FR 2792335 A1 20001020 FR 9904912 A 19990419 CYANOBACTERIES SUR-EXPRIMANT UN GENE IMPLIQUE DANS LA VOIE DE BIOSYNTHESE DES CAROTENOIDES. La présente invention concerne la production de caroténoïdes et plus particulièrement de zéaxanthine à partir de cyanobactéries. Ainsi, l'invention se rapporte à des cyanobactéries génétiquement modifiées de manière à accumuler des caroténoïdes. Certains caroténoïdes naturels ont un intérêt dans les domaines pharmaceutique et cosmétique, ou comme colorants alimentaires et pour l'alimentation des animaux. Plusieurs de ces pigments commercialisés sont synthétisés entièrement par voie chimique (20). La récente identification des voies de biosynthèse des caroténoïdes chez divers organismes bactériens offre de nouvelles opportunités pour la production de caroténoïdes in vivo grâce aux techniques du génie génétique (3) Les caroténoides sont des pigments synthétisés par les organismes photosynthétiques et certains organismes non photosynthétiques. Ils constituent des composants essentiels de l'appareil photosynthétique des membranes, o ils jouent le rôle d'antioxydants par le quenching des triplets de chlorophylle, limitant ainsi la formation de radicaux oxygénés libres hautement réactifs (9). Les caroténoïdes peuvent également avoir une fonction lors de la collecte de la lumière par l'antenne de l'appareil photosynthétique. Ainsi, ils peuvent transférer à la chlorophylle l'énergie lumineuse absorbée ou bien dissiper l'excès d'énergie radiante, protégeant ainsi l'appareil photosynthétique de la photo-oxydation (9). Chez les organismes photosynthétiques, les caroténoïdes sont associés spécifiquement de manière non covalente à des protéines membranaires (2). Leur distribution et leur localisation dans les membranes varient d'un organisme à l'autre. Cependant, les carotènes sont davantage associés au centre réactionnel de l'appareil photosynthétique que les xanthophylles (dérivés des carotènes, contenant un ou plusieurs groupements fonctionnels oxygénés). Chez les plantes, les xanthophylles sont essentiellement associés à l'antenne des systèmes photosynthétiques. Enfin, les caroténoïdes sont susceptibles d'influencer la stabilité membranaire (3, 10). Les caroténoides, comme les stérols ou les gibbérellines, font partie d'une famille de composés appelés les isoprénoides. Malgré leur diversité de structure et de fonction, les isoprénoides sont tous synthétisés à partir du même précurseur: l'isopentényl diphosphate (IPP). L'IPP est isomérisé en diméthylallyl diphosphate (DMAPP) par l'IPP isomérase. Plusieurs réactions de condensation aboutissent à la conversion du DMAPP en géranylgéranyl pyrophosphate (GGPP). La première étape spécifique de la voie de biosynthèse des caroténoïdes est la synthèse de phytoène par condensation de deux molécules de GGPP. Quatre étapes de désaturation aboutissent à la conversion du phytoène en lycopène via le phytofluène, le p-carotène et le neurosporène. Les carotènes, par exemple le 5-carotène, sont issus de réactions de cyclisation sur le lycopène et les xanthophylles, comme la zéaxanthine, sont des produits d'oxygénation des carotènes (3, 25). La figure 1 en annexe rapporte la voie de biosynthèse des caroténoïdes (zéaxanthine) à partir de l'IPP. Les gènes codant pour plusieurs des enzymes mises en jeu ont été identifiés Chez Synechocystis sp. PCC 6803: le gène crtB code la phytoène synthase (14), le gène crtD la phytoène désaturase (15), le gène crtQ la k- carotène désaturase (5), le gène crtO la f-carotène kétolase (7) et le gène crtR la P-carotène hydroxylase (16). Comme montré sur la figure 1, quatre caroténoïdes s'accumulent de manière significative chez Synechocystis. Il s'agit du myxoxanthophylle (2'-(P-l- rhamnopyranosyloxy)-3',4'-didéhydro-l',2'-dihydro-j, I- carotène-3,1'-diol), du 5-carotène (5,5-carotène), de l'échinénone (P,Pcaroten-4-one) et de la zéaxanthine ( été étudiés. La présente invention a donc pour but d'augmenter l'accumulation de caroténoïdes chez les cyanobactéries et plus particulièrement chez Synechocystis sp. PCC 6803 sans altérer les capacités de croissance desdites cyanobactéries. Les travaux réalisés par la Demanderesse sur la manipulation des gènes codant les enzymes impliquées dans la biosynthèse des caroténoïdes lui ont permis de mettre au point des systèmes de sur-expression des gènes codant les protéines ayant les activités enzymatiques impliquées dans cette biosynthèse de façon à modifier l'accumulation des caroténoïdes chez Synechocystis, et plus précisément d'augmenter la teneur en zéaxanthine chez cet organisme. Les connaissances acquises par la Demanderesse dans le domaine de la culture des microalgues et des cyanobactéries lui ont permis d'utiliser les cyanobactéries recombinantes ainsi obtenues pour la production de caroténoïdes et plus particulièrement de zéaxanthine. Ces buts sont atteints selon l'invention grâce à la préparation de cyanobactéries génétiquement modifiées de manière à accumuler des caroténoïdes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées avec au moins un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes et plus particulièrement de la zéaxanthine. Le génome de Synechocystis sp. PCC 6803 contient trois gènes codant la protéine D1: psbAI, psbAII et psbAIII. La Demanderesse a mis à profit le fait que l'expression de l'un seulement des gènes psbAII et psbAIII, est suffisante pour assurer la croissance normale de Synechocystis en l'absence des deux autres gènes, pour introduire à la place de l'un au moins des gènes psbAII et psbAIII un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes. De préférence, le gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes est introduit à la place du gène psbAII qui possède un promoteur fort chez Synechocystis sp. PCC 6803. L'invention concerne donc tout particulièrement des cyanobactéries génétiquement modifiées pour accumuler des caroténoïdes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées avec un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes placé sous le contrôle du promoteur du gène psbAII. Chez les souches mutantes ainsi obtenues, la protéine D1 du photosystème II est le produit de l'expression du gène psbAIII, et les mutants sont photoautotrophes. L'expression des gènes ipi, crtR et crtD/crtB, sous le contrôle du promoteur fort du gène psbAII se traduit par une augmentation de l'accumulation des transcrits correspondants chez les souches mutantes. Ce résultat indique que le promoteur du gène psbAII peut être utilisé pour induire la sur-expression de n'importe quel gène chez Synechocystis. La sur-expression du gène ipi est