FR 2790758 A1 20000915 FR 9902881 A 19990309 SOLUBILISATION D'ACIDES GRAS POLYINSATURES ET DE LEURS DERIVES PAR FORMATION DE COMPLEXES D'INCLUSION AVEC UNE CYCLODEXTRINE ET LEUR UTILISATION DANS DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES, COSMETIQUES OU ALIMENTAIRES. DESCRIPTION Domaine technique L'invention concerne la solubilisation et la stabilisation d'acides gras polyinsaturés et des sels, esters et triglycérides correspondants, par inclusion dans des cyclodextrines en vue d'obtenir des formulations solubles dans l'eau, incorporables à des compositions pharmaceutiques, alimentaires ou cosmétiques. Les acides gras polyinsaturés tels que les acides arachidonique ou eicosatétraénoique (AA) eicosapentaénoïque (EPA) et docosahexaénoïque (DHA) sont des acides gras polyinsaturés à longue chaîne de la série n-3. Ils sont contenus dans les produits issus de la mer, c'est-à-dire principalement dans les huiles de poissons, mais aussi dans certaines micro-algues. Ils sont obtenus par hydrolyse-estérification des triglycérides. Ces acides et les triglycérides correspondants répondent aux formules: COOH Acide arachidonique (AA) COOH X (Il) Acide eicosapentaénoïque (EPA) / = \ COOH (ll) Acide docosahéxaénoïque (DHA) OCOR1 OCOR2 OCOR3 Triglycérides: RI, R2, R3 représentent le groupe hydrocarboné d'un acide gras tel que EPA, DHA ou autre. Ces acides gras polyinsaturés de la série n-3 (AGPI) présentent des propriétés très intéressantes dans la prévention de certaines pathologies inflammatoires (psoriasis, arthrite) et des maladies cardio-vasculaires. Les premières études épidémiologiques suggérant l'existence d'effets potentiellement bénéfiques de ces acides gras sur la mortalité cardio- vasculaire, remontent aux observations effectuées chez les Esquimaux-. groenlandais. Dans cette population, consommatrice quasi-exclusive de mammifères marins et de poissons, environ 14 g d'AGPI n-3 sont ingérés quotidiennement, et les décès par maladies cardio- vasculaires sont rares. La relation entre le niveau de consommation de poissons (et à fortiori d'AGPI n-3) et l'incidence des maladies cardio-vasculaires a été retrouvée au Japon et dans certaines études prospectives. Les AGPI n-3 exercent leur effet bénéfique en intervenant à deux niveaux: - 1) ils abaissent la triglycéridémie (et non la cholestérolémie), cette diminution résultant pour l'essentiel d'une synthèse des lipoprotéines de basse densité et de leurs constituants; - 2) ils inhibent les phénomènes d'agrégation plaquettaire, de coagulation et d'inflammation en jouant sur la synthèse d'un grand nombre de molécules (thromboxanes, prostacylines, leucotriènes, PAF, fibrinogène, PDGF, cytokines,...). Dans le souci de limiter le taux de mortalité coronarienne pour l'ensemble de la population, il semble prudent de recommander la consommation de poisson. Les AGPI présentent également d'autres intérêts notamment au niveau de la peau et des structures nerveuses au cours du développement périnatal. En effet, des modifications apparaissent lors de déficience en AGPI au niveau de l'épiderme - perméabilité à l'eau augmentée, - hyperprolifération cellulaire (problème de kératinisation), - augmentation de l'épaisseur et du nombre de couches, - eczémas, irritations, érythèmes... Sur le plan nutritionnel, la période de développement périnatal est particulière en ce sens qu'elle correspond à la phase la plus active d'incorporation des AGPI à longue chaîne (22: 6 n-3; soit 22 atomes de carbone, 6 insaturations éthyléniques, la première étant sur le carbone n-3) dans les lipides de structure du système nerveux central, mais également la plus sensible aux apports alimentaires en AGPI. Pour le cerveau humain, cette période de croissance rapide s'étend des trois derniers mois de la vie foetale jusqu'à l'âge de deux ans. Au cours de la première année, le cerveau