FR 2695405 A1 19940311 FR 9310525 A 19930903 Les analyses pour la détermination du taux sérique de vitamine B 12 se sont révélées être extrêmement difficiles à élaborer Cela est dû principalement à la grande sensibilité requise, de l'ordre des picogrammes, ainsi qu'au5 fait que le sérum normal contient des agents endogènes fixant la vitamine B 12 Ces agents de fixation doivent être traités pour libérer la vitamine B 12 avant analyse; un tel traite- ment est très brutal et nécessite généralement une étape distincte pour sa mise en oeuvre En général, le traitement fait intervenir l'utilisation d'un chauffage à des températu- res élevées ( 1000 C), les analyses étant couramment désignées sous le nom d'analyse "par ébullition", ou bien l'utilisation d'agents chimiques puissants, les analyses étant désignées sous le nom d'analyses "sans ébullition" Un exemple d'une analyse sans ébullition est présenté dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N' 4 300 907 au nom de Mansbach et collaborateurs. En raison de ces impératifs, pratiquement toutes les analyses disponibles dans le commerce pour la vitamine B 12 consistaient jusqu'à une date très récente en analyses radio-isotopiques utilisant une protéine de liaison marquée avec un isotope radioactif pour la détection Il a été décrit dans la littérature un certain nombre d'autres modes d'analy- ses, comprenant l'utilisation d'un détecteur chimio- luminescent (Clin Chem Vol 35, N O 6, page 1194, Résumé N O 609 ( 1989 >), d'un détecteur fluorescent (Clin Chem Vol. 37, N' 6, page 978, Résumé N' 326 ( 1991)) et d'un détecteur consistant en vitamine B 12 marquée avec un colorant (disponi- ble auprès de Ciba Corning) Ces analyses utilisent pour la détection des microbilles revêtues avec une protéine fixant la vitamine B 12 et, comme telles, ne sont pas compatibles avec la plupart des méthodes de détection automatisées. En outre, des analyses par liaison à un enzyme, utilisant la phosphatase alcaline (Clin Chem Vol 38, No 6, page 1095, Résumé No 0691 ( 1992)) et la /3-galactosidase (Clin Chem Vol 33, No 6, page 963, Résumé N O 403 ( 1989)), ont été décrites; cependant, les deux enzymes sont très volumineux Puisque le temps requis pour les analyses immunologiques compétitives dépend fortement de la vitesse de diffusion, et puisque la vitesse de diffusion est ap- proximativement inversement proportionnelle à la racine cubique du poids moléculaire, l'utilité de ces modes dans de telles analyses est limitée. La présente invention propose une analyse compétitive non isotopique pour la vitamine B 12 En résumé, l'analyse utilise le facteur intrinsèque (IF) marqué avec de la peroxydase de raifort (PR) La PR peut être conjuguée au IF par couplage par l'intermédiaire d'agents hétéro- bifonctionnels de réticulation. Il a été trouvé que ce procédé permet la for- mation du conjugué IF/PR sans influence néfaste sur les sites de liaison à la vitamine B 12 présents sur le IF Ainsi, les conjugués peuvent être utilisés dans des analyses de vitamine B 12 En outre, le IF étant marqué avec la PR, les analyses20 peuvent être effectuées sur un appareil automatisé apte à l'utilisation du signal engendré par la réaction PR/substrat. De plus, le procédé permettant la conjugaison de quantités relativement importantes de PR au IF (c'est-à-dire un rapport PR/IF élevé), le signal engendré est également puissant, ce qui accroît la sensibilité de l'analyse. En outre, un procédé pour stabiliser les con- jugués résultants par prétraitement avec le n-éthylmaléimide est décrit Cette stabilisation permet un entreposage des conjugués pendant des temps prolongés. Les analyses de la présente invention utilisent l'affinité de liaison, bien connue, du facteur intrinsèque (IF) pour la vitamine B 12 En résumé, dans un mode d'analyse compétitif apprécié, l'échantillon (liquide) (qui contient la vitamine B 12) est mélangé au IF conjugué à la peroxydase de raifort (PR) et est laissé en réaction Une portion aliquote de ce mélange est ensuite mise en contact avec une phase solide contenant de la vitamine B 12 liée Puis la phase liquide est séparée de la phase solide, en laissant toute quantité de IF/PR liée à la vitamine B 12 de