FR 2715070 A1 19950721 FR 9400686 A 19940118 La présente invention concerne un produit à activité lipolytique et sa méthode de préparation. Elle concerne également des compositions pharmaceutiques ou cosmétiques incluant ledit produit comme principe actif. Dans l'état de la technique actuel, les lipolytiques utilisés sont les mêmes depuis de nombreuses années, à savoir les bases xanthiques telles que la caféine et la théophylline, la L-carnithine et les silanols. Ces molécules, bien qu'efficaces, sont fabriquées par synthèse chimique ou par extraction à partir de produits naturels. Dans les deux cas, la préparation des principes actifs fait intervenir de nombreux réactifs chimiques. Il en découle une image négative des cosmétiques incluant ces principes actifs auprès des consommateurs. Le but de l'invention est de proposer un nouveau produit à activité lipolytique extrait à partir de produits naturels sans faire intervenir de réactifs chimiques. La présente invention repose sur la découverte inattendue que des extraits d'algues présentent une activité lipolytique directe sur des cellules et plus particulièrement sur les adipocytes. Cette activité n'avait jamais été mise en évidence jusqu'à aujourd'hui pour les algues. Les premières étapes de la préparation des extraits d'algues sont effectuées conformément à un procédé déja décrit dans la demande de brevet français n 92 09497 déposée au nom de la présente demanderesse. Ledit procédé consiste à: a) faire subir à des algues préalablement lyophilisées une réhydratation par de l'eau déminéralisée au taux d'humidité originel, b) faire subir aux algues réhydratées une lixiviation en lit semi-fluide avec de l'eau déminéralisée, c) éliminer les macromolécules et les particules de taille supérieure à 0, 22 micron du jus d'extraction, Les caractéristiques du procédé et de l'appareillage utilisé sont décrites plus précisément dans la demande de brevet n 92 09497. Afin d'obtenir un produit à activité lipolytique, on a ajouté une nouvelle étape au procédé. Cette étape consiste à concentrer les éléments organiques par élimination des minéraux. A) Exemples de préparation d'extraits d'algues conformes à la présente invention: Exemple 1 On a lyophilisé puis réhydraté à l'eau déminéralisée 1,2 Kg d'algues du type Laminaria digitata coupées en morceaux d'environ 1 cm. Après réhydratation pendant 15 minutes dans 6,8 litres d'eau, on a fait subir à ces morceaux d'algues une lixiviation en lit semi- fluide. Le rendement maximal du processus d'extraction est atteint au bout d'environ une heure et demie de lixiviation en lit semi-fluide. On a ensuite fait subir au jus d'extraction ainsi obtenu un processus de purification. Pour cela, ledit jus d'extraction est passé sur un premier filtre de seuil de rétention d'environ 128 microns. La fonction de ce filtre est d'éliminer les débris d'algues. Le filtrat est ensuite passé sur deux filtres du type frontal à membrane cellulosique. Les seuils de rétention de ces deux filtres sont respectivement de 10 et 1 microns. Le filtrat obtenu est alors purifié par microfiltration tangentielle sur un filtre de seuil de rétention de 0,22 micron. Cette opération a pour but d'éliminer du filtrat des macromolécules telles que des polysaccharides ainsi que des microorganismes. Le filtrat obtenu est un liquide limpide de couleur jaune pâle, contenant des petites molécules telles que des oligo-éléments, des acides aminés, des peptides, des protéines, etc. Les étapes précédentes ainsi que les caractéristiques analytiques de l'extrait sont décrites plus précisément dans la demande de brevet n 92 09497. Le filtrat issu de l'étape précédente est alors concentré à un facteur de concentration volumique FCV 35 par nanofiltration. Cette étape est réalisée sur un système utilisant une pompe à piston permettant de faire passer le filtrat à travers une membrane de seuil de rétention de 400 Daltons. La pression de la pompe au cours de la concentration est comprise entre 20 et 40 bars. Dans un tel système, les minéraux monovalents et une partie des minéraux bivalents passent à travers le filtre et sont éliminés. Dans le même temps, le rétentat circulant dans un circuit