FR 2773079 A1 19990702 FR 9716655 A 19971230 1 2773079 Cette invention concerne l'enzyme apobec-1 et les protéines associées qui permettent la production de la protéine apoB48 dans l'intestin. L'invention porte notamment sur une méthode de détection d'inhibiteurs d'apobec-l et des protéines associées, sur l'utilisation du ou des gène(s) de la maladie d'Anderson comme cible pour un traitement de l'athérosclérose, de l'obésité, du diabète de type II (non-insuline dépendant), ou autres maladies caractérisées notamment par un niveau de chylomicrons et/ou de VLDL dans le plasma supérieur à la normale (hyperlipidémies, comme par exemple hypercholestérolémie, hypertriglycéridémie, etc) et/ou par une hyperglicémie. Le gène apoB code pour deux protéines, apoB100 et apoB48. Ces deux protéines sont traduites à partir du même ARN messager, modifié au niveau d'un unique nucléotide par une enzyme spécialisée, apobec-1 (pour: apoB editing compound 1) et des protéines associées. Dans le système digestif de l'homme, cette enzyme est exprimée dans l'intestin mais pas dans le foie. Dans l'intestin, elle modifie le codon 6666 de l'ARN messager d'apoB en créant un codon stop, qui aboutit à la production d'un polypeptide nommé apoB48 (pour 48 % de l'ARN messager traduit). ApoB48 est essentielle pour la formation des chylomicrons, qui servent à l'absorption et au transport du cholestérol, des triglycérides et autres lipides en provenance de l'intestin. Dans le foie, o l'enzyme apobec-1 n'est pas exprimée, et o aucune modification de l'ARN messager d'apoB n'a lieu, la protéine produite est apoB100, qui fait partie des lipoprotéines de très faible densité (VLDL, Very Low Density Lipoproteins) et de faible densité (LDL, Low Density Lipoproteins). Il existe actuellement trois maladies génétiques humaines qui affectent le niveau d'expression d'apoB, toutes ayant des phénotypes similaires: l'abétalipoprotéinémie, i'hypobétalipoprotéinémie et la maladie d'Anderson, également appelée maladie de la rétention de chylomicrons. L'abétalipoprotéinémie est due à une déficience en MTP (Microsomal Transfert Protein), alors que l'hypobétaprotéinémie est due à des mutations multiples du gène apoB. Dans ces deux cas, aucun VLDL ni chylomicron n'est détectable dans le plasma, associé respectivement à l'absence d'apoB 100 et d'apoB48. Par contre, dans la maladie d'Anderson, seuls manquent dans le plasma les chylomicrons (apoB48), tandis que les VLDL (apoB 100) restant détectables. Dans cette invention, il est suggéré: 1. que l'enzyme apobec-1 et ses protéines associées sont des cibles potentielles pour le traitement de l'athérosclérose et de l'obésité, et autres maladies caractérisées notamment par un niveau de chylomicrons et/ou de VLDL dans le plasma supérieur à la normale (hyperlipidémies, comme par exemple hypercholestérolémie, hypertriglycéridémie, etc) et/ou par une hyperglicémie. 2. que le ou les gène(s) responsable(s) de la maladie d'Anderson sont des cibles potentielles pour le traitement de l'athérosclérose et de l'obésité, et autres maladies caractérisées notamment par un niveau de chylomicrons et/ou de VLDL dans le plasma supérieur à la 2 2773079 normale (hyperlipidémies, comme par exemple hypercholestérolémie, hypertriglycéridémie, etc, et/ou par une hyperglicémie. 