FR 2724184 A1 19960308 FR 9410604 A 19940905 i PROCEDE DE RESOLUTION D'UN MELANGE D'ALCOOLS STEREOISOMERES La présente invention a pour objet un procédé de résolution d'un mélange d'alcools stéréoisomères. Elle concerne plus particulièrement un procédé de séparation enzymatique par acylation sélective de l'un des deux stéréoisomères. La production de composés optiquement actifs purs est un problème qui se pose dans de nombreux domaines techniques tels que par exemple, la pharmacie, l'agrochimie, I'industrie alimentaire (additifs alimentaires, arômes) et également dans l'industrie de la parfumerie. On s'attend à ce que ce problème prenne une importance croissante car de plus en plus, on constate que dans une application donnée, seul l'un des stéréoisomères présente la propriété recherchée. Pour résoudre ce problème, on a proposé des méthodes faisant appel à la catalyse enzymatique. Ainsi, Faber et al ont décrit un procédé de dédoublement d'alcools chiraux, en milieu organique [Synthesis, pp. 895 et suivantes (1992)]. Toutefois, la plupart des procédés décrits sont difficilement transposables à l'échelle industrielle. Il s'ensuit qu'il est très intéressant de disposer d'un procédé industriel permettant d'accéder au stéréoisomère souhaité. Il a maintenant été trouvé et c'est ce qui constitue l'objet de la présente invention, un procédé de résolution d'un mélange d'alcools stéréoisomères caractérisé par le fait qu'il consiste: - à faire réagir ledit mélange avec un agent d'acylation, en présence d'une hydrolase, en milieu bi-phasique, - à séparer l'isomère estérifié de l'isomère non estérifié afin d'obtenir d'une part, l'un des stéréoisomères de l'alcool et d'autre part, l'ester de l'autre stéréoisomère. L'une des caractéristiques du procédé de l'invention est de conduire la réaction de transestérification, en milieu bi-phasique. Les avantages obtenus sont ainsi nombreux. L'activité enzymatique est plus grande qu'en milieu organique et les temps de réaction obtenus sont compatibles avec une exploitation industrielle. De plus, en fin de réaction, ralcool et l'ester obtenus se trouvent en phase organique et l'enzyme en phase aqueuse, ce qui permet de les séparer aisément par simple séparation de phases, et de recycler la phase aqueuse, donc l'enzyme. Dans une variante préférée, l'agent d'acylation se trouve également en phase aqueuse. Le procédé de l'invention s'applique à tout mélange d'alcools stéréoisomères. Il est de préférence essentiellement soluble en milieu organique et doit être pris en considération par l'enzyme sélectionnée. Une première classe de substrats auxquels s'applique l'invention, sont les alcools chiraux c'est-à-dire des énantiomères comprenant un atome de carbone asymétrique. Ils répondent plus particulièrement à la formule (I) suivante: R-OH (I) dans ladite formule: - R représente un radical hydrocarboné comprenant au moins 4 atomes, monovalent, substitué ou non, qui peut être un radical aliphatique, acyclique, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié; un radical carbocyclique ou hétérocyclique, saturé ou insaturé, monocyclique ou polycyclique, - le groupe hydroxyle pouvant être porté ou non par le carbone asymétrique. On précisera, sans pour autant limiter la portée de l'invention, que le radical R représente, le reste: - d'un alcool chiral aliphatique, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, éventuellement porteur d'un cycle, d'un alcool chiral carbocyclique ou hétérocyclique, monocyclique, saturé ou insaturé, - d'un alcool chiral carbocyclique ou hétérocyclique, polycyclique comprenant au moins deux carbocycles, saturés et/ou insaturés, L'alcool chiral qui peut intervenir dans le procédé de l'invention répond plus particulièrement, à la formule (I) dans laquelle R représente un radical aliphatique acyclique, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié. Plus précisément, R représente un radical alkyle, alcényle, alcadiényle, alcynyle, linéaire ou ramifié ayant de préférence de 4 à 40 atomes de carbone. La chaîne hydrocarbonée peut être éventuellement interrompue par un hétéroatome (par exemple, oxygène ou soufre) ou par l'un des groupes suivants: -CO-, -COO-, -OCOO-, -S02-, -N-, -CO-N-, R1 R1 et/ou porteuse de l'un des substituants suivants:-OH, -COOR1, -CHO, -NO2, -X, -CF3: dans ces formules R1 représente de préférence l'hydrogène ou un radical alkyle linéaire ou ramifié ayant de 1 à 4 atomes de carbone, de préférence, un radical méthyle ou éthyle. Ledit radical aliphatique acyclique, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié peut être éventuellement porteur d'un substituant cyclique. Il peut être relié au cycle par un lien valentiel ou par l'un des groupes suivants:-O-, -CO-, -COO-, -OCOO-, -S-, -SO2-, -N-, -CO-N-, I I R1 R1 dans ces formules, R1 ayant la signification donnée précédemment. Par cycle, on entend un cycle carbocyclique ou hétérocyclique, saturé, insaturé ou aromatique. Comme exemples de substituants cycliques, on peut envisager des substituants cycloaliphatiques, aromatiques ou hétérocycliques, notamment cycloaliphatiques comprenant 6 atomes de carbone dans le cycle ou benzé- niques, ces substituants cycliques étant eux-mêmes éventuellement porteurs d'un ou plusieurs substituants. Les substituants cycliques préférés sont les noyaux benzéniques. Dans les alcools répondant à la formule (I), R peut représenter un radical carbocyclique, monocyclique. Le nombre d'atomes de carbone dans le cycle peut varier largement de 3 à 8 atomes de carbone mais il est de