FR 2780512 A1 19991231 FR 9808093 A 19980625 UTILISATION DE RECEPTEURS DE LA FAMILLE REV- ERB POUR LE CRIBLAGE DE SUBSTANCES UTILES DANS LE TRAITEMENT DES DYSFONCTIONNEMENTS DU MÉTABOLISME LIPIDIQUE. La présente invention est relative à l'utilisation de récepteurs de la famille Rev-erb pour le criblage de substances utiles dans le traitement des dysfonctionnements du métabolisme lipidique, liés notamment à l'apolipoprotéine C-III. L'invention concerne plus particulièrement les méthodes de criblage permettant de sélectionner des substances utiles pour le traitement de ces dysfonctionnements. L'invention concerne enfin l'utilisation des substances ainsi identifiées pour la préparation de compositions thérapeutiques utiles pour le traitement des dysfonctionnements du métabolisme lipidique liés a l'apolipoprotéine C-III, comme par exemple l'athérosclérose. L'apolipoprotéine C-III, ci-après nommée apo C-III, est une glycoprotéine de 79 acides aminés synthétisée dans le foie et dans une moindre mesure dans l'intestin. Elle joue un rôle majeur dans le métabolisme des triglycérides plasmatiques. En effet, les concentrations plasmatiques d'apo C-III sont corrélées positivement aux taux plasmatiques de triglycérides, que ce soit dans la population normale ou chez des patients hypertriglycéridémiques (1-4). De plus, la distribution relative de l'apo C-III par rapport aux autres classes de lipoprotéines semble importante: une augmentation de la concentration d'apo C-III dans les particules qui contiennent de l'Apo B (apo C-III-LpB) est associée à une élévation du risque de maladies cardiaques ou coronariennes (5). Plusieurs évidences lient l'apo C-III au catabolisme des triglycérides plasmatiques. Une carence en apo C-III se traduit par une augmentation du catabolisme des particules de très faible densité (VLDL), alors qu'une augmentation de la synthèse de l'apo C-III apparaît chez les patients hypertriglycéridémiques (6,7). De plus, des études génétiques ont mis en évidence la relation existant entre certains polymorphismes du gène de l'apo C-III et des concentration élevées de triglycérides et d'apo C-III plasmatiques (8,9). Enfin, la surexpression de l'apo C-III humaine dans des animaux transgéniques s'est traduite par le développement d'une hypertriglycéridémie alors que la délétion du gène endogène de l'apo C-III par recombinaison homologue chez la souris a conduit à une diminution de la concentration plasmatique d'apo C-III et à une protection de l'animal vis-à-vis de l'hypertriglycéridémie postprandiale (10,11). Les résultats d'études réalisées in vivo et in vitro indiquent que l'apo C-III agit principalement en retardant le catabolisme des particules riches en triglycérides soit en inhibant leur liaison à la surface de l'endothélium et la lipolyse subséquente par la lipoprotéine lipase, soit en interférant avec la clairance des particules résiduelles (remnants) assurée par le récepteur de l'apo E (12-16). Enfin, l'importance de l'apo C-III dans le métabolisme des lipoprotéines est également suggérée par l'observation de plusieurs caractéristiques de l'hyperlipidémie familiale combinée (grande quantité de VLDL et de LDL associée à des maladies cardiaques et coronariennes précoces) chez les descendants de croisements entre des souris dont le gène du récepteur des particules de faible densité (LDL) a été éliminé par recombinaison homologue et des souris surexprimant le gène humain de l'apo C-III (17). Les récepteurs nucléaires Rev-erb forment une sous-famille de récepteurs nucléaires orphelins codés par au moins trois gènes distincts, Rev- erb(earl), Rev-erbl(BD73,ear4,RVR) et HZF-2 (18-25) dont les ligands naturels sont actuellement inconnus. L'ARNm codant pour le récepteur nucléaire Rev-erbx est exprimé dans de nombreux tissus, particulièrement dans le muscle, le tissu adipeux brun et le cerveau (26). L'expression du gène Rev-erba est induite lors de la différenciation adipocytaire (26) et dans le foie en réponse à un traitement chronique aux fibrates (27). Les deux autres gènes sont notamment exprimés dans le cerveau (22,25). Rev-erba et Rev-erbP se lient respectivement comme monomère sous la forme de deux monomères sur un élément de réponse constitué d'un demi- site PuGGTCA précédé d'une région de 5 paires de bases riche en A/T (A/TA-A/T-N-T-A/G-G-G-T-C-A)(28, 21). Une liaison dimérique sur une répétition directe de deux demi-sites AGGTCA séparée de deux paires de bases et précédée d'une région riche en A/T a également été décrite in vitro (29). Contrairement à ce qui avait été initialement décrit (28), il semble que les récepteurs nucléaires de la sous-famille de Rev-erb répriment la transcription (29, 20). A ce jour, seulement trois cibles physiologiques ont été identifiées, l'oncogène N- myc (30), le gène de l'apo A-I de rat (27) et le récepteur nucléaire humain hRev-erba lui-même (31) Les travaux des Inventeurs ont permis de montrer que les récepteurs Rev-erb sont des régulateurs négatifs de la transcription du gène de l'apo C-III. Ces récepteurs sont donc capables de réprimer la transcription du gène de l'apo C-III qui est lié au développement de l'hypertriglycéridémie et de l'hyperlipidémie. La présente invention concerne donc l'utilisation de récepteurs Rev-erb et/ou d'un de leur élément de réponse ou d'un équivalent fonctionnel de ceux-ci pour le criblage de substances utiles dans le