3. que le gène apobec-1 ou les gènes codant pour les protéines associées sont des gènes candidats pour la maladie d'Anderson. La protéine apoB humaine est la principale apolipoprotéine des lipoprotéines riches en triglycérides (présentes dans les VLDL, LDL et chylomicrons). Son gène est exprimé à la fois dans l'intestin et dans le foie. Le foie produit une protéine de 4536 acides aminés appelée apoB100, tandis que dans l'intestin, le même gène code pour une protéine plus petite qui contient 2152 acides aminés, appelée apoB48. Cette protéine est identique à la partie N- terminale de l'apoB100. ApoB48 est le résultat de la traduction de l'ARN messager (ARNm) d'apoB modifié post-transcriptionnellement par l'enzyme apobec-1 (protéine d'édition de l'ARN messager d'apoB) au niveau du nucléotide 6666 (cytidine), qui subit une déamination donnant une uridine. Cette modification de 'ARN messager d'apoB crée un codon stop (UAA) (voir figure 1 et Chan L (1995) Biochimie, 75-78). Chez l'homme et le rat, I'ADN complémentaire (ADNc) qui code pour apobec1 a été cloné et séquencé récemment (Teng B et al (1993) Science, 18161819, Lau PP (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8522-8526). Chez l'homme, ce gène est exprimé uniquement dans le petit intestin, seul endroit o sont produits apoB48 et les chylomicrons. Dans le foie humain, aucune production d'apoB48 n'a lieu, ce qui est cohérent avec l'absence d'observation de l'enzyme apobec-1 dans cet organe. Au contraire, chez le rat, chez qui apoB 100 et apoB48 sont produites dans le foie et l'intestin, apobec- 1 est exprimée dans les deux organes, ce qui suggère un rôle essentiel de cette protéine dans la production d'apoB48 (Giannoni et al (1994) J. Biol. Chem., 5932-5936). Par ailleurs, il a été montré par les mêmes auteurs que la transfection de cellules hépatiques HepG2 avec un ADNc d'apobec-1 conduit à une modification de l'ARNm endogène d'apoB, et à la secrétion de la protéine apoB48 (Giannoni et al (1994) J. Biol. Chem., 5932-5936). Enfin, il a été démontré récemment que des souris transgéniques knock- out pour le gène apobec-1 perdent l'activité d'apobec-1, et ne possèdent aucune trace d'apoB48 dans la circulation sanguine (Hirano KI et al (1996) J. Biol. Chem.7154-7159, Morrison JR et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9887-9890). Trois maladies humaines d'origine génétique possédant un phénotype semblable ont été décrites: l'abétalipoprotéinémie, l'hypobétalipoprotéinémie et la maladie d'Anderson, également appelée maladie de la rétention de chylomicrons (tableau 1 et Havel RJ and Kane JB (1995) in The metabolic and molecular basis of inherited disease). La cause génétique de deux de ces maladies, l'abétalipoprotéinémie et l'hypobétalipoprotéinémie a été élucidée. Dans le cas de 1' abétalipoprotéinémie, une mutation "frameshift" a été décrite dans le gène de la protéine MTP (Microsomal Triglyceride Transfert) qui conduit à une absence totale de cette protéine et de son activité. Cette mutation empêche par conséquent la formation et la secrétion de lipoprotéines contenant apoB, et donc, la détection d'apoB100 et d'apoB48 dans le plasma des patients 3 2773079 (Sharp D et al (1993) Nature, 65-69, Wetterau JR et al (1992) Science, 999-1001). L' hypobétalipoprotéinémie est une maladie dans laquelle différentes mutations dans le gène apoB ont été décrites, conduisant à des protéines apoB tronquées, de différentes tailles. A présent, 25 mutations différentes (nonsense ou frameshift) à l'origine de l'hypobétalipoprotéinémie ont été décrites, résultant en un codon stop prématuré (Linton MF et al (1993) J. Lipid Res., 521-541, Rosseneu M and Lauber C (1995) FASEB J., 768-776). Le mécanisme par lequel ces troncatures de la protéine apoB conduisent à l'hypobétalipoprotéinémie est encore inconnu. Dans le cas de l'abétalipoprotéinémie et de l'hypobétalipoprotéinémie, l'absence d'absorption de chylomicrons conduit également à l'absence d'absorption de vitamine E, créant des symptomes neurologiques sévères. La troisième de ces maladies génétiques aux phénotypes similaires, la maladie de rétention des chylomicrons, décrite pour la première fois par Anderson, il y a 36 ans (Anderson CM et al (1961) Med. J. Aust., 617- 621) reste toujours une énigme. Cette affection est caractérisée par des diarrhées chroniques, une absorption des graisses déficiente, et un manque de vigueur. Dans certains cas, des symptomes neurologiques dus à l'absence de vitamine E ont été observés, mais ceux-ci sont moins sévères que dans le cas de l'abétalipoprotéinémie et de l'hypobétalipoprotéinémie (Havel RJ and Kane JB (1995) in The metabolic and molecular basis of inherited disease). Cette pathologies semble être héritée de façon autosomale récessive. Enfin, l'analyse du plasma des patients montre une absence totale de chylomicrons et de la protéine apoB48 (Havel RJ and Kane JB (1995) in The metabolic and molecular basis of inherited disease). Des études de liaisons génétiques par RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ont montré que le gène apoB n'est pas impliqué dans la maladie d'Anderson (Pessah M et al (1991) J. Clin. Invest., 367-370, Stritch D et al (1993) J. Pediatric Gastro. Nutrit., 257-264). Chez les patients atteints de la maladie d'Anderson, l'activité de la MTP est normale, ce qui suggère qu'un gène différent est impliqué dans cette maladie (Linton MF et al (1993) J. Lipid Res., 521-541). Ces expériences ainsi que d'autres suggèrent donc que l'origine de la maladie d'Anderson n'est pas liée à un problème de secrétion via la MTP, et que la rétention des chylomicrons met en jeu un autre mécanisme (Wetterau JR (1992) Science, 999-1001). Il est proposé dans cette invention, que le gène de la protéine apobec-1 est un candidat pour la maladie d'Anderson pour les raisons suivantes: 1. apobec-1 est exprimée exclusivement dans l'intestin. 2. apoB48 et les chylomicrons sont absents du plasma des patients atteints de la maladie d'Anderson, tandis que les VLDL contenant apoB100 y sont présents. Ceci constitue le phénotype principal des patients atteints de la maladie d'Anderson. 3. des souris knock-out pour le gène apobec- 1 perdent l'activité apobec1 et la modification de l'ARNm qui conduit d'ordinaire à la protéine apoB48, conduisant à l'absence de cette protéine dans le plasma (Hirano KI et al (1996) J. Biol. Chem.7154-7159, Morrison JR et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9887-9890). 4 2773079 4. des rats obèses Zucker ont une activité d'apobec-1 supérieure de 42 % à celle de rats témoins non obèses, avec pour conséquence un niveau de chylomicrons et d'apoB48 dans le sang 4.7 fois supérieur à celui des rats témoins (Phung TL et al (1996) Metabolism, 1056- 1058). 5. I a par ailleurs été proposé que la maladie d'Anderson soit due à une modification dans d'autres gènes impliqués dans la voie de sécrétion ou de glycosylation des protéines (Levy E et al (1987) J. Lipid Res., 12631274). Leurs résultats montrent de surcroît clairement qu'un patient atteint par la maladie d'Anderson sur les trois étudiés a un taux élevé d'apoB100 et relativement peu d'apoB48. En utilisant un système de détection plus sensible, marquage radioactif suivi d'une analyse par SDS-PAGE par exemple, on détecte chez les deux autres patients une quantité visible d'apoB100. La présence probable d'apoB48 parmi d'autres bandes visibles de protéines plus petites qu'apoB 100 pourrait être expliquée par une dégradation d'apoB 100. Enfin, il a été montré qu'une mutation dans la séquence d'ancrage autour du site de déamination de l'ARNm d'apoB (site 6666) peut entraîner une diminution voire une perte de l'édition de ce site (Shah RR et al (1991) J. Biol. Chem., 16301-16304). Il n'est donc pas exclu que la maladie d'Anderson soit un cas particulier de l'hypobétalipoprotéinémie dont certaines mutations du gène apoB100 affectent uniquement la formation et la sécrétion des chylomicrons, tandis