FR 2721215 A1 19951222 FR 9507095 A 19950614 1 2721215 La présente invention concerne des analogues monomères de l'insuline humaine. Plus spécifiquement, la présente invention concerne diverses formulations parentérales, qui comprennent un analogue monomère de l'insuline, du zinc, de la protarrmine et un dérivé phénolique. Les formulations fournissent une durée d'action prolongée. Un procédé pour la préparation des formulations d'analogues de l'insuline-protamine est également décrit. Depuis l'introduction de l'insuline dans les années 1920, des progrès continus ont été réalisés de manière à améliorer le traitement du diabète sucré. Des avances majeures ont été réalisées dans la pureté et la disponibilité de l'insuline avec le développement de la technologie de l'ADN recombinant. Diverses formulations avec des actions différentes dans le temps ont également été développées. Actuellement, il existe généralement sept formulations d'insuline disponibles dans le commerce: l'insuline normale, l'insuline semilente, l'insuline globine, l'insuline isophane, une suspension d'insuline-zinc, de l'insuline de zinc-protamine et l'insuline ultralente. Malgré la large gaimmne de formulations disponibles, la thérapeutique d'injection souscutanée ne réussit toujours pas à fourmir au patient une régulation pratique et un contrôle normalisé de la glycémie. Les écarts fréquents des niveaux normaux de glycémie au cours de la vie d'un patient mènent à une hyperglycémie ou à une hypoglycémie, il y a des complications à long terme, y compris la rétinopathie, la neuropathie, la néphropathie et la micro- et la macroangiopathie. Pour aider à éviter des niveaux alycémiques extrêmes, les personnes diabétiques pratiquent souvent une thérapeutique par injections multiples, l'insuline étant administrée après chaque repas. Cependant, cette thérapeutique n'a pas encore été optimisée. L'insuline présentant l'action la plus rapide qui est disponible dans le commerce présente son pic trop tard après l'injection et dure trop longtemps pour contrôler de manière optimale les taux de glucose. Récemment, un effort considérable a été consenti pour créer des formulations d'insuline et des formulations d'analogues de l'insuline qui altèrent la cinétique du procédé d'absorption souscutanée. Puisque toutes les formulations pharmaceutiques commerciales de l'insuline contiennent l'insuline dans l'état d'auto-association et surtout sous forme d'hexamère du zinc, on pense que l'étape limitative de la vitesse pour l'absorption de l'insuline à partir du 2 2721215 dépôt d'injections souscutanées dans la circulation sanguine est la dissociation de l'hexamère auto-agrégé de l'insuline. Récemment, des analogues monomères de l'insuline ont été développés qui ont moins tendance à s'associer en formes à poids moléculaire plus élevé que l'insuline humaine. Ce manque d'auto-association est dû à des modifications dans la séquence en acides aminés de l'insuline humaine qui diminue l'association en interrompant primairement la formation de dimères. Voir par exemple Brems et coll., Protein Engineering 5: 6, 527 533 (1992) et Brange et coll., Nature, 333: 679 - 682 (1988). Par conséquent, les analogues monomères de l'insuline présentent un départ d'activité relativement plus rapide tout en maintenant l'activité biologique de l'insuline humaine native. Ces analogues de l'insuline fournissent une absorption rapide de manière à ramener le temps d'injection et l'action maximale de l'insuline plus près de l'écart du glucose après le repas en réponse à celui-ci. Les propriétés et les caractéristiques physiques des analogues monomères ne sont pas analogues à l'insuline. Par exemple, Brems et coll. révèlent que de nombreux analogues monomères ne présentent pas ou peu d'association induite par Zn. Toute association qui est observée est due dans la plupart des cas à un multitude de formes à poids moléculaire plus élevé. Ceci differe de manière dramatique de l'insuline, qui se trouve presque exclusivement dans une conformation ordonnée, hexamère en présence de zinc. Brange et coll., Diabetes Care 13: 923-954 (1990). Le manque d'association entraîne des caractéristiques d'action rapide des analogues. Parce que les analogues présentent une tendance plus faible à s'associer, il est assez surprenant qu'un analogue monomère de l'insuline puisse être formulé de façon à fournir une durée intermédiaire d'action. La présente invention fournit une formulation d'analogue monomère de l'insuline qui fournit à l'utilisation une durée d'action intermédiaire. L'invention fournit en outre un nouveau cristal de protamine appelé analogue de l'insuline-NPD. La présente invention fournit également un mélange d'analogue de l'insuline-NPD et d'analogue monomère de l'insuline soluble. Ce mélange fournit un départ rapide d'action et une durée d'action intermédiaire. Par conséquent, le mélange présente des avantages tant par rapport à l'insuline que par rapport à l'analogue monomère. La présente invention fournit en outre un procédé pour préparer des cristaux uniformes de l'analogue de l'insuline-NPD. 3 2721215 Cette invention fournit une formulation d'analogue de l'insulineprotamine, qui comprend: un analogue monomere de l'insuline, de la protamine, du zinc et un dérivé phénolique. L'invention fournit en outre un complexe cristallin d'analogue de l'insuline- protamine. Ce complexe a été défini en tant qu'analogue de l'insulineNPD. La LysB2ProB29-insuline humaine-NPD comprend: une LysB28ProB29insuline humaine, environ 0,27 à environ 0,32 mg de protamine/100 U d'analogue de l'insuline, environ 0,35 à environ 0,9 % en poids de zinc et un dérivé phénolique. Cette invention fournit en outre un procédé pour préparer la LysB2SProB29- insuline humaine-NPD, qui comprend: la combinaison d'une solution aqueuse de LysB2SProB29-insuline humaine dans un état d'association hexamère, et une solution de protamine à une