FR 2715665 A1 19950804 FR 9401016 A 19940131 UTILISATION DU GENE DE LA LUCIFERASE DE VIRGULA POUR LA SELECTION D'EMBRYONS TRANSGENIQUES. La présente Invention est relative à un procédé de sélection d'embryons transgéniques. La transgénèse est largement utilisée chez la souris, mais encore peu développée chez d'autres animaux, tels que les animaux de ferme. Cette situation s'explique par le coût important de cette technologie liée principalement au faible taux d'intégration d'un transgène dans le noyau transcriptionnellement actif de l'oeuf : on estime que chez la plupart des espèces domestiques, moins de 1% des embryons injectés qui se développent à terme après transfert dans une femelle receveuse sont transgéniques [MURRAY et al. (1989)], alors que ce taux est d'environ 10% chez la souris. Cette situation implique chez ces espèces de recourir à un nombre d'autant plus élevé d'embryons et de femelles receveuses. De ce fait, le coût du premier veau transgénique produit a été estimé à environ 3 millions de francs [SEIDEL, (1993)]. Pour diminuer ce coût, il a été proposé d'augmenter le taux d'intégration de l'ADN exogène en recherchant de nouveaux vecteurs s'intégrant plus facilement dans le génome de l'embryon. Cette approche n'a toutefois pas encore débouché actuellement sur des résultats applicables industriellement. Une autre voie, plus directe et potentiellement plus intéressante à court terme, consisterait à réaliser un tri des embryons transgéniques avant leur transfert. En effet, chez plusieurs espèces, ce n'est pas tant le coût de production de ces embryons qui constitue l'obstacle économique principal, que celui lié à l'accès à un grand nombre de femelles receveuses une fois l'injection réalisée : il faut par exemple chez les bovins, l'équivalent d'environ 150 receveuses pour produire un animal transgénique fondateur [HILL et al., (1992)]. Dans ces conditions, le coût technique de production de blastocystes microinjectés ne représente que seulement 10% du coût d'entretien du troupeau de receveuses. Le tri des embryons avant leur transfert peut remédier à cette situation et une littérature abondante est consacrée à ce sujet. Toutes les méthodes proposées à ce jour ont recours à la biopsie de morula ou de blastocystes, associée à la détection directe du transgène après amplification par PCR. Elles impliquent de manipuler les embryons individuellement plusieurs jours après les avoir microinjectés et en outre ne permettent de réaliser qu'un tri négatif en éliminant les embryons pour lesquels aucun signal n'est obtenu après amplification : ceux-ci représentent selon les auteurs 50% [HORVAT et al., (1993)] à 80% [SEIDEL, (1993), publication précitée] des blastocystes bovins issus d'oeufs microinj ectés. Le recours à une biopsie qui ne permet de réaliser un diagnostic que sur une partie des morula et blastocystes manipulés [THIBIER et NIBART, (1992)] se heurte à deux obstacles majeurs - d'une part, il compromet les possibilités de développement après congélation [HEYMAN et CHESNE, (1988)], ce qui constitue un obstacle important à la diffusion des embryons - d'autre part, il conduit à la détection d'embryons "faux positifs" (à cause de problèmes techniques lors de la réalisation de l'amplification) pouvant représenter jusqu'à 10% des embryons analysés [HORVAT et al., (1993), publication précitée], ainsi qu'à celle d'embryons "faux-transgéniques" [SEIDEL, (1993), publication précitée] car la plupart des méthodes ne permettent pas de distinguer véritablement 1'ADN intégré de celui qui ne l'est pas et qui sera progressivement dégradé aux stades ultérieurs de l'embryogenèse. Chez les bovins, environ 20% des embryons microinjectés au stade "une cellule se divisent ensuite normalement en culture, et la moitié des blastocystes obtenus (soit 10% des embryons injectés) sont détectés comme positifs [ROSCHLAU et al., (1989) ; HORVAT et al., (1993), publication précitée]. Or, 20% des blastocystes (et morula) issus d'oeufs injectés sont capables de donner un veau [PURSEL et REXROAD, (1993)]. De ces données il ressort que 2% des embryons injectés sont susceptibles de donner naissance à un animal transgénique. Il semble que ce pourcentage soit en réalité plus faible, de l'ordre de 0.2% [HILL et al., (1992), publication précitée] à 0.1% seulement [SEIDEL, (1993), publication précitée]. Cette différence traduit probablement