FR 2738015 A1 19970228 FR 9509980 A 19950822 1 2738015 La présente invention a pour objet des nouvcllcs séqucnccs d'ADN et des plasmides susceptibles de s'hybrider avec celle-ci, porteurs d'au moins un mécanisme de résistance aux phages, les bactéries lactiques contenant ces séquences d'ADN ou ces plasmides, en particulier les lactocoques appartenant à l'espèce Lactococcus lactis, l'utilisation de certaines souches de ces lactocoques pour transférer, notamment par conjugaison, un mécanisme de résistance aux phages à des souches d'intérêt industriel, en particulier dans l'industrie laitière, et à l'utilisation de certaines souches de Lactococcus lactis pour obtenir ces plasmides. Les bactéries lactiques sont impliquées dans l'élaboration et la conservation d'un grand nombre de produits alimentaires, tels que les fromages, le beurre, les yaourts, le saucisson ou la choucroute. Parmi ceux-ci les produits laitiers occupent une place particulièrement importante. La transformation industrielle du lait est faite dans des cuves de fermentation de plus en plus grandes, dans lesquelles l'apparition de phages des bactéries lactiques peut avoir des conséquences graves, voire catastrophiques: variation des caractéristiques, notamment organolcptiques, du produit final; pcrtc du produit présent dans la cuve et nécessité de décontamincr cettc dmernière ainsi que les installations environnantes. Il existe donc dans l'industrie laitièrc un besoin impérieux de nouveaux moyens et de nouvelles méthodes permettant de rendre les bactéries plus résistantes aux phages. Les phages des bactéries lactiques appartiennent à trois grands groupes d'homologie (1), (II) et (III) définis par des études d'hybridation ADN/ADN selon RELANO P. et al (1987), J. Gen. Microbiol. 133, 3053-3063. Les groupes (I) et (III) comprennent uniquement des phages virulents. Le groupe (II) comprend des phages virulents et des phages tempérés. A l'intérieur d'un même groupe les homologies sont fortes et, d'un groupe à l'autre, les homologies sont très faibles. Les phages du groupe (I) ont une nucléocapside oblongue alors que les phages des groupes (II) et (III) ont une nucléocapside isométrique. On sait qu'il existe plusieurs mécanismes naturels de résistance aux phages dont les trois principaux sont: - l'inhibition de l'adsorption des phages; dans ce mécanismc, l'adsorption du phage par la bactérie est inhibée ou retardée. - le système restriction/modification; ce système fait intervenir une enzyme de restriction qui dégrade l'ADN du phage dès son entrcée dans la bactérie. - l'infection abortive; selon ce troisième mécanisme, l'adsorption des phages est normale, mais leur multiplication ne se produit pas. Ces mécanismes sont décrits en détail par SANDERS M. dans Biochimie 70, (1988), 411-421. 2 2738015 De nombreuses études ont déjà été effectuées pour mettre au point des bactéries lactiques résistantes aux phages. A cet effet, on peut se référer en particulier aux articles ci-après: VLEGELS et al.; Neth. Milk and Dairy J. 43 (1989) 245-259 - SANDERS and KLAENHAMMER. Applied and Environ. Microbiol. (1983) vol. 46, 1125-1133 qui concernent des plasmides qui inhibent l'adsorption des phages; Audrey W. JARVIS; Applied and Environ. Microbiol.; March 1988 p. 777-783; - EP-A3-0208 468; - COFFEY et al.; Neth. Milk and Dairy J. 43 (1989) 229-244; - KLAENHAMMER and SANOZKY; Journal of Gencral Microbiology (1985), 131, 1531-1541 - DURMAZ et al.; J. Bacteriol. (1992) 7463-7469 qui décrivent des plasmides qui confèrent une résistance aux phages par le mécanisme d'infection abortive. - JOSEPHSEN and KLAENHAMMER, Plasmid 23, 71-75 (1990) - MOINEAU et al.; Applied and Environ. Microbiol. (1995) 2193-2202 - brevet US 4 883 756 - GAUTIER and CHOPIN; Applied and Environ. Microbiol. (1987) 53 p. 923- 927, - McLANDSBOROUGH et al.; Applied and Environ. Microbiol. (1995) 2023- ces derniers articles décrivent notamment des plasmides conférant la résistance aux phages par le mécanisme de restriction/modification. Dans la