FR 2789085 A1 20000804 FR 9901078 A 19990129 I- --2789085 La présente invention concerne un procédé de préparation d'acides hydroxyoctadécadiénoïques, plus particulièrement l'acide 9-hydroxy-10, 12- octadécadiénoïque et l'acide 13-hydroxy-9, 1 1-octadécadiénoique, et leur mélange, ainsi que leurs isomères tels que l'acide 9(R/S)-hldroxy-10OE, 12Z- octadécadiénoiïque, éventuellement sous forme de leurs esters, plus particulièrement sous forme de leur ester éthylique. Dans la description suivante, l'acide hydroxyoctadécadiénoïque est appelé HODE. L'invention concerne un procédé de préparation de IHODE par oxydation contrôlée de l'acide linoléique et/ou de l'acide linolénique. puis réduction. L'invention concerne en outre un procédé de préparation de l'HODE à partir de triglycérides riches en acide linoléique et/ou en acide linolénique ou à partir d'acide linoléique et/ou d'acide linolénique sous forme d'acide gras libre ou sous forme d'ester ou de sel, par exemple sous forme d'ester éthylique. L'invention concerne en outre un médicament pour le traitement de l'obésité contenant comme principe actif l'HODE et des supports acceptables pharmacologiquement. L'invention concerne aussi un complément alimentaire contenant I HODE pour le traitement de l'obésité. L'invention concerne de plus un produit cosmétique contenant lHODE et des supports acceptables cosmétologiquement. D'une manière générale, il est admis que l'augmentation de la fréquence de surcharge pondérale et de l'obésité dans les pays développés est due à une alimentation inadaptée, tant par l'apport calorique global trop important que par une part trop élevée de lipides dans cet apport calorique. Cette part très importante de lipides dans l'alimentation (estimée en moyenne à près de 50% de l'apport énergétique) peut être réduite dans le cadre de régimes hypocaloriques dans lesquels les matières grasses sont fortement réduites. -2- 2789085 Cependant, les lipides ne peuvent pas être réduits à moins de 30% de l'apport énergétique dans la mesure o non seulement ils jouent un rôle important dans la texture et la perception gustative des aliments, mais aussi qu'une quantité minimale est nécessaire dans l'alimentation. notamment pour la biosynthèse des acides gras essentiels et des hormones, et le renouvellement des phospholipides membranaires. Un axe essentiel de la recherche concernant le traitement de l'obésité depuis plusieurs décennies est donc la sélection de " c'est-à-dire, des lipides qui ne sont pas emmagasinés dans l'organisme, mais utilisés comme source d'énergie. Dans ce contexte, il a été établi que la nature des acides gras composant les lipides jouait un rôle fondamental dans leur métabolisme. A titre d'exemple, les acides gras à chaîne courte sont plus thermogènes que les acides gras à chaîne longue. On a pu observer que la longueur de chaîne des acides gras a une s 5 influence directe sur la dépense énergétique et donc sur leur stockage dans l'organisme. Un des objectifs de l'invention était de trouver une molécule permettant la régulation de l'activité lipolytique de l'adipocyte c'est-à-dire, capable d'hydrolyser les triglycérides stockés dans les adipocytes en acides gras libres et en glycérols. On sait que l'adrénaline et la caféine sont deux molécules connues pour leurs effets lipolytiques. Ce sont notamment des molécules qui augmentent les taux d'adénosine mono phosphate cyclique (AMPc), première étape de l'activation de la lipolyse. Un des buts de l'invention est donc, entre autres, de trouver une molécule qui active la lipolyse de manière plus importante que la caféine ou l'adrénaline grâce à une stimulation de la production adipocytaire d'AMPc. - 3 - 2789085 Un autre but de l'invention est de fournir une molécule lipolytique synthétisée à partir de produits se trouvant couramment dans la nature, de