FR 2788782 A1 20000728 FR 9900775 A 19990125 L'invention concerne un produit multienzymatique à activités glucoamylasique, protéolytique et xylanasique et procédé pour sa production par fermentation à l'état solide de son de blé avec Aspergillus niger. Il est connu de produire de l'éthanol à partir d'amidon de maïs par un procédé enzymatique comprenant une étape de liquéfaction de l'amidon par une alpha-amylase visant à hydrolyser l'amidon en dextrines, puis une étape de saccharification par une glucoamylase (appelée aussi amylo- glucosidase) visant à hydrolyser les dextrines en glucose, et enfin une étape de fermentation de ce dernier en éthanol. La mise en oeuvre des enzymes alpha-amylase et glucoamylase est généralement satisfaisante lorsqu'on part de laits d'amidon relativement purs obtenus par broyage par voie humide du maïs, mais lorsqu'on désire substituer des amidons de blé ou des farines de blé à l'amidon de maïs, on n'obtient pas de résultats satisfaisants avec ces deux seules enzymes en raison de la présence d'hémicelluloses qui accroissent la viscosité des moûts de farine saccharifiés au point que cela crée un problème pour l'exécution du procédé. Il faut utiliser dans l'étape de saccharification des enzymes auxiliaires comme des cellulases et des hémicellulases pour réduire la viscosité et remédier à ce problème. Par ailleurs, il est souhaitable d'utiliser également des protéases au cours de la saccharification afin d'hydrolyser les protéines de la farine et enrichir ainsi le moût en azote soluble en prévision de l'étape ultérieure de fermentation alcoolique. L'apport en source azotée nécessaire à la croissance des levures traditionnellement effectué pendant cette fermentation peut ainsi être réduit. Toutes ces enzymes sont individuellement disponibles dans le commerce sous forme purifiée, mais ont l'inconvénient d'être relativement onéreuses et, donc, de grever, par conséquent, le coût de la production de l'éthanol de blé. En outre, il faut formuler des compositions à partir des enzymes individuelles, ce qui complique le procédé. Il existe donc un besoin pour un produit multienzymatique, bon marché, combinant des activités glucoamylasique, protéolytique et hémi- cellulasique afin de pouvoir produire de l'éthanol à partir de farines de blé à un coût réduit. L'invention vise à satisfaire ce besoin. La présente invention concerne un produit multienzymatique présentant des activités glucoamylasique, protéolytique et xylanasique, caractérisé en ce qu'il est constitué de son de blé fermenté avec une souche d'Aspergillus figer, lesdites activités enzymatiques glucoamylasique, protéolytique et xylanasique étant présentes aux valeurs minimales suivantes: - glucoamylasique: au moins 500 UG, de préférence au moins 1500 UG, par gramme de matière sèche - protéolytique: au moins 125 UP, de préférence au moins 400 UP, par gramme de matière sèche - xylanasique au moins 100 UX, de préférence au moins 300 UX, par gramme de matière sèche. L'invention concerne aussi un procédé de production de ce produit multienzymatique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (a) prendre du son de blé; (b) à humidifier et traiter thermiquement ledit son de façon à le pasteuriser ou le stériliser; (c) à inoculer le son de blé résultant par une souche d'Aspergillus niger; (d) le son étant sous la forme d'une couche d'au moins 10 cm d'épaisseur, le faire fermenter à l'état solide dans un réacteur aéré et agité périodiquement pendant une période de 1 à 3 jours, à une température de 28-38 C, de préférence 32 à 36 C, ledit son étant réglé à une teneur en humidité initiale de 50 à 60% en poids sensiblement maintenue pendant la durée de la fermentation, dans des conditions d'aération propres à éviter une accumulation de dioxyde de carbone nuisible à la fermentation dans le réacteur et une élévation de la température due à la fermentation au-delà de la gamme indiquée, jusqu'à ce que le produit de fermentation présente les valeurs minimales suivantes d'activités enzymatiques: - glucoamylasique: au moins 500 UG, de préférence au moins 1500 UG, par gramme de matière sèche - protéolytique: au moins 125 UP, de préférence au moins 400 UP, par gramme de