FR 2764903 A1 19981224 FR 9707803 A 19970623 1 2764903 La présente invention concerne un polynucléotide comprenant tout ou partie de la séquence codant pour la grande sous-unité (L) de la polymérase des paramyxovirus de type RSVB ainsi que le polypeptide codé par ledit polynucléotide. L'invention a aussi pour objet un procédé de diagnostic des virus de type RSVB dans un échantillon biologique mettant en oeuvre tout ou partie du polypeptide de la grande sous-unité (L) de la polymérase des paramyxovirus de type RSVB ou des anticorps reconnaissant un tel polypeptide. L'invention concerne également des polynucléotides dérivés des gènes codant pour la grande sous-unité de la polymérase (L) de la famille des Paramyxoviridae, utiles en tant que sondes et/ou amorces nucléotidiques pour la détection spécifique de ces virus, en particulier des Paramyxoviridae de type RSVA, RSVB et PIV3. L'invention a enfin pour objet un procédé de diagnostic différentiel des paramyxovirus de type RSVA, RSVB et PIV3 mettant en oeuvre lesdits polynucléotides, ainsi qu'une trousse de détection contenant ces derniers. Parmi les virus présentant un tropisme pour les organes du système respiratoire, les virus appartenant à la famille des Paramyxoviridae sont d'un grand intérêt médical. Les virus Parainfluenza de types 1 et 2 (PIVI, PIV2) sont plus généralement associés à des infections des voies respiratoires supérieures ou à la laryngo-trachéite. Les virus respiratoires syncitiaux, RSV des sous-groupes A et B (RSVA, RSVB) et les virus parainfl7uenza de type 3 (PIV3) sont la cause prépondérante des maladies virales aigues des voies respiratoires inférieures telles que les bronchiolites et les pneumonies (Falsey et al., 1992; Freymuth et al., 1983; Freymuth et al., 1987; Martin et al., 1978; Welliver, 1982). Ces infections présentent un caractère de (Travité exceptionnel et nécessitent très souvent une hospitalisation des patients infectés, plus particulièrement des enfants (Murphy et al., 1988). Les infections virales respiratoires causées par les virus RSVA, RSVB et PIV3 sont en conséquence une préoccupation importante de Santé Publique et il existe un besoin croissant de systèmes de dépistage précoce de telles infections virales qui doivent être caractérisés à la fois par leur spécificité, leur sensibilité ainsi que par leur rapidité et leur facilité de mise en oeuvre. En particulier, le diagnostic différentiel précoce des infections par les virus de type RSV (RSVA, RSVB) et PIV3 est nécessaire en vue de suivre le développement de l'infection chez les patients, plus particulièrement chez les enfants, et en vue d'administrer une thérapie antivirale adaptée: ribavirine ou immunoglobulines spécifiques (Hall, C. B. et al.. 1985, J. Anm. Mled. Ass., 254, 3047-3051) ainsi que pour la prévention d'une dissémination de nature nosocomiale. Les tests d'immunofluorescence (IFA) des antigènes viraux dans les aspirats nasals sont aujourd'hui utilisés pour le diagnostic d'infections par les virus RSV et PIV, car ces tests sont plus rapides et plus sensibles que les techniques antérieures d'isolement du virus (Freymuth et 2 2764903 al., 1986; Takimoto et al., 1991; Wendt et al., 1992). L'immunodétection mettant en oeuvre des anticorps monoclonaux anti-nucléocapside ou antiglycoprotéine est aujourd'hui le moyen le plus couramment employé pour la détection des Pramnyxoviridae (RSVA, RSVB et PIV3) associés aux maladies des voies respiratoires inférieures (bronchiolite et pneumonie) chez les enfants hospitalisés (Downham et al., 1979; Freymuth et al., 1980; Freymuth et al,, 1986). Le test d'immunofluorescence est rapide et moins onéreux que la technique de référence consistant à l'isolement du virus à partie de cellules en culture. Dans certains cas cependant, la quantité de virus présent dans l'échantillon biologique n'est pas suffisante pour une détection directe par immunofluorescence et une étape d'amplification de la quantité de virus sur des cultures de cellules (VIT) est nécessaire pour la détection et le typage des virus. L'étape d'amplification (VIT) est onéreuse et peut nécessiter plusieurs semaines de culture avant que le diagnostic puisse être réalisé. L'utilisation de la réaction d'amplification en chaîne d'acide nucléique à l'aide de la polymérase, précédée d'une réaction de transcription inverse du matériel génétique présent dans les échantillons biologiques (réaction dite "RT-PCR" pour "Reverse Transcription- Polymerase-Chain Reaction >>), commence peu à peu à se développer comme alternative aux tests d'immunofluorescence afin d'améliorer la sensibilité de la détection des virus RSV et PIV. Cette technique a récemment été mise en oeuvre pour la détection de certaines séquences de RSV et PIV3 dans les aspirats nasals d'enfants infectés (Cubie et al., 1992; Freymuth et al., 1995; Karron et al., 1994; Milaan et al., 1993; Paton et al., 1992; Sullender et al., 1993; Gilbert et al., 1996; Cane et al., 1991). Le génome des virus RSV et PIV est constitué d'un ARN à brin négatif non segmenté qui est transcrit de manière polaire (de l'extrémité 3' vers l'extrémité 5'), et en cascade, en ARN messagers de quantité de plus en plus faible. Le gène N, qui est codé par une région de l'extrémité 3' du génome viral, est transcrit de manière plus intense (Banerjee, 1987; Tordo et al., 1988-a) que les autres gènes, en particulier que le gène L qui est codé par une région localisée à l'extrémité 5' du génome viral. En conséquence, le gène N a constitué la cible principale pour la détection des RSV et PIV par amplification RT- PCR, du fait la grande quantité de transcrits qui était susceptible d'assurer une grande sensibilité de détection et du fait de la grande conservation de ce gène au sein des Pararmyxoviridae, qui était susceptible d'assurer une grande spécificité des tests. En effet, on a observé une similarité de l'ordre de 90%, au niveau des séquences nucléiques, entre les gènes N des virus de type RSVA et RSVB (Johnson et al., 1989). Les amorces pour RSV définies par Cane et al. en 1991 ont été utilisées par Cubie et al. comme amorces externes dan une réaction d'amplification de type "Nested PCR ", et par Freymuth et al. en 1995 dans une réaction de type RT-PCR dans laquelle une séquence interne avait été définie et utilisée comme 3 2764903 sonde dans un test d'hybridation non radioactif Van Milaan et al., en 1993, a tenté de définir des séquences cibles pour amplifier et hybrider des régions flanquantes du gène N situées à proximité de l'extrémité du gène lB proximal. Cependant, toutes les études de l'art antérieur confirment la meilleure sensibilité des tests ayant comme cible le gène N par rapport aux tests ayant comme cible d'autres gènes, tels que les gènes F et G, par exemple (Paton et al., 1992; Sullender et al., 1993). Un test de détection de PIV3 par RT-PCR a été décrit par Karron et al. en 1994, qui a utilisé des amorces hybridant une région hautement conservée du gène de l'hémagglutinine-neuraminidase (HN). Un travail semblable est décrit dans la demande PCT N0 WO 97/16570 (Henrickson). Sullender a décrit, en 1993, l'utilisation de sondes oligonucléotidiques synthétiques complémentaires de i'ARN messager de la glycoprotéine G d'attachement des RSV, reconnue pour porter le plus grand nombre de différences immunologiques entre les deux sous-groupes RSVA et RSVB. Plus particulièrement, Sullender a synthétisé deux sondes nucléiques, I'une d'entre elles étant complémentaire de l'ARN messager de la glycoprotéine G des virus RSV de type A, en se basant sur les séquences correspondantes des souches RSVA " A2 " et " Long ", la seconde sonde nucléique étant complémentaire de l'ARN messager de la glycoprotéine G des virus de type B, en se basant sur les séquences correspondantes de la souche RSVB " 8/60 ">. Le test de détection par hybridation des sondes marquées décrit par Sullender est effectué sur des cellules fixées, après inoculation d'une culture cellulaire respectivement par des isolats de laboratoire de RSVA et RSVB, sans réaction d'amplification préalable de l'ARN viral. Ce test a permis de différencier efficacement les cellules fixées préalablement infectées avec un isolat de RSVB ou de RSVA sans que les sondes ne présentent de réaction d'hybridation croisée. D'autres auteurs ont choisi une stratégie consistant à amplifier spécifiquement une région du génome de RSVA et/ou RSVB et PIV3 par une réaction d'amplification de type RT- PCR afin de détecter la présence de ces virus dans un échantillon biologique. Les couples d'amorces synthétisés par ces auteurs sont principalement complémentaires de différentes régions du gène de la nucléocapside (N) de ces virus. Ainsi, Gilbert et al., en 1996, ont synthétisé un couple d'amorces nucléotidiques spécifique d'une région du gène N de la nucléocapside des virus RSV (RSVA et RSVB) et un couple d'amorces nucléotidiques spécifique d'une région du gène F des virus de type PIV3. Ces deux couples d'amorces ont permis de générer des amplicons spécifiques respectivement des virus RSV et des virus PIV3 avec peu de réactivité croisée, à partir de lysats de cellules cultivées en présence d'échantillons cliniques de patients infectés. La stratégie mise en oeuvre par Gilbert et al. nécessite l'utilisation de deux couples d'oligonucléotides, le but ici étant la 4 2764903 mise au point d'un diagnostic différentiel des RSV et des virus Parainfluenza. Par ailleurs le couple d'amorces spécifique des RSV ne permet pas de différencier selon que l'ARN présent dans l'échantillon biologique, en l'occurrence un lavage naso-pharyngique, provient d'un virus RSVA ou d'un virus RSVB. Cane et al., en 1991, ont utilisé, pour le diagnostic des virus RSV, plusieurs couples d'amorces complémentaires du gène N ou du gène codant pour des petites protéines hydrophobes (protéines SH). Les couples d'amorces ainsi définies permettent l'obtention d'amplicons qui sont ensuite soumis à l'action d'enzymes de restriction, dans le but de différencier les virus RSVA des virus RSVB de l'échantillon biologique. L'amplicon généré à l'aide du couple d'amorces complémentaire d'une région du gène N des RSV présente plusieurs profils de restriction, respectivement trois profils de restriction différents pour les virus RSV de type A et deux profils de restriction différents pour les virus RSV de type B. Le test mis au point par Cane et al. nécessite donc une analyse assez complexe pour la détermination du type de RSV présent dans l'échantillon. Paton et al., en 1992, a synthétisé un couple d'amorces spécifique d'une région du gène de la sous-unité F1 de la glycoprotéine de fusion F des virus RSV. Cette technique a permis à Paton d'amplifier spécifiquement, par une réaction de RT-PCR, l'ARN des RSV présent dans les cultures de lignées cellulaires inoculées avec des fractions aliquotes d'aspirats nasals de patients infectés, sans toutefois pouvoir différencier les RSV de type A et de type B. Cubie et al., en 1992, ont synthétisé un couple d'amorces complémentaires d'une région du gène N des RSV afin d'amplifier spécifiquement l'ARN de ces derniers, sans que le test mis au point ne permette de différencier entre les virus de type A et de type B. Freymuth et al., en 1995, ont eux-mêmes synthétisé un couple d'amorces complémentaires d'une région du gène N des RSV, qui a permis d'amplifier, par RT-PCR, avec une grande sensibilité et sélectivité I'ARN des RSV présents dans des aspirats nasals d'enfants hospitalisés, sans toutefois distinguer les RSV de type A et les RSV de type B. L'inconvénient de chacun des protocoles décrits ci-dessus est que la détection est limitée à un seul type de virus et que le test doit être répété pour chaque type viral (RSVA, RSVB, PIV3, etc.) sur un échantillon donné. Tordo et al. ont, lors du Congrès de juillet 1995 organisé par la revue FEMS en Turquie, décrit un couple d'amorces génériques, respectivement complémentaires des motifs A et C du gène de la grande sous-unité (L) de la polymérase des virus RSVA et PIV3. Le gène L de PIV3 est notamment décrit dans la demande PCT N WO 97/20468 (St Louis Univ.) La polymérase des virus à ARN à brin négatif non segmenté est unique en ce qu'elle ne reconnait le génome viral que lorsqu'il est associé à la protéine de la nucléocapside (N). Cette 2764903 polymérase est constituée d'une phospho-protéine (la protéine P ou NS) et d'une grande protéine (L), qui constituent les différentes sous- unités de l'assemblage catalytiquement actif La grande sous-unité (L), d'un poids moléculaire de 220 kD, est considérée comme le support de l'activité de transcription et de réplication virale, même si la protéine P semble indispensable à l'expression de l'activité enzymatique. L'alignement des séquences peptidiques de la protéine L de cinq virus à ARN choisi parmi les rhabdovirus (virus de la stomatite vésiculaire, et virus de la rage) et les paramyxovirus (virus de Sendaï, virus de la maladie de Newcastle, et virus de la rougeole) a permis de distinguer, dans la protéine L, six régions particulières bien conservées entre les différents types viraux et numérotées de I à VI (Poch et al., 1990). Les couples d'amorces définis récemment par Tordo et al. sont localisés dans la région du gène L codant pour la région III de la protéine. Ces couples d'amorces se sont avérés capables de générer, par une réaction de type RT-PCR, un amplicon de 350 pb à partir de souches prototypes et d'isolats cliniques de virus de type RSVA, PIV3 et RSVB. Ces auteurs ont pu montrer que l'action des enzymes de restriction AvalI, BglII et PvuII sur les amplicons générés conduisait à des profils de restriction caractéristiques de chacun des trois types de paramyxovirus respiratoires. La technique mise au point par Tordo et al. se limite à la génération d'un amplicon dans une région étroite du gène L de la polymérase de RSVA et PIV3, respectivement entre les motifs A et C de la région III. A l'époque, la séquence du gène L des virus de type RSVB n'était pas connue, ce qui ne permettait pas à l'homme du métier d'identifier d'autres séquences consensus pour définir des couples d'amorces génériques capables d'amplifier à la fois l'ARN des virus de type RSVA, PIV3 et RSVB. Par ailleurs, l'examen des profils de restriction de chaque amplicon afin de caractériser le type de virus présent dans un échantillon biologique, s'il apparaît sélectif, constitue une technique longue, complexe et onéreuse et donc peu adaptée à une utilisation en routine en milieu hospitalier ou dans un laboratoire d'analyses médicales. De plus, à l'époque à laquelle Tordo et al. ont défini deux couples d'amorces génériques capables d'amplifier une partie de la région III du gène L des virus RSVA, PIV3 et RSVB, un fort préjugé technique existait quant à la fiabilité et la sensibilité d'un tel test, en raison du faible niveau d'expression du gène L. ()0 De manière surprenante, les présents inventeurs ont démontré que la sensibilité de la technique consistant à amplifier, par une réaction de type RT-PCR, I'ADNc obtenu à partir de la transcription inverse de l'ARN génomique du gène N n'est pas inférieure à la sensibilité d'autres techniques de l'art antérieur, telles que l'immunofluorescence et l'isolement du virus par culture de cellules. 6 2764903 Afin de définir des polynucléotides utiles en tant que sondes et/ou amorces utilisables dans un procédé de diagnostic différentiel des virus de type RSVA, PIV3 et RSVB, les inventeurs se sont attachés à isoler la région du génome du virus RSVB codant pour la grande sous-unité (L) de la polymérase et à séquencer la région III de cette dernière. Le séquencage de la région III du gène L de RSVB a permis aux inventeurs de construire des polynucléotides présentant différentes caractéristiques d'hybridation avec ladite séquence du gène L de RSVB, mais aussi, après une analyse comparative, avec les séquences respectives correspondantes du gène L des virus RSVA et PIV3. Les inventeurs ont ainsi séquencé la région III du gène codant pour la grande sous- unité (L) de la polymérase des virus de type RSVB. La séquence du polypeptide correspondant à la région III leur a permis de définir précisément, par comparaison avec les séquences des polypeptides codés par le gène L des virus de type RSVA et PIV3, puis analyse des régions conservées, des couples d'amorces génériques, différents de ceux décrits ci-dessus par Tordo et al., capables d'amplifier à la fois l'ARN correspondant à des régions particulières du gène L des trois types de paramyxovirus respiratoires considérés. Selon un autre aspect de l'invention, l'identification de la séquence de la région III du gène L du virus RSVB a rendu possible, après analyse comparative des régions les moins bien conservées du polypeptide correspondant, la synthèse de couples d'amorces spécifiques d'un type de paramyxovirus respiratoire donné, choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, qui ne présentent pas de réaction d'amplification croisée avec un acide nucléique provenant d'un virus d'un autre type. L'isolement et la caractérisation de la séquence du gène L du virus RSVB a aussi permis aux inventeurs de définir des sondes oligonucléotidiques hybridant spécifiquement avec l'ARN d'un type donné de paramyxovirus respiratoire choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, ainsi que des sondes génériques hybridant indifféremment avec l'un ou l'autre type de paramyxovirus respiratoire, ces dernières étant utiles notamment comme témoins internes dans un test de détection par hybridation d'un acide nucléique présent dans un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être infecté par un paramyxovirus respiratoire. Ainsi, la présente invention a pour objet un polynucléotide de 355 paires de bases correspondant à la région II1 du gène L des virus de type RSVB. Plus particulièrement, l'invention concerne un polynucléotide caractérisé en ce qu'il est choisi parmi: a) un polynucléotide comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de l'enchaînement de nucléotides suivant (SEQ ID N 1): ?'7 2764903 ACAACAGATCTCAGCAAATTCAATCAAGCATTTAGATATGAAACATCATGTATCTG CAGTGATGTATTAGATGAACTGCATGGGGTACAATCTCTGTTCTCTTGGTTGCATT TAACAATACCTCTTGTCACAATAATATGTACATATAGACATGCACCTCCTTTCATA AAGGATCATGTTGTCAATCTTAATGAAGTTGATGAACAAAGTGGATTATACAGAT ATCATATGGGTGGTATTGAGGGCTGGTGTCAAAAACTGTGGACCATTGAAGCTAT ATCATTATTAGATCTAATATCTCTTAAAGGTAAATTCTCCATCACAGCTCTGATAA ATGGTGACAATCAAGCAATAG; b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini en a); c) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec le polynucléotide défini en a) ou avec le polynucléotide défini en b). Les séquences soulignées correspondent respectivement à la séquence de l'amorce oligonucléotidique PI (SEQ ID N 7) et à la région d'hybridation de l'amorce oligonucléotidique P2 (SEQ 1D N 8). La séquence SEQ LD N I peut être alignée avec les séquences correspondantes du gène L d'autres types de paramyxovirus. En particulier, La séquence SEQ ID N I peut être alignée avec la séquence correspondante du gène L de la souche RSVA S2 ts I C accessible sur la base de données Genbank sous le numéro RSU39661. Dans ce cas, la base (A) en 3' de la séquence SEQ ID N l correspond au nucléotide en position 2092 du gène L de cet isolat de RSVA et la base (G) en 5' de la séquence SEQ ID N l correspond au nucléotide en position 2446 du gène L de cet isolat de RSVA, étant entendu que la numérotation des nucléotides du gène L dudit isolat de RSVA est réalisée en prenant comme repère la base A du codon ATG de début de traduction, numérotée n l. On entend par polynucléotide ou acide nucléique, selon la présente invention, aussi bien un ARN double brin, un ARN simple brin, un ADN simple brin ou double brin correspondant au produit de transcription inverse desdits ARN que des produits de transcription desdits ARN ou ADN. Des fragments particuliers du polynucléotide de séquence SEQ ID N l peuvent être obtenus en faisant agir les enzymes de restriction appropriées selon la méthode décrite dans 3(1 l'ouvrage de Sambrook de 1989, l'homme du métier étant guidé, pour le choix des enzymes de restriction à utiliser, par la carte de restriction de la séquence SEQ ID N I figurant àau paragraphe Annexe I. Par polynucléotide de sequence complémentaire, on entend tout ARN ou ADN dont les nucléotides sont complémentaires de ceux de la SEQ ID N 1 ou d'une partie de la SEQ ID N l, et dont l'orientation est inversée. 