FR 2787332 A1 20000623 FR 9815922 A 19981217 UTILISATION DE VARIANTS D'UN RECEPTEUR DES OESTROGENES EN THERAPIE ANTICANCEREUSE L'invention est relative à l'utilisation de variants des récepteurs des #strogènes (RE) dans le cadre de la thérapie anticancéreuse. Les #strogènes agissent sur leurs cellulescibles par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques, localisés dans le noyau. Les récepteurs des #strogènes appartiennent à la super-famille des récepteurs nucléaires, qui regroupe notamment les récepteurs des stéroïdes (glucocorticoïdes, minéralocorticoïdes, androgènes, #strogènes, progestérone), ainsi que les récepteurs de la vitamine D, de l'acide rétinoïque, et des hormones thyroïdiennes. Après liaison avec leur ligand, les récepteurs de cette famille agissent en activant spécifiquement la transcription de gènes cibles. Ils sont constitués de domaines fonctionnels séparés, et possèdent entre eux une grande similitude de structure. Les principaux domaines impliqués dans l'activité de ces récepteurs sont les suivants: - un domaine C-terminal qui comprend une séquence d'environ 250 acides aminés (région E) impliquée dans la liaison de l'hormone. La région E comprend en outre des séquences (AF-2) intervenant dans l'activation de la transcription du gène cible induite par la liaison de l'hormone. - un domaine central (région C) comprenant une séquence hautement conservée riche en cystéines, qui forme une structure tridimensionnelle en doigts de zinc . Cette structure est responsable de la liaison du récepteur avec l'ADN, et interagit spécifiquement avec les éléments de réponse aux hormones (HRE) qui sont des séquences particulières d'ADN, présentes dans les promoteurs des gènes hormono-régulés. - un domaine N-terminal (région A/B) de taille et de séquence variable selon le récepteur concerné ; domaine comprend des séquences (AF-1) intervenant de manière constitutive dans l'activation de la transcription. Deux types de récepteurs des #strogènes sont actuellement connus : le récepteur RE-a et le récepteur RE-ss. Ce dernier qui a été récemment caractérisé [MANGELDORF et al., Cell, 83,835-839, (1995) ; MOSSELMAN et al., FEBS Letters, 392,49-53, (1996) ], est très similaire, sur le plan structurel et fonctionnel, au récepteur RE-a, mais possède un profil différent d'expression tissulaire. Il est connu que les #strogènes sont impliqués dans l'étiologie de certains cancers, notamment le cancer du sein et des ovaires. On connaît deux types d'effets, a priori contradictoires, des #strogènes et de leurs récepteurs sur l'évolution de ces cancers. L'effet mitogène des #strogènes sur les cellules cancéreuses exprimant le récepteur RE-a augmenterait le risque d'apparition de la maladie en favorisant le développement des tumeurs [LIPPMAN et al., Cancer Res., 36,4595-4601, (1976); SPICER et PIKE, J. Natl. Cancer Inst., 16,137-149, (1994) ]. Cependant, des observations cliniques ont montré que la présence du récepteur RE-a était associée à un pronostic plus favorable chez des patientes atteintes de cancer du sein [McGUIRE, Semin. Oncol., 5,2428-2433, (1978)]; les cellules exprimant ce récepteur forment des tumeurs mieux différenciées sur le plan histologique, associées à un faible taux de rechute et à une survie plus longue ; part elles répondent mieux à une thérapie anti-oestrogénique. En outre, des études récentes ont mis en évidence un effet inhibiteur des #strogènes et du récepteur RE-a sur 2 facteurs intervenant dans la formation de métastases, à savoir la motilité des cellules tumorales, et leurs propriétés d'invasion des membranes basales. Il a ainsi été montré que 1'oestradiol diminue significativement l'invasion par des cellules cancéreuses mammaires ou ovariennes exprimant le récepteur RE-a (cellules RE-positives) [ROCHEFORT et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 65,163-168, (1998) ; HAYASHIDO et al., Int. J. Cancer, 75, 654-658, (1998)]. Des observations similaires ont été faites dans le cas de cellules cancéreuses issues de lignées n'exprimant pas le récepteur RE-a (cellules RE-négatives), transfectées de façon stable par des vecteurs