FR 2780285 A1 19991231 FR 9808250 A 19980629 UTILISATION DE SOLUTIONS SALINES ISOOSMOTIQUES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET MEDICAMENTS ANTI-INFLAMMATOIRES BASE DE CES SOLUTIONS L'invention a pour objet un médicament anti- inflammatoire. Ce médicament est destiné au traitement anti- inflammatoire des muqueuses des voies respiratoires humaines, notamment au niveau des fosses nasales et des bronches. Dans le cas de certaines affections des fosses nasales, celles-ci sont le siège de réactions de défense contre les agressions par les produits souvent irritants que15 transporte l'air ambiant, ces réactions de défense se traduisant par une accumulation de sécrétions muqueuses et mucopurulentes. Ces sécrétions ont pour conséquence de conduire à l'obstruction des fosses nasales. Il est connu de lutter contre ce type d'obstruction en procédant au lavage des fosses nasales au moyen d'eau de mer isotonique. Un produit qui donne d'excellents résultats à cet égard est constitué par l'eau de mer isotonique commercialisée sous la marque PHYSIOMER. L'inflammation des muqueuses des voies respiratoires peut se traduire, soit par un oedème des muqueuses des fosses nasales qui a son tour provoque un phénomène d'obstruction, rendant impossible la respiration par le30 nez, soit éventuellement par un oedème des muqueuses bronchiques entraînant des pathologies du type bronchopneumopathies. Ces inflammations sont elles aussi le résultat d'une agression de l'organisme, et plus particulièrement 2 2780285 des voies respiratoires, par les virus et les bactéries transportés par l'air respiré et également par tous autres éléments irritants et allergisants que transporte cet air, notamment les pollens et tous autres produits qui sont à la base de la pollution atmosphérique. Il est déjà connu de lutter contre ce type de pathologie en ayant recours à des agents décongestionnants à effet vasocontricteur. Il est également connu d'utiliser dans ce but des médicaments à base de corticostéroïdes. Les résultats ainsi obtenus sont satisfaisants mais les agents thérapeutiques mis en oeuvre ont des effets secondaires quelquefois gênants. L'invention a donc pour but surtout de remédier aux inconvénients de l'art antérieur et de fournir pour le traitement des pathologies en question, un médicament exempt des effets secondaires dont il vient d'être question. Et la Société Demanderesse a le mérite d'avoir trouvé, à l'issue de travaux de recherche approfondis, que ce but était atteint en ayant recours à un médicament à base d'une solution saline isoosmotique, notamment d'eau de mer isoosmotique. Cette solution saline isoosmotique est caractérisée: - par un pH de 7,8 à 8,3 - par une densité de 1,008 à 1,01 - par une teneur en matières sèches de 1 à 2% en poids - par une osmolarité de 305 à 315 mOs/kg 3 2780285 et par une constitution chimique résultant, pour ce qui est de ses principaux éléments, du tableau A ci- après: TABLEAU A Sodium (Na) de 2000 à 2600 mg/l Potassium (K) de 40 à 80 mg/l Chlorures (Cl) de 5800 à 6000 mg/l Calcium (Ca) de 300 à 400 mg/l Magnésium (Mg) de 1200 à 1500 mg/l En conséquence, l'invention réside dans l'utilisation de solutions salines isoosmotiques, notamment obtenues à partir de l'eau de mer, pour l'obtention d'un médicament destiné à un traitement anti- inflammatoire des muqueuses des voies respiratoires humaines. Pour préparer cette solution isoosmotique, on peut procéder comme suit: On utilise comme matière première une eau de mer prélevée par une profondeur de 5 à 10 mètres dans une zone à forts mouvements de courant, et caractérisée par une teneur en sels supérieure à 32 g/l. Cette eau est analysée, décantée puis rapidement: - désodée par la technique d'électrodialyse jusqu'à ce que l'isotonicité soit d'environ 9 g de chlorure de sodium au litre, - filtrée, - stockée dans des conditions stériles en cuve en acier inoxydable. Elle est de nouveau analysée à ce stade pour vérifier: - sa stérilité, son isotonicité (physiologique) 4 2780285 Enfin, elle est conditionnée de façon stérile dans un local spécialement traité en atmosphère contrôlée. Les travaux qui sont à la base de l'invention sont décrits ci-après. Ils comportent des expériences montrant la supériorité des solutions salines isoosmotiques utilisées conformément à l'invention par rapport aux deux produits de référence bien connus, à savoir le sérum physiologique et le tampon PBS; cette supériorité se situe tant au niveau de