FR 2792532 A1 20001027 FR 9905234 A 19990426 NOUVELLES COMPOSITIONS ANTISEPTIQUES ET LEUR PROCEDE D'OBTENTION La présente invention concerne le domaine de la chimie organique et plus particulièrement le domaine de la chimie thérapeutique. Elle a plus précisément pour objet de nouvelles compositions pharmaceutiques destinées à la désinfection de la peau et des muqueuses douées d'un large spectre d'activité antibactérienne. Elle a particulièrement pour objet une solution antiseptique, éventuellement moussante, formée d'une association d'un sel d'ammonium quaternaire et d'un dérivé cationique de biguanide, dispersée dans un véhicule aqueux. Elle se rapporte spécifiquement à une composition pharmaceutique, éventuellement moussante, caractérisée en ce qu'elle associe le chlorure de benzalkonium, un sel de chlorhexidine, et le cas échéant, un agent moussant amphotère ou zwitterionique, dans un véhicule aqueux pouvant renfermer d'autres ingrédients. On sait que les agents antiseptiques destinés à nettoyer les plaies, la peau ou les muqueuses doivent résoudre des problèmes complexes qui consistent en ce qu'on doit utiliser une solution qui présente un large spectre d'activité antimicrobienne, antifongique et anti-levure, qui soit facile à appliquer et qui en même temps ne soit pas trop fluide, qui adhère suffisamment aux tissus endommagés pour assurer une antisepsie de durée suffisamment prolongée et qui en même temps ne soit pas susceptible, malgré le contact prolongé, d'être absorbée par la peau. Parmi les antiseptiques utilisés les sels d'ammonium quaternaire comme le chlorure de cetylpyridium, le chlorure de benzethonium ou le chlorure de benzalkonium ont déjà reçu une grande notoriété en raison de leur pouvoir détersif qui s'ajoute à leur action bactéricide. Cependant si les ammonium quaternaires sont doués d'une activité bactéricide importante sur les germes Gram positifs, celle-ci est moindre sur les bactéries à Gram négatif Elle est faible sur les champignons, sur les levures et sur les virus enveloppés. Par contre les sels d'ammonium quaternaires présentent une très faible absorption cutanée et une tolérance remarquable chez l'homme. 2 2792532 C'est la raison pour laquelle il était très souhaitable d'adjoindre au chlorure de benzalkonium un autre agent antibactérien qui élargisse le spectre d'activité antibactérienne et qui en même temps soit compatible chimiquement, car beaucoup de substances ioniques réagissent avec les sels d'ammonium quaternaires pour donner des composés insolubles et par là inactifs. Les sels de chlorhexidine sont des dérivés cationiques compatibles chimiquement avec les sels d'ammonium quaternaire. Ils présentent en outre un spectre d'activité plus large, comprenant à la fois les bactéries à Gram positif et à Gram négati et notamment Pseudomonas et Serratia, les levures et les dermatophytes, aux concentrations usuelles. Les sels de chlorhexidine ne présentent pas d'absorption cutanée ou par les muqueuses, chez l'animal et chez l'homme. Le choix de l'association du chlorure de benzalkonium et d'un sel de chlorhexidine a été guidé par le souci de la complémentarité du spectre bactérien et par un effet synergique, mis en évidence au plan de l'activité antimicrobienne sur les bactéries Gram positif (Staphylocoques, Enterocoques, Bacillus...), sur les bactéries Gram négatif (Pseudomonas, Acinetobacter, Bordetella) sur les dermatophytes (Epidermophyton, Microsporum, Trichophyton); sur les agents étiologiques d'infections courantes des muqueuses tels que Neisseiria gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum et Trichomonas vaginalis, sur les levures (Candida, Torulopsis). En outre, l'agent générateur de mousse a été utilisé éventuellement pour renforcer l'action bactéricide des agents décrits, notamment en assurant le nettoyage des surfaces cutanées ou des muqueuses souillées ou endommagées. La composition selon l'invention peut être appliquée pure ou diluée, de préférence diluée au l/1o. La présence de deux agents antibactériens à spectre d'activité différent permet non seulement une additivité des spectres mais aussi amène une plus grande sensibilité des germes et la survenue moins fréquente de phénomènes de résistance. Il est intéressant de noter qu'il existe déjà une association de chlorhexidine et de chlorure de benzalkonium commercialisée sous les dénominations BISEPTINE et DERMASPRAY, destinée à l'antisepsie des plaies. Cette spécialité comporte en outre un autre antibactérien l'alcool benzylique. 3 2792532 Au total cette préparation contient des quantités faibles de chlorure de benzalkonium de telle sorte que la monographie parue au Dictionnaire Vidal fait essentiellement mention du fait que le chlorure de benzalkonium confère à la préparation des propriétés détergentes. En outre les propriétés antibactériennes de l'alcool benzylique ne sont pas très prononcées et ne renforcent certainement pas les effets bactéricides. Au contraire le choix dans les compositions antibactériennes selon l'invention d'une concentration relativement élevée en chlorure de benzalkonium et d'une concentration relativement faible en sel de chlorhexidine permet de réaliser un véritable optimum des propriétés antibactériennes. C'est ainsi que les spécialités BISEPTINE et DERMASPRAY qui contiennent toutes les