FR 2740973 A1 19970516 FR 9513512 A 19951115 NOUVELLE FORME D'ADMINISTRATION DE L' HYDROXOCOBALAMINE ET SON UTILISATION DANS LES INTOXICATIONS PAR LES CYANURES La présente invention se rapporte au domaine de la pharmacie, et plus particulièrement à celui de la chimie thérapeutique. La présente invention a plus particulièrement pour objet une nouvelle forme d'administration d'hydroxocobalamine servant dans le traitement des intoxications aux cyanures. On connait déjà des agents pour lutter contre les effets mortels de l'intoxication aux cyanures. Le Kélocyanor , qui se présente sous forme de solution injectable, est un sel dicobaltique de l'acide édétique. Le sel dicolbatique de l'acide édétique est ionisé en édétate de cobalt - et en cobalt +; I'ion cobalt se combine avec deux ions cyanure -; le sel dicobaltique s'ionise de nouveau lentement pour produire un autre ion cobalt qui se combine également avec deux ions cyanure. Les complexes cyanure-cobalt sont très stables et sont éliminés dans I 'urine. L' inconvénient de ce médicament est que l'on trouve du cobalt seul, sous forme ionisée, présentant un grand degré de toxicité et provoquant une multitude d'effets indésirables. On a déjà proposé d'utiliser des solutions d'hydroxocobalamine pour lutter contre les intoxications provoquées par l'acide cyanhydrique ainsi que pour diagnostiquer une hypercyanogénèse chronique (Brevet français N 2 153 156). Dans ce brevet précédent, on avait recours à des compositions toutes prêtes d'hydroxocobalamine, combinées avec du thiosulfate de sodium. Ces compositions étaient destinées au traitement aigu par administration intraveineuse et au traitement chronique par administration intramusculaire. La posologie qui y est décrite prévoit de pouvoir administrer des doses très élevées d'hydroxocobalamine pouvant aller jusqu'à 30000 pg. Ces trousses anti-cyanure nécessitaient donc des doses considérables d'hydroxocobalamine. De plus la combinaison avec le thiosulfate de sodium conférait à l'ensemble une stabilité 2 2740973 insuffisante, le thiosulfate de sodium étant notamment une substance réductrice et alcaline. On connait également la combinaison de l'hydroxocobalamine avec du Na2S203 pour le traitement de 1' empoisonnement par le cyanure (" Chemical Abstracts ", Vol 64, 1966, colonne 14 849, a-d). La présente invention permet de remédier à ces défauts de stabilité en proposant une nouvelle composition thérapeutique présentant l'hydroxocobalamine sous forme lyophilisée que l'on peut redissoudre au moment de l'emploi dans une solution saline, de préférence du sérum physiologique. Le sérum physiologique présente l'avantage d'être stable car il ne s'oxyde pas et ne se réduit pas, d'être neutre car il n'est pas alcalin, de plus il permet une dissolution quasi-instantanée du lyophilisat. Ces caractéristiques sont importantes car le domaine de stabilité de l'hydroxocobalamine est relativement étroit: les solutions alcalines, les solutions réductrices, les solutions oxydantes dégradent l'hydroxocobalamine et lui font perdre ses propriétés. La forme lyophilisée présente de nombreux avantages, elle permet une conservation indéfinie ainsi qu'une redissolution quasi-instantanée, à condition d'avoir été effectuée en milieu légèrement acide. De façon naturelle, I'hydroxocobalamine présente un pH alcalin, mais la stabilité de I'hydroxocobalamine est meilleure à pH acide. Les éléments bibliographiques, ainsi que les monographies " Hydroxocobalamine injection " des différentes pharmacopées montrent que les solutions d'hydroxocobalamine doivent être stabilisées notamment par addition de substances protectrices ( acides aminés). Dans tous les cas, le pH est fixé à des valeurs se situant entre 3.5 et 5, alors que la solution d'hydroxocobalamine base présente un pH voisin de 9. 