FR 2721931 A1 19960105 FR 9408096 A 19940630 CONJUGUES D'ANALOGUES DE DIPHOSPHATES OU TRIPHOSPHATES AVEC DES ENZYMES OU DES PORTEURS ANTIGENIQUES ET DOSAGE IMMUNOLOGIQUE UTILISANT DE TELS CONJUGUES. DESCRIPTION L'invention a pour objet des composés conjugués formés d'un analogue de diphosphate ou de triphosphate et d'une molécule choisie parmi les porteurs antigéniques et les enzymes. De façon plus précise, elle concerne des composés conjugués dans lesquels les analogues sont des analogues de diphosphates ou triphosphates de nucléosides qui sont d'un grand intérêt en biologie, tels que l'adénosine diphosphate (ADP) et l'adénosine triphosphate (ATP). En effet, les cellules vivantes captent, stockent, et transportent de l'énergie sous forme chimique, essentiellement sous forme d'adénosine triphosphate (ATP). L'ATP peut: transmettre son énergie à certaines autres molécules et libérer ainsi son groupement phosphate terminal; la molécule d'ATP riche en énergie devient alors de l'adénosine diphosphate (ADP) dont l'énergie a diminué, mais qui peut regagner un groupe phosphate pour redevenir de 1'ATP grâce à un apport d'énergie solaire dans les cellules photosynthétiques, ou d'énergie chimique dans les cellules animales. L'ATP est le principal chaînon de connexion entre deux grands ensembles de réactions catalysées par des enzymes dans les cellules. L'un de ces ensembles conserve l'énergie chimique provenant de l'environnement en provoquant la phosphorylation d'ADP pauvre en énergie, en ATP riche en énergie. L'autre ensemble utilise l'énergie de i'ATP pour effectuer la biosynthèse des composants cellulaires à partir de précurseurs simples, pour faire un travail mécanique nécessaire à la contraction et la locomotion, ou pour effectuer un travail osmotique de transport membranaire. Ces ensembles de réactions catalysées par des enzymes sont pratiquement identiques chez toutes les espèces vivantes. Aussi, on peut faire appel à l'ATP ou à l'ADP dans de nombreuses techniques, par exemple pour immobiliser, orienter ou transporter des molécules ayant un intérêt biologique. Cependant, ces techniques sont limitées en raison de la faible stabilité chimique de l'ATP et de l'ADP (hydrolyse des liaisons anhydride phosphorique). Il serait donc d'un grand intérêt de disposer d'analogues de l'ATP ou de l'ADP, non hydrolysables pour remplir ces fonctions. D'autres analogues de diphosphates et triphosphates intéressants sont les diphosphates et triphosphates d'agents anti-viraux nucléosidiques tels que le 3'-azido-3'-désoxythymidine (AZT), le didésoxyinosine (ddI), le didésoxycytidine (ddC) et le 2', 3'- déshydro-3'-désoxy-thymidine (d4T), qui sont des médicaments anti-VIH. En effet, des composés conjugués obtenus en couplant des analogues de diphosphates ou triphosphates d'agents anti-viraux nucléosidiques avec des molécules biologiques seraient d'un grand intérêt pour réaliser des dosages immunologiques des métabolites phosphorylés de ces agents antiviraux chez des patients soumis à un traitement par de tels agents. Un des problèmes majeurs rencontrés lors des traitements thérapeutiques du SIDA est l'extrême variabilité de réponse d'un patient à l'autre, ceci étant encore compliqué par l'apparition de phénomènes de résistance aux médicaments. Ainsi, l'un des objectifs primordiaux dégagés lors de la dernière réunion de Berlin sur le SIDA (9thInternational AIDS Conference, Berlin, 7-11 Juin 1993) est bien de quantifier chez les malades les métabolites actifs des différents antiviraux administrés. Pour presque toutes ces molécules nucléosidiques, le mécanisme d'action fait intervenir la phosphorylation en nucléotides 5'- triphosphate sous l'action de kinases cellulaires. L'AZT, par exemple, pénètre la membrane cellulaire et sous l'effet de kinases subit des phosphorylations qui le rend actif pour inhiber sélectivement la transcriptase inverse du VIH tout en étant également incorporé à l'extrémité 3' des brins d'ADN viraux en cours de croissance, jouant ainsi un rôle de terminateur de chaîne. Mis à part des problèmes d'effets secondaires, on a également récemment isolé des souches virales devenues résistantes à l'AZT. Ceci a conduit à la mise sur le marché d'autres médicaments comme la ddI ou la ddC dont le mode d'action est très similaire de celui de l'AZT. Un grand nombre d'autres nucléosides modifiés se sont également révélés être des inhibiteurs puissants de la réplication du VIH. Tous ces composés agissent selon le même mécanisme que l'AZT, c'est-à-dire inhibition de la transcriptase inverse sous forme de nucléotides triphosphates produits par l'action des kinases cellulaires. Leur activité est donc en relation avec leur vitesse de phosphorylation et avec leur affinité pour la transcriptase inverse, mais également avec leur éventuel catabolisme (sous l'action de phosphorylases, phosphatases, désamidases...). Compte tenu de cela, il est clair que d'un patient à l'autre, on va observer une grande variabilité dans la réponse aux antiviraux. Ainsi la possibilité de mesurer de façon rapide et efficace chez chaque individu traité les concentrations des métabolites phosphorylés devrait permettre un meilleur ajustement de la posologie et un suivi thérapeutique plus efficace. A ce jour, un certain nombre de dosages quantitatifs de l'AZT ou d'autres antiviraux nucléositiques ont été publiés. Les plus nombreux reposent sur la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) (G. Molema et coll. - J. Chromatogra. (1992), 579, 107-114). Des dosages radio-immunologiques (RIA) ont été décrits (S. Tedepalli et R. Quinn dans Clin. Chem. (1989), 35, 1187) et des trousses de dosage RIA ont été commercialisées ("The Immunoassay Kit Directory" Vol. 1; part 4 (1992), E. Naysmith, ed. Kluwer Academic Publishers, Lankaster, UK.) ainsi que d'autres techniques d'immunoanalyse basées sur l'utilisation de marqueurs non radioactifs comme la FPIA (Essai immunologique à polarisation de fluorescence) (G.G. Granich et coll. - Antimicrob. Agents Chemother. (1989) 33, 1275-1279 ou l'ELISA (Essai d'immunoabsorbant lié à une enzyme).(S. Tedepally, R. Quinn - J. Acq. Imm. Def. Syndr. (1990) 3, 19-27). Enfin, une technique microbiologique a été décrite (H. Etesse-Carsenti et coll. - AIDS (1990) 4, 265). Les techniques HPLC sont les plus utilisées. Elles ont l'avantage de permettre un dosage quantitatif des métabolites phosphorylés de l'AZT. Cependant, elles sont limitées en terme de sensibilité (-lng/ml) (prise de sang importante pour avoir un nombre de cellules suffisant) et elles nécessitent l'utilisation de procédés d'extraction (problèmes liés aux interférences plasmatiques). Les techniques immuno-analytiques sont plus sensibles (-O,lng/ml), plus simples à mettre en oeuvre, mais celles décrites jusqu'à présent ne permettent pas de discriminer l'AZT des métabolites phosphorylés pour des raisons liées à la stratégie d'obtention des anticorps nécessaires au dosage. Les recherches ont donc été poursuivies pour mettre au point un procédé de dosage de métabolites d'agents anti-viraux, répondant aux exigences suivantes: - sensible (pour éviter une prise d'essai trop importante et minimiser par dilution les interférences non spécifiques), - spécifique (pouvoir doser spécifiquement l'AZT et ses métabolites phosphorylés particulièrement le 5'triphosphate, - simple (pouvoir éviter des étapes de purification, être adapté aux dosages en grande série, pouvoir effectuer le transfert de technologie sans