FR 2789312 A1 20000811 FR 9901342 A 19990205 i La présente invention concerne les préparations cosmétiques, dermo- pharmaceutiques et vétérinaires, à usage externe, d'hygiène ou de soins de la peau et des phanères, contenant des stérol 3-sulfates, libres ou sous forme de sels; autres que le cholestérol sulfate et ses sels. Les stérols sont des alcools polycycliques partiellement insaturés universellement répandus dans les cellules vivantes. Le squelette de base des stérols est le cyclopentaphénanthrène. Les stérols possèdent une fonction alcool secondaire sur le carbone 3; cette fonction alcool se prête aisément à la sulfatation. La présente invention concerne l'ensemble des composés naturels de nature stérolique, sous forme de leurs dérivés 3-sulfate, purs ou en mélange, autres que le cholestérol sulfate (Figure 1) et ses sels: les stérols tels que le sitostérol 3-sulfate (Figure 2), le campestérol 3- sulfate, le stigmastérol 3-sulfate, l'ergostérol 3-sulfate, etc...., les alcools terpéniques (diméthyl 4-4 stérol 3-sulfate), et les méthyl stérol 3-sulfates. Ce sont principalement des stérols d'origine végétale, de levures, de bactéries. Exemples de produits concernés: dérivés sulfates de stérols de soja, dérivés sulfates de stérols de levures. L'utilisation des stérol 3-sulfates naturels dans les préparations cosmétiques, dermo- pharmaceutiques et vétérinaires, présente certains avantages compte tenu de l'évolution du marché vers l'utilisation de principes actifs d'origine non animale. 2.1 22 24 "j)o 12 19 II1 Na+ -O -- 6 Figure 1 Cholesterol sulfate -Cholesten-313 ol sulfate C27H4504Na, PM = 488,7 Na+ -0 S-0 Il Figure 2 P-sitosterolsulfate -Stigmasten-3[ ol sulfate C29H-O4SNa, PM = 516,7 Les stérols sont généralement les composés majoritaires de la fraction dite insaponifiable des corps gras. L'extraction et la purification de ces composés ne présente pas de difficultés particulières. Par exemple, après saponification de la matière grasse, les stérols peuvent être extraits par un solvant organique, purifiés par cristallisation ou par un procédé de type chromatographique. Différentes méthodes de synthèse chimique peuvent être employées pour réaliser la sulfatation du groupement hydroxyl en position 3 des stéroïdes. Par exemple, l'utilisation d'acide sulfurique concentré (1) ou d'un complexe de trioxyde de soufre (2,3). Les stérol 3-sulfates présentent une structure chimique homologue du cholestérol sulfate, un composé naturellement présent dans la peau et les phanères. Le cholestérol sulfate est un composé essentiel de l'épiderme et des cheveux (4,5,6,7). Dans l'épiderme, le cholestérol sulfate représente 2 à 3% de la totalité des lipides; dans le cheveu, sa teneur est estimée à 3,3 mg/g de cheveu. Le cholestérol sulfate est synthétisé dans l'épiderme à partir du cholestérol, grâce à l'action d'une sulfotransférase. Il atteint son taux maximal dans la couche granuleuse, (5%), puis il est en partie reconverti en cholestérol dans le stratum comrneum sous l'action d'une stéroïde sulfatase (8). Son taux est alors de 1,5%. L'épiderme est une structure adaptée à un grand nombre de fonctions dont la principale est la fonction barrière attribuée au stratum comeum: le contrôle des flux hydriques et la protection contre les agressions chimiques, physiques ou bactériennes de l'environnement. Sur le plan structural et fonctionnel, le stratum corneumn peut être comparé à un mur de " briques ". Les supérieures de l'épiderme. Le cholestérol sulfate est hydrolysé au cours de son transit dans les couches supérieures de l'épiderme par une stéroide sulfatase. Cette hydrolyse conduit à la desquamation. L'absence de cette enzyme induit un trouble de la desquamation: l'ichtyose récessive liée au