FR 2776072 A1 19990917 FR 9803100 A 19980311 l PERFECTIONNEMENTS AUX DISPOSITIFS DELECTROPHORESE MULTICAPILLAIRES DU TYPE A DETECTION EN SORTIE DES CAPILLAIRES La présente invention est relative aux dispositifs d'électrophorèse multicapillaires. On sait que les techniques d'électrophorèse en gel classiques, dans lesquelles on injecte différents échantillons sur une pluralité de pistes définies dans un gel compris entre deux plaques, ne sont pas satisfaisantes, étant donné d'une part qu'elles nécessitent un certain nombre d'opérations manuelles et d'autre part qu'elles ne permettent pas des vitesses de migration et donc des débits de traitement très importants. Or les grands programmes de séquençage et de génotypage nécessitent un débit très élevé de séparation et d'identification des molécules d'ADN. On connait par ailleurs des techniques d'électrophorèse utilisant pour la migration un capillaire rempli de gel ou d'une autre matrice de séparation présentant l'avantage d'être particulièrement maniable, facile à charger et de permettre un fonctionnement sensiblement automatique, avec des vitesses de séparation plus élevées que dans l'électrophorése en plaques de gel grâce à un champ électrique applicable important. Toutefois, l'utilisation d'u.n seul capillaire ne permet pas d'atteindre les mêmes débits que ceux que permettent les techniques d'électrophorèse en plaques qui possèdent de nombreuses pistes en parallèle, même si néanmoins les champs électriques qui peuvent être appliqués à un capillaire, et donc les vitesses de migration obtenues, sont plus importants. C'est pourquoi il a également été proposé des systèmes dits multicapillaires comportant une barrette de plusieurs capillaires juxtaposés. En particulier, il a été proposé des systèmes d'électrophorèse multicapillaires dans lesquels le faisceau laser d'excitation des molécules est envoyé sur celles-ci au travers des parois des capillaires, selon un axe dans le plan de la barrette selon laquelle lesdits capillaires sont répartis. Ledit axe est généralement perpendiculaire à la direction selon laquelle les capillaires s'étendent, la fluorescence des molécules étant observées par des moyens de réception présentant un axe optique perpendiculaire au plan de la barrette des capillaires. On pourra par exemple à cet égard se référer à la publication A capillary Array Gel Electrophresis System Using Multiple Laser Focusing for DNA Sequencing "- T. Anazawa, S. Takahashi, H. Kambara - Anal. Chem. - Vol. 68, N 15, - 1e Août 1996 - p. 2699-2704. Toutefois, une telle technique est peu satisfaisante compte tenu du bruit de détection résultant de l'interaction de la lumière d'excitation et de la fluorescence des parois du capillaire. En outre, le faisceau laser perd en intensité au fur et à mesure qu'il traverse les capillaires, de sorte que les molécules qui se trouvent dans les capillaires les plus éloignés de la source laser sont moins excitées que celles qui se déplacent dans les premiers capillaires. Pour résoudre ce problème, il a également été proposé, notamment dans: "Capillary Array Electrophoresis Using Laser-Excited Confocal Fluorescence Detection"- X. Huang, M. Quesada, R. Mathies - Anal. Chem. 1992, 64, 967-972, d'utiliser un faisceau d'excitation émis perpendiculairement par rapport au plan de la barrette et de réaliser une détection de la fluorescence par des moyens optiques dont l'axe est confondu avec celui du faisceau, cet axe et le faisceau d'excitation étant déplacés successivement dans le temps de capillaire en capillaire. Mais cette technique n'est pas non plus satisfaisante étant donné qu'elle nécessite des moyens mécaniques complexes et qu'en outre le déplacement des moyens de détection d'un capillaire à un autre induit beaucoup de temps mort. On connaiît par ailleurs des systèmes multicapillaires dans lesquels les molécules qui traversent les capillaires sont excitées par un rayonnement laser qui est envoyé, juste en sortie de la barrette, dans le plan de ladite barrette et perpendiculairement à la direction selon laquelle les capillaires s'étendent. La fluorescence des molécules excitées par ce rayonnement est détectée au moyen notamment d'une caméra CCD qui est orientée avec un axe perpendiculaire au plan de la barrette de capillaires. Un système de ce type est par exemple présenté dans la publication: "Analysis of Nucleic Acids by Capillary Electrophoresis. " - C. Heller p. 236 à 254 - Editions Vieweg - 1997. L'excitation des molécules et la détection de la fluorescence en dehors des capillaires assure un niveau de signal sur bruit supérieur à celui accessible