FR 2722798 A1 19960126 FR 9409272 A 19940725 l PROCEDE DE PRODUCTION D'ACIDES GRAS OU DERIVES A PARTIR DE PLANTES OLEAGINEUSES L'invention concerne un procédé de production d'acides gras ou dérivés d'acides gras (esters ou autres dérivés) à partir de plantes oléagineuses. Le procédé de l'invention s'applique en particulier à des plantes oléoprotéagineuses telles que colza, tournesol, soja, crambé... L'invention peut notamment être utilisée pour fabriquer des bio-carburants (diester), lubrifiants, adjuvants phytosanitaires, détergents... par transformation: des acides gras produits. On a tenté depuis 1970 de substituer aux produits dérivés du pétrole (notamment carburants) des produits obtenus à partir de matière végétale afin de réduire la dépendance vis-à-vis des pays producteurs de pétrole et d'élargir les débouchés des produits agricoles. La filière utilisant les plantes oléagineuses comme matière première passe par la production d'acides gras libres qui constituent la matière première pour les industries de transformation vers les carburants, lubrifiants... Les lipides accumulés par les plantes oléagineuses peuvent être transformés en acide gras par hydrolyse: deux procédés sont actuellement exploités industriellement pour opérer cette transformation. Un premier procédé consiste à hydrolyser les lipides après extraction en mettant en contact à chaud et sous pression les lipides extraits avec du méthanol sulfurique ou de la potasse méthanolique. Un autre procédé consiste à opérer l'hydrolyse dans des conditions similaires directement sur le broyat de graines sans extraction préalable. On pourra par exemple se reporter à la référence suivante pour plus de détails sur ces procédés qui sont les seuls exploités dans l'industrie pour hydrolyser les huiles végétales: K.J. Harrington et C. d'Arcy-Evans, Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Dev. 1985, 24, 314-318. Les défauts bien connus de ces procédés sont les suivants: coût de mise en oeuvre élevé, infrastructure industrielle lourde, caractère polluant des effluents, production de glycérol comme sous- produit sans marché actuellement. Ces procédés sont mis en oeuvre faute de techniques de remplacement. Par ailleurs, des expérimentations ont été conduites en laboratoire pour réaliser l'hydrolyse des lipides par voie enzymatique en mélangeant une lipase avec les lipides extraits des graines (G.P. McNeill et al., JAOCS, Vol. 68 n 1 janvier 1991, p. 1-5; S.M. Kim et J.S. Rhee, JAOCS Vol. 68 n 7 juillet 1991, p. 499-503; C. Gancet, In Heterogeneous Catalysis And Fine Chemicals II 1991, Guisnet Editors, p. 93-104). Toutefois, ces essais sont restés au stade du laboratoire car la technique est incompatible avec une exploitation industrielle en raison des quantités d'enzyme nécessaires et du coût de celle-ci. La présente invention se propose de fournir une nouvelle solution au problème de la production d'acide gras à partir de plantes oléagineuses. Elle vise à fournir une solution dont les coûts de mise en oeuvre sont considérablement abaissés par rapport aux procédés connus (aussi bien procédés chimiques industriels que procédé enzymatique de laboratoire). Un objectif de l'invention est ainsi de fournir un procédé exploitable sur le plan industriel dans des conditions douces de température et de pression, qui bénéficie d'une mise en oeuvre simple et non polluante, utilise une infrastructure légère et ne conduit à aucun sous-produit gênant. Un autre objectif, lié au précédent, est de permettre de multiplier les installations de production d'acides gras en vue de les rapprocher des lieux de culture des plantes oléagineuses et de réaliser ainsi des économies de transport de la matière premiere. A cet effet, le procédé conforme à l'invention pour la production d'acides gras ou dérivés d'acides gras à partir de plantes oléagineuses se caractérise en ce que: - on produit des plantes oléagineuses transgéniques