température d'environ 8 O à environ 22 C; ladite solution aqueuse comprenant d'environ 0,35 à environ 0,9 % en poids de zinc, de la LysB2SProB29-insuline humaine et un dérivé phénolique à un pH d'environ 7,1 à environ 7,6; ladite solution de protamine comprenant une protamine à un pH d'environ 7,1 à environ 7,6, de telle façon que la concentration finale de protamine est d'environ 0,27 à environ 0,32 mg de protamine/100 U d'analogue de l'insuline. L'invention fournit également des formulations qui présentent tant une action rapide qu'une action intermédiaire. Les formulations sont des mélanges d'analogue monomère de l'insuline et d'analogue de l'insulineNPD cristallin, dans lesquelles le rapport massique des deux composants est d'environ 1 - 99: 99 - 1. Finalement, l'invention fournit une méthode pour traiter un patient souffrant du diabète sucré, qui comprend l'administration audit patient d'une composition pharmaceutique contenant des cristaux d'analogue de l'insuline-protamine. La FIGURE 1 est une représentation graphique du profil d'action de la LysB28Pro29-hI-NPD et de l'insuline humaine-NPH. Le graphe représente des JlIU/ml en fonction du temps de perfusion. La figure démontre les avantages de la présente invention. 4 2721215 La FIGURE 2 présente une image de cristaux d'AspBeS-insuline humaine- protamine de la présente invention. L'image a été réalisée avec un agrandissement de 1.000 fois par contraste différentiel de phase. La FIGURE 3 présente une image de cristaux dLysB2SProB2hI-protamine de la présente invention. L'image a été réalisée avec un agrandissement de 1.000 fois par contraste différentiel de phase. Tel que noté ci-dessus, l'invention fournit diverses formulations d'un analogue monomère de l'insuline. Les termes "analogue monomère de l'insuline" ou "analogue de l'insuline", tels qu'ils sont utilisés ici, représentent un analogue de l'insuline à action rapide qui présente une tendance moindre à la dimérisation ou à l'auto-association. Un analogue monomère de l'insuline est l'insuline humaine dans laquelle Pro à la position B28 est substituée par Asp, Lys, Leu, Val ou Ala; et Lys à la position B29 représente la lysine ou la proline; dés(B28 - B30); ou dés(B27). Les analogues monomères de l'insuline sont décrits dans Chance et coll., demamde de brevet EP No. 0 383 472, et dans Brange et coll., demamde de brevet EP No. 0 214 826, et sont introduits ici à titre de référence. L'homme de métier admettrait que d'autres modifications de l'analogue monomère de l'insuline sont possibles. Ces modifications sont largement acceptées dans le domaine et comprennent le remplacement du résidu d'histidine à la position B 10 par l'acide aspartique; le remplacement du résidu de phénylalanine à la position B1 par l'acide aspartique; le remplacement du résidu thréonine à la position B30 par l'alanine; le remplacement du résidu sérine à la position B9 par l'acide aspartique; la délétion des acides aminés à la position B 1 seule ou en combinaison avec une délétion à la position B2; et la délétion de la thréonine de la position B30. Toutes les abréviations d'acides aminés utilisées dans la présente révélation sont celles acceptées par l'office de brevet et de marques des États-Unis d'Amérique telles que présentées dans 37 C.F.R. 1.822 (b) (2). Des analogues monomères de l'insuline particulièrement préférés sont la LysB2ProB29-insuline humaine (B28 est Lys; B29 est Pro) et l'AspB28-insuline humaine (B28 est Asp). Le terme "analogue monomère de l'insuline-NPD" ou "analogue de l'insuline- NPD" représente une suspension d'analogue cristallin de l'insuline et de protamine dans une formulation. NPD représente une formulation de Protamine Neutre conformément à 2721215 DeFelippis. La composition est préparée conformément au procédé revendiqué décrit dans ce document. Un terme apparenté "cristaux d'analogue de l'insuline-NPD", "analogue cristallin de l'insuline-NPD", ou "cristaux de LysB2SProB29insuline humaine- protamine" fait référence à des cristaux d'analogue de l'insulineprotaniine dans la formulation NPD. Le terme "traitement", tel qu'il est utilisé ici, décrit la direction et les soins d'un patient dans un but de combattre la maladie, la condition ou le désordre et comprend l'administration d'un composé de la présente invention de façon à empêcher le départ des symptômes ou des complications, pour alléger les symptômes ou les complications ou pour éliminer la maladie, la condition ou le désordre. Le terme "agent d'isotonicité" fait référence à un agent qui est toléré physiologiquement et qui entraîne une tonicité appropriée à la formulation de façon à empêcher un flux net d'eau à travers la membrane cellulaire. Des composés, tels que la glycérine, sont communément employés dans un tel but à des concentrations connues. La concentration de l'agent d'isotonicité se situe dans la gamme connue dans le domaine pour des formulations de l'insuline. Le terme "dérivé phénolique" représente le m-crésol, le phénol ou de préférence un mélange de m-crésol et de phénol. Le terme "base de base libre" indique la quantité de protamine dans la formulation. La base de base libre tient compte de la teneur en eau et en sel des sels de protamine disponibles dans le commerce et habituellement utilisés dans les formulations parentérales. La protamine préférée, le sulfate de protamine, représente environ 80 % de protamine. Le terme "IU" ou "U" représente l'unité internationale. Le terme "rapport isophane" représente la quantité d'équilibre de protamine nécessaire pour complexer l'analogue tel que décrit par Krayenb hl et Rosenberg, STENO MEMORIAL HOSPITAL REPORT (COPENHAGEN), 1: 60 (1946). Le rapport isophane est déterminé par titrage d'une manière bien connue dans le domaine et est décrit dans Krayenbuhl, et coil. La présente invention fournit une formulation d'analogue de l'insulineprotamine, qui comprend: un analogue monomère de l'insuline, de