FR 2687167 A1 19930813 FR 9301301 A 19930205 -1- Procédé de préparation de souches bactériennes produisant un amino-acide, et leur utilisation. L'invention concerne un procédé de préparation de souches bactériennes pour la production d'un amino-acide grâce à un traitement mutagène de souches productrices et la sélection de souches rendues optimales du point de vue génétique, ainsi que l'utilisation des souches bactériennes obtenues selon ce procédé. On utilise des amino-acides dans de nombreux do- maines, en particulier comme additifs à des aliments et au fourrage, dans des solutions pour perfusions, et aussi comme produit de départ dans l'industrie pharmaceutique ou chimique Font partie de ces amino- acides, entre autres, la L-lysine, la L-isoleucine, l'acide L-glutamique, la L-glu- tamine, la L-arginine, la L-phénylalanine et la L-thréoni- ne On produit ces amino-acides, à l'échelle industrielle, par fermentation, en utilisant des bactéries Les micro- organismes utilisés à cet effet font essentiellement partie des bactéries dites corynéformes, génératrices de glutama- te, dont le principal exemple est le Corynebacterium gluta- micum, avec les sous-espèces glut ssp lactofermentum et glut ssp flavum. On a déjà réalisé de multiples essais d'augmen- tation de productivité grâce à l'optimisation des condi- tions de procédé Dans ces essais, on utilise aussi les mi- cro-organismes proprement dits, en sélectionnant des sou- ches de production optimalisées, dans un groupe de mutants, grâce à la détermination de la concentration respective des amino-acides à l'intérieur de la phase de production, ou en essayant d'obtenir un taux augmenté de formation d'amino- acides, grâce à la reconnaissance du mode de synthèse à l'intérieur des cellules et à la modification appropriée ainsi que l'amplification du matériau génétique. Ainsi connaît-on, par exemple pour la L-lysine, l'introduction d'une auxotrophie pour des substances nutri- -2- tives définies, d'une résistance définie vis-à-vis des ana- logues de la lysine ou d'une sensibilité définie vis-à-vis des analogues du métabolisme central, ainsi que l'amplifi- cation d'un gène de la biosynthèse des amino-acides, au moyen de procédés de technique génétique. Pour la production de l'acide glutamique, on a déjà essayé aussi d'améliorer l'extraction de l'amino- acide formé à l'intérieur des cellules, grâce à la modification de la perméabilité de la membrane cellulaire Ainsi, on a essayé d'améliorer la rentabilité de la production de glu- tamate, au moyen du Corynebacterium glutamicum, grâce à une carence en biotine, un traitement détersif, une carence en acides gras essentiels (pour des souches auxotrophes des acides gras), une carence en glycérine (pour des souches auxotrophes de glycérine) ou un traitement à la pénicilli- ne Cependant, ces essais n'ont été couronnés de succès que pour la production de glutamate, tandis que la synthèse d'autres amino-acides n'a pas pu être améliorée de cette manière. Le but de l'invention est donc une augmentation de la production d'amino-acides par fermentation, grâce à l'obtention de souches bactériennes particulièrement opti- malisées. Le procédé selon l'invention élaboré à cet effet, pour la préparation de telles souches, est donc caractérisé en ce qu'on effectue la sélection grâce à un procédé de dé- pistage dans lequel on détermine l'activité du système de sécrétion. On effectue cette sélection en particulier par l'intermédiaire de la mesure de la variation temporelle de la concentration d'amino-acides intracellulaire et extra- cellulaire. D'autres caractéristiques de l'invention sont in- diquées dans les sous-revendications. Certes, S Brôer et B Kramer, Eur J Biochem. -3- 202 ( 1991) 137-143, ainsi que H Ebbighausen et al, Appl. Microbiol Biotechnol 31 ( 1989) 184-190, ont déjà étudié la cinétique de la sécrétion de lysine et d'isoleucine de l'intérieur des cellules en fonction de différents paramè- tres, comme le p H, le potentiel de la membrane et le gra- dient de concentration, mais sans se référer expressément à la rentabilité de la production des amino-acides. L'invention est fondée