FR 2723740 A1 19960223 FR 9410039 A 19940816 - 1- 2723740 L'invention concerne un procédé de fragmentation du virus grippal vivant, de mise en oeuvre simple, entraînant une destruction du pouvoir infectieux, utilisable notamment dans la fabrication d'un vaccin grippal inactive, ou dans l'obtention d'antigènes viraux à des fins diagnostiques. Le virus grippal ou Influenzavirus est un virus à ARN monocatenaire de symétrie hélicoïdale, enveloppé, appartenant à la famille des orthomyxoviridae. Les antigènes connus sont essentiellement représentés par les protéines structurales suivantes: NP: Nucléoprotéine de capside lié à l'ARN viral M: "matrice" protéique de l'enveloppe PA: Polymérases liées à l'ARN viral HA: Hémagglutinine protéique située à la surface de l'enveloppe NA: Neuraminidase protéine enzymatique de surface La nucléoprotéine et la protéine M sont les antigènes internes spécifiques des types viraux A et B, l'hémagglutinine et la neuraminidase déterminant les sous-types de virus L'hémagglutinine est la glycoprotéine la plus imrmunogénique des constituants viraux La teneur en hémnagglutinine est utilisée pour exprimer la charge d'antigènes viraux des vaccins grippaux; néanmoins il est aujourd'hui établi que l'ensemble des antigènes viraux intervient dans la stimulation de la réponse immunitaire et que les antigènes internes jouent un rôle majeur dans la réponse à médiation cellulaire. La nucléoprotéine (NP) est le principal antigène cible des Lymphocytes T Cytotoxiques (LTC), aucun LTC spécifique de t'hémagglutinine n'ayant été mis en évidence chez l'homme. La fragmentation virale permet de rompre l'enveloppe et de libérer l'ensemble des sites antigéniques viraux NP, M, RNA, Polymérases virales, HA et NA. Les vaccins obtenus par ce procédé sont donc extrêmnement imMunogènes et donnent des séroconversions supérieures à celles obtenues avec des vaccins ne contenant que les antigènes de surface (qui ne représentent que 36% des constituants viraux). -2- Les vaccins à virions fragmentés sont également mieux tolérés que les vaccins à virions entiers, plus réactogènes. Les procédés de fragmentation utilisés associent des traitements solvantdétergent tels que polysorbateléther anesthésique ou polysorbate/chloroforme [Institut Pasteur (Adamowicz-Muller) US Patent No 4522809]j. La mise en oeuvre de ces procédés en milieu industriel nécessite des locaux et un matériel appropriés tels que des équipements antidéflagrants dans le cas de l'éther et des protections spécifiques des opérateurs vis à vis de la toxicité neurotrope du chloroforme. D'autres procédés mettent en jeu des détergents, ou enzymes protéolytiques, ou sels biliaires, appliqués aux virus préalablement inactivés. Ces procédés sont essentiellement utilisés pour l'obtention de sous-unités de surface (HA et NA) dans la fabrication de vaccins sous-unitaires dépourvus des antigènes internes. On peut citer par exemple l'utilisation de sodium desoxycholate décrite dans le brevet DD 155875, celle de surfactants décrite dans le brevet USP 4.327. 182, enfin celle de détergents non ioniques décrite dans le brevet FR 2.483.779. Notre procédé, de mise en oeuvre simple, permet d'effectuer la frangmentation du virus grippal vivant purifié, sans solvant, à température ambiante. Ce procédé comprend l'élimination du détergent et des substances indésirables pernerttant d'obtenir le produit de fragmentation virale dans un environnement ionique tamponné, isotonique, parfaitement défini. Ce procédé entraîne une réduction très importante du titre infectieux de la suspension de virus grippal purifiée, pouvant aller jusqu'à l'inactivation totale en fonction des conditions opératoires retenues telles que la concentration et durée de contact entre détergent et virus grippaL La présente invention a donc pour objet un procédé de préparation d'antigènes grippaux purifiés, à partir d'un liquide contenant le virus grippai comprenant les étapes de concentration, de purification, de fragmentation et éventuellement d'inactivation caractérisé en ce que: A. ou bien l'étape de purification comporte plusieurs étapes dultra centrifugation séparées par une étape de filtration. B. ou bien l'étape