FR 2694754 A1 19940218 FR 9210094 A 19920812 Fragments d'ADN de mycobactéries, amorces d'amplification, sondes d'hybridation, réactifs et procédé de détection de mycobactéries Le genre Mycobacterium inclut au moins 54 espèces (Wayne, L G, and Kubica, G P 1986 Genus Mycobacterium. In "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (P H A. Sneath, N Mair, and M E Sharp, eds) Vol 2, pp. 1436-1457 Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland) La plupart de ces espèces sont saprophytes et ne causent pas de maladies humaines ou vétérinaires Les mycobactéries pathogènes pour l'homme les plus importantes en terme de morbidité et de mortalité sont Mycobacterium tuberculosis et M leprae, qui causent la tuberculose et la lèpre La tuberculose reste une des grandes maladies infectieuses de la planète, avec quelques 10 millions de nouveaux cas et 3 millions de décès par année (Stylbo, K 1983 Tuberculosis and its control: Lessons to be learned from past experience and its implications for leprosy control programmes Ethiop Med J 21:101- 122 et World Health20 Organisation 1986 Results of a World Health Organisation- sponsored workshop to characterize antigens recognized by Mycobacterium-specific monoclonal antibodies Infect. Immun 51:718-720). En Europe, en Afrique, en Amérique du Nord, une tendance récente à une augmentation de prévalence semble se dessiner, sans doute liée à la multiplication des cas de SIDA (Stead, W W, and Dutt, A K 1988 Changing faces of clinical tuberculosis In "Mycobacterium tuberculosis. Interactions with the Immune System" (M Bendinelli and H. Friedman, eds) pp 371-388 Plenum, New York) M tuberculosis est taxonomiquement très proche de M bovis, M africanum (qui causent aussi des tuberculoses chez l'homme) et M microti (tuberculose de certains rongeurs), de telle sorte qu'on réunit ces quatre espèces35 sous le nom de "complexe M tuberculosis" (Wayne LG et al.) Parmi les mycobactéries non tuberculeuses (parfois appelées "atypiques"), il faut mentionner l'incidence accrue des mycobactéries appartenant au complexe M avium- intracellulare chez des malades immunodéprimés (SIDA, transplantations, traitements du cancer) (Kielin, T E, Edwards, F F, Brannon, P, Tsang, A Y, Maio, M, Gold, J.W M,Whimby, E, Wong, B, McClatchy, J K, and Amstrong, D 1985 Infections caused by Mycobacterium avium complex in immunocompromised patients: Diagnosis by blood culture and fecal examination, antimicrobial susceptibility tests and morphological and seroagglutination characteristics J Clin Microbiol 21, 168-173 Macher, A M, M Kovacs, J A, Gill, V, Roberts, G.D, Ames, J, Parke, C H, Strans, S, Lane, H C, Parillo, J E, Fanci, A S, and Masur, H 1983 Bacteremia due to Mycobacterium avium-intracellulare in the acquired d'immunodeficiency syndrome Ann Intern Med 99, 782- 785) Ce complexe comprend les espèces M avium, M. intracellulare (très proches l'une de l'autre, d'o le terme M avium-intracellulare), M paratuberculosis (cause de la maladie de Johne chez le veau) et M lepraemurium (lèpre du rat) D'autres espèces produisent des infections humaines de moindre importance en terme de gravité ou de morbidité, comme M kansasii (adénites), M ulcerans et M. marinum (ulcérations cutanées). La quasi-totalité des mycobactéries présentent un antigène caractéristique et spécifique, dit antigène k D, complètement séquencé et identifié. L'antigène 65 k D présente nombre de caractéristiques intéressantes qui ont conduit à des études extensives Tout d'abord cette protéine apparaît comme un antigène mycobactérien majeur Les individus ou les animaux infectés ou immunisés avec des mycobactéries produisent des anticorps et des cellules T qui reconnaissent cet antigène dans la grande majorité des cas, ce qui a permis d'ailleurs d'en disséquer les épitopes Ensuite l'antigène 65 k D fait partie de la famille des protéines "heat-shock" ou protéines de choc thermique, également retrouvées avec un grand degré de conservation dans des nombreuses cellules procaryotes et eucaryotes Ces protéines fonctionnent comme "chaperon" dans l'assemblage post-traductionnel de certaines protéines de procaryotes, chloroplastes et mitochondries (Ellis J 1988 Nature 328: 378-9) Enfin, un intérêt particulier est aussi porté à l'antigène 65 k D dans la mesure o il a été associé à la pathogénèse d'arthrites auto-immunes (Thole, J E R, and Van Der Zee, R 1990 The k D antigen: molecular studies on a ubiquitous antigen. In: Molecular Biology of the Mycobacteria, J Mc Fadden Ed., Surrey University Press, London, pp 37-67). Ces points d'intérêt multiples expliquent pourquoi cet antigène a été l'un des tout premier a être cloné et séquencé chez diverses mycobactéries (Clark-Curtiss, J E, Jacobs, W R, Docherty, M A, Richtie, L R, and Curtiss III, R 1985 J Bacteriol 161, 1093-102 Young R A, Blooms, B R, Grosskinsky, C M, Ivangi, J, Thomas, D and Davis R W 1985 Proc Natl Acad Sci USA 