FR 2773488 A1 19990716 FR 9800205 A 19980112 La présente invention est relative à la mise en évidence des activités immuno-redox des SODs hétérologues (HSDs) et à une nouvelle utilisation thérapeutique, ainsi qu'à un procédé de sélection desdites HSDs. Dans les conditions normales de pression d'oxygène, l'oxygène donne naissance à de l'oxygène réactif (peroxyde d'hydrogène et radicaux libres tels qu'anion superoxyde, radicaux hydroxyles ou oxyde nitrique), qui est rapidement détruit par les cellules qui disposent d'au moins trois mécanismes majeurs endogènes d'autorégulation de l'oxygène réactif produit (substances antioxydantes, chélateurs métalliques, enzymes détoxi- fiantes). Par contre, si ces mécanismes sont affectés ou bien si la production d'oxygène réactif et notamment de radicaux libres est trop impor- tante, il en résulte un stress oxydatif et l'apparition d'un état pathologique. Les superoxydes-dismutases ou SODs, qui forment une classe de métalloprotéines contenant du fer, du cuivre, du zinc ou du manganèse, sont des enzymes capables d'induire la dismutation des anions superoxydes, pour protéger les cellules contre la toxicité de ces radicaux superoxyde (.02-). Les anions superoxydes se forment généralement lorsque l'oxygène moléculaire acquière un électron supplémentaire, ce qui se produit lorsque l'oxygène est soumis à des radiations ionisantes. Cet anion présente une durée de vie courte et est converti en peroxyde d'hydrogène par la SOD (dismutation). Cette dismutation génère du peroxyde d'hydrogène, qui est également un oxydant cellulaire. Pour répondre à l'élévation des concentra- tions en peroxyde d'hydrogène, les cellules augmentent l'activité des enzymes intervenant dans l'élimination du peroxyde d'hydrogène, à savoir la catalase et la glutathion peroxidase, conformément au schéma suivant: 202-+2H ----> H202+02 superoxyde dismutase 2H202 ----> 02+2H20 catalase ROOH+2GSH ---->ROH+H20+GSSG glutathion peroxydase. En l'absence de quantités suffisantes de catalase et de gluta- thion peroxydase et en présence de petites quantités de fer, résultant en parti- culier de lésions cellulaires, on obtient une conversion du peroxyde d'hydrogène en un composé encore plus toxique, les radicaux hydroxyles (réaction de Fenton), conformément au schéma suivant: 02-+Fe3+ ----> Fe2+ +02 Fe2++H22Oz ---->Fe3++OH-+OH 02-+H202 ---->02+OH-+OH Les radicaux libres dérivés de l'oxygène apparaissant impli- l0 qués dans de nombreuses affections, l'utilisation de la SOD en thérapeutique a donc été préconisée dans les pathologies induites par l'oxygène réactif telles que les états inflammatoires (arthropathies inflammatoires, par exemple) (R. NORDMANN et al., Cah. Nutr. Diet., 1991, 26, 6, 398-402); dans les maladies pulmonaires et plus particulièrement, la dysplasie bronchopulmonaire ou dans d'autres conditions toxiques, liées à la présence d'oxygène en quantité importante (système nerveux central, ischémie, désordres gastro-intestinaux non vasculaires, désordres oculaires (en local dans la chambre antérieure de l'oeil) ou lutte contre les effets indésirables des traitements anti-cancéreux), la SOD a également été proposée avec plus ou moins de succès (GREENWALD R.A., Free Radical Biol. Med., 1990, 8, 201-209). Trois types distincts de SOD, entrant dans deux familles évo- lutives distinctes on été décrits: - - SOD contenant du cuivre et du zinc, habituellement localisée dans le cytosol des cellules eucaryotes, dans le fluide extracellulaire des mammifères ainsi que chez certaines bactéries; - SOD contenant du manganèse (MnSOD) ou du fer (FeSOD), habituellement localisée chez les procaryotes ou dans les mitochondries (MnSOD); - SOD contenant du fer (FeSOD), localisée dans les bactéries anaérobies et les procaryotes. Parmi les SOD testées, ce sont celles qui présentent une demi- vie prolongée et une faible incidence des accidents de nature immunologique qui ont la préférence; on peut citer en particulier la Cu, Zn-SOD d'origine bovine (homodimère qui catalyse la dismutation du radical superoxyde), la Mn-SOD d'E. coli, la Fe-SOD, les SOD liposomales, les SOD conjuguées au polyéthylène glycol, les polymères ou copolymères de SOD, la Cu,Zn-SOD et la Mn-SOD humaines recombinantes ainsi que les SODs d'origine végétale. Dans différents tests d'inhibition de l'inflammation, les SODs hétérologues s'avèrent présenter une activité anti-inflammatoire significati- vement plus importante que les SOD homologues. Par exemple: dans un modèle de rat, dans lequel une inflammation est induite par des