FR 2783527 A1 20000324 FR 9811859 A 19980923 1 2783527 Procédé et composition de solubilisation et de dégradation des graisses dans le traitement des eaux usées L'invention concerne un procédé et une composition de solubilisation et de dégradation des esters d'acides gras, notamment des glycérides, tels que les triglycérides, composant majoritairement les graisses (d'origine animale, végétale, humaine ou industrielle). Les résidus graisseux figurent parmi les problèmes les plus importants posés par les déchets ménagers. Les quantités importantes récupérées, leur insolubilité dans l'eau et leur faible biodégradabilité sont à l'origine des principales nuisances engendrées par ces résidus. En effet, l'insolubilité des graisses en milieu aqueux provoque l'encrassement des ouvrages d'assainissement de petite taille tels que les fosses septiques et fosses toutes eaux et de taille supérieure tels que les stations d'épuration industrielles et urbaines. Elles sont également à l'origine du colmatage des canalisations. Ces graisses insolubles dans l'eau et de faible densité, se solidifient à basse température (15 C à 20 C), sont peu biodégradables, et constituent une source importante de nuisances pour l'assainissement autonome et les stations d'épuration. Outre ces effets néfastes, les résidus graisseux présentent également l'inconvénient majeur de s'assembler en surface pour former un "gâteau lipidique" imperméable à l'air, ce qui inhibe l'oxygénation du milieu, nécessaire à l'activité épuratoire biologique existant naturellement dans les ouvrages d'assainissement. De plus, les graisses constituent un élément de pollution pour l'environnement lorsqu'elles ne sont pas 2 2783527 convenablement traitées et éliminées. Par ailleurs, les graisses sont à l'origine de nuisances comme les mauvaises odeurs. De nombreuses solutions existent pour l'élimination de ces graisses mais toutes ou la plupart comportent une étape préalable de récupération avant la réalisation du traitement. La solution la plus répandue est la mise en décharge. Cependant, la réglementation en vigueur relative à l'évacuation des déchets graisseux a récemment évolué. Dès juillet 2002, les déchets graisseux ne seront plus acceptés en décharge. Une autre filière de traitement des graisses est l'incinération. Cependant, cette technique n'est pas dépourvue d'inconvénient en raison des risques d'explosion. De plus, elle nécessite l'installation coûteuse d'une usine d'incinération. Si le caractère fermentescible des déchets graisseux permet d'envisager un traitement biologique, les graisses se caractérisent cependant par une très grande hétérogénéité au niveau de leur composition et des polluants divers qu'elles peuvent contenir. Aussi de par leur caractère hydrophobe, les graisses ont un pouvoir colmatant et asphyxiant des sols très important. De plus, la technique de compostage nécessite des surfaces d'épandage importantes ainsi qu'un entretien régulier. Enfin, les graisses peuvent subir un traitement biologique aérobie qui correspond à une dégradation des corps gras par voie biologique, dans un réacteur approprié de façon à les rendre solubles et assimilables par des micro-organismes. Concernant cette dernière filière de traitement des graisses, il existe deux façons de procéder: 3 2783527 - soit par action d'une biomasse adaptée à la biodégradation des graisses et issue d'une boue activée maintenue en aération prolongée. - soit par action de bioadditifs biologiques (enzymes, agents bactériens). C'est cette dernière filière de traitement appliquée aussi aux cas de l'assainissement autonome (fosses septiques, siphons, canalisations) qui a retenu notre choix. Si les graisses présentent une composition très complexe et très variée, la structure de base est identique. Ce sont des triesters de glycérol ou d'alcools divers et d'acides aliphatiques. Les esters du glycérol appelés triglycérides sont de loin les plus nombreux. Tous les