fermé passe plusieurs fois sur le filtre. Il en résulte une concentration de la partie organique du rétentat au fur et à mesure que les minéraux sont éliminés. Le rétentat obtenu est appelé extrait 1. L'extrait 1 présente les caractéristiques analytiques suivantes: Protéines 11% - Lipides négligeables - Minéraux 20% - Glucides 69% EXAMEN ORGANOLEPTIQUE - Aspect liquide lég. trouble - Couleur brun foncé - Odeur caractéristique CONTROLES PHYSICOCHIMIQUES - pH à 20'C 4,88 - Densité à 20 C 1,061 - Indice de réfraction à 20 C 13,5 % - Conductance électrique 18,6 mS - Matières sèches (2 gr à 105 C pendant 2 heures) 12,07 % - Matières minérales ( à 550"C) 2,40 % ANALYSE MINERALE - Azote total 2,175 g/l - Magnésium 3,27 g/l - Chlorures 6,4 g/l - Calcium 1,3 g/l - Potassium 3,6 g/l - Sulfates 4,8 g/1 - Phosphore 0,48 g/l - Fer total 3, 9 mg/1 - Zinc 80 mg/1 - Cuivre 0,76 mg/1 - Manganèse 10 mg/1 RECHERCHE DES ACIDES AMINES Une analyse par chromatographie sur couche mince après hydrolyse de l'extrait révèle la présence des acides aminés suivants: alanine, acide glutamique, valine, phénylalanine, leucine, isoleucine ou méthionine. Exemple 2 On réalise les mêmes opérations que dans l'exemple 1 pour obtenir l'extrait 1 que l'on laisse ensuite décanter pendant 24 heures et que l'on filtre pour éliminer les éléments insolubles. Le filtrat obtenu est appelé extrait 2. Exemple 3 On réalise les mêmes opérations que dans l'exemple 1 mais la nanofiltration est poursuivie de façon à concentrer l'extrait à un facteur de concentration volumique FCV 90. Une ultrafiltration tangentielle à 1000 Daltons est ensuite réalisée sur le rétentat afin d'éliminer toutes les molécules de poids moléculaire supérieur à 3000-4000 Daltons. Ces molécules, du fait de leur grosseur, sont incapables de traverser la barrière cutanée. Le fitrat obtenu est appelé extrait 3. Exemple 4 L'extrait 4 est obtenu par lyophilisation de l'extrait 3. B) Détermination de l'activité lipolytique des extraits d'algues conformes à l'invention L'activité lipolytique de chaque extrait préparé a été mesurée sur des adipocytes isolés de rats. Au cours de la lipolyse, les triglycérides intracellulaires vont être hydrolysés en glycérol et en acides gras expulsés dans le milieu extracellulaire. Pour déterminer l'activité lipolytique de chaque extrait d'algue conforme à l'invention, on dose les acides gras et le glycérol libérés par les adipocytes dans le milieu d'incubation en présence des extraits d'algues. On compare ensuite ces valeurs avec celles qui sont obtenues en absence d'extraits d'algues. Le dosage des acides gras et du glycérol est effectué à l'aide de kits de dosage commercialisés (kit Biolyon(R) pour les acides gras et kit Boehringer(R) pour le glycérol). - Isolement des adipocytes de rat Le rat utilisé est un rat mâle Sprague Dawley pesant 400 g. Les adipocytes du tissu épididymaire ont été dissociés au moyen de collagénase 0,1 % dans un milieu de dissociation constitué de milieu MEM sans rouge de phénol additionné de 50 UI/ml de pénicilline, de 50 lg/ml de streptomycine, de 0,13 % de bicarbonate de sodium et de 0,5 % de glutamine. La suspension cellulaire a été filtrée puis lavée dans le milieu d'incubation constitué du milieu de dissociation additionné de 0,5% de BSA délipidée. La viabilité cellulaire a été contrôlée par oxymétrie; la consommation d'oxygène des adipocytes était située dans l'intervalle de valeurs habituellement obtenues dans le laboratoire. - Protocole d'incubation Les extraits à tester ont été dilués directement dans le milieu d'incubation. Ils ont été mis en contact avec le nombre approprié de cellules pendant deux heures à 37 C. Des incubations "témoins sans produit" ou "témoin sans cellules" ont été effectuées en parallèle. Chaque condition expérimentale a été réalisée en triplicate. - Expression des résultats Les résultats obtenus ont été regroupés dans les tableaux 1, 2, 3 et 4. Les valeurs ont été exprimées en micromoles d'acides gras (ou de glycérol) formées pendant un temps d'incubation de 0,5, de 2 et de 4 heures et pour un nombre de cellules donné. Les moyennes obtenues à partir des triplicates ont été effectuées puis les valeurs