FR 2789588 A1 20000818 FR 9901917 A 19990217 L'invention concerne l'utilisation d'une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie, notamment de Klebsiella pneumoniae, associée à un antigène ou un haptène pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse T cytotoxique dirigée contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. L'invention comprend l'utilisation de ces composés pour la prévention et le traitement d'infection ou du cancer, notamment les cancers associés à un antigène tumoral tels que les mélanomes, ainsi que des compositions pharmaceutiques comprenant certains de ces composés. La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Le succès des campagnes de vaccination dans ces domaines a permis d'étendre le concept de vaccin jusqu'alors utilisé dans le domaine de l'infectiologie aux domaines du cancer et des maladies auto-immunes. Les antigènes vaccinaux administrés seuls chez l'hôte ne sont souvent pas assez immunogéniques pour induire une réponse immunitaire, et doivent donc être associés à un adjuvant ou couplés à une protéine porteuse pour induire (ou augmenter) leur immunogénicité. Dans ces conditions, seule une réponse immune de type humorale peut être induite. Or, dans le cadre d'une thérapie antivirale, la génération de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de reconnaître et de détruire le virus est de toute importance (Bachmann et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24,2228-2236 ; Borrow P., 1997, J. Virol. Hepat., 4,16-24), comme l'attestent de nombreuses études montrant, in vivo, le rôle protecteur des réponses dirigées contre les épitopes viraux (Arvin AM, 1992, J. Inf. Dis., 166, S35-S41 ; Koszinowski et al., 1987 Immunol. Lett., 16,185- 192). L' importance des réponses CTL a aussi été fortement documentée dans les réponses antitumorales notamment celles dirigées contre les cellules de mélanome (revue dans Rivoltini et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18,55-63). Le ou les épitopes CTL (séquences peptidiques interagissant avec les molécules de classe 1 et présentés aux lymphocytes T CD8+) ont été définis pour plusieurs antigènes. Cependant, la difficulté réside dans la génération de CTL in vivo, due à la faible immunogénicité de ces peptides (Melief, 1992, Adv. Cancer Res., 58, 143-175 ; Nandaz et Sercaz, 1995, Cell, 82,13-17). Des recherches s'orientent par conséquent vers l'identification de nouveaux adjuvants, ou de système de délivrance d'antigènes ( delivery system ), permettant d'induire des CTL. Grâce à leur efficacité à présenter les antigènes et à stimuler le système immunitaire, les cellules dendritiques, par exemple, ont été utilisées pour générer des réponses CTL antivirales (Ludewig B et al., 1998, J. Virol., 72,3812- 3818 ; Brossard P. et al., 1997, J. Immunol., 158,3270-3276) ou anticancéreuses (Nestle F. O. et al., 1998, Nat. Med., 4,328-332). Les approches ont consisté à charger les cellules dendritiques ex vivo avec l'antigène d'intérêt (peptides ou lysat cellulaire) et réimplanter ces cellules chez le patient. D'autres approches consistent à transfecter ex vivo les cellules dendritiques avec le gène codant pour l' antigène d'intérêt et à réinjecter ces cellules transfectées (Gilboa E. et al., 1998, Cancer Immunol. Immunother., 46,82-87). Ces approches ont été utilisées avec succès chez la souris et récemment chez l' homme (Hsu F. J. et al., 1996, Nat. Med., 2,52-58) mais restent néanmoins complexes dans la mesure où ces cellules doivent être traitées ex vivo (transformation des cellules ou internalisation des antigènes) et transplantées dans l'organisme hôte. De même, l'utilisation de particules de type viral (Layton G.T. et al., 1993, J. Immunol., 151,1097-1107) ou de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA) (Valmori et al., Eur. J. Immunol., 1994,24, 1458-1462) permet de générer des réponses CTL. Toutefois, une vaccination antivirale ou antitumorale réalisée avec des peptides correspondant à des épitopes CTL et en présence d'un tel adjuvant peuvent conduire à un état de tolérance spécifique qui peut conduire dans certains cas à l'effet contraire recherché, c'est-à-dire à une diminution de la réponse immune (Toes et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996,93, 7855-7860). Ainsi, il existe aujourd'hui un grand besoin de disposer d'un composé qui, associé à une molécule, notamment un antigène ou haptène, soit capable