FR 2697525 A1 19940506 FR 9313066 A 19931103 PEPTIDES DE FUSION AYANT UNE ACTIVITE DE LIAISON A LA STREPTAVIDINE La présente invention concerne des peptides qui communiquent une affinité de liaison pour la streptavidine à une protéine qui est fusionnée avec un tel peptide, des protéines de fusion qui contiennent un tel peptide, ainsi que des procédés de préparation d'une protéine recombinée de ce type par expression d'une séquence d'ADN codant pour cette protéine dans des cellules hôtes convenables selon des méthodes connues en soi. Alors que des systèmes d'expression efficace de protéines étrangères dans un grand nombre d'organismes hôtes différents sont largement établis, le décèlement et la purification du produit génétique recombiné représentent comme avant un problème lors de la préparation de protéines par génie génétique C'est vrai surtout lorsque la protéine naturelle concernée n'a pas été isolée auparavant, de sorte qu'on n'a pas pu la caractériser par rapport à ses propriétés biochimiques, ni obtenir d'antisérums spécifiques ou d'anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine Cette situation s'est présentée de plus en plus souvent ces derniers temps en raison du développement de la réaction de polymérisation en chaîne (Bloch W ( 1991) Biochemistry 30, 2736-2747), qui permet souvent d'obtenir plus facilement des informations sur un gène codant pour la protéine que la protéine naturelle purifiée elle-même. Pour permettre le décèlement d'un produit génétique recombiné dans les cas o des réactifs immunologiques spécifiques pour la protéine ne sont pas disponibles, on a utilisé des marqueurs peptidiques courts ("tags" peptidiques), que l'on a fusionnés au niveau génétique avec la protéine recombinée Les séquences peptidiques fusionnées de ce type sont reconnues par des anticorps spécifiques lorsqu'elles sont reliées à l'extrémité amino ou carboxy terminale d'une séquence protéinique Des exemples de tels marqueurs peptidiques sont le Myc-tag (Munro & Pelham ( 1986) Cell 46, 291-300; Ward et coll ( 1989) Nature 341, 544-546), le peptide Flag (Hopp et coll ( 1988) Bio/Technology 6, 1204-1210), le peptide épitope de KT 3 (Martin et coll ( 1990) Cell 63, 843-849; Martin et col ( 1992) Science 255, 192-194), un peptide épitope de l'act-tubuline (Skinner et coll ( 1991) J Biol Chem. 266, 14163-14166) et le marqueur peptidique de la protéine du gène 10 de T 7 (Lutz- Freyermuth et coll ( 1990) Proc Natl Acad Sci USA 87, 6393-6397), qui ont été utilisés avec succès pour le décèlement et dans quelques cas aussi pour la purification du produit génétique recombiné En outre, on a mis en évidence dans la plupart des exemples cités que ces petits marqueurs peptidiques, qui ont normalement une longueur de 3 à 12 aminoacides, ne gênent pas la fonction biologique de la protéine et il n'est donc pas absolument nécessaire de les séparer après l'expression. Bien que ces peptides de fusion conviennent avantageusement pour le décèlement d'une protéine et soient donc des auxiliaires importants pour l'optimisation des rendements d'expression et des protocoles de purification, les possibilités d'application des propriétés d'affinité qui leurs sont inhérentes dans un schéma de purification sont limitées La raison en est que les propriétés avantageuses des peptides décrits jusqu'ici sont fondées sur leur forte liaison à un anticorps Il faut donc, lorsque la protéine est liée par l'intermédiaire du marqueur peptidique à une colonne d'affinité qui porte un anticorps immobilisé, utiliser des conditions assez extrêmes et donc pas très douces (à savoir une valeur de p H non physiologique ou des réactifs chaotropes) pour récupérer la protéine par élution à partir de la colonne. Lorsque la protéine recombinée a été produite sous une forme fonctionnelle, il est cependant souhaitable d'éviter des conditions potentiellement dénaturantes pendant la purification On n'a montré en effet que pour trois des exemples décrits ci-dessus (Hopp et coll ( 1988); Martin et coll ( 1990); Skinner et coll ( 1991) op cit) qu'il était possible