mécanismes de dégradation chimique de ces triglycérides reposent essentiellement sur deux réactions qui sont l'hydrolyse et l'oxydation. Les agents bactériens sont capables de réaliser ces réactions en synergie avec des enzymes comme les lipases et les P oxydases. La réaction d'hydrolyse est l'étape limitante du processus de dégradation des graisses. Les enzymes sont pour la plupart hydrosolubles; en conséquence leur contact avec des substrats graisseux et donc hydrophobes n'est pas idéal pour favoriser une bonne réactivité. De plus, les enzymes sont des substrats relativement onéreux dans la mesure o leur purification est délicate avec des risques importants d'une perte de l'activité. Quoiqu'il en soit, tous les produits biotechnologiques actuels sont à base d'agents bactériens et de cocktails enzymatiques qui agissent dans la phase aqueuse mais qui n'ont qu'une faible activité vis à vis des graisses non hydrosolubles. En conséquence, face à l'insuffisance 4 2783527 d'efficacité constatée de ces systèmes existants, il reste la solution ultime, coûteuse et provisoire de la collecte de ce chapeau graisseux qui nuit au bon fonctionnement des ouvrages d'assainissement par des opérations de vidange. L'invention vise donc à pallier ces inconvénients et à proposer un procédé et une composition de solubilisation et de dégradation des acides gras tels que les glycérides des graisses. L'invention vise ainsi à procurer une dégradation des esters d'acides gras améliorée en terme de rendement et de cinétique. Dans tout le texte, on désigne par "lipase" toute enzyme de type hydrolase qui catalyse l'hydrolyse des liaisons esters des glycérides en libérant des acides gras. De même, on désigne par "amphiphile" tout composé renfermant dans sa molécule au moins un groupement hydrophobe. De même, on désigne par "micelle" de façon générale, tout agrégat organisé supramoléculaire orienté d'au moins un composé tensioactif. Les composés tensioactifs sont amphiphiles c'est-à-dire que leurs molécules présentent une partie hydrophile et une partie hydrophobe. En milieu aqueux, les micelles se forment par rassemblement des parties hydrophiles qui se jouxtent en au moins une couche et forment une interface de la micelle avec la phase aqueuse. De même, par "ester d'acides gras", on désigne tout composé dont la molécule comprend au moins une fonction ester et au moins une chaîne grasse ayant entre 2 et 30 atomes de carbone, saturée ou insaturée, aliphatique (ramifiée ou non), cyclique ou non, aromatique ou non. Ce terme englobe les monoesters, diesters, triesters comprenant une ou plusieurs 2783527 chaînes grasses, et en particulier les triglycérides. Ainsi un ester d'acide gras comprend au moins un groupement qui répond à la formule générale: R-O-CO-G o G est un résidu d'acide gras et R, un groupement issu d'un alcool R-OH. L'invention concerne donc un procédé de solubilisation et de dégradation des esters d'acides gras notamment des glycérides composant majoritairement les graisses- caractérisé en ce qu'on met en présence dans un milieu aqueux contenant les esters d'acides gras à traiter: - au moins une lipase qui va assurer l'étape d'hydrolyse des graisses et libérer des acides gras - au moins de l'urée et de l'uréase qui potentialisent l'action de la lipase par alcalinisation continue du milieu, ce qui favorise la formation de savons (tensioactifs) lesquels solubilisent les graisses par formation de micelles. - au moins des agents bactériens qui vont renforcer l'activité lipasique par excrétion de systèmes enzymatiques et réaliser l'étape de dégradation des acides gras en sous- unités hydrosolubles. Avantageusement et selon l'invention, on utilise au moins une lipase qui hydrolyse les esters d'acides gras en glycérol (hydrosoluble) et en acide gras. Comme toutes les enzymes, ce sont des macromolécules de protéine qui présentent une activité spécifique par action sur un substrat défini. Compte tenu de