FR 2714670 A1 19950707 FR 9500007 A 19950102 La présente invention concerne l'isolement, la purification et la synthèse par recombinaison ou synthèse chimique de protéines qui exercent une influence sur la survie, la prolifération, la différenciation ou la maturation de cellules hématopolétiques, notamment de cellules progénitrices de plaquettes. L'invention concerne en particulier le clonage et l'expression d'acides nucléiques qui codent un ligand protéique capable de liaison au mpl et d'activation du mpl, qui est un représentant de la superfamille des récep- teurs de cytokine. La présente invention concerne en outre l'utilisation de ces protéines seules ou en association avec d'autres cytokines pour traiter des troubles immunitaires ou hématopolétiques, y compris la thrombocytopénie. I. Système himatopoiétique Le système hématopolétique produit les globules rouges matures hautement spécialisés dont on sait que l'existence est nécessaire à la survie de tous les mammifè- res. Ces cellules matures comprennent les érythrocytes, spécialisés dans le transport de l'oxygène et de l'anhydride carbonique, les lymphocytes T et B, à l'origine des réponses immunitaires sous la médiation de cellules et d'anticorps, les plaquettes ou thrombocytes, dont la spécialité est la formation de caillots sanguins, et les granulocytes et macrophages, assumant une fonction spéciale d'épurateurs et de cellules accessoires pour combattre des infections. Les granulocytes sont en outre subdivisés en neutrophiles, éosinophiles, basophiles et mastocytes, qui sont des types cellulaires spécialisés à fonctions distinctes. Il y a lieu de remarquer que toutes ces cellules sanguines matures spécialisées sont dérivées d'un unique type cellulaire primitif commun, appelé cellule souche pluripotente (ou totipotente), qui se trouve principalement dans la moelle osseuse (Dexter et al., Ann. Rev. Cell Biol., 3:423-441 [(1987]). Les cellules sanguines matures hautement spécia- lisées doivent être produites en grands nombres continuelle- ment pendant toute la vie d'un mammifère. La grande majorité de ces cellules sanguines spécialisées sont destinées à rester fonctionnellement actives pendant une durée allant de quelques heures seulement à plusieurs semaines (Cronkite et al., Blood Cells, 2:263-284 [1976]). Par conséquent, le renouvellement continu des cellules sanguines matures, des cellules souches primitives elles-mêmes, ainsi que de toutes lignées cellulaires intermédiaires ou ascendantes se situant entre les cellules primitives et les cellules à maturité, est nécessaire pour répondre aux besoins normaux du mammifère en cellules sanguines à l'état d'équilibre. La cellule ou les cellules souches pluripotentes sont au coeur du système hématopoiétique. Ces cellules sont relativement peu nombreuses et se renouvellent d'elles-mêmes par prolifération en produisant des cellules souches filles ou sont transformées, dans une série d'étapes de différencia- tion, en cellules progénitrices limitées à la lignée, de plus en plus matures, formant finalement la cellule ou les cellules sanguines matures hautement spécialisées. Par exemple, certaines cellules progénitrices multipotentes, appelées CFC-Mix, dérivées de cellules souches subissent une prolifération (auto-renouvellement) et un développement en produisant des colonies qui contiennent toutes les différentes cellules myéloides : érythrocytes, neutrophiles, mégacaryocytes (prédécesseurs de plaquettes), macrophages, basophiles, éosinophiles et mastocytes. D'autres cellules progénitrices de la lignée lymphoide subissent une prolifération et un développement en cellules T et B. En outre, il existe entre les cellules progéni- trices CFC-Mix et les cellules myéloides une autre catégorie de cellules progénitrices d'engagement intermédiaire à l'égard de leur descendance. Ces cellules progénitrices de lignée restreinte sont classées sur la base de la descendance qu'elles engendrent. Ainsi, les prédécesseurs immédiats connus des cellules myéloides sont : les unités formant des colonies érythrocytaires (CFU-E) pour les érythrocytes, les cellules formant des colonies de granulocytes/macrophages (GM-CFC) pour les neutrophiles et les macrophages, les ellules formant des colonies de mégacaryocytes (Meg-CFC) pour les mégacaryocytes, les cellules formant des colonies d'éosinophiles (Eos-CFC) pour les éosinophiles, les cellules formant des colonies de basophiles (Bas-CFC) pour les mastocytes. On connaît (voir ci-dessous) ou on peut mettre en évidence d'autres prédécesseurs cellulaires intermédiaires entre les cellules souches pluripotentes et les cellules sanguines à maturité, possédant des degrés variables de restriction en matière de lignée et de capacité d'auto- renouvellement. Le principe à la base du système cellulaire hématopolétique normal paraît être la capacité réduite d'auto-renouvellement du fait que la potentialité multiple est perdue et que la restriction en matière de lignée et la maturité sont acquises. Ainsi, il y a à une extrémité du spectre des cellules hématopolétiques la cellule souche pluripotente possédant la capacité d'auto-renouvellement et de différenciation en toutes les diverses cellules progéni- trices engagées spécifiques d'une lignée. Cette capacité est la base de la thérapie par greffe de moelle osseuse, dans laquelle des cellules souches primitives repeuplent le système entier de cellules hématopolétiques. A l'autre extrémité du spectre se trouvent des progéniteurs hautement limités en matière de lignée et leur descendance, qui ont perdu la capacité d'auto-renouvellement et qui ont acquis une activité fonctionnelle mature. La prolifération et le développement de cellules souches et de cellules progénitrices limitées en matière de lignée sont minutieusement dominés par divers facteurs de croissance hématopolétique ou cytokines. Le rôle de ces facteurs de croissance in vivo est complexe et incomplètement élucidé. Certains facteurs de croissance, tels que l'inter- leukine-3 (IL-3), sont capables de stimuler à la fois des cellules souches multipotentes ainsi que des cellules progénitrices engagées de plusieurs lignées, comprenant par exemple des mégacaryocytes. D'autres facteurs tels que le facteur de stimulation des colonies de granulocytes/macropha- ges (GM-CSF) ont été tout d'abord considérés comme étant limités dans leur action aux cellules GM-CFC. Plus tard, cependant, il a été mis en évidence que le facteur GM-CSF influençait aussi la prolifération et le développement, entre autres, de mégacaryocytes. Par conséquent, on a trouvé que la IL-3 et le GM-CSF possédaient des activités biologiques qui se recouvraient, bien qu'avec des degrés différents. Plus récemment, l'interleukine-6 (IL-6) et l'interleukine-11 (IL-11), bien que n'exerçant pas individuellement d'influence apparente sur la formation de colonies de mégacaryocytes, ont montré qu'elles agissaient de façon synergique avec la IL-3 en stimulant la maturation de mégacaryocytes (Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]). Ainsi, les facteurs de croissance hématopolétique peuvent influencer la croissance et la différenciation d'une ou plusieurs lignées, il peuvent se recouvrir avec d'autres facteurs de croissance en affectant une seule et même lignée cellulaire progénitrice, ou bien ils peuvent agir de façon synergique avec d'autres facteurs. Il apparaît également que des facteurs de croissance hématopolétique peuvent montrer leur effet à différents stades du développement cellulaire depuis la cellule souche totipotente jusqu'à la cellule sanguine à maturité en passant par les divers progéniteurs engagés, limités en matière de lignée. Par exemple, l'érythropoiétine (epo) semble n'activer que la prolifération de cellules progénitrices érythrocytaires matures. La IL-3 parait exercer plus tôt son effet en influençant des cellules souches primitives et des cellules progénitrices intermédiaires à lignée restreinte. D'autres facteurs de croissance tels que le facteur des cellules souches (SCF) peuvent influencer encore plus le développement de cellules primitives. Il ressort de ce qui précède que des facteurs de croissance hématopolétique nouveaux qui affectent la survie, la prolifération, la différenciation ou la maturation de toutes les cellules sanguines ou de leurs prédécesseurs seraient utiles, notamment pour favoriser le rétablissemnt d'un système hématopoiétique diminué à cause d'une maladie ou après une radiothérapie ou une chimiothérapie. II. Mégacaryocytopoi&se - production des plaquettes La régulation de la mégacaryocytopoièse et de la production des plaquettes a été étudiée en détail par Mazur, Exp. Hematol. 15:248 [1987] et par Hoffman, Blood, 74:1196- 1212 [1989]. En bref, des cellules souches pluripotentes de moelle osseuse se différencient en lignées cellulaires mégacaryocytaire, érythrocytaire et myélocytaire. On consi- dère qu'il existe une hiérarchie des cellules progénitrices mégacaryocytaires engagées entre cellules souches et mégaca- ryocytes. On a identifié au moins trois classes de cellules progénitrices mégacaryocytaires, à savoir : des mégacaryo- cytes (BFU-MK), d'unités formant des groupes de cellules, des mégacaryocytes (CFU-MK) d'unités formant des colonies, et des cellules progénitrices de mégacaryocytes de faible densité (LD-CFU-MK). La maturation mégacaryocytaire elle-même est un processus continuel de développement qui a été subdivisé en stades sur la base de critères morphologiques normaux. Le membre le plus rapidement reconnaissable de la famille des mégacaryocytes (MK ou meg) est celui qui appartient aux mégacaryoblastes. Ces cellules ont initialement un diamètre de 20 à 30 Mm, possèdent un cytoplasme basophile et ont un noyau légèrement irrégulier avec de la chromatine lâche, légèrement réticulaire, et plusieurs nucléoles. Plus tard, les mégacaryoblastes peuvent contenir jusqu'à 32 noyaux (polyploides), mais le cytoplasme reste peu abondant et immature. A mesure que la maturation s'accomplit, le noyau devient plus lobulé et pycnotique, le cytoplasme croît en quantité et devient plus acidophile et granulaire. Les cellules les plus matures dans cette famille peuvent donner 'impression de libérer des plaquettes à leur périphérie. Normalement, moins de 10 % de mégacaryocytes sont au stade de cellules blastiques et plus de 50 % sont à maturité. Les classifications morphologiques arbitraires communément appliquées à la série des mégacaryocytes comprennent le mégacaryoblaste pour la forme la plus précoce ; le promégaca- ryocyte ou le mégacaryocyte basophile pour la forme intermé- diaire ; et le mégacaryocyte mature (acidophile, granulaire ou producteur de plaquettes) pour les formes ultimes. Le mégacaryocyte mature étend des filaments de cytoplasme dans des espaces sinusoïdaux o ils se détachent et se fragmentent en plaquettes individuelles (Williams et al., Hematology, 1972). On présume que la mégacaryocytopoièse met en jeu plusieurs facteurs régulateurs (Williams et al., Br. J. Haematol., 52:173 [1982] et Williams et al., J. Cell. Physiol., 110:101 [1982]). On présume que le premier niveau de la mégacaryocytopoièse est mitotique, concernant la prolifération de cellules et l'initiation de colonies à partir de CFU-MK, sans toutefois être affecté par le nombre des plaquettes (Burstein et al., J. Cell. Physiol., 109:333 [1981] et Kimura et al., Exp. Hematol., 13:1048 [1985]). Le dernier stade de la maturation est non mitotique, qui implique une polyploidisation nucléaire et une maturation cytoplasmique et il est probablement régulé dans un mécanisme rétroactif par le nombre des plaquettes périphériques (Odell et al., Blood, 48:765 [1976] et Ebbe et al., Blood, 32:787 [1968]). L'existence d'un facteur distinct et spécifique stimulant les colonies de mégacaryocytes (MK-CSF) a été controversée (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1987]). Toutefois, la plupart des auteurs pensent qu'un processus aussi vital pour la survie que la production de plaquettes devrait être régulé par une ou plusieurs cytokines exclusive- ment responsables de ce processus. L'hypothèse selon laquelle il existe une ou plusieurs cytokines spécifiques des mégaca- ryocytes/plaquettes a constitué la base pendant plus de 30 années de recherche - mais à l'heure actuelle, aucune cytokine de ce genre n'a été purifiée, séquencée et établie par des méthodes expérimentales comme étant un facteur MK-CSF (TPO) unique. Bien qu'il ait été rapporté que des facteurs MK- CSF aient été partiellement purifiés en partant d'une thrombocytopénie déclenchée expérimentalement (Hill et al., Exp. Hematol., 14:752 [1986]) et d'un milieu conditionné de rein d'embryon humain [CM] (McDonald et al., J. Lab. Clin. Med., 85:59 [1975]) et, chez l'homme, en partant d'une anémie plastique et d'extraits urinaires en rapport avec un purpura thrombocytopénique idiopathique (Kawakita et ai., Blood, 6:556 [1983]) et de plasma (Hoffman et al., J. Clin. Invest., 5:1174 [1985]), leur fonction physiologique est jusqu'à présent inconnue dans la plupart des cas. Le milieu conditionné de cellules spléniques activées par le mitogène pokeweed (PWM-SpCM) et la lignée cellulaire myélomonocytaire murine WEHI-3 (WEHI-3CM) ont été utilisés pour la potentialisation des mégacaryocytes. La cellule PWM-SpCM contient des facteurs activant la croissance de CFU-MK (Metcalf et al., Pro. Natl. Acad. Sci., USA, 72:1744-1748 [1975] ; Quesenberry et al., Blood, 65:214 [1985] ; et N.N. Iscove, in Hematopoietic Cell Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, volume 10, publié sous la direction de Golde et al., [New York, Academy Press] pages 37-52 [1978]), dont l'un est 1'interleukine-3 (IL-3), facteur de stimulation des colonies à filiations multiples (multi-CSF [Burstein, Blood Cells, 11:469 [1986]). Les autres facteurs dans ce milieu n'ont pas encore été identifiés ni isolés. La lignée WEHI-3 est une lignée cellulaire myélomonocytaire murine qui sécrète des quantités relativement grandes de IL-3 et des quantités plus petites de GM-CSF. On a trouvé que la IL-3 exaltait la croissance d'une large gamme de cellules hématopoiétiques (Ihle et al., J. Immunol. 13:282 [1983]). On a également trouvé que la IL-3 exerçait une action synergique conjointement avec beaucoup des hormones d'hématopoiétiques ou des facteurs de croissance connus (Bartelmez et al., J. Cell. Physiol., 122:362-369 (1985] et Warren et al., Cell, 46:667- 674 [1988]), comprenant à la fois l'érythropoiétine (EPO) et l'interleukine-1 (IL-1), dans l'induction de précurseurs multipotentiels très précoces et la formation de très grandes colonies hématopoiétiques mixtes. On a trouvé d'autres sources de potentialisation mégacaryocytaire dans les milieux conditionnés de lignées cellulaires murines de poumon, d'os, de macrophages, des cellules d'exsudats péritonéaux et de cellules de rein d'embryon humain. Malgré certaines données contradictoires (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [19871), il existe certai- nes preuves (Geissler et al., Br. J. Haematol., 60:233-238 [1985]) que des lymphocytes T activés, plutôt que des monocytes, jouent un rôle en faveur de la mégacaryocyto- polèse. Ces observations suggèrent que des sécrétions de lymphocytes T activés telles que des interleukines peuvent être des facteurs de régulation dans le développement de MK (Geissler et al., Exp. Hematol., 15:845-853 [1987]). Plu- sieurs études portant sur la mégacaryocytopoièse mettant en jeu de l'érythropoiétine EPO purifiée (Vainchenker et al., Blood, 54:940 [1979] ; McLeod et al., Nature, 261:492-4 [1976] ; et Williams et al., Exp. Hematol., 12:734 [1984]) indiquent que cette hormone produit un effet activateur sur la formation de colonies de MK. Cela a aussi été démontré dans des cultures dépourvues de sérum ainsi que dans des cultures contenant du sérum et en l'absence de cellules accessoires (Williams et al., Exp. Hematol., 12:734 [1984]). On a émis l'hypothèse que l'EPO était impliqué davantage dans le stade monocellulaire et le stade bicellulaire constituant les aspects de la mégacaryocytopolèse par opposition à 'effet de PWM-SpCM qui a été impliqué au stade quadricel- lulaire du développement des mégacaryocytes. L'interaction de tous ces facteurs sur les phases précoce et tardive du développement des mégacaryocytes reste à élucider. Les résultats obtenus dans différents laboratoi- res suggèrent que les seuls facteurs de lignées multiples qui possèdent individuellement une activité de stimulation des colonies de MK sont les facteurs GM-CSF et IL-3 et, à un moindre degré, le facteur IL-6 stimulant les cellules B (Ikebuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:9035 [1987]). Plus récemment, plusieurs auteurs ont rapporté que le facteur IL-11 et le facteur d'inhibition de la leucémie (LIF) exerçaient une action synergique conjointement avec le facteur IL-3 en augmentant la taille et la ploidie des mégacaryocites (Yonemura et al., British Journal of Hemato- logy, 84:16-23 [1993] ; Burstein et al., J. Cell. Physiol., 153:305-312 [1992] ; Metcalf et al., Blood, 76:50-56 [1990] ; Metcalf et al., Blood, 77:2150-2153 [1991] ; Bruno et al., Exp. Hematol., 19:378-381 [1991] ; et Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]). D'autres documents intéressants comprennent : Eppstein et al., brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 962 091 ; Chong, brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 879 111 ; Fernandes et al., brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 604 377 ; Wissler et al., brevet des Etats30 Unis d'Amérique NO 4 512 971 ; Gottlieb, brevet des Etats- s d'Amérique N 4 468 379 ; Bennett et al., brevet des Etats-Unis d'Amérique NI 5 215 895 ; Kogan et al., brevet des Etats-Unis d'Amérique N 5 250 732 ; Kimura et al., Eur. J. Immunol., 20(9):1927-1931 [1990] ; Secor et al, J. of Immunol., 144(4):1484-1489 [1990] ; Warren et al. J. of Immunol., 140(1):94-99 [1988] ; Warren et al., Exp. Hematol., 17(11):1095-1099 [1989] ; Bruno et al., Exp. Hematol., 17(10):1038-1043 [1989] ; Tanikawa et al., Exp. Hematol., 17(8):883-888 [1989] ; Koike et al., Blood, 75(12):2286-2291 [1990] ; Lotem, Blood, 75(5):1545-1551 [1989] ; Rennick et al., Blood, 73(7):1828-1835 [1989] ; et Clutterbuck et al., Blood, 73(6):1504-1512 [1989]. III. Thrombocytopinie Les plaquettes sont les éléments déterminants du mécanisme de coagulation du sang. La déplétion du taux de plaquettes en circulation, appelée thrombocytopénie, accompa- gne divers états et troubles cliniques. La thrombocytopénie est communément définie comme représentant un taux de plaquettes inférieur à 150 x 109 par litre. Les principales causes de thrombocytopénie peuvent être grossièrement divisées en trois catégories sur la base de la durée de vie des plaquettes, à savoir : (1) l'altération de la production des plaquettes par la moelle osseuse, (2) la séquestration des plaquettes dans la rate (splénomégalie), ou (3) l'accen- tuation de la destruction des plaquettes dans la circulation périphérique (par exemple thrombocytopénie auto-immune ou chimiothérapie et radiothérapie) . En outre, chez des patients qui reçoivent de grands volumes de produits sanguins pauvres en plaquettes, administrés rapidement, une thrombocytopénie peut se développer par suite de la dilution. Les manifestations hémorragiques cliniques de la thrombocytopénie dépendent de la gravité de la thrombocytopé- nie, de sa cause et des défauts de coagulation qui peuvent y être associés. En général, des patients ayant des taux de plaquettes entre 20 et 100 x 109 par litre risquent une hémorragie post-traumatique excessive, tandis que ceux dont les taux de plaquettes sont inférieurs à 20 x 109 par litre peuvent présenter une hémorragie spontanée. Ces derniers patients sont candidats à la transfusion de plaquettes avec le risque immunitaire et viral qui s'y rapporte. Pour tout degré donné de thrombocytopénie, l'hémorragie tend à être plus sévère lorsque la cause est une production réduite que lorsqu'il s'agit d'une accentuation de la destruction des plaquettes. Dans ce dernier cas, une reconstitution accélérée es plaquettes met en circulation des plaquettes plus jeunes, plus grandes et plus efficaces au plan hémostatique. La thrombocytopénie peut résulter de divers troubles brièvement décrits ci-dessous. Une description plus détaillée peut être trouvée dans A.I. Schafner, "Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function", Internal Medicine, 3ème édition, publié sous la direction de John J. Hutton et al., Little Brown and Co. Boston/Toronto/Londres [1990]. (a) Thrombocytopénie due à une anomalie de production des plaquettes Les causes de thrombocytopénie congénitale comprennent l'anémie aplastique constitutionnelle (syndrome de Fanconi) et la thrombocytopénie amégacaryocytaire congéni- tale, qui peut être associée à des malformations du squelet- te. Les troubles acquis de la production des plaquettes sont causés par hypoplasie de mégacaryocytes ou par une thrombo- polèse inefficace. Une hypoplasie mégacaryocytaire peut résulter de divers états, comprenant une aplasie médullaire (englobant les formes idiopathiques ou myélosuppression par des agents chimiothérapeutiques ou par radiothérapie), la myélofibrose, la leucémie et l'invasion de la moelle osseuse par une tumeur métastatique ou des granulomes. Dans certains cas, des toxines, des agents infectieux ou des médicaments peuvent interférer de façon relativement sélective avec la thrombopoièse ; des exemples comprennent les thrombocytopé- nies transitoires causées par l'alcool et par certaines infections virales et la thrombocytopénie modérée associée à l'administration de diurétiques du type de thiazides. Enfin, une thrombopoièse inefficace accompagnant comme effet secondaire des processus mégaloblastiques (carence en folate ou B12) peut aussi provoquer une thrombocytopénie, s'accompa- gnant habituellement d'anémie et de leucopénie. Le traitement habituel de thrombocytopénies dues à une réduction 'de la production des plaquettes repose sur l'identification et les causes antécédentes de l'insuffisance médullaire. Les transfusions de plaquettes sont habituelle- ment réservées à des patients atteints de complications hémorragiques graves, ou en couverture pendant des interven- tions chirurgicales, attendu qu'une iso-immunisation peut amener le patient à être réfractaire à des transfusions ultérieures de plaquettes. Un saignement des muqueuses résultant d'une thrombocytopénie sévère peut être atténué par l'administration orale ou intraveineuse des agents antifibri- nolytiques. Des complications thrombotiques peuvent toutefois se développer si des agents antifibrinolytiques sont utilisés chez des patients présentant une coagulation intravasculaire disséminée (DIC). (b) Thrombocytopénie due à une séquestration splénique Une splénomégalie due à toute cause peut être associée à une thrombocytopénie allant de faible à modérée. Il s'agit d'un processus grandement passif (hypersplénisme) de séquestration splénique des plaquettes, en contraste avec la destruction active des plaquettes par la rate dans des cas de thrombocytopénie à médiation immunitaire commentée ci- dessous. Bien que la cause la plus courante de l'hyper- splénisme soit la splénomégalie congestive résultant d'une hypertension portale due à une cirrhose alcoolique, d'autres formes de splénomégalie congestive, infiltrante ou lymphopro- liférative sont aussi associées à la thrombocytopénie. Les taux de plaquettes ne tombent généralement pas en dessous de 50 x 10' par litre comme seule conséquence d'un hypersplénisme. (c) Thrombocytopénie due à une destruction des plaquettes sans médiation immunitaire La thrombocytopénie peut résulter d'une destruction accélérée de plaquettes par divers processus non immunologiques. Des troubles de ce type comprennent la coagulation intravasculaire disséminée, la présence de prothèses intravasculaires, la circulation extracorporelle du ang, et des microangiopathies thrombotiques telles que le purpura thrombocytaire thrombotique. Dans toutes ces situa- tions, des plaquettes en circulation qui sont exposées à des surfaces artificielles ou à des tuniques vasculaires anor- males sont consommées au niveau de ces sites ou sont endomma- gées puis prématurément éliminées par le système réticulo- endothélial. Des états pathologiques ou des troubles dans lesquels une coagulation intravasculaire disséminée (DIC) peut se manifester sont décrits de façon très détaillée dans Harrison's Principles of Internal Medicine, 11ème édition, page 1478, publié sous la direction de Braunwald et al., McGraw Hill [1987]. Des prothèses intravasculaires, compre- nant des valves cardiaques et des ballonnets intra-aortiques, peuvent provoquer une thrombocytopénie destructive faible à modérée, et une thrombocytopénie transitoire chez des patients subissant un pontage cardiopulmonaire ou une hémo- dialyse peut résulter de la consommation ou de l'altération de plaquettes dans le circuit extra-corporel. (d) Thrombocytopénie immune induite par médica- ments Plus de 100 médicaments ont été impliqués dans la thrombocytopénie sous médiation immunologique. Toutefois, seule la quinidine, la quinine, l'or, les sulfamides, la céphalothine et l'héparine ont été bien caractérisés. La thrombocytopénie induite par médicaments est fréquemment très sévère et apparait normalement de façon précipitée dans la période o les patients absorbent la médication sensibili- sante. (e) Purpura thrombocytopénique immun (auto-immun) (ITP) L'ITP chez des adultes est une maladie chronique caractérisée par une destruction auto-immune des plaquettes. L'auto-anticorps est habituellement une IgG, bien que d'autres immunoglobulines aient aussi été rapportées. Bien qu'on ait constaté que l'auto-anticorps de 1'ITP était ssocié à la membrane plaquettaire GPIIbIII., la spécificité à l'égard de l'antigène plaquettaire n'a pas été identifiée dans la plupart des cas. Une destruction extravasculaire des plaquettes sensibilisées a lieu dans le système réticulo- endothélial de la rate et du foie. Bien que plus de la moitié des cas d'ITP soit idiopathique, de nombreux patients ont des maladies rhumatismales ou auto-immunes (par exemple lupus érythémateux systémique) ou des troubles lymphoprolifératifs (par exemple leucémie lymphocytaire chronique) sous-jacents. (f) ITP induit par le virus du syndrome immunodé- ficitaire acquis, HIV L'ITP est une complication de plus en plus courante de l'infection à HIV (Morris et al., Ann. Intern. Med., 96:714-717 [1982]), et peut apparaître à tous les stades de l'évolution de la maladie, tant chez des patients chez lesquels le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) a été diagnostiqué que chez des patients présentant des symptômes complexes apparentés au SIDA et des patients présentant une infection par le virus HIV, mais sans sympt8- mes de SIDA. L'infection par HIV est une maladie transmissi- ble caractérisée au stade final par une profonde déficience de la. fonction immunitaire des cellules de même que par l'apparition d'une infection à germes opportunistes et d'une malignité. L'anomalie immunologique primaire résultant de l'infection par le virus HIV est la déplétion progressive et l'altération fonctionnelle des lymphocytes T exprimant la glycoprotéine de surface cellulaire CD4 (Lane et al., Ann. Rev. Immunol., 3:477 [1985]). La perte de fonction des cellules T auxiliaires/inductrices de CD4 est probablement à l'origine des profondes anomalies de l'immunité cellulaire et humorale menant à des infections par germes opportunistes et à des malignités caractéristiques du SIDA (H. Lane, supra). Bien que le mécanisme de 1'ITP associé au virus HIV ne soit pas connu, on supposequ'il est différent du mécanisme de 1'ITP non associé à une infection à HIV (Walsh et al., N. Eng. J. Med., 311:635-639 [1984] ; et Ratner, Am. J. Med., 86:194-198 [1989]). IV. Thérapie courante de la thrombocytopinie L'approche thérapeutique du traitement de patients atteints de thrombocytopénie est dictée par la gravité et l'urgence de la situation clinique. Le traitement est similaire pour la thrombocytopénie associée au virus HIV et la thrombocytopénie sans rapport avec le virus HIV, et bien qu'un certain nombre d'approches thérapeutiques diffé- rentes aient été pratiquées, la thérapie reste sujette à controverses. Les taux de plaquettes chez des patients chez lesquels une thrombocytopénie a été diagnostiquée ont été élevés avec succès par la thérapie aux glucocorticoides (par exemple prednisolone), toutefois chez la plupart des pa- tients, la réponse n'est pas complète ou bien une récidive apparaît lorsque la dose de glucocorticoides est réduite ou lorsque son administration est interrompue. D'après les études effectuées sur des patients atteints d'JTP associé au virus HIV, certains chercheurs ont suggéré que la thérapie par les glucocorticoides pouvait entraîner une prédisposition au SIDA. Les glucocorticoides sont habituellement administrés si le taux de plaquettes tombe au-dessous de 20 x 109/litre ou lorsqu'un saignement spontané apparaît. Pour des patients réfractaires aux glucocorti- coides, le composé : 4(2-chlorophényl) -9-méthyl-2- [3- (4-morpholinyl) -3-propanone1-yl]6H-thiéno[3,2,f] [1l,2,4]triazolo[4,3,a] [1,4]diazépine (WEB 2086) a été utilisé avec succès pour traiter un cas sévère d'ITP non associé au virus HIV. Un patient présentant des taux de plaquettes de 37 000-58 000/~1 a été traité au WEB 2086 et au bout d'un traitement d'une à deux semaines, les taux de plaquettes se sont élevés à 140 000-190 000/1 (brevet européen NO 361 077 et Lobman et al., Lancet, 1147 [1988]). ien que le traitement optimal du purpura thrombocytopénique amégacaryocytaire acquis (AATP) soit aléatoire, il a été démontré que la globuline antithymocy- taire (ATG), antisérum de cheval contre le tissu de thymus humain, produisait une rémission complète prolongée (Trimble et al., Am. J. Hematol., 37:126-127 (1991]). Toutefois, une publication récente indique que les effets hématopoiétiques de 1'ATG sont attribuables au thimérosal, là o vraisembla- blement la protéine agit comme un véhicule de mercure (Pannela et al., Cancer Research, 50:4429-4435 [1990]). De bons résultats grâce à la splénectomie ont été rapportés. La splénectomie élimine le site principal de destruction des plaquettes et la principale source de production d'auto-anticorps chez de nombreux patients. Cette mesure entraîne des rémissions prolongées sans traitement chez de très nombreux patients. Toutefois, étant donné que des opérations chirurgicales doivent généralement être évitées chez des patients dont l'immunité est altérée, une splénectomie n'est recommandée que dans des cas sévères de thrombocytopénie (par exemple en cas d'ITP sévère associé à 1'HIV) chez des patients qui ne répondent pas à un traitement de deux à trois semaines aux glucocorticoides ou qui n'obtiennent pas de réponse soutenue après l'interruption de l'administration des glucocorticoides. Dans l'état actuel des connaissances scientifiques, rien ne prouve que la splénecto- mie prédispose des patients au SIDA. En plus de la thérapie à la prednisolone et de la splénectomie, certains agents cytotoxiques, par exemple la vincristine et l'azidothimidine (AZT, zidovudine) se montrent également prometteurs dans le traitement de 1'ITP induit par le virus HIV; toutefois, les résultats sont préliminaires. Il ressort de ce qui précède qu'un moyen de traiter la thrombocytopénie serait d'obtenir un agent capable d'accélérer la différenciation et la maturation de mégacaryo- cytes ou de leurs précurseurs en la forme productrice de laquettes. Des efforts considérables ont été déployés pour identifier un tel agent, communément appelé "thrombopoiétine" (TPO). D'autres noms que l'on rencontre couramment dans la littérature pour la TPO comprennent : le facteur stimulant la thrombocytopoièse (TSF), le facteur stimulant les colonies de mégacaryocytes (MK-CSF), le facteur stimulant les mégacaryo- cytes et l'agent de potentialisation des mégacaryocytes. L'activité de la TPO a été observée dès 1959 (Rak et al., Med. Exp., 1:125) et les tentatives de caractérisation et de purification de cet agent ont été poursuivies jusqu'à ce jour. Bien qu'il existe des comptes-rendus de purification partielle de polypeptides à activité de TPO (voir, par exemple Tayrien et al., J. Biol. Chem., 262:3262 [1987] et Hoffman et al., J. Clin. Invest. 75:1174 [1985]), d'autres ont émis l'hypothèse que la TPO n'était pas une entité distincte en elle-même mais plutôt une simple manifestation polyfonctionnelle d'une hormone connue (IL-3, Sparrow et al., Prog. Clin. Biol. Res., 215:123 [1986]). Quelle que soit sa forme ou son origine, une molécule possédant une activité thrombopoiétique offrirait une valeur thérapeutique impor- tante. Bien qu'aucune protéine n'ait été identifiée sans ambiguité comme étant la TPO, un intérêt considérable entoure la récente mise en évidence du fait que le mpl, récepteur présumé de cytokine, pouvait être le transducteur d'un signal thrombopoiétique. V. Le mpl est un récepteur de cytokine megacaryocytopoi&tique On considère que la prolifération et la matura- tion de cellules hématopolétiques sont sous la dépendance étroite de facteurs qui modulent positivement ou négativement la prolifération de cellules souches pluripotentielles et la différenciation entre lignées multiples. Ces effets sont sous la médiation de la liaison par haute affinité de facteurs protéiques extracellulaires à des récepteurs spécifiques de la surface des cellules. Ces récepteurs de la surface des cellules partagent une homologie considérable et sont énéralement classés comme membres de la superfamille des récepteurs de cytokine. Des membres de la superfamille comprennent des récepteurs pour : IL-2 (chaînes j et y) (Hatakeyama et al., Science, 244:551-556 [1989] ; Takeshita et al., Science, 257:379-382 [1991]), IL-3 (Itoh et al, Science, 247:324-328 [1990] ; Gorman et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 87:5459-5463 [1990] ; Kitamura et al., Cell, 66:1165-1174 [1991a] ; Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5082-5086 [1991b]), IL-4 (Mosley et al., Cell, 59:335-348 [1989], IL-5 (Takaki et al., EMBO J. 9:4367-4374 [1990] ; Tavernier et al., Cell, 66:1175-1184 [1991]), IL-6 (Yamasaki et al., Science, 241:825-828 [1988] ; Hibi et al., Cell, 63:1149-1157 [1990]), IL-7 (Goodwin et al., Cell, 60:941-951 [1990]), IL-9 (Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5690-5694 [1992]), facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM-SCF) (Gearing et al. EMBO J., 8:3667-3676 [1991] ; Hayashida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 244:9655-9659 [1990]), facteur stimulant les colonies de granulocytes (G-CSF) (Fukunaga et al., Cell, 61:341-350 [1990a] ; Fukunaga et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8702-8706 (1990b] ; Larsen et al. J. Exp. Med., 172:1559-1570 [1990] ; EPO (D'Andrea et al., Cell, 57:277-285 [1989] ; Jones et al., Blood, 76:31-35 [1990]), facteur inhibiteur de leucémie (LIF) (Gearing et al., EMBO J., 10:2839-2848 [1991]), oncostatine M (OSM) (Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8641-8645 [1991]) ainsi que des récepteurs de prolactine (Boutin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7744-7748 [1988] ; Edery et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86-2112-2116 [1989]), hormone de croissance (GH) (Leung et al., Nature, 330:537-543 [1987]) et facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) (Davis et al., Science, 253:59-63 [1991]. Des membres de la superfamille des récepteurs de cytokine peuvent être groupés en trois catégories fonction- nelles (pour une vue d'ensemble, voir Nicola et al., Cell, 67:1-4 [1991]). La première classe comprend des récepteurs à chaîne unique tels que le récepteur d'érythropoiétine (EPO-R) ou le récepteur du facteur stimulant les colonies de granulo- cytes (G-CSF-R), qui fixe le ligand de haute affinité par le domaine extracellulaire et engendre ainsi un signal intracel- lulaire. Une deuxième classe de récepteurs, que l'on appelle sous-unités a, comprend le récepteur d'interleukine-6 (IL6-R), le récepteur du facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF-R), le récepteur d'interleu- kine-3 (IL-3-Ra) et d'autres membres de la superfamille des récepteurs de cytokine. Ces sous-unités a fixent le ligand de faible affinité mais ne peuvent pas accomplir la transduction d'un signal intracellulaire. Un récepteur de haute affinité capable de transduction de signaux est engendré par un hétérodimère entre une sous-unité a et un membre d'une troisième classe de récepteurs de cytokine, appelés sous- unités À, par exemple Oc, sous-unité 6 commune aux trois sous-unités a IL3-Ra et GM-CSF-R. La preuve de ce que le mpl est un membre de la superfamille des récepteurs de cytokine vient de l'homologie de séquence (Gearing, EMBO J., 8:3667-3676 [1988] ; Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6834-6938 [1990] ; Davis et al., Science, 253:59-63 [1991] et Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5640-5644 [1992]) et de son aptitude à la transduction de signaux prolifératifs. La séquence de la protéine déduite du clonage moléculaire de c-mpl de souris révèle que cette protéine est l'homologue d'autres récepteurs de cytokine. Le domaine extracellulaire contient 465 résidus d'aminoacides et est composé de deux domaines secondaires avec chacun quatre cystéines hautement conservées et un motif particulier dans le domaine secondaire N-terminal et dans le domaine secon- daire C-terminal. On peut prévoir que les domaines extra- cellulaires de fixation des ligands ont des géométries structurales similaires à double feuillet f en cylindre. Ce domaine extracellulaire doublé est très homologue avec la haîne de transduction de signaux commune aux récepteurs IL-3, IL-5 et GM-CSF ainsi qu'aux domaines de liaison de faible affinité de LIF (Vigon et al., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]). Ainsi, le mpl peut appartenir à la classe de liaison aux ligands de faible affinité des récepteurs de cytokine. Une comparaison du mpl murin et du mpl humain mature P révèle que ces protéines présentent une identité de séquence de 81 %. Plus particulièrement, les sous-domaines extracellulaires de l'extrémité terminale N et de l'extrémité terminale C partagent respectivement 75 % et 80 % de l'iden- tité de séquence. La région de mpl qui est le plus conservée est le domaine cytoplasmique montrant 91 % d'identité des aminoacides, avec identité d'une séquence de 37 résidus près du domaine transmembranaire dans les deux espèces. En conséquence, le mpl est rapporté comme étant l'un des membres le plus conservés de la superfamille des récepteurs de cytokine (Vigon, supra). La preuve de ce que le mpl est un récepteur fonctionnel capable de transduction d'un signal prolifératif résulte de la construction de récepteurs chimériques conte- nant un domaine extracellulaire provenant d'un récepteur de cytokine ayant une grande affinité pour une cytokine connue avec le domaine cytoplasmique mpl. Etant donné qu'aucun ligand connu pour le mpl n'a été rapporté, il était néces- saire de construire le domaine extracellulaire chimérique de liaison d'un ligand de haute affinité à partir d'un récepteur de cytokine de la première classe tel que IL-4R ou G-CSFR. Vigon et al., supra, ont soudé le domaine extracellulaire de G-CSFR avec le domaine transmembranaire ainsi que le domaine cytoplasmique de c-mpl. Une lignée cellulaire dépendant de IL-3, à savoir la lignée BAF/B03 (Ba/F3), a été transfectée avec la chimère G-CSFR/mpl en même temps qu'un témoin G-CSFR de longueur entière. Les cellules transfectées avec la chimère se sont développées également bien en présence de cytokine IL-3 ou G-CSF. De même, des cellules transfectées vec le récepteur G-CSFR se sont également bien développées dans IL-3 ou G-CSF. Toutes les cellules sont mortes en l'absence de facteurs de croissance. Une expérience similaire a été conduite par Skoda et al. EMBO J., 12(7):2645-2652 [1993], dans laquelle les deux domaines extracellulaire et transmembranaire de récepteur IL-4 humaine (hIL-4-R) ont été soudés au domaine cytoplasmique de mpl de souris, et trans- fectés dans une lignée cellulaire murine Ba/F3 dépendante de IL-3. Des cellules Ba/F3 transfectées avec le récepteur hIL- 4-R de type sauvage ont proliféré normalement en présence de IL-4 ou de IL-3 spécifique de l'espèce. Des cellules Ba/F3 transfectées avec hIL-4R/mpl ont proliféré normalement en présence de hIL-4 (en présence ou en l'absence de IL-3), démontrant ainsi que dans des cellules Ba/F3, le domaine cytoplasmique mpl contient tous les éléments nécessaires à la transduction d'un signal prolifératif. Ces expériences chimériques démontrent la capacité de tranduction de signaux de prolifération du domaine cytoplasmique mpl mais sont muettes pour ce qui est de savoir si le domaine extracellulaire mpl peut ou non fixer un ligand. Ces résultats concordent avec au moins deux possibilités, à savoir, le mpl est un récepteur à chaîne unique (classe un) comme EPO-R ou G-CSFR ou bien il s'agit d'une sous-unité 0 de transduction de signaux (classe trois) nécessitant une sous-unité a comme IL-3 (Skoda et al., supra). VI. Le ligand de mpl est une thraombopoaitine (TPO) Comme décrit ci-dessus, il a été suggéré que le sérum contient un facteur unique, parfois appelé thrombo- polétine (TPO), qui exerce une action synergique avec diverses autres cytokines en activant la croissance et la maturation de mégacaryocytes. Aucun facteur naturel de ce genre n'a jamais été isolé du sérum ou de toute autre source même si des efforts considérables ont été déployés par de nombreux groupes. Bien qu'on ignore si le mpl est capable ou on de fixer directement un facteur de stimulation des mégacaryocytes, des expériences récentes ont démontré que le mpl était impliqué dans la transduction de signaux proliféra- tifs à partir d'un ou plusieurs facteurs rencontrés dans le sérum de patients possédant de la moelle osseuse aplastique (Methia et al., Blood, 82(5):1395-1401 [1993]). La preuve de ce qu'un facteur sérique unique formant des colonies, distinct de IL-la, IL-3, IL-4, IL-6, IL-11, SCF, EPO, G-CSF et GM-CSF accomplit la transduction d'un signal prolifératif par l'intermédiaire de mpl résulte de l'examen de la distribution de l'expression de c-mpl dans des lignées cellulaires hématopolétiques primitives et engagées et d'études d'antisens mpl dans une ou plusieurs de ces lignées cellulaires. En utilisant la transcriptase inverse (RT)-PCR dans des cellules hématopolétiques humaines immunopurifiées, Methia et al., supra, ont démontré que des messages accentués d'ARNm de mpl ne se rencontraient que dans des cellules purifiées CD34', des mégacaryocytes et des plaquettes. Les cellules CD34' purifiées provenant de moelle osseuse (BM) représentent environ 1 % de la totalité des cellules de moelle osseuse et sont enrichies en progéniteurs primitifs et engagés de toutes lignées (par exemple érythrocytaire, granulomacrophage et mégacaryocytaire). Il a été démontré que des oligodésoxynucléotides antisens mpl supprimaient la formation de colonies mégacaryo- cytaires à partir de cellules CD34' pluripotentes cultivées dans du sérum provenant de patients possédant une moelle aplastique (source riche en activité stimulant les colonies mégacaryocytaires [MK-CSA]). Ces mêmes oligodésoxynucléotides antisens n'ont eu aucun effet sur la formation de colonies d'érythrocytes ou de granulomacrophages. On ignorait encore si le mpl directement lié à un ligand et si le facteur sérique présenté comme cause de la mégacaryocytopoièse agissaient par l'intermédiaire de mpl. Toutefois, il a été suggéré que si le mpl se liait directe- ment à un ligand, sa séquence d'aminoacides était susceptible d'être hautement conservée et d'avoir une réactivité croisée entre espèces à cause de l'identité considérable de séquence entre domaines extracellulaires mpl humain et murin (Vigon et al., supra [1993]). VII. Objets Compte tenu des indications qui précèdent, il y a lieu de remarquer qu'un besoin technique actuel et perma- nent existe de pouvoir isoler et identifier des molécules capables de stimuler la prolifération, la différenciation et la maturation de cellules hématopolétiques, notamment de mégacaryocytes ou de leurs prédécesseurs en vue d'un usage thérapeutique dans le traitement de la thrombocytopénie. On considère qu'une telle molécule est un ligand mpl et il existe donc en outre le besoin d'isoler un tel ligand ou des ligands similaires afin d'évaluer leur rôle dans la crois- sance et la différenciation cellulaires. En conséquence, l'un des buts de la présente invention est d'obtenir une molécule pharmaceutiquement pure capable de stimuler la prolifération, la différenciation et/ou la maturation de mégacaryocytes en la forme mature produisant des plaquettes. Un autre but de la présente invention est de présenter la molécule sous une forme qui convienne pour l'usage thérapeutique dans le traitement d'un trouble hématopoiétique, notamment de la thrombocytopénie. La présente invention a en outre pour but d'isoler, de purifier et d'identifier spécifiquement des ligands protéiques capables de se lier in vivo à un récepteur de la superfamille des cytokines appelé mpl et d'effectuer la transduction d'un signal prolifératif. Un autre but est de trouver des molécules d'acides nucléiques codant de tels ligands protéiques et d'utiliser ces molécules d'acides nucléiques pour produire es ligands de liaison de mpl dans une culture cellulaire recombinante à des fins diagnostiques et thérapeutiques. L'invention a en outre pour but de trouver des dérivés et des formes modifiées des ligands protéiques comprenant des variants de la séquence d'aminoacides, des formes de glycoprotéines des variants et leurs dérivés de covalence. Un autre but de l'invention est de trouver des formes de polypeptides fusionnées combinant un ligand mpl et une protéine hétérologue et ses dérivés de covalence. L'invention a en outre pour but de trouver des formes polypeptidiques de variants associant un ligand mpl à des additions d'aminoacides et à des substitutions d'amino- acides de la séquence EPO pour produire une protéine capable de réguler la prolifération et la croissance à la fois de plaquettes et de progéniteurs de globules rouges du sang. L'invention a en outre pour but de préparer des immunogènes afin de créer des anticorps contre des ligands mpl ou leurs formes fusionnées, ainsi que d'obtenir des anticorps capables de fixer ces ligands. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre. L'invention parvient aux buts qu'elle s'est proposé d'atteindre en créant une protéine isolée de mammi- fère activant la prolifération et la maturation mégacaryocy- topolétiques, appelée "ligand de mpl" (ML) ou "thrombo- poiétine" (TPO) capable de stimuler la prolifération, la maturation et/ou la différenciation de mégacaryocytes en la forme mature produisant des plaquettes. On utilisera aussi indifféremment l'expression "ligand mpl". Cette protéine principalement homogène peut être purifiée à partir d'une source naturelle par un procédé comprenant : (1) la mise en contact de plasma de départ contenant les molécules de ligand mpl devant être purifiées avec un polypeptide récepteur immobilisé, plus particulièrement un polypeptide mpl ou un polypeptide fusionné mpl immobilisé sur un support, dans des conditions dans lesquel- les les molécules de ligand mpl devant être purifiées sont adsorbées sélectivement sur le polypeptide récepteur immobi- lisé, (2) le lavage du polypeptide récepteur immobilisé et de son support pour éliminer la matière non adsorbée et (3) l'élution des molécules de ligand mpl, à l'aide d'un tampon d'élution, du polypeptide récepteur immobilisé auquel elles sont fixées par adsorption. La source naturelle est avanta- geusement du plasma ou de l'urine de mammifère contenant le ligand mpl. A titre facultatif, le mammifère est aplastique et le récepteur immobilisé est une fusion mpl-IgG. La protéine favorisant la prolifération et la maturation mégacaryocytopoiétiques peut être avantageusement un polypeptide ligand mpl isolé principalement homogène obtenu par des moyens de synthèse et par recombinaison. Le polypeptide "ligand mpl# ou "TPO" de la présente invention a avantageusement une identité globale de séquence d'au moins 70 % avec la séquence d'aminoacides du polypeptide ligand mpl de porc principalement homogène hautement purifié et au moins 80 % d'identité de séquence avec le "domaine EPO" du polypeptide ligand mpl de porc. Le ligand mpl de la présente invention peut être un ligand mpl humain (hML) mature, ayant la séquence mature d'aminoacides présentée sur la figure 1 (SEQ ID NO : 1) ou un variant ou une forme modifiée après transcription de cette séquence ou une protéine ayant enviorn 80 % d'identité de séquence avec le ligand mpl humain mature. Le variant de ligand mpl est éventuellement un fragment, notamment un fragment amino- terminal ou de "domaine EPO" du ligand mpl humain mature (hML). Le fragment amino-terminal garde la quasi-totalité de la séquence ML humaine entre les premier et quatrième résidus de cystéine, mais il peut contenir des additions, des délétions ou des substitutions importantes extérieurement à cette région. Conformément à cette forme de réalisation, le polypeptide fragmentaire peut être représenté par la for- mule : X-hML (7-151) -Y dans laquelle hML(7-151) représente la séquence d'aminoacides de TPO (hML) humain allant de Cys' à Cysll inclus ; X représente le groupe amino de Cys7 ou bien un ou plusieurs des résidus d'aminoacides amino-terminaux du ligand hML mature ou des extensions de résidus d'aminoacides jusqu'à ce ligand, telles que Met, Tyr ou des séquences leader contenant par exemple des sites de clivage protéolytique (par exemple le facteur Xa ou thrombine) ; et Y représente le groupe carboxy terminal de Cys'51 ou un ou plusieurs résidus d'amino- acides carboxy-terminaux du ligand hML mature ou des exten- sions correspondantes. Le cas échéant, le polypeptide ligand mpl ou son fragment peut être fusionné avec un polypeptide hétérologue (chimère). Un polypeptide hétérologue apprécié est une cytokine, un facteur stimulant les colonies ou une interleu- kine ou un fragment correspondant, en particulier un ligand- kit (KL), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF ou LIF. Un polypeptide hétérologue facultatif apprécié est une chaîne d'immunoglobuline, notamment d'IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD, IgM humaines ou un fragment correspondant, compre- nant en particulier le domaine constant d'une chaîne lourde d'IgG. Selon un autre de ses aspects, l'invention propose une composition comprenant un agoniste de mpl isolé qui est biologiquement actif et qui est avantageusement capable de stimuler l'incorporation de nucléotides marqués (par exemple 3H-thymidine) à l'ADN de cellules Ba/F3 dépen- dant de IL-3 transfectées avec du mpl humain. L'agoniste de mpl peut être le ligand mpl biologiquement actif et est avantageusement capable de stimuler l'incorporation de 35S aux plaquettes en circulation dans un essai de rebondissement sur des plaquettes de souris. Des agonistes de mpl convenables comprennent hML153, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML et pML2 ou leurs fragments. Dans une autre forme de réalisation, la présente invention propose un anticorps isolé capable de se lier au ligand mpl. L'anticorps isolé capable de liaison au ligand mpl peut facultativement être soudé à un second polypeptide et l'anticorps ou sa forme fusionnée peut être utilisée pour isoler et purifier le ligand mpl d'une source du type décrit ci-dessus pour le mpl immobilisé. Selon un autre aspect de cette forme de réalisation, l'invention propose une méthode de détection du ligand mpl in vitro ou in vivo, qui comprend les étapes consistant à faire entrer l'anticorps en contact avec un échantillon, notamment un échantillon de sérum, suspecté de contenir le ligand et à détecter si une liaison a eu lieu. Dans encore d'autres formes de réalisation, l'invention propose une molécule isolée d'acide nucléique d'acide nucléique, codant le ligand mpl ou ses fragments, cette molécule d'acide nucléique pouvant facultativement être marquée avec un groupement détectable, et une molécule d'acide nucléique ayant une séquence qui est complémentaire d'une molécule d'acide nucléique ayant une séquence codant pour un ligand mpl, ou qui s'hybride dans des conditions allant de modérées à très rigoureuses, avec cette molécule d'acide nucléique. Des molécules d'acide nucléique appréciées sont celles qui codent le ligand mpl humain, porcin et murin et comprennent l'ARN et l'ADN, tous deux génomiques, et 1'ADNc. Selon encore un autre aspect de cette forme de réalisation, la molécule d'acide nucléique est un ADN codant le ligand mpl et comprend en outre un vecteur réplicable auquel l'ADN est rattaché d'une manière pratique pour influencer des séquences reconnues par un hôte transformé avec le vecteur. L'ADN est facultativement de l'ADNc ayant la séquence 5'-3' (SEQ ID N 2), 3'-5' présentée sur la figure 1 ou un fragment de cette séquence. Cet autre aspect comprend des cellules-hôtes, de préférence des cellules CHO, transfor- mées avec le vecteur et un procédé d'utilisation de l'ADN pour effectuer la production de ligand mpl, qui consiste avantageusement à exprimer d'ADNc codant le ligand mpl dans une culture des cellules-hôtes transformées et à recueillir le ligand mpl des cellules-hôtes ou de la culture de cel- lules-hôtes. Le ligand mpl préparé de cette manière est avantageusement du ligand mpl humain. L'invention concerne en outre un procédé de traitement d'un mammifère atteint de trouble hématopolétique, notamment de thrombocytopénie, qui consiste à administrer une quantité thérapeutiquement efficace d'un ligand mpl au mammifère. Le ligand mpl peut être administré en association avec une cytokine, notamment un facteur stimulant les colonies ou une interleukine. Des facteurs appréciés stimu- lant les colonies ou des interleukines appréciées comprennent le ligand-kit (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 et IL-11. L' invention concerne en outre un procédé pour isoler et purifier la TPO (ML) à partir d'un micro-organisme producteur de TPO, qui comprend les étapes consistant : (1) à rompre ou à lyser des cellules contenant la TPO, (2) à séparer facultativement la matière soluble de la matière insoluble contenant la TPO, (3) à solubiliser la TPO contenue dans la matière insoluble à l'aide d'un tampon solubilisant, (4) à séparer la TPO solubilisée du reste de la matière soluble et insoluble, (5) à replier la TPO dans un tampon redox, et (6) à séparer la TPO convenablement pliée de la TPO mal pliée. Le procédé permet la solubilisation de matière insoluble contenant de la TPO avec un agent chaotrope, cet agent chaotrope étant choisi entre un sel de guanidine, le thiocyanate de sodium ou l'urée. Le procédé permet en outre de séparer la TPO solubilisée de la matière soluble et insoluble restante, par une ou plusieurs étapes choisies entre centrifugation, filtration sur gel et chromatographie à phase inversée. L'étape de repliement du procédé prévoit un tampon redox contenant à la fois un agentoxydant et un agent réducteur. En général, l'agent oxydant est de l'oxygène ou un composé contenant au moins une liaison disulfure et l'agent réducteur est un composé contenant au moins un groupe sulfhydryle libre. L'agent oxydant est avantageusement choisi entre le glutathion oxydé (GSSG) et la cystine et l'agent réducteur est choisi entre le glutathion réduit (GSH) et la cystéine. De préférence, l'agent oxydant consiste en gluta- thion oxydé (GSSG) et l'agent réducteur est du glutathion réduit (GSH). Il est également apprécié que la proportion molaire d'agent oxydant soit égale ou supérieure à celle de l'agent réducteur. Le tampon redox contient en outre un détergent, avantageusement choisi entre les substances CHAPS et CHAPSO, présentes dans une proportion d'au moins 1 %. Le tampon redox contient en outre du NaCl de préférence dans une plage de concentrations d'environ 0,1 à 0,5 M, et du glycé- rol, de préférence à une concentration supérieure à 15 k. Le pH du tampon redox va avantageusement d'environ 7,5 à 9,0 et l'étape de repliement est conduite à 4 pendant 12-48 heures. L'étape de repliement produit de la TPO biologiquement active dans laquelle une liaison disulfure est formée entre le groupe Cys le plus proche de l'extrémité terminale amino et le groupe Cys le plus proche de l'extrémité terminale carboxy du domaine EPO. L'invention concerne en outre un procédé pour purifier la TPO biologiquement active provenant d'un micro- organisme, comprenant : (1) la lyse de la membrane extracellulaise au moins du micro-organisme, 2) le traitement du lysat contenant la TPO avec un agent chaotrope, (3) le repliement de la TPO, et (4) la séparation d'impuretés et de TPO mal pliée de la TPO convenablement pliée. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 représente la séquence déduite des aminoacides (SEQ ID N : 1) d'ADNc de ligand mpl humain (hML) et la séquence de nucléotides codante (SEQ ID N : 2). Les nucléotides sont numérotés au début de chaque ligne. Les régions non traduites 5' et 3' sont indiquées en lettres minuscules. Les résidus d'aminoacides sont numérotés au- dessus de la séquence à partir de Ser 1 de la séquence protéique du ligand mpl mature (ML). Les limites de l'exon 3 présumé sont indiquées par les flèches et les sites poten- tiels de N-glycosylation sont encadrés. Les résidus de téine sont indiqués par un point au-dessus de la séquence. La séquence soulignée correspond à la séquence N-terminale déterminée sur du ligand mpl purifié à partir de plasma de porc. La figure 2 illustre le mode opératoire utilisé pour l'essai d'incorporation de 3H-thymidine ligand mpl. Pour déterminer la présence de ligand mpl provenant de diverses sources, les cellules mpl P Ba/F3 ont été privées de IL-3 pendant 24 heures dans un incubateur humidifié, à 37 C dans de l'air additionné de 5 % de CO.. Après la privation de IL-3, les cellules ont été étalées dans des boites de culture à 96 alvéoles avec et sans échantillons dilués et elles ont été cultivées pendant 24 heures dans un incubateur de culture de cellules. On a ajouté 20 Al de milieu RPMI dépourvu de sérum contenant 1 jCi de 3H-thymidine à chaque alvéole pendant les 6-8 dernières heures. Les cellules ont ensuite été récoltées sur des plaques filtrantes à 96 alvéoles et elles ont été lavées à l'eau. Des comptages ont ensuite été effectués sur les filtres. La figure 3 montre l'effet de la pronase, du DTT et de la chaleur sur l'aptitude de l'APP à stimuler la prolifération de cellules Ba/F3-mpl. Pour la digestion de l'APP par la pronase, on a couplé de la pronase (Boehringer Mannheim) ou de la sérum-albumine de boeuf à du gel Affi- GellO (Biorad) et on a procédé individuellement à son incubation avec l'APP pendant 18 heures à 37"C. Ensuite, les résines ont été enlevées par centrifugation et les liquides surnageants ont été titrés. L'APP a aussi été chauffé à 800C pendant 4 minutes ou ajusté à 100 SM en DTT puis dialysé contre du PBS. La figure 4 illustre l'élution de l'activité en ligand mpl de colonnes Phenyl-Toyopearl, Blue-Sepharose et Ultralink-mpl. Les fractions 4-8 de la colonne d'affinité à l'égard du mpl constituaient les fractions d'activité maximale éluées de la colonne. La figure 5 représente l'électrophorèse sur gel de dodécyl-sulfate de sodium et de polyacrylamide de frac- tions Ultralink-mpl éluées. On a ajouté à -200C 1 ml d'acé- tone contenant 1 mM de HCl à 200 4l de chacune des fractions 2-8. Au bout de 3 heures à -20"C, les échantillons ont été centrifugés et les culots résultants ont été lavés deux fois à l'acétone à -20"C. Les culots lavés à l'acétone ont ensuite été dissous dans 30 Ml de tampon de solubilisation au SDS, ajustés à 100 MM en DTT et la solution a été chauffée à 900C pendant 5 minutes. Les échantillons ont ensuite été résolus sur un gel de dodécyl-sulfate de sodium et de polyacrylamide à 4-20 % et les protéines ont été visualisées par coloration à l'argent. La figure 6 représente l'élution de l'activité en ligand mpl dans l'électrophorèse sur gel de dodécyl-sulfate de sodium et de polyacrylamide. La fraction 6 venant de la colonne d'affinité pour le mpl a été résolue sur gel de SDS- polyacrylamide à 4-200C dans des conditions non réductrices. Après l'électrophorèse, le gel a été tranché en 12 régions égales et électroélué de la manière décrite dans les exem- ples. Les échantillons électroélués ont été dialysés dans du PBS et titrés à une dilution de 1/20. Les témoins Mr utilisés pour étalonner le gel consistaient en témoins Novex Mark 12. La figure 7 illustre l'effet de l'APP épuisé en ligand mpl sur la mégacaryocytopoièse humaine. De l'APP épuisé en ligand mpl a été préparé par passage de 1 ml sur une colonne de 1 ml d'affinité pour le mpl (700 Mg de mpl-IgG/ml de NHS-superose, Pharmacia). Des cultures de cellules-souches périphériques humaines ont été ajustées à 10 % en APP ou à 10 % en APP épuisé en ligand mpl et elles ont été cultivées pendant 12 jours. La mégacaryocytopoièse a été estimée quantitativement de la manière décrite dans les exemples. La figure 8 illustre l'effet de la mpl-IgG sur la stimulation de la mégacaryocytopoièse humaine par l'APP. Des cultures de cellules-souches périphériques humaines ont été ajustées à 10 % en APP et cultivées pendant 12 jours. On a ajouté initialement les 2ème et 4ème jours de la mpl-IgG (0,5 gg) ou de l'ANP-R-IgG (0,5 gg). Au bout de 12 jours, la mégacaryocytopoièse a été évaluée quantitativement de la manière décrite dans les exemples. La moyenne d'échantillons effectués en double est représentée graphiquement avec les deux données réelles entre parenthèses. La figure 9 reproduit les deux brins d'un fragment de 390 paires de bases d'ADN génomique humain codant le ligand mpl. La séquence d'aminoacides déduite de l'"exon 3" (SEQ ID N : 3), la séquence codante (SEQ ID NI : 4) et son complément (SEQ ID NO : 5) sont représentées. La figure 10 représente la séquence déduite d'aminoacides de ligand mpl humain mature (hML) (SEQ ID N : 6) et l'érythropoiétine humaine mature (hEPO) (SEQ ID N : 7). La séquence d'aminoacides prédite pour le ligand mpl humain est alignée avec la séquence de l'érythropoiétine humaine. Les aminoacides identiques sont encadrés et les espaces introduits pour l'alignement optimal sont indiqués par des tirets. Les sites potentiels de N-glycosylation sont soulignés d'un trait plein pour le hML et de pointillés pour hEPO. Les deux cystéines importantes pour l'activité de l'érythropoiétine sont indiquées par un point renforcé. La figure 11 illustre la séquence déduite d'aminoacides d'isoformes de ligand mpl humain mature hML (SEQ ID N : 6), hML2 (SEQ ID NO : 8), hML3 (SEQ ID N : 9) et hML4 (SEQ ID N : 10). Des aminoacides identiques sont encadrés et des espaces introduits pour l'alignement optimal sont indiqués par des tirets. Les figures 12A, 12B et 12C illustrent l'effet du ligand mpl humain sur la prolifération de cellules Ba/F3-mpl (A) la mégacaryocytopoièse humaine in vitro estimée quantita- tivement au moyen d'un anticorps monoclonal IgG murin marqué par la radioactivité, spécifique de la glycoprotéine de mégacaryocyte (GPIIbIIIa (B) et la thrombopoièse murine mesurée dans un essai de rebondissement sur plaquettes (C). 293 cellules ont été transfectées par la méthode au CaPO4 (C. Gorman in DNA Cloning : A New Approach 2:143-190 [1985]) avec le vecteur pRK5 seul, pRK5-hML ou pRK5-ML1s3 pendant une nuit (le vecteur pRK5-MLls3 a été engendré par introduction d'un codon de terminaison après le résidu 153 de hML par PCR). Le milieu a ensuite été conditionné pendant 36 heures et titré afin d'évaluer la stimulation de la prolifération des cellules de Ba/F3-mpl comme décrit dans l'Exemple 1 (A) ou la mégacaryocytopoièse humaine in vitro (B). La mégacaryocytopoièse a été estimée quantitativement au moyen d'un anticorps monoclonal IgG murin marqué à l'isotope 125I (HPl-lD) contre la glycoprotéine spécifique des mégaca- ryocytes, GPIIbIIIa comme décrit par Grant et al., dans Blood 69:1334-1339 [1987] ) . L'effet du recombinant ML (rML) partiellement purifié sur la production de plaquettes in vivo (C) a été déterminé au moyen de l'essai de thrombocytose à rebondissement décrit par T.P. McDonald dans Proc. Soc. Exp. iol. Med. 144:1006-10012 (1973) . Du rML partiellement purifié a été préparé à partir de 200 ml de milieu condition- né contenant le ML recombinant. On a fait passer le milieu sur une colonne de 2 ml de bleu Sépharose équilibré en PBS et on a lavé la colonne au PBS et on l'a éluée avec du PBS ontenant 2M d'urée et autant de NaCl. La fraction active a été dialysée dans du PBS et ajustée à 1 mg/ml avec de la sérumalbumine de boeuf dépourvue d'endotoxine. L'échantillon contenait moins d'une unité d'endotoxine/ml. On a injecté à des souris 64 000, 32 000 ou 16 000 unités de rML ou l'exci- pient seul. Chaque groupe était constitué de six souris. L'écart moyen et l'écart type de chaque groupe est repré- senté. Les valeurs de p ont été déterminées par un test T à 2 traînes comparant les médianes. La figure 13 établit une comparaison entre l'effet d'isoformes de ligand mpl humain et les variants dans l'essai de prolifération de cellules Ba/F3-mpl. L'essai a porté sur hML, un blanc, hML2, hML3, hML(R153A, R154A) et hMLls3 à diverses dilutions comme décrit dans l'Exemple 1. Les figures 14A, 14B et 14C montrent la séquence déduite d'aminoacides (SEQ ID NO : 1) de ligand mpl humain (hML) ou de TPO humaine (hTPO) et la séquence codant l'ADN génomique humain (SEQ ID N : 11). Les nucléotides et les résidus d'aminoacides sont numérotés au début de chaque ligne. La figure 15 montre une électrophorèse sur gel de dodécyl-sulfate de sodium et de polyacrylamide de 293-rhML3,32 purifié et de 293-rhML,53 purifié. La figure 16 montre la séquence de nucléotides : séquence codant l'ADNc (SEQ ID N : 12) et la séquence d'aminoacides déduite (SEQ ID N : 13) du cadre de lecture ouverte d'une isoforme ML murine. Cette isoforme de ligand mpl murine mature contient 331 résidus d'aminoacides, quatre de moins que la longueur entière présumée mML, et est par conséquent désignée par mML2. Les nucléotides sont numérotés au début de chaque ligne. Les résidus d'aminoacides sont numérotés au-dessus de la séquence à partir de Ser 1. Les sites potentiels de N-glycosylation sont soulignés. Les résidus de cystéine sont indiqués par un point au-dessus de la séquence. La figure 17 montre la séquence d'ADNc (SEQ ID NO : 14) et la séquence prédite de protéine (SEQ ID NO : 15) de cette isoforme ML murine (mML). Les nucléotides sont numérotés au début de chaque ligne. Les résidus d'aminoacides sont numérotés au-dessus de la séquence à partir de Ser 1. Cette isoforme de ligand mpl murine mature contient 335 résidus d'aminoacides et on considère qu'il s'agit du ligand mpl de longueur entière, désigné par mML. La séquence de signaux est indiquée par un soulignement en tirets et le point de clivage présumé est désigné par une flèche. Les régions non traduites 5' et 3' sont indiquées par des lettres minuscules. Les deux délétions observées comme résultat d'un épissage alterne (mML2 et mML3) sont soulignées. Les quatre résidus de cystéine sont indiqués par un point. -Les sept sites potentiels de N-glycosylation sont encadrés. La figure 18 compare la séquence déduite d'amino- acides de l'isoforme ML humaine hML3 (SEQ ID NO : 9) et une isoforme ML murine désignée par mML3 (SEQ ID NO : 16). La séquence d'aminoacides prédite pour le ligand mpl humain est alignée avec la séquence murine du ligand mpl. Les amino- acides identiques sont encadrés et les espaces introduits pour l'alignement optimal sont indiqués par des tirets. Les aminoacides sont numérotés au début de chaque ligne. La figure 19 compare les séquences prédites d'aminoacides d'isoformes ML matures de souris (SEQ ID N0 : 17), de porc (SEQ ID NO : 18) et d'humain (SEQ ID N0 : 6). Les séquences d'aminoacides sont alignées, avec introduction d'espaces indiqués par des tirets, pour l'alignement optimal. Les aminoacides sont numérotés au début de chaque ligne avec encadrement de résidus identiques. Les sites potentiels de N- glycosylation sont indiqués par un cadre ombré et les résidus de cystéine sont désignés par un point. Le motif de diamino- acide conservé qui présente un site potentiel de clivage par une protéase est souligné. La délétion de quatre aminoacides dont l'apparition est constatée pour les trois espèces (ML2) est indiquée par un cadre en trait renforcé. La figure 20 représente la séquence d'ADNc (SEQ ID N : 19) et la séquence prédite de protéine mature (SEQ ID N : 18) d'une isoforme ML de porc (pML). Cette isoforme de ligand mpl de porc contient 332 résidus d'aminoacides et on considère qu'il s'agit du ligand mpl de porc de longueur totale, désigné par pML. Les nucléotides sont numérotés au début de chaque ligne. Les résidus d'aminoacides sont numérotés au-dessus de la séquence à partir de Ser 1. La figure 21 montre la séquence d'ADNc (SEQ ID : 20) et la séquence prédite de protéine mature (SEQ ID N : 21) d'une isoforme ML de porc (pML2). Cette isoforme de ligand mpl de porc contient 328 résidus d'aminoacides et est une forme avec délétion de quatre résidus du ligand mpl de porc de longueur totale désigné par pML2. Les nucléotides sont numérotés au début de chaque ligne. Les résidus d'amino- acides sont numérotés au-dessus de la séquence à partir de Ser 1. La figure 22 compare la séquence déduite d'amino- acides de l'isoforme ML de porc de longueur entière, pML (SEQ ID N : 18) et d'une isoforme ML de porc désignée par pML2 (SEC ID N : 21). La séquence d'aminoacides prédite pour pML est alignée avec la séquence de pML2. Des aminoacides identiques sont encadrés et des espaces introduits pour l'alignement optimal sont indiqués par des tirets. Les aminoacides sont numérotés au début de chaque ligne. La figure 23 montre les caractéristiques perti- nentes du plasmide pSV15.ID.LL.MLORF ("longueur entière" ou TP0332) utilisé pour la transfection des cellules-hôtes CHO- DP12 en vue de la production de CHO-rhTPO332. a figure 24 montre des caractéristiques perti- nentes du plasmide pSV15.ID.LL.MLEPO-D ("tronqué" ou TPO153) utilisé pour la transfection des cellules-hôtes CHO-DP12 en vue de la production de CHO-rhTPOs3. Les figures 25A, 25B et 25C montrent l'effet de E. coli-rhTPO(..t- 153 sur les plaquettes (A), les globules rouges (B) et les globules blancs (C) chez des souris normales. On a injecté à deux groupes de 6 souris femelles C57 B6, une fois par jour, du tampon PBS ou 0,3 Mg de E. coli-rhTPO(,t-l 1s3) (100 M1 par voie sous-cutanée). Initiale- ment et du 3ème au 7ème jour, on a prélevé 40 Ml de sang par le sinus orbital. Ce sang a été immédiatement dilué dans 10 ml de diluant du commerce et des comptages sur le sang entier ont été effectués sur un analyseur hématologique Serrono Baker 9018. Les résultats sont représentés par les moyennes, l'écart-type de la moyenne. Les figures 26A, 26B et 26C montrent l'effet produit par E.coli-rhTPO(,t-l, 53) sur les plaquettes (A), les globules rouges (B) et les globules blancs (C) -chez des souris irradiées à une dose sublétale. Deux groupes de 10 souris femelles C57 B6 ont été exposées à une irradiation sublétale avec 750 cGy de rayons gamma émis par une source de 137Cs et on leur a injecté chaque jour du tampon PBS ou 3,0 Lg de E. coli-rhTPO,,lt- 153 (100 M1 par voie sous-cutanée). Initialement puis par intervalles, on a prélevé 40 Ml de sang par le sinus orbital. Ce sang a été immédiatement dilué dans 10 ml de diluant du commerce et des comptages sur le sang entier ont été effectués sur un analyseur d'hématologie Serrono Baker 9018. Les résultats sont présentés comme moyennes l'écart-type par rapport à la moyenne. Les figures 27A, 27B et 27C montrent l'effet de CHO-rhTPO332 sur (A) les plaquettes (thrombocytes), (B) les globules rouges (érythrocytes) et (c) les globules blancs (leucocytes) chez des souris normales. On a injecté une fois par jour à deux groupes de six souris femelles C57 B6, le ampon PBS ou 0,3 gg de CHO-rhTPO332 (100 pg, par voie sous- cutanée). Initialement et du 3ème au 7ème jour, on a prélevé 40 g1 de sang par le sinus orbital. Ce sang a été immédiate- ment dilué dans 10 ml de diluant du commerce et des comptages sur le sang entier ont été effectués sur un analyseur hématologique Serrono Baker 9018. Les résultats sont présen- tés comme moyennes l'écart-type par rapport à la moyenne. La figure 28 représente des courbes de réponse à la dose pour diverses formes de rhTPO provenant de diverses lignées cellulaires. Les courbes de réponse à la dose ont été construites pour le rhTPO à partir des lignées cellulaires suivantes: hTPO332 issu de CHO (longueur complète de cellules ovariennes de hamster chinois) ; hTPOm-l 153 (forme tronquée dérivée de E. coli avec un groupe méthionine N-terminal) ; hTPO332 (TPO de longueur entière provenant de 293 cellules humaines) ; Met-less 155 E. coli (forme tronquée [rhTPO5ss] sans la méthionine terminale de E. coli). Des groupes de 6 souris femelles C57B6 ont reçu pendant 7 jours une injection journalière de rhTPO dépendant du groupe. Chaque jour, 40 g1 de sang ont été prélevés par le sinus orbital pour des numérations du sang entier. Les résultats présentés ci-dessus sont les effets maximaux observés avec les divers traitements et, à l'exception de (met 153 E. coli), ces effets sont apparus au 7ème jour de traitement. Dans le groupe "met 153 E. coli" mentionné ci-dessus, l'effet maximal a été observé le Sème jour. Les résultats sont présentés comme moyennes l'écart-type par rapport à la moyenne. La figure 29 représente des courbes de réponse à la dose qui comparent l'activité de formes entières et "pincées" de rhTPO produites dans des cellules CHO avec la forme tronquée provenant de E. coli. On a injecté quotidien- nement à des groupes de 6 souris femelles C57B6, 0,3 Mg de rhTPO de divers types. Du 2ème au 7ème jour, on a prélevé 40 il de sang par le sinus orbital pour des numérations du sang entier. Les groupes de traitement étaient : TPO,53, forme ronquée de TPO dérivé de E. coli ; TPO332 (fraction mixte) TPO entier contenant approximativement 80-90 % de la forme entière et 10-20 % des formes pincées ; TPO332 (fraction 30K) = fraction pincée purifiée provenant de la préparation Nmixten originelle ; TP0332(fraction 70K) = fraction TPO entière purifiée provenant de la préparation nmixte" origi- nelle. Les résultats sont présentés comme moyennes + l'écart- type par rapport à la moyenne. La figure 30 est un croquis montrant l'essai KIRA-ELISA pour le dosage de la TPO. Cette figure montre la chimère MPL/Rse.gD et les parties correspondantes des récepteurs dont elle dérive de même que l'assemblage final (partie droite de la figure) et un schéma de principe (partie gauche de la figure) montrant les étapes correspondantes de 1' essai. La figure 31 est un schéma de principe de l'essai KIRA-ELISA montrant chaque étape du procédé. Les figures 32A-32L montrent la séquence des nucléotides (SEQ ID N : 22) du vecteur d'expression pSV117.ID.LL utilisé pour l'expression de Rse.gD dans l'Exemple 17. La figure 33 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP1. La figure 34 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP21. La figure 35 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP151. La figure 36 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP202. La figure 37 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP172. La figure 38 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP210. La figure 39 est un tableau des cinq meilleurs clones d'expression de TPO de la banque du plasmide pMP210 SEQ ID NO : 23, 24, 25, 26, 27 et 28). La figure 40 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP41. La figure 41 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP57. La figure 42 est une représentation schématique de la préparation du plasmide pMP251. La figure 43 est une courbe d'étalonnage servant à la détermination de la concentration en TPO. DESCRIPTION DETAILLEE DE L' INVENTION I. Définitions D'une manière générale, les termes ou expressions suivants ont la définition indiquée, chaque fois qu'ils sont utilisés dans le présent mémoire. Un nagent chaotrope* désigne un composé qui, en solution aqueuse et à des concentrations convenables, peut provoquer un changement dans la configuration spatiale ou la conformation d'une protéine par rupture au moins partielle des forces responsables du maintien de la structure normale secondaire et tertiaire de la protéine. Ces composés comprennent, par exemple, l'urée, le chlorhydrate de guanidine et le thiocyanate de sodium. De hautes concentrations, habituelle- ment 4-9 M, de ces composés sont normalement nécessaires pour exercer l'effet de conformation sur des protéines. Le terme "cytokineu est un terme général utilisé pour désigner des protéines libérées par une population de cellules, qui agissent sur une autre cellule comme médiateurs intercellulaires. Des exemples de ces cytokines sont les lymphokines, les monokines et les hormones polypeptidiques traditionnelles. On compte au nombre des cytokines, l'hormone de croissance, les facteurs de croissance analogues à l'insuline, l'hormone de croissance humaine, l'hormone de croissance humaine N-méthionylée, l'hormone de croissance bovine, l'hormone parathyroidienne, la thyroxine, l'insuline, le pro-insuline, la relaxine, la prorelaxine, les hormones du type de glycoprotéines telles que l'hormone folliculo- stimulante (FSH), la thyrotropine (TSH) et l'hormone lutéini- sante (LH), le facteur de croissance hématopoiétique, le facteur de croissance hépatique, le facteur de croissance des fibroblastes, la prolactine, le lactogène placentaire, le facteur a de nécrose tumorale (TNF-a et TNF-0), l'hormone anti-mullérienne, le peptide associé à la gonadotropine de souris, l'inhibine, l'activine, le facteur de croissance endothéliale vasculaire, l'intégrine, les facteurs de croissance des nerfs tels que NGF-P, le facteur de croissance es plaquettes, les facteurs de croissance transformants (TGF) tels que TGF-a et TGF-j, les facteurs I et II de croissance analogues à l'insuline, l'érythropoiétine (EPO), les facteurs ostéo-inducteurs, les interférons tels qu'inter- féron-a, interféron- et interféron-T, les facteurs stimu- lants de colonies (CSF) tels que le CSF des macrophages (M- CSF), le CSF des granulocytes-macrophages (GM-CSF) et le CSF des granulocytes (G-CSF), les interleukines (IL), telles que IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 et d'autres facteurs polypeptidiques comprenant les facteurs LIF, SCF et kit-ligand. Les termes et expres- sions ci-dessus, utilisés dans le présent mémoire, couvrent les protéines d'origine naturelle ou provenant d'une culture cellulaire recombinante. De même, les termes et expressions sont destinés à couvrir des équivalents biologiquement actifs, par exemple dont la séquence d'aminoacides diffère d'un ou plusieurs aminoacides ou par le type ou le degré de glycosylation. Les termes et expressions "ligand de mpl" ou "polypeptide ligand mpl", "ML", "thrombopoiétine ou "TPO" sont utilisés de façon interchangeable dans le présent mémoire et comprennent tout polypeptide qui possède la propriété de s'attacher à mpl, membre de la superfamille des récepteurs de cytokines, et ayant une propriété biologique de ML comme défini ci-dessous. n exemple de propriété biologique est l'aptitude à stimuler l'incorporation de nucléotides marqués (par exemple 3H- thymidine) à l'ADN de cellules Ba/F3 dépendantes de IL-3 transfectées avec du mpl P humain. Un autre exemple de propriété biologique est l'aptitude à stimuler l'incorpora- tion de 35S à des plaquettes en circulation dans un essai de rebondissement impliquant des plaquettes de souris. Cette définition couvre le polypeptide isolé d'une source de ligand mpl telle que le plasma de porc aplastique décrit dans le présent mémoire ou provenant d'une autre source, par exemple d'une autre espèce animale, comprenant l'espèce humaine, ou préparé par des méthodes de recombinaison ou de synthèse, et couvre des variants, y compris des dérivés fonctionnels, des fragments, des allèles, des isoformes et leurs analogues. Un "fragment de ligand mpl" ou "fragment de TPO" est une portion d'une séquence de ligand mpl ou de TPO entière naturelle à maturité, dont un ou plusieurs résidus d'aminoacides ou motifs glucidiques ont été supprimés. Le ou les résidus d'aminoacides supprimés peuvent se trouver n'importe o dans le peptide y compris à l'extrémité Nterminaleou C-terminale ou en position interne. Le fragment partage au moins une propriété biologique avec le ligand mpl. Les fragments de ligand mpl ont normalement une séquence consécutive d'au moins 10, 15, 20, 25, 30 ou 40 résidus d'aminoacides qui sont identiques aux séquences du ligand mpl isolé d'un mammifère, comprenant le ligand isolé de plasma de porc aplastique ou le ligand humain ou murin, notamment son domaine EPO. Des exemples représentatifs de fragments N- terminaux sont hMLIs3 ou TPO(Met''1-153). Des "variants de ligands mpl" ou des "variants de séquences de ligands mpl" au sens du présent mémoire, désignent des ligands de mpl biologiquement actifs tels que définis ci-dessous ayant moins de 100 % d'identité de séquence avec le ligand de mpl isolé d'une culture cellulaire recombinante ou de plasma aplastique de porc ou le ligand humain ayant la séquence déduite représentée sur la figure 1 (SEQ ID N : 1). Ordinairement, un variant de ligand mpl biologiquement actif présente une séquence d'aminoacides ayant au moins environ 70 % d'identité de séquence d'amino- acides avec le ligand mpl isolé de plasma de porc aplastique ou le ligand murin ou humain mature ou des fragments de ce ligand (voir figure 1 [SEQ ID N : 1]), avantageusement d'au moins environ 75 %, mieux encore d'au moins environ 80 %, plus avantageusement d'au moins environ 85 %, encore plus avantageusement d'au moins environ 90 % et notamment d'au moins environ 95 %. Un "ligand chimérique de mpl" est un polypeptide comprenant un ligand mpl entier ou bien ou plusieurs frag- ments de ce ligand soudés ou liés à un second polypeptide hétérologue ou à un ou plusieurs de ses fragments. La chimère partage au moins une propriété biologique avec le ligand mpl. Le second polypeptide est normalement une cytokine, une immunoglobuline ouun fragment correspondant. Les expressions "ligand mpl isolé", ligand mpl hautement purifié" et "ligand mpl sensiblement homogène" sont utilisées de façon interchangeable et désignent un ligand de mpl qui a été obtenu par purification d'une source d'un tel ligand ou qui a été préparé par des méthodes de recombinaison ou de synthèse et qui est suffisamment débarrassé d'autres peptides ou protéines (1) pour obtenir au moins 15 et de préférence 20 résidus d'aminoacides de l'extrémité N-termi- nale ou d'une séquence interne d'aminoacides par utilisation d'un appareil de séquençage à cuvette centrifuge ou le meilleur appareil de séquençage d'aminoacides disponible dans le commerce ou tel que modifié par des procédés publiés à la date de la présente demande, ou (2) pour acquérir l'homogé- néité par électrophorèse sur gel de dodécyl-sulfate de sodium et de polyacrylamide dans des conditions non réductrices ou réductrices en utilisant le bleu Coomassie ou de préférence une coloration à l'argent. L'homogénéité, au sens du présent mémoire, signifie moins d'environ 5 % de contamination par des protéines provenant d'autres sources. L'expression "propriété biologique utilisée à propos du "ligan mpl' ou du "ligand mpl isolé" signifie que ce ligand possède une activité thrombopolétique ou une fonction d'effecteur ou une fonction antigénique in vivo ou une activité qui est causée ou exercée directement ou indirectement par un ligand mpl (dans sa conformation naturelle ou dénaturée) ou un fragment correspondant. Des fonctions d'effecteur comprennent la liaison à mpl et toute activité de liaison à un support, l'agonisme ou l'antagonisme vis-à-vis de mpl, notamment la transduction d'un signal prolifératif comprenant la réplication, la fonction de régulation de l'ADN, la modulation de l'activité biologique d'autres cytokines, l'activation de récepteurs (en particu- lier des cytokines), la désactivation, une régulation montante ou descendante, la croissance ou la différenciation de cellules, etc. Une fonction antigénique signifie la possession d'un site épitope ou antigénique qui est capable d'une réaction croisée avec des anticorps contre le ligand mpl naturel. La principale fonction antigénique d'un polypep- tide ligand mpl est qu'il s'attache avec une affinité d'au moins environ 10G 1/mole à un anticorps contre le ligand mpl isolé de plasma de porc aplastique. Ordinairement, le polypeptide s'attache avec une affinité d'au moins environ 107 1/mole. De préférence, le polypeptide ligand mpl doué d'activité antigénique est un polypeptide qui se lie à un anticorps contre le ligand mpl ayant l'une des fonctions d'effecteur décrite ci-dessus. Les anticorps utilisés pour définir une "activité biologique" sont des anticorps polyclo- naux de lapin élaborés par formulation du ligand mpl isolé d'une culture cellulaire recombinante ou de plasma de porc aplastique dans l'adjuvant complet de Freund, injection sous- cutanée de la formulation et accentuation de la réponse immunitaire par injection intrapéritonéale de la formulation jusqu'à ce que le titre de l'anticorps contre le ligand mpl soit en palier. L'expression "biologiquement actif" utilisée conjointement avec le "ligand mpl" ou le "ligand mpl isolé" désigne un ligand mpl ou polypeptide qui est doué d'activité thrombopoiétique et qui partage une fonction d'effecteur du ligand mpl isolé de plasma de porc aplastique ou exprimé dans une culture cellulaire recombinante décrite dans le présent mémoire. Une fonction d'effecteur principale connue du ligand mpl ou polypeptide dont il est question ici est la liaison au mpl et la stimulation de l'incorporation de nucléotides marqués (3H-thymidine) à l'ADN de cellules Ba/F3 sous la dépendance de IL-3, transfectées avec du mpl P humain. Une autre fonction d'effecteur connue du ligand mpl ou polypep- tide dont il est question dans le présent mémoire est l'aptitude à stimuler l'incorporation de 35S dans des plaquet- tes en circulation dans l'essai de rebondissement sur plaquettes chez la souris. L'aptitude à stimuler la mégaca- ryocytopolèse in vitro constitue encore une autre fonction d'effecteur connue du ligand mpl, qui peut être exprimée quantitativement par l'utilisation d'un anticorps monoclonal marqué par la radioactivité, spécifique de la glycoprotéine mégacaryocytaire GPIIbIIIa. L'expression "pourcentage de l'identité de séquence des aminoacides" utilisée à propos de la séquence du ligand mpl est définie dans le présent mémoire comme étant le pourcentage de résidus d'aminoacides dans la séquence du candidat qui sont identiques aux résidus dans la séquence du ligand mpl isolée de plasma de porc aplastique ou dans le ligand murin ou humain ayant la séquence déduite d'amino- acides représentée sur la figure 1 (SEQ ID N : 1), après alignement des séquences et introduction, si nécessaire, d'espaces pour obtenir le pourcentage maximal d'identité de séquence, sans considérer aucune substitution conservative comme partie de l'identité de séquence. Aucune des exten- ions, délétions ou insertions N-terminale, C-terminale ou interne dans la séquence du ligand mpl ne doit être interpré- tée comme affectant l'identité ou l'homologie de séquence. Ainsi, des exemples de polypeptides ligands mpl biologique- ment actifs considérés comme ayant des séquences identiques comprennent : le ligand prépro-mpl, le ligand pro-mpl et le ligand mpl mature. Le "microséquençage de ligand mpl" peut être accompli par tout mode opératoire classique approprié pourvu que ce mode opératoire soit suffisamment sensible. Dans un tel procédé, un polypeptide hautement purifié provenant de gels de dodécyl-sulfate de sodium ou d'une étape finale de chromatographie en phase liquide à haute performance est séquencé directement par dégradation automatisée de Edman (isothiocyanate de phényle) en utilisant un appareil de séquençage à phase gazeuse Applied Biosystems modèle 470A équipé d'un analyseur d'aminoacides à phénylthiohydantoine (PTH) 120A. En outre, des fragments de ligand mpl préparés par digestion chimique (par exemple CNBr, hydroxylamine, 2nitro-5-thiocyanobenzoate) ou enzymatique (par exemple trypsine; clostripaine, protéase staphylococcique) suivie d'une-purification des fragments (par exemple CLHP) peuvent être séquences de façon similaire. Les aminoacides de PTH sont analysés au moyen du système de données ChromPerfect (Justice Innovations, Palo Alto, CA). L'interprétation de la séquence est effectuée sur un ordinateur VAX 11/785 de Digital Equipment Co. comme décrit par Henzel et al. dans J. Chromatography, 404:41-52 [1987]. Le cas échéant, des portions aliquotes des fractions de CHLP peuvent être soumises à une électrophorèse sur gel à 5-20 % de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide avec électrotransfert à une membrane PVDF (ProBlott, AIB, Foster City, CA) et coloration au bleu brillant Coomassie (Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262:10035-10038 [1987]). Une protéine spécifique identifiée par la coloration est détachée de l'empreinte par xcision et le séquençage N-terminal est effectué avec l'appareil de séquençage à phase gazeuse décrit ci-dessus. Pour des séquences de protéines internes, les fractions de CLHP sont séchées sous vide (SpeedVac), remises en suspension dans des tampons appropriés et digérées au bromure de 10 cyanogène, à l'enzyme Lys-C spécifique de Lys (Vako Chemi- s, Richmond, VA), ou avec il'Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Après digestion, les peptides résultants sont séquences sous forme de mélange et après résolution par CLHP sur colonne C4, ils sont développés avec un gradient de propanol dans du TFA à 0,1 % avant le séquençage en phase gazeuse. La thrombocytopénie" est définie comme étant un nombre de plaquettes inférieur à 150 x 10' par litre de sang. L'"activité thrombopoiétique" est définie comme étant une activité biologique qui consiste à accélérer la prolifération, la différenciation et/ou la maturation de mégacaryocytes ou de leurs précurseurs en la forme produc- trice de plaquettes de ces cellules. Cette activité peut être mesurée dans divers essais comprenant l'essai de synthèse par rebondissement de plaquettes de souris in vivo, l'essai d'induction d'un antigène de surface des plaquettes comme mesuré par un immuno-essai anti-plaquettes (anti-GPIIbIIIa) pour la lignée cellulaire magacaryoblastique leucémique humaine (CMK) et l'induction d'une polyploidisation dans une lignée cellulaire mégacaryoblastique (DAMI). La "thrombopoiétine" (TPO) est définie comme étant un composé doué d'activité thrombopolétique ou étant capable d'accroître le nombre des plaquettes sériques chez un mammifère. La TPO est avantageusement capable d'accroitre les nombres de plaquettes endogènes dans une proportion d'au moins 10 %, de préférence de 50 %, notamment capable d'élever les quantités de plaquettes chez un être humain jusqu'à plus de 150 x 109 par litre de sang. L'expression "acide nucléique de ligand mpl solé" désigne de 'ARN ou de l'ADN contenant plus de 16 et de préférence 20 ou plus de 20 bases nucléotidiques en séquence codant le ligand mpl biologiquement actif ou son fragment, qui est complémentaire de 'ARN ou de l'ADN, qui s'hybride à l'ARN ou l'ADN et qui reste lié de façon stable dans des conditions allant de modérées à sévères. Cet ARN ou ADN est dépourvu d'au moins un acide nucléique source de contamination avec lequel il est normalement associé dans la source naturelle, et de préférence sensiblement dépourvu de tout autre ARN ou ADN de mammifère. L'expression dépourvu d'au moins un acide nucléique source de contamination avec lequel il est normalement associé" englobe le cas o l'acide nucléique est présent dans la source ou la cellule naturelle, mais se trouve en un site chromosomique différent ou est autrement flanqué de séquences d'acide nucléique qui ne sont pas normalement rencontrées dans la cellule source. Un exemple d'acide nucléique de ligand mpl isolé est l'ARN ou l'ADN qui code un ligand mpl biologiquement actif partageant au moins 75 % d'identité de séquence, avantageusement au moins 80 %, plus avantageusement au moins 85 %, mieux encore 90 % et de préférence 95 % d'identité de séquence avec le ligand mpl humain, murin ou porcin. L'expression "séquences de régulation" se réfère à des séquences d'ADN nécessaires pour exprimer une séquence codante liée de façon active dans un organisme hôte particu- lier. Les séquences de régulation qui conviennent pour des procaryotes comprennent par exemple un promoteur, facultati- vement une séquence d'opérateur, un site de liaison ribosomique et, éventuellement, d'autres séquences qui ne sont pas encore bien élucidées. Il est connu que des cellules d'euca- ryotes utilisent des promoteurs, des signaux de polyadényla- tion et des activateurs. L'expression "lié de façon active" se rapportant à des acides nucléiques signifie que les acides nucléiques sont placés en relation fonctionnelle avec une autre séquence 'aminoacides. Par exemple, l'ADN d'une préséquence ou d'un leader sécrétoire est lié de façon active à l'ADN pour un polypeptide s'il est exprimé comme une préprotéine qui prend part à la sécrétion du polypeptide ; un promoteur ou activa- teur est lié de façon active à une séquence codante s'il affecte la transcription de la séquence ; ou un site de liaison ribosomique est lié de façon active à un séquence codante s'il est positionné de manière à faciliter la traduction. Généralement, l'expression "lié de façon active" signifie que les séquences d'ADN qui sont liées sont conti- gués et, dans le cas d'un leader sécrétoire, contigués et en phase de lecture. Toutefois, des activateurs n'ont pas à être contigus. La liaison est accomplie par ligation au niveau de sites convenables de restriction. Si de tels sites n'existent pas, des adaptateurs ou fragments de liaison oligonucléotidiques de synthèse sont utilisés en accord avec la pratique classique. Le terme "exogène", lorsqu'il se rapporte à un élément, signifie une séquence d'acide nucléique qui est étrangère à la cellule, ou homologue à la cellule mais dans une position dans l'acide nucléique de la cellule-hôte o l'élément ne se trouve ordinairement pas. Le terme "cellule", les expressions "lignée cellulaire" et "culture de cellules* sont utilisés de façon interchangeable dans le présent mémoire et ces désignations comprennent toute descendance d'une cellule ou d'une lignée cellulaire. Ainsi, par exemple, des termes et expressions tels que "transformants" et "cellules transformées" désignent la cellule principale concernée et des cultures qui en sont dérivées, sans tenir compte du nombre de transferts. Il y a lieu de remarquer également que toute descendance ne peut pas être précisément identique en matière de teneur en ADN, à cause de mutations délibérées ou inadvertantes. La descen- dance formée de mutants qui ont la même fonction ou la même activité biologique que celle qui est détectée dans la ellule initialement transformée sont inclus. Lorsqu'on souhaite des désignations distinctes, cela ressort clairement du contexte. Des "plasmides" sont des molécules circulaires d'ADN à réplication autonome, possédant des origines de réplication indépendantes et ils sont désignés dans le présent mémoire par une lettre "p" minuscule précédée et/ou suivie de lettres capitales et/ou de nombres. Les plasmides de départ dont il est question dans le présent mémoire sont disponibles dans le commerce, accessibles au public sur une base illimitée ou peuvent être assemblés à partir de plasmi- des disponibles conformément aux procédés publiés. En outre, d'autres plasmides équivalents sont connus dans la pratique et sont évidents pour l'homme de l'art. L'expression "digestion par enzymes de restric- tion" s'adressant à l'ADN signifie un clivage catalytique de liaisons phosphodiester internes de l'ADN avec un enzyme qui agit uniquement en certains endroits ou sites dans la séquence d'ADN. Ces enzymes sont appelés "endonucléases de restriction". Chaque endonucléase de restriction reconnaît une séquence spécifique d'ADN appelée "site de restriction", qui montre une double symétrie. Les divers enzymes de restriction utilisés dans le présent mémoire sont disponibles dans le commerce et leurs conditions réactionnelles, leurs cofacteurs et autres exigences telles qu'établies par les ournisseurs d'enzymes sont utilisés. Les enzymes de restric- tion sont communément désignés par des abréviations composées d'une lettre capitale suivie d'autres lettres représentant le micro-organisme à partir duquel chaque enzyme de restriction a été initialement obtenu, puis d'un nombre désignant l'enzyme particulier. En général, on utilise environ i Mg de plasmide ou fragment d'ADN avec environ 1-2 unités d'enzyme dans environ 20 g1 de solution tampon. Des tampons et des quantités de substrat appropriés pour des enzymes de restric- tion particuliers sont spécifiés par le fabricant. On utilise ordinairement une incubation d'environ 1 heure à 370C, mais l'incubation peut varier conformément aux instructions du fournisseur. Après l'incubation, la protéine ou le polypep- tide est éliminé par extraction au phénol et au chloroforme et l'acide nucléique digéré est recueilli de la fraction aqueuse par précipitation à l'éthanol. La digestion avec un enzyme de restriction peut être suivie d'une hydrolyse par une phosphatase alcaline bactérienne des 5' phosphates terminaux pour empêcher les deux extrémités clivées par restriction d'un fragment d'ADN de "prendre une forme circulaire" ou de former une boucle fermée qui empêcherait l'insertion d'un autre fragment d'ADN au niveau du site de restriction. Sauf spécification contraire, la digestion de plasmides n'est pas suivie d'une déphosphorylation de l'extrémité 5' terminale. Les procédés réactifs de déphospho- rylation sont classiques, comme décrit dans les paragraphes 1.56-1.61 de l'ouvrage de Sambrook et al. intitulé Molecular Cloning : A Laboratory Manual [New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]. La "séparation ou l'"isolement" d'un fragment donné d'ADN d'un produit de digestion par restriction signifie la séparation du produit de digestion sur gel de polyacrylamide ou d'agarose par électrophorèse, l'identifica- tion du fragment intéressant par comparaison de sa mobilité avec celle de fragments d'ADN marqueurs de poids moléculaire connu, retrait de la section de gel contenant le fragment désiré et la séparation du gel de l'ADN. Cette méthode est généralement connue. Voir, par exemple Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9:6103-6114 [1981], et Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980]. L'"analyse Southern" ou "analyse Southern blot" est une méthode par laquelle la présence de séquences d'ADN dans un produit de digestion par endonucléase de restriction d'ADN ou d'une composition contenant de l'ADN est confirmée par hybridation en un oligonucléotide marqué connu ou en un ragment d'ADN. L'analyse Southern implique normalement la séparation électrophorétique de produits de digestion d'ADN sur des gels d'agarose, la dénaturation de l'ADN après séparation électrophorétique et le transfert de l'ADN à un support formé d'une membrane de nitrocellulose, de Nylon ou 10 d'une autre membrane convenable en vue de l'analyse avec une de marquée par la radioactivité, contenant de la biotine ou marquée par un enzyme comme décrit dans les paragraphes 9.37-9.52 de l'ouvrage de Sambrook et al., supra. L'expression "analyse Northern" ou "analyse Northern blot" désigne une méthode utilisée pour identifier des séquences d'ARN qui s'hybrident en une sonde connue telle qu'un oligonucléotide, un fragment d'ADN, l'ADNc ou un fragment d'ADNc, ou un fragment d'ARN. La sonde est marquée avec un radioisotope tel que 32p, ou par liaison à la biotine, ou avec un enzyme. L'ARN devant être analysé est habituel- lement séparé par électrophorèse sur un gel d'agarose ou de polyacrylamide, transféré à une membrane de nitrocellulose, de Nylon ou d'une autre matière convenable et hybridé avec la sonde, par des techniques classiques bien connues dans l'art antérieur telles que celles qui sont décrites dans les paragraphes 7.39-7.52 de l'ouvrage de Sambrook et al., supra. Le terme "ligation" désigne le processus de formation de liaisons photodiester entre deux fragments d'acide nucléique. Pour la ligation des deux fragments, les extrémités des fragments doivent être compatibles l'une avec l'autre. Dans quelques cas, les extrémités sont directement compatibles avec digestion par l'endonucléase. Toutefois, il peut être nécessaire de convertir tout d'abord les extrémités décalées communément produites après digestion par endo- nucléase en extrémités franches pour les rendre compatibles en vue de la ligation. Pour rendre les extrémités franches, on traite 1'ADN dans un tampon convenable pendant au moins 15 minutes à 15oC avec environ 10 unités du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I ou de l'ADN polymérase T4 en résence des quatre triphosphates de désoxyribonucléotide. L'ADN est ensuite purifié par extraction au phénol et au chloroforme et précipitation à l'éthanol. Les fragments d'ADN qui doivent être soudés ensemble sont mis en solution en quantités à peu près équimolaires. La solution contient aussi de l'ATP, du tampon pour ligase et une ligase telle que l'ADN ligase T4 à environ 10 unités pour 0,5 gg d'ADN. Si l'ADN doit être lié en un vecteur, le vecteur est tout d'abord linéarisé par digestion avec l'endonucléase ou les endo- nucléases de restriction appropriées. Le fragment linéarisé est ensuite traité avec de la phosphatase alcaline bac- térienne ou de la phosphatase intestinale de veau pour empêcher une auto-ligation pendant l'étape de ligation. La "préparation" de l'ADN à partir de cellules signifie l'isolement de l'ADN plasmidique d'une culture des cellules-hôtes. Des procédés communément utilisés pour la préparation d'ADN sont les préparations de plasmides sur grande et petite échelle décrites dans les sections 1.25-1.33 de Sambrook et al., supra. Après la préparation de -l'ADN, on peut le purifier par des procédés bien connus dans l'art ntérieur comme décrit au paragraphe 1.40 de l'ouvrage de Sambrook et al., supra. Les "oligonucléotides" sont des polydésoxynucléo- tides de faible longueur, à simple hélice ou à double hélice, qui sont synthétisés chimiquement par des procédés connus (par exemple, chimie des phosphotriesters, des phosphites ou des phosphoramidites, avec utilisation de techniques en phase solide telles que décrites dans le brevet européen N 266 032 publié le 4 mai 1988 ou en passant par des désoxynucléoside- H-phosphonates intermédiaires tels que décrits par Froehler et al., dans Nucl. Acids Res., 14:5399-5407 [1986]). D'autres procédés comprennent la réaction en chaîne avec une polymé- rase comme définie ci-dessous et d'autres procédés d'auto- amorçage et synthèses d'oligonucléotides sur des supports solides. Tous ces procédés sont décrits par Engels et al., ans Agnew. Chem. Int., édition de langue anglaise, 28:716- 734 (1989). Ces procédés sont utilisés si la séquence entière d'acide nucléique du gène est connue ou si la séquence de l'acide nucléique complémentaire du brin codant est disponi- ble. En variante, si l'on connaît la séquence-cible d'amino- acides, on peut déduire des séquences potentielles d'acides nucléiques en utilisant des résidus codants connus et préférés pour chaque résidu d'aminoacide. Les oligonucléoti- des sont ensuite purifiés sur des gels de polyacrylamide. Une "réaction en chaîne de polymérase" ou "PCR# se réfère à un mode opératoire ou à une technique dans laquelle de petites quantités d'un morceau spécifique d'acide nucléique, ARN et/ou ADN sont amplifiées comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 683 195 déposé le 28 juillet 1987. En général, une information sur la séquence depuis les extrémités de la région concernée ou au-delà nécessite d'être disponible, par exemple des amorces d'oligo- nucléotides peuvent être conçues ; ces amorces sont identi- ques ou semblables, dans leur séquence, aux brins opposés de la matrice devant être amplifiée. Les nucléotides 5' termi- naux des deux amorces peuvent coincider avec les extrémités de la matière amplifiée. La réaction PCR peut être utilisée pour amplifier des séquences d'ARN spécifiques, des séquences d'ADN spécifiques, à partir de l'ADN génomique total, et de 1'ADNc transcrit à partir d'ARN cellulaire total, des séquences de bactériophages ou de plasmides, etc. Voir d'une manière générale Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 [1987] ; publié sous la direction de Erlich, PCR Technology (Stockton Press, NY, 1989). Au sens du présent mémoire, la PCR est considérée comme étant l'un des exemples, mais non le seul, d'un procédé de réaction d'une polymérase d'acide nucléique pour amplifier un échantillon d'essai d'acide nucléique comprenant l'utilisation d'un acide nucléique connu comme amorce et d'une polymérase d'acide nucléique pour amplifier ou engendrer un morceau spécifique d'acide nucléique. Des "conditions rigoureuses" sont des condi- tions qui (1) utilisent une faible force ionique et une haute température pour le lavage, par exemple 0,015 M de NaCl/0,0015 M de citrate de sodium/0,1 * de NaDodSO4 (SDS) à 50 C, ou (2) utilisent pendant l'hybridation un agent de dénaturation tel que le formamide, par exemple du formamide à 50 % (en volumes/volume) avec 0,1 % de sérumalbumine de boeuf/0,1 % de Ficoll/0,1 % de polyvinylpyrrolidone/50 mM de phosphate de sodium comme tampon à un pH de 6,5 avec 750 mM de NaCl et 75 mM de citrate de sodium à 42 C. Un autre exemple est l'utilisation de 50 % de formamide, 5 x SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrate de sodium), 50 mM de phosphate de sodium (pH 6,8), 0,1 % de pyrophosphate de sodium, 5 x de solution de Denhardt, de l'ADN de sperme de saumon traité aux ultrasons (50 gg/ml), 0,1 % de SDS et 10 % de sulfate de dextrane à 420C, avec des lavages à 420C dans du SSC 0,2 x et du SDS à 0,1 %. Des conditions modérément rigoureuses" sont décrites par Sambrook et al., supra, et comprennent l'utili- sation d'une solution de lavage et de conditions d'hybrida- tion (par exemple température, force ionique et pourcentage de SDS) moins sévères que ce qui a été décrit ci-dessus. Un exemple de conditions modérément rigoureuses comprend des conditions telles qu'une incubation pendant une nuit à 37 C dans une solution comprenant 20 % de formamide, du SSC 5 X (150 mM de NaCl, 15 mM de citrate trisodique), 50 mM de phosphate de sodium (pH 7,6), 5 X de solution de Denhardt, 10 % de sulfate de dextrane et 20 4l/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé traité par cisaillement, l'opération étant suivie d'un lavage des filtres dans du SSC 1 X à environ 37- 50 C. L'homme de l'art reconnaîtra la manière d'ajuster la température, la force ionique, etc., selon les nécessités pour tenir compte de facteurs tels que la longueur de sonde, etc. es termes "anticorps" (Abs) et immunoglobu- lines" (Igs) désignent des glycoprotéines ayant les mêmes caractéristiques structurales. Tandis que des anticorps montrent une spécificité de liaison à un antigène spécifique, des immunoglobulines comprennent à la fois des anticorps et d'autres molécules analogues à des anticorps qui manquent de spécificité a l'égard d'antigènes. Des polypeptides de ce dernier type sont produits par exemple à de faibles taux par le système lymphatique et à des taux élevés par les myélomes. Des "anticorps et immunoglobulines naturels" sont des glycoprotéines habituellement hétérotétramères d'environ 150 000 daltons, composées de deux chaînes identiques légères (L) et de deux chaines identiques lourdes (H). Chaque chaîne légère est liée à une chaine lourde par une seule liaison disulfure de covalence tandis que le nombre de liaisons disulfure varie entre les chaînes lourdes de différents isotypes d'immunoglobulines. Chaque chaîne lourde et légère présente aussi des ponts disulfure intracaténaires régulière- ment espacés. Chaque chaîne lourde présente à l'une de ses extrémités un domaine variable (V.) suivi d'un certain nombre de domaines constants. Chaque chaîne légère présente un domaine variable à une extrémité (VL) et un domaine constant à l'autre extrémité ; le domaine constant de la chaîne légère est aligné avec le premier domaine constant de la chaîne lourde, et le domaine variable de la chaîne légère est aligné avec le domaine variable de la chaîne lourde. On considère que des résidus d'aminoacides particuliers forment une interface entre les domaines variables de la chatne légère et de la chaîne lourde (Clothia et al., J. Mol. Biol., 186:651- 663 (1985] ; Novotny et Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 [1985]). Le terme "variable" fait allusion au fait que certaines portions des domaines variables diffèrent considé- rablement dans leur séquence parmi les anticorps et sont utilisées dans la liaison et la spécificité de chaque anticorps particulier pour son antigène particulier. Toute- fois, la variabilité n'est pas uniformément distribuée dans tous les domaines variables d'anticorps. Elle est concentrée dans trois segments appelés régions déterminantes de complé- mentarité (CDR) ou régions hypervariables à la fois dans les domaines variables de la chaîne légère et dans ceux de la chaîne lourde. Les portions le plus fortement conservées des domaines variables sont appelées charpente (FR). Les domaines variables de chaînes lourdes et légères naturelles compren- nent chacun quatre régions FR,adoptant grandement la configuration d'un feuillet Y, reliées par trois régions CDR qui forment des boucles reliant la structure en feuillet l et faisant partie dans quelques cas de cette structure. Les régions CDR dans chaque chaîne sont maintenues rapprochées les unes des autres par les régions FR et, avec les CDR de l'autre chaîne, elles contribuent à la formation du site de liaison à un antigène des anticorps (voir Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD [1987]). Les domaines constants ne sont pas impliqués directement dans la liaison d'un anticorps à un antigène, mais présentent diverses fonctions d'effecteurs, par exemple la participation de l'anticorps à la toxicité cellulaire dépendant de l'anti- corps. La digestion d'anticorps par la papaine produit deux fragments identiques de liaison d'antigène, appelés fragments "Fab", chacun avec un unique site de liaison à l'antigène, et un fragment résiduel "Fc" dont le nom reflète son aptitude à se cristalliser aisément. Le traitement par la pepsine donne un fragment F(ab')2 qui présente deux sites de combinaison à un antigène et qui est encore capable de réticuler un antigène. Le terme "Fv" désigne le fragment minimal d'anticorps qui contient un site complet de reconnaissance et de liaison d'un antigène. Cette région est constituée d'un dimère de domaine variable à une chaîne lourde et une chaîne légère en association étroite, non covalente. C'est dans cette configuration que les trois régions CDR de chaque domaine variable agissent ensemble pour définir un site de liaison d'anticorps à la surface du dimère V.