difficulté), et - peu coûteux (à l'exception de l'investissement pour développer les outils de la méthode, il doit nécessiter par la suite un équipement simple et peu coûteux). Dans cette optique, les techniques immuno-analytiques sont et restent sans ambiguité les plus appropriées. Elles n'ont pas jusqu'à présent donné satisfaction pour le dosage des métabolites phosphorylés car les immuno-analystes se sont trouvés devant la difficulté d'obtenir des anticorps spécifiques de ces métabolites. En effet, l'AZT-5'-triphosphate de formule: o i l il 11AJ HO p ---O _p -->O-p P-- 0 OH OH H N3 qui sera pris comme exemple, appartient à la catégorie des haptènes. Il est nécessaire de coupler de façon covalente la molécule sur un porteur antigénique (la sérum albumine bovine par exemple) et d'administrer le conjugué à un animal (lapin ou souris, par exemple) pour déclencher une réponse immunitaire susceptible d'induire la synthèse d'anticorps spécifiques de l'haptène. Si l'on veut diriger la spécificité vers la chaîne triphosphate, il sera nécessaire de coupler à l'albumine une autre partie de la molécule afin de présenter au système immunitaire l'épitope voulu (ensemble chaîne triphosphate + sucre). Les liaisons anhydrides d'acide P-O-P impliquées dans la chaîne triphosphate étant particulièrement instables, il est tout à fait aléatoire (compte tenu du temps de demi- vie trop court de ce composé), d'espérer induire une réponse immunitaire contre une molécule de ce type non transformée. La présente invention a précisément pour objet des composés conjugués d'analogues de diphosphates et de triphosphates de nucléosides couplés à des porteurs antigéniques, qui permettent justement l'obtention d'anticorps spécifiques des métabolites de ces agents anti-viraux. Ces composés doivent avoir la double particularité de: - posséder des liaisons phosphate (di ou tri) stables, - mimer le mieux possible les liaisons phosphate naturelles de façon que les anticorps induits reconnaissent les nucléotides naturels. Elle concerne également des composés conjugués d'analogues de diphosphates ou triphosphates de nucléosides couplés à des enzymes, qui sont utilisables comme marqueurs dans des dosages enzymo-immunologiques de ces métabolites. Selon l'invention, le composé conjugué d'-un analogue de diphosphate ou de triphosphate et d'une molécule choisie parmi les porteurs antigéniques et les enzymes, dans lequel l'analogue répond à la formule: R Â Â- _- O O O ORO dans laquelle n est égal à 0 ou à 1, - X1 et X2 qui peuvent être identiques ou différents, représentent CH2, CHF, CF2,CC12 CHC1 ou NR6 avec R6 étant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, aryle ou aralkyle, les deux R6 pouvant être identiques ou différents lorsque n=l ou pouvant former ensemble une chaîne hydrocarbonée comportant un noyau phényle, R1, R2, R3 et R4 qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, NH4+, un ion ammonium quaternaire ou un ion de formule M+l/v avec M représentant un métal et v étant l'état de valence de ce métal, et - R5 est un groupe dérivé d'un nucléoside, et dans lequel l'analogue est couplé à ladite molécule, soit par l'intermédiaire du groupe R5 dérivé de nucléoside, soit par l'intermédiaire de l'un des groupes R1, R2, R3 et R4. L'utilisation dans ce composé conjugué d'un analogue de diphosphates ou de triphosphates répondant à la formule (I) donnée ci-dessus, est très intéressante, car le remplacement de la chaîne polyphosphate P-O-P du diphosphate ou triphosphate naturel par une chaîne P-X1-P ou P-X1-P-X2-P, conduit à un composé stable non hydrolysable. Ainsi, il est possible d'induire la synthèse d'anticorps anti-triphosphate d'agent anti-viral, par exemple d'anticorps anti-AZT-5'-triphosphate à l'aide de cet analogue chimique o la chaîne polyphosphate est stabilisée et dont la structure chimique et conformationnelle mime celle de la chaîne triphosphate naturelle de telle façon que les anticorps produits à l'aide de cet analogue stable reconnaissent avec une forte affinité l'AZT-5'triphosphate. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le composé conjugué est un immunogène destiné à la production d'anticorps. Dans ce cas, la molécule couplée à l'analogue de diphosphate ou de triphosphate de nucléoside est un porteur antigénique. Généralement, le couplage est effectué par l'intermédiaire d'un bras espaceur greffé sur la base pyrimidinique ou purique du nucléoside, qui comporte à son autre extrémité un groupe susceptible de réagir avec le porteur antigénique, par exemple un groupe NH2. Le greffage du bras espaceur sur le nucléoside peut être effectué soit sur un groupe NH2 exocyclique dans le cas o la base du nucléoside comprend un tel groupe, soit sur un atome d'azote présent dans le cycle de la base. Il peut également être effectué sur le sucre ou sur la chaîne phosphorée. Le bras espaceur est généralement une chaîne hydrocarbonée saturée. Toutefois, on peut utiliser d'autres espaceurs, par exemple un polyoxyéthyoène ( CH2-CH2-O)n ou un poLyoL -(CH0H)n. Dans certains cas, on peut aussi réaliser le couplage directement sur le nucléoside par l'intermédiaire d'un espaceur fixé sur la partie sucre du nucléoside. Dans tous les cas, le groupe susceptible de réagir avec le porteur antigénique est un groupe NH2, mais on peut aussi utiliser d'autres groupes susceptibles de réagir avec le porteur antigénique, par exemple un groupe COOH, maléimide, thil, aniline... Lorsque le groupe susceptible de réagir avec le porteur antigénique est un groupe NH2, le composé conjugué comportant un analogue de diphosphate ou triphosphate couplé à un porteur antigénique peut répondre à la formule suivante: O O O HOlP- 1 il X2 7 HO -P-P X - P-OR (CH2 -NH-Z (I) OH OH OH n dans laquelle R7 est un groupe bivalent dérivé d'un nucléoside, n est égal à 0 ou à 1, X1 et X2 ont les significations données ci-dessus, p est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 6 et Z est un porteur antigénique. A titre d'exemple, R7-(CH2)p-NH- peut répondre aux formules suivantes: o H N NH HO OH ' o N I. oN. z kJN Ho CH 1. De préférence, dans l'analogue de formule (I), R5 est dérivé d'un agent antiviral nucléosidique tel que ceux de formules: O o NH2 hN O 4 O - iO: h -o.o C, J Ni AZT - 2 dC d4T Les porteurs antigéniques susceptibles d'être couplés à l'analogue de diphosphate ou de triphosphate de nucléoside pour former le composé conjugué servant d'immunogène, peuvent être de différents types. On peut utiliser en particulier des protéines telles que l'albumine bovine, ovalbumine, polylysine et 0- lactoglobuline,, par exemple 11. l'hémocyanine de Patelle (keyhole lympet haemocyanin, KLH). Selon un second mode de réalisation de l'invention, le composé conjugué est un marqueur enzymatique. Dans ce cas, la molécule couplée à l'analogue de diphosphate ou de triphosphate de nucléoside est une enzyme. Les enzymes utilisables sont celles qui présentent des propriétés intéressantes (sensibilité, seuil de détection) pour les dosages immunologiques. A titre d'exemples de telles enzymes, on peut citer les peroxydases,, les phosphatases et 1 -galactosidase, en particulier les acétylcholinestérases telles que l'acétylcholinestérase d'Electrophorus electricus. Ce couplage peut être réalisé également par l'intermédiaire de réactifs appropriés sur un groupe NH2 du nucléoside de l'analogue de diphosphate ou de triphosphate. A titre d'exemple d'un tel conjugué, on peut citer le conjugué de l'analogue de