FR 2697633 A1 19940506 FR 9212605 A 19921021 La présente invention concerne un procédé d'immunodiagnostic en phase solide dans lequel la formation du complexe immun se traduit par une localisa- tion particulière de microparticules dans une matrice d'affinité. L'utilisation dans les immunoessais de particules, portant un antigène ou un anticorps spécifi- que d'un complexe immun dont l'un des 2 éléments est à déterminer, est bien connue que ce soit pour des particu- les naturelles comme les érythrocytes ou des microbilles d'un polymère, comme le latex, éventuellement magnéti- ques. La formation d'agglutinats ou l'immuno- adhérence de ces particules sur une phase solide d'immu- noaffinité convenable sont deux moyens de visualiser la réaction immunologique. Les groupages et phénotypages sanguins, la recherche des agglutinines irrégulières dans le sérum font généralement appel à des techniques d'agglutination plus ou moins complexes selon le pouvoir agglutinant des anticorps Ainsi, dans certains cas, on devra introduire dans le milieu réactionnel contenant le sérum et les hématies, des macromolécules comme l'albumine ou le dextran ou opérer en plusieurs étapes, comme dans le test de Coombs, c'est-à-dire séparation des hématies après incubation avec le sérum, lavage, introduction dans un milieu contenant une antiglobuline humaine puis centrifu- gation. Dans le brevet EP-A-194 212, on décrit un procédé pour la mise en évidence d'une agglutination érythrocytaire dans lequel le mélange sérum-hématies incubé est soumis à une centrifugation douce à travers un milieu gélifié contenant, si l'agglutination n'est pas spontanée, un anticorps ou un autre réactif, de telle sorte que les agglutinats alors formés restent vers le haut du gel, tandis que les érythrocytes ne portant pas le complexe antigène-anticorps se déposent au fond du tube Dans la demande EP-A-305 337, le milieu est constitué de microparticules de taille et densité convenables au lieu d'un gel. Dans FR-A-2 673 472, le mélange sérum- hématies incubé est placé en haut d'une microcolonne ouverte contenant une phase inerte convenable dans laquelle on fait passer un liquide, de telle sorte que les agglutinats formés restent dans le haut de ladite colonne Dans ces deux types de techniques, on sépare les particules agglutinées de celles restées libres grâce à leur différence de taille, les particules les plus petites migrant plus facilement, sous l'action de la force due à la centrifugation ou à la percolation, dans la matrice constituée d'un gel ou de microparticules en suspension. Dans le procédé de la présente invention, la séparation des particules de départ de celles portant un complexe immun qui peuvent être agglutinées ou non - n'est pas due à leur différence de taille mais d'immuno- réactivité; l'influence de l'intensité et de l'orienta- tion de la force de sédimentation sur la sensibilité et la reproductibilité du test est ainsi plus faible, et le choix des caractéristiques physiques de la matrice est moins critique. Le procédé d'immunodiagnostic selon l'inven- tion consiste à: a) mettre en contact des particules portant un antigène ou un anticorps avec un milieu suscepti- ble de contenir un anticorps ou un antigène corres- pondant, pour former un complexe immun; b) faire passer sous l'action d'une force extérieure le milieu réactionnel précédent à travers une matrice poreuse, sur laquelle est immobilisée une substance susceptible de se lier à l'anticorps ou à l'antigène initialement libre; et c) déterminer la présence éventuelle de particules portant un complexe immun fixées dans la matrice par la substance immobilisée sur ladite matrice. Selon le cas, c'est l'antigène ou l'anti- corps à déterminer qui sera immobilisé sur la particule ou sera libre dans le milieu liquide. Les particules peuvent être des cellules sanguines, érythrocytes ou lymphocytes par exemple, ou des microbilles de diamètre de l'ordre du micron de densité suffisante pour qu'elles sédimentent dans les conditions de l'essai et seront constituées d'un polymère naturel réticulé ou synthétique: on en trouve différents