FR 2715937 A1 19950811 FR 9401532 A 19940204 I Virus MSRV1 et MSRV2 associés ensemble à la Sclérose en Plaques et leurs constituants nucléiques La Sclérose en Plaques (SEP) est une maladie démyélinisante du système nerveux central (SNC) dont la cause reste encore inconnue. De nombreux travaux ont étayé l'hypothèse d'une étiologie virale de la maladie, mais aucun des virus connus testés ne s'est avèré être l'agent causal recherché: une revue des virus recherchés depuis des années dans la SEP a été faite par E. Norrby (Prog. Med. Virol. , 1978; 24, 1-39) et R.T. Johnson(dans "Handbook of clinical neurology, 47 Demyelinating diseases". Vinken P. et Bruyn G.W., eds. Amsterdam, Elsevier science Publishing, 1985, 319-336). Parallèlement, la possibilité d'un facteur exogène et/ou infectieux est suggérée par l'existence d'épidémies localisées ou "clusters" de SEP comme ce qui a été observé dans les Iles Feroes entre 1943 et 1960 (Cook 1980), en Sardaigne (Rosati, 1988), en Norvège (Riisse, 1991), ainsi que par les études sur les migrants (Elian, 1990). Parmi tous les facteurs exogènes suggérés, les virus ont été étudiés le plus souvent et une étiologie virale est classiquement évoquée. L'observation, dans la SEP, de phénomènes assimilables à une réaction d'auto-immunité a conduit à une hypothèse étiologique auto-immune "essentielle" (voir: Lisak R.P., Zweiman B. New Engl. J. Med. 1977; 297, 850- 853, et, Lassmann H. et Wisniewski H.M. Arch. Neurol. 1979; 36, 490-497). Cependant, cette auto-immunité dirigée contre certains composants du SNC s'est révèlée peu spécifique de la SEP et fréquente dans les inflammations du SNC, associées ou non à une infection, ainsi que cela a été montré par Hirayama M. et coll. (Neurology 1986; 36, 276-8), Kenneth G. Warren et coll. (Annals of Neurology 1986; 20, 20-25), Suzumura A. et coll. (Journal of Neuroimmunology 1986; 11, 137-47), et, Tourtelotte W. et coll. (Journal of Neurochemistry 1986; 46, 1086-93). De plus, comme l'a fait remarquer E.J. Field (The Lancet 1989; I, 1272.) aucune des thérapeutiques immuno- suppressives n'a permis d'obtenir des résultats décisifs contre la SEP. Il semble maintenant probable que les manifestations "auto-immunes" sont induites par un mecanisme d'origine virale: co-sensibilisation à des determinants viraux associés à des molécules d'origine cellulaire, phénomènes de mimétisme moléculaire -comme cela a été décrit par Fujinami R.S et Oldstone M.B.A (dans "Molecular mimicry: Cross-reactivity between microbes and host proteins as a cause of autoimmunity". Oldstone M.B.A., ed. Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 145, Berlin, Springer-Verlag, 1989)- ou, selon P. Rudge (Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry, 1991 54, 853-855), par expression de superantigènes rétroviraux. Des travaux ont étayé une hypothèse selon laquelle un Rétrovirus serait à l'origine de la maladie: la découverte récente par A. Gessain et coll. (J. Infect. Disease 1988; 1226-1234), de syndromes neurologiques associés au virus HTLV-I, connu à l'origine comme agent de leucémies T de l'adulte, a conduit de nombreux auteurs, tels que H. Koprowski et coll. (Nature 1985; 318, 154), M.Ohta et coll. (J. Imunol. 1986; 137, 3440), E. P. Reddy et coll. (Science 1989; 243, 529), S.J. Greenberg et coll. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 86, 2878), J.H. Richardson et coll. (Science 1989; 246, 821), S.L. Hauser et coll. (Nature 1986; 322, 176) et A. Karpas et coll. (Nature 1986; 322, 177), à rechercher une implication de ce rétrovirus humain dans la SEP, cependant sans succès ou avec des résultats évoquant des réactions croisées. Par ailleurs, il existe un modèle animal très proche de la SEP, induit par un rétrovirus: le virus MAEDI-VISNA du mouton. Il est connu que l'infection naturelle par ce virus peut provoquer deux types de maladies chez cet animal: le Maedi, une pneumonie interstitielle lymphocytaire qui peut survenir lors de la primo-infection par ce rétrovirus et une pathologie neurologique démyélinisante tardive suivant généralement une phase de latence prolongée, le Visna. La physiopathologie du Visna naturel concorde avec la plupart des données cliniques et biologiques de la SEP, comme le rapportent Johnson R.T. (Rev. Infect. Dis. 1985; 7, 66- 67), Narayan O. et Cork L.C. (Rev. Infect. Dis. 1985; 7, 89-98), et Nathanson N. et coll. (Rev. Infect. Dis. 1985; 7, 75-82). L'infection expérimentale des moutons par inoculation intra- ventriculaire de souches neurovirulentes du virus VISNA a permis d'établir la responsabilité de ce virus dans la génèse de cette affection démyélinisante du mouton. Comme l'expliquent Nathanson N. et coll. (Rev. Infect. Dis. 1985; 7, 75-82), Hoffman P.M. et Panitch H.S. (dans, "Handbook of clinical neurology, 12: Viral diseases" R.R. Mc Kendall, ed. Elsevier science Publishing, Amsterdam, 1989, p 453-466), et A. Haase (Nature 1986; 322, 130-136), elle diffère de l'infection naturelle par ses conséquences neuropathologiques exacerbées, mais reste proche de la SEP. Il est de plus notable que, dans l'ensemble des travaux effectués sur ce sujet par les auteurs précités, notamment, le virus Visna est régulièrement retrouvé dans les cellules de plexus choroïdes du cerveau qui constituent un site de latence et de réplication occasionnelle du provirus Visna; la localisation de ces cellules à l'interface sang/liquide céphalo-rachidien (LCR) explique certainement ce phénomène. De plus, le modèle du Visna apporte une donnée supplémentaire pour l'approche rétrovirologique de ce type de maladie. En effet, il s'avère que, dans le cadre de l'infection naturelle de ces moutons, des coïncidences épidémiologiques et biologiques ont été observées entre d'une part les pathologies du Maedi-Visna et d'autre part, l'adénomatose ovine pulmonaire ou Jaagsiekte, pathologie tumorale provoquée par un autre rétrovirus, le JSRV (De Martini J.C. et coll. J.N.C.I. 1987; 79, 167-177 / Rosadio R.H. et coll. Vet. Pathol. 1988; 25, 58-66 / Dawson M. et coll. Br. Vet. J. 1990; 146, 531-537). Le JSRV est un rétrovirus endogène, voire la souche exogène associée à une famille d'éléments endogènes, dont les propriétés infectieuses et oncogènes ont été mises en évidence (York D. F. et coll. J. Virol. 1992; 66, 4930-4939). Or, il est notable que, dans des isolats naturels de moutons affectés de maladies attribuées soit au rétrovirus Maedi-Visna, soit au rétrovirus Jaagsiekte, on retrouve généralement les deux rétrovirus (Dawson M. et coll. Br. Vet. J. 1990; 146, 531-537 / York D.F. et coll. J. Virol. 1991; 65, 5061-5067). Cette coexpression et/ou coinfection semble indiquer un rôle synergique de ces deux rétrovirus dans le cadre du Maedi (De Martini J.C. et coll. J.N.C.I. 1987; 79, 167-177). Ainsi, dans certaines techniques de purification d'isolats naturels sur gradient de saccharose on a pu mettre en évidence l'existence de deux pics de sédimentation séparés correspondant respectivement au JSRV et au rétrovirus Maedi-Visna (York D.F. et coil. J. Virol. 1991; 65, 5061-5067). Ces données permettent d'entrevoir la complexité d'une approche analytique visant à caractériser un agent rétroviral associé à une maladie donnée, à partir d'isolats naturels dans lesquels peuvent coexister plusieurs agents pathogènes. Récemment, un rétrovirus, différent des rétrovirus humains connus a été isolé chez des patients atteints de SEP par H. Perron et coll. (Res. Virol. 1989; 140, 551- 561/ dans: 'Current concepts in multiple sclerosis" Wiethôlter et coll., eds. Amsterdam, Elsevier, 1991, p. 111-116 / The Lancet 1991; 337, 862-863). Les auteurs ont aussi pu montrer que ce rétrovirus pouvait être transmis in vitro, que des patients atteints de SEP produisaient des anticorps susceptibles de reconnaitre des protéines associées à l'infection des cellules leptoméningées par ce rétrovirus et que l'expression de ce dernier pouvait être fortement stimulée par les gènes immédiats-précoces de certains herpesvirus (Perron et coll. Herpes simplex virus ICPO and ICP4 immediate-early proteins strongly enhance expression of a retrovirus harboured by a leptomeningeal cell-line from multiple sclerosis.1993. J. Gen. Virol. 74; 65-72). Tous ces résultats plaident en faveur du rôle dans la SEP d' au moins un rétrovirus inconnu ou d'un virus ayant une activité transcriptase inverse détectable selon la méthode publiée par H. Perron et coll. (Res. Virol. 1989; 140, 551-561) et qualifiée d'activité "RT de type LMI7". Récemment, les travaux de la demanderesse ont permis d'obtenir deux lignées continues de cellules infectées par des isolats naturels provenant de deux patients différents atteints de SEP, par un procédé de culture tel que décrit dans la demande de brevet n WO 93/20188. Ces deux lignées dérivées de cellules de plexus- choroïdes humains, dénommées LM7PC et PLI-2 ont été déposées à l'E.C.A.C. C. respectivement le 22 juillet 1992 et le 8 janvier 1993, sous les numéros 92072201 et 93010817, conformément aux dispositions du traité de Budapest. Par ailleurs, les isolats viraux possédant une activité RT de type LM7 ont également été déposés à 1'E.C.A.C.C. sous la dénomination globale de "souches". La "souche" ou isolat hébergé par la lignée PLI-2, dénommée POL-2, a été déposée le 22 juillet 1992 sous le n V92072202.La "souche" ou isolat hébergé par la lignée LM7PC, dénommée MS7PG, et a été déposée le 8 janvier 1993 sous le n V93010816. A partir des cultures et des isolats précités, caractérisés par des critères biologiques et morphologiques, on s'est ensuite attaché à caractériser le matériel nucléique associé aux particules virales produites dans ces cultures. Ainsi, les objets de l'invention sont les suivants: - une association de deux virus associés à la sclérose en plaques, à savoir, un premier virus humain, possédant une activité transcriptase inverse, et associé à une famille d'éléments rétroviraux endogènes, ou un variant du premier virus comprenant au moins un antigène reconnu par au moins un anticorps dirigé contre au moins un antigène correspondant dudit premier virus, et un second virus, possédant une activité transcriptase inverse, ou un variant dudit second virus, ces deux virus étant issus ensemble d'une même souche virale choisie parmi les souches dénommées respectivement POL-2, déposée le 22.07.1992 auprès de l'ECACC sous le numéro d'accès V92072202 et MS7PG déposée le 08.01.93 auprès de l'ECACC sous le numéro d'accès V93010816, et parmi les souches variantes consistant en des virus comprenant au moins un antigène qui est reconnu par au moins un anticorps dirigé contre au moins un antigène correspondant de l'un ou l'autre des virus des souches virales POL-2 et MS7PG précitées; - une