FR 2704144 A1 19941028 FR 9305050 A 19930423 STIMULATION DES KERATINOCYTES PAR L'ASC III POUR MODULER LES FIBROBLASTES -La présente invention est caractérisée par la réalisation de compositions agissant sur un premier type de cellules (kératinocytes) qui enverront un message à un autre type de cellules (fibroblastes) qui exprimeront le métabolisme souhaité. Bien entendu, le message envoyé par la première population cellulaire ne développe en lui-même aucune modification du type de celle attendue par le deuxième type cellulaire. Ces messages pourront comporter des instructions destinées aux cellules mésenchymateuses en vue de modifier la matrice extracellulaire et par là d'orienter la nature ou la composition de cette matrice. La matrice extracellulaire est un élément important des tissus puisqu'elle lui confère sa forme. C'est ainsi que de nombreux auteurs s accordent à dire que la structure d'un organisme de mammifère supérieur établit sa forme à partir de son ossature pour le squelette et de sa matrice extracellulaire pour les tissus mous. Le squelette contribue à l'architecture générale de l'organisme et assure sa mobilité à partir d'éléments rigides. Toutefois, la forme que nous percevons de cet organisme est liée à la structure que prennent les tissus mous autour de l'ossature. Chez certains êtres vivants telle la plupart des mollusques comme la limace (Limax), il n'existe pas de squelette osseux interne, toute l'architecture de l'animal est composée à partir de sa matrice extracellulaire.On voit donc que celle-ci joue un rôle important dans la définition du volume d'un être vivant. C'est dans la matrice extracellulaire que baignent toutes les cellules de notre corps, donnant à chaque organe sa forme, sa structure et contribue ainsi à sa fonctionnalité. Au cours de la vie, la matrice extracellulaire est appelée à être modifiée dans ses aspects qualitatif et quantitatif. I1 existe plusieurs situations à partir desquelles l'organisme va intervenir sur la modification de la matrice extracellulaire, hormis la croissance, la maturation et la sénescence, la matrice extracellulaire va être transformée lors des processus de cicatrisation, des états inflammatoires, enfin toutes les situations mettant en jeu un accroissement soit de l'organisme, soit d'un organe ou d'un tissu. - Chez l'hêtre humain, la matrice extracellulaire est composée en grande majorité par des biopolymères où les protéines jouent un rôle important et parmi celles-ci les collagènes. On peut donc dire que notre aspect (la forme de notre visage, de notre corps) est principalement élaborée par le modelage des collagènes de notre peau. L'étude des collagènes montre qu'il existe plus d'une quinzaine de types génétiquement différents. Au niveau de la peau, il est surtout possible d'identifier les collagènes I et III, accompagnés de faibles quantités de collagènes IV et V. Les rapports quantitatifs entre les collagènes I et III sont modifiés par les circonstances de la vie, notamment au cours de la croissance, de la sénescence et lors du processus de cicatrisation. Aussi, il peut être intéressant de modifier la qualité des synthèses collagéniques. Pour modifier la synthèse des collagènes, il existe de nombreuses possibilités d'intervention sur les cellules responsables de la synthèse des molécules que sont les fibroblastes. Il est possible de moduler l'activité métabolique des cellules en faveur d'une stimulation de la synthèse des collagènes ou d'augmenter leur prolifération. La plupart des substances susceptibles de modifier la matrice extracellulaire développe une activité directement sur les cellules fibroblastiques. Pour mieux comprendre l'intérêt de l'invention par rapport à de nombreuses revendications qui sont faites sur des produits actuellement sur le marché, il est important de revoir la nature et la structure des principaux acteurs intervenant au niveau de la peau. Tout d'abord, au niveau histologique, on distingue de l'extérieur vers l'intérieur de l'organisme - Une première barrière appelée stratum corneum située au niveau des couches superficielles de l'épiderme qui définit le soi du