FR 2690691 A1 19931105 FR 9205322 A 19920429 -1- L'invention a pour objet un procédé d'amplification d'acide ribonucléique (ARN), dans lequel tous les ingrédients nécessaires aux diverses réactions sont introduits dans la solution de départ, l'ensemble des étapes étant effectué dans un même conteneur et sans ajout ultérieur d'aucun ingrédient On peut ainsi opérer dans un conteneur fermé pendant toute la durée des opérations, et donc réduire les risques de contamination accidentelle et les risques d'erreur de manipulation. On sait actuellement amplifier une séquence d'ADN, sans qu'il soit nécessaire de la cloner dans une cellule-hôte La technique la plus connue dans ce domaine est celle dite d'amplification en chaîne par polymérase, souvent désignée par le sigle PCR, décrite par exemple dans les brevets US 4 683 195 et 4 683 202. La méthode d'amplification PCR peut être combinée à une étape préalable de transcription réverse pour amplifier, sous la forme d'ADN, une séquence d'ARN. La réaction d'amplification en chaîne par polymérase couplée à la transcription réverse (souvent désignée en abrégé par le sigle RT-PCR) est maintenant largement utilisée pour suivre l'expression des gènes au niveau des ARN messagers (AR Nm) ainsi que pour le clonage direct de séquences codantes. La réaction d'amplification en chaîne par polymérase couplée à la transcription reverse consiste donc à réaliser la synthèse d'un premier brin d'ADN complémentaire (AD Nc) à l'aide d'une transcriptase réverse, à dénaturer l'hétéroduplex ARN-AD Nc formé, à synthétiser un second brin d'AD Nc, complémentaire du premier brin, sous l'action d'une ADN polymérase, puis à soumettre l'AD Nc double brin obtenu à une amplification en chaîne par polymérase, selon les méthodes connues, qui consistent en une série de réactions successives de dénaturation de l'ADN double-brin suivie de sa réplication sous l'action d'une ADN polymérase. Plus précisément, la synthèse du premier brin d'AD Nc estréalisée à l'aide de nucléosides triphosphates, par élongation d'une amorce oligonucléotidique sous l'action d'une transcriptase réverse La copie de la matrice d'ARN étant effectuée dans le sens 3 ' 5 ' de la matrice, l'amorce oligonucléotidique doit être capable de s'hybrider avec une séquence située au voisinage de l'extrémité 3 ' de l'ARN à copier Pour cette raison, l'amorce utilisée lors de l'opération de transcription réverse est appelée amorce 3 '. Pour réaliser la synthèse du second brin d'ADN complémentaire, on procède par synthèse du produit d'élongation d'une seconde amorce capable de s'hybrider avec une séquence voisine de l'extrémité 3 ' du premier brin d'AD Nc Autrement dit, la seconde amorce doit être identique à une séquence voisine de l'extrémité 5 ' de l'ARN de départ, ou doit être suffisamment homologue d'une telle séquence pour pouvoir s'hybrider avec ladite séquence du premier brin d'AD Nc Pour cette raison, cette seconde amorce est appelée amorce 5 '. Les deux amorces encadrent donc la séquence à amplifier. La réaction de RT-PCR comporte, indépendamment de la méthodologie utilisée, plusieurs étapes réactionnelles successives, à savoir la dénaturation de l'ARN, l'hybridation de -2- l'amorce 3 ' sur l'ARN, la synthèse d'un premier brin d'AD Nc à l'aide d'une enzyme présentant une activité ADN polymérase ARN-dépendante (ou transcriptase réverse), la dénaturation de l'hétéroduplex ARN-AD Nc formé, l'hybridation de l'amorce 5 ' sur le premier brin d'AD Nc, la synthèse du second brin d'AD Nc à l'aide d'une enzyme présentant une activité ADN polymérase ADN-dépendante, puis la succession des réactions d'amplification par dénaturation de l'ADN double-brin, hybridation des amorces 3 ' et 5 ' avec le brin dont elles sont respectivement complémentaires et synthèse des seconds brins d'ADN par élongation à partir des amorces. La méthode RT-PCR est très sensible Cette grande sensibilité est d'ailleurs souvent à l'origine de résultats "faux-positifs" provoqués par des traces résiduelles d'ADN génomique dans les préparations d'AR Nm Pour des raisons analogues, il est très important d'éviter l'introduction accidentelle de séquences contaminantes Il est donc souhaitable de réduire au maximum les risques de contamination pendant la suite de réactions constituant l'amplification en chaîne Toutefois, suivant la méthodologie utilisée, diverses manipulations peuvent être requises lors de la réaction, accroissant le risque d'introduction de séquences contaminantes. Dans sa mise en oeuvre la moins élaborée, la méthode RT-PCR comporte trois étapes, à savoir: 1) la dénaturation de l'ARN par chauffage; 2) la synthèse du premier brin d'AD Nc dans un tampon contenant, outre des nucléotides triphosphates, l'amorce 3 ' et une transcriptase réverse; et 3) la synthèse du second brin d'AD Nc par addition de l'amorce 5 ' et d'une ADN polymérases, suivie de la suite de réactions d'amplification par PCR; voir par exemple Stefan SCHWARTZ, Journal of Virology, Vol 64, n 6, Juin 1990, pp 2519-259 Dans le but de simplifier la méthode et de réduire le nombre des manipulations, une méthode simplifiée a été décrite, basée sur la découverte d'un tampon commun pour la transcriptase réverse et pour l'ADN polymérase Taq Cette méthode simplifiée consiste: 1) à dénaturer l'ARN en solution aqueuse, les deux amorces 3 ' et 5 ' étant déjà présentes, et 2) à ajouter à la solution aqueuse les ingrédients du tampon, la transcriptase réverse et l'ADN polymérase Ensuite, sans ajout ultérieur de réactif, des opérations successives de synthèse du premier brin d'AD Nc, de dénaturation du duplex ARN-AD Nc, de synthèse du second brin d'AD Nc et de cycles d'amplification sont mises en oeuvre aux diverses températures appropriées; voir notamment C GOBLET et al, Nucl Acids Res, 17 ( 5), 2144 ( 1989) Cette méthode est appelée improprement "méthode en une étape" alors qu'en fait, comme on vient de le voir, elle en comporte deux, puisque la réaction de dénaturation et d'hybridation est effectuée avant l'ajout des ingrédients nécessaires aux étapes de transcription r 6 verse et de synthèse d'ADN double brin, ce qui accroît, tout comme dans la méthode classique en trois étapes, le risque d'introduire des séquences contamninantes. Une autre technique a été développée consistant à utiliser une enzyme thermostable (r Tth) présentant à la fois une activité ADN polymérase ARN-dépendante (transcriptase -3- reverse) et une activité ADN polymérase ADN-dépendante Toutefois, la première activité nécessite la présence d'ions manganèse tandis que la seconde nécessite la présence d'ions magnésium; voir MYERS T W et al, Biochem 30, 7661-7666 ( 1991) Il est donc nécessaire d'effectuer la synthèse du premier brin d'AD Nc en présence de Mn CI 2, suivie d'une dilution de l'échantillon avec apport de l'amorce 5 ', de Mg C 12, et d'un agent chélatant qui a le pouvoir de chélater fortement les ions manganèse Ici encore, un procédé de dilution, avec apport de réactifs, suit nécessairement la synthèse de l'AD Nc, ce qui accroît le risque d'introduire des séquences contaminantes. On a maintenant découvert qu'il est possible d'effectuer l'amplification couplée à la transcription reverse par une méthode ne nécessitant véritablement qu'une seule étape de manipulation, c'est-à-dire une méthode dans laquelle tous les réactifs et solvants sont tous introduits dès le départ dans le conteneur réactionnel, avant l'étape de dénaturation de i'ARN. Cela permet d'opérer de façon simple et en évitant tout risque de contamination lors d'un ajout ultérieur de réactifs ou solvants (on appelle ici solvant tout véhicule liquide ou tout constituant liquide du milieu dans lequel on opère) En outre, on a découvert que, de façon surprenante, cette façon d'opérer en une seule étape est plus efficace que d'opérer selon les techniques antérieures, comme cela sera montré dans la partie expérimentale ciaprès. Les problèmes posés par la réalisation de la RT-PCR avec introduction dès le départ de l'ensemble des réactifs sont liés notamment au choix d'une transcriptase réverse capable de fonctionner après avoir été portée à température relativement élevée pendant l'étape de dénaturation de 'ARN par la chaleur Cette étape de dénaturation de 'ARN par la chaleur est d'une très grande importance pour la réussite et la fiabilité d'une méthode