FR 2718138 A1 19951006 FR 9403872 A 19940401 La présente invention concerne de nouveaux stéroïdes comportant en position 20 une chaine aminosubstituée, leur procédé de préparation et les intermédiaires de ce procédé, leur application comme médicaments et les compositions phar- 5 maceutiques les renfermant. L'invention a pour objet les composés de formule (I): i/RR RSo c CH /(cCz)n N NH 2)n--N\ NH R50 dans laquelle R1 et R2, identiques ou différents, représen- tent un radical alkyle comportant de 1 à 12 atomes de carbo- ne, un radical aralkyle ayant de 7 à 15 atomes de carbone, ou forment ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont liés un hétérocycle saturé à 5 ou 6 chainons comportant éventuel-20 lement un autre hétéroatome choisi parmi l'oxygène, l'azote et le soufre, R3 en position a représente un radical alkyle comportant de 1 à 8 atomes de carbone, n désigne un nombre entier compris entre 2 et 15, R4 représente un radical alkyle comportant de 1 à 12 atomes de carbone, R5 représente un25 atome d'hydrogène, un groupement acyle comportant au plus 12 atomes de carbone ou un radical alkyle comportant au plus 12 atomes de carbone, et les traits ondulés indiquent que les centres asymétriques 17 et 20 peuvent être indépendamment de configuration absolue R ou S, ainsi que leurs sels d'addition30 avec les acides. Lorsque R1, R2, R4 et R5 représentent un groupement alkyle comportant de 1 à 12 atomes de carbone, il peut s'agir d'un radical méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tert-butyle, n-pentyle, n-hexyle, 2-méthyl penty- le, 2,3-diméthyl butyle, n-heptyle, 2-méthylhexyle, 2,2- diméthylpentyle, 3,3-diméthyl pentyle, 3-éthylpentyle, n-octyle, 2,2-diméthylhexyle, 3,3-diméthylhexyle, 3-méthyl-3- éthylpentyle, nonyle, 2,4-diméthylheptyle ou n-décyle. 2 2718138 I1 s'agit de préférence de méthyle, éthyle, isopropyle. Lorsque R1 et R2 représentent un groupement aralkyle comportant de 7 à 15 atomes de carbone, il s'agit de préfé- rence du groupement benzyle ou phénéthyle. 5 Lorsque R1 et R2 forment avec l'atome d'azote auquel ils sont liés un hétérocycle saturé à 5 ou 6 chaînons comportant éventuellement un autre hétéroatome choisi parmi l'oxygène, l'azote et le soufre, il s'agit de préférence d'un groupement pipéridino, morpholino, thiamorpholino, pipérazino ou pyrro-10 lidino. Lorsque R3 représente un groupement alkyle comportant de 1 à 8 atomes de carbone, il peut s'agir d'un radical méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tert-butyle, n-pentyle, n-hexyle, 2- méthyl pentyle, 2,3-diméthyl butyle, n-heptyle, 2-méthylhexyle, 2,2-diméthylpentyle, 3,3-diméthyl pentyle, 3-éthylpentyle. I1 s'agit de préférence de méthyle. Par groupement acyle ayant au plus 12 atomes de carbone, on entend de préférence un groupement choisi parmi acétyle, propionyle, butyryle, benzoyle, valéryle, hexanoyle, acry-20 loyle et crotonoyle. On peut également citer le groupement formyle. L'invention s'étend naturellement aux sels d'addition avec les acides des composés de formule (I), comme par exem- ple aux sels formés avec les acides chlorhydrique, bromhydri-25 que, nitrique, sulfurique, phosphorique, acétique, formique, propionique, benzoïque, maléique, fumarique, succinique, tartrique, citrique, oxalique, glyoxylique, aspartique, alcane sulfoniques tels que les acides méthane ou éthane sulfoniques, arylsulfoniques, tels que les acides benzène ou30 paratoluène sulfonique et arylcarboxyliques. On préfère les sels d'addition avec l'acide chlorhydrique. L'invention a plus spécialement pour objet les composés de formule générale (I) telle que définie précédemment dans laquelle n est égal à 2 ainsi que leurs sels d'addition avec35 les acides. L'invention a plus spécialement pour objet les composés de formule générale (I) telle que définie précédemment répon- dant à la formule générale (I'): 3 2718138 Me Me ile R XC H 1, CNH \ R H 0 dans laquelle R1 et R2 ont la même signification que précé- demment ainsi que leurs sels d'addition avec les acides. L'invention a tout spécialement pour objet les composés de formule (I) suivants: (20R) (8a,9p,13a,14P,17a) 20-(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-l,3,5(10)-trièn-3-ol, (20S) (8a,9p,13a,14P,17a) 20(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-1,3,5(10)-trièn-3-ol, (20R) (8a,9p,13a,14P,17p) 20-(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-l,3, 5(10)-trièn-3-ol, (20S) (8a,9p,13a,14P,170) 20-(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-1,3,5(10)-trièn-3-ol, ainsi que leurs sels d'addition avec les acides. L'invention a tout spécialement pour objet le composé de formule (I) suivant: (20S) (8a,9p,13a,14P,17a) 20-(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-l,3,5(10)-trièn-3-ol, ainsi que leurs sels d'addition avec les acides. L'invention a également pour objet un procédé de prépa- ration des produits de formule (I) telle que définie précé- demment et caractérisé en ce que l'on soumet le produit de formule (II): * 4 2718138 dans laquelle R3 à la même signification que précédemment, le cas échéant, à l'action d'un agent d'acylation