non soi. - Une deuxième barrière (la membrane basale) qui sépare l'épiderme du derme, c'est-à-dire l'extérieur de l'intérieur du corps. Les kératinocytes appartenant au soi et étant placés à l'extérieur de la membrane basale seront en relation avec les modifications de l'environnement du corps. Pour cela, ils - communiqueront aux fibroblastes situés à l'intérieur de la membrane basale les informations nécessaires pour adapter le comportement corporel aux circonstances environnementales. La membrane basale constitue la limite entre l'extérieur et l'intérieur du corps et délimite ainsi le domaine d'application des produits cosmétiques. C'est ainsi que le soin de l'épiderme peut relever du domaine de la cosmétique et de l'hygiène alors que toute action au niveau du derme sera pharmaceutique ou médicale. Les cellules situées dans la partie épidermique étant les premières soumises aux variations de l'environnement du corps, elles émettront des messages vers les cellules localisées plus profondément dans la peau (fibroblastes) afin d'adapter la peau aux modifications de son environnement. D'autre part, il faut savoir que l'épiderme est constitué principalement de cellules appelées kératinocytes se présentant sous plusieurs aspects selon leurs degrés de différenciation - Des cellules nucléées et ordonnées constituant une assise ancrée sur la membrane basale - Des cellules anucléées appelées cornéocytes et constituant le stratum lucidum. Le stratum corneum et le stratum lucidum forment une barrière peu perméable et difficile à franchir même pour les micro organismes. La membrane basale forme, elle aussi, une barrière. De nombreux actifs agissent uniquement au niveau du stratum corneum soit en constituant un filtre protecteur de la perspiration, des rayonnements ultra violet ou infrarouge, soit développant leur activité par leur propre état (maquillage décoratif et coloré), soit parce que leur action joue un rôle sur les sécrétions de la peau comme la sueur (déodorant), les phanères, etc..., soit afin qu'ils constituent des agents de nettoyage de la surface de la peau. De très nombreuses substances seront décrites comme agissant sur les fibroblastes par leurs propres structures originales. Ces substances relèvent théoriquement du domaine pharmaceutique. Elles déclarent rajeunir la peau, modifier l'état des cellules, etc... La littérature abonde d'exemples de substances comme la vitamine C qui stimulent la synthèse du collagène des fibroblastes mais leur emploi se révèle particulièrement délicat à partir du moment où il faut franchir deux barrières : le stratum corneum et la membrane basale. La présente invention permet d'utiliser des substances qui agissent sur les kératinocytes, ceux-ci émettront alors un message naturel spécifique adapté et destiné aux fibroblastes et qui est donc apte à franchir la membrane basale. Pour ce faire, les inventeurs ont dû mettre au point un modèle d'évaluation faisant intervenir les deux types cellulaires. Les actifs à évaluer sont présentés aux kératinocytes soit sous formes libres, soit mieux encore sous formes vectorisées afin d'assurer un meilleur passage au travers du stratum corneum. Ces actifs, dans le cadre de la présente invention, sont destinés à modifier la synthèse de la matrice extracellulaire dans laquelle baignent les cellules de la peau ou de certains organes obtenus par action d'un message que les kératinocytes stimulés ont envoyé aux fibroblastes. Afin d'évaluer avec certitude l'activité, des kératinocytes issus du même explant de peau humaine sont mis en culture avec ou sans adjonction d'actif. Après un délai variant de 2 à 24 heures, les kératinocytes sont rincés trois fois puis mis à incuber dans un milieu de culture approprié sans adjonction de stimulant, tel le sérum de veau foetal, à nouveau rincés. Après quelques heures, un nouveau milieu de culture sans sérum de veau foetal est ajouté aux cellules afin d'être sûr que l'actif utilisé est bien absent du milieu de culture. Après 24 heures, des fibroblastes sont cultivés dans les surnageants de culture isolés à partir du même explant initial. Les fibroblastes mis