FR 2698791 A1 19940610 FR 9314808 A 19931209 i NOUVEAUX EXTRAITS DE CUCURBITA sp, PROCEDE POUR LEUR PREPARATION ET MEDICAMENTS ET COSMETIQUES LES CONTENANT La présente invention concerne de nouveaux extraits de graines de Cucurbita pepo (tels que Cucurbita maxima, Cucurbita moschata, Cucurbita citrullina et d'autres espèces), un procédé pour leur préparation et des médicaments et des cosmétiques les contenant. Le procédé de préparation comprend l'utilisation d'une combinaison de solvants sélectifs pour concentrer les substances actives et éliminer les composants indésirables et toxiques, en particulier les substances allergéniques. La demanderesse connaît les documents suivants: LIST, Heinz: "Technologie pflanzlicher Arzneizubereitungen". Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mb H Stuttgart 1984, pages 89- 91, 116-117, 159-161, 171-173 Il décrit des systèmes d'extraction parmi lesquels figure l'extraction par un gaz supercritique. VOGEL, P: "Untersuchungen Uber K Urbiskernâl" In: Fette, Seifen, Anstrichmittel, Vol 80, n 8, 1978, pages 315-317, en particulier page 315, deuxième colonne, avant-dernier paragraphe Il décrit la composition de l'huile de graines de courge. N.N: "Hochdruck-Extraktion von Naturstoffen mit CO 2 " In: Seifen, Ole, Fette, Wachse, Vol 112, n 7, 1986, pages 218-220 Il décrit l'extraction de produits naturels, d'huiles et de graisses naturelles avec du C 02 supercritique. BORK, Michael: "Die Hochdruckextraktion mit CO 2 zur Gewinnung nat Urlicher Extrakte" In: Seifen, Èle, Fette, Wachse, Vol 116, n 16, 1990, pages 655-658 Il décrit l'utilisation d'une extraction avec du CO 2 supercritique pour la préparation de produits naturels. WILP, Ch; EGGERS, R: "Hochdruckextraktion mit mehrstufiger fraktionierender Separation zur schonenden Gewinnung von Keimâlen mit hochverdichtetem Kohlendioxid" -In: Fat Sci Technol, Vol 93, n 9, pages 348-354 Il décrit l'extraction avec du CO 2 supercritique de germes de maïs. Rote Liste 1992, Nr 81122 Il indique la composition de la spécialité médicale Prosta Fink contenant également des graines pulvérisées et de l'huile de Cucurbita. FR 26 73 375 Il revendique l'utilisation de la cucurbitine, pure ou contenue dans des extraits de Cucurbita, dans le domaine des cosmétiques et de la pharmacie, comme antiallergique. LIST, SCHMIDT: Technologie pflanzlicher Arzneizubereitungen, wbg Stuttgart, 1984, Seiten 161 bis 170 Il décrit en détail la théorie de l'extraction avec un gaz supercritique. EP O 129 739 Bi Il revendique un mode opératoire et un appareillage pour l'obtention de graisses et d'huiles à partir de plantes avec un gaz supercritique. Selon l'état de la technique (Cucurbita Species, Portrait einer Arzneipflanze (l'espèce Cucurbita, portrait d'une plante médicinale), Zeitschrift fur Phytotherapie, 7, 19-23, 1986), on utilise des graines de l'espèce Cucurbita, telles quelles ou sous forme d'extraits, pour le traitement de la dysurie associée à l'hypertrophie bénigne de la prostate Bien que les autorités sanitaires de divers pays aient autorisé l'utilisation de produits dérivés de Cucurbita sur la base d'applications empiriques, l'efficacité de ces produits n'a pas, à ce jour, été démontrée scientifiquement et il demeure certaines incertitudes concernant la valeur thérapeutique des extraits connus que l'on peut, à ce jour, obtenir à partir des graines de ces plantes. Les données pharmacologiques et cliniques les concernant sont assez hétérogènes car, dans une grande mesure, elles proviennent d'études non contrôlées utilisant des produits d'origine incertaine en ce qui concerne l'espèce botanique choisie En ce qui concerne la composition chimique, les graines de Cucurbita pepo, et des cultivars qui en dérivent, contiennent des substances grasses dans une proportion de 35 à 45 %, normalement de 42 %, sous forme d'une huile mal définie que l'on peut