ou d'alkyla- tion, pour obtenir le produit de formule (IIA): R3 (IIA) R 50 dans laquelle R3 a la même signification que précédemment, et R'5 a les mêmes significations que R5 telle que définies précédemment à l'exception d'hydrogène, et l'on soumet le15 produit de formule (II) ou (IIA) à l'action d'un agent de cyanuration, afin d'obtenir le produit de formule (III): - > OH C (III) dans laquelle R3 et R5 ont les mêmes significations que précédemment et dans laquelle le trait ondulé signifie que le produit se présente sous la forme de stéréoisomères purs (17a-OH, 17p-CN) ou (17a-CN, 17p- OH) ou sous la forme d'un mélange, que l'on soumet à une réaction de déshydratation afin d'obtenir le produit de formule (IV): 3 5 N(IV) R50 2718138 dans laquelle R3 et R5 ont les mêmes significations que précédemment, que l'on soumet à une réaction de réduction de la double liaison 16-17, afin d'obtenir le produit de formule (V): 5 R3 (v) RS0 dans laquelle le trait ondulé signifie que le substituant CN est en position 17a ou 17p, ou sous la forme d'un mélange 17a et 17p, et R3 et R5 ont les mêmes significations que précé- demment, que l'on soumet à l'action d'un réactif organométallique dérivé du radical R4 tel que décrit précédemment, puis à20 l'action d'un réactif d'hydrolyse acide, afin d'obtenir le produit de formule (VI): R4 (VI) dans laquelle R3, R4 et R5 ont les mêmes significations que précédemment et dans laquelle le trait ondulé signifie que le substituant COR4 est en position 17a ou 17p, ou sous la forme35 d'un mélange 17a et 17p, que l'on soumet à l'action d'un sel d'hydroxylamine afin d'obtenir le produit de formule (VII): 6 2718138 }t | (VII) 1iH R 5 0 JW Rs0 dans laquelle R3, R4 et R5 ont les mêmes significations que précédemment et dans laquelle le trait ondulé signifie que le substituant C(R4)=N-OH est en position 17a ou 17p, ou sous la forme d'un mélange 17a et 17p, et l'oxime est en position syn, anti, ou sous la forme d'un mélange syn et anti,15 que l'on soumet à une réaction de réduction de l'oxime, afin d'obtenir le produit de formule (VIII): NH2 (VIII) R50 dans laquelle le trait ondulé signifie que le substituant NIH2 est en position 20R ou 20S, ou sous la forme d'un mélange 20R et 20S, et dans laquelle R3, R4 et R5 ont les mêmes signifi- cations que précédemment, que l'on soumet à l'action d'un halogénure d'acyle de formule: X-CO-(CH2)n'-NR1R2 dans laquelle X représente un atome d'halogène, R1 et R2 sont tels que définis précédemment, n' est égal à n-l, n étant défini comme précédemment, puis, le cas échéant, à une hydro- lyse sélective en position 3 du composé diacylé formé inter- 7 2718138 médiairement, afin d'obtenir le produit de formule (IX): N Cz)n H -N\ (IX) R3 R 5 0 R Rs0 dans laquelle les traits ondulés, R1, R2, R3, R4, R5 et n' ont les mêmes significations que précédemment, que l'on soumet à une réaction de réduction du groupement céto de l'amide, puis si désiré et si nécessaire, à une ou plusieurs des réactions suivantes dans un ordre quelconque:15 acylation en position 3, - alkylation en position 3, - saponification du groupement acyloxy en position 3, - séparation des différents stéréoisomères, - salification par action d'un sel d'acide organique ou minéral. L'agent d'acylation est de préférence un dérivé d'acide carboxylique, par exemple un chlorure ou un anhydride en présence d'une base telle que la pyridine. L'alkylation éventuelle est effectuée selon les méthodes usuelles. On utilise un réactif d'alkylation qui est de préférence un halogénure d'alkyle tel que l'iodure d'alkyle ou le sulfate d'alkyle. L'agent de cyanuration est de préférence le cyanure de sodium ou de potassium. Cette réaction de cyanuration est effectuée de préférence dans un alcool inférieur tel que le méthanol en présence d'acide acétique. La réaction de déshydratation peut s'effectuer à l'aide d'un réactif de déshydratation tel que l'oxychlorure de phosphore dans la pyridine.35 La réaction de réduction de la double liaison 16-17 peut s'effectuer soit par hydrogénation catalytique, le réactif d'hydrogénation est l'hydrogène en présence de catalyseurs tel que le palladium sur charbon, ou un réactif au rhodium 8 2718138 tel que le réactif de Wilkinson, soit par action du boro- hydrure de sodium dans l'éthanol, soit par action du magné- sium dans le méthanol. Cette réduction est soit stéréospécifique et permet d'obtenir le substituant CN en position 17a ou en position 171, soit non stéréospécifique. On obtient alors un mélange de stéréoisomères (17a + 17p) que l'on sépare, le cas échéant, par les méthodes classiques telles que la cristalli- sation ou la chromatographie. Les réactifs organométalliques dérivés du radical R4 sont les réactifs classiques c'est-à-dire organolithien (R4-Li), organomagnésien (R4-Mg-X), X étant un halogène choisi parmi Cl, Br et I. Il s'agit de préférence de Br. La réaction d'hydrolyse acide qui suit la réaction avec l'organométallique, permet d'hydrolyser l'imine intermédiai- rement formée. Cette hydrolyse s'effectue dans les conditions classiques d'hydrolyse d'imine, en milieu acide tel que l'acide chlorhydrique, l'acide