FR 2787119 A1 20000616 FR 9815546 A 19981209 1 2787119 La présente invention concerne un procédé de criblage en levure de modulateurs positifs et négatifs de protéines kinases spécifiques de cellules humaines et de mammifères. La régulation de la plupart des voies métaboliques et de transduction de signaux dans les cellules humaines, et plus généralement dans les cellules eucaryotes supérieures, est effectuée par des réactions de phosphorylation/déphosphorylation (Hunter T., 1997, Oncoproteins network, Cell, 88, 333-346). Identifier les protéines kinases responsables de ces phosphorylations, et isoler des modulateurs positifs ou négatifs de leur activité, devrait permettre de développer de nouveaux médicaments pour le contrôle de processus pathologiques majeurs tels que cancers, inflammation, maladies infectieuses, etc. Dans les cellules humaines et mammifères, on estime le nombre total de protéines kinases à un millier (Hunter T., 1995, Cell, 80, 225-236). Depuis la disponibilité de la séquence complète du génome de levure, on sait que le nombre total de protéines kinases dans la levure s'élève environ à 120 (Hunter T. and Plowman G.D., 1997, Reviews, Tibs 22, 18-21). Parmi ces enzymes, on connaît certaines kinases qui sont relativement bien conservées de la levure jusqu'à l'homme et qui régulent quelques grandes voies de transduction de signal, comme les protéines kinases A, les MAP kinases, les kinases du cycle cellulaire, la caséine kinase 11, etc. Ces protéines kinases humaines peuvent complémenter les kinases correspondantes de levure dont le gène a été invalidé. Mais de telles kinases sont finalement très minoritaires. Le plus souvent, les protéines kinases humaines très spécialisées, responsables du contrôle de voies métaboliques très spécifiques des cellules humaines ou d'eucaryotes supérieurs, n'ont pas leur homologue dans la levure. C'est le cas des tyrosine kinases ou des sérine/thréonine kinases très spécialisées, comme par exemple IKKac et IKKP, qui sont responsables de la phosphorylation des IKB, qui sont eux-mêmes les inhibiteurs qui contrôlent l'activation du facteur de transcription NFKB (Mercurio et al. , 1997, Science, 278, 860-866). On ne connaît pas d'équivalent à IKKct et IKK[5 ou à IKB et NFKB dans la levure. On ne peut donc pas généralement espérer pouvoir utiliser la 2 2787119 levure pour l'étude in vivo de ces kinases très spécialisées spécifiques des régulations de voies métaboliques majeures des cellules humaines. L'étude de l'activité catalytique des protéines kinases, l'identification de leurs substrats in vivo et a fortiori l'isolement de modulateurs positifs ou négatifs de leur activité, exige souvent une méthodologie très lourde de marquage de la protéine phosphorylée avec du phosphate radioactif, d'immunoprécipitation et purification de cette protéine, de l'identification des sites phosphorylés après clivage, séparation et détection des peptides comprenant les sites phosphorylés. Ce type d'étude in vivo est très complexe et impossible à utiliser pour cribler à grande échelle pour des modulateurs d'activité. In vitro, cette technologie est également trop lourde pour être communément appliquée à des criblages d'inhibiteurs. Par ailleurs, pour mener ce type d'étude in vitro, il faut disposer de la protéine kinase recombinante, mais surtout, celle-ci, produite le plus souvent dans des bactéries, n'est pas dans une conformation "native" et perd en général sa spécificité pour un substrat. Il existe maintenant une batterie, en extension rapide, d'anticorps reconnaissant spécifiquement les formes phosphorylées de certaines protéines (Catalogne Biolabs 1998). Ces anticorps anti-phosphoprotéines sont souvent disponibles dans le commerce. La disponibilité de tels anticorps peut certainement simplifier les études de phosphorylation citées plus haut. Cependant, ces anticorps ne peuvent pas non plus permettre la mise en oeuvre d'un crible à haut flux de modulateurs, par une utilisation classique en immunoblotting, Elisa ou immunoprécipitation sur des lysats de cellules humaines exprimant les protéines kinases d'intérêt (Harlow, E. & Lane D., 1998, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Les phosphorylations/déphosphorylations s'accompagnent souvent de modifications dans la capacité d'une protéine à interagir avec une autre protéine. Ces modifications d'interaction sont à la base de la régulation des voies métaboliques et de la transmission de signaux dans la cellule. C'est ainsi par exemple que IKB ou la [-caténine interagissent avec la h-PTrCP uniquement sous forme phosphorylée, ce qui cause la dégradation de la forme phosphorylée de la protéine, alors que la forme déphosphorylée est résistante à la dégradation. La protéine Pho4 interagit avec la 3 2787119 protéine Mns5 uniquement quand elle est phosphorylée, ce qui conduit à son exportation du noyau. La protéine Pho4 déphosphorylée qui est incapable d'interagir avec la protéine Mns5 va interagir spécifiquement avec la protéine Psel, ce qui va conduire à son importation dans le noyau. Pho4 phosphorylée est incapable d'interagir avec Psel (Kaffman A. et al., 1998, Nature, 396, 482-486). Nous proposons maintenant un nouveau procédé de criblage de modulateurs de protéines kinases spécifiques de cellules humaines et de mammifères qui permette de surmonter les problèmes de méthodologie de l'art antérieur décrits cidessus. Ce procédé consiste à faire la corrélation entre les modifications des propriétés d'interaction d'une protéine détectées par un test doublehybride et son état de phosphorylation détecté par des anticorps spécifiques de la protéine phosphorylée. Par la combinaison de ces deux techniques, il est donc possible, par simple criblage double-hybride de modulateurs d'interaction, de cribler pour un modulateur de l'activité protéine kinase responsable de la phosphorylation de la protéine. Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de criblage en levure d'inhibiteurs de protéines kinases spécifiques de cellules humaines et de mammifères, caractérisé en ce qu'il consiste à: a) exprimer le ou les substrats de ces kinases en système double-hybride dans la levure Saccharomyces cerevisiae, b) cribler en système double-hybride pour des inhibiteurs desdites kinases par inhibition des interactions phosphorylation-dépendantes dudit ou desdits substrats avec son ou leur partenaire spécifique, et c) vérifier par un test classique antigène-anticorps que les inhibiteurs sélectionnés sont soit des inhibiteurs de kinase capables d'inhiber la phosphorylation du substrat (test négatif), soit des inhibiteurs exclusifs de l'interaction phosphorylation-dépendante (test positif). En particulier, la présente invention a pour objet un procédé de criblage en levure d'inhibiteurs de protéines kinases spécifiques de cellules humaines et de mammifères, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: a) cotransformer la levure Saccharomyces cerevisiae par un vecteur double- hybride contenant l'ADNc de ladite protéine en fusion soit avec un domaine de 4 2787119 liaison à l'ADN, soit avec un domaine d'activation, et un vecteur doublehybride contenant l'ADNc d'un partenaire spécifique de ladite protéine en fusion soit avec un domaine de liaison à l'ADN, soit avec un domaine d'activation, faire exprimer par la levure ladite protéine et ledit partenaire spécifique dans un milieu de culture selon les conditions classiques de double-hybride, vérifier par la méthode double-hybride qu'il y a interaction entre ladite protéine et ledit partenaire spécifique et vérifier par un test classique de réaction antigène- anticorps que ladite protéine est reconnue par des anticorps anti- protéine phosphorylée, b) vérifier qu'un mutant des sites de phosphorylation de la protéine n'interagit pas en test double-hybride avec ledit partenaire et qu'il n'est pas reconnu par les anticorps anti- phosphoprotéine, c) ajouter dans le milieu de croissance sélectif des levures cotransformées soumises au test double-hybride des agents inhibiteurs potentiels de l'interaction entre ladite protéine et ledit partenaire spécifique et sélectionner tous les agents capables d'inhiber l'interaction entre ladite protéine et ledit partenaire spécifique, d) vérifier