FR 2720832 A1 19951208 FR 9405064 A 19940422 A. Titre de l'Invention: ELECTRODES ET MEMBRANES ELECTROACTIVES A BASE DE PEPTIDES BIOACTIFS, POUR LA RECONNAISSANCE, L'EXTRACTION OU LE RELARGARGE D'ESPECES BIOLOGIQUEMENT ACTIVES. I. Introduction. Les polymères conjugués, tels que polypyroles, polythiophènes, polyanilines, polyphénylènes, et leurs dérivés sont actuellement connus pour leur caratère électroactif, largement décrit dans des ouvrages de revue tel que "Handbook of Organic Conducting Polymers (T.J. Skotheim Editeur, Marcel Dekker, New York, 1986). Ces polymères, sous forme de film sur électrode, sous forme de films auto-supportés ou encore sous forme de composite lorsqu'alliés à un polymère polycationique ou polyanionique, se comportent comme des électrodes organiques, qui se chargent suivant un processus d'oxydation anodique, par insertion d' ions du milieu électrolytique. Ce processus électrochimique est réversible, la réduction provoquant l'expulsion des ions de ce polymère conjugué ou du composite électroactif. exemples de polymères conjugués: s "' PoLyT-koP( J L Y'rtfce PiJ relf iJ4 Une seconde génération de polymères conjugués a ensuite été décrite dans la littérature, obtenue par le greffage covalent, sur les unités monomères de ces polymères, de groupes fonctionnels, capables d'apporter une fonction additionnelle à ces polymères conjugués électroactifs. Ces nouvelles fonctions sont par exemple 1 -la catalyse, par le greffage de complexes métalliques électrocatalytiques sur le polypyrole, 2 - la reconnaissance de cations du milieu électrolytique, par le greffage de macrocycles complexants spécifiques sur les chaines de polypyrrole ou de polythiophène, 3 - la reconnaissance d'anions optiquememnt actifs, par le greffage de groupes chiraux sur des polythiophènes. L'ensemble de ces voies de fonctionnalisation a fait également l'objet de mises au point détaillées dans la littérature (F. Garnier, Angew. Chemie, 1989, 101, 529; A. Deronzier, J.C. Moutet, Acc. Chem. Res. 1989, 22, 249; J. Roncali, Chem Rev., 1992, 92, 711). &' Une nouvelle étape vers la reconnaissance de molécules actives apparaît intéressante, dans la mesure o des petides de petite taille possèdent une activité biologique élevée, et sont connus pour contrôler de nombreuses fonctions biologiques (A.S. Dutta, Advances in Drug Research, B. Testa Editeur, Academic Press, New York, 1991, 21, 145), montrant par exemple un potentiel thérapeutique très important en tant que récepteur agoniste ou antagoniste, ou encore comme inhibiteurs très puissants qui se lient de façon forte à des enzymes, principe sur lequel est basée la chromatographie dite d'affinité. II. Objet de la présente invention La présente invention porte ainsi sur le développement de nouvelles électrodes organiques et de nouvelles membranes, élaborées à partir d'un polymère conjugué, sur lequel ont été greffés des peptides biologiquement actifs, en vue d'une interaction spécifique avec des espèces chimiques ou biologiques d'intérêt biologique ou médical. De nombreuses classes de peptides peuvent être greffées, comme le montre la liste non exhaustive ci après: hormones adrénocorticotropiques ou leurs fragments; analogues d'angiotensines ou leurs inhibiteurs (composants du système renine-angiotensine qui régulent l'hypertension rénale); peptides natriurétiques; bradykinine et ses dérivés petidiques; peptides chimiotactiques; dynorphine et ses dérivés; endorphines ou analogues; encéphalines ou leurs dérivés; inhibiteurs d'enzymes (tels que protéases); fragments de fibronectine et dérivés; peptides gastrointestinaux; peptides associés au largage d'hormones de