FR 2685916 A1 19930709 FR 9215448 A 19921222 TITRE: INHIBITEURS MIXTES DE LA NO SYNTHASE ET DE LA CYCLOOXYGENASE AINSI QU' UN PROCEDE POUR LEUR PREPARATION L'invention concerne des composés présentant une double activité biologique, ainsi qu' un procédé pour leur préparation Ces composés ont une double activité biologique, dans la mesure o ils inhibent à la fois le processus de la L-arginine / oxyde nitrique (NO) et le processus de la cyclooxygénase. Compte tenu du rôle potentiel de la NO synthase et de la cyclooxygénase dans la physiopathologie, les composés peuvent produire des effets bénéfiques et favorables dans le traitement des: troubles cardiovasculaires et cérébrovasculaires, comprenant, par exemple, les migraines, les congestions cérébrales, les infarctus, les ischémies, les chocs septiques, endotoxiniques et hémorragiques, les douleurs; diverses formes d'inflammation, comprenant, par exemple, les fièvres rhumatismales aiguës, les arthrites rhumatismales ou d'autres types d'arthrites, l'ostéo-arthrite, l'asthme; troubles du système immunitaire, comprenant les infections virales ou non virales, les maladies auto- immunes et toutes les pathologies caractérisées par une production excessive d'oxyde nitrique et/ou des métabolites d'acide arachidique. Les inhibiteurs de la cyclooxygénase ou des médicaments analogues de l'aspirine, c'est-à-dire l'acide acétylsalicylique et l'acide salicylique, les dérivés de l'indole méthylé, tels que l'indométacine (DCI de l'acide l 1-( 4-chlorobenzoyl)-5-méthoxy-2-méthyl-l H-indole-3- yll acétique et le sulindac (DCI de l'acide l 5-fluoro-2-méthyle-1-ll 4(méthylsulfinyle) phénylel- méthylènel-l H-indene-3-yll acétique, les dérivés des acides Nphénylanthraniliques (méclofénamate, fénamates), les dérivés d'acide propionique tels que l'ibuprofène (DCI de l'acide pisobutylhydratropique), naproxène, fénoprofène, sont largement employés et ont fait suffisamment leurs preuves comme médicament efficace en thérapie de l'inflammation, avec, cependant, quelques effets secondaires indésirables à des dosages élevés (R Flower, S. Moncada et J Vane, Mechanism of action of aspirin-like drugs In the pharmacological basis of therapeutics Goodman and Gilman, 1985, 29, 674-715) En outre, ces composés ont été utilisés à la fois dans le traitement aigu et prophylactique de la migraine La valeur de ces -2- médicaments est indéniable, bien que leurs réponses thérapeutiques soient souvent incomplètes et que, chez certains malades, le traitement par de tels composés ne soit pas adapté En raison de leurs propriétés anti- inflammatoire et anti-agrégante des plaquettes, ces composés ont également été utilisés pour la thrombose et avec une réduction évidente de l'oedème, dans les modèles d'ischémies du cerveau et, par conséquent, sont proposés dans le traitement et la prévention des infarctus, des commotions et des maladies cérébrovasculaires (W Armstrong Recent trends in research and treatment of stroke, SCRIP, PJB publications, 1991). L'activité biologique des inhibiteurs de la NO-synthase n'a été découverte que récemment et leur usage thérapeutique potentiel est seulement à l'étude Ces substances, dont les structures sont représentées par des analogues de la L-arginine et décrites dans le brevet français 90.15904, sont des inhibiteurs de la production d'oxyde nitrique (NO) Notre connaissance actuelle sur le NO a été intégralement révisée en 1991, par Moncada et al, (S Moncada, R.M J Palmer, E A Higgs: Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology - Pharmacological reviews 43, 2, 109-142) En substance, il apparaît que la NO sert de mécanisme de transduction pour la cyclase guanylate soluble dans la vascularisation, les plaquettes, le système nerveux, et de molécule effectrice dans les réactions immunologiques dans beaucoup de cellules et de tissus, y compris les macrophages et les neutrophiles Le NO est produit enzymatiquement à partir de la L-arginine, par une enzyme appelée NO synthase. Cette enzyme existe sous deux formes: l'une constitutive et l'autre inductible, toutes deux inhibées par les analogues de la L-arginine tels que définis ci-dessus Dans certaines pathologies, une production excessive de NO peut se produire, comme cela a déjà été démontré au cours d'un choc, et tel que cela a été décrit dans le brevet précédemment cité. Dans ce contexte, les inhibiteurs de la NO synthase sont des médicaments efficaces pour prévenir des conséquences vasculaires et la mortalité causées par une maladie, en particulier lorsqu'ils sont combinés avec les inhibiteurs de la cyclooxygénase comme l'aspirine, l'indométacine ou le méclofénamate Les effets bénéfiques de la combinaison de deux principes actifs dans la même molécule, sont susceptibles de se produire pour les patients souffrant de migraines, de congestions cérébrales, d'infarctus, d'ischémies cérébrales, de douleurs, d'inflammations et de diverses maladies immunologiques. L'association d'inhibiteur de la NO synthase et d'inhibiteur de la cyclooxygénase, a déjà été décrite, dans le brevet ci-dessus mentionné, pour les états de chocs Cependant, la combinaison de ces composés présente un meilleur effet synergique que l'association. -3- L'invention