traitement des dysfonctionnements du métabolisme lipidique. Au sens de la présente invention, on désigne par récepteur Rev-erb, l'ensemble des isoformes a, P et de la famille Rev-erb On entend par équivalent fonctionnel de Rev- erbtoute protéine possédant à la fois: - un site de fixation du ligand possédant une sélectivité comparable à celle de Rev-erb pour un ligand donné de celui-ci et - un site de fixation sur l'ADN reconnaissant le même élement de réponse que Rev-erb ou un élément de réponse possédant une séquence d'acides nucléiques proche. On entend également par équivalent fonctionnel de Rev-erb une protéine chimère possédant: - un site de fixation du ligand possédant une sélectivité comparable à celle de Rev-erb pour un ligand donné de celui-ci et - un site de fixation sur l'ADN reconnaissant un élément de réponse d'un gène rapporteur, ou un domaine protéique qui permet la purification aisée de la chimère et sa fixation spécifique à des matrices définie comme par exemple la maltose binding protein (MBP) ou la gluthation-S- transférase (GST). Ce dernier type de chimère a été souvent utilisé (53). Il présente l'avantage de permettre une purification de la protéine en une étape par colonne d'affinité ou de séparer spécifiquement celle-ci par des procédures simples bien connues de l'homme du métier (couplage à des billes ou à des résines, élution par du maltose ou du gluthation..) On entend par équivalent fonctionnel de l'élément de réponse du récepteur Rev-erb, toute séquence d'acide nucléique sur laquelle peut se fixer le récepteur Rev-erb et plus particulièrement une séquence dérivant de l'élément de réponse du récepteur Rev-erb. On préfère plus particulièrement dans l'utilisation de l'invention le récepteur hRev-erbc l'ARN messager de hRev-erba et l'élément de réponse du récepteur hRev-erba. La présente invention a donc pour objet un premier type de procédé de criblage de substances utiles dans le traitement des dysfonctionnements du métabolisme lipidique consistant à mettre en contact la substance à tester avec un récepteur de la famille Rev-erb et/ou un élément de réponse du récepteur Rev-erb, et/ou un facteur nucléaire capable de coupler fonctionnellement Rev-erb au complexe ARN-polymérase, ou un équivalent fonctionnel de ceux-ci, puis à mesurer par tout moyen approprié: - la fixation de ladite substance sur le récepteur Rev-erb et/ou son équivalent fonctionnel ou la fixation du complexe formé de ladite substance et du récepteur Rev-erb sur son élément de réponse et/ou sur un facteur nucléaire capable de coupler fonctionnellement Rev-erb au complexe ARNpolymérase,, et/ou - la modulation de l'activité transcriptionnelle d'un gène placé sous le contrôle d'un promoteur comprenant ledit élément de réponse. La mesure de la fixation de la substance sur le récepteur Rev-erb et/ou son équivalent fonctionnel ou la fixation du complexe formé de ladite substance et du récepteur Rev-erb sur son élement de réponse peut être réalisée par toutes méthodes directes ou indirectes connues de l'homme du métier, comme celles utilisant un gène rapporteur, les tests de binding,... De la même manière, la mesure de la modulation de l'activité transcriptionnelle d'un gène placé sous le contrôle d'un promoteur comprenant l'élément de réponse de Rev-erb peut être réalisée par toutes méthodes directes ou indirectes connues de l'homme du métier. Afin de préciser l'utilité de la substance testée dans le traitement des dysfonctionnements du métabolisme lipidique, le procédé de l'invention comprend une étape supplémentaire visant à déterminer par tout moyen approprié l'effet de ladite substance sur l'expression de l'apo C-III. La détermination de l'effet de la substance testée sur l'expression de l'apo C-III peut être réalisée par toutes méthodes directes ou indirectes connues de l'homme du métier, comme une transfection, une analyse des ARNm in vitro et sur des modèles in vitro et in vivo. Un premier exemple de procédé de criblage selon la présente invention comprend les étapes suivantes: a) on transfecte un hôte cellulaire avec un fragment d'ADN codant pour un récepteur Rev-erb ou l'un de ses équivalents fonctionnels, b) on cotransfecte l'hôte de l'étape (a) avec une construction comprenant un élément de réponse dudit récepteur Rev-erb et au moins un gène rapporteur, c) on mesure par tout moyen approprié l'expression du gène rapporteur en présence de la substance à tester. L'élément de réponse mis en oeuvre à l'étape (b) pourra par exemple être constitué du fragment proximal du promoteur de l'apo C-III. Tout gène rapporteur permettant de mesurer l'activité de récepteurs nucléaires sur la séquence comprenant leur élément de réponse peut être utilisé dans le procédé de criblage selon l'invention. Parmi ceux-ci, on peut citer par exemple le gène de la chloramphénicol acétyltransférase (CAT), le gène de la luciférase de luciole (Luc) ou de Renilla (Ren), le gène de la phosphatase alcaline secrétée (PAS) ou celui de la béta-galactosidase (9-Gal). L'activité des protéines codées par ces gènes peut être facilement mesurée par des méthode classiques et permet de connaitre l'effet des récepteurs nucléaires sur l'expression des gènes en mesurant la quantité de protéines produite et ou leur activité enzymatique. L'action des récepteurs Rev-erb et plus particulièrement du récepteur hRev-erbx sur le gène de l'apo C-III rapportée