utiliser telle quelle pour certaines applications thérapeutiques, des stérols sous forme libre et sous forme glucosidique (Kneipp-Physiotherapie 5, 2-7, 1985) et une quantité considérable d'oligo-éléments importants en thérapeutique, tels que le sélénium et le zinc (Dtsch Lebensm Rundsch, 78, 39, 1982). Les épreuves de sélection pharmacologique des extraits de Cucurbita pepo, effectuées par la demanderesse, révèlent que la fraction de stérols constituée des composants libres et glycosidiques, avec les acides gras libres présents dans les extraits, est un des composants actifs contre les troubles prostatiques (voir le mécanisme d'action décrit ci- après) Les glycérides d'acides gras (diglycérides et monoglycérides), les alcools à chaîne longue et les procaroténoides purifiés par élimination des substances sans intérêt et gênantes contribuent à moduler l'effet des stérols libres et de leurs glucosides Les nouveaux extraits préparés selon l'invention ont une activité plusieurs fois supérieure à celle des produits préparés selon les procédés classiques (extraction au solvant, pressage, etc). Le procédé selon l'invention comprend une première étape (a) qui est le broyage des graines de Cucurbita pepo Cette étape (a) est de préférence réalisée par broyage intensif des graines de Cucurbita à des températures entre -10 et + 10 WC, de préférence entre -7 et + 20 C et en particulier à -50 C, sous une atmosphère de gaz inerte (de préférence une atmosphère de dioxyde de carbone) On part de préférence des graines intactes et décortiquées La taille des particules des graines de Cucurbita ainsi broyées est, de façon appropriée, entre 0,1 et 1 mm, de préférence entre 0,3 et 0,5 mm Si on le désire, on sèche les graines avant le broyage Ce séchage des graines est de préférence effectué dans un séchoir avec aération forcée à une température entre 30 et 601 C, de préférence entre 35 et 550 C La teneur en eau après séchage est de préférence inférieure à %, mieux d'environ 5 %. Le procédé selon l'invention comprend, le cas échéant, une seconde étape (b), c'est-à-dire une préextraction avec du dioxyde de carbone supercritique pour éliminer les ponstituants indésirables et pour concentrer les substances actives Pour ce faire, on extrait la matière broyée dans l'étape (a) avec du dioxyde de carbone supercritique à une température de 34 à 501 C, de préférence entre 35 et 450 C et sous une pression entre 110 et 150 bars, de préférence entre 115 et 130 bars Une extraction de ce type peut éliminer les produits indésirables de bas poids moléculaire Les extraits obtenus dans les conditions indiquées ( 34 à 500 C et 110 à 150 bars), qui constituent environ 22 à 33 % ( 25 %) du poids des graines, sont normalement rejetés. Cette préextraction (b), qui a lieu le cas échéant, est suivie dans l'étape suivante de l'extraction proprement dite (c) des substances actives qui peut être réalisée de diverses façons Dans une première variante, cette extraction est réalisée avec du dioxyde de carbone supercritique sous une pression entre 250 et 330 bars, de préférence entre 270 et 310 bars, et à une température entre 34 et 650 C, de préférence entre 40 et 500 C L'extraction s'achève normalement en une période de 2 à 6 heures, de préférence de 3 à heures Le débit dépend de l'appareil d'extraction et est de préférence entre 7 et 12 kg/kg de matière végétale. La matière végétale, qui a été soumise à l'étape (a) et le cas échéant également à l'étape (b), est, dans une seconde variante de l'étape (c) (lorsque l'extraction (c) n'est pas réalisée avec du dioxyde de carbone supercritique), extraite complètement avec un solvant organique, tel que les solvants aliphatiques chlorés, comme le chloroforme, le chlorure de méthylène, le dichloroéthane, ou avec de l'acétone, ou des alcools aliphatiques comme le méthanol, l'éthanol, etc, de préférence avec le chlorure de