FR 2724175 A1 19960308 FR 9510394 A 19950905 PROCEDE DE PURIFICATION DE L'HIRUDINE PAR CROMATOGRAPHIE D'AFFINITE ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION 1. Domaine de l'invention La présente invention concerne un procédé de purification de l'hirudine, et plus particulièrement un procédé de purification de l'hirudine par chromatographie d'affinité. 2. Description de l'art antérieur L'hirudine, isolée à partir de la sangsue, Hirudo medicinalis, est un inhibiteur de la thrombine constitué de 65 - 66 acides aminés. On connait environ 11 variants de l'hirudine qui sont classés en deux groupes selon la séquence de l'acide aminé N-terminal: HV1 dont l'acide aminé N-terminal est Val-Val (Bagdy et al., Meth. Enzymol. 45, 669 (1976)) et HV2 dont l'acide aminé N-terminal est Ile-Thr (Walsmnn & Markwardt, Thromb. -2 - Res. 40, 563 (1985)). V1 et HV2 ont tous les deux été utilisés pour le traitement de la thrombose. L'hirudine présente une constante d'inhibition de la thrombine (Ki) de 10-1"M à 10-l4M, ce qui indique que l'hirudine peut inhiber la coagulation du sang à une très faible concentration (Mao et al., Anal. Biochem. 161, 514 (1987)). En particulier, des tests cliniques ont prouvé que l'hiru- dine ne présente aucun effet néfaste tel qu'allergie, réponses immunitaires, ou dysfonctionnement circulatoire (Markwardt et al., Thromb. Haemostas, 52, 160 (1984)). La quantité d'hirudine pouvant être obtenue à partir de un Hirudo medicinalis est aussi faible que gg (Markwardt, Meth., Enzymol., 19, 924, 1970). Par conséquent, il y a eu plusieurs tentatives pour produire une grande quantité d'hirudine par culture de micro- organismes modifiés par génie génétique (pour une revue, voir Fareed et ai., Blood coagulation and Fibrinolysis, 2, 135 (1991)). Riehl-Bellon et al. emploie la chromatographie d'échange d'anions et par HPLC en phase inverse pour purifier l'hirudine produite par les techniques de clonage de gènes (Riehl-Bellon et ai., Biochem., 28, 2941 (1989)). Et, Misawa et al. effectue une chromatographie sur colonne de DEAE-Cellulofine, de Butyl-Toyopearl, de Séphadex G-25 et de Q- Sépharose à leur tour pour purifier HV2 à partir d'une culture de E. coli recombinante (Misawa et ai., Proceeding of ApBioChEC. p. 62 (1992)). Toutefois, ces procédés n'ont été mis au point que pour mettre en évidence la production d'hirudine dans -3- des cellules hôtes et ils ne sont pas adaptés à la purification quantitative de l'hirudine. Une protéine recombinante à usage médical, employée sous forme de formulation injectable, doit être hautement purifiée et la purification est très importante en vue de la sécurité de la préparation et de considéra- tions économiques. Dans le but de purifier des protéines à usage médical, on a employé la chromatographie d'affinité immunitaire mettant en oeuvre une réaction d'antigène- anticorps. Toutefois, la chromatographie d'affinité immunitaire présente plusieurs inconvénients: elle est susceptible de subir l'inactivation et elle est coûteuse. Par conséquent, son utilisation est limitée à l'étape finale d'un procédé de purification. Dans ces circonstances, les présents inventeurs ont réalisé une étude poussée dans le but de fournir un procédé de purification de l'hirudine plus commode et non coûteux, et ils ont par conséquent trouvé que l'utilisa- tion de la chromatographie d'affinité d'ions métalliques, dans laquelle l'ion cuivrique (Cu") est utilisé comme adsorbant d'affinité (ion métallique) et un tampon phosphate est utilisé comme éluant, permet de réaliser ce but. RESUME DE L'INVENTION Ainsi, un objet de la présente invention est de fournir un procédé de purification de l'hirudine à un faible coût. Un autre objet de la présente invention est de -4 - fournir un procédé de purification de l'hirudine par la