FR 2754829 A1 19980424 FR 9612797 A 19961018 1 2754829 L'invention concerne un procédé de fermentation cyclique avec alimentation du substrat (cyclic fed batch culture) pour la production d'une composition de sophorolipides Les sophorolipides sont par exemple utilisés en cosmétologie, comme agent antiradicalaire et agent antiélastasique (WO 95/34282). Ils peuvent être aussi utilisés comme co-tensioactif dans un procédé de dépollution de sols (EP-A 605 308). Il a été mentionné dans les brevets US 3205150, US 3312684 et EP-B 516803 qu'une quantité de sophorolipides était produite par un procédé de fermentation mettant en jeu une culture de Candida bombicola. Les sophorolipides sont considérés comme étant un mélange de composés représentés par les formules (1) et (2), dans laquelle Ri représente l'hydrogène ou le groupe acétyle et R2 l'hydrogène ou un groupement alkyle comportant 1 à 9 atomes de carbone, ou bien R2 représente l'hydrogène ou un groupement méthyle, lorsque R3 est un chaîne hydrocarbonée insaturée à 13 ou 17 atomes de carbone. Ces composés sont utilisables comme agents de nettoyage et comme émulsifiants et ils présentent d'excellentes propriétés hygroscopiques et hydrophiles dues à la partie sophorose de chacune de ces molécules et des propriétés hydrophobes provenant des parties acides gras. La préparation de sophorolipides est généralement effectuée en présence d'un substrat tel que décrit dans le brevet US 3205150. Par exemple, ce substrat peut être des hydrocarbures, des acides gras saturés ou insaturés, des esters d'acides incluant des glycérides, des huiles végétales telles que l'huile de soja. L'alimentation en substrat consiste à réaliser en discontinu (batch) à des intervalles de temps d'environ 12 à 24 heures, l'injection d'une quantité d'environ 2 % en poids par rapport au volume réactionnel initial, pour chaque addition. L'alimentation en substrat est plus avantageusement réalisée en continu (fed batch) comme dans le cas du brevet européen de la Demanderesse EP-B 516803. 2 2754829 H20R1 r2 O- - R3 COOH H I Hr Ht H H VH20Rl H O' (1) H OH H20R1 R2 H CO H OH qH20Rl H 3 \ (2) HOH O C=O Structure des sophorolipides (1): formes acides (2): formes lactones Les procédés de fermentation discontinus avec l'alimentation de substrat discontinue (batch) ou continue (fed batch) présentent les inconvénients classiques de la fermentation discontinue. Ainsi, la mise en oeuvre répétée à l'échelle industrielle d'une série d'opérations discontinues (en batch ou en fed batch) impose de nombreux temps morts dans le fonctionnement des installations en raison du nettoyage et de la stérilisation de fermenteur qui doivent être répétés entre chaque culture. De même, doit-on effectuer à chaque fois, la propagation de la souche productrice depuis son état de conservation en tube gélosé par exemple, jusqu'au fermenteur de production, par une chaîne d'ensemensement qui implique la culture successive du microorganisme dans des fermenteurs de tailles croissantes. Cette opération de préculture peut prendre plusieurs jours. Pour éviter ces inconvénients et ces contraintes, on a recours habituellement à la culture continue dans laquelle on alimente le réacteur en milieu de culture et en substrat à débit équivalent et on soutire le moût fermenté à un débit équivalent. Le volume réactionnel est alors constant. Classiquement, la culture continue est réalisée selon le mode du chémostat ( Wang et al. 1979. Continuous culture. In Fermentation and enzyme technology, John Wiley & Sons (eds), pp 98-137). Un nutriment du milieu de culture est présent en quantité limitante de façon à contrôler la concentration stationnaire du microorganisme dans le fermenteur et obtenir un fonctionnement stable du système. Lorsque l'on veut produire des métabolites (tels que l'éthanol par exemple), on utilise généralement deux ou plusieurs fermenteurs placés en série (système bi ou multi étages). Dans le premier est réalisée la croissance du microorganisme (premier étage de fermentation) avec un milieu comportant un élément nutritif