FR 2687168 A1 19930813 FR 9201655 A 19920210 Fragment de l'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae, sonde d'hybridation, amorce d'amplification, réactif et procédé de détection de Streptococcus pneumoniae La présente invention concerne un fragment de l'ADN génomique de la bactérie Streptococcus pneumoniae, une sonde susceptible de s'hybrider spécifiquement avec 1 'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae, une amorce pour amplifier spécifiquement l'ADN génomique de Strepto- coccus pneumoniae, un réactif et un procédé pour détecter sélectivement, dans un échantillon biologique, ladite bac- térie, mis en oeuvre avec la sonde de l'invention. Des recherches ont porté sur l'isolement de deux fragments nucléotidiques, sur leur séquençage, leur spéci- ficité vis-à-vis de l'ADN génomique de Streptococcus pneu- moniae et leur utilisation pour fabriquer des sondes d'hy- bridation destinées à un procédé de diagnostic. Ces deux fragments sont respectivement le gène hex B, déposé et accessible à la banque de gènes EMBL (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, RFA) sous le numéro M 29686 et dont l'étude a notamment fait l'objet de la publication de M PRUDHOMME, B MARTIN, V. MEJEAN et J P CLAVERYS ( 1989) J Bacteriol 171, 5332- 5338 et qui code pour une protéine essentielle du système de réparation de mésappariements de l'ADN de Streptococcus pneumoniae, et l'opéron ami, déposé et accessible à la banque de gènes EMBL sous le numéro X 17337 et dont l'étude a notamment fait l'objet de la publication de G ALLOING, M.C TROMBE et J P CLAVERYS ( 1990) Mol Microbiol, 4,30 633-644, et qui est impliqué dans le transport des oligo- peptides chez le pneumocoque. Pour chacun de ces deux fragments, divers sous- fragments ont été préparés et utilisés comme sonde d'hy- bridation de l'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae Les sondes les plus couramment utilisées sont pour le gène hex B, le fragment hex B- 57 obtenu par action des enzymes de restriction Hind III-Bgl/II (du nucléotide 1321 au nucléo- tide 1776), de 455 nucléotides et pour l'opéron ami, le fragment ami-52, obtenu par action des enzymes de restric- tion Bam HI-Eco RI (du nucléotide 2419 au nucléotide 3564), de 1145 nucléotides. Chacune de ces deux sondes a été soumise à des expériences d'hybridation selon la technique dite "Dot- Blot" selon MANIATIS et coll ( 1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, avec l'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae et l'ADN génomique d'autres genres et espèces de bactéries, en conditions stringentes ( 50 % formamide, à 42 C), sur membranes de Nylon (nom commercial Biodyne A, de la Société Pall), pour deux concentrations respective- ment l Ong et 10 Ong d'ADN génomique. Des résultats identiques ont été obtenus avec les deux sondes hex B-57 et ami-Sz La Figure 1 montre les résul- tats obtenus avec la sonde ami-52 préalablement marquée par un marquage radioactif avec 32 p (nom commercial Kit Multi- prime de la Société Amersham), les hybridations étant ré- vélées par autoradiographie, pendant 12 heures à -70 C. Selon Figure 1, deux dépôts d'ADN respectivement de l Ong (flèche en pointillé) et de l O Ong (flèche en trait plein) ont été réalisés pour chacune des souches bactériennes utilisées Les souches de bactéries sont regroupées par séries et numérotées au sein de chaque série comme suit: Série a: ai-ail: Isolats clinique de Streptococcus pneumoniae appartenant à différents sérotypes. Série b: b 1-b 5: Streptococcus oralis de la collection A Pl (Bio Mérieux SA) (références internes A Pl n 7902025, 7902072, 8305023, 8040010 accessible à la National Culture Type Collection sous la référence NCTC 11427, 8408077). b 6-b 10: Isolats cliniques classifiés Streptococcus sanguis à partir de tests API-20 Strep (Bio Mérieux SA) dont le résultat est indiqué entre parenthèses ci-après dans l'ordre, SI ( 4061440), SII ( 0260451), SII ( 0270441), SI ( 0061440), SII ( 0240440). b 11-b 1 z: Isolats cliniques classifiés Streptococcus mitis à partir des tests API-20 Strep ( 0040401 pour les deux souches). b 13-b 14: Isolats cliniques classifiés Streptococcus milleri à partir des tests API-20 Strep ( 1061010 pour les deux souches). b 15-b 16: Isolats cliniques classifiés Streptococcus saliva- rius à partir des tests API-20 Strep ( 5060451 et 5060461). b 17-b 2 o: Isolats cliniques d'Enterococcus faecalis, Liste- ria monocytogènes, Haemophilus influenzae et Neisseria meningitidis. Série