croissance;. neurotensines et analogue; peptides opioides; oxytocine, vasopressine, vasotocine et dérivés; protéines kinases. Ces électrodes et (ou) membranes électroactives peuvent être appelées à être utilisées pour remplir plusieurs fonctions II. 1. reconnaissance de type électrochimique pour la détection d ' espèces biologiquement actives spécifiques des peptides greffés. En effet, comme il a été montré pour les polymères conjugués fonctionnalisés, la reconnaissance d'une espèce chimique externe par la fonction greffée entraîne une modification de la réponse électrochimique du polymère, visualisée par un changement du potentiel d'oxydation.(tel que décrit dans articles de revue, comme J. Roncali, cité précedemment). Cette variation du voltammogramme électrochimique d'oxydoréduction du polymère confère une fonction de capteur, et peut ainsi être utilisée pour une mesure quantitative de l'espèce biologiquement active, soit par la variation du potentiel, à courant fixe, soit par la variation du courant, à potentiel fixe. II.2. Extraction d'espèces biologiquement actives en solution. Dans plusieurs cas, l'espèce biologiquement active en solution se combine de façon forte au peptide greffé sur la chaîne de polymère, ce qui permet donc d'extraire l'espèce biologiquement active de façon sélective d'un milieu. Ce type d'extraction peut être réalisé in vitro, ou même in vivo lorsque le polymère support est biocompatible, tel que le polypyrrole par exemple. II.3. Source de relargage d'espèces biologiquement actives (enzymes ou autres), liées à l'activité du peptide greffé. II.4. Interaction spécifique avec le milieu biologique, liée à la nature du peptide (tel que peptide chinmiotactique) III. Exemple d'électrode pour reconnaissance biospécifique et pour extractive d'enzyme protéolytique L'exemple qui sera décrit dans ce qui suit porte sur le développement d'une telle électrode biospécifique, par greffage d'un dipeptide possédant des propriétés d'inhibition vis a vis d'enzyme protéolytique, ou protéase. Les fonctions de reconnnaissance et d'extraction de cette électrode seront caractérisées. III. 1. Synthèse des monomères Dans l'exemple décrit dans ce qui suit, le polypyrrole (1) a été choisi comme support polymère conjugué compte tenu de sa biocompatibilité (H. Naarmann, communication personnelle). Comme il a déjà été décrit, (D. Delabouglise, F. Garnier, New J. Chem., 1991, 15, 233) un bras espaceur acétyle A, est nécessaire entre l'atome de carbone 3 du noyau pyrrole et le substituant petidique pour préserver la conductivité et l'électroactivité du polypyrrole fonctionnalisé correspondant. Différents peptides, avec leur fonction terminale carboxylique protégée sous la forme ester méthylique, ont été choisis pour leur pertinence biologique et greffés sur un monomère pyrrole- acétique acide, PyA (1). Plusieurs mono et dipetides cont été greffés, et ont conduit aux dérivés pyrroliques suivants: pyrrole(GlycinedPhenylalanine), Py(GLY-dPHE) (2), pour sa capacité de complexation avec les enzymes protéolytiques tels que carboxypeptidase A (Sigma) et trypsine (Sigma) (J.R. Uren, Biochim. Acta, 1971, 236, 67), pyrrole(valine), Py(VAL) (3), pyrrole(phénylalanine), Py(PHE) (4), pyrrole(Phénylalanine- Proline), Py(PHE-PRO).