d'amplification En outre, la transcriptase réverse doit, après ce traitement par la chaleur, être encore capable de fonctionner à une température relativement élevée On sait en effet, que pour accroître la spécificité de la réaction d'amplification, il est utile d'opérer dans des conditions suffisamment discriminantes, c'est-à- dire notamment à la température la plus élevée possible, de façon à éviter un appariement non spécifique de l'amorce 3 ' qui risquerait d'entraîner l'amplification d'une séquence autre que la séquence cible, et aussi d'opérer à température suffisamment élevée pour éviter la renaturation de l'ARN à amplifier. Il est également nécessaire que l'ADN polymérase ADN-dépendante résiste à la chaleur, y compris lors de l'étape de dénaturation de l'hétéroduplex ARN-AD Nc qui nécessite des températures élevées, généralement supérieures à 90 C Ce problème est en fait déjà résolu puisqu'on a décrit l'utilisation d'une ADN polymérase provenant de microorganismes capables de survivre dans des conditions de températures élevées, et en particulier la polymérase Taq qui est capable de supporte des températures de l'ordre de 95 C. On connaît déjà, comme signalé ci-dessus, une transcriptase réverse thermostable et capable de jouer en outre le rôle d'ADN polymérase, mais qui nécessite une modification de l'environnement ionique pour exercer cette deuxième fonction (voir MYERS et al, article cité ci-dessus) Une telle enzyme n'est donc pas utilisable dans une méthode o tous les ingrédients -4- doivent être introduits ensemble dès le départ. On a maintenant découvert que certaines transcriptases réverses, non réputées thermostables, sont capables, lorsqu'elles sont utilisées en quantité suffisante, de fonctionner à des températures relativement élevées même après avoir subi le traitement thermique nécessaire à l'étape de dénaturation de l'ARN. La présente invention a donc pour objet un procédé d'amplification d'au moins une séquence spécifique d'ARN, contenu ou susceptible d'être contenu dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à: obtenir une solution de départ contenant 'ARN dudit échantillon dans un tampon approprié, dénaturer par chauffage 'ARN contenu dans ladite solution, traiter la solution obtenue, contenant l'ARN dénaturé, avec une première amorce (ou amorce 3 ') dans des conditions permettant l'hybridation de l'amorce suivie de la synthèse d'un premier brin d'ADN complémentaire de la séquence d'ARN à amplifier, en présence d'une quantité suffisante d'un système enzymatique ayant, dans ledit tampon, une activité de transcriptase réverse, dénaturer l'hétéroduplex ARN-AD Nc formé et traiter la solution obtenue avec une seconde amorce (ou amorce 5 ') dans des conditions permettant l'hybridation de la seconde amorce suivie de la synthèse du second brin d'AD Nc, en présence d'un système enzymatique thermostable ayant, dans le même tampon, une activité d'ADN polymérase, et à soumettre l'AD Nc obtenu à des cycles d'amplification en nombre suffisant pour obtenir le degré d'amplification désiré, caractérisé par le fait que ladite solution contient dès le départ tous les réactifs et solvants nécessaires auxdites étapes, et que l'ensemble des étapes est effectué dans un même conteneur et sans ajout de réactifs ou solvants. La solution de départ est généralement un tampon aqueux approprié permettant à la transcriptase réverse et à l'ADN polymérase de fonctionner, par exemple un tampon Tris, ayant un p H de 7 à 8,5 et de préférence supérieur à 8 Cette solution de départ contient notamment les ions nécessaires aux activités de transcriptase réverse et d'ADN polymérase, qui sont généralement des ions alcalins (Na, K) introduits par exemple sous forme de sels tels qu'un chlorure, à une concentration pouvant aller de 20 à 50 m M, et des ions magnésium, introduits par exemple sous forme de sel de magnésium tel que le chlorure, à une concentration pouvant aller de 1 à 5 m M Elle peut contenir en outre divers ingrédients usuels, par exemple ceux qui sont utilisés dans la partie expérimentale ci-après. La solution de départ peut contenir par exemple de 2,5 ng à 1 gg d'ARN total de l'échantillon à amplifier, pour un volume final de 100 Il L'ARN peut être par exemple dissous dans le milieu liquide ou être introduit dans celui-ci à l'état adsorbé sur un suppport solide approprié. La solution de départ contient bien entendu des nucléosides triphosphates en -5- quantité suffisante pour permettre la synthèse de l'ADN complémentaire, de même que la synthèse des brins d'ADN lorsque la méthode d'amplification est du type PCR Les nucléosides triphosphates peuvent être remplacés, totalement ou partiellement, par des nucléosides modifiés et/ou marqués permettant l'élongation des brins à synthétiser à partir des amorces. Un point critique dans l'amplification de 'ARN réside dans les structures secondaires de 'ARN qui peuvent induire des terminaisons précoces lors de l'étape de transcription r 6 verse Pour cette raison, l'amplification débute par une étape de dénaturation de ARN qui peut être réalisée par exemple par chauffage à une température généralement supérieure à 60 C, par exemple comprise entre 60 et 75 C, pendant 1 à 15 minutes Les conditions optimales, qui varient notamment selon la nature de l'ARN, peuvent être déterminées dans chaque cas par de simples expériences de routine On opère de préférence à une température au moins égale à 65 C. L'amorce 3 ' est généralement une amorce d'ADN Le choix de l'amorce est déterminé par des critères connus Il est possible d'utiliser une amorce oligonucléotidique oligo-d T Pour plus de spécificité, lorsque la séquence du gène est connue, ou lorsque la séquence de la protéine correspondante est connue, on pourra choisir de façon plus précise la localisation de l'amorce 3 ' En particulier, les problèmes liés à une contamination éventuelle par de l'ADN peuvent être maîtrisés dans certains cas en sélectionnant des amorces situées dans des exons séparés ou chevauchant des jonctions de sites d'épissage, ce qui induit dans le premier cas la coamplification de l'ADN et de l'ARN, et on obtient alors des produits d'amplification de tailles différentes facilement séparables, et dans le second cas, l'amplification exclusive de 'ARN Enfin, dans certains cas, on sera amené à choisir des amorces oligonucléotidiques non strictement complémentaires de la cible, pour l'amplification d'ARN de virus endogènes non identifiés ou de séquences inconnues théoriquement proches de séquences connues; c'est le cas notamment lorsque l'on recherche la présence d'un rétrovirus inconnu: on peut alors utiliser une amorce 3 ' complémentaire d'une séquence généralement bien conservée chez les rétrovirus, par exemple une séquence de la région "pol". De préférence, l'amorce 3 ' a une longueur (en nombre de nucléotides) suffisante pour pouvoir s'hybrider à 'ARN à la température de dénaturation choisie On sait que la force d'adhésion d'un ADN hybridé à un ARN ou à un ADN dépend de la nature des bases et du nombre de bases appariées Lorsque le duplex d'hybridation est chauffé, il se produit, à une certaine température, une rupture des liaisons hydrogène entre les bases, avec séparation des deux brins à cette température, dite température de dénaturation ou température de fusion. Cette température de dénaturation augmente avec le nombre de bases, et plus précisément avec le nombre de bases parfaitement appariées Dans le cas présent, il est généralement souhaitable de pouvoir obtenir une hybridation de l'amorce 3 ' à la température de dénaturation de l'ARN afin d'éviter une renaturation de 'ARN pendant cette étape d'hybridation Pour la même raison, on préférera généralement refroidir rapidement, à I'issue de l'étape de dénaturation de -6- ARN, jusqu'à la température à laquelle s'effectuera l'étape de transcription réverse. Généralement, l'amorce 3 ' contient au moins 15 nucléotides et en particulier de 15 à nucléotides, ou davantage lorqu'il est possible d'opérer à température élevée, le choix de la température élevée dépendant notamment de la capacité de la transcriptase réverse à supporter ladite température. Il est possible de déterminer par de simples expériences de routine la température et la durée du traitement thermique que la transcriptase réverse est capable de supporter