accompagnée d'un changement faible du contenu en caroténoïdes de la souche mutante. Par contre, la sur- expression des gènes crtD et crtB est suivie d'une augmentation de 50% des teneurs en myxoxanthophylle et zéaxanthine, les contenus en 5- carotène et échinénone restant inchangés chez cette souche. La sur- expression du gène crtR se traduit par une accumulation de zéaxanthine deux fois et demi plus élevée chez la souche mutante que chez la souche sauvage. Chez la souche mutante, la zéaxanthine devient ainsi le pigment majoritaire (57% de la teneur totale en caroténoides) et les contenus cellulaires en P-carotène et échinénone sont diminués d'un facteur deux. Le gène crtO code la P- carotène kétolase qui convertit le P-carotène en échinénone. Ce gène est inactivé chez la souche sauvage et chez les souches qui sur-expriment différents gènes, de façon à ce qu'elles n'accumulent plus d'échinénone. Par une combinaison de sur-expression et d'inactivation de certains gènes, la teneur en caroténoïdes des cyanobactéries est modifiée de manière significative. De façon remarquable ces modifications ne s'accompagnent pas de changement physiologique, ce qui suggère que certains caroténoides sont fonctionnellement interchangeables. Plus particulièrement, les cyanobactéries selon l'invention sont transformées avec au moins un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique se situant en aval de l'IPP isomérase dans la voie de biosynthèse des caroténoides et plus particulièrement de la zéaxanthine. On entend par activité enzymatique se situant en aval de l'IPP isomérase (ipi) dans la voie de biosynthèse des caroténoïdes, les activités des enzymes suivantes: - la phytoène synthase - la phytoène désaturase - la p-carotène désaturase - la lycopène cyclase - la P-carotène kétolase - la P- carotène hydroxylase Ainsi, les cyanobactéries selon l'invention sont transformées avec au moins un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique choisie parmi les activités des enzymes suivantes: IPP isomérase, phytoène synthase, phytoène désaturase, c- carotène désaturase, lycopène cyclase, [-carotène kétolase, p- carotène hydroxylase. L'invention concerne tout particulièrement la transformation des souches Synechocystis sp. PCC 6803. L'invention se rapporte également à un procédé de préparation des cyanobactéries décrites précédemment, consistant à transformer lesdites cyanobactéries, et plus particulièrement des souches Synechocystis sp. PCC 6803, avec au moins un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes et plus particulièrement de la zéaxanthine. Comme indiqué précédemment, les cyanobactéries de l'invention sont transformées en introduisant à la place de l'un au moins des gènes psbAII et psbAIII un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes. On préfère tout particulièrement introduire le gène codant pour une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes à la place du gène psbAII qui possède un promoteur fort chez Synechocystis sp. PCC 6803. De même, les cyanobactéries selon l'invention sont transformées avec au moins un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique choisie parmi les activités des enzymes suivantes: IPP isomérase, phytoène synthase, phytoène désaturase, k- carotène désaturase, lycopène cyclase, 5-carotène kétolase, [-carotène hydroxylase. Tout système de transformation connu de l'homme du métier peut être utilisé sur les cyanobactéries dans le cadre du procédé selon la présente invention. Toutefois, la Demanderesse a choisi de mettre au point un système permettant l'obtention de souches mutantes qui ne présentent pas de résistance à un antibiotique. L'invention concerne donc tout spécifiquement des cyanobactéries génétiquement modifiées pour accumuler des caroténoïdes et plus particulièrement de la zéaxanthine, et ne possédant pas de gène de sélection. Ce but est atteint en utilisant le gène sacB (26), qui code une levan sucrase comme marqueur de sélection négative. L'expression du gène sacB est létale lorsque la souche est cultivée en présence de saccharose. L'introduction du gène sacB, associé à un gène dont l'expression confère la résistance à un antibiotique, permet dans un premier temps la sélection positive du génotype mutant en utilisant la résistance à l'antibiotique correspondant. Après ségrégation, la cassette comprenant le gène sacB et le gène de résistance peut être éliminée du génome de la souche mutante en transformant celle-ci avec de l'ADN d'un plasmide qui ne porte pas de marqueur de sélection, et en sélectionnant les transformants résistants au saccharose. Le génome de la souche mutante ainsi obtenue est dépourvue de gène conférant la résistance à un antibiotique (27). Un procédé préféré de préparation des cyanobactéries et plus particulièrement des souches de Synechocystis sp. PCC 6803 selon l'invention, comprend donc les étapes suivantes: a) on introduit dans ladite cyanobactérie, une cassette d'expression comprenant un gène de sélection négatif et un gène de sélection positif, b) on sélectionne les génotypes mutants par sélection positive, c) on introduit par double recombinaison homologue un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoides et plus particulièrement de la zéaxanthine, d) on sélectionne les souches génétiquement modifiées ayant intégré le gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes par sélection négative. Plus particulièrement, le procédé ci-dessus consiste à l'étape (a) à insérer, avantageusement au niveau du locus psbAII, une cassette d'expression comprenant: - le gène de sélection négatif SacB, et - un gène de résistance à un antibiotique, préférentiellement à la kanamycine, comme gène de sélection positif. Les transformants sont sélectionnés à l'étape (d) par culture en milieu contenant l'antibiotique. Le gène d'intérêt, codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la voie de biosynthèse des caroténoïdes est inséré à l'étape (c) par double recombinaison homologue à la place de la cassette d'expression introduite en (a), puis, les souches ayant intégré ledit gène d'intérêt, ne présentant donc plus le gène SacB, sont sélectionnées par culture en milieu riche en saccharose. L'invention concerne enfin une biomasse microalguale dont les microalgues sont les cyanobactéries selon la présente invention, ainsi que les compositions nutritionnelles ou pharmaceutiques contenant ladite biomasse. L'invention concerne encore un procédé de culture de cyanobactéries génétiquement modifiées décrites précédemment, ainsi qu'un procédé de production de caroténoïdes et plus particulièrement de zéaxanthine à partir de la