FR 2708202 A1 19950203 FR 9309185 A 19930726 A L2708202 IMPLANT BIOCOMPATIBLE POUR L'EXPRESSION CHEZ L'HOMME OU CHEZ L'ANIMAL DE SUBSTANCES DETERMINEES La présente demande concerne un implant biocompatible pour l'expression chez l'homme ou chez l'animal de substances déterminées. L'introduction in vivo d'implants susceptibles d'exprimer des substances déterminées, par exemple à des fins thérapeutiques, nécessite l'utilisation de moyens efficaces s'agissant de la finalité thérapeutique ou prophylactique recherchée et la capacité pour l'organisme chez lequel est introduit l'implant, de le tolérer à plus ou moins long terme. L'invention concerne à cet égard l'utilisation de matériaux d'origine biologique, en tant que supports pour l'introduction chez l'homme ou chez l'animal, de cellules, par exemple de cellules recombinantes, à partir desquelles on souhaite produire une molécule déterminée, notamment à des fins thérapeutiques. La préparation d'implants fait appel à de tels supports d'origine biologique, propres à être mis au contact de cellules et de différents facteurs favorisant l'adhérence de ces cellules au support si nécessaire, dans des conditions telles que les différents constituants présents conservent leurs propriétés fonctionnelles et structurales naturelles principales. Ces supports d'origine biologique peuvent être résorbables ou non résorbables par l'hôte chez lequel ils sont introduits. L'invention a donc pour objet un implant caractérisé en ce qu'il comprend un support d'origine biologique permettant l'ancrage biologique de cellules préalablement mises en contact avec des constituants capables d'induire et/ou de favoriser leur inclusion au sein d'une matrice formant un gel, lesdites cellules étant choisies pour leur capacité à exprimer et à sécréter naturellement ou après recombinaison un composé déterminé, par exemple un composé ayant un intérêt thérapeutique. L'expression "ancrage biologique" signifie que les cellules contenues dans l'implant peuvent se fixer à la surface du support d'origine biologique ou, dans certains cas, pénétrer à l'intérieur de ce support. Cette fixation des cellules sur le support est permise notamment par la présence des constituants capables d'induire et/ou de favoriser l'inclusion des cellules au sein d'une matrice ayant la constitution d'un gel. Cette inclusion dans la matrice, appelée gélification permet l'organisation des cellules en une structure à trois dimensions dans un environnement amorphe, c'est-à-dire ne donnant pas lieu in vivo à une inflammation. L'implant obtenu est selon un premier mode de réalisation de l'invention constitué d'une part d'un support d'origine biologique à base de calcaire, en particulier à base de carbonate de calcium et, de préférence de corail et d'autre part d'un gel éventuellement chargé de cellules exprimant la substance d'intérêt, notamment de cellules recombinantes. De préférence, le corail utilisé est un corail à haute porosité, c'est-à-dire qu'il possède une porosité telle que décrite dans le brevet français n 2 460 657; il peut s'agir aussi d'une poudre de porosité suffisante pour permettre d'obtenir une armature solide en vue de la constitution d'un réseau cellulaire comportant ou non un support biologique tel que le collagène. Dans le cas o le corail est remplacé - 2 - par du collagène, réticulé ou non, ce dernier peut servir également à la fois comme support et comme matrice favorisant la gélification biologique pour la constitution du réseau de cellules. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le corail à haute porosité utilisé est de type sphérique. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'implant comporte un support d'origine biologique formant une matrice solide, ledit support contenant: - du collagène plus ou moins réticulé par exemple sous forme de fibres ou d'éponges telles que commercialisées sous les marques Hémostagène ou Paroguide ; - de l'os en poudre ou en fragment ou; - des polymères à base d'hydrates de carbones tels que le dextran ou l'acide hyaluronique. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'armature solide du support d'origine biologique est susceptible de résorption in vivo. L'implant ainsi constitué permet la formation in vivo d'un néo-organe individualisé et stable si nécessaire, dans lequel le support biologique est susceptible d'être progressivement résorbé en laissant place à une structure comportant un tissu conjonctif vascularisé de forme relativement comparable à celle de l'implant, ce néo-organe ayant cependant le cas échéant un volume diminué par rapport au volume de l'implant d'origine. Un implant particulièrement préféré dans le cadre de l'invention est tel que les constituants capables d'induire et/ou de favoriser la gélification des cellules sont par exemple du collagène non réticulé ou des alginates. - 3 - En particulier, on aura recours à du collagène par exemple de type I, notamment à une concentration de 1,5 mg/ml. D'autres