FR 2705607 A1 19941202 FR 9213502 A 19930201 DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE SECHAGE DU BOIS. Intérêts et limites Le séchage du bois est un préalable essentiel à son utilisation, que ce soit pour la menuiserie, la charpente ou la tonnellerie. Le bois frais ne possède pas une hygrométrie constante et au cours de sa déshydratation, ses propriétés mécaniques varient. Le bois perd sono10 eau spontanément (de 40% maximun à 12% minimum); au cours de cette étape sa densité est modifiée et ses propriétés mécaniques se stabilisent progressivement. Le bois est sec lorsque son humidité relative est en équilibre avec l'hygrométrie du milieu ambiant ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE Le séchage est obtenu naturellement, à l'air libre, artificiellement, en étuve ou par des procédés semi accélérés, associant les deux premiers principes.20 Séchage artificiel Le séchage artificiel est très utilisé dans l'industrie, il présente l'avantage d'être rapide et de produire un bois très homogène sur le plan de l'hygrométrie. Cette pratique permet, en outre, de25 limiter les immobilisations financières d'un parc à bois. Mais elle est fortement consommatrice d'énergie et nécessite des investissements important dans des équipements spécifiques et peu polyvalents. En tonnellerie, le séchage artificiel est une méthode complémentaire, permettant, en particulier, d'achever le séchage naturel et30 homogéneiser l'hygrométrie d'un lot de bois. Le bois monté en piles est déposé dans une enceinte fermée, soumis à une ventilation puissante pour accélérer le dessèchement, la température est réglable (30-40 C). Le séchage du bois vert doit être progressif pour éviter l'apparition de fentes de retrait. Pour limiter la perte de bois en cours de séchage, I'humidité est augmentée et le séchage est divisé en séquences (GIORDANO, 1971): le bois subit des périodes d'étuvage plus ou moins longues, entrecoupées de période de stabulation sous abri ventilé. Le séchage est alors progressif et l'apparition de fentes est limitée. La durée de séchage est de plusieurs semaines. Séchage naturel Le séchage naturel est généralement utilisé pour les bois destinés à la tonnellerie. Il s'agit d'une longue opération de plusieurs dizaines de mois, qui nécessite un parc de bois assurant un approvisionnement régulier en matière première de qualité pour la fabrication de barriques ou de fûts. Les bois utilisés pour le montage des foudres sont le plus souvent séchés artificiellement. Le sérieux d'un tonnelier est directement en relation avec le volume de bois disponible, car seul le séchage naturel peut donner des bois adaptés à l'élevage et à la bonification des vins (TARANSAUD, 1976). Aucuns travaux de description et d'investigation sur le mode de séchage n'a été réalisé, bien que son intérêt ait été récemment réaffirmé (CHATONNET, 1989). Le séchage naturel est réalisé sur de grandes surfaces planes et dégagées. Le sol est généralement bétonné et des écoulements d'eaux sont aménagés, pour éviter, d'une part la salissure du bas des piles de bois par la terre, et d'autre part la stagnation d'eaux constituant des foyers de mauvaises odeurs et de micro-organismes responsables d'altérations putrides. Le séchage s'étale traditionnellement sur 24 mois (douelles de 21 mm) ou sur 36 mois (douelles de 28 mm). On estime que le séchage progresse de 10 mm par an. En réalité, nos travaux ont montré que le séchage du bois est beaucoup plus rapide, puisque les 10 premiers mois constituent la période de déshydratation intense. Au-delà, la succession de pluies et de périodes sèches ne provoque que de faibles fluctuations de l'humidité du bois (2 à 8%). Cette seconde période est cependant indispensable à la maturation du bois, car elle est le siège d'un ensemble de réactions propres à améliorer les qualités du bois (propriétés mécaniques, qualités aromatiques et gustatives). On peut estimer en première approche qu'un séchage de 12 àl 8 mois est suffisant, au-delà le séchage ne se justifie plus. Des études, réalisées avec des éprouvettes placées dans les piles de bois, au sein d'un parc, montrent qu'une période pluvieuse moyenne ne permet pas de mouiller le bois situé dans la pile. De plus, un système d'aspersion fonctionnant 12 h à fort débit ne permet pas 3 2705607 de lessiver la partie interne d'une pile. Les mouvements liquides tout au long du séchage restent essentiellement localisés sur la partie externe des piles. L'hygrométrie au centre de la pile est supérieure à celle du milieu ambiant, ce qui explique que les douelles les plus internes de la pile présentent le moins de fentes de retrait. Au-delà de ces conditions techniques, le séchage naturel conduit à des bois dont le niveau de séchage est très hétérogène, leur couleur, du gris clair au marron foncé, en témoin Séchage après immersion Le séchage artificiel ou naturel se pratique parfois après immersion du bois pendant quelques jours dans une eau renouvelée. Cette pratique permet de lessiver le bois en profondeur et assure une élimination efficace des substances amères et astringentes. Mais elle présente l'inconvénient de durcir le bois et de lui faire perdre certaines propriétés mécaniques. De plus, I'élimination plus ou moins complète des polyphénols du bois n'est pas toujours souhaitable. Ces éléments participent activement à l'élevage des vins (GLORIES, 1 992). Cette technique bien qu'anecdotique reste utilisée par certains tonneliers pour écourter la période de séchage. Procédé mixte de séchage Le séchage mixte consiste à utiliser à la fois le séchage naturel et le séchage artificiel en bénéficiant des principaux avantages de chaque technique. Le séchage naturel est utilisé pour les profondes modifications qu'il induit dans le bois. Il constitue une étape d'affinage du bois. 4 2705607 Le séchage artificiel assure une déshydratation homogène et rapide. Il permet une utilisation plus souple du parc à bois, par exemple à la suite d'une forte pluie ayant réhumecté la couche superficielle des merrains. Cette technique, de plus en plus fréquemment employée, permet, sans écarter le séchage naturel, de limiter le volume des stocks de bois et l'immobilisation des sources financières parfois importantes. Description des figures. L'invention sera décrite plus en détail dans la description qui va suivre, description donnée à titre d'exemple uniquement en regard des dessins annexés sur lesquels: -figure 1 est un diagramme illustrant l'influence de la densité du grain sur l'extractibilité des polyphénols du bois. -figure 2: influence de l'origine botanique du chêne sur l'extractibilité des polypénols -figure 3: séchage des merrains de chêne au cours du séchage naturel. Annéel 992 Hygrométrie relative (Hr, %) constante après 250 jours de séchage. -figure 4: rehumectation des merrains après une pluie. Influence de la position du bois dans la pile -figure 5:Observation en microscopie optique des populations de microorganismes répartis sur les merrains de chêne (x 1000) -figure 6: Structure morphologique de Trichoderma harzianium,(1) de Trichoderma koningil (2) et d'Aureobasiduim pullulans (3) -figure 7: Evolution du nombre de spores et de la surface des merrains colonnisé par les champignons au cours du séchage naturel - figure 8: Répartition des espèces de champignons au cours du séchage naturel -figure 9: Autolyse des souches de moisissures isolées du bois de chêne en fonction du temps de culture. L'autolyse est suivie par la mesure de la D0210 nm -figurelO: Influence du substrat carboné sur la production dfe polysaccharides exocellulaire par Aureob. pull. après 1 mois de culture. -figure 11: Estimation des activités galactosidases, glucosidases, manosidase, rhamnosidase et arabinosidase de Aureob. pull. -figure 12: Variation de l'activité o de Aureob. pull. en présence de divers substrats carbonés. -figure 13: Variation de l'activité p-glucosidase au cours de l'incubation de Aureob. pull. en présence de divers substrats carbonés. -figure 14: Influence du mode de séchage et de l'origine géographique du bois sur l'extrait hydrosoluble et les cendres -figure 1 5 Influence du mode de séchage sur le taux de scopolétine du bois -figure 16 Hydrolyse enzymatique de quelques composés phénoliques du bois par une suspension d'Asp. oryzae non proliférante -figure 17: Fractionnement des enzymes exocellulaires brutes de quelques champignons rencontrés sur les merrains par Chromatographie haute performances de tamissage moléculaire, sur colone TSK G600-WP -figure 18: Libération des unités gallates du pentagalloyl-glucose au cours de son hydrolyse par la tannase d'Asp. oryzae -figure 19: Degradation de la castalagine (A) et de l'acide digallique (B) par les enzymes brutes exocellulaires d'Aureob. pull -figure 20: Libération de glucose à partir d'une solution d'ellagitanins (10 %) en présence du mycélium d'Aureob. pullulans. -figure 21: Mise en évidence de l'hydrolyse enzymatique de l'aesculine par couplage HPLC/Fluorimétrie. -figure 22: Formation d'aldéhyde-phénols au cours du développement de Trich. harzianum. -figure 23: les voies enzymatiques de dégradation des ellagitanins et des gallotanins. (PeHr: Phénols hétérosidase) -figure 24: La dégradation enzymatique des coumarines monoglucoside (CET: coumarine étherase) -figure 25: Hypothèse de production des aldéhyde- phénols par voie enzymatique (aldéhyde-phénols synthétase) à partir de la lignine. -figure 26: représentation de LINEWEAVER et BURK de l'hydrolyse des ellagitanins du chêne par l'activité phénols hétérosidase d'Auréob. pull. et de Trich. harz. Détermination des constantes cinétiques. -figure 27 Influence du Ph sur l'acitivité PeH d'Aureob. pull et de Trich. harz. -figure 27a Influence de la nature des tanins (tanins condensés ou tanins hydrolysables) et de leurs concentrations sur la croissance d'Aureob. pull. 6 2705607 -figure 28: Influence de la concentration en ellagitanins libres sur l'activité PeH d'Aureob. pull et de Trich. harz. -figure 29: Extrait à l'acétate d'éthyle de la fraction TP/TS d'un vin rouge. (1):Témoin; (2) enzyme 2% d'enzymes brutes; 7,5 mg:l de TP/TS. Incubation 20 C, 16 H dans un tampon NaAc 0,2M,pH=5 Identification des pics: 1:ac gallique; 2/ (+) catéchine On développera maintenant de manière plus précise la technique du SECHAGE NATUREL Le séchage naturel englobe un ensemble de phénomènes subordonnés aux conditions climatiques. Il s'agit du lessivage du bois, de sa déshydratation progressive et du développement de micro- organismes à sa surface. Ce dernier n'a été jusqu'à aujourd'hui que suspecté (PONTALLIER et al., 1982). Un quatrième paramètre à prendre en considération est l'origine botanique et géographique du bois. L'ensemble de ces facteurs seront abordés. Les mécanismes de séchage et de lessivage du bois Le bois entreposé à l'air libre subit au cours du temps une perte importante de l'eau de constitution. Si lors de son arrivée sur le parc à bois il renferme en moyenne 60% d'eau, le tonnellier considère qu'il est sec lorsque l'humidité résiduelle atteint un minimum situé vers 12%. Mais les premiers millimètres de bois exposés aux intempéries présentent une hygrométrie très hétérogène et subordonnée aux conditions climatiques journalières (des pluies passagères peuvent en fin de séchage réhumecter 5 à 10 mm de bois). Pour cette raison, on doit, avant utilisation, prévoir une période de stabulation dans un local fortement aéré pour rétablir un seuil d'humidité satisfaisant. Sur parc, les eaux de pluies assurent un lessivage intense du bois. Mais cette opération dépend de son taux d'hydratation naturel; les fibres du bois doivent être suffisamment gonflées pour assurer d'une part la pénétration de l'eau jusqu'aux tissus, d'autre part l'écoulement du liquide chargé. Plus la densité du bois est faible et plus le lessivage est intense. L'expérience suivante (tableau 1) illustre ces phénomènes: les essais ont été réalisés avec 2 catégories de bois frais, à grains fins et à grains lâches, superficiellement séchés pendant 3 semaines à 20 C en présence de Na2SO4 pour absorber l'excès d'humidité. Les 7 2705607 échantillons sont ensuite placés dans 2 enceintes, pendant 1 à 2 jours; I'une à 95% d'hygrométrie et l'autre est une étuve à 50 C. Puis macérés pendant 5 jours dans un mélange méthanol-eau-acétone (1/1/2). Le contenu phénolique des extraits est estimé par le réactif de FOLIN-CIOCALTEU (IFC). Au bout de 5 jours, les IFC sont à peu près identiques dans les 8 échantillons étudiés, on observe cependant une légère différence entre les grains fins et les grains lâches. L'indice d'extractibilité (E) exprime en pourcentage le rapport entre l'IFC obtenu après 1 journée de macération et celui obtenu après 5 jours. E= FClj / FC 5j x 100 En microscopie optique, on note un resserrement des fibres et donc une moindre aptitude à céder les constituants emprisonnés dans les tissus. La texture croisée du bois "effet contreplaqué" (ROLAND, 1 980) accentue le phénomène. Ceci explique qu'un bois riche e n polyphénols puisse avoir un indice d'extractibilité faible. 8 2705607 tableau I influence du mode de séchage du bois sur l'extractibilité des phénols totaux Indice d'extractibilité E = IFC1j / IFCSj grains fins grains lâches caractéristiques du local temps (G) 1 72% 98% % hygro. 