FR 2751657 A1 19980130 FR 9709410 A 19970724 -1 - Domaine technique de l'invention L'invention a trait à un procédé pour l'isolation de protéines anti-congélation (AFP) et à un produit alimentaire congelé contenant des AFP. Arrière-plan de l'invention On a proposé des protéines anti-congélation (AFP) pour améliorer la tolérance des produits alimentaires envers la congélation. Pour les besoins de l'invention, le terme AFP possède la signification telle que bien connue dans la technique, à savoir ces protéines qui présentent l'activité d'inhiber la croissance des cristaux de glace. Voir par exemple US 118 792. WO 90/13571 décrit des peptides anti-congélation produits chimiquement ou à l'aide de techniques de recombinaison d'ADN. On peut utiliser de manière appropriée les AFP dans les produits alimentaires. L'exemple 3B présente des formes de cristal de glace modifiées si l'on congèle un mélange de glace à l'eau en un film en combinaison avec 0,01% en poids d'AFP. WO 92/22581 décrit des AFP d'origine végétale que l'on peut utiliser pour réguler la forme des cristaux de glace dans la crème glacée. Ce document décrit également un -2- procédé d'extraction d'une composition de polypeptides à partir d'espaces extracellulaires de végétaux en infiltrant les feuilles avec un milieu d'extraction sans briser les végétaux. WO 94/03617 décrit la production d'AFP à partir de levure et leur utilisation possible dans de la crème glacée. WO 96/11586 décrit des AFP de poisson produits par des microbes. Plusieurs références bibliographiques mentionnent également l'isolation et/ou l'utilisation de protéines végétales pour une cryoprotection. Les protéines cryoprotectrices ont une fonction pour la protection des membranes végétales contre les dommages du gel. Toutefois, ces protéines ne possèdent pas de propriétés d'inhibition de la recristallisation et donc on ne les englobe pas dans les termes AFP. Hincha dans Journal of Plan Physiology, 1992, 140, pages 236 à 240 décrit l'isolation de protéines cryoprotectrices à partir de chou. Volger dans Biochimica et Biophysica Acta, 412 (1975), pages 335 à 349 décrit l'isolation de protéines de feuilles cryoprotectrices provenant d'épinard. Boothe dans Plant Physiol. (1995), 108: pages 759 à 803 décrit l'isolation de protéines provenant de Brassica 2 napus. Ici encore, on pense que ces protéines sont des protéines cryoprotectrices plutôt que des AFP. Neven dans Plant Molecular biology 21: 291 à 305, 1998 décrit la caractérisation de l'ADN d'une protéine cryoprotectrice d'épinard. Salzman dans Abstracts and Reviews of the 18th annual meeting of the ASEV/Eastern Section dans Au moins. J. Enol. Vitic. volume 44, n 4, 1993, décrit la présence de polypeptides stables à l'ébullition dans des bourgeons de Vitis. Bien que les protéines soient analogues à des -3- peptides anti-congélation de poisson, ce sont des protéines cryoprotectrices et non pas des AFP. Lin dans Biochemical and Biophysical Research Communication, volume 183, n0 3, 1992, pages 1103 à 1108 dans et Lin, Plant Physiology (1992) 99, pages 519 à 525 décrit le polypeptide cryoprotecteur de 15 kDa provenant d'Arabidopsis Hakaira. Houde dans The Plan Journal (1995) 8(4), pages 583 à 593 mentionne des protéines cryoprotectrices provenant du blé. De plus, tel qu'illustré dans l'exemple VIII, les extraits de chou, d'épinard, de Brassica napus et Arabidopsis ne possèdent pas de protéines d'inhibition de la recristallisation après chauffage. Toutefois, jusqu'à présent, on n'a pas mis en oeuvre l'utilisation des AFP dans les produits alimentaires disponibles dans le commerce. Une raison pour ceci est le coût élevé et le procédé compliqué d'obtention des AFP. Une autre raison est que l'on ne peut incorporer pas les AFP dans le mélange de formulation classique, AFP que l'on n'a jusqu'à présent pas proposé pour une utilisation dans les produits alimentaires congelés, parce qu'ils tendent à se déstabiliser au cours du traitement en particulier pendant l'étape de pasteurisation. On pense que cette déstabilisation est provoquée par la dénaturation des AFP; c'est un effet bien connu que l'on observe couramment pour les peptides et les protéines. La présente invention vise à offrir des solutions à ces problèmes. Etonnamment, il s'est avéré que l'on peut isoler des AFP provenant de sources naturelles telles que des végétaux acclimatés au froid au moyen d'un nouveau procédé relativement simple. Ce procédé conduit pour la première fois à l'identification des AFP que l'on peut incorporer de -4manière commode dans un mélange pour la préparation de produits congelés avant leur pasteurisation. Selon un premier aspect, l'invention a trait à un procédé de récupération des AFP à partir de sources naturelles, ledit procédé comprenant les étapes consistant: a) à isoler un jus contenant des AFP à partir de la source naturelle; b) à soumettre à un traitement thermique la source naturelle ou le jus contenant les AFP à une température d'au moins 60 C; c) à extraire la fraction insoluble. L'étape c du procédé ci-dessus aura habituellement lieu après les étapes a et b. On peut réaliser l'étape a et l'étape b dans un ordre quelconque souhaité, par exemple, l'étape a suivie par l'étape b (dans ce cas, on chauffera le jus riche en AFP) ou l'étape b suivie par l'étape a (dans ce cas on chauffera*la source naturelle) ou l'étape a et l'étape b simultanément. Etonnamment, nous avons trouvé que le procédé d'isolation de l'invention possédait un certain nombre d'avantages. D'abord, en utilisant le procédé, il n'est plus nécessaire d'éviter une rupture de la source