oxalique ou l'acide acétique. La formation de l'oxime de formule (VII) s'effectue de préférence par action du chlorhydrate d'hydroxylamine en présence d'une base telle que la pyridine, la soude ou le carbonate de sodium. La réaction de réduction du produit de formule (VII) peut s'effectuer par différentes méthodes telles que l'hydro- gènation catalytique avec comme réactif d'hydrogénation, l'hydrogène en présence de catalyseurs tels que le palladium sur charbon ou le dioxyde de platine, par action du zinc en milieu acétique, par le sodium dans un alcool tel que l'éthanol ou le npropanol, ou encore par addition de dibo-30 rane dans le diglyme. Cette réduction est soit stéréospécifique et permet d'obtenir le produit en position 20R ou en position 20S, soit non stéréospécifique. On obtient alors un mélange de stéréo- isomères 20R+20S que l'on sépare, le cas échéant, par les35 méthodes classiques telles que la cristallisation ou la chromatographie. La condensation du composé de formule X-CO-(CH2)n, -NR1R2, dans lequel X est un halogène choisi parmi Cl, Br et I et n', R1 et R2 sont tels que décrits précédemment, sur le composé de formule (VIII) s'effectue en milieu basique dans un solvant de préférence dipolaire aprotique tel que diméthylformamide (DMF). La réaction se fera de préférence 5 dans un milieu triéthylamine/diméthylformamide (TEA/DMF). L'hydrolyse sélective du composé O-acylé éventuellement formé intermédiairement, est réalisée dans les conditions usuelles à l'aide d'un agent qui peut être une base alcaline telle que la soude ou la potasse au sein d'un alcool infé-10 rieur tel que le méthanol ou l'éthanol. La réduction du groupement céto de l'amide du composé de formule (IX) s'effectue par exemple par l'intermédiaire d'un hydrure métallique tel que l'aluminohydrure de lithium (AlLiH4) dans un solvant polaire aprotique tel que le tétra- hydrofuranne (THF) ou l'éther, ou par l'intermédiaire de borohydrures alcalins tels que le borohydrure de sodium (NaBH4) en présence d'acides tels que l'acide acétique. Si désiré et si nécessaire, les réactions d'acylation ou d'alkylation du groupement -OH en position 3 s'effectuent par les méthodes telles que décrites précédemment. La réaction de saponification, si désiré et si néces- saire, s'effectue en présence, de préférence, d'une base alcaline comme la soude ou la potasse, le terbutylate de potassium ou l'acétylure de lithium dans l'éthylène amine. La25 réaction de saponification a lieu, de préférence, au sein d'un alcool inférieur, comme le méthanol ou l'éthanol. La séparation, si désirée et si nécessaire, des diffé- rents stéréoisomères, s'effectue selon les méthodes classi- ques de cristallisation ou de chromatographie.30 La salification par un acide est réalisée dans les conditions usuelles. On opère de préférence avec l'acide chlorhydrique, par exemple en solution éthérée. Lors de l'action d'un agent de cyanuration conduisant au produit de formule (III), d'un réactif organométallique conduisant au produit de formule (VI) ou du sel d'hydroxyla- mine conduisant au produit de formule (VII), on peut obtenir un produit de formule (III), (VI) ou (VII) dans lequel le groupement acyloxy est hydrolysé. L'invention s'étend à un procédé tel que défini précé- demment dans lequel le produit de formule (III), (VI) ou (VII), dans lequel le groupement acyloxy qui a été hydrolysé, est réacylé le cas échéant. Les produits de formules (V), (VI), (VII), (VIII) et (IX) sont éventuellement obtenus lors de leur procédé de préparation sous la forme d'un mélange de stéréoisomères. Ces produits sont, si désiré ou si nécessaire, soumis à des opérations de séparation de ces stéréoisomères.10 L'invention s'étend donc à un procédé tel que défini précédemment dans lequel les différents stéréoisomères obte- nus lors des procédés de préparation des produits de formules (V), (VI), (VII), (VIII) et (IX) sont, le cas échéant, sépa- rés. Les produits selon l'invention présentent 1) une forte affinité pour les récepteurs Sigma (voir les tests pharmacologiques) 2) une activité vis-à-vis de l'influx du calcium dans le spermatozoïde. Les résultats des tests montrent que parmi les produits se fixant sur les récepteurs Sigma, certains agissent en stimulant l'influx de calcium dans le spermatozoïde, d'autres en inhibant l'influx du calcium stimulé ou non par la pro- gestérone, molécule décrite comme se liant au récepteur25 Sigma. Ces propriétés justifient leur application en thérapeu- tique et l'invention a également pour objet, à titre de médicaments, les produits tels que définis par la formule (I) ci- dessus, ainsi que leurs sels d'addition avec les acides30 pharmaceutiquement acceptables. La présente invention a particulièrement pour objet à titre de médicaments les produits répondant à la formule (I') telle que définie précédemment ainsi que leurs sels d'addi- tion avec les acides pharmaceutiquement acceptables.35 La présente invention a plus particulièrement pour objet à titre de médicaments les composés de formule générale (I) suivants: il 2718138 - (20R) (8a,9p, 13a,143,17a) 