mise en oeuvre d'une chromatographie d'affinité d'ions métalliques dans laquelle l'ion cuivrique (Cu") est utilisé come adsorbant d'affinité (ion métallique) et un tampon phosphate est utilisé comme éluant. Encore un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé de purification de l'hirudine à partir d'une solution contenant de l'hirudine et d'autres substances comprenant les étapes consistant à: faire passer une solution d'un composé de cuivre dans une colonne garnie d'un ligand pour adsorber l'ion cuivrique (Cu++) sur le ligand; déposer la solution contenant de l'hirudine et d'autres substances sur la colonne pour fixer l'hirudine sur l'ion cuivrique; et décrocher l'hirudine de l'ion cuivrique et éluer l'hirudine de la colonne en utilisant un tampon phosphate comme éluant. Les autres objets, caractéristiques et applica- tions de la présente invention seront facilement évidents à l'homme de l'art ordinaire à partir de la description suivante. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La chromatographie d'affinité d'ion métallique, dans laquelle un ion métallique est utilisé comm---e adsor- bant d'affinité, a été mise au point pour la première fois en 1975 pour isoler les protéines du sérum humain (Porath et ai., Nature, 258, 598 (1975)). Porath et al. enseigne que certains acides aminés ayant une structure imidazole sont fixés sur un ion métallique adsorbé sur un ligand entassé dans une colonne chromatographique grâce à l'affinité entre l'acide aminé et l'ion métallique, puis les acides aminés sont décrochés de l'ion métallique en diminuant l'affinité entre l'acide aminé et l'ion métallique en utilisant un éluant. L'ion métallique peut être par exemple des ions métalliques divalents tels que Cu", Ni" et Zn". La chromatographie d'ion métallique présente des avantages, du point de vue industriel, en ce que le ligand sur lequel les ions métalliques sont adsorbés peut être facilement préparé et sa stabilité est excellente, et la matrice (ou le support) d'immobilisation peut être recyclé. Il n'y a eu aucune tentative pour appliquer la chromatographie d'affinité d'ions métalliques à l'isole- ment ou à la purification de l'hirudine. Les présents inventeurs ont pour la première fois tenté d'appliquer la technique de chromatographie d'affinité d'ions métalli- ques à la purification de l'hirudine et ils en ont établi les conditions optimales d'opération. Selon la présente invention, le procédé de purification mettant en oeuvre la chromatographie d'affi- nité d'ions métalliques comprend les étapes consistant à faire passer une solution d'un composé de cuivre dans une colonne garnie d'un ligand pour adsorber l'ion cuivrique (Cu") sur le ligand; déposer une solution contenant de l'hirudine à purifier sur la colonne pour fixer l'hirudi- ne sur l'ion cuivrique; et décrocher l'hirudine de l'ion cuivrique et éluer l'hirudine de la colonne en utilisant -6 - un tampon phosphate comme éluant. Le ligand, qui est immobilisé sur une matrice ou un support d'immobilisation et sur lequel est adsorbé l'ion cuivrique en tant qu'adsorbant d'affinité, peut être n'importe lequel qui est employé pour la chromato- graphie d'affinité d'ions métalliques. Les exemples du ligand peuvent inclure, mais ne sont pas limités A, l'acide iminodiacétique (IDA), la tris(carboxyméthyl)- éthylènediamine (TED) ou l'acide nitrilo-triacétique (NTA). On emploie de préférence l'acide iminodiacétique. Comme matrice ou support d'immobilisation, on peut employer un gel d'agarose ou de dextrose tel que la Sépharose (Pharmacia), le Séphadex (Pharmacia), la Cellufine (Amicon), le Toyopearl (Tosoh), etc. On peut préparer la matrice d'immobilisation sur lequel le ligand est fixé par des techniques connues de l'homme de l'art ordinaire ou peut être disponible dans le