FR 2790757 A1 20000915 FR 9902921 A 19990309 La présente invention concerne des oligonucléotides capables de s'hybrider avec une séquence d'acide nucléique cible, et qui sont stabilisés par une structure secondaire de manière à être résistant à la dégradation dans des milieux biologiques, principalement à la dégradation par des nucléases. L'invention concerne aussi les compositions pharmaceutiques comprenant de tels oligonucléotides et leur utilisation pour bloquer l'expression de gènes in vivo et in vitro. Les acides nucléiques anti-sens sont des séquences nucléiques capables de s'hybrider sélectivement avec des ARNs messager cellulaires-cible pour inhiber leur traduction en protéine. Ces oligonucléotides forment avec l'ARNm-cible, de manière locale, des régions double brin, par interaction de type Watson-Crick classique. Beaucoup d'états pathologiques sont la conséquence de l'expression d'un gène anormal au sein d'une cellule. De tels gènes étrangers peuvent s'intégrer dans l'ADN cellulaire, après une infection virale par exemple, et peuvent donc être exprimés par la cellule. Il en est de même pour de nombreux gènes oncogènes, qui sont capables de conférer le phénotype cancéreux à une cellule eucaryote, et une tumeur dans un organisme entier. Une des approches proposées dans l'art antérieur pour inhiber l'action de tels gènes réside dans l'utilisation d'oligonucléotides antisens (1-3). La régulation de l'expression de gène-cibles au moyen d'oligonucléotides antisens constitue en effet une approche thérapeutique en développement croissant. Cette approche repose sur la capacité des oligonucléotides à s'hybrider spécifiquement à des régions complémentaires d'un acide nucléique, et à inhiber ainsi spécifiquement l'expression de gènes déterminés. Cette inhibition peut intervenir soit au niveau traductionnel (oligonucléotide anti-sens) soit au niveau transcriptionnel (oligonucléotide anti-gène). L'application thérapeutique d'une technologie antisens est largement étudiée dans de nombreuses infections virales, incluant le virus d'immunodéficience acquise (4), le virus de l'influenza (5), le virus d'Epstein-Barr (6), les papillomavirus humains (7,8) et le virus simplex de l'herpes (9,10). Il peut s'agir par exemple d'oligonucléotides synthétiques, de petite taille, complémentaires d'ARNm cellulaires, et qui sont introduits dans les cellules-cible. De tels oligonucléotides ont par exemple été décrit dans la demande de brevet européen No. 92 574. Il peut également s'agir de gènes anti-sens dont l'expression dans la cellule cible génère des ARN complémentaires d'ARNm cellulaires. De tels gènes ont par exemple été décrits dans la demande de brevet européen No. 140 308. Cependant l'utilisation in vivo d'acides nucléiques antisens se heurte à un certain nombre de difficultés qui limitent jusqu'à aujourd'hui leur exploitation thérapeutique. En effet, les acides nucléiques présentent une grande sensibilité à la dégradation par des enzymes de l'organisme, telles que les nucléases (11,12), ce qui implique l'emploi de doses importantes. De plus, ils ont une faible pénétration dans certains types cellulaires et une distribution intracellulaire souvent inadéquate, ce qui les rend sans effet thérapeutique. Enfin, il est important de pouvoir disposer de séquences suffisamment sélectives et stables pour obtenir un effet spécifique sans altérer d'autres fonctions cellulaires. Depuis les premières tentatives par Stephenson et Zamecnik (13) pour inhiber le virus du sarcome de Rous en utilisant des oligonucléotides phosphodiesters, de nombreux efforts ont été fait pour optimiser l'efficacité de ces oligonucléotides, notamment sur la pénétration cellulaire (14-16), la fixation sur leur cible (17), la résistance aux nucléases (18-20).' Le problème de la résistance des oligonucléotides aux nucléases demeure un problème limitant les possibilités de développement de cette stratégie thérapeutique. Pour tenter de résoudre ce problème, il a été proposé dans l'art antérieur de modifier chimiquement le squelette phosphodiester des acides nucléiques pour donner lieu à de nouvelles classes d'oligonucléotides artificiels (21-23). Parmi ceux-ci, on peut citer les oligonucléotides phosphonates, phophoramidates et phosphorothioates qui sont décrit par exemple dans la demande de brevet internationale PCT No. W094/08003, ou les oligonucléotides couplés à différents agents tels que du cholestérol, un peptide, un polymère cationique, etc.... Toutefois, si certains de ces oligonucléotides modifiés présentent une bonne résistance aux nucléases, ces modifications présentent l'inconvénient d'être accompagnées par la perte d'autres propriétés importantes pour l'activité antisens, tel que leur affinité pour les cibles d'ARN, leur capacité à moduler la dégradation des ARNs par les