possédant, d'une part, au moins un gène codant pour une enzyme lipase, dit gène de lipase, d'autre part, associe a ce gène de lipase, un promoteur permettant une expression dudit gène soit dans des compartiments cellulaires, extracellulaires ou tissulaires différents de ceux o s'accumulent les lipides de la plante, soit sur induction exogène, - on recueille les graines ou fruits contenant les lipides desdites plantes, on broie lesdites graines ou fruits, le cas échéant après traitement inducteur, de façon à mettre en contact les lipides et la lipase contenue dans lesdites graines ou fruits, - on laisse incuber l'ensemble pour engendrer une hydrolyse enzymatique des lipides du broyat sous l'action catalytique de la lipase contenue dans ledit broyat, - on extrait les acides gras issus de l'hydrolyse ou on les transforme pour obtenir les dérivés d'acides gras recherchés. Ainsi le procédé de l'invention est un procédé d'hydrolyse enzymatique qui bénéficie des avantages de ce type de procédé (conditions douces de mise en oeuvre, absence de pollution, installations légères et peu coûteuses, absence de sous-produits gênants). Dans ce procédé, on amène la plante à produire elle-même l'enzyme nécessaire à la transformation ultérieure des lipides, en évitant que cette enzyme ne vienne prématurément au contact des lipides de façon à écarter tout risque d'auto- dégradation de la plante avant la récolte. L'hydrolyse est ensuite obtenue sans addition d'enzyme exogène en opérant la mise en contact des lipides et des enzymes produits par la plante. Un tel procédé présente un coût global de mise en oeuvre particulièrement réduit. Les installations de broyage et d'incubation sont légères et courantes dans le milieu agricole, de sorte que ces opérations peuvent être exécutées sur les sites de récolte des plantes. La production des plantes transgéniques est obtenue en réalisant initialement la transformation génétique d'une plante oléagineuse naturelle, en amenant la plante génétiquement transformée à se multiplier par la voie sexuée pour la production de semences transgéniques et en utilisant ensuite ces semences pour l'obtention de plantes transgéniques descendantes. La transformation génétique initiale consiste, selon un processus actuellement bien connu, a réaliser une cassette d'expression comprenant le gène de lipase et le promoteur d'expression de ce gène et à introduire cette cassette d'expression dans le génome de la plante. Une des caractéristiques essentielles du procédé de l'invention est que le promoteur associé au gène de lipase est adapté pour éviter une mise en contact prématurée de l'enzyme et des lipides; ce promoteur peut être de plusieurs types: il peut soit (1) diriger l'expression du gène dans des compartiments différents de ceux o s'accumulent les lipides, soit (2) initier l'expression du gène au moment opportun par induction exogène. Dans le premier cas, deux types de cassettes d'expression peuvent être utilisés: (1A) soit une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlant l'expression de ce gène dans un compartiment cellulaire ou tissulaire différent du compartiment d'accumulation des lipides, (lB) soit une cassette d'expression comprenant un promoteur constitutif et un gène de lipase muni d'une séquence d'adressage vers des compartiments cellulaires ou extracellulaires différents de ceux o s'accumulent les lipides. Dans le second cas (2), le promoteur utilisé dans la cassette d'expression est du type contrôlable de façon exogène par des signaux physiques, chimiques ou biochimiques, en particulier promoteur de stress commandant l'expression sur application d'un traumatisme physique sur les graines ou fruits. Par exemple pour produire des acides gras à partir de plantes oléoprotéagineuses, on peut utiliser le mode de mise en oeuvre 1A cidessus évoqué: - la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlant l'expression d'une protéine déterminée