sur la connaissance qu'on peut isoler des souches qui sécrètent des amino-acides for- més à l'intérieur de la cellule, à des taux augmentés, à travers la paroi cellulaire et en direction du milieu de culture, grâce à quoi on peut obtenir un taux de production d'amino-acides nettement amélioré En effet, une activité augmentée de sécrétion a une importance comparable au taux de formation à l'intérieur de la cellule. Cependant, comme on l'a découvert aussi, on ne peut pas obtenir, de manière convaincante, une telle aug- mentation du taux de sécrétion grâce à une perméabilisation de la membrane cellulaire ou en influant sur des gradients de substrat et de métabolites, mais on suppose plutôt que des protéines porteuses spécifiques contenues dans la mem- brane cellulaire sont responsables du phénomène de sécré- tion, dont la concentration et/ou l'activité et la spécifi- cité ne peuvent être modifiées que par une intervention dans la cellule, au niveau de l'ADN On a pu démontrer cela en particulier pour la sécrétion du L-glutamate, de la L- isoleucine, de la L-valine et de la L-lysine. Par conséquent, pour l'amélioration de l'opéra- tion de sécrétion d'amino-acides, il est approprié de sé- lectionner des souches ayant un taux de sécrétion particu- lièrement élevé, dans un groupe de mutants produits par mu- tagenèse chimique ou physique, grâce à un procédé de dépis- tage. L'analyse d'une mutation avantageuse réussie peut être effectuée directement dans des cultures proliférantes -4- ou, de manière particulièrement avantageuse, lors d'un es- sai rapide dans des suspensions cellulaires denses, comme cela a été décrit par Hoischen et Kramer (Arch Microbiol. 151 ( 1989) 342-7) A cet effet, on cultive des bactéries, pendant une nuit, dans un milieu complexe ou aussi dans un milieu minimal et après le lavage, on les reprend dans un tampon approprie. Ensuite, dans la culture maintenue dans les con- ditions définies ci-dessous (dans laquelle aucune produc- tion ultérieure intracellulaire ne doit se produire, norma- lement), successivement, on prélève des échantillons et on les soumet à des déterminations de la concentration d'ami- no-acides A cet effet, on sépare le milieu de culture et les cellules par centrifugation dans de l'huile de sili- cone, avec addition d'acide perchlorique pour l'inactiva- tion, et on identifie séparément les différents amino-aci- des présentant un intérêt, d'après des procédés connus, dans le milieu et dans l'extrait de cellules obtenu grâce a un traitement par ultrasons. Pour déterminer les véritables concentrations d'amino-acides à l'intérieur des cellules, on doit détermi- ner le volume cellulaire de la bactérie utilisée, ce qu'on peut obtenir, par exemple, selon Rottenberg (Methods Enzy- mol LV ( 1979) 547-565), en ajoutant à la culture, avant la séparation dans l'huile de silicone, de la l 14-Cl-taurine (ou un autre marqueur ne pénétrant pas dans la paroi cellu- laire), ainsi que l 3-Hl 20, comme marqueur de l'ensemble du volume perméable à l'eau Ensuite, après la centrifugation dans l'huile de silicone, on peut déterminer l'ensemble du volume de l'échantillon, perméable à l'eau, ainsi que la proportion de volume imperméable à l'eau de celui-ci En soustrayant ces deux valeurs, on obtient le volume cyto- plasmique des bactéries utilisées A partir du volume cyto- plasmique ainsi déterminé et la quantité d'amino-acide dé- terminée dans le sédiment cellulaire, on peut calculer la -5- concentration effective à l'intérieur des cellules. Ensuite, on trace un diagramme de la concentra- tion intracellulaire, ainsi que la concentration dans le surnageant de culture aux différents moments de prélève- ment, en fonction du moment de prélèvement et à partir de l'évolution de la courbe obtenue, on détermine les paramè- tres cinétiques KM (affinité du système de sécrétion) et vmax (vitesse maximale du système de sécrétion). D'après le procédé décrit, il va de soi qu'on peut déterminer aussi la dépendance entre le taux de sécré- tion et des valeurs d'influence telles que le p H et le po- tentiel de membrane, et trouver ainsi des souches optimali- sées De cette