que la formation et la sécrétion des VLDL ne sont pas affectées. La présente invention suggère donc qu'une mutation ou autre modification de la séquence d'ancrage autour du site de déamination de l'ARNm d'apoB peut être à l'origine de la maladie d'Anderson. Pour tester l'hypothèse que le gène apoB est un candidat pour la maladie d'Anderson, la présente invention propose de séquencer par RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) notamment, l'ARNm d'apoB de biopsies intestinales de patients souffrant de la maladie d'Anderson, autour de la séquence d'ancrage entourant le site 6666, et d'étudier le degré de déamination (conversion C --> U) de ce site. Si aucune mutation ou modification de la séquence d'ancrage entourant le site de déamination n'est observée, cela indiquera une forte présomption que l'origine de la maladie d'Anderson est due à apobec-1 ou les protéines associées. Pour tester l'hypothèse que le gène de la protéine apobec- 1 est à l'origine de la maladie d'Anderson, la présente invention propose de recloner et séquencer le gène apobec-1 chez les patients. Pour tester l'hypothèse que le gène de la protéine ABBP-1 (Apobec-1 Binding Protein), seule protéine associée à apobec-l clonée à présent (Lau PP et al (1997) J. Biol. Chem, 1452-1455), est à l'origine de la maladie d'Anderson, la présente invention propose de recloner et séquencer le gène ABBP-1 chez les patients, afin de détecter d'éventuelles différences avec le génotype normal. Dans le cas o d'autres protéines associées à apobec-1 viendrait à être clonées, la présente invention propose d'adopter la même technique pour tester l'hypothèse qu'elles sont à l'origine de la maladie d'Anderson. 2773079 Dans le cas o la maladie d'Anderson ne serait pas due à une modification de la séquence d'apoB, ni de celles de la protéine apobec-1 et de ses protéines associées connues et clonées, la présente invention propose de réaliser le clonage du ou des gène(s) responsable(s) par une technique d'hybridation soustractive comme décrit dans l'exemple 1 (Kaneko-Ishino T (1995) Nature Genet., 52-59) ou une technique de clonage par détection de mutations ponctuelles à l'aide de la protéine mutS, comme décrit dans l'exemple 2. Cette invention concerne aussi des molécules inhibitrices d'apobec-1, ou des protéines associées, susceptibles d'usage thérapeutique dans le cas de l'athérosclérose et de l'obésité, et autres maladies caractérisées notamment par un niveau de chylomicrons et/ou de VLDL dans le plasma supérieur à la normale (hyperlipidémies, comme par exemple hypercholestérolémie, hypertriglycéridémie, etc) et/ou par une hyperglicémie, obtenues à l'aide d'une technique de détection de déamination d'une cytidine dans un ARN (demande de brevet d'invention n 97 04388) comme décrit dans l'exemple 3. La cytidine déaminée étudiée est ici la cytidine en position 6666 de l'ARNm d'apoB, la séquence d'ARN utilisée comme substrat contenant la zone d'ancrage d'apobec-1 ou des protéines associées est telle que décrit dans la littérature (Shah RR et al (1991) J. Biol. Chem., 16301-16304, Davies MS et al (1989) J. Biol. Chem., 13395-13398), et les extraits de protéines utilisés pourront provenir de foie de rat ou d'autres sources. La séquence utilisée comme amorce dans la mise en oeuvre de la technique contient un nombre de nucléotides complémentaires de la séquence en 3' du site 6666 de l'ARNm d'apoB suffisant pour une hybridation correcte (supérieur ou égal à 14 nucléotides). La présente invention porte donc sur l'utilisation du gène de l'enzyme apobec-1, ou du gène de la protéine ABBP-1 ou de celui d'une protéine associée à l'enzyme apobec-1, ou encore d'un gène impliqué dans la maladie d'Anderson, pour la recherche et la fabrication