concerne des composés de formule générale AB, qui peuvent être des sels ou des amides, dans laquelle: A représente un inhibiteur de la cyclooxygénase ayant une fonction acide accessible, de formule générale RCOOH dans laquelle COOH représente la fonction acide accessible et R le radical approprié de l'inhibiteur de la cyclooxygénase, et B représente les analogues de la L-arginine de formnule R 2 N\ NH 2 R/C-NH-(CH 2)3-CH"NH 2 R 5 "COOR 1 dans laquelle R 1 représente un atome d'hydrogène ou le radical méthyl ou éthyl, R 2 représente l'atome d'hydrogène ou le radical nitro, et R 3 le radical amino, méthylamino, éthylamino, hydrazino, méthyl ou éthyl, avec la condition suivante: si AB est un sel dans lequel R 2 représente l'atome d'hydrogène, alors R 3 ne représente pas le radical amino. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'inhibiteur de la cyclooxygénase, de formule générale RCOOH, est sélectionné parmi l'acide salicylique, l'acide acétylsalicylique, l'acide méfénamique, l'ibuprofèene, l'indométacine et le sulindac. L'invention concerne, également, un procédé de préparation des composés de formule AB, comprenant l'étape qui consiste à faire réagir, dans des proportions substantiellement équimolaires, dans des conditions appropriées, un composé A ou un précurseur de ce composé, dans lequel A est tel que défini ci-dessus, avec un composé B ou un précurseur de ce composé B, dans lequel B est tel que défini ci-dessus. Plus particulièrement, le procédé pour la préparation des composés, sous forme de sel, de formule générale R 2 N,NH 3 + -OCR C-NH-(CH 2)3-CH, l R 3 COOR 1 dans laquelle R 1, R 2 et R 3 sont tels que définis ci-dessus, consiste à faire réagir, dans de l'eau ou un mélange d'eau et d'alcool, à une température comprise entre la température ambiante et le point d'ébullition du mélange réactionnel, un composé de formule générale A ou un précurseur de ce même composé dans lequel A est tel que défini cidessus, avec un composé de formule générale B ou un précurseur de ce composé B dans lequel B est tel que défini ci- dessus Le précurseur du composé A peut être un sel de ce composé A tel que, par exemple, le sel de sodium Le précurseur du composé B peut être, par exemple, l'acétate ou le -4- chlorhydrate de ce composé B L'alcool utilisé en mélange avec l'eau, peut être du méthanol ou de l'éthanol. Plus particulièrement, le procédé pour la préparation de composés, sous forme d'amide de formule générale o Il R 2 N,NH-C-R C-NH-(CH 2)3-CH R 3 COOR 1 dans laquelle R 1, R 2 et R 3 sont tels que définis ci-dessus, consiste à faire réagir un composé de formule générale B ou un précurseur de ce composé B, dans de l'acétonitrile, à une température comprise entre O C et la température ambiante, en présence d'une base, avec le précurseur du composé A de formule RCOX, dans lequel R est tel que défini ci-dessus et X représente un atome d'halogène Le précurseur du composé B peut être, par exemple, le chlorhydrate de ce composé B La réaction peut s'effectuer en présence de triéthylamine en tant que base. Les exemples suivants illustrent l'invention. Exemple 1: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = acide acétylsalicylique B = N-monométhyl-L-arginine (L-NMMA) 99 mg ( 0,52 mmol) de L-NMMA et 95 mg ( 0,52 mmol) d'acide acétylsalicylique sont dissous dans 10 ml d'éthanol ( 95 %), à température ambiante L'agitation est maintenue pendant 3 heures à température ambiante La solution est concentrée à sec et le résidu obtenu est traité avec 25 ml d'eau, puis lyophilisé pour obtenir 190 mg du composé souhaité (solide blanc; point de fusion = 170 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, D 20): 7,80-6,60 (m, 4 H, aromatique); 3,50 (t, 1 H, CHCO 2 H); 3,10 (m, 2 H, C_ 12-NH); 2,60 (s, 3 H, CH 3-NH); 2,15 (s, 3 H, CH 3-CO); 1,90-1,30 (m, 4 H, CH-CH 2-CH 2). -5- Exemple 2: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = acide salicylique B = N-monométhyl-L-arginine (L-NMMA) 0,52 mmol d'acétate de N-monométhyl-L-arginine et 0,52 mmol de sel de sodium de l'acide salicylique sont dissous dans l'eau, à température ambiante L'agitation est maintenue à température ambiante, jusqu'à l'obtention d'une solution limpide L'acétate de sodium formé est éliminé et la solution est lyophilisée pour obtenir 160 mg du composé souhaité (solide blanc; point de fusion = 172-175 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, D 20): 7,75-6,70 (m, 4 H, aromatique); 3,55 (t, 1 H, CH-COOH); 3,00 (m, 2 H, CH 2-N-H); 2,60 (s, 3 H, NH-CH 3); 1,90-1,30 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 3: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = acide acétylsalicylique B = N-co-nitro-L-arginine (L-NO) 500 mg ( 2,28 mmol) de N-oe-nitro-L-arginine et 411 mg ( 2,28 mmol) d'acide acétylsalicylique sont dissous dans un mélange d'éthanol / H 20 ( 100 ml / 70 ml), à chaud. L'agitation est maintenue pendant une heure, au reflux La solution est concentrée à sec et le résidu obtenu est traité avec 100 ml d'eau, puis lyophilisé pour obtenir 900 mg du composé souhaité (solide blanc; point de fusion > 260 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, D 20): 7,85-6,70 (m, 4 H, aromatique); 3,70 (t, 1 H, CH-COOH); 3,10 (m, 2 H, CH 2-NH); 2,16 (s, 3 H, CH 3); 1,90-1,35 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 4: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = acide salicylique B = N-co-nitro-L-arginine (L-NO) 500 mg ( 2,28 mmol) de Nco-nitro-L-arginine et 315 mg ( 2,28 mmol) d'acide salicylique sont dissous dans un mélange d'éthanol / H 20 ( 100 ml / 70 ml), à chaud L'agitation est maintenue pendant une heure, au reflux La solution est concentrée à sec et le résidu obtenu est traité avec 100 ml d'eau, puis lyophilisé pour obtenir 810 mg du composé souhaité (solide blanc; point de fusion > 260 C). -6- RMN-1 H ( 100 M Hz, D 20): 7,78-6,71 (m, 4 H, aromatique), 3,53 (t, 1 H, CH-COOH), 3,11 (m, 2 H, CH 2-NH), 2,00-1,30 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 5: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = acide acétylsalicylique B = ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine (LNAME) Ce composé est préparé en mélangeant, dans des proportions équimolaires, de l'acide acétylsalicylique et de l'ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine, selon la méthode décrite dans l'exemple 3 (rendement 98,7 %); (solide blanc; point de fusion > 260 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, D 20): 7,8-6,70 (m, 4 H, Ph); 3,80 (t, 1 H, CH-CO 2 H); 3,65 (s, 3 H, CO 2 CH_ 3); 3,10 (m, 2 H, CH 2 NH); 2,11 (s, 3 H, CH 3 CO); 1,90-1,35 (m, 4 H, CH 2-CH 2) Exemple 6: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = indométacine B = N-co-nitro-L-arginine (L-NO) Ce composé est préparé en mélangeant, dans des proportions équimolaires, de l'indométacine et de la N-co-nitro-L-arginine, selon la méthode décrite dans l'exemple 3 (rendement 97,8 %); (solide blanc; point de fusion > 260 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, D 20): 7,70-6,35 (m, 7 H, aromatique); 3,95 (m, 1 H, CH-COOH); 3,62 (s, 3 H, CH 30); 3,35 (s, 2 H, CH_ 2-COOH); 3,08 (m, 2 H, CH 2-NH); 2,10 ( 2 s, 3 H, CH 3-C=); 1,72-1,30 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 7: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = sulindac B = N-co-méthyl-L-arginine (L-NMMA) Ce composé est préparé en mélangeant, dans des proportions équimolaires, le sel de sodium de sulindac et de l'acétate de la N-o-méthyl-L-arginine, selon la méthode décrite dans l'exemple 2 (rendement 98 %); (solide orange; point de fusion > 260 C). -7- RMN-1 H ( 100 M Hz, D 20): 7,45 (m, 4 H, Ph-SO); 6,95-6,60 (m, 3 H, Ph-F); 6,29 (m, 1 H, =C-H); 3,15 (m, 5 H, CH-COOH, CH 2-COOH, CH 2 NH); 2,72 (s, 3 H, CH 3-NH); 2,60 (s, 3 H, CH 3-SO); 1,83 ( 2 s, 3 H, CH 3-C=); 1,40 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 8: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans leque I: A = ibuprofène B = N-o 0-nitro-L-arginine (L-NO) Ce composé est préparé en mélangeant, dans des proportions équimolaires, de l'ibuprofène et de la N-co-nitro-L-arginine, selon la méthode décrite dans l'exemple 3 (rendement 99 %) (solide blanc; point de fusion > 260 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, D 20): 7 (m, 4 H, aromatique); 3,6-3,3 (m, 2 H, 2 CHCO 2 H); 3,05 (m, 2 H, CH 2 N); 2,35 (d, 2 H, CH 2 Ph); 1,8-1,3 (m, 5 H, CH 2-CH 2 et CIH(CH 3)2); 1,2 (d, 3 H, CH-C_ 3); 0, 9 (d, 6 H, 2 CH 3). Exemple 9: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = acide méfénamique B = N-co-nitro-L-arginine (L-NO) Ce composé est préparé en mélangeant, dans des proportions équimolaires, de l'acide méfénamique et de la N-co-nitro-L-arginine, selon la méthode décrite dans l'exemple 3 (rendement 98 %); (solide blanc; point de fusion > 260 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, CD 3 OD): 8 (m, 1 H, H aromatique en a de CO 2 H); 7,3-6,5 (m, 6 H, aromatique); 3,6 (t, 1 H, CHCO 2 H); 3,3 (m, 2 H, CH 2 NH); 2,2 et 2,3 ( 2 s, 6 H, 2 CH 3); 1,85-1, 6 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 10: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = indométacine B = N-co-méthyl-L-arginine (L-NMMA) Ce composé est préparé en mélangeant, dans des proportions équimolaires, le sel de sodium de l'indométacine et de l'acétate de la N-co-méthyl-L-arginine, selon la méthode décrite dans l'exemple 2 (rendement 99 %); (solide jaune; point de fusion > 260 C). -8- RMN-1 H ( 100 M Hz, D 20): 7,70-6,35 (m, 7 H, aromatique); 3,67 ( 2 s, 3 H, CH 30); 3,47 (m, 1 H, CH-COOH); 3,35 (s, 2 H, C_ 2-COOH); 2,97 (m, 2 H, CH 2-NH); 2,57 (s, 3 H, CH 3-NH); 2,05 ( 2 s, 3 H, CH 3-C=); 1,72-1,30 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 11: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = sulindac B = ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine (L-NAME) Ce composé est préparé en mélangeant, dans des proportions équimolaires, le sel de sodium du sulindac et du chlorhydrate de l'ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine, selon la méthode décrite dans l'exemple 2 (rendement 98,6 %); (solide orange; point de fusion > 260 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, D 20): 7,30 (m, 4 H, Ph-SO); 6,70 (m, 3 H, Ph-F); 6, 11 (m, 1 H, =C-H); 3,78 (m, 1 H, CH-COOH); 3,62 (s, 3 H, O-CH 3); 3,18 (bs, 2 H, CH 2-COOH); 3,00 (m, 2 H, CH_ 2-NH); 2,61 (s, 3 H, CH 3-SO); 1,83 (bs, 3 H, CH 3-C=); 1,90-1,30 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 12: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = acide méfénamique B = N-co-méthyl-L-arginine (L-NMMA) Ce composé est préparé en mélangeant, dans des proportions équimolaires, de l'acide méfénamique et de la N-oe-méthyl-L-arginine, selon la méthode décrite dans l'exemple 3 (rendement 99 %); (solide blanc; point de fusion > 260 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, CD 3 OD): 8 (m, 1 H, H aromatique en o de CO 2 H); 7,3-6,5 (m, 6 H, Ph); 3,56 (t, 1 H, CHCO 2 H); 3,2 (m, 2 H, CI_ 2 NH); 2, 85 (s, 3 H, CH 3 NH); 2,2 et 2,3 ( 2 s, 6 H, 2 CH 3); 1,8-1,6 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 13: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = sulindac B = N-o-nitro-L-arginine (L-NO) Ce composé est préparé en mélangeant, dans des proportions équimolaires, du sulindac et de la N- co-nitro-L-arginine, selon la méthode décrite dans l'exemple 3 (rendement 98 %); (solide orange; point de fusion > 260 C). -9- RMN-1 H ( 100 M Hz, D 20): 7,30 (m, 4 H, Ph-SO); 6,70 (m, 3 H, Ph-F); 6,11 (m, 1 H, =C-H); 3,78 (m, 1 H, CH-COOH); 3,18 (bs, 2 H, CH 2-COOH); 3,00 (m, 2 H, CH 2-NH); 2,61 (s, 3 H, CH 3-SO); 1,83 (bs, 3 H, CH 3-C=); 1,90-1,30 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 14: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = acide salicylique B = ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine (L-NAME) Ce composé est préparé en mélangeant, dans des proportions équimolaires, le sel de sodium de l'acide salicylique et du chlorhydrate de l'ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine, selon la méthode décrite dans l'exemple 2 (rendement 97,8 %); (solide blanc; point de fusion > 260 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, D 20): 7,70-6,68 (m, 4 H, Ph); 4,00 (t, 1 H, CHCOOH); 3,65 (s, 3 H, COOCH 3); 3,11 (m, 2 H, C_ 2-NH); 2,00-1,30 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 15: Composé de formule AB, sous forme de sel, dans lequel: A = indométacine B = ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine (L-NAME) Ce composé est préparé en mélangeant, dans des proportions équimolaires, le sel de sodium de l'indométacine et le chlorhydrate de l'ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine, selon la méthode décrite dans l'exemple 2 (rendement 98,5 %); (solide jaune; point de fusion > 260 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, D 20): 7,70-6,35 (m, 7 H, aromatique); 3,95 (m, 1 H, CH-COOH); 3,67 (bs, 6 H, CH 30, COOCH 3); 3,35 (s, 2 H, C-12-COOH); 3,08 (m, 2 H, CH 2-NH); 2,10 ( 2 s, 3 H, CH 3-C=); 1,72-1,30 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 16: Composé de formule AB, sous forme d'amide, dans lequel: A = acide acétylsalicylique B = ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine (LNAME) On met en suspension dans de l'acétonitrile anhydre ( 15 ml) le chlorhydrate de l'ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine ( 675 mg, 2,5 mmol), puis on ajoute, sous agitation, 0,7 ml de triéthylamine ( 5 mmol) La solution devient limpide On refroidit à O C et on - ajoute 0,5 g ( 2,5 mmol) de chlorure de l'acide acétylsalicylique dans de l'acétonitrile ( 8 ml) un précipité se forme L'agitation est maintenue pendant deux heures, à température ambiante. Le précipité est filtré et le filtrat concentré à sec; le résidu obtenu est chromatographié sur colonne de silice (CH C 13/Me OH 95/5 comme éluent), pour obtenir le composé souhaité ( 73 %); (solide blanc; point de fusion = 180 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, CDC 13/D 2 O): 8,10-6,90 (m, 4 H, Ph); 4,85 (m, 1 H, CH-COOH); 3,82 (s, 3 H, OCH 3); 3,40 (m, 2 H, CH 2-NH); 2,40 (s, 3 H, CH 3-CO); 2,20-1,50 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 17: Composé de formule AB, sous forme d'amide, dans lequel: A = sulindac B = ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine (L-NAME) Ce composé est préparé en utilisant le chlorure de sulindac et l'ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine, selon la méthode décrite dans l'exemple 16 (rendement 70 %); (solide jaune; point de fusion = 154-156 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, CDC 13/D 2 O): 7,30 (m, 4 H, Ph-SO); 6,70 (m, 3 H, Ph-F); 6,11 (m, 1 H, =C-H); 3,60 (s, 3 H, OCH 3); 3,15-3,05 (m, 5 H, CH 2 CON, CHCO 2 CH 3, CH 2 NH); 2,61 (s, 3 H, CH 3 SO); 2,05 ( 2 s, 3 H, CH 3-C=); 1,8-1,3 (m, 4 H, CH 2-CH 2). Exemple 18: Composé de formule AB, sous forme d'amide, dans lequel: A = ibuprofène B = ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine (L-NAME) Ce composé a été préparé en utilisant le bromure d'ibuprofène et l'ester méthylique de la N-co-nitro-L-arginine, selon la méthode décrite dans l'exemple 16 (rendement 78 %); (solide blanc; point de fusion = 213 C). RMN-1 H ( 100 M Hz, CDC 13/D 20): 7 (m, 4 H, Ph); 3,6 (s, 3 H, OCH 3); 3, 5-3,3 (m, 2 H, CHCON, CHCO 2 CH 3); 3,10 (t, 2 H, CH 2 N); 2,35 (d, 2 H, CH 2, Ph); 1,8-1,3 (m, 5 H, CH 2-CH 2, CH(CH 3)2); 1,2 (d, 3 H, CH-CH 3); 0,8 (d, 6 H, 2 CH 3). Les composés de l'invention ont été soumis à quelques tests biologiques in vitro et in vivo, afin de prouver leur activité à bloquer la NO synthase (constitutive et inductive) et la cyclooxygénase; en outre, la combinaison est biologiquement plus active que l'association simple des deux principes actifs Leur activité a donc été évaluée sur des modèles il - pathologiques chez les animaux; ils ont été comparés à des substances de références telles que l'aspirine, l'indométacine et la L-N- monométhyl-arginine (L-NMMA), et la simple association de ces composés. 