association de deux virus associés à la sclérose en plaques, à savoir, un premier virus humain possédant une activité transcriptase inverse, et associé à une famille d'éléments rétroviraux endogènes, ou un variant du premier virus comprenant au moins un antigène reconnu par au moins un anticorps dirigé contre au moins un antigène correspondant dudit premier virus, et un second virus possédant une activité transcriptase inverse, ou un variant du second virus, ces deux virus étant produit par une même lignée cellulaire choisie parmi les souches dénommées respectivement PLI-2 déposée le 22.07.1992 auprès de l'ECACC sous le numéro d'accès 92072201 et LM7PC déposée le 08.01.93 auprès de l'ECACC sous le numéro d'accès 93010817, et par toutes cultures cellulaires infectées susceptibles de produire un virus comprenant au moins un antigène qui est reconnu par au moins un anticorps dirigé contre au moins un antigène correspondant de l'un ou l'autre des virus produits par les lignées PLI-2 et LM7PC précitées; - une association de deux virus, à savoir un premier virus dont le génome comprend une séquence nucléotidique présentant au moins 50 % et préférentiellement au moins 70 % d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID N05 ou sa séquence complémentaire, SEQ ID N05 comprenant mises bout à bout, SEQ ID Nl01, SEQ ID N03 et SEQ ID N04; SEQ ID Nol, SEQ ID N03 et SEQ ID N04 étant décrites respectivement à la Fig 1, à la Fig 9 et à la Fig 20, ou un variant dudit premier virus dont le génome code pour une séquence peptidique présentant au moins 50 % et préférentiellement au moins 70 % d'homologie avec la séquence peptidique codée par la séquence nucléotidique SEQ ID Nol, décrite à la Fig 1, ou sa séquence complémentaire, et un second virus, dont le génome comprend une séquence nucléotidique présentant au moins 50 % et préférentiellement au moins % d'homologie avec une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N02, décrite à la Fig 19, ou sa séquence complémentaire, ou un variant dudit second virus dont le génome code pour une séquence peptidique présentant au moins 50 %, et préférentiellement au moins 70 % d'homologie avec la séquence peptidique codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N02 ou sa séquence complémentaire; - un procédé de détection d'un premier virus, et/ou d'un second virus, associés à la sclérose en plaques, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre au moins deux fragments, un premier fragment dont la séquence nucléotidique présente au moins 50 % et de préférence au moins 70 % d'homologie avec SEQ ID N05 ou sa séquence complémentaire, et/ou un second fragment dont la séquence nucléotidique présente au moins 50 % et de préférence au moins 70 % d'homologie avec SEQ ID N02 ou sa séquence complémentaire, chacun desdits fragments étant une sonde ou une amorce; une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend une association de l'invention et un premier fragment nucléotidique, et/ou un second fragment nucléotidique, tels que définis dans l'invention; - un procédé pour détecter et/ou identifier une association de virus associés à la sclérose en plaques, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on expose un ARN et/ou un ADN spécifique à chaque dit virus, et/ou leur ARN et/ou ADN complémentaire à une association d'un premier fragment nucléotidique et d'un second fragment nucléotidique, tels que définis dans l'invention; un procédé de détection d'un premier virus, et/ou d'un second virus, associés à la sclérose en plaques, caractérisé en qu'on met en oeuvre un premier peptide codé de manière partielle ou totale par le premier fragment nucléotidique défini dans l'invention, et/ou un second peptide codé de manière partielle ou totale par le deuxième fragment nucléotidique défini dans l'invention; - une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un premier peptide et/ou un second peptide, définis dans l'invention; - une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par préparation d'un premier ligand spécifique du premier peptide, et/ou un second ligand spécifique du second peptide, et par association du premier ligand et/ou du second ligand; - un fragment nucléotidique, caractérisé en ce que sa séquence nucléotidique présente au moins 50% , et de préférence au moins 70% d'homologie, avec une séquence choisie parmi SEQ ID N01, SEQ ID N03, SEQ ID N04, et la séquence SEQ ID N05 comprenant bout à bout SEQ ID N01, SEQ ID N03, SEQ ID N04. Avant de détailler l'invention, différents termes utilisés dans la description et les revendications sont à présent définis: - selon l'invention, un fragment nucléotidique ou un oligonucléotide est un enchaînement de monomères, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique dans des conditions prédéterminées, l'enchaînement pouvant contenir des monomeres de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique, - ainsi un monomère peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée; dans l'ARN le sucre est le ribose, dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine; ou un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs; à titre d'exemple, la modification peut intervenir au niveau des bases, générant des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5- désoxyuridine et toute autre base modifiée favorisant l'hybridation, au niveau du sucre à savoir le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991)), au niveau du groupement phosphate par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les esters de diphosphate, d'alkyl et arylphosphonate et de phosphorothioate, - par "séquence informationnelle", on entend toute suite ordonnée de monomères, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence constituent une information de même qualité que celle des acides nucléiques naturels, par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, ayant des séquences suffisamment complémentaires, s'apparient pour former un double brin, une sonde est un fragment nucléotidique comprenant de 10 à 100 monomères, avantageusement de 10 à monomères, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un fragment nucléotidique ayant une séquence nucléotidique comprise dans l'ARN du virus de l'invention, l'ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN et l'ADN dont ledit ARN est le produit de transcription; une sonde peut être utilisée à des fins de diagnostic telles que les sondes de capture et/ou de détection ou à des fins de thérapie, - la sonde de capture peut être immobilisée sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption passive, - la sonde de détection est marquee au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes notamment choisis parmi la péroxydase et la phosphatase alcaline et ceux susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et la biotine, - les sondes utilisées à des fins de diagnostic de l'invention peuvent être mises en oeuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues et notamment les techniques dites "DOT-BLOT" (MANIATIS et al, Molecular I1 Cloning, Cold Spring Harbor, 1982), "SOUTHERN BLOT" (SOUTHERN. E.M., J. Mol. Biol., 98, 503 (1975), "NORTHEN BLOT" qui est une technique identique à la technique "SOUTHERN BLOT" mais qui utilise de l'ARN comme cible, la technique SANDWICH (DUNN A.R., HASSEL J.A., Cell, 12, 23 (1977)); avantageusement, on utilise la technique SANDWICH dans la présente invention comprenant une sonde de capture spécifique et/ou une sonde de détection spécifique, étant entendu que la sonde de capture et la sonde de détection doivent présenter une séquence nucléotidique au moins partiellement différente, - une autre application de l'invention est une sonde de thérapie antisens, ladite sonde étant susceptible de s'hybrider in vivo sur l'ARN et/ou sur l'ADN pour bloquer les phénomènes de traduction et/ou de transcription, - une amorce est une sonde comprenant de 10 à 30 monomères, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), dans un procédé d'élongation, tel que le séquençage, dans une méthode de transcription inverse ou analogue, - l'homologie caractérise le degré de similitude de deux fragments nucléotidiques comparés. Etant donné qu'un virus possédant une activité enzymatique transcriptase inverse peut être génétiquement caractérisé aussi bien sous forme d'ARN que d'ADN, il sera fait mention aussi de l'ADN que de l'ARN viral pour caractériser les séquences relatives à un virus possédant une telle activité transcriptase inverse. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre faite en référence aux figures annexées dans lesquelles: la figure 1, représente la séquence en acides nucléiques du clone PSJl7, (SEQ ID N0l), - la figure 2, donne un alignement de la séquence nucléique PSJ17 avec celle d'un rétrovirus connu ERV9, - la figure 3, correspond à la séquence en acides aminés de la séquence PSJl7, - la figure 4, donne la comparaison des séquences protéiques de SPJl7 et ERV9 théorique (selon La Mantia et col. (1991) ), - la figure 5 représente les séquences des différents clones MSRV-lB obtenus après PCR dans la région "pol" définie par Shih et col., - la figure 6, représente l'arbre phylogénique des séquences MSRV-lB obtenues par PCR dans la région "pol" définie par Shih et col., - la figure 7, donne la définition d'une trame de lecture fonctionnelle pour chaque type de famille de type MSRV-lB/"PCR pol", - la figure 8, représente, selon Fig 8A, l'ali- gnement des séquences protéiques déduites des consensus A, B, C et D de type MSRV-lB avec des séquences d'origine rétrovirale, selon Fig 8B l'arbre phylogénique et selon Fig 8C, l'homologie par rapport à ERV9, - la figure 9 représente les séquences consensus de type MSRV-lB obtenues à partir d'ARN viral, issu des lignées LM7PC et PLI-2, amplifié par PCR dans la région "pol", ainsi qu'un consensus général comprenant les amorces d'amplification, et dénommé SEQ ID N03, - - la figure 10 est une représentation de l'activité transcriptase inverse (RT) en dpm (désintégration par minute) dans les fractions de saccharose prélevées sur un gradient de purification des virions produits par les lymphocytes B en culture d'un patient atteint de SEP. - la figure l1 donne dans les mêmes conditions qu'à la figure 10 le dosage de l'activité transcriptase inverse dans la culture d'une lignée B obtenue à partir d'un témoin exempt de sclérose en plaques, - la figure 12 représente, selon Fig 12A, les séquences consensus et majoritaires de type MSRV-1B obtenues à partir des lymphocytes B d'un patient atteint de SEP, avec * MAJ correspondant à la séquence majoritaire dans laquelle les bases conservées dans tous les cas sont représentées par ATGC, les bases