triphosphate de formule CH4 cul OHueaéychlnséa -e OH OH OH OOH couplé à une acétylcholinestérase. Les analogues de diphosphates et triphosphates de nucléosides utilisés dans l'invention peuvent être préparés par réaction d'un diphosphate ou triphosphate de formule il1 il i _ I0O-P-X' _P- X OH (n) OR' OR n dans laquelle X1, X2 et n ont les significations données ci- dessus, et R8 est un groupe hydrocarboné, avec un dérivé de nucléoside dont les fonctions réactives sont protégées par des groupes appropriés sauf pour la fonction alcool primaire de la partie sucre du nucléoside. Les diphosphates ou triphosphates de formule III O-P-X1-- P-X' P OH (m) OR8 OR OR8 avec n=l et XI=X2=CH2 peuvent être préparés par réaction d'un bis- (halométhylène) phophinate de formule: O XCH2 P CH2X dans laquelle X est un atome d'halogène, avec un phosphite mixte de formule: R80 -P --oRi OR dans laquelle R8 est un groupe hydrocarboné et R9 est un groupe benzyle ou allyle pour obtenir un composé de formule (III) avec X1 = X2 = CH2 et n = 1 Dans ce procédé, l'analogue est préparé par une double réaction d'Arbuzov entre un phosphite mixte et un bis-(halo.éthylène)phosphinate d'aryle ou d'alkyle. Les produits de départ utilisés dans cette réaction peuvent être préparés par des procédés classiques. Ainsi, le bis- (halométhylène)phosphinate peut être préparé selon les méthodes décrites par Ivanov et al dans Zh. Obshch. Khim., 1967 37(8), p. 1856- 1862, et par Frank et al dans Can. J. Chem., 1966, 44, p. 2593-2596. Le phosphite mixte peut être préparé par réactions successives de différents alcools R8OH, R9OH sur PCl3 en présence d'une base. Généralement, la réaction d'Arbuzov est réalisée à une température de 140 C, sous basses pression, par exemple sous 4mm de mercure. De préférence, on soumet de plus le milieu réactionnel à une agitation violente pour éliminer en continu l'halogénure formé R9X. Les triphosphateS de formule (III) dans laquelle X1 et X2 représentent le groupe NR6 avec les deux R6 formant ensemble une chaîne hydrocarbonée telle que définie précédemment, peuvent être préparés par un procédé qui comprend les étapes suivantes: a) faire réagir un chlorophosphate de formule: O I-. R8ai P Ci OR8 avec une diamine de formule: H2N-R10-NH2 dans lesquelles R8 est un groupe hydrocarboné, et R10 est la chaîne hydrocarbonée formée par les 2R6, pour former un bis-phosphoramide de formule: O O il 10 Ila R O- P NH -R -NH -P--OR OR25 b) cycliser le bis phosphoramide ainsi obtenu sur un dichlorophosphite de formule: C12P-OR8 dans laquelle R8 est un groupe hydrocarboné, et c) oxyder le produit cyclisé ainsi obtenu. La diamine utilisée comme produit de départ dans cette réaction peut être synthétisée par des procédés classiques tels que ceux décrits par Carpino dans J. Org. Chem., 1986, 51, p. 4768-4779. Dans ce procédé, la première réaction correspond à une diphosphorylation de la diamine et cette réaction peut être effectuée en présence de deux équivalents de triéthylamine. Cette réaction est très rapide et elle permet d'obtenir le diphosphoramide avec un rendement élevé. On cyclise ensuite le diphosphoramide avec un dichlorophosphite en présence de triéthylamine et de 4- diméthylaminopyridine, dans un solvant organique approprié tel que le tétrahydrofurane. L'oxydation du produit cyclisé peut être effectuée ensuite avec l'acide 4-chloroperoxybenzoique. Après cette réaction, on obtient un analogue de triphosphate de formule (I) dans laquelle X1 et X2 sont des groupes NR6 et Rl, R2, R3 R4 et R5 sont des groupes benzyle. Pour préparer un analogue de triphosphate de formule (III) dans laquelle X1 et X2 sont respectivement les groupes CH2 et NR6, on peut utiliser un procédé qui consiste à faire réagir un méhyl phosphonate de formule: O P CH Ow P CH Ra avec un analogue de diphosphate de formule: Il l 11 Cl P- N P-OR8 OR8 R8 pour former le composé de formule: 8 1l i R6 O R C-P C-H2 P- N --OR8 OR OR8 18 OR L'analogue de diphosphate utilisé dans ce procédé peut être préparé à partir de l'imidodiphosphate correspondant dans lequel Cl est remplacé par OH, par réaction avec de l'acide chlorhydrique. Les diphosphates de formule (III) dans laquelle X1 est un groupe méthylène peuvent être préparés par un procédé qui consiste à faire réagir un chlorophosphate de formule: 8 1i R80 CP CI OR8 avec un méthylphosphcnate de formule: o0 Il O P -CH3 Les diphosphates de formule (III) dans laquelle Xl est le groupe NH peuvent être préparés par un procédé qui consiste à faire réagir le composé de formule: Ci3P - N PP Cl 3 1 ci C13P N--N--C Cl avec un composé de formule R8OH pour former le composé de formule: O O R80 P NH -P OR8 l I 0 R' OR8 Le pentachlorure précurseur peut être préparé par la méthode décrite par Emsley et ai dans J. Chem. Soc. A., 1971, p. 2873. Dans le cas des diphosphates de formule (III) dans lesquels X1 représente le groupe NR6, on peut préparer ceux-ci par réaction d'un composé de formule: 0 R6 0 il 1 Il CI-P -N -P -Cl I I Cl CI avec un alcool de formule R80H. A titre d'exemples, on décrit ci-après le schéma réactionnel de préparation d'un analogue non hydrolysable de l'ATP muni d'un bras espaceur en vue de son couplage avec un porteur antigénique ou une enzyme. Cl 1,,N,,, N .. N 08 08 08n1 H2N, NN,NH S-nO-P CH2.P CH,-P-O" HO j N P n iI NN.--e CH,-O I -CI I Y" N I'l N' *n-C2PH-- OH5nOHn OH 08n OB n O08n HO OH 0O0 H2 N i6SH Le couplage entre l'analogue de triphosphate et le nucNosidemodifiest ralis par activation de l'alcool en position 5' sur le sucre pour former le triphosphate de nucloside. Le chlore sur la base du nuclHosideest ensuite dplac par substitution nuclophile avec un prcurseur de diamine. La molcule finale est obtenue par hydrogénation catalytique. HODanslecas o 'on veut prparer un Le couplage non hydrolysablogue de 'AMT triphosphate, onet le nucléosidemodifié est réalisé par activation de l'alcool en position 5' sur le sucre pour former le20 triphosphate de nucléoside. Le chlore sur la base du nucléoside est ensuite déplacé par substitution nucléophile avec un précurseur de diamine. La molécule finale est obtenue par hydrogénation catalytique. Dans le cas oỉ l'on veut préparer un analogue non hydrolysablede 1'AMT triphosphate,on peut suivre le schéma réactionnel suivant: _11NH N o o 1 H 0 l 00 IIII BnO-PCH2 PCH2 P-OH * HOOnO P-CH_ P-O_ e0 08n 08n 08En OBn OB n OB, III N N O N3 N.] o 0 0 O IlIl il 0 À HO-P 012-P CH2 P- j OH OH OIH NH2 Le couplage entre le nucléoside et l'analogue de triphosphate est réalisé par activation de l'alcool primaire du sucre qui réagit ensuite avec l'analogue de triphosphate. La déprotection finale est réalisée comme précédem- ment par hydrogénation catalytique. Dans le cas o l'on veut préparer un analogue non h'-rolysable de l'AZT triphosphate, on peut utiliser le sch9éma réactionnel suivant:25 o 0 0 25. o o.o o l, HO-P CH2 P CH2 P-O 1Szoy N,1 C OHOHO _ OH N] N1 o o oo 0 00 N 0k 0 o,o o 'M M.l- l il il N O BnO-P CH, P CH, P-0 Oan OBn OSn 1 À N 1 N: V- N N' NH, 0-0 0. -CH.