commerce. L'ion métallique employé pour la présente inven- tion est un ion divalent, et il est de préférence l'ion cuivrique (Cu"). L'ion cuivrique peut être adsorbé sur le ligand en faisant passer une solution de composé de cuivre dans la colonne garnie du ligand. Le composé de cuivre est de préférence le sulfate de cuivre. Tout autre ion métallique divalent tel que le zinc ou le nickel n'a aucune affinité pour l'hirudine, et par conséquent ne peut pas être utilisé pour la purification de l'hirudine. L'hirudine peut être décrochée de l'ion métalli- que en utilisant un tampon tel que du phosphate, un - 7 - gradient de concentration d'imidazole, un gradient de pH, ou un agent chélateur tel que l'acide éthylène- diaminetétracétique ou l'acide éthylèneglycoltétra- cétique. Compte tenu du rendement de l'hirudine, on emploie avantageusement un tampon phosphate, particu- lièrement de 50 - 500 mM de phosphate, plus particulière- ment jusqu'à environ 100 mM de tampon phosphate. Le tampon phosphate peut contenir jusqu'à 20 mM d'imidazole car l'addition d'imidazole facilite le découplage de l'hirudine de l'ion cuivrique lorsque le couplage est très fort. L'hirudine pouvant être purifiée en utilisant le procédé de la présente invention peut inclure une hirudine naturelle isolée de Hirudo medicinalis, du bouillon de culture contenant de l'hirudine obtenu par culture de levure ou de bactérie ayant de l'ADN recombi- nant codant pour l'hirudine, des préparations d'hirudine non purifiées (brutes) disponibles dans le commerce, etc. L'hirudine pouvant être produite par une technique de l'ADN recombinant peut inclure l'hirudine HV2, Lys47-HV2 qui est une hirudine HV2 dans laquelle l'acide aminé 47 est substitué par Lys, ou l'hirudine HV1. Les levures ou les bactéries portant un ADN recombinant codant pour l'hirudine peuvent être cultivées par une technique de culture courante très connue de l'homme de l'art ordinaire pour produire l'hirudine. Et l'hirudine peut être isolée à l'état brut à partir de bouillon de culture de levures ou de bactéries en utili- sant des procédés connus de l'homme de l'art ordinaire, - 8 - par exemple en centrifugeant le bouillon de culture et en soumettant le surnageant résultant à une ultracentri- fugation. De manière alternative, le bouillon de culture peut être soumis à une chromatographie d'ions, ou à une précipitation à l'éthanol ou à l'acétone. Pour la présente invention, le terme solution brute contenant de l'hirudine" tel qu'employé dans l'application désigne une solution qui contient de l'hirudine ainsi que d'autres substances, et il est utilisé comme l'équivalent du terme *une solution conte- nant de l'hirudine et d'autres substances. La solution brute contenant de l'hirudine peut inclure le, mais n'est pas limitée au, bouillon de culture comme expliqué ci- dessus, ou de l'hirudine brute isolée à partir du bouil- lon de culture, des préparations d'hirudine non purifiée disponibles dans le commerce, etc. L'hirudine est quantitativement analysée par la méthode de Folin, et la pureté est déterminée par la méthode de Sohn (Sohn et al., J. Microbiol. Biotechnol., 1, 266 (1991)) dans laquelle la chromatographie liquide haute performance (HPLC; Bechman, Model System Gold) est effectuée sur une colonne C-8 (4,6 mm x 250 mm, Phenomenex) en utilisant un gradiant d'acétonitrile-eau à 15-30 %. Le titre anti-thrombine de l'hirudine est exprimé en unité antithrombine (UAT). L'activité de la thrombine est standardisée en U-NIH, et on définit une activité d'hirudine de 1 UAT comme étant la quantité d'hirudine inhibant complètement l'activité de la thrombine de i U- NIH. Le titre anti-thrombine de l'hirudine peut être déterminé en suivant la méthode de Nadine et ai. (Nadine et ai., Biochem., 28, 2941 (1989)). C'est-à-dire qu'on ajoute 