-VL. Les six régions CDR confèrent collectivement la spécificité de liaison d'antigène à l'anticorps. Toutefois, même un unique domaine variable (ou la moitié d'un fragment Fv ne comprenant que trois régions CDR spéciques d'un antigène) a la possibi- lité de reconnaître et de lire un antigène, bien qu'avec une plus faible affinité que le site de liaison entier. Le fragment Fab contient aussi le domaine constant de la chaîne légère et le premier domaine constant (CH1) de la chaîne lourde. Des fragments Fab' diffèrent de fragments Fab par l'addition d'un petit nombre de résidus à l'extrémité terminale carboxy du domaine CH1 de la chaîne lourde comprenant une ou plusieurs cystéines venant de la région de liaison de l'anticorps. On utilise ici le terme Fab'-SH pour désigner un fragment Fab' dans lequel le ou les résidus de cystéine de domaines constants portent un groupe thiol libre. Des fragments d'anticorps F(ab')2 ont été initialement produits comme paires de fragments Fab' présen- tant entre eux des cystéines comme segments de liaison. On connaît aussi d'autres couplages chimiques de fragments d'anticorps. Les "chaînes légères" d'anticorps (immunoglobuli- nes) provenant de toutes espèces de vertébrés peuvent être attribuées à l'un de deux types nettement distincts, appelés kappa et lambda (A), sur la base des séquences d'aminoacides de leurs domaines constants. Selon la séquence d'aminoacides du domaine constant de leurs chaînes lourdes, des immunoglobulines peuvent être attribuées à des classes différentes. Il existe cinq classes principales d'immunoglobulines : IgA, IgD, IgE, IgG et IgM, et plusieurs d'entres elles peuvent encore être ivisées en sous-classes (isotypes), par exemple IgG-1, IgG-2, IgG-3 et IgG-4 ; IgA-l et IgA-2. Les domaines cons- tants de la chaîne lourde qui correspondent aux différentes classes d'immunoglobulines sont désignés respectivement par les lettres a, delta, epsilon, y et p. Les structures des sous-unités et les configurations tridimensionnelles de différentes classes d'immunoglobulines sont bien connues. Le terme "anticorps" est utilisé à son sens le plus large et couvre spécialement de simples anticorps monoclonaux (comprenant des anticorps agonistes et antagonis- tes), des compositions d'anticorps de spécificité poly- épitopique, de même que des fragments d'anticorps (par exemple Fab, F(ab')2 et Fv), du moment qu'ils présentent l'activité biologique désirée. L'expression "anticorps monoclonal" utilisée dans le présent mémoire se réfère à un anticorps obtenu à partir d'une population d'anticorps principalement homogènes, c'est- à-dire que les anticorps individuels constituant la popula- tion sont identiques excepté des mutations naturelles possibles qui peuvent être présentes en quantités secondaires. Des anticorps monoclonaux sont hautement spécifiques, étant dirigés contre un unique site antigénique. En outre, en contraste avec des préparations classiques (polyclonales) d'anticorps qui comprennent normalement différents anticorps dirigés contre différents déterminants (épitopes), chaque anticorps monoclonal est dirigé contre un seul déterminant sur l'antigène. En plus de leur spécificité, les anticorps monoclonaux sont avantageux en ce qu'ils sont synthétisés par la culture d'hybridomes, non contaminés par d'autres immuno- globulines. L'épithète "monoclonal" indique le caractère de l'anticorps, à savoir le fait qu'il est obtenu à partir d'une population sensiblement homogène d'anticorps, et il ne doit pas être interprété comme exigeant la production de l'anti- corps par tout procédé particulier. Par exemple, les anti- corps monoclonaux devant être utilisés conformément à la présente invention peuvent être préparés par la méthode de l'hybridome décrite pour la première fois par Kohler & Milstein, dans Nature, 256:495 (1975), ou bien ils peuvent être préparés par des méthodes de recombinaison de l'ADN (voir, par exemple, le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 816 567 [Cabilly et al.]). Les anticorps monoclonaux dont il est question dans le présent mémoire comprennent spécialement des anti- corps "chimériques" (immunoglobulines) dans lesquels une portion de la chaîne lourde et/ou de la chaîne légère est identique ou homologue aux séquences correspondantes dans des anticorps dérivés d'une espèce particulière ou appartenant à une classe ou sous-classe particulière d'anticorps, tandis que le reste de la chaîne ou des chaînes est identique ou homologue à des séquences correspondantes dans des anticorps dérivés d'une autre espèce ou appartenant à une autre classe ou sous-classe d'anticorps, de même que des fragments de ces anticorps, du moment qu'ils montrent l'activité biologique désirée (brevet des Etats-Unis d'Amérique NI 4' 816 567 (Cabilly et al.) ; et Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]). Des formes "humanisées d'anticorps non humains (par exemple murins) sont des immunoglobulines chimériques, des chaînes d'immunoglobulines ou leurs fragments (par exemple Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou d'autres subséquences de liaison à un antigène d'anticorps) qui contiennent une séquence minimale dérivée d'immunoglobuline non humaine. Les anticorps humanisés sont pour la plupart des immunoglobulines humaines (anticorps d'un receveur) dans lesquels des résidus d'une région déterminante complémentaire (CDR) du receveur sont remplacés par des résidus d'une région CDR d'une espèce non humaine (anticorps de donneur) telle que souris, rat ou lapin ayant la spécificité, l'affinité et la capacité désirées. Dans quelques cas, des résidus de charpente Fv de l'immunoglobine humaine sont remplacés par des résidus non humains correspondants. En outre, un anticorps humanisé peut comprendre des résidus que l'on ne rencontre ni dans l'anti- corps du receveur ni dans les séquences importées des régions CDR ou de la charpente. Ces modifications sont effectuées afin de mieux affiner et optimiser la performance des anticorps. En général, l'anticorps humanisé comprend la quasi-totalité de l'un au moins et par exemple de deux domaines variables, dans lesquels la totalité ou la quasi- totalité des régions CDR correspondent à celles d'une immunoglobuline non humaine et la totalité ou la quasi- totalité des régions FR sont celles d'une séquence consensus d'immunoglobuline humaine. L'anticorps humanisé comprend aussi de façon optimale au moins une portion d'une région constante d'immunoglobuline (Fc), normalement celle d'une imunoglobuline humaine. Pour de plus amples détails, voir : Jones et al., Nature, 321:522-525 [1986], Reichman et al., Nature, 332:323-329 [1988] ; et Presta, Curt. Op. Struct. Biol., 2:593-596 [1992]. L'expression "non immunogénique chez un humain" signifie qu'au contact du polypeptide dans un support acceptable du point de vue pharmaceutique et en quantité thérapeutiquement efficace avec le tissu approprié d'un humain, aucun état de sensibilité ou une résistance au polypeptide ne peut être démontré lors de la seconde adminis- tration du polypeptide après une période de latence appro- priée (par exemple 8 à 14 jours). II. Formes de réalisation préf&r&es de l'invention Des polypeptides appréciés de la présente invention sont des polypeptides principalement homogènes, appelés ligand(s) mpl ou ligand(s) de mpl ou thrombopoiétine (TPO), qui possèdent la propriété de se lier à un mpl, représentant de la superfamille de récepteurs des cytokines, et ayant la propriété biologique de stimuler l'incorporation de nucléotides marqués (3H-thymidine) dans l'ADN de cellules Ba/F3 sous la dépendance de IL-3 transfectées avec un mpl P humain. Des ligands mpl que l'on apprécie davantage sont isolés de protéines de mammifères douées d'activité hémato- polétique, notamment mégacaryocytopolétique ou thrombocyto- poiétique, à savoir capables de stimuler la prolifération, la maturation et/ou la différenciation de mégacaryocytes o10 immatures ou de leurs prédécesseurs en la forme mature produisant des plaquettes. Des polypeptides très appréciés selon l'invention sont les ligands mpl humains, y compris leurs fragments doués d'activité hématopolétique, mégacaryo- cytopoiétique ou thrombopoiétique. Le cas échéant, ces ligands mpl humains manquent de glycosylation. D'autres ligands mpl humains appréciés sont le "domaine EPO" de hML appelé hML1s3 ou hTPOIs3, un forme tronquée de hML appelée hML24s ou hTPO24s et le polypeptide entier mature ayant la séquence d'aminoacides représentée sur la figure 1 (SEQ ID N : 1), appelé hML, hML332 ou hTPO332 et le variant de substitu- tion biologiquement actif, hML(R153A, R1S4A). D'autres polypeptides appréciés selon la présente invention sont des variants de ligands mpl doués d'activité biologique ou immunologique choisis entre hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML et pML2. Des polypeptides facultatifs appréciés de la présente invention sont des variants de ligands mpl biologi- quement actifs qui ont une séquence d'aminoacides présentant au moins 70 % d'identité de séquence d'aminoacides avec le ligand mpl humain (voir figure 1 [SEQ ID N : 1]), le ligand mpl murin (voir figure 16 [SEQ ID N : 12 et 131), le ligand mpl porcin recombinant (voir figure 19 [SEQ ID N : 181) ou le ligand mpl porcin isolé de plasma de porc aplastique, avantageusement au moins 75 %, plus avantageusement au moins 80 ', mieux encore au moins 85 %, de préférence au moins 90 % et notamment au moins 95 %. Le ligand mpl isolé de plasma de porc aplastique présente les caractéristiques suivantes : (1) Le ligand partiellement purifié est élué dans ne opération sur colonne de filtration sur gel dans du PBS, du PBS contenant 0,1 % de SDS ou du PBS contenant 4M de MgCl2 avec une valeur Mr de 60 000 à 70 000 ; (2) L'activité du ligand est détruite par la pronase ; (3) Le ligand est stable à un bas pH (2,5) SDS à 0,1 % et urée 2 M ; (4) Le ligand est une glycoprotéine, sur la base de sa liaison à diverses colonnes de lectine ; (5) Le ligang hautement purifié est élué dans l'électrophorèse sans réduction sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide avec une valeur Mr de 25 000- 35 000. De plus petites quantités d'activité sont aussi éluées avec une valeur Mr de l'ordre de 18 000-22 000 et de 60 000 ; (6) Le ligand hautement purifié se résout dans l'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide avec réduction, en un doublet avec les valeurs Mr de 28 000 et 31 000 ; (7) La séquence amino-terminale de 18 000- 22 000, 28 000 et 31 000 bandes est la même - SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID N : 29) ; et (8) Le ligand se lie et est élué des colonnes d'affinité suivantes : Bleu Sepharose, CM bleu-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, Lectine de lentille-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Ether 650m Toyopearl, Butyl 650 m Toyopearl, Phényl 650m Toyopearl, et Phényl-Sépharose. es polypeptides ligand mpl davantage appréciés sont ceux qui sont codés par l'ADN génomique humain ou ADNc ayant une séquence d'aminoacides telle que représentée sur la figure 1 (SEQ ID N : 1). D'autres polypeptides ligand mpl biologiquement actifs naturels appréciés de la présente invention compren- nent le ligand prépro-mpl, le ligand pro-mpl, le ligand mpl mature, des fragments de ligand mpl et leurs variants de glycosylation. D'autres polypeptides appréciés selon la présente invention comprennent des variants et chimères de la séquence de ligand mpl. Ordinairement, des variants et chimères de séquence de ligand mpl appréciés sont des variants de ligand mpl biologiquement actifs qui ont une séquence d'aminoacides présentant au moins 70 % d'identité de séquence d'aminoacides avec le ligand mpl humain ou le ligand mpl isolé de plasma de porc aplastique, avantageusement au moins 75 %, plus avantageusement au moins 80 %, mieux encore au moins 85 %, encore plus avantageusement au moins 90 % et notamment au moins 95 %. Un exemple de variant de ligand mpl apprécié est un variant hML à domaine N-terminal (appelé 'domaine EPO" en raison de son homologie de séquence avec l'érythropoiétine). Le domaine EPO hML préféré comprend approximativement les 153 premiers résidus d'aminoacides du hML à maturité et est appelé hML 153. Un variant de séquence hML apprécié en option est un variant dans lequel un ou plusieurs des résidus d'aminoacides monobasiques ou dibasiques dans le domaine C- terminal est substitué avec un ou plusieurs résidus d'aminoacides non basiques (par exemple hydrophobe, neutre, acide, aromatique, Gly, Pro, etc.). Un variant de séquence à domaine C-terminal hML apprécié comprend un variant dans lequel les résidus Arg 153 et 154 sont remplacés par des résidus Ala. Ce variant est appelé hML332 (R153A, R154A). Un autre variant hML apprécié comprend hML332 ou hML1s3 dans lequel les résidus amino 111-114 (QLPP ou LPPQ) sont supprimés ou remplacés par une séquence tétrapeptidique différente (par exemple AGAG, etc.). Les mutants de délétion ci-dessus sont appelés A4hML332 ou A4hML1s3. Une chimère appréciée est une fusion entre un ligand mpl ou son fragment (défini ci-dessous) et un polypep- tide hétérologue ou son fragment. Par exemple, le variant hMLls3 peut être soudé à un fragment d'IgG pour améliorer sa demi-vie dans le sérum ou à IL-3, G-CSF ou EPO pour produire une molécule dont l'activité thrombopoiétique ou hémato- polétique chimérique est renforcée. Une autre chimère de ligand mpl humain appréciée est une "chimère à domaine ML-EPO" qui est constituée des résidus de hML 153 à 157 de l'extrémité N-terminale substi- tués avec un ou plusieurs, mais non la totalité, des résidus EPO humains approximativement alignés comme représenté sur la figure 10 (SEQ ID N : 7). Dans cette forme de réalisation, la chimère hML aurait une longueur d'environ 153-166 résidus oh des résidus individuels ou des blocs de résidus venant de la séquence d'EPO humaine sont ajoutés ou substitués à la séquence hML dans des positions qui correspondent à l'aligne- ment représenté sur la figure 10 (SEQ ID NO : 6). Des exemples de segments d'insertion à séquence par blocs dans la portion N-terminale de hML comprendraient un ou plusieurs sites de N-glycosylation dans les positions (EPO) 24-27, 38- 40 et 83-85 ; un ou plusieurs des quatre faisceaux a-hélicoi- daux amphipathiques prédits dans les positions (EPO) 9-22, 59-76, 90-107 et 132-152 ; et d'autres régions hautement conservées comprenant les régions d'extrémités N-terminale et C-terminale et les positions de résidus (epo) 44-52 (voir, par exemple Wen et al., Blood, 82:1507-1516 [1993] et Boissel et al., J. Biol. Chem., 268(21):15983-15993 [1993]). On considère que cette "chimère à domaine ML-EPOn possède une activité biologique thrombopoiétique-érythropoiXétique (TEPO) mixte. D'autres polypeptides appréciés de la présente invention comprennent des fragments de ligand mpl ayant une séquence consécutive d'au moins 10, 15, 20, 25, 30 ou 40 résidus d'aminoacides qui sont identiques aux séquences du ligand mpl isolé du plasma de porc aplastique ou du ligand mpl humain décrit dans le présent mémoire (voir, par exemple le Tableau 14, Exemple 24). Un fragment de ligand mpl apprécié est le fragment ML[1-X] humain o X a la valeur 153, 164, 191, 205, 207, 217, 229 ou 245 (voir figure 1 (SEQ ID N : 1) pour la séquence de résidus 1-X). D'autres fragments de ligand mpl appréciés comprennent ceux qui sont produits comme résultat de l'hydrolyse ou de la digestion chimique ou enzymatique du ligand purifié. Un autre aspect apprécié de l'invention réside dans un procédé de purification de molécules de ligand mpl, qui comprend la mise en contact d'une source de ligand mpl contenant les molécules de ligand mpl avec un polypeptide récepteur immobilisé, plus particulièrement un polypeptide mpl ou un polypeptide fusionné mpl, dans des conditions dans lesquelles les molécules de ligand mpl à purifier sont sélectivement adsorbées sur le polypeptide récepteur immobi- lisé, le lavage du support immobilisé pour éliminer la matière non adsorbée, et l'élution, avec un tampon d'élution, des molécules devant être purifiées par élimination du polypeptide récepteur immobilisé. La source contenant le ligand mpl peut être du plasma dans lequel le récepteur immobilisé est avantageusement une fusion mpl-IgG. En variante, la source contenant le ligand mpl est une culture cellulaire recombinante dans laquelle la concentration en ligand mpl dans le milieu de culture ou dans les lysats cellulaires est généralement plus forte que dans le plasma ou dans d'autres sources naturelles. Dans ce cas, la méthode d'immunoaffinité mpl-IgG décrite ci-dessus, tout en étant encore utile, n'est habituellement pas nécessaire et on peut appliquer des méthodes traditionnelles de purifica- tion de protéines connues dans l'art antérieur. En bref, la méthode de purification que l'on préfère pour obtenir un ligand mpl sensiblement homogène comprend deux étapes qui consistent : à éliminer des débris de particules, représentés par des cellules-hâtes ou des fragments lysés, par exemple par centrifugation ou par ultrafiltration ; à titre faculta- tif, la protéine peut être concentrée avec un filtre de concentration de protéine disponible dans le commerce ; puis à séparer le ligand des autres impuretés par une ou plusieurs étapes choisies entre : immunoaffinité, échange d'ions (par exemple DEAE ou matrices contenant des groupes carboxyméthyle ou sulfopropyle), bleu-Sepharose, CM bleu-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lectine de lentille-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A- Sépharose, Ether Toypearl, Butyl Toypearl, Phenyl Toylpearl, protéine A-Sepharose, électrophorèse sur gel de dodécyl- sulfate de sodium et de polyacrylamide, CLHP à phase inversée (par exemple gel de silice portant des groupes aliphatiques appendus) ou tamis moléculaire Sephadex ou chromatographie par exclusion dimensionnelle et précipitation à l'éthanol ou au sulfate d'ammonium. Un inhibiteur de protéase tel que le fluorure de méthylsulfonyle (PMSF), peut être inclus dans l'une quelconque des étapes précédentes opur inhiber la protéolyse. Dans une autre forme de réalisation appréciée, la présente invention propose un anticorps isolé capable de se lier au ligand mpl. Un exemple apprécié d'anticorps isolé lié au ligand mpl est monoclonal (Kohler et Milstein, Nature, 256:495-497 [1975]) ; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, publié sous la direction de Burdon et al., volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam [1985] ; et Huss et al., Science 246:1275-1281 [1989]). Un anticorps isolé lié à un ligand mpl que l'on apprécie est un anticorps qui se lie à un ligand mpl avec une affinité d'au moins 106 1/mole. L'anticorps se lie plus avantageusement avec une affinité d'au moins environ o107 1/mole. De préférence, l'anticorps est dirigé contre le igand mpl ayant l'une des fonctions effectrices décrites ci- dessus. L'anticorps isolé capable de se lier au ligand mpl peut facultativement être fusionné avec un second polypeptide et l'anticorps ou sa forme fusionnée peut être utilisée pour isoler et purifier le ligand mpl d'une source telle que décrite ci-dessus pour un polypeptide mpl immobilisé. Selon un autre aspect apprécié de cette forme de réalisation, l'invention propose une méthode de détection du ligand mpl in vitro et in vivo, qui comprend les étapes consistant à mettre l'anticorps en contact avec un échantillon, notamment un échantillon de sérum suspecté de contenir le ligand, et à détecter si une liaison a eu lieu. Dans encore d'autres formes de réalisation appréciées, l'invention propose une molécule d'acide nucléi- que isolée qui code le ligand mpl ou ses fragments, cette molécule d'acide nucléique pouvant ou non être marquée avec un groupement détectable, et une molécule d'acide nucléique ayant une séquence qui est complémentaire d'une molécule d'acide nucléique ayant une séquence codant un ligand mpl, ou qui s'hybride dans des conditions rigoureuses ou modérément rigoureuses avec une telle molécule d'acide nucléique. Un acide nucléique ou un ligand mpl apprécié est un ARN ou un ADN qui code un ligand mpl biologiquement actif partageant au moins 75 % d'identité de séquence, avantageusement au moins 80 %, mieux encore au moins 85 %, plus avantageusement encore 90 % et notamment 95 % d'identité de séquence avec le ligand mpl humain. Des molécules d'acide nucléique isolées davantage appréciées sont des séquences d'ADN codant un ligand mpl biologiquement actif, que l'on choisit entre : (a) de l'ADN basé sur la région codante d'un gène de ligand mpl de mammifère (par exemple l'ADN comprenant la séquence de nucléotides proposée sur la figure i (SEQ ID N : 2) ou ses fragments) ; (b) un ADN capable de s'hybrider avec un ADN de (a) dans des conditions au moins modérément rigoureuses ; et (c) un ADN qui est dégénéré en un ADN défini en (a) ou (b) qui résulte de la dégénérescence du code génétique. On considère que les ligands mpl nouveaux décrits dans le présent mémoire peuvent être des membres d'une famille de ligands ou cytokines ayant une identité de séquence convenable que leur ADN peut hybrider avec 1'ADN de la figure 1 (SEQ ID N : 2) (ou son complément ou ses fragments) dans des conditions dont la rigueur va de faible à modérée. Ainsi, un autre aspect de la présente invention comprend de l'ADN qui s'hybride dans des conditions de rigueur faibles à modérées avec l'ADN codant les polypeptides ligands mpl. Dans une autre forme de réalisation appréciée de l'invention, la molécule d'acide nucléique est un ADNc codant le ligand mpl et comprend en outre un vecteur réplicable dans lequel 1'ADNc est lié de façon active pour réguler les séquences reconnues par un hâte transformé avec le vecteur. Cet aspect comprend en outre des cellules hôtes transformées avec le vecteur et un procédé d'utilisation de 1'ADNc pour effectuer la production de ligand mpl, qui comprend l'expres- sion de 1'ADNc codant le ligand mpl dans une culture des cellules hôtes transformées et l'isolement du ligand mpl de la culture de cellules hôtes. Le ligand mpl préparé de cette manière est avantageusement un ligand mpl humain sensiblement homogène. Une cellule hôte appréciée pour la production de ligand mpl est la cellule d'ovaire de hamster chinois (CHO). L'invention concerne en outre un procédé apprécié de traitement d'un mammifère atteint de trouble immunologique ou hématopolétique, notamment de thrombocytopénie, qui comprend l'administration d'une quantité à effet thérapeuti- que d'un ligand mpl au mammifère. A titre facultatif, le ligand mpl est administré en association avec une cytokine, notamment un facteur stimulant les colonies ou une inter- leukine. Des facteurs stimulant les colonies ou des inter- leukines que l'on apprécie comprennent les suivants : kit-ligand, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, Il-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 ou IL-11. II. Procédés de préparation Certains auteurs ont depuis longtemps pensé que la production de plaquettes pouvait être influencée par de multiples facteurs humoraux spécifiques des lignées. Il a été suggéré que deux activités de cytokines distinctes, appelées facteur stimulant les colonies de mégacaryocytes (méga-CSF) et thrompopoiétine, régulaient la mégacaryocytopoièse et la thrombopoièse (Williams et al., J. Cell. Physiol. 110:101-104 [1982] ; Williams et al., Blood Cells, 15:123-133 [1989] ; et Gordon et al., Blood, 80:302-307 [1992]). Conformément à cette hypothèse, le facteur meg-CSF stimule la prolifération de mégacaryocytes progéniteurs, tandis que la thrombopoiétine affecte principalement la maturation de cellules plus différenciées et, finalement, la libération de plaquettes. Depuis les années 1960, l'induction et l'aspect des activités en meg-CSF et en thrombopolétine dans le plasma, le sérum et l'urine d'animaux et d'êtres humains après des épisodes thrombocytopéniques ont fait l'objet d'une abondante documen- tation (Odell et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Méd., 108:428-431 [1961] ; Nakeff et al., Acta Haematol., 54: 340-344 [1975] ; Specter, Proc. Soc. Exp. Biol., 108:146-149 [1961] ; Schrei- ner et al., J. Clin. Invest., 49:1709-1713 [1970] ; Ebbe, Blood, 44:605-608 [1974] ; Hoffman et al. N. Engl. J. Med., 305:533 [1981] ; Straneva et al., Exp. Hematol., 17:1122-1127 [1988] ; Mazur et al., Exp. Hematol., 13:1164 [1985] ; Mazur et al., J. Clin. Invest., 68:733-741 [1981] ; Sheiner et al., Blood, 56:183-188 [1980] ; Hill et al., Exp. Hematol. 20:354- 360 [1992] ; et Hegyi et al., Int. J. Cell. Cloning, 8:236- 244 [1990]). Ces activités ont été rapportées comme étant spécifiques des lignées et distinctes de cytokines connues (R.J. Hill et al., Blood 80:346 (1992) ; C.L. Erickson-Miller et al., Brit. J. Haematol. 84:197-203 (1993) ; J.E. Straneva et al., Exp. Hematol. 20:4750 (1992) ; et J. Tsukada et al., Blood 81:866-867 [1993]). Jusqu'à présent, des tentatives de purification de meg-CSF ou de thrombopoiétine à partir de plasma ou d'urine thrombocytopénique n'ont pas été couronnées de succès. Conformément aux observations présentées ci- dessus, décrivant un plasma thrombocytopénique, on a trouvé que le plasma de porc aplastique (APP) tiré de porcs irradiés stimulait la mégacaryocytopoièse humaine in vitro. On a constaté que cette activité stimulante était abrogée par le domaine extracellulaire soluble de c-mpl, ce qui confirme que l'APP est une source potentielle du-ligand mpl (ML) présume. La Demanderesse est parvenue à purifier le ligand mpl de l'APP et l'information de séquence des aminoacides a été utilisée pour isoler l'ADNc de ML murin, porcin et humain. Ces ligands ML ont une homologie de séquence avec l'érythropolétine et ont des activités à la fois de meg-CSF et de thrombopoiétine. 1. Purification et identification de ligand mpl de plasma Comme indiqué ci-dessus, il a été rapporté que du plasma aplastique provenant de diverses espèces contenait des activités qui stimulaientl'hématopoièse in vitro, toutefois aucun facteur stimulant hématopolétique isolé du plasma n'avait encore été rapporté. Une source de plasma aplastique est celle que l'on tire de porcs irradiés. Ce plasma porcin aplastique (APP) stimule l'hématopoièse humaine in vitro. Pour déterminer si 1'APP contenait le ligand mpl, on a titré son effet en mesurant l'incorporation de 3H-thymidine dans des cellules Ba/F3 transfectées avec du mpl P humain (Ba/F3- mpl) par la méthode illustrée sur la figure 2. L'APP a stimulé l'incorporation de 3H-thymidine à des cellules Ba/F3- mpl mais non à des cellules Ba/F3 témoins (c'est-à-dire non transfectées avec du mpl P humain). En outre, aucune activité de ce genre n'a été observée dans du plasma normal de porc. Ces résultats ont indiqué que l'APP contenait un ou plusieurs facteurs qui effectuaient la transduction d'un signal prolifératif par l'intermédiaire du récepteur mpl et pouvait donc être le ligand naturel pour ce récepteur. Cette hypo- hèse a été renforcée par la mise en évidence de ce que le traitement de l'APP avec une mpl-IgG soluble bloquait les effets stimulants de l'APP sur des cellules Ba/F3-mpl. L'activité en APP a semblé être une protéine parce qu'une pronase, DTT, ou la chaleur détruit l'activité en APP (figure 3). L'activité a également été non dialysable. Toutefois, l'activité s'est montrée stable à un bas pH (pH 2,5 pendant 2 heures) et il a été démontré qu'elle se liait à plusieurs colonnes d'affinité pour la lectine et qu'elle en était éluée, ce qui indique qu'il s'agissait d'une glyco- protéine. Pour élucider davantage la structure et l'identité de cette activité, elle a été purifiée par affinité de l'APP au moyen d'une chimère mpl-IgG. De l'APP a été traité conformément au protocole décrit dans les Exemples 1 et 2. En bref, le ligand mpl a été purifié par chromatographie par interaction hydrophobe (HIC), chromatographie avec colorant immobilisé et chromatographie par affinité pour le récepteur mpl. L'activité recueillie dans chaque étape est représentée sur la figure - 4 et le facteur de purification est indiqué sur le Tableau 1. Le total de l'activité recueillie par la colonne d'affinité pour le récepteur mpl a été d'environ 10 %. La fraction d'activité maximale (F6) de la colonne d'affinité pour le mpl a une valeur spécifique estimée de 9,8 x 10' unités/mg. La purifi- cation globale à partir de 5 litres d'APP a atteint un facteur d'environ 4 x 10' (0,8 unité/mg à 3,3 x 10' unités/mg) avec une réduction d'un facteur 83 x 10' de la quantité de protéine (passage de 250 g à 3 gg). On a estimé que l'acti- vité spécifique du ligand élué de la colonne d'affinité pour le récepteur mpl était d'environ 3 x 10' unités/mg. TABLEAU 1 Purification du ligand Dpl Purification of m Iand I_ I T T.. ~~Activitéen- Facteur d Echan- Volume Pro- Unit/ml Unité spécie- puriicatillon ml téine fique, purifica- - inci/fhl -- nuit s/um tion ,. mqgl~l!ni&ffla2, % APP 5000 50 40 200 000 0.8 1 Phpnjle 4700 0.8 40 200 000 50 94 62 Bleu-Sep.640 0.93 400 256 000 430 128 538 mpl l'Exemple 2. Les résultats de cette expérience ont montré que la majeure partie de l'activité a été éluée d'une tranche de gel qui renfermait des protéines de Mr ayant une valeur de 28 000-32 000, avec une moindre activité éluée dans la région du gel de 18 000-22 000 (figure 6). Les seules protéines visibles dans ces régions avaient des valeurs Mr de 30 000, 28 000 et 18 000-22 000. Pour identifier et obtenir la séquence pour les protéines qui se résolvent dans cette région du gel (c'est-à-dire des bandes à 30, 28 et 18- 22 kDa), ces trois protéines ont été analysées par électro- blotting à des membranes PVDF et séquencées comme décrit dans l'Exemple 3. Les séquences amino-terminales obtenues sont représentées sur le Tableau 2 TABLEAU 2 Séquences amino-terminales de ligand mpl kDa 1 5 10 15 20 25 (S) P A P P A(C)D P R L L N K L L R DD(H/S) V L H (G) RL (SEQIDNO:30) 10 28 kDa 1 5 10 15 20 25 (S)PAPPAXDPRLLNKLLRDD(H)VL(H)GR (SEQIDNO:31) 18-22 kDa 1 5 10 X PA P P A XO P R LX(N) (K) SE ID NO: 32) L'analyse assistée par ordinateur a révélé que les séquences d'aminoacides étaient nouvelles. Du fait que les trois séquences étaient les mêmes, on a considéré que les protéines de 30 kDa, 28 kDa et 18-22 kDa étaient apparentées et pouvaient être des formes différentes de la même protéine nouvelle. En outre, cette protéine ou ces protéines consti- tuaient un candidat problable comme ligand mpl naturel parce que l'activité s'est résolue dans l' électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide dans la même région (28 000-32 000) d'un gel à 4-20 %. En outre, le ligand partiellement purifié a migré avec une valeur Mr de 17 000- 000 lorsqu'il a. été soumis à la chromatographie par filtration sur gel sur colonne de Superose 12 (Pharmacia). On considère que les différentes formes de Mr du ligand sont le résultat de différences de protéolyse ou de glycosylation ou d'autres modifications après ou avant traduction. Comme décrit dans ce qui précède, i'ARN mpl humain antisens a abrogé la mégacaryocytopolèse dans des cultures de moelle osseuse humaine enrichies en cellules progénitrices CD 34' sans affecter la différenciation d'autres lignées cellulaires hématopolétiques (Methia et al., supra). Ce résultat donne à penser que le récepteur mpl pourrait jouer un rôle dans la différenciation et la prolifé- ration de mégacaryocytes in vitro. Pour élucider davantage le rôle du ligand mpl dans la mégacaryocytopoièse, on a comparé les effets de l'APP et de l'APP épuisé en ligand mpl sur la mégacaryocytopolèse humaine in vitro. L'effet de l'APP sur la mégacaryocytopoièse humaine a été déterminé d'après une version modifiée de l'essai de mégacaryocytopoièse en suspension dans un liquide décrit dans l'Exemple 4. Dans cet essai, des cellules souches périphériques humaines (PSC) ont été traitées avec de l'APP avant et après chromatographie par affinité pour la mpl-IgG. La stimulation par GPIIbIII, de la mégacaryocytopoièse a été évaluée quantitativement avec un anticorps anti-IIbIII, marqué au 25sI (figure 7). Comme représenté sur la figure 7, 10 % d'APP ont causé une stimula- tion d'un facteur 3 environ tandis que l'APP épuisé en ligand mpl n'a eu aucun effet. Il importe de remarquer que l'APP épuisé en ligand mpl n'a pas entraXné de prolifération des cellules Ba/F3-mpl. Dans une autre expérience, de la mpl-IgG humaine soluble ajoutée au temps 0 et les 2ème et 4ème jours à des cultures contenant 10 % d'APP a neutralisé les effets stimulants de l'APP sur la mégacaryocytopolèse humaine (figure 8). Ces résultats indiquent que le ligand mpl joue un rôle régulateur sur la mégacaryocytopoièse humaine et peut donc être utile pour le traitement de la thrompocytopénie. 2. Clonage moléculaire du ligand mpl D'après la séquence d'aminoacides amino-terminale tirée des protéines de 30 kDa, 28 kDa et 18-22 kDa (voir Tableau 2 ci-dessus), deux groupes-amorces d'oligonucléotides dégénérés ont été conçus et utilisés pour amplifier par PCR l'ADN génomique de porc. On a considéré que si la séquence 'aminoacides amino-terminale était codée par un unique exon, on pouvait attendre pour le produit PCR correct une longueur de 69 paires de bases. Un fragment d'ADN de cette dimension a été trouvé et sous-cloné en pGEMT. Les séquences des amorces de réaction en chaîne par ADN-polymérase des oligonu- cléotides et les trois clones obtenus sont représentés dans l'Exemple 5. La séquence d'aminoacides (PRLLNKLLR [SEQ ID N : 33]) du peptide codé entre les amorces de PCR a été identique à celle qui avait été obtenue par le séquençage de la protéine amino-terminale du ligand porcin (voir résidus 9- 17 pour les séquences de protéines porcines de 28 et 30 kDa ci-dessus). * Un oligonucléotide synthétique basé sur la séquence du fragment de PCR a été utilisé pour trier une banque d'ADN génomique humain. Un oligonucléotide de 45 bases, appelé pR45, a été conçu et synthétisé sur la base de la séquence du fragment de PCR. Cet oligonucléotide avait la séquence suivante : S GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC'GTCACG-MAG-CAGITI"-ATT-TAG-GAG-TCG3' (SEO ID NO: 34) Ce désoxyoligonucléotide a été utilisé pour trier une banque d'ADN génomique humain en ygeml2 dans des condi- tions faiblement rigoureuses d'hybridation et de lavage conformément à l'Exemple 6. Des clones positifs ont été prélevés, purifiés sur plaques et analysés par cartographie de restriction et analyse Southern Blot. Un fragment EcoRI- XbaI de 390 paires de bases qui s'était hybridé en l'oligonu- cléotide de 45 bases a été sous-cloné en pBluescript SK-. Le séquençage d'ADN de ce clone a confirmé que l'ADN codant l'homologue humain du ligand pl porcin avait été isolé. La séquence d'ADN humain et la séquence déduite d'aminoacides sont représentées sur la figure 9 (SEQ ID NO 3 et 4). Les positions prédites d'introns de la séquence génomique sont également indiquées par des flèches, et définissent un exon présumé ("exon 3 ") . Sur la base de la séquence de l'"exon 3" humain (Exemple 6), on a synthétisé des oligonucléotides correspon- dant aux extrémités 3' et 5' de la séquence d'exon. Ces deux amorces ont été utilisées dans des réactions PCR utilisant comme matrice un ADN complémentaire préparé à partir de divers tissus humains. La grandeur attendue du produit de PCR correct était de 140 paires de bases. Après analyse des produits de PCR sur gel de polyacrylamide à 12 %, on a détecté un fragment d'ADN de longueur attendue dans des banques d'ADNc préparées à partir de rein d'adultes humains, de 293 cellules de rein de foetus et d'ADNc préparé à partir de foie humain de foetus. Une banque d'ADNc de foie foetal (7 x 10' clones) en lambda DR2 a ensuite été triée avec le même oligonucléo- tide de 45 bases que celui qui avait été utilisé pour traiter la banque génomique humaine et la banque d'ADNc de foie de foetus dans des conditions d'hybridation faiblement rigoureuses. Des clones positifs ont été prélevés, purifiés sur plaques et la longueur du segment d'insertion a été détermi- née par PCR. Un clone présentant un segment d'insertion de 1,8 kilobase a été choisi pour une analyse ultérieure. En utilisant les modes opératoires décrits dans l'Exemple 7, on a obtenu le nucléotide et la séquence déduite d'aminoacides du ligand mpl humain (hML). Ces séquences sont présentées sur la figure 1 (SEQ ID N 1 et 2). 3. Structure du ligand mpl humain (hML) La séquence d'ADNc du ligand mpl humain (hML) (figure 1 [SEQ ID N : 2]) comprend 1774 nucléotides suivis d'une queue poly(A). Elle contient 215 nucléotides de séquence 5' non traduite et une région 3' non traduite de 498 nucléotides. Le codon d'initiation présumé dans la position de nucléotides (216-218) se situe dans une séquence consensus favorable à l'initiation d'une traduction eucaryotique. Le cadre de lecture ouvert a une longueur de 1059 nucléotides et code un polypeptide à 353 résidus d'aminoacides, débutant dans la position de nucléotide 220. L'extrémité N-terminale de la séquence prédite d'aminoacides est fortement hydrophobe et correspond probablement à un peptide signal. L'analyse sur ordinateur de la séquence prédite d'aminoacides (voir von Heijne et al., Eur. J. Biochem., 133:17-21 [1983]) indique un site de clivage potentiel pour la peptidase de signal entre les résidus 21 et 22. Un clivage dans cette position engen- drerait un polypeptide mature de 332 résidus d'aminoacides débutant par la séquence amino-terminale obtenue à partir de ligand mpl purifié de plasma de porc. Le poids moléculaire non glycosylé prédit du ligand à 332 résidus d'aminoacides est d'environ 38 kDa. Il existe 6 sites potentiels de N- glycosylation et 4 résidus de cystéine. Une comparaison de la séquence du ligand mpl avec la base de données de séquence de la banque de gènes a révélé une identité de 23 % entre les 153 résidus amino-terminaux du ligand mpl humain mature et d'érythropoiétine humaine (figure 10 [SEQ ID NO : 6 et 7]). Lorsque des substitutions conserva- trices sont prises en considération, cette région de hML montre une similitude de 50 % par rapport à l'érythropoiétine humaine (hEPO). L'érythropoiétine hEPO et le ligand hML contiennent tous deux quatre cystéines. Trois de ces cystéi- nes sont conservées dans hML, y compris la première et la dernière cystéine. Des expériences de mutagénèse dirigée ont montré que les première et dernière cystéines de l'érythro- polétine formaient une liaison disulfure qui est exigée pour la fonction (F.F. Wang et al., Endocrinology 116:2286-2292 [1983]). Par analogie, les première et dernière cystéines de hML peuvent aussi former une liaison disulfure déterminante. Aucun des sites de glycosylation n'est conservé dans hML. Tous les sites de glycosylation potentiels liés à l'azote de hML sont localisés dans la moitié carboxy-terminale du polypeptide hML. Tout comme 1 'érythropoiétine hEPO, 1 'ARN messager de hML ne contient pas la séquence consensus de polyadényla- tion AAUAAA, et elle ne contient pas non plus l'élément régulateur AUUUA qui est présent dans les régions 3'-non traduites de nombreuses cytokines et on considère qu'il exerce une influence sur la stabilité de l'ARNm (Shaw et al., Cell, 46:659-667 [1986]). L'analyse Northern blot révèle de faibles taux d'un seul produit de transcription d'ARN de hML de 1,8 kilobase dans le foie de foetus et dans le foie adulte. Après une exposition plus longue, une bande plus faible de même dimension a pu être détectée dans le rein d'adulte. A titre comparatif, l'érythropoiétine humaine est exprimée dans le foie de foetus et, en réponse à une hypoxye, dans le rein et le foie d'adulte (Jacobs et al., Nature, 313:804-809 [1985] et Bondurant et al., Molec. Cell. Biol., 6:2731-2733 [1986]). L'importance de la région C-terminale de hML reste à élucider. Sur la base de la présence des six sites potentiels pour la glycosylation liée à l'azote et l'aptitude du ligand à se fixer à des colonnes d'affinité envers la lectine, cette région du ligand hML est de même glycosylée. Dans certaines expériences d'élution sur gel, on a observé une résolution d'activité avec une valeur Mr de l'ordre de 60 000, qui peut représenter la molécule glycosylée de longueur entière. La région C-terminale peut donc agir en stabilisant et en augmentant la demi-vie du hML en circulation. Dans le cas de l'érythropoiétine, la forme non glycosy- lée a une activité biologique entière in vitro, mais a une demi-vie notablement réduite dans le plasma par rapport à l'érythropoiétine glycosylée (Takeuchi et al., J. Biol. Chem., 265:12127-12130 [1990] ; Narhi et al., J. Biol. Chem., 266:23022-23026 [1991] et Spivack et al., Blood, 7:90-99 [19891). Le domaine C-terminal de hML contient deux séquences d'aminoacides dibasiques [motifs Arg-Arg dans les positions 153-154 et 245-246] qui pourraient servir de sites potentiels de maturation. Un clivage au niveau de ces sites peut être responsable de la génération des formes de 30, 28 et 18- 22 kDa de ML isolé de APP. Il importe de remarquer que la séquence Argls3-Arg,54 apparaît immédiatement après le domaine de ML semblable à l'érythropoiétine. Ces observations indiquent que le ML entier peut représenter une protéine précurseur qui subit une protéolyse limitée en engendrant le ligand mature. 4. Isoformes et variants du ligand mpl humain Des isoformes ou formes alternativement épissées de ligand mpl humain ont été détectées par PCR dans le foie d'humain adulte. En bref, on a synthétisé des amorces correspondant à chaque extrémité de même qu'à des régions internes choisies de la séquence codante de hML. Ces amorces ont été utilisées dans une région RT-PCR pour amplifier l'ARN de foie d'humain adulte comme décrit dans l'Exemple 10. En plus de la forme de longueur entière, appelée hML, on a observé ou déduit trois autres formes, appelées hML2, hML3 et hML4. Les séquences déduites d'aminoacides à maturité des quatre isoformes sont représentées sur la figure 11 (SEQ ID NI : 6, 8, 9 et 10). La forme hML3 présente une délétion de 116 nucléotides en position 700, de laquelle il résulte une suppression d'aminoacides et un décalage du cadre. L'ADNc code à présent un polypeptide mature qui a une longueur de 265 aminoacides et qui diverge de la séquence hML au niveau du résidu d'aminoacide 139. Enfin, la forme hML 4 comprend à la fois une délétion de 12 nucleotides faisant suite à la position du nucléotide 618 (que l'on trouve également dans les séquences de souris et de porc (voir ci-dessous]) et la délétion de 116 paires de bases observée dans la forme hML3. Bien qu'aucun clone avec une délétion de, seulement, 12 paires de bases (après le nucleotide 619) ait été isolé chez l'homme (forme désignée par hML2), cette forme est suscepti- ble d'exister du fait qu'une telle isoforme a été identifiée chez la souris et chez le porc (voir ci-dessous), et parce qu'elle a été identifiée conjointement avec la délétion de 116 nucléotides dans hML4. Un variant de substitution de hML dans lequel la séquence Argl53-Argl54 dibasique a été remplacée par deux résidus d'alanine et une forme tronquée à "domaine EPO" de hML ont été assemblés afin de déterminer si la forme ML de longueur totale était nécessaire pour l'activité biologique. Le variant de substitution à séquence dibasique Arg1s3-Argls4, appelé hML(R153A-Rl54A) a été assemblé en utilisant la réaction PCR comme décrit dans l'Exemple 10. La forme tronquée à "domaine EPO", hML,53, a aussi été réalisée en utilisant la réaction PCR par introduction d'un codon d'arrêt à la suite de Args3. 5. Expression de ligand mpl humain recombinant (rhML) dans (293) cellules rénales d'embryon humain i transfection transitoire Pour confirmer le fait que l'ADNc humain cloné codait un ligand pour mpl, le ligand a été exprimé dans 293 cellules de mammifères sous l'influence du promoteur précoce immédiat de cytomégalovirus en utilisant les vecteurs d'expression pRK5-hML ou PRK5-hML153. Les liquides surnageants de 293 cellules rénales d'embryons humains à transfection transitoire ont montré qu'elles stimulaient l'incorporation de 3H-thymidine dans des cellules Ba/F3-mpl, mais non dans les cellules parentales Ba/F3 (figure 12A). Des milieux issus des 293 cellules transfectées avec le vecteur pRK seul ne contenaient pas cette activité. L'addition de mpl-IgG à ces milieux a aboli la stimulation (données non représentées). Ces résultats montrent que 1'ADNc cloné code un ML humain fonctionnel (hML). Pour déterminer si le "domaine EPO" seul pourrait lier et activer le récepteur mpl, la forme tronquée de hML, à savoir rhML,53, a été exprimée dans 293 cellules. On a trouvé que les liquides surnageants de cellules transfectées avaient une activité analogue à celle qui existe dans les liquides surnageants provenant de cellules exprimant le hML de longueur entière (figure 12A), ce qui indique que le domaine C-terminal de ML n'est pas nécessaire pour la liaison et l'activation de c-mpl. 6. Le ligand mpl stimule la mgacaryocytopolèse et la thrombopoiese La forme rhML de longueur totale et la forme rbhML1s3 tronquée de hML recombinant ont stimulé la mégacaryo- cytopolése humaine in vitro (figure 12B). Cet effet a été observé en l'absence d'autres facteurs de croissance hémato- polétique d'origine exogène. A l'exception de IL-3, le ML a été le seul facteur de croissance hématopoiétique testé qui ait présenté cette activité. Cet effet sur la mégacaryocyto- polèse n'a pas été observé pour IL-11, IL-6, IL-1, l'érythro- polétine, G-CSF, IL-9, LIF, kit-ligand (LK), M-CSF, OSM et GM-CSF lorsqu'ils ont été testés séparément dans l'essai selon l'invention (données non représentées). Le résultat démontre que le ML déploie une activité stimulante à l'égard des mégacaryocytes, et indique un r8le de régulation de la mégacaryocytopolèse pour ML. Il a été démontré que les activités thrombopolé- tiques présentes dans le plasma d'animaux thromocytopéniques stimulaient la production des plaquettes dans un essai de thrombocytose à rebondissement chez la souris (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1001 [1973] et McDonald et al., Scand. J. Haematol., 16:326-334 [19761). Dans ce modèle, on déclenche une thrombocytopénie aigué chez des souris en utilisant un sérum spécifique antiplaquettes, ce qui entraine une thrombocytose à rebondissement prévisible. Ces souris immuno-thrombocythémiques sont plus sensibles à des activités exogènes analogues à la thrombopoiétine que le sont des souris normales (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1001 [1973]), tout comme des souris exhypoxi- ques sont plus sensibles à l'érythropolétine que le sont des souris normales (McDonald et al., J. Lab. Clin. Med., 77:134- 143 [1971]). Pour déterminer si le rML stimule la production de plaquettes in vivo, des souris atteintes de thrombocytose à rebondissement ont reçu une injection de rhML partiellement purifié. Les taux de plaquettes et l'incorporation de 3sS dans les plaquettes ont ensuite été évalués quantitativement. L'injection à des souris de 64 000 ou 32 000 unités de rML a accentué notablement la production de plaquettes, comme mis en évidence par une élévation d'environ 20 % de la numération des plaquettes (p = 0,0005 et 0,0001, respectivement) et une augmentation d'environ 40 % de l'incorporation de 35S aux plaquettes (p = 0,003) chez les souris traitées, comparative- ment à des souris témoins auxquelles l'excipient avait seul été injecté (figure 12C). Ce degré de stimulation est comparable à celui qui a été observé avec IL-6 dans ce modèle (résultats non représentés). Un traitement avec 16 000 unités de rML n'a pas notablement stimulé la production des plaquet- tes. Ces résultats indiquent que le ML stimule la production des plaquettes d'une manière dépendant de la dose et possède donc une activité analogue à celle de la thrombopoiétine. 293 cellules ont aussi été transfectées avec les autres assemblages d'isoformes hML décrits ci-dessus, et les liquides surnageants ont été titrés d'après l'essai de prolifération Ba/F3-mpl (voir figure 13). Les formes hML2 et hML3 n'ont pas présenté d'activité détectable dans cet essai, toutefois, l'activité de hML(R153A, R154A) a été semblable à celle de hML et de hMLs3, ce qui indique que la maturation au niveau du site dibasique Argls3-Argl. n'est ni nécessaire ni nuisible à l'activité. 7. Megacaryocytopoi&se et ligand mpl Il a été présumé que la mégacaryocytopoièse était régulée à de multiples niveaux cellulaires (Williams et al., J. Cell. Physiol., 110:101-104 [1982] et Williams et al., 2714670 84 Blood Cells, 15:123-133 [1989]). Cela est basé en grande partie sur l'observation du fait que certains facteurs de croissance hématopolétique stimulent la prolifération de progéniteurs de mégacaryocytes tandis que d'autres semblent affecter principalement la maturation. Les résultats présen- tés ici suggèrent que le ML agit à la fois comme facteur de prolifération et de maturation. Le fait que le ML stimule la prolifération des progéniteurs de mégacaryocytes est étayé par un certain nombre de preuves. Tout d'abord, l'APP stimule à la fois la prolifération et la maturation de mégacaryocytes humains in vitro, et cette stimulation est entièrement inhibée par la mpl-IgG (figures 7 et 8). En outre, l'inhibition de la formation de colonies de mégacaryocytes par des oligonucléotides antisens C-mpl (Methia et al., Blood, 82:1395-1401 [19931) et la mise en évidence du fait que le c-mpl pouvait effectuer la transduction d'un signal de prolifération dans des cellules dans lesquelles il était transfecté (Skoda et al., EMBO, 12:2645-2653 [1993] et Vigon et al., Oncogène, 8:2607-2617 (1993]) indiquent également que le ML stimule la prolifération. L'expression apparente ce c-mpl pendant tous les stades de différenciation des mégaca- ryocytes (Methia et al., Blood, 82:1395-1401 [1993]) et l'aptitude du ML recombinant à stimuler rapidement la production de plaquettes in vivo indiquent que le ML affecte aussi la maturation. La disponibilité du ML recombinant rend possible une évaluation minutieuse de son r8le dans la régulation de la mégacaryocytopolèse et de la thrombopoièse de même que son aptitude à influer sur d'autres lignées hématopolétiques. 8. Isolement du gène du ligand mpl humain (TPO) Des clones d'ADN génomique humain du gène TPO ont été isolés par triage d'une banque génomique humaine en X-Geml2 avec pR45, dans des conditions faiblement rigoureuses ou dans des conditions fortement rigoureuses avec un fragment correspondant à la moitié 3' de 1'ADNc humain codant pour le ligand mpl. Deux clones lambda à recouvrement couvrant 35 kb ont été isolés. Deux fragments à recouvrement (BamH1 et EcoRI), contenant le gène TPO entier ont été sous-clonés et séquences (voir figures 14A, 14B et 14C). a structure du gène humain est composée de 6 exons à l'intérieur de 7 kb d'ADN génomique. Les limites de toutes les jonctions exon/intron concordent avec le motif consensus établi pour des gènes de mammifère (M.B. Shapiro et al., Nucl. Acids Res., 15:7155 [1987]). L'exon i et l'exon 2 contiennent la séquence 5' non traduite et les quatre aminoacides initiaux du peptide signal. Le reste du signal sécrétoire et les 26 premiers aminoacides de la protéine mature sont codés dans l'exon 3. Le domaine carboxyle entier et la séquence 3' non traduite de même qu'environ 50 amino- acides du domaine analogue à l'érythropoiétine sont codés dans l'exon 6. Les quatre aminoacides impliqués dans la délétion observée dans hML-2 (hTPO-2) sont codés à l'extré- mité 5' de l'exon 6. L'analyse d'ADN génomique humain par Southern blot a indiqué que le gène pour TPO était présent en une copie unique. La localisation chromosomique du gène a été déterminée par hybridation fluorescente in situ (FISH), qui a indiqué le chromosome 3q27-28. 9. Expression et purification de TPO de 293 cellules La préparation et la purification de ML ou de TPO à partir de 293 cellules sont décrites en détail dans l'Exemple 19. En bref, i'ADNc correspondant au cadre de lecture ouvert entier de TPO a été obtenu par réaction PCR en utilisant le plasmide pRKS5-hmpl I. Le produit de PCR a été purifié et cloné entre les sites de restriction ClaI et XbaI du plasmide pRK5tkneo (vecteur dérivé de pRK5 modifié pour exprimer un gène résistant à la néomycine sous l'influence du promoteur de thymidine-kinase) afin d'obtenir le vecteur prKStkneo.ORF (vecteur codant pour le cadre de lecture ouvert entier). Un second vecteur codant pour le domaine homolo-gue d'EPO a été engendré de la même façon, mais avec utilisa- tion de différentes amorces de PCR pour obtenir l'assemblage final appelé pRK5-tkneoEPO-D. Ces deux assemblages ont été transfectés dans des cellules de rein d'embryon humain par la méthode au CaPO4, et des clones résistant à la néomycine ont été choisis et ont été développés jusqu'à la confluence. L'expression de ML1s3 ou de ML332 dans le milieu conditionné à partir de ces clones a été déterminée en utilisant l'essai de prolifération Ba/F3mpl. On a conduit la purification de rhML332 de la manière décrite dans l'Exemple 19. En bref, des milieux conditionnés par 293-rhML332 ont été appliqués à une colonne Blue-Sepharose (Pharmacia) qui a ensuite été lavée avec un tampon contenant de l'urée 2 M. La colonne a été éluée avec un tampon contenant de l'urée 2 M et du NaCl 1 M. Le volume élué de Blue-Sepharose a ensuite été appliqué directement à une colonne de WGA-Sepharose, lavé avec 10 volumes de colonne d'un tampon contenant de l'urée 2 M et du NaCl 1 M et élué avec le même tampon contenant de la N-acétyl-D-glucosamine 0,5 M. L'éluat de WGA-Sepharose a été chargé sur une colonne C4 de chromatographie en phase liquide à haute performance (Synchrom, Inc.) et élué avec un gradient de propanol discontinu. Dans l'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide, le 293-rhML332 purifié migre sous forme d'une large bande dans la région de 68-80 kDa du gel (voir figure 15). La purification de rhML1s3 a aussi été conduite de la manière décrite dans l'Exemple 19. En bref, des milieux conditionnés par 293-rhML1s3 ont été résolus sur Blue-Sepha- rose de la manière décrite pour rhML332. L'éluat de Blue- Sepharose a été appliqué directement à une colonne d'affinité pour mpl de la manière décrite ci-dessus. Le rhML1s3 élué de la colonne d'affinité pour mpl a été purifié jusqu'à consis- tance homogène au moyen d'une colonne de CLHP C4 opérant dans les mêmes conditions que celles qui ont été utilisées pour rhML332. Dans l'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide, le rhML153 purifié est résolu en eux bandes dominantes et deux bandes secondaires avec une valeur Mr d'environ 18 000-22 000 (voir figure 15). 10. Ligand mpl murin Un fragment d'ADN correspondant à la région codante du ligand mpl humain a été obtenu par PCR, purifié sur gel et marqué en présence de 32P-dATP et de 32P-dCTP. Cette sonde a été utilisée pour trier 10' clones d'une banque d'ADNc de foie de souris en XGTl0. Un clone murin (figure 16 [SEQ ID N : 12 et 13]) contenant un segment d'insertion de 1443 paires de bases a été isolé et séquencé. Le codon d'initiation présumé dans la position de nucleotides 138-141 se trouvait dans une séquence consensus favorable à l'initia- tion de la traduction eucaryotique (M. Kozak, J. Cell Biol., 108:229-241 [1989]). Cette séquence définit un cadre de lecture ouvert de 1056 nucléotides, qui prédit un produit de traduction primaire de 352 aminoacides. 