FR 2725727 A1 19960419 FR 9512049 A 19951013 - 1 - 2725727 PLASMIDES CODANT POUR LA RESISTANCE AUX BACTERIOPHAGES Domaine de l'invention La présente invention concerne des plasmides codant pour la résistance aux bactériophages, et en particulier des plasmides de ce type destinés à une utilisation chez les bactéries lactiques. Arrière-plan de l'invention Les bactéries lactiques sont largement utilisées entre autres dans l'industrie du lait pour la production de produits laitiers dont les fromages et les yaourts. Les bactéries lactiques peuvent toutefois succomber à l'infection par les bactériophages lors de la production de produits fermentés, conduisant ainsi à une moindre efficacité du procédé de fermentation. L'amélioration de la résistance aux bactériophages pose un problème persis- tant et représente un domaine très étudié dans -2 2725727 l'industrie des levains laitiers Lactococciques. Les approches vis-à-vis du développement de la résistance aux bactériophages chez les bactéries lactiques incluent: 1. l'isolement de mutants résistants aux bactério- phages; 2. l'isolement de nouvelles souches de l'environne- ment qui ont une meilleure résistance naturelle; 3. l'utilisation de souches en mélange et en rota- tion pour minimiser les problèmes d'infection par les bactériophages; 4. l'identification de plasmides codant pour la résistance aux bactériophages, puis l'intro- duction du plasmide dans une souche sensible aux bactériophages pour générer un variant résistant; et 5. l'introduction de plus d'un plasmide dans une souche sensible aux bactériophages o les résis- tances cumulées donnent une meilleure résistance aux bactériophages. L'ensemble des approches ci-dessus offre à court terme une protection des cultures vis-à-vis de l'infec- tion par les bactériophages mais aucune n'a pu résister à une exposition prolongée aux bactériophages dans l'environnement commercial. Une raison principale pour cela est que chaque procédé introduit habituellement un ou peut-être deux mécanismes différents de résistance aux bactériophages. Les bactériophages mutants du point de vue du spectre d'hôte ou des nouveaux bactériophages peuvent échapper aux mécanismes de résistance et dans (4) et (5), les constructions peuvent présenter un degré -3 -2725727 d'instabilité génétique pouvant faciliter l'infection par les bactériophages. Les présents inventeurs ont pu réduire l'insta- bilité génétique et réaliser l'introduction de détermi- nants de la résistance à des phages multiples dans des bactéries hôtes par le développement de nouveaux plasmi- des. Résumé de l'invention C'est pourquoi dans un premier aspect, la présen- te invention consiste en un plasmide codant pour la résistance aux bactériophages choisi dans le groupe constitué de pND801, pND802, pND809, pND811, pND851, pND852, pND853, pND859, pND860, pND862 et leurs équiva- lents fonctionnels. Dans un deuxième aspect, la présente invention consiste en une molécule d'acide nucléique isolée compor- tant une séquence nucléotidique codant pour la résistance aux bactériophages, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique est dérivée d'un plasmide choisi dans le groupe constitué de pND801, pND802, pND809, pND811, pND851, pND852, pND853, pND859, pND860, pND862 et leurs équivalents fonctionnels. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du deuxiè- me aspect de la présente invention, la molécule nucléique isolée inclut la séquence nucléotidique correspondant sensiblement à la séquence nucléotidique de la figure 8 ou de la figure 9. Dans un troisième aspect, la présente invention consiste en un procédé pour augmenter ou conférer la résistance aux phages à une bactérie comprenant l'intro- - 4 -2725727 - 4 - duction dans la bactérie d'au moins un plasmide ou d'au moins une séquence nucléotidique dérivée d'au moins un plasmide du premier aspect de la présente invention. De préférence, la bactérie est une bactérie lactique. Dans un quatrième aspect, la présente invention consiste en une bactérie ayant une résistance aux phages augmentée ou conférée produite par le procédé du troi- sième aspect de la présente invention. Dans un cinquième aspect, la présente invention consiste en un plasmide de bactérie lactique constitué d'ADN de bactérie lactique ou d'ADN synthétisé chimi- quement destiné à une utilisation pour augmenter ou conférer aux bactéries lactiques la résistance aux phages, le plasmide comportant au moins deux séquences nucléotidiques codant pour les mécanismes de défense phagiques choisis dans le groupe constitué par la res- triction contrôlée par l'hôte, la modification contrôlée par l'hôte, l'infection abortive et la prévention de l'adsorption des phages. De préférence, le plasmide comporte un minimum d'ADN et exclut sensiblement l'ADN qui n'est pas nécessaire pour le maintien du plasmide ou pour coder pour les mécanismes de défense phagiques. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du cin- quième aspect de la présente invention, le plasmide comporte au moins trois séquence nucléotidiques codant pour les mécanismes de défense phagiques. Dans un autre mode de mise en oeuvre préféré du cinquième aspect de la présente invention, les séquences nucléotidiques codant pour la résistance aux bactério- phages sont dérivées des plasmides du premier aspect de - 5 -2725727 la présente invention. Dans encore un autre mode de mise en oeuvre préféré du cinquième aspect de la présente invention, le plasmide comporte également une séquence nucléotidique codant pour au moins un marqueur de sélection. On pourra apprécier qu'il existe un certain nombre de mécanismes de défense phagiques différents chez les bactéries lactiques et que les plasmides de la présente invention peuvent comporter au moins deux séquences nucléotidiques différentes codant pour le même type de mécanisme. Dans un sixième aspect, la présente invention consiste en une bactérie comportant au moins un plasmide du cinquième aspect de la présente invention. De préfé- rence, la bactérie est une bactérie lactique. Dans un septième aspect, la présente invention consiste en un procédé pour augmenter ou conférer à une bactérie lactique la résistance aux phages comprenant l'introduction dans la bactérie d'au moins un plasmide du cinquième aspect de la présente invention. Dans encore un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, les plasmides du premier et/ou du cinquième aspect de la présente inven- tion sont introduits seuls ou en différentes combinaisons dans une bactérie de manière à augmenter ou à conférer à la bactérie la résistance aux bactériophages. Telle qu'utilisée ici, l'expression "leurs équivalents fonctionnels" est destinée à couvrir les plasmides ou les séquences d'acide nucléique dérivées de ceux-ci et qui ont des séquences d'acide nucléique E6 - 2725727 légèrement modifiées par rapport aux plasmides énumérés ci-dessus mais qui conservent sensiblement la même activité biologique. Ceci peut être réalisé par diffé- rents changements, tels que des insertions, des délétions et des substitutions, soit conservatrices soit non conservatrices dans les cas o de tels changements ne modifient pas sensiblement l'activité biologique de la protéine ou des protéines codées par les plasmides ou les séquences d'acides nucléiques dérivées de ceux-ci. Des échantillons de chacun des plasmides énumérés ci-dessus ont été déposés auprès des laboratoires analy- tiques du Gouvernement australien (AGAL) le 28 septembre 1995 et le 5 octobre 1995. Les numéros d'accès respectifs pour chaque dépôt sont énumérés ci-dessous: PLASMIDE NUMERO D'ACCES DATE pND801 N95/58018 28/09/95 pND802 