FR 2749856 A1 19971219 FR 9707417 A 19970616 La présente invention concerne un procédé et un appareil de culture de cellules animales et en particulier un procédé et un appareil de culture de cellules en monocouches qui dépendent d'un ancrage. Du fait de la demande croissante de produits dérivés de cellules ani- maies dans l'industrie pharmaceutique et en biotechnologie, le développement de procédés de culture de cellules animales est devenu un objectif indispensable dans le domaine biomédical. Pour la plupart des cultures de cellules animales telles que les cultures de cellules de mammifères, des substrats sont nécessaires pour ancrer les cellules car les cellules ne peuvent pas se développer en suspension dans un milieu de culture. On a développé de nombreux systèmes de culture de cellules pour la culture de cellules animales qui dépendent d'un ancrage, comme par exemple des flacons de culture de tissus, des flacons tournants, des microsupports dans des réservoirs agités, des fibres creuses et des systèmes céramiques. (Wei- Shou Hu et al., "Animal Cell Bioreactors-Recent Advances and challenges to Scale-Up" The Canadian Journal of Chemical Engineering, "Specialized Techniques" vol. 69, avril 1991, p. 409-420; "Specialized Techniques", Culture of Animal Cells, chapitre 23, p. 371-377). Dans le processus de culture de cellules animales, l'une des conditions fondamentales consiste à fournir une quantité suffisante d'un gaz tel que l'oxygène et de substances nutritives. Une fourniture insuffisante de gaz ou de substances nutritives retarde la croissance des cellules. Une autre condition consiste à con- trôler le niveau des produits métaboliques qui peuvent inhiber la croissance des cellules lorsqu'ils s'accumulent à haute concentration dans le milieu de culture. Le système de culture à flacons tournants est un système de type bain qui est dépourvu de dispositif de circulation de milieu. Ce système comprend des flacons destinés à recevoir un milieu de culture et à tourner sur un support. Typi- quement, un milieu de culture de cellules est placé à l'intérieur des flacons tournants en une quantité égale à 1/10-1/5 du volume intérieur des flacons, et les cellules sont amenées à croître sur la surface interne des flacons. La formation d'un film mince de milieu de culture sur la surface interne non submergée d'un flacon pendant sa rotation permet d'augmenter la quantité d'oxygène dissous, ce qui facilite les échanges gazeux entre les phases liquide et gazeuse. De ce fait, une quantité suffisante de gaz ou d'oxygène peut être fournie aux cellules même lorsque la densité des cellules est élevée. Par ailleurs, ce système autorise une, plus grande surface pour la fixation des cellules et une agitation douce. Il est possible d'utiliser un dispositif de transfusion ou un dispositif distributeur tel qu'une pipette ou une pompe péristaltique pour ajouter du milieu frais. Toutefois, ce système ne permet pas la commande du pH et de l'oxygène dissous. De plus, du fait de l'absence d'un dispositif de circulation de milieu, le retrait des sous-produits toxiques du métabolisme et l'appauvrissement des substances nutritives exigent un renouvellement constant du milieu, ce qui demande beaucoup de travail. Dans la production à grande échelle qui exige un grand nombre de flacons toumrnants, l'exploitation du système demande beaucoup de travail et l'obtention d'un produit de qualité uniforme et délicate. De ce fait, l'application d'un tel système est limitée. Les systèmes de culture de cellules dotés de dispositifs de circulation de milieu de culture sont avantageux pour le renouvellement du milieu de culture et le retrait des produits du métabolisme. Dans ces systèmes, les cellules sont constamment immergées dans le milieu de culture et le débit du milieu de culture est commandé de manière à fournir une quantité suffisante de substances nutritives et d'oxygène dissous aux cellules. Les systèmes à microsupports ou microsubstrats sont du type à circu- lation et peuvent être transposés aisément pour une production à grande échelle. Toutefois, ces systèmes sont coûteux et de maniement délicat du fait que les cellules se séparent facilement des microsubstrats, en particulier en présence de forces de cisaillement importantes. Les bioréacteurs à écoulement piston tels que les systèmes à fibres creuses et les systèmes céramiques constituent d'autres types de cultures de cellules à circulation. Dans les systèmes à fibres creuses, un milieu pénètre dans la lumière des fibres à débit élevé et une faible fraction seulement traverse la membrane constituée par la paroi des fibres. Généralement, ces systèmes autorisent une