de générer des CTL dirigés contre ladite molécule. Un tel composé pourrait en particulier être utilisé pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à induire une protection immunitaire de type CTL antiviral, antibactérien, antifongique ou antiparasitaire, ou antitumoral. De manière surprenante, il a été mis en évidence qu'une protéine de la membrane externe de bactérie à gram négatif, notamment une protéine OmpA d'entérobactérie telle que la protéine P40 de Klebsiella pneumoniae (protéine décrite dans WO 95/27787 et WO 96/14415), a la propriété d'éliciter une réponse CTL contre une molécule qui lui est associée de manière covalente ou non, de préférence sans recours à l'addition d'un autre adjuvant. Ainsi, la présente invention est relative à l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie, d'un de ses fragments ou d'une séquence nucléique codant pour ladite protéine OmpA ou l'un~de ses fragments pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale, in vitro ou in vivo, de préférence in vivo, ainsi que pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître ladite réponse T cytotoxique. Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme protéine également les peptides ou les polypeptides et par le terme OmpA (pour Outer Membrane Protéin ), les protéines de la membrane externe de type A. Par fragment d'une protéine OmpA, on entend désigner en particulier tout fragment de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés de la protéine OmpA qui, lorsqu'il est associé à un antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'une cellule tumorale, est capable de générer ou accroître une réponse T cytotoxique dirigée contre ledit agent infectieux ou ladite cellule tumorale, ledit fragment de la protéine OmpA comprenant au moins 5 acides aminés, de préférence au moins 10 acides aminés ou de manière plus préférée au moins 15 acides aminés. Par antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'une cellule tumorale , on entend désigner en particulier tout composé exprimé par un agent infectieux, tel qu'un virus, une bactérie, une levure, un champignon ou un parasite, par une cellule tumorale, ou un de leurs analogues structuraux, qui seul ou en association avec un adjuvant de l'immunité est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale. Par analogue d'un antigène ou haptène, on entend désigner en particulier dans la présente description un composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène ou haptène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène ou haptène dans un organisme préalablement immunisé avec ledit composé analogue. L'invention a également pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre, associé à ladite protéine OmpA d'entérobactérie, un antigène ou un haptène spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale. De préférence, l'invention comprend l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit agent infectieux est une particule virale, une bactérie, une levure, un champignon ou un parasite. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention comprend l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie. Les procédés d'extraction de protéines de membrane bactériennes sont connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés dans la présente description. On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter le procédé d'extraction décrit par Haeuw J.H. et al. (Eur. J. Biochem, 255,446-454, 1998). Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention comprend également l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par voie recombinante. Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description, on pourra néanmoins se référer à la méthode décrite dans les exemples. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, il faut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins P. O. et Lee S.C., 1993, Récent advances in heterologous gene expression in E. coli. Curr. Op. Biotechnology 4:520-525), mais également les cellules de levure (Buckholz R.G., 1993, Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gene Products. Curr. Op. Biotechnology 4 :538-542), même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifère (Edwards C. P. et Aruffo A., 1993, Current applications of COS cell based transient expression systems. Curr. Op. Biotechnology 4 :558-563) également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus (Luckow V.A., 1993, Baculovirus systems for the expression of human gene products. Curr. Op. Biotechnology 4:564-572). De manière tout à fait préférée, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ladite entérobactérie est Klebsiella pneumoniae. En particulier, l'invention est relative à l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae, ou l'un de ses fragments, comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N 2 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80, de préférence 90 %, avec la séquence SEQ ID N 2 ; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés d'une séquence telle que définie en a) ou b). Par séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec une séquence d'acides aminés déterminée, on entend désigner une séquence qui après alignement avec ladite séquence déterminée comprend au moins 80 % d'acides aminés en commun avec ladite séquence déterminée. L'invention comprend en outre l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est choisi parmi les protéines, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques, les lipides ou tout composé capable de diriger spécifiquement la réponse CTL contre ledit agent infectieux ou ladite cellule tumorale. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé ou mélangé avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments. L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé par liaison covalente, notamment par couplage chimique, avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments. Dans un mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit antigène ou haptène pour faciliter le couplage chimique, de préférence, ledit élément de liaison introduit est un acide aminé. Selon l' invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et ledit antigène ou haptène. Le couplage covalent entre la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et ledit antigène ou haptène selon l'invention peuvent être réalisés à l'extrémité N- ou C- terminale de la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité de la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, choisie pour effectuer le couplage et de la nature dudit antigène ou haptène à coupler. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que le couplage entre ledit antigène ou haptène et ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, est réalisé par recombinaison génétique, lorsque ledit antigène ou haptène est de nature peptidique. Les conjugués issus d'un couplage à ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, peuvent être préparés par recombinaison génétique. La protéine chimérique ou hybride (conjugué) peut être produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, d'une séquence codant pour ledit antigène ou haptène de nature protéique. Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D. V. Goeddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185, 3-187, 1990). Sous un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride, ou comprend un vecteur contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride ou une cellule hôte transformée contenant ladite construction nucléique capable d'exprimer ladite protéine hybride. L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à éliminer les agents infectieux ou à inhiber la croissance de tumeurs. De préférence, l'utilisation selon l'invention est relative à la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les maladies infectieuses ou les cancers, de préférence les cancers associés à un antigène tumoral. Parmi les cancers dont les tumeurs expriment un antigène tumoral associé pouvant être prévenus ou traités par les utilisations selon la présente invention, on peut citer en particulier, mais sans s'y limiter : # le cancer du sein, du poumon, du colon, et le carcinome gastrique (Kawashima et al., 1999, cancer Res. 59 :431-5) ; # le mésothéliome, l'ostéosarcome, les cancers du cerveau (Xie et al., 1999, J. Natl. Cancer. Inst. 91:169-75) ; # le mélanome (Zheuten et al., 1998, Bratilsl. Lek. Listy 99:426-34) ; # l'adénome cystique du pancréas (Hammel et al., 1998, Eur. J. gastroenterol. Hepatol. 10:345-8) ; # le cancer colorectal (Ogura et al., 1998, Anticancer Res. 18:3669-75) ; # le carcinome des cellules rénales (Jantzer et al., 1998, Cancer Res. 58:3078-86) ; et # le cancer de l'ovaire et du cervix (Sonoda et al., 1996, Cancer. 