137 nucléotides de séquence non traduite 5' et 246 nucleotides de séquence non traduite 3' flanquent ce cadre de lecture ouvert. Il n'y a pas de queue poly(A) à la suite de la région 3' non traduite, ce qui indique que le clone est probablement incomplet. L'extrémité N-terminale de la séquence prédite d'aminoacides est fortement hydrophobe et représente vraisemblablement un peptide signal. L'analyse sur ordinateur (G. von Heijne, Eur. J. Biochem. 133:17-21 [1983]) a indiqué un site de clivage potentiel pour la peptidase de signal entre les résidus 21 et 22. Un clivage dans cette position engendrerait un polypeptide mature de 331 aminoacides (35 kDa) identifié mML331 (ou mML2 pour des raisons décrites ci-dessous). La séquence contient 4 cystéines, toutes conservées dans la séquence humaine, et sept sites de N-glycosylation potentielle. 5 d'entre eux sont conservés dans la séquence humaine. Là encore, comme pour hML, les sept sites de N-glycosylation potentielle se trouvent dans la moitié C-terminale de la protéine. Par comparaison avec le ML humain, on a observé une identité considérable pour le nucléotide ainsi que pour les séquences déduites d'aminoacides dans les "domaines EPO" de ces ML. Toutefois, lorsque les séquences déduites d'amino- acides de ML humain et de ML de souris ont été alignées, il est apparu que la séquence murine présentait une délétion tétrapeptidique entre les résidus 111 et 114 correspondant à la délétion de 12 nucléotides faisant suite à la position de nucléotide 618 observée à la fois dans l'ADNc humain (voir ci-dessus) et l'ADNc de porc (voir ci-dessous). En conséquen- ce, on a examiné d'autres clones afin de détecter des isoformes murines ML possibles. L'un des clones codait un polypeptide à séquence déduite de 335 aminacides contenant le tétrapeptide "manquant" LPLQ. Cette forme est supposée être le ML murin de longueur entière et est appelée mML ou mML33s. Le nucléotide et la séquence déduite d'aminoacides pour mML sont représentés sur la figure 17 (SEQ ID N : 14 et 15). Ce clone d'ADNc est constitué de 1443 paires de bases suivies d'une queue poly(A). Il possède un cadre de lecture ouvert de 1068 paires de bases flanquées de 134 bases de séquence 5' non traduite et de 241 bases de séquence 3' non traduite. Le codon d'initiation présumé se situe dans la position de nucléotides 138-140. Le cadre de lecture ouvert code une protéine prédite de 356 aminoacides, dont les 21 premiers sont très hydrophobes et susceptibles de fonctionner comme signal de sécrétion. v Enfin, un troisième clone murin a été isolé, séquencé, et on a trouvé qu'il contenait la délétion de 116 nucléotides correspondant à hML3. Cette isoforme murine est donc dénommée mML3. Une comparaison des séquences déduites d'aminoacides de ces deux isoformes est représentée sur la figure 18 (SEQ ID NO : 9 et 16). L'identité de la séquence globale d'aminoacides entre ML humain et ML de souris (figure 19 (SEQ ID N : 6 et 171]) est de 72 %, mais cette homologie n'est pas uniformément distribuée. La région définie comme "domaine EPO" (amino- acides 1-153 pour la séquence humaine et 1-149 pour la souris) est mieux conservée (86 % d'homologie) que la région carboxy-terminale de la protéine (62 % d'homologie). Cela peut en outre indiquer que seul le "domaine EPO" est impor- tant pour l'activité biologique de la protéine. Il est intéressant de remarquer que, des deux motifs d'aminoacides dibasiques rencontrés dans hML, seul le motif dibasique faisant immédiatement suite au "domaine EPO" (position des résidus 153-154) dans la séquence humaine est présent dans la séquence murine. Cela concorde avec la possibilité selon laquelle le ML de longueur entière peut représenter une protéine précurseur qui subit un protéolyse limitée pour engendrer le ligand mature. En variante, une protéolyse entre Argls3-Argls4 peut faciliter la clairance de hML. Un vecteur d'expression contenant la séquence codante entière de mML a subi une transfection transitoire dans 293 cellules comme décrit dans l'Exemple 1. Des milieux conditionnés provenant de ces cellules ont stimulé l'incorpo- ration de 3H-thymidine dans des cellules Ba/F3 exprimant un mpl murin ou humain, mais n'ont eu aucun effet sur la lignée cellulaire parentale (mpl-less). Cela indique que l'ADNc de ML murin cloné code un ligand fonctionnel qui est capable d'activer à la fois le récepteur ML murin et le récepteur ML humain (mpl). 11. Ligand mpl porcin De l'ADNc de ML porcin (pML) a été isolé par réaction RACE PCR comme décrit dans l'Exemple 13. Un produit ADNc de PCR de 1342 paires de bases a été trouvé dans le rein et sous-cloné. Plusieurs clones ont été séquences et on a trouvé qu'ils codaient un ligand mpl de porc de 332 résidus d'aminoacides, appelé pML (ou pML332) ayant la séquence de nucléotides et la séquence déduite d'aminoacides représentées sur la figure 20 (SEQ ID NO : 18 et 19). Là encore, une seconde forme désignée par pML2, codant une protéine avec une délétion de 4 résidus d'amino- cides (228 résidus d'aminoacides) a été identifiée (voir figure 21 [SEQ ID NI : 21]). Une comparaison entre les séquences d'aminoacides de pML et de pML2 montre que cette dernière forme est identique, excepté que le tétrapeptide QLPP correspondant aux résidus 111-114 inclus a été supprimé (voir figure 22 [SEQ ID NO : 18 et 21]). Les délétions de quatre aminoacides observées dans l'ADNc de ML murin et de ML porcin apparaissent précisément dans la même position dans les protéines prédites. Une comparaison des séquences prédites d'amino- acides du ML mature d'être humain, de souris et de porc (figure 19 [SEQ ID NO : 6, 17 et 18]) indique que l'identité de la séquence globale est de 72 % entre souris et humain, de 68 % entre souris et porc et de 73 % entre porc et humain. L'homologie est notablement plus grande dans la moitié amino- terminale du ML (domaine homologue EPO). Ce domaine est identique à 80-84 % entre deux espèces quelconques, tandis que la moitié carboxy-terminale (domaine glucidique) n'est identique qu'à 57-67 %. Un motif d'aminoacides dibasiques qui pourrait représenter un site de clivage par protéase est présent à l'extrémité carboxylique du domaine d'homologie avec l'érythropoiétine. Ce motif est conservé entre les trois espèces dans cette position (figure 19 [SEQ ID N : 6, 17 et 18]) . Un second site dibasique présent dans les positions 245 et 246 dans la séquence humaine n'existe pas dans les séquences de souris ou de porc. Les séquences ML de souris et de porc contiennent 4 cystéines, toutes conservées dans la séquence humaine. Il existe sept sites de N-glycosylation potentielle dans le ligand de souris et six dans le ML de porc, donc S sont conservés dans la séquence humaine. Là encore, tous les sites de N-glycosylation potentielle sont localisés dans la moitié C-terminale de la protéine. 12. Expression et purification de TPO de cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) Les vecteurs d'expression utilisés pour la transfection de cellules de CHO sont appelés pSV15.ID.LL.MLORF (longueur totale ou TPO332) et pSVl5.I D.LL.MLEPO-D (forme tronquée ou TPO153). Les caractéristiques pertinentes de ces plasmides sont présentées sur les figures 23 et 24. Les opérations de transfection sont décrites dans l'Exemple 20. En bref, 1'ADNc correspondant au cadre de lecture ouvert entier de TPO a été obtenu par réaction PCR. Le produit de PCR a été purifié et cloné entre deux sites de restriction (ClaI et SalI) du plasmide pSV15.ID.LL pour obtenir le vecteur pSV15.ID.LL.MLORF. Un second assemblage correspondant au domaine homologue EPO a été engendré de la même façon mais avec utilisation d'une amorce inverse différente (EPOD.Sal). L'assemblage final pour le vecteur codant pour le domaine homologue EPO de TPO est appelé pSV15.ID.LL.MLEPO-D. Ces deux assemblages ont été linéarisés avec Notl et transfectés dans des cellules ovariennes de hamster chinois (cellules CHO-DP12, brevet européen N 307 247 publié le 15 mars 1989) par électroporation. 107 cellules ont été lectroporées dans un appareil d'électroporation BRL (350 volts, 330 mF, faible capacitance) en présence de 10, 25 ou 50 mg d'ADN comme décrit (G.L. Andreason, J. Tissue Cult. Meth. 15, 56 [1993]). Le lendemain de la transfection, les cellules ont été réparties dans des milieux sélectifs DHFR (DMEM-F12 à haute teneur en glucose 50:50 sans glycine, 2 mM de glutamine, 2-5 % de sérum de foetus de veau dialysé). 10 à 15 jours plus tard, des colonies individuelles ont été transférées sur des plaques à 96 alvéoles et on les a laissées se développer jusqu'à ce qu'elles soient confluen- tes. L'expression de ML153 ou de ML332 dans les milieux conditionnés provenant de ces clones a été déterminée d'après la méthode de prolifération de Ba/F3-mpl (décrite dans l'Exemple 1). Le processus de purification et d'isolement de TPO du liquide recueilli de culture de cellules de CHO est décrit dans l'Exemple 20. En bref, le liquide recueilli de culture de cellules (HCCF) est chargé sur une colonne Blue Sepharose (Pharmacia) dans un rapport d'environ 100 litres de HCCF par litre de résine. La colonne est ensuite lavée avec 3 à 5 fois son volume de tampon puis 3 à 5 fois son volume d'un tampon contenant de l'urée 2,0 M. Le TPO est ensuite élué avec 3 à 5 volumes de colonne de tampon contenant à la fois 2,0 M d'urée et 1,0 M de NaCl. L'éluat de Blue Sepharose rassemblé contenant le TPO est ensuite chargé sur une colonne de Sepharose contenant de la lectine de germe de blé (Pharmacia) équilibrée dans le tampon d'élution de Blue Sepharose dans un rapport de 8 à 16 ml d'éluat de Blue Sepharose par ml de résine. La colonne est ensuite lavée avec 2 à 3 fois son volume de tampon d'équilibrage. Le TPO est ensuite élué avec 2 à 5 volumes de colonne d'un tampon contenant de l'urée 2,0 M et de la Nacétyl-D-glucosamine 0,5 M. L'éluat de lectine de germe de blé contenant la TPO est ensuite acidifié et du CE, est ajouté à une concen- tration finale de 0,04 %. Le liquide résultant est chargé sur une colonne C4 à phase inversée équilibrée dans un milieu à 0,1 % de TFA et de 0,04 % de CI2E, à une charge d'environ 0,2 à 0,5 mg de protéine par ml de résine. La protéine est éluée dans un gradient linéaire à deux phases d'acétonitrile contenant 0,1 % de TFA et 0,04 a de C12E, et une collecte d'échantillons est effectuée sur la base de l'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide. Les échantillons collectés de la colonne C4 sont ensuite dilués et filtrés par dialyse contre environ 6 volumes de tampon sur une membrane d'ultrafiltration Amicon YM ou similaire ayant une plage de séparation de poids moléculaires de 10 000 à 30 000 daltons. Le diafiltrat résultant peut ensuite être directement traité ou bien il peut encore être concentré par ultrafiltration. Le diafil- trat/concentré est habituellement ajusté à une concentration finale de 0,01 % de Tween-80. La totalité ou une portion du diafiltrat/concen- tré équivalant à 2-5 % du volume calculé de la colonne est ensuite chargée sur une colonne Sephacryl S-300 HR (Pharmacia) équilibrée dans un tampon contenant 0,01 % de Tween 80, et chromatographiée. Les fractions contenant le TPO qui sont dépourvues d'agrégats et de produits de dégradation protéoly- tique sont ensuite rassemblées sur la base de l'électropho- rèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacryl- amide. L'échantillon rassemblé ainsi obtenu est filtré et conservé à 2 - 8 C. 13. Procédés de transformation et d'induction de la synthèse de TPO dans un micro-organisme et d'isolement, de purification et de repliement de la TPO qui y est produite a construction de vecteurs d'expression de TPO dans E. coli est décrite en détail dans l'ExempIe 21. En bref, des plasmides pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 et pMP202 ont tous été conçus pour exprimer les 155 premiers aminoacides de TPO en aval d'un leader de petite dimension qui varie entre les différents assemblages. Les leaders permettent principa- lement l'initiation de la traduction à un haut niveau et une purification rapide. Les plasmides pMP210-1, -T8, -21, -22, 30 -24, -25 sont conçus pour exprimer les 153 premiers amino- acides de TPO en aval d'une méthionine d'initiation et ne diffèrent que dans l'utilisation des codons pour les 6 premiers aminoacides de TPO, tandis que le plasmide pPM251 est un dérivé de pMP210-1 dans lequel l'extrémité carboxy- terminale de la TPO est prolongée par deux aminoacides. Tous les plasmides ci-dessus produisent de hauts niveaux d'expres- sion intracellulaire de TPO dans E. coli induite par le promoteur tryptophane (D.G. Yansura et al., Methods in Enzymology (publié sous la direction de D.V. Goeddel) 185:54- 0, Academic Press, San Diego [1990]). Les plasmides pPM1 et pMP172 sont des intermédiaires dans la construction des plasmides d'expression intracellulaire de TPO ci-dessus. Les plasmides d'expression de TPO ci-dessus ont été utilisés pour transformer le E. coli en utilisant la méthode du choc thermique au CaCl2 (M. Mandel et al., J. Mol. Biol., 53:159-162 [1970]) et d'autres modes opératoires décrits dans l'Exemple 21. En bref, les cellules transformées ont été cultivées d'abord à 370C jusqu'à ce que la densité optique (600 nm) de la culture ait atteint environ 2-3. La culture a ensuite été diluée et, après croissance avec aération, un acide a été ajouté. On a ensuite laissé la culture poursuivre sa croissance sous aération pendant encore 15 heures, après quoi les cellules ont été récoltées par centrifugation. Les opérations d'isolement, de purification et de repliement indiquées ci-dessous pour la production de TPO humaine repliée biologiquement active ou de fragments de TPO sont décrites dans les Exemples 22 et 23 et peuvent être appliquées à l'isolement de tout variant de TPO comprenant des formes à extension N-terminale ou C-terminale. D'autres modes opératoires qui conviennent pour le repliement de TPO recombinante ou synthétique peuvent être trouvés dans les brevets suivants : brevet des Etats-Unis d'Amérique NI 4 511 502 au nom de Builder et al., brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 512 922 au nom de Jones et al., brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 518 526 au nom de Olson et brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 620 948 au nom de Builder et al. ; pour une description générale des opérations d'isole- ment et de repliement de diverses protéines recombinantes exprimées en une forme insoluble dans E. coli. A. Séparation de TPO non soluble Un micro-organisme tel que E. coli exprimant la TPO codée par tout plasmide convenable est soumis à une fermentation dans des conditions dans lesquelles la TPO est déposée en "corps réfringents" insolubles. A titre faculta- tif, des cellules sont tout d'abord lavées dans un tampon de rupture des cellules. Par exemple, environ 100 g de cellules sont remis en suspension dans environ 10 volumes d'un tampon de rupture de cellules (par exemple 10 mM de Tris, 5 mM d'EDTA, pH 8) avec, par exemple, un homogénéiseur Polytron et les cellules sont centrifugées à 5000 x g pendant 30 minutes. On effectue ensuite la lyse des cellules en utilisant toute technique classique telle qu'un choc tonique, les ultrasons, un pompage sous pression, des opérations chimiques ou enzymatiques. Par exemple, le culot de cellules lavé ci- dessus peut être remis en suspension dans 10 autres volumes d'un tampon de rupture de cellules au moyen d'un homogénéi- seur et on fait passer la suspension de cellules dans un appareil de rupture de cellules LH (LH Inceltech, Inc.) ou dans un appareil de microfluidification (Microfluidics International) conformément aux indications du fabricant. La matière en particules contenant la TPO est ensuite séparée de la phase liquide et lavée au choix avec tout liquide conve- nable. Par exemple, une suspension de lysat cellulaire peut être centrifugée à 5000 x g pendant 30 minutes, les cellules sont remises en suspension et elles peuvent être centrifugées une seconde fois pour former un culot lavé de corps réfrin- gents. Le culot lavé peut être utilisé immédiatement ou bien il peut être conservé à l'état congelé (par exemple à -700C). B. Solubilisation et purification de TPO monomé- rique La TPO insoluble dans le culot de corps réfrin- gents est ensuite solublisée avec un tampon solubilisant. Le tampon solubilisant contient un agent chaotrope et il est habituellement tamponné à un pH basique et contient un agent réducteur destiné à améliorer le rendement en TPO monoméri- que. Des exemples d'agents chaotropes comprennent l'urée, le chlorhydrate de guanidine et le thiocyanate de sodium. Un agent chaotrope apprécié est le chlorhydrate de guanidine. La concentration de l'agent chaotrope est habituellement de 49 M, de préférence de 6-8 M. Le pH du tampon solubilisant est maintenu à l'aide de tout tampon convenable dans une plage de pH d'environ 7,5-9,5, de préférence de 8,0-9,0 et notamment à 8,0. Le tampon solubilisant contient aussi avantageusement un agent réducteur qui aide à la production de la forme monomérique de TPO. Des agents réducteurs convenables comprennent des composés organiques contenant un thiol libre (RSH). Comme exemples d'agents réducteurs, on mentionne le dithiothréitol (DTT), le dithioérythritol (DTE), le mercapto- 15 éthanol, le glutathion (GSH), la cystéamine et la cystéine. agent réducteur de choix est le dithiothréitol (DTT). Le tampon solubilisant peut éventuellement contenir un agent oxydant à action douce (par exemple de l'oxygène moléculaire) et un sulfite pour former la TPO monomérique par sulfitolyse. Dans cette forme de réalisation, le TPO-S-sulfonate résultant est ultérieurement replié en présence du tampon redox (par exemple GSH/GSSG) pour former la TPO convenablement repliée. La protéine TPO est, d'ordinaire, encore puri- fiée, par exemple par centrifugation, chromatographie par filtration sur gel et chromatographie sur colonne à phase inversée. A titre d'illustration, le mode opératoire suivant a donné des rendements convenables en TPO monoméri- que. Le culot de corps réfringents est remis en suspension dans environ 5 volumes en poids du tampon solubilisant (20 mM de Tris, pH 8, avec 6-8 M de guanidine et 25 mM de DTT) et la suspension est agitée pendant 1 à 3 heures ou pendant la nuit à 4 C pour effectuer la solubilisation de la protéine TPO. De fortes concentrations en urée (6-8 M) sont aussi utiles, mais elles donnent généralement des rendements un peu plus faibles comparativement à la guanidine. Après solubilisation, la solution est centrifugée à 30 000 x g pendant 30 minutes pour produire un liquide surnageant clair contenant la protéine TPO monomérique dénaturée. Le liquide surnageant est ensuite chromatographié sur une colonne de filtration sur gel Superdex 200 (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) à une vitesse d'écoule- ment de 2 ml par minute, et la protéine est éluée avec 20 mM de phosphate de sodium à pH 6,0 avec 10 mM de DTT. Les fractions contenant la protéine TPO dénaturée monomérique qui sont éluées entre 160 et 200 ml sont rassemblées. La protéine TPO est encore purifiée sur une colonne à phase inversée C4 semi-préparative (VYDAC 2 x 20 cm). L'échantillon est chargé à la vitesse de 5 ml/min sur une colonne équilibrée dans du TFA (acide trifluoracétique) à 0,1 % avec 30 % d'acétoni- trile. La protéine est éluée avec un gradient linéaire d'acétonitrile (30-60 % en 60 min). La protéine réduite purifiée est éluée lorsque l'acétonitrile est à environ 50 %. Cette matière est utilisée pour le repliement en vue d'obte- nir un variant biologiquement actif de TPO. 20 C. Repliement de TPO pour engendrer la forme logiquement active Après la solubilisation et après une autre purification de TPO, la forme biologiquement adtive est obtenue par repliement de la TPO monomérique dénaturée dans un tampon redox. Par suite de la grande activité de TPO (une stimulation semi-maximale dans l'essai Ba/F3 est obtenue à environ 3 pg/ml), il est possible d'obtenir une matière biologiquement active en utilisant de nombreuses conditions différentes en ce qui concerne le tampon, le détergent et le redox. Toutefois, dans la plupart des conditions, on obtient simplement une petite quantité de matière convenablement pliée ( plus de 50 %. Beaucoup de détergents différents comprenant le Triton X-100, le dodécyl-bêta-maltoside, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkosyl, Tween 20 et Tween 80, Zwittergent 3-14 ainsi que d'autres se sont montrés convenables pour la production d'au moins un peu de matière convenablement pliée. Parmi eux cependant, les détergents que l'on apprécie le plus ont été ceux de la famille CHAPS (CHAPS et CHAPSO) qui se sont révélés être ceux qui fonctionnaient le mieux dans la réaction de repliement et qui limitaient le mieux l'agréga- tion de la protéine et la formation inappropriée de disulfu- re. On a donné la préférence à des proportions de CHAPS supérieures à environ 1 %. La présence de chlorure de sodium a été nécessaire pour obtenir les meilleurs rendements, les proportions optimales se situant entre 0,1 M et 0,5 M. La présence d'EDTA (1-5 mM) dans le tampon redox a été appréciée pour limiter le degré d'oxydation (et d'agrégation) catalysé par un métal, que l'on a observé avec certaines préparations. Des concentrations en glycérol supérieures à 15 % ont donné les conditions optimales de repliement. Pour les rendements maximaux, il a été essentiel que le tampon redox renferme une paire d'oxydo-réduction constituée à la fois de thiol organique oxydé et réduit (RSH). Des paires convenables d'oxydo-réduction comprennent le mercapto-éthanol, le glutathion (GSH), la cystéamine, la cystéine et leurs formes oxydées correspondantes. Des paires d'oxydoréduction que l'on a appréciées ont été les paires glutathion(GSH) : glutathion oxydé (GSSG) ou cystéine : cystine. La paire d'oxydo-réduction que l'on a appréciée le plus a été la paire glutathion(GSH) : glutathion oxydé (GSSG). En général, des rendements élevés ont été observés lorsque la proportion molaire du membre oxydé de la paire d'oxydo-réduction a été égale ou supérieure à celle du membre réduit de cette même paire. Des valeurs de pH comprises entre 7,5 et environ 9 ont été optimales pour le repliement de ces variants de TPO. Des solvants organiques (par exemple éthanol, acétonitrile, méthanol) ont été tolérés à des concentrations de 10 à 15 % ou moins. De plus fortes proportions de solvants organiques ont accru la quantité de formes incorrectement pliées. Des tampons au Tris et au phosphate ont été généralement utiles. Une incubation à 40C a aussi produit de plus fortes proportions de TPO convenable- ment pliées. Des rendements de repliement de 40-60 % (sur la base de la quantité de TPO réduite et dénaturée utilisée dans la réaction de repliement) sont représentatifs de prépara- tions de TPO qui ont été purifiées par la première étape sur C4. De la matière active peut être obtenue lorsqu'on utilise des préparations moins pures (par exemple directement après la colonne Superdex 200 ou après l'extraction initiale de corps réfringents), bien que les rendements soient plus faibles par suite de la précipitation et de l'interférence accentuées de protéines étrangères à la TPO pendant le processus de repliement de TPO. Etant donné que la TPO contient 4 résidus de cystéine, il est possible d'engendrer trois versions disul- fure différentes de cette protéine : Version 1 : disulfures entre les résidus de cystéine 1-4 et 2-3 Version 2 : disulfures entre les résidus de cystéine 1-2 et 3-4 Version 3 : disulfures entre les résidus de cystéine 1-3 et 2-4. Pendant l'exploration initiale visant à détermi- ner les conditions de repliement, plusieurs pics différents contenant la protéine TPO ont été séparés par chromatographie à phase inversée sur colonne C4. Un seul de ces pics a eu une activité biologique importante comme déterminée par l'essai Ba/F3. Ensuite, les conditions de repliement ont été optimi- sées afin d'obtenir préférentiellement la version concernée. Dans ces conditions, les versions mal pliées ont représenté moins de 10 à 20 % du total de la TPO monomérique obtenue dans l'étape de solubilisation. On a déterminé que le motif disulfure pour la TPO biologiquement active était du type 1-4 et 2-3 par spectro- métrie de masse et séquençage de la protéine, les cystéines étant numérotées successivement à partir de l'extrémité amino-terminale. Ce motif de réticulation des cystéines concorde avec le motif connu de liaisondisulfure de l'éry- thropoiétine qui est une molécule apparentée. D. Activité biologique de la TPO repliée recombi- nante La TPO repliée et purifiée a une activité dans des essais aussi bien in vitro qu'in vivo. Par exemple, dans l'essai Ba/F3, une stimulation semi-maximale de l'incorpora- tion de thymidine à des cellules Ba/F3 pour TPO (Met' 1-153) a été obtenue à la dose de 3,3 pg/ml (0,3 pM) dans le test ELISA basé sur le récepteur mpl, l'activité semi-maximale étant apparue à 1,9 ng/ml (120 pM). Chez des animaux normaux et rendus myélodépressifs, sous l'effet d'une dose sub- léthale de rayons X, la TPO repliée (Met-' 1-153) s'est montrée très puissante (l'activité a été observée à des doses s'abaissant à 30 ng/souris) pour stimuler la production de nouvelles plaquettes. Une activité biologique similaire a été observée pour d'autres formes de TPO repliées conformément aux modes opératoires décrits ci-dessus (voir figures 25, 26 et 28). 14. Méthodes de mesure de l'activité thrombopol&tique L'activité thrombopoiétique peut être mesurée dans divers essais comprenant l'essai au ligand mpl Ba/F3 décrit dans l'Exemple 1, un essai de synthèse à rebondisse- ment de plaquettes de souris in vivo, un essai d'induction d'antigène de surface de cellule des plaquettes comme mesuré par un immuno-essai anti-plaquettes (anti-GPIIbIIIa) pour une lignée cellulaire mégacaryoblastique de leucémie humaine (CMK) (voir Sato et al., Brit. J. Heamotol., 72:184-190 [1989]) (voir également l'essai de mégacaryocytopoièse en suspension dans un liquide décrite dans l'Exemple 4), et l'induction d'une plyploidisation dans une lignée cellulaire mégacaryoblastique (DAMI) (voir Ogura et al., Blood, 72(1) : 49-60 [1988]). La maturation de mégacaryocytes à partir de cellules immatures grandement non synthétisantes d'ADN, en égacaryocytes morphologiquement identifiables, implique un procédé qui comprend l'apparition d'organelles cytoplasmi- ques, l'acquisition d'antigènes de membrane (GPIIbIII,), une endoréplication et la libération de plaquettes comme décrit en préambule. On doit s'attendre à ce qu'un promoteur spécifique de lignage (à savoir le ligand mpl) de maturation de mégacaryocytes induise au moins certaines de ces modifica- tions dans des mégacaryocytes immatures, conduisant à la libération de plaquettes et à l'atténuation de la thrombocy- topénie. Par conséquent, des essais ont été mis au point pour mesurer l'émergence de ces paramètres dans des lignées cellulaires de mégacaryocytes immatures, à savoir des cellules CMK et DAMI. L'essai CMK (Exemple 4) mesure l'appa- rition d'un marqueur spécifique de plaquettes, GBIIbIII, et le bourgeonnement de plaquettes. L'essai DAMI (Exemple 15) mesure l'endoréplication puisque des accroissements de la ploidie sont des empreintes de mégacaryocytes matures. Les mégacaryocytes reconnaissables ont des valeurs de ploidie de 2N, 4N, 8N, 16N, 32N, etc. Finalement, l'essai de rebondisse- ment sur plaquettes de souris in vivo (Exemple 16) est utile pour démontrer que l'administration du composé testé (en l'occurrence le ligand pour mpl) entraîne une élévation des nombres de plaquettes. Deux autres essais in vitro ont été mis au point pour mesurer l'activité en TPO. Le premier est un essai ELISA d'activation des récepteurs de kinase (KIRA) dans lequel des cellules CHO sont transfectées avec une chimère mpl-Rse et la phosphorylation de la tyrosine de Rse est mesurée par le test ELISA après exposition de la portion mpl de la chimère au ligand mpl (voir Exemple 17). Le second est un test ELISA basé sur le récepteur dans lequel une plaque ELISA revêtue d'IgG de lapin anti-humain capture le récepteur chimérique humain mpl-IgG qui s'attache au ligand mpl sur lequel porte l'essai. Un anticorps polyclonal de lapin lié à la biotine, contre le ligand mpl (TPOls5), est utilisé pour détecter le ligand mpl lié qui est mesuré au moyen de streptavidine- peroxydase comme décrit dans l'Exemple 18. 15. Réponse biologique in vivo de souris normales et irra- diees a la dose subléthale, traitées a la TPO Des souris normales et des souris irradiées à la dose subléthale ont été traitées avec de la TPO tronquée et entière isolée de cellules ovariennes de hamster chinois (CHO), de E. coli et de cellules de rein d'embryon humain (293). Les deux formes de TPO produites dans ces trois hôtes ont stimulé la production de plaquettes chez la souris, toutefois la TPO entière isolée de CHO a semblé produire la plus grande réponse in vivo. Ces résultats indiquent que la glycosylation correcte du domaine carboxy-terminal peut être nécessaire pour une activité optimale in vivo. (a) E. coli-rhTPO(Met-',153) La forme "Met" du domaine EPO (Met dans la position -1 plus les 153 premiers résidus de TPO humaine) produite dans E. coli (voir Exemple 23) a été injectée quotidiennement à des souris femelles normales C57 B6 comme décrit dans les légendes relatives aux figures 25 A, B et C. Ces figures montrent que la forme tronquée non glycosylée de TPO produite dans E. coli et repliée comme décrit ci-dessus est capable de stimuler à peu près le double de la production de plaquettes chez des souris normales sans affecter la population de globules rouges ou de globules blancs sanguins. La même molécule injectée quotidiennement à des souris femelles C57 B6 ayant reçu une irradiation subléthale ('37Cs) comme décrit dans les légendes des figures 26 A, B et C a stimulé la séparation des plaquettes et réduit le nadir, mais n'a eu aucun effet sur les érythrocytes ou les leuco- cytes. (b) CHO-rhTPO332 La forme entière de TPO produite dans des cellules CHO et injectée quotidiennement à des souris femelles normales C57 B6 comme décrit dans les légendes relatives aux figures 27 A, B et C a produit une augmentation d'un facteur cinq environ de la production des plaquettes chez des souris normales sans affecter la population d'éry- throcytes ou de leucocytes. (c) CHO-rhTPO332 ; E. coli-rhTPOt-1lls3) ; 293- rhTP0332 ; et E. coli-rhTPO5ss Des courbes de réponse à la dose ont été construites pour le traitement de souris normales avec de la rhTPO provenant de diverses lignées cellulaires (CHO-rhTPO332 ; E. coli-rhTPO(t-1.ls3) ; 293-rhTPO332 ; et E. coli-rhTPO!ss) comme décrit dans la légende relative à la figure 28. Cette figure montre que toutes les formes testées de la molécule stimulent la production de plaquettes, toutefois la forme entière produite dans des cellules CHO possède la plus grande activité in vivo. (d) CHO-rhTPOIs3, CHO-rhTPO.ó1,,. et CHO- rhTPO332 On a également construit des courbes de réponse à la dose pour le traitement de souris normales avec diverses formes de rhTPO produites dans CHO (CHO-rhTPO153, CHOrhTPO.cliw. et CHO-rhTPO332) comme décrit dans la légende relative à la figure 29. Cette figure montre que toutes les formes de CHO testées de la molécule stimulent la production des plaquettes, mais que la forme entière de 70 kDa a la plus grande activité in vivo. 6. Préparation recombinante générale de ligand mpl et de variants Le ligand de mpl est avantageusement préparé par des procédés classiques de recombinaison qui impliquent la production du polypeptide ligand mpl par culture de cellules ranfectées pour exprimer l'acide nucléique de ligand mpl (normalement par transformation des cellules avec un vecteur d'expression) et séparation du polypeptide des cellules. Toutefois, on envisage à titre facultatif que le ligand mpl puisse être produit par recombinaison homologue, ou avec des 5 procédés de production recombinante utilisant des éléments moins introduits dans des cellules contenant déjà de l'ADN codant le ligand mpl. Par exemple, un élément promoteur/activateur puissant, un suppresseur ou un élément exogène modulateur de transcription peut être inséré au génome de la cellule-hôte concernée avec une proximité et une orientation suffisantes pour influencer la transcription de l'ADN codant le polypeptide ligand mpl désiré. L'élément témoin ne code pas le ligand mpl, l'ADN étant plutôt indigène à l'égard du génome de la cellule-hôte. On trie ensuite les cellules produisant le polypeptide récepteur de la présente invention, ou les niveaux élevés ou abaissés d'expression, selon le cas. Ainsi, l'invention concerne un procédé de production de ligand mpl qui comprend les étapes consistant à insérer dans le génome d'une cellule contenant la molécule d'acide nucléique du ligand mpl un élément modulateur de transcription avec une proximité et une orientation suffisan- tes par rapport à la molécule d'acide nucléique pour influen- cer sa transcription, avec une autre étape facultative qui comprend la culture de la cellule contenant l'élément modulateur de transcription et la molécule d'acide nucléique. L'invention concerne aussi une cellule-hôte contenant la molécule indigène d'acide nucléique du ligand mpl lié de façon active à des séquences témoins exogènes reconnues par la cellule-hôte. A. Isolement de l'ADN codant le polypeptide ligand mpl L'ADN codant le polypeptide ligand mpl peut être obtenu à partir de toute banque d'ADNc préparée en partant d'un tissu dont on suppose qu'il possède l'ARNm du ligand mpl et qui l'exprime à un niveau détectable. Le gène du ligand pour mpl peut aussi être obtenu à partir d'une banque d'ADN génomique ou par synthèse d'oligonucléotides in vitro à partir de la séquence complète de nucléotides ou d'amino- acides. es banques sont triées avec des sondes conçues pour identifier le gène intéressant ou la protéine codée par lui. Pour des banques d'expression d'ADNc, des sondes convenables comprennent des anticorps monoclonaux et polyclo- naux qui reconnaissent le ligand mpl et se lient spécifique- ment à ce ligand. Des sondes qui conviennent pour des bandes d'ADNc comprennent des oligonucléotides d'une longueur d'environ 20-80 bases qui codent des portions connues ou suspectées de l'ADNc de ligand mpl de la même espèce ou d'espèces différentes ; et/ou des ADNc complémentaires ou homologues ou leurs fragments qui codent le même gène ou un gène similaire. Des sondes appropriées pour le triage de banques d'ADN génomique comprennent, à titre non limitatif, des oligonucléotides, des ADNc ou leurs fragments qui codent le même gène ou un gène similaire, et/ou des ADNc génomiques homologues ou leurs fragments. Le triage de la banque d'ADNc ou génomique avec la sonde choisie peut être conduit par des modes opératoires classiques tels que décrits aux chapitres 10-12 de l'ouvrage de Sambrook, et al., supra. Un autre moyen d'isolement du gène codant le ligand mpl consiste à utiliser la méthodologie PCR comme décrit au chapitre 14 de Sambrook et al., supra. Cette méthode nécessite l'utilisation de sondes oligonucléotidiques qui s'hybrident à de l'ADN codant le ligand mpl. Les straté- gies de sélection d'oligonucléotides sont décrites ci- dessous. Un procédé apprécié pour la mise en pratique de la présente invention consiste à utiliser des séquences d'oligonucléotides soigneusement choisies pour trier des banques d'ADNc provenant de divers tissus, de préférence de lignées cellulaires humaines ou porcines de rein (adulte ou foetal) ou de foie. Par exemple, des banques d'ADNc de lignées de cellules de foie de foetus humain sont triées avec les sondes oligonucléotidiques. En variante, des banques génomiques humaines peuvent être triées avec les sondes oligonucléotidiques. Les séquences d'oligonucléotides choisies comme sondes doivent avoir une longueur suffisante et doivent être suffisamment non ambiguês pour minimiser les données fausse- ment positives. La séquence ou les séquences nucléotidiques réelles sont habituellement désignées sur la base de régions du ligand mpl qui ont le moins de redondance de codon. Les oligonucléotides peuvent être dégénérés en une ou plusieurs positions. L'utilisation d'oligonucléotides dégénérés revêt une importance particulière lorsqu'on trie une banque issue d'une espèce pour laquelle l'usage préférentiel d'un codon n'est pas connu. L'oligonucléotide doit être marqué de manière qu'il puisse être détecté par hybridation à l'ADN dans la banque en cours de triage. Le procédé préféré de marquage consiste à utiliser de l'ATP (par exemple y32p) et une polynucléotide-kinase pour le marquage radioactif de l'extré- mité 5' de l'oligonucléotide. Toutefois, d'autres méthodes peuvent être utilisées pour marquer l'oligonu1léotide, comprenant à titre non limitatif un marquage à la biotine ou un marquage enzymatique. On attache un intérêt particulier à l'acide nucléique du ligand pour mpl qui code un polypeptide ligand pour mpl entier. Dans certaines formes de réalisation appréciées, la séquence d'acides nucléiques comprend la séquence naturelle de signaux du ligand mpl. L'acide nu- cléique ayant toute la séquence codant la protéine est obtenu par le triage de banques choisies d'ADNc ou génomiques en utilisant la séquence déduite d'aminoacides. B. Variants de séquence d'aminoacides de ligand mpl naturel On prépare des variants de séquence d'aminoacides de ligand mpl en introduisant des variations appropriées des ucléotides dans l'ADN de ligand mpl, ou par synthèse in vitro du polypeptide de ligand mpl désiré. Ces variants comprennent, par exemple, des suppressions ou des insertions ou des substitutions de résidus dans la séquence d'amino- acides pour le ligand mpl porcin. Par exemple, les parties carboxy-terminales du ligand mpl entier mature peuvent être enlevées par clivage protéolytique, in vivo ou in vitro, ou par clonage et expression d'un fragment de l'ADN codant le ligand mpl entier pour produire un variant biologiquement actif. On effectue toute combinaison de délétion, insertion et substitution pour parvenir à l'assemblage final, pourvu que cet assemblage final possède l'activité biologique désirée. Les variations d'aminoacides peuvent aussi modifier des processus du ligand mpl survenant après traduction, par exemple le changement du nombre ou de la position des sites de glycosylation. Pour la conception de variants de séquence d'aminoacides du ligand mpl, l'emplacement du site de mutation et la nature de la mutation dépendent de la caracté- ristique ou des caractéristiques du ligand mpl que l'on doit modifier. Les sites de mutation peuvent être modifiés individuellement ou en série, par exemple (1) par substitu- tion tout d'abord avec des choix d'aminoacides conservateurs puis avec des sélections plus radicales selon les résultats obtenus, (2) délétion du résidu-cible ou (3) insertion de résidus de la même classe ou d'une classe différente près du site localisé, ou des combinaisons des options 1-3. Une méthode utile d'identification de certains résidus ou de certaines régions du polypeptide ligand mpl qui sont des sites préférentiels pour la mutagenèse est appelée "mutagenèse d'exploration à l'alanine" comme décrit par Cunningham et Wells dans Science, 244:1081-1085 [19891. Dans cette méthode, un résidu ou un groupe de résidus-cibles est identifié (par exemple des résidus chargés tels que arg, asp, his, lys et glu) et remplacé par n'importe quel aminoacide, mais de préférence par un aminoacide neutre ou chargé négativement (de préférence alanine ou polyalanine) pour accomplir l'interaction des aminoacides avec le milieu aqueux environnant dans la cellule ou à l'extérieur de la cellule. Ces domaines démontrant une sensibilité fonctionnelle aux substitutions sont ensuite affinés par l'introduction d'un supplément de variants ou d'autres variants sur les sites ou pour les sites de substitution. Ainsi, bien que le site d'introduction d'une variation de séquence d'aminoacides soit prédéterminé, la nature de la mutation proprement dite ne nécessite pas d'être déterminée. Par exemple, pour optimiser la performance d'une mutation en un site donné, on conduit une mutagenèse d'exploration à l'alanine ou mutagénèse statistique au niveau du codon ou de la région-cible et on trie les variants des ligands mpl exprimés pour la combinai- son optimale de l'activité désirée. Il existe deux variables principales dans l'assemblage des variants de séquences d'aminoacides : l'emplacement du site de mutation et la nature de la muta- tion. Par exemple, des variants du polypeptide ligand mpl comprennent des variants par rapport à la séquence du ligand pour mpl, et peuvent représenter des allèles naturels (qui ne nécessitent pas de manipulation de l'ADN du ligand mpl) ou des formes mutantes prédéterminées obtenues par mutation de 1'ADN, pour parvenir à un allèle ou à un variant ne se rencontrant pas dans la nature. En général, l'emplacement et la nature de la mutation choisie dépendent de la caractéris- tique du ligand mpl qui doit être modifiée. Des délations de séquences d'aminoacides vont généralement d'environ 1 à 30 résidus, de préférence d'envi- ron 1 à 10 résidus, et sont normalement contiguës. En variante, des délétions de séquences d'aminoacides pour le ligand mpl peuvent comprendre une portion ou la totalité du domaine de glycoprotéine carboxy-terminale. Des délétions de séquences d'aminoacides peuvent aussi comprendre un ou plusieurs des 6 premiers résidus amino-terminaux de la 5 protéine mature. Des délétions facultatives de séquences d'aminoacides comprennent un ou plusieurs résidus dans une ou plusieurs régions de boucles qui existent entre les "fais- ceaux en hélice". Des délétions contiguès sont ordinairement effectuées en nombres pairs de résidus, mais des délétions uniques ou en nombres impairs rentrent dans le cadre de l'invention. Des délétions peuvent être introduites dans des régions de faible homologie parmi les ligands mpl qui partagent la plus grande identité de séquence pour modifier l'activité du ligand mpl. Ou bien des délétions peuvent être introduites dans des régions de faible homologie parmi des polypeptides ligands mpl de l'homme ou d'autres mammifères, qui partagent le plus d'identité de séquence avec le ligand mpl humain. Des délétions du polypeptide ligand mpl de mammifère dans des zones d'homologie importante avec d'autres ligands mpl de mammifères sont plus susceptibles de modifier l'activité biologique du ligand mpl dans une mesure plus importante. Le nombre de délétions consécutives est choisi de manière à préserver la structure tertiaire de ligands mpl dans le domaine affecté, par exemple un feuillet plié bêta ou une hélice alpha. Des insertions de séquences d'aminoacides comprennent des fusions amino-terminales et/ou carboxy- terminales dont la longueur va d'un résidu jusqu'à des polypeptides contenant 100 ou plus de 100 résidus, de même que des insertions internes aux séquences portant sur des résidus d'aminoacides simples ou multiples. Des insertions à l'intérieur de séquences (c'est-à-dire des insertions en dedans de la séquence du ligand mpl mature) peuvent aller généralement d'environ 1 à 10 résidus, mieux encore de 1 à 5, notamment de 1 à 3. Un exemple de fusion appréciée est celle d'un ligand mpl ou d'un fragment de ce ligand et d'une autre cytokine ou de son fragment. Des exemples d'insertions terminales comprennent un ligand mpl mature avec un résidu méthionyle N-terminal, un artéfact de l'expression directe de ligand mpl mature dans une culture de cellules recombinantes, et une fusion d'une séquence de signaux N-terminaux hétérolo- gues à l'extrémité N-terminale de la molécule de ligand mpl mature pour faciliter la sécrétion du ligand mpl mature par des hôtes recombinants. De telles séquences de signaux sont généralement obtenues à partir de l'espèce cellulaire hôte désirée et sont donc homologues de cette espèce cellulaire. Des séquences convenables comprennent STII ou Ipp pour E. coli, le facteur alpha pour une levure et des signaux viraux tels que l'herpès gD pour des cellules de mammifère. D'autres variants d'insertion de la molécule de ligand mpl comprennent la fusion à l'extrémité N- ou C- terminale de ligand mpl de polypeptides immunogéniques (c'est-à-dire non endogènes pour l'hôte auquel la fusion est administrée), par exemple des polypeptides bactériens tels qu'une bêta-lactamase ou un enzyme codé par le locus trp de E. coli, ou une protéine de levure, et des fusions C-termina- les avec des protéines ayant une longue demi-vie telles que les régions constantes d'immunoglobulines (ou d'autres régions d'immunoglobulines), l'albumine ou la ferritine, comme décrit dans le document WO 89/02922 mis à l'Inspection Publique le 6 avril 1989. Un troisième groupe de variants comprend des variants à substitution par des aminoacides. Ces variants présentent le retrait d'au moins un résidu d'aminoacides de la molécule de ligand mpl à la place duquel est inséré un résidu différent. Les sites de plus grand intérêt pour la mutagénèse par substitution comprennent des sites identifiés comme sites actifs de ligand mpl et des sites o les amino- acides rencontrés dans d'autres analogues sont notablement différents en termes d'encombrement de la chaîne latérale, de charge ou de caractère hydrophobe, mais o il y a également un haut degré d'identité de séquence au niveau du site choisi entre diverses espèces de ligands mpl et/ou dans les divers analogues animaux d'un membre ligand mpl. D'autres sites d'intérêt sont ceux dans lesquels des résidus particuliers du ligand mpl provenant de divers représentants d'une famille et/ou de diverses espèces animales d'un même représentant sont identiques. Ces sites, notamment ceux qui tombent dans une séquence d'au moins trois autres sites identiquement conservés, sont substitués d'une manière relativement conservatrice. Ces substitutions conservatrices sont représentées sur le Tableau 3 dans la colonne intitulée substitutions préférées. Si ces substitu- tions entraînent un changement d'activité biologique, de plus nombreux changements importants, appelés exemples de substi- tutions sur le Tableau 3, ou comme décrit plus loin à propos des classes d'aminoacides, sont introduits et les produits sont triés. TABLEAU 3 Residu Exeeples de Substitutions d'origine substitutions préférées Ala (A) Val; Leu: lie Val Arg (R) Lys; Gin; Asn Lys Asn (N) Gin; His; Lys; Arg Gin Asp (D) Glu Glu Cys (C) Set Ser Gin (Q) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly (G) Pro Pro His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg lie (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucine Leu Leu (L) norleucine; ile; val; Met; Ala: Phe lie Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; lie Leu Phe (F) Leu; Val; lie; Ala Leu Pro (P) Gly Gly Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala; norleucine Leu Des modifications importantes de fonction ou d'identité immunologique du ligand mpl sont accomplies par le hoix de substitutions qui diffèrent notablement par l'effet qu'elles produisent sur le maintien (a) de la structure du squelette de polypeptide dans l'aire de substitution, par exemple comme conformation en feuillet ou en hélice, (b) de la charge ou du caractère hydrophobe de la molécule sur le site visé ou (c) l'encombrement de la chaîne latérale. Les résidus naturels sont divisés en groupes basés sur les propriétés communes des chaînes latérales : (1) résidus hydrophobes : norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile ; (2) résidus hydrophiles neutres : Cys, Ser, Thr ; (3) résidus acides : Asp, Glu ; (4) résidus basiques : Asn, Gln, His, Lys, Arg ; (5) résidus qui exercent une influence sur l'orientation de la chaîne : Gly, Pro ; et (6) résidus aromatiques : Trp, Tyr, Phe. Des substitutions non conservatrices impliquent l'échange d'un représentant de l'une de ces classes contre un autre. Ces résidus substitués peuvent aussi être introduits sur les sites de substitution conservatrice ou, de préférence, dans les sites restants (non conservés). Dans une forme de réalisation de l'invention, il est souhaitable d'inactiver un ou plusieurs sites de clivage par protéase qui existent dans la molécule. Ces sites sont identifiés par l'inspection de la séquence d'aminoacides codée, dans le cas de la trypsine, par exemple pour un résidu arginyle ou lysinyle. Lorsque des sites de clivage par protéase ont été identifiés, ils sont rendus inactifs au clivage protéolytique par remplacement du résidu visé par un autre résidu, de préférence un résidu basique tel que la glutamine ou un résidu hydrophobe tel que la sérine ; par délétion du résidu ; ou par insertion d'un résidu prolyle immédiatement après le résidu. Dans une autre forme de réalisation, tout résidu méthionyle autre que le résidu méthionyle de départ de la séquence signal, ou tout résidu situé à moins d'environ 3 résidus de l'extrémité N-terminale ou C-terminale par rapport à chacun de ces résidus méthionyle, est substitué par un autre résidu (de préférence conformément au Tableau 3) ou supprimé. En variante, environ 1 à 3 résidus sont insérés dans des positions adjacentes à ces sites. Tout résidu de cystéine non impliqué dans le maintien de la conformation correcte du ligand mpl peut aussi tre substitué, généralement avec de la sérine, pour amélio- rer la stabilité à l'oxydation de la molécule et pour empêcher une réticulation aberrante. On a trouvé que les première et quatrième cystéines dans le domaine épo, numéro- tées à partir de l'extrémité amino-terminale, étaient nécessaires au maintien de la conformation correcte mais que les deuxième et troisième ne l'étaient pas. En conséquence, les deuxième et troisième cystéines dans le système épo peuvent être substituées. Des molécules d'acides nucléiques codant des variants de séquences d'aminoacides de ligand mpl sont prépa- rées par divers procédés connus dans l'art antérieur. Ces procédés comprennent, à titre non limitatif, l'isolement à partir d'une source naturelle (dans le cas de variants de séquences naturelles d'aminoacides) ou la préparation par mutagenèse sous la médiation d'oligonucléotides (ou dirigée sur un site), la mutagenèse par PCR et la mutagenèse en cassette d'un variant préparé auparavant ou d'une version non-variant du polypeptide ligand mpl. La mutagenèse sous la médiation d'un oligonucléo- tide est un procédé apprécié de préparation de variants de substitution, délétion et insertion d'ADN de ligand mpl. Cette technique est bien connue dans l'art antérieur, comme décrit par Adelman et al., DNA, 2:183 [1983]. En bref, de l'ADN de ligand mpl est modifié par hybridation d'un oligo- nucléotide codant la mutation désirée en une matrice d'ADN, o la matrice est la forme à un seul brin d'un plasmide ou bactériophage contenant la séquence d'ADN non modifiée ou naturelle du ligand mpl. Apres l'hybridation, une ADN- polymérase est utilisée pour synthétiser un second brin complémentaire entier de la matrice qui renfermera donc l'amorce de l'oligonucléotide et qui codera pour la modifica- tion choisie dans l'ADN de ligand mpl. En général, on utilise des oligonucléotides dont la longueur est d'au moins 25 nucléotides. Un oligonucléotide optimal comprend 12 à 15 nucléotides qui sont entièrement complémentaires de la matrice de part et d'autre du ou des nucléotides codant pour la mutation. Cela assure donc que l'oligonucléotide s'hybride correctement à la molécule matrice d'ADN à un seul brin. Les oligonucléotides sont aisément synthétisés par des techniques connues dans l'art antérieur telles que celle qui est décrite par Crea et al., dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765 [1978]. La matrice d'ADN peut être générée par des vecteurs qui sont dérivés de vecteurs de bactériophage M13 (les vecteurs M13mp18 et M13mp19 disponibles dans le commerce conviennent) ou des vecteurs qui contiennent comme origine de réplication un phage à un seul brin comme décrit par Viera etal., dans Meth. Enzymol., 153:3 [1987]. Ainsi, l'ADN qui doit être muté peut être inséré dans l'un de ces vecteurs pour générer une matrice à un seul brin. La production de la matrice à un seul brin est décrite dans les sections 4.21- 4.41 de l'ouvrage de Sambrook et al., intitulé Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Làboratory Press, NY 1989). En variante, une matrice d'ADN à un seul brin peut être générée par dénaturation d'ADN plasmidique double brin (ou autre), par des techniques classiques. Pour la modification de la séquence d'ADN naturelle (afin de générer par exemple des variants de séquences d'aminoacides), l'oligonucléotide est hybridé à la matrice à simple brin dans des conditions convenables d'hybridation. Un enzyme polymérisant l'ADN, habituellement le fragment de Klenow de l'ADN-polymérase I, est ensuite ajouté pour synthétiser le brin complémentaire de la matrice en utilisant l'oligonucléotide comme amorce pour la synthèse. Il est ainsi formé une molécule à double hélice hétérogène, de telle sorte qu'un brin d'ADN code la forme mutée du ligand mpl et que l'autre brin (la matrice originelle) code la séquence naturelle non modifiée du ligand mpl. Cette molécule à double hélice hétérogène est ensuite transformée en une cellule-hôte convenable, habituellement un procaryote tel que E. coli JM101. Après que les cellules se sont développées, elles sont étalées sur des plaques d'agarose et triées en utilisant l'amorce d'oligonucléotide marquée par la radio- activité avec un 32-phosphate pour identifier les colonies bactériennes qui contiennent l'ADN muté. La région de mutation est ensuite retirée et placée dans un vecteur approprié pour la production de protéines, généralement un vecteur d'expression du type normalement utilisé pour la transformation d'un hôte approprié. La méthode qui vient d'être décrite peut être modifiée de façon telle qu'il soit créé une molécule homo- duplex dans laquelle les deux brins du plasmide contiennent la mutation ou les mutations. Les modifications sont les suivantes : l'oligonucléotide à un seul brin est circularisé en la matrice à un seul brin comme décrit ci-dessus. Un mélange de trois désoxyribonucléotides, à savoir désoxyribo- adénosine (dATP), désoxyriboguanosine (dGTP) et désoxyribo- thymidine (dTTP), est associé à une thiodésoxyribocytosine modifiée appelée dCTP-(aS) (que l'on peut se procurer auprès de l'Amersham Corporation). Ce mélange est ajouté au complexe matrice-oligonucléotide. Lorsque de l'ADN-polymérase est ajouté à ce mélange, un brin d'ADN identique à la matrice, excepté les bases mutées, est généré. En outre, ce brin nouveau d'ADN contient la dCTP- (aS) au lieu de dCTP, qui sert à le protéger de la digestion par une endonucléase de restriction. Après que le brin de matrice de la double hélice hétérogène a été coupé à l'aide d'un enzyme de restriction approprié, le brin de matrice peut être digéré avec la nucléase ExoIII ou une autre nucléase appropriée au-delà de la région qui contient le site ou les sites devant subir la mutagénèse. La réaction est ensuite arrêtée en laissant une molécule qui n'est que partiellement rendue monocaténaire. Un omoduplex d'ADN double brin complet est ensuite formé au moyen d'ADN-polymérase en présence des quatre désoxyribonu- cléotide-triphosphates, d'ATP et d'ADN-ligase. Cette molécule homoduplex peut ensuite être transformée en une cellule-hôte convenable telle que E. coli JM101, comme décrit ci-dessus. De l'ADN codant des mutants de ligand