N95/58019 28/09/95 pND809 N95/58020 28/09/95 pND811 N95/58021 28/09/95 pND851 N95/58022 28/09/95 pND852 N95/59300 05/10/95 pND853 N95/58023 28/09/95 pND859 N95/58024 28/09/95 pND860 N95/59301 05/10/95 pND862 N95/58025 28/09/95 Pour que la nature de la présente invention soit mieux comprise, des formes préférées de celle-ci seront décrites en référence aux exemples suivants et aux - 7 -2725727 dessins annexes. Brève descriDtion des dessins La figure 1 montre des cartes de restriction de (a) pND801 et (b) pND802; la figure 2 montre une carte de restriction de pND861; les figures 3, 4, 5, 6 et 7 sont des représenta- tions schématiques du clonage de mécanismes de résistance aux phages de pND801, pND852, pND853, pND859 et pND862 respectivement; la figure 8 montre la séquence nucléotidique et la séquence d'acides aminés déduite du déterminant Abi isolées de pND852; la figure 9 montre la séquence nucléotidique et la séquence d'acides aminés déduite du mécanisme Abi isolées de pND859; les figures 10 et 11 sont des représentations schématiques de la construction de plasmides codant pour la résistance aux bactériophages selon la présente invention; la figure 12 est une représentation schématique de la production de plasmides codant pour la résistance aux bactériophages selon la présente invention, et la figure 13 est un exemple d'un fragment d'ADN codant pour la résistance aux phages dérivé de pND802. Description de l'invention MATERIEL Souches lactococciques Pour des raisons de commodité, les termes sui- vants sont utilisés: L. lactis désigne les espèces - 8 -2725727 Lactococcus lactis subsp lactis; L. cremoris désigne les espèces Lactococcus lactis subsp cremoris et L. lactis var diacetylactis désigne les espèces Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis. Les souches suivantes ont été utilisées comme donneurs pour l'isolement de plasmides codant pour la résistance aux bactériophages soit par conjugaison, mobilisation ou co-transformation: Les souches de L. lactis M195, M175, M113, M138, M181; les souches de L. cremoris M502, Mlll et L. lactis var diacetylactis UK12922, UK19161 et UK1392 ont toutes été initialement isolées à partir de souches de levains mixtes. Les souches suivantes ont été utilisées comme réceptrices dans les expériences de conjugaison, mobilisation ou électrotransformation: L. lactis MG1363 est un dérivé de L. lactis 712 dépourvu de plasmide, obtenu auprès de M. Gasson, Institut de Recherche sur les Aliments, Norwich, GB. L. lactis MG1363Sm est un dérivé de L. lactis 712 dépourvu de plasmide, rendu résistant à la strep- tomycine. L. lactis LM0230 est un dérivé de L. lactis C2 dépourvu de plasmide, obtenu auprès de L.L. McKay, Université du Minnesota, St Paul, Minn., Etats-Unis. L. lactis LM0230Sm est un dérivé de L. lactis C2 dépourvu de plasmide, obtenu auprès de L.L. McKay, Université du Minnesota, St Paul. Minn., - 9 -2725727 Etats-Unis, et rendu résistant à la streptomycine dans le laboratoire du présent inventeur. L. lactis LM0230Fus est un dérivé de L. lactis C2 dépourvu de plasmide, obtenu auprès de L.L. McKay, Université du Minnesota, St Paul, Minn., Etats-Unis, et rendu résistant à l'acide fusidi- que dans le laboratoire du présent inventeur. Autres souches Lactococciques utilisées: L. cremoris FG2 a été utilisée comme étalon pour estimer la taille de l'ADN plasmidique dans d'autres souches Lactococciques. Il héberge des plasmides ayant les tailles suivantes (kb): -135; 67; 50; 27; 14; 12,9; 11,9; 10,1; 8,8; 5,2; 3. Ces tailles ont été calculées par rapport à la souche de référence E. coli V517 (Macrina et al. 1978). Autres souches Référence E. coli v517 Macrina et ai, 1978 E. coli HB 101 Pro-, Leu-, Thi-, Boyer & Roulland- recA' dépourvu de Dussoix, 1969 plasmide E. coli NM522 Thi-, Lac'- , r'm' Gough et Murray (1983) A(lac-pro AB) - 10 - 2725727 II Bactériophages *712 Petit phage à tête isométrique Gasson, 1983 propagé sur LM0230 et MG1363 *C2V Phage à tête allongée propagé Jarvis & sur LM0230 et MG1363 Klaenhammer, III Plasmides conférant la résistance au= bactériophages (1) pND801 est un plasmide de 12 kb isolé à l'origine à partir de L. lactis M195 par co-transformation dans L. lactis LM0230 (2) pND802 est un plasmide de 19 kb isolé à l'origine à partir de L. cremoris M502 par co-transformation dans L. lactis LM0230 (3) pND803 est un plasmide de 29,2 kb construit par clonage de pND802 linéarisé par SphI dans le site SDhI de pSA3 (4) pND804 est un plasmide de 18,9 kb construit par clonage du fragment BqlII de 8,7 kb de pND802 dans le site BamHI de pSA3 (5) pND805 et un plasmide de 22,2 kb construit par clonage de pND801 linéarisé par EcoRI dans le site EcoRI de pSA3 (6) pND809 est un plasmide de 65 kb isolé à l'origine à partir de L. lactis M175 (pND300) par le protocole de mobilisation. Ce plasmide peut être transféré par conju- gaison dans les receveurs Lactococciques o il confère l'insensibilité à l'infection par les bactériophages et la résistance à la nisine (7) pND811 est un plasmide de 75 kb isolé à l'origine à partir de L. cremoris Mlll (pND300) par le protocole de mobilisation. Ce plasmide peut être transféré par conju- gaison dans les receveurs Lactococciques o il confère l'insensibilité à l'infection par les bactériophages, la résistance à la nisine et l'activité protéinasique - il -2725727 - 11 - (8) pND851 est un plasmide de 46 kb isolé à l'origine à partir de L. lactis M113 par co-transformation dans L. lactis LM0230 (9) pND852 est un plasmide de 56 kb isolé à l'origine à partir de L. lactis M138. Ce plasmide peut être trans- féré par conjugaison dans des receveurs Lactococciques o il confère l'insensibilité à l'infection par les bactériophages et également la résistance à la nisine (10) pND853 et un plasmide de 57 kb isolé à l'origine à partir de L. lactis M181. Ce plasmide peut être trans- féré par conjugaison dans des receveurs Lactococciques o il confère l'insensibilité à l'infection par les bactériophages et également la résistance à la nisine (11) pND859 est un plasmide de 16 kb isolé à l'origine à partir de L. lactis var diacetylactis UX 12922. Ce plasmide peut être transféré par conjugaison dans des receveurs Lactococciques o il confère l'insensibilité à l'infection par les bactériophages et également la résistance au cadmium (12) pND860 est un plasmide de 56 kb isolé à l'origine à partir de L. lactis var diacetylactis UK 19161. Ce plas- mide peut être transféré par conjugaison dans des rece- veurs Lactococciques o il confère l'insensibilité à l'infection par les bactériophages (13) pND861 est un dérivé de délétion "in vivo" de pND860, de kb, obtenu au cours d'une expérience de curage de plasmide. Ce plasmide confère l'insensibilité à l'infec- tion par les bactériophages (14) pND862 est un plasmide de 65 kb isolé à l'origine à partir de L. lactis var diacetylactis UK 1392. Ce plas- mide peut être transféré par conjugaison dans des rece- veurs Lactococciques o il confère l'insensibilité à - 12 - 2725727 -12 - l'infection par les bactériophages et code également pour l'utilisation de lactose et la production de proté- inase (15) pND817 est un plasmide de 12,3 kb construit par clonage du fragment HpaII de 2,6 kb de pND852 dans le site HpaII de pGB301 (16) pND825 est un plasmide de 34 kb construit par clonage des fragments HpaII de 2,7 et 1,6 kb de pND853 dans le site HpaII de pGB301 (17) pND863 est un plasmide 9,5 kb construit par clonage du fragment HindIII de 2,9 kb de pND859 dans le site HindIII de pDL278 (18) pND826 est un plasmide de 23,5 kb construit par clonage du fragment BamHI de 16 kb de pND862 dans le site BamHI de