Rnases, et leur pouvoir de pénétration et de distribution dans les différents compartiments cellulaires reste très faible (1,22,24). De plus, leur activité biologique n'est pas toujours augmentée et ils présentent certains effets secondaires liés à la présence de motifs non-naturels dans leur structure. En effet, les oligonucléotides ainsi modifiés présentent des caractéristiques indésirables comme des interactions non-spécifiques avec des protéines cellulaires, et une grande cytotoxicité (25-29). Une autre méthode permettant d'accroître la résistance des oligonucléotides aux nucléases, mais utilisant des phosphodiesters naturels, consiste à greffer sur l'extrémité 3' de la séquence à protéger un conjugué de dodecanol (demandes de brevet européen No. EP 117 777 et No. EP 169 787). Pour palier les inconvénient rapportés précédemment, il a aussi été proposé dans l'art antérieur, par exemple dans la demande de brevet internationale PCT No. WO 94/12633, d'adjoindre à l'une et/ou l'autre des extrémités de la séquence antisens à protéger des séquences nucléotidiques dont la structure secondaire se présente sous la forme de boucles ou d'épingles à cheveux, capable d'empêcher les nucléases de venir dégrader la séquence antisens (30-35). Or, cette technique n'est pas satisfaisante car la présence de nucléotides supplémentaires des séquences en épingles à cheveux gênent l'hybridation de la séquence antisens avec les acides nucléiques cibles. La présente invention vise précisément à offrir de nouveaux oligonucléotides capables de modifier ou d'inhiber l'expression de gènes in vivo ou in vitro et résistant aux digestions nucléasiques sans présenter les inconvénients décrits ci-dessus. Ce but est atteint grâce à un oligonucléotide contenant au moins une structure secondaire et capable de modifier ou d'inhiber l'expression d'un gène cible in vivo ou in vitro, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence antisens et éventuellement une séquence nucléotidique supplémentaire à l'une et/ou l'autre des extrémités de la séquence antisens, choisi(s) de façon à ce que la ou les structures secondaires se défasse(nt) lors de la fixation de l'oligonucléotide sur l'acide nucléique cible. Les oligonucléotides selon la présente invention sont remarquables en ce qu'ils sont constitués d'une séquence qui lui confère une structure capable de se défaire lors de la fixation de l'oligonucléotide à sa cible. Les oligonucléotides selon l'invention sont donc particulièrement avantageux par rapport aux oligonucléotides de l'art antérieur muni d'une structure secondaire car ils permettent pour une même longueur d'oligonucléotide de disposer d'une plus grande longueur fixée sur la cible ce qui assure une meilleur stabilité de l'hybride. En outre, à la différence de l'art antérieur, la structure secondaire des oligonucléotides selon l'invention se défait lors de l'hybridation et donc ne gène pas la fixation de la séquence antisens sur sa cible. On entend au sens de la présente invention par structure secondaire, une structure en épingle à cheveux, en boucle, ou encore en escargot, dans lesquels l'oligonucléotide, simple ou double brin est ouvert, c'est à dire que ces extrémités 3' et 5' sont libres. L'invention concerne plus particulièrement une structure secondaire en épingle à cheveux ou "hairpin loop" en anglais. Les oligonucléotides de l'invention admettent plusieurs modes de réalisation, selon que la structure secondaire est formée : - essentiellement de tout ou partie de la séquence antisens, essentiellement de tout ou partie des séquences nucléotidiques supplémentaires situés de part et d'autre de la séquence antisens, - de tout ou partie de la séquence antisens et de tout ou partie d'une ou des deux séquences nucléotidiques supplémentaires situés de part et d'autre de ladite séquence antisens. Selon une première forme de réalisation d'un oligonucléotide selon l'invention, la structure secondaire est formée principalement ou exclusivement de paires de nucléotides appartenant à la séquence antisens. Un exemple d'un tel oligonucléotide est donné à la figure 1 en annexe. Cette forme de mise en oeuvre concerne donc des acides nucléiques cibles possédant des séquences pseudo palindromiques que l'on estime à environ 2% du génome humain. Selon une seconde forme de réalisation d'un oligonucléotide selon l'invention, la structure secondaire est formée essentiellement ou exclusivement de paires de nucléotides appartenant aux séquences nucléotidiques supplémentaires située aux extrémités de la séquence antisens. Dans cette forme de mise en #uvre les séquences nucléotidiques placées de part et d'autre de la séquence antisens sont donc substantiellement complémentaires. Un exemple d'un tel oligonucléotide est donné à la figure 2 en annexe. Dans ce mode de réalisation, il