8 2764903 Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'acide nucléique complémentaires. A titre illustratif, des conditions de stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les polynucléotides selon l'invention, sont avantageusement les suivantes: l'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65 C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5% SDS et 100 p.g/ml d'ADN de sperme de saumon. Une solution de I x SSC correspond à 0,15 M NaCI et 0, 05M citrate de Na et une solution de I x Denhardt correspond à 0,02% Ficoll, 0,02% de polyvinylpyrrolidone et 0,02% de sérum albumine bovine. Les étapes de lavage sont avantageusement les suivantes - deux lavages de 5 min, préférentiellement à 65 C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1% SDS; - un lavage de 30 min, préférentiellement à 65 C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1% SDS; - un lavage de 10 min, préférentiellement à 65 C, dans un tampon de 0,1 x SSC et 0,1% SDS. Selon une modalité avantageuse de la présente invention, ledit polynucléotide défini ci- dessus comprend le polynucléotide de séquence SEQ ID N I et les fragments de celui-ci, ainsi que les séquences qui présentent au moins 90 % d'homologie avec ledit polynucléotide ou lesdits fragments. Par pourcentage d'homologie au sens de la présente invention, on entend un pourcentage d'identité entre les bases des deux polynucléotides homologues, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux polynucléotides étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. En séquençant les régions amplifiées du gène L de différents isolats viraux de type RSVB puis en comparant les séquences nucléotidiques obtenues, les inventeurs ont pu déterminer que la variabilité des séquences dans ce groupe précis de paramyxovirus respiratoires était très faible, plus spécifiquement d'environ 1 % pour l'ensemble des isolats étudiés. De manière générale, l'invention a également pour objet un fragment nucléotidique caractérisé en ce qu'il est capable de s'hybrider dans des conditions de forte stringence avec une séquence telle que définie ci-dessus. Les polynucléotides tels que définis précédemment sont susceptibles de constituer des sondes oligonucléotidiques pour la détection spécifique d'un paramyxovirus de type RSVB. Préférentiellement, de telles sondes comprennent un enchaînement d'au moins 12 nucléotides consécutifs du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1, d'un polynucléotide dont 9 2764903 la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide de SEQ D N 1 ou encore d'un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec ces derniers. De manière préférée, les enchaînements nucléotidiques caractérisant les sondes spécifiques de RSVB selon l'invention sont choisies dans des régions du gène L du virus de RSVB qui sont particulièrement conservées entre différents isolats de ce virus et qui sont divergentes avec les séquences correspondantes des autres paramyxovirus (Figure 2). A titre illustratif, une sonde oligonucléotidique hybridant spécifiquement avec la séquence SEQ ID N 1 selon l'invention est avantageusement l'oligonucléotide caractérisé par l'enchaînement nucléotidique suivant: SEQ ID N 2: 5'-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA- 3', étant entendu que le polynucléotide de séquence complémentaire à la séquence SEQ ID N 2 constitue également une sonde selon l'invention. D'autres sondes oligonucléotidiques spécifiques du virus de type RSVB sont les polynucléotides de séquence SEQ ID N 14 à 16 décrits plus loin dans le présent mémoire descriptif, ainsi que les polynucléotides de séquence complémentaire à SEQ ID N 14 à 16.. Les polynucléotides et sondes oligonucléotidiques selon la présente invention sont avantageusement marquées par un composé radioactif ou un composé non radioactif, ou encore par un oligonucléotide non apparenté lié covalamment à ceux-ci et utile comme moyen de marquage (par exemple par hybridation avec des oligonucléotides complémentaires eux- mêmes marqués par une enzyme, un composé fluorophore ou un composé radioactif). Selon un mode de mise en oeuvre particulier des polynucléotides et sondes oligonucléotidiques selon l'invention, ceux-ci sont immobilisés sur un support, de manière covalente ou de manière non-covalente. L'invention a encore pour objet des amorces nucléotidiques pour l'amplification spécifique d'un polynucléotide du génome et/ou d'un ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager d'un paramyxovirus de type RSVB, caractérisées en ce qu'elles comprennent un enchainement d'au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence SEQ ID N I, d'un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide de SEQ ID N I ou encore d'un polynucléotide hybridant dans des conditions 3(/ de forte stringence avec ces derniers, De manière préférée, les enchaînements nucléotidiques caractérisant les amorces spécifiques de RSVB selon l'invention sont choisies dans des régions du gène L du virus de RSVB qui sont particulièrement conservées entre différents isolats de ce virus et qui sont divergentes avec les séquences correspondantes des autres paramyxovirus (Figure 2). Plus particlièrement, on s'attachera à ce que les trois dernières bases de l'extrémité 3' desdites 2764903 amorces soient parfaitement complémentaires de la séquence correspondante du gène L de RSVB et conduise à des mésappariements vis-à- vis des séquences correspondantes des autres paramyxovirus. En particulier, l'invention concerne des amorces nucléotidiques spécifiques pour l'amplification d'un acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVB, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléique répondant à l'un des enchaînements de nucléotides suivants: SEQ ID N 3 (amorce aller): 5'-CTCTTGGTTGCATTTAACAATA-3'; SEQ ID N 4 (amorce aller): 5'-GTTGTCAATCTTAATGAA-3'; SEQ ID N 5 (amorce retour): 5'-TATCAGAGCTGTGATG-3'. L'invention a aussi pour objet un couple d'amorces nucléotidiques spécifique pour l'amplification d'un acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVB, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'un des couples d'amorces suivants: a) SEQ ID N 3 et SEQ ID N 5 (générant un amplicon d'environ 210 paires de bases); b) SEQ ID N 4 et SEQ ID N 5 (générant un amplicon d'environ 150 paires de bases). Les polynucléotides ayant une séquence exactement complémentaire des séquences SEQ ID N 3 à 5 peuvent également être mis en oeuvre en tantqu'amorces spécifiques d'un virus de type RSVB et font donc également partie de l'invention. Un autre but de la présente invention consiste en un procédé pour la détection O spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple d'amorces spécifiques du paramyxovirus RSVB selon l'invention, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'acide nucléique du virus de type RSVB; b) amplification de l'acide nucléique du virus de type RSVB; c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'acide nucléique correspondant au fragment encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une sonde oligonucléotidique spécifique de RSVB selon l'invention, ou encore d'une sonde consensus selon l'invention hybridant avec différents paramyxovirus, lesdites sondes étant le cas échéant marquées radioactivement ou non radioactivement. L'invention concerne aussi une trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants a) Un couple d'amorces nucléotidiques spécifiques du virus RSVB selon l'invention; I l 2764903 b) Les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'un acide nucléique; c) Le cas échéant, un composant permettant de détecter le fragment d'acide nucléique amplifié, de préférence une sonde oligonucléotidique spécifique de RSVB selon l'invention, ou encore d'une sonde consensus selon l'invention hybridant avec différents paramyxovirus, lesdites sondes étant le cas échéant marquées radioactivement ou non radioactivement. La présente invention a également pour objet un polypeptide correspondant à la région III de la grande sous-unité (L) de la polymérase des virus de type RSVB, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi: a) un polypeptide dont la séquence comprend l'enchaînement d'acides aminés SEQ ID N 6 suivant: NH2-TTDLSKFNQAFRYETSCICSDVLDELHGVQSLFSWLHLTIPLVTIICTYRHAPPFIK DHVVNLNEVDEQSGLYRYHIMGGIEGWCQKLWTIEAISLLDLISLKGKFSITALINGDN QAI-COOH; b) un fragment d'au moins 10 acides aminés du polypeptide défini en a), ledit fragment étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre la région III de la grande sous-unité (L) de la polymérase des virus de type RSVB; c) un polypeptide comportant, par rapport au polypeptide défini en a) ou b), au moins une modification par délétion, addition ou substitution d'un acide aminé, ledit polypeptide modifié, également dénommé dérivé peptidique dans la présente description, étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide correspondant à la région II1 de la grande sous-unité (L) de la polymérase des virus de type RSVB. La séquence SEQ ID N 6 est représentée selon le code international à une lettre. La correspondance avec le code à tois lettres peut être aisément rerouvé, par exemple dans l'ouvrage de Stryer, Biochemistry, Third Ed. (1988). Par ailleurs la correspondance entre la séquence d'acide nucléique SEQ ID N Il et la séquence d'acides aminés SEQ ID N 6 est représenté au paragraphe Annexe 2. Un tel polypeptide, tel que défini précédemment, est susceptible d'être reconnu spécifiquement par les anticorps présents dans le sérum de patients infectés par un paramyxovirus respiratoire de type RSVB. 3t0 Selon un autre aspect de l'invention, le polypeptide de séquence SEQ ID N 6, ses fragments et ses dérivés modifiés sont susceptibles d'induire it; vivo des anticorps capables de reconnaître le polypeptide correspondant à la région III de la grande sous-unité (L) de la polymérase des virus de type RSVB. Font également partie de l'invention les polypeptides homologues au polypeptide de séquence SEQ ID N 6 ainsi que les fragments de tels polypeptides homologues. Par 12 2764903 polypeptide homologue aux fins de la présente invention, on entend un polypeptide comprenant une ou plusieurs délétions et/ou substitutions d'acides aminés dans la séquence SEQ ID N 6. Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés -consécutifs ou non consécutifs- sont remplacés par des acides aminés " équivalents ". L'expression acide aminé " équivalent " vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les propriétés immunogènes des peptides correspondants. En d'autres termes, les acides aminés équivalents seront ceux qui permettent l'obtention d'un polypeptide de séquence modifiée qui permet l'induction in vivo d'anticorps capables de reconnaître le polypeptide de séquence SEQ ID N 6 ou l'un de ses fragments ci-dessus définis. Les polypeptides homologues font parties des dérivés peptidiques dans la présente descrition. Ces aminoacyles équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les aminoacyles auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'immunogénicité croisée auxquels les différents peptides sont susceptibles de donner lieu. A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptible d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie de l'immunogénicité des peptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. Pour la détermination des substitutions préférées d'un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non consécutifs du polypeptide de séquence SEQ ID N 6, sans modifier significativement la structure tridmensionnelle et/ou l'immunogénicité du polypeptide résultant, par rapport au polypeptide initial, on pourra se référer avantageusement également aux travaux de Bowie et al, (1990). La présente invention a également pour objet une famille de vecteurs recombinés, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une sequence nucléotidique conforme à l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N 1 ou un fragment de celle-ci. Selon une disposition préférée dudit mode de réalisation, ledit vecteur est un plasmide, ce plasmide comprenant ladite séquence associée à un vecteur de type pUC. Un tel plasmide répondant à la définition ci- dessus est le plasmide pUCI 8 dans lequel a été inséré la séquence SEQ ID N 1 au niveau du site de restriction SmaI, situé entre un site KpnI du côté 5' de la SEQ ID N l et un site BarnmHIl du'côté 3' de la SEQ ID N 1, ledit plasmide étant contenu dans une souche de E. coli déposée 13 2764903 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) le 20 juin 1997 sous le numéro d'accès 1-1880. La carte de restriction de ce plasmide est représentée à la Figure 4. Un autre objet de la présente invention est donc un vecteur approprié pour le clonage et/ou l'expression et/ou l'insertion d'une séquence, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique ci-dessus décrite en un site non essentiel pour sa réplication, le cas échéant sous le contrôle d'éléments de régulation susceptibles d'intervenir dans l'expression du polypeptide correspondant à la région III de la grande sous-unité (L) de la polymérase des virus de type RSVB, chez un hôte déterminé. Les régions promotrices de l'expression de la SEQ D N l ou d'un fragment de cette séquence sont choisies en fonction de l'hôte cellulaire dans lequel l'expression du polynucléotide d'intérêt est désirée. Des promoteurs bactériens préférés pour l'expression des polynucléotides selon l'invention sont les promoteurs lacl, lacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, le promoteur de la polyédrine ou de la protéine p 10 du baculovirus (kit Novagen) (Smith et al., 1983; O'Reilly et al., 1992), le promoteur lambda PR ou encore le promoteur trc. Des promoteurs préférés pour l'expression des polynucléotides selon l'invention dans des hôtes cellulaires eucaryotes sont le promoteur précoce de CMV, le promoteur de la thymidine kinase du virus de l'Herpès simplex, le promoteur précoce ou le promoteur tardif du virus SV40, les régions LTR de certains rétrovirus ou encore le promoteur de la métallothionéine I de souris. Le choix d'un promoteur spécifique parmi les promoteurs énumérés cidessus est à la portée de l'homme du métier, guidé par ses connaissances générales techniques dans le domaine de la recombinaison génétique, en s'appuyant, par exemple, sur l'ouvrage de Sambrook de 1989 ou encore selon les protocoles décrits par Fuller et al. en 1996. Des vecteurs particuliers sont par exemple des plasmides, des phages, des cosmides, des phagemides, des YAC. A titre illustratif, les vecteurs suivants sont utilisés pour une expression du polypeptide selon l'invention dans un hôte cellulaire particulier: a) Vecteurs pour bactéries: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pNH8a, pHN16a, pNH18a, pNH46a, commercialisés par la société Stratagene, pTrc99A, pKK223-3, pDR540, (30 pRIT5, commercialisés par la société Pharmacia, vecteur de transfert de type baculovirus pVL1392/1393 (Pharmingen); pQE-30, commercialisé par la société QlAexpress. b) Vecteurs pour cellules eucaryotes: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG, commercialisés par la société Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL, commercialisés par la société Pharmacia. 14 2764903 Ces vecteurs sont utiles pour transformer ou transfecter des hôtes cellulaires afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques de l'invention. Un hôte cellulaire recombinant selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est modifié par une séquence nucléotidique ou un vecteur ci-dessus décrits. A titre illustratif des hôtes cellulaires utilisés pour l'expression du polypeptide selon l'invention, les hôtes cellulaires suivants sont mis en oeuvre: a) Hôtes procaryotes: Souches de Escherichia coli (p. ex. la souche DH5-cE) ou de Bacillus ubtilis; b) Hôte eucaryotes: Cellules HeLa (ATCC N CCL 2; N CCL 2.1; N CCL 2. 2), cellules Cv- 1 (ATCC N CCL70), cellules COS (ATCC N CRL1650; N CRL1651), cellules Sf-9 (ATCC N CRL171 1). De préférence, l'hôte cellulaire est modifié par la séquence SEQ ID N 1, ou par une séquence qui en est dérivée, dans des conditions permettant l'expression de la région 11I de la protéine L de la polymérase de RSVB fonctionnel, s'agissant de sa reconnaissance par des anticorps le reconnaissant spécifiquement. Les techniques de biologie moléculaire nécessaires à la préparation des vecteurs recombinants sont décrites dans l'ouvrage de Sambrook et al. de 1989. Un hôte cellulaire recombiné particulier contenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 est le clone de E. coli ASC.3 déposé à la CNCM le 20 juin 1997 sous le numéro d'accès 1-1880. L'invention vise aussi un polypeptide recombinant caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'un hôte cellulaire recombinant tel que défini ci-dessus, et de préférence obtenu selon le procédé décrit ci-après. Il est aujourd'hui facile de produire des protéines en quantité relativement importante par génie génétique en utilisant comme vecteurs d'expression des plasmides, des phages, des phagemides. Le polynucléotide de séquence SEQ ID N I peut être inséré dans un vecteur d'expression approprié pour produire in vilro un polypeptide correspondant à la région III de la protéine L de la polymérase de RSVB. Ce polypeptide pourra être fixé sur une microplaque pour développer un test sérologique destiné à rechercher, dans un but de diagnostic, les anticorps spécifiques chez les patients infectés par le virus RSVB. Ainsi, la présente invention concerne plus particulièrement un procédé de préparation d'un polypeptide de l'invention comprenant les étapes suivantes: a) le cas échéant, l'amplification préalable suivant la technique PCR de la quantité de polynucléotide codant pour ledit polypeptide à l'aide de deux amorces nucléotidiques choisies de manière à ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 premiers 2764903 nucléotides du polynucléotide codant pour ledit polypeptide, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 derniers nucléotides (ou s'hybride avec ces 10 à 25 derniers nucléotides) dudit polynucléotide, ou inversement de manière à ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 derniers nucléotides dudit polynucléotide, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 premiers nucléotides (ou s'hybride avec les 10 à 25 premiers nucléotides) dudit polynucléotide, suivie de l'introduction dudit polynucléotide ainsi amplifié dans un vecteur approprié, par exemple l'un des vecteurs décrits ci-dessus, ledit polynucléotide étant placé sous le contrôle de signaux de régulation et/ou d'expression reconnus par un hôte cellulaire eucaryote ou procaryote; b) la mise en culture, dans un milieu de culture approprié, d'un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur approprié contenant un acide nucléique selon l'invention comprenant la séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide, et c) la séparation, à partir du susdit milieu de culture, dudit polypeptide produit par ledit hôte cellulaire transformé. Les polypeptides selon l'invention peuvent également être préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide. Par exemple, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrite par Houbenweyl en 1974, ou encore la technique décrite par Merrifield en 1963. Le polypeptide de séquence SEQ ID N 6, ses fragments et ses dérivés peptidiques peuvent avantageusement être mis en oeuvre dans un procédé de détection itn vitro d'anticorps dirigés contre la grande sous-unité de la polymérase des virus de type RSVB dans un échantillon biologique (tissu ou fluide biologique) susceptible de les contenir, ce procédé comprenant la mise en contact de l'échantillon biologique avec un polypeptide selon l'invention dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre ledit polypeptide et les anticorps éventuellement présents dans l'échantillon biologique, et la détection in vitro des complexes antigène-anticorps éventuellement formés. De préférence, I'échantillon biologique est constitué par un fluide, par exemple un sérum de patient. Toute procédure classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection. A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzvmatiques selon la technique ELISA, ou immunofluorescents, ou radioimmunologiques (RIA) ou équivalents. 