FR 2689904 A1 19931015 FR 9204528 A 19920408 ETAT DE LA TECHNIQUE: A) LES EPIDEPNES RECONSTITUEES IN VITRO Afin de pouvoir reproduire in vitro toutes les caractéristiques et étapes de la différenciation épidermique terminale, les conditions de culture doivent se rapprocher le plus possible de l'environnement naturel de l'épiderme. Par conséquent, après confluence, les cultures doivent être exposées à l'air et le milieu nutritif doit traverser le substrat pour parvenir par le bas aux cellules prolifératives de la première couche. Plusieurs systèmes de culture comprennent l'utilisation de substrats dermiques ou pseudodermiques, tandis que d'autres se contentent de substrat constitués par des filtres chimiquement inertes, recouverts ou non d'une matrice extracellulaire pouvant favoriser l'attachement cellulaire. Dans ces systèmes, on obtient la formation d'un vrai stratum corneum, c'est à dire une différenciation épidermique apparemment complète avec présence de toutes les couches cellulaires successives caractéristiques, et l'expression des marqueurs biochimiques essentiels. Le système de culture sur derme désépidermisé présente l'avantage de garder une membrane basale intacte comme surface d'attachement des kératinocytes tout en éliminant les interférences dues aux fibroblastes du derme, puisque ces derniers sont "tués" par congélations successives (Régnier et coll., 1981,1989; Pruniéras et coll., 1983a,b). Le système de Bell: L'équivalent de derme est préparé en incluant des fibroblastes vivants dans une matrice de collagène qui est modifiée et contractée par ces cellules résidentes. Des kératinocytes sont cultivés à la surface de ces substrats qui sont alors exposés à l'air au moyen de grilles en acier inoxydable (Bell et coll., 1983). Ces peaux reconstruites, en présence de 10% de sérum dans le milieu, expriment tous les principaux marqueurs de la différenciation épidermique, mais leur localisation précise dans les différentes couches cellulaires ne correspond pas tout à fait à celle observée dans l'épiderme in vivo (Asselineau et coll., 1985). De plus, certains antigènes des cellules basales ne sont pas polarisés comme in vivo (Asselineau et coll., 1986).Récemment le système a été perfectionné en ajustant la concentration en acide rétinoique à 10 9 M, grâce à l'utilisation d'un sérum délipidisé: l'expression des différents marqueurs ressemble alors fortement à la situation normale in vivo (Asselineau et coll., 1989). Le même substrat de derme-équivalent a servi pour l'obtention, à partir de follicules de cheveux humains exposé à l'interface air-liquide, d'un épiderme in vitro présentant tous les aspects de la différenciation épidermique (Lenoir et coll., 1988). Ce travail est en accord avec l'observation courante que les racines des poils qui subsistent dans une plaie après un traumatisme sont capables de régénérer un épiderme interfolliculaire normalement différencié. D'autres chercheurs cultivent des kératinocytes sur ces mêmes lattices de Bell, mais en culture d'organe, c'est à dire en y incorporant une biopsie de peau humaine (Coulomb et coll.,1986; 1989). D'autres systèmes consistent à inoculer des cellules épidermiques sur des films ou gels de collagène, des filtres en nylon ou de nitrocellulose couverts ou non de collagène ou d'équivalent de membrane basale déposé par des cellules endothéliales de boeuf, puis d'exposer ces cultures à l'air pour 14 à 21, ou même 65 jours (Fusenig et coll.,1983; Bernstam et coll.,l990; Vaughan et coll.,1986; Lillie et coll.,1980,1988). Un des points communs de tous ces systèmes de culture épidermique tridimensionnelle est l'exposition à l'air, qui semble essentielle pour la formation d'une couche cornée in vitro; mais surtout toutes ces cultures ont été réalisées en présence de sérum dans le milieu de culture, estimée nécessaire pour arriver à la différenciation terminale complète.Or, pour estimer ou mesurer l'influence de facteurs ou produits cosmétiques ou