FR 2698177 A1 19940520 FR 9213825 A 19921113 Procédé d'excitation et d'acquisition de signaux de résonance magnétique nucléaire, notamment dans l'eau légère La présente invention concerne le domaine des procédés et des techniques liés à l'application de la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), notamment pour des expériences de haute résolution, et a pour objet un pro- cédé d'excitation et d'acquisition de signaux de RMN, notamment dans l'eau légère. La RMN multidimensionnelle est devenue un ins- trument essentiel pour l'étude des molécules en solution, notamment des biomolécules, et a fait ses preuves en tant qu'alternative valable à la cristallographie par rayons X. En effet, il est actuellement possible d'obtenir des structures de protéines jusqu'à 30-40 k D (kilo Dalton) en utilisant une combinaison d'expériences de RMN à deux dimensions, trois dimensions et quatre dimensions (voir notamment G Marius Clore et Angela M Gronenborn, "Progress in NMR Spectroscopy", 23, 43 1991). Une étape cruciale pour la détermination de ces structures est l'attribution des signaux de tous les pro- tons de la molécule à analyser et, en particulier, des protons en échange avec ceux de l'eau ou du solvant cor- respondant. Puisque ces protons sont échangés avec l'eau, l'étude de ces molécules doit être réalisée dans une solu- tion présentant une proportion d'au moins 90 % d'eau ou de solvant correspondant. Dans ces conditions, la concentration en proton de l'eau est de 110 M (molaires) tandis que la concentra- tion de soluté (molécules à analyser) est d'environ 2 m M (millimolaires). Il en résulte des difficultés importantes pour l'observation de signaux qui sont environ 55 000 fois plus petits (plus faibles) que le signal le plus important, à savoir, celui correspondant aux protons de l'eau ou du solvant mis en oeuvre. 5 Un autre effet désavantageux de cette concen- tration importante de solvant est l'apparition d'un phéno- mène connu sous l'appellation "Radiation Damping" (atté- nuation de rayonnement), qui perturbe de manière supplé- mentaire l'observation des spins intéressants pour l'ex-10 périence. En vue de tenter de résoudre ces problèmes, la solution la plus conventionnelle et la plus fréquemment utilisée est la présaturation de la résonance de l'eau. Néanmoins, pour les protéines en p H neutre ou basique, cette solution conduit à une atténuation impor- tante des résonances des protons amides et pour les acides nucléiques, à une disparition totale des signaux des pro- tons imines et amides. Cet inconvénient peut être évité en adoptant des séquences d'impulsions qui ne perturbent pas la population des spins de l'eau pendant le temps de relaxation. Les différents procédés et méthodes de ce type connus actuellement peuvent être classés en trois catégo- ries distinctes.25 Une première catégorie de méthodes et de procé- dés met en oeuvre des séquences d'excitation sélective en tant qu'impulsion de détection du signal, tels que notam- ment le procédé connu sous la dénomination "jump and return", décrit par P Plateau et M Guéron dans le docu-30 ment J Am Chem Soc, 104, 7310 ( 1982) ou encore le pro- cédé connu sous la dénomination " 11 écho" décrit par V. Sklenar et A Bax dans le document J Magn Reson, 74, 469 ( 1987). Les différents procédés et méthodes regroupés dans la seconde catégorie proposent de déphaser la compo- sante tranversale de l'aimantation de l'eau par un champ radiofréquence inhomogène au moyen d'un verrouillage de spins (voir B A Messerle, G Wider, G Wider, G Otting, C Weber et K Wuthrich, J Magn Reson, 85, 608 1989). Enfin, les procédés et méthodes de la troisième catégorie utilisent les technologies récentes développées dans le cadre des applications de gradients de champ pulsés (voir notamment G W Vuister, R Boelens, R. Kaptein, R E Hurd, B John, and P C M Ziji, J Am. Chem Soc, 113, 9688 1991). Néanmoins, ces trois catégories de procédés et méthodes connus mentionnés ci-dessus présentent de nom- breux inconvénients communs, mais également spécifiques. Leur inconvénient commun principal réside dans le fait que la suppression ou l'atténuation du signal du solvant, notamment de l'eau, est faible si un seul tran- sitoire est enregistré et qu'une bonne atténuation du si- gnal correspondant au solvant ou à l'eau ne peut être obtenue qu'après accomplissement d'un cycle de phase com- plet. En outre, l'application de ces procédés et mé- thodes connus précités est limitée à certaines circons- tances et conditions expérimentales. Ainsi, le procédé "jump and return" peut être mis en oeuvre pour des expériences