densité de culture élevée et un rendement élevé. Néanmoins, comme l'apport des substances nutritives de faible masse moléculaire et le retrait des métabolites sont généralement réalisés par la diffusion moléculaire due au gradient de concentration au travers de la membrane, il peut se produire un déficit d'oxygène dissous et de substances nutritives lorsque la longueur ou l'épaisseur des fibres creuses est aug- mentée. De ce fait, la production de cellules à grande échelle est délicate avec les systèmes à fibres creuses. Dans les systèmes céramiques, des cellules sont inoculées dans les canaux d'un cylindre céramique poreux et un milieu est amené à circuler dans les canaux pour fournir les substances nutritives et pour retirer les métabolites. La quantité d'oxygène dissous est augmentée grâce à une pompe qui fait circuler le milieu. Toutefois, pour obtenir un apport suffisant d'oxygène dissous, il est généralement nécessaire d'augmenter le débit de circulation du milieu. Cette aug- mentation du débit peut détacher les cellules de leurs surfaces d'ancrage, ce qui a un effet néfaste sur le rendement de production. Pour remédier aux inconvénients évoqués ci-dessus, la présente invention a pour but de fournir un système de culture de cellules animales équipé d'un dispositif de circulation de milieu qui facilite le retrait des métabolites et le renouvellement ou le remplacement du milieu de culture et qui permet l'aération de la surface d'ancrage des cellules pendant la croissance des cellules, ce qui permet de résoudre le problème de manque d'oxygène qui peut se poser dans le cas d'une culture de cellules à haute densité. En outre, la présente invention a pour but de fournir un dispositif de circulation de milieu qui ne produit pas de forces de cisaillement élevées tout en permettant au milieu de fournir une quantité suffisante d'oxygène dissous pour la croissance des cellules. La présente invention a également pour but de fournir un dispositif de culture de cellules animales qui puisse être commandé et qui puisse être conçu aisément pour la production à grande échelle. Pour atteindre les buts ci-dessus, la présente invention fournit un appareil de culture de cellules comprenant une chambre de culture de cellules comportant des moyens d'entrée et de sortie, un substrat placé à l'intérieur de ladite chambre de culture et un moyen de circulation pour faire circuler un milieu de cul- ture dans ladite chambre de culture de cellules et lesdits moyens d'entrée et de sortie, ledit moyen de circulation étant relié auxdits moyens d'entrée et de sortie, caractérisé en ce que ledit moyen de circulation a pour fonction de faire monter et descendre tour à tour le niveau du milieu de culture par rapport à la surface dudit substrat entre un niveau haut au-dessus de la hauteur du substrat et un niveau bas au-dessous dudit substrat sans déplacer ledit substrat par rapport à ladite chambre de culture de cellules, ledit moyen de circulation étant capable de déclencher l'apport du milieu de culture par lesdits moyens d'entrée lorsque le milieu de culture atteint ledit niveau bas et de déclencher l'évacuation du milieu de culture par lesdits moyens de sortie lorsque ledit milieu de culture atteint ledit niveau haut. Grâce à ce moyen de circulation, les cellules fixées au substrat peuvent être tour à tour immergées dans le milieu et exposées à l'environnement gazeux présent au- dessus du niveau du milieu de culture sans déplacement du substrat et de la chambre de culture. La présente invention fournit également un procédé de culture de cel- lules qui dépendent d'un ancrage, caractérisé en ce qu'il comprend (a) la fourniture d'une chambre de culture de cellules comportant une entrée, une sortie et un substrat pour la fixation des cellules, (b) l'introduction d'un milieu de culture dans la chambre de culture de cellules et la fixation des cellules sur le substrat, (c) la circulation du milieu de culture par l'entrée et la sortie et la montée et l'abaissement successifs du niveau du milieu de culture pendant la croissance des cellules, sans déplacement du substrat par rapport à la chambre de culture, entre un niveau haut au-dessus du substrat et un niveau bas au-dessous du substrat de manière à immerger les cellules dans le milieu de culture et à les exposer tour à tour à l'environnement gazeux présent au-dessus du niveau du milieu de culture, (d) le déclenchement de l'évacuation du milieu de culture par ladite sortie lorsque le milieu de culture atteint ledit niveau haut et (e) le déclenchement de l'arrivée du milieu de culture par ladite entrée lorsque le milieu de culture atteint ledit niveau bas. De préférence, la chambre de culture est une chambre fixe et le substrat est constitué par des plaques de substrat verticales qui comportent des surfaces d'ancrage pour la fixation des cellules. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux dans la description détaillée qui suit et se réfère aux dessins annexés, donnés uni- quement à titre d'exemple, et dans lesquels: la figure 1 est une vue schématique montrant un mode de réalisation référé d'un appareil de culture de cellules qui dépendent d'un ancrage; la figure 2 est une vue d'une partie de l'appareil ci-dessus, dans laquelle la chambre de culture est représentée de manière plus détaillée; et la figure 3 montre un substrat constitué par un ensemble de plaques qui est utilisé dans le mode de réalisation préféré. Comme le montrent les figures 1 et 2, l'appareil de culture selon l'invention comprend un récipient 1 comportant une chambre de culture 11 desti- née à recevoir un milieu de culture, des orifices d'entrée inférieur et supérieur 12 et 13 pour introduire le milieu de culture, un orifice de sortie 14 pour évacuer le milieu de culture et un orifice 15 pour l'évacuation du trop-plein. Un premier réservoir de stockage 2 qui est en communication avec l'orifice de sortie 14 est situé à un niveau plus bas que la chambre de culture 11 et un second réservoir de stockage 3 qui communique avec les orifices d'entrée est situé en amont de la chambre de culture et à un niveau plus élevé que celle-ci. Un substrat 7 constitué par une multiplicité de plaques de substrat 71 (fig. 3) est monté dans la chambre de culture 11 pour fournir des surfaces d'ancrage pour la croissance des cellules. Les plaques de substrat 71 sont des plaques planes qui s'étendent verticalement et qui sont espacées horizontalement. Dans d'autres modes de réalisation, le substrat peut être constitué également par des plaques en forme de grille ou par des matériaux de garnissage tels que ceux qui sont utilisés de manière conventionnelle pour la fixation des cellules. Le moyen de circulation pour faire circuler le milieu de culture com- prend une conduite d'alimentation 41, une conduite d'évacuation 42, une conduite de trop-plein 43 et une conduite de recyclage 44. La conduite d'alimentation 41 est reliée aux orifices d'entrée 12 et 13 et au second réservoir de stockage 3, et la con- duite d'évacuation 42 est reliée à l'orifice de sortie 14 et au premier réservoir de stockage 2. La conduite de trop-plein 43 s'étend entre l'orifice de trop-plein 15 et le premier réservoir de stockage 2. La conduite de recyclage 44 relie entre eux les premier et second réservoirs de stockage 2 et 3 et comprend une pompe 45 qui assure le transport du milieu de culture du premier réservoir de stockage 2 au second réservoir de stockage 3. Il est prévu des vannes V, V2, V3 et V3, pour commander le débit du milieu de culture dans la conduite de trop-plein 43, la conduite d'évacuation 42 et la conduite d'alimentation 41. Grâce à la vanne V3, qui est une vanne à trois voies, le milieu de culture peut être introduit dans la chambre de culture 11 par les orifices d'entrée inférieur ou supérieur 12 et 13 en fonction des conditions de fonc- tionnement de l'appareil de culture. Il est prévu des filtres à air F1 et F2 pour la chambre de culture 11 et des fibres à air F3 et F4 pour les réservoirs 2 et 3, respec- tivement. Un moyen 5 qui peut être constitué par une pompe à air est relié au filtre à air F1 pour introduire de l'air frais dans la chambre de culture 11 lorsque cela est nécessaire. Un moyen 8 détecteur de niveau est relié au premier réservoir de stoc- kage 2 pour détecter le niveau de la surface du milieu dans ce réservoir. Lorsque ce niveau atteint une valeur prédéterminée, la pompe 45 est déclenchée de manière à transporter le milieu jusqu'au second réservoir de stockage 3. Un tube siphon 6 comporte une branche reliée au premier réservoir de stockage et une autre branche reliée à la conduite d'évacuation 42. La hauteur du tube siphon 6 est telle qu'il commence à aspirer le milieu de culture de la chambre dans le premier réservoir de stockage lorsque le milieu de culture atteint dans la chambre un niveau supérieur à la hauteur des plaques de substrat 71, niveau qui est légèrement inférieur à celui de l'orifice de trop-plein 15. L'appareil de culture selon la présente invention peut comporter égale- ment des moyens pour distribuer uniformément le milieu de culture au sommet ou S au fond de la chambre de culture ou au sommet et au fond de la chambre de culture. Dans le mode de réalisation qui est représenté, il est prévu un moyen dis- tributeur 9 au sommet de la chambre de culture 11 pour distribuer