pharmaceutiques (tels que les retinoïdes, ou des extraits organiques de toutes origines) sur le métabolisme et la différenciation épidermiques en culture, il faut pouvoir utiliser des concentrations parfois infimes (10 12 M, par exemple) de ces facteurs, et donc disposer d'un environnement (milieu et support) de culture chimiquement défini, où les interférences dues aux molécules présent dans le sérum sont impossible. Une différenciation épidermique terminale complète de kératinocytes humains cultivés en milieu chimiquement défini sur des substrats constitués par des filtres inertes à l'interface air-liquide est décrite dans la demande de brevet français n" 2665175 du 27.07.1990 (Rosdy et Clauss, 1990): Un épithélium totalement différencié ayant les caractéristiques de l'épiderme a été obtenu in vitro en cultivant des kératinocytes humains normaux (KHN) dans un milieu chimiquement défini sur des substrats de filtres inertes à l'interface air-liquide.Des coupes verticales doublement colorées et des études d'immunofluorescence indirecte ont montré la stratification et l'expression correctes de marqueurs protéiques de la différenciation; l'analyse par microscopie électronique montre la présence de desmosomes, de granules de kératohyaline, de corps lamellaires extrudant leur contenu lipidique et la formation d'un stratum corneum de dix couches. De plus, tous les lipides typiques de l'épiderme humain stratifié étaient présents dans ces cultures, notamment les céramides, qui sont probablement responsables de la relative imperméabilité du stratum corneum. B) LA PRESENCE DE MELANOCYTES FONCTIONNELS DANS LES éPIDERMES RECONSTITUES Lorsqu'on isole des cellules épidermiques à partir d'un échantillon de peau, on recueille une suspension constituée en grande majorité de kératinocytes, mais aussi d'un petit nombre de mélanocytes. Le rapport entre les deux types cellulaires que l'on obtient varie beaucoup selon les différents échantillons de peau. Ainsi, dans les cultures de kératinocytes sur couche nourritrice de fibroblastes irradiés et en présence de 10% de sérum (système développé par Howard Green à Boston; Rheinwald et Green,1975) on peut détecter des mélanocytes fonctionnels, c'est à dire qui sont capables de transférer des mélanosomes aux kératinocytes (DeLuca et coll., 1988). Ces cultures forment des feuillets de 3 à 4 couches cellulaires où le nombre de mélanocytes présents est aléatoire, donc n'est pas contrôlé. C'est le cas également pour le système de culture d'organe entier, bien qu'il permette la constitution d'équivalents épidermiques plus complets, toujours en présence de 10% de sérum dans le milieu de culture (Topol et coll., 1986). Sur de telles cultures d'organe, c'est à dire des excroissances à partir d'une biopsie de peau entière, la stimulation de la mélanogénèse a été décrite (Bertaux et coll., 1988). La prolifération des mélanocytes y est stimulée par les rayons UV-B, W-A, ainsi qu'en présence de psoralènes, mais la densité de mélanocytes ne peut être contrôlée, donc la mélanogénèse ne peut être normalisée dans ce système. Un autre système de coculture (Scott et Haake, 1991; Haake et Scott, 1991) permet en revanche d'étudier les conséquences de différents rapports mélanocyte/kératinocyte à l'ensemencement. Mais ce système nécessite également 10% de sérum dans le milieu de culture, ainsi qu'un derme artificiel contenant des fibroblastes de nouveau-né. En plus, les cellules utilisées ne sont pas adultes, mais proviennent de tissus de donneurs nouveau-nés, constituant des épidermes en culture qui diffèrent notablement de l'épiderme adulte. La stimulation de la mélanogénèse en culture n'a été décrite que sur des cultures immergées de mélanocytes pures, c'est à dire en absence de kératinocytes, ce qui est très loin de la situation épidermique in vivo (Libow et coll., 1988). En effet, les kératinocytes semblent contrôler par des mécanismes paracrines la prolifération et la différenciation (mélanogénèse) des