16 2764903 Ainsi, l'invention concerne également le polypeptide de séquence SEQ ID N 6 selon l'invention, ou tout fragment ou dérivé peptidique tel que décrit ci-dessus, marqué à l'aide d'un marqueur adéquat de type enzymatique, fluorescent, radioactif, etc. De telles méthodes comprennent par exemple les étapes suivantes - dépôt de quantités déterminées d'une composition polypeptidique selon l'invention dans les puits d'une plaque de microtitration, - introduction dans lesdits puits de dilutions croissantes du sérum devant être analysé, - incubation de la microplaque, introduction dans les puits de la plaque de microtitration d'anticorps marqués dirigés contre des immunoglobulines humaines ou animales, le marquage de ces anticorps ayant été réalisé à l'aide d'une enzyme sélectionnée parmi celles qui sont capables d'hydrolyser un substrat en modifiant l'absorption des radiations de ce dernier, au moins à une longueur d'onde déterminée, par exemple à 550 nm, -détection, en comparaison avec un témoin de contrôle, de la quantité de substrat hydrolysé. L'invention concerne également une trousse ou un nécessaire pour le diagnostic in vitro d'une infection par un virus de type RSVB, comprenant: - le polypeptide de séquence SEQ ID N 6, un de ses fragments, un de leurs dérivés peptidiques ou un polypeptide recombinant selon l'invention, - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique, -les réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique, ces réactifs peuvent également porter un marqueur, ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas o le polypeptide de séquence SEQ ID N 6, un de ses fragments, un de leurs dérivés peptidiques ou un polypeptide recombinant selon l'invention, n'est pas marqué, - le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin négatif) dépourvu d'anticorps reconnus par le polypeptide de séquence SEQ ID N 6, par un de ses fragments, par un de leurs dérivés peptidiques ou par un polypeptide recombinant selon l'invention, - le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin positif) contenant une quantité prédéterminée d'anticorps reconnus par le polypeptide de séquence SEQ ID N 6, par un de o ses fragments, par un de leurs dérivés peptidiques ou par un polypeptide recombinant selon I'invention. Les polypeptides selon l'invention permettent de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement lesdits polypeptides. Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975. Les anticorps polyclonaux pourront être 17 2764903 préparés, par exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris, avec un polypeptide selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le polypeptide ayant servi d'antigène. Les anticorps polyclonaux selon l'invention peuvent aussi être préparés par purification sur une colonne d'affinité, sur laquelle a préalablement été immobilisé un polypeptide selon l'invention, des anticorps contenus dans le sérum de patients infectés par un paramyxovirus de type RSVB. L'invention vise en conséquence un procédé pour la détection spécifique de la présence d'un antigène d'un virus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact de l'échantillon biologique (tissu ou fluide biologique) prélevé chez un individu avec un anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'invention, dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre ledit anticorps et ledit polypeptide présent dans l'échantillon biologique; b) Mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé. Entre également dans le cadre de l'invention, une trousse ou un nécessaire pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique, de la présence de virus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend a) Un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'invention; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection du complexe antigène-anticorps formé. Fait aussi partie de l'invention une trousse ou nécessaire pour le diagnostic spécifique de la présence d'un paramyxovirus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu 'il comprend: a) un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'invention; b) le cas échéant, un réactif pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique; c) un réactif permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique, ledit réactif pouvant porter un marqueur, ou être susceptible d'être reconnu à son tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas o ledit anticorps monoclonal ou polyclonal n'est pas marqué; d) le cas échéant, des réactifs pour effectuer la lyse des cellules de l'échantillon testé. 18 2764903 Les anticorps polyclonaux ainsi que les anticorps monoclonaux et les hybridomes produisant de tels anticorps monoclonaux constituent un objet de la présente invention. L'invention a également pour objet une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides selon l'invention, le cas échéant en présence d'un adjuvant de l'immunité tel que l'adjuvant complet de Freund, l'adjuvant incomplet de Freund ou un composé de la famille des muramyl peptides. Le(s) polypeptide(s) contenu(s) dans une composition immunogène selon la présente invention peuvent être couplés à des agents immunogènes, tels que la KLH (Keyhole lympet Hemocyanin), l'ovalbubine, la sérum albumine bovine ou humaine, l'anatoxine tétanique (tetanus toxoid), etc., par l'intermédiaire d'un agent de couplage tel que le glutaraldéhyde ou le carbodiimnide. Selon un mode de réalisation avantageux de la composition immunogène de la présente invention, le(s) polypeptide(s) contenus dans la composition sont conjugués à l'ovalbumine (Calbiochem) à l'aide du protocole à benzidine-bis-diazotée décrit par Gregory et al. en 1967, le rapport du nombre de molécules de polypeptide(s) au nombre de molécules d'ovalbumine étant de 5:1. Le(s) polypeptide(s), conjugués ou non conjugués, sont ensuite injectés à l'animal, par exemple au lapin ou à la souris, de préférence par injection intradermique multi-points; généralement, dix points d'injection sont effectués. Dans la cas de lapins injectés avec undit polypeptide conjugué à l'ovalbumine, l'injection au temps 0 est réalisée avec 1 mg dudit polypeptide conjugué. Deux mois après la première injection, les animaux sont injectés avec 0,5 mg du même polypeptide conjugué et une troisième injection de 0,5 mg dudit polypeptide conjugué est effectuée de deux à quatre mois après la seconde injection. L'antisérum est recueilli entre deux et quatre semaines après la troisième injection dudit polypeptide conjugué et est, le cas échéant, purifié sur une colonne de chromatographie d'affinité sur laquelle a été préalablement immobilisé le polypeptide ayant servi d'antigène. Une technique de préparation d'une telle colonne de chromatographie daffinité est par exemple décrite par Bird et al. en 1984. L'invention concerne aussi des polynucléotides caractérisés en ce qu'ils codent pour un polypeptide selon l'invention. Un alignement multiple des séquences en acides aminés du gène L des virus de type RSVA, PIV3 et RSVB a permis aux inventeurs de définir des régions de grande conservation entre les virus. Sur la base des séquences nucléotidiques codant ces régions peptidiques bien conservées, plusieurs couples d'amorces consensus ou génériques ont été synthétisés, caractérisés en ce qu'il peuvent être mis en oeuvre dans une réaction d'amplification d'un acide 19 2764903 nucléique cible pour amplifier indifféremment l'ARN provenant de l'un ou l'autre des paramyxovirus respiratoires de type RSVA, PIV3 ou RSVB. En particulier, les inventeurs ont suivi une démarche originale consistant tout d'abord à aligner les séquences d'acides aminés de la grande sous-unité de la polymérase (L) de différents paramyxovirus, incluant PIV3 et RSVA, et à repérer les régions de grande conservation en acides aminés (Figure 5; Figure 6), à la fois dans les domaines I à V de cette polymérase. Les domaines I à V ont été définis par Poch et al. en 1990. Des analyses des inventeurs représentées dans les Figures 5 et 6, il ressort que des motifs conservés en acides aminés sont principalement localisés dans les domaines I, II et III, tels que définis par Poch en 1990. A partir des données d'alignements en acides aminés, les inventeurs ont construit les alignements nucléotidiques correspondants et se sont attachés à définir les régions pour lesquelles les séquences nucléotidiques de RSVA et PIV3 présentent une très grande conservation (identifiées par " + " sur la Figure 7). A partir des données d'alignement nucléotidiques représentées à la figure 7, les inventeurs ont identifié des petites régions localisées dans les domaines I, II et III1 du gène de la polymérase dans lesquelles des amorces nucléotidiques génériques ou consensus (capable d'amplifier indifféremment les régions correspondantes du génome de RSVA, PIV3 et RSVB) ont été définies. Pour la définition des amorces, la dégénérescence du code génétique (" wooble >>) a été pris en compte. Ainsi, les acides aminés codés par un nombre peu important de codons (exemple: W) ont été préférés de manière à limiter la probabilité de variabilité de séquence entre la séquence des amorces et la sequence de l'acide nucléique cible et en conséquence limiter la probabilité de mésappariements entre l'amorce et l'acide nucléique cible.. Dans le domaine 1, les amorces génériques selon l'invention sont définies dans trois régions de très forte conservation: - La région allant du nucléotide en position nt1261 au nucléotide en position nt 1295 (Numérotation RSVA de la Figure 7). - La région allant du nucléotide en position nt1402 au nucléotide en position nt1443 de la Figure 7; - la région allant du nucléotide en position nt1603 au nucléotide en position nt 1631 de la Figure 7. Plus particulièrement, une amorce aller préférée comprendra l'enchaînement nucléotidique suivant SEQ ID N 27: 5'-1279-AGAATATTTGGACATCC-1295-3' 2764903 L 'amorce de SEQ ID N 27 possède un mésappariement avec le génome de RSVA (T/C) et possède deux mésappariemrents avec le génome de PIV3 (A/G et T/C). * Dans le domaine II, les amorces génériques selon l'invention sont définies dans deux régions de très forte conservation: - La région alant du nucléotide en position nt1733 au nucléotide en position nt1775 de la Figure 7; - La région allant du nucléotide en position nt1855 au nucléotide en position nt1891 de la Figure 7. Plus particulièrement, une amorce aller préférée comprendra l'enchaînement nucléotidique suivant: SEQ ID N 23: 5'- 1875 -AGGTAGATGTTTGCAA-1891-3' L 'amorce de SEQ ID N 23 possède un mésappariement avec le génome de RSVA (C/A) et possède un mésappariement avec le génome de PIV3 (G/C). La séquence complémentaire de la SEQ ID N 23 est avantageusement utilisée comme amorec retour; il s'agit du polynucléotide comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de l'enchaînement suivant SEQ ID N 24: 5'- 1891-TTGCAAACAGTCTACCT- 1875-3' Dans le domaine III, les amorces génériques selon l'invention sont définies dans deux régions de très forte conservation: - la région allant du nucléotide en position nt2323 au nucléotide en position nt2357 de la Figure 7; - la région allant du nucléotide en position nt2552 au nucléotide en position nt2579 de la Figure 7. Plus particulièrement, une amorce aller préférée comprendra l'enchaînement nucléotidique suivant: SEQ ID N 25: 5'-2341-TGTCAAAAACTATGGAC-2357-3' L 'amorce de SEQ ID N 25 possède un mesappariement avec le génome de RSVA (A/G) et possède un mésappariement avec le génome de PIV3 (C/T). Cette amorce a une séquence parfaitement complémentaire avec le génome de RSVB. La séquence complémentaire de la SEQ ID N 25 est avantageusement utilisée comme amorec retour; il s'agit du polynucléotide comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de l'enchaînement suivant: SEQ ID N 26: 5'-2357-GTCCATAGTTTTTGACA-2341-3' 21 2764903 En conséquence, la présente invention a aussi pour objet une amorce nucléotidique pour l'amplification d'un polynucléotide du génome et/ou d'un ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager d'un paramyxovirus de type RSV et PIV, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement nucléotidique inclus dans les régions nucléotidiques du gène L de RSV ou PIV telles que définies ci-dessus, et plus particulièrement les polynucléotides définis ci-dessus comprenant tout ou partie des enchaînements nucléotidiques de séquence SEQ IDN 23 à 26. La présente invention concerne également un couple d'amorces nucléotidiques pour l'amplification d'un polynucléotide du génome et/ou d'un ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager d'un paramyxovirus de type RSV et PIV, caractérisée en ce qu'elle comprend une combinaison d'enchaînements nucléotidiques inclus dans des régions nucléotidiques du gène L de RSV ou PIV très fortement conservées entrs les virus de types différents. Dans le but d'éviter un faible rendement de l'étape d'amplification, les amorces ont été choisies de manière à hybrider avec des séquences assez proches sur le génome. Plus particulièrement, un couple d'amorces nucléotidiques répondant à la définition ci- dessus est caractérisé en ce qu'il s'agit de l'un des couples d'amorces suivants - SEQ ID N 27 et SEQ ID N 24; - SEQ ID N 27 et SEQ ID N 26; - SEQ ID N 27 et SEQ BD N 8; - SEQ ID N 27 et SEQ ID N 9; - SEQ ID N 23 et SEQ ID N 26; - SEQ ID N 23 et SEQ ID N 8; - SEQ ID N 23 et SEQ ID N 9; - SEQ ID N 7 et SEQ ID N 26; - SEQ ID N 7 et SEQ ID N 8; - SEQ ID N 7 et SEQ ID N 9. Selon un mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre du procédé de diagnostic différentiel selon la présente invention, les différents couples d'amorces génériques définis sont utilisés en combinaison dans le mélange réactionnel nécessaire à la réaction d'amplification. L'invention concerne encore un procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes 22 2764903 a) I'ADN de l'échantillon biologique, ou l'ADNc obtenu par transcription inverse de l'ARN de l'échantillon biologique, est amplifié à l'aide d'un couple d'amorces tel que défini ci- dessus, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation des amorces nucléotidiques à l'acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3; b) Mise en contact d'un polynucléotide ou d'un mélange de sondes spécifiques d'un paramyxovirus d'un type donné avec l'acide nucléique résultant de l'amplification de l'étape a); Dans un mode particulièrement préféré dudit procédé de détection spécifique, les sondes spécifiques sont les polynucléotides de séquence SEQ ID N 10 à SEQ ID N 18 et SEQ ID N 2 selon l'invention; c) Détection de l'hybride formé entre le polynucléotide ou le mélange de polynucléotides et l'acide nucléique amplifié. La présente invention a également pour objet une trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSV ou PIV dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend: a) Au moins un couple d'amorces nucléotidiques tels que définis ci-dessus; b) Les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification d'un acide nucléique cible; Avantageusement, ladite trousse ou nécessaire de détection est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux couples d'amorces selon l'invention. De manière préférée, ladite trousse ou nécessaire de détection est caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moin une sonde oligonucléotidique spécifique du gène L d'un paramyxovirus donné, et de manière tout a à fait préférée la sonde olignucléotidique est choisie parmi les polynucléotides de séquences SEQ ID N 10 à SEQ ID N 18 et SEQ ID N 2. Enfin, ladite trousse ou nécessaire de détection, comme de manière générale l'ensemble des trousses ou nécessaires de détection selon l'invention, peut comprendre en outre, une sonde oligonucléotidique générique, comme par exemple une sonde de séquence SEQ ID N 19, SEQ ID N 20, SEQ ID N 21 ou SEQ ID N 22. 3O Les couples d'amorces consensus ou génériques selon l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans un procédé de diagnostic différentiel des virus RSVA, RSVB et PIV3, dans lequel l'étape de diagnostic différentiel proprement dite est constituée 23 2764903 soit d'une analyse du profil de restriction caractéristique des amplicons générés à l'aide du couple d'amorces considéré, soit d'une détection spécifique de l'amplicon généré à l'aide de sondes spécifiques selon l'invention, hybridant spécifiquement avec l'amplicon correspondant d'un virus de type RSVA, PIV3 ou RSVB, soit encore de toute autre technique conventionnelle de caractérisation d'un amplicon bien connue de l'homme du métier. En général, les couples d'amorces spécifiques de RSVB ou les couples d'amorces génériques selon l'invention peuvent être mis en oeuvre dans différents types de réaction d'amplification d'un acide nucléique cible, le cas échéant après transformation de l'ARN présent dans l'échantillon biologique en son ADNc en faisant agir une enzyme ayant une activité transcriptase inverse. La technique PCR nécessite le choix de paires d'oligonucléotides encadrant le fragment qui doit être amplifié. La technique dite PCR ou réaction d'amplification en chaîne à l'aide de la polymérase, qui a été décrite pour la première fois en 1985 par Saiki et al. et qui fait l'objet des brevets européens EP 201 184 et EP 200 362 ou encore dans les travaux de Erlich (1989), Innis (1990) ou Rolfs (1991). Les amorces oligodésoxyribonucléotidiques ou oligoribonucléotidiques selon l'invention ont avantageusement une longueur d'au moins 12 nucléotides. L'une des deux amorces est complémentaires du brin (+) [amorce aller] de la matrice et l'autre amorce est complémentaire du brin (-) [amorce retour]. Il est important que les amorces ne possèdent pas de structure secondaire ou de séquence complémentaire l'une de l'autre. D'autre part, la longueur et la séquence de chaque amorce doivent être choisies de manière à ce que les amorces ne s'hybrident pas avec d'autres acides nucléiques provenant de virus ou de cellules procaryotes ou eucaryotes, en particulier avec les acides nucléiques provenant de paramyxovirus n'appartenant pas aux types RSVA, PIV3 ou RSVB, ni avec l'ADN ou l'ARN humain pouvant éventuellement contaminer l'échantillon biologique. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés par une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou par une électrophorèse capillaire, ou encore par une technique chromatographique (filtration sur gel, chromatographie hydrophobe ou chromatographie échangeuse d'ions), le cas échéant après avoir fait agir une ou plusieurs endonucléases de restriction appropriées, ou encore par toute autre technique de visualisation des fragments d'acide nucléique amplifiés bien connue de l'homme du métier. L'invention vise également les fragments nucléotidiques obtenus par amplification du polynucléotide de séquence SEQ ID N l à l'aide d'un couple d'amorces selon l'invention, plus particulièrement à l'aide de l'un quelconque des couples d'amorces 24 2764903 spécifiques du paramyxovirus de type RSVB ou des couples d'amorces génériques définis ci- dessus. Ainsi, font également partie de l'invention les fragments nucléotidiques amplifiés (" amplicons ") définis ci-dessus. D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternatives à la PCR. La technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992) est une technique d'amplification isotherme dont le principe est fondé sur la capacité d'une enzyme de restriction de couper l'un des deux brins de son site de reconnaissance qui se trouve sous une forme hemiphosphorothioate et sur la propriété d'une ADN polymérase d'initier la synthèse d'un nouveau brin d'ADN à partir de l'extrémité 3'OH créée par l'enzyme de restriction et de déplacer le brin préalablement synthétisé qui se trouve en aval. La méthode comprend deux étapes principales: a). Synthèse, en présence de dCTP-alpha-S, de molécules d'ADN flanquées par des sites de restriction qui peuvent être coupés par une enzyme appropriée. b). Amplification exponentielle de ces molécules d'ADN ainsi modifiées, par coupure enzymatique, déplacement de brin et copiage des brins déplacés. Les étapes de coupure, de déplacement et de copiage sont répétées un nombre suffisant de fois afin d'obtenir une bonne sensibilité. Ainsi, le protocole de la technique SDA est simple: I'ADN cible présent dans l'échantillon à analyser est dénaturé par la chaleur en présence de tous les réactifs exceptées les enzymes (enzyme de restriction et polymérase) qui sont ajoutées au milieu réactionnel après l'étape de dénaturation. Initialement réalisée avec l'enzyme de restriction HinclU (Walker et al., 1992), cette technique est désormais mise en oeuvre avec une endonucléase de restriction isolée à partir de Bacillus stearothermophilus (BsoBl). et un fragment sans activité exonucléase 5' - 3' d'une ADN polymérase isolée de Bacillus cladotenax (exoBca) [= exo- moins-Bca]. Ces deux enzymes peuvent opérer à 60 C et le système est désormais optimisé pour permettre l'utilisation de dUTP et la décontamination par l'UDG. 3) Lors de la mise en oeuvre de cette technique, comme décrit par Spargo et al. en 1996, le temps de doublement de l'ADN cible est de 26 secondes et son taux d'amplification atteint ' après 15 minutes d'incubation à 60 C. La technique SDA est plus simple à réaliser que la PCR (un bain marie est suffisant) et elle est plus rapide que les autres techniques d'amplification. 2764903 Un autre objet de la présente invention est donc la mise en oeuvre des amorces oligonucléotidiques spécifiques selon l'invention dans un procédé d'amplification d'ADN ou d'ARN selon la technique SDA ci-dessus. La méthode d'amplification par SDA repose sur l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques modifiées en 5' par l'addition d'une séquence d'ADN reconnue par une enzyme de restriction, par exemple l'enzyme HinclI. Le processus requiert la formation d'un site de restriction thiolé par incorporation de déoxyadénosine thriphosphate soufré, et les actions alternées de ladite enzyme de restriction (par exemploe HinclI) qui hydrolyse partiellement (sur un seul brin), ledit site de restriction, et de l'ADN polymérase qui synthétise à partir du point d'hydrolyse un nouveau brin, avec déplacement simultané de la séquence nucléique précédemment coupée, sans que la dénaturation soit nécessaire. L'hybridation des amorces modifiées sur la cible nécessité seulement une première étape de dénaturation de l'ADN. La réaction se fait ensuite à 37 C et simultanément sur les deux brins d'ADN cible, ce qui conduit à une augmentation exponentielle du nombre de copies en fonction du temps de réaction. La méthode permet une amplification moyenne de la cible de l'ordre d'au moins 107. A titre illustratif de la mise la mise en oeuvre de la technique SDA dans le cadre de la présente invention, deux couples d'amorces sont utilisées: un couple d'amorces externes (B 1, B2) constituées d'une séquence hybridant avec la SEQ ID N I ou de leur séquence complémentaire, et un couple d'amorces internes (SI, S2) constituées d'un oligonucléotide de fusion entre une séquence spécifique de la SEQ ID N l ou de leur séquence complémentaire fusionnée à une séquence nucléotidique contenant un site reconnu par une endonucléase de restriction, par exemple l'enzyme BsoBI. Selon un autre aspect de la présente invention, les couples d'amorces utilisés pour la réalisation d'une réaction d'amplification de type SDA sont les couples d'amorces consensus ou génériques selon l'invention. A titre d'exemple de la mise en oeuvre des amorces génériques selon l'invention dans un procédé d'amplification de type SDA, on peut, pour réaliser une amorce utilisable dans une réaction SDA, ajouter, à l'extrémité 5' de la région de l'amorce de séquence SEQ ID N 3 selon l'invention, une séquence non spécifique du gène L de la grande sousunité de la 3() polymérase des paramyxovirus, en particulier des virus RSVA, PIV3 ou RSVB, contenant un site de restriction, et plus particulièrement un site de restriction reconnu par l'endonucléase HincI ou BsoBl. Une telle séquence additionnelle contenant le site de restriction reconnu par l'endonucléase BsoBI est avantageusement la séquence de nucléotides 26 2764903 GCATCGAATGCATGTCTCGGGT, les nucléotides représentés en caractères gras correspondant au site de reconnaissance de l'enzyme BsoBI. A titre illustratif, une amorce selon l'invention utilisable dans le cadre d'une amplification de type SDA peut être réalisée à partir de la séquence de l'amorce choisie et sera constituée de la séquence: GCATCGAATGCATGTCTCGGGTCTCTTGGTTGCATTTAACAATA (contenant la SEQ ID N 3), dans laquelle les nucléotides représentés en caractères gras correspondant au site de reconnaissance de l'enzyme BsoBI et les nucléotides soulignés correspondent à la séquence spécifique de l'ADN cible. Un second jeu d'amorces, amplifiant l'autre extrémité de l'acide nucléique cible, sera réalisé comme décrit ci-dessus. La sonde de détection sera choisie de telle manière à ce qu'elle hybride avec l'amplicon généré. Des amorces similaires, utilisables dans une technique d'amplification de type SDA peuvent être réalisées à partir de l'une quelconque des amorces selon l'invention et plus particulièrement avec l'une quelconque des amorces de séquence SEQ ID N 3, 4, 5, 7, 8, 9 selon l'invention. L'invention a donc également pour objet des amorces nucléotidiques conformes aux amorces décrites ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une technique d'amplification d'ADN par déplacement de brin (SDA). De manière préférentielle, lorsque l'on utilise des amorces contenant un site reconnu par l'endonucléase Hincll, les réactions SDA Hincll/exo&Klenow [= HincIL/exo-moins- Klenow] sont réalisées dans un volume de 50pl en présence de concentrations finales de 7,7 mM MgCI2, 0,2 mM de chaque dGTP, dCTP, dATP-alpha-S, 0,5 mM dUTP, 100 pg/ml de sérum albumine bovine acétylée, 10 ng/pl d'ADN de placenta humain, 50 mM K2'-P04, pH 7,6, 10% (v/v) diméthylsulfoxyde, 5% (v/v) glycerol, 0,5 gM de chacune des deux amorces SI, S2, 0,O5pjM de chacune des amorces BI, B2, 3 unités/pl de HincI, 0, 04 U/pl de exo' Klenow et des quantités variées de l'ADN cible. Préalablement à l'addition de HinclI, de exo' Klenow et de MgCI2, les réactions incomplètes (401pl) sont chauffées à 95 C pendant 2 min afin de dénaturer l'ADN cible, puis sont placées à la température de 40 C pendant 2 min afin S( d'hybrider les amorces. Après l'addition de 10 gl du mélange d'enzymes constitué de 5 gl de MgCI2 à 77 rruM, 0,2 pl de exolKlenow (10 U/pl), 2 il HinclI (75 U/pl) et de 2,8p.1 de glycérol à 50%, le mélange réactionnel est incubé à 40 C pendant 2 h. Des fractions aliquotes de chaque échantillon sont ajoutées directement à 5 ul de tampon non-dénaturant (20% Ficoll, 0,25% de bleu de bromophénol). L'analyse est ensuite effectuée par électrophorèse sur gel de 27 2764903 polyacrylamide à 10% non dénaturant suivie d'une coloration au bromure d'éthidium et d'une visualisation des bandes par illumination du gel d'électrophorèse aux rayons ultra-violet. De manière avantageuse, lorsque l'on utilise des amorces contenant un site reconnu par l'endonucléase BsoBI, les réactions SDA BsoBI/exo'Bca [= BsoBI/exo-moins-Bca] sont réalisées dans un volume de 50 Hl en présence de concentrations finales de 6mnM MgCI2, 0,2mM de chacun des dGTP, dATP, 0,5 mM dUTP, 1,4 mM dCTP-alpha-S, 100 ng/jil de sérum albumine bovine acétylée, 10 ng/pl d'ADN de placenta humain, 35 mM K21- PO4 pH 7,6, % (v/v) de glycérol, 0,5 pM de chacune des amorces S1 et S2, 0,05 1M de chacune des amorces B1 et B2, 3,2 U/pl BsoBI, 0,16 U/pl de exo'Bca et des quantités variées d'ADN cible. Préalablement à l'addition de BsoBI, de exo'Bca et de MgCI2, les réactions incomplètes (40 pil) sont chauffées à 95 C pendant 2 min afin de dénaturer l'ADN cible puis sont placées à 56 C pendant 2 min afin d'hybrider les amorces. Après l'addition de 10 pl du mélange enzymatique constitué de 5 pll de MgCI2 60 mnM, 0,8 pll exo'Bca (10 U/pl), 1 jil BsoBI (160 U/pl) et 3,2 p. l de tampon de dilution (10 mM Tris HCI, 10 mM MgC12, 50 mM NaCI, 1 mM DTT), les réactions sont incubées à 56 C pendant 20 min. Des fractions aliquotes de 10 pul de chacun des échantillons sont ajoutées directement à 5 gl de tampon non dénaturant et analysé comme décrit ci-dessus. Les polynucléotides de séquence SEQ ID N I et leurs fragments nucléotidiques, utiles comme amorces spécifiques des paramyxovirus de type RSVB ci-dessus décrits, ainsi que l'ensemble des amorces génériques selon l'invention, peuvent également être mis en oeuvre dans d'autres procédés d'amplification d'un acide nucléique cible, tels que - la technique d'amplification par déplacement de brin décrite dans la demande de brevet français N FR-9508945 (Bio Mérieux); - la technique TAS (Transcription-based Amplification System), décrite par Kwoh et al. en 1989; - la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication), décrite par Guatelli et al. en 1990; - la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), décrite par Kievitis et al. en 1991; -la technique TMA (Transcription Mediated Amplification). Les polynucléotides de séquence SEQ ID N 1 ainsi que leurs fragments oligonucléotidiques, utiles comme amorces spécifiques des paramyxovirus de type RSVB, et les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent aussi être employés dans des techniques d 'amplification ou de modification de l'acide nucléique servant de sonde, telles que: - la technique LCR (Ligase Chain Reaction), décrite par Landegren et al. en 1988 et perfectionnée par Barany et al. en 1991, qui emploie une ligase thermostable; 28 2764903 - la technique de RCR (Repair Chain Reaction), décrite par Segev en 1992; - la technique CPR (Cycling Probe Reaction), décrite par Duck et al. en 1990; - la technique d'amplification à la Q-beta-réplicase, décrite par Miele et al. en 1983 et perfectionnée notamment par Chu et al. en 1986, Lizardi et al. en 1988, puis par Burg et al. ainsi que par Stone et al. en 1996. Selon un autre aspect de l'invention, un alignement multiple des séquences en acides aminés connues du gène L de souches prototypes (souches de laboratoire) et d'isolats cliniques provenant de virus de type RSVA, PIV3 et de la séquence nouvelle de la région III du gène N du virus RSVB a permis aux inventeurs de définir des régions de faible conservation entre ces différents virus. Sur la base des séquences nucléotidiques codant ces régions peptidiques peu conservées, des oligonucléotides spécifiques ont été synthétisé dont la séquence a été définie de telle manière à ce qu'un oligonucléotide particulier n'hybride, dans des conditions d'hybridation fortement stringentes, qu'à un acide nucléique d'un paramrnyxovirus d'un type donné choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, à l'exclusion de tout autre type de paramyxovirus. Dans le but de mettre au point un outil de typage utilisable en diagnostic de routine dans les laboratoires d'analyse, les inventeurs ont recherché des sondes oligonucléotidiques dans des régions de l'amplicon spécifiques de chaque groupe de virus. Dans un mode de réalisation particulier des sondes selon l'invention utiles pour distinguer spécifiquement les virus des groupes RSVA et RSVB ont été sélectionnées dans la O2 région située entre le nucléotide en position 159 et le nucléotide en position 200 de l'amplicon, c'est à dire dans l'une des régions dans lesquelles les séquences de RSVA et RSVB sont les plus divergentes (Figure 2). Par exemple, la sonde spécifique de PIV3 de séquence SEQ ID N 17 a été sélectionnée dans la région délimitée par le nucléotide en position 77 et le nucléotide en position 118 de l'amplicon, c'est à dire dans une région dans laquelle les séquences PIV et RSV présentent une grande divergence (environ 50% de divergence entre lesdites séquences), cette région de forte divergence comprenant notamment un long " gap " unique de trois nucléotides. Les inventeurs ont mis au point un test de détection différentiel par hybridation qui met en oeuvre trois sondes oligonucléotidiques internes à un amplicon déterminé, la séquence de chaque sonde étant choisie de manière à ce que cette dernière soit spécifique de chaque type de virus et non spécifique des autres type viraux dont le génome est amplifié grâce aux amorces géenériques. Le test décrit dans l'Exemple 5 a permis de démontrer une corrélation de 97,5% entre les résultats obtenus à l'aide des sondes spécifiques selon l'invention et les données du séquençage des amplicons détectés avec ces sondes. Le test est en effet positif avec une sonde 29 2764903 homologue (valeur d'indice très supérieure à 1), et systématiquement négatif avec une sonde hétérologue (valeur d'indice inférieure à 1). Les résultats obtenus par les inventeurs à l'Exemple 5 indiquent clairement l'absence d'hybridation croisée des sondes spécifiques selon l'invention avec des amplicons dérivés de génomes hétérologues. Les sondes spécifiques de RSVA, RSVB et PIV3 ont été testées sur la plupart des échantillons cliniques et des souches prototypes, pour leur capacité de typage spécifique de chacun des groupes de virus, respectivement dans un test d'hybridation moléculaire et dans un test immunoenzymatique. La spécificité du test a été préalablement établie entre chacune des sondes et l'amplicon d'une souche prototype homologue ou hétérologue, à savoir les amplicons générés respectivement à partir de RSVA (Souche Long), RSVB (Souche 9320), PIV3 et le virus de Sendai (Tableau 1). En conséquence, un autre objet de l'invention concerne un polynucléotide d'une longueur d'au moins 12 nucléotides, caractérisé en ce qu'il est capable de s'hybrider spécifiquement, dans des conditions de forte stringence, à un premier acide nucléique codant pour la grande sous- unité (L) de la polymérase d'un virus de la famille des Paramyxoviridae d'un type donné, choisi parmi les virus de type RSVA, RSVB ou PIV3 ou à un second acide nucléique dont la séquence est complémentaire du premier acide nucléique. Selon un mode de réalisation préféré des sondes oligonucléotidiques spécifiques d'un type donné de paramyxovirus selon l'invention, ces dernières sont choisies à partir d'une région du gène L d'un type de paramyxovirus donné qui est très conservée au sein des différents isolats du type de paramyxovirus respiratoire avec l'acide nucléique duquel ladite sonde doit s'hybrider spécifiquement et assez divergente entre les paramyxovirus respiratoires de types différents. Avantageusement, les sondes hybridant spécifiquement respectivement avec des paramyxovirus d'un type différent présenteront au maximum 77 % d'identité entre elles du point de vue de leur séquence nucléotidique, de telle manière à éviter toute réaction d'hybridation croisée dans les conditions d'hybridation stringente définies ci-avant dans le présent mémoire descriptif Plus spécifiquement, le polynucléotide ci-dessus est caractérisé en ce qu'il s'hybride avec l'acide nucléique codant pour la région 111 de la grande sous-unité (L) de la polymérase d'un virus de la famille des Paramrnyxoviridae d'un type donné ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire. Un tel polynucléotide hybride spécifiquement avec l'acide nucléique correspondant d'un type donné de virus PIV, notamment PIVI, PIV2 et PIV3, ou RSV, et plus particulièrement d'un type donné choisi parmi les paramyxovirus PIV3, RSVA ou RSVB. 2764903 Avantageusement, la séquence d'une sonde spécifique selon l'invention est définie de telle manière que cette sonde hybride, dans des conditions de forte stringence, avec un amplicon généré dans une réaction d'amplification d'acide nucléique cible, à l'aide d'un couple d'amorces consensus ou générique selon l'invention, ou encore hybride avec l'amplicon obtenu en faisant agir l'un des couples d'amorces génériques décrits par Tordo et al. en 1995. De telles sondes oligonucléotidiques spécifiques selon la présente invention sont, par exemple, les oligonucléotides suivants a) Sondes spécifiques de RSVA: SEQ ID N 10: 5'-TACATTGTTAGGATCTACAGTATGATCTCCTATATAGGGG-3'; SEQIDN 1: '-2289-TACATTGTTAGGATCTACAGTATGATCTCCTATATAGGGG-2250-3' SEQ ID N 12: 5'-2216-TGAGGAATAGTTAAATGTAACCAGGAAAAT-2187- 3'; SEQ ID N 13: 5'-2424-AATTAAAGCAGTAATT-2409-3'; b) Sondes spécifiques de RSVB: SEQ ID N 14: 5'-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA-3'; SEQ D N 2: 5'-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA-3'; SEQ D N 15: 5'-AGAGGTATTGTTAAATGCAACCAAGAGAAC-3'; SEQ ID N 16: 5'-TATCAGAGCTGTGATG-3'; c) Sondes spécifiques de PIV3 SEQ ID N 17: 5'-GAGGGTGTAACCAATTAAACAATTTATTTAATCCAAATA-3'; SEQ ID N 18: 5'-2095-GAGGGTGTAACCAATTAAACAATTTATTTAATCCAAATAT- 2056-3' (définie à partir de la séquence de la souche Hu PIV3, souche JS). Les polynucléotides ci-dessus peuvent être marqués par un composé radioactif ou par un composé non radioactif Dans un mode de réalisation avantageux ces polynucléotides ci-dessus décrits, ces derniers sont immobilisés sur un support, de manière covalente ou noncovalente. Un autre objet de la présente invention consiste en des oligonucléotides comprenant une séquence de type consensus, capables de s'hybrider, dans des conditions fortement stringentes, à un acide nucléique provenant indifféremment d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3, à l'exclusion de tout autre paramyxovirus. Ces sondes oligonucléotidiques sont utiles notamment comme témoins internes dans une réaction de détection d'acides nucléiques cibles provenant de paramyxovirus dans un échantillon 3 1 2764903 biologique. En particulier, ces sondes oligonucléotidiques consensus ou génériques permettent de quantifier l'acide nucléique cible et de corroborer ainsi les données quantitatives apportées par la réaction d'hybridation d'une sonde spécifique selon l'invention. Dans l'hypothèseo un échantillon biologique à tester contiendrait un isolat de paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3 dont la séquence génomique aurait considérablement varié dans les régions dans lesquelles les séquences des sondes spécifiques selon l'invention ont été définies, ou encore dans l'hypothèse o l'échantillon biologique contiendrait plusieurs types de paramyxovirus parmi les types RSVA, RSVB ou PIV3, l'utilisation de la sonde consensus ou générique selon l'invention permet à l'expérimentateur d'observer une différence dans l'intensité de marquage du matériel génétique provenant de l'échantillon biologique due à l'hybridation de la sonde spécifique et de la sonde générique. De telles sondes consensus ou génériques, telles que définies ci-dessus, sont choisies dans des régions du gène L pour laquelle les séquences nucléotidiques des différents types de paramyxovius respiratoires, en particulier RSVA, RSVB et PIV3, sont très conservées. De manière particulièrement avantageuse, de telles sondes consensus ou génériques seront sélectionnées de telle manière que la région du gène L avec laquelle elles hybrident présente au sein des différents paramyxovirus respiratoires, et tout particulièrement RSVA, RSVB et PIV3, une séquence nucléotidique présentant un degré d'identité d'au moins 80 % entre les différents types de virus. Par ailleurs, et de manière tout a fait préférée, la sonde détection sélectionnée aura une séquence présentant un degré d'identité avec les séquences cibles (ou avec les séquences consensus représentées à la Figure 2) des différents paramyxovirus respiratoires d'au moins %, et avantageusement d'au moins 88% Des sondes consensus ou génériques selon l'invention sont, par exemple, les oligonucléotides comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de l'un des enchaînements nucléotidiques suivants: SEQ ID N 19: 5'-GGTGGTATAGAAGGCTGGTGTCAAAAATTATGGAC-3' SEQ ID N 20: 5'-GGGGGTATAGAAGGCTGGTGTCAAAAACTATGGAC-3', étant entendu que les oligonucléotides de séquence exactement complémentaire des séquence ci-dessus constituent également des sondes consensus ou génériques selon la présente invention; il s'agit des oligonucléotides comprenant les enchaînements de séquence suivants SEQ ID N 21: 5'-GTCCATAATTTTTGACACCAGCCTTCTATACCACC-3' SEQ ID N 22 5'-GTCCATAGTTTTTGACACCAGCCTTCTATACCCCC-3' Les oligonucléotides de séquence SEQ ID N 19 à 22 hybrident avec la séquence comprise entre le nucléotide situé en position 2357 et le nucléotide situé en position 2323 du 32 2764903 gène L de RSVA, et avec la séquence comprise entre le nucléotide situé en position 2166 et le nucléotide situé en position 2132 du gène L de PIV3. Les positions de nucléotides mentionnées ci-avant sont toutes calculées en prenant comme repère commun la base A du codon ATG de début de traduction du gène L du virus correspondant, numérotée n l. Il va sans dire que le degré de complémentarité des sondes génériques selon l'invention est suceptible d'être accru par la synthèse de sondes dégénérées. C'est le cas notamment pour les séquences SEQ ID NI 19 à 22 o les bases dégénérées sont soulignées. Les sondes consensus ou génériques de séquence SEQ ID N 19 à 22 hybrident avec une région du gène L codant pour le motif B de la grande sous-unité de l'ARN polymérase. En effet, le motif B a été déterminé par les inventeurs comme étant une région d'acides aminés particulièrement conservée entre les différentes séquences d'acides aminés caractérisant le gène L des paramyxovirus de type RSVA, RSVB et PIV3. De manière inattendue, la grande conservation des séquences d'acides aminés du motif B de la grande sous-unité de l'ARN polymérase s'est révélée correspondre à une région du gène o les séquences nucléotidiques correspondantes présentent un très fort degré d'identité, comme illustré ci-après ConsRSVB SI -????