant de discriminer une mutation ponctuelle sur le gène de la proté- ase du VIH-2, la sonde doit permettre, dans les conditions d'hybridation ou de lavage prédéterminées, de différencier une mutation ponctuelle. La taille de ces sondes est com- prise entre 5 et 40 nucléotides, et notamment entre 9 et 25 nucléotides. Des méthodes de détermination de ces sondes sont décrites par exemple dans la demande de brevet WO 97/27332. La sonde sera construite par exemple de telle manière que la position de la mutation à mettre en évidence soit sensiblement au centre de la sonde. Les oligonucléotides utilisés comme amorces ou sondes peuvent comporter des nucléotides naturels ou modifiés comme les phosphorothioates, les Hphosphonates, les alkylphosphorothioates, ou des analogues de nucléotides contenant des bases comme l'inosine ou la nébularine à la place des bases puriques ou pyrimidiques présentes dans les nucléotides A, T, C, G, U. 8- Ces amorces ou sondes peuvent aussi être composées totalement ou partiel- lement de nucléosides d'anomérie alpha ou bêta ou d'isomères de la série D ou L, ou en- core de PNA (Nielsen et al, Nucleic Acid Research, 21(2), pp. 197-200, 1993). Dans un autre mode de réalisation de l'invention, on recherche la ou les mu- tations par séquençage de tout ou partie du gène de la protéase. Les différentes méthodes de séquençage sont bien connues: on peut utiliser notamment les méthodes de séquençage de Sanger, les méthodes de séquençage utilisant 4 puits pour la réaction des séquences étudiées avec des amorces de séquençage marquées par 4 fluorophores différents (Procédure " ABI Prism Dye Primer " de Perkin Elmer), ou le procédé décrit dans le brevet US 5795722 (Visible Genetics), ou bien la méthode utili- sant non pas des amorces marquées mais des nucléotides marqués (procédure exemple, dans Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook, Fritsch and Mania- tis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Chapitre 13. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, on recherche unique- ment la présence d'une ou plusieurs mutations données. Dans un autre mode de réalisa- tion de l'invention, on recherche à la fois la séquence nucléotidique mutée et la séquence nucléotidique sauvage (non mutée). Dans le cas o l'on met en oeuvre une méthode d'hybridation, on définit donc pour chaque position susceptible de muter au moins deux sondes: une sonde spécifique de la séquence mutée et une sonde spécifique de la sé- quence sauvage. L'utilisation des ces deux sondes permet de contrôler la méthode, puis- que l'une au moins des deux sondes doit réagir. Un autre avantage est de mettre en évidence, le cas échéant, la présence à la fois de souches mutées et de souches sauvages chez un patient. De préférence, l'acide nucléique cible est soumis à une réaction préliminaire d'amplification enzymatique pour augmenter la sensibilité du test, mais il est envisagea- ble de détecter directement l'acide nucléique cible. Les articles de Lewis (1992. Genetic Engineering News, 12, 1-9) d'une part, et d'Abramson et Myers (1993. Curr. Opin. Bio- technol., 4, 41-47), d'autre part, donnent des exemples d'amplification de cible. La tech- nique d'amplification enzymatique est par exemple choisie parmi les techniques NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), TMA (Transcription Mediated Amplifi- -9- cation) RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction), SDA (Strand Dis- placement Amplification) ou LCR (Ligase Chain Reaction). La recherche des souches virales mutantes est effectuée à partir d'un échan- tillon biologique éventuellement prétraité. Par "prétraitement", on entend les différentes étapes de traitement de l'échantillon pour rendre accessible l'acide nucléique cible, c'est à dire le gène de la protéase, comme par exemple, la lyse, la fluidification, la concentra- tion, la capture (voir par exemple US 5 750 338 et US 5 766 849) selon les méthodes