FR 2713933 A1 19950623 FR 9315171 A 19931216 Méthode de superovulation dirigée des femelles bovines mises en anoestrus prolongé, méthode de mise en anoestrus et kit de superovulation. La présente invention a trait à une méthode de superovulation dirigée des femelles bovines après mise en anoestrus et aussi, en particulier, à la méthode spécifique de mise en anoestrus de ces animaux. Elle concerne aussi un kit de superovulation pour femelles bovines. La variabilité dans le nombre d'ovocytes obtenus après le traitement de superovulation couramment appliqué et reposant sur l'emploi combiné, d'une part de l'hormone gonadotrope FSH (Follicle Stimulating Hormone) 0 en présence de plus ou moins de LH (Luteinizing Hormone) et, d'autre part, d'un médicament lutéolytique, limite le développement de la technique de production d'embryons de bovins par la femelle superovulée. Bien que l'importance du moment de l'application du traitement sur les résultats de la superovulation ait été décrite très antérieurement (D. Monniaux et al., Theriogenelogy, 1983, 19, 55-81), ce sont les travaux récents sur les propriétés respectives des follicules apparaissant au cours de l'intervalle interovulatoire et les modifications concomitantes de la FSH plasmatique qui ont mis en lumière le rôle de certains mécanismes de régulation de la croissance des follicules antraux. 5 Chez les bovins, l'observation des follicules par les méthodes d'échographie a montré que la croissance folliculaire intervient sous forme de vagues au nombre de 2 ou 3 (Travaux de J. Ireland et J.F. Roche, 1983 cités par J.F. Roche et al., Theriogenelogy, 1991, a (1), 81-89) dans l'intervalle interovulatoire normal. 10 Chacune d'elles est constituée par le recrutement simultané de plusieurs follicules antraux de petit diamètre qui sont décelés dès que leur diamètre est voisin de 4 mm. Leur croissance laisse apparaître rapidement un follicule dominant, plus grand que les autres, qui peut être ovulatoire (follicule dominant de la 2e ou de la 3e vague dans les cycles à 2 ou 3 vagues respectivement) ou anovulatoire (follicule dominant de la le ou de la 2e vague dans les cycles à 2 ou 3 vagues respectivement). Les autres follicules, ou follicules surbordonnés, se différencient du précédent par l'arrêt de leur croissance, qui est suivie de leur régression. L'action inhibitrice du follicule dominant présent sur la réponse de superovulation au traitement par la20 FSH a été bien mise en évidence (L.A. Guilbaut et al., J. Reprod. Fert., 1991, 91, 81-89). Ces auteurs ont en effet montré qu'en l'absence de follicule dominant, le taux d'ovulation est plus élevé et moins variable qu'en sa présence. Cependant, ils observent qu'en présence du follicule dominant deux classes de réponse ovulatoire peuvent être décrites qu'ils qualifient de25 réponse de superovulation élevée ou basse. Cette expérimentation montre l'intérêt d'appliquer le traitement de superovulation au moment du cycle oestrien ne présentant pas de follicule dominant et conduit à mettre en oeuvre systématiquement un examen échographique quotidien avant de déterminer le moment le plus propice à l'application du traitement par la30 FSH. Une étude reposant sur les variations de la concentration plasmatique de FSH entourant la sélection du follicule dominant a permis de comparer les réponses de superovulation obtenues après l'application du traitement avant ou immédiatement après la sélection du follicule dominant35 (G.P. Adams et al., Anim. Reprod. Sci, 1993, 30, 259-271). Les auteurs ont montré dans leurs deux essais effectués sur la première vague de follicules l'importance de l'apport de FSH au moment de l'émergence du follicule dominant sur le maintien de la croissance des follicules subordonnés et leur transformation en follicules ovulatoires. L'accroissement de la taille des follicules subordonnés jusqu'au stade ovulatoire sous l'effet du traitement 5 de superovulation par la FSH a entraîné une moindre croissance du follicule dominant. Les auteurs n'ont pas observé l'émergence d'une nouvelle vague sous l'action du traitement, même s'il intervient après la phase de sélection (jour 5) o la concentration plasmatique de FSH est à son niveau le plus bas. Cet état réfractaire serait rapporté à l'action suppressive10 directe des autres follicules, bien qu'il n'en existe aucune démonstration expérimentale. Cet état réfractaire à l'apparition d'une nouvelle vague fut également observé en présence du follicule dominant actif de la vague précédente (O.J. Ginther et al., J. Reprod. Fert., 1989, 87, 223-230). Les connaissances acquises ces dernières années, illustrées par les travaux précités, montrent que l'efficacité du traitement de superovulation est augmentée si celui-ci intervient dès l'émergence du follicule dominant et pendant la durée de la phase dite de compétition au cours de laquelle les follicules subordonnés peuvent se développer si une quantité appropriée de FSH leur est fournie. Cette efficacité serait également augmentée en20 l'absence de follicules d'une vague antérieure pour éviter tout effet suppresseur de leur part. Les conditions physiologiques pouvant le mieux répondre à cette double exigence se rencontrent immédiatement après l'oestrus, état ovarien qui est caractérisé par la disparition du follicule dominant, l'absence concomitante de follicules en régression et le début de25 la croissance des follicules de la lère vague. Cependant les traitements de superovulation effectués sur la lere vague de follicules ne permettent d'obtenir qu'un nombre d'ovulations inférieur à celui qui est obtenu par l'application du traitement sur les autres vagues. La comparaison des résultats obtenus sur la lere vague (G.P. Adams et al., Anim. Reprod. Sci., 301l993, 30, 259-71) sont nettement inférieurs à ceux qui furent obtenus en intervenant sur la 2ème vague (L.A. Guilbaut et al., J. Reprod. Fert., 1991, 91, 81-89) entre les jours 7 et 12 du cycle. Elle montre que l'application du traitement de superovulation sur la lère vague ne peut apporter aucun avantage dans la pratique courante bien que le développement folliculaire de35 la lère vague soit un modèle d'étude physiologique privilégié. L'analyse descriptive de l'évolution des follicules ovariens a fait simultanément l'objet d'études sur les mécanismes indirects