FR 2714299 A1 19950630 FR 9415341 A 19941220 1 2714299 La présente invention se rapporte à l'isolement et la séparation de composés de fluides. La présente invention est une méthode améliorée de séparation d'affinité, qui est particulièrement utile dans l'isolement de composés biologiquement actifs. Les avancées dans la technologie ont rendu possible la production de quantités commerciales de protéines thérapeutiquement utiles qui jusqu'à maintenant avait été trop complexe ou trop chère à fabriquer par les procédés biochimiques traditionnels. La fabrication est accomplie par des cellules qui sont manipulées pour produire une protéine désirée et peuvent être mises à croître dans des bioréacteurs dans des conditions contrôlées. La technologie utilisée implique soit la fermentation de microorganismes qui ont été altérés par des techniques d'ADN recombinant soit la culture de cellules mammaliennes qui ont été altérées par des techniques d'hybridome. Les cellules sont mises en suspension dans un bouillon qui contient les sels, sucres, protéines et divers facteurs nécessaires à supporter la croissance des cellules particulières. La protéine désirée peut être soit sécrétée par les cellules dans le bouillon soit retenue dans le corps de la cellule. D'autres protéines d'intérêt peuvent être préparées en utilisant d'autres moyens, comme par altération génétique d'une espèce d'animal de façon à fournir à l'animal la capacité à produire la protéine désirée. Par exemple, certaines protéines peuvent être produites par des vaches transgéniques et dont on récolte le lait. La séparation, ou purification, de ces protéines d'un mélange hétérogène a été prouvée être une tâche formidable pour au moins les raisons suivantes: la protéine désirée représente souvent un petit pourcentage de la protéine totale; le bouillon ou autre liquide à traiter peut contenir des quantités significatives de débris de cellules et autres contaminants particulaires; des pyrogènes, des pathogènes, de toxines, et d'autres contaminants peuvent être présents en une concentration élevée et doivent être éliminés, et la 2 2714299 protéine souhaitée doit être séparée de la solution de protéine hétérogène sans la dénaturer. Comme un résultat de ces facteurs, un traitement en aval extensif a été nécessairement utilisé pour atteindre des quantités élevées de protéine purifiée. Un tel traitement en aval inclut les nombreuses étapes de traitement qui prennent place à la suite de la production de la protéine d'intérêt incluant, par exemple, une centrifugation une rupture de cellule, un tamisage mécanique, une microfiltration, un échange d'ions, une filtration à flux croisé, une séparation d'affinité, une stérilisation, une purification, et un emballage. Le traitement en aval représente un coût majeur dans la production de protéines biotraitées. Ainsi, une méthode qui fournit efficacement des hauts rendements de séparation de protéine par réduction du nombre d'étapes de traitement, et qui peut être utilisée à une échelle industrielle, accentuerait la commercialisation avec succès de la biotechnologie. On sait que beaucoup de composés se complexent avec des ligands de sorte que ces composés peuvent être isolés par une technique connue comme la séparation d'affinité. Voir généralement "Chromatography, Affinity," Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technoloqy, 6, 35- 54 (John Wiley & Sons: New York, 1979). Cette méthode de séparation implique trois phases: (i) une phase d'adsorption, dans laquelle le composé désiré, tel qu'une protéine, provenant d'un mélange hétérogène forme un complexe avec une fonctionnalité chimique, telle qu'un ligand, lié à un substrat insoluble, tel qu'un lit de verre ou de polymère, (ii) une phase de lavage dans laquelle la globalité de la solution est entraînée par lavage avec les contaminants liés de façon lâche au substrat insoluble, et (iii) une étape d'élution dans laquelle l'éluant rompt le complexe entre le composé désiré et le ligand lié au substrat insoluble de façon à libérer le composé désiré. Le substrat insoluble avec le ligand lié, qui est référencé comme particules d'affinité, 3 2714299 peut être lavé et réutilisé, et la méthode peut être répétée de nombreuses fois. Les particules d'affinité sont typiquement choisies sur la base de la surface spécifique par unité de masse. Par exemple, alors que des billes sphériques non poreuses de pm de diamètre peuvent fournir une surface spécifique de 0,06 m2/g de billes, des billes similaires de 1 Mm de diamètre procureraient une surface spécifique de 6,0 m2/g de billes, et des billes de 0,1 pm de diamètre procureraient une surface spécifique de 60 m2/g de billes. Clairement, des particules d'affinité plus petites fournissent une surface spécifique plus grande par unité de poids et sont donc plus souhaitables. Dans la séparation d'affinité, il est généralement souhaitable d'utiliser des particules d'affinité qui ont une surface spécifique supérieure à environ 20 m2/g. Ainsi, si l'on désire utiliser des particules d'affinité non poreuses dans un procédé de séparation d'affinité, de telles particules d'affinité doivent avoir un diamètre dans la gamme submicronique. La forme la plus largement pratiquée de séparation d'affinité est la chromatographie d'affinité. La chromatographie d'affinité utilise une colonne de particules d'affinité emballées de façon serrée à travers laquelle le fluide (par exemple un courant d'alimentation liquide) contenant le composé cible, tel qu'une protéine, est forcé sous pression. Les hydrodynamiques d'un système à lit fixe ou emballé tel que celui-ci est gouverné par l'équation de Ergun. Chem. Enq. Proq., 48 (1952). L'équation d'Ergun, qui est utilisée lorsque le lit subit un écoulement laminaire de fluide, démontre que la chute de pression à travers le lit est inversement proportionnelle au carré du diamètre de particule. Lorsque calculées, les chutes de pression des systèmes qui utilisent des particules d'affinité submi- croniques sont de l'ordre de un million de fois supérieures à celles emballées avec des particules de 100 pm. Cet effet a jusqu'à présent empêché l'utilisation de telles petites particules d'affinité dans les séparations d'affinité. Par 4 2714299 conséquent, le lit typique utilise des particules d'affinité d'environ 100 Mm de taille pour maintenir une chute de pression acceptable. Des essais ont été faits pour surmonter les problèmes associés avec les particules d'affinité non poreuses par rapport à la fourniture d'une surface spécifique élevée par unité de poids. En particulier, les particules d'affinité non poreuses ont été substituées par les particules d'affinité poreuses. Dans des applications typiques, des billes poreuses d'environ 100 pm de diamètre fournissent une surface spécifique dans l'intervalle d'environ 40 m2/g par bille et sous des conditions de chutes de pression modérées. L'utilisation de particules d'affinité poreuses, cependant, créée des problèmes additionnels qui ne sont pas subis par des particules d'affinité non poreuses. Pour des raisons non complètement comprises, mais peut être reliées au bouchage et à la résistance en diffusion, seulement à l'extérieur à environ 5 % de la région poreuse de la particule d'affinité est généralement accessible à la substance que l'on cherche à séparer. Ceci résulte en ce que la surface spécifique efficace de la particule d'affinité poreuse soit de beaucoup inférieure à la surface spécifique théoriquement disponible totale. Alors que le prétraitement du flux d'alimentation pourrait empêcher au moins une partie du phénomène de bouchage et de résistance diffusionnels des particules d'affinité poreuses, un tel prétraitement du courant d'alimentation implique une série d'étapes consommatrices de temps et coûteuses. De plus, chaque étape de traitement additionnel sert à augmenter la perte du composé cible et par là réduit la productivité. De plus, parce que la majorité de la surface spécifique totale dans les particules d'affinité poreuses est interne à la surface des particules d'affinité, le transfert de masse contrôle efficacement le procédé de séparation, résultant par là en des séparations laborieuses et consommatrices de temps. De plus, les pores des particules d'affinité peuvent agir comme des pièges pour les composés et débris non voulus et 2714299 peuvent éventuellement provoquer une contamination du composé désiré. Egalement, comme les pores dans les particules d'affinité se bouchent graduellement, l'efficacité des particules d'affinité est diminuée avec chaque cycle successif. En addition, la résistance mécanique des particules d'affinité est réduite en raison de la présence des pores, qui résulte en une résistance faible à l'abrasion et en une stabilité mécanique faible et peut résulter en ce que les particules d'affinité s'écroulent aux hautes pressions. Les particules d'affinités poreuses gonflent également parce qu'elles sont emballées dans un lit, ce qui requiert que des ajustements soient effectués pour ce phénomène. L'autre considération des techniques de colonne qui est indépendante des particules d'affinité est que, de façon à atteindre des débits élevés, la colonne doit avoir une grande capacité. De grandes colonnes, cependant, résultent en des pressions si élevées à la zone inférieure des colonnes qu'elles déforment les particules d'affinité et réduisent le passage. L'industrie a essayé de surmonter ce problème en concevant des colonnes qui sont courtes et plutôt larges. Ce compromis, cependant, n'est pas entièrement satisfaisant, puisque l'efficacité est grandement réduite en raison des problèmes d'écoulement comme la création de canaux et de départ provenant d'un écoulement de