mélanocytes humains (Yaar et coll., 1991), donc leur présence active est indispensable à la reconstitution normalisée de la mélanogénèse. C) TESTS DE BRONZAGE L'efficacité des produits de protection ou de stimulation solaires est testée couramment in vivo: les modèles animaux (cobaye, rat, souris) présentent l'avantage de pouvoir normaliser les séries de sujets, mais la peau des animaux est plus vulnérable à cause de la plus grande finesse de leur couche cornée et de l'absence de pigments mélaniques. Les essais chez l'homme restent les plus probants. La diversité de réactivité de la peau humaine aux rayons ultraviolets implique un grand échantillonage de sujets, ce qui revient très cher. L'appréciation clinique des résultats (sur l'animal ou chez l'homme) se fait couramment à l'oeil nu par 2 observateurs indépendants qui ne connaissent pas les conditions d'application et d'irradiations. Cette observation visuelle semble rester le moyen le plus sûr et le plus sensible, mais des techniques de mesure instrumentale de la couleur de la peau ont récemment été publiées (Chardon et coll. 1991). L'INVENTION: Test de bronzage épidermique humain in vitro. L'invention décrite ici consiste en un test de bronzage utilisant des épidermes humains adultes reconstitués par culture cellulaire en milieu défini. Le bronzage des épidermes reconstruits par culture en milieu chimiquement défini à l'interface air-liquide est évalué par la mesure quantitative de la production et sécrétion de grains de mélanine (mélanosomes) par les melanocytes présents dans ces cultures, et de leur transfert et distribution dans les kératinocytes environnants. La grande reproductibilité de l'aspect et des qualités biochimiques des épidermes reconstitués décrits, qui est due à l'emploi exclusif de milieux définis, permet de comparer les effets d'une stimulation (rayons UV, activateur chimique, etc...) avec une grande précision sur un nombre important d'échantillons produits en parallèle. Par cette uniformité des épidermes obtenus on peut en effet surmonter le problême des variations importantes du bronzage in vivo selon les endroits du corps, et donc normaliser le bronzage in vitro. De plus, on peut obtenir un très grand nombre d'équivalents d'épiderme qui ont tous le même comportement, c'est à dire la même intensité de bronzage, après irradiation aux rayons UV par exemple.Ceci permet de tester en parallèle un grand nombre de produits (ou de concentrations de produits) à usage cosmétique ou pharmaceutique censés interférer (freiner, inhiber ou stimuler) avec le bronzage de la peau humaine. L'intensité de la pigmentation des épidermes reconstitués en culture et donc la production et la distribution de mélanine après stimulation par des rayons W (ou d'autres stimulants physiques ou chimiques) est quantifiée et calibrée par des témoins négatifs et positifs appropriés pour chaque série d'épidermes reconstitués produits. Ainsi standardisés, ces équivalents d'épiderme humain sont utilisés pour des tests comparatifs reproductibles de produits favorisant, freinant ou inhibant le bronzage de la peau. Ces produit à tester peuvent être appliqués directement sur la couche cornée des épidermes reconstitués et/ou ajoutés au milieu de culture qui nourrit les cellules à travers le support qui sert de substrat aux cultures.Dans le premier cas, le test simule l'application topique sur la peau, dans le second cas le test simule les effets systémiques, c'est à dire après ingestion du produit. Les eventuels effets cytotoxiques d'un produit à tester sur les cellules épidermiques peuvent être détectés parallèlement. MéTHODES D'OBTENTION Les équivalents d'épiderme sont obtenus par ensemencement sur des substrats inertes ou collagèneux d'un nombre donné de kératinocytes humains adultes normaux et d'un nombre donné de mélanocytes humains adultes normaux. Ces deux types cellulaires doivent être isolés auparavant à partir d'échantillons de peau humaine saine, et leur nombre amplifié