20-(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-l,3,5(10)- trièn-3-ol, - (20S) (8a,9p,13a,14P,17a) 20-(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-l,3,5(10)-trièn-3-ol, (20R) (8a,9p,13a,14P,17p) 20-(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-l,3,5(10)-trièn-3-ol, - (20S) (8a,9p,13a,14P,17p) 20-(((diméthylamino) éthyl) amino) 19- norpregna-l,3,5(10)-trièn-3-ol, ainsi que leurs sels d'addition avec les acides pharmaceuti-10 quement acceptables. Parmi les médicaments de l'invention on peut citer tout particulièrement le composé de formule générale (I) suivant: - (20S) (8a, 9p,13a,14P,17a) 20-(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-l,3, 5(10)-trièn-3-ol, ainsi que leurs sels d'addition avec les acides pharmaceuti- quement acceptables. Les produits de formule (I) ayant une activité agoniste stimulent l'influx du calcium dans le spermatozoïde. Les médicaments correspondants selon l'invention peuvent être20 utilisés dans le traitement de certaines formes de stérilité, caractérisées par un pouvoir fécondant insuffisant des sper- matozoïdes. Les produits de formule (I) ayant une activité antago- niste, inhibent l'influx du calcium dans le spermatozoïde. Les médicaments correspondants selon l'invention sont donc potentiellement utilisables dans le contrôle de la réaction acrosomiale et interviennent par conséquent sur le pouvoir fécondant du spermatozoïde. Ils peuvent donc être utilisés comme contraceptif et en particulier comme contraceptif30 masculin. Ils peuvent aussi être utilisés dans le domaine vétéri- naire comme contraceptif mâle chez les animaux de compagnie (chiens, chats...) ou pour limiter la prolifération de toute espèce nuisible, en particulier les rongeurs ou les pigeons. La posologie utile varie en fonction de l'affection à traiter et de la voie d'administration. Elle peut varier par exemple de 10 à 1000 mg par jour chez l'adulte par voie orale. 12 2718138 L'invention s'étend aux compositions pharmaceutiques renfermant comme principe actif au moins un médicament tel que défini ci-dessus. Les composés de formule (I) sont utilisés par voie digestive, parentérale ou locale, par exemple, par voie percutanée en particulier chez la femme, ou par voie injecta- ble, en particulier sous cutanée, dans le domaine vétéri- naire. Ils peuvent être prescrits sous forme de comprimés simples ou dragéifiés, de gélules, de granulés, de supposi-10 toires, de préparation injectables, d'ovules et en particu- lier d'ovule vaginal, de pommades, de crèmes, de gels, de microsphères, d'implants, de patchs, lesquels sont préparés selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols,20 les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs. L'invention a également pour objet à titre de produits industriels nouveaux utiles notamment dans la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, les produits de formules (IIA),25 (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII) et (IX). Le produit de formule (II) est accessible selon les procédés décrits dans les références suivantes: - J.H. HUTCHINSON et al. Tétrahedron Letters 1985 26(15) p. 1819-1822 - L.L. SMITH et al. J. Am. Chem. Soc. 1966 3120-3128. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1: (20S) (8a,9p,13a,14P,17a) 20-amino 19-norpregna- 1,3,5(10)trièn-3-ol Stade A: 8a,9p,13a,14P 3-acétyloxy-estra-l,3,5(10)-trièn-17one A une suspension de 33,3 g d'estrone antipodale (prépa- ration décrite dans J.H. HUTCHINSON et al. Tétrahédron 13 2718138 Letters 1985 26(15) p. 1819-1822) dans 67 ml de pyridine, on ajoute 33,5 ml d'anhydride acétique. On observe une dissolu- tion légèrement exothermique la température s'élevant de 18 C à 32 C. On agite 18 heures à 18 2 C puis on verse dans un mélange eau glacée (660 ml)/acide chlorhydrique 22OBé (76 ml). Après cristallisation, on laisse au repos la suspen- sion pendant 1 heure, filtre, lave à l'eau et sèche. On obtient 38,7 g du produit brut attendu que l'on purifie par recristallisation par chaud et froid dans 83 ml d'alcool10 absolu et traitement sur charbon, passage au L2S, après filtration et séchage on obtient 32,7 g du produit recherché (F = 128 C). Stade B: (8a,9p,13a,14P,17p)-3-(acétyloxy) 17-hydroxy- estra- 1,3,5(10)-triène-17-carbonitrile A une solution, sous gaz inerte, de 32,7 g d'acétate d'estrone préparé selon le stade A, dans 654 ml de méthanol et 5,1 vol (167 ml) d'acide acétique, on introduit 91,6 g de cyanure de potassium, et on agite 16 heures à température ambiante. On ajoute ensuite à la suspension 330 ml d'un20 mélange glace-eau. Après observation d'une importante cris- tallisation, on verse dans 3 litres d'eau glacée, filtre et lave à l'eau. Le produit brut non séché est redissous dans 1,2 1 d'acétate d'éthyle, la phase organique est lavée, séchée, filtrée et concentrée jusqu'à cristallisation. Après refroidissement à -10 C pendant 1 heure, on filtre lave et sèche. On obtient 27,2 g de produit attendu (F=198-2000C). Stade C: (8a,9p,13a,14p) 3-hydroxy-estra-1,3,5(10),16- tétraène-17carbonitrile On chauffe au reflux pendant 4 heure 27,2 g du produit obtenu au stade B dans 82 ml de pyridine