FR 2779446 A1 19991210 FR 9807238 A 19980609 L'invention est relative à un procédé de synthèse enzyma- tique de désoxyribonucléosides triphosphates (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP 13 2 15 18 et dTTP) uniformément marqués aux isotopes stables ( C, H, N, O) ou radioactifs ( 4C) ainsi qu'à ses applications, telles que: - le marquage uniforme ou sélectif de molécules d'ADN, pour la détermination de leur structure par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN); lorsque lesdites molécules d'ADN sont complexées à d'autres macromolécules, telles que des protéines, un marquage uniforme et à haut pourcentage de deutération (OH) permet d'occulter les signaux d'un des parte- o0 naires au sein du complexe, et par conséquent de simplifier les spectres RMN ou - le marquage d'oligonucléotides destinés entre autre à la thérapie génique afin d'en déterminer le métabolisme et d'effectuer des études de biopharmacie (biodisponibilité, bioéquivalence). Le changement de la composition isotopique d'un compose par enrichissement en un ou plusieurs des isotopes (radioactifs ou stables) de ses éléments constitutifs va conférer à ce composé des propriétés qui vont faire de celui-ci un traceur des processus dans lesquels il est engagé. Le marquage de macromolécules biologiques par des dérivés isotopiques permet donc de suivre le devenir de ces macromolécules dans des milieux plus ou moins complexes, et en particulier dans le milieu biolo- gique. Le marquage aux isotopes stables, qui permet de synthétiser des iso- topomères de ces molécules dans lesquelles un ou plusieurs sites molécu- laires précis voient leurs atomes remplacés quantitativement (ou presque) par un de leurs isotopes, est très utilisé à des fins d'études structurales et dyna- miques de macromolécules en solution, en particulier par résonance magne- tique nucléaire (RMN). Cette dernière technique nécessite souvent un enri- chissement isotopique élevé ainsi que la mise en oeuvre d'une quantité importante de molécules. Si ce type de marquage est utilisé depuis quelques années dans le cas d'études des protéines, ce n'est qu'en 1992 que deux études ont porté sur la production de ribonucléosides triphosphates (rNTPs) marqués aux isotopes stables en quantité suffisante pour effectuer des études par RMN de fragments d'acide ribonucléiques (ARN) marqués, préparés a partir de ces précurseurs (rNTPs) (Nikonowicz E.P. et al., N.A.R., 1992, 20, 4507- 4513; Batey R.T. et al., N.A.R., 1992, 20, 4515-4523). Dans ces études, les rNTPs marqués ont été obtenus par phosphorylation enzymatique in vitro de ribonucléosides monophosphates (rNMPs) résultant de l'hydrolyse enzymatique de l'ARN de bactéries cultivées io sur milieu marqué (13C ou 15N). De manière plus précise, le procédé décrit dans ces deux articles, pour l'obtention d'ARN marqué uniformément en quantité suffisante, comprend: - la culture de bactéries (E. coli ou Methylophilus methylo- trophus) sur milieu enrichi en 3C ('3C-glucose ou '3C-méthanol) et/ou en '5N (15N-ammoniaque), - la lyse des cellules pour l'obtention des acides nucléiques totaux, - I'hydrolyse des acides nucléiques, qui permet d'obtenir des rNMPs en quantités importantes et des dNMPs en très petites quantités et la récupération des rNMPs, - la phosphorylation enzymatique des rNMPs, pour l'obtention d'un mélange de rNTPs, - la purification des différents rNTPs et - la transcription in vitro desdits rNTPs en ARN souhaité. Une tentative analogue de production de désoxyribonucléo- sides triphosphates (dNTPs) uniformément marqués a été proposée en 1995 par Zimmer D.P. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1995, 92, 3091-3095), à partir de dNMPs résultant de l'hydrolyse enzymatique d'acide désoxyribo- nucléique (ADN) de bactéries. Si le principe même de cette approche semble valide, le coût nettement plus élevé de la production de dNTPs que de rNTPs rend la production à grande échelle de ces composés difficilement envisa- geable par cette méthode. En effet, alors que la lyse de 4 g de cellules M. methylo- trophus fournit environ 33 mg de rNMPs (Batey R.T. et al., précité), la lyse de 3 g des mêmes cellules ne fournit que 10 pimoles de dNMPs soit environ 3,3 mg (Zimmer D.P. et al., précité). Ce surcoût de production est dû à divers facteurs, qui sont essentiellement les suivants (Pardi A., Curr. Opinion in Structural Biol. ,1992, 2, 832-835): 1/ Les organismes utilisés pour la production des précurseurs monophosphates contiennent plus, voire beaucoup plus d'ARN que d'ADN (80 à 90% des acides nucléiques d'une cyanobactérie sont sous forme d'ARN contre 10 à 20% d'ADN; ce rapport pouvant aller jusqu'à 1% ADN/99% ARN dans le cas de levures en fonction des conditions de croissance). 2/ Le rendement d'hydrolyse de l'ARN en dérivés mono- phosphates est beaucoup plus élevé que celui de l'ADN. Ceci est dû au fait que l'ADN est essentiellement sous forme double brin dans les cellules des organismes utilisés et que les exonucléases nécessaires pour générer les dérivés monophosphates de départ présentent en général une moins bonne affinité pour ce type de molécules que pour des acides nucléiques simples brins. 3/ Les rNMPs résultant de l'hydrolyse quantitative de l'ARN peuvent être purifiés très tôt dans le processus de synthèse des dérivés triphosphates par fixation sur une colonne d'affinité, ce qui n'est pas le cas des dNMPs. Cette purification précoce facilite les étapes ultérieures en élimi- nant des inhibiteurs potentiels de ces étapes. Or, il est important de pouvoir disposer d'ADNs uniformément et/ou sélectivement marqués, en vue de leur utilisation pour la détermination de ieur structure ou de leur métabolisme in vivo (suivi de ces molécules en thérapie génique). C'est pourquoi les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à un procédé de préparation à grande échelle de dNTPs marques, en vue de leur utilisation pour la préparation de molécules d'ADNs souhai- tées, uniformément marquées, qui réponde donc mieux aux besoins de la s pratique que les procédés antérieurement décrits (Zimmer D.P. et al., pré- cité). La présente invention a pour objet un procédé de production de dNTPs uniformément ou sélectivement marqués, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de rNMPs marqués, dans lesquels N = A, C, G ou U, obtenus à partir d'une culture d'un organisme procaryote ou eucaryote convenable dans un milieu enrichi en au moins un isotope stable ou radioactif d'au moins un éleément constitutif desdits rNMPs, en dNTPs marqués, dans lesquels N = A, C, G ou T, avec le même taux d'enrichissement que les rNMPs, en présence d'une batterie d'enzymes adaptées à ladite transforma- 1s tion, qui comprend essentiellement une étape de phosphorylation enzyma- tique en présence de nucléotide kinases appropriées, pour l'obtention de dérivés di- ou triphosphatés, une étape de réduction enzymatique des dérivés di- ou triphosphatés obtenus, en présence d'une ribonucléoside diou triphosphate réductase, la transformation du dUTP obtenu en dTTP, par I'action successive de dUTPase, de thymidylate synthase (TS) et de désoxynucléotide