du nouveau-né va prendre deux grammes par jour en raison principalement du phénomène de myélinisation. Cela implique que les apports alimentaires en AGPI doivent être corrects quantitativement et qualitativement. En raison d'une consommation moyenne faible de ces acides gras dans les pays industrialisés (200 à 400 mg/jour), un certain nombre d'industriels commencent à se pencher sur la façon d'enrichir certains aliments en ces acides gras en y additionnant des huiles de poisson (pain, margarine, mayonnaise...) Cependant l'incorporation de ces acides gras à longue chaîne dans des compositions alimentaires ou cosmétiques est rendue difficile en raison de l'insolubilité dans l'eau, de l'odeur indésirable et du manque de stabilité de ces acides gras. En effet, ceux-ci sont sensibles à la température et à la lumière. Ils sont instables et s'oxydent très facilement. Etat de la technique antérieure Pour surmonter ces difficultés, le document FR-A-2 547 829 [1] propose une composition stable contenant des composés d'acides gras insaturés et un composé organique stabilisant répondant à la formule: H2COR1 I R 2O--CH O I Il H2C---P-P-OCH2CH2N R3 I O- dans laquelle R et R représentent respectivement des restes d'acides gras alors que R3 représente H3 ou (CH3)3. On peut aussi ajouter à la composition une cyclodextrine dont le rôle est de réduire très fortement l'odeur déplaisante et l'amertume propres aux composés d'acides gras polyinsaturés et dont le rôle est également de rendre la composition agréable au palais. Dans le document FR-A-2 550 445 [2], on a proposé d'inclure un acide gras polyinsaturé tel que EPA dans la y-cyclodextrine. Dans ce but, on mélange les deux composés sous forme de pâte en présence de petits volumes -d'eau, ce qui conduit à l'obtention d'une poudre contenant un composé d'inclusion y- cyclodextrine-EPA. Le document EP-A-0 470 452 [3] décrit également l'obtention d'un produit comprenant de la y- cyclodextrine et une substance oléagineuse contenant EPA ou DHA, par précipitation à partir d'une solution. Toutes ces techniques ont l'inconvénient de conduire à des produits solides qui ne conviennent pas pour l'incorporation dans toutes les compositions pharmaceutiques, alimentaires ou cosmétiques. La présente invention a précisément pour objet des formulations sous forme de solutions aqueuses contenant en solution au moins une substance oléagineuse appartenant au groupe des acides gras polyinsaturés et de leurs dérivés (sels, esters et triglycérides), qui conviennent pour une telle incorporation. Exposé de l'invention Aussi, l'invention a pour objet une solution aqueuse comprenant au moins une substance oléagineuse choisie parmi les acides gras polyinsaturés et les sels, esters et triglycérides d'acides gras polyinsaturés, dans laquelle la (les)dite(s) substance(s) sont sous la forme de complexe d'inclusion dans une cyclodextrine choisie parmi la y-cyclodextrine et la 2,6-diméthyl-p-cyclodextrine. On rappelle que les cyclodextrines naturelles sont des oligosaccharides cycliques constitués d'unités D-glucopyranosyle liées en a-1,4. La y-cyclodextrine qui est une cyclodextrine naturelle, comprend huit unités D-glycopyrnosyle, alors que la - cyclodextrine en comporte 7. Elles répondent à la formule: 011 |0 (IV) avec n = 7 pour la P-cyclodextrine, et n = 8 pour la y-cyclodextrine. La 2,6-diméthyl 3-cyclodextrine répond à la formule: 4 O /,CH3 0 (V) J 7 Dans l'invention, on peut utiliser la 2,6- diméthyl-p-cyclodextrine pure (DIMEB) ou le produit commercial RAMEB qui présente en moyenne deux groupes OCH3 par unité glucose mais qui sont réparties de façon aléatoire sur les positions 2, 3 et 6. La RAMEB contient donc statistiquement une faible proportion de DIMEB pure répondant à la formule (V). Les substances oléagineuses utilisées dans l'invention peuvent être de différents types et