FR 2722199 A1 19960112 FR 9408542 A 19940711 Dérivés de l'acide valproique et leurs applications comme médicaments La présente invention concerne des dérivés de l'acide valproique et leurs applications cornmme médicaments. Il est connu que l'acide valproique (acide 2-propylpentanoïque ou dipropylacétique) et ses sels ainsi que le valpromide (2propylpentanamide ou dipropylacétamide) possèdent des propriétés antiépileptiques. L'acide valproïque et ses sels présentent un spectre antiépileptique large, ils sont utilisés dans le traitement des épilepsies généralisées de type Grand Mal, Petit Mal et myocloniques. Ils sont également utilisés en pédiatrie pour le traitement des convulsions fébriles du nourrisson et pour prévenir les crises chez les enfants à haut risque. Le valpromide par rapport à l'acide valproïque possède des propriétés anticonvulsivantes supérieures mais sa toxicité générale et sa neurotoxicité sont plus élevées. Pour ces raisons il est prescrit dans le cas d'épilepsies rebelles mais il est déconseillé en pédiatrie. Le traitement des épilepsies est obligatoirement chronique et les deux molécules utilisées actuellement en thérapeutique, la Dépakine) (acide valproïque et son sel sodique) et la Dépamide (valpromide), nécessitent la prise de plusieurs doses quotidiennes; ceci entraîne, compte-tenu de leur courte demi-vie plasmatique, une fluctuation importante de leur concentration sanguine entre deux prises. Les conséquences de cette fluctuation sont d'une part une moindre protection après quelques heures et d'autre part un risque de surdosage, juste après la prise, favorisant les effets secondaires. La Demanderesse s'est fixée comme but de synthétiser des composés chimiques contenant dans leur structure au moins un radical valproyle lié, par une liaison covalente, à un composé porteur atoxique de façon à ce que ces composés, in-vivo, présentent une activité biologique après libération ou non d'acide valpro'que avec cornme résultat une durée de demi-vie plus longue que celle des valproates salins ou des dérivés amides ci-dessus et permettant une prolongation de l'effet antiépileptique et une moindre variation des taux sériques réduisant ainsi les effets secondaires. Ce but est atteint par les composés selon l'invention de formule W-(O-COCH(-CH2-CH2-CH3)2)n dans laquelle W représente un radical d'un produit ayant au moins un groupe OH estérifiable par l'acide valproique ou ses dérivés ou encore, une partie labile Y pouvant être substituée par le groupement valproate, n pouvant varier de I au nombre total des groupes OH estérifiables ou Y substituables dans ledit produit. Dans le cadre de la présente invention le produit, de radical W, joue le rôle d'un transporteur d'acide valproïque et il est particulièrement avantageux de le choisir parmi des produits les moins toxiques possibles vis-à-vis des organismes vivants, dans la mesure o ce produit est libéré dans l'organisme et doit être par conséquent éliminé ou métabolisé. D'une manière préférée les composes ester ou polyester de la présente invention auront un radical W ayant pour précurseur W-OH qui peut être un monosaccharide, un polysaccharide - BAD ORIGINAL ou encore un itol, fonctionnalisé ou non, protégé ou non, et de préférence choisi parmi le D-glucose ou ses dérivés 1,2:5,6-diacétoneglucose ou 1,2:3,5diacétoncglucose ou 1,2- monoacétoneglucose, le D-galactose ou le diacétonegalactose, le Dfructose ou ses dérivés 2,3:4,5-diacétonefructose ou 1,2:4,5-diacétonefructose ou 1,2monoacétonefructose ou le 2,3- monoacétonefructose, le D-mannose ou ses dérivés 2,3:5,6- diacétonemannose ou 2,3- monoacétonemannose, le D-allose ou ses dérivés 1,2:5,6-diacétoneallose ou 1,2- monoacétoneallose, le D-xylose ou le 1,2-monoacétonexylose, le xylitol ou ses dérivés 2,3:4,5- diacétonexylitol ou 2,3-monoacétonexylitol ou 4,5-monoacétonexylitol ou le 2,4:3,5- diméthylènexylitol ou encore parmi les disaccharides et polysaccharides pouvant résulter de l'association de deux ou plusieurs des monosaccharides préalablement cités. Sont exclus comme précurseur le glycérol et le solkétal. Le ou les groupements valproyle sont greffés sur W soit par estérification d'un ou de plusieurs OH libres de la molécule W-OH ou par substitution d'un ou de plusieurs groupements Y portés par W selon les méthodes générales de la littérature. Les composés selon la présente invention sont prévus pour une utilisation eomme médicament seul ou en association avec d'autres composés, destinés comme l'acide valproique et ses sels ou ses amides, par exemple, à une utilisation relaxante et/ou hypnotique et/ou anticonvulsivante et/ou antiépileptique. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. Il doit être bien entendu, toutefois, que cette description et les exemples qu'elle contient sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple n l. Préparation du chlorure de l'acide 2-propylpentanoîque (chlorure de valproyle). Dans un flacon tricol de 500 mL, à température armbiante, on introduit 30 g (2,5.10-1 mol) de chlorure de thionyle puis, goutte à goutte, 30 g (2,1.10-1 mol) d'acide 2- propylpentanoique. A la fin de l'addition, le mélange est porté au reflux. Après 30 minutes, le contrôle CPV (colonne OV17 à 120 C longueur 75 cm) montre la disparition totale de l'acide valpr-oïque. La distillation du brut permet d'éliminer successivement l'excès de SOC12, ainsi que HCI et SOi formés et de recueillir le chlorure de valproyle (33,8 g rendement: 98%). Exemple n 2. Préparation du 3-0-(2'-propylpentanoyl)-1,2:5,6-di-Oisopropylidène- a-D-glucofuranose (valproare de diacéroneglucose). Dans un flacon tricot, on place 32 g (1,2.10-1 mol) de 1,2:5,6-di-Oisopropylidène-act-D- glucofuranose préparé par ailleurs selon les procédés connus; on introduit ensuite 200 mL de chloroforme, 15 mL de triéthylamrnine (TEA), puis goutte à goutte, 22 g (1,4.10-1 mol) de chlorure de valproyle dissous au préalable dans 100 mrnL de chloroforme. On chauffe l'ensemble sous agitation jusqu'à reflux pendant 12h. 2BAD ORIGINAL BAD ORIGINAL Après retour du mélange réactionnel à la température ambiante, on additionne 250 mi. d'une solution aqueuse saturée de NaHCO3. La phase organique est décantée, lavée successivement par 2 x 150 mL d'eau, séchée sur Na2SO4 anhydre, puis évaporée sous pression réduite. On obtient 54 g de brut réactionnel, que l'on purifie par chromatographie moyenne pression sur gel de silice (Kielselgel 60, 500 mL). On isole successivement: - après passage de 800 mL d'hexane, 0,9 g (7.10-3 mol) d'acide valproique; - après passage de 1,5 L de mélange hexane-éther éthylique, 93:7, (v/v), 30 g (rendement: 63%) de valproate de diacétoneglucose qui se présente sous la forme d'un liquide visqueux jaune pâle. [lt]02 = -29,4 (c = 2,1; CHC13) Formule brute: C20H3407 Analyse élémentaire: Calculée: C: 62,20%; H 8,90% Trouvée: C: 62,40%; H: 8,90% Les spectres RMN IH et 13C sont donnés dans les tableaux A et B. Exemple n 3. Préparation du 6-0-(2'-propylpentanoyl)-1,2;3,4-di-Oisopropylidêne- a-D-galacropyranose (valproate de diacétonegalacrose). Ce composé est préparé à partir du 1,2:3,4-di-O-isopropylidène-rx-Dgalactopyranose selon la méthode