2 60% 98% 1 5_ 1 5 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 25% 34% Etuve 2 26% 42% La densité du grain peut être classée, pour les échantillons considérés, par ordre décroissant de porosité déterminée visuellement: Limousin; Vosges; Nevers; Allier; Tronçais. Il s'agit, dans ce cas, de types de bois présentant les caractéristiques de la majorité des bois de ces régions. Cette classification est bien corrélée avec l'indice d'extractibilité des bois (fig.1). Il s'agit de différents échantillons séchés naturellement de façon identique, classés uniquement en fonction du type, indépendamment de l'origine géographique. Les résultats présentés correspondent à la moyenne d'une cinquantaine d'échantillons dans chaque cas. On trouve en effet dans chacune des régions un mélange de bois de caractère de grains différent, mais dont la moyenne reste le reflet de ce classement visuel. Sur une longue période de séchage, la perte par lessivage est importante dans les premiers mois, puis lorsque le taux d'humidité du bois descend. suffisamment bas, I'épuisement phénolique se ralentit considérablement, comme dans l'expérience modèle du tableau I. En effet, plus on avance dans le séchage et moins les constituants 9 2705607 pariétaux sont susceptibles d'être entraînés par les eaux de pluies. Tout au long du séchage les mécanismes oxydatifs, d'origine enzymatique ou chimique, conduisent d'une part à une diminution de la teneur en polyphénols, et d'autre part à différentes modifications de structure caractérisées par des polymérisations et des condensations avec les polymères de la paroi (cellulose, lignine...) (SHUYUN PENG et al.;1991). Récemment nous avons pu confirmer ces résultats pour des espèces de chêne français en situation de séchage naturel. Sur le plan analytique, le séchage naturel entraîne un appauvrissement du bois (tableau 11) par rapport au séchage artificiel. Mais le lessivage et la baisse du taux d'humidité ne suffisent pas à expliquer les profondes modifications subies par le bois. tableau Il influence du mode de séchage sur la teneur en acides phenols du bois de chêne (Allier) g de sciure (60 mesh) pour 20 ml de macération (MeOH/H20/HCOOH 50/40/10) 96h sous azote avec agitation magnétique Sechage naturel Séchage artificiel ac. gallique (mg/l) 64,0 98,0 ac. ellagique (mg/l) 58,0 70,0 IFC (1) 49 67 I ellagitannins(2) 0,08 0,12 I gallotannins (3) 0,26 0,68 1: indice de folin ciocalteu 2: réaction à l'acide nitreux (Bate-Smith; 1972) exprimé sous forme d'indice (A DO) 3: réaction au iodure de potassium (Haslam; 1965) exprimé sous forme d'indice (A DO) 2705607 ww Influence de l'origine botanique: Les chênes appartiennent au genre Quercus; mais les bois destinés à la tonnellerie sont rattachés à la section plus restreinte des Lepidobalanus, dans laquelle on retrouve les espèces présentant un intérêt économique de premier ordre: le chêne sessile (Quercus sessilis, Quercus petraea ou encore chêne rouvre) et le chêne pédonculé (Quercus pedonculata ou Quercus robur). Ces espèces ont été choisies pour leur aptitude à agir favorablement sur les vins (GLORIES, 1987). Le terroir influence les caractères structuraux du bois et leur contenu phénolique. Les résultats du tableau III représentent la moyenne de 20 échantillons par terroir étudié. Ces résultats s'expliquent par les caractères dominants de chacune des régions, responsables des types 15. tableau III influence de l'origine géographique sur la richesse phénolique du Quercus sp. espèces Q. pédonculata Q. sessilisQ. sessilisQ. sessilis terroirs Limousin Centre Vosges Nevers IFC (1) 46 28 26 63 catéchines (pg/g) 872 440 512 586 I ellagitannins (2) 0,21 0,08 0,12 0,28 1: indice de FOLIN-CIOCATEU 2: réaction à l'acide nitreux exprimé sous forme d'indice (A DO) Quelques analyses biométriques effectuées sur des échantillons de bois révèlent que le bois de printemps est moins abondant pour Q. sessilis (16%) en comparaison de Q. pedonculata (38%). Ce bois riche en faisceaux de gros diamètre favorise l'extraction des composés phénoliques des tissus (figure 2). Les résultats obtenus sont comparables à ceux de FLETCHER (1 978). Influence du climat local Les conditions climatiques de chaque region orientent significativement les phénomènes du séchage. Ainsi, la succession de période pluvieuse et sèche, chaude et froide, détermine à la fois la vitesse et l'intensité du séchage naturel. Les paramètres climatiques utiles au raisonnement du séchage: Le raisonnement du séchage et le choix de la date de début de l'opération passe par une parfaite connaissance du climat local (Macro-climat). Ainsi, certaines régions peu pluvieuses et trop sèches ne sont pas conseillées, car même si le séchage est couplé avec un système d'aspersion fréquent du bois, la déshydratation trop rapide induira une perte de bois peu compatible avec la rentabilité de la technique (fentes de retrait, lessivage incomplet). Les climats Français (océanique, océanique de transition, continental, méditerranéen) semblent, en revanche, convenir. Trois paramètres sont pris en compte pour choisir le début du séchage: D'abord, le séchage doit être précédé d'une phase de lessivage abondant du bois, indispensable à sa qualité; - Ensuite, vient l'implantation d'une flore, qui nécessite une humidité suffisante et des pluies permettant le développement des thalles. - Enfin, nous terminons par une période suffisamment sèche pour induire une déshydratation progressive et continue du bois. Conditions climatiques: exemple du climat Bordelais Sur une moyenne de 50 années de relevés météorologiques, le climat Bordelais se caractérise par (VIVAS, 1 987) * Une amplitude thermique (ATha) modérée (ATha = Tmin Tmax = 15 C); comprenant un minimum en Janvier (+5 C) et un maximum décalé en Août (+20 C). Le rôle de volant thermique joué par l'océan proche explique des résultats réguliers et sans extrêmes. 12 2705607 * Des précipitations régulièrement réparties sur toute l'année, sans période de sécheresse vraie. Quelques années subissent une subsécheresse plus ou moins accentuée. Le classement dégressif des précipitations, pour la détermination du type climatique donne: Hiver (229 mm), Automne (222mm), Printemps (212mm), Eté (154mm). La formules H.A.P.E est caractéristique des climats océaniques. Bien que la dernière décade (80-90) ait été marquée par des déficits pluviométriques records et des températures anormalement élevées, le climat océanique moyen est parfaitement superposable au profil climatique présenté. Incidence du climat régionnal moyen sur le choix du début du séchage: exemple du climat Bordelais Sur une période de 12 mois, et pour répondre aux exigences présentées (cf. 3.1), le séchage naturel dans le Bordelais doit débuter au mois de novembre, un mois avant les précipitations maximales (précipitation de Décembre: 100 mm). La période estivale relativement peu pluvieuse permet un assèchement homogène du bois. L'emploi du bois à la tonnellerie peut être précédé d'un passage à l'étuve de quelques jours. L'opération de séchage se répartit sur 12 à 24 mois en veillant bien d'utiliser le bois en fin de période estivale, ou après une stabulation de quelques semaines dans un local aéré. La période de séchage est plus efficace, adaptée aux conditions climatiques, elle peut être raccourcie. La décision d'interrompre le séchage est liée à l'aspect du bois (observations visuelles) et à son hygrométrie (mesurée par sondes). La déshydratation naturelle du bois de chêne au cours d'une année sèche suivie d'une période de forte pluviométrie. Année 1992 Quelque soit l'origine géographique du bois (fig.3), les profils d'assèchement des merrains restent comparables. Le bois de surface perd rapidement son eau, mais Hr reste dépendant des périodes de pluies. Une pluie passagère peut provoquer une augmentation de Hr de 10%. Mais la perte de cette eau est rapide, en 10 jours la surface retrouve son hygrométrie initiale. Les couches internes du bois se déshydratent rapidement durant les 100 premiers jours puis le 13 2705607 rythme d'assèchement s'infléchit sensiblement. En 12 mois le bois atteint un Hr de 18% compatible avec les contraintes de fabrication. En comparant les résultats 1992 à ceux de 1987, on observe le même type d'évolution avec cependant une période d'assèchement importante répartie sur 200 jours au lieu de 100 jours. Des analyses complémentaires montrent qu'une pluie de 80mm (sur 72 H) ne provoque pas de variation sensible du Hr d'un bois sec (fig.4). En revanche sur du bois vert l'humectation est plus importante, ceci est à relier avec les résultats précédents concernant l'accessibilité du solvant aux tissus. PROBLEME TECHNIQUE POSE L'étude des différents modes de séchage du bois de chêne a permis d'établir un bilan synthétique des avantages et des inconvénients de ces techniques. Il convient de définir et de préciser les problèmes de porosité liés à cette opération, ainsi que les propriétés organoleptiques des composés phénoliques du bois après séchage naturel. Certaines réponses seront apportées dans la seconde partie du travail. Le séchage naturel est traditionnellement une opération qui se produit sans l'intervention de l'homme. Les moisissures se développent lorssqu'elles sont en nombre suffisant et lorsque le milieu est favorable. C'est une opération non maitrisée et donnant des bois destinés à la tonnellerie de qualité très hétérogène. Après un programme de recherches scientifiques sur le sujet nous avons mis en évidence l'existence de moisissures parfaitement adaptées aux bois et susceptibles de provoquer des modifications compatibles avec une meilleure qualité de ce bois 14 2705607 EXPOSE DE L'INVENTION MATERIELS ET METHODES 1 - Analyse en HPLC des composés phénoliques du bois de chêne 1. 1- Dosage de l'acide gallique et de ces dérivés galloyls- glucose Le chêne est dépourvu d'acide digallique; en revanche le châtaignier en contient quelques centaines de pg/g de bois l0 (SALAGOITY et ai, 1986; VIVAS et al., 1992). Cette molécule est particulièrement amère (JOSEPH et MARCHE, 1975) et son hydrolyse, conduisant à la libération d'acide gallique, provoque la disparition complète de cette sensation. Ce type d'observation est également valable pour les galloyls-glucose. Son étude s'avère donc importante car elle illustre l'impact des estérases fongiques sur la saveur des extraits de bois. La technique d'extraction et de dosage est issue du protocole de SALAGOITY et al. (1986). Elle comprend une purification du milieu aqueux par extraction à l'acétate d'éthyle à pH=7 (élimination des composés neutres) et une seconde extraction à pH=2 permettant de recueillir et de concentrer l'acide gallique, I'acide ellagique, I'acide digallique et m-digallique, le trigalloyl-glucose et le pentagalloyl- glucose. L'identification des pics est réalisée par injection des produits de référence et par comparaison des spectres UV entre 240 et 400nm. Les résultats sont exprimés en mg/g de bois. 1.2- Séparation et identification des ellagitanins du bois de chêne La composition phénolique du bois non brûlé est relativement simple. Pour l'essentiel, nous retrouvons dans les extraits à l'eau la vescalagine, la catalagine, l'acide gallique, l'acide ellagique et quelques formes dimères, les roburines et le grandinin, en faible quantité. La séparation se réalise sur colonne C18 (ultrasphère ODSTM, dp: ,p; di: 4, 6mm; long: 25 cm). * Les solvants d'élutions A et B ont la composition suivante: A= H20 ultra pure + 5% HCOOH R.P; B= MeOH bidistillé + 5% HCOOH R.P. 2705607 * Programme d'élution: %B: O pendant 10 Omn; %B: 2% en 1 0 mn; %B: % en 20mn; %B: 100 pendant 1 Omn. La pureté des pics est contrôlée par la mesure de spectre UV entre 240 et 400nm. Les molécules sont identifiées par comparaison des temps de rétentions obtenus à partir des produits purs injectés dans les mêmes conditions chromatographiques, dont on possède le spectre RMN 1H / 13C, et par mesure du k. max dans l'UV. Les produits de référence nous ont été fournis par A.SCALBERT. 1.3- Dosage des coumarines Les coumarines contenues dans 20ml d'extrait de bois à l'eau sont extraites par 3 x 20ml d'éther diéthylique. La phase organique est évaporée à sec, reprise dans du MeOH et chromatographiée dans les conditions décrites par CHAUVET et al.(1992) en fluorimétrie. L'étalonnage est réalisé par injection de solutions de coumarines en quantités connues. 1.4- Recherche des produits de transformation Les produits issus de la dégration enzymatique des composés phénoliques du bois sont identifiés: D'une part, grace au TR obtenus en HPTLC dans des conditions standard (cf. 2./2.2) et comparé à ceux de produits purs. Puis par récupération des différentes taches séparées sur plaque de CCM (Silice gréffée C18) et solubilisées dans l'eau ultrapure, centrifugées (4500 tpm, 20mn), concentrées sous vide partiel jusqu'à 100upl à C et injectées en HPLC; D'autre part, par injection direct des milieux de réaction après centrifugation (4500 tpm, 20mn) en HPLC. 16 2705607 2. Utilisation de la chromatographie sur couche mince haute performances 2.7- Purification de certains composés phénoliques * Les composés phénoliques du raisin et du vin sont isolés selon les techniques mises au point par GLORIES (1978). * Les composé phénoliques du bois: Lesprincipaux tanins ellagiques (vescalagine, castalagine) sont isolés à partir d'un extrait de châtaignier vert épuisé à l'eau. La séparation des deux isomères s'effectue par HPTLC. On dépose 10 pl sur 5 mm d'une solution à 1 g/l sur des plaques RP1 8 ( silice greffée par des groupements octadécyles); la migration est réalisée en chambre linéaire de développement avec un mélange H20/CH3COOH/MeOH (89/10/1; v/v/v); la lecture s'effectue à 280 nm avec un densitomètre CAMAG. Les gallotannins et en particulier le pentagalloyl-glucose a été isolé à partir d'acide tannique du commerce ou de tanins d'Hamamélis selon le même protocole. 2.2- Suivi de la transformation enzymatique de certains composés phénoliques Le suivi de l'hydrolyse enzymatique des tanins du bois est réalisé en HPTLC dans les conditions précédemment décrites (cf. 2./2.1), avec un facteur de dilution de 10 ou 100. Les résultats sont exprimés sous la forme du logarithme décimal de la surface du pic correspondant (log Sp). La dégradation est mesurée au cours du temps par prélèvement de 100pl de surnageant du milieu réactionnel centrifugé (4500 tpm, mn). L'activité hétérosidase est stoppée par 1 0pl de HCI N. 17 2705607 3- Analyses microbiologiques 3.1- Isolement des micro-organismes Les moisissures sont isolées: a) à partir de sciure (60 mesh) représentant les 5 premiers millimètres du bois de surface (la sciure est conservée à -20 C) d'un ensemble de douelles séchées naturellement de 6 à 18 mois et réparties sur tout le parc à bois. Les suspensions fongiques sont obtenues par sonication (2 x 5s) de lg de sciure de surface des douelles dans 10 ml d'eau stérile. b) à partir de frottis de la surface des bois en cours de séchage. Un coton hydrophile stérile balayant la surface des merrains est agité dans 10 ml d'eau stérile. Les milieux solides sont ensemencés par 1 ml des eaux de macération de la sciure. L'incubation est de 24 ou 72H à 25 C. Les souches morphologiquement différentes sont isolées par fragmentation de portion de mycellium. Au-delà de 5j de culture la boîte est entièrement recouverte par les moisissures et la sélection de souches pures devient impossible. Seuls les individus rencontrés dans tous les isolements sont conservés pour être purifiés et identifiés; car de nombreux isolats fongiques ne sont présents que sur certains échantillons. Le but du travail étant de définir la flore spécifique du séchage naturel nous n'avons conservé que quelques spécimens retrouvés de façon constante tout au long du séchage. Les repiquages successifs, nécessaires pour purifier chaque souche repérée, sont réalisés sur milieu solide MAG: - extrait de malt gélosé: 45g - agar 1 5g - glucose: 25g - eau distillée: 1000ml autoclavé 15 mn à 1 15 C. 18 2705607 3.2- Culture et constitution de collection * milieux de culture - Milieu CZAPEK-DOX: (NH4)H2P04 5,75 g/I K2HPO4 1,0 g/I KCI 0,5 g/I MgSO4 0, 5 g/I FeSO4 0,005 g/I Glucose 25 g/I o0 Eau distillée qsp 1 I pH= 5; stérilisé 1 5min 120 C - Milieu non proliférant (NP) (NH4)H2P04 5,75 g/I K2HPO4 1,0 g/l KCI 0,5 g/l MgSO4 0,5 g/I FeSO4 0,005 g/I Eau distillée qsp 1 I pH= 5; stérilisé 1 Smin 120 C -milieu MAG: Extrait de malt gélosé 45 g/I Agar 15 g/I Glucose 25 g/I Eau distillée qsp 11 stérilisé 15 mn à 115 C. - Milieu bois Extrait de chêne à l'eau 1 g/I Extrait de malt gélosé 30 g/l Agar 20 g/I Eau distillée qsp 1 I pH=5; filtration stérile 0,22p. * collection Les moisissures en culture sont conservées soit sur milieu bois sur gélose inclinée, soit en boite de Pétri après sporulation sur milieu MAG, soit en milieu liquide NP supplémenté par 20% de glycérol et conservé à -20 C. 19 2705607 3;3- Identification des souches L'identification s'effectue en collaboration avec A. LABARERE (INRA-Université de Bordeaux II) et E. GUEHO (institut PASTEUR, Paris, laboratoire de mycologie). Les tests APITM sont pratiqués sur milieu liquide. La culture liquide (CZAPEK-DOX) est ensemencée avec une suspension de spores obtenue à partir de culture sur milieux solides MAG. Après 15j de culture à 20 C( + 2 C), sur table d'agitation, le mycélium est séparé du milieu de culture et homogénéisée à I'ultraturrax (30s); 10 ml d'homogénat sont prélevés et centrifugés (20 mn, 4500 tpm), rincés à l'eau stérile et recentrifugés. Le culot est mis en suspension dans un milieu non proliférant. Après 48 H à 30 C, le mélange est utilisé pour les tests d'assimilation et de fermentation. E. GUEHO, (Institut PASTEUR; Paris) à partir de cultures solides sur MAG, effectue la description taxonomique après culture sur plusieurs milieux spécifiques, permettant en particulier le développement des fructifications 4. Mesure des activités enzymatiques 4. 