FR 2715537 A1 19950804 FR 9501210 A 19950202 La présente invention concerne un procédé et une composition pour la lutte contre le piétin-échaudage des céréales d'hiver, en particulier du blé, de l'orge, de la triticale et du seigle et/ou le piétin-échaudage de parcelles de gazons. Le piétin-échaudage est une maladie des racines du blé, de l'orge et d'autres petites graines provoquée par le champignon Gâumannomycs gaminis var. tritici. Le piétin-échaudage constitue une limitation majeure à la culture de céréales dans presque toutes les zones de culture de céréales du monde. Rien qu'en Australie, on estime que les pertes de rendement sont supérieures à 000 000 S/an. La maladie ne peut pas être maîtrisée par des cultivars résistants ou par des fongicides. L'assolement avec des cultures qui ne sont pas des hôtes constitue le moyen principal de lutte. Cependant, malgré l'assolement, les pertes de rendement dans la deuxième ou troisième culture de céréales suivant la culture de repos peuvent encore être importantes et un meilleur procédé de lutte est nécessaire. La maîtrise biologique du piétin-échaudage utilisant des bactéries ou des champignons antagonistes a fait l'objet d'études en Australie et ailleurs. Le champignon du piétin-échaudage, à savoir G. gaminis, comprend trois variétés présentant différentes caractéristiques. La variété qui provoque principalement le piétin-échaudage dans le blé et l'orge est appelée G. gaminis var. tritici. La deuxième variété provoque le piétin-échaudage dans l'avoine et elle est appelée G. gaminis var. avenae. Elle peut également infecter le blé et l'orge, mais cela est moins habituel par rapport à la variété tritici. La variété avenae provoque égale- ment le piétin-échaudage de parcelles dans les gazons. La troisième variété, appelée variété rarniis est en règle générale un champignon qui ne provoque pas la maladie, mais elle est connue pour provoquer une maladie grave du riz aux Etats- Unis d'Amérique et aux Philippines. Cette maladie est appelée décoloration de l'enveloppe du riz. Un autre champignon, Phialophora. (à hyphopodes lobés) est très voisin de G. grarninis var. prninis. Il n'a jamais été indiqué comme agent pathogène des céréales d'hiver, du riz et des gazons. On a suggéré dans la littérature scientifique que Phialph peut être utile en tant qu'agent de lutte biologique contre le piétin- échaudagc (Wong et Southwell, Ann. appl. Biol. (1980), 94,41-49; Speakman, Phytopathol. Z. (1984), 109, 188-191). Malheureusement, tandis qu'il a été possible de mettre en évidence un certain degré de maîtrise, cela n'a été réalisé typiquement qu'à des niveaux faibles. Par exemple, Wong et Southwell, Ann. appl. Biol. (1980), 94, 41-49 ont montré qu'une inoculation avec un isolat de Phialphora M. DAR 32098 donnait une augmentation de rendement statistiquement significative par rapport au rnde- ment du blé non inoculé, mais ce rendement était encore inférieur de 54 % à celui du blé sain. Il a été montré ensuite que cet isolat se développait sur la gélose à raison de 0,5 mm/j à 5'C (voir le tableau 1). La demanderesse a maintenant découvert qu'on peut maîtriser à des degrés plus importants le piétin-échaudage en utilisant Phialgphora. si le ou les isolats de Phialophora ". sont "tolérants au froid". On entend ici par le terme "tolérants au froid" la capacité de présenter une vitesse de croissance radiale à 5C d'au moins 1,0 mm/j. Par conséquent, selon un premier aspect, la présente invention con- cerne un procédé de lutte contre le piétin-échaudage dans les céréales et/ou les gazons comprenant l'administration à la semence de céréale ou de gazon ou au sol d'une composition comprenant au moins un isolat de Phialbphora. et un support adapté, l'isolat de Phialophora sp. étant caractérisé en ce qu'il possède une vitesse de croissance radiale sur une gélose-pommes de terre-dextrose diluée au quart, telle que décrite ci- après, d'au moins 1,0 mmfj à 5C. Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne une compo- sition pour la lutte contre le piétin-échaudage dans les céréales et/ou les gazons, la composition comprenant un ou des isolats de Phi hora U. et un support, l'isolat de Phialophora sé. étant caractérisé en ce qu'il est susceptible d'une vitesse de croissance radiale sur la gélose-pommes de terrc-dextrose diluée au quart, telle que décrite ci-après, d'au moins 1, 0 mm/j à 5C. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'isolat de Phialophora sp. est appelé KY. On a déposé un échantillon de l'isolat de Phialpghgor l. KY selon le Traité de Budapest auprès de Australian Government Analytical Laboratories (AGAL), Pymble, NSW, Australie le 31 janvier 1995. Cette déposition a été accordée sous le n d'accès N95/6191. Pour une meilleure compréhension, les exemples suivants illustrent des formes préférées de la présente invention. Préparation de la gélose-pommes de terre-dextrose diluée au uart (14 PDA) utilisé dans les études de la vitesse de croissance Produits Pommes de terre 50,0 g Dextrose (Goodman Fielder Industries, Lidcombe, Australie) 5, 0 g Gélose (qualité J) (Davis Gelatine Co., Botany, Australie) 15,0 g Eau distillée 1 l Procédé On a nettoyé les pommes de terre pour les débanrrasser de la terre, on les a coupées en quarts ou en une dimension plus petite et on les a pesées. On a placé les morceaux de pommes de terre dans un bécher de 1 1 contenant 500 ml d'eau distillée. Dans un autre bêcher, on a ajouté la gélose à 500 ml d'eau distillé et on a agité. On a placé les deux béchers dans un cuiseur à vapeur pendant 1 h jusqu'à ce que toute la gélose soit fondue. On a filtré le contenu du bêcher conte- nant les pommes de terre en le faisant passer par deux couches de mousseline et en le récupérant dans une éprouvette graduée de 11. On a ajouté de l'eau distillée chaude dans l'éprouvette graduée pour compléter à 500 ml. On a ajouté cette solution dans le bécher contenant la gélose fondue et on a agité. Ensuite, on a ajouté le dextrose dans cette solution et on a agité jusqu' à ce qu'il soit dissous. On a ajusté le pH de la solution à 5,8. On a alors distribué la solution dans des bouteilles de 200 ml à bouchon fileté et on a passé à l'autoclave les bouteilles à 121'C pen- dant 20 min. Apres refroidissement, on a stocké la gélose à 4C et on l'a utilisée en deux semaines pendant le stockage. On a préparé des boîtes de gélose en faisant fondre la gélose des bouteilles et en répartissant des parties aliquotes de 15 ml dans des boîtes de Petri en plastique stériles de 9 cm de diamètre. On a séché la surface de la gélose solidifiée pendant 5 min dans une enceinte à écoulement laminaire. On a fait pousser les colonies des champignons à tester sur la gélose pendant 4 j à 20'C. On a réalisé des bouchons de 5 mm à partir des bords en croissance des colonies à l'aide d'un perce-bouchon stérile. Ensuite, on a placé un bouchon de gélose au centre de chaque boîte de gélose. On disposait de trois boites de réplica- tion par champignon à chaque température d'incubation. Pour les températures les plus élevées (15'C, 20'C et 25'C), on a mesuré tous les jours les rayons des colonies de champignon. Pour les températures les plus faibles (5 et 10'C), on a réalisé les mesures après 5 j et ensuite tous les 2 à 3 j. Sélection des champignons candidats On a obtenu des isolats de Phialophora S. en étalant des morceaux de racines d'espèces d'herbes recueillies dans des zones de culture du blé en NSW, Australie. On a lavé les racines pour les débarrasser de la terre et on a stérilisé en surface des morceaux de racines de 3 à 