matière sèche - xylanasique: au moins 100 UX, de préférence au moins 300 UX, par gramme de matière sèche. De préférence, la souche d'Aspergillus figer est choisie parmi la souche NRRL 3112, la souche ATCC 76061 et les souches obtenues à partir desdites souches par sélection ou mutation. La souche ATCC 76061 est particulièrement préférée. Le son de blé utilisé comme matière de départ doit être un son non désamidonné. A part cette restriction on peut utiliser un son quelconque. De préférence, toutefois, le son comporte une proportion significative (au moins 40% en poids) de particules inférieures à 1 mm. On donne ci-après, à titre illustratif et non limitatif, les caractéristiques de deux sons convenables. Caractéristiques SonA Son B Humidité (%) 12,3 19,5 Teneur en protéines (% MH*) 13,8 14,8 Teneur en amidon (% MH*) 24,6 21,3 Granulométrie >1, 25 mm 53,9 0,7 entre 1,0 et 1,25 mm 8,1 1,3 entre 0,5 et 1,0 mm 33,3 68,2 entre 0,25 et 0,5 mm 3,7 24,6 entre 0,16 et 0,25 mm 0,3 2,6 %MH = % par rapport à la matière humide. Le son de blé doit être humidifié et traité thermiquement en vue de le pasteuriser ou le stériliser. Il est avantageux que le traitement thermique ne précède pas l'humidification, car on a observé des résultats il de fermentation médiocres dans le cas o on traite thermiquement le son avant de l'humidifier. Le traitement thermique peut consister en un chauffage par exemple dans un autoclave. Un traitement en autoclave de mn à 120-121 C s'est avéré très satisfaisant, mais des conditions moins sévères (pasteurisation à 105 C, pendant 15 mn dans une étuve) conviennent aussi. Il est possible également d'opérer le traitement thermique du son en y injectant de la vapeur d'eau, ce qui peut permettre d'opérer simultanément l'humidification du son. Outre sa fonction de stérilisation, le traitement thermique a pour effet de favoriser la gélatinisation de l'amidon contenu dans le son de blé et, donc la disponibilité de ce substrat pour le champignon Aspergillus niger, ce qui permet des fermentations plus efficaces. L'humidification du son est importante car la teneur en eau influe sur la performance de la fermentation. La teneur en eau initiale du son est réglée initialement à 50-60%, de préférence 50-55%, de la masse de son sec et on la maintient sensiblement dans cet intervalle pendant la fermentation, par exemple en procédant périodiquement à des apports d'eau pour compenser la perte en eau du milieu. L'expression "sensiblement maintenue" veut dire qu'il est tolérable que le taux d'humidité prenne une valeur s'écartant un peu (+ 5 unités %) de l'intervalle de 50-60% pendant une relativement brève période entre deux ajustements successifs du taux d'humidité ou en fin de fermentation. Il est avantageux, en tout cas, de ne pas descendre en dessous d'un taux d'humidité de 45%. Le taux d'humidité du milieu de culture tend à baisser au cours de la culture par évaporation sous l'effet de l'augmentation de température générée par la croissance fongique, ledit milieu étant un mauvais conducteur de la chaleur. La qualité de l'eau utilisée joue aussi un rôle non négligeable. On peut utiliser une eau courante de bonne qualité ou de l'eau distillée. L'inoculation du son de blé peut se pratiquer avec tout inoculum approprié. L'homme du métier connaît de multiples façon de préparer un inoculum convenable à partir d'une souche sélectionnée. La dose d'inoculation est avantageusement d'au moins 1 x 107 spores/gramme de matière sèche initiale. La fermentation peut être conduite dans tout réacteur approprié. Des exemples de réacteur utilisable sont ceux décrits dans l'article de A. DURAND et Coll. publié dans Agro-Food-Industry Hi-Tech (Mai-Juin 1997, pages 39-42). La fermentation peut être conduite pendant une période de 1 à 3 jours, de préférence de 30 à 60 heures. En dessous de i jour, la fermentation est par trop incomplète. Au bout de 3 jours la fermentation est achevée ou quasiment achevée de sorte qu'il serait non économique de la prolonger davantage. La température du milieu est typiquement maintenue entre 28 et 38 C, de préférence entre 32 et 36 C, ce qui correspond au domaine d'activité optimum connu des souches d'Aspergillus niger à