FR 2708938 A1 19950217 FR 9309778 A 19930809 L'invention concerne un procédé enzymatique perfectionné de préparation d'oligomères de L-lysine. Les oligomères de lysine sont des produits intéressants dans le domaine cosmétique, en particulier pour éviter ou retarder le vieillissement cutané résultant de la rigidification des fibres de collagène. Les protéines (collagène et élastine) ou acides aminés incorporés actuellement dans des préparations cosmétiques ne peuvent éviter la rigidification des fibres de collagène : les premières ont une masse molaire trop élevée qui les empêche de pénétrer jusqu'au derme, et les seconds sont très rapidement métabolisés au niveau de l'épiderme. Un procédé de synthèse enzymatique d'oligomères de l'arginine, de la lysine ou de l'ornithine, en particulier les di- et tri-peptides, est connu par JP-A-92-128237 (Chisso) publiée le 06.03.92. Ce procédé implique la mise en contact d'un ester de l'amino-acide et de trypsine en milieu aqueux tamponné à pH 10. Ce procédé est conçu de façon à préparer exclusivement des di- et tri-peptides. La réaction de synthèse se déroule en milieu exclusivement aqueux sur une période de temps suffisamment longue (jusqu'à 24 heures) et avec une concentration d'enzyme adéquate pour permettre l'hydrolyse enzymatique des peptides de degré de polymérisation supérieur à 3. La trypsine étant inactive sur des dipeptides, ceux-ci s'accumulent finalement dans le milieu réactionnel avec notamment de la L-lysine sous forme libre.L'obtention des oligomères nécessite des opérations de concentration à partir d'un volume de réaction aqueux important et le substrat (ester alkylique de L-acide-a-aminé) subit une hydrolyse (chimique et enzymatique) importante, d'où des coûts de matières premières relativement élevés. Il existe donc un besoin pour un procédé perfectionné qui permettrait d'abaisser les coûts de production et permettrait aussi, si désiré, d'obtenir des oligomères d'un degré de polymérisation plus élevé. L'invention vise à satisfaire ce besoin. Plus précisément, l'invention concerne un procédé de synthèse enzymatique d'oligomères de lysine, comprenant la soumission d'un substrat constitué d'un ester d'alkyle inférieur de L-lysine ou d'un dérivé de celui-ci, à l'action d'au moins une enzyme protéase ou d'une préparation à activité protéolytique, dans un milieu réactionnel agité, caractérisé en ce que ledit milieu réactionnel est un mélange de 70 à 90% en volume de 1propanol et/ou de 2-propanol et de 10 à 30% en volume d'eau et en ce qu'on poursuit la réaction au moins jusqu'à formation de deux phases distinctes. L'invention réside dans l'utilisation, comme milieu réactionnel, d'un mélange de propanol et d'eau homogène dans lequel l'ester de L-lysine est soluble, qui se sépare en deux phases distinctes au cours de la formation des oligomères, ces derniers étant concentrés dans la phase aqueuse relativement lourde du fait de leur solubilité élevée dans l'eau et de leur plus faible solubilité dans l'alcool. Le partage du milieu réactionnel en deux phases distinctes lourde et légère avec concentration des oligomères recherchés dans la phase aqueuse lourde minoritaire facilite beaucoup la récupération desdits oligomères. En outre, la présence d'un solvant organique pendant la réaction d'oligomérisation permet d'accroître le rendement de la synthèse enzymatique et d'élever le degré de polymérisation moyen des oligomères (peptides) de lysine formés. Par "ester d'alkyle inférieur de L-lysine" on désigne des esters d'alkyle en C1 à C3 de L-lysine, tant sous forme de base libre que sous forme saline, par exemple de dichlorhydrate. On préfère particulièrement utiliser l'ester éthylique de L-lysine, 2HC1. L'ester d'alkyle inférieur de la L-lysine est avantageusement présent dans le milieu réactionnel à une concentration légèrement inférieure à sa limite de solubilité dans les conditions opératoires (pH, température, concentration de propanol) utilisées, afin de faciliter l'obtention d'une concentration d'oligomères produisant la séparation de phases recherchée. A titre indicatif, une concentration initiale de l'ester de Llysine représentant 80 à 95% de la concentration à saturation est habituellement satisfaisante. Par