FR 2720757 A1 19951208 FR 9406856 A 19940603 PROCEDE ET SONDES POUR LA DETECTION DE MARQUEURS LIES AU LOCUS DES AMYOTROPHIES SPINALES INFANTILES Les amyotrophies spinales infantiles (SMA) représentent le groupe d'affections héréditaires récessives autosomiques fatales le plus fréquent après la mucoviscidose (incidence: 1/6 000) (1). Les SMAs sont caractérisées par une dégénérescence des motoneurones de la corne antérieure de la moelle épinière, entraînant une paralysie progressive des membres et du tronc associée à une atrophie musculaire. Les amyotrophies spinales infantiles sont divisées en catégories dites de types I, II et III, selon l'âge de début des symptômes et leur évolutivité (2). Il est rappelé que les amyotrophies spinales de type I ne s'observent que chez le nouveau-né et chez le nourrisson: c'est le type le plus grave, l'espérance de vie de ces enfants ne dépassant guère quelques années. Les amyotrophies spinales de type II se manifestent également dès la première année de vie des enfants atteints, mais après qu'ils aient acquis la station assise. Ils ne peuvent alors plus guère se lever et atteignent au mieux le stade de l'adolescence. Enfin, l'amyotrophie spinale de type III apparaît chez l'enfant, lorsque celui- ci commence à marcher, les symptômes rappelés plus haut se développant alors plus lentement. Hormis le diagnostic fondé sur des signes cliniques et paracliniques (électromyographie et biopsie musculaire) d'apparition de la maladie, signes qui ne présentent souvent pas la spécificité requise, il n'existe guère d'autres procédés permettant un diagnostic équivalent, fut-ce seulement dans un nombre limité de cas. Il va sans dire que le clinicien est encore plus désarme, s'agissant d'anticiper l'apparition future de la maladie chez des patients présumés à risques ou, en médecine néonatale, chez le foetus. L'anomalie biochimique de cette affection est inconnue. Néanmoins, le gène responsable des trois formes de SMA a été localisé, par analyse de liaison génétique, sur le chromosome 5qll.2-q13.3 (3-6), de sorte qu'il s'agirait d'affections alléliques. Récemment, le gène responsable des SMAs a été localisé sur le chromosome 5 dans un intervalle de 2 centimorgans (cM) défini par les loci flanquants D5S629 et D5S637 (7). Plusieurs fragments issus de ce chromosome ont été clones dans des chromosomes artificiels de levures ou YACs (abréviation de l'expression anglaise correspondante: "Yeast Artificial Chromosomes"). Plusieurs contigs de YACs de la région 5q13 ont été décrits. l'expression "contig de la région 5q13" se rapporte à un ensemble de YACs dont les insérats formés de fragments de la région 5q13 peuvent être considérés comme se chevauchant les uns les autres, cet ensemble de fragments recouvrant néanmoins la totalité de la région 5q13. L'un de ces contigs était constitué de 7 YACs chevauchants couvrant approximativement 3,2 Mb (13), l'autre de 10 YACs chevauchants couvrant une région de 2 Mb (14). Mais aucun des marqueurs connus jusqu'à ce jour ne permet l'établissement d'une corrélation, fut elle seulement partielle mais fiable, entre la détection que l'on peut en faire et les signes cliniques de la maladie. L'invention repose plus particulièrement sur la découverte que la région 5q13 comportait plusieurs loci qui, abstraction faite de séquences répétitives en nombre variable, possédaient des séquences de nucléotides sensiblement identiques et formaient autant de marqueurs polymorphes caractéristiques de cette région. Le polymorphisme de ces marqueurs est à la source de la capacité que l'on a de les discriminer, de les corréler parfois à ceux que portent les parents des sujets étudiés, ou au contraire, à identifier le caractère de novo des mutations ou délétions dont ils peuvent être l'objet. C'est également ce polymorphisme qui est à l'origine de la capacité dont l'on dispose désormais dans un certain nombre de cas, soit d'y trouver la confirmation du caractère correct d'un diagnostic clinique de SMA, notamment de type 1, soit parfois de l'exclure, par exemple en médecine néonatale et lorsqu'il existe un antécédent de la maladie chez un frère ou une soeur. Ces nouveaux marqueurs d'ADN plus particulièrement des marqueurs polymorphes (microsatellites), ont été identifiés par criblage de fragments, contenus dans le susdit intervalle de deux cM identifié par (7) et contenu dans un YAC de 4 Mb. Ce criblage a été effectué en mettant en oeuvre une banque de YACs du Centre d'Etudes du Polymorphisme Humain (CEPH), Paris, France, et cela en utilisant les YACs de première génération 755B12 (contenant le marqueur AFM265wf5) et 751E3 (contenant le marqueur AFM 281yh9), par amplification PCR entre les amorces spécifiques de chaque marqueur selon la méthode tridimensionnelle (3d) précédemment décrite (8). Une marche chromosomique, selon une méthode préalablement décrite (12), a permis l'identification de nouveaux YACs chevauchant les YACs précédents, et contenant les nouveaux marqueurs d'ADN polymorphes (microsatellites). Il a notamment été procédé comme suit. Familles La carte génétique haute résolution préalablement effectuée avait