FR 2718369 A1 19951013 FR 9404294 A 19940412 La présente invention est relative à des microsphères gélifiées, à leur procédé de préparation et à leurs applications. Les microsphères, qui sont des particules de forme sphérique, dont la taille s'échelonne, générale- ment, entre 1 et 1 250 im, sont constituées d'un matériau support contenant la substance encapsulée et présentent un intérêt particulier, soit lorsqu'il est souhaitable d'administrer un médicament sous une forme permettant la10 libération contrôlée du composant actif au cours d'une certaine période, afin d'assurer une action pharmacolo- gique prolongée, soit lorsqu'il est nécessaire de proté- ger ledit composant actif d'une dégradation prématurée dans les voies digestives. Suivant la structure du matériau de support, on distingue deux types de microcapsules: - les microcapsules de type réservoir dans lesquelles le matériau support est une enveloppe solide, d'épaisseur variable contenant la substance à encapsuler, - les microcapsules de type matriciel, appe- lées également microsphères, dans lesquelles le matériau support est un réseau continu, dans lequel est dispersée la substance à encapsuler. Au sens de la présente invention, le terme microcapsule ou microsphère ne comprend que les micro- capsules ou microsphères de type matriciel. De nombreuses substances peuvent être encapsu- lées: il peut s'agir de produits chimiques tels que des médicaments, ou bien des macromolécules telles que des enzymes, et également des cellules vivantes. Les microsphères sont utilisées dans de nom- breux domaines, tels que la pharmacie, la bio-industrie, la cosmétologie, l'agroalimentaire, l'industrie pape- tière, etc... Plusieurs procédés de préparation de micro- capsules ont été décrits; on peut notaumment citer: - la méthode par séparation de phase, notam- ment décrite dans le brevet US 4 675 189 et la Demande EP 52 510 qui décrit des microcapsules préparées par une technique de séparation de phase en utilisant un agent de 5 coacervation, tel que les huiles minérales ou les huiles végétales. Cependant, les microcapsules préparées par cette méthode ainsi que par d'autres procédés analogues ont l'inconvénient de former des agglutinats (inter-adhé- sion de particules), lors de la préparation desdites microcapsules. - la méthode par évaporation de solvant, notamment décrite dans le Brevet US 4 479 911, la Demande EP 301 969 et la Demande EP 145 240; cette méthode com- prend la formation séparée d'une phase organique par dissolution d'un polymère convenable dans un solvant non miscible à l'eau et vola- til et d'une phase aqueuse contenant le principe actif intéressant, l'addition de la phase aqueuse dans la phase organique, le mélange des deux phases sous agitation et/ou en présence d'un agent énulsifiant puis l'évaporation du solvant, généralement sous agitation et à température ambiante, pour obtenir les microcapsules désirees. La Demande EP 145 240 décrit plus particuliè- rement des microcapsules produites en préparant une émul- sion E/H (émulsion primaire) comprenant une couche interne aqueuse contenant une substance hydrophile et une substance dite de rétention du médicament (mucilage natu- rel ou synthétique ou des composés de poids moléculaires élevés et plus particulièrement de la gélatine) et une couche huileuse contenant un polymère, de préférence un acide polylactique ou un copolymère d'acide lactique et d'acide glycolique ou leurs mélanges, dans un solvant non 3 miscible à l'eau tel que le dichlorométhane, puis en épaississant ou en solidifiant ladite couche interne aqueuse de manière à obtenir une viscosité supérieure à 000 centipoises, puis en préparant une émulsion secon- daire E/H/E, en présence d'un agent tensio-actif conve- nable, et finalement en soumettant l'émulsion ainsi obte- nue à une évaporation du solvant. Le procédé décrit dans cette Demande permet l'obtention de microcapsules d'un diamètre compris entre 0,5 et 400 pm.10 Toutefois ces microcapsules ou microsphères de l'Art antérieur ont l'inconvénient majeur d'avoir des diamètres de l'ordre du pm ou plus (1- 1250 pm); or, il existe de nombreuses applications pour lesquelles il est nécessaire et/ou particulièrement avantageux de pouvoir disposer de particules ayant un diamètre significative- ment plus petit, notamment de l'ordre du nm ou plus, entre 20 et 600 nm, par exemple. En conséquence, les Demanderesses se sont donné pour but la mise au point de microsphères gélifiées dont le diamètre peut être contrôlé et atteindre, si nécessaire, 20 nm. La présente invention a pour objet des micro- sphères, caractérisées en ce qu'elles comprennent un noyau polaire gélifié (GPC = gelified polar core) autour duquel sont, éventuellement, superposées concentriquement et alternativement n bicouches lipidiques ou n couches aqueuses à l'état liquide et n couches polaires géli- fiées, n étant un nombre entier et en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues par délipidation de lipo- somes, dénommés lipogélosomes (marque déposée au nom de la société LIPOGEL et désignant des liposomes à noyau polaire gélifié), du type comportant au moins une bicouche lipidique externe et au moins une phase polaire aqueuse interne contenant une substance gélifiée. De manière avantageuse, de telles micro- sphères: - présentent un diamètre contrôlable, de pré- férence compris entre 20 et 600 nm, - sont stables, - peuvent inclure des substances actives hydrosolubles, - permettent aussi bien la réalisation de formes à libération