et 25 ml d'oxychlo- rure de phosphore. Puis on refroidit à 200C et verse sur 450 ml de glace pilée. Après observation d'une précipitation exothermique on ajoute de l'acide sulfurique dilué au 1/5 afin d'obtenir un pH voisin de 1. On extrait avec de l'acé-35 tate d'éthyle, lave à l'eau puis avec une solution de bicar- bonate de sodium, sèche, filtre et évapore à sec sous pres- sion réduite. Le résidu est redissous dans 60 ml d'éthanol, puis on maintient sous agitation pendant 1 heure à 0 C, 14 2718138 filtre et sèche. On obtient 17,7 g du produit attendu (F=120 C). Stade D: (8a,9 ,13a,14P,17a)-3-hydroxy-estra-1,3,5(10)- triène 17-carbonitrile 5 A une suspension sous azote de 17,7 g de produit obtenu au stade C dans 354 ml d'acétate d'éthyle et 8,85 g d'hydroxyde de palladium à 10 % sur charbon on introduit 1,425 1 d'hydrogène en 14 minutes et on agite pendant 30 mn. On filtre, évapore à sec sous pression réduite, redissout l'extrait sec dans 90 ml d'éthanol, agite pendant une heure à la température de -10 C, essore et sèche. On obtient 15,35 g du produit attendu (F=144,5 C; (a)D= -100 (c = 1 % CHC13)). Stade E: (8a,9f,13a,14P,17a)3-hydroxy-19-norpregna- 1,3,5(10)-trièn-20-one A un mélange, sous gaz inerte, de 46 g de tournures de magnésium dans 307 ml de benzène et 307 ml d'éther on ajoute au reflux 121 ml d'iodure de méthyle en une heure. On chauffe au reflux pendant 30 mn et on introduit la solution préparée extemporanément de 15,35 g du produit obtenu au stade D dans20 154 ml de benzène et 154 ml d'éther. On agite au reflux pendant 93 heures. On arrête le reflux et verse lentement la suspension dans un mélange eau/glace, et ajoute 340 ml d'acide acétique (pH = 4). Après concentration, on essore, lave et sèche. On obtient 13,7 g du produit brut que l'on25 purifie dans 840 ml d'acétone et 0,6 g de charbon actif 3SA, filtre, concentre à 5 vol., agite pendant une heure à la température de -10 C, essore et sèche. On obtient 12,2 g du produit attendu (F = 2480C, (a)D= -156,6 (c = 0,5 % CHC13)). Stade F: (8a,9p, 13a,14P,17a) 20-hydroxyimino-19-norpregna-30 1,3,5(10)-trièn-3-ol A une solution, sous azote, de 10 g du produit obtenu au stade E, dans 100 ml de pyridine on ajoute 4,5 g de chlorhy- drate d'hydroxylamine et on chauffe à 80-85 C pendant 1 heure 30. On ajoute ensuite 310 ml d'eau déminéralisée et observe une cristallisation du produit que l'on essore et recristal- llise dans 120 ml d'éthanol au reflux. On ajoute de nouveau ml d'eau déminéralisée et observe une cristallisation importante du produit. On agite 30 mn à 0 C, essore, et sèche. On obtient 9,45 g de produit attendu (F = 2340C). Stade G: (20S) (8a,9p,13a,14P,17a) 20-amino 19-norpregna- 1,3,5(10)trièn-3-ol A une suspension de 2,94 g de dioxyde de platine dans 304 ml d'acide acétique on ajoute 7,35 g du produit obtenu au stade F dans 550 ml (+ 368 ml de rinçage) d'acide acétique et on effectue l'hydrogénation avec un volume total absorbé de 1075 ml d'hydrogène en 6 h 30. Obtention du chlorhydrate: Après filtration on effectue une concentration sous pression réduite jusqu'à obtention d'un extrait sec que l'on reprend dans un milieu acide constitué par un mélange de 4,15 ml d'acide chlorhydrique dans 53,5 ml d'éthanol et 1,2 ml d'eau. On ajoute à la solution obtenue 92 ml d'éther, agite à 0"C pendant 1 heure, essore et sèche. Le chlorhydrate brut est recristallisé par dissolution au reflux dans 50 ml d'éthanol à 0,5 % d'acide chlorhydrique et agitation pendant 1 heure à 0+5 C et essoré. Obtention de la base: A une solution du chlorhydrate purifié dans un mélange basique constitué de 11 ml de triéthylamine, 64 ml d'éthanol et 27 ml d'eau au reflux, on ajoute lentement à chaud 140 ml d'eau déminéralisée, observe une cristallisation, agite pendant 1 heure à 0+ 5 C, essore et sèche. On obtient 3,77 g25 de la base brute que l'on purifie par dissolution au reflux dans 120 ml d'éthanol, concentration à pression normale et sous azote jusqu'à un volume de 40 ml, agite 1 heure à 0 +5 C, essore, et sèche. On obtient 3,285 g de produit attendu (F = 235 C). Stade H: (20S) (8a,9p,13a,14P,17a) 2-diméthylamino N-(3- hydroxy 19norpregna-l,3,5(10)-trièn-20-yl) acétamide A une solution sous gaz inerte du produit obtenu au stade G dans 91,5 ml de DMF et 28,4 ml de TEA, obtenue à 800C puis refroidie à +5 C, on ajoute rapidement 12 g de chlorhy-35 drate de chlorure de N,N' diméthyle glycine, agite pendant 3 heures et verse dans une solution saturée de 370 ml de carbonate acide de sodium dans 550 ml de glace + eau. On agite pendant 1 heure et extrait avec 3 fois 100 ml de dichlorométhane et lave avec de l'eau puis une solution de bicarbonate de sodium, puis une solution d'eau salée. Les solutions organiques sont réunies et concentrées sous pres- sion réduite jusqu'à obtention d'un extrait sec de 6 g. 5 Le résidu est repris, sous gaz inerte, dans 37 ml de méthanol et 11 ml de soude 5N, on agite pendant 1 heure jusqu'à dissolution totale, ajoute lentement 220 ml d'eau déminéralisée, fait barboter du gaz carbonique (pH 8), ajoute 14,7 ml de TEA, agite 15 mn, extrait avec 250 ml puis 100 ml de