FR 2760365 A1 19980911 FR 9702770 A 19970307 La présente invention se rapporte à des compositions, pharmaceutiques ou cosmétologiques, destinées à améliorer l'aspect de la peau et à lutter contre les effets du vieillissement cutané. La peau comprend trois compartiments, l'épiderme, dont la couche externe est le stratum corneum, le derme, et plus en profondeur l'hypoderme. Il existe des échanges entre ces différents compartiments dermiques et épidermiques, qui sont destinés à assurer le renouvellement cellulaire, la cohésion et l'hydratation des couches externes. On sait que le vieillissement est un phénomène physiologique qui fait suite à une période de croissance. Il se traduit notamment par un amincissement de la peau et une perte d'élasticité, menant à l'apparition de rides plus ou moins profondes; il y a également un dessèchement superficiel et une pigmentation anarchique peut être observée. Tous ces signes reflètent les modifications de l'épiderme, de la jonction épidermique et du derme. Le derme résulte de l'activité biosynthétique des fibroblastes, qui élaborent les constituants de la matrice extracellulaire; celle-ci est formée de quatre grandes familles de macromolécules: les collagènes, l'élastine, les glycoprotéines de structure et les protéoglycanes. Le collagène est la protéine de structure la plus importante du derme, puisqu'il représente 70% du poids sec du derme. Il en existe différents types, génétiquement distincts. Parmi les collagènes majeurs, le collagène de type I se rencontre dans les tissus conjonctifs et représente la totalité du collagène au niveau de l'os et de la dentine; le collagène de type III est associé au collagène de type I dans la plupart des tissus conjonctifs, mais n'est pas retrouvé dans l'os ou le tendon. Il s'agit donc d'un marqueur du tissu conjonctif sous-épidermique. De nombreux actifs ont été proposés pour prévenir ou retarder les effet du vieillissement. Il a été montré que les rétinoïdes, et en particulier le rétinol, ont un effet favorable pour améliorer l'apparence et l'état de la peau et lutter contre les signes du vieillissement. La Demanderesse a maintenant trouvé que l'association de rétinoides avec une autre classe de composés permet de potentialiser l'activité de maintien de la peau dans de bonnes conditions et d'amélioration de son aspect. C'est pourquoi la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique ou cosmétologique, caractérisée en ce qu'elle contient une association d'au moins un rétinoïde avec au moins un oligosaccharide comprenant de 2 à 6 résidus osidiques et présentant un galactose en position terminale non réductrice, ou un dérivé d'un tel oligosaccharide substitué par un résidu hydrophobe. De préférence,l'oligosaccharide est choisi dans le groupe constitué du mélibiose, du lactose, et de leurs dérivés susceptibles d'être obtenus par addition d'un résidu hydrophobe. Par substituants hydrophobes, on entend notamment les alkyles en Ci- C18 linéaires ou ramifiés, les alkylamines en Ci-C18, les acides carboxyliques en CI-C18 linéaires ou ramifiés, éventuellement substitués, les amides primaires, secondaires ou tertiaires en Ci-C,8, linéaires ou ramifiés, et les arylalkyles en C1-Cs8. Les dérivés d'oligosaccharides adaptés à la mise en oeuvre de l'invention peuvent notamment appartenir à l'une des catégories citées ci-après, dans lesquelles l'oligosaccharide répond à la formule générale suivante: galactose-n (ct ou 3) - (Hex)p dans laquelle n représente la position 1, 2, 3, 4 ou 6, Hex représente un pentose ou un hexose en liaison a ou, p est un nombre compris entre 1 et 5 a) - des glycosides répondant aux formules (I) oligosaccharide 1-O-R, dans lequel R est un résidu alkyle de I à 18 atomes de carbone, linéaire ou branché, (II) oligosaccharide 1-O-R-O-1-oligosaccharide dans laquelle R = (CH2)m, m étant compris entre 2 et 10, b) - une osylamine acylée selon l'une des formules suivantes, dans lesquelles l'oligosaccharide est de préférence le lactose, le mélibiose ou le stachiose: - des osylamines acylées répondant à l'une des formules suivantes 5.