de l'exemple 2 avec un rendement de 74,8% après purification par chromatographie moyenne pression sur gel de silice [éluant: hexane-éther éthylique 93:7 (v/v)]. [X22 [ai] = -26,3o (c = 1,9; CHC13) Formule brute: C20H3407 Analyse élémentaire: Calculée: C: 62,20%; H: 8,90% Trouvée: C: 62,10%; H: 8,90% Les spectres RMIN H et 13C sont donnés dans les tableaux C et D. Exemple n 4. Préparation du 1-O-(2'-propylpentanoyl)-2,3:4,5-di-Oisopropylidene- 13-D-frucropyranose (valproate de diacétonefrucrose). - Ce composé est préparé à partir du 2,3:4,5-di-O-isopropylidène-[-Dfructopyranose selon la méthode de l'exemple 2 avec un rendement de 56, 1% après purification par chromatographie moyenne pression sur gel de silice [éluant: hexane-éther éthylique 93:7 (v/v)]. [C,22 [a]2 = -21,1 (c = 2,1; CHCI3) Formule brute: C20H3407 Analyse élémentaire: Calculée: C: 62,20%; H: 8,90% Trouvée: C: 62,40%; H: 9,20% Les spectres R.NIN IH et 13C sont donnés dans les tableaux E et F. BAD ORIGINAL Exemple n 05. Préparation du 1-0-(2'-propylpentanoyl)-2,3:4,5-di-0isopropylidène xylitol (valproaze de diacéronexylitol). Ce composé est préparé à partir du 2,3:4,5-di-O-isopropylidènexylitol selon la méthode de l'exemple 2 avec un rendement de 66,7% après purification par chromatographie moyenne pression sur gel de silice [éluant: hexane-éther éthylique 93:7 (v/v)]. [ = -0,6 (c = 2,08; CHC13) Formule brute: C19H340 Analyse élémentaire: Calculée: C: 63,70%; H: 9,60% Trouvée: C: 63,60%; H: 9,70% Les spectres RMN' IH et 13C sont donnés dans les tableaux G et H. Exemple n 6. Préparation des 1-0-(2' -propylpentanoyl)-2,3:5,6-di-O-isopropylidène -ca-D-mannofuranoside (valproate de a-diacétonemannoside) et du 1-0-(2'propylpentanoyl)- 2,3:5,6-di-0-isopropylidgne-fJ-D-mannofuranoside (vaiproate de 3diacétonemannoside). Ces composés sont préparés selon la méthode de l'exemple 2, à partir d'un mélange de 2,3:5,6-di-O-isopropylidène-ct-D-mannofuranose et de 2,3:5,6-di-Oisopropylidène-5-D- mannofuranose, dans les proportions ca/f = 75/25, préparé par ailleurs selon les procédés connus. Après purification du brut par chromatographie moyenne pression, sur gel de silice (Kielselgel 60), on isole successivement: - après élution avec le mélange hexane-éther éthylique 93:7 (v/v), le valproate de ct- diacétonemannose, avec un rendement de 69,1% par rapport à l'cadiacétonemannose initial. [OEID = -26,3 (c 1,59; CHCI3) Formule brute: C20H3407 Analyse élémentaire: Calculée: C: 62,20%; H: 8,90% Trouvée: C: 63,20%; H: 9,30% - après élurion avec le mélange hexane-éther éthylique, 88:12 (v/v), le valproate de I- diacétonemannoside avec un rendement de 80,6% par rapport au [3diacétonemannose initial. Analyse élémentaire: Calculée: C: 62,20%; H: 8,90% - Trouvée: C 62,10%; H 9,10% Les spectres RMN IH et 13C sont donnés dans les tableaux J, K, L et M. Exemple n 7. Préparation du 1-0-(2' -propylpentanoyl)-2,4:3,5-di-O-méthylène xylitol (valproate de dimethylènexylitol). Dans un flacon tricol de 500 ml- contenant 32 g (1,8.10-1 mol) de diméthylènexylitol dissous dans 200 mL de pyridine, on introduit, goutte à goutte, à température ambiante 38 g (2,4.10-1 mol) de chlorure de valproyle dans 100 mL de pyridine, puis on porte le mélange au reflux. Après 4h30 d'agitation, on laisse le mélange revenir à température ambiante puis on additionne 500 mL d'eau et 500 mL d'un mélange hexane-éther éthylique, 50:50 (v/v). BAD ORIGINAL La phase organique est décantée, lavée successivement par 200 mL d'une solution aqueuse de HC1 (0,5 N) et deux fois 200 mL d'eau, séchée sur Na2SO4 anhydre, filtrée puis évaporée sous pression réduite. Le résidu (72 g) est repris par 500 mL d'hexane puis porté au reflux sous agitation. Le diméthylènexylitol résiduel est filtré à chaud et le filtrat placé à O C pendant 12 heures. Après filtration on obtient 40 g de cristaux blancs que l'on recristallise dans 300 miL d'hexane. On isole 37 g (rendement: 62,1%) de valproate de diméthylènexylitol, qui se présente sous forme de cristaux blancs, de température de fusion: F = 86, 5e C. [c]22 = -0,4 (c = 2,1, CHCI3). Analyse élémentaire: Calculée: C: 59,60%; H: 8,70% Trouvée: C: 59,60%; H: 8,80% Les spectres R..MN IH et 13C sont donnés dans les tableaux N et P. Les composés monoacétonides ou non cétalisés contenant dans leur structure au moins un radical valproyle, peuvent être préparés par déprotecrion partielle ou totale des composés diacétonides correspondants, - soit en phase homogène (solvant organique - H30+ ou alcanol en milieu acide), - soit en phase hétérogène (Résine acide - solvant organique - H20 ou résine acide - alcanol). Exemple n 8. Préparation du 3-0-(2'-propylpenranoyl)-1,2-0isopropylidène-a-D- glucofuranose (3-valproate de monoacéroneglucose) et du 3-O-(2'propylpentanoyl)-D- glucofuranose (valproate de glucose). Les composés sont préparés par passage de 26 g de 3-O-(2'-propylpentanoyl)-l,2: 5,6- di-O-isopropylidène-x-D-glucofuranose en solution à 10% (m/v) dans le solvant dioxane - H20 :5 (v/v) sur une colonne de résine Amberlist 15 H* wet ( 250 mL), maintenu à 70 C avec un débit de 10 ml/imn. Après un passage d'un volume de solvant suplémentaire de 750 mL, l'éluant est évaporé sous pression réduite. On obtient 25 g de brut réactionnel, que l'on purifie par chromatographie moyenne pression, sur gel de silice. - On obtient successivement: - après passage de 400 niL du mélange hexane-éther éthylique, 80:20 (v/v), 0,95 g de valproate de diacétoneglucose résiduel; -après passage de 400 mL d'éther éthylique, 10 g de 3-valproate de monoacétoneglucose, qui se présente sous la forme d'un liquide visqueux jaune pâle. [aC]D2 = 9,00 (c = 1,5; CHCI3) Formule brute: C17H3007 Analyse élémentaire: Calculée C: 58,90%; H: 8,70% Trouvée: C: 59,00%; H: 8, 90% BAD ORIGINAL - après passage de 400 rnL de mélange THF-éther éthylique 50:50 (v/v), 11 g de 3- valproate de glucose qui se présente sous la forme de cristaux blancs, de tempéranture de fusion F = 74,6 C. []D2 = +55,1 (c = 1,90; CHCI3) Formule brute: C 14H2607 Analyse élémentaire: Calculée: C 54,90%; H: 8,60% Trouvée: C: 53, 10%; H: 8,60% La proportion de 3-valproate de glucose peut être augmentée, lorsque l'on opére l'hydrolyse acide ci-dessus en utilisant un débit d'éluant plus faible afin d'augmenter le temps de contact. De même, le composé monoacétonide peut être obtenu de manière plus sélective, lorsque l'on opére l'hydrolyse acide, à une température inférieure ou avec un débit d'éluant plus élevé, afin de diminuer le temps de contact. Les spectres R-M.N 1H et 13C sont donnés dans les tableaux Q-T. Exemple n 9. Préparation du 6-0-(2'-propylpentanoyl)-a-'D galactopyranose (valproate de galactose). Dans un réacteur thermostaté à 45' C, on place 80 mL de dioxane, 20 mL de solution aqueuse de HCI concentré à 37% et 10 g (2,6.10-2 mol) de valproate de diacétonegalactose. Après une heure d'agitation, le mélange est refroidi puis, l'acide est neutralisé par addition de 20 g de Na.HCO3 en poudre et de 20 mL d'eau. La phase organique est décantée et la phase aqueuse réextraite par 50 mnL de dioxane. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur Na2SO4 anhydre, filtrées puis évaporées sous pression réduite. Le résidu est repris par 100 mL de THF puis filtré et le filtrat évaporé sous pression réduite. On obtient 10 g de brut réactionnel que l'on purifie par chromatographie liquide moyenne pression sur gel de silice. On isole successivement: -après passage de 300 mL du mélange hexane- éther éthylique, 80:20 (v/v), I g (2,6.10-3 mol) de valproate de diacéronegalactose résiduel. - après passage de 300 mL du mélange éther éthylique -THF, 60:40 (v/v), 6,2 g (rendement: 78,3%) de valproate de galactose. [(c]22 = +68,20 (c = 1,69; CHCI3) Formule brute: C14H2607 Analyse élémentaire: Calculée: C: 54,90%; H: 8,60% Trouvée: C: 52,20%; H: 8,60% Le spectre RatN 13C est donné dans le tableau U. BAD ORIGINAL BAD ORIGINAL Exemple n 10. Préparation du 1-0-(2' -propylpentanoyl)-2,3-Oisopropylid}ne-[-D- frucropyranose (valproate de monoacétonefrucrose). Dans un réacteur thermostaté à 68 C, on place 25 nIL de résine acide Amberlist 15H+ wet et 4,5 g (1,16.10-2 mol) de valproate de diacétonefructose en solution dans 45 mnL de mélange éthanol-eau, 95:5 (v/v). Après 6 heures d'agitation, le mélange est refroidi puis filtré. Le filtrat est évaporé sous pression réduite et le résidu obtenu repris par 100 mL d'éther éthylique. La solution est séchée sur Na2SO4 anhydre, filtrée puis évaporée sous pression réduite. On obtient 4,95 g de brut que l'on purifie par chromatographie moyenne pression sur gel de silice. On isole successivement: - après passage de 500 mL du mélange hexane-éther éthylique, 90: 10 (v/v), 18 g de valproate de diacétonefructose résiduel. - après passage de 500 mL d'éther éthylique, 3,12 g (rendement 69,2%) de valproate de monoacétonefructose qui se présente sous la forme d'un liquide visqueux jaune ut:s pâle. [o[]22 = 7,410 (c = 2,8, CHCI3) Formule brute: C17H3007 Analyse élémentaire: Calculée: C: 58,90%; H: 8,70% Trouvée C: 61,10%; H 9, 00% Le spectre RMN 13C est donné dans le tableau V. Exemple n'Il. Préparation du l-0-(2'-propylpentanoyl)-2,3-O-isopropylidène xyiitol (valproate de monoacétonexylito!) et du I-O-(2'-propylpentanoyl)- xylitol (valproate de xylitol). Dans un réacteur thermostaié à 70 C, contenant 63 mL du mélange dioxaneeau, 80:20 (v/v), on additionne 35 mL de résine acide (AmberList 15H+). Après 2h de chauffage sous agitatrion, le mélange est refroidi, filtré puis le filtrat est évaporé sous pression réduite. Le résidu est repris par de l'éther éthylique, séché sur Na2SO4 anlydre puis le solvant est évaporé sous pression réduite. Le brut (10g) est purifié par chrornatographie moyenne pression sur gel de silice (250 mL). On isole successivement: - après passage de 400 mL du mélange hexane-éther éthylique, 80:20 (v/v), 0,3 g de valproate de diacétonexylitol résiduel; après passage de 400 mL d'éther éthylique 3,4 g de valproate de monoacétonexylitol (rendement = 38,3%). [(X] = 0,01 (c = 1,90, CHCi3) Formule brute: C16H3006 Analyse élémentaire: Calculée: C: 60,40%; H: 9,50% Trouvée: C 59,50%; H:9,70% "7B O BAD ORIGINAL - après passage de 400 mL du mélange THF-éther éthylique, 50:50 (v/v), 4, 6 g (rendement 59,2%) de valproate de xylitol. [ac]25 = -0,8 (c = 1,90, CHC13) Formule brute: C13H2606 Analyse élémentaire: Calculée: C 56,10%; H: 9,40%o Trouvée C 55,60%; H: 9,50% Les spectre RMNL 13C sont donnés dans les tableaux W et X. Exemple n 12. Préparanion du 1-0-(2'-propylpentanoyl)-2,3-0isopropylidéne-a-D- mannofuranoside (valproare de a-monoacétonemannoside). Dans un réacteur thermostaté à 68 C, on place 35 mL de résine acide Amberlist 15H+ wet et 8 g (2,1. 10-2 mol) de valproate de ctdiacétonemannoside en solution dans 63 mL de mélange dioxane-eau, 80: 20, v/v. Après 3h30 d'agitation, le mélange est refroidi puis filtré. Le filtrat est évaporé sous pression réduite et le résidu obtenu repris par 200 mnL d'éther éthylique. La solution est séchée sur Na2SO4 anhydre, filtrée puis évaporée sous pression réduite. Aux 7 g de brut obtenu, sont ajoutés 100 mL d'hexane, le mélange est porté au reflux puis filtré. Le filtrat est écarté et la phase solide contenant le produit est lavée par 250 mnL d'hexane. Le résidu est dissous dans 100 mL d'éther éthylique, filtré puis évaporé sous pression réduite. On isole ainsi 3,95 g (rendement: 55,1%) de valproate de camonoacétonemannoside sous la forme de cristaux blancs de point de fusion F = 92,4 C. []2 = 51,60 (c = 2,2, CHC13). Formule brute: C 17H3007 Analyse élémentaire: Calculée: C: 58,90%; H: 8,70% Trouvée C: 58,60% H: 8,70% Les spectres RMNLN 1H et 13C sont donnés dans les tableaux Y et Z. - Exemple n '13. Prépararion du 6-0-(2'-propylpentanoyl)-3-O-ocryl-1, 2-O- isopropylidine-ca-D-glucofuranose ( 6-valproate de 3-0O-ocrylmonoacéroneglucose). Dans un ballon contenant 100 mnL de toluène, on ajoute 6,8g (18.10-2 mol) de chlorure de valproyle et 4 mL (2,8. 10-2 mol) de triéthylamine à 40 C. Après 22 heures de réaction, le mélange réactionnel est neutralise avec une solution aqueuse saturée de NH4C1 puis extrait 2 fois avec 40 mL de toluène. La phase organique est évaporée sous pression réduite. Le brut (9 g) est chromatographié sur gel de silice avec un mélange hexane-acétone, 80:20 (v/v). On isole ainsi ,4 g (rendement: 65 %) de 6valproate de 3-0-octyl-monoacétoneglucose. [c]iD2= -31,2 (c = 1,4, CHCI3). Formule brute C25H4607 BAD ORIGINAL Analyse élémentaire: Calculée: C: 65,50%; H: 10,10% Trouvée: C: 61,00%; H: 9,80% Exemple n 14. Préparation du 6-O-(3'-désoxy-6'-O-valproyl-l',2'-O- isopropylidène-cz-D-glucofuranose-3'-yl)-3-0-oczyl-1,20-isopropylidÀne-aD-glucofuranose. Dans un ballon contenant 100 mL de toluène, on ajoute 10,0g (1,8.10-1 mol) de 6-0-(3'- désoxy- 1,2-O-isopropylidène-a-D-glucofuranose-3'-yl)-3-O-octyl- 1,2-Oisopropylidène-a-D- glucofuranose, 3,6 g (2.10-2 mol) de chlorure de valproyle et 3,9 mL (2, 8.10-2 mol) de triéthytamine que l'on porte à 40 C. Après 22 heures de réaction, on additionne 50 mL d'une solution de NH4CI puis on extrait avec 2 fois 40 mL de toluène. La phase organique est séchée avec du Na2SO4 anhydre puis évaporée sous pression réduite. Le brut (11 g) est chromatographié sur gel de silice avec un mélange hexane-acétone, 80:20 (v/v). On isole ainsi 7,6 g (rendement: 62%) de 6-O-(3'-désoxy-6'-O-valproyl-l,2-Oisopropylidène-ac-D- glucofuranose-3'-yl)-3-O-octyl- I,2-O-isopropylidène-ca-D-glucofuranose. F= 37-380C [a]2 = -31,2 (c = 1,4, CHC13). Tableaux A et B: Spectre RMN tH et 13C du VALPROATE DE DLACETONEGLUCOSE HI 5,59 d J1.2=3,6 Hz Cl 104,8 ppm H2 4,15 d J2.3-0 Hz C2 83,1 ppm H3 5,03 d J13,4=1,9 Hz C3 75,2 ppm H4 3, 91 dd J4.5=2,8 Hz C4 79,9 ppm H5 3,91 m J5.6=3.6 Hz C5 71,9 ppm H6 3,72 dd 16.6-=8.5 Hz C6 67,3 ppm H6' 3,85 dd J5.6-5.6 Hz CH3 26,4 ppm CH3 1.25 s - CH3 26,4 ppm CH3 1,13 s - CH3 25,9 ppm CH3 1,05 s - CH3 24,8 ppm CH3 1,03 s C- iso 112,9 ppm Hl" 2,13 m C iso 109,0 ppm H2'-et H2 1,33 m Cl I 45,0 ppm H3 1,13 m C2' 34,3 ppm H3' 1.13 m C2"' 34,3 ppm H4 et H4" 0.64 m J = 6,5 Hz C3 20,2 ppm C3" 20,1 ppm C4 13,6 ppm C4" 13,6 ppm COO 174.6 ppm - 10 - Tableaux C et D: spectres RMN 1H et 13C du VALPROATE DE DIACETONEGALACTOSE Hl 5,25 d J1.2=5,0O Hz C1 95.9 ppm H2 4,04 dd J2,3=2.4 Hz C2 70,1 ppm H3 4,33 dd J3.4=7,9 Hz C3 70,4 ppm H4 3,95 dd J4 5=1,6 Hz C4 70,7 ppm H5 3.74 m J5,6=7.8 Hz C5 65,8 ppm H6 3.84 dd J6,6-=11,4 Hz C6 62,6 ppm H6' 4,11 dd J5.6=4,4 Hz CH3 25,5 ppmn CH3 1, 48 s - CH3 25,5 ppm CH3 1,37 s - CH3 24,5 ppm CH3 1,31 s - CH3 24,0 ppm CH3 1,31 s - C iso 109,1 ppm H"- 2,13 m C iso 108,2 ppm H2z et H2" 1.31 m.C " 44,8 ppm HY 1.13 m __C2 34,3 ppm H3" 1,13 m C2" 34,1 ppm H4a et H4 0.61 m J = 7,2 Hz C3 20,1 ppm C3 " 20,1 pprn C4' 13,6 ppm C4-* 13,6 ppm COC 174,9 ppm Tableaux E et F: spectres RIMN IH et 13C du VALPROATE DE DIACETONEFRUCTOSE Hi 4,00 d |1J.