exemple, dans le cas d'un pH de 9,0 et d'une température de réaction de 25[deg]C, la solubilité limite de l'ester éthylique de L-lysine, 2HC1 dans le 2-propanol est voisine de 100 g/1.Dans un litre de solvant mixte 2-propanol-eau (80:20 V/V) contenant donc 800 cm de 2-propanol et pouvant donc dissoudre environ 80 g de l'ester de Llysine, on a trouvé que l'emploi d'une concentration de l'ester de L-lysine d'environ 75 g/1, soit 75/80 94% de la solubilité limite dans le 2-propanol, était optimale. Comme indiqué, on poursuit la réaction au moins jusqu'à formation de deux phases distinctes. La séparation des phases résulte de l'accumulation des oligomères de Llysine au cours de la réaction (accumulation qui dépend des concentrations d'enzyme, de substrat et de propanol, de la température et du pH). Ainsi, il a été observé une séparation de phases lorsque des oligomères de L-lysine ayant un degré de polymérisation moyen de 2,5, atteignaient une concentration - d'environ 10 g/1 en présence de 2-propanol-eau à 80/20 v/v, - d'environ 20 g/1 en présence de 2-propanol-eau à 70/30 v/v, - d'environ 15 g/1 en présence de 1-propanol-eau à 70/30 v/v, les valeurs de concentrations des oligomères de L-lysine étant rapportées au volume total. On pourra trouver des valeurs de la concentration minimale d'oligomères de L-lysine produisant une séparation des phases plus faibles que celles indiquées ci-dessus dans le cas d ' oligomères de L-lysine ayant un degré de polymérisation moyen plus élevé que 2,5. Toutes les conditions opératoires conduisant à de telles concentrations d'oligomères de L-lysine conviennent pour la préparation des oligomères de L-lysine selon le procédé de l'invention. Les protéases et préparations à activité protéolytique qui sont utilisables dans le procédé de l'invention sont celles qui effectuent : a) l'hydrolyse de l'ester éthylique de la L-lysine, 2HC1 (10 mM, pH optimal de la protéase, 25[deg]C) b) l'hydrolyse du substrat N-a-benzoyl-L-lysine pnitroanilide (0,3 mM, pH optimal de la protéase, 25[deg]C) c) l'hydrolyse de l'ester éthylique de N-a-benzoylL-arginine (méthode USP, pH optimal de la protéase). Des exemples de protéases qui conviennent sont la trypsine (par exemple de pancréas de boeuf), des protéases à sérine (EC 3.4.21.) telles que la pronase (de Streptomyces griseus) ou la protéase d'Achromobacter, des protéases à cystéine (EC 3.4.22.) telles que la papaïne, la ficine, la protéase de Streptococcus, la clostripaïne, la bromélaïne, la cathepsine B, la cathepsine C, etc... On préfère la trypsine pour des raisons de disponibilité et de coût. Fréquemment, pour des raisons de coût, on utilisera des préparations plus ou moins diluées et plus ou moins pures de telles enzymes, plutôt que des enzymes purifiées. La concentration d'enzyme à utiliser dépendra principalement du type d'enzyme ou des préparations enzymatiques utilisées. A titre indicatif, dans le cas d'une préparation enzymatique à base de trypsine pancréatique de boeuf, on a trouvé qu'environ 75 à 7500 Unités enzymatiques (USP)/ml de milieu réactionnel, soit environ 0,1 à 10 g/1 d'une préparation ayant une activité de 740 U (USP)/mg de préparation, étaient appropriées. La concentration de l'enzyme est un paramètre important qui influence la nature des oligomères ou peptides produits. Si la concentration d'enzyme est initialement relativement faible (par exemple inférieure à 0,5 g/1 pour une préparation ayant une activité de 740 U(USP)/mg de préparation ; autres conditions : 2-propanol: 80% v/v ; température : 25[deg]C ; ester éthylique de Llysine : 75 g/1 ; pH initial : 9,0), on observera un arrêt rapide de la réaction enzymatique par dénaturation de l'enzyme par le propanol avant que l'ester de L-lysine soit totalement consommé, avec pour résultat la production majoritaire d'oligomères de degrés de polymérisation (D.P.) élevés (D.P. 4 > D.P. 3 > D.P. 2).Si au contraire, la concentration d'enzyme est initialement relativement élevée (par exemple supérieure à 1,2 g/1 pour une préparation ayant une activité de 740 U(USP)/mg de préparation autres conditions : 2-propanol : 80% v/v ; température : 25[deg]C ; ester éthylique de L-lysine : 75 g/1; pH initial : 9,0), on observera une consommation totale