(Ill) oligosaccharide 1-NH-CO-R, dans laquelle R est un résidu alkyle de 2 à 18 atomes de carbone, contenant 0, 1 ou 2 double liaisons, (IV) oligosaccharide 1-NHII-CO-R-CO-NH-1-oligosaccharide, dans laquelle R = (CH2)m, m étant compris entre 2 et 8, c) - une alkylamine acylée par un acide aldonique obtenu par oxydation d'un oligosaccharide (V) oligosaccharide -CO-NII-R, dans laquelle R a la même signification que dans la formule (III), (VI) oligosaccharide CO-NH-R-NH-COoligosaccharide, o R a la même signification que dans la formule (III), d) - soit un produit de réduction des bases de Schiff formé par des oligosaccharides avec des mono- ou diamines aliphatiques, et répondant à l'une des formules suivantes: (VII) Gal - (I1ex)n -X-HN-R, (VIII) Gal (Hex)n - X-HN-R-NHI-X- (Hex)n - Gal, dans lesquelles: H-lex est un hexose ou un pentose, n =0, 1 ou 2, X = 1-NH2-hexitol, et R a la même signification que dans (III). De tels oligosaccharides ont notamment été décrits dans la demande WO 95/05155 pour leur utilisation dans la prévention du vieillissement des tissus, par modulation de la production d'élastase. Dans le cadre de la présente invention, il a été montré que d'autres mécanismes de lutte contre les effets du vieillissement peuvent être potentialisés. En particulier, la synthèse de collagène par les fibroblastes se trouve augmentée par le mélibiose; elle est également augmentée par le rétinol, et il existe une synergie de ces activités en présence des deux molécules. De préférence, le rétinoïde entrant dans les compositions selon l'invention est choisi dans le groupe constitué de l'acide rétinoïque ou la trétinoïne, le rétinol, les rétinaldéhydes, leurs sels et leurs esters. Des sels typiques sont les sels de métal alcalin, d'ammonium et d'ammonium en C2- C30. Les sels de sodium, de potassium, de triéthanolammonium et d'ammonium sont particulièrement préférés. Les combinaisons de tous les composés précédents peuvent être présentes dans les compositions. En outre, les termes "rétinol" et "acide rétinoique" doivent s'entendre comme incluant les isomères hydrogénés et non hydrogénés tels que le 9-cis- rétinol, le didéhydrorétinol, l'acide 13-cis-rétinoïque, l'acide 13- trans rétinoïque et l'acide didéhydrorétinoïque. Des compositions particulièrement adaptées à la mise en oeuvre de l'invention contiennent une association de rétinol et de mélibiose. Elles comprennent également des excipients adaptés à une administration par voie topique externe, notamment des excipients dermatologiquement acceptables. Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, les compositions contiennent des excipients adaptés à l'administration par voie orale. Des excipients adaptés à la formulation sont connus de l'homme du métier et comprennent notamment des épaississants, émulsionnants, conservateurs, colorants, parfums, etc. Les compositions peuvent se présenter par exemple sous forme de solution, gels, lotions, crèmes, émulsions huile-dans-eau, eau-dans-huile ou multiples, ou sous forme liposomée. Les compositions peuvent également contenir d'autres agents hydratants ou adoucissants. Les compositions selon l'invention, grâce à l'activité synergique du rétinoiïde et de l'oligosaccharide, en particulier de l'association du rétinol avec le mélibiose et/ou le lactose, ont un effet amélioré sur les signes majeurs du vieillissement, en terme d'efficacité et de rapidité d'action. Les premiers résultats peuvent être observés après six semaines de traitement par les compositions et s'exercent en profondeur. Ces effets comprennent la réduction du nombre et/ou de la profondeur des rides, le raffermissement de la peau et une meilleure hydratation; les compositions selon l'invention vont en outre unifier le teint et/ou prévenir ou diminuer l'apparition de taches de vieillesse. Les compositions selon l'invention seront particulièrement adaptées pour lutter contre les rides et le relachement des tissus. Elles protègent également la peau contre les agressions de l'environnement, notamment les U.V, et la pollution. Elles donnent un aspect uni et préparent la peau à recevoir d'autres produits cosmétiques et de maquillage. Les compositions selon l'invention pourront être utilisées au choix le matin et/ou le soir sur le visage ou les mains. Sur l'épiderme des mains, elles seront particulièrement appropriées pour améliorer la pigmentation et lutter contre l'apparition des taches de vieillesse, ainsi que pour augmenter la fermeté des tissus dans cette région, qui a tendance à devenir flasque avec l'âge. Les compositions selon l'invention permettent également de renforcer les ongles, en évitant qu'ils deviennent cassants et à améliorer leur aspect, notamment en luttant contre l'apparition de stries et/ou de taches. Les compositions selon l'invention sont particulièrement appropriées pour le traitement des zones du contour des yeux et des lèvres, qui sont très fragiles et ont une susceptibilité élevée à l'apparition de rides et de relachement. Des compositions selon l'invention sont très bien tolérées dans cette zone sensible o leur activité anti-âge, due à la synergie entre les différents composants, s'exercera dès six semaines d'application. Elles permettent de réduire visiblement le nombre de rides et les poches sous les yeux; elles raffermissent la peau particulièrement sensible du contour de l'oeil et de la bouche. Les compositions peuvent également s'appliquer sur les phanères et notamment sur la chevelure. Avantageusement, la concentration en rétinoïdes, notamment en rétinol, est supérieure ou égale à environ 0,0001% et inférieure à 3% par rapport au poids total de la composition. Elle est de préférence comprise entre 0,001% et environ 1% en poids, et de manière encore préférée inférieure ou égale à environ 0,5%. Le mélibiose est présent à une concentration comprise entre environ 0,0001% et environ 5%; avantageusement sa concentration sera supérieure ou égale à environ 0, 001% et inférieure ou égale à environ 2% en poids par rapport au poids total de la composition, de préférence inférieure ou égale à environ 1%. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'une association d'au moins un rétinoïde avec au moins un oligosaccharide comprenant de 2 à 6 résidus osidiques et présentant un galactose en position terminale non réductrice ou un dérivé d'un tel oligosaccharide susbtitué par un résidu hydrophobe, pour la préparation d'une composition destinée à améliorer l'élasticité de la peau et/ou à lutter contre les modifications de la peau liées au vieillissement. Plus particulièrement, les compositions dermocosmétiques selon l'invention sont destinées à améliorer les propriétés viscoélastiques de la peau et à prévenir ou diminuer la formation de rides. En effet, la Demanderessse a mis en évidence que le rétinol possède une activité anti-élastase, qui vient renforcer l'effet connu du mélibiose. L'association rétinol/mélibiose, en stimulant la synthèse de collagène, entraîne une densification des faisceaux de collagène avec une meilleure organisation des faisceaux. On observe en outre un épaississement du corps muqueux sous forme d'expansion épithéliale s'invaginant dans le derme. Une méthode de traitement cosmétique du photovieillissement et du vieillissement intrinsèque de la peau, des muqueuses ou des phanères, en particulier du visage et des mains, consistant à appliquer les compositions telles que décrites ci-dessus est également comprise dans l'invention. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer certains aspects de l'invention. Exemple 1: Effet du rétinol, de l'acide rétinoique, du mélibiose, ou de l'association rétinol-mélibiose sur l'expression d'ARNm pour le collagène par des fibroblastes Un modèle in vitro reposant sur l'utilisation de fibroblastes de derme humain cultivés dans des lattices de collagène (derme équivalent), a été retenu pour évaluer les effets du rétinol, du mélibiose, et de l'association rétinol plus mélibiose. Le niveau d'investigation retenu a été celui des ARN messagers (ARNm) codant pour le procollagène III (qui sera par la suite désigné par collagène III). La détection des ARNm a été réalisée par une méthode de reverse-transcription/amplification thermosensible. Cette technique présente des avantages par rapport à d'autres méthodes d'étude des ARN, notamment en ce qui concerne la sensibilité et la possibilité de quantifier (semi-quantitatif) les effets. 1- MATERIEL ET METIHIODES Svstème d'essai Le milieu de culture des fibroblastes (MCF) était constitué de MEM/199 (3/4, 1/4; v/v) additionné de pénicilline (100 tJUl/ml), dc streptomycine (100 Ftg/ml), de glutamine (2 mM) et de bicarbonate de sodium (0,2%, v/v). La solution de lavage du système d'essai était le tampon phosphate salin (PBS): NaCI 8 g/l; Na2H-PO4 1,15 g/l; KH2PO4 0,2 g/l; KC1 0,2 g/l; CaCL 2 0,1 g/l; MgCl2 0,1 g/l; pH 7,4. Les fibroblastes ont été isolés à partir d'une plastie mammaire prélevée chez une femme âgée de 34 ans. Les cellules ont été obtenues par culture d'explants de peau; elles ont été employées au septième passage. Les fibroblastes ont été mis en suspension dans une solution contenant du collagène I (2 mg/ml), du milieu MCF et 5% (v/v) de SVF. La suspension a été distribuée dans des plaques de culture de 6 puits, et les plaques ont été placées à 37 C, dans une atmosphère contenant 5% de CO2. Les systèmes d'essai étaient constitués par les lattices contractées par les fibroblastes après 96 heures de culture. Le mélibiose (M) a été testé à 0,01; 0,1 et 1 jtg/ml (soit 0,01; 0,1 et 1 ppm). Le rétinol (R) a été testé à 10-6; 10-5 et 10-4% (soit 0,01; 0,1 et 1 ppm). L'acide rétinoïque (AR) a été testé à 10-6; 10-5 et 10-4 % (soit 0,01; 0, 1 et 1 ppm). L'association des produits M et R a été testée respectivement à 0,1 ppm+0,01 ppm et à 0,1 ppm+0,1 ppm. Le mélibiose et le rétinol ont été directement solubilisés dans le milieu MCF. L'acide rétinoïque a été solubilisé à 0,1% (p/v) dans le DMSO, puis dilué dans le milieu MCF. La vitamine C, prise comme témoin positif, a été testée à 1 mM dans le milieu MCF. Les lattices de collagène ont été incubées pendant 96 heures avec les