de fragmentation est effectuée sur le virus vivant enprésence d'un détergent non-ionique amphiphile suivie d'une élimination des substances indésirables par filtration retenant l'ensemble des constituants viraux. Ou bien on opère selon ces deux étapes dans un ordre quelconque. Dans un mode préféré d'exécution du procédé, le virus grippal utilisé est obtenu par culture sur cellules hôtes sensibles, telles que les cellules de mamrmifres: cellules de reins de singe, de hamster, de porc, cellules de furets, de souris ou les cellules issues d'embryons, de tissu pulmonaire humain ou de fibroblastes d'embryon de poulet. Le système le plus courant pour la production industrielle de vaccin est l'oeuf de poule embryonné, c'est le système préféré. La présente invention a donc également pour objet le procédé tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que le virus grippal est obtenu par culture sur oeuf embryonné. Les oeufs fécondés doivent être soigneusement sélectionnés et provenir d'élevages sains, réservés à cette production. Ils sont placés en incubateur à 37,8 C (100'F) pendant 9 à 12 jours, le développement embryonnaire et la vitalité des embryons sont contrôlés par mirage avamnt inoculation du virus grippal par voie intra-allantoidienne. Les oeufs sont ensuite incubés pendant 2 à 3 jours en étuves de culture régulées en température et humidité de façon à assurer l'infection virale dans des conditions optimales. Ces conditions sont variables selon les souches grippales et les semences virales utilisées. L'incubation est arrêtée par une réfrigération rapide à 5 - 3 C. Le liquide allantoique, très riche en particules virales, est alors prélevé sur les oeufs infectés. On obtient donc le liquide allantoique virulent qui doit être rapidement purifié afin d'éliminer les irmpuretés présentes: protéines, dont ovalbumine, lécithines, bactéries etc. La récolte est clarifi&ée par centrifugation et concentrée jusqu'à 20 fois par ultrafiltration préalablement à la purification virale. Les opérations de purification virale connues de l'homme de métier font appel à des techniques séparatives telles que la filtration, 1'ultracentrifugation ou la chromatographie d'affinité. Ces opérations entraînent une concentration du virus grippal. Or nous avons constaté qu'il est préférable d'effectuer la.purification du virus grippal vivant, l'inactivation préalable à la purification pouvant entraîner de nombreux pontages chimiques irréversibles entre protéines virales et impuretés, préjudiciables à r'efficacité des opérations de purification. C'est pourquoi notre invention comprend l'obtention de virus grippal purifié vivant. La technique de purification objet du présent procédé s'appuie sur ?ultracentrifugation zonale. Cette ultracentrifugation est réalisée de préférence en gradient de densité, de préférence en gradient de saccharose mais on peut également opérer sur gradient de chlorure de césium_ On opère la centrifugation à une accélération-qui est de préférence de l'ordre de 90.000 G, ladite centrifugation peut être effectuée en continu ou par charges successives. On opère ainsi une séparation des particules virales en fonction de leur taille, leur densité et leur forme. Seules les fractions du gradient contenant le virus sont prélevées. Selon le type de rotor utilisé on effecruera une récolte dynamique (en cours de centrifugation) ou statique (à l'arrêt) après réorientation du gradient Le procédé objet de la présente demande comporte une séquence de plusieurs étapes dultracentrifugation de préférence deux étapes successives séparées par une étape de filtration. Par étape de filtration on entend soit une filtration unique soit une séquence de plusieurs filtrations dont la dernière peur être de l'ordre de 0,3}m et de préférence d'environ 0,5 mrn par exemple de 0,45 mLrn. Cette séquence, appliquée au virus grippal vivant, assure une purification industrielle reproducible des souches de virus grippaux cultivés sur oeufs embryonnés. Avant l'étape de fragmentation virale, la suspension de virus purini concentré est éventuellement standardisée par dilution à des valeurs constantes de densités optiques (D.O) indicatrices de la