dichlorométhane, lave avec 5 fois 100 ml d'eau, sèche la solution organique, traite sur charbon actif 3SA, filtre, concentre sous pression réduite jusqu'à obtention d'un extrait sec (huile) que l'on recristallise par deux entraînements à l'éthanol. On obtient 6,15 g de produit brut15 attendu que l'on dissout au reflux dans 80 ml d'éthanol, traite avec du charbon actif L2S, filtre, concentre à pres- sion normale jusqu'à un volume de 40 ml, observe une cristal- lisation, ajoute 10 ml d'eau, agite 1 heure à 00+50C, essore, et sèche. On obtient 3,03 g de produit attendu (F=226 C).20 Stade I: (20S) (8a,9p,13a, 14p,17a) 20-(((diméthylamino) éthyl) amino 19-norpregna-1,3,5(10)-trièn- 3-ol A une suspension, sous gaz inerte, de 1,845 g d'hydrure de lithium et d'aluminium et de 5,25 g de chlorure d'alumi- nium dans 131 ml de THF, on ajoute à la température de 20 C25 3,03 g duproduit obtenu au stade H et porte au reflux pen- dant 24 heures. Après refroidissement à 0+5 C on ajoute 20 ml d'acétate d'éthyle puis 100 ml d'une solution saturée de chlorure de sodium. La suspension est filtrée, puis successi- vement reprise par un mélange eau/HCl 6N (80 ml/50 ml),30 filtrée, reprise par 60 ml d'éthanol à 60 % et 8 ml de TEA et filtrée. On ajoute de l'eau à la solution, observe une précipita- tion, extrait avec du dichlorométhane, lave, sèche, traite sur charbon actif L2S, et concentre sous pression réduite35 jusqu'à obtention d'un extrait sec de 1,9 g. Cet extrait sec est dissous au reflux dans 60 ml d'acétate d'éthyle et 4 gouttes de TEA pendant 15 mn, puis on concentre sous pression réduite jusqu'à obtention d'un volume de 30 ml, refroidit pendant 1 heure à 0+5 C, essore et sèche. On obtient 1,03 g du produit attendu (F=177 C, (a)D= -80,6 (c=0,5 % EtOH)). Analyse pour: C24H38ON2 = 370,56 C H N % calculés: 77,78 10,34 7,56 % trouvés: 77,9 10,3 7,4 TESTS PHARMACOLOGIQUES METHHODE Préparation des spermatozoïdes humains10 Le sperme humain provient de donneurs sains. Les sperma- tozoïdes mobiles sont séparés par centrifugation sur gradient de Percoll (47,5-95 %) puis remis en suspension dans un milieu BWW hypertonique contenant: NaCl 166 mM, KCl 5 mM, CaC12 1,3 mM, KH2PO4 1,2 mM, MgSO4 1,2 mM, glucose 5,5 mM,15 lactate de sodium 21 mM, pyruvate de sodium 0,25 mM, NaHCO3 mM, Hepes 20 mM et 0,8 % de HSA (410 mosm/litre), pH 7,4 à température ambiante. Mesure du calcium intracellulaire Les spermatozoïdes mobiles sont incubés au minimum pendant 2 heures dans le milieu capacitant BWW/HSA. Ils sont ensuite incubés (à une concentration de 5-10 x 106/ml) avec du Fura2-AM (concentration finale 2 pM) à 37 C pendant 45 minutes. Après lavage (par centrifugation) à 600 g pendant mn dans du BWW sans HSA, les spermatozoïdes sont remis en suspension à une concentration de 4 x 106/ml. Le signal de fluorescence est mesuré à 37 C à l'aide d'un spectrofluori- mètre à des longueurs d'onde d'excitation de 340 et 380 nm (PTIM 2001Kontron) ou à 340, 360 et 380 nm (Hitachi F 2000 - B. Braun Science Tec.). L'émission de fluorescence est enre- gistrée à 505 nm. La progestérone ou les produits à tester, dissous dans l'éthanol absolu, sont ajoutés au milieu d'incu- bation à une concentration finale de 0,1 % d'éthanol. Lors- qu'un effet antagoniste de la progestérone est recherché, le produit est ajouté au milieu 2 mn avant la progestérone. A la35 fin de chaque dosage, 5 gM de ionomycine sont ajoutés à l'échantillon afin de mesurer le signal de fluorescence maximum; puis les spermatozoïdes sont perméabilisés avec 0,05 % de Triton X-100 et 10 mM d'EGTA sont ajoutés (pH 9,5) afin de mesurer le signal de fluorescence minimum. Ces valeurs permettent de calculer la concentration intracellu- laire en calcium ([Ca2+]i) selon la méthode décrite par Grunkiewicz et al (Grunkiewicz G., Poenie M. and Tsien R.Y. 5 (1985) J. Biol. Chem. 260, 3440-3450). Les résultats des concentrations en calcium intracellulaire sont exprimés par rapport au nivau basal pris arbitraitement égal à 1. Récepteur sigma: mesure de l'affinité relative de liaison L'affinité relative de liaison est évaluée sur des préparations de membranes de cerveau et de testicules de rat. Préparation des membranes: Des rats mâles Sprague-Dawle provenant d'Iffa Credo et pesant environ 200 g sont utilisés. Les animaux sont sacri- fiés par décapitation, le cerveau et les testicules sont15 prélevés et homogénéisés dans 10 à 25 volumes de tampon Tris- HCl 50 mM (pH 7,7) à 4 C, à l'aide d'un Ultrathurax. Les homogénats sont centrifugés à 30 000 g pendant 15 mn à 4 C, les culots sont ensuite lavés 3 fois par remise en suspension (dans le même tampon) et centrifugation dans les mêmes condi- tions. Les membranes ainsi obtenues sont conservées à -80 C. Incubation: Le marqueur des récepteurs sigmna utilisé est le 3H PPP (propyl-3-(3-hydroxyphényl) pipéridine de NEN possédant une activité spécifique de 3404 GBq/mmol. Les membranes sont remises en suspension dans du tampon Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 de façon à avoir une concentration en protéines d'environ 0,6 mg/ml pour les testicules et i mg/ml pour le cerveau. Des aliquotes d'homogénat sont incubées pendant 90 mn à 25 C (dans un volume total de 0,5 ml) avec30 3nM de 3H PPP en présence de concentrations croissantes de produit de référence (halopéridol) ou des produits à tester. A la fin de l'incubation, le 3H PPP lié aux membranes est séparé du 3H PPP libre par filtration rapide sur des filtres Whatman GF/C préalablement prétraités avec 0,05 % de poly-35 éthylèneimine. Le précipité est ensuite lavé 2 fois avec 5 ml de tampon Tris-HCl. Le comptage de la radioactivité est effectué après addition de 20 ml de liquide scintillant Aqualyte (Baker). 