exprimant ce récepteur [GARCIA et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,1538- 11542, (1992) ; GARCIA et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 61,11-17, (1997) ]. Cet effet inhibiteur de l'#stradiol est bloqué par les anti-#strogènes. Des effets comparables ont également été observés dans le cas de la migration de cellules normales du muscle lisse vasculaire [KOLODGIE, Am. J. Pathol., 148,969-976, (1996)]. Ces effets anti-invasifs du complexe oestrogène/récepteur RE-a apparaissent comme particulièrement intéressants, dans la mesure où ils peuvent constituer un frein à l'invasion métastasique, qui est la cause principale de mortalité dans de nombreux cancers, notamment le cancer du sein. Cependant, l'application de ces observations en thérapie anticancéreuse est problématique, du fait de l'effet stimulant de ce même complexe sur la prolifération des cellules cancéreuses. Pour mieux étudier cette action anti-invasive, les Inventeurs ont entrepris l'évaluation quantitative des propriétés invasives de cellules transfectées par une séquence d'ADN exprimant le récepteur RE-a. Pour éliminer l'influence d'éventuels artefacts de transfection et de clonage, qui peuvent entraîner des variations du niveau d'expression du gène testé et des propriétés invasives entre différents clones de cellules initialement transfectées par une même séquence, les Inventeurs ont mis au point une méthode de test basée sur l'évaluation de la mobilité et des propriétés invasives d'une population de cellules cotransfectées par le gène à tester et un gène rapporteur, et exprimant ces deux gènes de façon transitoire. Pour mettre en #uvre cette méthode, l'on procède à la co-transfection des cellules par le gène à tester et un gène rapporteur. L'expression transitoire du gène rapporteur est quantifiée sur une aliquote des cellules co-transfectées. Une autre aliquote est utilisée pour la mise en #uvre du test choisi de propriétés invasives ou de motilité, et l'expression transitoire du gène rapporteur est quantifiée dans la sous-population des cellules positives pour ce test. Les Inventeurs ont ainsi observé une réduction des propriétés invasives des cellules transfectées par le récepteur RE-a, cet effet étant encore accentué par l'addition d'oestrogènes. Ils ont en outre découvert que, de manière surprenante, la transfection de cellules cancéreuses par des variants du récepteur RE-a dépourvus du site de liaison aux #strogènes diminuait également les propriétés invasives de ces cellules, indépendamment de la présence d'#strogènes. De plus, ils ont constaté que cette diminution des propriétés invasives des cellules cancéreuses transfectées par des variants du récepteur RE-a dépourvus du site de liaison aux #strogènes se manifestait également in vivo, par une réduction de la formation de tumeurs. Les Inventeurs ont entrepris l'étude du mécanisme impliqué dans ces propriétés anti-invasives, et ont établi qu'il était totalement indépendant des #strogènes, et qu'il nécessitait la présence d'une portion -de la région C, correspondant aux acides aminés 179 à 215 du récepteur RE-a, et contenant le premier doigt de zinc. Les Inventeurs ont également testé d'autres récepteurs nucléaires : effets similaires à ceux du récepteur RE-a ont également été observés avec le récepteur RE-ss, mais pas avec d'autres récepteurs nucléaires, tels que les récepteurs de l'acide rétinoïque, les récepteurs des androgènes ou des glucocorticoïdes, le récepteur a-1 de l'hormone thyroïdienne, ou le récepteur de la vitamine D. La présente invention a pour objet l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique codant pour un variant d'un récepteur des #strogènes comprenant au moins la portion de la région C dudit récepteur contenant le premier doigt de zinc, pour l'obtention d'un médicament destiné en particulier à diminuer la motilité et les propriétés invasives des cellules cancéreuses, dans le cadre de la prévention et du traitement des cancers, et notamment du cancer du sein ou du cancer de l'ovaire. Selon un mode de mise en #uvre préféré de la présente invention, ledit variant comprend au