1 Effet in vitro sur la NO synthase constitutive sur l'aorte de rat isolée: Les préparations de l'aorte de rat isolée avec ou sans endothélium sont obtenues selon une méthode décrite précédemment (cf M Auguet, S Delaflotte, P E Chabrier et P Braquet - Comparative effects of endothelium and phorbol 12-13 dibutyrate in rat aorta, Life Sciences, 1989,45, 2051-2059). Des rats Male Sprague Dawley ( 270-360 g, Charles River, Paris) sont sacrifiés par dislocation cervicale et l'aorte thoracique extraite et nettoyée du tissu conjonctif Des anneaux de 2 mm de diamètre sont mis sous une tension de 2 g dans des cuves contenant 10 ml de solution physiologique à 37 C et gazés avec 02/CO 2 ( 95 % / 5 %) Les réponses contractiles sont mesurées en utilisant un capteur isométrique (Statham UC 2) coup 6 lé à un système d'acquisition de données Gould 8000 S Une période d'équilibrage d'une heure est nécessaire avant l'expérimentation Une solution physiologique normale est composée de (m M): Na Cl: 118; KC 1: 4,7; Ca C 12: 2 5; KH 2 PO 4: 1 2; Mg SO 4: 0 6; Na HCO 3: 25; glucose: 11 Après repos dans un milieu normal, la préparation est soumise à une dose sub-maximale (de l'ordre de 95 %) de phényléphrine (PE, li M) Lorsque la contraction est stable, le carbachol ( 10 i M) est testé afm d'évaluer la présence ou l'absence d'endothélium. Après lavage de la préparation et une nouvelle période de repos de 45 minutes, la préparation est soumise à la phényléphrine (PE, lg M) et le carbachol ( 10 g M) est administré pour obtenir la relaxation maximale Les antagonistes sont alors testés croissantes cumulatives et la CI 50 (Concentration Inhibitrice 50 %) pour inverser la relaxation du carbachol est calculée Les résultats sont résumés dans le tableau du paragraphe 2 (première colonne de résultats, intitulée "Test sur la NO synthase constitutive"). 2 Effet in vitro sur la NO synthase inductive sur l'aorte de rat isolée: Les composés sont testés sur l'aorte de rat isolée à partir d'animaux en état de choc, selon la méthode précédemment décrite (M Auguet, J M Guillon, S Delaflotte, E Etiemble, P E. Chabrier et P Braquet Endothelium independent protective effect of NG- monomethyl-L-arginine on endotoxin-induced alterations of vascular reactivity, Life Sciences, 1991, 48, 189-193). 12- Chez des rats Male Sprague Dawley ( 240-320 g), on injecte par voie intrapéritonale de l'endotoxine ( 10 mg/kg) ou du solvant (salin, 1 mg/kg) Trois heures plus tard, les animaux traités à l'endotoxine, montrent des signes d'endotoxémie, incluant piloérection, diarrhée et léthargie Les rats sont sacrifiés par dislocation cervicale et l'aorte thoracique est extraite et nettoyée du tissu conjonctif Des anneaux de 2 mm de diamètre sont mis sous une tension de 2 g dans des cuves contenant 10 ml d'une solution de Krebs-Henseleit (m M: Na CI: 118; KC 1: 4 7; Ca C 12: 2 5; KH 2 PO 4: 1 2; Mg SO 4:1 2; Na HCO 3: 25; glucose: 11) Cette solution est gazée de façon continue avec O 2/CO 2 ( 95 % / 5 %) Dans certains cas, l'endothélium est enlevé par grattage, avec un instrument mécanique Après une période de repos de 90 minutes, la contraction est provoquée par une concentration maximale de phényléphrine (PE, 1 g M) Lorsque la contraction a atteint son maximum, le carbachol ( 10 g M) est testé afin de vélifier l'intégrité de l'endothélium Les antagonistes sont introduits dans le bain 45 minutes avant l'application de la phény 11 phrine et la IC 50 est calculée Les résultats sont résumés dans le tableau suivant (deuxième colonne de résultats, intitulée "Test sur la NO synthase inductible"). Test sur la NO svnthase constitutive Test sur la NO svnthase inductible composés IC 50 so (M) IC 50 (M) L-NMMA 2 10-5 2 10-5 aspirine NA NA indométacine NA NA exemple 1 10-5 2 10-5 exemple 2 3 10-6 9 10-6 exemple 3 6 10- 6 6 10-6 exemple 4 2 10-6 10-5 exemple 5 10-5 5 10-6 exemple 6 8 10- 6 8 10-6 exemple 8 4 10-6 10-6 exemple 10 5 10-6 6 10-6 exemple 12 10-5 4 10-6 exemple 13 3 10-6 10- 6 exemple 16 9 10-6 4 10-6 exemple 17 5 10-6 5 10-6 NA = Non Actif -13- 3 Effet in vitro sur la NO synthase inductive sur les cellules de muscles vasculaires lisses. traitées par les lipopolysacchalides (LPS): Quelques-uns des composés sont alors testés sur des cellules de muscles lisses en culture, dans laquelle la NO synthase est induite par les LPS (M Auguet, M O Lonchampt, S Delaflotte, P E Chabrier et P Braquet FEBS Letters, 1992). Les cellules de muscles lisses, sont isolées par digestion enzymatique (élastase et collagénase) d'aorte thoracique de rat, comme cela a été précédemment décrit (P E Chabrier, P Roubert, M.O Lonchampt, P Plas et P Braquet J Biol Chem, 1988, 263, 13199-13202) Elles sont mises en culture pendant quatre jours, dans un milieu DMEM (Dubbeco's Modified