limitant (azote, phosphore) tandis que l'excrétion de métabolites est réalisée dans le second réacteur dans lequel est admis le moût de fermentation du premier étage. On a observé de manière tout à fait inattendue que la souche placée dans ces conditions de production, perdait progressivement et rapidement ses propriétés d'excrétion et que la productivité était très inférieure à celle observée en fed batch. Un objet de l'invention est de remédier aux inconvénients mentionnés ciavant. Un autre objet de l'invention est d'améliorer la productivité du système tout en obtenant des sophorolipides les plus purs possible de façon à éviter une étape d'extraction par solvant des produits obtenus. Un autre objet est d'accroitre la durée de production de sophorolipides dans les essais de fermentation qui dépassent la durée des essais discontinus (en batch ou fed batch), c'est à dire plus de 180 heures, tout en assurant des productivités élevées. On a découvert un procédé de préparation de sophorolipides permettant d'allonger la durée de production et la productivité volumique de sophorolipides. Ce procédé met en oeuvre une technique particulière de culture d'une levure, la fermentation cyclique (Moser A 1985. Special cultivation techniques. In Biotechnology vol 2, Rehm HI and Reed G (eds), pp 311-347). Plus précisément, l'invention concerne un procédé de production d'une composition de sophorolipides comprenant la mise en culture dans une zone de réaction dans des conditions de culture aérée d'une souche Candida bombicola ou Candida apicola dans un milieu contenant une source d'azote et un substrat. Le procédé est caractérisé en ce qu'il comprend un premier cycle de fermentation comportant une étape de croissance de la souche et une étape de production d'un moût de fermentation contenant des sophorolipides au moyen d'une alimentation de la souche en substrat dans la zone de réaction. Le procédé est en outre caractérisé en ce qu'on effectue au moins une fois les étapes suivantes: a) on soutire une partie du moût de fermentation; b) on ajoute à la partie restante du moût un milieu minéral contenant de l'azote de façon à constituer un second milieu; c) on effectue un nouveau cycle de fermentation à partir de ce second milieu et on produit un autre moût de fermentation. La durée desdits premier et nouveau cycles de fermentation est d'au moins 30 heures. On récupère ensuite les sophorolipides du moût des étapes (a) et (c). On a remarqué que dans ces conditions, on améliorait la productivité de la fermentation tout en obtenant une pureté de produits remarquable, c'est à dire sans présence d'une quantité substantielle d'acides gras ne nécessitant donc pas de fractionnement ultérieur pour les éliminer. Cet avantage est d'autant plus marqué que l'alimentation des nouveaux cycles de fermentation est réalisée en continu. On a par ailleurs constaté un gain considérable sur la chaîne d'ensemencement puisqu'on peut répéter la séquence de fermentation (étapes (a) à (c)) une pluralité de fois, par exemple 7 fois sans que la productivité en sophorolipides ne soit substantiellement affectée. La durée de chaque cycle de fermentation sera en général d'au moins 30 heures et de préférence d'au moins 70 heures, par exemple 80 à 130 heures pour permettre d'une part à la souche de se multiplier suffisamment et d'autre part une accumulation de sophorolipides suffisante pour une bonne décantation. Selon une caractéristique avantageuse du procédé, on peut séparer, par exemple par décantation, le moût de fermentation produit et récupérer un moût de fermentation débarrassé au moins en partie des sophorolipides sur lequel on effectue les étapes (a) à (c). On améliore alors la pureté des produits c'est à dire que la quantité d'acides gras résultant de l'hydrolyse du substrat est telle qu'elle ne nécessite pas de fractionnement ultérieur pour les éliminer. Selon une autre caractéristique, après avoir soutiré une partie du moût, on peut remplacer cette partie soutirée du moût par une quantité sensiblement égale de milieu minéral. Avantageusement, on