deux 25 mg de chlorure de benzalkonium et 250 mg de gluconate de chlorhexidine pour 100 ml de solution ne sont indiquées que pour l'antisepsie des plaies chirurgicales et traumatiques peu profondes et l'antisepsie de la peau, alors que les compositions selon l'invention qui présentent un rapport pondéral inverse, trouvent un emploi beaucoup plus extensif en dermatologie, en traumatologie, en chirurgie, en gynécologie et en cosmétologie. Par ailleurs les associations déjà décrites avec un dérivé phénolique (voir WO 97/17849), ne peuvent que conduire à des phénomènes de sensibilisation et d'allergies. L'essence de l'invention réside donc dans des compositions pharmaceutiques éventuellement moussantes, caractérisées en ce qu'elles renferment le chlorure de benzalkonium à une concentration s'échelonnant de 0,4 g à I g pour 100 ml, le sel de chlorhexidine à une concentration s'échelonnant de 0,15 à 0,50 g pour 100 ml exprimé en digluconate et l'agent générateur de mousse à une concentration s'échelonnant de 2 g à 3 g pour 100 mi. Selon l'invention le sel de chlorhexidine est choisi parmi le chlorhydrate, l'acétate, le difonnrmiate, le dipropionate, le diiodydrate, le dilactate, le mono gluconate, le digluconate, le dilactate, le tartrate, le dinitrate, le sulfate... Pour des raisons de solubilité le digluconate de chlorhexidine est le sel préféré. L'agent générateur de mousse est un agent tensioactif amphotère ou zwitterionique, et notamment de structure bétaïnique. Le composé préféré est celui vendu sous la dénomination alkyldiméthylbétaïne (alkyl de coco diméthylbétaïne). Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent contenir en outre des adjuvants ou des substances stabilisantes pour assurer une meilleure qualité ou une meilleure conservation des préparations. On pourra citer à cet égard des agents tensioactifs non ionogènes comme par exemple les polymères en bloc dénommés poloxamer; des agents épaississants ou générateurs de viscosité comme des dérivés de cellulose tels que la méthylcellulose, l'éthylcellulose, l'hydroxyéthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose ou l'hydroxypropylméthylcellulose; des agents tampons comme la paire phosphate monosodique - phosphate disodique ou acide citrique - citrate de sodium pour réaliser un pH proche de celui de la peau ou des muqueuses c'est-à-dire compris entre 4,0 et 8,0 et de préférence de 5,5 à 7,5. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent encore contenir un agent aromatisant comme une essence soluble dans l'eau (essence de citron, essence de lavande) ou un produit aromatique synthétique comme le levomenthol. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont destinées à être appliquées 1 à 2 fois par jour sur la peau ou sur des plaies superficielles. Pour l'utilisation gynécologique le produit doit être dilué au '/10. Les compositions selon l'invention peuvent trouver un usage en dermatologie, en cosmétologie, pour l'hygiène et pour la désinfection des dispositifs et des appareils médicaux ou chirurgicaux. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE I * Solution antibactérienne pour application locale * Chlorure de benzalkonium A (en solution à 50 %) À Gluconate de chlorhexidine B (en solution à 20 %) À Alkyl diméthylbétaïne 24,00 Kg (en solution à 30 %) * Copolymère en bloc oxyde d'éthylène - oxyde de propylène 24,00 Kg e (Hydroxyéthyl) cellulose (10.000 mPas) 2,00 Kg 2792532 * Acide citrique monohydrate 1,09 Kg * Citrate de sodium 5,09 Kg * Produit aromatisant qsp * Eau purifiée qsp 1.000 1 La fabrication fait l'objet de procédures strictes et rigoureuses. Le processus de fabrication comporte cinq étapes: Etape 1: Mélanger sous agitation 1,09 Kg d'acide citrique monohydraté, 5,09 Kg de citrate de sodium dans 1o 30 p. cent environ d'eau, et ce jusqu'à dissolution complète des deux composants. Etape 2: Après avoir mélangé dans un mélangeur de poudres, l'hydroxyéthylcellulose (2,00 Kg) et le copolymère d'oxyde d'éthylène et oxyde de propylène (24,00 Kg), on introduit sous agitation le mélange de poudres de la solution 1 et ce jusqu'à dissolution complète. Etape 3: Introduire sous agitation dans la solution 2 les composants suivants: Alkyldiméthylbétaïne: 24,00 Kg Chlorure de benzalkonium: A Kg (1) Gluconate de chlorhexidine: B Kg (2) Parfum: qs 1) Ajustement en fonction du titre de chlorure de benzalkonium (solution à 50 p. cent) Soit Tl le titre exprimé en g pour 100 ml, La quantité à mettre en oeuvre A est de: 9,85 X 50 Kg T1 2) Ajustement en fonction du titre de gluconate de chlorhexidine (solution à 20 p. cent) Soit T2 le titre exprimé en g pour 100 ml, La quantité à mettre en oeuvre B est de: 10,65 X 20 Kg T2 Etape 4: Compléter à 1.000 1 avec l'eau purifiée. 