chromosome X (9). Cette anomalie de la fonction enzymatique conduit à un aspect squameux de la peau. Le rapport en cholestérol et cholestérol sulfate est donc directement liée au processus normal de la desquamation. Ces dernières années, de nombreuses études ont mis en évidence les propriétés biologiques du cholestérol sulfate: stabilisateur de membranes biologiques (10, 11), hydratant membranaire (12), régulateur de la desquamation et de la différenciation cellulaire(13), action sur les kératinocytes (14), régulateur de la synthèse des lipides (15), précurseur de messagers stéroidiens, inhibiteur d'enzymes protéolytiques (16).... A l'heure actuelle, le cholestérol sulfate est utilisé dans les préparations cosmétiques et pharmaceutiques (17,18,19,20,21). La présente invention concerne les préparations cosmétiques, dermopharmaceutiques et vétérinaires, à usage extemrne, d'hygiène ou de soins de la peau et des phanères, contenant des stérol 3-sulfates libres ou sous forme de sels, autres que le cholestérol sulfate et ses sels, utilisés pour leurs propriétés physico-chimiques et biologiques. Les propriétés physico-chimiques sont liées au caractère amphiphile de la molécule au sein des structures lipidiques: propriétés tensioactives ou co-tensioactives permettant la fabrication de vésicules, et notamment des liposomes, en raison de leurs propriétés sur la stabilisation des structures lipidiques membranaires. Les propriétés biologiques reposent sur l'action des stérol 3-sulfates au niveau de la peau et des phanères; non seulement comme agent de cohésion et de protection, mais également en tant que produit actif sur le contrôle de la différenciation cellulaire, de la desquamation, de la régulation de la synthèse de lipides et de protéines cutanées, inhibition de certaines enzymes. Les propriétés des stérol 3-sulfates permettent des applications dans les préparations suivantes Les stérol 3-sulfates constituent des principes actifs pour préparations cosmétiques, comme par exemple, les produits de soins ou de maquillage anti-rides, anti-âge, hydratants, régénérants, etc. Les stérol 3-sulfates constituent des principes actifs pour préparations à usage dermatologique pour traiter les troubles de la desquamation, les états icthyosiques (peau sèche). Les stérol 3-sulfates constituent des principes actifs pour soins capillaires destinés à traiter le cheveu et le cuir chevelu, comme par exemple, les préparations antipelliculaires, les préparations destinées à rétablir les propriétés physico-chimiques du cheveu, à augmenter sa cohésion et à le protéger. Les stérol 3-sulfates constituent des principes actifs pour le soin des ongles. Les stérol 3-sulfates constituent des principes actifs pour produits à usage vétérinaire. Les stérol 3-sulfates constituent des principes actifs pour la protection des fibres naturelles ou synthétiques, comme par exemple, la laine. EXEMPLE 1 - MISE EN EVIDENCE DE L'ACTION DES STEROL 3-SULFATES SUR LA STABILITE DES MEMBRANES CELLULAIRES. Les cellules sont cultivées dans des Labteks en verre de 8 puits (Life TechnologieM, Nunc Labteklc) contenant un volume pratique de 400lI. On cultive dans ces Labteks des fibroblastes dans un milieu DMEM à faible concentration en glucose (1 g/l) de chez GIBCO avec 10% de sérum de veau foetal et 50 ig/ml de gentamycine. A confluence, les cellules sont prétraitées avec le stérol sulfate ([ sitostérol sulfate) à 0,5% ou le cholestérol sulfate à 0,5%, puis le SDS est appliqué à une concentration de 10 kg/ml pendant 24 heures. Ensuite, les cellules sont comptées et une coloration Hématoxyline et Eosine est réalisée pour étudier la structure et la morphologie des cellules. Pour cela, après avoir enlevé le milieu de culture des puits, la lame