0,005, 0,01, 0,015, 0,02, 0,025 ou 0,03 UAT d'hirudine authentique (Accurate Chem. & Scientific), ou de l'hirudine purifiée préparée dans les exemples de la présente invention, à 50 g1 de solution de réaction à thrombine (Tris-Cl 0,1 M, pH 8,0, NaCl 0,12 M, azide de sodium à 0,01 %, sérum albumine bovine à 0,1 %), puis on y ajoute 0,03 U-NIH/50 gl de thrombine humaine (Sigma). Ensuite, on y ajoute 100 gl de chromozyme TH 200 M (Boehringer Mannheim), un substrat synthétique de la thrombine, et le mélange résultant est incubé à 37 C pendant 5 minutes, et on mesure le développement de la coloration du chromozyme TH à 405 nm à l'aide d'un lecteur de microplaque. En utilisant les mesures à 405 nm pour chaque hirudine authentique et purifiée, on calcule le titre de l'hirudine purifiée obtenue dans les exemples. La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples non limitants qui suivent. Exemple 1 On a cultivé la levure Saccharomyces cerevisiae KCTC 8519P dans un milieu de culture mixte (extrait de levure à 4 %, casamino-acide à 0,5 %, acide succinique à 1 %, hydroxyde de sodium à 0,4 %, et galactose à 4 % comme source de carbone), à 30 C pendant 52 heures. La culture a été effectuée par un procédé de culture fed - 10 - batch dans lequel le galactose a été ajouté de façon intermittente pour maintenir sa concentration à 2-4 %. A la fin de la culture, le bouillon de culture a été centrifugé pour donner un surnageant qui a été filtré sur une membrane d'ultrafiltration YM3 ayant un seuil de coupure de poids moléculaire de 3000 (Amicon). Le filtrat ainsi obtenu a été appelé "solution brute contenant de l'hirudine" et utilisé dans le procédé de purification ultérieur. Exemple 2 L'IDA-Sépharose 6B Fast Flow, qui est un gel de Sépharose sur lequel de l'acide iminodiacétique (IDA) est fixé, a été acheté chez Signa. Une colonne chromatogra- phique de 1,5 x 30 cm a été garnie d'IDA-Sépharose 6B et on a fait passer une solution de sulfate de cuivre 20 mM à travers la colonne. ExemDle 3 On a fait passer 1 ml de la solution brute contenant de l'hirudine préparée à l'exemple 1 à un débit de 1 ml/min à travers la colonne d'IDA-Sépharose 6B Fast Flow préparée à l'exemple 2 pour fixer l'hirudine sur l'ion cuivrique, puis la colonne a été lavée avec du tampon phosphate 1 mM (pH 6,2) pour éliminer les pro- téines non fixées autres que l'hirudine. Ensuite, l'hiru- dine a été éluée en utilisant du tampon phosphate 100 mM (pH 6,2). Les fractions n 38 à 54, contenant l'hirudine, ont été récupérées et soumises à l'ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de coupure de poids molécu- laire de 3000. La quantité de protéines totales et - 11 - l'activité de l'hirudine contenues dans le filtrat ont respectivement été de 1,75 mg et de 4000 UAT/mg, alors qu'elles sont respectivement de 120,8 mg et de 68,6 UAT/mg pour la solution brute de départ contenant de l'hirudine. Le rendement et la pureté de l'hirudine ont été respectivement de 85,6 % et de 90 % ou plus. Examples comparatifs i - 2 Les protocoles décrits dans les exemples 1 à 3 ont été effectués sauf qu'une solution à 20 mM d'ion nickel (exemple comparatif 1) ou d'ion zinc (exemple comparatif 2) a été employée au lieu d'une solution de sulfate de cuivre. Il n'y a pas eu de changements dans les quantités de protéines totales et les activités de l'hirudine contenues dans la solution avant et après passage à travers la colonne. Exemple 4 On a acheté de l'hirudine naturelle non purifiée chez Sigma sous le numéro de catalogue H7016 et on l'a purifiée en suivant le protocole de l'exemple 3. La quantité de protéines totales et l'activité de l'hirudine avant passage à travers la colonne ont respec- tivement été de 0,08 mg et de 1720 UAT/mg, alors qu'après passage à travers la colonne, sont respectivement