FR 2712494 A1 19950524 FR 9313578 A 19931115 1 2712494 Procédé d'obtention d'une composition expectorante à partir d'extrait d'Erysimum officinal ainsi que composition expectorante obtenue à partir d'Erysimum officinal"." La présente invention concerne un procédé d'obtention d'une composition expectorante d'origine végétale, c'est-à-dire d'une composition de nature à faciliter le rejet des substances qui se trouvent dans les poumons et/ou dans les bronches. On propose actuellement sur le marché de nombreuses compositions expectorantes destinées à être administrées par voie orale ou injectées notamment par voie parentérale lorsqu'un traitement particulièrement rapide et efficace s'avère nécessaire; la quasi totalité de ces compositions renferment, en tant que principes actifs, des produits préparés par synthèse chimique qui sont de moins en moins bien acceptés par les patients qui, dans la mesure du possible, préfèrent les médecines dites "douces". Parmi ces principes actifs, l'un de ceux qui sont actuellement considérés comme les plus efficaces est l'ambroxol qui peut être mis en oeuvre dans des médicaments destinés à être administrés par voie orale tels que le Muxol (marque déposée) sous forme de solution buvable ou de comprimé, ou dans des médicaments destinés à être injectés par voie parentérale tels que le Surbronc (marque déposée); des études pharmacologiques et histologiques ont permis de prouver que l'ambroxol facilite la mobilisation puis l'expectoration des sécrétions de l'arbre trachéo- bronchique chez les malades présentant un encombrement des voies respiratoires. Indépendamment de ce qui précède, il est traditionnellement admis, sans que cela n'ait jamais été démontré expérimentalement, qu'une plante de la famille des Brassicaceae: l'Erysimum officinal, sisymbrium. officinale, Brassicaceae appelé aussi "herbe aux chantres" ou Erysimum vélar en France, possède des propriétés expectorantes. Ces propriétés ont déjà été utilisées dans la composition d'une spécialité anti- enrouement, les pastilles ou le sirop EUPHON (marque déposée), qui renferment de l'Erysimum associé à un autre principe actif, la codéine dont l'action antitussive est bien connue des spécialistes. L'idée à la base de l'invention consistait à préparer et étudier différents extraits d'Erysimum, à partir de matériel frais ou sec, dans le but de vérifier les propriétés traditionnellement admises de cette plante, à analyser la composition de ces extraits pour comparer les extraits préparés à partir de matériel frais et sec et tenter d'y découvrir la présence de principes actifs pouvant être à l'origine de ces propriétés, et à isoler ces principes actifs de façon à permettre de préparer des compositions expectorantes d'origine végétale ayant une efficacité pouvant être comparée à celle de médicaments obtenus par synthèse chimique qui sont actuellement sur le marché. Ces recherches ont été couronnées de succès et ont permis, de manière surprenante, de mettre au point un procédé permettant d'obtenir une composition expectorante apte à satisfaire aux impératifs susmentionnés. Selon l'invention, ce procédé est caractérisé en ce que l'on prépare un extrait stabilisé et concentré d'Erysimum officinal, on soumet cet extrait à une nébulisation de façon à obtenir une poudre soluble dans l'eau et dans l'alcool, on soumet cette poudre à au moins deux étapes de lavage successives par des solvants de polarité croissante, on prépare une solution aqueuse à partir du résidu sec obtenu à l'issue de_ ce lavage, on soumet cette solution à au moins une étape d'extraction par le chloroforme et on conserve la phase aqueuse que l'on soumet à des étapes de traitement ultérieures de concentration et/ou d'extraction et/ou de fractionnement. Conformément à l'invention, les solvants utilisés lors du lavage peuvent avantageusement être l'éther de pétrole puis l'acétate d'éthyle. Selon une autre caractéristique de l'invention, on soumet la phase aqueuse obtenue à l'issue de l'extraction par le chloroforme, à au