FR 2777785 A1 19991029 FR 9805354 A 19980427 Au cours de la vie, tant professionnelle que privée, l'exposition au soleil ainsi que les diverses pollutions provoquent des agressions chimiques et physiques qui induisent la production, entre autres facteurs, de différentes formes radicalaires de l'oxygène. Ces dernières, notamment au niveau cutané, provoquent des dégâts irréversibles dont les conséquences sont a minima des érythèmes, coups de soleil, vieillissement prématuré de la peau, et, a maxima, des cancers de la peau. L'aggravation des manifestations acnéiques, la perte de la souplesse cutanée, le dessèchement de la peau et l'apparition des rides correspondent aux premières manifestations macroscopiques du vieillissement. Au niveau des cellules cutanées, les modifications moléculaires mises en évidence dès les premières expositions au soleil, qui ne peuvent être décelées que par des méthodes invasives et très sophistiquées, sont donc encore plus pernicieuses puisque non détectables par la population en général. Le soleil n'est pas le seul responsable de la production des radicaux libres de l'oxygène. Un grand nombre de réactions biochimiques vitales, (comme par exemple l'oxydation des acides aminés ou celle des acides gras, la synthèse de prostaglandines...), engendrent tout naturellement ces formes hyper-réactives de l'oxygène, extrêmement toxiques pour les tissus en général et pour la peau en particulier. Les êtres humains sont naturellement protégés contre les effets délétères des formes radicalaires de l'oxygène par des régulations physiologiques, développées au cours de l'évolution: bronzage progressif à partir du printemps contre les conséquences sub- érythémateuses cutanées, présence d'enzymes antiradicalaires telles que des superoxyde- dismutases et des catalases, diminution de la réaction inflammatoire et/ou immunitaire, épaississement de l'épiderme.... Il est envisageable d'agir sur certains de ces mécanismes de défense, en les amplifiant ou en les favorisant, par exemple, en utilisant des enzymes telles que la SOD (superoxyde- dismutase). Malheureusement, ceci n'est pas suffisant pour empêcher le vieillissement actinique de la peau ou le vieillissement physiologique cutané induits par les radicaux libres. En effet, ainsi que le montre le schéma suivant, il est évident que si la catalase, présente naturellement dans la peau (Forestier JP (1992), Shindo al. (1994)), est soit défaillante, soit en quantité insuffisante ou devant faire face à une surproduction d'anion superoxyde, le peroxyde d'hydrogène s'accumule dans les tissus, y provoquant des dégâts irréversibles par le biais des réactions dites de terminaison et qui correspondent à la lipopéroxydation des membranes cellulaires de la peau. UV SOD CATALASE 02 > 02; ' H202 ' H20 + 02 Ion Superoxyde Peroxyde d'Hydrogène Comme la catalase figure, sous le N 74, dans la liste des substances qui ne peuvent entrer dans la composition des produits cosmétiques de l'annexe II(1) de la Directive européenne 93/35 du 14Juin 1993, il n'est pas possible d'utiliser une combinaison SOD- catalase dans les composition cosmétiques et dermopharmaceutiques. L'invention décrite ici propose donc de renforcer les défenses naturelles de la peau ou de pallier à leur(s) dysfonctionnement(s) en favorisant l'élimination des différents radicaux libres par un autre système biochimique. La racine de Raifort ou radis noir, plante de la famille des crucifères, est connue en Biochimie pour contenir de fortes concentrations d'une peroxydase très active, la peroxydase de raifort (EC 1.11.1.7, Horseradish peroxydase ou HRP). Cette enzyme est extraite à partir de Cochleasia Armoracia, condiment utilisé en Europe Centrale. La peroxydase de raifort est capable de détoxifier le peroxyde d'hydrogène (H202). Ses propriétés générales ont fait l'objet de nombreuses publications (par exemple: Halliwell B. & Alhuwallia S. (1976), Floris G. & al.