3 2740973 La présente invention se caractérise donc par le fait que l'on obtient un lyophilisat d'hydroxocobalamine stable en procédant à la lyophilisation à partir d'une solution aqueuse légèrement acide, de préférence entre 3,5 et 5,5. La zone optimale de pH s'échelonne de 4,0 à 5,0. Le pH acide est obtenu en ajoutant à la solution d' hydroxocobalamine un acide minéral fort ou un acide organique, comme par exemple de l'acide chlorhydrique, de l'acide sulfurique ou de l'acide acétique en quantité calculée. Il était nécessaire de vérifier que l'acidification de la solution d'hydroxocobalamine base par de 1' acide chlorhydrique ne bloquait pas le site actif de la molécule et que celle-ci conservait son pouvoir d' échange OH-≤ CN-. Des essais de cyanuration ont été menés et ont montré que la totalité des ions cyanure introduits étaient fixés. Pour les besoins de la lyophilisation, il peut être avantageux d' ajouter à la solution aqueuse une substance inerte neutre, comme par exemple le chlorhydrate d'arginine, le lactose, le glycocolle ou l'acétate de sodium. Dans la solution aqueuse d' hydroxocobalamine on peut ajouter aussi un agent tampon comme par exemple un sel de sodium d'acide organique. Selon un mode d'exécution préféré de l'invention, la solution à lyophiliser contient exclusivement de l'acide chlorhydrique, et de cette façon, le culot de lyophilisation est parfaitement homogène. La lyophilisation en milieu acide évite la dégradation et donne finalement un produit plus pur et plus stable. La concentration en hydroxocobalamine dans la solution à lyophiliser s'échelonne de 1,0 à 5,0 g et de préférence entre 2,0 et 3.0 g pour 100 ml. L'invention comprend également un procédé d'obtention des compositions pharmaceutiques à base d'hydroxocobalamine qui consiste à préparer une solution 4 2740973 d'hydroxocobalamine dans l'eau, à ajuster le pH à une valeur allant de 3, 0 à 5,0 par addition ménagée d'un acide minéral ou organique et, le cas échéant d'un agent de charge et/ou, d'un agent tampon, puis à procéder à la lyophilisation, à préparer par ailleurs des ampoules de solution saline d'un volume compris entre 20 et 150 ml. La solution saline utilisée pour la remise en solution est de préférence une solution de chlorure de sodium et en particulier une solution isotonique au plasma à 9 p. mille dans 1' eau purifiée. L'invention a encore pour objet la trousse d'urgence pour le traitement des intoxications aux cyanures, constituée d'une part par le flacon de lyophilisat renfermant entre 1,0 et 5,0 g d'hydroxocobalamine et d'une ampoule renfermant de à 150 ml d'une solution saline permettant la remise en solution de l'hydroxo- cobalamine. Ces trousses manifestent une parfaite stabilité et peuvent donc être conservées dans les armoires à médicament pendant une longue période. L'invention a encore pour objet l'utilisation des trousses à base d'hydroxocobalamine en vue du traitement des intoxications aiguës ou chroniques par les cyanures, qui consiste à administrer par voie intraveineuse le contenu reconstitué de la solution aqueuse d' hydroxocobalamine. EXEMPLE 1 COMPOSITION UNITAIRE 1) Formules des solutions d'hvdroxocobalamine avec ajustement du pH a) Hydroxocobalamine base 0,250 g Acétate de sodium 0,540 g tampon pH = 4,6 Acide acétique 0,240 g Eau ppi qsp 10,000 ml 2740973 b) Hydroxocobalamine base 0,250 g Acétate de sodium 0,188 g Chlorure de sodium 0, 041 g Acide