de la graine, et en introduisant cette cassette d'expression dans le génome de la plante de façon à faire exprimer la lipase dans les compartiments de la graine o s'accumulent la protéine précitée, - la mise en contact des lipides et de la lipase est effectuée par simple broyage. Pour le colza, le promoteur de la protéine utilisé est avantageusement le promoteur de la napine qui permet une accumulation massive de lipase dans les corps protéiques de la graine, séparés des globules lipidiques. Le mode de mise en oeuvre lB ci-dessus peut être utilisé quel que soit le type de plante oléagineuse, par exemple en choisissant le promoteur constitutif 35S du CaMV (Virus de la mosaïque du chou-fleur) et la séquence d'adressage PR-S du tabac afin de diriger l'excrétion des lipases produites vers les compartiments extracellulaires. La mise en contact des lipides et des lipases est également effectuée dans ce cas par simple broyage. Le mode de mise en oeuvre (2) ci-dessus peut être utilisé quel que soit le type de plante oléagineuse, par exemple en choisissant le promoteur inhibiteur de protéase isolé de la pomme de terre, qui commande l'expression des gènes en cas de blessures. Le traitement inducteur qui provoque la synthèse des lipases peut être dans ce cas une action de décorticage des graines, réalisée avant le broyage. De préférence, quel que soit le mode de mise en oeuvre choisi, on utilise un gène codant pour une lipase non spécifique, c'est-à-dire caractérisée par une activité hydrolytique non spécifique, afin d'obtenir une 4, hydrolyse totale des lipides accumulés par la plante et d'éviter les réactions parasites de saponification. I1 est toutefois possible, pour certaines utilisations des acides gras, de faire produire à la plante des lipases à activité hydrolytique spécifique afin de favoriser un type donné d'hydrolyse (par exemple: monoacylglycérollipase du Penicyllium camembertii réalisant uniquement l'hydrolyse d'une des trois liaisons du glycérol avec les acides gras, en vue de la fabrication de diacylglycérols). On peut en particulier utiliser des gènes de lipase non spécifique, caractérisé par les séquences suivantes ou par des séquences analogues aux séquences suivantes (les flèches délimitent la partie codante): SEQUENCE I 1 GATGACAACT TG-GTTGGTGG CPTGACTTTG GACTTACCCA GCGATGCTCC 51 TCCTATCAGC CTCTCTAGCT CTPCCAACAG CGCCTCTGAT GGTGGTAAGG lOl TTGTTGCTGC TACTACTGCT CAGATCCAAG AGTTCACCAA GTATGCTGGT 151 ATCGCTGCCA CTGCCTACTG TCGTTCTGTT GTCCCTGGTA ACAAGTGGGA 201 TTGTGTCCPA TGTCAAAAGT GGGTTCCTGA TGGCAAGATC ATCACTACCT 251 TTACCTCCTT GCTTTCCGAT ACAAATGGTT ACGTCTTGAG AAGTGATAAA 301 CAAAAGACCA TTTATCTTGT TTTCCGTGGT ACCAACTCCT TCAGAAGTGC 351 CATCACTGAT ATCGTCTTCA ACTTTTCTGA CTACAAGCCT GTCAAGGGCG 401 CCAAAGTTCA TGCTGGTTTC CTTTCCTCTT ATGAGCAAGT TGTCAATGAC 451 TATTTCCCTG TCGTCCAAGA ACAATTGACC GCCCACCCTA CTTATAAGGT 501 CATCGTTACC GGTCACTCAC TCGGTGGTGC ACAAGCTTTG CTTGCCGGTA 551 TGGATCTCTA CCAACGTGAA CCAAGATTGT CTCCCAAGAA TTTGAGCATC 601 TTCACTGTCG GTGGTCCTCG TGTTGGTAAC CCCACCTTTG CTTACTATGT 651 TGAATCCACC GGTATCCCTT TCCAACGTAC CGTTCACAAG AGAGATATCG 701 TTCCTCACGT TCCTCCTCAA TCCTTCGGAT TCCTTCATCC CGGTGTTGAA 751 TCTTGGATGA AGTCTGGTAC TTCCAACGTT CAAATCTGTA CTTCTGAAAT 801 TGAAACCAAG GATTGCAGTP ACTCTATCGT TCCTTTCACC TCTATCCTTG 851 ACCACTTGAG TTACTTTGAT ATCAACGAAG GAAGCTGTTT GTAAAACACT 901 TGACGTGTTA CTCTAATTTT ATAATAAAAT TAAGTTTTTA TACAAT fO19 900 d 9OVE90910iD 1o09VO0 i O09DO 1115i9 9V99I015D TSII V350VP5130V *00'dE1I390 O01IVU0U0 90JÀf91991 I09910f0 TO1IT S Z 50119VOEU1 O 99 09 EOY 0099E0D$000 00 D 0 EO iOlo3o IOOI V5130909019 005919901 9 91D00 19i900510900 0I 00 05i0V0ii8 OZ0 1300050100 IIE905VEEI 0010vilio DVI0DOD50V019vv0iTS6 DDDDDDVVDO 909I00E5E0 I00voolvd3cDV500vl9vv00Dov106 J011505050091999iD0 5VOVV5090 I EVEXI0E53 05DE5I0v0iJ 18; 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Par ailleurs, l'introduction de la cassette d'expression: gène de lipase/promoteur