majoritaires sont représentées par atgc et les bases délétées par rapport au consensus sont représentées par -, * VAR correspondant à la séquence majoritaire (variation) dans laquelle les bases conservées par rapport au consensus sont représentées par., les bases minoritaires sont représentées par atgc et les bases délétées par rapport au consensus sont représentées par - et * MIN correspondant aux séquences minoritaires (exception) dans lesquelles les bases conservées par rapport à la séquence majoritaire sont représentées par. et les bases délétées par rapport au consensus par -, ainsi que, selon Fig 12B, la traduction de la séquence majoritaire, avec an: acides nucléiques: - en gras, caractères de petites tailles: les sites de restriction des amorces - en gras, caractères majuscules, extrémité 3' des amorces - en souligné, la séquence nucléique majoritaire codante prot: séquence protéique: - en souligné: acides aminés codés par les amorces la figure 13 représente la séquence de type MSRV-2A obtenue à partir des cultures LM7 selon le protocole priginal de Shih et col., - la figure 14, représente l'alignement d'une séquence protéique MSRV-2A obtenue à partir de la culture LM7 avec des séquences protéiques rétrovirales connues; les acides aminés conservés entre le produit d'amplification (Trad pol SHIH) et certains rétrovirus sont soulignés dans l'alignement. Cette séquence est très éloignée de tous les rétrovirus connus à ce jour, en particulier de HTLV, notamment par la présence d'une délétion dans la région 5', - la figure 15, donne un exemple d'une séquence consensus pour les séquences de type MSRV-2B, - la figure 16 représente la définition d'une séquence consensus de type MSRV-2B selon Fig 16A, une définition d'une trame de lecture fonctionnelle selon Fig 16B, une répétition de l'amorce 3' selon Fig 16C et une séquence comprise entre VLPQG et YVDD selon Fig 16D, - la figure 17, représente l'alignement d'une séquence protéique MSRV-2B (avec 1 ou 2 amorces 3') avec des séquences protéiques rétrovirales connues; les acides aminés conservés (lère ligne) entre le consensus MSRV- 2B et certains rétrovirus sont soulignés dans l'alignement. Cette séquence est très éloignée de tous les rétrovirus connus à ce jour, en particulier de HTLV, notamment par la présence d'une délétion dans la région 5' et d'un site actif YVDD et non YMDD, - la figure 18, représente les séquences consensus et majoritaires de MSRV-2B obtenues à partir des lymphocytes B d'un patient atteint de SEP, selon Fig 18A, *MAJ correspondant à la séquence majoritaire dans laquelle les bases conservées dans tous les cas sont représentées par ATGC, les bases majoritaires sont représentées par atgc, et * VAR correspondant à la séquence majoritaire (variation) dans laquelle les bases minoritaires sont représentées par atgc ainsi que, la traduction de la séquence majoritaire, selon Fig 18B, dans laquelle la légende est la suivante: an: acides nucléiques: * en gras, caractères de petites tailles: les sites de restriction des amorces * en gras, caractères majuscules, extrémité 3' des amorces * en souligné, la séquence nucléique majoritaire codante prot: séquence protéique: * en souligné: acides aminés codés par les amorces - la figure 19, donne une analyse comparée des séquences nucléiques (Fig 19A) et protéiques (Fig 19B) de type MSRV-2 obtenues à partir des cultures LM7, LM7PC et PLI-2 et des lymphocytes B d'un patient atteint de SEP, selon le protocole original ou modifié de Shih et Col., la séquence consensus étant dénommée SEQ ID N02, et avec LigT4 correspondant à une séquence obtenue à partir des lignées, selon le protocole modifié, LBpatDuT4 correspondant à une séquence obtenue à partir de patient, selon le protocole modifié et polSHIH correspondant à une séquence obtenue à partir des lignées, selon le protocole original, - la figure 20, représente l'alignement du consensus MSRV-1B, avec le produit de PCR "nichée" M003- P004, tel que défini dans l'exemple 8, et le clone PSJ17 (MSRV-1A) avec la légende suivante: * en souligné: amorce M003-BCD telle que décrite dans l'exemple 8 amorce P004-BCD telle que décrite dans l'exemple 8 * en gras: séquence intermédiaire entre PSJ17 et MSVR-1B et montre que les séquences MSRV-lA et B appartiennent à la même famille virale et vraisemblablement à la même souche virale et constituent deux parties différentes d'un même génome viral, elle représente en outre la séquence intermédiaire PSJl7 et MSRVl-B, dénommée SEQ ID N04. EXEMPLE 1: OBTENTION D'UN CLONE PSJ17, DEFINISSANT UNE FAMILLE MSRV-1A, PAR REACTION DE TRANSCRIPTASE INVERSE ENDOGENE SUR UNE PREPARATION DE VIRION ISSUE DE LA LIGNEE PLI-2. Cette approche vise à obtenir des séquences d'ADN rétrotranscrites à partir de l'ARN supposé rétroviral dans l'isolat en utilisant l'activité transcriptase inverse présente dans ce même isolat. Cette activité transcriptase inverse ne peut théoriquement fonctionner qu'en présenced'un ARN rétroviral, lié à un ARNt amorce ou hybridé à des brins courts d'ADN déjà rétro-transcrits dans les particules rétrovirales (Lori F. et coll. J. Virol. 1992; 66,5067-5074). Ainsi l'obtention de séquences rétrovirales spécifiques dans un matériel contaminé par des acides nucléiques cellulaires, était optimisée grâce à l'amplification enzymatique spécifique des portions d'ARN viraux par une activité transcriptase inverse virale. Les auteurs ont, pour cela, déterminé les conditions physico- chimiques particulières dans lesquelles cette activité enzymatique de transcription inverse sur des ARN contenus dans des virions pouvait être effective in vitro; ceux-ci correspondent à la description technique des protocoles présentés ci-dessous (réaction de RT endogène, purification, clonage et séquençage). L'approche moléculaire a consisté à utiliser une préparation de virion concentré, mais non purifié, obtenu à partir des surnageants de culture de la lignée PLI-2 préparé selon la méthode suivante: les surnageants de cultures sont collectés deux fois par semaine, pré- centrifugés à 10 000 tpm pendant 30 minutes pour éliminer les débris cellulaires, et ensuite congelés à -80 C ou utilisés tels que pour les étapes suivantes. Les surnageants frais ou décongelés sont centrifugés sur un coussin de PBS-glycérol 30% à 100 000g (ou 30 000 tpm dans un rotor LKB-HITACHI de type 45 T) pendant 2h à 4 C. Après élimination du surnageant, le culot sédimenté est repris dans un petit volume de PBS et constitue la fraction de virions concentrés, mais non purifiés. Cet échantillon viral concentré mais non purifié a été utilisé pour effectuer une réaction dite de transcription inverse endogène, telle que décrite ci-après: un volume de 200gl de virions purifiés selon le protocole décrit ci-dessus et contenant une activité transcriptase inverse d'environ 1-5 millions de DPM est décongelé à 37 C jusqu'à apparition d'une phase liquide, puis placé sur de la glace. Un tampon fois concentré a été préparé avec les composants suivants: Tris-HCl pH 8. 2, 500 mM; NaCl 75 mM; MgC12 25 mM; DTT 75 mM et NP 40 0.10 %. 100 pl de tampon 5X + 25 p1 d'une solution de dATP lOOmM + 25 p1 d'une solution de dTTP lOOmM+ 25 p1 d'une solution de dGTP 10OmM + 25 M1 d'une solution de dCTP 100mM + 100 M1 d'eau distillée stérile + 200 p1 de la suspension de virions (activité T.I. de 5 million de DPM) dans le PBS ont été mélangés et incubés à 42 C pendant 3 heures. Après cette incubation le mélange réactionnel est directement mélangé avec un mélange tamponné phénol/chloroforme/alcool isoamylique (Sigma ref. P 3803), la phase aqueuse est collectée et un volume d'eau distillée stérile est ajouté à la phase organique pour ré-extraire le matériel nucléique résiduel. Les phases aqueuses collectées sont regroupées et les acides nucléiques contenus sont précipités par addition d'acétate de sodium 3M pH 5,2 au 1/10 de volume + 2 volumes d'éthanol + 1i1l de glycogène (BoehringerMannheim ref. 901 393) et mise à -20 C de l'échantillon pendant 4h ou la nuit à +4 C. Le précipité obtenu après centrifugation est ensuite lavé avec de l'éthanol à 70% et resuspendu dans 60 ml d'eau distillée. Les produits de cette réaction ont ensuite été purifiés, clones et séquences selon le protocole décrit ci-après: des ADN bouts francs avec des adénines non-appariées aux extrémités ont été générés: une réaction de "remplissage" a d'abord été effectuée: 25 M1 de la solution d'ADN précédemment purifiée ont été mélangés avec: 2M1 d'une solution 2,5 mM contenant, en quantité équimolaire, dATP + dGTP + dTTP + dCTP / 1 1 d'ADN polymerase T4 (Boehringer- Mannheim ref. 1004 786) / 5 /1 de 10X "incubation buffer for restriction enzyme" (Boehringer-Mannheim ref. 1417 975) / 1 Ml d'une solution à 1% de sérum-albumine bovine / 16 41 d'eau distillée sterile. Ce mélange a été incubé 20 minutes à 110C. 5041 de tampon TE et 11l de glycogène (Boehringer-Mannheim ref. 901 393) y ont été ajoutés avant extraction des acides nucléiques avec du phénol/chloroforme/alcool isoamylique (Sigma ref. P 3803), et précipitation à l'acétate de sodium comme décrit précédemment. L'ADN précipité après centrifugation est resuspendu dans 10 j1 de tampon 10 mM Tris pH 7.5. Puis, 5g1 de cette suspension ont été mélangés avec 20M1 de tampon Taq 5X, 20 J1 de 5mM dATP, 11i (5U) de Taq ADN polymerase (AmplitaqTM) et 54 41 d'eau distillée stérile. Ce mélange est incubé 2 h à 75 C avec un film d'huile à la surface de la solution. L'ADN en suspension dans la solution aqueuse prélevée en dessous du film d'huile après incubation est précipité comme décrit précédemment et resuspendu dans 2 pl d'eau distillée stérile. L'ADN obtenu a été inséré dans un plasmide à l'aide du kit TA CloningTM. Les 2g1 de solution d'ADN ont été mélangés avec 5g1 d'eau distillée stérile, 141 d'un tampon de ligation fois concentré "10X LIGATION BUFFER", 241 de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) et 141 de "TA DNA LIGASE". Ce mélange a été incubé une nuit à 12 C. Les étapes suivantes ont été réalisées conformément aux instructions du kit TA Cloning (British Biotechnology). A la fin de la procédure, les colonies blanches de bactéries recombinantes (white) ont été repiquées pour être cultivées et permettre l'extraction des plasmides incorporés selon la procédure dite de "miniprep" (Sambrook J., Fritsch E. F., et Maniatis T., Molecular cloning, a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press, 1989). La préparation de plasmide de chaque colonie recombinante a été coupée par une enzyme de restriction appropriée et analysée sur gel d'agarose. Les plasmides possédant un insert détecté sous lumière UV après marquage du gel au bromure d'éthidium, ont été sélectionné pour le séquençage