bouchon. Les colonnes montrent également un phénomène d'ondes de concentrations qui résulte en une utilisation efficace faible de l'adsorbant. Spécifiquement, lorsque l'alimentation passe à travers la colonne, seulement une petite zone des particules d'affinité est utilisée dans un cadre de temps particulier puisque la zone d'entrée est déjà saturée avec le composé cible. Ceci résulte en un phénomène d'ondes de concentrations ou seulement le front d'ondes interagit avec l'adsorbant à un moment donné. De façon à surmonter les désavantages inhérents aux lits fixes et les problèmes qui apparaissent lorsque des particules d'affinité poreuses sont utilisées dans ceux-ci, 6 2714299 les chercheurs ont tourné leur attention vers des systèmes de séparation d'affinité à lit mobile. Un lit fluidisé est un type de système d'affinité à lit mobile. Dans un tel lit, le courant d'alimentation est pompé vers le haut à partir du bas de la colonne, faisant que les particules d'affinité agissent comme un fluide. Comme résultat, les lits fluidisés ne montrent pas de caractéristique d'ondes de concentrations. De plus, toutes les particules d'affinité sont exposées au courant d'alimentation simultanément. Les lits fluidisés offrent une productibilité plus élevée que les colonnes comme résultat de l'utilisation efficace des particules d'affinité et du passage augmenté. De plus, ces lits peuvent accepter un niveau plus élevé de débris particulaires et fonctionnent encore relativement efficacement en comparaison aux systèmes à lit fixe. Un inconvénient avec les lits fluidisés, cependant, est que les efficacités limitent à la fois la taille et la densité des particules d'affinité qui peuvent être utilisées dans de tels systèmes, c'est-àdire, qu'il est nécessaire de maximiser la densité et d'optimiser la taille. Ceci est parce que, généralement, une majeure partie du procédé de séparation est contrôlée par la vitesse de sédimentation des particules d'affinité. Ainsi, plus la densité des particules d'affinité utilisées est élevée, plus les particules d'affinité sédimenteront vite, permettant par là des vélocités de fluidisation plus élevées. Une augmentation dans la vélocité de fluidisation résultera en un passage plus élevé et, donc, en une efficacité plus élevée, jusqu'à ce que la limite supérieure du taux des cinétiques soit atteinte. Alors que le taux de cinétique peut être augmenté par réduction de la taille des particules d'affinité (augmentant par là la surface spécifique disponible totale), l'augmentation du taux de cinétique a également l'effet négatif de limiter la vélocité de fluidisation qui peut être atteinte, abaissant par là l'efficacité. Ces considérations compétitives requièrent que des compromis soient faits en ce 7 2714299 qui concerne la taille et la densité des particules d'affinité, et ces compromis empêchent ce type de système d'atteindre des efficacités plus élevées. Un autre type de système à lit mobile, référencé système à réservoir agité, offre également un avantage significatif sur les colonnes à lit fixe. Dans un système à réservoir agité, les particules d'affinité sont maintenues en suspension dans un réservoir par des moyens mécaniques. Cette action de mélange permet à la suspension de se comporter comme un fluide homogène, en exposant par là toutes les particules au composé cible simultanément. Ce procédé peut donc être conçu comme une boucle avec une augmentation significative de la productivité. Les particules d'affinité dans un tel système sont de préférence suffisamment flottantes pour obtenir une suspension stable dans le fluide du procédé. Puisqu'il y a moins d'emballage dans ce système, le diamètre préféré des particules d'affinité est typiquement plus petit que dans une colonne ou un lit fluidisé, ce qui permet une augmentation de la surface spécifique. Une limitation majeure des réservoirs agités est que les filtres utilisés pour les étapes de lavage et d'élution s'encrassent comme un résultat de la nature brute du matériau de départ d'alimentation. Ainsi, le courant d'alimentation doit typiquement être prétraité, ajoutant par là une étape additionnelle de traitement et réduisant l'efficacité globale du système. Dans chacun de ces divers procédés de séparation d'affinité conventionnels, il y a de multiples étapes de traitement. Alors que chaque étape peut avoir une efficacité ou un rendement en produit de 80-90 %, l'existence de seulement quelques étapes de traitement peut facilement réduire l'efficacité du système global et du rendement en produit à 50 % ou moins. Avec chaque étape additionnelle de traitement, l'efficacité globale du système est même plus abaissée. Ainsi, il existe un besoin pour une méthode qui évite ces nombreux problèmes inhérents aux procédés de séparation 8 2714299 d'affinité existants et qui fournisse un moyen plus efficace pour isoler et séparer des composés, tels que des protéines et analogues, d'un fluide, par exemple, un courant d'alimentation liquide dilué. La présente invention fournit une telle méthode. La présente méthode inventive implique un procédé de séparation d'affinité avec moins d'étapes de traitement qui peut être mis en oeuvre dans une période de temps relativement courte et avec une efficacité globale augmentée pour éliminer un composé désiré d'un fluide. De plus, la présente méthode inventive surmonte les problèmes d'encrassement en ce qui concerne à la fois les particules d'affinité et le milieu de filtration qui gêne les cinétiques et l'écoulement au travers du système, sans le besoin de prétraiter le fluide contenant le composé désiré. De plus, une grande variété de particules d'affinité variant à la fois en densité et en taille, incluant des particules d'affinité petites avec une surface spécifique élevée par unité de poids peut être utilisée avec succès dans la méthode de séparation d'affinité de la présente invention, permettant par là au système d'être conçu spécialement pour atteindre une efficacité plus grande pour des utilisations finales particulières. Ces objets et d'autres et ces avantages et d'autres de la présente invention, aussi bien que des caractéristiques inventives additionnelles, seront apparents à partir de la description de l'invention donnée ici. La présente invention fournit une méthode de séparation d'affinité améliorée comprenant (a) l'introduction de particules d'affinité et d'un fluide contenant un composé cible et isolé qui est capable de s'adsorber sur les particules d'affinité dans un appareil de filtration dynamique comprenant des moyens moteur, un milieu de filtration ayant des côtés amont et aval, une entrée en communication de fluide avec le côté amont du milieu de filtration, et une sortie de filtrat en communication de fluide avec le côté aval du milieu de filtration, o le fluide est capable de passer à travers le milieu de filtration et les particules d'affinité sont 9 2714299 substantiellement incapables de passer à travers le milieu de filtration, (b) la mise en fonctionnement les moyens moteur de l'appareil de filtration dynamique avec la sortie de filtrat étant en position fermée de sorte que le fluide ne puisse pas passer à travers le milieu de filtration dans des conditions suffisantes pour que le composé cible s'adsorbe sur les particules d'affinité, et (c) la séparation des particules d'affinité du fluide en ouvrant la sortie de filtrat de façon à permettre au fluide de passer à travers le milieu de filtration de l'appareil de filtration dynamique. Le filtrat peut être par là rendu substantiellement exempt du composé cible. Si la récupération du composé cible est souhaitée et/ou si les particules d'affinité sont à réutiliser, les particules d'affinité sont ensuite lavées, et le composé cible est élué des particules d'affinité. La figure 1 est une représentation schématique des éléments significatifs utilisés dans le mode préféré de la présente invention. La figure 2 est une représentation schématique d'un appareil de filtration dynamique préféré pour utilisation avec la présente méthode inventive de séparation d'affinité. La présente invention fournit une méthode de séparation d'affinité améliorée. En particulier, on a découvert de façon surprenante que l'utilisation d'un appareil de filtration dynamique peut être utilisé pour effectuer efficacement le contact entre un fluide contenant un composé désiré (ou cible) et des particules d'affinité et que l'appareil de filtration dynamique peut après cela être utilisé pour séparer le fluide des particules d'affinité ayant le composé adsorbé ou complexé sur elles. Un tel procédé permet l'utilisation de particules d'affinité ayant de faibles diamètres et de relativement grandes surfaces spécifiques par poids des particules d'affinité. La présente méthode inventive est une méthode de séparation d'affinité améliorée comprenant: (a) introduction des particules d'affinité et d'un fluide contenant un composé cible à isoler qui est capable de 2714299 s'adsorber sur les particules d'affinité dans un appareil de filtration dynamique comprenant des moyens moteur, un milieu de filtration ayant des côtés amont et aval, une entrée en communication de fluide avec le côté amont du milieu de filtration, et une sortie de filtrat en communication de fluide avec le côté aval du milieu de filtration, o le fluide est capable de passer à travers le milieu de filtration et les particules d'affinité sont substantiellement incapables de passer à travers le milieu de filtration, (b) mise en fonctionnement des moyens moteur de l'appareil de filtration dynamique avec la sortie de filtrat étant en position fermée de sorte que le fluide ne peut pas passer à travers le milieu de filtration dans des conditions suffisantes