77:1501-9). L'invention a en particulier pour objet l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique vaccinale destinée à prévenir ou à traiter une maladie infectieuse, notamment d'origine virale, bactérienne ou fongique, ou parasitaire, ou un cancer, de préférence associé à un antigène tumoral, en particulier les mélanomes. L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité, notamment sous la forme d'un liposome. De préférence, l'invention comprend l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit véhicule est un vecteur viral contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments, ledit antigène ou haptène, ou ladite protéine hybride, ou une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit antigène ou haptène, ou ladite protéine hybride. Sous un dernier aspect, l'invention comprend l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite construction nucléique, ou la construction nucléique contenue dans ledit vecteur ou ladite cellule hôte transformée, comprend une séquence nucléique choisie parmi la séquence SEQ ID N 1, l'un de ses fragments présentant au moins 15 nucléotides, de préférence 30 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N 1, ou une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec l'une desdites séquences. Par séquence nucléique d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec une séquence nucléique déterminée, on entend désigner une séquence qui après alignement avec ladite séquence déterminée comprend au moins 80 % de nucléotides en commun. Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l' invention sans aucunement en limiter la portée. Légendes des figures : Figures lA, 1B, 1C et ID : Mesure de l'activité CTL de cellules effectrices Après immunisation avec 50 g hELA mélangé avec 3 g rP40 (figure 1A), 50 g hELA mélangé avec 300 g rP40 (figure 1B), 50 g hELA couplé à rP40 (figure 1C), ou 50 g du peptide TRP-2 mélangé avec 300 g rP40 (figure ID), les cellules de ganglions drainants sont stimulées avec des cellules EL-4 A2/Kb (figures lA, 1B, 1C) ou EL-4 (figure ID) irradiées et pré-pulsées avec 1 M du peptide relevant avant d'être évaluées pour leur capacité à tuer des cellules cibles pré-pulsées (rectangle) ou non (losange) avec le peptide relevant. Les abscisses des repères des figures 1A à 1D correspondent au rapport des cellules T effectrices (lymphocytes activés) mises en présence sur les cellules cibles (EL-4 A2/Kb ou EL-4). Exemple 1 : Clonage du gène codant pour la protéine P40 de Klebsiella pneumoniae Le gène codant pour la protéine P40 a été obtenu par amplification par PCR à partir de l'ADN génomique de Klebsiella pneumoniae IP I145 (Nguyen et col., Gène, 1998). Le fragment de gène codant de ce gène est inséré dans divers vecteurs d'expression sous contrôle de différents promoteurs, en particulier celui de l'opéron Trp. La séquence nucléotidique et la séquence peptidique de la protéine P40 sont représentées par les séquences SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2 ci-après. Une souche productrice E. coli K12, a été transformée par un vecteur d'expression pvaLP40. La protéine recombinante P40 (dénommée rP40) est produite sous forme de corps d'inclusion avec un rendement important (> 10 % en g de protéines/g de biomasse sèche). Cet exemple n'est qu'une illustration de l'expression de la protéine rP40, celleci pouvant être étendue à d'autres souches bactériennes ainsi qu'à d'autres vecteurs d'expression. Exemple 2 : de fermentation de protéines de fusion rP40 Dans un erlenmeyer contenant 250 ml de milieu TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) renfermant de l'Ampicilline (100 g/ml, Sigma) et de la Tétracycline (8 g/ml, Sigma) on inocule avec la souche E. coli transformée décrite ci-dessus. On incube pendant une nuit à 37 C puis, 200 ml de cette culture sont utilisés pour ensemencer 2 litres de milieu de culture dans un fermenteur (Biolafitte, France). De manière assez classique, le milieu de culture peut être composé d'agents chimiques, supplémentés par les vitamines, des extraits de levure, connus pour favoriser une croissance de cellules bactériennes à densité élevée. Les paramètres contrôlés durant la fermentation sont : le pH, l'agitation, la température, le taux d'oxygénation, l'alimentation de sources combinées (glycérol ou glucose). De manière générale, le pH est régulé à 7,0, la température est fixée à 37 C. La croissance est contrôlée en alimentant en glycérol (87 %) à un débit constant (12 