la protamine, du zinc et un dérivé phénolique. La concentration de protamine vaut de préférence environ 0,2 à environ 1,5 6 2721215 mg de protamine pour 100 U d'analogue de l'insuline sur une base de base libre. De la manière la plus préférée, la gamme de protamine se situe à environ 0,27 mg/100 U à environ 0,35 mg/100 U. La concentration de zinc s'élève à environ 0,35 à environ 0,9 % en poids. De préférence, la concentration de zinc est d'environ 0,7 %. Le dérivé phénolique est le m-crésol, le phénol ou un mélange de m- crésol et de phénol. De préférence, le dérivé phénolique est le m-crésol et le phénol. La concentration de dérivé phénolique est connue par les hommes de métier. Les concentrations doivent être suffisantes pour maintenir une efficacité de conservation, c'est-à-dire, retarder la croissance microbienne. En général, la concentration de composé phénolique se situe par exemple dans la gamme de 1,0 mg/ml à 6,0 mg/ml; de préférence supérieure à environ 2,5 mg/ml. La concentration la plus préférée est d'environ 3 mg/ml. La présence d'un dérivé phénolique est cruciale, parce que celui-ci agit de façon à complexer l'analogue, la protamine et le zinc en plus du fait de servir d'agent conservateur. Cependant, on pense que seulement une molécule de phénol est liée par molécule d'analogue de l'insuline dans la structure cristalline. De préférence, un agent d'isotonicité est ajouté à la formulation. L'agent d'isotonicité préféré est la glycérine. La concentration de l'agent d'isotonicité vaut par exemple 14 mg/ml à 18 mg/ml, de préférence environ 16 mg/ml. Le pH de la formulation peut être tamponné avec un tampon toléré physiologiquement, de préférence un tampon phosphate, tel que le phosphate de sodium dibasique. D'autres tampons tolérés physiologiquement comprennent le TRIS, l'acétate de sodium ou le citrate de sodium. Le choix et la concentration du tampon sont connus dans le domaine. En général, la concentration se situe par exemple entre environ 1,5 mg/ml et ,0 mg/ml; de préférence 3,8 mg/ml. La présente invention fournit en outre des conditions spécifiques dans lesquelles l'analogue de l'insuline-protamrnine existe sous forme d'un cristal stable. Des formulations de ces cristaux sont définies en tant qu'analogue de l'insuline-NPD. L'analogue de l'insuline-NPD est une suspension formulée de cristaux d'analogue de l'insuline-NPD et fournit suite à l'utilisation une durée d'action intermédiaire. Le profil de l'activité de l'analogue de l'insuline-NPD est assez surprenant à la lumière du manque d'auto- association de l'analogue monomère. 7 2721215 La capacité à former une formulation à action intermédiaire avec un analogue monomère est démontrée à la FIGURE I. La FIGURE I révèle un profil d'action pour la LysBSProB29-hI-NPD et pour l'insuline humaineNPH. Le profil de la NPD est similaire à celui de l'insuline-NPH. La durée d'action pour la formulation NPD et celle pour la formulation de l'insuline-NPH sont approximativement égales. Cependant, ce qui est le plus significatif est le fait que la présente formulation augmente plus rapidement et reste stable pendant une période plus longue que l'insuline-NPH. Cette différence est assez inattendue à la lumière du profil d'action rapide de l'analogue monomère. Une formulation particulièrement préférée d'analogue de l'insulineprotamine, la LysB ProB2-insuline humaine-NPD, comprend: la LysB28ProB29-insuline humaine, environ 0,27 à environ 0,32 mg de protamine/100 U d'analogue de l'insuline, environ 0,35 à environ 0,9 % en poids de zinc et un dérivé phénolique. La concentration de protamine vaut de préférence 0,3 mg/100 U sur une base de base libre. L'invention fournit également un procédé pour la préparation de cristaux de Lys2SProB29-insuline humaine-protamine qui comprend: la combinaison d'une solution aqueuse de LysB28ProB29-insuline humaine dans un état d'association hexamere et une solution de protamine à une température d'environ 8 à environ 22 C; ladite solution aqueuse comprenant d'environ 0,35 à environ 0,9 % en poids de zinc, de la LysB2SProB29-insuline humaine et un dérivé phénolique à un pH d'environ 7,1 à environ 7,6; ladite solution de protamine comprenant la protamine à un pH d'environ 7,1 à environ 7,6 de telle façon que la concentration finale de protamine est d'environ 0,27 à environ 0,32 mg de protamine/100 U d'analogue de l'insuline. Au moment de l'invention, on savait que les analogues monomeres de l'insuline présentaient une tendance moindre a s'associer et à former des hexamères. Les conditions nécessaires pour provoquer l'association des analogues monomères de l'insuline avec la protamine pour former des cristaux étaient inconnues au préalable dans le domaine. Des études précédentes concernaient l'insuline. La description concernant la préparation de l'insuline-NPH (formulation de protamine neutre conformément à Hagedomrn) ou de formulations d'insuline isophane par Krayenbuhl et Rosenberg, STENO MEMORIAL HOSPITAL REPORT (COPENHAGEN), 1: 60 (1946) ne sont pas pertinentes vu les 8 2721215 propriétés distinctes des analogues monomères de l'insuline. En fait, le procédé commercial pour produire lHumulin-N"M (insuline-NPH), un procédé acide-neutre, ne produit pas d'analogue de l'insuline-NPD cristallin. De la manière la plus significative, on a trouvé que les paramètres dans le présent procédé, c'est-à-dire, la température de cristallisation et la formation d'un complexe hexamère de l'analogue de l'insuline, de zinc et du dérivé phénolique sont des limitations cruciales à la formation de cristaux stables de LysB2SProB29-hI-NPD. La température de la cristallisation doit se situer entre environ 8 C à environ 22 C, de préférence de 13 C à 17 C. Si la température se trouve à l'extérieur de cette gamme, une formulation largement amorphe d'analogue de l'insuline-protamine en est le résultat. nl est également crucial que l'analogue de l'insuline