42:2583-7 Young, R A, Mehra, V, Sweeetser, D, Buchanan, T, Clark- Curtiss, J, Davis, R W, and Bloom, B R 1985 Genes for the major protein antigens of the leprosy parasite Mycobacterium leprae Nature 316:450-2 Lu, M C, Lien, M.H, Becken, R E, Heine, H C, Buggo, A M, Lipovsek, D., et al 1987 Infect Imm 55:23-82 Husson R N, and Younf R A 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84:1679-83. Andersen, A S, Worsaae, A, and Chaparas, S D 1988. Infect Imm 56:1344-51 Shinnick, T M 1987 The 65- kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis J. Bacteriol 169:1080- 88 Thole, J E R, Dauwesse, H G, Das, P K, Croothuis, D G, Shouls, L M and Embden, J.D A 1985 Cloning of Mycobacterium bovis BCG DNA and expression of antigens in Escherichia coli Inf Imm. :800-6 Mehra, V, Sweetser D, and Young, R A 1986. Efficient mapping of protein antigenic determinants Proc. Natl Acad Sci USA 83:7013-17). Le document WO-A-8800974, repris dans la référence de Young RA et al, décrit une séquence d'ADN codant pour l'antigène 65 k D de M leprae Le document WO-A-8806591 décrit une séquence d'ADN codant pour l'antigène 65 k D de M tuberculosis reprise dans la référence Shinnick et al. Plus récemment, le document FR-A-2 645 878, repris dans la référence Hance, A J, Grandchamp, B, Lévy- Frébault, V, Lecossier, D, Rauzier, J, Bocart, D, and Gicquel, B 1989 Detection and identification of Mycobacterium by amplification of mycobacterial DNA. Molecul Microbiol 3:843-9 décrit une séquence nucléotidique de 383 paires de bases du gène codant pour l'antigène 65 k D chez M avium, M fortuitum, M paratuberculosis et bovis BCG Cette demande de brevet vise en particulier la mise au point d'une méthode d'identification de certaines mycobactéries directement à partir d'échantillons biologiques, après amplification des20 séquences nucléotidiques appropriées. Cependant, toutes les techniques d'identification ou caractérisation qualitative et/ou quantitative de mycobactéries, décrites par l'art antérieur, directement à partir de leurs acides nucléiques, présentent encore les inconvénients suivants. La séquence d'ADN génomique, retenue aux fins d'identifier des zones quasi-constantes (à la notion d'homologie près) au genre Mycobacterium, et/ou des zones variables respectivement spécifiques aux espèces appartenant audit genre, n'est pas conservée chez la plupart des mycobactéries connues à ce jour Elle n'est en général conservée que pour quelques espèces En conséquence, la ou les amorces retenues pour amplifier cette zone n'hybrident pas l'ADN génomique de certaines espèces, (cf résultats du Tableau 2 relatifs aux amorces TB 1 et TB 2 du document FR-A-2 645 878), ce qui rend le processus d'identification non sélectif pour la totalité du genre Mycobacterium. Si différents oligonucléotides ont déjà été proposés à titre de sondes de détection d'une espèce donnée appartenant au genre Mycobacterium, on manque aujourd'hui de sondes discriminant un groupe d'espèces, tels que les complexes dit M tuberculoses et M avium/intracellulare. La présente invention a pour objet de remédier aux inconvénients précédents Plus précisément, l'invention a pour objet: 1) une séquence de l'ADN génomique des mycobactéries, appartenant au gêne codant pour l'antigène mycobactérien 65 kd, comprenant des régions quasi-constantes pour la majeure partie des espèces de mycobactéries; 2) toute amorce spécifique pour l'amplification par polymérisation d'ADN, de la séquence selon ( 1), quasi-constante pour la majeure partie des espèces appartenant au complexe M tuberculoses et/ou M avium- intracellulare; 3) une ou des sondes de détection, dites sondes de genre, s'hybridant sur une partie de la séquence selon ( 1), quasi-constante pour la majeure partie des espèces appartenant au genre Mycobacterium; 4) une ou plusieurs sondes de détection, dites sondes d'espèces, s'hybridant sur une partie de la séquence selon ( 1), quasi-constante pour la majeure partie des espèces appartenant au complexe M tuberculoses et/ou M avium-intracellulare; ) tout réactif ou réactifs mettant en jeu une ou plusieurs séquences isolées selon ( 1), et/ou des amorces selon ( 2), et/ou des sondes de genre selon ( 3), et/ou des sondes d'espèces selon ( 4).35 Les termes sondes et/ou amorces tels qu'utilisés dans la présente invention font référence à un fragment d'ADN ou d'ARN naturel, ou un oligonucléotide naturel ou de synthèse, ou un fragment d'ADN ou d'ARN de synthèse non modifié ou comprenant une ou plusieurs bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, la5 désoxyuridine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation, le fragment d'ADN pouvant être simple ou double brin. Selon la présente invention, on propose tout d'abord un fragment monocaténaire d'ADN, isolé ou faisant partie d'une macro-molécule d'ADN bicaténaire, dont la séquence nucléotidique est incluse dans le gène des espèces du genre