RMN à une dimension ou du type connu sous la dénomination NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy spectroscopie à effet nu- cléaire Overhauser), mais est très peu performant en asso- ciation avec des expériences RMN des types connus sous les dénominations TOCSY (T Otally Correlated Spectroscopy - spectroscopie totalement corrélée) et ROESY (R Otating Overhauser Effect Spectroscopy spectroscopie à effet Overhauser dans le référentiel tournant) et n'est prati- quement pas mis en oeuvre pour des expériences RMN hétéro- nucléaires. Le procédé mettant en oeuvre une impulsion de verrouillage de spins donne des résultats relativement bons pour des expériences RMN des types connus sous les dénominations HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Cohérence cohérence multiple quanta hétéronucléaire) et HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence cohérence simple quanta hétéronucléaire), mais est difficile à mettre en oeuvre pour des expériences homonucléaires. 5 Enfin, les procédés et méthodes mettant en oeuvre les techniques de gradients de champ pulsés ne sont efficaces, pour la suppression du pic de l'eau, que dans le cadre d'expériences RMN du type hétéronucléaire et ne sont d'aucune utilité dans le cadre des expériences de10 type NOESY, TOCSY et ROESY. Par ailleurs l'utilisation de ces derniers pro- cédés et méthodes entra ne une diminution de moitié du rapport signal/bruit. La présente invention a notamment pour but de pallier l'ensemble des inconvénients précités. A cet effet, elle a pour objet un procédé d'excitation et d'acquisition de signaux de RMN, notamment pour l'analyse de molécules dispersées dans un solvant, tel que par exemple de l'eau, caractérisé en ce qu'il con-20 siste essentiellement à soumettre tout d'abord l'échan- tillon à analyser à une séquence d'impulsions correspon- dant à l'expérience de RMN haute résolution à réaliser, puis à lui appliquer un premier gradient de champ pulsé selon une direction donnée, à le soumettre ensuite à un25 champ radiofréquence pulsé sélectif de 180 , affectant tout le spectre à l'exception de la fréquence de résonance de l'eau ou du solvant correspondant, à lui appliquer un second gradient de champ pulsé, identique au premier et, enfin, à effectuer l'acquisition et le traitement des si-30 gnaux de RMN résultants. L'invention sera mieux comprise grâce à la des- cription ci-après, qui se rapporte à des modes de réali- sation préférés, donnés à titre d'exemple non limitatif, et expliqués avec référence aux dessins schématiques35 annexés, dans lesquels: la figure l A représente un diagramme schématique montrant le déroulement du procédé conforme à l'invention dans le cas général, la figure 1 B représente un diagramme schématique montrant le déroulement du procédé conforme à l'invention, selon un premier mode de réalisation particulier,5 la figure 2 A représente un diagramme spectral montrant le profil d'excitation générée par le champ radiofréquence pulsé sélectif de 1800, obtenu en appliquant le premier mode de réalisation particulier de l'invention représenté à la figure l B, la figure 2 B représente un diagramme spectral montrant le profil d'excitation générée par le champ radiofréquence pulsé sélectif de 1800, obtenu en appliquant un deuxième mode de réalisation particulier de l'invention, la figure 3 A représente un diagramme schématique montrant15 le déroulement du procédé selon l'invention mis en oeuvre dans le cadre d'une expérience de RMN du type l D (à une dimension), la figure 3 B représente le spectre RMN recueilli après mise en oeuvre d'une expérience RMN du type représenté à20 la figure 3 A, les figures 4 à 7 représentent des diagrammes schématiques montrant le déroulement du procédé selon l'invention mis en oeuvre dans le cadre de différentes expériences de RMN, respectivement des types NOESY, TOCSY, ROESY et HSQC,25 la figure 8 A représente un diagramme schématique montrant le déroulement du procédé selon l'invention mis en oeuvre dans le cadre d'une expérience de RMN du type 1 D (à une dimension), selon une variante de réalisation, la figure 8 B représente le spectre RMN recueilli après30 mise en oeuvre de l'expérience représentée à la figure 8 A, effectuée dans les mêmes conditions que celles ayant con- duit au spectre représenté à la figure 3 B et, les figures 9 A et 9 B représentent les spectres RMN re- cueillis dans le cadre d'expériences de type NOESY et35 TOCSY, avec application du procédé selon l'invention. Conformément à l'invention, comme le montrent notamment les figures 1, 3 A, 4 à 7 et 8 A des dessins