de l'insert, apres hybridation avec une amorce complémentaire du promoteur Sp6 présent sur le plasmide de clonage du TA cloning kit. La réaction préalable au séquençage a ensuite été effectuée selon la méthode préconisée pour l'utilisation du kit de séquençage "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) et le séquençage automatique a été réalisé avec l'appareil "automatic sequencer, modèle 373 A Applied Biosystems selon les instructions du fabricant. L'analyse discriminante sur les banques de données informatiques des séquences clonées à partir des fragments d'ADN présents dans le mélange réactionnel a permis de mettre en évidence trois catégories de séquences: la première correspondait à des séquences totalement inconnues dans les banques de données et sans aucune parentée avec des gènes décrits. La seconde, correspondait à des séquences totalement homologues à des portions de gènes cellulaires connus. La troisième correspondait à des séquences présentant des homologies partielles plus ou moins importantes avec des séquences connues de rétrovirus ou d'éléments génétiques rétrotransposables comme les rétroposons ou rétrotransposons. L'origine des séquences de la première catégorie est difficile à définir alors que pour la seconde, elle s'explique par la présence attendue de fragments d'ADN cellulaire contaminant la fraction d'acides nucléiques extrait de l'échantillon viral concentré mais non-purifié, après incubation dans les conditions requises pour la réaction de transcription inverse endogène sus-mentionnée. L'origine des séquences de la troisième catégorie est manifestement rétroviral ou de type rétroviral. Il est connu que des séquences rétrovirales endogènes apparentées à un rétrovirus réplicatif, ou co-exprimées dans une même cellule infectée, peuvent être encapsidées dans les virions générés par une souche rétrovirale donnée (Linial M.L. and Miller A.D. dans "Current topics in microbiology and immunobiology. Retroviruses, strategies of replication" vol. 157, p. 125-152; Swanstrom R. et Vogt P.K. editeurs, Springer-Verlag, Heidelberg 1990) et la présence de certaines séquences de type rétroviral peut s'expliquer par ce phénomène. Cependant, parmi les séquences de cette catégorie, une séquence a été retrouvée le plus fréquemment et s'est avérée représenter la majorité des clones obtenus dans ces conditions à partir de l'isolat viral "POL-2" issu de la culture de la lignée PLI-2 entre le quarantième et le soixantième passage en culture après établissement de la lignée continue selon le principe décrit dans le brevet n WO-93/20188 au nom de la Demanderesse. Le clone correspondant PSJ17 a été entièrement séquencé et la séquence obtenue, présentée dans la figure 1, a été analysée à l'aide du logiciel "Geneworks " sur les banques de données actualisées "Genebank ". L'analyse des banques de données n'a pas permis de trouver de séquence identique déjà décrite. Seule une homologie partielle a pu être retrouvée avec certains éléments rétroviraux connus. L'homologie relative la plus intéressante concerne un rétrovirus endogène dénommé ERV-9, ou HSERV-9, selon les références (La Mantia et coll. Nucleic Acids Research 1991;19, 1513-1520). Ainsi la séquence du clone PSJ17 a pu eRre localisee lans la region pol codant pour la transcriptase inverse d'un rétrovirus, ou encore d'un virus possédant une enzyme avec une activité transcriptase inverse, par alignement avec la séquence décrite pour HSERV-9, tel que cela est présenté présenté dans la figure 2. La traduction en acides aminés du clone PSJ17 est présentée dans la figure 3, et la comparaison avec cette séquence protéique et la séquence protéique théorique de ERV9 telle que décrite par La Mantia et col est présentée dans la figure 4. EXEMPLE 2: OBTENTION DE CLONES APPARENTES A PSJ17, DEFINISSANT UNE FAMILLE MSRV-iA, PAR AMPLIFICATION ENZYMATIQUE (RT-PCR) SUR UNE PREPARATION DE VIRION ISSUE DE LA LIGNEE PLI-2. Des amorces nucléiques, PSJl7A et PSJl7B, ont été définies dans la séquence du clone PSJl7 et ont été utilisées pour rechercher la présence de l'ARN et/ou de l'ADN correspondant à un virus contenant cette séquence, dans différents échantillons biologiques. Celles-ci sont définies ciaprès: Séquence amorce sens PSJl7 A: AAATTTCCTCACTACCTG Séquence amorce antisens PSJl7 B: GGGTTTAAGAGTTGCACA Les réactions de PCR ont été faites dans un volume total de 100 il, contenant 200ng d'ADN, 33 gmole de chaque primer, 0.25mM de chaque dNTP, 10gl de tampon 10X (10 fois concentré) et 2,5 p1 d'enzyme Taq. Les cycles d'amplification sont réalisés comme suit: dénaturation 95 C/5 minutes, hybridation des amorces 50 C à 55 C/2 minutes, extension 72 C/2,5 minutes, puis pendant 33 cycles, 95 C/2minutes, 50 C à 55 C/2 minutes, 72 C/2,5 minutes, et enfin 95 C/2minutes, 50 C à 55 C/2 minutes et 72 C/7 minutes. Les reactions de RT-PCR, selon un un procede d'amplification d'ARN tel que décrit dans la demande de brevet n EP 0 569 272 Ai, ont été faites dans un volume total de 100 p1, contenant 200ng d'ARN, 1 g1 de RNA Guard, 33 pmole de chaque primer, 0.25mM de chaque dNTP, 101 de tampon 10X, 2,5 U d'enzyme Taq. et 0,4 p1 d'enzyme RT (10u) sont aussi ajoutés aux échantillons. Les cycles d'amplification sont réalisés comme suit: dénaturation de l'ARN 65 C/10 minutes, synthèse de l'ADNc 50 C/8 minutes puis les cycles sont identiques à ceux de la PCR décrite ci-dessus. Des réactions de contrôle ont été effectuées de manière à controler 1' absence de contaminants (réaction sur de l'eau). Les produits ont été analysés sur gel d'acrylamide 10%. Une des propriétés de la polymérase Taq consistant à ajouter une adénine à l'extémité 3' de chacun des deux brins d'ADN, les produits issus de la PCR et de la RT-PCR ont été purifiés selon le procédé décrit dans l'exemple 1 puis directement clones à l'aide du kit TA Cloning (British Biotechnology), puis séquencés selon le protocole décrit dans l'exemple 1. Le matériel biologique utilisé consiste en virion purifié à partir de l'isolat "POL-2" (ECACC n V92072202) selon la procédure décrite ciaprès: les surnageants de cultures sont collectés deux fois par semaine, pré- centrifugés à 10 000 tpm pendant 30 minutes pour éliminer les débris cellulaires, et ensuite congelés à -80 C ou utilisés tels que pour les étapes suivantes. Les surnageants frais ou décongelés sont centrifugés sur un coussin de PBS-glycérol 30% à 100 000g (ou 30 000 tpm dans un rotor LKB-HITACHI de type 45 T) pendant 2h à 4 C. Apres élimination du surnageant, le culot sédimenté est repris dans un petit volume de PBS et constitue la fraction de virions concentrés, mais non purifiés. Le virus concentré est ensuite déposé sur un gradient de sucrose dans un tampon PBS stérile (15 à 50% poids/poids) et ultracentrifugé à 35 000 tpm (100 000g) pendant 12 h à +4 C dans un rotor à godets. 10 fractions sont recueillies et 2041 sont prélevés dans chaque fraction apres homogénéisation pour y doser l'activité transcriptase inverse selon la technique décrite par H. Perron et coll. (Res. Virol. 1989; 140, 551-561). Les fractions contenant le pic d'activité RT de type LM7 sont ensuite diluées dans du tampon PBS stérile et ultracentrifugées une heure à 000 tpm (1000 000 g) pour sédimenter les particules virales. Le culot de virions purifiés ainsi obtenu est alors repris dans un petit volume d'un tampon adéquat pour l'utilisation ultérieure qui en sera faite (Ex. Tampon Guanidium Thiocyanate pour l'extraction des ARN; PBS stérile pour le stockage à -80 C). Notamment, un procédé d'amplification d'ARN tel que décrit dans la demande de brevet n EP 0 569 272 A1, utilisé sur de l'ARN purifié, utilisant des amorces telles que décrites ci-dessus, a permis d'amplifier du matériel nucléique sur une fraction de virion purifié sur gradient de saccharose selon la méthode décrite ci-dessus à partir de l'isolat "POL-2" (ECACC n V92072202). Ce matériel nucléique une fois cloné et séquencé selon les techniques décrites dans l'exemple 1, s'est révèlé être, dans ces virions purifiés, le même matériel génétique que celui du clone PSJl7 obtenu à partir de l'échantillon de virions concentrés mais non-purifiés contenus dans un isolat "POL-2". Une réaction PCR avec les mêmes amorces sur le même matériel, mais sans étape de synthèse d'un ADNc à partir de l'ARN présent dans le matériel nucléique de l'échantillon analysé, n'a permis aucune amplification de matériel nucléique. Ces résultats indiquent clairement que la séquence du clone PSJ17 est présente sous forme d'ARN et pas d'ADN, dans les fractions contenant le pic d'activité transcriptase inverse de type LM7, après purification sur gradient de saccharose. Ces résultats sont compatibles avec la présence de particules virales contenant un ARN génomique incluant la séquence du clone PSJ17 et une enzyme transcriptase inverse, liées à la présence d'un rétrovirus non caractérisé par ses séquences spécifiques jusqu'alors, dans les fractions purifiées de virions produits par la lignée PLI-2. Par ailleurs, la réaction RT-PCR sus-mentionnée (demande de brevet EP O 569 272 A1) a été appliquée sur des échantillons biologiques, issus de patients témoins exempts de SEP, obtenus dans des conditions identiques aux fractions de gradient de sacchorose sus- mentionnées, à la différence près qu'aucune activité transcriptase inverse spécifique de type "LM7" n'y a été détectée. Les fractions de même densité en saccharose que les pics d'activité transcriptase inverse répertoriés (environ 1.17g/ml) ont ainsi été utilisées. Dans ces échantillons provenant respectivement d'une culture de cellules leptoméningées de patiente atteinte de maladie de Strumpell-Lorrain, d'une culture de plexus choroïdes d'une patiente décédée d'accident vasculaire cérébral, d'une lignée de lymphocytes B (lignée lymphoblastoïde spontanée) d'un patient atteint de maladie génétique non précisée, tous étant exempts de SEP, cette réaction RT-PCR avec les amorces contenues dans la région "PSJ17" n'a pas permis d'amplifier de matériel nucléique ou, quand une amplification a été visualisée dans un cas, le matériel amplifié s'est révèlé n'avoir aucun rapport avec la séquence "PSJ17" (homologie partielle des amorces avec des gènes cellulaires). Ainsi, dans ces échantillons issus de témoins non-SEP et provenant de fractions de saccharose homologues à celles qui contiennent des particules virales associées à une activité transcriptase inverse dans les échantillons "POL-2/PLI-2" et "MS7PG/LM7PC" provenant de SEP, cette séquence rétrovirale n'a pas été retrouvée associée à de l'ARN. Ces résultats sont compatibles avec l'absence de production de particules rétrovirales contenant la séquence lu clone I1J1J ckli cl pIA l culture de