FR 2762993 A1 19981113 FR 9705582 A 19970506 NOUVELLE UTILISATION DE PHOSPHOLIPIDES D'ORIGINE ANIMALE EN THERAPEUTIQUE ETIOU DIETETIQUE La présente invention se rapporte à une nouvelle utilisation de phospholipides d'origine animale en thérapeutique et/ou diététique. La présente invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de phospholipides riches en acides gras polyinsaturés, en vue de la réalisation d'une composition pharmaceutique et/ou diététique ayant une action sur la sécrétion de la io mélatonine. Des études antérieures ont suggéré que la mélatonine, une neurohormone produite par l'épiphyse (glande pinéale), agit comme agent de synchronisation endogène chez les humains (Armstrong - Melatonin: The internal Zeitgeber of Mammals. i5 Pineal Res. Rev. 7: 157 - 202, 1989). Les propriétés pharmacologiques connues de la mélatonine sont notamment son action en tant que décontracturant musculaire, calmant, hypnotique et tranquillisant (Sugden. D, Psychopharmacological effects of melatonin in mouse and rat - J. Pharmacol. Exp. Ther. 227, 587-591, 1983). La mélatonine permet de soulager le déficit immun induit par le stress (Maestroni Melatonin, Stress and the immune system. Pineal Res. Rev. 7, 203-206, 1989) et peut prolonger l'espérance de vie, notamment chez la souris. La mélatonine et son principal métabolite hépatique - la 6-hydroxy mélatonine- permettent également d'éviter la lipoperoxydation expérimentale des membranes (R.J. Reiter, Antioxydant capacity of melatonin: a novel action not requiring a receptor - Neuroendocrinol, Lett. 15, 103-116, 1993). Les dernières années, de nombreux chercheurs ont impliqué l'épiphyse et la mélatonine à la fois dans les processus du vieillissement et des maladies liées au vieillissement. Ces théories proviennent du fait de l'importance de la mélatonine dans un grand nombre de fonctions biologiques et du fait que la production de mélatonine dans l'organisme diminue peu à peu durant la vie (R.J. Reiter - The pineal gland and melatonin in relation to aging; Experim. Geront. 30, 199-212, 1995). Plusieurs essais cliniques ont été conduits afin de confirmer l'efficacité de la mélatonine chez les humains (R. Wurtman, Effects of melatonin on human mood and performance, Brain Research 323, 201-207, 1984; R. Brook, A double blind trial of melatonin as a treatment for jet lag, Biol. psychiatry 33, 526-530, 1993). D'autres études ont également permis de vérifier que la mélatonine pouvait avoir une action sur la maladie d'Alzeihmer (C.P. Maurizi, The mystery of A's D. and its prevention by melatonin). L'utilisation chronique de mélatonine peut être discutée même si cette hormone io semble sans danger. Il est néanmoins intéressant d'étudier la régulation de la production de mélatonine par l'épiphyse, notamment dans l'alimentation. Il a été montré que la teneur en acides gras de la série n-3 de l'épiphyse peut être fortement diminuée lorsque les animaux sont nourris avec un régime déficient en acide a-linolénique (18: 3 n-3). Le changement le plus important a lieu pour les phospholipides glycérylés dans lesquels le niveau en acides gras de la série 22: 6 n-3 a été réduit de 10,14 % à 2,33 %. Dans ces conditions, I'activité de l'épiphyse cultivée du rat est inférieure en terme de libération de mélatonine, dans le milieu (N.Sarda, Effect of a n-3 fatty acid- deficient diet in melatonin release in cultured rat pineal. J. of Neurochemistry 61; 1057-1063, 1993). L'acide arachidonique (20: 4 n-6) et l'acide docosahexaénoïque ou DHA (22: 6 n-3) sont les principaux acides gras polyinsaturés de l'épiphyse. Ces deux acides gras représentent environ 25 % du total des lipides. Ils peuvent exister en outre sous forme de triglycérides dans les huiles de poisson ou sous forme de phospholipides d'origine