l'hétérogénéité des lipides, avantageusement et selon l'invention, un cocktail lipasique peut être employé afin d'adapter l'activité lipasique à une large gamme de substrats graisseux à dégrader. Avantageusement et selon l'invention, l'action enzymatique de type lipolytique développée par la (les) lipase(s) est complétée par l'action du couple formé par l'urée et l'uréase. La contribution de ce couple à l'invention réside dans le fait5 que l'uréase par son action sur l'urée va entraîner la libération progressive d'ammoniac. Et ceci va avoir 3 effets: - D'une part une augmentation du pH, ce qui va favoriser l'action des lipases. - D'autre part, une salification des acides gras qui auront été préalablement libérés dans le milieu en raison de l'hydrolyse des graisses par les lipases. - Enfin, les acides gras ainsi saponifiés ont des propriétés tensioactives. Ils participent donc à la formation de micelles et par voie de conséquence contribuent à la solubilisation des graisses qui n'auront pas encore été hydrolysées. Ces graisses ainsi solubilisées seront plus accessibles par les lipases et donc plus facilement dégradées. L'invention est donc caractérisée par un phénomène auto- entretenu de solubilisation et de dégradation des graisses, puisque l'action de la (les) lipase(s) est favorisée en milieu alcalin, celui-ci étant entretenu, en continu, par l'hydrolyse de l'urée par l'uréase. De plus, la libération d'ammoniac dans le milieu entraîne la salification des acides gras qui eux mêmes participent à la solubilisation des graisses et en conséquence optimisent l'action de la (les) lipase(s). Avantageusement et selon l'invention, on ajoute des agents bactériens, notamment des agents bactériens capables d'excréter dans le milieu aqueux différents systèmes enzymatiques dont les lipases. 7 2783527 Avantageusement et selon l'invention, on agite éventuellement la solution aqueuse avant de l'introduire dans le milieu à traiter. Avantageusement et selon l'invention, on dissous préalablement et éventuellement les enzymes (lipase(s) et uréase), (et urée) dans une solution aqueuse à 37 C, puis on introduit cette solution dans le milieu aqueux comprenant les esters d'acides gras. Avantageusement et selon l'invention, les agents bactériens utilisés se fixent dans le milieu sur un support à haute surface spécifique tel que la brique. Les différents composés peuvent être introduits dans le milieu aqueux simultanément par adjonction d'une composition selon l'invention. L'invention s'étend donc aussi à une composition de solubilisation et de dégradation des esters d'acides gras notamment des glycérides composant majoritairement les graisses-, en milieu aqueux, caractérisée en ce que l'on met en présence dans le milieu à traiter: - au moins une lipase qui va assurer l'étape d'hydrolyse des graisses et libérer des acides gras au moins de l'urée et de l'uréase qui potentialisent l'action de la lipase par alcalinisation du milieu, ce qui favorise la formation de savons (tensioactifs) lesquels solubilisent les graisses par formation de micelles. - au moins des agents bactériens qui vont renforcer l'activité lipasique par excrétion de systèmes enzymatiques et réaliser l'étape de dégradation des acides gras en sous- unités hydrosolubles. Avantageusement et selon l'invention, la composition comprend en outre des agents bactériens et notamment des 8 2783527 agents bactériens aptes à excréter des lipases dans le milieu aqueux. Dans un procédé selon l'invention, on introduit une composition selon l'invention dans un milieu aqueux contenant les esters d'acides gras - notamment les graisses- à dégrader. Il est à noter qu'une composition selon l'invention peut être utilisée comme additif introduit dans un milieu aqueux graisseux par exemple dans des fosses septiques, bacs à graisses. Une composition selon l'invention se présente avantageusement sous forme solide, que l'on peut introduire soit directement dans le milieu