FR 2696462 A1 19940408 FR 9211745 A 19921005 PROCEDE D'OBTENTION DE LA DESACETYL-10 BACCATINE III La présente invention concerne un procédé pour obtenir des intermédiaires utiles pour la préparation par des procédés semi- synthétiques du taxol, du Taxotère ou de leurs analogues à partir des différentes parties de plantes contenant ces intermédiaires. Plus particulièrement, l'invention concerne l'obtention sélective de la désacétyl-10 baccatine m à partir de l'écorce, du tronc, des racines ou des feuilles de différentes espèces d'ifs. Le taxol et le Taxotère ainsi que leurs analogues de formule générale: R-O O O-R' Ri-CO-NH O O l/a \ O 9 (I) fix 1 OH O H HO -OCOCH 3 OCOC 6 H 5 qui manifestent des propriétés anticancéreuses et antileucémiques remarquables, constituent des agents chimiothérapeutiques remarquables pour le traitement d'un certain nombre de cancers tels que par exemple les cancers du sein, de la prostate, du colon, de restomac, du rein ou des testicules et plus spécialement le cancer de l'ovaire. Notamment, dans la formule générale (I), Ar peut représenter un radical phényle éventuellement substitué, R peut représenter un atome d'hydrogène ou un radical acétyle ou un radical carbamoyle N-substitué, R' représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle N-substitué et R 1 peut représenter un radical phényle ou un radical R 2-O dans lequel R 2 représente un radical alcoyle, alcényle, alcynyle, cycloalcoyle, cycloalcényle, bicycloalcoyle, phényle ou hétérocyclyle. Le taxol correspond au produit de formule générale (I) dans laquelle Ar et R 1 représentent un radical phényle et R représente un radical acétyle et R' représente un atome d'hydrogène et le Taxotère corespond au produit de formule générale (I) dans laquelle Ar représente un radical phényle, R et R' représentent un atome d'hydrogène et R 1 représente un radical t butoxy. Le taxol, qui existe à l'état naturel dans différentes espèces d'ifs dans lesquelles il se trouve en faibles quantités, est difficile à isoler sans procéder à la destruction complète de la plante Par exemple, le taxol peut être isolé selon la méthode de C H O HUANG et coll J Natl Prod, 49, 665 ( 1986) qui consiste à traiter l'écorce broyée de Taxus brevifolia par le méthanol, à concentrer l'extrait, extraire le concentrat par le dichlorométhane, à concentrer à nouveau, à disperser le résidu dans un mélange hexane-acétone ( 1-1 en volumes), à purifier la partie soluble par chromatographie sur une colonne de Florisil pour obtenir le taxol brut qui est purifié par recristallisations successives dans des mélanges méthanol- eau et hexane- acétone puis par chromatographie et nouvelle cristallisation Les quantités de taxol ainsi extraites peuvent représenter de 0,005 à 0,017 % de la partie de la plante mise en oeuvre. Le Taxotère qui n'existe pas à l'état naturel peut être préparé par hémi- synthèse à partir de la désacétyl-10 baccatine m I de formule: HO 9 OH HO OCOCH 3 OCOC 6 H 5 selon les procédés qui sont décrits, par exemple, dans les brevets américains US 4,814,470 ou US 4,924,012 ou dans la demande internationale PCT WO 92/09589. Le taxol peut aussi être préparé par des procédés qui font intervenir la mise en oeuvre de la désacétyl-10 baccatine 1 I soit par passage par l'intermédiaire du Taxotère dans les conditions décrites dans le brevet américain US 4,857,653 soit par estérification de la baccatine II dans les conditions décrites dans les brevets européens EP 400,971 ou EP 428,376 soit par estérification de la désacétyl-10 baccatine m I et acétylation dans les conditions décrites dans les brevet américain US 4,924,011. Les différentes variétés d'ifs (Taxus baccata, Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cupidata, Taxus floridana, Taxus media, Taxus wallichiana) contiennent des dérivés du taxane dont les principaux sont essentiellement le taxol et la désacétyl-10 baccatine Im, les autres dérivés étant plus particulièrement la céphalomannine, la désacétyl-10 céphalomannine ou la baccatine Im éventuellement liés à des sucres. Alors que le taxol se trouve principalement dans le tronc et l'écorce, la désacétyl-10 baccatine HI est présente essentiellement dans les feuilles Par ailleurs, la teneur en désacétyl-10 baccatine Im dans les feuilles est généralement très supérieure à celle du taxol, que celui-ci soit présent dans l'écorce, le tronc ou dans les feuilles. Il en résulte qu'il est particulièrement