FR 2719309 A1 19951103 FR 9504909 A 19950425 NITRATES DE [1,3-14C2]-GLYCEROL MAROUES ET LEUR PROCEDE DE PREPARATION La présente invention a pour objet des nitrates de glycérol nouveaux, marqués, présentant une activité spécifique élevée, ainsi qu'un procédé permettant leur préparation. La présente invention a plus particulièrement pour objet les nouveaux dinitrates de [1,3-14C2]- glycérol, c'est-à-dire les [1,3-14C2]-glycérol-1,2-dinitrate et [1,3-14C2]-glycérol-l,3-dinitrate nouveaux ainsi qu'un procédé permettant la préparation de ces composés. Selon un autre aspect, la présente invention a égale- ment pour objet un procédé de préparation de trinitrate de [1,3-14C2]glycérol présentant une activité spécifique élevée. L'activité spécifique des nitrates de glycérol mar- qués selon la présente invention est extrêmement élevée et environ égale à 135 mCi/millimole. Le nitroglycérol est l'agent anti-angineux le plus efficace et le plus largement utilisé. Pour des études de pharmacocinétique et de biodégradation et pour l'étude du métabolisme, des techniques de marquage fiables sont re- quises. Ces tests nécessitent la préparation d'agents radioactifs hautement purs qui présentent une stabilité appropriée et qui peuvent être mesurés avec une précision fiable et mis en évidence, même lorsqu'ils sont présents en des quantités extrêmement faibles. La mesure d'échantillons biologiques contenant un agent actif de l'ordre de grandeur de 10-12 g nécessite la préparation d'un agent radioactif qui présente une ac- tivité spécifique extrêmement élevée. Cette exigence est une condition préalable fondamentale. Cela signifie que deux atomes de 14C "pratiquement" exempts de support doi- vent être incorporés dans la molécule contenant trois atomes de carbone (l'incorporation d'un atome de 14C conduit à une activité maximale d'environ mCi/millimole). R:\12800\12027 DOC - i avril 1995 - 1/13 Bien qu'il existe une référence dans l'art antérieur relative à la préparation de trinitrates de [1,3-14C2]- glycérol présentant une activité spécifique de 40-50 mCi/millimole - J.J. DiCarlo et M.D. Melgar: Biochem. Pharmacol. 19, 1371 (1970), J.W. Lawrie: Glycerol and Glycols, page 318, Catalog. Co., New York (1928) - dans le cas de composé marqué contenant en moyenne moins de un atome de 14C par molécule, la désignation de la position de l'atome de 14C indique une apparition statistique. D'autre part, les composés selon la présente invention contiennent deux atomes de carbone 14C qui sont présents dans plus de 95% des molécules à la position indiquée. De plus, l'activité spécifique extrêmement élevée constitue une condition préalable pour qu'il soit approprié pour une utilisation pour la finalité donnée. Il est connu que, dans les composés marqués avec des atomes de carbone radioactifs, une radiation-s, due à la présence de l'atome radioactif, induit souvent des procé- dés de décomposition drastiques dans la molécule support et la vitesse de cette décomposition augmente considéra- blement avec l'activité spécifique. Il est également connu que le nitroglycérol radio-inactif est un composé très instable susceptible de se décomposer. Ceci explique clairement que, outre les critères décrits ci-dessus, une stabilité adéquate pendant une période de temps désirée est également une condition préalable décisive pour une utilisation pour la finalité donnée. La présente invention a pour objet des nitrates de glycérol marqués de pureté élevée (supérieure à 