teneur en protéine virale de l'échantillon à traiter. La concentration finale peut par exemple de préférence être comprise entre 200 et 1000 sg de protéines par mL La dilution est effectuée de préférence à l'aide d'un tampon stérile par exemple le PBS (Phosphate Buffered Saline). -5- L'invention a donc aussi pour objet un procédé tel que décrit cidessus caractérisé en ce que, entre l'étape de purification et l'rétape de fragmentation, on procède à une étape de standardisation par ajustement de la concentration en protéines. La fragmentation virale est effectuée à température arabiante (20-25 C) par addition à la suspension de virus vivant purifiée et éventuellement standardisée d'un détergent non- ionique armphiphile. Ce détergent est de préférence un produit ayant la formule générale R (O - C2-CrH2)nOH dans laquelle R représente un- radical octryie ou nonyle et n représente un entier égal ou supérieur à 3. Parmi les produits couverts par la formule générale ci-dessus on peut citer les produits commerciaux suivants: les Triton X-100 , Triton X-165 , Triton X-205 , Triton X- 305 Plus particulièrement le détergent non-ionique amphiphile que l'on utilise de préférence est le Triton X-100 ou octoxynol-9. La réaction de fragmentation s'effectue sous agitation par exemple pendant au moins une heure de contact mais on peut opérer pendant un temps beaucoup plus long, par exemple jusqu'à 24 heures. La fragmentation est effectuée normalement en zone d'atrnosphère contrôlée à température ambiante. Au cours de cette opération, la structure virale est dissociée. L'enveloppe virale est rompue, libérant, dans le milieu, les constituants internes en particulier les antigènes NP et M, seuls antigènes connus impliqués dans la réponse immunitaire à médiation cellulaire. Une partie des antigènes de surface (HA, NA) est également libérée. Les études du profil de taille particulaire après traitement montrent que la suspension virale ne contient que presque exclusivement du virus fra2menté, ce qui répond, par exemple, aux critères de la Pharmacopée Europeenne pour les vaccins grippaux fragmentés à usage humain. La fragmentation est stoppée par élimination du détergent. -6 - La technique d'élimination des substances indésirables utilise une membrane de filtration dont la porosité permet le passage des molécules de détergent et d'autres solutés non viraux et retient le produit de fragmentation virale. Le choix de la membrane est orienté par la taille et le poids moléculaire des plus petites unités antigéniques libres. L'hémnagglutinine libre est un trimère de PM=210 Kilos Daltons (monomère: 70 Kilos Daltons). L'opération est réalisée par filtration tangentielle sur membrane de porosité inférieure ou égale à 100 Kilos Daltons, de préférence environ 50 Kilos Daltons, l'échantillon est diafiltré au cours de cette ultrafiltration par 10 à 30 volumes de tampon isotonique stérile de préférence le PBS. L'invention a donc pour objet un procédé tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que I'étape d'élimination des substances indésirables est effectuée selon une méthode de diafiltration permettant le lavage de la suspension de virus fragmenté par une solution tampon en utilisant une membrane de filtration retenant la majeure partie des constituants viraux Apres diafiltration, qui conduit à l'élimination des substances indésirables, la suspension de virus fragmenté, est concentrée sous un volume souhaité qui peut être adapté à une concentration virale standard par mesure de DO. Les essais d'inactivation virale effectués à l'issue de ce traitement montrent que le procédé de fragmentation provoque une chute très importante du titre infectieux de la suspension de virus purifié, pouvant aller jusqu'à l'inactivation totale du virus grippal quel que soit le type viral (A ou B). L'invention a donc aussi pour objet un procédé tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que 'Pétape de fragmentation est réalisée dans des conditions permettant une inactivation totale du virus grippal purifié. L'inactivation virale peut être éventuellement complétée par addition si nécessaire d'un agent inactivant (formol, 3 propiolactone) selon les techniques connues de l'homme de métier. Un conservateur et tout autre additif (adjuvant) peuvent éventuellement être ajoutés au vaccin obtenu. -7- L'invention a également pour objet un procédé tel que décrit cidessus caractérisé en ce que l'on opère soit selon l'étape A soit selon les deux étapes A et B. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'antigènes grippaux purifiés à partir d'un liquide allantoique concentré contenant le virus grippal vivant caractérisé en ce que: rl'on purifie le concentré viral par ultracentrifugation zonale, de préférence sur gradient de saccharose, filtre la récolte obtenue de préférence jusqu'à une taille de pore de 0,3 tm minimum puis répète l'opération d'ultracentrifugation; -- l'on standardise la suspension virale purifiée par dilution en tampon aqueux; - l'on fragmente le produit standardisé par addition d'octoxynol 9 puis procède à une élimination des substances indésirables par diafiltration en utilisant une ultrafiltration à l'aide d'une solution tampon; et l'on procède, si nécessaire et si désiré, à une inactivation de la suspension virale, de préférence à l'aide de formaldéhyde. La présente invention a également pour objet à titre de médicaments, les fragments viraux tels qu'obtenus selon le procédé décrit à l'une des revendications 1 à 9 ci-dessus, ainsi que l'application des antigènes grippaux purifiés tels qu'obtenus selon le procédé décrit ci-dessus à la préparation d'un vaccin grippal à usage humain ou vétérinaire et enfin rapplication des antigènes grippaux purifiés tels qu'obtenus selon le procédé décrit ci dessus, à la préparation de produits utilisables à des fins diagnostiques. La préparation des vaccins ainsi que des tests de diagnostics renfermant les antigènes grippaux tels qu'obtenus selon le procédé décrit ci- dessus peut être réalisée selon les méthodes connues de l'hornme de métier. Le procédé qui constitue cette invention est illustré à l'aide de l'exemple suivant qui ne saurait limiter la protection de ladite invention. Exemples 1. Culture virale - 8 - La souche A/I3N2 A/Beijing 32/92 X 117 est inoculée à des oeufs embryonnés de il jours, placés en incubation pendant 72 heures à 3 5 C. La récolte de liquide allantoique est clarifiée par centrifugation et filtration. Le liquide allantoique clarifié est ensuite concentré par ultrafiltration et stabilisé en tampon citrate. 2. Purification Le concentré viral est purifié par ultracentriffugation zonale en gradient de saccharose (10 à 55%) à 35.000 tours par minute. L'opération s'effectue en flux continu. La récolte des fractions virales du gradient représente environ 800 mil La concentration en saccharose est voisine de 40 %. Cette récolte est filtrée jusqu'à 0,45 gnm; le volume final de suspension, après rinçage des filtres, est égal à 15 litres. L'étape d'ultracentrifugation est conduite de nouveau selon les mêmnes conditions opératoires. 3. Fragmentation virale Apres la seconde purification, la suspension de virus purifié (1010 mi) est standardisée par dilution en tampon PBS stérile, de façon i obtenir une concentration protéique comprise entre 200 et 1.000.ig/mL Apres standardisation, le volume de la suspension virale est de 2000 miL Le titre infectieux est supérieur à 1010 ID50/mL La fragmentation virale est effectuée par l'addition aseptique de 10 ml (0,5% voL/voL) d'octoxynol 9 (Triton X 100) sous agitation magnétique, à température du laboratoire. Après une heure de contact, la suspension virale, qui présente une floculation, est clarifiée par centrifugation. La diafiltration est réalisée aseptiquement à volume d'échantillon constant par ultrafiltration sur membrane 50 Kd, à l'aide d'un volume de Tampon Phosphate (PBS) isotonique égale à 20 litres. -9- A l'issue de la diafiltration, l'échantillon est débarrassé du détergent et du saccharose (réduction de 100 fois). Le titre infectieux, après fragmentation, est réduit à 101,2 ID50/ml, ce qui représente une diminution supérieure à un facteur de 109, ceci pour une heure de traitement Sur d'autres expériences on a pu obtenir, grâce à des temps de contact virus/détergent prolongés (> 2 heures), une activation totale de la suspension virale