moins les acides aminés 179 à 215 du récepteur RE-a. Selon un autre mode de mise en #uvre préféré de la présente invention, ledit variant comprend au moins les acides aminés 143 à 179 du récepteur RE-p. Très avantageusement, il s'agit d'un variant dépourvu de la fonction de liaison aux #strogènes et/ou de la fonction AF-2 d'activation de la transcription, par exemple d'un variant dans lequel la région E a été partiellement ou totalement délétée, ou a subi une mutation inactivant totalement ou partiellement sa fonction. L'invention a également pour objet des médicaments comprenant au moins une séquence d'acide nucléique codant pour un variant d'un récepteur des oestrogènes, tel que défini ci-dessus. Dans les compositions thérapeutiques conformes à l'invention, ladite séquence d'acide nucléique généralement associée à des séquences appropriées, notamment un promoteur, permettant le contrôle de son expression, est placée dans un vecteur permettant son introduction dans les cellules-cibles. Des séquences de contrôle de l'expression et des vecteurs appropriés seront choisis en fonction de la cellule-cible dans laquelle on souhaite exprimer le variant du récepteur RE. Avantageusement, on choisira des séquences de contrôle de l'expression permettant une expression préférentielle dans les cellules cancéreuses. Les vecteurs, connus en eux mêmes, qui sont habituellement utilisés en thérapie génique, tels que des vecteurs viraux (par exemple, un vecteur de type adénovirus ou rétrovirus), des liposomes, etc. sont utilisables pour l'obtention de médicaments conformes à l'invention. L'utilisation, conformément à l'invention, de variants de récepteurs des #strogènes permet de réduire la progression et la dissémination tumorale, et donc de s'opposer à la formation de métastases ; sont efficaces non seulement sur les tumeurs impliquant des cellules cancéreuses RE-négatives, mais également sur celles impliquant des cellules cancéreuses RE-positives. Ces variants peuvent également être utilisés en association avec d'autres traitement anti-tumoraux. Avantageusement, on utilisera les variants dans lesquels le site de liaison des #strogènes est inactivé ; ces variants ne relaient pas l'effet mitogène dû à la présence d'oestrogènes, et leur activité est indépendante de la présence ou de l'absence de ceux-ci; ils peuvent donc être utilisés quel que soit l'état hormonal, de l'organisme. Ils peuvent aussi être combinés avec des traitements du type anti-oestrogènes qui n'interféreront pas avec leur activité. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant l'utilisation de variants du récepteur RE pour inhiber l'invasivité des cellules cancéreuses, et la croissance tumorale in vivo sur un modèle animal. EXEMPLE 1 : DE QUANTIFICATION DE L'INVASION CELLULAIRE. Pour mesurer les propriétés invasives des cellules, les Inventeurs ont développé une méthode d'évaluation quantitative de l'invasion d'une membrane basale artificielle. Principe de la méthode: Les cellules sont co-transfectées avec un mélange du vecteur à tester et d'un vecteur rapporteur exprimant une luciférase. Après transfection, les cellules sont déposées sur une membrane basale reconstituée (MATRIGEL), et le pourcentage de cellules invasives est calculé en déterminant le rapport entre l'activité luciférase des cellules capables de traverser la membrane et l'activité luciférase des cellules totales. Protocole opératoire: Culture et transfection des cellules: Des cellules de la lignée MDA-MB-231 (lignée RE-négative de carcinome mammaire humain), sont cultivées en monocouche dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplémenté avec 10% de SVF (Sérum de Veau Foetal), et 50 ug/ml de gentamycine. Pour éliminer les stéroïdes endogènes, les cellules sont cultivées pendant 6 jours dans du milieu DMEM sans rouge de phénol, supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal traité au charbon enrobé de dextrane. Le jour précédant la transfection, les cellules sont trypsinisées, et étalées dans un flacon de 75 cm2, à environ 80% de confluence. La transfection est effectuée par la méthode de co-précipitation de l'ADN au phosphate de calcium, selon le protocole classique de SAMBROOK et al. [Molecular cloning : Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Pour la co-transfection, le rapport : portant le gène à tester/vecteur portant le gène rapporteur codant pour la luciférase de 1/9 a été choisi, afin d'améliorer la sensibilité de la méthode en augmentant l'activité luciférase. 