d'expression de ce gène, dans le génome de la plante oléagineuse peut être réalisée par tout protocole connu. Par exemple, selon le protocole le plus courant actuellement, cette cassette d'expression peut être introduite dans le génome de cellules somatiques de la plante par un transfert à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Cette introduction dans lesdites cellules somatiques de la plante peut également être réalisée par une autre technique connue, notamment par électroporation, par biolistique ou par microinjection. Il est également possible d'introduire la cassette d'expression dans le génome de microspores de la plante par électroporation ou biolistique. Dans le protocole fourni plus loin à titre d'exemple, on a décrit la technique d'électroporation pour l'introduction de la cassette dans les microspores du colza. On pourra se reporter au document suivant "P.J.J. Hooykaas et R.A. Schilperoort, TIBS août 1985, p. 305-309" pour plus de détail sur la technique de transfert à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens. On rappelle que cette technique consiste à introduire la cassette d'expression concernée dans le plasmide Ti de la bactérie notamment par choc thermique, puis à mettre en contact la bactérie avec des disques de feuilles de la plante, à laisser incuber l'ensemble jusqu'à obtenir le transfert de la cassette d'expression dans le génome des cellules des disques foliaires, et à cultiver ces disques foliaires sur une succession de milieux jusqu'à régénération des plantes transgéniques. On pourra se reporter au document suivant "J.A. Russell et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 1992, 28P, p. 97-105" pour plus de détail sur la technique de biolistique. On rappelle que cette technique consiste à fixer le plasmide contenant la cassette d'expression sur des microbilles d'or ou de tungstène, à projeter ces microbilles à l'aide d'un canon à particules sur les cellules de la plante à transformer, et à cultiver ces cellules jusqu'à régénération des plantes transgéniques.10 On pourra se reporter au document suivant "Crossway A et Al, 1986, Mol. Gen. Genet 202, 179-185" pour plus de détail sur la technique de micro-injection. On rappelle que cette technique consiste à injecter dans des protoplastes ou de très jeunes embryons le plasmide contenant la cassette d'expression à l'aide de micro- seringues, et à cultiver les protoplastes jusqu'à régénération des plantes transgéniques. Après mise au contact par broyage de la lipase et des lipides, on laisse incuber l'ensemble pour réaliser l'hydrolyse enzymatique. Cette incubation est réalisée dans des conditions classiques, en particulier entre 20 C et 60 C, pendant le temps nécessaire à l'obtention d'une hydrolyse totale ou quasi-totale. L'extraction des acides gras issus de l'hydrolyse est ensuite opérée par tout procédé connu, en particulier par une extraction liquide/liquide utilisant un solvant apolaire tel que le chloroforme ou l'hexane.: Selon un autre mode de mise en oeuvre, il est possible de réaliser in situ une transformation des acides gras pour obtenir des dérivés d'acides gras qui sont ensuite extraits. Par exemple, les acides gras issus de l'hydrolyse peuvent être méthylés in situ par mise en contact avec du méthanol en catalyse acide sous ultrasons en vue de les transformer en esters méthyliques, ces derniers étant extraits par une extraction liquide/liquide utilisant un solvant apolaire. La présente demande vise, en tant que produit nouveau, toute plante oléagineuse ou semence de plante oléagineuse, d'une variété non protégeable par un certificat d'obtention végétale, qui comprend dans son génome une cassette d'expression possédant au moins un gène codant pour une enzyme lipase, associé à un promoteur permettant une expression dudit gène dans des compartiments cellulaires, extracellulaires ou tissulaires différents des compartiments lipidiques de la plante ou