FR 2706129 A1 19941216 FR 9306820 A 19930608 COMPOSITION DESTINEE A FAVORISER LA FORMATION ET LE DEVELOPPEMENT DES CELLULES OSSEUSES _______________________________________________________ La présente invention se rapporte à une composition pour stimuler la formation et le développement des cel- lules osseuses. La stimulation de la formation et du développement des cellules osseuses s'avère nécessaire à chaque fois qu'in- terviennent des phénomènes de consolidations ou de re- pousses osseuses. Il s'agit par exemple de la consolida- tion des fractures osseuses qu'elles soient provoquées ac- cidentellement ou chirurgicalement (ostéotomies, ostéocla- sies, etc.), de la reconstruction ou reconstitution des tissus osseux, ou bien de la fixation biologique des pro- thèses articulaires ou d'implants osseux. Il peut égale- ment s'agir de cas pathologiques, dans lesquels l'os re- pousse mal ou ne repousse pas, ou les fractures conso- lident mal ou pas (perte de substances osseuse, pseudar- throse, etc.). Selon l'état actuel de la technique, les chirurgiens utilisent divers types de substituts osseux ou matériaux de comblement, qu'ils soient naturels (corail, etc) ou synthétiques, pour obturer certaines cavités ou remplacer certains défects osseux. Or, l'usage de telles substances hétérogènes présente l'inconvénient de modifier l'expres- sion phénotypique des ostéocytes en contact avec elles et n'ont pas toujours fait la preuve de leur capacité à favo- riser la formation de l'os. D'autre part, les implants dits à fixation biologique présentent à la surface de - 2 - contact avec l'os une structure poreuse, dans les pores de laquelle le tissu osseux pénètre pour assurer la fixation de l'implant à l'os. Selon la structure poreuse en pré- sence, la repousse osseuse est très imparfaite, entraînant une mauvaise fixation de l'implant. Le but de la présente invention consiste donc à four- nir un matériau de comblement osseux qui ne présente pas les inconvénients précités et surtout qui favorise la for- mation et le développement des cellules osseuses (stimula- tion de l'ostéogénèse) assurant le comblement de la cavité ou du défect osseux et favorisant la repousse osseuse et l'ostéointégration des implants de quelque forme ou struc- ture par du tissu osseux. La composition de l'invention, qui vise à atteindre le but précité, comporte de l'acide désoxyribonucléique sur lequel sont fixés des vecteurs actifs modulant l'expres- sion phénotypique des cellules osseuses, ainsi qu'une quantité physiologiquement acceptable d'un stabilisant du pH. L'acide désoxyribonucléique (ADN) utilisé dans la com- position selon l'invention peut être d'origine végétale ou animale. Toutefois, il est préférable d'éviter les ADN ex- traits de mammifères, ceci afin de garantir à l'être hu- main sur lequel cette composition va être appliquée l'ab- sence de contaminants pathogènes transmissibles. A titre d'exemple préférentiel, on citera l'ADN de saumon. Les vecteurs fixés sur l'ADN sont destinés à moduler l'activité des cellules et à "dé-stresser" celles-ci pour leur redonner leur capacité de production et leur vitalité physiologique. Cette modulation permettra aux cellules -3- concernées de croître, de migrer, et de réaliser les syn- thèses nécessaires à l'établissement de nouvelles colonies osseuses. On peut citer comme additifs à la trame polymé- risée (ADN) les xanthophyles tels que l'astaxanthine ou la canthaxanthine, ainsi que les caroténo des tels que les lycopènes, les a et B carotènes, ou encore les tocophérols sous leurs différentes formes isomériques. De plus, la composition selon l'invention peut conte- nir au moins un stabilisant du pH destiné à maintenir une valeur physiologique de celui-ci (7,35+0,15), par exemple un sel de l'acide phosphorique comme les phosphates acides de sodium, de potassium ou