par les Inventeurs permet bien entendu d'utiliser, dans les constructions de l'invention et les procédés de criblages les mettant en oeuvre, le gène de l'Apo C-III comme gène rapporteur. Dans le procédé de criblage de l'invention, on entend par hôte cellulaire, tout type cellulaire adapté à l'expression des gènes ci-dessus, comme notamment des cellules de mammifères, des bactéries ou des levures ou encore des cellules d'insectes. Les vecteurs utilisés sont bien entendu adaptés au type cellulaire transfecté, on peut citer des plasmides, des virus ou des chromosomes artificiels. Un autre exemple de ce premier type de procédé de criblage selon l'invention comprend les étapes suivantes: a) on crée un plasmide qui comprend plusieurs copies d'un élément de réponse reconnu par Rev-erb comme par exemple un site RevDR2 du promoteur de Rev-erbx (31), le site consensus décrit par M. Lazar (28, 29), le site du promoteur apo C-III. Ces copies de l'élément de réponse sont clonées en amont d'un promoteur fort hétérologue comme le promoteur de la thymidine kinase du virus de l'Herpès Simplex, ou homologue comme le promoteur de l'apo C-III. Ce promoteur est lui même disposé de manière à contrôler l'expression d'un gène rapporteur comme la luciférase, la CAT, la phosphatase alcaline, la i-galactosidase, b) on transfecte la constuction de l'étape (a) dans des cellules qui expriment Rev-erb naturellement ou artificiellement, c'est à dire après cotransfection transitoire d'un vecteur d'expression ou création d'une lignée stable exprimant Rev- erb, et c) on incube l'hôte de l'étape (c) en présence de la substance à tester, d) on mesure par tout moyen approprié l'activité du gène rapporteur. Les sites revDR2 sont des éléments de réponse de Rev-erb sur lesquels le récepteur de fixe pour moduler l'activité transcriptionnelle du gène placé en amont. Ces sites peuvent être utilisés pour conférer une sensibilité pour Rev-erb à un promoteur hétérologue. Un exemple supplémentaire de ce premier type de procédé comprend les étapes suivantes: a) on crée un plasmide qui comprend plusieurs copies d'un élément de réponse reconnu par Rev-erb clonés en amont d'un promoteur fort qui contrôle l'expression d'un gène de sélection suicidaire comme par exemple l'activateur d'une prodrogue toxique telle que la thymidine kinase du virus de l'Herpès (48), b) on transfecte la construction de l'étape (a) dans un hôte cellulaire, c) on cotransfecte l'hôte de l'étape (b) à l'aide d'un vecteur exprimant Rev-erb et, d) on incube l'hôte de l'étape (c) en présence de la substance à tester, e) on mesure par tout moyen approprié la survie cellulaire en présence de la prodrogue toxique. La prodrogue toxique pourra par exemple être le ganciclovir Encore un autre exemple de ce premier type de procédé comporte les étapes suivantes: a) on crée un plasmide qui comprend plusieurs copies d'un élément de réponse reconnu par le facteur nucléaire de levure Gal4 clones en amont d'un promoteur fort, comme le promoteur de la thymidine kinase du virus de l'Herpès Simplex, qui contrôle l'activité d'un gène rapporteur tel que la luciférase, CAT, phosphatase alcaline, 9-galactosidase, hormones de croissance,- b) on crée le plasmide d'une chimère qui comprend le domaine de liaison à l'ADN de Gal4 (49) et les domaines DEF de Rev-erb qui sont les domaines de Rev-erb sur lesquels se fixent les ligands, I0 c) on cotransfecte les plasmides obtenus aux étapes (a) et (b) dans un hôte cellulaire et d) on incube l'hôte de l'étape (c) en présence de la substance à tester, e) on mesure par tout moyen appropriél'activité du gène rapporteur. Les domaines DEF des récepteurs nucléaires divergent entre les différents membres de cette famille. Ils comprennent des séquences impliquées dans la transactivation de la transcription et la liaison des ligands et des cofacteurs. Les domaines DEF de Rev-erb sont combinés au fragment Gal4 qui contient les 147 premiers acides aminés de Gal4 pour créer une chimère Gal4-Rev-erbDEF qui se fixe sur l'élément de réponse à Gal4 et dont l'activité transcriptionnelle dépend des ligands et/ou des cofacteurs de Rev-erb (29) L'activité de base de la chimère peut être augmentée par l'insertion d'un fragment d'ADN qui code pour tout ou partie de la protéine VP16 (50). Le premier type de procédé de criblage peut encore se réaliser de la manière suivante: a) on crée un plasmide qui comprend plusieurs copies d'un élément de réponse reconnu par le facteur nucléaire de levure Gal4 clones en amont d'un promoteur fort qui contrôle l'expression d'un gène de sélection suicidaire, comme expliqué plus haut, b) on crée une chimère qui comprend le domaine de liaison à l'ADN de Gal4 et les domaines DEF de Rev-erb, c) on cotransfecte les plasmides obtenus aux étapes (a) et (b) dans un hôte cellulaire, et d) on incube l'hôte de l'étape (c) en présence de la substance à tester, 1 1 2780512 e) on mesure par tout moyen approprié la survie cellulaire en présence de la prodrogue toxique. L'activité de base de la chimère peut être augmentée par l'insertion d'un fragment d'ADN qui code pour tout ou partie de la protéine VP16 (50). Un exemple supplémentaire de ce premier type de procédé de criblage consiste en l'évaluation quantitative des effets des composés testés dans des systèmes de type "double hybride" dans des levures ou d'autres cellules qui comprennent les fragments