le fait que pour une partie des blastocystes obtenus, 1'ADN injecté est sous forme non intégrée. La réalisation d'un tri positif permettant de repérer les embryons où 1'ADN injecté s'est effectivement intégré devient un objectif d'autant plus intéressant en pratique. La présente Invention se propose de lever ces deux obstacles, en permettant l'analyse des embryons au stade blastocyste (ou morula) par une méthode non invasive (qui ne fait pas appel à la micromanipulation), rapide, car permettant l'analyse de lots de blastocystes issus d'oeufs microinjectés, en ne retenant que ceux qui sont effectivement transgéniques, à un stade compatible avec leur conservation par congélation. Dans ce but, les Inventeurs ont eu l'idée d'effectuer l'injection d'un transgène simultanément avec un autre transgène rapporteur qui servirait à repérer les embryons où l'intégration s'est effectivement produite. Ceci nécessite toutefois de disposer d'un gène rapporteur s'exprimant chez l'embryon de manière aisément détectable, et de telle sorte que ni l'expression dudit gène, ni la détection de son activité ne compromettent la survie des embryons. De très nombreux gènes rapporteurs sont déjà utilisés en génie génétique pour sélectionner les cellules transformées. Parmi ceux qui sont utilisés dans des cellules eucaryotes, on citera par exemple l'alcool déshydrogénase [NIELSEN et PEDERSEN, (1991)], l'enzyme CAT, la 5-galactosidase ou la luciférase de luciole. Pour que ces systèmes rapporteurs soient compatibles avec une analyse in situ des cellules vivantes il faut les prétraiter, soit pour perméabiliser leurs membranes soit pour limiter le bruit de fond, qui augmente rapidement lors de la mesure en présence des substrats. Ce prétraitement implique des manipulations incompatibles avec une analyse rapide et en routine. L'utilisation de gènes rapporteurs dont le produit est sécrété dans le milieu pourrait lever ces obstacles. Tel est le cas avec la phosphatase alcaline du placenta humain, dont l'activité peut être détectée dans le milieu de culture par bioluminescence. Bien que sensible, cette méthode présente plusieurs inconvénients majeurs qui la rendent difficilement applicable pour la sélection d'embryons transgéniques : elle implique de cultiver les embryons séparément, de réaliser des prélèvements répétés dans le milieu de culture ; d'autre part la détection du signal est obtenue en deux étapes, ce qui entraîne une dilution rapide du signal dans le milieu environnant, rendant en pratique la mise en oeuvre délicate. Jusqu'à présent, le seul gène utilisé en tant que gène rapporteur pour le tri d'animaux transgéniques est un minigène de la tyrosinase qui transforme des souris albinos en souris pigmentées [OVERBEEK et al., (1991)], et qui a été mis en oeuvre chez la souris pour visualiser les nouveaux-nés transgéniques. Ce gène n'est toutefois pas utilisable pour une visualisation précoce avant transplantation des embryons injectés. Les Inventeurs ont maintenant sélectionné un gène rapporteur dont le produit est sécrété dans le milieu et aisément détectable : il s'agit du gène de la luciférase de Vargula (Vargula hilgendorfii) [THOMPSON et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6567-6571, (1989) THOMPSON et al., Gene, 199-204 (1990)]. L'activité de cette luciférase est détectable qualitativement et quantitativement par mesure de la luminescence induite dans le milieu, en présence de son substrat (luciférine), et d'O2 Le turn-over de la luciférase de Vargula est beaucoup plus élevé que celui des autres luciférases connues (1600 molécules par minute alors qu'il n'est que de quelques dizaines pour la luciférase de mouche), ce qui augmente d'autant la sensibilité de détection, et constitue un avantage important en imagerie de luminescence. Les Inventeurs ont en outre constaté que l'expression du gène de la luciférase de Vargula était détectable chez l'embryon dès les premiers stades du développement (stade 2 cellules), et n'interférait pas avec le développement ultérieur. Les Inventeurs ont en outre constaté que la détection du signal lumineux résultant de l'activité de la luciférase de Vargula pouvait être utilisée pour séparer au stade blastocyste les embryons qui expriment le transgène à l'état non-intégré (expression transitoire) de ceux où une intégration a effectivement eu lieu (embryon transgénique). La présente