préférence égal à 5 ou 6 atomes de carbone. Le carbocycle peut être saturé ou comprenant 1 ou 2 insaturations dans le cycle, de préférence de 1 à 2 doubles liaisons. Dans le cas o R représente un radical carbocyclique, monocyclique, saturé ou insaturé, il est possible que l'un ou plusieurs des atomes du carbone du cycle soient remplacés par un hétéroatome, de préférence, oxygène, azote ou soufre ou par un groupe fonctionnel, de préférence carbonyle ou ester, conduisant ainsi à un composé hétérocyclique, monocylique. Le nombre d'atomes dans le cycle peut varier largement de 3 à 8 atomes mais il est de préférence égal à 5 ou 6 atomes. Le radical R peut être également carbocyclique, polycyclique, de préférence bicyclique ce qui signifie qu'au moins deux cycles ont deux atomes de carbone en commun. Dans le cas des radicaux polycycliques, le nombre d'atomes de carbone dans chaque cycle varie entre 3 et 6: le nombre total d'atomes de carbone étant égal de préférence à 7. On donne ci-après des exemples de structure bicyclique, couramment rencontrée: [4,1,0] [2,2,1] [3,1,1] [3,2,0] Le radical R peut être également hérérocyclique, polycyclique, de préférence bicyclique ce qui signifie qu'au moins deux cycles ont deux atomes en commun. Dans ce cas, le nombre d'atomes dans chaque cycle varie entre 3 et 6 et est plus préférentiellement égal à 5 ou 6. Il est à noter que si le radical R comprend un cycle quelconque, il est possible que ce cycle porte un substituant. La nature du substituant est quelconque dans la mesure o il n'interfère pas au niveau du produit désiré. Les substituants portés le plus souvent par le cycle sont un ou plusieurs radicaux alkyle ou alkoxy ayant de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, de préférence trois radicaux méthyle, un radical méthylène (correspondant à une liaison exocyclique), un radical alcényle, de préférence un radical isopropène-yle, un atome d'halogène, de préférence chlore ou brome. Les substrats mis en oeuvre préférentiellement dans le procédé de l'invention sont les alcools aliphatiques, saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés, ayant de 4 à 30 atomes de carbone, pouvant éventuellement portés un substituant, par exemple, cyclique, et plus particulièrement, un groupe phényle, un atome d'halogène, un groupement amine ou alkoxy ayant généralement de 1 à 4 atomes de carbone. Comme exemples plus spécifiques, de mélanges d'alcools stéréoisomères qui peuvent être mis en oeuvre dans le procédé de l'invention, on peut mentionner, entre autres, le mélange de stéréoisomères du 2-phényl 1propanol (ou alcool hydratropique), du 1-phényléthanol (ou alcool aphényléthylique), ou du nortricyclanol. Une autre catégorie de substrats susceptibles d'être mis en oeuvre dans le procédé de l'invention, sont les stéréoisomères de position, notamment les stéréoisomères d'alcools cycliques secondaires, de préférence du cyclohexanol, l'un présentant le groupe hydroxyle en position axiale et rl'autre en position équatoriale. Dans lesdits stéréoisomères, la conformation est bloquée par la présence d'un groupement encombrant, de préférence un groupe alkyle aliphatique ou cycloaliphatique, ayant au moins 3 atomes de carbone jusqu'à 12 atomes de carbone. Les exemples d'alcools suivants illustrent tout à fait ce type de mélanges de stéréoisomères: le 4-tert-butylcyclohexanol, le 4-isobomylcyclohexanol, le 4- isocamphylcyclohexanol. Il est à noter que le rapport entre les deux stéréoisomères est tout à fait quelconque. Il peut varier par exemple entre 0,3 et 1,0. Pour ce qui est du choix de l'agent d'acylation, il est déterminé de telle sorte qu'il soit soluble en phase aqueuse. On fait appel préférentiellement à un ester d'acide organique ou à un anhydride d'acide organique. Il répond plus particulièrement à la formule (11): LR 0 lôR r 2 n dans laquelle: - n est un nombre égal à 1, 2 ou 3, - R1 représente un radical alkyle ayant une faible condensation en carbone, - R2 peut prendre les significations suivantes: si n = 1, R2 représente un radical alkyle ou alcényle de faible condensation en carbone ou un radical -CO-R3, avec R3, identique ou différent de R1, ayant la même signification que R1, À si n = 2, R2 représente un radical alkylène ou alcénylène de faible condensation en carbone, si n = 3, R2 représente un radical alkyle triyle de faible condensation en carbone. Dans le présent texte, on entend par l'expression faible condensation en carbone", moins de 3 atomes de carbone. R1 représente un radical alkyle ayant de 1 à 3 atomes de carbone, tel que méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, de préférence un radical méthyle. Lorsque l'agent d'acylation est un ester d'acide organique, les composés préférés répondent à la formule (Il) dans laquelle R2 représente: un radical méthyle ou vinyle, halogénométhyle, mono-, di- ou trihalogénométhyle, méthylsulfate, éthylsulfate pour n = 1; un radical diéthylène pour n = 2; un radical propanetriyle-1,2,3 pour n = 3. Lorsque l'agent d'acylation est un anhydride d'acide, les composés préférés répondent à la formule (Il) dans laquelle R1 et R3 sont identiques et représentent un radical alkyle ayant de 1 à 3 atomes de carbone. A titre illustratif d'agents d'acylation, on peut citer plus particulièrement: - la triacétine, - I'acétate de vinyle, - l'anhydride acétique. L'agent d'acylation préférentiellement mis en oeuvre dans la procédé de l'invention est la triacétine. La réaction de transestérification est conduite en présence d'un catalyseur qui est une enzyme