FR 2765341 A1 19981231 FR 9707950 A 19970625 La présente invention concerne une méthode pour l'analyse de l'activation des basophiles humains par mesure de l'expression membranaire du marqueur CD63 par cytométrie de flux et ses applications au diagnostic des allergies et d'autres maladies inflammatoires. L'inflammation en général est le résultat de l'activation par des substances exogènes ou endogènes de différents types cellulaires aboutissant à la synthèse et à la libération de nombreux agents pharmacologiques puissants appelés médiateurs. Il a été démontré que le basophile humain, cellule circulante, joue un rôle pro-inflammatoire majeur et peut même être trouvé sur le site tissulaire de la réaction inflammatoire par diapédèse et migration grâce à l'expression, sur le basophile activé, de molécules dites d'adhésion. L'allergie est un cas particulier de la réaction inflammatoire médiée par un anticorps spécifique, I'immunoglobuline E(lgE). La mesure de l'activation in vitro du basophile humain serait donc un reflet fiable du statut immun du sujet allergique. Jusqu'à présent, le diagnostic in vitro d'une allergie reposait principalement sur la recherche des IgE spécifique d'un allergène donné (pollen, animaux,...) dans le sang circulant. Or, la réaction allergique est principalement une réaction cellulaire impliquant l'allergène, I'lgE et diverses cellules dont les basophiles dans le sang et les mastocytes dans les tissus. La détection des IgE spécifiques dans le sang ne mesure alors que le trop-plein de synthèse de cet anticorps et donc est relativement éloignée de la réaction physio-pathologique. Le basophile humain possède de l'ordre de 300 000 sites de fixation pour les IgE sur sa membrane (récepteurs FcZRI) et seuls 1/100 des récepteurs occupés sont nécessaires à l'induction d'une réaction d'activation, ce qui explique la sensibilité de cette réaction cellulaire. Enfin, cette réaction est très rapide (quelques minutes) et ainsi l'activation des basophiles correspond à un mécanisme d'amplification considérable du signal. Plusieurs techniques cellulaires ont été mises au point depuis plus de trente ans. La première était basée sur la mesure d'un des principaux médiateurs du basophile humain, I'histamine, présent dans les granules du basophile au repos (médiateur préformé) et libéré dans le milieu extérieur après activation par l'allergène. Cette technique est devenue une technique de référence en pharmacologie mais reste lourde, non standardisée et chère. Etant de plus relativement peu sensible, elle n'a connu qu'une diffusion limitée. La seconde est le test de dégranulation des basophiles humains. Cette technique, abandonnée aujourd'hui, était basée sur un comptage manuel, au microscope, des basophiles colorés par des colorants spécifiques, les basophiles activés ne prenant plus le colorant. Toutefois, cette méthode présentait une difficulté de lecture au microscope certaine et un manque de fiabilité statistique relative. Plus récemment, le CAST ou " Cellular Allergen Stimulation Test " a été décrit et commercialisé. Il s'agit de la mesure d'un autre médiateur du basophile humain, le leucotriène C4 ou LTC4, libéré après la réaction d'activation cellulaire (médiateur néoformé) et donc ne préexistant pas dans les granules du basophile comme l'histamine. Les qualités intrinsèques du médiateur mesuré ainsi que l'addition d'une substance co-activatrice, I'interleukine 3 ou IL-3, ont permis la mise au point d'une méthode sensible et fiable. Toutefois, elle nécessite encore deux étapes (une étape d'activation et une étape de mesure du médiateur libéré) et est donc relativement longue et onéreuse. Enfin, a été proposée une méthode basée sur l'analyse d'une étape précoce d'activation du basophile humain aboutissant à l'expression membranaire d'un marqueur d'activation, le CD63 (Sainte Laudy et ai., Allergie et Immunologie, volume 26, n 6, 1994). Il a été démontré que cette protéine constitutive des granules intracytoplasmiques du basophile humain, est exprimée sur la membrane du basophile activé avec une haute densité. 