permis de reconnaître des évènements de recombinaison entre le locus SMA et les loci polymorphes flanquants les plus proches (D5S629 et D5S637) (7). L'analyse génétique des neuf familles comportant des recombinaisons clefs a été réalisée avec les nouveaux marqueurs polymorphes. Il s'agit soit de familles consanguines (n = 5) soit de familles comportant plusieurs sujets atteints (n = 4). Cette analyse génétique a consisté en la construction des haplotypes les plus vraisemblables, établis en minimisant le nombre d'évènements de recombinaison méiotique. Criblage des banques de YAC Les banques de YAC du CEPH ont été criblées par amplification PCR entre les amorces spécifiques de chaque marqueur selon la méthode tridimensionnelle (3d) précédemment décrite (8). Le génotype des YACs contenant les marqueurs microsatellites a été établi par électrophorèse des produits de PCR sur gel de polyacrylamide dénaturant, transféré sur membrane de nylon chargé et hybride avec un oligonucléotide (CA)n ou (CT)n marqué au 32p. La détection des répétitions dinucléotidiques a été effectuée par une méthode décrite (9). La taille des YACs a été estimée après électrophorèse en champ pulsé. Génération des marqueurs à partir des YACs sélectionnés L'ADN des YACs a été séparé des chromosomes de levure après électrophorèse en champ pulsé sur gel d'agarose, connu sous la marque "SEAPLAQUE GTG 1 %". Après traitement par la b agarase, l'ADN a été précipité dans l'éthanol. Un total de 300 ng de YAC a été digéré par l'enzyme de restriction Sau 3A, puis réparé partiellement, avant d'être clone dans le bactériophage M13 au site Sal 1 réparé partiellement. Les clones M13 contenant des répétitions (CA) ou (CT) ont été détectés grâce au criblage par les oligonucléotides (CA) 20 ou (CT) 20 marques au 32p. Les matrices positives ont alors été séquencées (10). Des amorces oligonucléotidiques flanquant les répétitions (CA) ou (CT) ont été choisies. La localisation chromosomique des marqueurs a été déterminée après amplification PCR des ADNs d'un panel d'hybrides somatiques du chromosome 5. Ce panel comporte la lignée HHW105 contenant comme unique chromosome humain le chromosome 5 entier, la lignée HHW1064 contenant le chromosome 5 délété dans la région 5qll- q14 et la lignée HHW213 contenant le chromosome 5p (11). Les loci polymorphes ont été reconnus en testant 5 individus contrôles non apparentés. Les marqueurs non polymorphes ont été utilisés comme STS (abréviation de l'expression anglaise "Sequence Tagged Site" ou site de séquence marqué). Marche chromosomique Cette marche a utilisé, à partir des YACs sélectionnés, les produits d'amplification PCR générés entre l'oligonucléotide A33 choisi dans les séquences moyennement répétées de type ALU. Ces produits ont permis la sélection de nouveaux YACs chevauchant les précédents selon la méthode préalablement décrite (12). Des nouveaux marqueurs d'ADN polymorphes ont été alors de nouveau isolés à partir de ces YACs. Cette marche chromosomique a permis l'identification de nouveaux YACs chevauchant les précédents, et de nouveaux marqueurs d'ADN ont alors été isolés. Sur les 28 marqueurs identifiés, 9 ont été exclus de l'étude car ils étaient aussi présents sur le bras court du chromosome 5, démontrant l'existence d'une duplication partielle de la région 5ql3 sur le chromosome 5p (tableau 1). Les 19 marqueurs spécifiques de la région 5q13 ont été retenus pour sélectionner des YACs potentiellement chevauchants. Neuf d'entre eux détectent plus d'un locus dans la région 5q13 (tableau 1). En effet, quatre marqueurs microsatellites polymorphes [C212 (D5F149S1-S2), C271 (D5F148S1-S2), C272 (D5F150Sl-S2), C171 (D5F151Sl-S2)] ont révélé la présence de deux produits d'amplification et un marqueur [C161(D5F153S1-S2-S3)] a révélé 3 produits d'amplification sur l'hybride somatique HHW105. Aucun d'eux n'était localisé en dehors de la région 5ql3. Ces résultats démontrent que les marqueurs C212, C272, C271, C171 détectent 2 loci et le marqueur C161 détecte trois loci dans la région 5q13. Ces résultats indiquent la présence d'éléments répétés sur le chromosome 5q13 (tableau 1). Du fait de l'organisation génomique complexe de cette région, ces loci polymorphes ont été utilisés pour sélectionner les YACs chevauchants et les génotyper par rapport à l'ADN du donneur, afin de s'assurer que toute la région était couverte. La confirmation de cette organisation génomique a été apportée par l'identification d'un YAC (903D1) dont le génotype est identique à ceux des YACs 595Cll et 759A3. Le contig de YAC contient un minimum de 5 YACs couvrant approximativement 4 Mégabases depuis le marqueur AFM265wf5 jusqu'au marqueur AFM281yh9 (figure 1). Cartographie génétique haute résolution au locus SMA Basé sur l'analyse conventionnelle des haplotypes et sur la méthode d'homozygotie par la descendance, 10 méioses recombinantes clefs ont été sélectionnées. L'analyse génétique de ces méioses recombinantes a été réalisée avec les nouveaux marqueurs polymorphes isolés à partir du contig de YAC (figure 1). Les marqueurs les plus polymorphes C212 et C272 ne révèlent plus d'évènement