par un test classique de réactions antigène- anticorps si l'inhibiteur sélectionné en c) inhibe ou non la reconnaissance de ladite protéine par les anticorps anti-protéine phosphorylée, et e) sélectionner d'une part les inhibiteurs capables d'inhiber la phosphorylation (test antigène-anticorps négatif) et d'autre part les inhibiteurs capables d'inhiber l'interaction sans inhiber la phosphorylation (test antigène- anticorps positif). Par partenaire spécifique de la protéine, on entend un partenaire protéique capable d'une interaction avec ladite protéine lorsque celle-ci a été phosphorylée. A titre de substrat de protéine kinase, c'est-à-dire de protéine pouvant être phosphorylée, on cite spécifiquement la protéine IKB, son partenaire spécifique étant la protéine humaine I3TrCP telle que décrit par Margottin et al. (1998, Molecular Cell, Vol. 1, 565-574). Dans le procédé de la présente invention, on vérifie tout d'abord que l'interaction détectée en système double-hybride pour une protéine donnée avec un partenaire donné est une interaction dépendante de la phosphorylation de la protéine. 2787119 Pour cela une protéine mutée sur ses sites de phosphorylation et qui ne peut donc être phosphorylée sera utilisée, en fusion avec un domaine de liaison à l'ADN ou d'activation de la transcription, dans un test doublehybride (Fields & Song, Nature, 340, 245-246, 1989), soit avec un partenaire particulier soit avec une banque d'ADN complémentaires fusionés également avec un domaine d'activation de la transcription. La ou les interactions dépendantes de la phosphorylation sont celles qui seront positives avec la protéine normale et négatives avec la protéine mutée. Ceci ne peut être fait que si l'on connaît au préalable les sites de phosphorylation de la protéine, ce qui est le cas de nombreuses phosphoprotéines (Catalogue Biolabs 1998- 1999) On vérifie ensuite que la protéine qui interagit est bien phosphorylée. Le moyen le plus simple de contrôler la phosphorylation de la protéine consiste par exemple à disposer d'anticorps spécifiques de la forme phosphorylée de la protéine. Des anticorps spécifiques de la forme phosphorylée de nombreuses phosphoprotéines sont disponibles, y compris commercialement (Catalogue Biolabs 1998-1999). Dans le cas contraire de tels anticorps peuvent être obtenu par le procédé de Kohler et Milsteim (Nature, 256, 490-497, 1975) ou de Harlow E. et Lane D. (supra).; par immunisation avec des peptides synthétiques représentatifs des sites de phosphorylation de la protéine. Ces anticorps seront utilisés sur un lysat de levure exprimant l'hybride de fusion avec la protéine d'intérêt, dans un test classique de réaction antigène-anticorps, soit par western blot, soit par Elisa (Harlow & Lane supra). La spécificité des anticorps pour la reconnaissance exclusive de la forme phosphorylée sera vérifiée par absence de réactivité avec la protéine mutée sur les sites de phosphorylation. Le criblage d'inhibiteurs de la phosphorylation sera effectué par test double- hybride avec la ou les interactions phosphorylation-dépendantes. Les inhibiteurs potentiels seront ajoutés au milieu de culture des levures sélectif pour l'interaction, par exemple le milieu sans histidine (Fields & Song US 5,667,973). Ces inhibiteurs devront inhiber la croissance des levures sur milieu sélectif pour l'interaction, mais pas sur milieu non sélectif. De même ces inhibiteurs ne devront pas inhiber la croissance de levures cotransformées avec deux protéines témoins d'interaction 6 2787119 comme Ras et Raf par exemple (Margottin et al., Mol. Cell, 1, 565-574, 1998). Les tests de criblage d'inhibiteurs d'interaction pourront être effectués par double-hybride classique (Fields & Song, 1989, supra; Bartel P & Fields S. Meth. Enzymol. 1995, 254, 241-263;), par conjugaison (Fromont-Racine et al. 1997, nature Genetics, 16, 277- 282), par réverse hybride (Vidal et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10315- 10320), par double-hybride membranaire (Broder et al. 1998, Curr. Biol., 8, 1121- 1124), par triple-hybride (Tirode et al. 1997, J. Biol. Chem., 272, 22995-22999) et éventuellement, si les phosphorylations peuvent prendre place dans les bactéries, par double-hybride bactérien (Karimova et al. 1998,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5752-5756). On pourra également utiliser le test du halo (Valtz & Peter, 1997, Meth. Enzymol. 