animale provenant de cervelles ou d'oeufs. Différentes expériences ont prouvé que les phospholipides d'origine animale constituent les meilleurs compléments alimentaires de DHA et d'acide arachidonique pour beaucoup d'usages, et les phospholipides eux mêmes sont les constituants des membranes biologiques. Ainsi, le demandeur a déjà décrit dans ses brevets antérieurs, EP 502 766, EP 502 765, FR 2 714 574, et dans les demandes de brevets EP 95 923 373 et EP 95 923 374, des phospholipides utilisés à des fins diététiques ou thérapeutiques. La présente invention a pour objet l'utilisation de phospholipides riches en acides gras polyinsaturés à longue chaîne provenant de cervelles animales ou d'oeufs de poules en vue de la réalisation d'une composition pharmaceutique et/ou diététique destinée à réguler la sécrétion de mélatonine. io Les acides gras polyinsaturés à longue chaîne sont ceux que l'on retrouve principalement dans l'épiphyse, à savoir l'acide arachidonique (20: 4 n-6) et l'acide docosahexaénoïque ou DHA (22: 6 n-3). Les phospholipides sont associés à des excipients, des diluants ou des supports s5 inertes, non toxiques, pharmaceutiquement acceptables en vue de la réalisation d'une composition pharmaceutique et/ou diététique permettant leur administration par voie orale ou par voie parentérale. Les excipients ou diluants appropriés pour ces voies peuvent être des produits minéraux inertes comme par exemple le carbonate de calcium, le phosphate tricalcique, le phosphate de magnésium, l'alumine, la silice colloïdale, le kaolin, les argiles, le silicate d'aluminium, le silicate de calcium ou l'oxyde de fer pour la voie orale, l'eau ou les liquides aqueux pour la voie parentérale. Les supports inertes peuvent être de nature organique comme les amidons, les dextrines, le lactose, la cellulose, les dérivés synthétiques de cellulose, les alginates, les carraghénates, les caséinates, les acides gras, les cires ou les resines. Les phospholipides peuvent encore être associés à d'autres principes actifs d'action complémentaire comme les vitamines, les oligo-éléments ou les sels minéraux. Les vitamines peuvent être celles du groupe B comme par exemple la vitamine B1, la vitamine B2, la vitamine B6, l'acide folique, I'acide pantothénique, l'acide dihydrofolique, la vitamine PP. Les oligo- éléments sont par exemple le sélénium, le lithium ou le rubidium et les sels minéraux seront par exemple les sels de magnésium. Les compositions selon l'invention se présentent sous forme d'ampoules buvables, de flacons, de gélules, de capsules, de comprimés nus ou enrobés, de tablettes, de pastilles, de granulés ou de poudres aromatisées ou non, édulcorées ou non. io Les compositions peuvent aussi se présenter sous forme liquide comme par exemple des préparations gélifiées ou des suspensions buvables ou bien encore des émulsions huile dans l'eau. Les phospholipides sont administrés en une quantité allant de 10 à 300 mg par prise unitaire. Les phospholipides de la présente invention sont utilisés en vue de la réalisation d'une composition pharmaceutique et/ou diététique permettant d'améliorer la qualité du sommeil pendant la nuit, la vigilance durant le jour, et les capacités de mémoire et d'apprentissage. Les exemples et l'étude ci-après illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE I Préparation d'une composition à base de phospholipides riches en acide arachidonique et en DHA, extraits de cerveaux de mammifères phospholipides d'origine cérébrale 10 à 300 mg - concentré d'huile de germe de blé 10 à 100 mg - lactose 50 à 200 mg - phosphate tricalcique 10 à 100 mg - bromure de magnésium 15 à 50 mg - caséinates 5à 20 mg pour une gélule. EXEMPLE II Gélules à base de phospholipides cérébraux riches en acide arachidonique et en DHA. - phospholipides