est trempée dans l'alcool à % pendant 4 min. puis plongée 3 fois dans un bain d'eau. Ensuite, elle est placée 5 min. dans l'hématoxyline, puis rincée 5 min. dans de l'eau tiède. Elle est alors plongée 3 fois dans de l'alcool à 80% et mise dans de l'éosine. Enfin, la lame est placée dans 2 bains croissants d'alcool (95 et 100%), de 4 min. chacun puis on dépose ensuite 2 gouttes de milieu de montage aqueux et on recouvre avec une lamelle avant observation au microscope. Cette étude est réalisée pour le stérol sulfate à 0.5% (p sitostérol sulfate) en comparaison avec le cholestérol sulfate à 0.5% et les résultats sont identiques et montrent que les cellules prétraitées présentent peu de modifications morphologiques au SDS et seulement 10% de mort cellulaire en comparaison aux cellules contrôle non traitées qui présentent d'importants changements morphologiques au SDS ainsi que 60% de perte de cellules. EXEMPLE 2 - MISE EN EVIDENCE DE L'ACTION DES STEROL 3- SULFATES SUR LES SYNTHESES DE KERATINES. Culture des kératinocytes: On utilise des kératinocytes épidermiques humains normaux qui se trouvent dans leur premier passage avec un temps de doublement de 20 heures. Le milieu utilisé est le Serum Free Keratinocyte Medium for Culture of Human Keratinocytes (Life TechnologiesTM) supplémenté avec des extraits pituitaires bovins (20-30 tg/ml) et du facteur de croissance épidermique recombinant (rEGF 0,1-0,2 ng/ml). Les cellules sont cultivées dans des Labteks et, à 60% de confluence, on applique 0,1-1% de stérol sulfate ([ sitostérol sulfate) ou 0,5% de cholestérol sulfate. L'imunomarquage s'opère après 24 à 48 heures d'incubation avec le produit. Les puits sont rincés 3 fois 1 min. avec du TBS 0,025M pH7,6 (Tris Buffer Saline), puis les cellules sont fixées et perméabilisées par 150 gIl par puits de méthanol froid (-20 C) pendant 5 min. à 4 C, suivi par 150 fIl d'acétone froid (-20 C) pendant 2 min. à température ambiante. Les puits sont ensuite rincés 2 fois 2 min. avec du TBS. Ensuite, 150 gl d'anticorps pan keratin mouse anti human TEBU 1% dans du TBS sont appliqués 30 min. dans chaque puits à température ambiante, à l'abri de la lumière et sous agitation constante pour marquer les kératines 6 et 10. Les puits sont ensuite rincés 3 fois avec du TBS pour éliminer l'excès d'anticorps primaire. Ensuite, on utilise le système Avidin-Biotin Complex de chez Vector pour marquer à la péroxydase. Les cellules sont incubées avec 150 pl d'anticorps secondaire biotinylé dilué au 1/100 dans du TBS. On laisse incuber 30 min. à température ambiante, à l'abri de la lumière et sous agitation constante. Les puits sont rincés 3 fois 1 min. avec du TBS afin d'éliminer l'excès de conjugué non fixé. Les cellules sont ensuite recouvertes avec 150 gil de la solution Vectastain ABC kit pendant 30 min. toujours à température ambiante, à l'abri de la lumière et sous agitation constante. Cette solution se compose de 10f1l d'avidine et de 10 il4 de péroxydase biotinylée qui sont dilués dans 1 ml d'eau distillée. On rince ensuite 3 fois 1 min. avec du TBS. La coloration est réalisée à l'aide du Kit "Substrat Péroxydase DAB" de chez VECTOR (SK- 4100). D'une solution de 5 ml d'eau distillée dans laquelle on dilue 2 gouttes de solution de tampon concentré (pH 7,5), 4 gouttes de DAB (3,3 diaminobenzidine tetrahydrochloride = chromogène) et 2 gouttes de péroxyde d'hydrogène (H202), on dépose 150 gil par puits. Le temps d'incubation est variable de 2 à 5 min. puis on stoppe la réaction en trempant les lames dans un bain d'eau durant 5 min.. Après 3 bains d'alcool croissant de 1 min. (90, 95 et 100%) afin de déshydrater les cellules, et 2 bains de xylène de 1 min., on verse 2 gouttes de milieu de montage Eukitt de chez