moins une étape d'extraction par le butanol et l'on conserve à la fois la phase aqueuse et la phase organique que l'on soumet séparément à des étapes de traitement ultérieures. On a, en effet, pu vérifier par l'expérience que, alors que, lors des étapes d'extraction par l'éther de pétrole, l'acétate d'éthyle et le chloroforme, les principes actifs responsables des propriétés expectorantes restent tous dans la phase aqueuse, lors de l'étape d'extraction par le butanol, ceux-ci se répartissent de manière essentiellement égale dans la phase aqueuse et dans la phase organique qui doivent, chacune, subir une purification ultérieure pour permettre d'obtenir une composition commercialement utilisable. Pour permettre une purification de cette phase organique, il s'est avéré avantageux, selon une autre caractéristique de l'invention, de soumettre celle-ci à une étape de fractionnement par chromatographie en phase liquide sur une colonne de silice moyenne pression, en utilisant, en tant qu'éluant, un mélange méthanol/chloroforme dont la concentration en méthanol augmente dans le temps de 0 à 50 %; il est ainsi possible de séparer huit fractions distinctes dont certaines se sont révélées particulièrement actives. La purification de la fraction aqueuse obtenue à l'issue de l'extraction par le butanol peut, quant à elle, être effectuée, selon une autre caractéristique préférentielle de l'invention, en soumettant cette phase à une étape de fractionnement par filtration sur gel de dextran. On peut, à cet effet, avantageusement effectuer cette filtration sur un gel du type dénommé "SEPHADEX" (marque déposée) qui est un gel de dextran, se présentant sous forme de perles, qui présente la particularité de gonfler dans l'eau ou dans de nombreuses solutions minérales ou organiques de façon à permettre la séparation de leurs constituants en fonction de leur poids moléculaire. Une telle filtration sur gel a pu permettre, conformément à l'invention, de séparer cinq fractions distinctes, dont certaines se sont, elles aussi, avérées particulièrement actives. Il est à noter que, conformément à l'invention, l'extrait stabilisé et concentré d'Erysimum officinal, obtenu à l'issue de la première étape du procédé, peut être préparé à partir de la plante fraîche ou de plantes préalablement séchées, notamment à l'étuve; on a cependant pu constater que, dans les conditions expérimentales, les extraits préparés à partir de la plante fraîche, en particulier de sommités fleuries de celle-ci, sont, d'une façon générale, plus actifs que ceux préparés à partir de la plante sèche. Conformément à l'invention, l'activité des extraits bruts et celle des différentes fractions, séparées à l'issue de la purification de la phase organique par chromatographie en phase liquide ou de la purification de la phase aqueuse par filtration sur gel, a été étudiée en utilisant un test normalisé bien connu des spécialistes: la mesure de l'expectoration par élimination du rouge de phénol administré par voie intra-péritonéale chez la souris. Ce test est décrit par Coppi et Gatti (Il Farmaco, 1989, 44(5), 541-545). Ayant ainsi trouvé, à partir des huit et des cinq fractions préalablement isolées, celles contenant des mélanges ayant une activité expectorante intéressante, il restait, conformément à l'invention, à analyser plus finement ces fractions de manière à déterminer et à séparer les composés purs qu'elles contiennent et en particulier ceux responsables de cette activité. On a, à cet effet, mis en oeuvre une étude analytique par chromatographie liquide à haute performance (HPLC "high pressure liquid chromatography") sur colonne de silice C18; lors de cette analyse, on a utilisé en tant qu'éluant un mélange méthanol/eau de concentration croissante en méthanol. On a ainsi pu isoler plusieurs substances pures que l'analyse par spectrométrie (masse, UV, IR et RMN) a permis d'identifier. Ces substances pures sont les suivantes: 1) Tyrosine: C9H11NO3; P.M. = 181,19. Identifiée par comparaison HPLC, UV, IR, Masse et