(1984), Halliwell B. & Alhuwallia S. (1976), Modi S. & Behere D.V. (1996), Buchanan I.D. & Nicell J.A. (1997), Goodwin D.C. & al. (1997). L'invention faisant l'objet de ce brevet a consisté à utiliser cette peroxydase en lieu et place de la catalase interdite en cosmétique. De plus, nous avons découvert que son action peut être renforcée en la combinant avec l'acide caféique, qui joue le rôle de substrat donneur d'électrons, permettant ainsi de détoxifier complètement les formes radicalaires de l'oxygène, tant l'anion superoxyde (02!) que le peroxyde d'hydrogène (H202), produites par les divers mécanismes mentionnés ci-dessus. Parmi les autres substances pouvant être utilisées comme substrat donneur d'électrons, on peut citer l'acide ascorbique, les phénols comme le pyrogallol ou le guaiacol, les polyphénols et parmi ces derniers les acides hydroxy-cinnamiques dont l'acide chicorique, l'acide rosmanique, l'acide chlorogénique l'acide 3,5 dicaféylquinique, sans que cette liste soit limitative. Cette dernière classe présente de nombreux avantages comme, par exemple, une meilleure solubilité et donc une meilleure disponibilité, une stabilité satisfaisante comparée à celles des tanins, une très faible coloration et une innocuité démontrée quotidiennement par les grandes quantités de café torréfié, de fruits (pommes, poires, cerises, myrtilles) et légumes frais (chicorée, artichaut) qui sont consommées dans le monde et qui contiennent chacun au moins l'une de ces molécules. L'efficacité du produit résultant de l'association de peroxydase de raifort avec l'acide caféique ou d'autres substances, est démontrée dans les trois exemples suivants. Exemple N I Cet exemple démontre l'effet inhibiteur de la peroxydase de Raifort (Horse Radish Peroxydase = HRP) sur la production de l'anion superoxyde 02! par le système Xanthine Oxydase (XOD) / Hypoxanthine (IHIX) selon l'équation réactionnelle suivante: Xanthine Oxydase Hypoxanthine, Acide Urique + 02 + H202 Cette réaction est connue pour libérer le radical superoxyde 02' mais, dans les concentrations de travail utilisés dans les exemples N 1 et N 3, il y a production des deux radicaux libres, superoxyde O2- et peroxyde d'hydrogène (H202), ce dernier étant majoritaire (Hausladen A. & Fridovich I. Arch. Biochem. Biophys. (93)304:479-482). La quantité de radicaux libres produits par cette réaction est classiquement suivie, à 560nm pendant 40 minutes, par l'évolution de la densité optique du milieu réactionnel, en présence de nitrobleu de tétrazolium (NTB) qui développe une coloration proportionnelle à la quantité de formazan formé (Miura et al., 1987). Les résultats suivants correspondent au moyennes SEM calculées sur 5 essais différents. La réaction contrôle ne comportant que l'enzyme (XOD) et son substrat (HX) en présence de NTB montre une variation de 0,888 + 0,021 DO. En présence de 0,33*10-3 % de peroxydase de raifort (HRP), la variation observée est égale à 0,668 + 0,025 DO, ce qui représente un inhibition de la réaction de 25 %. En présence de 0,01 % d'acide caféique, la variation est de 0,629 + 0,037 DO, soit une inhibition de 29 %. En présence de l'association de 0,33* 10-3 % d'HRP et de 0,01 % d'acide caféique, la variation de DO n'est plus égale qu'à 0,092 + 0,009, ce qui correspond à une inhibition de %, prouvant ainsi que dans ces conditions, la quantité de radicaux libres disponibles dans le milieu était minime en regard de la toxicité du système. Toutefois, nous avons validé ce test en faisant l'hypothèse que cette baisse de production de radicaux libres pouvait provenir de l'inhibition de la réaction enzyme-substrat par les produits testés. Les essais réalisés ont démontré qu'il n'en était rien et que la xanthine oxydase n'était pas inhibée dans les systèmes décrits puisque la quantité d'acide urique formé était en tout point comparable. Cet exemple illustre donc l'effet de destruction des radicaux libres de l'oxygène de la peroxydase de raifort et de l'acide caféique dans ce système. De plus, cet exemple démontre un effet de synergie importante puisque l'effet observé en présence de l'association HPR et acide caféique (-90 %) est beaucoup plus important que celui que l'on pouvait attendre et qui devait être voisin de l'addition des deux effets observés en présence de chacun de ces produits utilisés seuls (-26 % + - 30 % = -56 %). En faisant varier les proportions respectives des deux constituants de l'association, ou la quantité de l'association elle-même, il est même possible de mettre en évidence