faisant intervenir les variations de la FSH plasmatique sur la croissance des follicules, la sélection du follicule dominant et la régression des follicules subordonnés (G.P. Adams et al., J. Reprod. Fert., 1992, 94, 179-188). Les5 auteurs ont étudié d'une part l'effet de la suppression du follicule dominant sur le devenir des follicules subordonnés et l'apparition d'une nouvelle vague de follicules. Ils ont étudié d'autre part l'action inhibitrice de l'injection de liquide folliculaire qui entraîne l'abaissement ou la suppression de la sécrétion de FSH, action due essentiellement à l'inhibine,10 sur le retard apporté à l'apparition d'une nouvelle vague de follicules ou sur des follicules en croissance d'une nouvelle vague. Des essais avaient permis à cette équipe (J.P. Kastelic et al., Theriogenology, 1990, 34, 499-509) de proposer qu'une nouvelle vague de follicules n'est pas à l'origine de l'atrésie du follicule dominant et des follicules subordonnés de la vague précédente.15 Dans leur étude (Adams, 1992), ils ont en effet observé que l'administration de liquide folliculaire, d'une part, entraînait l'arrêt de la croissance et la régression des follicules de la nouvelle vague, respectivement 1 et 5 jours après le début du traitement, et, d'autre part, entraînait la disparition de la FSH plasmatique sans accélérer l'involution des follicules de la vague20 précédente. Ces essais (Adams 1992 et Kastelic 1990-supra), ont permis également de montrer que l'abaissement de la sécrétion basale de FSH par ce traitement inhibait la croissance du follicule dominant. Pour les auteurs, cette observation renforcerait l'hypothèse que le follicule dominant reste dépendant d'une concentration basale de FSH, inférieure à celle qui est25 nécessaire aux autres follicules de la même cohorte. Ces travaux (Adams, 1992 et 1993) ont montré qu'une décharge de FSH précède de 1 à 2 jours l'émergence d'une nouvelle vague de follicules, décelable par échographie, et qu'elle décline dès l'apparition de cette émergence. Cette diminution aboutit à la disparition de FSH 1 à 2 jours après l'apparition de la nouvelle vague. Ils font ressortir: a) que la présence de FSH est nécessaire pour assurer le recrutement des follicules d'une nouvelle vague, b) que le déclin rapide de la FSH entraîne la sélection du follicule dominant.35 L'origine de ce déclin de la sécrétion de FSH est attribué d'une part à l'action inhibitrice indirecte plus ou moins précoce des nouveaux follicules en croissance et d'autre part à l'abaissement important de la sécrétion hypophysaire après la libération initiale de la FSH stockée. Ce dernier serait responsable de la sélection et précéderait le mécanisme d'inhibition qui ne se mettrait en place qu'avec l'apparition de la sécrétion d'inhibine qui serait issue du follicule dominant. c) qu'un certain état réfractaire à l'action de FSH apparaît après la période de sélection au moment de la sécrétion basale de FSH et serait dû à l'action inhibitrice directe des follicules en croissance. Les mécanismes d'action de la FSH dans la sélection du follicule lo dominant chez les femelles bovines ont été également décrits dans d'autres espèces et plus spécialement chez les femelles ovines, qui, à la différence des femelles bovines, présentent un anoestrus saisonnier (A.S. McNeilly, W. Crow, J. Bordes et G. Evans, J. Reprod. Fert. Suppl. 45, 1992, 5-19). Ces auteurs ont pu montrer que le recrutement et la croissance des follicules ovulatoires ne dépendaient que de l'apport de FSH en présence d'une sécrétion basale de LH en utilisant un modèle d'anoestrus qui est obtenu par l'administration continue et prolongée d'un analogue agoniste de GnRH (Busereline), décrit antérieurement (A.S. McNeilly, H.M. Fraser, J. of Endocrin., 1987, 115, 273-282). Ils ont démontré également l'importance de la sécrétion pulsée de la LH (Luteinizing Hormone) et sa compensation par un apport accru de FSH dans la sélection du ou des follicules dominants pendant la phase lutéale de l'espèce ovine en appliquant à leur modèle expérimental des décharges de LH à la fréquence de ceux de la phase lutéale (1 toutes les 4 heures). Les auteurs ont observé que des brebis mises en anoestrus par un traitement prolongé à l'aide d'un analogue agoniste de LHRH et soumises à un traitement par la FSH pendant 120 heures développaient des follicules oestrogéniques comparables à ceux d'un cycle normal. L'administration de la hCG (gonadotrophine chorionique) a entraîné une ovulation supérieure à la normale, suivie de la formation de corps jaunes sécrétant des quantités normales de progestérone (A.M. Picton, C.G. Tsonis, A.S. McNeilly, J. of Endocrin., 1990, 126, 297-307). Ils ont également observé que les ovocytes obtenus ont pu être fécondés par insémination intra-utérine (G. Evans, J. Brooks, W. Crow, A.S. McNeilly, non publié et cité dans J. Reprod. Fert. Suppl. 45, 1992, 5-19). Des différences existent cependant entre les caractères de la physiologie ovarienne, polyovulatoire et saisonnière entre les femelles ovines et les femelles bovines. Notamment, pour certains auteurs (M.A. Driancourt, R. Webb, R.C. Fry, J. of Reprod. Fert., 1991, 293, 63-70), la folliculogénèse chez les femelles ovines présenterait certaines particularités la différenciant de celle des femelles bovines: c'est ainsi que le follicule5 dominant de la femelle ovine ne produirait pas de signal inhibant les autres follicules. Aux difficultés rencontrées dans les techniques de superovulation des femelles bovines s'ajoute la trop grande variabilité des résultats obtenus dans la pratique. En effet, si l'on peut avancer une moyenne de 4,5 à 5,510 embryons transférables par traitement de superovulation, ce nombre varie en fait dans la pratique entre 0 et 15 embryons environ sans qu'il soit possible de contrôler cette variabilité. Les objectifs recherchés sont donc avant tout de rechercher une méthode permettant d'obtenir un nombre d'embryons satisfaisant et cela d'une manière fiable en ce qui concerne la15 constance du nombre d'embryons transférables pour chaque traitement de superovulation. Lors de travaux sur la superovulation dirigée des femelles bovines, la demanderesse a découvert qu'il était possible de s'affranchir de toutes les contraintes physiologiques qui conduisaient les auteurs à déterminer de20 manière précise le moment propice pour essayer d'induire une superovulation, en amenant la femelle bovine dans un état d'anoestrus plus intense que l'état d'anoestrus physiologique et qui sera qualifié ci-après de profond. Il se caractérise par une désensibilisation de l'hypophyse à l'action de la LHRH endogène.25 En outre, il a été découvert que l'on pouvait maintenir un état d'anoestrus profond chez la femelle bovine, pouvant atteindre ou dépasser cent jours, au cours duquel, et cela est très surprenant et avantageux, il est possible de réaliser plus d'une superovulation menée jusqu'au stade de récolte des embryons. 