FR 2743817 A1 19970725 FR 9600743 A 19960123 1 2743817 La présente invention concerne un nouvel équivalent de peau, son procédé d'obtention, I'équivalent d'épiderme compris dans cet équivalent de peau et son procédé de préparation. On cherche à mettre au point, depuis plusieurs années, des modèles de peau reconstruite qui permettent d'effectuer les études nécessaires à la meilleure compréhension du rôle de la peau tant dans le domaine mécanique que dans le domaine physiologique. Ainsi, des modèles plus ou moins proches de la peau humaine ont pu être mis au point. On peut citer par exemple les modèles décrits dans les brevets ou dans les demandes de brevets EP 285471, EP 285474, EP 418035, WO-A- 9116010, EP 197090, EP 20753, FR 2665175, FR 2689904. De manière très générale, les modèles de peau reconstruite décrits dans ces ID documents sont constitués de kératinocytes humains déposés sur un support, souvent un équivalent de derme, et cultivés dans des conditions telles qu'ils entrent dans un programme de différenciation aboutissant à la formation d'un équivalent d'épiderme. Cependant, l'épiderme humain naturel est composé principalement de trois types de cellules qui sont les kératinocytes, très majoritaires, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Chacun de ces types cellulaires contribue par ses fonctions propres au rôle essentiel joué dans l'organisme par la peau. Les mélanocytes sont localisés dans la couche basale de l'épiderme. Ils sont le siège de la mélanogenèse et du fait de leur contact étroit avec les kératinocytes ils transfèrent à ceux-ci la mélanine néosynthétisée sous la forme de mélanosomes, donnant ainsi à la peau sa coloration. Le type et la quantité de mélanine contenue dans les mélanosomes détermine la coloration de la peau. De plus, la mélanine constitue principalement un écran efficace pour la 1 protection contre les rayonnements solaires en particulier les rayonnements ultraviolets. Un modèle de peau reconstruite ayant incorporé des mélanocytes est décrit dans la demande de brevet WO-A-9351165. Les cellules de Langerhans sont impliquées dans les défenses immunitaires de la peau. On sait depuis longtemps que celles-ci occupent une place essentielle dans les défenses immunitaires de l'hôte, en particulier comme première barrière face aux agressions extérieures. 2 2743817 Les cellules de Langerhans sont des cellules dérivées de la moelle osseuse qui jouent un rôle décisif dans l'initiation des réponses immunitaires dirigées contre les antigènes introduits dans la peau ou nouvellement générés par celle-ci. Mises en contact avec un allergène, les cellules de Langerhans migrent vers les ganglions o elles déclenchent les réactions spécifiques des cellules-T. A ce titre, elles sont donc assimilées aux cellules de présentation des antigènes, essentielles aux fonctionnement des lymphocytes T. 1o Ainsi, la principale fonction des cellules de Langerhans est de fournir un signal sensitif dans la réponse immunitaire de la peau induite contre une grande variété d'antigènes incluant les allergènes de contact, les antigènes tumoraux et les microorganismes. On peut donc en conclure que ces cellules interviennent probablement dans un grand nombre de pathologies de la peau. On comprend donc que les modèles de peau reconstruite décrits dans l'art antérieur ne permettent que des études incomplètes du rôle et/ou des réactions de la peau. En effet, en l'absence des cellules de Langerhans, cellules 2r essentielles pour les défenses immunitaires de la peau, aucun de ces modèles n'a permis à ce jour de réaliser in vitro des études tant immunologiques que pharmacologiques ou toxicologiques. Or, I'industrie des cosmétiques utilise de plus en plus de composés nouveaux dans les compositions qu'elle met au point. Un des problèmes majeurs auquel elle est confrontée est l'évaluation des effets néfastes que ces composés pourraient induire au contact de la peau. Et pour des raisons d'éthique il est évident que cette évaluation ne peut être 3u pratiquée ni sur l'homme, ni sur les animaux. La demanderesse qui, depuis de longues années, s'intéresse au domaine des peaux reconstruites, a maintenant découvert qu'il est possible d'incorporer des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans dans un modèle de peau reconstruite. La présente invention a donc pour objet un modèle de peau reconstruite, caractérisé par le fait qu'il comprend un équivalent d'épiderme sur un support, 3 2743817 ledit équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans. Dans la peau normale, les cellules de Langerhans sont localisées dans la partie suprabasale de l'épiderme. Préférentiellement, le modèle de peau reconstruite selon l'invention présente des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans localisés dans la partie suprabasale de l'équivalent d'épiderme. I( Il est bien entendu