naturelle, telle que des végétaux, tel que nécessaire dans le procédé WO 92/22581. Ceci augmente directement de manière importante l'aptitude à une mise en oeuvre industrielle du procédé, par exemple en comparaison à WO 92/22581, parce que les investissements très coûteux pour un traitement spécifique ne sont plus nécessaires. De même, en utilisant des températures élevées, il semble possible d'extraire à partir d'un groupe important de peptides présents dans les sources naturelles, un nouveau choix d'AFP très actifs provenant de la matière naturelle, lesdits AFP comprenant des peptides qui sont -5- très actifs en ce qui concerne les propriétés d'inhibition d'une recristallisation de glace. Troisièmement, contrairement aux attentes, l'utilisation de températures élevées ne dénature pas toute la matière protéinique, mais elle ne semble dénaturer que certaines protéines tandis que les AFP restants sont d'une stabilité accrue envers la température. Ceci permet d'inclure les AFP isolés dans des compositions qui doivent être soumises à des températures plus élevées, par exemple une étape de pasteurisation. Ceci est particulièrement étonnant, parce que, par exemple, les AFP dans WO 92/22581 ne semblent pas stables dans des conditions de chauffage (voir exemple VI). Le procédé de l'invention comprend dans l'étape b le chauffage de la source naturelle ou du jus riche en AFP jusqu'à une température supérieure à 60 C. De préférence la température est de 60 à 110 C, de manière tout particulièrement préférée de 80 à 105 C. L'étape de chauffage peut avoir lieu après isolation du jus riche en protéine (étape a) ou avant l'isolation du jus riche en protéine. On peut utiliser tout moyen approprié pour chauffer le jus, par exemple un chauffage classique ou par micro-onde, un chauffage éventuel avec un milieu d'extraction que l'on ajoute, une cuisson à la vapeur d'eau, etc. Si on utilise un milieu d'extraction, de préférence, on l'utilise en petit volume afin d'éviter une dilution inutile de la fraction AFP. On peut utiliser tout milieu d'extraction approprié, bien que l'on préfère particulièrement l'utilisation d'eau. Si souhaité, on peut ajouter des additifs à l'eau avant de l'utiliser comme milieu d'extraction. Toutefois, on utilise tout particulièrement de l'eau essentiellement exempte d'additif. - 6- On peut appliquer le procédé de l'invention à toute source naturelle d'AFP thermiquement stables. Dans cette liste, on inclut les végétaux, les poissons, les insectes et les micro-organismes. On peut utiliser à la fois les espèces d'origine naturelle ou les espèces que l'on a obtenues au moyen d'une modification génétique. Par exemple on peut modifier génétiquement des micro-organismes ou des plantes afin d'exprimer des AFP, puis on peut isoler les AFP selon la présente invention. On peut ainsi obtenir des AFP possédant une homologie d'au moins 80%, de manière particulièrement préférée de plus de 95%, de manière tout particulièrement préférée de 100% par rapport aux AFP obtenus directement de sources naturelles. Pour les besoins de l'invention, les protéines possédant ce degré élevé d'homologie sont également englobées dans le terme AFP. De même, les micro-organismes ou plantes transformés capables d'exprimer des gènes codant les AFP sont également englobés dans le champ de l'invention. On peut utiliser des techniques de manipulation génétique pour produire les AFP thermiquement stables décrits dans l'invention. On transformerait une cellule ou un organisme hôte approprié au moyen d'un produit de recombinaison de gène qui code le polypeptide thermiquement stable souhaité. On peut insérer la séquence de nucléotides codant le polypeptide thermiquement stable dans un vecteur d'expression approprié contenant les éléments nécessaires pour une transcription et une traduction, et d'une manière telle qu'ils seront exprimés dans des conditions appropriées (par exemple, selon une orientation correcte et un cadre de lecture correct et avec un ciblage et des séquences d'expression appropriés). Les procédés nécessaires à l'élaboration de ces vecteurs d'expression sont bien connus de l'homme de métier. -7- On peut utiliser un certain nombre de systèmes d'expression afin d'exprimer la séquence codant le polypeptide thermiquement stable. Ceux-ci incluent, mais ne s'y limitent pas, les bactéries, les systèmes cellulaires de levure et d'insecte, les systèmes de culture de cellules végétales et les végétaux tous transformés avec les vecteurs d'expression appropriés. On peut transformer une large diversité de végétaux et de systèmes de cellules végétales avec les produits de recombinaison d'acide nucléique des polypeptides isolés dans l'extrait thermiquement stable. Les formes de réalisation préférées incluraient, mais ne s'y limiteraient pas, le maïs, la tomate, le tabac, les carottes, les fraises, le colza et la betterave à sucre. De préférence, on extrait les AFP de végétaux (ceci signifie que soit on obtient directement les AFP à partir de la plante en tant que- source naturelle ou l'on produit de manière transgénétique les AFP ayant un degré élevé d'homologie par rapport à ces AFP, dans d'autres organismes). On peut utiliser toute plante contenant des AFP thermiquement stables, toutefois de préférence ce sont des plantes existant dans la nature (ou leur version génétiquement modifiée) qui sont capables de pousser dans des conditions de froid de sorte qu'elles contiennent des AFP. On préfère en particulier l'utilisation de seigle d'hiver, d'herbes vivaces et de joncs. D'autres plantes appropriées peuvent par exemple provenir du groupe