FR 2707644 A1 19950120 FR 9307925 A 19930629 BISTRAMIDES BIOLOGIQUEMENT ACTIFS, LEUR OBTENTION ET LEURS APPLICATIONS EN THERAPEUTIQUE L'invention a pour objet de nouveaux dérivés de bistramides, leur obtention et leurs applications en thérapeutique. Les bistramides sont ainsi appelés par analogie avec un organisme marin à partir duquel ils peuvent être extraits, à savoir l'ascidie Lissoclinum bistratum qui vit en symbiose avec ses prochlorons. Plusieurs bistramides ont déjà été décrits. Il s'agit en particulier des bistramides A, B et C. Leur structure chimique, complexe, n'a été élucidée que récemment (voir article de Foster et al. dans J.A.C.S. 1992, 114). Elle correspond à la formule (A) suivante: / / i. Formule A avec Ri et R2 représentant, respectivement, pour le bistramide A XL OH pour le bistramide B pour le bistraie C L'intérêt pour ces produits résulte, d'une manière générale, de la forte activité cytostatique qu'ils présentent en particulier in vitro. Cependant, leur cytotoxicité et leur toxicité élevées in vivo ne permettent pas d'envisager la mise à profit de leurs propriétés pour des utilisations comme médicaments. La DL50 de ces bistramides est en effet de l'ordre de 1,7 mg/kg (mesure sur la souris, après injection du produit par voie intra-veineuse). Les travaux des inventeurs sur les invertébrés marins, en particulier sur l'ascidie Lissoclinum bistratum Sluiter, accompagnée ou non de ses prochlorons symbiotes, les ont conduits à mettre au point des conditions d'extraction spécifiques permettant d'isoler de nouveaux bistramides présentant diverses activités biologiques de grand intérêt. De manière surprenante, l'étude de ces nouveaux bistramides a montré qu'ils étaient dotés d'un effet cytostatique in vitro et d'effets thérapeutiques in vivo, mais que, contrairement aux bistramides évoqués plus haut, leur cytotoxicité et leur toxicité in vivo étaient beaucoup plus faibles, voire inexistantes autorisant leur utilisation en thérapeutique. L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux dérivés présentant un squelette structural du type des bistramides. Elle a également pour but de fournir un procédé d'obtention de ces produits par extraction à partir de L. bistratum et/ou de ses prochlorons. L'invention vise également les applications biologiques et biochimiques de ces nouveaux bistramides, mettant à profit leur effet cytostatique, en particulier pour la thérapie de cancers, notamment, de tumeurs humaines solides, ou le traitement de maladies parasitaires. Les bistramides de l'invention sont caractérisés en ce que - ils sont capables d'exercer in vivo une activité antitumorale entraînant la différenciation des cellules tumorales, avec inhibition de l'expression de l'oncogène erb-2 normalement exprimé par les cellules des lignées bronchopulmonaires non à petites cellules, - leur DL50 est supérieure à 30 mg/kg, voire mg/kg ou plus, et - ils répondent à la formule (I) R - CO - NH R3 I X R2 4 X0S Y -NH - CO R R2 R4 dans laquelle -Rj, X, Y et R2, identiques ou différents les uns des autres, représentent une chaîne hydrocarbonée de 1 à 20 atomes de carbone, saturée ou insaturée, substituée par au moins un groupe -OH et/ou une fonction cétone, comportant, le cas échéant, au moins un cycle, ce cycle pouvant comporter une ou plusieurs insaturations, -R3, R4 et R5, identiques ou différents les uns des autres, sont choisis parmi l'hydrogène, les radicaux alcoyle ou alcoxy de 1 à 4 atomes de carbone, un groupe - -OH, -NH2 ou -N02, ou un atome d'halogène, ainsi que leurs isomères et les produits résultant de déshydratation interne. Selon un autre aspect, ces bistramides de formule (I) sont également caractérisés en ce qu'ils sont capables d'exercer une activité cytostatique vis-à-vis de parasites. L'expression "activité antitumorale in vivo" signifie qu'une inhibition de la prolifération tumorale des cancers bronchopulmonaires a été mise en évidence, sans toxicité aig e pour l'animal. Ces propriétés autorisent l'obtention d'un plateau