choisie parmi les hydrolases, et plus particulièrement les lipases, estérases ou acylases. Pour la définition des enzymes, on fait référence à la nomenclature internationale définie dans 'Enzyme Nomenclature 1984, IUB, Academic Press Inc. (1984). Conformément à la présente invention, on fait appel, plus précisément, à une hydrolase appartenant à la classe EC.3 selon la nomenclature précitée (pp. 270) et plus particulièrement aux carboxylestérases (3.1.1.1), aux triacylglycérol lipases (3.1.1.3) ou aux acylases (3.5.1.4). Tous ces types d'enzymes sont disponibles dans le commerce. On donne ci-après des exemples d'enzymes convenant tout à fait bien à la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Les lipases sont issues d'organes (par exemple foies, pancréas ou glandes salivaires) d'organismes supérieurs comme de bovins (veaux), porcs, chevaux, lapins ou proviennent de micro-organismes tels que, par exemple: Géotricum candidum, Penicillium cyclopium, Penicillium roqueforti, Candida cylindracea, Rhizopus delemar, Rhizopus niveus, Mucor javanicus, Pseudomonas fluorescences, Pseudomonas species. Les estérases peuvent être en particulier des estérases de foie de porc ou de cheval et les acylases obtenues à partir des micro-organismes tels que l'Aspergillus. L'enzyme mise en oeuvre préférentiellement dans le procédé de l'invention est obtenue à partir du Candida cylindracea. Les enzymes mises en oeuvre peuvent être libres ou supportées. L'enzyme doit être capable de discriminer l'un des deux stéréoisomères, afin d'en estérifier qu'un seul, majoritairement. Afin de savoir si l'enzyme est bien adaptée à la séparation d'énantiomères à faire, il y a lieu de déterminer le ratio énantiomérique E et le choisir de telle sorte qu'il soit supérieur à 5, de préférence supérieur à 10. Le ratio énantiomérique E est défini par le rapport suivant: In [1 - TT ( 1 + eep)] E= In [1 - TT ( 1 - eep)] dans lequel TT représente le taux de transformation du substrat (l'un des stéréoisomères) et eep l'excès énantiomérique du produit obtenu. Comme mentionné précédemment, l'une des caractéristiques du procédé de l'invention est de conduire la réaction en milieu bi-phasique comprenant donc une phase aqueuse et une phase organique constituée par au moins un solvant organique non miscible à l'eau. Le pH de la phase aqueuse est choisi de telle sorte qu'il soit compatible avec l'activité de l'enzyme. Généralement, ce pH se situe entre 5 et 8 et l'on préfère se placer entre 5 et 7. Il peut s'avérér nécessaire d'additionner un agent de neutralisation, le plus souvent la soude. La quantité ajoutée sera telle que l'on obtienne le pH souhaité. Il est également possible de contrôler le maintien du pH, par ajout d'un agent tampon tel que par exemple, phosphate, carbonate, bicarbonate, borate voire-même un agent tampon organique comme le tris-(hydroxyméthyl)amino- méthane. En ce qui concerne le solvant organique, on fait appel à un solvant organique non miscible à l'eau. Plusieurs impératifs président au choix du solvant. Le solvant doit permettre la solubilisation de toute ou partie du mélange d'alcools. On préfère que les stéréoisomères soient complètement solubilisés. Une autre condition est que le solvant organique soit inerte vis-à-vis de la réaction de transestérification. Une classe de solvants préférés sont les solvants organiques, aprotiques, peu polaires. A titre d'exemples non limitatifs de solvants convenant dans le procédé de l'invention, on peut citer: - les hydrocarbures aliphatiques et plus particulièrement les paraffines tels que notamment, le pentane, l'hexane, l'heptane, l'octane, l'isooctane, le nonane, le décane, r'undécane, le tétradécane, l'éther de pétrole et le cyclohexane; les hydrocarbures aromatiques comme notamment le benzène, le toluène, les xylènes, l'éthylbenzène, les diéthylbenzènes, les triméthylbenzènes, le cumène, le pseudocumène, les coupes pétrolières constituées de mélange d'alkylbenzènes notamment les coupes de type Solvesso , - les hydrocarbures halogénés aliphatiques ou aromatiques, et l'on peut mentionner: les hydrocarbures perchlorés tels que notamment le trichlorométhane, le tétrachlorure de carbone, le tétrachloroéthylène, l'hexachloroéthane; les hydrocarbures partiellement chlorés tels que le dichlorométhane, le dichloroéthane, le tétrachloroéthane, le trichloroéthylène, le 1-chlorobutane, le 1,2-dichlorobutane; le monochlorobenzène, le 1,2- dichlorobenzène, le 1,3-dichlorobenzène, le 1,4-dichlorobenzène ou des mélanges de différents chlorobenzènes, - les éther-oxydes aliphatiques, cycloaliphatiques ou aromatiques et, plus particulièrement, le diéthyléther, le dipropyléther, le diisopropyléther, le dibutyléther, le méthyltertiobutyléther, le ditertiobutyléther, le diméthyléther de l'éthylèneglycol, le diméthyléther du diéthylèneglycol; le diphényléther, le dibenzyléther, l'anisole, le phénétole, le 1,4-diméthoxybenzène, le vératrole; le 1,4-dioxane, le tétrahydrofurane (THF). Parmi les solvants précités, on choisit préférentiellement les hydrocarbures aliphatiques et aromatiques, de préférence, le pentane, l'heptane, l'éther de pétrole, le toluène. La quantité de solvant organique mise en jeu peut être très variable. Le rapport volumique entre la phase aqueuse et la phase organique peut varier entre 0,1 et 10, de préférence entre 1,0 et 5,0. Un mode préféré consiste à choisir un rapport volumique supérieur à 1,0. La concentration du mélange d'alcools stéréoisomères dans le solvant organique est fonction de sa solubilité. On