3 2765341 Cette méthode utilisant la cytométrie de flux vise à mesurer l'activation des basophiles humains par comptage spécifique des basophiles exprimant et n'exprimant pas le marqueur CD63 sur leur membrane. i Cependant, la méthode proposée par Sainte Laudy et al. (1994) ne décrit que des résultats préliminaires de la mise en oeuvre de la méthode chez des sujets intolérants aux sulfites et présente de plus un inconvénient majeur. Elle nécessite en effet une centrifugation préalable des échantillons de sang prélevés en gradient de densité. Or, les produits de densité sont des macromolécules généralement de type dextran susceptibles d'activer différents types cellulaires de façon non spécifique. La Demanderesse a à présent mis au point un perfectionnement de la méthode proposée par Sainte Laudy et al. (1994) selon une procédure précise respectant la physiologie des basophiles et l'équilibre ionique nécessaire à la réaction d'activation et permettant une présentation optimale du produit testé, nommé allergène, à la cellule. La méthode selon l'invention peut être appliquée au diagnostic des allergies et d'autres maladies inflammatoires, les corrélations biocliniques obtenues étant excellentes, tant sur le plan de la spécificité que sur celui de la sensibilité. L'invention a ainsi pour objet une méthode pour l'analyse de l'activation des basophiles humains, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à: a) enrichir un échantillon de sang total en leucocytes dans un milieu d'incubation physiologique; b) mettre en contact l'échantillon enrichi obtenu à l'étape a) avec au moins un anticorps dirigé contre le marqueur de surface membranaire des basophiles humains CD63, ledit anticorps comportant un groupe fluorochrome; c) analyser l'échantillon obtenu à l'étape b) par cytométrie de flux, pour déterminer le pourcentage des cellules portant le marqueur CD63 par rapport aux cellules ne l'exprimant pas. La technique en sang total permet de conserver lI'environnement humoral et cellulaire des cellules testées, le milieu d'incubation étant un milieu physiologique. Pour enrichir un échantillon de sang total en leucocytes, on peut notamment procéder à une simple centrifugation. L'analyse par cytométrie de flux permet de mesurer le io pourcentage des cellules portant le marqueur CD63 par rapport aux cellules ne l'exprimant pas. La cytométrie en flux est une méthode basée sur le passage un à une des cellules à analyser dans un fin capillaire illuminé par un faisceau laser à 488 nm et dont la diffraction permet la mesure de la taille et de la granulométrie des cellules. La lumière du faisceau laser est également susceptible d'exciter des fluorochromes émettant à leur tour de la lumière de fluorescence à 90 , cette lumière étant mesurée par des photo-multiplicateurs. Un jeu de filtres permet de sélectionner jusqu'à 3 ou 4 longueurs d'ondes différentes. Les fluorochromes portés par les anticorps selon l'invention peuvent être notamment FITC (fluorescéine isothiocyanate), PE (phycoérythrine) et TC (Tricolor). L'analyse de l'échantillon obtenu à l'étape b) par cytométrie en flux selon l'invention implique une sélection de la population cellulaire. Le cytomètre effectue pour cela un tri électronique permettant de différencier les basophiles des autres leucocytes sanguins, ce tri étant basé sur la spécificité de taille et de structure des cellules et/ou sur la fluorescence élevée par marquage avec un anticorps anti-lgE portant un groupement fluorescent. De manière avantageuse, on peut donc mettre en contact l'échantillon obtenu à l'étape a) avec en outre un anticorps anti-lgE comportant un groupe fluorochrome Dans ce dernier