FR 2792318 A1 20001020 FR 9905013 A 19990416 1 2792318 DERIVES D'INDAZOLE, LEUR PRÉPARATION ET LEUR APPLICATION EN THÉRAPEUTIQUE La présente invention a pour objet des dérivés d'indazole, leur préparation et leur application en thérapeutique, plus particulièrement en tant qu'antagonistes des récepteurs 5- HT3/ 5-HT4. Les dérivés d'indazole selon la présente invention répondent à la formule générale (I): o X-A Rl R1 (iXi) O R3 dans laquelle: R2 R1 représente un atome d'hydrogène, un halogène, un groupe C1i4 alcoxy, méthyle, hydroxy ou amino, R2 représente -(CH2)2-OH ou -CH2-C(O)OH lorsque R3 représente un atome d'hydrogène, ou R2 représente un atome d'hydrogène lorsque R3 représente- (CH2)2-OH ou -CH2-C(O)OH, ou R2 et R3 sont liés pour former un des cycles représenté ci-dessous: O -.O 0 OH OH X représente un atome d'oxygène, un groupe -NH- ou -N(Ci_4 alkyle)-, et A est un groupe de formule B ou C R4 -(CH2)n Y N N -(CH2)n (CH2)m B C dans lesquelles: Y représente un atome d'azote ou un groupe méthylène, R4 représente un atome d'hydrogène, un groupe C1_4 alkyle, ou un benzyle, nest égal à 0 ou 1, et m est égal à 0 ou 1. 2 2792318 Un autre objet de l'invention est représenté par les composés de formule (II) R4 N-O O/ f O -(CH, R X-2)n(CH2)n m O R5 dans laquelle: R6 A, X, m, n et R1 sont tels que définis précédemment et R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un groupe Cl4 alkyle, un phényle ou un benzyle. Dans la présente demande: - Cl-4 alkyle représente une chaîne carbonée pouvant avoir de 1 à 4 atomes de carbone, telle que par exemple un méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle ou tert- butyle, - le terme alkyle ou alcoxy représente respectivement un alkyle ou alcoxy à chaîne carbonée linéaire ou ramifiée, et - halogène représente un atome d'iode, brome, chlore ou fluor. Les composés de formule générale (I) ou (II) peuvent comporter un ou plusieurs atomes de carbone asymétrique. Ils peuvent donc exister sous forme d'énantiomères ou de diastéréoisomères. Ces énantiomères, diastéréoisomères, ainsi que leurs mélanges, y compris les mélanges racémiques, font partie de l'invention. Les composés de formule générale (I) ou (II) peuvent se présenter sous forme de base libre, de dérivés N-oxydes ou de sels d'addition à des acides pharmaceutiquement acceptables, qui font également partie de l'invention. Les composés préférés selon l'invention sont les composés de formule (I) pour lesquels A représente un groupe de formule C, plus particulièrement ceux pour lesquels A représente un groupe de formule C et X représente un atome d'oxygène. Parmi 3 2792318 ces derniers, les composés pour lesquels m=0 et n=0 sont préférés et plus particulièrement ceux pour lesquels R4 représente un méthyle. Parmi ceux-ci les composés de formule (I) dans laquelle R2 représente (CH2)2-OH ou -CH2-C(O)OH, plus particulièrement -CH2-C(O)OH, lorsque R3 représente un atome d'hydrogène, sont préférés. Les composés de l'invention peuvent être préparés par bio- transformation des composés de formule (III) O X-A XN R5 R6 dans laquelle Rl, R5, R6, A et X sont tels que définis pour le composé de formule (I) ou (II). Plus particulièrement, les composés de formule (I) sont préparés par biotransformation des composés de formule (III) dans laquelle R5 et R6 représentent chacun un atome d'hydrogène. Ainsi, les composés de formule (I) ou (II) peuvent être préparés par biotransformation des composés de formule (III) in vitro par incubation avec des hépatocytes en culture primaire selon des méthodes connues de l'homme du métier. Alternativement, les composés de formule (I) dans laquelle R2 représente -CH2-C(O)OH lorsque R3 représente un atome d'hydrogène, peuvent