constituants pour gélifier les cellules peuvent être naturellement utilisés dès lors qu'ils ont la propriété fonctionnelle recherchée et qu'ils présentent les propriétés de biocompatibilité requises pour être introduits in vivo chez l'homme ou chez l'animal. Un implant particulier propre à la réalisation de l'invention est en outre caractérisé en ce que les cellules sont des cellules recombinées comportant une information génétique étrangère à leur génome, susceptibles d'exprimer cette information supplémentaire in vivo et ayant la capacité d'être tolérées immunologiquement par un organisme auquel elles seraient administrées. Ces cellules peuvent être modifiées par un vecteur recombinant codant pour un polypeptide déterminé, ledit vecteur permettant l'expression de l'ADN étranger dans les cellules. Elles peuvent aussi être modifiées par les méthodes dites de recombinaison homologue. La pénétration du vecteur dans les cellules est réalisée en utilisant l'électroporation ou le précipité au phosphate de calcium ou encore par toute autre méthode impliquant l'entrée d'un acide nucléique soit seul soit par l'intermédiaire d'un virus recombinant par exemple. Par "cellules recombinées", on entend également des cellules autologues tumorales irradiées préalablement à leur introduction dans le gel, ayant la capacité de maintenir à leur surface des antigènes tumoraux accessibles au système immunitaire de l'hôte chez lequel l'implant selon l'invention a été introduit. -4 - Par "polypeptide", on entend toute séquence d'acides aminés, quelle que soit sa taille, cette expression comprenant les protéines, et les peptides. De même, le polypeptide peut être en réalité sous forme glycosylée ou non glycosylée. Avantageusement, les cellules recombinantes contenues dans l'implant sont des fibroblastes et, en particulier, des fibroblastes cutanés. I1 peut également s'agir de cellules endothéliales ou de myoblastes. De manière préférée, ces cellules sont des cellules autologues prélevées chez un patient ou un animal chez lequel on souhaite introduire l'implant. Les cellules recombinées peuvent être préparées en utilisant un vecteur recombinant rétroviral, la séquence codant pour le polypeptide dont on recherche l'expression (séquence de nucléotides exogène) étant introduite dans l'ADN proviral. Une séquence d'ADN de provirus ou "séquence d'ADN proviral" est une séquence d'ADN rétrotranscrite à partir de l'ADN génomique du virus puis intégrée dans les cellules hôtes du virus. On définit l'ADN du provirus comme comprenant ainsi des séquences codant pour les protéines gag, pol et env du rétrovirus, qui correspondent respectivement aux nucleoprotéines, polymérases, protéines et glycoprotéines d'enveloppe. L'ADN du provirus comporte également des enchaînements appelés LTR (Long Terminal Repeat), qui comportent des régions appelées R, U3 et U5. Ces séquences de la région LTR interviennent dans le cycle de réplication du rétrovirus. Un implant particulier selon l'invention est caractérisé en ce que le vecteur recombinant est un - 5 - vecteur rétroviral comprenant une séquence d'ADN de provirus modifiée de façon telle que: - les gènes gag, pol et env de l'ADN du provirus ont été délétés au moins en partie et ce afin d'obtenir un ADN proviral incapable de se répliquer, cet ADN ne pouvant, en outre, être recombiné pour former un virus sauvage, - la séquence LTR comporte une délétion dans la séquence U3, telle que la transcription sous forme d'ARNm qu'elle contrôle est réduite de manière significative, par exemple d'au moins 10 fois. Cette délétion permet de diminuer et de préférence, de neutraliser l'effet transcriptionnel de la région LTR, en conservant la capacité du promoteur exogène de promouvoir et contrôler l'expression de la séquence de nucléotides exogène contenue dans le vecteur rétroviral. Ce vecteur est tel que l'ADN proviral qu'il contient est avantageusement issu du rétrovirus MULV. La séquence LTR de l'ADN proviral a également été mutée par délétion, par exemple dans sa partie U3; cette délétion affecte les fonctions de l'activateur interne de la région LTR. Une "séquence de nucléotides exogène" selon l'invention est une séquence qui n'est pas exprimée naturellement dans une cellule dans laquelle on introduit le vecteur par exemple rétroviral de l'invention, ou y est exprimée de façon insuffisante, ou dont on veut obtenir une expression plus importante que l'expression normale. Ce défaut d'expression ou cette insuffisance d'expression résulte de la nature de la cellule ou survient à cause d'une pathologie affectant cette cellule chez un individu donné. De même, le promoteur utilisé pour la construction de rétrovirus recombinants selon l'invention est - 6 - avantageusement un promoteur constitutif exogène par rapport à la séquence dont il contrôle l'expression en ce sens qu'il ne lui est pas naturellement associé. On peut aussi utiliser le promoteur du gène exogène transféré. Le promoteur utilisé dans le