cérébraux 10 à 300 mg - vitamine B1 0,7 à 4,2 mg - vitamine B2 0,8 à 4,8 mg - vitamine B6 0,5 à 5 mg - acide folique 100 à 600.g Io - lactose 50 à 200 mg - stéarate de magnésium 5 à 30 mg silice colloïdale 5 à 25 mg pour une gélule L'étude suivante démontre l'application thérapeutique des phospholipides d'origine animale selon l'invention, à savoir la régulation de la sécrétion de mélatonine. ETUDE PHARMACOLOGIQUE ET APPLICATIONS THERAPEUTIQUES DES PHOSPHOLIPIDES SELON L'INVENTION 1 -Analyses Les phospholipides d'origine animale sont extraits, à l'aide de solvants appropriés, soit de cervelles de porc, soit d'oeufs de poules qui ont été nourries à l'aide d'un régime spécial riche en acides gras de la série n-3. Les conditions d'extraction des phospholipides ont été décrites respectivement dans les demandes de brevet européen n 95 923 373 (extraction à partir d'oeufs de poules) et n 95 923 374 (extraction à partir de cervelles de porc). Les produits finaux contiennent les classes usuelles de phospholipides; cependant les proportions de ces différents phospholipides varient selon leur origine. Classes de phospholipides Phospholipides cérébraux Phospholipides d'oeufs Sphingomyéline 5 à 10 % Phosphatidylcholine 20 à 30 % 70 % Phosphatidylsérine 15 à 20 % 5% Phosphatidylinositol 3 à 5 % Phosphatidyléthanolamine 30 à 40 % 16 % Acide phosphatidique 3 à 5 % 2 % Lysophospholipides 2 à 10 % 2 à 5 % Lorsque les poules ont été nourries avec un régime normal, la teneur en acides gras est quasiment identique entre les phospholipides cérébraux et les phospholipides d'oeufs de poules (voir tableau ci-dessous). Acides gras Phospholipides cérébraux Phospholipides d'oeufs Acides gras saturés 37,5 % 40 % Acides gras monoinsaturés 37,6 % 30 % Acides gras polyinsaturés (n-6) 15 % 19 % Acide arachidonique (4-5 %) (4-5 %) Acides gras polyinsaturés (n-3) 10 % 9 % Acide eicosapentaénoïque (EPA) (0,3 %) (0,4 %) Acide docosahexaénoïque (DHA) (9 %) (8 %) 2 - Expérimentation animale Protocole expérimental lo a) Animaux et régimes subis par ces animaux 4 groupes d'animaux ont été étudiés: Groupes I et 2: Les groupes 1 et 2 sont constitués par des rats de souche Wistar. Ces rats ont été nourris pendant deux générations avec un régime contenant 6 % d'un mélange (60/40) d'arachide et de graines de colza (ce groupe est dénommé " groupe témoin " ou " graines de colza ") ou avec seulement de l'huile d'arachide (ce groupe est dénommé " groupe déficient en n-3 " ou " arachide "). Le régime du groupe témoin est un régime équilibré en acides gras 18: 2 n-6 et 18: 3 n-3. * Groupes 3 et 4: Les groupes 3 et 4 sont constitués par des rats âgés de 21 jours, déjà sevrés, dont les mères font partie du groupe témoin (" graines de colza ") ou du groupe déficient en n-3 (" arachide "). Ces rats ont reçu un régime supplémenté en phospholipides animaux (" PL ") et enrichi en acides gras n-3 de façon à obtenir 200 mg d'acides gras n- 3 pour 100 g d'aliments pour les animaux déficients (ce groupe est dénommé groupe déficient en n-3 + PL - ou - a arachide " + PL -); 400 mg d'acides gras n-3 pour 100 g d'aliments pour des rats témoins (ce groupe est dénommé - groupe témoin + PL - ou - " graines de colza " + PL -). Les rats ont été nourris avec ce régime jusqu'à la fin de l'expérience. b) Echantillonacqe d'urines Les animaux sont gardés sous strictes conditions (lumière tamisée; température de 21 + 1 C; nourriture et boisson à volonté) dès qu'ils arrivent dans les cages à métabolisme. Le stress dû à l'isolation est pris en compte pendant 5 jours: ainsi, aucun échantillon ne sera prélevé durant cette période, mais cependant la reproductibilité du volume urinaire est contrôlée. Une fois cette période de 5 jours écoulée, les échantillons d'urines sont prélevés pour chaque