d'origines diverses, par exemple provenir de poissons ou de végétaux. On utilise avantageusement les acides gras polyinsaturés AA, EPA et DHA mentionnés précédemment, en particulier sous forme de triglycérides. On peut utiliser un mélange d'un ou plusieurs de ces acides avec d'autres acides gras saturés ou insaturés, par exemple une huile de poisson. Dans ce cas, la solution comprend plusieurs substances oléagineuses, celles-ci étant constituées par une huile de poisson. L'huile de poisson peut être en particulier une huile de sardine ou une huile de thon. Une telle huile comprend des acides gras insaturés ayant de 1 à 6 insaturations éthyléniques ainsi que des acides gras sans insaturation éthylénique. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une solution aqueuse comprenant au moins une substance oléagineuse choisie parmi les acides gras polyinsaturés et les sels, esters et triglycérides d'acides gras polyinsaturés. Selon un premier mode de réalisation du procédé de l'invention utilisant la y-cyclodextrine pour solubiliser ces substances, le procédé comprend les étapes suivantes: - a) dissoudre la y-cyclodextrine dans de l'eau, b) ajouter à la solution obtenue en a) la (les) substance(s) oléagineuse(s) à solubiliser, et - c) séparer le complexe précipité de y- cyclodextrine et de substance(s) oléagineuse(s) du surnageant qui contient également le complexe en solution. Ainsi, on peut obtenir directement une solution aqueuse de la ou (des) substance(s) oléagineuse(s). On peut aussi récupérer le complexe précipité, le sécher, puis le remettre en solution aqueuse. De même, on peut récupérer et sécher le complexe obtenu dans le surnageant et le remettre ensuite en solution aqueuse. Aussi, le procédé peut comprendre en outre une étape de récupération et de séchage d'au moins l'un des complexes obtenus dans l'étape c) suivie de la remise en solution aqueuse du (des) complexe(s) séché(s). Pour mettre en ouvre le procédé décrit ci- dessus, on commence par dissoudre la y-cyclodextrine dans de l'eau sous agitation en utilisant une quantité de y-cyclodextrine qui peut aller jusqu'à la saturation de la solution, soit 230 g/l. Dans l'étape b) qui suit, on ajoute la (les) substance(s) oléagineuse(s) en quantité telle qu'elle corresponde à un léger excès par rapport à la quantité de y-cyclodextrine nécessaire pour former le complexe équimolaire. On soumet également à une agitation. Dans l'étape c), on sépare le surnageant du précipité, par exemple par centrifugation. Lorsque l'on opère avec un excès de substance(s) oléagineuse(s), on élimine tout d'abord cet excès avant d'effectuer la séparation par centrifugation. Lorsque l'on soumet ensuite le(s) complexe(s) obtenu(s) à un séchage, celui-ci peut être effectué par lyophilisation ou encore par un procédé de déshydratation utilisant des zéolithes ou " Zéodratation ". Selon un second mode de réalisation de l'invention, destiné à l'inclusion de la (des) substance(s) oléagineuse(s) dans la 2,6-diméthyl p- cyclodextrine, le procédé comprend les étapes suivantes: - a) dissoudre la 2,6-diméthyl-3-cyclodextrine dans de l'eau, - b) ajouter à la solution obtenue en a) la (les) substance(s) oléagineuse(s) à solubiliser, et - c) récupérer la solution de complexe obtenue. Comme précédemment, on peut de plus récupérer le complexe en solution par séchage de la solution de complexe obtenue dans l'étape c) et remettre ensuite en solution aqueuse le complexe séché. L'utilisation de la 2,6-diméthyl-p- cyclodextrine est particulièrement intéressante car le complexe obtenu présente une solubilité dans l'eau très élevée. L'inclusion des substances oléagineuses précitées dans la y-cyclodextrine ou la 2,6-diméthyl- P-cyclodextrine permet de surmonter les problèmes suivants: - la polymérisation des acides gras polyinsaturés, - la migration des doubles liaisons cis en