vecteur de l'invention peut également être de type inductible. Ce promoteur constitutif ou inductible contrôle l'expression de la séquence de nucléotides exogène. Le promoteur peut le cas échéant être accompagné d'une séquence nucléique régulatrice par exemple activatrice ("enhancer") qui servirait à réguler son activité. Un premier vecteur rétroviral particulier dans le cadre de l'invention est tel que la séquence de nucléotides exogène et le promoteur constitutif exogène, ainsi que la séquence de l'ADN proviral, sont portés par un plasmide. A titre d'exemple, ces séquences peuvent être portées par le plasmide pBR322 qui permet la production de l'ADN dans une bactérie en vue de son introduction dans les lignées d'empaquetage. De préférence, les séquences des gènes pol et env de l'ADN proviral du vecteur rétroviral sont totalement délétées. Dans ce cas, la séquence du gène gag peut être également entièrement délétée ou au contraire être conservée en partie, dès lors que l'ADN du provirus ainsi constitué n'est plus susceptible de se répliquer. Avantageusement, un vecteur rétroviral tel que défini précédemment est caractérisé en ce que la région U3 du fragment LTR3' est délétée au niveau du nucléotide 2797 de la figure 1. Cette délétion correspond à une délétion d'un fragment situé entre les nucléotides 7935 et 8113 selon la numérotation de la séquence publiée par Shinnick et al (Nature 293, 543-548, 1981). Ce fragment délété de la séquence U3 du LTR3' comporte la région activatrice du LTR. -7 - De façon particulièrement avantageuse pour la réalisation d'un vecteur rétroviral selon l'invention, le promoteur constitutif exogène est un promoteur sans TATA box et en particulier le promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase (PGK-1). Ce promoteur est soit le promoteur de souris tel que décrit par Adra et al (Gene 60, 1987, 65-74) ou le promoteur humain correspondant. Ce promoteur présente l'avantage de permettre un haut niveau d'expression de la séquence de nucléotides exogène. D'autres promoteurs constitutifs peuvent être utilisés à la place du promoteur PGK-1. De façon générale, on aura recours à un promoteur actif dans les cellules que l'on cherche à transformer avec le vecteur rétroviral et en particulier des promoteurs actifs dans des fibroblastes à l'état quiescent, par exemple des promoteurs précédant les gènes du cytosquelette. On peut également citer le promoteur du gène de la 6- actine (Kost et al 1983, Nucl. Acids. Res. 11: 8287-8301) ou le promoteur du gène de la vimentine Rittling et Basenga (1987) Mol. Cell. Biol. 7: 1676-1685). Le promoteur utilisé peut être dépourvu de "TATA box". Selon une variante de réalisation de l'invention, la séquence provirale en amont du promoteur constitutif exogène est la séquence de nucléotides située entre les nucléotides 1 et 1500 environ selon la numérotation de la séquence représentée à la figure 1. Cette séquence en amont du promoteur est essentiellement dépourvue de l'ensemble des gènes gag, pol et env de la séquence provirale. La séquence de nucléotides exogène est avantageusement insérée sous le contrôle du promoteur - 8 - constitutif exogène, à la place des séquences qaq, pol et env délétées. La séquence de nucléotides exogène est avantageusement insérée au site BamHI en aval du promoteur. A titre préféré, un vecteur rétroviral selon l'invention est le vecteur pM48 représenté à la figure 2, modifié par la séquence de nucléotides exogène au site BamHI. Le vecteur rétroviral M48 LacZ encore désigné par l'expression pM48 LacZ, a été déposé à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Paris - France) sous le N 1-1298, le 16 Avril 1993. Ce vecteur est dérivé du vecteur pM48 et caractérisé en ce qu'il contient en aval du promoteur constitutif exogène, un fragment BamHI du gène de la P-galactosidase. Ce fragment du gène de la 3-galactodidase peut aisément être délété et être remplacé par une séquence de nucléotides exogène d'intérêt, par exemple une séquence codant pour une protéine ou une glycoprotéine susceptible d'avoir un intérêt thérapeutique ou contre le produit protéique de laquelle on souhaiterait par exemple obtenir des anticorps. Un vecteur rétroviral de l'invention peut également contenir une séquence capable d'augmenter l'activité transcriptionnelle du promoteur, soit de manière constitutive, soit de manière inductible. De manière préférée, un implant selon l'invention est caractérisé en ce que les cellules recombinantes sont modifiées par un vecteur contenant une séquence ou plusieurs séquences de nucléotides exogène) codant pour un antigène ou un déterminant antigénique ou codant pour un polypeptide ou une glycoprotéine, soluble dans le sérum, par exemple pour un polypeptide - 9 - ou une glycoprotéine d'intérêt thérapeutique, notamment pour une hormone, une protéine ou une glycoprotéine de structure ou une protéine ou une glycoprotéine du métabolisme ou une protéine ou une glycoprotéine virale ou une protéine