cellules provenant de patients exempts de SEP. Par contre ces séquences ont pu être détectées par cette même technique PCR, telle que décrite ci-avant, dans des échantillons biologiques tels que des cellules humaines diverses, des sérums obtenus après formation du caillot sanguin, des liquides céphalo-rachidiens obtenus par ponction lombaire et pouvant contenir des débris cellulaires, o de l'ADN humain était présent. Cela, chez des patients atteints de SEP, mais aussi chez des patients témoins et des témoins sains. Une étude en southern-blot avec le clone PSJ17 utilisé comme sonde, a confirmé que la séquence du clone PSJ17 était apparentée à une famille de rétrovirus endogènes présents dans le génome humain. Etant donnée la relative homologie avec le rétrovirus endogène ERV-9, il se peut que le rétrovirus contenant la séquence PSJ17 soit un membre d'une famille de rétrovirus endogènes apparenté à ERV-9, ou d'une nouvelle famille de rétrovirus endogènes proches d'ERV-9, ou encore, une souche exogène à laquelle la famille endogène ERV-9 serait apparentée, dans la mesure o aucune homologie avec un rétrovirus exogène connu n'a été identifiée pour ERV-9, contrairement à toutes les séquences rétrovirales endogènes humaines caractérisées à ce jour, tel que cela apparaît dans le tableau 1. Ces résultats sont donc compatibles avec une expression d'ARN issu d'une famille de rétrovirus endogènes que la demanderesse a dénommé MSRV-lA, ayant une homologie relative avec ERV-9, mais contenant un consensus de séquences nucléiques avec le clone de référence PSJ17. Ce virus MSRV-lA peut être exprimé de manière différente entre les patients atteints de SEP et les personnes exemptes de SEP, par tout type de cellules susceptible d'exprimer ce rétrovirus. Ces résultats sont aussi compatibles avec la présence d'un rétrovirus exogène MSRV- 1A, ayant une homologie relative avec ERV-9, mais contenant un consensus ie sequences nuclilques avec le clone de référence PSJ17, hébergé et exprimé par certaines cellules infectées chez les patients atteints de SEP et pas chez les témoins sains ou exempts de SEP. La séquence obtenue dans le clone PSJ17 et sus- décrite, sera le mieux utilisée pour la détection stricte d'ARN spécifiquement exprimé chez les patients atteints de SEP et, conséquemment, de peptides ou protéines contenant la séquence d'acides aminés codée par cette séquence ARN ou un consensus apparenté à cette dernière et provenant d'un variant MSRV-1A. De même l'utilisation de ces séquences peptidiques est conséquemment envisageable pour obtenir des antigènes qui permettront de détecter la réponse immunitaire à ces motifs antigèniques exprimés in vivo chez les patients atteints de SEP, dans la mesure o les ARN correspondants sont exprimés in vivo et permettent la synthèse protéique correspondante, de manière originale dans la SEP ou tout autre pathologie individualisée et trouvée associée à ce même phénomène d'expression rétrovirale. EXEMPLE 3: OBTENTION DE CLONES, DEFINISSANT UNE FAMILLE MSRV-1B, PAR AMPLIFICATION PCR "NICHEE" DES REGIONS POL CONSERVEES DES RETROVIRUS SUR DES PREPARATIONS DE VIRIONS ISSUES DES LIGNEES LM7 ET PLI-2. Une technique PCR dérivée de la technique publiée par Shih et coll. a été utilisée. Cette technique permet, par traitement de tous les composants du milieu réactionnel par la DNase, d'éliminer toute trace d'ADN contaminant. Elle permet parallèlement, par l'utilisation d'amorces différentes mais chevauchantes dans deux séries successives de cycles d'amplifications PCR, d'augmenter les chances d'amplifier un ADNc résultant d'une quantité d'ARN faible au départ et encore réduite dans l'échantillon par l'action parasite de la DNAse sur i'ARN; ce, d'autant plus la DNase est utilisée dans des conditions d'activité en excès qui permettent d'éliminer toute trace d'ADN contaminant avant inactivation de cette enzyme restant dans l'échantillon par chauffage à 85 C pendant 10 minutes. Cette variante de la technique PCR décrite par Shih et coll, a été utilisée sur des fractions de virions, purifiés comme précédemment pour les surnageants congelés des cultures LM7, issus cette fois de lignée lymphoblastoïde B spontanée provenant d'un nouveau cas de SEP, de la culture PLI-2 (ECACC n 92072201) et de la culture LM7PC (ECACC n 93010817), ces deux dernières cultures ayant été obtenues selon les méthodes ayant fait l'objet du brevet n WO 93/20188. Après clonage avec le TA cloning kit des produits amplifiés par cette technique et analyse de la séquence a l'aide du séquenceur automatique selon ce qui est décrit dans les exemples 1 et 2, les séquences ont été analysées à l'aide du logiciel Geneworks , sur la dernière version (n 79, novembre 93) à ce jour de la banque de données Genebank . Cette technique a d'abord été appliquée à deux fractions de virions purifiés comme décrit dans l'exemple 2 sur saccharose à partir de l'isolat "POL-2" produit par la lignée PLI-2 d'une part, et à partir de l'isolat MS7PG produit par la lignée LM7PC d'autre part. Les séquences clonées et séquencées à partir de ces deux échantillons correspondent à quatre catégories. Une première catégorie de séquence, correspond à des séquences amplifiées à partir de matériel nucléique rétroviral contaminant la transcriptase inverse du MoMuLV utilisée pour l'étape de synthèse de l'ADN complémentaire, ainsi que cela a déjà été signalé précédemment. La deuxième catégorie, retrouvée dans la majorité des clones (55% des clones issus des isolats POL-2 des culture PLI-2, et, 67% des clones issus des isolats MS7PG des cultures LM7PC) correspond à une famille de séquences "pol" proches mais différentes du rétrovirus endogène humain dénommé ERV-9 ou HSERV-9. La troisième catégorie correspond à des séquences très fortement homologues à la séquence attribuée à un virus nommé par la demanderesse MSRV-2B et décrit dans les exemples 6 et 7. La quatrième catégorie correspond à diverses séquences trouvées généralement en un exemplaire, ainsi qu'une de type rétroviral endogène, cependant jamais retrouvées par d'autres approches ou dans d'autres échantillons provenant de culture exprimant une activité transcriptase inverse de type LM7. La deuxième catégorie de séquences représentant la majorité des clones est constituée de séquences dont la variabilité permet de définir quatre sous-familles de séquences. Ces sous-familles sont suffisamment proches entre elles pour qu'on puisse les considérer comme des quasi-espèces provenant d'un même rétrovirus, tel que cela est bien connu pour le rétrovirus HIV-1 par exemple (Meyerhans et al., Cell 1989; 58, 901-910), ou comme le résultat de l'expression de plusieurs provirus endogènes co-régulés dans les cellules productrices, puisqu'appartenant à la même famille de rétrovirus endogène et donc sensibles aux mêmes signaux de régulation générés éventuellement par le provirus réplicatif (Linial M.L. and Miller A.D. dans "Current topics in microbiology and immunobiology. Retroviruses, strategies of replication" vol. 157, p. 125-152; Swanstrom R. et Vogt P.K. editeurs, Springer-Verlag, Heidelberg 1990). Cette nouvelle famille de rétrovirus endogènes ou, alternativement, cette nouvelle espèce rétrovirale dont nous avons obtenu en culture la génération de quasi- espèces, et qui contient un consensus des séquences décrites à la suite est dénommée MSRV-1B par la demanderesse. Dans la figure 5 sont présentées les séquences des différents clones MSRV1B séquencés lors de cette expérience. Ces séquences présentent une homologie en acides nucléiques allant de 70% à 88% avec la séquence HSERV9 référencée X57147 et M37638 dans la base de données Genebank. L'arbre phylogénétique de ces séquences est présenté dans la figure 6. Dans cette figure, les sous- familles A, B, C D représentent les séquences qui ont été retrouvées de manière prépondérante dans des expériences similaires répétées ultérieurement, dans les échantillons d'ARN pur de virions purifiés avec les isolats MS7PG et POL-2. A partir de ces familles de séquences, quatre séquences nucléiques "consensus" représentatives de différentes quasi- espèces d'un rétrovirus MSRV-1B éventuellement exogène ou de différentes sous-familles d'un rétrovirus endogène MSRV-lB, ont été définies. Ces consensus représentatifs sont présentés dans la figure 7, avec la traduction en acides aminés. Une trame de lecture fonctionelle existe pour chaque sous-famille de ces séquences MSRV-lB et l'on peut voir que la trame de lecture ouverte fonctionnelle correspond à chaque fois à la séquence acides aminés venant en deuxième ligne sous la séquence acide nucléiques. Un alignement des consensus A,B,C,D et d'un consensus général traduits en protéine avec les séquences de rétrovirus connus est présenté dans la figure 8. Le consensus général de la séquence MSRV-1B obtenue par cette technique PCR dans la région "pol" est présenté dans la figure 9. EXEMPLE 4: OBTENTION DE CLONES, DEFINISSANT UNE FAMILLE MSRV-1B, PAR AMPLIFICATION PCR "NICHEE" DES REGIONS POL CONSERVEES DES RETROVIRUS SUR DES PREPARATIONS DE LYMPHOCYTES B D'UN NOUVEAU CAS DE SEP. La même technique PCR modifiée d'après la technique de Shih et coll. a été utilisée pour amplifier et séquencer le matériel nucléique ARN présent dans une fraction de virions purifiés au pic d'activité transcriptase inverse "de type LM7" sur gradient de saccharose, selon les protocoles décrits dans 1' exemple 2, à partir d'une lignée lymphoblastoïde spontanée, obtenue par auto- immortalisation en culture de lymphocytes B d'un patient SEP séropositif pour le virus d'Epstein- Barr (EBV) après mise en culture des cellules lymphoïdes sanguine dans un milieu de culture approprié contenant une concentration appropriée de cyclosporine A. Une représentation de l'activité transcriptase inverse dans les fractions de saccharose prélevées sur un gradient de purification des virions produits par cette lignée (Duc.) est présentée dans la figure 10. De même, les surnageants de culture d'une lignée B obtenue dans les mêmes conditions à partir d'un témoin exempt de sclérose en plaques ont été traités dans les mêmes conditions et le dosage de l'activité transcriptase inverse dans les fractions du gradient de saccharose s'est avèré négatif partout (bruit de fond) et est présenté dans la figure 11. La fraction 3 du gradient correspondant à la lignée B de SEP et la même fraction sans activité transcriptase inverse du gradient témoin non-SEP, ont été analysées par la même technique RT-PCR que précédemment, dérivée de Shih et coll., suivie des mêmes étapes de clonage et de séquençage tels que décrites dans les exemples 1 et 2. L'analyse des clones recombinants prélevés au hasard a fourni les mêmes quatres catégories de séquences que précédemment. La première catégorie(type 1) correspond à l'amplification de matériel rétroviral contaminant la transcriptase inverse de MoMuLV. La seconde catégorie (type 2) correspond aux séquencesde type MSRV-lB telles que définies dans l'exemple 3. La troisième catégorie correspond à des séquences très fortement homologues à la séquence attribuée à un virus nommé par la demanderesse MSRV-2B et décrit dans les exemples 6 et 7. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Il est tout à fait notable que les séquences de type MSRV-lB soient retrouvées dans le seul matériel associé à un pic d'activité transcriptase inverse "de type LM7" provenant de la lignée lympLolastolle i Je 1II. s ces snqueont pas été retrouvées avec le matériel de la lignée lymphoblastoïde B témoin (non- SEP) dans 26 clones recombinants pris au hasard. Seules les séquences contaminantes de types Mo-MuLV et des séquences sans analogie rétrovirale particulière ont été retrouvées chez ce témoin. La différence de résultats est à l'évidence hautement significative (chi-2, p EXEMPLE 5: OBTENTION DE CLONES, DEFINISSANT UNE FAMILLE MSRV-2A, PAR AMPLIFICATION DES REGIONS POL CONSERVEES DES RETROVIRUS SUR UNE PREPARATION DE VIRION ISSUE DE LA LIGNEE LM7. L'approche moléculaire a consisté à utiliser une technique PCR permettant d'amplifier une région relativement conservée du gène pol des rétrovirus exogènes et endogènes, mais aussi des virus codant pour une enzyme à activité transcriptase inverse tels que notamment le virus de l'hépatite B, qui a été publiée par Shih et coll. (Shih A., Misra R., and Rush M.G. Detection of multiple, novel reverse transcriptase coding sequences in human nucleic acids: relation to primate retroviruses. J. Virol. 1989; 63, 64-75). Cette technique a été utilisée sur l'ARN extrait d'une préparation de virions purifiés obtenus selon le protocole décrit dans l'exemple 1, à partir des surnageants de la culture LM7 d'origine (Perron et coll. Res. Virol. 1989; 140, 551-561) gardés congelés à -80 C depuis lors. Préalablement à la réaction PCR, l'ARN de l'échantillon a été transcrit en ADN complémentaire (ADNc) à l'aide du Kit "cDNA synthesis system plus" (Amersham), selon les instructions du fabricant et en se basant sur une valeur approximée à un log près de la quantité d'ARN présente dans notre échantillon. Après amplification PCR selon la technique de shih et coll., le matériel nucléique obtenu a été déposé sur un gel avec 2% d'agarose et la bande visualisée sous lumière ultraviolette après marquage au bromure d'éthidium dans une région de poids moléculaire d'environ 100 paires de bases a été découpée et les acides nucléiques contenus, extraits selon le protocole usuel (Sambrook J., Fritsch E.F., et Maniatis T., Molecular cloning, a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press, 1989). puis clones en utilisant le kit TA cloning KITe tel que décrit dans les exemples 1 et 2 (British Biotechnology) et les procédures conseillées dans les protocoles joints au kit. Apres étalement des bactéries transformées sur le milieu de pousse approprié au protocoles du kit, quelques dizaines de clones recombinants ont été repiqués et amplifiés afin d'obtenir une quantité suffisante de plasmide selon la technique dite de "miniprep" décrite dans Sambrook J., Fritsch E.F., et Maniatis T. (Molecular cloning, a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press, 1989). L'insert des plasmides ainsi purifiés a été séquencé par séquençage automatique selon le protocole mentionné dans l'exemple 1. Les séquences obtenues ont ensuite été analysées à l'aide des logiciels Mac Vector et Geneworks sur banque de données informatiques Genebank , pour les séquences nucléiques, et Swiss Prot , pour les séquences en acides aminés déduites des trames de lecture mises en évidences dans les séquences nucléiques. L'analyse des séquences obtenues à partir d'échantillon viral provenant des surnageants LM7 décongelés et purifié au pic d'activité transcriptase inverse sur gradient de saccharose, a mis en évidence trois catégories de séquences. Une première catégorie, correspondant à des associations artéfactuelles des amorces nucléiques utilisées pour l'amplification PCR, une deuxième catégorie correspondant à des séquences sans trame de lecture ouverte consistante et une troisième catégorie correspondant à des séquences rétrovirales dans la région "pol" attendue de par les amorces utilisées, et présentant au moins une trame de lecture ouverte conséquente. Dans cette troisième catégorie, on a pu distinguer des séquences strictement homologues à des souches du murine leukaemia virus qui ont été retrouvées par la même approche méthodologique, dans des tubes témoins ne mettant en présence que de l'eau et l'enzyme transcriptase inverse du Moloney-murine leukaemia virus utilisée pour la synthèse de l'ADNc. Il est apparu évident que ces séquences provenaient de contaminants nucléiques associés à cette enzyme de rétrovirus murin utilisée pour cette étape réactionnelle. On a pu aussi y distinguer des séquences représentées par un nombre de clones allant de un à trois, et strictement homologues à des rétrovirus endogènes humains connus. Ces mêmes séquences ont été détectées dans des échantillons témoins ne provenant pas de SEP, traités dans les mêmes conditions. Enfin, on a aussi pu y distinguer une séquence représentée par une population majoritaire de clones (environ 42% des clones), relativement à la représentativité individuelle des autres séquences (toujours inférieure à 5%, voire 10% pour un petit nombre), et présentant des homologies partielles avec des rétrovirus connus dans la région "pol" attendue. L'interrogation de la banque de données Genebank actualisée à ce jour (version 79, novembre 93) n'a pas permis de mettre en évidence de séquence identique ou présentant des homologies significatives. Cette séquence est présentée dans la figure 13. Elle présente un cadre de lecture ouvert en phase avec les deux amorces PCR retrouvées aux extrémités mais elle est plus courte que l'ensemble des séquences rétrovirales connues dans la région attendue entre ces amorces. Une "délétion" de 45 paires de bases (15 acides aminés) y est observée à la suite de la séquence de l'amorce "amont", comme cela est présenté dans la figure 14, alors que les séquences précédant l'amorce "aval" sont présentes. Cependant la trame de lecture est ouverte et ininterrompue sur toute la séquence incluant les amorces et la séquence en acides aminés déduite présente une homologie significative avec la région correspondante des rétrovirus connus, comme cela est présenté dans la figure 14. Dans la séquence interne aux amorces PCR, les acides aminés E, R, Q, P et D, normalement assez bien conservés dans cette région pol des rétrovirus et des virus avec activité transcriptase inverse connus (shih et coll. J. Virol. 1989; 63, 64-75) sont retrouvés conservés aux bonne positions dans la trame de lecture de notre séquence originale. Enfin, étant donné que cette séquence est suffisamment divergente des séquences rétrovirales déjà décrites dans les banques de données on peut avancer qu'il s'agit d'une séquence appartenant à un nouveau virus que la demanderesse a dénommé MSRV-2A. Ce virus s'apparente à priori, d'après l'analyse des séquences obtenues, à un rétrovirus, mais, étant donnée la technique utilisée pour obtenir cette séquence, il peut aussi bien s'agir d'un virus à ARN dont le génome code pour une enzyme qui possède accessoirement une activité transcriptase inverse comme c'est le cas, par exemple, pour le virus de l'hépatite B, HBV (Shih et coll. J. Virol. 1989; 63, 64-75). EXEMPLE 6: OBTENTION DE CLONES, DEFINISSANT UNE FAMILLE MSRV-2B, PAR AMPLIFICATION PCR "NICHEE" DES REGIONS POL CONSERVEES DES RETROVIRUS SUR DES PREPARATIONS DE VIRIONS ISSUES DES LIGNEES LM7 ET PLI-2. Une technique PCR dérivée de la technique publiée par Shih et coll. a été utilisée. Cette technique permet, par traitement de tous les composants du milieu réactionnel par la DNase, d'éliminer toute trace d'ADN contaminant. Elle permet parallèlement, par l'utilisation d'amorces différentes mais chevauchantes dans deux séries successives de cycles d'amplifications PCR, d'augmenter les chances d'amplifier un ADNc résultant d'une quantité d'ARN faible au départ et encore réduite dans l'échantillon par l'action parasite de la DNAse sur i'ARN; ce, d'autant plus la DNase est utilisée dans des conditions d'activité en excès qui permettent d'éliminer toute trace d'ADN contaminant avant inactivation de cette enzyme restant dans l'échantillon par chauffage à 85 C pendant 10 minutes. Cette variante de la technique PCR décrite par Shih et coll, a été utilisée sur des fractions de virions, purifiés, comme décrit dans l'exemple 2, comme précédemment pour les surnageants congelés des cultures LM7, issus cette fois de lignée lymphoblastoïde B spontanée provenant d'un nouveau cas de SEP, de la culture PLI-2 (ECACC n 92072201) et de la culture LM7PC (ECACC n 93010817), ces deux dernières cultures ayant été obtenues selon les méthodes ayant fait l'objet des brevets n WO 93/20188. Apres clonage avec le TA cloning kit des produits amplifiés par cette technique et analyse de la séquence à l'aide du séquenceur automatique selon ce qui est décrit dans les exemples 1 et 2, les séquences ont été analysées à l'aide du logiciel Geneworks , sur la dernière version (79, novembre 93) à ce jour de la banque de données Genebank . Cette technique a d'abord été appliquée à deux fractions de virions purifiés sur saccharose à partir de l'isolat "POL-2" produit par la lignée PLI-2 d'une part, et à partir de l'isolat MS7PG produit par la lignée LM7PC d'autre part. Les séquences clonées et séquencées à partir de ces deux échantillons correspondent à quatre catégories. Une première catégorie de séquence, correspond à des séquences amplifiées à partir de matériel nucléique rétroviral contaminant la transcriptase inverse du MoMuLV utilisée pour l'étape de synthèse de l'ADN complémentaire, ainsi que cela a déjà été signalé précédemment. La deuxième catégorie, retrouvée dans la majorité des clones (55% des clones issus des isolats POL-2 des culture PLI-2, et, 67% des clones issus des isolats MS7PG des cultures LM7PC) correspond à une famille de séquences "pol", dénommées par la demanderesse MSRV-1B et décrites dans les exemples 3 et 4, proches mais différentes du rétrovirus endogène humain dénommé ERV-9 ou HSERV-9, cependant dans une autre région que l'homologie mentionnée précédemment avec la séquence du clone PSJ17 définissant la famille MSRV-1A comme décrit dans les exemples 1 et 2. La troisième catégorie correspond à des séquences très