méthylène Le solvant le mieux approprié pour ce faire est le chlorure de méthylène L'extraction est de préférence réalisée à une température entre 250 C et le point d'ébullition du solvant L'extraction de la matière végétale avec ces solvants aliphatiques chlorés, l'acétone ou ces alcools aliphatiques, est de préférence réalisée avec un total de 16 volumes de solvant par kg de matière végétale On réalise de préférence quatre extractions durant chacune 3 heures. L'extrait obtenu après l'étape (c) peut, en particulier lorsqu'il a été obtenu avec un des solvants aliphatiques chlorés ou des alcools aliphatiques ou l'acétone précités, être soumis à un traitement avec un adsorbant, tel que du charbon actif ou de la terre de diatomées. Les extraits obtenus dans l'extraction (c) sont, dans l'étape suivante (d), soumis à une extraction à contre-courant avec du CO, dans des conditions supercritiques (de préférence en utilisant la colonne décrite ci-après) Cette étape (d) sert à purifier l'extrait. La colonne de séparation que l'on utilise normalement pour le C 2 gazeux supercritique est de préférence une longue canalisation qui est divisée en trois à cinq segments, de préférence trois segments, et o l'on peut faire varier la température Le produit obtenu dans l'extraction (c) est introduit dans la colonne à la base ou dans un des segments inférieurs par une pompe sous la même pression que celle de la colonne Le liquide injecté s'élève à contre-courant du CO, supercritique La pression à l'intérieur de la colonne doit être maintenue constante L'extrait désiré demeure à la base, tandis que les composants à éliminer sont chassés par distillation. La gamme préférée des pressions dans la colonne est entre 110 et 180 bars, en particulier entre 130 et 160 bars La température peut varier entre 34 et 80, de préférence entre 34 et 65 et en particulier entre 40 et 601 C On utilise de préférence une colonne haute de 3 mètres et ayant un diamètre de 5 cm On peut ainsi fractionner 2 kg d'huile par heure Les fractions sont toujours recueillies au sommet de la colonne Les composants indésirables et/ou potentiellement toxiques peuvent être éliminés par cette extraction à contre-courant. Les conditions opératoires qui se sont révélées les mieux appropriées à l'extraction à contre-courant de l'extrait, sont des températures entre 34 et 80 WC, de préférence entre 45 et 500 C, et des pressions entre 120 et 180 bars, de préférence de 130 bars. On peut, grâce au procédé de l'invention, obtenir un nouvel extrait qui contient environ 0,2 à 0,5 % de stérols, 0,8 à 2 % de résidu insaponifiable et 82 à 94 % d'acides gras et qui a un indice de saponification de 170 à 190, un indice d'iode de 114 à 120 et un indice de réfraction de 1,45 à 1,48 Le produit a de préférence un indice d'acide de 10 à 15 et une densité relative de 0,90 à 0,92 (à 250 C) Une identification caractéristique d'un nouvel extrait obtenu par CGL-SM (chromatographie gaz-liquide/spectrométrie de masse) est illustrée par la figure 1 et le spectre de TF-IR (spectre IR à transformée de Fourier) est illustré par la figure 2 Les figures 3 et 4 illustrent des régions particulières de la figure 2. On a découvert que, de façon surprenante, les nouveaux extraits préparés selon l'invention présentent, dans des essais pharmacologiques et cliniques, une activité supérieure à celle des extraits connus préparés sans fractionnement et utilisés dans l'état de la technique Les essais in vitro réalisés sur des cultures de fibroblastes prostatiques humains ont montré que les extraits selon l'invention s'opposent à la fixation de la dihydrotestostérone à ses récepteurs spécifiques dans la proportion de 58 % (récepteurs cytosoliques prostatiques), tandis que l'extrait huileux complet connu, préparé par extraction par le n-hexane, ne s'oppose à la fixation que dans la proportion de 10 %, de façon non