c: c: "Streptocoques atypiques" provenant d'isolats cliniques. Selon Figure 1, les résultats sont les suivants: Toutes les souches de Streptococcus pneumoniae de la série a) donnent des signaux très visibles qui sont proportionnels à la concentration considérée. Les streptocoques atypiques de la série C, C 91, C 120, C 108, C 92, C 188, C 139, C 155, C 184, C 115, C 65 et C 174 donnent les mêmes signaux que ceux de la série a) et pourraient alors être classifiés, selon ce test, dans l'espèce des Streptococcus pneumoniae. Toutes les souches de Streptococcus oralis de la série b), à l'exception de la souche bs, la souche Strepto- coccus mitis bll et les streptocoques atypiques de la série C, C 185, C 160, C 85 donnent un signal visible pour la concen- tration de 10 Ong, l'intensité du signal étant environ 10 fois plus faible que celle obtenue pour les Streptococcus pneumoniae à la même concentration. Ces résultats mettent donc en évidence le manque de spécificité des sondes respectivement hex B-57 et ami-52 pour Streptococcus pneumoniae, au sein du genre Strepto- coccus puisqu'une hybridation partielle, mais néanmoins significative, est détectée avec les espèces Streptococcus oralis, espèce la plus voisine de Streptococcus pneumo- niae, et Streptococcus mitis Ces sondes sont en consé- quence non satisfaisantes pour l'obtention d'un test dis- criminant pour détecter Streptococcus pneumoniae parmi d'autres espèces bactériennes les plus proches. La présente invention vise à résoudre les pro- blèmes de détection sélective de Streptococcus pneumoniae, notamment rencontrés en bactériologie médicale. Le premier objet de l'invention est un fragment monocaténaire de 1 'ADN génomique de Streptococcus pneumo- niae comprenant au moins une séquence nucléotidique pré- sentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une sé- quence nucléotidique choisie par les séquences nucléoti-15 diques SEQ n 2, SEQ n" 3, SEQ n 4, représentées en fin de description, et leurs séquences complémentaires respectives Par séquence complémentaire, on entend toute séquence s'hybridant totalement avec la séquence représentée. De préférence, la séquence nucléotidique du frag- ment selon l'invention présente au moins 85 % d'homologie avec au moins une desdites séquences nucléotidiques. Un second objet de l'invention met directement en application ledit fragment et consiste en une sonde sus- ceptible de s'hybrider spécifiquement avec l'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae, ladite sonde comprenant une séquence nucléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une partie d'une séquence consensus de I'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae, cette séquence consensus étant choisie parmi les séquences nucléotidiques SEQ n 2, SEQ n 3, SEQ n 4 et leurs séquences com- plémentaires respectives. De préférence, la séquence nucléotidique de la sonde de l'invention présente au moins 85 % d'homologie avec au moins une partie de ladite séquence consensus. La sonde de l'invention comprend avantageusement au moins 12 nucleotides. Préférentiellement, la sonde de l'invention com- prend la séquence nucléotidique, SEQ n 3. Quand elle comprend la SEQ n 3, elle peut être flanquée à son extrémité 5 ' de la séquence nucléotidique SEQ n 2 et/ou à son extrémité 3 ' de la séquence nucléoti- dique SEQ n 4. La séquence nucléotidique, SEQ n 3, peut être répétée et elle l'est avantageusement quatre fois de manière contiguë. Selon l'invention, une sonde peut présenter une séquence nucléotidique plus courte et être choisie parmi les séquences SEQ n 5, SEQ n 6 et SEQ n 7, présentées en fin de description. Le marquage de la sonde n'influe pas sur sa spéci- ficité vis-à-vis de l'ADN génomique de Streptococcus pneu- moniae et un marqueur approprié est de préférence choisi parmi des isotopes radioactifs, des enzymes choisis parmi la péroxydase et la phosphatase alcaline et ceux suscep- tibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des com- posés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des ana- logues de bases nucléotidiques et la biotine.25 A des fins d'utilisation in vivo d'une sonde de l'invention, la structure moléculaire de cette dernière est chimiquement modifiée Des modifications chimiques ap- propriées, qui permettent d'améliorer la résistance vis-à- vis d'une dégradation enzymatique, en particulier due aux nucléases, et d'accroître en outre le rendement d'hybrida- tion, n'affecte bien entendu pas