demande EP-A1-452 224 une séquence d'ADN comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages est égalcmcnt décrite; cette séquence d'ADN comporte une partie fonctionnelle du fragment HindllI-Hindlll d'environ 3,3 kb du plasmide pPF 144-1 présent dans la souche Escherichia coli déposée le 9 avril 1991 à la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France) sous le N 1-1070. Ce fragment HindIII-HindII d'environ 3,3 kb, a été isolé à partir du plasmide pPF144 contenu dans la souche Lactococcus lactis ssp lactis, déposé à la C.N.C.M. le 12 avril 1990 sous le N' 1-945, laquelle est un transconjugant issu du croisement de la souche donneuse Lactococcus lactis ssp lactis S91 déposée à la C.N.C.M. le 12 Avril 1990 sous le N 1-940 et de la souche réceptrice Lactococcus lactis ssp lactis S45, dérivée de la souche 3 2738015 Lactococcus lactis ssp lactis C2-LL Mc. Kay etali, 1977, dans J. Bacteriol., 257-265. Ce fragment est porteur d'un ou plusieurs mécanismes de résistance aux phages. A la suite de ces travaux, une séquence d'ADN de 1,9 kb qui confere à elle seule la résistance aux phages a 6t6 isolée à partir de cette séquence d'ADN HindII-HindIl de 3,3 kb. Cette nouvelle séquence d'ADN d'environ 1,9 kb a été décrite dans EP-A1-643134. La demanderesse a isolé un fragment de 3704 paires de bases (pb) par une digestion partielle à l'aide de l'enzyme de restriction Sau3A de l'ADN total de la souche S94 de Lactococcus lactis ssp diacetylactis déposée à la C.N.C.M. le 12 Avril 1990 sous le N 1-941. Ce fragment est porteur d'un ou plusieurs m6canismes de résistance aux phages et confere à lui seul la résistance aux phages. Par la suite, à partir de cette séquence d'ADN de 3704 pb, la demanderesse a isolé une séquence d'ADN de 1345 pb qui confère à elle seule la résistance aux phages. La présente invention a donc pour objet deux nouvelles séquences d'ADN comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, lesdites séquences ayant respectivement: -3704 pb et présentant l'enchaînement d'acides nucléiques ci-après [SEQ ID N' 1]; - 1345 pb et présentant l'enchaînement d'acides nucléiques ci-après [SEQ ID N3]; Les séquences [SEQ ID N' 2] et [SEQ ID N 4] sont les séquences d'acides aminés déduites respectivement des séquences [SEQ ID N' 1] et [SEQ ID N'3]. La séquence [SEQ ID N3] est un fragment d'ADN de 1345 pb compris dans la séquence [SEQ ID N 1]. Ce fragment de 1345 pb peut être obtenu par la méthode PCR à l'aide des deux oligonucléotides ci-après: Oligonucléotide N 1 [SEQ N' 5]: ' TCATAGGQAT CAATAATCAACTAGCAATCG 3' amHI Oligonucléotide N 2 [SEQ N' 6]: ' CATTAIGTCGACAAATACAGGCTCTATAAAGC 3' SaI L'invention a également pour objet les séquences d'ADN qui présentent un degré d'homologic élevé avec les séquences d'ADN ci-dessus [SEQ ID N 1] et [SEQ ID N'3]. Un degré d'homologie élevé signifie une homologie (rapport entre les nucléotides identiques et le nombre total de nucléotides) d'au moins 70 %, et de préférence d'au moins 80 %, des séquences de nucléotides, lorsqu'elles sont alignées d'après l'homologie maximale, selon la méthode d'alignement optimal des séquences de Needleman et Wunsch, 1970; J. Mol. 4 2738015 Biol., 48, 443-453. Cette méthode est notamment utilisée dans le logiciel UWGCG de l'Université du Wisconsin: Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711-8721 - option GAP. L'invention a également pour objet lcs plasmides transformés avec l'une des séquences d'ADN selon l'invention. Ces plasmidcs pcuvcnt êtrc par cxemple le plasmide pLDP1 dans lequel on a cloné, selon les techniques habituelles bien connues de l'homme de l'art, l'une des séquences d'ADN selon l'invention. Le plasmide pLDP1 dérive du plasmide pVA838 (Macrina F.L et al, Gene 19, 345-353) par délétion du fragment de 1523 pb compris entre le site HffindIII (0) et le site EcoRI (1523) et remplacement de celui-ci par 54 paires de bases correspondant aux sites multiples de clonage du plasmide pUC18 (Yanisch - Perron C. t alI: 1985 - Gene 33, 103-119) bordés par les sites EcoRI et HindIII. L'invention a également trait aux bactéries lactiques résistantes aux phages, de préférence appartenant à l'espèce Lactococcus lactis, qui contiennent au moins une des séquences d'ADN ou un plasmide tels que définis ci-dessus. 