formé par les plantes ligneuses, les céréales d'hiver, etc. De manière particulièrement préférée, on extrait les AFP thermiquement stables à partir de Acer saccharoïdes, Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex -8- aquatilis, Colobanthus quintensis et Aqrostis tenuis, Festuca contracta et Poa annua. On peut séparer le jus riche en AFP de sa source par tout procédé commode, par exemple le pressage, le filtrage, l'homogénéisation, l'extraction, etc. De préférence, on transformera la source naturelle d'AFP telle que la matière végétale en de petits morceaux ou en une suspension avant de recueillir la fraction riche en protéines, par exemple par un filtrage. On peut effectuer cette macération par tout procédé approprié, par exemple dans un mélangeur. L'homme de métier aura les compétences nécessaires pour partager la matière en une forme telle que l'on puisse facilement recueillir le jus riche en protéines. Après recueil et chauffage (dans l'ordre souhaité) de la fraction protéinique, on peut ensuite traiter l'échantillon résultant contenant les AFP par tout procédé commode afin de retirer la fraction insoluble et de retenir la fraction liquide riche en AFP. On peut retirer la fraction insoluble, par exemple par filtrage, précipitation, etc. Puis on peut encore traiter avec avantage le liquide riche en AFP afin de concentrer ou d'isoler les AFP pour les transformer en une forme adaptée à une utilisation ultérieure. Des exemples de procédés appropriés sont le séchage pour obtenir une poudre ou une pâte, une concentration de plus afin d'obtenir un concentré d'AFP, une chromatographie afin de séparer les AFP du milieu d'extraction, etc. Ici encore, l'homme de métier aura la compétence nécessaire pour déterminer le moyen et les conditions adéquates pour une isolation appropriée. Pour certaines sources naturelles, les AFP obtenus par les procédé cidessus peuvent se composer d'un mélange de deux ou plusieurs AFP différents. Si souhaité, on peut séparer ces AFP par tout procédé classique, par exemple une chromatographie ou d'autres procédés se basant sur les -9- différences des propriétés physiques/chimiques telles que la masse moléculaire. De même, si souhaité, on peut déterminer la composition en aminoacides et la séquence des AFP isolés. On peut utiliser tout procédé approprié pour leur détermination. On décrit dans les exemples, des exemples de procédés appropriés. De même, si souhaité, on peut déterminer la séquence des acides nucléiques qui codent les AFP. Les vecteurs contenant une séquence d'acide nucléique capable de coder les acides aminés sont également englobés dans le champ de l'invention. En se basant sur l'information ci-dessus, il est également possible de modifier génétiquement d'autres sources naturelles de sorte qu'elles produisent les AFP avantageux que l'on a identifiés ci-dessus. On décrit dans les exemples des exemples d'AFP appropriés. Il s'est avéré que les AFP obtenus par le procédé ci- dessus possèdent une capacité accrue à résister à un traitement thermique. On pense que de tels AFP n'ont jamais été isolés auparavant. Comme décrit ci-dessus, cette résistance thermique accrue est d'un intérêt particulier pour une utilisation dans des produits alimentaires qui subissent une étape de chauffage, par exemple une pasteurisation. En conséquence, un autre aspect de l'invention a trait à des AFP qui possèdent une stabilité thermique telle que mise en évidence par l'absence de réduction significative des propriétés d'inhibition de la recristallisation après traitement thermique pendant 1 heure à 80 C ou 10 minutes à 100 C. On décrit un essai approprié en vue de déterminer les propriétés d'inhibition de recristallisation de glace dans les exemples et il consiste en une congélation rapide à -40 C suivi par un stockage pendant une heure à 6 C. De préférence, les AFP que l'on soumet à cet essai après -10traitement thermique aboutissent à une taille de particules de cristaux de glace qui est supérieure de moins de 5 Mm à la taille de cristaux de glace d'un échantillon avec le même AFP que l'on n'a pas traité thermiquement. De préférence la différence est inférieure à 3 pm, de manière tout particulièrement préférée inférieure à 1 pm. De préférence, on choisit les AFP qui possèdent des propriétés significatives d'inhibition de recristallisation de glace. On indique dans l'exemple VI un essai approprié en vue de déterminer les propriétés d'inhibition de recristallisation. De préférence, les AFP selon l'invention présentent une taille de particule de glace à la suite d'un essai d'inhibition de recristallisation de glace, tel que décrit dans les exemples, de 15 pm ou moins, de manière particulièrement préférée de 5 à 15 pm. On peut utiliser les AFP de manière appropriée dans les produits alimentaires de préférence dans les produits alimentaires qui sont congelés ou que l'on destine à la congélation. On préfère en particulier l'utilisation des AFP dans les produits que l'on chauffe, par exemple une pasteurisation ou une stérilisation avant congélation. On préfère en particulier l'utilisation dans les produits congelés de confiserie. Des exemples de tels produits alimentaires sont: les mélanges congelés de confiserie tels que les mélanges de crème glacée et les mélanges de glace à l'eau que l'on destine à une pasteurisation avant congélation. On stocke habituellement de tels mélanges à la température ambiante. Les formes de produits appropriées sont par exemple: un mélange de poudres que l'on emballe par exemple dans un sac ou dans des sachets. Ledit mélange étant capable de former la base du