Eagle's Medium) avec du sérum de veau foetal à 10 % et utilisés entre les passages 3 et 7 Les monocouches de cellules sont lavées et le milieu est remplacé par 2 ml de DMEM contenant de la glutamine ( 2 m M), des antibiotiques, et de l'isobutylxantine (IBMX) ( 0,1 m M), avec ou sans LPS (Escherichia Coli) Après 24 heures, le GMP cyclique (c GMP) est extrait des cellules après aspiration rapide du milieu et addition de 1 ml de HC 1 0,1 N Les échantillons sont congelés jusqu'à ce que le c GMP soit déterminé par dosage radioimmunologique Afin d'étudier l'effet inhibiteur, les cellules sont incubées pendant 24 heures dans un milieu tamponné RPMI 1640 (la concentration de la L- arginine est de 0,1 m M), avec ou sans LPS ( 0,1 lg/ml) L'isobutylxantine (IBMX: 0,1 m M) est additionnée 30 minutes avant l'extraction de c GMP, en présence ou non des substances testées ( 10- 4 M) La diminution de la production de c GMP est mesurée (% de diminution) et les résultats obtenus sont résumés ci- dessous. diminution de la production de c GMP (%) témoin O L-NMMA 35 exemple 1 30 exemple 2 35 exemple 3 25 exemple 4 25 exemple 5 35 exemple 6 35 exemple 8 25 exemple 13 25 exemple 17 30 -14- 4 Effet in vitro sur l'agrégation de plaquettes de lapins lavées induite par l'acide arachidonique: Ce protocole est utilisé pour mesurer l'effet des composés sur la cyclooxygénase La mesure de l'agrégation plaquettaire est conduite selon la méthode de Cazenave et al (Ann Biol. Chem 1983, 41, 167-179) Le sang est prélevé de l'artère auriculaire d'un lapin Male New- Zealand (d'un poids d'environ 2,5 kg) sur un mélange anticoagulant acide citrique / citrate de sodium / dextrose (ACD) Les plaquettes, lavées, sont préparées, puis transférées dans la cuve del'aggrégomètre (Chronolog Coultronics) Les antagonistes et l'acide arachidonique ( 0,5 m M) sont ajoutés et le pourcentage de transmission correspondant à l'agrégation (ou son inhibition) est mesurée, afin de déterminer la CI 50 Les résultats sont résumés ci- dessous, l'abréviation NA signifiant "Non Actif'. composés IC 50 (M) aspirine 2 104 indométacine 2 10-5 L-NMMA NA exemple 1 3 10-4 exemple 2 > 5 104 exemple 3 2 10-4 exemple 4 > 5 104 exemple 5 5 I 0-4 exemple 6 4 10-5 Effet in vitro sur la production de nitrite induite par des LPS + IN Fy, sur une lignée cellulaire de macrophage et monocyte J 774 Al: Les cellules de type macrophage telles que la lignée cellulaire J 774 A 1 sont intéressantes à utiliser car ce sont des cellules importantes dans l'inflammation et produisent une grande quantité de NO (en raison de l'induction de la NO synthase) et de métabolites de la cyclooxygénase Elles sont activées par les lipopolysaccharides (LPS) en présence d'interféron y (IN Fy) Ce test est utilisé pour comparer les effets des composés de l'invention avec l'association des composés séparés dont résulte leur combinaison. Les cellules macrophage/monocyte de souris sont utilisées dans un milieu DMEM (Dubecco's modified Eagle's medium) à 37 C Les cellules sont mises sur plaques cellulaires -15- de 24 puits (NUNC) et sont utilisées pour les expériences à 2 105 cellules par plaque Les cellules sont activées par les LPS ( 1 g Ig/ml) d'Escherichia Coli (SO 55:B 5) et du IF Ny ( 50 U/ml) recombinant de souris, puis incubées en présence ou absence de composés Après 48 heures, le niveau de nitrite (NO 2-), qui est lié à l'activation de la NO synthase, est mesuré dans le milieu de culture par une méthode colorimétrique selon Green et al (L Green, D Wagner, J Glogowski, P Skipper, J Wishwok and S Tannenbaum, Analysis of nitrate, nitrite and l 15 Nl nitrateinbiological fluids Analytical Biochemistry 126, 131-138, 1982). La production de NO 2 est indétectable en absence ou présence de composés, lorsque les cellules ne sont pas activées Sur les cellules activées, la C Is 50 de la L-NMMA, L-NO et L-NAME est de 8 10-6 M, 1, 5 10-5 M et 10-3 M respectivement, alors que les inhibiteurs de la cyclooxygénase (acide salicylique, acide acétylsalicylique, l'indométacine, le méclofénamate sont inactifs), sont en fait inactifs avec une inhibition non significative comprise entre 0,5 et %. Afin d'illustrer l'activité potentielle des composés de l'invention, une combinaison de principes actifs a été comparée par rapport à l'association de ces mêmes principes actifs Les pourcentages d'inhibition de la production de nitrite induite par les LPS et INF sur les lignées cellulaires J 774 sont indiqués dans le tableau suivant, pour quelques exemples: % D'INHIBITION Composés Concentration (M) -6 10-5 10-4 L-NMMA + acide acétylsalicylique 8 % 27 % 29 % Exemple 1 43 % 48 % 67 % L-NMMA + acide salicylique 11 % 29 % 33 % Exemple 2 53 % 61 % 75 5 % L-NO + acide acétylsalicylique 2 % 44 % 40 % Exemple 3 46 % 49 % 76 % L-NMMA + indométacine 15 % 34 % 29 % Exemple 10 51 % 63 % 66 % L-NO + sulindac 21 % 37 % 40 % Exemple 13 56 % 63 % 71 % L-NAME + sulindac 7 % 24 % 29 % Exemple 17 49 % 57 % 73 % -16- Les résultats montrent que les composés de l'invention, combinaison de deux composés, sont plus actifs, à concentration équivalente, que l'association de ces mêmes composés séparés. Ceci montre aussi l'effet de potentialisation de la combinaison d'un inhibiteur de la NO synthase et d'un inhibiteur de la cyclooxygénase. 