mpl avec plus d'un aminoacide devant être substitué peuvent être générés selon l'un de plusieurs procédés. Si les aminoacides occupent des positions rapprochées dans la chaîne de polypeptide, ils peuvent être mutés simultanément par l'utilisation d'un oligonucléotide qui code pour la totalité des substitu- tions désirées d'aminoacides. Toutefois, si les aminoacides se trouvent à une certaine distance les uns des autres (séparés de plus d'environ 10 aminoacides), il est difficile de générer un unique oligonucléotide qui code toutes les variations désirées. On peut au contraire utiliser l'un de deux procédés en variante. Dans le premier procédé, un oligonucléotide séparé est généré pour chaque aminoacide devant être substi- tué. Les oligonucléotides sont ensuite circularisés simulta- nément en ADN formant une matrice à un seul brin, et le second brin d'ADN qui est synthétisé à partir de la matrice code toutes les substitutions désirées d'aminoacides. L'autre procédé implique deux ou plus de deux reprises de mutagenèse pour produire le mutant désiré. La première reprise est telle que décrite pour les simples mutants : de l'ADN de type sauvage est utilisé pour la matrice, un oligonucléotide codant la première ou les premières substitutions d'aminoacides désirées est circula- risé en cette matrice, et la molécule d'ADN hétérogène double brin est ensuite générée. La seconde reprise de mutagénèse utilise l'ADN muté produit dans la première reprise de mutagénèse comme matrice. Ainsi, cette matrice contient déjà une ou plusieurs mutations. L'oligonucléotide codant l'autre ou les autres substitutions d'aminoacides désirées est ensuite circularisé en cette matrice, et le brin résultant d'ADN code à présent des mutations de la première et de la seconde reprise de mutagenèse. Cet ADN résultant peut être utilisé comme matrice dans une troisième reprise de mutagé- nèse, et ainsi de suite. Une mutagénèse par PCR, réaction en chaine par l'ADN-polymérase, convient aussi pour la production de variants d'aminoacides du polypeptide ligand mpl. Bien que les commentaires qui suivent se rapportent à l'ADN, il y a lieu de remarquer que la technique couvre aussi une applica- tion avec i'ARN. La technique de réaction PCR se rapporte généralement au mode opératoire suivant (voir Erlich, supra, chapitre rédigé par R. Higuchi, pages 61-70) : Lorsqu'on utilise de petites quantité d'ADN matrice comme matière de départ dans une PCR, des amorces qui diffèrent légèrement, par leur séquence, de la région correspondante dans un ADN matrice peuvent être utilisées pour générer des quantités relativement grandes d'un fragment spécifique d'ADN qui diffère de la séquence matrice uniquement dans les positions o les amorces sont différentes de la matrice. Pour 1'intro- duction d'une mutation dans un ADN plasmidique, l'une des amorces-est conçue pour recouvrir la position de la mutation et pour contenir cette dernière ; la séquence de l'autre amorce doit être identique à un segment de la séquence du brin opposé du plasmide, mais cette séquence peut être située n'importe o le long de l'ADN plasmidique. Toutefois, il est préférable que la séquence de la seconde amorce soit située à moins de 200 nucléotides de celle de la première amorce, de manière que, en fin de compte, la région amplifiée entière de l'ADN délimité par les amorces puisse être aisément séquen- cée. Une amplification par PCR avec utilisation d'une paire d'amorces telle que celle qui vient d'être décrite produit une population de fragments d'ADN qui diffère dans la position de la mutation spécifiée par l'amorce, et le cas échéant dans d'autres positions, attendu que la reproduction de la matrice est un peu sujette à erreur. Si le rapport de la matrice à la matière consti- tuant le produit est extrêmement bas, la grande majorité des fragments d'ADN du produit renferme la mutation ou les mutations désirées. Ce produit est utilisé pour remplacer la région correspondante du plasmide qui a servi de matrice de PCR d'après la technologie classique de l'ADN. Des mutations au niveau de positions séparées peuvent être introduites simultanément par l'utilisation d'une seconde amorce mutante ou par la conduite d'une seconde réaction PCR avec des amorces mutantes différentes et la soudure simultanée des deux fragments PCR résultants au fragment du vecteur dans une troisième ligation partielle (ou d'un ordre supérieur). Dans un exemple représentatif de mutagénèse par PCR, l'ADN plasmidique matrice (1 pg) est linéarisé par digestion avec une endonucléase de restriction qui possède un unique site de reconnaissance dans l'ADN plasmidique à l'extérieur de la région devant être amplifiée. On ajoute 100 ng de cette matière à un mélange PCR contenant un tampon de PCR, qui renferme les quatre désoxynucléotide-triphospha- tes et qui est inclus dans les kits de marque commerciale enregistrée GeneAmp (obtenus auprès de la firme Perkin-Elmer Cetus de Norwalk, CT et Emeryville, CA), et 25 pmoles de chaque amorce oligonucléotidique, jusqu'à un volume final de 50 Ml. Le mélange réactionnel est recouvert de 35 Ml d'huile minérale. Il est dénaturé pendant 5 minutes à 1000C, maintenu brièvement sur de la glace puis 1 1l d'ADN-polymérase de Thermus aquaticus (Taq) (5 unités/gl, commercialisé par la firme Perkin-Elmer Cetus), est ajouté au-dessous de la couche d'huile minérale. Le mélange réactionnel est ensuite intro- duit dans un appareil de traitement thermique cyclique d'ADN (vendu par la firme Perkin-Elmer Cetus), programmé comme suit : 2 min à 55 C 30 s à 72 C, puis 19 cycles établis comme suit : 0 s à 94 C 30 s à 550C, et 30 s à 72"C. A la fin du programme, la fiole de réaction est retirée de l'appareil à cycle thermique et la phase aqueuse est tranférée dans une nouvelle fiole, extraite avec un mélange phénol/chloroforme (50:50 en volume) et précipitée à l'éthanol, et l'ADN est recueilli par des opérations classiques. Cette matière est ensuite soumise à des traitements appropriés en vue de son insertion dans un vecteur. Un autre procédé de préparation de variants, à savoir la mutagenèse par cassette, est basé sur la technique décrite par Wells et al. dans Gene, 34:315 [1985]. La matière de départ est le plasmide (ou autre vecteur) comprenant l'ADN de ligand mpl devant être muté. Le codon ou les codons existant dans l'ADN de ligand mpl devant être muté sont identifiés. Il doit y avoir un site unique d'endonucléase de restriction de chaque côté du site ou des sites identifiés de mutation. S'il n'existe aucun de ces sites de restriction, ils peuvent être générés en utilisant la méthode de mutagé- nèse sous la médiation d'oligonucléotides décrite ci-dessus afin de les introduire dans des emplacements appropriés dans l'ADN de ligand mpl. Après que les sites de restriction ont été introduits dans le plasmide, ce dernier est sectionné au niveau de ces sites afin de le linéariser. Un oligonucléotide double brin codant la séquence de l'ADN entre les sites de restriction mais contenant la mutation ou les mutations désirées est synthétisé par des modes opératoires classiques. Les deux brins sont synthétisés séparément puis hybridés ensemble par des techniques classiques. Cet oligonucléotide double brin est appelé cassette. Cette cassette est concue de manière à présenter des extrémités 3' et 5' qui sont compati- bles avec les extrémités du plasmide linéarisé, afin qu'elle puisse être soudée directement au plasmide. Ce plasmide contient à présent la séquence d'ADN de ligand mpl muté. C. Insertion d'acide nucléique dans un vecteur apte à la réplication L'acide nucléique (par exemple de 1'ADNc ou de l'ADN génomique) codant le polypeptide ligand mpl naturel ou variant est inséré dans un vecteur susceptible de réplication en vue d'un clonage ultérieur (amplification de l'ADN) ou d'une expression. De nombreux vecteurs sont disponibles, et le choix du vecteur approprié dépend (1) de ce qu'il doit être utilisé pour l'amplification d'ADN ou pour l'expression d'ADN, (2) de la grandeur de l'acide nucléique devant être inséré dans le vecteur et (3) de la cellule-h8te devant être transformée avec le vecteur. Chaque vecteur contient divers composants selon sa fonction (amplification d'ADN ou expres- sion d'ADN) et la cellule-h8te avec laquelle il est compati- ble. Les composants du vecteur comprennent généralement, mais à titre non limitatif, un ou plusieurs des suivants : une séquence signal, une origine de réplication, un ou plusieurs gènes marqueurs, un élément activateur, un promoteur et une séquence de terminaison de transcription. (i) Composant séquence signal Le ligand mpl de la présente invention peut non seulement être exprimé directement, mais aussi comme fusion avec un polypeptide hétérologue, de préférence une séquence signal ou un autre polypeptide présentant un site de clivage spécifique à l'extrémité N-terminale de la protéine mature ou du polypeptide. En général, la séquence signal peut être un composant du vecteur, ou bien elle peut constituer une partie de l'ADN de ligand mpl qui doit être inséré dans le vecteur. La séquence signal hétérologue choisie doit pouvoir être reconnue et traitée (c'est-à-dire clivée par une peptidase signal) par la cellule-hôte. Pour des cellules-hôtes procaryotiques qui ne reconnaissent et ne traitent pas la séquence signal naturelle de ligand mpl, la séquence signal est remplacée par une séquence signal procaryotique choisie par exemple dans le groupe d'une phosphatase alcaline, d'une pénicillinase, de lpp ou de leaders d'entérotoxine II thermo- tables. Pour la sécrétion de levure, la séquence signal naturelle peut être remplacée par exemple par l'invertase de levure, le facteur alpha ou des leaders du type de phospha- tase acide, le leader de glucoamylase de C. albicans (brevet européen N 362 179 mis à l'Inspection Publique le 4 avril 1990) ou le signal décrit dans le document WO 90/13646 mis à l'Inspection Publique le 15 novembre 1990. Dans l'expression de cellules de mammifères, la séquence signal naturelle (c'est-à-dire la préséquence de ligand mpl qui, normalement, dirige la sécrétion de ligand mpl de ses cellules naturelles de mammifères in vivo) est satisfaisante, bien que d'autres séquences signaux de mammifères puissent convenir, par exemple des séquences signaux d'autres polypeptides ligands mpl ou du même ligand mpl provenant d'une espèce animale différente, des séquences signaux provenant d'un ligand mpl et des séquences signaux provenant de polypeptides sécrétés de la même espèce ou d'une espèce apparentée, de même que les leaders sécrétoires viraux, par exemple le signal de l'herpès simplex gD. (ii) Origine du composant de réplication Les deux vecteurs d'expression et de clonage contiennent une séquence d'acides nucléiques qui permet au vecteur de se répliquer dans une ou plusieurs cellules-hôtes choisies. En général, dans des vecteurs de clonage, la séquence est apte à permettre au vecteur de se répliquer indépendamment de l'ADN chromosomique de l'hôte, et renferme des origines de réplication ou des séquences de réplication autonome. Ces séquences sont bien connues pour diverses sortes de bactéries, de levures et de virus. L'origine de réplication à partir du plasmide pBR322 convient pour la plupart des bactéries Gram-négatives, l'origine du plasmide 2 y convient pour une levure, et diverses origines virales (SV40, polyome, adénovirus, VSV ou BPV) sont utiles pour le clonage de vecteurs dans des cellules de mammifères. En général, l'origine du composant de réplication n'est pas nécessaire pour des vecteurs d'expression de mammifères (l'origine SV40 peut par exemple n'être utilisée que parce qu'elle contient le promoteur précoce). La plupart des vecteurs d'expression sont des vecteurs "navettes", c'est-à-dire qu'ils sont capables de réplication dans au moins une classe d'organismes mais peuvent être transfectés dans un autre organisme en vue de l'expression. Par exemple, un vecteur est cloné dans E. coli puis le même vecteur est transfecté dans des cellules de levure ou des cellules de mammifères en vue de l'expression, même s'il n'est pas capable de se répliquer indépendamment du chromosome de la cellule-hôte. De l'ADN peut aussi être amplifié par insertion dans le génome d'un hôte. On y parvient aisément en utilisant comme hôtes des espèces du genre Bacillus, par exemple en incluant dans le vecteur une séquence d'ADN qui est complé- mentaire d'une séquence que l'on trouve dans l'ADN génomique de Bacillus. La transfection de Bacillus avec ce vecteur entraîne une recombinaison homologue avec le génome et l'insertion d'ADN de ligand mpl. Toutefois, la séparation de l'ADN génomique codant le ligand mpl est plus complexe que celle d'un vecteur répliqué de façon exogène, parce que la digestion par un enzyme de restriction est nécessaire pour exciser l'ADN de ligand mpl. (iii) Composant gène de sélection Des vecteurs d'expression et de clonage doivent contenir un gène de sélection, que l'on considère également comme un marqueur pouvant être choisi. Ce gène code une protéine nécessaire à la survie ou à la croissance de cellules-hôtes transformées qui se développent dans un milieu de culture sélectif. Des cellules-hôtes non transformées avec le vecteur contenant le gène de sélection ne survivent pas dans le milieu de culture. Des gènes de sélection représenta- tifs codent des protéines qui, (a) confèrent la résistance aux antibiotiques ou à d'autres toxines, par exemple ampicil- ine, néomycine, méthotrexate, ou tétracycline, (b) compen- sent des insuffisances auxotrophes ou (c) fournissent des substances nutritives critiques non disponibles dans des milieux complexes, par exemple le gène codant la D-alanine- racémase pour des représentants du genre Bacillus. Un exemple de schéma de sélection utilise un médicament pour arrêter la croissance d'une cellule-hôte. Les cellules qui sont transformées avec succès par un gène hétérologue expriment une protéine conférant la résistance aux médicaments et survivent donc au régime de sélection. Des exemples de cette sélection dominante utilisent les médicaments néomycine (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet., 1:327 [1982]), l'acide mycophénolique (Mulligan et al., Science, 209:1422 [1980]) et l'hygromycine (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 [1985]). Les trois exemples donnés ci-dessus utilisent des gènes bactériens sous influence eucaryotique pour transmettre la résistance au médicament approprié, G418 ou néomycine (généticine), xgpt (acide mycophénolique) ou respectivement hygromycine. Des exemples d'autres marqueurs convenables pouvant être choisis pour des cellules de mammifères compren- nent ceux qui permettent l'identification de cellules compétentes pour fixer l'acide nucléique de ligand mpl, comme la dihydrofolate-réductase (DHFR) ou la thymidine-kinase. Les transformants de cellules de mammifères sont placés sous une pression de sélection telle que seuls les transformants soient remarquablement rendus aptes à survivre du fait qu'ils ont fixé le marqueur. La pression de sélection est imposée par culture des transformants dans des conditions dans lesquelles la concentration en agent de sélection dans le milieu est successivement modifiée de manière à conduire à une amplification à la fois du gène de sélection et de l'ADN qui code le polypeptide ligand mpl. L'amplification est le processus par lequel des gènes davantage demandés pour la production d'une protéine déterminante pour la croissance sont renouvelés en tandem avec les chromosomes de générations successives de cellules recombinantes. Des quantités accrues de ligand mpl sont synthétisées à partir de l'ADN amplifié. Par exemple, des cellules transformées avec le gène de sélection DHFR sont tout d'abord identifiées par culture de tous les transformants dans un milieu de culture qui contient du méthotrexate (Mtx), qui est un antagoniste de compétition vis-à-vis de DHFR. Une cellule-hôte appropriée lorsqu'on utilise un DHFR de type sauvage est la lignée cellulaire d'ovaire de hamster chinois (CHO) présentant un déficit en activité de DHFR, préparée et propagée comme décrit par Urlaub et Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]. Les cellules transformées sont ensuite exposées à des taux croissants de Mtx. Cela mène à la synthèse de copies multiples du gène de DHFR et, en même temps, de copies multiples d'autres ADN comprenant les vecteurs d'expression, tels que l'ADN codant le ligand mpl. Cette technique d'amplification peut être utilisée avec tout hôte autrement convenable, par exemple CHO-K1 ATCC N CCL61, malgré la présence de DHFR d'origine endogène si, par exemple, un gène mutant de DHFR qui résiste au Mtx est utilisé (brevet européen N 117 060). En variante, des cellules-hôtes [en particulier des hôtes de type sauvage qui contiennent du DHFR endogène] transformées ou cotransformées avec des séquences d'ADN codant un ligand mpl, la protéine DHFR de type sauvage, et un autre marqueur pouvant être choisi tel que l'aminoglycoside-3'-phosphotransférase (APH) peuvent être sélectionnés par croissance cellulaire dans un milieu contenant un agent de sélection pour ce marqueur pouvant être choisi, tel qu'un antibiotique aminoglycosidique, par exemple la kanamycine, la néomycine ou le G418. Voir le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 965 199. Un gène de sélection convenable qui peut être utilisé dans une levure est le gène trpl présent dans le plasmide de levure YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 1979] ; Kingsman et al., Gene, 7:141 [1979] ; ou Tschemper et al., Gene, 10:157 [1980]). Le gène trpl offre un marqueur de sélection pour une souche mutante de levure qui n'est pas capable de croître dans le tryptophane, par exemple ATCC N 44 076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 [1977]). L'exis- tence d'une lésion de trpl dans le génome de la cellule-hôte de levure crée alors un environnement efficace pour détecter une transformation par croissance en l'absence de tryptopha- ne. De même, des souches de levure déficitaires en Leu2 (ATCC N 20 622 ou 38 626) sont complétées par des plasmides connus portant le gène de Leu2. (iv) Composant promoteur Les vecteurs d'expression et de clonage contien- nent habituellement un promoteur qui est reconnu par l'orga- nisme-hôte et qui est activement lié à l'acide nucléique du ligand pour mpl. Les promoteurs sont des séquences non traduites situées en amont (5') du codon de départ d'un gène structural (généralement dans les limites d'environ 100 à 1000 paires de bases) qui commandent la transcription et la traduction d'une séquence particulière d'acides nucléiques, par exemple la séquence d'acides nucléiques d'un ligand mpl, à laquelle ils sont liés de façon active. Ces promoteurs rentrent normalement dans deux catégories, à savoir les inductibles et les constitutives. Les promoteurs inductibles sont des promoteurs qui amorcent des niveaux accrus de transcription à partir d'un ADN sous leur influence en réponse à une certaine variation des conditions de culture, par exemple la présence ou l'absence d'une substance nutri- tive ou une variation de température. A l'heure actuelle, on connaît bien un grand nombre de promoteurs reconnus par une variété de cellules-hôtes potentielles. Ces promoteurs sont activement liés à l'ADN codant le ligand mpl par élimination du promoteur de l'ADN constituant la source par digestion par un enzyme de restriction et insertion, dans le vecteur, de la séquence isolée du promoteur. La séquence du promoteur aturel du ligand mpl et de nombreux promoteurs hétérologues peuvent être utilisés pour diriger l'amplification et/ou l'expression de l'ADN du ligand mpl. Toutefois, on préfère des promoteurs hétérologues, parce qu'ils offrent générale- ment une plus grande transcription et de plus hauts rende- ments du ligand mpl exprimé comparativement au promoteur naturel de ligand mpl. Des promoteurs avantageux à utiliser avec des hôtes procaryotiques comprennent les systèmes promoteurs de P-lactamase et de lactose (Chang et al., Nature, 275:615 [1978] ; et Goeddel et al., Nature, 281:544 [1979]), la phosphatase alcaline, un système promoteur de tryptophane (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980] et brevet européen N 36 776) et des promoteurs hybrides tels que le promoteur tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 [1983]). Toutefois, d'autres promoteurs bactériens connus sont convenables. Leurs séquences de nucléotides ont été publiées, ce qui permet à l'homme de l'art expérimenté de les souder effectivement à de l'ADN codant un ligand mpl (Siebenlist et al., Cell. 20:269 (1980]) en utilisant des segments de liaison ou des adapteurs pour créer tous sites désirés de restriction. Des promoteurs destinés à être utilisés dans des systèmes bactériens contiennent aussi une séquence de Shine-Dalgarno (S.D.) effectivement liée à l'ADN codant le polypeptide de ligand mpl. Des séquences de promoteurs sont connues pour des eucaryotes. Les gènes eucaryotiques ont pratiquement tous une région riche en AT située approximativement à 25-30 bases en amont du site o la transcription est initiée. Une autre séquence observée à 70-80 bases en amont du départ de la transcription de nombreux gènes est une région CXCAAT o X peut être n'importe quel nucléotide. A l'extrémité 3' de la plupart des gènes eucaryotiques, se trouve une séquence AATAAA qui peut être le signal de l'addition de la queue poly A à l'extrémité 3' de la séquence codante. Toutes ces séquences sont avantageusement insérées dans des vecteurs eucaryotiques d'expression. Des exemples de séquences promotrices convenables qui peuvent être utilisées avec des hôtes du type de levures comprennent les promoteurs pour la 3-phosphoglycérate-kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980]) ou d'autres enzymes glycolytique (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 [1968] ; et Holland, Biochemistry, 17:4900 [1978]), tels que l'énolase, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, l'hexokinase, la pyruvate décarboxylase, la phosphofructokinase, la glucose-6-phosphate isomérase, la 3phosphoglycérate mutase, la pyruvate kinase, la triose- phosphate isomérase, la phosphoglucose isomérase et la glucokinase. D'autres promoteurs de levures, qui sont des promoteurs inductibles ayant en outre l'avantage d'une transcription sous l'influence des conditions de croissance, sont les régions promotrices pour l'alcool-déshydrogénase 2, l'isocytochrome C, la phosphatase acide, des enzymes de dégradation associés au métabolisme de l'azote, la métallo- thionéine, la glycéraldéhyde-3-phosphate-déshydrogénase et des enzymes responsables de l'assimilation du maltose et du galactose. Des vecteurs et promoteurs avantageux à utiliser dans l'expression de levures sont en outre décrits par Hitzeman et al., dans le document européen N 76 657 A. Des activateurs de levures sont aussi utilisés avantageusement avec des promoteurs de levures. La transcription de ligands mpl par des vecteurs dans des cellules-h8tes de mammifères est influencée, par exemple, par des promoteurs obtenus de génomes de virus tels que le virus du polyome, le virus de la diphtérie aviaire (brevet britannique N 2 211 504 publié le 5 juillet 1989), un adénovirus (tel que l'Adénovirus 2), le virus du papillome bovin, le virus du sarcome aviaire, un cytomégalovirus, un rétrovirus, le virus de l'hépatite B et notamment le virus simien 40 (SV40), par des promoteurs hétérologues de mammifè- res, par exemple le promoteur d'actine ou un promoteur d'immunoglobuline, par des promoteurs de choc thermique et par le promoteur normalement associé à la séquence de ligand mpl, pourvu que ces promoteurs soient compatibles avec les systèmes cellulaires de l'hôte. Les promoteurs précoce et tardif du virus SV40 sont obtenus commodément comme un fragment de restriction de SV40 qui contient aussi l'origine de réplication du virus SV40 (Fiers et al., Nature, 273:113 [1978] ; Mulligan et Berg, Science, 209:1422-1427 [1980] ; Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402(19811. Le promoteur précoce immédiat du cytomégalovirus humain est commodément obtenu comme fragment de restriction Hind III E (Greenaway et al., Gene, 18:355-360 [1982]). Un système d'expression d'ADN dans des hôtes mammifères utilisant le virus de papillome bovin comme vecteur est révélé dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 419 446. Une version modifiée de ce système est décrite dans le brevet des Etats-Unis d>Amérique N 4 601 978. Voir également Gray et al., Nature, 295:503-508 [1982] à propos de l'expression d'ADNc codant l'interféron humain dans des cellules de singe ; Reyes et al., Nature, 297:598-601 [1982] au sujet de l'expression d'ADNc de 6- interféron humain dans des cellules de souris sous l'in- fluence d'un promoteur de thymidine-kinase provenant du virus d'herpès simplex ; Canaani et Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5110 [1982] au sujet de l'expression du gène de l'interféron humain 61 dans des cellules en culture de souris et lapins ; et Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 [1982] au sujet de l'expression de séquences CAT bactériennes dans des cellules de rein de singe CV-1, des fibroblastes d'embryon de poulet, des cellules ovariennes de hamster chinois, des cellules HeLa et des cellules de souris NIH-3T3, avec utilisation, comme promoteur, de la longue répétition terminale du virus du sarcome de Rous. (v) Composant élément activateur La transcription d'un ADN codant pour le ligand mpl de la présente invention par des eucaryotes supérieurs est souvent accentuée par l'insertion d'une séquence d'acti- vateur dans le vecteur. Les activateurs sont des éléments à action cis de l'ADN, allant habituellement d'environ 10 à 300 paires de bases, qui agissent sur un promoteur pour accroître sa transcription. Les activateurs sont relativement indépendants de l'orientation et de la position, du fait qu'ils ont été observés en 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 [1981]) et en 3' (Lusky et al., Mol. Cell. Bio., 3:1108 [1983]) par rapport à l'unité de trans- cription, dans un intron (Banerji et al., Cell, 33:729 [19831) ainsi que dans la séquence codante elle-même (Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4:1293 [1984]). De nombreuses séquences d'activateurs issus de gènes de mammifères sont à présent connues (globine, élastase, albumine, a-foetoprotéine et insuline). Toutefois, normalement, on utilise un activa- teur provenant d'un virus de cellule eucaryotique. Des exemples comprennent l'activateur SV40 du côté tardif de l'origine de réplication (100-270 paires de bases), l'activa- teur précoce de cytomégalovirus, l'activateur de polyome du côté tardif de l'origine de réplication et les activateurs d'adénovirus. Voir également Yaniv, Nature, 297:17-18(1982] au sujet d'éléments activateurs pour l'activation de promo- teurs eucaryotiques. L'activateur peut être épissé au vecteur en position 5' ou 3' par rapport à la séquence codant le ligand mpl, mais il est de préférence localisé en un site 5' à partir du promoteur. (vi) Composant de terminaison de transcription Des vecteurs d'expression utilisés dans des cellules-h8tes eucaryotiques (levure, champignons, insecte, plante, animal, être humain ou cellules nucléées provenant d'autres organismes multicellulaires) contiennent aussi des séquences nécessaires pour la terminaison de transcription et pour la stabilisation de l'ARN messager. Ces séquences sont communément disponibles à partir des régions non traduites 5' et, occasionnellement 3' d'ADN ou d'ADNc eucaryotiques ou viraux. Ces régions contiennent des segments de nucléotides transcrits comme fragments polyadénylés dans la portion non traduite de l'ARNm codant le ligand mpl. (vii) Construction et analyse de vecteurs La construction de vecteurs convenables contenant un ou plusieurs des composants énumérés ci-dessus emploie des techniques classiques de ligation. Des plasmides isolés ou des fragments d'ADN sont clivés, adaptés et resoudés sous la forme désirée pour générer les plasmides requis. Pour l'analyse en vue de confirmer des séquences correctes dans des plasmides assemblés, les mélanges de ligation sont utilisés pour transformer la souche 294 de E. coli K12 (ATCC N 31 446) et des transformants réussis sélectionnés d'après la résistance à l'ampicilline ou à la tétracycline selon les cas. Des plasmides issus des transfor- mants sont préparés, analysés par digestion par endonucléase de restriction et/ou séquences par la méthode de Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 [1981] ou par la méthode de Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 [1980]. (viii) Vecteurs d'expression transitoire Des vecteurs d'expression qui offrent une expression transitoire, dans des cellules de mammifères, d'ADN codant le polypeptide ligand mpl sont particulièrement utiles dans la mise en pratique de la présente invention. En général, l'expression transitoire implique l'utilisation d'un vecteur d'expression qui est capable de se répliquer effica- cement dans une cellule-hôte, de manière que la cellule-hôte accumule de nombreuses copies du vecteur d'expression et, par la suite, synthétise de fortes proportions d'un polypeptide désiré codé par le vecteur d'expression. (Sambrook et al., supra, pages 16,17 et 16-22). Des systèmes d'expression transitoire, comprenant un vecteur d'expression convenable et une cellule-hôte, permettent l'identification positive convenable de polypeptides codés par des ADN clones, de même que le tri rapide de ces polypeptides pour apprécier des propriétés biologiques et physiologiques désirées. Ainsi, les systèmes d'expression transitoire sont particulièrement utiles dans la présente invention aux fins de l'identifica- tion d'analogues et de variants de polypeptide ligand mpl qui ont une activité biologique en tant que polypeptide ligand pour mpl. (ix) Exemples convenables de vecteurs pour cellules de vertébrés D'autres méthodes, vecteurs et cellules-h8tes qui conviennent pour l'adaptation à la synthèse de ligand mpl dans une culture recombinante de cellules de vertébrés sont décrits par Gething et al. dans Nature, 293:620-625 [1981] ; Mantei et al., Nature, 281:40-46 [1979] ; Levinson et al. ; brevets européens NI 117 060 et 117 058. Un plasmide particu- lièrement utile pour l'expression du ligand mpl dans une culture de cellules de mammifères est le plasmide pRK5 (brevet européen Né 307 247, brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 5 258 287) ou le plasmide pSV16B (publication PCT NO WO 91/08291). D. Sélection et transformation de cellules-hôtes Des cellules-hôtes qui conviennent ici pour le clonage ou l'expression des vecteurs sont les cellules de procaryotes, de levure ou d'eucaryotes supérieurs décrites ci-dessus. Des procaryotes convenables comprennent des eubactéries, telles que des organismes Gram-négatifs ou Gram- positifs, par exemple E. coli, des bacilles tels que B. subtilis, des espèces du genre Pseudomonas tels que P. aeruainosa, Salmonella typhimurium ou Serratia marcescens. Une souche apprécie de E. coli comme hôte de clonage est E. coli 294 (ATCC N 31 446), bien que d'autres souches telles que E. coli B, E. coli X1776 (ATCC N 31 537) et E. coli W3110 (ATCC N 27 325) soient convenables. Ces exemples sont ne illustration plutôt qu'une limitation. De préférence la cellule-hôte doit sécréter des quantités minimales d'enzymes protéolytiques. En variante, on peut utiliser avantageusement des procédés de clonage in vitro, par exemple la réaction PCR ou d'autres réactions de polymérases d'acide nucléique. En plus de procaryotes, des micro-organismes eucaryotiques tels que des champignons filamenteux ou des levures sont des hôtes convenables pour des vecteurs codant le ligand mpl. L'espèce Saccharomvces cerevisiae, ou levure de boulangerie ordinaire, est, parmi les micro-organismes hôtes eucaryotiques inférieurs, celui que l'on utilise le plus couramment. Toutefois, un certain nombre d'autres genres, espèces et souches sont communément disponibles et utiles en l'occurrence, par exemple Schizosaccharomvces Dombe (Beach et Nurse, Nature, 290:140 [1981] ; brevet européen N 139 383 mis à l'Inspection Publique le 2 mai 1985), des hôtes du genre Kluyveromvces (brevet des Etats-Unis d'Améri- que N 4 943 529) tels que, par exemple L, lactis (Louven- court et al., J. Bacteriol., 737 [19831), K. fraëilis, K. bulcaricus, K. thermotolerans et K. marxianus, Yarrowia [brevet européen N 402 226], Pichia Dastoris (brevet européen N 183 070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Micro- biol., 28:265-278 [1988], Candida, Trichoderma reesia (Brevet européen N 244 234), Neurosvora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]) et des champignons filamenteux tels que, par exemple NeurosDora, Penicillium, Tolypocladium (document WO 91/00357 mis à l'Inspection Publique le 10 janvier 1991) et des hôtes du genre Aspergil- lus tels que A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983] ; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [19831 ; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 [1984]) et A. niqer (Kelly et Hynes, EMBo0, J., 4:475-479 (1985]). Des cellules-hôtes convenables pour l'expression de ligand mpl glycosylé sont dérivées d'organismes multicel- ulaires. Ces cellules-hôtes sont capables d'activités complexes de maturation et de glycosylation. En principe, n'importe quelle culture de cellules eucaryotiques supérieu- res peut être mise en oeuvre, qu'il s'agisse d'une culture provenant d'un vertébré ou d'un invertébré. Des exemples de cellules d'invertébrés comprennent des cellules de plantes et d'insectes. De nombreuses souches baculovirales et leurs variants et des cellules-hôtes permissives correspondantes provenant d'hôtes tels que Spodoptera fruaiDerda (chenille), Aedes aecrDti (moustique, Aedes albopictus (moustique), Drosophila melanogaster (drosophile) et Bombyx mori ont été identifiés. Voir, par exemple Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55 [1988] ; Miller et al., Genetic Engineering, publié sous la direction de Setlow et al., volume 8 (Plenum Publi- shing, 1986), pages 277-279 ; et Maeda et al., Nature, 315:592-594 [1985]. Diverses souches virales pour la trans- fection sont accessibles au public, par exemple le variant L-1 d'Autocrrapha californica NPV et la souche Bm-5 de Bombvx mori NPV, et ces virus peuvent être utilisés en l'occurrence comme virus conformément à la présente invention, en particulier pour la transfection de cellules de Spodoptera fruai- Perda. Des cultures de cellules végétales de cotonnier, mais, pomme de terre, soja, pétunia, tomate et tabac peuvent être utilisées comme hôtes. Normalement, des cellules végétales sont transfectées par incubation avec certaines souches de la bactérie Agrobacterium tumefaciens, qui a été préalablement manipulée de manière à contenir l'ADN de ligand mpl. Pendant l'incubation de la culture de cellules végétales avec A. tumefaciens, l'ADN codant le ligand mpl est transféré à la cellule végétale hôte de façon telle qu'elle est transfectée et que, dans des conditions appropriées, elle exprime 1'ADN de ligand mpl. En outre, des séquences de régulation et des séquences signaux compatibles avec des cellules végétales sont disponibles, par exemple des séquen- ces promotrices de nopaline synthase et des séquences signaux de polyadénylation (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 [1982]). En outre, des segments d'ADN isolés de la région amont du gène 780 d'ADN T sont capables d'activer ou d'accroître les niveaux de transcription de gènes pouvant être exprimés par des plantes dans un tissu végétal contenant de l'ADN recombinant. Voir le brevet européen NO 321 196 mis à l'Inspection Publique le 21 juin 1989. Toutefois, le plus grand intérêt a été attaché à des cellules de vertébrés, et la propagation de cellules de vertébrés en culture (culture de tissu) est devenue un procédé classique au cours des dernières années (Tissue Culture, Academic Press, publié sous la direction de Kruse et Patterson [1973]). Des exemples de lignées utiles de cellu- les-hôtes de mammifères sont la lignée CV1 de rein de singe transformée par SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; la lignée de cellules rénales d'embryon humain (293 ou 293 cellules sous- clonées pour leur croissance dans une culture en suspension, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 [1977]) ; des cellules rénales de jeunes hamsters (BHK, ATCC CCL 10) ; des cellules ovariennes de hamster chinois/-DHFR (CHO, Urlaub et Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:4216 [1980]) ; des cellules de Sertoli de souris (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 [1980]) ; des cellules rénales de singe (CV1 ATCC CCL 70) ; des cellules rénales de singe vert africain (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; des cellules humaines de cancer du col de l'utérus (HELA, ATCC CCL 2) ; des cellules rénales canines (MDCK, ATCC CCL 34) ; des cellules de foie de rat "buffalo" (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; des cellules de poumon humain (W138, ATCC CCL 75) ; des cellules de foie humain (Hep G2, HB 8065) ; la tumeur mammaire de souris (MMT 060562, ATCC CCL51) ; des cellules TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 [1982]) ; des cellules MRC 5 ; des cellules FS4 ; et la lignée cellulaire d'hépatome humain (Hep G2). Des cellules-hôtes sont transfectées et de préférence transformées avec les vecteurs d'expression ou de clonage de l'invention décrits ci-dessus et elles sont cultivées dans un milieu nutritif classique modifié de façon appropriée pour induire des promoteurs, sélectionner des transformants ou amplifier les gènes codant les séquences désirées. La transfection se rapporte à la fixation d'un vecteur d'expression par une cellule-hôte indépendamment de ce que toutes séquences codantes sont effectivement exprimées ou non. De nombreuses méthodes de transfection sont connues de l'homme de l'art, par exemple CaPO4 et l'électroporation. Le succès de la transfection est généralement reconnu lorsque toute indication de l'opération de ce vecteur apparaît au sein de la cellule-hôte. La transformation signifie l'introduction d'ADN dans un organisme de telle sorte que l'ADN soit réplicable, soit comme élément extrachromosomique, soit par un intégrant chromosomique. Selon la cellule-hôte utilisée, on effectue la transformation selon des techniques classiques appropriées à de telles cellules. Le traitement au calcium employant du chlorure de calcium, comme décrit dans la section 1.82 de l'ouvrage de Sambrook et al., supra, est généralement utilisé pour des procaryotes ou d'autres cellules qui contiennent des barrières importantes formées par leurs parois. L'infection par Aarobacterium tumefaciens est utilisée pour la transfor- 30 mation de certaines cellules végétales, comme décrit par Shaw al., dans Gene, 23:315 [1983] et dans le document WO 89/05859 mis à l'Inspection Publique le 29 juin 1989. En outre, on peut transfecter des plantes en utilisant un traitement aux ultrasons comme décrit dans le document WO 91/00358 mis à l'Inspection Publique le 10 janvier 1991. Pour des cellules de mammifères ne comportant pas ces parois cellulaires, la méthode de précipitation au phosphate de calcium de Graham et van der Eb, Virology, 52:456-457 [1978], est préconisée. Les aspects généraux de transformation de système d'hôtes formés de cellules de mammifères ont été décrits par Axel dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 399 216 déposé le 16 août 1983. Des transformations en levure sont normalement effectuées conformément au procédé de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 [1977] et de Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 [1979]. Toutefois, d'autres procédés d'introduction d'ADN dans des cellules, par exemple par injection nucléaire, électroporation ou par fusion de protoplaste, peuvent aussi être utilisés. E. Culture de cellules-hôtes Les cellules procaryotiques utilisées pour produire le polypeptide ligand mpl de la présente invention sont cultivées dans des milieux convenables comme décrit d'une manière générale dans l'ouvrage de Sambrook et al., supra. Les cellules-hôtes de mammifères utilisées pour produire le ligand mpl de la présente invention peuvent être cultivées dans des milieux variés. Des milieux disponibles dans le commerce tels que Ham's F10 (Sigma), milieu essentiel minimal [MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) et milieu de Eagle modifié selon Dulbecco ([DMEM], Sigma) conviennent pour la culture des cellules-hôtes. En outre, on peut utiliser comme milieux de culture pour les cellules-hôtes l'un quelconque des milieux décrits par Ham et Wallace dans Meth. Enz. 58:44 [1979], Barnes et Sato, Anal. Biochem., 102:255 [1980], brevets des Etats-Unis d'Amérique NO 4 767 704 ; 4 657 866 ; 4 927 762 ; ou 4 560 655 ; dans le document WO 90/03430 ; le document WO 87/00195 ; dans le brevet des Etats-Unis d'Améri- que Re. 30 985 ; ou dans les demandes de brevets des Etats- Unis d'Amérique N0 07/592 107 ou 07/592 141 toutes deux déposées le 3 octobre 1990, tous ces documents étant incor- pores ici à titre documentaire. L'un quelconque de ces milieux peut être complété si nécessaire avec des hormones et/ou d'autres facteurs de croissance (par exemple insuline, transferrine ou facteur de croissance épidermique), des sels (tels que chlorure de sodium, phosphate de calcium et magnésium), des tampons (tels que HEPES), des nucléosides (tels qu'adénosine et thymidine), des antibiotiques (tels que le médicament de marque commerciale Gentamycin), des oligo- éléments (définis comme étant des composés inorganiques habituellement présents à des concentrations finales dans la plage micromolaire) et du glucose ou une source d'énergie équivalente. Tous autres suppléments nécessaires peuvent aussi être inclus aux concentrations appropriées qui doivent être connues de l'homme de l'art. Les conditions de culture, telles que température, pH, etc., sont celles qui ont été antérieurement utilisées avec la cellule-hôte choisie pour l'expression, et elles sont évidentes pour l'homme de l'art. Les cellules-hôtes auxquelles il est fait allusion dans le présent mémoire comprennent des cellules en ulture in vitro de même que des cellules qui se trouvent dans un animal-hôte. F. Détection de l'amplification/expression de gènes L'amplification et/ou l'expression de gènes peut être mesurée directement dans un échantillon, par exemple par la méthode classique d'analyse Southern blot, la méthode d'analyse Northern blot pour l'évaluation quantitative de la transcription d'ARN messager (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]), l'analyse par empreintes (analyse de l'ADN) ou l'hybridation in situ en utilisant une sonde convenablement marquée, sur la base des séquences proposées dans le présent mémoire. On peut utiliser divers marqueurs, le plus couramment des radio-isotopes, en particulier 32p. Toutefois, d'autres techniques peuvent aussi être utilisées, par exemple on peut se servir de nucléotides modifiés par la biotine en les introduisant dans un polynucléotide. La biotine sert alors de site de liaison pour l'avidine ou pour des anticorps, qui peuvent être marqués avec une grande variété de marqueurs, tels que des radionucléides, des corps fluorescents, des enzymes, etc. En variante, on peut utiliser des anticorps capables de reconnaître des duplex spécifiques, comprenant des duplex d'ADN, des duplex d'ARN et des duplex hybrides ADN-ARN ou des duplex ADN-protéine. Les anticorps peuvent eux aussi être marqués, et l'essai peut être conduit là o le duplex est lié à une surface, de telle sorte qu'après formation du duplex sur la surface, la présence d'un anticorps lié au duplex puisse être détectée. En variante, l'expression d'un gène peut être mesurée par des méthodes immunologiques telles que la coloration immunohistochimique de coupes de tissus et un essai portant sur une culture cellulaire ou des liquides corporels, pour obtenir directement l'évaluation quantitative de l'expression du produit génique. Pour les techniques de coloration immunohistochimique, on prépare un échantillon cellulaire, normalement par déshydratation et fixation, puis on le fait réagir avec des anticorps marqués spécifiques du produit génique couplé, là o les marqueurs sont d'ordinaire détectables visuellement, par exemple des marqueurs ènzymati- ques, des marqueurs fluorescents, des marqueurs luminescents, etc. Une technique de coloration particulièrement sensible qui peut être utilisée avantageusement dans la présente invention est décrite par Hsu et al., dans Am. J. Clin. Path., 75:734-738 [1980]. Des anticorps utiles pour la coloration immuno- histochimique et/ou pour l'essai portant sur des liquides- échantillons peuvent être monoclonaux ou polyclonaux et ils peuvent être préparés dans tout mammifère. Ces anticorps peuvent avantageusement être préparés contre un polypeptide ligand mpl naturel ou contre un peptide synthétique basé sur les séquences d'ADN proposées ici, comme décrit plus loin. G. Purification de polypeptide ligand mpl Le ligand mpl est de préférence isolé du milieu de culture comme un polypeptide sécrété, bien qu'il puisse aussi être isolé de lysats de cellules-hôtes en cas d'expres- ion directe sans signal sécrétoire. Lorsque le ligand mpl est exprimé dans une cellule recombinante autre qu'une cellule d'origine humaine, ce ligand est complètement dépourvu de protéines ou de polypeptides d'origine humaine. Toutefois, il est encore habituellement nécessaire de purifier le ligand mpl en le débarrassant d'autres protéines ou polypeptides cellulaires recombinants pour obtenir des préparations qui sont sensible- ment homogènes en ce qui concerne le ligand mpl proprement dit. Dans une première étape, on centrifuge le milieu de culture ou le lysat pour éliminer les débris cellulaires sous forme de particules. La membrane et les fractions solubles de protéines sont ensuite séparées. En variante, on peut utiliser un filtre de concentration de protéines disponible dans le commerce (par exemple les unités d'ultrafiltration Amicon ou Millipore Pellicon). Le ligand mpl peut ensuite être débarrassé de la fraction protéique soluble et de la fraction de membrane du lysat de culture, selon que le ligand mpl est lié ou non à la membrane. Ce ligand est ensuite débarrassé des impuretés protéiques et polypeptidiques solubles par relargage et échange ou par des méthodes chromatographiques utilisant diverses matrices de gel. Ces matrices comprennent l'acrylamide, l'agarose, le dextrane, la cellulose et d'autres communément utilisés pour la purifica- tion de protéines. Des exemples d'opérations chromatographiques qui conviennent pour la purification de protéines comprennent : l'immunoaffinité (par exemple ligand anti-hmpl Mab), l'affinité pour des récepteurs (par exemple mpl-IgG ou protéine A Sepharose), la chromatographie par interaction hydrophobe (HIC) (par exemple l'éther, butyl- ou phényl- Toyopearl), la chromatographie en présence de lectine (par exemple Con A-Sepharose, lectine de lentille-Sepharose), l'exclusion dimensionnelle (par exemple Sephadex G-75), des colonnes d'échange de cations et d'anions (par exemple DEAE ou carboxyméthyl- ou sulfopropyl-cellulose) et la chromato- raphie en phase liquide à haute performance à phase inversée (RP-HPLC) (voir, par exemple Urdal et al., J. Chromatog., 296:171 [1984], o deux étapes successives de RP-HPLC sont utilisées pour la purification de IL-2 humain recombinant). D'autres étapes de purification comprennent, en variante : la précipitation par l'éthanol, la précipitation par le sulfate d'ammonium, le chromatofocalisation ; l'électrophorèse préparative sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide, etc. Les variants de ligands mpl dans lesquels des résidus ont été supprimés, insérés ou substitués, sont recueillis de la même façon qu'un ligand mpl naturel, compte tenu de toutes modifications importantes de propriétés occasionnées par la variation. Par exemple, la préparation d'un ligand mpl fusionné avec une autre protéine ou un polypeptide, par exemple un antigène bactérien ou viral, facilite la purification ; une colonne d'immunoaffinité contenant un anticorps contre l'antigène peut être utilisée pour adsorber le polypeptide fusionné. Des colonnes d' immunoaffinité telles qu'une colonne anti-ligand mpl polyclonal de lapin peuvent être utilisées pour absorber le variant de ligand mpl par liaison de ce variant à au moins un épitope immun restant. En variante, le ligand mpl peut être purifié par chromatographie d'affinité en utilisant un mpl-IgG purifié couplé à une résine immobilisée (de préférence), telle que Affi-Gel 10 (Bio-Rad, Richmond, CA), etc., par des moyens bien connus dans la pratique. Un inhibiteur de protéase tel que le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) peut aussi être utile pour inhiber une dégradation protéoly- tique pendant la purification, et des antibiotiques peuvent être inclus pour empêcher la croissance d'impuretés accidentelles. L'homme de l'art comprendra que des procédés de purification qui conviennent pour un ligand mpl naturel puissent nécessiter une modification pour tenir compte de modifications du caractère du ligand mpl ou de ses variants 5 lors de l'expression dans une culture cellulaire recombi- te. H. Modifications par covalence de polypeptides ligands mpl Les modifications par covalence de polypeptides ligands mpl sont comprises dans le cadre de la présente invention. On peut modifier par covalence aussi bien un ligand mpl naturel que des variants de séquence d'aminoacides du ligand mpl. Un type de modification par covalence rentrant dans le cadre de la présente invention est un fragment de ligand mpl. Des fragments de ligands mpl variants ayant jusqu'à environ 40 résidus d'aminoacides peuvent être commodément préparés par synthèse chimique ou par clivage enzymatique ou chimique du polypeptide ligand mpl entier ou variant. D'autres types de modifications par covalence du ligand mpl ou de ses fragments sont introduits dans la molécule par réaction de résidus d'aminoacides ciblés du ligand mpl ou de ses fragments avec un agent organique de dérivatisation qui est capable de réagir avec des chaînes latérales choisies ou les résidus N-terminaux ou C-terminaux. Le plus souvent, des résidus cystéinyle sont amenés -à réagir avec des a-halogénacétates (et les amines correspondantes), comme l'acide chloracétique ou le chlor- acétamide, pour former des dérivés carboxyméthyliques ou carboxyamidométhyliques. Les résidus cystéinyle sont aussi dérivatisés par réaction avec la bromotrifluoracétone, l'acide a-bromo-P-(5-imidazoyl)propionique, le phosphate de chloracétyle, des N-alkylmaléimides, le disulfure de 3-nitro- 2-pyridyle, le disulfure de méthyle et de 2-pyridyle, le p- chloromercuribenzoate, le 2-chloromercuri-4-nitrophénol ou le chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazole. Des résidus histidyle sont dérivés par réaction avec le pyrocarbonate de diéthyle à un pH de 5,5-7,0 parce que cet agent est relativement spécifique à l'égard de la chaîne latérale histidyle. Le bromure de parabromophénacyle st également utile ; la réaction est avantageusement conduite dans du cacodylate de sodium 0,1 M à pH 6,0. Les résidus lysinyle et amino-terminaux sont amenés à réagir avec l'anhydride d'acide succinique ou d'autres anhydrides d'acides carboxyliques. La dérivatisation avec ces agents a pour effet d'inverser la charge des résidus lysinyle. D'autres réactifs qui conviennent pour la dérivati- sation de résidus contenant des groupes amino comprennent des imido-esters tels que le picolinimidate de méthyle ; le phosphate de pyridoxal ; le pyridoxal, un chloroborohydrure ; l'acide trinitrobenzènesulfonique ; la O-méthyliso-urée ; la 2,4-pentanedione ; et une réaction avec un glyoxylate, catalysée par une transaminase. Lesrésidus arginyle sont modifiés par réaction avec un ou plusieurs réactifs classiques, entre autres le phénylglyoxal, la 2,3-butanedione, la 1,2-cyclohexanedione, et le ninhydrine. La dérivatisation de résidus d'arginine nécessite que la réaction soit conduite dans des conditions alcalines, à cause du pi, élevé du groupe guanidine fonction- nel. En outre, ces réactifs peuvent réagir avec les groupes de lysine, de même qu'avec le groupe epsilon-amino de l'argi- nine. La modification spécifique des résidus tyrosyle peut être effectuée, avec un intérêt particulier, en intro- duisant des marqueurs spectraux dans des résidus de tyrosyle par réaction avec des composés aromatiques de diazonium ou le tétranitrométhane. Le plus souvent, on utilise le N-acétyl- imidazole et le tétranitrométhane pour former respectivement les dérivés O-acétyl-tyrosyle et 3-nitro. Les résidus tyrosyle sont iodés au moyen de 125I ou de '3'I pour préparer des protéines marquées destinées à être utilisées dans un radio-immunoessai, la méthode à la chloramine T décrite ci- dessus étant convenable. Les groupes carboxyle latéraux (aspartyle et glutamyle) sont modifiés sélectivement par réaction avec des carbodiimides (R-N=C=N-R'), o R et R' sont des groupes alkyle différents, par exemple le l-cyclohexyl-3-(2-morpholi- nyl-4-éthyl)carbodiimide ou le 1-éthyl-3-(4-azonia-4,4- diméthylpentyl)carbodiimide. En outre, les résidus aspartyle et glutamyle sont convertis en résidus asparaginyle et glutaminyle par réaction avec des ions ammonium. Une dérivatisation avec des agents bifonctionnels est utile pour la réticulation de ligand mpl en une matrice ou surface de support insoluble dans l'eau destinée à être utilisée dans le procédé de purification d'anticorps anti- ligand mpl, et vice versa. Des agents de réticulation couramment utilisés comprennent par exemple le 1,1-bis (diazo- acétyl)-2-phényléthane, le glutaraldéhyde, des esters de N- hydroxysuccinimide, par exemple des esters formés avec l'acide 4-azidosalicylique, des imidoesters homobifonction- nels, comprenant des esters de disuccinimidyle tels que le 3,3'-dithiobis(succinimidylpropionate) et des maléimides bifonctionnels tels que le bis-N-maléimido-l,8-octane. Les agents de dérivatisation tels que le méthyl-3-[(p-azido- phényl)dithio]propio-imidate donnent des produits intermé- iaires photoactivables qui sont capables de former des liaisons de réticulation en présence de la lumière. En variante, des matrices réactives insolubles dans l'eau telles que des glucides activés au bromure de cyanogène et les substrats réactifs décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique NO 3 969 287 ; 3 691 016 ; 4 195 128 ; 4 247 642 ; 4 229 537 et 4 330 440 sont utilisés pour l'immobilisation de protéines. Des résidus glutaminyle et asparaginyle sont fréquemment désamidés en les résidus respectifs glutamyle et aspartyle correspondants. Ces résidus sont désamidés dans des conditions neutres ou basiques. La forme désamidée de ces résidus rentre dans le cadre de la présente invention. D'autres modifications comprennent l'hydroxyla- tion de la proline et de la lysine, la phosphorylation de groupes hydroxyle de résidus séryle ou thréonyle, la méthyla- tion des groupes a-amino des chaînes latérales de lysine, arginine et histidine (T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pages 79-86 [1983]), l'acétylation de l'amine N-terminale et l'amidation de tout groupe carboxyle C-terminal. Un autre type de modification par covalence du polypeptide ligand mpl rentrant dans le cadre de la présente invention comprend la modification du motif naturel de glycosylation du polypeptide. Le terme modification signifie la suppression d'un ou plusieurs groupements glucidiques rencontrés dans le ligand mpl naturel et/ou l'addition d'un ou plusieurs sites de glycosylation qui ne sont pas présents dans le ligand mpl naturel. La glycosylation de polypeptides est normalement en liaison avec l'azote ou en liaison avec l'oxygène. La liaison avec l'azote se réfère au rattachement du groupement glucidique à la chaîne latérale d'un résidu d'asparagine. Les séquences tripeptidiques asparagine-X-sérine et asparagine-X- thréonine, dans lesquelles X est un aminoacide quelconque excepté la proline, sont les séquences de reconnaissance du rattachement enzymatique du groupement glucidique à la chaîne latérale d'asparagine. Ainsi, la présence de l'une ou l'autre de ces séquences tripeptidiques dans un polypeptide crée un site potentiel de glycosylation. La glycosylation liée à l'oxygène se réfère au rattachement de l'un des sucres N- acétylgalactosamine, galactose ou xylose à un hydroxyaminoacide, le plus souvent la sérine ou la thréonine, bien que la 5-hydroxyproline ou la 5-hydroxylysine puisse aussi être utilisée. L'addition de sites de glycosylation au polypep- tide ligand mpl est commodément effectuée par modification de la séquence d'aminoacides de manière qu'elle contienne une ou plusieurs des séquences tripeptidiques décrites ci-dessus (pour des sites de glycosylation liés à l'azote). La modifi- cation peut aussi être effectuée par addition d'un ou plusieurs résidus de sérine ou de thréonine à la séquence de ligand mpl naturel ou la substitution de cette séquence par un ou plusieurs de ces résidus (pour des sites de glycosyla- tion liés à l'oxygène). Par commodité, la séquence d'amino- acides du ligand mpl est avantageusement modifiée par des changements au niveau de l'ADN, en particulier par mutation de l'ADN codant le polypeptide ligand mpl à l'emplacement de bases présélectionnées de manière à générer des codons qui effectuent la traduction en les aminoacides désirés. La mutation ou les mutations d'ADN peuvent être effectuées par des procédés décrits ci-dessus sous le titre "Variants de séquence d'aminoacides de ligand mpl". Un autre moyen d'accroissement du nombre de groupements glucidiques sur le ligand mpl réside dans le couplage chimique ou enzymatique de glycosides au poly- peptide. Ces opérations sont avantageuses en ce qu'elles ne nécessitent pas la production du polypeptide dans une cellule-hôte qui présente des aptitudes pour la glycosylation liée à l'azote ou liée à l'oxygène. Selon le mode de couplage utilisé, le sucre ou les sucres peuvent être attachés (a) à l'arginine et à l'histidine, (b) à des groupes carboxyle libres, (c) à des groupes sulfhydryle libres tels que ceux de la cystéine, (d) à des groupes hydroxyle libres tels que ceux de la sérine, de la thréonine ou de l'hydroxyproline, (e) à des résidus aromatiques tels que ceux de la phénylalanine, de la tyrosine ou du tryptophane, ou (f) au groupe amide de la glutamine. Ces procédés sont décrits dans le document WO 87/05330 mis à l'Inspection Publique le 11 septembre 1987, et par Aplin et Wriston dans CRC Crit. Rev. Biochem., pages 259- 306 [19811. L'enlèvement de groupements glucidiques présents sur le polypeptide ligand mpl peut être accompli par voie chimique ou enzymatique. La déglycosylation chimique néces- site l'exposition du polypeptide à l'acide trifluorométhane- sulfonique ou à un composé équivalent. Ce traitement entraîne le clivage de la plupart ou de la totalité des sucres excepté le sucre de liaison (N-acétylglucosamine ou N-acétylgalac- tosamine), tout en laissant le polypeptide intact. La déglycosylation chimique est décrite par Hakimuddin et al., dans Arch. Biochem. Biophys., 259:52 [1987] et par Edge et al., dans Anal. Biochem., 118:131 [1981]. Le clivage enzyma- tique de groupements glucidiques sur des polypeptides peut être effectué au moyen de diverses endo- et exo-glycosidases comme décrit par Thotakura et al., dans Meth. Enzymol., 138:350 [1987]. La glycosylation au niveau de sites de glycosy- lation potentielle peut être empêchée par l'utilisation du composé tunicamycine comme décrit par Duskin et al., dans J. Biol. Chem., 257:3105 [1982]. La tunicamycine inhibe la formation de liaisons protéine-N-glycoside. Une autre type de modification par covalence du ligand mpl comprend la liaison du polypeptide ligand mpl à l'un de divers polymères non protéiques, par exemple poly- éthylèneglycol, polypropylèneglycol ou polyoxyalkylènes, de la manière enseignée dans les brevets des Etats-Unis d'Amé- rique N 4 640 835 ; 4 496 689 ; 4 301 144 ; 4 670 417 ; 4 791 192 ou 4 179 337. Il y a lieu de remarquer qu'un certain triage du variant de ligand mpl recueilli sera nécessaire pour choisir le variant optimal à lier au récepteur mpl et ayant l'acti- vité immunologique et/ou biologique définie ci-dessus. On peut effectuer le triage en vue de la stabilité dans une culture cellulaire recombinante ou dans le plasma (par exemple contre un clivage protéolytique), une grande affinité pour le membre mpl, la stabilité à l'oxydation, l'aptitude à être sécrété en des rendements élevés, etc. Par exemple, un changement dans le caractère immunologique du polypeptide ligand mpl, par exemple l'affinité pour un anticorps donné, est mesuré par un immunoessai de type compétitif. D'autres modifications potentielles de propriétés de protéines ou de polypeptides telles que la stabilité à l'oxydo-réduction ou la stabilité thermique, le caractère hydrophobe ou la sensibilité à une dégradation protéolytique, sont analysés par des méthodes bien connues dans la pratique. 