un effet dont l'intensité dépend des concentrations mises en jeu. Le même type de résultat est observable si l'on remplace l'acide caféique par l'acide ascorbique, le pyrogallol, le guaïacol, l'acide chicorique, l'acide rosmanique, l'acide chlorogénique, l'acide 3,5 dicaféylquinique; ces dernières substances n'étant données qu'à titre d'exemple non-limitatif. Exemple N 2 Cet exemple rapporte l'effet destructeur de l'association HRP + acide caféique réalisée dans les mêmes proportions que dans l'exemple N 1, visà-vis du seul peroxyde d'hydrogène H202. Le test consiste à mettre en présence les produits à tester en présence d'H202 et de quantifier leur effet par la disparition de 1'H202 au moyen d'une électrode de Clark qui mesure la quantité d'O2 libéré dans le temps. La spécificité du protocole utilisé est vérifiée car lorsque l'on mets en présence la catalase avec 1'H202, un enregistreur relié à l'électrode de Clark trace alors un courbe ascendante qu'il est possible de quantifier par rapport à des étalonnages réalisés auparavant. En présence de la peroxydase de raifort seule, ou de l'acide caféique seul, aux mêmes concentrations que dans l'exemple précédent, on ne note aucune libération d'O2, ce qui signifie que 1'H202 n'est pas dégradé. Si l'on ajoute alors de la catalase, on constate une libération d'O2, comme dans le cas témoin précédent. Ceci prouve que les produits seuls n'ont pas dégradé l'H202. Curieusement, lorsque l'on répète l'expérience en présence du produit décrit dans ce brevet, on n'observe toujours pas de libération d'O2. Par contre, si l'on ajoute alors la catalase, contrairement au cas précédent, il est impossible de suivre l'apparition d'H202, ce qui démontre à l'évidence que le produit a dégradé entièrement 1'H202 mis en sa présence mais n'a pas libéré d'oxygène, comme le fait la catalase. I1 est possible d'en déduire que le produit détoxifie 1'H202 par un mécanisme différent de celui de la catalase et qu'il doit y avoir un transfert d'électrons de l'H202 provenant de l'acide caféique. Le même type de résultat est observable si l'on remplace l'acide caféique par l'acide ascorbique, le pyrogallol, le guaïacol, l'acide chicorique, l'acide rosmanique, l'acide chlorogénique, l'acide 3,5 dicaféylquinique; ces dernières substances étant données à titre d'exemple non-limitatif. Cet exemple démontre donc, de manière indirecte, d'une part que c'est l'association peroxydase de raifort avec l'acide caféique ou d'autres substances comme celles citées dans ce brevet, sans que la liste en soit limitative, qui présente une activité détoxifiante vis-à-vis du peroxyde d'hydrogène et que, d'autre part, cette activité est de type catalasique puisque s'exerçant contre l'H202. Exemple N 3 Nous avons testé les produits ci-dessus, seuls ou selon l'association précédemment décrite sur la mortalité cellulaire induite par un système HX-XOD. Tout comme dans l'exemple N I, les conditions opératoires utilisées font que la réaction libère les deux radicaux libres, superoxyde 02' et peroxyde d'hydrogène (H202), ce dernier étant majoritaire. Des fibroblates humains normaux, en culture (20.000 cellules/puits) sont mise en présence d'un tampon contenant 80 jtg/ml d'hypoxanthine (HX). Le test débute par l'ajout de 4mU/ml de xanthine oxydase (XOD). Après 90 minutes, la survie cellulaire est classiquement estimée par la révélation de la respiration mitochondriale au moyen du réactif MTT ([3- (4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,'-diphenyltetrazolium bromide]) dont la coloration passe du jaune au bleu lorsque la cellule est vivante. En présence de 0,01 % d'acide caféique, la survie est améliorée de 6,0 + 1,5 % par rapport à son absence. Dans les mêmes conditions, en présence de 0,33*10-3 % d'HRP, la survie cellulaire est supérieure de 18,1 + 3,2 % par rapport à ce que l'on observe en son absence. Lorsque l'on réalise le test en présence de l'association des deux produits précédents, aux mêmes concentrations que ci-dessus, la survie est améliorée de 60,5 + 3.7 % par rapport aux essais réalisés sans l'association. Des essais complémentaires ont démontré par ailleurs, que sur ce système la catalase était bien capable d'améliorer la survie cellulaire