FR 2707090 A1 19950106 FR 9307901 A 19930629 - 1- 2707090 FAMILLE DE PEPTIDES APPELES XENOXINES La présente invention se rapporte à une famille de peptides, appelés xénoxines, aux membres de la famille peptidique, ainsi qu'à des procédés pour les préparer et aux séquences d'ADN les encodant. Elle concerne également les compositions pharmaceutiques renfermant lesdites xénoxines ainsi que les trousses de diagnostic les contenant ou contenant des anticorps anti-xénoxine. 2 o Un nombre important de peptides avec des fonctions biologiques diverses ont déjà été isolés de la peau d'amphibiens. (V. Erspamer et P. Melchiorri, Neuroendocrine Perspectives, E.E. Miller et McLeod, Eds., (Elsevier Science Publishers B.V.) 2, (1983), p 37; C.L. Bevins et coll.; Ann. Rev. Biochem. 59; (1990); p 395). Dès le début on a trouvé que plusieurs de ces peptides étaient très similaires voire même identiques à des hormones et des neurotransmetteurs de mammifères (V. Erspamer et coll., Trends Pharmacol. Sci. 1, (1980), p 391). Ainsi la peau de grenouille est réputée être une source de peptides avec des propriétés pharmacologiques ou antibiotiques intéressantes. Plus particulièrement, la peau 3 0 deXenopus laevis, une grenouille d'origine africaine, contient d'importantes concentrations de peptides divers. Le rôle biologique que peuvent jouer ces peptides que l'on retrouve dans la matière sécrétée par la peau de Xenopus laevis n'est que partiellement connu. D'une part, les sécrétions pourraient avoir une fonction protectrice étant donné que la matière sécrétée semblerait être nuisible aux prédateurs. D'autre part, la matière sécrétée contient des peptides qui limitent la croissance des bactéries et des champignons et qui pourraient donc - 2- 2707090 se comporter comme antibiotiques sur la peau mouillée de la grenouille ou combattre les infections pendant la cicatrisation de blessures. Ces peptides antibiotiques contiennent en général entre 21 et 26 acides aminés, sont basiques et sont exempts de tyrosine. L'identité des séquences d'acides aminés des différents peptides antibiotiques est souvent très limitée. Par contre ces peptides ont en commun leur configuration en hélice alpha amphipathique. Au niveau des séquences signal d'environ 20 acides aminés l'identité des séquences d'acides aminés n'est que de 55 %. Toutefois on retrouve des segments conservés, communs aux séquences signal des différents peptides antibiotiques. En plus, ils partagent tous une séquence N'-terminale Arg-Xaa-Val-Arg qui serait le site d'action d'un enzyme de maturation commun. Comme autres exemples de peptides isolés et caractérisés chez leXenopus laevis, on peut citer la caeruléine, membre de la famille de peptides cholécystokinine/gastrine (Anastasi et coil., Brit. J. Pharmacol. 38, (1970), p 221); spasmolysine I et II (W. Hoffmann, J. Biol. Chem. 263 (16), (1988), p 7686); thyrotrophine releasing peptide (K. Richter et coll., EMBO J. 3(3), (1984), p 617) et xénopsine (K Araki et coUll., Chem. Pharmacol. Bull. 21 (12), (1973), p 2801). La plupart de ces peptides sont membres d'une famille de peptides qui contient entre autres des peptides analogues d'origine mammaliens. 2 o Bombésine et kassinine par exemple, ont servi comme référence pour identifier respectivement la gastrine releasing peptide et la substance K chez les mammifères (C.L. Bevins et coll, vi supra). Effectivement la matière sécrétée par la peau de grenouille contient des peptides en quantité abondante, tandis que, chez les mammifères le peptide analogue n'est souvent présent qu'en quantité faible. C'est pourquoi les peptides de grenouille se prêtent à l'identification des peptides mammaliens utiles. La présente invention concerne une nouvelle famille de peptides, que l'on a nommés xénoxines et qui possèdent des propriétés pharmaceutiques de valeur et en particulier la propriété d'influencer le fonctionnement des canaux ioniques 3 o transmembranaires tout en ne présentant pas d'activité neurotoxique. De plus, on a trouvé que ces peptides ont la propriété avantageuse d'éliminer les effets de l'activine. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à une xénoxine caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'acides aminés, laquelle: a. contient au moins 8 cystéines qui sont reliées par 4 ponts disulfure suivant la configuration cysl avec cys3, cys2 avec cys4, cys5 avec cys6 et cys7 avec cys8; -3- 2707090 b. contient 0 à 3 acides aminés du côté N'-terminal du cysl, 9 à 14 acides aminés entre cys1 et cys2, 3 à 7 acides aminés entre cys2 et cys3, 11 à 18 acides aminés entre cys3 et cys4, 1 à 6 acides aminés entre cys4 et cys5, 7 à 15 acides aminés entre cys5 et cys6, aucun acide aminé entre cys6 et cys7, 3 à 5 acides aminés entre cys7 et cys8 et 0 à 10 acides aminés du côté C-terminal du cys8; et c. présente une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 40 % avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3, ou un fragment dérivé de cette séquence. La présente invention concerne également les peptides intermédiaires qui n'ont pas encore adopté leur conformation repliée mais qui contiennent au moins 8 cystéines, susceptibles de se relier par 4 ponts disulfure suivant la configuration cysl avec cys3, cys2 avec cys4, cys5 avec cys6 et cys7 avec cys8. C'est pourquoi, la présente invention se rapporte à un peptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés, laquelle: a. contient au moins 8 cystéines qui, lorsque le peptide adopte sa conformation repliée, sont reliées par 4 ponts disulfure suivant la configuration cysl avec cys3, cys2 avec cys4, cys5 avec cys6 et cys7 avec cys8; 2 5 b. contient 0 à 3 acides aminés du côté N'- terminal du cysl, 9 à 14 acides aminés entre cys1 et cys2, 3 à 7 acides aminés entre cys2 et cys3, 11 à 18 acides aminés entre cys3 et cys4, 1 à 6 acides aminés entre cys4 et cys5, 7 à 15 acides aminés entre cys5 et cys6, aucun acide aminé entre cys6 et cys7, 3 à 5 acides aminés entre cys7 et cys8 et 0 à 10 acides aminés du côté C'-terminal 3 0 du cys8; et c. présente une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 40 % avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3, 3 5 ou un fragment dérivé de cette séquence. Les peptides préférés de la présente invention contiennent 2 acides aminés du côté N'-terminal du cys1, 10 à 13 acides aminés entre cys1 et cys2, 4 à 6 acides aminés entre cys2 4- 2707090 et cys3, 12 à 17 acides aminés entre cys3 et cys4, 1 à 5 acides aminés entre cys4 et cys5, 8à 14 acides aminés entre cys5 et cys6, aucun acide aminé entre cys6 et cys7, 4 acides aminés entre cys7 et cys8 et 2 acides aminés du côté C'-terminal du cys8. D'autres peptides, également préférés, de la présente invention présentent une identité d'acides aminés d'au moins 50 %, de manière particulièrement préférée d'au moins 60 % et de manière avantageuse d'au moins 70 % avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3. Les peptides particulièrement préférés conformes à l'invention sont les xénoxines caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'acides aminés laquelle: a. contient au moins 8 cystéines qui sont reliées par 4 ponts disulfure suivant la configuration cys' avec cys3, cys2 avec cys4, cys5 avec cys6 et cys7 avec cys8; b. contient 0 à 3 acides aminés du côté N'-terminal du cysl, 13 acides aminés entre cysl et cys2, 6 acides aminés entre cys2 et cys3, 12 acides aminés entre cys3 et cys4, 5 acides aminés entre cys4 et cys5, 14 acides aminés entre cys5 et cys6, aucun acide aminé entre cys6 et cys7, 4 acides aminés entre cys7 et cys8 2 o et 0 à 10 acides aminés du côté C-terminal du cys8; et c. présente une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 80 %, de préférence 90 %, avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3. Les peptides selon l'invention comportent de préférence de 42 à 86 acides aminés, de préférence de 51 à 75 acides aminés et de manière particulièrement préférée de 62 à 75 acides aminés. 3 o La présente invention concerne également des peptides de 66 acides aminés qui présentent une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 80 %, de manière préférée d'au moins 90 % et de manière particulièrement préférée d'au moins 95 %, avec la séquence d'acides aminés telle que identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3. 