soit transformé en un état hexamère avant la cristallisation. Le résultat de la cristallisation est un produit amorphe lorsque le procédé est réalisé avec un état d'association monomère. Des cristaux se forment sans agitation en 5 à 36 heures. Des cristaux de bonne qualité se forment généralement en 24 heures. L'analogue monomère de l'insuline soluble est complexé en un état d'association hexamère par mise en suspension de l'analogue monomère solide dans un diluant contenant le dérivé phénolique et en ajoutant du zinc jusqu'à ce que la concentration se situe entre environ 0,35 % à environ 0,9 % en poids. Le zinc est de préférence ajouté sous forme d'un sel. Des exemples représentatifs de sels de zinc comprennent l'acétate de zinc, le bromure de zinc, le chlorure de zinc, le fluorure de zinc, l'iodure de zinc et le sulfate de zinc. L'homme de métier reconnaîtra qu'il existe de nombreux autres sels de zinc qui pourraient également être utilisés dans le procédé de la présente invention. De préférence, on utilise l'acétate de zinc ou le chlorure de zinc. La dissolution de l'analogue de l'insuline dans le diluant peut être favorisée par ce qu'on appelle communément une dissolution acide. Dans une dissolution acide, le pH est diminué à une valeur d'environ 3,0 à 3, 5 avec un acide toléré physiologiquement, de préférence II-CI, de façon à augmenter la solubilité de l'analogue. D'autres acides tolérés physiologiquement comprennent l'acide acétique, I'acide citrique et l'acide phosphorique. Le pH est ensuite ajusté avec une base tolérée physiologiquement, de préférence le NaOH 9 2721215 jusqu'à environ 7,1 à 7,6 pour la cristallisation. D'autres bases tolérées physiologiquement comprennent le KOH et l'hydroxyde d'ammonium. De la manière la plus significative, le procédé de production du complexe LysBmSPro29-hI-NPD est sensible à la concentration en NaCI. Si la concentration dépasse environ 4 mg/ml, les cristaux de l'analogue de l'insuline-NPD se mélangent avec le produit amorphe. Par conséquent, on préfèere que l'analogue monomère soit dissous à pH neutre de fac,çon à éviter la formation d'ions salins. En variante, l'analogue peut être dissous dans le diluant à un pH acide avant l'addition du tampon Ceci réduit la concentration des sels générés par l'ajustement du pH. Cependant, l'ordre dans lequel les constituants sont ajoutés n'est pas crucial pour la formation de l'hexamère ou de la formulation amorphe. Tel que révélé précédenmment, un agent d'isotonicité peut être ajouté aux formulations de la présente invention. L'addition de l'agent d'isotonicité peut s'effectuer à la solution d'analogue, à la solution de protamine ou à la formulation finale d'analogue de l'insuline-NPD. De la même manière, l'addition du tampon toléré physiologiquement peut être effectuée à la solution d'analogue, à la solution de protamine ou à la formulation finale d'analogue de l'insuline-NPD. Cependant, il est préféré que tant la solution d'analogue que la solution de protamine contiennent l'agent d'isotonicité et le tampon avant la combinaison de la solution aqueuse et de la protamnine. À cause des effets du NaCI sur le procédé de production d'analogue de l'insuline-NPD cristallin, la glycérine est l'agent d'isotonicité préféré. L'invention fournit également des formulations d'analogues de l'insuline, qui comprennent des mélanges d'analogue de l'insuline-NPD sous forme d'un solide cristallin et d'analogue soluble de l'insuline. Ces mélanges peuvent être préparés dans une gamme d'environ 1: 99 à 99:1, par volume d'analogue de l'insuline-NPD en suspension par rapport à l'analogue de l'insuline soluble. L'analogue de l'insuline soluble est un analogue monomère de l'insuline dissous dans un diluant aqueux comprenant: du zinc, un dérivé phénolique, un agent d'isotonicité et du tampon. Les concentrations décrites dans le diluant sont les mêmes que celles précédemment révélées dans ce document. De préférence, le rapport d'analogue de l'insuline-NPD à l'analogue soluble de l'insuline vaut 25: 75 à 75: 25; et d'une manière plus préférée 50: 50. Les mélanges sont aisément préparés par mélange des constituants individuels. 2721215 Les formulations mélangées de la présente invention sont particulièrement appropriées pour le traitement du diabète sucré à cause de la combinaison d'un départ d'action rapide et d'une durée prolongée. Ces mélanges permettent un "contrôle fin" en variant la quantité de chacun des constituants individuels sur base des besoins, du régime et de l'activité physique du patient. Le mélange d'analogue de l'insuline-NPD en suspension et d'analogue de l'insuline soluble représente également un avantage parce qu'ils sont homogènes, c'est-à- dire, tout échange à l'équilibre entre les cristaux en suspension et l'analogue de l'insuline soluble est transparent. Les analogues de l'insuline de la présente invention peuvent être préparés par n'importe laquelle d'une grande variété de techniques de synthèse reconnues de peptides, y compris les méthodes classiques (en solution), les méthodes en phase solide, les méthodes semi-synthétiques et les méthodes plus récentes d'ADN recombinant. Par exemple, Chance et coll., demamde de brevet EP No. 0 383 472, et Brange et coUll., demamrde de brevet EP No. 0 214 826, révèlent la préparation de divers analogues monomères. Les exemples suivants sont fournis uniquement pour illustrer davantage la préparation des analogues de l'insuline et l'invention. L'étendue de la présente invention n'est pas censée être constituée uniquement des exemples suivants. Exemple 1 Préparation de LysB2SProB29-hI-NpD Une solution de LysSProB29-insuline humaine (LysB2SProB2-hI) à une concentration de 200 IU/ml (U 200) a été préparée en dissolvant des cristaux contenant du zinc de LysBSProB29-hI dans un système d'agent conservateur/tampon contenant: 1,6 mg/ml de m-crésol, 0,73 mg/ml de phénol (équivalent à 0, 65 mg/nml