annexés, le procédé d'excitation et d'acquisition de si- gnaux de RMN, consiste essentiellement à soumettre tout d'abord l'échantillon à analyser à une séquence d'impul- sions 1 correspondant à l'expérience de RMN haute résolu-5 tion à réaliser, puis à lui appliquer un premier gradient de champ 2 pulsé selon une direction donnée, par exemple la direction Z, à le soumettre ensuite à un champ radio- fréquence 3 pulsé sélectif de 1800, affectant tout le spectre à l'exception de la fréquence de résonance de10 l'eau, à lui appliquer un second gradient de champ 4 pul- sé, identique au premier et, enfin, à effectuer l'acquisi- tion et le traitement des signaux de RMN résultants. Le champ radiofréquence 3 pulsé sélectif de 1800 est par conséquent appliqué de manière sélective aux pro- tons à analyser dans le cadre de l'expérience de RMN réa- lisée, mais n'affecte pas la résonance du solvant, par exemple préférentiellement de l'eau. Ainsi, toutes les cohérences déphasées par le premier gradient de champ 2 pulsé sont rephasées par le second gradient de champ 4 pulsé, à condition qu'elles subissent une rotation de 1800, c'est-à-dire qu'elles soient affectées par le champ radiofréquence 3 pulsé sé- lectif de 1800. Dans le présent mémoire, le terme "sélectif" dé- signe un champ ou une impulsion affectant l'ensemble du spectre, à l'exception de la fréquence de résonance de l'eau ou du solvant correspondant et le terme "non sélec- tif" désigne un champ ou une impulsion affectant tout le spectre sans exception.30 Comme le montrent les figures 1, 3 A, 4 à 7 et 8 A des dessins annexés, les gradients de champ pulsés 2 et 4 et le champ radiofréquence 3 pulsé sélectif de 1800 sont mis en oeuvre immédiatement après achèvement de la sé- quence d'impulsions correspondant à l'expérience de RMN à35 réaliser. Pour le cas particulier d'une expérience du type HSQC, les gradients de champ 2 et 4 et l'application du champ radiofréquence 3 sont insérés dans la période de re- focalisation de l'étape dite INEPT inversée (Insensitive Nuclei Enhanced by Polarisation Transfer noyaux peu sen- sibles améliorés par transfert de polarisation) Il y a5 lieu, dans ce cas, de prendre en considération la durée des gradients de champ 2 et 4 et du champ radiofréquence 3 lors de l'ajustement du délai de refocalisation (figure 7). Selon une première caractéristique de l'inven- tion, représentée également sur les figures 1, 3 A, 4 à 7 et 8 A des dessins annexés, les deux gradients de champ 2 et 4 pulsés présentent préférentiellement des enveloppes d'impulsions de forme sinusoïdale, permettant de supprimer ou d'atténuer les signaux correspondant à l'eau ou au sol-15 vant utilisé, à un degré tel que leur intensité devient comparable à celle des signaux des protons à analyser dans le cadre de l'expérience réalisée. Néanmoins, d'autres formes d'enveloppes sont également envisageables telles que par exemple des enve- loppes du type carré, gaussien ou lorentzien. La durée totale s'écoulant entre la fin de l'ex- périence de RMN réalisée et le début de l'acquisition des signaux de RMN résultants est inférieure à 6 millisecon- des, ce en tenant compte des durées de recouvrement des25 gradients de 125 microsecondes environ. Conformément à un premier mode de réalisation de l'invention, le champ radiofréquence 3 pulsé sélectif de 1800 peut être constitué par trois composantes succes- sives, à savoir, une impulsion radiofréquence 6 non sélec- tive de 1800 orientée selon une direction donnée X, et deux impulsions radiofréquence 7 et 7 ' sélectives de 90 , identiques, de faible puissance, dont l'une 7 précède et dont l'autre 7 ' suit l'impulsion radiofréquence 6 non sé- lective de 180 , en étant orientées selon une direction -X35 opposée à la direction X de cette dernière (figure 1 B). Les impulsions radiofréquence 7 et 7 ' sélectives de 90 peuvent alors consister, de manière avantageuse, soit en des impulsions rectangulaires, soit en des impul- sions modulées en amplitude de manière telle que les va- riations d'amplitudes susceptibles d'être introduites dans le profil d'excitation soient éliminées (figure 2 A). 