FR 2783837 A1 20000331 FR 9812169 A 19980929 1 2783837 PROCÉDE CONTRÈLE DE CULTURE D'UN MICROORGANISME PHOTOSYNTHÉTIQUE DANS UN REACTEUR ET DISPOSITIF ASSOCIE. La présente invention concerne le domaine de la culture des microalgues photosynthétiques plus particulièrement pour la production d'une biomasse dont sera extrait des substances actives comme des acides gras polyinsaturés, des caroténoïdes, des pigments colorés, des protéines, etc... Le carbone est un substrat primordial pour la croissance des microalgues photosynthétiques. Dans la majeure partie des procédés de culture des microalgues, la source de carbone est apportée sous la forme d'un flux de dioxyde de carbone gazeux. Ce C02 gazeux va se dissoudre dans le milieu de culture avec une vitesse quantifiée par le coefficient de transfert de matière désigné Kla. Les variations de la concentration du carbone dans le réacteur sont généralement évaluées à l'aide de sondes potentiométriques permettant la mesure du C02 dissous. Or, la seule mesure de la concentration en C02 dissous ne suffit pas à connaître la quantité de carbone dont les microorganismes en culture disposent pour leur croissance. En effet, une partie du C02 dissous subit une réaction d'hydratation et est transformée en carbonates (HC03-) et bicarbonates (C032-) jusqu'à ce qu'un équilibre entre ces trois formes de carbone soit atteint. Le C02 dissous n'est pas forcément la forme de carbone préférentiellement absorbée par les microalgues, et l'on admet que ces trois formes de carbone peuvent être potentiellement utilisées par les microalgues pour leur croissance. Or, on ne connaît pas aujourd'hui de moyens permettant de déterminer quelle(s) forme(s) de carbone est (sont) préférentiellement absorbée(s) par les microalgues. Il est donc utile de connaître la quantité totale de carbone disponible dans le réacteur et non plus seulement la concentration en C02 dissous. Un moyen d'accéder à la quantité totale de carbone exploitable par les microalgues est donc de calculer la somme de ces trois formes de carbone, désignée ci-après conjointement Carbone Inorganique Total ou CIT. La présente invention a précisément pour but un procédé contrôlé de culture d'un microorganisme photosynthétique dans un réacteur clos suffisamment transparent pour permettre la pénétration de la lumière et donc la photosynthèse, comprenant l'apport au dit micro- organisme des nutriments nécessaires à sa croissance notamment l'apport de C02 gazeux, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on mesure la concentration en carbone inorganique total dans le réacteur, b) on calcule la vitesse de croissance dudit microorganisme à la concentration en carbone inorganique total mesurée à l'étape (a), puis c) on compare la vitesse de croissance calculée à l'étape (b) avec la vitesse de croissance potentielle maximale que peut atteindre le microorganisme et l'on ajuste l'apport de C02 gazeux et/ou de carbonates et/ou de bicarbonates dans le réacteur de façon à tendre vers la vitesse de croissance potentiel maximale que peut atteindre le microorganisme. Pour accéder à la concentration en carbone inorganique total dans le réacteur, les Inventeurs ont étudié en détail le système carbone-carbonates- bicarbonates. Il convient de rappeler que le CO2 dissous existe sous forme de C02 aqueux et d'acide carbonique 3 2783837 H2CO3, mais la forme H2C03 peut être négligée car elle représente moins de 1% (J. F. Cornet, Etude cinétique et énergétique d'un photobioréacteur Etablissement d'un modèle structuré - Applications à un système clos artificiel - Thèse de doctorat de l'Université de Paris Sud, Centre d'Orsay, 1989). L'équilibre C02 / HC03- / C032- est constitué des deux réactions simples suivantes: - d'une part: C02 + H20 a +. a a +. HCO- H a .HC0 3 K1 == K aacO2 C02 dans laquelle: - aH+ représente l'activité de l'ion H+ en mole/litre, - aHC03- représente l'activité de l'ion HC03- en mole/litre, - aco2 représente l'activité du C02 en mole/litre, - HC03- représente la concentration de HC03- en mole/litre, - CO2 représente la concentration en CO2 en mole/litre- - d'autre part: HC03- en C032- + H+ dont la constante d'équilibre est: a+ = a+. CO- H C03 a 30 K2H aHC03 HCO3 dans laquelle aH+ , aHC03- et aco2 ont la même signification que précédemment et: - ac032- représente l'activité de l'ion C032- en mole/litre, 4 2783837 C032- représente la concentration de l'ion C032- en mole/litre, HC03- représente la concentration de HCO3- en mole/litre. Si l'on considère que l'équilibre entre ces différentes espèces chimiques se fait de manière instantanée, il est possible de calculer la concentration en carbone inorganique total de la manière suivante: CIT = C2. (1 + K1 + K1 + K2) aH+ L'hypothèse admise par certains auteurs est