FR 2775983 A1 19990917 FR 9803333 A 19980313 -À' MILIEU ET PROCEDE DE PROPAGATION ET DE MULTIPLICATION VIRALES La présente invention est relative à un milieu et à un procédé de propagation et de multiplication virales sur des cellules en culture, notamment pour la production de vaccins. La production de vaccins viraux, qu'ils soient simplement atténués, inactivés, sous- unitaires ou recombinants, implique la production, à grande échelle, de virus. Cette production peut être effectuée, selon la nature du virus, sur différents supports permettant la réplication du virus; ainsi, par exemple, pour la plupart des vaccins contre la grippe actuellement commercialisés, la prolifération des virus est effectuée sur des oeufs de poules embryonnés, alors que pour certains vaccins contre l'encéphalite japonaise, cette étape est effectuée sur des cerveaux de souris. Or, l'utilisation de tels supports pose de nombreux problèmes: disponibilité, reproductibilité, mais surtout sécurité du fait des contaminations possibles par des virus, des mycoplasmes ou tout autre élément indésirable provenant du support. De plus en plus, on cherche donc à s'affranchir de tels supports et on utilise, à chaque fois que cela est possible, des cultures cellulaires que l'on infecte par une faible quantité du virus à produire et que l'on maintient ensuite dans des conditions favorables à la réplication des virus à l'intérieur des cellules infectées, ainsi qu'à la propagation de l'infection d'une cellule à l'autre. Les virus produits sont ensuite récoltés, soit à partir du milieu de culture dans lequel baignent les cellules lorsqu'il s'agit de virus intracellulaires quittant la cellule après leur bourgeonnement (ce qui a notamment pour avantage de permettre de réaliser plusieurs récoltes de virus avec les mêmes cellules en culture), soit par traitement des cellules elles-mêmes lorsqu'il s'agit de virus intracellulaires. Ces techniques impliquent de disposer de cultures cellulaires de bonnes qualités de nombreux développements de l'art antérieur ont donc porté sur l'amélioration des cultures cellulaires et notamment sur les milieux de culture utilisés. Afin de limiter les risques de contamination des cellules par des mycoplasmes, des virus, des agents de l'encéphalopathie bovine spongiforme ou tout autre agent transmissible non conventionnel, il a été proposé d'utiliser des milieux de culture dépourvus de sérum, et même de protéine, ainsi que cela est décrit dans la -2- demande de brevet WO 96/15231. De façon alternative, la demande FR 2732347 propose l'utilisation de milieu de culture cellulaire dépourvu de sérum animal, mais contenant des extraits végétaux. Ainsi, grâce à l'utilisation de tels milieux pour l'étape de culture des cellules, la sécurité des produits obtenus à l'aide des cellules ainsi produites est accrue. Cependant, lorsqu'il s'agit de produire des virus entrant dans la composition de vaccins, les étapes consécutives à cette phase de culture cellulaire, doivent, elles aussi, présenter le maximum de sécurité. En effet, de manière classique, et ainsi que cela est décrit dans le brevet US 4525349 lorsqu'on utilise des cellules en culture pour la production de virus, une fois la phase de culture des cellules effectuée, le milieu qui a été utilisé pour la culture cellulaire est évacué puis remplacé par un nouveau milieu dans lequel les cellules baignent pendant un moment afin d'être lavées; ce nouveau milieu est ensuite éliminé; cette opération de lavage des cellules peut éventuellement être renouvelée un certain nombre de fois. On introduit, ensuite, dans la culture cellulaire un nouveau milieu qui va permettre aux cellules d'une part de survivre et d'être infectées par les virus et d'autre part, de disposer d'éléments suffisants pour être le support de la réplication de ces virus. Or, ainsi que cela est décrit dans l'article " Protein-free culture of Vero cells: A substrate for replication of human pathogenic viru ses ", Cell Biology International, Vol. 17 N 9,1993 pp885-895, même dans le cas o la culture cellulaire est réalisée en milieu sans protéine, le milieu de culture utilisé lors de cette étape dans l'art antérieur contient généralement du sérum de veau foetal ou pour limiter les problèmes de contamination, du moins de l'albumine