Invention a pour objet l'utilisation d'un gène codant pour la luciférase de Vargula, placé sous contrôle d'un promoteur approprié, en tant que gène rapporteur pour la détection d'embryons transgéniques. Un "promoteur approprié" est un promoteur fonctionnel dans les cellules eucaryotes, en particulier les cellules de mammifères ; n'importe quel type de promoteur utilisable pour l'obtention d'animaux transgéniques peut convenir ; à titre d'exemple, on citera le promoteur du cytomégalovirus, le promoteur de métallothionéine, celui de la thymidine kinase, celui du facteur d'élongation EF1. Pour une mise en oeuvre optimale de l'objet de l'Invention, on choisira de préférence un promoteur fort, afin d'obtenir une expression importante de la luciférase, ce qui augmente la sensibilité de la méthode. Les Inventeurs ont obtenu plusieurs lignées de souris transgéniques homozygotes dans lesquelles les séquences codantes du gène de la luciférase de Vargula sont placées sous la dépendance du promoteur HSP 70-1 [HUNT et CALDERWOOD, (1990)]. Cette construction sera dénommée ci-après HSP-70-1-VL. L'activité luciférase dans le milieu de culture de blastocystes prélevés sur des souris transgéniques possédant seulement 2 copies de la construction HSP-70-1-VL peut être directement visualisée, après simple addition du substrat de la luciférase, sous un microscope optique équipé d'une caméra. Cette visualisation est rapide (10 à 30 secondes d'accumulation d'image suffisent), peut être effectuée à plusieurs stades d'évolution du blastocyste et est compatible avec le criblage simultané de plusieurs embryons. Les Inventeurs ont en outre constaté que lorsque l'ensemble promoteur/gène de la luciférase de Vargula est flanqué en 5' et 3' de séquences SAR, le niveau moyen d'activité luciférase mesuré dans les milieux de culture de blastocystes portant cette construction intégrée dans le génome est augmenté de façon importante (environ 10 fois). Des séquences SAR (Scaffold Attached Regions) également dénommées séquences MAR (Matrix Attached Regions) ont été mises en évidence en 5' et 3' du gène de l'interféron ss humain, [BODE et MAASS, Biochemistry, 27, 4706-4711 (1988)]. D'autres séquences SAR ont également été mises en évidence en 3' et 5' de divers gènes : [KAS AND CHASIN, J. Mol. Biol. 198: 677-692, (1987) ; GASSER AND LAEMMLI, Cell 46: 521-530, (1986) ; COCKERILL AND GARRARD, Cell 44: 273-282, (1986) ; PHI-VAN AND STRATLING, EMBO, 7: 655-664, (1988) ; JARMAN AND HIGGS, EMBO 7: 3337-3344 (1988)]. I1 a été montré que ces séquences SAR augmentent, indépendamment de leur orientation, la transcription des gènes qu'elles flanquent, lorsque ceuxci sont à l'état intégré, mais en revanche répriment l'expression de ces gènes lorsque ceux-ci sont portés par une molécule d'ADN sous forme linéarisée [KLEHR et al., Biochemistry, 30, 1264-1270 (1991)]. D'autre part, les Inventeurs ont constaté que ces mêmes séquences SAR n'exercent pas d'effet stimulateur sur l'expression du gène qu'elles flanquent lorsque 1'ADN portant cette construction est présent à l'état non-intégré, mais sous forme super-enroulée, alors que les observations faites par KLEHR et al concernaient uniquement 1ADN linéaire déroulé. La présence de séquences SAR permet donc d'augmenter l'écart entre le niveau d'activité luciférase due à l'expression transitoire, et celui dû à 1expression de 1'ADN intégré. Les Inventeurs ont en outre également constaté que l'activité de stimulation de l'expression du trans gène par les séquences flanquantes SAR, qui est observée chez l'embryon, ne s'exerce plus dans les tissus différenciés des animaux transgéniques nouveaux-nés et adultes, ce qui offre l'avantage de limiter les risques d'interférence d'une production élevée de luciférase avec la physiologie des animaux. Le gène hétérologue dont on souhaite détecter l'intégration peut être placé sur le même fragment d'ADN que le gène chimérique rapporteur conforme à l'Invention. I1 peut également être situé sur un autre fragment d'ADN qui est alors co-injecté avec le fragment portant le gène chimérique rapporteur. On a en effet observé que la coinjection dans l'oeuf de souris d'ADN différents est compatible avec l'expression normale de chaque ADN dans l'animal adulte [EINAT et al. Genes Devel., 1, 1075-1084, (1987), OVERBECK et al., Transgenic Research, 1, 31-37, (1991)] Le gène hétérologue peut