d'assimiler l'eau salée à l'eau pure en raison des contraintes de calcul des constantes d'équilibre K1 et K2 dans les milieux salés (Krystallidis A., Application du génie des procédés aux Biotechnologies Marines - Etude de faisabilité, Modélisation et Simulation Dynamique d'un procédé de culture de Microalgues. - Thèse de Doctorat de l'Ecole Centrale de Paris - 1994; Lee Y.K. et al., C02 Absorbtion rate in an algal culture : Effect of pH. - Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 34B, pages 28-32, 1984). Or, la prise en compte de la salinité du milieu de culture est importante car elle influe directement, avec la température, sur les constantes d'équilibre K1 et K2 par rapport à l'eau pure. Les Inventeurs ont donc comparé les valeurs fournies par des tables pour l'eau pure avec les valeurs obtenues pour l'eau salée. Les Inventeurs ont donc calculé les salinités du milieu Hemerick normal et du milieu Hemerick modifié (21 g/l NaCl au lieu de 29 g/l) dans un réacteur pilote (Dermoun D., Ecophysiologie de Porphyridium cruentum: Validation expérimentale d'un modèle de croissance - Etude de la production de polysaccharides - Thèse de doctorat de l'Université de Compiègne - 1987). La salinité (SO/oo) est définie comme le poids en gramme des composés solides séchés à poids constant à 480 C, obtenu à partir d'un kilo du milieu à analyser. Il est supposé que la matière organique a été oxydée, le brome et l'iode remplacés par leur équivalent en chlore et les carbonates convertis en oxydes (Rodier J., L'analyse de l'eau - Eaux naturelles, Eaux résiduaires, Eaux de mer, 1984). Les résultats obtenus démontrent qu'un écart de 50% est observé lorsque la concentration en CIT est estimée soit dans le milieu Hemerick (salinité 35 /o0) soit dans l'eau pure (non saline). Les compositions du milieu Hemerick normal et du milieu Hemerick modifié étant connues (Dermoun D., Ecophysiologie de Porphyridium cruentum: Validation expérimentale d'un modèle de croissance - Etude de la production de polysaccharides - Thèse de doctorat de l'Université de Compiègne - 1987), les Inventeurs ont calculé la salinité directement par le rapport des masses des ions minéraux sur un kilo de chacun desdits milieux. Les résultats obtenus sont les suivants: - milieu Hemerick normal: S = 35,78 /oo - milieu Hemerick modifié: S = 28,34 /oo Les constantes d'équilibre sont indiquées dans les tables de J. D. H. Strickland & T. R. Parsons (A manual of sea water analysis, issued by the Fisheries Research Board of Canada, Ottawa, 1965, Bulletin no. 25 - 2nd Edition): - pour S = 28, 34 /oo et T = 25 C (température régulée au niveau du photobioréacteur): K1 = 9,33 10-7 mol/l K2 = 6,82 10-10 mol/1 ! 1 6 2783837 - pour S = 35,780/0o et T = 25 C (température régulée au niveau du photobioréacteur): K1 = 1,0233 10-6 mol/l K2 = 8,3166 10-10 mol/1 Enfin, il convient de rappeler que la sonde à CO2 dissous placé dans le réacteur pilote donne en fait des pressions partielles en CO2. Celles-ci peuvent être reliées aux concentrations en C02 dissous grâce à la loi de Henry: C02 dissous (mol/l) = PCO2 / H dans laquelle: H = 33,04 atm/mol/l à 28,35 /oo de salinité pour le milieu Hemerick modifié, H = 33,39 atm/mol/1 à 35,78 /oo de salinité pour le milieu Hemerick normal. Sur la base des travaux ci-dessus concernant l'équilibre C02 / HC03- / C032-, les Inventeurs ont intégré le calcul du CIT dans une modélisation du comportement des microalgues photosynthétiques dans un réacteur, de façon à ce que le CIT constitue une variable de commande sur laquelle il est possible d'agir pour réguler la concentration en microalgues ou la matière sèche issue de la culture et donc optimiser les procédés de culture des microalgues photosynthétiques dans un réacteur clos. Ce but a été atteint grâce à une étude expérimental ayant pour but de tester différents facteurs sur la croissance d'une microalgue photosynthétique. Les niveaux de ces facteurs ont été choisis de façon à obtenir une zone o la croissance de la souche était limitée par le facteur et une zone suroptimale o la croissance était inhibée par ce même 7 2783837 facteur. Puis, le comportement de la souche face aux facteurs étudiés a été modélisé. On connaît dans l'art antérieur au moins douze types de modèles de croissance non-structurés, dont six sont sans inhibition et six prennent en compte une inhibition. Les six modèles sans inhibition sont présentés ci-après. Modèle de Monod (Nielsen J., Villadsen J., Bioreaction Engineering Princioples, 1994) répondant à la formule suivante: s p = Pmax - ks + s dans laquelle: - b représente la vitesse de croissance par heure, 9max représente la vitesse maximale de croissance par heure, - s représente la concentration en substrat en g/l ou en mol/l - ks représente la