immédiate ou retard, selon le point de fusion de la substance gélifiée, - peuvent servir de base à l'accrochage de ligands, de substances mal reconnues par le système réti- culo-endothélial (microsphères furtives), de composés électriquement chargés (ciblage électrique en électrothé- rapie), et - sont aptes à être rendues furtives (non reconnaissance par le système réticulo-endothélial), lorsqu'elles présentent un diamètre de l'ordre de 20- nm. Conformément à l'invention, la substance géli- fiable est sélectionnée parmi des composés gélifiables, polymérisables ou non, tels que les polysaccharides, les polypeptides ou les polyacrylamides. De manière préférée, la substance gélifiable non polymérisable est sélectionnée parmi la gélatine, i'agarose, ou les carraghenanes et la substance géli- fiable polymérisable est sélectionnée parmi les gels de polyacrylamide. De tels liposomes à noyau polaire gélifié ou lipogélosomes sont notamment décrit dans le Brevet EP 0 393 049, dans lequel il est précisé qu'ils sont constitués par une phase interfaciale en bicouche dans le cas des lipogélosomes unilamellaires ou d'une pluralité de phases interfaciales en bicouche superposées concen- triquement, dans le cas des lipogélosomes multilamel- laires et par une phase polaire aqueuse interne encapsu- lée gélifiée. Ce brevet décrit en particulier le procédé d'obtention de tels lipogélosomes unilamellaires ou multilamellaires: la phase aqueuse encapsulée gélifiée, est issue de la phase aqueuse initiale liquide, dans laquelle lesdits lipogélosomes sont préparés, par trans- formation de ladite phase aqueuse en gel, en raison de la présence, dans ladite phase aqueuse, d'un ou plusieurs composés gélifiables, polymérisables ou non; la phase aqueuse non encapsulée peut, en outre être rendue ingéli- fiable par action physique, chimique ou enzymatique. La/les phases interfaciales en bicouche sont constituées par exemple de lipides de classe 4 (phospholipides), éventuellement associés à des lipides de classe 2 et de classe 3 (cholestérol libre) et/ou des lipides de classe 5. Cette classification des lipides proposée par le Professeur HAUTON et coll., basée sur les coefficients de partage KD entre une phase polaire aqueuse et une phase interfaciale en monocouche ou en bicouche et KC entre une phase interfaciale et une phase hydrophobe ou apolalre, sera utilisee (HAUTON et LAFONT, Biochimie, 1987, 69, 177-204) et est également décrite dans le Brevet EP 393 049 précité. De tels lipogélosomes (LGS) sont généralement classés selon le nombre de bicouches: en petits et grands lipogélosomes uni- lamellaires: SULGS = small unilamellar lipogelosomes; LULGS = large unilamellar lipogelosomes et en lipogélosomes multilamellaires: MLGS = multilamellar lipogelosomes. Conformément à l'invention, l'étape de délipi- dation desdits lipogélosomes peut être mise en oeuvre de plusieurs manières et conduire, à des microsphères géli- fiées de diamètre contrôlé: a) délicidation superficielle des linoaélosomes unilamellaires ou multilamellaires car: (1) extraction de la bicouche lipidique super- ficielle desdits lipogélosomes unilamellaires ou multi- lamellaires, par un solvant organique ou un mélange de solvants organiques, non miscible à l'eau; (2) partage biphasique de la phase organique et de la phase aqueuse; et (3) séparation de la phase aqueuse contenant les microsphères gélifiées, superficiellement délipidées, (élimination de la bicouche la plus externe). Dans le cas de la délipidation de lipogéloso- mes unilamellaires (élimination de l'unique bicouche lipidique), on obtient des microsphères gélifiées15 conformes à l'invention, également dénommées gélosomes (GS) (marque déposée au nom de la société LIPOGEL) (petits gélosomes homogènes: SHGS = small homogenous gelosomes; grands gélosomes homogènes: LHGS = large homogenous geiosomes) ou des polymérisomes (marque dépo- sée au nom de la société LIPOGEL et désignant également des microsphères gélifiées conformes à l'invention) homo- gènes, c'est-à-dire ne comportant aucune bicouche lipi- dique et donc constitués par des microsphères aqueuses gélifiées homogènes, correspondant au noyau polaire géli- fié précité (GPC), polymérisé ou non. Dans le cas de la délipidation superficielle de lipogélosomes multilamellaires (élimination de la bicouche lipidique la plus externe), on obtient des structures hybrides entre lipogélosome (LGS) et gélosome (GS) dénommées gélosomes (GS) multicouches hybrides (hybrid MGS = hybrid multilayered gelosomes) ou polyméri- somes multicouches hybrides, constitués par un noyau polaire gélifié (GPC), polymérisé ou non, sur lequel se superposent concencentriquement des bicouches lipidiques, séparées par des couches aqueuses gélifiées, polymérisées ou non, la couche la plus externe étant une couche aqueuse gélifiée, polymerisée ou non. De telles microsphères conformes à l'invention, représentent en fait: des LGS unilamellaires, lorsque les LGS ini- tiaux non délipidés, qui ont servi à leur préparation, étaient bilamellaires, ou - des LGS multilamellaires, lorsque les LGS initiaux non délipidés, qui ont servi à leur préparation, étaient multilamellaires; ces microsphères sont entourées par une couche aqueuse superficielle polymérisée ou non (Tableau I et figures 2 et 3). Le solvant organique non miscible à l'eau est notamment, et ce de manière non limitative, de l'heptane. b) délinidation complète des liuoaélosomes unilamellaires ou multilamellaires par: (1) extraction lipidique des lipogélosomes