carraghénanes, l'activité anti-inflammatoire de différentes SODs est la suivante: Mn-SOD d'E. coli > Cu-SOD bovine > Cu-SOD humaine > Cu-SOD de levure > Cu-SOD de plante; dans ce cas, la Cu-SOD de rat présente une activité pro-inflammrnatoire significative; dans un modèle de rat, dans lequel une inflammation est induite par de l'adriamycine, l'activité anti-inflammatoire de différentes SODs est la suivante: Cu-SOD bovine > Mn-SOD d'E. coli; la Cu-SOD homo- logue de rat est totalement inactive, alors que la Cu-SOD de levure génère une réponse pro-inflammatoire. La Demanderesse a trouvé, de manière inattendue, qu'outre une activité dismutasique, les SODs hétérologues (HSD) possèdent une acti- vité immuno-redox, qu'il est possible de dissocier de l'activité dismutasique. On entend, au sens de la présente invention, par activité immuno-redox, la réactivation des défenses cellulaires internes, notamment une stimulation de la production à la fois de SOD endogène, de catalase et de glutathion peroxydase. De telles SODs hétérologues à activité essentiellement immuno-redox, outre le fait qu'elles n'induisent pas de réaction pro- inflammatoire, induisent la production de SOD endogène et stimulent la production de catalase et de glutathion peroxydase. De telles SODs augmentent ainsi les défenses non-spécifiques, qui protègent de la dégéné- rescence cellulaire et organique. La présente invention a pour objet l'utilisation d'une SOD hétérologue végétale à activité essentiellement immuno-redox, pour la prépa- ration d'un médicament destiné au traitement des maladies dans lesquelles on observe une dégénérescence cellulaire et organique. De telles SODs hétérologues, qui augmentent les défenses non- spécifiques, protègent les cellules de la dégénérescence; elles constituent ainsi un médicament anti-dégénératif de choix, quelle que soit l'origine de la dégénérescence: pathologie dégénérative telle que séquelles radio-induites, maladie de Parkinson, maladie d'Alzheimer..., dégénérescence induite par un agent infectieux (SIDA, bilharziose, cirrhose post-infectieuse (hépatite C)) ou dégénérescence iatrogène (action de détoxification médicamenteuse). Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ladite SOD à activité essentiellement immuno-redox est une SOD nitrée; une telle SOD a perdu son activité dismutasique alors qu'elle conserve son activité immuno-redox. Elle a l'avantage d'éviter tout risque d'activité pro-inflamma- toire liée à l'activité dismutasique et à la production de peroxyde d'hydrogène en excès, dans le cas o l'induction de la production de catalase et de glutathion peroxydase est trop faible pour répondre à la demande. De manière surprenante, des SODs selon l'invention (HSDs), qui ne présentent plus ou pratiquement plus d'activité dismutasique, mais qui ont conservé leur activité immuno-redox, utilisées comme médicament chez l'homme, stimulent la production de SOD endogène ainsi que la production de catalase et de glutathion peroxydase. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utili- sation, ladite SOD hétérologue végétale est notamment issue du melon. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, lesdites SOD sont mise en oeuvre pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies dégénératives, sélectionnées dans le groupe constitué par les maladies neurodégénératives, la cirrhose, les infections à lentivirus, les infections parasitaires et les maladies iatrogènes (détoxification médicamenteuse). La présente invention a également pour objet un procédé de sélection d'une SOD hétérologue végétale à activité essentiellement immuno- redox, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) la mesure de l'activité dismutasique d'une SOD, éventuel- lement modifiée, (b) la sélection des SODs sans activité dismutasique ou ayant une activité dismutasique réduite d'au moins un facteur 10, et (c) la mesure de l'activité immuno-redox des SODs sélection- nées en (b) sur un système cellulaire dans lequel l'expression de SOD endo- gène est inhibée. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, l'étape (a) de mesure de l'activité dismutasique est réalisée par réduction du ferricytochrome c. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, le système selon l'étape (c) est constitué par des cellules exprimant la protéine tat de VIH-1. - Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels: - la figure 1 illustre le profil électrophorétique SDS-PAGE de l'expression de SOD endogène dans des cellules U937 dans différentes condi- tions; - la figure 2 illustre l'activité de la SOD endogène des cellules U937 après activation par une SOD exogène; - les figures 3 (glutathion peroxydase) et 4 (catalase) illustrent les conditions dans lesquelles d'autres enzymes anti-oxydantes endogènes sont activées; - la figure 5 illustre l'activité dismutasique comparée de diffé- rentes SODs; - les figures 6 et 7 illustrent l'activité immuno-redox comparée de différentes SODs; - les figures 8 et 9 illustrent l'effet toxique de l'AZT, soit spon- tanément, soit après stimulation des CLC par des exotoxines de staphylo- coque telles que la TSST-1; - la figure 10 illustre l'effet toxique de plusieurs anti- rétroviraux sur des CLC ainsi que l'effet des SOD nitrées; - la figure 11 illustre l'effet de l'AZT sur l'apoptose spontanée ou induite par TSST-1 des cellules U1 chroniquement infectées par le VIH-1; - les figures 12 et 13 illustrent l'effet de différentes SODs sur deux pathologies dégénératives: maladie d'Alzheimer et maladie de Parkinson; - les figures 14 et 15 illustrent des coupes histologiques de foies. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. EXEMPLE 1: Mise en évidence de l'activité immuno-redox des SOD. I. Matériel et Méthodes - Culture de cellules La lignée cellulaire humaine leucémique promonocytaire U937 est cultivée à une concentration finale de 2.105 cellules/ml dans un milieu Iscove enrichi avec 100 U/ml de pénicilline, 100 gg/ml de strepto- mycine et 5 % de sérum de veau foetal, en l'absence (contrôle) ou en présence (activé) de 10 gg/ml de protéine HI-V-Tat. Pour chaque expérience, 30 U/ml de SOD [recombinante humaine (HuSOD), bovine (HSD1, Sigma, St Louis, 0 MO) ou végétale (issue du melon) (HSD2, BIOEXTRACTION, Bron, France)] sont ajoutées au milieu et incubées à 37 C, sous une atmosphère humide comportant 5 % de C02, pendant 24 heures. - Détermination de la SOD endogène Les cellules U937, traitées ou non avec la protéine HIV-Tat, en présence ou en l'absence des SOD précitées, sont lysées dans un tampon détergent comprenant: 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1 % de SDS, 1 % de Nonidet P-40, 10 gg/ml de leupeptine, 100 gg/ml de PMSF et 2 gg/ml d'aprotinine, par chauffage à 85 C pendant 5 min. Le lysat est ensuite briè- vement soniqué (3 x 30 sec). Des échantillons de 20 gg sont soumis à une électrophorèse en conditions réductrices sur un gel à 12 % de SDS-polyacrylamide. Les pro- téines sont ensuite analysées par électroblotting sur une membrane de 0, 2 gm de difluorure de vinylidène ultérieurement bloquée avec 10 mM de Tris-HC1, pH 7,4, 100 mM de NaCl (TBS) contenant 1 % de sérum albumine bovine (BSA) et 0,1 % de Tween 20. Les empreintes sont ensuite incubées avec un antisérum de lapin anti-SOD humaine ou avec un sérum de lapin préimmun à une concen- tration finale de 2 gg/ml. Les empreintes sont ensuite lavées deux fois avec du TBS contenant 0,1 % de Tween 20, puis incubées avec une Ig de chèvre anti-lapin conjuguée avec de la peroxydase de raifort; et les bandes sont révé- $ lées par chimioluminescence (luminol) et détectées par autoradiographie (film sensible à la lumière bleue). - Détermination de l'activité dismutasique de la SOD endo- gène L'activité superoxyde-dismutase totale est mesurée sur les lysats soniqués obtenus, comme décrit ci-dessus, par sa capacité à inhiber la réduction du ferrocytochrome c par les radicaux superoxydes produits par le système xanthine-oxydase/xanthine (McCord. J.M., 1969, J. Biol. Chem. 244, 6049). Une unité de superoxyde dismutase est définie comme la quantité qui inhibe 50 % de la réduction du cytochrome c, à température ambiante et à pH 7,8. - Détermination de l'activité immuno-redox de la SOD hétéro- logue végétale Après stimulation et traitement avec différentes sources et concentrations de SOD, les cellules U937 sont recueillies dans un sérum physiologique froid, tamponné au phosphate, et comptées. L'ARN total est extrait par des techniques standard (Chomczynski.P., 1987, Anal. Biochem. 