de l'ester de L-lysine puis une poursuite de l'activité enzymatique tendant à dégrader les oligomères de D.P. élevé en oligomères de D.P. plus faible, d'où la production majoritaire d'oligomères de bas D.P. (D.P. 2 > D.P. 3 >D.P. 4). Ainsi, en ajustant la concentration initiale de l'enzyme, on peut obtenir au choix des mélanges d'oligomères de lysine dont les D.P. peuvent aller, par exemple, de 2 à 6, de 2 à 8, ou même de 2 à 15, avec des degrés de polymérisation moyens allant de 2,5 à 6.On préfère notamment les mélanges dont les D.P. vont de 2 à 8, avec un D.P. moyen supérieur à 3. Le mélange propanol-eau utilisé comme milieu réactionnel est initialement homogène, le propanol étant miscible à l'eau. La présence du propanol permet de limiter la réaction d'hydrolyse de l'ester de lysine (substrat). Le propanol peut être du 1-propanol ou du 2propanol. Pour minimiser autant que possible l'hydrolyse du substrat, l'eau ne doit pas représenter plus de 30% en volume du mélange propanol-eau, mais elle doit représenter au moins 10% en volume dudit mélange pour pouvoir dissoudre convenablement l'ester de L-lysine puis les oligomères. On préfère utiliser un mélange propanol-eau contenant 70 à 80% en volume de propanol et 20 à 30% en volume d'eau. On préfère tout particulièrement utiliser un mélange contenant environ 80% de propanol et 20% d'eau.Le 1- et le 2-propanol sont les seuls solvants organiques trouvés par la Demanderesse qui, à la fois : - soient miscibles à l'eau - dissolvent le substrat (ester de lysine) au pH souhaité en présence d'eau - permettent le phénomène de démixtion de phases au cours de la formation des oligomères - soient aisément disponibles, non toxiques et bon marché. Avec d'autres alcools, tels que l'éthanol ou le méthanol, on n'observe pas de phénomène de démixtion de phases. La réaction peut s'effectuer à une température de 10 à 45[deg]C environ, de préférence d'environ 25[deg]C. Plus la température est élevée, plus l'enzyme sera rapidement dénaturée. Le pH de réaction devra se trouver dans la gamme de pH recommandée pour l'enzyme utilisée. Par exemple, dans le cas de la trypsine, un pH de 7,5 à 10,5, de préférence d'environ 9, convient. La durée de réaction peut aller de 1 à 20 h environ, selon les conditions opératoires. Pendant la réaction, il faut assurer une agitation vigoureuse du milieu réactionnel pour assurer un bon contact entre les phases. Après réaction, si désiré, l'enzyme peut être éliminée par ultrafiltration (membrane poreuse de seuil de coupure 10 kDa), l'enzyme étant retenue alors que les oligomères de lysine traversent totalement la membrane poreuse. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés dans le but d'illustrer l'invention. Exemple 1 Dans cet exemple on a utilisé le mode opératoire général suivant : Dans un bécher équipé d'un barreau-agitateur magnétique, on introduit 1 litre de mélange eau/2-propanol comprenant 80% en volume de 2-propanol à 25[deg]C. Sous agitation énergique ( 500 tours/minute), on ajoute 74,2 g (0,3 mole) d'ester éthylique de L-lysine, 2HC1. On ajuste le pH initial à 9,0 au moyen d'une solution 5N de soude. On ajoute alors 17 ml d'une préparation aqueuse contenant 50g de trypsine pancréatique par litre. La trypsine pancréatique utilisée provenait de la Société NOVO INDUSTRI AS (Danemark) et avait une activité de 740 U (USP)/mg de matière sèche. La quantité de préparation de trypsine ajoutée correspondait à 555 U (USP)/ml de milieu réactionnel. Après addition de la trypsine, le volume réactionnel total est de 1,13 litre et la concentration de l'ester de L-lysine est de 65,7 g/1.On laisse la réaction se dérouler à 25[deg]C jusqu'à ce que la composition du mélange réactionnel n'évolue plus, soit pendant 5 heures. Au bout de ce temps, on arrête l'agitation, on laisse reposer le milieu réactionnel qui se sépare en 2 phases, une phase supérieure riche en 2-propanol et représentant 91% du volume réactionnel et une phase inférieure aqueuse représentant 9% du volume réactionnel. Ces phases ont été analysées eu égard à leurs teneurs en ester éthylique de L-lysine, en L-lysine, et en peptides de L-lysine, avec les résultats suivants, exprimés en millimoles de chacun des composés : On a également déterminé