-11,5 Hz CI 64,8 ppm Hl 3,81 d C2 101,2 ppm H3 3,96 d 13,4=7.8 Hz C3 70,5 ppm H4 4,33 dd J4.5=2,6 Hz C4 69,7 ppm H5 4,01 m J5.6=1.9 Hz C5 70,1 ppm H6 3.64 dd J6.6-=12,9 Hz C6 60,9 ppm H6 3,47 d J5.6T'0 Hz CH3 26,1 ppm CH3 1.27 s CH3 25,5 pprn CH3 1.19 s CH3 25,0 ppm CH3 1,15 s CH3 23,7 ppm CH3 1, 06 C iso 108,8 ppm Hl 2,13 m C iso 108,3 ppm H2 et H2" 1.33 m C1' 44,8 ppm H3y 1,30 m C2' 34,2 ppm H3 1.06 m C2" 34;0 ppm H4 et H4- 0.62 td I = 7.2 Hz C3' 20,2 ppm C3" 20,2 ppm C4' 13,6 ppm C4" 13,6 ppm COO 174,5 ppm Tableaux G et H: spectres RMNN 1H ct 13C duVALPROATE DE DIACEIONEXYIJIDL HI 4,15 dd J.1=l13.5 Hz C1 63,5 ppm Hl 4,03 dd J'1,2=5,1 Hz C2 75,2 ppm H2 4,08 m 11J,2=5,8 Hz C3 77,4 ppm H3 3,77 dd J2,3=7,2 Hz C4 74,9 ppm H4 4,09 dd 13.4--=4,4 Hz C 65,4 ppmn H5 3,94 dd J4.5=6.8 Hz CH3 26,8 ppm H5 3,75 dd J5,-8.1 Hz CH3 26,7 ppm _ _ _ _ J4,5=8.0 HzCH3 25,9 ppm CH3 1,30 s CH31,30sCH3 25,2 ppm CH3 1.30 s C io 1 ppm À ' C is 1 098 ppm CH3 1,30 s - CH31,25 S-C iso 109,6 ppm CH3 1,25 s - 2Ct" 145,0 ppm H1I 2,29 m3 C2' 34.4 pi H2 et H2.1.48 m = 7,8 Hz C2 34 pp C2" 34,3 ppm H3' I 1,30 m C3' 20,4 ppmn Hy. 1.16 m C3. 20,4 ppm H4' et H40,77 m J = 7, 3 Hz C4' 13,8 ppm C4O 13,8 ppmn COO 175,9 ppm - '3 - Tableaux J et K: spectres RMN IH et 13C du VALPROATE DE fDIACETONEMANNOSIDE Ht 5,30 s J1,2= 0 Hz C1 99,9 ppn H2 4,43 d J2,3=5,8 Hz C2 84,6 ppm H3 4,59 dd J3,4=3,5 Hz C3 79,1 ppm H4 3,69 dd J4,5=7,7 Hz C4 81,9 ppm H5 4,13 m J5,6--4,4 Hz C5 72,4 ppm H6 3,70 dd 16,6=8,9 Hz C6 66,6 ppm H6 3,83 dd J5,6'=6,3 Hz CH3 26,5 ppm CH3 1,22 s - CH3 25,6 ppm CH3 1,11 s - CH3 24,8 ppm CH3 1,11 s - CH3 24,4 ppm CH3 1,08 s - C iso 112,9 ppm H1" 2,1 m C iso 109,0 ppm H2 et H2" C1 44,9 ppm H3' 1,04-1,31 C2' 34,2 ppm H3" C2" 34,0 ppm H4 et H4- 0,63 J = 7,2 Hz C3' 20,2 ppm C3" 20,2 ppm C4' 13,6 ppn C4" 13,6 ppm COO 174,4 ppm -14 - Tableaux L et M: spectres RMN IH ct 13C du VALPROATE DE a-DIACETONEMANNOSIDE H1 5,70 s JI1.2= 3,4 Hz C1 96,6 ppm H2 4,73 d J2,3=6,5 Hz C2 79,0 ppm H3 4,70 dd J3,4=3,4 Hz C3 79,4 ppm H4 3,66 dd J4,5=8,0 Hz C4 78,3 ppm H5 4,33 m J5,6=5,4 Hz C5 73,2 ppm H6, AAX J6.6-=5,3 Hz C6 66,8 ppm H6 ' 3,96 J5,6=5,3 Hz CH3 26,9 ppm CH3 1,43 s - CH3 25,8 ppm CH3 1,32 s - CH3 25,4 ppm CH3 1,26 s - CH3 25,3 ppm CH3 1,26 s - C iso 113,9 ppm Hl I 2,32 m C iso 1090 ppm H2' et H2CI- 45,1 ppm H3. 1,51-1,18 C2' 34, 4 ppm H3" C2- 34,2 ppm H4' et H4' 0,78 J = 6,83 Hz C3' 20,4 ppm C3" 20,4 ppm C4' 13,9 ppm C4" 13,9 ppmn COO 174,0 ppmin w - 1 Tableaux N et P: spectres RMN 1H et 13C du VALPROATE DE DIMETHYLENEXYLrOL H1 4,29 dcid J1,1-=13.5 Hz Cl 62,3 ppm HI' 4,17 dd J1'.2=5,1 Hz C2, 702 ppm H2 3.48 m J1.2=5,8 Hz C3 75,7 ppm H3 3,58 dcid J2,3=7,2 Hz C4 69,8 ppm H4 3, 81 dd J3,4=4,4 Hz C5 69,2 ppm H5 4,10 dd J4.5--=6.8 Hz CH2 92,9 ppm H5' 3,76 dd J5.5=8,1 Hz CH2 92,7 ppm J4.5'=8,0 Hz CI' 44,9 ppm H (CH2) 5,16 s JH.H=6,2-6A,4 Hz C 34,4 pp C2' 34,4 ppm H (CH2) 5,08 s JHH=6,2-6,4 Hz C2- 34,3 ppm H (CH2) 4,71 s JH.H--6,2-6,4 Hz C 20 ppm Cy 20,3 ppm H (CH2) 4,65 s JHH=6,2-6,4 Hz Cy. 20,3 ppm Hl 2, 33 m c4' 13,8 ppm H2' et H2" 1, 52 m J = 7,8 Hz 138 pp C4"- 13,8 ppm H3. 1,37 m COO 176,0 ppm H3" 1,20 m H4- et H4 0,82 m J = 7,2 Hz - 16 - Tableaux Q et R: spectres RMN IH1 et 13C du VALPROATE DE MONOACETONEGLUCOSE H1 5,77 d J1.2=3,7 Hz CI 104,8 ppm H2 4,37 d J2.3-0 Hz C2 83,1 ppm H3 5,17 d J3.4=2,5 Hz C3 76, 1 ppm H4 4,09 dd J45.3=8,65 Hz C4 78,9 ppm H5 non J5.6= non C5 68,3 ppm déterniné C6 63,9 ppm H6 3,75-3, 25 J6,6--déter CH3 26,5 ppm H6. 15.6=miné H6 - Js6'mine CH3 26,1 ppm CH3 1,41 C iso 112,3 ppm CH3 1,14 1C 1-" 45,1 ppm Hr' 2329 C2' 34,4 ppm H2' et H2' 1.47 H3....28 C2" 34,2 ppm H3' 1,28 C3 " 20.5 ppm H 3' 1,28 __ _ _ _ _ _ _C3" 20,5pprn H4' et H4" 0,79 J = 7,2 Hz C4' 13,9 ppm C4" 13.9 ppm COO 176,4 ppm Tableaux S et T: spectres RMN 13C DU VALPROATE DE GLUCOSE forne a forme CI 93,9 ppm Ci 98,7 ppm C2 72,4 ppm C2 74,6 ppmnn C3 76,7 ppm C3 78,5 ppm C4 69,9 ppm C4 69,7 ppm C5 73,5 ppm C5 78,2 ppm C6 62,4 ppm C6 623 ppmn C 1 " 46,0 ppm CI " 46,0 ppm C2' 35,1 ppm C2 35,1 pprn C2" 34,9 ppm C2- 34,9 ppm C3' 20,7 ppm C3' 20,7 ppmn C3" 20,7 ppm C3. 20,7 ppm C4' 14,2 ppm C4' 14,2 ppm C4" 14,2 ppm C4 " 14,2 ppm COO 176,3 ppm COO 176,3 ppm - 18 - Tableau U: spectre RMN 13C du VALPROATE DE GALACTOSE (FORME PYRANOSE a) Ci 93,5 ppm C2 69,9 ppm C3 70,0 ppm C4 68,3 ppm C5 70,3 ppm C6 64,0 ppm C 1" 44,6 ppm C2' 33,9 ppm C2" 33,9 ppm C3' 19,9 ppm C3" 19,9 ppm C4' 13,8 ppm C4" 13,8 ppm COO 175,4 ppm - 19- Tableau V: spectrce R.MN 13C VALPROATE DE MONOACETONEFRUCTOSE C I 62,2 ppm C2 101,0 ppm C3 76,4 ppm C4 66,8 ppm C5 63,8 ppm C6 62.8 ppm CH3 27,4 ppm CH3 25,8 ppm C iso 1103j ppm CI" 145,1ppm C2' 34,3 ppm C2' 34,3 ppm C3 20.4 ppm C3" 20,4 ppm C4' 13.8 ppm C4 " 13,86 ppm COO 176.4 ppm - 2c - Tableau W: spectre R.-Q 13C du VALPROATE DE MONOACETONEXVLITOL CI 63,7 ppm C2 74,9 ppm C3 77.6 ppm C4 70.4 ppm C5 63,3 ppm C 1" 44,8 ppm C2 34.1 ppm C2. 34,1 ppm C3 20,1 ppm C3y 20,1 ppm C4' 13,5 ppm C4" 13,5 ppm COO 176,1 ppm 2' - Tableau X: spectre RMN 13C du VALPROATE DE XYLTOL C I 65,2 ppm C2 70,4 ppm C3 71,7 ppm C4 69,4 ppm C5 62,5 ppm C 1" x4.3 ppm C2' 33,9 ppm C2"; 33,9 ppm C3 19,7 ppm C3. 19,7 ppm C4 13,6 ppm C4" 13,6 ppm COO 175,3 ppm - 22 - Tableaux Y et Z: spectrues RMN IH et 13C du VALPROATE DE ctMONOACETONEMANNOSIDE Hl 6,09 s J1.2=0 Hz CI 100,1 ppm H2 4,61 d J2,3=6,0 Hz C2 84, 6 ppm H3 4,84 dd 3J3,4=3,0 Hz C3 79,8 ppm H4 3,93 dd J4,s=n.d Hz C4 81,2 ppm H5 3,93 m J5.6=5,4 Hz C5 69,9 ppm H6 3,57 dd J6.6-=12.6 Hz C6 64,2 ppm OH 2,67 sl I CH3 26.0 ppm H6' 3,77 dd J5.6- =2,59 Hz CH3 24,8 ppm CH3 1,41 C iso 113,3 ppm CH3 1,27 s Cl" 45,2 ppm Hl" 2,25 m 1=5,1 Hz C2' 34.5 ppm H2 et H2- 1.45 m C2 " 34,3 ppm H3y 1,33 m C3 20.5 ppm H3 1,23 m Cy. 20,4 ppm H4 et H4- 0, 79 m J = 7,2 Hz C4' 13,9 ppm C4" 13,9 ppm COO 174,9 ppm - 23 - Exemple n 15. Toxicité et pharmacocinétique. 