biomasse obtenue de la culture desdites cyanobactéries. Les cyanobactéries sont de préférence cultivées en photobioréacteur tubulaire du type décrit dans les demandes de brevet FR87/332, FR87/12250, PCT W091/15735, Fr91/03781 et FR99/03781. La concentration en azote est de préférence non limitante et le rapport C/N avantageusement de l'ordre de 0,3. La culture est de préférence effectuée en mode continu sur un temps de renouvellement court de l'ordre de 1,7 à 3 jours, et sur milieu non carencé en azote, car ces deux conditions permettent de se placer à l'optimum du taux de croissance et de l'activité enzymatique, ce qui correspond à l'optimum de production de zéaxanthine. Le milieu de culture de Synechocystis est préférentiellement de type eau douce et plus particulièrement un milieu BG11 ou MM. Le pH est préférentiellement de l'ordre de 8, et la température optimale de culture est située à 34 C mais peut être établie entre 25 et 35 C. La culture étant menée en mode continu et le volume de culture demeurant constant, la récolte s'effectue par surverse au même débit que l'apport de milieu neuf. C'est la suspension cellulaire ainsi éliminée qui constitue la récolte. La séparation de la biomasse microalgale du milieu de culture usé est préférentiellement réalisée par centrifugation. La biomasse obtenue constitue une source de zéaxanthine qui peut être utilisée comme matière première pour l'extraction de caroténoides et l'obtention d'extraits enrichis. L'extraction de caroténoides peut être réalisée avec des solvants organiques. Du fait de la polarité relative de la zéaxanthine, qui est un oxycaroténoïde, on choisi de préférence des solvants plutôt polaire ou des mélange de solvants comme par exemple acétone/alcool, de préférence employés dans l'industrie alimentaire et pharmaceutique. L'extraction peut être réalisée directement sur la biomasse humide (teneur en eau supérieure ou égale à 80%). Afin de faciliter l'accès des solvants aux caroténoïdes, et plus particulièrement à la zéaxanthine imbriquée dans les systèmes membranaires de cellules, la biomasse peut également subir un traitement d'homogénéisation par pression-dépression, une AP de 800 bars garantissant l'éclatement des cellules. Le broyat ainsi obtenu est centrifugé et le culot de centrifugation, contenant les débris membranaires, est ensuite traité aux solvants d'extraction. Les étapes de broyage et de centrifugation sont particulièrement adaptées aux caroténoïdes associés aux systèmes membranaires, par contre les éventuels caroténoides apolaires (carotène, oxycaroténoïdes estérifiés) libérés en émulsion dans la phase aqueuse sont en partie éliminés avec le surnageant à la centrifugation. La phase organique récoltée est évaporée afin d'obtenir l'extrait de caroténoides. Ce dernier peut ensuite être utilisé directement comme ingrédient pour la préparation de compositions nutritionnelles ou pharmaceutiques, ou être partiellement purifié. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description qui suit se rapportant à des exemples de constructions génétiques et à la transformation de Synechocystis sp. PCC 6803 avec lesdites constructions, et dans laquelle il sera fait référence aux figures suivantes: La figure 1 est une représentation schématique de la voie de biosynthèse des caroténoïdes. Le nom des pigments qui s'accumulent de manière significative chez Synechocystis sp. PCC 6803 est encadré. Les noms des gènes identifiés chez Synechocystis sont indiqués entre parenthèses à coté des enzymes qu'ils codent. La flèche en pointillé indique une voie de biosynthèse qui reste hypothétique. IPP: isopentényl diphosphate, DMAPP: diméthylallyl diphosphate, GGPP: géranylgéranyl diphosphate. La figure 2 représente un exemple de construction d'intégration de gènes et son utilisation pour leur sur-expression chez Synechocystis sp. PCC 6803. En A: Construction d'intégration contenant deux marqueurs de sélection, d'une part le gène sacB codant une levane sucrase et d'autre part aphX un gène dont l'expression confère la résistance à la kanamycine. En B: Utilisation de la plate-forme d'intégration pour insérer un gène Y dans le génome de Synechocystis sp. PCC 6803, à la place du gène psbAII: l'introduction d'un site de restriction Nde I au niveau du codon de l'initiation de la traduction du gène Y permet le clonage en phase de ce gène dans la plate-forme d'intégration, sous le contrôle du promoteur fort du gène psbAII. La figure 3 représente la ségrégation des souches de Synechocystis sp. PCC 6803. En A: Organisation de l'ADN génomique aux loci des gènes psbAII et crtO chez les différentes souches. En B: Produits de PCR indiquant la ségrégation complète des souches psbAII-KS, crtDB et crtR+ au locus du gène psbAII et la présence d'une copie intacte des gènes endogènes crtD et crtB chez la souche crtDB+ et du gène crtR chez la souche crtR+. En C: Produits de PCR indiquant la ségrégation des différentes souches mutantes au locus du gène crtO. Les nombres 1/2, 3/4, /6 et 7/8 indiquent les quatre différents jeux d'oligonucléotides utilisés pour amplifier les gènes par PCR. 1: 5' psbAIIupt 2: 3' psbAIIdow, 3: 5' crtDB, 4: 3' crtDB, 5: 5' crtR, 6: 3' crtR, 7: 5' crtO et 8: 3' crtO (voir Tableau 1). Le site d'hybridation de ces oligonucléotides est indiqué dans la partie A de la figure. La figure 4 représente l'analyse de l'expression des gènes par northern-blot. Les ARN totaux sont extraits de la souche sauvage et des souches crtR' et crtDB+. Ils sont déposés (10 Fg par puits) sur des gels dénaturant contenant de la formaldéhyde, séparés par électrophorèse et transférés sur une membrane de nylon GeneScreen Plus. Les sondes radioactives sont préparées par PCR en utilisant les gènes clones comme matrice (Tableau 1) et du dATP marqué en a32P. En A: Niveau d'accumulation des ARNm du gène crtR chez la souche sauvage et la souche crtR*. La sonde utilisée correspond à un fragment de 400 pb interne au gène crtR. En B et C: Analyse de l'accumulation des transcrits chez la souche sauvage et la souche crtDB+ en utilisant une sonde correspondant à un fragment de 400 pb interne au gène crtB (partie B de la figure) ou au gène crtD (partie C de la figure). La figure 5 montre l'accumulation des ARNm du gène ipi -et la détection de l'IPP isomérase chez la souche ipi'. En A: Niveau d'accumulation des ARNm du gène ipi chez la souche sauvage et la souche ipit. Les ARN totaux sont extraits de la souche sauvage et de la souche ipi'. Ils sont déposés (10 pg par puits) sur un gel dénaturant contenant de la formaldéhyde, séparés par électrophorèse et transférés sur une membrane de nitrocellulose