1 Précipitation des protéines exocellulaires totales La précipitation des protéines au sulfate d'ammonium [(NH4)2SO4] à 80% de saturation (66g/100ml) constitue une méthode rapide de séparation des enzymes exocellulaires d'un milieu de culture. A 100ml d'un milieu de culture centrifugé d'une souche de champignon, en milieu liquide CZAPEK-DOX, sont ajoutés en 2 étapes 66g de (NH4)2SO4 à 4 C. Le milieu est supplémenté une première fois par 33g de sel, et agité 3H à 4 C (350 rpm). Puis saturé par un deuxième ajoût de 33g et agité 3H à 4 C (350 rpm). Le milieu est centrifugé (4500 tpm, 30mn). Le culot est solubilisé dans 2 ml de tampon NaAc (O,2M; pH=5) et supplémenté en (NH4)2SO4 jusqu'à sa limite de solubilité à 4 C, il est de nouveau agité (2H, 4 C, 300rpm) et centrifugé (4500 tpm, 30mn). 2705607 La fraction précipitée contenant une forte activité 1- glucosidase (dosée selon la méthode de DARRIET et al., 1988) est reprise par 2ml de tampon NaAC et utilisée directement, ou lyophilisée et conservée à -20 C. 4;2- Activité coumarine étherase * La mise en évidence de l'activité est faite sur une solution d'aesculine à 1 mg/10ml dans un tampon NaAc (0,2M; pH=4,5) incubée à 25 C durant 12H en présence de 10% du précipité au (NH4)2S04 (80% de saturation). L'aglycone formé (aesculetine) est dosé directement par HPLC. * L'activité est mesurée par la libération de glucose natif à partir de solution contenant environ l mg de coumarine/1 Oml de tampon NaAC. De fortes concentrations sont obtenues par extraction à pH=7 d'un extrait de chêne à l'eau et évaporation à sec de l'extrait. La méthode de dosage du glucose fait appel à un kit adapté au dosage du glucose dans le sérum sanguin (GLUCOSE [HK]TM; SIGMA diagnostics). Les résultats sont exprimés en mM de glucose/ml/h. 4.3- Mesure et suivi de l'activité phénol hétérosidase: * La mise en évidence de l'activité est réalisée par l'incubation (25 C; 12H) de pentagalloyl-glucose (1 mg/1 Oml) en présence de 1 0% du précipité protéique total, et dosage de l'acide gallique libéré par HPLC. * La mesure de l'activité enzymatique est basée sur la libération de fonctions carboxyliques abaissant le pH d'un milieu de réaction. Dans un tube à vis on place 9mg d'un extrait aqueux de chêne vert dans 9ml d'une solution NaCI (0,1M; pH=4,5) et l ml du précipité au (NH4)2S04 à raison de 1%. Un tube témoin est réalisé dans les mêmes conditions, sans enzymes. Le pH est mesuré dans les deux tubes au temps zéro (pHto: pour le temoin; pHeo: pour le tube enzyme) et après 4H d'incubation à 25 C (pHt4: pour le temoin; pHe4: pour le tube enzyme). 21 2705607 Les conditions optimales ont été établies au préalable, la corrélation entre la libération de glucose (méthode enzymatique) et la chute du pH sont parfaitement similaires après la première heure d'incubation (r= 0, 98). L'activité Phénol Hétérosidase est calculée à partir de la relation: (pHto - pHt4) - (pHeo - pHe4) x 100 PeH en 10 u pH/ml/h=----------------------------- 4.4- caractérisation d'une activité aldéhyde-phenol synthétase Le mode d'action de cette activité n'étant pas connu nous mettons simplement en évidence les transformations. La synthèse des aldéhyde-phénols est étudiée à partir de sciure de chêne (5g; 60 mesh) humidifiée, répartie en boîte de Pétri et ensemencée par du mycélium frais, sous la forme du culot de centrigation d'une culture de 15j (1 mg mycelium/1 00ml de milieu de culture CZAPEK-DOX). Les boites sont incubées à 30 C durant 1 5j. La sciure est alors extraite au moyen d'une solution hydroalcoolique (50% v/v + 1% HCI N) durant 24h à 25 C. 10ml de liquide centrifugé (4500 tpm, 20mn) est ajusté à pH=7 (NaOH N) et épuisé par 10, 5, puis 5 ml d'éther diéthylique. Les phases organiques sont rassemblées en ampoule à décanter, puis évaporées à sec; le résidu est repris par 1 ml de MeOH. L'extrait est chromatographié dans les conditions décrites par SALAGOITY et al. (1 987). La production de vanilline est de syringaldehyde est quantifiée à partir de solutions standards injectées dans les mêmes conditions. - Dosage des macromolécules fongiques 5.1- Précipitation et dosage des polysaccharides a) précipitation: Les polysaccharides sont précipités (24H à 4 C) à partir de 0,5ml de milieu de culture centrifugé (4500tpm, 20mn) pour 2,5ml d'éthanol 95% v/v (1/5; v/v). Après lavage par de l'éthanol 95% à - C et centrifugation (4500tpm, 20mn), le précipité est dissous dans 1Oml d'eau 22 2705607 b) dosage des polysaccharides neutres: Les polysaccharides neutres sont dosés par la méthode au phénol sulfurique. A 1 ml de solution à doser sont ajoutés 1 ml de phénol ( solution aqueuse à 5%) et 5 ml d'acide sulfurique RP. Après agitation immédiate, les tubes sont déposés au bain-marie à 1 00 C pendant mn, puis refroidis à 0 C. La densité optique est lue à 490nm sous 1 cm. Les valeurs sont issues d'une moyenne de trois dosages, les résultats sont exprimés en mg/l d'équivalent glucose. c) dosage des polysaccharides acides: Les polysaccharides acides sont dosés par la méthode au métaphénylphénol. A lml de solution à doser on ajoute 5ml d'acide sulfurique RP, en opérant dans un bain d'eau glacée. Après agitation, les tubes sont placés dans un bain-marie à 100 C pendant 3mn, refroidis à 0 C et supplémentés par 100pl de métadiphénylphénol (0,15% dans NaOH à 0,5%). Après 15 Smn la densité optique est mesurée à 520nm sous 1 cm. Les valeurs sont issues d'une moyenne de trois dosages, les * résultats sont exprimés en mg/I d'équivalent ac. galacturonique. 5.2- Dosage des protéines totales Les protéines sont dosées par la méthode au bleu de Coomassie. A 100 pli de milieu de culture centrifugé (4500 tpm, 20mn) on ajoute 1 ml de bleu de Coomassie G250 [10mg bl. Coom. G250 + 5ml d'EtOH 95% (v/v) + 10ml d'acide phosphorique à 85% (p/v) + eau distillée (qsp 100 ml)]. Après 5 mn la densité optique est mesurée à 595 nm sous l cm. Les résultats sont exprimés en mg/l d'équivalent BSA (albumine de sérum bovin) 23 2705607 MISE EN EVIDENCE DE LA FLORE FONGIQUE DU BOIS DE CHENE 1- Observation in situ En microscopie optique, des fragments de bois de surface apparaissent recouverts par endroit d'agglomérations noires et brillantes (x 400). Chaque regroupement semble constitué de sous- unités plus ou moins sphériques. La plus forte concentration de population est localisée sur les zones défibrées et au niveau des fentes de retrait, très fréquentes en fin de séchage. A un grossissement plus fort (x 1000), la flore se distingue plus facilement et peut être classée d'après la couleur et la forme: - des amas de sphères noires plus ou moins allongées recouvrent le bois (fig. 5a). En l'absence de ces moisissures, les fibres sont "marron opaque" et laissent peu passer la lumière; en revanche, après l'implantation de ce type de micro-organismes, les fibres deviennent blanches, translucides et peu épaisses. On peut supposer qu'il s'agit de micro-organismes cellulolytiques ou lignolytiques; le mycelium se répartit entre les fibres du bois et reste difficile à observer. On peut le mettre en évidence par culture de quelques massifs noirâtres dans une solution de glucose (fig.5Sb); - Des micro-organismes formant de petites tâches vertes (fig.5c). Ils s'accumulent et se développent en recouvrant les organismes précédents (fig.5d). Le mycélium se répartit à la surface du bois. En microscopie électronique à balayage: [cf. feuille annexe] 2- isolement et identification des souches. Localisation sur le parc à bois Les micro-organismes sont isolés soit à partir de sciure (60 mesh) représentant les 5 premiers millimètres du bois de surface (la sciure est conservée à -20 C), soit sur coton stérile frotté à la surface du bois et agité dans 10 ml d'eau stérile pour collecter les spores. D'une part, I'inoculum liquide est immédiatement ensemencé sur milieu solide MAG à raison de 1 ml pour 10 ml de gélose; d'autre 24 2705607 24 =/w part, la sciure contenant l'inoculum est ajoutée à de l'eau stérile ( 1/10, p/v) et soniquée 10 s avant d'être ensemencée. Cinquante repiquages successifs seront nécessaires pour isoler champignons dont 3 représentent 99% de la biomasse et 1 plus de 80%. Pour ce dernier, nous possédons 4 souches isolées à différents moments du séchage et à différents endroits sur le parc à bois. Un échantillon de chaque espèce est déposé dans la collection de l'institut d'oenologie; I'institut PASTEUR (Paris) en possède également quelques exemplaires. Les résultats d'identification sont rassemblés dans les tableaux IV et V et la planche Nous avons identifié: -Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud; -Trichoderma harzianum Rifai -Trichoderma koningii Oud - Rhizopus stolonifer (Ehrenb. ex Fr) Lindner et isolé une souche non déterminée codée "ECLR2-91" Les sources d'inoculation sont diverses (tableau vi) puisqu'à l'exception de ECLR l'ensemble des espèces se rencontre avec plus ou moins d'importance dans tout l'environnement. Ainsi, au cours du séchage, les spores et les conidies se déposeront à la surface du bois et seules les mieux adaptées pourront s'implanter et devenir majoritaires. Le champignon ECLR peut être considéré comme une contamination car il provient exclusivement de l'écorce des arbres. R. Stolonifer est également une souche dont la présence est accidentelle dans la mesure o elle a été isolée d'un grand nombre de substrat moisi (BOTTON et al., 1985) et n'est pas spécifique de la flore fongique liée au séchage naturel. 2705607 tableau Vl localisation des différentes sources de contamination sur le parc à bois isolement à partir: d'eaux de ruissellement (a), d'écouvillonnage de la surface du bois (b), de macération de terre fine (c) de stabulation de gélose à l'air (d) eaux écorce des billes de bois sol atmosphère isolement a b c - d genres/espèces Rhizopus stolonifer - + +++ Aureobasidium pullulans ++ + Trichoderma harzianum + + + - + + Trichoderma koningii ++ + + "ECLR2-92" 0 +++ 0 0 0: absent; -: rare ( 8 / 1 O) 26 2705607 3- Ecologie des moisissures au cours du séchage naturel 3.1- succession des moisissures au cours du séchage Sur tout le parc à bois on prélève des merrains à différents stades de séchage; des éprouvettes de bois (5x5 cm) sont découpées et réparties en poches stériles avant analyse. Chaque échantillon (10 éprouvettes) représente un temps de séchage différent (0, 4, 6, 12, 18, 20 mois). Au laboratoire les éprouvettes sont lavées par 100 ml d'eau stérile durant 2 H sur table d'agitation; puis soniquées (5x2s). Les eaux de lavage sont utilisées pour le comptage des spores sur MAG; les éprouvettes rincées sont déposées en boîtes de Pétri et recouvertes de gélose MAG refroidie (40 C), elles serviront à l'étude de la répartition des mycélias sur le bois. Après 4 j d'incubation (25 C) pour les spores et 6 j pour le mycélium on compte: - le nombres de colonies visibles (SFT = spores formant des thalles). Ce critère est à employer avec précaution. Il peut donner une indication sur la pression de l'inoculum à la surface du bois et exprime également la capacité à sporuler ou l'aptitude du mycélium à se fragmenter. Chaque SFT peut englober une ou plusieurs spores. - le % de mycélium de surface (% mycélium). Cette méthode permet de mieux exprimer l'importance de la biomasse fongique par rapport à la surface du bois. Tout au long du séchage naturel, le nombre de spores augmente (fig. 7a); au-delà de 12 mois le rythme d'accumulation de l'inoculum (spores, conidies, chlamydospores) s'infléchit sensiblement. Dans le même temps (fig.7b) la colonisation du bois par les moisissures est rapide et maximale en 12 mois. a) évolution de la quantité d'inoculum et de la vitesse d'implantation des mycélias (fig.7a et b) Les conidies, les spores et les chlamydospores ne participent pas au processus de séchage, en revanche ils seront déposés par le vent ou par les eaux de lessivage sur les merrains verts. Les mycéliums implantés sur le bois (Trichoderma sp. ) ou dans les fibres de surface (A. pullulans) sont issus de cet inoculum indigène qui germe et forme un thalle. Plus la pression d'inoculation est grande et plus vite le bois est recouvert de champignons. 