de phénol calculé à 89%), 16 mg/ml de glycérine et 3,78 mg/ml de tampon de phosphate de sodium dibasique. Le taux de zinc endogène dans les cristaux a été complété en ajoutant un volume approprié d'une solution de ZnO acide (10 mg/ml) de façon à obtenir une concentration finale de 0,025 mg/100 IU (0,7 %). La dissolution de la LysB2SProB29-hI a été accomplie à température ambiante en diminuant le pH à environ 3 avec des volumes de l'ordre du pl d'HCl 5 M. Après la clarification de la solution, le pH a été réajusté à 7,5 avec des volumes de l'ordre du pl de NaOH 5 M. 1 1 2721215 Une solution de protamine a été préparée en dissolvant suffisamment de sulfate de protamrine solide dans la solution d'agent conservateur/tampon de façon à obtenir une concentration finale de 0,6 mg/100 IU calculée sur une base de base libre. Le pH de cette solution a été ajusté à 7,5 et équilibré à 15 C. Les deux solutions ont été diluées à la concentration finale avec de l'eau pour injection et filtrées. Des aliquotes de 5 ml de la sous- section LysB2SProB29-hI ont été conditionnés dans des fioles en verre propres séparées, et les échantillons ont été incubés dans un bain d'eau à 15 C. Après un temps approprié pour l'équilibre (15 minutes), la précipitation a été induite en ajoutant rapidement 5 ml de solution de protamine aux échantillons de LysB2SProB29-hI. On a laissé la cristallisation progresser pendant environ 24 heures à 15 C. Exemple 2 Préparation de LysB28ProB29 -hI-NPD Le procédé est identique à celui de lExemple 1, sauf que la dissolution de la LysB2ProB29-hI se produit à pH neutre. Le procédé a été réalisé de telle façon que le pH final était de 7,4. Exemple 3 Préparation de Lys28ProB29-hI-NPD L'analogue de l'insuline-NPD a été préparé d'une manière analogue à celle de lExemple 1, mais la dissolution acide de la LysB28ProB29-hI a été réalisée en présence de tous les excipients à l'exception du tampon de phosphate de sodium dibasique. Du phosphate de sodium dibasique solide est ajouté après que la solution d'analogue de l'insuline a retrouvé un pH de 7,4. L'addition de phosphate de sodium dibasique a clarifié la solution. Exemple 4 Préparation de formulations de mélanges d'analogue de l'insuline-NPD Des mélanges de formulations de LysB2SProB29-hI à action intermédiaire et rapide sont préparés de la manière suivante. La préparation de la suspension à action intermédiaire est préparée par les méthodes décrites à lExemple 3 et sert de section à 12 2721215 action intermédiaire pour le mélange. Une solution séparée de LysB2 ProB -hI (100 IU) est préparée en dissolvant des cristaux de LysB2SProB29-hI contenant du zinc à température ambiante dans le diluant décrit à l'Exemple 1. Le taux de zinc endogène de la LysBSProB29-hI dans cette solution est complété par l'addition d'une solution de ZnO acide de façon à faire correspondre le taux dans la section en suspension (c'est-à-dire, 0,025 mrg/100 IU (0,7 %)). De l'eau pour injection est utilisée pour diluer la solution à la concentration finale après que le pH a été ajusté à 7,4, en utilisant des solutions à 10 % d'HCl et/ou de NaOH. Cette solution est la section à action rapide des mélanges. Le mélange final est préparé en combinant des volumes appropriés des sous- sections à actionintermédiaire et rapide de façon à obtenir le rapport souhaité. Un mélange 50/50 est préparé en combinant une part de la section à action intermédiaire avec une part de la section à action rapide par volume. Exemple 5 Effet de la force ionique sur la cristallisation de la LysB2SProB29-hIprotamine L'effet de la force ionique sur la cristallisation à été déterminé en ajoutant du NaCI à la section de LysB2SProB29-hI avant le mélange avec la protamine. Du NaCl a été ajouté de telle façon que la concentration totale était de 20, 30 et 40 mM (1,2, 1,8, et 2,3 mg/ml). La taille volumique des particules a montré un comportement multimodal (des pics supplémentaires aux petites tailles de particules) au fur et à mesure que la concentration de NaCl a été augmentée. La taille volumique moyenne des particules a diminué au fur et à mesure que la concentration en NaCI a été augmentée, ce qui indique une augmentation dans le matériel amorphe. Les résultats de la taille des particules en fonction de la concentration en NaCI sont les suivants: [NaCI] Taille volumique moyenne des particules (gtm) 13 mM 3,9 mM 3,5 mM 3,3 mM 3,2 13 2721215 L'analyse au microscope a montré que tous les échantillons contenaient un mélange de matériel amorphe et cristallin. L'échantillon contenant du NaCl 40 mM était constitué principalement de matériel amorphe et de très peu de cristaux. Exemple 6 Dynamiques comparatives de la LysB2:ProB29-hI-NPD et de l'insuline humaine-NPH Cette étude a été réalisée dans un modèle de chien conscient. Avant le début de l'étude, trois échantillons de base ont été prélevés. Une perfusion de somatostatine (0,3 gg/kg-min) a été initiée. Après un intervalle de 10 minutes, une injection sous- cutanée soit de NPD, soit de NPH a été administrée. La surveillance fréquente du glucose plasmatique a été initiée et une perfusion variable de glucose (20 %) a été administrée de telle façon à maintenir une glycémie proche de la normale. Des échantillons ont été prélevés tout au long de l'étude et ont été analysés du point de vue de l'insuline immunoréactive (anticorps Linco) et du point de vue du glucose. Les résultats sont illustrés à la FIGURE 1. Exemple 7 Préparation de cristaux d'analogue Asp(B28)-protamine Une soussection d'Asp(B28)-hI à une concentration de 200 IU/ml (U 200) a été préparée en dissolvant une masse lyophilisée (pureté de 95 %) dans un système d'agent conservateur/tampon contenant: 1,6 mg/ml de m-crésol, 0, 73 mg/ml de phénol (équivalent à 0,65 mg/ml de phénol calculé à 89 %), 16 mg/ml de glycérine et 3,78 mg/ml de phosphate de sodium dibasique. Du zinc a été ajouté au système en utilisant un volume