être préparés par une oxydation microbiologique selon des méthodes connues de l'homme du métier, par exemple, par oxydation enzymatique en présence de cytochrome P450 de champignons filamenteux. Les composés de formule (III) sont décrits dans la demande de brevet PCT/FR98/02221. Les exemples suivants illustrent les procédés et techniques appropriées pour la préparation de cette invention, sans toutefois limiter l'étendue de la revendication. Les spectres de masse, RMN et/ou microanalyses confirment les structures. EXEMPLE 1: 1.1 Préparation des hépatocytes Les hépatocytes de souris et de rat ont été préparés selon la procédure après dissociation à la collagénase. Les hépatocytes humains ont été préparés à partir de biopsies obtenues par le Laboratoire de Biochimie de l'Hôpital Paul Brousse à Villejuif en accord avec le comité d'éthique de10 l'Hôpital. Les hépatocytes de chien et de singe cryoconservés ont été obtenus auprès de Bioprédic (Liverbeads) (Rennes, France). 1.1 Préparation des composés selon l'invention Le chlorhydrate de 7,8-dihydropyrazolo[1,5,4- de][1,4]benzoxazine-2-carboxylate de endo-8-méthyl-8- azabicyclo[3.2.lloct-3-yle est mis à incuber avec les hépatocytes de l'espèce choisie à une concentration de 20pM. Après 24 h d'incubation, les composés de formule (I) ou (II) ont été isolés par HPLC (colonne Kromasil C8 5p, éluant: acetate d'ammonium 15mM, pH4/ acétonitrile)à partir du surnageant extra-cellulaires et identifiés par LC/ESI-MS (Electrospray, HP/MSD, Hewlett Packard) et par LC/ESI-MS/MS (Quattro I, VG).(voir tableaux) EXEMPLE 2: 240 mg de chlorhydrate de 7,8-dihydropyrazolo[1,5,4- de] [1,4]benzoxazine-2-carboxylate de endo-8-méthyl-8- azabicyclo[3.2.1]oct-3-yle sont mis à incuber en présence d'une souche de champignons filamenteux Cunninghamella echinulata NRRL 3655 pendant un mois à 27 C, sous agitation orbitalaire. La biomasse est alors éliminée par filtration, et le filtrat évaporé partiellement est extrait à l'acétate d'éthyle. La phase aqueuse contenant le 7-(carboxyméthoxy)1H-indazole-3-carboxylate de 8-méthyl-8-azabicyclo[3.2.1]oct-3-yle est évaporée à sec puis lavée avec un mélange dichlorométhane/méthanol. L'insoluble est essoré et le filtrat concentré est purifié par chromatographie sur gel de silice (solvant d'élution: dichlorométhane 80%/méthanol 20%). Les fractions contenant 7-(carboxyméthoxy) -lHindazole-3-carboxylate de 8-méthyl-8-azabicyclo[3.2.1]oct-3-yle sont repurifiées par HPLC préparative (Kromasil C8, 5p) pour donner 15 mg 7-(carboxyméthoxy)-lH-indazole-3-carboxylate de endo- 8-méthyl-8azabicyclo[3.2.1]oct-3-yle MS (API, ES+): m/z 360 (M + 1); 301; 124 Composition élémentaire: m/z = 360.1536 (calc. 360.1524) pour C18H21N30 RMN 1H (en ppm):7.7 (d, 1H); 7.2 (t, 1H); 6.8 (d, 1H); 5.3 (m, 1H); 4.55 (s, 2H); 2.5 (s, 3H); 2-2,5 (m, 8H). RMN 13C(en ppm): 68.6 (t); 70 (d); 107 (d); 114.3 (d); 125.6 (d); 137 (s); 147 (s); 166 (s); 178 (s). EXEMPLE 3 En appliquant les méthodes décrites selon l'exemple 1 ou 2, d'autres composés selon l'invention peuvent être synthétisés. Les tableaux qui suivent illustrent les composés obtenus selon l'exemple 1 ou 2. 