FR 2777155 A1 19991015 FR 9804495 A 19980409 1 2777155 SEMENCES ET PLANTES DONT LE POUVOIR GERMINATIF EST DÉTRUIT PAR L'ABSENCE TOTALE OU PARTIELLE D'AU MOINS UNE RÉSERVE ÉNERGÉTIQUE INDISPENDABLE À LA GERMINATION. La présente invention concerne un procédé pour détruire le pouvoir germinatif d'une semence de plante par l'introduction, dans ladite semence, d'une séquence d'acide nucléique codant pour une enzyme apte à métaboliser rapidement une réserve énergétique indispensable à la germination de ladite semence. L'invention est fondée sur le fait qu'il peut arriver lorsque l'on réalise une culture en plein champ, qu'une quantité non négligeable de semences nouvellement formées tombe sur le sol au cours de la culture et/ou de la récolte. Ces semences disséminées involontairement seront aptes à germer et à se multiplier dès que les conditions climatiques s'y prêteront. Le contrôle de la non-multiplication des plantes résultant de cette dissémination impose un suivi contraignant des parcelles cultivées, consistant par exemple en un traitement par des herbicides, une rotation des cultures, parfois pendant plusieurs années pour certaines plantes comme le colza, dont les graines peuvent survivre une dizaine d'années. La présente invention vise précisément à détruire le pouvoir germinatif des semences restées au champ afin d'empêcher leur multiplication sans recourir à l'emploi d'une substance toxique. Ce but est atteint grâce à la présence dans les semences d'enzymes aptes à brûler rapidement leur réserve énergétique avant que ne soit initiée la germination. Cette modification confère aux semences de l'invention un désavantage très net qui limite considérablement, voir interdit, leur multiplication involontaire. En effet, lorsque les conditions climatiques adaptées à la germination surviendront, les semences modifiées selon l'invention ne disposeront plus de l'énergie nécessaire à leur germination et seront donc incapables de se multiplier. Si par contre, la semence est stockée, dès la récolte, dans des conditions différentes de celle rencontrées en plein champ, l'activité enzymatique introduite sera inhibée et la semence conservera son pouvoir germinatif et pourra être multipliée. Les réserves énergétiques indispensables à la germination d'une semence sont, le plus souvent, sous forme de lipide ou d'amidon. Les conditions normales, aptes à permettre la germination, sont caractérisées par une humidité, une. oxygénation et une température suffisante. L'invention a donc pour objet des semences de plante dont le pouvoir germinatif est détruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination, dans laquelle la destruction du pouvoir germinatif est conférée par une enzyme présente dans la semence à un niveau permettant la consommation rapide de ladite réserve énergétique. L'invention concerne donc tout particulièrement des semences et plantes transgéniques dont le pouvoir de germination est détruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination. Un premier mode de réalisation d'une semence de l'invention est une semence transgénique qui contient 3 2777155 au moins un gène hétérologue codant pour une enzyme qui confère la destruction du pouvoir germinatif de ladite semence par consommation rapide d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à une semence transgénique qui contient au moins un gène hétérologue codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination. Une telle semence transgénique contient dans ses cellules au moins un gène chimère comprenant successivement: - un promoteur, par exemple le promoteur constitutif double 35S ou plus particulièrement un promoteur semence spécifique - éventuellement une séquence codant pour un peptide signal, - un gène codant pour une enzyme choisie dans le groupe des lipases, des protéases, des amylases, dont l'action sur le métabolisme de la semence est identique à celle des enzymes de la germination, - une séquence de terminaison. Le promoteur est avantageusement choisi parmi: - Le promoteur pCRU du gène de la cruciférine de radis permettant l'expression de protéines ou polypeptides uniquement dans les semences ou dans les graines (Depigny-This et al., Plant Mol. Biol., 20, 467-479, 1992). - Les promoteurs pGEAl et pGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEA1 et GEA6, d'Arabidopsis thaliana permettant une expression 4 2777155 spécifique dans les graines (Gaubier et al., Mol. Gen. Genet., 238, 409-418, 1993). La séquence codant pour un peptide signal est avantageusement choisie parmi: - La séquence nucléotidique de 69 nucléotides codant pour le prépeptide de 23 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce, ce peptide signal permettant l'entrée des polypeptides recombinants dans le système de sécrétion des cellules végétales transformées, principalement dans le réticulum endoplasmique. - La séquence nucléotidique de 42 nucléotides codant pour le propetide N-terminal d'adressage vacuolaire de 14 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce, permettant l'accumulation de polypeptides recombinants dans les vacuoles des cellules végétales transformées. - La séquence de 111 nucléotides codant pour le prépropetide de 37 acides aminés de la sporamine A constitué de la partie N-terminale vers la partie C- terminale des 23 acides aminés du prépeptide susmentionné suivi par les 14 acides aminés du propetide susmentionné, ce prépropetide permettant l'entrée de polypeptides recombinants dans le système de sécrétion et leur accumulation dans les vacuoles des cellules végétales transformées. Les trois séquences ci-dessus sont décrites dans les articles de Murakami et al. (Plant Mol. Biol., 7, 343-355, 1986) et Matsuoka et Nakamura (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 834-838, 1991). La séquence hétérologue codant pour l'enzyme peut être par exemple celle de la lipase gastrique de chien décrit dans la demande de brevet PCT publiée sous 2777155 le Numéro WO 96/33277 ou celle de la lipase pancréatique humaine (Lowe et al., J. Biol. Biochem., 264, 20042- 20048, 1989). L'activité de la lipase dans les semences de plantes selon l'invention entraîne, lorqu'elle n'est pas arrêtée ou ralentie par les conditions de stockage, une diminution de la teneur en triglycéride sans modification de la composition en acides gras. En effet, l'action de la lipase sur la composition de la graine doit être identique à celles des enzymes de la germination et/ou de la digestion. Un deuxième mode de réalisation d'une semence selon l'invention, est une semence transgénique qui contient au moins un gène endogène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination, placé sous le contrôle d'un promoteur choisi parmi ceux permettant la surexpression et l'activation dudit gène avant l'initiation du processus de germination, comme un promoteur semence spécifique plus ou moins précoce. L'invention concerne aussi un plante transgénique ou partie de cette plante, comme des cellules, caractérisée en ce qu'elle contient: - au moins un gène hétérologue codant pour une enzyme qui confère la destruction du pouvoir germinatif des semences de ladite plante par consommation rapide d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination, comme décrit précédemment, ou - au moins un gène endogène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination, placé sous le contrôle d'un promoteur choisi parmi ceux permettant 6 2777155 la surexpression et l'activation dudit gène avant l'initiation du processus de germination. Les semences et plantes ou parties de plantes selon l'invention peuvent en outre contenir un ou plusieurs gènes hétérologues d'intérêt, tels que des gènes capables de conférer à la plante un caractère agronomique ou une résistance à un prédateur ou à un herbicide ou un gène codant pour une protéine d'intérêt pharmaceutique. Ces gènes hétérologues d'intérêt peuvent être introduits dans les semences en même temps ou avant les gènes chimères permettant de détruire le pouvoir germinatif desdites semences conformément à l'invention. Les semences de l'invention sont alors remarquables en ce qu'elles permettent d'empêcher la dissémination non volontaire de semences portant ces gènes d'intérêt. Les semences et plantes selon l'invention peuvent être des semences et plantes dicotylédones ou monocotylédones, comme