5 Pour le cas o des impulsions radiofréquence 7 et 7 ' rectangulaires sélectives de 90 , de faible puis- sance, sont mises en oeuvre, la largeur de la région non excitée est délimitée par la longueur desdites impulsions 7 et 7 ' sélectives de 90 (longueur T) tandis que la lar- geur de bande d'excitation est limitée principalement par l'intensité du champ radiofréquence de l'impulsion 6 non sélective de 1800. Selon une première approximation, le domaine spectral présentant des intensités réduites est limité aux fréquences multiples de 1/T à partir de la fréquence de la porteuse centrée sur la position spectrale correspondant au pic de résonance de l'eau. La variation d'amplitude introduite par les deux impulsions rectangulaires 7 et 7 ' sélectives de 90 est inférieure à 10 % et peut être supprimée en modulant les enveloppes de ces impulsions 7 et 7 ' Conformément à un deuxième mode de réalisation de l'invention non représenté aux dessins annexés, le champ radiofréquence 3 pulsé sélectif de 1800 est consti-25 tué par une séquence d'impulsions successives de forte puissance correspondant à une séquence du type: 3 Z 9 o L Z - 19 x -719 Z 99 3, avec 26 = 1800 et Z correspondant au délai entre deux impulsions successives. Cette séquence d'impulsions de forte puissance peut être obtenue par optimisation au moyen d'une simu- lation sur ordinateur et présente des propriétés de refo-35 calisation optimales A titre d'exemple, le profil d'exci- tation de cette séquence d'impulsions est représentée à la figure 2 B (avec fréquence porteuse = 500 M Hz, 6 = 250 microsecondes et puissance de champ = 19 230 Hz). La séquence d'impulsions de forte puissance peut présenter, par exemple, les phases respectives suivantes ( 0,0,0,180,180,180) pour ses différentes composantes suc- cessives, permettant de délivrer un train d'impulsions réalisant une non excitation à la fréquence porteuse et à des fréquences décalées de + / k/r avec k = 0,1,2,3 Néanmoins, la séquence d'impulsions de forte puissance peut également présenter les phases respectives ( 0,180,0,0,180,0) pour ses différentes composantes succes- sives, permettant la suppression du pic spectral de ré- sonance de l'eau ou du solvant correspondant à des fré- quences décalées de +/ ( 2 k + l)/2 Z par rapport à la fré- quence porteuse. Les deux séquences d'impulsions décrites ci- dessus génèrent des spectres composés de signaux de phase pure et réalisent une suppression ou une atténuation im- portante du pic correspondant à l'eau ou au solvant correspondant, avec un facteur d'atténuation de l'ordre de 4 5 10 à 105, ce lors d'un unique balayage. Cette propriété avantageuse de l'invention pro- vient du fait que, dans le cadre d'un balayage unique, l'effet des deux gradients de champ pulsés 2 et 4 précé- dant et suivant l'impulsion radiofréquence 3 sélective de25 1800 est, pour l'essentiel, équivalent à l'application d'un procédé de cycle de phase à quatre étapes connu sous la dénomination EXORCYCLE et décrit dans le document "Journal of Magnetic Resonance", 27, 511-514, 1977 par Geoffrey Bodenhausen, Ray Freeman et David L Turner. Le gradient de champ pulsé 4 précédant immédia- tement la phase d'acquisition assure une élimination pra- tiquement complète du pic spectral correspondant à l'eau ou au solvant utilisé et autorise l'emploi de gains du ré- cepteur très élevés.35 En outre, et contrairement aux différents procé- dés et méthodes connus de l'art antérieur, le procédé d'excitation et d'acquisition conforme à l'invention, peut être utilisé en association avec la plupart des expérien- ces RMN haute résolution, notamment celles mentionnées au début du présent mémoire. Conformément à une variante de réalisation de l'invention, représentée à la figure 8 A des dessins anne- xés, le procédé d'excitation et d'acquisition consiste, de manière avantageuse, avant émission de la séquence d'impulsions 1 correspondant à l'expérience de RMN haute résolution à réaliser, à soumettre l'échantillon à une im- pulsion de radiofréquence 8 sélective de 90 , présentant une fréquence de porteuse identique à la fréquence de ré- sonance du solvant, par exemple de l'eau, de telle manière que l'aimantation du solvant retourne à sa position d'équilibre sous l'influence d'une seconde impulsion ra- diofréquence 8 ' non sélective de 900. La Figure 8 a représente la mise en oeuvre de cette disposition supplémentaire de l'invention dans le cadre d'une expérience RMN 1 D Néanmoins, il est également possible d'appliquer cette disposition en association avec d'autres expériences RMN, notamment du type 2 D. Cette disposition supplémentaire de l'invention permet, lorsque le délai de relaxation est sensiblement de même valeur que le temps de relaxation Tl de l'eau ou du solvant correspondant, d'éviter une saturation partielle de la résonance de l'eau ou du solvant correspondant, et donc une saturation et une modification des signaux des protons échangés avec l'eau ou le solvant, ces effets néfastes pouvant éventuellement également être transférés, par l'intermédiaire de la diffusion des