6 2792318 Tableau 1 O R4 R1x 3 O R3 R2 B C R2 (I) no R1 R2 R3 R4 X A m n Y MS (API, ES') (M+1) 1H CH3 O Ce 0 0 - 344 XN- Or'OH 2 H H -(CH2)2 -OH CH3 0 Ce 0 0 346 3 H H -CH2-C(O)OH CH3 O Ce 0 0 - 360 4 H -(CH2) 2 -OH H CH3 O Ce 0 0 - 346 H -CH2-C(O)OH H CH3 0 Ce 0 0 - 360 Dans la colonne A Ce" indique que le composé C est sous forme endo. Tableau 2 R N-O- o R,/ N X -(CH2)n H2)m Ri NN OC R5 R6 (II) n R1 R5 R6 R4 X m n MS(API ES+) (M+1) 6 H H H CH3 O 0 0 344 7 2792318 Les composés de formule (I) selon l'invention, ont fait l'objet d'essais pharmacologiques qui ont montré leur intérêt comme substances actives en thérapeutique. Ils ont en particulier été testés quant à leurs effets inhibiteurs de la liaison du [3H]-(S)-zacopride avec les récepteurs sérotoninergiques de type 5-HT3 du cortex de rat, selon la méthode décrite par N.M. Barnes et Coll., dans J. Pharm. Pharmacol., 40, 548-551 (1988). Des rats mâles Sprague-Dawley (OFA, Iffa credo) de 200 à 250 g sont euthanasiés et leur cerveau est prélevé. On dissèque le cortex et on l'homogénéise à l'aide d'un broyeur Polytron (position 7,20 s) dans 20 volumes de tampon Tris 25 mM (pH = 7,4, 22 C). On centrifuge l'homogénat pendant 10 min à 45000xg (dans une centrifugeuse SORVALL munie d'un rotor SS34), puis le culot est remis en suspension dans 10 volumes de tampon Tris et incubé à 37 C pendant 10 min sous agitation. On dilue ensuite la suspension à 20 volumes à l'aide de tampon Tris et on centrifuge dans les mêmes conditions que précédemment. Le culot obtenu est remis en suspension dans 5 volumes de tampon Tris puis réparti en fractions aliquotes de 5 ml qui sont congelées à -80 C. Le jour de l'expérience, la préparation est décongelée à 4 C puis diluée 1,2 fois à l'aide du tampon d'incubation Tris- NaCl (Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH = 7,4, 220C). La suspension membranaire (100 Ml, 1 mg de protéines) est incubée à 25 C pendant 25 min en présence de 0,5 nM de [3H]- (S)-zacopride (activité spécifique: 75-85 Ci/mmole, Amersham, Little Chalfont, Royaume-Uni) dans un volume final de 500 Ml de tampon TrisNaCl, en l'absence ou en présence du composé à tester. On arrête l'incubation par filtration en utilisant des filtres Whatman GF/B préalablement traités avec de la polyéthylènimine (0,1 %). Chaque tube réactionnel est prédilué avec 4 ml de tampon Tris-NaCl puis rincé 3 fois avec 4,5 ml de tampon Tris-NaCl. Les filtres sont prédécoupés avant séchage dans l'étuve (120 C, 5 min). La radioactivité retenue sur les filtres est mesurée par scintigraphie liquide. La liaison non spécifique 8 2792318 est déterminée en présence de 10 MM de MDL 72222 (ligand décrit dans l'article N. M. Barnes et coll. ci-dessus référencé). Pour chaque concentration de composé étudié, on détermine le pourcentage d'inhibition de la liaison spécifique du [3H]- (S)-zacopride, puis la concentration du composé inhibant 50 % de la liaison spécifique du [3H]-(S)-zacopride (CI50). Les CI50 des composés de l'invention se situent entre 0,5 rnM et 3 MM. Les composés de l'invention ont été étudiés quant à leurs effets antagonistes vis-à-vis des récepteurs 5-HT3 du muscle lisse de côlon descendant isolé de cobaye, selon la méthode décrite par Grossman et coll. dans Br. J. Pharmacol. (1989) 97 451. La sérotonine (0,1-100 MM), après blocage des récepteurs de types 5-HT1 et 5-HT2 (Méthysergide 0,1 MM) et désensibilisation des récepteurs 5-HT4 (5-méthoxytryptamine MM) provoque une contraction, dépendante de la concentration, de la partie musculaire lisse du côlon descendant de cobaye, par stimulation des récepteurs 5-HT3. Les contractions sont enregistrées en isométrie. L'effet antagoniste d'un composé sur les récepteurs sérotoninergiques 5HT3 est quantifié par la mesure du déplacement d'une courbe effetconcentration témoin de sérotonine (concentrations successives croissantes non cumulées), à des concentrations comprises entre 1 nM et 0,1 MM, avec une incubation de 30 min. Les composés de l'invention ont également été étudiés quant à leur affinité vis-à-vis des récepteurs 5- HT4 dans le striatum de cobaye, selon la méthode décrite par Grossman et coll., dans Br. J. Pharmacol., 109, 618-624 (1993). On euthanasie des cobayes (Hartley, Charles River) de 300 à 