celles sélectionnées dans le groupe constitué par les solanacées (tomate, tabac), les crucifères (colza), les céréales (maïs, blé). Le procédé selon l'invention présente des avantages par rapport aux techniques couplant une stérilité mâle cytoplasmique et un gène d'intérêt. En effet, la destruction du pouvoir germinatif de la semence interdit la multiplication des semences issues des gamètes mâles et femelles. Tandis qu'une stérilité mâle n'empêche pas l'obtention de semences issues de gamètes femelles. En outre, l'obtention de semences homozygotes pour le gène hétérologue est facile alors qu'elle est complexe dans le cas d'une technique stérilité mâle, car il est nécessaire de disposer d'une technique de restauration de la fertilité. 7 2777155 L'invention se rapporte donc également à l'utilisation d'un gène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination pour préparer une plante transgénique dont la germination est contrôlée. Plus particulièrement l'invention concerne l'utilisation d'un gène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination pour préparer une plante transgénique dont le pouvoir germinatif est détruit. On préfère tout particulièrement utiliser selon l'invention, un gène qui code pour une enzyme choisie dans le groupe des lipases, des protéases, des amylases, dont l'action sur le métabolisme de la semence est identique à celle des enzymes de la germination et/ou de la digestion. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description qui suit se rapportant à la préparation de semences transgéniques de l'invention de tabac et de colza exprimant une lipase hétérologue, et dans laquelle il sera fait référence au dessin en annexe o la figure 1 représente la conservation de semences de colza transgéniques exprimant une lipase sous promoteur semence spécifique. 1) Préparation de graines de tabac exDrimant la lipase de chien sous le contrôle d'un promoteur constitutif. Le promoteur utilisé est le promoteur double 35S. En amont du gène codant pour la lipase de chien est placée une séquence codant pour un peptide signal de sécrétion. Les plants de tabac utilisés pour les expériences de transformation (Nicotiana tabacum var. Xanthi NC et PBD6) sont cultivés in vitro sur le milieu 8 2777155 de base de Murashige et Skoog (1962) additionné des vitamines de Gamiborg et al. (1968, Sigma référence M0404) de saccharose à 20g/l et d'agar (Merk) à 8 g/1. Le pH du milieu est ajusté à 5,8 avec une solution de potasse avant autoclavage à 120 C pendant 20 min. Les plantules de tabac sont repiquées par bouture des entre- noeuds tous les 30 jours sur ce milieu de multiplication MS20. Toutes les cultures in vitro sont réalisées en enceinte climatisée, dans les conditions définies ci- dessous: - intensité lumineuse de 30pE. m-2.S-1; photopériode de 16h; thermopériode de 26 C le jour, 24 C la nuit. La technique de transformation utilisée est dérivée de celle de Horsch et al. (Science, 227, 1229- 1231, 1985). Une préculture d'Agrobactérium tumefaciens souche LBA4404 contenant les plasmides pBIOC29 ou pBIOC26 ou pBIOC25 est réalisée durant 48h à 28 C sous agitation, dans du milieu LB (Sambrook et al., Molecular Cloning Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) additionné des antibiotiques adéquats (rifampicine et tétracycline). La préculture est ensuite diluée au 50ème dans le même milieu et cultivée dans les mêmes conditions. Après une nuit, la culture est centrifugée (10 min., 3000 g), les bactéries sont reprises dans un volume équivalent de milieu MS30 (30 g/1 saccharose) liquide et cette suspension est diluée au 10ème. Des explants d'environ lcm2 sont découpés à partir des feuilles des plantules décrites ci-dessus. Ils sont ensuite mis au contact de la suspension 9 2777155 bactérienne pendant une heure, puis séchés rapidement sur papier filtre et placés sur un milieu de coculture (MS30 solide). Après 2 jours, les explants sont transférés en boîtes de Pétri sur le milieu de régénération MS30, contenant un agent sélectif, la kanamycine (200 mg/l), un bactériostatique, l'augmentin (400 mg/l) et les hormones nécessaires à l'induction de bourgeons (BAP, lmg/l et ANA, 