approprié d'une solution de ZnO acide (10 mg/ml) de façon à obtenir une concentration finale de 0,025 mg/100 IU. La dissolution d'Asp(B28) a été réalisée à température ambiante à un pH neutre. Le pH final de la section était de 7,4. Une cristallisation a été réalisée de la manière décrite à l'Exemple 2. Les concentrations finales en protamine de 0,3 mg/100U, 0,35 mg/100U et 0,4 mg/100 U ont été étudiées. Ces concentrations de protamine correspondent à 2,9 %, 9,3 % et 10,5 % respectivement sur une base de poids/poids. Les températures d'incubation comprenaient 5 C (0,3 mg/100 U uniquement), 15 C et 22 C. Après 24 heures à ces températures, les échantillons ont été analysés du point de vue de la 14 2721215 formation de cristaux. Les résultats tels qu'ils ont été déterminés par microscopie, illustrent un mélange comprenant peu de cristaux et du produit amorphe. Exemple 8 Préparation de cristaux d'analogue Asp(B28)-protamine La cristallisation de la protamine Asp(B28) a été réalisée de la manière décrite à l'Exemple 7, sauf que la protamine ait d'abord été dissoute dans un diluant exempt de tampon. L'addition de la solution-mère de ZnO acide a été suffisante pour acidifier l'échantillon à pH 2,0 à 2,5. Après la clarification de la solution, le pH a été réajusté à environ pH 7 avec des volumes de l'ordre du!ll de NaOH 5 N. Du phosphate de sodium dibasique a été ajouté en utilisant une solution-mère concentrée à 47,25 mg/ml de façon à obtenir la concentration finale de 3,78 mg/ml. La sous- section a été ajustée à pH 7,4 en utilisant des quantités de l'ordre du pl de HCI. La cristallisation a été initiée en combinant les sections Asp(B28) et protamine de la manière décrite dans les exemples précédents. Les concentrations finales en protamine de 0,3 mg/100 U, 0,35 mg/IOOU et 0,4 mg/100U ont été étudiées. Les températures d'incubation comprenaient 15 C et 22 C. Après 24 heures à ces températures, les échantillons ont été analysés quant à la formation de cristaux. Les résultats tels qu'ils ont été déterminés par microscopie illustrent un mélange de cristaux et de matériel amorphe. Exemple 9 Préparation de cristaux d'analogue Leu(B28)Pro(B29)-protamine Une sous-section de Leu(B28)Pro(B29) (pureté de 93 %) à une concentration de 200 IU/ml (U 200) a été préparée de la manière décrite à l'Exemple 8 en utilisant une dissolution acide de la masse suivie par un ajustement du pH avec du NaOH 5 N jusqu'à pH 7,4. La cristallisation a été réalisée de la manière décrite ci- dessus. Les concentrations finales en protamine de 0,3 mg/100 U, 0,35 mg/100 U et 0,4 mg/100 U ont été étudiées. Les températures d'incubation comprenaient 5 C, C et 22 C. Après 24 heures à ces températures, tous les échantillons contenaient quelques cristaux, mais étaient principalement amorphes tel que déterminé par microscopie. 2721215 Exemple 10 Cristaux de dés(B27)hI-protamine Une sous-section de désThr(B27) (pureté de 97,37 %) à une concentration de 200 IU/ml (U 200) a été préparée de la manière décrite à l'Exemple 8 en utilisant une dissolution acide de la masse suivie par un ajustement du pH avec du NaOH 5 N jusqu'à pH 7,4. Une cristallisation a été réalisée de la manière décrite ci-dessus. Les concentrations finales en protamine de 0,3 mg/100U, 0,35 mg/100 U et 0,4 mg/100 U ont été étudiées. Les températures d'incubation comprenaient 15 C et 22 C. Après 24 heures à ces températures, tous les échantillons étaient principalement amorphes tel que déterminé par microscopie. D'une manière qualitative, des cristaux ont été observés. Exemple 11 Dés(B28-B30)hI-protamine Une sous-section de dés(28-30) (pureté de 96,3 %) à une concentration de 200 IU/ml (U 200) a été préparée de la manière décrite à l'Exemple 8 en utilisant une dissolution acide de la masse suivie par un ajustement du pH avec du NaOH 5 N jusqu'à pH 7,4. Une cristallisation a été tentée en utilisant la méthode de combinaison neutre/neutre des sections de protéine et de protamine de la manière décrite ci-dessus. Les concentrations finales en protamine de 0,3 mg/100 U, 0,35 mg/100 U et 0,4 mg/100 U ont été étudiées. Les températures d'incubation comprenaient 15 C et 22 C. Après 24 heures à ces températures, tous les échantillons étaient principalement amorphes tel que déterminé par microscopie. D'une manière qualitative, des cristaux ont été observés. Les cristaux sont bien définis. Exemple 12 Analogue Asp(B28)-protamine Une solution d'insuline Asp(B28)-analogue de l'insuline humaine a été préparée en dissolvant 16,6 mg de la protéine dans 1 ml d'une solution contenant 3,2 mg/ml de m-crésol, 1,3 mg/ml de phénol et 32 mg/ml de glycérine. Un aliquote de 14,4 pl d'une solutionmère de zinc acide (10 mg/ml de Zn2+, préparé par dissolution de 0, 311 g d'oxyde de zinc dans 5 ml d'HCI à 10 % et par dissolution jusqu'à 25 ml 16 2721215 avec de l'eau) a été ajouté. Le pH de la solution était de 2,3, ce qui a permis la dissolution complète de la protéine. Un aliquote de 10 gl de NaOH à 10 % a été ajouté de façon à ajuster le pH à une valeur de 7,06. A la solution on a ajouté 100 pl de phosphate de sodium dibasique 0,28 M, pH 7,0 qui a augmenté le pH de la solution à une valeur de 7,27. Un aliquote de 870 pl d'eau pour injection a été ajouté à la solution. Du HCI à 10 % (1 pl) et du NaOH (0,7 pil) supplémentaires ont été ajoutés et le volume final de la solution a été porté à 2 ml avec de l'eau pour injection, entraînant un pH final de 7,26. La solution a été filtrée à travers un filtre de type Supor Acrodiscl13 de 0,2 pm (Gelman Sciences) avant l'utilisation. Des solutions-mères de protamine ont été préparées par dissolution de sulfate de protamine dans une solution contenant 1,6 mg/ml de m-crésol, 0,65 mg/ml de phénol, 16 mg/ml de glycérine et 14 mM de phosphate de sodium dibasique. Le pH final de la solution a été ajusté à 7,3. La concentration finale en protamine était de 0,60 mg/100 U sur une base de