important de pouvoir disposer de désacétyl-10 baccatine HI qui est essentielle à la préparation de quantités de taxol beaucoup plus importantes que par extraction directe à partir des ifs ainsi qu'à la préparation du Taxotère. En extrayant la désacétyl-10 baccatine HI à partir des feuilles d'ifs, on n'est pas conduit à une destruction totale de la plante dont les feuilles peuvent être utilisées à nouveau après chaque cycle de croissance. Généralement, les méthodes connues d'extraction des dérivés du taxane contenus dans les différentes parties de l'if (écorce, tronc, racines, feuilles,) nécessitent la mise en oeuvre de techniques chromatographiques longues et coûteuses qui ne permettent pas une séparation totale et quantitative des dérivés du taxane présents initialement dans la plante. La désacétyl-10 baccatine III peut être obtenue, avec des rendements voisins de 300 mg par kg de feuilles (Taxus baccata), par un procédé qui met en oeuvre une macération des aiguilles dans réthanol, une extraction par un solvant organique tel que le chlorure de méthylène et des chromatographies successives selon le procédé qui est décrit dans le brevet américain US 4,814,470. Les différents constituants dérivés du taxane présents dans les différentes parties de lif peuvent aussi être séparés par des méthodes mettant en oeuvre la chromatographie en phase liquide "reverse" qui sont décrites, en particulier dans la demande international PCT WO 92/07842 Ces procédés consistent essentiellement à traiter les extraits bruts d'ifs par chromatographie en phase liquide "reverse" sur un adsorbant sur lequel se fixent les dérivés du taxane, à éluer les dérivés du taxane et à les isoler Selon ce procédé, il est possible d'isoler 200 mg de désacétyl-10 baccatine III à partir de 1 kg de feuilles broyées et séchées. Il a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que la désacétyl-10 baccatine HI peut être extraite très sélectivement, et avec un excellent rendement, à partir des différentes parties de l'if, et plus particulièrement des feuilles, par un procédé simple ne mettant pas en oeuvre des techniques chromatographiques Par exemple, il est possible d'extraire environ 800 mg de désacétyl-10 baccatine Im par kg de feuilles d'if (Taxus baccata). Plus particulièrement le procédé selon l'invention consiste 1) à traiter par l'eau les parties broyées de l'if (Taxus sp), 2) à séparer la solution aqueuse, contenant la désacétyl-10 baccatine III, de la masse végétale en suspension, 3) à extraire la désacétyl-10 baccatine III de la solution aqueuse par un solvant organique, 4) à séparer l'extrait organique, contenant la désacétyl-10 baccatine II, de la phase aqueuse, ) à éliminer le solvant organique de 'extrait organique ainsi séparé, 6) à faire cristalliser sélectivement la désacétyl-10 baccatine II à partir du résidu ainsi obtenu dans un solvant organique, 7) à isoler la désacétyl-10 baccatine I Im sous forme purifiée. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre sur toute partie appropriée de l'if telle que l'écorce, le tronc, les racines ou les feuilles L' if utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention appartient de préférence à la variété Taxus baccata, Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cupidata Taxus floridana, Taxus media ou Taxus wallichiana Il est particulièrement avantageux d'utiliser les feuilles d'if (Taxus baccata, Taxus brevifolia) qui généralement sont plus riches en désacétyl-10 baccatine III Les fragments utilisés peuvent avoir des dimensions variant de 0,5 à quelques millimètres Pour des questions de commodité, il peut être avantageux d'utiliser des fragments dont les dimensions moyennes sont inférieures à 1 mm Les parties broyées, et éventuellement séchées, de rif peuvent être obtenues par des opérations de broyage, et éventuellement de séchage, qui, éventuellement, précèdent ou suivent des opérations de congélation et de décongélation des parties fraîches de la plante ou s'intercalent dans des opérations de congélation et de décongélation des parties fraîches de la plante. Le traitement par reau des parties broyées de l'if est effectué selon les techniques connues de rhomme de rart En particulier, la solution aqueuse contenant la désacétyl-10 baccatine Im est généralement obtenue par agitation, à une température comprise entre 20 et 65 C, des parties broyées de rif dans de reau pendant 30 minutes à 2 heures La quantité d'eau