- GGTGGTATTGAGGGCTGGTGTCAAAAACTGTGGAC-????- 3' À ******* ** ** ************** ***** 31/35 88,5% similarité ConsRSVA 5 -2323GGTGGTATCGAAGGGTGGTGTCAAAAACTATGGAC-2357- 3' À* ***** ***** ****..*.... 29/35 = 82,9% similarité ConsPIV3 5' -2132-GGGGGTATAGAAGGATTTTGTCAAAAATTATGGAC-2166- 3' ConsRSVB, ConsRSVA et ConsPIV3 représentant la partie correspondante des séquences consensus de chacun des types viraux établies par les inventeurs et représentée à la Figure 2. Les sondes oligonucléotidiques de séquence SEQ ID N 19 et SEQ ID N 20 ont été conçues à partir des comparaisons de séquences ci-dessus et leur degré d'identité avec les séquences consensus de chacun des types viraux PIV3, RSVA et RSVB est représenté ci- après, les astérisques représentant les bases conservées À * *********** * **********.à.* piv3 88,5% À ****** ******** ***** RSVA 91,5% À********* ************* * *******RSVB 88,5% q.q SEQID N 19 GGTGGTATAGAAGGCTGGTGTCAAAAATTATGGAC ************* * ********* ******".piv3 88,5% À ** **********....*........ RSVA 91,5% À *........****'*******'*** *....RSVB 88,5% SEQID N 20 GGGGGTATAGAAGGCTGGTGTCAAAAACTATGGAC 33 2764903 Les oligonucléotides non marqués peuvent être utilisés directement comme sondes, cependant les séquences sont généralement marquées par un élément radioactif (32p, 35S, 3H, I) ou par une molécule non-radioactive (biotine, acétylaminofluorène, digoxigénine, 5- bromo-désoxyuridine, fluorescéine) pour obtenir des sondes utilisables pour de nombreuses applications. De manière avantageuse, les sondes spécifiques ou les sondes génériques selon l'invention sont mises en contact avec un acide nucléique cible qui aura été préalablement amplifié. Des exemples de marquages non radioactifs de sondes sont décrits, par exemple, dans le brevet français N 78.10975 ou par Urdea et al. ou par SanchezPescador et al. en 1988. Dans ce dernier cas, on pourra aussi utiliser l'une des méthodes de marquage décrites dans les brevets FR 2 422 956 et FR 2 518 755. La technique d'hybridation peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al., 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait de l'échantillon biologique (salive ou cellules en cultures inoculées avec de la salive d'un patient) sur un support (nitrocellulose, NylonTM, polystyrène, ) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde). Avantageusement, les sondes nucléotidiques marquées selon l'invention peuvent avoir une structure telle qu'elles rendent possible une amplification du signal radioactif ou non- radioactif. Un système d'amplification répondant à la définition cidessus comprendra des sondes de détection sous la forme d'un ADN ramifié, branché (" branched DNA ") telles que celles décrites par Urdea et ai. en 1991. Selon cette technique, on utilisera avantageusement plusieurs types de sondes notamment une sonde de capture, afin d'immobiliser l'ADN ou ARN cible sur un support, et une sonde de détection. La sonde de détection lie un ADN " chimioluminescent, par exemple un dérivé du dioxétane-phosphate. Selon un autre mode avantageux de mise en oeuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite " sonde de capture ", est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester. Si nécessaire, le support solide est séparé de l'échantillon et le duplex formé entre la 34 2764903 sonde de capture et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite Les fragments oligonucléotidiques peuvent être obtenus à partir des séquences selon l'invention, par coupure avec des enzymes de restriction comme décrit par Sambrook et al. en 1989, ou par synthèse chimique selon les méthodes classiques, par exemple selon la méthode décrite dans le brevet européen N EP-0305929 (Millipore Corporation) ou encore par d'autres procédés. Un mode de préparation approprié des acides nucléiques de l'invention comportant au maximum 200 nucléotides (ou 200 pb s'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes: a) la synthèse d'ADN en utilisant la méthode automatisée des béta- cyanethylphosphoramidite décrite par Sonveaux en 1986, b) le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique par hybridation avec une sonde appropriée. Un autre mode de préparation, par voie chimique, d'acides nucléiques selon l'invention de longueur supérieure à 200 nucléotides (ou 200 pb lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes: a) l'assemblage d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leur extrémité de sites de restrictions différents, dont les séquences sont compatibles avec l'enchaînement en acides aminés du polypeptide naturel selon le principe décrit par Urdea et al. en 1983, b) le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique recherché par hybridation avec une sonde appropriée. Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être mises en oeuvre au sein d'un dispositif de détection comprenant une banque matricielle d'oligonucléotides. Un exemple i25 de réalisation d'une telle banque matricielle peut consister en une matrice d'oligonuléotides sondes fixés sur un support, chacune des sondes de l'arrangement matriciel étant ainsi complémentaire d'une séquence distincte de l'ADN ou l'ARN cible à détecter et chaque sonde de séquence connue étant fixée en une position prédéterminée du support. La séquence cible à détecter peut être avantageusement marquée radioactivement ou non radioactivement. Lorsque la séquence cible marquée est mise en contact avec le dispositif matriciel, celle-ci forme des hybrides avec les sondes de séquences complémentaires. Un traitement à la nucléase, suivi d'un lavage, permet d'éliminer les hybrides sondes-séquence cible qui ne sont pas parfaitement complémentaires. Du fait de la connaissance précise de la séquence d'une sonde à une position déterminée de la matrice, il est alors possible de déduire la séquence nucléotidique de la séquence d'ADN ou d'ARN cible. 2764903 Une alternative à l'utilisation d'une séquence cible marquée peut consister en l'utilisation d'un support permettant une détection " bioélectronique " de l'hybridation de la séquence cible sur les sondes du support matrice, lorsque que ledit support est constitué ou comprend un matériau capable d'agir, par exemple, en tant que donneur d'électrons aux positions de la matrice auxquelles un hybride a été formé. Un tel matériau donneur d'électron est par exemple de l'or. La détection de la séquence nucléotidique de l'ADN ou ARN cible est alors déterminée par un dispositif électronique. Un exemple de réalisation d'un biocapteur, tel que défini ci-dessus, est décrit dans la demande de brevet européen N EP-0721 016 au nom de Affymrnax technologies N.V. ou encore dans le brevet américain N US 5.202.231 au nom de Drmanac. L'invention a donc pour objet un procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'invention, spécifique de RSVA, RSVB ou PIV3, ou d'un mélange de sondes selon l'invention dont chaque sonde est spécifique d'un paramyxovirus choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, avec un échantillon biologique, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation du polynucléotide à l'acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3; b) Détection de l'hybride formé entre le polynucléotide et l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique. Un autre but de la présente invention consiste en un procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) Mise en contact d'une première sonde oligonucléotidique selon l'invention, spécifique de RSVA, RSVB ou PIV3, ou d'un mélange de sondes selon l'invention dont chaque sonde est spécifique d'un paramyxovirus choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, immobilisée sur un support, avec un échantillon biologique, I'acide nucléique de l'échantillon ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation du polynucléotide à l'acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3; b) Mise en contact de l'hybride formé entre la première sonde ou le mélange des premières sondes immobilisés sur un support et l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'acide nucléique de l'échantillon biologique 36 2764903 n'ayant pas hybridé avec le polynucléotide, avec une seconde sonde oligonucléotidique selon l'invention, spécifique de RSVA, RSVB ou PIV3 ou un mélange de secondes sondes selon l'invention dont chaque sonde est spécifique d'un paramyxovirus choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, étant entendu que ladite seconde sonde oligonucléotidique possède une séquence ne recouvrant pas la séquence de la première sonde oligonucléotidique de l'étape a). Un mode particulier de réalisation des procédés de détection de RSVA, RSVB et PIV3 ci-dessus est caractérisé en ce que, préalablement à l'étape a), I'ADN de l'échantillon biologique, ou l'ADNc obtenu par transcription inverse de l'ARN de l'échantillon biologique, est amplifié à l'aide d'un couple d'amorces. Dans un mode de réalisation préférentiel des procédés de détection cidessus, le couples d'amorces mis en oeuvre prélablement à l'étape a) n'est pas spécifique d'un paramyxovirus d'un type donné. Ce couple d'amorce est au contraire capable d'amplifier l'acide nucléique correspondant de plusieurs types de paramyxovirus, en particulier à la fois RSVA, RSVB et PIV3. Alternativement, ledit couple d'amorces est capable d'amplifier un acide nucléique d'un virus de type RSVA et RSVB ou encore un acide nucléique d'un virus de type RSVA et PIV3. De manière avantageuse les couples d'amorces suivant sont mis en oeuvre: a) Couple d'amorces pour l'amplification de l'acide nucléique à la fois de RSVA et de RSVB - PI (SEQ ID N 7) 5'-ACAACAGATCTCAGCAAAT-3'; - P2 (SEQ ID N 8) 5'-CTATTGCTTGATTGTCACC-3'; b) Couple d'amorces pour l'amplification de l'acide nucléique de RSVA et PIV3 - PI (SEQ ID N 7) 5'-ACAACAGATCTCAGCAAAT-3'; - P3 (SEQ ID N 9) 5'-CTATTGCTTGATTGTCTC-3'. La présente invention a encore pour objet une trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants a) Une sonde oligonucléotidique selon l'invention, spécifique d'un paramyxovirus d'un type donné choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3 ou un mélange de sondes selon l'invention dont chaque sonde est spécifique d'un paramyxovirus choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3; b) Les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation; c) Le cas échéant, un couple d'amorces non spécifique d'un type de paramyxovirus donné, choisi parmi 37 2764903 - un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA, RSVB et PIV3; - un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et RSVB; - un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et PIV3, ou un mélange d'un ou plusieurs de ces trois couples d'amorces, ainsi que les réactifs nécessaires à l'amplification d'un acide nucléique L'invention vise aussi une trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants a) Un polynucléotide, dit polynucléotide de capture, consistant en une premnière sonde oligonucléotidique selon l'invention, spécifique d'un paramyxovirus d'un type donné choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3 et immobilisée sur un support, de manière covalente ou non- covalente; Alternativement, un mélange de sondes selon l'invention dont chaque sonde est spécifique d'un paramyxovirus choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3 b) Un polynucléotide, dit polynucléotide de révélation, consistant en une seconde sonde oligonucléotidique selon l'invention, spécifique d'un paramyxovirus d'un type donné choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, non immobilisée sur un support et, le cas échéant marquee radioactivement ou non radioactivement, étant entendu que ladite seconde sonde oligonucléotidique possède une séquence ne recouvrant pas la séquence de la prmière sonde oligonucléotidique de l'étape a); Alternativement, un mélange de sondes de révélation selon l'invention dont chaque sonde est spécifique d'un paramyxovirus choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3 c) Le cas échéant, un couple d'amorces non spécifique d'un type de paramyxovirus donné, choisi parmi: - un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA, RSVB et PIV3; - un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et RSVB; - un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et PIV3; ou un mélange d'un ou plusieurs de ces trois couples d'amorces, ainsi que les réactifs nécessaires à l'amplification d'un acide nucléique. 38 2764903 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures suivants, sans pour autant limiter la portée de l'invention à leur mise en oeuvre particulière FIGURES Figure 1: Séquence consensus déduite de l'alignement des motifs fonctionnels A et C du gène L des virus RSVA, PIV3, de Sendaï, PIV2, de la rougeole (MEAS), des oreillons (MUMP), virus simien 5 (SV5) et de la maladie de Newcastle (NDV). Ligne supérieure: séquence d'acides aminés des motifs (majuscules: résidus conservés; Minuscules: résidus variables). Les séquences nucléotidiques correspondantes sont alignées en prenant comme référence la séquence consensus. Un tiret correspond à une base identique à la base de la séquence consensus (CONS) située à la même position. Les bases indiquées pour chacune des séquences correspondant à un type viral particulier sont les bases différant par rapport à la base correspondante de la séquence concsensus. La position de l'extrémité 5' (à gauche) et de l'extrémité 5' (à droite) de chaque séquence nucléotidique est donnée en prenant comme référence la première base du codon d'initiation de la séquence codant pour la protéine L de chaque type viral (IATG). La structure de la sonde P3 est donnée en prenant comme référence la séquence de la sonde P2. Figure 2: Alignement multiple des séquences nucléotidiques de la région amplifiée par le jeu d'amorces Pl/P2 (ou PI/P3) à partir des isolats cliniques et des souches prototypes de RSVA, RSVB et PIV3. Les séquences sont comparées par rapport à une séquence consensus de RSV (ConsRSV) ou par rapport à une séquence consensus de PIV3 (ConsPIV3). La position des amorces Pl et P2 sont indiquées respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'alignement de séquences. La fenêtre d'une longueur de 260 nucléotides utilisée pour l'analyse phylogénétique est délimitée par les deux lignes verticales. Les séquences correspondant aux sondes ou aux sites de coupure des enzymes de restriction AvalI, BglII et PvuII sont soulignées. Les tirets représentent les nucléotides conservés par rapport aux séquences consensus. Les points représentent des parties d'une région qui n'ont pas été séquencées. Les marques astérisques représentent les identités de nucléotides entre les deux séquences consensus. la marque (.) représente le gap de trois nucléotides dans les séquences de PIV3. Figure 3: Arbre phylogénétique des isolats cliniques et des ouches prototypes de RSVA, RSVB et PIV3. L'arbre est calculé en utilisant une fenêtre d'une longueur de 260 nucléotides en utilisant la méthode du plus proche voisin ("Neighbour Joining "), comme décrit dans la 39 2764903 rubrique Matériels et Méthodes. La longueur des lignes horizontales reflète la distance génétique entre plusieurs groupes. Les lignes verticales ont été représentées par simple souci de clarté, celles-ci n'apportant pas d'information supplémentaire. Figure 4: Carte du plasmide préparé à partir du vecteur pUC18 et contenant un insert de séquence SEQ ID N 1 (RSVB) au niveau du site SmaI. La boîte représente le niveau d'insertion de la séquence SEQ ID N l. Figure 5: Représentation du degré de conservation en acides aminés de la grande sous-unité (L) de la polymérase, après alignement des séquences d'acides aminés des virus suivants PIV2, SV5, Mumps, ndv, Measles, Sendai, PIV3 et RSVA. Plus le degré de conservation entre les différentes séquences est élevé, plus l'indice de similarité (en ordonnées) sera élevé. En abscisse: numérotation des aminoacides des séquences alignées, l'acide aminé N)l correspondant à l'acide aminé de l'extrémita N-terminale de la grande sous-unité de la polymérase. Figure 6: Alignement des séquences d'acides aminés de la grande sousunité (L) de la polymérase de différents parmyxovirus respiratoires. Ligne supérieure: identification des domaines I à V (définis initialement par Poch et al., 1990). Ligne inférieure: les astérisques marquent les positions d'acides aminés de parfaite identité entre les séquences; les points * marquent les positions de forte identité entre les séquences. Figure 7: Alignement des séquences nucléotidiques codant pour les domaines 1(1) à V (5) de la grande sous-unité de la polymérase. Ligne située entre les séquences de PIV3 et RSVA: les symboles " + " marquent les positions pour lesquelles il y a identité entre les séquences de PIV3 et les séquences de RSVA. Les régions contenant la plus forte identité sont les régions préférentielles au sein desquelles ont été définies les couples d'amorces selon l'invention. Ligne inférieure: indication des acides aminés correspondants lorque ceux-ci sont fortement conservés (cf Figure 6). La séquence de RSVA est numérotée et sert de ponit de référence commun pour la numérotation des séquences selon l'invention, étant entendu que la convention suivante est adoptée: le nucléotide en position I correspond à la base A du codon ATG du gène L du virus de type RSVA, souche RSVA S2 ts 1 C, accessible notamment sur la base de données Genbank sous le numéro RSU39661. 