est également possible que la structure secondaire comprennent aussi une ou plusieurs paires de nucléotides appartenant uniquement à la séquence antisens comme représenté à la figure 3. Selon une troisième forme de réalisation d'un oligonucléotide selon l'invention, la structure secondaire est formée de paires de nucléotide appartenant à la séquence antisens et à une séquence nucléotidique supplémentaire placée à l'une des extrémités de ladite séquence antisens. Dans cette forme de mise en #uvre la séquence nucléotidique placée à l'une des extrémités de la séquence antisens est substantiellement complémentaire de ladite séquence antisens. Bien entendu, dans ce mode de réalisation, l'oligonucléotide peut comprendre deux structures secondaires, une à chaque extrémité de la séquence antisens. Un exemple d'un tel oligonucléotide est donné aux figures 4,5 et 6 en annexe. Dans ce mode de réalisation, il est également possible que la structure secondaire comprenne une ou plusieurs paires de nucléotides appartenant uniquement à la séquence antisens. Dans ces trois modes de réalisation des oligonucléotides de l'invention, la ou les deux structures secondaires se défont lors de la fixation de l'oligonucléotide sur sa cible. Dans les cas où l'oligonucléotide de l'invention comprend une ou deux séquences nucléotidiques supplémentaires, celles-ci, lors de la fixation de la séquence antisens sur la cible resteront sous une forme simple brin et ne gêneront pas la stabilité de l'hybride ou la fixation de la RNase H sur cet hybride. Ceci est très important car c'est la Rnase H qui est la cause finale de l'effet antisens. Or, il s'agit précisément d'un des inconvénients des oligonucléotides de l'art antérieur muni d'un structure secondaire qui ne se défait pas lors de la fixation de la séquence antisens sur sa cible. La structure secondaire présente dans les oligonucléotides de l'invention comprend de trois à vingt paires de nucléotides successives, mais peut aussi comprendre quelques mésappariements dès lors qu'ils ne modifient pas substantiellement la stabilité de la structure secondaire. De préférence la structure secondaire présente dans les oligonucléotides de l'invention comprend de cinq à dix paires de nucléotides. Les oligonucléotides de l'invention sont de préférence constitués d'ADN. En effet, un hybride ADN/ADN étant moins stable q'un hybride ADN/ARN, à proximité de l'acide nucléique cible la structure secondaire des oligonucléotidiques de l'invention se défait au profit de la formation de l'hybride formé de la séquence antisens et de la cible sans reformation ultérieure de la structure secondaire. Les oligonucléotides de l'invention résistent à la dégradation dans les milieux biologiques sans nécessiter l'utilisation de nucléotides modifiés chimiquement ou de couplage à des groupement chimiques ou des composés divers décrits dans l'art antérieur. Ils sont donc avantageusement constitués de nucléotides naturels qui présentent l'avantage d'être moins coûteux que les nucléotides chimiquement modifiés ; cesderniers présentent en outre l'inconvénient de générer des produits de dégradation toxiques pour les cellules. Toutefois, par exemple pour des utilisation in vitro ou bien pour cumuler les effets de protections contre la dégradation due d'une part à la structure secondaire et d'autre part aux modifications chimiques, les oligonucléotides de l'invention peuvent être constitués ou contenir des bases chimiquement modifiées ou encore être couplés à des agents divers connus de l'homme du métier. La séquence antisens composant les oligonucléotides de l'invention comprend de l'ordre de 5 à 30 nucléotides et de préférence de l'ordre 8 à 20 nucléotides. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant un ou plusieurs oligonucléotides décrits précédemment identiques ou différents associés dans la dite composition à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les oligonucléotides de l'invention peuvent être libres, encapsulés, couplés, conjugués à des substances diverses comme des anticorps, des protéines, des liposomes, des microsphères, des microorganismes ou des cellules adaptés aux modes d'administration utilisés, ou à tout autre type de vecteur comme des nanoparticules, des dendrimères, des lipides cationiques ou des peptides. Les oligonucléotides de l'invention sont tout particulièrement destinés à s'hybrider avec une séquence complémentaire d'ARNm, et peuvent donc être utilisés comme médicament pour le traitement d'un organisme humain, animal ou végétal, consitant à bloquer l'expression d'un ou plusieurs gènes impliqés dans la pathologie visée. Mais les oligonucléotides de l'invention peuvent aussi être utilisés dans le domaine du diagnostic dès lors que se pose le problème de résistance des oligonucléotides dans un milieu biologique, comme par exemple le screening génétique de matériel biologique avec des sondes marquées. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent et qui se réfèrent aux dessins en annexes dans les lesquels : Les figures 1 à 6 représentent schématiquement des exemples de réalisation des oligonucléotides de l'invention. Dans ces figures les traits épais symbolisent la séquence antisens, les traits fins symbolisent la ou les séquences supplémentaires si elle(s) est(sont) présente (s), et les barres horizontales symbolisent les liaisons de la paire de bases. La figure 7 représente les oligonucléotides utilisés dans la partie expérimentale ci-après. Les séquences cibles d'ADN et d'ARN de 21 mer sont soulignées. Les séquences des oligodéoxyribonucléotides antisens complémentaires des cibles D et R sont en caractères gras. La figure 8 représente l'analyse en électrophorèse de la formation de duplexes en PAGE natif à 15% à 37 C. En A : fixation de la cible d'ARN marqué au 32P (ligne 1) aux oligodéoxynucléotides 21L (ligne 2), 21PS (ligne 3), H6 (ligne 4), H8 (ligne 5), HO (ligne 6), Dh6 (ligne 7), L8 (ligne 8), L10 (ligne 9), SL (ligne 10), 55L (ligne 11). En B : : fixation de la cible d'ADN marqué au 32P (ligne 1) aux oligodéoxynucléotides 21L (ligne 2), 21PS (ligne 3), H6 (ligne 4), H8 (ligne 5), HO (ligne 6), Dh6 (ligne 7), L8 (ligne 8), L10 (ligne 9), SL (ligne 10), 55L (ligne 11). - La figure 9 représente le clivage de la cible d'ARN par la Rnase H en présence des oligonucléotides antisens 21L (ligne 2), 21PS (ligne 3), H6 (ligne 4), H8 (ligne 5), HO (ligne 6), Dh6 (ligne 7), L8 (ligne 8), L10 (ligne 9), SL (ligne 10), 55L (ligne 11). ARN R marqué au 32P, seul (ligne 1) et en présence de Rnase H sans ODNS (ligne 12). Les flèches indiquent les sites majeurs de clivages. - La figure 10 représente la dégradation des oligonucléotides antisens dans le DMEM supplémenté avec 10% de FBS inactivé par la chaleur, en l'absence (a, b) et en présence (c, d) de SuperFectTM. - La figure 11 représente la dégradation des oligonucléotides antisens dans les lysats cellulaires : (a, b) lysat HeLa, (c, d) lysat NIH 3T3. - La figure 12 représente la dégradation des oligonucléotides antisens complexés avec SuperFectTM à l'intérieur des cellules : (a, b) HeLa, (c, d) NIH 3T3. I - Matériels et méthodes. 1) Olicfonucléotides. Les oligonucléotides ont été acquis auprès de la Société Eurogentec (Seraing, Belgique), puis désalés sur des colonnes Sephadex G25 et quantifiés par absorbance à 260 nm. 2) Protection de l'extrémité 5' phosphate des oligonucléotides antisens. Le marquage à l'extrémité 5' des oligonucléotides a été réalisé en utilisant de l'ATP(32Py) (Amersham) et la T4 polynucléotide kinase (Promega). Les oligonucléotides marqués ont été purifiés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 20%, puis dissous dans 100 fil de tampon de Nméthylmorphine 1 M (pH 7,5), MgCl2 20 mM, contenant 50 % d'éthanol et la solution a été supplémentée par 10 mg d 1-éthyl-3(3'-diméthylaminopropyl)carbodiimide. La réaction a été réalisée pendant 16 h à 4 C et les oligonucléotides ont été précipités deux fois avec 1 ml d'une solution de LiCl04 à 2% dans de l'acétone et lavés avec de l'acétone. Ces oligonucléotides ayant le phosphate terminal protégé par un résidu éthyle contre l'hydrolyse par une phosphatase ont été ensuite mélangés avec des oligodéoxynucléotides (ODNs) non marqués et utilisés pour étudier leur résistance à une digestion enzymatique. 3) Expériences de dénaturation thermique. Les courbes d'aborbance/température ont été enregistrées à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre Uvikon 933 équipé d'un thermoprogrammateur. Les solutions d'ODNs ont été préparées dans 600 (il d'un tampon phosphate de sodium 10 mM (pH 7,5) avec NaCl 50 mM. La concentration de chaque brin d'oligonucléotide est de 10-6 M. L'absorbance a été mesurée pendant que la température était augmentée de 20 C à 80 C à raison de 0,5 C par minute. Les températures de fusion (Tm) ont été déterminées par ajustement informatique à partir de la dérivée première de l'absorbance suivant 1/T. La précision des Tm a été estimée à 0,5 C à partir des répétitions des expériences. Les valeurs d'énergie libre pour la dissociation du duplexe ont été dérivées par ajustement informatique des courbes de fusion en utilisant le model à deux-états (36). 4) Gel d'électrophorèse natif. Les matrice ARN et ADN (R et D) ont été marquées en utilisant l'ATP(32-P-[gamma]) et la polynucléotide kinase de T4. Les oligonucléotides (10 pmoles pour chaque brin) ont été dissous dans 10 l de tampon Trisacétate (pH 7,5), CH3COONa 150 mM, MgCL2 2 mM, et incubés à 37 C pendant 1 heure puis supplémentés avec 1 l d'une solution à 70% de glycérol contenant du cyanol xylène et du bleu de bromophénol. Les éléctrophorèses ont été réalisés dans un gel d'acrylamide à 15% non dénaturant (19: 1 acrylamide/bis-acrylamide) dans le même tampon Tris-acétate à 37 C pendant 24 heures (9 V/cm). 