d'ammonium, et de préférence le phosphate acide monosodique NaH2PO4, lequel présente en outre l'intérêt de contribuer à la consolidation osseuse par apport de phosphore. Cette composition peut également contenir des adju- vants de structure, tels que les polypeptides (albumine, collagène, etc. ), les polyosides (diholosides comme la saccharose, les polyholosides comme la cellulose, les dex- trans, la chitine ou le chitosan, etc.), ainsi que d'autres éléments tels que des agents conservateurs et des antioxydants. Il peut s'agir par exemple de tocophérol (acétate), de palmitate d'acide ascorbique ou d'hydroxy- proline, ou encore de lécithine à très bas indice d'iode, notamment le di-palmitate et le di-stéarate de phosphati- dylcholine, et de glycérol. Ces composés présentent géné- ralement une bonne inertie à la radiostérilisation à la- quelle la composition selon l'invention est en principe soumise. - 4Enfin, le nouveau matériau selon l'invention peut se présenter, comme cela sera décrit plus en détails ci- après, sous plusieurs formes différentes selon l'utilisa- tion prévue, par exemple sous forme de gel concentré, sous forme lyophilisée, sous forme de poudre, etc. D'une manière générale, le procédé de fabrication de la composition selon l'invention comprend le broyage des fibres d'ADN choisies, éventuellement par cryobroyage en présence d'azote liquide, la fixation des vecteurs modu- lants actifs et l'adjonction d'une quantité appropriée de stabilisant du pH, par exemple du NaH2PO4, de telle sorte que le pH d'une solution d'ADN dans l'eau soit au niveau physiologique et enfin l'adjonction éventuelle d'autres adjuvants tels que des agents facilitant la lyophilisation ou la dissolution. Le produit est ensuite séché sous vide, puis stérilisé de préférence par radiostérilisation, et enfin conditionné sous forme d'un produit utilisable et commercialisable. Plus particulièrement, on peut utiliser comme produit de base de la composition un ADN commercial, par exemple de la laitance de saumon, qui est généralement salifié et présente ainsi un pH trop élevé, qu'il sera nécessaire d'abaisser au niveau physiologique, par exemple avec un phosphate acide de sodium, de potassium ou d'ammonium. La quantité d'agent stabilisant du pH à utiliser dépend no- tamment de la provenance de l'ADN, et varie généralement entre environ 0,1 et 10% de la composition. Afin que le gel ait une tenue sur l'os, la concentra- tion en ADN pourra être assez élevée, en pratique entre environ 1 et 25%. Toutefois, si les concentrations en ADN -5- supérieures à 15% présentent un intérêt plastique, elles sont difficiles à employer lors d'une intervention et né- cessitent le recours à une pompe ou autre dispositif ap- proprié pour extruder le gel à partir de son conditionne- ment. Le gel peut également être stérilisé à chaud, mais dans ce cas les conditions de cette stérilisation doivent respecter le fait que l'ADN ne doit pas être remué lors des refroidissements, et que le gel ne se reconstitue plus au-delà d'une certaine température, ni après un certain nombre de cycles de chauffage et de refroidissement. On peut également prévoir pour remédier à cet inconvé- nient un gel extemporané à partir d'une poudre radiostéri- lisée et d'eau stérilisée. Un conditionnement à deux com- partiments est utilisable pour permettre le mélange eau- poudre sans nécessité d'ouvrir ledit conditionnement. Dans le cas de la poudre prête à gélifier, la composition contient en plus des agents facilitant la dissolution. Il peut s'agir de sucres, d'acides aminés, de peptides ou de sels. A titre d'exemple, on peut citer des sels tels que le chlorure de sodium ou de potassium, des sels d'acétates alcalins, des phosphates, des sulfates, des sels d'acides osidiques, ou des dérivés d'oses tels que l'acide glucuro- nique, le glucophosphate