17. Procédés généraux de préparation d'anticorps contre un ligand mpl Préparation des anticorps (i) Anticorps polyclonaux Des anticorps polyclonaux contre des polypeptides ligand mpl ou leurs fragments sont généralement produits chez des animaux par des injections sous-cutanées (sc) ou intra- péritonéales (ip) multiples du ligand mpl et d'un adjuvant. Il peut être utile de conjuguer le ligand mpl ou un fragment contenant la séquence-cible d'aminoacides à une protéine qui est immunogène chez l'espèce devant être immunisée, par exemple l'hémocyanine de patelle, la sérumalbumine, la thyroglobuline de boeuf ou l'inhibiteur de trypsine de soja en utilisant un agent bifonctionnel ou un agent de dérivati- sation, par exemple l'ester de maléimidobenzoyle du sulfo- succinimide (conjugaison par des résidus de cystéine), le Nroxysuccinimide (par des résidus de lysine), le glutaral- déhyde, l'anhydride succinique, SOC12 ou un composé RIN=C=NR dans lequel R et R' sont des groupes alkyle différents. Des animaux sont immunisés contre le polypeptide ligand mpl ou son fragment, des conjugués ou des dérivés mmunogènes, par combinaison de 1 mg ou 1 Fg du peptide ou du conjugué (respectivement pour des lapins ou des souris) avec 3 volumes d'adjuvant complet de Freund et injection de la solution par voie intradermique en des sites multiples. Un mois plus tard, les animaux ont reçu des injections de rappel sous-cutanées, en des sites multiples, d'un cinquième à un dixième de la quantité initiale de peptide ou de conjugué dans l'adjuvant complet de Freund. 7 à 14 jours plus tard, les animaux sont saignés, et on analyse dans le sérum le itre en anticorps ligand mpl. Les animaux reçoivent des injections de rappel jusqu'à ce que le titre soit en palier. De préférence, les animaux reçoivent des injections de rappel du conjugué du même ligand mpl, mais conjugué à une protéine différente et/ou par l'intermédiaire d'un réactif différent de liaison croisée. Des conjugués peuvent aussi être préparés en culture cellulaire recombinante comme protéines fusion- nées. On utilise aussi des agents d'agrégation tels que l'alun pour favoriser la réponse immunitaire. (ii) Anticorps monoclonaux On obtient des anticorps monoclonaux à partir d'une population d'anticorps principalement homogènes, c'est- à-dire que les anticorps individuels constituant la popula- tion sont identiques, excepté des mutations pouvant apparaî- tre naturellement, qui peuvent être présentes en quantités secondaires. Ainsi, l'épithète "monoclonal indique le caractère de l'anticorps, à savoir qu'il n'est pas formé d'un mélange d'anticorps distincts. Par exemple, les anticorps monoclonaux ligands pour mpl de l'invention peuvent être préparés par le procédé d'obtention d'hybridomes initialement décrit par Kohler et Milstein, dans Nature, 256:495 [1975] ou peut être préparés par des procédés de recombinaison d'ADN (brevet des Etats- Unis d'Amérique NO 4 816 567 (Cabilly et al.]). Dans le procédé d'obtention d'hybridomes, une souris ou un autre animal-hôte approprié tel qu'un hamster est immunisé de la manière décrite ci-dessus afin d'obtenir des lymphocytes qui produisent ou qui sont capables de produire des anticorps qui se lient spécifiquement à la protéine utilisée pour l'immunisation. En variante, des lymphocytes peuvent être immunisés in vitro. Les lymphocytes sont ensuite fusionnés avec des cellules de myélome par l'intermédiaire d'un agent de soudure convenable tel qu'un polyéthylèneglycol pour former une cellule d'hybridome (Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pages 59-103 [Academic Press, 1986]). Les cellules d'hybridomes ainsi préparées sont ensemencées et développées dans un milieu de culture convena- ble qui contient avantageusement une ou plusieurs substances inhibant la croissance ou la survie des cellules parentales de myélome non fusionnées. Par exemple, si les cellules parentales de myélome ne contiennent pas l'enzyme appelé hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl-transférase (HGPRT ou HPRT), le milieu de culture pour les hybridomes renferme normalement de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine (milieu HAT), substances qui empêchent la crois- sance de cellules déficientes en HGPRT. Des cellules de myélome que l'on apprécie sont celles qui se fusionnent efficacement, qui soutiennent une expression stable de haut niveau d'un anticorps par les cellules sélectionnées produisant l'anticorps et qui sont sensibles à un milieu tel que le milieu HAT. Parmi elles, des lignées cellulaires de myélome que l'on apprécie sont les lignées de myélome murin, telles que celle qui sont dérivées de tumeurs MOPC-21 et MPC-ll de souris disponibles auprès du Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califor- nie, Etats-Unis d'Amérique, et les cellules SP-2 disponibles auprès de l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique. Des lignées cellulaires de myélome humain et d'hétéromyélome murin-humain ont aussi été décrites pour la production d'anticorps monoclonaux humains (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 [1984] ; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pages 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987). Le milieu de culture dans lequel des cellules d'hybridomes se développent est titré en vue de la production d'anticorps monoclonaux dirigés contre le ligand mpl. La spécificité de liaison d'anticorps monoclonaux produits par des cellules d'hybridomes est avantageusement déterminée par immunoprécipitation ou par un essai de liaison in vitro, par xemple par radio-immunoessai (RIA) ou par un essai utilisant un immunoabsorbant lié à un enzyme (ELISA). L'affinité de liaison de l'anticorps monoclonal peut, par exemple, être déterminée par l'analyse Scatchard de Munson et Pollard, Anal. Biochem., 107:220 [1980]. Après avoir identifié les cellules d'hybridomes qui produisent des anticorps de spécificité, d'affinité et/ou d'activité désirée, on peut sous-cloner les clones en limitant les processus de dilution et les cultiver par des procédés classiques (Goding, supra). Des milieux de culture qui conviennent à cette fin comprennent par exemple, le milieu d'Eagle modifié selon Dulbecco ou le milieu RPMI-1640. En outre, les cellules d'hybridomes peuvent être cultivées in vivo comme tumeurs d'ascite chez un animal. Les anticorps monoclonaux sécrétés par les sousclones sont convenablement séparés du milieu de culture, du liquide d'ascite ou du sérum par des opérations classiques de purification d'immunoglobulines, par exemple protéine A- Sepharose, chromatographie sur hydroxylapatite, électropho- rèse sur gel, dialyse ou chromatographie par affinité. L'ADN codant les anticorps monoclonaux de l'invention est facilement isolé et séquencé par des procédés classiques (par exemple en utilisant des sondes d'oligonu- cléotides qui sont capables de s'attacher spécifiquement à des gènes codant les chaînes lourde et légère d'anticorps de souris). Les cellules d'hybridomes de l'invention servent comme source préférée d'un tel ADN. Une fois isolé, 1'ADN peut être introduit dans des vecteurs d'expression qui sont ensuite transfectés dans des cellules-hôtes telles que des cellules COS de singe, des cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) ou des cellules de myélome qui ne produisent pas autrement de protéine du type d'une immunoglobuline, pour obtenir la synthèse d'anticorps monoclonaux dans les cellu- les-hôtes recombinantes. L'ADN peut aussi être modifié, par exemple, en remplaçant par la séquence codante pour les omaines constants de chaîne lourde et de chaîne légère les séquences murines homologues (Cabilly et al., supra ; Morisson et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 81:6851 (1984]) ou par liaison par covalence à la séquence codante de l'immuno- globuline de la totalité ou d'une partie de la séquence codant pour un polypeptide non-immunoglobuline. Normalement, ces polypeptides qui ne sont pas des immunoglobulines sont substitués aux domaines constants d'un anticorps de l'invention, ou bien ils sont substitués aux domaines variables d'un site de combinaison à un antigène d'un anticorps de l'invention pour créer un anticorps bivalent chimérique comprenant un site de combinaison à un anticorps doué de spécificité pour un ligand mpl et un autre site de combinaison à un anticorps doué de spécificité pour un antigène différent. Les anticorps chimériques ou hybrides peuvent aussi être préparés in vitro par des procédés d'emploi connu dans la chimie des protéines de synthèse, comprenant ceux qui impliquent des agents de réticulation. Par exemple, on peut assembler des immunotoxines en utilisant une réaction d'échange de disulfure ou en formant une liaison thioéther. Des exemples de réactifs qui conviennent à cette fin compren- nent un iminothiolate et le méthyl-4-mercaptobutyrimidate. Pour des applications diagnostiques, les anti- corps de l'invention sont normalement pourvus d'un marqueur détectable. Le marqueur détectable peut être n'importe lequel de ceux qui sont capables d'émettre directement ou indirecte- ment un signal détectable. Par exemple, le marqueur détecta- ble peut être un radio-isotope tel que 3H, 14C, 32p, 3s ou 125I, un composé fluorescent ou chimioluminescent tel que l'iso- thiocyanate de fluorescéine, la rhodamine ou la luciférine ; un marqueur isotopique radioactif tel que, par exemple, 125I, 32p, '4C ou 3H ou un enzyme tel qu'une phosphatase alcaline, une bêta-galactosidase ou la peroxydase de raifort. On peut utiliser tout procédé connu dans la ratique pour conjuguer séparément l'anticorps au marqueur détectable, comprenant les procédés décrits par Hunter et al., dans Nature, 144:945 [1962] ; par David et al., dans Biochemistry, 13:1014 [1974] ; par Pain et al., dans J. Immunol. Meth., 40:219 [1981] et par Nygren dans J. Histo- chem. and Cytochem., 30:407 [1982]. Les anticorps de la présente invention peuvent être utilisés dans toute méthode d'essai connue, par exemple dans des essais de liaison compétitive, des essais de type sandwich directs et indirects et des essais d'immunoprécipi- tation. Voir Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, pages 147-158 (CRC Press, Inc., 1987). Des essais de liaison compétitive sont fondés sur l'aptitude d'un témoin marqué (qui peut être un ligand mpl ou une portion à réactivité immunologique de ce ligand) à entrer en compétition avec l'analyte de l'échantillon testé (ligand mpl) pour se lier à une quantité limitée d'anticorps. La quantité de ligand mpl dans l'échantillon testé est inverse- ment proportionnelle à la quantité de témoin qui s'est liée aux anticorps. Pour faciliter la détermination de la quantité de témoin qui se lie, on insolubilise généralement les anticorps avant ou après la compétition, de manière que le témoin et l'analyte qui sont liés aux anticorps puissent être commodément séparés du témoin et de l'analyte qui restent non liés. Les essais de type sandwich impliquent l'utilisation de deux anticorps, capables chacun de se lier à une portion immunogène différente ou épitope de la protéine (ligand mpl) à détecter. Dans un essai du type sandwich, l'analyte de l'échantillon testé est lié par un premier anticorps qui est immobilisé sur un support solide, puis un second anticorps se lie à l'analyte en formant ainsi un complexe tripartite insoluble. Voir David et Greene, brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 376 110. Le second anticorps peut lui-même recevoir un marqueur détectable (essais directs de type sandwich) ou peut être mesuré au moyen d'un anticorps anti-immunoglobuline qui est porteur d'un marqueur détectable (essai indirect de type sandwich). Par exemple, l'un des types d'essais sandwich est un essai ELISA, auquel cas le marqueur détectable est un enzyme (par exemple la peroxydase de raifort). (iii) Anticorps humanisés et humains Des procédés d'humanisation d'anticorps non humains sont bien connus dans la pratique. En général, un anticorps humanisé renferme un ou plusieurs résidus d'amino- acides qui y sont incorporés depuis une source non humaine. Ces résidus d'aminoacides non humains sont souvent appelés résidus "importés", qui sont normalement empruntés à un domaine d' "importation" variable. L'humanisation peut être effectuée essentiellement d'après les procédé de Winter et 20 collaborateurs (Jones et al., Nature, 321:522-525 [1986] ; Riechmann et al., Nature, 332:323-327 [1988] ; Verhoeyen et ai., Science, 239:1534-1536 [1988]) en substituant des séquences CDRs ou CDR de rongeurs à des séquences correspon- dantes d'un anticorps humain. En conséquence, ces anticorps "humanisés" sont des anticorps chimériques (Cabilly et al., supra) -dans lesquels un domaine humain variable, loin d'être intact a été remplacé par la séquence correspondante prove- nant d'une espèce non humaine. Dans la pratique, des anti- corps humanisés sont des anticorps typiquement humains dans lesquels certains résidus CDR et le cas échéant certains résidus FR sont remplacés par des résidus provenant de sites analogues dans des anticorps de rongeurs. Le choix de domaines humains variables, tant légers que lourds, devant être utilisés dans la préparation d'anticorps humanisés est très important pour réduire l'antigénicité. Conformément au procédé dit de "meilleure adaptation", la séquence du domaine variable d'un anticorps de rongeur est comparée par triage à la banque entière de séquences de domaines humains variables connus. La séquence umaine qui se rapproche le plus de celle du rongeur est ensuite admise commne charpente humaine (FR) pour l'anticorps humanisé (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 [1993] ; Ghothia et Lesk, J. Mol. Biol., 196:901 [1987]). Un autre procédé utilise une charpente particulière dérivée de la séquence consensus de tous les anticorps humains d'un sous-groupe particulier de chaines légères ou lourdes. La même charpente peut être utilisée pour plusieurs anticorps humanisés différents (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 [1992] ; Presta et al., J. Immunol., 151:2623 [1993]). * Il est en outre important que des anticorps soient humanisés en conservant une haute affinité pour l'antigène et d'autres propriétés biologiques favorables. Pour parvenir à ce résultat, conformément à un procédé préféré, on prépare des anticorps humanisés par un procédé d'analyse des séquences parentales et de divers produits conceptuels humanisés en utilisant des modèles tridimension- nels des séquences parentale et humanisée. Des modèles tridimensionnels d' immunoglobulines sont couramment disponi- bles et sont familiers à l'homme de l'art. On dispose de programmes d'ordinateur qui illustrent et affichent des structures probables de conformation tridimensionnelle de séquences d'immunoglobulines candidates sélectionnées. L'examen de ces affichages permet l'analyse du r8le probable des résidus dans le fonctionnement de la séquence d'immuno- globuline candidate, c'est-à-dire l'analyse de résidus qui exercent une influence sur l'aptitude de l'immunoglobuline candidate à s'attacher à son antigène. En opérant de la sorte, on peut choisir et combiner des résidus FR de la séquence consensus et de la séquence importée de manière à obtenir la caractéristique désirée d'anticorps, telle qu'une plus grande affinité pour l'antigène ou les antigènes-cibles. En général, les résidus CDR sont directement et considérable- ment impliqués dans l'influence exercée sur la liaison à l'antigène. Pour de plus amples détails, voir la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique N 07/934 373 déposée le 21 août 1992, qui est une continuation en partie de la demande N 07/715 272 déposée le 14 juin 1991. En variante, il est à présent possible de produire des animaux transgéniques (par exemple des souris) qui sont capables, après immunisation, de produire tout un répertoire d'anticorps humains en l'absence d'une production d'immunoglobuline endogène. Par exemple, il a été indiqué que la délétion homozygote du gène de la région (J=) reliant les chaînes lourdes d'anticorps chez des souris mutantes chiméri- ques et de lignée germinale entrainait l'inhibition totale de la production endogène d'anticorps. Le transfert de la série des gènes d' immunoglobulines de lignée germinale humaine dans de telles souris mutantes de lignée germinale entraîne la production d'anticorps humains par exposition à des anti- gènes. Voir, par exemple, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-255 [1993] ; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 [1993] ; Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993]. Des anticorps humains peuvent aussi 25 être produits dans des banques d'affichage de phages (Hoogen- boom et Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 [1991] ; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991]). (iv) Anticorps bispécifiques Des anticorps bispécifiques sont des anticorps monoclonaux, de préférence humains ou humanisés, qui possè- dent des spécificités de liaison vis-à-vis d'au moins deux antigènes différents. Des méthodes de production d'anticorps bispécifiques sont connues dans l'art antérieur. Traditionnellement, la production recombinante d'anticorps bispécifiques est basée sur la co-expression de deux paires de chaînes lourdes-chaînes légères d' immunoglobu- lines, o les deux chaînes lourdes ont des spécificités différentes (Millstein et Cuello, Nature, 305:537-539 [1983]). A cause de l'assortiment aléatoire de chaînes lourdes et légères d'immunoglobulines, ces hybridomes (quadromes) produisent un mélange potentiel de 10 molécules différentes d'anticorps, dont une seule a la stucture bispécifique correcte. La purification de la molécule correcte, que l'on effectue ordinairement par des étapes de chromatographie d'affinité, est plut8t laborieuse, et les rendements en produit sont faibles. Des procédés similaires sont révélés dans la publication PCT N WO 93/08829 (mise à l'Inspection Publique le 13 mai 1993) et dans Traunecker et al., EMBO, 10:3655-3659 [1991]. Conformément à une approche différente et davantage appréciée, des domaines variables d'anticorps présentant les spécificités de liaison désirées (sites de combinaison anticorps-antigène) sont soudés à des séquences d'immunoglobulines à domaines constants. La soudure est effectuée de préférence avec un domaine constant à chaîne lourde d'immunoglobuline, comprenant une partie au moins des régions CH2 et CH3formant le segment intermédiaire. Il est préférable que la première région constante de chaîne lourde (CH1) contenant le site nécessaire pour la liaison à la chaîne légère soit présente dans l'une au moins des soudures. Des ADN codant les soudures de chaînes lourdes d'immunoglobu- lines et, le cas échéant, la chaîne légère d'immuunoglobuline, sont insérés dans des vecteurs d'expression séparés et sont cotransfectés dans un organisme-hôte convenable. Cela offre une grande souplesse d'ajustage des proportions mutuelles des trois fragments polypeptidiques dans des formes de réalisation lorsque des rapports inégaux des trois chaînes polypep- tidiques utilisées dans l'assemblage permettent d'obtenir les rendements optimaux. Toutefois, il est possible d'insérer des séquences codantes pour deux des trois chaînes peptidiques ou pour les trois chaînes dans un unique vecteur d'expression lorsque l'expression d'au moins deux chaînes polypeptidiques dans des rapports égaux permet d'obtenir de hauts rendements et lorsque les rapports n'ont pas une importance particu- ière. Dans une forme appréciée de mise en oeuvre de cette approche, les anticorps bispécifiques sont composés d'une chaîne lourde dimmunoglobuline hybride avec une première spécificité de liaison dans un bras et une paire hybride chaine lourde-chaîne légère d'immunoglobuline (offrant une seconde spécificité de liaison) dans l'autre bras. Il a été observé que cette structure asymétrique facilitait la séparation du composé bispécifique désiré des combinaisons non désirées de chaînes d'immunoglobulines, attendu que la présence d'une chaine légère d'immunoglobuline dans une moitié seulement de la molécule bispécifique constitue un moyen aisé de séparation. Cette approche est révélée dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique simultanément pendante N 07/931 811 déposée le 17 août 1992. Pour d'autres détails concernant la production d'anticorps bispécifiques, voir par exemple, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 [1986]. (v) Anticorps hétéroconjugués Les anticorps hétéroconjugués rentrent aussi dans le cadre de la présente invention. Ils sont composés de deux anticorps liés par covalence. Ces anticorps ont par exemple été proposés pour cibler des cellules de systèmes immunitai- res sur -des cellules indésirables (brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 676 980) et pour le traitement d'une infection à virus HIV (documents PCT portant les numéros de publication WO 91/00360 et WO 92/00373 ; brevet européen N 03089). Des anticorps hétéroconjugués peuvent être préparés par tous procédés convenables de formation de liaisons transversales. Des agents qui conviennent pour la formation de liaisons transversales sont bien connus dans la pratique et sont révélés dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 676 980, ainsi qu'un certain nombre de techniques de formation de telles liaisons. IV. Utilisation thérapeutique du ligand mpl came protéine migacaryocytopoiétique e ligand mpl biologiquement actif ayant une fonction d'effecteur hématopolétique et appelé protéine mégacaryocytopoiétique ou thrombocytopoiétique (TPO) dans le présent mémoire peut être utilisé dans une préparation ou formulation pharmaceutique stérile pour stimuler l'activité mégacaryocytopoiétique ou thrombopoiétique chez les patients atteints de thrombocytopénie due à une altération de la production, une séquestration et une destruction accrue des plaquettes. L'hypoplasie de la moelle épinière associée à la thrombocytopénie (par exemple anémie aplastique à la suite d'une chimiothérapie ou d'une transplantation de moelle osseuse) peut être traitée efficacement avec les composés de l'invention de même que des troubles tels que coagulation intravasculaire disséminée (DIC), thrombocytopénie immune (comprenant l'ITP induite par le virus HIV et i'ITP non induite par le virus HIV), thrombocytopénie idiopathique chronique, thrombocytopénie congénitale, myélodysplasie et thrombocytopénie thrombotique. En outre, ces protéines mégacaryocytopoiétiques peuvent être utiles au traitement de thrombocytoses myéloprolifératives de même qu'à la thrombocy- tose due à des conditions inflammatoires et à une carence en fer. La protéine mégacaryocytopoúétique ou thrombo- cytopolétique (TPO) de la présente invention peut être utilisée avantageusement en liaison avec une chimiothérapie myélotoxique, une chimiothérapie avec ablation de moelle et une thrombocytopénie due à une insuffisance de moelle osseuse. D'autres troubles utilement traités avec les protéines mégacaryocytopoiétiques de la présente invention comprennent des problèmes liés aux plaquettes ou une altéra- tion des plaquettes résultant de l'absorption de médicaments, d'un empoisonnement ou d'une activation sur des surfaces artificielles. Dans ces cas, les composés de l'invention peuvent être utilisés pour stimuler le bourgeonnements de plaquettes neuves 'inaltérées. Pour une liste plus complète es applications utiles, voir le préambule exposé ci-dessus, notamment les paragraphes (a) à (f) et les références qui y sont citées. Les protéines mégacaryocytopoiétiques de la présente invention peuvent être utilisées seules ou en association avec d'autres cytokines, des hématopolétines, des interleukines, des facteurs de croissance ou des anticorps dans le traitement des troubles et états identifiés ci- dessus. Ainsi, les composés de l'invention peuvent être utilisés conjointement avec d'autres protéines ou peptides doués d'activité thrombopoiétique, comprenant : G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, IL-3, érythropolétine (EPO) kit ligand, IL-6 et IL-l. Les protéines mégacaryocytopolétiques de la présente invention sont préparées en mélange avec un support acceptable du point de vue pharmaceutique. Cette composition thérapeutique peut être administrée par voie intraveineuse ou par voie nasale ou pulmonaire. La composition peut aussi être administrée par voie parentérale ou par voie sous-cutanée, le cas échéant. Lorsque la composition thérapeutique est administrée par voie systémique, elle doit être apyrogène et en solution acceptable par voie parentérale compte tenu du pH, de l'isotonicité et de la stabilité. Ces conditions sont connues de l'homme de l'art. En bref, des formulations dosées des composés de la présente invention sont préparées en vue de leur conservation ou de leur administration, par mélange du composé ayant le degré désiré de pureté avec des supports, excipients ou stabilisants acceptables du point de vue physiologique. De telles matières sont non toxiques pour les receveurs aux doses et aux concentrations utilisées, et comprennent des tampons tels que phosphate, citrate, acétate et d'autres sels d'acides organiques ; des anti-oxydants tels que l'acide ascorbique ; des peptides de bas poids molécu- laire (inférieur à environ 10 résidus) tels que polyarginine, des protéines telles que l'albumine sérique, la gélatine ou des immunoglobulines ; des polymères hydrophiles tels que la polyvinylpyrrolidinone ; des aminoacides tels que la glycine, l'acide glutamique, l'acide aspartique ou l'arginine ; des monosaccharides, des disaccharides et d'autres glucides y compris la cellulose ou ses dérivés, le glucose, le mannose ou des dextrines ; des agents chélateurs tels que 1'EDTA ; des sucres-alcools, tels que le mannitol ou le sorbitol ; des ions complémentaires tels que le sodium et/ou des surfactants non ioniques tels que Tween, Pluronics et un polyéthylène- glycol. On formule environ 0,S à 500 mg d'un composé ou d'un mélange de la protéine mégacaryocytopolétique sous forme de l'acide ou de la base libre ou sous forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable, avec un véhicule, un support, un excipient, un liant, un conservateur, un agent stabili- sant, un arôme, etc., acceptable du point de vue physiologi- que conformément à la pratique pharmaceutique admise. La quantité d'ingrédient actif dans ces compositions est choisie de manière à obtenir une dose convenable dans la plage indiquée. Des compositions stériles à injecter peuvent être formulées conformément à la pratique pharmaceutique classi- que. Par exemple, on peut souhaiter la dissolution ou la mise en suspension du composé actif dans un véhicule tel que l'eau ou une huile végétale naturelle commue l'huile de sésame, l'huile d'arachide ou l'huile de graines de cotonnier ou un véhicule gras synthétique tel que 1'o1léate d'éthyle, etc. Des tampons, des conservateurs, des anti-oxydants, etc., peuvent être incorporés conformément à la pratique pharmaceutique admise. Des exemples convenables de préparations à libération prolongée comprennent les matrices semi-perméables de polymères hydrophobes solides contenant le polypeptide, ces matrices étant sous forme d'articles façonnés, par exemple de films, ou de microcapsules. Des exemples de matrices à libération prolongée comprennent des polyesters, des hydrogels [par exemple poly(2-hydroxyéthylméthacrylate) comme décrit par Langer et al., dans J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 [1981] et Langer, Chem. Tech., 12:98-105 [1982] ou un polymère d'alcool vinylique], des polylactides (brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 773 919, brevet européen N 58 481), des copolymères d'acide L-glutamique et de gammaéthyl-L-glutamate (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 [1983]), un copolymère éthylène-acétate de vinyle non dégradable (Langer et al, supra), un copolymère acide lactique-acide glycolique dégradable tel que le produit de marque commerciale Lupron Depot (microsphères injectables composées d'un copolymère d'acide lactique et d'acide glycolique et d'acétate de leuprolide) et acide poly-D-(-)-3- hydroxybutyrique (brevet européen Ne 133 988). Bien que des polymères du type éthylène-acétate de vinyle et acide lactique-acide glycolique permettent la libération de molécules pendant plus de 100 jours, certains hydrogels libèrent des protéines pendant des périodes plus courtes. Lorsque des protéines encapsulées séjournent dans l'organisme pendant une durée prolongée, elles peuvent se dénaturer ou s'agglutiner comme conséquence de l'exposition à l'humidité à 37 C, avec pour résultat une perte d'activité biologique et des modifications éventuelles de l'immunogéni- cité. Des stratégies rationnelles peuvent être imaginées pour une stabilisation des protéines selon le mécanisme impliqué. Par exemple, si l'on s'aperçoit que le mécanisme d'agrégation est une formation de liaisons S-S intramoléculaires par échange entre disulfures, on peut réaliser une stabilisation par modification des résidus sulfhydryle, par lyophilisation à partir de solutions acides, par limitation de la teneur en humidité, par utilisation d'additifs appropriés et par mise au point de compositions à matrice polymérique spéciale. Des compositions de protéines mégacaryocytopoié- tiques à libération prolongée comprennent aussi une protéine mégacaryocytopoiétique emprisonnée dans des liposomes. Des liposomes contenant une protéine mégacaryocytopolétique sont préparés par des procédés connus : brevet allemand N 3 218 121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985] ; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 [1980] ; brevets européens N 52 322, 36 676, 88 046, 143 949, 142 641 ; demande de brevet japonais N 83-118 008 ; brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 485 045 et 4 544 545 ; et brevet européen N 102 324. Ordinairement, les liposomes sont du type unilamellaire de petite dimension (environ 200 - 800 angstrôms) selon lequel la teneur en lipide est supérieure à environ 30 moles % de cholestérol, la proportion choisie étant ajustée en vue de la thérapie optimale avec la protéine mégacaryocytopoiétique. La posologie est déterminée par le médecin traitant, compte tenu de divers facteurs connus pour leur aptitude à modifier l'action de médicaments, comprenant la gravité et la nature de la maladie, le poids corporel, le sexe, le régime alimentaire, le moment et la voie d'adminis- tration, l'absorption d'autres médicaments, ainsi que d'autres facteurs cliniques pertinents. Normalement, la dose journalière est comprise dans la plage de 0,1 à 100 pg/kg de poids corporel. La dose se situe avantageusement dans la plage de 0,1 à 50 pg/kg de poids corporel. De préférence, elle est comprise dans la plage de 1 à 5 gg/kg/jour. A titre facultatif, la plage posologique est la même que celle qui est établie pour d'autres cytokines, notamment G-CSF, GM-CSF et EPO. Des doses thérapeutiquement efficaces peuvent être déterminées par des méthodes in vitro ou in vivo. nPTLES Sans plus de détails, on considère que l'homme de l'art peut, en se servant de la description qui précède et des exemples pratiques, réaliser et exploiter la présente invention dans la mesure la plus complète. Les exemples pratiques suivants indiquent donc spécialement des formes de réalisation préférées de la présente invention, et ne doivent pas être considérés comme limitant d'une quelconque manière les autres parties du présent mémoire. EXMLE 1 Purification partielle du ligand apl porcin Du plasma pauvre en plaquettes a été recueilli sur des porcs normaux ou atteints d'anémie aplasique. Des porcs ont été rendus aplasiques par une irradiation corpo- relle totale de 900 cGy en utilisant un accélérateur linéaire de 4 MeV. Les porcs irradiés ont été soutenus pendant 6 à 8 jours avec des injections intramusculaires de céfazoline. Ensuite, leur volume sanguin total a été prélevé sous anesthésie générale, additionné d'héparine et centrifugé à 1800 x g pendant 30 min afin de former du plasma pauvre en plaquettes. On a trouvé que l'activité de stimulation des mégacaryocytes passait par un maximum 6 jours après l'irra- diation. Le plasma porcin aplasique provenant de porcs irradiés est ajusté à 4 M en NaCl et agité pendant 30 min à la température ambiante. Le précipité résultant est séparé par centrifugation à 3800 tr/min dans une centrifugeuse Sorvall RC3B et le liquide surnageant est chargé sur une colonne Phenyl-Toyopearl (220 ml) équilibrée dans du NaPO4 10 mM contenant du NaCl 4 M. On lave la colonne avec ce tampon jusqu'à ce que la valeur A2ie soit inférieure à 0,05 et on l'élue avec de l'eau distillée. Le pic élué de protéine est dilué à l'eau distillée à une conductivité de 15 mS et chargé sur une colonne Blue Sepharose équilibrée (240 ml) dans du PBS. Ensuite, on lave la colonne avec 5 fois son volume de PBS et autant de NaPO4 10 mM (pH 7,4) contenant de l'urée 2 M. Les protéines sont éluées de la colonne avec du NaPO4 10 mM4 (pH 7,4) contenant de l'urée 2 M et du NaCl 1 M. Le pic élué de protéine est ajusté à 0,01 % en octylglucoside (n-octyl-0-D-glucopyranoside) et ajusté à 1 mM en EDTA et en Pefabloc (Boehringer Mannheim) et chargé directement sur des colonnes jumelées CD4-IgG (D.J. Capon et al., Nature, 337:527-531 [1989]) et mpl-IgG Ultralink (Pierce) (voir ci- dessous). La colonne CD4-IgG (2 ml) est retirée après que l'échantillon a été chargé et la colonne mpl-IgG (4 ml) est lavée avec 10 fois son volume de PBS et autant de PBS contenant 2 M de NaCl et elle est éluée avec du chlorhydrate de glycine 0,1 M à pH 2,25. Les fractions sont recueillies dans le 1/10 de leur volume de chlorhydrate de Tris 1 M (pH 8,0). L'analyse de fractions éluées de la colonne d'affinité pour mpl par électrophorèse sur gel de dodécyl- sulfate de sodium et de polyacrylamide (gel Novex 4-20 %) dans des conditions réductrices a révélé la présence de plusieurs protéines (figure 5). Les protéines que l'argent colore avec la plus forte intensité se résolvent avec des valeurs Mr apparentes de 66 000, 55 000, 30 000, 28 000 et 14 000. Pour déterminer laquelle de ces protéines stimule la prolifération de cultures de cellules Ba/F3-mpl, on a élué ces protéines du gel de la manière décrite dans l'Exemple 2 ci-dessous. Colonnes d'affinité Ultralink On couple 10 A 20 mg de mpl-IgG ou de CD4-IgG dans du PBS à 0,5 g de résine Ultralink (Pierce) selon les instructions données par le fabricant. Construction et expression de mpl-IgG Une molécule chimérique comprenant le domaine extracellulaire entier de mpl humain (aminoacides 1-491) et la région Fc d'une molécule d'IgGl humaine a été exprimée dans 293 cellules. Un fragment d'ADNc codant les aminoacides 1-491 de mpl humain a été obtenu par PCR dans une banque d'ADNc de cellules CMK mégacaryocytaires humaines et a été séquencé. Un site ClaI a été inséré à l'extrémité 5' et un site BstEII a été inséré à l'extrémité 3'. Ce fragment a été cloné en amont de la région codante Fc de l'IgGI dans un vecteur Bluescript entre les sites ClaI et BstEII après digestion partielle du produit de PCR avec BstEII à cause de deux autres sites BstEII présents dans l'ADN qui code le domaine extracellulaire de mpl. Le site BstEII introduit à l'extrémité 3' du produit mpl de PCR a été conçu de manière que la région Fc se trouve dans le cadre avec le domaine extracellulaire mpl. L'assemblage a été sous-cloné dans le vecteur pRK5-tkneo entre les sites ClaI et XbaI et transfecté dans 293 cellules rénales d'embryon humain par la méthode au phosphate de calcium. Les cellules ont été sélectionnées dans du G418 à 0,4 mg/ml et les clones individuels ont été isolés. L'expression de mpl-IgG de clones isolés a été déterminée par un test ELISA spécifique de Fc humain. Le meilleur clone d'expression avait un niveau d'expression de 1-2 mg/ml de mpl-IgG. Cellules d'expression de Ba/F3 mpl P Un ADNc correspondant à la région entière codante de mpl P humain a été cloné dans le vecteur pRK5-tkneo qui a ensuite été linéarisé avec NotI et transfecté dans la lignée cellulaire Ba/F3 dépendant de IL-3 par électroporation (1 x 107 cellules, 9605F, 250 V). Trois jours plus tard, la sélection a été amorcée en présence de 2 mg/ml de G418. Les cellules ont été sélectionnées en groupes ou bien des clones individuels ont été obtenus par dilution limitative dans des plaques à 96 alvéoles. Des cellules choisies ont été mainte- nues dans du RPMI contenant 15 % de FBS, 1 mg/ml de G418, 20 mM de glutamine, 10 mM de HEPES et 100 zg/ml de Pen-Strep. L'expression de mpl P dans des clones sélectionnés a été déterminée par analyse FACS en utilisant un anticorps polyclonal de lapin anti-mpl P. Analyse du ligand Ba/F3 mpl L'analyse du ligand mpl a été conduite de la manière représentée sur la figure 2. Pour détecter la présence de ligand mpl provenant de diverses sources, les cellules Ba/F3 de mpl P ont été privées de IL-3 pendant 24 heures à une densité cellulaire de 5 x 105 cellules/ml dans un incubateur humidifié à 37 C dans de l'air contenant 5 % de Co2. Après privation de IL-3, les cellules ont été étalées sur des plaques de culture à 96 alvéoles à une densité de 50 000 cellules dans 200 pl de milieu avec ou sans échantillons dilués et elles ont été cultivées pendant 24 heures dans un incubateur pour culture de cellules. On a ajouté à chaque alvéole 20 p1 de milieu RPMI dépourvu de sérum contenant 1 gCi de 3H-thymidine pendant les 6-8 dernières heures. Les cellules ont ensuite été récoltées sur des plaques filtrantes GF/C à 96 alvéoles et elles ont été lavées cinq fois à l'eau. Les filtres ont été comptés en présence de 40 p1 de liquide de scintillation (Microscint 20) dans un compteur Packard du type Top Count. EXUMPLE 2 Ligand mpl porcin hautememit purifié Protocole d'élution sur gel Des quantités égales de ligand mpl purifié par affinité (fraction 6 éluée de la colonne de mpl-IgG) et de tampon d'échantillonnage Laemmli 2X ont été mélangées à la température ambiante sans agent réducteur et le mélange a éé chargé aussi rapidement que possible sur un gel Novex à 4- 20 % de polyacrylamide. L'échantillon n'a pas été chauffé. Comme témoin, on a fait passer un tampon-échantillon sans ligand dans une voie adjacente. Le gel a été traversé à 4-6 C sous tension de 135 V pendant environ 2 heures et 15 minutes. Le tampon qui s'écoulait se trouvait initialement à la température ambiante. Le gel a ensuite été retiré de la botte à gel et la plaque d'un c8té du gel a été enlevée. Une réplique du gel a été effectuée sur microcel- lulose comme suit : Un morceau de nitrocellulose a été humidifié à l'eau distillée et déposé avec précaution sur la face exposée du gel de manière à exclure les bulles d'air. Des marques ont été disposées comme repères sur la nitrocel- ulose et sur la plaque de gel de manière que la réplique puisse être remise en place avec précision après la colora- tion. Au bout d'environ 2 minutes, la nitrocellulose a été soigneusement enlevée et le gel a été enveloppé d'une feuille plastique et placé au réfrigérateur. La nitrocellulose a été colorée avec le colorant à l'or pour protéine totale BioRad, par agitation tout d'abord dans 3 fois 10 ml de Tween 20 à 0,1 % additionné de 0,5 M de NaCl et de 0,1 M de chlorhydrate de Tris à pH 7,5 pendant environ 45 minutes, puis dans 3 x 10 ml d'eau purifiée pendant 5 minutes. Le colorant à l'or a ensuite été ajouté et on l'a laissé se développer jusqu'à ce que les bandes apparaissent visiblement dans les témoins. La réplique a ensuite été rincée à l'eau, placée sur l'enveloppe plastique entourant le gel et soigneusement alignée avec les marques de repère. Les positions des témoins Novex ont été repérées sur la plaque de gel et des lignes ont été tracées pour indiquer les positions de coupe. La nitrocellulose et l'enveloppe de matière plastique ont ensuite été retirées et le gel a été découpé le long des lignes indiquées, au moyen d'une lame de rasoir non émoussée. Les coupes ont été rolongées au-delà des bandes formées par les échantillons de manière à pouvoir être utilisées pour déterminer les posi- tions des tranches après coloration du gel. Après enlèvement des tranches, le gel restant a été coloré à l'argent et les positions des témoins et les marques de découpage ont été mesurées. Les poids moléculaires correspondant aux positions de coupe ont été déterminés d'après les références Novex. Les 12 tranches de gel ont été disposées dans les cellules de deux appareils d'électro-élution BioRad modèle 422. On a utilisé dans les cellules des coiffes à membrane de sélection par exclusion de poids moléculaire de 12-14 K. Le tampon d'élution contenait 50 mM de bicarbonate d'ammonium + 0,05 % de SDS (pH 7,8 environ). i litre de tampon a été refroidi pendant environ i heure dans un réfrigérateur à 4- 6 C avant son utilisation. Les tranches de gel ont été éluées 10 mA cellule (40 V initialement) dans un réfrigérateur à 4-6 C. L'élution a duré environ 4 heures. Les cellules ont été retirées avec précaution et le liquide au-dessus de la fritte a été prélevé à l'aide d'une pipette. La chambre d'élution a été enlevée et tout liquide se trouvant au-dessus de la coiffe à membrane a été aspiré à l'aide d'une pipette. Le liquide contenu dans la coiffe à membrane a été enlevé à l'aide d'un Pipetman et gardé. Des portions aliquotes de 50 g1 d'eau purifiée ont ensuite été mises en place dans la coiffe, agitées et retirées jusqu'à ce que tous les cristaux DS soient dissous. Ces liquides de lavage ont été rassemblés avec le liquide gardé indiqué ci-dessus. Le volume total des échantillons d'élution était de 300-500 p1 par tranche de gel. Les échantillons ont été placés dans un tube de dialyse Spectrapor 4 de 10 mm de sélection par exclusion de 12-14 K qui avait été immergé plusieurs heures dans de l'eau puri- fiée. Ils ont été dialysés pendant une nuit à 4-6"C contre 600 ml de solution saline tamponnée au phosphate (la PBS est approximativement 4 mM en potassium) pour 6 échantillons. Le tampon a été remplacé le lendemain matin et la dialyse a été poursuivie pendant 2,5 heures. Des échantillons ont ensuite été prélevés des sacs de dialyse et introduits dans des tubes de microcentrifugeuse. Les tubes ont été maintenus sur de la glace pendant 1 heure, microcentrifugé à 14 K tr/min pendant 3 minutes et les liquides surnageants ont été séparés avec précaution du SDS précipité. Les liquides surnageants ont ensuite été maintenus sur de la glace pendant encore 1 heure environ et microcentrifugés de nouveau pendant 4 minutes. Les liquides surnageants ont été dilués dans de la solution de sel tamponnée au phosphate et soumis à un essai d'activité. Les échantillons restants ont été congelés à -700C. EXEMPLE 3 Microsaquençage de ligand mpl de porc La fraction 6 (2,6 ml) venant de la colonne d'affinité mpl-IgG a été concentrée sur un appareil Microcon- 0 (Amicon). Pour empêcher le ligand mpl de s'absorber sur le Microcon, la membrane a été rincée avec du SDS à i % et 5 p1 de SDS à 10 % ont été ajoutés à la fraction 6. Un tampon échantillon (20 p1) de 2X a été ajouté à la fraction N 6 après concentration au Microcon (20 p1) et le volume total (40 p1) a été chargé sur une bande unique d'un gel d'acrylamide ayant un gradient de 4-20 % (Novex). L'opération sur gel a été conduite d'après le protocole Novex. Le gel a ensuite été équilibré pendant 5 minutes avant l'analyse par transfert électrique dans un tampon 10 mM d'acide 3-(cyclo- hexylamino)-1-propanesulfonique (CAPS) à pH 11,0, contenant 10 % de méthanol. L'analyse par transfert électrique sur membranes Immobilon-PSQ (Millipore) a été effectuée pendant 45 minutes sous courant constant de 250 mA dans une cellule de transfert (32) Trans-Blot de la firme BioRad. La membrane PVDF a été colorée avec du bleu Coomassie R-250 à 0,1 % dans du méthanol à 40 % contenant 0,1 % d'acide acétique pendant une minute et décolorée pendant 2-3 minutes avec de l'acide acétique à 10 % dans du méthanol à 50 %. Les seules protéines visibles dans les régions de valeurs Mr de 18 000-35 000 du diagramme d'empreintes avaient des valeurs Mr de 30 000, 28 000 et 22 000. Des bandes à 30, 28 et 22 kDa ont été soumises à un séquençage de protéines. Un séquençage automatique de protéines a été effectué sur un appareil de séquençage Applied Biosystem modèle 470A équipé d'un analyseur PTH en ligne. L'appareil de séquençage avait été modifié pour l'injection de 80-90 % de l'échantillon (Rodriguez, J. Chromatogr., 350:217-225 [1985]). De l'acétone (environ 12 #1/1) a été ajouté au solvant A pour équilibrer l'absorp- tion ultraviolette. Les protéines analysées par transfert électrique ont été séquencées dans la cartouche Blott. On a intégré les pics avec un logiciel Justice Innovation en utilisant des interfaces Nelson Analytical 970. L'interpréta- tion des séquences a été effectuée sur un appareil VAX 5900 Henzel et al., J. Chromatogr., 404:41-52 (1987]). Les séquences N-terminales (utilisation d'une lettre code avec les résidus indéterminés entre parenthèses) et la quantité de matière obtenue (entre crochets) sont indiquées sur le Tableau 2'. TABLEAU 2' Siquences amino-terminales de ligand tpl 30 kDa [1;8 pmoq' 1 5 10 15 20 25 (S) P A P P A(C)D P R L L N K L L R D D (H/S) V L H (G)RL (SEQ IDNO:30) 28 kDa [0;5 pmol] 10 15 20 25 (S) PAPPAXD P R LL N K LL R DD (H) VL( GR (SEO ID NO: 31) 18-22 kDa [0o5 pmolj 1 5 10 X P A P P A X DP R LX(N)(K) (SEQ ID NO: 32) E":. LE 4 Essai de mégacaryocytopoièse en suspension dans un liquide 15 Des cellules-souches périphériques humaines (PSC) (prélevées sur des patients consentants) ont été diluées 5 fois avec du milieu IMDM (Gibco) et centrifugées pendant 15 minutes à 800 x g à la température ambiante. Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans du milieu IMDM 20 et déposés sur du Percoll à 60 % (masse volumique 1,077 g/ml) armacia) etcentrifugés à 800 x g pendant 30 minutes. Les cellules mononucléaires de faible densité ont été aspirées à l'interface et lavées deux fois avec de l'IMDM, et repiquées à raison de 1-2 x 10' cellules/ml dans du milieu IMDM contenant 30 % de FBS (volume final 1 ml) par groupes de culture de tissu dans 24 alvéoles (Costar). De I'APP ou de l'APP épuisé en ligand mpl a été ajouté en portion de 10 % et les cultures ont été développées pendant 12 à 14 jours dans n incubateur humidifié à 37 C dans de l'air contenant 5 % de CO2. Les cultures ont aussi été développées en présence de 10 % de APP avec addition de 0,5 ,g de mpl-IgG initialement et les 2ème et 4ème jours. L'APP avait été épuisé en ligand mpl par passage sur une colonne d'affinité mpl-IgG. Pour évaluer quantitativement la mégacaryocytopolèse dans ces cultures en suspension dans un liquide, on a utilisé une version modifiée de l'essai de Solberg et al. et on s'est servi d'un anticorps monoclonal IgG de souris marqué par la radioactivité (HPl-lD) contre GPIIbIIIa (procuré par le Docteur Nichols, Mayo Clinic). 100 Mg de HII-lD (voir B. Grant et al., Blood 69:1334-1339 [1987]) ont été marqués par la radioactivité avec 1 mCi de Na2sI en utilisant le produit Enzymobeads (Biorad, Richmond, CA) selon les instructions données par le fabricant. Du HP1-1D marqué par la radio- activité a été conservé à -70 C dans du PBS contenant 0,01 % d'octyl-glucoside. Les activités spécifiques représentatives ont été de 1-2 x 10G cpm/pg (précipitation à plus de 95 % par l'acide trichloracétique à 12,5 %). Des cultures en suspension liquide ont été établies en trois exemplaires pour chaque point expérimental. Après 12 à 14 jours de culture, les cultures de 1 ml ont été transférées dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml et centrifu- gées à 800 x g pendant 10 minutes à température ambiante, et les culots cellulaires résultants ont été remis en suspension dans 100 il de PBS contenant 0,02 % d'EDTA et 20 % de sérum de veau. On a ajouté aux cultures remises en suspension 10 ng de 12SI-HPli-lD dans 50 pl de tampon d'essai et on les a fait incuber pendant 60 minutes à la température ambiante (TA) en les agitant occasionnellement par secousses. Ensuite, on a recueilli les cellules par centrifugation à 800 x g pendant 10 minutes à la TA et on les a lavées deux fois avec le tampon d'essai. Un comptage a été effectué sur les culots pendant i minute dans un compteur gamma (Packard). La liaison non spécifique a été déterminée par addition de 1 pg de 5 HP1-lD non marqué pendant 60 minutes avant l'addition de HP1-lD marqué. La liaison spécifique a été déterminée d'après le total lié de '25I-HPl-lD moins la quantité liée en présence de HP1-lD non marqué en excès. EIEPLE 5 Amorces oligonucl&otidiques pour PCR Sur la base de la séquence d'aminoacides amino- terminale obtenue à partir des protéines de 30 kDa, 28 kDa et 18-22 kDa, on a conçu des oligonucléotides dégénérés en vue de leur utilisation comme amorces de réactions en chaîne par polymérase (PCR) (voir Tableau 4). On a synthétisé deux groupes d'amorces, à savoir un groupe de 20 éléments à sens positif codant des résidus d'aminoacides 2-8 (mpl 1) et un groupe antisens de 21 éléments complémentaires de séquences codant des aminoacides 18-24 (mpl 2). TABLEAU 4 Groupes d'amorces oligonucléotidiques ddgin4r6es mpl 1:5' CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (facteur de (SEQ ID N : dgénérescence 2048) 35) mpl 2:5' NCC RTO AR MAC RTG RTC RTC 3' (facteur de (SUQ ID N : dégénérescence 2048) 36) De 1'ADN de génome de porcs, isolé de lymphocytes de sang périphérique de porc, a été utilisé conmme matrice pour la réaction PCR. Les 50 p1 de mélange réactionnel contenaient 0,8 #g d'ADN de génome de porc dans 10 mM de chlorhydrate de Tris (pH 8,3), 50 mM de KC1, 3mM de MgC12, 100 Mg/ml de sérumalbumine de boeuf, 400 SM de dNTPs, 1 pM de chaque groupe d'amorces et 2,5 unités de Taq polymérase. La dénaturation initiale de la matrice a été effectuée à 940C pendant 8 minutes, suivie de 35 cycles de 45 secondes à 940C, 174 2714670 d'une minute à 550C et d'une minute à 72 C. On a laissé le cycle final se prolonger pendant 10 minutes à 72oC. Les produits de réaction PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 12 * et visualisés par coloration u bromure d'éthidium. On a conclu que si la séquence d'aminoacides amino-terminale était codée par un unique exon, on devait alors s'attendre à ce que le produit correct de réaction PCR ait 69 paires de bases. Un fragment d'ADN de cette dimension a été élué du gel et sous-cloné en le plasmide pGEMT (Promega). Les séquences de trois clones sont représentées ci-dessous sur le Tableau 5. TABLEAU 5 Fragments d'ADN de génome de porc de 69 paires de bases gemT3 5'CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 3'GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATITAMTG ACGGAGCACT TGACCACGTT CAGCACGGC [69 pb] (SEQ ID NO: 37) ACTGG TGCAA GTC (SEO ID NO: 38) gemT7 5'CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 3'GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATMAMTG ACGAAGCACI CGACCACGTC CATCACGGC [69 pbl (SEQ ID NO: 39) GCTGG TGCAGQ GTAGTG CCG (SEQ ID NO:. 