99%), présentant une activité spécifique extrêmement élevée (supérieure à 135 mCi/millimole) et une stabilité appro- priée (supérieure à 30 jours). Cette radioactivité spéci- fique est supérieure aux valeurs divulguées dans l'art antérieur. L'objet exposé ci-dessus est résolu selon la présente invention par les nouveaux [1,3-14C2]-glycérol- 1,2-dinitrate et [1,3-14C2]-glycérol-1,3-dinitrate pre- sentant une activité spécifique extrêmement élevée (supérieure à 135 mCi/millimole) et par le trinitrate de R \12800\12827 DCC - 18 avril 1995 - 2/13 [1,3-14C2]-glycérol présentant une activité spécifique supérieure à la valeur indiquée ci-dessus. La présente invention a pour objet un procédé de pré- paration de dinitrate de [1,3-14C2]-glycérol qui comprend l'élimination du carbonate de baryum radioactif présen- tant dans le dioxyde de carbone; la réduction du dioxyde de carbone ainsi obtenu dans un solvant organique inerte; la réaction du dérivé aldéhydique sous la forme 14C ainsi obtenu avec du nitrométhane; la réduction du dérivé [1,3- 14C2]-dihydroxy-acétone ainsi obtenu dans un solvant or- ganique inerte; la nitration du dérivé de [1,3-14C2]-gly- cérol ainsi obtenu avec un mélange d'acide nitrique et d'acide sulfurique; et la séparation du mélange de [1,3- 14C2]-glycérol-1,2-dinitrate et de [1,3-14C2]-glycérol- 1,3-dinitrate ainsi formé en ces deux composants. Le [1,3-14C2]-glycérol-1,2-dinitrate et le [1,3- 14C2]-glycérol-1,3-dinitrate sont des composés nouveaux qui n'ont jamais été décrits dans l'art antérieur. Dans la première étape du procédé, le dioxyde de car- bone est débarrassé du carbonate de baryum radioactif. Le procédé est mis en oeuvre en milieu acide, de préférence en utilisant de l'acide chlorhydrique. Il est avantageux de mettre en oeuvre la réaction sous une atmosphère de gaz inerte (par exemple de l'azote). Le dioxyde de carbone marqué ainsi obtenu est réduit en un dérivé de 14Cformaldéhyde. La réduction peut être mise en oeuvre par utilisation d'un hydrure métallique complexe, de préférence hydrure de lithium-aluminium. La réduction est mise en oeuvre dans un solvant organique inerte. En tant que solvant, on peut utiliser de préfé- rence un éther, par exemple diéthyléther. La réduction est mise en oeuvre à une température faible, de préfé- rence à une température comprise entre -40 C et -60 C, et plus particulièrement à une température d'environ -50 C. La solution aqueuse du formaldéhyde marqué ainsi ob- tenu est ensuite neutralisée (de préférence avec un car- bonate alcalin tel que carbonate de sodium ou carbonate de potassium), puis on la fait réagir avec du nitromé- R \12800\12827.DOC - 18 avr1l 1995 - 3/13 thane. La réaction peut être mise en oeuvre à une tempé- rature comprise entre 0 C et la température ambiante, de préférence à une température d'environ 10 C. Le dérivé de [1,3-14C2]-dihydroxy-acétone ainsi obtenu est ensuite ré- duit. La réduction peut être de préférence mise en oeuvre avec un hydrure métallique, de préférence avec du borohy- drure de sodium. La réduction peut être de préférence réalisée dans un alcool aliphatique (par exemple le mé- thanol). Le dérivé de [1,3-14C2]-glycérol ainsi obtenu est en- suite à une nitration par un mélange d'acide nitrique et d'acide sulfurique. Pour ce faire, on préfère utiliser un mélange contenant 20 à 60%, de préférence 40%, d'acide nitrique. Le mélange réactionnel ainsi obtenu est traité par extraction. En tant que solvant d'extraction, on peut utiliser