27 2705607 L'augmentation du nombre de spores dans les premiers mois est essentiellement liée à un apport du milieu environnant (vent, eau, poussière...), mais dès que les premiers thalles ont atteint leur maturité phénologique, le recouvrement du bois se réalise de proche en proche. Lorsque la colonisation devient saturante (12 mois: 87%), I'inoculum sporogène reste constant. Toute la surface est occupée par des thalles se chevauchant plus ou moins et l'expansion des populations en place est nulle. Les spores assureront la dispersion des souches sur du bois vert. b) répartition des espèces en fonction de la durée du séchage (fig. 8) D'après la classification de JARWIS (1978) Aureob. pull. est une espèce constante (fréquence > 80%), Trich sp. est occasionelle (fréquence 1020%) et les autres espèces représentant moins de 10% de la population sont accidentelles (R. stolonifer., ECLR). La dynamique des populations demeure relativement stable. On peut noter, en début de séchage la présence de 3 à 4 spores d'espèces différentes, mais dès le 6ième mois, seul A. pullulans est présent. En fin de séchage la part des Trichoderma sp. s'accroît. Les observations sont renouvelées pour les mycéliums implantés, avec toutefois une présence exclusive plus rapide et plus massive d'A. pullulans. Ceci suggère qu'il s'agit d'une espèce bien adaptée au développement sur bois et qui possède une source d'inoculation dans l'environnement. L'étude de l'écologie des espèces, implantées sur le bois, révèle qu'A. pullulans est une moisissure spécifique du séchage naturel du bois de chêne; au moins dans le Bordelais. Les autres champignons peuvent être considérés comme des espèces de contamination. 3.2- Les phénomènes d'inhibition La relative homogénéité de la flore fongique et l'implantation tardive de Trichoderma sp., sur le bois déja colonisé par A. pullulans en phase stationnaire, laissent supposer qu'un certain nombre de mécanismes d'inhibition peuvent agir. D'une part, nous évaluons l'effet inhibiteur éventuel des Trichoderma sp. et de A. pullulans sur plusieurs micro-organismes fréquemment rencontrés dans l'environnement. Les souches testées sont prélevées sur des milieux solides et déposées par stries successives au centre de la. boîte (milieu solide MAG). Après 96H d'incubation à 25 C on ajoute au milieu 1 ml d'une suspension de spore 28 2705607 (Trichoderma sp.) ou de chiamydospores (A. Pullulans); après 8 j d'incubation les résultats sont collectés - l'inhibition est positive (+ ) lorsque la souche préalablement implantée est recouverte par l'espèce testée et la boîte est pratiquement occupée par un seul type de microorganisme; - I'inhibition est négative (-) lorsque l'espèce testée ne s'est pas développée; - I'inhibition est faible (+/-) lorsque les deux mycéliums ont continué leur développement chacun dans une partie libre du milieu de culture. D'autre part, nous étudions plus particulièrement les compétitions entre Trichoderma sp. et A. Pullulans. Le même protocole est utilisé et l'inhibition est suivie grâce à des clichés effectués à différents temps d'incubation. Tableau VII Inhibition de plusieurs champignons par Trichoderma sp. et Aureobasidium pullulans +: inhibition +/-: faible inhibition -:sans effet Espèces testées Espèces inhibitrices Trich. sp. Aureob. pull. S. cerevisiae (EG8C) + + Trichoderma sp. / + /- A. pullullans + / B. cinerea + + A. niger + +/- Penicillium sp. + +/- R. stolonifer +/- ECLR2-91 + ± On constate (tableau VII) que les deux espèces (Trichoderma sp; A. pullulans.) inhibent tous les micro-organismes testés. On comprend donc que lorsque A. pullulans, après 18 à 24 mois de développement, laisse un vide écologique sur le bois, T. harzianum et koningii puissent s'implanter. 29 -2705607 De part leur adaptation aux milieux ligneux et leur virulence, ces champignons ont la possibilité de coloniser la surface du bois et constituent une flore fongique limitée et spécifique. L'antagonisme de Trichoderma sp. à l'égard de Botrytis cinerea a déjà été signalé par WOOD (1951). ARTIGUES (1981) met en évidence l'existence d'une corrélation positive entre le niveau de l'activité & (1-3) glucanase de Trichoderma sp. et la destruction du champignon. L'inhibition peut être également liée à certaines substances antibiotique, fongicide ou fongistatique (WYLLIE et MORENMOUSE, 1977- 1978). Pour illustrer ce phénomène nous avons complété nos observations par une étude concernant la compétition et l'inhibition de A. pullulans par Trichoderma sp. Trichoderma sp. s'implante puis colonise toute la surface de la culture en 15j. On peut également noter sur la ligne délimitant les deux espèces l'apparition d'une coloration jaune-orangée qui n'est pas présente en culture pure. D'autre part cette zone contient une substance hydrosoluble qui provoque un arrêt de croissance de A. pullulans (gélose orangée dissoute dans de l'eau distillée; filtrée stérilement 0,22p et ajoutée à un milieu solide MAG inoculé par A. pullulans). 4- Discussion et conclusion 1- L'observation microscopique de la surface du bois de chêne en cours de séchage naturel, révèle la présence d'un certain nombre de micro-organismes. Les uns développant leur mycélium entre les fibres du bois, les autres restant en surface. 2- Cette flore fongique est représentée pour plus de 80% par Aureobasidium puflulans. On y trouve également quelques isolats de Trichoderma harzianum et koningii. La présence de Rhizopus stolonifer et d'une souche non identifiée codée ECLR2-91 reste limitée. 2705607 3- Au cours d'une période de séchage de 18 à 24 mois, la flore est exclusivement constituée par Aureobasidium pullulans; Trichoderma sp. apparaît en fin de période et représente alors 10 à % de la flore. L'implantation et la colonisation du bois par Aureobasidium pullulans sont liées d'abord à une pression d'inoculation très importante par l'ensemble de l'environnement, ensuite par une inhibition exercée à l'égard d'un bon nombre de micro- organismes, enfin par une adaptation remarquable au milieu. Néanmoins, lorsque cette espèce a colonisé toute la surface du bois (phase stationnaire), Trichoderma sp. peut s'implanter, grâce à un matériel enzymatique et antibiotique adapté. Le bois passe progressivement du stade de séchage naturel à celui de substrat en décomposition; la flore est alors profondément modifiée: apparition de colonies importantes de R. stolonifer et de Trichoderma sp. accompagnées parfois de Geomyces sp., Geotrichum sp., Trichothechom... (MOREAU, 1952). DEVELOPPEMENT ET CROISSANCE DES MOISISSURES Tous les essais au laboratoire concernent principalement A. pullulans (PNDS4-91, SNDS1-91), T. harzianum (VFFS1-91) et ECLR2-91. Les cultures sont pratiquées sur milieu liquide CZAPEK- DOX ou en milieu non proliférant. La croissance est évaluée à partir du poids sec de mycélium produit. 1- Croissance des moisissures Afin de mesurer l'aptitude des champignons à se développer, nous testons plusieurs espèces, isolées du bois, en milieu liquide (lmg de mycélium sec/ 100ml de milieu). Après 1 ou 2 mois sur table d'agitation à 200 C (+2 C) les cultures sont centrifugées (4500 tpm, mn). Le culot est rincé 3 fois par de l'eau stérile et 3 fois par de l'éthanol 95% v/v; chaque opération est suivie d'une centrifugation (4000 tpm, 20mn). Les mycéliums sont alors déshydratés à l'étuve (60 C), jusqu'à poids constant. Par différence de pesée entre le tube taré vide et contenant le culot de centrifugation sec on évalue la quantité de mycélium produit en mg/100ml de milieu ou en mg/g de substrat carboné consomme. 31 2705607 La croissance des micro-organismes en milieu glucosé est très différente en fonction des espèces étudiées (tableau VIIi): - ECLR2-91 se développe peu; d'ailleurs sur le bois ou sur des extraits de bois gélosé sa croissance est également très lente; - R. stolonifer (SB-92) a une croissance très limitée alors qu'en milieu solide, sur du bois ou sur des extraits de bois gélosé sa croissance est très rapide; il semble donc que le milieu liquide ne convienne pas pour sa culture; - T. koningii (VCFS1-91) et A. pullu!ans (SNDS1-91) présentent une faible capacité à se développer sur un milieu liquide les milieux gélosés donnent le même type de résultats; - T. harzianum (VFFS2-91) et A. pullulans (PNDS4-91) sont les mieux adaptés au milieu liquide, leur croissance est rapide; l'utilisation du sucre est complète. En outre ces caractéristiques Tableau VIII [culture 2 mois; substrat carboné: glucose 25g/i; inoculumr: tmg/lOOmlj espèces souches poid de rmyceliumrn sucre résiduel mg mycellium c/l par g de substrat mg/lOOml mg/g de milieu de substrat Trichoderma: - T. harzianumVFFS2-91 100 40 0,5 41 - T. koningiiVCFS1-91 7,5 3 9,0 4,7 Aureobasidium: - A. pullulansPNDS4-91 127,5 51,2 53,5 - A. pullulansSNDS1-91 7,1 3,1 9,5 4,5 Rhizopus: -R. stolonifer SB-92 6,2 2,5 8.4 3,7 inconnus ECLR2-91 2 0,8 12 1,5 32 2705607 s'expriment également sur le bois et dans des milieux gélosés d'extrait de bois. Le métabolisme glucidique (avec du glucose directement assimilable) est déficient pour la plupart des espèces testées, mis à part T. koningii (VCFS1-91) et A. pullulans (SNDS1-91). Tableau IX Incidence du substrat carboné sur la croissance de Trichoderma harzianum et Aureobasidium pullulans [culture: lmois; inoculum: l mg/1 00ml] mg de mycélium mg de mycélium/g /100 mi de substrat substrat dose g/I T. harz. A. pull. T.harz A. pull. glucose 25 24 34 9,6 16,3 polysaccharides 25 10 8 4 3,2 de bois tanins de chêne 25 33 46 13,2 18,4 à l'eau 2 5 cellulose 5 14 9 28 18 Afin de tester l'influence de la source énergétique sur la croissance de T. harzianum et de A. pullulans, nous avons réalisé des cultures dans les mêmes conditions en utilisant une gamme de substrats que l'on peut retrouver dans le boisde chêne - glucose: D(+)-glucose - polysaccharides: extraits à partir de sciure de chêne (60 mesh) dans HCI à 0,1% (lkg de sciure pour 5 I, agité durant 72H à température ambiante). Le liquide de couleur bleutée est ensuite additionné d'EtOH 95% à raison de lIvol pour 9 vol d'EtOH. Après 3 jours à -4 C le précipité formé est centrifugé (5000 tpm, 30mn), rincé par 3 fois avec de l'EtOH 95% à -15 C et centrifugé (5000tpm, mn). Le culot est repris par le minimum d'eau et lyophilisé. La poudre obtenue renferme 20% de polysaccharides neutres. La plus 33 2705607 grande part des polysaccharides du bois étant sous forme combinée, nous avons dû abandonner la purification sur pvpp car elle s'avère peu rentable. - cellulose: cellulose DIFCOTM - tanins de chêne: extraits par épuisement à l'eau de l kg de sciure (1/5, p/v) durant 96H à température ambiante, sur table d'agitation. Les solutions brutes sont collectées, le volume réduit au 1/2 par évaporation et l'extrait aqueux concentré est alors purifié par demixion selon la technique de GLORIES (1978). Les deux espèces étudiées (tableau IX) peuvent se développer sur tous les substrats employés, on peut supposer qu'elles possèdent des activités enzymatiques spécifiques au métabolisme des différentes sources d'osides (hétérosides, holosides). Le rendement d'utilisation de ces composés peut être présenté par ordre décroissant du poids de mycélium produit par g de substrat: - A. pullulans: tanins> cellulose> glucose>> polysaccharides T. harzianum: cellulose>> tanin> glucose> polysaccharides Ce classement souligne une plus grande affinité à l'égard de la cellulose pour T. harzianum (champignon cellulolytique) et une affinité cellulose/tanins de chêne pour A. pullulans (champignon saprophyte, lignolytique). La culture de ces champignons sur milieu de EGGINS et PUGH confirme le classement établi, ainsi que le caractère cellulolytique des Trichoderma sp. en général (BOTTON et al., 1985). Ce milieu est constitué de (NH4)2SO4 0,5g; L-asparagine : 0,5g; KH2PO4: 1,0g; KCI 0,5g; MgSO4 0,2g; CaCI2 0,1g; DIFCO Yeast Extract: 0,5g; Agar: 20g; cellulose: lo0g; eau qsp 1000ml. On comprend ainsi pourquoi A. pullulans se développe en premier et transforme la surface du bois en une masse fibreuse et blanche. Le substrat cellulosique peut ensuite être attaqué par T. harzianum. Ces champignons ne semblent pas adaptés à l'hydrolyse et à l'assimilation des polysaccharides du bois, en revanche la croissance est améliorée si on utilise des polysaccharides levuriens ou même du glucane de Botrytis cinerea. Ceci est à relier à l'existence de glucanase adaptée à la libération des oses constitutifs de ces macromolécules glucidiques (DUBOURDIEU, 1982; LLAUBERES, 1988) 34 2705607 2- Libération de macromolécules a) autolyse de T. harzianum et de A. pullulans Après une phase stationnaire plus ou moins longue, les champignons entrent en phase de déclin. Une autolyse endocellulaire progressive débute alors sous l'action de différentes activités enzymatiques étudiées chez Saccharomyces sp. (protéase: SILVA et al., 1987; FEUILLAT, 1985; estérase: CHEN et al., 1980; glucanase: LLAUBERES, 1987); chez Pediococcus (LLAUBERES, 1987) et chez Botrytis cinerea (MARTINEZ et al., 1983). L'étude porte sur la turbidité des cultures au cours du développement des moisissures (Turbidimètre SIGRIST PHOTOMETER KTL65) en milieu liquide CZAPEK-DOX (lmg de mycélium sec/1 00ml) sur table d'agitation; ainsi que sur les phénomènes de lyse dans le même milieu suivis par mesure de la DO 210nm selon le protocole de GARBAY et LONVAUD (1 991). Tableau X Evolution de la turbidité des milieux de culture au cours du développement de Trichoderma harzianum, Aureobasidium pullulans et ECLR2 [culture: milieu liquide sur table d'agitation, inoculum: 1 mg/100ml] unité: NTU espèces Trichoderma harzianum Aureobasidium pullulans Inconnue souches VFFS2-91 SNDS1-91 PNDS4- 91 ECLR2-91 temps en semaines: 1 10 22 8 2 2 10 36 10 6 4 11 42 26 9 6 28 72 28 15 8 32 110 89 18 36 112 92 21 2705607 La turbidité du milieu augmente très rapidement pour A pullulans; en revanche, T. harzianum et ECLR2 opacifient peu le milieu. La turbidité est proportionnelle au poids de mycélium produit et au-delà de 10 semaines toutes les cultures perdent un peu de trouble. Cette observation indique la fin de la croissance des champignons et le début de leur autolyse (GARBAY et LONVAUD, 1991). La mesure de la DO 210nm montre (fig._f) que l'autolyse débute dès les premiers jours de culture. Le relarguage de macromolécules l0 absorbant dans l'UV est limité durant les 4 premières semaines (D0210 milieu liquide. Au cours du développement des moisissures, il existe un équilibre entre les enzymes lytiques et les enzymes de construction: - en phase de croissance: la masse cellulaire augmente et les enzymes lytiques ont un rôle mineur; - en phase de déclin: la masse cellulaire est constante et la lyse des tissus devient prépondérante. Les champignons utilisent alors les macromolécules pariétales comme nutriment (DUBOURDIEU, 1982). La lyse est déclenchée soit par la disparition du substrat carboné ou azoté, soit par l'absence de substrat adéquat, soit par la toxification du milieu. b) production de polysaccharides et de proteines exocellulaires au cours de la croissance et de la lyse Les milieux et les conditions de culture sont identiques