produits à l'essai ou le produit de référence, à 37 C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. Les ARN totaux ont été extraits et purifiés à partir des fibroblastes inclus dans les lattices de collagène à l'aide du kit RNA Instapur (EUROGENTEC, lot 17). L'intégrité des ARN extraits et l'absence d'ADN génomique contaminant ont été vérifiées par séparation des ARN sur un gel d'agarose à 1% (p/v) contenant 10 lig/ml de BET. La concentration et la pureté des préparations d'ARN ont été déterminées par spectophotométrie à X=260 nm et 280 nm. Le rapport DO 260/DO 280 devait être supérieur à 2. Les ARN messagers ont été transformés en ADNC par reverse transcription dans un volume total de 20 FI de mélange réactionnel contenant 500 ng de random primer, 0,5 mM de chaque dNTP, 22U d'inhibiteur de ribonucléases, le tampon de l'enzyme et 200U de MmLV reverse transcriptase (PROMEGA). Cette réaction a été réalisée à 42 C pendant 1 heure. Amplification thermosensible Pour chaque ARNm étudié, 2 oligonucléotides (dits "amorces") complémentaires d'une séquence codante du gène ont été choisis en fonction des critères suivants: - taille de l'amorce, 20 nucléotides, - distance entre les amorces comprises entre 300 et 1000 paires de bases, - pourcentage de [Guanine + Cytosine] dans la séquence compris entre 50% et 80%. Les caractéristiques des oligonucléotides employés figurent dans le tableau ci-après. Tableau 1: Caractéristiques des oligonucléotides employés pour la réaction d'amplification thermosensible ARNm cible Température Nombre de cycles Taille du (/ARNm standard d'hybridation d'amplification fragment couplé) des amorces thermosensible amplifié (OC) (en paires de bases) Collagène I 61 35 922 (/13-actine-A) Collagène III 56 22 406 (/pS-actine-C) Collagène VII 62 30 661 (/13-actine-A) 3-actine-A 300 3-actine-C 838 Les séquences cibles des ADNC obtenus ont été amplifiées dans 20 1l de mélange réactionnel contenant lmNmM de chacun des oligonucléotides (5'--3' et 3'-5'), 0,25mM de chaque dNTP, 1,S mM de MPgC12, le tampon de l'enzyme et 0,1U de Taq polymérase (EUROGENTEC). Le nombre de cycles permettant une réaction proportionnelle à la quantité initiale d'ADNC a été déterminé pour chaque ADNC. Un ADNc a été inclus comme standard interne dans chaque amplification, celui de la 3- actine. Deux jeux d'amorces qui diffèrent par la température optimale d'hybridation et par la taille du fragment amplifié ont été employés pour la 13-actine: cela permettait une réaction ou une séparation correcte, pour les différentes séquences cibles étudiées. En outre, une amplification a été réalisée en parallèle à partir des ARN non reverse-transcripts et d'un ADN génomique, comme contrôles complémentaires, dans chaque série expérimentale. Chaque réaction d'amplification a été réalisée en double. Les produits issus de l'amplification thermosensible (appelés amplicons) ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 2% (p/v) contenant 10 fg/ml de BEI', colorant des amplicons. L'intensité des bandes correspondant aux amplicons étudiés à été mesurée à l'aide d'un scanneur densimètre couplé au logiciel DENSYLAB). Les résultats ont été exprimés en intensité des bandes et également sous forme de rapport entre l'intensité de la bande de l'amplicon obtenu à partir de l'ARNm standard. 2- Résultats L'expression des ARNm cibles a été étudiée par une technique de reverse transcription-amplification thermosensible. Plusieurs contrôles ont été réalisés à chaque étape pour pouvoir comparer et (semi) quantifier les niveaux d'expression des ARNm cibles. Ces contrôles étaient notamment les suivants - qualité des ARN extraits, absence de contamination d'ADN génomique, - spécificité des amorces, linéarité de la réaction d'amplification, - inclusion d'un standard interne. Les résultats ont été exprimés en terme de ratio ARNm cible/ARNm standard. Des différences supérieures à un facteur 1,5 étaient considérées comme significatives. Collagène III Le rapport d'intensités observé pour les fibroblastes cultives en présence du produit de référence (vitamine C), testé à 1mNImM, était supérieur a celui du témoin d'un facteur 2,6 (tableau 2). Le rapport d'intensités observé pour les fibroblastes cultivés en présence du mélibiose (M), essayé à 0,01 ppm, était supérieur à celui du témoin d'un facteur 1,5. Aux autres concentrations testées, les rapports d'intensités obtenus étaient comparables à celui du témoin (tableau 2). Les rapports d'intensités observés pour les fibroblastes cultivés en présence du rétinol (R), essayé à 0,01 et 0,1 ppm, étaient supérieurs à celui du témoin respectivement d'un facteur 1,5 et 1,9 (tableau 2). Le rapport d'intensités observé pour les fibroblastes cultivés en présence de l'acide