manière simple et efficace. Les inventeurs ont découvert de manière surprenante que les dérivés de s l'acide gras hydroxyoctadécadiénoïque (HODE) présentaient des propriétés thermogéniques intéressantes sans entraîner de toxicité et notanmnent l'acide 9- hydroxyoctadécadiénoïque sous forme d'acide libre ou sous forme d'esters ou de sels. L'invention concerne donc un procédé d'obtention d'une huile enrichie en io acide gras hydroxyoctadécadiénoïque (HODE) et notamment d'acide 9- hydroxyoctadécadiénoïque (9-HODE), ou de ses esters ou de ses sels, à partir d'un mélange huileux contenant de l'acide linoléique et/ou de l'acide linolénique, ou leurs esters ou leurs sels, caractérisé en ce que l'on effectue une oxydation contrôlée de l'acide linoléique et/ou de l'acide linolénique, ou de leurs esters, en présence d'un catalyseur d'oxydation, l'oxydation étant arrêtée lorsque la teneur totale en HODE, ou de ses esters, est supérieure à au moins55%o et/ou la teneur en isomère acide 9-hydroxy-10,12-octadécadiénoïique (9- HODE), ou de ses esters, est supérieure à au moins 1.5%/ et en ce que l'on réduit les hydropéroxydes formés lors de la réaction d'oxydation, par un réducteur. Le mélange huileux de départ est une huile végétale renfermant plus de % en poids d'acide linoléique et/ou d'acide linolénique sous fomle de triglycérides, telle que l'huile de maïs, de bourrache. de carthame, de soja. d'onagre, de tournesol, de pépins de cassis, germes de blé, de chanvre, de pépins de courge, de lin. Le mélange huileux de départ est un mélange huileux contenant plus de % en poids d'acide linoléique et/ou d'acide linolénique. de préférence, contenant 75%' de linoléate d'étlhyle. La teneur finale dans l'huile enrichie en HODE totaux ou en 9-HODE est au moins 5%, respectivement 1,5% en poids. De préférence, la teneur finale dans l'huile enrichie en HODE totaux ou en 9-HODE est respectivement comprise entre 10 et 12 % en poids et entre 2.2 et 2.5% en poids. Le catalyseur d'oxydation est un halogénure de fer, de cuivre, de s préférence FeCI3. Le réducteur est de préférence NaBH4. L'invention concerne en outre l'huile enrichie en acide gras hydroxyoctadécadiénoïque (HODE) ou ses esters ou ses sels, obtenue comme décrit ci-dessus. De plus, l'invention concerne un médicament pour le traitement de l'obésité contenant comme principe actif l'acide gras 9- hydroxyoctadécadiénoïque (9-HODE) ou ses esters ou ses sels, acceptables pharmacologiquement, de préférence sous forme d'huile enrichie obtenue comme décrit ci-dessus. L'invention concerne en outre un complément alimentaire pour le traitement de l'obésité contenant comme principe actif l'acide gras 9- hydroxyoctadécadiénoïque (9-HODE) ou ses esters ou ses sels acceptables pharmacologiquement, de préférence sous forme d'huile enrichie obtenue comme décrit ci-dessus. L'invention concerne de plus un produit cosmétique pour le traitement de l'obésité contenant comme principe actif l'acide gras 9- hydroxyoctadécadiénoïque (9-HODE) ou ses esters ou ses sels acceptables cosmétologiquement, de préférence sous forme d'huile enrichie obtenue comme décrit ci-dessus. Selon l'invention, on obtient l'acide hydroxyoctadécadiénoïque (HODE) par oxydation contrôlée de l'acide linoléique et/ou de l'acide linolénique. Ces acides gras sont présents dans de nombreuses huiles végétales. Par exemple, les huiles végétales suivantes renferment plus de 40% d'acide linoléique sous forme de triglycérides: l'huile de bourrache, de carthame, de soja, d'onagre, de tournesol, de pépins de cassis, de germes de blé, dc chanvTC, dc pSpins dc courge, de lin. Selon un mode de réalisation de l'invention, on peut obtenir ITIODE à partir de triolycérides riches en acide linoléique et'ou linolénique. Ce procédé est intéressant dans la mesure o il permet d'utiliser une huile végétale naturelle donc