uniformément le milieu de culture sur les plaques de substrat 71. Ce moyen comprend des tubes distributeurs 81 qui sont reliés à l'orifice d'entrée 13 et qui comportent une multi- plicité d'ouvertures dirigées vers le côté supérieur de la chambre de culture 11, et un plateau perforé 82 destiné à recevoir le milieu de culture provenant des tubes distributeurs 81 et à distribuer ce milieu de culture sur les plaques de substrat 71. Il est possible d'utiliser des dispositifs de pulvérisation (non représentés) à la place du plateau perforé 82 pour pulvériser le milieu de culture. Le fonctionnement de l'appareil commence au stade de la fixation des cellules. A ce stade, un milieu de culture est introduit dans la chambre de culture 11 depuis le second réservoir de stockage 3 par gravité ou par un gradient de pres- sion, à un débit constant approprié commandé par la vanne V3. A ce moment, la vanne V, située au niveau de l'orifice de trop-plein 15 est ouverte pour maintenir le niveau de la surface du milieu de culture à une hauteur h4 de manière à immerger toutes les plaques de substrat 71 dans le milieu de culture. Le milieu de culture provenant de l'orifice de trop-plein 15 s'écoule dans le premier réservoir de stockage 2 par la conduite 43 sous l'effet de la gravité ou d'un gradient de pression. Grâce au moyen 8 qui surveille le niveau du milieu dans le premier réservoir de stockage 2, la pompe 45 est actionnée pour transporter le milieu de culture jusqu'au second réservoir de stockage 3. Lorsque le niveau du milieu dans le premier réser- voir de stockage 2 est inférieur à sa limite inférieure, la pompe 45 ne fonctionne pas. Ainsi, le milieu de culture est soumis à une circulation en boucle dans la chambre de culture 11 et les premier et second réservoirs de stockage 2 et 3. La durée de la circulation peut être de 30 min ou bien encore plus courte ou plus longue en fonction de la durée nécessaire pour la fixation des cellules sur le substrat. Après la fixation des cellules sur les surfaces des plaques de substrat 71, la vanne V, est fermée et la vanne V2 est ouverte tandis que la vanne V3 est toujours en position ouverte. Etant donné qu'à ce stade le niveau du milieu de cul- ture dans la chambre atteint sa hauteur maximale, c'est-à-dire supérieure à la hau- teur du tube siphon 6, il est aspiré par le tube siphon 6 dans le premier réservoir de stockage 2 par l'orifice d'évacuation 14. Lorsque le niveau du milieu de culture baisse, les surfaces d'ancrage des plaques de substrat 71 sont exposées et seul un mince film de milieu demeure sur chaque plaque de substrat 71. Cette opération est répétée de sorte que les plaques de substrat 71 sont exposées par intermittence au milieu de culture. L'opération est interrompue lorsque les cellules recouvrent les surfaces des plaques de substrat 71. La durée d'un cycle est de préférence de 30 s. La durée du cycle qui s'étend du début de la baisse du niveau à la fin de la montée du niveau peut être déterminée de la manière qui sera décrite dans la suite en fonc- tion des débits volumiques fl et f2 dans les conduites 41 et 42. Sur la figure 2, hi et h2 représentent respectivement la hauteur du fond des plaques de substrat 71 par rapport au fond de la chambre de culture 11 et la hauteur du sommet des plaques de substrat 71 par rapport au fond de la chambre de culture 11. h3 représente la hauteur du tube siphon 6 par rapport au fond de la chambre de culture 11 et h4 représente la hauteur de l'orifice de trop-plein par rapport au fond de la chambre de culture 11. La hauteur du niveau de la surface du milieu est désignée par hl. Sur la figure 3, w représente la largeur de la chambre de culture et I représente sa longueur. Lorsque du milieu de culture est introduit dans la chambre de culture pour faire monter le niveau de la surface du milieu, le tube siphon 6 ne fonctionne pas et le débit volumique f2 est nul. Dans cette situation, lorsque 0 (o N est le nombre de plaques de substrat et d est l'épaisseur de chaque plaque). Lorsque le niveau de la surface du milieu baisse du fait du fonctionne- ment du tube siphon 6, en supposant que les débits fl et f2 sont constants, on est en présence de la situation suivante: lorsque 0 la descente du niveau de la surface du milieu, il est possible d'utiliser des disposi- tifs pour faire monter et descendre des plaques de substrat afin de les exposer et de les immerger tour à tour. REVENDICATIONS 1. Appareil de culture de cellules comprenant une chambre de culture de cellules (11) comportant des moyens d'entrée (12, 13) et de sortie (14, 15), un substrat (7) placé à l'intérieur de ladite chambre de culture et un moyen de