humaine. L'utilisation de l'albumine humaine, à ce stade d'un procédé de fabrication de vaccins viraux, est considérée sans risque pour la qualité du vaccin. Cependant, dans le but d'éliminer complètement tout risque, même théorique, il serait souhaitable de pouvoir disposer d'un milieu apte à la propagation et à la multiplication de virus sur un support constitué par des cellules en culture, dépourvu d'albumine humaine, animale ou recombinante, mais permettant cependant des rendements de production compatibles avec les exigences industrielles afin de ne pas accroître les coûts de production des vaccins comprenant des virus produits sur cellules en culture. -3 - Le but de l'invention est notamment de proposer un tel milieu. Un autre but de l'invention est de proposer un milieu et un procédé de propagation et de multiplication virales permettant ensuite, lorsque cela est souhaité, de procéder à une étape d'inactivation des virus. Pour atteindre ces différents buts, la présente invention a pour objet un milieu de propagation et de multiplication virales sur des cellules en culture, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de protéines humaines ou animales et en ce qu'il comprend des protéines ou glycoprotéines extraites de pommes de terre ou de concombre, ayant un potentiel mitogène et dont le poids moléculaire est compris entre 10 et 200 kd ( i.e entre 10 000 et 200 000 daltons). Selon une caractéristique particulière de l'invention, les protéines ou glycoprotéines sont extraites de pommes de terre. Selon une autre caractéristique de l'invention, les protéines ou glycoprotéines sont obtenues de la manière suivante: - réduction de la pulpe de la pommes de terre ou du concombre, - traitement de la pulpe par un solvant, - évaporation du solvant, - purification de l'extrait obtenu par thermocoagulation, par précipitation, par technique au sulfate d'ammonium, ou par chromatographie. Selon une autre caractéristique, le milieu de propagation et de multiplication virales selon l'invention est particulièrement adapté à la multiplication virale sur cellules VERO. Selon une autre caractéristique, le milieu de propagation et de multiplication virales selon l'invention est particulièrement approprié à la multiplication des virus de l'encéphalite japonaise, des virus de la poliomyélite, des virus de la rage. -4 - La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication de vaccins viraux comportant une phase de production virale sur cellules en culture, caractérisé en ce qu'on procède à la phase de propagation et de multiplication des virus en présence d'un milieu dépourvu d'albumine humaine, animale ou recombinante, mais comprenant des protéines ou glycoprotéines extraites de pommes de terre ou de concombre, ayant un potentiel mitogène et dont le poids moléculaire est compris entre 10 et 200 kd. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre. Le milieu et le procédé selon l'invention sont adaptés à la production de tous les virus aptes à se répliquer sur des cultures cellulaires. Il peut notamment s'agir des virus appartenant aux familles suivantes: orthomyxovirus, paramyxovirus, reovirus, picomrnavirus, flavivirus, arenavirus, herpesvirus, poxvirus, et les adénovirus. Il peut également s'agir de virus recombinants. De manière particulière, l'invention est particulièrement adaptée à la production de virus susceptibles de rentrer dans la composition de vaccins, et notamment de vaccins humains pour lesquels les exigences de sécurité sont maximales. Il peut en particulier s'agir des virus de la poliomyélite, de la rage, de l'encéphalite japonaise, de la fièvre jaune, de la rubéole, des oreillons, de la Dengue, de la rougeole, des différentes hépatites, du SIDA, de la varicelle, de l'herpes, des maladies provoquées par le virus syncytial respiratoire, le cytomegalovirus, I'EBV, les rotavirus ou la grippe. La présente invention est particulièrement avantageuse pour la production des virus responsables de la poliomyélite, de la rage, de l'encéphalite japonaise, de la rubéole, de la varicelle, de l'hépatite A, de la grippe, de la Dengue, de la rougeole, des oreillons. Les cellules susceptibles d'être utilisées pour la production de virus selon l'invention sont toutes les cellules aptes à se multiplier en culture et