dans les schémas de détection classiques, o l'excitation et la détection a lieu directement au travers des parois des capillaires. Toutefois, un tel système oblige à prévoir des moyens empêchant que les molécules en sortie des différents capillaires ne divergent de façon trop importante. Ceci est généralement réalisé au moyen de flux laminaires de tampon, ce qui nécessite pour la cuvette dans laquelle les capillaires sont reçus une réalisation mécanique de haute précision dans du verre. En particulier, le dispositif devra permettre d'éviter toute bulle de gaz venant perturber le flux. Comme on l'aura compris, une telle technique présente l'inconvénient majeur d'être très onéreuse. En outre, elle ne permet pas à l'opérateur de manier aisément les capillaires, qui doivent être pré-remplis au moment de la fabrication. Et on constate dans la pratique que cette technique est difficilement utilisable autrement que par des spécialistes. Un but de l'invention est donc de proposer un dispositif d'électrophorèse multicapillaires dans lequel l'excitation des molécules et la détection de leur fluorescence sont réalisées en sortie des capillaires, qui ne présente pas les inconvénients des systèmes antérieurs et qui est particulièrement fiable, facile d'utilisation, et présente des performances permettant un séquençage et un génotypage à haut débit. A cet effet, l'invention propose un dispositif d'électrophorèse multicapillaires comportant une pluralité de capillaires juxtaposés, des électrodes qui imposent un champ électrique entre les extrémités des capillaires, au moins une source pour l'émission d'un faisceau destiné à exciter des molécules en sortie du capillaire, des moyens pour détecter la fluorescence des molécules excitées par ledit faisceau, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens pour appliquer en sortie des capillaires un champ électrique de confinement qui impose aux molécules de se déplacer sensiblement sans divergence dans l'axe desdits capillaires. Un tel dispositif est avantageusement complété par les différentes caractéristiques suivantes prises seules ou selon toutes leurs combinaisons techniquement possibles: - il comporte au moins une électrode intermédiaire qui, avec la (ou les) électrode(s) en sortie des capillaires, impose au niveau de ladite sortie un champ électrique de confinement; - le potentiel qui est appliqué à cette électrode intermédiaire est à une valeur entre celles des potentiels des électrodes imposant un champ électrique entre les extrémités des capillaires - les capillaires sont répartis de façon que le champ électrique en sortie d'un capillaire soit confiné latéralement par le champ électrique en sortie des capillaires adjacents; - l'épaisseur des parois des capillaires est inférieure à leur diamètre interne; - les capillaires sont répartis en barrette(s) et dans la direction perpendiculaire au plan de la (ou des) barrette(s), le champ électrique en sortie des capillaires est confiné par la géométrie de la cavité dans laquelle lesdits capillaires sont reçus; une barrette de capillaires est comprise entre des lames diélectriques qui, en sortie des capillaires, présentent un décrochement et sont espacées d'une distance inférieure ou égale au diamètre externe desdits capillaires - il comporte en regard des capillaires une pluralité d'orifices qui sont alignés avec lesdits capillaires et dans lesquels les champs électriques en sortie des capillaires sont canalisés; - seul un capillaire sur deux est chargé en échantillons - il ne comporte des orifices qu'en regard des capillaires chargés; - les orifices sont des extrémités de capillaires. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront encore de la description qui suit. Cette description est purement illustrative et non limitative. Elle doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels - la figure 1 est une représentation schématique en perspective avec arraché d'un dispositif conforme à un mode de réalisation possible de l'invention; - la figure 2 est une représentation schématique en vue de dessus du montage de confinement du dispositif de la figure 1; - la figure 3 est une représentation schématique en vue de dessus illustrant les lignes de courant selon lesquelles les molécules sortant du capillaire se déplacent en sortie d'un capillaire; - la figure 4 est une représentation semblable à celle de la figure 3 illustrant un autre mode de réalisation possible de l'invention; - les figures 5a et 5b sont des représentations schématiques en vue en coupe axiale et transversale illustrant les moyens utilisés pour réaliser un