283, 350-365). Toutes ces techniques pourront donner lieu à des tests automatisées, sur plaques de microtitration. Une fois les inhibiteurs sélectionnés après le criblage double-hybride décrit ci-dessus, un test de réactivité des anticorps antiphosphoprotéine avec un lysat de levure exprimant la protéine d'intérêt en présence de l'inhibiteur est effectué. Si le test de réactivité des anticorps (western blot ou Elisa, par exemple) est négatif, il permettra de conclure que l'inhibiteur agit bien comme un inhibiteur de la phosphorylation. Si le test de réactivité des anticorps est positif, il permettra de conclure que l'inhibiteur agit au niveau de l'interaction, mais pas au niveau de la phosphorylation. En utilisant le mutant des sites de phosphorylation de la protéine d'intérêt qui n'est pas phosphorylé et n'est donc pas capable d'interagir avec le partenaire dont l'interaction est phosphorylation dépendante, nous pouvons faire un crible double- hybride pour des modulateurs positifs qui pourraient favoriser l'interaction entre mutant et partenaire en mimant la conformation du site de phosphorylation. Ainsi, un autre objet de la présente invention concerne un procédé de criblage en levure de modulateurs positifs d'interaction entre une protéine mutée sur ses sites de phosphorylation et le partenaire de ladite protéine normale phosphorylée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: a) cotransformer la levure Saccharomyces cerevisiae par un vecteur double- hybride contenant l'ADNc de ladite protéine mutée en fusion soit avec un domaine de 7 2787119 liaison de l'ADN, soit avec un domaine d'activation et un vecteur doublehybride contenant l'ADNc d'un partenaire spécifique de ladite protéine normale, faire exprimer par la levure ladite protéine mutée et ledit partenaire spécifique dans un milieu de culture selon les conditions du double-hybride, vérifier par la méthode double-hybride qu'il y a interaction entre ladite protéine normale et ledit partenaire, et qu'il n'y a pas d'interaction avec ladite protéine mutée, et vérifier par un test classique de réaction antigène-anticorps que ladite protéine normale est reconnue par des anticorps anti-protéine phosphorylée, mais que ladite protéine mutée n'est pas reconnue, b) ajouter dans le milieu de croissance sélectif des levures cotransformées soumises au test double-hybride des agents modulateurs positifs potentiels de l'interaction entre ladite protéine mutée et ledit partenaire de ladite protéine normale et sélectionner tous les agents capables d'activer l'interaction entre ladite protéine mutée et le partenaire de ladite protéine normale, c) vérifier par séquençage d'ADN qu'aucune mutation de réversion au type sauvage n'a été introduite dans ladite protéine mutée mise en présence du modulateur, et d) vérifier par un test classique de réaction antigène-anticorps si le modulateur active la reconnaissance de ladite protéine mutée par les anticorps anti- protéine phosphorylée (test positif) ou ne l'active pas (test négatif). On entend par partenaire de la protéine normale phosphorylée, tout partenaire protéique capable d'interagir avec la protéine normale, donc non mutée, lorsque celle-ci a été phosphorylée. La technique de séquençage utilisée dans la présente demande est largement décrite par Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, chapter 3) La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des figures 1 et 2 sur lesquelles - la figure 1 est la photographie en boîte de Petri montrant la croissance de cellules de Saccharomyces cerevisiae cotransformées par les plasmides contenant [3TrCP + hKcia; PTrCP + IK3ct S32-36A; [TrCP + Raf; Ras + IKcet; PTrCP + Vpuc et Ras + Raf sur un milieu en présence d'histidine (His+), sur un -1 T - 8 2787119 milieu en absence d'histidine (His-) et sur un milieu en