FR 2712190 A1 19950519 FR 9408039 A 19940624 -1-- Précédente de l'Invention La structure lipidique à double couche propre aux membranes biologiques, peut aussi se trouver dans l'enveloppe pelliculaire qui constitue la couche externe des particules globulaires génériquement dénommées "liposomes". Ces particules globulaires sont des vésicules ou sacs microscopiques, dont le diamètre est d'une grandeur de 0,01- 0,2 microns, découvertes au début des années 60, et correspondent à l'organisation spontanée des molécules de certains lipides de nature amphiphile dans un milieu aqueux, comme les phospholipides. La méthode conventionnelle pour préparer les liposomes se base sur le traitement de la pellicule déposée moyennant l'évaporation totale du solvant des solutions de phospholipides (par exemple, la lécithine), avec un milieu aqueux sous une agitation énergique (méchanique ou sonique). Sous ces conditions, ladite pellicule se désintègre, les molécules amphipiles se réordonnent spontanément dans le milieu aqueux en formant une dispersion de globules ou vésicules, le diamètre moyen de celles-ci étant déterminé par l'intensité de l'agitation, la température, etc. Un fois que les molécules amphiphiles ont été réordonnées dans le milieu de la dispersion, une population de vésicules -2- apparaît lesquelles se présentent de préférence sous les formes suivantes: 1) des vésicules délimitées par une enveloppe constituée par une double couche de molécules amphiphiles (d'une épaisseur d'environ quatre nanomètres) unies par leurs extrémités ou queues non polaires et dont les têtes (polaires) sont respectivement orientées vers le milieu de dispersion et le milieu aqueux capsulé; 2) des vésicules dont l'enveloppe comprend au moins deux desdites couches concentriques, séparées par une mince couche du milieu de dispersion. Ces structures majoritaires sont respectivement connues comme "vésicules unilamilaires" et "vésicules plurilamilaires". Ladite méthode n'est pas l'unique pour préparer les vésicules mentionnées (liposomes). D'autres ont été décrites, basées sur l'injection en milieu aqueux, de solutions de lipides dans des solvants très volatiles comme les fréons, ou la dispersion dans ledit milieu de lipides en état de poudre, obtenus par l'évaporation de lipides dissous pulverisés sur des surfaces "ad hoc", etc. En général, la population de liposomes ainsi obtenue ne présente pas un diamètre homogène. L'uniformité requise pour plusieurs applications notamment en médecine et en cosmétique, s'obtient par des traitements postérieurs moyennant -3- ultrasonique, et aussi moyennant filtration &à travers des membranes à pores sélectifs. Les liposomes ont trouvé une application étendue et croissante dans le domaine du transport des agents thérapeutiques dans les organismes; par exemple, les bronchodilateurs; dans le domaine du transfert de matériel génétique pour la nutrition des végétaux, dans l'industrie alimentaire pour le mûrissage des fromages, et en cosmétique (préparations liposomiques pour le traitement de la peau). D'un autre côté, sont bien connues les exigences nutritionnelles ayant trait à l'apport d'éléments qui sont essentiels pour le développement des processus vitaux, dénommés "microéléments" (ou oligoéléments), dont la plupart sont des métaux de transition, principalement le fer, le zinc, le cobalte, le manganèse, le molibdène, le chrome, et en plus le sélénium. Le fer se trouve présent dans une solution de 3 & 4 grammes, le zinc & raison de 1,8 g/70 kg de poids, et les restants, à raison de 1 à 80 mg. L'économie corporelle de ces éléments se base sur leur réutilisation métabolique et sur leur entrée normale par ingestion des aliments. Dans le cas du fer, il faut environ 0,6 à 1,5 mg/Jour, si l'on considère une absorption de l'ordre du 10 % en moyenne sur le contenu total du fer dans le régime alimentaire. Le taux de l'absorption intestinale du fer dépend de -4- plusieurs facteurs: la nature des aliments; l'absorption du fer est moindre dans le cas des aliments d'origine végétal (formation des phitates de fer insolubles; de la façon d'ingérer les aliments, crûs ou cuits; de la forme chimique du fer: le fer est absorbé en état ferreux et