produit alimentaire congelé, par exemple après ajout d'eau et éventuellement d'autres ingrédients et une aération éventuelle. -1 1- Un autre exemple de mélange approprié pourrait être un mélange liquide (éventuellement aéré) que l'on peut congeler, si nécessaire après ajout de composants supplémentaires et après une aération éventuelle supplémentaire. Le net avantage des mélanges susmentionnés est que la présence de l'ingrédient AFP permet la congélation des mélanges dans des conditions calmes, par exemple dans un congélateur de magasin ou domestique sans qu'il se forme des formes de cristaux de glace inacceptables et donc avec une texture différente de celle des produits que l'on obtient normalement par une congélation tranquille. On emballe ces mélanges de manière très commode dans des récipients fermés (par exemple, des cartons, des sacs, des boîtes, des récipients en matière plastique, etc.). Pour des portions uniques, la taille d'emballage sera en général de 10 à 1000 g. -Pour des portions multiples, des tailles d'emballage allant jusqu'à 500 kg peuvent convenir. En général, la taille d'emballage sera de 10 g à 5000 g. Comme indiqué ci-dessus, les produits préférés dans lesquels on utilise les AFP sont des produits congelés de confiserie tels que la crème glacée ou la glace à l'eau. De préférence, la concentration en AFP est de 0,0001 à 0,5% en poids par rapport au produit final. Si l'on utilise des mélanges à sec ou des concentrés, la concentration peut être plus élevée afin d'assurer que la concentration dans le produit congelé final soit dans les gammes ci-dessus. Etonnamment, il s'est avéré que les compositions de l'invention pouvaient contenir de très faibles quantités d'AFP tout en étant de très bonne qualité. Etonnamment, il s'est avéré que la concentration en AFP peut être aussi faible que 0,1 à 50 ppm tout en offrant encore des propriétés de recristallisation et une tolérance à la température adéquate dans les produits congelés de -12- confiserie. Bien que les demandeurs ne souhaitent en aucune façon être liés par une quelconque théorie, la raison de ceci peut résulter de ce que l'interaction entre les solides de la confiserie congelée et les AFP offre un excellent mécanisme d'inhibition de la croissance cristalline. De la manière la plus appropriée, la concentration en AFP est de 1 à 40 ppm, de manière particulièrement préférée de 2 à 10 ppm. Pour les besoins de l'invention, le terme "produit congelé de confiserie" comprend les confiseries congelées contenant du lait telles que la crème glacée, le yaourt congelé, le sorbet, le lait glacé et la crème anglaise congelée, les glaces à l'eau, les granitas et les purées de fruits congelées. Pour certaines applications, on préfère moins leur utilisation dans les produits alimentaires fermentés congelés. De préférence, la -concentration en solides de la confiserie congelée (par exemple, du sucre, des matières grasses, des arômes, etc.) est supérieure à 4% en poids, par exemple supérieure à 30% en poids, de manière particulièrement préférée de 40 à 70% en poids. On peut produire les produits congelés de confiserie selon l'invention à l'aide de tout procédé approprié à la production de confiserie congelée. Toutefois, de manière particulièrement préférée, on mélange entièrement tous les ingrédients de la formulation avant une pasteurisation et avant de commencer le processus de congélation. Le processus de congélation peut avec avantage comprendre une étape de durcissement, par exemple jusqu'à une température de -34 C (-30 F) ou inférieure. -1 3- Exemple I Isolation des AFP en recueillant en premier lieu le jus suivi par un traitement thermique et une isolation des AFP. On a coupé du seigle d'hiver (variété Halo) en janvier (la température moyenne pendant ce mois était de 3,5 C assurant l'acclimatation au froid appropriée des plantes). On a rapidement transporté le tissu dans le laboratoire pour un traitement supplémentaire et on l'a lavé minutieusement avec de l'eau afin d'éliminer les salissures. On a homogénéisé 400 g des tiges coupées à la température ambiante dans un mélangeur Waring avec 800 g d'eau jusqu'à briser complètement le tissu de feuille. On a recueilli le jus riche en AFP en filtrant à travers 4 couches de mousseline. Puis on a soumis le -jus riche en AFP à un traitement thermique en faisant bouillir le jus pendant 10 minutes. Ceci a provoqué la précipitation de la protéine tandis que l'AFP à utiliser selon la présente invention est resté en solution. On a séparé le surnageant du précipité par une centrifugation à 15 000 g pendant 20 minutes ou par un complément de filtration à travers de la mousseline. On peut isoler les AFP du surnageant par une lyophilisation. A des fins de témoin, on a pu obtenir un extrait apoplastique (extrait extracellulaire) de seigle d'hiver de la manière suivante: on a découpé des feuilles provenant de plants de seigle acclimaté au froid âgé de 30 jours en des longueurs de 3 cm et on les a lavées minutieusement dans de l'eau distillée afin d'éliminer tout contenu cellulaire. On a séché les morceaux de feuille en tamponnant sur une serviette en papier et on les a immergés totalement dans un mélange d'extraction de EDTA 5mM, d'acide ascorbique 10mM, -14- d'acide caproique 2mM, de benzamidine 2mM et de fluorure de phénylméthylsulphonyle lmM (PMSF). Puis on les a infiltrés sous vide dans un flacon Buchner pendant 60 minutes après quoi on a retiré les feuilles et on les a complètement séchées en tamponnant. Puis on les a disposées dans le sens de la longueur dans un cylindre de seringue en matière plastique