FR 2721174 A1 19951222 FR 9507350 A 19950620 EXTRAIT DE REHMANNIA GLUTINOSA. COMPOSITION PROTECTRICE CONTRE LE PARAQUAT ET PROCEDE DE TRAITEMENT La présente invention concerne un extrait obtenu à partir de la plante Rehmannia glutinosa ayant une activité protectrice contre l'herbicide paraquat, une composition protectrice contenant cet extrait et un procédé pour l'utiliser. L'herbicide paraquat détruit sensiblement toutes les plantes vertes de manière non sélective. Lorsque le paraquat est répandu sur les mauvaises herbes, les cultures agricoles traitées subissent également des dommages par phytotoxicité du fait de son caractère non sélectif. En agriculture, il est nécessaire de consacrer beaucoup de temps et d'efforts pour lutter contre les mauvaises herbes. En culture à grande échelle, on utilise habituellement des herbicides pour lutter contre les mauvaises herbes. Les herbicides peuvent être classés en herbicides qui attaquent les mauvaises herbes sélectivement sans causer de dommages aux cultures et en herbicides non sélectifs qui attaquent toutes les plantes dans la zone o ils sont répandus. Cependant, les herbicides sélectifs excellents sont rares et la plupart des herbicides sont de type non sélectif. Les herbicides peuvent aussi être classés selon le procédé d'application en herbicides de type séjournant dans le sol et en herbicides de type à pulvérisation sur les feuilles. Les herbicides de type séjournant dans le sol sont utilisés avant la germination des mauvaises herbes de sorte qu'ils sont moins nocifs pour les plantes. Cependant, ils sont relativement coûteux et l'efficacité de la lutte contre les mauvaises herbes décroît au fur et à mesure que les mauvaises herbes se développent. Les herbicides de type à pulvérisation sur les feuilles sont relativement peu coûteux, mais aucun herbicide à pulvérisation sur les feuilles sélectif n'a été décrit jusqu'à maintenant. Le paraquat, qui est un excellent herbicide non sélectif, est un herbicide de type à pulvérisation sur les feuilles qui peut détruire la plupart des végétaux verts en une durée aussi courte qu'environ deux jours. Le paraquat détruit les végétaux en inhibant directement le métabolisme cellulaire par formation d'anions superoxyde dans les cellules. Le paraquat est utilisé dans le monde entier du fait de sa grande efficacité pour la lutte contre les mauvaises herbes bien que son spectre d'utilisation soit considérablement limité par son caractère non sélectif. Le terme "protecteur" désigne d'une manière générale des produits conçus et préparés pour faciliter l'utilisation des herbicides en réduisant ou empêchant la phytotoxicité vis à vis des cultures tout en permettant une lutte suffisante contre les mauvaises herbes. Bien entendu, ce type de produit peut être utilisé aussi avec des insecticides ou des fongicides. Cependant, ces produits sont utilisés dans la plupart des cas avec des herbicides. L'utilisation d'un protecteur ayant un excellent effet sur le paraquat permettrait d'économiser beaucoup de temps et d'efforts dans la lutte contre les mauvaises herbes. Pour obtenir une protection suffisante des plantes, il est nécessaire que le protecteur ait une excellente aptitude à la pénétration et à la migration lorsqu'il est pulvérisé sur les feuilles. De plus, les caractéristiques d'étalement, de mouillage, d'adhésion et de résistance aux intempéries du protecteur doivent aussi être excellentes pour que, pendant une durée suffisante, il ne soit pas perdu ou dégradé à la surface des feuilles. Bien que le paraquat détruise la plupart des végétaux verts, on a constaté que certaines mauvaises herbes présentent une résistance au paraquat. Dans l'article intitulé "Resistance of the medicinal plant Jiwhang (Rehmnannia glutinosa) on paraquat" du document Korean Journal of Weed Science vol. 12, nO. 4, pages 374-379 il est indiqué que la plante médicinale Rehmannia glutinosa présente une résistance au paraquat. Après avoir vérifié la résistance spécifique de