de la semence. Le promoteur associé au gène de lipase peut être un promoteur à expression cellulaire ou tissulaire spécifique. Ce promoteur peut également être un promoteur constitutif, auquel cas le gène de lipase est muni d'une séquence d'adressage vers des compartiments cellulaires ou extracellulaires différents des compartiments d'accumulation des lipides.: La présente demande vise également toute 4 plante oléagineuse ou semence de plante oléagineuse, d'une variété non protégeable par un certificat d'obtention végétale, qui comprend dans son génome une cassette d'expression possédant au moins un gène codant pour une enzyme lipase, associé à un promoteur permettant une expression dudit gène sur induction exogène, en particulier par un stress. La description qui suit en référence au dessin fournit à titre d'exemple un protocole de mise en oeuvre du procédé de l'invention; la figure 1 du dessin schématise la préparation du matériel génétique à transférer. 1/ PROTOCOLE D'OBTENTION DE PLANTES TRANSGENIOUES DE: COLZA EXPRIMANT UN GENE DE LIPASE a) Matériel végétal i On utilise des graines de colza (Brassica napus, Var Tapidor) qui sont obtenues dans le commerce. Les graines sont semées en serre et cultivées dans des conditions standard. L'état sanitaire des plantes est rigoureusement surveillé. Les jeunes bourgeons (taille inférieure 3,5 mm) sont prélevés, stérilisés dans l'hypochlorite de :.- sodium pendant 30 minutes et les microspores sont extraites des anthères par broyage au Waring Blendor dans le milieu de Huang et al (Huang et al. 1990, Plant. Cell. Rep. 8, 594-597). Après filtration sur un tamis métallique de 50 pm de vide de maille, les microspores sont récupérées par centrifugation 5 minutes à 100xg (Protocole décrit dans: Jardinaud et al., 1993, Plant. Sci. 93, 177-184).- b) Construction génétique La construction génétique retenue met en oeuvre le promoteur de la napine, le cDNA de la lipase de Rhizopus niveus et le terminateur NOS. Le promoteur de la napine dirige l'expression de cette protéine dans un compartiment protéique de la graine différent de celui o s'accumulent les lipides. L'ensemble est introduit dans le plasmide pRT1 contenant le gène de sélection pat utilisé pour cribler les transformants en vue de former la construction pRT1L. Le détail de la construction est donné à la figure 1 du dessin. Le promoteur napine désigné "Prom. Nap" a été isolé par l'équipe du Professeur Rask (Stalberg K. et al, 1993, Plant Molecular Biology, 23: 671-683). Le cDNA de la lipase de Rhizopus niveus, désigné "Lip", a été isolé par le Central Research Institute (Kugimiya et al., 1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716-719). Un codon d'initiation, désigné "start codon", compatible avec l'extrémité 5' du cDNA (disponible sur le marché) est, greffé sur cette extrémité. Sur l'extrémité 3' de l'ensemble obtenu, désigné "lip", on greffe un terminateur désigné NOS extrait du plasmide pRT1 ci-après évoqué et, sur l'extrémité 5', le promoteur Nap. La cassette d'expression ainsi obtenue est introduite dans un plasmide désigné "Blue-Script" (nom commercial) en vue d'en réaliser l'amplification. La cassette d'expression amplifiée est ensuite extraite de "Blue- Script" et introduite dans un plasmide désigné pRT1 qui a été préparé en greffant le promoteur désigné CaMV35S sur l'extrémité 5' du gène "pat" ylle codant pour la phosphinothricine acétyl transférase (gène de sélection) et le terminateur NOS sur l'extrémité 3'. On obtient un plasmide désigné pRT1L contenant la cassette d'expression visee. c) Transfert de gène et production des plantes transgéniques Les microspores isolées en a) (106 microspores ml-1) sont mises en suspension dans le milieu de Brewbaker et Kwack (J.L. Brewbaker et B. H. Kwack, 1963, Am. J. Bot. 50, p. 859-865) contenant 13 % de saccharose et ajusté à pH 5,9. 