trans, et - la peroxydation. L'inclusion des acides gras polyinsaturés ou de leurs triglycérides, sels et/ou esters dans des cyclodextrines, conformément à l'invention, permet d'obtenir des formulations aqueuses contenant ces acides gras en supprimant et en réduisant fortement les problèmes liés à leur oxydabilité et à leur instabilité. De telles formulations aqueuses peuvent être utilisées pour inclure ces acides gras polyinsaturés et/ou leurs triglycérides, sels et esters dans des compositions alimentaires et dans des compositions cosmétiques. Aussi, l'invention a encore pour objet des compositions pharmaceutiques, alimentaires ou cosmétiques comprenant une solution aqueuse d'au moins une substance oléagineuse choisie parmi les acides gras polyinsaturés -et les sels, esters et triglycérides d'acides gras polyinsaturés, dans laquelle la (lesdites) substance(s) sont sous la forme de complexe d'inclusion dans une cyclodextrine choisie parmi la y- cyclodextrine et la 2,6-diméthyl-p-cyclodextrine. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, donnée bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins annexés. Brève description des dessins La figure 1 est le spectre obtenu par résonance magnétique nucléaire du proton, dans la pyridine, du complexe y-cyclodextrine-huile de poisson, précipité dans l'exemple 1. La figure 2 est le spectre de résonance magnétique nucléaire du proton, dans l'eau, du complexe d'inclusion d'EPA et de diméthyl-f-cyclodextrine. La figure 3 est le spectre de résonance magnétique nucléaire du proton, dans l'eau, du complexe obtenu avec l'huile de poisson et la 2,6-diméthyl-p- cyclodextrine. Exposé détaillé des modes de réalisation de l'invention L'exemple 1: Solubilisation d'huile de poisson au moyen de ycyclodextrine. On introduit dans un récipient 9,9931 g de y- cyclodextrine et 87 ml d'eau pour obtenir une solution à 114, 86 g/l de y-cyclodextrine, ce qui correspond sensiblement à la moitié de la solubilité maximale (230 g/l) de la y-cyclodextrine. On agite le mélange sur un plateau tournant à 300 tours/minute jusqu'à complète dissolution de la y-cyclodextrine, ce qui est obtenu en quelques minutes. On ajoute alors 10 ml d'huile de poisson brute (référence SO 30 qui contient au moins 30 % d'acide -3), et on maintient une agitation constante à 300 tours/minute sur plateau tournant pendant 24 heures. Il se forme un précipité blanc qui se dépose au fond du récipient, et on observe une phase aqueuse opalescente intermédiaire et une suspension huileuse en surface. On élimine la suspension huileuse et on sépare la phase aqueuse du précipité par centrifugation deux fois successivement à 1000 tours/minute pendant minutes, à la température ambiante. On lyophilise séparément le surnageant (phase aqueuse) et le précipité, après congélation dans l'azote liquide. On examine ensuite les produits lyophilisés par résonance magnétique nucléaire du proton (RMN 'H) après dissolution dans la pyridine deutériée, à 298 K, à l'aide d'un spectromètre BRUKER DRX 500, opérant à 500,13 MHz. La figure 1 illustre le spectre de résonance magnétique nucléaire 'H du précipité. La comparaison de ce spectre avec celui de la y-cyclodextrine seule montre la présence de signaux (notés TGL sur la figure) qui sont attribués sans ambiguïté aux triglycérides issus de l'huile de poisson. Le spectre RMN H obtenu avec le surnageant est identique à celui de la figure 1. La quantité de triglycérides inclus dans le surnageant est assez importante et la quantité incluse dans le précipité est encore plus importante. On examine ensuite la solubilité des complexes lyophilisés, par remise en solution dans l'eau. A cet effet, on ajoute la quantité d'eau nécessaire pour obtenir la dissolution de 0,0846 g de complexe lyophilisé; celle-ci est de 47,08 ml et elle conduit à une solution opalescente dont la concentration