peut soutirer une quantité de moût telle qu'il reste au moins 5 % en poids et de préférence 20 à 50 % du moût dans la zone de réaction. Selon une autre caractéristique du procédé, on peut interrompre chaque cycle de fermentation lorsque la productivité en sophorolipides durant le dit cycle diminue. De préférence on r'interrompt avant 140 heures de fermentation et plus particulièrement après une période de temps comprise entre 70 et 120 heures. On stoppe généralement le dernier cycle de fermentation, c'est à dire la fermentation, lorsque la productivité en sophorolipides calculée sur les 24 premières heures de production de ce dernier cycle atteint 70 % de la productivité du premier cycle calculé sur la même période de production. Selon une caractéristique particulièrement avantageuse permettant de minimiser la présence d'acides gras dans le moût obtenu, on peut maintenir la concentration résiduelle en substrat dans la zone de réaction durant chaque cycle de fermentation à une valeur qui n'excède pas 18 grammes par litre de volume réactionnel initial pendant qu'on alimente la zone de réaction en substrat. C'est en alimentant la souche de préférence sensiblement en continu à un débit d'alimentation compris entre 0,01 et 4 grammes par heure et par litre de volume réactionnel initial que l'on peut contrôler au mieux cette concentration résiduelle en substrat et obtenir les meilleurs résultats en termes de pureté. Une alimentation discontinue par petits ajouts en général inférieurs à 10g/1 n'est toutefois pas à exclure. Le substrat généralement utilisé est au moins une huile animale, au moins une huile végétale et/ou au moins un ester de ladite huile, ladite huile ou ledit ester incorporant une chaîne linéaire aliphatique de 10 à 24 atomes de carbone. Avec la souche Candida bombicola CBS 6009, on a obtenu d'excellents résultats en termes de croissance et de production de sophorolipides. Le milieu de culture généralement choisi ainsi que le milieu minéral apporté lors de l'étape (b) peuvent contenir un sucre, par exemple du glucose. L'invention sera mieux comprise au vu des exemples suivants: EXEMPLE 1 (selon l'invention) Culture cyclique avec alimentation continue et sans décantation du moût La souche C. bombicola CBS 6009 est utilisée pour ensemencer un milieu de culture qui, indépendamment du glucose, est dépourvu de substrat. Le substrat est ajouté en continu dès le début de la culture. Il s'agit de l'ester éthylique de colza. La composition du miIieu de culture utilisé est la suivante: Glucose 100 g.1-1 (NH4)2S04 4 g.1- KH2P04 1 g.[ MgSO4, 7H20 0,5 g.1-1 Liqueur séchée de macération de maïs 5 g.1-i Glucose et MgSO4, 7H20 sont stérilisés dans un fermenteur de laboratoire de 4 litres de capacité en solution dans 1620 ml d'eau tandis que KH2PO4, (NH4)2S04 et liqueur séchée de macération de maïs sont stérilisés séparément dans une fiole d!Erlenmeyer en solution dans 180 ml d'eau. La stérilisation des deux solutions est réalisée à l'autoclave à la température de 120 C pendant 30 minutes et le milieu de culture est reconstitué après refroidissement des deux solutions. Il est ensemencé par ml d'une préculture préparée dans une fiole de Fernbach avec le mrnême milieu que le milieu de fermentation mais additionné de 10 ml d'ester éthylique de colza. Cette fiole est ensemencée par 1 g environ d'un congelat de la souche de C. bombicola. Elle est incubée sous agitation à la température de 25 C. Elle fournit après 24 heures la préculture de fermenteur. La fermentation de production est conduite dans un fermenteur de quatre litres de capacité sur un volume réactionnel initial de deux litres. L'agitation du milieu est obtenue avec une turbine RAYNERI dont la vitesse de rotation est de 1000 rpm. L'aération est fixée à 0,5 vvm d'air sous pression atmosphérique. Après auto- acidification du milieu de la culture, le pH est maintenu à la valeur constante de 3,5 grâce à une solution de soude 4N. En cours de fermentation, on procède à des additions journalières de glucose sous forme solide à raison de 100 