5) Clivage par la Rnase-H. Afin d'étudier le déclenchement de l'activité RNase H par les ODNs, 10 pmoles de ceux-ci ont été mélangés avec 1 pmole de la matrice d'ARN (R) marqué en 5'au (32P) dans 10 l de tampon Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM ; KC1 100 mM, DTT 0,1 mM en présence de 0,5 l de RNasin (Gibco BRL) et incubés pendant 30 minutes à 37 C. Puis 0,5 U de RnaseH d'E. coli (Promega, Madison, WI) a été ajouté et les mélanges ont été incubés à 37 C pendant 15 minutes. Les échantillons ont été précipités avec de l'acétone contenant 2 % de LiClO.,, séchés, dissous dans 4 fil de formamide:eau (4: 1), 0,01 % de bleu de bromophénol, et 0,01 % de cyanol de xylène et analysés par éléctrophorèse dans un gel de polyacrylamide à 20% dénaturant suivie d'une autoradiography. 6) Cellules et milieux. Des lignées cellulaires NIH 3T3 et HeLa ont été cultivées dans un milieu DMEM supplémenté avec respectivement 5% et 10% de sérum bovin f#tal inactivé par la chaleur (FBS) (Gibco, BRL), de la streptomycine (100 mg/ l) et de lapenicilline (100 U/ml). Toutes les cellules ont été incubées à 37 C dans 5% CO2. 7) Préparation des lysats de cellules. Les cellules NIH 3T3 et HeLa ont été lavées trois fois avec du PBS puis déposées dans 1 ml de tampon Sodium-Phosphate 10 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, 1% NP-40,02 mg/ml phénylméthylsulphonylfluoride (PMSF) et conservées à -20 C pendant 30 C. Après décongélation, les cellules ont été centrifugées à 14000 g pendant 15 minutes à 4 C. Le surnageant a été utilisé pour étudier la dégradation enzymatique des oligonucléotides. La concentration en protéine dans chaque lysat a été quantifiée en utilisant la BSA comme standard (37) . 8) Étude de la dégradation de l'oligonucléotide dans un milieu biologique. La détermination du taux de dégradation de l'oligonucléotide a été effectuée dans du DMEM contenant 10% de FBS inactivé par la chaleur (56 C pendant 30 minutes) et dans les lysats de cellules. Les lysats ont été dilués dans un tampon sodium-phosphate 10 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM afin de disposer de la même concentration totale de protéine de 1,22 mg/ml. Pour éviter le clivage enzymatique du phosphate marqué au 32P, les oligonucléotides avec le phosphate terminal protégé préparés comme décrit précédemment ont été utilisés. Les ODNs marqués au 32P à une concentration de 10 M ont été incubés dans 120 l du milieu correspondant à 37 C. A différents temps, des aliquots de 15 l ont été prélevés, supplémentés par 15 fil d'EDTA 50 mM et congélés à -20 C. Les échantillons ont été extraits deux fois avec un mélange phénol/chloroforme/iso-amyl alccol (25/24/1). Les oligonucléotides ont été précipités à partir des fractions aqueuses par 10 volumes d'acétone contenant 2% de LiCl04, séchés, et dissous dans 5 (il d'un mélange formamide/eau (4/1), 0,01% de bleue de bromophénol, et 0,01% de cyanol xylène. Les échantillons ont été analysés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide 20% dénaturant. Les gels obtenus ont été scannés en utilisant un phosphoimager (Storm 840, Molecular Dynamics). La dégradation des oligonucléotides a été quantifiée comme le rapport du signal efficace des bandes correspondant aux oligonucléotides intacts et dégradés. La précision des pourcentage de dégradation a été estimée à 0,5% sur la base des répétitions des expériences. 9) Étude de la dégradation de l'oligonucléotide dans la cellule. Un jour avant, les cellules ont été ensemencées sur une plaque 6 puits pour obtenir 60-80% de confluence (4x105 cellules). 5 g de chaque ODN ont été mélangés avec 6 l de SuperFectTM (Quiagen, Canada) dans un volume final de 150 l de DMEM (sans FBS et antibiotique) pendant 10 minutes à la température de la pièce. Les cellules ont été lavées avec du PBS, les mélanges de SuperFectTM-ODN ont été dilués avec 850 l de 10 % (pour les cellules HeLa) ou 5% (pour les cellules NIH 3T3) FBS DMEM (avec des antibiotiques) et ajoutés aux cellules. Le surnageant a été extrait après 16 ou 48 heures, et les cellules ont été récoltées par un traitement à la trypsine. Ensuite, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS, suspendues dans 500 l de tampon sodium-phosphate 10 mM (pH 7,5), NaCll50 mM, EDTA 20 mM, 1% NP-40 et laissées 30 minutes à -20 C. Après décongélation, les cellules ont été chauffées 30 minutes à 90 C afin de détruire complètement tous les compartiments cellulaires et extraites deux fois avec un mélange phénol/chloroforme/ alcool iso-amyl (25/24/1). Les ODNs ont été précipités à partir des fractions aqueuses contenant 0,5 M d'acétate de sodium en ajoutant de l'éthanol 5 fois en excès, dissous dans un mélange formamide/eau (4/1), 0,01% de bleu de bromophénol et 0,01% de cyanol de xylène et analysés par électrophorèse sur gel dénaturant 20%. Les gels obtenus ont été scannés en utilisant un phosphorimager (Strom 840, Molecular Dynamics) La dégradation des oligonucléotides a été quantifiée comme un rapport du signal efficace des bandes correspondant aux oligonucléotides intactes et dégradés. II - Résultats. 