en complexe est de 1,79 g/l. On précise que dans le cas de la - cyclodextrine, le complexe formé dans les mêmes conditions a une solubilité trois fois plus faible (0,65 g/l). On vérifie maintenant que le complexe du surnageant et le complexe du précipité sont tous deux des complexes d'inclusion des triglycérides dans la y- cyclodextrine. Dans ce but, on dissout le complexe lyophilisé obtenu à partir du surnageant et le complexe lyophilisé obtenu à partir du précipité dans un volume minimum de diméthylformamide DMF, ce qui dénature le complexe en séparant les deux espèces qui le constituent. Ayant prélevé une masse de 1 g de complexe, il faut un volume de DMF de 4 ml pour tout dissoudre. On ajoute environ 60 ml d'éther à chaque échantillon car les triglycérides y sont solubles mais pas la cyclodextrine qui précipite instantanément. Afin de bien isoler la phase organique contenant les - triglycérides de la y-cyclodextrine précipité, on a recours à une centrifugation pendant minutes, à 1000 tours/minute, à la température ambiante. On transfère la partie liquide récupérée dans une ampoule à décanter. On lave quatre fois successivement à l'eau pour extraire les traces de y- cyclodextrine restées éventuellement dans la phase organique. On sèche cette phase sur Na2SO4 et on bouche le flacon. Après environ 1 heure, on filtre les échantillons sur fritté sous le vide de la trompe à eau, puis on élimine le solvant organique d'extraction (éther) à l'évaporateur rotatif. On récupère ainsi la fraction des triglycérides qui ont été inclus dans la y- cyclodextrine. Le fluide obtenu est d'aspect huileux. La masse de triglycérides récupérée est de 0,1178 g pour 1 g du complexe provenant du surnageant et de 0,2164 g pour 1 g du complexe issu du précipité. Les échantillons sont stockés sous argon pour éviter toute dégradation à l'air, avant leur analyse par chromatographie en phase gazeuse, qui donnera leur profil en acides gras caractéristique. Les résultats obtenus, exprimés en pourcentage des acides gras identifiés sont donnés dans le tableau qui suit. Tableau 1 Huile Huile Acides gras provenant du provenant du surnageant précipité. 12: 0 0,2 0,2 14: 0 8,7 _8,7 14: 1 0,3 0,3 : 0 0,5 0,5 16: 0 18,0 _ 17,6 16: 1 n-9 0,2 0,3 16 1 n-7 9, 8 | 9 17: 0 iso 0,4 _0,4 17: 0 0,4 __ 0,5 18 0 3, 8 3, 7 18 1 n-9 11,4 11,4 18: 1 n-7 3, 2 3,2 18: 2 n-6 1,5 1,5 19: 0 0,4 0,4 18: 3 n-6 0,3 0,3 18: 3 n-3 0,6 0,6 18: 4 n-3 2,2 2,2 : 1 n-9 0,8 0,8 : 4 n-6 (AA) 1,1 1,1 22 0 0,9 0,9 5 n-3 EPA 21,1 20,9 22: 4 n-3 0,8 0,8 24 0 0,4 0,4 22: 5 n-3 2,6 2,6 22: 6 n-3 (DHA) 10, 6 10,8 Total saturés 33,7 33,3 Monoinsaturés 25,7 25,9 Polyinsaturés 40,8 40,8 Dans ce tableau, les acides gras sont identifiés par leur nombre d'atomes de carbone, suivi du nombre d'insaturations éthyléniques et de l'emplacement dans la chaîne de la première insaturation. Ainsi, EPA correspond à 20: 5 n-3. Les résultats du tableau montrent que l'huile issue du surnageant a la même composition en acides gras que l'huile provenant du précipité. C'est bien la preuve que l'on trouve du complexe à l'état dissous dans le.surnageant. Exemple 2: Solubilisation d'acide eicosapentaénoïque (EPA) dans la 2,6-diméthyl-p-cyclodextrine. On prépare 10 ml de solution aqueuse à 10 mmol/l de 2,6-diméthyl-pcyclodextrine et on y ajoute 100 pl de EPA. Le système hétérogène obtenu est maintenu sous forte agitation magnétique pendant 1 nuit à la température ambiante à et l'abri de l'air. On obtient ainsi une solution biphasique comportant une phase aqueuse parfaitement limpide surmontée d'une suspension huileuse. On centrifuge le mélange diphasique à 6 000 tours/minute pendant 10 minutes pour éliminer la phase supérieure (suspension huileuse constituée de l'acide gras en excès). On congèle ensuite la solution aqueuse limpide et on lyophilise. On redissout le produit lyophilisé dans