kinase et éventuellement la séparation et/ou la purification des différents dNTPs obtenus, dans lesquels N = A, C, G ou T. Conformément à l'invention, ledit procédé de production de dNTPs uniformément ou sélectivement marqués comprend, de manière plus précise, dans un premier mode de mise en oeuvre: (a) I'obtention d'un mélange de rNMPs marqués, dans lesquels N = A, C, G ou U, à partir d'une culture d'un organisme procaryote ou eucaryote convenable, dans un milieu enrichi en au moins un isotope stable ou radioactif des éléments constitutifs desdits rNMPs (carbone, hydro- gène, azote ou oxygène), (b) la triphosphorylation des rNMPs dans lesquels N = A, C ou G (rAMP, rCMP et rGMP), en dérivés rNTPs correspondants, en présence de nucléotide kinases appropriées et l'obtention d'un mélange comprenant du rATP, du rCTP, du rGTP et du rUMP, (c) la réduction des trois dérivés triphosphates (rATP, rCTP, rGTP) obtenus en (b) en dérivés désoxy-correspondants (dNTPs dans lesquels N = A, C ou G: dATP, dCTP, dGTP), en présence d'une ribonucléo- side triphosphate réductase (RTPR), (d) I'isolement du rUMP du mélange obtenu en (c), (e) la triphosphorylation dudit rUMP en rUTP, en présence de nucléotide kinases appropriees, suivie d'une réduction du rUTP en dérivé désoxy-correspondant (dUTP), en présence d'une ribonucléoside triphosphate réductase (RTPR), (f) la transformation du dUTP obtenu en (e), en dTTP par déphosphorylation en dérivé monophosphate correspondant (dUMP) en présence d'une dUTPase, transfert d'un groupement méthyle provenant du ,10-méthylène tétrahydrofolate sur la position 5 du cycle de la molécule de dUMP, en présence d'une thymidylate synthase (TS), générant ainsi le dTMP et triphosphorylation du dTMP en dTTP, en présence de nucléotide kinases appropriées et (g) éventuellement la séparation et/ou la purification des diffé- rents dNTPs obtenus en (c) et en (f). De manière surprenante, si la biomasse de départ fournissant les rNMPs précurseurs est marquée, on obtient des produits finaux dNTPs, marqués avec le même taux d'enrichissement que les rNMPs, avec un rendement significativement supérieur à celui obtenu si l'on considère les seuls dNMPS. On obtient par exemple un rendement supérieur d'un facteur de l'ordre de 10, lorsque l'on met en oeuvre des cyanobactéries. Le principe général de cette transformation est basé sur l'utili- sation d'enzymes toutes disponibles soit sous forme commerciale, soit sous forme clonée et donc faciles à surexprimer et à produire en quantité impor- tante. Un très haut pourcentage de transformation des rNMPs en dNTPs est obtenu sans perte d'enrichissement isotopique, malgré la complexité relative du processus dans son ensemble. Dans un premier temps, trois des quatre dérivés rNMPs sont triphosphorylés en dérivés rNTPs correspondants (rAMP, rCMP et rGMP) alors que le quatrième (rUMP), qui nécessite une transforma- tion plus complexe, est laissé inchangé afin de pouvoir mieux être séparé des trois autres dans une réaction ultérieure. Les trois dérivés triphosphates (rATP, rCTP et rGTP) obtenus sont ensuite réduits en dérivés désoxy corres- pondants (dATP, dCTP et dGTP) à l'aide d'une ribonucléoside triphosphate réductase (RTPR). Le quatrième nucléotide (rUMP) est alors isolé des trois autres (dATP, dCTP et dGTP) par passage sur une colonne d'affinité retenant spécifiquement les composés possédant une fonction cis-diol (ce qui est le cas du ribose de la molécule de rUMP et pas de celui du désoxyribose présent dans les molécules de dATP, dCTP et dGTP). Le rUMP isolé est i5 alors triphosphorylé à son tour en rUTP, puis réduit en dUTP à l'aide d'une RTPR. La molécule de dUTP synthétisée doit ensuite être transformée en dTTP, qui est le quatrième désoxyribonucléotide entrant dans la composition de l'ADN. Pour cela, le dUTP est, dans un premier temps, déphosphorylé en dérivé monophosphate correspondant (dUMP) en présence d'une dUTPase, puis soumis à l'action de l'enzyme thymidylate synthase (TS), qui catalyse le transfert d'un groupement méthyle provenant du 5,10-méthylène tétrahydro- folate sur la position 5 du cycle de la molécule de dUMP, générant ainsi le dTMP. Ce dernier est ensuite triphosphorylé en dTTP, fournissant ainsi le quatrième et dernier des quatre dNTPs entrant dans la composition de l'ADN. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, I'organisme convenable selon l'étape (a) est une cyanobactérie ou une bactérie méthylotrophe (c'est-à-dire qui est capable d'utiliser le méthanol comme source carbonée). Les cyanobactéries sont des organismes photo-autotrophes capables de métaboliser le CO, le NO et l'eau. Certaines cyanobactéries, telles que Synechocystis sp. peuvent être adaptées progressivement à pousser en présence de quantités croissantes de D O (jusqu'à 99,9%; maxi- mum de pureté commerciale disponible). Si la culture de ces organismes est 13 1 réalisée en présence de CO, NO et/ou de 100% ou proche de D O, la 2 3 2 13 15 2 biomasse obtenue sera uniformément marquée au C, N et/ou H(=D) aux mêmes taux. Si l'on part des quatre rNMPs uniformément marques au C, 13 5 au C et/ou au N provenant de l'hydrolyse de l'ARN de cyanobactéries culti- vées dans un milieu uniformément marqué à plus de 99%, les quatre dNTPs o obtenus par cette méthode de transformation peuvent être obtenus unifor- mément marqués à plus de 99%, avec un rendement global de transformation de l'ordre de 90% par rapport à la quantité initiale de rNMPs en ce qui concerne l'AMP et le CMP et de l'ordre de 70% en ce qui concerne le GMP et l'UMP. s Dans le cas d'un marquage au N, aucune précaution parti- culière n'est à prendre lors de la transformation pour obtenir des produits ayant un pourcentage de marquage identique à celui du produit de départ. Dans celui du marquage au C (seul ou en combinaison) ou au C, le formaldéhyde utilisé pour la synthèse in situ du 5,10-méthylène 13 14 tétrahydrofolate devra être uniformément marqué au C ou au C, si l'on veut maintenir 100% du marquage du produit de départ. Ces produits sont disponibles commercialement. Dans celui enfin du marquage au deutérium ( H), qui est le plus délicat à réaliser du fait de la cytotoxicité du produit au delà de 90%, pour la plupart des organismes vivants, il faudra effectuer les étapes de réduction (passage du ribo- au désoxyribonucléotide correspondant (figure 1) dans un milieu uniformément deutéré afin de maintenir le taux de deutération au niveau du sucre du nucléotide (Voir figure 2: exemples de I'uridine et de la thymidine). En ce qui concerne le dTTP, il peut être obtenu deutéré à 75% ou 91% selon que l'on utilise du formaldéhyde (HCHO) standard ou du formal- déhyde uniformément deutéré pour la préparation in situ de la molécule de ,10-méthylène tétrahydrofolate d'o le groupement méthyle en position 5 du cycle de la molécule de dTTP est issu (Voir également figure 2, les structures comparees de l'uridine et de la thymidine). Une deutération à 100% de la valeur du produit de départ nécessiterait l'utilisation de DTT deutéré et de ,10-méthylène tétrahydrofolate uniformément deutéré, produit qui n'est pas disponible actuellement. L'étape (a) en tant que telle a précédemment été décrite par 1o Nikonowicz et al. ou Batey et al. (références précitées, 1992). Toutefois, dans le cadre de la présente invention, ce sont les produits de dégradation de î'ARN de cyanobactéries, uniformément marqués par culture sur milieu adéquat, à savoir les rNMPs, qui servent, de préférence, de produits de départ de la synthèse des dNTPs (figure 1). Ces rNMPs représentent entre 15 et 20 fois la quantité de dNMPs que l'on peut obtenir à partir de l'hydrolyse partielle de l'ADN de ces microorganismes. Conformément à l'invention, préalablement a l'étape (b), lesdits rNMPs sont de préférence purifiés, pour éliminer les dNMPs présents en petites quantités et les contaminants de la préparation de nucléotides monophosphates. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, la triphosphorylation de l'étape (b) est de préférence mise en oeuvre à 37 C par incubation des rNMPs avec une adénylate kinase (AdK) en quan- tité optimisée pour assurer une phosphorylation complète du rAMP et du rCMP, tout en prévenant celle du rUMP, qui est pourtant reconnu comme substrat de cette enzyme, mais avec une affinité moindre, une guanylate kinase (GK), une pyruvate kinase (PK), du phosphoénol pyruvate (PEP) et de l'ATP non marqué, pour amorcer les réactions de phosphorylation. On entend par quantité optimisée, au sens de la présente invention, des quantités d'enzyme en excès. Par exemple si l'on compare aux quantités utilisées dans l'Art Antérieur (Batey et al. précité), AdK est utilisée à une quantité finale supérieure d'au moins 10 - 35 % et de préférence d'au moins 30 % par rapport à celle utilisée par Batey et al. (précité), dans le cas o l'on ne souhaite pas phosphoryler le rUMP, sur la base d'une quantité identique de substrat à transformer; la quantité de GK est au moins trois fois supérieure et celle de PK est au moins le double. De préférence, le phosphoénol pyruvate est également utilisé en excès. De manière générale, les quantités d'enzymes utilisés, n'ont de sens que par rapport à la quantité de substrat que l'on veut transformer. Les temps d'incubation sont variables et dépendent du pourcentage de produit formé (analyse par HPLC) et/ou de la concentration en enzyme. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, la réduction de l'étape (c) est de préférence mise en oeuvre à 37 C, en présence d'un agent réducteur, de préférence sélectionné parmi des thiols, tels que le dithiotréitol (DTT) ou le dihydrolipoate et de la ribonucléoside triphosphate réductase (RTPR) de Lactobacillus leichmanii. Le rUMP est isolé (étape (d)) du mélange contenant le dATP, le dCTP et le dGTP par chromatographie d'affinité sur une colonne de boro- nate, qui retient sélectivement, à pH basique, les molécules présentant des groupements cis-diols (cas du ribose présent dans le rUMP) par formation d'une liaison covalente, réversible à pH acide (pH 3) entre le diol et la fonction boronate de la colonne (Batey et al., 1992, précité). Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, le rUMP isolé à l'étape (d) est triphosphorylé à l'étape (e) en rUTP, par incubation dudit rUMP à 37 C avec de l'adénylate kinase (AdK) en quantité significativement supérieure, par exemple de l'ordre d'au moins un facteur 10 par rapport à celle mise en oeuvre à l'étape (b), de la pyruvate kinase (PK) et du phosphoénol pyruvate; le rUTP obtenu est réduit en dUTP, par l'action, à 37 C, d'un agent réducteur, de préférence sélectionné parmi des thiols, tels que le dithiotréitol (DTT) ou le dihydrolipoate et de la ribonucléoside triphosphate réductase (RTPR) de Lactobacillus leichmanii, dans un milieu présentant une haute force ionique, de préférence supérieure à 0,5 M. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, la transformation du dUTP en dTTP, conformément à l'étape (f) comprend l'incubation à 37 C du dUTP, dans le milieu réactionnel obtenu en fin d'étape (e) avec une dUTPase, pour obtenir du dUMP, suivie de la synthèse du dTMP dans un tampon à pH sensiblement neutre par incubation de milieu réactionnel avec une thymidylate synthase (TS), en présence de o 5,10 méthylène tetrahydrofolate et éventuellement de la purification dudit dTMP obtenu par chromatographie en phase inverse, suivie de la phosphorylation du dTMP en dTTP en milieu à pH sensiblement neutre par incubation à 37 C du produit de la réaction précédente (dTMP) avec un mélange de désoxynucléotide kinase (TK), de pyruvate kinase et d'adénylate kinase, en présence d'ATP non marqué. Par exemple 0,8 U de TS correspondent à environ 0,3 U de TS/pmole de substrat (dUMP) transformé en produit (dTMP) en 30 minutes d'incubation à 37 C. Ce mode de mise en oeuvre permet de synthétiser les quatre dNTPs à partir des quatre rNMPs (figure 1) et de les purifier, si nécessaire. Toutefois, il existe plusieurs variantes audit procédé. Variante I: Dans cette variante, l'étape (al) est identique à l'étape (a) exposée ci-dessus; I'étape (bl) est différente de l'étape (b) et comprend la triphosphorylation des quatre rNMPs (y compris le rUMP) dans les conditions exposées ci-dessus; en (cl), cette variante comprend la réduction des quatre rNTPs par la RTPR, dans les conditions telles que précisées ci-dessus à l'étape (c); I'étape (dl) comprend la transformation du dUTP obtenu en (cl) en dTTP, par déphosphorylation en dUMP (action d'une dUTPase, hautement spécifique du dUTP, directement sur le mélange des quatre dNTPs obtenus), le transfert d'un groupement méthyle provenant du 5,10-méthylène tétrahydrofolate sur la position 5 du cycle de la molécule de dUMP, en ll présence d'une thymidylate synthase (TS), générant ainsi le dTMP et la triphosphorylation du dTMP en dTTP, en présence de nucléotide-kinases appropriées, dans les conditions exposées ci-dessus (figure 4). Conformément à cette variante, ledit procédé comprend: (al) I'obtention d'un mélange de rNMPs marqués, dans lesquels N = A, C, G ou U, à partir d'une culture d'un organisme procaryote ou eucaryote convenable dans un milieu enrichi en au moins un isotope stable ou radioactif du carbone, de l'hydrogène, de l'azote ou de l'oxygène, (bl) la triphosphorylation des rNMPs dans lesquels N = A, C, o G ou U (rAMP, rCMP, rGMP et rUMP), en dérivés rNTPs correspondants, en présence de nucléotide kinases appropriées et l'obtention d'un mélange comprenant du rATP, du rCTP, du rGTP et du rUTP, (cl) la réduction des quatre dérivés triphosphates (rATP, rCTP, rGTP et rUTP) obtenus en (bl) en dérivés désoxy-correspondants (dNTPs dans lesquels N = A, C, G ou U: dATP, dCTP, dGTP et dUTP), en présence d'une ribonucléotide triphosphate réductase (RTPR), et (dl) la transformation du dUTP obtenu en (cl), en dTTP par déphosphorvylation en dérivé monophosphate correspondant (dUMP) directe- ment sur le mélange des quatre dNTP obtenu en (cl) en présence d'une dUTPase, transfert d'un groupement méthyle provenant du 5,10-méthylène tétrahydrofolate sur la position 5 du cycle de la molécule de dUMP, en présence d'une thymidylate synthase (TS), générant ainsi le dTMP et triphos- phorylation du dTMP en dTTP, en présence de nucleotide kinases