cas, le rapport des cellules anti-lgE+, CD63+/anti-lgE+, CD63- est fourni directement par le cytomètre. Ce rapport peut être affiné en tenant également compte du nombre absolu de cellules anti-lgE+, I'activation des basophiles induisant également une diminution du nombre de ces cellules. Par ailleurs, on peut aussi éliminer les cellules éventuellement contaminantes par un marquage spécifique des cellules à éliminer et ne reconnaissant pas le basophile humain. Ainsi, I'utilisation d'anticorps anti-CD14 et anti-CD19 permet o10 une élimination positive des cellules susceptibles de porter des IgE et donc de contaminer la population cellulaire testée, à savoir en particulier les monocytes (portant le marqueur CD14) et les lymphocytes B (portant le marqueur CD19). De manière avantageuse, on peut donc mettre en contact l'échantillon obtenu à l'étape a) avec en outre des anticorps respectivement dirigés contre CD14 et CD19 et comportant un groupe fluorescent. Les anticorps anti-CD63, anti-lgE, anti-CD14 et anti-CD19 conformément à l'invention sont de préférence des anticorps monoclonaux. Avant d'analyser les suspensions cellulaires au cytomètre, on peut en outre effectuer une lyse des globules rouges éventuellement restants, notamment en incubant l'échantillon obtenu selon l'étape a) ou b) avec un tampon de lyse qui par exemple ne contient pas de formaldéhyde. De manière avantageuse, on peut incuber l'échantillon obtenu à l'étape a) avec de l'interleukine 3 (IL-3) et/ou le fragment du complément C5a, préalablement à l'étape b). Ces deux effecteurs agissent en augmentant sensiblement la réponse cellulaire, la stimulation spontanée n'étant que faiblement augmentée. IL-3 est utilisée de préférence à une concentration de 2 ng/ml et C5a à une concentration de 0,5 x 10' M. 6 2765341 En particulier, I'addition de C5a permet la détection de pathologies telle que l'intolérance à l'aspirine, largement répandue et pouvant être à l'origine de réactions très graves. Selon un mode de réalisation de l'invention, I'échantillon obtenu à l'étape a) peut être mis en contact avec une substance sensibilisant à tester préalablement à l'étape b). Cette substance sensibilisante peut être un allergène, tel que des pneumoallergènes, (acariens, dactyle, chat, chien, alternaria, arbres, armoise, ambroise, pariétaire), des trophallergènes (composants alimentaires notamment, comprenant en particulier les protéines du lait, des ceufs, du poisson, de l'arachide et du blé), des substances médicamenteuses, des venins d'hyménoptères. Les petites molécules comme les médicaments sont couplées à une macromolécule porteuse telle que par exemple la sérumalbumine humaine purifiée et cristallisée, une micromolécule libre, en l'absence d'une macromolécule porteuse ayant, au contraire, une activité inhibitrice. De manière préférée, les concentrations allergéniques en médicament sont supérieures à 2 ng/ml, de préférence entre 2 ng/ml et 10 pg/ml. De manière avantageuse, les allergènes peuvent être présentés sur un support solide dans des conditions optimales d'activation pour le test, selon le protocole décrit dans l'exemple 1, de façon à être utilisés simplement. La méthode selon l'invention est utile dans le domaine du diagnostic allergologique à de nombreux égards. Elle est particulièrement adaptée au diagnostic des allergies aux pneumoallergènes tels que les graminées, les squames de chien et les poussières de maison riches en acariens, pour lesquels on a montré une corrélation clinique totale et une sensibilité et une spécificité de %. 