3 5 Comme exemples de peptides particulièrement préférés on peut citer le peptide, xénoxine-1 tel que identifié sous le numéro SEQ ID NO: 3, ainsi que la xénoxine-2 selon SEQ ID NO: 4 et la xénoxine-3 selon SEQ ID NO: 5. - s -2707090 Les peptides selon l'invention peuvent être sous forme de leurs sels d'addition d'acides non toxiques pharmaceutiquement acceptables. Comme exemples d'acides pharmaceutiquement acceptables, on peut citer les acides minéraux comme les acides chlorhydriques, sulfuriques, phosphoriques, etc. et les acides organiques comme les acides sulfoniques et carboxyliques telles que l'acide acétique, lactique, palmitique, stéarique, maléique, tartrique, ascorbique, citrique, etc. Les peptides selon l'invention peuvent également être sous forme de leurs sels d'addition de base étant donné qu'ils contiennent des groupements carboxyliques libres. Comme exemples de sels pharmaceutiquement acceptables on peut citer les sels de sodium, de potassium, de calcium ou de magnesium et les dérivés d'ammonium quaternaire. Etant donné que les peptides selon l'invention contiennent à la fois des groupements carboxylique et amine libres, ils peuvent être sous forme de leurs sels internes ou sous forme combinée de sels d'additions et de sels internes. Pour déterminer l'identité d'acides aminés on aligne les cystéines de telle façon qu'elles se trouvent en position identique avec les cystéines de la séquence d'acides aminés 2 o telle que présentée sous SEQ ID NO: 3 et on introduit des écarts pour maximaliser l'alignement des séquences tout en gardant le nombre d'écarts à un minimum. On identifie alors les acides aminés identiques qui se trouvent en position identique, y compris les cystéines. L'identité d'acides aminés est exprimée en pourcentage et calculée selon la formule (1) suivante: n x 100 (1) 66 + p 3 0 dans laquelle n est le nombre d'acides aminés identiques, 66 est le nombre d'acides aminés de la séquence identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3, p est le nombre d'écarts introduits. Une famille de xénoxines selon l'invention comprend des peptides qui sont issus de différentes espèces d'amphibiens ou de mammifères. Comme exemple d'amphibiens on peut citer les espèces qui appartiennent au superordre des Salienta, anoures telles que les grenouilles, les crapauds, les rainettes, etc; ou à l'ordre des Caudata, urodèles telles que les salamandres, les tritons etc.; ou encore à l'ordre des Gymnophiona, apodes telles que - 6 - 2707090 les anguilles, les murènes etc. I1 est également possible d'obtenir des xénoxines de mammifère notamment de souris, de porc ou d'homme. Les xénoxines selon l'invention ont en commun des propriétés pharmaceutiques chez le mammifère basée notamment sur leurs interactions avec le fonctionnement des canaux ioniques transmembranaires et leur interraction avec l'activine. L'identité d'acides aminés des différentes xénoxines peut varier à cause des divergences interespèces ou alleliques. Le plus souvent il s'agit de substitutions conservatives qui permettent de conserver la conformation squelettique du peptide. Ainsi de façon préférée, dans les xénoxines selon l'invention une substitution en position homologue, comparée à la séquence identifiée sous SEQ ID NO: 3, se fait avec un acide aminé ayant une fonctionnalité équivalente pour ce qui concerne ses propriétés hydrophobiques, de charge ou d'espacement. On choisi par exemple parmi le groupe des acides aminés hydrophobes entre alanine, isoleucine, leucine, méthionine, phénylalanine, proline, tryptophane et valine; parmi le groupe des acides aminés polaires non chargés asparagine, cystéine, glutamine, glycine, sérine, thréonine et tyrosine; parmi les acides aminés chargés positivement arginine, histidine et lysine; parmi les acides aminés chargés négativement acide aspartique et acide glutamique et parmi le groupe des acides aminés d'espacement équivalent alanine, glycine et sérine. Une modification post-traductionnelle telle que la formation des ponts disulfure entre les cystéines du peptide stabilise la conformation repliée des xénoxines, ce qui permet l'exercice de leurs activités pharmacologiques. Les différents ponts disulfure ne se forment pas de façon aléatoire. Quand on permet à la séquence d'acides aminés de s'enrouler, les groupements disulfures qui se relient sont ceux de deux cystéines voisines dans le peptide replié. C'est pourquoi la conformation du squelette peptidique peut être décrite par la configuration des ponts 3 o disulfure. A cet effet, on décrit les liaisons qui se sont formées entre les cystéines dans le peptide replié et on donne une indication du nombre d'acides aminés entre les différentes cystéines successives dans la séquence primaire des peptides. Il existe donc une double similarité structurelle entre les peptides de la même famille, notamment au niveau du squelette peptidique, et au niveau de l'identité d'acides aminés. Ainsi, quand on compare deux peptides de la même famille, il peut se trouver qu'ils possèdent des séquences d'acides aminés avec une disparité significative, voir même une identité d'acides aminés aussi faible que 40 %. Par contre, la similitude de la 7 2707090 configuration des cystéines impliquées dans la formation des ponts disulfure sera frappante. Les xénoxines selon l'invention sous forme totale ou sous forme de fragment peuvent également être introduites dans des structures chimiques ou physico-chimiques plus complexes destinées à faciliter leur activité ou à leur conférer des propriétés thérapeutiques avantageuses comme par exemple la forme retard ou protégée. L'invention concerne également les xénoxines qui présentent éventuellement des modifications connues pour les peptides telle que la glycosylation notamment, ainsi que les produits déglycosylés ou non-glycosylés notamment. Les xénoxines conformes à la présente invention peuvent être isolées selon le procédé suivant: a. on divise en fractions la matière sécrétée par la peau de grenouille par précipitation à l'aide de sulfate d'ammonium, ou un agent précipitant équivalent, 2 o b. on soumet les précipités qui se forment entre 30 % et 70 % de saturation en sulfate d'ammonium, de préférence entre 30 % et 60 %, ou en conditions équivalentes, à une chromatographie par perméation de gel, et c. on récolte la fraction peptidique qui élue tardivement. Si on le désire, le mélange de xénoxines ainsi obtenu peut ensuite être purifié par HPLC d'échange de cations et suivi de HPLC phase inverse. Selon un aspect préféré de la présente invention, la matière sécrétée par la peau de 3 0 grenouille est issue de Xenopus laevis. Dans le procédé selon l'invention on précipite la fraction de peptides avantageusement à l'aide de sulfate d'ammonium. Toutefois, d'autres agents précipitants peuvent être utilisés tels que le polyéthylène glycol, l'éthanol ou le sulfate de sodium. Il 3 5 appartient à l'homme de métier de choisir la fourchette de saturation en agent précipitant nécessaire pour obtenir les précipités exempts de protéines d'une part et de peptides avec des poids moléculaires inférieurs à 10.000 Da, de préférence 8.000 Da, d'autre part. - 8 - 2707090 Normalement, la chromatographie par perméation de gel permet de séparer les molécules en fonction de leur poids moléculaire. Dans le procédé selon l'invention cette chromatographie permet d'écarter tous les molécules de poids moléculaire important des peptides concernés en récoltant uniquement la fraction qui élue tardivement de la colonne. De ce fait chaque type de gel de perméation ayant une zone de fractionnement au delà de 10 kDa peut être utilisé. Dans le commerce ce genre de gel est disponible sous le nom, par exemple, de Sephacryl S300 (Pharmacia), Sephadex (Pharmacia), Fractogel (Merck) ou Toyopearl (Toso Haas). On peut également synthétiser chimiquement les peptides selon l'invention par des méthodes de synthèse connues de l'homme du métier. A titre de référence on citera E. Bayer, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30, (1991), p 113. La présente invention concerne également l'expression des xénoxines dans des systèmes cellulaires autres que le système cellulaire naturel dont elles sont issues. Pour ce faire, l'invention concerne également les séquences d'ADN isolées codant pour lesdites xénoxines, ainsi que des cassettes d'expression desdites séquences assurant 2 o leur expression dans la cellule désirée. Par fragment d'ADN isolé, on entend un fragment d'ADN qui n'est plus associé à l'ensemble des régions naturelles qui contrôlent son expression dans l'organisme dont il est issu, c'est à dire dans le cas de l'exemple cité ci-dessous duXénopus laevis. Parmi les séquences d'ADN isolé qui comprennent une séquence codant pour un peptide selon l'invention, il faut citer en particulier l'ADN qui est repris dans la liste d'identification des séquences sous le numéro SEQ ID NO: 1, et plus particulièrement la partie de la SEQ ID NO: 1 de la position 39 à 290 et la partie de la SEQ ID NO: 1 de la 3 o position 93 à 290. L'invention concerne des cassettes d'expression desdites séquences d'ADN codant pour un peptide selon l'invention. 