de molécules ou agents thérapeutiques inhibant l'expression d'un ou plusieurs de ces gènes ou l'activité des enzymes ou protéines exprimées par ces gènes. La présente invention porte également sur l'utilisation des molécules ou agents thérapeutiques découverts et fabriqués selon la revendication précédente pour la prévention, la stabilisation ou le traitement de l'athérosclérose, de l'obésité, du diabète de type II (non- insuline dépendant), ou autres maladies caractérisées notamment par une hyperlipidérnie, comme par exemple une hypercholestérolémie, une hypertriglycéridémie, etc, et/ou par une hyperglicémie, due par exemple à un niveau de chylomicrons et/ou de VLDL dans le plasma supérieur à la normale. La présente invention concerne donc également toute molécule ou agent thérapeutique permettant une inhibition de l'activité de ces enzymes ou protéines, ou de l'expression de ces genes. 6 2773079 Cette invention concerne notamment l'utilisation de molécules anti-sens d'acide nucléique pouvant réduire la quantité d'apobec-1 ou des protéines associées, ou la quantité de protéines exprimés par le ou les gène(s) de la maladie d'Anderson ou tout gène impliqué dans la formation, la stabilisation, la sécrétion, la glycosilation ou le transport des chylomicrons et/ou de VLDL (Uhlmann E and Peyman A (1990) Chem. Rev., 543-584). De telles molécules anti-sens peuvent se lier de façon covalente ou non à l'ADN ou à 'ARN de l'apobec-1 ou des protéines associées, ou à l'ADN ou à l'ARN du ou des gènes responsable(s) de la maladie d'Anderson ou de tout gène impliqué dans la formation, la stabilisation, la sécrétion, la glycosilation ou le transport des chylomicrons et/ou de VLDL. Par exemple, une telle liaison de molécule anti-sens peut cliver ou faciliter le clivage de l'ADN ou ARN, d'apobec-1, ou des protéines associées, ou du ou des gène(s) responsable(s) de la maladie d'Anderson ou de tout gène impliqué dans la formation, la stabilisation, la sécrétion, la glycosilation ou le transport des chylomicrons et/ou de VLDL. Une telle liaison de molécule anti-sens peut également augmenter la dégradation de l'ARNm nucléaire ou cytoplasmique correspondant, ou inhiber sa traduction, la fixation de facteurs de transcription ou d'ARN pré-messager, ou bien encore par exemple inhiber l'épissage de l'ARN pré-messager. L'ensemble de ces modes d'action de molécules anti-sens ont pour effet la diminution de l'expression du gène d'apobec-1, ou des protéines associées, ou du ou des gène(s) responsable(s) de la maladie d'Anderson ou de tout gène impliqué dans la formation, la stabilisation, la sécrétion, la glycosilation ou le transport des chylomicrons et/ou de VLDL, ce qui en fait un mode de traitement important de l'obésité, du diabète de type II (non-insuline dépendant ou de l'athérosclérose, par exemple. Parmi les cibles potentielles de telles molécules anti-sens, on pourra citer sans pour autant s'y limiter les séquences du gène d'apobec-1, ou des protéines associées, ou du ou des gène(s) responsable(s) de la maladie d'Anderson ou de tout gène impliqué dans la formation, la stabilisation, la sécrétion, la glycosilation ou le transport des chylomicrons et/ou de VLDL, mais également les séquences en 3' et 5' de ces gènes qui pourraient être des régions de contrôle de ces gènes. La présente invention concerne donc également des molécules anti-sens d'acide nucléique simple brin (ADN ou ARN) d'au moins 12 nucléotides agissant sur le gène ou son ARN, ou sur une région régulatrice de l'expression du gène permettant une ihnibition de l'expression du gène de l'enzyme apobec-l, ou du gène de la protéine ABBP-1 ou de celui d'une protéine associée à l'enzyme apobec-l, ou encore d'un gène impliqué dans la maladie d'Anderson