utilisée peut varier dans de larges limites, cependant il est convenable d'utiliser une quantité d'eau de 2 à 10 litres calculée par kg de partie de plante broyée et séchée et de préférence environ 5 litres d'eau par kg de partie de plante à traiter I 1 peut être avantageux d'utiliser de l'eau déminéralisée pour effectuer ce traitement et d'opérer sous ultra-sons. Dans le but d'améliorer le rendement, il peut être avantageux d'effectuer plusieurs traitements à reau de la masse végétale afin d'obtenir des solutions aqueuses dont on extrait la désacétyl-10 baccatine III dans les conditions décrites ci-après. La solution aqueuse obtenue contenant la désacétyl-10 baccatine II est séparée de la masse végétale par les techniques habituelles telles que la filtration, la centrifugation ou la décantation La solution aqueuse résultante est éventuellement refroidie puis la désacétyl-10 baccatine III est extraite, en une ou plusieurs fois, par un solvant organique Les solvants organiques qui conviennent particulièrement bien sont choisis parmi les éthers tels que le méthyl t butyléther, l'éthyl t butyléther, le méthyl n butyléther, le méthyl n amyléther, l'éthyl t amyléther, le t butyl isopropyléther, l'éthyl isobutyléther, le t butyl n propyléther ou l'éthyl n hexyléther et les esters aliphatiques tels que l'acétate d'éthyle, l'acétate de propyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n butyle, l'acétate de t butyle, le tbutylacétate de méthyle, le propionate de t butyle ou l'acétate de t amyle D'un intérêt tout particulier sont le méthyl t butyléther, l'éthyl t butyléther, l'acétate d'éthyle ou l'acétate de n butyle. L'extraction par un solvant organique est généralement effectuée sur une solution aqueuse dont le p H est inférieur à 7 et de préférence inférieur à 6. Les extraits organiques, contenant la désacétyl-10 baccatine HI, sont séparés de la phase aqueuse par application des techniques habituelles telles que la décantation. Les extraits organiques sont éventuellement lavés au moyen d'une solution aqueuse d'une base faible (solution aqueuse de carbonate de sodium par exemple) et/ou à l'eau Après séchage, le solvant organique de l'extrait est éliminé selon les méthodes habituelles et en particulier par distillation éventuellement sous pression réduite, pour donner un résidu généralement solide dont on isole la désacétyl-10 baccatine III. La cristallisation sélective de la désacétyl-10 baccatine Im est effectuée à partir d'une solution du résidu obtenu dans un solvant organique ou dans un mélange de solvants organiques Comme solvants permettant la cristallisation sélective de la désacétyl-10 baccatine HI peuvent être avantageusement utilisés les nitriles tels que l'acétonitrile, le propionitrile ou l'isobutyronitrile éventuellement en mélange avec un alcool aliphatique tel que le méthanol, l'éthanol, le propanol, risopropanol ou le n butanol ou un ester aliphatique tel que l'acétate d'éthyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n butyle ou l'acétate de t butyle ou une cétone aliphatique telle que racétone, la méthyl éthylcétone, la méthyl propylcétone, la méthyl n butylcétone ou la méthyl isobutylcétone Il est particulièrement avantageux d'effectuer la cristallisation sélective dans l'acétonitrile éventuellement en présence d'éthanol et/ou d'acétate d'éthyle ou de n butyle et/ou d'acétone. La désacéty I-10 baccatine III qui précipite peut être séparée par filtration, décantation ou centrifugation. Le procédé selon rinvention permet d'obtenir la désacéty I-10 baccatine HI pratiquement pure avec des rendements généralement très supérieurs à ceux obtenus par la mise en oeuvre des procédés antérieurement connus Le procédé selon l'invention permet d'extraire de façon quasiment quantitative la totalité de la désacétyl-10 baccatine Im contenue dans les parties de la plante utilisées et en particulier des feuilles. La désacéty I-10 baccatine III obtenue selon le procédé d'extraction de la présente invention peut être utilisée pour préparer le taxol ou le Taxotère ou leurs dérivés dans les conditions qui sont décrites plus particulièrement dans les brevets EP 0 253 738, EP O 253 739, EP O 336 841, EP O 336 840, WO 92 09589, EP 0 400 971 et EP 0 428 376. Les exemples suivants illustrent le procédé selon l'invention. EXEMPLE 1 A 2,5 litres d'eau déminéralisée chauffés à 50 C, on ajoute 500 g de feuilles d'ifs (Taxus baccata) broyées et séchées dont la