50ig par ml du plasmide pRT1L sont ajoutés au milieu et des impulsions électriques de 400 V/cm pendant 10 ms sont appliquées à la suspension à l'aide d'un électroporateur "Jouan" (marque déposée) (TRX, GHT) délivrant des impulsions en vague carrée. Après 20 minutes de repos, le milieu de culture (Huang et al.) contenant 100 mg/l de phosphinothricine est ajoute aux microspores. Les microspores sont cultivées à l'obscurité 24 h à 35 C puis à 25 C. Après 2 semaines de culture un volume égal de milieu neuf est ajouté et les microspores placées à la lumière sous photopériode 16 h jour / 8 h obscurité. Après environ 1 mois les embryons sont transférés en milieu B5 (Gamborg et al., 1979, Exp. Cell. Res. 50, 151-158) contenant G3A3 1 ml/g, 20g/l saccharose et solidifié par 8/1 de gélifiant "Bacto Agar" (marque déposée). Les plantes régénérées résistantes à la phosphinothricine sont analysées en "southern" de façon à vérifier la présence dans leur génome de la séquence codant pour la lipase. Le stock chromosomique des plantes retenues est doublé par la colchicine (0,1 g/l plus quelques gouttes de teepol) et les plantes diploïdes fertiles produites sont autofécondées. Sur un nombre restreint de graines, on recherche l'activité de la lipase. Les plantes présentant des graines dont l'activité lipase est la plus élevée sont retenues et les graines utilisées pour la multiplication des plantes jusqu'à obtention d'un stock de graines suffisant pour réaliser les expériences d'hydrolyse des lipides de la graine par les lipases endogènes. 2/ HYDROLYSE ENZYMATIQUE DES LIPIDES DES GRAINES DE COLZA OBTENUES Les graines sont broyées, le broyat placé dans un incubateur maintenu à la température constante de 40 . Le broyat est soumis à une agitation permanente de façon à augmenter le contact entre les lipides et la lipase. Après 48 h d'hydrolyse, les acides gras sont extraits par le chloroforme. Le chloroforme est évaporé et les acides gras récupérés. REVENDICATIONS 1/ - Procédé de production d'acides gras ou de dérivés d'acides gras à partir de plantes oléagineuses, caracterise en ce que: - on produit des plantes oléagineuses transgéniques possédant, d'une part, au moins un gène codant pour une enzyme lipase, dit gène de lipase, d'autre part, associe a ce gène de lipase, un promoteur permettant une expression dudit gène soit dans des compartiments cellulaires, extracellulaires ou tissulaires différents de ceux o s'accumulent les lipides de la plante, soit sur induction exogène, - on recueille les graines ou fruits contenant les lipides desdites plantes, - on broie ledites graines ou fruits, le cas échéant après traitement inducteur, de façon à mettre en contact les lipides et la lipase contenue dans lesdites graines ou fruits, - on laisse incuber l'ensemble pour engendrer une hydrolyse enzymatique des lipides du broyat sous l'action catalytique de la lipase contenue dans ledit broyat, - on extrait les acides gras issus de l'hydrolyse ou on les transforme pour obtenir les dérivés d'acides gras recherchés. 2/ - Procédé selon la revendication 1, dans lequel on produit les plantes transgéniques en effectuant une transformation génétique d'une plante oléagineuse naturelle, en amenant la plante génétiquement transformée à se multiplier par la voie sexuée pour la production de semences transgéniques et en utilisant lesdites semences pour l'obtention de plantes transgéniques descendantes. 3/ - Procédé selon la revendication 2 pour la production d'acides gras à partir de plantes oléoprotéagineuses, caractérisé en ce que: - la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlant l'expression d'une protéine déterminée de la graine, et en introduisant cette cassette d'expression dans le génome de la plante de façon à faire exprimer la lipase dans les compartiments de la graine o s'accumulent la protéine précitée, - la mise en contact des lipides et de la lipase est effectuée par simple broyage. 