ou de l'activité des enzymes ou protéines exprimées par ces gènes. LEGENDES DES FIGURES: Tableau 1: Trois maladies génétiques possédant des phénotypes similaires. Dans le cas de l'abétalipoprotéinémie, la MTP est mutée, conduisant à l'absence de particules contenant 7 2773079 apoB100 ou apoB48 dans le sang. Dans le cas de l'hypobétalipoprotéinémie, le gène apoB est muté, avec pour résultat un niveau très bas de VLDL et de chylomicrons. La maladie d'Anderson se caractérise par l'absence d'apoB48 uniquement, ayant pour conséquence l'absence de chylomicrons à un niveau détectable dans le sang. Figure 1: Expression d'apoB. Le gène apoB est exprimé dans le foie et l'intestin. Dans le foie, l'ARNm d'apoB est traduit en apoB 100, alors que dans l'intestin, le codon CAA commençant à la position 6666 (indiquée par un astérisque) dans l'ARNm est édité par l'enzyme apobec- 1, qui déamine la cytidine en uracyl, donnant un codon stop aboutissant à la formation de la protéine apoB48. Figure 2: Clonage du ou de(s) gène(s) de la maladie d'Anderson par hybridation soustractive. La première étape de la technique consiste à isoler des cellules enterocytes provenant de l'intestin d'un patient et d'un individu normal. On procède ensuite à la synthèse de brins d'ADN complémentaires des ARNm extraits de ces cellules, à l'aide de l'enzyme Reverse Transcriptase. A la fin de la synthèse d'un second brin d'ADN complémentaire de cet ADN à l'aide de l'ADN polymérase, des bouts francs sont créés. Ceci permet la ligation d'une rallonge constituée d'une vingtaine de paires de base à chaque extrémité. On utilise deux séquences différentes pour le patient (rallonge-A) et pour l'individu normal (rallonge-N). L'ADNc ainsi récupéré est amplifié par PCR en utilisant comme amorces les séquences correspondant aux deux rallonges A et N, l'amorce correspondant au patient étant biotinilée par exemple. L'ADNc ainsi modifié des deux individus est alors mélangé et mis dans des conditions de dénaturation et réassociation. L'ADNc hybridé est mis en présence de billes magnétiques couvertes de streptavidine, ce qui permet finalement d'isoler en solution après plusieurs itérations, les ADNc de l'individu normal correspondant au gène non transcrit chez le patient. Une amplification par PCR de ce gène à l'aide des amorces correspondant à la rallonge N. Figure 3: Clonage du ou de(s) gène(s) de la maladie d'Anderson par utilisation de la protéine mutS. La premiere étape de la technique consiste à isoler des cellules enterocytes provenant de l'intestin d'un patient et d'un individu normal. On procède ensuite à la synthèse de brins d'ADN complémentaires des ARNm extraits de ces cellules en quantité équivalente pour le patient et l'individu normal, à l'aide de l'enzyme Reverse Transcriptase. A la fin de la synthèse d'un second brin d'ADN complémentaire de cet ADN à l'aide de l'ADN polymérase, des bouts francs sont créés. Ceci permet la ligation d'une rallonge constituée d'une vingtaine de paires de base à chaque extrémité. L'ADNc ainsi modifié des deux individus est alors mélangé et mis dans des conditions de dénaturation et réassociation. Au moment de l'hybridation la mutation ponctuelle dans le gène recherché n'empêche pas le réappariement des deux brins complémentaires malgré le mésappariement d'une paire de base. L'ADNc hybridé est alors purifié sur une colonne d'affinité contenant la protéine mutS immobilisée. n est alors possible de l'utiliser pour cribler une banque d'ADNc intestinale ou génomique totale. 