3 5 Une telle cassette d'expression comprend notamment un fragment d'ADN isolé qui est placé sous le contrôle d'éléments permettant sa transcription et sa traduction dans la cellule hôte considérée. - 9 - 2707090 Ces éléments de contrôle sont essentiellement un promoteur de la transcription approprié ainsi que des codons d'initiation et de fin de traduction. Dans certains cas, il est aussi avantageux d'ajouter un terminateur de transcription et un peptide signal. L'invention concerne également une cellule qui est transformée avec une cassette d'expression qui comprend un fragment d'ADN selon l'invention. La cassette d'expression peut être soit intégrée dans le génome de la cellule soit portée par un vecteur d'expression approprié tel que par exemple un plasmide ou un vecteur viral. La présente invention concerne également l'utilisation de vecteurs d'expression susceptibles d'être administrés pour produire les xénoxines in situ chez l'homme ou l'animal, notamment lorsque le vecteur est un vecteur viral. Enfin, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un peptide selon l'invention qui consiste à cultiver une cellule transformée selon l'invention et à récolter ledit peptide à partir de la culture. Les technologies permettant le clonage et l'expression d'un gène étranger dans des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes sont connues de l'homme du métier. Elles seront 2 0 illustrées dans les exemples ci-dessous, étant entendu que d'autres vecteurs et d'autres cellules hôtes peuvent être utilisés. L'homme du métier sait bien évidemment choisir le promoteur de la transcription approprié en fonction de l'hôte dans lequel on souhaite exprimer le fragment d'ADN et en fonction du vecteur dans lequel la cassette d'expression doit être insérée pour assurer sa réplication. Selon un procédé préféré de préparation d'un peptide selon l'invention le fragment d'ADN isolé est exprimé dans des cellules hôtes qui permettent la sécrétion des peptides synthétisés dans le milieu de culture afin d'assurer la formation des ponts disulfure. A titre d'exemple, on peut citer les cellules hôtes de procaryotes tel que E. coli, de eucaryotes 3 0 inférieurs tel que Saccharomyces cerevisiae ou de eucaryotes supérieurs tel que l'homme ou l'animal. Pour diriger un peptide vers le système de sécrétion des cellules hôtes on prévoit dans la cassette d'expression une séquence peptidique généralement connue sous le nom peptide signal qui est située de façon avantageuse du côté de l'extrémité 5' de l'ADN à exprimer. Pendant le processus de translocation ce peptide signal sera clivé par un enzyme, la peptidase signal. C'est alors un peptide mature qui est sécrété dans le milieu de culture ou dans le périplasme de l'hôte. -10- 2707090 Le peptide signal préférablement utilisé est issu de gènes dont il est connu que le produit qu'ils encodent est sécrété de façon efficace. A titre d'exemple on cite les peptides signal de l'invertase périplasmique SUC2 (R.A. Smith et coil., Science 229, (1985), p 1219; C.N. Chang et coll., Mol. Ceil. Biol. 6, (1986), p 1812), ainsi que les peptides signal toxines "killer" de Kluyveromyces lactis (C. Baldazi et coll., EMBO J. 6,(1987), p 229) ou de Saccharomyces cerevisiae (M. Tokunaga et coil., Nucleic Acids Res. 16, (1988), p 7499). A titre d'indication on précise toutefois que le peptide signal du gène BGL2 issu de S. cerevisiae (T. Achstetter et col., Gene 110, (1992) p 25), et utilisé dans les exemples ci- dessous, permet d'obtenir de très bons résultats. Dans certains cas, le peptide obtenu pourra ne pas présenter la bonne configuration, il pourra alors être nécessaire de procéder à son réarrangement par des méthodes chimiques comportant, par exemple, la mise en solution et le repliement en utilisant des conditions de pH et l'urée par exemple. La présente invention concerne également les anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-xénoxines qui peuvent être obtenus par des procédés connus ainsi que leur application tant en thérapie que dans le domaine diagnostic pour identifier ou 2 o quantifier les xénoxines. La présente invention concerne donc également des trousses de diagnostic utilisant les xénoxines ou les anticorps correspondants. Les peptides selon l'invention ont des applications thérapeutiques chez les mammifères et notamment chez l'homme étant donné leurs propriétés de pouvoir influencer le fonctionnement des canaux ioniques transmembranaires, et de l'activine, sans avoir d'activité neurotoxique. 3 o En conséquence l'invention se rapporte également à: une composition pharmaceutique qui comprend à titre d'agent actif au moins un peptide selon l'invention; - l'usage thérapeutique d'un peptide selon l'invention; La composition pharmaceutique selon l'invention est en particulier destinée au traitement préventif ou curatif de maladies telles que par exemple des arythmies - 11- 2707090 cardiaques dues à une hyper ou hypotension; des maladies fibrokystiques d'origine génétique telle que la maladie fibrokystique du pancréas, mieux connue sous le nom de mucoviscidose; les troubles associés à un déséquilibre de gonadotrophine chorionique humaine pendant la grossesse; les maladies dues à une sécrétion déséquilibrée des hormones FSH, STH et ACTH (respectivement, pour follicle stimulating hormone, somatotropic hormone et adenocorticotropic hormone en Anglais); les compositions pharmaceutiques selon l'invention permettent également le réglage de l'érythropoièse. Les compositions pharmaceutiques renfermant les peptides selon l'invention peuvent être administrées par la voie la plus appropriée à sa distination finale, notamment par voie orale, parentérale ou rectale. Les compositions pharmaceutiques utilisables pour l'administration orale peuvent être solides ou liquides, par exemple sous forme de comprimés (enrobés ou non), pilules, dragées, capsules en gélatine, solutions, sirops, etc. De même, les compositions utilisables pour l'administration par voie parentérale, sont les formes pharmaceutiquement connues pour ce genre d'administration, par exemple des solutions, des suspensions ou émulsions aqueuses ou huileuses, qui conviennent e.a. 2 0 pour des injections intramusculaires, intraveineuses, intrapéritonéales, sous cutanées ou des applications cutanées ou transmuqueuse, par exemple par spray, pommades etc. Pour l'administration par voie rectale, les compositions contenant les composés de l'invention se présentent généralement sous forme de suppositoires. Les composés selon l'invention pourront également être préparés sous une forme à libération contrôlée et en fonction de la voie d'administration retenue sous une forme protégée appropriée afin d'éviter une dégration trop rapide du peptide. 3 0 Les formes pharmaceutiques telles que solutions injectables, suspensions injectables, compnmés, gouttes, suppositoires, etc. sont préparées selon les méthodes couramment utilisées par les pharmaciens. Les formes pharmaceutiques comprennent également les compositions qui permettent de délivrer le peptide actif d'une manière progressive. On mélange les composés de l'invention avec un véhicule solide ou liquide, 3 5 non toxique, pharmaceutiquement acceptable, et éventuellement avec un agent dispersant, un agent désintégrant, un agent stabilisant etc. On peut y ajouter, par exemple, des agents édulcorants, des agents colorants, etc. Le pourcentage de produit actif dans les -12- 2707090 compositions pharmaceutiques peut varier dans des limites très larges, selon le patient et le mode d'administration, en particulier selon la fréquence d'administration. Les exemples qui suivent illustrent la présente invention, sans la limiter, il y est fait référence aux figures 1 à 4. La figure 1 représente un SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie de deux stades différents de purification. (1) fraction peptidique récoltée après chromatographie par perméation de gel Sephacryl S300; (2) Marqueurs de poids moléculaire d'en bas jusqu'en 0 haut: lysozyme (14.300 Da), inhibiteur de trypsine (21.500 Da), anhydrase carbonique (30.000 Da), ovalbumine (46.000 Da), albumine de sérum bovin (69.000 Da) phosphorylase b (92.500 Da) et myosine (200.000 Da); (3) xénoxine-1 purifiée par HPLC d'échange de cations et phase inverse selon l'exemple 1 ci-dessous. La figure 2 représente un profil d'élution obtenu après HPLC à échange de cations de la fraction peptidique issue de sécrétion de la peau deXenopus laevis obtenue par précipitation au sulfate d'ammonium suivie d'une chromatographie par perméation de gel dans les conditions de l'exemple 1 qui est repris ci-dessous. Les fractions qui contiennent respectivement xénoxine-1, xénoxine-3 et xénoxine-2 sont indiquées par des flèches 2 o successives. La figure 3 A représente l'alignement de (a) xénoxine-1 avec (b) la cytotoxine issue de Naja naja kaouthia, Naja naja siamensis, un cobra monocle (S. Inoue et coll., FEBS Lett. 218, (1987), p 17) et (c) la neurotoxine d courte de Laticauda colubrina, un bungare de mer aux lèvres jaunes (N. Tamiya et coUll. Toxicon (Suppl. 