0,1 mg/l). Un repiquage des explants est effectué sur le même milieu après 2 semaines de culture. Après 2 semaines supplémentaires, les bourgeons sont repiqués en boites de Pétri sur le milieu de développement composé du milieu MS20 additionné de kanamycine et d'augmentin. Après 15 jours, les bourgeons sont repiqués de moitié. L'enracinement prend environ 20 jours, au terme desquels les plantules peuvent être clonées par bouture d'entre-noeuds ou sorties en serre. Selon le même procédé, il est possible d'obtenir des graines de tabac exprimant la lipase pancréatique humaine sous le contrôle d'un promoteur constitutif. 2) Préparation de graines de colza exprimant la lipase de chien sous le contrôle d'un promoteur semence spécifiaue. Le promoteur utilisé est le promoteur de la cruciférine. En amont du gène codant pour la lipase est placée une séquence codant pour un peptide signal de sécrétion. Les grains de colza de printemps (Brassica napus cv WESTAR ou lignées Limagrain) sont désinfectées pendant 40 minutes dans une solution de Domestos à 15%. Après 4 rinçages à l'eau stérile, les graines sont mises à germer, à raison de 20 graines par pot de 7 cm de I( 2777155 diamètre et 10 cm de haut, sur du milieu minéral de Murashige et Skoog (Sigma M 5519) avec 30g/l de saccharose et solidifié avec de l'agargel à 5g/l.Ces pots sont placés dans une chambre de culture à 26 C avec une photopériode de 16h/8h et sous une intensité lumineuse de l'ordre de 80 pE m-2 s-1. Après 5 jours de germination, les cotylédons sont prélevés stérilement en coupant chaque pétiole environ lmm au-dessus du noeud cotylédonaire. Parallèlement une préculture d'Agrobacteriumn turnefaciens souche LBA4404, contenant le plasmide pGAZE dans lequel a été inséré la séquence codant pour un signal d'adressage PPS (ou PS) sous contrôle du promoteur pCRU (ou pd35S), est réalisée en erlen meyer i5 de 50 ml, pendant 36 h à 28 C dans 10 ml de milieu bactérien 2YT (Sambrook et al., Molecular Cloning Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) complémenté avec les antibiotiques utiles à la sélection de la souche utilisée. Cette préculture sert à ensemencer à 1% une nouvelle culture bactérienne effectuée dans les mêmes conditions. Au bout de 14 h la culture est centrifugée min à 3000g et les bactéries sont reprises dans un volume équivalent de milieu de germination liquide. Cette suspension est distribuée dans les boîtes de pétri de 5 cm de diamètre à raison de 5ml/boîte. L'extrémité sectionnée du pétiole est immergée quelques secondes dans la solution d'agrobactéries ainsi préparées, puis le pétiole est enfoncé de quelques millimètres dans le milieu de régénération. Ce milieu à la même composition de base que le milieu de germination avec en plus 4mg/l de benzyl-amino-purine (BAP), phytohormone favorisant la néoformation de bourgeons. Dix explants (cotylédon avec Il 2777155 pétiole) sont mis en culture par boîte de Petri de 9 cm de diamètre (Greiner référence 664102). Après 2 jours de coculture dans les mêmes conditions environnementales que les germinations, les explants sont repiqués dans des boîtes phytatray (Sigma, référence P1552) contenant le milieu précédent complémenté avec un agent sélectif: 45 mg/1 de sulfate de kanamycine (Sigma, référence K4000) et un bactériostatique: mélange de 1/6 (en poids) de sel de potassium d'acide clavulanique et de 5/6 sel de sodium d'amoxicilline (Augmentin injectable) à raison de 600 mg/l. Deux fois de suite, à 3 semaines d'intervalle, les explants sont repiqués stérilement sur du milieu neuf dans les mêmes conditions. Les bourgeons verts apparus à la fin du deuxième ou du troisième repiquage sont séparés de l'expiant et mis en culture individuellement dans des pots transparents de 5cm de diamètre et de 10 cm de haut contenant un milieu identique au précédent mais dépourvu de BAP. Après 3 semaines de culture la tige du bourgeon transformé est sectionnée et le bourgeon est repiqué dans un pot de milieu frais. Au bout de trois à quatre semaines les racines sont assez développées pour permettre l'acclimatation en phytotron (température 21 C, photopériode 16h/8h et 84% d'humidité relative), les plantules