8 2773079 Figure 4: Criblage d'inhibiteurs de l'activité déaminase d'apobec- 1 à l'aide d'une technique de détection d'une déamination utilisant le système SPA . La technique met en jeu une séquence d'ARN synthétique contenant la séquence d'ancrage (environ 50 nucléotides dans le cas d'apobec-1) couplée à une bille SPA . Après l'incubation avec les inhibiteurs testés en présence de l'enzyme dans le milieu nécessaire, on ajoute une amorce complémentaire de la séquence en 3' du site déaminé de l'ARN dans des conditions d'hybridation. On ajoute alors l'enzyme Reverse Transcriptase et des nucléotides radiomarqués (uniquement d3HGTP dans l'exemple figuré). En cas de déamination, aucune incorporation n'a lieu et le signal détecté ne se distingue pas du bruit de fond. En cas d'activité de l'inhibiteur (pas de déamination), l'incorporation d'un nucléotide radiomarqué a lieu, et un signal est détecté. EXEMPLES: Exemple 1: Clonage du ou des gène(s) responsable(s) de la maladie d'Anderson par hybridation soustractive. La première étape de l'exemple décrit sur la figure 2, consiste à isoler des cellules enterocytes provenant de l'intestin d'un patient et d'un individu normal. On procède ensuite à la synthèse de brins d'ADN complémentaires des ARNm extraits de ces cellules, à l'aide de l'enzyme Reverse Transcriptase. A la fin de la synthèse d'un second brin d'ADN complémentaire de cet ADN à l'aide de l'ADN polymérase, des bouts francs sont créés. Ceci permet la ligation d'une rallonge constituée d'une vingtaine de paires de base à chaque extrémité. On utilise deux séquences différentes pour le patient (rallonge-A) et pour l'individu normal (rallonge-N). L'ADNc ainsi récupéré est amplifié par PCR en utilisant comme amorces les séquences correspondant aux deux rallonges A et N, l'amorce correspondant au patient étant biotinilée par exemple. L'ADNc ainsi modifié des deux individus est alors mélangé et mis dans des conditions de dénaturation et réassociation. L'ADNc hybridé est mis en présence de billes magnétiques couvertes de streptavidine, ce qui permet finalement d'isoler en solution après plusieurs itérations, les ADNc de l'individu normal correspondant au gène non transcrit chez le patient. Une amplification par PCR de ce gène à l'aide des amorces correspondant à la rallonge N. Exemple 2: Clonage du ou des gène(s) responsable de la maladie d'Anderson par utilisation de la protéine mutS. La première étape de l'exemple décrit sur la figure 3, consiste à isoler des cellules enterocytes provenant de l'intestin d'un patient et d'un individu normal. On procède ensuite à la synthèse de brins d'ADN complémentaires des ARNm extraits de ces cellules en quantité équivalente 9 2773079 pour le patient et l'individu normal, à l'aide de l'enzyme Reverse Transcriptase. A la fin de la synthèse d'un second brin d'ADN complémentaire de cet ADN à l'aide de l'ADN polymérase, des bouts francs sont créés. Ceci permet la ligation d'une rallonge constituée d'une vingtaine de paires de base à chaque extrémité. L'ADNc ainsi modifié des deux individus est alors mélangé et mis dans des conditions de dénaturation et réassociation. Au moment de l'hybridation la mutation ponctuelle dans le gène recherché n'empêche pas le réappariement des deux brins complémentaires malgré le mésappariement d'une paire de base. L'ADNc hybridé est alors purifié sur une colonne d'affinité contenant la protéine mutS immobilisée. Il est alors possible de l'utiliser pour cribler une banque d'ADNc intestinale ou génomique totale. Exemple 3: Criblage de molécules susceptibles d'inhiber l'activité déaminase d'apobec-l à l'aide du système SPA( . L'exemple utilise une séquence d'ARN synthétique contenant la séquence d'ancrage d'apobec- 1 (environ 50 nucléotides (Shah RR et al (1991) J. Biol. Chem., 1630116304, Davies MS et ai (1989) J. Biol. Chem., 13395-13398)) couplée à une bille SPA (système commercialisé par la société Amersham) disposée dans une plaque de 96 puits, suivant