162, 156), dans 1 ml de réactif TRIzol (Life Technologies X 15596), selon les instructions du fabricant. Après son extraction, l'ARN est précipité avec de l'alcool isopropylique, les culots sont lavés dans de l'éthanol à 70 % et séchés à l'air. Les culots séchés sont remis en suspension dans 50 gl d'EDTA 0,5 mM, pH 8, et quantifiés par spectrophotométrie. Pour la transcription inverse, 2 gg de l'ARN total dans 10 gl sont ensuite utilisés pour synthétiser l'ADNc, en présence de l'amorce univer- selle oligo-dT [Young R.A., 1983, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 80, 1194] dans le mélange réactionnel suivant: 1 gl de transcriptase inverse Superscript II [Life Technologies # 18089] avec 6 gl de 5x de tampon de transcription inverse (250 mM de Tris-HCl, pH 8,3, à 42 C, 50 mM de MgCl2, 300 mM de KCl, mM de DTT), 0,5 gl d'inhibiteur d'ARNase, 1,5 pl d'oligo-dT (lmg/ml) et 6 gl de dNTP 2,5 mM (Boehringer Mannheim). Après une préincubation de 5 min. de l'ARN total à 65 C et un refroidissement sur de la glace, le mélange réactiornnel est ajouté et la réac- tion a lieu pendant une heure à 42 C. Pour l'amplification par PCR, la même quantité d'ADNc est soumise à trente cycles dans un volume réactionnel de 50 A1 (25 mM de TAPS pH 9,3, 50 mM de KCl, 1 mM de MgC12, 100 pM de chaque dNTP, 20gM de chaque amorce et une unité de polymérase Goldstar). Le programme d'amplification comporte: cinq cycles comprenant 60 sec. à 92 C, 60 sec. à 58 C et 60 sec. à 74 C, suivi de 25 cycles comprenant 30 sec. à 92 C, 60 sec. à 60 C et 60 sec. à 74 C, et pour finir la température est maintenue à 74 C pendant encore 3 minutes. Les amplifica- tions positives PCR sont ensuite déterminées par une électrophorèse sur gel d'agarose à 1,2 % dans 0,5x de tampon TAE. - Détermination de la transcription des gènes exprimant la i5 catalase et la gluthation peroxydase L'ARN cellulaire total des cellules U937 traitées ou non traitées est préparé d'après Chirgwin et al. 1979 (Chirgwin J.M., 1979, Biochemistry, 18, 5294). Pour la transcription inverse et l'amplification par PCR, on procède comme ci-dessus. Pour la RT-PCR, les amorces sont décrites dans la littérature, comme suit: - transcription de l'ARN de MnSOD: Beck. Y., 1987, Nucl. Acid. Res., 15, 9076, - transcription de l'ARN de Cu/ZnSOD: Sherman. L., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5465, - transcription de l'ARN de la glutathion peroxydase: Mullenbach. G.T., 1987, Nuc. Acid. Res., 15, 5484, - transcription de l'ARN de la catalase: Ponte.P., 1984, ibid, 12, 1687/Sukenaga.Y., 1987, ibid, 15,7178/Zeviani.M., 1987, Gene, 55,205. I. Résultats Détermination de l'activité immuno-redox de la SOD exogène sur des cellules stimulées U937 HIV-Tat - Expression de la SOD endogène: La protéine HIV-Tat est capable, à elle-seule, de réduire fortement l'expression de la protéine Mn-SOD, dans les cellules U937, sans changer celle de la Cu/Zn-SOD (Flores C.S., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, , 7632). Au contraire, HSD2 (SOD végétale modifiée ou non), seule, est capable de potentialiser l'expression de base mise en évidence dans les cellules U937 non stimulées. Le résultat le plus significatif est obtenu pour les cellules activées HIV-Tat, dans lesquelles l'expression Mn-SOD reste indétec- table après traitement avec la SOD humaine, alors qu'elle est rétablie après traitement avec HSD2, une forme hétérologue de SOD (figure 1). - Activité de la SOD endogène L'inhibition de l'expression de la Mn-SOD dans les cellules U937, induite par la protéine HIV-Tat, peut être levée par différentes SOD hétérologues: HSD1 (SOD bovine) ou HSD2 (SOD végétale), alors qu'elle n'est pas levée par la SOD homologue telle que la SOD humaine (HuSOD). Ceci suggère que l'inhibition de l'expression de la Mn-SOD des cellules U937, induite par la protéine HIV-Tat, peut être levée par une SOD exogène, uni- quement dans un contexte hétérologue, comme l'illustre la figure 2; la Mn- SOD exprimée dans ce contexte est active. - Activation endogène d'autres enzymes antioxydantes: La protéine HIV- Tat diminue la quantité totale de gluthation GSH, qui est un substrat dans la réduction des peroxydes, catalysée par la gluthation peroxydase (Gpx), dans les cellules HeLa ainsi que dans les cellules Jurkat (Westerndorp M.O., 1995, EMBO J.; 14, 546). Alors que la protéine HIV-Tat ne diminue pas la transcription de Gpx dans les cellules U937, la SOD végétale (HSD2) est capable de stimu- i1 ler sa transcription, alors que HuSOD ne le permet pas, comme l'illustre la figure 3. La même apparition d'une potentialisation par la SOD hétéro- logue du taux de transcription de la catalase endogène peut être observée dans des cellules non traitées autant que dans des cellules traitées par la protéine HIV-Tat, comme l'illustre la figure 4. Ces résultats montrent que lors d'un stress oxydatif tel que celui observé dans la lignée cellulaire promonocytaire U937 pendant une simulation d'infection par l'-HIV, obtenue avec la protéine HIV-Tat, les défenses antioxydantes globales et notamment la levée de l'inhibition de la Mn-SOD endogène, peuvent