sans perte notable d'activité On pourra donc effectuer la dénaturation de l'ARN et l'hybridation de l'amorce 3 ' pendant un temps suffisant pour permettre l'hybridation, mais non supérieur à une durée prédéterminée au-delà de laquelle le système enzymatique à activité de transcriptase réverse risquerait d'être inactivé. Il convient de noter que l'amorce 3 ' peut comporter, du côté de son extrémité 5 ', une queue oligonucléotidique non spécifique qui n'intervient pas dans l'hybridation avec la cible, c'est-à-dire avec 'ARN à amplifier Cette queue non spécifique peut comporter par exemple de façon connue un site de restriction (qui facilite un clonage ultérieur), une séquence promotrice (qui facilite une transcription ultérieure), ou toute séquence particulière pouvant favoriser un procédé de réplication ultérieur. Après l'étape de dénaturation et d'hybridation, on peut refroidir la solution, de préférence rapidement, jusqu'à une température prédéterminée permettant la mise en oeuvre de l'activité de transcriptase réverse, ladite température étant suffisamment élevée pour éviter la renaturation de 'ARN, et aussi pour maintenir l'hybridation de l'amorce 3 ' dans des conditions suffisamment discriminantes, c'est-à- dire suffisamment élevée pour éviter toute hybridation insuffisamment spécifique de l'amorce 3 ', étant entendu qu'à la température choisie, la transcriptase réverse doit pouvoir exercer son activité La température choisie pour l'étape de transcription r 6 verse est de préférence au moins égale à 45 ou à 50 C environ, et par exemple comprise entre 50 et 75 C environ, en particulier entre 50 et 60 C. Lorsque la séquence d'ARN à amplifier est inconnue ou n'est qu'imparfaitement connue, et que l'on utilise alors une amorce 3 ' non strictement complémentaire de la cible, il est souhaitable qu'après l'étape de dénaturation de I'ARN, on refroidisse la solution à une température suffisamment basse pour permettre l'hybridation de l'amorce 3 ' à une séquence d'ARN non rigoureusement complémentaire, pendant un temps suffisamment faible pour éviter toutefois des hybridations purement aléatoires ou non spécifiques, après quoi on réchauffe la solution jusqu'à la température prédéterminée choisie pour l'étape de transcription réverse Dans ce cas, on refroidit jusqu'à une température inférieure à 50 C, mais au moins égale à 40 C, en procédant par exemple par essais à des températures de plus en plus basses. On peut ensuite remonter la température jusqu'à celle choisie pour l'étape de transcription réverse; le choix de cette température a déjà été discuté précédemment. La durée de l'étape de transcription réverse dépend évidemment de la longueur du brin d'ARN à amplifier On aura intérêt à choisir le temps le plus court, mais suffisant, -7- permettant d'obtenir un brin d'AD Nc ayant une longueur suffisante pour contenir au moins la séquence complémentaire de la deuxième amorce (amorce 5 ') Lorsque cela sera possible, on déterminera la durée de l'opération de transcription réverse par des expériences de routine. Dans les autres cas, ce temps devra être estimé en prenant garde notamment de ne pas opérer à température trop élevée pour éviter des phénomènes de "fatigue" (perte d'efficacité) de la transcriptase réverse lorsque la séquence d'ARN est relativement longue. La durée de l'étape de synthèse du premier brin d'AD Nc sera généralement inférieure à 15 minutes De préférence, cette durée peut varier de 1 à 10 minutes environ. Pour l'opération de transcription réverse, on pourra utiliser une transcriptase réverse 0 non réputée thermostable, choisie après une simple expérimentation permettant de déterminer les traitements thermiques que l'enzyme étudiée est capable de supporter (dans le cadre défini plus haut), ce qui permet de sélectionner les transcriptases réverses qui sont utilisables dans le procédé de l'invention On a en effet découvert, comme déjà indiqué ci-dessus, que des transcriptases réverses non réputées thermostables l'étaient en fait suffisamment pour pouvoir être utilisées dans un procédé d'amplification d'ARN avec introduction de l'ensemble des réactifs dans la solution de départ. La transcriptase réverse peut être choisie par exemple parmi les transcriptases réverses de virus de la myéloblastose aviaire (en abrégé RT-AMV), et les transcriptases réverses de virus de Moloney de la leucémie murine (en abrégé RT-M Mu LV) On peut citer par exemple la RT-AM Vbo (Boehringer-Mannheim), la RT-AM Vbrl (Bethesda Research Laboratory), la RT-M Mu L Vss (Bethesda Research Laboratory), etc Comme indiqué ci-dessus, la transcriptase réverse doit être utilisée en quantité suffisante pour permettre, après traitement de dénaturation de l'ARN par la chaleur, l'obtention du premier brin d'AD Nc dans les conditions choisies Cette quantité suffisante correspond généralement à un excès par rapport à l'ADN polymérase. La quantité (ou la concentration) de la transcriptase réverse peut être déterminée dans chaque cas par des expériences de routine Elle peut varier par exemple 5 à 200 U, notamment 5 à 20 U pour RT-AMV et 100 à 200 U pour RT-M Mu LV, pour un volume final de il. Après l'opération de transcription réverse, on peut dénaturer l'hétéroduplex ARN-AD Nc formé par chauffage à une température suffisante, par exemple une température supérieure à 90 C Bien entendu, il conviendra alors d'utiliser, en vue des opérations ultérieures d'amplification de l'ADN, un ADN polymérase capable de supporter une telle température, comme par exemple la Taq-polymérase, la r Tth (Cetus), la Pfu DNA Polymérase (Stratagene), la Vent Polymérase (Biolabs), etc Le rapport des proportions de transcriptase réverse et d'ADN polymérase (en unités d'enzyme) est généralement supérieur à 2, et de préférence au moins égal à 3. Après l'étape de dénaturation de l'hybride ARN-AD Nc, on abaisse la température de façon à permettre l'hybridation de la seconde amorce (amorce 5 ') Ici encore, cette température d'hybridation sera choisie de préférence assez élevée, par exemple au moins égale à 500 C, notamment de 50 à 80 'C, de façon à permettre l'hybridation dans des conditions suffisamment discriminantes. Les critères de choix de l'amorce 5 ' et de sa longueur sont évidemment les mêmes, avec les adaptations nécessaires, que ceux exposés ci- dessus pour le choix de l'amorce 3 ', et lorsque l'amorce 5 ' sera une amorce non strictement complémentaire de la cible, on pourra, comme précédemment, refroidir la solution à une température suffisamment basse (par exemple inférieure à 50 C, notamment entre 40 et 50 'C) pour permettre l'hybridation de l'amorce 5 ' à une séquence d'ADN non rigoureusement complémentaire, pendant un temps suffisamment faible pour éviter des hybridations purement aléatoires ou non spécifiques, après quoi on réchauffera la solution jusqu'à une température prédéterminée choisie pour l'étape de synthèse du second brin d'AD Nc. Cette étape de synthèse du second brin d'AD Nc s'effectue à une température suffisamment discriminante, c'est-à-dire une température suffisamment élevée mais restant compatible avec le maintien de l'hybridation spécifique de l'amorce 5 ', en particulier une température d'au moins 50 'C (par exemple de 50 à 80 'C environ) Les étapes d'hybridation de l'amorce sur le premier brin d'AD Nc et de synthèse du second brin d'AD Nc peuvent être effectuées à la même température. Les amorces 3 ' et 5 ' peuvent être utilisées par exemple en quantités sensiblement équimolaires Ces amorces, qui peuvent être constituées d'ARN ou d'ADN, sont utilisées en grand excès, comme cela est connu pour les réactions d'amplification L'amorce 5 ' peut comporter à son extrémité 5 ' une queue oligonucléotidique non spécifique, comme on l'a déjà expliqué plus haut à propos de l'amorce 3 '. Après l'étape de synthèse du second brin d'AD Nc, on peut soumettre l'AD Nc double brin obtenu à un nombre suffisant de cycles d'amplification selon les méthodes connues, par exemple par dénaturation de l'ADN double brin, hybridation des amorces 3 ' et 5 ' sur les brins d'ADN néoformés dont elles sont respectivement complémentaires et synthèse de produit d'élongation sous l'action de l'ADN polymérase De tels cycles d'amplification peuvent être effectués selon les méthodes connues par simples traitements thermiques à diverses températures, par