thérapeutique permettant l'accès aux normes du National Cancer Institute paur les produits Cavec I C La "DL50" des produits de l'invention a été mesurée sur la souris après injection des produits par voie intraveineuse. Compte tenu de la valeur de la DL50 des bistramides ainsi définis, les bistramides A, B, et C mentionnés plus haut se trouvent exclus du champ de l'invention. On notera de plus qu'en raison de leur forte toxicité ces bistramides A, B et C ne pourraient conduire, pendant la durée d'un traitement, à l'obtention des effets avantageux observés avec les produits de l'invention. Selon une disposition préférée de l'invention, Ri comporte de 5 à 15 atomes de carbone. Selon une autre disposition préférée, Ri comporte une ou deux doubles liaisons éthyléniques. R2 comprend de préférence de 6 à 10 atomes de carbone, notamment 8 ou 9, et comporte avantageusement une double liaison éthylénique. Dans encore une autre disposition préférée, X et Y comportent de 2 à 8 atomes de carbone, notamment de 2 à 6 atomes de carbone, en particulier de 3 à 5. R3 et R5 représentent avantageusement, dans l'une quelconque des dispositions qui précèdent, un radical alcoyle ou alcoxy, notamment de 1 à 4 atomes de carbone, et R4 un atome d'hydrogène. Des bistramides particulièrement préférés, compte tenu de l'intérêt de leurs propriétés thérapeutiques in vivo qui seront exposées dans la suite de la description, sont choisis parmi - le bistramide D, de formule (II) H H OHNH - le bistramide K de formule (III) OH H O H OH - le bistramide L de formule (IV) t o H 0N NH Les formes énantiomères ou diastéréoisomères, seules ou en mélanges, des bistramides définis ci-dessus font également partie de l'invention. La connaissance de la formule chimique de ces produits permet de recourir aux procédés de synthèse chimique pour leur obtention. L'invention vise également les bistramides tels qu'obtenus par extraction à partir de L. bistratum et/ou de ses prochlorons, et les dérivés de ces bistramides. Ce procédé d'extraction comprend des fractionnements successifs par chromatographie à partir d'un extrait organique de L. bistratum et/ou de ses prochlorons. Ces fractionnements sont réalisés en mettant en oeuvre les opérations suivantes:: - chromatographie liquide basse pression de l'extrait organique sec pour éliminer au moins la majeure partie des impuretés ayant une polarité supérieure ou inférieure à celles des produits recherchés, - chromatographie liquide haute pression des fractions riches en bistramides, de manière à obtenir des a fractions enrichies en un bistramide donné, et avantageusement, - purification de ces fractions par chromatographie liquide haute pression pour isoler sélectivement un bistramide donné. La nature du support des colonnes de chromatographie et sa granulométrie, ainsi que le ou les mélanges de solvants utilisés sont choisis de manière à séparer sélectivement en peu d'étapes les bistramides biologiquement actifs. Les deux premiers fractionnements sont avantageusement réalisés sur des colonnes de silice en utilisant des solvants du type de l'acétate d'éthyle, dichlorométhane, avantageusement additionnés de méthanol. Dans l'étape de purification finale des fractions, on utilise de l'eau avec des solvants du type du méthanol, du dichlorométhane ou de l'acétonitrile. L'élution peut être réalisée selon un gradient, ou en variante de manière isocratique. Les fractions telles qu'isolées à chaque étape sont également visées par l'invention. L'extrait organique auquel est appliquée cette succession d'étapes de fractionnements est obtenu par le traitement de poudre lyophilisée de L. bistratum et/ou de ses prochlorons avec du dichlorométhane. L'étude des propriétés pharmacologiques des produits de l'invention a montré qu'ils exercent un effet cytostatique in vitro. Sur des cellules tumorales, on constate que cet effet s'exerce selon un mécanisme différent de celui observé avec les agents antitumoraux utilisés habituellement en chimiothérapie des cancers. Il apparait