FR 2777015 A1 19991008 FR 9802145 A 19980223 La présente invention se rapporte aux domaines techniques de la biotechnologie, de la médecine, de la biologie et de la biochimie. Ses applications concernent les domaines de la santé humaine et de la santé animale. L'invention concerne plus particulièrement des procédés pour l'obtention de modèles cellulaires et animaux -de maladies neurodégénératives, et les moyens (tels que acides nucléiques ou vecteurs) utilisables pour la mise en oeuvre de ces procédés. Les maladies neurodégénératives représentent un problème majeur et croissant de santé publique, lié principalement à l'allongement de la durée moyenne de vie dans les pays industrialisés. Ainsi, la démence Alzheimer et la maladie de io Parkinson ont un réel impact économique non seulement dû à leurs issues fatales mais également aux prises en charge longues et contraignantes qu'elles imposent. Même si la description des symptômes cliniques et l'identification de quelques gènes de susceptibilité ont permis de faire des pas significatifs dans la connaissance de ces pathologies, les bases moléculaires soutenant le développement de ces maladies sont toujours très obscures. L'élucidation des cascades de signalisation, dérégulées dans ces états pathologiques, conduira vraisemblablement à la découverte de cibles propices à une intervention thérapeutique. Ces maladies neurodégénératives sont très certainement caractérisées pour partie par une mauvaise balance entre facteurs de survie et facteurs inducteurs de mort cellulaire. A cet égard, la littérature est riche d'exemples soulignant l'importance de l'épissage alternatif dans la génération de protéines jouant des rôles antagonistes sur ces processus (famille Bc12, caspases, Grb2, etc). L'innovation dans ces domaines aura un impact énorme puisqu'il n'existe à ce jour aucun traitement efficace de qualité. La nature des maladies neurodégénératives rend difficile leur étude notamment puisque l'analyse de l'expression génétique dans les tissus malades et dans des contrôles sains est quasi-impossible du fait de la difficulté d'obtenir des biopsies en quantité et en qualité suffisantes. Il est donc évident que l'obtention de modèles animaux et cellulaires représente un progrès décisif dans la 2 2777015 compréhension de la physiopathologie de ces désordres du système nerveux. Ces modèles permettront: - d'identifier de nouveaux ADNc impliqués dans les différents stades de développement des maladies neurodégénératives de tester l'impact de ces ADNc ou de toute construction dérivée de ces ADNc sur le modèle, animal ou cellulaire, de départ. Aucun modèle animal ne peut néanmoins envisager de refléter l'intégralité d'une pathologie humaine. Il existe donc un réel intérêt à disposer de plusieurs modèles pour une même maladie, ce qui permet de multiplier les gènes d'intérêt io identifiables avant de les évaluer dans une situation physiopathologique humaine complexe. Des modèles murins ont été établis pour différentes pathologies neurodégénératives: - par transgenèse pour la maladie d'Alzheimer (Johnson-Wood et al,1997, PNAS, 94, pp1550-1555), la sclérose amyotrophique latérale (SLA)(Gurney et al, 1997, J.Neurol, 244, S15-S20), la chorée de Huntington(Davies et ai, 1997, Cell, 90, p537) ainsi que les maladies à prions(Moore,R.C. and Melton,D.W., 1997, Mol.Hum.Reprod., 3, pp 529-544). -par recombinaison homologue pour les maladies de Tay-Sachs et de Sandhoff(Sango, K. et al, 1996, Nat.Genet.,14, pp348-352.). -par l'obtention de souris mutantes pour des voies métaboliques dans le cas de modèle de lipofuscinose céroiïde infantile(Vance et al, Biochim.Biophys.Acta, 1997,1344, pp286-299.). Ces modèles reproduisent plus ou moins correctement les atteintes comportementales et histologiques caractéristiques des pathologies. De plus, ces modèles visent à reproduire des désordres initiés par des mutations dominantes calquées sur celles observées chez des patients mais ne sont pas informatifs des cas sporadiques qui ne sont associés à aucune mutation des gènes de susceptibilité identifiés et qui n'ont pas de composante familiale. 