l'eau lourde pour l'analyser par résonance magnétique nucléaire du proton. La figure 2 représente le spectre obtenu par RMN 1H du produit lyophilisé dans l'eau lourde. On constate ainsi que la fraction soluble dans l'eau correspond à un complexe 1/1 entre la cyclodextrine et l'acide gras (EPA). Exemple 3: Solubilisation d'huile de poisson dans la 2,6-diméthyl-pcyclodextrine. On suit le même mode opératoire que dans l'exemple 2 pour inclure dans la 2,6-diméthyl-p- cyclodextrine de l'huile de poisson (SO 30). La figure 3 représente le spectre RMN 1 H obtenu en solution dans l'eau lourde. Comme précédemment, on voit que la fraction soluble dans l'eau correspond à un complexe 1/1 entre la 2,6- diméthyl-p-cyclodextrine et le mélange d'acides gras (huile de poisson). On détermine la solubilité du complexe lyophilisé par remise en solution dans l'eau en déterminant la quantité d'eau nécessaire pour dissoudre 0,1875 g de complexe lyophilisé. On trouve qu'il suffit de 300 pl d'eau, ce qui correspond à une solubilité très élevée de 625 g/l alors que la solubilité maximale de la 2,6-diméthyl-3-cyclodextrine est de 285 g/l. Ceci est très intéressant en vue d'une utilisation dans des compositions alimentaires ou cosmétiques, car on peut limiter à des valeurs très faibles la quantité de solution aqueuse de complexe ajoutée. REFERENCES CITEES [1]: FR-A-2 547 829. [2]: FR-A-2 550 445. [3]: EP-A-0 470 452. REVEND I CATIONS 1. Solution aqueuse comprenant au moins une substance oléagineuse choisie parmi les acides gras polyinsaturés et les sels, esters et triglycérides d'acides gras polyinsaturés, dans laquelle la (les) dite(s) substance(s) sont sous la forme de complexe d'inclusion dans une cyclodextrine choisie parmi la y-cyclodextrine et la 2,6-diméthyl-p- cyclodextrine.- 2. Solution aqueuse selon la revendication 1 dans laquelle la (les) substance(s) oléagineuse(s) sont choisies parmi l'acide arachidonique (AA), l'acide eicosapentaénoïque (EPA), l'acide docosahexaénoïque (DHA) et leurs triglycérides. 3. Solution aqueuse selon la revendication 1 comprenant plusieurs substances oléagineuses, dans laquelle lesdites substances sont constituées par une huile de poisson. 4. Solution selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la cyclodextrine est la y-cyclodextrine. 5. Solution selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la cyclodextrine est la 2,6-diméthyl-p-cyclodextrine. 6. Procédé de préparation d'une solution aqueuse selon la revendication 4, qui comprend les étapes suivantes: - a) dissoudre la y-cyclodextrine dans de l'eau, - b) ajouter à la solution obtenue en a) la (les) substance(s) oléagineuse(s) à solubiliser, et - c) séparer le complexe précipité de y- cyclodextrine et de substance(s) oléagineuse(s) du surnageant qui contient également le complexe en solution. 7. Procédé selon la revendication 6, qui comprend de plus le séchage d'au moins l'un des complexes obtenus dans l'étape c) suivi de la remise en solution aqueuse du (des) complexe(s) séché(s). 8. Procédé de préparation d'une solution aqueuse selon - ia revendication 5, qui comprend les étapes suivantes: - a) dissoudre la 2,6-diméthyl-p-cyclodextrine dans de l'eau, - b) ajouter à la solution obtenue en a) la (les) substance(s) oléagineuse(s) à solubiliser, et - c) récupérer la solution de complexe obtenue. 9. Procédé selon la revendication 8, comprenant de plus le séchage de la solution de complexe obtenue dans l'étape c) suivi d'une remise en solution du complexe séché. 10. Composition alimentaire comprenant une solution aqueuse selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 11. Composition cosmétique comprenant une solution aqueuse selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 12. Composition pharmaceutique comprenant une solution aqueuse selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.