connues en soi. Pour extraire l'ARN viral, on peut utiliser par exemple le réactif vendu par la société Boeringher Mannheim (High Pure Viral RNA référence 1858882) ou le kit Quia- gen (Viral RNA référence 29504). D'autres procédures sont décrites dans Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2e Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. L'échantillon biologique peut être un prélèvement quelconque du corps hu- main ou éventuellement un prélèvement enrichi par culture, comme par exemple, le sang, le sperme, un tissu cutané, un lavage broncho-alvéolaire, une biopsie, I'urine, des colo- nies, une culture liquide, etc. Les exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLES EXEMPLE 1 Une étude a porté sur trois patients contaminés par le VIH-2. Les patients I et 2 n'avaient jamais reçu d'anti-protéases. Le patient 3 avait déjà reçu du Ritonavir pendant 8 mois, et ce traitement avait été arrêté 5 mois avant le début de l'étude. Le premier échantillon étudié a été prélevé avant le début du traitement, chez les patients I et 2, et 6 semaines après le début du traitement par Ritonavir chez le patient 3. Chez les patients I et 2, des échantillons prélevés respectivement 2 mois et 5 mois après le début du traite- ment ont été étudiés. Pour le patient 3, deux échantillons (8 mois et 11 mois) ont été ana- lysés. Le traitement était constitué de Ritonavir pour le patient 2 et de Ritonavir/Saquinavir pour les patients I et 3, aux doses préconisées. BR99754/IDI. 991885 -10- Méthodes: Les plasmas ont été obtenus par centrifugation du sang total à 800 xg pen- dant 10 minutes et clarifiés par une deuxième centrifugation à 3 000 xg pendant 15 mi- nutes. 500 microlitres de plasma pur ont été ajoutés à 1,5 millilitres de culture de lymphocytes frais stimulés par la PHA (106 cellules / boîte). La réplication virale dans le surnageant a été suivie deux fois par semaine par la mesure de la concentration d'antigène P 24 de VIH (ELAVIA Ag I, Sanofi Diagnostics Pasteur). Les surnageants po- sitifs ont été stockés à - 80 C.. Après ultracentrifugation de I millilitre de surnageant (23 500 xg pendant I heure), l'ARN de VIH-2 a été extrait à l'aide du kit Amplicor HCV Spécimen Préparation (Roche). Le gène Protéase a été rétrotranscrit à partir de 10 microlitres de la solution d'ARN viral et amplifié avec le kit Titan One Tube RT - PCR (Roche Molecular Diag- nostics). La transcription inverse et la première amplification ont été effectuées avec les amorces 3' Prot et 5' RT 3. (voir ci-dessous). La réaction à 50 C pendant 30 minutes est suivie d'une étape de dénaturation à 94 C pendant 5 minutes puis de 40 cycles (30 se- condes à 94 C, 30 secondes à 55 C, 90 secondes à 68 C) et enfin à 68 C pendant 7 mi- nutes. La deuxième étape de la PCR a été effectuée avec 5 microlitres du produit de la première étape avec les amorces 3' RTD et 5' Prot 2.1, avec une dénaturation de 5 minu- tes à 94 C, suivie de 30 cycles (30 secondes à 94 C, suivie de 30 cycles à 55 C et 30 se- condes à 72 C) et enfin 10 minutes à 72 C. La séquence des amorces est la suivante: 3' Prot: CAGGGGCTGACACCAACAGCACCCCC ' RT 3: CCATTTTTTCACAGATCTCTTTTAATGCCTC 3' RTD: ATGTGGGGGTATTATAAGGATTT 5' Prot 2.1: GAAAGAAGCCCCGCAACTTC Les produits d'amplification ont été purifiés avec le kit QUIACQUICK PCR purification (Quiagen) et séquencées directement à l'aide des amorces 3 ' RTD et 5 ' Prot 2.1 à l'aide du kit ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystem). Ils ont été analysés avec le séquenceur automatique Applied Biosystem 377 et les séquences ont été alignées avec les séquences consensus d'VIH-2 (sous-types A et B). -11- Résultats Avant traitement, aucune mutation n'a été détectée par rapport aux séquences consensus VIH-2 A et B. Après traitement, on a observé les mutations suivantes: - position 45: chez les patients I et 2, on a observé la coexistence d'une po- pulation non-mutée (lysine; codon AAA) et d'une