2764903 Matériels et méthodes A. Isolement et identification des souches de virus par immunofluorescence (IFA) et Technique d'isolement viral (VIT). Les souches de référence RSVA (Souche Long) et RSVB (Souche 9320) ont été obtenues auprès de l'Amrnerican Type Culture Collection sous les numéros respectifs ATCC VR-26 et ATCC VR-955. Les souches de référence PIV2 et PIV3 ont été obtenues auprès de la société Diagnostics Pasteur (Marnes- la Coquette, France) et les souches du virus de SendaY et du virus de la maladie de Newcastle (NDV) ont été obtenues auprès de M. le Professeur Lebon (Hôpital Saint Vincent de Paul, Paris). Cinquante et un isolats sauvages humains ont été isolés à partir d'aspirats nasals d'enfants hospitalisés dans le service pédiatrique de l'hôpital universitaire de Caen, France. Il s'agit des isolats de RSVA (n=14), RSVB (n=13), PIVI (n=4), PIV2 (n=3), Virus influenza de type A (n=l) et B (n=l). Les isolats des virus de la rougeole et des oreillons (Freymuth et al., 1991). 261 aspirats nasals provenant d'enfants hospitalisés au sein de l'Unité Pédiatrique de l'Hôpital Universitaire de Caen ont été recueillis durant la période allant d'octobre 1995 à mars 1996, dans un volume de 5 ml du milieu de transport décrit ci-dessous. Les aspirats nasals sont remis en suspension dans 5 ml de milieu de culture MEM (Eagle's Minimum Essential Medium, Sigma Chemicals, Saint Louis, Missouri, USA; tampon Hepès, Eurobio, France; albumine bovine; penicilline; gentamicine) et conservés à -70 C. Pour les expériences décrites dans les Exemples ci-après, 0,2 ml des specimens conservés comme décrits ci-dessus (souches prototypes et aspirats nasals) sont inoculés sur différentes lignées cellulaires en culture. Pour l'isolement des virus de type RSV, on réalise des cultures de la lignée de fibroblastes pulmonaire embryonnaires humains MRC-5 (ATCC N CCL 171) dans des flacons de culture de 25 cm2. Pour l'isolement des virus PIV, ainsi que des virus de la rougeole ou des oreillons, des cultures de la lignée NCI-H292 (ATCC N CRL 1848) de cellules muco-épidermoïdes pulmonaire humaines sont réalisées dans des microplaques de 48 puits pour cultures de tissu. Des cultures de cellules MDCK (Madin-Darby Canine Kidney, ATCC N CCL34) sont effectuées pour l'isolement des virus influenza. Lorsque les cellules présentent un effet cytopathogène (lignée MIRC-5), ou après une période d'incubation de 5 jours (cellules NCI-H292 et MDCK), ces cellules sont recueillies par grattage du support de culture puis centrifugation. Le culot cellulaire est remis en suspension, puis déposé sur une lame de microscope et fixé par l'acétone. Le virus est ensuite identifié par immunofluorescence (IFA). 41 2764903 Les différents anticorps monoclonaux mis en ouvre dans les expériences d'immunofluorescence sont décrits ci-après. Les anticorps utilisés pour l'identification des virus RSV des sous-groupes A et B sont produits respectivement par les clones d'hybridome B90 et 7858 (Freymuth et al., 1991) et mis en oeuvre comme décrit par Freymuth et al., 1982. Les anticorps monoclonaux utilisés pour identifier les virus PIV et les virus influenza sont commercialisés par Imagen (Kit ImagenTM, Virus Respiratoire Syncitial Dako; Kit ImagenTM Virus Parainfluenza Dako) et les anticorps monoclonaux ayant permis l'identification des virus de la rougeole et des oreillons sont commercialisés par Argène Biosoft, France. B. Extraction de l'acide nucléique Après décongélation, 100l des échantillons conservés à -70 C sont soumis à une digestion par la méthode classique à la protéinase K. Selon cette méthode, la digestion est réalisée par addition de 2pl de protéinase K (10 mg/ml), 10 pl de SDS à10%, 1.2 Il de tampon Tris-HCI 1M. (pH 7,6) et en incubant les échantillons ainsi traités à 56 C pendant 1 h. Les acides nucléiques sont extraits à l'aide d'une solution de phénol:chloroforme (1:1) et de chloroforme:isoamylalcool (24:1). Les acides nucléiques totaux sont alors précipités dans de l'éthanol à 66% et 0,3 M. d'acétate de sodium à pH 5,6 à -20 C pendant une nuit, recueillis par centrifugation, soumis à un lavage dans de l'éthanol à 70%, puis remis en suspension dans p1l de H20 contenant 20 U d'inhibiteur de RNAase ( Boehringer Mannheim Biochemica). C. Amorces Du fait que les virus d'intérêt RSV et PIV sont génétiquement distants, des amorces ont été définies par alignement de séquence de la région la plus conservée du génome, c'est à dire les motifs A et C du gène de L polymérase (Tordo et al., 1988; Tordo et al., 1992). En particulier, une amorce aller (+) Pl et deux amorces retour (-) P2 et P3 ont été synthétisées selon la technique des phosphoramidites (Sonveaux et al., 1986; Urdea et al., 1983; Caruthers et al.), dont les séquences nucléotidiques sont présentées ci-après - P 1 5'- ACAACAGATCTCAGCAAAT-3' (19-mer); - P2 5'-CTATTGCTTGATTGTCACC-3' (19-mer); - P3 5'-CTATTGCTTGATTGTCTC-3' (19-mer); La position de chacune des amorces sur le génome des virus RSVA, PIV3, Sendaf (SEND)), PIV2, virus de la rougeole (MEAS), virus des oreillons (MNUMP), virus simien SV5 et le virus de la maladie de Newcastle (NDV) est représentée sur la Figure 1. Les oligonucléotides, sondes ou amorces selon l'invention, ont été synthétisés selon la méthode de Sonveaux et al., 1986. 42 2764903 D. Transcription inverse et réaction PCR Pour chacun des échantillons à tester, chacun des couples d'amorces P1/P2 et Pl/P3 ont été mis en oeuvre séparément dans une réaction de type RT-PCR. Les deux amorces de chaque couple d'amorces sont donc présents durant les étapes de transcription inverse et d'amplification PCR. La synthèse d'ADNc est réalisée à 42 C pendant 60 min dans un volume réactionnel de 25 il de tampon-RT (Gibco Brl, USA) contenant 5 tl d'extrait d'acide nucléiques, 200 U de transcriptase inverse M-MLV (Gibco Brl, USA), 20 U d'inhibiteur de Rnase (RNAsineTM, Promega, France), 40 pmol de chacune des amorces, ImM de chacun des dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 10 mM DTT (Gibco Brl, USA). Pour l'étape d'amplification PCR, le volume réactionnel est ajusté à 100 Fl à l'aide d'un tampon PCR (Perkin Elmer Cetus, USA), 1,5 mM MgCI2 et 2, 5 U de polymérase Taq (Perkin Elmer Cetus, USA). L'amplification est réalisée à l'aide d'un appareil Omnigene themocycler (Hybaid) de la manière suivante: on effectue 30 cycles d'amplification dont chaque cycle comprend une étape de dénaturation de 30 sec à 94 C, une étape d'hybridation des amorces de 1,5 min à 45 C et une étape d'extension d'amorce de 1,5 min à 72 C. Les produits résultants de l'amplification sont ensuite analysés par électrophorèse en gel d'agarose à 1,2%. Les fragments séparés par électrophorèse sont alors colorés par le bromure d'ethidium (BET) et visualisés par exposition du gel d'électrophorèse à un rayonnement ultra-violet. E. Analyse et typage des séquences par polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP). Des colonnes de type Microspin (Pharmacia, Uppsala, Suède) sont utilisées pour la purification des fragments amplifiés (amplicons) à partir des mélanges résultant de l'amplification par PCR. Le séquençage des amplicons est réalisé à l'aide d'une trousse de séquençage Delta Taq Cycle (Pharmacia, Uppsala, Suède) en suivant les indications du constructeur. Les fragments purifiés sont alors séquences selon la méthode de séquençage automatique utilisant la fluorescence Ref XXX (Pharmacia, Uppsala, Suède). L'alignement multiple des séquences est réalisé à l'aide du logiciel Clustal-W (Higgins, 1989). L'analyse phylogénétique des séquences alignées est réalisée selon la méthode 43 2764903 BglI et PvuII ont été choisis après analyse de l'alignement multiple de séquences. Les produits d'amplification PCR (5pl) sont soumis à l'action des endonucléases de restriction selon les instructions du fabricant (Bethesda Research Laboratories) et analysés par électrophorèse en gel d'agarose suivie d'une coloration par le bromure d'ethidium. F. Hybridation et test immunoenzymatique (EIA). Des sondes génomiques (brin moins) spécifiques internes au produits d'amplification du gène L sont sélectionnées à partir des résultats de l'alignement multiple de séquences décrit ci- dessus. D'autres sondes ont été sélectionnées à partir de séquences accessibles sur la base de données Genbank. Ces sondes sont les suivantes: - Sonde RSVA:5'-2289-TACATTGTTAGGATCTACAGTATGATCTCCTATATAGGGG- 2250-3'; - Sonde RSVB:5'-2289-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA- 2250-3'; - Sonde PIV3:5'-2095-GAGGGTGTAACCAATTAAACAATTTATTTAATCCAAATAT- 2056-3'. La position des nucléotides aux extrémités des sondes ci-dessus est donnée par référence au codon d'initiation de chaque protéine L (IATG). Les sondes sont synthétisées selon les méthodes classiques puis biotinylées à leur extrémité 5'. Les sondes d'ADN simple brin sont immobilisées sur la surface d'une plaque de microtitration préalablement recouverte de streptavidine. Les produits résultants de l'amplification par PCR sont alors mis en présence des sondes immobilisées dans des conditions permettant leur hybridation à ces dernières, puis les hybrides formés sont visualisés par un test immunoenzymatique (commercialisé par Gen- ET1-K DEIATM, Sorin, France) réalisé selon les instructions du fabricant. La concentration optimale de chacune des sondes RSVA, RSVB et PIV3 sont respectivement de 0,1 ng/.tl, I ng/pl et 0,5 ng/gl. Exemples Exemple 1: Choix des amorces Les inventeurs ont recherché des amorces capables d'amplifier deux types de virus distants génétiquement, à savoir les virus de type RSV et les virus de type PIV 3. En conséquence les amorces ont été choisies dans la région génomique la mieux conservée des Paramyxoviridae. Des comparaisons entre les séquences en acides aminés des protéines L des virus à ARN à brin négatif faites antérieurement avaient mis en évidence l'existence de 6 blocs 44 2764903 de séquences fortement conservées, séparés par des régions variables. Le Bloc III, qui correspond au domaine catalytique pour la polymérisation, contient 4 à 5 motifs hautement conservés au sein des polymérases ARN dépendantes (ARN polymérases et transcriptases inverse) (Poch et al., 1990; Tordo et al., 1992). Les séquences du Bloc III conservé de différents paramyxovirus, tels que RSVA, PIV3, Sendai, PIV2, rougeole, oreillons, virus simien 5 (SV5) et virus de la maladie de Newcastle (NDV), ont tout d'abord été alignées. Les amorces ont été choisies au sien des motifs conservés A et C du Bloc III afin de détecter spécifiquement RSV et PIV3 (Figure 1). La séquence de chacune des amorces correspond à une séquence de type consensus qui a été définie de manière à assurer une complémentarité acceptable vis-à-vis des séquences génomiques des paramyxovirus à détecter et/ou amplifier. Une amorce aller (brin +) unique a été construite de manière à ne contenir que deux bases consécutives non complémentaires des séquences génomiques des paramyxovirus RSVA et PIV3 à détecter et/ou amplifier, et au moins trois bases non complémentaires des autres séquences de paramyxovirus (Figure 1). Deux amorces retour (brin moins), les amorces P2 et P3, sont nécessaires, pour tenir compte de la variabilité des séquences entre PIV3 et RSVA. Les amorces P2 et P3 diffèrent par un nucléotide unique à la position 17 desdites amorces (c.à.d. en position -3 à partir du premier nucléotide incorporé). L'amorce P2 contient une base non complémentaire du génome de RSVA et deux bases non complémentaire du génome de PIV3. Inversement, l'amorce P3 contient un nucléotide non complémentaire du génome de PIV3 et deux nucélotides non complémentaires du génome de RSVA. Les deux amorces sont moins complémentaires des génomes des autres paramyxovirus, à l'exception du génome du virus de Sendai murin (un nucléotide non complémentaire de P2, deux nucléotides non complémentaires de P3, comme pour RSVA). Selon les données de l'étude, les deux jeux d'amorces, Pl/P2 et Pl/P3, sont capables d'amplifier des segments d'ADN du gène L, d'une longueur de 355 pb pour RSVA et d'une longueur de 352 bp pour PIV3 et le virus de Sendai. Les amorces ont été volontairement choisies pour hybrider avec une région du gène L situées aux extrémités d'une région variable de ce gène des paramyxovirus, ce qui a permis aux inventeurs de construire des sondes spécifiques de ces régions variables pour chaque type de paramyxovirus, ou de choisir des endonucléases de restriction ayant un site de coupure au sein de cette région variable afin de différencier les différents types de paramyxovirus par le profil des bandes d'électrophorèse dans des expériences de polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP). 2764903 Exemple 2: Analyse des produits issus des isolats viraux amplifiés par PCR, par électrophorèse sur gel. La spécificité des jeux d'amorces Pl/P2 et P1/P3 a été déterminée sur des souches prototypes ainsi que sur une série de 51 isolats cliniques. Les résultats sont représentés sur le Tableau 1. Un test d'immunofluorescence (IFA) a permis d'identifier ces isolats comme appartenant respectivement aux types suivants: RSVA (n=14), RSVB (n=13), PIVI (n=4), PIV2 (n=3), PIV3 (n=13), virus des oreillons (n=l), virus de la rougeole (n=l), virus influenza A -H3N2- (n=l) et virus influenza B (n=l). Deux types de virus ont généré un amplicon de la taille attendue sur un gel d'électrophorèse d'agarose coloré par le BET, à la fois avec Pl/P2 et Pl/P3: RSVA (la souche Long et les 14 isolats cliniques) ainsi que le virus e Sendai. Pour le type RSVB, l'amplicon de taille attendue n'est observé qu'avec le jeu d'amorce Pl/P2 (souche 9320 et pour 12 des 13 isolats cliniques). L'ADN de l'un des 13 isolats cliniques de RSVB (n 9401891) est amplifié à la fois avec Pl/P2 et P1/P3, c'est à dire comme l'ADN des virus RSVA et Sendaï. Les échantillons de virus de type PIV3 présentent un profil intermédiaire. La souche prototype et 6 (46%) des 13 isolats cliniques de PIV3 ont un ADN amplifié par le jeu d'amorces Pl/P2, tandis que tous les virus PIV3 de l'étude ont un ADN amplifié par le jeu d'amorces Pl/P3. Un tel résultat est en accord avec le fait que l'amorce P3 présente une meilleure complémentarité que l'amorce P2 avec le génome de PIV3 (Figure 1). Pour les autres paramyxovirus (4 PIVI, 3 PIV2, I virus de la rougeole, 1 virus des oreillons) ou pour les orthomyxovirus ( I virus influenza A, I virus influenza B) ainsi que pour les extraits cellulaires non infectés utilisés comme témoins négatifs, aucune amplification n'a été observée, quel que soit le jeu d'amorces Pl/P2 ou Pl/P3 utilisé. La sensibilité du test RT-PCR a été déterminé en analysant des dilutions successives de dix fois des lysats de cultures de cellules MRC5 inoculées avec RSVA (souche Long) ou RSVB (souche 9320), à un titre de 103/ml et 104/ml TCID50. Les produits résultant de la 3( réaction d'amplification sont visualisés à la fois sur un gel d'agarose pour une dilution des lysats cellulaires de RSVA et RSVB respectivement de 10' et 10'2 et par hybridation pour une dilution des lysats cellulaires de RSVA et RSVB respectivement de 102 et 103. La quantité d'ADN viral détecté par RT-PCR est d'environ 10 TCID50. 46 2764903 Exemple 3: Analyse des séquences et phylogénie. Afin d'évaluer la variabilité entre les différents isolats et leur liaison avec les souches prototypes, on a réalisé une analyse des séquences des amplicons générés par l'amplification PCR à partir de 11 isolats cliniques de RSVA, 6 isolats cliniques de RSVB et 10 isolats de PIV3 (9 échantillons cliniques et la souche de l'Institut Pasteur PIV3 JS)), à l'aide d'une méthode automatisée. Cette méthode a permis de définir une séquence génomique consensus pour chacun des échantillons, qui correspond à un compromis entre les virus individuels de la population virale (quasi-espèces) et l'isolat considéré. Un alignement multiple de la séquence des amplicons est représenté sur la Figure 2, qui inclus également les séquences correspondantes des souches RSVA2 et PIV3JS accessibles dans les bases de données. La Figure 3 représente l'arbre phylogénétique calculé selon la méthode de " en utilisant une fenêtre de calcul d'une longueur de 260 nucléotides (soulignée sur la Figure 2). Les virus RSVA, RSVB et PIV3 sont regroupés de manière distincte dans trois principales branches. Les groupes RSVA et RSVB sont assez proches (85% de similarité dans le région considérée) et sont tous les deux distants du groupe PIV3 (43% de similarité avec RSVA et RSVB dans la région considérée). Par ailleurs la variabilité au sein de chaque branche principale est très faible. Cette variabilité intrinsèque est plus importante au sein des groupes de RSV (1,53% dans le groupe RSVA et 1,17% dans le groupe RSVB) que dans le groupe de PIV3 (0,4%). Il n'a pas été possible de regrouper de manière statistiquement significative les différents isolats au sein de chaque groupe, que ce soit au regard de la date ou de la localisation géographique de leur isolement. Dans le groupe de RSVA, la souche prototype A2 est regroupée avec les isolats cliniques. La même situation est observée pour la souche prototype JS de PIV3 mais la souche PIV3 de Pasteur est clairement distincte. Deux isolats cliniques RSVA (n 9400961 et n 9346219) et deux isolats cliniques RSVB (n 9344256 et n 9400215) ont été seulement partiellement séquencés et ne figurent donc pas dans l'arbre phylogénétique de la Figure 2. Néanmoins, leur séquence partielle permet de les placer sans ambiguïté au sein de leurs groupes respectifs. De manière surprenante, la séquence de deux isolats cliniques a permis de classer ces derniers dans des groupes différents des groupes dans lesquels ces isolats sont classés d'un point de vue immunologique par immunofluorescence (IFA). Il s'agit, d'une part, de l'isolat identifié comme appartenant au groupe RSVA dans le test d'immunofluorescence (isolat n 9400504) et qui appartient pourtant sans équivoque au groupe RSVB, comme il résulte de l'analyse phylogénétique. Il s'agit, d'autre part, de l'isolat identifié comme appartenant au groupe RSVB dans le test d'immunofluorescence (isolat n 9301891, non représenté sur la 47 2764903 Figure 2) et qui appartient sans ambiguïté au groupe de RSVA si l'on considère l'analyse de sa séquence partielle. Exemple 4: Typage des virus par analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP). Afin de différencier les trois groupes de virus générant des amplicons de taille identique avec les jeux d'amorces selon l'invention, les inventeurs ont recherché sur les séquences des amplicons de chacun des trois groupes des sites de restrictions particuliers, très conservés au sein des trois groupes mais localisés à des positions différentes de la séquence des amplicons générés dans chacun des trois groupes. Sur la base des résultats d'alignement des séquences de la Figure 2, les sites de coupure par les endonucléases de restriction AvalI, BglII et PvulI ont été retenus. Ces enzymes de restriction ont été utilisées pour une analyse systématique des isolats cliniques et des souches prototypes par RFLP (Tableau 1). Les enzymes AvalI et PvuII coupent exclusivement les amplicons issus de l'ADN des virus RSV et PIV3. L'enzyme AvaIl coupe l'amplicon de 355 pb de RSV en deux fragments d'une longueur respective de 263 pb et 92 pb. L'enzyme PvuII coupe l'amplicon de 352 pb de PIV3 en deux fragments d'une longueur respective de 295 pb et 57 pb. La coupure par l'enzyme BglII permet de différencier entre les groupes RSVA et RSVB et ne coupe pas l'amplicon généré par PIV3 (à l'exception de l'amorce P1, rendant compte du fait qu'un fragment de 6 pb soit systématiquement éliminé de tous les amplicons). Tous les amplicons issus de RSVB sont clivés par BglII en deux fragments d'une longueur respective 283 pb et 66 pb. Par ailleurs, 79 % des isolats de RSVA (représentant 11 isolats cliniques) ne sont pas clivés par BglIl, alors que, pour les 3 autres échantillons viraux (2 isolats cliniques et la souche prototype Long), I 'amplicon de 355 pb est coupé en deux fragments d'une longueur respective de 177 pb et 172 pb. En ce qui concerne les deux isolats pour lesquels les données d'immunofluorescence et de typage génétique ne sont pas en accord, on observe un profil de restriction qui permet de la classer conformément aux données d'analyse phylogénétique de leurs séquences. Ainsi, l'isolat n 9400504 présente un profil RFLP de typa RSVB et l'isolat n 