que l'équivalent de peau de l'invention peut comprendre tout autre type cellulaire qui pourrait y être incorporé. Les cellules de Langerhans purifiées à partir de prélèvement de peau sont des cellules dont le cycle de différenciation est déjà induit. La culture in vitro de i telles cellules se résume à un maintien en survie du fait de l'incapacité pour ces cellules de se multiplier. De ce fait, I'incorporation de ces cellules dans un modèle de peau reconstruite n'a, jusqu'à présent, pas été envisagée. La demanderesse a cependant réussi à établir un procédé de préparation d'un équivalent de peau comprenant un équivalent d'épiderme sur un support, ledit 2) équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans. L'invention à également pour objet un procédé pour la préparation d'un équivalent de peau tel que décrit ci-dessus, caractérisé par le fait que l'on cultive simultanément sur le support des kératinocytes et des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans. Le support utilisé selon l'invention peut être l'un quelconque de ceux décrits dans l'art antérieur. A titre d'exemple, on citera comme support les lattices mixtes collagène/fibroblastes, le derme préalablement désépidermisé, les membranes artificielles comme par exemple les filtres de marque Millipores, les substituts sous-cutanés à base de collagène, le plastique ou tout autres support compatible avec la viabilité cellulaire. Préférentiellement, le support est constitué par un derme préalablement désépidermisé. 4 2743817 Quelque soit le support choisi, le protocole pour sa mise en oeuvre utilisé selon l'invention peut-être l'un quelconque des protocoles décrits dans l'art antérieur. Préférentiellement, selon l'invention lorsque le support est constitué par un derme préalablement désépidermisé on met en oeuvre le protocole décrit dans Prunieras et collaborateurs, Ann. Chir. Plast., 1979, 24,n 4, 357-362. Selon l'invention, pour obtenir l'équivalent d'épiderme comprenant au moins I( des kératinocytes et des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans, on cultive simultanément sur le support au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs de cellules de Langerhans. I; Les kératinocytes utilisés selon l'invention peuvent être préparés selon toute méthode connue de l'art antérieur. On citera à titre d'exemple la culture à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale ou la culture de keratinocytes issus de la gaine du follicule pileux. :,, Préférentiellement, selon l'invention les kératinocytes utilisés sont préparés à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale selon la méthode décrite dans Régnier et collaborateurs, Frontier of Matrix Biology, Vol.9, 4-35 (Karger, Basel 1981). Les cellules de Langerhans utilisées selon l'invention peuvent être purifiées à partir de prélèvement de peau normale. Ces cellules ont progressé dans leur cycle de différenciation. Toute cellule de Langerhans purifiée à partir de peau normale peut être utilisée selon le procédé de l'invention, quelque soit son stade de différenciation. Préférentiellement, les cellules sont choisies parmi celles présentant un stade de différenciation précoce. La purification des cellules de Langerhans à partir de prélèvement de peau peut s'effectuer selon tout protocole connu de l'homme du métier. Avantageusement, on utilisera le protocole de purification décrit dans Kobayashi et coll., Eur. J. Immunol. 1994; 24: 2254-2257. 2743817 Les précurseurs de cellules de Langerhans peuvent être toute cellule souche apte à se différencier en cellules de Langerhans. Par exemple, ces cellules peuvent être des leucocytes, des monocytes ou des cellules hématopoïétiques CD34+(Caux et collaborateurs, Nature, Vol. 360, Nov. 1992, 258). Avantageusement, selon l'invention on utilise des cellules hématopoïétiques CD34+. Les précurseurs de cellules de Langerhans peuvent être purifiés à partir des tissus dans lesquels ils se trouvent, parmi lesquels on peut citer la moelle osseuse, le sang périphérique, le cordon ombilical. Préférentiellement, on utilise selon le procédé de l'invention des précurseurs de cellules de Langerhans préparés à partir de sang périphérique ou de cordon ombilical. Toute méthode de purification peut être utilisée à cette fin. On citera par exemple celle décrite dans Caux et collaborateurs, Nature, Vol. 360, Nov. 1992, 258. Il est bien entendu qu'il est possible d'utiliser pour la préparation de l'équivalent de peau des précurseurs de cellules de Langerhans non encore induits et de procéder à l'induction une fois que ces cellules sont mises en culture. Inversement, il est possible de procéder à l'induction de ces cellules avant leur mise en culture. Selon le procédé de l'invention, les précurseurs de cellules de Langerhans cultivés simultanément avec les kératinocytes sont préférentiellement des cellules induites avant mise en culture. La différenciation de ces précurseurs de cellules de Langerhans peut être induite par toute méthode connue. On citera par exemple la différenciation induite par les cytokines telles que le facteur de stimulation de colonies (Granulocyte/Macrophage - Colony Stimulating Factor ou GM-CSF), le facteur de nécrose tumorale (Tumor Necrosis Factor ou TNF-a), le facteur de cellules souches (Stem Cell Factor ou SCF) ou encore l'interleukine 4. 