pMU1328. (19) pND821 est un plasmide de 5,6 kb construit par sous- clonage du fragment HpaII de 2,6 kb de pND817 dans le site Clal de pGEM 7zf(+) (20) pND806 est un plasmide Lactococcique de 46 kb qui confè- re l'insensibilité à l'infection par les bactériophages et qui s'est avéré posséder le gène Abi A signalé par Hil et al. (1990). Ce plasmide a été utilisé comme témoin positif pour les expériences d'hybridation. Autres plasmides: Réferences pND325 plasmide hybride de 4,8 kb, Mauri Laboratories contenant EmR du plasmide pE194 de S. aureus et un réplicon d'un plasmide cryptique de L. lactis M127 pSA3 vecteur hybride de 10,2 kb, Dao & Ferretti, codant pour Cm', TcR 1985 (selection E. coli) et Em - 13 - 2725727 - 13 - (selection L. lactis) pGB301 vecteur streptococcique de Behnke & Gilmore, 9,8 kb codant pour EmR, CmR 1981 pGEM -7zf(+) vecteur de 3 kb de E. coli Promega codant pour AmpR et la selection LacZ pND300 60 kb, nisR, tra' Iarvey et Dunn, 1989 pMu1328 plasmide sonde promoteur Acben et al., 1986 EmR; cat sans promoteur pDL278 6,6 kb SpecR Lac Z' Dunny et ai., 1991 B. Milieux Le milieu M17 (Terzaghi & Sandine, 1975) a été utilisé principalement pour la croissance des souches Lactococciques, contenant soit 0,5 % de glucose, M17(G), soit 0,5 % de lactose, M17(L). Pour faire la distinction entre les isolats lactose-positifs et lactose- négatifs, l'indicateur pourpre de bromocresol (0,004 %) a été ajouté au milieu M17(L). L'antibiotique érythromycine a été utilisé à une concentration de 5 gg/ml, la nisine à 300 UI/ml, la streptomycine à 500 gg/ml, l'acide fusidi- que à 40 Lg/ml et la spectinomycine à 100 gg/ml pour les souches lactococciques. Le FSDA (Huggins & Sandine, 1984) plus 0,5 % de glucose a été utilisé pour faire la dis- tinction entre les isolats Lactococciques protéinase- positifs et protéinase-négatifs. METHODES A. Isolement de plasmides codant pour la résistance aux phages I Conjugaison Des conjugaisons par appareillement sur filtre 14 - 2725727 ont été effectuées comme décrit ci-dessus. Selon le phénotype de la souche donneuse sauvage, on a sélectionné pour le transfert des caractères suivants: (a) utilisation de lactose - sélection sur des boîtes M17(L) contenant du pourpre de bromocresol (0,004 %) plus un antibiotique approprié (b) utilisation de protéinase - sélection sur FSDA(G) plus un antibiotique approprié (c) résistance à la nisine - sélection sur des boîtes M17(G) contenant de la nisine (300 UI/ml) plus un antibiotique approprié (d) résistance au cadmium - sélection sur des boîtes M17(G) contenant du cadmium (1 mM) plus un anti- biotique approprié. Méthode d'appareillement sur filtre Des cultures d'une nuit de souches donneuses et réceptrices ont été cultivées soit en bouillon M17(G) soit en bouillon M17(L). Les cultures donneuses et réceptrices ont été mélangées dans un rapport de 1:2. Un volume de 0,2 ml de ce mélange d'appareillement et des cultures réceptrices et donneuses individuelles (témoins) ont été placés sur des filtres de 0,45 gm dans des boîtes de Pétri en verre stériles contenant du papier filtre Whatman n 1. On a laissé les filtres de 45 gm sécher par buvardage, puis on les a transférés sur des boîtes de gélose M17(G). Apres incubation pendant une nuit, les filtres de 0,45 ym ont été enlevés et mis en suspension dans 3 ml de sérum physiologique. Les cellules ont été lavées du filtre par agitation au vortex. Pour la sélec- tion de la résistance à la nisine, les filtres ont été - 15 - 2725727 mis en suspension et agités au vortex dans 10 ml de sérum physiologique. Cette suspension cellulaire a été centri- fugée (10 min, 6000 t/min) puis remise en suspension dans 3 ml de sérum physiologique frais. Cette étape de lavage supplémentaire a réduit le nombre de mutants résistants à la nisine apparaissant. La suspension résultante a été diluée successi- vement et des aliquots de 150 g1 ont été étalés sur des milieux sélectifs. Ces boîtes ont été incubées à 30 C pendant 1-2 jours. Les transconjugants ont été soumis à un criblage pour la résistance aux phages par étalement en stries croisées. Il Co-transformation On a transformé L. lactis MG1363 ou LM0230 par électroporation selon le protocole donné dans la partie techniques moléculaires. L'ADN transformant était l'ADN plasmidique total des souches sauvages. On a aussi utilisé l'inoculation de cet ADN (rapport de 4:1) avec un petit plasmide, pND325, codant pour la résistance à Em pour favoriser la sélection des transformants. On a utilisé soit l'utilisation de lactose soit la résistance à l'érythromycine pour la sélection des transformants. Les transformants ont été soumis à un criblage pour la résistance acquise aux phages par étale- ment en stries croisées. III Mobilisation par pND300 Il a été démontré que le plasmide de résistance à la nisine, pND300, mobilise des caractères non conjuga- tifs (Harvey & Dunn, 1989). Ce plasmide, c'est-à-dire pND300, est transféré dans la souche sauvage à étudier - 16 - 2725727 par conjugaison en sélectionnant pour les transconjugants lac+ nisR (donc applicable seulement aux souches sauvages nisS). Un transconjugant résistant à la nisine provenant de cet appareillement est alors utilisé comme donneur au LM0230 SmR en sélectionnant pour le transfert de la résistance à la nisine (également lac+ et prt+). Les transconjugants sont alors soumis à un criblage pour la résistance acquise aux phages. IV Curage plasmidique Le curage de plasmides provenant des lactocoques a été réalisé par l'un ou l'autre des procédés suivants: (a) Température élevée - la souche a été cultivée dans des conditions non sélectives à une température qui permettait une croissance légère et non turbide dans du bouillon M17 (habituellement 40 C L. lactis; 36/37 C L. cremoris). La souche étudiée a été repiquée trois fois ou plus à cette température, puis testée pour la perte du phénotype pertinent et/ou criblage des isolats par le protocole d'extraction de plasmide. Le repiquage pourra continuer jusqu'à ce que le curage ait été réalisé. (b) Electroporation - protocole modifié de Heery D.M. et al. (1989) Curing of a plasmid from E. coli using high-voltage electroporation (Curage d'un plasmide de E. coli en utilisant l'électroporation à haute tension). Nucleic Acids Research 17:10131. B. Techniques bactériophagiques Etalement en stries croisées Ce procédé a été employé pour le criblage initial des isolats résistants ou sensibles aux phages. Un applicateur en coton stérile a été imbibé d'une - 17 - 2725727 - 17 - préparation phagique de titre élevé et étalé en stries le long d'une boîte de M17 (CaCi2). Apres séchage de la ligne de stries phagiques, les colonies à tester ont été étalées en stries à travers la ligne phagique. Un témoin sensible aux phages a toujours été inclu dans chaque boîte. Les plages ont été incubées à 30 C ou à 37 C pendant une nuit et les résultats enregistrés le lende- main matin. Les isolats sensibles ont été identifiés par une absence de croissance de la culture après avoir rencontré la ligne bactériophagique. Préparation bactériophagique à titre élevé Une plage purifiée unique a été découpée d'une boîte à l'aide d'un scalpel stérile et remise en suspen- sion, par agitation au vortex, dans 3 ml d'une solution de sérum physiologique. Deux millilitres de cette suspen- sion phagique ont été inoculés dans 20 ml d'une culture en phase logarithmique précoce (= 2 heures) de l'hôte sensible aux phages. On a ajouté du CaCl2 et du MgCl2 dans une concentration finale de 10 mM. Cette culture du phage/de l'hôte a été incubée à 30 C pendant une nuit, puis titrée comme décrit ci-dessous. Des titres > 108 