lactogluconique, etc. Les oses utilisables pour faciliter la dissolution sont choisis de préférence parmi les oses simples, les diholosides (sac- charose, lactose, thréalose, etc.), les polyholosides comme les dextrans, etc. -6- L'application de gel sur un site opératoire peut pré- senter des inconvénients ou du moins des difficultés de mise en oeuvre. Pour y remédier, il est possible de pré- voir un gel lyophilisé, dont la consistance et la tenue lui confère des propriétés particulières, le matériau pre- nant l'aspect d'un tissu non tissé. En effet, la tenue du matériau est assez souple pour la mettre en forme; puis, une fois humidifiée, la plaque lyophilisée reprend sa consistance de gel et conserve ses propriétés pharmacody- namiques vis-à-vis des cellules. Des lyophilisats obtenus à partir de solutions concentrées permettent d'obtenir des matériaux très rigides aptes à combler des cavités os- seuses. De telles formulations de lyophilisats comportent des adjuvants de lyophilisation qui doivent bien entendu répondre notamment aux propriétés suivantes: absence de cytotoxicité, possibilité d'être admis comme produits pharmaceutiques, être radiostérilisables, c'est-à-dire être susceptibles de garder leurs propriétés après stéri- lisation, ne pas altérer les propriétés de la composition et ne pas modifier les propriétés galéniques du produit. En général, ces adjuvants de lyophilisation sont choi- sis préférentiellement parmi les sucres, dont les oses simples et les polyoses, les sels, les sels minéraux, cer- tains peptides et les acides aminés, par exemple le thréa- lose. Au gel d'ADN, qu'il soit issu d'un lyophilisat, d'une poudre à gélification instantanée ou d'un gel préconsti- tué, on ajoute selon l'invention des adjuvants actifs qui confèrent à la composition des propriétés spécifiques, par exemple un effet antistress cellulaire et une modulation de l'expression phénotypique vers la synthèse du pro- collagène III. La plupart des caroténoïdes permettent de développer des effets antistress sur les cellules (stress cellulaire = perte de la capacité de migrer et à se diviser), par exemple le B-carotène, l'astaxantine, la canthaxantine, le lycopène, etc. Le B carotène, lorsqu'il est encapsulé dans une struc- ture vésiculaire, présente donc un effet antistress, c'est-à-dire qu'il permet de restaurer l'aspect et le fonctionnement des cellules quand elles sont soumises à un stress physique (thermique ou mécanique), biologique ou chimique (par des stéroïdes). La concentration utilisée varie de 0,001 à 1% environ de la solution vésiculaire qui peut contenir à titre purement indicatif 6% de phospholi- pides, 0,5% de cholestérol, 0,05% de tocophérol, de 0,05% d'ascorbate de sodium et 0,05% de mannitol. La taille des vecteurs est de l'ordre de 200nm + 50, et leur potentiel zéta est d'environ -30mV (cette valeur pouvant toutefois considérablement varier selon l'épaisseur de la couche de Stern). Les phospholipides utilisés doivent être radiosté- rilisables et sont généralement des acides gras à degré de saturation élevé (indice d'iode faible). La modulation phénotypique des cellules mésenchyma- teuses pour produire du collagène III (collagène cicatri- ciel) est obtenue grâce à des vecteurs dont la structure et la composition orientent la synthèse cellulaire vers ce collagène III de manière préférentielle (AMPC IIIR). Les vecteurs actifs sont généralement de structure na- novésiculaire, soit de nature liposomiale ou capsulaire. - 8 Les liposomes sont les vecteurs les plus aisés à mettre en oeuvre. Les vecteurs vésiculaires du genre nano- capsulaire sont également utilisables, tels que ceux obte- nus selon les méthodes connues décrites par Leverge (poly- mère d'acide polylactique glycolique)ou par Couvreur (polymère de cyanoacrylate). D'autre part, on peut considérer trois types de trans- porteurs