par culture en immersion classique dans un milieu de culture chimiquement défini qui permet leur prolifération rapide, sur un ou plusieurs passages. Ensuite ces stocks de cellules (kératinocytes et mélanocytes) sont congelés et des échantillons sont décongelés selon les besoins, oubien ils sont utilisés directement pour la fabrication des épidermes reconstitués. Après trypsination, les concentrations cellulaires de chacune des suspensions (kératinocytes et mélanocytes) sont ajustées pour permettre l'ensemencement du mélange dans un petit volume de milieu défini en respectant le rapport voulu de mélanocytes sur kératinocytes. Plus le nombre de cellules totales est petit, plus le rapport mélanocytes sur kératinocytes doit tendre vers 1.Quand la 5 2 densité de l'ensemencement dépasse 5X105 cellules par cm ce rapport doit être inférieur ou égal à 1/2. Ceci est dû au fait que, contrairement aux kératinocytes, les mélanocytes ne se divisent que rarement dans les cultures d'épidermes reconstitués (comme dans l'épiderme in vivo), donc leur densité d'ensemencement doit être déterminée avec précision. Alternativement, les mélanocytes peuvent être ensemencés avant les kératinocytes. Des mélanocytes provenant d'un autre échantillon de peau (d'un autre donneur) que les kératinocytes peuvent être coensemencés avec ces derniers. Après avoir atteint la confluence, les cultures sont exposées à l'interface air/milieu de culture en hissant les substrats de culture sur des supports inertes permettant le flux du milieu jusqu'à la face inférieure de ces substrats. Après au minimum 2 jours de culture sur un milieu chimiquement défini, les cultures sont irradiées aux rayons UV à l'aide d'un irradiateur de laboratoire: Des irradiations répétées de UV-A et/ou UV-B sont effectuées en présence des produits à tester ainsi que de témoins négatifs et positifs. Le témoin négatif peut être une crême cosmétique classique qui n'interagit pas avec la stimulation du bronzage par les rayons UV, tandis que le témoin positif peut être par exemple une crême cosmétique de protection filtrant les rayons UV oubien, au contraire renforçant les effets des rayons UV (par exemple: contenant des psoralènes). Les effets des stimulations (exemple: rayons UV) sur les épidermes reconstitués dans ces différentes conditions expérimentales sont ensuite caractérisés et/ou quantifiés selon plusieurs méthodes: -mesure du nombre de grains de mélanine dans un certain nombre de coupes verticales colorées des cultures par analyse d'images assistée par ordinateur. -mesure du contenu en mélanine des homogénats de cultures par des techniques biochimiques. -mesure de l'activité de la tyrosinase épidermique contenue dans les cultures par techniques biochimiques. -mesure du nombre de mélanocytes présents et de leur localisation dans les cultures par coloration à la DOPA, par des techniques d'immunofluorescence indirecte ou de microscopie électronique. -mesure instrumentale de la couleur par colorimétrie qui tient compte de l'équilibre variable entre les différents pigments et leur états physico-chimiques. -toute autre technique permettant d'évaluer précisément l'intensité de bronzage obtenu. Les intensités et les durées de stimulation nécessaires pour induire une synthèse accrue détectable de grains de mélanine et leur transfert dans les kératinocytes environnants varient en fonction de la race et de l'âge du donneur de cellules initial: La calibration du test est donc nécessaire chaque fois que les cellules d'un autre donneur sont utilisées. Pour réduire ces variations dûes aux donneurs de peau, on peut établir des stocks de cellules (kératinocytes et mélanocytes séparément) où les cellules de plusieurs donneurs sont mélangées. Ceci apporte aussi l'avantage de disposer de stocks cellulaires plus importants, donc de pouvoir effectuer un plus grand nombre de cultures à partir d'un même stock. Mais chacune des séries de cultures d'épidermes reconstitués doit néanmoins être