la technique décrite dans la demande de brevet d'invention n 97 04388. Brièvement, après l'incubation avec les inhibiteurs testés en présence de l'enzyme dans le milieu et avec les réactifs nécessaires, on ajoute une amorce complémentaire de la séquence en 3' du site déaminé de l'ARN dans des conditions d'hybridation (Maniatis T et al (1982) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY). On ajoute alors une enzyme Reverse Transcriptase et des nucléotides radiomarqués (uniquement d3HGTP dans l'exemple illustré sur la figure 4). Dans le cas présent, il serait également possible d'utiliser d3HTTP en plus. En cas de déamination, c'est-à-dire une activité normale de l'enzyme apobec-1, aucune incorporation n'a lieu et le signal détecté, dû à la scintillation de proximité des billes SPA, ne se distingue pas du bruit defond. En cas d'activité de l'inhibiteur, l'activité de déamination par apobec-1 est diminuée, rendant possible l'incorporation d'un nucléotide radiomarqué (ou deux si d3HTTP est également utilisé) à l'extrémité 3' d'une partie des amorces hybridées. Dans ce cas, un signal de scintillation peut être détecté qui se distingue du bruit de fond. -10 Maladie Phénotype Diagnostic Déficience Maladie d'Anderson Diarrhée chronique Faible taux de . cholestérol et Mauvaise absorption cholestérol et des graisses, d'apoB, Ma ede vigueur, Taux de triglycéride Manque de vigueu r, normal, Retard de croissance, apoB48 et Symptômes chylomicrons absents neurologiques après un repas riche en modérés graisse Abétaplipoprotéinémie Diarrhée chronique Faible taux de . cholest6rol, Mauvaise absorption cholestérol, des graisses, apoB 100 et apoB48 Manque de vigueur, absents, MTP Chylomicrons, VLDL, Retard de croissance, Chyloerons, VLDL, LDL absents, Symptômes Faible taux de neurologiques très triglycérides et sévères cholestérol Hypobétaplipoprotéiné indifférentiable du Les homozygotes ont mie précédent un faible taux de cholestérol et de triglycérides, Les hétérozygotes ont gène apoB tronqué approximativement 50 % du taux de cholestérol, triglycérides et apoB 100 Tableau 1 l 2773079 REVENDICATIONS 1. Utilisation du gène de l'enzyme apobec-1, ou du gène de la protéine ABBP-1 ou de celui d'une protéine associée à l'enzyme apobec-1, ou encore d'un gène impliqué dans la maladie d'Anderson, pour la recherche et la fabrication de molécules ou agents thérapeutiques inhibant l'expression d'un ou plusieurs de ces gènes ou l'activité des enzymes ou protéines exprimées par ces gènes. 2. Utilisation des molécules ou agents thérapeutiques découverts et fabriqués selon la revendication 1 pour la fabrication de molécules ou agents thérapeutiques destinés à la prévention, la stabilisation ou le traitement de l'athérosclérose, l'obésité, du diabète de type II (noninsuline dépendant), ou autres maladies caractérisées notamment par une hypercholestérolémie, une hypertriglycéridémie et/ou par une hyperglicémie, due par exemple à un niveau de chylomicrons et/ou de VLDL dans le plasma supérieur à la normale. 3. Utilisation de molécules ou agents thérapeutiques suivant les revendications 1 à 2, caractérisée en ce que l'expression de plusieurs gènes est inhibée. 4. Utilisation de molécules ou agents thérapeutiques suivant les revendications 1 à 2, caractérisée en ce que l'activité de plusieurs protéines ou enzyme est inhibée. 5. Utilisation de molécules suivant les revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'il s'agit de molécules anti-sens d'acide nucléique simple brin (ADN ou ARN) d'au moins 12 nucléotides agissant sur le gène ou son ARN, ou sur une région régulatrice de l'expression du gene. 6. Molécule ou agent thérapeutique caractérisés en ce qu'ils sont utilisés selon les revendications 1 à 5.