constante de demi- saturation en g/l ou en mol/l. Une courbe représentative de ce modèle est donnée à la figure 1 en annexe. Ce modèle est caractérisé par une limitation d'un substrat considéré. Modèle de Moser (Nielsen J., Villadsen J., Bioreaction Engineering Princioples, 1994) répondant à la formule suivante: n s g [nmax 'n = max -ks + s dans laquelle: I, Pmax, s, ks ont la même signification que précédemment. s 2783837 Une courbe représentative de ce modèle est donnée à la figure 2 en annexe. Ce modèle est caractérisé par une limitation d'un substrat considéré. Modèle de Contois (Nielsen J., Villadsen J., Bioreaction Engineering Princioples, 1994) répondant à la formule suivante: s [= Pmax ks. x + s dans laquelle: P, Pmax, s, ks ont la même signification que précédemment et x représente la concentration cellulaire (x 106 cellules/ml). Une courbe représentative de ce modèle est donnée à la figure 3 en annexe. Ce modèle est caractérisé par une limitation d'un substrat considéré. Modèle de Webb (Krystallidis A., Application du génie des procédés aux Biotechnologies Marines - Etude de faisabilité, Modélisation et Simulation Dynamique d'un procédé de culture de Microalgues. - Thèse de Doctorat de l'Ecole Centrale de Paris - 1994) répondant à la formule suivante: g [ max s 2 s + ks + dans laquelle: p, Pumax, s, ks ont la même signification que précédemment et - D représente un facteur multiplicatif, - kis représente la constante d'inhibition du substrat. Une courbe représentative de ce modèle est donnée à la figure 4 en annexe. )9 2783837 Ce modèle est caractérisé par une limitation du substrat considéré. Modèle de Tamiya (Molina Grima et coll., A study on simultaneous photolimitation and photoinhibition in dense microalgal cultures taking acount incidentand averaged irradiances, Journal of Biotechnology, 45 (1996) pages 59-69) répondant à la formule suivante: S P = max - Pmax + S dans laquelle: p, Pmax et S ont la même signification que précédemment. Une courbe représentative de ce modèle est donnée à la figure 5 en annexe. Ce modèle est caractérisé par une limitation du substrat considéré. Modèle de Van Oorschot (Molina Grima et coll., A study on simultaneous photolimitation and photoinhibition in dense microalgal cultures taking acount incidentand averaged irradiances, Journal of Biotechnology, 45 (1996) pages 59-69) répondant à la formule suivante: P = max 1 - e Smaxj dans laquelle: p, Pmax et s ont la même signification que précédemment et Smax représente la concentration maximale en substrat. Une courbe représentative de ce modèle est donnée à la figure 6 en annexe. Ce modèle est caractérisé par une limitation pour le substrat considéré. 1 2783837 Les six modèles avec inhibition sont présentés ci-après. Modèle de Andrews et Noack (Krystallidis A., Application du génie des procédés aux Biotechnologies Marines - Etude de faisabilité, Modélisation et Simulation Dynamique d'un procédé de culture de Microalgues. - Thèse de Doctorat de l'Ecole Centrale de Paris - 1994) répondant à la formule suivante: s kis P= max (ks + s tkis + s) dans laquelle: I, Pmax, s, ks et kis ont la même signification que précédemment. Une courbe représentative de ce modèle est donnée à la figure 7 en annexe. Ce modèle est caractérisé par le fait que la vitesse maximale de croissance n'est jamais atteinte sauf pour ks.tendant vers 0 ou bien kis tendant vers l'infini. Modèle de Aiba (Krystallidis A., Application du génie des procédés aux Biotechnologies Marines - Etude de faisabilité, Modélisation et Simulation Dynamique d'un procédé de culture de Microalgues. - Thèse de Doctorat de l'Ecole Centrale de Paris - 1994) répondant à la formule suivante: s ksis P= Pmax ( s ek (ks + s dans laquelle: u, pmax, s, ks et kis ont la même signification que précédemment. Une courbe représentative de ce modèle est donnée à la figure 8 en annexe. Ce modèle est caractérisé par le fait que la vitesse maximale de croissance n'est jamais atteinte il 2783837 sauf pour ks. tendant vers 0 ou bien ks tendant vers l'infini. Modèle de Teissier (Krystallidis A., Application du génie des procédés aux Biotechnologies Marines - Etude de faisabilité, Modélisation et Simulation Dynamique d'un procédé de culture de Microalgues. - Thèse de Doctorat de l'Ecole Centrale de Paris - 1994) répondant à la formule suivante: = max e ks. ekis) dans laquelle: p, Pmax, s, ks et kis ont la même signification que précédemment. Une courbe représentative de ce modèle est donnée à la figure 9 en annexe. Ce modèle est caractérisé par une inhibition immédiate par le substrat. Modèle de Peeters er Eilers (Dermoun D., Ecophysiologie de Porphyridium cruentum: Validation expérimentale d'un modèle de croissance - Etude de la production de polysaccharides - Thèse de doctorat de l'Université de Compiègne - 1987) répondant à la formule suivante: = 2. Pmax y2 + 2..y + 1 avec y = S / Sopt, et dans laquelle: et Pmax ont la même signification que précédemment, et - f représente une constante sans unité, - Sopt représente la concentration en substrat optimale au delà de laquelle la croissance est inhibée. 