rétinoïque (AR), essayé à 0,01 ppm, était supérieur à celui du témoin d'un facteur 2,4 (tableau 2). Les rapports d'intensités observés pour les fibroblastes cultivés en présence du produit M+R, essayé à 0,1 ppm+0,01 ppm et 0,1 ppm+0,1 ppm, étaient supérieurs à celui du témoin respectivement d'un facteur 3,4 et 2,7 (tableau 2). La comparaison des rapports des intensités densimétriques ARNm cible/ARNm standard met en évidence un effet des produits à l'essai MNI, R, AR et M+R sur l'expression des ARNm codant pour le collagène 11I par des fibroblastes dermiques humains cultivés en lattice de collagène. Les produits à l'essai augmentent l'expression des ARNm codant pour le collagène 111. L'intensité de cet effet était variable selon les produits. L'effet le plus important était observé avec le produit M+R, suivi par le produit AR et R. Les produits MNI, AR et M+R présentaient une relation effet dose; les effets les plus significatifs étaient observés aux plus faibles concentrations testées. Tableau 2 Effet des produits à l'essai M, R, AR et M+R et du produit de référence sur les taux d'ARN messager codant pour le collagène III par des fibroblastes dermiqueshumains normaux cultivés en lattice de collagène Amplicon Tém. Tém. Produit à l'essai Produit DNISO référence M R AR M+R (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) Vit.C 0,01 0,1 1 0,01 0,1 1 0,01 0,1 1 0,1 + 0,1 + lmM 0,01 0,1 Collagène 111 2564 1902 1020 1833 1638 498 1926 1662 1748 1968 1613 1678 1906 232 {-actine-C 465 241 120 309 286 60 180 259 92 240 280 89 124 16 Rapport Collagène III1/ 5,517,89 8,50 5,93 5,72 8,30 10,70 6,41 19,00 8,20 5,76 18,8 15,3 14,50 7 A-actine-C Rapport en % 100 154 108 104 151 194 116 342 278 264 du témoin -.1 1 00 240 104 73 o w Les résultats sont exprimés en intensité densimétrique des bandes et sous forme de rapport (intensité ARNm cible/intensité ARNm standard). En italique: rapport des intensités en pourcentage du témoin Des différences supérieures à un facteur 1,5 étaient considérées comme significatives. Exemple 2: Effet sur la peau humaine de rétinol seul ou en association avec le mélibiose Les effets de trois crèmes cosmétiques sur la peau humaine normale sont analysés après 28 jours d'application. Pour cela, on utilise un modèle de peau humaine maintenue en survie par culture d'organes. 1- Matériel et Méthodes Les cultures d'organe sont réalisées selon le protocole suivant. Dans un premier temps, les fragments de peau (provenance: chirurgie plastique) sont déposés dans des inserts eux- mêmes positionnés sur des puits de culture. Les trois produits sont déposés directement sur la peau. Du milieu de culture (antibiotique, SVF) est ajouté dans le fond des puits, un passage s'effectuant par diffusion lente entre les deux compartiments par l'intermédiaire d'une membrane poreuse (0,45 km). L'ensemble est maintenu en culture d'organes pendant 28 jours. Le milieu de culture des puits est également renouvelé trois fois par semaine. Les trois crèmes sont renouvelées trois fois par semaine au niveau des peaux: - crème 1: rétinol - crème 2: rétinol + mélibiose - crème 3: excipient Le maintien en survie d'une peau non traitée pendant 28 jours permet un contrôle de manipulation de culture. 1-1- Etude de 1' épithélium et du collagène a) Analyse de l'épithélium par une analyse histologique après fixation dans le liquide de Bouin et inclusion en paraffine avec coloration par l'hemalun- éosine permettant: un calcul du nombre de couches au niveau du corps muqueux et de l'épaisseur de la couche cornée; - par une analyse immunohistochimique de la différentiation épithéliale à l'aide d'anticorps anti-cytokératines totales. b) Etude du collagène - par une analyse histologique après coloration par le trichrome de Masson vert. - analyse par gel d'électrophorèse des collagènes de type I et III Une autre série de peaux est recueillie et le collagène est extrait après traitement par la pepsine. Un gel d'électrophorèse (SDS-PAGE à 7, 5% d'acrylamide) avec réduction par le i-mercaptoéthanol permet d'isoler et de quantifier les chaines de collagènes spécifiques des types I et III en fonction de leur poids moléculaire par rapport aux autres protéines cutanées (technique de Sykes et coll.). 1-2- Analyse de l'activité anti-élastasiquc par l'étude de la protection des fibres élastiques au niveau de peaux humaines maintenues en survie ex vivo A l'aide du modèle de peau humaine sur laquelle un protocole expérimental de destruction du réseau de fibres élastiques par les élastases des polynucléaires et des macrophages est utilisé. Pour cela, de l'élastase leucocytaire humaine (ELH-t) sera ajouté à la surface de la peau trois fois par semaine, les crèmes possédant éventuellement un actif à visée anti-élastasique étant déposées en même temps au niveau épidermique trois fois par semaine. Au terme de 28 jours de culture, les fragments de peau seront fixés dans le liquide de Bouin et les fibres élastiques seront révélées par une coloration par la (+)-catéchine. La conservation des fibres élastiques sera analysée: - histologiquement, - par une quantification par analyse d'image de la surface des fibres élastiques. 