de Rev- erb qui intèragisent avec des cofacteurs et les fragments correspondant des cofacteurs (ex. RIP13a, RIP13dl (51), N-COR (52) ou éventuellement SMRT et P300/CBP) qui couplent Rev-erb à la machinerie transcriptionnelle et notamment au complexe ARN polymérase. Un autre exemple de premier type de méthode de criblage selon l'invention consiste à évaluer de manière quantitative les effets des composés testés sur la capacité d'interaction in vitro entre la protéine hRev-erba entière ou certains de ses fragments et des cofacteurs ou certains de leurs fragments par toute technique connue de l'art du métier (par exemple par l'approche CARLA développée pour le criblage de ligand PPAR (53), méthode par mesure de transfert d'énergie de fluorescence par résonnance). Un dernier exemple du premier type de procédé de criblage selon l'invention consiste à transformer un hôte cellulaire comme défini précédemment, avec une construction portant un gène codant pour le récepteur Rev-erb ou son équivalent fonctionnel et/ou un élément de réponse du récepteur Rev-erb, puis à utiliser lesdits hôtes cellulaires ou des extraits de ceux-ci dans des essais de "binding" fondés sur le déplacement compétitif entre un ligand froid et un ligand marqué. La présente invention a également pour objet un deuxième type de procédé de criblage de substances utiles dans le traitement des dysfonctionnements du métabolisme lipidique consistant à déterminer l'effet de la substance à tester sur la modulation de l'expression de Rev-erb. Un exemple de procédé de criblage basé sur la mesure de la modulation de l'expression de Rev-erb consiste à évaluer de manière directe l'effet de composés sur l'accumulation cellulaire de l'ARNm codant pour Rev-erb par hybridation in situ (technique Amersham), RPA,RT-PCR quantitative ou semi-quantitative, Dot Blot ou Northern Blot. Un deuxième exemple de détermination de la modulation de l'expression de Rev-erb consiste à mesurer l'effet de la substance à tester sur l'expression cellulaire de la protéine Rev-erb par immunocytochimie, ELISA ou western blotting. Un exemple supplémentaire de ce deuxième type de procédé consiste à évaluer de manière indirecte l'activité du promoteur du gène Rev-erb. Ce procédé comprend les étapes suivantes: a) on crée un plasmide qui comprend le promoteur du gène de Rev-erb (31) cloné en amont d'un gène rapporteur tel qu'un gène luciférase, CAT, phosphatase alcaline, P-galactosidase, hormones de croissance,... ou d'un gène de sélection comme un gène 13 2780512 de résistance à un antibiotique ou à un enzyme de conversion d'un précurseur non métabolisable, b) on transfecte un hôte cellulaire, c) on introduit la substance à tester, d) on mesure par tout moyen approprié l'activité du gène rapporteur ou la survie cellulaire. Le promoteur de Rev-erb contrôle l'expression du gène de Rev-erb et contient notamment un élément de réponse à Rev-erb responsable d'une auto- inhibition de la transcription du gène. Des constructions comprenant des fragments de ce promoteur sont disponibles pour caractériser les facteurs impliqués dans la modulation de l'expression de ce gène. Un exemple supplémentaire de procédé de mesure de la modulation de l'expression de Rev-erb consiste à mesurer l'activité du promoteur endogène du gène Rev-erb. Ce procédé comprend les étapes suivantes: a) on crée un plasmide qui comprend plusieurs copies d'un élément de réponse reconnu par Rev-erb clones en amont d'un promoteur fort qui contrôle l'expression d'un gène de sélection suicidaire comme un activateur d'une prodrogue telle que la thymidine kinase du virus de l'Herpès, ou un gène rapporteur, b) on transfecte la construction obtenue à l'étape(a) dans un hôte cellulaire, c) on établit une lignée cellulaire stable qui exprime cette construction et qui exprime hRev-erbc et d) on incube l'hôte de l'étape (b) ou (c) en présence de la substance à tester, e) on mesure par tout moyen approprié la survie cellulaire en présence de la prodrogue toxique ou l'activité du gène rapporteur. La présente invention a aussi pour objet les substances sélectionnées par une méthode de criblage selon la présente invention, ainsi que l'utilisation de ces substances pour la préparation d'une composition notamment pharmaceutique réprimant l'expression de l'apo C-III et donc destinée au traitement des dysfonctionnements du métabolisme lipidique chez l'homme ou l'animal. En effet, les composés possédant de telles propriétés sont sélectionnés sur la base de leur capacité à réprimer l'expression de l'apo C-III, et peuvent être des ligands de Rev-erb ou des analogues de Rev-erb, dont les propriétés sont mises en évidence soit directement à partir du niveau d'expression de l'apo C- III, soit par le biais de l'expression d'un gène rapporteur, ou encore par leur capacité à former un complexe avec le récepteur Rev-erb. L'invention concerne donc plus généralement l'utilisation d'une substance capable de moduler l'expression de l'apo C-III pour la préparation d'une composition notamment pharmaceutique utile pour le traitement et/ou à la prévention des dysfonctionnements du métabolisme lipidique liés à l'apolipoprotéine C-III chez l'homme ou l'animal. Plus particulièrement l'invention se rapporte à l'utilisation d'une substance capable de se fixer au récepteur Rev-erb ou à son élement de réponse pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour le traitement et/ou à la prévention des dysfonctionnements du métabolisme lipidique chez l'homme ou l'animal. L'invention concerne encore l'utilisation d'une substance capable de moduler l'expression du gène codant pour le récepteur Rev-erb pour la préparation d'une composition notamment phrmaceutique utile pour le traitement et/ou la prévention des dysfonctionnements du métabolisme lipidique lié à l'apolipoprotéine C-III chez l'homme ou l'animal. Parmi les dysfonctionnements liés au métabolisme lipidique de l'apolipoprotéine C-III chez l'homme ou l'animal on peut citer l'hyper lipidémie, les complications liées au diabète, l'obésité, le syndrome X, ou la résistance à l'insuline et les maladies cardiaques et coronariennes. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent décrivant la modulation de l'expression de l'apo C-III humaine par le récepteur hRev-erbx. I. METHODES. 1. Culture cellulaire. Les lignées HepG2 (hepatome humain) et RK13 (rein de lapin) proviennent de l'E.C.A.C.C. (Porton down, Salisbury, U.K.). Ces lignées ont été maintenues dans des conditions de culture standard (Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium, supplémenté de 10% de sérum de veau foetal, incubation à 37 C dans une atmosphère humide de 5% C02/95% air). Le milieu de culture est changé tous les deux jours. 2. Construction des plasmides recombinants. L'activité du promoteur du gène de l'apo C- III a été étudiée selon les techniques classiques utilisant des gènes rapporteurs. Un fragment génomique qui comprend les séquences -1415/+24 du promoteur du gène de l'apo C-III humaine a été préparé par digestion avec les enzymes EcoRI et PvuII, rendu franc par 16 2780512 traitement au fragment de Klenow de l'ADN polymérase et cloné dans le site HincII du vecteur PUC18. Ensuite, le promoteur de l'apo C-III a été excisé par digestion avec HindIII et BamHI et sous-cloné dans les sites de restriction correspondants du vecteur pBLCAT5 (32) pour générer le plasmide -1415/+24 WT-hCIII-CAT. Le plasmide -1415/+24 C3Pmut- hCIII-CAT a été réalisé par mutagenèse dirigée du plasmide sauvage correspondant à l'aide du système Amersham de mutagenèse in vitro basé sur la méthode de Nakayame et Eckstein (33). Pour ce faire, un oligonucléotide couvrant la région -58/-80 du promoteur du gène de l'apo C-III humaine et comprenant deux mutations ponctuelles (5'-TGA CCT TTG CTG AGC GCC CTG GG-3') a été hybridé au fragment simple brin -1415/+24 du promoteur de l'apo C-III humaine sous-cloné dans le bactériophage M13mpl8. Les plasmides -198/+24 WThCIII- CAT et -198/+24 C3PmuthCIII-CAT comprenant le fragment proximal du promoteur de l'apo C-III humaine ont été obtenus par digestion des plasmides -1415/+24WThCIII-CAT et -1415/+24 C3Pmut-hCIII-CAT par PstI et religation. Afin de transférer le gène rapporteur Luc+ dans les constructions décrites précédemment, le gène rapporteur luciférase Luc+ du vecteur rapporteur pGL3 (Promega) a été excisé par les enzymes SacI et BamHI et sous-cloné dans les sites correspondants du vecteur pBKCMV(Stratagene) pour donner le vecteur pBKCMV-Luc+. Le gène rapporteur CAT des constructions - 1415/+24WThCIII-CAT, -1415/+24 C3Pmut-hCIII-CAT, - 198/+24 WThCIII-CAT et -198/+24 C3PmuthCIII-CAT a été excisé par les enzyme KpnI et BamHI et remplacé par le gène rapporteur Luc+ obtenu par digestion du plasmide pBKCMV-Luc+ par les enzymes BglII et KpnI pour donner les plasmides -1415/+24 WThCIII-Luc+, -1415/+24 C3PmuthCIII-Luc+, -198/+24WThCIII-Luc+ et - 198/+24C3PmuthCIII-Luc+. Le plasmide Tk-Luc+ a été construit en insérant le gène rapporteur Luc+ obtenu par digestion du plasmide pBKCMV- Luc+ avec les enzymes BglII et KpnI dans le vecteur pBLCAT4 (32) coupé par BglII et KpnI à la place du gène rapporteur CAT. Les fragments - 1415/+24 et -198/+24 du promoteur de l'apo C-III ont également été amplifiés par PCR en utilisant une amorce ' qui transforme le site HindIII du vecteur pBLCAT5 en un site NheI (5'-ACG GCC AGT TGC TAG CTT GCA TGC CTG C- 3'), une amorce 3' qui s'hybride au début du gène rapporteur Luc+ (5'-TAT GCA GTT GCT CTC CAG CGG TTC CAT CTT CC-3') et les plasmides -1415/+24 WThCIII-Luc+ et - 198/+24WThCIII-Luc+ comme matrice. Les fragments PCR obtenus ont été digérés par HindIII et NheI et insérés dans les sites correspondants du vecteur pGL3. Le plasmide pTk-pGL3 a été construit en amplifiant par PCR le fragment du promoteur de la thymidine kinase du virus de l'Herpès Simplex présent dans le plasmide pBLCAT4 à l'aide des amorces suivantes 5'-CGA CTC TAG AAG ATC TTG CCC CGC CCA GCG-3' et 5'-TCG CCA AGC TTC TCG TGA TCT GCG GCA-3', en digérant le fragment PCR obtenu par les enzymes BglII et HindIII et en l'insérant dans les sites correspondants du vecteur pGL3. Toutes les constructions ont été vérifiées par séquençage. Les plasmides pSG5-hRev-erba (31) et pCMX- hRORO (34) permettant l'expression exogène des récepteurs nucléaires correspondant ont été transmis par V. Laudet et par V. Giguère, respectivement. Le plasmide pSG5-hHNF4 a été obtenu et décrit dans notre laboratoire (35). 