Des expérimentations identiques ont été réalisés sur des kératinocytes humains normaux, avec les mêmes produits et les mêmes concentrations testées. La survie est améliorée de 8,3 + 1,8 %, 12,5 + 2,2 % et 59,0 + 2,4 % en présence, respectivement, d'acide caféique, d'HRP et de leur association. Cet exemple démontre l'activité relative de chacun des produits utilisés sur la mortalité cellulaire induite par les deux formes radicalaires de l'oxygène, ainsi que la nette synergie que l'on obtient lorsque l'on utilise ces deux produits en association. Le même type de résultat est observable si l'on remplace l'acide caféique par l'acide ascorbique, le pyrogallol, le guaïacol, l'acide chicorique, l'acide rosmanique, l'acide chlorogénique l'acide 3, 5 dicaféylquinique; ces dernières substances étant données à titre d'exemple non-limitatif. En conclusion, les exemples ci-dessus démontrent que le produit découlant de l'association de la peroxydase de Raifort avec l'acide caféique, ou d'autres substances comme celles décrites dans ce brevet sans que la liste en soit limitative, possède un puissant effet anti-radicalaire in vitro, aussi bien de type superoxyde dismutase sur l'anion superoxyde 02- que de nature catalasique sur le peroxyde d'hydrogène (H202). Cette dernière activité est toutefois portée par un mécanisme différent de celui classiquement décrit pour la catalase elle-même. De plus, il est évident que, de cette association découle une synergie importante, puisque l'effet mesuré est nettement supérieur à celui attendu à l'examen des effets des seuls constituants lorsqu'ils sont utilisés isolement. Il est également évident que d'autres peroxydases de structure similaires peuvent être isolées à partir d'autres plantes voisines et peuvent être utilisées en lieu et place de la peroxydase de raifort décrite ici. Lorsque la peroxydase est utilisée seule, sa concentration est comprise entre 0,01.10-3 % et 20.10-3 % (p/p), préférentiellement entre 0,1.10-3 % et 3,0.10-3 %, en poids dans la composition cosmétique ou dermopharmaceutique. Dans le produit résultant de l'association de la peroxydase de raifort et du substrat donneur d'électron, comme l'acide caféique, la concentration de la peroxydase de raifort peut varier entre 0,01.10-3 % et 50.10-3 % (p/p), préférentiellement entre 0,1.10-3 % et 10.103 % (p/p); celle de l'acide caféique peut varier entre 0,003.10-3 % et 10. 103 % (p/p), préférentiellement entre 0,01.10'3 % et 1,0.10-3 % (p/p). La concentration du produit résultant de l'association de la peroxydase de raifort et du substrat donneur d'électron, comme l'acide caféique, peut varier entre 0,1 % et 50 % (p/p), préférentiellement entre 0,5 % et 20 %, en poids dans la composition cosmétique ou dermopharmaceutique. L'association de peroxydase de raifort et d'acide caféique, précédemment décrite et faisant l'objet de ce brevet, peut être utilisée dans toute forme galénique employée en cosmétique ou dermopharmacie: émulsions H/E et E/H, laits, lotions, polymères gélifiants et viscosants, tensioactifs et émulsifiants, pommades, lotions capillaires, shampooings, savons, sticks et crayons, sprays, huiles corporelles, sans que cette liste soit limitative. Il est possible d'incorporer l'association, dans des vecteurs cosmétiques comme les liposomes, les chylomicrons, les macro-, micro- et nanoparticules ainsi que les macro-, micro- et nanocapsules, de les absorber sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites et autres supports minéraux. L'association, peut être combiné dans les compositions cosmétiques avec tout autre ingrédient habituellement utilisé en cosmétique: lipides d'extraction et/ou de synthèse, polymères gélifiants et viscosants, tensioactifs et émulsifiants, principes actifs hydro- ou liposolubles, extraits d'autres plantes, extraits tissulaires, extraits marins. Le produit est utilisé dans les applications cosmétiques qui corrigent et/ou réparent au niveau cutané, les effets délétères des formes radicalaires de l'oxygène produites au cours: - des réactions physiologiques telles que, par exemple, l'oxydation des acides aminés ou des acides gras, la synthèse des prostaglandines, - de l'irradiation par les rayonnements UV solaires, normale