GeneScreen Plus. La sonde radioactive utilisée est préparée par PCR en utilisant un fragment de 400 pb interne au gène ipi comme matrice (voir Tableau 1) et du dATP marqué en &32P. En B: Analyse des protéines sur gel dénaturant PAGE-SDS. Cette analyse est faite sur la fraction sub-cellulaire contenant les protéines solubles. Cette fraction est préparée en cassant les cellules d'une culture de la souche sauvage et de la souche ipi+ et en conservant le surnageant après centrifugation. Ces fractions sont déposées (20 gg de protéines par puits) sur un gel PAGE-SDS contenant 10% d'acrylamide. Les protéines sont détectées en colorant le gel avec du bleu de Coomassie. Les flèches indiquent deux protéines mises en évidence uniquement chez la souche ipi'. I - MATERIELS ET METHODES 1) Souches et conditions de culture. La souche Synechocystis sp. PCC 6803 est cultivée à 30 C dans du milieu BG-11 (24) modifié et tamponné avec du TES-NaOH 10 mM pH 8, sous une intensité lumineuse de 50 pmol de photon.m-2.s-1. La modification apportée au milieu BG-11 correspond à un remplacement partiel du NaNO3 par une concentration équivalente de NH4NO3 (la concentration finale en ammonium est de 4,5 mM). La culture sur milieu gélosé se fait sur milieu BG- 11 contenant 0,3% (p/v) de thiosulfate de sodium et solidifié avec 1,5% (p/v) d'agar. La sélection des souches se fait en présence de 50 gg.ml-' de kanamycine. Pour éliminer la cassette (gène de résistance antibiotique/sacB) du génome de souches mutantes, les cellules mutantes sont transformées avec de l'ADN d'un plasmide ne portant pas de marqueur de sélection. Après transformation, les cellules sont cultivées dans du milieu BG-11 liquide pendant 4 jours. Les cellules transformées sont ensuite sélectionnées sur milieu BG-11 contenant 5% de saccharose. 2) Plate-forme d'intégration et plasmides. La séquence du génome de Synechocystis sp. PCC 6803 (12) est consultée à travers la base de données Cyanobase. Les séquences des oligonucléotides nécessaires à l'amplification des séquences de Synechocystis utilisées dans la construction de la plate-forme d'intégration et des différents plasmides sont données dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1: Séquence et position relative dans le génome de Synechocystis sp. PCC 6803 des oligonucléotides utilisés dans la présente étude. Oligo Séquence Position 'psbAIIup 5'gagagagagctgcagAGCGTTCCAGTGGAT 3' 6733-6747 3'psbAIIup 5'gagagagagaCATaTGGTTATAATTCCTTATG 3' 7210-7231 'psbAIIo 5'gagagagagggatccTAATTCCTTGGTGTAATGCC 3' 8309-8328 n 3'psbAIIdo 5'gagagagagagaattCGATCGCCTTGGCAAAACAAC 3' 8781-8801 n 'IPP 5'aacagacatATGACTGCCGACAACAATAG 3' 3'IPP 5'aacagaggatccTTATAGCATTCTATGAATTTGCC 3' 'crtDB 5'AGACAGTAACatATGCGCGTTGTG 3' 1397807- 3'crtDB 5'ATCAACCATaGATCtGTGGTCGGA 3' 1400319- 'crtR 5'AAGTGCGTCCCATcataTGTGCCAGGAGT 3' 982617- 3' crtR 5'GGAAAGCAAggAtCCTAGCTAGGG 3' 981673- 'crtO 5'ACCGCAATGGGatCCGACAAATTG 3' 2894607- 3'crtO 5'TTGATCAGATgAATTcGAGCCTGG 3' 2896875- 'IPPp 5'TGAAGTCTCTAACTTCATTG 3' 3'IPPp 5'TGAAAAGGGTTTACTACATC 3' 'crtDp 5'CATTGCCATGAGTAAGGCGT3' 1398325- 3'crtDp 5'TGGAGGTTAATGACCGGGAC 3' 1398719- 'crtBp 5'AAGGAGGGCCATTTGGGCGA 3' 1399519- 3'crtBp 5'ATTGGTTCGCCACCCCCAAG 3' 1399921- 'crtRp 5'AATCCCAACGTGGCCATGTT 3' 982511- 3'crtRp 5'AAAAGATCTCATGGTAGAAG 3' 982170- Les nucléotides en lettres minuscules correspondent aux changements introduits dans la séquence pour introduire des sites de restriction utilisés pour le clonage des gènes. Les sites de reconnaissance des enzymes de restriction sont indiqués en caractère gras. La position relative des oligonucléotides dans le génome de Synechocystis correspond à celle donnée sur le site Internet.Cyanobase. Dans le cas du gène codant l'IPP isomérase de levure, les oligonucléotides ont été choisies d'après la séquence publiée du gène. Aucune position relative de ces oligonucléotides dans le génome de Saccharomyces cerevisiae n'est donnée. Les oligonucléotides dont le nom se termine par un indice p sont utilisés dans la préparation des sondes radioactives pour les analyses de l'accumulation des ARNm. Pour choisir les oligonucléotides utilisés pour amplifier la séquence codante du gène ipi codant l'IPP isomérase de Saccharomyces cerevisiae, il a été fait référence à la séquence publiée (1). Les séquences sont amplifiées par PCR en utilisant l'ADN polymérase Taq. La plate-forme d'intégration, p(psbAII), est composée de régions situées en amont et en aval du gène psbAII. Elle est construite comme suit: un fragment Pst I-Nde I de 500 bp situé en amont de l'ATG du gène psbAII et un fragment BamH I-EcoR I de 500 bp situé en aval du codon TAA de terminaison de la transcription du gène psbAII sont amplifiés par PCR et clonés dans le plasmide pSL1180 (Pharmacia Biotech). Le plasmide ainsi obtenu est appelé p(psbAII). L'introduction d'un site Nde I (CATATG) au niveau de l'ATG du gène psbAII permet le clonage de n'importe quelle séquence sous le contrôle du promoteur du gène psbAII. Le codon d'initiation de la traduction du gène ainsi cloné est fusionné avec celui du gène psbAII (ATG). Le plasmide p(psbAII-KS) est construit en insérant, entre les sites Hpa I et BamH I de la plate-forme d'intégration p(psbAII), le gène aphX, issu du plasmide pUC4K (21) et dont l'expression confère la résistance à la kanamycine et le gène sacB issu du plasmide pRL271 (4, 26) (Fig. 2). Un fragment Nde I-BamH I de 1 kb, commençant à l'ATG du gène ipi de Saccharomyces cerevisiae, est amplifié et cloné entre les sites Nde I et BamH I de p(psbAII); le plasmide obtenu est p(ipi). Un fragment Nde I-Bgl II de 2,5 kb, débutant à i'ATG du gène crtD et contenant à la fois laséquence codante du gène crtD et celle du gène crtB, est amplifié et inséré entre les sites Nde I et BamH I de p(psbAII); le vecteur obtenu est pcrtDB. Un fragment de 0,9 kb contenant la région codante du gène crtR est amplifié par PCR de façon à introduire un site Nde I au niveau du codon d'initiation de la traduction de ce gène. Ce codon, initialement GTG, devient ATG. Le plasmide pcrtR est obtenu en clonant le fragment amplifié entre les sites Nde I et BamH I du plasmide p(psbAII). Un fragment BamH I-EcoR I de 2,3 kb contenant le gène crtO est amplifié et cloné entre les sites BamH I et EcoR I du plasmide pSL1180. Du plasmide pcrtO ainsi obtenu est éliminé un fragment Bcl I-Bcl I de 1,37 kb de façon à enlever une large partie de la séquence codante du gène crtO. Ce plasmide tronqué est appelé pAcrtO. Dans le plasmide p(Acrto-KS), le fragment manquant dans la séquence du gène crtO du plasmide pAcrtO est remplacé par une cassette (gène conférant la résistance à la kanamycine/sacB). 