6 2792532 Etape 5: Répartition en flacons de 125,300 et 1.000 ml. Boucher. EXEMPLE II Solution antibactérienne non moussante Chlorure de benzalkonium: 0, 925985 % Gluconate de Chlorhexidine 1, 065 % (en solution à 20%) Acide citrique monohydraté 0, 109 % Citrate de sodium dihydraté 0, 44 % Arôme qs Eau purifiée qsp 100 % EXEMPLE m Etude bactériologique des compositions selon l'invention Les propriétés de la composition de l'exemple I ont été établies, soit selon des méthodologies bien codifiées à l'échelle nationale par l'Association Française de Normalisation et la Pharmacopée Française en matière de bactéricidie et levuricidie, soit selon des techniques reconnues intemationalement telles que la détermination des concentrations minimales inhibitrices et bactéricides (CMI - CMB). Dans toutes les études, les méthodes et matériels ont été clairement précisés, et un soin particulier apporté, lorsqu'il s'est agi de révéler un effet létal, à l'élimination de l'activité résiduelle par l'inclusion d'un neutralisant approprié ou de cycles de centrifugation. L'éventail taxonomique et le nombre élevé des souches étudiées, comprenant aussi bien des bactéries banales que des espèces ", des champignons et des protozoaires, ont fait mettre en oeuvre une méthodologie extrêmement variée. Même si elle a dû être parfois adaptée aux conditions de culture des agents pathogènes, cette méthodologie a toujours été orientée vers l'observation principalement d'un effet létal, et secondairement d'un effet inhibiteur, de la composition de l'exemple I. 7 2792532 A la lumière des résultats ainsi générés, il est permis de conclure que la composition de l'exemple I est douée d'une excellente activité antiseptique intrinsèque se traduisant par une action bactéricide et levuricide importante après un contact de cinq minutes sur les cinq souches préconisées par la Pharmacopée Française, cette activité n'étant que légèrement diminuée en présence de substance interférentes. Par ailleurs, cette activité est maintenue en l'absence de substances interférentes, même à des temps de contact aussi courts qu'une minute puisque les cinq souches sont tuées à une concentration de 16 % de produit. L'activité bactéricide et levuricide de la composition de l'exemple 1 a été corroborée par une étude de spectre o le produit dilué à 25 % s'est révélé létal sur 42 des 43 souches microbiennes examinées. Par ailleurs, une étude bactériostatique et fongistatique sur 57 souches représentant 37 espèces microbiennes a montré que la composition de l'exemple I possède un spectre très large comprenant aussi bien des bactéries à Gram positif et négatif que des dermatophytes et des levures. Enfin, la composition de l'exemple I, présente une excellente activité létale sur les agents étiologiques d'infections courantes des muqueuses tels que Neisseria gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum et Trichomonas vaginalis. La composition de l'exemple I s'est montrée résistante à la contamination microbienne telle que précisée par la Pharmacopée Française. L'interaction bactéricide de la composition de l'exemple I avec Bétadine solution dermique, Hibitane et Hexomédine solution s'étant révélée synergique dans 44,5 %, indifférente dans ,5 % et antagoniste dans aucune des réponses, l'utilisation concomitante de cette nouvelle préparation avec d'autres antiseptiques non moussants ne paraît pas rédhibitoire. En l'absence de modèles expérimentaux validés, la confirmation de l'activité in vitro de toute préparation antiseptique peut être rapidement obtenue par des essais sur peau saine chez l'homme. La composition de l'exemple 1 s'est montrée efficace dans les modèles du pli du coude et l'avant-bras après applications répétées. 8 2792532 L'activité immédiate et rémanente cumulative obtenue dans ces modèles et le niveau et le spectre d'activité établis in vitro permettent d'affirmer que la composition, selon l'invention, présente un intérêt majeur dans le nettoyage et l'antisepsie de la peau et des muqueuses, notamment en dermatologie et gynécologie, ainsi que dans le traitement d'appoint des affections dermatologiques primitivement bactériennes ou susceptibles de se surinfecter. Au plan toxicologique, l'ensemble des données autorise à conclure que les deux principes actifs (chlorure de benzalkonium et digluconate de chlorhexidine) présents dans la composition de l'exemple 1 présentent une bonne innocuité. En effet, chez l'animal, ils sont très peu toxiques, aussi bien après une administration par voie générale que au cours des études d'administrations répétées (3 mois ou plus). Il ne présentent pas de caractère tératogène. Le chlorure de benzalkonium a été déclaré non mutagène. Même si dans certains tests sur cellules animales, le digluconate de chlorhexidine a été classé comme faiblement mutagène, les tests de cancérogénèse ont permis de conclure à l'absence de risque cancérogène, aussi bien pour la chlorhexidine que pour le benzalkonium. Le risque de toxicité systémique par passage transcutané de produit semble pouvoir être écarté dans les conditions normales d'utilisation pour ces deux principes actifs. Considérant le nombre de références disponibles dans la littérature, seule la préparation de la composition de l'exemple 1 a été soumise à des essais de toxicologie. Après administration massive par voie orale à des rongeurs, la composition selon l'invention est révélée très peu toxique (DL50 > 10 ml / Kg). L'administration pendant 6 semaines par voie cutanée au lapin a seulement mis en évidence de légers phénomènes d'intolérance, ne s'aggravant pas au cours d'administrations ultérieures. Il faut remarquer que l'expérience acquise a prouvé que même si le lapin est préconisé par les autorités de tutelle pour la mise en oeuvre des tests de tolérance cutanée, il est doté d'une sensibilité particulière. Aucun signe de toxicité systémique par voie transcutanée n'a été observé au cours de cette même étude. Par voie vaginale chez la chienne, on a observé quelques phénomènes d'irritation qualifiés de légers. Il faut cependant souligner ici les conditions sévères d'administration mises en oeuvre dans ce protocole. Par contre, il n'a pas été enregistré de signes de toxicité systémique lié à un passage transvaginal de la préparation. 