4/ - Procédé selon la revendication 3 pour la production d'acides gras à partir de colza, caractérisé en ce que la transformation génétique est effectuée à partir d'une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et le promoteur de la napine. / - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que: 15. la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlable de façon exogène, et en introduisant cette cassette d'expression dans le génome de la plante, 20. un traitement inducteur est appliqué aux graines et fruits avant broyage de façon à provoquer la synthèse de la lipase. 6/ - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que: 25. la transformation génétique est effectuée à partir d'une cassette d'expression comprenant un gène de lipase et un promoteur de stress, le traitement inducteur est constitué par un traumatisme physique appliqué sur les graines ou fruits avant le broyage. 7/ - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que: la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant un promoteur constitutif et un gène de lipase muni d'une séquence d'adressage vers des compartiments cellulaires ou extracellulaires différents de ceux o s'accumulent les lipides, la mise en contact des lipides et de la lipase est effectuée par simple broyage. 8/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on produit des plantes transgéniques possédant un gène de lipase caractérisée par une activité hydrolytique non spécifique. 9/ - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on produit des plantes transgéniques possédant un gène de lipase caractérisé par une séquence identique ou analogue à l'une des séquences suivantes (les flèches délimitent la partie codante): SEQUENCE I 1 GATGACA4CT TGGTTGGTGG CATG-CTTTG GACTTACCCA GCGATGCTCC 51 TCCTATCAGC CTCTCTAGCT CTACCAACAG CGCCTCTGAT GGTGGTAAGG 101 TTGTTGCTGC TACTACTGCT CAGATCCAAG AGTTCACCAA GTATGCTGGT 151 ATCGCTGCCA CTGCCTACTG TCGTTCTGTT GTCCCTGGTA ACAAGTGGGA 201 TTGTGTCCAA TGTCAAAAGT GGGTTCCTGA TGGCAAGATC ATCACTACCT 251 TTACCTCCTT GCTTTCCGAT ACAAATGGTT ACGTCTTGAG AAGTGATAAA 301 CAAAAGACCA TTTATCTTGT TTTCCGTGGT ACCAACTCCT TCAGAAGTGC 351 CATCACTGAT ATCGTCTTCA ACTTTTCTGA CTACAAGCCT GTCAAGGGCG 401 CCAAAGTTCA TGCTGGTTTC CTTTCCTCTT ATGAGCAAGT TGTCAATGAC 451 TATTTCCCTG TCGTCCAAGA ACAATTGACC GCCCACCCTA CTTATAAGGT 501 CATCGTTACC GGTCACTCAC TCGGTGGTGC ACAAGCTTTG CTTGCCGGTA 551 TGGATCTCTA CCAACGTGAA CCAAGATTGT CTCCCAAGAA TTTGAGCATC 601 TTCACTGTCG GTGGTCCTCG TGTTGGTAAC CCCACCTTTG CTTACTATGT 651 TGAATCCACC GGTATCCCTT TCCAACGTAC CGTTCACAAG AGAGATATCG 701 TTCCTCACGT TCCTCCTCAA TCCTTCGGAT TCCTTOATCC CGGTGTTGAA 751 TCTTGGATGA AGTCTGGTAC TTCCAACGTT CAAATCTGTA CTTCTGAAAT 801 TGAAACCAAG GATTGCAGTA ACTCTATCGT TCCTTTCACC TCTATCCTTG 851 ACCACTTGAG TTACTTTGAT ATCAACGAAG GAAGCTGTTT GTAAAACACT 901 TGACGTGTTA CTCTAATTTT ATAATAAAAT TAAGTTTTTA TACAAT WOODDIOV OVVIV90 oiovdoDDo SO 0IDVO0 500i1 TOIT V99V331990V 99W31V939 9VlOVV9V3 9D31V91991 V099910DVD TOIT 5Z 9013V93091O 005991391 0053 0V9Oi DO0990ii5OI v90vOl0OO9 T0OT V930901901 0099iD190 11003OVO09 VDOOiDiV010 9O 0V TOO 13DOlOi1 113 0 VEDODEi 0O0VllDoV VI5199OIV Vo099VVO10i 106 DOODOIDOI 0090990100 iOO1DO5EDODSOOlDDOiI DOiO IO I00I 093E9VVDO 9DO1OO099D0O iOovoooit 099d05000 dl5v0v5oD0 106 V011093509 0091959V30 DVOVV91giD iDVi91O9O1 o95s5io0oi IS8 OZ DV9VO90OiD 900V09V95 0O500111i0 11i9Ovlv1i 050D955010 108 OD9VVVO199 1099500101 9919V099VD 055005991i 3D900v001ú TGL V9wooD9o91 011OV93333 OVOV993119 99VVOV0933 ODO3333D13 10L 9O3iVOi 11oD31V913 OV9i0D1O0V 1O9090i9O0D 3909090i t9SS 909O100950 9119VOOE Oi 93DO01VO 0VV30159VV 00V0D099 109 UO9OV1ODO O9OO99V011O V330511091 OVlV090919 990191OV0 T0S O3V9O309O1 9 D3O130011 31013O9OOVO iV9IOIO t 0V0010VV1 TOú 0 J I0 OJ"OOE0100OOOOOl 010001 01O1 1D ODOID1O 0ED1D10 991005V01 V3339D9913 00339DOd9V VO3D1OD9i9 DOD9DOII9 D ISZ 99000i0 ii000950 005D50 DODDiOOiiD D30dODDiOD1 10 JDODiPd OD 0DI D1IOOliEO OD3OODOD OODOODOO 191 31V1133V09 3V30910139 O31OitOiO O7OVOVOt _)9'90111,$.iC J91993993 9399vD,190O OiOii%)9C$ iO r Oi_!)301iO 1OOOOi,!