choisit, avantageusement une concentration élevée, de l'ordre de 1 mole/litre. La quantité de l'agent d'acylation à mettre en oeuvre exprimée par rapport à la quantité de stéréoisomère de l'alcool à transformer, est de préférence au moins égale à la quantité stoechiométrique. D'une manière préférentielle, on l'introduit en une quantité supérieure à la quantité stoechiométrique: l'excès pouvant varier de 1 à 40 par rapport à la stoechiométrie, de préférence de 1 à 5. Pour ce qui est de la quantité d'enzyme mise en oeuvre, on utilise de 0, 1 à 100 %, de préférence de 1 à 10 % en poids d'enzyme par rapport au mélange d'alcools stéréoisomères. La température de la réaction doit être compatible avec l'activité de l'enzyme. Elle est choisie de préférence inférieure à 60 C, et plus préférentiellement entre 20 et 40 C. La réaction est conduite avantageusement sous pression atmosphérique mais il n'y a aucun inconvénient à utiliser des pressions inférieures ou supérieures à la pression atmosphérique. D'un point de vue pratique, le procédé selon l'invention est simple à mettre en oeuvre. On donne ci-après un mode de réalisation préférentielle de la présente invention. On commence à préparer séparément les phases aqueuse et organique. La phase aqueuse est constituée du mélange d'eau, de l'enzyme et éventuellement l'agent permettant d'otenir le bon pH. Par ailleurs, on introduit le mélange d'alcools stéréoisomères à séparer dans le solvant organique ce qui compose la phase organique. On procède au mélange des phases aqueuse et organique puis l'on initie la réaction par ajout de l'agent d'acylation. On porte le milieu réactionnel à la température désirée, tout en maintenant le milieu réactionnel sous bonne agitation. La durée de la réaction est fonction du taux de transformation de l'alcool à estérifier. Dans le cas o la sélectivité de l'enzyme n'est pas très bonne, on a recours à une technique connue de l'Homme du métier qui est de limiter le taux de transformation. En fin de réaction, on obtient dans la phase organique, l'un des stéréoisomères sous forme estérifiée et également l'autre stéréoisomère qui reste sous forme d'alcool. On sépare les phases organique et aqueuse. On traite la phase organique afin d'éliminer le solvant organique par distillation. On sépare l'ester obtenu de l'alcool selon les techniques classiques de séparation, de préférence la distillation ou la cristallisation. Afin d'obtenir l'autre isomère, il est à noter que l'ester peut être rétrogradé en alcool selon les techniques habituelles telles que l'hydrolyse en milieu acide (acide sulfurique, acide trifluorométhanesulfonique). La phase aqueuse qui comprend l'enzyme peut être avantageusement recyclée. Le procédé de l'invention convient parfaitement bien à la résolution de nombreux mélanges d'alcools stéréoisomères, notamment celui du 4-tert- butylcyclohexanol constitué de deux stéréoisomères se distinguant par la présence d'un groupe hydroxyle, en position axiale ou équatoriale. Une variante préféree consiste à transestérifier ledit mélange à l'aide de triacétine ce qui conduit à la séparation des deux stéréoisomères selon les réactions suivantes: OH OH tBu \> +OtBu nOH t + u On peut ainsi selon l'invention séparer l'isomère présentant un groupe OH en position axiale par rapport à celui présentant un groupe OH en position équatoriale. On donne ci-après des exemples de réalisation pratique de l'invention. Les exemples qui suivent, illustrent l'invention sans toutefois la limiter. nb de moles d'alcools stéréoisomères transformées TT= nb de moles d'alcools stéréoisomères engagées nb de moles d'ester formées RTagent d'acylation= Ragent d'acylation nb de moles d'agent d'acylation transformées nb de moles d'ester formées RRalcool = RRacoo =nb de moles d'alcool engagées -- I nb de moles de (S) - nb de moles de (R) I Excès énantiomérique ee = nb de moles de (S) + nb de moles de (R) Excès diastéréoismèrique ed = I nb de moles d'isomère équatorial - nb de moles d' isomère axial I ed = nb de moles d'isomère équatorial + nb de moles d' isomère axial Activité = quantité d'alcool transformé en g, par heure et par kg d'enzyme. EXEMPLES: Exemple 1: Résolution du 1-phényléthanol Le mélange est résolu par acétylation de la forme (R) selon la réaction suivante: OH OAc (R) lipase/triacétine (R) OH heptane/tampon phosphate OH (S) ( I Dans un tube en verre de 4 ml, on charge 10 mg de lipase PS (provenant de Pseudomonas fluorescences), commercialisée par la Société AMANO, et 0, 4 ml d'un tampon phosphate de sodium de pH égal à 7 (100 mmoVlI). On additionne 10 mg de 1-phényléthanol (0,082 mmol) dissous dans 0,5 ml d'heptane. On mélange la phase aqueuse et la phase organique, par agitation magnétique. On ajoute alors 100 pI (0,5 mmol) de triacétine. Après 60 minutes d'agitation à la température ambiante, on détermine le taux de transformation par chromatographie en phase gazeuse (colonne CARBOWAX de 15 m) et les excès énantiomériques par chromatographie liquide en phase chirale (colonne CHIRALCEL OJ ). Les résultats obtenus sont les suivants: TT= 19 % ee [1-phényléthanol] = 24 % ee [1-acétoxy 1-phényléthane] = 100 % E> 100 activité = 190 g/h.kg d'enzyme ExemDle 2: Résolution de l'alcool hydratroDieue Le mélange est résolu par acétylation de la forme (S) selon la réaction suivante: "-[> OH stéapsine / triacétine I[OAc heptane / tampon phosphate "OH OH Dans un tube en verre de 4 ml, on charge 10 mg de Stéapsine (lipase issue du pancréas de porc) vendue par Biocatalyst et 0,4 ml d'un tampon phosphate de sodium de