circulation (2, 3, V3, V2, 6, 8, 44, 45) pour faire circuler un milieu de culture dans ladite chambre de culture de cellules et lesdits moyens d'entrée et de sortie, ledit moyen de circulation étant relié auxdits moyens d'entrée et de sortie, caractérisé en ce que ledit moyen de circulation a pour fonction de faire monter et descendre tour à tour le niveau du milieu de culture par rapport à la surface dudit substrat entre un niveau haut pour plonger dans le milieu de culture les cellules maintenues par ledit substrat et un niveau bas pour exposer à un environnement gazeux les cellules maintenues par ledit substrat sans déplacer ledit substrat par rapport à ladite chambre de culture de cellules, ledit moyen de circulation étant capable de déclen- cher l'apport du milieu de culture par lesdits moyens d'entrée lorsque le milieu de culture atteint ledit niveau bas et de déclencher l'évacuation du milieu de culture par lesdits moyens de sortie lorsque ledit milieu de culture atteint ledit niveau haut. 2. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit moyen de circulation comprend un premier réservoir de stockage (2) qui communique avec ledit moyen de sortie (14) et qui est situé à un niveau plus bas que le fond de ladite chambre de culture de cellules (11). 3. Appareil selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit moyen de circulation comprend un second réservoir de stockage (3) qui est situé en amont de ladite chambre de culture (11) à un niveau plus haut que le sommet de ladite chambre de culture de cellules (11). 4. Appareil selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit moyen de circulation comprend une pompe (45) entre lesdits premier et second réservoirs de stockage (2, 3). 5. Appareil selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit moyen de circulation comprend un tube siphon (6) relié audit moyen de sortie (14) et audit premier réservoir de stockage (2) et qui crée une force d'aspiration lorsque le niveau de la surface du milieu de culture atteint ledit niveau haut. 6. Appareil selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit moyen de circulation comprend une première vanne (V2) reliée audit moyen de sortie (14) pour commander la sortie dudit milieu de culture et une seconde vanne (V3) reliée auxdits moyens d'entrée (12, 13) pour commander l'entrée dudit milieu de culture dans ladite chambre de culture de cellules. 7. Appareil selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit moyen de circulation comprend une conduite de trop- plein (43) qui communique avec ladite chambre de culture de cellules à un niveau plus haut que le sommet dudit substrat et une vanne de trop- plein (VI) reliée à ladite conduite de trop-plein (43). 8. Appareil selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que ledit moyen de circulation comprend un moyen (8) pour détecter le niveau haut de la surface dudit milieu de culture dans ledit premier réservoir de stockage (2) et pour déclencher le fonctionnement de ladite pompe (45). 9. Appareil selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits moyens d'entrée comprennent un premier orifice d'entrée (13) situé en position adjacente au sommet de ladite chambre de culture de cellules et un second orifice d'entrée (12) situé en position adjacente au fond de ladite chambre de culture de cellules. 10. Appareil selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un moyen (5) pour introduire un gaz dans ladite chambre de culture de cellules depuis son sommet. 11. Procédé de culture de cellules, caractérisé en ce qu'il comprend (a) la fourniture d'une chambre de culture de cellules (11) comportant un orifice d'entrée (12), un orifice de sortie (14) et un substrat (7) pour la fixation des cellules, (b) l'introduction d'un milieu de culture dans la chambre de culture de cellules et la fixation des cellules sur le substrat, (c) la circulation du milieu de culture par les orifices d'entrée et de sortie et la montée et l'abaissement successifs du niveau du milieu de culture pendant la croissance des cellules, sans déplace- ment du substrat par rapport à la chambre de culture, entre un niveau haut pour plonger dans le milieu de culture les cellules maintenues par ledit substrat et un niveau bas pour exposer à un environnement gazeux présent au-dessus du niveau du milieu de culture les cellules maintenues par ledit substrat, (d) le déclenchement de l'évacuation du milieu de culture par l'orifice de sortie (14) lorsque le milieu de culture atteint ledit niveau haut et (e) le déclenchement de l'arrivée du milieu de culture par l'orifice d'entrée (12) lorsque le milieu de culture atteint ledit niveau bas.