30 L'invention a donc pour objet une méthode de superovulation dirigée des femelles bovines, comprenant les étapes suivantes: - administrer à l'animal un analogue de la LHRH de manière à désensibiliser l'hypophyse à l'action de la LHRH endogène, ce qui induit un état d'anoestrus profond caractérisé notamment par l'arrêt du développement des follicules antraux, - à l'instant de son choix à l'intérieur de la période d'anoestrus profond ainsi induite, administrer à l'animal de l'hormone FSH, associée ou non à la LH, de manière à induire le recrutement et le développement des follicules ovulatoires, - en fin de développement de ces follicules, administrer à l'animal une hormone choisie parmi le groupe consistant en LH et hCG, de manière à déclencher l'ovulation de ces follicules. La méthode de superovulation proposée consiste donc à décider du moment du recrutement des follicules, de stimuler leur croissance par un traitement par l'hormone gonadotrope FSH associée ou non à LH, à isoler10 les follicules en croissance de toute action inhibitrice ou stimulatrice indirecte ayant pour origine l'action ovarienne sur l'axe hypothalamo- hypophyso-ovarien pour supprimer ou diminuer fortement la divergence entre follicules ovulatoires et non ovulatoires et provoquer l'ovulation par un apport, à un moment déterminé du développement des follicules, de la LH15 ou de l'hCG en quantité et pendant un temps suffisant. Ces conditions sont remplies au cours de l'anoestrus profond que la méthode de traitement conforme à l'invention entraîne. Il est tel qu'il permette le développement des follicules antraux jusqu'au stade de prérecrutement. Cet état d'anoestrus qui est obtenu et qui est décrit dans les20 exemples a limité la croissance des follicules décelables à une valeur inférieure à 5 mm. Le mécanisme peut sans doute être rapporté à la suppression de la sécrétion de la LH pulsée et à l'abaissement de la sécrétion basale de FSH, ainsi qu'à la suppression des mécanismes d'inhibition indirecte partant des ovaires.25 Le nouveau mode de sécrétion des hormones gonadotropes a entraîné la suppression des cycles oestriens. Cet état d'anoestrus est contrôlé, après la disparition de la phase lutéale existant au moment de l'application du traitement (moment préféré), par le maintien du taux de progestérone plasmatique au-dessous du seuil de détection. Le traitement30 commence de préférence au début de cette phase lutéale. La désensibilisation de l'hypophyse à l'action de l'hormone LHRH endogène peut être obtenue notamment soit par l'administration d'un analogue agoniste de LHRH à dose élevée (supraphysiologique) et continue, soit par l'administration d'un analogue antagoniste de LHRH, pendant le35 temps nécessaire à la mise en place et au maintien de l'anoestrus profond permettant l'application du ou des traitements successifs de superovulation, de fertilisation des ovocytes par insémination artificielle et de récolte des embryons, qui sera suivie de leur transfert avant ou après congélation. Ces trois dernières techniques sont les techniques habituelles utilisées par les personnes spécialisées dans les opérations d'insémination artificielle, de5 récolte et de transfert des embryons. Plutôt que de recourir à de multiples injections, on préfère utiliser des formulations permettant la libération continue de l'analogue de la LHRH sur une durée qui détermine la durée de la phase d'anoestrus profond.10 Pour ce faire, on dispose des nombreuses techniques mises au point pour la préparation des formulations à libération continue, notamment à base de polymères dégradables, en particulier poly (lactide-glycolide) ou poly (lactique-glycolique), ou de corps gras, notamment acides gras ou esters d'acides gras ou de polyéthylène- glycol, réalisées notamment sous forme de films, implants ou microsphères. On préférera des microsphères de poly (lactide-glycolide) ou de poly (lactique-glycolique), ou éventuellement d'autres compositions, préparées notamment selon le procédé décrit dans la demande de brevet français n0 92 0241 du 27 juillet 1992 non encore publiée. Le procédé de préparation décrit dans les essais est conforme à cette demande antérieure. Par analogue agoniste de la LHRH, il faut entendre comme il est d'usage toute molécule possédant les propriétés biologiques de la LHRH naturelle, c'est-à-dire notamment action sur l'hypophyse déclenchant une sécrétion de LH et de FSH. Il peut également s'agir de la LHRH elle- même.25 De nombreux analogues agonistes de la LHRH sont aujourd'hui connus des spécialistes et il n'entre donc pas dans le cadre de cette demande de les citer tous. Ils peuvent être d'origine naturelle, de recombinaison ou synthétique, c'est-à-dire obtenus par synthèse chimique complète ou par modification chimique d'une molécule naturelle, par exemple par substitution d'acides30 aminés et/ou modification des extrémités carboxyterminale ou aminoterminale. L'invention utilise préférentiellement l'analogue D.Trp6- LHRH (brevet FR-A-2 313 940) ou le Des-Gly-D.Trp6-LHRH éthylamide (brevet FR-A-2 397 192). L'effet recherché avec l'agoniste est une saturation des récepteurs hypophysaires de la LHRH qui dure tout au long de la période d'anoestrus profond qui a été choisie. L'agoniste est donc administré de manière que, durant toute la période d'administration, il soit en concentration supraphysiologique dans le sang, ce qui signifie que la concentration en agoniste reste à un niveau toujours supérieur aux pics de sécrétion de LHRH endogène par l'hypothalamus. Il s'agit là de l'application à5 l'hypophyse du phénomène bien connu de désensibilisation (appelé "downregulation" des récepteurs de la LHRH par