3), (1983), p 445). Des écartements (-) sont introduits et les ponts disulfure indiqués. La figure 3 B représente le nombre d'acides aminés entre les cystéines successives dans les séquences primaires pour les trois familles de peptides xénoxines, cytotoxines et 3 o neurotoxines courtes, respectivement. La figure 4 représente l'alignement de xénoxine-1 avec 27 acides aminés du site de fixation N'-terminal de 116 résidus du récepteur humain de l'activine. -13- 2707090 Exemple 1: Purification et caractérisation des xénoxines. 1.1 Isolement et purification des xénoxines. Les Xenopi laevis, (Herpetologic Institute, DeRover, Pays Bas) sont maintenus dans des bacs aérés et alimentés avec du foie de porc haché. Toutes les trois semaines, les animaux sont soumis à un léger choc électrique (15 V) et les sécrétions de leur peau sont récoltées dans une solution de 0,9 % de NaCl selon la méthode décrite par C. Mollay et coll. , Eur. J. Biochem. 160, (1986), p 31. Le mucus ainsi extrait est soumis à deux 0 extractions successives par le n-butanol à volume égal. La fraction insoluble est éliminée par centrifugation pendant 15 minutes à 15.000 tours par minutes (Sorvall RC-5B, rotor SS34). Du sulfate d'ammonium est ensuite ajouté au surnageant et le matériel précipitant entre 30 et 60 % de saturation est récupéré. Ce précipité est dissous et dialysé dans l'acétate d'ammonium 50 mM, pH 5,0 et soumis à une chromatographie par perméation de gel en utilisant une colonne Sephacryl S300 (2,7 cm x 120 cm; Pharmacia) équilibrée avec le même tampon. La fraction peptidique est détectée à 280 nm et élue tardivement sous forme d'un pic large. Seule cette fraction tardive est collectée et lyophilisée. On établit un SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie pour vérifier que les 2 o molécules de poids moléculaire au delà de 10kDa sont écartées, (voir Figure 1). La fraction peptidique lyophilisée est reprise dans 50 ml d'acétonitrile 5 %, dans l'acétate d'ammonium 20 mM à pH 4,6 puis centrifugée pendant 15 minutes à 15.000 tours par minute (Sorvall RC-5B, rotor SS34). Le surnageant est filtré sur filtre Millex GV de 0,22 tm (Millipore) et des aliquotes de 5ml sont congelées à -80 C. Un aliquot de 5 ml de la solution est dilué dans 90 ml de tampon CE1 (acétonitrile % dans du phosphate de potassium monobasique 5 mM ajusté à pH 3,0 à l'aide de l'acide phosphorique). La conductivité de la solution est ajustée à 8 mS à l'aide du tampon 3 o CE1 et si nécessaire, le pH est ajusté à 3,0 à l'aide de l'acide phosphorique. La solution ainsi obtenue est alors séparée en trois aliquots qui sont successivement soumis à une séparation par HPLC (Chromatographie Liquide Haute-Performance) d'échange de cations (Shimadzu) avec détection UV à 215 nm, de la façon suivante: l'aliquot est chargé sur une colonne HPLC (poly-Sulfoéthyle Aspartamide SCX; 9,4 mm x 200 mm; The Nest Group) à un débit de 1,6 ml/minutes; -14- 2707090 la colonne est lavée avec le tampon CE1 jusqu'à ce que la ligne de base à 215 nm se soit stabilisée; un gradient 0 à 100 % de tampon CE2 (chlorure de potassium 600 mM dans du tampon CE1) est appliqué en 40 minutes, pour éluer le matériel adsorbé qui est collecté manuellement par fractions de 1,6 ml; - la colonne est lavée par le tampon CE2 pendant 10 minutes; - un gradient 100 % tampon CE2 à 100 % de tampon CE1 est appliqué en 5 minutes; et - la colonne est lavée par le tampon CE1 pendant 15 minutes. On obtient respectivement la xénoxine-1 qui élue entre 362 et 392 mM de chlorure de potassium après 33,3 à 35,5 minutes; la xénoxine-3 (398-415 mM; 35,9-37,1 minutes); et laxénoxine-2 (415-435 mM; 37,1-38,6 minutes) qui sont indiquées par les flèches successives sur le diagramme de la Figure 2. Une étape de séparation en HPLC phase inverse (Hewlett-Packard 1090A) avec détection UV à 205 nm est ensuite réalisée. A cet effet, les fractions individuelles issues de la chromatographie HPLC d'échange de cations sont directement chargées sur une colonne 2 o HPLC Vydac C18 (10 mm x 250 mm; Vydac Separation Group) équilibrée avec le tampon RP1 (0,10 %o (v/v) d'acide trifluoroacétique (TFA) dans l'eau dé-ionisé par le système de préparation d'eau réactif de Millipore (eau Milli Q)) à un débit de 1,5 ml/minute. Pour chaque fraction chargée, les xénoxines sont éluées de la colonne selon la 2 5 procédure suivante: - 100 % tampon RP1 pendant 5 minutes pour restabiliser la colonne; - un gradient 100 % de tampon RP1 à 71,4 % de tampon RP2 (30/70/0,10 (v/v/v) d'eau Milli Q/acétonitrile/TFA) est appliqué en 3 o 100 minutes; - la colonne est lavée par 71,4 % de tampon RP2 pendant 10 minutes; - un gradient 71,4 % de tampon RP2 à 100 % de tampon RP1 est appliqué en 5 minutes; et - la colonne est lavée par 100 % de tampon RP1 pendant 15 minutes. Les fractions sont collectées manuellement et les xénoxines désalées et purifiées sont concentrées à l'aide d'un Speed Vac Concentrator (Savant) et stockées à -20 C. -15- 2707090 - 15- On obtient ainsi, à partir d'un équivalent de sécrétions de peau de 150 Xenopi laevis, 800 pg de xénoxine-1, 650 Mg de xénoxine-2 et 200 /g de xénoxine-3. 1.2 Caractérisation des xénoxines 1.2.1 Réduction et alkylation ,4g de xénoxines purifiées et concentrées selon l'exemple 1.1 sont repris dans un tampon d'alkylation (Tris-HCl 250 mM, pH 8,5; chlorure de guanidinium 6M; EDTA 1 mM) à une concentration de 250,tg/ml, puis homogénéisées au vortex et soniquées 5 minutes. Ensuite 5,4 de 20/80 (v/v) B- mercaptoéthanol en eau Milli Q sont ajoutés, le mélange est mis sous argon et laissé à 37 C. Après 2 heures, 10g1l de 4-vinylpyridine (4VP; Janssen) sont ajoutés, le mélange est à nouveau mis sous argon et laissé à température ambiante. Après 2 heures, le mélange de réaction est congelé et gardé à -20 C jusqu'à son utilisation pour digestion ou désalage. 1.2.2 Digestion à la clostripaine (CL), trypsine (T) ou au bromure de cyanogène (CNBr). La clostripaine (Sigma) est activée à une concentration de 1 mg/ml dans du tampon 2 o CL (Tris-HCl 100mM, pH 7,5; dichlorure de calcium lmM, DTT 2,5 mM) à 37 C pendant 2 heures. 12,g de xénoxine préparée selon l'exemple 1.1. (alkylée avec 4VP, selon l'exemple 1.2.1, ou non-alkylée), sont incubés dans le tampon CL pendant 16 heures à 37 C àune concentration de 150 mg/ml et un rapport protéase/substrat de 1:10 (w/w). 8,1 d'acide acétique glacial et 70,1 du tampon RP1 (voir ci-dessus) sont ensuite ajoutés. La solution ainsi obtenue est alors utilisée pour déterminer la carte peptidique par chromatographie HPLC phase inverse comme décrit dans l'exemple 1.2.3, cidessous. La trypsine (1 mg/ml dans HC1 lmM) (Boehringer) est diluée 10 fois dans du tampon TR (N-éthylmorpholine-HCl 100mM, pH 8,3; dichlorure de calcium 0,1 mM). 25 3 o,g de xénoxine préparée selon l'exemple 1.1. (alkylée avec 4VP ou non-alkylés), sont incubés dans le tampon TR pendant 16 heures à 37 C à une concentration de 240 ug/ml et un rapport protéase/substrat entre 1:5 et 1:100 (w/w). 2,1 de tampon TFA pure et 100 /l de tampon RP1 sont ensuite ajoutés et la solution ainsi obtenue est utilisée pour déterminer la carte peptidique par chromatographie HPLC phase inverse comme décrit 3 5 dans l'exemple 1.2.3. /l de CNBr 1% (w/v) (Pierce) dans de l'acide formique 70 % sont ajoutés à /g de xénoxine préparée selon l'exemple 1.1. (alkylée avec 4VP ou nonalkylée). La -16- 2707090 réaction se poursuit pendant 16 heures après addition de 300 gl d'eau Milli Q. Le mélange de réaction est séché à l'aide d'un Speed Vac Concentrator. 250,l de tampon RP1 sont ajoutés. La solution ainsi obtenue est utilisée pour déterminer la carte peptidique par chromatographie HPLC phase inverse comme décrit dans l'exemple 1.2.3. 