1 5 Ces séquences d'ADN ou ces plasmides peuvent avoir été introduits dans les bactéries lactiques par conjugaison, transformation, fusion de protoplastes ou par toute autre méthode de transfert de gènes bien connue de l'homme du métier. Les bactéries lactiques qui peuvent avantageusement être transformées à l'aide des séquences d'ADN selon l'invention ou d'un plasmidc les contenant sont par exemple les souches Lactococcus lactis ssp cremoris, Lactococcus lactis ssp lactis, Lactococcus lactis ssp lactis var. diacetylactis. Ces souches ainsi transformées peuvent être utilisées pour transmettre par conjugaison, transformation, transduction, fusion de protoplastes ou toute autre méthode de transfert de gènes bien connue de l'homme du métier, un mécanisme de résistance aux phages à une souche d'intérêt industriel. Ce mécanisme peut être porté par un plasmide ou par une autre partie du génome de la bactérie. Lorsque celui-là est porté par un plasmide il est avantageux de le transférer par conjugaison. L'invention a également trait aux souches d'intérêt industriel résistantes aux phages ainsi obtenues. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ci-après, qui comprennent des résultats expérimentaux et une discussion de ceux-ci. Certains de ces exemples concernent des expériences effectuées dans le but de réaliser l'invention, d'autres concernant des exemples de réalisation de l'invention donnés bien sûr à titre purement illustratif. Une grande partie de l'ensemble des tcchniques décrites dans ces exemples, bien connues de l'homme de l'art, est exposée en détail dans l'ouvrage de Sambrook Fritsch et 2738015 Maniatis: "Molecular cloning; a Laboratory Manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New York (2e édition). La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des figures 1 à 2 ci-après qui représentent respectivement: FIG. 1: Organisation des ORF déduites dc la séqucnce du fragmcnt de 3704 paires de bases. FIG. 2: Amplification par PCR de 2 fragments internes au fragment de 3704 pb conférant la résistance aux phages. Exemple 1: Séquence du fragment de 3704 pb La souche S94 de Lactococcus lactis ssp diacetylactis déposée à la C.N.C.M. le 13 Avril 1990 sous le N' 1-941, contient un ou plusieurs mécanismes de résistance aux phages. En particulier, elle a transféré par conjugaison dans la souche réceptrice Lactococcus lactis S45, dérivée de la souche Lactococcus lactis C2-LL décrite par McKay et al., 1977, J. Bacteriol. 257-265, le plasmide pPF72 qui confère la résistance aux phages 0 53 (groupe I) et 0 59 (groupe III). D'autres mécanismes de résistance aux phages peuvent être présents dans la souche 1-941. Cest pourquoi une banque d'ADN total a été construite à partir de la souche 1-941. Le fragment de restriction de 3704 pb conférant la résistance aux phages, obtenu par une digestion partielle à l'aide de l'enzyme dc restriction Sau3A de l'ADN total de la souche S94 (I-941) a été cloné dans le vecteur pLDP1 au site BamHI. Le piasmide recombinant pLAB206, obtenu, confère à la souche Lactococcus lactis ssp lactis S56 une résistance totale au phage 0 59. La séquence d'acides nucléiques de ce fragment de 3704 pb déterminée par la méthode de Sanger et al. (PNAS-USA, 14, 5463, 1977) est la séquence [SEQ IDN 1] ci- après. L'analyse de la séquence a montré que le fragment de 3704 pb possède 2 phases de lecture ouvertes complètes (ORF1 et ORF2) et deux phases de lectures ouvertes tronquées (ORF3 et ORF4) ne comportant que les parties N-terminales (figure 1). 