3) Analyse de l'accumulation des transcrits. Les ARN totaux de Synechocystis sp. PCC 6803 sont extraits selon un protocole décrit ultérieurement (18). Les ARN sont séparés par électrophorèse sur gel de formaldéhyde contenant 1,2% d'agarose puis transférés sur une membrane de nylon GeneScreen Plus selon les instructions du fournisseur. Les sondes radioactives sont préparées par PCR en utilisant les gènes clonés comme matrice et du dATPmarqué en a32P. La membrane est hybridée à 37 C pendant 12 heures dans un tampon contenant 30% de formamide, 1% de SDS, 10% de sulfate de dextran, de l'EDTA 1 mM pH 8, du Tris-HCl 30 mM pH 7,5 et du 3xSSC (NaCl 0,45 M, citrate trisodique 45 mM pH 7). 4) Analyse du contenu en Diqments. Les cellules de Synechocystis sp. PCC 6803 sont récoltées à partir de cultures en phase exponentielle de croissance (DO730=0.5). Les pigments sont extraits au méthanol à partir d'un même nombre de cellules pour toutes les souches. Les extraits sont conservés à l'abris de l'air. Les caroténoïdes sont analysés par HPLC sur une colonne C18 Spherisorb ODS2 de 4 mm x 250 mm, en utilisant un gradient d'acétate d'éthyle (de 0 à 100%) dans un mélange acétonitrile-eau- triéthylamine (9:1:0.01, v/v/v), pendant 15 min avec un débit de 1,5 ml/min. Les spectres d'absorption correspondants aux différents pics sont obtenus avec un détecteur à photodiodes. Chaque caroténoïde est identifié par son spectre d'absorption et son temps de rétention spécifiques. Le contenu en chaque caroténoïde est déterminé selon l'équation suivante: &hi X Acar Ccar = Cchl X&h Acar &ar X Achl o CChl est la concentration de l'extrait en chlorophylle, mesurée avec un spectrophotomètre Shimadzu UV-160A, Echl et úcar sont les coefficients d'extinction à 440 nm, respectivement de la chlorophylle et des caroténoides (13), et Ach, et Acar sont les surfaces délimitées par les pics sur le chromatogramme (enregistré à 440 nm), respectivement pour la chlorophylle et les caroténoides. II - RESULTATS 1) Obtention des souches recombinantes de Svnechocvstis. L'ADN du plasmide p(psbAII-KS), qui contient un gène conférant la résistance à la kanamycine et le gène sacB entre les séquences régulatrices du gène psbAII, est utilisé pour transformer Synechocystis sp. PCC 6803 (souche sauvage). Les transformants sont sélectionnés en présence de kanamycine. La ségrégation complète de la souche psbAII- KS est vérifiée par PCR en utilisant des oligonucléotides s'hybridant en amont et en aval du gène psbAII (Fig. 3 A, B). Cette souche est ensuite transformée avec l'ADN des plasmides p(ipi), pcrtR ou pcrtDB. Dans ces plasmides, les séquences codantes des gènes ipi (gène codant l'IPP isomérase chez Saccharomyces cerevisia), crtR (gène codant la V- carotène hydroxylase chez Synechocystis sp. PCC 6803), et crtD et crtB (gènes impliqués dans des étapes antérieures de la voie de biosynthèse des caroténoïdes chez Synechocystis), sont insérées en phase sous le contrôle du promoteur du gène psbAII de façon à ce que leur codon d'initiation de la traduction soit fusionné avec l'ATG du gène psbAII. La ségrégation complète des souches crtR' et crtDB (i. e. souches qui sur-expriment ces gènes) est vérifiée par PCR en utilisant le même jeu d'oligonucléotides que précédemment (Fig. 3 A, B). La séquence du gène ipi dans la souche ipi+ est vérifiée par séquençage (résultat non montré). La souche psbAII-KS possède, comme la souche sauvage, une copie du gène crtR. Une recombinaison homologue simple au locus du gène crtR avec l'ADN du plasmide pcrtR aboutirait à l'insertion d'une partie de l'ADN du plasmide dans le génome et à une duplication du gène crtR. Même si cet événement est peu probable, nous avons choisi de vérifier par PCR l'organisation du génome au locus du gène crtR. Des oligonucléotides sont choisis pour s'hybrider en amont et en aval du gène crtR pour amplifier uniquement la copie endogène du gène crtR. Cette copie du gène crtR est effectivement présente dans le génome de la souche crtR et aucun fragment d'ADN étranger n'est inséré en ce locus. Le même type de vérification est faite pour les gènes crtD et crtB chez la souche crtDB (Fig. 3 A, B). Afin de modifier davantage la composition en caroténoïdes des différentes souches de Synechocystis obtenues jusqu'ici, le gène crtO est inactivé chez les souches sauvage, crtR* et crtDB. Les cellules des souches sauvage, crtDB ou crtR+ sont transformées avec de l'ADN du plasmide p(AcrtO-KS). La ségrégation complète des souches mutantes ainsi obtenues est vérifiée par PCR en utilisant des oligonucléotides choisis pour s'hybrider en amont et en aval du gène crtO. Ces souches, appelées AcrtO-KS, crtDB+AcrtO-KS et crtR*AcrtO-KS sont ensuite transformées avec l'ADN du plasmide pAcrtO pour éliminer la cassette (gène conférant la résistance à la kanamycine-sacB) présente dans leur génome et obtenir ainsi des souches ne portant pas de marqueur de résistance à un antibiotique (Fig. 3 A,C). 2) Auacmentation de l'accumulation des transcrits des gènes ipi, crtD-crtB et crtR chez les souches ipi, crtDB et crtR+. Le niveau d'accumulation des transcrits des gènes ipi, crtD-crtB et crtR est déterminé par des analyses de northern-blot, en utilisant des sondes ADN radioactives spécifiques de chacun de ces gènes. La souche sauvage et les souches mutantes sont cultivées dans les même conditions. Les cellules sont récoltées à partir de cultures en phase exponentielle de croissance. Dans ces conditions, nous estimons que la quantification des ARN totaux est représentative de la quantité d'ARNm présents dans les cellules. Chez la souche sauvage, aucun transcrit n'est détecté avec la sonde correspondant au gène crtR. Ce résultat suggère que le gène crtR est faiblement exprimé. A l'inverse, chez la souche crtR* un transcrit de 1 kb, taille attendue pour l'ARNm du gène crtR, s'accumule fortement (Fig. 4 A). Ces résultats indiquent que l'intégration d'un gène étranger au locus du gène psbAII aboutit à sa sur- expression. L'accumulation des transcrits des gènes crtD et crtB chez les souches sauvage et crtDB' est étudiée à l'aide de deux sondes différentes, spécifiques du gène crtB ou crtD. Dans les deux cas, un signal plus fort est détecté chez la souche crtDB' que chez la souche sauvage (Fig. 4 B, C). Avec la sonde spécifique du gène crtB sont détectés des transcrits de 1,2; 2,2 et 2,6 kb (Fig. 4 B). Le plus petit des transcrits est accumulé à un niveau très faible. Sa taille est proche de celle attendue pour le transcrit du gène crtB. La bande à 2,6 kb peut correspondre à un long transcrit qui inclurait les deux transcrits des gènes associés crtD et crtB. Le