fortement homologues à la séquence attribuée à un virus nommé par la demanderesse MSRV-2A et obtenue précédemment à partir des surnageants de culture LM7 (voir exemple 5) par la technique non modifiée de shih et coll. Cependant la proportion des clones de cette catégorie est inférieure à celle qui a été trouvée précédemment sur l'isolat viral issu de la culture LM7 (5% des clones issus des isolats POL-2 des culture PLI-2, et, 6% des clones issus des isolats MS7PG des cultures LM7PC). La quatrième catégorie correspond à diverses séquences trouvées généralement en un exemplaire, ainsi qu'une de type rétroviral endogène, cependant jamais retrouvées par d'autres approches ou dans d'autres échantillons provenant de culture exprimant une activité transcriptase inverse de type LM7. La troisième catégorie de séquences obtenues dans cette expérience, est identique au séquence "pol" de type MSRV-2 obtenues précédemment, à quelques mutations près qui peuvent s'expliquer par une variabilité normale du génome viral et par des erreurs des enzymes transcriptase inverse et taq-polymérase utilisées dans cette technique. Cependant, lors de cette deuxième approche utilisant une modification de la technique décrite par Shih et coll., une duplication a priori artéfactuelle de l'amorce aval ("amorce 3') a été observée. Ceci peut provenir de la configuration des amorces chevauchantes utilisées pour les deux séries de cycles d'amplification PCR (technique "semi-nested). La séquence consensus de ces clones est présentée dans la figure 15. La trame de lecture fonctionelle correspondante, une représentation de la duplication de l'amorce aval (amorce 3') ainsi que la séquence acides aminés visualisant le motif interne aux régions conservées dans la plupart des rétrovirus (VLPQG et YVDD) sont présentées dans la figure 16. Une comparaison des séquences acides aminés de type MSRV-2B obtenues lors de cette expérience et lors de la précédente fait apparaître une seule différence dans la région communément clonée, à savoir le remplacement de la méthionine M retrouvée dans la région de l'amorce PCR par une valine V, substituant ainsi le motif YVDD, au motif YMDD. L'analyse dans les banques de données de cette dernière séquence, obtenue par cette technique modifiée sur des échantillons viraux distincts, ne modifie en rien le fait qu'aucune homologie significative n'est trouvée avec des séquences déjà répertoriées dans la base de données Genebank . Cependant, une analogie certaine de la séquence acides aminés avec la région équivalente des rétrovirus connus existe, ainsi que cela est présenté dans la figure 17. Cette analogie fait intervenir, comme dans les clones issus de la technique précédente, une délétion suivant l'amorce amont. Cette séquence est, ici aussi, compatible avec un génome rétroviral inconnu ou avec un génome viral ARN (transcrit en ADNc dans notre protocole) codant pour une enzyme ayant une activité transcriptase inverse. En effet, les virus de l'hépatite B et de la mosaïque du choufleur (CaMV) qui ne sont pas des rétrovirus mais qui possèdent une polymérase à activité transcriptase inverse ont pu être amplifiés selon la technique de Shih et coll. De plus, comme cela est aussi montré dans la figure 17, le CaMV (clone CaMV QG-YM) possède une délétion dans cette région mais, contrairement à la séquence de type MSRV-2, elle se situe du côté de l'amorce aval (amorce 3'). EXEMPLE 7: OBTENTION DE CLONES, DEFINISSANT UNE FAMILLE MSRV-2B, PAR AMPLIFICATION PCR "NICHEE" DES REGIONS POL CONSERVEES DES RETROVIRUS SUR DES PREPARATIONS DE LYMPHOCYTES B D'UN NOUVEAU CAS DE SEP. Enfin, la même technique PCR modifiée d'après la technique de Shih et coll. a été utilisée pour amplifier et séquencer le matériel nucléique ARN présent dans une fraction de virions purifiés au pic d'activité transcriptase inverse "de type LM7" sur gradient de saccharose, selon les protocoles décrits dans les exemples 1 et 2, à partir d'une lignée lymphoblastoïde spontannée, obtenue par auto-immortalisation en culture de lymphocytes B d'un patient SEP séropositif pour le virus d'Epstein- Barr (EBV) après mise en culture des cellules lymphoïdes sanguine dans un milieu de culture approprié contenant une concentration appropriée de cyclosporine A. Une représentation de l'activité transcriptase inverse dans les fractions de saccharose prélevées sur un gradient de purification des virions produits par cette lignée (Duc.) est présentée dans la figure 10. De même, les surnageants de culture d'une lignée B obtenue dans les mêmes conditions à partir d'un témoin exempt de sclérose en plaques ont été traités dans les mêmes conditions et le dosage de l'activité transcriptase inverse dans les fractions du gradient de saccharose s'est avèré négatif partout (bruit de fond) et est présenté dans la figure 11. La fraction 3 du gradient correspondant à la lignée B de SEP et la même fraction sans activité transcriptase inverse du gradient témoin non-SEP, ont été analysées par la même technique RT-PCR que précédemment, dérivée de Shih et coll., suivie des mêmes étapes de clonage et de séquençage, comme décrit dans les exemples 1 et 2. L'analyse des clones recombinants prélevés au hasard a fourni les mêmes quatres catégories de séquences que décrites dans les exemples 3,4 et 6. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Il est tout à fait notable que les séquences de type MSRV-2 soient retrouvées dans le seul matériel associé à un pic d'activité transcriptase inverse "de type LM7" provenant de la lignée lymphoblastoïde B de SEP. Ces séquences n'ont pas été retrouvées avec le matériel de la lignée lymphoblastoïde B témoin (non-SEP) dans 26 clones recombinants pris au hasard. Seules les séquences contaminantes de type Mo-MuLV et des séquences sans analogie rétrovirale particulière ont été retrouvées chez ce témoin. La différence de résultats est à l'évidence hautement significative (chi-2, p L'analyse des séquences de type MSRV-2 obtenues dans toutes les fractions de virions purifiées provenant respectivement des cultures LM7, LM7PC, PLI-2 et de la lignée lymphoblastoïde B de SEP (Duc.), par les deux techniques PCR dérivée de la technique publiée par Shih et coll.,est présentée dans la figure 19. On y constate que la séquence en acide nucléique y est très conservée, à quelques mutations près, et que la seule variation de séquence acides aminés observée dans ces clones concerne la méthionine ou la valine du site amorce 3' YMDD/YVDD. EXEMPLE 8: Amplification PCR des la séquence nucléique contenue entre la région 5' définie par le clone "pol MSRV-iB" et la région 3' définie par le clone PSJ17 (MSRV-1A). Cinq oligonucléotides, M001, M002-A, M003-BCD, P004 et P005, ont été définis pour amplifier de l'ARN provenant de virions purifiés POL-2. Des réactions de contrôle ont été effectuées de manière à contrôler la présence de contaminants (réaction sur de l'eau). L'amplification consiste en une étape de RT-PCR selon le protocole décrit dans l'exemple 2 suivie d'une PCR "nichée" selon le protocole PCR décrit dans l'exemple 2. Dans le premier cycle RT-PCR, les amorces M001 et P004 ou P005 sont utilisées. Dans le deuxième cycle PCR, les amorces M002-A ou M003-BCD, et l'amorce P004 sont utilisées. Les amorces sont positionnées comme suit: M002-A M003-BCD M001 P004 P005 ARN POL-2 pol MSRV-1 SJ17 Leur composition est: amorce M001: GGTCITICCICAIGG amorce M002-A: TTAGGGATAGCCCTCATCTCT amorce M003-BCD: TCAGGGATAGCCCCCATCTAT amorce P004: AACCCTTTGCCACTACATCAATTT amorce P005: GCGTAAGGACTCCTAGAGCTATT L'alignement du consensus MSRV-1B avec le produit d'amplification "nichée" décrit ci-dessus et nommé M003- P004 et le clone PSJ17 (MSRV-1A) montrant la communauté de famille des isolats MSRV-1A et MSRV-1B, ainsi que la séquence nucléique de la région comprise entre MSRV-1B et MSRV-1A sont présentés dans la figure 20. Il convient ici de rappeler que, dans le modèle naturel animal de la SEP représenté par le Visna du mouton, la co-existence, le co-isolement, la co- purification et même, dans certaines situations pathologiques étudiées sous cet angle, la coopération, de deux virus, les rétrovirus Maedi-Visna et JSRV (rétrovirus de l'adénomatose ovine pulmonaire) est connue et fréquemment mise en évidence dans les maladies naturelles (et non-expérimentales), ainsi que l'ont rapporté De Martini J.C. et coll. (J.N.C.I. 1987; 79, 167-177), Rosadio R.H. et coll. (Vet. Pathol. 1988; 25, 58-66), Dawson M. et coll. (Br. Vet. J. 1990; 146, 531-537) et York D. F. et coll. (J. Virol. 1991; 65, 5061-5067). Or, le virus Maedi-Visna est un rétrovirus exogène directement responsable de la pathologie neurologique du mouton alors que le JSRV est un rétrovirus endogène responsable d'un cancer, l'adénomatose ovine pulmonaire. La coopération entre ces deux virus a été étudiée et montrée dans une troisième pathologie du mouton, le maedi qui est une forme de pneumonie interstitielle lymphocytaire, mais cette synergie n'a pas été étudiée ni recherchée dans le cas du Visna, la maladie démyélinisante du système nerveux central. Dans ces conditions, on peut considérer que la présence de deux éléments viraux différents, co-isolés dans une pathologie naturelle humaine telle que la SEP, trouve un précédent logique du point de vue conceptuel dans le modèle du mouton évoqué ci-dessus. Ces virus peuvent donc être à l'origine de pathologies différentes mais aussi coopérer dans certains processus pathogéniques. Dans ces conditions on doit concevoir que les applications diagnostiques et thérapeutiques découlant de la découverte des virus MSRV-1 et MSRV-2 contenant les séquences définies dans le présent brevet, aux variations près que ces virus peuvent naturellement présenter, pourraient se recouper dans le cadre de la SEP. Par exemple, des rétrovirus endogènes de type MSRV-1 pourrait interférer de façon variable, selon les génotypes MSRV-1 portés par des individus différents, avec l'infection par un virus exogène de type MSRV-2 qui serait plus spécifiquement associé à l'induction de la maladie sclérose en plaques. Ils pourraient donc moduler la pathogénicité de ce dernier. Dans ces conditions, le génotypage des gènes de type MSRV-1 portés par un individu dans une famille ou une région à risque, permettrait de faire un diagnostic de "risque individuel". Le diagnostic d'une infection à MSRV-2, devrait être confronté à ce typage MSRV-1, pour évaluer le risque de maladie clinique. De plus, certaine formes graves ou, à contrario bénignes, de SEP pourraient être caractérisées par la présence d'un haplotype MSRV-1 endogène particulier, et ainsi, un pronostic sur l'évolution clinique pourrait être donné. De plus, de tels éléments génétiques pourraient