rat. c) Résultats Le dosage en acides gras de l'épiphyse met en évidence des différences significatives entre les différents groupes en ce qui concerne les acides gras de la série n-3 et spécialement pour le DHA. TABLEAU I: Un supplément en phospholipides (PL) permet d'augmenter de façon significative le taux en acides gras 22: 6 n-3. Groupe témoin Groupe déficient Groupe témoin Groupe déficient en n-3 + en n-3 + " graines de phospholipides phospholipides colza " " arachide " animaux animaux 22: 6 n-3 7,2% 1% 10,6% 11,3% ú n-3 8,5 % 1,2 % 12 % 12,3 % n-6 3,1 27,3 2,2 2,1 n-3 :4n-6 1,83 15,3 1, 3 1,3 22: 6 n-3 Chez ces animaux, on constate que la libération nocturne de mélatonine décroît de 32 % dans le groupe déficient en n-3 par rapport au groupe témoin. Inversement, la prise de phospholipides d'origine animale fait augmenter de 75,8 % la mélatonine présente dans l'urine par rapport au groupe déficient en n-3 et 31 % par rapport au groupe témoin. La figure 1 illustre les effets de différents régimes nutritionnels sur l'excrétion de sulfatoxy-mélatonine dans l'urine de rat pendant les phases diurnes (J) et nocturnes (N) pendant 5 semaines sur 2 nuits consécutives. L'axe des abscisses représente le rapport (J/N), I'axe des ordonnées représente la quantité en ng de sulfatoxy mélatonine excrétée sur 12 heures. Les rectangles gris pointillés l représentent le groupe " arachide " déficient en n-3, les rectangles faiblement hachurés représentent le groupe témoin " graines de colza ", les rectangles noirs pointillés * représentent le groupe " arachide " déficient en n-3 supplémenté en phospholipides animaux, et les rectangles fortement hachurés O représentent le groupe témoin " graines de colza " supplémenté en phospholipides animaux. (a) p stimuler la production de mélatonine. 3 - Etude des effets des phosDholipides cérébraux sur les mauvais dormeurs a) Conditions expérimentales L'expérience suivante a été conduite sur 24 sujets sains des deux sexes, mauvais dormeurs, d'une moyenne d'âge de 30,3 ans. Ces sujets ont dû répondre à au moins 2 critères sur les 4 critères suivants: * temps d'endormissement: > 20 minutes périodes d'éveil nocturne: > 60 minutes nombre d'éveils nocturnes: 4 durée du sommeil:. chiffrés visuellement selon les critères de Rechtschaffen et Kale. L'étude en parallèle menée en double aveugle a duré 9 semaines à la dose journalière de 4 gélules et avec deux groupes qui ont été divisés de façon égale selon la table de randomisation de Cochran et Cox. Groupe A: 15 mg de phospholipides cérébraux par gélule Groupe B: placebo Chaque sujet a rempli un agenda journalier sur son sommeil selon 3 échelles analogiques relatives au temps d'endormissement, à la vigilance lors du réveil, à la durée du sommeil, et a finalement répondu au questionnaire de l'hôpital. b) Résultats À Les sujets du groupe A ont trouvé que leur sommeil a été plus profond que les sujets du groupe B. La figure 2 illustre la profondeur du sommeil des groupes A et B. L'axe des abscisses représente le nombre de semaines et l'axe des ordonnées la profondeur du sommeil. Les sujets du groupe A ont noté qu'ils se réveillaient moins souvent (entre 0 et 1 fois) que les sujets du groupe B (entre 1 et 2 fois). La figure 3 illustre le nombre d'éveils nocturnes des groupes A et B. L'axe des abcisses représente le nombre de semaines et celui des ordonnées le nombre d'éveils nocturnes. * Les sujets du groupe A ont également noté qu'ils se réveillaient la nuit pendant une durée moins longue que les sujets du groupe B. La figure 4 illustre la durée des éveils nocturnes des groupes A et B. L'axe des abscisses représente le nombre de semaines et celui des ordonnées la durée des éveils nocturnes (en minutes). La durée totale du temps de sommeil a augmenté de façon