unilamellaires ou multilamellaires, par un solvant orga- nique ou un mélange de solvants organiques, miscible à l'eau ou partiellement miscible à l'eau; (2) partage biphasique de la phase organique et de la phase aqueuse; (3) séparation du/des solvant(s) organique(s) de la phase aqueuse; et (4) séparation des microsphères gélifiées et complètement délipidées. Conformément à l'invention, lorsque l'étape (1) est réalisée à l'aide d'une phase organique miscible à l'eau, un solvant organique apolaire est ajouté préala- blement à l'étape (2), permettant ainsi le partage bipha- sique. Dans le cas de la délipidation complète de lipogélosomes unilamellaires (élimination de l'unique bicouche lipidique), on obtient des gélosomes (GS) ou des polymérisomes homogènes, tels que définis ci-dessus. Dans le cas de la délipidation complète de lipogélosomes bilamellaires, on obtient un noyau polaire gélifié (GPC), polymérisé ou non, entouré d'une couche aqueuse à l'état liquide et d'une seule couche superfi- cielle aqueuse à l'état gélifié, polymérisée ou non. Dans le cas de la délipidation complète de lipogélosomes multilamellaires, on obtient des gélosomes (GS) multicouches (MGS = multilayered gelosomes) ou poly- mérisomes multicouches, constitués par un noyau polaire gélifié (GPC), polymérisé ou non, sur lequel se superpo- sent concencentriquement des couches aqueuses gélifiées, polymérisées ou non, séparées entre elles par des couches aqueuses à l'état liquide. Le solvant organique est avantageusement mais de manière non limitative, du n-butanol. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de microsphères conformes à l'invention, comprenant un noyau polaire gélifié (GPC = gelified polar core) autour duquel sont, éventuellement, superposées concentriquement et alternativement n bicouches lipidiques ou n couches aqueuses à l'état liquide et n couches polaires gélifiées, n étant un nombre entier, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend: (a) la préparation de liposomes, dénommés lipogélosomes, du type comportant n+l bicouches lipi- diques, dont une bicouche lipidique externe et au moins une phase polaire aqueuse interne contenant une substance gélifiée, et (b) la délipidation desdits lipogélosomes. L'étape (a) est décrite dans le Brevet EP 0 393 049. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, préalablement à l'étape de délipidation, les lipogélosomes sont sélectionnés en fonction de leur diamètre, de préférence par ultrasonication. Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux dudit procédé, préalablement à l'étape de délipida- tion, les substances non encapsulées sont éliminées, de préférence par ultrafiltration tangentielle.5 On obtient alors un concentré de lipogélosomes dans le rétentat d'ultrafiltration; l'étape de délipida- tion est alors effectuée dans ledit rétentat d'ultrafiltration. Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux dudit procédé, l'étape (b) de délipidation comprend, pour une délipidation superficielle: (1) l'extraction de la bicouche lipidique superficielle desdits lipogélosomes unilamellaires ou multilamellaires, par un solvant organique ou un mélange de solvants organiques, non miscible à l'eau; (2) le partage biphasique de la phase orga- nique et de la phase aqueuse; et (3) la séparation de la phase aqueuse conte- nant les microsphères gélifiées, superficiellement déli- pidées, telles que définies ci-dessus. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, l'étape (b) de délipidation comprend, pour une délipidation complète: (1) l'extraction lipidique des lipogélosomes unilamellaires ou multilamellaires, par un solvant orga- nique ou un mélange de solvants organiques, miscible à l'eau ou partiellement miscible à l'eau; (2) le partage biphasique de la phase orga- nique et de la phase aqueuse; (3) l'élimination du solvant organique de la phase aqueuse; et (4) la séparation des microsphères gélifiées et complètement délipidées, telles que définies ci- dessus. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, ainsi qu'aux dessins annexes dans lesquels: - la figure 1 illustre une microsphère géli- fiée obtenue par délipidation d'un lipogélosome unilamel- laire; - la figure 2 illustre une microsphère géli- fiée obtenue par délipidation superficielle ou complète d'un lipogélosome bilamellaire; - la figure 3 illustre une microsphère géli- fiée obtenue par délipidation superficielle ou complète d'un lipogélosome multilamellaire; - la figure 4 illustre les variations des volumes molaires de lipogélosomes unilamellaires, en fonction du rayon R (coordonnées log/log); - la figure 5 illustre les variations des volumes molaires de gélosomes homogènes (SHGS ou LHGS), en fonction du rayon R-h (coordonnées log/log); - la figure 6 illustre les variations des volumes molaires de lipogélosomes multilamellaires, en fonction du rayon R (coordonnées log/log). Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Les différents types de microsphères gélifiées conformes à l'invention sont illustrés au Tableau I ci- après, ainsi qu'aux figures 1 à 3. il TABLEAU I délipidation délipidation superficielle complète GPC non gélosomes homo- gélosomes homo- polymérisé gènes (SHGS et gènes (SHGS et LGS LHGS) (figure 1) LHGS) (figure 1) unilamellaires - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - (SULGS et GPC polymé- polymérisomes polymérisomes LULGS) risé homogènes (figure homogènes (figure 1) 1) GPC non gélosomes multi- gélosomes multi- polymérisé couches hybrides: couches: GPC + GPC + bicouches couches aqueuses lipidiques concen- gélifiées concen- triques séparées triques séparées par couches par couches aqueuses gélifiées aqueuses à l'état LGS multi- (figures 2 et 3) liquide (figures 2 lamellaires et 3) (MLGS) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - GPC polymé- polymérisomes mul- polymérisomes risé ticouches multicouches: GPC hybrides: GPC + + couches aqueuses bicouches lipi- gélifiées concen- diques concen- triques séparées triques séparées par couches par couches aqueuses à l'état aqueuses gélifiées liquide (figures 2 (figures 2 et 3) et 3) La figure 1 illustre les microsphères géli- fiées, polymérisées ou non, obtenues par délipidation superficielle ou complète d'un lipogélosome unilamel- laire. Les lipogélosomes unilamellaires (SULGS et LULGS) comprennent un noyau polaire gélifié (GPC), poly- mérisé ou non (représenté en blanc) de rayon RGpC et une bicouche de phospholipides (représentée en foncé) d'épaisseur h = 10- 8 cm; le rayon desdits lipogélosomes unilamellaires est R = RGpC + h. Par délipidation du lipogélosome unilamel- laire, on obtient, comme précisé ci-dessus, un gélosome homogène (SHGS et LHGS), si le noyau polaire gélifié est non polymérisé, ou un polymérisome homogène, si le noyau polaire gélifié est polymérisé. Le rayon de la microsphère gélifiée conforme à l'invention, polymérisée ou non, est égal à RGpC. La phase aqueuse liquide environnant les LGS et les microsphères est représentée par une série de traits (hachurage). La figure 2 illustre les microsphères géli- fiées, polymérisées ou non, obtenues par délipidation superficielle ou complète d'un lipogélosome bilamellaire. La figure 2A représente un lipogélosome bilamellaire comprenant un noyau polaire gélifié (GPC), polymérisé ou non (représenté en blanc), de rayon RGpC et deux bicouches lipidiques (représentées en foncé), d'épaisseur h = 10-8 cm, et séparées par une couche aqueuse gélifiée d'épaisseur H; le rayon desdits lipogé- losomes (LGS) bilamellaires RLGS = RGpC + 2h + H. (1) La figure 2B représente les gélosomes ou poly- mérisomes multicouches hybrides obtenus par délipidation superficielle desdits LGS bilamellaires: seule la bicouche lipidique superficielle étant extraite, on obtient des microsphères qui comprennent un noyau polaire gélifié, polymérisé ou non, et entouré d'une bicouche lipidique, puis d'une couche aqueuse gélifiée superfi- cielle d'épaisseur H, polymérisée ou non. Le rayon de ces microsphères conformes à l'invention est R = RGpC + h + H. (2) La figure 2C représente les gélosomes ou poly- mérisomes multicouches obtenus par délipidation complète desdits LGS bilamellaires: les deux bicouches lipidiques étant extraites, on obtient un gélosome ou un polyméri- some non-homogène constitué par un noyau polaire gélifié (GPC), polymérisé ou non, une couche aqueuse à l'état liquide, d'épaisseur h. et enfin une couche aqueuse géli- fiée superficielle, polymérisée ou non, d'épaisseur H; le rayon de ces microsphères est R = RGpC + h + H. La figure 3 représente les gélosomes ou poly- mérisomes multicouches obtenus par délipidation superfi- cielle ou délipidation complète de lipogélosomes multi- lamellaires (MLGS). 5 Ces MLGS comprennent un noyau polaire gélifié (GPC), polymérisé ou non (représenté en blanc), de rayon RGpC et n bicouches lipidiques (représentées en foncé), avec n = 3, l'épaisseur de chaque bicouche étant h = -8 cm; le rayon desdits lipogélosomes multilamellaires RLGS = RGPC + nh + (n-l)H (3), est de, lorsque n = 3, égal à RGpC + 3h + 2H (4). Par délipidation superficielle desdits LGS trilamellaires, on obtient des gélosomes ou des polyméri- somes multicouches hybrides comprenant un noyau polaire gélifié (GPC), polymérisé ou non, une bicouche lipidique, puis une première couche aqueuse gélifiée, une deuxième couche lipidique, puis superficiellement une deuxième couche aqueuse gélifiée, polymérisée ou non. Le rayon de telles microsphères conformes à l'invention est R = RGpC + 2h + 2H (5). Par délipidation complète desdits LGS tri- lamellaires, on obtient des gélosomes ou des polyméri- somes multicouches comprenant un noyau polaire gélifié (GPC), polymérisé ou non, une première couche aqueuse à l'état liquide (représentée en hachurée), une première couche aqueuse gélifiée, une deuxième couche aqueuse à l'état liquide, puis superficiellement une deuxième couche aqueuse gélifiée, polymérisée ou non. Le rayon de telles microsphères conformes à l'invention est R = RGpC + 2h + 2H. EXEMPLE 1: Détermination des paramètres physiques des lipogélosomes (LGS) et des microsphères conformes à l'invention (superficiellement délipidées ou complètement délipidées): appréciation du contr8le du diamètre des5 microsphères. Une condition nécessaire pour obtenir une méthode standardisée de calcul des paramètres physiques d'un type bien défini de particules sphériques est de respecter strictement un système d'Unités LMT.10 Parmi les différents systèmes d'Unités, l'ancien système C.G.S. est le mieux adapté aux habitudes des biologistes. Mais il est facile de passer d'un sys- tème d'Unités à l'autre par l'utilisation de facteurs de conversion appropriés. Dans le respect du système C.G.S., il faut donc toujours exprimer une longueur en cm, une surface en cm2, un volume en cm3, une densité en g.cm-3, une concen- tration en g.cm-3 ou en mol.cm-3 et un temps en seconde, conditions nécessaires pour pouvoir obtenir des modèles standardisés dont l'absence constitue une lacune dans les Sciences biologiques par l'absence d'utilisation d'Unités cohérentes entres elles (HAUTON J.C. et ai., BIOCHIMIE, 1987, 69, 177-204, Lipid Biodynamics: new perspectives). 