manière, on peut trouver en particulier des souches dont le taux de sécrétion d'amino-acides reste re- lativement élevé jusque dans la plage acide. Le procédé de dépistage à utiliser selon l'inven- tion donne une courbe de concentration intracellulaire en fonction du temps, la concentration au moment "zéro" ser- vant de référence pour la capacité de production à l'inté- rieur des cellules On cherche à obtenir des souches pré- sentant une courbe de concentration diminuant de manière aussi abrupte que possible (par comparaison avec la souche de départ). L'évolution de la concentration intracellulaire donne, dans tous les cas, une première information sur l'utilité économique d'une souche et est importante, comme moyen de correction, pour reconnaître la formation ulté- rieure ou le métabolisme à l'intérieur des cellules, ces derniers pouvant fausser l'information résultant de l'évo- lution de la concentration intracellulaire. Une utilisation spécifique du procédé de dépista- ge décrit ci-dessus est qu'il est possible, de cette maniè- re, avec des souches déjà existantes et grâce à la mesure de l'évolution de la concentration d'amino-acides à l'inté- rieur et à l'extérieur des cellules, de déterminer des sou- -6- ches ayant une excellente biosynthèse, avec lesquelles on peut obtenir une optimisation complémentaire de la rentabi- lité grâce a une amélioration de la sécrétion de l'amino- acide accumulé à l'intérieur de la cellule. La modification avantageuse de l'activité de sé- crétion est introduite, de préférence, dans des souches qui appartiennent au genre Corynebacterium glutamicum avec les sous-espèces glut ssp lactofermentum et glut ssp fla- vum Comme exemples de bactéries particulièrement appro- priées, qui sont connues en tant que bactéries corynéformes productrices de L-glutamate, on peut citer: Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 31833, Corynebacterium acétoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium lilium ATCC 15990, Corynebacterium herculis ATCC 13868, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240. La production de l'amino-acide avec des mutants préparés de cette manière se déroule d'après des proc 6 dés usuels de fermentation, tels qu'on les connaît déjà pour d'autres mutants producteurs d'amino-acide Cela signifie que les mutants modifiés lors de la sécrétion d'amino-aci- des sont cultivés dans un milieu qui contient une source de carbone, une source d'azote, des ions inorganiques et éven- tuellement des amino-acides, des vitamines, etc Des exem- ples de sources de carbone appropriées sont le glucose, le saccharose, des hydrolysats d'amidon et des molasses Comme source d'azote, on peut utiliser l'ammoniac, une solution ammoniacale, des sels d'ammonium ou d'autres composés con- tenant des atomes d'azote L'amino-acide accumulé dans le milieu de culture peut être isolé ensuite au moyen de pro- cédés normaux. Grâce au procédé selon l'invention, on peut pro- -7- duire, par exemple, la L-lysine à une échelle considérable- ment améliorée, comme on le montre ci-après en se référant à des exemples. Exemple 1 ( 1 Mutation) On effectue la mutagenèse du Corynebacterium glutamicum DSM 5714 avec de la N-méthyl-N'-nitro-N-nitroso- guanidine et après dilution, on l'applique sur des plaques de BHI-agarose (Difco 0418-01-5) On fait incuber les pla- ques à 30 C pendant 2 jours et ensuite, on les transfère, au moyen de tampon, dans quatre milieux minimaux diffé- rents Le milieu 1 contient, par litre, 5 g de sulfate d'ammonium, 1 g d'urée, 1 g de diphosphate de potassium, 3 g de phosphate dipotassique, 0,25 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 10 mg de chlorure de calcium, 10 mg de sulfa- te de fer heptahydraté, 10 mg de sulfate de manganèse mono- hydraté, 0,1 mg de sulfate de zinc heptahydraté, 0,02 mg de sulfate de cuivre, 2 ig de chlorure de nickel hexahydraté, 0,2 mg de biotine et 40 g de glucose monohydraté Le milieu 2 est identique au milieu 1, sauf qu'il contient en plus 300 mg/litre de L-leucine Le milieu 3 est identique au mi- lieu 1, sauf qu'il contient en plus 300 mg/l de L-isoleuci- ne Le milieu 4 est