FR 2717656 A1 19950929 FR 9403522 A 19940325 La présente invention est relative à un pro- cee de préparation d'embryons somatiques et de points vgeetatifs aptes p produire après germination des plan- u-es -resentant un ieveioppement homogène et vigoureux, - rAce à un controie de la maturation desdits embryons ou ^zonts végétatifs et à ses applications. Dans a Présente invention, le terme point v-gétatif correspond à tous ies tissus biologiques divers susceptibles d'entraîner la néo- formation de plantes et -tnciut, en particui-er, es nodules ou amas méristéma- -iques, -es microtubercules et les protocornes. Certaines zones particulières de végétaux (axe --vpocotyie, axes inflorescentiels, cotylédons, etc...) -euven: être source de tissus ou cals embryogènes qui - crcuisent des enmr-ons qui, pour former des semences _ynchéeimzues ou ar:-:-cielles, doivent être enrobés pour es.mainten-r en ve en est de même des points végé- labifs precites. Toutefcis un certain nombre de problèmes, cncernant aussi ien a production desdits embryons que _eur enrobage, ont ete mis en evidence. a. produc:ion des embryons: heure actuelle, les embryons somatiques ed-ent- t re produits en grande quantité en fermenteur. -En n art lier, uians ie cas ce la carotte, un fragment de isszu =e ieu __uide, peut donner 600 à 800 embryons a--abes e: cii frencies. Toutefois, l'optimisation et la n -ra isation de cette technique s'avère particulière- men délicae: en effet, les problèmes essentiels rela-' ifs à certe technicue sont liés à la synchronisation du ieveiocpemenc ces embrvons, Jusqu'à un stade optimal per- mettahn une cerminatton homogène des embryons matures. En tele, les embryons somatiques placés sur milieu de ger- minatton a un stade trop précoce croissent d'une manière 'eeroe gene et.euven développer des cotylédons et même roduire des feuilles, sans qu'il y ait eu, au préalable, nltlatcion et dévelccpemenz de la racine. b. enrobage Lorsque _es embrons matures sont enrobés, ils ioivent conserver.n zertain nombre de propriétés et notamment - la coservation de leur potentiel embryo- gène, - la limitration de l'embryogenèse secondaire, - la mise en dormance réversible des embryons !contrôle de la germination), et - le maintien du pouvoir germinatif des embryons. Un certain nombre d'études ont déjà été réali- sées; on peut citer, en particulier: H. HUET et al. (C.R. Acad. Sci Paris, 1992, 314, III, 171-177) ont proposé la culture d'une suspen- sion cellulaire de carotte (Daucus carota L. var. Mandor), en présence d'auxine (milieu 2,4-D+ ou d'induction), en lumière constante et à environ 25'C. Après repiquages successifs et réensemencement, sur le même milieu, de cellules à une densité initiale de 5 mg de matière fraîche ml1-1, les amas de cellules embryogènes sont sélectionnés et ensemencés sur un milieu 2,4-D (ou de développement) et les embryons sont sélectionnés par Àamisage. Ces Auteurs étudient plus particulièrement le râle de la a cyclodextrine sur la germination des embryons et décrivent un effet inhibiteur des 1-cyclo- dextrines sur la germination des embryons somatiques de carotte ainsi obtenus et la réversibilité de cet effet après lavage. Ils précisent, en outre, que les P-cyclo- dextrines ne modifient pas de manière significative la cinétique de croissance des cellules de carotte (phase d'induction), à faible concentration, alors qu'elles inhibent ladite croissance à des concentrations impor- tantes. J.L. -FOURRE et al. (Med. Fac. Landbouww. ?ijksuniv. Gent.,!391, -6(4a), 1449-1451) ont proposé la cuiture de cals e-mbryogéniques (masse proembryogénique) dun coni'ère, ?cea abies, sur un miiieu solide BM contenant de l'auxn--e!2,4-D, milieu d'induction), de la X nn -ne KIN), te -a benzyladénine et du saccharose g/l), jusque L'obtention d'embryons immatures; le Développement des embryons immatures en embryons matures est réalisé dans ie même milieu, sans auxines (2,4-D-, miiieu de développement) ou cytokinines, mais contenant de l'acide absc-ssique et 30 g/l de saccharose (milieu de maturation) L. r =.uRRE et al. décrivent en outre, un crocédé d'encapsu=-:aon des embryons somatiques de Picea uies cbtenus, qui =comprend le mélange des embryons soma- -iques matures avec _une solution d'alginate de sodium (1, _ ou C/v); 'es embryons en solution sont ajoutés, un a un, a une so=u:uon de chlorure de calcium; après incubazion, se =orme des billes