mycobactérie, codant pour l'antigène mycobactérien dit 65 k D, comportant des régions constantes15 ou homologues à pratiquement toutes les espèces du genre mycobactéries, et une ou plusieurs régions variables, spécifiques, c'est-à-dire constantes ou homologues pour une espèce donnée Selon l'invention, et à partir du séquençage du gène précité établi par Schinnick (Schnnick20 TM 1987, J Bacteriol 169: 1080-88), la séquence du fragment selon l'invention présente au moins 70 % d'homologie et préférentiellement au moins 85 % d'homologie, avec une séquence prédéterminée ou de référence, commençant au nucléotide 438 et finissant au nucléotide 751, ou homologue avec la séquence complémentaire de cette séquence prédéterminée ou de référence choisie selon l'invention. Par homologie, on entend toute similitude tolérée de la séquence d'un ADN, permettant à ce dernier de s'hybrider spécifiquement sur la séquence prédéterminée, par rapport à laquelle on apprécie l'homologie. Par séquence complémentaire, on entend toute séquence s'hybridant totalement avec la séquence prédéterminée ou de référence. A titre d'exemple, la séquence du fragment monocaténaire présente au moins 70 % d'homologie, et préférentiellement 85 % d'homologie, avec l'une quelconque des séquences 3,4,5,6,7,8,12 et 13, identifiées dans la description. Grâce au fragment monocaténaire selon l'invention, amplifié avec toutes amorces appropriées, et détecté avec toutes sondes de genre et d'espèces déterminées ci-après, toutes les mycobactéries testées, soit 21 souches représentant 19 espèces, ont répondu positivement au test effectué, là o des essais comparables, par exemple selon10 le document FR-A-2 645 818, ne permettent d'amplifier que souches sur 21, laissant par conséquent non détectées 6 souches de mycobactéries. L'invention concerne également toute macromolécule d'ADN génomique ou isolé, ou d'ARN, comprenant ou intégrant un fragment monocaténaire tel que défini précédemment Répondent à cette définition, notamment tout vecteur de réplication incorporant undit fragment, mais aussi tout produit d'amplification, résultant du marquage par des amorces appropriées d'une séquence nucléotidique20 correspondant à la séquence prédéterminée définie précédemment, à au moins 70 % d'homologie près; dans ce cas, on obtient une séquence nucléotidique dont la partie centrale correspond, sous forme monocaténaire, à la séquence prédéterminée, flanquée des deux amorces d'amplification par exemple. A partir de la séquence prédéterminée retenue, l'invention a défini différentes amorces spécifiques pour l'amplification par polymérisation de l'ADN génomique d'une bactérie du genre mycobactérie De manière générale, une telle amorce comprend une séquence nucléotidique lui permettant d'hybrider une zone dite constante de cette séquence prédéterminée, homologue ou identique pour pratiquement toutes les espèces du genre mycobactéries, notamment la zone commençant au nucléotide 438 et35 finissant au nucléotide 457, et la zone commençant au nucléotide 733 et finissant au nucléotide 751, toujours selon le séquençage de Schinnick. Cette amorce comprend avantageusement entre 15 et bases. A titre d'exemple, cette amorce répond, sous forme de brin monocaténaire, aux formules dites MYC-1 S et MYC-2 A identifiées dans la description ci-après. Toute technique d'amplification peut être utilisée, et en particulier on retiendra tous couples d'amorces tels que définis comme précédemment, par exemple tous couples d'amorces comprenant au moins 10 bases de MYC-1 S et MYC-2 A. Toujours à partir du même fragment monocaténaire selon l'invention, cette dernière propose aussi une sonde dite de genre, susceptible d'hybrider une zone constante dudit fragment, homologue ou constante pour pratiquement toutes espèces du genre mycobactéries. Préférentiellement, cette sonde de genre est susceptible d'hybrider une zone extrême du fragment monocaténaire selon l'invention, correspondant à une amorce telle que définie précédemment, intégrée ou liée audit fragment. Mais, cette sonde de genre peut hybrider toute autre zone constante du même fragment monocaténaire; avantageusement, ces sondes répondent aux formules dites MYC-2 S et MYC-3, identifiées dans la description. Toujours à partir du même fragment monocaténaire selon l'invention, cette dernière propose différentes sondes d'espèce, comprenant chacune une séquence nucléotidique lui permettant d'hybrider une zone dite variable de ladite séquence prédéterminée, identifiée précédemment, cette zone variable étant spécifique à au moins une espèce du genre mycobactérie. Avantageusement, et selon une caractéristique importante de la présente invention, cette sonde d'espèce comprend une séquence nucléotidique lui permettant d'hybrider une zone variable de la séquence prédéterminée selon l'invention, commune à plusieurs espèces d'un même complexe, à savoir M tuberculosis ou M