ayant les caractéristiques d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps. De façon préférée, l'implant contient en outre un ou plusieurs facteurs angiogéniques, en particulier du bFGF. La fixation du facteur angiogénique, par exemple du bFGF, est favorisée par la présence de l'agent de gélification. Cet agent contribue à la fixation stable des facteurs angiogéniques au support d'origine biologique de l'implant. De façon particulièrement avantageuse, l'implant contient également de l'héparine ou un dérivé héparinique tel que l'héparan sulfate ou des fractions hépariniques. L'héparine et ses dérivés sont capables de se fixer aux constituants favorisant la gélification et ainsi d'augmenter l'affinité des facteurs angiogéniques aux constituants permettant la gélification. En particulier, l'héparine se fixe au collagène et augmente ainsi l'affinité du bFGF pour le collagène. L'implant selon l'invention peut être mis en oeuvre de façon permanente ou transitoire, pour l'utilisation chez l'homme ou chez l'animal. En effet, sa capacité à constituer in vivo un néo-organe individualisé, dans lequel le support biologique est le cas échéant au moins partiellement résorbé, permet de le retirer par prélèvement si nécessaire. Un implant selon l'invention est, de façon particulièrement intéressante, utilisable pour: - 10 - - le traitement de maladies génétiques, en particulier pour le traitement de maladies de surcharge lysosomale, de l'hémophilie A ou de l'hémophilie B, de la P- thalassémie, la séquence de nucléotides exogène contenue dans les cellules recombinantes correspondant respectivement à celles qui codent pour la 6- glucuronidase pour le facteur VIII, le facteur IX ou l'érythropoïétine, ou pour une partie active de ces séquences; - le traitement de maladies acquises, par exemple pour le traitement de maladies virales, notamment pour le traitement d'une infection due au rétrovirus HIV par exemple par l'expression et la sécrétion dans le sérum de molécules CD4 solubles ou d'une protéine anti-virale soluble; - le traitement de tumeurs, la séquence de nucléotides exogène contenue dans les cellules recombinantes codant pour un composé capable de favoriser ou d'augmenter la réponse immunitaire contre les cellules de la tumeur. L'invention a aussi pour objet une composition caractérisée en ce qu'elle comprend un implant selon l'invention et un ou plusieurs autres constituants tels que par exemple un antigène, un adjuvant notamment pour la vaccination. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures qui suivent. - Figure 1: séquence de nucléotides du vecteur M48; - Figure 2: représentation du vecteur PM48. EXEMPLES PREPARATION DU VECTEUR RECOMBINANT - 11 - Le transfert et l'expression de matériel génétique exogène permet de modifier expérimentalement les propriétés d'un tissu. Des traitements reposant sur ce principe pourraient être proposés à des malades présentant des déficiences génétiques ou des maladies acquises. L'exemple décrit ci-dessous fait appel à un vecteur rétroviral pour introduire dans des cellules l'information génétique codant pour une protéine secrétée. La réimplantation dans l'organisme des cellules génétiquement modifiées est réalisée en associant ces cellules avec du collagène, un facteur angiogénique et l'armature de type corail ou collagène réticulé. L'expression in vivo à long terme du matériel génétique ainsi transféré est obtenue en utilisant le promoteur du gène murin de la phosphoglycérate kinase. 1 - VECTEUR RETROVIRAL 1.1 - Caractéristiques Le vecteur rétroviral M48 (figure 2) est construit à partir de séquences provirales isolées de l'ADN génomique de cellules de rat infectées par le rétrovirus leucémogène murin de Moloney (Mo-MuLV). Les gènes gag, pol et env qui codent pour les protéines du virus ont été retirés et remplacés par les séquences à véhiculer. On a conservé les séquences rétrovirales nécessaires en cis à la production et à la maturation des transcrits du génome viral recombinant, à leur empaquetage dans des particules virales infectieuses, à leur transcription inverse et à leur intégration dans le génome de la cellule infectée. Les séquences du provirus recombinant et les fragments flanquants d'ADN cellulaire sont portés par le plasmide bactérien pBR322. - 12 - Le promoteur du gène de la phosphoglycérate kinase (PGK-1) de souris a été inséré à la place des gènes viraux. Un site de clonage unique BamHI permet de placer les séquences à véhiculer dans le vecteur rétroviral sous le contrôle de ce promoteur. Ce vecteur rétroviral comporte une délétion dans les séquences U3 du LTR interne (Cone et al., Mol. Cel. Biol. 7, 887-897, 1987). Ceci entraîne, dans la cellule infectée, une forte diminution des ARNm démarrant au niveau du LTR 5', et une prédominance des ARNm produits à partir du promoteur PGK-1. L'utilisation de ce vecteur résulte donc en l'insertion, dans le génome de la cellule cible d'une cassette d'expression de la séquence d'intérêt