(5). Des dérivés de dipetide plus volumineux peuvent également être gréeffes, tel que le PhénylalanineHydroxyethylamine-Proline, Py(PHE[HEA]PRO) (6), connu pour être un inhibiteur potentiel intéressant pour la protéase associée au virus HIV-1 du SIDA. Ces monomères ont été synthétisés suivant une voie chimique décrite (D. Delabouglise, F. Garnier, Synth. Met., 1990, 39, 117). Ces monomères ont été purifiés et caractérisés par RMN, microanalyse, et spectrométrie de masse. III.2. Polymérisation Ces monomères ont été polymérisés par voie électrochimique sur électrode de platine de 0,7 cm2, ainsi que sur grille de platine de 10 cm2 de surface, en milieu carbonate de propylene avec 0.5 M de NaCl, à un potentiel constant de 0,8 V/SCE. Des films épais de polymère sont obtenus, jusqu'à des épaisseurs de 10 rim. L'électroactivité de ces polymères a été confirmée par voltammétrie cyclique en milieu H20-NaCl 0,5 M, à un pH neutre de 7. (Figure 1). Les valeurs de potentiel d'oxydation, de l'ordre de 0,30 V/SCE, proches de celle du polypyrrole non substitué, confirment l'électroactivité de ces polypyrroles fonctionnalisés avec des dipeptides. OH yOH (a OH (a) N\ H a N 0OebOMe (b) o N H O H N - H[j H PYA[VALJ(33 PyA CA-) PyA[GLY-,PHE]C2) OH (a) OH O= PHEI (4PyA(PHE-PROI (t 'j (,) 4CrA t U 5a-V/SîE Fijg 1. Voltammogrammes de polymères fonctionalisés, en milieu H20-NaCI 0,5 M (1) Poly(pyrrole-acétique acide), Poly(1); (2) Poly(pyrrole (GLY-dPHE)), Poly (2) (3) Poly(pyrrole (VAL), Poly(3) (4) Poly(pyrrole(PHE)), Poly(4). 111.3 Fonction de reconnaissance Les propriétés spécifiques de complexation de ces polypyrroles vis à vis d'enzymes protéolytiques ont été analysées avec la carboxypeptidase A, avec laquelle (GLY-dPHE) est connu pour former des complexes stables à pH neutre. Des solutions de concentration croissante de carboxypeptidase A, allant de lmg à 5 mg dans 5 cm3 de H20-NaCl 0,5 M ont été analysées. Lorsque l'on immerge dans cette solution des électrodes non spécifiques telles que polypyrrole non susbtitué, ou poly(3, 4, 5 ou 6), un voltammogramme identique à celui obtenu en 11.2 est observé, sans modification aucune. Lorsque cependant l'on utilise le poly(pyrrole(GLYdPHE)), poly(2), le voltammogramme montre un déplacement vers les potentiels plus élevés, de 0,340 V/SCE pour une quantité initiale nulle en carboxypeptidase A jusqu'à une valeur limite de 0;500 mV/SCE pour une quantité de 5mg de carboxypeptidase A dans la solution (Fig. 2). Le déplacement de potentiel est attribué à un encombrement et une rigidification de la chaîne de polypyrrole, produite lors de la complexation de l'enzyme sur le dipeptide porté par la chaîne polymère. La formation de ce complexe entre enzyme et poly(pyrrole-dipeptide) a été confirmée par le relargage de l'enzyme en milieu acide, à pH = 3, ainsi que cela est réalisé classiquement en chromatographie d'affinité (I.M. Chaiken, M. Wilchek, I. Parikh, Affinity Chromatography and Biological Recognition, Academic Press, New York, 1983). L'enzyme relarguée a été caractérisée de façon classique par le test de Bradford, en mesurant l'activité enzymatique avec le bleu brillant de comassii, et par l'utilisation d'un standard d'albumine de serum de bovin. Lorsque l'on utilise un film de poly(Gly-dPHE) contenant 5x10-6 unités monomères, correspondant à une charge de polymérisation de 1 Coulomb, une quantité significative de 400 microgrammes de carboxypeptidase A a été obtenue après relargage dans un mileiu acide. Considérant la taille de cette enzyme, de 307 unités d'aminoacides, cette quantité d'enzyme relarguée montre qu'environ 1 molécule d'enzyme est complexée pour 200 unités monomères de (pyrrole-dipeptide), ce qui semble raisonnable compte tenu de la différence de taille (environ d'un facteur 100). Ce résultat montre également que que l'enzyrme doit être distribuée à l'intérieur du film de polymère, ce qui démontre sa perméablité vis à vis de l'enzyme. Des résultats comparables ont été obtenus lorsque la trypsine a été utilisée comme enzyme. Fis. 2 Voltammogramme de Poly(2) '. H20-NaCI 0,5 M, en présence de Carboxypeptidase A en concentration de. , 0,0 mg dans 5cm3 électrolyte - /. 