permissives au virus que l'on souhaite produire. Il peut notamment s'agir de cellules VERO, de cellules CV-1, de cellules LLC-MK2, de cellules MDCK, de cellules MDBK, de cellules WI-38, de cellules MRC5 (fibroblastes humains), ou encore de cellules -5- BHK2 1. On a obtenu de particulièrement bons résultats avec des cultures de cellules VERO ou des cultures de cellules MRC5. La culture cellulaire peut être effectuée selon les différentes techniques habituellement utilisées: en cytoculteurs, en flacons roulants, sur boîtes de Roux, sur Multitray', sur Cell-Cube'. On préfère, pour des raisons industrielles, effectuer la culture cellulaire en cytoculteurs, en utilisant des microsupports constitués par exemple par des billes de CytodexTM. Cette culture cellulaire peut être réalisée dans différentes conditions, notamment en ce qui concerne le milieu utilisé; il est en effet possible, de mettre en oeuvre la présente invention alors que le milieu de culture utilisé pour la phase de croissance cellulaire contenait du sérum ou du moins des protéines humaines ou animales; dans ce cas, bien sûr, il sera nécessaire de procéder à un lavage parfait des cellules avant leur infection, afin de ne pas perdre l'avantage apporté par la mise en oeuvre de l'invention en ce qui concerne l'absence de risque de contamination. Cependant, on préfère utiliser des cultures cellulaires obtenues en utilisant un milieu de culture cellulaire dépourvu également de protéines d'origine humaine ou animale. Selon la nature des cellules utilisées et des virus à produire, le moment le plus opportun pour procéder à l'infection des virus par un inoculum du virus peut varier. En général, on procède à cette opération plutôt au milieu ou en fin de la phase exponentielle de croissance; on a remarqué, en effet, que dans ces conditions, les résultats obtenus étaient particulièrement satisfaisants. Selon l'invention, le milieu de culture utilisé pour l'étape de propagation et de multiplication virales est un milieu dépourvu d'albumine humaine,animale ou recombinante, mais comprenant des protéines ou glycoprotéines extraites de pommes de terre ou de concombre, ayant un potentiel mitogène et dont le poids moléculaire est compris entre 10 et 200 kd. Ce milieu est un milieu comprenant tous les éléments classiquement utilisés pour la multiplication virale, tel que le milieu HAM F 12, mais additionné d'extraits végétaux, obtenus par exemple de la manière suivante: -réduction de la pulpe végétale, -6- - traitement de pulpe obtenue par un solvant, -évaporation du solvant, -purification de l'extrait obtenu par exemple par chromatographie. Le potentiel mitogène des protéines ou glycoprotéines convenant aux fins de l'invention peut être apprécié grâce notamment à des tests d'analyse de croissance cellulaire et d'activité mitogénique, tels que les tests de coloration au M.T.T. Les extraits végétaux convenant aux fins de l'invention sont notamment ceux décrits dans la demande de brevet FR 2732347. On peut également utiliser les produits commercialisés par la Société Biomedia sous la dénomination GCR1003 et TCR1005, ou encore le produit PROLIFIX II commercialisé également par cette Société et comprenant tous les éléments nutritifs du milieu classique HAM F 12 additionné des extraits végétaux appropriés. I est possible d'ajouter à ces milieux tout autre élément susceptible d'améliorer ou de faciliter une des étapes conduisant à l'obtention d'un vaccin, de même qu'il est possible de modifier légèrement ce milieu sans en changer les caractéristiques. n est notamment possible de le supplémenter en hydrolysats végétaux, tels que les hydrolysats de riz ou de soja. Les exemples qui suivent illustrent, de façon non limitative des modes de réalisation de l'invention. EXEMPLE 1 PRODUCTION DE VACCINS CONTRE L'ENCEPHALITE JAPONAISE. On utilise pour produire le virus responsable de l'encéphalite japonaise des cellules VERO. Les cellules utilisées sont des cellules issues de la souche distribuée par l'ATCC ( American Type Culture Collection) sous le N0 ATCC-CCL 81- VERO F 1415 qui est au 124 passage et qui est amené au 137&* passage de façon conventionnelle. Le virus que l'on souhaite produire est le virus de la souche P3 au 88*I passage fourni par le NVSI. On remplit la cuve d'un cytoculteur de 15 litres avec du milieu ISCOVE additionné de 4% de serum de veau contenant des microporteurs Cytodex iTM à une -7- concentration de 3,5g/1. On ensemence le milieu par un inoculum de cellules VERO à raison de 200 000 cellules /ml. La culture est amplifiée et subcultivée 2 fois par semaine tous les 4-5 jours. Les concentrations cellulaires que l'on obtient sont comprises entre 2 et 3. 