sous le contrôle du promoteur PGK-l. 1.2. - Structure du vecteur La séquence complète du vecteur M48 (Figure 1) comprend: - Position 1 à 2019: Séquences du Mo-MuLV comprenant la longue répétition terminale 5'(ou 5 'LTR ou LTR5'), les séquences d'empaquetage a+ qui incluent une partie du gène gag (position -447 à 1564 dans la numérotation de Shinnick et al. (Nature 293, 543-548, 1981). Ces séquences sont modifiées de la façon suivante: insertion d'un linker Sac II (5'CCCGCGGG3') en position 1074 (position 626, Shinnick et al.). Ceci conduit à une mutation en phase avec la séquence codant pour gag. - Position 2020 à 2526: Promoteur du gène de souris codant pour la phosphoglycérate kinase (position -524 à -20, avant le codon de début de traduction, d'après Adra et al. Gene 60, 65-74, 1987). - 13 - - Position 2527 à 2532: Site unique BamHI pour l'insertion de séquences qui seront exprimées sous le contrôle du promoteur PGK-1. - Position 2533 à 3101: Séquences du Mo-MuLV comprenant l'extrémité 3' du gène env (32 codons) et le LTR3'. Ces séquences sont modifiées de la façon suivante: délétion des séquences U3 du LTR comprises entre 7935 et 8113 dans la numérotation de Shinnick et al. et insertion d'un linker Sal I (2798 dans la numérotation présente). - Position 3102 à 3674: Séquences génomiques de rat. - Position 3675 à 8003: Séquences du plasmide vecteur pBR322 (position 4363 à 29) comprenant le gène de 3-lactamase. Ces séquences sont modifiées de la façon suivante: destruction du site BamH I (position 7657, numérotation présente). - Position 8004 à 8388: Séquences génomiques de rat. 1.3. - Production de vecteur rétroviral Cette production s'effectue en introduisant la structure provirale recombinante dans une lignée cellulaire o les gènes gag, pol et env sont exprimés constitutivement. Cette lignée, dite transcomplémentante ou d'empaquetage synthétise des particules rétrovirales dépourvues d'ARN génomique. La lignée TCRIP, dérivée de fibroblastes de souris NIH/3T3 est utilisée ici (Danos et Mulligan Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85, 6460-6465, 1988). Lorsque la construction recombinante est introduite par transfection, les ARN transcrits à partir du LTR5' sont encapsidés et les cellules - 14 - produisent alors des particules capables de transmettre le génome recombinant mais incapables de se répliquer. Après transfection de la construction recombinante, les cellules productrices de vecteur rétroviral sont sélectionnées. On utilise pour la préparation de vecteur, soit un clone producteur de hauts titres virauxîe hauts titres viraux, soit une population polyclonale. Les étapes de l'isolement d'un clone producteur sont les suivantes: 1) Les cellules WCRIP sont transfectées par un coprécipité au phosphate de calcium (Graham et Van Der Erb, Virology, 52, 456, 1973) de la construction rétrovirale et du plasmide pSV2neo (Southern and Berg, J. Mol. Appl. Gen. 1, 327-341, 1982), dans un rapport molaire de 10 pour 1. 2) Les cellules ayant intégré de manière stable et exprimant l'ADN exogène sont sélectionnées en présence de G418 à 1 mg/ml (Geneticin, Gibco). 3) La population de cellules résistantes au G418 o des clones individuels isolés sont testés pour leur capacité à produire le vecteur rétroviral. Pour cela, des cellules cibles NIH/3T3 sont mises en présence du milieu de culture recueilli à partir de cellules 4CRIP, et la transmission du provirus recombinant est analysée après 48 heures. L'analyse, effectuée à partir de l'ADN génomique des cellules cibles, se fait par PCR (méthode qualitative) ou par Southern blot (méthode quantitative). 4) Une banque de cellules productrices est conservée à - 135 C. 2 - PREPARATION DES STOCKS DE VECTEUR RETROVIRAL Le surnageant de culture des cellules d'empaquetage est recueilli après une incubation de 24 heures sur les cellules d'empaquetage produisant le - 15 - vecteur rétroviral, et mis en contact avec les cellules cibles pour réaliser l'infection. 2.1. - Préparation en masse Un stock d'une centaine d'ampoules contenant des cellules productrices est conservé à -135 C. Après décongélation, les cellules sont amplifiées pendant 10 jours, successivement en flacon puis en rollers de 875 cm2, jusqu'à obtention de 20 rollers confluents. La production est alors commencée. Elle dure 4 ou 5 jours. Le milieu de culture est du DMEM contenant 1 g/l de glucose, 10 mM de pyruvate de Na, et additionné avec 5 % de sérum de veau nouveau-né (Hyclone). Chaque roller permet le conditionnement de 100 ml de milieu par 24 heures. Ce surnageant de culture est centrifugé pour éliminer les débris cellulaires. La production hebdomadaire est de 8 à 10 litres de surnageant viral. 2.2. - Concentration Le surnageant peut être concentré pour augmenter le titre infectieux du vecteur rétroviral. Après centrifugation, le surnageant est dialysé tangentiellement contre une membrane Sartocon de porosité 100.000, en utilisant le dispositif Crossflow de Sartorius. Une concentration de 20 fois est obtenue en 3 heures. Elle s'accompagne d'une augmentation de 20 fois des titres infectieux. Après concentration, la préparation virale est utilisée immédiatement, ou conservée à -80 C si le délai d'utilisation est supérieur à 2 semaines. 