12 2783837 Une courbe représentative de ce modèle est donnée à la figure 10 en annexe. Ce modèle est caractérisé par le fait qu'il prend en compte une limitation par le substrat dans les cas o S les cas o S>Sopt. Modèle de Nielsen et Nielsen J., Villadsen J., Bioreaction Engineering Princioples, 1994) répondant à la formule suivante: s s2 --- + ks + s (kis dans laquelle: u, lmax, s, ks et kis ont la même signification que précédemment. Une courbe représentative de ce modèle est donnée à la figure 11 en annexe. Ce modèle est caractérisé par le fait que la vitesse maximale n'est jamais atteinte sauf pour ks tendant vers 0 ou kis tendant vers l'infini. Modèle de Steele (Microbial kinetics an dynamics in chemical reactor theory. Lapidus, L. and Amundson, N. R. (eds), Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ? Chapt. 7, PP. 405-483) répondant à la formule suivante: s Sopt = Pmax. e sop1 Sopt dans laquelle: p, Dmax, s et Sopt ont la même signification que précédemment. Une courbe représentative de ce modèle est donnée à la figure 12 en annexe. Ce modèle est caractérisé par le fait qu'il prend en compte une limitation par le substrat pour S sopt- 13 2783837 Les modèles sans inhibition ne sont pas satisfaisants pour prendre ne compte la présence d'une zone optimale pour la croissance et ceci pour n'importe quel substrat. En effet, les expérimentations réalisées par les Inventeurs ont mis en évidence la présence de deux zones distinctes de croissance pour chaque facteur étudié: - le facteur étudié limite la croissance, - le facteur étudié inhibe la croissance, et il a bien entendu été observé un passage par une valeur optimale. Il est donc nécessaire de disposer d'un modèle capable de représenter cet optimum. En conséquence, les modèles ne prenant pas en compte une inhibition liée au facteur étudié ne peuvent pas convenir. Un autre but de l'invention est d'établir un modèle dont la valeur des paramètres soit physique, c'est à dire que les valeurs régressées des paramètres soient cohérentes avec les niveaux des facteurs testés. En conséquence, les modèles de Andrews et Noak, Nielsen et Villadsen et Aiba ne sont pas satisfaisants. En outre, par commodité et pour obtenir une meilleure qualité physique de la valeur, il est nécessaire que le nombre de paramètres à régresser par variable considérée soit minimal ce qui exclut le modèle de Peeters et Eilers ou deux paramètres doivent être régressés par variable. Le modèle de Teissier n'est pas satisfaisant car s'il prend bien en compte l'inhibition liée au niveau du facteur étudié, il ne peut pas passer par une valeur optimale, ce qui n'est pas cohérent vis-à-vis des objectifs fixés par les Inventeurs. Seul le modèle de Steele permet de ne régresser qu'un seul paramètre par variable prise en compte. En outre, le modèle de Steele est capable de traduire l'optimum sans être entaché d'une divergence de 14 2783837 ses paramètres. Mais le modèle de Steele n'a jamais été mis en oeuvre avec le CIT. Une forme de mise en oeuvre avantageuse du procédé de l'invention comprend donc les étapes suivantes: a) on mesure la concentration en carbone inorganique total dans le réacteur, b) on calcule la vitesse de croissance dudit microorganisme à la concentration en carbone inorganique total mesurée à l'étape (a), selon la formule suivante: 1 -CI = kmax CI e CITOpt] CITopt dans laquelle: - h représente la vitesse de croissance en h-1 - max représente la vitesse maximale de croissance en h, - CIT représente la concentration en CIT n g/l ou en mol/l, - CITopt représente la concentration optimale en CIT pour la croissance des microalgues en g/l ou en mol/l, puis, c) on compare la vitesse de croissance calculée à l'étape (b) avec la vitesse de croissance potentielle maximale que peut atteindre le microorganisme et l'on ajuste l'apport de C02 gazeux et/ou de carbonates et/ou de bicarbonates dans le réacteur de façon à tendre vers la vitesse de croissance potentiel maximale que peut atteindre le microorganisme. Toutefois, le procédé ci-dessus peut être amélioré en prenant en compte les deux variables 2783837 suivantes non seulement le Carbone Inorganique Totale (CIT), mais aussi l'énergie disponible pour la croissance des microorganisme. En effet, il est admis que l'énergie lumineuse disponible pour la croissance est fonction (Krystallidis A., Application du génie des procédés aux Biotechnologies Marines - Etude de faisabilité, Modélisation