ufp/ml ont habituellement été obtenus par ce procédé. De manière alternative, on a combiné des taux appropriés de phage et de culture en phase logarithmique pour donner une multiplicité d'infec- tion (MOI) de 0,1 à 0,01. La préparation de phages a ensuite été stérilisée par filtration après centrifugation (6000 t/min, 10 min) et conservée à 4 C. Purification des bactériophages sur plage unique Un tapis de la culture d'hôte sensible a été la - 2725727 - lB - préparé par l'addition de 3 ml de gélose de surcouche fondue à 0,8 % à 0, 2 ml d'une culture d'une nuit plus une goutte de CaC12 1 M. Ceci a été versé sur une boîte de M17 (CaCl2) et on l'a laissé se solidifier. En utilisant une bouche métallique en platine, une plage unique a été enlevée et étalée en stries avec soin sur cette surcou- che. Les boîtes ont été incubées à 30 C pendant une nuit. Les bactériophages ont été purifiés par étalement en stries pour des plages uniques au moins deux à trois fois. Titrage des préparations de bactériophages Des dilutions successives appropriées de la préparation de phages ont été ajoutées (100 gl) à 0,2 ml d'hôte sensible (culture d'une nuit) plus une goutte de CaCl2 à 1 M. Apres cinq min à température ambiante, 3 ml de gélose de surcouche fondue à 0,6 % ont été ajoutés au tube, mélangés rapidement et versés sur une boîte de M17 (CaCl2). Apres solidification, les boîtes ont été incu- bées pendant une nuit à 30 C ou à 37 C. Le titre a été calculé en ufp/ml (unité formant des plages/ml) pour la préparation de phages. L'efficacité d'étalement (EOP) a été calculée en divisant le titre phagique obtenu sur l'hôte à l'essai par le titre phagique obtenu sur l'hôte sensible ou témoin. Des essais d'activité sur du lait ont été effec- tués selon le procédé de Heap et Lawrence (1976) pour vérifier l'efficacité des plasmides OR au cours d'essais simulés de fabrication de fromage en laboratoire. On a réalisé des courbes de croissance en présence et en - 19 -2725727 - 19 - absence de bactériophages selon le procédé de Sanders et Klaenhammer (1984). C. Procédé de détermination des mécanismes de résis- tance aux bactériophages (i) L'adsorption de bactériophages a été étudiée en utilisant le procédé de Sanders et Klaenhammer (1980) (ii) Restriction/Modification Les mécanismes de restriction et de modification ont été déterminés par titrage réciproque des phages. LM0230 a été infectée par 4712 ou %C2V pour obtenir une préparation de phage de titre élevé (étape 1). La préparation de phage résul- tante a ensuite été titrée sur LM0230 (utilisée comme témoin) et les autres souches en vue de l'essai (étape 2). Une préparation de phage unique des boîtes de l'étape 2 a été réalisée et utilisée pour retitrer de nouveau sur toutes les souches (étape 3). Les préparations de phage de l'étape 2 et de l'étape 3 ont été comparées par titrage, les phages provenant des souches R/M devant présenter un titre augmenté. (iii) Des expériences portant sur le nombre à l'éclate- ment ont été effectuées selon un protocole modifié de Durmaz et al (1992) et calculées selon le pro- cédé de Casey et al (1992). Une réduction du nombre à l'éclatement indiquait la présence d'un mécanisme d'infection abortive. (iv) Des essais de centre infectieux et des mesures de survie/lcellulaire après infection phagique *- 20 - 2725727 ont été effectués selon Sing et Klaenhammer (1990). D. Techniques moléculaires (i) Transformation L. lactis ssp lactis a été transformé par électro- poration comme décrit par Powell et ai (1988) avec quelques modifications. Les cellules ont été lavées deux fois par une solution de saccharose glacée (0,5 M) et remises en suspension dans 0,5 ml d'une solution de saccharose (0,5 M). Les solutions d'ADN, habituellement 5 g1 contenant 1 gg d'ADN, et 50 g1 de suspension cellulaire ont été mélangés, et l'électroporation a été effectuée à 12500 v/cm dans une cuvette Gene-Pulser (écarte- ment des électrodes, 2 mm). Une impulsion électri- que (2,5 kV, 25 iF, 200 ohms) a ensuite été appli- quée pour générer une intensité maximale du champ de 12,5 kV/cm avec le Pulse Controller (contrôleur d'impulsion) (Bio-Rad). Apres l'impulsion électri- que, la cuvette a ensuite été enlevée de la cham- bre et 1 ml de milieu M17G-saccharose (M17GS) a été ajouté immédiatement. Apres avoir laissé au repos pendant 2 h à 30 C, les cellules ont été étalées sur gélose M17GS contenant des antibioti- ques sélectifs. Pour E. coli, le procédé de transformation par CaCl2 de Dagert et Ehrlich (1979) a été utilisé sans la pré-incubation poussée dans du CaCl2. (ii) Isolement d'ADN plasmidique, analyse par endonu- cléase de restriction, clonage moléculaire et - 21 - 2725727 - 21- électrophorèse sur gel d'agarose De l'ADN plasmidique Lactococcique a été isolé par la méthode de Anderson & McKay (1983). Des plasmi- des de E. coli ont été isolés comme décrit par Bimbolm & Doly (1979). L'ADN plasmidique a été purifié par centrifugation sur gradient de densité chlorure de césium-bromure d'éthidium et dessalé par dialyse dans du tampon TE. Des digestions par restriction et un clonage moléculaire ont été effectués par les procédés décrits dans Sambrook et ai (1989). L'ADN a été fractionné en utilisant de l'agarose à 0,6 % sur des gels horizontaux dans du tampon Tris-acétate (pH 8,0) à 4 V/cm, suivi d'une coloration au bromure d'éthidium (0,5 mg/ml). La souche V517 de E. coli (Macrina et ail, 1978) a été initialement utilisée comme référence pour estimer la taille du plasmide Lactococcique. A partir de cette information, L. cremoris FG2 a été ultérieurement utilisée comme étalon pour estimer les tailles des plasmides. (iii) Hybridation Une modification du protocole présenté dans Sambrook et ai (1989) a été utilisée. Des sondes oligonucléotidiques ont été construites pour sonder la présence d'Abi A, C et 416 en sélection- nant une séquence particulière adaptée à une utilisation comme sonde. Ces séquences sont les suivantes: Abi A (Hill, C, et ail, 1990) a rapporté qu'une sonde constituée d'un fragment interne XbaI de 456 pb (positions 2067 à 2523) était spécifique - 22 - 2725727 de la séquence hsp. Les amorces de PCR ont toute- fois été sélectionnées à partir de la position 2677 à 2698 (22 pb) et 2875 à 2896 (22 pb), créant au total un produit PCR de 222 pb pour la sélec- tion d'amorces appropriées. f: 5'-TTT GAT AGG TTT GTT GCT CAC G-3' (position 2677-2698) r: 5'-CTT CGT TTT GAA GTA AGC CAG C-3' (position 2896-2875) sonde oligo à partir du fragment XbaI de 456 bp (position de 2450 à 2471: 22 pb) '-CTA TCT TGA AAG CTG ACG ACC A-3' Abi C (Durmaz, E, et al, 1992). L'oligonucléotide du gène de structure Abi C (1056 pb) a été synthétisé (position de 426 à 455: 30 pb). '-GAG GGC AAT TAA CGA CAA ACA TGG CAA CTC3' Abi 416 (Cluzel. P-J, et al. 1991). L'oligonucléotide du gène de structure Abi 416 a été synthétisé (position de 973 à 1003: 31 bp). 