7 2765341 Des résultats identiques ont été trouvés dans le cas des allergies aux venins d'hyménoptères. La méthode selon l'invention ouvre de plus de larges perspectives pour le diagnostic des allergies à des haptènes tels que notamment médicaments et conservateurs. Du fait de son extrême sensibilité et de sa spécificité, la méthode selon l'invention peut être utilisée en criblage multiallergénique. Une application pour le diagnostic d'une allergie chez l'enfant est également envisageable, ainsi qu'une utilisation néo-natale de la méthode selon l'invention, en prélevant du sang du cordon ombilical par exemple. Il s'agit de prédire chez le nouveau-né une allergie ultérieure chez l'enfant, un dépistage précoce permettant une meilleure surveillance des enfants potentiellement allergiques. Cette dernière utilisation est particulièrement intéressante, dans la mesure o la plupart des méthodes existantes ont échoué dans ce domaine. Le mélange d'allergènes à tester pourrait être notamment acariens, dactyle, chat, chien, alternaria, bouleau, frêne, ovalbumine, protéines du lait, arachide et latex. Pour des allergènes classiques mais également pour des allergènes sensibles tels que les aliments et les venins d'hyménoptères, la sensibilité et la spécificité de la méthode selon l'invention sont voisines de 100 %. Pour les allergènes classiques, sachant que l'heure est à l'optimisation des diagnostics et globalement aux économies de santé, ce test pourrait devenir un test de criblage en remplacement de ceux utilisés à l'heure actuelle dont la sensibilité varie, en fonction des allergènes, de à 85 % et dont la spécificité est très variable. La méthode selon l'invention peut par ailleurs être utilisée pour l'évaluation de l'atopie, I'atopie étant l'aptitude à présenter, isolées ou associées, un certain nombre de manifestations cliniques (rhinite allergique, asthme bronchique, urticaire, eczéma constitutionnel, allergies alimentaires, etc.) au contact d'allergènes banals, inoffensifs pour des 8 2765341 sujets normaux (poussières de maison, pollen, poils d'animaux domestiques par exemple). La définition biologique de l'atopie est actuellement basée sur le dosage des anticorps circulants et sur les tests cutanés. Cette définition est prise en défaut chez les sujets mauvais répondeurs en IgE et n'est donc qu'un pis aller. Une autre définition de l'atopie pourrait être fournie par la technique cytométrique, cette fois basée sur la densité moyenne de fluorescence des cellules très fluorescentes après marquage par un anti-lgE. Cette densité de fluorescence est directement proportionnelle au nombre de molécules d'lgE fixées sur la membrane des basophiles et est ainsi directement liée à un des paramètres fondamentaux de la réactivité du basophile. La méthode selon l'invention pourrait être appliquée également à d'autres pathologies inflammatoires débordant le cadre strict de l'anaphylaxie. Il s'agit par exemple des maladies auto-immunes (lupus, uvéites) dans lesquelles des immunoglobulines E interviennent. La durée totale de mise en oeuvre de la méthode selon l'invention est d'environ trois heures. Outre sa sensibilité, les principaux points forts de cette technique sont sa rapidité, sa relative facilité d'exécution, sa possibilité d'automatisation et sa reproductivité. L'invention sera décrite plus en détail dans les exemples ci- dessous et les figures annexées. La légende des figures est la suivante: - La figure 1 représente l'analyse taille/structure des populations cellulaires par cytométrie de flux. - La figure 2 représente l'analyse par double marquage de la population cellulaire présentant les caractéristiques des lymphocytes par des anticorps anti-CD19-TC et anti-lgE-FITC. - La figure 3 représente l'analyse par double marquage de la population cellulaire présentant les caractéristiques des lymphocytes par des anticorps anti-CD63-PE et anti-lgE-FITC. - La figure 4 représente l'analyse par double marquage de la population cellulaire présentant les caractéristiques des lymphocytes par des anticorps anti-CD63-FITC et anti-CD19-PE. a: avant activation des basophiles b: après activation des basophiles induite par l'allergène - La figure 5 représente le nombre