en contact avec les surnageants de kératinocytes cultivés avec un actif modulent leur phénotype vers la synthèse de certains types de collagène et, notamment, le collagène III. Grace à cette méthodologie, les auteurs ont étudié un grand nombre de substances et, parmi celles-ci, ils ont sélectionné les substances susceptibles de moduler l'expression phénotypique des fibroblastes vers la synthèse du collagène III et l'inhibition des collagénases. L'intérêt de ces substances est évidente dans les processus de cicatrisation et dans les processus de lutte contre le vieillissement tissulaire,notamment - cutané. En effet, ces substances agissent directement sur les cellules les plus superficielles de la peau. Ces dernières émettront un message vers les fibroblastes qui répondront en fonction de la spécificité du message. Ces substances se caractérisent par - Une légère cytotoxicité sur les kératinocytes quand elles sont en solution. - Par le fait qu'elles sont amphiphiles et qu'elles résultent de l'association d'au moins un groupement lipophile condensé avec un groupement hydrophile. - L'utilisation de vecteurs matriciels ou vésiculaires inférieurs à 1 un de diamètre, ou mieux, d'une taille comprise entre 80 et 600 nm permet de diminuer la cytotoxicité avec des doses inférieures à 500 pg/ml pour 106 cellules. - L'activité de ces vecteurs n'est pas fonction de la concentration en actif, ni de celle en vecteur pour une large plage de concentration. - A ces mêmes concentrations, l'activité des cellules issues d'explants âgés avec un nombre de cellules constant augmente avec le temps, ce qui montre que le phénomène observé n'est pas un phénomène de saturation. Le test classique M.T.T. permet d'évaluer la cytotoxicité d'un composé par étude de l'activité des NADPHH+ mitochondriales. Le substrat en sel de trétazolium (jaune) est transformé par les enzymes mitochondriaux en un formazan de couleur bleue. L'activité se mesure par la densité optique à 570 nm caractéristique du formazan bleu. Le nombre de cellules est constant et le dosage se fait à 48 heures. Le dosage du collagène III est réalisé par immunofluorescence et mesure de la surface de la fluorescence. Pour le test dont les résultats suivent, nous avons utilisé 105 kératinocytes dont le surnageant, produit 48 heures après le rinçage, a été utilisé pour traiter 5.105 fibroblastes ne produisant normalement pas de collagène de type III. - A titre d'exemple D.O. S. Collagène III unité de surface cellulaire en mm2 Témoin 0,801 10.65 dipalmitate de saccharose 0.735 11.21 dipalmitate de saccharose dipalmitate de saccharose encapsulé dipalmitate d'hydroxyproline 0.657 9.88 dipalmitate dthydroxyproline encapsulé 0.810 137.28 La molécule encapsulée est dénommée modulant et son activité augmente avec le temps (cellules extraites d'explants de peau âgée de 66 ans suivant les mêmes conditions du culture précedemment décrites). Jours Jourl Jour2 Jour9 Témoin 20 i 18 19 20 Modulant 18 218 734 921 Données exprimées en ng/ml Dans les mêmes conditions de culture, traitement de 105 kératinocytes de 60 ans, rinçage, 48 heures d'incubation, traitement de 106 fibroblastes et d'analyses (RIA), nous avons étudié la sécrétion de collagénases par les fibroblastes après 48 heures de culture dans les surnageants de kératinocytes. - mV/ml Témoin 1 235 Vecteur modulant 565 au dipalmitate dthydroxiproline Vecteur modulant 383 au dipalmitate de galactose La notion d'activité indépendante de la dose dans une plage de concentration et l'amplification de la réponse avec le temps sont des éléments importants car ils justifient l'existence d'un message entre les cellules. La cellule atteinte par le vecteur ou la substance enverra des messages vers la deuxième population cellulaire. L'activité de la deuxième population dépend de la stimulation ou non de la première population et du temps que mettent les premières cellules à synthétiser les messages et non du nombre de kératinocytes atteints. Les substances susceptibles de développer une telle activité ont été décrites plus haut, ce sont des composés constitués de l'association de groupement lipophile