en effet que les bistramides induisent une différenciation terminale irréversible des cellules tumorales, se concrétisant par un arrêt du développement de la tumeur. Ce mode d'action, qui avait été envisagé pour le bistramide A, ne pouvait toutefois être mis à profit, étant donné la toxicité aig e de ce produit. Son administration pendant la durée d'un traitement répétitif, entraînerait obligatoirement l'intoxication de l'organisme traité. Tout au contraire, le caractère faiblement toxique des produits de l'invention pour l'organisme permet à l'effet différenciateur de se manifester sur le tissu tumoral, sans effets défavorables, autorisant ainsi l'établissement d'un plateau thérapeutique en vue d'un traitement. De plus, selon un aspect présentant un intérêt majeur, l'effet cytotoxique des bistramides de l'invention s'exerce également vis-à-vis de parasites. D'une manière inattendue, les bistramides provoquent un arrêt de la prolifération parasitaire durant la phase G1 du cycle cellulaire. En particulier, une activité antiplasmodique a été mise en évidence chez ces bistramides. On mesurera l'intérêt de cette activité en rappelant que le paludisme humain représente l'une des toutes premières endémies mondiales, responsable d'une importante morbidité et d'une mortalité estimée actuellement à 1 ou 2 millions d'individus pour la très grande majorité des enfants vivant en zone tropicale. L'intérêt de fournir de nouvelles molécules actives est d'autant plus grand que les phénomènes de résistance de souches de Plasmodium falciparum, l'espèce mortelle, vis-à-vis des médicaments antimalariques usuels se développent et que, de plus, la protection vaccinale, pour laquelle d'importantes recherches sont effectuées, ne pourra être effectuée avant plusieurs années. Parmi les autres activités anti-parasitaires de ces bistramides, on citera leur activité anti- leishmanienne. ' Ainsi, à la dose de 500 pg/ml, le bistramide D présente in vitro une activité anti-leishmanienne sur L.(L) donovani. L'invention vise donc la mise à profit des propriétés de ces bistramides pour l'élaboration de compositions pharmaceutiques. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins un bistramide tel que défini ci- dessus, en association avec un véhicule pharmaceutique inerte. Ces compositions renferment le cas échéant des principes actifs d'autres médicaments. On citera notamment leur association avec des médicaments anti- mitotiques poisons de fuseau, tels que la vincristine ou la vinblastine dans le cadre d'applications anti- tumorales, ou avec la chloroquine pour le traitement de maladies parasitaires. Ces compositions sont particulièrement appropriées pour la chimiothérapie des cancers dans lesquels peu de cellules se trouvent en état de prolifération. Elles sont ainsi avantageusement utilisables pour le traitement des tumeurs humaines solides à évolution lente, donc très chimiorésistantes, comme certaines tumeurs pulmonaires, tumeurs coliques, tumeurs du sein et mélanomes pour lesquels la thérapeutique actuelle ne dispose d'aucun médicament réellement efficace. Ces compositions sont également utilisables pour le traitement de maladies parasitaires, comme le paludisme ou les leishmanioses. L'invention vise donc également l'application des bistramides définis plus haut pour obtenir un médicament destiné à une utilisation comme anti- parasitaire. il Elle vise en particulier l'utilisation de ces bistramides et notamment de ceux répondant aux formules (II) à (IV), pour élaborer des médicaments pour le traitement du paludisme, ou encore de leishmanioses. Les conditionnements en vue de la vente, en particulier l'étiquetage et les notices d'emploi, et avantageusement l'emballage sont élaborés en fonction de l'application thérapeutique prévue. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont administrables sous différentes formes, plus spécialement par voie orale ou injectable. Pour l'administration par voie orale, on a recours en particulier à des comprimés, pilules, tablettes, gélu-les, gouttes. Ces compositions renferment avantageusement de 10 à 100 mg de principe actif par unité de prise, de préférence de 40 à 60 mg. D'autres formes d'administration comprennent des solutions injectables par voie intra-veineuse, sous- cutanée ou intramusculaire, élaborées à partir de solutions stériles ou stérilisables. Il peut s'agir également de suspensions ou d'émulsions. Ces formes injectables renferment par unité de prise de 10 à 50 mg de principe actif, de préférence de à 30 mg. A titre indicatif, la posologie utilisable chez l'homme correspond aux doses suivantes: ainsi on administre par exemple au patient 10 à 30 à mg/jour, en une ou plusieurs prises pour le traitement de tumeurs bronchopulmonaires. L'invention vise encore les réactifs biologiques dont les principes actifs sont constitués par les dérivés de bistramides définis plus haut. Ces réactifs peuvent être utilisés comme références ou étalons dans des études d'éventuelles activités antitumorales ou anti-parasitaires. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent relatifs à l'obtention de dérivés de bistramides et à l'étude de leur activité antitumorale et anti- parasitaire et en se référant à la figure unique qui représente une courbe de croissance en fonction du temps de xénogreffes tumorales pulmonaires chez la souris nude après traitement avec des bistramides de l'invention. EXEMPLE 1: Isolement des bistramides D, K et L par extraction à partir de Lissoclinum bistratum. On rapporte un exemple d'extraction à partir d'échantillons de Lissoclinum bistratum, accompagnée de ses prochlorons symbiotes, provenant des îles de Ua et de N'Do, Nouvelle Calédonie. Ces échantillons ont été débarassés des débris apparents, broyés, puis lyophilisés quelques heures après la récolte. PROCEDE D'EXTRACTION Les quantités pondérales et volumiques sont données pour le traitement de 100 g de matière première lyophilisée. La poudre lyophilisée d'ascidie et de ses prochlorons est traitée à 4 reprises par 400 ml de dichlorométhane, à température ambiante, et sous agitation. La solution organique est filtrée, puis évaporée à sec à l'évaporateur rotatif (température inférieure ou égale à 40 C). Le poids d'extrait brut obtenu est de 750 mg. Cet extrait brut est fractionné par chromatographie liquide basse pression (silice 60-200 pm acétate d'éthyle:méthanol 93:7 en élution isocratique). Parmi la série des fractions obtenues, trois sont à nouveau fractionnées, mais par chromatographie 13; liquide haute pression (CLHP) (silice 8 pm; dichlorométhane: méthanol 95:5 en élution isocratique). Les nouvelles fractions obtenues sont réunies en fonction de leur composition en bistramides: il en résulte trois lots: n 1, n 2 et n 3. Le lot n 1 (50,7 mg) est purifié par CLHP (C- 18 15-25 pm; méthanol:eau 85:15 en élution isocratique) et fournit 19,8 mg de bistramide D. Le lot n 2 (9,0 mg) est purifié par CLHP (C-18 10 pm; méthanol:eau 85:15 en élution isocratique) et fournit 3,6 mg de bistramide K. Le lot n 3 (18,2 mg) est fractionné par CLHP (silice 10 pm; dichlorométhane:méthanol:eau 96:3,9:0,1, élution isocratique, puis C18,8pm;acétonitrile:eau 60:40), ce qui conduit à l'isolement de 2,9 mg de bistramide L. Les trois produits se présentent comme des solides amorphes non colorés. Ils peuvent être chromatographiés sur couche mince (silice, dichlorométhane: méthanol 90:10) et révélés par un réactif à base de vanilline (vanilline lg, acide sulfurique pur 100 ml; pulvérisés sur la chromatographie, puis celle-ci est chauffée 10 minutes à C). Les rendements, par rapport au poids de poudre sèche, sont de: bistramide D 21,4.10-3À, bistramide K 3,7.10- 3%, bistramide L 2,9.10-3K. FORMULES BRUTES ET POIDS MOLECULAIRES Bistramide D: C40H70N208, PM 706; ion C40H68N207, PM = 688,5006 Bistramide K: C40H70N208, PM 706; ion C40H68N207, PM = 688,5022 14- Bistramide L: C40H68N208, PM 704,4968 FORMULES DEVELOPPEES Les formules développées données plus haut ont été établies sur la base des données spectrales