détachable et on les a centrifugées doucement à 2000 g pendant 30 minutes. On a recueilli l'extrait apoplastique dans un tube eppendorf sous la seringue. Exemple II Isolation des AFP en chauffant d'abord la source naturelle, suivi par une isolation du jus riche en AFP et une isolation des AFP. On a coupé du tissu d'un mélange de graminées (Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis) en janvier (la température moyenne pendant ce mois était de 3,5 C assurant une acclimatation au froid appropriée des plantes). On a rapidement transporté le tissu d'herbes dans le laboratoire pour un traitement supplémentaire et on l'a lavé minutieusement avec de l'eau pour éliminer les salissures. On a placé 500 g de coupe d'herbe dans un four à micro- ondes de 650 Watts et on a chauffé à pleine puissance pendant 5 minutes, la température s'est élevée ainsi jusqu'à 85 - 100 C. Puis on a refroidi la coupe d'herbe à la température ambiante. En variante, on a mélangé les coupes d'herbe avec 500 g d'eau bouillante et on a chauffé à nouveau le mélange à 100 C, suivi par une ébullition pendant 10 minutes sous agitation, puis on l'a laissé refroidir à 60 C. Après l'étape de chauffage, on a séparé le jus riche en AFP des coupes par une filtration. On a agité en continu la masse pendant 5 minutes en présence d'un volume égal -15- d'eau, puis on l'a pressée à travers 3 couches de mousseline. On peut lyophiliser le surnageant afin d'éliminer l'eau, suivi par un stockage. En variante, on peut congeler le surnageant pour stockage. Exemple III On a fabriqué un pré-mélange liquide afin de préparer une crème glacée en mélangeant: Ingrédient % en poids Poudre de lait écrémé 11,390 Saccharose 3,140 Maltodextrine (MD40) 4,000 Gomme de caroube 0,072 Sirop de mais 63DE 20,705 Gomme de guar 0,048 Genulta L100 0,020 Beurre 9,015 Avicel RC581 0,240 Gélatine 0,140 Monoglycéride (palmitate) 0,450 Vanilline 0,010 AFP (de l'exemple I*) 0,100 ou aucun (témoin) Eau le complément * remarque: on ajoute l'AFP sous forme de solution concentrée en AFP en utilisant une partie de l'eau ajoutée comme diluant, le pourcentage se réfère à la quantité d'AFP. -16- On peut pasteuriser ce mélange de manière commode à C pendant 15 secondes et on le stocke refroidi dans une boîte. On peut utiliser les mélanges dans la préparation d'une crème glacée en les battant avec un mixer domestique classique jusqu'à un gonflement d'environ 100%, suivi par une congélation lente dans un congélateur domestique. La composition selon l'invention possédait une texture remarquablement meilleure que celle de l'échantillon témoin. On peut obtenir de très bons résultats similaires en utilisant l'AFP de l'exemple II au lieu de l'AFP de l'exemple I. Exemple IV On a préparé un pré-mélange liquide pour la préparation de crème glacée en mélangeant: Ingrédient % en poids Poudre de lait écrémé 10,00 Saccharose 13,00 Maltodextrine (MD40) 4,00 Gomme de caroube 0,14 Matière grasse du lait 8,00 Monoglycéride (palmitate) 0,30 Vanilline 0,01 AFP (de l'exemple I*) 0,01 ou aucun (témoin) Eau complément * remarque: on ajoute l'AFP sous forme de solution concentrée en AFP dans une certaine quantité de l'eau, le pourcentage se réfère à la quantité d'AFP. -17- On a mélangé les ingrédients à la température ambiante suivi par une pasteurisation pendant 60 secondes à 89 C. On a rempli aseptiquement des conditionnements de 500 ml avec le mélange, on les a scellés et stockés aux températures ambiantes. On peut utiliser le mélange pour la préparation d'une crème glacée en la battant avec un mixer domestique classique jusqu'à un gonflement d'environ 110%, suivi par une congélation dans des conditions tranquilles dans un congélateur domestique. Après deux mois de stockage, la composition selon l'invention possédait une texture remarquablement meilleure que celle de l'échantillon témoin. On obtient de très bons résultats en utilisant l'AFP de l'exemple II au lieu de l'AFP de l'exemple I. Exemple V On a répété l'exemple IV, mais on a aéré au préalable le mélange de crème glacée jusqu'à un gonflement de 70% avant le remplissage aseptique et le scellement. On peut stocker le produit résultant à la température ambiante et on peut produire une crème glacée en plaçant le mélange dans un congélateur domestique et en le congelantdans des conditions tranquilles. Exemple VI On peut déterminer les propriétés d'inhibition de recristallisation de glace des AFP de la manière suivante: On a ajusté la concentration en saccharose d'un échantillon d'un produit contenant de l'AFP à 30% en poids (si la concentration initiale de l'échantillon était supérieure à 30%, on l'y a conduit par dilution, si la concentration était plus faible, on a ajouté du saccharose jusqu'à la concentration de 30%). -18- On a placé une goutte de 3 p1 de l'échantillon sur une lame porte-objet de 22 mm. Puis on a placé une lame couvre- objet d'un diamètre de 16 mm par-dessus et on a placé un poids de 200 g sur l'échantillon afin d'assurer une épaisseur uniforme de lame. On a scellé les bords de la lame couvre-objet avec du vernis à ongles transparent. On a placé la lame sur une platine de microscope thermostaté Linkham THM 600. On refroidit rapidement la platine (50 C par minute) jusqu'à -40 C afin de produire une grande population de petits cristaux. Puis on a élevé rapidement la température de la platine (50 C par minute) jusqu'à -6 C et on l'a maintenue à cette température. On a observé la phase de glace à -6 C en utilisant un microscope Leica Aristoplan. On a utilisé des conditions de lumière polarisée conjointement avec une lame onde afin