pour permettre au composé cible de s'adsorber sur les particules d'affinité, et (c) séparation des particules d'affinité du fluide en ouvrant la sortie de filtrat de façon à permettre au fluide de passer à travers le milieu de filtration de l'appareil de filtration dynamique. Le fluide peut par là être rendu substantiellement exempt du composé cible. Si la récupération du composé cible est souhaitée et/ou si les particules d'affinité sont à réutiliser, alors les particules d'affinité sont lavées, et le composé cible est élué des particules d'affinité. La présente méthode inventive fournit la séparation exceptionnellement efficace à partir d'une solution diluée d'un composé capable d'être séparé par un procédé de séparation d'affinité, tel qu'une protéine provenant d'une solution de fermentation diluée. La présente invention fournit un moyen pour abaisser le nombre d'étapes de traitement requises pour effectuer une séparation d'affinité en comparaison aux méthodes connues de séparation d'affinité, augmentant par là le rendement global de la méthode de séparation. En effet, la présente méthode inventive peut échapper au besoin d'un prétraitement du fluide avant le contact avec les particules d'affinité. De plus, la présente il 2714299 méthode inventive peut être menée en une quantité relativement plus faible de temps en comparaison aux procédés de séparation d'affinité connus. De plus, puisque la présente méthode inventive utilise de préférence des particules d'affinité non poreuses, la présente invention évite ces problèmes attenant à l'utilisation de particules d'affinité poreuses, par exemple, l'encrassement des particules d'affinité, la probabilité de se briser, le gonflement, et de faibles surfaces spécifiques efficaces. En addition, la présente méthode inventive évite généralement les problèmes de création de canaux, de phénomène d'ondes de concentrations, et d'encrassement du milieu de filtration associés avec les méthodes conventionnelles de séparation d'affinité. La présente méthode inventive comprend l'introduction des particules d'affinité et du fluide à traiter, c'est-à- dire, d'un fluide contenant un composé cible à isoler qui est capable de s'adsorber sur les particules d'affinité dans un appareil de filtration dynamique. Un tel appareil de filtration dynamique comprendra de façon souhaitable des moyens moteur, un milieu de filtration ayant un côté amont et aval, une entrée en communication de fluide avec le côté amont du milieu de filtration, et une sortie de filtrat en communication de fluide avec le côté aval du milieu de filtration. Le milieu de filtration a une gradation de pores qui permet au fluide d'être traité pour passer entièrement ou substantiellement entièrement à travers le milieu de filtration sans permettre aux particules d'affinité de substantiellement passer à travers le matériau de filtration. Lorsque les particules d'affinité et le fluide à traiter sont introduits dans l'appareil de filtration dynamique, l'appareil est configuré de façon à empêcher tout fluide de passer à travers le milieu de filtration, par exemple, par utilisation d'un moyen de vannes approprié pour fermer la sortie de filtrat. Les moyens moteur sont ensuite engagés (ou peuvent être engagés pendant l'introduction des particules d'affinité du fluide à traiter, de façon à 12 2714299 provoquer le mélange du composé cible dans le fluide à traiter avec les particules d'affinité pour assurer leur interaction consistante. Ce procédé de mélange est continué pendant une période satisfaisante de temps, par exemple, jusqu'à ce que l'adsorption du composé cible sur les particules d'affinité ait atteint un niveau maximum ou d'équilibre. Comme résultat de l'interaction consistante et reproductible du composé cible et des particules d'affinité, le procédé de mélange permet une grande précision dans le traitement de lots similaires de fluides en ce qui concerne la quantité de particules d'affinité à utiliser dans l'isolement du composé cible et le temps d'interaction entre le fluide contenant le composé cible et les billes d'affinité. Ainsi, la présente méthode inventive fournit un procédé de cycle rapide et l'utilisation efficace et conservée des particules d'affinité dans des procédés de fabrication permanents o des fluides similaires sont à traiter sur une base routinière. Les particules d'affinité sont ensuite séparées du fluide en permettant au fluide de passer à travers le milieu de filtration. Une telle séparation peut être accomplie par, par exemple, ouverture de la sortie de filtrat, alors les moyens moteur continuent de préférence à fonctionner dans le mode normal. Les particules d'affinité sont ensuite de préférence lavées avec une solution appropriée, par exemple un tampon de lavage, de façon à éliminer tous fluides résiduels. Le composé cible est récupéré par élution du composé des particules d'affinité. Une telle élution peut être mise en oeuvre par toute technique appropriée, de préférence par emballage des particules d'affinité dans un réceptacle approprié, par exemple, un colonne, et passage de l'éluant, par exemple, un agent de désorption, à travers le réceptacle sur les particules d'affinité pour éliminer le composé cible des particules d'affinité. De façon à minimiser la quantité d'éluant et augmenter par là la concentration du produit récupéré, les particules d'affinité sont de préférence 13 2714299 emballées de façon aussi dense que possible dans le réceptacle d'élution. Le composé cible sera typiquement présent dans l'éluant à une concentration d'au moins environ fois, de préférence d'au moins environ 20 fois, supérieure à la concentration du composé cible dans le fluide non traité, c'est-à-dire, le fluide avant contact avec les particules d'affinité. De façon plus souhaitable, la quantité d'éluant passée à travers le réceptacle d'élution sera équivalente à environ le volume libre de vides, ou au moins non supérieur à environ deux à trois fois le volume libre de vides, du réceptacle d'élution, par exemple, environ la moitié du volume d'une colonne emballée de façon dense avec les particules d'affinité sphériques substantiellement monodisperses. Les tailles relatives du débris le plus grand dans le fluide à traiter, des pores du milieu de filtration et du diamètre des billes d'affinité sont importantes dans l'utilisation pratique de la présente méthode inventive de séparation d'affinité. Idéalement, le milieu de filtration permettra le passage à travers lui de tout le fluide (incluant le débris le plus grand), tout en empêchant toutes les particules d'affinité de passer à travers lui. Le milieu de filtration, donc, aura de préférence une taille de pores d'au moins un facteur de deux, préférablement un facteur de cinq ou dix, supérieure au débris le plus grand dans le fluide à traiter, et les particules d'affinité seront de préférence supérieures d'un facteur d'au moins deux, et de préférence d'un facteur d'au moins cinq ou dix, à la taille des pores du milieu de filtration. Ainsi, par exemple, si le débris le plus grand dans le fluide à traiter est de l'ordre d'environ 0,1-0,2 Mm, la taille de pores du milieu de filtration sera de préférence de l'ordre de environ 1-3 Mm, alors que les particules d'affinité seront de préférence de l'ordre d'environ 10-20 pm. En général, les particules d'affinité les plus petites acceptables, par exemple, des particules d'affinité de 60 Mm de diamètre ou moins, particulièrement des particules 14 2714299 d'affinité de 20 Mm ou moins de diamètre, sont de préférence utilisées pour améliorer la récupération du composé cible en augmentant la surfacespécifique disponible par unité de poids des particules d'affinité pour une interaction avec le fluide traité. Par conséquent, alors qu'un prétraitement du fluide à traiter est généralement non souhaitable en conjonction avec la présente méthode inventive parce qu'il a un impact défavorable sur la récupération du composé cible par introduction d'une étape de traitement additionnelle, il y a certains cas dans lesquels la perte de récupération résultante du prétraitement, particulièrement d'une préfiltration et/ou d'une homogénisation, pour réduire la taille du débris le plus large dans le fluide sera plus influencé par la capacité résultante à utiliser des particules d'affinité plus petites ayant une surface spécifique plus élevée par unité de poids des particules d'affinité. La présente invention peut être mieux comprise en référence aux dessins d'accompagnement. La figure 1 décrit schématiquement des éléments significatifs utilisés dans un mode préféré de la présente invention. Au début de la présente méthode inventive, le fluide à traiter qui contient le composé cible à séparer du restant du fluide réside dans le réservoir de maintien 1, alors que les particules d'affinité résident dans le réservoir de maintien 2; A la fois le fluide et les particules d'affinité sont transférés dans un réservoir tampon 3 o ils sont combinés pour former un mélange et de préférence agités en rotation. Le mélange est ensuite transféré à l'appareil 4 de filtration dynamique via une entrée 5, bien que le fluide et les particules d'affinité puissent être directement transférés à l'appareil 4 de filtration dynamique sans passer par le réservoir tampon 3. Le mélange est soumis à l'agitation mécanique de l'appareil 4 de filtration dynamique sans qu'aucune partie du fluide ne passe à travers le milieu de filtration de l'appareil 4 de filtration dynamique, par, par exemple, la vanne de filtrat 7 étant en position fermée. 