confinement selon la direction perpendiculaire au plan d'une barrette de capillaires avec un dispositif du type de celui illustré sur la figure 4; - les figures 6 et 7 sont des représentations schématiques semblables à celles des figures 3 et 4 illustrant d'autres modes de réalisation encore possibles pour l'invention. Le dispositif qui est illustré sur les figures let 2 comporte - un récipient 1 dans lequel est défini un canal la, - une barrette 2 de capillaires 2a qui s'étend en partie dans le canal dudit récipient 1, une cuve 3 dans laquelle ladite barrette de capillaires 2 est reçue à une extrémité et dans laquelle est disposée une cathode 4, - une anode 5 disposée dans le canal du récipient 1 en aval de l'autre extrémité de la barrette de capillaires 2, - une cavité de détection 6 dans laquelle ladite extrémité de la barrette 2 de capillaires est reçue, - une électrode 7 intermédiaire qui est disposée dans le canal du récipient 1 en amont de l'extrémité de la barrette 2, - des moyens 8 pour imposer des différences de potentiel données entre la cathode 4 et l'anode 5, ainsi qu'entre l'électrode intermédiaire 7 et l'anode 5. Le canal la est rempli de tampons ou d'une solution de polymères identique à celle du milieu de séparation électrophorétique dans les capillaires. L'électrode intermédiaire 7 est une électrode métallique perpendiculaire aux capillaires de la barrette 2 et parallèle à l'anode 5. Cette électrode 7 est par exemple un fil métallique ou encore une plaque métallique percée de trous traversés par les capillaires de la barrette 2. Bien entendu, de nombreuses autres réalisations peuvent également convenir. Les électrodes 5 et 7 baignent dans des tampons ou des solutions de polymères, qui sont reliés au travers du canal la. Le potentiel qui est appliqué à cette électrode intermédiaire 7 est à une valeur entre celle du potentiel appliqué à l'anode 5 et celle du potentiel appliqué à la cathode 4. Ainsi, l'électrode intermédiaire 7 permet d'établir en sortie des capillaires 2a un champ électrique qui, au lieu d'être divergent comme c'est généralement le cas, est sensiblement parallèle aux axes des capillaires, comme l'illustre les flèches de la figure 2 qui symbolisent le sens des lignes de courant entre les électrodes 5 et 7. En effet, avec les répartitions classiquement utilisées pour les capillaires, en l'absence de champ de confinement, les champs en sortie des capillaires divergent fortement: ils sont équivalents à celui d'une charge ponctuelle radiale. Avec le champ de confinement imposé par l'électrode intermédiaire 7, le mouvement des molécules analysées se poursuit quasiment linéairement au delà des capillaires 2a. Plus précisément, la valeur du potentiel de l'électrode 7 est préférentiellement choisie pour que les lignes selon lesquelles les molécules à analyser se déplacent soient, en sortie du capillaire 2a, du type de celles illustrées par les flèches de la figure 3. A titre d'exemple, les différents éléments constitutifs du dispositif qui vient d'être décrit peuvent présenter les caractéristiques suivantes. Le récipient 1 est en plexiglas et est d'une hauteur de I cm, d'une largeur de 1.5 cm et d'une longueur de 12cm. La cavité de détection 6 est disposée sur le fond du canal la. Elle est de forme rectangulaire et présente une section ajustée à celle de la barrette 2 de capillaires. Elle est constituée de deux plaques en téflon d'épaisseur égale au diamètre externe des capillaires utilisés (de 36Optm), de longueur sensiblement égale à 2cm, posés sur le fond du récipient principal et entre lesquels sont interposés des espaceurs. La largeur de ces espaceurs (environ égale à 0.5cm) est ajustée pour que la profondeur de la cavité corresponde à celle de la rangée de capillaires. Une lamelle de microscope en verre de 2mm d'épaisseur pressée sur les séparateurs sert de couvercle à la cavité 6. Les capillaires 2a sont revêtus de polyimide jusqu'à leurs extremités. L'excitation des molécules dans la cavité 6 est réalisée en sortie des capillaires 2a par un faisceau qui est perpendiculaire à l'axe desdits capillaires et qui est soit dans le plan dans lequel lesdits capillaires 2a sont répartis, soit perpendiculaire à ce plan. Dans le premier cas, la largeur de la barrette 2 de capillaires est limitée par la divergence naturelle du faisceau laser, mais tout le faisceau est exploité pour exciter les molécules dans tous les capillaires. Dans le deuxième cas, on utilise par exemple un faisceau elliptique dont le grand axe est d'une longueur correspondant à la largeur de la barrette des capillaires 2a. Seule une