de cellules fixant fortement l'anti-lgE en fonction de la concentration en allergène, chez les patients allergiques aux venins d'hyménoptères, en comparaison avec les sujets sains. - La figure 6 représente le pourcentage d'activation des basophiles en fonction de la concentration en allergène, le rocuronium, chez deux patients allergiques au rocuronium (anamnèse et tests cutanés positifs) et six sujets sains. - La figure 7 représente l'activation des lymphocytes et des basophiles par le Diclofénac injectable (contenant des métasulfites) chez un patient présentant cliniquement une sensibilité aux sulfites. 2765341 EXEMPLE 1: Matériels et méthodes Pour chaque sujet à tester, 10 ml de sang ont été recueillis sur héparine (5 UI/ml) et EDTA (5 mM). Les basophiles sont enrichis avec les cellules mononuclées par centrifugation simple. Le culot cellulaire à la limite de séparation plasma/hématies est lavé en tampon hepes EDTA (HEB = hepes 20 mM, NaCI 130 mM, KCI 5 mM, EDTA Na 35 mM, glucose 5 mM, BSA 1 mg/ml pH 7,4) et est mis à incuber avec un mélange d'lL-3 et C5a pendant 10 minutes à 37 C. pl de culot cellulaire sont alors distribués dans les puits d'une microplaque et mélangés à 30 pl d'une concentration cible de 1' anti-lgE (0,2 pg/ml) et 30 gl de l'allergène à tester dilués dans le tampon hepescalcium (HCB= hepes 20 mM, NaCI 130 mM, KCI 5 mM, Ca++ 10 mM, Mg"* 2 mM, glucose 5 mM, BSA 1 mg/ml, pH 7,4). Un contrôle sans allergène et un témoin anti-lgE sont prévus. Après 45 minutes d'incubation à 37 C, 100 pl de tampon d'arrêt sont ajoutés dans tous les puits et la suspension cellulaire est alors mélangée à un mélange d'anticorps monoclonaux (anti-lgE FITC et anti- CD63 biotinylé). Après une incubation de 30 minutes à 4 C les globules rouges sont lysés (rapport liquide de lyse/culot: 10/1) et les plaques sont centrifugées (500 g pendant 5 minutes). Les culots cellulaires sont alors analysés par cytométrie de flux (Cytoron absolute Ortho Diagnostics Systems). L'analyse à trois longueurs d'ondes permet, du fait de la réaction bi-modale du marqueur CD63, d'exprimer les résultats directement en pourcentages, les cellules éventuellement interférentes (monocytes et lymphocytes B) ayant été élipminées. Le temps de passage de l'échantillon est adapté afin de compter 150 à 400 basophiles. h11 2765341 Origine commerciale des réactifs: Sels et HSA: Sigma, anticorps monoclonaux: Tebu; anti- lgE froid: Bio-Rad. On peut alors définir un rapport d'activation résultat du calcul suivant: (AIT) x 100. o T =nombre de cellules anti-lgE+ et A =nombre de cellules CD63+. Conditions de présentation de l'allergène aux cellules immunocompétentes: Les allergènes tels que les micromolécules, médicaments, etc., sont préalablement dilués à la concentration de 100 pg/ml dans de l'eau distillée contenant 2,5 mg/ml de sérum albumine humaine purifiée et cristallisée. 50 pl de chacune de ces dilutions sont distribués au fond des puits à fond en U de barrettes ou de plaques de polystyrène et évaporés à la température du laboratoire. Au moins deux concentrations de l'allergène (100 et 20 pg/ml) sont testées systématiquement avec en parallèle un témoin sans allergène et un témoin de réactivité contenant 0,2 pg/ml d'un anticorps anti-lgE à la place de l'allergène. EXEMPLE 2: Analyse des populations cellulaires par cytométrie de flux. 1. Sélection des basophiles: La diffraction aux petits et aux grands angles du faisceau laser permet de cibler une première population cellulaire (zone A) dans laquelle sont situés les basophiles chez l'homme (figure 1). 