aqueux, soit après une étape préalable de solubilisation ou de présolubilisation. L'efficacité de l'innovation constituant l'invention est illustrée dans les exemples qui suivent à partir des compositions massiques suivantes: Composition A Urée: 88,11% Uréase: 0,99% Levure: 2,00% Brique: 8,90% Composition B Urée: 80,18% Uréase: 0,90% Levure: 1,80% Brique: 8, 11% Culture bactérienne: 9,01% Composition C Lipase: 100% 9 2783527 Composition D Lipase: 50% Culture bactérienne:50% Composition E Urée: 80,18% Uréase: 0,90% Levure: 1,80% Brique: 8,11% Lipase: 9,01% Composition F Urée: 73,55% Uréase: 0, 83% Levure: 1,65% Brique: 7,44% Lipase: 8,26% Culture bactérienne: 8,26% La mise en évidence de l'action lipolytique de ces différentes compositions est basée sur deux tests. * la détermination de la quantité de matières extractibles à l'hexane (analyse gravimétrique). * la détermination de la quantité d'acides gras présents en solution et qui correspond à l'efficience de la réaction d'hydrolyse: première étape (limitante) de la réaction de dégradation des graisses. Dans ces tests, le substrat choisi est l'huile d'olive qui est à la fois reconnue comme le meilleur inducteur de lipase et considérée comme le substrat idéal en raison de sa composition connue, constante et représentative des graisses recueillies lors du prétraitement réalisé dans les stations d'épuration. Plus précisément, l'huile d'olive employée est une huile d'olive vierge extra qui contient après hydrolyse 2783527 chimique, 81 % d'acide oléique, 10 % d'acide palmitique et 9 % d'acide linoléique. Tous les tests sont menés en laboratoire selon des procédures reconnues scientifiquement par des laboratoires comme étant adaptées au problème à traiter. Pour ce faire, on travaille dans des erlenmeyers, en aérobiose, à une température de 37 C (afin de se situer au maximum d'activité des enzymes) et sous agitation dans une étuve bactérienne. La durée de la réaction est de 5 jours. Dans tous les cas, le milieu réactionnel est enrichi en azote et phosphore avec une solution à 13 g/1 en hydrogénophosphate di-ammonium (NH4)2HP04 utilisé en tant que nutriments bactériens afin d'éviter des carences en Carbone, Azote et Phosphore.15 Le protocole d'essai expérimental est le suivant: Dans un erlenmeyer, la solution de (NH4)2HP04 à 13 g/1 est ajoutée à l'urée, l'uréase, la lipase, la levure, la brique, (la culture bactérienne). L'huile d'olive est alors rajoutée. Le mélange réactionnel est alors introduit dans l'étuve bactérienne et maintenu sous agitation, à 37 C, pendant 5 jours. La quantité de matière extractible à l'hexane est estimée par extraction à l'hexane selon le protocole suivant [G. Bridoux, P. Dhulster, J. Manem. T.S.M. 1994, 5, 247] L'erlenmeyer est retiré de l'étuve bactérienne après 5 jours de réaction. Le pH de la solution est ajusté à la valeur 1 à l'aide d'une solution de HCl 0,lN afin de maintenir les acides gras sous leur forme non dissociée et en conséquence solubles dans l'hexane. Cette solution est ensuite filtrée sur buchner en utilisant un papier filtre que l'on prendra soin, 11n 2783527 après filtration, de bien laver à l'hexane afin de récupérer toutes les graisses. Après plusieurs lavages, les phases organiques sont rassemblées et séchées sur Na2S04. La phase organique est récupérée dans un ballon préalablement taré. Après évaporation sous vide à l'aide d'un évaporateur rotatif, on obtient la masse de graisse non dégradée et donc la quantité de matière extractible à l'hexane. Dans ces conditions, pour les trois compositions testées, les pourcentages de matière extractible à l'hexane sont les suivants: Composition A: pourcentage de matière extractible à l'hexane: 0,4% Composition B: pourcentage de matière extractible à l'hexane: 2% Composition C: pourcentage de matière extractible à l'hexane: 12% Composition D: pourcentage de matière extractible à l'hexane: 18% Composition E: pourcentage de matière extractible à l'hexane: 13% Composition F: pourcentage de matière extractible à l'hexane: % La détermination de quantité de matière extractible à l'hexane correspond à la quantité de triglycérides et d'acides gras liposolubles. L'estimation de l'efficacité de la méthode est alors optimisée par la seule prise en compte des triglycérides restants en fin de réaction. Pour cela, les acides gras sont éliminés par la mise à profit de l'action de sels de cations divalents sur les acides gras (méthode largement utilisée par ailleurs). 