1.2.3. Détermination de la carte peptidique par chromatographie HPLC phase inverse. La carte peptidique est réalisée par chromatographie HPLC phase inverse à l'aide d'une unité FIPLC 1090A (Hewlett-Packard) avec détection UV à 205 nm. Les molécules de xénoxine intactes, leurs fragments protéolytiques ainsi que leur équivalent alkylé avec 4VP sont chargés sur une colonne HPLC Superspher 100C18 (4 mm x 125mm; Merck) équilibrée avec TFA 10 mM dans 10/90 (v/v). acétonitrile/eau Milli Q à un débit de 1 ml/minute. Les peptides sont alors élués suivant le protocole suivant: La colonne est lavée avec TFA 10 mM dans 10/90 (v/v) acétonitrile/eau Milli Q pendant 15 minutes; et un gradient linéaire jusqu'à TFA 10 mM dans 50/50 (v/v) 2 o acétonitrile/eau Milli Q est appliqué en 40 minutes. Les fractions éluées sont collectées manuellement et concentrées à l'aide d'un Speed Vac Concentrator. Les temps de rétention observés sont repris dans les tableaux I, II et mI ci-dessous. 1.2.4. Détermination de la séquence en acides aminés. Les peptides obtenus selon l'exemple 1.2.3. sont solubilisés dans une solution 3 o d'acide formique 80 % et la détermination de la séquence N-terminale est réalisée à l'aide d'un séquenceur de protéines de type 477A couplé à un analyseur HPLC d'acides aminés phénylthiocarbamique (Applied Biosystems Inc.) selon les procédures standards. Les résultats du séquençage sont présentés dans les tableaux I, II et mI ciaprès. - 17 - TABLEAU I Peptide (1) temps SEQUENCE EN ACIDES AMINES de rétention 10 20 30 40 50 60 (minutes) 0lo xénoxine-1, alkyléea 37,5 LKCVNLQANGIKMTQECAKEDTKCLTLRSLKKTLKFC xénoxine-1, alkylée 34,0 LKCVNLQANGIKXXQECAKEDTKCLTLRSLKKTLKFCAXXXTC fragment CNBR1,c, d TQECAKEDTKCLTXRSLKKTLKFCAXGRTCT xénoxine-1, aly1ée 27,7 LKCVNLQA fragment CL1 SLKKTLKFCASG xénoxine-1 33,4 TXTTMK fragment T1b,d IMSLPGEQITXXEGNMXNA xénoxine-1, alkylée 28,2 SLPGEQITCCEGN fragment CNBR2>c ' KIMSLPGEQITCCEGN xénoxine-1, alkylée 32,9 IMSLPGEQITCCEGNMCN fragment CL2 xénoxine-1 40,0 LKCVNLQANGIKMTQECAKEDTKCLTLRSLKKTLKFCASGRTCTTMKIMSLPGEQITCCEGNMCNA (1) CNBR, CL ou T précisent la méthode protéolitique utilisée a Molécule complète, seule la partie analysée est présentée b Deux séquences peptidiques sont lues en parallèle c Un peptide dérive d'un clivage incomplet d Les résidus marqués X ne sont pas identifiables - 18 - TABLEAU II Peptide (1) temps SEQUENCE EN ACIDES AMINES de rétention 10 20 30 40 50 60 (minutes) xénoxine-2, alkyléea 37,5 LKCVNLQANGIKMTQECAKEDNKCLTLRSLKKTLKFCAXDRICKTMKIMSLPGEXI xénoxine-2a,b 40,0 LKXVNLQANGIKMTQEXAKEDNKXLTLRSLKKTLKFCASDXIXKTMK xénoxine-2, alkylée 23,0 ITCCEGNMCNA fragment CL3 xénoxine-2 28,0 IMSLPGEK fragment T3 xénoxine-2 40,0 LKCVNLQANGIKMTQECAKEDNKCLTLRSLKKTLKFCASDRICKTMKIMSLPGEKITCCEGNMCNA (1) CL ou T précisent la méthode protéolitique utilisée a Molécule complète, seule la partie analysée est présentée b Les résidus marqués X ne sont pas identifiables - 19 - TABLEAU III Peptide (1) temps SEQUENCE EN ACIDES AMINES de rétention 10 20 30 40 50 60 (minutes) xénoxine-3, alkyléeabc 35,5 LXCVNLQANGXKMXQECXKE KCVNLQANGVKMTQECAKED CVNLQANGVKMTQECAKEDT xénoxine-3, alkylée 7,0 FCASDR fragment T4 xénoxine-3, alkylée ? IASLPGEQITCCEGNMCNA fragment T5 xénoxine-3, qlkylée ? IASLPGEQITXXEGNMXNA fragment T6 xénoxine-3d 40,0 LKCVNLQANGVKMTQECAKEDTKCLTLRSLKKTLKFCASDRICKTMKIASLPGEQITCCEGNMCNA (1) T précise la méthode protéolitique utilisée a Molécule complète, seule la partie analysée est présentée b Les résidus marqués X ne sont pas identifiables c Trois séquences peptidiques sont lues en parallèle d Les acides aminés en italiques sont déduits des séquences des xénoxine-1 et xénoxine-2 -20- 2707090 1.2.5 Spectrométrie de masse Les mesures de spectrométrie de masse sont effectuées par ESMS (Electrospray Mass Spectrometry) sur un spectromètre de masse de type VG Bio Tech BioQ (VG Biotech Ltd.). Les protocoles utilisés sont connus de l'homme du métier et sont repris par exemple dans A. Van Dorsselaer et coll., Biomed. Environ. Mass Spectrom. 19, (1990), p 692. Les masses moléculaires calculées sont données comme des valeurs moyennes basées sur les valeurs des masses atomiques des éléments C, H, N, O et S suivantes: C = 12,011; H = 1,0079; N = 14, 0067; O = 15,9994 et S = 32,06. Les résultats sont présentés dans le tableau IV ci-après. TABLEAU IV SPECTROMETRIE DE MASSE Peptide Masse moléculaire Masse moléculaire expérimentale calculée xénoxine-1 7228,3 + 0,1 Daa 7227,6 Dab 2 0 xénoxine-1, alkylée 8077,7 + 0,4 Dac 8076,7 Dad xénoxine-1, T1 2693, 5 + 0,2 Da 2694,6 Dae xénoxine-1, T2 1662,0 + 0,2 Da 1662,0 Daf mélange de fragments 2329,2 + 0,6 Da 2329,7 Dag trypsiques 1164,5 + 0,4 Da 1164,3 Dah xénoxine-1, alkylée 744,4 Da 744,8 Dai 709,4 Da 709,5 Dai xénoxine-2 7337,5 + 0,5 Da 7337,8 Dab xénoxine-2, alkylée 8188,7 + 0,5 Dac 8186,9 Dad xénoxine-2, fragment T2' 1661,9 + 0,6 Da 1662,0 Daf 3 0 mélange de fragments 1473,0 + 0,2 Da 1473,7 Dak trypsiques 1164,7 + 0,2 Da 1164,3 Dah xénoxine-2, alkylée 873,5 Da 874,1 Dai 709,5 Da 709,5 Dai xénoxine-3 7251,2 + 0, 4 Da 7250,6 Dab xénoxine-3, aikylée 8100,6 + 0,8 Dac 899,8 Dad -21- 2707090 a Masse correspondant au signal majoritaire; un signal moins intense donne une masse de 7243,8 + 0,4 Da, probablement dû à l'addition d'un atome d'oxygène à la première méthionine. b En admettant que les 4 ponts disulfure soient intacts. c Indiquant 8 composés 4VP par protéine; pour la xénoxine-1 un signal moins intense donne une masse de 8091,8 + 0,9 Da, probablement dû à l'addition d'un atome d'oxygène. d Xénoxine réduite, alkylée avec 8 composants 4VP. e TCIIMK, cystéine liée à IMSLPGEQITCCEGNMCNA; en admettant que les 2 ponts disulfure soient intacts. f CVNLQANGIK, cystéine liée à CLTLR, en admettant que le pont disulfure soit intact. g IMSLPGEQITCCEGNMCNA, alkylé par 3 composés 4VP. h CVNLQANGIK, alkylé par un composé 4VP. i FCASGR, alkylé par un composé 4VP. j CLTLR, alkylé par un composé 4VP. k ITCCEGNMCNA, alkylé par 3 composés 4VP. 1 IMSLPGEK -22- 2707090 Exemple2: Clonage de l'ADN complémentaire codant pour des xénoxines Pour plus de précisions sur les techniques générales de manipulation des acides nucléiques et de clonage moléculaire qui ne sont pas détaillées dans l'exemple qui suit, on peut se reporter à l'ouvrage de Maniatis et coil. (Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990)). 2.1. Synthèse des amorces oligonucléotidiques o0 En utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides ABI 380B (Applied Biosystems Inc.) suivant les procédures standards préconisées par le constructeur, 0,2, mole des oligonucléotides suivants sont synthétisés. Les bases dégénérées sont exprimées selon leur code à une lettre de l"'International Union of Biochemistry" (I.U.B.); I correspond à l'inosine. OTG3278 (5'-ATGTCGACCARGARTGYGCIAARGARGA-3'), Le. brin sens-Q- E-C-A-K-E-D avec addition d'un site de restriction SalI à l'extrémité 5' afin de faciliter le sous clonage ultérieur; et 2 o OTG3279 (5'-ATAAGCTrCACATR1TICCYTCRCARCA-3'), iLe. brin antisens-C- C-E-G-N-M-C avec addition d'un site HindII à l'extrémité 5' afin de faciliter le sous clonage ultérieur. * Après déprotection, les oligonucléotides sont purifiés sur /-Bondapak C18 (3,5 mm x 300mm; Waters) à l'aide d'un gradient 20% - 30% d'acétonitrile en présence de triéthylamine/acide acétique 100mM, pH 6,9. Les oligonucléotides sont détritylés suivant les conditions standard bien connues par l'homme du métier et quantifiés à l'aide de leur spectre UV entre 230 et 340 nm. 3 o 2.2. Amplification génique De l'ARN messager deXenopus laevis est obtenu selon la méthode décrite dans KI Richter, et col, J. Biol. Chem. 261, (1986), p 3676 et est alors soumis à une transcription inverse initiée par des amorces dégénérées. On obtient ainsi l'ADNc qui servira de matrice pour l'amplification. Une étape d'amplification génique par PCR (Polymerase Chain Reaction) est alors réalisée sur 0,5 gg de l'ADNc dans 50,l contenant 250 ng des oligonucléotides OTG3278 (brin sens) et OTG3279 (brin anti-sens) synthétisés selon l'exemple 2.1, ainsi que Tris-HCl 10 mM, pH 8,3; chlorure de potassium 10mM; - 23 - 2707090 dichlorure de magnésium 1,6 mM; DIT 1 mM; 200/M de chacun des désoxyribonucléosides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTrP) (Pharmacia) et 2,5 unités d'ADN Polymérase AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus). Une unité étant la quantité d'enzyme qui permet la synthèse de 10 nmoles d'ADN pendant 30 minutes d'incubation. 30 cycles d'amplification sont réalisés selon le protocole suivant: Lors des 5 premiers cycles: Dénaturation à 93 C pendant 1 minute (3 minutes lors du premier cycle); hybridation des amorces à 50 C pendant 2 minutes; polymérisation effectuée à 72 C pendant 30 secondes, avec une augmentation de température de 1 C par 20 secondes; Lors des 25 cycles restants: dénaturation à 93 C pendant 1 minute; hybridation à 60 C pendant 1 minute; et polymérisation à 72 C pendant 45 secondes. 