de recombinaison avec le locus SMA. Ces résultats démontrent que ces marqueurs détectent les loci les plus proches du gène des SMAs. L'invention concerne plus particulièrement des moyens (acides nucléiques et procédés) permettant la détection et, s'il y a lieu, la discrimination de plusieurs de ces marqueurs polymorphes. En particulier, elle concerne des brins d'ADN dont chacun est caractérisé en ce que sa propre séquence de nucléotides: - est contenue dans la séquence nucléique de l'un des brins d'un marqueur polymorphe d'une région chromosomique humaine réputée comporter un locus SMA, ce marqueur contenant des séquences de répétition, notamment dinucléotidiques, en nombre variable; - contient elle-même une séquence caractéristique présente dans ce marqueur polymorphe mais extérieure à la région de celui-ci qui contient lesdites séquences de répétition, cette séquence caractéristique présentant une taille suffisante, notamment d'au moins 12 et, de préférence, d'au moins 15 nucléotides, pour qu'un fragment de même séquence soit utilisable en tant qu'amorce pour la détection par PCR de marqueurs correspondants dans une préparation d'ADN d'origine humaine. Parmi les brins préférés de l'invention, on mentionnera ceux dont la propre séquence -ou la sequence qui lui est complémentaire- est constituée par tout ou partie de l'une des régions extérieures à la région contenant les séquences de répétition, respectivement contenues dans l'une des séquences d'ADNs ci- après identifiées sous les désignations C212, C272, AFM157, C161 et C171. C212 (D5F149S1, S2), ci-après "C212,, ACCTGANCCCAGANGGTCAAGGCTGCAGTGAGACGAGATTGCNCCACTGCCCTCC ACCCTGGGTGATAAGAGTGGGACCCTGTNTCAAAACATACACACACACACACACA CACACACACACACACACACACACACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCTCTCTCAAAAACACTTGGTCTGTTATTTTTNCGAAATTGTCAGTCAT AGTTATCTGTTAGACCAAAGCTGNGTAAGNACATTTATTACATTGCCTCCTACAA CTTCATCAGCTAATGTATTTGCTATATAGCAATTACATATNGGNATATATTATCT TNAGGGGATGGCCANGTNATAAAACTGTCACTGAGGAAAGGA C272 (D5F150S1, S2), ci-après "C272" CCTCCCACCTNAGCCTCCCCAGTAGCTAGGACTATAGGCGTGCNCCACCAAGCTC AGCTATTTTTNNTATTTAGTAGAGACGGGGTTTCGGCANGCTTAGGCCTCGTNTC GAACTCCAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG TGTGTAGATATTTATTCCCCCTCCCCCTTGGAAAAGTAAGTAAGCTCCTACTAGG AATTTAAAACCTGCTTGATCTATATAAAGACAAACAAGGAAAGACAAACATGGGG GCAGGAAGGAAGGCAGATC APM157xdlO TCGAGGTAGATTTGTATTATATCCCATGTACACACACACACACACACACACACAC ACACACACACACAGACTTAATCTGTTTACAGAAATAAAAGGAATAAAATACCGTT TCTACTATACACCAAAACTAGCCATCTTGAC C161 (D5F153S1, S2, S3), ci-après "C161" CCCTGAGAAGGCTTCCTCCTGAGTATGCATAAACATTCACAGCTTGCATGCGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGTTTGCTTGCACTGTAAAAACAATTGCAACATC AACAGAAATAAAAATTAAAGGAATAATTCTCCTCCGACTCTGCCGTTCCATCCAG TGAAACTCTTCATTCTGGGGTAAAGTTCCTTCAGTTCTTTCATAGATAGGTATAT ACTTCATAAGTCAAACAATCAGGCTGGGTGCAGTAGCTCATGCCTGTAATCCCAG CCCTTTGGGAGGCCGAGCTGGGCAGATCGA C171 (D5F151S1, S2), ci-après "C171" TCCACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGCNCTGGGATTACAGGCGTGACTGCCGCACCC AGCTGTAAACTGGNTTNNTAATGGTAGATTTTNAGGTATTAACAATAGATAAAAA GATACTTTTNGGCATACTGTGTATTGGGATGGGGTTAGAACAGGTGTNCTACCCA AGACATTTACTTAAAATCGCCCTCGAAATGCTATGTGAGCTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTATTAAGGAAAAGCATGAAAGTATTTATGCTTGATTTTTTTTTT TNACTCATAGCTTCATAGTGGANCAGATACATAGTCTAAATCAAAATGTTTAAAC TTTTTATGTCACTTGCTGTC Ces brins d'ADNs, surtout s'ils sont assez longs, peuvent être utilisés comme sondes directes, par exemple pour la présence ou non d'une delétion dans le marqueur correspondant. L'invention concerne alors également dans ce cas des ADNs recombinants (simple brins ou double brins) contenant ce brin recombinant à un acide nucléique non humain et non susceptible d'hybrider avec un fragment d'ADN humain. Cependant, de préférence, les brins préférés sont ceux qui peuvent être utilisés dans un procédé d'amplification de chaînes, notamment de type PCR (abréviation de l'expression anglaise "Polymerase Chain Reaction" ou réaction de chaînes en présence d'une polymérase). En particulier, l'invention concerne les paires d'amorces comportant de préférence au moins 12, avantageusement au moins 15 nucléotides dont les sequences sont respectivement contenues dans les paires de séquences, notamment issues de: - C212 (1) ACCTGANCCCAGANGGTCAAGGCTGCAGTGAGACGAGATTGCNCCACTGCC CTCCACCCTGGGTGATAAGAGTGGGACCCTGTNTCAAAACATA (2) séquence complémentaire de: CAAAAACACTTGGTCTGTTATTTTTNCGAAATTGTCAGTCATAGTTATCTG TTAGACCAAAGCTGNGTAAGNACATTTATTACATTGCCTCCTACAACTTCA TCAGCTAATGTATTTGCTATATAGCAATTACATATNGGNATATATTATCTT NAGGGGATGGCCANGTNATAAAACTGTCACTGAGGAAAGGA ou vice versa - C272 (1) CCTCCCACCTNAGCCTCCCCAGTAGCTAGGACTATAGGCGTGCNCCACCAA GCTCAGCTATTTTTNNTATTTAGTAGAGACGGGGTTTCGGCANGCTTAGGC CTCGTNTCGAACTCCA (2) séquence complémentaire de: AGATATTTATTCCCCCTCCCCCTTGGAAAAGTAAGTAAGCTCCTACTAGGA ATTTAAAACCTGCTTGATCTATATAAAGACAAACAAGGAAAGACAAACATG GGGGCAGGAAGGAAGGCAGATC ou vice versa - AFM157xd1O (1) TCGAGGTAGATTTGTATTATATCCCATGTA (2) séquence complémentaire de: CTTAATCTGTTTACAGAAATAAAAGGAATAAAATACCGTTTCTACTATACA CCAAAACTAGCCATCTTGAC ou vice versa - C161 (1) CCCTGAGAAGGCTTCCTCCTGAGTATGCATAAACATTCACAGCTTGCATGC (2) séquence complémentaire