faire l'objet d'une thérapeutique complémentaire utilisant les procédés de la thérapie génique ou, plus simplement, des inhibiteurs de l'expression rétrovirale actifs sur des rétrovirus endogènes. Selon un autre exemple, l'expression d'un rétrovirus endogène de type MSRV-1 pourrait être transactivée par une protéine régulatrice codée et exprimée par un virus de type MSRV-2. Ainsi, on peut concevoir dans ces conditions qu'un diagnostic devrait dépister une infection par MSRV-2 mais aussi une réaction immunitaire particulière contre (ou une expression particulière de) MSRV-1, pour être à même de caractériser l'état de "sclérose en plaques active". Ainsi encore, une réponse immunitaire contre MSRV-2 ou la détection directe d'un de ses antigènes ou d'une séquence nucléique lui appartenant, en l'absence d'expression anormale d'un endogène de type MSRV-1, pourrait caractériser un stade "latent" de la maladie. Aussi, le contrôle régulier direct (détection ARN ou protéines virales) ou indirect (immunité) de l'état d'expression de populations endogènes MSRV-1, pourrait constituer un contrôle pronostic extrêmement précoce de passage à la maladie clinique si celle-ci s'accompagnait d'une modification caractéristique de cette expression. Ce type de suivi "diagnostic ou pronostic" pourrait permettre de rationaliser une approche thérapeutique et d'en optimiser l'efficacité. Selon un autre exemple, ces deux virus pourraient être exogènes tous les deux, bien que l'un d'entre eux soit phylogénétiquement proche d'une famille de rétrovirus endogène, et présenter une synergie ainsi que cela peut se rencontrer notamment dans le cas bien connu de l'hépatite delta, dont l'agent causal, le virus VHD possède un génome défectif dépendant du virus VHB, agent de l'hépatite B. Cet exemple connu démontre que deux maladies affectant le même organe et différenciables, pour l'étude clinique, essentiellement sur des critères de gravité, peuvent coexister par superposition de l'une (hépatite delta) sur l'autre (hépatite B) dont la présence est requise du fait de la dépendance du génome du VHD par rapport au VHB. Un tel cas de figure, ou tout autre type d'interaction, peut donc se concevoir dans le cas de deux virus exogènes, et même d'un rétrovirus endogène, associés à la SEP. Dans un cas similaire à celui des hépatites B et delta, on pourrait dissocier, par les diagnostics respectifs liés à MSRV-1 et MSRV-2, des formes de SEP avec un seul virus associé, et des formes, à priori plus graves, avec deux virus associés. Selon un autre exemple qui s'inspire d'un raisonnement analogique étayé sur la connaissance des hépatites virales, il est aussi concevable que plusieurs virus indépendants puissent provoquer un syndrome inflammatoire du système nerveux central, dont les variantes cliniques sont regroupées sous la dénomination "sclérose en plaques", ainsi qu'il existe des "hépatites" causées alternativement par le VHA, le VHB, le VHC, le VHE ou l'association VHB et VHD. Dans ces conditions, le diagnostic des différents virus associés à une "sclérose en plaques" permettrait de préciser le type de virus en cause et, par là, les mesures de prohylaxie et les méthodes thérapeutiques à utiliser pour chaque malade, alors qu'un traitement anti- inflammatoire ou immunodépresseur global est actuellement proposé sans discrimination efficace des causalités de la maladie, chez l'ensemble des malades atteints de SEP. Ces virus peuvent aussi être à l'origine d'autres pathologies individualisées, et notamment, dans le cas de MSRV-1 dont l'expression est nettement accrue dans les cellules immortalisées ou transformées des lignées continues par rapport aux mêmes cellules en culture primaire, une association avec des processus tumoraux, certains cancers ou syndromes hyperprolifératifs, est concevable. Alternativement, un des deux virus peut s'avérer, seul et à l'exclusion de l'autre, jouer un rôle dans la pathogénie de la SEP et, donc, seules les applications diagnostiques et thérapeutique de celui-ci seraient d'intérêt pour la sclérose en plaques. Mais, comme dans l'exemple du visna et du jaagsiekte précité, il se pourrait que l'autre virus puisse indépendamment induire un tout autre type de maladie chez l'homme. Princiiiaux rétrovirtis endogènes huLmans Nom Longueur Nombre de copies Relation avec les Références ___ __ __ __ __ _ _!(kb) rétrovirus exogènes 4- 1 8.8 5-1(10 MoMuLV Marlin, IN AS, 1981 51- 1 6 35-50 MoMuLV Slcele, Science, 1984 ERV-I 3 - 4 I MoMuLV/B3aEV Blonrer, PNAS, 1982 ERV-3 9.9 1 B3aEV O'Connell, Virology, 1984 Ill.NI-2 9 5() MMTV Callalhan, PINAS, 1982 I IERV-K 9.5 50 MMTV Ono, J, Virol., 1987 luRRS-P' 8 - 9 20)-4(0 MoMuLV Kroger, J. Virol., 1987 R'lV-iJ.. 5.8 1!(.) 1 TLV-I/BLV Mager, J. Virol., 1987 IlIERS- I 5 - 6 1 1'LV-I Pei, (IcInioîics, 1991 M7-rel 4 - 1) 300 MI baboon RV Noda, Nucl. Acids Res., 1982 S71 6 1 SSAV Werner, Virology, 1990) ERV-9 8 35-40) ? l.a Manuia, Nucl. Acids Res., 1991 11s5 5 - 1) ? FelV/Fv-4 Levy, J. CGen. Virol., 199(0 EIIS- 3.2 - 9.5 7 1 - 11V-I lorwilz, J. Virol., 1992 EIIS-2 3.2 - 9.5 ? HIV-1 TABLEAU 2 REPARTITION DES SEQUENCES OBTENUES PAR PCR MODIFIEE D'APRES SHIIH ET COLL A PARTIR DE CULTURE DE LYMPHOCYTES B D'UN PATIENT ATTEINT DE SCLEROSE EN PLAQUES VERSUS UN PATIENT CONTROLE TYPE I TYPE 2 TYPE 3 TYPE 4 MSRV-2B _ Lympho B 0 11 4 8 patient SEP 0% 48% 17% 35% Lympho B 5 O O 21 patient non SEP 19% 0% 0% 81% REVENDICATIONS 1/ Association de deux virus associés à la sclérose en plaques, à savoir, un premier virus humain, possédant une activité transcriptase inverse, et associé à une famille d'éléments rétroviraux endogènes, ou un variant du premier virus comprenant au moins un antigène reconnu par au moins un anticorps dirigé contre au moins un antigène correspondant dudit premier virus, et un second virus, possédant une activité transcriptase inverse, ou un variant dudit second virus, ces deux virus étant issus ensemble d'une même souche virale choisie parmi les souches dénommées respectivement POL-2, déposée le 22.07.1992 auprès de l'ECACC sous le numéro d'accès V92072202 et MS7PG déposée le 08.01.93 auprès de l'ECACC sous le numéro d'accès V93010816, et parmi les souches variantes consistant en des virus comprenant au moins un antigène qui est reconnu par au moins un anticorps dirigé contre au moins un antigène correspondant de l'un ou l'autre des virus des souches virales POL-2 et MS7PG précitées. 2/ Association de deux virus associés à la sclérose en plaques, à savoir, un premier virus humain possédant une activité transcriptase inverse, et associé à une famille d'éléments rétroviraux endogènes, ou un variant du premier virus comprenant au moins un antigène reconnu par au moins un anticorps dirigé contre au moins un antigène correspondant dudit premier virus, et un second virus possédant une activité transcriptase inverse, ou un variant du second virus, ces deux virus étant produit par une même lignée cellulaire choisie parmi les souches dénommées respectivement PLI2 déposée le 22.07.1992 auprès de l'ECACC sous le numéro d'accès 92072201 et LM7PC déposée le 08.01.93 auprès de l'ECACC sous le numéro d'accès 93010817, et par toutes cultures cellulaires infectées susceptibles de produire un virus comprenant au moins un antigène qui est reconnu par au moins un anticorps dirigé contre au moins un antigène correspondant de l'un ou l'autre des virus produits par les lignées PLI-2 et LM7PC précitées. 3/ Association de deux virus, à savoir un premier virus dont le génome comprend une séquence nucléotidique présentant au moins 50 % et préférentiellement au moins % d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID N01 ou sa séquence complémentaire, ou un variant dudit premier virus dont le génome code pour une séquence peptidique présentant au moins 50 % et préférentiellement au moins % d'homologie avec la séquence peptidique codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N05 ou sa séquence complémentaire, et un second virus, dont le génome comprend une séquence nucléotidique présentant au moins 50 % et préférentiellement au moins 70 % d'homologie avec une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N02 ou sa séquence complémentaire, ou un variant dudit second virus dont le génome code pour une séquence peptidique présentant au moins 50 %, et préférentiellement au moins 70 % d'homologie avec la séquence peptidique codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N02 ou sa séquence complémentaire 4/ Procédé de détection d'un premier virus, et/ou d'un second virus, associés à la sclérose en plaques, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre au moins deux fragments, un premier fragment dont la séquence nucléotidique présente au moins 50 % et de préférence au moins 70 % d'homologie avec SEQ ID N05 ou sa séquence complémentaire, et/ou un second fragment dont la séquence nucléotidique présente au moins 50 % et de préférence au moins 70 % d'homologie avec SEQ ID N02 ou sa séquence complémentaire, chacun desdits fragments étant une sonde ou une amorce. 5/ Composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend une association selon la revendication 4 et un premier fragment nucléotidique, et/ou un second fragment nucléotidique, tels que définis selon la revendication 4. 6/ Procédé pour détecter et/ou identifier une association de virus associés à la sclérose en plaques, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on expose un ARN et/ou un ADN spécifique à chaque dit virus, et/ou leur ARN et/ou ADN complémentaire à une association d'un fragment nucléotidique et d'un second fragment nucléotidique, tels que définis à la revendication 4. 7/ Procédé de détection d'un premier virus, et/ou d'un second virus, associés à la sclérose en plaques, caractérisé en qu'on met en oeuvre un premier peptide codé de manière partielle ou totale par le premier fragment nucléotidique défini à la revendication 4, et/ou un second peptide codé de manière partielle ou totale par le deuxième fragment nucléotidique défini à la revendication 4. 8/ Composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un premier peptide et/ou un second peptide, définis à la revendication 7. 9/ Composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par préparation d'un premier ligand spécifique du premier peptide, et/ou un second ligand spécifique du second peptide, et par association du premier ligand et/ou du second ligand. 10/ Fragment nucléotidique, caractérisé en ce que sa séquence nécléotidique présente au moins 50% , et de préférence au moins 70% d'homologie, avec une séquence choisie parmi SEQ ID Nl01, SEQ ID N03, SEQ ID N04, et la séquence SEQ ID N05 comprenant bout à bout SEQ ID Nl01, SEQ ID N03, SEQ ID N04.