significative dans le groupe A (445 minutes + 29 minutes de temps de sommeil) par rapport au groupe B (362 minutes + 28 minutes de temps de sommeil). La figure 5 illustre la durée totale du temps de sommeil des deux groupes A et B. L'axe des abscisses représente le nombre de semaines et celui des ordonnées la durée totale du temps de sommeil (en minutes). Le nombre d'épisodes de somnolence et de sieste durant la journée est plus important dans le groupe B par rapport au groupe A. La figure 6 illustre le nombre d'épisodes de somnolence des groupes A et B. L'axe des abscisses représente le nombre de semaines, celui des ordonnées le nombre d'épisodes de somnolence. c) Conclusion Ces résultats démontrent l'effet favorable des phospholipides cérébraux sur la qualité et la durée du sommeil ainsi que sur la vigilance journalière. 4 - Etude de iour des performances psvchomotrices des mauvais dormeurs a) Conditions expérimentales Cette étude a été conduite dans un hôpital universitaire spécialisé dans le sommeil. 16 mauvais dormeurs ont été sélectionnés pour l'étude et ont été divisés en deux groupes parfaitement homogènes. Il On a administré à chacun des deux groupes 4 capsules par jour durant 2 mois de produit A (15 mg de phospholipides cérébraux par capsule) ou de produit B (placebo). Les sujets ont été soumis à une série de tests psychomoteurs aux jours 1, 15, 43 et 57. Les données ont été évaluées statistiquement selon l'analyse de variance (ANOVA). b) Résultats À Test d'attention concentrée (assistance par ordinateur). Le temps de réaction moyen a augmenté de façon significative dans le groupe A. Le nombre d'erreurs a augmenté de façon significative (p=0. 0005) dans le groupe B (4.58) par rapport au groupe A (2.48). La figure 7 illustre le test d'attention concentrée. Les rectangles hachurés représentent le groupe A et les rectangles blancs le groupe B (placebo). L'axe des abscisses représente l'heure à laquelle le test a été effectué et l'axe des ordonnées le nombre d'erreurs. * Test de dextérité manuelle Ce test démontre que les phospholipides cérébraux permettent d'améliorer le test le plus complexe de coordination visio-motrice (assemblage) mais n'ont pas d'efficacité sur les tests les plus simples. À Test des signes croisés La proportion de signes correctement croisés a augmenté de façon significative dans le groupe A, sans aucun effet sur les performances de rapidité. Test d'apprentissage verbal auditif Le nombre de mots mémorisés est plus grand dans le groupe A (79,96 %) que dans le groupe B (75,64 %). - La vitesse d'apprentissage est beaucoup plus grande dans le groupe A (4.76) que dans le groupe B (5.54). La figure 8 illustre la vitesse d'apprentissage des groupes A et B. Le groupe A est représenté par les rectangles hachurés, et le groupe B (placebo) par les rectangles blancs. L'axe des abscisses représente l'heure à laquelle le test a été effectué et l'axe des ordonnées la vitesse d'apprentissage. - Le nombre d'erreurs décroît de façon significative dans le groupe A (0. 56) par rapport au groupe B (1.82). La figure 9 illustre le nombre d'erreurs des groupes A et B. Le groupe A est représenté par les rectangles hachurés et le groupe B (placebo) par les rectangles blancs. io L'axe des abscisses représente l'heure du test et celui des ordonnées le nombre d'erreurs. Ces résultats permettent de conclure que les phospholipides cérébraux entraînent une amélioration importante des capacités d'apprentissage et de mémoire, liée à une sécrétion plus importante de mélatonine. * Test de série numérique Ce test consiste à répéter une série de figures aussi longtemps que possible. Il n'y a pas eu de différence significative entre les 2 groupes. * Test de reconnaissance visuelle différée Le nombre d'objets reconnus n'est pas différent