ml/h) pour maintenir le signal de tension de l'oxygène dissous à 30 %. Lorsque la turbidité de la culture (mesurée à 580 nm) atteint la valeur de 80 (après environ 24 heures de culture), la production des protéines est déclenchée par addition de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de 25 mg/1. Environ 4 heures après induction, les cellules sont récoltées par centrifugation. La quantité de biomasse humide obtenue est d'environ 200 g. Exemple 3 : Procédé d'extraction et de purification de la protéine rP40 Extraction de la rP40 Après centrifugation du bouillon de culture (4000 rpm, 10 min, 4 C), les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 8,5. Les insolubles, ou corps d' inclusion, sont obtenus après un traitement par le lysozyme (0,5 g/litre, 1 heure à température ambiante sous agitation douce). Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (15 min à 10 000 g à 4 C) est repris dans un tampon Tris-HCl, 25 mM à pH 8,5 et 5 mM MgCl2, puis centrifugé (15 min à 10 000 g). On solubilise les corps d'inclusion à 37 C pendant 2 heures dans un tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 8,5 contenant 7 M urée (agent dénaturant) et 10 mM de dithiothréitol (réduction des ponts disulfures). Une centrifugation (15 min à 10 000g) permet d'éliminer les particules non solubles. On resuspend ensuite dans 13 X volumes de tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 8,5 contenant du NaCl (8,76 g/1) et du Zwittergent 3-14 (0,1 %, p/v). La solution est laissée pendant une nuit à température ambiante sous agitation douce au contact de l'air (favoriser la renaturation de la protéine par dilution et réoxydation des ponts disulfures). Purification de la protéine rP40 - Etape de chromatographie d'échange d'anions. Après une nouvelle centrifugation, la solution est dialysée contre un tampon Tris-HCI, 25 mM, pH 8,5 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 (100 X volumes de tampon) pendant une nuit à 4 C. Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur d'anions forts (gel Biorad Macro Prop High Q) équilibrée dans le tampon décrit cidessus, à un débit linéaire de 15 cm/h. Les protéines sont détectées à 280 nm. La protéine rP40 est éluée, avec un débit linéaire de 60 cm/h, pour une concentration de 0,2 M en NaCI dans le tampon Tris-HCl 25 mM, pH 8,5 : % Zwittergent 3-14. - Etape de chromatographie d'échange de cations. Les fractions contenant la protéine rP40 sont poolées et concentrées par ultrafiltration à l'aide d'un système de cellule à agitation Amicon utilisé avec une membrane Diaflo de type YM10 (seuil de coupure 10 kDa) pour des volumes de l'ordre de 100 ml, ou à l'aide d'un système de filtration à flux tangentiel Minitan Millipore utilisé avec des plaques de membranes possédant un seuil de coupure 10 kDa pour des volumes supérieurs. La fraction ainsi concentrée est dialysée pendant une nuit à 4 C contre un tampon citrate 20 mM pH 3,0, à 0,1 % de Zwittergent 3-14. Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur de cations forts (gel Biorad Macro Prep High S) équilibrée dans le tampon citrate 20 mM, pH 3,0, à 0,1 % de Zwittergent 3-14. La protéine rP40 est éluée (vitesse 61 cm/h) pour une concentration 0,7 M en NaCl. Les profils électrophorétiques montrent un degré de pureté de l'ordre de 95 %. L'état de la protéine est suivi par SDS-PAGE. Selon sa forme dénaturée ou native, la protéine P40, extraite de la membrane de Klebsiella pneumoniae, possède un comportement électrophorétique (migration) caractéristique. La forme native (structure en feuillets P) présente en effet une masse moléculaire plus faible que la forme dénaturée (structure en hélices a) sous l'action d'un agent dénaturant, tel que l'urée ou le chlorhydrate de guanidine, ou par chauffage à 100 C en présence de SDS. La protéine rP40 n'est pas correctement renaturée en fin de renaturation, que celle-ci soit réalisée en absence ou en présence de 0,1% ; (p/v) Zwittergent 3-14. En revanche, une renaturation totale est obtenue après dialyse contre un tampon Tris/HCI 25 mM pH 8,5 contenant 0,1 % (p/v) Zwittergent 3-14. Toutefois, il faut noter que cette renaturation n'est obtenue que, lorsque l'étape de dilution et le traitement à température ambiante, sont réalisés euxmêmes en présence de Zwittergent 3-14 (résultats négatifs en absence de détergent). Exemple 4 : génération de CTL anti-Melan-A après immunisation par rP40 mélangé à un peptide analogue au Melan-A Le peptide hELA, utilisé dans les expériences ci-dessous, est l'objet du brevet LUD5483. 