utiliser dans l'invention. Avantageusement, à cette fin, la température de l'air est réglée à 34-38 C pendant les premières heures de la fermentation pour favoriser la germination des spores, puis réduite à 28- 32 C pour le reste de la fermentation pour contribuer à la régulation de la température du milieu. Le pH du milieu de fermentation n'est pas régulé habituellement. Si sa valeur de départ est voisine de 6,0-6,4, le pH baisse à 3,8-4,2, au cours de la culture, puis remonte à la fin. Ce retour est généralement corrélé avec la phase de sporulation du champignon. Le suivi de l'évolution du pH constitue un bon indicateur de l'état de la culture. Le fermenteur doit être aéré, de préférence en continu, afin d'apporter l'oxygène nécessaire à la fermentation et éviter l'accumulation excessive de dioxyde de carbone produit par la fermentation. En outre, l'aération participe au contrôle de la température et de l'humidité du milieu de culture. L'air sera, de préférence, sensiblement saturé en eau pour limiter la tendance à l'assèchement du milieu. Il est difficile de donner des indications quantitatives sur le débit d'aération, car de multiples variables, en particulier la taille et la géométrie du réacteur, la quantité du I[ l- son chargée, etc...., interviennent. De simples essais de routine permettront, toutefois, à l'homme de l'art de déterminer aisément un débit d'aération convenable dans chaque cas pratique. La charge de son dans le fermenteur doit être périodiquement ajoutée à l'aide des moyens d'agitation, tels que des bras agitateurs, des lames ou spatules, ou des vis sans fin au cours de la fermentation en vue d'éviter la formation de masses imperméables et afin que l'aération intéresse de la façon la plus homogène possible toute la masse de son. Il faut, toutefois, éviter une agitation trop vigoureuse qui pourrait nuire au champignon. Le produit de l'invention est un produit solide qui peut être directement ajouté à l'amidon liquéfié (dextrines) obtenu dans l'étape de liquéfaction, afin de procéder à la saccharification. Le produit de l'invention peut être séché ou congelé en vue de sa conservation, si désiré. Le séchage doit être réalisé à une température modérée pour ne pas affecter l'activité enzymatique. Un chauffage en étuve à 40 C s'est révélé approprié, par exemple. La congélation, de son côté, peut être réalisée sur le produit humide à basse température, par exemple à -20 C. Dans les exemples, les diverses activités enzymatiques ont été mesurées selon les protocoles établis par P. LABEILLE et Coll. et publiés dans la revue "Industrial Crops and Products", 1997, Vol. 6, pp. 291-295. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés en vue d'illustrer l'invention. EXEMPLE 1 - Sélection de souches d'Aspergillus On a étudié de façon comparative l'aptitude de sept souches différentes d'Aspergillus disponibles dans le commerce à produire de la glucoamylase par fermentation en milieu solide de son de blé. Les essais ont été effectués sur 50 g de milieu de fermentation dans une fiole d'Erlenmeyer. Le milieu était constitué de 21,5 g de son de blé, de 27,5 g d'eau, et de 1 g d'amidon de blé. Le pH initial du milieu était de 6,0- 6,5. Le milieu a été stérilisé pendant 20 min dans un autoclave à 120 C. [l.,- On a inoculé chaque milieu avec 2.107 spores de la souche à tester par gramme de matière sèche initiale. L'âge des spores était de 3 jours. On a laissé la fermentation se dérouler pendant 40 ou 50 heures, les fioles d'Erlenmeyer étant placées dans une étuve à 35 C. A la fin de la fermentation on a mélangé le milieu fermenté avec 150 ml d'eau distillée afin de mettre les enzymes produites en solution, puis on a filtré pour récupérer la solution enzymatique. On a centrifugé la solution pour éliminer les spores et particules résiduelles, puis on a conditionné la solution en flacons de 100 ml que l'on a conservée à - 20 C jusqu'à l'analyse de l'activité glucoamylasique. Les souches testées et les résultats obtenus sont récapitulés dans le Tableau 1 suivant: Réf. souches de collections Durée de la FMS Ac. GA (h) (UG.g-1 MSI) A. niger ATCC 76060 50 627 A. niger ATCC 76061 50 943 A. niger MUCL 28815 40 710 A. niger MUCL 28816 