d'améliorer le contraste des cristaux de glace. On a enregistré l'état de la phase de glace (taille des cristaux de glace) au moyen d'une microphotographie en 35 mm à T=0 et T=1 heure. En général, on peut appliquer cet essai à toute composition appropriée comprenant de l'AFP et de l'eau. En général, la concentration en AFP dans une telle composition d'essai n'est pas très critique et peut être par exemple de 0,0001 à 0,5% en poids, de manière particulièrement préférée de 0,0005 à 0,1% en poids, de manière tout particulièrement préférée de 0,001 à 0,05% en poids, par exemple de 0,01% en poids. On peut utiliser toute composition appropriée comprenant de l'AFP et de l'eau pour effectuer l'essai. Toutefois, en général il ne sera pas nécessaire d'obtenir l'AFP sous une forme purifiée. Pour les applications pratiques, il suffira normalement de préparer un extrait liquide ou un jus de la matière naturelle, dans lequel on peut ensuite tester cet extrait ou ce jus. -19- On peut appliquer ce procédé par exemple aux extraits contenant de l'AFP obtenu dans l'exemple I ou II, avec ou sans une étape de concentration. On a mesuré les propriétés d'inhibition d'une recristallisation de plusieurs échantillons. On a obtenu les échantillons à partir de seigle que l'on a récolté à plusieurs dates au cours de l'année. On a mesuré les propriétés de recristallisation comme ci-dessus des jus AFP obtenus après extraction et chauffage selon l'exemple I. A titre de comparaison, on a utilisé du seigle que l'on a fait pousser dans une serre (à des températures qui n'induisent normalement pas de formation de l'AFP). On a mesuré les tailles de cristaux de glace suivantes: Echantillon Taille des cristaux de glace après 1 heure (Um) Témoin 25 Echantillon de décembre 17 Echantillon de janvier 10 Echantillon de février 15 Echantillon de mars 18 Echantillon d'avril 18 Echantillon de mai 25 Ces mesures indiquent que pour une bonne activité d'AFP, on doit récolter les plantes pendant les mois d'hiver, par exemple de décembre à avril. On préfère particulièrement des échantillons capables d'offrir des tailles de cristaux de glace de 15 pm ou moins. Dans ce cas, on peut le réaliser en récoltant les plantes en janvier ou en février. -20- On a effectué les mêmes mesures sur les échantillons d'AFP de janvier qui avaient subi un traitement thermique (1 heure à 60 C). On n'a observé aucune diminution significative des propriétés de recristallisation. A titre de comparaison, on a utilisé l'extrait apoplastique de l'exemple I. Ceci a abouti à une taille finale des cristaux de glace après 1 heure de 11,1 pm; après traitement thermique par une ébullition pendant 10 minutes à 100 C, le résultat de l'essai après 1 heure était une taille de cristal de glace de 16,8 pm. Cet exemple montre que l'extrait apoplastique provenant de seigle d'hiver n'est pas thermiquement stable. Exemple VII On a obtenu un extrait d'herbe n'ayant pas subi de traitement thermique provenant d'herbe récoltée en janvier de chez Silsoe (Royaume-Uni). On a centrifugé l'extrait pendant 1 heure afin d'éliminer la terre et les débris insolubles de la manière suivante, centrifugeuse; Sorvall RC3C, rotor: H6000A, température: +5 C, vitesse de rotor: 5000 tr/mn (7268 g). On a lyophilisé un échantillon de l'extrait afin de déterminer sa teneur totale en matières solides. On a trouvé qu'elle était de 11,48 mg/ml. On a ensuite réhydraté l'extrait sec avec une solution de saccharose à 30% jusqu'à sa concentration initiale totale en solides. On a préparé plusieurs solutions en diluant l'extrait autant que nécessaire avec une solution de saccharose à 30%. On a mesuré une activité anti-congélation en utilisant l'essai de l'exemple VI. On a mesuré les tailles moyennes de cristaux de glace d'après les images prises à T=0 et T=1 heure provenant des essais de recristallisation, en utilisant l'analyseur Zeiss -21- TGA 10. On présente les résultats obtenus dans le tableau ci-dessous. Echantillon Solides Taille des cristaux de glace (jum) Croissance des totaux cristaux de glace (mg/ml) T=0 | T1 heure à -61C en 1 heure à - 6 C (jim) T=0 ITIhueh- Non dilué 11,48 5,2 7,3 2,1 %d'extrait 5,74 5,5 7,6 2,1 %d'extrait 2,87 6,3 8,9 2,6 12,5%d'extraitt, 435 6,6 13,1 6,5 6,25%d'extrait0,7175 8, 1 14,7 6,6 3,125%d'extrait0,359 7,4 17, 0 9,6 1,5625% 0,179 9,0 20,3 11,3 d'extrait Ces résultats montrent la variation de la taille finale des cristaux et la modification de la taille des cristaux de glace pendant 1 heure à -6 C pour diverses dilutions de l'extrait d'herbe. On peut constater que l'on peut faire varier la teneur en solides dans l'extrait d'herbe dans une large plage tout en obtenant encore de bonnes propriétés d'inhibition de recristallisation. De préférence, on choisit les concentrations qui aboutissent à une taille de cristaux de glace après 1 heure de 15 pm ou moins. On a effectué un essai similaire avec un extrait d'herbe que l'on n'avait pas soumis à un traitement thermique (10 minutes à 1000C). On n'a observé aucune détérioration significative des propriétés d'inhibition de recristallisation. En outre, on a testé les extraits d'herbe de l'exemple II en utilisant le même essai d'inhibition de recristallisation. On a obtenu les résultats suivants: -22- Traitement thermique Taille de cristal en pm T=O T=1 C, 1 heure 9,6 11,1 Ebullition pendant 10 minutes 9,8 11,3 Ces résultats montrent que même après avoir chauffé l'extrait de l'herbe acclimatée au froid, celui- ci conservait sa capacité d'inhiber la croissance des cristaux de glace. Exemple VIII On a récolté plusieurs plantes contenant de l'AFP en janvier. On