les Anglo-Saxons). La posologie se définit en fonction de la durée de libération choisie pour l'analogue de la LHRH et dépend donc de la formulation choisie. On ne peut pas en effet définir la teneur plasmatique minimale requise en10 analogue car, en dessous d'un certain seuil, les techniques ne permettent plus de détecter et mesurer la concentration réelle en analogue. L'effet recherché étant un anoestrus profond, on doit obtenir une disparition persistante de la sécrétion de progestérone (dosage par les techniques usuelles) et l'examen échographique ne doit pas révéler l'existence de15 follicules de diamètre supérieur à 5 mm. Il est aisé de déterminer les doses d'analogue qui sont nécessaires en liaison avec une formulation donnée, en recourant à des essais et en vérifiant, par les techniques ci-dessus, l'obtention d'un anoestrus profond sur une période donnée, en s'aidant des essais décrits plus loin. 20 On a pu ainsi déterminer des doses efficaces de 150 mg d'analogue agoniste pour une libération continue de l'ordre de 40 jours et de 300 mg agoniste pour une libération continue de l'ordre de 85 à 100 jours et même de 300 mg pour une libération continue de l'ordre de 85 à 100 jours, et même de 50 mg pour une durée de libération de l'ordre de 40 jours. De préférence, pour une formulation à libération continue d'une durée de l'ordre de 40 jours, on administre à l'animal une dose d'analogue agoniste de la LHRH comprise entre 40 et 150 mg environ et de préférence environ 50 à 100 mg. Pour une libération de 85 à 100 jours environ, la dose peut être comprise entre 100 et 300 mg environ. Si l'on ne souhaite réaliser qu'une seule phase de superovulation, on choisira avantageusement des formulations à libération courte, par exemple de l'ordre de 40 jours, afin que l'animal retrouve rapidement son état normal après la récolte des embryons. Les formulations à plus longue durée de libération seront plus appropriées à l'induction de plusieurs phases de superovulation successives au cours d'un anoestrus profond unique. L'invention prévoit aussi l'utilisation d'analogues antagonistes de la LHRH. Il s'agit là de ce qu'il est communément convenu d'appeler les molécules s'opposant à l'action de la LHRH endogène par leur fixation sur les récepteurs spécifiques à cette hormone. Leur action est plus rapide que celle des agonistes et requiert une concentration permettant de bloquer les5 récepteurs sur la durée choisie pour l'anoestrus profond. Les antagonistes ne provoquent pas un effet de stimulation premier de courte durée de la sécrétion de LH et FSH, comme c'est le cas avec les agonistes avant d'obtenir l'état de désensibilisation. On connaît un grand nombre d'antagonistes de la LHRH. On pourra notamment utiliser les antagonistes décrits dans la 0 demande de brevet internationale WO 92/19651 (agonistes selon les séquences SEQ ID NO: 1 et NO: 2 décrites dans cette demande) et les agonistes ORG 30850 (G.H.J. Deckers et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., vol. 42, 705 - 712, 1992), Antide (K. Wallen et al., Physiology & Behavior, vol. 50, 429-435, Pergamon Press plc, 1991). Voir aussi dans V.J. Csernus et al., P.N.A.S. USA, vol. 89, 5759 - 5763, 1992. La libération continue des agonistes de LHRH (ou GnRH) a déjà été décrite chez les bovins dans un but différent de celui qui fait l'objet de l'invention. Les administrations de la GnRH synthétique à la génisse prépubère (S.E. Dodson et al., J. Reprod. Fertil., 1988, 82, 526-538) ou de la20 buséréline (F. Grassalli et al., Anim. Reprod. Sci., 1993, 32, 153-161) sont effectuées à faible dose, sont limitées à 10-15 jours, et ont pour but le déclenchement d'une ovulation précoce. Les auteurs ont observé une forte augmentation de la LH dès l'administration de GnRH ou de son agoniste. Faisant suite à cette libération précoce succède une sécrétion basale de LH25 augmentée (F. Grasselli, 1993) ou abaissée (S.E. Dodson, 1988). Cette diminution de la sécrétion basale de LH est également observée par traitement de vaches en post-partum à faible dose à l'aide d'implants de buséréline (B.J. McLeod et al., Anim. Reprod., Sci., 1991, 24, 1-11) et est rapportée à un état de downregulation ou désensibilisation de l'hypophyse. 30 Ces travaux ne sont pas orientés vers la superovulation, ils visent à diminuer la période prépubère et à obtenir une ovulation précoce pour les deux premiers et à supprimer l'anoestrus post-partum pour l'emploi de doses faibles de GnRH ou de ses agonistes pour le dernier. Ensuite, le recrutement et la croissance folliculaire sont assurés par il un apport de FSH, qu'elle soit une hormone d'extraction FSH porcine ou ovine ou bovine ou équine, ou qu'elle soit une hormone FSH de recombinaison. Cet apport par voie parentérale est administré au moins deux fois par jour, à intervalle régulier, ou est délivré par un système à5 relargage continu (par exemple du type décrit pour l'analogue de la LHRH). Cet apport est maintenu de préférence pendant de 7 à 10 jours. L'administration de LH ou d'hCG est effectuée de préférence pendant de 2 à 3 jours environ et commence de préférence le dernier jour de l'administration de FSH. La LH utilisée est soit une hormone d'extraction, lo porcine, ovine ou bovine ou équine ou une hormone de recombinaison. L'invention a aussi pour objet la méthode elle-même qui consiste à administrer à l'animal un analogue, agoniste ou antagoniste, de la LHRH de manière à désensibiliser l'hypophyse à l'action de la LHRH endogène, pour obtenir un anoestrus profond.15 En variante, la désensibilisation de l'hypophyse à la LHRH endogène peut aussi être réalisée par immunoneutralisation anti-LHRH par voie active ou passive. Enfin, l'invention a encore pour objet un kit de superovulation pour les femelles bovines, comprenant, séparément, une formulation à libération continue comprenant comme principe actif un analogue de la LHRH, une formulation comprenant comme principe actif de l'hormone FSH et une formulation comprenant un principe actif choisi dans le groupe consistant en hormone LH et hormone hCG. L'invention va être maintenant décrite plus en détail dans ce qui suit, avec la description des modes préférés de préparation des formulations d'analogue de la LHRH, la présentation d'essais de mise en anoestrus profond et la description