5'-GTT GGC TTT CTT TTG ATA ACA TGC CAA TTC C-3' (iv) Séquençage de l'ADN nucléotidique Les séquençages nucléotidiques ont été déterminés par la méthode de terminaison de chaîne didesoxy avec dATP-a35 (Sanger et al. 1977). Le séquençage d'ADN à double brin a été effectué pour les déterminants résis- tants aux phages et les réactions de séquençage ont été effectuées avec le kit de séquençage T7' (Pharmacia Biotech). Le séquençage des déterminants résistants aux phages a été initié en utilisant les amorces T7 et Sp6 de pGEM-7Zf(+), puis poursuivi en utilisant des oligo- - 23 - 2725727 - 23 - nucleotides basés sur les séquences obtenues. Les oligo- nucleotides pour le séquençage d'ADN ont été synthétisés sur un synthétiseur d'ADN (Oligo 1000, Beckman) selon les instructions du fabricant. Les données pour la séquence d'ADN ont été analysées en utilisant le système de logiciel ANGIS opéré par le centre d'information génomi- que australien de l'Université de Sidney. De manière alternative, un autre protocole a été utilisé pour le séquençage d'ADN comme suit: Le plus petit fragment codant pour la résistance aux phages a été sous-cloné dans le vecteur pGEM (Promega Corporation) et transformé dans E. coli NM522, avec un criblage bleu/blanc pour des recombinants. De l'ADN à double brin a été séquencé sur les deux brins essentiellement selon le protocole accompagnant le séquenceur d'ADN 377 (Applied Biosystems, Inc., Calif). Brièvement, l'ADN a été utilisé dans des réac- tions de séquençage par terminaison de chaîne didesoxy- nucléotidique avec la Taq DNA polymérase et des termina- teurs couplés à des colorants fluorescents (Dye DeoxyT Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, Inc., Calif.). Des amorces oligonucléotidiques de 20 mer ont été synthétisées et utilisées pour "marcher le long de la matrice d'ADN. L'enregistrement et l'analyse de la séquence nucléotidique ont été effectués en utilisant le logiciel d'assemblage de la séquence d'ADN Auto AssemblerTM (Applied Biosystems, Inc., Calif.) et le système de logiciel Angis (comme décrit précédemment). - 24 - 2725727 - 24 - RESULTATS Isolement de plasmides résistants aux bactériophages à partir de souches sauvages Des techniques de transfert de plasmide ont été réalisées selon celles décrites dans la partie Méthodes. Des transformants/transconjugants ont été criblés pour la résistance aux 4712 et 4C2V par la méthode d'étalement en stries croisées. Des isolats résistants aux phages ont ensuite été soumis à une analyse des plasmides et les plasmides acquis ont été identifiés. Un résumé des 10 plasmides isolés par conjugaison, co- transformation ou mobilisation à partir des souches de type sauvage est donné dans le tableau 1. La confirmation que les plasmides identifiés dans le tableau 1 ont codé pour la résistance aux phages a été obtenue par transfert ultérieur dans une autre souche réceptrice par des techniques de transformation ou de conjugaison. Les transformants ou les conjugants de la deuxième série ont été criblés pour la résistance aux phages par étalement en stries croisées et la teneur en plasmide. Caractérisation physique des plasmides codant pour la résistance aux phages Un résumé de la résistance aux phages des plasmi- des de la présente invention est donné dans les tableaux 2 à 6. En outre, le cas échéant, la résistance aux phages des sous-clones de ces plasmides est également donnée dans les tableaux 2 à 6. Les données présentées dans le tableau 2 démontrent que les plasmides de la présente invention, et - 25 - 2725727 leurs dérivés sous-clonés, réduisent l'efficacité d'étalement (EOP) et/ou interfèrent avec la morphologie des plages et/ou la taille des plages en comparaison avec les témoins dépourvus de plasmides. Le tableau 2 montre que ces plasmides codent pour un certain type de mécanis- me(s) de résistance aux bactériophages qui est efficace contre e712 (phage du type isométrique) et/ou 4C2V (phage du type allongé). Tableau 1: Résumé des plasmides codant pour la résistance aux phages PlasmideHôte Origine Taille Procédé Mécanisme de d'isolement résistance aux phages pND801 MG1363 L. lactis M195 12kb Co-transformation R/M pND802 LM0230 L. cremors 502 l9kb Co-transformation R/M pND809 LM023OSm L. lactiJ M175 65kb Mobilisation R/M (+Abi) pND811 LM0230 L. cremoria Mlll75kb Mobilisation R/M (+Abi) pND851 LM0230 L. lactis M113 46kb Co-transformation Abi pND852 LM023OSm L. lactis M138 56kb Conjugaison Abi pND853 LM023OSm' L. lactia M181 57kb Conjugaison Abi pND859 LM0230Fus' L. lactis var 16kb Conjugaison Abi diacetylactia UK12922 pND860 LM0230Fus'L. lactis var 56kb Conjugaison Abi (+ R/M)* diacetylactis UK19161 pND862 LM0230Sm' L. lactis var 63kb Conjugaison Abi + R/M diacetylactlai UX1392 R/M restriction modification; Abi - mécanisme d'infection abortive les données sur la résistance aux phages conféree par ces plasmides indiquent qu'il y a plus d'un mécanisme en jeu, vraisemblablement un système R/M en combinaison avec un système Abi. - 26 - 2725727 Tableau 2: EOP/taille de plage/+ morphologie 6712 OC2V Plasmide 300C 37 C 30 C 37 C Témoin 1 i 1 1 2 mm 1-2 mm 3 mm 3-4 mm pND801 2 x 10-6 10'- 1 0,9 2 nmm 2 mm 3 mm 3 mm pND802 10-3 10-3 10-3 10-3 2 mm 2 mm 3 mm 3 mm pND809 10-5 10o6 i0- 2 10-2 2 mm 2 mm 3 mm 3 mm pND811 1 10' 1 10242 12 1 mml 1 mm 3 mm 3 mm pND851 10'-2 0,16 10'4O 10-4* 1 mm 1 mm 1-2 mm 1-2 -mm pND852 10-3# 103 10 o-2# lO-1 NA 0,5 mm mix: - 27 - 2725727 Tableau 3: Adsorption des bactériophages 712 et C2V sur l'hôte LN0230 et l'hôte LM0230/LM0230Sme hébergeant les plasmides pND852, pND853, pND859, pND860, pND861 et pND862 % d'adsorption (30 C) Souche/Plasmide q712 %C2V LM0230 (témoin) 99,6 98, 6 LM0230 SmR (pND852) 97 99,8 LM0230 SmR (pND853) 99 99 LM0230 (pND859) 99,2 NA LM0230 (pND860) 99,5 99,6 LM0230 (pND861) 99,6 99,8 LM0230 (pND862) 99,6 NA NA non applicable A partir de ces données et d'autres, il a été établi qu'aucun des 10 plasmides étudiés ne code pour la prévention de l'adsorption des phages, ce qui démontre une adsorption des phages 712 et/ou C2V (le cas échéant) 2 96 %. Activité de restriction et de modification Mécanismes de résistance aux phages codés par pND801 et pND8 02 L'efficacité de l'étalement de 4712 sur des souches hébergeant pND801 et pND802 est donnée dans le tableau 4. Le phage 4712 propagé sur la souche LM0230 a présenté une EOP de 4 x 10'lorsqu'il est étalé sur une souche MG1363 (pND801). Les phages prélevés des rares plages formées sur cette souche n'étaient plus restreints par la même souche. S'il est repropagé sur la souche LM0230, - 28 - 2725727 - 2B - toutefois, le phage a présenté la même faible efficacité d'étalement sur la souche MG1363 (pND801) que le stock d'origine. Les dérivés de MG1363 (pND801), qui ont été curés de pND801, n'ont pas présenté la réduction en étalement de phage. Le titrage réciproque de 4712 sur LM0230 (pND802) a donné des résultats similaires comme à celui sur MG1363 (pND801). Ces résultats indiquent que les systèmes de restriction modification contrôlés par l'hôte fonctionnent chez MG1363 (pND801) et LM0230 (pND802). Le phage e712 propagé sur MG1363 (pND801) a présenté une faible efficacité d'étalement sur la souche LM0230 (pND802) et e712 propagé sur LM0230 (pND802) a été restreint par la souche MG1363 (pND801), ce qui illustre que la spécificité des activités R/M codées par pND801 et pND802 est différente. pND801 et pND802 ont aussi été testés pour la résistance aux phages codée sur le phage allongé OC2V dans une expérience similaire à celle décrite ci-dessus et il a été trouvé que le système de restriction de pND801 n'était pas actif sur le phage allongé 4C2V. Le plasmide pND802 a codé une restriction aussi bien vis-à- vis de e712 isométrique que du phage allongé 4C2V. - 29 - 2725727 - 29 - /O= Tableau 4: Exemple d'étalement réciproque pour les plasmides pND801 et pND802. EOP de $712 iso- métrique et de OC2V allongé sur des souches hébergeant les plasmides pND801, pND802 et pND803 ESte bact6ri-n MG1363 LM0230 LM0230 Phage LM0230 MG1363 (pND801) (pND802) (pNDS03) 4712 LM0230 1,0 1,0 4 x 10-' 9 x 10-' 7 x 10-' 4712 LM0230 (pND801) 1,0 1,0 1,0 4 x 10-' 5 x 10' $712 LM0230 (pND802) 1,0 1,0 2 x 10-' 1,0 1,0 $712 LX0230 (pND801 + 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 pND803) $C2V LM0230 1,0 1,0 1,0 2 x 10-' 3 x 10-' À C2V LM0230 (pNDS802) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 * Le nombre à l'éclatement est défini co me le nombre moyen de particules de bactériophage libérées par cellule infectée suivant l'infection lytique d'une population de cellules sensibles. (Pour les plasmides ne présentant pas d'étalement réciproque, c'est-à- dire les systèmes RM uniquement, des expériences portant sur le nombre à l'éclatement ou des essais de centre infectieux ont été effectués. Ces résultats sont donnés dans les tableaux 5a et 5b. - 30 - //2725727 Tableaux 5a et 5b Exemple de mise en évidence de la présence de mécanismes d'infection abortive par réduction du nombre à l'éclatement ou de la formation de centre infectieux Tableau 5a Nombre à l'éclatement 712e C2V4 Souche/plasmide 30oC 39C 300C 390C LM0230 166 200 100 100 LM0230 (pND851) ND ND 5 200 LM0230 (pND852) 5 100 ND ND LM0230 (pND853) 11,6 2 ND ND LM0230 (pND862) 7,5 11,2 NA NA NA non applicable; ND non déterminé Les résultats donnés dans le tableau 5a montrent que les plasmides pND851, pND852, pND853 et pND862 réduisent le nombre à l'éclatement de 4712 ou eC2V (le cas échéant) lorsqu'ils sont présents dans un hôte LM0230. Les résul- tats portant sur le nombre à l'éclatement à 39 C pour LM0230 (pND851) et LM0230 (pND852) indiquent que les mécanismes de résistance fonctionnant chez ces hôtes peuvent être sensibles à la température. La formation de centre infectieux (e.o.c.) a été déterminée pour le plasmide pND859, son sous-clone dérivé pND863 et pND861 comme le montre le tableau 5b. - 31 - 2725727 - 31 - Tableau 5b Hôte Formation de centre infectieux (e.o.c.) pour *712 LM0230 Fus' 1 LM0230 FusR (pND859) 0,05 LM0230 Fus' (pND863) 0,05 LM0230 Fus' (pND861) 0,15 Le nombre de centres infectieux formés sur LM0230 FusR (pND859) ou LM0230 FusR (pND863) par rapport au témoin, c'est-à-dire LM0230 FusR a été réduit de 95 % pour le phage 712 alors qu'une réduction d'e.o.c. de 85 % a été observée pour 7124> lorsque LM0230 FusR (pND861) était utilisée comme hâte. Tableau 6: Test d'activité vis à vis du lait (Modifié, Heap & Lawrence, 1976) Exemple: Comparaison de L. lactis LM0230 Sm' et L. lactis LM0230 Sm' (pND852) et L. lactis LM0230 Sm' (pND853) pour réduire le pH du lait en présence du phage 712. NB: le lait (RSM) a été enrichi en glucose (0,5 %) et en extrait de levure (1 %). Souche LM0230 Sm LM0230 SmR LM0230 SmR Cycle (pND852) (pND853) -b712 +4712 -4>712 +'712 -4>712 +4> 712 i 4,44 6,09 4,60 4,68 4,64 4,70 2 4,68 6,08 4,90 4,88 4,90 4,78 3 4,65 6,12 4,79 4,74 4,84 4,79 4 4,55 6,08 4,82 4,83 4,85 4,83 (pH RSM = 6,2) - 32 - 2725727 0,1 ml de 7124 (8 x 109 ufp/ml) et 0,2 ml d'une culture d'une nuit sur du lait de la souche appropriée ont été ajoutés au Cycle 1. Dans les cycles ultérieurs, (2-4), 0,1 ml du lactosérum provenant du cycle précédent a été ajouté plus 0,2 ml de culture sur du lait de la souche appropriée. Aucune interférence n'a été observée pour les souches LM0230 SMR (pND852) et LM0230 SMR (pND853) en présence de 4>712 sur quatre cycles. Ceci se contraste avec la souche témion sensible aux phages, LM0230 SM', qui a subi une interférence à partir du premier cycle lorsque 4>712 était présent. Cette interférence est indiquée lorsque ApH est > 0,2, ApH = (pH de test + 4>712) - (pH du test - 4712), plus ApH est élevé, plus l'interférence ou la réduction de la production d'acide est élevée. Données d'hybridation Les plasmides ont été sondés avec des oligonucléo- tides construits comme précisé dans matériel et méthodes. Le plasmide pND806 a servi de témoin positif pour la détection d'AbiA. Aucun des plasmides de la présente invention ne s'est hybridé avec la sonde AbiA, indiquant qu'ils ne possèdent pas le gène AbiA. De même, aucune hybridation n'a été observée pour les sondes AbiC ou Abi416; toutefois, des témoins positifs n'étaient pas disponibles. Ces trois gênes Abi étaient les seules séquences d'ADN du gène Abi disponibles au moment de ces travaux. - 33- 2725727 - 33 - Analyse de restriction et cartographie physique des plasuides de résistance aux phages Une analyse de restriction des plasmides a été effectuée en utilisant une série d'enzymes de restriction et les données de restriction sont énumérées dans le tableau 7. Les plasmides ont été extraits de souches hébergeant des plasmides résistants aux phages et soumis à une simple ou double digestion par diverses enzymes de restriction. Les fragments d'ADN générés ont été visua- lisés sur des gels d'agarose et des cartes de restriction des plasmides ont été construites. Ces cartes de restric- tion de pND801, pND802 et pND861 sont présentées aux figures 1 et 2. - 34 - 2725727 Tableau 7: Analyse de restriction de plasmides résistants aux phages Plasmide Enzyme Poids moléculaires des fragments (kb) pND801 BstI 12,0 EcoRI 8,9; 2,0; 1,1 EcoRV 12,0 PvuII 12,0 XbaI 8, 3; 2,7 pND802 BglII 11,8; 9,2 ClaI 16,1; 3,9 EcoRI 18, 2; 1,8 EcoRV 11,6; 4,3; 4,1 HindIII 20,0 SphI 18,9; 1,1 pND809 EcoRI 39,0; 11,2; 7,6; 5,8; 1,4 pND811 EcoRI > 23; 15; 9;6; 2,2 PstI > 23; 18; 9 doublet PvuII > 23;15 doublet, 2,5; 2,2 pND851 EcoRI 16,7; 9,5; 5,3; 4,8; 4,15; 3,8; 2,2; 0,7 PatI 20, 0; 9,0; 7,5; 6,2; 4,1 pND852 HpaII 13,0; 9,6; 8,9; 7,4; 6,0; 5,4; 3,7; 2,8 EcoRI > 23;11; 2,0; 1,8 ClaI > 23;17; 5,5; 2,7; 2,1 pND853 HpaII 22,0; 15,0; 8,9; 5,6; 2,7; 2,1; 1,6 EcoRI > 23; 15; 13; 3,6; 2,0 pND859 HindIII 6,5; 4,5; 2,9; 2 pND861 ClaI - 18; 9,4; 9,2; 6 PstI 27; 4,2 BglII > 23; 6,3; 3,5; 3,2 BamHI 14, 9,4; 8,4; 6,5 pND862 BamHZ 1; 16; 23; 23 BglII 25; 38 EcoRI 20; 10; 7,8; 7,2; 4,8; 4; 3,1; 2,3; 2; 1,6 HpaIZ 16; 12,5; 8, 5; 5,5; 3,65; 3,5; 3,4; 2,4; 1,8; 1,65; 1,5; 1,5; 0,8 PstI 40;13; 10 HindIII 14,4; 11,2; 7,2; 5,8; 4,9; 4,8; 3,8; 3,2; 3, 1,7; 1,1; 0,9; 0,8 ClaI 16; 15; 13; 11; 5,3 ScaI 20; 13; 9,8; 8,6; 3,7; 3,1; 2,2; 2; 0;4 AccI 13; 11; 11; 4,5; 2,3; 2; 1,5; 1,2; 1 et de multiples petits fragments BsaBl 20; 13; 9,3; 6; 5,2; 3,5; 1,8; 1,7; 0,9; 0,7 et élement en frottis des petits fragments XbaI 22,5; 21; 11; 5,2; 1, 5; 1; 0,7 ScaI 19; 13; 9; 8,4; 4; 3,3; 2,2; 2; 1,5; 0,6 - 35 - 2725727 - 35 - Effet cumulé de l'introduction de différents plasmides résistants aux phages dans le même hôte Différents plasmides codant pour la résistance aux phages ont été introduits en combinaisons différentes dans MG1363Sm ou LM0230Fus par conjugaison et électroporation pour étudier les effets cumulés de la résistance aux phages. Les différentes constructions ont été étalées en stries croisées et titrées contre 4712 (titre phagique = 2,0 x 109 ufp/ml-1) et 4C2V (titre phagique = 2,0 x 109 ufp ml') pour déterminer la résis- tance cumulée aux phages attribuée aux différentes combi- naisons de plasmides qu'elles contiennent. Les résultats sont présentés au tableau 8. L'effet de la résistance additive aux phages due à l'acquisition de plasmides multiples a été apparent dans la plupart des combinaisons de plasmides. La résistance additive aux phages s'est manifestée par une réduction du titre phagique, de l'EOP et de la taille des plages. En particulier, MG1363Sm (pND851 + pND803 + pND852), MG1363Sm (pND851 + pND803 + pND853), MG1363Sm (pND803 + pND851) et LM0230Fus (pND851 + pND805) se sont avérées présenter une résistance totale aussi bien à e712 isométrique qu'à 4C2V allongé. - 36 - 2725727 Tableau 8: Profils des étalements en stries croisées, taille des plages et EOP des constructions. Exemples des effets cumulés de la résistance aux bactériophages des mécanismes de résistance aux bactériophages codés par des plasmides uniques, doubles et triples. Etalement en Diamètre des stries plages croisées (m) EOP Souche 4712 4C2V 4712 4C2V 4712 *C2V Donneurs MC1363 (pNDS01) +/- - 1 5S 2 x 10' 2 1 LM0230 (pND803) +/- +/- 