sa bio- disponibilité augmente quand il se présente comme Fe- héminique. Dû & l'importance du fer dans la synthèse des molécules vitales (hémoglobine, miohémoglobine, hémines célullaires, enzymes métaboliques, etc.), la tendance s'est développée d'enrichir le régime alimentaire avec du fer, le cas donné en le supplémentant avec d'autres microéléments (cuivre, zinc, etc), par exemple en enrichissant le pain, les préparations basées sur des céréaux, et spécialemente le lait, pour obtenir des niveaux de fer bio-disponibles dans lesdits aliments qui soient compatibles avec le niveau de fer moyen requis dans le régime alimentaire. Dans la pratique, la préparation des aliments avec du fer, se fait en aJoutant des sels de fer inorganiques, par exemple le sulfate de fer (II), du fer organique sous la forme de lactate ou citrate de fer, etc., dont l'absorption se réalise à niveau intestinal d'une façon partielle en rapport au contenu de fer des aliments ingérés. L Invention Il a été constaté maintenant qu'il est possible d'augmenter -5- le niveau de fer bio-disponible dans les substrats ingérables, moyennant l'incorporation dans celles-ci, de fer (II) en solution aqueuse stabilisée avec des agents réducteurs inhibiteurs de l'oxidation de fer vers son état (III), ladite solution étant microcapsulée dans des liposomes. En conséquence, l'un des objectifs de l'invention concerne un procédé pour préparer des liposomes contenant du Fer II, biodisponible, qui comprend former une suspension homogène de phosphoglycérides dans l'eau à raison de 30 - 50 g/L; congeler & de - 10 a - 15 QC et décongeler à la température ambiante la suspension formée, ceci en forme de cycles répétifis, deux fois au moins, de congélation rapide et décongélation lente; incorporer dans la solution homogénéisée et décongelée, du fer (II) en solution aqueuse qui comporte des agents réducteurs capables d'inhiber l'oxidation du fer vers son état (III); répéter la congélation rapide et la décongélation lente et séparer les liposomes formés. Un autre objectif de l'invention concerne un procédé pour préparer des liposomes contenant du fer (II), qui comprend former une solution de phosphoglycérides à raison de 30 - 50 g/L dans un milieu solvant organique; évaporer la solution Jusqu'à former une mince pellicule sur les parois du récipient d'évaporation, libre de solvant; ajouter dans le récipient d'évaporation, une solution aqueuse de Fe (II) qui comporte des agents réducteurs capables d'inhiber la transformation en Fer (III))par oxidation du Fe (II), sous agitation à la -6- temperature ambiante, et séparer les liposomes formées. Description Détaillée de l Invention Les phosphoglycérides tenus en compte pour former des liposomes contenant du fer (II) biodisponible de la présente invention, comprennent, dans un sens général, les phosphoglycérides dont la fraction de tête polaire est pourvue d'aminoalcohols, tels comme l'éthanolamine et la choline (phosphoglycérides d'éthanolamine et phosphoglycérides de choline) et/ou des aminoacides tels comme la s6rine. Ceci comprend les mélanges de phospoglycérides qui s'obtiennent par fractionnement et purifications des phospholipides naturels connus comme "lécithine", "cépahline", etc., tels que la lécithine d'oeuf ou de soya. Le fer (II) microcapsulé dans les liposomes de la présente invention, comprend tous les sels ferreux inorganiques solubles dans l'eau, acceptables du point de vue pharmaceutique, notamment le sulfate de fer, et aussi les sels complexes avec des anions et agents chélants organiques: citrates, lactates et complexes avec du EDTA. Les liposomes de la présente invention, comprennent en plus un composant ou système réducteur biocompatible, capable d'inhiber l'oxidation du fer, durant les étapes de fabrication et stationnement des liposomes et des produits les contenant. L'acide ascorbique et les ascorbates solubles sont particulièrement préférés, et aussi d'autres réducteurs biocompatibles avec le potentiel redox approprié. Le capsulage du fer (II) pour former les liposomes de la présente invention, comprend plusieurs alternatives opératoires, notamment en utilisant une lécithine choisie5 parmi celles dont la température de