parfaitement adaptée à une utilisation par voie orale, mais présente l'inconvénient de limiter considérablement la teneur finale en isomère 9-HODE. En effet. le fait que l'acide linoléique et/ou linolénique soit sous forme de glycérides limite l'effet d'oxydation, qui est la première étape de la î0 préparation du 9-HODE, mais surtout la teneur en acide linoléique de l'ordre de à 50%0 parmi l'ensemble des acides gras de l'huile naturelle limite la teneur finale en 9-HODE. La structure du produit de départ est un triglyceride d'acide linoléique ou un ester d'acide linoléique de formule générale suivante ( I À 13 9 (i) 12 10 dans laquelle X est un reste triglycéryle ou un reste Et (éthvle) ou tout autre reste alkyle inférieur en CI-C6. LUn tel composé possède une double liaison en position 9. 10 et une double liaison en position 12.13. Par oxydation contrôlée, on obtient selon l'invention les composés de fornules générales ( Il) et (I I) suivantes OH 12 10 qui est l'ester glyceryle ou alkyle de l'acide 9-hydroxy-10,12- octadécadiénoïque. OU OH 13 9 j' j coox 12 10o(ai) qui est l'ester glycerérle ou alkyle de l'acide 13-hxdroxy-9,11- octadécadiénolque. o Par oxdation contrôlée de ( I) on obtient donc un melange d'isomères (I) et (III) L'acide linolénique existe sous deux formes: l'acide ot-linolénique (ou acide (ZZ.Z)9. 12, I 5octadécatriénoïque) et l'acide y-linolénique (ou acide (Z,Z,.Z)6.9, 1 2-octadecatriénoTque. X5 On effectue la réaction d'oxydation en présence d'un catalyseur d'oxgaénation tel qu'un halogénure de fer, de cuivre. de préférence FeCI3. La réaction a une durée variable de 1 2 a 78 heures et a une température entre -20 C et 40 C, à pression atmosphérique et/ou sous pression réduite. On suit le degre d'oxydation par differents critères :o - dosage des hy droxydes formés par chromatographie en phase gazeuse, - évolution de l'absorbance dans le domaine de]'ultraviolet a 233+5 nm, - variation de l'indice de réfraction. Lorsque le pourcentage en poids de compose ( Il)(9-HODE) ou le pourcentage en poids du mélange de composés ( I) et (1II) atteint de I à 20%. on réduit le mélange. à savoir, on réduit les hldroperox\des tformés lors de l'oxvdation. On utilise une solution éthanolique de NaBFI4 ou une solution ethanolique de tout autre agent réducteur que l'on ajoute par parties au melange réactionnel. On maintient la température du melange entre 4 et 25 C. La réduction est terminée lorsque la température devient constante. On neutralise le milieu réactionnel à pH6 - 7 en ajoutant une solution d'acide, de préférence une solution d'un acide acceptable phanrmacologiquement et/ou cosmétologiquement, par exemple de l'acide citrique. On extrait les composés ( II) et ( III) par de l'hexane ou tout autre solvant s organique pouvant les solubiliser. On lave la phase organique avec de l'eau jusqu'à neutralité. On sèche ensuite la phase organique sur du sulfate de sodium ou du sulfate de magnésium anhydre. Puis on évapore le filtrat sous vide. Le produit obtenu est un liquide huileux jaune clair possédant une odeur légèrement aromatique. Il possède une teneur totale de composés ( II) et (III) (déterminée par chromatographie en phase gazeuse) supérieure à 5% en poids et une teneur en composé ( II) [acide 9(R/S)hydroxy- 10E, 1 2Zoctadécadiénoïque ou ester de l'acide 9(R/S)hydroxy-10E, 12Zoctadécadiénoïque] supérieure à 1s 1,5% enpoids. Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention qui est préféré, le produit de départ est un mélange huileux contenant 75% en poids de linoléate d'éthyle. Le principe est le même que celui décrit pour le premier mode de réalisation de l'invention. On effectue une oxydation sélective du linoléate d'éthyle puis une réduction des hydropéroxydes formés et une purification par lavages successifs. On obtient une huile jaune clair, d'odeur spécifique, contenant environ 2,5% en poids d'acide 9-hydroxy-10E, 12Z-octadécadiénoïque (sous forme d'ester éthylique) et 12% d'un mélange des composés ( Il) et (Ill) (sous formnne d'esters éthyliques). La fonction hydroxyle peut être en position 9 ou 13 et les doubles liaisons sous forme conjuguée en 101 O 2 (trans. trans et cis, trans) et en position 91. I 1 (trans, trans et cis, trans). Exemple de préparation d'une huile enrichie en HODE à partir d'un mélange contenant 75% de linoléate d'éthyle -8- 2789085 1- Oxydation Dans un réacteur thermostaté on introduit 500 g de linoléated'éthyle à 75%. On ajoute 0,500 g de FeCI3 anhydre (calalyseur d'oxydation), on porte le mélange à une température voisine de 25-27 C et on le maintient sous agitation regulière. On fait buller de l'oxygène (qualité technique) dans le milieu réactionnel à l'aide d'un filtre en acier inoxydable ou en bronze, d'une porosité de 2 à 4 pm (du genre filtre HPLC ou filtre à particules pour gaz). On maintient ce bullage fin à un débit de 1 litre/min pendant 48 à 72 heures. On contrôle le taux d'oxydation soit: - par mesure de l'indice de réfraction à 20 C sur le produit brut du milieu réactionnel, - par mesure de l'absorbance en UV à 234 rn (détection des diènes conjugués), 1i5 - par dosage en chromatographie phase vapeur après réduction de l'échantillon prélevé dans le réacteur. On arrête l'oxydation lorsque la teneur en 9-HODE et/ou HODE totaux sont respectivement de 2,2%o à 2,5% et de 10% à 12%. 2 - Réduction On rajoute dans le mélange hydropéroxydé 0,16 g d'antioxydant du type Coviox T70. On prépare une solution éthanolique de NaBH4 à 2% (poids/volume) et on la refroidit à 4 C environ. On fait couler cette solution réductrice lentement et en plusieurs fractions sur le mélange hydropéroxydé tout en maintenant la température du milieu réactionnel inférieure à 25 C (environ 20 C). La phase de réduction est tenrminée lorsque la température est constante lorsque l'on maintient l'agitation à température ambiante (I heure environ). La réaction de réduction libère de l'hydrogène. - 9-2789085 3 - Neutralisation à pH 6-7 On ajoute au mélange réactionnel, lentement sous agitation, 100 ml d'une solution d'acide citrique à 25% dans l'éthanol. Il peut se produire une libération d'hydrogène et parfois une précipitation de citrate de sodium. 4 - Extraction, décantation, lavage et séchage On ajoute au milieu réactionnel, sous agitation rapide, 500 ml de n-hexane puis 500 ml d'eau et on laisse décanter. Après séparation des deux phases, on récupère la phase organique. On lave cette phase organique jusqu'à neutralité des eaux de lavage, puis on sèche par filtration sur environ 140 g de sulfate de sodium anhydre. - Evaporation On ajoute à la phase organique 0,16 g d'antioxydant (Coviox T70) et on évapore sous vide le n-hexane à une température voisine de 50 C à 60 C. 6 - Conditionnement et stockage On conserve l'huile obtenue dans un récipient en verre brun ou en fût sous azote et à une température inférieure à 1 0 C. Propriétés pharmacologiques Le but de l'invention est de trouver une molécule ayant une activité sur la lipolyse c'est-à-dire, capable de favoriser l'hydrolyse des triglycérides stockés dans les adipocytes, les acides gras libres ainsi libérés étant ensuite métabolisés. Etude pharmacologique sur les adipocytes humains Cette étude a pour but d'étudier l'effet du 9-HODE sur la production d'AMPc (adénosine monophosphate cyclique) qui est un activateur de la lipolyse, dans les adipocytes humains. On étudie l'effet du 9-HODE par rapport à celui de l'adrénaline et de la caféine qui sont deux molécules connues pour leurs effets stimulants de la lipolyse. On a trouvé qu'une concentration de 104 M de 9-HODE entraîne une augmentation de l'AMPc équivalente à celle de 10-3 M de caféine et supérieure à celle obtenue, quelle