2714299 Après, ou même pendant, une agitation appropriée, toute partie du mélange est transférée via une vanne 8 de concentré dans un procédé en discontinu ou en continu (en ligne) vers un réservoir de détection 9, o la concentration du composé cible dans le fluide qui reste non liée aux particules d'affinité est déterminée. Une telle détection, si souhaité, pourrait également se situer sur une base continue ou intermittente dans l'appareil 4 de filtration dynamique. De plus, dans un procédé de fabrication permanent dans lequel des lots similaires de fluide sont à traiter répétitivement, il peut ne pas avoir de besoin d'un quelconque moyen de détection après la détermination d'une quantité appropriée de fluide, de particules d'affinité et de temps de séjour dans l'appareil de filtration dynamique en ce que la présente méthode inventive est tout à fait consistante et reproductible en ce qui concerne la récupération du composé cible. Dans la mesure o des moyens de détection sont utilisés, cependant, de tels moyens de détection de préférence contrôlent l'ouverture et la fermeture de la vanne 7 de filtrat, de la vanne 8 de concentré, de la vanne 11 de tampon de lavage, contrôlant par là la direction d'écoulement du mélange et l'initiation et l'arrêt du procédé de filtration en utilisant l'appareil 4 de filtration dynamique. Si un réservoir 9 de détection séparé est utilisé, et que la concentration du composé cible non lié dans le fluide est supérieure à un niveau présélectionné, le mélange est transféré en retour à l'appareil 4 de filtration dynamique via un réservoir tampon 3 et la méthodologie précédemment décrite. Ce procédé est répété jusqu'à ce que la concentration du composé cible non lié dans le fluide soit inférieure au niveau présélectionné, indiquant par là qu'une quantité suffisante du composé cible a été adsorbée sur les particules d'affinité. Lorsqu'il est déterminé, par quelque moyen que ce soit, qu'une quantité suffisante de composé cible a été adsorbée sur les particules d'affinité, alors la vanne 7 de filtrat est ouverte de façon à ce que le fluide passe à travers le 16 2714299 milieu de filtration de l'appareil 4 de filtration dynamique dans un réservoir 6 de déchets, laissant par là les billes d'affinité dans l'appareil 4 de filtration dynamique. La vanne 7 de filtration est ensuite typiquement fermée, bien que, alternativement, du fluide additionnel puisse être passé dans l'appareil 4 de filtration dynamique pour contacter les billes d'affinité, particulièrement si les billes d'affinité ne sont pas saturées avec le composé cible. Un tel fluide additionnel peut être passé dans l'appareil 4 de filtration dynamique d'une manière continue ou semi-continue alors qu'une partie du fluide dans l'appareil 4 de filtration dynamique continue à passer à travers le milieu de filtration de l'appareil 4 de filtration dynamique. Après que l'addition du fluide dans l'appareil 4 de filtration dynamique soit complétée et que le fluide dans l'appareil 4 de filtration dynamique soit passé à travers le milieu de filtration de l'appareil 4 de filtration dynamique, la vanne 11 de tampon de lavage est ouverte pour permettre au tampon de lavage provenant du réservoir 10 de tampon de lavage d'entrer dans l'appareil 4 de filtration dynamique. Le tampon de lavage est laissé à s'intermélanger avec les particules d'affinité pendant une période de temps appropriée, et ensuite la vanne 7 de filtrat est à nouveau ouverte pour permettre au tampon de lavage de passer vers le réservoir 6 de déchets. Typiquement, il y aura plusieurs cycles de lavage pour assurer que le fluide traité, pour le composé cible lié aux particules d'affinité, a été éliminé de l'appareil 4 de filtration dynamique. Les particules d'affinité sont ensuite transférées au réceptacle 13 d'élution via la vanne 8 de concentré. Un tel transfert peut être accompli en utilisant un tampon de lavage provenant du réservoir 10 de tampon de lavage pour transporter les particules d'affinité au réceptacle 13 d'élution dans lequel elles sont de préférence emballées de façon hermétique. La vanne 14 d'éluant est ensuite ouverte pour permettre à l'éluant provenant du réservoir 15 d'éluant de passer à travers le réceptacle 13 d'élution pour éluer le 17 2714299 composé cible des particules d'affinité et passer le composé cible à travers le réceptacle 13 d'élution pour collecte. Lorsque le courant d'effluent existe dans le réceptacle 13 d'élution, il passe de préférence à travers des moyens 16 de détection d'effluent qui contrôlent le niveau de composé cible dans le courant d'effluent et ferment la vanne 14 d'éluant lorsque la concentration du composé cible atteint un niveau présélectionné, par exemple, environ zéro. Les particules d'affinité, qui n'ont plus le composé cible lié à elles, sont ensuite réutilisées. De préférence, un tampon de suspension est introduit dans le réceptacle 13 d'élution à partir d'un réservoir 12 de tampon de suspension de façon à transférer les particules d'affinité à partir du réceptacle 13 d'élution vers le réservoir 2 de maintien pour une réutilisation subséquente. En contrôlant de façon précise le temps des opérations de l'appareil 4 de filtration dynamique et d'élution du composé dans le réceptacle 13 d'élution, les deux dispositifs peuvent être simultanément mis en fonctionnement, convertissant ainsi le traitement en batch en un procédé semi-continu. La figure 1, bien sûr, est purement une illustration schématique d'un mode de réalisation préféré de la présente invention, et l'équipement réel et son emplacement peuvent être changés considérablement pour d'autres modes de réalisation de la présente invention. Par exemple, les moyens de détection 9 peuvent être situés séparément de l'appareil 4 de filtration dynamique ou peuvent être situés dans l'appareil 4 de filtration dynamique de façon à éliminer le besoin du transfert du mélange dans et hors de l'appareil 4 de filtration dynamique. De façon similaire, les moyens de détection 16 peuvent être situés séparément de ou dans le réceptacle 13 d'élution, et l'élution du composé cible provenant des particules d'affinité peut prendre place dans le réceptacle 13 d'élution ou dans tout autre appareil approprié. D'autres variations seront apparentes à ceux de spécialisation ordinaire dans l'art. De façon similaire, les références à des composants 18 2714299 communs tels que des moyens de canalisation et de pompage ont été omises de la figure 1, aussi bien que de la discussion ci-dessus, dans des buts de clarté. L'utilisation de tels composants dans le contexte de la présente invention est bien dans la spécialisation de ceux de l'art pertinent. Particules d'affinité Toute particule d'affinité appropriée peut être utilisée en conjonction avec la présente invention. Les particules d'affinité comprennent un substrat et un ligand sur la surface de celles-ci qui est capable de se lier au composé cible dans un fluide de façon à permettre la séparation de ce composé du restant du fluide et ensuite être capable d'être retiré des particules d'affinité. Des particules d'affinité appropriées, incluant des substrats et ligands appropriés, sont bien connues dans l'art. Beaucoup de telles particules d'affinité sont utilisées dans le contexte des méthodes de séparation d'affinité conventionnelles et seront ou plus utilisement utilisées en conjonction avec la présente méthode inventive. Bien sûr, les particules d'affinité utilisées pour séparer un composé particulier d'un fluide particulier varieront, spécialement par rapport au ligand lié à la surface substrat de la particule d'affinité. La sélection appropriée du ligand assurera que le composé cible se lie sélectivement et réversiblement, par exemple se complexe avec ou s'adsorbe sur, la particule d'affinité. Les particules d'affinité ont de préférence une surface qui est lisse et non poreuse (c'est-à-dire, ayant des pores de moins d'environ 2000 angstroms de diamètre ou n'ayant pas de pores visibles à un agrandissement de 10.000 sur une micrographie électronique à balayage), qui est hydrophile (c'est-à-dire, ayant une tension de surface de mouillage critique d'au moins environ 72 dynes/cm ou 72 107N.m), et qui a une faible susceptibilité de liaison à des protéines non spécifiques (par exemple, la liaison ne se produit que par les ligands attachés). Les particules d'affinité sont 19 2714299 également de préférence homogènes entre elles, particulièrement en ce qui concerne la quantité de ligands qui y sont attachés, de façon à fournir des résultats de séparation d'affinité consistant et prévisibles dans le contexte de la présente invention. Les particules d'affinité peuvent être de toute forme appropriée mais sont de préférence substantiellement sphériques. De plus, les particules d'affinité sont de préférence substantiellement monodisperses en diamètre. Les particules d'affinité sphériques de tailles similaires procurent le fonctionnement le plus efficace de la présente méthode inventive, particulièrement par rapport à la manipulation des particules d'affinité. De telles particules d'affinité auront généralement la probabilité la plus faible de créer des problèmes d'écoulement et permettront la minimisation de la taille du réceptacle d'élution et de la quantité d'éluant utilisée pour retirer le composé cible des particules d'affinité comme un résultat d'un emballage plus uniforme et dense qui peut être atteint avec de telles particules d'affinité. Les particules d'affinité peuvent être de toute taille appropriée. Les diamètres moyens des particules d'affinité seront typiquement inférieurs à environ 100 Mm, et plus usuellement inférieurs à environ 60 pm. De préférence, les particules d'affinité auront un diamètre moyen de moins d'environ 20 Mm, et plus préférablement de moins d'environ Mm. Pour beaucoup d'utilisations, les particules d'affinité