population mutée (arginine; codon AGA), c'est-à-dire la mutation K45K/R; - position 54: on a observé chez les patients I et 2, le remplacement de l'isoleucine (codon ATA) par la méthionine (codon ATG): soit la mutation 154M; - position 64: on a observé une population non mutée et une population dans laquelle l'isoleucine (codon ATA) est remplacée par une valine (codon GTA): soit la mutation I641/V; - position 84: chez le patient 3 on a observé une population non mutée (isoleucine; codon ATC) et une population mutée avec remplacement de l'isoleucine par une leucine (codon CTC): soit la mutation I84I/L; - position 90: chez les 3 patients, on a observé le remplacement de la leu- cine (codon CTG) par une méthionine (codon ATG): soit la mutation L9OM. EXEMPLE 2: Exemple de sondes utilisables pour détecter les mutations sur le gène de la protéase de VIH-2 Les sondes utilisables pour rechercher l'existence éventuelle de mutations, conformément à l'invention, selon les techniques d'hybridation, peuvent être définies à partir des alignements publiés par Myers G et al., 1997, Human Retroviruses and AIDS: A compilation and analysis of nucleic acid and aminoacid sequences, Los Alamos Natio- nal Laboratory, Los Alamos; New Mexico. En fonction des conditions particulières de l'hybridation, et notamment de la température et de la composition des tampons d'hybridation et de lavage, il est possible de définir des sondes qui devront comprendre aumoins l'une des séquence(s) minimums ci-dessous, ou leur(s) complémentaire(s). Des sondes contenant ces séquences permettent de discriminer les mutations dans un procédé d'hybridation. Bien entendu, des sondes analogues, obtenues notamment en introduisant des analogues de base tels que linosine ou la nébularine en des positions o un polymorphisme dû à une variabilité intrinsèque du -12- virus est présent, permettent d'obtenir un résultat similaire et font aussi partie de l'inven- tion. Ces séquences sont données dans le sens 5' vers 3' CCA AAA ATA pour une forme sauvage de la position 45. CCA AAA GTA pour une forme sauvage de la position 45. CCT AAA ATA pour une forme sauvage de la position 45. CCA AGA ATA pour une forme mutée de la position 45. CCA AGA GTA pour une forme mutée de la position 45. CCT AGA ATA pour une forme mutée de la position 45. TIT ATA AAC pour une forme sauvage de la position 54. TIT ATA AAT pour une forme sauvage de la position 54. TTT ATG AAC pour une forme mutée de la position 54. TIT ATG AAT pour une forme mutée de la position 54. * GAA ATA AAA pour une forme sauvage de la position 64. GAA ATA GAA pour une forme sauvage de la position 64. GAA GTA AAA pour une forme mutée de la position 64. GAA GTA GAA pour une forme mutée de la position 64. AAC ATC TIT pour une forme sauvage de la position 84. AAC ATT TI pour une forme sauvage de la position 84. AAC CTC TIT pour une forme mutée de la position 84. ATT CTG ACA pour une forme sauvage de la position 90. ATC CTG ACA pour une forme sauvage de la position 90. ATT CTA ACA pour une forme sauvage de la position 90. ATC CTA ACA pour une forme sauvage de la position 90. ATT ATG ACA pour une forme mutée de la position 90. ATC ATG ACA pour une forme mutée de la position 90. Pour obtenir des sondes plus longues que celles ayant les séquence mini- mums de 9 nucléotides représentées ci-dessus, on doit bien entendu choisir les nucléoti- des supplémentaires de façon à respecter la séquence du gène de la protéase d'au moins une souche de VIH-2. Ces séquences peuvent être obtenues dans les banques de données. Par exemple, on peut utiliser les sondes qui sont indiquées ci-après, ou leurs complémentaires. -13 - (a) position 45 On peut utiliser une sonde comportant par exemple 9 à 25 nucléotides (de préférence répartis symétriquement autour du codon muté AGA), dont la séquence est incluse dans l'une des séquences suivantes: ATTACACTCCAAGAATAGTAGGGGG ATTATAGCCCAAGAATAGTAGGGGG ATTATAGTCCAAGAATAGTAGGGGG