3 2777015 La présente demande permet de remédier aux inconvénients de l'art antérieur. La présente invention décrit en effet de nouveaux procédés et moyens pour l'obtention de modèles cellulaires et animaux de maladies neurodégénératives. La présente invention résulte en partie de l'observation que les maladies neurodégénératives citées ci-dessus sont toutes associées à des accumulations anormales de protéines ou de peptides dans des compartiments cellulaires précis ou à des accumulations de protéoglycans dans des ultrastructures cellulaires pathologiques (corps de Lewy). io Dans le cas de la maladie d'Alzheimer, les peptides accumulés le sont sous forme agrégée. Il s'agit du peptide beta-amylolde 1-42 issu par clivage protéolytique de la protéine APP (Amyloïd Precursor Protein). Bien que ce peptide agrégé en plaque amyloïde est présent dans l'espace intercellulaire cérébral, sa production a lieu après clivage spécifique de l'APP dans le réticulum endoplasmique o des conditions propices a son agrégation sont présentes(Hartmann, T., et al, 1997, Nat.Med., pp1016-1020). Cette accumulation dans ce compartiment intracellulaire provoque vraisemblablement un stress du réticulum endoplasmique connu pour déclencher une augmentation de la concentration du calcium intracytoplasmique, facteur initiateur de cascades apoptotiques. La protéine prion (Prp) est présente dans une conformation anormale dans les tissus cérébraux atteints d'encéphalies spongiformes (BSE, Kuru, maladie de Creutzfeld- Jakob). Cette conformation est caractérisée par une résistance à la digestion par la protéinase K. Le compartiment endosomal a été décrit comme étant l'endroit o la conversion, puis l'agrégation, de la forme anormale de Prp se produit (Arnold,J.E.,1995, J.Pathol.,176,pp403-411). La chorée de Huntington est caractérisee par l'agrégation d'une forme modifiée d'une protéine cellulaire. Il s'agit de l'Huntingtin modifiée par des répétitions d'acides glutamiques de longueur variable à l'extrémité NH2-terminale de la protéine. Les agrégats sont détectés dans les neurites dystrophiques ainsi 4 2777015 que dans des inclusions nucléaires, ces deux localisations reflétant un transport rétrograde de l'huntingtin, lié à sa fonction encore non élucidée (DiFiglia,M., et al, 1997, Science, 277, pp1990-1993.). Ces trois exemples illustrent les phénomènes d'accumulation de protéines ou peptides dans des compartiments cellulaires, dans le développement de ces pathologies. Le but de la présente invention est précisément de fournir des modèles capables de reproduire les dérégulations cellulaires liées à l'agrégation de protéines. Ces modèles peuvent être des modèles animaux obtenus par transgenèse ou des modèles cellulaires. Ces modèles cellulaires peuvent être o obtenus par transfection et être dérivés aussi bien de cellules neuronales que d'autres types cellulaires tels des fibroblastes. Un premier aspect de l'invention concerne plus particulièrement des acides nucléiques recombinants codant pour des protéines ou peptides impliqués dans des pathologies neurodégénératives, modifiés pour permettre l'adressage desdits i5 protéines ou peptides dans un compartiment cellulaire donné. Un aspect plus particulier de l'invention concerne des acides nucléiques recombinants codant pour des protéines ou peptides impliqués dans des pathologies neurodégénératives, modifiés pour permettre l'adressage desdits protéines ou peptides dans un compartiment cellulaire donné, dans le but d'entraîner leur agrégation ou des changements conformationnels. Un autre aspect de l'invention concerne les produits d'expression des acides nucléiques recombinants ci-dessus, ainsi que tout vecteur comprenant un tel acide nucléique recombinant. L'invention concerne également toute cellule comprenant un acide nucléique recombinant ou un vecteur tels que définis ci-avant. Avantageusement, il s'agit d'une cellule capable d'exprimer ledit