appro- priéees. Variante 2: Cette variante comprend la mise en oeuvre de l'étape de réduction, à savoir le passage du ribo- au désoxyribonucléotide au niveau des ribonucléosides diphosphates (rNDPs -> dNDPs), à l'aide de l'enzyme ribonucléoside diphosphatase réductase (RDPR) provenant d'autres organismes comme E. coli, par exemple (figure 5). Dans ce cas, la triphosphorylation des nucléotides se fait au niveau des dNDPs au lieu des rNDPs. Conformément a cette variante, ledit procédé comprend (a2) I'obtention d'un mélange de rNMPs marqués, dans lesquels N = A, C, G ou U, à partir d'une culture d'un organisme procaryote ou eucaryote convenable dans un milieu enrichi en au moins un isotope stable ou radioactif des éléments constitutifs desdits rNMPs (carbone, hydro- gène, azote ou oxygène), (b2) la diphosphorylation des rNMPs dans lesquels N = A, C, G ou U (rAMP, rCMP, rGMP et rUMP), en dérivés rNDPs correspondants, en io présence de nucléotide kinases appropriées et d'ATP, de préférence marqué, et l'obtention d'un mélange comprenant du rADP, du rCDP, du rGDP et du rUDP; cette étape est réalisée en l'absence de pyruvate kinase (PK) et de phosphoénol pyruvate (PEP), afin de ne pas obtenir directement des dérivés triphosphates, (c2) la réduction des quatre dérivés diphosphates (rADP, rCDP, rGDP et rUDP) obtenus en (b2) en dérivés désoxy-correspondants (dNDPs dans lesquels N = A, C, G ou U: dADP, dCDP, dGDP et dUDP), en présence d'une ribonucléoside diphosphate réductase (RDPR), (d2) la triphosphorylation des dNDPs dans lesquels N = A, C, G ou U (dADP, dCDP, dGDP et dUDP), en dérivés dNTPs correspondants, en présence de nucléotide kinases appropriées et l'obtention d'un mélange comprenant du dATP, du dCTP, du dGTP et du dUTP, (e2) la transformation du dUTP obtenu en (d2), en dTTP par déphosphorylation en dérivé monophosphate correspondant (dUMP) directe- ment sur le mélange des quatre dNTP obtenu en (d2) en présence d'une dUTPase, transfert d'un groupement méthyle provenant du 5,10-méthylène tétrahydrofolate sur la position 5 du cycle de la molécule de dUMP, en présence d'une thymidylate synthase (TS), générant ainsi le dTMP et la triphosphorylation du dTMP en dTTP, en présence de nucléotide kinases appropriées, dans les conditions exposées ci-dessus. Le procédé selon l'invention permet de synthétiser facilement des dNTPs d'une pureté bien supérieure à celle que l'on peut obtenir à partir des produits d'hydrolyse de l'ADN de la cyanobactérie utilisée, du fait, notamment de l'utilisation d'une colonne d'affinité pour les rNMPs, placée en début de procédure. Conformément à l'invention, le procédé utilise des voies métaboliques et des enzymes bien précises. Le même résultat final, à savoir la production de dNTPs à partir de rNMPs est également obtenu en utilisant des voies métaboliques o parallèles existantes, à savoir les variantes 1 et 2 (voir figures 4 et 5) ou susceptibles d'être créées artificiellement par modification des propriétés intrinsèques d'enzymes existantes ou par création de nouvelles activités. De même, des enzymes catalysant les mêmes réactions, mais provenant d'autres organismes peuvent également permettre d'arriver au même résultat final. C'est en particulier l'utilisation des produits de dégradation de l'ARN marqué, à savoir les rNMPs, pour synthétiser des dNTPs marqués par une série de transformations appropriées qui constitue l'originalité de l'inven- tion, quelle que soit la variante mise en oeuvre. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'ADN uniformément ou sélectivement marqué avec au moins un isotope stable ou radioactif d'au moins un des éléments constitutifs dudit ADN (carbone, hydrogène, azote ou oxygène), caractérisé en ce qu'il comprend: (1) la synthèse enzymatique de dNTPs uniformément ou sélectivement marqués conformément aux procédés décrits ci-dessus et (2) la production d'un ADN souhaitable en utilisant les dNTPs obtenus à l'étape (1), par exemple par duplication in vitro d'une matrice d'ADN. Le fait que les résidus T ne soient pas entièrement deutérés conduit à la synthèse de molécules d'ADN qui ne sont deutérées qu'à 90-95% (si l'on considère que la base T représente en moyenne 25% des bases totales), mais le fait que le défaut de deutération est parfaitement connu et uniforme (groupement méthyle de tous les résidus T), et donc parfaitement identifiable, fait que ce défaut ne devrait pas être gênant dans l'interprétation de spectres de RMN, par exemple, et peut être considéré comme un avan- tage, dans certains cas car il permet de s'assurer de la présence de la molé- cule d'ADN au sein d'un complexe protéine-ADN, et même de quantifier cet ADN, le cas échéant. Ce procédé peut être appliqué quel que soit le marquage 2 13 15 désiré ( H, C, N ou toutes les combinaisons entre ces isotopes), pourvu io que la biomasse de départ (d'o sont extraits les NMPs) soit marquée en conséquence. Dans la transformation décrite ci-dessous, des dNMPs deuté- rés ont été préparés à partir d'une biomasse de cyanobactéries deutérées à 98%. Le DTT utilisé pour réduire les rNTPs en dNTPs n'était pas deutéré (1 !s atome d'hydrogène sera donc introduit sur chaque molécule de ribose en position 2'). Le formaldéhyde utilisé pour transformer le dUMP en dTMPn'était pas deutéré non plus. Dans ces conditions, on ne peut s'attendre qu'à des pourcentages maximum de deutération de 88,2%, 88,2%, 87,2% et ,3%, respectivement pour le dATP, le dCTP, le dGTP et le dTTP, I'ensemble de la transformation est réalisé selon le processus décrit dans la figure 1. Outre les dispositions qui précèdent, I'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels: - la figure 1 est une représentation schématique d'un des modes de mise en oeuvre du procédé de synthèse enzymatique de dNTPs selon l'invention; - la figure 2 représente les structures comparées d'un ribo- nucléotide et d'un désoxyribonucléotide; - la figure 3 représente l'analyse HPLC de la réaction de triphosphorylation; - les figures 4 et 5 représentent d'autres modes de mise en oeuvre du procédé de synthèse enzymatique de dNTPs selon l'invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration objet de l'invention, dont ils ne consti- tuent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1: Obtention d'une biomasse uniformément deutérée à partir d'une culture de cyanobactéries. Les cyanobactéries Synechocystis sp. sont cultivées en fermenteur de 25 litres en présence de H O deutérée à 99,92% et des sels minéraux suivants préalablement déshydratés dans un dessicateur: 0,5 g/I KH 2PO, 1 g/I K2SO4, 1 g/I NaCI, 10 g/I Na2CO3, 2,5 g/I NaNO, 0,2 g/I MgSO, 0,04 g/I CaCI, 0,01 g/I FeSO et 0,08 g/I EDTA. Le pH du milieu est établi et maintenu automatiquement à une valeur de 9,5 durant toute la durée de la culture à l'aide de H SO. La culture est effectuée à 30 C, sous agitation 2 4 constante (150 tours/minute), sous un flux permanent d'argon de manière à prévenir une hydratation par l'eau atmosphérique. Les données de tempéra- ture, de pH, de vitesse d'agitation, de pression d'oxygène ainsi que l'évolution de la densité optique de la culture suivie à 366 nm (DO366) sont enregistrées automatiquement et rapportées par un ordinateur connecté au fermenteur. Lorsque la culture a atteint une DO d'environ 12, la culture est centrifugée à 000 g. La biomasse obtenue (2 g/I en poids sec par litre de culture) et donc tous ses constituants, dont les acides nucléiques, est deutérée a plus de 99%. Soixante litres de culture de cyanobactéries ont été nécessaires pour produire 120 g de biomasse sèche. EXEMPLE 2: Hydrolyse des acides nucléiques totaux. Les acides nucléiques totaux ont été essentiellement obtenus comme décrit par Batey et al. 1992 cité avec toutefois une étape supplémentaire de délipidation au départ, réalisée par traitement de la biomasse par un mélange d'acétone, de chloroforme et de méthanol dans un rapport 2/1/1. Cette étape conduit à l'obtention de 100 g de biomasse sèche délipidée d'o sont extraits les acides nucléiques totaux (1,51 g). L'hydrolyse de ces acides nucléiques est effectuée à 55 C, à une concentration en acides nucléiques égale à 50 A /ml dans un tampon 50 mM acétate d'ammonium 26O contenant 0,1 mM de ZnCI, pH 5,2, à l'aide de nucléase P1 (concentration finale: 1 U/ml). La nucléase libère des rNMPs à partir de l'ARN, ainsi que des dNMPs à partir de I'ADN mais nécessite comme substrats des acides nucléiques sous forme simple brin. En conséquence, les acides nucléiques totaux ont été dénaturés par chauffage à 100 C durant 5 minutes, suivi d'un refroidissement brutal dans un bain d'eau glacée durant 5 autres minutes, sous agitation forte, préalablement à l'addition de la nucléase. Le traitement d'hydrolyse est particulièrement efficace dans ces conditions en ce qui concerne l'ARN (hydrolyse pratiquement quantitative), alors qu'il n'est efficace qu'entre 30 et 50% (en dNMPs libérés) dans le cas de l'ADN. Cette efficacité est vérifiée par analyse par chromatographie liquide haute performance (HPLC) des produits d'hydrolyse. EXEMPLE 3: Purification des rNMPs. Les rNMPs sont purifiés par chromatographie d'affinité à 4 C, sur colonne d'Affi-gelT (Bio-Rad). Le support utilisé retient sélectivement, à pH basique, les molécules présentant des groupements cis-diols (ce qui est le cas du ribose présent dans les rNMPs) par formation d'une liaison covalente réaction réversible à pH acide (pH 3), entre le diol et la fonction boronate du support. Les 1,51 g d'acides nucléiques hydrolyses (amenés à pH 9,5, à l'aide de triéthylamine) sont déposés sur une colonne (20 x 5 cm) contenant 40 g d'Affi-gel préalablement équilibrée en tampon triéthylamine bicarbonate (150 mM, pH 9,5) à un débit de 4 ml/minute. Les dNMPs ne possédant pas de groupements cis-diols sont éliminés à cette étape ainsi que la grande majorité des contaminants de la préparation de nucléosides monophosphates. Les rNMPs (1,15 g, déterminé par DO et HPLC) sont ensuite élues de la colonne à l'aide d'acide acétique 150 mM (pH 3). Ils sont obtenus ici dans une proportion relative exprimée en moles de 24% rAMP, 26% rCMP, 30% rGMP et 20% rUMP. Méthode utilisée pour le suivi des réactions enzymatiques des Exemples 4à11: Toutes les réactions enzymatiques sont effectuées à 37 C Une mise au point individuelle de toutes les réactions enzy- matiques développées dans les Exemples 4 à 11 qui vont suivre doit être o réalisée pour chaque préparation de rNMPs, en prenant comme point de départ les valeurs données dans les exemples correspondants en respectant les rapports enzymes/substrats pour des temps d'incubation équivalents, la composition du mélange étant susceptible de varier d'une préparation à l'autre. Pour chaque réaction de phosphorylation, de réduction, de i5 déphosphorylation et de méthylation (voir figure 1), la mise au point est d'abord réalisée sur des fractions aliquotes des mélanges, en faisant varier les quantités d'enzymes et le temps d'incubation jusqu'à transformation totale ou maximale du ou des substrats en produits. Pour cela les quantités d'enzymes utilisées sont très généralement en large excès (à l'exception de la première réaction de phosphorylation des rNMPs en rNTPs o l'on veut phosphoryler à la fois I'AMP et le CMP à l'aide de l'AdK, sans toucher à l'UTP, qui est pourtant lui aussi substrat de cette enzyme). Le déroulement des réactions est suivi par analyse par HPLC, qui permet, dans les conditions utilisées, d'identifier et de quantifier les substrats et produits des différentes réactions catalysées par leurs temps de rétention caractéristiques établis à l'aide de solutions témoins de concentrations connues. Une fois ces mises au point réalisées à petite échelle, l'ensemble de la préparation est traitée en une seule fois en adaptant les quantités d'enzymes à celles de substrats. A la fin du temps d'incubation optimal précédemment déterminé, la préparation finale de produits est analy- sée par HPLC, et les ajustements finaux, éventuellement nécessaires, (poursuite de l'incubation et/ou addition d'enzyme ou de co-facteurs) sont effectués jusqu'à obtention de la transformation souhaitée de substrats en produits. Dans les Exemples 4 à 11 suivants, 1 unité (U) enzymatique correspond à 1 pmole de substrat transformé/minute. Ces unités sont définies à l'aide des substrats AMP, GMP, phosphoénol pyruvate, ATP (en présence de AcONH4 (acétate d'ammonium) 1M), d'UMP et TMP, pour les enzymes adénylate kinase (AdK) (issue de muscle de poulet, SIGMA), guanylate o kinase (GK) (issue de cerveau de porc, SIGMA), pyruvate kinase (PK) (issue de muscle de lapin, SIGMA), ribonucléoside triphosphate réductase (RTPR), thymidylate synthase (TS) et désoxynucléotide kinase du phage T4 (TK), respectivement. La RTPR est notamment purifiée à partir d'un plasmide surexprimé dans E. Coli (voir Bader et al.) EXEMPLE 4: Triphosphorylation du rAMP, du rCMP et du rGMP. L'ensemble des réactions de triphosphorylation est réalisé en une seule étape, dans un mélange réactionnel contenant tous les effecteurs (KCI 10 mM, dithiotréitol 10 mM, MgCI 10 mM) et les enzymes nécessaires, en 2 heures 30 minutes. Les dérivés monophosphates de A, C et G sont tout d'abord phosphorylés au sein du mélange précédent (3,65 mmoles dans 365 ml, soit 1,15 g totaux) en dérivés diphosphates correspondants à l'aide des enzymes commerciales AdK (10 U/ml) en ce qui concerne A et C, et GK (0,06 U/ml) pour G, en utilisant une quantité catalytique d'ATP (1 pM) non marque pour amorcer les réactions de phosphorylation. Les dérivés diphosphates sont transformés en dérivés triphosphates correspondants par l'enzyme PK (15 U/ml) qui catalyse la réaction de transfert du groupement phosphate d'une molécule de phosphoénol pyruvate (PEP, qui peut alternativement être préparé in situ à partir de 3-phosphoglycérate comme décrit dans Batey et al. 1992) sur une molécule de diphosphate. La régénération permanente de I'ATP durant ces étapes de phosphorylation est assurée par la présence de l'enzyme AdK. La quantité d'enzyme AdK est optimisée afin d'assurer une phosphorylation complète de l'AMP et du CMP tout en prévenant celle de I'UMP qui est pourtant reconnu comme substrat par cette enzyme, mais avec une affinité moindre (voir Exemple 7). Les analyses par HPLC