106 par ml. On rince ensuite la suspension cellulaire obtenue avec le milieu de propagation virale dans le but d'éliminer le maximum de sérum de veau résiduel. Afin de tester un milieu selon l'invention comparativement à un milieu de l'art antérieur, on effectue la même opération en parallèle, dans plusieurs cytoculteurs identiques,avec 2 milieux différents: - un milieu selon l'invention constitué par le milieu HAM F 12 (fourni par Life Technologies GIBCO)additionné par du milieu PROLIFIX II fourni par la Société BIOMEDIA, à une concentration 10 fois celle indiquée à leur catalogue de 1996, dans une proportion de 1 volume de PROLIFIX II concentré 10 fois pour 10 volumes de HAM F 12, - un milieu selon l'art antérieur constitué par le milieu ISCOVE( fourni par Life Technologies GIBCO) additionné par de l'albumine humaine afin d'obtenir une concentration finale en albumine dans le milieu de 0,3%. Après rinçage, un inoculum de virus est introduit dans chacun des cytoculteurs, en quantité correspondant à une MOI (Multiplicity Of Infection) de 1/6000. Le contenu des cytoculteurs est ensuite maintenu sous agitation à une température de 37 C pendant 3 jours, puis on procède à la 1 récolte par récupération du milieu de propagation virale qui est devenu une suspension virale, que l'on remplace dans chacun des cytoculteurs par une quantité égale de milieu frais de même nature; on effectue ensuite toutes les 24 heures une récolte du milieu de propagation, ceci jusqu'à 5 récoltes. Chacune des récoltes est filtrée sur filtre dont le seuil de coupure est de 0,22gm, et stockée à +5 C en attendant d'être mélangée avec les 4 autres récoltes issues du même cytoculteur. Lorsque les 5 récoltes ont été effectuées, elles sont mélangées, puis ce mélange est concentré par filtration jusqu'à un facteur de 100. Le mélange constitué par les 5 récoltes issues d'un même cytoculteur constitue un lot. -8- Afin de déterminer la quantité de virus produits, on réalise pour chacun des lots produits un test de l'activité infectieuse. Le test est réalisé de 2 façons différentes soit en activité infectieuse mesurée sur nappe cellulaire, soit en activité infectieuse mesurée sur souris par inoculation intracérébrale aux souris, observation des animaux pendant 14 jours et calcul de DL50. Les résultats sont exprimés en Log 10 de particules infectieuses par litre de cytoculteur. Lorsqu'on considère le titrage sur cellules, la moyenne des résultats obtenus pour les différents lots produits en utilisant un milieu selon l'invention est de 8,84 alors que la moyenne obtenue pour les lots produits en utilisant un milieu selon l'art antérieur est de 7,85. Si on considère le titrage sur souris, la moyenne pour les lots produits selon l'invention est cette fois de 9,22 alors que la moyenne des lots produits avec un milieu selon l'art antérieur est de 9,30. On constate donc, de façon inattendue, que les résultats obtenus avec le milieu selon l'invention sont équivalents à ceux obtenus avec un milieu de l'art antérieur, alors qu'on s'attendait à ce que le défaut d'albumine qui est une protéine considérée comme jouant un rôle important dans le transport des éléments nutritifs à l'intérieur de la cellule, ait pour conséquence une réduction importante de la quantité de virus produits. Les lots obtenus ont ensuite été inactivés par l'ajout d'une solution de formaldéhyde en quantité permettant d'avoir une concentration finale dans le mélange de 1/4000 et maintenue à température ambiante sous agitation continue pendant 14 jours. La vérification de l'inactivation par un contrôle selon le protocole recommandé par l'OMS (Rapport technique 771 de 1988) a montré que les lots produits étaient conformes aux recommandations de l'OMS. Ces lots inactivés ont ensuite été purifiés par chromatographie échangeuse d'ions et par gel filtration afin d'en éliminer toutes les protéines virales et les impuretés