40 631 A. niger NRRL 3112 50 1056 A. oryzae ATCC 22788 50 903 A. oryzae ATCC 42149 50 861 On voit que les souches A. niger NRRL 3112, A. niger ATCC 76061 et A. oryzae ATCC 226788 ont les meilleures activités en terme de production de glucoamylase. Une autre propriété importante à prendre en considération, toutefois, est la stabilité de la glucoamylase produite. On a donc procédé à des essais de thermostabilité en effectuant des traitements thermiques des solutions enzymatiques à 55 et 60 C pendant 30 min et en mesurant l'activité de la glucoamylase au bout de ce temps. Ces traitements se rapprochent des conditions d'utilisation pour la saccharification de l'amidon. Il a été trouvé que les souches A. niger ATCC 76061 et A. niger NRRL 3112 donnaient les glucoamylases les plus stables (100% d'activité résiduelle après 30 min à 55 C et environ 50% d'activité résiduelle après 30 min à 60 C) alors que les souches A. oryzae ATCC 22788 et ATCC 42149 donnaient des glucoamylases ayant 0% d'activité résiduelle après 30 min à C et 46% d'activité résiduelle après 30 min à 55 C. Ceci nous a donc conduit à sélectionner les souches ATCC 76061 et NRRL 3112 de A. niger. Par ailleurs la souche A. niger NRRL 3112 s'est avérée être génétiquement assez instable (perte d'activité après quelques cycles reproductifs) de sorte que la souche la plus préférée est la souche ATCC 76061 de A. niger. C'est cette souche qui a donc été utilisée dans les exemples suivants. EXEMPLE 2 - Production de glucoamylases en cuves pilotes fournies par 1'INRA de 50 1 non stériles: importance du prétraitement du son de blé. Les essais ont été réalisés avec un fermenteur non-stérile de 50 1 conforme à celui décrit dans l'article de A. DURAND et collaborateurs précité (Figure 1) et du son de blé BCE (fourni par la distillerie Brie Champagne Ethanol, Provins, France). Deux modes de préparation du son ont été mis en oeuvre pour obtenir 5 kg milieu de culture à 55% d'humidité: 20. son sec: le son est autoclave 1 h à 105 C puis mélangé à de l'eau (essai F4C3); * son humide: le son est humidifié à 45% dans un pétrin et autoclavé 20 min. à 121 C (essai F4C4). Dans les deux cas, on effectue une inoculation avec 2.107 spores.g- MS et on règle la teneur en eau des milieux à environ 55%. Ils sont ensuite fermentés sur 10 cm de hauteur de couche dans des cuves aérées. Au cours de ces cultures, le milieu est strié par intermittence à l'aide d'une spatule pour réduire sa température. Pendant la fermentation, l'atmosphère est renouvelée en permanence par un air conditionné dont la température, l'humidité et le débit sont tels qu'indiqués dans les Tableaux. Les résultats sont présentés dans les Tableaux 2 (essai F4C3) et 3 (essai F4C4). Ces données permettent de dégager plusieurs conclusions: L'humidification du son de blé, préalablement au traitement thermique est nécessaire à une production de glucoamylases efficace. Au- delà de la décontamination, le traitement thermique du son de blé favorise vraisemblablement la gélatinisation de l'amidon; - Le pH apparaît comme un bon indicateur qualitatif de l'évolution de la croissance et de la production de GA fongiques, sans pour autant permettre d'estimer la quantité de GA obtenue: - Une légère agitation du milieu (striage) n'altère pas la production d'enzymes; - L'évolution de la teneur en eau pendant ces deux fermentations indique un assèchement considérable du milieu de culture qui pourrait être préjudiciable à la croissance fongique. EXEMPLE 3: Production de glucoamylases en fermenteur pilote fourni par la Société FUJIWARA: importance du maintien de l'humidité du milieu au cours de la fermentation. Cet essai a été mis en oeuvre avec un fermenteur pilote vendu par la Société FUJIWARA, Okayama, Japon, et du son de blé BCE. Il diffère notamment du fermenteur utilisé dans l'exemple 2 par le diamètre de la cuve qui est de 0,66 m contre 0,35 m pour les cuves INRA. Dans ce fermenteur, 20 kg de milieu à 55% d'eau préparés selon le mode son humide décrit dans l'exemple 2 sont nécessaires pour mettre en oeuvre une culture sur 12 cm d'épaisseur. L'agitation est assurée par trois vis sans fin verticales à rotation constante qui viennent mixer le milieu