de: ATGTTTGCTTGCACTGTAAAAACAATTGCAACATCAACAGAAATAAAAATT AAAGGAATAATTCTCCTCCGACTCTGCCGTTCCATCCAGTGAAACTCTTCA TTCTGGGGTAAAGTTCCTTCAGTTCTTTCATAGATAGGTATATACTTCATA AGTCAAACAATCAGGCTGGGTGCAGTAGCTCATGCCTGTAATCCCAGCCCT TTGGGAGGCCGAGCTGGGCAGATCGAou vice versa - C171 (1) TCCACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGCNCTGGGATTACAGGCGTGACTGCCGC ACCCAGCTGTAAACTGGNTTNNTAATGGTAGATTTTNAGGTATTAACAATA GATAAAAAGATACTTTTNGGCATACTGTGTATTGGGATGGGGTTAGAACAG GTGTNCTACCCAAGACATTTACTTAAAATCGCCCTCGAAATGCTATGTGAG CT (2) séquence complémentaire de: ATTAAGGAAAAGCATGAAAGTATTTATGCTTGATTTTTTTTTTTNACTCAT AGCTTCATAGTGGANCAGATACATAGTCTAAATCAAAATGTTTAAACTTTT TATGTCACTTGCTGTC ou vice versa étant naturellement entendu que l'expression "vice versa" signifie que chacune des amorces issues des paires susdites de séquences (1) et (2) pourrait être remplacée par une amorce complémentaire. A titre d'exemples de paires d'amorces préférées, correspondant aux familles sus-indiquées, on mentionne les oligo-nucléotides suivants: C212A: CCTCCACCCTGGGTGATAAG C212B: GCTGATGAAGTTGTAGGAGGC C272A: TAGAGACGGGGTTTCGGCAT C272B: GATCTGCCTTCCTTCCTGC C161A: GGCTTCCTCCTGAGTATGCA C161B: GTTTCACTGGATGGAACGGC C171A: ATCGCCCTCGAAATGCTATG C171B: CTGTTCCACTATGAAGCTATG L'invention concerne naturellement aussi des brins d'ADN qui peuvent être considérés comme des répliques entières des marqueurs correspondants, ces brins (qui comportent alors également les séquences répétées correspondantes), pouvant aussi être utilisées comme sondes spécifiques des marqueurs correspondants, et ce par exemple à des fins de vérification de l'existence ou non de ce marqueur spécifique sur l'un des allèles d'un chromosome étudie. L'invention concerne aussi un procédé pour l'étude de la région chromosomique réputée contenir au moins l'un des gènes impliqués, soit par sa présence, soit par son absence, dans la SMA et provenant d'un sujet (patient ou foetus) atteint ou susceptible d'être atteint, ce procédé comprenant la mise en contact d'un échantillon d'ADN chromosomique de ce sujet ou foetus avec au moins l'un des brins d'ADN tel que définis ci-dessus, notamment dans des conditions amplificatrices autorisant, dès lors qu'il s'hybriderait à des marqueurs correspondants de cet ADN chromosomique, l'élongation de ses chaînes vers et au-delà des séquences répétées de ces marqueurs, puis à se placer dans des conditions permettant de discriminer entre les chaînes d'élongation obtenues selon leurs longueurs respectives, pour obtenir des informations représentatives du nombre de ces marqueurs. Il sera de préférence procédé par PCR, l'échantillon d'ADN chromosomique étant alors mis en contact avec une paire d'amorces telles que ci-dessus définies, susceptibles de s'hybrider aux régions des marqueurs, extérieures à celles qui contiennent leurs séquences répétées respectives, la discrimination entre les chaînes d'élongation produites étant alors obtenues, notamment par leur migration dans un gel électrophorétique approprié. Il résulte, notamment des expériences dont les résultats sont relates plus loin, que dans un pourcentage appréciable de cas, l'existence ou la potentialité d'une SMA, notamment de type 1, se manifeste par un nombre de marqueurs polymorphes détectés inférieur à celui observé dans des ADNs chromosomiques provenant de sujets sains, cette réduction témoignant de ce que chez les sujets atteints, des parties essentielles de la région 5q13 ont en fait été délétées. Dans des formes d'exécution préférées de l'invention, plus particulièrement appliquées à des sujets à risques, notamment en raison de l'existence présente ou passée d'autres cas de SMA dans la même famille, le procédé selon l'invention sera également et à titre comparatif mis en oeuvre sur des préparations chromosomiques provenant des parents ou autres personnes apparentées. Les essais dont les résultats sont exposés ci- après, tendent à montrer que ceux des sujets ayant reçu de leurs deux parents un allèle contenant un marqueur ayant donné matière à élongation de chaîne, sont moins menacés par une SMA, notamment de type 1, que ceux qui n'en ont reçu qu'un ou dont l'un des allèles n'est par porteur d'un tel marqueur. Du fait du polymorphisme des marqueurs mis en oeuvre, il est en effet possible de discerner, notamment grâce aux migrations différentiées des produits d'amplification, tenant à leurs tailles différentes, ceux des allèles porteurs d'un marqueur hérité, le cas échéant, de l'un des parents et ceux hérités, le cas échéant, de l'autre, ou encore, comme l'invention a permis de le constater, l'apparition de délétions de novo, avec pour conséquence le risque d'apparition de la maladie chez des sujets dont les parents ne témoignaient apparemment d'aucune prédisposition pour elles. A l'inverse, la détection chez un sujet donné, notamment chez le foetus, de la présence d'au moins un marqueur polymorphe sur chacun des allèles du chromosome correspondant, notamment lorsque l'étude comparative permettra de conclure que le foetus a hérité ces marqueurs de ses deux parents respectifs et qu'il n'est pas prédisposé à la maladie. Il pourrait en être de