être restaurées par un traitement avec une SOD hétérologue, de préférence modifiée, de manière à ne conserver que son acti- vité immuno-redox, alors qu'elles sont peu modifiées par un traitement avec la SOD homologue. EXEMPLE 2: Mise en évidence de la perte de l'activité dismutasique d'une SOD modifiée (SOD nitrée). I. Matériel et méthode - mesure de l'activité glutathion peroxydase: voir exemple 1. - mesure de la Mn-SOD: voir exemple 1. - cellules cibles: cellules lymphoïdes circulantes ou CLC, cul- tivées dans les mêmes conditions que celles exposées à l'exemple 1 pour les cellules U937. - préparation de la SOD nitrée: elle est préparé conformé- ment à la méthode décrite dans l'Article au nom de L.A. MacMillan-Crow, 2s paru dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93,11853-11858. II. Résultats La figure 5 montre que les SODs nitrées ont perdu l'activité dismutasique; en effet, l'administration de SOD à activité essentiellement immuno-redox n'a pas d'action sur la production d'anions superoxydes induite par un ester de phorbol (PMA) dans des cellules lymphoïdes circu- lantes ou CLC, alors que l'on observe une stimulation de la glutathion peroxydase et de la Mn-SOD endogène (figure 6 et figure 7), dans ces mêmes cellules cibles. EXEMPLE 3: Effets des SOD sur une dégénérescence cellulaire d'origine iatrogène; cas des antiviraux. I. Matériel et méthodes - Réactifs * Des cellules U937, chroniquement infectées par le VIH-1 (cellules U1), ayant un taux de production de p24 faible ( RPMI complémenté avec de la L-glutamine, de la pénicilline, de la strepto- mycine et du sérum de veau foetal à 10 % (produits Gibco). Elles sont utilisées pour la production de p24 et pour évaluer l'apoptose. Le milieu de culture, les produits chimiques et le sérum de veau foetal sont testés pour leur absence d'effet direct sur ces cellules U1 (expression de TNF-ca et de p24, comme marqueurs d'activation). Les cultures sont également complémentées avec: TSST-1 (exotoxine de staphylocoque) (Sigma, Paris, France), de la SOD humaine Cu/Zn (HuSOD), de la SOD bovine (HSD1) (Sigma, St Louis, MO) ou de la SOD de melon Cu/Zn (HSD2), fournie par la Société BIO- EXTRACTION (Bron, France). Ces cellules U1 sont stimulées avec du TSST-1 (10 pgg/ml), de la ZINOVUDINE (AZT) (Welcome) (1 à 10 gg/ml), du SAQUINAVIR (Roche) ou du RITONAVIR (Abbott) (10 gg/ml), pendant 48 heures. Dans les expériences de contrôle, les produits anti-rétroviraux sont testés seuls. Quelques cultures sont également complémentées avec HuSOD, HSD1 ou HSD2, à une concentration finale de 30 U /ml. Une analyse préliminaire utilisant différentes concentrations de ces réactifs, a permis de définir ces doses optimales. Après I à 3 jours d'incubation, les surnageants de cellules sont récupérés et les taux de p24, de nitrites et de TNF-a sont déterminés. Les cellules viables sont comptées par exclusion au bleu trypan. * Les protéines HIV-p24 (Institut Pasteur)et TNF-cc (Genzyme) sont mesurées par ELISA, selon les recommandation du fabricant. * NO et NO2- sont mesurés par la réaction de Greiss. II. Tests - Cultures de CLC pour l'évaluation de TSST-1 et de HSD Isolement et culture de cellules mononucléées humaines du sang périphérique (CLC), qui sont utilisées pour évaluer la production de nitrites, de TNF-a et l'apoptose. Les CLC sont isolées à partir de 10 sujets, par centrifugation à 900 rpm pendant 10 min., pour éliminer la majorité des plaquettes contami- nantes. Les échantillons sanguins sont ensuite dilués dans un milieu RPMI 1640 (Bioproduct) et les CLC sont récupérées après une centrifugation de 20 min à 2 000 rpm sur un gradient Ficoll-Hypaque (Pharmacia). Ces donneurs ne présentent aucune infection (hépatite ou SIDA), ni cirrhose; certains des donneurs présentent des rhinites ou un état asthmatique mais ont été testés en dehors des périodes de pollinisation et en l'absence de tout traitement. Les CLC sont cultivées à une concentration cellulaire finale de 2.106 cellules/ml dans des plaques de culture en plastique comprenant 12 ou 24 puits (Nunc) et dans un milieu Iscove complémenté avec 100 U/ml de pénicilline, 100 gg/ml de streptomycine, 1,8 pg/ml d'éthanolamine, 40 Rg/ml de transferrine, 5 gg/nml d'insuline, 2 gg/ml d'acide linoléique, 2 gg/ml d'acide oléique, 2 gg/ml d'acide palmitique, 0,25 % de sérum albumine bovine et 5 % de sérum de veau foetal. Ce milieu de culture ne contient pas d'endotoxine (estimation avec un test au limulus). Les cellules sont incubées à 37 C en atmosphère humide (100 %) comprenant 95 % d'air et 5 % de CO2, pendant 2-6 jours en présence ou en l'absence de TSST-1 (10 fM) et de HuSOD, HSD1 ou HSD2 (30 U/ml). Des expériences similaires sont effectuées pour évaluer l'effet toxicologique potentiel de l'AZT, du SAQUINAVIR ou du RITONAVIR (10 gg/ml) et l'effet protecteur des SOD (HuSOD, HSD1 et HSD2 à 30 U/ml). - Dosage des nitrites (NO2-). Pour évaluer la quantité d'oxyde nitrique produite (NO ), on dose, dans les surnageants de culture, les nitrites (NO2-), un produit final stable obtenu à partir de l'oxyde nitrique, par la réaction de Griess. 