RMN avec le composé de référence. Elle existe dans- l'extrait de la plante fraîche mais n'existe seulement qu'à l'état de trace dans l'extrait de la plante sèche. HO- 7ÄCH2 H COOH NE2 2) S-Phénylalanine: C9HllNO2; P.M. = 165,19. Identi- fiée par comparaison HPLC, UV, IR, Masse et RMN avec le composé de référence. Elle existe aussi bien dans l'extrait de plante fraîche que dans celui de la plante sèche. $cg2 O NE2 3) Adénine: C5H5N5; P.M. = 135,14. Identifiée par comparaison HPLC, UV, IR, Masse et RMN avec le composé de référence. Elle existe dans l'extrait de la plante fraîche mais n'existe pas dans l'extrait de la plante sèche. H N 4) Uridine: C9H12N206; P.M. = 244,20. Identifiée par comparaison HPLC, UV, IR, Masse et RMN avec le composé de référence. Elle existe dans l'extrait de la plante fraîche mais n'existe pas dans l'extrait de la plante sèche. S0OH O ) Guanosine: C10H13N505; P.M. = 283,24. Identifiée par comparaison HPLC, UV, IR, Masse et RMN avec le composé de référence. Elle existe aussi bien dans l'extrait de plante fraîche que dans celui de la plante sèche. N _OH 6) Cytidine: C9H13N305; P.M. = 243,22. Identifiée par comparaison HPLC, UV, IR, Masse et RMN avec le composé de référence. Elle existe aussi bien dans l'extrait de plante fraîche que dans celui de la plante sèche. []2 0i 7) Gluconapine: C11H18NO9S2K; P.M. = 411. Identifiée par comparaison HPLC, UV, IR, Masse et RMN avec le composé de référence. Elle existe aussi bien dans l'extrait de plante fraîche que dans celui de la plante sèche. /O--03K 1120H j / C CECH2__, H CH2 H OH 8) 6,3'-disinapoylsucrose: C34H42019; P.M. = 754. Identifié par comparaison HPLC, UV, IR, Masse et RMN. Il y a peu de changement après séchage. 3 BO HOR3O O On a pu déterminer que les fractions actives obtenues par purification de la phase organique par chromatographie en phase liquide peuvent contenir les composés purs suivants: tyrosine, adénine, uridine, guanosine et 6,3'-disinapoylsucrose, tandis que celles obtenues par purification de la phase aqueuse par filtration sur gel peuvent renfermer les composés purs suivants: tyrosine, cytidine, uridine, guanosine, 1- phénylalan e gc ine et gluconapine. L'invention concerne, en conséquence, une composition expectorante d'origine végétale, obtenues à l'issue l ta de l'tapede fractionnement par chromatographie en phase liquide renfermant, en tant que principe actif, au moins un composé appartenant au groupe formé par la tyrosine, l'adénine, l'uridine, la guanosine et le 6,3'-disinapoylsucrose. Elle concerne également une composition expectorante d'origine végétale obtenues à l'issue de l'étape de fractionnement par filtration sur gel renfermant, en tant que principe actif, au moins un composé appartenant au groupe formé par la tyrosine, la cytidine, l'uridine, la guanosine, la 13-phénylalanine et la gluconapine. L'activité expectorante des huit composés purs susmentionnés a été déterminée par mesure de l'expectoration par élimination du rouge de phénol administré par voie intra-péritonéale chez la souris et on a ainsi pu constater que les composés les plus actifs sont la tyrosine, l'uridine, l'adénine, la guanosine, la gluconapine, la 6,3'-disinapoylsucrose. Il est à noter que trois de ces composés (la tyrosine, l'uridine et l'adénine) disparaissent dans la plante sèche. Compte tenu de cette constatation, on a pensé, conformément à l'invention, à utiliser ces composés purs pour la préparation d'une composition expectorante. L'invention se rapporte donc également à l'utilisation, pour la préparation d'une composition expectorante, de la tyrosine et/ou de l'uridine et/ou de l'adénine et/ou de la guanosine et/ou de la gluconapine et/ou du 6,3'-disinapoylsucrose. Bien entendu, selon cet aspect de l'invention, il importe peu que le composé pur utilisé soit d'origine naturelle, notamment végétale, ou obtenu par synthèse chimique. Les caractéristiques du procédé ainsi que de la composition expectorante qui font l'objet de l'invention seront décrites plus en détail en se