FR 2707086 A1 19950106 FR 9307839 A 19930628 Procédé de préparation de l'ergothionéine. La présente invention a pour objet un procédé original de préparation de la D,L-ergothionéine et de la L- (+)-ergothionéine qui est un composé naturel. La L-ergothionéine ou 2'-mercapto-Na-triméthyl-L- histidine est une molécule naturelle qui a été isolée d'un champignon de l'ergot de seigle Claviceps purpurea (référence 1). Elle a été ultérieurement identifiée dans les érythrocytes et le foie de rat, puis dans de nombreux autres tissus animaux et en particulier chez l'Homme (référence 2). Elle est exclusivement biosynthétisée par les champignons et les mycobactéries. Chez les végétaux, l'assimilation de l'ergothionéine se fait par les racines, après synthèse fongique à l'intérieur des conidies. Son apport chez l'Homme est uniquement d'origine alimentaire. Bien que le rôle biologique exact de l'ergothionéine reste incertain, ses propriétés antioxydantes sont bien documentées (références 3 et 4). L'ergothionéine a été obtenue soit par voie microbiologique (référence 5), soit par voie chimique (références 6 à 8). Cette dernière voie, pour être réalisable, implique de surmonter les trois difficultés suivantes: * la 3-élimination très facile du groupement triméthylammonium conduisant à l'acide 2'-mercapto- urocanique; * la méthylation d'un groupement azoté en présence d'un groupement soufré; * la racémisation très aisée de l'ergothionéine en raison de sa structure de type bétaïne. De plus, la préparation à l'échelle industrielle de ce composé implique un rendement global au moins égal à %. L'intermédiaire-clef des préparations synthétiques de l'art antérieur est la 2'- mercaptohistidine obtenue soit par dégradation du noyau imidazole de l'histidine puis synthèse du noyau 2-mercapto-imidazole à l'aide de thiocyanate de potassium (référence 6), soit par synthèse totale (références 7 et 8). La préparation de l'ergothionéine à partir de la 2'- mercaptohistidine utilise ensuite toujours le même procédé (référence 6), ce qui constitue le principal écueil de ces préparations. En effet, l'étape de méthylation finale nécessite l'utilisation de grandes quantités d'oxyde d'argent, d'hydrogène sulfuré pour éliminer les sels d'argent, puis d'acide phosphotungstique, le tout dans des conditions particulièrement sévères. De plus, la mise en oeuvre de cette dernière étape est laborieuse et apparaît inapplicable à une préparation industrielle de l'ergothionéine. Enfin, l'ergothionéine est obtenue partiellement, voire totalement racémisée et le rendement global faible de ces préparations ne dépasse jamais 8 %. Compte tenu de l'intérêt bien connu que présentent l'ergothionéine en général et plus particulièrement la L-(+)-ergothionéine, la Demanderesse a cherché une nouvelle voie de synthèse de ces molécules qui permettait d'éviter les inconvénients susmentionnés, tout en obtenant le produit désiré dans des conditions très douces et avec un bon rendement. Ce but est atteint selon l'invention qui fournit une nouvelle synthèse de l'ergothionéine basée sur un procédé original de synthèse du noyau 2-mercapto-imidazole. L'étape-clef du procédé selon l'invention est basée sur une stratégie originale selon laquelle on effectue une thiocabonylation du noyau imidazole selon un mécanisme de type "Addition Nucléophile-Ouverture du Cycle-Refermeture du Cycle (ANORC). Plus précisément, l'invention a pour objet un procédé de synthèse chimique des différentes formes optiques de l'ergothionéine, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à: - préparer ou utiliser un sel d'ester d'histidine N,N-diméthylé, si nécessaire optiquement actif; - traiter ce composé, éventuellement saponifié, par un halogénothionoformiate d'alkènyle ou de phényle, en présence d'une base, dans un solvant polaire; - après protection du substituant soufré du composé obtenu, transformer ce dernier en un composé de type triméthylammonium; et - libérer l'ergothionéine désirée par saponification ou hydrolyse acide, selon le cas. L'ester d'histidine est avantageusement un ester d'alkyle en C1-C6, notamment un ester méthylique. Le sel est avantageusement un halogénure, notamment un dichlorhydrate. On peut par exemple former un sel de l'ester méthylique de la N,Ndiméthyl-L-histidine obtenu selon le procédé de Reinhold V.N. et coll. (référence 9). On peut également partir d'un composé commercial tel que le dichlorhydrate de l'ester méthylique de la L- histidine que l'on méthyle. L'halogénothionoformiate d'alkènyle utilisé est avantageusement le chlorothionoformiate de vinyle. Lors du traitement par ce composé, la base utilisée est par exemple le bicarbonate de sodium et le solvant polaire est par exemple un mélange eau-tétrahydrofuranne. La protection du substituant soufré peut être effectuée au moyen d'un chloroformiate usuel dans ce cas tel que, par exemple, le chloroformiate d'éthyle ou le chloroformiate de phényle. La transformation en composé de type triméthylammonium est réalisée au moyen d'un agent méthylant comme, par exemple, l'iodure de méthyle ou le sulfate de diméthyle. Si le composé traité par un halogénothionoformiate n'a pas été préalablement saponifié, le composé de type triméthylammonium est saponifié, par exemple au moyen de triéthylamine dans un mélange eau/méthanol. Selon une variante, notamment dans le cas o l'on part d'un composé optiquement actif pour obtenir une ergothionéine également optiquement active, la saponification est avantageusement réalisée avant le traitement par un halogénothionoformiate, au moyen d'une base telle que la soude, l'hydroxyde de lithium ou la triéthylamine. Dans ce cas, après formation du composé de type triméthylammonium, l'ergothionéine préparée est avantageusement libérée par hydrolyse acide, par exemple par l'acide chlorhydrique aqueux. Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a pour objet un procédé de synthèse chimique de la D,Lergothionéine, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à: - préparer ou utiliser un sel d'ester d'histidine N,N-diméthylé; - traiter ce composé par un halogénothionoformiate d'alkènyle ou de phényle, en présence d'une base, dans un solvant polaire; - protéger le substituant soufré, de préférence au moyen d'un halogénoformiate d'alkyle, en présence d'une base, de préférence la triéthylamine; - traiter le composé protégé obtenu par un agent méthylant, de préférence par l'iodure de méthyle dans le méthanol; et - libérer la D,L-ergothionéine par saponification, de préférence au moyen de triéthylamine dans un mélange eau/méthanol. Selon un mode préféré de réalisation, l'invention a pour objet un procédé de synthèse chimique de la L-(+)- ergothionéine, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à: - préparer ou utiliser un sel d'ester de L-histidine N,N-diméthylé; - traiter ce composé par un halogénothionoformiate d'alkènyle ou de phényle, en présence d'une base, dans un solvant polaire; - saponifier l'ester soufré obtenu par une base, de préférence l'hydroxyde de lithium; - protéger le substituant soufré, de préférence au moyen d'un halogénoformiate de phényle, en présence d'une base, de préférence la triéthylamine; - traiter le composé protégé obtenu par un agent méthylant, de préférence par l'iodure de méthyle dans le méthanol; et - libérer la L-(+)- ergothionéine par hydrolyse acide, de préférence au moyen d'acide chlorhydrique aqueux. Par ailleurs, chacun des isomères optiques D et L de l'ergothionéine peuvent être obtenus à partir de l'ergothionéine racémique (D,L) par analogie avec les techniques connues de résolution d'aminoacides. L'invention sera expliquée plus en détail au moyen des exemples non limitatifs décrits dans la partie expérimentale qui suit. PARTIE EXPERIMENTALE Toutes les réactions ont été effectuées sous atmosphère inerte d'azote, sauf indication contraire. Les spectres de masse ont été enregistrés sur un appareil Nermag R10-10B. Le mode d'ionisation utilisé est soit l'impact électronique (IE) à 70 électrons-volts, soit l'ionisation chimique (IC) dans l'ammoniac, soit le bombardement par atomes rapides (FAB) sur une matrice glycérol. Les spectres RMN 1H et 13C ont été enregistrés sur un appareil Varian Gemini-200. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm par rapport au tétraméthylsilane. Les multiplicités sont exprimées comme suit: "s" pour singulet, "sl" pour singulet large, "d" pour doublet, "t" pour triplet et "m" pour multiplet. Les points de fusion (pF C) ont été enregistrés sur un appareil Gallenkamp et sont donnés non corrigés. Les purifications par chromatographie liquide sur colonne ont été effectuées, selon les cas, avec de la silice Merck Si60 F254 ou avec de la cellulose microcristalline Merck . Exemple 1: Préparation de la D.Lergothionéine: Dichlorhydrate de l'ester méthylique de la NaXN- diméthylhistidine: A une solution du dichlorhydrate de l'ester méthylique de la L-histidine (Janssen; 18,16 g; 75 mmoles) dans 150 ml d'eau déionisée, est ajoutée une solution aqueuse de formaldéhyde à 37% (Janssen; 12,29 g). Le mélange est hydrogéné sous pression (7 bars) en présence de palladium sur charbon à 10% (Aldrich; 1,0 g) pendant 5 h à température ambiante. Le catalyseur est séparé par filtration puis rincé à l'eau; le filtrat est évaporé à sec, sous vide, pour donner le produit attendu sous forme d'une huile (20,3 g) qui est utilisée directement dans l'étape suivante. Caractéristiques physiques: * RMN 1H (200 MHz, D20) 2,91 ppm (s, 6H); 3,50 ppm (m, 2H); 3,72 ppm (s, 3H); 4,48 ppm (dd, 5,54-9,04 Hz, 1H); 7,38 ppm (s, 1H); 8,61 ppm (s, 1H) Ester méthylique de la Na,Na-diméthyl-2'-mercaptohistidine: Du dichlorhydrate de l'ester méthylique de la N0,NX- diméthylhistidine (27,0 g; 100 mmoles) est dissous dans 450 ml d'eau. On y ajoute lentement du bicarbonate de sodium (Labosi; 58,8 g; 700 mmoles) puis 450 ml de THF. A ce mélange sous agitation, on ajoute goutte à goutte, en 30 minutes, du chlorothionoformiate de phényle (Lancaster; 34, 5 ml; 250 mmoles). Le mélange réactionnel est agité pendant 7 jours à température ambiante. Le mélange biphasique est