Rehmannia glutinosa au paraquat et étudié le comportement d'un extrait de Rehmannia glutinosa en tant que protecteur contre le paraquat, les présents inventeurs ont obtenus un extrait de Rehmannia glutinosa ayant une bonne activité protectrice contre le paraquat et ont constaté, après avoir purifié l'extrait, que des constituants tels que le stachyose présentent l'activité protectrice contre le paraquat. C'est pourquoi, la présente invention concerne un extrait de Rehmannia glutinosa présentant une activité protectrice contre le paraquat, une composition protectrice comprenant du stachyose, des hydrates de stachyose ou un dérivé de ceuxci qui peut être utilisée de manière stable comme protecteur contre le paraquat du fait qu'elle réduit ou élimine la phytotoxicité du paraquat vis à vis des plantes intéressantes lorsque le paraquat est utilisé comme herbicide, et un procédé pour utiliser l'extrait ou la composition avant ou pendant le traitement des plantes intéressantes avec le paraquat. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture de la description suivante qui se réfère aux dessins annexés, dans lesquels: la figure 1 est une photographie montrant le résultat d'une vérification biologique de l'effet d'un extrait de Rehmannia glutinosa selon la présente invention sur l'activité du paraquat dans le cas du riz; la figure 2 est une photographie montrant le résultat d'une vérification biologique de l'effet d'un extrait de Rehmannia glutinosa selon la présente invention sur l'activité du paraquat dans le cas du chou chinois; la figure 3 est une photographie montrant le résultat d'une vérification biologique de l'effet d'un extrait de Rehmannia glutinosa selon la présente invention sur l'activité du paraquat dans le cas du soja; la figure 4 est une photographie montrant le résultat d'une vérification biologique de l'effet d'un extrait de Rehmannia glutinosa selon la présente invention sur l'activité du paraquat dans le cas du mais; la figure 5 est une photographie montrant le résultat d'une vérification biologique de l'effet du tétrahydrate de stachyose sur le chou chinois, "UNTREATED" désignant la plante non traité, "PARAQUAT + PTRS" désignant la plante traitée avec le tétrahydrate de stachyose et le paraquat et "PARAQUAT" désignant la plante traitée avec la paraquat. La composition protectrice selon la présente invention comprend un extrait de Rehmannia glutinosa ayant l'activité protectrice de Rehmannia glutinosa. Cet extrait de Rehmannia glutinosa selon la présente invention contient du stachyose. La composition protectrice selon la présente invention comprend du stachyose, un hydrate de stachyose, de préférence le tétrahydrate de stachyose ou un dérivé de ceux-ci. On sait que le stachyose est extrait d'une racine de l'espèce Stachys (épiaire), de la tige du jasmin, des graines de Lupinus luteus et de Soja max, de la sève d'un frêne occidental, entre autres (voir Dictionary of Natural Products, vol. 5, page 5229, 1994, Chapman & Hall). Aucune utilisation particulière du stachyose n'a été décrite. Cependant, des recherches ont été menées récemment sur l'utilisation du stachyose pour favoriser le développement des micro-organismes utiles dans l'intestin. Pour les besoins de la présente invention, l'extrait contenant du stachyose provenait des feuilles, des tiges ou des racines de Rehmannia glutinosa. Cependant, l'origine du stachyose, de l'hydrate de stachyose ou d'un dérivé de ceux- ci n'est pas limitée à ce végétal. La composition protectrice selon la présente invention peut comprendre aussi des tensioactifs ou des adjuvants pour en améliorer l'activité. Comme tensioactifs, il est possible d'utiliser des tensioactifs cationiques, non ioniques et zwitterioniques. Certains tensioactifs anioniques inhibent au contraire l'activité protectrice de l'extrait selon la présente invention de sorte qu'ils ne peuvent pas être utilisés. Parmi les tensioactifs utilisables, on préfère les tensioactifs non ioniques. Ces