des étapes subséquentes de la méthode de superovulation. Les figures annexées montrent - à la figure 1, un graphe présentant, pour la vache n0 1, le profil de la concentration plasmatique de progestérone, déterminée par dosage radioimmunologique, après injection au jour 0 d'une formulation PLG 50:50 / D.Trp6-LHRH (150 mg d'analogue agoniste) ayant un profil de libération de l'ordre de 40 jours, le plateau qui correspond à l'absence de détection de progestérone plasmatique représentant la phase d'anoestrus profond - ce graphe correspond au tableau 1; - à la figure 2, un graphe analogue à celui de la figure 1, pour la vache n 4, traitée dans les mêmes conditions que la vache n 1; - à la figure 3, un graphe analogue aux précédents, pour une formulation PLG 65:35 / D.Trp6- LHRH (300 mg d'analogue agoniste) ayant un profil de libération de l'ordre de 85 à 100 jours - vache n 5 - ce graphe correspond au tableau 2; - à la figure 4, un graphe analogue à celui de la figure 3, pour la vache n 6, traitée dans les mêmes conditions que la vache n 5; et o10 - à la figure 5, un graphe présentant le profil de la concentration plasmatique de progestérone d'une vache témoin n'ayant pas reçu de formulation d'analogue de la LHRH - les cycles se déroulent normalement. A - PREPARATION DES FORMULATIONS D'ANALOGUES DE LA LHRH Plusieurs méthodes de formulation des analogues de LHRH permettent d'obtenir une libération prolongée et continue du principe actif à partir de la forme galénique. Les méthodes citées ci-dessous permettent de moduler la durée de libération de l'analogue en fonction de certains paramètres de formulation. Ces méthodes font appel à deux catégories d'excipients: - des polymères dégradables représentés en particulier par la famille des poly(lactide-glycolide) et poly(lactique-glycolique); - des corps gras représentés en particulier par des acides gras et des esters d'acide gras ou de polyéthylène-glycol. La première méthode de formulation fait appel à des polymères dégradables de la famille des poly(lactide-glycolide) et poly(lactique- glycolique) (PLG). Ces polymères présentent une biocompatibilité très satisfaisante et ont la capacité de s'hydrolyser pour générer descomposants naturels, l'acide lactique et l'acide glycolique. La vitesse d'hydrolyse de ces polymères est modulable en fonction essentiellement du ratio des comonomères lactide et glycolide, de la masse moléculaire des polymères, et des isomères lactide utilisés. Cette vitesse est maximale lorsque le ratio est égal à 50/50, puis elle diminue lorsque la proportion de lactide augmente. Cette propriété est utilisée pour moduler la durée de libération des analogues LHRH à partir d'une forme galénique réalisée avec ces polymères.Les analogues de LHRH et plus particulièrement les agonistes de LHRH sont des peptides insolubles dans une matrice de PLG. Ces composés se présentent généralement sous forme d'une microdispersion dans l'excipient PLG. La forme galénique peut être variable: films, implants ou microsphères. Cette dernière forme galénique présente l'avantage d'être5 aisément injectable, après remise en suspension dans un liquide adéquat. Les méthodes de microencapsulation permettant d'obtenir cette forme galénique sont variables, essentiellement: la microencapsulation par coacervation, par évaporation de solvant, et la méthode d'atomisation ou "spray-drying". La méthode de microencapsulation par évaporation de o solvant est décrite dans l'exemple n 1. Les mécanismes de libération de l'agoniste LHRH à partir de la forme galénique sont variés: - Libération par dissolution rapide de l'agoniste situé en périphérie de la forme galénique, et exposé directement aux fluides biologiques. - Libération par percolation: ce mode de diffusion d'un principe actif dispersé dans une matrice polymère hydrophobe est lié à l'interconnexion des particules de principe actif entre elles, ce réseau interconnecté étant lui- même en contact avec le milieu extérieur. La libération du principe actif est liée à la pénétration progressive des fluides biologiques dans le réseau,20 permettant la dissolution du principe actif et sa diffusion dans le milieu extérieur. Ce mode de libération est modulé quantitativement et dans le temps par la proportion de principe actif dispersé dans la matrice polymère, la solubilité du principe actif, sa granulométrie. - Libération liée à l'hydrolyse du polymère: l'hydrolyse du polymère, par exemple un PLG, scinde les chaînes polymériques en fragments plus courts hydrosolubles à terme. Ce phénomène induit une augmentation de l'hydrophilie et de la porosité de la forme galénique, permettant la pénétration des fluides biologiques et l'extraction du principe actif. Ce mécanisme de libération est modulé dans le temps par la vitesse d'hydrolyse30 du polymère et par la masse moléculaire initiale du polymère. Ces trois mécanismes interviennent lors de la libération d'agonistes LHRH à partir de microsphères de PLG, et sont à l'origine de cinétiques de libération triphasiques: lère phase: libération instantanée ou "burst effect", se produisant peu après l'administration du produit. 2ème phase: phase de diffusion liée à la percolation, dont le débit de libération est contrôlé par la proportion d'agonistes de LHRH utilisée dans la formulation de microsphères. La durée de cette phase est contrôlée par le ratio de co-monomères lactide/glycolide, et par la masse moléculaire initiale du polymère. Cette phase est d'autant phis courte que le ratio 5 lactide/glycolide est proche de 50/50 et la masse moléculaire initiale du polymère est faible. 