exemples dans le commerce, adaptés pour une utilisation en immunoessai. Les antigènes ou anticorps seront immobilisés sur les particules par les moyens bien connus de l'homme du métier, par liaison chimique ou par adsorption, lorsqu'ils ne sont pas naturellement présents comme sur les cellules sanguines On pourra notamment se référer à l'ouvrage "Antibodies-Ed Harlow, David, Lane ( 1988)" qui décrit des techniques d'immobilisation des protéines. Lorsque la répartition des particules dans la matrice est étudiée à l'oeil nu ou à l'aide d'un photomè- tre, celle-ci doit être transparente et les particules colorées, comme le sont les érythrocytes; on peut aussi utiliser des particules pratiquement incolores comme les lymphocytes dans un milieu coloré mais transparent, ou les colorer préalablement. Le milieu liquide peut être un liquide biologique, sang total, sérum, urine, ou une suspension cellulaire, éventuellement dilué, dans les conditions bien connues de l'homme du métier, avec des tampons physiologiques ou les solutions habituelles qui accélè- rent la formation du complexe immun telles qu'une solution basse force ionique. On peut utiliser le procédé de l'invention pour la recherche des antigènes sur les érythrocytes des systèmes Rhésus, Lutheran, Kell, Duffy et autres, ou celle d'anticorps dits irréguliers, qui ne sont présents dans le sérum qu'après immunisation, comme dans l'alloim- munisation foetomaternelle ou transfusionnelle; le typage HLA des lymphocytes est un autre exemple d'appli- cation. Dans les domaines de la bactériologie et de la virologie, on utilisera des particules synthétiques ou des érythrocytes, sur lesquels on aura fixé l'anti- corps ou l'antigène convenable. Après la première étape d'incubation, au cours de laquelle se forme le complexe immun, le milieu réactionnel est introduit dans une matrice poreuse sur laquelle est immobilisée une substance qui a la capacité de fixer l'antigène ou l'anticorps initialement libre. La matrice peut être placée dans un microtube ou dans les cupules d'une plaque de microtitration; elle peut se présenter sous forme gélifiée ou sous forme de microbilles, notamment d'agarose ou polyacryliques, de diamètre compris entre 40 et 200 pm dans un tampon physiologique ou une solution favorisant la formation du complexe immun L'état physique de la matrice sera tel que les particules puissent y circuler sous l'action d'une force appliquée sensiblement parallèlement à l'axe du tube, sans que cela entraîne une déformation sensible de ladite matrice. Ladite force peut résulter de la centrifuga- tion du tube ou d'une augmentation de pression. On préfère la centrifugation, mais les conditions de celle-ci ne sont pas critiques, comme dans le procédé décrit dans la demande de brevet européen EP- A-305 337; il suffit en effet d'éviter que les particu- les ne soient entraînées trop rapidement vers le fond du tube, ce qui empêcherait la formation de liaisons spécifiques avec la matrice pour celles qui ont été sensibilisées pendant la phase d'incubation, c'est-àdire qui portent le complexe immun. Si les particules sont magnétiques, elles peuvent être déplacées dans un champ magnétique par action d'une force magnétique. On peut aussi opérer dans un tube vertical ouvert aux deux extrémités et comportant un filtre hydro- phobe sur lequel reposera la matrice, de telle sorte que les particules sont entraînées par un liquide s'écoulant de haut en bas de la matrice. La matrice peut porter une substance comme les protéines A ou G et une anti-immunoglobuline Ig G humaine ou ses fragments Fab ou F(ab)'2 lorsqu'un antigène est immobilisé sur les particules, en hématolo- gie, sérologie ou virologie. Lorsqu'un anticorps est immobilisé sur les particules, la substance est un autre anticorps monoclo- nal ou polyclonal qui reconnaît l'antigène initialement libre. Les moyens de fixation de la substance à la matrice sont bien connus de l'homme du métier, soit par liaison chimique, soit par liaison de type immunologique, par exemple par l'intermédiaire de la protéine A. On pourra par exemple utiliser des gels o est