à ceux employés pour les expériences précédentes (2/ a)). Les cultures sont menées jusqu'à 3 mois et les analyses suivantes sont effectuées sur les surnageants obtenus après centrifugation (4500 tpm; 30mn) -polysaccharides acides au métaphenyl-phénol (DURBOURDIEU, 1982); -polysaccharides neutres au phénol sulfurique (DUBOURDIEU, 1982); -les proteines totales au bleu de COOMASSIE (BRADFORD, 1976). En fin de croissance active, A. pullulans a libéré dans le milieu entre 150 et 350mg/l de polysaccharides neutres (fig.i0). Sur un 36 2705607 milieu non agité on peut supposer que la production d e polysaccharides est plus limitée (LLAUBERES, 1988). La nature de la source d'énergie influence fortement la production de polysaccharides. On observe que plus le glucose est difficile à investir dans le métabolisme (cellulose, ellagitanins), et plus le champignon forme de polysaccharides exogènes. En outre, plus le substrat est pauvre en ose (ellagitanins), plus le relargage est intense. Ainsi la production des polysaccharides semble être liée aux difficultés de croissance dans le milieu. Tableau Xl Libération de protelines et de polysaccharides exocellulaires par différents champignons isolés du bois de chêne au cours de leur lyse [culture: 4mois en milieu liquide, sur table d'agitation; inoculum: 1 mg/1 00ml Source de carbone: glucose] Polysaccharides acides polysaccharides neutres Proteines totales mg/l eq. ac. galacturonique mg/I éq. glucose mg/I éq. BSA Trichoderma koningii (VCFS1-91) 0 198 1,5 Trichoderma harzianum (VFFS1-91) 0 495 tr Aureobasidium pullulans (PNDS4-91) 0 806 tr (SNDS1-91) 0 1375 12 Rhizopus stolonifer (SB1-92) 0 1053 tr Souche non idenfiée (ECLR2-91) 0 341 0, 25 tr: trace; BSA: bovine sérum albumin 37 2705607 Le tableau Xl montre, d'une part, l'absence de polysaccharides acides chez les souches étudiées, d'autre part, la faible proportion de protéines, sauf pour A. pullulans (SNDS1-91), enfin, la forte production de polysaccharides neutres par Aureobasidium sp. (1lg/l) et R. stolonifer(lg/l). Les propriétés polysaccharidogènes d'A. pullulans sont établies depuis longtemps (BOUVENG et al., 1963) et sont susceptibles de permettre l'inactivation de la fraction astringente des tanins du bois. En outre, il y a eu vraisemblablement hydrolyse des protéines durant les 4 mois de l'incubation par des protéases fongiques. 3-Caractérisation des activités enzymatiques L'aptitude de certaines espèces de champignons à se développer sur des milieux particuliers (cellulose, polysaccharides, tanins de chêne) suggère l'existence de matériel enzymatique adapté assurant l'utilisation de la fraction osidique des différents substrats. 3.1- principales activités enzymatiques exocellulaires. -Evdolution au cours du déveloperment Les études portent essentiellement sur Aureob. pull., car il s'agit de l'espèce la plus fréquemment rencontrée tout au long du séchage naturel. Un test préalable sur galerie API LRA, OSIDASETM révèle u n grand nombre d'activités exocellulaires osidiques dans les 10 premières heures de culture, en milieu non proliférant ou sur extrait de bois de chêne. En revanche, le milieu supplémenté en glucose présente un profil enzymatique (OSIDASES) d'intensité trop faible pour être lue. Les principales activités d'A. pullulans sont évaluées grâce à des substrats pNP (p-nitrophénol) selon la technique de DARRIET et al. (1988) et s'exprime en ADO 400nm/ml/12H d'incubation à 25 C. L'activité a amylase se mesure avec le kit AMYLASE 3TM (SIGMA) sur 20jl de prise d'essai (protocole adapté de la mesure de l'activité a amylase dans les urines) et s'exprime en 103 unité/ml/mn. a)mise en évidence de quelques activités osidiques chez Aureobasidium pullulans: Aureob. pullulans possède essentiellement une actiyité I- glucosidase (fig.$1), qui peut être inhibée par le glucose (DUBOURDIEU et al., 1988). Trichoderma sp. présente un profil enzymatique 38 2705607 comparable. Le culot de centrifugation en condition non proliférante ou le surnageant de culture possèdent également une forte activité Rglucosidase. Cette activité est thermodégradable (1H à 65 C), fortement réprimée par les tanins condensés du raisin (100mg/l). A contrario, les ellagitanins n'ont pas d'effet sur l'activité enzymatique même à des concentrations plus élevées (1lg/l), Enfin l'activité ne semble pas être inhibée par des teneurs en NaCI de l'ordre de 0,5 à 1 M. I-1. b)évolution des activités f3-glucosidase et a amylase au cours du temps Au cours de la croissance d'A. pullulans en milieu liquide (CZAPEK- DOX, 1 mg mycelium/100ml) sur différents substrats (1 00mg/1 OOml) deux types d'activités sont suivies (fig.2. et 13): - une activité a amylase (EC:3.2.1.2) dont le maximum est atteint en moins de 10 OH de culture et reste peu importante quelque soit le milieu. Seuls les polysaccharides du chêne semblent stimuler la production de cette enzyme. Son rôle dans le métabolisme des substrats n'est que très faible. - une activité &-glucosidase (EC:3.2.1.21) dont le maximum se situe à 48H de culture. Cette activité est intense durant toute la phase d'utilisation du substrat carboné par le mycélium. Les profils d'activité glucosidase présentent deux faits remarquables : d'une part, on note une activité r&-glucosidase très élevée dans le milieu non proliférant; d'autre part, une augmentation de cette même activité dans le milieu supplémenté en glucose au-delà de 60H de culture. Ces deux observations montrent l'adaptabilité du champignon au milieu: - production de &-glucosidase exocellulaire dans le milieu non proliférant, pour se procurer un substrat énergétique indispensable à sa croissance. Au-delà de plusieurs heures, I'activité chute rapidement, en l'absence de source d'hétérosides. - production de R-glucosidase dans le milieu contenant 1 g/I de glucose après 60H de culture. Cette augmentation correspond à la quasi-disparition du glucose natif du milieu. 3.2- Profil enzymatique total. Monographie des activités esterases et osidases. Les tests sont pratiqués sur galeries API. ZYM. LRATM, en suivant le protocole établi par le fabricant. Les résultats sont regroupés dans le tableau XII. 39 2705607 Les profils enzymatiques moyens (n = 5) présentés permettront une identification plus aisée de ces deux champignons. Il est intéressant de remarquer que A. pullulans possède un spectre d'activité osidique et estérasique plus large que celui de T. harzianum On peut souligner l'activité maltosidase et lactosidase (fait peu fréquent) et les activités butyrate et valérate estérases d'A. pullulans. Tableau XII: Profils osidases et esterases de Trichoderma harzianum et d'Auresobasidium pullulans ( voir annexe) 4- Discussion et conclusion 1-L'étude de la croissance, du développement et de certaines activités enzymatiques des champignons isolés du chêne au cours de son séchage naturel permet de mieux comprendre l'écologie de cette flore spécifique 2-Colonisation rapide du milieu par A. pullulans (fécondité, vitesse de croissance, utilisation de substances à faible PM facilement assimilables). C'est un champignon lignicole, donc qui dégrade la lignine et les ellagitanins. Le résultat est une meilleure accessibilité des fibres cellulosiques (aspect du bois) pour les autres micro-organismes. 3-Possibilité pour Trichoderma sp. de dégrader après le passage de A. pullulans, la cellulose en se nourrissant des débris autolytiques d'A. pullulans. De nombreuses espèces de Trichoderma sont hyperparasites fongiques. On a donc au cours du séchage deux catégories de champignons différents possédant deux métabolismes distincts; on a donc deux phases d'évolution du bois. 4-L'ensemble des champignons rencontrés sur le bois libère dans le milieu un grand nombre d'enzymes, dont la R-glucosidase (estimé parle pNP-E-D-glucose)est la principale. INFLUENCE DE LA FLORE FONGIQUE SUPERFICIELLE DU BOIS DE CHENE SUR SA COMPOSITION PHENOLIQUE 1. Observation sur l'influence du mode de séchage sur la composition du bois D'une façon générale, le séchage naturel provoque une diminution de la fraction hydrosoluble du bois (tableau Xlil fig.14). Le lessivage du bois exposé à l'air durant plusieurs mois provoque 2705607 simultanément une élimination des composés phénoliques (80% de l'extrait hydrosoluble) et des sels ou des éléments minéraux libres. Il convient de noter que l'élimination des composés phénoliques est plus importante que pour la matière minérale; le rapport cendre(C) / extrait hydrosoluble(H) augmente de 5 à 10% entre le séchage naturel et le séchage artificiel. Si le bois subit au cours du séchage naturel un simple lessivage, le rapport C/H doit demeurer constant entre les deux modes de séchage. En revanche, si une action enzymatique assure la destruction des molécules hétérosidiques et permet l'accumulation des phénols simples, facilement lessivables et moins encombrants sur le plan stérique, alors, le rapport C/H augmente. En outre, I'insolubilisation d'une fraction d'ellagitanins peut accentuer le phénomène (VIVAS et GLORIES, 1992). C'est ce deuxième mécanisme que l'on observe lors du séchage naturel. En accord avec les résultats de CHATONNET (1992), le séchage naturel appauvrit le bois en flavonols, en ellagitanins, en acides phénols. La densité du grain (grains serrés ou grains lâches) peut accélerer ou ralentir ces phénomènes. La disparition de composés incrustés dans la matrice du bois (cellulose, hemicellulose, lignine...) facilite l'accessibilité des solvants jusqu'aux fibres (ROSEN, 1978). CHARUK et RAZUMOVA (1974) ont établi que l'extraction du bois de pin augmente sa perméabilité au gaz. Enfin, I'importance des fentes de retrait au cours du séchage semble subordonnée à la teneur en matières extractibles du bois; plus le bois est pauvre en extrait hydrosoluble et plus les fentes de retrait seront abondantes ou profondes (SALOMON et KOZA, 1968). Par son action sur l'ultrastructure du chêne, le mode de séchage peut donc modifier l'intensité des phénomènes oxydatifs au cours de l'élevage des vins en fûts. 41 2705607 Tableau XIII Incidence du mode de séchage sur la composition phénolique du chêne bois de la région centre Séchage naturel Séchage artificiel (24 mois) extraits hydrosoluble (mg/g) 97 +10(1) 134 +5 IFC (2) 19,6 +1 22,5 +1,5 d440nm 0,03 +0,001 0,03 0,001 Flavanols (mg/g eq.(+) catéchine) 0,21 + 0,01 0,46 +0,05 I ell (3) 0,12 +0,01 0,18 +0,05 ac gallique (mg/g) 26 + 4 39 6 ac ellagique (mg/g) 17 +3 24 +3, 5 : écarts à la moyenne : Indice de Folin Ciocalteu : Indice ellagitanins (ADO600nm; BATES-SMITH, 1972) 2. Observations sur la transformation de certains composés du bois au cours du séchage naturel Au cours du séchage naturel, les constituants phénoliques hydrosolubles sont éliminés par lessivage, lors des périodes pluvieuses. Mais, il existe également un ensemble de mécanismes provoquant une modification de la composition du bois de chêne. Nous étudions ici certaines molécules phénoliques caractéristiques d u chêne et susceptibles d'affecter les qualités gustatives des vins (astringence, amertume). 42 2705607 2. 1- évolution des ellagitanins Le chêne vert ou séché naturellement renferme 10% d'ellagitanins (MOUTOUNNET et al., 1992; MOUTOUNNET, 1992) dont la majeure partie est représentée par la castalagine (50%) et l a vescalagine (30%). L'étude par chromatographie liquide haute performance au cours du séchage montre, d'une part, que les teneurs en castalagine et en vescalagine diminuent légèrement au profit de la castaline et de la vescaline - après perte d'un groupement Hexa- hydroxy-diphénique-; d'autre part, que des formes insolubles liées à la paroi du bois apparaissent, ainsi que des molécules oxydées (augmentation de la d 440 nm). Néanmoins, ces variations sont de faible intensité et ne permettent pas de différencier nettement le mode de séchage. Deux interprétations peuvent être avancées, pour expliquer ces conclusions - D'abord, au cours du séchage, la dégradation des ellagitanins conduit à des phénols simples (ac. gallique, surtout ac. ellagique) facilement éliminés par lessivage. L'augmentation du rapport C/H complète cette interprétation; - Enfin, la variabilité liée à l'échantillonnage étant souvent supérieure à la variabilité liée au mode de séchage, les résultats deviennent difficilement exploitables. D'après MOUTOUNNET (communication personnelle), la vescalagine et la castalagine n'interviennent que faiblement dans les propriétés gustatives des vins; en revanche la pédonculagine et certains gallotanins isolés de Quercus sp. par ISHIMARU (1987) peuvent participer activement aux sensations amères et astringentes du bois. En toute objectivité les substances sapides responsables des impressions de vert, de sève, d'astringence sont aujourd'hui encore inconnues. Leur destruction par voie enzymatique libère dans le milieu des phénols simples relativement neutres sur le plan gustatif. 2.2- évolution des coumarines Les coumarines sont étudiées dans les vins et les eaux-de-vie depuis fort longtemps. JOSEPH et MARCHE (1972) ont été les premiers à isoler la scopolétine, I'aesculétine, l'ombelliférone et la méthyl- ombelliférone, dans des extraits de Cognac. Ils ont également mis en évidence certaines des formes hétérosidiques, en particulier la scopoline et l'aesculine. 43 2705607 Si à l'état d'aglycone (aesculétine, scopolétine) les coumarines sont relativement neutres sur la plan gustatif, en revanche, sous forme hétérosidique (aesculine, scopoline) elles sont fortement amères et confèrent aux vins des sensations de verdeur et d'amertume prononcées. La dégustation à l'aveugle d'une série de vins supplémentés en aesculétine (lmg/l) et en aesculine (lmg/l) souligne nettement le rôle des coumarines hétérosidiques dans les propriétés organoleptiques des vins. Comme le supposent JOSEPH et MARCHE (1972), au cours du séchage naturel, la disparition des coumarines liée au glucose sous l'action de micro-organismes, permet d'atténuer fortement l'amertume des extraits de bois. Sur un échantillon de bois provenant de l'Allier, du Limousin et des Vosges, répondant aux critères caractéristiques de ces différents types de bois (VIVAS et GLORIES, 1992), nous pratiquons soit un séchage naturel soit un séchage artificiel; puis les extraits à l'éther sont analysés. La fig.15 regroupe l'ensemble des déterminations. Quelque soit l'origine géographique du bois, le séchage naturel permet une augmentation significative des teneurs en scopolétine. Le précurseur le plus probable étant la scopoline. La disparition de la fraction glycosidique des coumarines du bois permet de limiter les sensations d'amertume des vins élevés en fûts. Ce type de résultat est à relier avec les dégustations réalisées sur des vins élevés en fût, dont le bois est soit séché artificiellement soit naturellement. En général, le séchage artificiel donne des vins plus amers, avec des impressions de sève et de verdeur (PONTALLIER, 1981; PONTALLIER *et al.,1 982). 