1,0 mg ".". ".| ";LT;,/ 2,0m g" " " - 4,0 mg " ' _ - _ 5,0 mg.. ... . W ' / X g 1m. 4 Relargage contrôlé de l'enzyme Une caractéristique supplémentaire intéressante de ces électrodes concerne le fait qu'il a été montré dans la littérature que le poly(pyrrole acétique acide), ou poly(l) relargue des protons dans le milieu électrolytique lorsqu'il est soumis à oxydation électrochimique (D. Delabouglise, F. Garnier, New J. Chem., cité précédenmment; P. Baiierle et al. Adv. Mater., 1990, 2, 490; H. Korri, F. Garnier et al., Adv. Mater., 1994, à paraître). Des variations importantes de pH peuvent être observées dans un faible volume électrolytique, jusqu'à des valeurs de l'ordre de 3. Ce relargage de protons s'observe également lorsque la fonction carboxylique est éloignée du noyau pyrrole, tel que c'est le cas pour un aminoacide ou un peptide non protégé greffé sur le pyrrole. Deux voies existent pour le relargage contrôlé de protons. Soit l'utilisation d'un peptide dont la fonction terminale carboxylique n'est pas protégée, COOH, soit par l'utilisation d'un copolymère entre pyrrole-acétique acide et pyrrole-peptide protégé. Un exemple de cette deuxième voie est donné. Un copolymère entre Py(A), (1) et Py(GLY-dPHE), (2), a été réalisé électrochimiquement, dans les mêmes conditions que précédemment.. Ce copolymère, Poly(1, 2) conduit, lorsque soumis à électrooxydation à 0.3 V/SCE à une variation de pH importante jusqu'à pH = 4 au voisinage de l'électrode. A partir de ce copolymère Poly(1, 2), ou à partir du polymère Poly(2) dont la fonction carboxylique est libre, deux procédés peuvent être mis en oeuvre pour l'extraction, un procédé en discontinu et un procédé en continu. 1.4 a Procédé discontinu. Ce procédé consiste à utiliser une membrane ou électrode à base des matériaux précités, de la mettre en contact avec le milieu dans lequel l'espèce biologiquement active recherchée, [E], coexiste avec d'autres espèces. L'affinité sélective apportée par le peptide greffé vis à vis de cette espèce [E] provoquera la complexation de [E] sur le peptide greffé sur le polymère de l'électrode ou de la membrane. Cette membrane ou électrode est ensuite retirée du milieu d'analyse et introduite dans un un autre milieu, dit de récupération. Dans ce milieu de récupération, contenant un sel support de type NaCl, l'électrode ou membrane est soumise à une oxydation électrochimique, qui provoque l'expulsion de protons, par les groupes acides carboxyliques, jusqu'à un pH suffisant pour la dissociation et le relargage de l'espèce [E]. III.4 b. Procédé en continu. Le copolymère Poly(l, 2), ou le polymère Poly(2) abvec sa fonction carboxylique libre, est réalisé sous forme de membrane ou d'électrode, avec éventuellement l'aide d'un polymère support, polycationique ou polyanionique, de type polystyrene sulfonate ou encore membrane perfluorée telle que Nafion.. Cette électrode ou membrane, éventuellement composite, constitue la jonction entre deux compartiments A et B, tel que schématisé dans la figure 3. Un exemple d'extraction de carboxypeptidase A par ce dernier procédé en continu va être décrit dans ce qui Suit. L'élément biosélectif est constitué dans ce cas d'un copolymère Poly(1, 2) décrit précédemment, polymérisé dans une membrane de NAFION (Aldrich), obtenue par évaporation sur une grille très fine de platine de 10 gl d'une solution à 5% de NAFION dans un mélange d'alcools linéaires supérieurs (Aldrich). Le film de NAFION qui en résulte, qui présente une épaisseur d'environ 5 um, sert alors de support pour l'électropolymérisation du copolymère Poly(1, 2), aboutissant à une membrane composite électroactive Poly(l, 2)-NAFION. *MF-IERA.NE DC PLYPYRROLE FON'CTION.ALLSEE AVEC Ci R U.N PE'iDú IACTIF A a E E -E 0 0 ^ O 0.