1. Toxicité 1. a. Détermination des DL50 Les toxicités aigUes chez la souris SWISS sont déterminées selon les protocoles nomalisés habituels. Tableau 1. Abréviation et numérotation des molécules utilisées lors des études biologiques. Molécules abréviation numérotation acide valproique VPA I valpromide VPD II valproate de diacétoneglucose VPA-DGlu II valproate de monoacétoneglucose VPA-MGlu IV valproate de glucose VPA- Glu V valproate de diacétonegalactose VPA-DGal VI valproate de galactose VPA-Gal VII valproate de dirméthylénexylitol VPA-DMXyl VII valproate de diacétonexylitol VPA-DXyl IX valproate de monoacétonexylitol VPA-MXyl X valproate de xylitol VPA-Xyl XI valproate de diacétonemannose a VPA-DMan XII valproate de diacétonemannose VPA-DMan xIII valproate de monoacétonemannose c VPA-MMan a XIV cc cc XIV valproate de diacétonefructose VPA-DFru XV valproate de monoacétonefructose VPA-MFru XVI valproate de monoacétoneglucose-O-C-8 VPA-MGlu-OC8 XVII 3-0-octyl monoacétoneglucose (6 -> 3)-6'-O- VPA-S-S-OC8 XVIII valproyl de monoacétoneglucose - 24 - Tableau 2. Valeur des DL 50 pour la voie orle. molécule valeur graphique DL 50 calculée Valeur DL 50 g/kg en mmol/kg I 1,8 1,8 0,17 12,5 I1 1,3 1,3 + 0,21 9,09 II > 8 n d * > 20,7 IV > 8 nd > 23,1 V >8 nd >26,1 VI > 8 n d > 20,7 VII 6,5 6,5 + 0,8 20,0 VIII 6,0 6,0 + 0,73 19,8 IX > 8 n d > 22,3 XII > 8 n d > 20,7 XIII > 8 n d > 20,7 XIV >8 nd > 14,5 XV > 8 n d > 20,7 XVI 5,0 5,0 +0,15 14,5 lTableau 3. Valeur des DL 50 pour la voie intrapéritonéale. molécule valeur graphique DL 50 calculée Valeur DL 50 g/kg g/kg en mmol/lcg I 0,65 0,65 + 0,08 4,50 II 0,40 0,40 0,09 2,79 III 1,80 1,80 + 0,29 4,66 IV 0.85 0,85 + 0,06 2,45 V 0,65 0,65 + 0,12 2,12 VI 1,80 1,80 + 0,36 4,66 VIIu 1,20 1,20 0,13 3,90 Vm 3,00 3,00 + 0,28 9,93 IX 1,95 1,95 0,53 5,44 X 0,60 0,60 + 0,11 1,73 XII 1,70 1,70 + 0,23 4,40 XIII 1,70 1,70 + 0,23 4,40 XV 2,10 2,10 + 0,45 5,44 XVI 1,20 1,20 + 0,25 3,40 XVII >4 n d > 8,73 XVIII 0,70 0.70 + 0,11 0,92 - 25 - I. b. Observations pharrnmacologiques au cours des tests de toxicité aigue L'observation après ingestion ou injection de doses croissantes de dérivés valproiques (y compris le valpromide (If) et l'acide valproique (T)) met en évidence que les Animaux passent par 4 phases successives: - une phase d'agitation; - une phase de baisse de l'activité; - une phase hypnotique (période o peut survenir la mort); - une phase de réveil et de récupération. La durée moyenne de chacune des phases varie selon la voie d'administration, la nature du dérivé valprolque et la dose administrée. On constate que l'action des monoesters valproiques dérivés de monosaccharides est retardée et que la durée des trois premières phases est allongée par rapport à l'acide valproïque (I) et à son amnide (II). Ces résultats indiquent que les esters sont des prodrogues de l'acide valproique puisque l'on observe les mêmes effets avec seulement un décalage dans le temps. Cette interprétation est confirmée par le fait qu'aux doses mortelles le décès de l'animal survient après 6 à 10 heures pour les esters contre 3 à 4 heures pour l'acide valproique. Tableau 4. Durée moyenne desphases (min) per os: exemple des esters glucosiques. rw molécules phase I phase Il phase ImI phase IV I VPA 5 10 900 960 II VPD 5 10 900 960 M[ VPA-DGlu 10 30 900 960 IV VPA-MGIu 10 25 900 960 X V VPA-Glu T 10 20 900 960 Tableau 5. Durée moyenne des phases (min) I.P.: exemple des ester glucosiques. r? molécules phase I phase II phase I phase IV I VPA 2 4 900 960 ri VPD 3 2 900 960 LII VPA-DGlu 10 10 900 960 IV VPA-MGIu 10 10 900 960 V VPA- Glu 10 10 900 960 - 26 - BAD ORIGINAL 2. Tests pharmacocinétiques chez le Rat. Ces tests ont été réalisés avec les produits I, II, IV et V de la manière suivante: les rats sont répartis par lots de 6 après implantation de cathéters. Les doses utilisées sont de 0,1 mmol/kg, correspondant respectivement à 16,6 mg/kg pour I (VPA): 38,6 mg pour mI (VPA-DGlu), 34,6 mg/kg pour IV (VPA-MGIu), et 30,6 mg/kg pour V (VPA- GIu). Les quatre produits sont administrés par voie intraveineuse lente dans des volumes ne dépassant pas 0,1 mL pour un rat de 100g. Les prélèvements (200 pL) sont réalisés sur héparine aux temps: 5, 15, 30, 45 minutes * et 1, 2, 4, 6, 8 12, 24, 48 et 72 heures. Le sang est centrifugé (2000 tours/minute) durant 3 minutes; 100 gL de plasma sont recueillis et conservés par congélation immédiate. Le culot est repris par 100.L de sérum physiologique et reinjecté à l'animal. La concentration en acide valproïque circulant est déterminée spécifiquement par une technique de dosage immunoenzymatique (test EMIT). Avec cette méthode de dosage et pour les produits délivrés à cette dose, l'acide valproique est détectable pendant 60 minutes. Au delà, pour les esters glucosiques les taux sont très faibles de l'ordre de 1 gtg/mL ou à l'état de traces de 2 à 4 heures selon les cas. Pour le VPA, les concentrations sont très faibles au bout de 45 minutes et ne sont plus détectables ensuite. La demi-vie plasmatique des 3 sucroesters est respectivement de 20 minutes pour VPADG1u (In), minutes pour VPAMAGIu (IV) et de I heure pour VPAGIu (V), contre 10 minutes pour VPA (I). Exemple n '16. Mise en évidence des propriétées anriconvulsivanres chez l'animal: rest au penrérrazole (PTZ). 1. Protocole expérimental et résultats pour la voie intrapéritonéale. Dans ces expériences, nous cherchons à déclencher des crises tonicocloniques avec perte de l'équilibre sans provoquer la mort de l'animal. Dans nos tests, la dose de pentétrazole (>TZ) provoquant de manière systématique ces convulsions chez 97 % des animaux (DC 97), après injection sous-cutanée, est de 90 mg/kg. Nous utilisons pour ce test des souris mâles de 19 à 23 g ( type O F I Laboratoire IFFA CREDO). Les animaux sont reçus au minimum 24 heures avant le début des tests. Ils sont alors répartis en lots de 10 et chaque animal ne sert qu'à une seule expérience. Durant les études par voie intapérironéale les animaux n'ont accès ni à la boisson ni à la nourriture. Pour une estimation correcte du potentiel anticonvulsivant, il est nécessaire de déterminer le pic d'action maximale de chaque molécule testée. Le pic d'action maximale est le moment o après l'injection, la molécule agit le plus efficacement sur le test PZ. Les animaux sont repartis en lots de 10 et après injection par voie intrapéritonéale du dérivé à tester, le mT est délivré pour chaque lot, à un temps différent, à intervalle régulier. On détermine alors le nombre d'animaux présentant ou non des convulsions. D'autres paramètres sont aussi pris en compte commenri le moment d'appanrition des crises généralisées ainsi que le nombre et l'intensité des signes - 27 - BAD ORIGINAL convulsifs. Expression des résultats: l'activité d'une substance est exprimée en dose efficace 50 (DE ). Cette DE 50 correspond à la dose théorique de substance capable de supprimer les convulsions maximales tonico-cloniques avec perte de l'équilibre chez 50% des animaux du lot Elle est déterminée graphiquement (papier logarithme-probit) selon la méthode de MILLER et TAINTER. Apres injection du PTZ, un animal est considéré corrmme protégé s'il ne montre pas de crise généralisée durant un période de 30 minutes. L'appréciation par un critère de type tout ou rien permet, pour chaque lot, de calculer le pourcentage d'animaux présentant des crises. Drogues et solutions: les produits sont injectés par voie intrapéritonéale dans des volumes ne dépassant pas 0,20 mL pour une souris de 20g. Les solvants utilisés sont le sérum physiologique (S(p) pour les molécules solubles dans l'eau, le S(p additionné de 0,4 % de Tween 80 pour les liquides insolubles dans l'eau (S(pT) et l'huile d'olive pure (HO) pour les produits solides et insolubles dans reau. Une solution à base de DMSO (Sérum physiologique-DMSO 90:10 (v/v)) a été aussi utilisée pour le VPD (II) et pour le VPA-S-S-OC8 (XVIII) ainsi que pour les molécules support le diacétoneglucose (DaGlu), le monoacétoneglucose (MaGlu) et le dimnéthylènexylitol (DMXyl). L'acide valpro'que est testé sous deux formes; la forme acide (VPA) insoluble dans l'eau et la forme sel sodique (VPA-Na) soluble dans l'eau. Les conditions de solubilisation des molécules sont décrites dans le tableau 6. Le pentétrazole est solubilisé juste avant l'injection en raison de sa mauvaise conservation en solution. Il est dissous dans du sérum physiologique à la concentration de 0,9 mg/mL, ce qui correspond à l'injection d'un volume de 0,20 mL en sous-cutané pour une souris de 20g. Tableau 6. Solutions et concentrations des produits utilisés lors du test au PTZ (IP). Produits Adjuvants Principe actifs mg/mL; concentration VPA-Na (1) S(p 10 - 40 VPA (I) SqpT 10- 40 VPD (i) DMSO 10 % 5- 20 VPA-DGIu (If) S - 28 - BAD ORIGINAL VPA-DXylvI (IX) SpT 20- 80 VPA-DMan cc (X) S(pT 20 - 80 VPA-DMan, (XII) SpT 20 - 80 VPA-MGlu-OC8 (XV) SoDT 60 DM50 10% MaGlu-0-C8 DMOlo25 MaGlu-0C8 Tween 0,5% HO MaGIu-0-C8 S(pT 20VPA-S-S-OC8 (XVIII) S(pT 50 DaGlu DMSO 10 % 60 MaGlu DMSO 10 % 60 DMXvl DMSO 10 % 80 Résultats: La détermnination du pic d'action maximale a été réalisée pour chaque produit (tableau 7). Tableau 7. Test PTZ IP Apparition du pic d'action maximale. [ r Molécules Pic d'action en minutes I VPA 10 I VPA-Na 10 i, VPD 10 III VPA-DGlu (T) 30 ai VPA-DGlu (HO) 45 IV VPA-MGlu 15 V VPA-Glu 45 VI VPA-DGal 30 VII VPA-Gal 45 IX VPA-DXyl 30 X VPA-DMXvl 30 XII VPA-DMan x 30 XIII VPA-DMan a 30 Les résultats montrent que l'ensemble des esters présentent un pic d'action maximale retardé (15 à 45 minutes) par rapport aux molécules de référence VPA et VPD (10 minutes). Les valeurs de la dosé efficace 50 (DE 50), au pic d'action maximale, sont rassemblées dans le tableau 8. Les esters valproiques dérivés de saccharides ont un réel potentiel anticonvulsivant vis-à- vis du test au PTZ, les doses efficaces 50 pour les esters valproiques s'échelonnent de 380 à 680 mg/kg soit 1,09 mmol/kg à 1,59 mmol/kg, pour les molécules de référence les DE50 sont - 29 - BAD ORIGINAL respectivement 150, 140 et 140 mg/kg pour le valproate de sodium, l'acide valproique et le valpromide. Les vecteurs (W) délivrés à forte dose et à des temps différents, ne montrent aucune action anticonvulsivante sur le test PIZ, ceci indique que ces molécules support ne sont pas impliquées dans l'action. Les sucroesters valproïques réduisent de façon importante les convulsions maximales induites par le pentétrazole, mais afin de mieux évaluer leur potentiel anticonvulsivant, il est nécessaire de déterminer l'indice de protection ou l'indice thérapeutique (rapport entre dose efficace 50 (DE 50) de la molécule sur un aspect toxique de celle-ci, dose létale 50 (DL 50) ou dose toxique 50 (DT 50) pour un des tests réalisés). Tableau 8. Test PTZ IP: Dose efficace 50 mesurée au pic d'action. n molécules Valeur graphique DE 50 Calculée Valeur DE 50 mg/kg. m/kg en mmol/kg I VPA-Na 150 150 + 8.2 0,9 I VPA-OH 140 140 5.1 0,95 [I VPD 65 140 4.5 0,45 [II VPA-DGluT 450 450 27 1,11 mI VPA-DGlu HO 500 500 + 84 1,29 IV VPAMGlu 410 410 + 32 1,09 V VPA-Glu 430 430 34 1,38 VI VPA-DGal 470 470 + 19 1,23 VII VPA-Gal 380 380 + 19 1,31 VIII VPA-DMXvYl 440 440 37 1,59 IX VPA-DXyvl 480 480 83 1,21 XII VPA-DMan ct 500 500 27 1,24 XII VPA-DMan f3 680 680 59 1, 42 XVII VPA-MGlu-OC8 Non Ac* n d** n d** MaGlu-OC8.... __ XVIII VPA-S-S-OC8. . T." DaGlu MaGLU..... DMXyi Non Ac: molécule n'ayant pas démontré d'activité anticonvulsivante pour ce test À* n d: non déterminé. ú5 Le calcul de l'indice de protection est couramment utilisé dans l'évaluation de l'activité anticonvulsivante de nouvelles molécules. Ce critère est notamment préconisé par "the BAD ORIGINAL Andiepileptic Drug Development Program of the Epilepsy Branch du NIH" oerogramme de développement des antiépileptiques de la branche épilepsie de l'Institut National de la Santé des USA). Un nouvel antiépileptique doit exercer ses effets anticonvulsivants (DE 50) à des doses inférieures à sa TD 50. Le tableau 9 donne l'indice de protection (DE 50/DL50)lorsque les molécules testées sont injectées par voie intrapéritonéale. Dans ce tableau, la molécule de référence est le valproate de sodium (activité = 1) qui est comparé à l'activité des esters. Tableau 9. Indice de protection des molécules testées pour la voie IP. nf molécules Indice de protection Activité * DL 50/DE 50 I VPA-Na 4,76 1 il VPD 6,25 1,31 III VPA-DGlu 4,00 0,84 IV VPA-MGIu 2,08 0,44 V VPA-Glu 1,51 0,31 VI VPA-DGal 3,85 0,81 VII VPA-Gal 3,13 0,67 VIII VPA-DMXvl 7,14 1,50 IX VPA-DXyI 4,00 0,84 XII VPA-DMan cc 2,44 0,51 XIII VPA-DMan[3 1,75 0,37 * Activité comparée à celle de l'acide valpro'que Parmi les esters testés seul le VPA-DMXyl possède un indice de protection supérieur à celui du VPA et même du VPD pour la voie IP (1, 5 contre 1), les autres sucroesters ont un indice de 20 % à 60 % inférieur. Si l'indice de protection est calculé de la même manière en tenant compte des résultats 1 5 obtenus lors des essais de neurotoxicité (rapport de la TD 50 et la DE 50) on voit, pour la voie [P, qu'aucune molécule n'a un indice supérieur à celui du VPA-Na (tableau 10). Tableau 10. Indices de protection des molécules testées pour la voie IP. TD 50/DE 50 TD50/ED 50 TD 50/DE 50 test de cheminée test du rotorod test de traction I VPA-Na 2,38 2,86 2,63 II VPD 0,66 0,97 0,97 III VPA-DGIu 1,11 1,88 2,63. IV VPA-MGlu 0,52 0,52 0,47 V VPA-Glu 1,25 1,70 1,72 VIII VPA- DMXyI 1,16 1,25 1,25 BAD ORIGINAL Les esters ont un indice deux fois moindre que l'acide valproique quel que soit le test choisi pour le calcul de l'indice. Le caractère neurotoxique supérieur et les propriétés anticonvulsivantes inférieures des sucroesters valproiques par voie intrapéritonéale expliquent cette différence. 2. Protocole expérimental et résultats pour la voie orale. Des essais par voie orale ont été effectués sur les trois esters du glucose et le valproate de diméthylènexylitol. Ces tests permettent d'évaluer la durée de l'effet anticonvulsivant et de quantifier l'action du produit après son absorption per os. Les souris mises à jeun pendant 12 heures sont pesées et réparties en lot de 6 à 10 puis sont gavées le marin entre 8 et 9 heure. La nourriture et la boisson sont remises à disposition 6 heures après le gavage. Les animaux sont observés les 7 jours suivants afin de déceler d'éventuels effets toxiques à plus long terme. Les drogues sont administrées par canulation gastrique à la dose de 10 mmol/kg. Le VPA-DGIu et le VPA-MGlu sont additionnés de 50 % d'huile d'olive. Le VPA-Glu est mis en solution dans l'eau à 300 g/L et pour le VPA-DMXyl, une suspension à 12 g/L de l'ester est réalisée dans une solution à base d'agar-agar 40g/L. Le PTZ est injecté par voie sous-cutanée, dans du sérum physiologique, toutes les heures pendant une période de 26 heures. Le protocole pour le VPA est différent car on ne peut pas faire absorber une dose équivalente à celle des esters en une fois, sa DL50 de 1,3 g/kg étant trop importante. Les animaux sont gavés pour cette raison deux fois avec un dose de 550 mg/kg à six heures d'intervalle. Le VPA est mis en solution dans l'eau à la concentration de 55 g/L. Les résultats