100 gl de surnageant sont ajoutés dans des plaques de microtitration comportant 96 puits, ainsi que 100 gl d'une solution réactive composée de sulfinamide à 1 % dans de l'acide acétique à 30 % et de dihydrochlorure de N-1-naphtyl- éthylènediamine à 0,1% dans de l'acide acétique à 60 %. La courbe standard est effectuée avec du NaNO2 dilué dans du milieu Iscove. Les densités optiques (OD) sont mesurées à 540 nm (lecteur Dynatech laboratories Inc., Alexandria, VA). - Mesure de l'apoptose Les cellules U1 ou les cellules CLC en apoptose précoce sont estimées par une détection cellulaire par fluorescence (FACS ou fluorescence- activated cell sorting) de la phosphatidylsérine en présence d'annexine V marquée au FITC, avec un marquage simultané ou non au iodure de propi- dium. La fragmentation d'ADN induite par l'apoptose est aussi estimée, avec le kit de détection de la fragmentation de l'ADN ApoALERT (Clontech, Palo Alto, CA). III. Résultats - les figures 8 et 9 illustrent l'effet toxique de l'AZT (figure 8 et figure 9), soit spontanément, soit après stimulation des CLC par des exo- toxines de staphylocoque telle que la TSST-1; la figure 10 illustre l'effet toxique de plusieurs antiviraux sur des CLC ainsi que l'effet des SODs nitrées; on observe, sur cette figure 10 l'effet des SODs nitrées sur la produc- tion d'oxyde nitrique (mesure des nitrites (uM)), la production de cytokine pro-inflammatoire (mesure de TNF (ng/ml) et l'évaluation de la mort cellu- laire (% de cellules en apoptose) sur des cellules non-infectées (CLC) sous s traitement (monothérapie, bithérapie et trithérapie). - Le Tableau I ci-après illustre l'effet de l'AZT sur la réplica- tion virale du VIH-1 et sur le statut pro-inflammatoire des cellules chroni- quement infectées (U1). Tableau I AZT Superoxyde (+PMA) Oxyde nitrique TNF Antigène p24 (gg/ml) Témoin +TSST- Témoin +TSST-1 Témoin +TSST-1 Témoin + TSST-1 0 1,1* 2,5* 0,5 5,5 0,01 1,5 3,3 0,8 6,1 0,1 2,3 3,5 0,9 7,0 1 2,5 4,2 0,9 12,2 55 401 312 809 2,9 5,1 0,9 15,3 95 805 100 312 * Les témoins sans PMA sont 0,3 sans TSST-1 et 0,5 avec TSST-1 oxyde nitrique: les résultats sont exprimés en gM de nitrites TNF: les résultats sont exprimés en pg/ml antigène p24: les résultats sont exprimés en pg/ml. Les résultats sont calculés à partir d'une série d'expériences représentatives parmi 5 différentes et sont la moyenne de quadruplicats, l'écart à la moyenne n'excèdent pas 10 %. - Le Tableau II et la figure 11 illustrent l'effet de l'AZT sur l'apoptose spontanée ou induite par TSST-1 des cellules U1 chroniquement infectées par le VIH-1. Tableau II AZT (pig/rml) % de cellule en apoptose Témoin +TSST-1 0 7 + 2 24 3 0,01 9+ 1 27 +1 0,1 17 + 4 42 3 1 25+5 61 +2 29 + 4 90 4 Les résultats exprimés en % de cellules en apoptose (Kit Apoptag) représentent la moyenne + SEM de quatre expériences différentes. * * effet des SODs non-nitrées et nitrées sur le statut inflamma- toire des cellules infectées par le HIV-1, traitées ou non par un antiviral. Le Tableau Ill illustre l'effet de la HuSOD, de la HSD1 et de la HSD2 sur la réplication virale et la mort cellulaire programmée des cellules UI chroniquement infectées par le VIH-1 (en présence ou en l'absence d'antiviraux). Tableau III Stimulation p24 (pg/ml) % d'apoptose A: sans agent anti-rétroviral Témoin 950 + 25 15 2 HuSOD 700 12 10 + 1 HSD1 550 + 32 8 1 HSD2 480 23 6 + 2 TSST-1 1756 + 75 89 5 TSST-1 + HuSOD 1290 45 75 + 2 TSST-1 + HSD1 900 56 30 + 4 TSST-1 + HSD2 923 78 34 + 7 B: en présence d'AZT Témoin 233 12 45 2 HuSOD 200 27 35 + 1 HSD1 125 + 32 18 1 HSD2 130 + 26 11 2 TSST-1 1056 + 45 98 1 TSST-1 + HuSOD 890 + 21 70 + 2 TSST-1 + HSD1 300 + 76 17 + 4 TSST-1 + HSD2 223 78 15 7 C: en présence de Saquinavir Témoin 763 45 15 + 2 HuSOD 301 + 12 13 + 1 HSD1 223 33 9 + 1 HSD2 170 21 10 + 2 TSST-1 925 54 75 + 5 TSST-1 + HuSOD 700 29 65 + 2 TSST-1 + HSD1 313 + 24 24 + 5 TSST-1 + HSD2 208 21 19 + 7 Tableau III (suite) D: en présence de Ritonavir Témoin 843 + 56 15 2 HuSOD 658 + 