dans la cuve en rotation (5-10 min/tour). Au cours de la fermentation, comme pour les cuves INRA de l'exemple 2, l'atmosphère gazeuse est renouvelée en permanence par un air conditionné dont la température, l'humidité et le débit sont tels qu'indiqués dans le Tableau 4. Au cours de cet essai appelé FII, l'opportunité d'une régulation de l'humidité a été étudiée. Des mesures ponctuelles de l'humidité de la culture, effectuées avec un appareil à infrarouge, et de la masse de milieu sont utilisées pour déterminer la quantité d'eau à ajouter pour maintenir la teneur en eau du milieu au-dessus de 50%. Les résultats de cet essai FII sont reportés dans le Tableau 4. Les résultats obtenus appellent les commentaires suivants: - FII indique clairement que le maintien de la teneur en eau entre 50 et 55% favorise la production d'enzymes avec 1600 UG/g MS libérées après 44 h de fermentation, soit plus du double de l'activité obtenue au cours de l'essai F4C2 de l'exemple 2 qui n'avait pas bénéficié de cette régulation; - la stabilisation de la production d'enzymes dès 44 h de culture corrélée à l'apparition de spores fongiques montre qu'il n'est pas nécessaire de poursuivre la culture au-delà de cette phase; - une régulation satisfaisante de la température du milieu autour de 35 C peut être obtenue par une bonne combinaison du conditionnement de l'air et de l'agitation du milieu; - la culture supporte sans dommages le brassage intermittent mis en oeuvre par le système d'agitation du fermenteur FUJIWARA. EXEMPLE 4: Production de glucoamylases en fermenteur pilote INRA agité de 50 1: utilité d'un prétraitement thermique du son à la vapeur et d'une culture en "conditions stériles". Ce fermenteur pilote est semblable à celui présenté dans WO-A- 94 18306 et sur la figure 4 de l'article de A. DURAND et Collaborateurs précité. Cet outil permet de traiter le son à la vapeur directement dans le fermenteur, mode de préparation préféré à l'échelle industrielle. La culture est également préparée, inoculée et réalisée en conditions stériles à l'exception des prélèvements, ce qui confère une semistérilité à cet essai et diffère des deux précédents exemples. A) Conditions expérimentales 9 kg de son BCE sont introduits dans le fermenteur, pré-humidifiés par 1,5 1 d'eau, puis stérilisés en place 20 minutes à 121 C, avec une agitation périodique de 5 secondes toutes les 5 minutes. Ce traitement permet d'atteindre un taux d'humidité de 46%, ajusté ensuite à 55% lors de l'inoculation. Le son est inoculé par une préparation de type koji: g de son BCE (55% d'humidité initiale) fermentés 4 jours à 35 C sont mélangés à 3 litres d'eau stérilisée de façon à obtenir une suspension de spores qui constitue l'inoculum. Les conditions initiales de la fermentation sont les suivantes: 18,3 kg de culture à 55% d'humidité et un pH initial de 5,7; cm de hauteur de couche; Débit d'aération: 314 1.min-; Tair d'entrée: 35 C; Humidité relative de l'air à l'entrée: 95%. B) Suivi de la fermentation Outre la mesure du pH, de la température du milieu, du pourcentage de matière sèche et de la production de GA, l'évolution de la masse de la culture est enregistrée en continu sur le fermenteur de 50 1 agité, tandis que, pour le réacteur non stérile, des pesées de la culture sont effectuées à 21 h et à 42 h de fermentation. Ces mesures de la masse présentent un double intérêt: Maintien de l'humidité au cours de la culture par estimation du pourcentage de MS. Pendant la fermentation deux phénomènes contribuent à la diminution de la masse de la culture, il s'agit: - de l'assèchement du milieu d'une part que l'on désire compenser par un apport d'eau, - de la perte de matière sèche d'autre part, liée à la croissance du champignon. Cette perte de matière sèche n'est pas négligeable, 20% de MS étant perdus en 40 h de culture, soit 0,5% de MS par heure si l'on fait l'approximation d'une perte linéaire. A partir de là, connaissant à chaque instant la masse de la culture (M(t)), il est possible d'en déduire le pourcentage de MS théorique au temps t, par la relation: MSI (MSI. 0,5%).t % MS théorique (t) - o MSI est la quantité de matière M(t) sèche initiale. Lorsque ce % MS ainsi calculé dépasse 