2. Marquage par un anticorps anti-IE-FITC: Le marquage par un anticorps anti-lgE-FITC permet d'extraire de la zone A une zone B contenant les cellules très fluorescentes composée essentiellement de basophiles (figure 2). Les cellules fluorescentes situées dans la partie supérieure de ce schéma (zones 1 et 2) sont des lymphocytes ou des monocytes. Deux populations cellulaires peuvent être distinguées par leur intensité de fluorescence: celle non marquée par l'anticorps anti- lgE-FITC (zone 1) et celle fortement marquée (zone 2). Le double marquage fluorescent par anti-lgE-FITC/anti- CD14-PE ou anti-lgE-FITC/anti-CD19 PE de la population cellulaire présentant les caractéristiques des lymphocytes en cytométrie de flux permet de montrer que les cellules CD14+ ou CD19+ appartiennent à la population faiblement marquée par l'anti-lgE. 3. Marquage par un anticorps anti-CD63: Ces cellules très fluorescentes après marquage anti-lgE- FITC sont séparées électroniquement (figure 3), après marquage par un anticorps anti-CD63, en cellules anti-lgE+/CD63 (zone 1) et cellules anti- lgE+/CD63* (zone 2). Le pourcentage de cellules anti-lgE*/CD63+ peut ainsi être directement calculé (dans l'exemple 21,9 %) ainsi que le rapport d'activation décrit plus haut. La différence des densités moyennes de fluorescence est très marquée (7,1 pour la population CD63- et 106,1 pour la population CD63+). Un double marquage fluorescent anti-CD63-FITC/anti- CD19PE de la population cellulaire présentant les caractéristiques des lymphocytes en cytométrie de flux permet de démontrer l'absence de lymphocytes B parmi les cellules CD 63+ (figure 4). 13 2765341 EXEMPLE 3: Diagnostic des allergies aux pneumoallergènes. Le tableau I présente les pourcentages d'activation obtenus pour une population de 14 patients allergiques aux pneumoallergènes avec une histoire clinique évocatrice. Le tableau Il présente les pourcentages d'activation obtenus pour une population témoin non allergique. Les tableaux I et Il montrent une corrélation totale et une sensibilité et une spécificité de 100 % pour les allergènes suivantes: pollens de graminées, squames de chien et acariens (poussières de maison). TABLEAU I Patients allergiques PNEUMOALLERGENES POURCENTAGES TESTS IgE SPECIFIQUES D'ACTIVATION CUTANES (kU/l) Contrôle 1 2 3 Acariens il11 71 96 71 + 11.7 " 0,7 7 10 13 + " 2 83 83 75 + ND* " " 0,8 3 7 7 + 4,6 " 3 78 81 76 + > 100 " " pollens de graminees 7 18 18 16 + > 100 " 5 43 36 24 +/- " 6 77 53 16 + 76 100 squames de chiens 15 67 76 32 + 44 squames de chiens 2 96 95 93 + 2765341 Tableau II Témoins non allergiques PNEUMOALLERGENES POURCENTAGES TESTS IgE SPECIFIQUES D'ACTIVATION CUTANES (kU/1) ContrôleI 2 3 Acariens Acariens5 5 4 9 " 7 5 9 9 " 6 10 7 7 - " 1 3 4 3 - " 4 0 0 0 ND* 4 0 3 3 - ND* pollens de graminéesO O O 0 - ND* 4 1 2 1 - ND* squames de chiens 3 2 1 3 - ND* 0 I 1 0 - ND* Moyenne 3.5 3,2 2,9 3,3 Nombre de positifs 0/12 * ND: non déterminé EXEMPLE 4: Diagnostic des allergies aux venins d'hyménoptères Le tableau III présente les pourcentages d'activation obtenus pour une population de 11 sujets allergiques aux venins d'hyménoptères dont un était en cours de traitement (immunothérapie). Le tableau IV présente les pourcentages d'activation obtenus pour une population de 11 sujets non allergiques aux venins d'hyménoptères. Pour les venins d'abeille et de guêpe, la sensibilité et la spécificité sont également de 100 %, ce qui est susceptible d'induire des chocs mortels. Il faut noter que les méthodes classiques sont, dans ce cas, prises en défaut, que ce soient les tests cutanés ou la recherche des IgE spécifiques. 17 2765341 TABLEAU III Patients allergiques VENINS POURCENTAGES D'ACTIVATION TEST IgE LIBERATION CUTANES SPECIFIQUES D'HISTAMINE contrôle I 2 3 Abeille 2 15 36 23 + 29 + Abeille 0 77 87 90 + > 100 + Abeille 1 22 21 16 + 9,7 + Abeille 6 53 60 39 + 2,6 Guêpe 0 81 86 93 + 21 + Guêpe 0 74 80 81 ' 4,1 + Guêpe 0 68 57 50 Guêpe 0 66 48 25 - - Moyenne 1,7 45,4 47 40,1 Nombre 11/11 7/11 8/11 6/11 de positifs ( patient sous immunothérapie) TABLEAU IV Témoins non allergiques VENINS POURCENTAGES D'ACTIVATION TEST Ige CUTANES SPECIFIQUES _Contrôle 1 2 3 Abeille O O O O0 Abeille 7 3 4 5 Abeille 0 1 0 3 Abeille 4 1 1 1 Guêpe 0 0 0 0 Guêpe 0 1 0 I Guêpe 0 1 1 0- - Guêpe 0 2 1 0 - 0.4 Guêpe 2 0 0 I - - Guêpe 7 1 2 5 - Guêpe 4 2 1 1 Moyenne 2,1 0,97 0,85 1,4 Une analyse du nombre de cellules IgE de forte intensité par cytométrie de flux, montre une diminution du nombre de cellules fixant fortement I'anti-lgE chez les patients allergiques aux venins d'hyménoptères (figure 5). 