habituelles (UV, IR, RMN et masse), et par comparaison avec celle du bistramide A comme décrit par Foster et al dans la référence précitée. EXEMPLE 2: Etude des effets pharmacodynamiques des bistramides D, K, et L invitr et in vivo: Effets in vitro On rapporte ci-après les résultats des cytoxicités exprimées en CI50 en pg/ml (concentration correspondant à une inhibition de 50 % de la croissance des cellules) sur différents types cellulaires. Les déterminations ont été effectuées selon le protocole donné dans Cancer Chemother. Pharmacol. (1991) 28:283-292 par Roussakis et al. Bistramide D Bistramide K Bistramide L NSCLC.N6-L16 3,43 3,23 0,12 B16 0,10 1,90 2,4 p388r 5,82 > 10 0,12 P388s 0,36 1,57 0,48 KB 10,00 > 10 0,72 HT 29 2,76 5,60 0,29 L'effet cytostatique des produits au niveau du cycle cellulaire a été également étudié par cytofluorimétrie. La technique utilisée correspond à celle rapportée par Roussakis et al. dans la référence ci- dessus. On constate un effet antiprolifératif des produits lié à un blocage irréversible en phase G1, entraînant la mort des cellules tumorales bronchopulmonaires "non à petites cellules" (NSCLC-N6). Ce blocage en phase G1 est suivi d'un passage en phase GlDT, qui caractérise l'état de la différenciation terminale. Les cellules qui atteignent cette phase G1DT produisent une substance intracytoplasmique, de nature protéique, qui est le produit de l'expression d'un gène spécifique, lequel joue probablement le rôle d'un anti-oncogène. Lorsque les cellules NSCLC-N6 sont induites à la différenciation terminale sous l'effet des bistramides de l'invention, on observe en effet, in vitro, l'inhibition de l'expression de l'oncogène erb-b2, habituellement exprimé par le modèle expérimental utilisé, et de son produit d'expression, l'oncoprotéine c-erb-b2. Effets invivo L'activité antitumorale des produits de l'invention a été étudiée à l'encontre de tumeurs solides de type NSCLC greffées chez la souris nude. Les tumeurs greffées en sous-cutanée ont été mesurées sur leur grande longueur L et leur petite longueur 1. Le volume tumoral a été évalué d'après la formule Vt=Lx12/2. La croissance tumorale au jour j a été calculée par la formule Vtj/Vtjo pour chaque souris, Vtjo0 étant le volume tumoral au début du traitement. La figure unique montre les courbes de croissance tumorale en fonction du temps (jours) obtenues avec ou sans traitement par les bistramides. La courbe " se rapporte à l'expérience témoin, les courbes "-------", "--" et "----" aux expériences avec respectivement 10, 20 et 5 mg/kg de bistramide D et la courbe " ---- ---- " une expérience avec 10 mg/kg de bistramide K. Chaque point est la moyenne des croissances tumorales de 6 souris. Dans ces expériences, le bistramide K est injecté à raison de 10 mg/kg par voie intrapéritonéale, pendant 16 jours, et le bistramide D à raison de 5 mg/kg par voie intrapéritonéale quotidiennement pendant 16 jours; à 10 mg/ kg par voie intraveineuse aux jours 1, , 9, 14, et à 20 mg/kg par voie intraveineuse aux jours 1, 5, 9, 14. L'examen de ces courbes montre que par rapport aux témoins (100 %), la croissance tumorale s'établit, au bout de 30 jours, pour les animaux traités, a bistramide D (5 mg/kg, IP) 100 % (10 mg/kg, IV) 76 % (20 mg/kg, IV): 53% bistramide K (10 mg/kg, IP): 49 % EXEMPLE_: Prépraration d'une solution injectable de bistramide D. On dissout 2 g de bistramide D dans 1000 ml de soluté physiologique apyrogène. La solution obtenue est répartie, dans des conditions aseptiques, dans des ampoules de 10 ml, contenant 20 mg de produit par ampoule. On rapporte les résultats d'expériences réalisés sur un modèle in vivo en utilisant Plasmodium vinckei petteri, espèce plasmodiale de rongeur entretenue sur souris blanches femelles, qui présente l'intérêt d'une synchronisation parfaite du cycle endo- érythrocytaire. 