de 0,01179 mg et de 10500 UAT/mg. Le rendement et la pureté de l'hirudine ont respectivement été de 90 % et de 97 % ou plus. Exemple 5 On a acheté de l'HV1 non purifiée chez CalBioChem - 12 - sous le numéro de catalogue 377855 et on l'a purifiée en suivant le protocole de l'exemple 3. Le décrochage de l'hirudine de l'ion cuivrique a été effectué en utilisant du tampon phosphate 100 mM (pH 6,2) contenant de l'imida- zole 20 mM. La quantité de protéines totales et l'activité de l'hirudine avant passage à travers la colonne ont respec- tivement été de 0,93 mg et de 215 UAT/mg, alors qu'après passage à travers la colonne, elles sont respectivement de 0,215 mg et de 890 UAT/mg. Le rendement et la pureté de l'hirudine ont respectivement été de 96 % et de 90 % ou plus. Exemple 6 On a acheté de l'hirudine recombinante, Lys 47- HV2, chez Sigma sous le numéro de catalogue H0393 et on l'a purifiée en suivant le protocole de l'exemple 3. La quantité de protéines totales et l'activité de l'hirudine avant passage à travers la colonne ont respec- tivement été de 0,01 mg et de 9900 UAT/mg, alors qu'après passage à travers la colonne, elles sont respectivement de 0,0095 mg et de 12000 UAT/mg. Le rendement et la pureté de l'hirudine ont respectivement été de 90 % et de 99 % ou plus. Exemple comparatif 3 Les protocoles décrits dans les exemples 1 à 3 ont été effectués sauf qu'un gradient de pH de 6 à 4 a été formé en utilisant du tampon acétate de sodium (20 mM) contenant du NaCl 1M pour éluer l'hirudine de la colonne. - 13 - Le décrochage de l'hirudine de l'ion cuivrique a été incomplet et le rendement en hirudine a été d'environ %. Exemple 7 Les protocoles décrits dans les exemples 1 à 3 ont été effectués sauf qu'on a employé de la tris-car- boxyméthyléthyl1nediamine au lieu de l'acide iminodi- acétique comme ligand. Le rendement et la pureté de l'hirudine ont respectivement été de 86,3 % et de 90 % au plus. Cette invention peut être pratiquée ou mise en oeuvre dans d'autres manières sans s'écarter de l'esprit et du caractère essentiel de celleci. Les modes de mise en oeuvre préférés décrits ici sont par conséquent illustratifs et non restrictifs, la portée de l'invention étant indiquée par les revendications annexes visant à embrasser toutes les variations entrant dans le cadre des revendications. - 14 - Revendications: 1. Procédé de purification de l'hirudine à partir d'une solution contenant de l'hirudine et d'autres substances, caractérisé en ce que le procédé comprend une étape consistant à soumettre la solution à une chromatographie d'affinité d'ions métalliques dans laquelle l'ion métallique est l'ion cuivrique (Cu+) et un tampon phos- phate est utilisé comme éluant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: faire passer une solution d'un composé de cuivre dans une colonne garnie d'un ligand pour adsorber l'ion cuivrique (Cu") sur le ligand; déposer une solution contenant de l'hirudine et d'autres substances sur la colonne pour fixer l'hirudine sur l'ion cuivrique; et décrocher l'hirudine de l'ion cuivrique et éluer l'hirudine de la colonne en utilisant un tampon phosphate comme éluant. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caracté- risé en ce que l'hirudine est une hirudine naturelle, HVl, HV2 ou Lys47-HV2. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caracté- risé en ce que ladite solution d'un composé de cuivre est une solution de sulfate de cuivre. 5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractéri- sé en ce que ledit tampon phosphate a une concentration inférieure à 100 mM. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en - 15 - ce que ledit tampon phosphate contient jusqu'à 20 mM d'imidazole. 7. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le ligand est de l'acide iminodiacétique.