ATTATACCCCAAGAATAGTAGGGGG ATTATAGTCCAAGAATAGTAGGAGG ATTATACCCCAAGAATAGTAGGAGG (b) position 54: On peut utiliser une sonde comportant par exemple 9 à 25 nucléotides (de préférence répartis symétriquement autour du codon muté ATG), dont la séquence est incluse dans l'une des séquences suivantes: TAGGGGGATTTATGAACACCAAAGA TAGGGGGATTCATGAACACCAAAGA TAGGAGGATTCATGAACACCAAAGA TAGGAGGGTTCATGAACACCAAAGA (c) position 64 On peut utiliser une sonde comportant par exemple 9 à 25 nucléotides (de préférence répartis symétriquement autour du codon muté GTA), dont la séquence est incluse dans l'une des séquences suivantes: AAAATGTAGAAGTAAAAGTACTAAA AAAATATAGAAGTAAAAGTACTAAA AAGATGTAGAAGTAAAGGTACTAAA AAAATGTAGAAGTAGAAGTTCTAAA AAAATGTAGAAGTAGAAGTCCTGGA AAAGTGTAGAAGTAAGAGTGCTAAA - 14 - (d) position 84: On peut utiliser une sonde comportant par exemple 9 à 25 nucléotides (de préférence répartis symétriquement autour du codon muté CTC), dont la séquence est incluse dans la séquence suivantes: CCCCAATCAACCTCTTTGGCAGAAA (e) position 90: On peut utiliser une sonde comportant par exemple 9 à 25 nucléotides (de préférence répartis symétriquement autour du codon muté ATG), dont la séquence est incluse dans l'une des séquences suivantes: GCAGAAATATTATGACAGCCTTAGG GCAGAAATATTATGGCAACCTTAGG GCAGAAATGTTATGACAGCTTTAGG GCAGAAATATCATGACAGCCTTGGG GCAGAAACATTATGACAGCCTTAGG -15- REVENDICATIONS 1. Procédé de recherche d'une résistance éventuelle d'une souche virale VIH-2 à un traitement par un agent anti-protéase, dans lequel on recherche, selon les méthodes connues, la présence d'au moins une mutation à l'une des positions 45, 54, 64, 84 et 90 de la séquence protéique de la protéase de ladite souche virale provenant d'un échantillon biologique prélevé sur un patient contaminé par VIH-2, ladite mutation ayant été préalablement reconnue comme induisant ladite résistance, et dans lequel on conclut, dans le cas o une telle mutation a été trouvée, à l'existence d'une résistance audit agent anti-protéase chez le patient considéré. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel a) on recherche, selon les méthodes connues, la présence d'au moins une mutation à l'une de positions 45, 54, 64, 84 et 90 de la séquence protéique de la pro- téase de ladite souche virale provenant d'un échantillon biologique prélevé sur un patient contaminé par VIH-2, b) on sélectionne, parmi les mutations trouvées en a), celles qui, après clonage dans un virus VIH-2, n'empêchent pas le clone viral obtenu de se multiplier en culture en présence dudit agent anti-protéase, et c) dans le cas o au moins une mutation est sélectionnée à l'étape b), on conclut à l'existence d'une résistance audit agent anti-protéase mentionné en b). 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on recherche la présence d'au moins une mutation choisie parmi les mutations suivantes: K 45 R, 1 54 M, I 64 V, I 84 L, L 90 M, dans la séquence protéique de la protéase de ladite souche virale, et dans lequel on con- dclut à la présence de ladite résistance en cas de présence de ladite mutations ou desdites mutations. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans le- quel on effectue la recherche d'une mutation sur tout ou partie du génome viral. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel on effectue ladite recherche à l'aide des techniques d'hybridation, selon les méthodes connues. 6. Procédé selon la revendication 4, dans lequel on effectue ladite recherche à l'aide des techniques de séquençage, selon les méthodes connues. -16- 7. Sonde nucléotidique utilisable dans le procédé de l'une quelconque des revendications I à 3, comprenant comme séquence minimum l'une des séquences sui- vantes: CCAAGAATA CCAAGAGTA CCT AGA ATA TTA ATG AAC TTA ATG AAT GAA GTA AAA GAA GTA GAA AAC CTC TTT ATT ATG ACA ATC ATG ACA éventuellement complétées par la séquence de la région avoisinante, de part et d'autre de la séquence minimum, ou une séquence complémentaire.