des mélanges initiaux et finaux sont présentés dans la figure 3 a titre d'exemple. EXEMPLE 5: Réduction du rATP, du rCTP et du rGTP. Cette étape de réduction est réalisée ici sur le mélange obtenu dans l'Exemple 4, en 1 heure d'incubation a 37 C, par l'action de la o ribonucléoside triphosphate réductase (RTPR), du microorganisme Lacto- bacillus leichmannii. L'enzyme purifiée à partir d'un plasmide cloné et surexprimé dans E. coli (Booker et Stubbe, 1993) ne reconnaît que les rNTPs comme substrats (il ne réduit pas l'UMP présent dans le mélange décrit précédemment). Le mélange réactionnel est constitué de tampon HEPES 25 mM, pH 7,5 contenant 30 mM de dithiotréitol (DTT), 8 pM coenzyme B-12, 1 mM EDTA, le mélange obtenu dans l'exemple 4 et l'enzyme (1 U/ml). L'agent réducteur utilisé dans cet Exemple est le DTT, mais peut être remplacé par d'autres thiols tel que le dihydrolipoate, par exemple (Blakley, 1966). Il est à noter qu'une partie non négligeable du GTP (environ 30 à 35%) n'est pas converti en dGTP, et ceci même si l'on augmente le temps d'incubation ou les quantités d'enzyme ou de co-enzyme. C'est essentiellement ce composé qui servira de donneur de groupement phosphate dans l'Exemple 7. EXEMPLE 6: Séparation du rUMP des trois dNTPs (N = A, C et G). Cette séparation est réalisée par passage du mélange sur colonne d'Affigel (12 g) comme décrit dans l'Exemple 3. Seuls le rUMP et les nucléotides résiduels non réduits de l'Exemple 5 seront capables de se fixer sur la colonne. Les dATP, dCTP et dGTP ne se fixent pas sur la colonne et sont récupérés sous forme d'un mélange à peu près équimolaire (632 Emoles soit 309 mg d'ATP, 594 pmoles soit 276 mq de dCTP et 632 pmoles soit 318 mq de dGTP, dans un volume de 177 ml) qui pourra être séparé en ses constituants individuels par des méthodes appropriées, si nécessaire. LUMP (528 Imoles dans 60 ml, soit 171 mg) est élue de la colonne à pH acide, comme décrit dans l'Exemple 3. Les dNTPs et I'UMP ont été quantifiés par HPLC. EXEMPLE 7: Triphosphorylation du rUMP en rUTP. Celle-ci est réalisée a l'aide des enzymes AdK et PK comme décrit dans l'Exemple 4, dans un volume final de 90 ml contenant les 528 pmoles de rUMP de l'exemple 6, en utilisant une quantité d'AdK nettement plus importante (300 U/ml), et durant une nuit d'incubation à 37 C. Les o donneurs de groupement phosphate permettant de passer de l'UMP à l'UDP sont constitués par les rNTPs résiduels non réduits de l'Exemple 5 et qui sont co-purifiés avec l'UMP lors de l'étape précédente. Pour réaliser cette phosphorylation du rUMP en rUTP, on met en oeuvre 30 fois plus d'AdK (300 unites/ml au lieu de 10 unités/ml), pour une quantité de substrat a transformer du même ordre de grandeur. Avec cette quantité d'enzyme, on peut phosphoryler la totalité du rUMP en 12-15 heures, alors qu'avec la quantité utilisée dans l'exemple 4 (10 unités/ml), le rUMP reste non phosphorylé au bout de 2-3 heures. EXEMPLE 8: Réduction du rUTP en dUTP. Cette réduction est réalisée comme décrit dans l'Exemple 5, mis à part le fait qu'une haute force ionique est nécessaire ici (AcONH4 1M) pour assurer le passage de l'UTP au dUTP. Dans l'Exemple 5, la réaction de réduction a pu être effectuée sans addition de AcONH4, probablement du fait de la présence de plusieurs NTPs dans le mélange, dont en particulier le GTP, qui permet une autostimulation en cascade des réactions de réduction (Blakley, 1966). Le dUTP n'a pu être quantifié à cette étape pour les raisons développées dans l'Exemple 9 suivant. EXEMPLE 9: Hydrolyse du dUTP en dUMP. Cette étape peut être réalisée à l'aide de l'enzyme dUTPase (Hoffmann et al., 1987) qui en une étape déphosphoryle le dUTP en dUMP. Dans le cas présent, I'enzyme RTPR utilisée dans l'Exemple 8 et qui n'avait pas été purifiée jusqu'à homogénéité totale (omission de la dernière étape de purification préconisée par Booker et Stubbe, 1993) présentait une activité responsable de la déphosphorylation du dUTP en dUMP. Le dUMP a donc été obtenu ici en une seule étape à partir de l'UTP (étapes 7 et 8 cumulées). La quantité de dUMP obtenue à ce stade est de 139 mg (450 pmoles dans ml). EXEMPLE 10: Synthèse et purification du dTMP. La synthèse du dTMP est effectuée en 30 minutes a 37 C à partir de la solution précédente de dUMP, dans un volume réactionnel de 210 o ml contenant 50 mM HEPES, pH 7,5, 3 mM 5,10-méthylène tétrahydrofolate et 0,8 U/ml d'enzyme TS (enzyme de Lactobacillus lactis, clonée et surexpri- mée dans E. coli; Greene et al., 1994). Le 5,10-méthylène tétrahydrofolate, qui est le co-substrat donneur du groupement méthyle, est préparé extempo- ranément à partir de tétrahydrofolate et de formaldéhyde (Friedkin, 1963). Le dTMP synthétisé est purifié à cette étape par chromatographie en phase TM inverse sur colonne Supelcosyl LC-18-T (Sigma), dans les conditions suivantes: Tampon A: 8 mM de tétrabutylamoniumhydrogène sulfate dans 140 mM KH2PO /K2HPO, pH 6,0 Tampon B: 30% méthanol dans le tampon A Vitesse d'élution: 1 ml/minute Programme: Temps (min): 0 5 10 20 25 30 32 45 Tampon B(%):0 0 20 40 100 100 0 0 Le dTMP purifié est concentré 5 fois à l'aide d'un évaporateur rotatif à 40 C, sous pression réduite et rechromatographié dans les mêmes conditions expérimentales mais avec une modification de la phase mobile (Tampon A': 100 mM acétate d'ammonium, pH 6,0; Tampon B': 30% méthanol dans le tampon A'). La fraction contenant le dTMP est évaporée à sec, rincée plusieurs fois à l'eau déminéralisée, puis reprise dans 80 ml d'eau déminéralisée (400 jimoles soit 129 mg de dTMP). EXEMPLE 11: Synthèse du dTTP. Cette synthèse est réalisée en 4 heures a 37 C, dans un volume réactionnel de 160 ml contenant 50 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MgCI, 20 pM ATP, 0,1 U/ml TK (enzyme du phage T4, clonée et surexprimée dans E. coli; Brush et al., 1990), PK (5 U/ml) et AdK (5 U/ml). Le dosage HPLC du produit de la réaction indique une conversion totale du dTMP en dTTP dans ces conditions, conduisant à une quantité totale de 181 mg de dTTP synthétisés à partir des 171 mg d'UMP, soit un rendement global de o 71% de conversion à partir de I'UMP. Après transformation des NMPs en dNTPs, les proportions relatives en moles obtenues pour les différents nucléotides sont de 27,3% pour le dATP, 29,6% pour le dCTP, 25,3% pour le dGTP et 17,7% pour le dTTP, alors que l'on était partit de 24% pour l'AMP, 26% pour le CMP, 30% pour le GMP et 20% pour I'UMP. EXEMPLE 12: Utilisation des 4 dNTPs deutérés comme substrats dans une réaction de PCR. Les quatre dNTPs deutérés tels qu'ils sont obtenus dans les Exemples 6 et 1 1 peuvent être utilisés dans une expérience de PCR (Polymerase Chain Reaction) pour amplifier une séquence d'ADN correspon- dant à la séquence consensus reconnue spécifiquement par la protéine c- * Myb. Dans l'Exemple présent, les matrices et amorces utilisées ont la séquence suivante: Matrice: 5'ATTCCGACAGCACGGCGAGG.CCTAACGGTCTAATGG.CCTAACGGTCT AATGG. CCATCTCCTGCATGGCACGA-3' Amorce 1: 5'-ATTCCGACAGCACGGCGAGG-3' Amorce 2: 3'-GGTAGAGGACGTACCGTGCT- 5' La réaction de PCR est réalisée en 30 cycles (Séparation des brins: 