que soit la concentration, à celle de l'adrénaline. A une concentration de 10-3 M de 9-HODE, la concentration d'AMPc est 10 fois supérieure à celle obtenue avec la caféine (7,940 fentomoles d'AMPc/million d'adipocytes contre 799). Ces résultats permettent de conclure que le 9-HODE est, in vitro, un puissant activateur de la lipolyse grâce à une stimulation de la production adipocytaire d'AMPc supérieure à celle des molécules de caféine et d'adrénaline. Etudes chez le rat On réalise l'étude sur douze rats qui sont d'abord soumis à une restriction alimentaire (simulation d'un régime) pendant deux semaines, puis qui reçoivent une alimentation normale (reprise de poids) associée ou non à l'administration s d'une huile de tournesol traitée selon le procédé de la présente invention et contenant 2% en poids de 9-HODE. On utilise un groupe témoin qui reçoit l'huile de tournesol dépourvue de 9-HODE. Après onze jours de traitement, on mesure la masse grasse dans les deux groupes. Les résultats obtenus montrent dans le groupe recevant l'huile de tournesol contenant 2% en poids de 9-HODE que la masse grasse est significativement (p groupe placebo (21,8 g par rapport à 29,5 g dans le groupe témoin). L'administration par voie orale d'huile de tournesol contenant 2% en poids de 9-HODE pennet donc de diminuer de manière statistiquement significative la masse de graisse des rats traités par cette huile végétale. Etude de pénétration cutanée On réalise une étude de pénétration cutanée in vitro sur de la peau humaine avec des cellules de FRANZ. Ces cellules comportent une surface de peau humaine de 1,76 cm2 sur laquelle on dépose 800 pg de 9-HODE. Après 6 - " 2789085 heures de contact, on effectue un dosage du 9-HODE par chromatographie en phase gazeuse à la surface de l'échantillon de peau humaine, dans l'épiderme, dans le demie et dans la phase réceptrice. La répartition du 9-HODE est la suivante s - surface de la peau 33% épiderme: 11% - derme 32% - phase réceptrice 24% Le 9-HODE présente donc un pouvoir de pénétration cutanée important lo lui permettant d'agir directement au niveau des adipocytes. Etudes cliniques du 9-HODE Etude clinique évaluant l'efficacité d'un gel cosmétiuque contenant 0,5% de 9-HODE. On réalise une étude clinique chez vingt femmes présentant un excès de tissus adipeux au niveau des cuisses ( "). Les volontaires ont appliqué pendant un mois, deux fois par jour, un gel contenant 0,5% de 9-HODE sur chaque cuisse. Le critère d'efficacité est la mesure de la circonférence de la cuisse à deux niveaux. Les résultats obtenus démontrent l'efficacité du produit puisque l'on observe une réduction de la circonférence de 6 mm au niveau supérieur et de 5,4 mm au niveau inférieur de la cuisse, ces deux réductions étant statistiquement très significatives. Etude clinique évaluant l'augmentation de la thermnogénèse après prise orale unique de 9-HODE On réalise une étude sur dix volontaires sains qui ont absorbé de façon aléatoire les produits suivants - huile de tourmesol: 20 g - huile de tournesol: 20 g contenant 2% de 9-HODE - 12- 2789085 Chaque sujet reçoit à une semaine d'intervalle chacun des produits selon un ordre aléatoire (protocole croisé ou ). Les volontaires passsent deux heures dans la chambre calorimétrique (dépense énergétique basale), puis absorbent l'un des deux produits au cours d'un repas standardisé de 800 kcal. Et restent 6 heures dans la chambre calorimétrique (dépense énergétique après traitement). La dépense énergétique (kjoule/minute) moyenne avec les deux produits est: Dépense énergétique Dépense énergétique Basale après traitement îo Huile de tournesol 5,76 6,35 Huile de tournesol +2 % de 9-HODE 5,68 6,82 La différence de dépense énergétique après traitement est statistiquement significative (p particulièrement intéressante pour le traitement de