19 2718138 Calcul de l'affinité relative de liaison (ARL): Les deux courbes suivantes sont tracées: pourcentage du marqueur tritié lié 100 x B/BO en fonction du logarithme de la concentration du produit de référence froid ou en fonction 5 du logarithme de la concentration du produit froid testé. La droite d'équation suivante est déterminée: I50 = 100(BO/BO+Bmin/BO)/2 soit I50=100(l+Bmin/BO)/2 = 50(l+Bmin/BO) BO = concentration du marqueur tritié lié en l'absence de10 tout produit froid. B = concentration du marqueur tritié lié en présence d'une concentration X de produit froid. Bmin = concentration du marqueur tritié lié en présence d'un grand excès du produit de référence froid (5 000 nM).15 Les intersections de la droite I50 et des courbes, permettent d'évaluer les concentrations du produit de réfé- rence froid (CH) et du produit froid testé (CX) qui inhibent de 50 % la liaison spécifique du marqueur tritié sur le récepteur. L'affinité relative de liaison (ARL) du produit20 testé est déterminée par l'équation: ARL = 100 (CH)/(CX). L'ARL de l'halopéridol est prise arbitrairement égale à 100. TESTS PHARMACOLOGIQUES 1 - Affinité relative de liaison (ARL) pour le récepteur Sigma Cerveau Testicule (rat) (rat) Réf: Halopéridol 100,0 100,0 Progestérone 0,7 0,3 Estrone Produit de l'exemple 1 (produit U) 4,3 58,0 2 - Mesure du calcium intracellulaire Effet de la progestérone 10-5M après 2 minutes de prétraitement par le produit U, à différentes doses 10-8M à -5M sur [Ca2+]i Mean SEM n = 3 PROG. U10-8M U1O-7M U106M U10-5M seule + PROG + PROG + PROG + PROG 3,67 0,97 3, 33 0,87 4,26 1,93 2,63 0,57 l,0 0,0 Les résultats sont exprimés par rapport au niveau basal pris égal à 1. Valeur du niveau basai dans les trois expériences 176.70 22.90 nM. Effet antagoniste du produit de l'exemple 10-5M sur l'effet de PROG 105M. Mean SEM n = 8 PROG. 10 5M seule U10-5M seul Prétraitement 2 mn avec U10O5M + PROG. 10-5M ,76 0,84 0,95 0,05 0,95 0,05 Les résultats sont exprimés par rapport au niveau basai pris égal à 1. CONCLUSION: Effet sur le calcium intracellulaire des spermatozoïdes humains La progestérone à la concentration de 10-5 M induit une augmentation transitoire du [Ca2+]i suivie d'une deuxième phase ou le [Ca2+]i est légèrement supérieur au niveau basal.30 Le produit de l'exemple (à 10-5M) quant à lui antagonise complètement l'effet de la progestérone lorsqu'il est ajouté au milieu 2 mn avant celle-ci. Affinité relative de liaison (ARL) pour le récepteur sigma Ce produit ainsi que la progestérone, sont capables de déplacer le 3H PPP. Les ARL calculées sur des membranes de cerveau de rat ont également été évaluées sur testicules et sont données dans le tableau. Les différences observées entre les ARLs au niveau du cerveau et des testicules pourraient s'expliquer par une répartition différente des divers types de sites du récepteur sigmna entre ces deux organes. De tels produits pourraient donc inhiber la réaction acrosomiale (étape essentielle de la fertilisation) dans le cas des agonistes comme le produit de l'exemple 1 et donc10 être utilisés dans la contraception masculine. 22 2718138 REVENDICATIONS 1) Les composés de formule (I): 5.3 i C H (C H 2z)nn N N H oH| Z (I) H R 2M R5O dans laquelle R1 et R2, identiques ou différents, représen- tent un radical alkyle comportant de 1 à 12 atomes de carbo- ne, un benzyle ou forment ensemble avec l'azote auquel ils15 sont liés un hétérocycle saturé à 5 ou 6 chainons comportant éventuellement un autre hétéroatome choisi parmi l'oxygène et l'azote, R3 en position a représente un radical alkyle comportant de 1 à 8 atomes de carbone, n désigne un nombre entier compris entre 2 et 15, R4 représente un radical alkyle20 comportant de 1 à 12 atomes de carbone, R5 représente un atome d'hydrogène, un groupement acyle comportant au plus 12 atomes de carbone ou un radical alkyle comportant au plus 12 atomes de carbone, et les traits ondulés indiquent que les centres asymétriques 17 et 20 peuvent être indépendamment de25 configuration R ou S. 2) Les composés de formule générale (I) telle que définie à la revendication 1, dans laquelle n=2, ainsi que les sels d'addition avec les acides. 3) Les composés de formule générale (I) telle que définie à la revendication 1, de formule générale (I'): R, v: |[ / R: " 9 4; 4 / - - \: ( I') X X 5 - À zR H O 23 2718138 dans laquelle R1 et R2 ont la même signification que précé- demment ainsi que leurs sels d'addition avec les acides. 