2, propriété de l'Institut Ludwig de Recherche sur le Cancer. hELA est un analogue du décapeptide 26-35 (EAAGIGILTV) de Melan-A/MART-1, une protéine exprimée sur les mélanocytes et les mélanomes. Bien que le décapeptide 26-35 de Melan-A/MART-1 soit capable de se lier à la molécule HLA-A0201 (Romero et al., 1997, J. Immunol. 159,2366-2374), il est faiblement immunogène in vitro et in vivo (Valmori et al., 1998, J. Immunol. 160,1750-1758). L'analogue hELA a été généré par la substitution du second acide aminé du décapeptide 26-35 de Melan-A/MART-1 (une alanine) par une leucine. Le résultat de cette substitution, qui est basée sur une analyse des résidus nécessaire à l'ancrage des peptides à la molécule HLA-A0201, est une reconnaissance plus efficace par les CTL de patients de mélanome et une meilleure immunogénicité in vitro (Valmori et al. , 1998, J. Immunol. 160,1750- 1758). Des souris transgéniques HLA-A* 0201/Kb (A2/Kb) de souche C57BI/6 x BDA/2 (Vitiello et al., 1991, J. Exp. Med., 173,1007-1015) ont été utilisées dans cette étude pour tester ELA. La molécule MHC de classe I exprimée chez ces souris est une molécule chimérique formée des domaines al et a2 de la molécule humaine HLA-A0201 (allotype le plus fréquemment retrouvé) et du domaine a3 de la molécule murine Kb. Le peptide TRP-2 est un octapeptide correspondant aux acides aminés 181-188 (VYDFFVWL) de la tyrosinase-related protein 2 (TRP-2). TRP-2 est exprimé dans les mélanocytes et les mélanomes. Il a été démontré que cet antigène induit des réponses CTL protectrices du mélanome dans les souris C57BL/6 (H-2Kb) (Bloom et al., 1997, J. Exp. Med. 185,453-459). Protocole expérimental Des souris A2/Kb ont reçu par injection sous-cutanée à la base de la queue : - 50 g ELA mélangés à 3 ou 300 g rP40 ; - 50 g ELA couplés de façon covalente à 300 g rP40. Des souris C57BL/6 ont reçu par injection sous-cutanée à la base de la queue : - 50 g du peptide TRP-2 (181-188) mélangés à 300 g rP40. Génération de cellules cytotoxiques effectrices 10 jours après immunisation, les souris sont sacrifiées et les lymphocytes des ganglions drainant sont récupérés pour être stimulés in vitro avec le peptide relevant. Ces lymphocytes (4 à 5 106) sont cultivés en plaque 24 puits en DMEM plus 10 mM HEPES, 10 % SVF et 50 M (3-2-mercaptoéthanol avec 2 à 5 105 cellules EL- 4 A2/Kb ou EL4 irradiées (10 kRads) pré-pulsées 1 h à 37 C avec 1 M du peptide relevant. Après deux stimulations hebdomadaires, les cellules sont testées pour leur activité cytotoxique. Mesure de l'activité cytotoxique Les cellules EL-4 A2/Kb ou EL4 sont incubées 1 h avec du 51Cr en présence ou non du peptide relevant, lavées puis co-incubées avec les cellules effectrices à différents ratio en plaque 96 puits dans un volume de 200 l pendant 4 à 6h à 37 C. Les cellules sont ensuite centrifugées et le relargage de 51Cr est mesuré dans 100 l de surnageant. Le pourcentage de lyse spécifique est calculé comme suit : % lyse spécifique = (relargage expérimental-relargage spontané)/ (relargage total - relargage spontané) X 100. Résultats Comme le montrent les figures 1A à 1D, l'immunisation de souris avec une dose optimale de rP40 (300 g) en mélange avec hELA (figure 1B) ou TRP-2 (figure 1D) induit une forte réponse CTL spécifique. Une telle réponse est également observée après immunisation avec rP40 couplée à hELA (figure 1C). Par contre, l'immunisation avec le peptide seul ou rP40 seule (résultats non montrés) ou avec le peptide hELA en mélange avec une dose sous-optimale de rP40 (3 g) n'induit aucune activité CTL (figure 1A). Ces résultats démontrent que la molécule rP40 mélangée ou couplée à des peptides immunogènes permet d'induire une réponse CTL spécifique in vivo, et ce sans l'ajout d'adjuvant. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT : (A) NOM : PIERRE FABRE MEDICAMENT (B) RUE : 45 PLACE ABEL GANCE (C) VILLE: BOULOGNE (E) PAYS : (F) CODE POSTAL: 92100 CEDEX (ii) TITRE DE L' INVENTION : D'UNE PROTEINE OMPA D'ENTEROBACTERIE ASSOCIEE A UN ANTIGENE DANS UNE COMPOSITION PHARMACEUTIQUE DESTINEE A GENERER OU ACCROITRE UNE REPONSE CYTOTOXIQUE ANTIVIRALE, ANTIPARASITAIRE OU ANTITUMORALE. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT : disk (B) ORDINATEUR : PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version SI.