de préférence des éthers (par exemple éthyl- éther). La solution organique contenant les dinitrates de glycérol marqués est lavée avec une solution alcaline (par exemple carbonate alcalin tel que carbonate de so- dium ou carbonate de potassium) et évaporée sur un sup- port approprié (par exemple gel de silice). Le mélange de dinitrates de glycérol marqués est élué du support avec un solvant organique approprié (par exemple un alcool aliphatique tel que méthanol). Après évaporation, un mélange de [1,3-14C2]-glycérol-1,2-dinitrate et de [1,3- 14C2] -glycérol-1,3-dinitrate est obtenu, séparé en ses deux composants, de préférence par une HPLC préparative. En tant qu'éluant, on peut utiliser de préférence un mélange acétonitrile/eau: 1/9. Le [1,3-14C2]-glycérol-1,2-dinitrate et le [1,3- 14C2]-glycérol-l,3-dinitrate ainsi obtenus peuvent être de préférence stockés dans une solution diluée avant leur utilisation. Le stockage peut être de préférence mis en oeuvre dans une solution présentant une concentration de 0,1-1 mg/ml et plus particulièrement une concentration de 0,3 mg/ml. Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation de trinitrate de [1,3- R:\12800\12827.DOC - 19 avr1 1995 - 4/13 14C2]-glycérol présentant une activité spécifique élevée, de préférence au moins égale à 135 mCi/millimole, qui comprend l'élimination du carbonate de baryum radioactif présent dans le dioxyde de carbone, la réduction du di- oxyde de carbone ainsi obtenu dans un solvant organique inerte, la réaction du dérivé de 14C-formaldéhyde ainsi obtenu avec du nitrométhane, la réduction du dérivé de [1,3-14C2]-dihydroxy-acétone ainsi obtenu dans un solvant organique inerte et la nitration du dérivé de [1,3-14C2]- glycérol ainsi obtenu: a) avec un mélange de nitrate de métal alcalin et d'acide sulfurique, puis la séparation du trinitrate de [1,3-14C2]glycérol, ou b) avec un mélange d'acide nitrique et d'acide sulfu- rique, puis la séparation du trinitrate de [1,3- 14C2]-glycérol et des dinitrates de [1,3-14C2]-glycé- rol. Le dérivé de [1,3-14C2]-glycérol peut être préparé comme cela est décrit ci-dessus. Selon le procédé a), la nitration dudit composé est réalisée avec un mélange d'un nitrate de métal alcalin (par exemple nitrate de sodium ou nitrate de potassium) et d'acide sulfurique. I1 est préférable d'utiliser un mélange de nitrate de potassium et d'acide sulfurique. Le mélange obtenu après nitration peut être traité comme cela est décrit ci-dessus. La ni- tration peut être de préférence mise en oeuvre à une tem- pérature proche de la température ambiante. Le trinitrate de [1,3-14C2]glycérol peut de préférence être purifié par HPLC préparative. En tant qu'éluant, on peut utiliser de façon avantageuse un mélange méthanol/eau = 6/4. Selon le procédé b), la nitration est mise en oeuvre avec un mélange d'acide nitrique et d'acide sulfurique. Le procédé peut être mis en oeuvre conformément au pro- cédé décrit pour la préparation des dinitrates de [1,3- 14C2]-glycérol. Le trinitrate de [1,3-14C2]-glycérol formé peut être séparé des dinitrates de [1,3-14C2]-gly- cérol au moyen d'une HPLC préparative. En tant qu'éluant, R.