leur activité anti-inflammatoire, qu'au niveau de leur toxicité, lesdites solutions s'étant, en effet, révélées significativement moins toxiques que le sérum physiologique et le tampon PBS. Les toxicités respectives des solutions salines isoosmotiques utilisées conformément à l'invention, du sérum physiologique et du tampon en PBS ont été définies par le biais d'une étude comparative portant sur la viabilité en présence de ces trois produits des cellules respiratoires humaines, c'est à dire des cellules que l'on rencontre dans les muqueuses respiratoires. Pour faire cette étude, on a utilisé des cellules glandulaires respiratoires humaines issues de prélèvements bronchiques humains. On a ensemencé ces cellules épithéliales respiratoires à la même densité cellulaire dans des plaques de culture de 12 puits. On les a cultivées pendant 48 heures dans un milieu de culture DMEM/F12 supplémenté d'une part avec 2% d'un nutriment constitué par le produit commercialisé sous la marque ULTROSER G et d'autre part avec une dose d'antibiotiques suffisante pour éviter la contamination 2780285 bactérienne; on obtient ainsi des cultures en monocouche homogènes et confluentes, soit 310 000 cellules par puits de culture après 48 heures de culture. Au moment o la confluence est atteinte, les cellules sont lavées avec une solution physiologique (PBS/Ca2+, pH 7.4) et mises en présence d'une part de la solution saline isoosmotique utilisée selon l'invention, d'autre part de sérum physiologique, d'autre part encore de tampon PBS et, enfin, de milieu de culture cellulaire de référence DMEM/F12. A l'issue de plusieurs périodes de contact cellulaire, à savoir 4 heures, 8 heures, 16 heures et 24 heures, on a évalué la viabilité cellulaire en présence des quatre milieux dont il vient d'être question. Cette viabilité cellulaire est exprimée par le pourcentage de cellules viables à la fin de chaque période d'incubation dans la solution saline isoosmotique utilisée selon l'invention, dans le sérum physiologique et dans le tampon PBS par rapport au nombre de cellules viables dans le milieu de culture DMEM/F12. Elle a été évaluée à l'aide du test d'exclusion dit au bleu de Trypan, en solution à 0,4%, suivi d'un comptage avec une cellule de Malassez. Conformément au test en question, les cellules sont détachées du support de culture en utilisant de la trypsine; les cellules vivantes sont ensuite comptées dans une solution aqueuse à 0,4% de bleu de Trypan, ce qui est rendu possible par le fait que le bleu de Trypan est un colorant cellulaire qui ne pénètre pas à l'intérieur d'une cellule vivante, seules les cellules non viables laissant entrer le bleu de Trypan. 6 2780285 Le nombre de cellules vivantes dans le milieu de culture DMEM/F12 étant par définition rapporté à 100, il est possible d'exprimer la viabilité cellulaire dans les autres milieux, en pourcentage par rapport au milieu de culture. Les résultats de cette étude montrent que les solutions salines isoosmotiques utilisées selon l'invention permettent une meilleure viabilité cellulaire sur des périodes d'incubations longues, c'est à dire jusqu'à 24 heures de contact. Le pourcentage de viabilité cellulaire enregistré, à savoir 58%, est supérieur à celui enregistré avec le sérum physiologique, à savoir 48% et a fortiori supérieur à celui enregistré avec le tampon PBS, ce dernier pourcentage étant égal à zéro, la viabilité des cellules dans ce dernier étant donc nulle. Dans le tableau B ci-après, on a réuni les pourcentages de viabilité cellulaire enregistrés dans le cadre des expériences qui précédent pour les périodes d'incubation de 4, 8, 16 et 24 heures. TABLEAU B Pourcentage de viabilité cellulaire Milieux Périodes d'incubation 4 heures 8 h 16 h 24 h Solution saline 100 85 79 59 isoosmotique_ Sérum physiologique 100 81 72 49 Tampon PBS 100 81 66 O Milieu de culture 100 100 100 100 DMEM/F12 Pour la mise en évidence de l'activité anti- inflammatoire des solutions salines isoosmotiques 7 2780285 utilisées conformes à l'invention, on procède comme indiqué ci-après. Il est connu que sous l'action de certains agents pro-inflammatoires d'origine bactérienne, tels que par exemple le lipopolysaccharide de P. aeruginosa (LPS, sérotype 10, utilisé à la concentration de 1 gg/ml) à l'unité U314, INSERM, Reims, les cellules concernées libèrent des médiateurs chimiques tels que l'interleukine 8, qui déclenchent les phénomènes inflammatoires. Pour lutter contre l'apparition des