2.3- évolution des aldéhydes phénols Les aldéhydes phénols proviennent de la dégradation des lignines. Ces polymères sont constitués par condensation d'alcool phényl-propénoïque: alcool hydroxy-4-cinnamique (structure hydroxy-benzoyl; alcool coumarilique), alcool hydroxy-4-méthoxy-3- cinnamique (structure gaïacyl; alcool coniférilique), alcool hydroxy- 4-diméthoxy-3,5-cinnamique (structure syringyl; alcool sinapylique). Après oxydation chimique ou enzymatique les aldéhydes correspondants s'accumulent dans le bois (SEIKEL et al.,1971): aldéhydes hydroxy-4-méthoxy-3-cinnamique (coniféraldhehyde), hydroxy-4-diméthoxy-3, 5 cinnamique(sinapaldéhyde).L'apparition d'aldéhydes hydroxy-4-méthoxy-3-benzoïque (vanilline) et hydroxy- 44 2705607 4-diméthoxy-3,5-benzo'que (syringaldéhyde) serait due à l'oxydation des ac-propanones (CHO-CH=CH), selon le mécanisme de ROBERT et CHEN (1987), repris par MONTIES (1992). Dans le tableau XIV sont regroupés les résultats d'un essai effectué en 1991, sur des bois d'origine géographique différente (Allier, Limousin, Vosges) dont chaque lot a été divisé en deux; l'un séché artificiellement, I'autre séché naturellement. L'analyse des aldéhydes phénols est effectuée sur l'extrait éthéré de la fraction neutre du bois (extraction à pH=7). tableau XIV Dosage de certains aldéhydes phénols sur des bois de chêne séchés artificiellement et naturellement A: bois de l'allier; L: bois du limousin; V: bois des vosges SN: séchage naturel; SA: séchage artificiel résultats en mg/l origine / mode de séchage vanilline syringaldéhyde coniféraldéhyde sinapaldéhyde ASA 0,28 0,92 0,09 0,12 ASN 0,58 1,26 0,28 0,12 LSA 0,35 0,56 0,17 0,07 LSN 0,41 0,55 0,10 0,10 VSA 0,32 0,61 0,10 0,10 VSN 0,46 1,08 0,15 0,15 moyenne aldéhyde-phénols SA 0,31 0,69 0,12 0,09 SN 0,48 0,96 0,17 0,12 3 0 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - pourcentage d'augmentation55 40 40 35 (SN/SA) La variabilité de l'échantillonnage est supérieure à la variabilité liée à l'origine géographique. En revanche, les différences liées aux modes de séchage sont significatives. Le pourcentage d'augmentation entre SA (Séchage artificiel) et SN (Séchage naturel) représente 30 à 50% des aldéhydes phénols totaux. 2705607 Les aldéhydes phénols du bois de chêne sont principalement représentés par la vanilline et la syringaldéhyde; ces molécules augmentent fortement au cours du séchage naturel. La coniferaldéhyde et la sinapaldéhyde sont faiblement présentes et relativement peu affectées par le mode de séchage. Ces résultats suggèrent que les mécanismes ayant pour effet d'augmenter la teneur en aldéhydes phénols, essentiellement de la série benzoïque, ont pour origine: - soit la rupture des alcools cinnamiques terminaux des lignines, suivie d'une part de leur oxydation en aldéhydes et d'autre part de l'oxydation des a-propanones donnant naissance aux aldéhydes benzoïques (cf. IV/4/4.1); - soit les aldéhydes liées aux composés pariétaux, selon l'hypothèse de MONTIES (1992), libérables par voie chimique ou enzymatique. Nous préférons faire référence à la première hypothèse, dans la mesure o MONTIES (1992) émet lui même des réserves quant à l'existence d'aldéhydes liées par liaison de covalence. Enfin, parce que ces aldéhydes liées peuvent englober les alcools cinnamiques constitutifs des motifs de lignines et libérables par hydrolyse alcaline ou acide. 3- origines microbiologiques des transformations Afin de confirmer l'action des micro-organismes isolés du chêne sur les hétérosides du bois et sur la lignine, il convient de reproduire les phénomènes dans des conditions contrôlées, au laboratoire. 3.1- dégradation enzymatique des tanins du bois. identification des produit d'hydrolyse a) dégradation enzymatique de quelques composés phénoliques hétérosidiques du bois en milieu non proliférant Une suspension non proliférante d'Aspergillus oryzae o u d'Aureob. pulL, ou encore de Trich. sp., mise en présence de tanins hydrolysables purifiés (vescalagine, pentagalloyl-glucose et ac. digallique), peut les hydrolyser en moins de 80 h. Le classement par ordre décroissant de demi-dégradation (50% de la molécule -hydrolysée) donne l'ordre suivant: 46 2705607 - ac. digallique (6h), - vescalagine (8h), - pentagalloyl-glucose (30h). Nous présentons sur la fig.11 un exemple des profils d'hydrolyse enzymatique obtenus. Les genres Trichoderma, Aspergillus et Aureobasidium, présentent le même type de courbe. Le précipité (1%) au (NH4)2SO4 (80% de saturation) des proteines totales d'un milieu de culture de ces moisissures, recèlent une activité flE-glucosidase majoritaire (R-glucosidase: 4,2 u DO 440nm/ml/12h). L'étude cinétique des courbes de dégradation de l'acide digallique et du pentagalloyl-glucose montrent: d'une part, I'existence d'une activité depsidase active dans les 10 premières heures de l'incubation (Vmax=5h), provoquant l'hydrolyse précoce et rapide de l'acide digallique; d'autre part, I'existence d'une activité estérase, dont l'activité maximale succède à l'activité depsidase (Vmax=20h). Ces résultats sont confirmés par les travaux de BEVERINI et METCHE (1990). Ces auteurs ont purifié une tannase commerciale, en deux tannases notées I et 11, sur Séphadex G50, Boigel P-300 et CON A-Utragel. La tannase I possède une activité estérase plus importante (substrat: methyl-gallate), alors que la tannase Il présente une activité depsidase majoritaire (substrat: ac. digallique). Les activités spécifiques varient en fonction du substrat utilisé. En collaboration avec LAGUNE (Laffort) nous avons confirmé l'existence de deux tannases à partir des enzymes exocellulaires d'une culture pure d'Aureob. pull. par chromatographie haute performance de tamisage moléculaire, sur colonne TSK G6000 PW (figl7). La fig.1 6 montre nettement le décalage entre la dégradation de l'acide digallique et du pentagalloyl-glucose. Ces observations sont conformes aux travaux cités plus haut. 47 2705607 On peut donc envisager la séparation de l'activité tannase en - Activité tannase vraie: depsidase (EC: 3.1.1.200); - Activité estérase: phénol hétérosidase (EC: 3.1.1.201) b) identification des produits d'hydrolyse La fig.18, montre la dégradation enzymatique du pentagalloyl- glucose. On observe simultanément une disparition des gallotanins et l'apparition dumonomère correspondant, l'acide gallique. Il convient de signaler que seul est suivi, dans cet exemple, l'augmentation de l'acide gallique, néanmoins le pentagalloyl-glucose donne des produits intermédiaires: trigalloyl-glucose, digalloyl-glucose et monogalloyl qui, à leur tour, libèrent de l'acide gallique, sous l'action de la tannase. Les profils chromatographiques de la fig.19 montrent la dégradation d'une part de la castalagine en castaline et en acide ellagique (fig. 19a) et d'autre part de l'acide digallique en acide gallique (fig.19b). La dégradation d'extrait de chêne à l'eau, purifié par demixion (GLORIES, 1978), en présence de suspension non proliférante d'A. pullulans, permet la libération de glucose natif dosé par méthode enzymatique (fig.20). 3.2- dégradation des coumarines hétérosidiques: a) incidence des enzymes exocellulaire d'A. pullulans sur l'aesculine A partir de l'aesculine purifiée sur plaque de cellulose à partir d'Aesculus hypocastanum, on prépare une solution à 10pg/ml d'un précipité au (NH4)2SO4 (80% de saturation) d'une culture pure d'A. pullulans, une solution sans enzyme constitue le témoin. Les deux tubes sont maintenus à l'obscurité pendant 12h à 25 C. Le contenu de chaque tube est extrait par 2xlml d'éther diéthylique (300rpm, 5mn), les phases organiques sont regroupées en ampoule à décanter puis évaporées à sec et reprises par 1 ml de MeOH. Les extraits sont ensuite analysés par HPLC (SALAGOITY et al., 1 987). L'hétéroside coumarique n'est pas fluorescent, en revanche son aglycone l'est (fig.21), ce qui permet de mettre en évidence par HPLC couplé à un détecteur fluorimétrique l'apparition de l'aesculétine (dihydroxy-6,7coumarine) et la disparition de l'aesculine ([dihydroxy-6,7coumarine]-7-1-D-monoglucoside). A. pullulans possède donc une activité ethérase exocellulaire permettant 48 2705607 d'expliquer en partie l'augmentation de la stopolétine et de l'aesculétine au cours du séchage naturel. L'hydrolyse des hétérosides coumariques est confirmée par le dosage enzymatique du glucose dans les milieux réactionnels. "L'enzyme nomenclature" ne présente pas dans sa dernière version d'hydrolase susceptible d'agir sur les liaisons éther des coumarine-7monoglucoside". Il semble donc judicieux de placer dans les hydrolase (EC: 3), une catégorie numérotée EC: 3.1.8, intitulé "carboxylic éther hydrolase" permettant de classer la coumarine éthérase, pour laquelle nous proposons le code suivant: (EC: 3.1.8.10). b) utilisation des enzymes exocellulaire d'A. pullulans précipité à partir d'un milieu de culture, pour révéler les coumarines hétérosidiques du bois de chêne. Des extraits à l'eau (20%; p/v) de sciure (60 mesh) de chêne vert, séché artificiellement et naturellement, sont concentrés puis lyophylisés. Les poudres obtenues servent à constituer des solutions à 1 Og/l dans un tampon NaAc 0,2M, pH=5. 1 Oml de chaque extrait sont incubés à 25 C pendant 1 2h en présence de 10% du précipité au (NH4)2S04 (80% de saturation), d'une culture d'A. pullulans au maximum de l'activité Iglucosidase; le témoin est supplémenté par l ml d'eau. Les milieux réactionnels sont épuisés par 10, 5, 5 ml d'éther diéthylique (300rpm; 5mn); les phases organiques sont réunies en ampoule à décanter et évaporées à sec, puis reprises par I ml de MeOH et chromatographiés (SALAGOITY et al., 1987). Les résultats du dosage sont regroupés dans le tableau XV. Le témoin non enzymé renferme les coumarines sous forme aglycones et les tubes enzymés représentent les coumarines totales (aglycones)+ hétérosidiques). Les résultats ne permettent pas de comparer les différents échantillons de chêne, dans la mesure o ils représentent chacun un échantillon de sciure d'une journée de travail à la tonnellerie. Par contre, les profils en hétérosides et en aglycones peuvent être confrontés. Notre protocole permet de doser simultanément, sur le même échantillon l'aesculine, la scopoline, I'aesculétine et la scopolétine. Nous pouvons, également, verifier l'impact du séchage naturel sur la teneur en coumarines hétérosidiques et aglycones. Ce dernier permet de transformer, sous l'effet des enzymes exocellulaires des 49 2705607 moisissures, la quasi totalité de l'aesculine et la scopoline en aglycone corespondant. Le séchage artificiel, sans pour autant provoquer des transformations aussi complètes permet d'éliminer % des coumarines glucosidiques; ce qui suggère l'existence d'activité coumarine ethérase dans le bois ou plus vraisemblablement la possibilité d'une hydrolyse chimique dans les conditions du séchage artificiel. Tableau XV Dosage de l'aesculétine de la scopolétine et de leurs hétérosides dans le bois de chêne séché artificiellement ou naturellement. [extrait de chêne à l'eau incubé dans un tampon NaAc 0,2M, pH=5 en présence des enzymes exocellulaires d'A. pullulans (10%)] résultats en g/li chêne vert chêne séchage chêne séchage naturel artificiel Aesculine 6 4 0,2 Scopoline 36 26 4,1 j hétérosides 42 30 4,3 Aesculétine 0,1 0,8 4,8 Scopolétine 2,5 12 30,4 Y ag!ycones 2,6 22,8 35,2 3.3- synthèse d'aldhéhydes phénols La synthèse des aldéhydes phénols est étudiée à partir de sciure de chêne (5g; 60 mesh) humidifiée, répartie en boite de Pétri et ensemencée par le mycélium frais de Trich. harz., sous la forme du surnageat de centrifugation d'une culture de 1 5j (1 mg mycélium/1 OOml de milieu de culture CZAPEK-DOX). Les boîtes sont incubées à 30 C durant 15j. La sciure est ensuite extraite au moyen d'une solution hydroalcoolique (50% v/v + 1% HCI N) durant 24h à C. 1 0ml- de liquide centrifugé (4500 tpm, 20mn) est ajusté à pH=7 (NaOH N) et épuisé par 10, 5, 5 ml d'éther diéthylique. Les phases 2705607 organiques sont rassemblées en ampoule à décanter, puis évaporées à sec et reprises par 1 ml de MeOH. L'extrait est chromatographié dans les conditions habituelles. Une expérience est menée dans les mêmes conditions avec d'une part, le mycélium d'A. pullulans et d'autre part, avec de la sciure dont on a éliminé par de l'eau chaude les composés extractibles hydrosolubles. La fig.22 montre une augmentation importante des aldéhydes phénols, surtout de la vanilline et la syringaldéhyde, en présence de T. harzianum L'origine microbiologique des aldéhydes phénols au cours du séchage naturel est donc très vraisemblable. Tableau XVI Production d'aldéhydes phénols durant l'incubation de mycelium, en présence de sciure de chêne [inoculum: mycélium frais d'une culture liquide de 15j, incubation: 15j à 30 C] résultats en mg/l sciure de chêne sciure épuisée -------------------- --- à l'eau + T. harzianum + A. pullulans +A. pullulans vanilline +0,3 +0,15 +0,4 syringaldehyde +1,1 +0,6 +0,7 T. harzianum et A. pullulans sont capables de libérer des quantités non négligeables de vanilline et de syringaldéhyde (Tableau Xvl). L'élimination d'une grande quantité d'extrait hydrosoluble par l'eau chaude (90 C) ne limite pas la production d'aldéhydes par voie microbienne. Le précurseur de ces aldéhydes phénols peut être la lignine. Mais cette origine devra être vérifiée à partir de lignine purifiée du bois de chêne (lignine-dioxane, lignine-éthanol). Cette activité enzymatique d'origine fongique est nommée "aldéhyde phénol synthétase". Une étude détaillée devrait permettre de préciser son mode d'action. 