1. les rongeurs les animaux utilisés sont des souris blanches femelles, SWISS (IFFA CREDO) pesant environ 30 grammes. Le nombre de souris, réparties par lot est de cinq. 2. la souche L'espèce Plasmodium vinckei petteri utilisée provient de la souche 279 BY, (voir article Cambie G et al dans CR.Acad.Sci.PARIS 310,série III,183-188). Ce plasmodie réalise un cycle schizogonique en 24h, de façon synchrone. Par la technique de congélation-décongélation de sang infecté, seul le stade mérozoïte résiste, les autres formes étant détruites. Si l'injection des mérozoïtes a lieu à Oh, on observe sucessivement comme stade prédominant: - A 3h le stade anneau (A) - A 6h le stade trophozoïte jeune (TJ) - A 12h le stade trophozoïte moyen (TM) - A 18h le stade trophozoïte âgé (TA) La maturation du parasite dans l'hématie, du stade anneau au stade trophozoïte âgé correspond à la phase G1 du cycle cellulaire. Cette phase est suivie par la multiplication du parasite, phases S et M du cycle cellulaire. Le stade schizonte correspond à l'éclatement et à la libération des mérozoïtes. L'observation des parasites sanguins se fait sur frottis colorés réalisés en prélevant une goutte de sang à la queue. Les frottis sont ensuite colorés au May- Grumwald-Giemsa. Le calcul de la parasitémie (nombre de parasites pour 100 hématies) se fait sur frottis. Les études entreprises nécessitent la constitution d'un stock de sang parasité conservé à -70 C dans l'azote liquide. Les souris infestées sont prélevées au sinus rétro-orbitaire à l'aide d'une pipette 1X pasteur héparinée. Une solution de glycérol à 10% est ajoutée volume à volume au sang parasité. Le sang est ensuite réparti dans des tubes à congélation à raison de 0,5 ml par tube. 3. injection du bistramide On utilise, dans ces essais, le bistramide D dans de l'eau physiologique stérile contenant 5% de DMSO. Ce produit est injecté par voie sous-cutanée au niveau de la cuisse. 4. Mise en évidence de l'activité A/ Test de PETERS Pour vérifier l'activité du composé étudié, on applique le test de PETERS qui constitue la référence pour le criblage de molécules à activité antimalarique. (PETERS W..1980. Chemoterapy and Drug resistance in Malaria vol II Academic Press). Après 4 jours de traitement, on compare le pourcentage d'hématies parasitées sur frottis mince entre le lot témoin et le lot traité. On établit de cette façon un pourcentage d'inhibition. - Méthodologie: a) injection de 107 hématies parasitées par voie I.P. (Jo) b) injection du Bistramide D à 15 mg/kg/jour, pendant 4 jours en sous-cutané (JO,J1,J2,J3) c) contrôle sur frottis de la parasitémie à J4 Résultats: essai A: - témoins à J4: parasitémie 4% - lot traité à J4: parasitémie 0,64% soit 84% d'inhibition essai B: - témoins à J4: parasitémie 4% - lot traité à J4: parasitémie 0,50% soit 87% d'inhibition 5.essai C : - témoins à J4: parasitémie 1,20% - lot traité à J4: parasitémie 0,23% soit 81% d'inhibition L'examen des résultats obtenus dans les trois essais ci-dessus, montre une inhibition moyenne de 84% lorsqu'on administre un bistramide selon l'invention. B/ ETUDE DU STADE PARASITAIRE SENSIBLE AUX BISTRAMIDES Pour apprécier le ou les stades parasitaires les plus sensibles à l'action des bistramides de l'invention, on a étudié l'effet de ces bistramides sur chaque stade parasitaire prédominant durant le cycle cellulaire d'une espèce de Plasmodium donné. Les résultats donnés ci-après concernent l'effet du bistramide D sur les stades parasitaires de Plasmodium vinckei petteri. - Méthodologie: Après infestation des souris, on constitue cinq lots de cinq souris. Chaque lot est traité par une dose de 15 mg/kg de bistramide D au moment o prédominent l'un des stades. On dispose donc, en plus, du lot témoin, d'un lot mérozoïtes, d'un lot anneaux, d'un lot trophozoïtes jeunes, d'un lot trophozoïtes moyens et d'un lot trophozoïtes âgés. On évalue le retard de parasitémie ou période patente comme le temps en jours nécessaire pour que la parasitémie atteigne 1%. -Résultats: 15. lot témoin 5 J lot mérozoïtes 5 J lot anneaux 5,4 J lot trophozoïtes jeunes 5,6 J lot trophozoïtes moyens 6,25 J 20. lot trophozoïtes âgés 6,2 J Le test statistique