fixée la protéine A telle que le Sepharose CL 4 B- protein A de chez Pharmacia, ou IPA-300 et 400 de chez Repligen; on peut aussi utiliser des gels tels que Sephadex G 200 ou Sepharose 6 MB (Br CN), sur lesquels on fixe selon la méthode préconisée par le fournisseur Pharmacia de la protéine A ou G ou une anti-Ig G Parmi les microbilles, on peut citer la n-protein A Avidgel de chez Bioprobe Int. En général, ces produits commerciaux sont passivés préalablement à leur emploi pour éviter les fixations non spécifiques. La matrice peut être aussi composée de deux couches superposées, la couche inférieure ne contenant pas de substance affine. Sous l'action de la force appliquée, les particules introduites dans la matrice poreuse, qui ne portent pas de complexe immun, la traverseront et se réuniront au fond du tube ou de la cupule de microtitra- tion au bout d'un temps qui sera fonction du matériel utilisé et des conditions opératoires, mais que l'homme du métier pourra déterminer sans difficulté Par contre, les particules sensibilisées, c'est-à-dire portant le complexe immun, seront arrêtées dès qu'elles rencontre- ront la substance affine fixée sur la matrice; on observera alors une tranche colorée vers le haut du tube dont l'épaisseur et la distance à la surface de la matrice seront fonction des conditions opératoires. Le procédé selon l'invention est particuliè- rement simple à mettre en oeuvre lorsque les deux étapes d'incubation et de révélation peuvent être effectuées dans un même dispositif. A cette fin, on peut utiliser un microtube en verre ou en matière plastique évasé vers le haut comme ceux décrits dans EP-A-305 337 précédemment cité. On a d'autre part constaté que le milieu d'incubation ne traversait pas spontanément, sous l'effet de la seule gravité, un filtre dont les diamètres des pores ne sont pas trop grands et composé d'un matériau hydrophobe tel que le polyéthylène, le polypropylène, fritté ou tissé; le milieu traverse par contre ledit filtre lorsqu'il est soumis à une force, comme celle utilisée pour le faire passer à travers la matrice poreuse. Aussi, un autre objet de l'invention est le récipient utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'il contient un filtre en matériau hydrophobe de diamètre de pores compris entre et 150 pim, de préférence entre 40 et 50 pm, ledit filtre étant situé entre la zone supérieure d'incubation et la partie inférieure contenant la matrice d'affinité. On trouve dans le commerce des filtres convenables, tel que le polyéthylène fritté d'Isolab (USA) ou le polypropylène tissé dénommé Scrynel de Polylabo (FR). Le récipient peut se présenter sous forme d'un tube à essais pour microdosages qui comporte une partie supérieure cylindrique de diamètre compris entre 4 et 10 mm et de hauteur comprise entre 2 et 5 cm, et une partie inférieure de préférence conique de 0,5 à 2 cm de hauteur, dans laquelle sera introduite la matrice d'affinité On peut aussi utiliser une couche plus fine de matrice d'affinité disposée sur une couche de matrice neutre d'au moins la même épaisseur, et de préférence d'une épaisseur de 2 à 3 fois celle de la matrice d'affinité Le filtre de 0,5 mm à 5 mm d'épaisseur, selon sa rigidité, de diamètre au plus égal à celui de la partie cylindrique du tube, sera placé au-dessus de la matrice ou des matrices, de préférence en laissant entre le filtre et la (les) matrice(s) un volume proche de celui du milieu d'incubation. On peut également remplacer le filtre par une couche d'une huile minérale, végétale, ou de synthèse, de préférence transparente, de densité inférieure à celle de la matrice, de viscosité suffisante pour que le milieu d'incubation ne la franchisse pas spontanément On peut par exemple utiliser l'huile de paraffine commercialisée par La Coopération Française (réf 2164). On peut également solidariser plusieurs récipients à l'aide d'un support en carton, d'un portoir en matière plastique, avec lequel éventuellement les tubes ne feront qu'une seule pièce, l'homme du métier étant à même de réaliser diverses solutions en tenant compte des moyens nécessaires à