avium-intracellulare. Préférentiellement, ces sondes d'espèce ou de complexe comprennent de 10 à 40 bases. Avantageusement, la séquence nucléotidique de la sonde répond à l'une quelconque des formules dites TUB-15, AVIC et MAIC 4 S à MAI ClîS, identifiées dans la description. Toutes ces sondes, de genre ou d'espèce, sont des sondes de détection ou identification, et aux fins d'une analyse qualitative et/ou quantitative, sont marquées avec un marqueur approprié, choisi préférentiellement parmi la peroxydase et la phosphatage alcaline, et tous autres enzymes susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogéne, fluorigène ou luminescent Mais ces sondes peuvent être marquées également avec des isotopes radioactifs, des composés chimiques chromophores, des composés chromogénes, fluorigènes ou luminescents, ou des analogues de bases nucléotidiques, et de la biotine Ces sondes peuvent être également modifiées chimiquement. Selon l'invention, on propose un réactif ou ensemble de réactifs pour détecter sélectivement dans un échantillon biologique, une bactérie du genre Mycobacterium, appartenant aux complexes M tuberculosis et M avium-intracellulare Un tel ensemble comprend, éventuellement une ou plusieurs amorces telles que décrites précédemment, éventuellement une ou plusieurs sondes de genre telles que décrites précédemment, et une ou plusieurs sondes d'espèces telles que décrites précédemment. La plupart des techniques d'hybridation connues peuvent être utilisées, notamment les techniques dites Dot-Blot, Southern, et le procédé d'hybridation dit sandwich; dans ce dernier cas, on associe deux sondes, par exemple une sonde de genre et une sonde d'espèce, l'une des sondes étant fixée sur un support solide, en tant que sonde de capture, tandis que l'autre sonde marquée par tout marqueur approprié est en milieu liquide, en tant que sonde de détection. En définitive, la ou les sondes selon l'invention sont en milieu liquide et/ou fixées sur un support solide, directement ou indirectement S'agissant du support solide selon l'invention, sous toutes formes appropriées telles que tube, cône, puits, plaque de microtitration, feuille, ou polymère soluble, il est choisi parmi les polystyrènes,10 les copolymères styrène-butadiène, les copolymères styrène-butadiène en mélange avec des polystyrènes, des polypropylènes, des polycarbonates, des copolymères polystyrène-acrylonitrile, des copolymères styrène-méthylméthacrylate de méthyle, parmi les fibres synthétiques et naturelles, parmi les polysaccharides et les dérivés de la cellulose. L'invention concerne aussi un procédé pour détecter sélectivement dans un échantillon biologique une bactérie du genre mycobactérie Ce procédé présente les étapes suivantes: préparation des échantillons afin de libérer l'acide nucléique mycobactérien hybridation de l'ADN et/ou d'ARN génomique de la bactérie, et/ou de son ARN de transcription, avec au moins une amorce telle que définie précédemment; multiplication du fragment d'ADN ou ARN flanqué de ladite ou desdites amorces, pour obtenir une multitude de fragments monocaténaires d'ADN, répondant à la définition selon l'invention; ces deux étapes sont éventuelles, et ont pour but d'éviter la culture des bactéries exposition du fragment ou des fragments à au moins une sonde d'espèce, et/ou au moins une sonde de genre, telles que définies précédemment. Pour terminer, la présente invention concerne également tous produits d'expression d'une chaîne d'ADN il correspondant à elle seule, ou pour partie, à un fragment monocaténaire selon l'invention, que ce produit d'expression soit un peptide ou une protéine, ledit peptide pouvant également constituer le motif répété d'un polymère polypeptidique. A partir du produit d'expression du fragment monocaténaire selon l'invention, sous forme isolée ou recombinante, l'invention concerne aussi toute composition immunogène, à des fins de diagnostic, ou thérapeutiques10 (préventive et/ou curative), cette composition comprenant un peptide ou une protéine telle que définie précédemment. A cet égard, l'invention concerne aussi des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, obtenus par immunisation d'un mammifère avec un peptide ou une protéine tels que définis précédemment, quelle que soit l'utilisation desdits anticorps, par exemple dans une réaction immuno-spécifique. La présente invention est maintenant exposée selon les exemples 1 à 5, et à l'appui des tableaux 1 et 2 et de la figure 1 (décomposée en figure la, lb, et lc), selon lesquels la figure 1 décomposée en figures la, lb, lc représente l'alignement des séquences nucléotidiques (selon la numérotation de Shinnick et al 1987) sur une portion de 314 bp du gène codant pour l'antigène 65 K Da des mycobactéries; les séquences des souches des espèces suivantes sont issues de la littérature: M tuberculosis (Document WO-A-8806591 et Shinnick, T M 1987 The 65-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis J Bacteriol 169:1080-88) M bovis BCG (Thole et al 1987 Characterization, sequence determination, and immunogenicity of a 64- kilodalton protein of Mycobacterium bovis BCG expressed in Escherichia coli K-12 Inf Imm 55:1466-1475). M avium, M fortuitum et M paratuberculosis (Document FR-A-2 645 878, et Hance, A J, Grandchamp, B, Lévy-Frébault, V, Lecossier, D, Rauzier, J, Bocart, D, and Gicquel, B 1989 Detection and identification of mycobacterium by amplification of mycobacterial DNA. Molecul Microbiol 3:843-9) Mycobacterium leprae (Young, R A, Mehra, V, Sweeetser, D, Buchanan, T, Clark-Curtiss, J, Davis, R.W, and Bloom, B R 1985 Genes for the major protein antigens of the leprosy parasite Mycobacterium leprae. Nature 316:450-2) Les séquences des espèces suivantes ont été déterminées à partir de souches disponibles chez le déposant: M africanum, M microti, M chitae, M intracellulare 3324, M intracellulare 83 2230, M malmoense, M scrofulaceum. Selon les figures la à lc un tiret signifie que la base est identique à celle identifiée en première ligne. Le Tableau 1 représente des séquences oligonucléotidiques selon l'invention, exemplifiées ci-après, et reprises par leurs noms abrégés dans les revendications. Tableau 1 Oligonucléotides de synthèse utilisés en tant qu'amorces de polymérisation ou de sonde pour détecter une portion du gène de l'antigène 65 K Da des mycobactéries, et dont la spécificité est de niveau genre ou espèces de mycobactéries (*) les chiffres entre parentheses indiquent la position de l'oligonucléotide selon la numérotation de Shinnick et al 1987, C indique une homologie avec le brin complémentaire. o 1 igonuclotide Séquence* Amorces de polymérisation ou amplification MYC-1 S: GAT CCG TAC GAG AAG ATC GG ( 438-457) MYC-2 A: ACC TTG TCC ATC GCC TCG G (C'733-751) Sondes d'hybridation de qenre: MYC 3: CGC AAC GTC GCG GCC GGC GCC AAC CCG C ( 561-588) MYC-2 S: CCG AGG CGA TGG ACA AGG T ( 733-751) Sondes d'hybridation d'espèces: AVIC (complexe avium-intracellulare): TGC TCA AGT CGG CCA AGG ( 640-657) MAIC 4 S (complexe avium- intracellulare): ACG GCA CGA CGA CGG ( 508-522) MAIC 5 S (complexe avium-intracellulare): CCA CGG TGC TCG CCC AGG ( 523-540) MAIC 5 S b(complexe avium-intracellulare): CCA CGG TGC TCG CTC AGG ( 523-540) MAIC 5 S c(complexe avium-intracellulare): CCA CGG TGC TGG CCC AGG ( 523- 540) MAIC 6 S (complexe avium-intracellulare): GAC CAG TCG ATC GGC GAC C ( 708-726) MAIC 6 S b(comp Lexe avium-intracellulare): GAC CAG CGG ATC GGC GAC C ( 708-726) MAIC 7 S (complexe avium-intracellulare): CCG CTG GGT CTC AA ( 585-538) MAIC 7 S b(complexe avium-intracellulare): CCG CTG GGT CTG AA ( 585-538) MAIC 8 S (complexe avium-intrace L Lu Lare): GCG TTG GTC CGC GAG GGC C ( 540-558) MAIC 9 S (complexe avium-intracellu Lare): CGA CGA CGG CCA CGG TGC T ( 514-532) MAIC 10 S (complexe avium- intrace Llu Lare): CCG CTG GGT CTC AAG CGC G ( 585-603) MAIC 10 S b(comp Lexe avium-intracellulare): CCG CTG GGT CTG AAG CGC G ( 585-603) MAIC 11 S (complexe avium-intracellulare) CCA ACC CGC TGG GTC TCA A ( 580-598) MAIC 11 S b(complexe avium-intracellulare) CCA AAC CGC TGG GTC TCA A ( 580-598) MAIC 11 i S c(complexe avium-intracellulare) CCA ACC CGC TGG GTC TGA A ( 580-598) TUB i S (complexe tuberculosis):GGT CAA AGA GGT AGC CAA G ( 467-485) AVIC (complexe avium-intrace Llulare): TGC TCA AGT CGG CCA AGG ( 640-657) Le Tableau 2 représente les spécificités d'amplification enzymatique et d'hybridation des souches bactériennes testées Dans ce tableau: s'agissant de l'origine, les chiffres 1 réfèrent à des souches disponibles auprès du Centre de Collection des Mycobactéries, CHUV à Lausanne, 2 au Centre Médical Universitaire de Genève, 3 à l'Institut d'Hygiène de Genève, et Bio M aux laboratoires de bio Mérieux TBI et TB 2 réfèrent à des amorces selon le document FR-A-2 654 878. Tableau 2 AMPLIFICATION HYBRIDATIONDUPRODUITD'AMPLIFIOATION, ët marquage de Za sonde 32 P radioactif ( 32 P) ou détection enzymatique (froid) M tuberculosis M microtl M bovis M africanum La 1077 TB 1; TB 2 + + + h'E MYC t S MYC 2 A + + GMY E GS(r E MYC 3 ( 32 P) MYC 2 S (frold) + + + + + M kansasil M marinum 2417 M simlae ATCC 25275 M scrofulaceum M gordonae M szulgal M flavescens M intracellulare 83- 2230 M Intracollulare 83-3324 M intracellularo ATCC 357 64 M avlum M avium-lntracellulare 4556 M xenopl 4333 M terrae ATCC 15755 M malmoanse M nonchromogenicum M triviale ATCC 23 292 M gastri M larcinogonos M haomophilum h E h E (D 0 l ESPECE ORIGINE + + + + NE + + + Tg TUBIS (foid) + + + + + + + + + + + + + B Io M Bio M B Io M B Io M Bio M Bio M + + + + + + + + + + + + + h E h E NE u H + + + + + + + + + + + + + + + + *+ + + + + + + 3 h E 1 NE +N + + + + + + + + + + + Tableau 2 M ulcorans M paratuborculos Is M cheolonoi M chelonol ATCO 14472 M fortultum 833359 M diornhoferl M chitae M cholonel-absossus M sonegaloso M vaccae M phlol M