3,75 ug du vecteur HEGO, codant pour le récepteur RE-a de type sauvage [TORA et al., EMBO J., 8, 1981-1986, (1989) ] ou 3,75 ug du variant à tester, ou bien 3,75 ug du vecteur de contrôle pSGl, sont cotransfectés avec 33,75 pg du vecteur pGL3, exprimant la luciférase (PROMEGA). Après incubation des cellules avec le coprécipité pendant 8 heures, celles-ci sont lavées 3 fois dans du milieu sans rouge de phénol, et incubées pendant 16 heures dans du milieu frais, préalablement à l'essai d'invasion. Essai d'invasion sur membrane basale artificielle (MATRIGEL): Pour les essais d'invasion, 3 X 105 cellules transfectées, en suspension, sont déposées sur un filtre de polycarbonate (diamètre des pores, 8 m), préalablement recouvert avec 30 ug de membrane basale artificielle MATRIGEL (BECTON DICKINSON), dans le compartiment supérieur d'un dispositif TRANSWELL (COSTAR, Cambridge, MA). Le compartiment inférieur de ce dispositif contient une solution de 30 ug/ml de fibronectine (SIGMA). L'ensemble est incubé pendant 24 heures à 37 C, selon le protocole préalablement décrit par ALBINI et al. [Cancer Res., 47,3239-3245, (1987) ] ou GARCIA et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,11538- 11542, (1992)]. Parallèlement, une seconde aliquote de 3 x 105 cellules transfectées est étalée sur une plaque de culture à 24 puits et incubée dans les mêmes conditions, afin de déterminer la quantité totale de cellules transfectées. Pour déterminer la motilité cellulaire qui est une des composantes des propriétés invasives, le même essai est effectué sur filtre sans MATRIGEL. Après 24 heures, les cellules ayant migré sur la face inférieure du filtre sont récupérées, rincées, et lysées dans 100 l de tampon de lyse (25 mM Tris/H3PO4, pH7,8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycérol, et 1% Triton X-100). Parallèlement, les cellules récupérées à partir de la plaque à 24 puits sont lysées dans 300 l du même tampon. L'activité luciférase est déterminée sur des fractions de 100 l du lysat en mesurant la luminescence (temps d'intégration 15 secondes) dans un luminomètre LKB (LKB Instruments, Rockville, MD), après injection de 100 l de réactif de détection de l'activité luciférase (270 pM de coenzyme-A, 470 pM de luciférine, 530 uM d'ATP, 20 mM de tricine, 1 mM de (MgC03)4Mg(OH)2.5H20, 2,7mM MgS04, 0,1mM EDTA, et 3,3 mM DTT, pH 7,8). Le pourcentage de cellules invasives est déterminé par la formule suivante: Activité luciférase des cellules invasives x 100 Activité luciférase totale L'expression du récepteur des #strogènes ou du mutant dans les cellules transfectées est en outre vérifiée par marquage immunologique, à l'aide d'anticorps monoclonaux dirigés contre la région N-terminale A/B (anticorps 1D5), ou contre l'extrémité C-terminale (anticorps C311) de ce récepteur. Le complexe anticorps/récepteur est révélé par un anticorps de chèvre anti-souris conjugué à la rhodamine. Ceci permet de vérifier qu'il existe dans les cellules transfectées une co-expression effective entre le gène à tester et le gène marqueur. EXEMPLE 2: ACTION DU RÉCEPTEUR RE-A OU DE MUTANTS DE CELUI-CI SUR L'INVASIVITÉ DES CELLULES CANCÉREUSES. Les propriétés invasives de cellules transfectées par des plasmides exprimant soit le récepteur RE-a humain de type sauvage, soit des mutants de ce récepteur, ont été testés dans les conditions décrites à l'exemple 1 ci-dessus. Les plasmides utilisés comme matériel de départ sont le plasmide HEGO (publication de TORA et al. citée ci-dessus) ainsi que des mutants de la série HE [KUMAR et al., Cell,51, 941-951, (1987) ; ALI et al., EMBO J., 12,1153-1160, (1993) ; METZGER et al., J. Biol. Chem., 270,9535-9542, (1995) ]. Ces plasmides ont été fournis par le Professeur CHAMBON (Laboratoire