9 2792532 La composition, selon l'invention, n'a été ni sensibilisante ni photosensibilisante chez le cobaye, espèce reconnue prédictive pour la mise en évidence de ces phénomènes. EXEMPLE IV Etude de tolérance des compositions pharmaceutiques selon l'invention. 2.1.2. Protocoles Au cours de quatre essais, les différents tests pratiqués étaient tous d'utilisation classique. 2.1.2.1. Tests épicutanés (IV A 1 et IV A 2) Dans deux essais de tolérance cutanée, les tests épicutanés ont été réalisés par application de 15 tl de produit en solution diluée à I % dans de l'eau pour préparation injectable sur cupule d'aluminium (Finn Chamber) posée ensuite sur la peau du dos sans préparation préalable de celle- ci. Le produit a été laissé en place pendant 48 heures, et le dispositif maintenu par un pansement Micropore. La lecture des tests a été réalisée à 48 heures (20 à 30 mn après l'ablation du matériel) pour les deux études et à 96 heures pour l'essai d'application unique. 2.1.2.2. Etude du potentiel sensibilisant Le potentiel du produit test selon l'invention pour induire et mettre en place une sensibilisation cutanée retardée, a été déterminé à l'aide d'un modèle sur cobaye, en utilisant le test de maximisation de Magnusson et Klingman. Les concentrations de produit essayé employé dans l'étude principale ont été déterminées par les résultats des tests préliminaires de criblage. Le test principal de sensibilisation a été effectué en employant un groupe d'essai de 20 animaux et un groupe témoin de dix animaux. Pour essayer d'induire la sensibilisation, les animaux d'essai ont reçu par voie intradermique une injection d'une émulsion d'adjuvant complet de Freund et la substance essayée, à une concentration de 10% à la fois dans le véhicule sélectionné et dans une émulsion d'adjuvant complet de Freund. Une semaine plus tard ceci a été amplifié par application topique de la substance d'essai non diluée, sur les sites d'injection. 2792532 Méthodologie L'étude a été divisée en deux phases distinctes. La première phase a été un choix dans l'échelonnement des doses (dose- ranging) qui a été utilisé pour déterminer des niveaux de dose appropriés pour l'emploi dans la seconde phase. Cette seconde phase a constitué l'étude de base pour la détermination du potentiel sensibilisant du produit d'essai. Répartition en groupe: les animaux ont été choisis parmi les lots disponibles et répartis au hasard aux groupes de traitement préalablement à chaque phase de l'étude. Les animaux ont été identifiés par tatouage dans l'oreille avec un numéro individuel. Iniection intradermique. Les animaux ont été distribués en vue du traitement pour fournir un groupe d'essai de 20 animaux et un groupe témoin de 10 animaux. Le jour de l'administration (Jour 1), les poils ont été coupés à partir de la région scapulaire de chaque animal sur une zone d'environ 20 x 40 mm Trois paires d'injection intradermiques ont été effectuées sur l'emplacement cutané préparé de chaque animal. Toutes les injections ont été faites à la lisière de l'emplacement préparé et les injections antérieures et médianes ont été placées proches l'une de l'autre et à distance des injections postérieures. Les animaux du groupe testé ont été traités comme suit Site d'injection Traitement Antérieur adjuvant complet de Freund en émulsion Médian substance d'essai à 1% dans l'eau stérile Postérieur substance d'essai à 1% en émulsion dans l'adjuvant complet de Freund Les animaux du groupe témoin ont été traités de la même façon sauf que la substance d'essai a été remplacée par le véhicule seul. Le plan de traitement était Site d'injection Traitement Antérieur adjuvant complet de Freund en émulsion Il 2792532 Médian véhicule (eau stérile) Postérieur véhicule mélangé à de l'adjuvant complet de Freund Une réaction cutanée a été déterminée environ 24 heures après l'injection. Deux semaines après la seconde étape d'induction, tous les animaux ont subi une provocation par application topique à la fois du véhicule et du produit non dilué. Durant la provocation, aucune réponse, soit au produit d'essai soit au véhicule tout seul, n'a été observée chez aucun animal des groupes d'essai ou témoin. Les modifications dans le poids corporel pendant la période d'étude, étaient en général semblables chez les animaux, à la fois du groupe d'essai et du groupe de contrôle. Ces résultats indiquent que le produit d'essai ne provoque pas de réponse de sensibilisation chez les cobayes. On n'a pas observé de réaction durant la provocation après une période d'exposition à l'induction avec le produit. La composition de l'exemple I a été diluée avec de l'eau préalablement à la mise en émulsion avec l'adjuvant complet de Freund. Procédure On a utilisé de jeunes cobayes femelles adultes multipares ayant une gamme de poids allant de 300 à350 get 4 à 5 semaines. Les animaux ont été logés par groupes de moins de 5 animaux dans des cages en acier inoxydable, mesurant 63 x 48 x 41 avec un plancher grillagé. Étude principale - Provocation Le jour 22, trois semaines après avoir préparé les animaux pour la première phase d'induction de l'étude principale, tous les animaux ont été préparés pour la provocation en rendant les flancs exempts de poils par rasage, de façon à exposer des zones d' approximativement 50 x 50 mm sur chaque flanc. 