12 10 1 HSD1 221 + 11 4 + 1 HSD2 172 + 19 6 + 2 TSST-1 1025 62 70 + 3 TSST-1 + HuSOD 810 + 13 59 + 4 TSST-1 + HSD1 203 + 12 34 _ 2 TSST-1 + HSD2 228 + 11 22 + 3 E: AZT + Saquinavir + Ritonavir Témoin 203 + 13 45 +2 HuSOD 150 + 10 30 3 HSD1 70 + 12 10 + 1 HSD2 82 + 14 10 + 2 TSST-1 275 + 24 85 + 3 TSST-1 + HuSOD 200 + 21 62 + 3 TSST-1 + HSD1 88 +10 10 + 2 TSST-1 + HSD2 87 + 11 5 + 1 Le Tableau IV illustre l'effet de la HuSOD, de la HSD1 et de la HSD2 sur le statut inflammatoire des cellules U1 chroniquement infectées par le VIH-1 Tableau IV Nitrites (gM) TNF (pg/ml) Témoin +TSST-1 Témoin +TSST-1 Traitement: Témoin 1 s0,5 12 3 1:AZT 5 + 0,2 33 +4 175 +23 2934 + 76 2: Saquinavir 1 + 0,2 11 + 2 1+2 -- 1 + 0,2 13 +4 1 + 3 1 + 0,1 14 + 2 1 + 2 + 3 7 + 0,4 29 +3 178 + 21 2765 + 34 4: HuSOD 1 0,2 9 +2 1 + 4 4 _+ 0,3 20 + 4 154 22 975 + 44 1+2+ 3 + 4 6+0,2 24 _5 109 + 17 999 + 65 :HSD1 1 _ 0,2 3 1 1+5 2 + 0,3 9 1 55 _ 10 175 + 22 1 + 2 + 3 + 5 1 + 0,4 5 +1 23 + 2 108 + 11 6:HSD2 1 +0,1 4 +2 1+6 1 +0,2 ll +4 33 + 2 200 + 14 1 + 2 + 3 + 6 1 +0,3 6 +1 25+ 4 109 + 19 Les Tableaux III et IV montrent que sous l'action de la TSST-1 seule ou en présence d'agents anti-rétroviraux, on note une forte augmenta- tion de la réplication virale et de l'apoptose, alors que les HSDs réduisent significativement ces effets; par contre, la HuSOD n'a pas ou peu d'effets. Ces résultats démontrent que les HSDs renforcent les effets des anti-rétroviraux tout en inhibant leurs effets toxiques. EXEMPLE 4: Effets des SODs sur une pathologie dégénérative; cas de la maladie d'Alzheimer et de la maladie de Parkinson. I. Matériel et méthodes - culture pour l'évaluation des effets des protéines - amyloides et MPTP * Isolement des macrophages humains. Les CLC sont isolées à partir de 23 sujets sains; dans les mêmes conditions que celles exposées ci-dessus. Les populations de cellules adhérentes sont obtenues par incubation des CLC (1.107 cellules/ml) soit des boîtes de Pétri (Nunc) soit dans des plaques de culture à 6 puits (Nunc) pendant 30 min à 37 C dans un milieu RPMLI 1640 complémenté avec sérum de veau foetal à 10 % (v/v). Les monocytes sont alors récupérés par grattage des plaques après addition d'une solution de PBS froide contenant 1 mM d'EDTA. Les préparations cellulaires comportant plus de 85 % de macro- phages viables sont estimées par exclusion au bleu Trypan et coloration avec une estérase non spécifique. * Culture des macrophages. Les macrophages sont cultivés à une concentration finale de 2.106 cellules/ml dans des plaques de culture en plastique comportant 12 ou 24 puits (Nunc) et dans un milieu Iscove complémenté avec 100 U/ml de pénicilline, 100 pgg/ml de streptomycine et 5% de sérum de veau foetal. Ce milieu de culture ne contient pas d'endotoxine. Les cellules sont incubées pendant 48 heures à 37 C en atmosphère humide (100 %) contenant 95 % d'air et 5% de CO2, en présence ou en l'absence de gg/ml de 03-amyloïde ou de MPTP. Les surnageants cellulaires sont récupérés pour la mesure du TNF et des nitrites, alors que l'apoptose est évaluée directement sur les cellules. II. Résultats Les figures 12 et 13 illustrent les résultat obtenus. Ces figures montrent que les protéines P-amyloide et le MPTP stimulent la production de TNF-a par les macrophages et induisent leur mort 0 par apoptose. Les HSDs, modifiées ou non, réduisent significativement ces effets, alors que la HuSOD (modifiée ou non) n'a pas ou peu d'effets. EXEMPLE 5: Effets des SODs sur une pathologie dégénérative; cas de la fibrose radio-induite. Le développement de la fibrose apparaît au cours de la plupart des hépatopathies chroniques d'origines variées: infectieuse ou virale (hépatite), parasitaire (bilharziose) ou toxique (alcool, héroïne). Le tissu fibreux, en se développant, déséquilibre l'unité fonc- tionnelle de l'organe et agit sur certaines populations cellulaires, principale- ment les cellules périsinusoidales, situées dans l'espace de Disse. La caractérisation des cellules effectrices des fibroses, la régu- lation des cytokines sur le dépôt matriciel, la standardisation des moyens sériques et tissulaires pour contrôler l'évolution de la maladie chez l'homme permettent d'établir des conduites thérapeutiques afin de limiter, réduire ou arrêter tout processus anormal de fibrogenèse. Parmi les maladies parasitaires étudiées, la schistosomiase est responsable d'une pathologie hépatique chronique conduisant à la formation d'un dépôt matriciel à l'origine d'une hypertension portale. Le modèle expérimental de la bilharziose hépatosplénique