1) Paramètres physiques d'une espèce particu- laire sphérique bien définie: une particule sphérique X, telle qu'un lipogé- losome (LGS), un gélosome (GS) ou une structure hybride entre lipogélosome (LGS) ou gélosome (GS), de rayon R en cm, est une entité plurimoléculaire de volume vX en cm3, de densité dX en g.cm-3, de masse mX en g et de surface sX en cm2 (les paramètres physiques d'une particule étant exprimés par des caractères minuscules). Ainsi, une mole de X, soit N particules de X ou 6,023x1023 particules (les paramètres physiques molaires étant exprimés par des caractères majuscules) a un volume molaire MV (Molar Volume) MVX de vxN cm3, égal à 4/3n R3N cm3 ou 25,22x1023R3 cm3, une masse molaire MM (Molar Mass) MMX de mXN g ou 25,22xR3dx g et une surface molaire MS (Molar Surface) MSX de sxN cm2, égale à 4z R2N cm2 ou 75, 68x1023R2 cm2 (4/32X=4,188; 4/3tN=25,23x1023; 4x=12,5664 et 4rtN=75,69x1023). Si la concentration de l'espèce particulaire X est exprimée en mol.cm-3 par [X], on a alors par cm3 d'un volume de référence bien défini (phase aqueuse, in vitro, sang total, plasma, fluide interstitiel, bile, contenu intraluminaire, etc...), la relation suivante donnant le nombre nx de particules par cm3: nX = [X]N ou nx = [X]/N-1 (l'inverse du nombre d'AVOGADRO N-1 égal à O,166x10- 23 devient une constante exprimant en mol.cm-3 la concentra- tion d'un seul atome, d'une seule molécule ou d'une seule particule). Un paramètre physique ou chimique molaire d'une espèce particulaire multiplié par N ou divisé par N-1 donne la valeur de ce paramètre par particule. 2) Délipidation des lipogélosomes (LGS) uni- lamellaires: Dans le cas des lipogélosomes (LGS) unilamel- laires, d'un rayon donné R en cm, on a une phase aqueuse encapsulée gélifiée, polymérisée ou non, dite PP (Polar Phase) se présentant sous la forme d'une sphère de rayon (R-h) cm, h exprimant l'épaisseur en cm de la bicouche lipidique superficielle, dite BIP (Bilayer Interfacial Phase). La sphère aqueuse gélifiée encapsulée est dési- gnée par le symbole GPC (Gelified Polar Core). Les résultats sont obtenues à partir de la méthode de calcul exposée ci-dessus, et montrent les caractéristiques physiques des lipogélosomes (LGS) unila- mellaires de divers diamètres, et des microsphères conformes à l'invention, c'est-à-dire gélifiées et obte- nues par délipidation (soit les GPC). Les symboles sui- * vants sont utilisés: R = rayon donné des lipogélosomes (LGS) en cm, h = épaisseur en cm d'une bicouche lipidique superficielle (BIP) avoisinant 40x10-8cm (soit 40 A ou 4 nm). Une demi-BIP avoisine donc 20x10-8cm. MVLGS = volume molaire en cm3 des lipogélo- somes (LGS) d'un rayon donné R. MVGpC = volume molaire en cm3 du noyau polaire gélifié (GPC) de lipogélosomes (LGS) unilamellaires d'un rayon donné R, soit le volume molaire des microsphères obtenues par la délipidation des lipogélosomes (LGS) uni- lameilaires. MVBIP = volume molaire en cm3 de l'unique BIP superficielle entourant les lipogélosomes (LGS) uni- lamellaires d'un rayon donné R. MVBIP(e) = volume molaire de la monocouche phospholipidique externe de l'unique BIP superficielle entourant les lipogélosomes (LGS) unilamellaires d'un rayon donné R. MVBIp(i) = volume molaire de la monocouche phospholipidique interne de l'unique BIP superficielle entourant les LGS unilamellaires d'un rayon donné R. MSLGS = surface molaire en cm2 de lipogélo- somes (LGS) d'un rayon donné R. MSGpC = surface molaire en cm2 des GPC derayon (R-h)cm, soit la surface molaire des microsphères gélifiées obtenues par délipidation. Quatre exemples sont montrés. a) Lipogélosomes (LGS) unilamellaires de R= x 10-8 cm (soin diamètre de 20 nm): MVLGS = 2,55 x 106 cm3, MVGpC = 0,54 x 106 cm3 (soit 22 M de MVLGS), MVBIP = 1,98 x 106 cm3 (soit 78 % de MVLGS), MVBIP(e) = 1,23 x 106 cm3 (soit 62,2 % de MVBIP), MVBIP(i) = 0,75 x 106 cm3 (soit 37,8 % de MVBIP), MSLGS = 7,57 x 1012 cm2, MSGpC = 2,72 x 1012 cm2. b) Lipogélosomes (LGS) unilamellaires de R= 500 x 10-8 cm (soit diamètre de 100 nm): MVLGS = 315 x 106 cm3, MVGpC = 247 x 106 cm3 (soit 77,9 % de MVLGS), MVBIP = 70 x 106 cm3 (soit 22,1 % de MVLGS), MVBIP(e) = 36 x 106 cm3 (soit 52 % de MVBIP), MVBIP(i) = 33 x 106 cm3 (soit 48 % de MVBIP), MSLGS = 189 x 1012 cm2, MSGpC = 160 x 1012 cm2. c) Llpogélosomes (LGS) unilamellaires de R = 2 500 x 10-8 cm (soit diamètre de 500 nm): MVLGS = 39 413 x 106 cm3, MVGPC = 37 545 x 106 cm3 (soit 95,3 % de MVLGS), MVBIP = 1 862 x 106 cm3 (soit 4,7 % de MVLGS), MVBIP(e) = 939 x 106 cm3 (soit 50,4 % de MVBIP), MVBIP(i! = 923 x 106 cm3 (soit 49,6 % de MVBiP), MSLGS = 4 730 x 1012 cm2, MSGpC = 4 580 x 1012 cm2. d) Lipogélosomes (LGS) unilamellaires de R = 000 x 10-8 cm (soit diamètre de 2 000 nm ou 2 microns): MVLGS = 2 522 432 x 106 cm3, MVGpC = 2 492 284 x 106 cm3 (soit 98,8 % de MVLGS), MVBIP = 30 155 x 106 cm3 (soit 1,2 % de MVLGS), MVBIP(e) = 15 108 x 106 cm3 (soit 50,1 % de MVBIP), MVBIP(i) = 15 047 x 106 cm3 (soit 49,9 % de VBIP), MSLGS = 75 690 x 1012 cm2, MSGpC = 75 076 x 1012 cm2. Par délipidation des petits (SULGS) ou des grands (LULGS) lipogélosomes unilamellaires, l'unique bicouche lipidique superficielle est extraite; seuls les GPC (Gelified Polar Core) subsistent, donnant ainsi des5 gélosomes (GS) homogènes, polymérisés (homogenous polymerisomes) ou non polymérisés, comme précisé ci- dessus. Les figures 4 et 5 montrent en coordonnées log/log, d'une part les variations des MVLGS en cm3 en fonction du rayon R exprimé en cm et d'autre part celles des MVGS en fonction du rayon (R-h) exprimé en cm. Les résultats exprimés en MV (Molar Volume) en cm3.moî1- peuvent s'exprimer en MM (Molar Mass) en g.mol-1 en multipliant le MV par la densité d en g.cm-3. Connaissant la densité dpp de la phase polaire aqueuse encapsulée gélifiée, polymérisée ou non, et celle de la bicouche lipidique superficielle dBIp, il est alors pos- sible de calculer la densité dLGS des lipogélosomes (LGS) ou celle dGS des gélosomes (GS). 