6 2738015 Exemple 2: Amplification par PCR d'un fragment interne du fragment de 3704 pb La technique de la PCR (Polymerase Chain Reaction), décrite par exemple dans l'ouvrage de Maniatis, déjà cité, permet d'amplifier un fragment d'ADN compris entre deux oligonucléotides convenablement choisis. Cet ADN amplifié peut être aisément cloné si des sites de restriction sont apportés par les oligonucléotides. En effet, les séquences de ces oligonucléotides peuvent comporter, à leur extrémité 5', une partie hétérologue de l'ADN à amplifier, constituée par exemple de 10 à 12 paires dc bases, dont 6 constituent un site de restriction. Cette technique a été appliquée en vue de déterminer si l'un ou l'autre des deux cadres ouverts de lecture (ORF1, ORF2) mis en évidence dans la séquence nucléotidique du fragment de 3704 pb correspond à un gène de résistance aux phages, mais également en vue de constituer une sonde spécifique de ce gène. Pour cela, 4 oligonucléotides de 31 et 32 bases (dont 6 constituent un site de restriction) ont été synthétisés. La séquence de ces 4 oligonucléotides est la suivante: Oligonucléotide N 1 [SEQ N' 5]: ' TCATAGGATCCAATAATCAACTAGCAATFCG 3' BamHI Oligonucléotide N 2 [SEQ N 6]: ' CA'ITAI GTCGACAAATACAGGCTCTATAAAGC 3' Sa!I Oligonucléotide N' 3 [SEQ N'7]: ' TCATAGITC 1AACAATAAAATYACTCTGC 3' BamHI Oligonucléotide N* 4 [SEQ N' 8] ' CATAGTCGACITAAATITGATATFGATGCG 3' SalI Leurs emplacements sur le fragment de 3704 pb sont indiqués sur la figure 2. Les oligonucléotides N 1 et 2 ont permis d'amplifier un fragment d'ADN de 1345 pb comportant l'ORF1 de 1038 pb sous la forme d'un fragment BamHI lI, grâce aux sites de restriction apportés par les oligonucléotides, permettant un clonage directionnel dans le plasmide navette pLDP1. De la même manière, les oligonucléotides N' 3 et 4 ont permis d'amplifier un fragment d'ADN de 1152 pb comportant l'ORF2 de 573 pb sous forme d'un fragment BamHI-alI comme ci-dessus. 7 2738015 Les fragments d'ADN ont été amplifiés par PCR à partir d'une préparation d'ADN total de la souche S94 (I-941) avec la Taq polymérase classique. Les produits de PCR ont été purifiés par une extraction au phénolchloroformne, précipités à l'éthanol, digérés par les enzymes de restriction BamHI et SalI et clonés dans le vecteur navette pLDP1 ouvert aux sites BamHI et SalI. Le clonage de ces fragments dans le vecteur pLDP1 a conduit aux plasmides recombinants pLAB207 et pLAB208. Ces plasmides ont été introduits dans la souche TG1 de E.çcoli et dans la souche S56 de L.lactis. L'introduction des plasmides pLAB207 et pLAB208 dans la souche S56 de L. actis a permis de déterminer s'ils conferent la résistance aux phages. Une synthèse des résultats concernant le clonage des différents fragments d'ADN amplifiés est présentée dans le tableau 1 suivant: TABLEAU 1 Paire Taille du Sites rajoutés Cloné dans Phénotypes* d'oligonucléotides fragment pLDP1 1-2 1345 pb BamHl-Sal pLAB207 rap+ 3-4 1152 pB BamHl-Sall pLAB208 rap- * phénotypes: rap+ = résistance aux phages rap- = non résistance aux phages Exemple 3: Résistance aux phages conférée par le plasmide pLAB207 Le plasmide pLAB207 a été introduit dans la souche S56 L.lactis. La résistance aux phages des clones obtenus a été testée en réalisant une titration (UFP/ml) avec les phages 0 53 et 0 59. Les résultats sont donnés ci-après: 8 2738015 phage 53 (I) phage 59 (III) Souche Titre Taillc des Titre Taille des plages UFP/ml) plages (rmm) (UFP/ml) (mm) S56 1010 3 3.109 2 S56 (pLDP1) 6.109 3 2.109 2 S56 (pLAB207) 106 0,5 0 - UFP/ml = unité formant plages par ml Le plasmide pLAB207 contenant le fragment amplifié par PCR de 1345 pb correspondant à l'ORF1 confère une résistance aux phages. 