sont rempotées dans des pots de 12 cm de diamètre remplis du même terreau enrichi en engrais retard (Osmote, à raison de 4 g/1 de terreau) puis transportées en serre (classe S2) régulée à 18 C, avec deux arrosages quotidien de 2 minutes à l'eau. Dès l'apparition de fleurs celles-ci sont ensachées (Crispac, référence SM 570y 300 mm*700 mm) de façon à empêcher la fécondation croisée. )2 2777155 Lorsque les siliques sont arrivées à maturité, elles sont récoltées, séchées, puis battues. Les graines obtenues servent au dosage de l'activité biochimique. La sélection de la descendance transgénique se fait par germination sur un milieu contenant du sulfate de kanamycine à raison de 100 à 150 mg/l (selon les génotypes). Les conditions opératoires sont identiques à celles décrites ci-dessus à ceci près que les germinations sont effectuées en tubes de verre avec une seule graine par tube. Seules les plantules développant des racines secondaires les trois premières semaines sont acclimatées en phytotron avant d'être passées en serre. Selon le même procédé, il est possible d'obtenir des graines de colza exprimant la lipase pancréatique humaine sous le contrôle d'un promoteur semence spécifique. 3) Mesures de l'effet de l'activité de la lipase sur le pouvoir de germination dans les graines des exemples 1 et 2. L'activité de la lipase, lorsqu'elle n'est pas ralentie ou arrêtée par des conditions de conservation, froid de 4 C et hygrométrie réduite, entraîne une diminution de la teneur en triglycéride sans modification de la composition en acide gras. L'activité lipasique est déterminée à l'aide d'un pH-STAT par la méthode titrimétrique de Gargouri et al. (Gastroenterology, 91, 919-925, 1986) dans laquelle le substrat utilisé est la tributyrine. L'émulsion de tributyrine (4 ml pour 30 ml d'émulsion) est réalisée au vortex en présence de sels biliaires (1,04 g/l) d'albumine bovine (0,1 g/l) et de NaCl (9 g/l). Le dosage consiste à neutraliser l'acide butyrique libéré sous l'action de la lipase par une solution de soude à 13 2777155 un pH de consigne de 5,5 à 37 C. Une unité lipase correspond à la quantité d'enzyme qui provoque la libération d'une micromole d'acide gras en 1 minute à 37 C et dans le conditions optimales de pH (5,5). La lipase gastrique de chien purifiée a une activité spécifique de 570 unités/mg de protéine. L'activité lipase peut être mesurée sur le broyat total, sur le culot ou sur le surnageant de centrifugation. Les mesures de l'activité lipasique confirment l'expression, dans les graines de plants transformés, de la lipase codée par le gène hétérologue. Si l'on suit l'évolution du pouvoir de germination de ces graines à l'activité lipasique au cours du temps, on observe une dégradation rapide de la capacité de ces graines à germer jusqu'à disparition après 16 semaines. Par contre, si ces graines sont conservées dans des conditions qui ne permettent pas l'expression de l'activité lipasique (4 C), leur pouvoir de germination n'est pas dégradé (Figure 1). Ce qui confirme l'effet de l'activité lipasique sur le pouvoir germinatif transgéniques et l'intérêt de son utilisation selon l'invention. 4) Essais au champ. Pour mettre en évidence la limitation de la dissémination engendrée par l'invention, il suffit de réaliser dans les mêmes parcelles des cultures de plantes transgéniques selon l'invention, par exemple du colza exprimant la lipase gastrique de chien sous contrôle du promoteur de la cruciférine de radis, et les lignées isogéniques non transgéniques, chacun sur des espaces repérés, et de récolter les plantes dans les mêmes conditions. Une partie des semences produites vont tomber dans la parcelle pendant la culture ou lors de la récolte, et l'année suivante, on note l'intérêt des 14 2777155 semences et plantes selon l'invention en comparant le nombre de repousse sur chacune des parcelles. 1 5 2777155 REVENDICATIONS 1) Semence de plante dont le pouvoir germinatif est détruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination, dans laquelle la destruction du pouvoir germinatif est conférée par une enzyme présente dans la semence à un niveau permettant la consommation rapide de ladite réserve énergétique. 