l'enchaînement des bases. Des exemples en sont l'introduction entre au moins deux nucleotides d'un groupement choisi parmi les esters de diphosphate, d'alkyl et acryl-phosphonate et de phospho-35 rothioate ou le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide. Un troisième objet de l'invention est une amorce (ou "primer") pour la polymérisation spécifique de l'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae, en vue de réaliser une amplification de ce dernier Cette amorce comprend une séquence nucléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une partie d'une séquence consensus de l'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae, cette séquence consensus étant choisie parmi les séquences nucléotidiques SEQ n 2, SEQ n 3, SEQ n" 4 et leurs séquences complémen- taires respectives. De préférence, la séquence nucléotidique d'une amorce de l'invention est choisie parmi les séquences SEQ n 8 à SEQ n 21, représentées en fin de description. Selon les techniques d'amplification envisagées, il est préférable d'utiliser un couple d'amorces compre- nant au moins une amorce de l'invention. Dans le cas o le couple est constitué par deux amorces de l'invention, ledit couple est avantageusement choisi parmi les couples de sonde constitués par une sonde répondant à la séquence nucléotidique SEQ n 8 et une sonde répondant à l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ n 11, SEQ n 13, SEQ n 15, SEQ n 17, SEQ N 019 et SEQ n 21 et parmi les couples de sonde constitués par une sonde répondant à la séquence nucléotidique SEQ n 10 et25 une sonde répondant à l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ n 13, SEQ n 15, SEQ n 19 et SEQ n 21. Un quatrième objet de l'invention est un réactif pour détecter sélectivement Streptococcus pneumoniae dans un échantillon biologique, mettant en application une30 sonde de l'invention telle que décrite ci-dessus. Si la technique d'hybridation prévue est la tech- nique dite "sandwich", le réactif de l'invention comprend une sonde de capture et une sonde de détection, présentant les caractéristiques d'une sonde de l'invention, la sonde35 de détection étant notamment marquée au moyen d'un des marqueurs décrits précédemment Dans le réactif, la sonde de l'invention est en milieu liquide ou fixée sur un sup- port solide, directement ou indirectement Ledit support est sous toute forme appropriée telle que tube, cône, puits, plaque de microtitration, feuille, polymère soluble Il est constitué par un matériau naturel, de syn- thèse, modifié chimiquement ou non et est, selon la tech- nique retenue, choisi parmi les polystyrènes, les copoly- mères styrène-butadiène, les copolymères styrène-butadiène en mélange avec des polystyrènes, des polypropylènes, des polycarbonates, des copolymères polystyrène-acrylonitrile, des copolymères styrène- méthylméthacrylate de méthyle, parmi les fibres synthétiques Nylon et naturelles, parmi les polysaccharides et les dérivés de la cellulose. En outre, le réactif de l'invention peut contenir au moins une amorce telle que décrite ci-dessus, pour per- mettre de mettre en oeuvre une technique d'amplification avant la détection sélective de Streptococcus pneumoniae, et de préférence il contient un couple d'amorces selon l'invention.20 Le dernier objet de la présente invention est un procédé de détection sélective de Streptococcus pneumoniae dans un échantillon biologique, consistant à exposer l'ADN génomique des bactéries contenues dans ledit échantillon, sous forme de fragments monocaténaires, à une sonde de25 l'invention, puis à détecter les zones d'hybridation avec ladite sonde. La plupart des techniques d'hybridation connues peuvent être mises en oeuvre dans ce procédé et notamment les techniques dites "Dot Blot", "Southern" et d'hybrida-30 tion "sandwich" Pour la mise en oeuvre de cette dernière technique, le procédé consiste à exposer préalablement l'ADN génomique des bactéries de l'échantillon à une sonde de capture de l'invention, sur laquelle se fixera spécifi- quement l'ADN génomique du Streptococcus pneumoniae, puis35 à exposer l'ADN fixé à une sonde de détection de l'inven- tion. Selon l'invention, le procédé comprend avantageu- sement une étape d'amplification de l'ADN génomique de Streptococcus pneumonia, en présence d'un système enzyma- tique adapté et au moins une amorce et notamment un couple d'amorces de l'invention, préalablement à l'étape de dé- tection de Streptococcus pneumoniae. La génèse de l'invention et son