la phase solide;5 toute quantité de IF/PR liée à la vitamine B 12 de l'échantillon reste dans le liquide La quantité du conjugué IF/PR dans l'échantillon peut ensuite être mesurée par addition de substrat de PR et mesure du produit de réaction La valeur obtenue est directement en rapport avec la quantité de10 vitamine B 12 dans l'échantillon En variante, l'activité du conjugué IR/PR lié est déterminée pour évaluer indirectement la quantité de vitamine B 12 dans l'échantillon. Le substrat utilisé est n'importe quel substrat sensible à l'action de la PR; les substrats préférés comprennent: la tétraméthylbenzidine, la o-phénylènediamine, le luminol/iodophénol et la tyramine. Le couplage de la PR au IF est une condition déterminante de cette analyse Puisque de nombreux procédés de couplage nécessitent un traitement avec des agents chimiques qui peuvent avoir une influence néfaste sur le IF et/ou la PR, le traitement doit être suffisamment doux pour permettre à ces deux constituants de rester inaltérés, tout en étant suffisamment puissant pour permettre la formation d'un conjugué qui ne se dissocie pas dans les conditions d'entreposage et/ou d'analyse. Dans un tel procédé, la PR peut être conjuguée au IF par l'intermédiaire de réactifs hétérobifonctionnels consistant en 4-(pmaléimidophényl)butyrate de succinimidyle (SMPB) et 5-acétylthioacétate de N-succinimidyle (SATA). L'utilisation et la préparation de conjugués de PR au moyen de SATA sont décrits par Duncan et collaborateurs dans Anal. Biochem 132, et l'utilisation de SMPB pour le couplage à des anticorps est décrite par Teale et collaborateurs dans J. Mol Cell Imunol, 2, pages 283-292 ( 1986) et Yoshitake et collaborateurs dans Anal Letters, 15, pages 147-160 ( 1982), l'ensemble de ces trois documents étant cité à titre de référence dans le présent mémoire. En résumé, le SATA est amené à réagir avec la PR et le SMPB est amené à réagir avec le IF dans des procédés distincts Puis l'entité SATA-PR est amenée à réagir avec l'entité SMPB-IF pour former un conjugué PR-SATA-SMPB-IF. Plus précisément, la PR est dissoute dans un tampon aqueux, de préférence du sérum physiologique tamponné avec un phosphate, contenant un agent chélatant, de préférence le EDTA 1 m M La concentration de PR dans le tampon est comprise dans l'intervalle de 1 à 50 g/l, avantageusement de 5 à g/l, de préférence de 10 à 15 g/l Cette solution est mélangée à du SATA 150-350 m M, de préférence 200-300 m M, dans du diméthylformamide (DMF) en un rapport SATA-PR (mole/mole) de 3- 10:1, de préférence de 7-6:1 Le SATA n'ayant pas réagi est ensuite éliminé et le conjugué SATA-PR résultant est désacétylé par addition d'une solution d'un agent de désacy- lation, de préférence le chlorhydrate d'hydroxylamine, à un taux de 10 Ml de solution 50 m M par mg de SATA-PR. Le conjugué SMPB-IF est préparé par dissolution de SMPB dans le même solvant que le SATA, à une concentration de 5 à 35 m M, de préférence 20 à 30 m M Cette solution est amenée à réagir avec 0,1 à 1 g/l, de préférence 0,3 à 0,7 g/l, de IF, dissous dans le même tampon que pour la PR, à un rapport SMPB:IF de 50-250:1, de préférence 75-125:1 La réaction s'effectue à température ambiante, et le SMPB n'ayant pas réagi est ensuite éliminé. Le conjugué SMPB-IF résultant est amené à réagir avec le conjugué SATA- PR désacylé par addition goutte à goutte du SATA-PR désacylé en un rapport final PR:IF d'envi- ron 10-30:1, de préférence 15-25:1 Puis le produit est dialysé contre le même tampon et du glycérol ou un diluant convenable est ajouté pour faciliter l'entreposage. Dans une autre modification du mode opératoire précité, la stabilité des conjugués résultants peut être accrue par prétraitement du IF avec le N-éthylmaléimide (NEM) Ce traitement est couramment utilisé pour bloquer les groupes sulfhydryle libres avant de telles réactions, qui tendraient à la formation de dimères protéiques formés par réunion avec le SMPB Cependant, puisqu'une telle formation n'est pas observée à un degré notable quelconque avec le IF, et puisque le IF ne possède aucun groupe sulfhydryle libre, la stabilisation conférée aux conjugués est tout à fait inattendue. Pour effectuer le