g aux temps 24, 48 et 72 heures. L'alimentation en ester éthylique de colza est réalisée dès le début de la culture avec une pompe péristaltique dont la vitesse d'alimentation est fixée à 2,1g. par heure. On suit par des prélèvements d'échantillons la production de sophorolipides que l'on dose par la méthode de Gôbbert et al. (Biotechnol. Lett. 1984, 6, 225-230). La production qui commence après la phase de croissance augmente avec l'addition de rester éthylique de colza. Après 96. heures de culture, on soutire une partie du moût fermenté de façon à ne laisser qu'un litre de moût dans le fermenteur. On complète celui-ci à deux litres avec un litre de milieu frais contenant du glucose à la concentration de 100 g.1-1. On réalise un deuxième cycle de fermentation d'une durée de 96 heures avec le même débit d'ester de colza. On effectue alors la même opération de soutirage et de remplissage qu'à la fin du cycle précédent. On effectue ainsi au total 7 cycles de fermentation de 96 heures. On a donc fourni à la culture 500 g de glucose au premier cycle et 400 g à chacun des cycles suivants. La fourniture d'ester éthylique de colza est de 201,6 g à chaque cycle. Les sophorolipides sont récupérés à partir des différents prélèvements effectués à chaque fin de cycle ainsi que sur le prélèvement final constitué par la totalité du moût de fin de fermentation. Sur chaque prélèvement, on laisse décanter les sophorolipides pendant une heure et on les récupère. On les remet en suspension sous agitation avec 1,5 litre d'eau distillée à la température de 45 C et on les laisse décanter à nouveau pendant quatre heures. On effectue un second lavage à 45 C dans des conditions identiques à celles du premier. On récupère ainsi à l'issue du second lavage un échantillon de sophorolipides hydratés sur lequel on mesure la teneur en eau par la méthode de Karl- Fisher, la teneur en sophorolipides anhydres par la méthode de G0bbert et al. (Biotechnol. Lett.1984, 6, 225-230) et la teneur en acides gras par la méthode de Davila et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992, 38, 6-1 1). Les acides gras constituent, en effet, la principale impureté du produit. On déduit de ces mesures les productivités volumiques par rapport au volume initial (2 1) et les rendements massiques par rapport aux deux sources de carbone ajoutées, le glucose et l'ester éthylique de colza (Tableau 1) Tableau 1: Performances de la fermentation cyclique avec alimentation continue d'ester et sans décantation du produit Cycles Heures des sophorolipides Acides gras dans Productivités Rendements prélèvements anhydres (g) sophorolipides (%) (g.1-1.h1) 1 96 155 0,5 0,8 0, 22 2 192 255 0,5 1,33 0, 42 3 288 240 4 384 265 0,8 1,38 0, 44 I5 480 270 0,5 1,4 0, 45 6 576 230 7 672 450 0,7 2,34 0, 74 Moyennes 266 0,5 1,38 0,43 Cet exemple montre que la mise en oeuvre de la fermentation selon l'invention permet de maintenir la production de sophorolipides pendant au moins 672 heures de culture. La productivité volumique moyenne sur la durée de l'essai est de 1,38g.11.h-1 et le rendement massique moyen est de 0,43. Les performances du premier cycle sont plus faibles que la moyenne du fait que le temps de croissance de la souche y est plus long; celles du cycle terminal sont en revanche plus élevées du fait que lon récupère la totalité du moût contenu dans le fermenteur. EXEMPLE 2 (comparatif):Culture discontinue alimentée ou "fed-batch" sans décantation du produit On cultive, dans la même installation de fermentation, la souche selon le mode de culture du discontinu alimenté. L'alimentation en ester de colza est maintenue constante à 2,1 g par heure. On procède à des additions journalières de glucose de g aux temps 24, 48, 72, 96, 120, 144 heures. Après 144 heures de culture, la vitesse d'assimilation du glucose se ralentit progressivement. On arrête la fermentation après 192 heures, lorsque la production de sophorolipides a cessé. Les performances de cet essai sont les suivantes (Tableau 2): Tableau 2: Performances de la fermentation discontinue alimentée (fed-batch) Durée sophorolipides Acides gras dans Productivités Rendements (h) anhydres (g) sophorolipides (% (g.'1. h-1) 192 630 0,5 1,64 0,52 Cet exemple montre que la culture de la souche selon le mode discontinu alimenté ou "fed-batch" ne permet pas de maintenir l'excrétion de sophorolipides au-delà d'une durée de culture sensiblement égale à 190 heures. EXEMPLE 3 (comparatif): Culture continue en chémostat multi-étagé On utilise une installation de cinq fermenteurs fonctionnant en série. Le premier a un volume utile de 0,44 litre tandis que les quatre autres ont un volume utile de deux litres. On alimente le premier en ester éthylique de colza à raison de 2, 1 g par heure. On propage la souche dans le premier réacteur pendant 24 h (durée de la croissance) puis on lance la culture continue multi-étagée en alimentant le premier réacteur avec un flux de milieu frais (à 100 g.1-1 de glucose) de 44 ml.h-1. On récupère, à la température de 4 C pendant des périodes de 96 heures, le moût sortant du dernier fermenteur. Les performances de lessai en chémostat multi-étagé sont indiquées dans le tableau 3. Tableau 3: Performances de la culture continue en chémostat multi-étagé Collecte Période sophorolipides Acides gras dans Productivités Rendements anhydres (g) sophorolipides (% (g. 1.h-1) 1 0 à 96 h 88 0,8 0,11 0,1 2 96 à 192 h 31 3 0,04 0,5 3 192 à 288 h 5 7,8 0,01 0,01 4 288 à 384 h capacité d'excrétion de sophorolipdes. EXEMPLE 4: Culture cyclique avec alimentation discontinue et sans décantation du produit On répète l'exemple 1 en remplaçant l'addition continue d'ester de colza par des additions ponctuelles d'ester en début de chaque cycle égales à 201,6 g. Les performances de l'essai sont rassemblées dans le tableau 4. Tableau 4: Performances de la fermentation cyclique avec alimentation discontinue d'ester et sans décantation du produit Cycles Heures des sophorolipides Acides gras dans Productivités Rendements prélèvements anhydres (g) sophorolipides (% (g.1I1.h'1) I 96 70 2,5 0,36 0, 1 2 192 220 2,9 1,14 0, 36 3 288 185 2 0,96 0, 3 4 384 215 3,1 1,19 0, 35 480 195 2,9 1,01 0,32 6 576 185 3,5 0,96 0, 3 7 672 475 3 2,47 0, 78 Moyennes 220 2,8 1,15 0,35 Cet exemple montre que la culture cyclique avec alimentation discontinue de l'ester éthylique de colza produit plus de sophorolipides qu'en fed-batch mais moins de sophorolipides que culture cyclique avec alimentation continue. Sans décantation du produit De plus, les sophorolipides récupérés renferment davantage d'impuretés que dans le cas de la culture cyclique avec alimentation continue d'ester de colza. EXEMPLE 5: (selon l'invention) Culture cyclique avec alimentation continue et décantation des sophorolipides On répète l'exemple 1 en modifiant chaque cycle de la façon suivante: Avant de procéder à la récupération du moût de fermentation, on le laisser décanter pendant une à deux minutes. On récupère la totalité des sophorolipides décantés et une partie du moût de fermentation de façon à ne laisser dans le fermenteur qu'un litre de moût débarrassé de sophorolipides. Les résultats de l'essai sont rassemblés dans le tableau 5. Tableau 5: Performances de la fermentation cyclique avec alimentation continue d'ester et avec décantation du produit Cycles Heures des sophorolipides Acides gras dans Productivités Rendements prélèvements anhydres (g) sophorolipides (%) (g.l1.h-1) 1 96 235 2 192 380 3 288 345 4 384 360 480 330 6 576 355 7 672 540 Moyennes 363 le cas de la culture cyclique avec alimentation continue sans décantation du produit. EXEMPLE 6: Culture cyclique avec alimentation discontinue et décantation des sophorolipides On répète l'exemple 4 en procédant à la fin de chaque cycle à la décantation et à la récupération des sophorolipides produits. Les résultats de l'essai sont indiqués dans le tableau 6. Tableau 6: Performances de la fermentation cyclique avec alimentation discontinue d'ester et avec décantation du produit Cycles Heures des sophorolipides Acides gras dans Productivités Rendements prélèvements anhydres (g) sophorolipides %) (g.1-1.h1) 1 96 225 1 1,17 0, 32 2 192 360 1,3 1,87 0, 59 3 288 350 1,7 1,82 0, 58 4 384 345 0,9 1,79 0, 57 480 330 1,1 1,71 0,54 6 576 345 1,3 1,79 0, 57 7 672 515 2 2,68 0, 85 Moyennes 352 1,83 0,57 Cet exemple montre que la productivité et le rendement de la fermentation cyclique avec alimentation discontinue et décantation des sophorolipides sont élevés. Cependant, la pureté des sophorolipides est moins bonne, ce qui nécessitera des extractions successives par solvant, à chaud de préférence, pour atteindre un niveau de pureté comparable à celui du produit de l'exemple 5. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'une composition de sophorolipides comprenant la mise en culture dans une zone de réaction dans des conditions de culture aérée d'une souche Candida bombicola ou Candida apicola dans un milieu contenant une source d'azote, et un substrat, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend un premier cycle de fermentation comportant une étape de croissance de la souche et une étape de production d'un moût de fermentation contenant des sophorolipides au moyen d'une alimèntation de la souche en substrat, dans la zone de réaction, le procédé étant en outre caractérisé en ce qu'on effectue au moins une fois les étapes suivantes: a) on soutire une partie du moût de fermentation; b) on ajoute à la partie restante du moût un milieu minéral contenant de l'azote de façon à constituer un second milieu; c) on effectue un nouveau cycle de fermentation à partir de ce second milieu et on produit un autre moût de fermentation; la durée des dits premier et nouveau cycles de fermentation étant d'au moins 30 heures et de préférence d'au moins 70 heures, le procédé étant de plus caractérisé en ce que l'on récupère les sophorolipides du moût des étapes (a) et (c). 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on sépare le moût de fermentation produit et on récupère un moût de fermentation débarrassé au moins en partie des sophorolipides sur lequel on effectue les étapes (a) à (c). 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel on ajoute, à la partie restante du moût, du milieu minéral en quantité sensiblement égale à la quantité prélevée. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel on soutire une quantité de moût telle qu'il reste au moins 5 % en poids et de préférence 20 à 50 % du moût dans la zone de réaction. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel on interrompt chaque cycle de fermentation lorsque la productivité en sophorolipides durant le dit cycle diminue et de préférence on l'interrompt avant 140 heures de fermentation et plus particulièrement après une période de temps comprise entre 70 et 120 heures. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel on stoppe le dernier cycle de fermentation, lorsque la productivité en sophorolipides calculée sur les 24 premières heures de production de ce dernier cycle atteint 70 % de la productivité du premier cycle calculé sur la même période de production. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel on maintient la concentration résiduelle en substrat dans la zone de réaction durant chaque cycle de fermentation à une valeur qui n'excède pas 18 grammes par litre de volume réactionnel initial pendant qu'on alimente la zone de réaction en substrat. 8. Procédé selon l'une des revendication 1 à 7, dans lequel le substrat généralement utilisé est au moins une huile animale, au moins une huile végétale et/ou au moins un ester de ladite huile, ladite huile ou ledit ester incorporant une chaîne linéaire aliphatique de 10 à 24 atomes de carbone. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel le milieu minéral de l'étape (b) et le milieu de culture contiennent un sucre. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel la souche est Candida bombicola CBS 6009. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel on alimente la souche en substrat de manière sensiblement continue, à un débit d'alimentation compris entre 0,01 et 4 g par heure et par litre de volume réactionnel initial.