intérêt sont à présent exposés selon les étapes 1 à 4 et à l'appui des figures 2 et 3 selon lesquelles: figure 2, permet de localiser, au voisinage de différents gènes de Streptococcus pneumoniae, les sé- quences nucléotidiques répétées appelées respectivement bolte A, bofte B, bofte C figure 3 illustre la détermination des séquences consensus respectivement SEQ n 2, SEQ n 3 et SEQ n 4 par alignement des différentes séquences répétées au voisinage de 5 gènes de Streptococcus pneumoniae. ETAPE 1 Isolement d'une séquence répétée dans 1 'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae L'isolement par les techniques de recombinaison génétique in vitro au cours des travaux développés sur l'étude de Streptococcus pneumoniae d'une séquence d'ADN génomique, a permis de mettre en évidence un fragment pré- sentant une homologie, à l'aide de la technique d'hybrida- tion avec de l'ADN total selon la technique SOUTHERN avec plusieurs autres fragments génomiques Cette situation se traduit par l'apparition de 20 à 25 fragments Ce fragment s'est montré expérimentalement spécifique de Streptococcus pneumoniae La détermination de sa séquence a permis de mettre en évidence un gène nouveau désigné mms A pouvant être impliqué dans les mécanismes moléculaires de répara- tion et de recombinaison de l'ADN. Une séquence particulière responsable de ces hybridations multiples a été localisée sur ce fragment Il s'agit d'une séquence nucléotidique située dans la région aval, dans le sens 5 ' > 3 ', du gène mms A Cette séquence obtenue par action des enzymes de restriction Hpa I et Pvu II, compte 340 paires de bases, selon la SEQ n l donnée en fin de description La séquence nucléotidique complète des deux brins complémentaires de ce fragment a été déter- minée par la méthode de termination de chaine (selon SANGER et coll, Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74, 5463-5467) à partir de matrices d'ADN simple brin du phage M 13 On a alors mis en évidence, à l'intérieur de cette séquence, l'existence d'une séquence de 45 nucléotides appelée boite B, directement répétée 4 fois. Cette séquence boite B a ensuite été retrouvée par comparaison de séquences dans des régions en amont des gènes hex B, com A, lyt A, ply, SI, SII On a constaté que ces copies de boite B pouvaient être flanquées en 5 ' et en 3 ' de séquences d'une cinquantaine de nucléotides, elles aussi conservées, appelées respectivement bolte A et bolte C Pour chacune de ces bottes, respectivement A, B, C, on a déterminé par alignement des différentes séquences nucléotidiques des régions de hex B, com A, lyt A, ply, SI, SII, une séquence consensus correspondant à l'enchaînement nucléotidique le plus fréquemment retrouvé dans ces régions Les séquences consensus SEQ n 2, SEQ n 3 et25 SEQ n 4 correspondent aux boites respectivement A, B, C. Organisation et localisation chromosomique: L'organisation générale de ces régions répétées dans l'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae est sché- matisée sur la figure 2. Les sites chromosomiques incluant les séquences situées au voisinage des gènes hex B, com A, lyt A et mms A ont été caractérisés Ces sites sont localisés à des en- droits différents sur la carte chromosomique de Strepto- coccus pneumoniae établie par séparation de fragments d'ADN par électrophorèse en champ pulsé (Gasc et coll, 1991) En adoptant une représentation circulaire de cette carte, basée sur une division arbitraire en 60 minutes avec une position 0/60 située en haut du cercle et un sens de rotation horaire, la localisation, exprimée en minutes, des divers fragments est, pour la souche testée: com A: 7 ' hex B:10-11 ' lyt A: 21- 24 ' mms A: 24-26 ' Cette observation suggère que les fragments conte- nant ces régions répétées ont des localisations chromoso- miques complètement différentes Cette situation est très intéressante car elle garantit que, même en cas de rema- niement chromosomique important, nombre de copies de cette séquence répétée seront conservées dans l'ADN génomique. ETAPE 2 Mise au point des sondes de l'invention Par traitement informatique, on a réalisé les ali- gnements de séquence entre les différentes copies identi- fiées Ces alignements ont permis d'obtenir les séquences consensus décrites précédemment pour les copies de bolte A, boite B et bofte C Ces séquences consensus sont données en fin de description selon les références respectivement SEQ n 2, SEQ n 3 et SEQ n 4. Selon figure 3, ces alignements ont permis de