9 2738015 LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: SYSTEMS BIO-INDUSTRIES (B) RUE: 4, place des Ailes (C) VILLE: BOULOGNE (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 92100 (G) TELEPHONE: 47 12 25 25 (H) TELECOPIE: 47 12 26 56 (ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES D'ADN ET PLASMIDES COMPRENANT AU MOINS UN MECANISME DE RESISTANCE AUX PHAGES, BACTERIES LES CONTENANT ET LEUR UTILISATION (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 8 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 3704 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE (A) ORGANISME: Lactococcus Lactis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1095..2132 2738015 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GATCAAAACT GATGCAAATG GAGTAATTAA GGCAAATCAT CTAAAACCAG GTAAATACAC 60 mIÂIIIIGAA ACAGAGGOOCTC CAGCAGGTTA TCAATTAAGT CAAGAAACTA GAGCITrTTTGA 120 AATTAAAGCA AOCGCAGAAA ACAAACCACA AGTGTTTAAT ACTGGAAAGT TCGTCAATAA 180 AAGACTTCCA ATTACACCTA AAAAGCCAGA ATTACCTAAG ACAGGAGAAG AACGAAATAC 240 iTrCTrGCCT ATAGTGGTG TrGGACTATr AATGGTGGGT GCTACITTTAT ATGTATTITr 300 TAAAAGACGT AAAATGTAAA ATTATATAAA AACATGGCTT TAGCCATGTT TTTrGATTTGG 360 GAAAAGTGGT AGTGACTTrAA TACAAAAATA TTTrAGTTG TAATACCTAA AAATAATACT 420 TCAGTTT'GCA GTATTCCAAT AAGTAAAAAA GATTTGGCTA TATTAGAACC ACCCAAAAAA 480 ACTCAAAATC ATGTAAATAT TAAGCTTGGA TTGGCCCAAT AGAGAAAATT TTTTC=TFCA 540 TCATTATAGT TTGCAAAATG GTATTCCAAA TGTAGTCACA GTAAATAAAA CAATGAAAAA 600 GATGTTAAAT GAGTTAGAAA TTGAGCCAAT AATTACAAGT GAGGTGTTAG ATAAACTTGT 660 GATAGTGTAC TACTAAGTTA AGGTATCGAT AATAAAGTAG TGGCAAAGTT AATGGGCATA 720 AAGATACATC AATGCTAATA AAAATATAAT TAAAAGAATA TGATAAAATA ATAAAAAACC 780 TTGTATATCA ACGATACAAG O'GlTTTATC TATGCCGAGT GCAGGATTGT TTAGATAGTr 840 TTCAAAGTTA AATACAGGCT CTATAAAGCT CTCAAAGTGT TCACTATAGA AAAGCTCTTA 900 AAGTGAAAAA TAAAATGGGG CAAATTGGGG GCATTCAAG TTAAGAGTAT TCAAATATGT 960 AACTAAAAAA AATTATTTTT TTGAATTAGT GTITiTCTAT T'rTGCATATTT TTrCGAGATr 1020 TTCTGITT ATTATTATAT AATTATATTT ATATTTATAG TTATAGTTAT TGAGTTAAGT 1080 TAGTGGGAGA TACA ATG AAA TTA TAT ATA GTT GGT AAT GGC TTr GAT TTA 1130 Met Lys Leu Tyr Ile Val Gly Asn Gly Phe Asp Leu 1 5 10 TCA CAC AAT CTG AAA ACA TCA TAT ACA GAG TTT AGA TTA TAT TTA TTG 1178 Ser His Asn Leu Lys Thr Ser Tyr Thr Glu Phe Arg Leu Tyr Leu Leu 20 25 GAA CAT AGG GAT GAA GTA TAT ACA GAT GAA GAT TTA ATA ATA TCA AAA 1226 Glu His Arg Asp Glu Val Tyr Thr Asp Glu Asp Leu Ile Ile Ser Lys 35 40 GGA GAT ATT TTA CGA AAT TT GAA AGA TAT TGT CAA CCA AAT GAT TTA 1274 Gly Asp Ile Leu Arg Asn Phe Glu Arg Tyr Cys Gln Pro Asn Asp Leu 50 55 60 TGG AGC GAT =T GAA GAA CAG ACT GAG AAA ATA ATA TCA GAA ATA TCA 1322 Trp Ser Asp Phe Glu Glu Gln Thr Glu Lys Ile Ile Ser Glu Ile Ser 70 75 GAG GGG AAA ATT ATA ATC TTT GAA GAA GAA TGG AGC TGC AAA TTA GAT 1370 Glu Gly Lys Ile Ile Ile Phe Glu Glu Glu Trp Ser Cys Lys Leu Asp 85 90 il 2738015 ATT GGA GGT GAG AGG CAT AAA = ATT GAT TGT TTT AAA AAG TTA ATA 1418 Ile Gly Gly Glu Arg His Lys Phe Ile Asp Cys Phe Lys Lys Leu Ile 100 105 AAA AAA CAA GAT AGT ACA TTC GAT ACT GAT ATA TAT CAT AAT GAA ATT 1466 Lys Lys Gln Asp Ser Thr Phe Asp Thr Asp Ile Tyr His Asn Glu Ile 115 120 CAA GAG TAT GCC TTA AAG TAT TTT AAC AAT AAG GTA AGG GAA CTA TAT 1514 Gln Glu Tyr Ala Leu Lys Tyr Phe Asn Asn Lys Val Arg Glu Leu Tyr 130 135 140 ATA TGG GTT CCA TAT TTA TAT ATT AGT =T CAA GAA TGG ATA CAA ACG 1562 Ile Trp Val Pro Tyr Leu Tyr Ile Ser Phe Gln Glu Trp Ile Gln Thr 150 155 ATT ATT TTA AAA AAT ACG AAA AAT ATC TAT GAA ATA GAT GAA GAT TCG 1610 Ile Ile Leu Lys Asn Thr Lys Asn Ile Tyr Glu Ile Asp Glu Asp Ser 165 170 TCT GTA ATT TCC TTT AAC TAT ACA AAT ACT ATG GAA GAT GTT TAT CAA 1658 Ser Val Ile Ser Phe Asn Tyr Thr Asn Thr Met Glu Asp Val Tyr Gln 180 185 CAA AAA GAT GTA CTA CAT TTA CAT GGT TCT GTA AAA AAT CTA GAA GAT 1706 Gln Lys Asp Val Leu His Leu His Gly Ser Val Lys Asn Leu Glu Asp g190 195 200 GTA GTA TTA GGA TTT CAT TCG CCA GAA ATA GAC GAC AAA TTA CCA GGG 1754 Val Val Leu Gly Phe His Ser Pro Glu Ile Asp Asp Lys Leu Pro Gly 205 210 215 220 TTA GAA ACA AGT = ACG AAG GAA TTT AAG GAA ACA CAA AGA ATG TTT 1802 Leu Glu Thr Ser Phe Thr Lys Glu Phe Lys Glu Thr Gln Arg Met Phe 225 230 235 GCA GAA CAG CGGT TCT AGA AAG CTT AAT TCT AAT AAG TTT TAT GAT GAA 1850 Ala Glu Gln Gly Ser Arg Lys Leu Asn Ser Asn Lys Phe Tyr Asp Glu 240 245 250 AAT ATA GGA AGA T=T TAT AAA CCA GTA AAT CTT TTA AAA GAC TCA ATT 1898 Asn Ile Gly Arg Phe Tyr Lys Pro Val Asn Leu Leu Lys Asp Ser Ile 255 260 265 12 2738015 GAG TCT TTT GTT AAA AAT AAA AAT ATT CAT GAA GTA ATA ATC TTA GGT 1946 Glu Ser Phe Val Lys Asn Lys Asn Ile His Glu Val Ile Ile Leu Gly 