a obtenu des extraits en broyant du tissu frais, par exemple des racines, des tiges, des bourgeons ou des feuilles avec un pilon et un mortier (refroidis à 4 C), dans un volume égal de tampon A (EDTA 10mM, acide ascorbique 20 mM, tamponné avec Tris à un pH de 7,4) D maintenu sur de la glace. On a filtré les homogénats à travers une ou plusieurs couches de mousseline et on les a gardés sur de la glace avant une utilisation ultérieure. On a soumis les extraits à l'essai d'inhibition de recristallisation de l'exemple VI à la fois après chauffage à 60 C pendant 1 heure et après ébullition pendant 10 minutes. Les plantes suivantes contenaient des AFP thermiquement stables, tel que mis en évidence par la conservation des propriétés d'inhibition de recristallisation: Acer saccharoïdes, Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, -23- Colobanthus quintensis et Aqrostis tenuis, Festuca contracta, et Poa annua. Les plantes suivantes ne contiennent pas d'AFP thermiquement stables: le chou, l'épinard, Brassica napus et Arabidopsis. Exemple IX On peut évaluer l'activité d'hystérésis thermique des AFP de la manière suivante. On a placé des échantillons de 1 ml dans des tubes eppendorf dans un bain d'eau chaude et on a chauffé pendant i heure à 60 . Puis on a mesuré les propriétés d'hystérésis thermique de l'échantillon de la manière suivante: On place le produit fondu sur une micro-lamelle (Camlab Cambridge, longueur de chemin 0,1 mm). On a scellé les extrémités de la micro-lamelle avec de la gelée de pétrole. On introduit de la glace dans l'échantillon en utilisant une pulvérisation d'aérosol provoquant une congélation. Puis on a immergé la lame dans un bain d'éthanol thermostaté à -0,1 C. Après équilibration pendant minutes, on vérifie l'échantillon. Si la glace fond complètement, on abaisse la température du bain par pas de 0,1 C suivi par une équilibration. On répète ces étapes 2 jusqu'à atteindre une température o il existe une faible quantité de cristaux de glace dans l'échantillon. Après équilibration à cette température, on diminue la température du bain en pas de 0,01 C par minute. On enregistre le point de congélation de l'échantillon comme étant la température à laquelle débute la propagation de la glace à partir des cristaux équilibrés. Puis on détermine la température de fusion de l'échantillon en augmentant la température en partant du point de congélation, par pas de 0,01 C par minute, jusqu'à -24- ce que tous les cristaux de glace fondent. Cette température est la température de fusion de l'échantillon. L'hystérésis thermique de l'échantillon est la différence entre la température de fusion et la température de congélation. Ce procédé d'essai s'effectue sur un premier échantillon (avant un traitement thermique) et sur un deuxième échantillon après traitement thermique suivi par un refroidissement. De manière similaire, on peut déterminer la stabilité thermique à l'aide de l'essai ci-dessus dans lequel on fait bouillir l'échantillon dans de l'eau pendant 30 secondes suivi par une détermination de l'hystérésis thermique. On a mesuré l'hystérésis thermique de plusieurs échantillons. On a obtenu les échantillons à partir de seigle d'hiver que l'on a récolté à plusieurs dates au cours de l'année. On a mesuré l'hystérésis thermique, comme dans l'exemple VI, des jus de- AFP obtenus après extraction et chauffage selon l'exemple I. A titre de comparaison, on a utilisé du seigle d'hiver que l'on a fait pousser dans une serre (à des températures qui normalement n'induisent pas une formation d'AFP). Echantillon IHystérésis thermique ( C) Témoin 0,04 Echantillon de décembre 0,18 Echantillon de janvier 0,21 Echantillon de février 0,17 Echantillon de mars 0,15 Echantillon d'avril 0,12 Echantillon de mai 0, 05 -25- Ces mesures montrent que pour obtenir une bonne activité d'AFP, on doit récolter les plantes pendant les mois d'hiver, par exemple de décembre à mars. On a effectué les mêmes mesures sur les échantillons d'AFP de janvier que l'on avait soumis à un traitement thermique (1 heure à 60 C). On n'a observé aucune diminution significative de l'hystérésis thermique. Exemple X Détermination de la séquence des acides aminés des AFP On a concentré approximativement 10 fois l'extrait d'herbe thermiquement stable de l'exemple II en utilisant une chambre d'ultrafiltration Amicon avec une membrane de coupure à 10 kDa. On a chargé le concentré résultant dans une colonne échangeuse d'anion FPLC MonoQ (Pharmacia) HR /5. La fixation à la colonne s'est effectuée dans un tampon Tris/HCl 50mM, pH 8,5, et la fraction active inhibant la recristallisation était éluée avec un gradient linéaire de NaCl jusqu'à une concentration finale de 0,5M dans le même tampon Tris de pH 8,5. On a réalisé une chromatographie à un débit de 1 ml/min-1 et on a recueilli des fractions de 1 ml et on a testé leur activité d'inhibition de recristallisation (comme dans l'exemple IX). On a regroupé ensemble les fractions actives et on les a concentrées jusqu'à un volume de 0,05 ml sur un concentreur centrifuge Centricon (Amicon) tournant à 10 000 tr/mn pendant 10 minutes dans un rotor Sorvall SS 34 (8 x ml). On a chargé le concentré sur une colonne de filtration à gel Superdex 75 PC 3.2/30 fonctionnant sur un système de microséparation Smart (Pharmacia). On a élué la colonne avec un tampon Tris/HCl 50mM, pH 8,5, à un débit de 0,05 ml/min-1. On a recueilli des fractions de 0,05 ml après que l'on a chargé l'échantillon jusqu'à un volume -26- total de 3,5 ml. On a évalué l'activité d'inhibition de recristallisation des fractions (comme dans