ensuite décanté. Les deux phases sont séparées et la phase organique est séchée. Le solvant est évaporé sous vide. Le résidu de la phase organique est chromatographié sur SiO2 (éluant: AcOEt) pour donner 12,02 g de l'ester attendu. Rendement de l'ester méthylique de la Nc,Na- diméthyl-2'-mercaptohistidine: 52%. Caractéristiques physiques: * pF: 171-173 C * RMN 1H (200 MHz, CDCl3): 2, 39 ppm (s, 6H); 2,78 ppm (d, J=7,30 Hz, 2H); 3,38 ppm (t, J=7,30 Hz, 1H); 3,72 ppm (s, 3H); 6,44 ppm (s, 1H); 10,08 ppm (s large, 1H); 10,24 ppm (s large, 1H). * RMN 13C (50 MHz, DMSO-D6): 24,52 ppm (t); 41,03 ppm (q); 51,03 ppm (d); 65,04 ppm (q); 112,74 ppm (d); 126,13 ppm (s); 160,35 ppm (s); 171,17 ppm (s) * SM(IE, 70 eV): 229 (M+, 25), 170 (8), 116 (100). Ester méthylique de la NaNx-diméthyl-1'-éthoxycarbonvl-2'éthoxycarbonylthiohistidine: De l'ester méthylique de la Nc,Nc-diméthyl-2'- mercaptohistidine (12,80 g; 55,9 mmoles) est mis en suspension dans 200 ml de dichlorométhane, sous atmosphère inerte. De la triéthylamine (Janssen; 23,3 ml; 168 mmoles) y est ajoutée. Puis on ajoute goutte à goutte, à 0 C, du chloroformiate d'éthyle (Janssen; 12,8 ml; 134 mmoles) en 30 minutes. Le mélange réactionnel est agité pendant lh à température ambiante puis hydrolysé par addition de 150 ml d'une solution aqueuse saturée de NaCl. On sépare la phase organique qui est ensuite lavée avec une solution aqueuse saturée de NaCI, séchée sur MgSO4 et évaporée à sec, sous vide. Le produit brut est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant: AcOEt/cyclohexane=1:1) pour conduire à 18,71 g de produit désiré (90%). Caractéristiques physiques: * RMN 1H (200 MHz, CDC13): 1,25 ppm (t, J=7, 16 Hz, 3H); 1,35 ppm (t, J=7,16 Hz, 3H); 2,31 ppm (s, 6H); 2,81 ppm (dd, J=6,54-14,66 Hz, 1H); 2,96 ppm (dd, J=8,46-14,66 Hz, 1H); 3,60 ppm (dd, J=6,54-8,46 Hz, 1H); 3,62 ppm (s, 3H); 4,26 ppm (q, J=7,16 Hz, 2H); 4, 36 ppm (q, J=7,16 Hz, 1H); 7,41 ppm (s, 1H) * RMN 13C (50 MHz, CDC13): 172,41 ppm (s); 167,40 ppm (s); 148,55 ppm (s); 140,76 ppm (s); 35,12 ppm (s); 120,15 ppm (d); 66,89 ppm (q); 65,17 ppm (t); 64,88 ppm (t); 51, 51 ppm (d); 41,99 ppm (q); 27,97 ppm (t); 14,37 ppm (q); 14,18 ppm (q) * SM (IE, 70 eV): 373 (M+, 6), 314 (26), 116 (100). Ester méthylique de la Na.NaNa-triméthyl-l'-éthoxycarbonyl- 2'-éthoxycarbonylthiohistidine: A une solution d'ester méthylique de la NX,NCL- diméthyl-1 ' -éthoxycarbonyl-2' éthoxycarbonylthiohistidine (0,64 g; 1, 72 mmoles) dans 20 ml de méthanol, est ajouté du iodométhane (Lancaster; 0,6 ml; 9,6 mmoles). Le mélange est agité à température ambiante sous azote pendant 70 h. Le solvant et l'iodométhane en excès sont évaporés à température ambiante, sous vide, pour conduire à une huile qui contient essentiellement le composé de type ammonium attendu. Caractéristiques physiques: * RMN 1H (200 MHz, acétone-D6): 1,26 ppm (t, J=7,16 Hz, 3H); 1,37 ppm (t, J=7,16 Hz, 3H); 3,50-3,60 ppm (m, 2H); 3,64 ppm (s, 9H), 3,74 ppm (s, 3H); 4,33 ppm (q, J=7,16 Hz, 2H); 4, 44 ppm (q, J=7,16 Hz, 2H); 4,84 ppm (dd, J=4,08-10,84 Hz, 1H); 7,99 ppm (s, 1H). DL-ergothionéine: De l'ester méthylique de la NX,NOE,NX-triméthyl-l'- éthoxycarbonyl-2'-éthoxycarbonylthiohistidine (0,85 g; 1,65 mmole) est dissous dans 25 ml de triéthylamine/eau/méthanol (1:4:6). La solution est chauffée à 60 C pendant 45 h. Les solvants sont évaporés à sec, sous