51 2705607 4- Activités hétérosidases d'Aureobasidium pull. et de Trichoderma sp. Etude des activités phénol hétérosidase et coumarine étherase 4.1Recherche des substrats adaptés aux activités phénol hétérosidase et coumarine étherase La recherche de substrats adaptés aux activités phénol hétérosidase (PeH) et coumarine étherase (CET) se pratique en milieu liquide non proliférant: - Tampon NaCI 0,1M pH=4,5; pour l'activité PeH et depsidase; - Tampon NaAc 0,2M pH=5; pour l'activité CET. Les substrats sont utilisés à la dose de 1 mg/1 Oml et les enzymes exocellulaires provenant du précipité au (NH4)2S04 (80% de saturation) d'une culture au maximum d'activité R-glucosidase. L'activité CET est mesurée par la libération de glucose natif (méthode enzymatique) et l'activité PeH et depsidase par la méthode de "ApH". Les tests sont positifs lorsque, d'une part la différence de pH est supérieure à 10% de celle du témoin non enzyme, et d'autre part lorsque la libération de glucose natif est supérieure à 20% du témoin non enzymé. Les résultats sont rassemblés dans le tableau XVII 52 2705607 Tableau XVII Substrat hétérosidique susceptible d'être hydrolysé par les enzymes exocellulaires d'Aureobasidium pullulans. et de Trichoderma harzia n um [activités mesurées: PeH par ApH; CET par libération de glucose] activité/substrat Aureob. pull. Trich. harz. -PeH: *ellagitanins: extrait de châtaignier + + extrait de chêne + + vescalagine + + *gallotanins: extrait de noix de galle + + tanins de tara + + tanins de myrobolan + + acide tannique +/- + trigalloyl- glucose + + pentagalloyl-glucose + + *tanins condensés: tanins de pepins de raisin fraction TP d'un vin rouge +/- + *anthocyanes: malvidine monoglucoside + + *flavonol: kaempférol monoglucoside + + -CET: aesculine + + -Depsidase: acide digallique + + D'une façon générale, tous les substrats hétérosidiques sont utilisés par les activités enzymatiques des champignons isolés du boisdechêne. 53 2705607 Les tanins condensés sont inhibiteurs de l'activité PeH; bien que la fraction TP (Tanins-polysaccharides et Tanins-proteines, GLORIES, 1978) soit modestement utilisée. L'inhibition semble partiellement levée lorsque les sites d'astringence sont en partie bloqués. voies de transformation de certains composés phénoliques du bois de chêne Les activités enzymatiques étudiées sont la PeH, la CET et aldéhyde phénol synthétase; elles concernent trois types de substrat : les tanins hydrolysables (gallotanins, ellagitanins) et leurs depsides, les coumarines glycosilés et la lignine. 4.2- Les voies de transformation proposées sont issues de l'analyse des produits de réactions entre substrats et enzymes. a) dégradation des ellagitanins et des gallotanins L'acidolyse des tanins du bois donnent le même type de résidus que ceux obtenus par voie enzymatique: - L'acidolyse ménagée des gallotanins (HCI N, 100 C, 30 mn) donne du glucose natif et de l'acide gallique et parfois, selon les structures, de l'acide quinique; - L'acidolyse des ellagitanins (HCI 6N, 100 C, 60mn) donne de l'acide ellagique et du glucose lié, difficilement libéré par voie chimique. Cette propriété est utilisée pour leur dosage spécifique. La dégradation enzymatique des tanins du bois(fig.23) conduit dans tous les cas, si la réaction est menée jusqu'à son teme, à des phénols simples (souvent acide gallique ou ellagique) et à du glucose (plus rarement des pentoses). L'activité PeH agit sur les liaisons esters entre les hydroxyles du glucose et les carboxyles de l'acide gallique pour les dérivés galloyl et de l'acide hexa-hydroxy- diphénique pour les ellagitanins. La dégradation est conduite en plusieurs étapes - Pour les gallotanins, on observe la perte progressive des unités gallates et on peut suivre par HPLC l'apparition d u tétragalloyl-glucose ainsi que du tri-, du di- et du monogalloyl- glucose. Le terme de la réaction correspond à la libération de toutes les unités gallate du glucose, ce dernier pouvant être utilisé pour le métabolisme énergetique du champignon. - Les ellagitanins donnent dans un premier temps de l'acide hexa-hydroxydiphénique (HHDP) et de la vescaline ou de la castaline 54 2705607 (pour cet exemple, fig. 22). L'acide HHDP n'est stable que sous forme glycosilée, il évolue donc rapidement par estérification intramoléculaire en acide ellagique (Scalbert, communication personnelle). Dans un second temps, la vescaline ou la castaline sont dégradées pour donner de faible quantité d'acide gallique, du glucose et de l'acide HHPD qui produit instantanément de l'acide ellagique. b) dégradation des coumarines monoglucosides L'hydrolyse acide des coumarines-monoglucosides conduit généralement à une transformation de la molécule, qui perd alors ses propriétés de fluorescence, à l'état d'aglycone. Par voie enzymatique, la rupture de la liaison éther entre les- OH de la coumarine et du glucose est connue depuis fort longtemps (JOSPEH et MARCHE, 1972). Le terme de la réaction peut être facilement suivi par l'apparition d'une fluorescence caractéristique de l'aglycone (fig.24). Au cours de l'hydrolyse enzymatique d'un concentré de coumarines de chêne vert, extrait par l'éther diéthylique, à partir d'une solution aqueuse neutralisée (pH=7), nous avons constaté la diminution de l'ombélliferone et l'apparition d'un pic en fin de chromatogramme (colonne silice greffé C18) également fluorescent. Ce pic révélé après traitement enzymatique possède le même spectre UV et le même temps de rétention que le sporalen o o oo Sporalen MURRAY et al. (1982) ont particulièrement étudié cette voie, qui utilise comme précurseur la 7-diméthylalyl-pyrophosphate et l'ombélliférone. Bien que nous n'ayons pas identifié avec certitude de furanocoumarine tel que le sporalen, cette réaction mérite d'être confirmée. 2705607 c) hypothèse de formation enzymatique des aldéhydes phénols à partir de lignine Bien qu'admise par CHEN et CHANG (1985), la dégradation de la lignine par des populations fongiques n'a toujours pas été formellement démontrée. MONTIES (1992) parle toujours d'hypothèse pour cette voie de transformation. La production d'aldéhydes phénols à partir de lignine concerne les unités terminales de type phénylglycérol dont la fonction benzylique "a" est libre ou éthérifiée (fig.25). Deux mécanismes sont envisagés l'élimination "y-D" qui permet d'une part, la rupture de la liaison aryléther et la libération du radical cinnamoyl, d'autre part, la production d'aldéhyde cinnamique. Dans notre exemple (fig.25), nous observons la production de coniféraldéhyde (hydroxy-4- méthoxy-3-cinnamaldehyde). Les aldéhydes benzoïques dérivent de l'oxydation des a-propanones; il s'accumule alors dans le milieu de la vanilline (hydroxy-4-méthoxy-3-benzaldéhyde). - I'élimination "c-e" qui conduit après oxydation des a- propanones aux aldéhydes benzoïques par voie directe. 4.3- caractéristiques des phénols hétérosidases de A. pullulans. et de Trichoderma sp. N'ayant pas purifié les différentes enzymes, nous avons estimé les cinétiques enzymatiques, les affinités à l'égard du substrat et les activités en fonction du pH, à partir de surneageant de culture au maximum d'activité [3-glucosidase. La figure 26 est la représentation de LINEWEAUER et BURK, sous la forme de: 1/V = f(1/S) [S: concentration en mg/Il; V: vitesse de réaction 10-3 u pH/ml/h], de l'hydrolyse enzymatique des ellagitanins de chêne vert 3o permet le calcul du Km et du Vm. Les constantes cinétiques sont estimées à: km = 14,5 et Vm 0,14 pour T. harzianum; Km = 70 et Vm = 0,45 pour A. pullulans. A. pullulansprésente une meilleure affinité que Trichoderma sp. pour le substrat étudié. L'activité PeH est maximale pour les deux genres au pH=5 (fig.27). à pH =2 I'activité est pratiquement inexistante, au-delà de pH=6 elle décroît rapidement. 56 2705607 4.4- inhibition de l'activité phénol hétérosidase Les tanins condensés du raisin et du vin possèdent la propriété de combiner les protéines, ils sont donc susceptibles de limiter la croissance des moisissures et d'inactiver les enzymes libérées. Si les ellagitanins du chêne n'affectent que peu la croissance des moisissures, en revanche, les tanins condensés de pépins de raisin inhibent nettement leur développement (fig.27a), même à de faible concentration (500 mg/l). L'activité PeH est inhibée par le glucose libre des milieux de culture dès 10g/l, en revanche, la disparition du glucose permet de lever l'inhibition. Les tanins condensés répriment l'activité PeH, puisque les mycéliums lavés et remis en suspension dans un milieu convenable ne retrouvent pas leur activité osidase initiale. Enfin, pour de fortes concentrations en ellagitanins libres (> 1g/l) I'activité PeH est inhibée (Fig.28). Dans le bois, les ellagitanins imprègnent les fibres et sont libérés progressivement. De telles concentrations ne se rencontrent pas à l'état libre dans le bois; d'ailleurs, le lessivage du bois, précédant l'implantation des populations fongiques, appauvrit les couches de fibres superficielles. L'inhibition de l'activité par les tanins du raisin et du vin est fortement diminuée par l'inactivation des sites d'astringence par des protéines ou des polysaccharides. On observe sur la fig.29 I'effet de la PeH d'A. pullulans sur la fraction TP-TS d'un vin (GLORIES, 1978). Le chromatogramme montre, d'une part une nette augmentation du pic de l'acide gallique et une faible augmentation de la (+) catéchine, d'autre part l'apparition de deux pic en fin de chromatogramme. 4.5- recherche d'une souche performante L'étude épidémiologique précédente, a permis de montrer que le séchage naturel induit une flore fongique assez restreinte. A. pullulans s'avère la souche la plus fréquemment rencontrée sur le bois et ce tout au long du séchage. La recherche d'une souche de ce champignon, particulièrement adaptée aux conditions du séchage naturel peut trouver une application en tonnellerie au même titre que dans d'autres biotechnologies (produits laitiers, bières, vins, paneries...). L'utilisation d'un levain fongique adapté pourrait assurer un "séchage" du bois plus complet et plus homogène. Les cribles de sélection se répartissent sur deux niveaux 57 2705607 - sélection d'après les critères de la microbiologie classique. Une moisissure possède un certain nombre de caractéristiques phénologiques, physiologiques et écologiques dont la plupart se retrouvent dans les nombreuses monographies concernant les champignons. - sélection d'après des critères spécifiques à la technologie mise en oeuvre. Ces critères sont directement liés aux contraintes de la production. a) sélection d'après les critères de la microbiologie classique Pour se développer sur le bois, en cours de séchage, le champignon doit trouver dans le milieu un potentiel hydrique minimum de croissance (awo), compris entre 0,75 et 0,60 (JAY, 1978). Le potentiel hydrique du bois (aw) varie au cours du séchage de 0,45 à 0,12. Mais A. pullulans se developpe à la surface du bois et peut donc bénéficier de l'hygrométrie ambiante et des pluies. L'humidité atmosphérique relative en climat océanique varie de 55 à % (aw = 0,55 -0,95) la plupart du temps les valeurs sont supérieures à 0,70; ce qui permet une activité quasi continue du champignon. A. pullulans peut se développer sur des substrats secs dont le aw est inférieur à 0,70. Les Trichoderma nécessitent un aw plus élevé (0,80) ainsi que Rhyzopus sp. (0,93), d'après JAY (1978). D'après CORLETT et BROWN (1980) la gamme de pH acceptable pour la croissance de nombreux organismes fongiques varie de 1,5 à 10. Sur le bois de chêne le pH n'est pas un critère limitant. La température est également un facteur important. Sur le parc à bois, le soleil estival peut provoquer une élévation de la température de surface jusqu'à 45-50 c dans les cas les plus extrêmes. A. pullulans est un champignon résistant à la chaleur; il peut résister à un traitement de stérilisation classique des aliments (JENSEN, 1960;; KING et ai, 1969). En outre les amplitudes thermiques et les chocs thermiques stimulent la germination des spores. b) sélection sur des critères liés aux contraintes de la production Les champignons ne doivent pas former de composés odorants susceptibles d'affecter la qualité du bois. Peu de travaux ont été réalisés sur ce sujet. On sait que Trichoderma sp. peut produire à partir de méthylacétate, -formiate, -propionate et -myristate du menthol et de l'iso-menthol. 58 2705607 Le champignon doit rapidement s'implanter sur le bois et représenter une flore majoritaire. A. pullulans possède dans l'environnement de nombreuses sources d'inoculation. Son adaptation au milieu lui permet, en outre, de s'implanter rapidement pour représenter 70 à 80% de la flore fongique du séchage. Ainsi, la pression de sélection semble être en faveur d'A. pullulans. Le champignon doit posséder une activité p-glucosidase exocellulaire suffisamment intense pour modifier le profil phénolique hétérosidique du bois. La production de polysaccharides capables d'inactiver certaines molécules astringentes complète le spectre d'action choisi. A. pullulans présente une réponse satisfaisante à l'ensemble des cribles de sélection présentés pour le séchage naturel du chêne dans le Bordelais. 5. Discussion et conclusion La flore fongique superficielle du bois de chêne est susceptible de provoquer des modifications de la structure des composés phénoliques. Le séchage naturel représente un ensemble de réactions physico-chimiques, microbiologiques et enzymatiques capables d'affecter la qualité du bois. 1- Le séchage artificiel provoque une simple déshydratation du bois et une destruction partielle de certains composés phénoliques. En comparaison, le séchage naturel modifie en profondeur la composition du bois de chêne. Ce mode de préparation induit une élimination plus importante des composés phénoliques hydrosolubles, par rapport à la fraction minérale du bois. Le rapport Cendres / Extrait hydrosoluble augmente par le fait du séchage naturel. A ce stade, nous pouvons soupçonner soit une modification de I'accessibilité des tissus imprégnés au solvant, soit une diminution de l'encombrement stérique des molécules phénoliques solubles dans l'eau. Les deux hypothèses sont vraisemblables et seul un ensemble de réactions d'hydrolyse du bois et des tanins imprégnant la matrice semblent envisageables (MONTIES, 1 992). 2- Dans les conditions du séchage naturel, on note à la fois l'hydrolyse des ellagitanins et des coumarines glycosidiques, l'apparition de produits de réaction caractéristiques (ac. gallique, ac. ellagique, vescaline, castaline, aglycones coumarique et glucose natif) et la modification de la composition de la paroi 59 2705607 (insolubilisation des ellagitanins par combinaison avec les constituants de la paroi et altération des lignines donnant naissance à des aldéhydes phénols). L'ensemble de ces mécanismes a déjà été observé (JOSEPH et MARCHE, 1972; SEIKEL et al., 1971; ROBERT et CHEN, 1987; SHUYUN PENG et al., 1991; VIVAS et GLORIES, 1992), mais leur origine fongique n'a jamais été formellement établie (MONTIES, 1992, VIVAS et al., 1991). 