éventuellement être placé sous contrôle du même promoteur que le gène de la luciférase ; toutefois, il est préférable qu'il soit muni de ses propres séquences de contrôle (promoteur, enhancer, etc ...) La présente Invention a pour objet un gène chimérique, utilisable en tant que gène rapporteur pour détecter l'insertion d'un gène hétérologue, caractérisé en ce qu'il comprend - une séquence codant pour la luciférase de Vargula, laquelle séquence est placée sous contrôle d'un promoteur approprié - l'ensemble étant flanqué en 5' et 3' de séquences SAR. Les Inventeurs ont établi, avec différentes constructions conformes à l'Invention et comprenant des séquences SAR, plusieurs lignées de souris transgéniques. En quantifiant l'activité luciférase de leurs embryons, il est possible de mesurer finement l'effet de perturbations de l'environnement chromatinien sur l'activité du noyau embryonnaire à différents stades de la période préimplantatoire. La présente Invention peut être mise en oeuvre pour rendre utilisable en routine chez différentes espèces animales, y compris les mammifères, mais également d'autres animaux tels que les poissons, et en particulier chez les animaux d'élevage, le tri, à différents stades du développement, des embryons effectivement transgéniques après microinjection au stade pronoyau. Chez la souris, on sait que environ la moitié des blastocystes positifs pour la présence d'ADN exogène après injection au stade pronoyau (et détection après amplification par PCR) sont effectivement transgéniques. On peut utiliser cette espèce pour réaliser un calibrage des constructions en définissant lors de l'observation des embryons en microscopie de luminescence un temps seuil d'enregistrement des images obtenues, temps à partir duquel seule l'activité des morulas ou blastocystes transgéniques sera effectivement prise en compte. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de construction d'animaux transgéniques conformes à l'Invention, et de détection de l'activité luciférase chez les embryons de ces animaux. I1 doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 - CONSTRUCTION D'UN PLASMIDE COMPRENANT LE GENE DE LA LUCIFERASE DE VARGULA SOUS CONTROLE DU PROMOTEUR HSP70-1 Un fragment HincII de 800 pb comprenant les éléments essentiels du promoteur du gène HSP70-1 de souris [HUNT et CALDERWOOD, Gene, 87, 199-204, (1990)]., à savoir 4 éléments inductibles par choc thermique, disposés en tandem, et permettant la liaison de facteurs de transcription spécifiques du choc thermique ; une boîte CCAAT en orientation inverse; une boîte TATA en orientation inverse ; deux sites de liaison pour le facteur de transcription SP1, et un site de liaison pour le facteur de transcription AP2, a été obtenu à partir d'un fragment BglII-NcoI isolé d'un fragment EcoRI du plasmide pM2.3 de HUNT et CALDERWOOD (Gène 87, 199-204, 1990) et cloné au site HincII du plasmide pBluescript SK (STRATAGENE). Le plasmide ainsi obtenu a été dénommé pBHS Un fragment HindIII-BamHI de 2000 pb codant pour la luciférase de Vargula a été obtenu à partir du plasmide PRSWL [THOMSON et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6567-6571 (1989)] et cloné entre les sites Hind III et BamHI du vecteur pBHS. Le plasmide obtenu de la sorte a été dénommé pBHSVL. EXEMPLE 2 - CONSTRUCTION D'UN PLASMIDE COMPRENANT DES SEQUENCES SAR 3' et 5' D'autre part, des séquences SAR 5' et 3' ont été obtenues comme suit A partir d'une banque d'ADNc humain, il est possible d'amplifier la séquence du gène codant pour l'interféron ss, en utilisant des amorces appropriées, dérivées de la séquence publiée par OHNO et TANIGUCHI, [Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 5305-5309, (1981)]. Après purification du fragment amplifié par électrophorèse sur gel d'agarose, des sondes marquées au 32P sont obtenues par amorçage aléatoire à partir de ce fragment ; ces sondes sont alors utilisées pour cribler une banque d'ADN génomique humain, afin d'obtenir des clones génomiques comprennant les séquences flanquantes 5' et 3' du gène de l'interféron ss. A partir des clones génomiques obtenus, et en se basant sur la carte de restriction des régions SAR en 3' et 5' du gène de l'interféron ss qui a été publiée par BODE et MAASS, [Biochemistry, 27: 4706-4711, (1988)], l'on procède au sous-clonage d'un fragment EcoRI de 2,2 kb qui comprend la séquence SAR 5', et d'un