phénomènes inflammatoires il s'agit donc de limiter la libération de ces médiateurs chimiques. Et c'est cette limitation qui se produit très fortement de façon surprenante et inattendue lorsqu'après la susdite stimulation par des agents pro-inflammatoires, on incube les cultures cellulaires concernées dans les solutions salines isoosmotiques utilisées selon l'invention, démontrant ainsi leur importante activité anti- inflammatoire. Les expériences correspondantes réalisées par la Société Demanderesse, ont été effectuées sur des cultures sécrétoires glandulaires de la sous-muqueuse bronchique humaine. Pour ce faire, on cultive les cellules en question dans un milieu de culture, par exemple le milieu de culture RPMI1640, additionné de 2% de milieu ULTROSER G, puis on élimine le milieu de culture, après avoir atteint une confluence de 90% et après avoir introduit l'agent pro-inflammatoire. Après lavage des cellules ainsi traitées, on les réincube: 8 2780285 - dans le même milieu de culture RPMI1640 seul qui joue le rôle de milieu de contrôle, - dans le sérum physiologique (solution de NaCl à 0, 9% en tant que milieu de référence) - dans la solution saline isoosmotique utilisée selon l'invention. La production d'interleukine-8 par les cellules épithéliales glandulaires est estimée par méthode de dosage ELISA (en utilisant le kit de dosage vendu sous la marque MEDGENIX DIAGNOSTIC, Belgique) après une période de temps de contact d'une heure dans les surnageants des trois milieux identifiés ci-dessus. Les résultats enregistrés pour les trois milieux montrent que la production d'interleukine-8 est: - de 121 pg/ml/heure dans le cas du milieu RPMI1640, - de 65 pg/ml/heure dans le cas du sérum physiologique, - de 48 pg/ml/heure dans le cas de la solution saline isoosmotique utilisée selon l'invention, ce qui montre la supériorité de cette dernière du point de vue de l'activité anti-inflammatoire par rapport au sérum physiologique. Ces résultats sont confirmés par des expériences réalisées sur la culture d'une lignée cellulaire de l'épithelium respiratoire de surface (ligne respiratoire 16-HBE). Dans la pratique, la solution saline isoosmotique conforme à l'invention est administrée sous forme d'aérosols ou de nébulisats ou par instillation sous forme de gouttes. 9 2780285 Il s'agit d'un médicament destiné au traitement des manifestations inflammatoires survenant dans les affections rhinopharingées et pulmonaires. La solution saline isoosmotique utilisée conformément à l'invention peut être présentée sous la forme d'un Aérosol nasal et buccal à action locale exerçant son effet sur la muqueuse bronchique et la muqueuse nasale. La posologie habituelle peut être de 2 bouffées espacées d'une trentaine de secondes, répétées deux à trois fois par jour en inhalation buccale selon l'état et l'âge du patient. Dans le cas d'une inhalation nasale, elle est habituellement d'une à deux bouffée dans chaque narine 3 à 4 fois par jour selon l'état et l'âge du patient. 2780285 REVENDICATIONS l.Utilisation de solutions salines isoosmotiques, notamment obtenues à partir de l'eau de mer, pour l'obtention d'un médicament destiné à un traitement anti- inflammatoire des muqueuses des voies respiratoires humaines. 2. Médicament anti-inflammatoire des muqueuses des voies respiratoires à base d'une solution saline isoosmotique. 3. Utilisation selon la revendication 1 d'une solution saline isoosmotique caractérisée: - par un pH de 7,8 à 8,3 - par une densité de 1,008 à 1,01 - par une teneur en matières sèches de 1 à 2% en poids - par une osmolarité de 305 à 315 mOs/kg et par une constitution chimique résultant, pour ce qui est de ses principaux éléments, du tableau A ci- après: TABLEAU A Sodium (Na) de 2000 à 2600 mg/l Potassium (K) de 40 à 80 mg/l Chlorures (Cl) de 5800 à 6000 mg/l Calcium (Ca) de 300 à 400 mg/l Magnésium (Mg) de 1200 à 1500 mg/l 4.Procédé de préparation de la solution saline isotonique utilisée conformément aux revendications 1 et 3 caractérisé par le fait que l'on utilise comme matière première une eau de mer prélevée par une profondeur de 5 à mètres dans une zone à forts mouvements de courant, et caractérisée par une teneur en sels supérieure à 32 g/l. - on analyse et décante cette eau qui est ensuite Il 2780285 - désodée par la technique d'électrodialyse jusqu'à ce que l'isotonicité soit d'environ 9 g de chlorure de sodium au litre, - filtrée, - stockée dans des conditions stériles en cuve en acier inoxydable.