3. Transfection transitoire et mesure d'activité du promoteur de l'apo C-III humaine. L'activité des récepteurs nucléaires a été mesurée par des techniques classiques de gène rapporteur/cotransfection. L'ADN a été introduit dansles cellules étudiées par les technologies courantes disponibles au laboratoire (phosphate de calcium, Èlectroporation, lipofection,...). Les vecteurs pSG5 et pCMX ont été utilisés comme contrôles négatifs. Dans les expériences présentées, les cellules ont été transfectées à 50-60% de confluence par la technique de précipitation au phosphate de calcium avec un mélange de plasmides qui comprenait en plus des plasmides rapporteur Luc+ ou pGL3 (0.5 gg/ boîte de 60 mm) et des vecteurs d'expression pSG5-hRev-erbx, pSG5-hHNF4 et pCMX-hRORc (0.1-1 pg/ boite de 60 mm), 0.1 gg/ boite de mm du plasmide pCMV- - gal (Clontech) comme contrôle d'efficacité de transfection (36). Après 5 à 6-heures, les cellules étaient lavées deux fois au PBS et incubées pendant 36 heures dans du milieu de culture frais contenant 10% de sérum de veau foetal. Après la transfection, les cellules étaient lysées et les activités luciférase et É-gal étaient mesurées selon des protocoles classiques (37). 4. Expériences in vivo. Des souris dont le gène Rev-erb a été détruit par recombinaison homologue (Rev-erb KO) ont été obtenues par Bjôrn Vennstrôm (Lab. of Developmental Biology, CMB, Karolinska Institute, Stockholm, Su de)(fond SV129 croisé avec un fond BalbC). Nous avons obtenu de Bjôrn Vennstrôm des prélèvements sanguins et des échantillons de foie de souris transgéniques Rev-erb KO ou normales soumises à des régimes Chow ou enrichis en cholestérol (2%). 5. Analyse des paramètres sanquins. Les concentrations lipidiques sériques ont été déterminées par dosage colorimétrique en utilisant les dosages enzymatiques disponibles chez Boehringer Mannheim. Pour établir les profils FPLC (fast protein liquid chromatography), un pool de 200 pl de sérum représentatif de la moyenne a été injecté sur une colonne Superose 6HR 10/30 préconditionnées (Pharmacia, Uppsala, Suède) et éluées à débit constant (0,2 ml/min.) avec du PBS pH 7,4. La densité optique des éluats était mesurée à 280 nm avant qu'ils ne soient récoltés par fraction de 0,27 ml. Le cholestérol et les triglycérides étaient ensuite dosés dans 0,1 ml de chaque fraction (dosage Boehringer). Des volumes équivallents de plasma de souris transgéniques ou témoins ont également été déposés sur gel de polyacrylamide afin de séparer les protéines sériques par électrophorèse. L'identité des protéines révélées par coloration au bleu de Coomasie a été vérifiée par immuno-blotting. 6. Analyse des ARN. Les extractions d'ARN hépatique des souris transgéniques, la préparation et l'hybridation des Northern et Dot Blots et les mesure des niveaux d'ARNm apo C-III ont été effectués selon les protocoles décrits précédemment (38). Les ADNc du clone 36B4 codant pour la phosphoprotéine ribosomale acide PO humaine (39), la GAPDH (40) ou la 5-actine (41) ont été utilisés comme contrôle. Les sondes ADNc ont été marquées au 32p en utilisant des amorces aléatoires grâce au kit distribué par Boehringer Mannheim. Les membranes ont été hybridées avec l.5x106 cpm/ml de chaque sonde selon le protocole décrit précedemment (42). Elles ont été lavées une fois dans un tampon 0.5x SSC et 0.1% SDS à température ambiante pour 10 min et deux fois dans le même tampon à C pendant 30 min et ensuite autoradiographiées (film X-OMAT-AR, Kodak). Les autoradiographies ont été analysées par densitométrie (Densitomètre Biorad GS670). Les résultats ont été normalisés relativement aux niveaux des ARNms des sondes contrôles utilisées(42). 7. Retards sur gel. Les protéines hRev-erbc et hRORc ont été synthétisées in vitro au départ des plasmides pSG5-hRev- erbc et pCMX-hRORO à l'aide de lysats de réticulocyte à l'aide du kit "TnT T7 quick coupled transcrition/translation system" de Promega. Les expériences de retard sur gel ont été réalisées selon le protocole décrit précédemment (43, 44) en utilisant des oligonucléotides double brin phosphorylés aux extrémités par la polynucléotide-kinase en présence d'ATP32P. Les séquences des oligonucléotides utilisés sont les suivantes: RevDR2 = site Rp: élément de réponse à Rev- erb présent dans le promoteur de hRev-erbc (31) oligo sens: 5'- GAT CCG GAA AAG TGT GTC ACT GGG GCA CGA-3' oligo antisens: 5'-GAT CTC GTG CCC CAG TGA CAC ACT TTT CCG-3' RORE = site de fixation consensus pour les récepteurs nucléaires ROR et Rev-erb (45) oligo sens: 5'-GAT CCA GCT TAG AAT GTA GGT CAA-3' oligo antisens: 5'-GAT CTT GAC CTA CAT TCT AAG CTG-3' rAI-TATA-wt = boite TATA du promoteur de l'apo A-I de rat (45) oligo sens: 5'-GAT CCA CAC ATA TAT AGG TCA GGG AAG AAG A-3' oligo antisens: 5'-GAT CTC TTC TTC CCT GAC CTA TAT ATG TGT G-3' rAI-TATA-mut = boite TATA mutée du promoteur de l'apo AI de rat (45) oligo sens: 5'-GAT CCA CAC ATA TAT AGG CAG GGA AGA AGA-3' oligo antisens: 5'-GAT CTC TTC TTC CCT GCC TAT ATA TGT GTG-3' hCIII-TATA-wt = boite TATA du promoteur de l'apo C-III humaine (position -32/+3) oligo sens: 5'-GAT CTG ATA TAA AAC AGG TCA GAA CCC TCC-3' oligo antisens: 5'-GAT CGA GGG TTC TGA CCT GTT TTA TAT CA-3' C3P-DR2 = DR2 potentiel du promoteur de l'apo C-III humaine (- 103/-71) oligo sens: 5'-GAT CCT CAT CTC CAC TGG TCA GCA GGT GAC CTT TGC-3' oligo antisens: 5'-GAT CGC AAA GGT CAC CTG CTG ACC AGT GGA GAT GAG-3' C3P-DR1 = site C3P du promoteur de l'apo C- III humaine (-88/-62) oligo sens: 5'-GAT CTC AGC AGG TGA CCT TTG CCC AGC GCC C-3' oligo antisens: 5'-GAT CGG GCG CTG GGC AAA GGT CAC CTG CTG A-3' Les oligo double brin ont été obtenus en incubant 2,5 ou 5 pg des oligonucléotides sens et antisens dilués dans un tampon d'hybridation (Tris-HCl pH8 50 mM, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, DTT 10 mM) chauffés à C pendant 10 min ensuite à 65 C pendant 10 min et en refroidissant lentement le mélange à température ambiante. 