2) Semence transgénique dont le pouvoir de germination est détruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination. 3) Semence transgénique selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un gène hétérologue codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination. 4) Semence transgénique selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un gène hétérologue codant pour une enzyme qui confère la destruction du pouvoir germinatif de ladite semence par consommation rapide d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination. ) Semence selon l'une des quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un gène chimère comprenant successivement: - un promoteur, une séquence codant pour un peptide signal, 16 2777155 - un gène codant pour une enzyme choisie dans le groupe des lipases, des protéases, des amylases, dont l'action sur le métabolisme de la semence est identique à celle des enzymes de la germination et/ou de la digestion, et - une séquence de terminaison. 6) Semence selon la revendication 5, caractérisée en ce que le promoteur est choisi parmi: - Le promoteur pCRU du gène de la cruciférine de radis permettant l'expression de protéines ou polypeptides uniquement dans les semences ou dans les graines. - Les promoteurs pGEAl et pGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEA1 et GEA6, d'Arabidopsis thaliana permettant une expression spécifique dans les graines. 7) Semence selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que la séquence codant pour un peptide signal est choisie parmi: - La séquence nucléotidique de 69 nucléotides codant pour le prépeptide de 23 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce. - La séquence nucléotidique de 42 nucléotides codant pour le propeptide N-terminal d'adressage vacuolaire de 14 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce. - La séquence de 111 nucléotides codant pour le prépropetide de 37 acides aminés de la sporamine A constitué de la partie N-terminale vers la partie C- terminale des 23 acides aminés du prépeptide de la sporamine A chez la patate douce suivi par les 14 acides 17 2777155 aminés du propeptide N-terminal d'adressage vacuolaire de la sporamine A chez la patate douce. 8) Semence selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisée en ce que le gène hétérologue code pour la lipase gastrique de chien. 9) Semence selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un gène endogène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination, placé sous le contrôle d'un promoteur choisi parmi ceux permettant la surexpression et l'activation dudit gène avant l'initiation du processus de germination. ) Plante transgénique ou partie de cette plante, caractérisée en ce qu'elle contient: - au moins un gène hétérologue codant pour une enzyme qui confère la destruction du pouvoir germinatif des semences de ladite plante par consommation rapide d'au moins une réserve énergétique indispensable à la germination, ou - au moins un gène endogène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination, placé sous le contrôle d'un promoteur choisi parmi ceux permettant la surexpression et l'activation dudit gène avant l'initiation du processus de germination. 11/ Semence transgénique selon l'une quelconque des revendications 2 à 9 ou plante transgénique selon la revendication 10, caractérisée en qu'elle contient en outre un ou plusieurs gènes hétérologues d'intérêt, tels que des gènes capables de IX 2777155 conférer à la plante un caractère agronomique ou une résistance à un prédateur ou à un herbicide ou un gène codant pour une protéine d'intérêt pharmaceutique. 12) Utilisation d'un gène codant pour une enzyme responsable de la consommation d'une réserve énergétique indispensable à la germination pour préparer une plante transgénique dont le pouvoir germinatif est détruit. 13) Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que le gène code pour une enzyme choisie dans le groupe des lipases, des protéases, des amylases, dont l'action sur le métabolisme de la semence est identique à celle des enzymes de la germination et/ou de la digestion.