acide nucléique recombinant de manière à produire la protéine ou le peptide dans un compartiment cellulaire donné. L'invention concerne encore tout animal (non-humain) possédant un ou plusieurs acides nucléiques recombinants ou vecteurs définis ci-dessus dans 2777015 certaines ou toutes ses cellules. L'invention concerne enfin l'utilisation de ces cellules ou animaux pour l'identification de molécules susceptibles d'interférer avec le développement des pathologies neurodégénératives. Les possibilités d'obtenir des modèles par adressage de protéines ou de peptides dans des compartiments cellulaires précis peuvent être illustrées par exemple pour les pathologies d'Alzheimer, de Creutzfeld- Jakob et d'Huntington Ainsi, un acide nucléique recombinant particulier selon l'invention est io représenté par toute modification de I'ADNc codant pour le peptide amylogénique betal-42 dans le but d'adresser ce peptide dans un compartiment cellulaire donné dans le but d'y provoquer son agrégation. Plus particulièrement, cette modification peut être, d'une part l'ajout en amont de la séquence codant pour le peptide beta1- 42 d'une séquence d'acides nucléiques correspondant à une séquence de sécrétion is permettant la sécrétion dans le réticulum endoplasmique et codant pour une succession d'acides aminés hydrophobes (séquences bien connues de l'homme de l'art) et d'autre part l'addition en aval de l'enchainement des acides aminés KDEL, spécifiant ainsi la rétention dans le réticulum endoplasmique (Griffiths, G., et al., 1994, J. Cell Biol., 127, pp1557-1574.) de la forme agrégante du peptide amyloïde. Un autre acide nucléique recombinant particulier selon l'invention est représenté par toute modification de l'ADNc de la protéine prion dans le but d'adresser cette protéine dans un compartiment cellulaire donné dans le but d'y provoquer sa conformation pathologique. Plus particulièrement, cette modification peut être l'adjonction en aval de la séquence codant pour la protéine Prp de la séquence d'ADNc codant pour la région cytoplasmique du récepteur cation- dépendant au mannose-6-phosphate (Rohrer, J. et ai, 1995, J. Cell. Biol., 130, 1297-1306). Cette modification doit permettre la localisation de la protéine Prp ainsi modifiée dans les endosomes afin d'y favoriser sa transconformation pathologique. Un autre acide nucléique recombinant particulier selon l'invention est encore 6 2777015 représenté par toute modification de l'ADNc de la protéine Huntingtin dans le but d'adresser cette protéine dans un compartiment cellulaire donné dans le but d'y provoquer son agrégation. Précisément, cette modification se fait sur l'ADNc de l'Huntingtin additionné en 5' d'une séquence codant pour une répétition de 115 à 156 acides glutamiques qui confèrent des propriétés agrégantes à cette protéine (Davies et al, 1997, Cell, 90, p537). Plus particulièrement, cette modification peut se faire par insertion dans cette protéine d'une séquence de localisation nucléaire dont l'archétype est représenté par l'enchaînement des acides aminés PKKKRKV (Efthymiadis, A., et al, 1997, 272, pp 22134-22139). Avantageusement, cette io séquence de localisation nucléaire peut être additionnée à l'extrémité C-terminale de l'Huntingtin, n'interférant ainsi pas avec les répétitions d'acides glutamiques à l'origine des propriétés agrégantes et qui sont situés à l'extrémité NH2- terminale de cette protéine. Les acides nucléiques recombinants de l'invention peuvent être des ADN s5 (complémentaires, génomiques, synthétiques, semi-synthétiques, etc) ou des ARN. En outre, ces acides nucléiques peuvent comporter des signaux de transcription (promoteur, terminateurs, etc). Les acides nucléiques recombinants de l'invention peuvent être insérés dans toute construction de vecteurs viraux (rétrovirus, adénovirus, AAV, herpes virus) et non viraux permettant l'expression dans des cellules de l'une des protéines ou peptides modifiés décrits ci-dessus. Avantageusement, il peut s'agir d'un vecteur adénoviral qui permet