tensioactifs non ioniques peuvent être par exemple des esters aliphatiques de sorbitan en C12-C18, des esters aliphatiques de polyoxyéthylènesorbitan en C12-C18, des esters aliphatiques de polyoxyéthylène en C12-C18, des résinates de polyoxyéthylène, des diesters de polyoxyéthylène en C12-C18, l'huile de ricin polyéthoxylée, l'huile de ricin polyéthoxylée traitée, des polyoxyéthylènealkyléthers en C12-C18, des polyoxyéthylènealkylphényléthers en C12-C18, des polyoxyéthylènedialkylphényléthers en C12-C18, des condensats de polyoxyéthylènealkylphényléther et de formaldéhyde en C12-C18, des copolymères séquences polyoxyéthylène-polyoxypropylène, des alkyl(C12-C18)éthers de copolymères séquences polyoxydiéthylènepolyoxypropylène, des alkyl(C12-C18)phényléthers de copolymères séquences polyoxydiéthylène-polyoxydipropylène, des polyoxyéthylène- alkylamines en C12-C18, des amides aliphatiques de polyoxyéthylène en C12-C18, des polyoxyéthylène- bisphényléthers, des polyoxyalkylène(éthylène ou propylène)- benzophényl(ou phénylphényl) éthers, des polyoxyalkylène- (éthylène et propylène)styrylphényl(ou phénylphényl)éthers, des polyoxyéthylèneéthers, des esters de silicone, des tensioactifs à base de fluor. De préférence, la quantité de tensioactif(s) dans la composition est de 5 à 20% en masse. Il est possible d'utiliser des adjuvants dans la présente composition pour améliorer le pouvoir de pénétration et de migration. Il est possible par exemple d'utiliser efficacement un copolymère de N- alkylpyrrolidone et d'alkylvinylpyrrrolidone dont les groupes alkyle sont en Cl-Cî2 ou un homopolymère de polyvinylpyrrolidone. De préférence, la quantité d'adjuvant(s) dans la composition est de 1 à 5% en masse. La présente invention concerne aussi un procédé d'obtention d'un extrait de Rehmannia glutinosa et un procédé pour purifier un extrait de tétrahydrate de stachyose présentant une activité protectrice contre le paraquat. Les procédés d'extraction et de purification selon la présente invention sont les suivants: des feuilles, des tiges ou des racines de Rehmannia glutinosa sont coupées finement ou broyées et pesées. Une quantité d'eau, d'un solvant polaire ou d'un mélange d'eau et d'un solvant polaire 4 à 5 fois supérieure à leur poids est ajoutée et le mélange est chauffé pour l'extraction. Comme solvant polaire il est possible d'utiliser un alcool comme le méthanol ou l'éthanol. Lorsque l'on utilise un mélange d'eau et d'alcool comme solvant d'extraction, la quantité d'alcool est de 20 à 80% en volume, de préférence de 30 à 60% en volume, et de préférence encore de 40 à 50% en volume. Pour augmenter la pureté de l'extrait, il est possible de répéter la première extraction faite au moyen d'un solvant polaire en utilisant le même solvant mentionné ci- dessus. On filtre l'extrait résultant de la première extraction à l'aide d'un appareillage de filtration courant tel qu'un tissu de coton, un filtre multicouche, un filtre- presse, puis on le concentre à l'aide d'un évaporateur rotatif, d'un évaporateur sous vide à cylindre courant, d'un évaporateur sous vide à membrane ou analogue. Les impuretés telles que les pigments sont retirées de l'extrait concentré au moyen d'un solvant non polaire non miscible à l'eau tel que le dichlorométhane, l'acétate de méthyle, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'éther éthylique, l'isooctane, le cyclooctane. Pour ce faire, le solvant non polaire est ajouté à l'extrait concentré obtenu et le mélange est agité. Après un moment de repos, la couche aqueuse est recueillie. Le processus ci-dessus ayant été répété deux ou trois fois, la plupart des impuretés telles que les pigments sont éliminées. Il est possible d'ajouter deux ou trois volumes d'eau ou d'un mélange d'eau et d'un alcool en C1-C4 pour faciliter la séparation de la couche aqueuse et de la couche de solvant. L'extrait obtenu peut être utilisé dans des essais en champs directement ou après avoir été dilué à l'eau, sans autre purification. L'extrait