pH égal à 7 (100 mmol/l). On additionne 10 mg de 2-phényl 1-propanol (0,075 mmol) dissous dans 0,5 ml d'heptane. On mélange la phase aqueuse et la phase organique, par agitation magnétique. On ajoute alors 100 Il (0,5 mmol) de triacétine. On maintient le milieu réactionnel, sous agitation, à 25 C, pendant 1 heure minutes. On analyse la masse réactionnelle et l'on détermine le taux de transformation par chromatographie en phase gazeuse (colonne CARBOWAX de 15 m) et l'on détermine l'excès énantiomérique de l'acétate formé par chromatographie liquide en phase chirale (CHIRALPACK AD). Les résultats obtenus sont les suivants: TTr = 32 % ee [1- acétoxy 2-phénylpropane] = 69 % E = 7,4 activité = 240 g/h.kg d'enzyme ExemDle 3: 15. Résolution du nortricyclanol Le mélange est résolu par acétylation du (-) nortricyclanol selon la réaction suivante: OH H H OH OH H H OAc lipase AY / triacétine vm. heptane / tampon phosphate (+) () Dans un tube de 4 ml, on charge 0, 5 g de lipase AY (provenant de Candida cylindracea) et 40'ml d'un tampon phosphate de sodium de pH égal à 7 (100 mmolI). On additionne 2,5 g de nortricyclanol (22,7 mmol) dissous dans 50 ml d'heptane. On mélange la phase aqueuse et la phase organique, par agitation magnétique. On ajoute alors 10 g (45 mmol) de triacétine. Après 2 heures d'agitation à la température ambiante, on détermine le taux de transformation par chromatographie en phase gazeuse (colonne CARBOWAX de 15 m) et l'excès énantiomérique de l'acétate, par polarimétrie après séparation de l'alcool et l'acétate sur colonne de silice: réf. [(a]D = 47,4 dans l'éther éthylique, référence définie par Yoshiki HIROSE et ai [Chemistry Letters pp. 1939-1942(1989)]. Les résultats obtenus sont les suivants: TT=59% ee [acétate] = 66 % E=17 activité = 1475 g/h.kg d'enzyme Exemple 4: Résolution du menthol Le mélange est résolu par acétylation du (-) menthol selon la réaction suivante: lipase AY / triacétine OH OAc HO' tampon phosphate / heptane - ())) Dans un tube de 4 ml, on charge 10 mg de lipase AY et 0,4 ml d'un tampon phosphate de sodium de pH égal à 7 (250 mmol/l). On additionne 10 mg de menthol (0,064 mmol) dissous dans 0,5 ml d'heptane. On mélange la phase aqueuse et la phase organique, par agitation magnétique. On ajoute alors 100 pl (0,5 mmol) de triacétine. _ Après 2 heures 30 minutes d'agitation à la température ambiante, on détermine le taux de transformation par chromatographie en phase gazeuse (colonne CARBOWAX de 15 m). Les résultats obtenus sont les suivants: TT = 47,7 % activité = 191 g/h.kg d'enzyme Exemple 5 Résolution du menthol Le mélange est résolu par acétylation du (-) menthol comme décrit dans l'exemple 4. Dans un réacteur de 250 ml, on charge 1 g de lipase AY et 40 ml d'un tampon phosphate de sodium de pH égal à 7 (250 mmoVlI). On additionne 10 g de menthol (64 mmol) dissous dans 50 ml d'heptane. On mélange la phase aqueuse et la phase organique, par agitation magnétique. On ajoute alors 10 ml (50 mmol) de triacétine. Après 120 heures d'agitation à température ambiante, on ajoute 1 g de lipase AY et 10 ml de triacétine. Après 170 heures d'agitation à température ambiante, la réaction est stoppée. On effectue la décantation par arrêt de l'agitation et la séparation des phases. La phase aqueuse est extraite avec 50 ml d'heptane. Les phases heptaniques sont réunies et le solvant évaporé. * On sépare l'alcool de l'acétate sur colonne de silice. On détermine la pureté optique de l'acétate formé par rapport à un étalon commercial de (-) menthol par polarimètrie en procédant à une hydrolyse basique (KOH à 38 % + méthanol rapport V/V = 1/1). Les résultats obtenus sont les suivants: IT = 47,5 % ee[acétate] = 91 % E = 54 Exemple 6: Résolution du 4-tert-butvylcvclohexanol Le mélange est résolu par acétylation de l'isomère équatorial selon la réaction suivante: OH OH tBu ZE lipase AY / triacétine tBu-IZ tBu" heptane / tampon phosphate tBuOAc B-e - Il contient 70 % d'isomère équatorial et 30 % d'isomère axial. Dans un réacteur de 6 litres, on met en solution 2 g de lipase AY dans 1,25 litre d'un tampon phosphate de sodium de pH égal à 7 (100 mmol/). On additionne 1,25 I d'heptane contenant 150 g de 4-tertbutylcyclohexanol (961 mmoles) contenant 70 % d'isomère équatorial pour 30 % d'isomère axial. La réaction est initiée par l'ajout de 200 ml de triacétine (975 mmoles). Le réacteur est maintenu à température ambiante et agité mécaniquement de façon à assurer la microémulsion du système. Le pH de la phase aqueuse est régulé à 7 par addition d'une solution aqueuse de soude 12 N. Différents ajouts sont effectués au cours de la réaction: - 0,2 g de lipase au bout de 70 heures; 0,8 g de lipase au bout de 165 heures, - 100 ml de triacétine au bout de 165 heures; 100 ml de triacétine au bout de 189 heures. Au bout de 261 heures, 70,4 % du 4-tert-butylcyclohexanol sont transformés. La réaction est stoppée par décantation et séparation des phases. La conversion du substrat et la sélectivité de la réaction sont mesurées par chromatographie en phase gazeuse. TT = 70,4 % La phase aqueuse est lavée à l'heptane, et les phases organiques sont séchées puis évaporées. 