IGBMCLGME-U. 184-LMP, Illkirch, FRANCE). Les plasmides de la série ER ont été construits à partir des plasmides HE, comme décrits ciaprès : - le plasmide ER100 (A3-178), a été obtenu à partir du plasmide HE344/384 (A3-50 et A150-178), par excision à l'aide de l'enzyme XhoI, de la séquence codant pour les acides aminés 50 à 150 ; - le vecteur d'expression ER103 (A150-216) est obtenu en remplaçant le fragment XhoI-XbaI de HE384 (correspondant à la séquence codant pour les acides aminés 179 à 379) par un fragment codant pour les résidus 216-379, avec un site XhoI précédant le codon de l'acide aminé 216. Les mutants de délétion ER106, ER107, ER108 ont été construits comme suit: Le vecteur HE15-NLS a d'abord été construit à l'aide de deux oligonucléotides complémentaires codant pour le signal de localisation nucléaire du grand antigène T de SV40 (NLS) [KALDERON et al., Cell, 39,499- 509, (1984)]. Ces oligonucléotides ont été insérés à l'extrémité 3' de la séquence codant pour ERal-282 (séquence du plasmide HE15), entre les sites XhoI et AocI; ils contiennent un site KpnI, en face du NLS, qui permet d'orienter l'insert. Les mutants ER106 (A270-281), ER107(A251-281), ER108 (A216-281) ont été construits en remplaçant le fragment NotI-XhoI de HE15-NLS (acides aminés 65 à 282), par des fragments codant respectivement pour les résidus 65-269 (plasmide ER106), 65-250 (plasmide ER107), 65-215 (plasmide ER108). La liste des vecteurs utilisés est représentée dans le tableau I ci après: TABLEAU VECTEUR MUTATION HEGO Non muté HEO (G400V) HE11 (#185-251; G400V) HE15 (A283-595) HE19 ~~~ (#1-178; G400V) HE344 (A3-50) HE91 (E203G; A207V;G400V) HE302 (#3-101) HE384 (#150-178) HE314 (A94-178) HE344/384 (A3-50; #150-178) ER100 #3-178) ER103 (#150-216) ER106 (A270-281) ER107 (A251-281) ER108 (#216-281) HEmutAF2 (L540F; M543V;L544F) D'autres vecteurs, utilisés à titre de comparaison, ont été construits par clonage des ADNc codant respectivement pour le récepteur RE-ss [MOSSELMAN et al., FEBS Letters, 392,49-53, (1996) ], le récepteur de la vitamine D (VDR), le récepteur de l'hormone thyroïde (TRal), le récepteur de l'acide rétinoique (RARa), le récepteur des androgènes (AR) et le récepteur des glucocorticoides (GR). Les propriétés invasives des cellules transfectées par ces différents vecteurs ont été déterminées selon le protocole décrit dans l'exemple 1 ci-dessus, en l'absence de stéroïdes (les stéroïdes endogènes ayant été préalablement éliminés des cellules comme indiqué à l'exemple 1) ou en présence de 17 p- #stradiol (E2) à une concentration de 20 nM. Des expérimentations ont également été réalisées en présence des anti-#strogènes 4-hydroxy-tamoxifène (OHT) à une concentration de 100 nM, ou ICI 164,384, à une concentration de 100 nM. Après incubation pendant 24 heures à 37 C, les propriétés invasives sont quantifiées comme décrit à l'exemple 1. Parallèlement le même essai a été effectué en l'absence de MATRIGEL pour déterminer la motilité cellulaire. Expression du récepteur RE-a de type sauvage Les résultats obtenus dans le cas des cellules exprimant le récepteur RE-a de type sauvage (transfection par le vecteur HEGO), en l'absence de stéroïdes (C), ou en présence d'#stradiol (E2) et/ou d'antiestrogènes (OHT) et (ICI), sont représentés par la figure 1A. Ces résultats représentent la moyenne de 3 expériences (*)= P Ils montrent que ni le traitement par l'oestradiol, ni le traitement par les antiestrogènes ne modifie significativement les propriétés invasives des cellules transfectées par le vecteur pSGl vide. En revanche, l'expression du récepteur RE-a induit une diminution d'un facteur 3,3 du pourcentage d'invasion, en l'absence de tout ligand. Cet effet est renforcé en présence d'#stradiol, qui induit une diminution supplémentaire d'un facteur 2. Dans le cas des antiestrogènes l'agoniste/antagoniste partiel OHT n'a pas d'effet significatif sur l'invasion, alors que l'anti-#strogène ICI 164-384 inhibe presque totalement les propriétés anti-invasives du récepteur RE-a, et ce aussi bien en l'absence qu'en présence d'#stradiol. La figure 1B illustre la comparaison entre les effets du