1 3 1 x 10l' 3 x 10-' LM0230 (pND805) +/- - 1 5 1 x 10- 1 LM0230 (pND809) +/- +/- 1 4 4 x 210' 6 x 10' LM0230 (pND811) + - 1 3 2 x 210' S x 10-' LM0230 (pND851) +/- * 0,7 0,3 5 x 10-' 1 x 10-' LM0230 (pNDSS2) + - 0,1 1 1 x 10' 2 x 10' LM0230 (pNDSS3) + - 0,1 MG1363 Sm (pND852 + pND803)+ + NP 0,1 MG1363 Sm (pND853 + pND803)+ + NP 0,2 30 C. Stabilité des plasmides hébergés par les constructions MG1363Sm (pND803 + pND851) La construction MG1363Sm (pND803 + pND851) s'est - 37 - 2725727 - 37 - avérée présenter une résistance totale aussi bien à 4712 isométrique qu'à OC2V allongé. Ayant réalisé la combinaison de plasmides donnant une protection maximale vis-à-vis aussi bien du phage isométrique que du phage allonge, l'étape suivante serait de tester la stabilité de ces plasmides après croissance pendant plusieurs générations sans sélection. Une culture d'une nuit de la souche a été cultivée dans du bouillon M17G jusqu'à la phase stationnaire (109 cellules ml'), diluée à 104 cellules ml1 et cultivée de nouveau. Ceci a été répété pendant 100 générations. A la fin de cette période, des isolats ont été étalés en stries croisées et dosés pour des phages pour voir si le phénotype de résistance aux phages avait été conservé. Il a été observé que cette combinaison de plasmides était relativement stable (98 %) sur 100 générations de croissance dans du bouillon liquide sans pression de sélection. Clonage de gènes résistants aux phages de pND801, pND802, pND852, pND853, pND859 et pND862 (i) pND802 Aussi bien pND802 que le vecteur pSA3 contiennent un site SphI unique et ils ont été totalement digérés par SphI puis ligaturés sur eux-mêmes par la T4 DNA ligase. Le mélange de ligation a été précipité par de l'éthanol et transféré dans LM0230 par électroporation. Des trans- formants ont été obtenus sur des boîtes de sélection M17G + 0,5 Sac + Em. Les colonies formées sur les milieux de sélection ont été criblées par étalement en stries croisées à travers e712. Sur les transformants testés, 60 % ont présenté une résistance à e712 du type pND802. - 38 - 2725727 - 3B - Une des colonies a été purifiée et le plasmide hébergé dans la souche a été désigné pND803. L'expression de la résistance aux phages codée par pND803 chez L. lactis a été étudiée en éprouvant des transformants hébergeant pND803 par un phage différent et les résultats sont présentés dans le tableau 6. pND803 a restreint le e712 isométrique et le 4C2V allongé dans une proportion similaire tout comme les souches hébergeant le plasmide parental pND802. Un sous-clonage supplémentaire a réduit le système R/M dans pND802 à un fragment de 9 kb par la construction de pND804. pND804 est un plasmide recombinant construit par clonage d'un fragment BglII de 9 kb de pND802 dans le site BamHI unique de pSA3 et confère la résistance aux phages au phage 712 et au phage C2V lorsqu'il est intro- duit dans L. lactis LM0230. (ii) pND801 L'ensemble de pND801 a été cloné dans le site EcoRI unique du vecteur pSA3 pour générer pND805. pND801 a été partiellement digéré par EcoRI pour former une bande linéaire. Le vecteur pSA3 a été totalement digéré par EcoRI. Les deux produits de digestion ont ensuite été ligaturés. Le mélange de ligation a été transformé dans LM0230 par électroporation. Les transformants ont été sélectionnés et éprouvés par D712. Le plasmide recom- binant pND805 résultant a été vérifié par analyse de restriction (cf. figure 3). (iii) pND852 pND852 contient huit sites HpaII. En utilisant la technique de clonage short gun, on a tenté de cloner les - 39 - fragments à l'aide du vecteur streptococcique, pGB301, contenant un site HpaII unique. Apres la restriction et la ligation, le mélange a été transféré par électropora- tion dans LM0230. Des transformants se sont formés à partir du milieu de sélection M17G + Sac + Em et ils ont été testés pour la résistance aux phages et la taille de plasmide. Une représentation schématique montrant les étapes impliquées dans le clonage du système Abi de pND852 est donnée dans la figure 4. Les transformants résistants aux phages hébergeaient tous un fragment HpaII de 2,6 kb. Un sous-clone représentatif, pND817, a conféré une résis- tance totale (EOP comme le plasmide parental, pND852. (iv) pND853 pND853 a été partiellement digéré par HpaII, puis ligaturé à pGB301 digéré par HpaII. Les transformants ont été sélectionnés sur des boîtes de M17G + Sac + Em et étalés en stries croisées à travers 4712. Diverses tailles plasmidiques ont été isolées des transformants résistants aux phages. Ceux-ci ont été analysés par digestion par des endonucléases de restriction. On a trouvé que tous les plasmides contenaient un fragment HvaII de 2,7 kb outre d'autres fragments de taille différente. Ce résultat indique que le fragment HpaII de 2,7 kb couramment isolé de pND853 code pour Abi. Des clones représentatifs, par ex. pND825, se sont avérés conférer une plus grande résistance à e712 que le plasmi- de parental. Une représentation schématique montrant les étapes de clonage du système Abi de pND853 est donnée à - 40 - 2725727 la figure 5. (v) pND859 Le plasmide pND859 a été digéré par HindIII et ligaturé à pDL278 digéré par HindIII; des transformants résistants à laspectinomycine ont été criblés pour la résistance à 4712 par étalement en stries croisées. Les transformants résistants aux phages se sont avérés héber- ger un fragment HindIII de 2,9 kb. Un exemple en est pND863 comme illustré à la figure 6. Le plasmide pND862 a été digéré par BamHI et ligaturé à pMUT1328 digéré par BamHI. Des transformants résistants à l'erythromycine ont été criblés pour la résistance à 4712 par étalement en stries croisées. Les transformants résistants aux phages se sont avérés héberger un fragment BamHI de 16 kb comme illustré à la figure 7. Séquençage d'ADN des systèmes Abi de pND852 et pND859 Les données de séquence d'ADN pour les deux mécanismes d'infection abortive, isolée de pND852 et pND859 sont présentées aux figures 8 et 9 respectivement. La séquence nucléotidique de l'insert d'ADN de 2,6 kb dans pND852 a été déterminée. Une analyse de la séquence, présentée à la figure 8, a mis en évidence un grand cadre de lecture ouvert (ORF) de 996 pb corres- pondant à une séquence de 332 acides aminés. En amont du codon d'initiation présumé, on a trouvé un site présumé de liaison des ribosomes et des régions promoteurs potentielles. En aval du codon d'arrêt présumé, un terminateur existe également. L'analyse de la séquence d'ADN du fragment - 41 -2725727 - 41 - HindIII de 2,9 kb de pND859 a mis en évidence un cadre de lecture ouvert d'environ 846 pb de long, précédé d'une séquence SD et de plusieurs régions promoteurs potentiel- les (comme le montre la figure 9). On n'a pas détecté d'homologie avec aucun des gènes de résistance aux phages publiés dans la base de données du gène pour les deux mécanismes Abi de pND852 et de pND859. Construction de plasmides codant pour la résistance aux bactériophages pND824 est un plasmide recombinant construit par clonage d'un fragment BglII de 9 kb de pND802 dans le site BamEI unique de pMU1328 et confère la résistance aux phages au phage 712 et au phage C2V lorsqu'il est intro- duit dans L. lactis LM0230. pND813 est un plasmide recombinant contenant un fragment BamEI de 16 kb de pND862 inséré dans pND600 à son site BamHI unique. Ce plasmide confère une résistance totale aux phages à %712 lorsqu'il est introduit dans L. lactis LM0230. pND824 a été digéré par XbaI et SmaI et une bande d'ADN de 9 kb a été récupérée du gel d'agarose. pND827 a été linéarisé par XbaI et PruUII et mélangé avec l'ADN de 9 kb. La ligation a été