même pour des enfants en bas âge, chaque fois que les signes cliniques qu'ils présentent conduisent le clinicien à s'interroger sur la possibilité qu'ils auraient à développer la maladie. On comprend alors l'importance du résultat que l'invention permet d'obtenir, au moins dans un certain nombre de cas, ne serait-ce que pour s'assurer, en médecine néonatale, de l'absence de potentialité génétique de la maladie chez le foetus ou pour confirmer un diagnostic négatif chez l'enfant en bas âge, alors que certains signes cliniques semblaient présager du contraire. L'invention et les résultats qu'elle permet d'obtenir sont encore illustrés de façon plus détaillée -et non limitative- dans ce qui suit. Il sera également fait référence aux dessins, et au tableau, dont l'interprétation peut être faite en se reportant aux légendes qui apparaissent à la fin de la présente description. FAMILLES ET METHODES FAMILLES Deux-cent-une familles de SMA ont été étudiées. Celles-ci ont été sélectionnées selon les critères diagnostiques retenus par le Consortium International sur les SMA (15). Les sujets ayant une SMA confirmée ont été répartis en trois sous-groupes (type I, II ou III). Quatre-vingt-dix patients appartenaient au type I, 81 au type II et 30 au type III. Deux grandes familles de référence du CEPH, 22 familles saines composées des deux parents et d'un enfant, et 60 individus sains non-apparentés ont été utilisés comme contrôles. Pour les besoins de l'analyse statistique, il n'a été inclus dans l'étude qu'un seul enfant atteint par famille. METHODES Buvardage de Southern (Southern blot): L'ADN des différents individus a été extrait à partir de culots de leucocytes ou de lignées lymphoblastoides. I1 a ensuite été digéré par différents enzymes de restriction puis mis à migrer sur gel d'agarose 0.8%, avant d'être transféré sur membrane de nylon chargé. Détection des polymorphismes de répétition dinucléotidique: A partir des mêmes ADNs, une amplification PCR a été réalisée entre les amorces spécifiques des marqueurs C212 (D5F149S1 et S2), C272 (D5F150S1 et S2) et C161 (D5F153S1, S2 et S3). Les conditions d'amplification sont les suivantes: dénaturation à 94 C pendant 1 min., hybridation à 55 C pendant 1 min. et extension à 72 C pendant 1 min. durant 30 cycles. Les produits de PCR sont ensuite mis à migrer sur gel de polyacrylamide dénaturant, transférés sur une membrane de nylon chargée positivement qui est hybridée avec une sonde reconnaissant les répétitions de dinucléotides CA (20). Construction d'une banque de phages à partir du YAC 595C11l Après digestion partielle par l'enzyme Sau 3A, l'ADN du clone 595C11 a été déposé et mis à migrer sur gel d'agarose (connu sous la désignation "SEAPLAQUE GTG 0.5%"). Après migration, les fragments, d'une taille de 12 à 23 Kb, sont découpés, digérés par la b-agarase puis précipités dans l'éthanol. Après réparation partielle du site Sau 3A, l'ADN est sous- cloné au site Xho 1 réparé partiellement du bactériophage FIX II (Stratagene). Les clones lambda contenant les marqueurs C212 (L- 51), C272 (L-51, L-132) et C171 (L-5, L-13) ont été utilisés comme sondes pour rechercher des polymorphismes de restriction (RFLP) avec les enzymes de restriction EcoR I, Bgl II, Hind III et Xba I. La sonde JK53 (D5S112) a été utilisé comme contrôle interne pour les analyses de dosage génique. Les autoradiographies ont été examinées par densitométrie à 600 nm (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco). RESULTATS Pour tester l'hypothèse selon laquelle la présence d'éléments répétés pouvait favoriser la survenue de réarrangements chez les patients, la ségrégation des allèles a été analysée aux loci détectés par les marqueurs C212 et C272 chez 201 familles de SMA non consanguines. Une non-contribution parentale à ces loci chez huit enfants atteints appartenant à sept familles non apparentées. Quatre patients étaient atteints de la forme de type I, deux de type II et deux de type III. L'absence de contribution parentale était d'origine maternelle dans cinq des cas (familles 3, 4, 5, 6) et d'origine paternelle dans les trois autres (familles 1, 2, 7; figure 1). Un des patients de type I présentait un réarrangement survenu de novo n'emportant qu'un seul des deux loci reconnus par les marqueurs C212 et C272 (figure 1, famille 7). Des résultats identiques ont été obtenus en utilisant des paires d'oligonucléotides différentes pour chacun des marqueurs. La construction des haplotypes à l'aide des marqueurs flanquant le locus SMA (21) a permis d'exclure l'hypothèse d'une fausse paternité ou d'une erreur d'échantillonage. Ces résultats indiquent la présence de réarrangements emportant le locus morbide chez ces huit patients. De plus, parce que le nombre de patients présentant un réarrangement avait pu être sous-estimé par un défaut d'informativité des méioses, le nombre de produits d'amplification PCR distincts révélés par les marqueurs C212 et C272 a été analysé chez les familles de SMA des trois types ainsi que chez 60 contrôles composés d'individus non-apparentés (figure 2). Chez 16 des 90 patients de type I (18%), un seul produit