significative. Cet effet illustre un mécanisme par lequel les extraits inhibent l'hyperplasie cellulaire qui constitue la base pathogénétique de l'hypertrophie bénigne de la prostate Les extraits inhibent également, in vitro, l'activité de la 5-î-réductase prostatique, c'est-à-dire l'enzyme qui catalyse la conversion de la testostérone en dihydrotestostérone, et cette activité constitue une des bases des aspects de l'invention Cet effet produit un antagonisme de la production excessive de ce métabolite androgène qui est connu pour avoir un effet de stimulation de la prolifération du tissu glandulaire La CI 50 des extraits est d'environ 128 25 lig/ml, tandis que l'extrait complet connu précité se révèle être inactif. In vivo, chez des rats castrés venant juste d'être sevrés, les extraits de l'espèce Cucurbita présentent un antagonisme statistiquement significatif de l'effet de la testostérone administrée simultanément en tant que substance active Les extraits selon l'invention présentent une activité antiprostaglandine qui conduit à un effet anti- inflammatoire ayant une valeur thérapeutique pour le traitement des troubles de la prostate et du prostatisme normalement associés à l'hypertrophie bénigne de la prostate Le mécanisme d'action de l'extrait selon l'invention est nouveau et constitue un des aspects de l'invention. Les extraits selon l'invention peuvent donc être utilisés en particulier pour le traitement de manifestations pathologiques liées à l'hypertrophie bénigne de la prostate Leur domaine d'utilisation est donc, en particulier, le traitement de l'hypertrophie bénigne de la prostate et des manifestations cliniques apparentées, telles que le prostatisme et les troubles de la miction. Du point de vue pharmacotoxicologique, les extraits selon l'invention présentent une toxicité aiguë chez les rats et les souris à des doses supérieures à 3 000 mg/kg, tandis que les doses des extraits qui provoquent des effets pharmacodynamiques sont dans la gamme de 20 à 200 mg/kg. On a découvert que, lors de l'utilisation clinique, les extraits selon l'invention réduisent, de façon significative, à des posologies journalières entre 100 et 1 000 mg, la dysurie et la fréquence des mictions diurnes et nocturnes Le volume d'urine résiduelle est réduit d'environ 70 % Après six mois de traitement avec une posologie de 400 mg par jour, divisée en deux administrations, les extraits provoquent une diminution statistiquement significative d'environ 25 % du volume de la prostate. Les extraits selon l'invention peuvent être introduits dans des formulations pharmaceutiques, telles que des capsules de gélatine molle ou dure, des comprimés, des suppositoires, etc Les formulations pharmaceutiques préférées sont des capsules de gélatine molle. Les médicaments selon l'invention sont de préférence administrés à une posologie journalière de 10 à 500 mg d'extrait, en particulier de 250 mg d'extrait La dose journalière est de préférence divisée en deux administrations, par exemple le matin et le soir. Les extraits selon l'invention conviennent également au traitement de troubles cutanés liés au métabolisme des androgènes, tels que l'acné, en particulier l'acné juvénile, et la séborrhée et sont donc aussi utilisés dans des cosmétiques Dans ce cas, les extraits peuvent être incorporés à des formulations standard, telles que des émulsions eau dans l'huile et huile dans l'eau, des laits détergents et des savons Les concentrations recommandées pour une efficacité cosmétique appropriée sont dans la gamme entre 0,1 et 2 %. Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. Exemple 1 Préparation d'un extrait lipophile purifié de Cucurbita pepo (variété moschata) On broie finement les graines décortiquées de Cucurbita pepo (variété moschata) ( 50 kg), en utilisant un broyeur refroidi à -5 a C et on extrait avec du dioxyde de carbone dans des conditions supercritiques, à une température de 351 C et sous une pression de bars pendant 3 heures L'extracteur est raccordé à deux séparateurs, les conditions dans le premier étant 95 bars et 350 C et dans le second 60 bars et 45 WC Cela élimine 15 kg d'une huile de couleur paille que l'on rejette en raison de sa faible activité. Ensuite, on extrait la matière végétale demeurant comme résidu trois fois avec 80 1 de chlorure de méthylène, chaque fois, à la température ordinaire et sous une atmosphère d'azote On concentre sous vide les extraits combinés dans le chlorure de méthylène jusqu'à ce que le solvant soit totalement éliminé On soumet l'huile restante ( 7,8 kg), qui a une couleur verdâtre, à une extraction à contre-courant avec du dioxyde de carbone dans des conditions supercritiques en utilisant une colonne à trois étages fonctionnant à des températures différentes ( 500 C en tête, 401 C au milieu et 341 C à la base) et sous une même pression ( 150 bars) Les conditions de séparation de la fraction biologiquement active sont 500 C et bars On rejette la fraction distillée en raison de sa faible activité, tandis que l'on recueille dans la colonne le produit restant qui constitue la fraction active. Cette fraction huileuse a les caractéristiques suivantes 0,38 % de stérols totaux déterminés par chromatographie gaz-liquide et exprimés en t 3-sitostérol, 92,84 % d'acides gras (après saponification) et 1,04 % de résidu insaponifiable L'huile a un indice de saponification de 189,5, un indice d'iode de 119, un indice de réfraction de 1,4645, un indice d'acide de 11,9 et une densité relative de 0,912 Le profil de CGL est illustré par la figure 1. Exemple 2 Préparation d'un extrait lipophile purifié de Cucurbita pepo (variété moschata) on broie finement les graines décortiquées de Cucurbita pepo (variété moschata) ( 50 kg) en utilisant un broyeur refroidi à -50 C et on extrait avec du chlorure de méthylène à une température de 350 C sous une atmosphère d'azote On réalise quatre extractions avec, chaque fois, 80 1 de chlorure de méthylène On traite les extraits recueillis dans le chlorure de méthylène avec 0,5 kg de charbon végétal actif et 2 kg de Célite, en agitant à reflux modéré pour éliminer la turbidité Aprês refroidissement, on filtre la suspension et on chasse le solvant sous vide Cela provoque la séparation de 22,5 kg d'une huile verdâtre que l'on fractionne par extraction à contre-courant dans la colonne avec du dioxyde de carbone dans des conditions supercritiques Les conditions opératoires sont les suivantes On porte la colonne à une pression de 160 bars avec un gradient de température diminuant de la tête à la base ( 500 C en tête, 400 C au milieu et 340 C à la base) On fractionne le produit biologiquement actif à une température de 500 C L'application de ce procédé produit 6,2 kg d'une huile jaune rougeâtre Cette huile a les caractéristiques suivantes: 0,26 % de stérols totaux et 90,45 % d'acides gras (après saponification) L'huile a un indice de saponification de 184,6, un indice d'iode de 119, un indice de réfraction de 1,4745, un indice d'acide de 11,9 et une densité relative de 0,914 Le profil de chromatographie gaz-liquide concorde essentiellement avec celui précédemment indiqué dans l'exemple 1. Exemple 3 Préparation d'un extrait lipophile purifié de Cucurbita pepo (variété moschata) On broie finement des graines décortiquées de Cucurbita pepo (variété moschata) ( 50 kg) dans un broyeur refroidi à -51 C et on extrait avec du dioxyde de carbone dans des conditions supercritiques, à une température de 350 C et sous une pression de bars, pendant 3,5 heures Cela provoque l'élimination de 15 kg d'une huile de couleur paille que l'on rejette en raison de sa faible activité On extrait ensuite la matière végétale restante à 450 C et à 300 bars pendant 3,5 heures pendant lesquelles on maintient la température