effectuée avec la T4 DNA ligase. Le mélange de ligation a été transformé dans un E. col! HEB101O compétent. Des transformants se sont formés sur des boîtes de sélection LB Amp 100 et ils ont été examinés pour la taille de l'insert obtenu. Le plasmide recombi- nant avec un insert de 25 kb a été désigné pND828 (cf. figure 10 pour le schéma de la construction). Cet insert de 25 kb peut être libéré de pND828 et cloné dans un - 42 - 2725727 - 42 - vecteur lactococcique de qualité alimentaire. De même, la figure 11 présente la construction d'un autre plasmide résistant à des phages multiples en utilisant les méca- nismes de résistance phagiques de pND852 et de pND801. La figure 12 présente le concept général de la construction de plasmides codant pour la résistance aux bactériophages chez les bactéries lactiques. Un fragment d'ADN particulier codant pour la résistance aux bactério- phages est identifié et sous-cloné à une taille minimum. Initialement, la taille des plasmides peut aller de 60 kb à 100 kb bien que la séquence codant pour la résistance aux bactériophages peut être d'une taille allant de 2 kb à 10 kb. Les fragments d'ADN sous-clonés codant pour la résistance aux bactériophages sont alors joints ensemble et reliés à un vecteur de clonage acceptable susceptible d'être utilisé chez les bactéries lactiques approuvées dans les aliments. Le plasmide est sélectionné ou manipulé de sorte que lorsqu'il est dans une cellule hôte, il n'interfère pas avec la réplication de n'importe quel plasmide naturel résidant dans l'hôte. Une fois construit, le plasmide peut être transféré dans * différentes souches de bactéries lactiques. Les bactéries lactiques peuvent être regroupées selon leur sensibilité à différents bactériophages. Approximativement 25 groupes de lactocoques sont connus qui n'ont pas de rapport avec des bactériophages (Klaen- hammer, 1984). Un plasmide selon la présente invention peut être introduit dans une souche de chaque groupe n'ayant pas de rapport avec des phages. Ceci fournit par conséquent la résistance naturelle de chaque groupe -43 - 2725727 n'ayant pas de rapport avec des phages ainsi que les mécanismes de résistance aux bactériophages codés par le plasmide. Comme les plasmides de la présente invention sont constitués uniquement d'ADN dérivé de bactéries lacti- ques, ils conviennent à une utilisation chez les bacté- ries lactiques utilisées pour la production d'aliments destinés à la consommation humaine. La figure 13 présente un exemple d'un fragment d'ADN codant pour la résistance aux bactériophages vis-à- vis du petit phage isométrique et du phage allongé sur Lactococcus lactis. Ce fragment peut être un fragment BglII de 9 kb dérivé de pND802 et il est adapté pour une incorporation dans un plasmide selon la présente inven- tion. - 44 - 2725727 -44 - Références Achen, M.G., Davidson B.E. et Hillier A.J. 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(1975) Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages (Milieu amélioré pour les streptocoques lactiques et leurs bactériophages). Appl. Microbiol. 29:807-813. Il sera apprécié par l'homme de l'art que de nombreuses variations et/ou modifications peuvent être apportées à l'invention telle qu'elle est présentée dans les modes de mise en oeuvre particuliers sans s'écarter de l'esprit ou du cadre de l'invention telles que décrite de manière générale. Les présents modes de mise en oeuvre doivent par conséquent être considérés à tous égards comme étant illustratifs et non restrictifs. - 50 - 2725727 - 50 - Revendications: 1. Plasmide codant pour la résistance aux bactério- phages choisi dans le groupe constitué de pND801 (N95/58018), pND802 (N95/58019), pND809 (N95/58020), pND811 (N95/58021), pND851 (N95/58022), pND852 (N95/59300), pND853 (N95/58023), pND859 (N95/58024), pND860 (N95/59301), pND862 (N95/58025) et leurs équiva- lents fonctionnels. 2. Molécule d'acide nucléique isolée comportant une séquence nucléotidique codant pour la résistance aux bactériophages, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique est dérivée d'un plasmide choisi dans le groupe constitué de pND801 (N95/58018), pND802 (N95/58019), pND809 (N95/58020), pND811 (N95/58021), pND851 (N95/58022), pND852 (N95/59300), pND853 (N95/58023), pND859 (N95/58024), pND860 (N95/59301), pND862 (N95/58025) et leurs équivalents fonctionnels. 3. Molécule d'acide nucléique isolée selon la reven- dication 2, caractérisée en ce que la séquence nucléoti- dique codant pour la résistance aux bactériophages correspond sensiblement à la séquence nucléotidique de la figure 8. 4. Molécule d'acide nucléique isolée selon la reven- dication 2, caractérisée en ce que la séquence nucléoti- dique codant pour la résistance aux bactériophages correspond sensiblement à la séquence nucléotidique de la figure 9. 5. Procédé pour augmenter ou conférer la résistance aux phages à une bactérie comprenant l'introduction dans la bactérie d'au moins un plasmide ou d'au moins une - 51 - 2725727 séquence nucléotidique dérivée d'au moins un plasmide selon la revendication 1. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la bactérie est une bactérie lactique. 7. Bactérie ayant une résistance aux phages augmen- tée ou conférée, produite selon le procédé de la revendi- cation 6. 8. Plasmide de bactérie lactique constitué d'ADN de bactérie lactique ou d'ADN synthétisé chimiquement destiné à une utilisation pour augmenter ou conférer aux bactéries lactiques la résistance aux phages, le plasmide comportant au moins deux séquences nucléotidiques codant pour les mécanismes de défense phagiques choisis dans le groupe constitué par la restriction contrôlée par l'hôte, la modification contrôlée par l'hôte, l'infection abor- tive et la prévention de l'absorption des phages. 9. Plasmide selon la revendication 8, caractérisé en ce que le plasmide comporte un minimum d'ADN et exclut sensiblement l'ADN qui n'est pas nécessaire pour le maintien du plasmide ou pour coder pour les mécanismes de défense phagiques. 10. Plasmide selon la revendication 8 ou 9, caracté- risé en ce que les au moins deux séquences nucléotidiques sont dérivées de plasmides choisis dans le groupe constitué de pND801 (N95/58018), pND802 (N95/58019), pND809 (N95/58020), pND811 (N95/58021), pND851 (N95/58022), pND852 (N95/59300), pND853 (N95/58023), pND859 (N95/58024), pND860 (N95/59301), pND862 (N95/58025) et leurs dérivés fonctionnels. 11. Plasmide selon la revendication 8 ou 9, - 52 - 2725727 - 52 - caractérisé en ce qu'au moins une des deux séquences nucléotidiques correspond sensiblement à la séquence nucléotidique de la figure 8 ou de la figure 9. 12. Plasmide selon la revendication 8 ou 9, caracté- risé en ce que les deux séquences nucléotidiques corres- pondent sensiblement aux séquences nucléotidiques de la figure 8 et de la figure 9. 13. Plasmide selon l'une quelconque des revendica- tions 8 à 12, comportant au moins trois séquences nucléo- tidiques codant pour les mécanismes de défense phagiques. 14. Plasmide selon l'une quelconque des revendica- tions 8 à 13, comportant de plus une séquence nucléotidi- que codant pour au moins un marqueur de sélection. 15. Bactérie comportant au moins un plasmide selon l'une quelconque des revendications 8 à 14. 16. Bactérie selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie lactique. 17. Procédé pour augmenter ou conférer la résistance aux phages à une bactérie comprenant l'introduction dans la bactérie d'au moins un plasmide selon l'une quelconque des revendications 8 à 14. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la bactérie est une bactérie lactique.