d'amplification PCR avec le marqueur C272 a été détecté, résultat statistiquement très diffèrent de celui observé chez les patients de type II (1/81 soit 1%), de type III (1/30 soit 3%) et les contrôles (0/59 soit 0%, p montrant une contribution parentale anormale. L'analyse des RFLP et du dosage génique confirma alors la présence de délétions héritées ou de novo (figure ). DISCUSSION ET CONCLUSION La présente étude fournit la preuve génétique et physique directe de l'existence de délétions englobant le locus de la maladie chez 10 enfants atteints appartenant à 9 familles non-apparentées. De plus, la présence de délétions de la région 5q13 est fortement soutenue par l'observation d'une réduction allelique statistiquement associée à la forme sévère de la maladie (type I). Les délétions sont aussi rencontrées occasionnellement chez des patients de type II ou III. Des mutations alleliques distinctes pourraient donc expliquer l'expression clinique variable de la maladie. Ces résultats confirment aussi que le ou les gènes responsables des trois types de SMA se situent bien dans la même région. Les dystrophies musculaires de Duchenne ou de Becker peuvent également résulter de délétions mais, dans ce cas, il existe une différence mécanistique entre les types de délétions (25) alors qu'une telle analyse n'est pas encore rendue possible dans les SMA. Cette étude démontre également que les délétions peuvent se produire de novo, une caractéristique qui pourrait expliquer le faible coefficient de ségrégation précédemment rapporté par plusieurs auteurs dans les SMA (26, 27) et jusqu'ici assez mal compris. Les délétions de novo de la région 5q13 peuvent également expliquer l'apparente hétérogénéité génétique des SMA (18, 28) quand, dans une même famille, un enfant sain présente le même haplotype que l'enfant atteint avec les marqueurs flanquants. Cette observation est également importante pour le conseil génétique. En effet, l'apparente haplo- identité entre un foetus et l'enfant atteint d'une même famille déterminée à l'aide des marqueurs flanquants peut conduire à des erreurs de diagnostic prénatal lorsqu'une délétion de novo survient. La présence d'éléments répétés dans la région 5q13 peut expliquer l'instabilité de cette région contribuant ainsi à l'apparition de délétions chez les sujets atteints de SMA par des événements de crossing-over inégaux. Il est a remarquer que la séquence C272 est apparemment contenue dans un fragment d'ADN (dénommé L132) susceptible de révéler la présence, soit de délétions héritées, soit de délétions de novo par l'analyse en "Southern blot" des polymorphismes de longueurs des fragments de restriction ou par l'analyse du dosage genique (dosage d'un certain taux de détérioration d'un gène du fait de l'affaiblissement d'un signal d'hybridation donnée par une sonde susceptible de le reconnaître. Tableau Marqueurs Type(n) produits P C R Statut Nombre d'ampl i fications distinctes d e 1 2 3 4 C212 I 13% 13% Atteints (90) 66.5% 6.5% I I 2.5% 35.5% 59% 2.5% (76) I I I 3% 23% 66.5% 6.5% (30) Parents I 1.5% 42% 45.5% 10.5% (180) I I.5% 30% 53% 16% (150) I I I 0 23.5% 52.5% 23.5% (59) Contrôles (60) 0 18% 60% 21.5% C272 I 18.5% 15.5% Atteints (90) 61% 4.5% I I 1% 34% 63% 1% (81) I I I 3% 33% 46.5% 16.5% (30) Parents I 1.5% 38.5% 47.5% 11.5% (180) I I.5% 33% 53% 13% (162) I I I 1.5% 22% 44% 32% (59) Contrôles (59) 0 20% 54% 25% Tableau. Nombre de produits d'amplification PCR distincts observé avec les marqueurs C212 et C272 chez les sujets atteints de SMA de type I, II et III, leurs parents et des contrôles. (n) indique le nombre d'individus testés. LEGENDES DES FIGURES Figure 1: Carte génétique des délétions chez les patients atteints de SMA. A). Carte génomique de la région 5q13. Les différents marqueurs sont indiqués au-dessus de leur position génétique. Les parenthèses encadrant les blocs C212- C272-C171 indiquent que l'ordre des marqueurs à l'intérieur du bloc est inconnu. B). Carte génétique des délétions. Les tirets correspondent aux marqueurs cités ci-dessus. Dans la famille 7, la délétion peut entraîner soit le bloc centromèrique C212-C272-C171 soit le bloc télomèrique. Figure 2: Contribution des allèles parentaux chez les patients atteints de SMA déterminé par les marqueurs C212 et C272. La figure montre l'étude des familles soit avec le marqueur C272 (familles 1, 2, 5 et 7b) soit avec le marqueur C212 (familles 3, 4, 6 et 7a). Les patients sont atteints de la forme de type I (familles 3, 5, 6 et 7), de type II (familles 1 et 2) ou de type III (famille 4). La construction des haplotypes avec les marqueurs flanquant le locus SMA (11) nous a permis de déterminer que les enfants sains des familles 4 et 5 avaient reçu l'allele muté de leur mère. Dans la famille 7, on note la contribution incomplète du père à son enfant atteint avec les marqueurs C212 (7a) et C272 (7b) comparé au foetus haplo-identique comme établi avec les marqueurs flanquants (données non présentées). F: father (père), M: mother (mère), A: affected (atteint), NA: nonaffected (non-atteint), Fe: fetus (foetus). Les points indiquent les fragments alleliques. Figure 