1) Structures des oligonucléotides structurés. Comme montré à la figure 7, tous les oligodéoribonucléotides étudiés comprennent la séquence de 21 bases 5'-TGAACACGCCATGTCGATTCT-3' soulignée ou indiquée en gras dans la figure 7, complémentaire de la région d'initiation de la traduction de l'ARN env du rétrovirus de la leucémie murine de Friend. Les oligonucléotides 21L et 55L ont une structure linéaire comme l'oligonucléotide 21PS. Toutefois, ce dernier contient deux groupes phosphothioates à chaque extrémité pour le protéger de la dégradation enzymatique. Les oligonucléotides H6, H8 et H10 présentent un nombre différent de paires de bases (pb) dans la séquence supplémentaire de la structure secondaire en épingle à cheveux localisée à l'extrémité 3'. DH6 peut former une structure secondaire en épingle à cheveux avec des queues de 6pb aux extrémités 5' et 3'. L8 et L10 peuvent former des structures secondaires en boucle avec 13 nucléotides situés dans la boucle et dans les queues avec respectivement 8 et 10 pb. 2) Étude des propriétés de liaison des oliqonucléotides. Le tableau 1 ci-dessous rapporte la température de fusion (Tm) et le #G037 déterminés à la fois pour les oligonucléotides (ONs) seuls et pour les complexes avec les cible ADN (D) ou ARN (R), dans 10 mM phosphate, 50 mM NaCl, pH = 7,5. Tableau 1 ONs + cible Tm( C)(a) -#H (b) -#S(e.u)(c) -#G037 (kcalmol1) (kcal mol-1) 21L + D 60 101 267 18,2 21L + R 57 105 286 16,3 21PS + D 60 82 215 15,4 21PS + R 57 86 232 14,1 H6 52 45 139 1,9 H6 + D 58 92 249 14,8 H6 + R 56 82 222 13,2 H8 66 62 190 3,1 H8 + D 60 60 151 13,2 H8 + R 56 52 130 11,7 H10 75 44 128 4,3 H10 + D 43, 60, 73 43 102 11,4 H10 + R 40,57, 73 35 78 10,8 Dh6 52 35 104 2,8 Dh6 + R 57 90 245 14,1 Dh6 + R 55 80 218 12,4 L8 47 46 142 2,0 L8 + D 60 96 260 15,4 L8 + R 57 101 280 14,2 L10 53 68 208 3,5 L10 + D 57 94 255 15,0 L10 + R 55 96 265 13,9 AH, AS et AG sont les moyennes de plusieurs valeurs obtenues de courbes de fusion indépendantes et sont arrondis. (a) : l'erreur sur les Tm est de 0,5 C. (b) : l'erreur sur les AH est de 5 kcalmol-1. (c) : l'erreur sur les AS est de 10 e.u. Les domaines double brin des ODNs possédant une structure secondaire, aussi désignés "SODNs) ont été trouvés stables dans des conditions sensiblement physiologiques. La stabilité thermique des duplexes internes dans les ODNs H6, H8, H10 et L8 et L10 dépend du nombre de paires de base dans leur région de queue. Toutefois, comme montré dans le tableau 1, tous les SODNs sont capables d'interagir avec à la fois les cibles d'ADN et d'ARN pour former des duplexes intermoléculaires ayant des paramètres thermodynamiques différents des duplexes intramoléculaires. Le Tm trouvé pour ces duplexes bimoléculaires diffère significativement du Tm des SODNs et correspond approximativement au Tm détecté pour les duplexes formés par l'ODN linéaire 21 L avec les deux cibles. La seule exception est l'oligonucléotide H10 qui présente une épingle à cheveux très stable (Tm = 75 C). En présence de cibles D ou R, la courbe de fusion présente trois périodes : - la première correspond à la fusion d'un duplexe intermoléculaire partiel formé entre le fragment simple brin de 11 mers de cet ODN et la cible (43 C avec la cible d'ADN et 40 C avec la cible d'ARN), la seconde correspond à la fusion du duplexe intermoléculaire complet (60 C avec la cible d'ADN et 57 C avec la cible d'ARN), - la troisième correspond à la fusion de son propre domaine en double hélice (73 C). La fixation des SODNs avec les cibles d'ADN et d'ARN a aussi été étudiée par un test de mobilité sur gel. Les ODNs ont été incubés avec des cibles D et R marquées au (32P) à 37 C et la mobilité des complexes formés a été déterminée par électrophorèse dans un gel de polyacrylamide non dénaturant à 15%. La figure 8 montre que la mobilité électrophorétique des deux cibles change en présence de tous les SODNs du fait de leur implication dans la formation des complexes correspondants. La capacité des SODNs à s'hybrider au brin d'ARN complémentaire et à déclencher la coupure par la Rnase H a aussi été étudiée. La figure 9 montre le résultat de l'incubation de la cible d'ARN (0,1 M) et de différents ODNs (1 M) avec 0,5 unité de Rnase H pendant 15 minutes à 37 C. La coupure de l'ARN (R) par la RNase H en présence de l'oligonucléotide linéaire 21L et de tous les SODNs intervient avec la même efficacité et aux mêmes sites. Les sites majeurs de coupure sont indiqués par des flèches sur la figure 9. En l'absence d'ODNs complémentaires aucune coupure de l'ARN n'est observée. Tous ces résultats montrent que la structure double brin interne des ODNs n'empêche pas leur interaction avec leur cibles d'ADN ou d'ARN. Les duplexes internes semblent se dissocier lorsque les complexes bimoléculaires entre les SODNs et leurs cibles sont formés. Évidemment, comme montré dans le tableau 1, les duplexes bimoléculaires sont thermodynamiquement préférés. 