40) gemT9 - P R L L N K L L R(SEQID NO: 32) 5' CCAGCACCGCCGGCATGTGACCCCCGACTCCTAAATAAACTGCTTCGTGACG 3' GGTCGTGGCGGCCGTACACTGGGGGCTGAGGATTTGAIrCGCGAAGCACTGCQ ATCATGTCTATCACGGT 3' (SEQ ID NO: 41) TAGTACAGATAGTGCCA 5' (SEQ ID NO: 42) La position des amorces de PCR est indiquée par les bases soulignées. Ces résultats vérifient la séquence N-terminale obtenue pour les aminoacides 9-17 pour les protéines de 30 kDa, 28 kDa et 18-22 kDa et indiquent que cette séquence est codée par un unique exon d'ADN de porc. wrEPLE 6 Gène de ligand mpl humain Sur la base des résultats de l'Exemple 5, un désoxyoligonucléotide 45-màre, appelé pR45, a été conçu et synthétisé pour le triage d'une banque génomique. Le désoxy- oligonucléotide 45-mère avait la séquence suivante : 5' GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TFr-ATT-TAG-GAG-TCG 3' (SEO ID NO: 28) Cet oligonucléotide a été marqué au phosphore 32p à l'aide de (T32P)-ATP et de T4 kinase et utilisé pour le triage d'une banque d'ADN génomique humain en Xgeml2 dans des conditions peu rigoureuses d'hybridation et de lavage (voir Exemple 7). Des clones positifs ont été prélevés, purifiés sur plaque et analysés par cartographie de restriction et analyse par la méthode de transfert Southern. Le clone NO 4 a été sélectionné pour une autre analyse. Un fragment BamHI-XbaI de 2,8 kb qui s'est hybridé en l'oligonucléotide 45-mère a été sous-cloné en pBluescript SK-. Le séquençage d'ADN partiel de ce clone a été effectué en utilisant comme amorces des oligonucléotides spécifiques de la séquence d'ADN de ligand mpl de porc. La séquence obtenue a confirmé que 1'ADN codant l'homologue humain du ligand mpl de porc avait été isolé. Un site de restriction EcoRI a été détecté dans la séquence, ce qui a permis à la Demanderesse d'isoler un fragment EcoRI-XbaI de 390 paires de bases du fragment BamHi-XbaI de 2,8 kilobases et de le sous-cloner en pBluescript SK-. Les deux brins de ce fragment ont été séquencés. La séquence d'ADN humain et la séquence déduite d'aminoacides sont représentées sur la figure 9 (SEQ ID N : 3 et 4). Les positions prédites d'introns dans la séquence génomique sont aussi indiquées par des flèches et définissent un exon présumé ("exon 3"). L'examen de la séquence prédite d'aminoacides confirme qu'un résidu de sérine constitue le premier amino- acide du ligand mpl mature, comme déterminé d'après l'analyse directe de la séquence d'aminoacides. Immédiatement en amont de ce codon, la séquence d'aminoacides prédite suggère à un haut degré une séquence signal impliquée dans la sécrétion du ligand mpl mature. Cette région codant la séquence signal est vraisemblablement interrompue au niveau de la position du nucléotide 68 par un intron. Dans la direction 3', il apparaît que l'exon se termine par le nucléotide 196. Cet exon code donc une séquence de 42 aminoacides dont 16 font vraisemblablement partie d'une séquence signal et 26 font partie du ligand mpl humain mature. EEMPLE 7 ADNc du ligand apl humain entier Sur la base de la séquence de "exon 3" humain (Exemple 6), on a synthétisé deux oligonucléotides non dégénérés correspondant aux extrémités 3' et 5' de la séquence texon 3" (Tableau 6). TABLEAU 6 Amorces oligonucliotidques de PM non d6gin&r&es d'ADNc humain Amorce 5' GCT AGC TCT AG AAT TGC TCC TCG TGG TCA TGC TTC T 3 'SEQ ID NO: directe : 4 43) Amorce 5' CAG TOT GCC GTG AAG GAC ATG G 3' (SEQ ID NO: inverse : 44 44 ) Ces deux amorces ont été utilisées dans des réactions PCR utilisant comme matrice de l'ADN provenant de diverses banques d'ADNc humain ou 1 ng d'ADNc Quick Clone (Clonetech) provenant de divers tissus, dans les conditions décrites dans l'Exemple 5. La longueur attendue du produit correct de PCR était de 140 paires de bases. Après analyse des produits de PCR sur un gel de polyacrylamide à 12 %, un fragment d'ADN de la longueur escomptée a été détecté dans les banques d'ADNc préparées à partir de cellules rénales adultes, de 293 cellules de rein de foetus et d'ADNc préparé à partir de foie de foetus humain (No de catalogue Clonetech 7171-1). Une banque d'ADNc de foie de foetus en À DR2 (N de catalogue Clonetech HL1151x) a été triée avec le même oligonucléotide 45-mère que celui avait été utilisé pour le triage de la banque génomique humaine. L'oligonucléotide a été marqué au (y32P)-ATP au moyen de T4 polynucléotide kinase. La banque a été triée dans des conditions d'hybridation de faible rigueur. Les filtres ont été préhybridés pendant 2 heures puis hybridés avec la sonde pendant une nuit à 42 C dans du formamide à 20 % contenant du SSC 5x, du milieu de Denhardt lox, du phosphate de sodium 0,05 M (pH 6,5), 0,1 % de pyrophosphate de sodium, 50 ug/ml d'ADN de sperme de saumon traité aux ultrasons, pendant 16 heures. Les filtres ont ensuite été rincés dans du SSC 2x puis lavés une fois dans du SSC 0,Sx, à 0,1 % de SDS à 42 C. Les filtres ont été exposés pendant une nuit à un film radiographique Kodak. Les clones positifs ont été prélevés, purifiés sur plaque et la longueur du segment d'insertion a été déterminée par PCR en utilisant des oligonucléotides flanquant le segment BamHI- XbaI de clonage en À DR2 (Ne de catalogue Clonetech 6475-1). On a utilisé 5 Hi de souche de bactériophage comme source constituant la matrice. La dénaturation initiale a été conduite pendant 7 minutes a 94 C suivie de 30 cycles d'amplification (1 minute à 940C, 1 minute à 520C et 1,5 mi- nute à 72 C). La prolongation finale a été de 15 minutes à 72 C. Le clone N FL2b avait un segment d'insertion de 1,8 kilobase et a été choisi pour l'analyse ultérieure. Le plasmide pDR2 (Clonetech, clonage de XDR2 et pDR2 et Expression System Library Protocol Handbook, page 42) contenu dans les segments d'extrémité du bactériophage XDR2 a été libéré d'après les instructions données par le fabri- cant (Clonetech, clonage de XDR2 et pDR2 et Expression System Library Protocol Handbook, pages 29-30). L'analyse par restriction du plasmide pDR2-FL2b avec BamHI et XbaI a révélé la présence d'un site interne de restriction par BamHI dans le segment d'insertion occupant approximativement la position 650. La digestion du plasmide avec BamHI-XbaI a découpé le segment d'insertion en deux fragments, l'un de 0,65 kilobase et l'autre de 1,15 kilobase. La séquence d'ADN a été détermi- née avec trois classes différentes de matrice dérivées du plasmide pDR2-FL2b. Le séquençage de l'ADN plasmidique à double hélice a été effectué avec l'appareil de séquençage d'ADN automatique à fluorescence AB1373 (Applied Biosystems, Foster City, Californie) d'après les protocoles classiques pour des terminateurs didésoxynucléoside-triphosphate marqués par un colorant (terminateurs colorés) et des initiateurs de marche synthétisés conformément à l'usage (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 [1977] ; Smith et al., Nature, 321:674-679 (1986]). Le séquençage direct de fragments du plasmide amplifiés par une réaction en chatne par polymérase a été effectué avec l'appareil de séquençage AB1373 en utilisant des réactions impliquant des initiateurs classiques et des terminateurs marqués par un colorant. Une matrice à un seul brin a été générée avec le vecteur Janus M13 (DNASTAR, Inc. Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl. Acids Res., 21:3385-3390 [1993]). Les fragments BamHI-XbaI (1,15 kilobase) et BamHI (0,65 kilobase) ont été isolés du plasmide pDR2-FL2b, les extrémités ont été comblées avec l'ADN-polymérase de T4 en présence de désoxynucléotides, puis 2714670 179 sous-clonées en le site SmaI de Janus M13. Le séquençage a été effectué selon des protocoles classiques pour des initiateurs universels et inverses M13 marqués avec un colorant, ou des initiateurs de marche et des terminateurs arqués avec un colorant. Des réactions de séquençage manuel ont été effectuées sur de l'ADN M13 à un seul brin en utilisant des initiateurs de marche et la chimie classique des terminateurs didéoxy (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 [1977]), de l'a-dATP marqué au phosphore 33P et la Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). L'assemblage de la séquence d'ADN a été effectué avec l'appareil Sequencher V2.1b12 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan). La séquence des nucléotides et la séquence déduite de hML sont représentées sur la figure 1 (SEQ ID N : 1). EXEMPLE 8 Isolement du gène (TPO) du ligand mpl humain Des clones d'ADN génomique humain du gène TPO ont été isolés par triage d'une banque génomique humaine en X-Geml2 avec pR45, sonde oligonucléotidique déjà décrite, dans des conditions de faible rigueur (voir Exemple 7) ou dans des conditions de forte rigueur avec un fragment correspondant à la moitié 3' d'ADNc humain codant pour le ligand mpl (du site BamHI à l'extrémité 3'). Deux clones lambda à recouvrement couvrant 35 kilobases ont été isolés. Deux fragments (BamHI et EcoRI) à recouvrement contenant le gène TPO entier ont été sous-clonés et séquencés. La struc- ture du gène humain est composée de 6 exons avec 7 kilobases d'ADN génomique (figure 14 A, B et C). Les délimitations de toutes les jonctions exon/intron concordent avec le motif consensus établi pour des gènes de mammifère (M.B. Shapiro et al., Nucl. Acids Res. 15:7155 [1987]). L'exon 1 et l'exon 2 contiennent une séquence 5' non traduite et les quatre aminoacides initiaux du peptide signal. Le reste du signal sécrétoire et les 26 premiers aminoacides de la protéine mature sont codés dans l'exon 3. Le domaine carboxyle entier et la moitié 3' non traduite de même qu'environ 50 amino- acides du domaine analogue à l'érythropoiétine sont codés dans 1'exon 6. Les quatre aminoacides impliqués dans la délétion observée dans hML-2 (hTPO-2) sont codés à l'extré- mité 5' de l'exon 6. EXEMPLE 9 Expression transitoire de ligand mpl h-umain (hXL) En vue de sous-cloner le segment d'insertion entier contenu dans pDR2-FL2b, le plasmide a été digéré avec XbaI jusqu'à la fin puis digéré partiellement avec BamHI. Un fragment d'ADN correspondant au segment d'insertion de 1,8 kilobase a été purifié sur gel et sous-cloné dans pRKS (pRKS-hmpl I) (voir le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 5 258 287 pour la construction de pRK5) sous l'influence du promoteur précoce immédiat de cytomégalovirus. L'ADN de l'assemblage pRKS-hmpl I a été préparé par la méthode au polyéthylèneglycol et transfecté dans 293 cellules de rein embryonnaire humain maintenues dans le milieu de Eagle modifié selon Dulbecco (DMEM) contenant en supplément du mélange nutritif F-12, 20 mM de HEPES (pH 7,4) et 10 * de sérum de foetus de veau. Les cellules ont été transfectées par la méthode au phosphate de calcium comme décrit par C. Gorman [1985] dans DNA Cloning : A Practical Approach (publié sous la direction de D.M. Glover), volume II, pages 143-190, IRL Press, Washington, D.C.). 36 heures après la transfec- tion, le liquide surnageant des cellules transfectées a été soumis à un titrage d'activité dans l'essai de prolifération (voir l'Exemple 1). Le liquide surnageant de 293 cellules transfectées avec le vecteur pRK a montré simplement qu'il n'y avait pas de stimulation des cellules Ba/F3 ou Ba/F3-mpl (figure 12A). Le liquide surnageant de cellules transfectées avec prK5-hmpl I n'a eu aucun effet sur les cellules Ba/F3 mais a stimulé de façon spectaculaire la prolifération de cellules Ba/F3-mpl (figure 12A), ce qui indique que cet ADNc code un ligand mpl humain doué d'activité fonctionnelle. EaPLE 10 TSoformes de ligand tpl humain h]L2, hIL3 et h.L4 En vue d'identifier des formes alternativement épissées de hML, on a synthétisé les initiateurs correspon- dant à chaque extrémité de la séquence codante de hML. Ces initiateurs ont été utilisés dans la réaction en chaîne par polymérase à la température ambiante pour amplifier de l'ARN de foie d'adulte humain. En outre, des initiateurs internes flanquant des régions sélectionnées présentant un intérêt (voir ci-dessous) ont été construits et utilisés de la même façon. Le séquençage direct des extrémités du produit de la réaction PCR a révélé l'existence d'une seule séquence correspondant exactement à la séquence de l'ADNc isolé de la banque de foie de foetus humain (voir figure 1 [SEQ ID N : 1]). Toutefois, une région proche de l'extrémité C-terminale du domaine EPO (au milieu du produit de réaction PCR) a présenté un motif de séquence complexe suggérant l'existence de variants éventuels d'épissage dans cette région. Pour isoler ces variants d'épissage, les initiateurs représentés sur le Tableau 7 flanquant la région d'intérêt ont été utilisés dans une réaction PCR comme matrices pour de l'ADNc de foie d'adulte humain. TABLEAU 7 Initiateurs PCR d'isoformes de XL humain phmpi.odna.3e1: 5"TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3' (SEQ ID NO: 45) pbx4.f2: 5'GGTCCAGGGACCTGGAGGTTrG3' SEQ ID NO: 46) Les produits de réaction PCR ont été sous-clonés avec des extrémités franches en M13. Le séquençage de sous- clones individuels a révélé l'existence d'au moins 3 isofor- mes de ML. L'une d'elles, hML (également appelée hML332) , est la forme la plus longue et correspond exactement à la séquence isolée de la banque de foie foetal. Les séquences des quatre isoformes de ligand mpl humain énumérées de la plus longue (hML) à la plus courte (hML-4) sont représentées sur la figure 11 [SEQ ID N : 6, 8, 9 et 10]. EXEMPLE 11il Construction et expression transitoire d'isoformes de ligand mpl humain et de variants de substitution hML2, hML3 et hML(R153A, R154A) Les isoformes hML2 et hML3 et le variant de substitution hML (R153A, R154A) ont été reconstituées à partir de hML en utilisant la technique PCR recombinante décrite par Russell Higuchi dans PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, Acad. Press, publié sous la direction de M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky et T.J. White. Dans tous les assemblages, les initiateurs "externes" utilisés sont représentés sur le Tableau 8 et les initiateurs "chevauchants' sont représentés sur le Tableau 9. TABLEAU 8 Initiateurs externes Cla.FL.F2: 5'ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G3' (SEQ ID NO: 47) HMPLL-R: 5GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA3' (SEQ ID NO: 48) À ~~~~~~~- TABLEAU 9 Initiateura chevauchants hML-2: MLà4.F: 5'CTC CTT GGA ACC CAG GGC AGG ACC 3' (SEQ ID NO: 49) ML.4.R 5'GGT CCT GCC CTG GGT TCC AAG GAG 3' (SEO ID NO 50) hML-3: hML 116+: 5'CTG CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT 3' (SEQ ID NO: 51) hMLA1 16-: 5'AAT CCA GMAA GTC CTT TCC TCG GAG CAG 3' (SEO ID NO: 52) hML(R153A. R154A): RR-KO-F: 5'CCC TCT GCG TCG CGG CGG CCC CAC CCA C 3' (SEO ID NO: 53) RR-KO-R: 5'GTG GGT GGG GCC GCC GCG ACG CAG AGG G 3' (SEQ ID NO: 54) Toutes les amplifications par PCR ont été ffectuées avec de l'ADN-polymérase de Pfu clonée (Strata- gene) en utilisant les conditions suivantes : la dénaturation initiale de la matrice a été effectuée à 94 C pendant 7 minutes, suivie de 30 cycles de 1 minute à 94 C, 1 minute à 55 C et 1,5 minute à 72 C. On a laissé le dernier cycle se prolonger pendant 10 minutes à 72 C. Le produit PCR final a été digéré avec ClaI-XbaI, purifié sur gel et cloné dans pRKStkneo. 293 cellules ont été transfectées avec les divers assemblages décrits ci-dessus et le liquide surnageant a été titré au moyen de l'essai de prolifération Ba/F3-mpl. Les isoformes hML-2 et hML-3 n'ont pas présenté d'activité détectable dans cet essai, toutefois l'activité de hML(R153A, R154A) a été analogue à celle de hML, ce qui indique que le traitement au niveau de ce site dibasique ne s'impose pas pour l'activité (voir figure 13). EXPx"LE 12 ADNc de ligand mpl de souris mML, iML-2 et mUL-3 Isolement de 1'ADNc de mML. Un fragment d'ADN correspondant à la région codante entière du ligand mpl humain a été obtenu par PCR, purifié sur gel et marqué par amorçage aléatoire en présence de 32P-dATP et de 32P-dCTP. Cette sonde a été utilisée pour trier 106 clones d'une banque d'ADNc de foie de souris en XGT10 (N de catalogue Clontech ML3001a). Des répliques de filtres ont été hybridées dans du formamide à 35 % contenant du SSC 5x, du milieu de Denhardt 10x, 0,1 % de SDS, 0,05 M de phosphate de sodium (pH 6,5), 0,1 % de pyrophosphate de sodium, 100 Mg/ml d'ADN de sperme de saumon traité aux ultrasons, pendant une nuit en présence de la sonde. Les filtres ont été rincés dans du SSC 2x puis lavés une fois dans du SSC 0,5x à 0,1 % de SDS à 42 C. Les bactériophages d'hybridation ont été purifiés sur plaque et les segments d'insertion d'ADNc ont été sous-clonés dans le site EcoRI du plasmide Bluescript SK. Le clone "LD" avec un segment d'insertion de 1,5 kilobase a été choisi en vue d'une analyse ultérieure et les deux brins ont été séquences de la manière décrite ci-dessus pour l'ADNc de ML humain. La séquence de nucléotides et la séquence d'aminoacides déduites provenant du clone LD sont reproduites sur la figure 14 (SEQ ID N : 1 et 11). La séquence déduite de ML mature dérivée de ce clone avait une longueur de 331 résidus d'aminoacides et a été identifiée comme mML33X (OU mML-2 pour des raisons décrites ci-dessous). Une identité considérable pour la séquence de nucléotides et la séquence déduite d'aminoacides a été observée dans les domaines semblables à EPO de ces isoformes ML. Toutefois, lorsque les séquences déduites d'aminoacides des isoformes ML humaine et murine ont été alignées, il est apparu que la séquence murine présentait une dél1tion tétrapeptidique entre les résidus humains 111-114 correspon- dant à la délétion de 12 nucléotides faisant suite à la position du nucléotide 618 apparaissant dans les ADNc humain (voir ci-dessus) et porcin (voir ci-dessous). En conséquence, d'autres clones ont été examinés afin de détecter des isoformes ML murines possibles. L'un des clones, L7", avait un segment d'insertion de 1,4 kilobase avec une séquence déduite de 335 aminoacides contenant le tétrapeptide LPLQ "manquant". Cette forme est supposée être l'isoforme ML murine entière et elle est appelée mML ou mML33s. La séquence S des nucléotides et la séquence déduite des aminoacides pour mML sont présentées sur la figure 16 (SEQ ID NO : 12 et 13). Enfin, le clone "L2" a été isolé et séquencé. Ce clone présente la délétion de 116 nucléotides correspondant à hML3 et est donc appelé mML-3. Une comparaison des séquences déduites d'aminoacides de ces deux isoformes est représentée sur la figure 16. Expression de mML recombinant. Des vecteurs d'expression pour l'isoforme ML murine ont été préparés essentiellement comme décrit dans l'Exemple 8. Des clones codant mML et mML-2 ont été sous-clonés en le plasmide pRKStkneo, vecteur d'expression de mammifère qui effectue l'expression sous l'influence du promoteur CMV et d'un signal de polyadénylation SV40. Les vecteurs d'expression résul- tants, mMLpRKtkneo et mML2pRKtkneo ont été exposés à une transfection transitoire dans 293 cellules par la méthode au phosphate de calcium. Après la transfection transitoire, le milieu a été conditionné pendant cinq jours. Les cellules ont été maintenues dans le milieu DMEM à haute teneur en glucose, avec un supplément de 10 % de sérum de foetus de veau. Expression de mpl murin (mmpl) dans des cellules Ba/F3. Des lignées cellulaires stables exprimant c-mpl ont été obtenues par transfection de mmpl-pRKtkneo, essentiellement comme décrit pour le mpl humain dans l'Exemple 1. En bref, un vecteur d'expression (20 Mg ; linéarisé), contenant la séquence codante entière de mpl murin (R.C. Skoda et al., EMBO, J. 12:2645-2653 [1993]) a été transfecté dans des cellules Ba/F3 par électroporation (5 x 10' cellules, 250 volts, 960 pF), l'opération étant suivie d'une sélection vis-à-vis de la résistance à la néomycine avec 2 mg/ml de G418. L'expression de mpl a été évaluée par l'analyse cytométrique par écoulement en utilisant des antisérums de lapin anti-mpl-IgG de souris. Des cellules Ba/F3 ont été maintenues dans le milieu RPMI 1640 provenant de cellules WEHI-3B comme source de IL-3. Les liquides surnageants de 293 cellules ayant subi une transfection transitoire avec mML et mML-2 ont été analysés dans des cellules BaF3 transfectées avec mmpl et hmpl comme décrit dans l'Exemple 1. INp~LE 13 ADNc de ligand tpl porcin pML et pML-2 De l'ADNc de ML porcin (pML) a été isolé par réaction RACE PCR. En bref, un initiateur oligo dT et deux initiateurs spécifiques ont été conçus sur la base de la séquence de 1' exon du gène de ML de porc codant l'extrémité amino-terminale de ML purifié provenant de sérum de porc aplasique. De l'ADNc préparé à partir de divers tissus de porc aplasique a été obtenu et amplifié. Un ADNc produit de réaction PCR, de 1342 paires de bases, a été trouvé dans le rein et sous-cloné. Plusieurs clones ont été séquences et on a trouvé qu'ils codaient le ligand mpl de porc mature (ne renfermant pas de signal de sécrétion complet). On a trouvé que 1'ADNc codait une protéine mature de 332 aminoacides (pML332) ayant la séquence représentée sur la figure 18 (SEQ ID NO : 9 et 16). Mode opératoire : isolement du gène et de l'ADNc de pML. Des clones génomiques du gène de ML de porc ont été isolés par triage d'une banque génomique de porc en EMBL3 (Clontech Inc.) avec le plasmide pR45. La banque a été triée essentiellement de la manière décrite dans l'Exemple 7. Plusieurs clones ont été isolés et l'exon codant la séquence d'aminoacides identique à ce que l'on avait obtenu à partir de ML purifié a été séquencé. L'ADNc de ML de porc a été obtenu d'après une version modifiée du protocole de réaction RACE PCR. Deux initiateurs ML spécifiques ont été conçus sur la base de la séquence du gène ML de porc. L'ARN messager polyadénylé a été isolé du rein de porcs aplasiques essentiellement comme décrit dans ce qui précède. L'ADNc a été préparé par trans- cription inverse avec l'initiateur BamdT ~~~5 ~ (BamdT: 5'GACTCGAGGATCCATCGAI I I I I I I I I I I I I 3) (SEQ ID NO: 55) dirigé contre la polyadénosine formant la queue de 1'ARNm. Une reprise initiale d'amplification de PCR (28 cycles de 60 secondes à 950C, de 60 secondes à 580C et 90 secondes a 72 C) a été conduite en utilisant l'amorce ou initiateur direct h-fwd-l spécifique de ML (h-fwd-1: 5'GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT 3) (SEQ ID NO: 43) et l'amorce ou initiateur BAMAD (BAMAD: 5' GACTCGAGGATCCATCG 3) (SEQ ID NO: 56) dans un volume de réaction de 100 ml (50 mM de KC1, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de Tris à pH 8,0, 0,2 mM de dNTP, avec 0,05 U/ml depolymérase Amplitaq [Perkin Elmer Inc.] ). Le produit de réaction PCR a ensuite été digéré avec Call, extrait avec un mélange phénol-chloroforme (1:1), précipité à l'éthanol et attaché par ligation à 0,1 mg du vecteur Bluescript SK- (Stratagene Inc.) qui avait été coupé avec Clal et Kpn 1. Après incubation pendant 2 heures à la température ambiante, un quart du mélange de ligation a été ajouté directement à une seconde reprise de la réaction PCR (22 cycles comme décrit ci-dessus) en utilisant une seconde amorce directe fwd-l spécifique de ML (fwd- 1: 5' GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG 3) (SEQ ID NO: 57) et T3-21 (oligonucléotide qui se lie à une séquence adjacente à la région de clonage multiple dans le vecteur Bluescript SK-) : (5 CGAAATTAACCCTCACTAAAG 3') (SEQ ID NO: 58). Le produit de réaction PCR résultant a été digéré avec Xbal et Clal et sous-cloné dans Bluescript SK-. Plusieurs clones venant de réactions PCR indépendantes ont été séquences. Là encore, une seconde forme, appelée pML-2, codant une protéine avec une délétion de 4 résidus d'amino- acides (328 résidus d'aminoacides), a été identifiée (voir figure 21 [SEQ ID N : 21]). Une comparaison des séquences d'aminoacides de pML et pML-2 montre que la seconde forme est identique, excepté que le tétrapeptide QLPP correspondant aux résidus 111-114 inclus a été supprimé (voir figure 22 [SEQ ID N : 18 et 21]). Les délétions de quatre aminoacides obser- vées dans 1'ADNc de ML murin, humain et porcin apparaissent précisément en même position dans les protéines prédites. E:=OPLE 14 Spreuve CM de la thrombopoltine (TPO), induction de l'expression de l'antigène plaquettaire GPIbIII, On entretient des cellules CMK en milieu RMPI 1640 (Sigma) contenant en supplément 10 % de sérum de foetus de veau et 10 mM de glutamine. Dans la préparation en vue de l'essai, on récolte les cellules, on les lave et on les remet en suspension à une densité de 5 x 10s cellules/ml dans du milieu GIF sans sérum contenant en supplément 5 mg/l d'insu- line de boeuf, 10 mg/l d'apo-transferrine, et des oligo- éléments (1 x). En utilisant une plaque à fond plat à 96 alvéoles, on ajoute le témoin de TPO ou des échantillons expérimentaux à chaque alvéole à des dilutions appropriées en volume de 100 j1. On ajoute 100 ~1 de la suspension de cellules CMK à chaque alvéole et on fait incuber les plaques à 37 C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 48 heures. Après l'incubation, on centrifuge les plaques à 1000 tr/min à 40C pendant 5 minutes. On jette les liquides surnageants et on ajoute à chaque alvéole, 100 i1 de l'anticorps 2D2 monoclonal anti-GPIIbIII, conjugué à un FITC. Après incubation 40C pendant 1 heure, on centrifuge de nouveau les plaques à 1000 tr/min pendant cinq minutes. Les liquides surnageants contenant l'anticorps non lié sont jetés et 200 #1 de solution de lavage à 0,1 % de sérum-albumine de boeuf dans du PBS sont ajoutés à chaque alvéole. L'étape de lavage au PBS à 0,1 % de sérum-albumine de boeuf est répétée trois fois. Les cellules sont ensuite analysées sur un appareil FASCAN en utilisant l'analyse standard à un seul paramètre mesurant l'intensité relative de fluorescence. EEXMPLE 15 Dosage DAMI'de la thrombopolitine (TPO) par mesure de l'activité endomitotique de cellules DAMI sur des plaques de microtitrage a 96 alvéoles On entretient des cellules DAMI dans du milieu IMDM additionné de 10 % de sérum de cheval (Gibco) avec en supplément 10 mM de glutamine, 100 ng/ml de pénicilline G et 50 pg/ml de streptomycine. En vue de l'essai, on récolte les cellules, on les lave et on les remet en suspension à une densité de 1 x 10' cellules/ml dans du milieu IMDM additionné de i % de sérum de cheval. Dans une plaque à fond rond à 96 alvéoles, on ajoute 100 p1 du témoin de TPO ou d'échantil- lons expérimentaux à la suspension de cellules DAMI. On fait ensuite incuber les cellules pendant 48 heures à 37oC dans un incubateur renfermant 5 % de CO2. Apres l'incubation, on centrifuge les plaques dans une centrifugeuse Sorvall 6000B à 1000 tr/min pendant cinq minutes à 4eC. On jette les liquides surnageants et on répète l'étape de lavage avec 200 g1 de PBS à 0,1 % de sérum-albumine de boeuf. On fixe les cellules par addition de 200 M1 de PBS à 70 % d'éthanol refroidi à la glace et on les remet en suspension par aspiration. Apres incubation à 40C pendant 15 minutes, on centrifuge les plaques à 2000 tr/min pendant 5 minutes et on ajoute à chaque alvéole 150 p1 de RNAse à i mg/ml contenant 0,1 mg/ml d'iodure de propidium et 0,05 % de Tween 20. Après incubation pendant une heure à 37 C, on mesure les variations e teneur en ADN par cytométrie par écoulement. On mesure la polyploidie et on l'évalue quantitativement comme suit : (cellules t dans G2+N/cellules% dans G2+N/cellules% dans EXEMPLE 16 Epreuve in vivo a la thrombopolétine (TPO) (Essai de rebondissement sur plaquettes de souris) Epreuve in vivo de détermination par 3$S de la production des plaquettes On injecte à des souris C57BL6 (provenant de Charles River) par voie intrapéritonéale (IP) 1 ml de sérum de chèvre anti-plaquette de souris (6 amps) le premier jour pour provoquer une thrombocytopénie. Les 5ème et 6ème jours, on administre aux souris en deux injections intrapéritonéales le facteur ou du PBS comme témoin. Le 7ème jour, on injecte par voie intraveineuse 30 pCi de Na23SSO4 dans 0,1 ml de sérum physiologique et on mesure le pourcentage d'incorporation de 35S de la dose injectée dans les plaquettes en circulation dans des échantillons de sang prélevés sur des souris traitées et des souris témoins. On effectue des numérations de plaquettes et des numérations de leucocytes au même moment sur du sang prélevé dans le sinus rétro-orbital. EXEMPLE 17 Dosage KIRA ELISA de la thrombopolitine (TPO) par mesure de la phosphorylation dans le récepteur chimérique mpl-Rue.gD Le récepteur mpl humain a été décrit par Vigon et al., PNAS, USA 89:5640-5644 (1992). Un récepteur chimérique comprenant le domaine extracellulaire (ECD) du récepteur mpl et le domaine transmembranaire (TM) et intracellulaire (ICD) de Rse (Mark et al., J. of Biol. Chem. 269(14):10720-10728 [1994]) avec un polypeptide à groupe terminal carboxyle (à savoir Rse.gD) a été préparé en vue de son utilisation dans le dosage KIRA ELISA décrit ici. Voir les figures 30 et 31 our une description schématique du dosage. (a) Préparation d'un agent de capture On a produit un anti-gD monoclonal (clone 5B6) contre un peptide dérivé de la glycoprotéine D du virus de l'Herpès simplex (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990]). La préparation mère purifiée a été ajustée à 3,0 mg/ml en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à pH 7,4 et des portions aliquotes de 1,0 ml ont été conservées à -200C. (b) Préparation d'un anticorps anti-phospho- tyrosine De l'anti-phosphotyrosine monoclonale, clone 4G10, a été acquise auprès de UBI (Lake Placid, NY) et combinée à la biotine en utilisant un biotine-N-hydroxysuc- cinimide à long segment d'extrémité (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH). (c) Ligand Le ligand mpl a été préparé par les techniques de recombinaison décrites dans le présent mémoire. Le ligand mpl purifié a été conservé à 40C comme solution mère. (d) Préparation de l'acide nucléique Rse.gD oligonucléotides synthétiques à double brin ont été utilisés pour reconstituer la séquence codante pour les 10 aminoacides C-terminaux (880 - 890) de Rse humain et pour ajouter 21 autres aminoacides contenant un épitope pour l'anticorps 5B6 et un codon d'arrêt. Le Tableau 10 présente la séquence finale de la portion synthétique du gène fu- sionné. TABLEAU 10 Portion synthétique à double brin du gêne fusionné de Rae humain Brin codant : 5'-TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTAGCCTCAAGA TGGCTGATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTTCCGGTCCTGTAGAAGCT-3' (SEQ ID NO: 59) Brin non codant (anti-sens) : 5'.AGCTTCTACAGGACCGGAAGATCImTGCCGCGGAATCGAMTGGATCAGCCA TCTTG AGGCTAGCATCTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAGCCCTTGCTGCA-3' (SEQ ID NO: 60) 'ADN synthétique a été lié à l'ADNc codant les aminoacides 1-880 de Rse humain au niveau du site PstI commençant au nucléotide 2644 de la séquence d'ADNc de Rse humain publiée (Mark et al., Journal of Biological Chemistry 269(14):10720-10728 [1994]) et au niveau des sites HindIII du segment de liaison multiple du vecteur d'expression pSV17.ID.LL (voir figure 32 A-L ; SEQ ID N : 22) pour créer le plasmide d'expression pSV.ID.Rse.gD. En bref, le plasmide d'expression comprend le produit de transcription primaire dicistronique qui contient la séquence codant DHFR délimitée par les sites d'épissage des introns, donneur 5' et accepteur 3', suivie d'une séquence qui code le Rse.gD. Le message entier (non épissé) contient DHFR comme premier cadre de lecture ouvert et génère par conséquent la protéine DHFR pour permettre la sélection de transformants stables. (e) Préparation d'acide nucléique mpl-Rse.gD Le plasmide d'expression pSV.ID.Rse.gD produit de la manière décrite ci-dessus a été modifié pour produire le plasmide pSV.ID.M.tmRd6 qui contenait les séquences codantes de l'ECD du mpl humain (aminoacides 1-491) soudé au domaine transmembranaire et au domaine intracellulaire de Rse.gD (aminoacides 429-911). Des oligonucléotides synthétiques ont été utilisés pour lier la séquence codante d'une portion du domaine extracellulaire de mpl humain à une portion de la séquence codant Rse dans une réaction de clonage PCR en deux étapes comme décrit par Mark et al. dans J. Biol. Chem. 67:26166-26171 (1992). Les amorces ou initiateurs utilisés pour la première réaction PCR ont été les suivants : M1 (5'-TCTCGCTACCGTTTACAG-3') (SEO ID NO: 61) et M2 (5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3') (SEQ ID NO: 62) avec une matrice d'ADNc de mpl et R1 (5'-GGGCCATGACACTGTCAA-3') (SEQ ID NO: 63) et R2 (5'GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3') (SEQ ID NO: 64) avec une matrice d'ADNc de Rse. La portion PvuII-SmaI de cette jonction fusionnée a été utilisée pour l'assemblage du epteur chimérique entier. (f) Transformation des cellules Des cellules CP12.CHO (brevet européen N 307 247 publié le 15 mars 1989) ont été électroporées avec le plasmide pSV.ID.M.tmRd6 qui avait été linéarisé au niveau d'un site NotI unique de sa structure. L'ADN a été précipité à l'éthanol après extraction au phénol/chloroforme et il a été remis en suspension dans 20 p1 de Tris EDTA 1/10. Ensuite, on a fait incuber 10 gg d'ADN avec 107 cellules DP12 d'ovaire de hamster chinois dans 1 ml de PBS sur de la glace pendant 10 minutes avant électroporation sous 400 volts et 330 gf. Les cellules ont réintégré la glace pour une durée de 10 minutes avant d'être ensemencées en milieu non sélectif. Au bout de 24 heures, les cellules ont été additionnées de milieu dépourvu de nucléoside pour la sélection de clones DHFR+ stables. g) Sélection de cellules transformées destinées à être utilisées dans le dosage KIRA ELISA Les clones d'expression de MPL/Rse.gD ont été identifiés par analyse western-blot de lysats cellulaires entiers après fractionnement par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide en utilisant l'anticorps 5B6 qui détecte l'identité de l'épitope gD. (h) Milieu Les cellules ont été cultivées en milieu F12/DMEM à 50:50 (Gibco/BRL, Life Technologies, Grand Island, NY). Le milieu contenait en supplément 10 % de FBS diafiltré (HyClone, Logan, Utah), 25 mM de HEPES et 2 mM de L-glutamine. (i) KIRA ELISA Des cellules DP12.CHO transformées par mpl-Rse.gD ont été ensemencées (3 x 104 par alvéole) dans les alvéoles d'une plaque de culture à fond plat & 96 alvéoles dans 100 g1 de milieu et elles ont été cultivées pendant une nuit à 370C en présence de 5 % de CO2. Le lendemain matin, les liquides surnageants des alvéoles ont été décantés et les plaques ont été légèrement pressées sur du papier absorbant. On a ensuite ajouté à chaque alvéole 50 g1 de milieu contenant des échantillons expérimentaux ou 200, 50, 12,5, 3,12, 0,78, 0,19, 0,048 ou 0 ng/ml de ligand mpl. Les cellules ont été stimulées à 37 C pendant 30 minutes, les liquides surnageants des alvéoles ont été décantés et les plaques ont été une nouvelle fois légèrement pressées sur du papier absorbant. Pour effectuer la lyse des cellules et solubiliser les récepteurs chimériques, on a ajouté 100 g1 de tampon de lyse à chaque alvéole. Le tampon de lyse était constitué de 150 mM de NaCl contenant 50 mM de HEPES (Gibco), 0,5 % de Triton-X 100 (Gibco), 0,01 % de thimérosal, 30 kUI/ml d'aprotine (ICN Biochemicals, Aurora, OH), i mM de chlorhydrate de fluorure de 4-(2-aminoéthyl)-benzènesulfonyle (AEBSF ; ICN Biochemi- cals), 50 gM de leupeptine (ICN Biochemicals) et 2 mM d'orthovanadate de sodium (Na3VO4 ; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), à pH 7,5. La plaque a ensuite été agitée modéré- ment sur une secoueuse pour plaques (Bellco Instruments, Vineland, NJ) pendant 60 minutes à la température ambiante. Tandis que les cellules se solubilisaient, une plaque de microtitrage ELISA (Nunc Maxisorp, Inter Med, Danemark) revêtue pendant une nuit à 4"C d'anticorps monoclo- nal anti-gD 5B6 (5,0 pg/ml dans du tampon au carbonate 50 mM, pH 9,6, 100 pl/alvéole) a été décantée, pressée sur un tampon de papier absorbant et bloquée avec 150 gl/alvéole de tampon bloquant [PBS contenant 0,5 % de BSA (Intergen Company, Purchase, NY) et 0,01 % de thimérosal] pendant 60 minutes à la température ambiante sous agitation modérée. Au bout de 60 minutes, la plaque revêtue d'anti-gD 5B6 a été lavée 6 fois avec un tampon de lavage (PBS contenant 0,05 % de Tween 20 et 0,01 % de thimérosal) en utilisant un appareil automatique de lavage de plaques (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc., Sterling, VA). Le lysat contenant le MPL/Rse.gD solubilisé provenant des alvéoles de microtitrage pour culture de cellules a été transféré (85 l/alvéole) dans une alvéole ELISA revêtue d'anti-gD 5B6 et bloqué et il a été incubé pendant 2 heures à la température ambiante sous agitation modérée. Le mpl-Rse.gD non lié a été enlevé par lavage avec un tampon et 100 p1 de 4G10 (anti-phosphotyrosine) lié à la biotine dilué dans un rapport de 1:18 000 dans un tampon diluant (PBS contenant 0,5 % de sérum-albumine de boeuf, 0,05 % de Tween-20, 5 mM d'EDTA et 0,01 % de thimérosal), c'est-à-dire à 56 ng/ml ont été ajoutés à chaque alvéole. Après incubation pendant 2 heures à la température ambiante, la plaque a été lavée et 100 #1 de streptanidine conjuguée à la peroxydase de raifort (HRPO) (Zymed Laboratories, S. San Francisco, CA) diluée dans un rapport de 1:60 000 dans un tampon diluant ont été ajoutés à chaque alvéole. On a fait incuber la plaque pendant 30 minutes à la température ambiante tout en l'agitant modérément. Le conjugué dépourvu d'avidine a été éliminé par lavage et 100 p1 de solution de substrat franchement préparée (tétraméthylbenzidine [TMB] ; composition pour substrat à 2 composants ; Kirkegaard et Perry, Gaithersburg, MD) ont été ajoutés à chaque alvéole. On a laissé la réaction se poursuivre pendant 10 minutes, après quoi le développement de la couleur a été arrêté par l'addi- tion de 100 gl/alvéole de H3PO4 1,0 M. L'absorption à 450 nm a été lue avec une longueur d'onde de référence de 650 nm (ABS4s,/6s0) en utilisant un lecteur de plaque vmax (Molecular Devices, Palo Alto, CA) sous la commande d'un ordinateur Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) et d'un logiciel DeltaSoft (BioMetallics, Inc., Princeton, NJ). La courbe de référence a été construite par stimulation de cellules dpl2.trkA,B ou C.gD avec 200, 50, 12,5, 3,12, 0,78, 0,19, 0,048 ou 0 ng/ml de ligand pour mpl et cette courbe représente la variation du nombre de ng/ml de TPO en fonction de la valeur moyenne ABS4s0,/s0 l'écart-type, avec utilisation du logiciel DeltaSoft. Les concentrations des échantillons ont été obtenues par interpolation de leur absorbance sur la courbe d'étalonnage et sont exprimées en termes d'activité en TPO, en ng/ml (figure 43). - On a trouvé que le ligand mpl était capable d'activer le récepteur chimérique mpl-Rse.gD d'une manière dépendant de la concentration et spécifique du ligand. En outre, on a trouvé que l'essai KIRA-ELISA de mpl-Rse.gD avait une tolérance allant jusqu'à 100 % de sérum humain (représen- té) ou 100 % de plasma (non représenté), ce qui permet d'utiliser cet essai pour trier aisément des échantillons de patients et des échantillons de pK. Tableau des valeurs CEs de TPO _ CE50 CE 50 Forme TPO (cellules) (poids/volume) (molarité) Hu TPO 332 (293) 2 56 nglml 67,4 PM Mu TPO 332 (293) 3,69 na/ml 9711 PM Hu TPO 153 (293) -41 ng/ml -108 nM Hu TPO 155 (E. coi) 0,44 na/ml 11.6 DM Hu TPO 153met (E. co/i) ,829 naml 21,8 g M EXEMPLE 18 Essai ELISA base sur les récepteurs pour le osage de thrombopoiétine (TPO) Des plaques pour dosage ELISA ont été revêtues de F(ab')2 de lapin anti-IgG humaine (Fc) dans un tampon au carbonate à pH 9,6 à 4 C pendant une nuit. Les plaques ont été bloquées avec 0,5 % de sérum-albumine de boeuf dans du PBS à la température ambiante pendant 1 heure. La récolte de l'appareil de fermentation contenant le récepteur chimérique, mpl-IgG, a été ajoutée aux plaques que l'on a fait incuber pendant 2 heures. Des doubles dilutions en série (0,39- 25 ng/ml) de la substance de référence (TPO332 produit dans 293 cellules avec détermination de la concentration par analyse quantitative des aminoacides) et des échantillons dilués en série dans 0,5 % de sérum-albumine de boeuf et 0,05 % de Tween 20 ont été ajoutés aux plaques que l'on a fait incuber pendant 2 heures. La TPO liée a été détectée avec des anticorps de lapin liés à la biotine, débarrassés de la protéine A, contre la TPOss5 qui avait été produite dans E. coli (incubation pendant 1 heure) suivis de streptavidine- peroxydase (incubation pendant 30 min) avec de la 3,3',5,5'- tétraméthylbenzidine comme substrat. L'absorption a été lue à 450 nm. Les plaques ont été lavées entre les étapes. Pour l'analyse des données, la courbe de référence est adaptée en utilisant un programme d'adaptation de courbe à 4 paramètres, par un appareil Kaleidagraph. Les concentrations des échan- tillons ont été calculées à partir de la courbe d'étalonnage. RXEMPLE 19 xpression et purification de TPO provenant de 293 cellules 1. Préparation des vecteurs d'expression des 293 cellules Un ADNc correspondant au cadre de lecture ouvert entier de la TPO a été obtenu par réaction PCR en utilisant comme initiateurs, les oligonucléotides suivants TABLEAU 1i 293 initiateurs de réaction en chaîne par polym&rase Cla.FL.F: 5' ATC GAT ATC GAT CAG CCA GAC ACC CCG GCC AG 3 (SEQ ID NO: hmplI-R: 5' GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA 3' (SEQ ID NO: 48) On a utilisé le plasmide pRKS-hmpl I (décrit dans l'Exemple 9) comme matrice pour la réaction en présence d'ADN-polymérase pfu (Stratagene). La dénaturation initiale a été effectuée pendant 7 minutes à 94 C suivie de 25 cycles d'amplification (1 min à 940C, I min à 55 C et I mifi à 720C). La prolongation finale a été de 15 min à 720C. Le produit de réaction PCR a été purifié et cloné entre les sites de restriction ClaI et XbaI du plasmide pRK5tkneo, vecteur dérivé de pRK5 modifié pour exprimer un gène de résistance à la néomycine sous l'influence du promoteur thymidine-kinase, afin d'obtenir le vecteur pRKStkneo.ORF (cadre de lecture ouvert). Un second assemblage correspondant au domaine homologue epo a été généré de la même façon mais en utilisant Cla.FL.F comme amorce directe et l'amorce inverse suivante Arg.STOPXb& S TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA CC 3' (SEQ ID NO: 66) L'assemblage final est appelé pRK5-tkneoEPO-D. La séquence des deux assemblages a été vérifiée comme décrit dans l'Exemple 7. 2. Transfection de cellules de rein d'embryon humain es 2 produits d'assemblage ont été transfectés dans des cellules de rein d'embryon humain par la méthode au CaPO4 telle que décrite dans l'Exemple 9. 24 heures après la transfection, la sélection de clones résistant à la néomycine a été entreprise en présence de 0,4 mg/ml de G418. 10 à 15 jours plus tard, des colonies individuelles ont été transfé- rées sur des plaques à 96 alvéoles et on les a laissées se développer jusqu'à la confluence. L'expression de Ms3 ou ML332 dans le milieu conditionné venant de ces clones a été estimée au moyen de la méthode d'essai de prolifération de Ba/F3-mpl (décrite dans l'Exemple 1). 3. Purification de rhML332 Le milieu conditionné de 293-rhML332 a été chargé sur une colonne Blue-Sepharose (Pharmacia) qui avait été équilibrée avec du phosphate de sodium 10 mM à pH 7,4 (tampon A). La colonne a ensuite été lavée avec 10 fois son volume de tampon A et autant de tampon A contenant de l'urée 2 M. La colonne a ensuite été éluée avec du tampon A conte- nant 2 M d'urée et 1 M de NaCl. L'éluat rassemblé de la colonne de Blue-Sepharose a ensuite été directement chargé sur une colonne de WGA-Sepharose équilibrée en tampon A. La colonne de WGA-Sepharose a ensuite été lavée avec 10 fois son volume de tampon A contenant de l'urée 2 M et du NaCl 1 M et elle a été éluée avec le même tampon contenant 0,5 M de N- acétyl-D-glucosamine. L'éluat de WGA-Sepharose a été chargé sur une colonne CLHP-C4 (Synchrom, Inc.) équilibrée en TFA à 0,1 %. La colonne CLHP-C4 a été éluée avec un gradient discontinu de propanol (0-25 %, 25-35 %, 35-70 %). On a trouvé que le rhML332 était élué dans la région à 28-30 a de propanol du gradient. Dans l'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide, le rhML332 purifié migre sous forme d'une large bande dans la région de 68-80 kDa du gel (voir figure 15). 4. Purification de rhML15s3 Le milieu conditionné de 293-rhMLIs3 a été résolu sur Blue-Sepharose comme décrit pour rhML332. L'éluat de Blue Sepharose a été chargé directement sur une colonne d'affinité pour mpl comme décrit ci-dessus. Le rhML1s3 élué de la colonne d'affinité pour mpl a été purifié jusqu'à consistance homogène au moyen d'une colonne CLHP-C4 fonctionnant dans les mêmes conditions que pour rhML332. Dans l'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide, le rhMLs53 purifié se résout en deux bandes dominantes et deux bandes secondaires avec une valeur Mr d'environ 18 000-21 000 (voir figure 15). EXEMPLE 20 Expression et purification de TPO provenant de cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) 1. Description de vecteurs d'expression de CHO Les vecteurs d'expression utilisés dans les protocoles d'électroporation décrits ci-dessous ont été désignés comme suit : pSVl5.ID.LL.MLORF (entier ou hTPO332), et pSV15.ID.LL..MLEPO-D (tronqué ou hTPO53)'. Les caractéristiques pertinentes de ces plasmides sont présentées sur les figures 23 et 24. 2. Préparation de vecteurs d'expression de CHO Un ADNc correspondant au cadre de lecture ouvert entier de hTPO a été obtenu par réaction en chaîne par polymérase avec utilisation des amorces oligonucléotidiques du Tableau 12. TABLEAU 12 Amorces de PCR des vecteurs d'expression de CHO Cla.FLF2 5' ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G (SE ID NO: 47) ORF. Sal 5' AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT CTG AGA ACC 3 (SEO ID NO: 67) On a utilisé pRKS-hmpl I (décrit dans les xemples 7 et 9) comme matrice pour la réaction en présence d'ADN-polymérase pfu (Stratagene). La dénaturation initiale a été effectuée pendant 7 minutes à 94 C, suivie de 25 cycles d'amplification (1 min à 94 C, 1 min à 55 C et 1 min à 72 C). La prolongation finale a été de 15 min à 72 C). Le produit de réaction PCR a été purifié et cloné entre les sites de restriction ClaI et SalI du plasmide pSV15.ID.LL pour obtenir le vecteur pSV15.ID.LL.MLORF. Un second produit d'assemblage correspondant au domaine homologue EPO a été engendré de la même façon mais en utilisant Cla.FL.F2 comme amorce directe et l'amorce inverse suivante : EPOO.Sai 5' AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3 (SEQ ID NO: 68) Le produit d'assemblage final est appelé pSV15.ID.LL.MLEPO-D. La séquence des deux produits d'assemblage a été vérifiée comme décrit dans les Exemples 7 et 9. Pour l'essentiel, les séquences codantes pour le ligand entier et le ligand tronqué ont été introduites dans le site de clonage multiple du vecteur PSVl5.ID.LL d'expres- sion de CHO. Ce vecteur contient la région promoteur/activa- teur précoce de SV40, unité d'épissage modifiée contenant 1'ADNc de DHFR de souris, site de clonage multiple pour l'introduction du gène concerné (en l'occurrence les séquences TPO décrites), le signal de polyadénylation de SV40 et l'origine de réplication et le gène de bêta-lactamase pour la sélection et l'amplification du plasmide dans des bactéries. 3. Méthodologie pour l'établissement de lignées de cellules CHO stables, exprimant la TPO332 et la TPO1s3 humaines recombi- nantes ~5 ~ a. Description de la lignée cellulaire parentale de CHO La lignée cellulaire h8te de CHO (ovaire de hamster chinois) utilisée pour l'expression des molécules de TPO décrites dans le présent mémoire répond à la dénomination CHO-DP12 (voir le brevet européen N 307 247 mis à l'Inspec- tion Publique le 15 mars 1989). Cette lignée cellulaire de mammifère a été choisie par clonage à partir d'une transfec- tion de la lignée parentale (CHO-K1 DUX-Bll(DHFR-) acquise auprès du Docteur Franck Lee de Stanford University avec l'autorisation du Dr. L. Chasin), avec un vecteur exprimant la prépro-insuline pour obtenir des clones ayant des besoins réduits en insuline. Ces cellules sont aussi des cellules DHFR moins et des clones peuvent être choisis pour la présence de séquences vecteurs d'ADNc de DHFR par croissance sur un milieu dépourvu de suppléments nucléosidiques (glyci- ne, hypoxanthine et thymidine). Ce système de sélection de lignées cellulaires CHO donnant une expression stable est couramment utilisé. b. Méthode de transfection (électroporation) Des lignées cellulaires d'expression de TPO332 et TPOIs3 ont été générées par transfection de cellules DP12 par électroporation (voir, par exemple G.L. Andreason, J. Tiss. Cult. Meth., 15, 56 (1993]) avec, respectivement, les plasmides pSVI5.ID.LL.MLORF ou pSVl5.ID.LL.MLEPO-D linéari- sés. Trois (3) mélanges réactionnels d'enzymes de restriction ont été établis pour chaque coupure de plasmide : 10 jg, 25 gg et 50 pg du vecteur avec l'enzyme NOTI par des méthodes classiques de biologie moléculaire. Ce site de restriction ne se trouve qu'une seule fois dans le vecteur dans la région de linéarisation 3' et en dehors des unités de transcription du ligand TPO (voir figure 23). Les mélanges réactionnels de 100 M1 ont été maintenus en incubation pendant une nuit à 37 C. Le lendemain, les mélanges ont été extraits une fois avec un mélange phénol-chloroforme-alcool isoamylique (50:49:1) et précipités à l'éthanol sur de la neige carboni- que pendant environ 1 heure. Le précipité a ensuite été recueilli par microcentrifugation pendant 15 minutes, et séché. L'ADN linéarisé a été remis en suspension dans 50 M1 de milieu DMEM-F12 de Ham à 1:1 contenant en supplément des antibiotiques classiques et 2 mM de glutamine. Les cellules DP12 se développant dans la suspen- sion ont été recueillies, lavées une fois dans le milieu décrit pour la remise en suspension de l'ADN et finalement remises en suspension dans le même milieu à une concentration de 107 cellules par 750 t1. Des portions aliquotes de cellules (750 l1) et chaque mélange d'ADN linéarisé ont été maintenus enincubation ensemble à la température ambiante pendant 1 heure puis tranférés dans une chambre d'électropo- ration BRL. Chaque mélange réactionnel a ensuite été exposé à l'électroporation dans un appareil d'électroporation BRL classique à 350 volts, réglé à 350 gF et à une faible capacitance. Après l'électroporation, on a laissé les cellules se sédimenter dans l'appareil pendant 5 minutes puis sur de la glace pendant une autre période d'incubation de 10 minutes. Les cellules ayant subi l'électroporation ont été transférées dans des boites de 60 mm pour culture de cel- lules, contenant 5 ml de milieu normalisé de culture complète pour cellules CHO (DMEM-F12 50:50 à haute teneur en glucose sans glycine, contenant en supplément du GHT 1X, 2 mM de glutamine et 5 % de sérum de foetus de veau) et elles ont été cultivées pendant une nuit dans un incubateur pour culture de cellules en présence de 5 % de CO. c. Méthode de sélection et de triage Le lendemain, les cellules ont été trypsinées hors des plaques par des méthodes classiques et transférées dans des boites de 150 mm pour culture de tissu contenant du milieu sélectif DHFR (milieu DMEM-F12 de Ham, à 1:1, décrit ci-dessus, contenant en supplément 2 % ou 5 % de sérum de foetus de veau dialysé mais dépourvu de glycine, d'hypoxan- hine et de thymidine, constituant le milieu de sélection DHFR normal que la Demanderesse a utilisé). Les cellules provenant de chaque boite de 60 mm ont ensuite été repiquées dans 5 boîtes de 150 mm. Ensuite, on a fait incuber les cellules pendant 10 à 15 jours (avec un changement de milieu) 10 à 37"C/5 % de CO2 jusqu'à ce que des clones commencent à araître et aient atteint des tailles permettant le transfert aux plaques à 96 alvéoles. Sur une période de 4 à 5 jours, on a transféré les lignées cellulaires à des plaques à 96 alvéoles en utilisant des pointes stériles de couleur jaune adaptées à un "pipettman" réglé à 50 ml. On a laissé les cellules se développer jusqu'à confluence (habituellement 3 à 5 jours) puis on a trypsiné les plateaux et on a repro- duit deux copies du plateau originel. Deux de ces copies ont été conservées à court terme au congélateur, avec dilution des cellules de chaque alvéole dans 50 g1 de sérum de foetus de veau à 10 % dans du DMSO. Les échantillons de milieu dépourvu de sérum conditionnés pendant 5 jours ont été titrés à partir des alvéoles confluents dans le troisième plateau pour l'expression de TPO par la méthode d'essai d'activité basée sur les cellules Ba/F. Les clones d'expression maximale sur la base de cet essai ont été ranimés après le stockage et amplifiés en deux nappes en T confluentes de 150 mm en vue du transfert au groupe de culture de cellules pour l'adaptation de la suspension, un nouveau titrage et l'établissement d'une banque. d. Protocole d'amplification Plusieurs lignées cellulaires du plus haut titre provenant de la sélection décrite ci-dessus ont ensuite été soumises à un régime classique d'amplification au métho- trexate pour générer des clones de titre élevé. Des clones de cellules de CHO sont développés et ensemencés dans des boîtes de 10 cm à 4 concentrations en méthotrexate (à savoir 50 nM, 100 nM, 200 nM et 400 nM), à deux ou trois nombres de cellules (10s, 5 x lOs et 10'6 cellules par botte). On fait ensuite incuber ces cultures à 37 degrés/5 % de CO2 jusqu'à ce que les clones se soient établis et soient prêts à être transférés dans des boites à 96 alvéoles pour la suite de l'essai. Plusieurs clones à haut titre venant de cette sélection ont été de nouveau soumis à de plus fortes concentrations de méthotrexate (à savoir 600 nM, 800 nM, 1000 nM et 1200 nM), et, comme précédemment, on a laissé des clones résistants s'établir puis on les a transférés dans des bottes à 96 alvéoles et on les a titrés. 4. Culture de lignées cellulaires CHO stables exprimant la TPO332 et la TPO1s3 humaines recombinantes Les cellules en banque sont décongelées et la population de cellules est amplifiée par des méthodes classiques de croissance des cellules dans un milieu dépourvu de sérum ou dans un milieu contenant du sérum. Après amplifi- cation jusqu'à une densité cellulaire suffisante, les cellules sont lavées pour éliminer le milieu de culture cellulaire usé. Les cellules sont ensuite cultivées par toute méthode classique comprenant la culture discontinue, semi- continue ou continue à 25-40 C, à pH neutre, avec une teneur en 02 dissous d'au moins 5 % jusqu'à ce que la TPO constituée par sécrétion se soit accumulée. Le liquide de la culture de cellules est ensuite séparé des cellules par des moyens mécaniques tels que centrifugation. 