base libre. Les deux solutions ont été filtrées à travers des unités de filtre (Millipore Sterivexm-GV) de 0,22 pm avant l'utilisation. La cristallisation a été réalisée en mélangeant la solution d'Asp(B28)insuline humaine dans un rapport 1: 1 à une température contrôlée de la manière décrite dans le Tableau 1. Les conditions du mélange final étaient de 3,94 mg/ml d'Asp(B28)- insuline humaine, 0,0359 mg/ml (0,9 %) d'ions de zinc, 1,6 mg/ml de mcrésol, 0,65 mg/ml de phénol, 16 mg/ml de glycérine, 14 mM de phosphate de sodium dibasique et 0,30 mg/100 U de protamine à un pH de 7, 3. De manière spécifique, des portions de -200 pl de la solution d'AspB28-insuline humaine ont été transférées dans des fioles en verre, et les échantillons ont été équilibrés à 4, 8, 15 ou 23 (température ambiante) C. Des portions des deux solutions de protamine ont été également équilibrées à ces températures. Après 15 à 20 minutes, un volume équivalent de l'une ou de l'autre solution de protamine a été pipeté dans des échantillons d'Asp(B28)- insuline humaine. Le mélange a été agité doucement, recouvert et ensuite laissé au repos à une température contrôlée pendant la période de cristallisation. Tous les échantillons ont été examinés par microscopie après 24 heures et ils se sont avérés être principalement amorphes. Après 48 heures, l'échantillon contenant 0,30 mg/100 U de protamine et incubé à 15 C a montré des quantités importantes de cristaux sous forme d'aiguilles et un peu de matériel amorphe. 17 2721215 Exemple 13 Une solution d'insuline Asp(B28)-analogue de l'insuline humaine a été préparée en dissolvant 10,62 mg de la protéine dans 0,71 ml d'une solution contenant 3,2 mg/ml de m-crésol, 1,3 mg/ml de phénol et 32 mg/ml de glycérine. Un aliquote de 10,2 M1 d'une solution-mère de zinc acide (10 mg/ml de Zn2', préparé par dissolution de 0,311 g d'oxyde de zinc dans 5 ml dHClI à 10 % et par dissolution jusqu'à 25 ml avec de l'eau) a été ajouté. Le pH de la solution était de 2,3, ce qui a permis la dissolution complète de la protéine. Un aliquote de 6,5 Ml de NaOH à 10 % a été ajouté de façon à ajuster le pH à une valeur 7,00. A la solution on a ajouté 71 Ml de phosphate de sodium dibasique 0,28 M, pH 7,0 qui a augmenté le pH de la solution à une valeur de 7,26. Un aliquote de 620 pl d'eau pour injection a été ajouté à la solution. Du HCI à 10 % (0,2 ll) et du NaOH (0,6 Ml) supplémentaires ont été ajoutés et le volume final de la solution a été porté à 1,42 ml avec de l'eau pour injection, entraînant un pH final de 7,42. La solution a été filtrée à travers un filtre de type Supor Acrodisc13 de 0,2 lm (Gelman Sciences) avant l'utilisation. Une solution-mère de protamine a été préparée par dissolution de sulfate de protamine dans une solution contenant 1,6 mg/ml de m-crésol, 0,65 mg/ml de phénol, 16 mg/ml de glycérine et 14 mM de phosphate de sodium dibasique. Le pH final de la solution a été ajusté à 7,4, et la concentration finale en protamine était de 0,60 mg/100 U sur une base de base libre. La solution a été filtrée à travers une unité de filtre (Millipore Sterivex'-GV) de 0,22 gm avant l'utilisation. La cristallisation a été réalisée en mélangeant la solution d'Asp(B28)insuline humaine dans un rapport 1: 1 avec la solution de protamine de la manière décrite à lExemple 12 à des températures contrôlées de 13 C, 15 C, 17 C et 23 C. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1. Les conditions de mélange final étaient de 3,74 mg/ml d'Asp(B28)- insuline humaine, 0,0359 mg/ml (0,9 %) d'ions de zinc, 1,6 mg/ml de m- crésol, 0,65 mg/ml de phénol, 16 mg/ml de glycérine, 14 mM de phosphate de sodium dibasique et 0,30 mg/100 U de protamine à un pH de 7,4. On a étudié 4 températures différentes de cristallisation. Un aliquote de 1 ml d'AspB28- insuline humaine équilibré à 15 C a été mélangé avec 1 ml de la solution de protamine ajustée à la même température. Après agitation douce, la préparation a été laissée au repos à 15 C. Un autre échantillon a été préparé en équilibrant 100 M1 de 18 2721215 la solution d'Asp(B28)-insuline humaine a 13 C, et en combinant ensuite celui-ci avec pl de la solution de protamine ajustée à la même température. Le mélange final a été incubé à 13 C. Le troisième échantillon a été préparé d'une manière similaire, sauf que les deux aliquotes de 100 gl ont été équilibrés, combinés et ensuite incubés à 17 C. La solution finale a été préparée en mélangeant des aliquotes de 80 kil de solutions d'Asp(B28)-insuline humaine et de protamine équilibrés à température ambiante et en incubant celle-ci à température ambiante (23 C). Tous les échantillons ont été évalués par microscopie après 24 heures et à d'autres intervalles de temps ultérieurs tels qu'énumérés dans le Tableau 1. 19 2721215 Tableau 1 Conditions' de cristallisation et résultats de la microscopie [AspB2] [protamine] Température Temps Résultat de la microscopieb (mg/ml) (mg/100 U) ( C) (heures) 3,94 0,30 15 24 amorphe 48 cristallin 72 cristallin 96 cristallin cristallin 3,94 0,30 23 24 amorphe 48 amorphe 72 amorphe 3,74 0,30 13 24 amorphe cristallin/amorphe 48 cristallin/amorphe 69 cristallin/amorphe 3,74 0,30 15 24 amorphe/cristallin cristallin 48 cristallin 69 cristallin 3,74 0,30 17 24 amorphe/quelques cristaux cristallin/amorphe 48 cristallin/amorphe 69 cristallin/amorphe 3,74 0,30 23 24 amorphe amorphe/quelques cristaux 48 amorphe/quelques cristaux 69 amorphe/quelques cristaux * Toutes les solutions contenaient également 0,9 % d'ions de zinc, 1,6 mg/ml de m-crésol, 0,65 mg/ml de phénol, 16 mg/ml de glycérine et 14 mM de phosphate de sodium dibasique, pH 7,4. b Le résultat de la cristallisation a été évalué par microscopie à un agrandissement de 600 x (microscope de type Nikon Optiphot 66) ou à 1. 000 x (microscope de type Zeiss Axioplan avec un contraste d'interface différentiel). Les deux microscopes ont été équipés d'accessoires pour la photographie. Les cristaux préparés en accord avec les exemples ci-dessus sont illustrés à la Figure 2 et à la Figure 3. 