acétique 0,041 g Eau ppi qsp 10,000 ml c) Hydroxocobalamine base 0,250 g HCI 0,1 N qsp pH = 4,0 Eau ppi qsp 10,000 ml d) Hydroxocobalamine base 0,250 g HCI 0,1 N qsp pH = 5,0 Eau ppi qsp 10,000 ml e) Hydroxocobalamine base 0,250 g Acétate de sodium 0,166 g Chlorure de sodium 0,041 g Acide acétique qsp pH = 4,0 Eau ppi qsp 10,000 ml 2) Formules des solutions d'hvdroxocobalamine avec sustances protectrices f) Hydroxocobalamine base 0,250 g Arginine, chlorhydrate 0,010 g Eau ppi qsp 10,000 ml g) Hydroxocobalamine base 0,250 g Lactose 0,033 g Eau ppi qsp 10, 000 ml 6 2740973 h) Hydroxocobalamine base 0,250 g Glycocolle 0,033 g Eau ppi qsp 10,000 ml Les solutions f), g) et h) ont été divisées en 2 et chaque moitié a été acidifiée. i) On reprend la formule précédente, mais en flacons perfusion de 250 ml à 2,5 g d' hydroxocobalamine: Hydroxocobalamine base 2,5 g HCI 0,1 N qsp pH = 4,0 Eau ppi qsp 100,0 ml EXEMPLE 2 SOLUBILITE DU LYOPHILISAT DANS LE SERUM PHYSIOLOGIQUE 1) Mode opératoire Ajouter à un flacon de lyophilisat (environ 2,5 g) 125 ml de sérum physiologique. Agiter énergiquement le flacon pendant 30 secondes exactement. Filtrer immédiatement la solution sur membrane en acétate de cellulose, de porosité 0,45 pm et de diamètre 47 mm (SARTORIUS réf. 11106). Après égouttage de la membrane (face inférieure posée sur papier filtre absorbant), examiner sous un microcoscope les particules qui y sont éventuellement présentes. Examiner également les parois du flacon pour vérifier que la solubilité a été totale. Puis introduire le filtre avec les particules recueillies dans un bécher contenant 25,0 ml de phase mobile utilisée pour l'analyse CLHP. Tremper le filtre rapidement et l'agiter pour décrocher ou solubiliser les particules éventuellement présentes. Injecter la solution obtenue en CLHP. 7 2740973 2) Essais effectués Deux essais ont été effectués sur: - 1 flacon de lyophilisat + 125 ml de sérum physiologique conservés à la température du laboratoire (21 C) - 1 flacon de lyophilisat + 125 ml de sérum physiologique conservés au réfrigérateur avant utilisation (+ 5 C). 3) Résultats L'examen visuel des flacons vidés permet de constater qu'aucune particule non dissoute ne reste présente sur les parois du flacon pour les 2 conditions de température testées. L'examen au microscope de la membrane permet de visualiser quelques petits cristaux incolores et 1 ou 2 cristaux de couleur rosée. Le résultat est similaire dans les deux conditions de température. L'analyse par CLHP des solutions ayant servi à tremper les filtres (avec le résidu éventuel recueilli) indique que la quantité d'hydroxocobalamine retrouvée représenterait au maximum 0,03 % de la quantité présente dans les flacons. Le résultat est similaire pour les deux conditions de conservation testées. Ce pourcentage recouvre en fait l'hydroxocobalamine solubilisée amenée par la solution qui imprègne le filtre et éventuellement de l'hydroxocobalamine non solubilisée. 8 2740973 EXEMPLE 3 STABILITE DE LA SOLUTION APRES RECONSTITUTION PENDANT LA DUREE DE LA PERFUSION 1) Conditions opératoires a) Préparation des solutions a Essai avec exposition à la température et lumière ambiantes du laboratoire Ouvrir un flacon de lyophilisat à 2,5 g d'hydroxocobalamine. Ajouter 125 ml d'une solution de chlorure de sodium à 9 p. mille dans l'eau purifiée. Agiter manuellement vigoureusement pendant 30 s. 1 5 A l'aide d'une pipette jaugée, introduire 5,0 ml de la solution obtenue dans une fiole jaugée de 100 ml. Compléter au volume avec la phase mobile utilisée pour la chromatographie. Injecter immédiatement cette solution en CLHP (analyse au temps TO). Conserver le flacon contenant la solution reconstituée à la lumière du jour et température ambiante (20 à 22 C) sur une étagère devant une fenêtre du laboratoire. Le laboratoire est également éclairé par des lampes du type néon. Après 2h, 4h, 6h et 8h de conservation de la solution reconstituée dans les conditions ci-dessus, procéder à des prélèvements dans le flacon et à l'analyse extemporanée du prélèvement par CLHP comme indiqué pour l'analyse initiale au temps TO. Essai avec exposition sous une lampe UV à 366 nm Procéder comme indiqué dans l'essai avec exposition à la température et lumière ambiantes du laboratoire, en conservant la solution reconstituée sous une lampe UV à 366 nm. 9 2740973 Procéder a un prélèvement au temps TO et après 1 h, 3h et 5h de conservation sous UV à 366 nm. b) Analyses chromatoaraphiques L'aire du pic d'hydroxocobalamine intacte et la teneur en substances apparentées dans les solutions reconstituées au temps 0 et après conservation sont déterminés par CLHP. 2) Résultats Les résultats détaillés des analyses CLHP réalisées sur les prélèvements effectués après différents temps de conservation des solutions d'hydroxocobalamine obtenues après reconstitution d'un flacon de lyophilisat (environ 2,5 g d'hydroxocobalamine base avec 125 ml de solution de NaCI à 9 p. mille), sont présentés: dans le tableau 1: pour la solution reconstituée conservée dans les conditions de température et de lumière ambiantes du laboratoire, dans le tableau 2: pour la solution reconstituée sous lampe UV à 366 nm. La valeur absolue des teneurs en substances apparentées mesurées dans la solution reconstituée n'est pas tout à fait exacte. Elle est calculée pour un volume final exact de 125 ml. Elle est cependant comparable tout au long de la conservation d'une même solution. Pour juger de la stabilité des solutions d'hydroxocobalamine, on doit s'intéresser principalement: * à l'évolution de l'aire du pic d'hydroxocobalamine mesurée à chaque temps de conservation par rapport à l'aire du pic d' hydroxocobalamine mesurée sur la même solution au temps TO; 2740973 à l'évolution des teneurs en substances apparentées mesurées en cours de conservation par rapport aux teneurs en substances apparentées mesurées au temps TO sur la même solution. Evolution de la teneur en hydroxocobalamine intacte retrouvée en cours de conservation: Après 8 heures de conservation de la solution reconstituée dans les conditions de lumière et de température ambiantes du laboratoire et après 5 heures de conservation sous lampe UV à 366 nm, on n'observe pas de diminution significative de l'aire du pic d'hydroxocobalamine par rapport aux analyses effectuées au temps TO sur les solutions reconstituées. S'il y a baisse de la teneur en hydroxocobalamine, cette baisse est faible et insuffisante pour pouvoir être mise en évidence par CLHP compte tenu de la précision de la méthode d'analyse. Evolution des teneurs en substances apparentées de l'hvdroxocobalamine en cours de conservation: L'augmentation des teneurs en substances apparentées de l'hydroxocobalamine mises en évidence par CLHP, après 8 heures de conservation dans les conditions ambiantes de température et de lumière du laboratoire et après 5 heures de conservation sous lampe UV à 366 nm reste très limitée: environ 1 p. cent. il 2740973 TABLEAU 1 DOSAGE DE L'HYDROXOCOBALAMINE ET DES SUBSTANCES APPARENTEES APRES RECONSTITUTION EXPOSITION A LA LUMIERE DU JOUR TR TRR termino 100% TO T 2H T4H T6H T8H 9.108 0.45 57616 58786 59985 54130 58406 59531 SURFACES 10.883 0.54 66134 64167 69257 63020 68001 70589 11.882 0.59 