résiduelles non souhaitées dans les vaccins. Le mélange obtenu a ensuite été formulé pour conduire à la production de doses vaccinales. La bonne qualité des vaccins produits a été vérifiée grâce au test d'immunogénicité sur souris recommandé par l'OMS pour les vaccins contre l'encéphalite japonaise, consistant à déterminer le taux d'anticorps meutralisants produits par des souris immunisées. -9- L'activité des vaccins produits selon le procédé de l'invention n'étant pas inférieure à celle des vaccins de l'art antérieur, cela confirme qu'il est possible, grâce au milieu et au procédé selon l'invention, de produire des vaccins viraux dans des conditions de sécurité accrue, en s'affranchissant de l'utilisation d'albumine. EXEMPLE 2 PRODUCTION DE VACCIN CONTRE LA RAGE On réalise une culture de cellules VERO dans un cytoculteur de 21 en milieu classique, puis après lavage, on infecte les cellules par du virus de la rage avec une MOI de 1/1000, et on maintient les cellules dans un milieu identique à celui décrit à l'exemple 1 (soit milieu HAM F12 supplémenté en PROLIFIXM II); la même expérience est réalisée de façon parfaitement identique, dans un autre cytoculteur de même capacité, avec comme seule différence l'utilisation d'un milieu de propagation et de multiplication virales de l'art antérieur comprenant de l'albumine humaine. On effectue des récoltes successivement 4, 5, 6 et 7 jours après l'infection. Les numérations effectuées sur les récoltes obtenues grâce au milieu selon l'invention et sur les récoltes obtenues grâce au milieu selon l'art antérieur ont permis d'obtenir des résultats comparables avec les 2 milieux; de même, les titres infectieux des virus obtenus étaient équivalents. Ces résultats démontrent donc la possibilité de produire sur cellules du virus contre la rage. EXEMPLE 3 PRODUCTION DE VACCIN CONTRE LA POLIOMYELITE. On a effectué des essais de production de virus de la poliomyélite de type 1 sur des cellules VERO en culture. Les titres infectieux des virus obtenus en utilisant un milieu de propagation et de multiplication virales selon l'invention ayant la composition décrite à l'exemple 1 étaient équivalents à la moyenne des titres infectieux obtenus avec les récoltes effectuées avec le milieu utilisé pour la fabrication des vaccins actuellement commercialisés. - 10- REVENDICATIONS 1. Milieu de propagation et de multiplication virales sur des cellules en culture, caractérisé en ce qu'il est dépourvu d'albumine d'origine humaine, animale ou recombinante, et en ce qu'il comprend des protéines ou glycoprotéines extraites de pommes de terre ou de concombre, ayant un potentiel mitogène et dont le poids moléculaire est compris entre 10 et 200 kd. 2. Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend des protéines ou glycoprotéines extraites de pommes de terre. 3. Milieu selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les protéines ou glycoprotéines sont obtenues de la manière suivante: M réduction de la pulpe de pomme de terre ou de concombre, * traitement de la pulpe par un solvant, * purification de l'extrait obtenu par thermocoagulation, par précipitation, par technique au sulfate d'ammonium, ou par chromatographie. 4. Milieu selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules utilisées pour le support de la propagation et de la multiplication virales sont des cellules VERO. 5. Milieu selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les virus produits sont des virus de l'encéphalite japonaise, de la rage, de la poliomyélite, de l'hépatite A, de la grippe, de la Dengue, de la rougeole, des oreillons, de la varicelle, de la rubéole. 6. Milieu selon une de revendications précédentes, caractérisé en ce que les virus produits sont des virus de l'encéphalite japonaise destinés à être utilisés dans des vaccins humains. - 11 - 7. Procédé de fabrication de vaccins viraux comportant une phase de production virale sur cellules en culture, caractérisé en ce qu'on procède à la phase de propagation et de multiplication des virus en présence d'un milieu dépourvu d'albumine humaine, animale ou recombinante, mais comprenant des protéines ou glycoprotéines extraites de pommes de terre ou de concombre, ayant un potentiel mitogène et dont le poids moléculaire est compris entre 10 et 200 kd.