5. Purification de la TPO humaine recombinante à partir de liquides de culture de cellules CHO Le liquide de culture de cellules récolté (HCCF) est directement chargé sur une colonne Blue Sepharose 6 à écoulement rapide (Pharmacia) équilibrée dans du phosphate de sodium 0,01 M à pH 7,4 contenant 0,15 M de NaCl dans un rapport d'environ 100 ml de HCCF par litre de résine et à une vitesse d'écoulement linéaire d'environ 300 ml/h/cm2. La colonne est ensuite lavée avec 3 à 5 fois son volume de tampon d'équilibrage puis 3 à 5 fois son volume de phosphate de sodium 0,01 M à pH 7,4 contenant 2,0 M d'urée. La TPO est ensuite éluée avec 3 à 5 volumes de colonne de phosphate de sodium 0,01 M à pH 7,4 contenant 2,0 M d'urée et 1,0 M de NaCl. Le liquide rassemblé de la colonne de Blue Sepharose contenant la TPO est ensuite chargé sur une colonne de Sepharose 6 MB contenant de la lectine de germe de blé (Pharmacia), équilibrée dans du phosphate de sodium 0,01 M à pH 7,4 contenant 2,0 M d'urée et 1,0 M de NaCl dans un rapport de 8 à 16 ml de liquide élué de Blue Sepharose par ml de résine à une vitesse d'écoulement d'environ 50 ml/h/cm'. La colonne est ensuite lavée avec 2 à 3 fois son volume de tampon d'équilibrage. La TPO est ensuite éluée avec 2 à 5 volumes de colonne de phosphate de sodium 0,01 M à pH 7,4 contenant 2,0 M d'urée et 0,5 M de N-acétyl-D-glucosamine. Le liquide rassemblé de la colonne contenant la lectine de germe de blé est ensuite ajusté à une concentra- tion finale de 0,04 % de C12E, et 0,1 % d'acide trifluoracétique (TFA). Le liquide résultant est chargé sur une colonne C4 à phase inversée (Vydac 214TP1022) équilibrée dans une solution à 0,1 % de TFA et 0,04 % de C12, à une charge d'environ 0,2 à 0,5 mg de protéine par ml de résine à une vitesse d'écoulement de 157 ml/h/cm'. La protéine est éluée dans un gradient linéaire à deux phases d'acétonitrile contenant 0,1 % de TFA et 0,04 % de C12E*. La première phase est composée d'un gradient linéaire allant de 0 à 30 % d'acétonitrile en 15 minutes. La seconde phase est composée d'un gradient linéaire allant de 30 à 60 % d'acétonitrile en 60 minutes. La TPO est éluée pour environ 50 % d'acétonitrile. On rassemble le liquide sur la base de l'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide. Le liquide rassemblé sur C4 est ensuite dilué avec 2 volumes de phosphate de sodium 0,01 M à pH 7,4 additionné de 0,15 M de NaCl et diafiltré contre environ 6 volumes de phosphate de sodium 0,01 M à pH 7,4 additionné e 0,15 M de NaCl sur une membrane d'ultrafiltration Amicon YM ou similaire ayant des limites d'exclusion de poids moléculaire de 10 000 à 30 000 daltons. Le diafiltrat résultant peut ensuite être traité directement ou encore concentré par ultrafiltration. Le diafiltrat/concentré est ajusté à une concentration finale de 0,01 % de Tween-80. La totalité ou une portion du diafiltrat/concen- tré équivalant à 2-5 % du volume de colonne calculé est ensuite chargée sur une colonne Sephacryl S-300 HR (Pharma- cia) équilibrée dans du phosphate de sodium 0,01 M à pH 7,4 15 contenant 0,15 M de NaC1 et 0,01 % de Tween-80 et chromato- phiée à une vitesse d'écoulement d'environ 17 ml/h/cm2. Les fractions contenant la TPO qui sont dépourvues d'agrégat et de produits de dégradation protéolytique sont rassemblées sur la base de l'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide. Le liquide rassemblé résultant est filtré sur un filtre Millex-GV ou similaire de 0,22 pm et conservé à 2-8oC. EXWMPLE 21 Transformation et induction de la synthèse de la protéine TPO dans . coli 1. Construction des vecteurs d'expression de TPO de E. coli Les plasmides pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 et pMP202 sont tous conçus pour exprimer les 125 premiers aminoacides de TPO en aval d'un leader de petite dimension qui varie entre les différents produits d'assemblage. Les leaders offrent principalement un haut niveau d'initiation de traduction et une purification rapide. Les plasmides pMP210- 1, -T8, -21, -22, -24, -25 sont conçus pour exprimer les 153 premiers aminoacides de TPO en aval d'une méthionine d'ini- tiation et ne diffèrent que par l'utilisation des codons pour les 6 premiers aminoacides de la TPO, tandis que le plasmide pMP251 est un dérivé du plasmide pMP210-1 dans lequel l'extrémité carboxy-terminale de la TPO est prolongée de deux aminoacides. Tous les plasmides indiqués ci-dessus produisent de hauts niveaux d'expression intracellulaire de TPO dans E. coli lors de l'induction du promoteur tryptophane (D.G. Yansura et al., Methods in Enzymology (publiés sous la direc- tion de D.V. Goeddel) 185:54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Les plasmides pMP1 et pMP172 sont des intermédiaires dans la construction des plasmides d'expression intracellu- laire de TPO ci-dessus. (a) Plasmide mMP1 Le plasmide pMP1 est un vecteur de sécrétion pour les 155 premiers aminoacides de TPO, et il a été construit par liaison de 5 fragments d'ADN ensemble comme représenté sur la figure 33. Le premier de ces fragments était le vecteur pPho21 dans lequel le petit fragment Mlul-BamHI avait été enlevé. Le vecteur pPho21 est un dérivé de phGH1 (C.N. Chang et al., Gene 55:189-196 [1987]) dans lequel le gène de l'hormone de croissance humaine a été remplacé par le gène phoA de E. coli, et le site de restriction Mlul a été incorporé par manipulation dans la séquence codante pour la séquence signal STII au niveau des aminoacides 20-21. Les deux fragments suivants, un morceau d'ADN Hinfl-PstI de 258 paires de bases provenant de pRKS-hmpl I (Exemple 9) codant les aminoacides 19-103 de la TPO, et l'ADN synthétique suivant codant les aminoacides 1-18 5-CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCT'CG TG ATACGGTCGGGCGA A GAACACTGGAGGCTCAGGAGTCA GAGAAGC ACTGA-5' (SEQ ID NO: 69) (SEQ ID NO: 70) ont été préalablement soudés avec l'ADN-ligase T4 et le second a été coupé avec PstI. Le quatrième était un fragment PstI-HaeIII de 152 paires de bases provenant de pRK5hmpII codant les aminoacides 104-155 de la TPO. Le dernier était un fragment StuI-BamHI de 412 paires de bases venant de pdh1O8, contenant le lambda relatif au terminateur de transcription comme déjà décrit (S. Scholtissek et al., NAR 15:3185 [1987]) (b) Plasmide pMP21 Le plasmide pMP21 est conçu pour exprimer les 115 premiers aminoacides de la TPO à l'aide d'une séquence leader de 13 aminoacides comprenant une partie de la séquence signal STII. Il a été construit par ligation de trois (3) fragments d'ADN ensemble comme représenté sur la figure 34, le premier de ces fragments étant le vecteur pVEG31 dans lequel le court fragment XbaI-SphI avait été enlevé. Le vecteur pVEG31 est un dérivé de pHGH207-1 (H.A. de Boer et al., dans Promoter Structure and Function (publié sous la direction de R.L. Rodriguez et M.J. Chamberlain), 462, Praeger, New York [1982]), dans lequel le gène de l'hormone de croissance humaine avait été remplacé par le gêne du facteur de crois- sance endothélial vasculaire (ce fragment vecteur identique peut être obtenu à partir de ce dernier plasmide). La seconde partie de la ligation a été un duplex d'ADN synthétique avec la séquence suivante : 5-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATI,,'CTTCTTAA TTAATACTTT'CTTATAGGAAAGAAGAATTGCGC-5 (SEQ ID NO: 71) (SEO ID NO: 72) Le dernier morceau était un fragment MluI-SphI de 1072 paires de bases dérivé de pMP1 codant 155 aminoacides de la TPO. (c) Plasmide pMP151 Le plasmide pMP151 est conçu pour exprimer les 155 premiers aminoacides de la TPO en aval d'une séquence leader comprenant 7 aminoacides de la séquence signal STII, 8 histidines, et un site de clivage du facteur Xa. Comme représenté sur la figure 35, le plasmide pMP151 a été construit par ligation de trois fragments d'ADN ensemble, le premier de ces fragments étant le vecteur pVEG31 déjà décrit duquel le petit fragment XbaI-SphI avait été éliminé. Le second était un duplex d'ADN synthétique ayant la séquence suivante : SCTAGAMTTATGAAAAAGAATATCGCAM-CATCACCATCACCATCACCATCACATCGAAG GTCGTAGCC TrAATATIiTiiCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGTAGTGTAGTGTAGCTTC CAGCAT-5' (SEO ID NO: 73) (SEQ ID NO: 74) Le dernier était un fragment BgII-SphI de 1064 paires de bases dérivé de PMP11 codant 154 aminoacides de la TPO. Le plasmide pMP11 est identique au plasmide pMPl à l'exception de quelques modifications des codons dans la séquence signal STII (ce fragment peut être obtenu à partir de pMPl). d) Plasmide pMP202 Le plasmide pMP202 est très semblable au vecteur d'expression pMP151 excepté que le site de clivage du facteur Xa dans la séquence leader a été remplacé par un site de clivage de la thrombine. Comme représenté sur la figure 36, le plasmide pMP202 a été construit par ligation de trois fragments d'ADN ensemble. Le premier de ces fragments était le pVEG31 déjà décrit dans lequel le court fragment XbaI-SphI avait été enlevé. Le second était un duplex d'ADN synthétique présentant la séquence suivante : 5.-CTAGAATTATGAAAMAAGAATATCGCATTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAA CCACGTAGCC TrAATACr ICIATrAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTA"TGGTAGTGTAGCTT GGTGCAT-5' (SEO ID NO: 75) (SEQ ID NO: 76) Le dernier morceau était un fragment BgII-SphI de 1064 paires de bases dérivé du plasmide pMP11 décrit précédemment. (e) Plasmide pMP172 Le plasmide pMP172 est un vecteur de sécrétion pour les 153 premiers aminoacides de la TPO, et est un intermédiaire pour la construction de pMP210. Comme repré- senté sur la figure 37, le plasmide pMP172 a été préparé par ligation de trois fragments d'ADN ensemble, dont le premier était le vecteur pLS32IamB dont la petite section EcoRIHindIII avait été enlevée. Le second était un fragment EcoRI- HgaI de 946 paires de bases dérivé du plasmide pMP11 précé- demment décrit. Le dernier morceau était un duplex d'ADN synthétique ayant la séquence suivante : 5'-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (SEQ ID NO: 77) GGAGACGCAGTCCATCGA-5' (SEQ ID NO: 78) (f) Plasmide pMP210 Le plasmide pMP210 est conçu pour exprimer les 153 premiers aminoacides de la TPO après une méthionine d'initiation par traduction. Ce plasmide a été conçu en réalité comme banque de plasmides dans laquelle les six premiers codons de TPO avaient été randomisés dans la troisième position de chaque codon, et il a été construit de la manière représentée sur la figure 38 par ligation de trois fragments d'ADN. Le premier de ces fragments était le vecteur PVEG31 déjà décrit dans lequel le court fragment XbaI-SphI avait été enlevé. Le second était un duplex d'ADN synthétique représenté ci-dessous, traité d'abord avec l'ADN polymérase I (Klenow) puis par digestion avec les enzymes XbaI et HinfI, et codant la méthionine d'initiation et les 6 premiers codons randomisés de TPO. 5' GCAGCAGT-CTAGAA1TATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA GTTCTCAGTAAA (SEQ ID NO: 79) CAAGAGTCATITGACGAAGCACTGAGGGTACAGGmG-S (SEQ ID NO: 80) Le troisième était un fragment HinfI-SphI de 890 paires de bases dérivé de pMP172 codant les aminoacides 19-i53 de la TPO. La banque de plasmides pMP210 d'environ 3700 clo- nes a été retransformée sur des plaques LB à haute teneur en tétracycline (50 pg/ml) pour sélectionner des clones de haute initiation de traduction (D.G. Yansura et al., Methods : A Companion to Methods in Enzymology 4 : 151-158 [1992]). Sur les 8 colonies qui sont apparues sur les plaques à haute teneur en tétracycline, cinq des meilleures en termes d'expression de la TPO ont été soumises à un séquençage d'ADN et les résultats sont représentés sur la figure 39 (SEQ ID N 23, 24, 25, 26, 27 et 28). (g) Plasmide pMP41 Le plasmide pMP41 est conçu pour exprimer les 155 premiers aminoacides de la TPO fusionnés à une séquence leader constituée de 7 aminoacides de la séquence signal STII suivie d'un site de clivage du facteur Xa. Le plasmide a été construit comme représenté sur la figure 40 par ligation de trois morceaux d'ADN ensemble, dont le premier était le vecteur pVEG31 précédemment décrit dans lequel le court fragment XbaI-SphI avait été enlevé. Le second était le duplex d'ADN synthétique suivant : 5'-.CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC (SEOID NO:81) TTAATACTmCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-' (SEO IDNO:82) Le dernier morceau de la ligation était le fragment BgII-SphI de 1064 paires de bases dérivé du plasmide pMP11 décrit ci- dessus. (h) Plasmide pMP57 Le plasmide pMP57 exprime les 155 premiers aminoacides de la TPO en aval d'une séquence leader consti- tuée de 9 aminoacides de la séquence signal STII et le site dibasique Lys-Arg. Ce site dibasique offre un moyen d'enlève- ment de la séquence leader avec la protéase ArgC. Ce plasmide a été construit comme représenté sur la figure 41 par ligation de trois morceaux d'ADN ensemble. Le premier de ces morceaux était le vecteur pVEG31 décrit précédemment dans lequel le petit fragment XbaI-SphI avait été enlevé. Le second était le duplex d'ADN synthétique suivant : 5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCAIICTTCTTAAACGTAGCC (SEQ ID NO: 83) TTAATAC1TrTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5 (SEO ID NO: 84) La dernière partie de la ligation était le fragment BgII-SphI de 1064 paires de bases dérivé du plasmide pMPl1 décrit ci- dessus : (i) Plasmide pMP251 Le plasmide pMP251 est un dérivé de pMP210-1 dans lequel deux autres aminoacides de la TPO sont inclus à l'extrémité carboxy-terminale. Comme représenté sur la figure 42, ce plasmide a été construit par ligation de deux morceaux d'ADN ensemble, le premier d'entre eux étant le pMP21 précédemment décrit dans lequel le petit fragment XbaI-ApaI avait été enlevé. La seconde partie de la ligation était un fragment XbaI-ApaI de 316 paires de bases dérivé de pMP210-1. 2. Transformation et induction de E. coli avec des vecteurs d'expression de TPO Les plasmides d'expression de TPO ci-dessus ont été utilisés pour transformer la souche de E. coli 44C6 (w3110 tonAl rpoHt, long clpP, GalE) au moyen du procédé de choc thermique au CaCl2 (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53:159-162 [1970]). Les cellules transformées ont été 15 développées tout d'abord à 37 C dans le milieu LB contenant 50 gg/ml de carbénicilline jusqu'à ce que la densité optique (600 nm) de la culture ait atteint environ 2-3. La culture LB a ensuite été diluée 20 fois dans du milieu M9 contenant 0,49 % de casamino-acides (en poids/volume) et 50 pg/ml de 20 carbénicilline. Après croissance avec aération à 30 C pendant 1 heure, on a ajouté de l'acide indole-3-acrylique à une concentration finale de 50 jg/ml. On a ensuite laissé la culture se poursuivre à 30 C avec aération pendant encore heures et à ce moment, les cellules ont été recueillies 25 par centrifugation. EIMP>LE 22 Production de TPO biologiqument actif (Met'1-153) dans B. colu Les modes opératoires indiqués ci-dessous pour la production de TPO replié biologiquement actif (met-' 1-153) peuvent être appliqués par analogie à l'isolement d'autres variants de TPO comprenant les formes à extension N-terminale et C-terminale (voir Exemple 23). A. Isolement de TPO non soluble (Met' 1-153) Des cellules de E. coli exprimant la TPO (Met-' 1-153) codée par le plasmide pMP210-1 sont soumises à la fermentation comme décrit ci-dessus. Normalement, environ 100 g de cellules sont remises en suspension dans 1 litre (10 S volumes) de tampon de rupture de cellules (10 mM de Tris, 5 mM d'EDTA, pH 8) avec un homogénéiseur Polytron et les cellules sont centrifugées à 5000 x g pendant 30 minutes. Le culot cellulaire lavé est remis en suspension dans 1 litre de tampon de rupture de cellules avec l'homogénéiseur Polytron, et on fait passer la suspension de cellules à travers un appareil de rupture de cellules LH (LH Inceltech, Inc.) ou à travers un microfluidiseur (Microfluidics International) conformément aux instructions des fabricants. On centrifuge la suspension à 5000 x g pendant 30 min et on remet les cellules en suspension, et on centrifuge une seconde fois la suspension pour obtenir un culot de corps réfringents lavés. Le culot lavé est utilisé immédiatement ou conservé à l'état congelé à -700C. B. Solubilisation et purification de TPO monomérique (Met' 1-153) Le culot obtenu ci-dessus est remis en suspension dans 5 volumes en poids de tampon Tris 20 mM à pH 8 addi- tionné de 6-8 M de guanidine et de 25 mM de DTT (dithiothréi- tol) et la suspension est agitée pendant 1-3 h ou pendant une nuit à 40C afin d'effectuer la solubilisation de la protéine TPO. De fortes concentrations en urée (6-8 M) sont aussi utiles mais donnent généralement de plus faibles rendements comparativement à la guanidine. Après solubilisation, la solution est centrifugée à 30 000 x g pendant 30 min en produisant un liquide surnageant clair contenant la protéine TPO monomérique dénaturée. Le liquide surnageant est ensuite chromatographié sur colonne de filtration sur gel Superdex 200 (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) à une vitesse d'écoulement de 2 ml/min et la protéine est éluée avec du phosphate de sodium 20 mM à pH 6,0, avec 10 mM de DTT. On rassemble les fractions contenant la protéine TPO monomérique dénaturée éluée entre 160 et 200 ml. La protéine TPO est encore purifiée sur une colonne à phase inversée C4 semi-préparative (VYDAC 2 x 20 cm). L'échantillon est chargé à la vitesse de 5 ml/min sur une colonne équilibrée dans du TFA (acide trifluoracétique) à 0,1 % avec 30 % d'acétonitrile. La protéine est éluée avec un gradient linéaire d'acétonitrile (30-60 % en 60 min). La protéine réduite purifiée est éluée à environ 50 % d'acéto- nitrile. Cette matière est utilisée pour le repliement en vue d'obtenir un variant de TPO biologiquement actif. C. Production de TPO biologiquement active (Met-' 1-153) On dilue environ 20 mg de protéine TPO monoméri- que, réduite et dénaturée dans 40 ml de TFA à 0,1 % dans 50 % d'acétonitrile dans 360 ml de tampon de repliement contenant dans les conditions optimales les réactifs suivants : 50 mM de Tris 0,3 M de NaCl 5 mM d'EDTA 2 a de détergent CHAPS 25 % de glycérol 5 mM de glutathion oxydé 1 mM de glutathion réduit pH ajusté à 8,3 Après mélange, le tampon de repliement est modérément agité à 4 C pendant 12-48 h afin d'obtenir les rendements maximaux de repliement de la forme correcte de TPO liée au disulfure (voir ci-dessous). La solution est ensuite acidifiée à l'acide trifluoracétique jusqu'à une concentra- tion finale de 0,2 %, filtrée sur filtre de 0,45 ou de 0,22 Am et 1/10 du volume d'acétonitrile est ajouté. Cette solution est ensuite envoyée directement par pompage sur une colonne C4 à phase inversée et la TPO repliée purifiée (Met' 1-153) est éluée avec le même programme de gradient que ci-dessus. La TPO repliée biologiquement active est éluée à environ 45 % d'acétonitrile dans ces conditions. Les versions non convenables de TPO liées au disulfure sont éluées plus tôt. La TPO purifiée finale (Met-' 1-153) a une pureté de plus de 95 % comme déterminé par chromatographie sur gel de dodécylsulfate de sodium et chromatographie analytique C4 à hase inversée. Pour des études sur les animaux, la matière purifiée sur colonne C4 a été dialysée dans des tampons physiologiquement compatibles. Des tampons isotoniques (10 mM d'acétate de sodium, pH 5,5, 10 mM de succinate de sodium, pH 5,5 ou 10 mM de phosphate de sodium, pH 7,4) contenant 150 mM de NaCl et 0,01 i de Tween 80 ont été utilisés. En raison de cette haute activité de la TPO dans l'essai Ba/F3 (une stimulation semi-maximale est atteinte à environ 3 pg/ml), il est possible d'obtenir la matière biologiquement active en utilisant de nombreuses conditions différentes concernant le tampon, le détergent et l'oxydoréduction. Toutefois, dans la plupart des conditions, seule une petite quantité de matière convenablement pliée ( CHAPS (CHAPS et CHAPSO) s'est montrée généralement utile dans la réaction de repliement pour limiter l'agrégation de protéines et la formation incorrecte de disulfure. Des proportions de CHAPS supérieures à 1 % ont été très utiles. Du chlorure de sodium a été nécessaire pour obtenir les meilleurs rendements, des concentrations optimales se situant entre 0,1 et 0,5 M. La présence d'EDTA (1-5 mM) a limité le degré d'oxydation (et d'agrégation) catalysée par un métal qui a été observé avec certaines préparations. Des concentra- tions en glycérol de plus de 15 % ont produit les conditions optimales de repliement. Pour les rendements maximaux, il a été essentiel de disposer en même temps de glutathion oxydé et réduit ou de cystéine oxydée et réduite comme paire de réactifs d'oxydo-réduction. Généralement, de plus hauts endements ont été observés lorsque le rapport molaire du réactif oxydé était égal ou supérieur au membre réactif réduit de la paire d'oxydo-réduction. Des valeurs de pH comprises entre 7,5 et environ 9 ont été optimales pour le repliement de ces variants de TPO. Des solvants organiques (par exemple éthanol, acétonitrile, méthanol) ont été tolérés à des concentrations de 10-15 % ou moins. De plus fortes concentrations en solvants organiques ont accru la quantité de formes incorrectement pliées. On a généralement utilisé un tampon Tris et un tampon au phosphate. Une incubation à 4 C a également produit de plus fortes proportions de TPO correctement pliée. Des rendements de repliement de 40-60 % (sur la base de la quantité de TPO réduite et dénaturée utilisée dans la réaction de repliement) sont représentatifs de prépara- tions de TPO qui ont été purifiées par la première étape C4. De la matière active peut être obtenue avec des préparations moins pures (par exemple immédiatement après la colonne Superdex 200 ou après l'extraction initiale de corps réfrin- gents), bien que les rendements soient inférieurs en raison de la précipitation et de l'interférence de grande envergure protéines non-TPO pendant le processus de repliement de TPO. Etant donné que la TPO (Met' 1-153) contient 4 résidus de cystéine, il est possible de générer trois versions disulfurées différentes de cette protéine : version 1 : disulfures entre les résidus de cystéine 1-4 et 2-3 version 2 : disulfures entre les résidus de cystéine 1-2 et 3-4 version 3 : disulfures entre les résidus de cystéine 1-3 et 2-4. Pendant l'exploration initiale dans la détermina- tion des conditions de repliement, plusieurs pics différents contenant la protéine TPO ont été séparés par chromatographie C4 à phase inversée. Un seul de ces pics a eu une activité iologique importante comme déterminé en utilisant l'essai Ba/F3. Ensuite, les conditions de repliement ont été optimi- sées afin d'obtenir préférentiellement cette version. Dans ces conditions, lesversions mal pliées représentent moins de 10-20 % du total de la TPO monomère obtenue. Le motif disulfure pour la TPO biologiquement active a été localisé par spectrométrie de masse et par séquençage des protéines à 1-4 et 2-3 (c'est-à-dire la version 1). Des portions aliquotes des divers pics résolus sur C4 (5-10 nmoles) ont été soumises à une digestion à la trypsine (rapport molaire de la trypsine à la protéine, 1:25). Le mélange après digestion a été analysé par spectro- scopie de masse par désorption laser assistée par matrice avant et après réduction avec le dithiothréitol (DTT). Après réduction, les masses correspondant à la plupart des plus grands peptides tryptiques de TPO ont été détectées. Dans les échantillons non réduits, certaines de ces masses étaient manquantes et des masses nouvelles ont été observées. La masse des pics nouveaux correspondait fondamentalement à la somme des peptides trypsiques individuels impliqués dans la paire de disulfures. Il a donc été possible d'attribuer de façon univoque le motif disulfure de la TPO biologiquement active recombinante repliée à la forme 1-4 et 2-3. Cela concorde avec le motif disulfure connu de l'érythropolétine qui est une molécule apparentée. D. Activité biologique de la TPO repliée recombinante (met 1-153) La TPO repliée et purifiée (Met' 1-153) est douée d'activité dans des essais tant in vitro qu'in vivo. Dans l'essai sur Ba/F3, une stimulation semi-maximale de l'incor- poration de thymidine aux cellules Ba/F3 a été obtenue à la concentration de 3,3 pg/ml (0,3 pM). Chez des animaux normaux et myélosupprimés, produits par irradiation X subléthale, la TPO (Met' 1-153) a stimulé avec une grande puissance (l'acti- vité a été observée à des doses s'abaissant à 30 ng/souris) la production de nouvelles plaquettes. EXEMPLE 23 Production d'autres variants de TPO biologiquement actifs dans E. coli Trois variants différents de TPO produits dans E. coli, purifiés et repliés en formes biologiquement actives, sont présentés ci-dessous. (1) MLF - 13 résidus de la séquence signal STII d'origine bactérienne sont soudés au domaine N-terminal de la TPO (résidus 1-155). La séquence résultante est MKKNIAFLLNAYASPAPPAC---.CVRRA (SEQ ID NO: 85) o la séquence leader est soulignée et C ....C représente la séquence Cys' à Cysls51. Ce variant a été construit pour créer une tyrosine pour la radio-iodation de TPO en vue d'études de récepteurs et d'études biologiques. (2) H8MLF - 7 résidus provenant de la séquence STII, 8 résidus d'histidine et la séquence IEGR dé clivage enzymatique du Facteur Xa sont soudés au domaine N-terminal (résidus 1-155) de la TP0. La séquence est MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC .....CVRRA (SEQ ID NO: 86) o la séquence leader est soulignée et C .... C représente la séquence de Cys' à Cys'. Ce variant, une fois purifié et replié, peut être traité avec le Facteur enzymatique Xa qui effectue un clivage après le résidu d'arginine de la séquence IEGR en donnant un variant de TPO d'une longueur de 155 résidus avec la sérine comme aminoacide N-terminal naturel. (3) T-H8MLF - cette forme est préparée de la manière décrite ci-dessus pour le variant (2), excepté qu'une séquence IEPR sensible à la thrombine est soudée au domaine N-terminal de la TPO. La séquence résultante est MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC.--CVRRA (SEQ ID NO: 87) o la séquence leader est soulignée et C ....C représente la séquence Cys? à Cys'sl. Ce variant, après purification et repliement, peut être traité enzymatiquement avec la throm- bine pour engendrer un variant naturel N-terminal de TPO d'une longueur de 155 résidus. A. Isolement, solubilisation et purification de variants (1), (2) et (3) monomériques biologiquement actifs de TPO. Tous les variants ont été exprimés dans E. coli. La plupart des variants ont été trouvés dans des corps 15 réfringents, comme observé dans l'Exemple 22 pour la TPO t-' 1-153). Des méthodes identiques d'isolement, de solubilisation et de purification de variants monomériques de TPO ont été réalisées comme décrit dans l'Exemple 22. On a utilisé des conditions de repliement identiques à celles qui avaient été utilisées pour la TPO (Met' 1-153) avec des rendements globaux de 30-50 %. Après repliement, les variants de TPO ont été purifiés par chromatographie à phase inversée C4 dans du TFA à 0,1 % en utilisant un gradient d'acéto- nitrile comme décrit précédemment. Tous les variants de TPO (sous la forme non protéolysée) étaient doués d'activité biologique comme déterminé dans l'essai Ba/F3, avec des activités semi-maximales de 2-5 pM. B. Traitement protéolytique de variants (2) et (3) pour générer la TPO N-terminale authentique (1-155). Les variants de TPO (2) et (3) indiqués ci-dessus ont été conçus avec un peptide leader susceptible de clivage enzymatique avant le résidu normal d'aminoacide N-terminal de la TPO. Apres repliement et purification des variants (2) et (3) comme décrit ci-dessus, chacun a été soumis à une digestion avec l'enzyme approprié. Pour chaque variant, l'acétonitrile venant de l'étape à phase inversée C4 a été éliminé par passage d'un courant modéré d'azote sur la solution. Ensuite, les deux variants ont été traités avec le Facteur Xa ou la thrombine comme décrit dans ce qui suit. Pour le variant de TPO (2), du tampon Tris 1 M à pH 8 a été ajouté à la solution dépourvue d'acétonitrile jusqu'à une concentration finale de 50 mM et le pH a été ajusté à 8 si nécessaire. Du NaCl et du CaCl2 ont été ajoutés en proportions respectives de 0,1 M et de 2 mM. Le Facteur Xa (New England Biolabs) a été ajouté de manière à atteindre un rapport molaire approximatif de l'enzyme au variant de 1:25 à 1:100. On a fait incuber l'échantillon à la température ambiante pendant 1-2 heures pour obtenir le clivage maximal me déterminé par un changement dans la migration sur gels de dodécylsulfate de sodium représentant la perte de la séquence leader. Ensuite, le mélange réactionnel a été purifié par chromatographie à phase inversée C4 en utilisant le même gradient et les mêmes conditions que ce qui a été indiqué ci-dessus à propos de la purification de variants convenablement pliés. Le variant B non clivé a été séparé dans ces conditions du variant (2) clivé. Il a été montré que les aminoacides N-terminaux consistaient en SPAPP, ce qui indique que l'élimination de la séquence leader N-terminale avait réussi. Le facteur Xa a aussi engendré des degrés variables d'un clivage interne dans le domaine TPO ; le clivage a été observé après le résidu d'arginine dans la position NO 118, générant une autre séquence N-terminale de TTAHKDP.(SEQ ID NO : 88). Sur des gels de dodécylsulfate de sodium non réducteur, une bande unique à environ 17 000 daltons a été observée pour le variant clivé au Facteur Xa ; sur des gels réducteurs, deux bandes de poids moléculaires approximativement égaux à 12 000 et 5000 daltons sont apparues, en conformité avec le clivage au niveau de l'argi- nine 118. Cette observation a aussi confirmé que les deux parties de la molécule avaient été maintenues assemblées par une liaison disulfure entre les premier et quatrième résidus de cystéine, comme déduit des expériences de digestion par la trypsine décrites ci-dessus. Dans l'essai biologique Ba/F3, le variant de TPO purifié (1-155), après élimination de la séquence leader N-terminale et avec le clivage interne, a eu une activité maximale de 0,2 à 0,3 picomole. Le variant intact avec la séquence leader a eu une activité semi- maximale de 2-4 picomoles. Pour le variant (3), le tampon de digestion était constitué de Tris 50 mM à pH 8 contenant 2 % de CHAPS, 0,3 M de NaCl, 5 mM d'EDTA et de la thrombine humaine ou bovine (Calbiochem) dans un rapport en poids de l'enzyme à la protéine du variant TPO de 1:25 à 1:50. La digestion a été conduite à la température ambiante pendant 2-6 heures. La progression de la digestion a été déterminée sur des gels de dodécylsulfate de sodium comme décrit ci-dessus pour la réaction de clivage du Facteur Xa. En général, on a obtenu à ce moment plus de 90 % de clivage de la séquence leader. La TPO résultante a été purifiée sur des colonnes C4 à phase inversée comme décrit ci-dessus et on a trouvé qu'elle présentait l'extrémité N-terminale désirée, par séquençage des aminoacides. Seules de très faibles quantités (moins de 5 %) d'un clivage interne au niveau de la même liaison arginine-thréonine tel qu'observé avec le Facteur Xa ont été obtenues. La protéine TPO résultante avait une haute activité biologique avec des réponses semi-maximales dans l'essai Ba/F3 à une concentration en protéine de 0,2-0,4 picomole. Dans l'essai ELISA basé sur le récepteur mpl, cette protéine a eu une réponse semi-maximale pour une concentration en protéine purifiée de 2-4 ng/ml (concentration 120-240 picomolaire) tandis que le variant intact contenant la séquence leader a été moins puissant d'un facteur 5 à 10 dans les deux essais. Dans des études effectuées sur des animaux, la protéine clivée purifiée par CLHP a été dialysée dans des tampons acceptables du point de vue physiologique, avec 150 mM de NaCl, 0,01 % de Tween 80 et 10 mM de succinate de sodium à pH 5,5, ou 10 mM d'acétate de sodium, à pH 5,5, ou 10 mM de phosphate de sodium à pH 7,4. Par CLHP ou sur des gels de dodécylsulfate de sodium, la protéine purifiée s'est montrée stable pendant plusieurs semaines lorsqu'elle a été conservée à 4"C. Chez les souris normales et myilosupprimées, cette TPO purifiée présentant la séquence N-terminale authentique a été très active, stimulant la production de plaquettes à des doses s'abaissant à 30 ng/souris. EXMPLE 2A Ligand mpl synthétique Bien que le ligand mpl humain (hML) soit habi- tuellement préparé par des méthodes recombinantes, on peut aussi le synthétiser par ligation enzymatique de fragments synthétiques de peptides en utilisant les procédés décrits ci-dessus. La production synthétique de hML permet l'incorpo- ration d'aminoacides non naturels ou de fonctionnalités synthétiques tels que le polyéthylèneglycol. Auparavant, un mutant de la sérine protéase subtilisine BPN, à savoir la substiligase (S221C/P225A), a été manipulé afin d'obtenir la ligation efficace d'esters peptidiques en solution aqueuse (Abrahmsen et al., Biochem., 30:4151-4159 [1991]). Il vient d'être démontré que des peptides synthétiques pouvaient être enzymatiquement soudés d'une manière séquentielle pour produire les peptides et protéines à longue chaîne enzymati- quement actifs tels que la ribonucléase A (Jackson et al., Science, [1994]). Cette technologie, décrite de façon plus détaillée ci-dessous, a permis à la Demanderesse de synthéti- ser chimiquement de longues protéines qui ne pouvaient être obtenues antérieurement que par la technologie de l'ADN recombinant. Une stratégie générale pour la synthèse de hML1s3 avec utilisation de subtiligase est représentée sur le Schéma 1. En partant d'un peptide entièrement débarrassé de sa protection, correspondant au fragment C-terminal de la protéine, on ajoute un peptide ester protégé à l'extrémité N-terminale et activé à l'extrémité C-terminale en même temps que la subtiligase. Lorsque la réaction est achevée, le produit est isolé par CLHP à phase inversée et le groupe protecteur est éliminé de l'extrémité N-terminale. Le fragment de peptide suivant est soudé, débarrassé de la protection et le procédé est répété avec utilisation de peptides successifs jusqu'à ce que la protéine de longueur entière ait été obtenue. Le procédé est analogue à la méthodologie en phase solide dans laquelle un peptide à extrémité N-terminale protégée et à extrémité C-terminale activée est soudé à l'extrémité N-terminale du peptide précédent et la protéine est synthétisée dans une direction C-N. Toutefois, du fait que chaque couplage entraîne une addition de jusqu'à 50 résidus et que les produits sont isolés après chaque ligation, des protéines plus longues de grande pureté peuvent être synthétisées en des rendements raisonnables. Schéma 1. Stratégie de synthèse de hML avec utilisation de subtiligase R-NH-Peptide2-CO-R' + H2N-Peptide1-CO2 1) Subtiligase R-NH-Peptide2-CO-NH-Peptide1-C02 ; 2) Zn/CH3CO2H H2N-Peptide2-CO-NH-Peptidel -C02 1 3)Répéter 1 + 2 H2N-Peptide3-CO-NH-Peptide2-CO-NH-Peptide1 -C02 0 0~~ R- R= ko0 =NH NH2 ~~~~N 0 ~O (CH2)4 NH2 Sur la base des connaissances acquises concernant a spécificité de séquence de la subtiligase ainsi que de la séquence d'aminoacides du "domaine epo" biologiquement actif de hML, la Demanderesse a divisé hMLs53 en sept fragments d'une longueur de 18 à 25 résidus. Des tétrapeptides de ligation expérimentale ont été synthétisés afin de déterminer les jonctions convenables de ligation pour le fragment 18-25 mère. Le Tableau 13 indique les résultats de ces ligations expérimentales. TABLEAU 13 Ligations expérimentales de hML. Des peptides donneurs et nucléophiles ont été dissous en proportion de 10 mM dans de la tricine 100 mM (pH 7,8) à 22 C. De la ligase a été ajoutée à une concentration finale de 10 pM à partir d'une solution mère à 1,6 mg/ml (environ 70 MM) et on a laissé la ligation s'effectuer pendant une nuit. Les rendements sont basés sur le pourcentage de ligation par rapport à l'hydrolyse des peptides donneurs. Site 1Donneur(glc-K-NH2) Nucélophile-NH2 |lldrolMe,.% Uzatior4z 1 (23/24) HVLH SRLS 92 08 (SEO ID NO: 89) (SEO ID NO: 90). (22123) SHVL HSRL 48 52 (SEQ ID NO: 91) (SEQ ID NO: 92) 2 (46/47) AVDF SLGE 22 78 (SEO ID NO 93) (SEO ID NO: 94) 3 (69/70) AVTL LLEG 53 47 (SEO .D _ NO: 95) (SEQ ID NO: 96) 4 (89/90) LSSL LGQL 95 0 5 (SEO ID NO: 97) (SEQ ID NO: 98) , (88/89) C(acm)LSS LLGQ 0 0 0 0 (SEC ID NO: 99) lSEQ ID NO: 100) (90/91) SSLL GQLS 45 55 (SEQ ID NO: 101) (SEQ ID NO: 102) _ ( 8 8/8 9) CLSS LLGQ 90 10 (SEQ ID NO: 103) (SEQ ID NO: 100) .. 5(107/108) LQSL LGTQ 99 01 (SEQ ID NO: 104) (SEQ ID NO: 105) (106/107) ALOS LLGT 70 30 (SEQ ID NO: 106) (SEQ ID NO 107) 6(128/129) NAIF LSFQ 60 40 (SEQ ID NO: 108) (SEO ID NO: 109) Sur la base de ces expériences, les peptides de ligation indiqués sur le Tableau 14 doivent être liés efficacement par la subtiligase. Un groupe protecteur convenable pour l'extrémité N-terminale de chaque peptide ester donneur a été nécessaire pour empêcher une auto- ligation. La Demanderesse a choisi un groupe protecteur isonicotinyle (iNOC) (Veber et al., J. Org. Chem., 42:3286- 3289 [1977]) en raison de sa solubilité dans l'eau. Il peut être incorporé dans la dernière étape de la synthèse de peptides en phase solide et il est stable au HF anhydre utilisé pour l'élimination de la protection et le clivage de peptides à partir d'une résine en phase solide. En outre, on peut l'éliminer du peptide après chaque ligation dans des conditions modérément réductrices (Zn/CH3CO2H) pour obtenir une extrémité N-terminale libre en vue de ligations ultérieu- res. Un ester du type glycolate-lysyl-amide (glc-K-NH2) a été utilisé pour l'activation C-terminale sur la base d'expérien- ces préalables qui ont montré que cet ester était efficace- ment acylé par la subtiligase (Abrahmsen et al., Biochem., 30:4151-4159 (1991]). Les peptides activés par un glc-K-amide et protégés par un groupe iNOC peuvent être synthétisés par des procédés classiques en phase solide comme représenté (Schéma 2). Les peptides sont ensuite soudés en' séquence jusqu'à ce que la protéine complète ait été produite, et le produit final est replié in vitro. Sur la base de l'homologie avec 1'EPO, on suppose que des paires de disulfures sont formées entre les résidus de cystéine 7 et 151 et entre 28 et 85. L'oxydation des disulfures peut être accomplie par simple agitation de la matière réduite sous une atmosphère d'oxygène pendant plusieurs heures. La matière repliée peut ensuite être purifiée par CLHP et les fractions contenant la protéine active peuvent être rassemblées et lyophilisées. En variante, des disulfures peuvent faire l'objet d'une protection différentielle afin d'influencer l'oxydation séquentielle entre des paires spécifiques de disulfures. La protection des cystéines 7 et 151 avec des groupes acétamidométhyle (acm) assurerait l'oxydation de 28 et 85. Les groupes acm pour- raient ensuite être éliminés et les résidus 7 et 151 seraient oxydés. Inversement, les résidus 28 et 85 pourraient être protégés par des groupes acm et oxydés au cas o une oxyda- tion séquentielle serait requise pour un repliement correct. A titre facultatif, les cystéines 28 et 85 peuvent être remplacées par un autre résidu naturel ou non naturel différent de Cys afin d'assurer l'oxydation correcte des cystéines 7 et 151. TABLEAU 14. Fragments peptidiques utilis&s pour la synthèse totale de h-ML en présence de subtiligase Fraciment Sicuence 1 (SEQ ID NO: 110) iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH2 (1-22) 2(SEQ ID NO: 111) iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH2 (23-46) 3 (SEQ ID NO: 112) iNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAODILG AVTL-glc-K-NH2 (47-69) 4 (SEQ ID NO: 113) iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH2 (70-90) 5 (SEQ ID NO: 114) iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH2 (90-106) 6 (SEQ ID NO: 115) iNOC-HN-LLGTOLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH2 (107-128) 7 (SEQ ID NO: 116) H2N.LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO2 (129-153) Les ligations de peptides sont effectuées à 250C dans de la tricine à 100 mM à pH 8 (fraîchement préparée et dégazée par filtration sous vide sur un filtre de 5 nm). Normalement, le fragment C-terminal est dissous dans un tampon (peptide 2-5 mM) et une solution mère 10x de subtili- gase (1 mg/ml dans de la tricine 100 mM, pH 8) est ajoutée de manière à porter la concentration finale en enzyme à environ 5 pM. Un excès 3-5 molaire du peptide donneur activé par glc-K-NH2 est ensuite ajouté sous la forme solide, dissous, et le mélange est laissé au repos à 25 C. Les ligations sont contrôlées par CLHP analytique à phase C18 inversée (gradient CH3CN/H20 avec 0,1 a de TFA). Les produits de ligation sont purifiés par CLHP préparative et lyophilisés. L'élimination du groupe isonicotinyle (iNOC) protecteur a été effectuée par agitation de zinc en poudre activé au HC1 avec le peptide protégé, dans de l'acide acétique. Le zinc en poudre est enlevé par filtration et l'acide acétique est évaporé sous vide. Le peptide résultant peut être utilisé directement dans la ligation suivante et le processus peut être répété. Du hMLs3 synthétique peut être soudé par des procédés analogues à ceux qui ont été décrits ci-dessus pour le hMIs4.332 syn- thétique ou recombinant afin de produire du hML synthétique ou semi-synthétique de longueur entière. Le hML synthétique offre de nombreux avantages par rapport au recombinant. Des chaines latérales non naturelles peuvent être introduites en vue d'améliorer la puissance ou la spécificité. Des fonctionnalités polymériques telles que du polyéthylèneglycol peuvent être incorporées pour améliorer la durée d'action. Par exemple, du poly- éthylèneglycol peut être attaché à des résidus de lysine des fragments individuels (Tableau 14) avant ou après qu'une ou plusieurs étapes de ligation ont été effectuées. Des liaisons peptidiques sensibles à la protéase peuvent être éliminées ou modifiées pour améliorer la stabilité in vivo. En outre, des dérivés d'atomes lourds peuvent être synthétisés pour faciliter la détermination de la structure. Schéma 2. Synthèse en phase solide de fragments peptidiques pour la ligation de segments 0 0 H~14Nb H2N XQ ~a Br O 1 2 B0C-NH N.NHk vE e , f(clivage) H2N '->1 0 R 0 4 0 0 0 O J, NH' (Peptide)",, NHr 0_-- Ng"' NH ~~N m5 0 R o (H2)4 i i NH2! Isonicotinyle (iNOC) glycolate-lysyl-amude (glc-K-NH2) a) De la résine de lysyl-paraméthylbenzhydrylamine (MBHA) 1 (0,63 méq/g, Advanced ChemTech) est agitée avec de l'acide bromacétique (5 équivalents) et du diisopropyl-carbodiimide (5 équivalents) pendant 1 heure à 25 C dans du diméthyl- acétamide (DMA) pour former le dérivé bromacétylique 2. b). La résine est abondamment lavée avec du DMA, et des aminoacides individuels protégés par le groupe Boc (3 équivalents, Bachem) sont estérifiés par agitation avec du bicarbonate de sodium (6 équivalents) dans du diméthylform- amide (DMF) pendant 24 h à 50 C pour produire la résine glycolate-phénylalanyl-amide 3 correspondante. La résine mino-acétylée 3 est lavée au DMF (3 fois) et au dichloromé- thane (CH2C12) (3 fois) et peut être conservée à la tempéra- ture ambiante pendant plusieurs mois. La résine 3 peut ensuite être chargée dans un synthétiseur automatique de peptides (Applied Biosystems 430A) et les peptides peuvent être allongés en utilisant les procédés classiques en phase solide (5). c) Le groupe N-a-Boc est éliminé avec une solution à 45 % d'acide trifluoracétique dans du CH2C12. d) Les aminoacides à protectin Boc suivants (5 équivalents) sont préactivés au moyen d'hexafluorophosphate de benzotriazole-1yl-oxy-tris-(diméthylamino)-phosphonium (BOP, 4 équivalents) et de la N-méthylmorpholine (NMM, 10 équivalents) dans du DMA et couplés pendant 1 à 2 heures. e) Le groupe N-a-Boc final est éliminé (TFA/CH2Cl2) en donnant la résine 4 et le groupe isonicotinyle (iNOC) protecteur est introduit comme décrit précédemment (4) sous agitation à l'aide de carbonate de 4isonicotinyl-2,4-dinitrophényle (3 équivalents) et de NMM (6 équivalents) dans du DMA à 25 C pendant 24 h. f) Un clivage et une élimination de la protection du peptide par traitement avec du HF anhydre (5 % d'anisole/5 % de sulfure d'éthylmé- thyle) à 0oc pendant 1 heure donnent le peptide 5 protégé par le groupe iNOC et activé au glycolate-lys-amide, qui est purifié par CLHP à phase inversée C18 (gradient CH3CN/H20, 0,1 % de TFA). L'identité de tous les substrats est confirmée par la spectrométrie de masse. I1 y a lieu de remarquer que la présente inven- tion peut être mise en oeuvre conformément à la description qui précède en accord avec les références et à l'aide de matières premières faciles à obtenir. Néanmoins, la Demande- resse a déposé auprès de l'American Type Culture Collection, Rockville, Md., Etats-Unis d'Amérique (ATCC) la lignée cellulaire indiquée ci-dessous : Escherichia coli, DH10B-pBSK - hmplI 1,8, N de référence ATCC CRL 69 575, déposé le 24 février 1994. Plasmide, pSV15.ID.LL.MLORF, NO de référence ATCC CRL , déposé le décembre 1994 ; et Cellules CHO DP-12 d'ovaire de hamster chinois, ML 1/50 MCB (N d'immatriculation 1594), NO de référence ATCC CRL 11 770, déposé le 6 décembre 1994. Ce dépôt a été effectué selon les dispositions du Traité de Budapest concernant la Reconnaissance Internatio- nale du Dépôt de Micro-organismes en vue des procédures de brevet et de la réglementation qui s'y rapporte (Budapest Treaty). Ces dispositions garantissent l'entretien d'une culture viable pendant 30 ans à compter de la date de dépôt. Les organismes sont disponibles auprès de 1'ATCC aux conditions établies par le Traité de Budapest, et leur obtention est assujettie à un accord entre les déposants et l'ATCC qui assure la disponibilité sous réserve après délivrance du brevet des Etats-Unis correspondant. La disponibilité de la souche déposée ne doit pas être interpré- tée comme une autorisation de mise en pratique de l'invention en contravention avec les droits accordés sous l'autorité de tout gouvernement en conformité avec ses lois sur les brevets d'invention. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent être apportées sans sortir de son cadre. Toutes les références citées dans le présent mémoire sont expressément incorporées ici à titre documen- taire. REVENDICATIONS 1. Polypeptide ligand mpl isolé sensiblement homogène. 2. Polypeptide ligand mpl suivant la revendica- tion 1, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe comprenant (a) un polypeptide fragment ; (b) un polypeptide variant ; et (c) un polypeptide chimérique. 3. Polypeptide ligand mpl suivant la revendica- tion 1, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe comprenant (a) le polypeptide qui est isolé d'un mammi- fère ; b) le polypeptide qui est préparé par des moyens recombinants ; et (c) le polypeptide qui est préparé par des moyens de synthèse. 4. Polypeptide ligand mpl suivant la revendica- Tion 1, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe comprenant (a) un polypeptide qui est humain ; et (b) un polypeptide qui est non imminogénique chez un être humain. 6. Polypeptide fragmentaire suivant la revendica- tion 2, caractérisé en ce qu'il est représenté par la formule X-hTPO(7-151) -Y dans laquelle hTPO(7-151) représente la séquence d'aminoacides de la thrombopoiétine (TPO) humaine (hML) de Cys7 à Cysl5 inclus ; ~S ~ X représente un groupe amino de Cys7 ou le ou les résidus d'aminoacides amino-terminaux choisis dans le groupe M, MA, MPA, MPPA, (SEQ ID NO: 117) MAPPA, (SEQ ID NO: 118) MPAPPA, (SEO ID NO: 119) MSPAPPA, (SEQ ID NO: 120) A, PA, PPA, APPA, (SEQID NO:121) PAPPA, (SEQ ID NO: 122) SPAPPA, (SEQ ID NO: 123) Y représente le groupe carboxy-terminal de Cys1s' ou le ou les résidus d'aminoacides carboxy-terminaux choisis dans le groupe V, VR, VRR, VRRA. (SEO ID NO: 124) VRRAP, (SEO ID NO: 125) VRRAPP,. (SEQ ID NO: 126) VRRAPPT,. (SEO ID NO: 127) VRRAPPrT, (SEQO ID NO: 128) VRRAPPTTA, (SEO ID NO: 129) VRRAPP1TAV. (SEQ ID NO: 130) VRRAPP1TAVP, (SEQ ID NO: 131) VRRAPP1TAVPS, (SEQ ID NO: 132) VRRAPPTTAVPSR, (SEQ ID NO: 133) VRRAPPTTAVPSRT, (SEQ ID NO: 134) VRRAPPTTAVPSRTS, (SEQ ID NO: 135) VRRAPPTrAVPSRTSL, (SEQ ID NO: 136) VRRAPPTrAVPSRTSLV, (SEQ ID NO: 137) VRRAPPTFAVPSRTSLVL. (SEQ ID NO: 138) VRRAPPTIAVPSRTSLVLT, (SEO ID NO: 139) VRRAPPTFAVPSRTSLVLTL, (SEQ ID NO: 140) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN, (SEQ ID NO: 141) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE, (SEQ ID NO: 142) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL, (SEQ ID NO: 143) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP, (SEO ID NO: 144) et les extensions d'un ou plusieurs résidus d'aminoacides amino-terminaux comprenant un ou plusieurs des résidus 176-332 de ML d'être humain comme représenté sur la figure 1 (SEQ ID N : 1). 7. Polypeptide fragmentaire suivant la revendica- tion 6, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe TPO (1-153) et TPO (1-245). 8. Polypeptide fragmentaire suivant la revendica- tion 2, caractérisé en ce que sa séquence d'aminoacides comprend SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL, (SEO ID NO: 110) HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF, (SEQ ID NO: 111) SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL, (SEQ ID NO: 112) LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL (SEQ ID NO: 113) GQLSGQVRLLLGALOS. (SEQ ID NO: 114) LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF. (SEQ ID NO: 115) LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR., et (SEQ ID NO: 116) et des formes combinées. 9. Polypeptide suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est non glycosylé. 10. Polypeptide isolé, caractérisé en ce qu'il est codé par un acide nucléique ayant une séquence qui s'hybride dans des conditions modérément rigoureuses aux molécules d'acides nucléiques ayant une séquence d'acides nucléiques représentée sur la figure 1 (SEQ ID. No : 2). 11. Polypeptide suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est biologiquement actif. 12. Polypeptide suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe hML, hMLls3, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML et pML2. 13. Polypeptide suivant la revendication 2, caractérisé en ce que sa séquence d'aminoacides comprend les résidus d'aminoacides 1 à X de la figure 1 (SEQ ID N : 1), o X est choisi dans le groupe des nombres 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 et 332. 14. Polypeptide ligand mpl isolé principalement homogène, caractérisé en ce qu'il partage au moins 80 % d'identité de séquence avec le polypeptide suivant la revendication 13. 15. Polypeptide suivant la revendication 13, caractérisé en ce que X est égal à 153. 16. Chimère, caractérisée en ce qu'elle comprend le ligand mpl suivant la revendication 13 soudé à un polypep- tide hétérologue. 17. Chimère suivant la revendication 16, caracté- risée en ce que le polypeptide hétérologue est un polypeptide du type d'une immunoglobuline. 18. Chimère suivant la revendication 16, caracté- risée en ce que le polypeptide hétérologue est un polypeptide du type interleucine. 19. Chimère caractérisée en ce qu'elle comprend les résidus N-terminaux 1 à environ 153-157 de hML substitués avec un ou plusieurs, mais non la totalité, des résidus d'EPO humaine ajoutés ou substitués dans les résidus N-terminaux de hML dans des positions correspondant à l'alignement représenté sur la figure 10. 20. Anticorps caractérisé en ce qu'il est capable de se lier au polypeptide ligand mpl suivant la revendication 13. 21. Lignée cellulaire d'hybridome, caractérisée en ce qu'elle est capable de produire l'anticorps suivant la revendication 20. 22. Molécule isolée d'acide nucléique, caractéri- sée en ce qu'elle code le polypeptide ligand mpl suivant la revendication 1. 23. Molécule isolée d'acide nucléique, caracté- risé en ce qu'elle code le polypeptide ligand mpl suivant la revendication 13. 24. Molécule isolée d'acide nucléique, caractéri- sée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides nucléiques à cadre de lecture ouvert représentée sur la figure 1 (SEQ ID N : 2). 25. Molécule isolée d'acide nucléique suivant la revendication 24, caractérisée en ce qu'elle code un polypep- tide ligand mpl choisi dans le groupe comprenant hML, hMLS3, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML et pML2. 26. Molécule isolée d'acide nucléique, caractéri- sée en ce qu'elle est choisie dans le groupe comprenant 30 (a) un clone d'ADNc comprenant la séquence de léotides de la région codante du gène du ligand mpl ; (b) une séquence d'ADN capable de s'hybrider dans des conditions rigoureuses à un clone de (a) ; et (c) un variant génétique de l'une quelconque des séquences d'ADN de (a) et (b) qui code un polypeptide possédant une propriété biologique d'un polypeptide ligand mpl naturel. 27. Molécule d'ADN isolée, caractérisée en ce qu'elle a une séquence capable de s'hybrider à une séquence 'ADN suivant la figure 1 (SEQ ID N 2) dans des conditions modérément rigoureuses, et en ce qu'elle code un polypeptide ligand mpl biologiquement actif. 28. Molécule d'acide nucléique suivant la reven- dication 25, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un promoteur lié de façon exploitable à la molécule d'acide nucléique. 29. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides nucléiques suivant la revendi- cation liée de façon exploitable pour conditionner des séquences reconnues par une cellule-hôte transformée avec le vecteur. 30. Cellule-hôte, caractérisée en ce qu'elle est transformée avec le vecteur suivant la revendication 29. 31. Procédé d'utilisation d'une molécule d'acide nucléique codant le polypeptide ligand mpl pour effectuer la production de ce polypeptide, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver la cellule-hôte suivant la revendication 30. 32. Procédé suivant la revendication 31, caracté- risé en ce que le polypeptide ligand mpl est isolé de la cellule-hôte. 33. Procédé suivant la revendication 31, caracté- risé en ce que le polypeptide ligand mpl est isolé du milieu de culture de la cellule-hôte. 34. Procédé de détection de la présence de polypeptide ligand mpl, caractérisé en ce qu'il consiste à hybrider l'ADN codant le polypeptide ligand mpl à un acide nucléique d'un échantillon à analyser et à détecter la présence d'ADN du polypeptide ligand mpl. 35. Procédé pour amplifier un échantillon testé d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il consiste à amorcer une réaction d'acide nucléique-polymérase avec un acide nucléique codant un polypeptide ligand mpl. 36. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend le polypeptide ligand mpl suivant la revendication 1 et un support acceptable du point de vue pharmaceutique. 37. Composition suivant la revendication 36, contenant une quantité thérapeutiquement efficace de polypep- tide ligand mpl suivant la revendication 1 pour le traitement d'un mammifère atteint ou risquant d'être atteint de thrombo- cytopénie. 38. Composition suivant la revendication 36, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent choisi dans le groupe comprenant une cytotoxine, un facteur stimulant les colonies ou une interleucine. 39. Composition suivant la revendication 38, caractérisée en ce que l'agent est choisi entre KL, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 et IL-11. 5. Agoniste de mpl isolé sensiblement homogène, caractérisé en ce que : (a) il stimule l'incorporation de nucléotides marqués (3H-thymidine) à l'ADN de cellules Ba/F3 sous la dépendance de IL-3 transfectées à l'aide de P mpl humain ; ou (b) il stimule l'incorporation de 35S dans des plaquettes en circulation dans l'essai de rebondissement plaquettaire.