vecteur pSGl et du vecteur HEGO sur les propriétés invasives et la motilité des cellules respectivement transfectées par ces vecteurs. Les essais de motilité cellulaire illustrés par la figure 1B montrent que l'expression du récepteur RE-a de type sauvage réduit la motilité cellulaire à 69% de celle observée dans le cas du témoin pSGl, ce qui indique que l'effet inhibiteur de l'invasion cellulaire (30% de celle observée en présence du vecteur pSGl vide) serait dû en partie à un effet sur la motilité cellulaire. Expression des mutants du récepteur RE-[alpha] Les résultats obtenus avec les différents mutants, en l'absence ou en présence d'#stradiol sont illustrés par la figure 2. En l'absence d'oestradiol: Dans le cas des cellules transfectées par le plasmide HEGO, on n'observe que 29% de cellules invasives par rapport au témoin pSGl. L'effet inhibiteur du plasmide HEO (G400V) est légèrement moindre (46% de cellules invasives par rapport à pSGl). Le mutant HE15 (1-282) qui est dépourvu du domaine de liaison de l'hormone et du domaine AF2, ainsi que le mutant HE91 (E203G;A207V) qui porte deux mutations ponctuelles dans le domaine de liaison à l'ADN, qui préviennent la transactivation par l'intermédiaire des éléments de réponse aux #strogènes, ont des propriétés inhibitrices comparables à celles du vecteur HEGO, ce qui indique que ces fonctions ne sont pas impliquées dans l'inhibition indépendante du ligand. En revanche, les vecteurs HE19 (179-595) et HE11 (A185-251), respectivement délétés des domaines A/B et C, n'ont aucun effet inhibiteur. En présence d'#stradiol: On observe pour le vecteur HEO un effet inhibiteur supplémentaire, du même ordre que celui observé dans le cas du vecteur HEGO exprimant le récepteur sauvage. Le mutant HE19 qui est inactif en l'absence d'#stradiol, présente un effet inhibiteur important en présence de celui-ci. En revanche, le mutant HE11 est inactif en présence ou en l'absence d'#stradiol. L'#stradiol n'a aucun effet supplémentaire sur l'activité inhibitrice des mutants HE91, HE15 ou HRmutAF2 (L540F, M543V, L544F). Ces résultats montrent que les effets du ligand hormonal sont supprimés par les délétions du domaine de liaison à l'hormone, du domaine de liaison à l'ADN, ou par des mutations dans le domaine de liaison aux éléments de réponse aux #strogènes, ou au c#ur du domaine AF2. En revanche, la délétion de la région A/B n'a aucune influence sur l'effet hormonal. Les résultats sont résumés dans le Tableau II ci-dessous: TABLEAU II VECTEUR INHIBITION DE L'INVASION E2-Indépendante E2-Dépendante HEGO + + HEO + + HE19 0 + HE11 0 0 HE91 + 0 HE15 + 0 HEmutAF2 + 0 Ces résultats montrent que l'inhibition due au récepteur RE-a en l'absence de ligand et au récepteur REa activé par l'oestradiol résultent de deux mécanismes différents, impliquant des domaines différents du récepteur RE. L'action hormonale nécessite la liaison aux éléments de réponse aux #strogènes et la fonction AF2 alors que celles-ci ne sont pas nécessaires pour l'action du récepteur en l'absence de ligand. Mutations de la région A/B Le tableau III illustre l'effet de différents mutants de délétion de la région A/B sur l'activité inhibitrice indépendante des #strogènes. TABLEAU))! VECTEUR INVASION (% du contrôle pSG) HE19 96 18 HE344 35 ~ 12 HE302 36 ~ 14 HE384 28 11 HE314 38 23 HE344/384 37 ~ 3 ER100 43 ~ 1 Ces résultats montrent que les délétions de différentes parties de la région A/B n'influencent pas l'effet inhibiteur indépendant des #strogènes. En outre, une mutation ponctuelle de la sérine 118, préalablement décrite comme essentielle pour l'activation indépendante des stéroïdes [KATO et al., Science, 270,1491-1494, (1995) ; BUNONE et al., EMBO J., 15,2174-2183, (1996) ], (HE457 ou HE15/457) n'altère pas l'activité inhibitrice de HEGO ou de HE15. Le vecteur ER100 (A3-178) qui exprime un mutant ne comportant, par rapport à celui exprimé par le vecteur HE19, que deux acides aminés supplémentaires à l'extrémité N-terminale, possède des propriétés inhibitrices de l'invasion, ce qui indique que ces deux acides aminés sont indispensables pour l'inhibition indépendante des #strogènes. Mutations des régions C et/ou D : Le tableau IV illustre les résultats obtenus dans le cas des mutants délétés dans les régions C et D. TABLEAU IV VECTEUR INVASION (% du contrôle pSG) HE15-NLS 58 ~ 5 HE384 34 ~ 3 ER103 105 ER106 58 10 ER107 61 ~ ER108 57 10 Le signal de localisation nucléaire NLS a été ajouté à l'extrémité C-terminale des mutants délétés des séquences de localisation nucléaire situés dans la région 256-303 du RE-a, afin de conserver leur adressage nucléaire. Les résultats obtenus avec les mutants ER106, ER107 et ER108 délétés progressivement des acides aminés 281 à 216, indiquent que la région D et le second doigt de zinc de la région C ne sont pas nécessaires pour l'inhibition indépendante des #strogènes. En revanche, le vecteur ER103 (A150-215) qui est dérivé du vecteur HE384 par délétion de la région 179-215, contenant le premier doigt de zinc, est totalement dépourvu d'activité. L'analyse de l'expression des différents mutants par immunofluorescence (anticorps ID5) montre que les différences observées au niveau de l'activité inhibitrice sont une conséquence directe des mutations et ne sont pas dues à des différences au niveau de l'expression de la protéine mutée. Ces résultats montrent que la région du récepteur RE-a comprise entre les acides aminés 179 et 215, et comprenant le premier doigt de zinc est essentiel pour inhiber l'invasion cellulaire en l'absence d'hormone. Expression de différents récepteurs nucléaires (essai comparatif): Les résultats obtenus dans le cas de cellules transfectées avec des vecteurs exprimant différents récepteurs nucléaires sont illustrés par la figure 3A. Ces résultats montrent que seuls les vecteurs exprimant les récepteurs des #strogènes peuvent inhiber l'invasion cellulaire en l'absence d'hormone. On observe une inhibition moins importante dans le cas du récepteur RE-P que dans celui du récepteur RE-a; cette différence pourrait s'expliquer par la présence de récepteur P endogène dans ces cellules [DOTZLAW et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 82,2371-2374, (1996)]. Il apparaît donc que l'inhibition des propriétés invasives en l'absence d'oestrogènes est spécifique des récepteurs RE-a et RE-ss. La séquence en acides aminés 179-215 de RE-a a été comparée avec celle de TR-al, VDR, RAR-a, et RE-ss. L'alignement de séquences est représenté sur la figure 3B, qui montre que c'est entre RE-a et RE-P que l'homologie est la plus importante. Notamment, 7 acides aminés (signalés par des flèches sur la figure 3B) sont spécifiques de ces 2 récepteurs : s'agit de A186, Y191, W200, S201, A207, K210, G215. Ceci permet de supposer que ces acides aminés jouent un rôle important dans l'action des récepteurs RE en l'absence de ligand. EXEMPLE 3 : EFFET DU RÉCEPTEUR RE-a DE TYPE SAUVAGE, ET DU RÉCEPTEUR RE-a DÉLÉTÉ DU SITE DE LIAISON DE L'HORMONE SUR LA CROISSANCE TUMORALE IN VIVO CHEZ LA SOURIS. Des cellules transfectées de manière stable par des vecteurs exprimant soit le récepteur RE-a sauvage, soit le récepteur RE-a dépourvu du site de liaison de l'hormone ont été obtenues comme suit: Récepteur RE-[alpha]: la séquence codant pour le récepteur RE-a a été excisée du plasmide HEGO et sous-clonée dans le vecteur pUHC13.3-CMV. Ce vecteur a été utilisé en même temps que le vecteur pY3 portant un gène de résistance à l'hygromycine, pour co-transfecter un clone de cellules MDA-MB-231. Les clones capables de croître en présence de 250 ug/ml d'hygromycine ont été isolés et l'expression du RE-a a été évaluée par immunofluorescence, comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus. 2 types de clones exprimant RE-a ont été obtenus : - les premiers, dénommés ci-après clones à expression modérée exprimant une quantité de RE-a évaluée par ELISA à environ 24 fmoles/mg de protéines de cytosol (moyenne des clones), - les seconds, dénommés ci-après clones à expression forte exprimant le récepteur RE-a à un niveau moyen évalué à 57 fmoles/mg de protéines du cytosol. Récepteur RE-[alpha] dépourvu de site de liaison à l'hormone: Le fragment EcoRI du mutant HE15 codant pour les acides aminés 1-282 du récepteur