exemple une température de 90-980 C environ pour la dénaturation de l'ADN double brin, une température de 40-80 'C environ pour l'hybridation des amorces et une température de 60-80 'C environ pour la synthèse des produits d'élongation Ces cycles d'amplification, de même que l'ensemble des étapes du procédé de l'invention, peuvent être mis en oeuvre de façon automatique dans des appareils programmables du commerce. Le procédé de l'invention est applicable notamment au diagnostic des infections virales ou bactériennes, et des désordres génétiques Il est applicable aussi au typage bactérien ou viral, et au typage cellulaire, y compris le ELA Il est applicable également au clonage d'endogènes non identifiés ou de séquences d'ARN inconnues théoriquement proches mais différentes de séquences connues en utilisant l'étape d'hybridation à température contrôlée, -9- suffisamment basse, entre l'étape de dénaturation de l'ARN et la synthèse de l'AD Nc Le procédé de l'invention permet également d'amplifier de l'ARN in situ sur tissus (par exemple sur tissus fixés, sur tissus congelés ou sur frottis convenablement préparés) déposés ou fixés sur un support, le compartiment réactionnel étant par exemple délimité par la lame-support sur laquelle est fixé le tissu et une lame couvrante scellée, comme cela était réalisé pour l'amplification de l'ADN; voir Nuovo GJ et al, Am J Pathol, 139, 847- 854 ( 1991). Le procédé de l'invention peut être utilisé pour réaliser des coamplifications, soit avec des systèmes d'amorces distincts, soit avec une amorce 3 ' commune. L'invention concerne également l'utilisation comme sonde (dans un procédé de détection du virus HIV 1) ou comme amorce (dans un procédé d'amplification quelconque de ARN du virus HIVI 1, y compris un procédé tel que décrit dans la présente demande), d'une séquence oligonucléotidique: comprenant la séquence CCTATCTGTCCCCTCAGCTAC utilisable notamment comme amorce 3 ', ou comprenant la séquence TCTATCAAAGCAACCCAC utilisable notamment comme amorce 5 '. Les avantages procurés par l'utilisation de ces séquences ressortent de la partie expérimentale ci-après. L'invention a également pour objet des oligonucléotides purifiés, comportant par exemple au plus 30 nucléotides environ, et contenant l'une des deux séquences qui viennent d'être définies Lesdits oligonucléotides purifiés peuvent comporter, à au moins l'une des extrémités de la séquence minimum indiquée, des nucléotides qui peuvent être choisis parmi ceux entourant ladite séquence dans l'ADN complémentaire correspondant à l'ARN du VIH-1. Lesdits oligonucléotides purifiés peuvent également contenir à leur extrémité 5 ' une queue oligonucléotidique non spécifique, commme cela a été expliqué ci-dessus à propos des amorces d'amplification Les oligonucléotides purifiés de l'invention peuvent également contenir des nucléotides modifiés et/ou marqués avec un agent traceur Ils peuvent être utilisés notamment comme sondes de capture ou de détection dans une méthode de diagnostic des infections par le VIH-1, et/ou comme amorces d'amplification Ils peuvent être préparés selon les procédés classiques de la synthèse d'oligonucléotides. On va maintenant illustrer davantage l'invention à l'aide de la partie expérimentale donnée ci-après Dans les exemples qui suivent, les amorces peuvent également être appelées "amplimers" ou encore "primers", et l'amorce 3 ' peut être également appelée "primer inverse". La technique de transfert d'ADN, dite transfert de Southern, depuis un gel, par exemple après électrophorèse, sur une membrane o l'ADN peut être hybridé avec une sonde nucléique marquée est désignée par l'expression "Southern Blot" Il en va de façon analogne pour la technique de transfert d'ARN dite transfert de Northern Dans ces exemples, on fera référence -10aux dessins annexés dans lesquels: la fig 1 est un schéma de l'organisation des ARN messagers du VIH-1, avec indication des sondes ou amorces employées; la fig 2 représente le signal observé, en coups par minutes (cpm) après amplification selon la procédure décrite à l'exemple 1, en fonction du pourcentage initial de cellules infectées (deux manipulations indépendantes); la fig 3 est une image en autoradiographie obtenue après amplification et transfert de Southern selon le procédé de l'exemple 2; la colonne MPM (Marqueurs de poids moléculaire) représente des étalons de poids moléculaire; les nombres indiqués dans la 0 colonne de gauche sont des nombres de nucléotides; les fig 4 et 5 représentent les images obtenues en autoradiographie respectivement après amplification et transfert de Southem respectivement dans les exemples 3 et 4; la fig 6 est un schéma des cycles de températures utilisés à l'exemple 5, avec indication du moment de l'introduction des réactifs; la fig 7 est l'image obtenue en autoradiographie après amplification et transfert selon le procédé de l'exemple 5; les références portées sur la fig 7 correspondent aux divers modes opératoires indiqués à la fig 6; la fig 8 est l'image en autoradiographie obtenue à l'issue du procédé de l'exemple 6; la fig 9 est l'image en autoradiographie obtenue à l'issue du procédé de l'exemple 7; les références des diverses colonnes correspondent aux quantités (n M) d'amorce 3 '; la fig 10 représente l'image en autoradiographie obtenue à l'issue du procédé de l'exemple 8; les références des colonnes correspondent aux quantités d'ARN de l'échantillon analysé (en ng); le trait correspondant à la bande observée sur la photographie originale de la colonne 2 5 a été renforcé pour être davantage visible sur les reproductions de la fig 10; la fig 1 1 représente les images d'autoradiographie obtenues à l'issue des diverses expériences décrites à l'exemple 9 (chapitre "Identification de fragments amplifiés"); la fig 12 représente les images obtenues en autoradiographie dans les expériences décrites à l'exemple 9 (chapitre "Qualité de l'amplification"). 11- PARTIE EXPERIMENTALE Le modèle biologique étudié dans cette partie expérimentale est I'ARN du virus de l'immunodéficience humaine, VIH-1 La structure des AR Nm du virus et en particulier la localisation des sites donneurs (dl à d 4) et accepteurs (al à a 10) d'épissages, la nomenclature des exons (traits gras marqués 1 à 7 avec caractérisation A,B,D,AE,BE ou E) et des introns (i 4 à i 5) ainsi que la localisation des amplimers 5 ' (flèche de gauche à droite), des primers inverses/amplimers 3 ' (flèche de droite à gauche) et des sondes (blocs gras) sont répertoriés dans la figurer Les amorces et sondes oligonucléotidiques ont été synthétisées sur un synthétiseur Applied Biosystem 394 DNA/RNA, analysées et purifiées en HPLC phase inverse lorsque cela était requis Elles sont répertoriées dans le tableau 1 ci- dessous La numérotation utilisée dans la figure 1 et le tableau suit la nomenclature du clone moléculaire HIV-HXB 2 R (Lawrence, J, et al 1990, edited 1 5 by Myers, G, et al). Tableau 1: amorces et sondes oligonucléotidiques. -Amplimers et primers inverses. Analyse des AR Nm multi-épissés. * 335 ( 171-189) amplimer 5 ': ATCTCTAGCAGTGGCGCCC * 338 ( 7967-7949) amplimer 3 ' et primer inverse: TTCCTTCGGGCCTGTCGGG Analyse des AR Nm mono-épissés. * 335 ( 171-189) amplimer 5 ': ATCTCTAGCAGTGGCGCCC * 337 ( 5933-5912) amplimer 3 ' et primer inverse: CACAAAATAGAGTGGTGGTTGC Analyse des AR Nm utilisant les sites d'épissage d 4-a 10. * 1082 ( 5580-5591 à 7925-7930) amplimer 5 ': TCTATCAAAGCA-ACCCAC * 972 ( 8254-8234) amplimer 3 ' et primer inverse: CCTATCTGTCCCCTCAGCTAC - Sondes * 344 ( 5540-5524) Exon 5: TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTC * 343 ( 5526- 5507) Exon 4 B: CTTCCTGCCATAGGAGATGC * 455 ( 5382-5359) Exon 4: CTCCATTCTTGCTCTCCTCTGTC * 345 ( 5654-5676) Intron 4: CCACACAACTATTGCTTATTA * 338 ( 7967-7949) Exon 7: TTCCTTCGGGCCTGTCGGG * 519 ( 5524-5541) Exon 5: AAGAAGCGGAGACAGCGA * 526 ( 5754-5773) Intron 4: AGCAGAAGACAGTGGCAATG 12 - EXEMPLE 1: Efficience et Sensibilité de la méthode en une étape. Pour déterminer la sensibilité de la méthode d'amplification en une étape unique de manipulation, nous avons défini un couple d'amplimers, à l'aide des jonctions des sites accepteurs d 4-a 8 du virus VIH-1 (Tat exonsl-4-7, Rev exons 1- 4 A-7, Nef exons 1-5-7, figure 1), conduisant à l'amplification spécifique d'AR Nms multi-épissés du virus VIH-1 (l'aspect épissage du VIH-1 sera développé ultérieurement dans l'exemple 9) 1 pi de ARN guard (Pharmacia LKB Biotechnology) est ajouté, comme inhibiteur de RN Ase, à tous les échantillons, 0 ceux-ci contenant 1 gig d'ARN Les ARN ont été extraits à partir de la lignée lymphoide H 9 infectée par la souche HTLV-IIIB, par la technique dite du guanidium isothiocyanate (Chirgwin J M, et al 1979 Biochem 18:5294-5299) suivie d'une ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium (Gilsin V, et al 1973. Biochem 13:2633-2638) La concentration finale du tampon utilisé est 1 Om M Tris 1 5 p H 8 3, 50 m M KCI, 1 5 m M Mg CI 2, 0 01 % gélatine Les concentrations finales sont: amplimers 310 n M, d NT Ps 250 p M,Taq polymérase (Perkin Elmer-Cétus) 2 5 U, RT-AMV (Boehringer-Mannheim) 10 U Le protocole d'amplification, réalisé dans un thermo-cycleur, consiste en une incubation de 10 minutes à 65 C (dénaturation de l'ARN et hybridation du primer inverse lui-même identique à l'amplimer 3 '), puis 8 minutes à 500 C (réverse transcription), puis 5 minutes à 950 C (dénaturation des hybrides ADN/ARN et inactivation de la réverse transcriptase), puis consécutivement, 35 cycles de PCR sont alors réalisés, un cycle consistant en 1 minute à 95 C pour la dénaturation de l'ADN, 1 minute à 5500 pour l'hybridation des amplimers sur les matrices ADN monocaténaires, et 1 minute à 72 O C pour l'élongation des amorces oligonucléotidiques (amplimers); le dernier cycle présente de plus une extension de 7 minutes de l'étape d'élongation afin de terminer la synthèse des fragments d'ADN incomplets Les produits de RT- PCR sont ensuite analysés en southern blot Ils sont analysés sur gel d'acrylamide 5 % puis l'ADN est dénaturé à la chaleur par immersion du gel dans de l'eau bouillante pendant 5 minutes, puis le gel est équilibré dans un tampon de transfert (Tris base 89 m M, acide borique 89 m M, EDTA 2 m M, p H 8,0) L'ADN subit alors un transfert électrique ( 1 heure, 300 m A, 4 C) sur membrane de nylon et est fixé aux UV La préhybridation est réalisée pendant une nuit à 4200 dans un tampon 5 x SSC, 0 1 % SDS, Denhart 5 X, ADN de sperme de saumon 0 2 mg/ml, formamide désionisée 18 %, et l'hybridation est réalisée pendant 4 heures à 500 C, dans le susdit tampon, contenant 106 cpm/ml de la sonde oligonucléotide marquée au dd ATP 32 P à l'aide de l'enzyme terminale transférase (Boehringer Mannheim), à une activité spécifique de 108 cpm/mg Les filtres sont alors lavés en 1 x SSC, 0 1 % SDS, 10 minutes à température ambiante et 10 minutes à 50 C, puis développés par 13 autoradiographie 3 heures à -80 C L'analyse en southern blot d'AR Ns amplifiés par les primers 1082-972 (voir tableaul et figure 1) met en évidence en autoradiographie la bande de 340 pb attendue, révélée avec la sonde 338 (tableau 1, figure 1) Aucun signal n'a pu être observé, que ce soit en absence de RT ou lorsque la PCR a été réalisée en présence de 1 p g d'ADN, extrait de cellules infectées HTLV-IIIB, comme cela était attendu Une bande faible, observée après 4 heures d'autoradiographie à -80 C, prouve que I'ARN spécifique du VIH peut être détecté quand une cellule sur 106 est infectée, en utilisant la méthode en une étape selon l'invention Les rendements d'extraction permettent d'affirmer que P'ARN d'environ 0 1 cellules H 9 infectée est présent dans l'échantillon ( 1 glg d'ARN) résultant de la dilution finale utilisée pour la RT-PCR Le seuil de sensibilité de l'essai est donc vraisemblablement compris entre 10 et 100 copies d'une cible donnée L'essai en une étape a été aussi testé pour la quantification potentielle 1 5 d'ARN, à l'aide d'une dilution séquentielle d'un facteur dix des cellules infectées. Une courbe de PCR typique, représentant la quantité de signal généré en fonction de la proportion de cellules infectées a été déterminée (figure 2): le résultat indique que, dans ces conditions expérimentales, le signal obtenu est corrélé à la concentration initiale d'AR Nm cible. EXEMPLE 2: Comparaisons de plusieurs RT-AMV avec plusieurs RT-M Mu LV. Les conditions expérimentales utilisées sont essentiellement identiques à celles décrites dans l'exemple 1 L'ARN est extrait de cellules H 9 infectées par la souche HTLV-IIIB, les primers utilisés sont 335 et 337, les enzymes sont la RT-AM Vbm (Boehringer-Mannheim), à 10 U par réaction, la RT-AM Vbrl (Bethesda Research Laboratory), à 10 U par réaction, la RT-M Mu L Vbrl (Bethesda Research Laboratory), à 200 U par réaction, la RT-M Mu L Vss clonée et ne possédant pas d'activité RN Ase H (Bethesda Research Laboratory), à 200 U par réaction, les cycles de température étant de 10 minutes à 650 C, 8 minutes à 50 oc, 5 minutes à 95 C, puis consécutivement, 35 cycles de PCR sont alors réalisés, un cycle consistant en 1 minute à 95 C, 2 minutes à 55 C, et 2 minutes 30 secondes à 72 C; le dernier cycle présente de plus une extension de 7 minutes de l'étape d'élongation. L'analyse en southern blot (cf exemple 1) d'AR Ns amplifiés par les primers 335-337 (voir tableaul et figure 1) met en évidence la bande majoritaire attendue à 530 pb (figure 3), révélée avec la sonde 526 (tableau 1, figure 1) Les intensités respectives des signaux montrent la plus grande efficacité de la RT-AMV, quelle que soit sa source d'obtention. 14 - EXEMPLE 3: Influence de l'ajout de RN Ase H avec la RT-AMV. Les conditions expérimentales utilisées sont essentiellement identiques à celles décrites dans l'exemple 1 L'ARN est extrait de cellules H 9 infectées par la souche HTLV-IIIB, les cellules infectées représentant soit 100 % (A) soit 1 % (B) de la population traitée Les primers utilisés sont 335-337, la quantité de RN Ase H (Boehringer Mannheim) introduite est de 1 Unité, 0 1 Unité, 0 01 Unité et O Unité comme contrôle Les cycles de température utilisés sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 2 L'analyse en southern blot (cf exemple 1) d'AR Ns amplifiés par les primers 335-337 (tableaul, figure 1) met en évidence la bande attendue à 530 pb (figure 4), révélée avec la sonde 526 ( tableau 1, figure 1) Aucune différence notable n'est observée, indépendamment de la quantité initiale d'ARN cible. Remarquons également que, indépendamment du fait que la RT-M Mu L Vss (RN Ase H moins) soit moins efficace que les RT-AMV (exemple 2 figure 3), elle est cependant notablement plus efficace que les RT-M Mu LV non clonées présentant une activité RN Ase H (exemple 2 figure 3) L'ensemble de ces résultats montre que l'efficacité de la méthode n'est pas due à une activité RN Ase H présente dans le tube réactionnel. EXEMPLE 4: Cinétique de température. Les conditions expérimentales utilisées sont essentiellement identiques à celles décrites dans l'exemple 1 L'ARN est extrait de cellules H 9 infectées par la souche HTLV-IIIB, les primers utilisés sont 335-337 Le cycle d'amplification, réalisé dans un thermo-cycleur consiste en une incubation de 10 minutes à 65 C, puis la réverse transcription est réalisée à 8 minutes à différentes températures, respectivement 40 C, 45 C, 50 C, 55 C, 60 C, puis 5 minutes à 95 C, et consécutivement, 35 cycles de PCR sont alors réalisés, un cycle consistant en 1 minute à 95 C, 2 minutes à 55 C, et 2 minutes 30 secondes à 72 C; le dernier cycle présente de plus une extension de 7 minutes de l'étape d'élongation. L'analyse en southern blot (cf exemple 1) d'AR Ns amplifiés par les primers 335-337 (tableau 1, figure 1) met en évidence la bande attendue à 530 pb (figure 5), révélée avec la sonde 526 (tableau 1, figure 1) Les intensités respectives des signaux ne montrent pas une décroissance notable de l'efficacité de l'amplification, et donc de l'efficacité de la RT-AMV, dans une gamme de température comprise entre 40 O C et C, pendant 8 minutes, en plus du cycle de dénaturation à 65 C pendant 10 minutes. EXEMPLE 5: Positionnement de la Taq et de l'amplimer 5 ' dans la réaction d'amplification. Les conditions expérimentales utilisées sont identiques à celles décrites dans - l'exemple 1 L'ARN est extrait de cellules H-19 infectées par la souche HTLV-IIIB, les primers sont 335- 337, la Taq et/ou l'amplimer 5 ' étant introduits dans le tube réactionnel soit dès le début de la réaction, soit à la fin de l'étape de synthèse de l'AD Nc de 8 minutes à 50 C Les quatre combinaisons ont été réalisées et sont explicitées