dé- finir la séquence et la localisation de trois oligodésoxy- ribonucléotides indiqués en fin de description selon les références respectivement SEQ n 5, SEQ n" 6 et SEQ n 7. L'un des ces oligonucléotides est dérivé de l'alignement des copies de boite A (SEQ n 5) Le second oligodésoxyribo- nucléotide (SEQ N 06) est dérivé de l'alignement des copies de bolte B, un troisième (SEQ n 7) est dérivé de35 l'alignement des copies de bolte C Ces oligodésoxyribonu- cléotides ainsi que toute autre séquence consensus établie d'après les données de bolte A, bolte B et bolte C ou toute séquence présentant au moins 70 % d'homologie avec l'une des séquences consensus peuvent être utilisés comme sonde spécifique de l'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae. ETAPE 3 Détermination de la spécificité par hy- bridation moléculaire à l'aide des sondes SEQ n 6, et SEQ n 7 a) Choix des souches bactériennes: La classification de souches bactériennes utili- sées est précisée ci-après: 1 Souche de laboratoire R 800 de Streptococcus pneumoniae (Lefèvre, J C, Claverys, J P, et Sicard, A M. ( 1979) J Bacteriol 138, 80-86), dérivée de la souche R 36 A (Tiraby, G, Fox, M S, et Bernheimer, H ( 1975) J. Bacteriol 121, 608-618). 2 Isolat clinique atypique ( 101/87), non capsulé, résistant à l'optochine, résistant à la lyse par le DOC, mais lyt A+. 3 Souche de Escherichia coli GM 99 (Prère, M -F. et Fayet, O ( 1986) Microbiol Lett 33, 37-41). 4 Isolat clinique classifié Streptococcus sanguis II (API-20 Strep 0260451), résistant à l'opto- chine, pneumolysine négatif. Isolat clinique classifié Streptococcus sanguis II (API-20 Strep 0270441), résistance intermé- diaire à l'optochine, pneumolysine négatif. 6 Souche OB Il de Streptococcus gordonii (ex Streptococcus sanguis Challis (Haisman, R J et Jenkinson, H F 1991 Mutants of Streptococcus gordonii Challis overproducing glucosyltransferase J Gen. Microbiol 137, 483-489), biovar 2 d'après Kilian et coll.35 (Kilian et coll, 1989). 7 Isolat clinique classifié Streptococcus mitis (API-20 Strep 0040401). 8 Isolat clinique classifié Streptococcus mitis (API-20 Strep 0040401). 9 Souche de Streptococcus oralis collection A Pl SYSTEM (réf n 7902072). Souche de Streptococcus oralis NCTC 11427 (Ronda et coll, 1988). 11 Isolat clinique de Streptococcus pneumoniae (sérotype 18). 12 Isolat clinique de Streptococcus pneumoniae (sérotype 6). 13 Isolat clinique de Streptococcus pneumoniae (sérotype 23). Parmi les espèces de Streptocoques, les résultats d'hybridation ADN-ADN (Kilpper-Balz, R, Wenzig, P, et Schleifer, K H 1985 Molecular relationships and classsi- fication of some viridans streptococci as Streptococcus oralis and amended description of Streptococcus oralis (Bridge and Sneath 1982) Int J Sys Bact 35, 482-488) montrent que Streptococcus oralis qui comprend diverses souches classifiées antérieurement S sanguis II, S. mitior, S viridans, et S mitis sont les deux espèces les plus proches de Streptococcus pneumoniae La souche de25 Streptococcus oralis NCTC 11427 retenue dans cette étude est la souche type (Kilpper-Bâlz et coll, 1985, et Coykendall, A L 1989, Classification and identification of Viridans Streptococci Clin Microbiol Rev 2, 315- 328, Kilian, M, Mikkelsen, L, et Henrichsen, H 1989, Taxonomic study of Viridans Strepotocci: description of Streptococcus gordonii sp nov and emended descriptions of Streptococcus sanguis (White and Niven 1946), Strepto- coccus oralis (Bridge and Sneath 1982); and Streptococcus mitis (Andrewes and Horder, 1906), Int J Sys Bact 39,35 471-484) C'est d'ailleurs à partir de cette souche qu'a été isolé le fragment d'ADN qui constitue une sonde spé- cifique pour Streptococcus oralis (Schmidhuber et coll, 1988) Streptococcus mitis est représenté par deux isolats cliniques. Streptococcus gordonii, espèce nouvellement créée (Kilian et coll, 1989) qui regroupe nombre de souches classifiées antérieurement S sanguis II, représentée par la souche OB 11 (ex S sanguis Challis) (Kilian et coll, 1989, Haisman et Jenkinson, 1991), ainsi que S sanguis qui n'est pas représenté dans cette étude peuvent être considérés, d'après les résultats d'hybridation ADN-ADN, comme moins proches de Streptococcus pneumoniae que Strep- tococcus oralis et Streptococcus mitis. Les résultats des expériences d'hybridation ADN- ADN de Kilpper-Bâlz et coll ( 1985) dans lesquelles figu- rent au moins une souche typique de chacune de ces espèces sont résumés dans la figure 8. b) Préparation des