22 2780512 Les tampons de liaison avaient les compositions suivantes: Tampon 1: Hepes 10 mM, KC1 50 mM, glycérol 1 %, MgC12 2,5 mM, DTT 1,25 mM, polydIdC 0,1 gg/pl, ADN de sperme de hareng 50 ng/pl, albumine sérique bovine lig/pl, lysat de réticulocyte: 10%. Tampon 2: Hepes 10 mM, KCl 80 mM, glycérol %, DTT 10 mM, polydIdC 0,1 lig/pl, ADN de sperme de hareng 50 ng/pl, albumine sérique bovine 1ig/pl, lysat de réticulocyte: 10%. Lors des expériences de compétition, des concentrations croissantes d'oligonucléotides double brin non marqués (excès molaire de 50 à 100 fois) étaient ajoutées aux mélanges et incubés 15 min à température ambiante avant l'addition des sondes radioactives. Après addition des sondes radioactives, les lysats de réticulocytes étaient incubés 15 min à température ambiante et les complexes protéine/ADN étaient séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (4%) dans un tampon TBE 0.25X à température ambiante (46). II. Résultats. 1. hRev-erba réduit l'activité du promoteur de l'apo C-III humaine dans les cellules HepG2. Lorsque des cellules HepG2 cotransfectées avec un plasmide comprenant un large fragment du promoteur de l'apo C-III humaine en amont du gène rapporteur Luc (-1415/+24WThCIIILuc+) sont transfectées avec le plasmide pSG5-hRev-c qui permet l'expression exogène du récepteur nucléaire Rev-erba, une réduction dose-dépendante de l'activité du gène rapporteur est observée (figure 1). Ces résultats suggèrent la présence d'un élément de réponse puissant au récepteur nucléaire hRev- erba dans le promoteur de l'apo C-III humaine capable de réduire considérablement l'activité de ce promoteur. 2. hRev-erbo réprime l'activité du promoteur de l'apo C-III dans d'autres cellules. Afin de vérifier si la répression de l'activité du promoteur de l'apo C-III humaine par le récepteur nucléaire hRev-erbx dépend du contexte cellulaire et d'identifier un modèle cellulaire plus pratique à utiliser, les expériences précédentes ont été reproduites avec des cellules RK13. Ces expériences ont produit des résultats similaires (figure 2). Ce modèle a été utilisé par la suite du fait de la stabilité de son phénotype. 3. L'effet du récepteur nucléaire hRev-erbx est spécifique du promoteur de l'apo C-III humaine. Afin d'établir la spécificité de l'effet du récepteur nucléaire hRev- erbx sur le promoteur de l'apo C-III humaine, son activité a été comparée sur d'autres promoteurs (promoteur de la thymidine kinase du virus de l'Herpes Simplex, et dans deux contextes plasmidiques (pGL3 et pBLCAT5). La répression de l'expression du gène rapporteur Luc+ ne s'observe que si celui-ci est précédé de promoteurs spécifiques. Il n'est pas observé en l'absence de promoteurs ou avec le promoteur de la thymidine kinase du virus de l'Herpes Simplex ou le promoteur du virus de SV40 (figure 3). L'effet du récepteur nucléaire hRev-erbo est spécifique. 4. L'effet du récepteur nucléaire hRev-erb. sur l'activité du promoteur de l'apo C-III humaine est dominant. Plusieurs membres de la superfamille des récepteurs nucléaires aux hormones à laquelle appartient hRev-erba reconnaissent des éléments de réponse propres au niveau du promoteur de l'apo C-III humaine: HNF4, le complexe PPAR/RXR, ARPl et COUPTF se fixent sur le site C3P (-58/-80)(47) et modulent l'activité du promoteur de l'apo C- III humaine. Afin d'établir dans quelle mesure hRev-erba influence l'action d'autres récepteurs nucléaires aux hormones, des cellules RKl3 ont été cotransfectées avec une quantité fixe de plasmide rapporteur et des plasmides permettant l'expression exogène des récepteurs hHNF4 ou hRORO et des quantité croissantes de plasmide permettant l'expression exogène de hRev-erbc. Quel que soit le récepteur nucléaire cotransfecté, hRev-erba diminue l'activité du gène rapporteur en dessous du niveau de base: l'effet de hRev-erba est dominant (figure 4, 5). 5. Evaluation de la pertinence physiologique de la modulation par Rev-erb de l'expression de l'apo C-III. Afin d'établir la pertinence physiologique des observations réalisées in vitro décrites plus haut, l'effet de la destruction par recombinaison homologue du gène Rev-erbc dans des souris C57/BL6 a été évalué sur les paramètres sanguins (taux plasmatique de triglycérides et de cholestérol, profil lipidique), l'accumulation hépatique des ARN messagers codant pour l'apo C-III et l'accumulation d'apo C-III dans les lipoprotéines d'animaux normaux et transgéniques sous régime normal ou enrichi en cholestérol (2%). a. Paramètres sanguins. Une augmentation importante de la concentration de triglycérides dans les fractions à faible temps d'élution (VLDL) a été observé dans les souris mutantes par rapport aux souris normales, quel que soit le régime étudié (figure 6). b. Expression du gène de l'apo C-III. L'expression de l'ARNm codant pour l'apo C- III est accrue dans les souris dont le gène Rev-erba a été détruit par recombinaison homologue (figure 7) c. Expression et sécrétion de la protéine. L'accumulation d'apo C-III dans le plasma révélée par électrophorèse unidimensionnelle en gel de polyacrylamide est accrue dans les souris dont le gène Rev-erba a été détruit par recombinaison homologue (figure 8) Ces résultats montrent que des modifications de l'expression de Rev-erb affectent les taux plasmatiques de triglycérides chez la souris: nos observation sont physiologiquement pertinentes. 