sur le schéma de la figure 6 Les cycles de température utilisés sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 2 L'analyse en southern blot (cf exemple 1) d'AR Ns amplifiés par les primers 335-337 (tableaul, figure 1) met en évidence la bande majoritaire attendue à 530 pb (figure 7), révélée avec la sonde 526 (tableau 1, figure 1) Aucune différence significative est observée, quels que soient le moment d'introduction de la Taq et I ou de l'amplimer 5 '. EXEMPLE 6: influence du moment d'introduction de la RT Les conditions expérimentales utilisées sont essentiellement identiques à celles décrites dans l'exemple 1 L'ARN est extrait de cellules H 9 infectées par la souche HTLV-IIIB, les primers sont 335-337 ou 335-338 Les cycles de température utilisés sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 2 La réverse transcriptase est présente dans le tube réactionnel dès le début de la réaction (A) ou introduite après l'étape de dénaturation/hybridation à 65 C (P) L'analyse en southern blot (cf exemple 1) d'AR Ns amplifiés par les primers 335-337 ou 335-338 (tableaul, figure 1) met en évidence les bandes caractéristiques attendues (figure 8), révélées avec la sonde 519 (tableau 1, figure 1) Dans le cas o la RT est introduite après l'étape de dénaturation, on peut remarquer en particulier pour l'amplification d'AR Nm fortement structurés ( 335-338, colonne P) un accroissement des signaux aspécifiques dont l'interprétation sera développée ultérieurement (cf exemple 9). EXEMPLE 7: influence de la quantité de primer 3 ' (primer inverse et amplimer) Les conditions expérimentales utilisées sont essentiellement identiques à celles décrites dans l'exemple 1 L'ARN est extrait de cellules H 9 infectées par la souche HTLV-IIIB, 250 ng d'ARN sont utilisés comme substrat réactionnel, les primers sont 335-338, la quantité de primer inverse ( 338) étant soit de 310 n M (équimolaire avec l'amplimer 5 '), soit de 930 n M Un essai a également été réalisé en utilisant l'enzyme r Tth avec une concentration de 750 n M du primer inverse et de 150 n M de l'amplimer 5 ', selon une méthodologie décrite dans le paragraphe Il ( Myers T W, et ai 1991 Biochem 30:7661-7666) Les cycles de température utilisés sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 2 L'analyse en southern blot (cf exemple 1) d'AR Ns amplifiés par les primers 335-338 (tableaul, figurer) met en évidence les bandes caractéristiques attendues (figure 9), révélée avec la sonde 519 (tableau 1, figure 1) Aucune différence tant qualitativement que quantitativement n'est observée, quelle que soit la quantité de primer inverse Il ne semble donc pas 16 - nécessaire d'utiliser celui-ci en excès par rapport à l'amplimer 5 '. EXEMPLE 8: influence de la quantité d'ARN dans le tube réactionnel. Les conditions expérimentales utilisées sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1 L'ARN est extrait de cellules H 9 infectées par la souche HTLV-l IB, les cellules infectées représentant 0 01 % de la population traitée La quantité d'ARN total utilisée est de 2 5, 10, 25, 100, 250 et 1000 ng L'analyse en southern blot (cf exemple 1) d'AR Ns amplifiés par les primers 1082-972 (tableaul, figure 1) met en évidence la bande 340 pb attendue (figure 10), révélée avec la sonde 338 (tableau 1, figure 1) Le signal obtenu est proportionnel à la quantité initiale d'ARN cible et semble indépendant de la quantité totale d'ARN présente dans le tube réactionnel. EXEMPLE 9: comparaison des paramètres réactionnels impliqués dans la RTPCR. On a comparé les efficacités relatives des méthodes dites en "une étape" ou en "deux étapes", en utilisant à la fois la RT et la Taq. Dans la méthode en 'deux étapes", nous avons étudié l'influence des paramètres volume, tampon et température sur l'hybridation du primer inverse ainsi que sur la transcription inverse Les différents protocoles de RT-PCR comprenant en outre l'ensemble des constituants impliqués dans la réaction, leur concentration ainsi que l'ordre séquentiel de leur introduction sont répertoriés dans le tableau 2. gi 1 de ARN guard (Pharmacia LKB Biotechnology) est ajouté à tous les échantillons, ceux-ci contenant 1 zig d'ARN Les ARN ont été extraits à partir de la lignée promonocytique U 937 infectée par la souche VIH-LAV. Dans le tableau 2, chaque colonne correspond à un mode de réalisation particulier utilisé, selon les amorces employées, soit pour l'amplification de la région Reg, soit pour l'amplification de la région Env Chaque numéro d' échantillon, arbitraire, correspond à une expérience particulière Dans tous les cas, la dénaturation de l'ARN est effectuée par chauffage pendant 10 minutes à 650 C. Elle est suivie soit d'un refroidissement lent (+) en 30 minutes à 420 C, soit la réaction est immédiatement enchaînée avec l'étape de réverse transcription (e) ou le tube est refroidi rapidement dans la glace (-) Pour la réaction de synthèse du premier brin d'AD Nc (Extension), on a indiqué sur la première ligne le temps en minutes (sauf indications contraires) et sur la seconde ligne la température en OC. 000 e seinulw S L ep l Aln S 001 00 00 O 1 00 1 00 1 00-L ook (ri) leule awnlo A edele + + + + + + 9 nole + + (v AUO L), S 1 ewlldwe L edeg + + + + + + glnofe + + ns'z be L OSZ O Z 09 ? OGSZ OSZ O Sz OS? 50 O Sz 9 Od P Od l Od X Od L Od P Od k 9 Od Od LXU Od Lx Id Od L"d Od krd Od LXU Od Ld Od L"d Od L Od S S'. l::Od o 'ull - 0056-Ul W ú 09 Zb S b OS zi Sb OS Os ST SV Ist 141 O QL 4 k 01 8 y 41 86 86 86 86 86 86 00 OL 8 86 j.ed Le + + + + +no+ + OSZ 50 Z 50 ZO S o 09 O O? O L O OZ S ' S'I S ' S' S' S' Si' S'V S - I Xl I Od LXH Od lxd::Od XU Od I Xd Od XP:Od X'd Od CX:Od l d Od (Wv) dl NP (yw") 3106 v A N Od VJ. (c a V lu 3) S Od uollefnleuec U Ol S Ue IX 3 (li) Ieuli U ewnlo A (not) AVYV (V Ap) d LNP (Rw) gl O 6 m N Od IVI (Z 3 d V 13) NOI Jd ILOSNV Hi U q S:IA 3: + + + e lue Weslplo J 4 e U o 09-u L uol Jneue L/6 001 k O O L:S; 0 01 01-8 01-8 Z O Z O S? O S? SL S- LX.d Od Lxd Od I I. O fi OZ OZ (Id) leu 1-i awnlo A 0 O (nl)A/V-_ld:be L O o (Wu),S Jwlldwue S I O S k (Wu), j wlldwe 0 O (Wi) dl NP 0 O (Rw) Z 106 R ea nie N Od W vl 1 1 ( 6 i) NUV (IL:d V L:q) NOI L Vl I Ui SAH 9 L SL /L EL ZL L L> 8 L IL AU 3 98 998 8 889 ? 8 1 8 > 89 L 8 Be U uollueq O 3 U Od-LU ep se Jnp 9 ooja sap uolldlosa Q:? nelqej Ll - T 69069 Z L 6 O OL 0 Z os? S'- L::Od I. /6 O'S 01-8 1. I.D L 6 OSZ 01.-8 S? LX Ud Od 1- L 6 OS? OSZ S'L Vbd Od I. L 6 O S? I. 0 q. S'1- L.xbl Od 1- 0 OL S E -18- Chaque échantillon est stocké dans la glace avant tout apport de réactifs lorsque ceci est requis L'hybridation du primer inverse (étape 1) est réalisée dans de l'eau ou dans un tampon 10 m M Tris p H 8 3, 50 m M KCI, 1 5 m M Mg CI 2, 0 01 % gélatine (appelé PCRX 1) ou dans un tampon 30 m M Tris p H 8 3, 150 m M KCI, 4 5 m M Mg CI 2, 0 01 % gélatine (appelé PC Rx 3), à 650 C, avec ou sans refroidissement lent à 420 C Les primers inverses, 338 (tableau 1, figure 1) pour les ARN multi-épissés (appelés Reg dans le tableau 2), 337 (tableau 1, figure 1) pour les ARN mono- épissés (appelés Env dais le tableau 2), sont choisis comme étant identiques à l'amplimer 3 ' impliqué dans la réaction de PCR L'étape de réverse transcription est réalisée en présence de concentrations de Mg CI 2 et de d NT Ps adaptées soit à l'activité de la réverse transcriptase soit de la Taq polymérase, en faisant varier à la fois le temps (de 8 minutes à 1 heure) et la température ( 42 C à 500 C) de la réaction de synthèse de l'AD Nc La concentration de la RT-AMV (Boehringer Mannheim) est de 1 OU pour 1 A Ig d'ARN Avant l'enchainement des cycles de PCR, les hybrides AD Nc/AR Nm sont dénaturés et la réverse transcriptase inactivée par chauffage de l'échantillon à 95 C pendant 5 minutes 35 cycles de PCR sont alors réalisés, un cycle consistant en 1 minute à 950 C pour la dénaturation de l'ADN, 2 minutes à 550 C pour l'hybridation des amplimers sur les matrices ADN 2 monocaténaires, et 2 minutes à 72 C pour l'élongation des amorces oligonucléotidiques; le dernier cycle présente de plus une extension de 7 minutes de l'étape d'élongation afin de terminer la synthèse des fragments d'ADN incomplets La concentration de la Taq polymérase (Perkin Elmer-Cetus) est de 2.5 U pour 1 lpg d'ARN initial Dans tous les cas, la réaction de PCR est réalisée dans le tampon 1 Om