l'obésité. L'invention permet donc de traiter l'obésité par voie orale et la surcharge pondérale localisée par voie topique. Par voie orale, le 9- HODE peut être administré sous forme d'acide ou sous forme de triglycéride. Par voie topique, le 9-HODE est administré de préférence sous forme d'acide libre. On peut administrer le 9-HODE comme complément alimentaire sous forme de gélules, de comprimés, de solution buvable, de pastilles, de pâtes à mâcher, etc... et/ou dans les aliments. On peut utiliser le 9-HODE pur ou dilué dans des crèmes, gels, bâtons, pommades, etc... Appliqué sur des zones de surcharge pondérale, il permet d'avoir une action directe sur les adipocytes. On peut administrer le 9-HODE comme médicament par voie systémique ou topique pour le traitement de l'obésité. Les doses d'administration sont, par exemple. par voie orale, de 50 à 5 000 mg/jour et par voie locale, de 0,1 à 100%. -13 - 2789085 REVENDICATIONS I - Procédé d'obtention d'une huile enrichie en acides gras hydroxyoctadécadiénoïques (HODE) ou de ses esters à partir d'un mélange huileux contenant de l'acide linoléique, ou ses esters, caractérisé en ce que l'on effectue une oxydation contrôlée de l'acide linoléique et/ou de l'acide linolénique ou de leurs esters, en présence d'un catalyseur d'oxydation, l'oxydation étant arrêtée lorsque la teneur en HODEou de ses esters totaux, est supérieure à 5% et/ou la teneur en isomère acide 9-hydroxy-10,12- octadécadiénoïque (9-HODE), ou de ses esters, est supérieure à 1,5%, et en ce que l'on réduit les hydropéroxydes formés lors de la réaction d'oxydation, par un réducteur. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange huileux de départ est une huile végétale renfermant plus de 40% en poids d'acide linoléique et/ou d'acide linolénique sous forme de triglycérides, telle que l'huile de maïs, de bourrache, de carthame, de soja, d'onagre, de tournesol, de pépins de cassis, de germes de blé, de chanvre, de pépins de courge, de lin. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange huileux de départ est un mélange huileux contenant plus de 40% en poids d'acide linoléique et/ou d'acide linolénique, sous forme d'ester éthylique, de préférence contenant % de linoléate d'éthyle. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractériseé en ce que la teneur finale dans l'huile enrichie en HODE totaux ou en 9HODE est au moins 5%, respectivemenit 1,5% en poids. - 14 - 2789085 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la teneur finale dans l'huile enrichie en HODE totaux ou en 9HODE est comprise entre 10 et 12% en poids, respectivement comprise entre 2,2 et 2,5% en poids. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le catalyseur d'oxydation est un halogénure de fer. de cuivre, de préférence FeCI3. 0o 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le réducteur est de préférence NaBH4. 8 - Huile enrichie en acide gras 9-hydroxyoctadécadiénoïque (9-HODE) ou ses esters ou ses sels, obtenue par le procédé selon l'une quelconque des l 5 revendications I à 7. 9 - Médicament pour le traitement de l'obésité contenant commne principe actif l'acide gras 9-hydroxyoctadécadiénoïque (9-HODE) ou ses esters ou ses sels acceptables pharmacologiquement, de préférence sous forme d'huile enrichie selon la revendication 8. - Complément alimentaire pour le traitement de l'obésité contenant comme principe actif l'acide gras 9-hydroxyoctadécadiénoïque (9-HODE) ou ses esters ou ses sels acceptables pharmacologiquement, de préférence sous forme d'huile enrichie selon la revendication 8. I1 - Produit cosmétique pour le traitement de l'obésité contenant comme principe actif l'acide gras 9-hlydroxyoctadécadiélnoiïque (9-HODE) ou ses esters - 15 - 2789085 ou ses sels acceptables cosmétologiquement, de préférence sous forme d'huile enrichie selon la revendication 8.