3) Délipidation de lipogélosomes (LGS) multi- lamellaires Les lipogélosomes (LGS) multilamellaires (MLGS) consistent en un GPC (Gelified Polar Core) poly- mérisé ou non, d'un rayon RGpC exprimé en cm, sur lequel se superposent concentriquement une première bicouche li- pidique d'épaisseur h avoisinant 40x10-8 cm, puis une couche aqueuse gélifiée, polymérisée ou non, d'épaisseur H de l'ordre de 100 x 10-8 cm, puis d'une deuxième bicouche lipidique, et ainsi de suite. Le symbole n représentant le nombre de bicouches lipidiques, le rayon R d'un lipogélosome multilameilaire (MLGS) est donné par l'équation (3) ci- dessus. Le Tableau II montre comme exemple les varia- cions des MVLGS et les pourcentages volumiques respectifs %MVp de la phase aqueuse encapsulée gélifiée, polyméri- sée ou non, et %MVBIp de la phase lipidique de LGS ayant un RGpC de 210 x 10-8 cm et n bicouches lipidiques, et donc (n-l) couches aqueuses gélifiées, polymérisées ou non, d'épaisseur 100 x 10-8 cm. La figure 6 montre en coordonnées log/log les paramètres précités, pour des lipogélosomes multilamellaires. En pratique, il faut déterminer les paramètres RGpC, n. h et H d'une espèce définie de lipogélosome multilamellaire (MLGS) pour bien préciser leurs caractéristiques physiques. TABLEAU II Nombre de R MVWGS % MVpp % MV p Jill' 10- 8 1 I bcM3. "01- 1 00 m.iiol' l! I 250) 39 59.3 40.7 52 39 3.530 370 63.7 36.8 I ! 4 (,/ 760() 65.2 34.8 X1O I 340 66.2 33.8 6 95ó) 2 160) 67 33.0 / 10'( S, I Z3) 4 690 68 32.0 9 1370) 6 480 68.3 31.7 1I) 1510) 8 680 68.6 41.4 H i 151) 1l 3(X) 68.8 31.2 12 179 13 (.93) 18 100 69.2 30.8 14 - 0'/() 22 40 Conformément à l'invention, lors de la délipi- dation superficielle, seule la bicouche lipidique super- ficielle ou externe d'épaisseur h des lipogélosomes multilamellaires (MLGS) est extraite. On obtient alors des structures hybrides entre lipogélosomes (LGS) et gélosomes (GS) comprenant une couche aqueuse gélifiée d'épaisseur H. polymérisée ou non, et contenant (n-l) bicouches lipidiques entourant le GPC, polymérisé ou non. Le rayon de ces structures hybrides sera égal à RLGS-h, RLGS étant le rayon des lipogélosomes multilamellaires (MLGS) avant délipidation. Conformément à l'invention, lors de la délipi- dation complète, toutes les bicouches lipidiques des lipogélosomes multilamellaires (MLGS) sont extraites, laissant un espace qui sera occupé par la phase polaire aqueuse à l'état liquide lors du partage phase orga- nique/phase aqueuse. On obtient ainsi les structures non homogènes désignées comme gélosomes multicouches (MGS) (multilayered gelosomes), dont la phase aqueuse encapsu- lée gélifiée initiale provenant des lipogélosomes multi- lamellaires (MLGS) est polymérisée (multilayered polyme- risomes) ou non. Le rayon de ces gélosomes (GS) non homo- gènes sera égal RLGS-h, RLGS étant le rayon des lipogélo- somes multilamellaires (MLGS) avant délipidation. Après délipidation complète, le pourcentage molaire de l'espace lipidique ainsi libéré et occupé par la phase aqueuse liquide provenant du partage solvant/eau sera égal au % MVBIP des lipogélosomes multilamellaires (MLGS) non délipidés. EXEMPLE 2: Préparation de microsphères conformes & l'invention. A. Produits: a) phospholipides: La phase lipidique est constituée par des phospholipides de soja déshuilé STERN-France, présenté sous forme sèche et est utilisée à une concentration de 7,5 % en poids/volume. b) Agents gélifiables non polymérisables: - la gélatine, de type B150 Blooms Sanofi- Bioindustries, France; elle a une température de fusion entre 30 et 35'C et est utilisée à une concentration de 7,5 % en poids/volume. - le carraghénane, de Sanofi-Bioindustries, France. Le mélange gélatine/carraghénane à 80/20 (p/p) a une température de fusion de 50'C. Ce mélange est utilisé à une concentration de 7,5 % en poids/volume. La gélatine ou le mélange géla- tine/carraghénane, dans les proportions et concentrations précitées, donne une phase aqueuse gélifiée non polyméri- sée au dessous des températures de fusion respectives de -35'C et 50'C. c) Agent gélifiable polymérisable: - Acrylamide/bis-acrylamide SIGMA. Une phase aqueuse gélifiée polymérisée est obtenue par mélange d'acrylamide/bis-acrylamide SIGMA, de Temed BIO-RAD et de persulfate d'ammonium BIO-RAD, dans des conditions de concentrations appropriées; une concentration de 15 % en poids/volume en acrylamide/bis- acrylamide est notamment utilisée. Le gel de polyacrylamide constitue un exemple non limitatif, sélectionné parmi les composés polyméri- sables. d) Agent cryoprotecteur: - saccharose SIGMA (utilisé à 7, 5 % en poids/volume). B. Protocole opératoire: Les concentrations données sont celles utili- sées dans la phase aqueuse initiale, dans laquelle sont dispersés les phospholipides. Parmi les divers procédés utilisés pour la préparation des liposomes et des lipogélosomes, et adap- tables