\12800\12927 DOC - 18 avrll 1995 - 5/13 on peut utiliser de préférence un mélange méthanol/eau = 6/4. Le trinitrate de [1,3-14C2]-glycérol ainsi obtenu peut être de préférence stocké sous la forme d'une solu- tion diluée avant utilisation. Le stockage peut avanta- geusement être réalisé sous forme d'une solution présen- tant une concentration de 0,1-1 mg/ml, de préférence une concentration de 0,3 mg/ml. L'activité spécifique est déterminée par comparaison de la radioactivité des échantillons avec les valeurs quantitatives attribuées à une référence correspondant à du nitroglycérol dilué de la pharmacopée USP XXII. Les avantages des nouveaux [1,3-14C2]-glycérol-l,2- dinitrate, [1,3-14C2]-glycérol-1,3-dinitrate et[1,3- 14C2]-glycérol-trinitrate selon la présente invention sont les suivants: pureté élevée; - stabilité qui répond aux exigences pratiques; - activité spécifique élevée supérieure à 135 mCi/millimole; - applicabilité simple pour une détermination très précise d'un taux sanguin. De plus amples détails sur la présente invention sont donnés dans les exemples suivants qui ne limitent pas la portée de celle-ci. La pureté radiochimique et la stabilité des composés marqués sont déterminées et contrôlées par des méthodes classiques et également par des procédés de CG-SM, HPLC- détecteur de radioactivité et CMM-autoradiographe digi- tal. EXEMPLE 1 On élimine le carbonate de baryum radioactif présent dans du dioxyde de carbone (0,8 g, 8,73 GBq) par uti- lisation de 7 ml d'acide chlorhydrique à 10% sous une at- mosphère d'azote gazeux. Le dioxyde de carbone est séché et introduit dans une solution de 0,38 g d'hydrure de li- thium-aluminium et 20 ml de diéthyléther à -50 C. La ré- duction se déroule pendant 2-3 minutes. Le mélange réac- R.\12800\12827 DOC - 18 avril 1995 - 6/13 tionnel est hydrolysé à -5 C par addition de 2 ml d'eau puis 4 ml d'acide sulfurique à 10%. La solution ainsi ob- tenue est distillée à partir d'un bain d'huile (température 130-140 C). La teneur du distillat en [14C]- formaldéhyde est déterminée à partir d'un aliquot de la solution par une méthode iodométrique. Rendement: 1,9 mmole. La solution aqueuse de formaldéhyde est neutrali- sée dans du carbonate de potassium, refroidie dans de l'eau glacée, puis 0,060 g de nitrométhane sont ajoutés. Le mélange réactionnel est agité à une température d'environ 10 C pendant 4 heures puis évaporé à siccité à -50 C. Le résidu de distillation est dissous dans 1 ml de méthanol et 1 ml d'une solution méthanolique contenant 1,7 mmole de méthylate de sodium est ajouté. Le produit précipité est filtré. Le filtrat est dissous dans 1,5 ml d'eau, acidifié avec 1 ml d'acide sulfurique à 50%, agité pendant 10 minutes et 0,5 g de carbonate de calcium sont ajoutés. Le produit précipité est filtré, le filtrat est évaporé sur 0,2 g de gel de silice et soumis à une chro- matographie sur colonne (10 g de Kieselgel 60, éluant: acétate d'éthyle/méthanol = 9,5/0,5). Les fractions pures sont évaporées. On obtient ainsi 0,030 g de [1,3-14C2]- dihydroacétone qui est dissous dans 2 ml de méthanol et 0,010 g de borohydrure de sodium solide est ajouté à la solution. La réduction est contrôlée par chromatographie sur couche mince (éluant: acétate d'éthyle/méthanol = 8,2, détection: 1% de permanganate de potassium dans une solution d'hydroxyde de sodium à 1 N). Le Rf de la dihy- droxyacétone est de 0,5 et le Rf du glycérol est de 0,3. La radioactivité de la solution brute de glycérol radio- actif est d'environ 524 MBq. 0,4 ml de la solution méthanolique est pesé dans un ballon approprié et évaporé sur un évaporateur rotatif. Au résidu issu de l'évaporation, on ajoute 0,01 ml d'acide nitrique à 100% et 0,02 ml d'acide sulfurique à 98%. Le mélange réactionnel est agité à la température ambiante pendant 30 