3ème phase: phase de libération liée à l'hydrolyse du polymère dont la durée est contrôlée essentiellement par le ratio lactide/glycolide. Cette durée peut varier de un mois environ à plus d'une année. Le débit de libération est10 généralement supérieur à celui de la phase précédente. Le profil triphasique de libération peut être modifié avec les paramètres de formulation: - La réduction de la durée, voire la disparition de la 2ème phase est observée avec des polymères de forte vitesse de dégradation et de faible masse moléculaire initiale, par exemple des polymères PLG50:50 de faible masse moléculaire, ceci permettant d'obtenir des débits de libération relativement constants. - L'augmentation du débit de libération pendant la 2ème phase est obtenue en augmentant la proportion de principe actif dans la formulation, la cinétique de libération tendant vers un profil régulièrement décroissant avec le temps. Des profils de libération non triphasiques, mais relativement constants ou régulièrement décroissants sont également obtenus avec des polymères de faible masse moléculaire, par exemple des poly (D.L. lactide) de masse moléculaire de l'ordre de 2000. Ces polymères peuvent être utilisés purs dans la formulation, ou préalablement mélangés avec des polymères de plus haute masse moléculaire puis formulés. La combinaison des paramètres de formulation permet d'obtenir des durées et des profils de libération contrôlés. La durée totale de libération 3 d'un agoniste LHRH peut être ajustée pour atteindre des périodes variant de quelques jours à plus d'un an. Une deuxième méthode de formulation fait appel à des corps gras, par exemple des acides gras ou des esters d'acides gras, formulés en implants ou microsphères avec le principe actif. Le mécanisme de libération d'un agoniste LHRH à partir de ces formulations est lié: - à la diffusion du principe actif dans l'excipient lipidique. La durée de libération d'un agoniste LHRH peut être ajustée: par la proportion d'agoniste incorporée dans la formulation: la durée de libération décroit avec l'augmentation de la proportion d'agoniste incorporée. 5. par la valeur HLB (Balance Hydrophile Lipophile) de l'excipient lipidique: l'augmentation par exemple de 1 à 5 de la valeur HLB de l'excipient lipidique permet de réduire de 5 mois à une semaine la durée totale de libération d'un agoniste LHRH incorporé dans des implants lipidiques. 1 - à l'érosion de l'excipient lipidique: ce phénomène est d'autant plus rapide que la température de fusion de l'excipient lipidique utilisé est faible. La durée de libération de l'agoniste LHRH peut être contrôlée en modifiant ce paramètre. B - ESSAIS DE MISE EN ANOESTRUS PROFOND La mesure des concentrations plasmatiques de la D.Trp6-LHRH libérée et de la progestérone est effectuée par méthode radioimmunologique. Le dosage radioimmunologique de la D.Trp6-LHRH plasmatique repose sur le principe d'une réaction d'inhibition compétitive entre la D.Trp6-LHRH marquée à l'125I en quantité constante et la D.Trp6-LHRH étalon ou celle contenue dans les échantillons de plasma, vis-à-vis des sites de liaison d'un sérum anti-D.Trp6-LHRH. La quantité de D.Trp6-LHRH est exprimée en ng/ml de plasma. Le dosage radioimmunologique de la progestérone plasmatique est effectué par méthode directe à l'aide de la progestérone marquée par 1'125I. Elle repose sur une réaction d'inhibition compétitive entre la progestérone marquée en quantité constante et la progestérone étalon ou celle contenue dans les échantillons de plasma. La quantité de progestérone est exprimée en ng/ml de plasma. ler exemple (3 tableaux (1 à 3), 2 figures (1 et 2)) Le traitement de désensibilisation a été appliqué sur 4 vaches à l'aide de l'analogue agoniste de la LHRH, la D.Trp6-LHRH. Celle-ci fut incorporée dans des microsphères de copolymères lactique-glycolique qui assurent une concentration plasmatique décelable chez la femelle bovine pendant 40 jours pour une première formulation et 85-100 jours pour la seconde. Préparation et administration de microsphères de PLG incorporant l'analogue D.Trp6-LHRH: a) Formulation PL5O.50 Cette formulation permet de libérer l'agoniste D.Trp6-LHRH pendant environ 40 jours à des niveaux détectables chez la vache. 45 mg d'un lyophilisat de D.Trp6-LHRH (trifluoroacétate) sont pesés puis dispersés dans une solution composée de 1455 mg de poly (D.L. lactide-glycolide) 50:50 de viscosité inhérente 0,4 dl/g, dans 5,4 ml de dichlorométhane sous agitation. Ce solvant permet la dispersion fine du lyophilisat et permet la 0lo solubilisation du polymère. Lorsque la répartition du peptide est homogène, la dispersion est injectée à travers un tube de 2 mm de diamètre dans 450 ml d'une solution d'alcool polyvinylique à 1% dans de l'eau déminéralisée à C, sous l'agitation d'une hélice tournant à 700 tours par minute. Deux gouttes d'une émulsion silicone antimousse sont réparties, puis le dichlorométhane est évaporé par diffusion d'air comprimé dans le mélange. Après évaporation, les microsphères durcies sont récoltées par filtration sous vide, lavées à l'eau déminéralisée puis sont séchées sur un papier filtre. Un lavage complémentaire avec 40 ml de trichloro 1,1,2 trifluoro 1,2,2 éthane permet d'éliminer le silicone antimousse résiduel. Les microsphères sont séchées, puis stockées à + 4 C. Cette opération est répétée jusqu'à l'obtention d'une quantité suffisante de microsphères incorporant D.Trp6-LHRH. La quantité de D. Trp6-LHRH présente dans les microsphères est déterminée par une méthode d'extraction puis dosage en chromatographie liquide haute performance. Administration aux vaches: La quantité de microsphères équivalent à 150 mg de D.Trp6-LHRH incorporée est répartie dans 2 seringues. Les microsphères de chaque seringue sont mises en suspension dans 20 ml d'un liquide visqueux composé de 2% de carboxyméthyl-cellulose et de 0,2% de Tween 80 en solution dans de l'eau physiologique, puis sont injectées par voie intramusculaire profonde dans l'encolure. b) Formulation PLG6535 Cette formulation permet de libérer l'agoniste pendant environ 85- jours. Le même mode de préparation est adopté avec un polymère poly(D.L. lactide-glycolide) 65:35 de viscosité inhérente 0,34 dl/g: 90 mg d'un lyophilisat D.Trp6-LHRH sont pesés puis dispersés dans une solution composée de 1410 mg de poly(D.L. lactide-glycolide) 63:35 dans 3 ml de dichlorométhane, sous agitation. Les étapes ultérieures sont identiques à la description précédente. 