l'application de la force sur les particules. Lorsque la matrice est distribuée dans les cupules d'une plaque de microtitration, de préférence dans des cupules à fond conique d'au moins 1 cm de profondeur, on préfère, pour que la zone d'incubation ait un volume suffisant, utiliser un récipient annexe dont la forme évite le transvasement Ainsi, un autre disposi- tif selon l'invention est constitué d'une plaque de microtitration dont les cupules contiennent une matrice d'affinité, éventuellement avec une matrice neutre, disposée sous la matrice d'affinité, surmontée d'une plaque de même type comportant aussi une série de petites cavités, de préférence de forme cylindrique ou légèrement coniques, situées audessous de chacune des cupules, de volume sensiblement équivalent au volume de celles-ci, le fond de ces cavités étant muni d'un filtre en matériau hydrophobe, de diamètre de pores compris entre 5 et 150 Pm. La surplaque peut être solidarisée de la microplaque par un ensemble de clips fixés sur les bords, ou les cavités de la surplaque peuvent être engagées dans les cupules sur une faible hauteur, bloquant ainsi l'une sur l'autre; les cavités et les cupules doivent alors avoir des sections de dimensions adaptées. Dans ce qui suit, des exemples du procédé de l'invention sont décrits; ils ont été effectués dans des tubes à fond conique, dits tubes à sédimentation, en matière plastique de -hauteur totale de 4,5 cm, de diamètre intérieur de 2 mm et de hauteur de 0,7 cm dans la partie cylindrique inférieure, puis S 'évasant sur une hauteur de 0,3 cm jusqu'à un diamètre de 5 mm, et se terminant par une partie supérieure cylindrique de 5 mm de diamètre jusqu'à la hauteur totale de 4,5 cm, de telle sorte que le milieu d'incubation ne s'écoule pas sponta- nément sur la matrice placée préalablement dans la partie cylindrique inférieure Ces tubes sont commercialisés par Starstedt (Ivry France) sous la référence 72702. EXEMPLE 1 On introduit dans le tube à sédimentation pl de gel neutre préparé à partir de Sephadex G 100 Superfine réhydraté, puis passivé par mise en suspension dans une solution d'albumine bovine à 3 % dans un tampon phosphate salin de p H 7,2 à raison de 0,5 g de poudre pour 10 ml de solution (comme préconisé par le fournis- seur). On introduit ensuite 10 pl de gel d'affinité constitué d'un gel d'agarose à 6 % sur lequel est fixé par liaison covalente de la protéine A recombinante, réhy- draté et passivé dans les mêmes conditions que le gel neutre Ce gel est commercialisé par Repligen Corpora- tion sous la référence IPA-300. Une centrifugation d'une minute à 150 g permet de tasser le gel et d'éliminer les bulles d'air éventuelles. On dispose ensuite 30 pl du sérum plus ou moins dilué, à tester, et 50 pl d'une suspension d'éry- throcytes de spécificité connue, à 0,8 % d'hématocrite dans une solution de basse force ionique. Après 10 minutes d'incubation à 370 C, le tube est centrifugé durant 8 minutes à 250 g et l'image obtenue observée: la présence d'un point rouge au fond du tube traduit l'absence de formation de complexe immun, et donc une réaction négative, tandis que la présence d'une bande rouge dans la partie supérieure de la matrice traduit une réaction nettement positive. On a ainsi étudié divers sérums de patients contenant, de façon connue, des agglutinines irréguliè- res, en utilisant les érythrocytes correspondants du commerce. Dans le tableau I sont indiqués les titres, c'est-à-dire l'inverse de la plus grande dilution du sérum dans une solution aqueuse saline à 9 % contenant de l'albumine bovine à 6 %, qui donne un résultat encore positif, ainsi que les titres obtenus avec la technique de Coombs classique pour le même échantillon. EXEMPLE 2 On mélange 4 volumes de Sephadex G 100 Superfine et 1 volume de gel IPA-300 passivés comme à l'exemple précédent et on en introduit 30 pl dans un microtube. On opère ensuite comme à l'exemple précédent mais avec un sérum test anti-K 1, monoclonal, et une suspension d'érythrocytes 2 à 0,8 % d'un patient dans une Sérum avec Exemple: titre Test de Coombs: Titre -anti-E 32 8 anti-S 64 16 