23607 37327 49821 38212 46438 44820 13.735 0.68 20859 14089 20064 10884 1672 17123 16.388 0.82 16894 20932 29e09 22837 Ni 259S2 17.725 0.88 179243 220728 224772 243505 299941 276644 20.052 1.00 18379040 18341948 18863300 17675508 18279040 18168326 26.043 1.30 29265 49659 30579 50000 61549 45724 38.49 1.92 9212 151908 215684 205421 194838 190731 53.145 2.65 26971 27447 22015 41413 sonme Si 402830 617596 726942 715456 767760 772527 tamin lot 57917 PT 61.65 mg T% sec 100.8 c 1.022 mg/rl H% 17.8 tkrni5% S= 930847 T% tIel que 828576 TRR TO T2H T4H T6H T8H MM(g) 2.656 2.656 2.656 2656 2656 % 0.45 0.32 0.32 0.33 0.30 0.32 0.33 de 0.54 0.36 0.35 0.38 0.35 0.37 0.39 0.59 0.13 0.20 0.27 0.21 0.25 0.25 substances 0.68 0.11 0.08 0.11 0.06 0.09 0.09 0.82 0.09 0.11 0.16 0.13 0.14 apparenties 0.88 0.98 1.21 1.23 1.34 1.65 1.52 1.00 1.30 0.16 0.27 0.17 0.27 0.34 0.25 1.92 0.05 0.83 1.18 1.13 1.07 1.05 265 0.00 0.00 0.15 0.15.0.12 0.23 substances appa (%): 2.21 3.39 3.99 3.93 4.21 4.24 % en hydroxocobalmlne part rapport a TO 100.0% 102.8% 96.4% 99.7% 99.1% NI: non itégr6 * pnis en compb dans le pic de TRR 0.88 12 2740973 TABLEAU 2 DOSAGE DE L'HYDROXOCOBALAMINE ET DES SUBSTANCES APPARENTEES APRES RECONSTITUTION EXPOSITION SOUS LAMPE UV 366 nm TR TRR tenoin 100% TO 0 T1H T3H T 5H 9.423 0.43 58375 61403 57524 59669 61494 SURFACES 11.38 0.52 62877 71503 66314 69342 69934 12.423 0.57 29963 47572 48343 42826 34806 14.49 0.67 24104 23374 18195 12293 9748 17.425 0.80 27503 27183 39478 38154 42460 18.797 0.87 172368 220359 207299 233187 275029 21.715 1.00 18203892 18167878 17683928 18236596 18135146 28.758 1.32 25323 28171 76643 32907 72284 43.806 2.02 7027 179220 212275 207668 212788 60.277 2.78 24889 36611 52788 somme Si 407540 658785 748960 732657 831331 tnimn lot 57917 PT 61.65 mg T% sec 100.8 c 1.022 nmg/l H% 17.8 tunoi5% S= 951271 T% tel que 82_8576 TRR trorin 100% TO 0 TIH T3H T 5H MM(g) 2656 2.656 2.656 2.656 # 0.43 0.31 0.33 0.31 0.32 0.33 de 0.52 0.34 0.38 0.36 0.37 0.38 0.57 0.16 0.26 0.25 0.23 0.19 substances 0.67 0.13 0.13 0.10 0.07 0.05 0.80 0.15 0.15 0.21 0.20 0.23 apparentes 0.87 0.93 1.18 1.11 1.25 1.48 1.00 1.32 0.14 0.15 0.41 0.18 0.39 202 0.04 0.96 1.14 1_12 1.14 2.78 0.00 0.00 0.13 0.20 0.28 subsbances apparentées (%): 2.19 3.54 4.02 3.93 4.44 % en hydroxocobalarine par rapport à TO 100.0% 97.3% 100.4% 99.8% 13 2740973 3) Conclusion Les résultats de cette étude montrent une stabilité satisfaisante du lyophilisat d'hydroxocobalamine reconstitué avec une solution aqueuse de chlorure de sodium à 9 p. mille dans les proportions retenues pour l'administration du produit, sur une période couvrant largement le temps nécessaire pour l'administration d'un flacon de lyophilisat par perfusion lente. L'essai de conservation réalisé sous lampe UV à 366 nm semble confirmer que le facteur lumière ne serait pas un paramètre très critique pour la conservation des solutions d'hydroxocobalamine pendant la durée nécessaire à l'administration du produit par perfusion. 14 2740973 REVENDICATIONS 1. Nouvelles compositions pharmaceutiques contenant de l'hydroxocobalamine sous forme lyophilisée caractérisées en ce que l'hydroxocobalamine est lyophilisée en milieu acide de manière à se redissoudre de façcon quasi- instantanée dans une solution saline neutre. 2. Nouvelles compositions pharmaceutiques contenant de l'hydroxocobalamine sous forme lyophilisée selon la revendication 1, caractérisées en ce que l'on redissout l'hydroxocobalamine dans une solution de chlorure de sodium et notamment du sérum physiologique. 