peut aussi être purifié encore pour augmenter la concentration de l'ingrédient actif. On peut obtenir un excellent effet protecteur en pulvérisant systématiquement du paraquat après avoir pulvérisé l'extrait de Rehmannia glutinosa sur les feuilles. Lorsque le traitement au paraquat est réalisé après l'application de l'extrait purifié, avec ou sans tensioactif, on n'observe aucun symptôme phytotoxique sur les plantes traitées avec l'extrait, tandis que les plantes et mauvaises herbes non traitées sont totalement détruites. Lorsque l'extrait est appliqué avec un tensioactif/adjuvant, la durée de protection des plantes peut être augmentée. Une purification plus poussée peut être faite par des procédés connus comme la chromatographie liquide haute pression (CLHP). Après la purification finale, le tétrahydrate de stachyose est confirmé par comparaison du spectre RMN obtenu avec celui du stachyose standard (Aldrich Chemical Company) et avec les données RMN présentées dans The Aldrich Library of 13C and 1H FT-NMR Spectra, 1ère édition, vol. 1, page 30, de Aldrich Chemical Company. L'extrait peut être utilisé en l'état ou, si nécessaire, concentré ou séché sous forme d'une poudre qui peut être utilisée en l'état ou diluée à une concentration appropriée pour chaque plante et déterminée par des expériences. Pour confirmer l'activité protectrice contre le paraquat de l'extrait de Rhemannia glutinosa et de la composition contenant du stachyose ou de l'hydrate de stachyose selon la présente invention, un test de vérification biologique a été réalisé sur un groupe de plantes comprenant des monocotylédones et des dicotylédones. L'extrait agit comme protecteur contre le paraquat sur toutes les plantes, monocotylédones et dicotylédones. Parmi ces plantes, les effets sont particulièrement satisfaisants sur le riz, le soja, le mais, le coton, le chou chinois, le radis, l'ananas, le gommier, le cocotier, et sur d'autres légumes et d'autres fruits. La présente invention concerne aussi des procédés pour utiliser la composition protectrice. La composition protectrice selon la présente invention peut être utilisée de différentes manières selon la situation. Dans un procédé, les semences sont plongées dans la solution diluée de composition protectrice et, si nécessaire, séchées avant d'être semées. Dans un autre procédé, la composition protectrice de la présente invention est diluée à une concentration appropriée et la solution obtenue est pulvérisée sur les feuilles des cultures. Par exemple, la composition peut être appliquée sur les cultures avant le traitement avec le paraquat. En culture extensive, le paraquat est utilisé avec précaution juste au niveau des sillons pour éviter une phytotoxicité sur les cultures. Cependant, les cultures situées sur les billons sont endommagées par les projections de paraquat. Dans ce cas, les cultures peuvent être protégées et les mauvaises herbes combattues par une application de la composition protectrice avant ou pendant l'application du paraquat. Dans un autre procédé qui peut être utilisé pour transplanter des cultures telles que le riz, le poivre rouge, le chou chinois, le radis, l'extrait ou la composition protectrice de la présente invention est pulvérisé avant ou après la transplantation des cultures dans un champ débarrassé des mauvaises herbes avant que les mauvaises herbes se développent, après quoi le paraquat est pulvérisé lorsque les mauvaises herbes poussent. Exnmmle 1 Extraction et purification du composé ayant une activité protectrice Cent grammes de racines tubéreuses de Rehmannia glutinosa lavées et coupées en tranches ont été placés dans un ballon rond de 1 litre muni d'un appareil à reflux puis 500 ml de méthanol à 80% ont été ajoutés. L'extraction a été accomplie pendant 6 heures à 80 C sous agitation intermittente. Les amas de grande taille ont été retirés à l'aide d'une toile métallique et la solution a été filtrée à l'aide d'un papier filtre pour produire 500 ml de filtrat. Le