encadrant un groupement hydrophile. Le groupement hydrophile peut être choisi - Parmi les polyalcools et plus particulièrement parmi les oses simples et les diholosides comme le lactose, le cellobiose, le maltose, le saccharose et leurs dérivés comme, par exemple, les désoxyriboses, les osamines, les acides sialiques, muciques et neuraminiques, les méthylpentose (rhamnose et fucose). - Parmi les mono peptides possédant deux fonctions basiques ou les dipeptides, citons la cystéine, l'ornithine, la lysine, l'arginine, le tryptophane, l'histidine, la citridine, l'asparagine, la carnosine, l'ansérine. - Parmi les dérivés basiques comportant des fonctions alcool (acide ascorbique) ou aminées, ces composés pouvant être estérifiés ou amidifiés grâce à des acides gras de préférence à structure linéaire ou cyclique : cholestérique (acide cholique). Ces composés, lorsqu'ils correspondent à la formation d'une molécule composée de deux groupements lipophiles enserrant un groupement hydrophile présentent la caractéristique d'être à l'inverse des membranes cellulaires schématisées comme étant composées de deux feuillets hydrophiles enserrant une structure lipophile. L'intérêt de l'encapsulation au sein de vésicules ou de sphères consiste surtout à réduire la toxicité et de réaliser l'activité qui n' existe pas quand le produit est en solution à une concentration où il est trop cytotoxique. Les composés, lorsqu'ils correspondent à l'association d'un groupement lipophile et d'une stucture hydrophile ne sont actifs que s'ils sont encapsulés dans des vésicules. Tout se passe comme si la réponse du kératinocyte, en émettant un message vers les fibroblastes, était indépendante de la nature des composés mais dépendait de la présentation de la structure. En effet, le kératinocyte perçoit une situation dans laquelle il reconnait une structure correspondant à l'inverse d'une structure membranaire. Cette image est interprétée par le kératinocyte comme l'existence d'une lésion cellulaire (il perçoit 1 ' intérieur du contenant, ce qui veut dire que le contenant est ouvert, la perception du contenu ne serait pas discriminante puisque toutes les cellules ont le même contenu). Le choix de la vectorisation est donc un facteur souvent déterminant pour obtenir l'effet recherché. D'autre part, la légère cytotoxicité des composants n'autorise pas toujours une exploration biologique à long terme. Pour remédier à cela, il est fait classiquement appel à des vecteurs pouvant être définis par une taille très petite au regard de la taille des cellules. Nous pourrions décrire successivement les nanoparticules avec les nanosphêres, les nanovésicules avec les nanocapsules et les liposomes. Pour illustrer notre propos, nous présenterons à titre d'exemple trois types de formulation qui sont bien appropriées à la stimulation de la synthèse des messages des kératinocytes destinés aux fibroblastes. a) les nanosphères : de nature pleine, elles présentent l'intérêt de ne pas être captées par les cornéocytes, d'être phagocytées par certaines cellules. Elles ont une bonne rémanence au niveau du stratum corneum. Leur faible pouvoir de - pénétration à travers la membrane des kératinocytes leur font préférer aux nanovésicules les liposomes et les nanocapsules. b) les liposomes : obtenus le plus souvent à partir de phospholipides purs ou contenus dans des lécithines, ils présentent une excellente affinité pour les membranes cellulaires. A moins d'être pilotés, leur sélectivité est faible et ils fusionneront autant avec les cellules nucléées qu'avec les cellules non nucléées. Il est possible d'utiliser une formule du type - lécithines de soja partiellement hydrogénée ............. 5.5 % - cholestérol .......................... 0.5 % - tocophérols ......................... 0.05 % - additifs membranaires choisis parmi ceux cités .........,., 0.05 % - H2 O + conservateurs QS ................ 