3: Nombre de produits d'amplification PCR distincts révélés par le marqueur C272 chez les patients, leurs parents et des contrôles. Un total de 90 patients de type I, 81 patients de type II, 30 patients de type III, leurs parents et 59 contrôles ont été étudiés. En abscisse figure le nombre de produits d'amplication PCR distincts, en ordonnée le nombre d'individus testés (%). atteints,: parents,: contrôles. Figure 4: Preuve de l'existence de délétions survenues de novo détectées par le microsatellite C161 chez des patients atteints de type I. A. La ségrégation des allèles détectés par le marqueur C272 ne prouve ni n'exclue l'existence de délétions dans les familles 8, 9 et 10. On note que les patients ne présentent qu'un seul produit d'amplification PCR. B. La ségrégation des allèles détectés par le marqueur C161 révèle l'existence de délétions survenues de novo dans les familles 8 et 9 car l'enfant atteint n'a reçu qu'un seul locus de ses parents (famille 8) ou de son père (famille 9). Dans la famille 10, la détection de six produits d'amplification PCR distincts exclue toute possibilité d'une délétion emportant un des trois loci détectés par C161. F: father (père), M: mother (mère), A: affected (atteint). Les points indiquent les fragments alleliques. Figure 5: Analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) et du dosage génique au locus détecté par le phage L-132 chez les patients atteints d'une SMA de type I. L'analyse génétique a été réalisée après digestion de l'ADN soit avec EcoR I (familles 6 et 7) soit avec Xba I (familles 3 et 5). Les membranes ont été hybridées avec le clone L-132 (A) et la sonde JK53 (B). Le dosage genique a été déterminé par examen densitométrique du signal d'hybridation pour les familles 3, 6 et 7. Dans la famille 6, l'intensité de la bande est réduite de 50% chez la mère et l'enfant atteint ce qui indique qu'il s'agit d'une délétion héritée. Dans les familles 7 et 3, l'intensité de la bande des enfants atteints est nettement plus faible que celle des parents suggérant que la délétion soit survenue de novo. Dans la famille , l'analyse du RFLP détecté par l'enzyme Xba I montre que l'enfant atteint n'a pas reçu d'allèle de sa mère. REFERENCES 1. Pearn J. 1980. Classification of spinal muscular atrophies. Lancet; 1:919-922. 2. Munsat TL. 1991. Workshop report. International SMA collaboration. Neuromuscular Disorders; 1:81. 3. 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Brin d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une partie au moins de sa propre séquence, ou de la séquence qui lui est complémentaire, est contenue dans une région extérieure à la région contenant les répétitions de dinucléotides de cette dernière, au sein de la séquence C212 qui suit: ACCTGANCCCAGANGGTCAAGGCTGCAGTGAGACGAGATTGCNCCACTGCCCTCC ACCCTGGGTGATAAGAGTGGGACCCTGTNTCAAAACATACACACACACACACACA CACACACACACACACACACACACACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCTCTCTCAAAAACACTTGGTCTGTTATTTTTNCGAAATTGTCAGTCAT AGTTATCTGTTAGACCAAAGCTGNGTAAGNACATTTATTACATTGCCTCCTACAA CTTCATCAGCTAATGTATTTGCTATATAGCAATTACATATNGGNATATATTATCT TNAGGGGATGGCCANGTNATAAAACTGTCACTGAGGAAAGGA 3. Brin d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une partie au moins de sa propre séquence, ou de la séquence qui lui est complémentaire, est contenue dans une région extérieure à la région contenant les répétitions de dinucléotides de cette dernière, au sein de la séquence C272 qui suit: CCTCCCACCTNAGCCTCCCCAGTAGCTAGGACTATAGGCGTGCNCCACCAAGCTC AGCTATTTTTNNTATTTAGTAGAGACGGGGTTTCGGCANGCTTAGGCCTCGTNTC GAACTCCAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG TGTGTAGATATTTATTCCCCCTCCCCCTTGGAAAAGTAAGTAAGCTCCTACTAGG AATTTAAAACCTGCTTGATCTATATAAAGACAAACAAGGAAAGACAAACATGGGG GCAGGAAGGAAGGCAGATC 4. Brin d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une partie au moins de sa propre séquence, ou de la séquence qui lui est complémentaire, est contenue dans une région extérieure à la région contenant les répétitions de dinucléotides de cette dernière, au sein de la séquence AFM157xd1O qui suit: TCGAGGTAGATTTGTATTATATCCCATGTACACACACACACACACACACACACAC ACACACACACACAGACTTAATCTGTTTACAGAAATAAAAGGAATAAAATACCGTT TCTACTATACACCAAAACTAGCCATCTTGAC 5. Brin d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une partie au moins de sa propre séquence, ou de la séquence qui lui est complémentaire, est contenue dans une région extérieure à la région contenant les répétitions de dinucléotides de cette dernière, au sein de la séquence C161 qui suit: CCCTGAGAAGGCTTCCTCCTGAGTATGCATAAACATTCACAGCTTGCATGCGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGTTTGCTTGCACTGTAAAAACAATTGCAACATC AACAGAAATAAAAATTAAAGGAATAATTCTCCTCCGACTCTGCCGTTCCATCCAG TGAAACTCTTCATTCTGGGGTAAAGTTCCTTCAGTTCTTTCATAGATAGGTATAT ACTTCATAAGTCAAACAATCAGGCTGGGTGCAGTAGCTCATGCCTGTAATCCCAG CCCTTTGGGAGGCCGAGCTGGGCAGATCGA 6. Brin d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une partie au moins de sa propre séquence, ou de la séquence qui lui est complémentaire, est contenue dans une région extérieure a la région contenant les répétitions de dinucleotides de cette dernière, au sein de