du tableau 11 indiquent que l'effet maximum d'action est retardé pour les sucroesters par rapport à l'acide valproique et que la durée de l'action est 2 à 3 fois plus longue pour les sucroesters. Tableau 11. Protection vis-à-vis de PTZ par voie orale. molécule findel'efe molécule Protection 80% d refin de l'effet _________________ d __ __ a __ _ protection totale _ _ _ _ _ [ VPA 40 minutes qq minutes 5h30 III VPA-DAGlu I heure 6 heures 16 heures [V VPA-M.IAGIu 3 heures I heure 11 heures V VPA-Glu 3 heures I heure 15 heures VIEI VPA-DMXvl lh30 2 heures 12 heures Exemple n 15. Essais in vitro. Les tests in vitro ont pour but de mettre en évidence une action éventuelle des sucroesters - 2 - SAD ORIGINAL avant libération d'acide valproïque. L'étude a été réalisée sur des tranches d'hippocampe de RatL Deux types d'activités épileptiformes ont été induites dans ces tranches, soit en diminuant le taux de calcium dans le milieu extracellulaire (test Bas Calcium), soit en perfusant une solution contenant du pentétrazole, convulsivant chimique utilisé précédemment (test PTZ). l. Protocole expérimental général. Les techniques décrites ci-aprés sont communes aux deux tests: la réalisation des tranches, leur conservation, ainsi que les méthodes d'enregistrement. Réalisation des tranches: les rats sont de type WISTAR mâle 250 à 300 g (élevage CHARLES RIVER). L'animal est décapité à l'aide d'une guillotine. Aprés ouverture de la boite crânienne, la dure mère est incisée et repliée. Le cerveau est ensuite extrait et immergé dans une solution de Ringer standard refroidie, saturée en carbogène (mélange gazeux 95 % oxygène, 5% dioxyde de carbone). L'hippocampe est isolé grâce à une série d'incisions après avoir enlevé le cortex sus-jacent, puis placé sur un réceptacle. Les tranches sont réalisées grâce à un trancheur vertical de type Mc ILWAIN selon un plan de coupe perpendiculaire au grand axe de l'hippocampe. Les tranches d'hippocampe de 450 iAm d'épaisseur sont ruises dans une chambre de conservation remplie de solution de Ringer standard, oxygénée continuellement par bullage de carbogène. Mise en place des tranches: les tranches (quatre maximum) sont placées dans une cuve d'enregistrement électrophysiologique de type HAAS à interface. Elles sont déposées dans une petite chambre dont le fond est tapissé de papier filtre (WHAIlTMAN n 105) et elles sont perfusées par une solution de Ringer standard. La température du bain est maintenue à 33 + 0,2 C et l'oxygénation reste constante durant toute l'expérience. Solutions de perfusion: un temps de récupération d'une heure minimum, est laissé aux tranches dans la cuve, perfusées à l'aide d'une solution de Ringer standard; avant le début des expériences, la débit de perfusion est de I mL/min. Ensuite les différentes activités sont induites par perfusion de la solution dite Bas Calcium (R Ca 0) dans un cas et d'une solution contenant du PTZ 2 mM (R K ptz) dans l'autre. Les principes actifs à tester sont alors mélangés aux solutions sous forme d'émulsion avec du Tween 80 (0,305 mM) pour les produits insolubles liquides et sous forme de suspension avec de l'hydroxypropyl-3- cyclodextrine (HP 3 CD) 2,66 mM pour les produits insolubles solides. Ces adjuvants ont été testés et ils n'interfèrent pas sur les activités électriques des tranches que ce soit pour les essais en Bas Calcium ou pour les essais P'TZ. Enregistrement: l'activité épileptiforme induite par les solutions décrites précédemrnment - 33 - BAD ORIGINAL est enregistrée à l'aide des microélectrodes de verre placées dans l'espace extracellulaire. Elles sont fabriquées, à partir de tubes de verre (CLARK Electromedical Instruments ref GC150F- ), à l'aide d'une étireuse verticale NARISHI[GE. Elles sont remplies avec une solution de NaCI 150 mM et reLiées à un amplificateur et à un enregistreur. L'état des tranches, après la période d'acclimatation, est évalué en enregistrant les réponses à une stimulation électrique délivrée par une semi-microélectrode bipolaire de tungstène au niveau des afférences (collatérales de Schaffer) qui forment des synapses sur les neurones enregistrés. Les tranches sont en bon état si elles donnent une réponse ample et rapide. Les enregistrements des potentiels de champs extracellulaires sont obtenus dans la région CA I de l'hippocampe (aire n0 I Corne d'Amon) au niveau de la couche des cellules pyramidales. Les tranches sont alors perfusées par les solutions déclenchant les activités. 2. Expérience en Bas Calcium Lorsque le calcium est omis des solutions de perfusion délivrées, il se développe des activités spontanées épileptiformes en absence de transmission synaptique après un délai d'une heure. Ces activités apparaissent dans l'aire CA 1, ceci de manière récurrente avec une fr&équence stable. Elles sont caractérisées par un potentiel négatif lors d'un enregistrement extracellulaire. Mode opératoire: après avoir perfusé les tranches avec une solution Bas Calcium durant une période moyenne de 45 minutes, on observe des activités spontanées épileptiformes d'intensités et de fréquences variées. Les produits à étudier solubilisés dans le R Ca 0, sont mélangés à la perfusion qui est maintenue jusqu'à ce que les activités cessent ou, dans les autres cas, durant une période maximale de 20 minutes. Les tranches sont alors à nouveau perfusées en Bas Calcium jusqu'au retour de l'activité épileptiforme. Ce lavage est observé pendant un laps de temps plus ou moins grand, selon les produits et leur concentration. Chacune des substances a été testée à des concentrations différentes; pour chacune des concentrations, nous avons utilisé au minimum 5 tranches. Analyse des données: les activités paroxystiques sont amplifiées 1000 fois, enregistrées dans les zones de fréquence situées entre 10 Hz et 10 KHz et suivies sur un oscilloscope. Les signaux sont numérisés (interface de numérisation CED 1401) et mis en mémoire par un ordinateur. Le programme SPIKE 2 analyse les données et permet un traitement différé. Pour toutes les molécules testées, la concentration minimale inhibitrice est déterminée et le temps de suppression totale de l'activité est relevé. Drogues et solurions: quatre esters valproiques ont été testés: valproate de diacétoneglucose (VPA-DGlu), valproate de monoacétoneglucose (VPA-MGlu), valproate de 34 - BAD ORIGINAL glucose (VPA-GIu) et valproate de diméthylènexylitol (VPA-DMXyl) ainsi que quatre antiépileptiques de référence, le valproate de sodium (VPA- Na), le valpromide (VPD), le phénobarbital (PILE) et la phénito'ne (DPH). Les conditions de solubilisation sont décrites dans les tableaux ci-après. Molécules VPA-DGIu (Em) VPA-.MGIGu (IV) VPA-Glu (V) VPA-DMXyl (VIi) Concentration 1 à5 MM 1 à5 rm 1 à5 M0,l à 1 mmn Solution R Cao R Cao R Ca( R Ca( Additif Tween Tween HP J CD HP D CD Molécules VPA-Na (I) VPD (Il) PHE DPH Concentration I à 5 mI.M l à 5 mM 0,l à m, I I mM Solution R Cao R Cao R Cao R Ca( Additif. . . HP _ CD Choix de l'animal: les rats sont de type Wistar dont le poids est inférieur à 300 g. Influence de la concentration en potassium: la concentration en potassium optimale a été préalablement déterminée et se situe entre 6 et 7 rmM. La valeur pour nos expériences a été fixée à 6,5 mM. Résultars: après L'introduction de la molécule active, on observe une diminution progressive de l'amplitude des potentiels de champ qui peut aller jusqu'à leur disparition complète. Les doses efficaces minimales (DEM) capables d'inhiber totalement en moins de 20 minutes les activités Bas calcium sont: - lmM pour le valproate de glucose (V): _ - lmM pour le valproate de monoacétoneglucose (IV); - - 0,25rmM pour le valproate de diacétoneglucose (Il); - 0,1 mM pour le valproate de diméthylènexylitol (VI). les antiépileptiques de référence ayant une DME de: - >l1OmM pour le VPA (I): - 2,5mM pour le VPD (UI); - I mNM pour le phénobarbital: - 0,25mam pour la phénitoine. 