transcrit de 2,2 kb serait alors un produit de dégradation du transcrit de 2,6 kb. Trois transcrits de 1,4; 2,2 et 2,6 kb sont également détectés avec la sonde correspondant au gène crtD (Fig. 4 C). Le transcrit de 1,4 kb, peu visible sur la figure, correspondrait à l'ARNm issu de la transcription du gène crtD et les transcrits de 2,2 et 2,6 kb à un long transcrit, plus ou moins dégradé, incluant les ARNm des gènes crtD et crtB. Le transcrit de 2,6 kb est détecté chez la souche sauvage et chez la souche crtDB+ mais son accumulation est 3 à 4 fois plus élevée chez la souche mutante. Les transcrits de 1,2 kb et 1,4 kb correspondant respectivement aux ARNm des gènes crtB et crtD ne sont pas détectés chez la souche sauvage et s'accumulent à un faible niveau (faible intensité du signal) chez la souche crtDB*. Ces deux transcrits peuvent être des produits de maturation du long transcrit de 2,6 kb. Le gène codant l'IPP isomérase n'est pas identifié chez Synechocystis sp. PCC 6803, et aucune séquence du génome de cet organisme n'est homologue à celle du gène ipi de la levure (base de données Cyanobase). De ce fait, l'utilisation d'une sonde correspondant au gène ipi ne permet pas de détecter de transcrit chez la souche de Synechocystis sauvage. Chez la souche ipi* un transcrit de 1 kb, taille attendue pour les ARNm du gène ipi, s'accumule fortement (Fig. 5 A). Ce résultat indique que le promoteur du gène psbAII peut être utilisé pour sur-exprimer n'importe quel gène, y compris des gènes présents chez d'autres organismes. 3) Accumulation de l'IPP isomérase chez la souche ini+. La présence de l'IPP isomérase chez la souche ipi+ est déterminée par électrophorèse monodimensionnelle en conditions dénaturantes (PAGE- SDS). Des fractions contenant les protéines solubles sont préparées à partir des souches sauvage et ipi* en cassant les cellules et en récoltant le surnageant après centrifugation. Les polypeptides (25 Fg par puits) contenus dans ces fractions sont séparés sur un gel PAGE-SDS contenant 10 % d'acrylamide. La présence des protéines est révélée en colorant le gel au bleu de Coomassie (Fig. 5 B). Deux protéines, de masses moléculaires respectives proches de 40 et 20 kDa sont présentes chez la souche ipi* mais pas chez la souche sauvage. La protéine de 40 kDa a une masse moléculaire en accord avec celle de l'IPP isomérase de Saccharomyces cerevisiae déterminée après migration sur un gel de type PAGE-SDS (1). La protéine de 20 kDa (difficilement visible sur la figure) pourrait être un produit de dégradation de celle de 40 kDa. 4) Teneur en caroténoldes des différentes souches. La teneur en caroténoides des différentes souches est déterminée par HPLC. Les pigments sont extraits des cellules avec du méthanol et les analyses sont faites sur ces extraits. Les résultats sont indiqués dans le tableau 2 ci-dessous. TABLEAU 2: Teneur en caroténoïdes des différentes souches de Synechocystis sp. PCC 6803. Souche Teneur en caroténoides (gg/OD7,) myxoxanthophylle zéaxanthine échinénone f-carotène souche sauvage 0, 45 0,02 0,39 0,02 0,25 0,01 0,53 0,02 crtR+ 0,42 0,04 0, 98 0,02 0,12 0,01 0,20 0,01 crtDB+ 0,75+0,02 0,55+0,02 0,27+ 0,02 0,54+0,02 ipi+ 0,47 0,03 0,41 0,02 0,25+0,01 0,53 0, 02 AcrtO 1,05+0,05 0,44 0,02 0 0,56 0,03 crtR+ AcrtO 0,35 0,01 0,95 0,02 0 0,19+0,01 crtDB+AcrtO 1,19 0,10 0,62 0,02 0 0,68 0,03 Les valeurs correspondent à des moyennes de 9 mesures faites sur 3 cultures différentes. Les pigments sont extraits avec du méthanol. Les extraits sont analysés par HPLC et les teneurs en caroténoïdes sont calculées selon les instructions données dans la section Matériels et Méthodes. La sur-expression du gène ipi n'est pas accompagnée de changement significatif de la composition en caroténoïdes de la souche ipi' par rapport à la souche sauvage. Suite à la sur-expression du gène crtR, la teneur en zéaxanthine est augmentée d'un facteur 2,5 et les teneurs en Pcarotène et échinénone sont diminuées d'un facteur 2 chez la souche crtR'. Le contenu en myxoxanthophylle est peu affecté par la sur-expression du gène crtR. La sur-expression des gènes crtD et crtB induit une augmentation de 60% de l'accumulation du myxoxanthophylle et de 37% de l'accumulation de zéaxanthine chez la souche crtDB+ comparée à la souche sauvage. Chez ce mutant, les teneurs en échinénone et j- carotène sont peu modifiées. La composition en caroténoïdes est également étudiée chez les souches AcrtO, crtR+AcrtO et crtDB*AcrtO (Tableau 2). L'inactivation du gène crtO et l'absence de synthèse d'échinénone sont décrites comme n'ayant pas d'effet sur le taux de croissance, la photosynthèse et le contenu en caroténoïdes (mis à part l'absence d'échinénone) (7). Chez la souche AcrtO obtenue dans notre étude, les teneurs en 0- carotène et zéaxanthine ne sont pas significativement différentes de celles de la souche sauvage. Ce résultat est en accord avec les données de travaux antérieurs (7). Par contre, chez le mutant AcrtO, le myxoxanthophylle s'accumule en des quantités plus de 2 fois plus élevées que chez la souche sauvage. L'inactivation du gène crtO chez la souche crtDB se traduit par une faible augmentation des teneurs en 1- carotène et zéaxanthine et une augmentation significative (30%) de la teneur en myxoxanthophylle. Par contre, la composition en caroténoïdes de la souche crtR'AcrtO est peu modifiée par rapport à celle de la souche crtR. III - Conclusion. Le gène psbAII est décrit comme ayant un promoteur fort chez Synechocystis sp. PCC 6803 (19). Dans cette étude, nous montrons que ce promoteur peut être utilisé pour contrôler et induire la sur-expression de n'importe quel gène chez Synechocystis: l'insertion de la séquence codante de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des caroténoïdes à la place de la séquence codante du gène psbAII est suivie d'une accumulation forte et stable des transcrits correspondants. La sur-expression du gène codant l'IPP isomérase de Saccharomyces cerevisiae se traduit par l'accumulation chez la souche ipi' d'une protéine dont la masse moléculaire est proche de 40 kDa. Cette valeur est en accord avec celle de la masse moléculaire de l'IPP isomérase de Saccharomyces cerevisiae déterminée sur un gel de type PAGE-SDS (1). L'expression chez Escherichia coli du gène codant l'IPP isomérase de levure se traduit par une augmentation de la biosynthèse des caroténoïdes (11). Dans ce système, l'augmentation des teneurs en caroténoïdes est proportionnelle à celle de l'activité de l'IPP isomérase. Dans notre étude, la sur- expression du gène ipi n'a aucun effet sur la composition en caroténoïdes de la souche ipi'. L'activité globale