12 2792532 Des pièces de gaze mesurant 20 mm x 20 mm ont été imbibées avec des aliquotes de 0,2 ml de la substance d'essai non diluée. Celles-ci ont été disposées sur le flanc droit de chaque animal à la fois du groupe d'essai et du groupe témoin, dans le centre de l'emplacement cutané préparé. Le flanc gauche de chaque animal été traité de la même façon avec des pièces imbibées avec 0,2 ml de véhicule seulement (eau stérile). Les emplacements traités ont été recouverts avec un ruban de feuille d'aluminium pour agir comme barrière occlusive et chaque animal a été alors enveloppé d'une pièce de bandage adhésif élastique pour maintenir la substance d'essai et le véhicule en contact avec la peau. Après une période de contact de 24 heures, les pansements et les pièces ont été enlevés. Environ 21 heures après le retrait des pansements et des pièces, les emplacements traités ont été rasés pour éliminer tout poil qui a pu pousser. Environ 3 heures après, soit 24 heures après le retrait des pansements, les emplacements traités ont été examinés pour détecter un signe de réaction au traitement. L'échelle suivante de notation a été employée pour décrire une quelconque réaction observée: Notation Réaction observée 0 pas de changement visible 1 érythème discret ou irrégulier 2 érythème modéré ou confluent 3 érythème intense et gonflement Cette vérification a été répétée 24 heures plus tard, 48 heures après le retrait des pansements. Poids corporel Les animaux de l'étude principale ont été pesés au début du traitement et à l'achèvement de l'étude. Achèvement et autopsie Les animaux survivants ont été tués par narcose au dioxyde de carbone à la fin du processus expérimental, mais n'ont pas été soumis à la procédure d'autopsie. 13 2792532 Classement Les résultats obtenus au cours de l'essai ont été employés pour classer la substance d'essai en différentes catégories indiquant son potentiel pour agir comme agent sensibilisant (on a employé le schéma décrit par B. Magnusson et A-M. Klingman, J.Invest. Dermatol 52 (1969) 268-276. Celui-ci est détaillé ci-dessous: Incidence sur la Degré Classement sensibilisation 0- 8% I faible i0 9- 28% i léger 29 - 64% HI modéré - 80% IV fort 81 - 100% V extrême Résultats a) Tests de tolérance préliminaire par injection Le test de tolérance préliminaire pour déterminer une concentration appropriée pour une injection dans l'essai principal de sensibilisation, a indiqué que la substance d'essai à une concentration de 10% était raisonnablement tolérée par le système d'essai. b) Test de tolérance par application topique Le test d'application topique a démontré que la substance d'essai non diluée était tolérée par le système d'essai, et qu'elle n'entraînait aucune réponse d'irritation. Induction Une réaction importante était apparente sur les emplacements d'injection intradermique après administration de l'adjuvant complet de Freund (groupe d'essai et groupe témoin) de la substance d'essai mélangée à l'adjuvant complet de Freund (groupe d'essai) et du véhicule mélangé à l'adjuvant complet de Freund (groupe témoin). Ces emplacements traités par le véhicule seul (groupe témoin) ou par la substance d'essai dans le véhicule (groupe d'essai) ont manifesté une réponse restreinte. 14 2792532 Aucune irritation de la peau traitée n'a été observée tout autour des points d'injection après 48 heures d'exposition topique à la substance d'essai (groupe d'essai) ou au véhicule seul (groupe témoin). Provocation Aucune réponse à la fois à la substance d'essai ou au véhicule seul n'était apparente chez aucun des 19 animaux survivants du groupe d'essai ou chez aucun des dix animaux du groupe témoin suivant la fin de la période d'exposition à la provocation: Groupe Traitement Incidence de la réponseLen %) 24h 48h Témoins substance d'essai 0% 0% véhicule 0% 0% Essai substance d'essai 0% 0% véhicule 0% 0% Poids corporel Des modifications dans le poids corporel pendant la période d'étude ont été en général semblables chez les animaux à la fois du groupe de l'essai et du groupe témoin. Conclusion Les résultats de cette étude ont indiqué que la composition étudiée (exemple I) n'agit pas comme agent sensibilisant chez le cobaye, car aucune réponse n'a été observée après provocation suivant une période d'induction d'exposition au produit essayé. Selon l'échelle de Magnusson et Klingman, la composition est placée en Classe I, c'est-à-dire considérée comme ayant la possibilité de provoquer une réponse de sensibilisation. 