400 g et on prélève leur cerveau. On excise les striata et on les congèle à -80 C. Le jour de l'expérience, on décongèle le tissu à +4 C dans 33 volumes de tampon Hépès-NaOH 50mM (pH = 7,4 à 20 C) et on l'homogénéise à l'aide d'un broyeur Polytron'. On centrifuge l'homogénat pendant 10 min à 9 2792318 48000xg, on récupère le culot, on le remet en suspension et on le centrifuge de nouveau dans les mêmes conditions. On suspend le culot final dans du tampon Hépès-NaOH (30 mg de tissu frais/ml). Cette suspension membranaire est utilisée telle quelle. On incube 100 M1 de la suspension membranaire à 0 C pendant min, en présence de 0,1 nM de [3H]GR113808 (activité spécifique: 80-85 Ci/mmole), dans un volume final de 1 ml de tampon Hépès-NaOH (50 mM, pH = 7,4), en l'absence ou en présence du composé à tester. On arrête l'incubation par filtration sur filtres Whatman GF/B , préalablement traités avec de la polyéthylèneimine 0,1 %, on rince chaque tube par 4 ml de tampon à 0 C et on filtre de nouveau. On mesure la radioactivité retenue sur les filtres, par scintigraphie liquide. On détermine la liaison non spécifique en présence de sérotonine 30 iM. La liaison spécifique représente 90% de la radioactivité totale récupérée sur le filtre. Pour chaque concentration de composé étudié, on détermine le pourcentage d'inhibition de la liaison spécifique du [3H]GR113808, puis la concentration du composé testé qui inhibe 50% de la liaison spécifique (CI50). Les CI50 des composés de l'invention se situent entre 1 nM et 2MM. Enfin, les composés de l'invention ont été étudiés quant à leurs effets agonistes ou antagonistes vis-à-vis des récepteurs 5-HT4 dans l'oesophage de rat selon la méthode décrite par Baxter et coll., dans Naunyn Schmied Arch. Pharmacol. (1991), 343, 439. On utilise des rats mâles Sprague Dawley pesant de 300 à 450 g. On prélève rapidement un fragment d'environ 1,5 cm de la partie terminale de l'oesophage, on élimine la couche musculaire, on ouvre longitudinalement la tunique muqueuse musculaire interne, on la monte dans une cuve à organe isolé contenant une solution de Krebs-Henseleit à 32 C oxygénée par un courant carbogène (95% 02 et 5% CO2), et on la connecte à un transducteur isométrique sous une tension basale de 0,5 g. On induit une contraction du tissu par l'addition de 0,5 pM de carbachol, on attend que la contraction se stabilise (15 2792318 min), puis on expose la préparation au composé à étudier, en concentration cumulées croissantes de 0,1 nM à 1 MM. Les composés qui induisent une relaxation sont caractérisés comme des agonistes 5-HT4. Pour les composés qui n'induisent pas de relaxation, la préparation est exposée à la sérotonine en concentrations cumulées croissantes, de 0,1 nM jusqu'à une concentration induisant une relaxation maximale, et la courbe de relaxation due à la sérotonine, en présence du composé à étudier, est alors comparée à une courbe témoin établie en l'absence du dit composé. Si sa présence induit un déplacement de la courbe vers la droite, le composé étudié est caractérisé comme un antagoniste 5-HT4. Les pKb des composés selon l'invention se situent entre 5 et 10. Ils peuvent donc être utilisés pour la préparation de médicaments destinés à agir en tant qu'antagonistes des récepteurs sérotoninergiques 5-HT3 et 5-HT4. Ainsi, les composés de l'invention de formule (I), sont particulièrement utiles pour le traitement et/ou la prévention des troubles fonctionnels intestinaux tels que la les troubles moteurs et sécrétoires intestinaux, les troubles de la sécrétion intestinale, du côlon irritable, de la viscérosensibilité, des douleurs intestinales, diarrhée, mais également du reflux oesophagien,; de la fibrose