rapportant aux exemples ci-dessous: 1) Préparation d'un extrait stabilisé concentré d'Erysimum officinal. On a coupé en petits morceaux d'environ 8 cm, kg de sommités fleuries de la plante fraîche, puis on les a réduits en poudre dans un broyeur à couteaux "HENRY" (marque déposée). On a ensuite extrait cette poudre par macération à froid dans 4 litres d'éthanol à 40 % pendant 2 heures sous agitation, puis on l'a filtrée sous vide sur un petit B chner en acier inoxydable. On a ensuite réextrait le résidu obtenu à l'issue de cette filtration par macération à froid dans 3 litres d'éthanol à 40 % pendant 2 heures sous agitation, et on a effectué une nouvelle filtration sur B chner inox. On a réuni les filtrats obtenus lors de deux processus de filtration et on les a concentrés sous vide à 35 C jusqu'à 2 litres environ. On a ensuite nébulisé l'extrait concentré en utilisant un nébulisateur "RAM" de façon à obtenir 256 g d'une poudre jaune, soluble dans l'eau et dans l'alcool. il 2) Extraction et fractionnement de cette poudre. On a ensuite pesé 10 g de cette poudre que l'on a soumis à 2 lavages successifs dans, respectivement, 100 ml d'éther de pétrole; on a éliminé la fraction soluble dans l'éther de pétrole correspondant à 0,64 g et on repris le résidu sec que l'on a à nouveau soumis à 2 lavages successifs, cette fois par, respectivement, 100 ml d'acétate d'éthyle. On a, là encore, éliminé la fraction soluble dans l'acétate d'éthyle qui correspond à 0,48 g de-l'extrait de départ et on a conservé le résidu sec. Celui-ci a été repris et traité par 100 ml d'eau de façon à obtenir une solution que l'on a soumise à 3 étapes d'extraction successives par respectivement 100 ml de chloroforme. On s'est, à chaque fois, débarrassé des phases organiques, c'est-à-dire de la fraction soluble dans le chloroforme qui représente 0,76 g de l'extrait de départ et on a conservé la phase aqueuse, c'est-à- dire la fraction soluble dans l'eau. On a ensuite soumis cette fraction à 3 extractions successives par respectivement 80 ml de butanol et on a, cette fois, conservé à la fois, d'une part, les phases organiques préalablement rassemblées, c'est-à-dire la fraction soluble dans le butanol qui représente 1,42 g de l'extrait de départ, et, d'autre part, la phase aqueuse résiduaire, c'est-à-dire la fraction soluble dans l'eau qui représente 6,61 g de l'extrait de départ. On a ensuite purifié ces deux fractions de la manière suivante: On a traité la phase organique par chromatographie en phase liquide sur une colonne de silice moyenne pression en utilisant un gradient de 0 à 50 % de méthanol dans le chloroforme; on a ainsi divisé cette phase en 8 fractions distinctes. On a traité la phase aqueuse par deux filtrations successives sur gel de dextran, tout d'abord sur gel "Séphadex LH-20" (marque déposée) puis un gel "Séphadex G-10" (marque déposée); on a ainsi divisé cette phase en 5 fractions distinctes. 3) Analyse des fractions ainsi isolées. On a analysé ces différentes fractions par chromatographie à haute performance HPLC dans les conditions suivantes: - Phase stationnaire: colonne semi-préparative de silice C18, ultrabase, 250 X 10 mm, 5 pm. - Echantillons: on a injecté un volume correspon- dant à une concentration identique pour chaque fraction. - Détecteur: "Waters 991" à barrettes de diodes relié à un ordinateur. - Eluant: on a successivement utilisé, en gradient, du chlorure de sodium 0,5 M, un mélange 1/1 de méthanol et d'eau et du méthanol pur. Cette analyse a permis d'isoler, dans les fractions issues de la phase organique, les substances suivantes: tyrosine, adénine, uridine, guanosine, 6,3' disinapoylsucrose et deux flavonoïdes, et dans les fractions issues de la phase aqueuse, les substances suivantes: tyrosine, cytidine, uridine, guanosine, 3- phénylalanine et gluconapine. Ces substances ont été identifiées par spectrométrie (masse, UV, IR et RMN). Les temps de rétension TR des substances ainsi identifiées sont rassemblés dans le tableau suivant: Substance Tyrosine Cytidine