l'infection de cellules non prolifératives telles des cultures primaires de neurones. Un autre vecteur particulier selon l'invention est une construction de vecteurs permettant l'obtention d'animaux transgéniques exprimant dans leurs neurones l'une des protéines modifiées telles que décrites ciavant. L'invention vise également l'établissement de clones cellulaires exprimant de façon constitutive ou inductible l'une des protéines modifiées telles que décrites ci- avant. Avantageusement, ces clones peuvent être dérivés de cellules présentant certaines caractéristiques de différenciation neuronale telles les cellules PC12. 7 2777015 L'invention vise aussi les animaux décrits ci-avant et toute utilisation de tels animaux transgéniques à des fins de mise en culture primaire de neurones exprimant l'une des protéines modifiées telles que décrites ci-avant. L'invention vise aussi toute utilisation de l'une des protéines modifiées telles que décrites ci-avant et exprimée dans des modèles acellulaires, cellulaires ou animaux à des fins de criblage ou d'identification de composés ou compositions, notamment chimiques, ayant la propriété d'inhiber les agrégations des protéines en question. L'invention vise encore toute utilisation de l'une des protéines modifiées io telles que décrites ci-avant et exprimées dans des modèles cellulaires ou animaux dans le but de cribler ou d'identifier des composés ou compositions, notamment chimiques, pour leurs capacités a inhiber l'apoptose induite par l'agrégation des protéines mentionnées. L'invention concerne également les procédés de criblage ou d'identification de composés ayant la propriété d'inhiber les agrégations des protéines impliquées dans des pathologies neurodégénératives ou la capacité à inhiber l'apoptose induite par l'agrégation de telles protéines. Ces procédés comprennent notamment la mise en présence d'une cellule ou d'un animal tels que définis ci-dessus avec un composé ou composition test et la mise en évidence de l'effet sur l'agrégation ou I'apoptose. La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. 1. Exemple de modèle de stress cellulaire induit par accumulation de peptide amyloide dans le réticulum endoplasmique Les adjonctions au peptide amyloïde beta 1-42 de la séquence de sécrétion et de la séquence de rétention dans le réticulum endoplasmique, c'est à dire l'enchainement des acides aminés KDEL est réalisée selon des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme de l'art. Le but de cette construction étant d'exprimer des protéines ayant la propriété 8 2777015 de s'agréger et conséquemment d'induire l'apoptose des cellules, il est choisi avantageusement d'introduire la séquence d'ADNc codant pour le peptide amyloïde modifié dans un vecteur d'expression inductible. Avantageusement le vecteur inductible est choisi pour assurer une stricte répression du transgène dans des conditions non induites, en particulier en présence de tétracycline et pour permettre une forte induction lors du retrait de cet antibiotique. Le but de ce modèle étant d'identifier des stratégies ou des compositions chimiques afin d'inhiber l'agrégation du peptide beta- amyloïde ou d'améliorer la viabilité cellulaire, le choix du modèle cellulaire dans lequel établir un système io d'expression inductible du transgène choisi s'est porté sur la lignée d'origine humaine HeLa. Cette lignée, non neuronale, possède une bonne efficacité de transfection et une absence de niveau basal d'expression en présence de tétracycline. La lignée Hela exprimant de façon constitutive le répresseur tet est obtenue i commercialement (Clontech). Le vecteur contenant l'ADNc codant pour le peptide beta amyloïde 1-42 modifié selon les revendications ci-dessus est introduit par transfection selon les techniques connues de l'homme de l'art. La sélection des clones Hela ayant intégré cette construction génétique se fait grâce à la cotransfection d'un deuxième plasmide permettant la résistance à un agent de sélection. Avantageusement l'agent choisi est