à l'échelle industrielle, le procédé suivant est préférable, car il comporte une étape d'ultrasonication (adaptée à l'échelle industrielle) permettant d'obtenir une grande prépondérance de lipogélosomes (LGS) d'un dia- mètre de l'ordre de 100 nm, soit un rayon R de 500 x -8 cm. Par diffusion quasi-élastique mesuré par un gra- nulomètre laser de Sema-Tech (Nice), 81 % de la popula- tion en nombre des lipogélosomes (LGS) sont centrés sur un diamètre de 92,7 nm (un rayon R de 413 x 10-8 cm) et 19 % sur un diamètre de 312 nm (un rayon R de 1 560 x -8 cm). Ce procédé comprend: 1) Agitation mécanique lente de phospholipides de soja déshuilé STERN-France à une concentration de 7,5 % (p/v) pendant 3 heures, dispersés dans une phase aqueuse contenant l'agent gélifiant (7,5 % de gélatine ou du mélange gélatine/carraghénane, ou 15 % d'acrylamide/bis-acrylamide sans Temed et persulfate d'ammonium), à l'état liquide. Eventuellement du saccha- rose à 7,5 % (p/v) est ajouté coumme agent cryoprotecteur. a) pour les agents gélifiants non polyméri- sables (gélatine ou mélange gélatine/carraghénase), cette étape d'agitation mécanique s'effectue au dessus du point de fusion de ces agents gélifiants. b) pour le polyacrylamide comme agent géli- fiant polymérisable, cette agitation mécanique s'effectue sans addition de Temed et de persulfate d'ammonium, ce qui empêche le processus de polymérisation. Cette étape d'agitation mécanique produit des liposomes multilamellaires (puisque non encore transfor- més en lipogélosomes) d'un diamètre variant de 297 à 2 084 nm avec un diamètre moyen de 504 nm (soit un rayon R de 2 520 x 10-8 cm). 2) Ultrasonication par un ultrasonicateur SONROREATOR (Undatim Ultrasonics, Louvain-La-Neuve, Belgique) avec sonotrodes en titane adaptés au volume de la suspension de liposomes. La fréquence de 20 KHz est utilisée, la puissance étant adaptée au volume de la sus- pension de liposomes. Pour des volumes de l'ordre de cm3, le temps de sonication se situe entre 3 et 4 minutes, tandis qu'il est élevé à 10 minutes pour des volumes de 700 à 750 cm3. a) Pour les agents gélifiants non polyméri- sables précités, la sonication se fait au dessus du point de fusion de ces agents. b) Pour l'agent gélifiant polymérisable poly- acrylamide, le Temed et le persulfate d'ammonium indui- sant le processus de polymérisation sont ajoutés en début de l'ultrasonication. Une dilution aqueuse immédiate en fin de sonication (1/10 à 1/20e) empêche la polymérisa- tion de la phase aqueuse non encapsulée dans les lipo- somes, tandis que la phase aqueuse encapsulée dans ceux- ci va polymériser. 3) Elimination des composés non encapsulés par ultrafiltracion tangentielle, les liposomes et/ou lipo- gélosomes restant dans le rétentat. Le matériel utilisé provenant de Filtron (France) peut être dimensionné en fonction du volume à traiter. Les membranes utilisées ont un seuil de coupure de 300 kDa ou 1 000 kDa (soit plus correctement de 300 000 ou 1 million de g.mol-1). En l'absence d'une dilution aqueuse, l'ultrafiltration tangentielle des liposomes doit se faire à une température supérieure à la température de fusion des agents gélifiants non polymérisables (gélatine ou mélange gélatone/carraghénane). Une dilution aqueuse appropriée après la sonication peut permettre d'utiliser l'ultrafiltration tangentielle à la température ambiante. Pour augmenter le rendement de la dialyse des composés gélifiés encapsulés non polymérisables, la papaine a été utilisée pour fragmenter la gélatine non encapsulée. Par la suite, l'abaissement de la température va transformer les liposomes en lipogélosomes qui vont se concentrer dans le rétentat. Pour le polyacrylamide comme agent gélifiant polymérisable, une dilution appropriée et une ultrafil- tration suivant immédiatement la sonication élimine l'agent polymérisable non encapsulé, tandis que l'agent polymérisable encapsulé va transformer les liposomes en lipogélosomes. 4) Délipidation superficielle ou complète des lipogélosomes (LGS): Les lipogélosomes (LGS) plus ou moins concen- trés dans le rétentat d'ultrafiltration, selon les condi- tions opératoires choisies, sont superficiellement déli- pidés par un solvant (ou un mélange de solvants) non mis- cible à l'eau. L'heptane a été utilisé comme solvant non miscible à l'eau. Une délipidation complète s'obtient en utilisant un solvant miscible à l'eau, ou de préférence partiellement miscible à l'eau, tel que le n-butanol. Après un partage biphasique phase organique/phase aqueuse, les diverses microsphères précédemment décrites sont récupérées dans la phase polaire aqueuse, soit: petits (SHGS) ou grands (LHGS) gélosomes homogènes non polymérisés, petits (SHGS) ou grands (LHGS) gélosomes homogènes polymérisés (ou homogenous polymerisomes), lipogélosomes multilamellaires (MLGS) entourés par une couche aqueuse gélifiée non polymérisée (structures hybrides entre lipogélosomes (LGS) et gélosomes (GS), lipogélosomes multilamellaires (MLGS) entourés par une couche aqueuse gélifiée polymérisée (structures hybrides entre lipogélosomes (LGS) et gélosomes (GS), et gélosomes multicouches non polymérisés ou polymérisés (multilayered polymerisomes). Par granulométrie laser et microscopie élec- tronique, un contrôle de la diminution des diamètres obtenus par délipidation superficielle ou complète des lipogélosomes (LGS) unilamellaires permet de vérifier que le procédé utilisé s'est effectué correctement. Par ail- leurs, le dosage des lipides dans la phase organique obtenue après le partage solvant(s)/eau permet de véri- fier l'efficacité de la délipidation. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien- nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve- nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente inven- tion. REVENDICATIONS 1') Microsphères, caractérisées en ce qu'elles comprennent un noyau polaire gélifié autour duquel sont, éventuellement, superposées concentriquement et alterna- tivement n bicouches lipidiques ou n couches aqueuses à l'état liquide et n couches polaires gélifiées, n étant un nombre entier et en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues par délipidation de liposomes, du type comportant au moins une bicouche lipidique externe et au moins une phase polaire aqueuse interne contenant une substance gélifiée, dénommés liposomes à noyau polaire gélifié. 2') Microsphères selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles présentent un diamètre compris entre 20 et 600 nm. 3') Microsphères selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisées en ce que la substance gélifiable est sélectionnée parmi des composés géli- fiables, polymérisables ou non, tels que les polysaccha- rides, les polypeptides ou les polyacrylamides. 4') Microsphères selon la revendication 3, caractérisées en ce que la substance gélifiable non poly- mérisable est sélectionnée parmi la gélatine, l'agarose, ou les carraghenanes et la substance gélifiable polyméri- sable est sélectionnée parmi les gels de polyacrylamide. ') Microsphères selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que la délipi- dation est mise en oeuvre par délipidation superficielle des liposomes à noyau polaire gélifié unilamellaires ou multilamellaires par: (1) extraction de la bicouche lipidique super- ficielle desdits liposomes à noyau polaire gélifié uni- lamellaires ou multilamellaires, par un solvant organique ou un mélange de solvants organiques, non miscible à l'eau; (2) partage biphasique de la phase organique et de la phase aqueuse; et (3) séparation de la phase aqueuse contenant les microsphères gélifiées, superficiellement délipidées. 6') Microsphères selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que la délipi- dation est mise en oeuvre par délipidation complète des liposomes à noyau polaire gélifié unilamellaires ou multilamellaires par: (1) extraction lipidique des liposomes à noyau polaire gélifié unilamellaires ou multilamellaires, par un solvant organique ou un mélange de solvants organiques, miscible à l'eau ou partiellement miscible à l'eau;15 (2) partage biphasique de la phase organique et de la phase aqueuse; (3) séparation du/des solvant(s) organique(s) de la phase aqueuse; et (4) séparation des microsphères gélifiées et complètement délipidées. 7') Microsphères selon la revendication 6, caractérisées en ce que, lorsque l'étape (1) est réalisée à l'aide d'une phase organique miscible à l'eau, un sol- vant organique apolaire est ajouté préalablement à l'étape (2). 8 ) Procédé de préparation de microsphères selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, compre- nant un noyau polaire gélifié autour duquel sont, éven- tuellement, superposées concentriquement et alternative- ment n bicouches lipidiques ou n couches aqueuses à l'état liquide et n couches polaires gélifiées, n étant un nombre entier, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend: a) la préparation de liposomes à noyau polaire gélifié, du type comportant n+l bicouches lipi- diques, dont une bicouche lipidique externe et au moins 28 une phase polaire aqueuse interne contenant une substance gélifiée, et (b) la délipidation desdits liposomes à noyau polaire gélifié. 9') Procédé selon la revendication 8, caracté- risé en ce que préalablement à l'étape de délipidation, les liposomes à noyau polaire gélifié sont sélectionnés en fonction de leur diamètre, de préférence par ultraso- nication. 10') Procédé selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape de délipidation, les substances non encapsulées sont éliminées, de préférence par ultrafiltration tangen- tielle. 11') Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 8 A 10, caractérisé en ce que l'étape (b) de délipidation comprend, pour une délipidation superfi- cielle: (1) l'extraction de la bicouche lipidique superficielle desdits liposomes à noyau polaire gélifié unilamellaires ou multilamellaires, par un solvant orga- nique ou un mélange de solvants organiques, non miscible à l'eau; (2) le partage biphasique de la phase orga- nique et de la phase aqueuse; (3) la séparation de la phase aqueuse conte- nant les microsphères gélifiées, superficiellement déli- pidées. 12') Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 8 à 10, caractérisé en ce que l'étape (b) de délipidation comprend, pour une délipidation complète: (1) l'extraction lipidique des liposomes à noyau polaire gélifié unilamellaires ou multilamellaires, par un solvant organique ou un mélange de solvants organiques, miscible à l'eau ou partiellement miscible à l'eau; (2) le partage biphasique de la phase orga- nique et de la phase aqueuse; (3) la séparation du/des solvant(s) orga- nique(s) de la phase aqueuse; et (4) la séparation des microsphères gélifiées et complètement délipidées. 13') Application des microsphères selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comme vecteurs de substances actives. D0 14') Application des microsphères selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comme réactif de diagnostic.