de l'IPP isomérase reste à déterminer chez cette souche de façon à savoir si l'IPP isomérase de levure est fonctionnelle chez la souche de Synechocystis mutante. Deux hypothèses peuvent expliquer l'absence d'effet d'une sur-expression du gène codant l'IPP isomérase sur la teneur en caroténoïdes: (i) 1'IPP isomérase de levure est trop différente de celle de Synechocystis pour être fonctionnelle chez cet organisme ou bien (ii) l'isomérisation de l'IPP n'est pas une étape limitante chez Synechocystis sp. PCC 6803. La sur-expression des gènes de Synechocystis directement impliqués dans la biosynthèse des caroténoïdes est apparemment suivie d'une augmentation de la synthèse des enzymes codées par ces gènes car la composition en caroténoïdes des souches mutantes obtenues est modifiée par rapport à celle de la souche sauvage. La modification de l'expression de gènes permet de mieux comprendre la régulation de la biosynthèse des caroténoïdes. La sur-expression des gènes codant la phytoène synthase et la phytoène désaturase (respectivement crtB et crtD) chez la souche crtDB+ se traduit par une augmentation de l'accumulation d'un transcrit de 2,6 kb. Ce long transcrit semble inclure les deux transcrits des gènes crtD et crtB. Il est détecté chez la souche mutante et la souche sauvage, ce qui suggère que les gènes crtD et crtB fassent partie du même opéron. La présence chez la souche crtDB' de deux transcrits de plus petite taille (1,2 kb et 1,4 kb), spécifiques des gènes crtB et crtD, reflète la maturation du transcrit de 2,6 kb ou bien la transcription des deux gènes indépendamment. Des données obtenues antérieurement et montrant que l'inactivation du gène crtD n'affecte pas l'expression d'un gène rapporteur inséré à la place du gène crtB, semblent indiquer que le gène crtB possède son propre promoteur (14). La détection récente de transcrits de taille inférieure à 2,5 kb (taille attendue pour un ARNm dicistronique), spécifiques des gènes crtB et crtD, confirme ces résultats (8). La désaturation du phytoène est une étape limitante de la biosynthèse des caroténoides chez Synechococcus sp. PCC 7942 (6). Chez Synechocystis sp. PCC 6803, la seule sur-expression du gène crtD codant la phytoène désaturase n'induit pas d'augmentation de la synthèse des caroténoïdes chez la souche mutante correspondante (résultat non montré). Par contre, la sur-expression des deux gènes associés crtD et crtB (le second codant la phytoène synthase) se traduit par une augmentation de 50% des teneurs en myxoxanthophylle et zéaxanthine. Ces deux caroténoïdes étant deux produits finaux de voies de biosynthèse chez Synechocystis, la capacité globale de biosynthèse des caroténoïdes est donc accrue chez la souche crtDB*. La voie de biosynthèse du myxoxanthophylle reste à ce jour inconnue. Ce pigment semble être synthétisé à partir du 7-carotène (2). Chez la souche crtDB', la sur-expression des gènes crtD et crtB serait suivie d'une augmentation de la synthèse de y-carotène, pigment non accumulé mais converti en partie en myxoxanthophylle. L'augmentation de la synthèse en 7- carotène devrait se traduire également par une augmentation de la synthèse en P-carotène. La teneur en -carotène chez la souche crtDB' n'est pas modifiée par rapport à la souche sauvage, mais la teneur en zéaxanthine, pigment directement formé à partir du P- carotène, est augmentée. Ces résultats indiquent que le contenu en 5carotène ne peut être beaucoup augmenté mais que les teneurs en zéaxanthine ou myxoxanthophylle sont moins strictement régulées. Plusieurs hypothèses peuvent être avancées: il peut exister davantage de sites de liaisons aux caroténoïdes libres pour la zéaxanthine et le myxoxanthophylle que pour le P- carotène. La zéaxanthine et le myxoxanthophylle peuvent également être présents à l'état libre dans les membranes plus facilement que le p-carotène. Dans la membrane, les caroténoïdes dipolaires comme la zéaxanthine ou le myxoxanthophylle prennent une orientation différente de celle du 5-carotène. Ils sont ancrés dans la bicouche lipidique, leur axe pratiquement perpendiculaire à celui de la membrane, alors que les molécules de 1-carotène sont réparties de manière homogène dans la membrane sans orientation définie. Il en résulte que les caroténoïdes dipolaires diminuent la fluidité de la membrane alors que le 1-carotène a tendance à l'augmenter (10). Ces effets contraires des caroténoïdes sur la fluidité membranaire peuvent expliquer les différences observées dans l'accumulation de la zéaxanthine, du myxoxanthophyll et du 1-carotène chez la souche crtDB*. La sur-expression du gène codant la 1- carotène hydroxylase se traduit par une forte augmentation de l'accumulation de zéaxanthine chez la souche crtR*. Chez la souche sauvage, la teneur en zéaxanthine représente 24% de la teneur totale en caroténoïdes et le 1-carotène est le caroténoïde le plus abondant (33% du total). Chez le mutant crtR*, la zéaxanthine devient le caroténoïde le plus abondant (57% du total) et le 1-carotène devient un pigment minoritaire. Ce résultat suggère que l'hydroxylation du 1-carotène est une étape limitante de la synthèse de zéaxanthine chez Synechocystis sp. PCC 6803: la conversion du 1-carotène en zéaxanthine est régulée par la quantité de P-carotène hydroxylase disponible. D'après des travaux antérieurs, l'inactivation du gène codant la P-carotène kétolase (crtO) a pour seul effet l'absence de synthèse d'échinénone (7). Dans cette même étude, les teneurs en myxoxanthophylle de la souche sauvage et de la souche mutante chez laquelle le gène crtO a été inactive, semblent faibles par rapport aux autres caroténoïdes. Dans notre étude, les teneurs en myxoxanthophylle sont plus élevées chez les souches AcrtO et crtDB'AcrtO que chez les souches sauvage et crtDB+. Les teneurs des autres caroténoïdes (P-carotène et zéaxanthine) sont peu ou prou modifiées suite à l'inactivation du gène crtO. Ces différences observées dans la composition en caroténoïdes peuvent être la conséquence de l'utilisation de méthodes différentes pour extraire et analyser les teneurs en caroténoïdes. Dans notre étude, l'inactivation du gène crtO se traduit par une augmentation nette de la teneur globale en caroténoïdes des souches mutantes dérivées des souches sauvage et crtDB+, augmentation entièrement due à l'accroissement du contenu en myxoxanthophylle. Le fonctionnement de cette régulation reste à déterminer. Chez la souche crtR', la teneur en échinénone est réduite car la sur-expression de la P-carotène hydroxylase se traduit par une conversion préférentielle du P-carotène en zéaxanthine plutôt qu'en échinénone. De ce