taille moyenne des particules est inférieure à i mm et dont le titre en désacétyl-10 baccatine HI, déterminé par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), est de 0,08 % (soit 400 mg de désacétyl-10 baccatine III dans 500 g de feuilles) On agite pendant 1 heure à 50 C puis on filtre. Le filtrat ( 1,8 litre), dont le p H est de 5,4, est extrait par 3 fois 0,9 litre d'acétate d'éthyle Les phases organiques réunies ( 2,7 litres) sont lavées 2 fois par 1 litre d'une solution de carbonate de sodium 0,1 M puis par 2 fois 1 litre d'eau déminéralisée et enfin séchées sur sulfate de sodium Après filtration et concentration à sec, on obtient un solide ( 3,2 g) que l'on reprend par 9 cm 3 d'acétonitrile à une température voisine de 70 C Après refroidissement pendant une nuit à une température voisine de + 4 C, le précipité est séparé par filtration On obtient ainsi, après séchage, 245 mg de cristaux contenant, d'après l'analyse par HPLC, 75 %o de désacétyl-10 baccatine Im pure, soit 183 mg Les eaux-mères, d'après ranalyse par HPLC, contiennent 40 mg de désacétyl-10 baccatine Im. La masse végétale, qui a retenu 0,7 litre d'eau, est extraite 2 fois dans les conditions décrites ci-dessus Les filtrats aqueux réunis sont traités comme précédemment On obtient ainsi 2,5 g d'un produit solide que lon reprend dans 5 cm 3 d'acétonitrile à une température voisine de 70 C Apres refroidissement pendant une nuit à une température voisine de + 4 C, on sépare par filtration 169 mg de cristaux contenant, d'après l'analyse par HPLC, 75 % de désacétyl-10 baccatine Im pure soit 127 mg Les eaux-mères contiennent, d'après l'analyse par HPLC, 47 mg de désacétyl-10 baccatine II. La quantité totale de désacétyl-10 baccatine Im extraite par l'eau est de 183 + + 127 + 47 = 397 mg. Le rendement est pratiquement quantitatif. EXEMPLE 2 On chauffe 3 litres d'eau déminéralisée à 50 C puis on ajoute 500 g de feuilles d'ifs broyées et séchées et dont le diamètre moyen des particules est de 1 mm et dont le titre en désacétyl-10 baccatine HI, déterminé par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), est de 0,08 % (soit 400 mg de désacétyl-10 baccatine HI dans 500 g de feuilles) On agite pendant 1 heure à 50 C puis on filtre Le filtrat ( 1,97 litre), dont le p H est de 5,15, est ajusté à p H = 4,6 par addition d'acide chlorhydrique concentré puis il est filtré sur une membrane de carton amianté dans un filtre Seitz On recueille 1,8 litre de filtrat. On extrait 300 cm 3 de filtrat par 2 fois 150 cm 3 puis 4 fois 60 cm 3 de méthyl tert butyl éther (MTBE) Les extraits réunis et concentrés fournissent 620 mg de solides qui sont repris par 3 cm 3 d'acétonitrile à 70 C. Après refroidissement pendant une nuit à + 4 C, on sépare par filtration 28 mg de désacétyl-10 baccatine III cristallisé dont le titre déterminé par HPLC est de % Les eaux-mères contiennent 12,8 mg de désacétyl-10 baccatine Im (dosage par HPLC). REVENDICATIONS 1 Procédé d'obtention de la désacétyl-10 baccatine III à partir des différentes parties de l'if (Taxus sp) caractérisé en ce que 1) on traite par l'eau les parties broyées de l'if, 2) on sépare la solution aqueuse, contenant la désacétyl-10 baccatine III, de la masse végétale en suspension, 3) on extrait la désacétyl-10 baccatine Imf de la solution aqueuse par un solvant organique, 4) on sépare l'extrait organique contenant la désacétyl-10 baccatine III de la phase aqueuse, ) on élimine le solvant de l'extrait organique ainsi séparé, 6) on fait cristalliser sélectivement la désacétyl-10 baccatine III à partir du résidu ainsi obtenu dans un solvant organique, puis 7) on isole la désacétyl-10 baccatine III sous forme purifiée. 2 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les parties broyées, et éventuellement séchées, de l'if sont agitées avec de l'eau à une température comprise entre 20 et 651 C. 3 Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que les parties broyées, et éventuellement séchées, de lif sont obtenues par des opérations de broyage, et éventuellement de séchage, qui, éventuellement, précèdent ou suivent des opérations de congélation et de décongélation des parties fraîches de la plante ou s'intercalent dans des opérations de congélation et de décongélation des parties fraîches de la plante. 4 Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'on utilise de 2 à 10 litres d'eau par kg de partie de plante broyée et séchée. Procédé selon lune des revendications 2 à 4 caractérisé en ce que l'on utilise de l'eau déminéralisée. 