fraction du faisceau sert effectivement à l'excitation du signal. La détection de la fluorescence peut être réalisée perpendiculairement au plan de la barrette des capillaires. Les inventeurs ont testé un dispositif de ce type en y faisant migrer en continu de la fluoresceine. Un faisceau laser (à une longueur d'onde de 488 nm et émis avec une puissance de 10mW) éclaté sur une largeur d'environ lcm était focalisé perpendiculairement à l'axe des capillaires, à une distance réglable des extremités. La lumière de fluorescence était collectée par un appareil photographique muni d'un objectif macro et d'un filtre coloré SCHOTT coupant la lumière laser, placé à la verticale de la zone de détection. Pour cette expérience, les capillaires 2a étaient insérés de 1.5cm à l'intérieur de la cavité de détection 6; l'électrode intermédiaire 7 était un simple fil électrique de diamètre lmm placé à 2cm des extrémités (à l'extérieur de la cavité 6) et simplement pressé contre les capillaires 2a; l'anode 5 était un fil identique placé en regard des capillaires 2a, en dehors de la cavité de détection 6, à 2cm des extrémités. Les électrodes 4, 5 et 7 étaient en contact électrique au travers de la solution de polymère (Hydroxylpropylcellulose à 0.5% en solution dans du tampon TBE 0. IX) qui remplit la cavité 6 et les capillaires 2a. Le montage était mis sous tension par deux alimentations en série un premier étage, haute tension, entre la cathode 4 à l'entrée des capillaires 2a et l'électrode intermédiaire 7 assurait la différence de potentiel dans les capillaires 2a pour la migration électrophorétique (correspondant à un champ de 35 à 70 V/cm) un second étage, à plus faible tension, entre l'électrode intermédiaire 7 et l'anode 5, impose le champ électrique dans la cellule de détection que constitue la cavité 6 (champ de l'ordre de 75 V/cm). Le potentiel de l'électrode intermédiaire 7 était fixé à la masse. Il a été constaté que les courants issus des capillaires 2a étaient confinés et que les bandes en sortie des capillaires 2a étaient séparées. Ces bandes sont d'autant plus confinées que le champ extérieur est intense. D'autres modes de réalisation que celui qui vient d'être décrit sont bien entendu envisageables. En particulier, il est en fait possible, dans une géométrie réduite, de confiner les lignes de champ sortant des capillaires sans électrode intermédiaire. Par exemple, on peut utiliser des capillaires 2a dont les épaisseurs et les diamètres internes sont suffisamment faibles pour que, lorsque lesdits capillaires 2a sont disposés de façon contiguë, l'élargissement latéral du champ soit limité par l'entre-axe entre les capillaires 2a. Les molécules issues d'un capillaire 2a, qui suivent les lignes de champ, restent isolées de celles des capillaires 2a adjacents. C'est ce qui a été illustré sur la figure 4. Dans cette configuration o les capillaires sont contigus, l'épaisseur des parois desdits capillaires est préférentiellement inférieure à leur diamètre interne. Dans la direction perpendiculaire au plan de la barrette de capillaires, l'élargissement peut être limité par une géométrie étroite de la cavité de détection 6, ajustée au diamètre des capillaires 2a. C'est ce qu'on a illustré sur les figures 5a et 5b, qui illustre une configuration dans laquelle la barrette 2 de capillaires 2a est prise entre des lames 9 en des matériaux dielectriques, lesdites lames 9 se prolongeant au delà desdits capillaires. La distance entre les lames 9 est préférentiellement inférieure ou égale au diamètre externe des capillaires. A cet effet, les lames 9 présentent un décrochement en sortie des capillaires. En variante encore, que l'on utilise des dispositifs avec ou sans électrode intermédiaire, on peut charger uniquement un capillaire sur deux en échantillons à analyser, ce qui permet de séparer plus distinctement les signaux de chaque voie d'analyse, puisque celles-ci sont séparées par les lignes de courant des capillaires intermediaires. En variante encore, il peut être prévu que les extrémités des capillaires 2a de séparation électrophorèse font face à une série d'orifices dans lesquels le champs électrique est canalisé, ces orifices pouvant avantageusement être constitués par des capillaires 10 placés dans l'alignement des capillaires 2a (figure 6). Les lignes de courant sont alors d'avantage confinées. Ce confinement peut encore être renforcé en ne chargeant en échantillons à analyser qu'un capillaire sur deux et en disposant des capillaires 10 uniquement en regard des capillaires 2a destinés à être chargés. Comme l'illustre la figure 7, cette configuration