-oi HO - CHZ P CH2 Pl y0O OH OH OH NS Dans ce cas, le nucléoside est préparé en deux étapes à partir d'un dérivé de la thymidine décrit dans la littérature. Le couplage avec l'analogue de triphosphate est réalisé comme précédemment. La déprotection finale est réalisée avec le bromure de triméthyl silyle (TMSBr) suivie d'un passage en milieu basique. Pour réaliser le couplage de ces analogues de diphosphates ou triphosphates de nucléosides avec une enzyme ou un porteur antigénique, on utilise les techniques classiques de couplage par liaison covalente entre un groupe réactif porté par le nucléoside et un groupe réactif porté par l'enzyme ou le porteur antigénique tel que les groupes lysyle, tyrosyle, histidyle, tryptophanyle ou glutamyle. Les groupes réactifs du nucléoside peuvent être constitués par des fonctions acide, amine, phénol, hydroxyle ou cétone. Les réactions de couplage peuvent être réalisées au moyen de réactifs tels que les carbodiimides, le gluraraldéhyde, la benzidine, les anhydrides mixtes, les esters d'haptène activés et l'acide para-aminophényl acétique. Les composés conjugués de l'invention, peuvent être utilisés soit comme immunogènes, soit comme marqueurs enzymatiques. Aussi, l'invention a également pour objet un procédé de préparation d'anticorps spécifiques d'un diphosphate ou triphosphate de nucléoside de formule: O O O il il i HO P- 0 P O (V) OH OH OH n dans laquelle n=O ou 1 et R5 représente un dérivé de nucléoside, qui consiste - à injecter à un mammifère un composé conjugué d'un analogue de diphosphate ou triphosphate de nucléoside de formule: 0 0 0 1 o À iP xl--P2P-il-R (0 OR3 O n dans laquelle R1, R2, R3, R4, Xl et X2 ont les significations données ci-dessus pour la formule (I), et n et R5 ont les significations données ci-dessus pour la formule (V), couplé à un porteur antigénique, et - à prélever ensuite du sang du mammifère immunisé pour isoler les anticorps produits. Elle concerne également un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux d'analogues de diphosphates ou triphosphates de nucléoside en partant du composé conjugué décrit ci-dessus, par la technique de Kohler et Milstein. L'invention concerne encore un procédé de dosage immunologlque d'un diphosphate ou triphosphate de nucléoside de formule: 0 io 0 HO P--O P -O À P O (V) OOH OH n dans laquelle n=0 ou 1 et R5 représente un dérivé de nucléoside, qui consiste à effectuer une réaction de compétition entre le diphosphate ou triphosphate de formule (V) à doser et un composé conjugué d'une enzyme et d'un analogue de diphosphate ou de triphosphate de formule: 0 O O R ilo, l X_ R1 O-P-X'- X2P--OR (D R2 1 R4 OR3 n dans laquelle R5 et n ont les significations données pour la formule (V) et R1, R2, R3, R4, X1 et X2 ont les significations données pour la formule (I), pour des sites limités d'un anticorps spécifique dudit analogue, et à déterminer ensuite la quantité de composé conjugué fixée sur l'anticorps. Ce procédé de dosage peut s'appliquer au dosage de l'adénosine triphosphate (ATP) ou au dosage d'un métabolite d'un agent anti-viral nucléosidique tel que les médicaments anti-VIH comme l'AZT. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence à la figure unique annexée. La figure annexée est un diagramme illustrant le résultat de dosages immunologiques effectués conformément à l'invention, c'est-à-dire la variation du rapport B/B0 dans lequel B représente l'activité enzymatique liée à l'anticorps en présence d'une substance à doser, et B0 représente l'activité enzymatique liée à l'anticorps en l'absence de substance à doser, en fonction de la concentration (en pmol/ml) de substance à doser. Exemple 1: Préparation du (dibenzyl phosphonométhyl) (benzyl hydrogénophosphono-méthyl)phosphinate de benzyle (composé n 1). C3OHa3OP3 PM: 614,50 a) Préparation du tribenzyl phosphite (compose n 2) de formule: o C21H2103P PM: 352,37 A une solution de 25ml (286,5 mmol, 1 éq.) de trichlorure de phosphore dans 1,5 litre d'éther anhydre, refroidie à -78 C, on ajoute goutte à goutte en dix minutes 123,8 ml ( 888,3 mmol, 3,1 éq.) de triéthylamine anhydre. On traite ensuite le milieu réactionnel goutte à goutte avec 92,95 g (859,6 rmmol, 3 éq.)d'alcool benzylique dissous dans 300 ml d'éther. Au bout de 2 heures, on réchauffe la solution à température ambiante et on agite sous argon pendant 8 heures. On filtre le précipité formé, on évapore le solvant sous vide, et on chromatographie le résidu sur colonne de silice(Ether éthylique/hexane/triétyl- amine:40/60/1); on obtient ainsi 90 g d'une huile incolore (rdt:89%). Les caractéristiques du produit obtenu sont les suivantes: CCM Rf = 0,5(Et2O/hexane/Et3N: 50/50/1). RMN1H: (CDCl3) 200 MHz 6 (ppm): 7,37 (m, 15H, protons aromatiques); 4,94 (d, 3JH-P=8 Hz, 6H, Ha). RMN13C:(CDCl3) 50 MHz 6(ppm): 138,21 (3Cb); 128,37 (6Cd);127,67(3Ce); 127,49 (6Cc); 64,47 (d, 2J-C-P=11,1 Hz, 3Ca). RMN31P:(CDCl3/H3PO4)81,015 MHz 6 (ppm):20,17(s). IR (pur film) cm-1 3088;3063;3031;2940;2874;1606;1497;1454; 1375;1211;994;787. b) Préparation de bis(chlorométhylène) chlorophospinate (composé n 2) de formule: formule B p 108 o CY/\x /C Cl ci C2H4Cl3OP PM:181, 39 On dissout 25 g (284,1 mmol, léq.) de NaH2PO2 et 17,05 g (568,3 mmol, environ 2éq. dépolymérisés) de paraformaldéhyde dans 140 ml d'eau distillée. On ajoute 50 ml d'acide chlorhydrique concentré et on porte le mélange au reflux pendant 44 heures. Après distillation de l'eau puis filtration des sels, on reprend le filtrat avec 50 ml d'acétone et on filtre à nouveau les sels formés. On concentre le filtrat, puis on le reprend avec 3 fois 100 ml de benzène, ce qui donne, après évaporation sous vide, un sirop jaune. On dissout le résidu dans 100 ml -de benzène, puis on porte au reflux, tandis que sont ajoutés goutte à goutte pendant 3 heures 72,53 ml (994,4 mmol, 3,5éq) de chlorure de thionyle (gros dégagement gazeux). Après cela, on laisse le milieu réactionnel au reflux encore 12 heures. Après évaporation sous vide du solvant, on obtient une huile qui est purifiée par distillation sous vide pour donner 44,4 g de bis(chlorométhylène)chlorophosphinate sous la forme d'une huile incolore (rendement de 86 %). Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes: Teb=85-88 C (lmmHg). RMN1H:(CDCl3)200 MHz 6(ppm):4,09 (partie AB, syst.ABX, JAB=14,2Hz, JAX=7,4Hz, JBX=7,5Hz, vA=4,13, vB=4,03, 4H). RMN13C:(CDCl3)50MHz 6(ppm):36,99(d,lJc-P=88,5Hz, 2C). RMN31p:(CDCl3/H3PO4)81,015MHz 6(ppm):49,3 (s) IR(pur, film) cm-1: 3020; 2998; 2942; 2870; 1490; 1384; 1258; 1200; 1120; 990. c) Préparation du bis(chloro- méthylène)phosphinate de benzyle (composé n 4) de formule: v 0v coot lo C9HllC1202P PM: 253,06 A 20g (110,3mmol, léq.) de bis(chlorométhylène)chlorophosphinate (composé n 2) dissous dans 400ml d'éther anhydre à 0 C, on ajoute 16,9ml (121,3mmol, 1,léq.) de triéthylamine anhydre. On ajoute ensuite en 15min, 13,11g (121, 3mmol, 1,1 éq.) d'alcool benzylique dans 50ml d'éther anhydre. Au bout d'une heure à 0OC, on réchauffe la solution à la température ambiante et on agite pendant une heure. On filtre le précipité formé, on évapore le filtrat sous vide et on le chromatographie (acétate d'éthyle/hexane: de 60/40 à 100/0); on obtient ainsi * 24,6g d'une huile incolore (rendement 88%). Les caractéristiques du composé n 4 sont les suivantes: CCM: Rf=0,5 (Et20) RMN 1H: (CDC13) 200 MHz 6 (ppm): 7,45-7,37 (m, 5H, protons aromatiques); 5,19 (d, 3JHp=9,3 Hz, 2H, Ha); 3, 66 (partie AB, syst. ABX, JAB=12,5 Hz, JAX=7,5 Hz, JBX=8,1 Hz, VA=3,72, VB=3,60, 4H, Hf) RMN13C:(CDC13) 50MHz 6(ppm):134,93(d,3JCp=5,1Hz, lCb); 128,63(lCe); 128,40(2Cd); 127,97(2Cc); 67, 73(d,2Jcp=6,5Hz, lCa); 32,63(d, 1Jcp=104,7Hz, 2Cf). RMN31P:(CDCl3/H3PO4)81,015MHz 6(ppm):41,25(s). IR(CH2CL2)cm-1: 3091; 3050; 3000; 2950; 2895; 1498; 1456; 1393; 1262; 1200; 1110; 1007; 847. d) Préparation du bis(dibenzylphosphono- méthyl)phosphinate de benzyle (composé n 5) de formule: b ó C37H3908P3 PM: 704,63 A 8g (31,61 mmol, éq. du bis(chlorométhylène)phosphinate de benzyle obtenu en a), on ajoute 44,5 g (126,4 mmol, 4 éq.)du tribenzyl phosphite obtenu en b). On chauffe le mélange sous vide, à 140 C, sous 4 mm de mercure. Et on le soumet à une agitation violente afin d'éliminer en continu le chlorure de benzyle. Après 10 heures d'agitation, on chromatographie le mélange réactionnel sur une colonne de silice (Et20/acétate d'Ethyle/Ethanol:de 100/0/0 à 0/80/20); on obtient ainsi 15,8 g du composé n 4 sous la forme d'une huile incolore (rendement de 71%). Les caractéristiques du composé N 4 sont les suivantes: CCM: Rf=0,4 (AcOEt) RMN1H:(CDCl3)200 MHz 6(ppm): 7,32-7,28 (m, 25H, protons aromatiques); 5,13-4,95 (m,3JH-p=8,5 Hz, 10 H, Ha et Ha'); 2,84 (dd, 2JH-pp=20,3 Hz, 2JH-Pa=18,2 Hz, 4Hf). RMN13C:(CDC13) 50 MHz (ppm): 135,77-135,57 (m, 3JC-P=7,5 Hz, 4Cb, et lCb,); 128,75-127,53 (8Cd, 2Cd,, 8Cc, 2Cc,, 4Ce, lCe); 67,95 et 67,72 (2d, 2JC-P=6,2 Hz, 4Ca); 66,79 (d, 2JC-P=6,5 Hz, lCa,); 28, 65 (dd, 1JC-P=130 Hz, 1JC-P=87,5 Hz, 2Cf). RMN31P:(CDCl3/H3P04) 121,44 MHz 6(ppm):38,47 (t, 2Jpapp=4,5 Hz, PCa)et 20,90 (d, 2Jpap=4,5 Hz,2pO) SM:(IC/NH3) m/z: 21,8 (MNH4+) IR (pur, film) cm- 3088; 3C'3; 3033; 2954; 2894; 1497;.1468; 1380; 1250; 1182; P93. e) Préparation du (dibenzyl phosphonométhyl) (benzyl hydrogénophosphono-méthyl) phosphinate de benzyle (composé n 1). A 0,796 g de 1,4-diazabicyclo[2,2,2]octane (DABCO) (7,09 mmol, léq), on ajoute 5 g du composé n 4 (7,09 mmol, léq) en solution dans 70 ml de toluène anhydre. On porte le mélange réactionnel au reflux pendant 2 heures. On réduit la solution sous vide et on dissout le sel obtenu dans 100 ml d'un mélange eau/méthanol (30/70). A la solution précédente, on ajoute une résine échangeuse d'ions chargée en ions H30+ (Dowex 50X8) puis on agite pendant 12 heures. On récupère la résine par filtration, on concentre le filtrat et on le reprend 3 fois par 100 ml de toluène. On obtient ainsi 4,18 g du composé n 12 sous la forme d'une huile jaune qui peut être utilisée sans aucune purification (rendement de 96 %). Les caractéristiques du composé n 1 sont les suivantes RMN1H: (DMSO d6)200MHz: 6(ppm):7,37-7,31 (m, 20H, protons aromatiques); 5,07(d, 3JHp=7,2 Hz, 2H, H benzyliques); 4,97(d,3JHp=7,4Hz, 6H, H benzyliques); 2,77(t,2JHp=20,LHz, 4H, Hf). RMN13C:(CD30D)50MHz 6(ppm):137,82-137,38 (2Cb, lCb', lCb");129,60-128,85(4Cd, 2Cd', 2Cd", 2Ce, lCe', lCe", 4Cc, 2Cc', 2Cc"); 69,45(d, 2Jcp=5,7Hz)-68,75kd,2Jcp=5, 7Hz)68,33(d,2Jcp=6,3Hz) (2Ca, lCa' et ICa"); 29,62(dd, 1Jcp=87, lHz et iJcp=130,6Hz,2Cf). RMN31P:(CDCl3/H3Pz4)81,O15MHz 6(ppmU):4I, 21(d,2Jpp=4,7 Hz, Pa) et 18,59(d,2Jp_p=5, 3:Hz, P? et Po'). SM:(IC/NH3) m/z:63',9?'MNH4+); 524,2(M-Bn+H+)- IR(pur, film)cm-1À 3064-2300; 1693; 1610; 1498; 1455; 1382; 1215; 997; 854; 734. Exemple 2: Préparation de la 6-chloro-2',3'-O- benzylidène(5'-hydroxy)purine-9H (composé n 6) de formule: a 2 f l0 C17Hl5CLN404 PM: 374,78 a) Préparation de 2',3'-O- benzylidène inosine (composé n 7) Ès OH ON 2 z" Cl7Hl6N405 PM: 356,34 On ajoute 20 g (74, 5 mmol, 1 éq.) d'inosine à 56,7 g (372,5 mmol, 5 éq.) de benzaldéhyde diméthylacétal en solution dans 400 ml d'acétonitrile anhydre et on refroidit à 0 C. On traite le mélange goutte à goutte avec 13,9 ml (149 mmol, 2éq.) d'oxychlorure de phosphore fraîchement distillé. Après 1 heure à 0 C, on agite le milieu pendant encore 2 heures à la température ambiante; la solution devient jaune et limpide puis se trouble. On verse ensuite le mélange réactionnel très lentement sur un mélange d'eau saturée en NaHC3/glace et on l'agite pendant environ 3/4 d'heure. Un précipité blanc apparaît, on le filtre, puis on lave à l'eau et à l'éther. Après séchage sous vide, on obtient 23,9 g de 2',3'-O-benzylidène inosine (rendement de 90 %). Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes: CCM: Rf=0, 3 (CH2Cl2/EtOH:90/10) F =254-2550 C RMN1H (CD30D)200MHz 6(ppm):8,33(s, 1H,H8), 8,08(s,l1H,H2);7,54-7,46 (m, 5H, protons aromatiques); 6,26 (d, 3JH,'-H2'=3Hz, 1H, H1,); 6, 01(s, 1H, Ha); ,40(dd,3JH2-Hl=3HZ, 3JH2 -H3,=5HZ, 1H, H2, ); ,12(dd, 3JH3'-H2'=5HZ,3JH3 H4 =2,5Hz, 1H, H3,); 4,60(m, 3JH4'-H3'=2,5HZ, 1H, H4.); 3,75 (m, 2H, H5,). RMN13C: (DMSO-d6)50MHz 6(ppm): 156,42(1C6); 147,75(1C4); 146,02(1C2); 138,81(1C8); 136,12(lCb); 129,71(lCe); 128,37(2Cd); 126,82(2Cc); 124,42(1C5); 106,58(lCa); 89,55(1C1'); 86,53(1C4,); 84,44(1C2,), 82,61(1C3'); 61,46(1C5). IR(KBr) cm-1: 3392; 3048; 2876; 1700;1589; 1550; 1508; 1419; 1214; 1098; 974. b) Préparation de 2, 3'-O-benzy- lidène(5'-acétyl) inosine (composé n 8) de formule: oH s 0N g b 1O Yod C19H18N406 PM: 398,37 On ajoute à 24 g (67,35 mol, léq.) de la 2,3'-O-benzylidène inosine obtenue précédemment, dissous dans 500 ml d'acétonitrile anhydre, 11,26 ml (80,82 mmol, 1,2 éq.) de triéthylamine anhydre, 7 ml (74, 09 mmol, 1,1 éq.) d'anhydride acétique et 822 mg (6,74 mmol, 0,1 éq. ) de 4-diméthyl-aminopyridine (DMAP), et on agite pendant 2 heures à la température ambiante. On évapore le solvant pour obtenir une huile. On précipite ensuite le produit en utilisant le mélange éther diéthylique/CH2Cl2:90/10. On filtre le précipité, on le lave à l'éther et on le sèche sous vide. On obtient ainsi 23, 34 g de 2',3'-O-benzylidène(5'-acétyl)inosine sous la forme d'un solide pulvérulent blanc (rendement de 87 %). Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes: CCM:Rf=0,5(CH2C12/EtOH:90/10). F =170-171 C RMN1H:(CDCl3)200MHz 6(ppm):8,27(s,lH,H8); 7,95(s,lH,H2); 7, 60- 7,43 (m, 5H, protons aromatiques); 6,27(d,3JH1.-H2t=l, 9HZ, 1H, H1i); 6,21(s, lH,Ha); ,54(dd3JH2,-Hli=1,9Hz, 3JH2f-H3=6, 5HZ, 1H, H2,);5,13(dd,3JH3,-H4,=3,2Hz, 3JH3'-H2,=6, 5Hz; 1H, H3,); 4,67 (partie X d'un ABX, 1H, H4,); 4,33 (partie AB syst.ABX, Jab=11,9Hz, JAX=4,3Hz, JBX=6,1Hz, vA=4,39, vB=4,28,2H, H5s); 2,02(s, 3H; Hg). RMN13C:(DMSO-d6)50MHz 8(ppm):169,87(1Cf); 156,46(1C6); 147,65(1C4); 146,02(1C2); 139,02(1C8); 135,88(lCb); 129,78(lCe); 128,37(2Cd); 126,85(2Cc); 124,42(1Cs); 106,85(1Ca); 89,09(1C1,); 84,34(1C4,); 83,64(1C2,), 81,99(1C3'); 63,56(1C5,); 20,32(1Cg). IR(CH2Cl2)cm-1: 3370; 3066; 2990; 2900; 1745; 1689; 1588; 1547; 1513; 1460; 1374; 1229; 1093; 977. c) Préparation de la 6-chloro-2',3'-O- benzylidène(5'-acétyl)purine-9H de formule: o 0 E o 2ti} C 19H 17Cl'N405 PM: 416,82 On ajoute 20 g (50,20 mmol, léq.) de la 2',3'-O-benzylidène(5'-acétyl)inosine à un mélange de ml d'oxychlorure de phosphore et de 6,37 ml (50,20 mmol, léq.) de N,N'-diméthylaniline. On chauffe préalablement un bain d'huile à 120 C. On agite le mélange vigoureusement, on le porte pendant 1 minute et secondes au reflux, puis on le refroidit à 0 C et on distille immédiatement sous vide d'une trompe à eau ml d'oxychlorure de phosphore. La solution restante est versée très lentement sur un mélange d'eau saturée en NaHCO3/glace, et agitée pendant environ 30 minutes. On extrait la solution aqueuse avec du chlorure de méthylène. On sèche la phase organique sur sulfate de sodium, on la réduit sous vide et on la purifie par chromatographie sur colonne de silice (éther éthylique/hexane: de 80/20 à 100/0); on obtient ainsi 16,11 g de la 6-chloro-2',3'-O-benzylidène (5'-acétyl)purine-9H (rendement de 77 %). Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes: CCM: Rf=0,5(Et20). RMN1H: (CDC13)200 MHz 6(ppm):8,78(s, 1H, H8); 8,26(s, 1H, H2); 7,567,39(m, 5H, protons aromatiques); 6,32{d,3JH1,-H2, =2,iHz, 1H, Hi,); 6,06(s, 1H, Ha); ,64(dd, 3JH2'-Hl,=2,1HZ, 3JH2,-H3,=6,5HZ, 1H, H2,); ,16(dd,3JH3,-H2,=6,5Hz, 3JH3,-H4'=3,1Hz, 1H, H3,); 4,70(partie X d'us ABX, 1H, H4'); 4,30 (partie AB syst.ABX,JAB=20Hz,a.J=4,4Hz, JBx=6Hz, vA=4,37, vB=4,25, 2H, H5'); 1,97(s, 3H; Hg). RMN13C: (CDC13) 5.jMHz 6(pprn):-',94(1Cf); 152,00(1C6); 151,54(1C2 ou 1C4); 150,82 t'C2 ou 1C4); 144,23(1C8); 135,36(1Cb); 131,41 (1C5). 