3. Experiences avec le PTZ. L'action du PTZ in vitro est étudiée sur ['hippocampe de Rat car il induit des décharges paroxystiques. Ce test permet l'évaluation de l'activité des molécules anticonvulsivantes. BAD ORIGINAL Mode opératoire: le protocole de mise en place et d'enregistrement des tranches est le même que celui décrit précédemment. Les tranches sont perfusées à l'aide de la solution R K PTZ. Les décharges spontanées paroxystiques apparaissent en 20 minutes en moyenne. Après une période nécessaire à la stabilisation de l'activité, les drogues sont perfusées. Les produits sont appliqués durant 20 à 60 minutes selon les doses, puis les tranches sont de nouveau perfusées avec le R K PTZ jusqu'à un retour total de l'activité initiale. Les essais sont à chaque fois répétés sur quatre tranches différentes au minimum. Drogues et solutions. les substances à étudier sont ensuite appliquées et l'on analyse l'effet sur la fréquence des activités. L'hvdroxy-3cyclodextrine (HP 1 CD) est utilisé à la concentration de 2,66 mM. Molécules VPA-Na (I) VPD (II) VPA-Glu (V) VPA-DMXyl (VE) Concentration 2 mM 1 et 2 rmv 1 et 2 rnM 0,1 et 0,5 rnmM Solution R K PTZ R K pTZ R K Pz RK ETZ Additif ---.. HP CD HP C CD Analyse des données. Ies décharges en bouffées sont amplifiées 1000 fois et enregistrées dans les zones de fréquence situées entre 10 Hz et 10 KHz et observées sur un oscilloscope. Les signaux sont enregistrés sur un enregistreur sur papier (GOULD) avec une bande passante réduite (10-200Hz). L'évolution du nombre de décharges par intervalle de temps est relevée dugant tout le test. Les valeurs sont ensuite retranscrites dans un tableau et traduites graphiquement pour obtenir les courbes finales. Résultats: Les tests in-vitro montrent que la suppression des activités induites par le PTZ est obtenues à la dose de: -0,1 imM pour le VPA-diméthyvlènexylitol (VIII) (95% inhibition après 40 min de perfusion); - 0,5 mM pour le VPA-diméthylènexylitol (VIII) (100% inhibition après 20 min de perfusion); -2 mMl pour le VPA- diacétoneglucose (III) (100% inhibition après 34 min de perfusion); - 2 mM pour le VPD (Il) (100%inhibition après 12 min de perfusion); A 2 mM il n'y a pas d'inhibition par le valproate de sodium (I) (le pourcentage d'inhibition est inférieur à 50%). Dans tous les cas, l'activité induite par le PTZ est retrouvée après arrêt de la perfusion du pnrinclpe actif. BAD ORIGINAL Revendications 1. Composés correspondant à la formule générale: W-(OCO-CH(CH2CH2CH3)2)n dans laquelle W représente un radical d'un produit ayant au moins un groupe OH estérifiable par l'acide valproique ou ses dérivés ou encore, une partie labile Y pouvant être substituée par le groupement valproate, n pouvant varier de I au nombre total des groupes OH estérifiables ou Y substituables dans ledit produit. Les composés ester ou polyester de la présente invention ont un radical W ayant pour précurseur W-OH qui peut être un monosaccharide, un polysaccharide ou encore un itol, fonctionnalisé ou non, protégé ou non, et de préférence choisi parmi le D-glucose ou ses dérivés 1,2:5,6-diacéconeglucose ou 1,2:3,5-diacétoneglucose ou 1, 2- monoacétoneglucose, le D-galactose ou le diacétonegalactose, le Dfructose ou ses dérivés 2,3:4,5-diacétonefructose ou 1,2:4,5-diacétonefructose ou 1,2monoacétonefructose ou 2,3- monoacétonefructose, le D-mannose ou ses dérivés 2,3:5,6- diacétonemannose ou 2,3- monoacétonemannose, le D-allose ou ses dérivés 1,2:5,6-diacétoneallose ou 1,2- monoacétoneallose, le D-xylose ou le 1,2-monoacétonexylose, le xylitol ou ses dérivés 2,3:4,5- diacétonexylitol ou 2,3-monoacétonexylitol ou 4,5-monoacétonexylitol ou le 2,4:3,5- diméthylènexylitol ou encore parmi les disaccharides et polysaccharides pouvant résulter de l'association de deux ou plusieurs des monosaccharides préalablement cités. Sont exclus comme précurseur le glycérol et le soLkétal. Sont exclus comme composés revendicables les esters valproiques repondant à la formule générale ci-dessus dans laquelle W represente le motif glycérol ou solkétal, le 1,3-dipalmitoyl-2-valproyl-glycérol, le 1,3didécanoyl-2-valproyl- glycérol, le 1,3-dihexanoyl-2-valproyl-glivcérol, le 1,3-dibutanoyl-2valproyl-glycérol, le 1,3- diacétyl-2-valproyl-glyvcérol, le 2-valproyl-glycérol, le 1,3-divalproylglycérol, le 2-acétyl-1,3- divalproyl-glycérol, le 2-butanoyl- 1,3-divalproyl-glycérol, le 2décanoyl-1I,3-divalproyl- glycérol, le 1,3-divalproyl-glycérol. 2. Le 3-O-valproyl-D-glucose et ses dérivés 3-O-valproyl-1,2:5,6-di-Oisopropylidène- t-D-glucofuranose et 3-O-valproyl- 1.2-O-isopropylidène-ot-Dglucofuranose. 3. Le 6-O-valproyl-D-galactose et le dérivé 6-O-valproyl-1,2:3,4-di-Oisopropylidène- cx-D-galactopyranose. 4. Le l-O-valproyl-D-mannoside et ses dérivés l-O-valproyl-2,3-Oisopropylidène-D- mannofuranoside et I -O-valproyl-2,3:5,6-di-O-isopropylidène-Dmannofiranoside. 5. Le l-O-valproyl-5-D-frucrose et ses dérivés l-O-valproyl-2,3-Oisopropylidène-p-D- fructopyranose et I -O-valproyl-2,3::4,5-di-O-isopropylidène-5-Dfructopyranose. 6. Le 3-O-valprovl-5-D-fructose et ses dérivés 3-O-valproyl-1,2-Oisopropylidène-3-D- fiructopyranose et 3-O-valproyl- 1,2:4,5-di-O-isopropylidène-J-Dfructopyranose. 7. Le 1-O-valprovl-xylitol et ses dérivés 1-O-valproyl-2,4-Oisopropylidène-xylitol, 1- -- BA ORIGINAL BAD ORIGINAL O-valproyl-3,5-O-isopropylidène-xylitol et 1 -O-valproyl-2,4:3,5di-Oisopopylid ne-xylitoL 8. Le 1-O-valproyvl-2,3:4,5-di-O-méthvlènc-xylitol. 9. Le 6-O-valproyl-3-O-octvl-D-glucose et le 6-O-valproyl-3-O-octyl-1,2O- isopropylidène-a-D- glucofuranose. 10. Le 6-0-(3'-désoxv-6'-O-valproyvl- 1',2'-O-isopropylidène-ac-Dglucofuranose-3'- yivl)-3-O-octyvl- 1 '2-O-isopropylidène-ct-D-glucofiuranose. 11. M\édicaments relaxants comprenant les esters valproïques selon l'une quelconque des revendications I à 10, utilisés seuls ou en association avec d'autres composés. 12. Médicaments hypnotiques comprenant les esters valpro'ques sielon l'une quelconque des revendications I à 10. utilisés seuls ou en association avec d'autres composés. 13. Médicaments anticonvulsivants comprenant les esters val.proiïqucs selon l'une quelconque des revendications I à 10, utilisés seuls ou en association avec d'autres composés. 14. Médicaments antiépileptiques comprenant les esters valproiques selon l'une quelconque des revendications I à 10, utilisés seuls ou en association avec d'autres composés. BAD ORIGINAL