50%, une addition d'eau stérilisée est effectuée de façon à ramener ce pourcentage à 45%. Expressions des résultats par gramme de MS initiale. Les évolutions de la masse et celles du pourcentage de MS mesuré permettent de calculer la perte de matière sèche réelle (PMs exprimée en %) au cours de la culture. Ainsi, la quantité de GA exprimée jusque là en UG.g-1 MS peut être exprimée en UG.g-1 MS initiale grâce à la relation suivante: (UG.g-1 MSI) - (UG.g1 MS). (100 - PMS)/100 C) Résultats Les Tableaux 5 et 6 récapitulent les conditions opératoires et les résultats obtenus en réacteur agité sur son vapeur. Malgré l'aération de la culture par un air saturé en humidité, l'assèchement du milieu est tel qu'il a été nécessaire à deux reprises de réajuster sa teneur en eau quand elle descendait en dessous de 50% comme indiqué sur le Tableau 5. La température du milieu a pu être maintenue à une valeur moyenne de 35 C grâce à l'abaissement de l'air d'entrée, mais surtout par une agitation intermittente. Dans ces conditions de culture, la croissance du champignon, dont on suit l'évolution par la mesure du pH, est maintenue pendant 60 h et permet d'atteindre une production de 1436 UG.g1 MS en 44 h et de 1990 UG. g' MS en 63 h. Ramenée à la MS initiale, la quantité de GA produite est respectivement de 1160 et 1540 UG.g-1 MSI. Pour comparaison, nous avions obtenu dans le cadre de l'exemple 3 en 44 h de culture 1605 UG.g' El-- MS équivalentes à 1067 UG.gl MSI. Cette information est intéressante car elle indique que la productivité de ces deux essais est identique, mais que les conditions expérimentales de l'exemple 4 ont permis de prolonger la production d'enzymes même avec 40 cm de hauteur de couche. Le traitement du son à la vapeur puis sa fermentation dans le réacteur INRA de 501 agité prolonge donc la culture fongique et la production d'enzymes. Ramenée à la MS initiale, la quantité de GA produite est de 1540 UG.g'- MSI. Sur les mêmes échantillons, des dosages d'activités xylanases et protéases ont été effectués. Les résultats obtenus sont très satisfaisants avec un maximum, en moyenne, à 50 h de fermentation de 350 UX.g-1 MSI pour les xylanases; 400 UP.g-1 MSI pour les protéases. Grâce à l'enregistrement en continu de la masse, il a été possible de calculer la perte de matière sèche au cours de la culture. Elle est d'environ 23% au bout de 60 h de culture (à 2% près compte tenu de la précision des pesées). EXEMPLE 5: Utilisation des sons fermentés produits dans l'Exemple 4 pour l'hydrolyse de farines de blé Une série de saccharifications avec les sons fermentés obtenus dans l'exemple 4 a été menée sur des farines de blé préalablement soumises à un traitement de liquéfaction enzymatique classique. La préparation de glucoamylases AMG 300L commercialisée par la Société NOVO a servi de témoin. Ces essais ont été réalisés avec une farine de blé conventionnelle type 45. Les conditions opératoires sont récapitulées dans le Tableau 7 pour 750 g de moût. TABLEAU 7 Produit AMG Son fermenté Son fermenté 300L ((Novo) séché Référence AMG 300 L Ex. 4 Ex. 4 Présentation Liquide Son humide Son sec Mode à +5 C à -20 C à T ambiante conservation Farine Commerciale Commerciale Commerciale type 45 type 45 type 45 Quantité utilisée 300 300 300 Mat. Sèche du 35 35 35 milieu (%) Cond. lh/88 C/pH 6,1 lh/88 C/pH 6,2 lh/88 C pH 6,2 Liquéfaction Enzyme 1251d Termamyl. 1251] Termamyl. 125R1 Termamyl. L 120L 120L Cond. Saccharif. 44h/58 C/pH 4,6 40h/58 C/pH 4,55 44h/60 C/pH 4,52 Qt. Equiv. à 205 l 4, 3g 2,1g 3500 UG Au cours de ces hydrolyses de farine de blé, nous avons prélevé trois échantillons de milieu à chaque fois. Les résultats de concentrations en sucres réducteurs (S.R.) à différents moments de la saccharification présentés dans le Tableau 8 sont la moyenne de ces trois prélèvements. Ces dosages, effectués selon la technique au DNS, ont été réalisés sur les surnageants des prélèvements centrifugés. On a également mesuré la viscosité finale des produits saccharifiés. TABLEAU 8 Mesures AMG 300L Son fermenté Son fermenté (Novo)_ séché Conc. S.R. 180,9+4,6 185,0+3,1 171,5+4,5 ((initiale (g/l) Conc. S.R. finale 327,5+18,5 325,0+ 22,5 348,3+19,1 Viscosité (mPa.s) 