et Simulation Dynamique d'un procédé de culture de Microalgues. - Thèse de Doctorat de l'Ecole Centrale de Paris - 1994): - des énergies lumineuses incidente et sortante, - de la forme du réacteur, et - de la concentration de microorganisme dans le réacteur. Ainsi, l'énergie lumineuse disponible peut être calculée en fonction de ces paramètres par la formule suivante: (Iin - Iout) - A E= V. X dans laquelle: - E représente l'énergie lumineuse disponible par cellule, - Iin représente l'énergie lumineuse incidente en pE.m2. s-, - Iout représente l'énergie lumineuse sortante en pE.m2. s- - A représente l'aire du réacteur en m2, - V représente le volume utile du réacteur en m, - X représente la concentration cellulaire x 106 cellules /ml. Les inventeurs ont donc étendu le modèle de Steele aux deux variables suivantes: - le CIT, 16 '2783837 - l'énergie lumineuse disponible par cellule. En conséquence, une forme de mise en oeuvre particulièrement avantageuse du procédé de l'invention comprend les étapes suivantes: a) on mesure la concentration du carbone inorganique total dans le réacteur et l'énergie lumineuse disponible pour la croissance, b) on calcule la vitesse de croissance dudit microorganisme à la concentration du carbone inorganique total et à l'énergie lumineuse disponible mesurées à l'étape (a), puis c) on compare la vitesse de croissance calculée à l'étape (b) avec la vitesse de croissance potentielle maximale que peut atteindre le microorganisme et l'on ajuste l'apport de C02 gazeux et/ou de carbonates et/ou de bicarbonates dans le réacteur de façon à tendre vers la vitesse de croissance potentiel maximale que peut atteindre le microorganisme. Avantageusement à l'étape (b), on calcule la vitesse de croissance dudit microorganisme à la concentration du carbone inorganique total et à l'énergie lumineuse disponible mesurées à l'étape (a) selon la formule suivante: E CIT E (1-) CIT (1 CIT i= max rÀ.e Eopt op. e CITopt dans laquelle: - Pmax représente la vitesse spécifique de croissance maximale que peut atteindre le microorgansime, E représente l'énergie lumineuse accessible par cellule, 17 2783837 - CIT représente la concentration en carbone inorganique total, Eopt représente la valeur de l'énergie lumineuse à 9max, - CITopt représente la valeur du Carbone Inorganique Total à Pmax, La vitesse spécifique maximale de croissance (9max), l'énergie lumineuse optimale (Eopt), et la concentration en CIT optimale (CITopt) sont des paramètre du modèle utilisé dans la présente invention. Ces paramètres sont calculés par régression du modèle sur un jeu de valeurs expérimentales donnant p, E, et CIT, grâce à un logiciel ou à un programme adapté. E est calculé à partir des mesures de Iin, Iout et X grâce à la relation suivante: _(Iin-I,,u).A E= X.V dans laquelle - E représente l'énergie lumineuse disponible par cellule, - Iin représente l'énergie lumineuse incidente en pE.m2., - lout représente l'énergie lumineuse sortante en pE.m2.s, - A représente l'aire du réacteur en m2, - V représente le volume utile du réacteur en m, - X représente la concentration cellulaire x 106 cellules /ml. CIT est calculé à partir des mesures du pH et du C02 dissous grâce à la relation suivante: Kt KiK: CIT = CO. (1+ K.: a a dans laquelle: - a,, =10O' aH représentant l'activité de l'ion H en g/1 ou en mol/1 et pH étant le potentiel hydrogène de la culture, - CO, représente la concentration en CO2 dissous en g/1 ou en mol/l, - CIT représente la concentration en CIT en g/1 ou en mol/l, - K1, K2 représentent les constantes d'équilibre du système carbone-carbonate-bicarbonate en g/l ou en mol/l. Une courbe représentative de ce modèle est donnée à la figure 13 en annexe. Cette courbe fait apparaître la présence d'une plage optimale de croissance pour le CIT centrée autour de la valeur CITopt. On peut constater qu'une faible diminution du CIT par rapport à la valeur de CITopt entraîne une baisse significative de la vitesse de croissance. Par contre, si une augmentation du CIT est observée, les performances sont altérées plus faiblement. Le procédé de l'invention quelle que soit sa forme de mise en oeuvre est applicable à tous les types de microorganismes photosynthétiques comme des microalgues ou des cyanobactéries, par exemple Porphyridium cruentum. En effet, celles-ci réagissent toutes selon le même principe basé sur le fait que pour une variable, il y a un passage par un optimum avec une zone de limitation précédant cet optimum et une zone d'inhibition le succédant. C'est effectivement ce qui a été observé avec le modèle à deux variables décrits précédemment. 