2- RESULTATS 2.1- ETUDE DE L'EPITIIELIUMN PAR DES TECHINIQUES HISTOLOGIQUE ET IMMUNOHIISTOCHIMIQUE a) Analyse histologique de l'épaisseur de l'épithélium et de la couche cornée Le nombre de couche après 28 jours de culture ex vivo a été calculé au niveau du corps muqueux ainsi que l'épaisseur de la couche cornée (moyenne + SD) à l'aide des coupes histologiques colorées par l'hemalun- éosine (HE). Au niveau du corps muqueux, nous avons effectué un comptage du nombre de couches minimum et maximum (expansions dermiques). Nombre de couches au niveau de l'épiderme Couche cornée Corps muqueux nb. couches expansion min. peau traitée 5,95 + 2,55 7 + 2,9* 7 + 0,7* crème 1 peau traitée 6,65 + 3,1 5,3 + 1,5 8,36 + 1,65* par crème 2 peau traitée 7,6 + 2,9 3,9 + 0,9 0 par crème 3 * résultat statistiquement différent par rapport à l'excipient, la crème n 3 (p modification significatives de l'épaisseur de la couche cornée. Résultats concernant le corps muqueux: Dans le cas des peaux traitées par les crèmes 1 et 2 on note la présence d'un épaississement du corps muqueux sous forme d'expansion épithéliale par rapport à la crème 3 (excipient). La longueur de l'expansion est plus importante pour la crème n 2 (rétinol + mélibiose). c) Analyse immunohistochimique de la différentiation épithéliale à l'aide d'anticorps anti-cytokératines totales Avec les peaux traitées par la crème 2, une augmentation de l'intensité du marquage (témoignant d'une amélioration de la différenciation) d'aspect sensiblement identique est observée dans 6 cas sur 8. 2.2- ANALYSE HISTOLOGIQUE ET BIOCHIMIQUE DU COLLAGENE a) Analyse histologique (coloration par le Trichrome de blasson) Pour chaque crème, une évaluation au nmicroscope optique de l'intensité du marquage et de l'organisation des faisceaux de collagène est effectuée de façon comparative. On observe dans tous les cas: - crème n 2 > crème n 1 > crème n 3. On observe de manière nette avec la crème n 2 une densification des faisceaux de collagène avec une augmentation de l'épaisseur des faisceaux et de leur nombre réduisant ainsi les espaces inter- cellulaires; ce phénomène est surtout visible dans le derme superficiel au contact de la membrane basale. Cette modification de l'organisation des faisceaux est responsable de l'augmentaton de l'intensité du marquage avec le trichrome. Les faisceaux apparaissent également mieux organisés. b) Analyse par gel d'électrophorèsc des collagènes de type I et III Les gels d'électrophorèse ont permis de mettre en évidence une augmentation de la synthèse de collagène pour les peaux traitées avec les crèmes 1 et 2. En effet, les bandes protéiques révélées correspondant aux collagènes de type I et III présentent une intensité de marquage plus forte que celles de la crème 3. Il est à noter que l'augmentation de synthèse parait plus forte pour le collagène de type I que pour le collagène de type III. La quantité de collagène (type I et 11) des peaux traitées par la crème 3 ne diffère pas d'une peau normale. 2-3 EVALUATION DES ALTERATIONS DES FIBRES ELASTIQUES INDUITES PAR L'ELH DANS DES PEAUX MAINTENUES EN SURVIE ETl EVALUATION DE LEUR PROTECTION APRES TRAITEMENT PAR TROIS CREMES A VISEE ANTI- VIEILLISSEMENT a) Analyse histologique des fibres élastiques Au niveau des 6 peaux analysées, le protocole expérimental de destruction des fibres élastiques par l'ELHI a permis d'obtenir une dégradation partielle du réseau de fibres élastiques. Cette destruction est variable d'une peau à l'autre. Ainsi, la comparaison du pourcentage de protection des fibres élastiques sera effectuée entre la biopsie traitée par l'ELH et celle traitée par la crème. Secondairement, une moyenne des pourcentages est réalisée sur les 6 peaux. Pour les peaux traitées par la crème n 1, la protection, évaluée de façon semi-quantitative, est égale à 40%. Pour les peaux traitées par la crème n 2, la protection obtenue est de 41,25%. Enfin pour celles traitées par la crème n 3, la protection est de 0%; la destruction des fibres élastiques est identique à celle obtenue avec l'élastase leucocytaire humaine seule. b) Quantification par analyse d'image des fibres élastiques Une analyse quantitative du réseau élastique du derme a été effectuée au niveau des peaux traitées par l'enzyme ELI- avec ou sans présence des quatre crèmes à tester. On a mesuré