d'alginate de calcium, -_ans lesquelles es embryons matures sont encapsulés. Les procédés de préparation des embryons soma- :ques matures uecri:s dans ces documents ne permettent cas d'obtenir un développement synchrone -c'est-à-dire sans chénomène d'embr- vogenèse secondaire- et conforme-c:'est-â-dire sans malformation- desdits embryons matures, icrs de ia terminaticn. En consequence, les Demandeurs se sont donné cour but, en mclifiant ie milieu de maturation, d'obtenir -es embêrons scmac,ues Presentant une germination homo- %ène es syncnrone des axes caulinaires et racinaires absence d'embrvoaenese secondaire) et pouvant être sto- 7kés ou non cendant plusieurs mois, sous la forme de raines ar;i - L e-s, stables et aptes à germer et à se ievelopper normalement dans des conditions convenables. C'est égalemen: un but de l'invention d'ob:enir une germinaticn régulière de points végétatifs car un passage dans un milieu de maturation particulier. La presente nv-.enion a pour objet un procédé = e preparation d'embr/ons scmatiques de végétaux, carac- -érise en ce qu'il comprend: (a) la culture d'embryons somatiques immatures sur un milieu de maturation comprenant entre 0,01 et mg/l, de préférence entre 0,05 et 1 mg/1, d'une 5- cyclodextrine hydrosoluble, pendant une période comprise entre 5 et 30 jours, pour l'obtention d'embryons matures aptes à une germination synchrone et vigoureuse, (b) puis la séparation et le lavage des embryons obtenus en (a). On entend notamment par stade immature, l'embryon somatique au stade globulaire. On entend par embryon mature, un embryon apte a la germination, notamment des embryons au stade tor- ille. UTJn tel procédé permet, lorsqu'il y a transfert sur un milieu de germination dépourvu de 5-cyclodextrine, l'obtention d'un développement homogène, vigoureux et sans malformation, des plantules. De manière inattendue, un tel procédé permet donc de contrôler la maturation des embryons somatiques. On entend par dérivé P-cyclodextrine hydroso- luble, des dérivés, tels que l'hydroxypropyl-5-cyclo- dextrine. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux 0 dudit procédé, le milieu de maturation comprend en outre, des macroéléments, des vitamines, au moins un acide aminé, un sel d'adénine, au moins un sucre, notamment du saccharose, au moins un polyol, notamment du mannitol et au moins une hormone de croissance, telle qu'une cytoki- nine. Les embryons somatiques peuvent être sélec- --onnes, et ce de maniere non limitative, parmi les embryons somatiques de café, de tomate, de tournesol, de iuzerne, de colza, de pois, de maïs ou de palmier. -n:e' procédé permet effectivement de resoudre le problème de la maturation et du développement ces embryons, ors de la germination des embryons matures, de façon synchrone et efficace: obtention de plantules homogènes, vigoureuses et sans malformation. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de points végétatifs matures, Caractérisé en ce qu'il comprend: (a) la culture de points végétatifs sur un milieu de maturation comprenant entre 0,01 et 10 mg/l, de - réreérenc_ entre 3,05 et i mg/l, d'une 5cyclodextrine nvydrosoluble, pendant une période comprise entre 5 et 30 ours, b) cuis a séparation et le lavage des points -vgeta:ifs obtenus en 'a). _es -oin-s véeégatifs peuvent être issus espèces véeétales selectionnées, et ce de manière non i-mztai:ve, parmi -es endives, les peupliers, les orchi- dées ou les pommes de terre. La crésente invention a également pour objet _ _n rccede e reparation de graines artificielles, :arac:rise en ce cuil comprend: *a) -a creparation d'embryons somatiques ou de ci....s vegéatifs mat-res, aptes à produire, après germi- nas-on, des ciansules présenrtant un développement homo- cene et sans malformation. ccnformément au procédé défini zi-dessus, :b) 'enrobage desdis embryons ou points veaetuarss avec un mélange d'enrobage comprenant au moins 1 00 mg/l de 5-cyclodextrine hydrosoluble, afin c'nduire la dormance et I à a % d'un hydrocolloide, et (c)!égouttage et le séchage des embryons ou oin:s v-égétatifs enrobés. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit Procédé, ledit mélange d'enrobage comprend, en outre, au moins L'un des composants suivants: une hor- mone végétale, des visamines, des fongicides. De maniere inattendue, la combinaison des traitements conformes à l'invention, à savoir utilisation d'un milieu de maturation assurant un déve- _J loppement synchrone et vigoureux des embryons et des autres points végétatifs précités, d'une part, et L'enrobage avec un mélange -cyclodextrine hydro- solubie/hydrocolloide, d'autre part, permet de contrôler de manière efficace, notamment dans le cadre d'une appli- cation industrielle, à la fois la conservation (dormance), la maturation et la germination des embryons somatiques ou des autres points végétatifs. En outre, l'enrobage desdits embryons ou autres points végétatifs à l'aide d'une solution 03 d'enrobage comprenant un dérivé hydrosoluble de P-cyclo- dextrine à une concentration 2 à 5 mg/l et un hydrocol- loide permet, après lavage, des rendements de germination particulièrement importants. Une gamme de concentrations en -cyclodextrine comprise entre 5 et 100 mg/l ralentit, puis freine consi- dérablement, jusqu'à l'inhiber, le développement des embryons au stade torpille. Ce blocage est réversible puisque les embryons bloques, soumis à un simple lavage, puis repiqués sur un milieu sans cyclodextrine reprennent leur développement vers la germination. On entend par hydrocolloides: - les polysaccharides: carboxyméthylcellu- loses sodiques), hydroxypropylcellulose, amidons, pec- tines, dextranomères, gommes naturelles (arabique, de zuar, de caroube, de karaya, adragante, xanthane), algi- nates, carraghénane, agar.... - les hydrocoiloides minéraux: argile.... - les polypeptides: gélatine, caséine, glu- Les graines artificielles ainsi constituées sont stockables pendant plusieurs mois, sans perte de eur pouvoir germinatif. Aucune caulogenèse ni rhizo- zenèse ne sont observées durant cette période. De plus, 0 aucune embryogenèse secondaire n'apparait, rendant homo- gene et synchrone l'état des semences artificielles ainsi Préparées. La levée de dormance est effectuée simplement par lavage des graines à l'eau. La croissance homogène et synchrone s'observe dans les conditions normales de tem- crature et de lumière requises par l'espèce. Outre es dispositions qui précèdent, -'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiron- de la description qui va suivre, qui se reéfre à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet fe a cresente invention. dl doit etre bien entendu, toutefois, que ces exempies sont donnés uniquement à titre d'illustration de _'oojet de ''invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1: Rôle du milieu ie maturation conforme à l'invention dans la synchronisation du développement des embryons. res embryons somatiques de caféier Arabica au stade ziobulalre sont placés dans des tubes à essai contenant un milceu de base (MB) liquide, constitué de macroéléments MS. du complexe vitaminique MS, tels que leftnis car MURASHIGE et SKOOG, de 50 mg/l de L-cystéine, e -:0 mg/l de sulfate d'adénine et de 500 mg/l d'extrait e malt. Ce milieu MB est additionné de 2 % de saccha- rose, de 2 % de mannitol et de 1,5 mg/1 d'une cytokinine, La benzylaminopurine (BAP). Après stéri!isation par ultrafiltration avec des filtres Acradisc ^D,2 um, de l'acide abscissique (ABA) ou de la 5CD sont ajoutés à différentes concentra- -ions: 0,05 mg/l, 0,1 mg/1, 0,5 mg/1 et 1 mg/l. Ensuite, cour chaque milieu, 3x100 embryons somatiques sont culti- vés, à i 'obscurité, sur un plateau vertical tournant à 50 tours par minute pendant 15 'surs. Après quoi, les embryons sont rincés trois fois avec du milieu de base MB liquide, puis sont mis à germer sur un milieu de germina- tion constitué de macroéléments et de microéléments MS dilués (MS l/4X), du complexe vitaminique MS dilué au demi et additionné de i % de saccharose, de 0,5 mg/1 de AIA (auxine), de 0,1 mg/i1 de kinétine (cytokinine) et de 0,1 mg/1 de GA3 (gibbérelline). La germination est évaluée après 60 jours de culture sur la base des critères suivants: allongement é et verdissement des cotylédons, élongation et verdisse- ment de l'hypocotyle, émergence et croissance des feuilles primaires et secondaires, formation et élonga- tion de la racine, vigueur des plantules, homogénéité dans le développement, dans la taille et dans la couleur25 des plantules. Le Tableau I ci-après montre l'effet de la JCD sur la germination ultérieure des embryons somatiques, en présentant le nombre de plantules germées ayant au moins deux paires de feuilles et une racine de 1 à 2 cm de long, après 60 jours de culture sur le milieu de germina- tion. TABLEAU I _oncen- Nombre moyen de Nombre moyen de -ration plantules ayant au plantules à une ABA ou moins 2 paires de racine de 1 à 2 cm e 3CD feuilles (mg/i) ABA CD ABA CD Moy- |car: Moy- júcar: Moy- Ecart Moy- Ecart er.nne - -ype erne - zype enne - type enne - type 0 40 2,08 40 2,08 16 1,00 16 1,00 0,05 44 6.,43 71 t4,42 31 4,16 65 13,45 | 3,1 46 3,22 68 4,93 31 2,30 61 4,36 C,_ 5 3 6,11 64 6,08 16 4,16 61 6,66 - l 0 3,51 60 6 5,35 14 2,52 56 5,20 -f Les vaieurs présentées sont les moyennes des -esures réalisées après 60 jours de culture, au cours de épcétitions ccmrortanc 100 embryons somatiques par m:-ieu et par repetinion. Ces résuitats montrent que chez les embryons 3 -cmacniues, dont _a maturation est réalisée en présence e 5CD, la croissance des feuilles et des racines est s:ni-icacivement superieure a celle des embryons soma- --zues dont ia maturation est réalisée en présence d'ABA. n effec,! a comparaison multcple des moyennes de 3 répé- --_ions moncre une différence significative au seuil a = e% ntre les concentrations de 0,1 mg/l, 0,5 mg/1 et - m.g/: d'ABA et de 5CD. Les différences concentrations de PCD sont ecuiv-.entes encre elles et permetcent unr meilleure s:rci-zssance des!euiles et des -_cnes que le témoin absence d'ABA ou de CD) et i'ABA. Les concentrations de mgi ez 0,1 mg/l d'ABA ont un effet supérieur aux =ncencrations de 0,5 mg/l et 1 mg/l d'ABA mais ne diffè- -ent pas significacivement du témoin. L'ABA et la PCD en milieu liquide de matura- -ion inhibent la germination précoce des embryons soma- --ques, que l'on observe sur le milieu témoin. Bien sue le milieu de maturation contenant z soit de 'ABA, soit de -a 5CD permette d'obtenir une ger- mination homogène après transfert des embryons somatiques matures sur milieu de germination, l'observation des plantules provenant de ces deux milieux de maturation (Tableau I) montre que les plantules provenant des embryons somatiques dont la maturation est réalisée en presence d'ABA sont significativement moins homogènes et moins développés que les plantules provenant des embryons somatiques, dont la maturation est réalisée en présence de CD. '. En effet: - les plantules provenant des embryons soma- -iques développés en milieu contenant 0,05 mg/1 et L mg/1 d'ABA mesurent 2 cm de haut; les feuilles sont petites et cassantes, les racines ont 1 à 2 cm de long et zcassent facilement lorsqu'on les retire du milieu de ger- mination, - les plantules provenant des embryons soma- tiques développés en milieu contenant 0,5 mg/1 et 1 mg/1 d'ABA sont plus grandes et plus vigoureuses que les pré- cédentes mais leur nombre est diminué de 50 %; ces Nlantes sont moins vertes, leurs feuilles sont jaunâtres, - les plantules provenant des embryons soma- tiques développés en milieu contenant 0,05 mg/l, 0,1 mg/1 et 0,5 mg/1 de 5CD sont très développées: elles mesurent -0 de 2 à 3 cm de haut et ont des racines de 2 à 3 cm de long. Il y a une plus grande homogénéité dans le dévelop- cement et un pourcentage plus élevé de plantules conformes, qu'avec le témoin ou en présence d'ABA; avec mg/1 de CD, les plantules développées atteignent 4 cm de haut avec des racines bien développées (3 à 4 cm de long). Ces résultats montrent: - que la phase de maturation des embryons somatiques est critique, - que l'incorporation de CD dans le milieu de maturation, an ayant des effets bénéfiques sur la matura- zion, entraîne, en outre, une germination significative- ment améliorée: on ne retrouve aucune anomalie de conformation telle que embryon bloqué au stade globu- laire, cotylédon déformé ou atrophié, hypertrophie de Y 'hypocotyle. EXEMPLE 2: Encapsulation d'embryons somatiques matures de caféier Arabica selon l'exemple 1. Les embryons somatiques au stade torpille après maturation, obtenus à l'exemple 1 sont mélangés dans une solution stérile d'alginate de sodium (de 1 à 4 % poids/volume) contenant de 5 à 100 mg/l d'hydroxyprcpyl--cyclodextrine. Mls sont ensuite plongés dans une solution stérile de CaClî, 0,1 M. Des billes d'alginate de calcium 0 se forment, incluant les embryons et la "CD bloquant la germination. On obtient ainsi des graines artificielles stockables rendant plus de 6 mois, à 15'C, sans perte de leur pouvoir germinatif. Aucune caulogenèse, ni rhizoge- nese ne scn: observées lors du stockage. De plus, aucune embryogenèse secondaire n'apparaît, rendant homogène et synchrone Les graines artificielles