fragmentée. Dans l'exemple présenté, l'inactivation a été complétée par addition de formol (0,01% volJ voL). Le vaccin obtenu a été filtré sur 0,2 gm et additionné de merthiolate (0, 01% poids/vol.). Cet essai a permis de produire 13.000 rnl de vaccin monovalent AfBeijing 32/92 X 117 titrant 137 ig de HA/mi. La qualité des antigènes obtenus, évaluée par vérification de l'intégrité immunologique des protéines: hémagglutinine et neuraminidase, satisfait aux spécifications internationales (Pharmacopée Européenne). Par ailleurs, les propriétés vaccinantes des préparations, vérifiées par administration à l'homme et l'animal (souris), ont permis d'obtenir des séroconversions induisant une protection immunologique, selon les critères d'évaluation clinique des vaccins grippaux - 10- Revendications 1. Procédé de préparation d'antigènes grippaux purifiés, à partir d'un liquide contenant le virus grippal, comprenant les étapes de concentration, de purification, de fragmentation et éventuellement d'inactivation caractérisé en ce que: A. ou bien l'étape de purification comporte plusieurs étapes d'ultra centrifugation séparées par une étape de filtration, B. ou bien l'étape de fragmentation est effectuée sur le virus vivant en présence d'un détergent non-ionique amphiphile suivie d'une élimination des substances indésirables par filtration retenant l'ensemble des constituants viraux, ou bien on opère selon ces deux étapes dans un ordre quelconque. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le détergent non- ionique amphiphile que l'on utilise est de préférence l'octoxynol 9. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que l'on opère soit selon l'étape A soit selon les deux étapes A et B. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que, entre l'étape de purification et l'étape de fragmentation, on procède à une étape de standardisation par ajustement de la concentration en protéines. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'rétape d'élimination des substances indésirables est effectuee selon une méthode de diafiltration permettant le lavage de la suspension de virus fragmenté par une solution tampon en utilisant une membrane de filtration retenant la majeure partie des constituants viraux. - 11 - 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que l'étape de fragmentation est réalisée dans des conditions permettant une inactivation totale du virus grippal purifié. 7. Procédé selon l'une des revendications i à 6 caractérisé en ce que rétape de purification comporte deux étapes d'ultracentrifugation zonale séparées par une étape de filtration des récoltes purifiées jusqu'à une taille de pores au moins égale à 0,3 grm et de préférence de 0,5 pmr environ. 8. Procédé de préparation d'antigènes grippaux purifiés à partir d'un liquide allantoique concentré contenant le virus grippal vivant caractérisé en ce que: - l'on purifie le concentré viral par ultracentrifugation zonale, de préférence sur gradient de saccharose, filtre la récolte obtenue de préférence jusqu'à une taille de pore de 0, 3.Lm minimum puis répète l'opération d'ultracentrifugation; - r'on standardise la suspension virale purifiée par dilution en tampon aqueux; r'on fragmente le produit standardisé par addition d'octoxynol 9 puis procède à une élimination des substances indésirables par diafiltration en utilisant une ultrafiltration à l'aide d'une solution tampon; et l'on procède, si nécessaire et si désiré, à une inactivation de la suspension virale, de préférence à l'aide de formaldéhyde. 9. Procédé selon les revendications 1 et 8 caractérisé en ce que le virus grippal est obtenu par culture sur oeuf embryonrné. 10. A titre de médicaments, les fragments viraux tels qu'obtenus selon le procédé décrit à rune des revendications 1 à 9. Il. Application des antigènes grippaux purifies tels qu'obtenus selon le procédé décrit à l'une des revendications 1 à 9 à la préparation d'un vaccin grippal à usage humain ou véterinaire. - 12 - 2723740 -12.- 12. Application des antigènes grippaux purifiés tels qu'obtenus selon le procédé décrit à l'une des revendications 1 à 9 à la préparation de produits utilisables à des fins de diagnostiques.