le rendement R de la réaction d'oligomérisation (nombre de moles de peptides dans la phase inférieure/nombre de moles du substrat de départ) et le degré de polymérisation moyen (DP moyen) des produits contenus dans la phase inférieure, avec les résultats suivants : R = 76% et DP moyen : 3,3 Plus de 98% des produits de la réaction ont donc été extraits dans un volume correspondant à 9% du volume réactionnel, ce qui est particulièrement avantageux pour la récupération des produits. Exemple comparatif A Dans un bécher équipé d'un barreau-agitateur magnétique, on introduit 1 litre d'eau à 30[deg]C. Sous agitation à 500 t/mn, on ajoute 47,0 g (190 millimoles) d'ester éthylique de L-lysine, 2HC1. On ajuste le pH initial à 9,0 avec une solution 5N de soude. On ajoute alors 0,125 g (5 umoles) de trypsine fournie par la Société SIGMA sous la désignation T0134, et 0,11 g (1 millimole) de CaCl2 (stabilisant pour l'enzyme). On laisse alors la réaction se dérouler à 30[deg]C, sous agitation, jusqu'à ce que la composition du mélange réactionnel n'évolue plus, soit pendant 2 heures. On n'observe pas de séparation de phases. Le produit obtenu contient, d'après analyse : Le rendement R est de 41% et le degré de polymérisation DP moyen est de 2,8. Exemple comparatif B On opère comme dans l'exemple comparatif A, si ce n'est qu'on opère les modifications suivantes : - on remplace l'eau par un mélange éthanol/eau contenant 80% en volume d'éthanol - on introduit 49,4 g (200 millimoles) d'ester éthylique de L-lysine, 2HC1 au lieu de 47,0 g - on ajuste le pH initial à 8,8 au lieu de 9,0. - on ajoute 1,0 g (25 umoles) de trypsine pancréatique NOVO de l'exemple 1 à la place des 0,125 g de trypsine SIGMA. - on poursuit la réaction pendant 5 heures au lieu de 2 heures. On n'observe pas de séparation de phases dans le produit obtenu, qui contient, d'après analyse : Le rendement R de la réaction d'oligomérisation est de 50% et le degré de polymérisation DP moyen est de 2,5. Une comparaison des résultats obtenus dans l'exemple 1 et dans les exemples comparatifs A et B montre à l'évidence la supériorité du procédé de l'invention. Il va de soi que le mode de réalisation décrit n'est qu'un exemple et que l'on pourrait le modifier, notamment par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour cela du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse enzymatique d'oligomères de lysine, comprenant la soumission d'un substrat constitué d'un ester d'alkyle inférieur de L-lysine ou d'un dérivé de celui-ci, à l'action d'au moins un enzyme protéase ou d'une préparation à activité protéolytique, dans un milieu réactionnel agité, caractérisé en ce que ledit milieu réactionnel est un mélange de 70 à 90% en volume de 1propanol et/ou de 2-propanol et de 10 à 30% en volume d'eau et en ce qu'on poursuit la réaction au moins jusqu'à formation de deux phases distinctes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on laisse les phases distinctes se séparer en une phase aqueuse relativement lourde et une phase propanolique relativement légère, et on recueille la phase aqueuse lourde contenant les oligomères de lysine. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on utilise, comme enzyme, de la trypsine ou une préparation de celle-ci. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise, comme substrat, l'ester éthylique de L-lysine ou un dérivé de celui-ci. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise le dichlorhydrate de l'ester éthylique de L-lysine. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu réactionnel propanol-eau contient 70 à 80% en volume de propanol et environ 20 à 30% en volume d'eau. 7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on utilise une proportion de trypsine correspondant à 75 à 7500 Unités enzymatiques (USP) par ml de milieu réactionnel. 8. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que la concentration du substrat représente 80 à 95% de sa concentration à saturation. 9. Mélanges d'oligomères de L-lysine produits par un procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10. Mélanges d'oligomères selon la revendication 9, caractérisés en ce que lesdits oligomères présentent des degrés de polymérisation allant de 2 à 8.