6 2743817 Avantageusement, I'induction de la différenciation s'effectuera par la combinaison de plusieurs de ces cytokines. Selon le procédé de l'invention les cellules de Langerhans ou les précurseurs des cellules de Langerhans sont mis en culture à tout stade de l'élaboration de l'équivalent d'épiderme. Avantageusement, le procédé selon l'invention comporte une étape dans I( laquelle les cellules de Langerhans et/ou les précurseurs des cellules de Langerhans sous mis en culture avec les kératinocytes en un temps qui permet leur localisation suprabasale dans l'équivalent d'épiderme. Préférentiellement, les cellules de Langerhans ou les précurseurs des cellules I) de Langerhans sont mis en culture à un temps choisi entre le moment o la couche suprabasale de l'équivalent d'épiderme commence à se former et le moment o les kératinocytes différenciés commencent à former la première couche du stratum corneum. r Encore plus préférentiellement, les cellules de Langerhans et/ou les précurseurs de cellules de Langerhans sont mis en culture à un temps choisi entre le moment o la couche suprabasale de l'équivalent d'épiderme commence à se former et le cinquième jour de culture. 2 Le milieu de culture utilisé pour le procédé selon l'invention peut être tout milieu de culture connu pour sa capacité à permettre la prolifération et la différenciation des kératinocytes. Avantageusement, après ensemencement des kératinocytes sur le support, la culture est maintenue immergée dans un milieu nutritif qui peut être par exemple le milieu décrit par Reynwald et Green (Cell, 1977, 6, 331-343), milieu qui permet la prolifération des kératinocytes. Après un temps de culture de 3 à 5 jours, I'équivalent de peau est préférentiellement maintenu à l'interface air/liquide par exemple par dépôt sur une grille métallique. Le liquide est alors préférentiellement constitué du même milieu nutritif que le précédent, à la différence prêt que seuls 3 des facteurs de croissances initialement contenu dans le milieu de Reynwald et Green sont 7 2743817 conservés aux mêmes concentrations, à savoir le facteur de croissance épidermique (EGF), I'insuline et l'hydrocortisone. La culture se poursuit ensuite jusqu'à obtention d'un l'équivalent de peau présentant les caractéristiques recherchées. Ainsi, la culture se poursuit pendant une durée comprise entre 5 et 30 jours. Le modèle de peau.reconstruite ainsi réalisé est constitué de deux entités, le support et l'équivalent d'épiderme, qu'il est possible de séparer physiquement l'un de l'autre. L'équivalent d'épiderme peut alors être utilisé séparément du support. L'invention concerne donc également un équivalent d'épiderme, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans et son procédé de préparation, tel que décrit ci-dessus. Préférentiellement, I'équivalent d'épiderme selon l'invention présente des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans localisés dans sa partie suprabasale. Bien entendu, I'équivalent de peau qui présente la meilleure similitude avec la peau normale est l'équivalent de peau qui contient les trois types cellulaires essentiels présents dans la peau normale. Ainsi, avantageusement, le modèle de peau reconstruite selon l'invention comprend en outre des mélanocytes. L'invention concerne avantageusement un équivalent d'épiderme contenant des keratinocytes, des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans et des mélanocytes. Les mélanocytes utilisés selon l'invention peuvent être purifiées à partir de tout organe en contenant comme par exemple la peau normale ou le follicule de cheveu. 8 2743817 Préférentiellement, on utilise des mélanocytes purifiés à partir de peau normale. Toute méthode de purification connue de l'art antérieur peut être utilisée pour préparer ces mélanocytes. On peut citer par exemple la méthode décrite dans Olsson et collaborateurs, Acta Derm. Venereol., 1994, 74, 226-268. Pour obtenir un équivalent de peau contenant les trois types cellulaires présents dans la peau normale, il est nécessaire de cultiver simultanément des kératinocytes, des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs de cellules de Langerhans et des mélanocytes sur un support. Ainsi, selon un autre mode particulier du procédé de l'invention, celuici se caractérise par le fait que l'on cultive simultanément sur un support, des kératinocytes. des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans et des mélanocytes. 