filtrat a été concentré à 100 ml dans un évaporateur rotatif à 200 tr/min et 80 C. L'extrait obtenu était un liquide brun sombre visqueux. Trois cent millilitres de dichlorométhane ont été ajoutés à la solution concentrée obtenue et le mélange a ensuite été agité. Après une heure de repos, la couche aqueuse a été retirée. Trois cent millilitres de cyclohexane ont été ajoutés à la couche aqueuse retirée et le mélange a ensuite été agité. Après une heure de repos, la couche aqueuse a été retirée de nouveau. Le processus ci-dessus a été répété trois fois pour obtenir un premier extrait purifié qui était un liquide limpide peu visqueux et sensiblement incolore. 1 5 Trente millilitres de ce premier extrait purifié ont été versés sur une colonne de 2,0 cm x 50 cm garnie de gel de silice (0,074 mm (200 mesh) pour chromatographie) qui avait déjà été équilibrée avec de l'acétate d'éthyle et du dichloroeméthane (60:40, v/v). Une élution lente a été opérée avec 500 ml d'un mélange d'acétate d'éthyle et de propanol (60:40, v/v) suivie par une élution avec le même volume d'un mélange d'acétate d'éthyle et de propanol (30:70, v/v). Parmi les fractions obtenues par élution avec 500 ml d'un mélange de méthanol et d'eau (95:5, v/v), les fractions présentant une activité protectrice ont été recueillies et concentrées à 30 ml pour obtenir un second extrait purifié qui présentait une absorption UV maximale à 280 nm et à 330 nm. Exemple 2 Purification du stachyose Un millilitre du second extrait purifié obtenu dans l'exemple 1 a été analysé par CLHP dans les conditions suivantes. Un pic important (temps de rétention: 4,87 min) a été obtenu. Pompe: TOSOH, CCPM; détecteur (à 254 nm): TOSOF, UV8010I; colonne: MERCK, C18, 10 x 250 nmm; débit: 3,0 ml/min; gradient de concentration: 0 min (H20/MeOH = 100/0, v/v), 5 min (H20/MeOH = 100/0, v/v), 20 min (H20/MeOH = 0/100, v/v), min (H20/MeOH = 0/100, v/v), 27 min (H20/MeOH = 100/0, v/v), 32 min (H20/MeOH = 100/0, v/v). Les données RMN des fractions du pic unique obtenu en CLHP étaient les suivantes: RMN 13C (100 MHz): 108,47, 104,48, 98,94, 98,66, 92,84, 81,95, 77,27, 74,85, 73,35, 71,92, 71,58, 70,23, ,10, 69,99, 69,88, 69,44, 68,93, 68,83, 67,23, 66,55, 63,27, 62,18, 61,72. RMN 1H (400 MHz): 5,44 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,01 (s, 2H), 4,25-3,50 (m, 25H). Vérification biologique sur le riz Des grains de riz sélectionnés ont été soumis à une immersion, amenés à germer et ont été plantés dans un lit de semences à riz pour croître jusqu'au stade de trois feuilles. Deux cents plants de riz au stade de trois feuilles ont été transplantés dans 20 pots en plastique (diamètre 9 cm) contenant de la terre de rizière (10 plants ont été plantés dans chaque pot). Vingt millilitres du second extrait purifié (350 ml ont été obtenus à partir de g de racines tubéreuses de Rehmannia glutinosa) ont été dilués avec 1000 ml d'eau. Cette solution a été appliquée en pulvérisation foliaire sur 15 pots. Une semaine après, du paraquat dilué dans de l'eau à une concentration de 400 ppm a été utilisé pour traiter les 20 pots. Le traitement a été réalisé par pulvérisation de la solution sur les plants de manière uniforme à l'aide d'un petit pulvérisateur. Les cinq témoins ont été traités avec le paraquat seulement. L'efficacité de l'extrait de Rehmannia glutinosa a été évaluée en comparant sur les pots traités avec l'extrait et sur les pots témoins l'apparition d'une nécrose ou d'un brunissement qui constituent le symptôme typique de la phytotoxicité par le paraquat. Comme le montre la figure 1, une nécrose est apparue au bout de 48 heures dans le cas des témoins qui ont été traités avec le paraquat seul, et les plants étaient totalement détruits au bout de 96 heures. Par contre, aucun symptôme de phytotoxicité n'est apparu pour les pots traités d'abord avec l'extrait puis avec le paraquat. 