19 2783837 Le procédé de l'invention est applicable à tous types de réacteurs, comme un photobioréacteur, ou tout type de réacteur mettant en oeuvre des microorganismes photosynthétiques. L'invention concerne également un dispositif de contrôle de la concentration en carbone inorganique dans un réacteur pour la culture de microalgues photosynthétique, ainsi qu'un réacteur muni d'un tel dispositif. En effet, l'objectif de la régulation selon l'invention pour une production optimale est le maintien du CIT dans la plage optimale. La mesure et le calcul en ligne conformément aux procédés de l'invention grâce à un dispositif implanté sur le site du réacteur permet de réaliser cette optimisation. Ce dispositif comprend des moyens d'acquisition de données disposés au niveau du réacteur. Le contrôle du carbone inorganique total dans le réacteur conformément à l'invention passe par l'acquisition de la pression partielle en C02 dans le liquide, qui permet le calcul de la concentration en C02 dans le liquide (CO2T), connaissant la constante de Henry. Le réacteur selon l'invention est donc muni d'un ou plusieurs moyens d'acquisition de la pression partielle en CO2 dans le liquide La dissolution du C02 est dépendante de la salinité et de la température du milieu de culture. Un ou plusieurs moyens d'acquisition de la température, désignés par "TT" dans la figure 14, peuvent donc également équiper le réacteur. La salinité du milieu de culture est une caractéristique propre à chaque milieu et peut donc être considérée comme un paramètre fixe dont l'acquisition ne se justifie pas puisque la salinité n'évolue pas au cours du temps. () 2783837 Un ou plusieurs moyens d'acquisition du pH, désignés pHT dans la figure 14, sont également nécessaire pour le calcul du carbone inorganique total. Le dispositif de contrôle du CIT comprend également un calculateur qui exploite la valeur des variables mesurées par les moyens d'acquisition placés au niveau du réacteur, de façon à calculer la concentration en carbone inorganique total dans le réacteur. La valeur du CIT ainsi obtenue est comparée au point de consigne d'un régulateur, lequel peut être soit intégré dans le calculateur, soit être indépendant. La sortie du régulateur commande: - soit une électrovanne permettant l'injection de C02 gazeux dans le milieu de culture, - soit une pompe permettant l'apport d'une solution contenant différentes formes de carbonates et/ou bicarbonates, comme du Sodium Carbonate ou du Calcium Carbonate, dans le milieu de culture. Les moyens d'acquisition disposés au niveau du réacteur sontavantageusement constitués par des moyens de mesure de la pression partielle de CO2 (Sonde C02 "Ingold", électrode type 780 et amplificateur CO2 "Ingold" 4F-502), des moyens de mesure de la température (sonde pt 100 et régulateur numérique de température Microcor III MCF de chez Coreci), du pH (électrode "Ingold Mettler Toledo" 405-DPA-SC-S8 225mm, diamètre 12mm, à gel pressurisé sans entretien et autoclavable et amplificateur "Polymetron"8262. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples de mise en oeuvre du procédé qui suivent. Le protocole expérimental décrit ci-après a été élaboré afin d'acquérir les données nécessaires pour 21 2783837 pouvoir régresser convenablement un modèle de croissance de la microalgue Porphyridium cruentunm. Les expériences rapportées ci-après ont été réalisées en discontinu dans des réacteurs de petit volume. Exemple 1: Description du réacteur. Le réacteur est de forme cylindrique et de volume utile de 2,5 litres. Il est muni d'une double paroi o circule de l'eau thermostatée à la température de consigne. De l'air enrichi en dioxyde de carbone est injecté à la base du réacteur. Le mélange air-C02 est stérilisé en amont grâce à un filtre de 0,2 tm. Le réacteur est placé sur un bâti équipé de six tubes néons, trois de type Biolux et trois de type Fluora. Exemple 2: Protocole expérimental. Les conditions opératoires de croissance de la microalgue Porphyridium cruentum optimisées expérimentalement par la Demanderesse sont rapportées dans le tableau I ci-dessous: Tableau I opératoires Valeur optimisée Condition opratoires expérimentalement Intensité lumineuse 120 pmoles de photons/m2/s Débit du mélange air-CO2 2,5 V.V.H. % de CO2 dans le gaz 2% d'alimentation Photopériode COntinue pH Température 251C o "2 2783837 L'unité du débit du mélange air-C02 exprimée en V.V.H signifie volume par volume et par heure. Il s'agit rapport du débit volumique du gaz par le volume de la culture. Sur le photobioréacteur pilote décrit à l'exemple 1, le pH et la température sont régulés aux valeurs de consigne rapportées dans le tableau I. EN conséquence, l'étude de l'influence de ces deux paramètres sur la croissance de Porphyridium cruentum a été éliminée. Par contre, la lumière et la source carbonée ont été intégrées pour la définition du modèle, ce qui démontre l'intérêt d'étudier l'influence de l'intensité lumineuse et de la photopériode pour la lumière et du débit de gaz et de pourcentage de C02 dans le gaz d'alimentation pour la source carbonée. Un plan expérimental paramètre par paramètre a été adopté, et un paramètre à la fois a été modifié. Pour l'étude de l'intensité lumineuse incidente, ce paramètre a été modifié autour de sa valeur nominale (120 imoles de photons/m2/s) tout en gardant les autres conditions opératoires à leur valeur optimale. Le tableau II ci-dessous récapitule les *expériences effectuées. 