5 Administration: la quantité de microsphères équivalent à 300 mg de D.Trp6-LHRH incorporée est répartie dans 2 seringues, puis administrée dans les mêmes conditions que précédemment. L'administration des microsphères à base de copolymères lactique- glycolique a été effectuée en début de la phase lutéale. Elle a entraîné sur tous les animaux un allongement de la phase lutéale, par comparaison avec la durée de la phase lutéale du cycle précédent. La disparition persistante de la sécrétion de progestérone a défini l'anoestrus en l'absence d'autres examens (échographie, dosages de LH et FSH). La fin de la période d'anoestrus est moins précise et doit intervenir 15 quelques jours avant la réapparition de la progestérone. L'examen échographique fut limité à 2 observations à une semaine d'intervalle à des moments précis du traitement, d'une part vers la fin probable de son efficacité, un mois après la disparition de trace décelable de D.Trp6-LHRH dans le plasma, d'autre part pendant la phase stationnaire20 du traitement, marquée par une concentration stable et caractéristique de l'agoniste de LHRH. Cet anoestrus a pu être classé en deux états bien différents dans l'un et l'autre moment, un anoestrus profond pendant la phase correspondant à la mise en évidence dans le plasma de l'agoniste, un anoestrus léger un mois après la disparition plasmatique de D.Trp6-LHRH.25 L'état d'anoestrus profond, pendant lequel les follicules ne dépassent pas le diamètre de 3-4 mm, correspond à l'état nécessaire à l'application du traitement de superovulation. Il permet le recrutement par l'apport de la FSH (vaches 5 et 6). Il est suivi d'un état d'anoestrus moins profond pendant lequel le recrutement et la sélection des follicules sont observés3o spontanément (vaches 1 et 4). Cet anoestrus léger est comparable à l'anoestrus physiologique observé après la mise-bas ou pendant la gestation il précède la réapparition de l'oestrus dans cette expérimentation. Le tableau 1 et les figures 1 et 2 concernent les vaches 1 et 4 ayant reçu un traitement de désensibilisation de courte durée (40 jours décelables). La fin de la phase lutéale commence 21 jours après l'administration en début de phase lutéale pour les vaches 1 et 4. L'examen échographique fut effectué 1 mois après la disparition de la D.Trp6-LHRH plasmatique mesurable, soit respectivement 65 et 72 jours pour la vache 1 et 58 et 65 jours pour la vache 2 après l'administration des microsphères, il a conduit aux observations suivantes (nombre de follicules F et diamètre en mm) qui 5 traduisent un anoestrus léger a) Vache n 1 (1393) ler examen 2 examen +65j +72j ovaire droit 1 F 12 mm 1 F 12-13 mmn 5F 4mm IF 5mm ovaire gauche 2 F 6mm 1 F 20 mm 4F 4mm b) Vache n 4 (1866) 1er examen 2e examen +58j +65j ovaire droit 2F 4mm 1 F 12 mm 4F 3mm ovaire gauche 0 F (non décelé) 5 F 4 mmn Le tableau 2 et les figures 3 et 4 concernent les vaches n 5 et 6 ayant reçu un traitement de désensibilisation de longue durée (D.Trp6-LHRH décelable dans le plasma pendant 86 et 103 jours). La fin de la phase lutéale commence, pour la vache n 5, 15 jours, et pour la vache n 6, 25 jours, après l'administration en début de phase lutéale. L'examen échographique fut effectué pendant la phase de libération stable et caractéristique des microsphères de D.Trp6-LHRH respectivement et 72 jours pour la vache n 6 et 58 et 65 jours pour la vache n 5 après l'administration des microsphères. Il correspond à la phase d'anoestrus profond au cours duquel aucun follicule supérieur à 5 mm n'est observé. a) Vache n 6 ler examen 2e examen +65j +72j ovaire droit 3F 3mm 4F 3mm ovaire gauche 2F 3mm 3F 3mm b) Vache n 5 ler examen 2e examen ovairedroit 1F 5 mm 2F 4mm 1F 3mm lO ovaire gauche 3F 3mm 5 F 3 mm Le tableau 3 et la figure 5 concernent les mesures de progestérone faites sur une vache témoin (1398). Le retour de l'oestrus a été observé sur les 4 vaches. Après le début du traitement de courte durée15. 100 jours chez la vache 1 (1393) jours chez la vache 4 (1866) 2e exemple - 2 tableaux (n 4 et 5) Le traitement de désensibilisation a été appliqué sur 6 vaches à l'aide de l'analogue agoniste de la LHRH, la D.Trp6-LHRH. Il est appliqué en début de la phase lutéale à l'aide de la formulation D.Trp6- LHRH/PLG 50-50 à la dose de 50 mg ou de 16,7 mg par vache. a) Dose de 50 mg- tableau 4 vache 1 - 1393 Suppression de la phase lutéale 14 jours après le début du traitement de désensibilisation. Retour de la sécrétion de progestérone 114 jours après le début du traitement..vache 7 - 1901 Suppression de la phase lutéale 17 jours après le début du traitement de désensibilisation. 2o vache 10- 1923 Suppression de la phase lutéale 21 jours après le début du traitement de désensibilisation. b) Dose de 16,7 mg- tableau 5 - vache 3 - 1398 Dose inefficace - vache 4 - 1866 Dose inefficace - vache 5 - 1867 lO Dose partiellement efficace 3e exemple: Formulation de Des-Gly-D.Trp6-LHRH éthylamide/PLG50-50 Cet agoniste est incorporé dans le poly(D.L.lactide-glycolide) 50-50 dans les mêmes conditions que dans le ler exemple. - une quantité de microsphères correspondant à 50 mg d'agoniste est injectée dans 15 ml de milieu de suspension par voie intramusculaire profonde. - une quantité de microsphères correspondant à 16,7 mg d'agoniste est injectée dans 5 ml de milieu de suspension par voie intramusculaire profonde. C - ETAPES ULTERIEURES A LA MISE EN ANOESTRUS PROFOND lère étape: Recrutement et développement des follicules. Cette étape peut être déclenchée à tout moment de la phase d'anoestrus profond. Il suffit de respecter - la période de mise en place de l'anoestrus profond après injection de la formulation d'analogue de la LHRH, celle- ci variant selon le type d'analogue, agoniste (plusieurs jours selon la formulation retard utilisée) ou antagoniste (immédiate: absence de phase de latence); - le temps nécessaire pour aboutir aux embryons et à leur récolte, étant donné qu'il est préférable que l'ensemble des opérations, y compris la récolte des embryons, soit réalisée à l'intérieur de la phase d'anoestrus profond. A partir du début du traitement par la FSH, il faut compter de 18 à 21 jours environ jusqu'à la récolte des embryons. Pour les formulations utilisées au cours des essais décrits plus haut, la période de mise en place de l'anoestrus profond est en moyenne de - PLG 50:50: moins de 20 jours (environ 18 jours) - PLG 65:35: moins de 25 jours (environ 21 jours). Cette période est facile à déterminer pour chaque formulation au cours d'un essai de mise en anoestrus et du suivi de l'évolution de la concentration en progestérone (et examen échographique et éventuellement mesure de la FSH pour confirmer l'état d'anoestrus profond). O Au jour choisi, on administre à l'animal de l'hormone FSH en présence éventuellement de l'hormone LH. Formulation: - hormone FSH d'extraction de préférence d'origine porcine, ovine (ou encore bovine ou équine), ou hormone de recombinaison; - posologie journalière selon l'origine de l'hormone: de 200 à 300 ug/j. - autres constituants: éventuellement LH à un maximum de 40 à 60 ug/j. Pour les essais, on a choisi d'administrer 125 ug d'hormone FSH d'origine porcine, à deux reprises par voie intramusculaire, pendant de 7 à jours. On peut aussi choisir d'utiliser une formulation à libération continue du type décrit plus haut, permettant de libérer la dose journalière requise sur la période totale de 7 à 10 jours. L'apport de FSH déclenche le recrutement et la croissance des follicules qui se trouvaient au stade de prérecrutement dans la phase d'anoestrus profond (follicules antraux). Après de 7 à 10 jours de traitement par la FSH, on aboutit à des follicules ovulatoires. 