Uridine Gluconapine B-phénylalanine Guanosine TR (min) 20,5 21,4 2 23,6 25,2 27,3 28,1 Substance Adenine 6,3'-Disinapoylsucrose TR (min) 28,9 43,4 %O Les différentes étapes du procédé ayant conduit à l'isolement de ces différents produits purs sont rassemblés dans le tableau schématique ci- dessous: Nébulisat d'extrait de la plante fraîche (10 g) lavage à l'éther de pétrole (2 x 100 ml) Fraction sol.Ether Pétrole Résidu sec (0, 64 g) lavage à l'AcOEt (2 x 100 ml) Fraction sol CHCl3 Résidu sec H20 (100 ml) Solution Extrait par CHCl3 (3 x 100 ml) Fraction sol CHCl3 Fraction sol. H20 Extrait par BuOH (3 x 80 ml) Fraction sol BuOH (1,42 g) Fraction sol H20 (6,61 g) Chromatographie moyenne pression sur Filtration par les gels de silice par un gradient de MeOH dans dextran CHCl (0 - 50 %) 1) Sephadex LH - 20 3 2) Sephadex G - 10 8 Fractions 5 Fractions Chromatographie préparative Chromatographie préparative HPLC sur colonne C par un HPLC sur colonne C18 18 par un gradient de MeOH dans un gradient de MeOH dans H2O H2O V Tyrosine, Adénine, Uridine, Guanosine 6,3'disinapoylsucrose et 2 flavonoïdes V Tyrosine, Cytidine, Uridine, Guanosine Sol. = Soluble 8phénylalanine et Gluconapine 4) Protocole expérimental permettant de vérifier l'ac- tivité expectorante de l'extrait brut et des frac- tions et composés purs isolés. Des souris Swiss femelles, pesant environ 25 g ont été mises à jeun de nourriture (eau à volonté) la veille de l'expérimentation. On leur a administré par voie intrapéritonéale (i.p.) du rouge de phénol en suspension dans une solution isotonique de chlorure de sodium à raison de 200 mg/kg et ce dans un volume de 10 ml/kg. -minutes avant cette injection du rouge de phénol, on a administré aux souris, soit par voie orale (p.o.) dans l'eau distillée soit par voie intrapéritonéale dans une solution isotonique de chlorure de sodium (sous un volume de 0,2 ml/10 g de poids corporel) les substances à étudier ou des substances témoins. En tant que témoins, on a utilisé de l'eau distillée (p.o.) et une solution isotonique de chlorure de sodium (i.p.) et l'ambroxol, sous forme d'ampoule de Surbronc (marque déposée). On a ensuite sacrifié les souris dans une atmosphère d'éther, 30 min après l'injection du colorant; leur trachée a alors été canulée et connectée à une seringue de 1 ml: 6 lavages pulmonaires ont alors été effectués avec, chaque fois, 0,5 ml de solution isotonique de chlorure de sodium. On a réuni les liquides collectés après chaque lavage et complété le volume à 3 ml. On a ensuite soumis ce liquide à une centrifugation pour séparer les hématies et ajouté de la soude 0,01 N à une partie du surnageant (1 ml) jusqu'à obtenir un volume de 3 ml. On a alors effectué la lecture de la coloration à 546 nm. A l'aide d'une gamme d'étalonnage, il est possible d'estimer la quantité totale, en microgrammes, de rouge de phénol éliminée par voie trachéobronchique. ) Activité expectorante des produits purs isolés. Pour déterminer celle-ci, on a mesuré la quantité totale moyenne de rouge de phénol expectorée pour un groupe de souris auxquelles on a administré par voie orale ou intrapéritonéale une dose de - 20 mg/kg ou de 100 mg/kg du produit à tester par rapport à un groupe équivalent de souris auxquelles on a administré de l'eau distillée ou la solution témoin de chlorure de sodium isotonique, selon la voie d'administration choisie. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau ci-dessous: Dose: 20 mg/kg Dose: 100 mg/kg (i.p.) (p.o.) (i.p.) (p.o.) Tyrosine + 61% + 27 % Adénine + 54 % + 27 % Uridine + 26 % + 22 % + 73 % 31 % B-phénylalanine + 11 % + 18 % Cytidine 0 + 18 % Gluconapine + 48 % + 31 % 32 % 6,3'- disinapoylsucrose + 30 % + 39 % + 19 % + 62 % Guanosine + 14 % + 36 % Pour compléter ces résultats, on a ensuite, dans le cas particulier du 6,3'-disinapoylsucrose administré par voie orale, analysé les variations de l'effet obtenu en fonction de la dose administrée. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau suivant: Dose (p.o. ) 100 mg/kg 40 mg/kg 20 mg/kg 10 mg/kg Activité + 62 % +34 % +39 % + 21% A titre de comparaison, on a ensuite recherché quelles sont les doses d'Ambroxol pouvant, à chaque fois, permettre d'obtenir un effet équivalent. Les résultats de ce nouvel essai sont rassemblés dans le tableau suivant: Dose (p.o.) 150 mg/kg 125 mg/kg 75 mg/kg 62 mg/k 31mg/kg Activité + 66 % + 39 % + 42 % + 35 % + 18 % Les résultats susmentionnés montrent, qu'à concentrations équivalentes, le 6,3'-disinapoylsucrose est nettement plus actif que l'Ambroxol. Les résultats expérimentaux, qui ont été effectués conformément à l'invention, ont permis de prouver que, parmi les substances isolées, les 6 plus actives sont la tyrosine, l'uridine, l'adénine, la guanosine, la gluconapine et le 6,3'-disinapoylsucrose. L'activité expectorante de tous ces composés est au moins égale, sinon supérieure, à celle de l'Ambroxol. R E V E N D I C A T I 0 N S 1 ) Procédé d'obtention d'une composition expectorante d'origine végétale, caractérisé en ce que l'on prépare un extrait stabilisé et concentré d'Erysimum officinal, préparé à partir de la plante fraîche ou de la plante sèche, on soumet cet extrait à une nébulisation de façon à obtenir une poudre soluble dans l'eau et dans l'alcool, on soumet cette poudre à au moins deux étapes de lavage successives par des solvants de polarité croissante, on prépare une solution aqueuse à partir du résidu sec obtenu à l'issue de ce lavage, on soumet cette solution à au moins une étape d'extraction par le chloroforme et on conserve la phase aqueuse que l'on soumet à des étapes de traitement ultérieures de concentration et/ou d'extraction et/ou de fractionnement. ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on soumet la phase aqueuse obtenue à l'issue de l'extraction par le chloroforme à au moins une étape d'extraction par le butanol et l'on conserve à la fois la phase aqueuse et la phase organique que l'on soumet séparément à des étapes de traitement ultérieures. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que, lors du lavage, on utilise successivement en tant que solvant l'éther de pétrole et l'acétate d'éthyle. 4 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que l'on soumet la phase organique obtenue à l'issue de l'extraction par le butanol à une étape de fractionnement par chromatographie en phase liquide sur une colonne de silice moyenne pression en utilisant, en tant qu'éluant, un mélange méthanol/chloroforme de concentration croissante en méthanol de façon à séparer huit fractions distinctes. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que l'on soumet la phase aqueuse obtenue à l'issue de l'extraction par le butanol à une étape de fractionnement par filtration sur gel de dextran de façon à séparer cinq fractions distinctes. 6 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on prépare l'extrait stabilisé et concentré d'Erysimum officinal à partir de sommités fleuries de la plante fraîche. 7 ) Composition expectorante d'origine végétale obtenue à l'issue de l'étape de fractionnement par chromatographie en phase liquide, selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle renferme, en tant que principe actif, au moins un composé appartenant au groupe formé par la tyrosine, l'adénine, l'uridine, la guanosine et le 6,3'-disinapoylsucrose. 8 ) Composition expectorante d'origine végétale obtenue à l'issue de l'étape de fractionnement par filtration sur gel selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle renferme en tant que principe actif, au moins un composé appartenant au groupe formé par la tyrosine, la cytidine, l'uridine, la guanosine, la 3-phénylalanine et la gluconapine. 9 ) Utilisation pour la préparation d'une composition expectorante d'au moins un principe actif présent dans l'extrait d'Erysimum officinal susceptible d'être isolé par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et choisi dans le groupe formé par la tyrosine, l'uridine, l'adénine, la gluconapine, le 6,3'-disinapoylsucrose et la guanosine.