3. FIBROBLASTES CUTANES 3.1. - Isolement et mise en culture Les fibroblastes destinés au transfert de gène sont obtenus par une biopsie cutanée effectuée en conditions d'aseptie très soigneuse. Chez la souris, un - 16 - animal syngénique est sacrifié à cet usage. Chez le gros mammifère, un ou plusieurs fragments de peau d'environ 10 cm2 sont prélevés au cours d'une anesthésie générale. Après découpage en lambeaux de quelques mm2, les fragments sont dissociés par un traitement enzymatique. Pour un fragment de 10cm2, la réaction est effectuée pendant 2 heures à 37 C en agitation douce dans 50ml de milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum de veau foetal, 100 mg de collagénase (Worthington), 500 U de dispase (Collaborative Research Inc.). Après centrifugation et lavage, les cellules sont comptées, puis ensemencées dans des flacons de 150 cm2 à la concentration de 1 à xlO6/cm2. Le milieu de culture est du RPMI 1640 additionné de 10 à 20 % de sérum de veau foetal. 3.2. - Infection par le vecteur rétroviral Les infections avec la préparation de vecteur rétroviral sont débutées le lendemain de la mise en culture, alors que la densité cellulaire est inférieure à 20 % de confluence. Elles sont répétées quotidiennement, suivant le même protocole pendant 4 ou jours. Après retrait du milieu de culture, les cellules sont mises en contact avec la préparation de vecteur rétroviral non concentrée ou concentrée, dans tous les cas, additionnée avec 8gg/ml de polybrene. L'incubation est effectuée pendant 2 heures à 37 C, puis, sans lavagepréalable, la préparation virale est remplacée par du milieu de culture. Lorsqu'un vecteur codant pour une protéine détectable à l'examen microscopique est utilisé, on constate que ce procédé permet l'introduction du gène étranger dans plus de 90 % de fibroblastes. Le niveau de sécrétion de la protéine dans le surnageant de culture peut être contrôlé au cours et à la fin de ce - 17 - processus. Les cellules peuvent être congelées en partie ou en totalité à ce stade. Apres infection, les cellules sont amplifiées jusqu'à obtention d'un nombre suffisant pour la réimplantation, soit 2-6x108 cellules/kg de poids corporel. L'amplification est réalisée dans des plateaux de culture (multitray, Nunc). 3.3. - Recueil des cellules génétiquement modifiées. Après amplification, les cellules sont recueillies par traitement à la trypsine. Après lavage et comptage, elles sont disponibles pour servir à la formation d'un neo-organe. Un échantillon est conservé pour contrôler le transfert génétique par Southern blot, ainsi que l'expression et la sécrétion de la protéine étrangère par une technique appropriée. UTILISATION IN VIVO D'IMPLANT COMPRENANT DU CORAIL A TITRE DE SUPPORT BIOLOGIQUE 1. Chez la souris Chez la souris C3H/He des expériences de compatibilité du Biocoral en tant qu'implant, ont montré qu'il pouvait représenter une alternative avantageuse par rapport à des supports synthétiques. Le Biocoral a pu en effet être efficacement recouvert de différents éléments de la matrice extra cellulaire ainsi que de facteurs angiogéniques. On a montré que le collagène de type I murin à une concentration de 0.5 mg/ml dans 0.001% d'acide acétique adhère et recouvre le support corallien après séchage à l'air ambiant pendant 12 à 24 hrs. La présence de cet élément de la matrice extra-cellulaire a ensuite permis la liaison irréversible de facteur basique de - 18 - croissance des fibroblastes marqué avec 125I 125I-basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) au Biocoral . On a réalisé ainsi la fixation en moyenne de 50 ng de bFGF sur 40 mg de support corallien prétraité au collagène murin de type I. Bien que cette liaison ait pu s'effectuer aussi en l'absence de prétraitement au collagène, elle était dans ce cas réversible donc de faible affinité. Le collagène est donc un intermédiaire indispensable et justifié pour la fixation stable de facteurs angiogéniques au Biocorail. Enfin, la liaison du bFGF a pu être augmentée de cinq à dix fois lorsque le recouvrement de 40 mg de Biocoral par du collagène était complété par de l'héparan sulfate (Signa) 200 g (solution à 1 mg/ml dans du PBS) ou de l'héparine (Roche) 500 unités (solution à 5000 unités/ml). Ces deux composants de la matrice extra-cellulaire ont une affinité connue pour le collagène (Baird, A., Schubert, D., Ling, N., and Guillemin, R. (1988) Receptor and heparine binding domains of basic fibroblast growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2324-2328). Leurs caractères anionique et poly-sulfaté sont responsables de la forte affinité pour le bFGF (Johnson, D.E., Lee, P.L., Lu, J., and Williams, L.T. (1990) Diverse forms of a receptor for