6. Identification du (des) site(s) de liaison de hRev-erba sur le promoteur de l'apo C-III humaine. a. Evaluation de la fixation in vitro de hRev-erba sur des fragments du promoteur de l'apo C-III humaine. L'analyse comparative des séquences des promoteurs humains et murins de l'apo C-III a permis d'identifier plusieurs sites potentiels de fixation de hRev-erbu, bien qu'aucun d'eux ne corresponde parfaitement au consensus décrit (28). La fixation de hRev-erbc sur des fragments du promoteur de l'apo C-III humaine et sur des sites de fixations décrits préalablement dans la littérature a été évaluée par la technique de retard sur gel. Une fixation très faible dans les conditions utilisées de hRev-erba a été observé sur un oligonucléotide double brin dont la séquence correspond à celle de la boite TATA (-32/+3) du promoteur de l'apo C-III humaine (figure 9). Une meilleure fixation est observé dans un autre tampon (figure 10). Une fixation plus intense est observée, quel que soit le tampon utilisé, sur des oligonucléotides doubles brins dont les séquences correspondent au site consensus décrit (RORE), à la boite TATA du gène de l'apo A-I de rat sur laquelle se fixe Rev- erbx (45) et sur le site Rev-DR2 du promoteur du gène hRev-erbc. Aucune liaison significative n'a été observée sur les oligonucléotides double brin dont les séquences correspondent aux fragments et du promoteur de l'apo C-III humaine (site C3P(-88/-62) et DR-2 potentiel chevauchant le site C3P (-103/ -71)). 7. Equivalences fonctionnelles des récepteurs Rev-erd sur le promoteur de l'apo C-III. La répression de l'expression du gène rapporteur Luc+ sous contrôle du promoteur du gène humain de l'apo C-III par Rev- erba est reproduite par Rev-erbP (poulet et rat) et Rev-erby (HZF- 2: zebra fish). Ces résultats sont illustrés sur la figure 11. REFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Curry, M. D., W. J. McConathy, J. D. Fesmire, and P. Alaupovic. 1980. Quantitative determination of human apolipoprotein C-III by electroimmunoassay. Biochim. Biophys. Acta. 617:503-513. 2. Schonfeld, G., P. I. Georges, J. Miller, P. Reilly, and J. Witztum. 1979. Apolipoprotein C-II and * C-III levels in hyperlipoproteinemia. Metabolism. 28:1001-1009. 3. Stocks, J., G. 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REVENDICATIONS 1) Utilisation des récepteurs Rev-erb et/ou de leur élément de réponse ou d'un équivalent fonctionnel de ceux-ci pour le criblage de substances utiles dans le traitement des dysfonctionnements du métabolisme lipidique. 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le récepteur Rev-erb et l'élément de réponse du récepteur Rev-erb sont le récepteur hRev- erbo et l'élément de réponse du récepteur hRev-erbx. 3) Procédé de criblage de substances utiles dans le traitement des dysfonctionnements du métabolisme lipidique caractérisé: - en ce que l'on met en contact la substance à tester avec un récepteur de la famille Rev-erb et/ou un élément de réponse du récepteur Rev-erb, et/ou un facteur nucléaire capable de coupler fonctionnellement Rev-erb au complexe ARN-polymérase, ou un équivalent fonctionnel de ceux-ci, - en ce que l'on mesure par tout moyen approprié: - la fixation de ladite substance sur le récepteur Rev-erb ou la fixation du complexe formé de ladite substance et du récepteur Rev-erb sur son élement de réponse, et/ou sur un facteur nucléaire capable de coupler fonctionnellement Rev-erb au complexe ARN-polymérase, et/ou - la modulation de l'activité transcriptionnelle des gènes placés sous le contrôle d'un promoteur comprenant l'élément de réponse de Rev- erb. 4) Procédé de criblage de substances utiles dans le traitement des dysfonctionnements du métabolisme lipidique consistant à déterminer l'effet de la substance à tester sur la modulation de l'expression du gène codant pour le récepteur Rev-erb. ) Utilisation d'une substance sélectionnée par un procédé de criblage selon l'une des revendications 3 à 4 pour la préparation d'une composition notamment pharmaceutique utile pour le traitement des dysfonctionnements du métabolisme lipidique liés à l'apolipoprotéine C-III chez l'homme ou l'animal. 6) Utilisation d'une substance capable de se fixer au récepteur Rev-erb ou à son élément de réponse pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour le traitement et/ou la prévention des dysfonctionnements du métabolisme lipidique liés à l'apolipoprotéine C-III chez l'homme ou l'animal. 7) Utilisation d'une substance capable de moduler l'activité transcriptionnelle d'un gène placé sous le contrôle d'un promoteur contenant l'élément de réponse du récepteur Rev-erb pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour le traitement et/ou la prévention des dysfonctionnements du métabolisme lipidique liés à l'apolipoprotéine C-III chez l'homme ou l'animal. 8) Utilisation d'une substance capable de moduler l'expression du gène codant pour le récepteur Rev-erb pour la préparation d'une composition notamment pharmaceutique utile pour le traitement et/ou à la prévention des dysfonctionnements du métabolisme lipidique liés à l'apolipoprotéine C-III chez l'homme ou l'animal.