3- Au cours de la croissance de la flore fongique caractéristique du séchage naturel dans le bordelais (A. pullulans, Trichoderma sp.) nous avons pu reproduire au laboratoire les mécanismes observés sur le terrain. Mais cette biomasse fongique peut également agir en condition non proliférante. Ainsi, lorsque le bois est entièrement recouvert par les champignons, les activités exocellulaires continuent à être sécrétées et à agir après infiltration dans le bois par capillarité. Trois activités enzymatiques ont été mises en évidence: - L'activité phénol hétérosidase (PeH), qui agit sur les ellagitanins et les gallotanins du bois; elle correspond à deux enzymes: une tannase vraie, la depsidase pour laquelle nous proposons le code (E.C: 3.1.1.200), et une estérase pour laquelle nous proposons le code (E.C: 3.1.1.201). L'activité tannase (E.C: 3.1.1.20) se trouve donc scindée en deux sous classe (200 et 201). L'existence de ces deux activités distinctes a été récemment confirmée par BEVERINI et METCHE (1990). - L'activité coumarine étherase (CET) a particulièrement été étudiée sur la scopoline, l'aesculine et leurs aglycones respectifs : la scopolétine et l'aesculétine. Cette activité est de nature carboxylique éther hydrolase, nous proposons donc le code (E.C: 3.1.8.10). - Enfin, une activité aldéhyde phénol synthétase dont nous ne connaissons pas exactement le mode de fonctionnement. La lignine est très probablement le substrat spécifique de cette activité. 4-L'activité phénol hétérosidase agit sur une grande variété de substrats. La nature hétérosidique des molécules semble être le seul critère déterminant la transformation du substrat. Les tanins condensés inhibent fortement l'activité; mais l'inactivation de certains sites d'astringence par oxydation ou par combinaison avec des proteines limite ce phénomène. 2705607 Un travail d'enzymologie doit être entrepris pour purifier ces différentes activités et en déterminer les caractères spécifiques. Une des aplications du travail est la sélection d'un champignon adapté au séchage naturel. Sa culture et son utilisation sous la forme de levains fongiques sont envisagées. A. Pullulans semble être l'espèce la mieux adaptée; quelques souches particulièrement performantes ont été isolées et constituent la base de la sélection et de la production industrielle du champignon tableau IV identification des souches de champignons isolées du bois de chêne. Tests morphologiques (en collaboration avec E. GUEHO, lnstitut PASTEUR, PARIS) [ rganes decrit j Genres et espéces colonies -92 9 S 1 FFS1-91 -91 1 SB PNDoS- 1 IvCFS-91Iv - couleur: blanc-gris noir vert-olive vert foncé forme: non caract. ronde irrégulières ronde aspect: filamenteux glacé poudreux poudreux croisance des thalles: trés rapide moyenne rapide rapide slolons: + - appareil reproducteur sporocytospores: + haut (mm) 2,5 spores: + fo rm e anguleuses diam (um) 350 long (um) 10-15 chlamydospores: + + conidies: + + + f o r m e ilisses elliptique subglobulaires ellip. ou oblongues forresbl uolngue diamr(um) 7-16 2,8-3,2 3,5 long(um) 3,5-7 2,5-2, 8 2-2,8 classification division Amastigomicota Amastigomicota Amastigomicota Amastigomicota groupes Zygomycétes Deuteromycétes Deuteromycétes Deuteromycétes ordres Mucorales Hypomycétes Hypomycètes Hypomycètes identification genres Rhizopus Aureobasidium Trichoderma Trichoderma espces stolonifer pullulans harzianum koninii stolonlfer pullulans harzianum koningii Tableau V identification d'Aureobasidium pullulans et de Trichoderma harzianum par des tests physiologiques d'assimilation et de fermentation TESTS PHYSIOLOGIQUES FERMENTATION ASSIMILATION SUBSTRATS CARBONES Aureobasidfum Trichoderma Auraobasidlum Trichoderma pullulans harzianum pullulans harzlanum glycérol - + érythritol + + D-arabinose - + L-arabinose - + + ribose ± + + D-xylose ± + L-xylose + + adonitol + + B methyl-xylose galactose + + + + D-glucose + + + + D-fructose + - + + + D-mannose + + + + L-sorbose + + + rhamnose + + + - dulcitol + + inositol mannitol + + + sorbitol + + - dL méthyl-D-mannoside + - a! méthyl-D-glucoside + + N- acéthyl glucosaminidase - + + + amygdaline + + + arbutine + + + + esculine + + + + salicine. + + + cellobiose + + maltose + + lactose + + + mélibiose + + saccharose + + tréhalose + + + inuline + + mélézitose + D-raffinose - + amidon + + + glycogbne - + + +xylitol B gentobiose - + + D-turanose + + + + D-Iyxose + + + + D-tagatose + - D-fucose + - + D-arabitol L-arabitol + + + _gluconate - - + - + 2-céto-gluconate + + -' + + -céto-gluconate + - + Tableau Xii Profils osidases et estérases de Trichoderma harzianum et d'Aureobasidium pullulans. +; +; ++; +++ intensité croissante de la réaction colorée. A ctivités osidases A ctivités estérases Act lvi tés Trichoderma Aureobasidium Activi tés Trichoderma Aureobasidium harzianum pullulans harzianum pullulans a-D-galactosidase +++ +++ C4-estérase +++ b-Dgalactosidase -+++ C5-estérase.- ++ a-L-rhamnosidase + +++ C6-estérase + a-L-arabinosidase +++ C8- estérase ++... a-D-glucosidase ++ ++ C9- estérase +++ b-D-glucosidase. +++ C0lO-estérase + ++ b-D- galacturonase + 012- estérase,I- ±+ b-D-glucuronosidase + C14-estérase + a-D-matosidase + C16- estérase ++ -+± b-D-maltosidase + + C18- estérase + + N-acetyl-a-D-glucosaminidase +++= +++ N-acetyl-b-D-glucosaminidase +++ ++ a-L-fucosidase +++ +++ b-D-fucosidase +++ b-L-fucosidase +++t- b-D-lactosidase ++ ++ a-D-manosidase + + b-D-manosidase + a-D- xylosidase. b-D-xylosidase a:,,; b: J3 64 2705607 BIBLIOGRAPHIE ARTIGUES.M -1981- Recherches de critères de selection de clones de Trichoderma actifs contre le Sclerotinia minor et Sclerotium rolfsii. Thèse doct-ing, Montpellier BATE-SMITH.E.C -1972- detection and determination of ellagitannins. Phytochem. 11, 1153-1156 BEVERINI.M and METCH.M -1990- Identification, purification and physicochemical properties of tannase of Aspergillus orizae. Sc. Aliments. BOTTON.B; BRETON.M; LEVRE.M; GUY.Ph; LARPENT.P et VEAU.P -1988- Moisissures utiles et nuisibles. Importance industrielles. ed. Masson. Paris BOUVENG.H.O; KIESSLING.H; LINDBERG.B and Mc KAY.J -1963Polysaccharides elaborated by Pullularia pullulans (Aureobasiduim pullulans). Acta Chem. Scand. 17, - 1351- BRADFORD.H -1976- A rapid and sensitive method for the quantification of * microorganismes quantities of proteïns utilising the princip of proteïnsdye-binding. Ann. Biochem. 72, 248-254 CHARUK.E.V and RAZUMOVA.A.F -1974- Der e influss von holzextrakstoffin auf permeabilitât von. Holz. Holztecnol. 15, 36-37 CHATONNET.P -1989- Selection et preparation des bois destinés à l'élevage des vins de qualités. Rev. OEnol. 52, 21-25 CHATONNET.P - 1991- Incidence du bois de chêne sur la composition chimique et les qualités organoleptiques des vins - Applications technologiques. Thèse DER, Université Bordeaux Il. CHATONNET.P -1992- Origine et traitement des bois en tonnellerie. in "le bois et la qualité des vins et des eaux-de-vie". ed. Vigne et vin publ. internat. CHAUVET.S; VIVAS.N; GLORIES.Y et SUDRAUD.P -1992- Les tanins oenologiques: Caractérisation de la nature des produits commerciaux. Rev. OEnol. 18, 64, 8-10 2705607 CHEN.C.H; JAMIESON.A.M; VAN GHELUW -1980- The release of fatty acids as a consequence of yeast aulpJysis. Amrn. Soc. Brewing. Chemist., J. 38, 1, 13-18 CHEN.C.L and CHANG.H.M -1985- Chemistry of lignin biodegradation. in "Biosynthesis and Biodegradation of wood conponents" ed. Higuchi DARRIET.Ph; BOIDRON.J.N et DUBOURDIEU.D -1988- L'hydrolyse des hétérosides terpéniques du Muscat à petits grains par les enzymes périplasmiques de Saccharomycès cerevisiae. Connaissance Vigne Vin. 22, 3, 189-195 DUBOURDIEU.D -1982- Recherches sur les polysaccharides sécrétés par Botrytis cinerea dans la baie de raisin. Thése d'état es science. Université de Bordeaux II. DUBOURDIEU.D; DARRIET.Ph; OLLIVIER.C; BOIDRON.J.N et RIBEREAU-GAYON.P - 1988- Role de la levure Sacchamomycès cerevisiae dans l'hydrolyse des heterosides terpéniques du jus de raisin. C.R. Acad. Sc. Paris. Ill. 306, 489-493 FEUILLAT.M -1985- Aluine caratteristiche del metodo classico di elaborazione degli spumante. Enotecnico. 21, 5, 475-484 GARBAY.S et LONVAUD-FUNEL.A -1990- Etude de la lyse de Leuconostoc oenos. J. Int. Sc. Vigne Vin. 24, 4, 157-167 GIORDANO.G -1971- Caractteristiche fisiche et meccaniche del legno. in "'Technologia del legno". vol 1. Utet ed. GLORIES.Y -1978- Recherches sur la matière colorante des vins rouges. Thèse doct. és sciences. Université Bordeaux II GLORIES.Y -1992- Les mécanismes oxydatifs liès à la conservation sous bois. in "le bois et la qualité des vins et des eaux-de-vie". ed. Vigne et vin publ. intern. GREAVES.H -1970- The effect of some wood inhabiting bacteria on the permeability of Eucalyptus regnans and Pinus radiata sapwood and heartwood. Holzforschung. 24, 6- 14 HIGUCHI.T; FUKAZAWA.K and SHIMADA.M -1967- Res. Bull. Collége Exp. For. 25, 167- 66 2705607 ISKIMARU.K -1987- (en japonais) Etude chimique des tanins de la famille des Quercus. Thèse doct.. JARVIS.B -1978- Methods for detection fungi in foods and beverages. in "food and beverage mycologie". ed. Beuchat. Wesport Conn. Avi. Pub. Inc. JOSEPH.E; MARCH.M; GOIZET.A et AUDEBERT.J -1975b- Etude theorique sur le cognac et son vieillissement en fûts de chêne. Rev. Fr. OEnol. 57, 1-17 LLAUBERES.R.M -1988- Les polysaccharides sécrétés dans les vins par Saccharomycès cerevisiae et Pediococcus sp. Thèse docteur de l'Université de Bordeaux Il MARCHE.M et JOSEPH.E -1975a- Etude théorique sur le cognac, sa composition chimique et son vieillissement en fûts de chêne. Rev. Fr. OEnol. 57, 1-106 MONTIES.B -1992- Composition chimique du bois de chêne: composés phénoliques, relation avec quelques propriétés physiques et chimiques susceptibles d'influencer la qualité des vins et des eaux-de-vie. in "le bois et la qualité des vins et des eaux-de- vie" ed. vigne et vin publ. internat. MOREAU.F -1952- Encyclopédie mycologique. Tome I et Il. ed. Paul Lechenvallier. Paris. MOUTOUNNET -1992- Les tanins du bois de chêne. in C.R. Colloque "incidence du bois de chêne sur la qualité des vins" sous direction Y.GLORIES (à paraitre) MOUTOUNNET.M; RABIER.P; SARNI.F et SCALBERT.A -1992- Les tanins du bois de chêne: Les conditions de leur présence dans les vins. in "le bois et la qualité des vins et des eaux-de-vie". ed. Vigne et vin publ. internat. MURRAY.R.D.H; MENDEZ.J and BROWN.S.A -1982- The naturals coumarins: Occurence, chemistry and biochemistry. Wiley ed. Chichester PENG.S; SCALBERT.A and MONTIES.B -1991- Insoluble ellagitanins in Castanea sativa and Quercus petraea woods. Phytochem. 30, 3, 775-778 67 2705607 PENG.S; SCALBERT.A and MONTIES.B -1991- Insoluble ellagitanins in Castanea sativa and Quercus petreae woods. Phytochem. 30, 3, 775-778 PONTALLIER.P -1981- Recherche sur les conditions d'élevage des vins rouges. Role des phénomènes oxydatifs. thèse Doct-lng, Université Bordeaux Il PONTALLIER.P; SALAGOITY.M.H et RIBERAU-GAYON.P -1982- Intervention du bois de chêne dans l'évolution des vins rouges élevés en barriques. Connaissance vigne vin. 16, 1, 45-61 ROBERT.D and CHEN.C.L -1987- Structural analysis of biodegraded lignins from spruce wood decayed by Phanerochaetes chrysosporum by quantitative 13C NMR spectroscopy. IV [nt. Wood and Pulping Chem. ISNPC. Paris. 139145 ROSEN.H.N -1978- Interaction of alcools and organics acids with wood. Wood Science. , 151-157 SALAGOITY.M.H; TRICARD.C; MARSAL.F; SUDRAUD.P -1986- Preliminary investigation for the differenciation of cenological tanins according to botanical origin Determination of gallic acid and its derivates. Am. J. Eno. Vitic. 37, 4, 301-303 SALAGOITY.M.H; TRICARD.C et SUDRAUD.P - 1987Dosage simultané des aldehydes aromatiques et des coumarines par chromatographie liquide haute performance. Application aux vins et eaux-de-vie vieillis en fûts de chêne. J. Chromatogr. 392, 379-387 SALOMON.M and KOZA.K -1968- Shrinkage of sapwood and heartwood of young dougles fir trees. Forest Prod. J. 18, 90-94 SEIKEL.M.K; HOSTETTLER. F.D and NIEMANN.G.L -1971- Phenolics of Quercus rubra SILVA.A; FUMI.M.D; MONTESISSA.G; COLOMBI.M.G et COLANGRANDE -1987- Incidence de la conservation en présence de levures sur la composition des vins mousseux. Connaissance vigne vin. 21, 3, 141-162 TARANSAUD. J -1976Le livre de la tonnellerie. ed. La roue à livres diffusion 68 2705607 VIVAS.N -1987- Expérimentation de plusieurs système de conduite en lyre dans le vignoble Bordelais. Mem..[9TS viti-oeno. ed. INRA-Bordeaux. 110p VIVAS.N; CHAUVET.S; GLORIES,Y et SUDRAUD.P -1992- Definition et caractérisation des préparations commerciales de tanins oenologiques. J. tnt. Sc. Vigne Vin. (soumris à acceptation). VIVAS.N; GLORIES.Y et FRANCOIS.J -1991- Mise au point sur l'élevage des vins rouges en fûts de chêne. Rev. OEnol. 17, 62, 17-21 VIVAS.N et GLORIES.Y -1992- Function e importancia del sistema de secado en la production de madera de roble destinada a la toneleria. Vib'Expo 92, 19-21 juin 1992. Madrid VIVAS.N et GLORIES.Y -1992- Role et importance du mode de séchage du bois destiné à la fabrication des barriques: Incidence sur la porosité et sur la saveur des composés phénoliques. ( en préparation) WOOD.R -1951- The control of diseases of lettuce by the use of antagonistic organisms. 1- The control of Botritis cinerea. Ann. Appl Biol. 38, 203- WYLLIE.T.D and MORENHOUSE.L.G -1977- Micotoxic fugi, mycotoxine and micotoxicoses. Vol I; l; lil. ed. Dekker. New-york. R E V E N D I C A T ION S 1. Procédé de séchage du bois de chêne caractérisé en ce que l'on ensemence des moisissures sur le bois à traIter afin d'obtenir une flore fongique viable, en place, constituant des moyens de séchage naturel et de contrôle de la 5 composition du bois de chêne. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moisissures sont préalablement isolées à partir de la flore naturelle du bois de chêne en cours de séchage. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les moisissures sont utilisées sous la forme de levain fongique. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les moisissures appartiennent au genre AUREOBASIDIUM PULLULANS.15 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les moisissures appartiennent au genre TRICHODERMA HARZIANUM. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les moisissures appartiennent an genre TRICHODERMA KONINGII. 7. Procédé de séchage selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on contrôle la composition du bois afin d'agir sur la qualité aromatique et gustative d'un vin ou d'une eau-de-vie de vin, ou d'un alcool en contact avec le25 bois de chêne. 8. Bois de chêne obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Bois de chêne selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est destiné à la tonnellerie. 10. Bois de chêne selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est destiné à l'élevage des vins, eaux-de-vie de vin ou alcools.