acidic and basic fibroblast growth factors. Mol. Cell. Biol. 10, 4728-4739). Après incubation en présence de l'un ou l'autre de ces composants, 1 hr à 4 C sous agitation, le Biocorail a été séché à l'air ambiant. Ainsi hépariné, le corail a une action anticoagulante. Des essais d'implantation sous-cutanée de corail sphérique de 40 mg, à haute porosité (50%), recouvert de collagène de type I murin et de bFGF (=50 ng/40 mg de corail) ont été réalisés in vivo sur une dizaine de souris. L'aspect macroscopique et histologique de ces implants a été analysé sur une période de 7 mois. Les - 19 - résultats montrent que le Biocoral était progressivement résorbé en quelques mois et laissait place à une structure formée de tissu conjonctif vascularisé ayant la forme sphérique initiale de l'implant corallien avec cependant une réduction de volume d'approximativement un tiers. L'analyse histologique de ce tissu conjonctif à trois mois, montrait une vascularisation intense et l'absence totale de cellules inflammatoires en regard des résidus coralliens. Le tissu conjonctif proprement dit était formé de cellules mésenchymateuses peu denses, entourées de fibres de collagène néo-formé. L'analyse à 7 mois montrait des résultats semblables sans involution. 2. Chez le chien: Chez un chien de 25 kg, nous avons réalisé une première expérience d'implantation de néo-organe dont la partie externe en corail poreux (50%) a permis de retenir un gel de collagène rétracté contenant 1 à 2 x 109 fibroblastes autologues génétiquement modifiés. Le support en Biocoral avait été recouvert par du collagène murin de type I et de l'héparine (Roche). Après séchage, le corail ainsi prétraité a été incubé en présence de facteur de croissance angiogénique de type bFGF (Farmitalia) puis rincé en PBS. L'implantation chirurgicale réalisée sous anesthésie générale, a consisté à insérer l'ensemble entre les deux feuillets pariétal et viscéral du tablier épiploique à proximité de la grande courbure de l'estomac. Ce geste rapide a permis des suites opératoires simples, et laisse envisager pour l'avenir une implantation par coeliochirurgie. Quarante cinq jours après, une laparotomie exploratrice a été - 20 - réalisée afin de pratiquer un bilan macroscopique de l'implant. La mise à jour du tablier épiploiïque a été facile, sans adhérence et le repérage de l'implant corallien, contenant les fibroblastes autologues génétiquement modifiés, s'est fait très rapidement. Aucune adhérence n'a pu être notée, et la vascularisation était importante, comportant des vaisseaux de gros calibre en connexion avec l'implant. Un processus de résorption progressive du corail a été observé pendant 4 mois au moins. 3. Autres mammifères: La création de néo-organes, en utilisant du Biocoral, adaptés à l'implantation chirurgicale sur de gros mammifères, notamment chez l'homme, en vue d'un développement clinique est réalisée de façon analogue. Le Biocoral est modulable dans sa conception, capable de déclencher une angiogénèse soutenue associée à sa propre résorption et enfin dénué d'effets systémiques et locaux de type inflammatoire. Un tel bio- matériau sert avantageusement de receptacle et de squelette à un gel de collagène de type I contenant des cellules autologues génétiquement modifiées, capables de sécréter un facteur thérapeutique dans la circulation une fois les connexions vasculaires établies. - 21 - REVENDICATIONS 1. Implant caractérisé en ce qu'il comprend un support d'origine biologique permettant l'ancrage biologique de cellules préalablement mises en contact avec des constituants capables d'induire et/ou de favoriser leur gélification, lesdites cellules étant choisies pour leur capacité à exprimer et à sécréter naturellement ou après recombinaison un composé déterminé, par exemple un composé ayant un intérêt thérapeutique. 2. Implant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support d'origine biologique est de type résorbable in vivo, au moins partiellement. 3. Implant selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le support d'origine biologique est un support à base de calcaire, en particulier de carbonate de calcium, de préférence en ce qu'il s'agit de corail. 4. Implant selon la revendication 3, caractérisé en ce que le support d'origine biologique est du corail à haute porosité. 5. Implant selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisé en ce que le corail à haute porosité est du corail sphérique. 6. Implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les constituants capables d'induire et/ou de favoriser la gélification des cellules sont du collagène, en particulier du collagène de type I, de préférence à une concentration de l'ordre de 1,5 mg/ml. 7. Implant selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le support d'origine biologique est choisi parmi: - 22 - - du collagène réticulé, notamment sous forme de fibres ou d'éponges, - de la poudre d'os, - polymères à base d'hydrates de carbones tels que le dextran ou l'acide hyaluronique. 8. Implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les constituants capables d'induire et/ou de favoriser la gélification des cellules sont choisis parmi des supports à base de: - collagène non réticulé, - alginates. 9. Implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules recombinantes ayant la capacité d'être tolérées immunologiquement par un organisme auquel elles seraient administrées, modifiées par une séquence de nucléotides codant pour un polypeptide déterminé. 10. Implant selon la revendication 9, caractérisé en ce que les cellules recombinantes sont des fibroblastes, en particulier des fibroblastes cutanés. 11. Implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le vecteur recombinant est un vecteur rétroviral comprenant une séquence d'ADN de provirus modifiée de façon telle que: - les gènes gag, pol et env de l'ADN du provirus ont été délétés au moins en partie et ce afin d'obtenir un ADN proviral incapable de se répliquer, cet ADN ne pouvant, en outre, être recombiné pour former un virus sauvage, - la séquence LTR comporte une délétion dans la séquence U3, telle que la transcription sous forme d'ARNm qu'elle contrôle est réduite de manière significative, par exemple d'au moins 10 fois, et le vecteur rétroviral recombinant comprend, en outre, une séquence de nucléotides exogène sous le contrôle d'un - 23 - promoteur, par exemple d'un promoteur constitutif ou inductible, exogène. 12. Implant selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'ADN proviral du vecteur est issu du rétrovirus Mo-MuLV. 13. Implant selon la revendication 11 ou la revendication 12, caractérisé en ce que les séquences des gènes pol et env de l'ADN proviral sont entièrement délétées. 14. Implant selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que la région U3 du fragment LTR3' de 1'ADN proviral est délétée au niveau du nucléotide 2797 de la figure 1. 15. Implant selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides exogène est sous le contrôle du promoteur PGK-1 de souris ou du promoteur PGK-1 humain, le cas échéant dépourvu de "TATA box". 16. Implant selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que la séquence provirale en amont du promoteur constitutif exogène est la séquence de nucléotides du provirus, située entre les nucléotides 1 et 1500 environ de la séquence représentée à la figure 1. 17. Implant selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, caractérisé en ce que le vecteur rétroviral est le vecteur pM48 représenté à la figure 2, modifié par l'insertion de la séquence de nucléotides exogène au site BamHI. 18. Implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou 11 à 17, caractérisé en ce que les cellules recombinantes sont des cellules tumorales. 19. Implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que les cellules recombinantes sont modifiées par un vecteur contenant une - 24 - séquence ou plusieurs séquences de nucléotides exogène(s), codant pour un antigène ou un déterminant antigénique ou codant pour un polypeptide ou une glycoprotéine, soluble dans le sérum, par exemple pour un polypeptide ou une glycoprotéine d'intérêt thérapeutique, notamment pour une hormone, une protéine ou une glycoprotéine de structure ou une protéine ou une glycoprotéine du métabolisme ou une protéine ou une glycoprotéine virale ou une protéine ayant les caractéristiques d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps. 20. Implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce qu'il contient en outre un ou plusieurs facteurs angiogéniques, en particulier du bFGF. 21. Implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il contient de l'héparine ou un dérivé héparinique. 22. Moyen thérapeutique comportant à titre de principe actif un implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, pour le traitement - soit de maladies génétiques, en particulier pour le traitement de maladies de surcharge lysosomale, de l'hémophilie A ou de l'hémophilie B, de la P-thalassémie, la séquence de nucléotides exogène contenue dans les cellules recombinantes correspondant respectivement à celles qui codent la 3-glucuronidase pour le facteur VIII, le facteur IX ou l'érythropoïétine, ou pour une partie active de ces séquences; - soit de maladies acquises, par exemple pour le traitement de maladies virales, notamment pour le traitement d'une infection due au rétrovirus HIV par exemple par l'expression et la sécrétion dans le sérum de molécules CD4 solubles ou d'une protéine anti-virale soluble; - 25 - - soit de tumeurs, la séquence de nucléotides exogène contenue dans les cellules recombinantes codant pour un composé capable de favoriser ou d'augmenter la réponse immunitaire contre les cellules de la tumeur. 23. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend un implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, avec une ou plusieurs substances, notamment un antigène ou un adjuvant. - 26 -