actifs: a) les vecteurs de taille perceptible à l'oeil nu, qui sont généralement dénommés sphères, sphérules, perles, microperles, etc; b) ceux dont la taille est comprise entre 1 et 600 wm, qui sont les microvecteurs, qui peuvent être déplacés grâce à une force mécanique ou un champ électrique, et qui se sub- divisent en vecteurs pleins (microsphères), vecteurs creux (microcapsules) et vecteurs de nature spongieuse (micro- sponges); c) les vecteurs de taille nanométrique, qui ont une vi- tesse de déplacement fonction de la température et qui présentent une bonne affinité cellulaire; on distingue les vecteurs pleins ou nanosphères, les vecteurs creux ou na- novésicules (si la limitante entre le milieu interne du vecteur et l'extérieur est constituée par une membrane formée à base de phospholipides on parle de liposomes, s'il s'agit d'une paroi formée par un milieu homogène, on parle de nanocapsules, et si elle a une structure en maille ou en grillage, on utilise le terme de rétoides, et les vecteurs de nature spongieuse (structures matricielles dans lesquelles circulent des canalicules ou des vésicules -9 - forment une structure ouverte ou fermée). A titre d'exemple, on peut citer les formulations sui- vantes: (1) Gel préconstitué (pour 100gr) ADN 10 g Liposomes de B carotène 1 g Liposomes AMPC III@ 1 g NaH2PO4 3,26 g Eau QS (2) Poudre à gélification instantanée (pour un gel de ml) ADN 10 g Liposomes de B carotène 1 g Liposomes AMPC II1 1 g NaH2PO4 3,26 g Thréalose 1,5 g NaCl 0,25 g Dextran 50000 1 g (3) Matériau souple obtenu par lyophilisation (pour 100ml) ADN 1 g Collagène 1 g NaH2PO4 QS pH 7 Thréalose 0,2 g Liposomes de B carotène 0,01 g Liposomes AMPC IIe 0,01 g Eau QS - 10 - (4) Matériau dur obtenu par lyophilisation (pour 100ml) ADN 5g Dextran 60 000 0,1 g NaH2PO4 QS pH 7 Thréalose 1 g Liposomes de B carotène - 0,05 g Liposomes AMPC III9 0,05 g Eau QS Les deux produits (3) et (4) peuvent être coulés sous forme de plaques d'épaisseur et de forme variables. Ces produits solides peuvent donc être de consistance va- riable, allant de très souple (type coton hydrophile) à dur (type bois), avec toutes les gradations intermé- diaires. Les compositions selon l'invention peuvent être avan- tageusement utilisées non seulement comme matériau de com- blement osseux, mais également pour toutes les applica- tions mentionnées à titre d'exemples dans l'introduction de la présente description. On a pu constater en pratique que lorsqu'une composi- tion selon l'invention est appliquée par exemple dans une cavité osseuse formée artificiellement, elle modifie sen- siblement le phénomène de la cicatrisation osseuse en l'a- méliorant. Il convient de rappeler que la synthèse de l'os trabéculaire (os qui transmet les forces) est précédée d'une étape correspondant à l'élaboration d'un tissu pré- curseur de l'os, l'ostéoïde. Or, l'utilisation de la com- position selon l'invention permet de doubler la vitesse de formation de cet ostéo de. Lors du processus d'ossification, l'ostéo de disparaît au profit de l'os. Dans le cadre de tests pratiques, on a constaté en effet que la masse osseuse globale était dou- - 11 - blée en utilisant la composition selon l'invention par ra- port à un produit témoin habituel, ceci sans que l'espace intertrabéculaire (espace permettant au processus nutritif de circuler) ne soit modifié. La troisième étape de l'ossification consiste en l'in- tégration de l'os néoformé dans l'os ancien (ostéointégra- tion). Ce processus biologique est caractérisé par le re- modelage osseux qui se traduit histologiquement par la présence de surface érodée. Le matériau selon l'invention a démontré qu'il provoquait une amplification du remanie- ment osseux (construction des trabécules osseuses) d'un facteur 7. On peut ainsi conclure que la composition selon l'in- vention est efficace