entre les 2 groupes. On peut en conclure que la prise de phospholipides cérébraux améliore les capacités de mémoire relatives à l'apprentissage et à la mémorisation. Ces résultats sont en accord avec l'étude précédente qui a montré une amélioration du sommeil et de la vigilance durant le jour. Ces résultats permettent de comprendre les effets sur les capacités d'apprentissage. Ces études expérimentales confirment que la prise de phospholipides riches en DHA et en acide arachidonique provenant de cerveaux de mammifères ou d'oeufs de poules correctement nourries, entraîne la sécrétion de mélatonine, ce qui permet d'améliorer d'une part la qualité du sommeil et d'autre part les capacités de mémoire. Les compositions pharmaceutiques et/ou diététiques de la présente invention, destinées à réguler la sécrétion de mélatonine, sont particulièrement adaptées pour les personnes âgées ou les mauvais dormeurs chez lesquels on observe habituellement une diminution de la concentration plasmatique en mélatonine durant la nuit. io Les compositions pharmaceutiques et/ou diététiques de la présente invention ont particulièrement des effets bénéfiques sur le sommeil et sur la qualité du sommeil, sur le réveil et la vigilance, sur l'humeur, sur les capacités d'apprentissage et de memorisation. L'action antioxydante de la mélatonine et son activité antiradicalaire permettent en outre d'utiliser les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour ralentir les processus de vieillissement. La maladie d'Alzeihmer est un cas particulier intéressant: dans cette maladie, la sécrétion nocturne de mélatonine est quasiment inexistante. REVENDICATIONS 1. Utilisation de phospholipides riches en acides gras polyinsaturés à longue chaîne provenant de cervelles animales ou d'oeufs de poules en vue de la réalisation d'une composition pharmaceutique et/ou diététique destinée à réguler la sécrétion de mélatonine. 2. Utilisation de phospholipides selon la revendication 1, dans laquelle les phospholipides sont riches en acide arachidonique (20: 4 n- 6) et en acide docosahexaénoique ou DHA (22: 6 n-3). 3. Utilisation de phospholipides selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que dans la composition pharmaceutique et/ou diététique les phospholipides sont associés à des excipients, des diluants ou des supports inertes, non toxiques, pharmaceutiquement acceptables, permettant leur administration par voie orale ou par voie parentérale. 4. Utilisation de phospholipides selon l'une au moins des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que dans la composition pharmaceutique et/ou diététique les phospholipides sont associés à au moins une vitamine. 5. Utilisation de phospholipides selon l'une au moins des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que dans la composition pharmaceutique et/ou diététique les phospholipides sont associés à au moins un oligo-élément. 6. Utilisation de phospholipides selon l'une au moins des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que dans la composition pharmaceutique et/ou diététique les phospholipides sont associés à au moins un sel minéral. 7. Utilisation de phospholipides selon l'une au moins des revendications 1 à 6, en vue de la réalisation d'une composition pharmaceutique et/ou diététique permettant d'améliorer la qualité du sommeil pendant la nuit et la vigilance durant le jour. 8. Utilisation de phospholipides selon l'une au moins des revendications 1 a 6, en vue de la réalisation d'une composition pharmaceutique et/ou diététique permettant d'améliorer les capacités de mémoire et d'apprentissage. 9. Utilisation de phospholipides selon l'une des revendications précédentes dans laquelle les phospholipides sont administrés en une quantité allant de 10 à 300 mg par prise unitaire.