thormoroslstibllo M smogmatls Nocardia asteoroidos 864 Nocardia asteroldes 866 Nocardia asteroldos 889 Nocardia astoroldes 870 Nocardia cavlae 881 1 E B Io M + + + +E + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 2 E 2 SE 2 SE 2 E 2 b E + + + + ts E + +l E + + + + t'E o-I h E E h E E 1 contre de collection des mycobactérles, Lausanne, 2 Centre Mddieca Unuiversitaire de Genève, 3 Institut d'hygiène de Genève NE: non- effectué KO u D 0 n Exemple N 1: Définition d'amorces d'amplification spécifiques de genre et leur utilisation Après différentes expériences préliminaires, il a été constaté que les séquences proposées par la littérature, en tant qu'amorces "universelles" au genre Mycobacterium, ne répondent pas à certaines souches ou espèces connues à ce jour; ainsi les amorces dites TB 1 et TB 2 selon le document FR-A-2 564 878 ne répondent-elles pas à certaines espèces, comme indiqué précédemment. Il a donc été procédé à un séquençage du gène codant pour l'antigène de 65 k D chez différentes espèces, dont ledit gène n'avait pas encore été exploré Par alignement des séquences ainsi obtenues avec celles déjà décrites dans l'art antérieur, on a ensuite choisi des amorces nouvelles, dont on a découvert qu'elles hybridaient des séquences conservées chez pratiquement toutes les mycobactéries; cf MYC-1 S et MYC-2 A du tableau 1 Cette découverte a été effectuée par amplification à partir d'une souche de mycobactéries La technique utilisée est décrite ci-après. L'extraction de l'ADN génomique a été conduite selon le protocole de Sj 8 bring (Sjôbring et al 1990. Polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis J Clin Microbiol 28 ( 10):2200-2204) 200 ml de culture liquide sont centrifugées à 2600 t/mn pendant 15 mn Le surnageant est écarté et les culots sont regroupés On lave le culot avec du tampon p H 8 0 ( 50 m M Tris-base, 50 m N Na Cl, 5 m M EDTA p H 8 0) On ajoute 0, 1 volume de tampon digestion 10 x ( 100 m M Tris p H 8 0, 200 mm EDTA, SDS 10 %) et la protéinase K à 5 mg/ml final On incube à 60 C pendant 3 heures avec agitation et on chauffe 5 minutes à 100 C pour inactiver la protéinase K. L'ADN est précipité une première fois par ajout d'une solution de 0,4 volume de solution de bromure de cétyltrimethyl-ammonium ( 5 % dans 0,4 M Na Cl), on incube 15 minutes à température puis 10 mn à 4 C On transfère dans des tubes Eppendorf et on centrifuge 15 mn à 12000 tpm On écarte lesurnageant et on lave le culot dans du tampon TE (Tris EDTA) ( 10 m M Tris p H 7,5, 1 m M EDTA) L'ADN est précipité une deuxième fois après une extraction au phénol-chloroforme ( 1:1)-alcool isoamylique ( 24:1) L'ADN est précipité avec 2 volumes d'éthanol absolu et 0,1 volume d'acétate de sodium 3 M.10 L'ADN est amplifié selon la technique PCR de Saiki et al (Saiki et al 1988 Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase) à l'aide d'un appareil PCR Dri-Bock PCH-1 (TECHNE, Grande- Bretagne) Le milieu de réaction est constitué de Tris Cl, 10 mmol/l; Mg C 12 1,5 mmol/l; K Cl 50 mmol/l; gélatine 1 mg/ml; d ATP, d CTP, d GTP, d TTP 0,5 mmol/l chacun; p H 8,3; oligonucléotide TB 1 (selon le document FR-A-2 654 878, pmol; oligonucléotide TB 2 (selon le document FR-A-2 654 878), 25 pmol et 10 Ml de la préparation de l'ADN bactérien Apres dénaturation 5 mn suivie d'une centrifugation, on ajoute l'enzyme à 1,5 U/réaction La PCR est effectuée sur 27 cycles avec les paramêtres 96 C/43 C/74 C, pendant 1 mn, 1 mn, et 0,7 mn respec- tivement. L'ADN amplifié est analysé par electrophorèse en gel d'agarose 0,8 % en tampon TBE (Tris Borate EDTA) ( 89 m M Tris base, 89 m M acide borique, 2 m M EDTA) Les bandes sont visualisées par le bromure d'éthidium. Exemple N 2: Détermination de séquences nucléotidiques de diverses espèces de mycobactéries et alignement de séquence. A partir de l'ADN total isolé comme précédemment, une portion du gène codant pour l'antigène de 65 k D a été amplifiée à l'aide des amorces MYC-l S et MYC-2 A du tableau 1 Les produits d'amplification obtenus ont été directement séquencés à l'aide du kit Gibco BRL (cyclage thermique) Les diverses séquences obtenues sont présentées dans la figure 1. Exemple N 3: Détermination des sondes oligonucléotidiques spécifiques de genre et d'espèces et leur utilisation sur les échantillons d'ADN amplifiés selon l'exemple N 1. Les produits d'amplification par PCR obtenus à partir des amorces MYC 1- S et MYC 2-A (tableau 2) ont été testés avec diverses sondes d'espèces ou de genre décrites dans le tableau 1, selon la technique du Dot-Blot. L'ADN substrat de la réaction d'amplification est extrait par une technique différente de celle de l'exemple 1: après centrifugation d'un aliquote de 107 mycobactéries en Tween 0,5 %, les bactéries sont suspendues dans un tampon Tris H Cl (p H 8 0, 50 m M) puis sont soumises à sonication 10 mn à 55 C en présence de billes de verre gm siliconées, puis à ébullition 5 