270 275 280 CAT TCA TAT AAT AAG ATA GAC TGG GTT TAT TTT AAA GAA CTA GTC AGA 1994 His Ser Tyr Asn Lys Ile Asp Trp Val Tyr Phe Lys Glu Leu Val Arg 285 290 295 300 TGC GCC CCT GAA GCA AAA TAT TTA TT= AGC TAT TAT TCC CAA AAT GAT 2042 Cys Ala Pro Glu Ala Lys Tyr Leu Phe Ser Tyr Tyr Ser Gln Asn Asp 305 310 315 AAA GAA AAC ATA AAT AAA ATT ATA TTG GAG AAT AAA TTT GAT ATT GAT 2090 Lys Glu Asn Ile Asn Lys Ile Ile Leu Glu Asn Lys Phe Asp Ile Asp 320 325 330 TGC GAA AAA ATA CAT GTA GAT AAC TTT AAA ATT AAA AAA GAT 2132 Cys Glu Lys Ile His Val Asp Asn Phe Lys Ile Lys Lys Asp 335 340 345 TAGCAAAAAT TTAGGAGTTT TATATGATTA TATTTATAGA CCCGAATTGC TAGTTGATTA 2192 TTTAGCCATG ACTTGATACC CGATAGAATA TCTTAAAGTC TCTGGTTCCA GTGATTTAGC 2252 TGATTTrAAC AGTAAAGAAT ACGCTAAAAG TATCATCTCT AATTTCAATT GAAAACCTTG 2312 AGGCGAACGA CTTTTACAAC GCTCAGCTCC TAGATTTGTC AAAAAAGAGA AAACTCGCTC 2372 AATCACTTTT CTACGTTTTG AAAAATTAGG GAAAAGGATT TTCTTTCGCT TCATGTCTT 2432 CCTGACAGGT GTCATrAGAT CAATTCCTT TAATTCCAGC CTATCATGCA GTGACTGACC 2492 TAAATATCCC ATATCTCCAA GGACTGTTGG TGTCCCAAAT TGACTCAACA CTTCCTCGGC 2552 CATTGTACTG TCAGCTATTG AAGCAGGAGT AATTGTGTAG TCTATGACAT AGCCTGATTC 2612 ACTGACTAAA GCATGACATT TACATCCATA GAAGTACTGT CCCTTTOTAA CATTGTAGCC 2672 AACATTTGCA TAATCTCCAA GAACTTTGCT TCTGAAATTA CGAATCGACT GACACAAAGG 2732 AATGGGGAAG CTGTCAATAA TGGATACACT CATTCCTTCA ACCTCTTTAA AGACGAGTGC 2792 TrGGCGAATG ACTTGGATAC TCGGTAAGAG GGCATTACAA CGGCGGACAA AGCGAGAATA 2852 TTCTAGGAAA TTAGGAAATA AACTTTGAGC CAATTGGTGC TTAGCTTTAA GTGTTTCACT 2912 AAAATGCAGT ACGCCCCATA GGTAACAAGC GATAACTAAG CAATCTGATG TTGCGAGATG 2972 GACGTTCTTT CGGTTTTGAA CCTCAAGGGG ACACTCGITTT GATAAATCGT CTCAATGGTT 3032 GTCAGTAAAT AAACCAAAAA CTTTTGGAAG TGTGCTATTA TAAGTCATAT AAGTCGTGCG 3092 * CTTTCTAATG CTTAGTGGGT TAAGATTAGG ATAGCACGAC TTATTTATTT TCCAATGAAA 3152 TTAACTAGCA ATTCGGGTTT TCTTAATTIT TTTATAAAA AAATTACTCC TAAAGCAGAG 3212 TAATTTATT GTTAATITT ATCAGAGATT ATTCCAAAAA 'TITTCTGAT AAAAATGAAG 3272 TATCACTCCT ACCGAAAATC CTAAAAGGAG GACTAGGGCA AGGTTAACAA CTAAAGGATA 3332 TGGAATAAAG ATAATCAGGG CAATAATTGC TCCAATGAGT GCTCCTGCTC CCAAAAGCGT 3392 AGCAAAGAAA ATGATAAAAA CCCGAAATCC CCCAGAACCT CTTGTAAAAA GTTGAGTCAA 3452 CGCAGTCCAA TTAAATTTA AGAGATGCCA ATCTCTGACA AAATAATGAA GTGAAATCAG 3512 ATATACCCCA ATAACATTCC CAATTAACAG CCCAAAGAGC AAGGTAACAG GGACTTTCAG 3572 13 2738015 TAAAATACCA ATCACTAAAG ATAAGATrAA GTCAAGAACT AGTTGAATAA AAAAGGCAAA 3632 ATGAAATTTC ACTCTGAGAT AGAAATTCAA CTTCATGGGT AAGCTTTTAA AATAATTAAA 3692 ATTTTCCCGA TC 3704 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 346 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Met Lys Leu Tyr Ile Val Gly Asn Gly Phe Asp Leu Ser His Asn Leu 1 5 10 15 Lys Thr Ser Tyr Thr Glu Phe Arg Leu Tyr Leu Leu Glu His Arg Asp 25 30 Glu Val Tyr Thr Asp Glu Asp Leu Ile Ile Ser Lys Gly Asp Ile Leu 40 45 Arg Asn Phe Glu Arg Tyr Cys Gin Pro Asn Asp Leu Trp Ser Asp Phe 55 60 Glu Glu Gln Thr Glu Lys Ile Ile Ser Glu Ile Ser Glu Gly Lys Ile 70 75 80 Ile Ile Phe Glu Glu Glu Trp Ser Cys Lys Leu Asp Ile Gly Gly Glu 90 95 Arg His Lys Phe Ile Asp Cys Phe Lys Lys Leu Ile Lys Lys Gln Asp 105 110 Ser Thr Phe Asp Thr Asp Ile Tyr His Asn Glu Ile Gln Glu Tyr Ala 120 125 Leu Lys Tyr Phe Asn Asn Lys Val Arg Glu Leu Tyr Ile Trp Val Pro 135 14o Tyr Leu Tyr Ile Ser Phe Gin Glu Trp Ile Gin Thr Ile Ile Leu Lys 150 155 160 Asn Thr Lys Asn Ile Tyr Glu Ile Asp Glu Asp Ser Ser Val Ile Ser 170 175 Phe Asn Tyr Thr Asn Thr Met Glu Asp Val Tyr Gln Gln Lys Asp Val 185 190 Leu His Leu His Gly Ser Val Lys Asn Leu Glu Asp Val Val Leu Gly 200 205 Phe His Ser Pro Glu Ile Asp Asp Lys Leu Pro Gly Leu Glu Thr Ser 210 215 220 Phe Thr Lys Glu Phe Lys Glu Thr Gln Arg Met Phe Ala Glu Gln Gly 225 230 235 240 14 2738015 Ser Arg Lys Leu Asn Ser Asn Lys Phe Tyr Asp Glu Asn Ile Gly Arg 245 250 255 Phe Tyr Lys Pro Val Asn Leu Leu Lys Asp Ser Ile Glu Ser Phe Val 260 265 270 Lys Asn Lys Asn Ile His Glu Val Ile Ile Leu Gly His Ser Tyr Asn 275 280 285 Lys Ile Asp Trp Val Tyr Phe Lys Glu Leu Val Arg Cys Ala Pro Glu 290 295 300 Ala Lys Tyr Leu Phe Ser Tyr Tyr Ser Gln Asn Asp