129, 35 (ICe); 128,46(2Cd); 126,54(2Cc); 108,01 (lCa); 90,85(1C1,); 84,60(1C4' et 1C2,); 82,30(1C3); 63,52(1C5,); 20,37(lCg). d) Préparation de la 6-chloro-2',3'-O- benzylidène(5'-hydroxy) purine-9H (composé n 6). On dissout 8 g (19,19 mmol) de la 6-chloro-2',3'-O- benzylidène(5'-acétyl) purine-9H obtenue précédemment dans 140 ml d'une solution de méthanol saturée en ammoniaque, et on agite le mélange pendant 2 heures à la température ambiante. On réduit la solution sous vide et on la purifie directement par chromatographie (éther éthylique/hexane: de 60/40 à /0); on obtient ainsi 5, 89 g de la 6-chloro-2',3'-O-benzylidène(5'-hydroxy) purine-9H sous la forme d'un solide blanc (rendement de 82 %). Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes: CCM: Rf=0, 4 (Et20) F =190-191 C. RMN1H: (CDC13)200 MHz 6(ppm):8,79 (s, 1H, H8); 8,22(s, 1H, H2); 7,60-7, 46(m, 5H, protons aromatiques);6,12(d, 3Jhl,-H2,=4,6Hz, 1H, Hi,); 6,09(s, 1H, Ha); 5,36(dd, 3JH2-Hi'=4,6Hz, 3JH2'-H3'=6,2Hz, 1H, H2,); 5,23(dd, 3JH3,-H2,=6,2Hz, 3JH3,-H4,=l,3 Hz, 1H, H3,); 5,09(dd, 3JHf-H5,=2,7HZ, 3JHfH5,=9,8HZ, 1H, Hf); 4,73 (m, 1H, H4,); 3,93(m, 2H, H5,). RpMN13C:(DMSO-d6) 50MHz 68(ppm):151,58(1C6); 151,29(1C2 ou 1C4); 149,29(1C2 ou 1C4); 145,74(1C8); 136,03(lCb); 131,38(1C5); 129,66(lCe); 128,31(2Cd); 126,77(2Cc); 106,38 (lCa); 90,32(1C1l); 87,13(1C4,); 84,29(1C2'); 82,59(1C3'); 61,33(1C5'). SM:(IC/HN3) m/z:375(MH+) IR(KBr) cm-1: 3400; 3069; 2926; 2876; 1593; 1565; 1493; 1434; 1406; 1339; 1201; 1111; 1072. Exemple 3: Préparation de la 6-chloro-2',3'-O- benzylidène 5'[tétrabenzyl-a,Q:a,y -diméthylène triphosphate] purine-9H (composé n 10). ci N g C47H6CIN4o01lP3 PM: 971,27 A une solution de 1,19 g (1, 93 mmol, léq.) du composé n 1, 726 mg (1,93 mmol, 1 éq.) de 6- chloro-2 ',3' -O-benzylidène(5' -hydroxy)purine-9H (composé n 6) et 1,27 g (4,82 mmol, 2,5 éq.) de triphénylphosphine dissous dans 30 ml de THF anhydre, on ajoute goutte à goutte 759 g1 (4,82 mmol, 2,5 éq. ) d'azodicarboxylate d'éthyle à la température ambiante. Après 1 heure, on évapore le solvant sous pression réduite et on chromatographie le résidu sur colonne de silice (éther éthylique/acétate d'éthyle/éthanol: de 100/0/0 à 0/90/10); on obtient ainsi 1,32 g du composé n 10 sous la forme d'une poudre blanche (rendement de %). Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes: CCM: Rf=0, 5 (AcOEt/EtOH:95/5). F =49-50 C RNlH:(CDCl3)200MHz, mélange de diastéréoisomères: 6(ppm):8,75-8,46(m, 2H, H8 et H2); 7,61-7,2(m,25H,protons aromatiques); 6,41- 6,27 (4d, 3JH1,_H2,=2,6Hz, 1H, Hi'); 6,01-5,94 (6s, 1H, Hf); , 58-5,52 (m, 1H, H2'); 5,40-5,33 (m, 1H, H3,); ,30-4,85 (m,8H, Ha, Ha' et Ha"); 4,60(m, 1H, H4'); 4,38-4,04(m, 2H, H5'); 2,95-2,55(m, 4H, Hk et Hk'). RMN13C: (CDCl3)50MHz, mélange de diastéréoisomères: 6(ppm):151,58 (1C6); 151,15-150,96 (1C2 et 1C4); 144,44-144,35(1C8);135,66-135,18(2Cb, lCb', lCb" et lCg); 132,08-131,39(1C5); 129,88-129,87(2Ce,lCe',lCe" et lCj),128,52-127,92(4Cd, 2Cd', 2Cd", 4Cc, 2Cc', 2Cc", 2Ch et 2Cj); 107,92(1Cf); ,70-90,58(1C1');90,23-90,22(1C4'); ,05-84,44(1C2');82,05-81,78(1C3'); 68,41-61,83(2Ca, lCa', lCa" et 1C5'); 30,76-25,7-0(lCk et lCk'). SM:(IC/NH3) m/z:633,1(M-357+H++NH4+); 614,9(M-373 + H+ + NH4+)- Cl CI N N N e/ XJ N N o /o \/ Ph Ph M=373 M=357 IR(CC14)cm-1: 3088; 3063; 3033; 2954; 2894; 1593; 1505; 1468; 1380; 1250; 1108; 1074. Exemple 4 Préparation de la N6 -(4-azidobutyl) -2',3'-O- benzylidène-5 ' - (tétrabenzyl-a,3:0,y-diméthylène triphosphate) adénosine (composé n 11) de formule: e 1 n d N HN N N3 C51H55N80 3PM:1048,5-26 m O c oN ' N_5 N N.b0b 0' 2 C5lH55N8011P3 PM 1048,52 A une solution de 0,59g (0,61immol, léq.) du composé n'10 dans 20ml de méthanol anhydre on ajoute 0,20g (1,74mmol, 2,8éq.) de 4-azido-1- butylamine, à température ambiante. Le mélange réactionnel est agité 36h, puis il est réduit sous vide et le résidu est chromatographié sur silice (acétate d'éthyle/éthanol: /0 à 90/10). On obtient ainsi 0,51g du composé n11 sous la forme d'un solide vitreux (rendement de 80%). Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes: CCM: Rf = 0,7 (acétate d'éthyle/éthanol: 90/10). RMNlH (CDCl3) 200 MHz mélange de diastéréoisomères d (ppm) 8,36-7,95 (n. 2H, H8, H2); 7,41-7,26 (m, 25H, protons aromatiques); 6,31-5,92 (m, 3H, NH, Hi', Hf); ,53 (m, 1H, H2'); 5,12-4,86 (m, 8H, Ha, Ha', Ha"); 4,58 (m, 1H, H3'); 4,37-3,92 (m, 3H, H4', H5'); 3, 62 (m, 2H, Ho); 3,25 (m, 2H, Hl); 2,95-2,65 (m, 4H, Hk, Hk'); 1,66 (m, 4H, Hm, Hn). IR (CHC13) cm-1: 3291, 2942, 2096, 1619, 1458, 1251, 998, 828. Exemple 5 Préparation de la N6-(4-aminobutyl)-5'- (a,0:0,y-diméthylène triphosphate) adénosine (composé n 12) de formule: a c HO N.HN NH2 b d cps n ad nma hn HO HO HO 1i 3 2' HO OH C16H29N6011P3 PM: 574 A une solution de 76mg (72,5umol, léq.) du composé n 11 dans 3ml d'un mélange méthanol/eau: 9/1 on ajoute 76mg de Pd/C à 10% et 460mg (7,2 mmol, 100éq.) de formate d'ammonium. Le mélange est porté à reflux pendant 2h avec addition, par portions, de 3ml d'eau supplémentaire dans le milieu. Le mélange est filtré sur papier puis on provoque la précipitation du produit par addition d'éthanol. On centrifuge, le surnageant est écarté et le culot est redissous dans 2ml d'eau, puis lyophilisé. On obtient ainsi 34mg du composé n 12 sous forme d'une poudre blanche hygroscopique (rendement de 82%). Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes: RMN1H (D20) 200 MHz: 6 (ppm) 8,07 (s, 1H, H2 ou H8); 7,78 (s, 1H, H2 ou H8); 5,92 (d, 3JH1-H2,=4,6Hz, Hl'); 4,50 (m, 1H, H2'); 4,34 (m, 1H, H3'); 3,98 (m, 2H, H5'); 3,42 (m, 2H, Ha); 2,77 (m, 2H, Hd); 2,26-1,96 (m, 4H, He, Hf); 1,58 (m, 4H, Hb, Hc). Exemple 6: Préparation de la 3'-déoxy-3'-azido-5'- (tétrabenzyl-c,4: ,y-diméthylène triphosphate) thymidine (composé n 13) de formule:. h o o o NH 0 0 o C40H43N5011P3 PM: 862 A une solution de 165mg (0,62mmol, léq.) d'AZT dans 5ml de toluène anhydre on ajoute 380mg (0,62mmol, léq.) du composé n l. La solution est évaporée à sec, reprise avec 5ml de toluène anhydre, puis réévaporée à sec. Le résidu est dissous dans 2,5ml de THF anhydre et on ajoute 0,5ml (2,53mmol, 4,léq.) d'azodicarboxylate de diisopropyle. A cette solution, on ajoute lentement au goutte à goutte 648mg (2,47mmol, 4éq.) de triphénylphosphine dissous dans 2ml de THF anhydre. L'addition est réalisée en lh et la solution est encore agitée 3h à température ambiante. Le solvant est évaporé sous vide et on chromatographie le résidu sur colonne de silice (acétate d'éthyle/éthanol: 100/0 à 85/15). On obtient ainsi 172mg d'un solide vitreux (rendement de 32%). Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes: CCM: Rf = 0,2 (acétate d'éthyle). RMN1H (CDC13) 200 MHz, mélange de diastéréoisomères: 6 (ppm) 7,30 (m, 21H, protons aromatiques, Ha); 6,22- 6,01 (m, 1H, Hl'); 5,11-4,94 (m, 9H, Ha', Ha", Ha'", H3'); 4,44-3,85 (m, 3H, H4', H5'); 3,20-2,65 (m, 4H, Hc, Hd); 2,40-2,18 (m, 2H, H2'); 2,07 (s, 3H, Hb). Exemple 7: Préparation de la 3'-déoxy-3'-amino-5'- (a4,:3,y-diméthylène triphosphate) thymidine (composé n 14) de formule: 0 NH _- _ P cû =. ' N O C12H22N3011P3 PM: 477 A une solution de 82mg (95,11mol, léq.) du composé n 100 dans 10ml d'éthanol on ajoute 3ml de THF et 69mg de Pd/C à 10%. Le mélange est soigneusement purgé à l'hydrogène et agité à température ambiante pendant 1,5h, sous une pression de 1 atmosphère d'hydrogène. On ajoute ensuite 5ml d'eau et on réduit de moitié le mélange sous vide. On purge le milieu à l'hydrogène et on agite encore 2h sous une pression de 1 atmosphère d'hydrogène. Le mélange est ensuite filtré sur papier. Le fLitrat est lavé 2 fois avec 10ml d'acétate d'éthyle et la phase aqueuse est ensuite lyophilisée. On obtient ainsi 29mg d'un solide blanc hygroscopique (rendement de 64%). Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes: RIMN1H (D20) 200 MHz: (ppm) 7,47 (s, 1H, Ha); 6,02 (m, 1H, Hi'); 4,62 (m, 1H, H3'); 4, 19 (m, 1H, H4'); 4,01 (m, 2H, H5'); 2,65-2,25 (m, 6H, Hc, Hd, H2'); 1,69 (s, 3H, Hb). Exemple 8: Préparation d'un composé conjugué du composé n 12 avec l'hémocyanine de patelle (KLH). On réalise le couplage entre le composé n 12 et l'hémocyanine de patelle (KLH) par l'intermédiaire du glutaraldéhyde qui réagit simultanément avec les fonctions amines primaires portées par le composé n 12 et la protéine (résidus lysines). Pratiquement: A 2 ml d'une solution de KLH (Keyhole Lympet Haemocyanin) à 5 mg/ml dans du tampon phosphate -1M pH 7,4, on rajoute successivement 2 ml d'une solution du composé n 12 à 1,05 mg/ml dans le même tampon puis 16 gi d'une solution de glutaraldéhyde à %. Après 2 heures de réaction à température ambiante, la préparation est fractionnée en 4 volumes de 1 ml et conservée à -20 C jusqu'à l'utilisation. On évalue l'efficacité du couplage après filtration sur colonne de G25, en mesurant l'absorbance dans l'ultraviolet. Ces mesures ont montré qu'environ 12 molécules du composé n 12 ont été fixées par molécules de KLH (pour une masse moléculaire supposée de 100 000 kDa). Exemple 9: Préparation d'anticorps anti-composé n 12 On utilise pour cette préparation trois lapins de race Blanc de Bouscat de 2,5 kg que l'on traite de la façon suivante. On prépare une émulsion en mélangeant 1 ml de la solution d'immunogène, soit 2,5 mg du conjugué compose n 12-KLH de l'exemple 8, avec 1 ml d'eau distillée et 2 ml d'adjuvant complet de Freund. Au jour JO, chaque lapin reçoit une injection de lml de l'émulsion précitée par voie intradermique, sur le dos en 50 points. Au jour J=42, on effectue un premier rappel dans les mêmes conditions que l'immunisation, puis les lapins sont saignés une fois par semaine à partir du Jour J=49. Deux rappels sont effectués à deux mois d'intervalle, dans les mêmes conditions. On récupère ainsi dans le sérum du sang recueilli des anticorps spécifiques du composé n 12. Exemple 10: Préparation d'un conjugué composé n 12-acétyl cholinestérase d'Electrophorus Electricus. Le couplage entre le composé no 12 et l'acétylcholinestérase (AChE) d'Electrophorus electricus (forme G4) est obtenu par l'intermédiaire d'un réactif hétérobifonctionnel le N-succinimidyl-4-(maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC). Cette méthode implique la réaction d'un groupement thiol (préalablement introduit dans le composé n 12) au niveau de la fonction amine primaire) avec des groupements maléimide introduits à la surface de l'AChE par traitements avec le SMCC. a) Préparation de l'AChE-SMCC: à cette étape, la fonction succinimidyl-ester active du SMCC réagit avec les fonctions aminr.e primaire de l'enzyme. L'AChE est d'abord traitée avec un excès de Néthyl-maléimide de façon à bloquer toutes les fonctions thiol éventuellement présentes à la surface de l'enzyme. La réaction avec le SMCC est réalisée dans un tampon phosphate 0,1M pH 7,4. Le SMCC dissous dans du diméthyl formamide anhydre est ajouté à la solution d'enzyme dans un rapport moléculaire SMCC/AChE=300. Pratiquement: pl d'une solution à 12,5 mg/ml de N-éthyl maléimide dans du tampon phosphate 0,1M pH 7,4 sont ajoutés à 564 pl d'une solution d'AChE (8,8 mg/ml) dans le même tampon. Après 30 minutes de réaction à 30 C, on ajoute 50 pl d'une solution de SMCC (31,2 mg/ml) dans le diméthyl formamide anhydre. Après 30 minutes de réaction à 30 C, l'AChE-SMCC est purifié par filtration sur colonne de Biogel A 1,5 m. L'AChE-SMCC est conservée à -80 C jusqu'à l'utilisation. b) Thiolation du composé n 12: le composé n 12 est thiolé par réaction avec l'ester de l'acide S-acétyl-thioglycolique et du N-hydroxysuccinimide (SATA). A cette étape, la fonction succinimidyl-ester active du SATA réagit avec la fonction amine primaire du composé n 12. A 500 p1 d'une solution à 2 mg/ml du composé n 12 en tampon borate 0,1M pH 9 sont ajoutés pl d'une solution de SATA à 75 mg/ml dans le diméthyl formamide anhydre. Après 30 minutes de réaction à 30 C, le produit de la réaction (composé n 12-SATA) est purifié sur une cartouche de Seppak C18. L'éluat méthanolique est lyophilisé et conservé à -20 C jusqu'à l'utilisation. c) Couplage entre le composé n 12 thiolé et l'AChE-SMCC: le lyophilisat du composé n 12-SATA est redissous dans un tampon phosphate 0,1M pH 6 puis traité à l'hydroxylamine pour débloquer la fonction thioester du SATA. Les fonctions thiols libérées sont mesurées après réaction avec l'acide -5'-dithiobis- nitrobenzoique (DTNB, méthode d'Ellman). Le couplage entre le compose n 12 thiolé et l'AChE-SMCC est obtenu en mélangeant les deux réactifs dans un rapport thiol/AChE de 10. Pratiquement: Le lyophilisat du composé n 12-SATA est repris dans 1,6 ml de tampon phosphate 0,1M pH 6 avant ajout de 400 gl d'hydroxylamine 1M. Après 10 minutes de réaction à température ambiante, on mesure les thiols par réaction de 150 pl de DTNB 10-3 M avec 50 pl du composé n 12 thiolé. A cette étape, la concentration en groupements thiols est de 4, 4. 10-4M. On ajoute ensuite 11,5 pl du composé n 12 thiolé (5 nmol) à 350 pl d'une solution de G4-SMCC (0,5 nmol). Après 3 heures de réaction à 30 C, le conjugué est purifié par filtration sur colonne de Biogel A 0, 5 m et conservé à -20 C jusqu'à l'utilisation. Exemple 11: Dosage enzymo-immunologique de l'adénosine triphosphate (ATP) de formule: NH2 N N N% N O O O [l Il tl HO-P-O--P-O-P-OCH- OH OH OH OH OH Adenosine 5'-triphosphate Pour ce dosage, on utilise des plaques de micro-titration dont les puits sont revêtus d'un anticorps monoclonal de souris anti-IgG de lapin. On introduit dans chacun des puits 50 rl d'une solution diluée d'anti-sérum obtenu dans l'Exemple 9, 50 pil du conjugué obtenu dans l'Exemple 10 à une concentration de 1 unité/ml, et 50pl d'une solution étalon du composé n 12 ou de l'ATP. Après une nuit de réaction immunologique à +4 C, on lave les plaques avec un tampon phosphate, contenant 0,05 % de Tween 20, puis on ajoute 200 g1 de réactif d'Ellman utilisé comme substrat. Après une heure de réaction enzymatique, on mesure l'absorbance de chacun des puits à 414 nm. Les résultats obtenus sont représentés par les courbes 1 et 2 de la figure 1. La courbe 1 se rapporte au composé n 12 et la courbe 2 se rapporte à l'ATP. Ces courbes illustrent les variations de B/B0 (en %) en fonction de la dose (en pmol/ml) de composé n 12 ou d'ATP dosé. Les deux courbes sont très proches et confirment ainsi que l'on peut doser l'ATP en utilisant l'anticorps dirigé contre l'analogue de l'ATP (compose n 12) et le conjugué enzymatique produit également à partir de cet analogue de l'ATP. Exemple 12: Dosage de l'adénosine 5'diphosphate (ADP) de formule: NH, I3 N Ol O HO-P-O--P--OCH| J I - OH OH Adénosine 5'-diphosphate OH OH On suit le même mode opératoire