100 La synthèse des vésicules peut se faire selon les méthodes décrites dans les ouvrages tels "Les liposomes" PUISIEUX, ou décrits dans le brevet FR 89.09275 "Procédé et dispositif de production directe de liposomes". c) les nanocapsules : elles présentent le grand intérêt de ne pas fusionner avec les cellules non nucléées. Elaborées à partir des composants les plus divers, il est possible de citer à titre d'exemple une formule du type - monopalmitate de saccharose ................ 1.5 % - monopalmitate d'ascorbyl ................... 0.5 % - cholestérol ................................ 1.5 % - additifs membranaires ..................... 0.05 % - H2 O + conservateurs QS ...................... 100 Les nanocapsules utilisées lors des tests réalisés avec cette formule avaient une taille comprise entre 80 et 600 nm. L'additif membranaire dans les formules C et D est choisi parmi les substances contenant un acyl d'une substance hydrophile, avec comme fonction acyl, un acide gras et comme substance hydrophile un ose ou un acide aminé. D'autres modulants sont obtenus toujours avec la même molécule hydrophile mais combinée avec deux acides gras. Cet additif membranaire peut être utilisé dans des concentrations allant de 10-5 à 10-2. - Quand ils interviennent comme agents de solubilisation d'un composant, ils pourront être actifs à des concentrations beaucoup plus élevées, c'est à dire jusqu'à 5 et 10 % de la masse totale de la préparation. Les kératinocytes isolés sont incubés 16 heures dans leur milieu de culture, sans ajout de sérum de veau foetal, supplémenté en antibiotiques et additionné ou non de 1 % de la solution de vecteur. Les surnageants de culture sont éliminés après le laps de temps puis les cellules fixées sont rincées trois fois et remises à incuber dans le même milieu mais non additionnés de vecteurs pendant 48 heures. Les surnageants sont alors récupérés et utilisés pour cultiver des fibroblastes pendant 48 heures. L'expérimentateur note alors les modifications de morphologie, la densité cellulaire, l'intensité des synthèses en collagène III et en collagénase. Globalement, on note une modification de morphologie des fibroblastes lorsque ceux-ci sont issus d'explants de peau provenant de sujets âgés, une augmentation de la synthèse du collagène III et une diminution de la synthèse des collagénases (ces deux résultats ne sont pas en opposition mais bien la conséquence du remodelage tissulaire). L'utilisation d'une telle forme d'actif vectorisé dans la formulation de produits cosmétiques permet d'objectiver des résultats par des biopsies. Ces biopsies montrent un accroissement important du volume de la matrice extracellulaire des kératinocytes, une augmentation de la population cellulaire, les premiers facteurs concourant à un épaississement de l'épiderme. L'augmentation de la matrice extracellulaire se traduit par une amélioration de la cohésion cellulaire. REVENDICATIONS - 1 - Formulations destinées à moduler l'activité des fibroblastes agissant par l'intermédiaire des kératinocytes, caractérisées en ce qu'elles contiennent des molécules amphiphiles composées de l'association d'un groupement hydrophile et d'au moins un groupement lipophile. 2 - Formulations destinées à moduler l'activité des kératinocytes, selon la revendication 1, caractérisées en ce que le composé amphiphile est présenté aux cellules grâce à un vecteur de taille compris entre 80 et 600 nm de nature nanocapsulaire. 3 - Formulations destinées à moduler l'activité des kératinocytes, selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisées en ce que les kératinocytes vont synthétiser un composé qui orientera l'activité du fibroblaste vers la synthèse du collagène III. 4 - Formulations destinées à moduler l'activité des kératinocytes, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que les kératinocytes vont synthétiser un composé qui inhibera la synthèse des collagénases par les fibroblastes. 5 - Formulations destinées à moduler l'activité des kératinocytes, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées dans des préparations cosmétiques destinées à stimuler la synthèse du collagène III. 6 - Formulations destinées à moduler l'activité des kératinocytes, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées dans les préparations cosmétiques destinées à inhiber la synthèse des collagénases.