9 2743817 REVENDICATIONS 1. Equivalent de peau, caractérisé par le fait qu'il comprend un équivalent d'épiderme sur un support, ledit équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans. 2. Equivalent de peau selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le support est choisi parmi les lattices mixtes collagène/fibroblastes, le derme I( préalablement désépidermisé, les membranes artificielles comme par exemple les filtres de marque Millipores, les substituts sous-cutanés à base de collagène, le plastique ou tout autre support compatible avec la viabilité cellulaire. Iv 3 Equivalent de peau selon la revendication 2, caractérisé par le fait que le support est constitué par du derme préalablement désépidermisé. 4 Equivalent de peau selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre des mélanocytes. Equivalent de peau selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que les cellules de Langerhans et/ou les précurseurs des cellules de Langerhans ont une localisation suprabasale dans l'équivalent d'épiderme. 6 Procédé de préparation d'un équivalent de peau tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l'on cultive simultanément sur un support des kératinocytes et des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que le support est constitué par du derme préalablement désépidermisé. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisé par le fait que les kératinocytes sont obtenus par la culture à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale ou la culture de kératinocytes issus de la gaine du follicule pileux. 2743817 9. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que les kératinocytes sont obtenus à partir de prélèvement de peau normale. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé par le fait que les cellules de Langerhans sont purifiées à partir de prélèvement de peau normale. 11. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que les cellules de Langerhans présentent un stade de différenciation précoce. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé par le fait que les précurseurs des cellules de Langerhans sont purifiées à partir de moelle osseuse, de sang périphérique, de cordon ombilical. i5 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que les précurseurs de cellules de Langerhans sont choisis parmi les leucocytes, les monocytes ou les cellules hématopoïétiques CD34+. 14. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que les précurseurs de cellules de Langerhans sont des cellules hématopoïétiques CD34+. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9 et 12 à 14, caractérisé par le fait que la différenciation des précurseurs de cellules de Langerhans est induite avant ou après leur mise en culture par une cytokine choisie parmi le facteur de stimulation de colonies, le facteur de nécrose tumorale, le facteur de cellules souches et l'interleukine 4. 16. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que la différenciation est induite par la combinaison de plusieurs cytokines. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9 et 12 à 16, caractérisé par le fait que la différenciation des précurseurs de cellules de Langerhans est induite avant leur mise en culture. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 17, caractérisé par le fait que les cellules de Langerhans et/ou les précurseurs des cellules de 1 1 2743817 Langerhans sont mis en culture avec les kératinocytes en un temps permettant leur localisation dans la partie suprabasale de l'équivalent d'épiderme. 19. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que les cellules de Langerhans et/ou les précurseurs de cellules de Langerhans sont mis en culture à un temps choisi entre le moment o la couche suprabasale de l'équivalent d'épiderme commence à se former et le moment o les kératinocytes différenciés commencent à former la première couche du stratum corneum. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé par la fait que les cellules de Langerhans et/ou les précurseurs de cellules de Langerhans sont mis en culture à un temps choisi entre le moment o la couche suprabasale de l'équivalent d'épiderme commence à se former et le cinquième jour de culture. 21 Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 20, caractérisé par le fait que l'on cultive en outre simultanément des mélanocytes. 22. Equivalent d'épiderme, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs des cellules de Langerhans. 23 Equivalent d'épiderme selon la revendication 22, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre des mélanocytes. 24. Equivalent d'épiderme selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23, caractérisé par le fait que les cellules de Langerhans et/ou les précurseurs des cellules de Langerhans ont une localisation suprabasale.