= Eo. g .-. IE 0 0 *-, 2 e Dans une première étape, step 1, une quantité de 10 grammes de carboxypeptidase A est introduite dans le compartiment A, dans un milieu H20-NaCI 0,5 M. Une complexation sur la membrane de composite [Poly(12)]-NAFION, s'ensuit immédiatement sur les unités peptidiques de (2), telle que décrite précédemment en III. 3. Par la suite, une oxydation est réalisée, au moyen d'une contre électrode et électrode de référence introduites dans le compartiment B. Dans une seconde étape, step 2, l'oxydation électrochimique conduit au relargage de protons dans ce compartiment B, jusqu'à un pH de l'ordre de 4, et au relargage immédiat de la carboxypeptidase A. Une quantité de 1,2 grammes de Carboxypeptidase A a été alors récupérée dans le compartiment B lors d'un cycle de ce processus en continu, ainsi que cela a été déterminé par dosage de l'activité enzymatique. Ces résultats confirment ainsi le phénomène de reconnaissance de ces électrodes vis à vis d'enzymes, ainsi que leur capacité d'extraction de ces enzymes. Ce comportement est lié de façon biunivoque à la nature chimique du dipeptide greffé sur la chaîne de polypyrrole. IV Revendications de la présente invention. IV.1. Tout polymère conjugué, toute association de polymères conjugués, tout copolymère résultant de la copolymérisation de deux monomères conjugués, tout copolymère résultant de la polymérisation de monomère conjugué avec un monomère classique, tout composite résultant de l'association des précédents avec un polymère polycationique ou polyanionique, qui présentent la particularité de posséder, sur chacun des monomères ou sur quelques uns d'entre eux, un groupement fonctionnel de type peptide ou dérivé de peptide, tel qu' énuméré en II, présentant une activité biologique spécifique. IV.2. Tout dispositif résultant de ces polymères, copolymères ou composites, soit à l'état de dépôt sur un substrat conducteur, tel que métal, dérivé de carbone ou autre conducteur, soit à l'état de film auto-supporté. IV3. Toute application de ces matériaux ou de ces dispositifs dans le domaine biologique ou médical, telle que dosage, in vitro ou in vivo, d'espèces biologiques ou biologiquement active dont l'interaction spécifique avec le dipeptide entraîne une modification de la réponse électrochimique du polymère conjugué, copolymère ou composite décrit en IV 1. IV.4. Toute application de ces matériaux ou de ces dispositifs dans le domaine biologique ou médical, telle que extraction, in vitro ou in vivo, d'espèces biologiques (enzymes ou autres) qui se seraient associées sélectivement avec ces peptides. Ces extractions peuvent être effectuées, en ce qui concerne le relargage final à partir de l'électrode ou de la membrane chargée, soit par voie chimique telle que lavage acide ou par un autre solvant spécifique de l'espèce adsorbée, soit par voie électrochimrique en discontinu ou en continu, tel que décrit dans III.4 par variation de pH externe. IV.5 Toute application de ces matériaux ou de ces dispositifs dans le domaine biologique ou médical, telle que relargage d'espèces biologiquement actives qui auraient été préalablement fixées ou adsorbées sur ces matériaux IV.6 Toute application dans le domaine biologique ou médical de ces matériaux ou de ces dispositifs, résultant d'interactions specifiques entre les peptides greffés sur ces polymères, copolymères ou composites et des espèces biologiquement actives, soit in vitro soit in vivo.