4) Les composés de formule (I) telle que définie à la reven- dication 1, dont les noms suivent: - (20R) (8a,9p,13a,14P,17a) 20-(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-l,3,5(10)-trièn-3-ol, - (205) (8a,9p,13a, 14P,17a) 20-(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-l,3,5(10)- trièn-3-ol, (20R) (8a,9p,13a,14P,17p) 20-(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-l,3,5(10)-trièn-3-ol, - (20S) (8a,9p,13a,14P,17p) 20(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-l,3,5(10)-trièn-3-ol, ainsi que leurs sels d'addition avec les acides. 5) Le composé de formule (I) telle que définie à la revendi- cation 1, dont le nom suit: - (20S) (8a,9p,13a,14P,17c) 20(((diméthylamino) éthyl) amino) 19-norpregna-l,3,5(10)-trièn-3-ol, ainsi que ses sels d'addition avec les acides. 6) Un procédé de préparation des produits de formule (I) telle que définie à la revendication 1 et caractérisé en ce que l'on soumet le produit de formule (II): _ 3 (II) dans laquelle R3 a la même signification qu'à la revendica- tion 1, le cas échéant, à l'action d'un agent d'acylation ou d'alkylation, pour obtenir le produit de formule (IIA): (IIA) 24 2718138 dans laquelle R3 a la même signification que précédemment, et R'5 a les mêmes significations que R5 telles que définies à la revendication 1, à l'exception d'hydrogène et l'on soumet le produit de formule (II) ou (IIA) à l'action d'un agent de 5 cyanuration, afin d'obtenir le produit de formule (III): R3 OH CN (III) R 0 dans laquelle R3 et R5 ont les mêmes significations que précédemment et dans laquelle le trait ondulé signifie que le produit se présente sous la forme de stéréoisomères purs (17a-OH, 17P-CN) ou (17a-CN, 17P-OH) ou sous la forme d'un mélange que l'on soumet à une réaction de déshydratation afin d'obtenir le produit de formule (IV):20 CN (IV) dans laquelle R3 et R5 ont les mêmes significations que précédemment, que l'on soumet à une réaction de réduction de la double30 liaison 16-17, afin d'obtenir le produit de formule (V) C SXS (V)N (V) 2718138 dans laquelle le trait ondulé signifie que le substituant CN est en position 17a ou 17 , ou sous la forme d'un mélange 17a et 17p, et R3 et R5 ont les mêmes significations que précé- demment, 5 que l'on soumet à l'action d'un réactif organométallique dérivé du radical R4, tel que décrit à la revendication 1, puis à l'action d'un réactif d'hydrolyse acide, afin d'obtenir le produit de formule (VI): t3t (VI) dans laquelle R3, R4 et R5 ont les mêmes significations que précédemment et dans laquelle le trait ondulé signifie que le substituant COR4 est en position 17a ou 17p, ou sous la forme20 d'un mélange 17a et 17p, que l'on soumet à l'action d'un sel d'hydroxylamine afin d'obtenir le produit de formule (VII): (VII) R5,3 dans laquelle R3, R4 et R5 ont les mêmes significations que précédemment et dans laquelle le trait ondulé signifie que le substituant C(R4)=N-OH est en position 17a ou 17p, ou sous la forme d'un mélange 17a et 17p, et l'oxime est en position syn, anti ou un mélange syn et anti, que l'on soumet à une réaction de réduction de l'oxime, afin d'obtenir le produit de formule (VIII): NH2 (VIII) W R50 dans laquelle le trait ondulé signifie que le substituant NH2 est en position 20R ou 20S, ou sous la forme d'un mélange 20R et 20S, et dans laquelle R3, R4 et R5 ont les mêmes signifi- cations que précédemment, que l'on soumet à l'action d'un halogénure d'acyle de formule15 X-CO-(CH2)n,-NR1R2 dans laquelle X représente un atome d'halogène, R1 et R2 sont tels que définis à la revendication 1, n' est égal à n-l, n20 étant défini comme à la revendication 1, puis, le cas échéant, à une hydrolyse sélective en position 3 du composé diacylé formé intermédiairement, afin d'obtenir le produit de formule (IX): v P > / / N ' \ - '{./j].... -3 (IX) R, Rs50 dans laquelle les traits ondulés, R1, R2, R3, R4, R5 et n' ont les mêmes significations que précédemment, que l'on soumet à une réaction de réduction du groupement céto de l'amide, puis si désiré et si nécessaire, à une ou plusieurs des réactions suivantes dans un ordre quelconque: - acylation en position 3, - alkylation en position 3, - saponification du groupement acyloxy en position 3, - séparation des différents stéréoisomères, - salification par action d'un sel d'acide organique ou minéral. 7) A titre de médicament, les composés de formule (I) telle que définie à la revendication 1, ainsi que les sels d'addi- tion avec les acides pharmaceutiquement acceptables. 8) A titre de médicament, les composés de formule (I) tels que définis à l'une quelconque des revendications 2 à 4, ainsi que les sels d'addition avec les acides pharmaceutique- ment acceptables. 9) A titre de médicament, le composé de formule (I) tel que défini à la revendication 5, ainsi que les sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables. ) Les compositions pharmaceutiques renfermant comme prin- cipe actif l'un au moins des médicaments définis à l'une quelconque des revendications 7 à 9. 11) A titre de produits industriels nouveaux, les produits de formules (IIA), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII) et (IX) tels que définis à la revendication 6.