Labonord puis une lamelle est déposée sur la préparation. La lecture est réalisée au microscope. En parallèle, des contrôles négatifs sont réalisés pour identifier les colorations non spécifiques. Pour l'anticorps primaire, on utilise le facteur FVIII ou le facteur de Von Willebrand. Si une coloration apparaît, les résultats ne peuvent être interprétés car le marquage est non spécifique. Il est aussi possible que les anticorps secondaires seuls se lient de façon non spécifique aux cellules. pour cela, après la fixation des cellules, on dépose 150 Ill de sérum (de l'espèce avec laquelle l'anticorps a été produit) à 10% dans du TBS pendant 10 min. puis 3 rinçages de 1 min. avant le dépôt de l'anticorps primaire. Les résultats montrent que le [3 sitostérol sulfate et le cholestérol sulfate augmentent tous les deux significativement la production de kératine. EXEMPLE 3 PREPARATION D'UNE CREME AUX STEROL 3- SULFATES INGREDIENTS J NOM CHIMIQUE% l I =% STEROLS 3-SULFATES 3 Sitostérol sulfate HUILE DE VASELINE Mineral Oil 10 CETIOL HE Polyol - ester d'acide gras 2 EMULGADE SEV Glyceryl Stearate & Ceteareth- 20 & Ceteareth-10 & 5 Cetearyl Alcohol & Cetyl Palmitate EAU Water 75,2 UREE Urea 3 GLUCOLYSAN Polydextrose 0,5 PHENONIP Phenoxyethanol & Methylparaben & Butylparaben & 0,3 Ethylparaben & Propylparaben SEPIGEL Polyacrylamide & C 13-14 Isoparafine & Laureth-7 3 EXEMPLE 4 ETUDE IN VIVO DE L'INFLUENCE DES STEROL 3- SULFATES SUR L'AMELIORATION DE L'ASPECT DES PEAUX SECHES Protocole La formule utilisée est décrite dans l'Exemplel. La formule placebo ne contient pas les stérols sulfates. Le test est réalisé sur dix volontaires sains avec des peaux à tendances sèches. Ces volontaires sont des femmes en bonne santé agées entre 25 et 38 ans. Les peaux sont classées de normale à sèche, avec quelques problèmes mineurs typiques des peaux à tendances sèches. Chaque volontaire a fait part de ses remarques avant, en cours, et après le test; de façon à apprécier l'efficacité du produit. Application Chaque volontaire a appliqué le produit sur un avant bras, contre un placebo sur l'autre avant bras; une fois par jour, le soir, pendant une semaine. Ceci, de façon à pouvoir comparer les formules. Une évaluation clinique ainsi qu'un examen de l'état de la peau on été réalisés par un dermatologue avant et après applications. Evaluation Après dix jours d'application, on ne note aucun phénomène d'intolérance ou d'allergie. On observe une sensation de confort due à une diminution de la sensibilité aux facteurs extérieurs donc une meilleure protection des peaux sensibles. On remarque aussi une peau plus souple et régénérée. Le produit agit donc comme hydratant et réparateur de la barrière cutanée. Les stérol 3-sulfates constituent des principes actifs pour soins capillaires, aussi bien pour le cheveu que le cuir chevelu, comme par exemple les produits destinés à traiter les états pelliculaires, à rétablir les propriétés physico-chimiques du cheveu, à augmenter la cohésion du cheveu et à le protéger. EXEMPLE 5 - PREPARATION D'UN SHAMPOOING AUX STEROL 3- SULFATES INGREDIENTS NOM CHIMIQUE STEROLS 3-SULFATES 3 Sitostérol sulfate 1 TEXAPON N 40 Laurylethersulfate de sodium 30 COMPERLAN KD Diethanolamide d'acide gras de coco 6 CETIOL HE Polyol - ester d'acide gras 5 WATER Eau 58 BIBLIOGRAPHIE: 1. LANTERI A.. Sulfonation and sulfiation technology. Journal ofAmerican Oil Chemists Society 55:128-133 (1978). 2. GILBERT EE. The reaction of sulfur trioxide, and its adducts, with organic compounds. Chemical Revue 62: 549-589 (1962) 3. GRISSHKOVETS VI et al. New preparation of triterpenoïd-3-sulfate by the use of S03 complex. Advances in Experimental Medical Biology 405: 209-210 (1996) 4. BONTE F., SAUNOIS A.. Existence of lipid gradient in the upper stratum corneum, and its possible biological signifiance. Arch. Dermatol. Res 289: 78-82 (1997). 