6 Effet in vitro sur la production de prostaglandine induite par des LPS + INFT sur une lignée cellulaire de macrophage et monocyte J 774 AI: Dans les mêmes expériences telles que décrites ci-dessus, nous avons comparé les effets des composés de l'invention, combinaison de composés, avec l'association de ces mêmes composés, sur la production des métabolites de la cyclooxygénase, afin de vérifier si l'amélioration de l'activité des composés a également une corrélation sur l'inhibition de la cyclooxygénase. Les niveaux de l'un des principaux métabolites de la cyclooxygénase, produits par la lignée cellulaire J 774 A 1 (c'est-àdire: 6 keto PG Fla et le métabolite stable de PGI 2) sont mesurés dans les milieux de culture, à l'aide d'un dosage radioimmunologique spécifique (NEN, Kit NEK 025). Tout d'abord, on a observé que la libération de 6 keto PG Flo dans les milieux de culture n'était pas touchée par la L-NMMA, la L-NAME ou la LNO, mais supprimée d'une dépendante de la dose, avec l'indométacine et l'aspirine, avec une IC 50 d'environ 10-6 M et de -5 M. Le pourcentage d'inhibition de la production de 6-keto PG F 1 induite par les LPS et INF dans la lignée cellulaire J 774 A 1, est présenté dans le tableau suivant: suivant ces résultats, les combinaisons présentent une plus grande activité que l'association. % D'INHIBITION Composés Concentration (M) -7 10-6 10-5 10-4 L-NO + acide acétylsalicylique 30 % 58 % 74 % Exemple 3 58 5 % 78 5 % 91 5 % L-NMMA + indométacine 55 % 85 % 84 % - Exemple 10 94 % 97 % 100 % - L-NAME + sulindac 37 % 48 % 63 % Exemple 17 74 % 83 % 92 % 17 - 7 Effet in vitro sur la production de nitrite à partir des macrophages activés par la murine: Afin de confirmer les résultats obtenus dans la lignée cellulaire J 774, qui montre une activité plus importante des composés synthétisés, en comparaison avec l'association d'un inhibiteur de cyclooxygénase avec un inhibiteur de la NO synthase, des expériences similaires ont été réalisées sur des macrophages activés de souris. Des macrophages péritonaux sont obtenus à partir de la cavité péritonale de souris BBA/2 femelles, âgées de 7-8 semaines, 3 jours après l'injection de thioglycollate ( 3 % 1,5 ml/souris) Les macrophages ( 2 10-5 cellules/puits) sont activés à 37 C, avec des LPS (E Coli: 011 B 4) ( 0,1 gg/ml) et du IN Fy recombinant de souris ( 100 gg/ml) dans des puits de plaques à 96 puits, pendant 20 heures, dans un milieu tamponné RPM 1 1640, contenant du sérum de veau foetal ( 10 %); les macrophages sont alors lavés et, enfin, incubés pendant 24 heures Les cellules sont incubées, en absence ou présence de différents composés, et le niveau de nitrite est mesuré dans le milieu de culture. Le pourcentage de variation (inhibition de la formation de nitrite), comparé au contrôle, est de 56 % pour la combinaison de l'indométacine et de la L-NMMA (soit l'exemple 10), de 32 % pour l'association de l'indométacine et de la L-NMMA, et bien inférieur à 30 % pour chaque composé pris séparément. De plus, le pourcentage de variation est de 48 % pour la combinaison de l'indométacine et du L-NAME (soit l'exemple 15), de 25 % pour l'indométacine et de moins de 15 % pour l'association et le L-NAME. 8 Effet in vivo sur la mortalité induite par le NMDA (N-Méthyl-DAspartate): Le glutamate et l'aspartate sont d'importants médiateurs neurotoxiques, impliqués dans l'ischémie cérébrale Leurs actions sont liées à l'activation du récepteur NMDA L'injection i.v d'une forte dose de NMDA induit une mortalité, chez la souris, en moins de 35 secondes. Les composés qui peuvent retarder cette échéance dans ce test sont considérés comme des composés anti-ischémiques potentiels Les effets du glutamate et de l'aspartate étant apparemment liés à une libération exagérée de NO, nous avons utilisé ce test pour un screening des composés et aussi pour différencier in vivo l'effet de la combinaison et de l'association des composés séparés. -18- Sur des souris Male OF 1 ( 20-22 g, Charles River), on injecte 250 mg/kg de NMDA (i v), 1 heure après l'administration, par voie orale, des composés On mesure le temps de survie. Ainsi, la combinaison est beaucoup plus active que les composés séparés, seuls ou en association Il y a, ainsi, un effet synergique de la combinaison. COMPOSES DOSE (mg/kg IP) % DE PROTECTION acide salicylique 4 L-NMMA 5,7 6 acide salicylique + L-NMMA ( 4,0 + 5,7) 6 Exemple 2 10,0 66 acide salicylique 0,4 L-NMMA 0,57 3 acide salicylique + L-NMMA ( 0,4 + 0,57) 3 Exemple 2 1 63 sulindac 6,4 18,2 L-NMMA 3,4 5,4 sulindac + L-NMMA ( 6,4 + 3,4) 20 Exemple 7 10 54,5 indométacine 6,55 - L-NMMA 3,40 4,5 indométacine + L-NMMA ( 6,55 + 3,40) 4,5 Exemple 10 10 33,5 acide salicylique 3,7 - L-NAME 6,3 5 acide salicylique + L-NAME ( 3,7 + 6,3) 5 Exemple 14 10 26 9 Effet in vivo sur la mort neuronale après ischémie cérébrale focale sur la souris: L'administration (i p) des composés est effectuée 5 heures et 24 heures après ischémie corticale induite par l'occlusion de l'artère cérébrale de souris Male Swiss ( 20-22 g), selon la méthode décrite par Duverger (cf Pharmacology of cerebral ischemia in Krieglstein and