de KRUSKAL-WALLIS unilatéral (BMDP, Statistical software manual 1990, vol.1, Ed WJ DIXON U. of Californy Press) met en évidence une différence significative (p témoin et les lots trophozoites moyens et âgés. On observe donc une activité sélective du bistramide D sur les stades trophozoïtes moyens et âgés. D'après une étude préliminaire en cytométrie en flux, des hématies murines parasitées par l'espèce Plasmodium vinckei petteri montrent, en présence de bistramide D, un blocage partiel du parasite au stade de sa maturation. Ceci a pour conséquence un arrêt de la prolifération parasitaire au stade trophozoite moyen et âgé. Ce blocage, qui correspond à la phase G1 du cycle cellulaire, est dose- dépendant, et est probablement lié à une maturation atypique du parasite. C/ COMPARAISON DES SCHEMAS THERAPEUTIOUES MONODOSE ET MULTIDOSE L'objectif est de suivre au quotidien la parasitémie et d'évaluer l'inhibition de la parasitémie selon le schéma thérapeutique adopté pour un traitement. On met en évidence les modifications morphologiques du parasite par la formule parasitaire, le calcul de la formule parasitaire se fait également sur frottis et permet d'évaluer la proportion de chaque stade: anneau, trophozoite jeune, trophozoïte moyen, trophozoïte âgé pour 100 hématies. La méthodologie appliquée est la suivante: a) après infestation, on constitue trois lots de cinq souris, à savoir - un lot témoin, à JO, - un lot dit monodose, pour lequel une seule injection de bistramide D (15mg/kg), à JO, est effectuée sur la souris - un lot dit multidose, o l'injection de bistramide D est effectuée en administrant cinq doses respectivement à JO,J1,J2,J3,J4 (dose totale 15mg/kg) b) la confection et la lecture des frottis sont effectuées tous les jours pendant 21 jours. On a déterminé pour chaque lot le pourcentage de parasitémie et le pourcentage d'inhibition du développement du parasite. Les résultats obtenus sont donnés dans les tableaux 1 et 2. 2- Tableau 1 Jour Témoins Monodose Multidoses JO - J1 - - _ J3 0,33 0,16 0,12 J4 1,2 0,80 0,2 J5 5,5 3,5 1,6 J7 50 64 7,4 J8 67 56 74 J9 48 42 67 J10 1 1 30 Tableau 2Jour Monodose Multidoses J3 51,5 63,6 J4 33,3 83,3 J5 36,3 70,9 J7 0 85,2 *J8 16,4 0 J9 12,5 0 J10 0 0 Les formules parasitaires dans chacun des lots sont données à J5 et à J7 dans le tableau 3. Tableau 3 Stade Témoin Monodose Multidose J5 J7 J5 J7 J5 J7 A 72,5% 58% 40% 47% 25% 7% TJ 17,5% 17% 37% 31% 28% 0% TM 7% 15% 14% 14% 40% 0% TA 3% 10% 9% 6% 7% 93% L'ensemble de ces résultats met en évidence une différence très notable à J7 o la parasitémie du lot multidose est dix fois moins élevée par rapport au lot témoin (le pourcentage d'inhibition est de 85%). Le parasite se trouve essentiellement sous forme trophozoïte âgé (93%) dans le lot multidose et sous forme anneau dans le lot témoin. Le parasite apparaît donc bloqué au stade trophozoïte âgé. A partir de J8, la parasitémie entre les deux lots est comparable, le Plasmodium n'étant apparemment plus sous l'effet du bistramide D. La dernière injection de la drogue dans ce lot multidose a été effectué à J4, la durée d'action du bistramide D est d'environ 3 jours. Cela semble être confirmé avec le lot monodose: A J4 (trois jours après l'injection de bistramide D) on n'observe pas de différence entre la parasitémie du lot témoin et celle du lot monodose. 2L REVENDICATIONS 1. Dérivés de bistramides biologiquement actifs, caractérisés en ce que ils sont capables d'exercer in vivo une activité antitumorale entraînant la différenciation des cellules tumorales, avec inhibition de l'expression de l'oncogène erb-2 normalement exprimé par les cellules des lignées bronchopulmonaires non à petites cellules, - leur DL50 est supérieure à 30 mg/kg, voire mg/kg ou plus, et - ils répondent à la formule (I) R1 - CO -NH R3 X R2 0 R4 dans laquelle -R1, X, Y et R2, identiques ou différents les uns des autres, représentent une chaîne hydrocarbonée de 1 à 20 atomes de carbone, saturée ou insaturée, substituée par au moins un groupe -OH et/ou une fonction cétone, comportant, le cas échéant, au moins un cycle R5, ce cycle pouvant comporter une ou plusieurs insaturations, - R3, R4 et R5, identiques ou différents les uns des autres, sont choisis parmi l'hydrogène, les radicaux alcoyle ou alcoxy de 1 à 4 atomes de carbone, un groupe -OH, -NH2 ou -N02, ou un atome d'halogène, ainsi que _, leurs isomères et les produits résultant de déshydratation. 