12 2783527 Le protocole expérimental suivant est appliqué: L'erlenmeyer est retiré de l'étuve bactérienne après 5 jours de réaction. Au mélange réactionnel est rajouté du chlorure de Calcium. Il est alors observé la formation d'un précipité qui correspond à la formation de sels calciques d'acides gras (RCOO)2Ca insolubles dans l'eau. L'ensemble est maintenu quelques minutes sous agitation magnétique. Ce précipité est éliminé par filtration. Le filtrat est alors10 extrait à l'hexane afin de récupérer les graisses restantes. Par cette méthode, les résultats suivants sont obtenus: Composition A: rendement de solubilisation (précipitation par CaCl2): 26% Composition B: rendement de solubilisation (précipitation par CaCl2): 26% Composition C: rendement de solubilisation (précipitation par CaCl2): 66%20 Composition D: rendement de solubilisation (précipitation par CaCl2): 66% Composition E: rendement de solubilisation (précipitation par CaCl2): 100% Composition F: rendement de solubilisation (précipitation par CaC12): 100% Les résultats obtenus mettent alors en évidence l'efficacité de l'action combinée de l'urée/uréase et de la lipase sur la base des explications avancées précédemment; puisque effectivement le rendement passe de 26% à 100%. Dans le cas des compositions E et F, les rendements obtenus sont identiques. Dans les conditions décrites, la culture bactérienne apporte peu à l'étape d'hydrolyse; cependant, elle complète l'action de dégradation des graisses par le 13 2783527 biais de processus oxydatifs. Par ailleurs, sa présence peut faciliter et accélérer le processus de dégradation dans son ensemble par ensemencement du milieu à traiter. De plus, en ce qui concerne les compositions A, B, C, et D, il est possible d'augmenter encore les rendements de dégradation (déterminés par précipitation par CaCl2). Pour cela, il faut savoir que les enzymes, comme tout catalyseur, ne font qu'accélérer une réaction jusqu'à atteinte de l'équilibre régi par la thermodynamique sans faire varier la thermodynamique de la réaction. En présence d'un système clos, ce qui correspond au cadre de nos expériences, les enzymes n'agissent plus une fois l'équilibre de la réaction atteint. Ainsi, pour ces compositions, par élimination des acides gras (précipitation par CaCl2) générés lors de l'étape d'hydrolyse, il est possible par rajout de matière active et réaction de 5 jours, dans les conditions précédemment décrites, d'augmenter le rendement: 68% pour la composition A, 50% pour la composition B, 100% pour les compositions C et D. En revanche, dans le cas d'un milieu ouvert, ce qui correspond au cas réel d'utilisation des compositions décrites, l'équilibre de la réaction sera déplacé dans le sens de la dégradation puisque les acides gras seront consommés par la flore bactérienne présente en grande quantité dans ces milieux, ainsi la réaction sera auto-entretenue. De manière plus pratique, le taux de lipase (formulations E et F) ainsi que celui de la culture bactérienne (formulation 14 2783527 F) sont abaissés. Les formulations qui sont ainsi testées présentent les compositions ci-dessous: Composition G Urée: 88,68% S Uréase: 1,32% Levure: 0,50% Brique: 9,00% Lipase: 0,50% Composition H Urée: 88,68% Uréase: 1,32% Levure: 0,00% Brique: 9, 00% Lipase: 1,00% Composition I Urée: 88,10% Uréase: 1,32% Levure: 0,00% Brique: 8,58% Lipase: 2,00% Composition J Urée: 88,68% Uréase: 1,32% Levure: 0,00% Brique: 