23 2783837 Tableau II Influence du Intensité Débit du Pourcentage Photopériode paramètre lumineuse mélange du CO2 dans (heures étudié (120 lmoles air-C02 le gaz d'éclairement de (V.V.H) d'alimentat / heures photons/m2/s) ion (%) d'obscurité) Lumière 60 2,5 2 continue 2,5 2 continue 2,5 2 continue 300 2,5 2 continue 460 2,5 2 continue Débit de gaz 120 1 2 continue 4,6 2 continue 13 2 continue % de CO2 120 2,5 1 continue 2,5 3 continue 2,5 5 continue Photopériode 120 2,5 2 8/16 2,5 2 12/12 2,5 2 16/8 Chacune de ces expériences a duré environ 15 jours soit la durée d'un cycle de croissance dont la courbe est représentée à la figure 15 en annexe. Le cycle de vie d'un microorganisme se décompose en plusieurs phases montrées sur la courbe de la figure 15: - 1 phase de latence - 2: phase d'accélération - 3 phase exponentielle de croissance - 4 phase de ralentissement - 5 phase stationnaire - 6: phase de déclin La courbe type de la figure 15 a été obtenue pour chaque expérience effectuée. L'analyse de la phase exponentielle de croissance permet d'accéder à la vitesse spécifique de croissance p (T-1). En effet, seule la phase exponentielle de croissance a été analysée car l'objectif de l'invention est d'aboutir à 24 2783837 une représentation de la croissance de la microalgue dans un procédé continu. Or en continu, les cellules sont maintenues constamment en phase exponentielle de croissance. La vitesse spécifique de croissance est déterminée par la formule suivante: dC dt.C o C est la concentration cellulaire. Le calcul de la vitesse spécifique de croissance dans le procédé préféré de l'invention est relié d'une part au carbone inorganique total et d'autre part à l'énergie lumineuse accessible par la cellule conformément à la formule suivante: E CIT E (1) CIT (1T) P= max.e Eopt.e CITopt Eept CITept Afin de régresser ce modèle, les Inventeurs ont, pour chaque expérience réalisée, calculé la vitesse de croissance spécifique dans chaque intervalle de temps de la phase exponentielle de croissance. A chaque t obtenu, il a été attribué le CIT et le E moyens de ces mêmes intervalles de temps. Les tests successifs de régression ont conduit aux valeurs ajustées suivantes pour les paramètres de la formule ci-dessus: - 9max = 3,379 10-2h-1 - Eopt = 120,66 pE.m-2.s1 - CITopt = 12,93 mmol.1-1 Exemple 3: Evolution du CIT dans le réacteur pilote de l'exemple 1. La figure 16 représente l'évolution du CIT dans le photobioréacteur. Les courbes de la figure 16 ont été obtenues en comparant les valeurs de CIT lorsque 2783837 l'apport de C02 dans la culture est seulement réalisé par la régulation du pH (Novembre 1997) et lorsqu'une injection est effectuée en continu (mars 1998). On constate que l'évolution du CIT dans le cas o un apport en continu est effectué est intéressante pour assurer une vitesse de croissance maximale. Par contre, l'évolution dans le cas o seule la régulation du pH intervient pour apporter du C02 semble limiter la croissance de la microalgue dans le photobioréacteur puisque la majorité du temps la concentration en CIT est inférieure à lOmmol/l. Exemple 4: Comparaison des modes d'apport en C02. Sur la base des résultats expérimentaux de l'exemple 3, le système d'injection du C02 du réacteur pilote a été modifié de façon à avoir un apport continu en C02 pendant la phase lumineuse, c'est à dire de 7 h 00 à 21 h 00. La figure 17 en annexe est un schéma simplifié de l'apport de C02 par la régulation du pH utilisé avant le mois de Mars 1998, et la figure 18 est un schéma simplifié de l'injection continue de CO2. Pour des raisons de sécurité, les deux systèmes pourraient coexister, mais la régulation du pH à la consigne de 7,0 0,2 n'est plus utile puisque le pH oscille, avec le nouveau système, autour de cette valeur. La mesure du nombre de cellules/ml et de la matière sèche montrent une différence significative entre les deux systèmes d'injection du C02. Lorsque le pH en régule l'apport, on obtient en moyenne, sur une période de 10 jours et avec un temps de séjour de 1,7 jour, 12,2 3,0 cellules/ml et I "O' 2783837 2,2 + 0,3 g de matière sèche.1--. Avec un apport continu de C02, on obtient en moyenne sur une même période et un même temps de séjour, 19,8 2,1 cellules/ml et 2,8 0,2 g de matière sèche.1-1. 