prétraitement, du NEM est dissous dans le même solvant que le IF à une concentration de 1 à 2 mg/ml, de préférence 1,3 à 1,5 mg/ml Cette solution est mélangée à la solution de IF en un rapport NEM:IF de 15:1 à 200:1, avantageusement de 75:1 à 150:1, de préférence de 100:1; le mélange total est mis à l'abri de la lumière et soumis à une réaction à 25-30 'C pendant 60 minutes Immédia- tement après, la solution de SMPB est ajoutée au mélange et le conjugué SMPB:IF est formé de la manière décrite ci- dessus; le NEM est ensuite éliminé par n'importe quel moyen convenable, de préférence par chromatographie de séparation des sels, et le conjugué est prêt à l'emploi. Chacun des conjugués précités peut être utilisé dans l'analyse compétitive de vitamine B 12 décrite ci-dessus. Les modes opératoires précités conviennent particulièrement pour la préparation de conjugués PR-IF car ils réduisent au minimum l'utilisation du IF coûteux, par utilisation d'un excès de PR (ou de SATA-PR et de SMPB) pour garantir la réaction de la totalité du IF, outre le fait de laisser la PR et le IF relativement intacts et fonctionnellement non30 modifiés. En outre, le mode opératoire d'analyse précité, utilisant les conjugués PR-IF, convient particulièrement à une utilisation dans des appareils d'analyse automatisés, tels que l'analyseur AFFINITYO produit et commercialisé par Becton, Dickinson and Company, en raison du fait que l'acti- vité de PR est mesurée De nombreuses analyses pouvant être formatées pour l'utilisation de PR comme marqueur ou détec- teur, la polyvalence d'une telle analyse et, ainsi, d'un tel appareil est accrue.5 EXEMPLES Les exemples suivants démontrent certaines formes appréciées de réalisation de la présente invention, mais ne sont pas destinés à illustrer toutes les formes de réalisa- tion. Exemple 1 Préparation de PR-SATA-SMPB-IF De la PR a été dissoute dans du sérum physiologi- que tamponné avec un phosphate, contenant de i'EDTA 1 m M (STP/EDTA), à une concentration de 12 mg/ml Conjointement, du 5-acétylthioacétate de N-succinylimidyle (SATA) a été dissous dans du diméthylformamide (DMF) à une concentration de 240 m M Ces solutions ont été ensuite mélangées, en un rapport SATA:PR ( 3) égal à 4,8:1, et ont été mises en incubation à 20-25 C pendant 15 minutes Puis le SATA n'ayant pas réagi a été éliminé par dialyse contre du STP/EDTA. Les conjugués SATA-PR résultants ont été ensuite désacétylés par addition de 10 il de chlorhydrate d'hydroxyl- amine 50 m M dans du STP/EDTA (p H 7,5) par mg de SATA-PR, et ont été laissés en réaction pendant 3 heures, à une tempéra- ture de 20 à 25 C, à l'abri de la lumière. Conjointement avec la désacétylation, du 4-(p- maléimidophényl)butyrate de succinimidyle (SMPB) a été dissous dans du DMF, à une concentration de 2,8 m M Cette solution a été mélangée à une solution à 0,5 mg/ml de IF dans du STP-EDTA, en un rapport SMPB:IF (mole:mole) égal à 100:1. Cette formulation a été mise en incubation pendant 30 minutes à 20-25 C, à l'abri de la lumière, temps au bout duquel le SMPB n'ayant pas réagi a été éliminé par chromatographie de séparation des sels. Le conjugué SMPB-IF résultant a été ensuite mélangé au SATA-PR désacétylé en un rapport PR:IF (mole:mole) de 20:1, et soumis à une réaction pendant 2 heures à 20-25 o C, à l'abri de la lumière Le conjugué résultant a été ensuite dialysé contre du STP-EDTA pendant 24 heures à une tempéra- ture de 2 à 80 C, à l'abri de la lumière Les solutions5 résultantes ont été mélangées à un volume égal de glycérol et stockées à une température de -18 à -220 C. Exemple 2 Préparation de conjugués PR-SATA-SMPB-IF stabi- lisés Le mode opératoire de l'exemple 1 a été répété, sauf que le IF a été amené à réagir avec du N-éthylmaléimide (NEM) avant conjugaison avec le SMPB Le NEM a été dissous dans du STP/EDTA à une concentration de 1, 43 mg/ml, et a été mélangé à la solution à 0,5 mg/ml de IF en un rapport molaire NEM/IF égal à 100:1 Le mélange a été laissé en réaction à 20 C pendant une heure, à l'abri de la lumière Après réaction, le NEM n'ayant pas réagi a été éliminé par chroma- tographie de séparation des sels, et le IF résultant a été utilisé de la manière indiquée dans l'exemple 