fragment BglIII de 3 kb qui comprend la séquence SAR 3'. Le fragment BglIII de 3 kb a été cloné dans le site BamHI du plasmide pBHSVL décrit ci-dessus pour donner le plasmide pSHSVL. D'autre part, le fragment EcoRI de 2,2 kb préalablement pourvu à chacune de ses extrémités d'adaptateurs XhoI-EcoRI a été inséré dans le site XhoI de pSHSVL, en 5' du promoteur HSP70.1. Le plasmide obtenu a été dénommé pSHSVLS EXEMPLE 3 - OBTENTION DE SOURIS TRANSGENIQUES Les souris transgéniques ont été obtenues à partir des deux constructions différentes, pBHSVL (SAR ) et pSHSVLS (SAR+) obtenues selon les protocoles décrits respectivement aux exemples 1 et 2. Les fragments KpnI-BamHI de pBHSVL et KpnI NotI de pSHSVLS ont été purifiés à partir de gels d'agarose (kit GENE CLEAN ; BIO 101), et 1'ADN a été injecté à une concentration de 2ng/R1 dans les pronuclei d'oeufs fertilisés obtenus par croisement d'hybrides F1 (mâles et femelles) C57BL6/CDA. Les fondateurs transgéniques ont été identifiés par PCR en utilisant des amorces spécifiques du gène de la luciférase de Vargula. Le nombre de copies du gène a été déterminé par analyse densitométrique de transferts de Southern réalisés de façon quantitative. Après identification des fondateurs, ceux-ci ont été croisés entre eux afin d'obtenir des animaux homozygotes pour le transgène. EXEMPLE 4 - OBTENTION DES EMBRYONS ET DES TISSUS D'ANIMAUX TRANSGENIQUES 1) Embrvons Une surovulation a été induite chez des hybrides F1 femelles C57BL6/CBA, en injectant 10U de gonadotropine de sérum de jument gestante (PMSG INTERVET) dans 0,1 ml de sérum physiologique, cette injection étant suivie 46 à 48 heures plus tard par l'injection de 5U de gonadotropine chorionique humaine (HCG ; INTERVET), dans 0,1 ml de la même solution. Les femelles traitées ont été accouplées avec des mâles transgéniques homozygotes pour le transgène, et des embryons au stade 1 cellule ont été récupérés dans les oviductes 21 à 23 heures après l'injection d'HCG. Les embryons ont été placés dans des gouttes de milieu M16 [HOGAN et al., Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y. (1986)] à une densité d'environ 1 embryon/ml de milieu de culture. Les embryons ont été cultivés en incubateur, à une température de 37 C et en présence de 8% C02. L'expression constitutive est mesurée tout au long de la période de culture en prélevant un peu de milieu à des intervalles de temps souhaités, et en le remplaçant à chaque fois par du milieu frais. Chaque fraction prélevée est immédiatement congelée à -80'C jusqu'à la détection de l'activité luciférase. Pour déterminer l'expression inductible au stade blastocyte, des boîtes de cultures contenant des blastocytes (101-112 heures après HCG) scellées au moyen d'un film d'étanchéité, ont été immergées dans un bain d'eau à 43 C pendant 30 minutes. Le film d'étanchéité a été enlevé, et les boîtes placées à nouveau dans l'incubateur à 37 C. La luciférase de Vargula commence à s'accumuler dans le milieu après environ 3 heures. On peut suivre la cinétique d'accumulation par des prélèvements successifs, ou mesurer la quantité totale accumulée à la fin de la culture. 2) Tissus d'anlmaux transaéniaues Des femelles de génération F1 de la lignée hybride C57BL6/CBA ont été accouplées avec des mâles homozygotes pour le transgène. Les gestations ont été menées à terme, et deux lots d'animaux ont été choisis pour les expérimentations : ou bien des souriceaux de 1 jour, ou des adultes de 5 semaines. Les animaux ont été sacrifiés et des échantillons de tissu prélevés. EXEMPLE 5 - DETERMINATION DE L'ACTIVISTE LUCIFERASE L'activité de la luciférase sécrétée par les embryons est analysée par deux méthodes différentes 1ère méthode On prélève un aliquot du milieu de culture des embryons. Cet aliquot est alors dilué avec 200 mM de Tris-HCl, pH 7,6, jusqu'à un volume de 100 ru. L'échantillon ainsi dilué est placé au fond d'un tube de mesure de 5 ml (SARSTEDT) et introduit dans la chambre de mesure d'un photomètre LUMAT LB 9501 (BERTHOLD Instruments). La luciférine, substrat de la luciférase de Vargula, est préparée selon l'un des protocoles décrits par TSUJI [Methods Enzymol. 57, 364-372, (1978)], ou par KISHI et al., [Tetrahedron Lett., 3445-3450, (1966)], INOUE et al.