auront avantageusement un diamètre d'environ 1 à environ 5 Mm. Comme antérieurement décrit, les particules d'affinité sont de préférence substantiellement monodisperses en diamètre, de sorte que la gamme des diamètres ne diffère pas de préférence de plus d'environ 50 %, plus préférablement d'environ 25 %, et le plus préférablement d'environ 10 %, comme déterminé en divisant le diamètre de la plus petite particule par le diamètre de la plus grande particule. Les diamètres des particules d'affinité peuvent être déterminés 2714299 par des moyens connus, comme par l'utilisation de micrographies électroniques à balayage. Dans tous les cas, il est souhaitable que substantiellement toutes les particules d'affinité ne passent pas à travers le milieu de filtration, puisque les particules d'affinité qui le font représentent ainsi une perte dans les particules d'affinité aussi bien qu'une diminution dans la récupération du composé cible étant donné qu'un tel passage se produirait après que le composé cible ait été lié aux particules d'affinité. De façon à éviter une telle perte des particules d'affinité, les particules de substrat sont de préférence soumises au milieu de filtration à utiliser dans l'appareil de filtration dynamique avant traitement ultérieur. De cette manière, les particules de substrat qui passeraient à travers le milieu de filtration sont éliminées avant l'attachement du ligand qui liera le composé cible. L'efficacité de la méthode de séparation d'affinité globale est par là augmentée pour assurer la récupération presque absolue des particules d'affinité avec le composé cible et le rétrécissement de la distribution de tailles des particules d'affinité pour une manipulation améliorée. La distribution de taille des particules d'affinité ainsi obtenue peut être de plus améliorée en changeant le milieu de filtration en un milieu de filtration ayant une taille de pores plus grande et en soumettant les particules de substrat au procédé de filtration dynamique une fois encore. Les particules de subtrat récupérées qui passaient à travers le milieu de filtration dans ce second passage auraient même une distribution de tailles plus étroite (substantiellement limitée à l'extrémité basse par la taille de pores du premier milieu de filtration et substantiellement limitée à l'extrémité haute par la taille de pores du second milieu de filtration. Alors que de telles méthodes de contrôle de tailles sont de préférence mises en oeuvre sur les particules de substrat avant l'attachement du ligand à celles-ci, les techniques, bien sûr, peuvent également être utilisées pour 21 2714299 la mise à la taille des particules d'affinité (c'est-à-dire, après attachement du ligand aux particules de substrat). Les particules d'affinité peuvent avoir toute densité appropriée. Les particules d'affinité ont avantageusement une densité moyenne dans l'intervalle d'environ 0,5 g/cm3 à environ 3,0 g/cm3, de préférence environ 1 g/cm3 à environ 2 g/cm3, et plus préférablement environ 1 g/cm3, pour assurer la flottaison adéquate du milieu pendant le traitement. Particules de substrat Tout substrat approprié peut être utilisé pour préparer les particules d'affinité. Comme discuté ci-dessus, la surface des particules d'affinité est de préférence lisse, non poreuse, et hydrophile et a une faible susceptibilité d'adsorption des composés, particulièrement des protéines. Le substrat peut être un matériau homogène, qui satisfait de préférence aux caractéristiques ci- dessus mentionnées préférées, ou peut comprendre plus d'un matériau (par exemple, un matériau de coeur revêtu avec un autre matériau), dont la couche de surface satisfait de préférence aux caractéristiques préférées ci-dessus mentionnées. Ainsi, par exemple, les particules de susbtrat peuvent comprendre un matériau non poreux homogène, un matériau de coeur à recouvrir par un matériau polymérique non poreux, ou même un matériau de coeur non poreux recouvert avec un matériau polymérique non poreux. Alors que les particules de substrat peuvent comprendre, par exemple, un matériau poreux homogène ou même un matériau de coeur revêtu avec un matériau poreux, de telles particules de substrat ne sont pas préférées pour l'utilisation dans la présente méthode inventive. Les particules de substrat sont de préférence préparées à partir de verre, d'alumine, d'acier (particulièrement d'acier inoxydable), de silice, de SiAl, de terre de diatomées, ou, de préférence d'un matériau polymérique tel que, par exemple, du polystyrène, du polyéthylène, du polytétrafluoro-éthylène, de la cellulose, des esters de 22 2714299 cellulose, du polycarbonate, du polystyrène, de l'acrylonitrile-butadiène-styrène, un polymère d'oxyde de polyphénylène, du polysiloxane, et du latex. La surface exposée du substrat peut permettre la liaison d'un ligand approprié, qui ne deviendra pas non lié pendant le traitement ultérieur. Le substrat doit être mécaniquement stable, non gonflant, et non réactif lorsqu'exposé au fluide à traiter. D'autres caractéristiques du substrat varieront avec le fluide particulier à traiter et le composé cible à séparer de celui-ci. Par exemple, le substrat peut être choisi de sorte que les particules d'affinité possèdent un degré désiré de flottaison. Les substrats particulièrement utiles pour la séparation d'affinité des protéines incluent des polyéthylènes haute et basse densité des Séries Microthène disponibles de Quantum Chemical (gravité spécifique: 0,92 - 0,96; surface spécifique DuPont (taille moyenne: environ 0,1 à 0,5 pm). Dans la mesure o le susbtrat est revêtu pour rendre le substrat lisse, non poreux, hydrophile et/ou moins susceptible de liaison de protéines, tout polymère peut être utilisé en tant que matériau de revêtement tant qu'un ligand approprié peut être attaché à celui-ci pour utilisation dans l'isolement du composé cible. Toute méthode appropriée d'attachement du revêtement polymérique au matériau de coeur peut être utilisée. Ainsi, par exemple, des méthodes telles que la greffe par irradiation de monomères (particulièrement la greffe par faisceau électronique) et le revêtement de solution polymèrique peuvent être utilisées de façon satisfaisante. Les dérivés cellulosiques et de cellulose modifiée, tels que l'acétate de cellulose, sont les polymères biocompatibles qui sont généralement tout à fait utiles dans le contexte de la présente invention. De tels dérivés cellulosiques modifiés incluent les polymères cellulosiques modifiés en surface par liaison covalente de groupes de 23 2714299 surface biocompatible au polymère substrat cellulosique le rendant plus biocompatible. Alors que de nombreux groupes de surface appropriés sont bien connus dans l'art, l'albumine a montré une utilité particulière en tant que tel groupe modifiant. Les polymères appropriés pour le revêtement de surface des matériaux de coeur incluent les homopolymères et copolymères qui peuvent être préparés à partir d'une grande variété de monomères. Par exemple, des monomères particulièrement appropriés pour la greffe par irradiation incluent les acides acryliques et méthacryliques (particulièrement les hydroxyalkyl acrylates et les hydroxyalkyl méthacrylates par exemple, l'hydroxyéthyl acrylate, l'hydroxypropyl acrylate et l'hydroxybutyl méthacrylate) et les alcools allyliques. Les polymères particulièrement appropriés pour le revêtement en solution incluent les polymères fonctionnels hydroxy tels que les alcools allyliques, les alcools polyvinyliques, les polyacrylamides, les éthers vinyl glycidyle, et les éthers vinyl allyle. Beaucoup d'autres monomères et polymères peuvent, bien sûr, être utilisés dans la préparation des particules d'affinité pour utilisation dans le contexte de la présente invention. La surface du substrat, que ce soit un substrat de coeur revêtu ou homogène, est de préférence telle qu'elle ne possède pas ou une faible affinité pour le composé cible dans le fluide traité. Une telle surface assure que le composé cible se complexera de façon réversible ou s'attachera autrement au ligand sur la surface des particules de substrat plutôt qu'à la surface des particules de substrat per se o le composé cible peut être trop faiblement ou trop fortement attaché de façon à ce qu'il soit perdu ou irrécupérable dans un traitement ultérieur. La surface de substrat est également de préférence spontanément mouillable par le fluide traité, par exemple, hydrophile, pour assurer un bon contact entre les particules d'affinité et le fluide traité et, par là, une bonne récupération du composé cible du fluide traité. De plus, la surface du substrat est de préférence lisse pour 24 2714299 minimiser l'adhérence du matériau autre que le composé cible au ligand attaché sur la surface des particules d'affinité et pour fournir un nettoyage facile des particules d'affinité. Le substrat est de préférence capable d'être utilisé de nombreuses fois et il doit être chimiquement stable de sorte qu'il ne se décompose pas et ne pose d'autres problèmes de contamination. Ligand Le ligand peut être toute fonctionnalité chimique qui peut être attachée aux particules de substrat sans être éliminée pendant le traitement subséquent et qui se liera sélectivement avec le composé cible, telle que des anticorps, des antigènes, des protéines, des acides nucléiques, des composants compléments, des hormones, des vitamines, et analogues. Le ligand sera typiquement fournit par réaction d'un composé particulier ayant la fonctionnalité désirée avec les particules de substrat, mais peut être une partie intégrale de la particule de substrat, par exemple, du revêtement polymérique sur un matériau de coeur. Les méthodes pour attacher le ligand aux particules de substrat sont