2.1.2.3. Tolérance vulvo-vaginale La tolérance en gynécologie, (IV.A.3) a été appréciée d'une part par les femmes elles-mêmes au moyen d'une fiche individuelle quotidienne et d'autre part par l'investigateur qui a recueilli les 2792532 informations concernant les signes fonctionnels et effectué une recherche clinique de signes de vulvite, de vulvo-vaginale ou de cervicite. De plus, trois examens ont été réalisés 48 heures après l'arrêt du traitement => un examen bactériologique et virologique permettant de juger d'une éventuelle modification de la flore vaginale, => un examen cytologique vérifiant le retentissement sur la muqueuse cervico vaginale, => et un examen biologique semblable à celui réalisé à l'inclusion. Les questionnaires subjectifs de tolérance ont mis en évidence quelques plaintes mineures concernant l'odeur de la composition, ainsi que sa température (trop froide). Ces plaintes envers des propriétés physiques connues du produit n'ont pas empêché la poursuite de l'étude et étaient en général d'intensité régressive avec la prolongation de l'application. Quelques volontaires (10%) ont signalé des petits épisodes de prurit vulvaire apparaissant après l'application et durant quelques minutes. Ces prurits sont probablement à rattacher à l'activité antiseptique de la composition selon l'invention et ne reflètent pas une mauvaise tolérance cutanéo-muqueuse de la composition selon l'invention. La tolérance générale a été excellente. Aucun événement intercurrent général n'a été signalé. Dans les conditions de cette étude et selon l'investigateur, la tolérance cutanéo-muqueuse clinique et bactériologique vulvo-vaginale d'une application biquotidienne de la composition selon l'invention est bonne. Les quelques désagréments mineurs et transitoires rapportés (sensation de froid, odeur de la composition, épisodes de prurit vulvaire et/ou de sécheresse du site d'application) sont à relier aux caractéristiques physico-chimiques du produit ainsi qu'à son activité antiseptique. De plus, le rythme d'application élevé (2 applications par jour pendant 10 jours) de toute solution antiseptique entraîne exactement le même type de symptômes. Toutes les variables quantitatives ont été décrites à l'aide de la moyenne, de l'écart-type et des valeurs extrêmes. Les variables qualitatives ont été décrites à l'aide des fréquences et des pourcentages. L'analyse de la tolérance a été descriptive, et incluait les paramètres suivants: tolérance clinique, tolérance générale subjective, signes vitaux, tolérance bactériologique et biologique. 16 2792532 Les prélèvements bactériologiques ont été à l'origine de la principale difficulté de cette étude. En effet, il a été détecté dans un très grand nombre de cas, la présence de germes du type uréaplasma uréalyticum (mycoplasmes). Ce germe a été retrouvé de manière souvent transitoire, intermittente avec disparition et/ou apparition spontanée sans aucun facteur déclenchant évident et de manière strictement isolée: les volontaires ne présentaient aucun symptôme d'infection vaginale même latente (pas de pertes vaginales, pas de symptômes d'irritation ou d'inflammation, pas d'antécédents de maladies sexuellement transmissibles). Selon l'avis de l'investigateur, la tolérance de la composition selon l'invention peut être 0o considérée comme bonne. En effet, seulement 3 volontaires sur 30 ont rapporté des événements intercurrents mineurs (épisodes de légère sécheresse vulvaire: 1 sujet; épisodes de légers prurits: 2 sujets). Ces événements étaient mineurs, bien tolérés et spontanément régressifs et sont survenus chez des volontaires sans anomalies bactériologiques. i5 L'examen clinique vulvo-vaginal n'a pas permis de mettre en évidence de signes de mauvaise tolérance, ni de signes d'irritation ou d'inflammation cutanéo-muqueuse. Les prélèvements bactériologiques effectués aux jours 1 et 11 n'ont pas permis de retrouver de modifications significatives des germes présents. Quelques germes ont été retrouvés mais de manière non spécifique et ils ne traduisaient aucune pathologie infectieuse réelle en dehors de deux sujets présentant une mycose vaginale persistante du jour 1 au jour 11. Deux volontaires supplémentaires ont présenté une pathologie infectieuse en cours de traitement (volontaire n 15 et volontaire n 25) qui présentaient une mycose vaginale à Candida Albicans au Jour 11. Cette infection ne peut pas être directement reliée au produit testé. Elle est plus probablement à rattacher à une contamination sexuelle banale ou à une présence de germes non significative. 2.1.2.4. Evaluation de l'activité sur peau saine (IV.A.4.) L'évaluation de l'activité se fait de façon codifiée selon plusieurs méthodes: Activité immédiate au niveau du pli du coude. Les prélèvements bactériologiques sont effectués, avant et 5, 10, 15, 30 et 60 minutes après application de l'antiseptique et comparés aux mesures témoins de la flore aérobie juste avant l'application de la composition de l'exemple 1. 17 2792532 e Activité au niveau de l'avant-bras pendant 24 heures sous pansement occlusif Les prélèvements sont effectués avant la pose du pansement et 5, 15, 30 et 60 minutes après l'application de l'antiseptique effectuée dès la levée du pansement occlusif. rmanente au niveau de l'avant-bras aprs 24 heures. Les prélèvements sont effectués avant l'application de l'antiseptique, 5 minutes après l'application et à la levée d'un pansement occlusif mis en place pendant 24 heures. Activité rémanente au niveau de l'avant bras après applications répétées. L'antiseptique est appliqué 3 fois par jour pendant 6 jours. Les prélèvements sont effectués chaque jour, les cinq premiers jours, avant la première application du matin, avant la 2ème application du 5ème jour et 36 heures après la dernière application du 6ème jour. Pour ces 4 mesures d'activité, la technique dérive de la méthode de Williamson et Kligman modifiée par J.FLEURETTE: le principe consiste à laver et frotter une surface de peau délimitée par un cylindre de verre dans lequel se trouvent 2 ml d'un liquide de lavage. La surface cutanée est frottée par une palette de caoutchouc (15 secondes) permettant le recueil de plus de germes qu'un simple grattage à la pipette et une dispersion homogène dans le liquide de lavage. 