3) Stabilité des oligonucléotides antisens vis-à-vis de la dégradation nucléolytique. La capacité des ODNs avec une structure secondaire à résister à l'hydrolyse enzymatique a été étudié dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS inactivé par la chaleur, généralement utilisé pour la croissance des cellules, ainsi que dans les lysats cellulaires de deux types ce lignées cellulaires (NIH 3T3 et HeLa) Afin d'éviter le clivage du phosphate marqué au (32P), des oligonucléotides avec un phosphate protégé en 5'par un résidu éthyl ont été utilisés pour cette étude. La figure 10 (a) et (b) se rapportant à l'analyse de la dégradation de l'ODN dans le milieu de culture contenant du FBS démontre que la structure secondaire, en épingle à cheveux, en boucle ou en escargot augmente significativement la résistance aux nucléases des SODNs. La résistance des ODNs avec l'épingle à cheveux et la boucle à la dégradation dépend du type de duplexes internes de leur stabilité thermique. Par exemple, la demi-vie de l'épingle à cheveux la plus thermostable H10 est supérieure à celle des épingles à cheveux H6 et H8. En même temps, l'ODN L10 avec une boucle est aussi résistant à la dégradation que l'ODN H8 avec une épingle à cheveux alors que sa stabilité thermique est inférieure (53 C pour L10 et 60 C pour H8). Tous les oligonucléotides linéaires 21L, 55L et 21PS sont rapidement dégradés. Ces résultats confirment les données rapportées précédemment sur la demi-vie très courte des oligonucléotides phophorothoates et phosphodiesters linéaires dans le sérum (10, 11). Afin d'augmenter la pénétration de l'oligonucléotide dans les cellules plusieurs réactifs de transfection peuvent être utilisés (38-42). L'influence de l'un d'entre-eux, une molécule dendrimérique dénommée SuperFectTM,sur la stabilité de l'ODN dans le DMEM supplémenté avec 10% de FBS a été étudiée. Comme montré à la figure 10 (c) et (d), les complexes formés par les ODNs avec SuperFectTM présentent une plus forte résistance à la dégradation nucléolytique que les ODNs seuls. L'augmentation de la résistance est la plus significative avec les ODNs linaires 55L et 21PS. Par exemple, la demi-vie de l'ODN phosphorothioate 21PS avec et sans SuperFectTM est respectivement d'environ 12 heures à 30 minutes. La même augmentation de la stabilité a été observée avec le 55L comme montré à la figure 10 (a) et (c). Ceci est en accord avec les données connues de la littérature montrant que la formation de complexes de composés polyamines avec les ODNs augmente leur stabilité vis-à-vis de nucléases (38). Par ailleurs, la demi-vie de l'ODN non modifié 21L avec et sans SuperFectTM est sensiblement identique. Il est possible que le complexe formé par le SuperFectTM avec cet ODN court ne protège pas suffisament les extrémités de l'oligonucléotide qui subissent les dégradations enzymatiques. La stabilité des ODNs dans les lysats des cellules HeLa et NIH 3T3 varie avec le type de lysat. Il convient de noter que la concentration en protéine dans ces lysats est identique. En conséquence, les distinctions entre leurs activités nucléolithiques dépend de leur différence quantitative ou qualitative de l'activité des nucléases. La figure 11 (a) et (b) montre que la dégradation est plus rapide dans le lysat HeLA. Tous les ODNs linéaires, 21L, 21PS et 55L, sont rapidement dégradés, leur demi-vie étant d'environ 10 minutes. En ce qui concerne le lysat NIH 3T3, la figure 11 (c) et (d) montre que le taux de dégradation des SODN est plus faible que dans le lysat HeLa. De façon intéressante, les SODNs Dh6, L8 et L10 avec tous une protection 5' et 3' sont plus stables que les SODNs H6 à H10 qui ont seulement une épingle à cheveux à l'extrémité 3'. Ces résultats suggèrent que la contribution de l'activité exonucléasique 5' sur la dégradation de l'ODN est très importante dans ce lysat. Toutefois, la modification par un phosphorothioate terminal n'a pas d'influence significative sur la résistance de l'ODN, par rapport aux ODNs 21L et 21PS. La figure 12 rapporte le evenir des ODNs dans les deux lignées cellulaires HeLA et 3T3. Afin d'améliorer la pénétration des ODN dans les cellules, leurs complexes avec l'agent de transfection SuperFectTM ont été formés et incubés avec les cellules. La figure 12 (b) et (d) montre que seulement des traces du 21L ont été trouvées dans les deux types cellulaires après 16 heures d'incubation. Au contraire, la figure 12 (a) à (d) montre que des quantités significatives (50 à 80%) des autres ODNs incluant les linéaires (55L et 21PS) sont détectées dans les cellules. Après 48 heures d'incubation, la quantité d'ODNs intact à l'intérieur des cellules diminue mais demeure à un niveau de 20 à 30%. La figure 12 (a), (b) et (c), (d) montre qu'il n'y a pas de différence significative entre les deux lignées cellulaires. Tous les ODNs avec une structure secondaire ont la même stabilité qui est supérieure à la stabilité des ODNs linéaires 55L et 21PS. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Curcio L.D. ; BouffardD.Y.; Scanlon K.J. Pharmacol. Ther., 1997,74, 317-332. 2. Wyngaarden J.; Potts J.; Cotter F.; Martin R.R.; Mehta V.; Agrawal S.; Eckstein F.; Levin A.; Black L.; Cole R.; Crooke S.; Kreig A.; Diasio R.; Gait M.J. ; Nature Biotech., 1997,15,519-524. 3. Agrawal S ; Trends Biotech., 1996,14, 376-387. 4. 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REVENDICATIONS 1) Oligonucléotide contenant au moins une structure secondaire capable de modifier ou d'inhiber l'expression d'un gène cible in vivo ou in vitro, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence antisens et éventuellement une séquence nucléotidique supplémentaire à l'une et/ou l'autre des extrémités de la séquence antisens, choisi(s) de façon à ce que la ou les structures secondaires se défasse(nt) lors de la fixation de l'oligonucléotide sur l'acide nucléique cible. 2) Oligonucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la structure secondaire est formée : - essentiellement de tout ou partie de la séquence antisens, ou essentiellement de tout ou partie des séquences nucléotidiques supplémentaires situés de part et d'autre de la séquence antisens, ou - de tout ou partie de la séquence antisens et de tout ou partie d'une ou des deux séquences nucléotidiques supplémentaires situés de part et d'autre de ladite séquence antisens. 3) Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la structure secondaire est formée principalement ou exclusivement de paires de nucléotides appartenant à la séquence antisens. 4) Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la structure secondaire est formée essentiellement ou exclusivement de paires de nucléotides appartenant aux séquences nucléotidiques supplémentaires située aux extrémités de la séquence antisens. 5) Oligonucléotide selon la revendication 4, caractérisé en ce que les séquences nucléotidiques placées de part et d'autre de la séquence antisens sont substantiellement complémentaires l'une de l'autre. 6) Oligonucléotide selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que la structure secondaire comprend aussi une ou plusieurs paires de nucléotides appartenant uniquement à la séquence antisens. 7) Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la structure secondaire est formée de paires de nucléotide appartenant à la séquence antisens et à une séquence nucléotidique supplémentaire placée à l'une des extrémités de ladite séquence antisens. 8) Oligonucléotide selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique placée à l'une des extrémités de la séquence antisens est substantiellement complémentaire de ladite séquence antisens. 9) Oligonucléotide selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisée en ce que l'oligonucléotide comprend deux structures secondaires, une à chaque extrémité de la séquence antisens. 10) Oligonucléotide selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisée en ce que la structure secondaire comprend une ou plusieurs paires de nucléotides appartenant uniquement à la séquence antisens. 11) Oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce la structure secondaire est une structure en épingle à cheveux. 12) Oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce la structure secondaire comprend de trois à vingt paires de nucléotides et de préférence de cinq à dix paires de nucléotides. 13) Oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il est constitué de nucléotides naturels. 14) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs oligonucléotides identiques ou différents selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, libres, encapsulés, couplés, conjugués à des substances diverses, associés dans la dite composition à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 15) Composition pharmaceutique selon la revendication 14 pour le traitement d'un organisme humain, animal ou végétal, ledit traitement consistant à bloquer l'expression d'un ou plusieurs gènes impliqués dans une pathologie à l'aide d'un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.