1 minute à 88 C/hybridation: 1 minute à 55 C/élongation: 1 minute à C), avec une phase d'élongation augmentée de 1 minute tous les 10 cycles, dans un appareil de PCR commercial (Perkin Elmer). Le volume réac- tionnel de 100 pl est composé de 10 mM Tris-HCI, pH 9, 1,5 mM MgC2I, 50 mM KCI, de la matrice (10 nM), des amorces (2 pM de chaque), de l'enzyme Taq Polymerase (20 U/ml) et des dNTPs deutérés (25 pIM de chaque). Cette concentration peut être augmentée si les produits de départ sont suffisam- ment purs. L'analyse sur gel d'agarose 4,5% du produit de PCR obtenu de 72 paires de bases contenant 2 fois la séquence recherchée: CGTAACGGTCTAATGG GGATTGCCAGATTACC confirme la taille attendue pour le produit, qui est de plus sensible a la coupure par une enzyme de restriction spécifique de séquence connue (Haelll dans le cas présent), attestant de la synthèse correcte de l'oligo- nucléotide. EXEMPLE 13: Production de 1 imole d'un fragment d'ADN uniformé- ment marqué Un prototype a été spécialement mis au point dans le labora- toire afin de réaliser la synthèse par PCR de fragments d'ADN en quantité compatible avec les exigences de la RMN. Cet appareil nous permet d'effec- tuer des expériences de PCR dans les conditions décrites dans l'Exemple 12, en utilisant les dNTPs préparés par la méthode décrite ici dans un volume compris entre 300 ml et 2 I, conduisant à la production d'ADN en une seule fois dans des quantités de l'ordre de 1 à plusieurs imoles, quantités tout à fait suffisantes pour effectuer des expériences de RMN. Après coupure du produit de PCR par l'enzyme de restriction Haelll, I'oligonucléotide de 16 paires de bases correspondant à la séquence cidessus est introduit dans un plasmide p-Bluescript précédemment ouvert par l'enzyme de restriction Smal. Après amplification du nouveau plasmide, celui-ci est purifié et sa séquence est déterminée par séquençage automa- tique sur un séquenceur Perkin Elmer 301 ABI Prism. Il a pu ainsi être vérifié que I'oligonucléotide synthétisé par la méthode décrite dans cet Exemple en utilisant les dNTPs deutérés présentait la séquence attendue. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Batey, R.T., Inada, M. Kujawinski, E., Puglisi, J.D. and Williamson, J.R. 1992 Preparation of isotopically labeled ribonucleotides for multidimensional NMR spectroscopy of RNA. Nucl. Acid Res. 20: 4515-4523 Blakley, R.L. 1966 B - dependent synthesis of deoxyribonucleotides. Fed. Proc. 25:1633-1638 Booker, S. and Stubbe, J. 1993 Cloning, sequencing, and expression of the adenosylcobalamin-dependent ribonucleotide reductase from Lactobacillus leichmannii. Proc. Natl. 1o Acad. Sci.90: 8352-8356 Brush, G.S. Bhatnagar, S.K. and Bessman, M.J. 1990 Bacteriophage T4 deoxynucleotide kinase: gene cloning and enzyme purifi- cation. J. Bacteriol. 172: 2935-2939 Friedkin, M. 1963 i5 Enzymatic aspects of folic acid. Ann. Rev. Biochem., 32: 185-214 Greene, P.J., Yu, P-L, Zhao, J., Schiffer, C.A. and Santi, D. 1994 Expression, purification and characterization of thymidylate synthase from Lactococcus lactis. Protein Science 3: 1114-1116 Hoffman, I., Widstrom, J., Zeppezauer, M. and Nyman, P.O. 1987 Overproduction and large-scale preparation of deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase from Escherichia coli. Eur. J. Biochem 164: 45-51 Nikonowicz, E.P., Sirr, A., Legault, P., Jucker, F.M., Baer, L.M. and Pardi, A. Preparation of C and N labelled RNAs for heteronuclear mutidimensional NMR studies. Nucl. Acid Res. 20: 4507-4513 Pardi, A. 1992 Isotope labelling for NMR studies of biomolecules, Curr. Op. Struct. Biol. 2 832-835 Zimmer, D.P. and Crothers, D.M. 1995 13 15 3o NMR of enzymatically synthesized uniformly C N-labeled DNA oligonucleo- tides, Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3091-3095. Rappel des abréviations utilisées: A: adénosine AcONH4: acétate d'ammonium ADN: acide désoxyribonucléique ARN: acide ribonucléique C: cytidine d: désoxyribo- DO: densité optique o0 DTT: dithiotreitol EDTA: acide éthylène diamine tétra-acétique Enzymes: Adk: adénosine/désoxyadénosine kinase (ou myokinase) dUTPase: désoxyuridine triphosphate nucléotido- hydrolase GK: guanosine/désoxyguanosine kinase PK: pyruvate kinase RDPR: ribonucléoside diphosphate réductase RTPR: ribonucléoside triphosphate réductase TK: désoxynucléotide kinase du phage T4 TS: thymidylate synthase UMPICMP K: uridine monophosphate/cytidine mono- phosphate kinase G: guanosine HPLC: chromatographie liquide haute performance NDPs: nucléosides diphosphates NMPs: nucléosides monophosphates NTPs: nucléosides triphosphates PCR: réaction de polymérisation en chaîne r: ribo- T: thymidine U: uridine ou unité Ainsi que cela ressort de ce qui précède, I'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Procédé de production de désoxyribonucléosides triphosphates (dNTPs) uniformément ou sélectivement marqués, dans lesquels N = A, C, G ou T, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ribonucléosides monophosphates (rNMPs) marqués, obtenus a partir d'une culture d'un organisme procaryote ou eucaryote convenable dans un milieu enrichi en au moins un isotope stable ou radioactif d'au moins un élément constitutif desdits rNMPs, en dNTPs marqués, dans lesquels N = A, C, G ou T, avec le même taux d'enrichissement que les rNMPs, en présence I0 d'une batterie d'enzymes adaptées à ladite transformation, qui comprend essentiellement une étape de phosphorylation enzymatique en présence de nucléotide kinases appropriees, pour l'obtention de dérivés di- ou triphosphatés, une étape de réduction enzymatique des dérivés di- ou triphosphatés obtenus, en présence d'une ribonucléoside di- ou triphosphate réductase, la transformation du dUTP obtenu en dTTP, par l'action successive de dUTPase, de thymidylate synthase et de désoxynucléotide kinase et éventuellement la séparation et/ou la purification des différents dNTPs obtenus, dans lesquels N = A, C, G ou T. 2 ) Procédé de production de dNTPs selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) I'obtention d'un mélange de rNMPs marqués, dans lesquels N = A, C, G ou U, à partir d'une culture d'un organisme procaryote ou eucaryote convenable, dans un milieu enrichi en au moins un isotope stable ou radioactif des éléments constitutifs desdits rNMPs, (b) la triphosphorylation des rNMPs dans lesquels N = A, C ou G, en dérivés rNTPs correspondants, en présence de nucléotide kinases appropriées et l'obtention d'un mélange comprenant du rATP, du rCTP, du rGTP et du rUMP, (c) la réduction des trois dérivés triphosphates (rATP, rCTP, rGTP) obtenus en (b) en dérivés désoxycorrespondants (dNTPs dans lesquels N = A, C ou G: dATP, dCTP, dGTP), en présence d'une ribonucléo- side triphosphate réductase (RTPR), (d) I'isolement du rUMP du mélange obtenu en (c), (e) la triphosphorylation dudit rUMP en rUTP, en présence de nucléotides-kinases appropriées, suivie d'une réduction du rUTP en dérivé désoxy-correspondant (dUTP), en présence d'une ribonucléoside triphosphate réductase (RTPR), (f) la transformation du dUTP obtenu en (e), en dTTP par déphosphorylation en dérivé monophosphate correspondant (dUMP), en présence d'une dUTPase, transfert d'un groupement méthyle provenant du io 5,10-méthylène tétrahydrofolate sur la position 5 du cycle de la molécule de dUMP, en présence de thymidylate synthase (TS), générant ainsi le dTMP et triphosphorylation du dTMP en dTTP, en présence de nucléotide-kinases appropriées et (g) éventuellement la séparation et/ou la purification des diffé- rents dNTPs obtenus en (c) et en (f). 