vide, pour conduire à un résidu solide. Celui-ci est purifié par chromatographie sur une colonne de cellulose. On obtient ainsi la D,L-ergothionéine (0,35 g; 89%). Caractéristiques physiques: * pF: 275 C (déc.); recristallisée dans EtOH/H20 = 1:1. * RMN 1H (200 MHz, D20): 3,01-3,18 ppm (s, 9H superposé à m, 2H); 3,80 ppm (dd, J=4,52-11,24 Hz, 1H); 6,70 ppm (s, 1H). * RMN 13C (50 MHz, D20): 173,11 ppm (s), 158,82 ppm (s), 126,68 ppm (s), 118,11 ppm (d), 79,82 ppm (d), 54,79 ppm (q), 25,38 ppm (t). Ces spectres de RMN sont identiques à ceux obtenus à partir d'un échantillon commercial d'ergothionéine (ICN, France). * UV (H20, c = 36,7 gM): Xmax = 257 nm. Cette valeur est en concordance avec les indications de la référence 10. Exempole2: Préparation de la L-(+)-erQothionéine: Na N-diméthyl-2'mercaptohistidine: A une solution de l'ester méthylique de la Nx,Nx- diméthyl-2'-mercaptohistidine (1,3 g; 5,6 mmoles) dans 10ml de méthanol est ajoutée, à 0 C, une solution aqueuse d'hydroxyde de lithium, LiOH (5, 6 ml d'une solution 1N). On laisse le mélange réactionnel réagir pendant 2 h dans ces conditions. Le produit désiré est obtenu après purification par chromatographie sur colonne de silice (éluant: méthanol) et recristallisé dans l'eau, pH = 7,0. Rendement: 87%. Caractéristiques physiques: * pF: 274 C (déc.). * RMN 1H (200 MHz, D20): 2,83 ppm (s, 6H); 3,03 ppm (dd, J=8,14-15,60 Hz, 1H); 3,17 ppm (dd, J=5,54-15,60 Hz, 1H); 3,75 ppm (dd, J=5,54- 8,14 Hz, 1H); 6,76 ppm (s, 1H). NcONa-diméthyl-1'-phénoxycarbonvl-2'-phénoxycarbonyl- thiohistidine: De la Na,Na-diméthyl-2'-mercaptohistidine (1,1 g; ,1 mmoles) est mise en suspension dans 50 ml d'acétonitrile sous atmosphère inerte. De la triéthylamine (Janssen; 2,2 ml; 16 mmoles) y est ajoutée. Puis on ajoute goutte à goutte, à O C, du chloroformiate de phényle (Janssen; 1,6 ml; 13 mmoles) en 30 minutes. Le mélange réactionnel est agité pendant 4 h à température ambiante puis hydrolysé par addition de 20 ml d'une solution aqueuse saturée de NaCl. Le solvant est évaporé sous vide. Le produit brut est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant: AcOEt/méthanol 7:3) pour conduire à 2,0 g du produit désiré (84%). Caractéristiques physiques: * RMN 1H (200 MHz, CD30D): 2,35 ppm (s, 6H); 2,80 ppm (dd, J=6,54-14,66 Hz, 1H); 3,01 ppm (dd, J=8,46-14,66 Hz, 1H); 3,70 ppm (dd, J=6,54- 8,46 Hz, 1H); 7,41 ppm (s, 1H); 7,50-75 ppm (m, 10H). NU, NU, NC-triméthyl-l'-phénoxycarbonvl-2 ' -phénoxycarbonyl- thiohistidine: A une solution de NX,Nc-diméthyl-l'-phénoxycarbonyl- 2'-phénoxycarbonylthiohistidine (0,76 g; 1,72 mmole) dans 20 ml de méthanol, est ajouté de l'iodométhane (Lancaster; 0,6 ml); 9, 6 mmoles). Le mélange est agité à température ambiante sous azote pendant 70 h. Le solvant et l'iodométhane en excès sont évaporés à température ambiante, sous vide, pour conduire au composé désiré (0,74 g). Rendement: 95 %. Caractéristiques physiques: * RMN 1H (200 MHz, CD30D): 3,50-3,60 ppm (m, 2H); 3,64 ppm (s, 9H); 4,84 ppm (dd, J=4,08-10,84 Hz, 1H); 7,99 ppm (s, 1H); 8,20-8,50 ppm (m, 10H). L- (+)-ergothionéine: De la NC,Na,Na-triméthyl-1'-phénoxycarbonyl-2'- phénoxycarbonylthiohistidine (0,70 g; 1,52 mmole) est dissoute dans 25 ml d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 6N. La solution est chauffée à 60 C pendant h. Le solvant est évaporé sous vide pour conduire à un