M Tris p H 8 3, 50 m M KCI, 1 5 m M Mg CI 2, 0 01 % gélatine. Nous avons choisi l'AR Nm du VIH-1 comme modèle parce qu'il est connu pour présenter une stratégie complexe de l'épissage ( Schwartz S, et ai 1990 a J Virol 64 ( 6):2519-2529) liée au type cellulaire (Robert- Guroff M, et al 1990 J Virol 64 ( 7):3391-3398) et à l'état de différenciation de la cellule L'épissage différentiel conduit à trois classes d'AR Nm, non-épissés, mono-épissés et multi-épissés, qui peuvent être identifiées respectivement en Northern blot par trois bandes majeures respectivement de 9 5, 4 3 et 1 8-2 Kb Cependant, les AR Nm du VIH forment une famille complexe comprenant plus de 20 AR Nm, et seuls des outils très performants tels que la méthode de protection par des ribonucléases ou la RT-PCR peuvent permettre de discriminer entre plusieurs AR Nm dans une même classe Une difficulté supplémentaire concerne les structures secondaires de fortes stabilités situées dans les AR Nm rétroviraux et qui pourraient compromettre la réaction de synthèse de l'AD Nc. 19 - 1/ Identification de fraaments amplifiés Le typage phénotypique des AR Nm de VIH a été réalisé à l'aide de primers spécifiques des classes décrites précédemment, choisis dans des exons séparés, respectivement 337-335 (tableau 1, figure 1) pour l'identification de AR Nm mono- épissés et 338-335 (tableau 1, figure 1) pour la caractérisation de AR Nm multi- épissés Cette localisation de primers ne permet pas l'amplification d'ADN potentiellement contaminant et d'ARN génomique La même analyse a été réalisée à la fois pour les essais en une étape (tableau 2, colonnes K 8 et K 7) et en deux étapes (tableau 2, colonnes 84 et 74) Les amplimers, primer inverses et sondes oligonucléotidiques spécifiques des divers introns et exons sont répertoriés dans le tableau 1 et localisés sur la figure 1 Sur la figure 11 est indiquée en face de chaque bande son équivalence en jonction d'exons, la nomenclature utilisée étant celle décrite sur la figure 1 L'analyse en southern blot (cf exemple 1) d'AR Nm multi-épissés amplifiés à l'aide des amorces 335- 338 a mis en évidence un modèle complexe qui peut être résolu grâce à des sondes discriminantes (figure 11, colonnes K 8 et 84) Les AR Nm mono-épissés n'ont pas été amplifiés, comme cela était attendu, par les primers 335-338, (figure 11, sonde 345, colonnes K 8 et 84) car le fragment d'acide nucléique est trop long pour être amplifié dans ces conditions de PCR L'ARN amplifié par les primers 335-338 (figure 11, colonnes K 8 et 84) a produit un modèle complexe comprenant 4 bandes qui pourraient être interprétées comme des AR Nm codant pour les protéines Nef, Rev, Tat et Vif ( Schwartz S, et al. 1990 a J Virol 64 ( 6):2519-2529; Guatelli J C, et al 1990 J Virol 64 ( 9):4093-4098. Robert-Guroff M, et al 1990 J Virol 64 ( 7):3391-3398) La bande inférieure d' environ 231 pb, correspondant aux exons 1-5-7, codant pour la protéine Nef, a été révélée par la sonde 344 (exon 5) mais pas par les sondes en amont ( 343, 455) ni par la sonde intron Env ( 345) La bande immédiatement supérieure, d' environ 247 pb, révélée à la fois par les sondes 344 (exon 5) et la sonde 343 (exon 4 B), mais négative avec les sondes 455 (exon 4) et 345 (intron 4), correspond à l'AR Nm codant pour Rev suivant les jonctions exon 1-4 B-7 Les bandes supérieures, d'environ 430 à 1295 pb, révélées par toutes les sondes, sauf celle correspondant à l'intron env ( 345) peuvent correspondre aux exons 1-4-7 et 1-2 A-7, codant respectivement pour les AR Nms Tat et Vif Les bandes supplémentaires (*a, *b, *c, *d) sont difficiles à interpréter Les bandes appelées *a et *b peuvent être le résultat de l'utilisation des deux sites accepteurs a 4 et a 5 (révélés par les sondes 344 et 343, mais négatifs avec la sonde 455) et peuvent représenter les AR Nms 1-3-4 A- 6 D-7 ( 422 pb) et 1-3-4 B-6 D-7 ( 436 pb) pouvant coder pour un AR Nm codant pour une protéine présentant une activité de type Rev, comme dans le cas de la protéine Tev (Benko D M, et al 1990 J Virol 64:2505-2518) La bande *c d'environ 730 pb est interprétée comme un AR Nm utilisant les sites accepteurs de Rev (a 4 et a 5). - L'analyse en southern blot (cf exemple 1) d'ARN amplifiés par lesprimers 335-337 (figure 11, colonnes K 7 et 74), a mis en évidence deux bandes pouvant être interprétées comme des AR Nms codant pour les protéines Env Npu et Tat (Schwartz S, et al 1990 b J Virol 64 ( 11):5448-5456) La bande inférieure d'environ 530 pb pourrait être I'AR Nm de Env Npu, correspondant aux exons 1-5 E, révélés à la fois par les sondes 345 (exon 4) et 344 (exon 5), mais négatifs pour les sondes présentes en amont ( 343 et 455) La bande immédiatement supérieure, d'environ 729 pb, révélée par les sondes 345 (intron 4), 455 ( exon 4), 343 (exon 4 B) et 344 (exon 5), peut être interprétée comme un AR Nm 1-4 E codant pour la protéine Tat Trois bandes appelées *e, *f et *g n'ont toujours pas été expliquées. La réactivité avec les sondes 343 et la non-réactivité avec la sonde 455 sembleraient prouver que les AR Nms *e et *f utilisent les sites accepteurs de Rev. De plus, de nombreuses bandes inattendues ont été observées dans la colonne 74, à l'aide des sondes 344, 343, 455 (parenthèses A, B, C) La distribution typique de ces bandes, suivant le signal des sondes et leur répartition, a permis de les identifier comme résultant de l'amplification des AR Nms multi-épissés (cf paragraphe précédent, amplification 335-338) Ces bandes peuvent être identifiées par l'absence de signal avec la sonde intron d'Env ( 345) et par la perte des bandes typiques ressemblant à celles de Nef et Rev, utilisant respectivement les sondes 343 et 455 En outre, du fait que leur taille est d'environ 20 pb inférieure à celle obtenue lors de l'amplification des AR Nm multi-épissés originaux, ces bandes ne résultent pas de la contamination par le primer 338 Juste en amont de la région du primer 338 se trouve la séquence suivante AAA /ACQCCACCTCCCAACCCC AG (exon 5 / exon Z) qui présente des similitudes (soulignées) avec le primer Env inverse 337 GCAACCACCACTQTCTA'FTGTG, incluant 11 puissantes interactions potentielles (A-T, G-C) avec un noyau central riche en C et une interaction faible (G-T) à la terminaison 3 ' Nous pouvons alors nous attendre à ce que, sous des conditions non-optimales de la transcription inverse, un AD Nc soit généré, et à ce que dans la PCR subséquente, ce signal non spécifique soit considérablement amplifié Nous avons d'ailleurs observé ce phénomène lors de l'étude de différentes conditions de RT-PCR décrites ci-dessous. 2/Qualité de l'amplification La RT-PCR inclut trois étapes, successivement l'hybridation du primer inverse avec ARN, la synthèse AD Nc et l'amplification PCR De nombreux protocoles décrivent différentes conditions pour chacune de ces trois étapes, notamment les étapes d'hybridation et de transcription inverse Nous avons donc testé différentes façons de réaliser la RT-PCR (tableau 2), comprenant différentes conditions pour l'hybridation du primer inverse (Hybridation, étape 1) et la synthèse 21 - de l'AD Nc (Reverse transcription, étape 2), suivies d'une PCR standard (PCR étape 3) Les données répertoriées sur le tableau 2 concernent la composition du tampon réactionnel, le volume d'incubation, le temps et la température de réaction, les concentrations de d NTP, les concentrations et le moment d'introduction des amplimers, de la Taq polymérase et de la réverse transcriptase Les AR Nm multi- épissés (tableau 2: Reg, figure 12: M) et les AR Nm mono-épissés (tableau 2: Env, figure 12: S), amplifiés respectivement avec les primers 335-338 et 335-337, ont été analysés par southern blot avec la sonde 344 (figure 12). 