échantillons, électrophorèse sur gel et transfert sur membrane nylon: L'ADN chromosomique des différentes souches de streptocoques a été préparé par la technique décrite par Fenoll et coll ( 1990) La digestion enzymatique par l'enzyme Pstl ainsi que les électrophorèses sur gel d'aga- rose et les transferts sur membrane Nylon chargée (Biodyne B, provenance PALL) ont été effectuées dans les conditions décrites par Maniatis, T, Fristsch, E F, et Sambrook, ( 1982) Molecular cloning; A laboratory manual (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory). c) Conditions d'hybridation moléculaire: L'oligodésoxyribonucléotide a été marqué en 5 ' par l'ADN kinase du bactériophage T 4 (provenance Bethesda Research Laboratory) avec de l'ATP 7-32 p(à 3000 Ci/m M). il de solution d'oligonucléotide marqué (lx 107 cpm pour environ 2,5 picomoles) ont été introduits dans un tampon d'hybridation l 6 x SSC (Saline Sodium Citrate), lox Denhardt's, 0,1 % SDS (dodécyl sulfate de Na)l, 50 mg/ml (ADN de sperme de saumon, 1 % de réactif bloquant boehringer) (Maniatis et coll, 1982) L'hybridation a été réalisée à 40 C (sonde de SEQ n 6) ou 48 C (sonde de SEQ n 7), pendant environ 15 heures Après deux lavages brefs dans une solution de 6 x SSC, 0,1 % SDS, à température ambiante, la membrane a été mise au contact d'un film radiographique qui a été exposé pendant 3 à 36 heures à - C. Une expérience d'identification de Streptococcus pneumoniae par hybridation moléculaire a été réalisée en utilisant comme sonde les oligonucléotides (SEQ n 6 et SEQ n 7) Des ADN chromosomiques de Streptococcus pneumo- niae et d'autres streptocoques parmi lesquels Streptococ- cus oralis et Streptococcus gordonii, deux des espèces les plus proches de cette bactérie ont été digérés par l'en- zyme de restriction Pstl, séparés par électrophorèse sur20 gel d'agarose, puis transférés sur membrane Nylon L'oli- gonucléotide marqué au 32 p a été mis au contact de cette membrane, en conditions standard d'hybridation. Les résultats de l'hybridation montrent des si- gnaux d'hybridation très importants obtenus avec l'ADN de Streptococcus pneumoniae, alors qu'ils sont inexistants avec l'ADN de Streptococcus oralis, espèce la plus proche de Streptococcus pneumoniae, ainsi qu'avec l'ADN de Strep- tococcus gordonii, des isolats cliniques classifiés Streptococcus sanguis, et d'un des isolats cliniques classifié Streptococcus mitis. ETAPE 4 Identification de Streptococcus pneumo- niae par hybridation directe sur colonies en utilisant un système de détection non-radioactif et semi-automatisé dé-35 crit dans le brevet français N 90 07249 dont le contenu est incorporé à la présente description, si besoin est. L'identification des souches de Streptococcus pneumoniae à partir des souches décrites dans l'étape 3 a été confirmée selon cette technologie de détection non-ra- dioactive. L'extraction de l'ADN total à partir des colonies est réalisée de la manière suivante Une colonie bacté- rienne standardisée à un inoculum 109 bactéries est reprise dans 400 p 1 d'une solution de citrate de sodium 0,1 M conte- nant 0,85 g de chlorure de sodium On ajoute 40 pl de dé- tergent désoxycholate de sodium ( 1 %) Après incubation minutes à température ambiante, 4 extractions phénol- chloroforme sont effectuées (Maniatis et coll 1982). L'ADN est précipité à l'éthanol Le culot est repris dans 100 pl de tampon citrate de sodium cette solution est so- niquée avec un sonicateur 60 W (Société Bioblock sous la réf C 72442) utilisant une sonde de type "cuphorn" (Société Bioblock sous la réf C 72438) afin d'obtenir une population de fragments de taille majoritaire de 1 Kilobase Un aliquote correspondant à 108 bactéries dans Al est alors identifié par hybridation selon le proto- cole suivant Dans une plaque de microtitration (Nom com- mercial Nunc 439454) est déposée une solution de la sondeoligonucléotidique de capture (sonde SEQ n 6) à 1 ng/l dans du PBS 1 X ( 0 15 M Na Cl, 0 05 M phosphate de sodium, p H 7 0) La plaque est incubée 2 h à 37 C puis lavée 3 fois avec 300 Al de PBST (PSB + détergent de marque TWEEN de la Société MERCK) La cible constituée par 10 Ml de l'ADN total soniqué est mélangée avec 70 gl de tampon PBS saumon lPB 53 X + ADN de sperme de saumon 10 Mg/ml, (Société Sigma sous la réf D 9156)l et 10 pl de soude 2 N. L'ensemble est neutralisé 5 minutes après, par l'addition de 10 Jl d'acide acétique 2 N L'ensemble est ajouté dans le puits en plus de 50 Ml d'une solution du conjugé sonde de