180 g de produits sont récupérés. Après séparation sur colonne de silice, on obtient 130 g d'acétate de 4tert- butylcyclohexyle équatorial et 39 g de 4-tert-butylcyclohexanol axial. Les résultats obtenus sont les suivants: ed alcool = 93 % ed acétate = 97 % ExemDles 7 à 10: Essais a à d: Résolution du 4-tert- butvlcvclohexanol 25... Dans cette série d'exemples, on met en évidence l'influence de la nature de l'agent d'acétylation sur la transestérification du 4-tert-butylcyclohexanol catalysée par la lipase AY. De plus, on montre l'influence du milieu bi-phasique heptane/eau (exemples 7 à 10) par rapport à un milieu anhydre heptane (essais a à d). Exemoles 7 à 10: Dans un tube de 4 ml, on charge 10 mg de lipase AY et 0, 4 ml d'un tampon phosphate de sodium de pH égal à 7 (100 mmoVI). On additionne 15,6 mg de 4-tert-butylcyclohexanol (0,1 mmol) dissous dans 0,5 ml d'heptane. On mélange la phase aqueuse et la phase organique par agitation magnétique. On ajoute alors 0,2 mmol d'un agent d'acylation dont la nature est précisée dans le tableau I. Après une durée d'agitation précisée dans le tableau suivant, à 25 C, on détermine le taux de transformation et l'excès énantiomérique par chromatographie en phase gazeuse. Les conditions et résultats sont répertoriés dans le tableau I. Essais a à d: Dans un tube de 4 ml, on charge 10 mg de lipase AY, 0,5 ml d'heptane et 15,6 mg de 4-tert-butylcyclohexanol (0,1 mmol). On mélange la phase aqueuse et la phase organique, par agitation magnétique. On ajoute alors 0,2 mmol d'un agent d'acylation dont la nature est précisée das le tableau I. Après une durée d'agitation précisée dans le tableau suivant, à 25 C, on détermine le taux de transformation et l'excès énantiomérique par chromatographie en phase gazeuse. Les conditions et résultats sont répertoriés dans le tableau I. Tableau I Réf. Agent acylant Milieu Durée TT ed Activité ex. alcool acétate (h) (%) (%) (g/h.kg de lipase) a triacétine heptane 1,7 39 100 360 7 heptane/eau 0,5 37 100 1100 b vinylacétate heptane 2,7 15 100 80 8 heptane/eau 31 91 170 c anhydride heptane 2,7 18 100 100 acétique 9 heptane/eau 58 35 325 d éthylacétate heptane 2,7 1 100 5 ______heptane/eau 3 100 17 Il ressort de l'examen de ce tableau que le système hydoorganique est cinétiquement plus favorable. Parmi les différents agents d'acylation, la triacétine reste le meilleur agent d'acétylation suivie par les esters activés. Exemples 11 à 14: Dans cette série d'exemples, on montre l'influence de la teneur en lipase AY sur l'acétylation du 4-tert-butylcyclohexanol par la triacétine. Dans un tube de 4 ml, on charge x mg de lipase AY et 0,4 ml d'un tampon phosphate de sodium de pH égal à 7 (100 mmol/I). On additionne 50 mg de 4-tert-butylcyclohexanol (0,32 mmol) dissous dans 0,5 ml d'heptane. On mélange la phase aqueuse et la phase organique par agitation magnétique. On ajoute alors 0,1 ml de triacétine soit 0,5 mmol. Après une durée de réaction de 0,5 heure à 25 C, on détermine le taux de transformation et l'excès énantiomérique par chromatographie en phase gazeuse. Les conditions et résultats sont répertoriés dans le tableau Il. Tableau II Réf. ex. Lipase AY TT Activité ed acétate (g/I) (%) (g/h.kg (%) d'enzyme) 11 10 19 2000 99 12 5 12 2500 99 13 1 2,5 2800 99 14 0,5 1,7 3300 99 Exemples 15 à 19: Au cours de la réaction d'acétylation du 4tert-butylcyclohexanol, on note une réaction parasite d'hydrolyse de la triacétine. Dans cette série d'exemples, on montre l'influence du pH sur la compétition des réactions d'hydrolyse et de transestérification de la triacétine. Une partie de la triacétine est consommée par réaction d'hydrolyse et il a été trouvé que le choix du pH permettait de minimiser l'hydrolyse. A cet effet, on détermine le rendement en triacétine (RTtriacétine) par l'équation suivante: nb de moles de 4-tert-butylcyclohexanol estérifiées RTtriacétine = nb de moles de triacétine consommées Cette détermination est effectuée à différents pH, en suivant le protocole opératoire suivant. Dans un réacteur de 250 ml, on charge 50 mg de lipase AY, 30 ml de tampon phosphate de sodium de pH égal à 7 (5 mmol/l). On additionne 1 g de 4-tert-butylcyclohexanol (6,4 mmol) dissous dans 50 ml d'heptane. On mélange la phase aqueuse et la phase organique, par agitation magnétique. On ajoute alors 20 ml (100 mmol) de triacétine. Au cours de la réaction, le pH est régulé, selon les exemples, à une valeur allant de 5 à 9 par ajout d'une solution aqueuse de soude 2N, ce qui permet de déterminer la quantité de triacétine hydrolysée en fonction du pH. On détermine le taux de transformation du 4-tert-butylcyclohexanol, par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau III. Tableau III Réf. ex. pH RT triacétine _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ (%) 5 41 16 6 36,5 17 7 34 18 8 26,3 19 9 11,9 L'examen du tableau III conduit à choisir un pH le plus bas possible afin d'éviter l'hydrolyse de la triacétine. ExemDles 20 à 23 Dans les exemples suivants, on met en évidence l'influence de la concentration du substrat de départ sur la compétition entre la réaction d'hydrolyse et de transestérification. On reproduit le mode opératoire des exemples 15 à 19 à la différence près que l'on change la concentration du 4-tert-butylcyclohexanol, dans le milieu réactionnel. Dans lesdits exemples, le pH est régulé à 7,0, par ajout de la solution aqueuse de soude 2N. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau IV. Tableau IV Réf. ex. Concentration en RT triacétine 4 tert-butylcyclohexanol (g/lI) (%) 0 0 21 1 4,1 22 10 32,2 23 100 36,3 Il ressort de l'examen du tableau IV qu'il est préférable d'avoir une concentration en substrat élevée afin de minimiser la réaction d'hydrolyse de la triacétine. -- Exemples 24 à 30 On conduit les exemples 24 à 30 à différentes températures selon le mode opératoire défini ci-après. Dans un tube de verre de 4 ml, on charge 20 mg de lipase AY et 0,9 ml d'un tampon phosphate de sodium de pH égal à 7 (100 mmoVlI). On additionne 50 mg de 4-tert-butylcyclohexanol (0,32 mmol) dissous dans 1,0 ml d'heptane. On mélange la phase aqueuse et la phase organique, par agitation magnétique. Par chauffage, on porte la masse réactionnelle à une température variant selon l'exemple et qui est précisée dans le tableau récapitulatif (tableau V). La réaction est initiée par ajout de 100 pl (0,5 mmol) de triacétine. Après 20 minutes de réaction, on analyse la masse réactionnelle par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau V. Tableau V Réf. ex. Température Activité ( C) (g/h.kg) 24 20 970 30 1240 26 40 1820 27 45 2110 28 50 2400 29 55 2600 60 2520 La température a une faible incidence sur la cinétique réactionnelle puisque I'on constate seulement un doublement de l'activité tous les 25 C. REVENDICATIONS 1 - Procédé de résolution d'un mélange d'alcools stéréoisomnères caractérisé par le fait qu'il consiste: - à faire réagir ledit mélange avec un agent d'acylation, en présence d'une hydrolase, en milieu bi-phasique, - à séparer l'isomère estérifié de l'isomère non estérifié afin d'obtenir d'une part, l'un des stéréoisomères de l'alcool et d'autre part, l'ester de l'autre stéréoisomère. 2- Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le mélange d'alcools stéréoisomères est un mélange d'énantiomères ou de stéréoisornères de position. 3- Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé par le fait que le mélange d'alcools stéréoisomères est un mélange d'énantiomères d'un alcool répond à la formule (I) suivante: R-OH (I) dans ladite formule: - R représente un radical hydrocarboné comprenant au moins 4 atomes, monovalent, substitué ou non, qui peut être un radical aliphatique, acyclique, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié; un radical carbocyclique ou hétérocyclique, saturé ou insaturé, monocyclique ou polycyclique, - le groupe hydroxyle pouvant être porté ou non par le carbone asymétrique. 4 Procédé selon la revendication 3 caractérisé par le fait que l'alcool répond à la formule (I) dans laquelle R représente: - un radical alkyle, alcényle, alcadiényle, alcynyle, linéaire ou ramifié ayant de préférence de 4 à 40 atomes de carbone: la chaîne hydrocarbonée pouvant être éventuellement interrompue par un hétéroatome (par exemple, oxygène ou soufre) ou par l'un des groupes suivants: -CO-, -COO-, -OCOO-, -SO2-, -N-, -CO-N-, I I R1 R1 et/ou porteuse de l'un des substituants suivants:-OH, -COOR1, -CHO, -NO2, -X, -CF3: dans ces formules R1 représente de préférence l'hydrogène ou un radical alkyle linéaire ou ramifié ayant de 1 à 4 atomes de carbone, de préférence, un radical méthyle ou éthyle, - un radical aliphatique acyclique, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié éventuellement porteur d'un substituant cyclique: le reste aliphatique acyclique pouvant être relié au cycle par un lien valentiel ou par l'un des groupes suivants: -O-, -CO-, -COO-, -OCOO-, -S-, -SO2-, -N-, -CO-N-, 1 1 R1 R1 dans ces formules, R1 ayant la signification donnée précédemment, - un radical carbocyclique, monocyclique, saturé ou comprenant 1 ou 2 insaturations; le nombre d'atomes de carbone dans le cycle pouvant varier de 3 à 8 atomes et étant égal de préférence à 5 ou 6, - un radical hétérocyclique, monocyclique, saturé ou comprenant 1 ou 2 insaturations; le nombre d'atomes dans le cycle pouvant varier de 3 à 8 atomes et étant égal de préférence à 5 ou 6, - un radical carbocyclique, polycyclique, de préférence bicyclique, saturé ou comprenant 1 ou 2 insaturations; le nombre d'atomes de carbone dans chaque cycle variant entre 3 et 6 et le nombre total d'atomes de carbone étant égal de préférence à 7. - un radical hétérocyclique, polycyclique, de préférence bicyclique, saturé ou comprenant 1 ou 2 insaturations; le nombre d'atomes dans chaque cycle variant entre 3 et 6 et étant égal de préférence à 5 ou 6. - Procédé selon l'une des revendications 3 et 4 caractérisé par le fait que l'alcool est un alcool aliphatique, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, ayant de 4 à 30 atomes de carbone, pouvant éventuellement porté un substituant, par exemple, cyclique, et plus particulièrement, un groupe phényle, un atome d'halogène, un groupement amine ou alkoxy ayant généralement de 1 à 4 atomes de carbone. 6- Procédé selon l'une des revendications 3 à 5 caractérisé par le fait que le mélange de stéréoisomères à séparer est un mélange de stéréoisomères du 2- phényl 1-propanol (ou alcool hydratropique), du 1-phényléthanol (ou alcool a- phényléthylique) ou du nortricyclanol. 7- Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé par le fait que le mélange d'alcools stéréoisomères est un mélange stéréoisomères d'alcools cycliques secondaires, de préférence du cyclohexanol, l'un présentant le groupe hydroxyle en position axiale et l'autre en position équatoriale; la conformation étant bloquée par la présence d'un groupement encombrant, de préférence un groupe alkyle aliphatique ou cycloaliphatique, ayant au moins 3 atomes de carbone jusqu'à 12 atomes de carbone. 8- Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé par le fait que le mélange de stéréoisomères à séparer est un mélange de stéréoisomères de 4- tert-butylcyclohexanol, de 4-isobornylcyclohexanol, de 4-isocamphyl- cyclohexanol. 9- Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé par le fait que I'agent d'acylation est un ester d'acide organique ou à un anhydride d'acide organique. - Procédé selon la revendication 9 caractérisé par le fait que l'agent d'acylation répond à la formule (Il): LRV] CR2 n (Il) dans laquelle: - n est un nombre égal à 1, 2 ou 3, - R1 représente un radical alkyle ayant une faible condensation en carbone, - R2 peut prendre les significations suivantes: si n = 1, R2 représente un radical alkyle ou alcényle de faible condensation en carbone ou un radical -CO-R3, avec R3, identique ou différent de R1, ayant la mêmesignification que R1, si n = 2, R2 représente un radical alkylène ou alcénylène de faible condensation en carbone, si n = 3, R2 représente un radical alkyle triyle de faible condensation en carbone. 11 - Procédé selon l'une des revendications 9 et 10 caractérisé par le fait que I'agent d'acylation répond à la formule (Il) dans laquelle: - R1 représente un radical alkyle ayant de 1 à 3 atomes de carbone, - R2 représente un radical méthyle ou vinyle, halogénométhyle, mono-, di- ou trihalogénométhyle, méthylsulfate, éthylsulfate pour n = 1; un radical diéthylène pour n = 2; un radical propanetriyle-1,2,3 pour n = 3 lorsque l'agent d'acylation est un ester d'acide organique. - R1 et R3 sont identiques et représentent un radical alkyle ayant de 1 à 3 atomes de carbone, lorsque l'agent d'acylation est un anhydride d'acide. 12- Procédé selon l'une des revendications 9 à 11 caractérisé par le fait que l'agent d'acylation est choisi parmi: - la triacétine, - l'acétate de vinyle, - l'anhydride acétique. 13- Procédé selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé par le fait que que l'enzyme est choisie parmi les hydrolases, et plus particulièrement les lipases, estérases ou acylases. 14- Procédé selon la revendications 13 caractérisé par le fait que l'enzyme est une hydrolase appartenant à la classe EC.3 selon la nomenclature intemrnationale et plus particulièrement aux carboxylestérases (3.1.1.1), aux triacylglycérol lipases (3.1.1.3) ou aux acylases (3.5.1.4). - Procédé selon l'une des revendications 13 et 14 caractérisé par le fait que I'enzyme est une lipase issue d'organes (par exemple foies, pancréas ou glandes salivaires) d'organismes supérieurs comme de bovins (veaux), porcs, chevaux, lapins ou provient de micro-organismes tels que, par exemple: Géoticum candidum, Penicillium cyclopium, Penicillium roqueforti, Candida cylindracea, Rhizopus delemar, Rhizopus niveus, Mucor javanicus, Pseudomonas fluorescences, Pseudomonas species; une estérase de foie de porc ou de cheval et une acylase obtenue à partir des micro-organismes tels que l'Aspergillus. 16- Procédé selon l'une des revendications 13 à 15 caractérisé par le fait que l'enzyme est obtenue à partir du Candida cylindracea. 17- Procédé selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisé par le fait que le pH de la phase aqueuse est choisi de telle sorte qu'il soit compatible avec l'activité de l'enzyme, de préférence, entre 5 et 8, et encore plus préférentiellement entre 5 et 7. 18- Procédé selon la revendication 17 caractérisé par le fait que le pH est régulé par addition d'un agent de neutralisation, de préférence, la soude ou par ajout d'un agent tampon de préférence, phosphate, carbonate, bicarbonate, borate voire-même un agent tampon organique comme le tris- (hydroxyméthyl)amino-méthane. 19- Procédé selon l'une des revendications 1 à 18 caractérisé par le fait que le solvant organique est un solvant organique non miscible à l'eau, de préférence, un solvant organique, aprotique, peu polaire. - Procédé selon la revendication 19 caractérisé par le fait que le solvant organique est un hydrocarbure aliphatique ou aromatique, un hydrocarbure halogéné aliphatique ou aromatique, un éther-oxyde aliphatique, cycloaliphatique ou aromatique. 21 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 20 caractérisé par le fait que le rapport volumique entre la phase aqueuse et la phase organique varie entre 0,1 et 10, de préférence entre 1,0 et 5,0. 22- Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 caractérisé par le fait que que la concentration du mélange d'alcools stéréoisomères dans le solvant organique est à une concentration élevée, de l'ordre de 1 mole/litre. 23 Procédé selon l'une des revendications 1 à 22 caractérisé par le fait que la quantité de l'agent d'acylation est au moins égale à la quantité stoechiométrique, de préférence, en excès variant de 1 à 40 par rapport à la stoechiométrie, de préférence de 1 à 5. 24- Procédé selon l'une des revendications 1 à 23 caractérisé par le fait que la quantité d'enzyme mise en oeuvre représente de 0,1 à 100 %, de préférence de 1 à 10 % du poids du mélange d'alcools stéréoisomères. - Procédé selon l'une des revendications 1 à 24 caractérisé par le fait que la température de la réaction est choisie de préférence inférieure à 60 C, et plus préférentiellement entre 20 et 40 C. 26- Procédé selon l'une des revendications 1 à 25 caractérisé par le fait que rl'on prépare la phase aqueuse constituée du mélange d'eau, de l'enzyme et éventuellement l'agent permettant d'obtenir le bon pH, que l'on introduit le mélange d'alcools stéréoisomères à séparer dans le solvant organique ce qui compose la phase organique, que l'on procède au mélange des phases aqueuse et organique puis que l'on initie la réaction par ajout de rl'agent d'acylation, que l'on porte le milieu réactionnel à la température désirée, tout en maintenant le milieu réactionnel sous bonne agitation, que l'on récupère en phase organique, l'un des stéréoisomères sous forme estérifiée et également l'autre stéréoisomère qui reste sous forme d'alcool.