1 5 Exenmle Vérification biologique sur le chou chinois, le soja et le mais Des graines de chacune de ces plantes ont été semées dans des pots en plastique de 9 cm de diamètre contenant du sol de région montagneuse. Après que le chou chinois et le soja ont atteint le stade de deux feuilles et que le mais a atteint le stade de trois feuilles, ils ont été traités avec l'extrait dilué dans les même proportions que dans l'exemple 3. Une semaine après, du paraquat dilué à 400 ppm a été appliqué sur tous les pots. Le traitement a été réalisé par pulvérisation de la solution sur les plants de manière uniforme à l'aide d'un petit pulvérisateur. Les témoins ont été traités avec le paraquat seulement. L'efficacité de l'extrait de Rehmannia glutinosa a été estimée visuellement par observation de l'apparition d'une nécrose ou d'un brunissement. Comme le montrent les figures 2 à 4, pour les témoins qui ont été traités avec le paraquat seul, une nécrose a commencé à apparaître au bout de 12 à 24 heures et les plants étaient totalement détruits au bout de 48 heures. Par contre, aucun symptôme de phytotoxicité n'est apparu pour les pots traités d'abord avec l'extrait de Rhemannia glutinosa puis avec le paraquat. Exemple 5 Vérification de l'activité biologique du tétrahydrate de stachyose Le tétrahydrate de stachyose obtenu dans l'exemple 2 a été dilué à 0,015% avec de l'eau. La vérification de l'activité biologique du tétrahydrate de stachyose sur le chou chinois a été faite avec 200 ppm de paraquat par le procédé décrit dans l'exemple 4, et le résultat est représenté sur la figure 5. Le test ci-dessus a été réalisé aussi avec le tétrahydrate de stachyose standard de Wako Pure Chemical Industries, Ltd. par le même procédé, et le même résultat a été obtenu. Exemple 6 Préparation d'une composition protectrice Une composition protectrice contenant 1,0 % en volume de l'extrait de Rehmannia glutinosa de l'exemple 1, 25,0% en volume de nonylphénol éthoxylé, 0,5% en volume de N-dodécyl- 2-pyrrolidone, 0,5% en volume d'homopolymère de polyvinylpyrrolidone et 73,0% en volume d'eau a été préparée. REVEDICATIONS 1. Extrait de Rehmannia glutinosa caractérisé en ce qu'il a une activité protectrice contre l'herbicide paraquat. 2. Extrait selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient du tétrahydrate de stachyose. 3. Composition protectrice à activité protectrice contre le paraquat, caractérisée en ce qu'elle comprend comme constituant principal du stachyose, de l'hydrate de stachyose ou un dérivé de ceux-ci. 4. Composition protectrice selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit constituant principal est le tétrahydrate de stachyose. 1 5 5. Composition protectrice selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un tensioactif choisi dans le groupe consistant en les tensioactifs cationiques, les tensioactifs zwitterioniques et les tensioactifs non ioniques, ou au moins un adjuvant choisi dans le groupe consistant en un copolymère de N- alkyl(C1-Cî2)pyrrolidone et d'alkyl(Cl-C12)vinylpyrrolidone et un homopolymère de polyvinylpyrrolidone. 6. Composition protectrice selon la revendication 5, caractérisée en ce que la quantité dudit tensioactif est de 5 à 20% en masse et la quantité dudit adjuvant est de 1 à 5% en masse. 7. Procédé de traitement au moyen d'une composition protectrice, caractérisé en ce qu'une composition selon la revendication 3 est appliquée en traitement avant ou pendant un traitement avec le paraquat. 8. Procédé de traitement au moyen d'une composition protectrice, caractérisé en ce qu'une composition selon la revendication 4 est appliquée en traitement avant ou pendant un traitement avec le paraquat. 9. Procédé de traitement au moyen d'une composition protectrice, caractérisé en ce qu'une composition selon la revendication 5 est appliquée en traitement avant ou pendant un traitement avec le paraquat. 10. Procédé de traitement au moyen d'une composition protectrice, caractérisé en ce qu'une composition selon la revendication 6 est appliquée en traitement avant ou pendant un traitement avec le paraquat.