2721215 REVENDICATIONS 1. Complexe d'analogue de l'insuline-protamine, qui comprend: de l'insuline humaine dans laquelle Pro à la position B28 est substitué par Asp, Lys, Leu, Val ou Ala, et Lys à la position B29 est Lys ou Pro, la dés(B28-B30)-insuline humaine ou la dés(B27)-insuline humaine; de la protamine; du zinc et un dérivé phénolique; pour autant que si l'insuline est l'AspB2 -insuline humaine, la concentration en protamine est inférieure à 10 % en poids. 2. Complexe selon la revendication 1, qui est la LysB2ProB29-insuline humaine, environ 0,27 à environ 0,32 mg de protamine/100 IU d'analogue de l'insuline, environ 0,35 à environ 0,9 %0 en poids de zinc et un dérivé phénolique. 3. Complexe selon la revendication 1, qui est la Asp321-insuline humaine, environ 0,27 à environ 0,35 mg de protamine/100 1U d'analogue de l'insuline, environ 0,35 à environ 0,9 % en poids de zinc et un dérivé phénolique. 4. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3, dans lequel le complexe est cristallin. 5. Formulation pharmaceutique parentérale d'analogue de l'insuline- protamine, qui comprend le complexe selon la revendication 1, 2, 3 ou 4. 6. Formulation selon la revendication 5, qui comprend en outre environ 0, 2 à environ 1,5 mg de protamine/100 IU d'analogue de l'insuline; environ 0,35 à environ 0,9 % en poids de zinc; et un dérivé phénolique. 7. Formulation pharmaceutique parentérale selon la revendication 6, qui B28 B '*9 comprend: la Lys B2Pro 29-insuline humaine, environ 0,27 à environ 0,32 mg de protamine/100 IU d'analogue de l'insuline et environ 0,35 à environ 0,9 % en poids de zinc. 21 2721215 8. Formulation pharmaceutique parentérale selon la revendication 6, qui comprend: l'AspB2S-insuline humaine, environ 0,27 à environ 0,35 mg de protamine/100 IU d'analogue de l'insuline et environ 0,35 à environ 0,9 % en poids de zinc. 9. Formulation pharmaceutique parentérale, qui comprend: la LysB2SProB29- insuline humaine, environ 0, 3 mg de protamine/100 IU d'analogue de l'insuline, environ 0,7 % en poids de zinc, environ 1,7 mg/ml de m-crésol, environ 0,7 mg/ml de phénol, environ 16 mg/ml de glycérine et environ 3,78 mg/ml de phosphate de sodium dibasique. 10. Formulation pharmaceutique parentérale selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, qui comprend en outre un analogue soluble de l'insuline. 1i1. Formulation pharmaceutique parentérale, qui comprend: un mélange d'analogue soluble de l'insuline et de cristaux d'analogue de l'insulineprotamine; dans laquelle le rapport en poids des deux composants vaut environ 1: 99 à 99: 1 d'analogue de l'insuline aux cristaux d'analogue de l'insuline-protamine; ledit analogue de l'insuline est l'insuline humaine dans laquelle Pro à la position B28 est substitué par Asp, Lys, Leu, Val ou Ala, et Lys à la position B29 est Lys ou Pro, la dés(B28-B30)-insuline humaine ou la dés(B27)-insuline humaine; pour autant que si l'insuline est l'AspB2S-insuline humaine, la concentration en protamine est inférieure à 10 % en poids. 12. Formulation pharmaceutique parentérale selon la revendication 11, dans laquelle le rapport en poids des deux composants est d'environ 75: 25 à 25: 75. 13. Formulation pharmaceutique parentérale selon la revendication 12, qui comprend: la LysB2SProB29-insuline humaine et des cristaux de LysB28ProB29-insuline humaine-protamine. 22 2721215 14. Formulation pharmaceutique parentérale selon la revendication 13, dans laquelle le rapport en poids des deux composants vaut 50: 50, 75: 25 ou 25: 75. 15. Formulation pharmaceutique parentérale selon l'une quelconque des revendications 5 a 14, pour l'utilisation dans le traitement du diabète sucré. 16. Procédé pour la préparation du complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, qui comprend: le fait de combiner un analogue monomère de l'insuline, de la protamine, du zinc et un dérivé phénolique dans un solvant aqueux et de laisser le complexe se former. 17. Procédé pour la préparation de cristaux de LysB2SProB29-insuline humaine-protamine, qui comprend: la combinaison d'une solution aqueuse de LysB2 ProB29-insuline humaine dans un état d'association hexamère, et une solution de protamine à une température d'environ 8 à environ 22 C; ladite solution aqueuse comprenant d'environ 0,35 à environ 0,9 % en poids de zinc, de la LysB2SProB29-insuline humaine et un dérivé phénolique à un pH d'environ 7,1 à environ 7,6; ladite solution de protamine comprenant la protamine à un pH d'environ 7,1 à environ 7,6 de telle façon que la concentration finale de la protamine est d'environ 0, 27 à environ 0,32 mg de protamine/100 IU d'analogue de l'insuline. 18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel la température vaut 15 C; la concentration en zinc est de 0,7 % à 0,9 % en poids; et la concentration en protamine vaut 0,3 mg/100 IU d'analogue de l'insuline. 19. Procédé pour la préparation de cristaux d'AspB2S-insuline humaine- protamine, qui comprend: 23 2721215 la combinaison d'une solution aqueuse d'AspB28-insuline humaine dans un état d'association hexamère, et une solution de protamine à une température d'environ 13 à environ 17 C; ladite solution aqueuse comprenant d'environ 0,35 à environ 0,9 % en poids de zinc, de l'AspB2S-insuline humaine et un dérivé phénolique à un pH d'environ 7,1 à environ 7,6; ladite solution de protamine comprenant la protamine à un pH d'environ 7,1 à environ 7,6 de telle façon que la concentration finale de la protamine est d'environ 0,27 à environ 0,32 mg de protamine/100 IU d'analogue de l'insuline. 20. Procédé pour la préparation d'une formulation pharmaceutique parentérale selon l'une quelconque des revendications 5 à 14, qui comprend: la suspension de cristaux d'analogue de l'insuline-protamine dans un diluant pharmaceutiquement acceptable.