mn 10 g 1 du lysat sont ensuite amplifiés selon le protocole PCR décrit dans l'exemple n l. L'hybridation des oligonucléotides d'espèces ou de genre a été conduite selon le protocole décrit par Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Smith JA, Seidman JG et Struhl K ( 1987) Current protocols in molecular biology, Green publishing Associated and Wiley intersciences, New- York Les oligonucléotides sont marqués par kination au lgamma(ou)_ 32 pl ATP ( 5000 Ci/mmol) et les températures et conditions de lavage sont les suivantes, par exemple pour MYC 3: 59 C, 30 mn en lx SSC (Saline Sodium Citrate: 0,15 M Na Cl, 0,015 M Na 3 citrate ( 2 H 20 p H 7 0) 1 % SDS Le typage d'espèces de mycobactéries par hybridation d'un produit d'amplification de genre mycobactérien à l'aide de sondes oligonucléotidiques est fait en utilisant un système de détection non-radioactif5 et semi-automatisé décrit dans le document FR-A-2 663 040. Les produits d'amplification obtenus dans l'exemple n 3 ont été à nouveau testés selon la technologie sonde froide décrite ci-après selon deux variantes. La première technique utilise un format plaque de microtitration Dans une plaque de microtitration (Nunc 439454) est déposée une solution de l'oligonucléotide de capture à 1 ng/gl dans du PBS 3 X ( 0 45 M Na Cl 0 15 M phosphate de sodium p H 7 0) L'oligonucléotide ou sonde de capture est choisi parmi les oligonucléotides décrits dans le tableau 2 (MYC-3, MYC-2 S, TU Bl S, AVIC, MAIC 4 S à MAI Cll S), spécifiques du genre ou de diverses espèces de mycobactéries Leur position dans la séquence est indiquée dans la Figure 1 La plaque est incubée 2 h à 37 C, puis lavée 3 fois avec 300 i 1 de PBST (PBS lx, Tween 20 0,5 % (Merck 822184)) La cible constituée par 4 il du produit amplifié est mélangée avec 76 il de tampon PBS saumon (PB 53 X + ADN de sperme de saumon 10 Mg/ml (Sigma D 9156) et 10 il de soude 2 N L'ensemble est neutralisé 5 mn après par l'addition de 10 il d'acide acétique 2 N L'ensemble est ajouté dans le puits en plus de 50 il d'une solution du conjugué oligonucléotide-péroxydase à la concentration de 0 5 ng/gl en oligonucléotide dans un tampon PBS cheval (PB 53 X + 10 % sérum de cheval (Bio Mérieux 55842) Le conjugué oligonucléotide-péroxydase constitue la sonde de détection et possède la séquence nucléotidique de MYC 2-S. La plaque est incubée 1 h à 37 C et lavée par 3 X 300 il de PBST Dans chaque puits, on rajoute 100 il de substrat OPD (ortho- phenylenediamine Cambridge Medical Biotechnology ref/456) dans un tampon adapté ( 0,055 M acide citrique, 0 1 M Na 2 HP 04,p H 4,93) à la concentration de 4 mg/ml, auquel on ajoute extemporanément H 202 à 30 volumes au 1/1000 Apres 20 mn de réaction l'activité enzymatique est bloquée par 100 gl d'H 25 04 IN et la lecture est effectuée sur un appareil Axia Microreader (Axia, marque déposée par Bio Mérieux) à 492 nm. Les résultats de spécificité sont mentionnés dans le tableau 2 Ils indiquent que la sonde MYC 2-S est spécifique du genre mycobactéries, que la sonde TUB 1-S est spécifique uniquement des espèces du complexe tuberculosis Par ailleurs la sonde peut être marquée à l'aide d'un isotope radioactif, d'une enzyme appropriée, d'un fluorochrome, d'un analogue de base, ou d'un composé impliqué dans une réaction de luminescence En outre la sonde peut avoir un squelette ester de diphosphate, alkyl ou acrylphosphonate ou phosphorothioate ou de nature polyamide La seconde technique utilise le format de l'automate VIDAS (marque déposée par bio Mérieux, France) REVENDICATIONS 1/ Fragment nucléotidique d'ADN, dont la séquence nucléotidique est incluse dans le gène des espèces du genre mycobactérie, codant pour l'antigène mycobactérien5 de 65 k Da, comportant des régions homologues à pratiquement toutes les espèces du genre mycobactéries, et au moins une région variable spécifique à l'espèce, caractérisé en ce que la séquence dudit fragment présente au moins 70 % d'homologie, et préférentiellement au moins10 85 % d'homologie, avec une séquence prédéterminée, commençant au nucléotide 438 et finissant au nucléotide 751, ou avec la séquence complémentaire à ladite séquence prédéterminée. 2/ Fragment selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence présente au moins 70 t d'homologie, et préférentiellement 85 % d'homologie, avec l'une quelconque des séquences ( 3),( 4),( 5),( 6),( 7),( 8),( 12) et ( 13), identifiées dans la description. 3/ ADN génomique ou isolé, et/ou ARN, notamment vecteur de réplication, comprenant ou intégrant un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 2. 4/ Amorce spécifique pour l'amplification par polymérisation de l'ADN génomique d'une bactérie du genre mycobactérie, caractérisée ce qu'elle comprend une25 séquence nucléotidique lui permettant d'hybrider une zone dite constante de la séquence prédéterminée définie à la revendication 1, homologue à pratiquement toutes les espèces du genre mycobactéries. / Amorce selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 15 et 25 bases. 