permet de canaliser dans les capillaires 10 les lignes de champ des capillaires 2a chargés et des capillaires 2a intermédiaires. Les dispositifs qui viennent d'être décrits présentent de nombreux avantages par rapport aux dispositifs de détection hors capillaires connus à ce jour, et notamment par rapport aux dispositifs à flux laminaire. Notamment, ils présentent une haute sensibilité et permettent une grande dynamique de détection. Ils sont d'une grande facilité d'utilisation. Ils permettent également de faire baigner les capillaires dans des solutions visqueuses de polymère, alors que les techniques à flux capillaire nécessitaient des capillaires remplis de gel et un flux de tampon. En outre, les dispositifs proposés permettent un remplissage aisé des capillaires, la solution visqueuse de polymère pouvant être injectée à partir du récipient de sortie, une fois les capillaires en place. Egalement, alors que les capillaires remplis de gel utilisés avec les techniques à flux laminaire ne peuvent être utilisés qu'une seule fois, les dispositifs proposés permettent de laisser les capillaires en place, pour plusieurs analyses, avec par exemple un cycle d'évacuation, de rinçage et de chargement automatique d'une nouvelle matrice de séparation. Par ailleurs, les échantillons peuvent y être chargés par pression hydraulique, alors que dans les dispositifs à flux laminaire, seule une injection électrocinétique est possible. Egalement, le dispositif proposé par l'invention permet une tolérance plus importante sur les alignements des capillaires. La fabrication du dispositif est simplifiée. Enfin, les structures qui viennent d'être décrites présentent l'avantage de pouvoir être utilisées avec des capillaires répartis matriciellement, selon plusieurs barrettes superposées. REVENDICATIONS 1. Dispositif d'électrophorèse multicapillaires comportant une pluralité de capillaires (2a) juxtaposés, des électrodes (4, 5) qui imposent un champ électrique entre les extrémités des capillaires (2a), au moins une source pour l'émission d'un faisceau destiné à exciter des molécules en sortie du capillaire, des moyens pour détecter ia fluorescence des molécules excitées par ledit faisceau, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens (2a, 7) pour appliquer en sortie des capillaires (2a) un champ électrique de confinement qui impose aux molécules de se déplacer sensiblement sans divergence dans l'axe desdits capillaires (2a). 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une électrode intermédiaire (7) qui, avec la (ou les) électrode(s) en sortie des capillaires (2a), impose au niveau de ladite sortie un champ électrique de confinement. 3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que le potentiel qui est appliqué à cette électrode intermédiaire est à une valeur entre celles des potentiels des électrodes imposant un champ électrique entre les extrémités des capillaires (2a). 4. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les capillaires (2a) sont contigus et sont de diamètre interne et externe tels que le champ électrique en sortie d'un capillaire est confiné latéralement par le champ électrique en sortie des capillaires (2a) adjacents. 5. Dispositif selon la revendication 4, caractérise en ce que l'épaisseur des parois des capillaires est inférieure à leur diamètre interne. 6. Dispositif selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que les capillaires (2a) sont répartis en barrette(s) et en ce que dans la direction perpendiculaire au plan de la (ou des) barrette(s), le champ électrique en sortie des capillaires (2a) est confiné par la Géométrie de la cavité dans laquelle lesdits capillaires (2a) sont reçus. 7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'une barrette de capillaires est comprise entre des lames diélectriques qui, en sortie des capillaires, présentent un décrochement et sont espacées d'une distance inférieure ou égale au diamètre externe desdits capillaires. 8. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en regard des capillaires (2a) une pluralité d'orifices (10) qui sont alignés avec lesdits capillaires (2a) et dans lesquels les champs électriques en sortie des capillaires (2a) sont canalisés. 9. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que seul un capillaire (2a) sur deux est chargé en échantillons. 10. Dispositif selon les revendications 8 et 9, caractérisé en ce qu'il ne comporte des orifices qu'en regard des capillaires chargés. 1l. Dispositif selon l'une des revendications 8 ou 10, caractérisé en ce que les orifices sont des extrémités de capillaires (10).