identique au milieu 1, sauf qu'il con- tient en plus 300 mg/litre de L-méthionine On fait incuber les plaques de nouveau et après trois jours, on inocule des souches auxotrophes d'amino-acides pour une caractérisation supplémentaire. ( 2 Caractérisation de l'activité de sécrétion) Pour la détermination de l'activité de sécrétion, on essaie ensui- te, individuellement, les clones obtenus A cet effet, on inocule le milieu complexe de BHI avec le clone respectif et on le fait incuber pendant une nuit, à 30 C, en tant que culture liquide Ensuite, on récolte les cellules grâce a une centrifugation de 5 minutes, à 4 C et 4000 tr/min, dans une centrifugeuse à refroidissement (J 2-21 M/E, Beckmann, Munich) On lave les cellules deux fois avec un tampon Tris - 8- glacial ( 50 m M Tris-H Cl, p H 7,5; 10 m M Na Cl et 10 m M K Cl, et enfin, on les remet en suspension dans un volume tel qu'on obtient une suspension cellulaire dense, d'environ 40 mg de poids sec par ml de tampon On induit la sécrétion de la lysine intracellulaire en diluant cette suspension de cellules au 1/12 ème dans un tampon Tris préchauffé à 250 C ( 50 m M Tris-H Cl, p H 7,5, 10 m M Na Cl) Directement après le prélèvement d'échantillon, ainsi que toutes les 3 minutes, pendant un laps de temps total de 30 minutes, on prélève des échantillons pour la centrifugation dans de l'huile de silicone A cet effet, on prélève des quantités de 100 jpl. On introduit ces échantillons dans un tube de centrifuga- tion de 400 gl (Beckmann Instruments Gmb H, Munich) qui con- tient déjà 30)il d'acide perchlorique à 20 %, recouvert de 65 jal d'huile de silicone de 1,04 g/cm 3 de densité Immé- diatement après cela, on centrifuge l'échantillon dans une microcentrifugeuse E (Beckmann Instruments Gmb H, Munich) à 13 750 tr/min Ensuite, on prélève les surnageants, pour la détermination de la lysine dans le filtrat de culture, et on les conserve à -20 'C jusqu'au moment de l'analyse. Pour la détermination de la L-lysine intracellu- laire dans le sédiment, on sectionne les tubes dans la pha- se huileuse, on les retourne et on les place dans des réci- pients de centrifugation de 50 pal Grâce à une centrifuga- tion de 3 minutes dans un appareil Biofuge A (Heraues Christ Gmb H, Osterode), on transfère le contenu quantitati- vement dans le récipient de centrifugation de 750 p l Après l'élimination de la pointe vide, on place le récipient, pour sa libération complète, dans un bain d'ultrasons dans un appareil à ultrasons Branson et on l'expose à l'action des ultrasons pendant 10 minutes, dans cet appareil Après l'addition de 25 jal de KOH 5 M, de triéthanolamine 1 M, de H Cl pour la neutralisation de l'homogénéisat, on sépare KC 104 précipité, les débris cellulaires et l'huile de sili- cone, grâce a une centrifugation de 10 minutes, à 4 C et -9- 13 000 tr/min (Centrifugeuse à refroidissement 202 MK, Sigma Gmb H, Osterode) On purifie les phases aqueuses et on les conserve aussi à -20 C jusqu'au moment de l'analyse. Pour la détermination du volume cellulaire, on ajoute, avant la centrifugation dans l'huile de silicone, 500 4 l de suspension cellulaire avec 20 pl de taurine ( 10 m M), 5 4 l de 14 C-taurine ( 1 p Ci) et 5 gl de 3 H-H 20 ( 0,5 g Ci) et on fait incuber le mélange pendant 2 minutes, en le secouant de temps à autre On sépare des échantillons de cette composition, de la manière décrite précédemment, par centrifugation dans de l'huile de silicone, on prélève 20 )l du surnageant, on y ajoute 200 Dl d'eau et on mesure la désintégration radio-active dans un scintillomètre (Rackbe- ta 1214, LKB Instruments Gmb H, Grâfelfing) On sectionne les petits tubes d'huile de silicone dans la phase huileu- se, on retraite le sédiment et on le dissout de la manière décrite cidessus, ensuite on mélange 650 pl du surnageant aqueux provenant du retraitement du sédiment avec 4 ml d'agent de scintillation et on détermine la désintégration radio-active A partir de cela, on détermine un réservoir d'eau de 4,9 pl/mg de poids sec et un réservoir de taurine de 3,0 il/mg de poids sec Ceci donne un volume cytoplasmi- que de 1,9 pl/mg de poids sec des mutants