2.1.3 Résultats 2.1.3.1. Tolérance clinique La tolérance clinique cutanée et muqueuse a été relevée chez les 118 volontaires sains ayant participé aux 4 essais de pharmacologie clinique. Elle a été jugée bonne dans l'ensemble, tant par les sujets que par les investigateurs. Les tests épicutanés (IV.A. 1) ont permis de montrer l'absence de réaction irritative ou allergique pour la composition de l'exemple I. Des cas d'irritations ont été constatés avec l'excipient (1 cas), avec le Mercryl Laurylé (3 cas) ou surtout avec le Lauryl sulfate de sodium qui a servi de témoin d'irritation (16 cas à la lecture de 48 h et 33 cas à la lecture de 96 heures). 18 2792532 Au cours de l'essai de tolérance à dose répétée, les mêmes tests épicutanés ont été réalisés avant l'essai et deux semaines après la dernière application en cas d'irritation initiale observée avec l'un des produits. Aucun effet savon (irritation classique observée avec les produits moussants sous système occlusif), aucune irritation ni aucune sensibilisation, n'ont été observés avec la composition de l'exemple I au cours de ces tests. La tolérance clinique au cours des essais IV.A. 2, IV.A. 3 et IV.A. 4 a été jugée sur des paramètres subjectifs relatés par les sujets ou objectifs observés par les investigateurs. La tolérance cutanée à la composition de l'exemple I a été particulièrement bonne, puisqu'aucun signe fonctionnel n'a été signalé lors des applications répétées sur la peau. Un prurit vulvaire ou vaginal et des sensations de brûlure ont été observés dans quelques cas au cours de l'essai IV.A. 3 de tolérance en gynécologie, durant moins d'une heure après l'application du produit et signalés un seuljour dans plus du 1/3 des cas. De même il n'y a eu que d'exceptionnels signes physiques observés au cours de ces essais érythème ou dessèchement dans l'essai IV.A. 4, érythème dans l'essai IV. A. 3. EXEMPLE IV Étude sur des sujets contaminés ou lésés 1 - CARACTÉRISTIQUES DEMOGRAPIJQUES Le nombre d'inclus a été de 64 adultes dans l'essai IV.B. 1 et de 30 enfants dans l'essai IV.B. 2. L'âge des patients s'est situé entre 16 et 91 ans pour l'essai 1V.B. I et entre 2 et 15 ans pour l'essai IV.B. 2. Les autres données démographiques sont rapportées dans le tableau 3.1.(1). Tableau 1: CARACTERISTIQUES DÉMOGRAPHIQUES (Moyennes) 19 2792532 Réf. Sexe Taille (cm) Poids (Kg) Age Effectif Essai (années) IV.B.1 Hommes 175.8 72.8 47 Femmes 162.6 62.4 17 IV.B.2 Garçons 127.4 27.4 17 Filles 121.4 24.7 13 2 - PROTOCOLES Deux protocoles identiques ont été mis en oeuvre et ont eu pour but principal de vérifier la tolérance de la composition de l'exemple I sur peau lésée, en particulier au cours des soins de lésions cutanées post-traumatiques et souillées. L'objectif secondaire était d'apprécier l'évolution vers la cicatrisation ou la restitution ad integrumn de l'épithélium cutané. Les essais ont été menés en ouvert, un essai comparatif sur ce type de lésions étant difficile à mener de façon objective. Si le patient avait été son propre témoin, il aurait fallu au moins deux lésions à peu près équivalentes, ce qui est rarement le cas en traumatologie. Si deux groupes parallèles avaient été choisis, l'extrême subjectivité de l'un des critères d'évaluation (absence de douleur lors de l'application) aurait rendu aléatoire les résultats. Enfin, la grande diversité des plaies aurait rendu difficile la constitution de groupes parallèles homogènes. La population choisie a comporté des patients vus le plus souvent en soins ambulatoires, plus rarement hospitalisés, dans un service d'urgence traumatologique, patients de plus de 15 ans dans l'étude IV.B. 1, de moins de 15 ans dans l'essai IV.B. 2. Les patients devaient avoir une lésion cutanée récente (de moins de 4 jours), souillée, de nature traumatique, pour laquelle une antisepsie simple par solution moussante était indiquée. C'est ainsi que deux types de lésions ont été retenues: * plaies profondes drainées et suturées, ou plaies non suturées, contuses ou non, avec ou sans perte de substances, 2792532 lésions cutanées superficielles à type de dermabrasion mécanique, chimique ou thermique, de plaie non suturée. Le traitement a consisté en un bain avec de l'eau stérile (VERSOL ) ou du chlorure de sodium à 90/ 0 stérile pendant 10 minutes pour des plaies très souillées, ou avec réaction fibrineuse importante, ou encore un bain avec la composition de l'exemple I dilué au 1/10ème dans de l'eau stérile pour lavages et irrigations. Le nettoyage des plaies superficielles a été fait avec la composition de l'exemple I peu utilisée au moyen d'une compresse par tamponnement pendant une minute, suivi d'un rinçage abondant à l'eau du robinet. I0 Les plaies profondes ont été irriguées avec la composition de l'exemple I diluée au 1/10ème pendant une minute et