3. Nouvelles compositions pharmaceutiques contenant de l'hydroxocobalamine sous forme lyophilisée selon les revendications 1 et 2 caractérisées en ce que le i15 milieu acide utilisé pour la mise en solution initiale du lyophilisat permet d'obtenir une solution stable et se conservant bien. 4. Un procédé d'obtention du Iyophilisat d'hydroxocobalamine selon la revendication 1 caractérisé en ce que la solution d'hydroxocobalamine est réalisée en milieu acide éventuellement additionné d'un agent de charge et en ce que l'on procède ensuite à la lyophilisation dans le récipient destiné à être utilisé. 5. Un procédé d'obtention du lyophilisat d'hydroxocobalamine selon la revendication 4, caractérisé en ce que le milieu acide de dissolution a un pH variant de 3,5 à 5,5. 6. Un procédé d'obtention du lyophilisat d'hydroxocobalamine selon les revendications 4 et 5, caractérisé en ce que le pH de la solution s 'échelonne de 4,0 à 5,0. 7. Un procédé d'obtention du lyophilisat d'hydroxocobalamine selon les revendications 4 à 6, caractérisé en ce que le pH acide est obtenu en ajoutant à 1 5 2740973 la solution d'hydroxocobalamine un acide minéral fort ou un acide organique, et notamment de l'acide chlorhydrique, de l'acide sulfurique ou de l'acide acétique en quantité calculée. 8. Un procédé d'obtention du lyophilisat d'hydroxocobalamine selon les revendications 4 à 7, caractérisé en ce que l'on ajoute éventuellement à la solution aqueuse un agent de charge choisi parmi le chlorhydrate d'arginine, le lactose, le glycocolle ou l'acétate de sodium. 9. Un procédé d'obtention du lyophilisat d'hydroxocobalamine selon les revendications 4 à 8, caractérisé en ce que l'on ajoute éventuellement à la solution aqueuse un agent tampon constitué par un sel de sodium d'acide organique. 10. Un procédé d'obtention du lyophilisat d'hydroxocobalamine selon les revendications 4 à 9, caractérisé en ce que la concentration en hydroxocobalamine dans la solution à lyophiliser s'échelonne de 1 à 5 g pour mI. 11. Un procédé d'obtention du lyophilisat d'hydroxocobalamine selon la revendication 10, caractérisé en ce que la concentration en hydroxocobalamine dans la solution à lyophiliser s 'échelonne de préference entre 2 et 3 g pour 100 mI. 12. Un procédé d'obtention des compositions pharmaceutiques à base d'hydroxocobalamine qui consiste à préparer une solution d'hydroxocobalamine dans de l'eau, à ajuster le pH à une valeur allant de 3 à 5 par addition ménagée d'un acide minéral ou organique et, le cas échéant d'un agent de charge et/ou d'un agent tampon, à procéder à la lyophilisation, et à préparer par ailleurs des ampoules de solution saline d'un volume compris entre 20 et 150 ml. 13. Un procédé d'obtention des compositions pharmaceutiques à base d'hydroxocobalamine selon la revendication 12, dans lequel la solution saline 16 2740973 utilisée pour la remise en solution est une solution de chlorure de sodium et en particulier une solution isotonique au plasma à 9 p. mille dans l'eau purifiée. 14. Trousses d'urgence pour le traitement des intoxications aux cyanures constituées d'une part, par le flacon de lyophilisat d'hydroxocobalamine, obtenu selon les revendications 4 à 11, renfermant entre 1 et 5 g d'hydroxocobalamine et d'autre part, d'une ampoule renfermant de 20 à 150 ml d'une solution saline permettant la remise en solution de l'hydroxocobalamine. 15. Utilisation des trousses d'urgence à base d'hydroxocobalamine selon la revendication 14 en vue du traitement des intoxications aiguës ou chroniques par les cyanures, qui consiste à administrer par voie intraveineuse le contenu reconstitué de la solution aqueuse d'hydroxocobalamine selon la revendication 1.