le pourcentage de surface de derme occupé par les fibres élastiques colorées par la (+) catéchine. Les résultats obtenus en moyenne pour les 6 cas analysés sont: % de surface peaux témoins 12,6 % + 0,6 peaux + ELH 4% + 0,5 peaux traitées par crème 1 + ELII 7,5 %+ 0,5* peaux traitées par crème 2 + ELII 7,8 % + 0,7* peaux traitées par crème 3 + ELHLI 4,2 % + 0,2 * résultat statistiquement différent par rapport à la peau + ELII (p revanche aucune protection n'a été obtenu avec la crème n 3. L'évaluation de la taille des fibres élastiques permet de mesurer sur plusieurs champs la moyenne des fibres élastiques les plus longues (jm). ILm peaux témoins 58 + 5 peaux + ELH 36 + 8,6 peaux traitées par crème 1 + ELHI 54 + 4,7* peaux traitées par crème 2 + ELH 54 + 5,4* peaux traitées par crème 3 + ELH 35 + 7,7 * résultat statistiquement différent par rapport à la peau / ELH (p longueur similaire aux peaux témoins pour les fibres les plus longues. Après traitement par l'ELH, l'aspect fragmenté des fibres élastiques observé histologiquement est confirmé par l'analyse d'image: les fibres élastiques ont pour longueur maximum 36 Ilm, résultat significativement différent des peaux témoins (p Les peaux traitées par la crème 3 n'ont pas permis de protéger les fibres élastiques de la fragmentation induite par l'élastase leucocytaire humaine. La longeur obtenue est, en effet, de 35 tm au maximum pour les fibres les plus longues. Exemple 3: Influence du rétinol et du mélibiose sur l'activité antiélastasique sur coupes de peau humaine normale Matériels et Méthodes Des coupes congelées de 8 ilm d'épaisseur ont été réalisées à partir de prélèvement obtenus en chirurgie plastique. L'élastase leucocytaire humaine (ELH à 10 ig/ml) était appliquée sur les coupes de peau pendant 2 heures à température ambiante et en atmosphère humide avec ou sans rétinol ou mélibiose. Ainsi, les fibres élastiques étaient soumises directement à l'action enzymatique. Après fixation dans l'acétone et déshydratation dans de l'éthanol à C, les fibres élastiques qui subsistaient après traitement étaient colorées par la (+) catéchine. L'évaluation semi-quantitative des fibres élastiques était complétée par une quantification par analyse d'image. L'activité anti-élastasique du rétinol et du mélibiose était comparée à celle du PMFS (fluride de phénylméthylsulfonide), inhibiteur puissant des élastases. Résultats Les résultats expérimentaux sont rassemblés-dans le tableau suivant: Produits % d'activité anti- élastasique Rétinol 1 mg/ml 80% 1g/ml 70% &g/ml 60% Mélibiose 1 mg/ml 15% Le rétinol présente donc une activité anti-élastasique importante. Cet effet est dose dépendant. Le mélibiose présente également une activité anti-élastasique mais cet effet n'est pas dose dépendant. Exemple 4: Compositions contenant des associations selon l'invention Formule A: Emulsion H/E % - Glycérine 5 - EDTA disodique 0,2 - Méthyl paraben/Phénoxyéthanol/Propyl I paraben - Eau 65,3 - Polyacrylamide et C13-14 2 isoparaffine et laureth-7 - Diméthicone 2 - Alcool cétéarylique 0,5 - Cyclométhicone 1,5 Isopropyl palmitate 2 - BHT 0,1 - Citrate de tri-C14-C15 alkyle 4 - Alcool 90 6 -Caféine 2 -Mélibiose 0,5 - Rétinol 0,3 -Butylène glycol 2 - Lactose 4,5 - Acide stéarique 1,0 Hydroxyde de sodium 0,1 Formule B: Emulsion H/E % - Eau 67,473 - Carbomère 0,300 - Glycérine 5,000 - PEG 8 2,000 - EDTA disodique 0,200 - Hydroxyde de sodium 0,135 - Eau 1,000 - Mélibiose 0,500 - Lactose 4,50 - Phénoxyéthanol méthyl paraben propyl 0,200 paraben - Glycéryl stéarate Peg 100 stéarate 5,000 - Cétéaryl octanoate isopropyl myristate 3,000 - C12-15 alkyle benzoate 3,500 - Glycéryl stéarate 3,000 Alcool stéarylique 0,500 - Alcool cétostéarylique 0,500 - Palmitate de cétyl - 0,500 - Talc 0,200 - BHT 0,100 - Phénoxyéthanol méthyl paraben propyl 0,800 paraben - Benzoate d'alkyle C12-15 0,500 - Rétinol 0,092 - Diméthicone 1,000 Total 100,- Formule C: Emulsion H/E % - Eau 64,808 - Carbomer 0,100 - Polymère réticulé Acrylates / 0,500 Acrylate d'alkyle C10-30 réticulé - Poloxamer 407 0,500 - Glycérine 5,000 - Glycéryl polyméthacrylate propylène 5,000 glycol aqueux - EDTA disodique 0,200 - Hydroxyde de sodium 0,200 - Eau 1,000 - Mélibiose 0,500 - Lactose 4,50 - Phénoxyéthanol méthyl paraben propyl 0,200 paraben - Cétéaryl Octanoate isopropyl myristate 5,000 Octyl méthoxycinnamate 8,000 - Butyl méthoxydibenzoylméthanc e 1,500 Talc 1,000 - BHT 0,100 - Phénoxyéthanol méthyl paraben propyl 0,800 paraben - Acétate de tocophéryl 0,500 - Cétéaryl octanoate isopropyl myristate 0,500 - Rétinol 0,092 Total 100,-- Formule D: Emulsion HI/E % - Gomme Xanthane 0,100 - Eau 57,802 - Glycérine 3,000 - PEG 8 5,000 - EDTA disodique 0,200 - Lactose 5,000 - Glycéryl polyméthacrylate, propylène 