4 cm pendant 30 à 60 s dans l'hypochlorite à 10 % dans l'éthanol à 50 %. On a rincé les racines par de l'eau stérile et on les a coupées en conditions aseptiques en morceaux de 1 cm. On a alors étalé ces morceaux de racines dans des boîtes sur un milieu gélosé et on a incubé à 10'C. Après 7 j, on a découpé des champignons ressemblant à Phialphora p. et on les a repiqués dans des boîtes du même milieu. On a obtenu des cultures pures et on les a identifiées selon Walker (chapitre 2 dans Biology and Control of Take-all, eds. Asher MJ.C. and Shipton PJ., Academic Press, 1981). On a ensuite testé leurs vitesses de croissance à 5'C, 10'C, 15 C, 20'C et 25 C. On a alors testé, dans une expérience de plein champ, la capacité des isolats se développant le plus vite à 5 C à supprimer le piétin-échaudage. Expérience de plein champ 1 On a préparé des inoculums du champignon du piétin-échaudage et de Phialophora sp. (à hyphopodes lobés) en cultivant chaque champignon sur des graines d'avoine humidifiées qui avaient été stérilisées (60 min à 121 C) pendant 2 j successifs. Après 4 semaines, on a séché à l'air, à température ambiante pendant 7 j, les graines d'avoine colonisées et on les a stockées à 4C jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'emploi. On a mis en oeuvre l'expérience de plein champ à l'Agricultural Research Station à Cowra, NSW. Les traitements étaient les suivants: (i) Pas d'inoculation (témoin sain) (ii) Inoculation par le champignon du piétin-échaudage seul (iii) Inoculation par le champignon du piétin-échaudage + iala 30, On a mélangé la semence de blé avec l'inoculum ou les inoculums fongiques et on a semé le mélange dans le même sillon. Les parcelles avaient 1,5 m de large et 12,5 m de long. On a construit l'expérience de plein champ sous la forme d'un modèle à blocs complets aléatoires présentant 6 réplications. On a mélangé la semence de blé, l'inoculum de champignon du piétin-échaudage et l'inoculum de Phialophora p. dans les proportions de 2:2:1 et on a semé le mélange à raison de 60 kg de blé par hectare. On a estimé le piétin-échaudage des parcelles sur une échelle de 0 à 10 sur laquelle 10 représente la maladic maximale, et on a estimé la colonisation des racines par Phialoehmrî j. (à hyphopodes lobés). On a obtenu les rendements en graines au moment de la maturité de la culture. Expérience de plein champ 2 On a préparé des inoculums du champignon de piétin-échaudagc et trois isolats de phbialophora s. (à hyphopodes lobés) comme dans l'expérience 1. On a mis en oeuvre l'expérience de plein champ au Biological and Chemical Research Institute de Rydalmere. Les traitements étaient les suivants: (i) Pas d'inoculation (témoin sain) (ii) Inoculation par le champignon du piétin-échaudage seul (iii) Inoculation par le champignon du piétin-échaudage + Phialphora (K1) (iv) Inoculation par le champignon du piétin-échaudage + Phialah spK C) (v) Inoculation par le champignon du piétin-échaudage + Phialgbh s (6A). On a mélangé la semence de blé avec l'inoculum ou les inoculums fongiques et on a semé le mélange dans le même sillon. Les parcelles étaient des lignes uniques de 1,5 m de long. On a construit l'expérience comme un modèle à blocs complets aléatoires présentant 4 réplications. On a semé le blé à raison de 1,5 g/parcelle et on a utilisé chaque inoculum fongique à raison de 1,5 g/parcelle. On a estimé le piétin-échaudage des parcelles sur une échelle de 0 à 5 sur laquelle 5 représente la maladie maximale. On a obtenu les rendements en graines au moment de la maturité de la culture. Résultats 1. Sélection des champignons candidats Les études de vitesses de croissance à des températures comprises entre S et 25'C ont montré que les isolats de PhialUhora. KY, K1 et KC se sont développés à 5 C respectivement à raison de 1,4, 1,2 et 1,0 mm/j (tableau 1). Les isolats de Phialophora sp. DAR 32098 se sont développés à raison de 0,5 mm/j, tandis que l'isolat 6A ne s'est pas développé à 5 C sur les milieux définis. Des iso- lats de G. gaminis var. tritici pathogène, également testé, ne se sont pas dévelop- pés ou se sont développés plus lentement (par exemple, 921) sur ces boîtes à 5C (tableau 1). 