présence du substrat de la P-galactosidase X-Gal (P-Gal), - la figure 2 est la photographie d'un western blot d'un lysat de la souche Saccharomyces cerevisiae L40 exprimant le domaine d'activation de la protéine Gal4 fusionné respectivement aux protéines Raf, IKBa et IKBat S32-36A en présence d'anticorps anti-IKBac et anti-IKBactS32P. Exemple 1: Mise en évidence de l'interaction entre la protéine IK{ et la protéine h-OTrCP On a vérifié cette interaction en effectuant un test double-hybride entre ces deux protéines. Pour ce faire, on a fusionné l'ADNc des protéines décrites ci-dessous, en fusion soit au domaine d'activation de la transcription de Gal4 (GaI4D), soit au domaine de liaison de l'ADN de LexA (LexABD): - {3TrCP = protéine humaine [TrCP de la présente invention, - IKBac = protéine IKB forme a, IKBct S32-36A = mutant de IKBct au niveau des sérines S32 et S36 de sorte qu'il n'y a pas phosphorylation, - Ras = protéine contrôle, - Raf = protéine contrôle, - Vpuc = protéine Vpu cytoplasmique telle que décrite dans Margottin et al. (1998, supra). Les milieux utilisés sont un milieu avec histidine (His+), un milieu sélectif sans histidine (His-) et un milieu permettant la mise en évidence de l'expression de P-galactosidase (13-Gal). Le résultat de ce test est donné sur la figure 1. Sur cette figure, il est montré que: - les deux protéines h-PTrCP et IKB sont capables d'interagir, - l'interaction h-13TrCP/IKB est spécifique des deux hybrides puisque, lorsque l'un des deux hybrides est remplacé par un hybride avec une autre protéine 9 2787119 telle que Gal4AD-Raf ou LexABD-Ras, il n'y a plus, alors que ces deux hybrides contrôles sont capables d'interagir, et - cette interaction est perdue quand les résidus sérines S32 et S36 de la protéine IKB sont mutés en résidus non phosphorylables comme Alanine. Il est à noter qu'on observe également une interaction, déjà décrite par Margottin et al. (supra), entre la protéine Vpu du virus HIV-1 et la protéine h-P3TrCP. Exemple 2: Utilisation des anticorps anti- IKB phosphorylée pour le criblage d'inhibiteurs de phosphorvlation On a réalisé un lysat de la souche Saccharomyces cerevisiae L40O exprimant le domaine d'activation de la protéine Gal4 fusionné respectivement aux protéines Raf, IKBct, IKBact muté sur les résidus sérine S32 et S36 remplacés tous deux par un résidu alanine. On a transféré les lysats sur membrane de nitrocellulose et on les a mis à réagir soit avec des anticorps contre la protéine IKB reconnaissant toutes les formes de la protéine (anticorps monoclonal 10B, Jaffray et al. Mol. Cell. Biol. , 15, 2166- 2172, 1995) (ct-IKBct), soit contre des anticorps spécifiques de la forme phosphorylée de la protéine (9241S, New England Biolabs) (ac-IKB S32P). Les anticorps 9241S spécifiques de la forme phosphorylée de IKBa ont reconnu en western blot (WB) la protéine normale exprimée dans la levure (panneau de droite). Ni la protéine mutée sur ses sites de phosphorylation S32S36, ni la protéine contrôle Raf n'ont été reconnues (panneau de droite). En revanche, l'anticorps 10B qui reconnaît toutes le formes de IKBct a réagi avec la protéine normale et la protéine mutée, mais pas avec la protéine contrôle Raf. Cette expérience démontre que IKBat est bien phosphorylée dans la levure sur ses sites "canoniques" de phosphorylation, malgré l'absence dans la levure de protéines kinases analogues aux IKK humaines. La combinaison des expériences illustrées dans les figures 1 et 2 démontre la faisabilité des criblages de modulateurs de phosphorylation proposés dans ce brevet. 2787119 REVENDICATIONS 1. Procédé de criblage en levure d'inhibiteurs de protéines kinases spécifiques de cellules humaines et de mammifères, caractérisé en ce qu'il consiste à: a) exprimer le ou les substrats de ces kinases en système double-hybride dans la levure Saccharomyces cerevisiae, b) cribler en système double-hybride pour des inhibiteurs desdites kinases par inhibition des interactions phosphorylation- dépendantes dudit ou desdits substrats avec son ou leur partenaire spécifique, et c) vérifier par un test classique antigène- anticorps que les inhibiteurs sélectionnés sont soit des inhibiteurs de kinase capables d'inhiber la phosphorylation du substrat (test négatif), soit des inhibiteurs exclusifs de l'interaction phosphorylation-dépendante (test positif). 