minutes, refroidi dans de l'eau glacée et dilué avec 0,5 ml d'eau. La solution aqueuse R \12800\1282' DC - 18 avrll 1995 - 7/13 est extraite à cinq reprises avec 1 ml d'éther à chaque fois. La solution éthérée est lavée à plusieurs reprises avec une solution de carbonate de sodium diluée et évaporée sur 1 g de gel de silice. Le produit est élué à partir du gel de silice avec 5 ml de méthanol. La solution ainsi obtenue est évaporée jusqu'à 1 ml puis soumise à une HPLC préparative (colonne Nucleosil C-18, éluant: méthanol/eau = 3/7). Dans un premier temps, un mélange des deux dinitrates (c'est-à-dire [l,3-14C2]- glycérol-l,2-dinitrate et [1,3-14C2]-glycérol-1,3- dinitrate) est obtenu (radioactivité: 18 MBq). L'élution est ensuite poursuivie avec un mélange méthanol/eau = 6/4 pour conduire à des fractions contenant le trinitrate de [1,3-14C2]-glycérol. Rendement total = 61 MBq (1,65 mCi). Les deux produits sont stockés en solution diluée (environ 0,3 mg/ml) dans l'éluant dans un réfrigérateur à O5 C. Activité spécifique: 5-5,2 GBq/millimole (135-140 mCi/millimole), puretés chimique et radiochimique: supé- rieures à 99%, stabilité radiochimique: décomposition in- férieure à 1% en 30 jours. EXEMPLE 2 0,2 ml de la solution méthanolique de [1,3-14C2]-gly- cérol préparée selon l'exemple 1 est évaporé. Le ballon contenant le résidu de l'évaporation est placé dans un bain de glace et 0,025 g de nitrate de potassium et 0,050 ml d'acide sulfurique à 98% sont ajoutés. Le mé- lange réactionnel est agité à la température ambiante pendant 30 minutes puis traité comme cela est décrit dans l'exemple 1. Selon une analyse par chromatographie sur couche mince, aucun dinitrate de glycérol ne se forme au cours de la réaction. Le trinitrate de [1,3-14C2]-glycé- rol est isolé et purifié comme cela est décrit dans l'exemple 1. Rendement: 85 MBq (2,3 mCi). EXEMPLE 3 0,4 ml de la solution méthanolique de [1,3-14C2]-gly- cérol préparée selon l'exemple 1 est évaporé, refroidi dans de l'eau glacée, puis 0,025 ml d'acide nitrique à R \128-\12827 DOC - 19 avrll 1995 - 8/13 %, puis 0,070 ml d'acide sulfurique à 98% sont ajoutés. La réaction est mise en oeuvre et le mélange réactionnel est traité comme cela est décrit dans les exemples précé- dents. Selon une analyse par chromatographie sur couche mince, seule une très faible quantité de dérivé trinitro est formée, le produit majeur étant le dérivé dinitro et un autre produit (probablement le dérivé mononitro) est également formé en une quantité détectable. Les deux dé- rivés dinitro sont isolés et séparés par HPLC en utili- sant en tant qu'éluant un mélange acétonitrile/eau = 1/9. Rendement: en [1,3-14C2]-glycérol-1,2-dinitrate: 12 MBq (0,32 mCi) et en [1,3-14C2]-glycérol-1,3-dini- trate: 54 MBq (1,46 mCi). R:\12800\1282' DOC - 18 avrl 1995 - 9/13 REVENDICATIONS 1.- Dinitrates de [1,3-14C2]-glycérol. 2.- [1,3-14C2]-glycérol-l,2-dinitrate selon la reven- dication 1. 3.- [1,3-14C2]-glycérol-l,3-dinitrate selon la reven- dication 1. 4.- Composés marqués selon la revendication 1, 2 ou 3 présentant une activité spécifique d'au moins 135 mCi/millimole. 5.- Procédé de préparation de dinitrates de [1,3- 14C2]-glycérol selon la revendication 1, qui comprend l'élimination du carbonate de baryum radioactif présent dans la dioxyde de carbone, la réduction du dioxyde de carbone ainsi obtenu dans un solvant organique inerte, la réaction du dérivé aldéhydique sous la forme 14C ainsi obtenu avec du nitrométhane, la réduction du dérivé de [1,3-14C2]dihydroxyacétone ainsi obtenu dans un solvant organique inerte, la nitration du dérivé de [1,3-14C2]- glycérol ainsi obtenu avec un mélange d'acide nitrique et d'acide sulfurique, et la séparation du mélange de [1,3- 14C2]-glycérol-1,2-dinitrate et de [1,3-14C2]-glycérol- 1,3-dinitrate ainsi formé en ses deux composants. 