2-1/ Hybridation Effet de la température: Durant nos expériences, I'hybridation du primer inverse a montré qu'après 10 minutes de dénaturation d'ARN à 65 C, le refroidissement lent à 42 C avait un effet néfaste sur le résultat attendu, aussi bien qualitativement que quantitativement La comparaison (figure 12 S) des colonnes 71/74, 72/75 et 73/76, pour l'amplification des AR Nm mono-épissés, a mis en évidence une augmentation de signaux inattendus (parenthèse A), de poids moléculaire faible (voir ci-dessus: identification de fragments amplifiés) correspondant à une baisse du signal spécifique majeur (Env Npu AR Nm 1-5 E à 530 pb) Une telle baisse du signal spécifique peut aussi être observée après amplification d'AR Nm multi-épissés (figure 12 M: 81/84, 82185, 83/86), bien que moins importante et sans apparition de bandes aspécifiques Ceci suggère que le refroidissement lent favorise la formation de structures secondaires stables, interférant avec l'étape de RT Ceci est plus frappant dans le cas des AR Nm mono-épissés, du fait de la grande stabilité de leur structure secondaire, dans la région de fixation de la protéine Rev (Rev Responsive Element: RRE 7325- 7531) (Holland S M, et al 1990 J Virol 64 ( 12):5966-5975) située dans l'intron Env et décrite comme une structure secondaire très stable. 2-2/ Transcription inverse Influences de la température d'hybridation, et des concentration d NT Ps et Mg CI 2 L'efficacité de la RT-PCR est améliorée avec l'augmentation de la température pour la réaction de RT, comme indiqué par l'augmentation du signal spécifique (figure 12 S: 74 > 75 > 76 et figure 12 M: 84 > 85 > 86) Une synthèse d'AD Nc de 45 minutes, suivie d'une élongation à 50 C, a occasionné des perturbations qualitatives et quantitatives, en comparaison avec le chauffage direct à 50 C Dans le tampon PC Rx 3, avec de hautes concentrations de Mg CI 2 ( 4 5 m M) et de d NT Ps ( 750 gi M), la conséquence de la température est moins critique, et nous avons obtenu les meilleurs résultats à une température uniforme (figure 12 S: 78/74- 75 et figure 12 M: 88/84-85) Cependant, le meilleur ratio signal 22 - spécifique I bruit de fond a été obtenu avec l'expérience en une étape (figure 12 M/K 7 et figure 12 S/K 8) grâce à des conditions de température élevée pour la transcription inverse. -23- REVENDICATIONS 1 Procédé d'amplification d'au moins une séquence spécifique d'ARN, contenu ou susceptible d'être contenu dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à: obtenir une solution de départ contenant 'ARN dudit échantillon dans un tampon appropriéne, dénaturer par chauffage l'ARN contenu dans ladite solution, traiter la solution obtenue, contenant 'ARN dénaturé, avec une première amorce dans des conditions permettant l'hybridation de l'amorce suivie de la synthèse d'un premier brin d'ADN complémentaire de la séquence d'ARN à amplifier, en présence d'une quantité suffisante d'un système enzymatique ayant, dans ledit tampon, une activité de transcriptase réverse, dénaturer l'hétéroduplex ARN-AD Nc formé et traiter la solution obtenue avec une seconde amorce dans des conditions permettant l'hybridation de la seconde amorce suivie de la synthèse du second brin d'AD Nc, en présence d'un système enzymatique thermostable ayant, dans le même tampon, une activité d'ADN polymérase, et à soumettre l'AD Nc obtenu à des cycles d'amplification en nombre suffisant pour obtenir le degré d'amplification désiré, caractérisé par le fait que ladite solution contient dès le départ tous les réactifs et solvants nécessaires auxdites étapes, et que l'ensemble des étapes est effectué dans un même conteneur et sans ajout de réactifs ou de solvants. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on effectue la dénaturation de 'ARN par chauffage à une température supérieure à 60 C environ. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'on effectue ladite dénaturation à une température d'au moins 65 C. 4 Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé par le fait que ladite première amorce a une longueur suffisante pour pouvoir s'hybrider à 'ARN à la température de dénaturation choisie. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé par le fait que l'on effectue la dénaturation de 'ARN et l'hybridation pendant un temps suffisant pour permettre l'hybridation, mais non supérieur à une durée prédéterminée au-delà de laquelle le système enzymatique à activité de transcriptase réverse serait inactivé. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'après l'étape de dénaturation et d'hybridation, on refroidit, de préférence rapidement, la solution jusqu'à une température prédéterminée permettant la mise en oeuvre de l'activité de transcriptase réverse, ladite température étant suffisamment élevée pour permettre le maintien de l'hybridation de la première amorce dans des conditions suffisamment discriminantes. 7 Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ladite 24 - température prédéterminée est au moins égale à 45 C, et en particulier au moins égale à 50 C. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait qu'après l'étape de dénaturation de 'ARN, on refroidit la solution à une température suffisamment basse pour permettre l'hybridation de l'amorce à une séquence d'ARN non rigoureusement complémentaire, pendant un temps suffisamment faible pour éviter des appariements non spécifiques, puis on réchauffe la solution jusqu'à une température prédéterminée choisie pour l'étape de transcription réverse. 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que ladite température suffisamment basse est au moins égale à 40 C. 10 Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé par le fait qu'on laisse agir le système ayant l'activité de transcriptase réverse à ladite température pendant un temps suffisant pour obtenir un brin d'AD Nc ayant une longueur suffisante pour contenir au moins la séquence complémentaire de la deuxième amorce. 11 Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ladite température est au moins égale à 50 C environ. 12 Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ladite température est comprise entre 50 et 60 C environ. 13 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on utilise une transcriptase réverse non réputée thermostable. 14 Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ladite transcriptase r 6 verse est choisie parmi celles de virus de la myéloblastose aviaire et celles de virus de Maloney de la leucémie murine. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on dénature l'hétéroduplex par chauffage à une température suffisante. 16 Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on dénature l'hétéroduplex par chauffage à une température, supérieure à 90 C, pouvant être supportée, sans inactivation notable, par l'ADN polymérase. 17 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on effectue l'étape d'hybridation de la seconde amorce à une température permettant l'hybridation dans des conditions suffisamment discriminantes. 18 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé par le fait qu'après l'étape de dénaturation de l'hétéroduplex, on refroidit la solution à une température suffisamment basse pour permettre l'hybridation de la seconde amorce à une séquence d'ADN non rigoureusement complémentaire, pendant un temps suffisamment faible pour éviter des appariements non spécifiques, puis on réchauffe la solution jusqu'à une température prédéterminée choisie pour l'étape de synthèse du second brin d'AD Nc. 19 Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 et 18, caractérisé par le fait que l'on effectue la synthèse du second brin d'AD Nc à une température suffisamment élevée compatible avec le maintien de l'hybridation de la seconde amorce. - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'après la synthèse du second brin d'AD Nc, on soumet l'AD Nc double-brin obtenu à un nombre suffisant de cycles d'amplification par dénaturation de l'ADN double-brin, hybridation des amorces sur les brins d'ADN néoformnés dont elles sont respectivement complémentaires, et synthèse de produits d'élongation sous l'action de l'ADN polymérase. 21 Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le rapport des quantités de transcriptase r 6 verse et d'ADN polymérase, exprimées en unités d'enzymes, est supérieur à 2, et en particulier au moins égal à 3. 22 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on opère in situ sur coupes de tissus, frottis ou autres prélèvements déposés ou fixés sur un support. 23 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour l'amplification d'ARN du virus l I Vi, caractérisé par le fait que la première amorce comprend la séquence suivante: CCTATCTGTCCCCTCAGCTAC 24 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour l'amplification d'ARN du virus HI Vl, caractérisé par le fait que la seconde amorce comprend la séquence suivante: TCTATCAAAGCAACCCAC