que dans l'Exemple 11 pour effectuer ce dosage. Les résultats obtenus sont illustrés par la courbe 3 de la figure. Au vu de cette courbe, on remarque qu'on peut également doser 1'ADP avec l'anti-sérum et le conjugué enzymatique, mais la sensibilité est moins bonne. Exemple 13: Dosage du A-tétra-P de formule: NH, N 0 0 0 0 P!I liH HO---P-0- P-O-P-oCH2 t OH OH OH OH,:o OH OH Adenosine S'-étraphosphate On suit le même mode opératoire que dans l'Exemple 11 pour effectuer ce dosage en utilisant le même anti-sérum et le mêmeconjugué enzymatique. Les résultats obtenus sont illustrés par la courbe 4 de la figure. Exemple 14: Dosage de l'adénosine monophosphate AMP de formule: N2 ou O il HO-P--OCH2 OH OH OH Adénosine 5'-monophosphate On suit le même mode opératoire que dans l'Exemple 11 pour effectuer ce dosage en utilisant le même antisérum et le même conjugué enzymatique. Les résultats obtenus sont illustrés par la courbe 5 de la figure. Exemples 15 à 17 On suit le même mode opératoire que dans l'Exemple 11 pour doser l'adénosine, le didésoxy-ATP et l'azido-ATP de formule: NH2 N KNN O O O Il il Il HO-P-O--P--O-P-OCH2 OH OH OH H H Dideoxv ATP NH2 NH2 N 0 0 0 KN N K1 N O O O Il Il Il HOCH2 HO-P-O-P-O-P-OCH, I OH OH OH N3OH H OH N3Azido-ATP Adéosine Azido-ATPAdnse en utilisant dans chaque cas l'anti-sérum et le conjugé enzymatique des exemples 7 et 8. Les résultats obtenus sont illustrés par les courbes 6(adénosine), 7(didésoxy-ATP) et 8(azido-ATP) de la figure. On remarque que ces courbes ne permettent pas de réaliser un dosage satisfaisant, l'affinité de ces nucléotides pour l'anti-sérum n'étant pas suffisante. De même, on a constaté que l'adénine ou i'AMP cyclique de formule: NH2 NK s O Il HO-P-OCH2 -0 O OH Adénosine 3'-5'-cyclc monophosphate ne donnait pas lieu à une réaction avec l'anti-sérum à des doses supérieures à 10 000 pmol/ml. Les résultats des dosages des exemples 9 à montrent qu'il est possible de réaliser un dosage fiable d'un diphosphate ou triphosphate de nucléoside, en utilisant des anticorps dirigés contre un analogue de ce diphosphate ou triphosphate de nucléoside, ainsi qu'un conjugué enzymatique préparé à partir de cet analogue. De plus, on remarque que de tels anticorps ne reconnaissent pas les nucléotides azidés, les didésoxy nucléotides et les bases seules. Ainsi, la reconnaissance des anticorps implique à la fois la chaîne phosphate et le sucre, ce qui garantit l'absence de réaction croisée avec les nucléotides et nucléosides naturels, dans le cas du dosage des métabolites phosphorylés d'agents antiviraux tels que l'AZT. REVENDICATIONS 1. Composé conjugué d'un analogue de diphosphate ou de triphosphate et d'une molécule choisie parmi les porteurs antigéniques et les enzymes, dans lequel l'analogue répond à la formule: 1il 1 il _ il RO P x - X2- P -OR5( O OO R O R'X1-P - OR5 (qR4 n dans laquelle n est égal à 0 ou à 1, - X1 et X2 qui peuvent être identiques ou différents, représentent CH2, CHF, CF2,CCl2, CHCl ou NR6 avec R6 étant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, aryle ou aralkyle, les deux R6 pouvant être identiques ou différents lorsque n=l ou pouvant former ensemble une chaine hydrocarbonée comportant un noyau phényle, - R1, R2, R3 et R4 qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, NH4+, un ion ammonium quaternaire ou un ion de formule M+ l/v avec M représentant un métal et v étant l'état de valence de ce métal, et - R5 est un groupe dérivé d'un nucléoside, et dans lequel l'analogue est couplé à ladite molécule, soit par l'intermédiaire du groupe R5 dérivé de nucléoside, soit par l'intermédiaire de l'un des groupes Rl, R2, R3 et R4. 2. Composé conjugué selon la revendicatiion 1, caractérisé en ce que R5 est dérivé d'un agent antiviral nucléosidique. 3. Composé conjugué selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que R5 répond à l'une des formules suivantes: oo NHZ H-N MN N OHM N3. N N OHN o o AZT A NMT d d MN' - " NH2 N N ES = N EN z HO OH 4. Composé conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite molécule est un porteur antigénique. 5. Composé conjugué selon la revendication 4, caractérisé en ce que le porteur antigénique est l'hémocyanine de patelle. 6. Composé conjugué selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que le couplage de l'analogue de diphosphate ou triphosphate avec le porteur antigénique est réalisé au moyen d'un bras espaceur formé d'une chaine hydrocarbonée saturée, terminée par un groupe NH2, greffée sur la base purique ou pyrimidinique de R5. 7. Composé conjugué selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que le couplage de l'analogue de diphosphate ou triphosphate avec le porteur antigénique est réalisé au moyen d'un bras espaceur en polyoxyéthylène (CH2-CH2-O)n ou polylol Hn 8. Composé conjugué répondant à la formule: 0 0 0 I o il X 1 _ il __ ilp 7 HO-P-X -P -À --P - OR -(CH2 -NH -Z (II) OH OH OH n dans laquelle n, Xl et X2 ont les significations données dans la revendication 1, R7 est un groupe bivalent dérivé d'un nucléoside, p est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 6, et Z est un porteur antigénique. 9. Composé conjugué selon la revendication 8, caractérisé en ce que R7(CH2)pNH répond à l'une des formules suivantes H N NH\ -K o N N HOOH 10. Composé conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite molécule est une enzyme. 11. Composé conjugué selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite enzyme est une acétylcholinestérase. 12. Composé conjugué de l'analogue de triphosphate de formule: HHQ '-" H2 Oo Oi HO-P'CH2.'PCH2P-O. O OH Oh CH- HO.OH et d'acétylcholinestérase d'Electrophorus electricus. 13. Procédé de préparation d'anticorps spécifiques d'un diphosphate ou triphosphate de nucléoside de formule: HO-P- O -O l 11 11 Ho--P O- -PO0 PPOR5 (V) I II OH OH OH n dans laquelle n=0 ou 1 et R5 représente un dérivé de nucléoside, qui consiste - à injecter à un mammifère un composé conjugué d'un analogue de diphosphate ou triphosphate de nucléoside de formule: 0 0 0 il [1 ilil R10 p- X -XI*P- P-R5 21(14 R 2 OR3 OR4 n dans laquelle R1, R2, R3, R4, X1 et X2 ont les significations données dans la revendication 1), et n et R5 ont les significations données ci-dessus pour la formule (V), couplé à un porteur antigénique, et - à prélever ensuite le sang du mammifère immunisé pour isoler les anticorps produits. 14. Procédé de dosage immunologique d'un diphosphate ou triphosphate de nucléoside de formule: O O O IJ IF Il il 11 - HO P--O 'P -O P OR (V) OH OH OH n dans laquelle n=0 ou 1 et R5 représente un dérivé de nucléoside, caractérisé en ce que l'on effectue une réaction de compétition entre le diphosphate ou triphosphate de formule (V) à doser et un composé conjugué d'une enzyme et d'un analogue de diphosphate ou triphosphate de formule: 1 l 1 i l 2 il R10-P-X P-X2- P --Olé( O OR' OR -n R10 p--PX1 - x2-P ' - OR5 (I) dans laquelle R5 et n ont les significations données ci-dessus et R1, R2, R3, R4, X1 et X2 ont les significations données dans la revendication 1, pour des sites limités d'un anticorps spécifique dudit analogue, et en ce que l'on détermine la quantité de composé conjugué fixée sur l'anticorps. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le diphosphate ou triphosphate à doser est l'adéonosine triphosphate (ATP) ou un métabolite d'un agent antiviral nucléosidique. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'agent antiviral est le 3'-azido-3'-désoxythymidine (AZT)