Lys Glu Asn Ile 305 310 315 320 Asn Lys Ile Ile Leu Glu Asn Lys Phe Asp Ile Asp Cys Glu Lys Ile 325 330 335 His Val Asp Asn Phe Lys Ile Lys Lys Asp 340 345 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1345 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE (A) ORGANISME: Lactococcus Lactis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 246..1283 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: AAATACAGGC TCTATAAAGC TCTCAAAGTG TTCACTATAG AAAAGCTCTT AAAGTGAAAA 60 ATAAAATGGG GCAAATTGGG GGCATTTCAA GTTAAGAGTA TTCAAATATG TAACTAAAAA 120 AAATTATTTTT TGAATTAG TGTITITCTA /TTGCATATT TTTTCGAGAT TrTCTGITFr 180 GATrATrATA TAATrATATT TATATTTATA GTTATAGITA TTGAGTTrAAG TTAGTGGGAG 240 ATACA ATG AAA T'ITA TAT ATA GTT GGT AAT GGC TT GAT TTA TCA CAC 287 Met Lys Leu Tyr Ile Val Gly Asn Gly Phe Asp Leu Ser His 1 5 10 2738015 AAT CTG AAA ACA TCA TAT ACA GAG TTT AGA TTA TAT TTA ITG GAA CAT 335 Asn Leu Lys Thr Ser Tyr Thr Glu Phe Arg Leu Tyr Leu Leu Glu His 20 25 30 AGG GAT GAA GTA TAT ACA GAT GAA GAT TTA ATA ATA TCA AAA GGA GAT 383 Arg Asp Glu Val Tyr Thr Asp Glu Asp Leu Ile Ile Ser Lys Gly Asp 40 45 ATT TTA CGA AAT TTT GAA AGA TAT TGT CAA CCA AAT GAT TTA TGG AGC 431 Ile Leu Arg Asn Phe Glu Arg Tyr Cys Gln Pro Asn Asp Leu Trp Ser 55 60 GAT TTT GAA GAA CAG ACT GAG AAA ATA ATA TCA GAA ATA TCA GAG GGG 479 Asp Phe Glu Glu Gln Thr Glu Lys Ile Ile Ser Glu Ile Ser Glu Gly 70 75 AAA ATT ATA ATC TTT GAA GAA GAA TGG AGC TGC AAA TTA GAT ATT GGA 527 Lys Ile Ile Ile Phe Glu Glu Glu Trp Ser Cys Lys Leu Asp Ile Gly 85 90 GGT GAG AGG CAT AAA TT ATT GAT TGT TTT AAA AAG TTA ATA AAA AAA 575 Gly Glu Arg His Lys Phe Ile Asp Cys Phe Lys Lys Leu Ile Lys Lys 100 105 110 CAA GAT AGT ACA TTC GAT ACT GAT ATA TAT CAT AAT GAA ATT CAA GAG 623 Gln Asp Ser Thr Phe Asp Thr Asp Ile Tyr His Asn Glu Ile Gln Glu 120 125 TAT GCC TTA AAG TAT TrT AAC AAT AAG GTA AGG GAA CTA TAT ATA TGG 671 Tyr Ala Leu Lys Tyr Phe Asn Asn Lys Val Arg Glu Leu Tyr Ile Trp 135 140 GTT CCA TAT TTA TAT ATT AGT TIT CAA GAA TGG ATA CAA ACG ATT ATT 719 Val Pro Tyr Leu Tyr Ile Ser Phe Gln Glu Trp Ile Gln Thr Ile Ile 150 155 TTA AAA AAT ACG AAA AAT ATC TAT GAA ATA GAT GAA GAT TCG TCT GTA 767 Leu Lys Asn Thr Lys Asn Ile Tyr Glu Ile Asp Glu Asp Ser Ser Val 165 170 ATT TCC TT AAC TAT ACA AAT ACT ATG GAA GAT GTT TAT CAA CAA AAA 815 Ile Ser Phe Asn Tyr Thr Asn Thr Met Glu Asp Val Tyr Gln Gln Lys 180 185 190 16 2738015 GAT GTA CTA CAT TTA CAT GGT TCT GTA AAA AAT CTA GAA GAT GTA GTA 863 Asp Val Leu His Leu His Gly Ser Val Lys Asn Leu Glu Asp Val Val 200 205 TTA GGA TTT CAT TCG CCA GAA ATA GAC GAC AAA TTA CCA GGG TTA GAA 911 Leu Gly Phe His Ser Pro Glu Ile Asp Asp Lys Leu Pro Gly Leu Glu 210 215 220 ACA AGT TTm ACG AAG GAA TTT AAG GAA ACA CAA AGA ATG TTT GCA GAA 959 Thr Ser Phe Thr Lys Glu Phe Lys Glu Thr Gln Arg Met Phe Ala Glu 225 230 235 CAG GGT TCT AGA AAG CTT AAT TCT AAT AAG TTT TAT GAT GAA AAT ATA 1007 Gln Gly Ser Arg Lys Leu Asn Ser Asn Lys Phe Tyr Asp Glu Asn Ile 240 245 250 GGA AGA TTT TAT AAA CCA GTA AAT CTT TTA AAA GAC TCA ATT GAG TCT 1055 Gly Arg Phe Tyr Lys Pro Val Asn Leu Leu Lys Asp Ser Ile Glu Ser 255 260 265 270 TTT GTT AAA AAT AAA AAT ATT CAT GAA GTA ATA ATC TTA GGT CAT TCA 1103 Phe Val Lys Asn Lys Asn Ile His Glu Val Ile Ile Leu Gly His Ser 275 280 285 TAT AAT AAG ATA GAC TGG GTT TAT TTT AAA GAA CTA GTC AGA TGC GCC 1151 Tyr Asn Lys Ile Asp Trp Val Tyr Phe Lys Glu Leu Val Arg Cys Ala 290 295 300 CCT GAA GCA AAA TAT TTA =m AGC TAT TAT TCC CAA AAT GAT AAA GAA 1199 Pro Glu Ala Lys Tyr Leu Phe Ser Tyr Tyr Ser Gln Asn Asp Lys Glu 305 310 315 AAC ATA AAT AAA ATT ATA TTG GAG AAT AAA TTT GAT ATT GAT TGC GAA 1247 Asn Ile Asn Lys Ile Ile Leu Glu Asn Lys Phe Asp Ile Asp Cys Glu 320 325 330 AAA ATA CAT GTA GAT AAC TIT AAA ATT AAA AAA GAT TAGCAAAAAT 1293 Lys Ile His Val Asp Asn Phe Lys Ile Lys Lys Asp 335 340 345 TTAGGAGTTT TATATGATTA TATTTATAGA CCCGAATTGC TAGTTGATTA TT 1345 17 2738015 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 346 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: Met Lys Leu Tyr Ile Val