et quotidienne, - de l'irradiation par les rayonnements UV solaires, excessive pendant les vacances, ou par des les UV artificiels, - de toutes sortes d'agressions physique ou chimiques telles que la pollution chimique atmosphérique, l'air climatisé, les gaz de combustion de carburants automobile ou industriel, l'alimentation déséquilibrée, le stress, l'alcool, le tabac, Le produit peut également être utilisé pour la protection des cheveux, du cuir chevelu, des ongles et des muqueuses sans que cette liste soit limitative. REVENDICATIONS 1. Produit d'origine végétale contenant de la peroxydase de Raifort possédant une action détoxifiante aussi bien de type superoxyde dismutase sur l'anion superoxyde O2- que de nature catalasique sur le peroxyde d'hydrogène (H202). 2. Composition cosmétique selon la revendication 1 caractérisée en ce que la concentration de peroxydase est comprise entre 0,01.10-3 % et 20.10-3 % (p/p), préférentiellement entre 0,1.10'3 % et 3,0.10-3 % en poids. 3. Produit résultant de l'association de la peroxydase de Raifort selon 1 avec des substrats donneurs d'électrons. 4. Produit selon la revendication 3 caractérisé en ce que le substrat peut provenir de différente classes chimiques telles que les phénols et les polyphénols. 5. Produit selon 3 à 4 caractérisé en ce que le substrat faisant partie des acides hydroxy- cinnamiques est particulièrement l'acide caféique. 6. Produit selon 3 à 5 caractérisé en ce que l'activité finale est caractérisée par la synergie apportée par l'association des deux composants utilisés. 7. Produit selon 3 à 6 caractérisé en ce que, dans le produit, la concentration de la peroxydase de raifort peut varier entre 0,01.10-3 % et 50.10-3 % (p/p), préférentiellement entre 0,1.10-3 % et 10.10-3 % (p/p); celle de l'acide caféique peut varier entre 0,003.10-3 % et 10. 10'3 % (p/p), préférentiellement entre 0,01.10'3 % et 1,0.10'3 % (p/p). 8. Compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques caractérisées en ce que la concentration du produit selon la revendication 3 à 7, peut varier entre 0,1 % et 50 % (p/p), préférentiellement entre 0,5 % et 20 %, en poids. 9. Compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques caractérisées en ce que le produit selon 1 à 2 ou 3 à 8 est utilisé dans toute forme galénique employée en cosmétique ou dermopharmacie: émulsions H/E et E/H, laits, lotions, polymères gélifiants et viscosants, tensioactifs et émulsifiants, pommades, lotions capillaires, shampooings, savons, sticks et crayons, sprays, huiles corporelles. 10. Compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques caractérisées en ce que le produit selon 1 à 2 ou 3 à 9 est incorporé dans des vecteurs cosmétiques comme les liposomes, les chylomicrons, les macro-, micro- et nanoparticules ainsi que les macro-, micro- et nanocapsules, de les absorber sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites et autres supports minéraux. 11. Compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques caractérisées en ce que le produit selon 1 à 2 ou 3 à 10 est utilisé avec tout autre ingrédient habituellement utilisé en cosmétique: lipides d'extraction et/ou de synthèse, polymères gélifiants et viscosants, tensioactifs et émulsifiants, principes actifs hydro- ou liposolubles, extraits d'autres plantes, extraits tissulaires, extraits marins. 12. Utilisation d'une composition selon 2 ou 8 à 1 1 pour la préparation d'un médicament pour les soins de la peau, y compris contre les effets délétères des formes radicalaires de l'oxygène produites au cours: - des réactions physiologiques telles que, par exemple, l'oxydation des acides aminés ou des acides gras, la synthèse des prostaglandines, - de l'irradiation par les rayonnements UV solaires, normale et quotidienne, de l'irradiation par les rayonnements UV solaires, excessive pendant les vacances, ou par les UV artificiels, - de toutes sortes d'agressions physique ou chimiques telles que la pollution chimique atmosphérique, l'air climatisé, les gaz de combustion de carburants automobile ou industriel, l'alimentation déséquilibrée, le stress, l'alcool, le tabac, ainsi que pour favoriser la protection des cheveux, du cuir chevelu, des ongles et des muqueuses.