caractérisée et contrôlée par l'utilisation de témoins négatifs et positifs. EXEMPLE Des échantillons de peau adulte saine sont fournis par un service chirurgical après une opération de réduction mammaire. L'épiderme est séparé du derme avec 0.25% de trypsine dans une solution saline oubien d'abord par l'action de la dispase ou de la collagènase. Après comptage, la suspension cellulaire est diluée dans un milieu de culture défini favorisant l'attachement et la croissance soit des mélanocytes (Pittelkow et Shipley, 1989), soit des kératinocytes (Boyce et Ham, 1983). La prolifération des mélanocytes est stimulée dans un milieu défini par la présence de facteurs de croissance tels que le basic-FGF (fibroblast growth factor), l'insuline, et le TPA (l2-O-tetradecanoyl phorbol 13-acetate) qui par ailleurs inhibe la prolifération des kératinocytes présents en induisant leur différenciation terminale irréversible.La croissance des kératinocytes est stimulée par l'insuline, 1'EGF (epidermal growth factor) et l'hydrocortisone. Ce dernier type de milieu permet cependant la survie des mélanocytes: ceci permet d'isoler les mélanocytes après quelques jours de culture mixte à l'aide d'une trypsination différentielle: les mélanocytes se détachent en effet beaucoup plus rapidement que les kératinocytes. Le milieu défini utilisé est soit le MCDB 153 (Boyce et Ham,1983), soit un milieu préparé à partir de DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium) et de milieu de Ham F-12. Avant le dernier passage, les mélanocytes sont sevrés de TPA pendant plusieurs jours.Après un certain nombre de passages et avant d'atteindre la confluence, les cellules sont trypsinées, comptées, et ensemencées dans un rapport 5 1/2 2 mélanocytes/kératinocytes 1/2 à une densité de 105 par cm sur des filtres en polycarbonate. Les milieux sont changés tous les deux-trois jours. Après avoir atteint la confluence, les cultures sont hissées à l'interface air-liquide sur des grilles en inox ou des pastilles en fibre de verre. Le milieu de culture n'arrive alors plus que par le bas à travers le filtre jusqu'à la couche basale des cultures.Après 14 jours de culture ainsi émergée, certains épidermes reconstruits sont fixées dans une solution de formol, puis inclus dans des blocs paraffine, d'autres sont congelés dans l'azote liquide et stockés à -80 C, d'autres sont inclus dans des blocs de résine pour la microscopie électronique, d'autres encore sont homogénéisés et traités pour la mesure biochimique des activités tyrosinase et de la mélanine. Sur des coupes paraffines la coloration Fontana Mas son permet de distinguer les différentes couches cellulaires formées et de visualiser et de compter (par analyse d'image assistée par ordinateur) les grains de mélanine présents. Dans les cultures non stimulées, les mélanocytes contenant des grains de mélanine se situent surtout dans la première couche cellulaire, comme in vivo, alors que les kératinocytes n'en contiennent pas.La stimulation par irradiation aux UV-B (à partir du jour 10, 4 fois 100mCoules/jour) induit une distribution beaucoup plus homogène des grains de mélanine, puisque pratiquement toutes les cellules des deux trois premières couches en contiennent. L'analyse d'image sur plusieurs coupes parallèles montre une augmentation de la quantité de mélanine présente de l'ordre de 45 fois le niveau contrôle. L'application topique préalable d'une goutte de 20~1 de crême solaire à filtre UV total avant chaque irradiation empêche à 89% (+/- 5%) cette mélanogénèse induite par les UV-B. L'irradiation aux UV-A (4 fois 2.5 Joules/jour) en présence et absence de psoralène (10 6M de 8-MOP)dans le milieu de culture produit une plus faible réaction de bronzage: 5 fois plus de grains de mélanine, mais en plus le nombre de mélanocytes chargés de mélanine triple dans la couche cellulaire basale. Les cultures congelées en parallèle ont permis de marquer spécifiquement et de compter à l'aide d'anticorps antimélanosome (Tomita et coll.,l991) par immunofluorescence indirecte, les mélanocytes présents selon les conditions expérimentales. Les homogénats en milieu tamponné ont permis la quantification biochimique de la mélanine totale présente dans chacune des cultures: la même augmentation d'un facteur 45 (+/-6) a été mesurée après irradiation aux W-B. L'activité tyrosinase (Halaban et coll., 1991) est augmentée d'un facteur trois après la première irradiation aux UV-B et reste à ce niveau même après 4 irradiations. Ces résultats sont bien entendu relatifs aux cellules utilisées (donneur féminin de 36 ans, type caucasien) et ne sont décrits ici qu'à titre d'exemple. Des variations et différences dues aux systèmes de culture cellulaire utilisés et aux sources de cellules sont évidentes pour l'homme de l'art. BIBLIOGRAPHIE Asselineau D, Bernard BA, Bailly C, Darmon H. Epidermal morphogenesis and induction of the 67Kd keratin polypeptide by culture of human keratinocytes et the liquid-air interface. Exp.Cell Res. 159:536-539; 1985 Asselineau D, Bernard Ba, Bailly C, Darmon H, Pruniéras M. Human epidermis reconstructed by culture: is it "normal"? J.Invest.Dermatol. 86:181-186; 1986 Asselineau D, Bernard BA, Bailly C, Darmon H. Retinoic acid improves epidermal morphogenesis. Developmental Biology 133:322-325; 1989 Bell E, Sher S, Hull B, Herrill C, Rosen S, Chamson A, Asselineau D, Dubertret L, Coulomb B, Lapierre C, Nusgens B, Neveux Y. The reconstitution of living skin. 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Cell Biol. 115:821-828; 1991 REVENDICATIONS: 1- Test de bronzage caractérisé par le fait qu'on utilise des épidermes reconstitués humains par culture cellulaire qui bronzent sous l'action d'une stimulation physique et/ou chimique. 2- Epidermes humains reconstitués par culture cellulaire en milieu défini et exposés à l'interface air/milieu caractérisés par le fait que l'irradiation par des rayons ultraviolets et/ou la présence d'un produit chimique spécifique dans le milieu de culture stimule la production de grains de mélanine par les mélanocytes présents, ainsi que leur transfert dans les kératinocytes. 3- Epidermes humains reconstitués par culture cellulaire en milieu défini et exposés à l'interface air/milieu selon la revendication 2, caractérisés par le fait qu'on ensemence un mélange précis de kératinocytes humains adultes normaux et de mélanocytes humains adultes normaux cultivés auparavant séparément en immersion en milieu défini. 4- Test de bronzage selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'on applique sur l'épiderme reconstitué décrit dans la revendication 3 le ou les produits à tester. 5- Test de bronzage selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'on ajoute dans le milieu de culture sousjacent au substrat de culture des épidermes reconstitués décrit dans la revendication 3, le ou les produits à tester. 6- Test de bronzage selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le bronzage des épidermes reconstitués est mesuré par quantification des grains de mélanine sur une ou plusieurs coupes verticales colorées par analyse dimage assistée par ordinateur. 7- Test de bronzage selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le bronzage des épidermes reconstitués est mesuré par dosage biochimique de la mélanine et/ou de l'activité tyrosinase. 8- Test de bronzage selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le bronzage des épidermes reconstitués est mesuré par marquage par immunofluorescence indirecte à l'aide d'anticorps reconnaissant des antigènes jouant un rôle dans la mélanogénèse et/ou le transfert des mélanosomes. 9- Test de bronzage selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le bronzage des épidermes reconstitués est mesuré par microscopie électronique. 10- Test de bronzage selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le bronzage des épidermes reconstitués est évalué par la mesure instrumentale de leur couleur (colorimétrie).