bien connues de ceux spécialisés dans l'art. Des méthodes d'attachement appropriées incluent l'attachement spontané covalent, l'activation chimique de groupes fonctionnels terminaux, et l'attachement de réactifs de couplage. L'attachement covalent spontané de certains ligands aux surfaces de supports polymères se fait via des groupes chimiquement réactifs s'étendant à partir du support polymère. Ainsi, par exemple, des groupes réactifs tels qu'un aldéhyde ou un époxy s'étendant à partir du support de polymère se couplent facilement avec des ligands contenant des groupes disponibles hydroxyles, aminos ou thiols. Egalement, par exemple, des groupes aldéhyde libres sur le support polymère se couplent via des liaisons acétal avec des composés contenant un hydroxyle et via des liaisons imide 2714299 avec des composés contenant un amino. Additionnellement, par exemple, des groupes oximes libres se couplent via des liaisons alkylamine, éther et thioéther avec des composés contenant des groupes amine, hydroxyl et thio respectivement. Des discussions plus complète de ces réactions peuvent être trouvées, par exemple, dans Chen et al., "Chemical Procedures for Enzyme Immobilization of Porous Cellulose Beads", Biotechnoloqy and Bioengineerinq, XIX, 1463-1473 (1977), et dans "Epoxy Activated Sepharose," Pharmacia Fine Chemicals (Affinity Chromography), 6B, 27-32 (1979). L'activation chimique des groupes fonctionnels terminaux peut être par activation des groupes fonctionnels de surface du polymère par modification chimique de leurs composants terminaux. Cette méthode peut être exemplifiée par l'oxydation des fonctions époxy terminales avec l'acide periodique pour former des groupes aldéhyde actifs. Cette méthode est de plus exemplifiée, par exemple, dans Svec et al., "Immobilization of Amyloglucosidose on Poly [(Glycidyl Methacrylate) Co (Ethylène Diméthacrylatep)] Carrier and Its Derivatives," Biotechnoloqy and Bioenqineerinq, XX, 1319-1328 (1978). L'immobilisation du ligand telle qu'un ligand peut se dérouler comme décrit ci- dessus. Des réactions de condensation peuvent être accomplies entre des groupes amine et carboxy libres via une activation carbodiimide des groupes carboxy comme cela est décrit, par exemple, dans Hoffman et al., "New Approaches to Non-Thrombogenic Materials," Coagulation-Current Research and Clinical Applications, (Academic Press, New York 1973). L'immobilisation des ligands est effectuée par activation carbodiimide par soit le polymère soit les groupes carboxyle du ligand et condensation avec une amine libre pour former une liaison peptide stable. L'orientation finale du ligand est généralement un facteur concernant le choix d'utiliser une amine ou un polymère contenant un carboxyle. L'attachement du réactif de couplage peut être accompli en utilisant une variété d'agents de couplage pour former des ponts covalents entre les polymères et les ligands. Les 26 2714299 ligands et polymères contenant une amine et/ou un hydroxyle libre peuvent être couplés de façon covalente par des réactifs tels que, par exemple, du bromure de cyanogène, des diisocyanates, des dialdéhydes et des trichloro-s-triazine. Une discussion plus exhaustive de cette technique peut être trouvée, par exemple, dans la référence Chen et al. citée ci- dessus. La méthode préférée pour immobiliser un ligand sur un substrat polymère dans un cas donné est généralement dictée par les positions moléculaires de la moitié réactive du ligand et des groupes fonctionnels particuliers du ligand et du substrat de polymère qui peuvent être combinés de façon covalente. Par exemple, on préfère actuellement dans le cas de substrats polymère contenant des fonction hydroxy terminales d'activer par traitement avec une solution alcaline de bromure de cyanogène (par exemple 10-20 % p/v). Typiquement le mélange réaction est maintenu à température ambiante (par exemple, 20-25 C) pendant environ 30 minutes. Le pH de la solution est maintenu dans un intervalle d'environ 10 à 12 par l'addition du matériau alcalin, par exemple, KOH ou NaOH. Le polymère est ensuite extensivement lavé avec une solution saline physiologique (0,9 % g) et incubé avec des solutions d'un ligand purifié dissous dans une solution tampon légèrement alcaline pendant 12-16 heures à 2-8 C. Le polymère est extensivement rincé avec une solution saline physiologique pour éliminer les ligands liés non spécifiquement ou non liés. De façon similaire, les ligands sont de préférence immobilisés sur des polymères contenant un glycidyle via des liaisons éther, thioéther ou alkylamine. Les substrats polymère activés époxy sont rincés et mis à gonfler avec des solutions de tampon neutre aqueuses à température ambiante. Les ligands purifés, les solutions tampon dissoutes borate, carbonate ou phosphate sont incubées avec le substrat polymère glycidyle pendant 12heures à 4-30 C. Les ligands en excès et liés non spécifiquement sont éliminés par rinçage du polymère avec une solution saline, de l'acide acétique 27 2714299 (0,2-1,0 M), et des solutions salines tamponnées phosphate (pH = 7,2 0,2). L'activation des matrices polymères contenant une amine et un carboxyle est effectuée par traitement avec des ligands purifiés dissous dans des solutions tampon légèrement acides (pH = 4,5-6,5) d'un carbodiimide soluble dans l'eau. Les ligands sont couplés de façoncovalente à un substrat polymère par incubation du substrat polymère, du ligand, et des réactifs carbodiimide pendant 12-16 heures à 2-8 C. Les conjugués polymère-ligand sont lavés alternativement dans des rinçages acides et ensuite alcalins jusqu'à ce que les solutions de rinçage soient exemptes de ligand et de réactants carbodiimide. Au moyen d'un exemple supplémentaire, une méthode de liaison des ligands à la surface des particules de substrat est décrite dans le brevet U.S. 5 077 210. Un silane est lié au substrat et se couple à un agent de réticulation hétérobifonctionnel à un groupe fonctionnel du ligand, laissant par là un groupe fonctionnel différent qui est libre de lier le composé cible, tel qu'une protéine. De préférence, le silane a un groupe fonctionnel qui réagit avec le groupe hydroxyle du substrat et un groupe terminal thio qui réagit avec un groupe fonctionnel d'un agent de réticulation hétérobifonctionnel qui contient un groupe succinimide pour une réaction subséquente avec un groupe amino d'un composé cible, tel qu'une protéine. Une méthode de liaison d'anticorps à la surface des particules de substrat est décrite par le brevet U.S. 4 357 311. Cette méthode implique la liaison covalente d'un anticorps par une trichloro- triazine pour donner les particules d'affinité. De plus, de nombreuses méthodes pour immobiliser des enzymes sur la surface de particules de substrat sont décrites dans "Enzyme Technology" (Noyes Data Corporation 1983), particulièrement aux pages 38 à 59 de celui-ci. Des espaceurs peuvent être également utilisés dans la préparation des particules d'affinité pour utilisation dans la présente méthode inventive de séparation d'affinité. Un 28 2714299 espaceur est généralement une molécule qui a au moins deux groupes fonctionnels réactifs, qui peuvent être identiques ou différents, situés aux extrémités opposées de la molécule et qui est utilisé pour lier les particules de substrat et le ligand. Les espaceurs peuvent être utilisés pour faciliter l'attachement d'un ligand à des particules de substrat et pour assurer que le ligand est maintenu suffisamment loin des particules de substrat de façon à contacter plus efficacement le fluide traité et, plus particulièrement le composé cible. Les espaceurs appropriés dans lesquels les groupes fonctionnels réactifs sont identiques incluent, par exemple, le 6- diaminohexane, la divinyl sulfone, le glutaraldéhyde, l'acide 1,4-cyclohexanedicarboxylique, l'acide éthylène- diamine tétraacétique, le triéthylène glycol, le 1,4- butanediol diglycidyl éther, le méthylène-p-phényl diisocyanate et l'anhydride succinique. Les espaceurs appropriés dans lesquels les groupes fonctionnels relatifs ne sont pas identiques inlcuent, par exemple, l'acide 6- aminocaproique, le chlorure de p-nitrobenzoyle, le 1-2-époxy- 3-(p-nitrophenoxy) propane, l'aminopropyltriéthoxy-silane, et l'homocystéine thiolactone. Les polypeptides et plus spécifiquement les protéines, peuvent être utilisés en tant qu'espaceurs. L'albumine, une protéine à faible affinité, par exemple, a été employée avec succès en tant qu'espaceur, et l'albumine et d'autres protéines naturelles servent également à rendre les particules de substrat plus biocompatibles. 