6,80 2,82 2,80 Viscosité (mPa.s) 6,80 2,82 2, 80 Par ailleurs, on a constaté un accroissement de la teneur en azote soluble des moûts après saccharification dû à l'action protéolytique du son fermenté. Ces résultats indiquent que les sons fermentés produits dans l'Exemple 4 sont capables d'hydrolyser la farine de blé avec la même efficacité qu'une préparation standard de GA, quel que soit leur mode de stockage. L'hydrolyse de la farine avec du son fermenté entraîne également une réduction notable de la viscosité comparée à une préparation enzymatique conventionnelle. Il va de soi que les modes de réalisation décrits ne sont que des exemples et l'on pourrait les modifier, notamment par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour cela du cadre de l'invention. TABLEAU 2 Tps Cult Air, Air, Air, Air, T milieu pH % UGA/g Tps Cult. (h) T entrée Débit Débit % HR moyenne moyen Humidité MS (h) (OC) (1/min) (m/s) moyenne | F4C30,0 35 174,4 8,0 96 25,0 0,0 son sec 3,0 35 174,4 8,0 95 33,8 6,33 3,0 11,0 32 174,4 8,0 94 34,6 5,13 54,53 20,56 11,0 14,0 30 174,4 8,0 95 35,4 4,38 54,19 71,13 14,0 Striage 16,0 30 174,4 8,0 94 33,3 4,36 52, 17 123,12 16,0 (17h) Striage 18,0 28 174,4 8,0 92 37,4 4,51 51,31 85,78 18,0 (1 8 h)_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ,0 28 174,4 8,0 96 31,8 3,79 49,54 132,81 20,0 22,0 28 174,4 8,0 95 34,7 4,12 45,17 188,0 22,0 ,0 28 174,4 8,0 37,6 4,34 45,13 181,03 25,0 Ix "--4 28,0 28 174,4 8,0 94 32,6 4,63 36,47 129,58 28,0 0o --,4 31,0 28 174,4 8,0 32,8 5,05 30,68 198,10 31,0 ,0 28 174,4 8,0 95 31,9 5,69 23,96 246,86 40,0 ,0 28 174,4 8,0 95 31,9 5,69 23,96 246,86 40,0 TABLEAU 3 Tps Cult Air, Air, Air, Air, T milieu pH % UGA/g Tps Cult. (h) T entrée Débit Débit % HR moyenne moyen Humidité MS (h) ( C) (/min) (im/s) moyenne F4C4 0,0 35 174,4 8,0 96 25,0 5,96 0,0 son 3,0 35 174,4 8,0 95 33,8 6,12 3,0 humide 11,0 32 174,4 8,0 94 35,1 5,06 53,93 135, 77 11,0 Striage 14,0 30 174,4 8,0 95 39,9 4,66 53, 04 121,02 14,0 (14h) 16,0 30 174,4 8,0 94 33,1 4,59 51,53 182, 96 16,0 Striage 18,0 28 174,4 8,0 92 38,0 4,48 50, 80 327,41 18,0 (18h) ,0 28 174,4 8,0 96 34,3 3,72 51,76 360,25 20,0 22,0 28 174,4 8,0 95 36,9 3,70 47,65 618, 00 22,0 ,0 28 174,4 8,0 36,3 4,15 41,68 658,05 25,0 28,0 28 174,4 8,0 94 30,9 4,53 35,73 660, 03 28,0 31,0 28 174,4 8,0 30,8 5,18 33,98 583, 62 31,0 ,0 28 174,4 8,0 95 30,2 4,88 30,02 702,74 40,0 TABLEAU 4 Tps (h) Vitesse Humidité T C T C Humidité pH UG/g MS UG/g Tps de ventiair (%) entrée milieu milieu % MSI (h) lation air tours/mn Agit. 0 15 99,0 35,0 25,0 54,0 6,36 4,3 4,3 0 15 98,5 35,0 34,7 53,7 5,95 23,9 10 12 33,0 12 15 98,6 33,0 34,5 51,6 4,92 133,3 15 Agit. 18 15 98,8 33,0 37,3 49,7 4,18 304,8 273,1 18 + 3 1 eau 21 15 98,3 30,0 30,7 54,7 3,83 472,1 21 24 15 98,2 30,0 31,9 52,4 3,76 709,2 24 Agit. 28 15 97,9 30,0 33,4 46,6 4,08 1198,0 28 + 2 1 eau 29 25 98,0 30,0 51,6 1054,0 29 Agit. 38 15 98,6 32,0 31,5 39,2 5,00 1469,7 976,1 38 + 6 1 eau 39 15 99,0 32,0 60,6 1338,0 39 42 15 99,2 32,0 33,9 59,7 5,28 1514,8 42 44 15 98,1 32,0 34,1 54,8 5,76 1605,1 1067,6 44 46 15 96,8 32,0 33,7 52,6 6,33 1601,0 46 66 15 99,0 32,0 32,4 34,0 7,28 1594,4 1161,7 66 TABLEAU 5 - Paramètres physico-chimiques de la FMS en fermenteur de 50 1 agité sur son vapeur Tps Cult Air, T entrée Air, Débit Air, % HR T milieu pH Masse Traitement (h) (OC) (1/min) moyenne moyen totale 0 35,0 314,0 94,6 5,70 18,30 13 36,1 312,7 92,6 38,8 4,72 18,00 13 (après agit) 471,0 38,6 4,68 agitation 16 29,8 448,6 94, 6 32,4 4,60 17,50 agitation 18 33,2 466,5 77,2 31,0 4,37 17,10 ,33 32,6 466,5 93,7 34,3 4,20 16,80 23,66 34,2 4, 13 15,80 26 29,8 467,5 94,6 32,9 4,17 15,10 26 29,8 467,5 94,6 33,3 3,81 17,30 agitation + 2,5 1 d'eau 36,75 29,0 467,5 94,6 agitation 36,75 27,0 467,5 94,6 29,9 3, 71 14,30 ,58 27,0 467,5 94,6 31,0 4,20 13,10 ,66 27,0 467,5 94,6 31,7 3,60 15,10 agitation + 2,1 1 d'eau 44,58 448,6 33,6 3, 71 14,10 47,17 467,5 34,8 4, 04 13,30 27,0 303,3 94,6 32,0 4,09 12,80 agitation co 63,33 28,7 303,0 _____________ 31,0 5,75 10, 30 _Co 63,33 28,7 303,0 31,0 5, 75 10,30 Co N)j TABLEAU 6: Synthèse des résultats de la FMS en fermenteur de 50 1 agité sur son traité à la vapeur Tps Cult Teneur Perte de MS Perte en MS