moyennes trouvées dans les incubations effectuées en présence des produits à l'étude et en l'absence des cellules ont été soustraites. Les tableaux 1, 2, 3 et 4 démontrent l'activité lipolytique des extraits 1 à 4. L'activité lipolytique croît globalement dans le temps avec un maximum au bout de 2 heures, ce qui démontre qu'il y a assimilation du principe actif des extraits dans les adipocytes. On remarquera que le facteur de stimulation de l'hydrolyse des triglycérides en acides gras non estérifiés est de l'ordre de 140% par rapport aux témoins en absence des extraits d'algues. On notera également qu'il n'y a pas de différences significatives d'activité lipolytique entre les extraits 1, 2, 3 et 4. Ceci tend à démontrer que les étapes ajoutées après la nanofiltration à 400 Daltons n'améliorent pas de manière significative l'efficacité de l'extrait. Le dosage du glycérol, bien que moins précis que le dosage des acides gras, confirme la stimulation de la lipolyse en présence des extraits d'algues conformes à l'invention. Ayant subi une ultrafiltration tangentielle de 1000 Daltons, l'extrait 3 ne contient plus de molécules de poids moléculaire supérieur à 3000-4000 Daltons. Il présente cependant une activité lipolytique. Les principes actifs ont donc un poids moléculaire inférieur à 3000-4000 Daltons et ils seront capables de passer la barrière cutanée dont le seuil de passage est d'environ 6000 Daltons. C) Comparaison de l'activité lipolytique des extraits d'algues avec des lipolytiques connus. Le tableau 5 compare l'activité lipolytique de l'extrait d'algues 1 avec plusieurs molécules témoins appartenant à la famille des lipolytiques connus. Les concentrations des témoins ont été choisies de façon à présenter un maximum d'activité sans toutefois présenter une cytotoxicité envers les adipocytes. La destruction des cellules entraînerait en effet une libération d'acide gras et de glycérol dans le milieu d'incubation qui fausserait la détermination de l'activité lipolytique des témoins. Tableau 5 PRODUITS CONCENTRATIONS Eq EXTRAIT SEC ACTIVITE LIPOLYTIQUE L. Carnithine 0,1 mM 0,01 % 120 Caféine 0,1 mM 0,02 % 152 Théophyline 0,1 mM 0,02 % 132 Mannuronate de 1,0 % 0,01 % 140 méthylsilane- triol Extrait 1 0,1 % 0,01 % 145 Il résulte de l'analyse du tableau 5 que l'extrait 1 issu du procédé décrit dans l'exemple 1 a une activité équivalente aux lipolytiques habituellement utilisés en cosmétique et ceci pour des pourcentages de molécules actives du même ordre de grandeur. Les extraits d'algues conformes à la présente invention ne présentent aucune cytotoxicité pour les extraits 1 à 3 jusqu'à une concentration de 1% et pour l'extrait 4 (produit lyophilisé) jusqu'à une concentration de 0,1%. Une légère toxicité envers les adipocytes est notée à partir d'une concentration de 10% et respectivement 1% pour le produit lyophilisé. On montre ainsi que les résultats concernant l'hydrolyse des triglycérides sont dus à une activité au niveau des adipocytes et non à une destruction de ceux-ci. On notera que les produits lipolytiques conformes à l'invention présentent l'avantage par rapport aux lipolytiques actuels d'être extraits à partir de produits naturels par un procédé ne faisant intervenir aucun réactif chimique. Il en résulte la mise au point de nouvelles compositions cosmétiques répondant aux besoins actuels des consommateurs. Une étude portant sur la stabilité dans le temps des extraits d'algues conformes à l'invention a également été effectuée. Les résultats sont représentés dans le tableau 6. On remarque à la lecture dudit tableau que l'activité lipolytique de l'extrait 1 ?0 mesurée à 6 mois d'intervalle n'a pas subi de variations notoires. Tableau 6 STABILITE DE L'ACTIVITE LIPOLYTIQUE dans le temps CONCENTRATION (%,V/V) T = 2 h 0 0,05 0,1 0,5 1 Extrait 1 13+/-0 14+/-1 15+/-1 16+/-1 14+/-1 % 100 107 122 129 107 Extrait 1 15,03 21,73 17,27 6 mois après +/- 1,44 +/- 0,85 +/- 0,98 % 100 145 115 Grâce aux extraits d'algues conformes à l'invention, on obtient des compositions pharmaceutiques ou cosmétiques présentant une activité lipolytique. L'application de ces compositions sur la peau a pour résultat de produire un amincissement local. De telles compositions peuvent intervenir notamment dans le traitement de la cellulite. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif de compositions conformes à l'invention. Les proportions des composants sont exprimées en poids centésimal. Exemple 1: gel amincissant Eau 88,00 Propylène glycol 1,00 Cyclométhicone 1,00 Huile de vaseline 5,00 Extrait d'algue 1 1,00 Sepigel 305 3,00 Conservateur, parfum q.s. 100 Exemple 2: lotion amincissante à pulvériser Eau 85,00 Propylène glycol 2,00 Cétiol ME 1,00 Eau de rose 10,00 Extrait d'algue 1 1,00 Conservateur, colorant, parfum q.s. 100 Exemple 3: crème amincissante et drainante Huile de vaseline 5,00 Acide stéarique 1,00 Alcool cétylique 1,50 Huile d'amandes douces 4,00 Triéthanolamine 1,20 Propylène glycol 1,00 Eau 81,00 Carbomer 940 0,50 Extraits de plantes 3,00 Extrait d'algue 1 1,00 Parfum, colorant q.s. 100 Tableau 1: DOSAGE DES ACIDES GRAS NON ESTERIFIES EN M d'ACIDES GRAS LIBERES (après 0,5 heure d'incubation) CONCENTRATION (%, V/V) ou (%, P/V) T = 0,5 h 0 0,01 0,1 1,0 1 10,87 13,90 12,83 +/- 1,65 +/- 2,42 +/- 2,69 % 100 128 118 2 10,87 11,13 8,63 +/- 1,65 +/- 2,37 +/- 0,98 % 100 102 79 3 10,87 10,33 10,60 +/- 1,65 +/- 0,98 +/- 1,28 % 100 95 98 4 10,87 15,90 16,17 +/- 1,65 +/- 0,80 +/- 2,11 % 100 146 149 Tableau 2:DOSAGE DES ACIDES GRAS NOn ESTRIIES E pN D'ACIDES GRASc LIBERES (après 2 heures d'incubation) CONCENTRATION (%, V/V) ou (%, P/V) T=2h 0 0,01 0,1 1,0 1 15,03 21,73 17,27 +/- 1,44 +/- 0,85 +/- 0,98 % 100 145 115 2 15,03 20,07 19,80 +/- 1,44 +/- 3,00 +/- 3,14 % 100 133 132 3 13,10 14,50 16,73 +/- 1,91 +/- 1,91 +/- 0,85 %100 111 128 4 13,10 14,20 16,73 +/- 1,91 +/- 1,70 +/- 3,00 % 100 108 128 Tableau 3: DOSAGE DES ACIDES GRAS NON ESTERIFIES EN la d'ACIDES GRAS LIBEERES (après 4 heures d'incubation) CONCENTRATION (%, V/V) ou (%, P/V) T = 4 h 0 0,01 0,1 1,0 1 14,47 19,27 15,07 +/- 4,12 +/- 4,66 +/- 0,85 % 100 133 104 2 10,03 13,35 13,13 +/- 1,44 +/- 1,20 +/- 3,87 % 100 133 131 3 10,03 16,70 14,50 +/- 1,44 +/- 4,65 +/- 2,96 % 166 145 4 10,03 8,93 9,47 +/- 1,44 +/- 1,76 +/- 0,92 % 100 89 94 Tableau 4: DOSAGE DE GLYCEROL NON IFIES EN RN DE GLYCEROL LIBERES (après 4 heures d'incubation) CONCENTRATION (%, V/V) ou (%, P/V) T= 4h 0 0,01 0,1 1,0 1 2,85 3,90 4,65 % 100 137 163 2 2,85 4,05 8,80 % 100 142 309 3 2,20 2,85 4,05 % 100 130 184 4 2,20 2,40 2,35 % 100 109 107 REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation d'un produit à activité lipolytique, caractérisé en ce qu'il consiste à faire subir à des algues les étapes suivantes: a) réhydratation au taux d'humidité originel avec de l'eau déminéralisée des algues préalablement lyophilisées, b) lixiviation en lit semi-fluide des algues réhydratées, c) élimination des macromolécules et des particules de taille supérieure à 0,22 micron du jus d'extraction, d) concentration des éléments organiques par élimination des minéraux. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'élimination des minéraux est réalisée par nanofiltration. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la nanofiltration est effectuée sur un filtre de seuil de rétention de 400 Daltons. 4) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'élimination des macromolécules et des particules de taille supérieure à 0,22 micron est effectuée par microfiltration tangentielle sur filtre de seuil de rétention de 0,22 micron ) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la microfiltration tangentielle est précédée par une filtration de type frontal sur filtre de seuil de rétention de 1 micron. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la filtration de type frontal est précédée par une filtration du même type sur filtre de seuil de rétention de 10 microns. 7) Produit à activité lipolytique, caractérisé en ce que ledit produit est préparé par le procédé selon l'une des revendications précédentes. 8) Composition pharmaceutique ou cosmétique, caractérisée en ce qu'elle contient un produit selon la revendication 7. 9) Utilisation d'un produit obtenu par le procédé d'extraction selon les revendications 1 à 6 pour la préparation de compositions pharmaceutiques ou cosmétiques à activité lipolytique.