29 2714299 Appareil de filtration dynamique L'appareil de filtration dynamique peut être tout appareil de filtration dynamique approprié. Le principe de fonctionnement d'un appareil de filtration dynamique est de maintenir un milieu de filtration exempt de bouchage ou d'encrassage par répulsion de la matière particulaire du milieu de filtration et en rompant la formation de couches gateau adjacentes au milieu de filtration. Ces résultats sont accomplis en bougeant le courant de fluide assez vite par rapport au milieu de filtration pour produire des vitesses de cisaillement élevées aussi bien que des forces de soulèvement élevées sur les particules, de préférence par utilisation de moyens de rotation fonctionnant dans l'appareil de filtration dynamique qui agit lorsque le fluide est traité, afin que d'autres moyens, tels que des moyens oscillants et de va et vient, puissent être utilisés de façon similaire pour atteindre un effet similaire. Le cisaillement à l'interface fluide- milieu de filtration dans un procédé de filtration dynamique est pratiquement indépendant de toute vélocité de fluide à flux transversal, au contraire des techniques de filtration tangentielles ou à flux croisés (qui souffrent d'autres problèmes tels que le bouchage prématuré du filtre en raison de l'adsorption du composé et des chutes de pression élevées et non uniformes associées avec des vélocités tangentielles élevées le long de la longueur du filtre, provoquant potentiellement l'écoulement en retour à travers le milieu de filtration et la réduction de la filtration). La filtration dynamique offre un nombre d'avantages de performance dans le contexte de la présente invention. Les taux de cisaillement très élevés produits dans l'assemblage de filtration dynamique procurent un excellent moyen pour assurer que les particules d'affinité sont vigoureusement mises en contact par le fluide traité de façon à assurer un taux élevé de récupération du composé cible. De plus, puisque des augmentations dans le taux de perméation du flux ont été 2714299 observées pour être approximativement linéaires avec le taux de cisaillement élevé dans certains systèmes, la surface de filtration requise pour éliminer efficacement le fluide traité des particules d'affinité peut être dramatiquement réduit par rapport à d'autres moyens de filtration. Un appareil de filtration dynamique typique comprend un logement imperméable extérieur et un élément intérieur qui contient le milieu de filtration qui bouge par rapport au fluide. Une variété de moyens moteur appropriés peut être utilisée pour mettre en oeuvre un tel déplacement relatif, tels que, par exemple, des moyens de rotation, d'oscillation et de va et vient. Des systèmes de filtration dynamique cylindriques appropriés sont décrits dans les brevets U.S. 3 797 662, 4 066 554, 4 093 552, 4 427 552, 4 900 440 et 4 956 102. Les systèmes de filtration dynamique à disque rotatif appropriés sont décrits dans les brevets U.S. 3 997 447, 4 956 102 et 5 037 562 aussi bien que dans la demande de brevet U.S. série No. 07/812 123, déposée le 24 Décembre 1991. D'autres systèmes de filtration dynamiques appropriés sont décrits dans les brevets U.S. 4 952 317. Les assemblages de filtration dynamiques commercialement disponibles incluent le ASEA Brown Bovery rotary CROT, New Logic V-SEP, et les dispositifs de filtration discutés dans Murkes, "Fundamentals of Crossflow Filtration," Separation and Purification Methods, 19(1), 1-29 (1990). D'autres configurations appropriées pour l'appareil de filtration dynamique peuvent également être utilisées dans le contexte de la présente invention. Dans le contexte de la présente invention, l'appareil de filtration dynamique produit de préférence des taux de cisaillement d'au moins 5 000 s-1, et plus préférablement d'au moins environ 10 000 s-1. Le milieu de filtration utilisé en conjonction avec l'appareil de filtration dynamique peut être tout milieu de filtration approprié et sera typiquement une membrane poreuse, de préférence, une membrane polymérique microporeuse. Alors que le milieu de filtration peut avoir tout intervalle de tailles de pores appropriées, par exemple, 31 2714299 d'environ 20 Mm ou moins, d'environ 10 pm ou moins, d'environ pm ou moins, ou même d'environ 1 Mm ou moins, le milieu de filtration permettra de préférence que tout, ou au moins substantiellement tout, le fluide traité passe à travers le milieu de filtration tout en retenant toutes, ou au moins substantiellement toutes, les particules d'affinité. Ainsi, l'intervalle de tailles de pores du milieu de filtration dépend largement de la taille des particules d'affinité et de la taille du débris le plus large (c'est-à-dire le composé non cible) dans le fluide traité. La figure 2 décrit schématiquement un appareil de filtration dynamique préféré pour utilisation avec la présente méthode inventive de séparation d'affinité. L'appareil de filtration dynamique comprend un logement 20 ayant un orifice d'alimentation 21, un orifice de concentré 22, et un orifice de filtrat 23. Un moyen de rotation 24 est disposé dans le logement 20 avec le milieu de filtration 25. L'orifice d'alimentation 21 et l'orifice de concentré 22 sont en communication de fluide avec le côté amont du milieu 25 de filtration, alors que l'orifice de filtrat 23 est en communication de fluide avec le côté aval du milieu de filtration 25. Le fluide est capable de passer à travers le milieu de filtration 25, alors que les particules d'affinité sont substantiellement incapables de passer à travers le milieu de filtration 25. Un réceptacle 26 d'élution est en communication de fluide avec le côté aval du milieu 25 de filtration et est connecté au logement 20 aux moyens d'une vanne 27 d'entrée de réceptacle d'élution qui peut contrôler l'écoulement des particules d'affinité et des fluides au sommet du réceptacle 26 d'élution. Le réceptacle 26 d'élution a également une vanne 28 de sortie de réceptacle d'élution au fond du réceptacle 26 d'élution qui peut contrôler le flux d'entrée et le flux de sortie des fluides dans le réceptacle 26 d'élution. En utilisation, un mélange du fluide contenant le composé cible et les particules d'affinité sont alimentés dans le logement 20 de l'appareil de filtration dynamique via *32 2714299 un orifice 21 d'alimentation. Les moyens 24 de rotation sont activés pendant une période de temps suffisante pour effectuer la liaison du composé cible avec les particules d'affinité et dans l'appareil de filtration dynamique, avec l'orifice 22 de concentré et l'orifice 23 de filtrat étant fermé de façon à ce qu'aucune partie du mélange ne puisse passer à travers le milieu 25 de filtration. Le mélange est ensuite filtré à travers le milieu de filtration 25 en ouvrant l'orifice 23 de filtrat pour permettre au fluide d'être éliminé de celui-ci dans l'appareil de filtration dynamique. Un tampon de lavage peut être introduit dans l'appareil de filtration dynamique via l'orifice 21 d'alimentation pour éliminer tout matériau non lié de celui-ci dans l'appareil de filtration dynamique, et le tampon de lavage peut ensuite être laissé à passer à travers l'orifice 23 de filtrat. De multiples étapes de lavage, si cela est souhaitable, peuvent bien sûr être mises en oeuvre de la même manière. Les particules d'affinité sont ensuite transférées au réceptacle 26 d'élution via la vanne 27 d'entrée de réceptacle d'élution, de préférence par l'introduction d'une petite quantité de tampon de lavage dans l'appareil de filtration dynamique. De façon à assurer que le volume mort entier de l'appareil de filtration dynamique soit efficacement et complètement drainé dans le réceptacle 26 d'élution, l'appareil de filtration dynamique est de préférence quelque peu déplacé, par exemple, de 5- 10 , à partir de l'horizontal avec le réceptacle d'élution situé au point bas de l'appareil de filtration dynamique. L'éluant est ensuite introduit dans le réceptacle 26 d'élution, par exemple, via l'orifice 21 d'alimentation et la vanne 27 d'entrée de réceptacle d'élution, pour éliminer le composé cible des particules d'affinité qui peuvent être soutirées du réceptacle 26 d'élution via la vanne 28 de sortie de réceptacle d'élution. Après que le composé cible ait été éliminé des particules d'affinité et récupéré, les particules d'affinité sont ensuite réutilisées par, par exemple, introduction d'un tampon de suspension dans le 33 2714299 réceptacle 26 d'élution via la vanne 28 de sorte de réceptacle d'élution pour transférer les particules d'affinité en retour dans l'appareil de filtration dynamique via la vanne 27 d'entrée de réceptacle d'élution. Le tampon de suspension peut ensuite être éliminé, si désiré, au moyen de l'orifice 23 de filtration, et, le procédé répété avec le fluide additionnel contenant le composé cible. La figure 2, bien sûr, est purement une illustration schématique d'un mode préféré de l'appareil utile dans la mise en oeuvre de la présente méthode inventive, et des aspects particuliers d'un appareil réel pour utilisation dans la présente invention peuvent être changes considérablement. Par exemple, les moyens de détection peuvent être situés dans l'appareil de filtration dynamique pour déterminer la quantité de composé cible non lié. De façon similaire, un moyen de détection peut être situé séparément ou dans le réceptacle d'élution pour déterminer la quantité de composé cible élué des particules d'affinité. D'autres variations seront apparentes à ceux de spécialisation ordinaire dans l'art. De façon similaire, les références à des composants communs tels qu'un moyen de conduit et de pompage ont été omises de la figure 2, aussi bien que de la discussion ci- dessus, dans des buts de clarté. L'utilisation de tels composants dans le contexte de la présente invention est bien dans la spécialisation de ceux spécialisés dans l'art pertinent. Utilisation illustrative La présente méthode inventive peut être utilisée pour séparer ou isoler tout composé de tout fluide o le composé et le fluide sont appropriés pour une séparation d'affinité. Par exemple, la présente méthode inventive peut être utilisée pour isoler des protéines et des anticorps de fluides tels que des produits de fermentation, du lait et du sang entier ou du sérum. La présente méthode inventive peut également 34 2714299 être utilisée pour isoler un stéréoisomère particulier d'un mélange racémique. La présente méthode inventive est particulièrement bien adaptée pour l'isolement ou la séparation d'une protéine d'un bouillon de fermentation chargé en protéine parce que la présente méthode inventive ne requiert pas que le bouillon soit prétraité pour éliminer les contaminants non désirés, par exemple, les débris de cellule, les pyrogènes, les pathogènes ou les toxines. Diverses autres combinaisons de ligands des composés cibles sont décrits ci-après. Ligand Composé Cible inhibiteur; cofacteur; enzymes; apoenzymes groupe prosthétique; substrat polymérique enzyme inhibiteurs polymériques acide nucléique acide nucléique (brin unique) (brin complémentaire) haptène; antigène anticorps anticorps protéines; polysaccharides monosaccharide; lectines; récepteurs polysaccharide lectine glycoprotéines; récepteurs petit composé cible protéines liantes protéine de liaison petits composés cibles D'autres relations composé cible-ligand sont connues de ceux de spécialisation ordinaire dans l'art et peuvent être utilisées dans le contexte de la présente méthode inventive de séparation d'affinité. 