UG/g UG/g UX/g MS UX/g UP/g MS UP/g (h) en eau (%) (%) % lissée) MS MSI MSI MSI moyenne moyenne 0 54,50 -2,07 0,00 0,00 0,0 0, 0 0,0 0,0 13 57,52 7,78 0,4 92,69 85,48 16,1 16,0 131,0 130,49 16 53,72 2,11 1,0 170,53 166,92 19,2 19,0 196,2 194,15 18 55,23 7,21 1,8 129,25 222,01 27,9 27,4 103,9 102,02 ,33 51,90 1,91 3,1 429,36 421,18 35,0 33,9 193,7 187,63 23,66 50,88 5,57 5,9 551,93 521,21 51,0 48,0 283,4 266,81 26 49,06 6,15 8,2 651,45 611,36 75,4 69,2 296,5 272,14 o 26 57,76 10,57 8,2 548,42 490,44 54,1 49,7 262,1 240,57 36,75 49,27 10,75 18,4 1127,09 1005,88 203,,5 166,2 359,1 293,20 ,58 51,14 20,55 20,5 ,66 58,72 22,54 22,0 1278,58 990,35 227,3 180,7 347,9 276,52 44,58 54,10 19,21 22,6 1436,16 1160,27 408,3 318,6 367,1 286,45 47,17 54,01 23,07 23,2 1535,69 1181,43 511,5 395,7 496,8 384,30 Co Co 54,66 26,67 24,4 1742,78 1277,91 429,8 330,1 628,2 482,48 M 63,33 44,69 22,62 22,6 1989,07 1539,07 410,3 310,1 478,3 361,5 REVENDICATIONS 1. Un produit multienzymatique présentant des activités glucoamylasique, protéolytique et xylanasique, caractérisé en ce qu'il est constitué de son de blé fermenté avec une souche d'Aspergillus niger, lesdites activités enzymatiques glucoamylasique, protéolytique et xylanasique étant présentes aux valeurs minimales suivantes: - glucoamylasique: au moins 500 UG par gramme de matière sèche - protéolytique: au moins 125 UP par gramme de matière sèche - xylanasique: au moins 100 UX par gramme de matière sèche. 2. Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente une activité glucoamylasique d'au moins 1500 UG/g de matière sèche, une activité protéolytique d'au moins 400 UP/g de matière sèche, et une activité xylanasique d'au moins 300 UX/g de matière sèche. 3. Produit selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la souche d'Aspergillus niger est choisie parmi la souche NRRL 3112, la souche ATCC 76061 et les souches obtenues à partir desdites souches par sélection ou mutation. 4. Produit selon la revendication 3, caractérisé en ce que la souche d'Aspergillus niger est la souche ATCC 76061. 5. Un procédé de production du produit multienzymatique défini à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (a) prendre du son de blé; (b) à humidifier et traiter thermiquement ledit son de façon à le pasteuriser ou le stériliser; (c) à inoculer le son de blé résultant par une souche d'Aspergillus niger; (d) le son étant sous la forme d'une couche d'au moins 10 cm d'épaisseur, le faire fermenter à l'état solide dans un réacteur aéré et agité périodiquement pendant une période de 1 à 3 jours, à une température de 28-38 C, ledit son étant réglé à une teneur en humidité initiale de 50 à 60% en poids sensiblement maintenue pendant la durée de la fermentation, dans des conditions d'aération propres à éviter une accumulation de dioxyde de carbone nuisible à la fermentation dans le réacteur et une élévation de la température due à la fermentation au-delà de la gamme indiquée, jusqu'à ce que le produit de fermentation présente les valeurs minimales suivantes d'activités enzymatiques: - glucoamylasique: au moins 500 UG par gramme de matière sèche - protéolytique: au moins 125 UP par gramme de matière sèche - xylanasique: au moins 100 UX par gramme de matière sèche. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la fermentation est poursuivie au moins jusqu'à ce que le produit présente une activité glucoamylasique d'au moins 1500 UG/g de matière sèche, une activité protéolytique d'au moins 400 UP/g de matière sèche, et une activité xylanasique d'au moins 300 UX/g de matière sèche. 7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que la souche d'Aspergillus figer est choisie parmi la souche NRRL 3112, la souche ATCC 76061 et les souches obtenues à partir desdites souches par sélection ou mutation. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la souche d'Aspergillus figer est la souche ATCC 76061. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce qu'on évite que le taux d'humidité du son ne tombe en dessous de 45% au cours de la fermentation. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape supplémentaire consistant à congeler ou à sécher le produit obtenu dans l'étape (d). IVr