et la pression dans les deux séparateurs raccordés, respectivement à 400 C et 90 bars et 600 C et 50 bars, en recyclant en continu le dioxyde de carbone jusqu'à épuisement complet. L'application de ce procédé fournit 6,2 kg d'une huile verdâtre On purifie l'huile par extraction à contre-courant dans des conditions supercritiques selon les paramètres indiqués dans l'exemple 2 On obtient 6,1 kg d'une huile rougeâtre L'huile présente les caractéristiques suivantes: 0,24 % de stérols totaux et 91,54 % d'acides gras (après saponification) L'huile a un indice de saponification de 182,9, un indice d'iode de 118,4, un indice de réfraction de 1,4739, un indice d'acide de 12,1 et une densité relative de 0,911 Le profil de chromatographie gaz-liquide concorde essentiellement avec celui précédemment indiqué dans l'exemple 1. Exemple 4 Préparation de capsules de gélatine molle contenant 160 mg d'huile purifiée extraite de Cucurbita Chacune des capsules de gélatine molle contient Ingrédient actif Fraction purifiée de Cucurbita pepo préparée selon l'exemple 1 160 mg Constituants de l'enveloppe de la capsule Gélatine 84 mg Glycérol 32 mg p-hydroxybenzoate d'éthyle 0,4 mg Dioxyde de titane E 171 0,8 mg REVENDICATIONS 1 Procédé pour la préparation d'un extrait de graines de Cucurbita sp, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) le broyage des graines de Cucurbita, c) l'extraction des substances actives des graines de Cucurbita broyées avec du dioxyde de carbone dans des conditions super- critiques ou avec des solvants organiques et d) la purification de l'extrait obtenu par extraction fractionnée à contre-courant avec du dioxyde de carbone dans des conditions supercritiques. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que c) l'extraction des substances actives est effectuée avec des solvants aliphatiques chlorés, l'acétone ou des alcools aliphatiques à une température entre 251 C et le point d'ébullition du solvant. 3 Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que c) l'extraction des substances actives est effectuée à l'aide de dioxyde de carbone supercritique sous une pression entre 250 et 330 bars et à une température entre 34 et 650 C. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que c) l'extraction des substances actives est effectuée à l'aide de dioxyde de carbone supercritique sous une pression entre 270 et 310 bars et à une température entre 40 et 50 'C. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que b) les graines broyées de Cucurbita sont soumises, avant l'extraction (c) des substances actives, à une extraction avec du dioxyde de carbone supercritique à une température de 34 à 500 C et sous une pression entre 110 et 150 bars, pour éliminer les produits indésirables. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'extraction à contre-courant (d) est réalisée avec du dioxyde de carbone supercr itque à des températures entre 340 C et 80 WC et à des pressions entre 110 et bars. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le broyage des graines (a) est réalisé à des températures entre -10 et -100 C pour obtenir une taille des particules entre 0,1 et 1 mm. 8 Extrait pouvant être obtenu selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9 Composition pharmaceutique contenant un extrait selon la revendication 8 en tant qu'ingrédient actif. Composition cosmétique contenant un extrait selon la revendication 8 en tant qu'ingrédient actif. 11 Utilisation d'un extrait selon la revendication 8 pour le traitement des complications provoquées par l'hypertrophie bénigne de la prostate. 12 Utilisation d'un extrait selon la revendication 8 pour le traitement de l'acné juvénile et de la séborrhée. 13 Utilisation d'un extrait selon la revendication 8 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des complications provoquées par l'hypertrophie bénigne de la prostate.