2. Expérience de piein champ 1 La maladie était significativement plus importante dans les parcelles à piétin-échaudage seul que dans les parcelles à piétin-échaudage + Ehaohora s. (tableau 2). Le rendement moyen en graines des parcelles protégées par Phialophora sp. était significativement plus important (p 3. Experience de plein champ 2 Le piétin-échaudage des parcelles inoculées avec Phialophoa s. (isolats K1 et KC) était significativement moins important (p Ces résultats mettent en évidence le fait que la tolérance au froid est une caractéristique importante pour que Phialophora sp. soit efficace contre le piétin-échaudage. On peut déduire l'importance de la tolérance au froid pour une maîtrise biologique efficace d'après les résultats indiqués dans les tableaux 3 et 4. Dans le tableau 3, les deux isolats de Phialophora s. tolérants au froid, K1 et KC, ont donné une maîtrise significativement meilleure que l'isolat 6A qui ne se développe pas à 5 C. En effet, l'isolat 6A n'a pas protégé du piétin-échaudage dans cette expérience. Une autre série d'argument est indiquée dans le tableau 4. Des données d'un document de Wong et Southwell (1980) ont montré que PhialoUhm.. (isolat DAR 32098), lequel se développe sur la gélose à raison de 0,5 mm/j à 5_C, protégeait le blé du piétin-échaudage jusqu'à un certain degré, mais que son rendement en graines était inférieur à la moitié (45, 7 %) de celui du blé sain. Au contraire, Phialophora sp. (isolat KY), lequel se développe à raison de 1,4 mm/j sur la gélose à 5'C, a donné un niveau plus élevé de protection et son rendement en graines était égal à 93,1 % de celui du blé sain. Cela soutient la comparaison avec les rendements relatifs de 93,7 % et 87,6 % obtenus respectivement par les deux autres isolats de Phialophora SP, tolérants au froid, K1 et KC (tableau 3). On peut voir d'après le tableau 5 que la vitesse de croissance de l'isolat de Phialophora sp. KY peut varier dans une certaine mesure en fonction de la source du milieu gélosé utilisé. Par conséquent, il faut estimer le critère de tolé- rance au froid utilisé ici d'une vitesse de croissance radiale sur le milieu 1/4 PDA d'au moins 1,0 mm/j en utilisant le milieu 1/4 PDA préparé selon le protocole indiqué ci-dessus. Tableau 1 Vitesse de croissance radiale (mm/j) d'isolats de Phial.Ihora z. et de G. g. tritici (921) à diverses températures sur la gélose-pommes de terre-dextrose diluée au quart. Températures Champignon 5C 10C 1 C 20'C 25 C Phialophora sp. (KY) 1,4 0,2 2,8 0,1 3,8 0,1 5,5 0,2 6,0 + 0,5 Phialophorasp.(K1) 1,2 0,2 2, 3 0,1 3,6 +0,1 2,4 +0,2 2,2 O0,2 Phialophora sp. (KC) 1,0 0,2 1,7 0,2 3, 9 0,3 6,5 0,2 4,1 :0,3 Phialophora sp. (DAR 32098) 0,5 + 0,2 2,4 + 0, 2 4,7. 0,3 6,3 + 0,2 6,5 0,4 Phialophora sp. (6A) 0,0 1,8 0,1 4,0 0, 2 5,7 0,3 6,4 0,3 G.g. tritici (921) 0,5 0,1 1,6 + 0,1 3,6 0,2 4,7 0,2 4,6 0,3 Tableau 2 Maîtrise biologique du piétin--chaudage utilisant l'isolat de Phiaoph= sj. (à hyphopodes lobés) KY dans une expérience de plein champ. Traitement Appréciation de la mala- Rendement cn graine die (0-10) (kg/parcllr) Témoin sain 0,0 7,2 Piétin-échaudage seul 5,8 4,7 Piétinéchaudage + Phialophora sp. 2,4 6,7 Caractère de poids faible (p = 0,05) 1,2 0,9 Tableau 3 Maîtrise biologique du piétin-échaudage utilisant différents isolats de Phibalphora W, (à hyphopodes lobés). Traitement Appréciation de Remins en Renmlent