kystique du pancréas, du syndrome carcinoide; de l'incontinence urinaire ou intestinale, du mégacôlon. D'autre part, les composés de l'invention, de part leur affinité vis à vis des récepteurs 5-HT3 peuvent encore être utilisés en vue du traitement et/ou de la prévention des nausées et vomissements, par exemple consécutifs à un traitement antitumoral ou à l'administration d'un anesthésique; du spasme oesophagien; des troubles du système nerveux central tels que la schizophrénie, la manie, l'anxiété et la dépression; des troubles de la cognition tels que la démence sénile du type de la maladie d'Alzheimer 11i 2792318 ou démences liées à l'âge, les déficits de mémoire et d'attention, les déficiences cérébrales vasculaires, la maladie de Parkinson; les psychoses; la dyskinésie, les douleurs, migraines et maux de tête; des troubles de la 5 dépendance ou du sevrage de l'alcool ou de drogues; des troubles de la fonction gastro-intestinale tels que dyspepsie, ulcère peptique, aigreurs d'estomac, flatulences; des troubles du système cardio- vasculaire et des troubles respiratoires. Les composés de l'invention, en association avec des excipients appropriés, peuvent être présentés sous toutes formes convenant à une administration orale ou parentérale, telles que comprimés, dragées, gélules, capsules, suspensions ou solutions buvables ou injectables, et dosées pour permettre une administration de 0,005 à 10 mg/kg, 1 à 4 fois par jour. 12 2792318 Revendications 1. Composé de formule (I) o X-A O R3 dans laquelle: R2 R1 représente un atome d'hydrogène, un halogène, un groupe Cl-4 alcoxyle, méthyle, hydroxy ou amino, R2 représente -(CH2)2-OH ou -CH2-C(O)OH lorsque R3 représente un atome d'hydrogène, ou R2 représente un atome d'hydrogène lorsque R3 représente-(CH2)2-OH ou -CH2-C(O)OH, ou R2 et R315 sont liés pour former un des cycles représentés ci-dessous: 0 0 O- OH OH X représente un atome d'oxygène, un groupe -NH- ou -N(Cl_4 alkyle)-, et A est un groupe de formule B ou C N4 -(CH2)n y Y N -(CH2) (CH2) 2)m B C dans lesquelles: Y représente un atome d'azote ou un groupe méthylène, R4 représente un atome d'hydrogène, un groupe Cl_4 alkyle, ou un benzyle, n est égal à 0 ou 1, et m est égal à 0 ou 1, et éventuellement sous forme d'énantiomère, de diastéréoisomère, y compris de mélange racémique ainsi que les dérivés N-oxydes et sels d'addition à des acides pharmaceutiquement acceptables d'une de ces formes. 13 2792318 2. Composé de formule (I) selon la revendication 1 caractérisé en ce que A représente un groupe de formule C. 3. Composé de formule (I) selon la revendication 2 caractérisé en ce que X représente un atome d'oxygène, m= 0, n=0. 4. Composé de formule (I) selon la revendication 3 caractérisé en ce que R4 représente un méthyle. 5. Composé de formule (II) R4 N-O +NO- Ri1 X -(CH2)n (CH2)m R1 N (II) is (Nz) OCJ'R5 dans laquelle: R6 X, m, n et R1, R4 sont tels que définis dans la revendication 1 et, R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un groupe Cl14 alkyle, un phényle ou un benzyle et éventuellement sous forme d'énantiomère, de diastéréoisomère, y compris de mélange racémique ainsi que les sels d'addition à des acides pharmaceutiquement acceptables d'une de ces formes.25 6. Procédé de préparation d'un composé selon la revendication 1 ou 5 par biotransformation d'un composé de formule (III) O X-A R1 N o R5 (III) R6 dans laquelle A, X, Rl, R5 et R6 sont tels que définis dans la revendication 1 et 5. 7. Médicament caractérisé en ce qu'il est constitué par un composé selon la revendication 1 ou 5. 14 2792318 8. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un composé selon la revendication 1 ou 5 et un ou plusieurs excipients.