3 ) Procédé de production de dNTPs uniformément ou sélec- tivement marqués selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend: (al) I'obtention d'un mélange de rNMPs marqués, dans lesquels N = A, C, G ou U, à partir d'une culture d'un organisme procaryote ou eucaryote convenable, dans un milieu enrichi en au moins un isotope stable ou radioactif des éléments constitutifs desdits rNMPs, (bl) la triphosphorylation des rNMPs dans lesquels N = A, C, G ou U (rAMP, rCMP, rGMP et rUMP), en dérivés rNTPs correspondants, en présence de nucléotide kinases appropriées et l'obtention d'un mélange comprenant du rATP, du rCTP, du rGTP et du rUTP, (cl) la réduction des quatre dérivés triphosphates (rATP, rCTP, rGTP et rUTP) obtenus en (bl) en dérivés désoxy-correspondants (dNTPs dans lesquels N = A, C, G ou U), en présence d'une ribonucléoside triphosphate réductase (RTPR), et (dl) la transformation du dUTP obtenu en (cl), en dTTP par déphosphorylation en dérivé monophosphate correspondant (dUMP) directe- ment sur le mélange des quatre dNTP obtenu en (cl), en présence d'une dUTPase, transfert d'un groupement méthyle provenant du 5,10-méthylène tétrahydrofolate sur la position 5 du cycle de la molécule de dUMP, en présence d'une thymidylate synthase (TS), générant ainsi le dTMP et triphos- phorylation du dTMP en dTTP, en présence de nucléotide kinases appropriées. 4 ) Procédé de production de dNTPs uniformément ou sélec- tivement marqués selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend: (a2) I'obtention d'un mélange de rNMPs marqués, dans io lesquels N = A, C, G ou U, à partir d'une culture d'un organisme procaryote ou eucaryote convenable, dans un milieu enrichi en au moins un isotope stable ou radioactif des éléments constitutifs desdits rNMPs, (b2) la diphosphorylation des rNMPs dans lesquels N = A, C, G ou U (rAMP, rCMP, rGMP et rUMP), en dérivés rNDPs correspondants, en présence de nucléotide kinases appropriées et l'obtention d'un mélange comprenant du rADP, du rCDP, du rGDP et du rUDP, (c2) la réduction des quatre dérivés diphosphates (rADP, rCDP, rGDP et rUDP) obtenus en (b2) en dérivés désoxy-correspondants (dNDPs dans lesquels N = A, C, G ou U: dADP, dCDP, dGDP et dUDP), en présence d'une ribonucléoside diphosphate réductase (RDPR), (d2) la triphosphorylation des dNDPs dans lesquels N = A, C, G ou U (dADP, dCDP, dGDP et dUDP), en dérivés dNTPs correspondants, en présence de nucléotide kinases appropriées et l'obtention d'un mélange comprenant du dATP, du dCTP, du dGTP et du dUTP, (e2) la transformation du dUTP obtenu en (d2), en dTTP par déphosphorylation en dérivé monophosphate correspondant (dUMP) directe- ment sur le mélange des quatre dNTP obtenu en (d2), en présence d'une dUTPase, transfert d'un groupement méthyle provenant du 5,10-méthylène tétrahydrofolate sur la position 5 du cycle de la molécule de dUMP, en présence d'une thymidylate synthase (TS), générant ainsi le dTMP et la triphosphorylation du dTMP en dTTP, en présence de nucléotide kinases appropriées. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'organisme convenable selon l'étape (a), (al) ou (a2) est une cyanobactérie ou une bactérie méthylotrophe. 6 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que préalablement a l'étape (b), (bl) ou (b2), lesdits rNMPs sont de préférence purifiés, pour éliminer les dNMPs présents en petites quantités et les contaminants de la préparation de nucléotides mono- phosphates. 7 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la triphosphorylation de l'étape (b) ou (bl) est mise en oeuvre à 37 C par incubation des rNMPs avec de l'adénylate kinase (AdK) en quantité optimisée pour assurer une phosphorylation complète du rAMP et du rCMP, tout en prévenant celle du rUMP, de la guanylate kinase (GK), de la is pyruvate kinase (PK), du phosphoénol pyruvate et de l'ATP non marqué pour amorcer les réactions de phosphorylation. 8 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la réduction de l'étape (c), (cl) ou (c2) est mise en oeuvre à 37 C, en présence d'un agent réducteur sélectionné dans le groupe constitué par des thiols, tels que le dithiotréitol (DTT) ou le dihydrolipoate et de la ribonucléoside triphosphate réductase (RTPR) de Lactobacillus leichmanii (étapes c ou cl) ou de la ribonucléoside diphosphate réductase (RDPR) pour l'étape c2. 9 ) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la triphosphorylation de l'étape (e), est mise en oeuvre par incubation dudit rUMP à 37 C avec de l'adénylate kinase (AdK) en quantité significativement supérieure à celle mise en oeuvre à l'étape (b), de pyruvate kinase (PK) et de phosphoénol pyruvate et est suivie de la réduction du rUTP obtenu en dUTP, par l'action, à 37 C, d'un agent réducteur, de préférence sélectionné dans le groupe constitué par des thiols, tels que le dithiotréitol (DTT) ou le dihydrolipoate et de la ribonucléoside triphosphate réductase (RTPR) de Lactobacillus leichmanii, dans un milieu présentant une haute force ionique. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la transformation du dUTP en dTTP, conformément aux étapes (f), (dl) ou (e2), comprend l'incubation à 37 C du dUTP, avec une dUTPase, pour obtenir du dUMP, suivie de la synthèse du dTMP dans un tampon à pH sensiblement neutre par incubation de milieu réactionnel obtenu pendant 15 min à 2 heures avec de la thymidylate synthase (TS), en présence de 5,10 méthylène tetrahydrofolate et éventuellement de la purifica- o tion dudit dTMP obtenue par chromatographie en phase inverse, suivie de la phosphorylation du dTMP en dTTP en milieu à pH sensiblement neutre par incubation à 37 C du produit de la réaction précédente (dTMP) avec un mélange de désoxynucléotide kinase (TK), de pyruvate kinase et d'adénylate kinase, en présence d'ATP non marqué. 11 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 4, caractérisé en ce que la diphosphorylation de l'étape (b2) est réalisée en l'absence de pyruvate kinase (PK) et de phosphoénol pyruvate (PEP), afin de ne pas obtenir directement des dérivés triphosphates, et en présence d'ATP, de préférence marqué 12 ) Procédé de préparation d'ADN uniformément ou sélecti- vement marqué avec au moins un isotope stable ou radioactif d'au moins un des éléments constitutifs dudit ADN, caractérisé en ce qu'il comprend: (1) la synthèse enzymatique de dNTPs uniformément ou sélectivement marqués conformément au procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, et (2) la production d'un ADN souhaitable en utilisant les dNTPs obtenus à l'étape (1). 13 ) Procédé selon la revendication 1 1, caractérisé en ce que l'étape (2) de production d'ADN est réalisée par duplication in vitro d'une matrice d'ADN.