Gly Asn Gly Phe Asp Leu Ser His Asn Leu 1 5 10 15 Lys Thr Ser Tyr Thr Glu Phe Arg Leu Tyr Leu Leu Glu His Arg Asp 25 30 Glu Val Tyr Thr Asp Glu Asp Leu Ile Ile Ser Lys Gly Asp Ile Leu 40 45 Arg Asn Phe Glu Arg Tyr Cys Gln Pro Asn Asp Leu Trp Ser Asp Phe 55 60 Glu Glu Gln Thr Glu Lys Ile Ile Ser Glu Ile Ser Glu Gly Lys Ile 70 75 80 Ile Ile Phe Glu Glu Glu Trp Ser Cys Lys Leu Asp Ile Gly Gly Glu 90 95 Arg His Lys Phe Ile Asp Cys Phe Lys Lys Leu Ile Lys Lys Gln Asp 105 110 Ser Thr Phe Asp Thr Asp Ile Tyr His Asn Glu Ile Gln Glu Tyr Ala 120 125 Leu Lys Tyr Phe Asn Asn Lys Val Arg Glu Leu Tyr Ile Trp Val Pro 135 14o Tyr Leu Tyr Ile Ser Phe Gln Glu Trp Ile Gln Thr Ile Ile Leu Lys 150 155 160 Asn Thr Lys Asn Ile Tyr Glu Ile Asp Glu Asp Ser Ser Val Ile Ser 170 175 Phe Asn Tyr Thr Asn Thr Met Glu Asp Val Tyr Gln Gln Lys Asp Val 185 190 Leu His Leu His Gly Ser Val Lys Asn Leu Glu Asp Val Val Leu Gly 200 205 Phe His Ser Pro Glu Ile Asp Asp Lys Leu Pro Gly Leu Glu Thr Ser 210 215 220 Phe Thr Lys Glu Phe Lys Glu Thr Gln Arg Met Phe Ala Glu Gln Gly 225 230 235 240 Ser Arg Lys Leu Asn Ser Asn Lys Phe Tyr Asp Glu Asn Ile Gly Arg 245 250 255 Phe Tyr Lys Pro Val Asn Leu Leu Lys Asp Ser Ile Glu Ser Phe Val 260 265 270 18 2738015 Lys Asn Lys Asn Ile His Glu Val Ile Ile Leu Gly His Ser Tyr Asn 275 280 285 Lys Ile Asp Trp Val Tyr Phe Lys Glu Leu Val Arg Cys Ala Pro Glu 290 295 300 Ala Lys Tyr Leu Phe Ser Tyr Tyr Ser Gln Asn Asp Lys Glu Asn Ile 305 310 315 320 Asn Lys Ile Ile Leu Glu Asn Lys Phe Asp Ile Asp Cys Glu Lys Ile 325 330 335 His Val Asp Asn Phe Lys Ile Lys Lys Asp 340 345 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 31 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT: 6..11 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /function= "SITE DE RESTRICTION BamHI" (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: miscstructure (B) EMPLACEMENT: 12..31 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /function= "SEQ. HOMOLOGUE ADNc CORRESP. NUCLEOT. 1325-1345 de SEQ.ID No3" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: TCATAGGATC CAATAATCAA CTAGCAATTC G 31 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 31 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique 19 2738015 (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT: 6..11 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /function= "SITE DE RESTRICTION SalI" (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: miscstructure (B) EMPLACEMENT: 12..31 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /function= "SEQ.HOMOLOGUE NUCLEOTIDES 1-21 de SEQ. No.3" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: CATTAGTCGA CAAATACAGG CTCTATAAAG C 31 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 32 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT: 6..11 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /function= "SITE DE RESTRICTION BamHI" 2738015 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: TCATAGGATC CTTAACAATA AAATTACTCT GC 32 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 32 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: misc_signal (B) EMPLACEMENT: 6..11 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /function= "SITE DE RESTRICTION: SalI" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: CATrAGTCGA CTTAAATTmG ATATTGATTG CG 32 21 2738015 REVENDICATIONS 1. Séquence d'ADN comprenant au moins un mécanismc dc résistance aux phages, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences [SEQ ID Ne 1] et [SEQ ID Ne 3] ou une séquence présentant un degré d'homologie élevée avec lesdites séquences [SEQ ID Ne 1] et [SEQ ID Ne 3]. 2. Plasmide comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'ADN selon la revendication 1. 3. Bactérie lactique résistante aux phages, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un plasmide selon la revendication 2. 4. Utilisation des bactéries lactiques selon la revendication 3, pour conférer un mécanisme de résistance aux phages à des souches d'intérêt industriel.