transition est de l'ordre de OoC et celles dont la température de transition est supérieure à 200C. L'une d'elles est basée sur l'utilisation de lécithines dont la température de transition est prochaine à 0 C. Par exemple, en partant de lécithine de soya ou d'oeuf (avec un contenu de Phosphatidil Choline par exemple non inférieur à 90%) à température ambiante, en utilisant un homogéneisateur à turbine et des concentrations de lécithine d'entre 30 et 50 g/L. Une fois obtenue une suspension homogène, l'on refroidit rapidement à de -10 à -15 C. Le lendemain, on laisse décongeler spontanément et on répète l'opération de congélation rapide et décongélation lente. La suspension obtenue est supplémentée avec la solution de sulfate ferreux stabilisé avec le réducteur choisi, l'on mélange convenablement et congèle rapidement, et laisse décongeler spontanément. Finalement, les liposomes sont séparés de la solution de sulfate ferreux non microcapsulé, par centrifugation. Une autre méthode opérative possible consiste à dissoudre le phosphoglycéride (lécithine de soya par exemple) dans un milieu approprié. Par exemple: On procède à dissoudre de la lécithine (dont la température de transition est prochaine à 0 C) dans du -8- 2712190 chloroforme/méthanol 2:1, dans la proportion- correspondante (laquelle dépend de la lécithine employée), pour obtenir une solution limpide. De préférence l'on prépare des solutions dans lesquelles la concentration de lécithine est comprise entre 30 et 50 g/L. A continuation, on évapore le solvant de la solution limpide formée dans un évaporateur rotatif à pression réduite (trombe d'eau) jusqu'à obtenir une fine pellicule sur les parois du récipient. Il faut s'assurer qu'il n'y aie pas de restes de solvant organique; il convient donc de brancher le récipient à une pompe à vide (une pression de suelement quelques microns) pendant quelques heures. A la suite, on procède à former les liposomes en ajoutant la solution de sulfate ferreux, stabilisé moyennant le réducteur appropié, au récipient précédent, suivi par une agitation énergique & température ambiante; l'agitation est poursuivie jusqu'à ce qu'il n'y aie plus de lécithine déposée sur les parois. Il convient de soumettre la suspension de lécithine & un procès de sonication dans un bain ultrasonique pendant quelques minutes avec des séquences de 30 secondes de sonication et 30 secondes de repos. Finalement, l'on laisse en repos la suspension & 4 QC pendant une nuit, avant de centrifuger pour séparer les liposomes. Dans les techniques mentionnées, la congélation des suspensions de lécithine peut être omise, en travaillant avec des solutions de lécithine dans des solvants organiques (méthanol/chloroforme, déjà mentionnés), en maintenant lesdites solutions & une température non inférieure à 20 QC en-dessous de la température de transition de la lécithine, et l'addition de la solution de sulfate ferreux doit se faire à _C au-dessus de la température de transition de la lécithine utilisée. La solution aqueuse microcapsulée peut être enrichie avec d'autres microéléments, en plus du fer, tel comme le zinc, le cuivre, le cobalte, ou mélanges de ceux-ci. Les liposomes de la présente invention s'appliquent à l'enrichissement des aliments avec du fer biodisponible, à l'enrichissement du lait entier ou décrémé, dans la préparation du lait maternisé et d'autres produits lactés de consommation massive tel que le yaourt, le lait cultivé et les fromages en général. Les liposomes en question ont démontré aussi leur utilité pour augmenter le fer biodisponible dans les sucreries et desserts divers, tels que la crème caramel, les gélatines. Dans le suivant Exemple présenté a titre illustratif, il est décrit une des possibles formes pour mettre l'invention en pratique. Exemnle A un litre d'eau destinée, à la température ambiante (environ 25 OC), sont ajoutés 40 gr de lécithine de soya (NC -10- de Natterman Chemie, Allemagne) finement divisée et en petites portions, en secouant avec vigueur dans une turbine munie d'un déflecteur, tout en évitant d'incorporer de l'air pendant l'homogénéisation. Une fois obtenu la suspension homogène (contrôlée par microscopie & contraste de phase), on la