2714299 Toutes les références citées ici, incluant les publications, les brevets et les demandes de brevet, sont ici incorporées dans leur entier par référence. Alors de cette invention qui a été décrite en insistant sur des modes de réalisation préférés, il sera évident à ceux de spécialisation ordinaire dans l'art que des variations des modes de réalisation préférés peuvent être utilisées et qu'il est entendu que l'invention peut être pratiquée autrement que sous la forme spécifiquement décrite ici. Par conséquent, cette invention inclut toutes les modifications embrassés dans l'esprit et l'étendue de l'invention telle que définie par les revendications suivantes. 36 2714299 REVENDICATIONS 1. Méthode de séparation d'affinité caractérisée en ce qu'elle comprend: (a) l'introduction de particules d'affinité et d'un fluide contenant un composé cible à isoler qui est capable de s'adsorber sur lesdites particules d'affinité dans un appareil de filtration dynamique comprenant des moyens moteur, un milieu de filtration ayant des côtés amont et aval, une entrée en communication de fluide avec le côté amont dudit milieu de filtration, et une sortie de filtrat en communication de fluide avec le côté aval dudit milieu de filtration, o ledit fluide est capable de passer à travers ledit milieu de filtration et lesdites particules d'affinité sont substantiellement incapables de passer à travers ledit milieu de filtration, (b) l'actionnement desdits moyens moteur dudit appareil de filtration dynamique avec ladite sortie de filtrat étant en position fermée de sorte que ledit fluide ne peut pas passer à travers ledit milieu de filtration dans des conditions suffisantes pour permettre audit composé de s'adsorber sur lesdites particules d'affinité, et (c) la séparation desdites particules d'affinité dudit fluide en ouvrant ladite sortie de filtrat de façon à permettre audit fluide de passer à travers ledit milieu de filtration dudit appareil de filtration dynamique. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite étape de séparation (c) est mise en oeuvre lorsque la concentration dans ledit fluide dudit composé cible non adsorbé sur lesdites particules d'affintié tombe à un niveau prédéterminé. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend de plus (d) le lavage desdites particules d'affinité, et (e) l'élution dudit composé cible desdites particules d'affinité. 37 2714299 4. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit composé cible est élué desdites particules d'affinité par transfert desdites particules d'affinité ayant ledit composé cible adsorbé sur elles dudit appareil de filtration dynamique dans un réceptacle d'élution et passage d'un éluant à travers ledit réceptacle d'élution pour éliminer ledit composé cible. 5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit composé cible est présent dans ledit éluant à une concentration au moins environ 10 fois supérieure à la concentration dudit composé cible dans ledit fluide avant de contacter lesdites particules d'affinité. 6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que la quantité d'éluant passée à travers ledit réceptacle d'élution est équivalente à environ le volume de vide libre dudit réceptacle d'élution. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que lesdites particules d'affinité éluées sont ensuite transférées en retour audit appareil de filtration dynamique et que la méthode est répétée. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit réceptacle d'élution est en communication de fluide avec le côté amont dudit milieu de filtration dudit appareil de filtration dynamique. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit appareil de filtration dynamique est mis en fonctionnement pour atteindre un taux de cisaillement d'au moins environ 5 000 s-1. 10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit appareil de filtration dynamique est mis en fonctionnement pour atteindre un taux de cisaillement d'au environ 10 000 s-1. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que lesdites particules d'affinité sont non poreuses. 38 2714299 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que lesdites particules d'affinité sont substantiellement sphériques. 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que lesdites particules d'affinité sont substantiellement monodisperses en diamètre. 14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdites particules d'affinité ont un diamètre au moins deux fois supérieur à la taille des pores dudit milieu de filtration. 15. Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que lesdites particules d'affinité ont un diamètre au moins cinq fois plus grand que la taille des pores dudit milieu de filtration. 16. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que lesdites particules d'affinité ont un diamètre moyen d'environ 60 Mm ou moins. 17. Méthode selon la revendication 16, caractérisée en ce que lesdites particules d'affinité ont un diamètre moyen d'environ 20 pm ou moins. 18. Méthode selon la revendication 17, caractérisée en ce que lesdites particules d'affinité ont un diamètre moyen d'au moins environ 1 pm. 19. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que ledit milieu de filtration a une taille de pores au moins deux fois supérieure à la taille du débris le plus grand dans ledit fluide. 20. Méthode selon la revendication 19, caractérisée en ce que ledit milieu de filtration a une taille de pores au moins cinq fois supérieure à la taille du débris le plus grand dans ledit fluide. 21. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisée en ce que ledit milieu de filtration a une taille de pores inférieure à environ 5 pm. 22. Méthode selon la revendication 21, caractérisée en ce que ledit milieu de filtration est une membrane 39 2714299 microporeuse ayant une taille de pores inférieure à environ 1 m. 23. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisée en ce que la concentration dans ledit fluide dudit composé cible qui n'est adsorbé sur lesdites particules d'affinité est contrôlée. 24. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisée en ce que ledit composé cible est biologiquement actif. 25. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisée en ce que ledit composé cible est une protéine. 26. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisée en ce que ledit composé cible est un anticorps. 27. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 26, caractérisée en ce que ledit fluide est un produit de fermentation. 28. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 26, caractérisée en ce que ledit fluide est du lait. 29. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 26, caractérisée en ce que ledit fluide est du sérum ou du sang entier. 30. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisée en ce que ledit composé cible est un stéréoisomère et ledit fluide est un mélange racémique. 31. Méthode pour mettre à la taille les particules d'affinité comprenant: (a) l'introduction de particules de substrat dans un appareil de filtration dynamique comprenant un moyen moteur, un milieu de filtration ayant des côtés amont et aval, une entrée en communication de fluide avec le côté amont dudit milieu de filtration, et une sortie de filtrat en communication de fluide avec le côté aval dudit milieu de filtration, (b) la mise en fonctionnement dudit moyen moyen moteur dudit appareil de filtration dynamique avec ladite sortie de 2714299 filtrat étant en position ouverte de sorte que toutes lesdites particules de substrat ayant un diamètre significativement plus petit que la taille de pores dudit milieu de filtration passe à travers ledit milieu de filtration, et (c) la récupération desdites particules de substrat qui ne passent pas à travers ledit milieu de filtration dudit appareil de filtration dynamique. 32. Méthode selon la revendication 31, caractérisée en ce que ladite méthode est répétée avec lesdites particules de substrat récupérées en utilisant un milieu de filtration avec une taille de pores plus grande, et en ce que lesdites particules de substrat qui passent à travers ledit milieu de filtration sont récupérées. 33. Méthode selon la revendication 31 ou 32, caractérisée en ce qu'un ligand est subséquemment attaché auxdites particules de substrat récupérées de façon à former des particules d'affinité. 34. Particule d'affinité caractérisée en ce qu'elle comprend un substrat et un ligand attaché à celui-ci, ledit substrat comprenant un matériau de coeur et un revêtement en polymère hydrophile, non poreux sur celui-ci. 35. Particule d'affinité selon la revendication 34, caractérisée en ce que ledit revêtement polymère comprend des monomères greffés par irradiation. 36. Particule d'affinité selon la revendication 35, caractérisée en ce que lesdits monomères sont choisis dans le groupe consistant des acides acryliques et méthacryliques. 37. Particule d'affinité selon l'une quelconque des revendications 34 à 36, caractérisée en ce que le matériau de coeur est poreux.