notamment pour favoriser la cicatri- sation osseuse, pour stimuler la formation des ostéoldes et des trabécules osseux sans modifier les espace inter- trabéculaires, et pour améliorer l'ostéointégration. - 12 - REVENDICATIONS 1. Composition pour favoriser la formation et le déve- loppement des cellules osseuses, caractérisée par le fait qu'elle comporte de l'acide désoxyribonucléique (ADN) sur lequel sont fixés des vecteurs actifs modulant l'expres- sion phénotypique des cellules osseuses, ainsi qu'une quantité physiologiquement acceptable d'un stabilisant du pH. 2.Composition selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'ADN est présent en une quantité de 1 à 25%. 3.Composition selon la revendication 1 ou la revendica- tion 2, caractérisée par le fait qu'elle comporte une quantité de stabilisant permettant de maintenir le pH à une valeur physiologique de 7,35 + 0,15, ce stabilisant du pH étant choisi parmi les phosphates acides de sodium, de potassium et d'ammonium. 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée par le fait qu'elle comporte de 0,1 à 10% de phosphate acide monosodique (NaH2PO4). 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, ca- ractérisée par le fait que les vecteurs modulants actifs sont choisis parmi les tocophérols, les caroténoides tels que les carotènes a et B et les lycopènes, et les xantho- phyles tels que l'astaxanthine et la canthaxanthine. 6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, ca- ractérisée par le fait qu'elle comporte encore d'autres _ 13 - adjuvants choisis parmi les polypetides tels que l'albu- mine et le collagène, les diholosides tels que le saccha- rose et le lactose, les polyholosides tels que les dex- trans, la cellulose, la chitine et le chitosan, le palmi- tate d'acide ascorbique, le distéarate de phosphatidylcho- line, l'hydroxyproline, et le-glycérol. 7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, ca- ractérisée par le fait qu'elle se présente sous la forme d'un gel, d'une poudre à gélification instantanée, d'un gel lyophilisé, d'un lyophilisat, ou d'un solide de consistance variable. 8. Composition selon la revendication 7 sous la forme d'une poudre à gélification instantanée par mélange avec de l'eau, caractérisée par le fait qu'elle comporte des agents pour améliorer la prise rapide du gel, par exemple choisis parmi les oses tels que les oses simples, les di- holosides comme le saccharose et le lactose et les polyho- losides comme les dextrans, les acides aminés, les pep- tides et les sels tels que les acétates alcalins, les phosphates, les sulfates et les sels d'acides osidiques. 9.Composition selon la revendication 7 sous la forme d'un lyophilisat, caractérisée par le fait qu'elle com- porte comme adjuvants de lyophilisation des oses simples, des polyoses, des sels minéraux, des peptides et/ou des acides aminés. 10. Procédé pour la préparation d'une composition pour favoriser la formation et le développement des cellules osseuses selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait qu'on broye des fibres d'ADN, on ajoute à la poudre obtenue des vecteurs modulants actifs et d'éven- - 14 - tuels adjuvants, on ajoute un stabilisant de pH de telle sorte que la solution aqueuse de la composition présente un pH physiologique, qu'on sèche le mélange en poudre et qu'on stérilise celui-ci, puis qu'on conditionne la compo- sition obtenue. 11. Utilisation de la composition selon l'une des reven- dications 1 à 9 pour stimuler la formation des ostéoldes et des trabécules osseux afin de favoriser la cicatrisa- tion osseuse et l'ostéointégration, et/ou pour favoriser les repousses osseuses et l'ostéointégration d'un implant de quelque forme ou structure dans un tissu osseux. 12. Utilisation de la composition selon l'une des reven- dications 1 à 9, comme matériau de comblement osseux.