détection marquée à la péroxydase selon SEQ n 7 à la concentration de 0,1 ng/pl dans un tampon PBS cheval lPB 53 X + 10 % sérum de cheval, (Société bio Mérieux SA réf 55842)l. La plaque est incubée i h & 37 C et lavée par 3 X 300 Al de PBS Tween lPB 51 X + O 5 % Tween 20 (Société Merck réf 822184)l. il de substrat OPD (ortho-phenylenediamine de Cambridge Medical Biotechnology ref/456) dans un tampon spécifique ( 0,055 M acide citrique, 0 1 M Na 2 HPO 4, p H 4,93) à la concentration de 4 mg/ml auquel on ajoute extempora- nément H 202 à 30 volumes au 1/1000, sont ajoutés par puits. Après 20 minutes de réaction, l'activité enzymatique est bloquée par 100 pl d'H 2 SO 4 1 N et la lecture est effectuée sur un lecteur de microplaques de la marque déposée Axia Microreader (Société bio Mérieux SA) à 492 nm. Le système ne génère pas de bruit de fond puisque le puits contenant l'ADN de saumon du tampon d'hybridation qui est soniqué de la même manière que l'ADN des souches * testées, ne génère pas de signal Les résultats de spéci- ficité sont les mêmes que que ceux obtenus dans l'étape 3. Cette application d'une sonde froide indique que la spéci- ficité de la séquence de l'invention est conservée quelle que soit la méthodologie d'hybridation utilisée. SEQ N 1: GTTAACACTT ACTGACTTCG TCTATCCACA AAAACAGTGT GCATCATGCG AGTTTCTGTT TTCAAAAATC TCAGTTCTAT ACCTCAAAAC TTTGAGCTGA GCTAGCTTCT TTCTTTTTAT TCTTCAAACA CTGCCACCTC AGTGTTTTGA CTTTGTCAGT TAGTTTGCTC GGACTATAAA ACGTCAGCTT AAAACGGTGT GCTGACTTCG CTTATCTACA TTTGATTTTC TGTTCAGCTG TGCCTTGCCG TTTGAGCTGA TCAGTTCTAT ACCTCAAAAC ATTGAGTATA TATATATGTT CTTCGTCAGT CCACAACCTC AGTGTTTTGA AAACAGATG SEQ N 2: TAATACTCTT CGAAAATCTC TTCAAACCA CGTCAGCGTC GCCTTGCCGT AGATAT GTT A SEQ N 3: CTGACTTCGT SEQ N 4: CAACCTGCGG CAGTTCTATC TACAACCTCA AAACAGTG TTTTGAG CTAGCTTCCT AGTTTGCTCT TTGATTTTCA TTGAGTATAA SEQ N 5: ACGTCARCKT YRCCTTRCCG SEQ N 6: TATYYACARY STCAAAAYAG TG SEQ N 7: TAGTTTGCTC TTTGATTTTY ATTGAGTAT SEQ N 8: ACGTCAGCTT TGCCTTGCCG SEQ N 9: CGGCAAGGCA AAGCTGACGT SEQ N 10: ATCTGCCACC TCAAMACGGT SEQ N 11: ACCGTTTTGA G SEQ n 12: ATCCACAACC T SEQ n 13: ACTGTTTTGA G SEQ n 14: ATCTACAACC T SEQ N 015: ACTGTTTTGA G SEQ n 16: GAGCATCATG C SEQ n 17: AAGCTAGCCG C SEQ n 18: GCTAGCTTCT T SEQ n 19: GAGCAAACTA A SEQ n 20: TGCTCTTTGA T SEQ n 21: TCAATGAAAA T GTGGCAGAT CAAAACAGT GTTGTGGAT CAAAACAGT GTTGTAGAT GGCTAGCTT ATGATGCTC AGTTTGCTC GAAGCTAGC TTTCATTGA CAAAGAGCA REVENDICATIONS 1/ Fragment monocaténaire de l'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 5 70 % d'homologie avec au moins une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences nucléotidiques SEQ n 2, SEQ n 3, SEQ n 4 identifiées dans la description et leurs séquences complémentaires respectives. 2/ Fragment selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique dudit fragment pré- sente au moins 85 % d'homologie avec au moins une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences nucléotidiques SEQ n 2, SEQ n 3, SEQ n 4 identifiées dans la description et leurs séquences complémentaires respectives. 3/ Sonde susceptible de s'hybrider spécifiquement avec l'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae, caracté- risée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une par- tie d'une séquence consensus de l'ADN génomique de Strep- tococcus pneumoniae, cette séquence consensus étant choi- sie parmi les séquences nucléotidiques SEQ n 2, SEQ n 3, SEQ n" 4 identifiées dans la description et leurs séquences complémentaires respectives. 4/ Sonde selon la revendication 3, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique de ladite sonde présente au moins 85 % d'homologie avec au moins une partie de la- dite séquence consensus. / Sonde selon la revendication 3 ou 4, caractéri- sée en ce que la séquence nucléotidique de ladite sonde comporte au moins 12 nucléotides. 6/ Sonde selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence nucléotidique, SEQ n 3. 7/ Sonde selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite séquence nucléotidique SEQ n 3 est flanquée à son extrémité 5 ' d'une séquence nucléotidique SEQ n 2. 8/ Sonde selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite séquence nucléotidique SEQ n 3 est flanquée à son extrémité 3 ' d'une séquence nucléotidique SEQ n 4. 9/ Sonde selon la revendication 6, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique SEQ n 3 est répétée quatre fois de manière contiguë. / Sonde selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléoti- dique choisie parmi les séquences SEQ n 5, SEQ n 6 et SEQ n 7, identifiées dans la description. 