résidu solide. Celui-ci est purifié par chromatographie sur une colonne de cellulose. On obtient ainsi la L-(+)- ergothionéine (0,27 g; 79%). Caractéristiques physiques: * pF: 275 C (déc.); recristallisée dans EtOH/H20=1:1. * RMN 1H (200 MHz, D20): 3,01-3,18 ppm (s, 9H superposé à m, 2H); 3,80 ppm (dd, J=4,52-11,24 Hz, 1H); 6,70 ppm (s, 1H). * RMN 13C (50 MHz, D20): 173,11 ppm (s), 158,82 ppm (s), 126,68 ppm (s), 118,11 ppm (d), 79,82 ppm (d), 54,79 ppm (q), 25,38 ppm (t). * UV (H20, c = 3 6,7 AM): Xmax = 257 nm. * Pouvoir rotatoire OD (H20)= +119 '. Microanalyse: C9H15N302S PM = 229,29 C H N S Calculé (%) 47,1 6,5 18,3 13,9 Trouvé (%) 46,7 6,4 18, 1 13,9 Références bibliographiques 1. TANRET C., (1909), C.R.Acad.Sci., 149, 222-224 2. MELVILLE D.B., (1958), Vitam.Horm., 17, 155-204 3. HARTMAN P.E., (1990), Meth.Enzymol., 186, 310-318 4. AKANMU D. et coll., (1991), Arch.Biochem.Biophys., 288, -16 5. MIYOSHI T. et SAKAI H., (1968), brevet japonais n 43020716 du 05/09/1968 6. HEATH H. et coll., (1951), J.Chem.Soc., 2215 7. SUNKO D.E. et WOLF G., (1958), J. Chem.Soc., 4405 8. HEGEDUS B., (1955), Helv.Chim.Acta, 38, 22-27 9. REINHOLD V.N. et coll., (1968), J.Biol.Chem., 11, 258 10. Merck Index, (1989), 11th ed., Merck and Co ed., New Jersey, USA - n 3611. REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse chimique des différentes formes optiques de l'ergothionéine, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à: - préparer ou utiliser un sel d'ester d'histidine N, N-diméthylé, si nécessaire optiquement actif; - traiter ce composé, éventuellement saponifié, par un halogénothionoformiate d'alkènyle ou de phényle, en présence d'une base, dans un solvant polaire; - après protection du substituant soufré du composé obtenu, transformer ce dernier en un composé de type triméthylammonium; et - libérer l'ergothionéine désirée par saponification ou hydrolyse acide, selon le cas. 2. Procédé de synthèse chimique de la D,L- ergothionéine, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à: - préparer ou utiliser un sel d'ester d'histidine N,N-diméthylé; - traiter ce composé par un halogénothionoformiate d'alkènyle ou de phényle, en présence d'une base, dans un solvant polaire; - protéger le substituant soufré, de préférence au moyen d'un halogénoformiate d'alkyle, en présence d'une base, de préférence la triéthylamine; - traiter le composé protégé obtenu par un agent méthylant, de préférence par l'iodure de méthyle dans le méthanol; et - libérer la D,L-ergothionéine par saponification, de préférence au moyen de triéthylamine dans un mélange eau/méthanol. 3. Procédé de synthèse chimique de la L-(+)- ergothionéine, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à: - préparer ou utiliser un sel d'ester de L-histidine N,N-diméthylé; - traiter ce composé par un halogénothionoformiate d'alkènyle ou de phényle, en présence d'une base, dans un solvant polaire; - saponifier l'ester soufré obtenu par une base, de préférence l'hydroxyde de lithium; - protéger le substituant soufré, de préférence au moyen d'un halogénoformiate de phényle, en présence d'une base, de préférence la triéthylamine; - traiter le composé protégé obtenu par un agent méthylant, de préférence par l'iodure de méthyle dans le méthanol; et - libérer la L-(+)- ergothionéine par hydrolyse acide, de préférence au moyen d'acide chlorhydrique aqueux.