l'exemple IX) et on a soumis les fractions les plus actives à une séparation sur un gel SDS-PAGE et à un buvardage électrophorétique avant séquençage N-terminal. Les fractions actives Superdex 75 ont été absorbées dans le tampon de chargement du gel (Tris/HCl 50mM, pH 6,8, % de glycérol, dithiothréitol 10mM, 2% de SDS) puis on les a séparées sur un gel de polyacrylamide en suivant le procédé de Laemmli. Après électrophorèse, on a mis le gel en sandwich contre une feuille de membrane Problott (Perkin-Elmer) mouillée au méthanol et on l'a soumis à un électrobuvardage sous 20 volts pendant 16 heures dans un tampon d'acide 3(cyclohexylamino)-1-propanesulfonique (CAPS) 10mM (pH 11, 0) contenant 10% de méthanol. Après buvardage, on a lavé brièvement avec du méthanol puis avec de l'eau milli Q (millipore) et on a visualisé les protéines fixées avec une solution de bleu brillant coomassie à 0,1% (p/v). 2 0 On a visualisé deux bandes de protéines de masse moléculaire apparente 25 kDa et 35 kDa au moyen de la coloration coomassie. La protéine de 35 kDa semblait correspondre de manière particulièrement étroite aux fractions les plus actives d'inhibition de recristallisation. On a excisé deux de ces bandes avec une lame de scalpel et on les a soumises à un séquençage. On a également soumis à un séquençage une zone non colorée de la membrane correspondant à une masse moléculaire apparente de à 75 kDa puisqu'une coloration par l'argent des gels des fractions les plus actives avaient montré précédemment une bande de protéines à cette masse moléculaire. On a réalisé le séquençage de toutes les trois zones excisées de membrane en les chargeant dans une cartouche de séquençage Blott et on a déterminé la séquence en utilisant -27- des cycles de réaction et de conversion tels que décrits par le fabricant (Perkin-Elmer). On donne ci- dessous les énumérations des séquences N-terminales. L'AFP de 25 kDa comprend une séquence partant de la terminaison N, essentiellement homologue à: ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL- X-ILE-VAL-PRO-THR L'AFP de 35 kDa comprend une séquence partant de la terminaison N, essentiellement homologue à: ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP- ALA-ALA-X-VAL-PRO L'AFP de 65 à 70 kDa AFP comprend une séquence partant de la terminaison N, essentiellement homologue à: X-GLU-GLN-PR0O-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR Dans chaque séquence, X désigne une substance inconnue qui peut être un aminoacide quelconque trouvé dans les protéines végétales. Pour les besoins de l'invention, le terme essentiellement homologue désigne un chevauchement d'au moins 80% dans les acides aminés, de manière particulièrement préférée de plus de 90%, de manière tout particulièrement préférée de 95 à 100%. -28- REVENDICATIONS 1. Procédé de récupération des AFP à partir de sources naturelles, ledit procédé comprenant les étapes consistant: a) à isoler un jus contenant des AFP provenant de la source naturelle; b) à traiter thermiquement la source naturelle ou le jus contenant des AFP à une température d'au moins 60 C; c) à retirer la fraction insoluble. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les étapes a et b (dans un ordre quelconque) ont lieu avant l'étape c. 3. AFP ayant une stabilité thermique telle que mise en évidence par l'absence d'une réduction significative des propriétés d'inhibition de recristallisation de glace après un traitement thermique pendant 1 heure à 60 C, 1 heure à C ou 10 minutes à 100 C. 4. AFP selon la revendication 3, dans lesquels la taille de cristal de glace d'une composition d'un AFP traité thermiquement dans de l'eau après une congélation rapide à -40 C suivie par un stockage à -6 C pendant 1 heure est supérieure de moins de 5 Mm à la taille de cristal de glace du même AFP qui n'a pas subi de traitement thermique. 5. AFP selon la revendication 3 ou 4, dans lesquels la taille de cristal de glace d'une composition d'AFP dans de l'eau après congélation rapide à -40 C suivie par un stockage à -6 C pendant 1 heure, est de 15 pm ou moins. 6. AFP selon la revendication 3 ou 4 comprenant une ou plusieurs protéines possédant une masse moléculaire de kDa, 35 kDa et de 65 à 75 kDa. -29- 7. AFP selon la revendication 6 ayant une séquence N-terminal, essentiellement homologue à: - un AFP de 25 kDa ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU- VAL-X-ILE-VAL-PRO-THR - un AFP de 35 kDa: ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL- TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO - un AFP de 65 à 75 kDa AFP: X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR 8. Vecteur contenant une séquence d'acides nucléiques capable de coder au moins un des AFP selon la revendication 7. 9. Organisme transformé capable d'exprimer au moins un des AFP selon la revendication 7. 10. Produit congelé de confiserie comprenant de 0,0001 à 0,5 %- en poids de l'AFP selon la revendication 3. 11. Prémélange approprié à une utilisation dans la production d'un produit congelé de confiserie selon la revendication 10, comprenant l'AFP selon la revendication 3. 12. Procédé de préparation d'un produit congelé de confiserie consistant en la préparation d'un mélange de formulation comprenant un AFP à raison de 0,0001 à 0,5% en poids, ledit AFP ayant une stabilité thermique telle que mise en évidence par l'absence d'une réduction significative des propriétés d'inhibition de recristallisation de glace après un traitement thermique pendant 1 heure à 60 C, 1 heure à 80 C ou 10 minutes à C, suivi par une congélation du mélange dans des conditions tranquilles.