11/ Sonde de capture d'ADN dénaturé caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les sondes selon l'une quelconque des revendications 3 à 10. 12/ Sonde selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle est marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi des isotopes radioactifs, des enzymes choisis parmi la péroxydase et la phosphatase alcaline et ceux susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chi-20 miques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et la biotine. 13/ Sonde de détection caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les sondes selon la revendication 12. 14/ Amorce spécifique pour l'amplification par la polymérisation de l'ADN génomique de Streptococcus pneumo- niae, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nu- cléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une partie d'une séquence consensus de l'ADN géno-30 mique de Streptococcus pneumoniae, cette séquence consen- sus étant choisie parmi les séquences nucléotidiques SEQ n 2, SEQ n" 3, SEQ n 4 identifiées dans la description et leurs séquences complémentaires respectives. / Amorce selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les amorces répondant aux séquences nucléotidiques respectivement SEQ n 8 à SEQ n 21, identifiées dans la description. 16/ Couple d'amorces caractérisé en ce qu'il com- prend au moins une amorce choisie parmi les amorces selon la revendication 15. 17/ Couple d'amorces selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les couples d'amorces constitués par une amorce répondant à la sé- quence nucléotidique SEQ n 8 et une sonde répondant à l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ n 11, SEQ n 13, SEQ n 15, SEQ n 17, SEQ n 19 et SEQ n 21 ou parmi les couples d'amorces constitués par une amorce ré- pondant à la séquence nucléotidique SEQ n 10 et une amorce répondant à l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ n 13, SEQ n 15, SEQ n 19 et SEQ n 21, identifiées dans la description. 18/ Réactif pour détecter sélectivement Strepto- coccus pneumoniae dans un échantillon biologique, caracté- risé en ce qu'il comprend au moins une sonde selon l'une quelconque des revendications 3 à 10. 19/ Réactif selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend une sonde selon la revendication 11. / Réactif selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend une sonde selon la revendication 12. 21/ Réactif selon la revendication 18, caractérisé en ce que la sonde est en milieu liquide ou fixée sur un support solide directement ou indirectement. 22/ Réactif selon la revendication 21, caractérisé en ce que ledit support est choisi parmi les polystyrènes, les copolymères styrène-butadiène, les copolymères sty- rène-butadiène en mélange avec des polystyrènes, des poly- propylènes, des polycarbonates, des copolymères polystyrène-acrylonitrile, des copolymères styrène-méthyl- méthacrylate de méthyle, parmi les fibres synthétiques et35 naturelles, parmi les polysaccharides et les dérivés de la cellulose. 23/ Réactif selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une amorce selon la revendication 14 ou 15. 24/ Réactif selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il comprend un couple d'amorce selon la revendi- cation 16 ou 17. / Procédé de détection sélective de Streptococ- cus pneumoniae dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'on expose l'ADN génomique des bactéries contenues dans ledit échantillon, sous forme de fragments monocaté- naires, à une sonde selon l'une quelconque des revendica- tions 3 à 10 ou selon les revendications 12 et 13, et on détecte les zones d'hybridation avec ladite sonde. 26/ Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'on expose l'ADN génomique des bactéries, à une sonde de détection selon la revendication 13. 27/ Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'avant d'exposer l'ADN génomique des bactéries à ladite sonde de détection, on l'expose à une sonde de cap- ture selon la revendication 11. 28/ Procédé selon lune quelconque des revendica- tion 25 à 27, caractérisé en ce que avant d'exposer les- dits fragments à ladite sonde, on réalise une amplifica- tion de l'ADN génomique de Streptococcus pneumoniae, en25 présence d'un système enzymatique adapté et au moins une amorce selon la revendication 14 ou 15 ou un couple d'amorces selon la revendication 16 ou 17.