anti-Fya 64 16 anti-D 40 000 5 000 il solution basse force ionique Une réaction positive est observable jusqu'à un titre de 1 000 avec la technique de Coombs classique, et un titre de 8 000 dans les conditions du présent exemple. EXEMPLE 3 On dispose dans un microtube 20 pl de gel Sephadex G 100 Superfine, réhydraté et passivé comme à l'exemple 1, puis 10 pl de Sepharose 6 MB (-CN Br/activa- ted) commercialisé par Pharmacia, sur lequel on a fixé à raison de 2 mg/ml de gel, des Ig G anti-Fc humaines selon un procédé préconisé par le fournisseur. On introduit ensuite dans la partie évasée du tube 30 pl de sérum, plus ou moins dilué comme à l'exem- ple 1, et 50 pl de suspension d'hématies de spécificité connue. Après 10 minutes d'incubation à 37 C et une centrifugation de 8 minutes à 150 g, on observe l'image formée dans la matrice gélifiée. Dans le cas d'un sérum anti-D, le titre le plus faible décelable est 80 000, alors qu'il est de 000 dans la technique de Coombs classique. Pour un sérum anti-S, on obtient respective- ment les titres de 128 et 16. EXEMPLE 4 On opère comme à l'exemple 3, mais le gel d'affinité est un gel Sepharose CL 4 B-(Fab anti-Ig G humaine) à 2 mg d'anti-Ig G / ml de gel, commercialisé par Pharmacia Après 8 minutes de centrifugation à 250 g, le titre pour du sérum anti-D est 40 000 pour 5 000 en technique de Coombs et pour un sérum anti-S de 64 et 16. REVENDICATIONS 1 Procédé d'immunodiagnostic comprenant les étapes consistant à: a) mettre en contact des particules portant un antigène ou un anticorps avec un milieu suscepti- ble de contenir un anticorps ou un antigène corres- pondant, pour former un complexe immun; b) faire passer sous l'action d'une force extérieure le milieu réactionnel précédent à travers une matrice poreuse, sur laquelle est immobilisée une substance susceptible de se lier à l'anticorps ou à l'antigène initialement libre; et c) déterminer la présence éventuelle de particules portant un complexe immun fixées dans la matrice par la substance immobilisée sur ladite matrice. 2 Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la force est une force centrifuge. 3 Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les particules sont des érythrocytes. 4 Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la force est une force magnétique et les particules sont magnétiques. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'un antigène est immobilisé sur les particules et en ce que la substance susceptible de se lier à l'anticorps est une immunoglobu- line anti-Ig G, ou ses fragments Fab et F(ab)'2. 6 Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'un antigène est immobilisé sur les particules et en ce que la substance susceptible de se lier à l'anticorps est la protéine A ou la protéine G. 7 Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'un anticorps est immobilisé sur les particules et en ce que la substance susceptible de se lier à l'antigène est un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique de l'antigène. 8 Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les particules sont des érythrocytes, l'anticorps initialement libre est un anticorps de groupe sanguin, et que l'étape b) est effectuée par centrifuga- tion dans un tube contenant un gel ou des microbilles portant une immunoglobuline anti-Ig G ou ses fragments Fab ou F(ab')2, la protéine A ou la protéine G. 9 Dispositif pour la mise en oeuvre d'une procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un tube à essais pour microdosages contenant la matrice poreuse et un filtre en matériau hydrophobe de diamètre de pores compris entre et 150 pm, situé entre la matrice et la zone o sont introduits les réactifs. Dispositif pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractéri- sée en ce qu'il est constitué d'une plaque de microtitra- tion, dont les cupules sont remplies avec la matrice poreuse et d'une surplaque à cavités sensiblement cylindriques dont l'axe coïncide avec celui des cupules et dont le fond est constitué d'un filtre en matériau hydrophobe de diamètre de pores compris entre 5 et Pim.