2.3. Analyse En électrophorèse sur gel d'agarose (1%) un aliquot de 5g1 du produit de PCR présente une large bande d'environ 120 paires de base. 2.4. Clonage de l'ADNec-PCR L'ADN restant est soumis à une digestion à l'aide des enzymes de restriction Hindll et SalI, (Gibco-BRL) puis les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille à 3 0 l'aide d'agarose à point de fusion bas (agarose type II, Sigma). Les ADN ainsi séparés sont purifiés et clonés dans un bactériophage M13 selon les procédures standards. Les fragments d'ADNc-PCR ainsi clonés sont utilisés comme sonde pour le criblage de la banque d'ADNc de peau de Xenopus laevis. 3 5 2.5. Criblage de la banque d'ADNc de peau de Xenopus laevis. On prépare une sonde marquée au 32p en utilisant le fragment d'ADNc-PCR, PCR1, d'un clone préparé selon l'exemple 2.4. La séquence de l'insert PCR1 est -24- 2707090 représentée dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO: 28. PCR1 est marquée avec ca[32P]dATP (Amersham) selon la méthode des amorces aléatoires (Boehringer Mannheim). Pour le criblage, on utilise la banque d'ADNc de la peau de Xenopus laevis construite dans le vecteur d'expression xgtll, selon Kuchler et coll., J. Biol. Chem. 265, (1990), p 11731. Des boîtes contenant environ 2 x 104 plages de phage sont préparées et une empreinte est réalisée sur filtre de nitrocellulose BA85 (Schleicher & Schuill). Les filtres empreintes sont alors hybridés avec la sonde PCR1 32p dans 2 x SET (chlorure de sodium-EDTA-Tris-HCl), 10 x solution de Denhardt et SDS 0, 1% à 55 C. Les clones positifs sont utilisés dans deux criblages consécutifs. 2.6. Séquençage des clones d'ADNc L'ADN des phages positifs est isolé et les inserts d'ADNc sont sous-clonés dans des vecteurs M13TG130 (Kieny et coll., Gene 26, (1983), p 91) selon les méthodes standards. 2 o Le séquençage de ces inserts d'ADNc est fait selon la méthode enzymatique de Sanger et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, (1977), p 5463 à l'aide du Sequenase Kit (US Biochemical Corp.) La séquence nucléotidique d'un clone avec un insert d'ADNc constitué de 462 paires de bases a été établie. Cette séquence est représentée dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID. NO: 1 et contient un cadre de lecture ouvert codant pour la pré- xénoxine-1 qui contient 84 acides aminés. Le peptide pré-xénoxine-1 tel que déduit de la séquence d'ADNc commence avec une méthionine d'initiation encodée par le codon ATG (pb 39 à 41), suivie d'un peptide signal de 18 acides aminés qui précède la séquence de la 3 o xénoxine- 1 mature. La séquence d'acides aminés de la xénoxine-1 mature déduite correspond exactement à la séquence complète d'acides aminés déterminée par dégradation d'Edman de la xénoxine-1 purifiée selon l'exemple 1.1 et représentée dans la liste des séquences sous le numéro SEQ ID NO: 3. Le signal de polyadénylation AATAAA se trouve 12 paires de bases en amont de l'extrémité 3'. 2.7. Analyse des séquences peptidiques -25- 2707090 Les séquences des xénoxines ont été comparées à la banque de données SWISS- PROT/PIR/GBTRAN release 24 en utilisant PROSCAN, Ver.6.0. du logiciel DNA STAR (DNA STAR Inc). Cette recherche a seulement permis d'identifier des familles de peptides qui ont une similarité structurelle au niveau du squelette peptidique mais non pas au niveau de l'identité d'acides aminés. Comme illustré à la Figure 3 A, l'identité n'est que de 25,9 % avec un membre représentatif de la famille des cytotoxines, et seulement de 21,3 % avec une neurotoxine courte bien que la configuration des ponts disulfure soit la même. A part les cystéines ce ne sont que Asn5, TMhr14 et Asn71 qui sont conservées dans les trois familles de peptides. Les Gly20, Pro50 et Lys51 qui sont communes aux cytotoxines et aux neurotoxines courtes sont des substitutions non-conservatives comparées aux xénoxines. Les Arg4l et Gly42 sont délétées chez les xénoxines. En ce qui concerne le nombre d'acides aminés entre les cystéines on se réfère à la Figure 3B. Pour les trois familles le nombre est comparable du côté N'-terminal jusqu'au cys3 et à partir du cys6 jusqu'au côté C'terminal. Par contre, chez les xénoxines le nombre de résidus entre cys3 et cys4 est plus petit et entre cys4 et cys5 et entre cys5 et cys6 il est plus 2 o important. il existe également une similarité au niveau des cystéines entre les xénoxines et la famille multigénique du alloantigène Ly-6 de murin (K.P. Le Clair et coll., EMBO J. 5, (1986), p 3227). Par contre, l'identité n'est que de 26,0 % pour le fragment Tyr29 à Phe96 de 67 acides aminés du Ly-6 avec la xénoxine-1. De même pour la similarité des xénoxines avec la famille à laquelle appartient le facteur humain MACIF (Y. Sugita et coll., J. Biovhem. 106, (1989), p555). Bien que très similaire au niveau des cystéines, l'identité du fragment Tyr3 à Val106 de 76 acides aminés 3 o du MACIF n'est que de 20,9 % par rapport à la xénoxine-1. Comme illustré dans la Figure 4, la partie C'-terminale des xénoxines (Cys37 à Asn65, 29 résidus) comprenant les cys4 à cys8 partage une identité d'acides aminés de 50 % avec 27 acides aminés (Cys85 à AsnlllT) du récepteur humain de l'activine. Du côté N'- 3 5 terminal des xénoxines, on ne retrouve pas d'identité des séquences même pas au niveau des cystéines. Exemple 3: Préparation des xénoxines recombinantes -26- 2707090 Les xénoxines selon l'invention peuvent être obtenues par des techniques de génie génétique, notamment en utilisant comme cellule hôte des levures Saccharomyces cerevisiae. Pour ce faire on synthétise un fragment d'ADN codant pour la xénoxine-1 mature telle qu'identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 1, allant de la base en position 93 jusqu'à la base en position 290 et cloné dans le bactériophage M13TG131 (M.P. Kieny et coll., Gene 26, (1983), p91). On construit un plasmide d'expression de la xénoxine-1 qui permet la synthèse et la sécrétion par S. cerevisiae selon la demande de brevet internationale PCI/FR90/00306 qui décrit des peptides signal utiles pour la sécrétion d'une protéine hétérologue par la levure. Le fragment SphI -SmaI de 1045 paires de bases du bactériophage M13TG3846 décrit dans l'exemple 1.E. de ladite demande de brevet internationale est transféré dans le vecteur M13TG3869 (décrit dans l'exemple 1.D. de la même demande) préalablement digéré par SphI et SmaI. On obtient ainsi le vecteur M13TG4803 qui porte: - le promoteur du gène MFa1, suivi d'un codon ATG, - la séquence XII (voir PCT/FR/90/00306), - la séquence "pro" mutée du gène MFal suivi des codons codant pour Lys- Arg, - la séquence codant pour rHV2Lys47. Afin de remplacer la séquence codant pour rHV2Lys47 par celle codant pour la xénoxine-1 on introduit un site Hindll dans la séquence codant pour "pro" mutée de MFa1 selon l'exemple 3.B. de la demande internationale. 3 o Puis, on introduit un fragment HindI -BamHI qui porte la séquence synthétique codant pour la xénoxine-1 dans ce vecteur préalablement traité par HindII et BamHI pour éliminer la séquence codant pour rHV2Lys47. Le fragment SphI-SalI de M13TG4803 est introduit dans le plasmide pTG3828 (voir exemple 1.B. de la demande internationale) ouvert aux sites SphI et SalI pour donner le vecteur d'expression de la xénoxine-1 qui comporte: la séquence du gène URA3 délétée de son promoteur (URA3- d), -27- 2707090 - 27 - 2@/y le promoteur du gène MFa1, suivi d'un ATG, la séquence XII comme peptide signal, la séquence "pro" mutée du gène MFa1 suivi des codons codant pour Lys- Arg, - la séquence synthétique codant pour la xénoxine-1, - le terminateur de transcription du gène codant pour PGK de la levure, - un fragment de pBR322 qui permet la réplication et la sélection chez E. coli, - un fragment du plasmide 2,4 qui possède des éléments structuraux nécessaires à la réplication et à l'équipartition mitotique dans la levure. o10 On transforme une souche de S. cerevisiae que l'on mettra en culture dans des conditions connues. -28- 2707090 LISTE DE SEQUENCES NOMBRE DE SEQUENCES: 28 INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 462 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 39..293 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /codonstart= 39 /product= "prexenoxine-l" /note= "le peptide signal comprend les dix-huit premier residus d'acides amines" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: AAGATGTGCT GTGATTGGTT GAAAGCTTGA GCCACACA ATG CGT TAC GCC ATC 53 Met Arg Tyr Ala Ile 1 5 GTC TTC TTT CTC GTT TGT GTC ATT ACT CTT GGA GAA GCA CTG AAA TGT 101 Val Phe Phe Leu Val Cys Val Ile Thr Leu Gly Glu Ala Leu Lys Cys 15 20 GTG AAT TTA CAA GCG AAT GGA ATA AAG ATG ACA CAA GAG TGT GCA AAG 149 Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr Gln Glu Cys Ala Lys 30 35 GAG GAT ACC AAA TGC TTA ACA TTA AGA TCA TTA AAA AAA ACT TTA AAG 197 Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys Thr Leu Lys 45 50 TTT TGT GCC TCT GGT CGA ACA TGT ACG ACT ATG AAA ATA ATG TCT TTG 245 Phe Cys Ala Ser Gly Arg Thr Cys Thr Thr Met Lys Ile Met Ser Leu 60 65 CCT GGG GAA CAG ATT ACA TGC TGT GAA GGA AAC ATG TGC AAT GCT TGAGATGATT 300 Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Ala 70 75 80 85 CTTCCAATGG AGGTTGCCGG GATTTTCTCT TCTCACATGA AGCAATGGCC CTACCAAAAC 360 ATTTGTCCTC TCCTCTCTCC TCTTTTCCCT TCTGTCCACT CTCCTATAGA TACTAGGGTG 420 TAGCTTGATT CCTAATATCC ATTAAATAAA GCACTCAACT GC 462 -29- 2707090 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 84 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Met Arg Tyr Ala Ile Val Phe Phe Leu Val Cys Val Ile Thr Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ala Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr 25 30 Gln Glu Cys Ala Lys Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu 40 45 Lys Lys Thr Leu Lys Phe Cys Ala Ser Gly Arg Thr Cys Thr Thr Met 55 60 Lys Ile Met Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn 65 70 75 80 Met Cys Asn Ala (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 66 acides aminés (B)TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr Gln Glu 1 5 10 15 Cys Ala Lys Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys 25 30 Thr Leu Lys Phe Cys Ala Ser Gly Arg Thr Cys Thr Thr Met Lys Ile 35 40 45 Met Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys 55 60 Asn Ala -30- 2707090 - 30 - (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 66 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr Gln Glu 1 5 10 15 Cys Ala Lys Glu Asp Asn Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys 25 30 Thr Leu Lys Phe Cys Ala Ser Asp Arg Ile Cys Lys Thr Met Lys Ile 35 40 45 Met Ser Leu Pro Gly Glu Lys Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys 55 60 Asn Ala (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 66 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Val Lys Met Thr Gln Glu 1 5 10 15 Cys Ala Lys Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys 25 30 Thr Leu Lys Phe Cys Ala Ser Asp Arg Ile Cys Lys Thr Met Lys Ile 40 45 Ala Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys 50 55 60 Asn Ala (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: -31-. 2707090 (A) LONGUEUR: 37 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..37 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "partie analysee de xenoxine-1, alkylee" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr Gln Glu 1 5 10 15 Cys Ala Lys Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys 20 25 30 Thr Leu Lys Phe Cys (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 43 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..43 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragement CNBR1(1)" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Xaa Xaa Gln Glu 1 5 10 15 Cys Ala Lys Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys 25 30 Thr Leu Lys Phe Cys Ala Xaa Xaa Xaa Thr Cys 40 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 31 acides aminés (B) TYPE: acide aminé -32- 2707090 (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..31 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragment CNBR1(2)" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: Thr Gln Glu Cys Ala Lys Glu Asp Thr Lys Cys Leu Thr Xaa Arg Ser 1 5 10 15 Leu Lys Lys Thr Leu Lys Phe Cys Ala Xaa Gly Arg Thr Cys Thr 25 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 8 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..8 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragment CL1(1)" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala 1 5 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 12 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..12 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragment CL1(2)" 33- 2707090 - 33 - (xi> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: Ser Leu Lys Lys Thr Leu Lys Phe Cys Ala Ser Gly 1 5 10 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..6 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, fragment T1(1)" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: Thr Xaa Thr Thr Met Lys 1 5 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..19 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, fragment T1(2)" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: Ile Met Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Xaa Xaa Glu Gly Asn Met 1 5 10 15 Xaa Asn Ala (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 13 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire -34- 2707090 (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..13 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragment CNBR2(1)" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn 1 5 10 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 16 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..16 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragment CNBR2(2)" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: Lys Ile Met Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn 1 5 10 15 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..18 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-1, alkylee fragment CL2" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: Ile Met Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met 1 5 10 15 - 2707090 - 35 - Cys Asn (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 56 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..56 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "partie analysee de xenoxine-2, alkylee" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: Leu Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr Gln Glu *1 5 10 15 Cys Ala Lys Glu Asp Asn Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys 25 30 Thr Leu Lys Phe Cys Ala Xaa Asp Arg Ile Cys Lys Thr Met Lys Ile 40 45 Met Ser Leu Pro Gly Glu Xaa Ile 50 55 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 47 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..47 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "partie analysee de xenoxine-2" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: Leu Lys Xaa Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Ile Lys Met Thr Gln Glu 1 5 10 15 -36- 2707090 - 36 - Xaa Ala Lys Glu Asp Asn Lys Xaa Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys 25 30 Thr Leu Lys Phe Cys Ala Ser Asp Xaa Ile Xaa Lys Thr Met Lys 35 40 45 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 11 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..11 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-2, alkylee fragment CL3" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Ala i 5 10 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 8 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..8 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-2, fragment T3" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: Ile Met Ser Leu Pro Gly Glu Lys 1 5 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 acides aminés 37- 2707090 - 37 - (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..20 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "partie analysee de xenoxine-3, alkylee(l)" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: Leu Xaa Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Xaa Lys Met Xaa Gln Glu 1 5 10 15 Cys Xaa Lys Glu 20 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..20 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "partie analysée de xenoxine-3, alkylee(2)" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21: Lys Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Val Lys Met Thr Gln Glu Cys 1 5 10 15 Ala Lys Glu Asp 20 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: -38- 2707090 - 38 - (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..20 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "partie analysée de xenoxine-3, alkylee(3)" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22: Cys Val Asn Leu Gln Ala Asn Gly Val Lys Met Thr Gln Glu Cys Ala 1 5 10 15 Lys Glu Asp Thr (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..6 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-3, alkylee fragment T4" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23: Phe Cys Ala Ser Asp Arg 1 5 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..19 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-3, alkylee fragment T51" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24: Ile Ala Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met 1 5 10 15 Cys Asn Ala 39 2707090 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..19 