spins aux protons non échangés avec l'eau ou le solvant correspondant. L'effet bénéfique de cette disposition supplémentaire de l'invention peut être aisément constaté en comparant les spectres RMN représentés sur les figures 3 B et 8 B. L'impulsion 8 sélective de 900 appliquée peut, par exemple, consister en une impulsion du type connu sous la dénomination EBURP 2 (Excitation Band selective Uniform il Response Pure phase excitation uniforme sélective de phase pure) et décrite notamment dans "Journal of magnetic résonance", 93, 93-141, 1991 par Helen Geen and Ray Freeman Une telle impulsion 8, permet de réaliser une excitation à bande étroite des molécules d'eau ou de sol- vant correspondant, avec une phase uniforme sur la largeur de bande d'excitation et une perturbation négligeable dans les autres domaines spectraux restants. Le procédé d'excitation et d'acquisition selon la présente invention décrit ci-dessus en association avec des expériences RMN à une dimension ou à deux dimensions peut, bien évidemment, également être mis en oeuvre en association ou dans le cadre d'expériences de RMN tridi- mentionnelles ou quadridimentionnelles. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits et représentés aux dessins annexés Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention. R E V E N D I C A T I O N S 1 Procédé d'excitation et d'acquisition de si- gnaux de RMN, notamment pour l'analyse de molécules dis- persées dans un solvant, tel que par exemple de l'eau, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à soumet- 5 tre tout d'abord l'échantillon à analyser à une séquence d'impulsions ( 1) correspondant à l'expérience de RMN haute résolution à réaliser, puis à lui appliquer un premier gradient de champ ( 2) pulsé selon une direction donnée, à le soumettre ensuite à un champ radiofréquence pulsé sé-10 lectif de 1800 ( 3), affectant tout le spectre à l'excep- tion de la fréquence de résonance de l'eau ou du solvant correspondant, à lui appliquer un second gradient de champ ( 4) pulsé, identique au premier et, enfin, à effectuer l'acquisition et le traitement des signaux de RMN résul- tants. 2 Procédé, selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les deux gradients de champ ( 2 et 4) pulsés présentent des enveloppes d'impulsions de forme sinu- soidale.20 3 Procédé, selon l'une quelconque des revendi- cations 1 et 2, caractérisé en ce que le champ radiofré- quence pulsé sélectif de 1800 ( 3) est constitué par trois composantes successives, à savoir, une impulsion radiofré- quence non sélective de 1800 ( 6) orientée selon une direc-25 tion donnée (X), et deux impulsions radiofréquence sélec- tives de 90 ( 7 et 7 ') identiques, de faible puissance, dont l'une ( 7) précède et dont l'autre ( 7 ') suit l'impul- sion radiofréquence non sélective de 1800 ( 6), en étant orientées selon une direction (-X) opposée à la direction30 (X) de cette dernière. 4 Procédé, selon la revendication 3, caracté- risé en ce que les impulsions radiofréquence sélectives de 900 ( 7 et 7 ') consistent, soit en des impulsions rectangu- laires, soit en des impulsions modulées en amplitude de manière déterminée. Procédé, selon l'une quelconque des revendi- cations 1 et 2, caractérisé en ce que le champ radiofré- quence pulsé sélectif de 1800 ( 3) est constitué par une séquence d'impulsions successives de forte puissance 5 correspondant à une séquence du type: 3 Z; 9 i, %19 o -dû 19 îz Z; 9 ae Z, 3 " avec 26 c = 1800. 6 Procédé, selon la revendication 5, caracté- risé en ce que la séquence d'impulsions de forte puissance présente les phases respectives suivantes ( 0,0,0,180,180,180) pour ses différentes composantes suc- cessives. 7 Procédé, selon la revendication 5, caracté- risé en ce que la séquence d'impulsions de forte puissance présente les phases respectives suivantes ( 0,180,0,0,180,0) pour ses différentes composantes succes- sives. 8 Procédé, selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 7, caractérisé en ce qu'il consiste, avant émission de la séquence d'impulsions ( 1) correspondant à l'expérience de RMN haute résolution à réaliser, à sou- mettre l'échantillon à une impulsion de radiofréquence sé-25 lective de 90 ( 8), à la fréquence de résonance du sol- vant, de telle manière que l'aimantation du solvant re- tourne à sa position d'équilibre sous l'influence d'une seconde impulsion radiofréquence ( 8 ') non sélective de 900. 9 Procédé, selon la revendication 8, caracté- risé en ce que le champ radiofréquence pulsé sélectif de ( 8) appliqué consiste en une impulsion du type connu sous la dénomination EBURP 2.