murine à Schistosoma mansoni permet de montrer l'action d'une SOD à activité immuno-redox. Après infestation des souris, la lésion initiale est une inflam- mation granulomateuse à médiation cellulaire qui se développe autour des oeufs localisés dans les radicules portaux induisant progressivement une fibrose périovulaire, puis lobulaire, suite à l'activation des cellules hépatiques étoilées (lipocytes), dans l'espace de Disse. La fibrose évoluant selon un processus dynamique, peut régresser à la suite de certains traitement antifibrosants: cytokines (interféron ae, 3 et/ou y), corticostéroïdes ou antioxydants (SOD). L'activité antifibrosante des SOD a déjà été décrite (Demande Internationale PCT WO 96/16670 et Delanian et al., 1992 et LEFAIX et al., 1996); toutefois, il existe toujours le risque d'une action proinflammatoire, alors que les SOD selon la présente invention permettent d'éviter un tel risque. I. Matériel et méthodes * Animaux: 90 souris IOPS OF1 femelles de 26/28 g (IFFA- CREDO, Les Oncins, L'Arbresle) * Infestation: chaque souris reçoit, par voie intrapéritonéale, cercaires de la souche Puerto Rico de Schistosoma mansoni. Protocole 1: - 1. 5 souris contrôles, non infectées 2. 5 souris témoins infectées 3. 25 souris infestées et traitées simultanément pendant 8 semaines, à raison de 3 injections IM/semaine, conformément à la répartition suivante: - 5 souris placebos: NaC1 à 0,9 % - 10 souris: SOD bovine en I.M, 1 mg/kg, - 10 souris: SOD bovine en I.M., 2 mg/kg. Protocole 2: 1. 5 souris contrôles, non infectées 2. 5 souris témoins infectées 3. 45 souris infestées et traitées simultanément pendant 16 semaines, à raison de 3 injections IM/semaine ou 3 gavages/semaine, conformément à la répartition suivante: - 5 souris placebo: NaCI à 0,9 %, - 10 souris: SOD bovine en I.M., 1 mg/kg, - 10 souris: SOD bovine en I. M., 2 mg/kg, - 10 souris: SOD de melon en gavage, 2mg/kg, -10 souris: SOD de melon en gavage, 4 mg/kg. * Prélèvements: sérum: congélation à -20 C, pour l'étude éventuelle des marqueurs sériques 15. foie: un fragment est fixé dans l'AFA (Alcool, Formol, Acide acétique) pour l'étude histologique et morphométrique et un autre fragment est congelé pour les dosages biochimiques. II. Résultats - analyse macroscopique du foie: aspect, répartition des granulomes - analyse qualitative histologique: étude descriptive des lésions et évaluation semi-quantitative de l'inflammation et de la fibrose, sur coupe -histologique de 5 mm, colorées respectivement par l'hémalun- phloxine-safran (figure 14) et le rouge de Picrosirius (figure 15), analyse quantitative des dépôts fibreux dans leur ensemble par dosage colorimétrique, basé sur les affinités tinctoriales du rouge Sirius pour le collagène et du fast green pour les protéines; les résultats sont expri- més en pg de collagène/mg de protéines. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.5 REVENDICATIONS 1 ) Utilisation d'une SOD hétérologue végétale à activité essentiellement immuno-redox, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies dans lesquelles on observe une dégénérescence cellulaire et organique. 2 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite SOD est nitrée. 3 ) Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ladite SOD est notamment issue du melon. 4 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies dégénératives sélectionnées dans le groupe constitué par les maladies neuro- dégénératives, la cirrhose, les infections à lentivirus, les infections parasitaires et les maladies iatrogènes. 5 ) Procédé de sélection d'une SOD végétale à activité essen- tiellement immuno-redox, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) la mesure de l'activité dismutasique d'une SOD, éventuel- lement modifiée, (b) la sélection des SOD sans activité dismutasique ou ayant une activité dismutasique réduite d'au moins un facteur 10, et (c) la mesure de l'activité immuno-redox des SODs sélection- nées en (b) sur un système cellulaire dans lequel l'expression de SOD endo- gène est inhibée. 6 ) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'étape (a) de mesure de l'activité dismutasique est réalisée par réduction du ferricytochrome c. 7 ) Procédé selon la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisé en ce que le système selon l'étape (c) est constitué par des cellules exprimant la protéine tat d'HIV-1. ) Utilisation d'une SOD hétérologue végétale pour la prépa- ration d'un médicament à activité essentiellement immuno-redox, destiné à la détoxification médicamenteuse.