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Klebsiella pneumoniae (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : exon (B) EMPLACEMENT:1..1032 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (B) EMPLACEMENT:1033..1035 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (B) EMPLACEMENT:1..1032 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 1 : ATG AAA GCA ATT TTC GTA CTG AAT GCG GCT CCG AAA GAT AAC ACC TGG 48 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala AlaPro Lys Asp Asn Thr Trp 1 5 10 15 TAT GCA GGT GGT AAA CTG GGT TGG TCC CAG TAT CAC GAC ACC GGT TTC 96 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe 20 25 30 TAC GGT AAC GGT TTC CAG AAC AAC AAC GGT CCG ACC CGT AAC GAT CAG 144 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln 35 40 45 CTT GGT GCT GGT GCG TTC GGT GGT TAC CAG GTT AAC CCG TAC CTC GGT 192 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly 50 55 60 TTC GAA ATG GGT TAT GAC TGG CTG GGC CGT ATG GCA TAT AAA GGC AGC 240 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser 65 70 75 80 GTT GAC AAC GGT GCT TTC AAA GCT CAG GGC GTT CAG CTG ACC GCT AAA 288 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys 85 90 95 CTG GGT TAC CCG ATC ACT GAC GAT CTG GAC ATC TAC ACC CGT CTG GGC 336 Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly 100 105 110 GGC ATG GTT TGG CGC GCT GAC TCC AAA GGC AAC TAC GCT TCT ACC GGC 384 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly 115 120 125 GTT TCC CGT AGC GAA CAC GAC ACT GGC GTT TCC CCA GTA TTT GCT GGC 432 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140 GGC GTA GAG TGG GCT GTT ACT CGT GAC ATC GCT ACC CGT CTG GAA TAC 480 Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr 145 150 155 160 CAG TGG GTT AAC AAC ATC GGC GAC GCG GGC ACT GTG GGT ACC CGT CCT 528 Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro 165 170 175 GAT AAC GGC ATG CTG AGC CTG GGC GTT TCC TAC CGC TTC GGT CAG GAA 576 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu 180 185 190 GAT GCT GCA CCG GTT GTT GCT CCG GCT CCG GCT CCG GCT CCG GAA GTG 624 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro AlaPro Ala Pro Glu Val 195 200 205 GCT ACC AAG CAC TTC ACC CTG AAG TCT GAC GTT CTG TTC AAC TTC AAC 672 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn 210 215 220 AAA GCT ACC CTG AAA CCG GAA GGT CAG CAG GCT CTG GAT CAG CTG TAC 720 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gin Gin Ala Leu Asp Gin Leu Tyr 225 230 235 240 ACT CAG CTG AGC AAC ATG GAT CCG AAA GAC GGT TCC GCT GTT GTT CTG 768 Thr Gin Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu 245 250 255 GGC TAC ACC GAC CGC ATC GGT TCC GAA GCT TAC AAC CAG CAG CTG TCT 816 Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gin Gin Leu Ser 260 265 270 GAG AAA CGT GCT CAG TCC GTT GTT GAC TAC CTG GTT GCT AAA GGC ATC 864 Glu Lys Arg Ala Gin Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile 275 280 285 CCG GCT GGC AAA ATC TCC GCT CGC GGC ATG GGT GAA TCC AAC CCG GTT 912 Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val 290 295 300 ACT GGC AAC ACC TGT GAC AAC GTG AAA GCT CGC GCT GCC CTG ATC GAT 960 Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp 305 310 315 320 TGC CTG GCT CCG GAT CGT CGT GTA GAG ATC GAA GTT AAA GGC TAC AAA 1008 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys 325 330 335 GAA GTT GTA ACT CAG CCG GCG GGT TAA 1035 Glu Val Val Thr Gin Pro Ala Gly * 340 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 2 : Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe 20 25 30 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln 35 40 45 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly 50 55 60 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser 65 70 75 80 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys 85 90 95 Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly 100 105 110 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly 115 120 125 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140 Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr 145 150 155 160 Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro 165 170 175 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu 180 185 190 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val 195 200 205 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn 210 215 220 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr 225 230 235 240 Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu 245 250 255 Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser 260 265 270 Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile 275 280 285 Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val 290 295 300 Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp 305 310 315 320 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys 325 330 335 Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly 340 REVENDICATIONS 1/ Utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. 