utilisés. On détermine la L-lysine par fluorométrie, en tant que dérivé ophtaldéhyde, après dérivation automatique de la pré-colonne, avec un réactif de o-phtaldéhyde prêt à l'emploi (Pierce Europe B V OudBeijerland, Pays-Pays) et séparation par chromatographie sur adsorbant Li Chrospher, RP-18, 5 9 m (Merck, Darmstadt) dans un chromatographe à liquide sous haute pression (HP 1090 M, Hewlett-Packard, Waldbronn) Pour la séparation de la L-lysine des autres amino-acides, on utilise un protocole normal. A partir du volume de cellules et des détermina- tions de lysine, on détermine les concentrations internes effectives de lysine intracellulaire On reporte ces con- -10- centrations internes dans un diagramme, en fonction des différents moments de prélèvement d'échantillons, et on procède de la même manière pour la quantité accumulée à l'extérieur A partir de cela, on détermine un taux de sé- crétion de L-lysine de 10 nmol/min mg à l'état sec pour la souche DSM 6870 déposée par la Deutsche Stammsammlung fur Mikroorganismen, alors qu'on détermine un taux de sécrétion d'au plus 7,5 nmol/min mg à l'état sec pour la souche de départ (tableau 1). ( 3 Production de L-lysine qrâce à la nouvelle souche ainsi obtenue). On fait fermenter la souche obtenue dans un milieu qui contient, par litre, 40 g de sulfate d'ammonium, 0,5 g de phosphate de potassium, 0,5 g de diphosphate de potassium, 0,30 g de L-leucine, 0,25 g de sulfate de magnésium hepta- hydraté, 10 mg de sulfate de zinc heptahydraté, 0,02 mg de sulfate de cuivre, 2 pg de chlorure de nickel hexahydraté, 0,2 mg de biotine et 100 g de glucose monohydraté Ce mi- lieu contient, en outre, 20 g de chaux Après l'inocula- tion, on fait incuber les cultures à 30 C sur un secoueur rotatif et après 72 heures, on prélève des échantillons pour la détermination de la L-lysine La concentration de la L-lysine ainsi formée est indiquée dans le tableau 1. Tableau 1: Séparation de L-lysine dans la souche DSM 6870 obtenue grâce au procédé décrit. Taux de sécré Concentration Concentration tion de lysine de lysine in de lysine ex- à p H 7,2 tracellulaire tracellulaire Souche nmol/min mg à (m M) (m M) l'état sec C. glutamicum 7,5 39 72 DSM 5714 C.glutamicum 10 25 208 DSM 6870 -11- Avec la souche DSM 6870 de Corynebacterium glutamicum, on obtient, dans des conditions analogues, des rendements de lysine particulièrement élevés, comparés à ceux obtenus en utilisant des souches connues. *+ 2687167 -12- REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation de souches bactériennes pour la production d'un amino-acide grâce à un traitement mutagène de souches productrices et à une sélection de sou- ches optimalisées du point de vue génétique, caractérisé en ce qu'on effectue la sélection grâce a un procédé de dépis- tage dans lequel on détermine l'activité du système de sé- crétion. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la sélection au moyen de la mesure de la variation temporelle de la concentration d'amino-acides intracellulaire et extracellulaire. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce qu'on choisit une souche ayant, en outre, une faible dépendance entre le p H et l'activité de sécrétion. 4 Procédé selon une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on choisit une souche pour la forma- tion de lysine à un taux de sécrétion >, 10 nmol/min g l'état sec, à p H 4 7,5. 5 Procédé selon une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on part de bactéries corynéformes. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on utilise, pour la préparation d'une souche pro- ductrice de lysine, à sécrétion améliorée, la souche Cory- nebacterium glutamicum ayant le n de dépôt DSM 5714. 7 Souche Corynebacterium glutamicum en tant que générateur de lysine, obtenue grâce au procédé selon la re- vendication 1, caractérisée par le numéro de dépôt DSM 6870. 8 Utilisation des souches bactériennes à sécré- tion améliorée obtenues selon une des revendications 1 à 6, pour la production d'un amino-acide. 9 Utilisation de la souche Corynebacterium glu- tamicum selon la revendication 7 pour la production de ly- sine.