27 2783837 REVENDICATIONS 1) Procédé contrôlé de culture d'un microorganisme photosynthétique dans un réacteur clos suffisamment transparent pour permettre la pénétration de la lumière, comprenant l'apport audit micro-organisme des nutriments nécessaires à sa croissance notamment l'apport de C02 gazeux et/ou de carbonates et/ou de bicarbonates, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on mesure la concentration en carbone inorganique total dans le réacteur, b) on calcule la vitesse de croissance dudit microorganisme à la concentration en carbone inorganique total mesurée à l'étape (a), puis c) on compare la vitesse de croissance calculée à l'étape (b) avec la vitesse de croissance potentielle maximale que peut atteindre le microorganisme et l'on ajuste l'apport de C02 gazeux et/ou de carbonates et/ou de bicarbonates dans le réacteur de façon à tendre vers la vitesse de croissance potentielle maximale que peut atteindre le microorganisme. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on mesure la concentration en carbone inorganique total dans le réacteur, b) on calcule la vitesse de croissance dudit microorganisme à la concentration en carbone inorganique total mesurée à l'étape (a), selon la formule suivante: CIL K LCITJ CIT e CITOpt = Pmnaxe CITopt dans laquelle: à 2783837 - p représente la vitesse de croissance par heure, - gmax représente la vitesse maximale de croissance par heure, - CIT représente la concentration en carbone inorganique total en g/l ou en mol/l, - CITopt représente la concentration en carbone inorganique total permettant une croissance maximale en g/1 ou en mol/l. puis, c) on compare la vitesse de croissance calculée à l'étape (b) avec la vitesse de croissance potentielle maximale que peut atteindre le microorganisme et l'on ajuste l'apport de C02 gazeux et/ou de carbonates et/ou de bicarbonates dans le réacteur de façon à tendre vers la vitesse de croissance potentielle maximale que peut atteindre le microorganisme. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on mesure la concentration du carbone inorganique total dans le réacteur et l'énergie lumineuse disponible par cellule, b) on calcule la vitesse de croissance dudit microorganisme à la concentration du carbone inorganique total et à l'énergie lumineuse disponible mesurées à l'étape (a), puis c) on compare la vitesse de croissance calculée à l'étape (b) avec la vitesse de croissance potentielle maximale que peut atteindre le microorganisme et l'on ajuste l'apport de C02 gazeux et/ou de carbonates et/ou de bicarbonates dans le réacteur de façon à tendre vers la vitesse de croissance 29 2783837 potentielle maximale que peut atteindre le microorganisme. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), on calcule la vitesse de croissance dudit microorganisme à la concentration du carbone inorganique total et à l'énergie lumineuse disponible mesurées à l'étape (a) selon la formule suivante: E CIT E (1) CIT (1) = max.e Eopt. ITOpt E1pt CITopt dans laquelle: - Pmax représente la vitesse spécifique de croissance maximale que peut atteindre le microorganisme par heure, - E représente l'énergie lumineuse disponible par cellule, - CIT représente la concentration en carbone inorganique total en g/1 ou en mol/l, Eopt représente la valeur de l'énergie lumineuse à tmax, - CITopt représente la valeur du Carbone Inorganique Total à pmax, 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le réacteur est un photobioréacteur. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le microorgansime photosynthétique est une microalgue ou une cyanobactérie. 3o 2783837 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la microalgue est une souche de Porphyridi um cruen tun. 8) Dispositif de contrôle de la concentration en carbone inorganique dans un réacteur pour la culture de microorganismes photosynthétiques, caractérisé en ce qu'il comprend: - des moyens d'acquisition de la pression partielle en C02 dans le liquide et/ou de la concentration en C02 dans le liquide, du pH, et éventuellement de la température du milieu de culture - un calculateur qui exploite la valeur des variables mesurées par les moyens d'acquisition placés au niveau du réacteur, de façon à calculer la concentration en carbone inorganique total dans le réacteur. - un régulateur qui compare la valeur du CIT obtenue par le calculateur à un point de consigne et commande soit une électrovanne permettant l'injection de C02 gazeux, soit une pompe permettant l'apport d'une solution contenant différentes formes de carbonates et/ou bicarbonates, dans le milieu de culture. 9) Un réacteur pour la culture de microorganismes photosynthétiques, caractérisé en ce qu'il est muni d'un dispositif selon la revendication 8.