m grane, % la maladie (O-5) graine, (patce) dublé sin Aucun O 118,2 100,0 Pitin-échaudage seul 4,2 76, 3 64,6 Piétin-échaudage + Phialophora sp. (Kl) 2,3 110,7 93,7 Piétin6chaudage + Phialophora sp. (KC) 2,6 103,5 87,6 Piétin-chaudage + Phialophora sp. (6A) 4,0 80,6 68,2 Caractère de poids faible (P = 0,05) 1,2 17,1 -_ Tableau 4 Efficacité relative de deux isolats de Phialophora. (à hyphopodes lobés) dans la lutte contre le piétin-échaudage. Isolat de Vitesse de Rendement en graines Rgedement en Rendeme., en grain. du Phialophora croissance à du blé inoculé, graine du blé bl inoculé en % du blé Sp. 5-c,' (mre,)(kg/parcele) sain, (w paxoe-) Min DAR 32098 0,5 0,2 2,0 4,4 45,7 KY ** 1,4 0,2 6,7 7,2 93,1 À Données provenant de Wong et Southwell (1980), p. 45, tableau 4. À * Données provenant des tableaux i et 2 ci-dessus. Tableau 5 Effet des milieux sur les vitesses de croissance (mm/j) de l'isolat de PhjalgpbrZi (à hyphopodes lobés) KY à diverses températures. Températures Milieu 5'C 10'C 15'C 20'C 25'C 1/4 PDA (préparé en laboratoire) 1,4 0,2 2,8 0,1 3,8 0,1 5,5 - 0,2 6,0 0,5 1/4 PDA (Oxoid) 0,9 0,2 2,2 0,1 4,9 0,2 6,1 0,4 7,0 0,8 Czapek- Dox (Oxoid) + 0,2 gul d'extrait de levure (DIFCO) 1,0 0,2 2,7 0,1 5,2 0,3 7,3 0,4 8,2 0,6 Comme cela est évident d'après les résultats cidessus, la présente demanderesse a découvert un procédé biologique et une composition pour la lutte contre le piétin-échaudage des céréales d'hiver. Le procédé et la composition de l'invention ont donné une réduction significative de la maladie dans des expériences de plein champ utilisant des semences de blé mélangées avec le champignon de traitement biologique. Etant donné la ressemblance entre le piétin--échaudage des céréales d'hiver, le piétin--échaudage des gazons et la décoloration de l'enveloppe du riz, on pense que la composition de l'invention sera également utile pour la lutte contre le piétin-échaudage des gazons et la décoloration de l'enveloppe du riz. Les spécialistes seront en mesure d'imaginer diverses variantes et/ou modifications à partir de l'invention telle qu'elle est décrite dans les modes de réalisation spécifiques sans s'écarter du cadre ou de l'esprit de l'invention. Il est entendu que l'invention n'est nullement limitée par les présents modes de réalisa- tion donnés à titre d'illustration seulement. REVENDICATIONS 1. Procédé de lutte contre le piétin-échaudage dans les céréales et/ou les gazons comprenant l'administration à la semence de céréale ou de gazon ou au sol d'une composition comprenant au moins un isolat de walphrj. et un support adapté, l'isolat de Phialophora s. étant caractérisé en ce qu'il possède une vitesse de croissance radiale sur la gélose-pommes de terre-dextrose diluée au quart d'au moins 1,0 mm/j à 5'C. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'isolat de Phialophora sp. possède une vitesse de croissance radiale sur la gélosepommes de terre-dextrose diluée au quart d'au moins 1,4 mm/j à 5 C. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'isolat de PhialopIhora sp. est KY. 4. Composition pour la lutte contre le piétin-échaudage dans les céréales et/ou les gazons, la composition comprenant au moins un isolat de Phialophora sp. et un support, l'isolat de Phial.hQra M. étant caractérisé en ce qu'il possède une vitesse de croissance radiale sur la gélose-pommes de terre- dextrose diluée au quart d'au moins 1,0 mm/j à 5'C. 5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'isolat de Phialophora sp. possède une vitesse de croissance radiale sur la gélose-pommes de terre-dextrose diluée au quart d'au moins 1,4 mm/j à 5'C. 6. Composition selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisée en ce que l'isolat de Phialo2hora s. est KY. 7. Culture biologiquement pure de Phialophora sp. KY.