5,000 glycol aqueux -Glycine 0,200 - Mélibiose 0, 500 - Urée 2,000 - Phénoxyéthanol méthyl paraben propyl 0,200 paraben - Cétéaryl alcool, cétéaryl glucoside 5,000 - Isocétyl stéarate 4,500 -trioactanoine 2,000 - Malate de di (C 1 2-C13) alkyle 5,000 - Diméthicone - 1,()00 Cyclométhicone 2,000 - MIT 0,100 - Phénoxyéthanol méthyl paraben propyl 0,800 paraben - Isocétyl stéarate 0,500 - Rétinol 0,092 Formule E: Gel % - Glycérine 5 - EDTA disodique 0,2 - Méthyl paraben/Phénoxyéthanol/Propyl 1 paraben - Eau 66,4 Polyacrylamide et C13-14 2 isoparaffine et laureth 7 - Diméthicone 2 Alcool cétéarylique 0,5 - Cyclométhicone 1,5 - Isopropyl palmitate 2 - BHT 0,1 - Tri-C14-C15 citrate d'alkyle 4 - Alcool 90 6 - Caféine 2 - Mélibiose 0,5 - Rétinol 0,3 - Butylène glycol 9 - Lactose 4,5 Formule F: Emulsion II/E % - Glycérine 5 - EDTA disodique 0,2 - Méthyl paraben/Phénoxyéthanol/Propyl 1 paraben - Eau 65,4 - Polyacrylamide et C13-14 2 isoparaffine et laureth-7 - Diméthicone 2 - Alcool cétéarylique 0,5 - Cyclométhicone 1,5 - Isopropyl palmitate 2 - BHT 0,1 - Tri-C14-C15 citrate d'alkyle 4 - Alcool 90 6 - Caféine 2 - Mélibiose 0,5 - Rétinol 0,3 - Butylène glycol 2 - Lactose 4,5 - Acide stéarilyque 1,0 - Hydroxyde de sodium 0,1 - Alcool cétéarylique - cétéaryle glucoside 1,0 Formule G: E mulsion H/E % - Eau 60,491 - Carbomer 0,300 - Eau 1,000 Hydroxyde de sodium 0,135 - Chondrus crispus 1,000 - Magnésium aluminium silicate 0,250 - EDTA disodique 0,200 - Lactose 4,000 - Kaolin 1,000 - PEG 8 1,000 - Acide glycyrrhétinique 0,500 - Mélibiose 1,00 - Sorbitol 2,000 Phénoxyéthanol méthyl paraben propyl 0,200 paraben - Isocétyle stéarate 5, 500 - Cétéaryl octanoate-isopropyl myristate 4,000 - Sorbitan stéarate 4,080 - PEG 20 stéarate 7,920 - Alcool cétéarylique 2,000 - BHT 0,100 - Phénoxyéthanol méthyl paraben propyl 0,800 paraben - Isocétyl stéarate 0,500 - Rétinol 0,024 - Hamamelis virginiana 2,000 REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique ou cosmétologique, caractérisée en ce qu'elle contient une association d'au moins un rétinoide avec au moins un oligosaccharide comprenant de 2 à 6 résidus osidiques et présentant un galactose en position terminale non réductrice, ou un dérivé d'un tel oligosaccharide substitué par un résidu hydrophobe, et des excipients pharmaceutiquement ou cosmétologiquement acceptables. 2. Composition pharmaceutique ou cosmétologique selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'oligosaccharide est choisi dans le groupe constitué du mélibiose, du lactose et de leurs dérivés susceptibles d'être obtenus par addition d'un résidu hydrophobe. 3. Composition pharmaceutique ou cosmétologique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le rétinoïde est choisi dans le groupe constitué du rétinol, de l'acide rétinoique, de leurs sels et de leurs esters. 4. Composition pharmaceutique ou cosmétologique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle contient une association de rétinol et de mélibiose. 5. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle contient des excipients dermatologiquement acceptables. 6. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle contient en outre des excipients adaptés à l'administration par voie orale. 7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le rétinol est présent à une concentration comprise entre 0,0001% et 3%, et en ce que le mélibiose est présent à une concentration comprise entre 0,001% et 2%. 8. Utilisation d'une association d'au moins un rétinoïde avec au moins un oligosaccharide comprenant de 2 à 6 résidus osidiques et présentant un galactose en position terminale non réductrice ou un dérivé d'un tel oligosaccharide susbtitué par un résidu hydrophobe, pour la préparation d'une composition destinée à améliorer l'élasticité de la peau et/ou à la prévention ou au traitement des modifications de la peau et des phanères liées au vieillissement. 9. Utilisation d'une association selon la revendication 7, caractérisée en ce que le rétinoïde est le rétinol et l'oligosaccharide est le mélibiose ou ses dérivés susceptibles d'être obtenus par addition d'un résidu hydrophobe. 10. Utilisation selon l'une des revendications 7 ou 8 pour la préparation d'une composition dermocosmétique destinée à améliorer les propriétés viscoélastiques de la peau et à prévenir ou diminuer la formation de rides. 11. Utilisation d'un rétinoide pour la préparation d'une composition permettant de lutter contre la dégradation des fibres élastiques du tissu conjonctif. 12. Méthode de traitement cosmétique des modifications liées au vieillissement de la peau et/ou des phanères, caractérisée en ce qu'on applique sur la peau et/ou les phanères une composition selon l'une des revendications 1 à 4 ou 7.