Oberpichler, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart, 1990, 409- 413) Quatre jours plus tard, les souris sont décapitées et leurs cervelles prélevées et congelées pour être ensuite sectionnées en tranches coronales de 10 gm d'épaisseur La taille de l'infarct est mesurée par imagerie électronique La réduction du volume de l'infarct est mesurée et comparée avec les -19 animaux non traités Le pourcentage indique la réduction moyenne de la taille de l'infarct pour un groupe de six animaux Le MK 801, un antagoniste de la NMDA, est utilisé comme témoin Les résultats obtenus sont les suivants: Réduction de l'infarct MK 801 ( 3 mg/kg) -51 % exemple 1 ( 3 mg/kg) -68 % exemple 2 ( 3 mg/kg) -55 % exemple 3 ( 3 mg/kg) -70 % exemple 10 ( 3 mg/kg) -64 % exemple 17 ( 3 mg/kg) -69 % Effet in vivo sur le rat demedullé choqué par l'endotoxine: Comme cela a déjà été mentionné, l'association d'un inhibiteur de la NO synthase et d'un inhibiteur de la cyclooxygénase présente un effet synergique pour la restitution de la pression artérielle et de la réactivité vasculaire, sur un animal choqué. Des rats Male Sprague Dawley ( 280-320 g) sont tués par demedullation Une heure plus tard, on administre, pendant 60 minutes, de l'endotoxine (EDTX, Escherichia Coli, lipopolysaccharide, O m I, B 4 = 300 gg/kg/h) Ceci conduit à une importante hypotension et une perte de réactivité vasculaire vis à vis d'agents vaso-presseurs, telle que la méthoxamine. Les composés sont administrés avec de l'endotoxine, par perfusion, pendant 60 minutes. Après cette perfusion, on trace une courbe de réponse à la méthoxamine et la valeur de la DE 50 ( 50 % de la dose efficace nécessaire pour la restauration de l'activité normale à la méthoxamine) est défminie pour chaque animal Les résultats obtenus sont les suivants: Composés Dose réactivité vasculaire à la méthoxamine Composes mg/kg/h D Eo 50 (gg/kg) témoin 79 + 9 animal traité à i'EDTX 278 + 34 L-NMMA 50 189 + 15 aspirine 150 136 + 29 exemple 1 30 82 + 18 exemple 2 30 98 + 35 exemple 3 30 76 12 exemple 4 30 72 + 11 -20 - Toxicologie: Les composés sont administrés per os (p o) ou par voie i p, sur des groupes de 10 souris, avec des doses croissantes La DL 50 des animaux est comprise entre 100 et 1 000 per os, et entre 150 et 500 par i p. Posologie: Les composés de l'invention peuvent être administrés à une dose comprise entre 1 et 300 mg, par jour. -21- REVENDICATIONS 1 Composés de formule générale AB, qui peuvent être des sels ou des amides, dans laquelle: A représente un inhibiteur de la cyclooxygénase ayant une fonction acide accessible, de formule générale RCOOH dans laquelle COOH représente la fonction acide accessible et R le radical approprié de l'inhibiteur de la cyclooxygénase, et B représente les analogues de la L-arginine de formule R 2 N,NH 2 C-NH-(CH 2)3-CH" R 3/ COOR 1 dans laquelle R 1 représente un atome d'hydrogène ou le radical méthyl ou éthyl, R 2 représente l'atome d'hydrogène ou le radical nitro, et R 3 le radical amino, méthylamino, éthylamino, hydrazino, méthyl ou éthyl, avec la condition suivante: si AB est un sel dans lequel R 2 représente l'atome d'hydrogène, alors R 3 ne représente pas le radical amino. 2 Composés selon la revendication 1, dans lesquels l'inhibiteur de la cyclooxygénase de formule RCOOH, est choisi parmi l'acide salicylique, l'acide acétylsalicylique, l'acide méfénamique, l'ibuprofene, l'indométacine et le sulindac. 3 Composés selon la revendication 1 ou 2, sous forme de sel de formule générale R 2 N N Hi 3 ±OCR C-NH-(CH-2)3-CH i O R 3 COOR 1 dans laquelle R 1, R 2 et R 3 sont tels que définis dans la revendication 1. 4 Composés selon la revendication 1 ou 2, sous forme d'amide de formule générale o Il R 2 Nx,NH-C-R C-NH-(CH 2)3-CH" R 3/ COOR 1 dans laquelle R 1, R 2 et R 3 sont tels que définis dans la revendication 1. Procédé de préparation des composés selon la revendication 1, comprenant l'étape qui consiste à faire réagir, dans des proportions substantiellement équimolaires, dans des conditions appropriées, un composé A ou un précurseur de ce composé A dans lequel A est -22- tel que défini ci-dessus, avec un composé B ou un précurseur de ce composé B, dans lequel B est tel que défini dans la revendication 1. 6 Procédé selon la revendication 5, pour la préparation de composés sous forme de sel, ledit procédé consistant à faire réagir, dans de l'eau ou un mélange d'eau et d'alcool, à une température comprise entre la température ambiante et le point d'ébullition du mélange réactionnel, un composé de formule générale A ou un précurseur de ce même composé dans lequel A est tel que défini ci-dessus, avec un composé de formule générale B ou un précurseur de ce composé B dans lequel B est tel que défini dans la revendication 1. 7 Procédé selon la revendication 5, pour la préparation de composés sous forme d'amide, ledit procédé consistant à faire réagir un composé de formule générale B ou un précurseur de ce composé B, dans de l'acétonitrile, à une température comprise entre O' C et la température ambiante, en présence d'une base, avec le précurseur du composé A de formule RCOX, dans lequel R est tel que défini ci-dessus et X représente un atome d'halogène.