9401981 présente un profil RFLP de type RSVA. Les données d'analyse des profils de restriction RFLP permet de distinguer simplement les amplicons RSV et PIV sur la base de la présence exclusive respective des sites de restriction AvalI (RSV) et Pvull (PIV). Afin de différencier, au sein du groupe RSV, les isolats appartenant respectivement au groupe RSVA ou RSVB, l'analyse de longueur du fragment obtenu par digestion avec l'enzyme BgllI est nécessaire. L'enzyme BglII coupe l'amplicon issu des virus du groupe RSVB en deux fragments d'une longueur respective de 48 2764903 283 pb et 66 pb. L'analyse de la longueur des fragments issus de la coupure par BgllI des amplicons issus des virus du groupe RSVA fait apparaître un certain polymorphisme, en accord avec leur hétérogénéité génétique (Figure 3): la majorité des amplicons issus des virus RSVA (78%) ne sont pas coupés par BGIII; une faible proportion est coupée de manière distincte, générant des fragments dont les plus longs sont d'une longueur respective de 177 pb et 172 bp. Exemple 5 Typage des virus par hybridation spécifique et par test immunoenzymatique. Dans le but de mettre au point un outil de typage utilisable en diagnostic de routine dans les laboratoires d'analyse, les inventeurs ont recherché des sondes oligonucléotidiques dans des régions de 1 'amplicon spécifiques de chaque groupe de virus. Les sondes pour distinguer spécifiquement les virus des groupes RSVA et RSVB ont été sélectionnées dans la région situées entre le nucléotide en position 159 et le nucléotide en position 200 de l'amplicon, c'est à dire dans l'une des régions dans lesquelles les séquences de RSVA et RSVB sont les plus divergentes (Figure 2). La sonde spécifique de PIV3 a été sélectionnée dans la région délimitée par le nucléotide en position 77 et le nucléotide en position 118 de l'amplicon, c'est à dire dans une région dans laquelle les séquences PIV et RSV présentent une grande divergence (environ 50% de divergence entre lesdites séquences), cette région de forte divergence comprenant notamment un long " gap " unique de trois nucléotides. Les sondes spécifiques de RSVA, RSVB et PIV3 ont été testées sur la plupart des échantillons cliniques et des souches prototypes, pour leur capacité de typage spécifique de chacun des groupes de virus, respectivement dans un test d'hybridation moléculaire et dans un test immunoenzymatique. Les tests d'hybridation on été réalisés à l'aide du kit de détection GEN-ETIK DEIA (DNA Enzyme lmmunoassay), commercialisé par Sorin Biomedica, Antony, France), l'étape d'hybridation proprment dite ayant été réalisée à 50 C pendant 60 minutes. La spécificité du test a été préalablement établie entre chacune des sondes et l'amplicon d'une souche prototype homologue ou hétérologue, à savoir les amplicons générés respectivement à partir de RSVA (Souche Long), RSVB (Souche 9320), PIV3 et le virus de Sendai (Tableau 1). Le test est considéré comme positif lorsque la valeur de l'indice " D.O. de l'échantillon/D.O. seuil (D.O. seuil = Valeur de D.O. du contrôle négatif + 0,15 D.O.) est supérieure à 1. Pour chacune des trois sondes, les résultats d'hybridation sont positifs avec I'ADN de la souche prototype homologue, les valeurs d'indices étant fortes, en général supérieure à 10. En revanche, les résultats d'hybridation de chacune des trois sondes avec 49 2764903 I'ADN des souches prototypes hétérologues sont systématiquement négatifs, les valeurs d'indice étant inférieures à 1. Ces résultats démontrent clairement l'absence d'hybridation croisée d'une sonde spécifique sélectionnée selon l'invention avec les amplicons issus des différentes souches virales prototypes. De plus, 97,5% des amplicons obtenus à partir des isolats cliniques ne donnent des résultats positifs qu'avec la sonde homologue, montrant ainsi une excellente corrélation avec les données moléculaires. Néanmoins, on peut noter que pour l'un des 13 isolats de RSVB, tel que typé à l'aide du test immunoenzymatique, la souche n 9401891, il a été observé une hybridation croisée avec la sonde spécifique de RSVA (Valeur d'indice =2) et la sonde spécifique de RSVB (Valeur d'indice = 2,4). 2764903 Tableau 1: Analyse des souches RSVA, RSVB et PIV3 par Immunofluorescence (IFA), amplification en chaîne à la polymérase (PCR), polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) et hybridation spécifique. Echant. IFA(I) PCR(2) RFLP(3) ID Hybridation (4) SéquL(5) N Pl/P2 PI/P3 Avail Bglll PvulI Paires de bases (355) (355) (263/92) (177/172) Long RSVA + + + + - 10 0,6 0,2 ND(5) 9345839 RSVA + + + - 8,4 0,2 0,1 ND 9343012 RSVA + + + - - 9,5 0,1 0,4 RSVA 9346219 RSVA + + + - - 10,5 0,4 0,2 RSVA 9344506 RSVA + + + - - 1,5 0,1 0,2 ND 9400961 RSVA + + + - - 10,9 0,1 0,2 RSVA 9404584 RSVA + + + - - 10 0,2 0,1 ND 9402928 RSVA + + + + - 9,6 0,3 0,1 RSVA 9401927 RSVA + + + + - 8 0,2 0,1 RSVA 9344539 RSVA + + + - - 11,3 0,2 0,2 RSVA 9400220 RSVA + + + - - 1,3 0,2 0,3 RSVA 9400932 RSVA + + + - - 2,6 0,03 0,2 RSVA 9401887 RSVA + + + - - 8.3 0.04 0,3 RSVA 9400972 RSVA + + + - - 6,7 0.2 0,3 RSVA (283/66) 9400504 RSVA + + + - - 0,2 5,3 0,1 RSVB 51 2764903 Tableau 1 (suite 1) Echant, IFA(1) PCR(2) RFLP(3) ID Hybridation (4) S6qu(5) N Pl/P2 PI/P3 Avall BgIII PvuII Paires de bases (355) (355) (263/92) (283/66) 9320 RSVB + - + + - 0,3 10,3 0,3 ND 9400906 RSVB + - + + - 0,3 10,3 0,3 ND 9342557 RSVB + - + + - 0,2 11,7 0,1 ND 9346188 RSVB + - + + - 0,3 11,4 0,2 ND 9346000 RSVB + - + + - 0,4 12,9 0,1 RSVB 9401761 RSVB + - + + - 0,3 7,7 0,2 ND 9346417 RSVB + - + + - 0,7 5,5 0,1 RSVB 9401990 RSVB + - + + - 0,2 4,3 0,2 ND 9402975 RSVB + - + + - 0,4 9,2 0,1 ND 9400215 RSVB + - + + - 0,5 10.5 0,2 RSVB 9344256 RSVB + - + + - 0,2 8,6 0,2 ND 9401023 RSVB + - + + - 0,7 8,8 0,1 RSVB 9338709 RSVB + - + + - 0,3 9,3 0,2 RSVB 9401891 RSVB + + + - - 2.0 2,4 0.2 RSVA 52 2764903 Tableau I (suite 2) Echant. IFA(I) PCR(2) RFLP(3) ID Hybridation (4) Séqu(5) N PI/P2 PI/P3 AvalI BgIII Pvull Paires de bases(352) (352) (295/57) Pasteur PIV3 + + - - + 0,5 0,3 12,3 PIV3 9441219 PIV3 + + - - + 0,2 0,1 11,1 PIV3 9439318 PIV3 + + - - + 0.1 0,3 11,4 PIV3 9439389 PIV3 + + - - + 0,4 0,2 13,0 ND 9426479 PIV3 - + - - + 0,2 0,4 10,3 PIV3 9426019 PIV3 + + - - + 0,2 0,4 5,8 PIV3 9426354 PIV3 - + - - + 0,2 0,2 9,4 PIV3 9431422 PIV3 - + - - + 0,2 0,2 10,5 ND 9504839 PIV3 + + - - + 0.3 0,3 8,4 PIV3 9511637 PIV3 - + - - + 0,2 0,2 6,4 PIV3 9436203 PIV3 - + - - + ND ND ND PIV3 9509919 PIV3 + + - - + ND ND ND PIV3 9438367 PIV3 - + - - + ND ND ND ND 9419101 PIV3 - + + ND 53 2764903 Tableau 1 ( suite 3) Echant. IFA(!) PCR(2) RFLP(3) ID Hybridation (4) Séqu(5) N P1/P2 Pl/P3 Avail Bgll PvulI Paires de bases (263/92) (295/57) Sendai + + + - + 0.5 0,25 0.25 Sendaï PIVI (n=4) - - PIV2 (n=3) - - Roug. (n=l) - - Oreill. (n=l) - - InfA (n=1) - - InfB (n=l) - - (1) Test d'immunofluorescence (IFA) (2) Produits amplification résultant de la réaction de RT-PCR de la taille attendue, obtenus avec les jeux de sondes Pl/p2 ou Pl/P3 et visualisés sur un gel d'électrophorèse. (3): Coupure par les endonucléases de restriction AvalI, PvuII et BglII et tailles des fragments obtenus. (4): Valeur de l'indice d'hybridation, calculé de la manière suivante: D.O. de l'échantillon/D.O. seuil (D.O. seuil = Valeur de D.O. du contrôle négatif + 0,15 D.O.. L'indice d'hybridation est considéré comme positif si sa valeur est supérieure à 1. (5) Type de séquence (6) Séquençage non effectué. Exemple 6: Détection des virus dans des échantillons cliniques par RT- PCT et par EIA. Des aspirats nasals recueillis chez 261 enfants hospitailés atteints de bronchiolite ont été testés simultanément par les techniques classiques (IFA, VIT) et par la technique RT-PCR en utilisant simultanément les amorces P l, P2, P; la technique de révélation EIA par hybridation a été réalisée en utilisant simultanément les trois sondes spécifiques respectivement de RSVA, RSVB et PIV3 (technique RT-PCR-EIA). Les résultats comparatifs des tests PCR avec les techniques de IFA et VIT sont résumés dans le Tableau 2. La technique RT-PCR-EIA a permis de détecter des séquences virales de type RSV dans 103 échantillons (39,4 %); la technique IFA-VIT a permis de détecter des virus de type RSV dans 109 échantillons (41,7 %). Sept 54 2764903 échantillons (2,6 %) sont sélectionnes positivement après IFA-VIT mais ne sont pas sélectionnés par PCR. Un seul échantillon (0,4 %) est positif pour la technique RT-PCR-EIA et non visualisé par la technique IFA-VIT. La totalité des 63 échantillons typés RSVA, mais seulement 17 échantillons sur les 21 écantillons typés RSVB sont identifiés à la fois par la technique IFA-VIT et par la technique RT-PCR-EIA. Parmi ceux-ci, 4 échantillons ont généré un signal positif avec la sonde RSVA. Pour 25 infections par RSV (9,5%), il n'a pas été possible de définir l'appartenance au type A ou au type B en utilisant les anticorps monoclonaux (IFA-VIT), et la moitié d'entre eux ont été identifié comme appartenant au type RSVA par la technique RT-PCR-EIA. Quinze échantillons positifs pour PIV3 sont détectés par la technique IFA-VIT, la technique RT-PCR- EIA détectant des séquences PIV3 pour 14 d'entre eux. Tableau 2: Comparaison des techniques [FA-VIT et RT-PCR-EIA pour la détection de RSV (RSVA ou RSVB) dans 261 aspirats nasals d'enfants hospitalisés. Positif en RT-PCR-EIA Négatif en RT- PCR Hvbridation positive avec: Pas SEQID N 10 SEQID N 14 d'hybridation avcc les sondes Positif en IFA-VIT RSVA 63 O O O RSVB 4 17 O O RSV non typable 12 O 6 7 Négatif en IFA-VIT 1 0 0 151 Les résultats obtenus par les inventeurs dans les différents Exemples ci-dessus démontrent clairement la sensibilité, la sélectivité et la reproductibilité du test de diagnostic différentiel mis au point, en particulier lorsque des sondes spécifiques sont mises en oeuvre à la suitede l'étape d'amplification à l'aide des amorces génériques, ainsi que l'excellente corrélation entre les résultats issus du diagnostic par RFLP, du diagnostic avec les sondes 2764903 spécifiques et les données du séquençage des amplicons.. L'isolat RSVB n 94001891 identifié par immunofluorescence (IFA) présente une hybridation croisée avec deux sondes respectivement spécifiques de RSVA et RSVB, alors que les données de séquençage indiquent clairement que cet isolat appartient au type RSVA. Le résultat de typage par les sondes spécifiques (EIA) pourrait être expliqué par la présence simultanée de virus de type A et de virus de type B dans le même échantillon biologique. Sur l'analyse de l'alignement de séquences de la Figure 2, une région très conservée (aux environs des positions 240-280) dans le motif fonctionnel B au sein de la région catalytique III de la protéine L, dans laquelle il a été possible de définir une sonde générique adaptée à la détection simultanée des trois types de virus RSVA, RSVB et PIV3. Sur les 261 échantillons cliniques issus du prélèvement des aspirats nasals, les observations effectuées sur les isolats cliniques isolés par VIT ont été confirmés et généralisés. Les tests IFA-VIT et RT-PCR-EIA ont permis d'obtenir des résultats concordants pour les échantillons infectés par RSV (96,9%) et pour les échantillons infectés par PIV3 (93,3%). Ces observations indiquent que la méthode RT-PCR-EIA selon l'invention est une alternative avantageuse, extrêmement fiable et beaucoup plus rapide que les techniques de l'art antérieur. Cependant, 1 échantillon, parmi les 14 échantillons positifs pour PIV3 par la technique IFA-VIT a été visualisé comme négatif par la technique RT-PCR-EIA. Par ailleurs, 7 échantillons parmi les 109 échantillons positifs pour RSV par la technique IFA-VIT sont négatifs par la technique RT-PCR-EIA, et dans 6 cas supplémentaires, le produit amplifié n'a pas pu être amplifié par RT-PCR-EIA. L'ensemble de ces résultats suggèrent que la technique de RT-PCR-EIA est beaucoup plus efficace que la technique IFA-VIT pour différencier les échantillons contenant RSVB des échantillons contenant RSVA. En effet, la technique RT-PCR-EIA n'a pas permis de détecter RSV dans des isolats cliniques ou aspirats nasals que dans 3,7 à 5,8 % des cas, alors que la technique IFA-VIT n'a pas permis de détecter RSV dans les mêmes échantillons pour plus de 23 % des cas. On peut aussi noter que les deux méthodes donnent des résultats en total désaccord (RSVA/RSVB) dans 3,7 à 4,7 % des cas. En dépit des différences d'efficacité évoquées ci-dessus, les techniques RT-PCR-EIA et IFA-VIT ont un niveau de sensibilité comparable. Cependant, l'utilisation de la détection des produits amplifiés par hybridation d'une sonde oligonucléotidique interne permet d'obtenir une sensibilité 10 fois plus grande que lors d'une visualisation des produits amplifiés sur gel d'agarose. Freymuth et al. (1995) avaient observé que l'application de la technique RT-PCR-EIA à l'amplification du gène N donnait des résultats meilleurs que la mise en oeuvre de la 56 2764903 technique IFA-VIT sur les mêmes échantillons. La technique RT-PCR-EIA appliquée à l'amplification du gène N a été réalisée sur les 261 échantillons cliniques (résultats non représentés). Dans cette expérience, 56 % des échantillons testés ont été visualisés comme étant positifs pour RSV, contre 39,4 % des mêmes échantillons lorsque la technique RT-PCR- EIA appliquée au gène L selon l'invention est mise en oeuvre. Les raisons d'une telle différence dans les résultats obtenus selon les deux techniques pourraient être dues à la meilleure conservation des amorces utilisées selon l'invention, qui ne contiennent que deux mésappariements de bases, favorisant ainsi la reconnaissance des brins matrices. Cette différence pourrait également être expliquée par la taille plus faible du fragment amplifié (278 pb contre 355 pb selon la technique de l'invention), résultant en un nombre plus grand de copies de l'amplicon. Au vu de ces dernières observations expérimentales, il apparaît clairement que la mise en oeuvre de la technique RT-PCR au niveau du gène L est beaucoup plus fiable que lorsque cette technique est mise en oeuvre au niveau du gène N. En conclusion, les inventeurs ont développé une technique moléculaire permettant la détection en une étape puis le typage des principaux paramyxovirus responsables des infections des voies respiratoires inférieures: RSVA, RSVB et PIV3. Seule la détection des virus de type PIVI et PIV2 nécessiterait la construction de jeux d'amorces adaptées, mais ces deux types de virus sont fréquemment associés dans les infections des voies respiratoires supérieures et sont en conséquence plus rarement isolés chez les patients hospitalisés. Les techniques moléculaires objet de la présente invention constituent une alternative efficace et très compétitive aux techniques de détection d'un antigène viral, en particulier en ce que les techniques de l'invention améliore de manière importante la sensibilité de la détection des virus dans un échantillon biologique. Il est, en effet, important de souligner que les techniques d'immunofluorescence ou de multiplication (amplification) du virus sur cultures de cellules avant isolement conduisent à l'observation d'une proportion significative de résultats faussement négatifs chez des patients ayant une infection des voies respiratoires inférieures (Wendt et al., 1992). Les techniques moléculaires selon la présente invention sont testées sur des isolats viraux multiplié sur des cultures cellulaires (cf Exemples) et sont particulièrement adaptées pour une mise en oeuvre directe sur les échantillons biologiques, plus particulièrement sur des aspirats nasals pendant le développement d'une épidémie. De plus, la rapidité du procédé de diagnostic différentiel de l'invention en fait un outil particulièrement adapté à un diagnostic précoce des infections par RSVA, PIV3 et RSVB, de nature à rendre possible l'administration aux patients d'une thérapie ciblée sur le type viral en cause et de nature à assurer en conséquence un traitement efficace, dès la déclaration de la maladie. 57 2764903 Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. 58 2764903 Annexe I Carte de restriction du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 Dde I Sau3A I Mbo I Dpn II TspR I Dpn I Sfc I BstY I Tsp509 I Pst I Bgl II Apo I Nla III Nla III II Il I ACAACAGATCTCAGCAAATTCAATCAAGCATTTAGATATGAAACATCATGTATCTGCAGTGATGTATTAGATGA ACTGC A 80 TGTTGTCTAGAGTCGTTTAAGTTAGTTCGTAAATCTATACTTTGTAGTACATAGACGTCACTACATAATCTACT TGACG T Il l 11 o I o 11 0o o 6 16 47 6 17 54 7 54 7 55 10 Rsa I Rsa I Tsp45 I Csp6 I Csp6 I Mse I Mae III BsrG I Nla III I I I Il I 3. TGGGGTACAATCTCTGTTCTCTTGGTTGCATTTAACAATACCTCTTGTCACAATAATATGTACATATAGACATG CACCT C 160 ACCCCATGTTAGAGACAAGAGAACCAACGTAAATTGTTATGGAGAACAGTGTTATTATACATGTATATCTGTAC GTGGA G i o o o o o o o o 112 127 139 151 127 140 140 Nla III Sau3A I Mbo I Nde I Dpn Il Msl I Dpn I Mse I EcoR V Il I I CTTTCATAAAGGATCATGTTGTCAATCTTAATGAAGTTGATGAACAAAGTGGATTATACAGATATCATATGGGT GGTAT T 240 GAAAGTATTTCCTAGTACAACAGTTAGAATTACTTCAACTACTTGTTTCACCTAATATGTCTATAGTATACCCA CCATA A '9 2764903 oI I o o o ol I o o 172 188 221 172 226 172 226 Sau3A I Mbo I Dpn II Dpn I Sau96 I BstY I Tsp509 I Ava II Alu I Bgl II Mse I Apo I I I I I I GAGGGCTGGTGTCAAAAACTGTGGACCATTGAAGCTATATCATTATTAGATCTAATATCTCTTAAAGGTAAATT CTCCA T 320 CTCCCGACCACAGTTTTTGACACCTGGTAACTTCGATATAGTAATAATCTAGATTATAGAGAATTTCCATTTAA GAGGT A o o I o I O 1oo I I o *263 273 288 302 310 263 288 311 289 2764903 Tsp45 I Alu I Mae III 1 1 CACAGCTCTGATAAATGGTGACAATCAAGCAATAG 355 GTGTCGAGACTATTTACCACTGTTAGTTCGTTATC [ o I o o 324 338 SITES DE RESTRICTION Ava II g/gwcc 1 1(262) 1 263( 93) 2 BsrG I t/gtaca 1 1(138) 2 139(217) 1 Dde I c/tnag 1 1( 9) 2 10(346) 1 EcoR V gat/atc 1 1(220) 1 221(135) 2 Msl I caynn/nnrtg 1 1(225) 1 226(130) 2 Nde I ca/tatg 1 1(225) 1 226(130) 2 Pst I ctgca/g 1 1( 53) 2 54(302) 1 Sau96 I g/gncc 1 1(262) 1 263( 93) 2 Sfc I c/tryag 1 1( 53) 2 54(302) 1 TspR I nncagtgnn/ 1 1( 54) 2 55(301) 1 Alu I ag/ct 2 1(272) 1 273( 51) 2 324( 32) 3 Apo I r/aatty 2 1( 15) 3 16(294) 1 310( 46) 2 Bgl II a/gatct 2 1( 5) 3 6(282) 1 288( 68) 2 BstY I r/gatcy 2 1( 5) 3 6(282) 1 288( 68) 2 Csp6 I g/tac 2 1( 84) 2 85( 55) 3 140(216) 1 Mae III /gtnac 2 1(126) 2 127(211) 1 338( 18) 3 Rsa I gt/ac 2 1( 84) 2 85 175(181) 1 47 sites retrouvÈs 61 2764903 Annexe I. Correspondance entre bases nucléiques de la SEQ lD N 1 et acides aminés de la SEQ ID NI 6. 1/1 31/11 ACA ACA GAT CTC AGC AAA TTC AAT CAA GCA TTT AGA TAT GAA ACA TCA TGT ATC TGC AGT T T D L S K F N Q A F R Y E T S C I C S 61/21 91/31 GAT GTA TTA GAT GAA CTG CAT GGG GTA CAA TCT CTG TTC TCT TGG TTG CAT TTA ACA ATA D V L D E L H G V Q S L F S W L H L T I 121/41 151/51 CCT CTT GTC ACA ATA ATA TGT ACA TAT AGA CAT GCA CCT CCT TTC ATA AAG GAT CAT GTT P L V T I I C T Y R H A P P F I K D H V 181/61 211/71 GTC AAT CTT AAT GAA GTT GAT GAA CAA AGT GGA TTA TAC AGA TAT CAT ATG GGT GGT ATT V N L N E V D E Q S G L Y R Y H M G G I 241/81 271/91 GAG GGC TGG TGT CAA AAA CTG TGG ACC ATT GAA GCT ATA TCA TTA TTA GAT CTA ATA TCT E G W C Q K L W T I E A I S L L D L I S 301/101 331/111 CTT AAA GGT AAA TTC TCC ATC ACA GCT CTG ATA AAT GGT GAC AAT CAA GCA ATA G L K G K F S I T A L I N G D N Q A I 62 2764903 Bibliographie Banerjee A.K., 1987, Microbiological Reviews, 51:66-87. Barany F., 1991, Proc. Natl. Acad. 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Paediatr. 101:180-187. Wendt C.H. et al., 1992, New Engl. J. Med., 326:921-926. 2764903 Revendications 1. Polynucléotide caractérisé en ce qu'il est choisi parmi a) un polynucléotide comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de l'enchaînement de nucléotides suivant (SEQ ID N l): ACAACAGATCTCAGCAAATTCAATCAAGCATTTAGATATGAAACATCATGTATCTG CAGTGATGTATTAGATGAACTGCATGGGGTACAATCTCTGTTCTCTTGGTTGCATT TAACAATACCTCTTGTCACAATAATATGTACATATAGACATGCACCTCCTTTCATA AAGGATCATGTTGTCAATCTTAATGAAGTTGATGAACAAAGTGGATTATACAGAT ATCATATGGGTGGTATTGAGGGCTGGTGTCAAAAACTGTGGACCATTGAAGCTAT ATCATTATTAGATCTAATATCTCTTAAAGGTAAATTCTCCATCACAGCTCTGATAA ATGGTGACAATCAAGCAATAG; b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini en a); c) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec le polynucléotide défini en a) ou avec le polynucléotide défini en b). 2. Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour la région III de la grande sous-unité (L) de la polymérase des paramyxovirus de type RSVB. 3. Sonde oligonucléotidique pour la détection spécifique d'un paramyxovirus de type RSVB, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement d'au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 et 2. 4. Sonde oligonucléotidique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée parmi les oligonucléotides suivants: SEQ ID N 14: 5'-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA-3'; SEQ ID N 2: 5'-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA-3'; SEQ ID N 15: 5'-AGAGGTATTGTTAAATGCAACCAAGAGAAC-3'; SEQ ID N 16: 5'-TATCAGAGCTGTGATG-3'. 5. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est marqué. 66 2764903 6. Polynucléotide selon l'une des revandications 1 à 4, caractérisé en ce que celui-ci est immobilisé sur un support, de manière covalente ou non-covalente. 7. Amorce nucléotidique pour l'amplification spécifique d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 ou 2. 8. Amorce nucléotidique pour l'amplification spécifique d'un polynucléotide du génome et/ou d'un ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager d'un paramyxovirus de type RSVB, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement d'au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 ou 2. 9. Amorce nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 7 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléique répondant à l'un des enchaînements de nucléotides suivants: SEQ ID N 3 (amorce aller): 5'CTCTTGGTTGCATTTAACAATA-3', SEQ ID N 4 (amorce aller): 5'GTTGTCAATCTTAATGAA-3'; SEQ ID N 5 (amorce retour): 5'-TATCAGAGCTGTGATG-3'. 10. Couple d'amorces nucléotidiques, caractérisé en ce qu'il est constituté de deux amorces selon l'une des revendications 7 à 9. 11. Couple d'amorces selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les couples d'amorces suivants: Couple a): SEQ ID N 3 et SEQ ID N 5; Couple b); SEQ ID N 4 et SEQ ID N 05. 12, Polypeptide correspondant à la région III de la grande sous-unité (L) de la polymérase d'un virus de type RSVB, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi: a) un polypeptide dont la séquence comprend l'enchaînement d'acides aminés SEQ ID N 6 suivant NH2-TTDLSKFNQAFRYETSCICSDVLDELHGVQSLFSWLHLTIPLVTIICTYRHAPPFIK DHVVNLNEVDEQ S GLYRYUMGGIEGWCQKLWTIEAISLLDLI S LKGKFSITALINGDN QAI-COOH; 67 2764903 b) un fragment d'au moins 10 acides aminés du polypeptide défini en a), ledit fragment étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre la région 111 de la grande sous-unité (L) de la polymérase des virus de type RSVB; c) un polypeptide comportant, par rapport au polypeptide défini en a) ou b), au moins une modification par délétion, addition ou substitution d'un acide aminé, ledit polypeptide modifié étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide correspondant à la région III de la grande sous-unité (L) de la polymérase des virus de type RSVB. 13. Polynucléotide caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide selon la revendication 12. 14. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression et/ou d'insertion caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide selon l'une des revendications 1, 2 et 13. 15. Vecteur recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide contenu dans le clone de E. coli ASC.3, déposé à la CNCM le 20 juin 1997 sou le numéro d'accès 1-1880. 16. Hôte cellulaire recombinant caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide selon l'une des revendications 1, 2 et 13 ou un vecteur recombinant selon la revendication 14. 17. Hôte cellulaire recombinant selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il s'agit du clone de E. coli ASC.3 déposé à la CNCM le 20juin 1997 sous le numéro 11880. 18. Polypeptide recombinant caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'un hôte cellulaire recombinant selon l'une des revendications 16 et 17. 19. Anticorps polyclonal ou monoclonal caractérisé en ce qu'il reconnaît spécifiquement un polypeptide selon l'une des revendications 12 et 18. 20. Anticorps selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps marqué. 21. Composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des revendications 12 et 18. 68 2764903 22. Polynucléotide ayant une longueur d'au moins 12 nucléotides, caractérisé en ce qu'il est capable de s'hybrider spécifiquement, dans des conditions de forte stringence, à un premier acide nucléique codant pour la grande sous-unité (L) de la polymérase d'un virus de la famille des Paramyxoviridae d'un type donné ou à un second acide nucléique dont la séquence est complémentaire du premier acide nucléique. 23. Polynucléotide selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il s'hybride spécifiquement avec l'acide nucléique codant pour la région III de la grande sous-unité (L) de la polymérase d'un virus de la famille des Paramyxoviridae d'un type donné ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire. 24. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 22 et 23, caractérisé en ce que le virus de la famille des Paramyxoviridae est choisi parmi les virus parainfluenza (PIV) et les virus respiratoires syncitiaux (RSV). 25. Polynucléotide selon la revendication 24, caractérisé en ce que les virus parainfluenza sont sélectionnés parmi les virus PIV1, PIV2 et PIV3. 26. Polynucléotide selon la revendication 24, caractérisé en ce que les virus respiratoires syncitiaux sont sélectionnés parmi les virus RSVA ou RSVB. 27. Polynucléotide selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il s'hybride spécifiquement à un acide nucléique codant pour le gène L du virus de type PIV3 et en ce qu'il comprend l'enchaînement de nucléotides suivant: SEQ ID N 17: 5'-GAGGGTGTAACCAATTAAACAATTTATTTAATCCAAATA-3'; SEQ ID N 18: 5'-2095-GAGGGTGTAACCAATTAAACAATTTATTTAATCCAAATAT- 2056-3'. 28. Polynucléotide selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il s'hybride spécifiquement à un acide nucléique codant pour le gène L du virus de type RSVA et en ce qu'il est choisi parmi les enchaînements de nucléotides suivants: SEQ ID N 10: 5'-TACATTGTTAGGATCTACAGTATGATCTCCTATATAGGGG-3'; SEQIDN 11: '-2289-TACATTGTTAGGATCTACAGTATGATCTCCTATATAGGGG-2250-3', SEQ ID N 12: 5'-2216-TGAGGAATAGTTAAATGTAACCAGGAAAAT-2187- 3'; 69 2764903 SEQ ID N 13: 5'-2424-AATTAAAGCAGTAATT-2409-3'. 29. Polynucléotide selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il s'hybride spécifiquement à un acide nucléique codant pour le gène L du virus de type RSVB et en ce qu'il est choisi parmi les enchaînements de nucléotides suivants: SEQ ID N 14: 5'-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA-3'; SEQ ID N 2: 5'-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA-3'; SEQ D N 15: 5'-AGAGGTATTGTTAAATGCAACCAAGAGAAC-3'; SEQ ID N 16: 5'-TATCAGAGCTGTGATG-3'. 30. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 22 à 29, caractérisé en ce qu'il est marque. 31. Polynucléotide selon l'une des revandications 22 à 29, caractérisé en ce que celui-ci est immobilisé sur un support, de manière covalente ou non-covalente. 32. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple d'amorces selon l'une des revendications 7 à 11, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'acide nucléique du virus de type RSVB; b) amplification de l'acide nucléique du virus de type RSVB; c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'acide nucléique correspondant au fragment encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une sonde oligonucléotidique marquée selon l'une quelconque des revendications 3 et 4. 33. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact d'un polynucléotide ou d'un mélange de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 22 à 30 avec un échantillon biologique, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été 2764903 rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation du polynucléotide ou du mélange de polynucléotides à l'acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3; b) Détection de l'hybride formé entre le polynucléotide ou le mélange de polynucléotides et l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique. 34. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact d'un polynucléotide ou d'un mélange de polynucléotides immobilisé sur un support selon la revendication 31 avec un échantillon biologique, l'acide nucléique de l'échantillon ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation du polynucléotide ou du mélanges du polynucléotides à l'acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3; b) Mise en contact de l'hybride formé entre le polynucléotide ou le mélange de polynucléotides immobilisé sur un support et l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'acide nucléique de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec le polynucléotide, avec un polynucléotide ou un mélange de polynucléotide marqué selon la revendication 30, étant entendu que ledit polynucléotide marqué possède une séquence ne recouvrant pas la séquence du polynucléotide de l'étape a). 35. Procédé selon l'une quelconque des revendications 33 et 34, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape a), I'ADN de l'échantillon biologique, ou l'ADNc obtenu par transcription inverse de I'ARN de l'échantillon biologique, est amplifié à l'aide d'un couple d'amorces. 36. Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que le couple d'amorces n'est pas spécifique d'un paramyxovirus d'un type donné. 37. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que le couple d'amorces permet l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA, RSVB et PIV3. 38. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que le couple d'amorces permet l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et RSVB. 71 2764903 39. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que le couple d'amorces permet l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et PIV3. 40. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que le couple d'amorces est le suivant: - PI (SEQ D N 7):5'-ACAACAGATCTCAGCAAAT-3'; - P2 (SEQ ID N 8): 5'-CTATTGCTTGATTGTCACC-3'. 41. Procédé selon la revendication 39, caractérisé en ce que le couple d'amorces est le suivant: - PlI (SEQ ID N7): 5'-ACAACAGATCTCAGCAAAT-3'; - P3 (SEQ ID N 9): 5'-CTATTGCTTGATTGTCTC-3'. 42. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un antigène d'un paramyxovirus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon l'une des revendications 19 et 20; b) Mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé. 43. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un anticorps d'un paramyxovirus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec un polypeptide selon l'une des revendications 12 et 18, b) Mise en évidence du complexe antigène-anticorps éventuellement formé. 44. Procédé de préparation d'un polypeptide selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Insertion d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1, 2 et 13 dans un vecteur d'expression, ledit polynucléotide étant placé sous le contrôle de signaux de régulation et/ou d'expression reconnus par un hôte cellulaire eucaryote ou procaryote; b) transformation de l'hôte cellulaire par le vecteur d'expression obtenu à l'étape a); 72 2764903 c) mise en culture, dans un milieu de culture approprié, de l'hôte cellulaire transformé à l'étape b); d) séparation, à partir du milieu de culture, du polypeptide produit par l'hôte cellulaire transformé qui constitue le produit d'expression dudit polynucléotide porté par le vecteur recombinant. 45. Trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) Un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 22 à 30; b) Les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation; c) Le cas échéant, un couple d'amorces non spécifique d'un type de paramyxovirus donné, choisi parmi: - un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA, RSVB et PIV3; - un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et RSVB; - un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et PIV3; ou un mélange d'un ou plusieurs de ces trois couples d'amorces, ainsi que les réactifs nécessaires à l'amplification d'un acide nucléique. 46. Trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) Un polynucléotide, dit polynucléotide de capture, selon la revendication 31; b) Un polynucléotide, dit polynucléotide de révélation, selon l'une des revendications I à 4 et 22 à 30; c) Le cas échéant, un couple d'amorces non spécifique d'un type de paramyxovirus donné, choisi parmi - un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA, RSVB et PIV3; - un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et RSVB; 73 2764903 - un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et PIV3; ou un mélange d'un ou plusieurs de ces trois couples d'amorces, ainsi que les réactifs nécessaires à l'amplification d'un acide nucléique. 47. Trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) Un couple d'amorces nucléotidiques selon l'une des revendications 7 à 11; b) Les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'un acide nucléique; c) Le cas échéant, un composant permettant de détecter le fragment d'acide nucléique amplifié, de préférence une sonde oligonucléotidique spécifique de RSVB selon l'une des revendications 3 et 4, ou encore une sonde consensus hybridant avec différents paramyxovirus, lesdites sondes consensus étant choisie parmi la SEQ ID N 19, la SEQ ID N 20, la SEQ ID N 21 ou la SEQ ID N 22, le cas échéant marquées. 48. Trousse ou nécessaire pour la détection de la présence d'un paramyxovirus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) Un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'une des revendications 19 et 20; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection du complexe antigène-anticorps formé. 49. Trousse ou nécessaire pour la détection de la présence d'un paramyxovirus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants a) Un polypeptide selon l'une des revendications 11 et 18; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection du complexe antigène-anticorps forme. 50. Amorce nucléotidique pour l'amplification d'un polynucléotide du génome et/ou d'un ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager d'un paramyxovirus de type RSV et PIV, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement nucléotidique inclus dans les régions nucléotidiques du gène L de RSV ou PIV correspondant aux positions suivantes sur le gène L du virus RSVA: - La région allant du nucléotide en position nt1261 au nucléotide en position nt 1295 (Numérotation RSVA de la Figure 7). 74 2764903 - La région allant du nucléotide en position nt1402 au nucléotide en position nt1443 de la Figure 7; - la région allant du nucléotide en position ntl603 au nucléotide en position nt 1631 de la Figure 7. - La région alant du nucléotide en position nt1733 au nucléotide en position nt1775 de la Figure 7; - La région allant du nucléotide en position nt1855 au nucléotide en position ntl891 de la Figure 7. - la région allant du nucléotide en position nt2323 au nucléotide en position nt2357 de la Figure 7; - la région allant du nucléotide en position nt2552 au nucléotide en position nt2579 de la Figure 7. 51. Amorce nucléotidique selon la revendication 50, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement nucléotidique choisi parmi les enchaînement de nucléotides suivants: SEQ ID N 23: 5'- 1875 -AGGTAGATGTTTGCAA- 189 1 -3'; SEQ ID N 24: 5'- 1891 -TTGCAAACAGTCTACCT- 1875-3'; SEQ ID N 25: 5'-2341-TGTCAAAAACTATGGAC-2357-3'; SEQ ID N 26: 5'-2357-GTCCATAGTTTTTGACA-2341-3'; SEQ ID N 27: 5'-1279-AGAATATTTGGACATCC-1295-3'. 52. Couple d'amorces nucléotidiques pour l'amplification d'un polynucléotide du génome et/ou d'un ADN complémentaire correspondant à I'ARN messager d'un paramyxovirus de type RSV et PIV, caractérisée en ce qu'elle comprend une combinaison d'enchaînements nucléotidiques inclus dans les régions nucléotidiques du gène L de RSV ou PIV correspondant aux positions suivantes sur le gène L du virus RSVA, étant entendu qu'une combinaison particulière d'enchaînement nucléotidique comprend une amorce aller et une amorce retour.: - La région allant du nucléotide en position nt1402 au nucléotide en position nt1443 de la Figure 7; - la région allant du nucléotide en position nt 1603 au nucléotide en position nt 1631 de la Figure 7. - La région alant du nucléotide en position nt1733 au nucléotide en position nt1775 de la Figure 7; - La région allant du nucléotide en position nt1855 au nucléotide en position ntl891 de la Figure 7. 2764903 - la région allant du nucléotide en position nt2323 au nucléotide en position nt2357 de la Figure 7; - la région allant du nucléotide en position nt2552 au nucléotide en position nt2579 de la Figure 7. 53. Couple d'amorces nucléotidiques selon la revendication 52, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'un des couples d'amorces suivants - SEQ ID N 27 et SEQ ID N 24; -SEQ ID N 27 et SEQ ID N 26; -SEQ ID N 27 et SEQ ID N 8; -SEQ ID N 27 et SEQ ID N 9; -SEQ ID N 23 et SEQ ID N 26; - SEQ ID N 23 et SEQ ID N 8; -SEQ ID N 23 et SEQ ID N 9; -SEQ ID N 7 et SEQ ID N 26; -SEQ ID N 7 et SEQ ID N 8; -SEQ ID N 7 et SEQ ID N 9. 54. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) I'ADN de l'échantillon biologique, ou l'ADNc obtenu par transcription inverse de l'ARN de l'échantillon biologique, est amplifié à l'aide d'un couple d'amorces selon l'une des revendications 52 et 53, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation des amorces nucléotidiques à l'acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3; b) Mise en contact d'un polynucléotide ou d'un mélange de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 22 à 30 avec l'acide nucléique résultant de l'amplification de l'étape a); c) Détection de l'hybride formé entre le polynucléotide ou le mélange de polynucléotides et l'acide nucléique amplifié. 76 2764903 55. Trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSV ou PIV dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend: a) Au moins un couple d'amorces nucléotidiques selon l'une des revendications 52 et 53; b) Les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification d'un acide nucléique cible; 56. Trousse ou nécessaire de détection selon la revendication 55, caractérisé en ce qu'il comprend d'au moins deux couple d'amorces selon l'une des revendications 52 et 53. 57. Trousse ou nécessaire de détection selon l'une des revendications 55 et 56, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications I à 4 et 22 à 30. 58. Polynucléotide capable d'hybrider, dans des conditions stringentes d'hybridation, à un acide nucléique codant pour la grande sous-unité (L) de la polymérase d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB et PIV3, caractérisée en ce qu'il a une longueur d'au moins 12 nucléotides, en ce qu'il est sélectionné de telle manière que la région du gène L avec laquelle il s' hybride présente au sein des différents paramyxovirus respiratoires, et tout particulièrement RSVA, RSVB et PIV3, une séquence nucléotidique présentant un degré d'identité d'au moins 80 % entre les différents types de virus et en ce qu'il est sélectionné de telle manière que sa séquence présente un degré d'identité avec les séquences cibles des différents paramyxovirus respiratoires d'au moins 85%, et avantageusement d'au moins 88%. 59. Polynucléotide selon la revendication 58 caractérisée en ce qu'elle a une longueur d'au moins 12 nucléotides consécutifs de l'un des enchaînements nucléotidiques suivants SEQ D N 19: 5'-GGTGGTATAGAAGGCTGGTGTCAAAAATTATGGAC-3'; SEQ ID N 20: 5'-GGGGGTATAGAAGGCTGGTGTCAAAAACTATGGAC-3'; SEQ D N 21: 5'-GTCCATAATTTTTGACACCAGCCTTCTATACCACC-3'; SEQ ID N 22: 5'-GTCCATAGTTTTTGACACCAGCCTTCTATACCCCC-3'; ou de la séquence complémentaire des séquences SEQ ID N 19 à SEQ ID N 22.