rincées avec de l'eau stérile pour lavages et irrigations. Les lésions ont été ensuite soit laissées à l'air libre, soit recouvertes d'un pansement de propreté. Si le nombre des applications a été laissé à l'initiative de l'investigateur, il a été conseillé une application/jour dans les plaies drainées et suturées, 1 ou 2 applications/jour pour les autres plaies. La durée du traitement a été fixée à 10 +/- 2 jours mais une prolongation des soins jusqu'à * cicatrisation complète a été permise. Les critères d'appréciation ont porté sur l'évaluation de la tolérance recueillie au moyen d'une fiche individuelle fournie au patient complétée par l'examen clinique, et d'un interrogatoire réalisé par l'investigateur, notant les éventuels signes fonctionnels. L'évolution vers la cicatrisation a été également évaluée selon la nature de la réaction cicatricielle, le délai de la cicatrisation. 3 - RESULTATS Dans l'essai 1, 19 plaies non suturées et 45 lésions cutanées superficielles ont été traitées. Dans l'essai 2, cette répartition a été de 23 plaies anfractueuses et 7 dermabrasions mécaniques. Les plaies et lésions concernent surtout les membres pour les plaies profondes chez les adultes et la face ou le cuir chevelu chez l'enfant. 21 2792532 Deux patients de l'essai 1 ont été inclus à tort car ils présentaient des plaies anciennes de plus de quatre jours, mais reprises pour lâchages de suture. Le protocole a été respecté dans les deux essais à l'exception de 4 patients de l'essai B. 1, une sortie d'essai au 3ème jour pour infection locale et générale nécessitant une antibiothérapie par voie générale, et 3 non revus ou non traités. L'appréciation de la tolérance a donc porté sur 90 patients. Dans l'ensemble, le nombre d'applications a été de 2 parjour chez les adultes et 1 par jour chez les enfants. La tolérance d'un antiseptique sur peau lésée est importante à considérer: spontanément, une plaie ou une dermabrasion est douloureuse. Si l'application amplifie la douleur, l'acceptabilité ne sera pas bonne, en particulier chez l'enfant. C'est pourquoi l'objectif essentiel de ces deux essais a été d'apprécier la tolérance. Au début du traitement, la moitié des adultes a signalé des sensations de brûlure, ou de prurit ou parfois de sensations de sécheresse, d'intensité faible le plus souvent. Globalement, la tolérance a été jugée bonne dans 87 cas et moyenne dans 3 cas (2 adultes et l'enfant). En fin de traitement, dans 86 cas sur les 90 évalués, l'investigateur n'a noté aucun signe fonctionnel concernant la plaie. Quatre fois chez des adultes l'investigateur a signalé des signes fonctionnels en relation avec la cicatrisation. L'acceptabilité est excellente puisque jugée bonne par 59 adultes sur 60 et par tous les enfants qui redoutent pourtant toujours l'application d'un produit sur une plaie. Aucune eczématisation n'a été notée. La cicatrisation s'est faite normalement: complète dans 59 cas sur 90 en 5 à 12 jours, elle a été jugée favorable à la fin du traitement chez les 31 autres patients, parmi lesquels quelques cas ont présenté une réaction fibrineuse ou inflammatoire. 22 2792532 REVENDICATIONS 1. Nouvelles compositions pharmaceutiques, hygiéniques et/ou cosmétologiques, éventuellement moussantes destinées à la désinfection et/ou au nettoyage de la peau, des muqueuses et des annexes, formées d'une association d'agents antibactériens, caractérisées en ce qu'elle contiennent un sel de benzalkonium, un sel de chlorhexidine et, le cas échéant, un agent moussant tensioactif amphotère ou zwitterionique, dans un véhicule aqueux pouvant renfermer d'autres ingrédients. 2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que le sel de benzalkonium est le chlorure de benzalkonium. 3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que le sel de chlorhexidine est choisi parmi le chlorhydrate, l'acétate, le diformiate, le dipropionate, le diiodhydrate, le dilactate, le dinitrate, le sulfate, le monogluconate, le digluconate, le dilactate et le tartrate. 4. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications I à 3, dans laquelle l'agent moussant est une alkyldiméthyl béta'ne. 5. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications I à 4, dans laquelle la concentration en sel de benzalkonium s'échelonne de 0,4 à 1,0 g pour 100 ml. 6. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications I à 5, dans laquelle la concentration en sel de chlorhexidine s'échelonne de 0,15 à 0,50 g pour 100 ml. 7. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications I à 6, dans laquelle la concentration en agent moussant éventuellement présent s'échelonne de 2 g à 3 g pour mi. 8. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 7 dans laquelle on ajoute en outre un agent tensioactif non ionogène. 9. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle on ajoute en outre un agent épaississant ou générateur de viscosité. 23 2792532 10. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle on ajoute en outre un agent tampon assurant un pH compris entre 4,0 et 8,0. 11. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 10, dans laquelle on ajoute éventuellement un agent aromatisant. 12. Utilisation des compositions selon l'une des revendications I à 11 pour la désinfection des dispositifs ou appareils médicaux ou chirurgicaux.