obtenues (voir exemple 4). EXEMPLE 3: Levée de la dormance des graines artifi- cielles selon l'exemple 2. Les graines obtenues à l'exemple 2 sont rin- cees à 'eau, puis sont mises à germer sur un milieu de germination tel que défini à l'exemple 1. La germination est évaluée comme à l'exemple On obtient des résultats similaires à ceux de l'exemple 1 (milieu de maturation contenant CD). La 5CD soluble utilisée dans le milieu de maturation a un effet de stimulation significatif sur la g ermination ultérieure -es embryons somatiques; une telle stimulation est, en outre, encore accrue lorsque les embryons somatiques sont enrobés dans une composition d'enrobage contenant de l'hydroxypropyl-PCD. EXEMPLE 4: Etude de la stabilité des graines artifi-!0 cielles selon l'exemple 2 pendant le stockage. Les graines obtenues à l'exemple 2 sont sto- ckées pendant 6 mois, à 15'C, et la caulogenèse, la rhi- zogenèse, l'embryogenèse somatique secondaire, le pour- centage d'embryons somatiques restant dormant et le pour- i5 centage de survie des embryons sont étudiés, à l'issue de cette période de 6 mois. Les résultats sont illustrés aux figures 1 à 6 dans lesquelles (1) représente les embryons somatiques non enrobés, (2) les embryons somatiques enrobés sans traitement ABA, ni PCD, après maturation, (3) les embryons somatiques enrobés après maturation, en présence de 20 mg/l d'ABA, (4) embryons somatiques enrobés après maturation, en présence de 1 mg/l de PCD, (5) embryons somatiques enrobés après maturation, en présence de 5 mg/l de PCD, (6) embryons somatiques enrobés après maturation, en présence de 10 mg/l de PCD. Ces différentes figures illustrent le nombre d'embryons somatiques: ayant formé des cotylédons (figures 1 et 3), - ayant formé des racines (figures 2 et 3), - ayant formé des embryons secondaires (figure 4), n'ayant pas germé (figure 5) et - vivants (figure 6). Les valeurs présentées sont les moyennes des observations réalisées au cours de trois répétitions de embryons somatiques par traitement. Les traits verti- caux portés sur certains des histogrammes représentent l'écart-type observé. Ces résu:ats montrent que les graines artifi- ielles conformes à l'invention peuvent être stockées aisément. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien- nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve- nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente inven- tion. REVENDICATIONS 1') Procédé de préparation d'embryons soma- tiques de végétaux, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) la culture d'embryons somatiques immatures sur un milieu de maturation comprenant entre 0,01 et mg/l, de préférence entre 0,05 et 1 mg/l, d'une 9- cyclodextrine hydrosoluble, pendant une période comprise entre 5 et 30 jours, pour l'obtention d'embryons matures, aptes à une germination synchrone et vigoureuse, (b) puis la séparation et le lavage des embryons obtenus en (a). 2') Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que le milieu de maturation comprend en outre, des macroéléments, des vitamines, au moins un acide aminé, un sel d'adénine, au moins un sucre, au moins un polyol, et au moins une hormone de croissance. 3') Procédé de préparation de points végéta- tifs matures, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) la culture de points végétatifs sur un milieu de maturation comprenant entre 0,01 et 10 mg/l, de préférence entre 0,05 et 1 mg/l, d'une 5-cyclodextrine hydrosoluble, pendant une période comprise entre 5 et 30 jours, (b) puis la séparation et le lavage des points végétatifs obtenus en (a). 4') Procédé de préparation de graines artifi- cielles, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) la préparation d'embryons somatiques matures ou de points végétatifs matures, aptes à pro- duire, après germination, des plantules présentant un développement homogène et sans malformation, conformément au procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, (b) l'enrobage desdits embryons ou points végétatifs avec un mélange d'enrobage comprenant au moins à 100 mg/1 de 1-cyclodextrine hydrosoluble et 1 à 4 % d'un hydrocollolde, et (c) l'égouttage et le séchage des embryons ou points végétatifs enrobés. -) Procédé selon la revendication 4, caracté- risé en ce que ledit mélange d'enrobage comprend, en outre, au moins l'un des composants suivants: une hor- mone végétale, des vitamines, des fongicides.