2/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre, associé à ladite protéine OmpA d'entérobactérie, un antigène ou un haptène spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale. 3/ Utilisation selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que ledit agent infectieux est une particule virale, une bactérie ou un parasite. 4/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie. 5/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par voie recombinante. 6/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite entérobactérie est Klebsiella pneumoniae. 7/ Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N 2 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID N 2 ; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés d'une séquence telle que définie en a) ou b). 8/ Utilisation selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est choisi parmi les peptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques, les lipides ou tout composé capable de diriger spécifiquement la réponse CTL contre ledit agent infectieux ou ladite cellule tumorale. 9/ Utilisation selon l'une des revendications 2 à 8, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé ou mélangé avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments. 10/ Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé par liaison covalente avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments. 11/ Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que le couplage par liaison covalente est un couplage réalisé par synthèse chimique. 12/ Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit antigène ou haptène pour faciliter le couplage chimique. 13/ Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit élément de liaison introduit est un acide aminé. 14/ Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que le couplage entre ledit antigène ou haptène et ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, est réalisé par recombinaison génétique lorsque ledit antigène ou haptène est de nature peptidique. 15/ Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride. 16/ Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite construction nucléique est contenue dans un vecteur, ou dans une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine hybride. 17/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 16, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à éliminer les agents infectieux ou à inhiber la croissance de tumeurs. 18/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 17, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les maladies infectieuses comprenant les infections virales, bactériennes, fongiques et parasitaires. 19/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 17, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les cancers. 20/ Utilisation selon la revendication 19, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les cancers associés à un antigène tumoral. 21/ Utilisation selon les revendications 19 et 20, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir les mélanomes. 22. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 21, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité. 23/ Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que ledit véhicule est un liposome, un vecteur viral contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit antigène ou haptène, ou ladite protéine hybride, ou une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit antigène ou haptène, ou ladite protéine hybride. 24/ Utilisation selon l'une des revendications 15, 16 et 23, caractérisée en ce que ladite construction nucléique ou la construction nucléique contenue dans ledit vecteur ou ladite cellule hôte transformée, comprend une séquence nucléique choisie parmi la séquence SEQ ID N 1, l'un de ses fragments présentant au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N 1, ou une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec l'une desdites séquences.