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "xenoxine-3, alkylee fragment T6" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25: Ile Ala Ser Leu Pro Gly Glu Gln Ile Thr Xaa Xaa Glu Gly Asn Met 1 5 10 15 Xaa Asn Ala (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 28 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: modifiedbase (B) EMPLACEMENT: 20 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /modbase= i (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: misc_feature (B) EMPLACEMENT: 1..28 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "oligonucleotide OTG3278" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26: ATGTCGACCA RGARTGYGCN AARGARGA 28 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 28 paires de bases -40- 2707090 (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: modifiedbase (B) EMPLACEMENT: 17 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /modbase= i (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: misc feature (B) EMPLACEMENT: 1..28 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /note= "oligonucleotide OTG3279" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27: ATAAGCTTCA CATRTTNCCY TCRCARCA 28 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 149 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: misc feature (B) EMPLACEMENT: 1..149 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "PCR1" /note= "fragment d'ADNc-PCR utilise pour le criblage decrit dans l'exemple 2.5." (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28: CAGGAGTGTG CGAAGGAGGA TAACAAATGC TTAACATTAA GATCGTTAAA AAAAACTTTA 60 AAGTTTTGTG CCTCTGATCG AATATGTAAG ACTATGAAAA TAATGTCTCT GCCTGGGGAA 120 AAGATTACAT GCTGCGAAGG CAACATGTG 149 -41- REVENDICATIONS 1. Peptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés, laquelle: a. contient au moins 8 cystéines qui sont reliées par 4 ponts disulfure suivant la configuration cysl avec cys3, cys2 avec cys4, cys5 avec cys6 et cys7 avec cys8; b. contient 0 à 3 acides aminés du côté N'-terminal du cysl, 9 à 14 acides aminés entre cysl et cys2, 3 à 7 acides aminés entre cys2 et cys3, 11 à 18 acides aminés entre cys3 et cys4, 1 à 6 acides aminés entre cys4 et cys5, 7 à 15 acides aminés entre cys5 et cys6, aucun acide aminé entre cys6 et cys7, 3 à 5 acides aminés entre cys7 et cys8 et 0 à 10 acides aminés du côté C'-terminal du cys8; et c. présente une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 40 %o avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3, ou un fragment dérivé de cette séquence. 2. Peptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés, laquelle: a. contient au moins 8 cystéines qui, lorsque le peptide adopte sa conformation repliée, sont reliées par 4 ponts disulfure suivant la configuration cys1 avec cys3, cys2 avec cys4, cys5 avec cys6 et cys7 avec cys8; b. contient 0 à 3 acides aminés du côté N'-terminal du cysl, 9 à 14 acides aminés entre cysl et cys2, 3 à 7 acides aminés entre cys2 et cys3, 11 à 18 acides aminés entre cys3 et cys4, 1 à 6 acides aminés entre cys4 et cys5, 7 à 15 acides aminés entre cys5 et cys6, aucun acide aminé entre cys6 et cys7, 3 à 5 acides aminés entre cys7 et cys8 et 0 à 10 acides aminés du côté C-terminal du cys8; et c. présente une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 40 % avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3, ou un fragment dérivé de cette séquence. - 42 - 3. Un peptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés contient 2 acides aminés du côté N'-terminal du cysl, 10 à 13 acides aminés entre cys' et cys2, 4 à 6 acides aminés entre cys2 et cys3, 12 à 17 acides aminés entre cys3 et cys4, 1 à 5 acides aminés entre cys4 et cys5, 8 à 14 acides aminés entre cys5 et cys6, aucun acide aminé entre cys6 et cys7, 4 acides aminés entre cys7 et cys8 et 2 acides aminés du côté C-terminal du cys8. 4. Un peptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés présente une identité d'acides aminés d'au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, avec la séquence des aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3. 5. Un peptide selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'identité d'acides aminés est au moins 70 %. 6. Un peptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés laquelle contient 0 à 3 acides aminés du côté N'-terminal du cysl, 13 acides aminés entre cysl et cys2, 6 acides aminés entre cys2 et cys3, 12 acides aminés entre cys3 et cys4, 5 acides aminés entre cys4 et cys5, 14 acides aminés entre cys5 et cys6, aucun acide aminé entre cys6 et cys7, 4 acides aminés entre cys7 et cys8 et 0 à 10 acides aminés du côté C'-terminal du cys8; et qui présente une identité d'acides aminés après alignement, d'au moins 80 %, de préférence 90 %, avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3. 7. Un peptide selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés comprend une séquence telle que identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. 8. Un peptide selon la revendication 6 caractérisé en ce que l'identité d'acides aminés est au moins 95 % avec la séquence d'acides aminés identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3. 9. Un peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés comprend une séquence telle que identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3. 10. Un procédé de préparation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que pour isoler ledit peptide à partir de la matière sécrétée par la peau d'une grenouille, de préférence deXenopus laevis, - 43 - a. on divise en fractions la matière sécrétée par la peau de grenouille par précipitation à l'aide de sulfate d'ammonium, ou d'un agent précipitant équivalent, b. on soumet les précipités qui se forment entre 30 % et 70 % de saturation en sulfate d'ammonium, de préférence entre 30 % et 60 %, ou en conditions équivalentes, à une chromatographie par perméation de gel, et c. on récolte la fraction peptidique qui élue tardivement, et si nécessaire, d. on soumet cette fraction peptidique à une chromatographie HPLC d'échange de cations éventuellement suivi d'une chromatographie HPLC phase inverse. 11. Un fragment d'ADN isolé caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour un peptide selon l'une des revendications 1 à 9. 12. Un fragment d'ADN selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour le précurseur d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 9. 13. Un fragment d'ADN selon la revendication 11, caractérisé en ce que la séquence code pour une séquence d'acides aminés telle que identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. 14. Un fragment d'ADN selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés telle que identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 1 et allant de la base en position 93 jusqu'à la base en position 290. 15. Un fragment d'ADN selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés telle que identifiée sous le numéro SEQ ID NO: 1 et allant de l'acide nucléique en position 39 jusqu'à l'acide nucléique en position 290. -44 - 16. Une cassette d'expression d'un fragment d'ADN isolé selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que ledit fragment d'ADN est placé sous le contrôle d'éléments permettant sa transcription et/ou sa traduction dans la cellule transformée considérée. 17. Une cassette d'expression selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle comprend un fragment d'ADN selon la revendication 12. 18. Une cellule transformée avec une cassette d'expression selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisée en ce que ladite cassette d'expression est soit intégrée dans le génome de la cellule transformée ou soit portée par un vecteur d'expression. 19. Une cellule transformée selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi le groupe constitué de S. cerevisiae et E. coli. 20. Une cellule transformée selon la revendication 18, caractérisée en ce que la cellule est d'origine mammifère. 21. Procédé de préparation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on cultive une cellule transformée selon l'une des revendications 18 à 20 sur un milieu approprié et l'on récupère le peptide à partir de ladite culture. 22. Composition pharmaceutique à usage humaine ou vétérinaire caractérisée en ce qu'elle comprend comme agent actif au moins un peptide selon l'une des revendications 1 à 9, un vecteur contenant une cassette d'expression selon l'une des revendications 16 et 17 ou une cellule transformée selon l'une des revendications 18 à 20. 23. Un anticorps, monoclonal ou polyclonal, caractérisé en ce qu'il reconnaît un peptide selon l'une des revendications 1 à 9.