9,00% Lipase: 0,50% Culture bactérienne: 0,50% Composition K Urée: 87,80% Uréase: 1,32% Levure: 0,00% Brique: 8,88% Lipase: 1,00% Culture bactérienne: 1,00% 2783527 Les rendements de solubilisation obtenus pour ces cinq formulations sont: Composition G: rendement de solubilisation (précipitation par CaC12): 50% Composition H: rendement de solubilisation (précipitation par CaCl2): 68% Composition I: rendement de solubilisation (précipitation par CaC12): 70% Composition J: rendement de solubilisation (précipitation par CaCl2): 73% Composition K: rendement de solubilisation (précipitation par CaC12): 74% Ces résultats mettent en évidence le maintien de l'efficacité de l'activité lipasique même à faible concentration. 16 2783527 REVENDICATIONS 1/ Procédé de solubilisation et de dégradation des esters d'acides gras tels que les triglycérides,, les cérides, les stérides... qui sont les lipides composant majoritairement les graisses caractérisé en ce que l'on met en présence dans le milieu à traiter:10 au moins une lipase qui va assurer l'étape d'hydrolyse des graisses et libérer des acides gras. - au moins de l'urée et de l'uréase qui potentialisent l'action de la lipase par alcalinisation continue du milieu, ce qui favorise la formation de savons (tensioactifs) lesquels solubilisent les graisses par formation de micelles. - au moins des agents bactériens qui vont renforcer l'activité lipasique par excrétion de systèmes enzymatiques et réaliser l'étape de dégradation des acides gras en sous- unités hydrosolubles. 2/ Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que une ou plusieurs lipases sont utilisées afin d'adapter le spectre d'activité enzymatique à la nature des différents substrats graisseux à dégrader. 3/ Procédé selon les revendications 1 et 2 caractérisé en ce que les agents bactériens se fixent dans le milieu sur un support à haute surface spécifique. 4/ Composition de solubilisation et de dégradation des esters d'acides gras tels que les triglycérides, les cérides, les stérides... qui sont les lipides composant majoritairement les graisses caractérisée en ce que l'on met en présence dans le milieu à traiter: - au moins une lipase à un taux minimum de 0,5% qui va assurer l'étape d'hydrolyse des graisses et libérer des acides 17 2783527 gras. Cette lipase se présente sous forme de granulés titrant au minimum 1% de protéine enzymatique. - au moins de l'urée et de l'uréase qui potentialisent l'action de la lipase par alcalinisation continue du milieu, ce qui favorise la formation de savons (tensioactifs) lesquels solubilisent les graisses par formation de micelles. L'uréase est utilisé à un taux minimum de 0, 83% sous forme d'une poudre contenant au moins 39% de protéine enzymatique. - au moins des agents bactériens qui vont renforcer lo l'activité lipasique par excrétion de systèmes enzymatiques et réaliser l'étape de dégradation des acides gras en sous- unités hydrosolubles. / Composition selon la revendication 4 caractérisée en ce que une ou plusieurs lipases sont utilisées afin d'adapter le spectre d'activité enzymatique à la nature des différents substrats graisseux à dégrader. 6/ Composition selon les revendications 4 à 5 caractérisée en ce que l'introduction d'un support à haute surface spécifique favorise dans le milieu la fixation des agents bactériens. 7/ Procédé selon l'ensemble des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il est applicable dans tous les dispositifs autonomes et collectifs d'évacuation (siphons et canalisations) des eaux usées. 8/ Procédé selon l'ensemble des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il est applicable dans tous les dispositifs de traitements des eaux usées (bacs à graisses, fosses septiques, fosses toutes eaux, drains et puisards) 9/ Procédé selon l'ensemble des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il est applicable dans des réacteurs appropriés pour dégrader industriellement ces graisses.