6/ Amorce selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle répond à l'une quelconque des formules dites MYC-IS et MYC-2-A identifiées dans la description. 7/ Couple d'amorces, caractérisé en ce qu'il comprend deux amorces choisies parmi les amorces selon la revendication 4. 8/ Couple d'amorces, selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend deux amorces répondant aux formules dites MYC-l S et MYC-A-2, identifiées dans la description. 9/ Sonde de genre, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'hybrider une zone constante d'un fragment monocaténaire selon l'une quelconcque des revendications 1 à 3, homologue à pratiquement toutes les espèces du genre mycobactéries. / Sonde de genre, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'hybrider une zone extrême d'un fragment monocaténaire selon l'une quelconcque des revendications 1 à 3, correspondant à une amorce selon l'une quelconque des revendications 5 à 6, intégrée dans ledit fragment. 11/ Sonde selon la revendication 10, caractérisée en ce que sa séquence nucléotidique répond à la formule dite MYC-25. 12/ Sonde d'espèce, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique lui permettant d'hybrider une zone dite variable de la séquence prédéterminée définie à la revendication 1, spécifique d'au moins une espèce du genre mycobactéries. 13/ Sonde d'espèce, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique lui permettant d'hybrider une zone dite variable de la séquence prédéterminée définie à la revendication 1, commune à plusieurs espèces d'un même complexe, à savoir M tuberculosis ou M avium-intracellulare. 14/ Sonde selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comprend de 10 à 40 bases. / Sonde selon la revendication 13, caractérisée en ce que sa séquence nucléotidique répond à l'une quelconque des formules dites TU Bi S, AVIC, et MAIC 45 à MAI Cll S. 16/ Ensemble de réactifs pour détecter sélectivement dans un échantillon biologique une bactérie du genre mycobactérie, appartenant notamment aux complexes M tuberculosis et M avium-intracellulare, caractérisé en ce qu'il comprend, d'une part au moins une amorce selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, et d'autre part au moins une sonde d'espèces selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, et éventuellement une sonde de genre selon l'une quelconque des revendications 10 et 11. 17/ Ensemble selon la revendication 16, carac- térisé en ce que la ou les sondes sont en milieu liquide et/ou fixées sur un support solide directement ou indirectement. 18/Ensemble selon la revendication 17, carac- térisé en ce qu'il associe une sonde de genre et une sonde d'espèce, et l'une des sondes est fixée sur un support solide, en tant que sonde de capture, tandis que l'autre sonde est en milieu liquide, en tant que sonde de détection. 19/ Ensemble selon la revendication 17, carac- térisé en ce que la ou les sondes sont fixées sur un support solide choisi parmi les copolymères styrène-butadiène en mélange avec des polystyrènes, des polypropylènes, des polycarbonates, des copolymères polystyrène-acrylonitrile, des copolymères styrène-méthylméthacrylate de méthyle, parmi les fibres synthétiques et naturelles, parmi les polysaccharides et les dérivés de la cellulose. / Procédé pour détecter sélectivement dans un échantillon biologique une bactérie du genre mycobactérie, caractérisé en ce qu'on hybride l'ADN génomique de la bactérie contenue dans ledit échantillon, et/ou son ARN de transcription avec au moins une amorce selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, on multiplie le fragment d'ADN et/ou d'ARN ainsi flanqué de ladite amorce pour obtenir une multitude de fragments monocaténaires d'ADN, selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, et on expose lesdits fragments à une sonde d'espèce selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, et éventuellement une sonde de genre selon l'une quelconque des revendications 10 et 11. 21/ Peptide ou polymère à motifs répétés polypeptidiques caractérisé en ce qu'il correspond au produit d'expression d'une chaîne d'ADN correspondant à un fragment monocaténaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 10 22/ Protéine caractérisée en ce qu'elle correspond au produit d'expression d'une chaîne d'ADN incluant un fragment monocaténaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 23/ Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide selon la revendication 21 ou une protéine selon la revendication 22 éventuellement associé à un milieu pharmaceutiquement acceptable. 24/ Anticorps polyclonaux ou monoclonaux, caractérisé en ce qu'ils sont obtenus par immunisation d'un mammifère avec un peptide selon la revendication 21, ou une protéine selon la revendication 22.