la séquence C171 qui suit: TCCACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGCNCTGGGATTACAGGCGTGACTGCCGCACCC AGCTGTAAACTGGNTTNNTAATGGTAGATTTTNAGGTATTAACAATAGATAAAAA GATACTTTTNGGCATACTGTGTATTGGGATGGGGTTAGAACAGGTGTNCTACCCA AGACATTTACTTAAAATCGCCCTCGAAATGCTATGTGAGCTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTATTAAGGAAAAGCATGAAAGTATTTATGCTTGATTTTTTTTTT TNACTCATAGCTTCATAGTGGANCAGATACATAGTCTAAATCAAAATGTTTAAAC TTTTTATGTCACTTGCTGTC 7. Paire d'amorces, notamment pour PCR, caractérisée en ce que leurs propres séquences sont contenues dans les deux séquences qui suivent: - C212 (1) ACCTGANCCCAGANGGTCAAGGCTGCAGTGAGACGAGATTGCNCCACTGCC CTCCACCCTGGGTGATAAGAGTGGGACCCTGTNTCAAAACATA (2) séquence complémentaire de: CAAAAACACTTGGTCTGTTATTTTTNCGAAATTGTCAGTCATAGTTATCTG TTAGACCAAAGCTGNGTAAGNACATTTATTACATTGCCTCCTACAACTTCA TCAGCTAATGTATTTGCTATATAGCAATTACATATNGGNATATATTATCTT NAGGGGATGGCCANGTNATAAAACTGTCACTGAGGAAAGGA ou vice versa 8. Paire d'amorces selon la revendication 7, caractérisée en ce que les deux amorces présentent respectivement les séquences de nucléotides qui suivent: C212A: CCTCCACCCTGGGTGATAAG C212B: GCTGATGAAGTTGTAGGAGGC 9. Paire d'amorces, notamment pour PCR, caractérisée en ce que leurs propres séquences sont contenues dans les deux séquences qui suivent: - C272 (1) CCTCCCACCTNAGCCTCCCCAGTAGCTAGGACTATAGGCGTGCNCCACCAA GCTCAGCTATTTTTNNTATTTAGTAGAGACGGGGTTTCGGCANGCTTAGGC CTCGTNTCGAACTCCA (2) séquence complémentaire de: AGATATTTATTCCCCCTCCCCCTTGGAAAAGTAAGTAAGCTCCTACTAGGA ATTTAAAACCTGCTTGATCTATATAAAGACAAACAAGGAAAGACAAACATG GGGGCAGGAAGGAAGGCAGATC ou vice versa 10. Paire d'amorces selon la revendication 9, caractérisée en ce que les deux amorces présentent respectivement les séquences de nucléotides qui suivent: C272A: TAGAGACGGGGTTTCGGCAT C272B: GATCTGCCTTCCTTCCTGC 11. Paire d'amorces, notamment pour PCR, caractérisée en ce que leurs propres séquences sont contenues dans les deux séquences qui suivent: - C161 (1) CCCTGAGAAGGCTTCCTCCTGAGTATGCATAAACATTCACAGCTTGCATGC (2) séquence complémentaire de: ATGTTTGCTTGCACTGTAAAAACAATTGCAACATCAACAGAAATAAAAATT AAAGGAATAATTCTCCTCCGACTCTGCCGTTCCATCCAGTGAAACTCTTCA TTCTGGGGTAAAGTTCCTTCAGTTCTTTCATAGATAGGTATATACTTCATA AGTCAAACAATCAGGCTGGGTGCAGTAGCTCATGCCTGTAATCCCAGCCCT TTGGGAGGCCGAGCTGGGCAGATCGA ou vice versa 12. Paire d'amorces selon la revendication 11, caractérisée en ce que les deux amorces présentent respectivement les séquences de nucleotides qui suivent: C161A: GGCTTCCTCCTGAGTATGCA C161B: GTTTCACTGGATGGAACGGC 13. Paire d'amorces, notamment pour PCR: - C171 (1) TCCACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGCNCTGGGATTACAGGCGTGACTGCCGC ACCCAGCTGTAAACTGGNTTNNTAATGGTAGATTTTNAGGTATTAACAATA GATAAAAAGATACTTTTNGGCATACTGTGTATTGGGATGGGGTTAGAACAG GTGTNCTACCCAAGACATTTACTTAAAATCGCCCTCGAAATGCTATGTGAG CT (2) séquence complémentaire de: ATTAAGGAAAAGCATGAAAGTATTTATGCTTGATTTTTTTTTTTNACTCAT AGCTTCATAGTGGANCAGATACATAGTCTAAATCAAAATGTTTAAACTTTT TATGTCACTTGCTGTC ou vice versa 14. Paire d'amorces selon la revendication 13, caractérisée en ce que les deux amorces présentent respectivement les séquences de nucléotides qui suivent: C171A: ATCGCCCTCGAAATGCTATG C171B: CTGTTCCACTATGAAGCTATG 15. Paire d'amorces, notamment pour PCR, caractérisée en ce que leurs propres séquences sont contenues dans les deux séquences qui suivent: AFM157xd10 TCGAGGTAGATTTGTATTATATCCCATGTACACACACACACACACACACACACAC ACACACACACACAGACTTAATCTGTTTACAGAAATAAAAGGAATAAAATACCGTT TCTACTATACACCAAAACTAGCCATCTTGAC 16. Fragment d'ADNs caractérisé en ce que leurs seéquences sont choisies parmi les séquences complètes définies dans l'une quelconque des revendications 2 à 6 ou les séquences qui leur sont respectivement complémentaires. 17. Fragment recombinant le fragment d'ADN de la revendication 16 ou d'une partie de ce fragment avec un fragment non humain. 18. Utilisation d'un fragment selon la revendication 17 en tant que sonde d'hybridation pour la détection directe du marqueur correspondant à ce fragment ou de la région le contenant. 19. Procédé pour l'étude de la région chromosomique réputée contenir au moins l'un des gènes impliqués, soit par sa présence, soit par son absence, dans la SMA et provenant d'un sujet (patient ou foetus) atteint ou susceptible d'être atteint, ce procédé comprenant la mise en contact d'un échantillon d'ADN chromosomique de ce sujet ou foetus avec au moins l'un des brins d'ADN tel que définis ci-dessus, notamment dans des conditions amplificatrices autorisant, dès lors qu'il s'hybriderait a des marqueurs correspondants de cet ADN chromosomique, l'élongation de ses chaînes vers et au-delà des séquences répétées de ces marqueurs, puis à se placer dans des conditions permettant de discriminer entre les chaînes d'élongation obtenues selon leurs longueurs respectives, pour obtenir des informations représentatives du nombre de ces marqueurs. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact de l'échantillon chromosomique avec une paire d'amorces conformes à l'une quelconque des revendications 7 à 15 et en ce que la discrimination entre les chaînes d'élongation est obtenue, notamment par migrations électrophorétiques sur gel.