19 2765341 EXEMPLE 5: Diagnostic des allergies alimentaires La spécificité de la méthode selon I 'invention pour des patients ayant tous les critères d'une allergie vraie aux allergènes alimentaires, est encore dans ce cas de 100 %, ainsi que la sensibilité lorsque le test est réalisé sur les propres basophiles du patient. Cette étude bio-clinique a été réalisée à l'aveugle. TABLEAU V.1 Pourcentage de sujets réactifs à l'anti-lgE SUJETS NON SUJETS REACTIFS Khi2 p REACTIFS A A L'ANTI-IgE L'ANTI-IgE Contrôles 15 16 0,18 (non significatif) Sujets allergiques 18 8 TABLEAU V. 2 Tests d'activation des basophiles (CD63) NEGATIFS POSITIFS Khi2 p Tests directs Contrôles 16 O EXEMPLE 6: Diagnostic des allergies médicamenteuses Le tableau VI présente les pourcentages d'activation obtenus pour un patient ayant présenté cliniquement les symptômes d'une allergie au paracétamol. Le tableau VII présente les résultats de l'exploration d'un sujet ayant présenté les symptômes d'une allergie à la spiramycine. Les résultats montrent une très bonne spécificité et une sensibilité moyenne (figures 6-7). TABLEAU Vl Allergie au paracétamol TEST D'ACTIVATION DES BASOPHILES IgE- IgE-/CD63- % d'activation (nbre de cellules) (nbre de cellulese Témoin 89 0 0 anti-IgE 5x10-3M 39 12 23,5 Paracétamol 10 gg/ml 123 28 18,5 2 gg/niml 112 18 13.8 0,4 jtg/ml 136 22 13.9 0,08 gIg/ml 128 12 8,6 0,016 lag/ml 148 23 13.5 TABLEAU VII Anamnèse Test cutané Test d'activation des basophiles Contrôle + - Patient + + + sensibilisé à la spiramnvcine REVENDICATIONS 1. Méthode pour l'analyse de l'activation des basophiles humains, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à: a) enrichir un échantillon de sang total en leucocytes dans un milieu d'incubation physiologique; b) mettre en contact l'échantillon enrichi obtenu à l'étape a) avec au moins un anticorps dirigé contre le marqueur de surface membranaire des basophiles humains CD63, ledit anticorps comportant un groupe fluorochrome; c) analyser l'échantillon obtenu à l'étape b) par cytométrie de flux, pour déterminer le pourcentage des cellules portant le marqueur CD63 par rapport aux cellules ne l'exprimant pas. 2. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'on met en contact l'échantillon obtenu à l'étape a) avec un agent sensibilisant à tester, préalablement à l'étape b). 3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que l'on met en contact l'échantillon obtenu à l'étape a) avec en outre un anticorps anti-lgE comportant un groupe fluorochrome. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'on met en contact l'échantillon obtenu à l'étape a) avec en outre des anticorps respectivement dirigés contre CD14 et CD19 et comportant un groupe fluorochrome. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que lesdits anticorps sont des anticorps monoclonaux. 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'on met en contact l'échantillon obtenu à l'étape a) avec l'IL-3 et/ou le fragment du complément C5a, préalablement à l'étape b). 7. Utilisation de la méthode selon l'une des revendications 2 à 6, pour le diagnostic allergologique. 8. Utilisation selon la revendication 7, pour le diagnostic néo-natal d'une allergie. 9. Utilisation de la méthode selon l'une des revendications 1 et 3 à 4 pour le diagnostic de maladies inflammatoires autres que l'allergie. 10. Utilisation selon la revendication 9, pour le diagnostic des maladies auto-immunes impliquant les immunoglobulines E.