1. Exemple 3 Stabilité des conjugués Pour évaluer la stabilité des conjugués préparés dans les exemples 1 et 2, des quantités de chaque conjugué ont été entreposées pendant des temps variables et leur activité a été testée par une analyse compétitive dans laquelle la vitamine B 12 liée dans un tube revêtu entre en compétition avec la vitamine B 12 libre pour le IF-PR La totalité du IF-PR réagissant avec la vitamine B 12 de l'échan- tillon (libre) est évacuée du tube et la concentration de la vitamine B 12 est déterminée par contrôle de l'activité de PR restant dans le tube. Les résultats sont présentés ci-dessous Pourcentage de perte d'activité Temps d'entreposage/ température Exemple 1 Exemple 2 Solution fraîche O O jours/4 C O 1,06 jours/370 C 30, 04 3,98 De la manière indiquée, les conjugués frais ont donné les mêmes résultats, ce qui démontre que le NEM n'a aucun effet sur le IF frais Cela est en accord avec l'absence de groupes sulfhydryle libres dans le IF Cepen- dant, les conjugués de l'exemple 2 sont beaucoup plus stables lors d'un stockage prolongé et à température plus élevée, ce qui indique l'effet de stabilisation du traitement avec le NEM. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation de conjugués facteur intrinsèque/peroxydase de raifort, caractérisé en ce qu'il comprend: (i) la réaction de peroxydase de raifort (PR) avec du 5-acétylthioacétate de N- succinylimidyle (SATA) pour former un produit consistant en SATA-PR, puis la désacétylation dudit produit pour former un SATA-PR désacétylé; (ii) la réaction du facteur intrinsèque (IF) avec le 4-(p-maléimidophényl)butyrate de succi- nimidyle (SMPB) pour former un produit consis- tant en SMPB-IF; (iii) le mélange dudit produit SMPB-IF avec ledit produit SATA-PR désacétylé pour former un conjugué PR-SATA-SMPB- IF; et (iv) la concentration ultérieure dudit conjugué. 2 Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que le produit SATA-PR est préparé par réaction de SATA et de PR en un rapport SATA/PR (mole:mole) de 3-10/1. 3 Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que le produit SATA-PR est désacétylé par addition de chlorhydrate d'hydroxylamine. 4 Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce que le conjugué PR-SATA-SMPB-IF est préparé par réaction du produit SATA-PR désacétylé avec le produit SMPB- IF en un rapport PR/IF (mole:mole) de 10-30/1. Procédé de production d'un conjugué PR-SATA- SMPB-IF stabilisé, caractérisé en ce qu'il comprend: (i) le mélange du facteur intrinsèque (IF) avec du N-éthylmaléimide (NEM) pour former un produit consistant en NEM/IF; (ii) la réaction dudit produit NEM/IF avec le 4- (p-maléimidophényl)butyrate de succinimidyle (SMPB) pour former un produit consistant en SMPB-IF; (iii) la réaction de peroxydase de raifort (PR) avec le 5acétylthioacétate de N-succinylimidyle (SATA) pour former un produit consistant à SATA- PR, puis la désacétylation dudit produit pour former un produit consistant en SATA-PR désa- cétylé; (iv) le mélange dudit produit SMPB-IF avec ledit produit SATA-PR désacétylé pour former un con- jugué PR-SATA-SMPB-IF; et (v) la concentration ultérieure dudit conjugué. 6 Procédé suivant la revendication 5, carac- térisé en ce que le produit NEM/IF est obtenu par réaction de NEM avec IF en un rapport NEM/IF (mole:mole) de 50-200/1.15 7 Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le produit SATA-PR est préparé par réaction de SATA-PR en un rapport SATA/PR (mole:mole) de 3- 10/1. 8 Procédé suivant la revendication 6, carac- térisé en ce que le produit SATA-PR est désacétylé par addition de chlorhydrate d'hydroxylamine. 9 Kit pour l'analyse compétitive de la vitamine B 12 au moyen d'un marqueur consistant en facteur intrinsèque marqué avec la peroxydase de raifort, caractérisé en ce que le perfectionnement comprend l'utilisation, comme marqueur, du conjugué PR-SATA-SMPB-IF suivant la revendication 1. Kit pour l'analyse compétitive de la vitamine B 12 au moyen d'un marqueur consistant en facteur intrinsèque marqué avec la peroxydase de raifort, caractérisé en ce que le perfectionnement comprend l'utilisation, comme marqueur, du conjugué PR-SATA-SMPB-IF suivant la revendication 5.