2ème étape: Déclenchement de l'ovulation. Le dernier jour du traitement à la FSH, on administre en sus à l'animal de l'hormone LH ou de l'hormone hCG. Formulation: - hormone d'extraction d'origine porcine, ovine, bovine ou équine, ou hormone de recombinaison; - dose: de 2 à 4 mg/j pour LH ou de 3 000 à 6 000 UI/j pour la hCG. Pour les essais, on a choisit d'administrer 3 mg de LH d'origine porcine par jour (en deux administrations par voie intramusculaire), pendant de 2 à 3 jours. On peut avantageusement utiliser une formulation à libération continue. Ce traitement déclenche l'ovulation. On applique ensuite les étapes classiques des méthodes de superovulation, jusqu'à la récolte des embryons, à savoir: - fertilisation des ovocytes par insémination artificielle, - récolte des embryons, et - transfert des embryons. %-I N.IIIIIIIIIIII1'0;0?o?000o0000000000 OC tP 'o roio.: Eo dI PDiorooooodoodooooo o wEi _ zxE Éo oo _N 0 0 _ n jO ç_ sN O_ OO OO OO:OO OO OOOOO OO OO OO OO OO OO(OO ONoN O4 On O0 00O c sG mo E 'C' *C oCO N, PCI èl, 'Pt -N' PoNN0 Nsb0 0N 0O _v-4_.:,." Fie e &c00 w!!!. O tt O0C o In.'rW 0 0 0 0 0 0 0 -tC * *0 0) _tD m h N) _C mN 1 C i O N) 1 Pv0 _t n m #v 0 Fpg} n&e, $ 0es 28 68 88le? 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Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce l'on administre l'analogue de la LHRH au début de la phase lutéale. 3 - Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la mise en anoestrus profond est réalisée par l'administration d'un analogue agoniste de LHRH à dose supraphysiologique. 4 - Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la mise en anoestrus profond est réalisée par l'administration d'un analogue antagoniste de LHRH. - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'on administre un analogue de LHRH présenté au sein d'une formulation permettant sa libération continue. 6 - Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que la formulation comprend des polymères dégradables. 7 - Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que les polymères sont des poly (lactide-glycolide) ou des poly (lactiqueglycolique). 8 - Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que la formulation comprend des corps gras. 9 - Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que les corps gras sont des acides gras ou des esters d'acide gras ou de polyéthylène- glycol. - Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisée en ce qu'on administre une formulation sous forme de films, implants ou microsphères. 11 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisée en ce que l'on administre à l'animal une dose d'analogue agoniste comprise entre 40 et 150 mg pour une libération sur 40 jours environ et entre 100 et 300 mg pour une libération sur de 85 à 100 jours5 environ. 12 - Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que, comme formulation, on utilise des microsphères de poly (lactide-glycolide) ou de poly (lactique-glycolique) de ratio allant de 50:50 à 65:35. 13 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que l'on administre un analogue agoniste de la LHRH choisi parmi le groupe consistant en D.Trp6-LHRH et Des-Gly-D.Trp6- LHRH éthylamide. 14 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que, pour induire le recrutement et le développement des follicules ovulatoires, on administre de l'hormone FSH pendant de 7 à 10 jours. - Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que l'hormone FSH est administrée au sein d'une formulation permettant sa libération continue sur la période de 7 à 10 jours.20 16 - Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que l'hormone FSH est administrée par voie parentérale à raison de deux administrations journalières. 17 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisée en ce que l'on associe de l'hormone LH à l'hormone FSH. 18 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisée en ce que, pour déclencher l'ovulation, on administre de l'hormone LH ou hCG le dernier jour du traitement à la FSH. 19 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que, pour déclencher l'ovulation, on administre de l'hormone LH ou hCG pendant de 2 à 3 jours environ. - Méthode de mise en anoestrus profond, dans laquelle on administre à l'animal un analogue de la LHRH, choisi dans le groupe consistant dans les agonistes et les antagonistes de la LHRH, en quantité suffisante pour désensibiliser l'hypophyse à l'action de l'hormone LHRH35 endogène. 21 - Méthode selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'on administre à l'animal, au début de sa phase lutéale, un analogue de la LHRH présenté dans une formulation permettant sa libération continue sur une durée appropriée à l'obtention de la durée choisie pour l'anoestrus5 profond. 22 - Méthode selon la revendication 21, caractérisée en ce que la formulation est à base de polymères choisis parmi le groupe consistant en poly (lactide-glycolide) et poly (lactique-glycolique). 23 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisée en ce que l'analogue de la LHRH est choisi dans le groupe consistant en D.Trp6-LHRH et Des-Gly-D.Trp6-LHRH éthylamide. 24 - Kit de superovulation pour les femelles bovines, comprenant, séparément, une formulation à libération continue comprenant comme principe actif un analogue de la LHRH, une formulation comprenant15 comme principe actif de l'hormone FSH et une formulation comprenant un principe actif choisi dans le groupe consistant en hormone LH et hormone hCG.