5. WERTZ P.W. & DOWNING D.T.. Integral lipids of Human hair. Lipids 23 (9): 878-881 (1988). 6. WERTZ P.W. & DOWNING D.T.. Integral lipids of Mamnalian hair. Comparative Biochem. Physiol [B] 92 (4): 759-761 (1989). 7SERIZAWA S. & NAGUAI T. & ITO M. & SATO Y. Cholesterol sulphate levels in the hair and nails of patients with recessive X-linked ichthyosis. Clin. Exp. Dermatol 15 (1): 13-15 (1990). 8. FORESTIER J.P. Les enzymes de l'espace extra-cellulaire du Stratum Cornéum. International Journal of Cosmetic Science 14: 47-63 (1992). 9. MALONEY M.E., WILLIAMS M.L., EPSTEIN E.H. Lipids in the pathogenesis of Ichtyosis: Topical cholesterol sulfate induce scaling in hairless mice. Journal of Invest. 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Abe TAKASHI, Kondo MITSUO. (Kanebo Itd.), Cosmetics containing Cholesteryl sulfates, JP 60161911 (1985). Il REVENDICATION S 1. Les préparations cosmétiques, dermo-pharmaceutiques et vétérinaires, à usage extemrne, d'hygiène ou de soins de la peau et des phanères, caractérisées en ce qu'elles contiennent des stérol 3-sulfates, libres ou sous forme de sels, autres que le cholestérol sulfate et ses sels, utilisés pour leurs propriétés physico-chimiques et biologiques. 2. Préparations selon la revendication 1 caractérisées en ce que les stérol 3-sulfates, comme par exemple, le sitostérol 3-sulfate, le campestérol 3-sulfate, le stigmastérol 3-sulfate, I'ergostérol 3-sulfate, les alcools terpéniques (diméthyl 4-4 stérol 3-sulfates), et les méthyl stérol 3- sulfates, sont utilisés pour leurs propriétés tensioactives ou cotensioactives. 3. Préparations selon les revendications 1 et 2 caractérisées en ce qu'elles permettent l'utilisation de stérol 3-sulfates dans la fabrication de vésicules, et notamment des liposomes, en raison de leurs propriétés sur la stabilisation des structures lipidiques membranaires. 4. Préparations selon les revendications 1, 2 et 3 caractérisées en ce que les stérol 3- sulfates sont utilisés pour leurs propriétés biologiques au niveau de la peau et des phanères: contrôle de la différenciation cellulaire, de la desquamation, régulation de la synthèse de lipides et de protéines cutanées, inhibition de certaines enzymes. 5. Préparations selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que les stérol 3-sulfates constituent des principes actifs pour préparations cosmétiques, comme par exemple produits de soins ou de maquillage anti-rides, anti-âge, hydratant ou régénérants. 6. Préparations selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que les stérol 3-sulfates sont intégrés dans des préparations à usage dermatologique pour traiter les troubles de la desquamation. 7. Préparations selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que les stérol 3-sulfates constituent des principes actifs pour soins capillaires destinés à traiter le cheveu et le cuir chevelu, comme par exemple, les préparations antipelliculaires, les préparations destinées à rétablir les propriétés physico-chimiques du cheveu, à augmenter sa cohésion et à le protéger. 8. Préparations selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que les stérol 3-sulfates constituent des principes actifs pour le soin des ongles. 9. Préparations selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que les stérol 3-sulfates constituent des principes actifs pour produits à usage vétérinaire. 10. Préparations selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que les stérol 3-sulfates sont utilisés dans des préparations de type détergeants ou lessives, pour l'entretien et la protection des fibres naturelles ou synthétiques.