[Tetrahedron Lett., 1609-1610, (1969)], SUGIURA et al., [Yakugaku Zasshi, 90, 707-710 (1970]. Une solution 100 nM de luciférase dans 200 mM de tampon phosphate de sodium à pH 6,8 est placée dans un récipient de verre dans lequel on fait barboter en continu de l'argon (afin de prévenir l'auto-oxydation de la luciférine). Pour mesurer l'activité luciférase de l'échantillon, 100 1 de la solution de luciférine est injectée dans le tube comprenant l'échantillon, et l'intensité de la lumière émise est mesurée par le photomètre. 2ème méthode : L'activité luciférase peut également être visualisée directement sous microscope, muni d'une caméra (Argus-50, HAMMAMATSU instruments). Des gouttes de 2 1 d'une solution 50 ÂM de luciférine dans du tampon PBS sont disposées dans la chambre de microscopie, et recouvertes d'huile. Les embryons sont introduits dans ces gouttes, et l'ensemble est placé sous un microscope à inversion muni d'une caméra. Après exposition pendant une période de 10 à 30 secondes, la luminescence émise par les embryons transgéniques qui ont intégré le gène de la luciférase est détectée, ce qui permet la sélection des embryons. RESULTATS I1 est connu que le gène HSP70-1 s'exprime de façon constitutive chez l'embryon au stade 2-cellules et est inductible par le choc thermique au stade blastocyte [BENSAUDE et al., Nature, 305, 331-333, (1983)]. Le développement in vitro des embryons transgéniques contenant les constructions avec les séquences SAR, ou sans celles-ci, est le même que celles des embryons non transgéniques utilisés comme contrôle. Les lignées SAR+ montrent une expression plus élevée que les lignées SAR- aussi bien au stade 2-cellules qu'au stade blastocyte. Au stade 2-cellules, toutes les lignées SARmontrent pratiquement le même niveau basal d'expression, qui n'apparaît pas dépendant du nombre de copies. En revanche, les lignées transgéniques SAR+ expriment la luciférase à des niveaux plus élevés, et l'expression est fonction du nombre de copies. En moyenne, on observe une expression 6 fois plus élevée dans le groupe SAR+ que dans le groupe SAR-. Lorsque cette expression est ramenée au nombre de copies, on observe une augmentation 2 fois et demi plus élevée dans le groupe SAR+ que dans le groupe SAR-. Au stade blastocyte, le même type d'observations a été fait : les lignées SAR- expriment la luciférase de façon indépendante du nombre de copies, alors que dans les lignées SAR+ l'expression de la luciférase est en corrélation positive avec le nombre de copies. L'expression par copie dans les lignées SAR+ est 4,1 fois plus importante que l'expression par copie dans les lignées SAR-. Les résultats de l'expression dans les tissus d'animaux nouveaux-nés et d'adultes montrent qu'il n'y a plus de stimulation de l'expression du transgène par les séquences flanquantes SAR dans les tissus différenciés, à l'exception toutefois des biopsies de queue, dans lesquelles il semble que les séquences SAR confèrent encore un certain degré de stimulation de l'expression du transgène. En outre, l'expression du transgène décroît de la souris nouveau-né à la souris adulte dans le cas des lignées SAR-, alors que dans le cas des lignées SAR+ elle est sensiblement équivalente quelque soit l'âge de 1 'animal. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'un gène codant pour la luciférase de Vargula, placé sous contrôle d'un promoteur approprié, en tant que gène rapporteur pour la détection d'embryons transgéniques. 2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit promoteur est le promoteur HSP70-1. 3) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'ensemble promoteur/gène de la luciférase de Vargula est flanqué en 5' et 3' de séquences SAR. 4) Gène chimérique, utilisable en tant que gène rapporteur pour détecter l'insertion d'un gène hétérologue, caractérisé en ce qu'il comprend - une séquence codant pour la luciférase de Vargula, laquelle séquence est placée sous contrôle d'un promoteur approprié - l'ensemble étant flanqué en 5' et 3' de séquences SAR. 5) Animal transgénique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une copie du gène codant pour la luciférase de Vargula, sous contrôle d'un promoteur approprié. 6) Animal transgénique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend un gène chimérique selon la revendication 4. 7) Animal transgénique selon l'une quelconque des revendictions 5 ou 6 caractérisé en ce que ledit animal est un mammifère. 8) Embryon d'un animal selon une quelconque des revendications 5 à 7.