d'éluer le produit de fusion du peptide et de la protéine en utilisant des conditions plus douces, c'est-à-dire par exemple de façon compétitive avec le peptide de synthèse Cependant, même dans ce cas, il reste des inconvénients, car les anticorps monoclonaux dirigés contre les marqueurs peptidiques sont soient chers, soit difficiles à obtenir en quantité suffisante. Un objet de la présente invention était donc de développer de courtes séquences peptidiques qui i) puissent se lier avec une protéine recombinée sans gêner sa fonction, ii) permettent le décèlement avec un réactif facilement disponible et iii) présentent des propriétés de liaison faciles à maîtriser. Le problème a été résolu selon l'invention par un peptide comprenant la séquence d'aminoacides Trp-X-His-Pro-Gln-Phe-Y-Z, dans laquelle X représente un aminoacide quelconque et Y et Z signifient tous les deux Gly, ou Y signifie Glu et Z est Arg ou Lys On a établi effectivement dans le cadre de l'invention que la séquence peptidique indiquée présente une forte affinité de liaison pour la streptavidine, ou la streptavidine-"noyau" (produit de dissociation protéolytique de la streptavidine) (Bayer, E A, Ben-Hur, H, Hiller, Y et Wilchek, M ( 1989) Biochem. J 259, 369-376). De ce fait, lorsque la séquence indiquée est présente dans une protéine de fusion, cette protéine de fusion manifeste aussi une forte affinité pour la streptavidine. La protéine de fusion correspondante forme donc aussi un objet de la présente invention La séquence peptidique peut dans ce cas être présente à l'extrémité carboxy terminale de la protéine de fusion, mais elle peut aussi théoriquement se trouver à l'extrémité amino terminale ou à l'intérieur de la séquence d'aminoacides de la protéine, dans la mesure o cela n'entraîne pas de propriétés négatives telles que, par exemple l'inhibition ou la destruction de l'activité biologique, etc. La protéine présente dans la protéine de fusion peut être aussi bien une protéine entière qu'un mutant d'une protéine, comme par exemple un mutant par délétion ou un mutant par substitution, et il est finalement possible aussi d'obtenir ici simplement une partie intéressante d'une protéine liée avec le peptide selon l'invention. Les protéines de fusion selon l'invention peuvent être facilement décelées par une liaison à un produit conjugué constitué par la streptavidine et un marqueur, tous les marqueurs connus de l'homme de métier pouvant être utilisés comme marqueurs Le reste du processus de ce décèlement de protéines peut aussi être mis en oeuvre dans des conditions classiques pour l'homme de métier. Un autre objet de l'invention est un vecteur d'expression, en particulier un vecteur d'expresion bactérien, qui contient une séquence d'ADN codant pour un peptide selon l'invention et placée de façon à pouvoir s'exprimer sous le contrôle d'un promoteur et d'un opérateur convenables, ainsi que plusieurs sites de coupure de restriction dans la direction 5 ' à la suite de cette séquence d'ADN qui permettent l'insertion d'une autre séquence d'ADN qui code pour la protéine ou une partie de la protéine à exprimer. A l'aide du vecteur d'expression selon l'invention, il devient possible de placer facilement la séquence d'ADN codant pour une protéine intéressante devant une séquence d'ADN codant pour le peptide selon l'invention, et donc d'obtenir, après l'expression par exemple dans Escherichia coli, une protéine de fusion selon l'invention Lorsque l'on insère la séquence d'ADN pour la protéine dans le site de coupure de restriction dans la direction 5 ' de la séquence peptidique, ce qui, comme les autres opérations du procédé de préparation du vecteur d'expression selon l'invention, est une opération courante pour l'homme de métier, on obtient une protéine de fusion qui comporte, à l'extrémité carboxy terminale, un peptide selon l'invention qui lui communique une affinité pour la streptavidine. Le site de coupure de restriction dans le vecteur d'expression selon l'invention ne doit pas nécessairement se trouver juste à côté de la première ou de la