fait, l'inactivation du gène crtO chez la souche crtR ne se traduit pas par une augmentation de l'accumulation de myxoxanthophylle. L'absence d'échinénone n'est pas accompagnée de changement physiologique chez les mutants de Synechocystis mais leur composition en caroténoïdes est modifiée. Les changements relatifs observés dans les teneurs des différents caroténoïdes sont peut être liés au remplacement fonctionnel d'un caroténoïde par un autre. Des opérons composés de gènes impliqués dans la biosynthèse des caroténoïdes ont été isolés et la fonction de chaque gène identifiée chez de nombreux microorganismes (3). Le génie génétique utilise les techniques de la biologie moléculaire et de l'ADN recombinant pour modifier les voies métaboliques dans des cellules vivantes afin de produire des composés cibles avec des rendements et une productivité supérieurs. Ces techniques ont été largement utilisées pour la production in vivo de caroténoïdes chez des organismes bactériens ou des levures qui n'en produisent pas de manière naturelle (voir référence 17). Dans notre étude, nous montrons que ces techniques peuvent être utilisées avec succès chez Synechocystis sp. PCC 6803 pour produire des caroténoides cibles comme la zéaxanthine. IV - Extraction des caroténoïdes d'une culture de cvanobactéries qénéticquement modifiées. L'extraction des caroténoides d'l kg de biomasse microalgale de teneur en matière sèche comprise entre 10 et 20% est réalisée à l'aide de 10 litres d'un mélange de méthanol/acétone 1/1 (v/v). La biomasse additionnée de la phase extractive est mixée rapidement, puis placée sous agitation pendant 20 minutes à température ambiante. La biomasse est ensuite séparée du mélange de solvants par centrifugation, et subit une deuxième extraction dans le mêmes conditions. Les deux phases extractives ainsi obtenues sont regroupées et évaporées sous vide ou sous azote. Deux extractions successives permettent la récupération de plus de 95% des caroténoides, et 90% de la zéaxanthine sont extraits dès la première extraction. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Anderson, M. S., M. Muehlbacher, I. P. Street, J. Proffitt and C. D. Poulter. 1989. Isopentenyl diphosphate:dimethylallyl diphosphate isomerase. An improved purification of the enzyme and isolation of the gene from Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 264:19169-19175. 2. Armstrong, G. A. 1994. Eubacteria show their true colors: genetics of carotenoid pigment biosynthesis from microbes to plants. J. Bacteriol. 176:4795-4802. 3. 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REVENDICATIONS 1) Cyanobactérie génétiquement modifiée caractérisée en ce qu'elle est transformée avec au moins un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes et plus particulièrement de la zéaxanthine. 2) Cyanobactérie selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est transformée avec au moins un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes et plus particulièrement de la zéaxanthine, introduit à la place de l'un au moins des gènes psbAII et psbAIII. 3) Cyanobactérie selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce qu'elle est transformée avec un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes placé sous le contrôle du promoteur du gène psbAII. 4) Cyanobactérie selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est transformée avec au moins un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique se situant en aval de l'IPP isomérase dans la voie de biosynthèse des caroténoïdes et plus particulièrement de la zéaxanthine. ) Cyanobactérie selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est transformée avec au moins un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique choisie parmi les activités des enzymes suivantes: IPP isomérase, phytoène synthase, phytoène désaturase, 4-carotène désaturase, lycopène cyclase, 5-carotène kétolase, 3- carotène hydroxylase. 6) Cyanobactérie génétiquement modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle ne possède pas de gène de sélection. 7) Cyanobactérie selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est du type Synechocystis sp. PCC 6803. 8) Procédé de préparation d'une cyanobactérie génétiquement modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on transforme une cyanobactérie avec au moins un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes et plus particulièrement de la zéaxanthine. 9) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend donc les étapes suivantes: a) on introduit dans une cyanobactérie, une cassette d'expression comprenant un gène de sélection négatif et un gène de sélection positif, b) on sélectionne les génotypes mutants par sélection positive, c) on introduit par double recombinaison homologue un gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes et plus particulièrement de la zéaxanthine, d) on sélectionne les souches génétiquement modifiées ayant intégré le gène codant une protéine ayant une activité enzymatique impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes par sélection négative. ) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il consiste à l'étape (a) à insérer, avantageusement au niveau du locus psbAII, une cassette d'expression comprenant: - le gène de sélection négatif SacB, et - un gène de résistance à un antibiotique, préférentiellement à la kanamycine, comme gène de sélection positif. 11) Biomasse microalguale caractérisée en ce que les micro-algues sont des cyanobactéries selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 12) Procédé de production de caroténoïde et plus particulièrement de zéaxanthine consistant: - à cultiver des cyanobactéries génétiquement modifiées selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, - à séparer la biomasse microalgale du milieu de culture usé de préférence par centrifugation, - à extraire les caroténoïdes de la biomasse. 13) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la culture est réalisée dans un photobioréacteur tubulaire. 14) Procédé selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que la culture est effectuée en mode continu sur un temps de renouvellement court de l'ordre de 1,7 à 3 jours, et sur milieu non carencé en azote. ) Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que la culture est réalisée avec un milieu de culture à un pH de l'ordre de 8 et à une température située entre 25 et 35 C. 16) Procédé selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que l'extraction des caroténoïdes de la biomasse microalgale est réalisée avec un ou plusieurs solvants organiques, de préférence polaires.