2. Procédé de criblage en levure d'inhibiteurs de protéines kinases selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: a) cotransformer la levure Saccharomyces cerevisiae par un vecteur double- hybride contenant l'ADNc de ladite protéine en fusion soit avec un domaine de liaison à l'ADN, soit avec un domaine d'activation, et un vecteur double-hybride contenant l'ADNc d'un partenaire spécifique de ladite protéine en fusion soit avec un domaine de liaison à l'ADN, soit avec un domaine d'activation, faire exprimer par la levure ladite protéine et ledit partenaire spécifique dans un milieu de culture selon les conditions classiques de double-hybride, vérifier par la méthode double-hybride qu'il y a interaction entre ladite protéine et ledit partenaire spécifique et vérifier par un test classique de réaction antigène-anticorps que ladite protéine est reconnue par des anticorps anti-protéine phosphorylée, b) vérifier qu'un mutant des sites de phosphorylation de la protéine n'interagit pas en test double-hybride avec ledit partenaire et qu'il n'est pas reconnu par les anticorps anti- phosphoprotéine, c) ajouter dans le milieu de croissance sélectif des levures cotransformées soumises au test double-hybride des agents inhibiteurs potentiels de l'interaction 11 2787119 entre ladite protéine et ledit partenaire spécifique et sélectionner tous les agents capables d'inhiber l'interaction entre ladite protéine et ledit partenaire spécifique, d) vérifier par un test classique de réactions antigène-anticorps si l'inhibiteur sélectionné en c) inhibe ou non la reconnaissance de ladite protéine par les anticorps anti- protéine phosphorylée, et e) sélectionner d'une part les inhibiteurs capables d'inhiber la phosphorylation (test antigène-anticorps négatif) et d'autre part les inhibiteurs capables d'inhiber l'interaction sans inhiber la phosphorylation (test antigène- anticorps positif). 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite protéine est la protéine IKB et son partenaire spécifique est la protéine h-3TrCP. 4. Procédé de criblage en levure de modulateurs positifs entre une protéine mutée sur ses sites de phosphorylation et le partenaire de ladite protéine normale phosphorylée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: a) cotransformer la levure Saccharomyces cerevisiae par un vecteur double- hybride contenant l'ADNc de ladite protéine mutée en fusion soit avec un domaine de liaison de l'ADN, soit avec un domaine d'activation et un vecteur double-hybride contenant l'ADNc d'un partenaire spécifique de ladite protéine normale, faire exprimer par la levure ladite protéine mutée et ledit partenaire spécifique dans un milieu de culture selon les conditions du double-hybride, vérifier par la méthode double-hybride qu'il y a interaction entre ladite protéine normale et ledit partenaire, et qu'il n'y a pas d'interaction avec ladite protéine mutée, et vérifier par un test classique de réaction antigène-anticorps que ladite protéine normale est reconnue par des anticorps anti-protéine phosphorylée, mais que ladite protéine mutée n'est pas reconnue, b) ajouter dans le milieu de croissance sélectif des levures cotransformées soumises au test double-hybride des agents modulateurs positifs potentiels de l'interaction entre ladite protéine mutée et ledit partenaire de ladite protéine normale et sélectionner tous les agents capables d'activer l'interaction entre ladite protéine mutée et le partenaire de ladite protéine normale, 12 2787119 c) vérifier par séquençage d'ADN qu'aucune mutation de réversion au type sauvage n'a été introduite dans ladite protéine mutée mise en présence du modulateur, et d) vérifier par un test classique de réaction antigèneanticorps si le modulateur active la reconnaissance de ladite protéine mutée par les anticorps anti- protéine phosphorylée (test positif) ou ne l'active pas (test négatif).