6 Procédé selon lune des revendications 2 à 4 caractérisé en ce que lon opère sous ultra-sons. 7 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on sépare la solution aqueuse contenant la désacétyl-10 baccatine Im de la masse végétale en suspension par filtration, centrifugation ou par décantation. 8 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on extrait la solution aqueuse contenant la désacétyl-10 baccatine II par un solvant organique choisi parmi les éthers et les esters aliphatiques. 9 Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le solvant organique est choisi parmi le méthyl t butyléther, l'éthyl t butyléther, le méthyl n.butyléther, le méthyl n amyléther, l'éthyl t amyléther, le t butyl isopropyléther, réthyl isobutyléther, le t butyl n propyléther, l'éthyl n hexyléther, l'acétate d'éthyle, l'acétate de propyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n butyle, l'acétate de t butyle, le t butylacétate de méthyle, le propionate de t butyle et l'acétate de t amyle. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le solvant est choisi parmi méthyl t butyléther, l'éthyl t butyléther, l'acétate d'éthyle et l'acétate de n butyle. 11 Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que l'on opère avec une solution aqueuse dont le p H est inférieur à 7. 12 Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que le p H de la solution aqueuse est inférieur à 6. 13 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on sépare l'extrait organique contenant la désacétyl-10 baccatine III de la solution aqueuse par décantation. 14 Procédé selon la revendication i caractérisé en ce que l'on élimine le solvant de rextrait organique contenant la désacétyl-10 baccatine HI, éventuellement lavé au moyen d'une solution aqueuse d'une base faible et/ou à reau, par distillation. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que l'élimination du solvant de r'extrait organique est effectuée par distillation sous pression réduite. 16 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on cristallise sélectivement la désacétyl-10 baccatine III, à partir du résidu obtenu après rélimination du solvant, dans un solvant organique ou dans un mélange de solvants organiques. 17 Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que le solvant est choisi parmi les nitriles aliphatiques éventuellement en mélange avec un alcool aliphatique ou un ester aliphatique ou une cétone aliphatique. 18 Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que les nitriles sont choisis parmi l'acétonitrile et le propionitrile. 19 Procédé selon la revendication 17 cractérisé en ce que l'alcool aliphatique est choisi parmi le méthanol, l'réthanol, le propanol, l'isopropanol et le n butanol. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que rester aliphatique est choisi parmi l'acétate d'éthyle, l'acétate d'isopropyle, racétate de n.butyle et l'acétate de t butyle. 21 Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que la cétone aliphatique est choisie parmi l'acétone, la méthyl ethylcétone, la méthyl propylcétone, la méthyl n butylcétone et la méthyl isobutylcétone. 22 Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que la cristallisation sélective est effectuée dans l'acétonitrile éventuellement associé a l'éthanol et/ou l'acétate d'éthyle ou de n butyle et/ou l'acétone. 23 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la désacétyl- baccatine III est isolée par filtration, décantation ou centrifugation. 24 Procédé selon rune des revendications 1 à 23 caractérisé en ce que ron extrait la désacétyl-10 baccatine HI à partir de récorce, du tronc, des racines ou des feuilles de rif. 25 Procédé selon rune des revendications 1 à 23 caractérisé en ce que l'on extrait la désacétyl-10 baccatine HI à partir des feuilles de rif. 26 Procédé selon rune des revendications 24 ou 25 caractérisé en ce que rif appartient à la variété Taxus baccata, Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cuspidata, Taxus floridana, Taxus media ou Taxus wallichiana. il 27 Utilisation de la désacétyl-10 baccatine III obtenue selon le procédé de l'une des revendications 1 à 26 pour la préparation du taxol, du Taxotère ou de leurs dérivés. 28 La désacéty I-10 baccatine m II lorsqu'elle est obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon rune des revendications 1 à 26.