congèle rapidement dans un freezer à - 10, QC et la conserve pendant la nuit. Le lendemain, on laisse décongeler spontanément & la température ambiante (environ 25 degrés) et on répète le processus de congélation rapide et décongélation spontanée. A 1 L de cette suspension est ajoute 1 L de solution de sulfate ferreux heptahidraté (qualité alimentaire) d'une concentration de 150 g/L avec de l'acide ascorbique à 10 g/L, lequel agit comme stabilisateur, on mélange avec soin et on congèle rapidement a - 10, - 15 Q C. Le lendemain, on laisse décongéler de façon spontanée et on sépare les liposomes par centrifugation a 8000 g pendant 2 heures. Ainsi fut obtenu une suspension (environ 0,5 litre) concentrée de liposomes contenant du fer (II) capsulé, suffisante pour supplémenter le lait avec un rapport 1/1000 (1 L de ladite suspension avec 10000 L de lait ordinaire) et mener la concentation du Fe (II) à 15 mg/L dans le lait enrichi. (Suivent les revendications) R E V E N D) I C A T I 0 NI 1.- Liposomes utiles comme source de fer biodisponible, caracterisés en ce qu'ils comprennent du fer (II) en solution aqueuse microcapsulée et stabilisée avec des agents réducteurs inhibiteurs de la transformation en fer (III) par oxidation. 2.- Liposomes selon la revendication 1, caracterisés en ce que l'agent réducteur est l'acide ascorbique ou ses sels. 3.- Liposomes selon les revendications 1 et 2, caracterisés en ce que le Fe (II)se trouve sous la forme de sulfate, lactate ou citrate. 4.- Liposomes selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'enveloppe est une menbrane à double couche formée par la lécithine. 5.- Liposomes selon la revendication 4, caracterisés en ce que ladite lécithine est une lécithine dont la température de transition est de l'ordre de 0 QC. 6.- Liposomes selon la revendication 4, caractérisés en ce que la lécithine est une lécithine dont la température de transition est supérieure à 20 C. 7.-Liposomes selon la revendication 1, caracterisés en ce que ladite solution aqueuse contient d'autres microéléments, -12-- 2712190 tels que cuivre, zinc et cobalte, et les mélanges de ceux-ci. 8.- Procédé pour préparer des liposomes selon la revendication 1, caracterisé en ce qu'il comprend la formation d'une suspension homogène de phosphoglycérides à raison de 30 a 50 g/L, dans de l'eau; la congélation à de - 10 a - 15 QC et la décongélation à la température ambiante de la suspension formée, à la faóon de cycles et en répétant deux fois au moins, de congélation rapide et décongélation lente; l'incorporation dans la suspension homogénéisée et décongélée, du fer (II) en solution aqueuse avec des agents réducteurs capables d'inhiber la transformation en fer (II)l par oxidation; la répétition de la congélation rapide et de la décongélation lente, et la séparation des liposomes formés. 9.- Procédé pour préparer des liposomes selon la revendication 1, caracterisé en ce qu'il comprend la formation d'une suspension de phosphoglycérides à raison de 30 à 50 g/L, dans un milieu solvant organique; l'évaporation de la solution jusqu'à former une mince pellicule sur les parois du récipient d'évaporation, libre de solvant; l'addition dans le récipient d'évaporation, d'une solution aqueuse de Fe (II) comprenant des agents réducteurs capables d'inhiber la transformation en fer Fe (III)par oxidation, sous agitation à la température ambiante; et la séparation des liposomes formés. 10.- Procédé selon les revendications 7 et 8, caractérisé -13- en ce que ladite solution aqueuse contient d'autres microéléments, tels que cuivre, zinc, cobalte, et les mélanges de ceux-ci. 11.-Procédé selon les revendicationes 7 et 8, caracteris6 en ce que l'agent réducteur est l'acide ascorbique ou ses sels. 12.-Procédé selon les revendications 7 à 10, caracterisé en ce que el fer (II) se trouve sous la forme de sulfate de fer (II). 13.- Produits alimentaires enrichis avec du fer, caractérisés en ce qu'ils comprennent des liposomes selon les revendications 1 à 4, comme source additionnelle de fer biodisponible. 14.- Lait enrichi avec du fer, caractérisé en ce qu'il comprend comme source additionnelle de fer biodisponible, des liposomes selon les revendications 1 à 4.