l'hygromycine. La sélection des clones HeLa résistants à l'hygromycine se poursuit par la caractérisation de l'expression du peptide modifié lors de l'induction de l'expression par retrait de la tétracycline. Typiquement, les 5 clones permettant la plus forte expression sont sélectionnés pour étude ultérieure. Parmi ces cinq, le clone 15.09 qui présente la meilleure viabilité en présence de tétracycline et qui présente la plus forte apoptose en l'absence de cet antibiotique (mise en évidence par dégradation de l'ADN génomique) est ensuite 9 2777015 caractérisé sur le plan morphologique. Les techniques de biologie cellulaire et d'immunohistochimie révèlent une accumulation du peptide modifié dans le réticulum endoplasmique, et ce spécifiquement en l'absence de tétracycline. De plus, un élargissement tout a fait significatif de cette organelle est visible dans les heures qui suivent la dérépression de l'expression du peptide modifié. Outre les motifs de dégradation de l'ADN génomique qui sont révélés par électrophorèse, I'apoptose induite dans les cellules HeLa est corrélée avec une activation élevée des kinases de stress JNK1 et JNK2. Aucun de ces marqueurs apoptotiques n'est observé dans des clones exprimant le peptide beta amyloïde fusionné à la séquence non plus KDEL mais ELKD utilisée comme contrôle ni dans la lignée HeLa de départ. De même, lorsqu'un peptide de 42 acides aminés correspondant aux même acides aminés que le peptide beta amyloïde mais dans un ordre différent est fusionné à la séquence KDEL, aucune altération des ultrastructures cellulaires, aucune modification de l'ADN génomique ni aucune activation constitutive des kinases de stress n'est observée. Ces résultats documentent l'obtention d'un modèle d'apoptose par rétention dans le réticulum endoplasmique du peptide agrégant le plus relevant de la pathologie d'Alzheimer. Les applications de ce modèle sont les suivantes: - Utilisation d'un modèle cellulaire basé sur la stratégie exposée ci-dessus dans le but d'identifier des composés chimiques capables d'inhiber l'agrégation du peptide beta-amyloïde. - Utilisation d'un modèle cellulaire basé sur la stratégie exposée ci- dessus dans le but d'identifier des composés chimiques capables d'inhiber l'apoptose induite par agrégation du peptide beta-amyloïde. REVENDICATIONS 1. Acide nucléique recombinant codant pour une protéine ou un peptide impliqués dans une pathologie neurodégénérative, modifié pour permettre l'adressage dudit protéine ou peptide dans un compartiment cellulaire donné. 2. Protéine ou peptide résultant de l'expression d'un acide nucléique recombinant selon la revendication 1. 3. Vecteur comprenant un acide nucléique recombinant selon la revendication 1. 4. Cellule comprenant un acide nucléique recombinant selon la revendication 1 ou un vecteur selon la revendication 3. 5. Animal (non-humain) possédant un ou plusieurs acides nucléiques recombinants selon la revendication 1 ou vecteurs selon la revendication 3 dans certaines ou toutes ses cellules. 6. Utilisation d'une cellule ou d'un animal selon les revendications 4 ou 5 pour l'identification de molécules susceptibles d'interférer avec le développement des pathologies neurodégénératives. 7. Utilisation d'une cellule ou d'un animal selon les revendications 4 ou 5 pour le criblage ou l'identification de composés ou compositions ayant la propriété d'inhiber les agrégations des protéines ou peptides produits. 8. Utilisation d'une cellule ou d'un animal selon les revendications 4 ou 5 pour le criblage ou l'identification de composés ou compositions capables d'inhiber l'apoptose induite par l'agrégation des protéines ou peptides produits. 9. Utilisation selon la revendication 7 pour le criblage ou l'identification de composés ou compositions capables d'inhiber l'agrégation du peptide beta- amyloïde. 10. Utilisation selon la revendication 8 pour le criblage ou l'identification de composés ou compositions capables d'inhiber l'apoptose induite par agrégation du peptide beta-amylolde.