6.- Procédé selon la revendication 5, qui comprend la réduction du dioxyde de carbone marqué avec un hydrure métallique complexe, de préférence hydrure de lithium- aluminium. 7.- Procédé selon la revendication 6, qui comprend la mise en oeuvre de la réaction dans un éther, de préfé- rence du diéthyléther. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, qui comprend la mise en oeuvre de la réduction à une température comprise entre -40 C et -60 C, de préférence à une température de -50 C. 9.- Procédé selon la revendication 5, qui comprend la réduction du dérivé de [1,3-14C2]-dihydroxyacétone avec un hydrure métallique, de préférence avec du borohydrure de sodium. 10.- Procédé selon la revendication 9, qui comprend la mise en oeuvre de la réduction dans un alcool alipha- tique, de préférence du méthanol. 11.- Procédé selon la revendication 5, qui comprend l'utilisation d'acide nitrique à 20-60%, de préférence à %, pour la nitration du dérivé de [1,3-14C2]-glycérol. 12.- Procédé selon la revendication 5, qui comprend la séparation du [1, 3-14C2]-glycérol-l,2-dinitrate et du [1,3-14C2]-glycérol-1,3-dinitrate par HPLC. 13.- Procédé selon la revendication 12, qui comprend l'utilisation d'un mélange acétonitrile/eau = 1/9 en tant qu'éluant. 14.- Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 5 à 13, qui comprend le stockage du [1,3-14C2]-gly- cérol-1,2-dinitrate et du [1,3-14C2]-glycérol-1,3-dini- trate en une solution diluée, présentant une concentra- tion de 0,1-1 mg/ml, de préférence une concentration de 0,3 mg/ml. 15.- Trinitrate de [1,3-14C2]-glycérol présentant une activité spécifique d'au moins 135 mCi/millimole. 16.- Procédé de préparation de trinitrate de [1,3- 14C2]-glycérol qui comprend l'élimination du carbonate de baryum radioactif présent dans le dioxyde de carbone, la réduction du dioxyde de carbone ainsi obtenu dans un sol- vant organique inerte, la réaction du dérivé de 14C-for- maldéhyde ainsi obtenu avec du nitrométhane, la réduction du dérivé de [1,3-14C2]-dihydroxyacétone ainsi obtenu dans un solvant organique inerte, et la nitration du dé- rivé de [1,3-14C2]-glycérol ainsi obtenu: a) avec un mélange de nitrate de métal alcalin et d'acide sulfurique, puis la séparation du trinitrate de [1,3-14C2]-glycérol, ou b) avec un mélange d'acide nitrique et d'acide sulfu- rique, puis la séparation du trinitrate de [1,3- 14C2]-glycérol et des dinitrates de [l,3-14C2]-glycé- rol. 17.- Procédé selon le procédé a) de la revendication 16, qui comprend l'utilisation du nitrate de potassium et du nitrate de sodium en tant que nitrate de métal alca- lin. 18.- Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 16 et 17, qui comprend la séparation du [1,3-14C2]- trinitrate par HPLC préparative. 19.- Procédé selon la revendication 18, qui comprend l'utilisation d'un mélange méthanol/eau = 6/4 en tant qu'éluant. 20.- Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 16 à 19, qui comprend le stockage du trinitrate de [1,3-14C2]glycérol obtenu sous la forme d'une solution diluée présentant une concentration de 0,1-1 mg/ml, de préférence une concentration de 0,3 mg/ml.