%eL \ 9OODOOOOD09D:)UDOd UWD;iEi 'iLDICG iiOOdl)f)z% T Olú1*/D1VVO iVDiU90D 511100D0 OD090OiDI:0 Ui:O091i99 ITTI 1i00OVV009 990903001 WD0015100t V i0911911V 59150ofiO0 TOIT OIúDO'iOV'i /DOOD00i OIIODDOi$ $01001000 05DOV51DOD TT0 3133O3OV91 V9VO3V3Iffl 11439031 k&00DIID1fO D153U01V0 TO0T IVOOD1ID D990fDO031 11VOD3011iD D9100VODi 100vdo1Do1 1001 V00O11119300 919D11Ifd 591013O5ODO i O1D O10V0 dOVV0110 156 3OiV Oo1 31Vo3 Vl o3o 3o19f9oVoo OoD EOvod 0319D39DIO 106 O19i1913O VV11iD019DO i3DiDOO0 15Eo00 9 O11IoOV90oTS8Oz VVVO3fV119 OD1VIffO10J 19vv109So 9000190DVO 0ODV10O010 108 991V109311 31V19VV393) OVff3VVOV19 1199999933 lVVf9OVIL 3DDVS91OV9 0951VO3V0ff 1OfO 510 5O 9DIO 90O5D991 1TOL VO131D919E 0V39VV0950 O f1OO91V 03O51990D3 oviot?3D01 19 OID1OvO1 0911O9D9D 0110D3VV90 9$00OO01IOD Eff O50OVl T09 O[ 1OOOOOl E'1ODOEJlO ODO1ODUO1 DO5LZ0DDO 00DDO1DO0 IO Ol1OEOO1do O91 9 ODD9 01001t O iDL ODDOIV 9059901iV9 TS5 9391VVV931 093139VffO99 3393ff91ff90I VlV091odl99v99 1TSb VOO9O99309ff oVov13D00 9VVd5VV9D ll0OllO00O 9D19O091Vi TOt 39139ffff339 3333ffl3999 100051tO0 ODlV103 TV99 I OOIIIOV31 3399I3V1109 0301i! 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Procédé selon la revendication 2, dans lequel la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant le gène de lipase et le promoteur associé, et en5 introduisant cette cassette d'expression dans le génome de cellules somatiques de la plante par un transfert à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens, ou par électroporation, ou par biolistique, ou par microinjection. 11/ - Procédé selon la revendication 2, dans lequel la transformation génétique de la plante est effectuée en réalisant une cassette d'expression comprenant le gène de lipase et le promoteur associé, et en introduisant cette cassette d'expression dans le génome de microspores de la plante par électroporation ou biolistique. 12/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel l'incubation pour engendrer l'hydrolyse enzymatique est réalisée à une température comprise entre 20 C et 60 C. 13/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, dans lequel l'extraction des acides gras issus de l'hydrolyse est réalisée par une extraction liquide/liquide utilisant un solvant apolaire. 14/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, dans lequel les acides gras issus de l'hydrolyse sont méthylés in situ par mise en contact avec du méthanol en catalyse acide sous ultrasons en vue de les transformer en esters méthyliques, ces derniers étant extraits par une extraction liquide/liquide utilisant un solvant apolaire. / - Plante oléagineuse ou semence de plante oléagineuse, d'une variété non protégeable par un certificat d'obtention végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend dans son génome une cassette d'expression possédant au moins un gène codant pour une enzyme lipase, associé à un promoteur permettant une expression dudit gène dans des compartiments cellulaires, extracelullaires ou tissulaires différents des compartiments lipidiques de la plante ou de la semence. 16/ - Plante ou semence selon la revendication 15, dans laquelle le promoteur associé au gène de lipase est un promoteur à expression cellulaire ou tissulaire spécifique. 17/ - Plante ou semence selon la revendication 15, dans laquelle le gène de lipase est muni d'une séquence d'adressage vers des compartiments cellulaires ou extracellulaires différents des compartiments d'accumulation des lipides, le promoteur étant un promoteur constitutif. 18/ - Plante oléagineuse ou semence de plante oléagineuse, d'une variété non protégeable par un certificat d'obtention végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend dans son génome une cassette d'expression possédant au moins un gène codant pour une enzyme lipase, associé à un promoteur permettant une expression dudit gène sur induction exogène, en particulier par un stress.