RE-a a été souscloné dans le plasmide pBK-CMV (STRATAGENE, La Jolla, CA) portant un gène de résistance à la généticine. Les cellules MDA-MB-231 ont été transfectées par ce vecteur, et les cellules capables de croître en présence de 1,6 mg/ml de G418 (SIGMA) ont été regroupées en culture. Le niveau d'expression du mutant RE-a 1-282 dans la culture de cellules transfectées a été évalués par immunofluorescence et apparaît similaire à celui du RE-a de type sauvage dans les clones à expression modérée. Induction des tumeurs : Les transfectants ont injectés par voie souscutanée sous le second coussinet graisseux mammaire de souris nude (BALB/c nu/nu) de sexe femelle âgées de 5 à 6 semaines, à raison de 3 x 106 cellules par site d'injection. Pour les transfectants exprimant le récepteur RE-a mutant, on a injecté directement les cellules prélevées à partir de la culture. Pour les transfectants exprimant le RE-a sauvage, un mélange de 2 clones de chaque type a été injecté. Des contrôles ont été réalisés en injectant selon le même protocole des cellules transfectées par le vecteur vide pUHC13.3-CMV, ou par le vecteur vide pBKCMV. Les résultats sont illustrés par la figure 4, qui représente la surface des tumeurs pour chaque type d'injection, en fonction du temps (en jours) après injection. La figure 4A représente les résultats observés avec le récepteur RE-sauvage dans le cas de 2 clones à faible niveau d'expression du récepteur RE (0), des 2 clones à niveau d'expression élevé (#) du récepteur RE-a, et des 2 clones de contrôle négatif (#). La figure 4B représente les résultats obtenus avec la culture du mutant RE-al-282 (0), ou avec la culture du témoin négatif (#). Le tableau V ci-après illustre l'incidence des tumeurs (nombre d'animaux présentant des tumeurs par rapport au nombre d'animaux injectés) pour chacun des vecteurs testés, 41 jours après injection. TABLEAU V TRANSFORMANT INCIDENCE DES TUMEURS PUHC13.3-CMV (témoin) 7/7 RE-a RE-a expression modérée 3/6 RE-a expression forte 0/6 pBK-CMV (témoin) 4/5 RE-a 1-282 RE-a 1-282 3/5 expression modérée 3/5 Ces résultats montrent que l'expression du récepteur RE-a de type sauvage, au niveau le plus élevé abolit totalement la formation de tumeurs. L'expression du récepteur sauvage à un plus faible niveau diminue de 50% l'incidence des tumeurs ; observe également une diminution de l'incidence des tumeurs dans le cas du récepteur mutant 1-282, qui est exprimé à un niveau comparable. La surface moyenne des tumeurs observées est diminuée de 97% (P Il apparaît donc que l'expression constitutive d'un récepteur RE-a de type sauvage, ou bien d'un récepteur RE-a dépourvu du site de liaison aux #strogènes prévient la croissance tumorale chez la souris. L'efficacité apparemment plus importante du récepteur de type sauvage peut refléter un effet additionnel des #strogènes endogènes des animaux testés, agissant par l'intermédiaire du mécanisme mis en évidence dans l'exemple 2 ci-dessus. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'une séquence d'acide nucléique codant pour un variant d'un récepteur des oestrogènes comprenant au moins la portion de la région C dudit récepteur contenant le premier doigt de zinc, pour l'obtention d'un médicament. 2) Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à être utilisé pour diminuer la motilité et les propriétés invasives des cellules cancéreuses, dans le cadre de la prévention et du traitement des cancers. 3) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à être utilisé dans le traitement du cancer du sein ou du cancer de l'ovaire. 4) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit variant comprend au moins les acides aminés 179 à 215 dudit récepteur RE-a. 5) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 4 , caractérisée en ce que il s'agit d'un variant dépourvu de la fonction de liaison aux oestrogènes et/ou de la fonction AF-2 d'activation de la transcription. 6) Médicament comprenant en tant que principe actif au moins une séquence d'acide nucléique codant pour un variant d'un récepteur des oestrogènes, tel que défini dans une quelconque des revendications 1 à 5.