2. Dérivés selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont capables d'exercer une activité cytostatique vis-à-vis de parasites. 3. Dérivés selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que Ri comporte de 5 à 15 atomes de carbone. 4. Dérivés selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que Ri comporte 1 ou 2 doubles liaisons éthyléniques. 5. Dérivés selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que R2 comporte de 6 à 10 atomes de carbone, notamment 8 ou 9 et, avantageusement une double liaison éthylénique. 6. Dérivés selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisés en ce que X et Y comportent de 2 à 8 atomes de carbone, notamment de 2 à 6 atomes de carbone, en particulier de 3 à 5. 7. Dérivés selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisés en ce que R3 et R5 représentent un radical alcoyle ou alcoxy, notamment de 1 à 4 atomes de carbone, et R4 un atome d'hydrogène. 8. Le bistramide D de formule (II) o H OH 9. Le bistramide K de formule (III) OH 10. Le bistramide L de formule (IV) I H (IV) 11. Dérivés de bistramides selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisés en ce qu'il s'agit de formes énantiomères ou diastéréoisomères. 12. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité efficace d'au moins 1 bistramide selon l'une des revendications 1 à 11, en association avec un véhicule pharmaceutique. 13. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'elles sont administrables par voie orale ou injectable. 14. Compositions pharmaceutiques selon la revendica- tion 13, caractérisées en ce qu'il s'agit de tablettes, comprimés, gélules, pilules et qu'elles renferment de 10 à 100 mg de principe actif par unité de prise, de préférence de 40 à 60 mg. 21- 15. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'il s'agit de solutions injectables, ces solutions renfermant avantageusement par unité de prise de 10 à 50 mg de principe actif, de préférence de 15 à 30 mg. 16. Compositions pharmaceutiques selon l'une des revendications 12 à 15, utilisées comme médicaments anti- tumoraux, en particulier pour le traitement de tumeurs solides. 17. Compositions pharmaceutiques selon l'une des revendications 12 à 15, utilisées comme médicaments anti- parasitaires, en particulier pour le traitement du paludisme ou des leishmanioses. 18. Utilisation des bistramides selon l'une des revendications 1 à 11, pour l'élaboration de médicaments aXparasitaires, en particulier de médicaments destinés au traitement du paludisme ou des leishmanioses. 19. Procédé d'obtention de bistramides selon l'une des revendications 1 à 11 par extraction à partir de L. bist, et/ou de ses prochlorons symbiotes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de - chromatographie liquide basse pression de l'extrait organique sec pour éliminer au moins la majeure partie des impuretés ayant une polarité supérieure ou inférieure à celles des produits recherchés. - chromatographie liquide haute pression des fractions riches en bistramides, de manière à obtenir des fractions enrichies en un bistramide donné, et avantageusement - purification de ces fractions par chromatographie liquide haute pression pour isoler sélectivement un bistramide donné, les deux premiers fractionnements étant avantageu- sement réalisés sur des colonnes de silice en utilisant des solvants du type de l'acétate d'éthyle, 2# dichlorométhane, avantageusement additionnés de méthanol, et l'étape de purification finale des fractions, en utilisant de l'eau avec des solvants du type du méthanol, du dichlorométhane ou de l'acétonitrile.