dernière base de la séquence d'ADN codant pour le peptide Il devrait cependant de préférence être situé de façon que le cadre de lecture ne soit pas altéré lors de la transcription et qu'il se forme entre le peptide et la séquence d'aminoacides de la protéine un composé n'ayant qu'un petit nombre, de préférence inférieur ou égal à dix, d'aminoacides supplémentaires. Un autre objet de la présente invention est un procédé de préparation d'une protéine recombinée par expression d'une séquence d'ADN codant pour cette protéine dans des cellules hôtes convenables par des méthodes connues en soi dans lesquelles on fait s'exprimer une séquence d'ADN qui code pour une protéine de fusion selon l'invention Les avantages de ce procédé résident dans le fait que la présence du produit d'expression est facile à déceler par l'intermédiaire d'un produit conjugué de streptavidine et d'un marqueur et/ou que la séparation pour la purification de la protéine désirée sous forme de la protéine de fusion peut se faire par chromatographie d'affinité avec la streptavidine. Comme on l'a déjà été indiqué ci-dessus, on peut utiliser pour déceler la présence du produit d'expression, à savoir de la protéine de fusion, de la streptavidine sous forme de produit conjugué avec un marqueur quelconque, un marqueur enzymatique étant préféré dans le cadre de l'invention On peut par ailleurs utiliser les méthodes connues en soi pour le décèlement des protéines, par exemple les méthodes ELISA, RIA, d'analyse par immuno-empreinte (transfert Western), etc. Un autre avantage du procédé selon l'invention réside dans le fait que la purification de la protéine de fusion exprimée peut être effectuée facilement par chromatographie d'affinité sur une colonne de streptavidine immobilisée L'élution peut alors avantageusement s'effectuer dans des conditions très douces, par exemple par addition de biotine ou de composés analogues à la biotine, ou encore à l'aide des peptides ayant une affinité pour la streptavidine obtenus par synthèse peptidique. Dans le cadre de la présente invention, on préfère l'élution avec de la biotine On préfère aussi utiliser pour la chromatographie d'affinité une colonne qui est chargée d'une matrice d'agarose-streptavidine ou de streptavidine couplée à de l'Eupergit C. On peut voir d'après l'exposé ci-dessus de la présente invention les avantages remarquables qui sont inhérents au peptide selon l'invention et aux protéines de fusion qui contiennent ce peptide, dans la mesure o le décèlement de la protéine de fusion produite par l'expression peut se faire de façon plus rapide et plus sûre, et il faut remarquer que la streptavidine représente un réactif bon marché et facilement disponible, qui peut aussi être obtenu en combinaison avec des marqueurs comme des marqueurs fluorescents ou des marqueurs enzymatiques De plus, la protéine de fusion exprimée manifeste des propriétés de liaison à la streptavidine facilement maîtrisables en raison de la présence du peptide selon l'invention, ce qui permet une purification facile du produit d'expression qui peut s'effectuer aussi à l'échelle industrielle. Les vecteurs d'expression selon l'invention facilitent l'expression d'une protéine de fusion selon l'invention, de tels vecteurs d'expression pouvant être utilisés de façon universelle pour toutes les protéines à exprimer Le peptide selon l'invention ne gêne pas dans la protéine de fusion l'activité biologique du reste de la protéine et ne doit donc pas obligatoirement être séparé avant l'utilisation ultérieure Cependant, au cas o, pour une raison quelconque, on souhaite le séparer, on peut aussi construire le vecteur d'expression selon l'invention de façon qu'il comporte, entre le site de coupure de restriction destiné à l'insertion de la séquence d'ADN pour la protéine et la séquence codant pour le peptide, une autre séquence d'ADN qui code pour un site de coupure par une protéase spécifique On pourrait de cette façon séparer facilement la séquence peptidique après l'expression et éventuellement la purification ou le décèlement du produit d'expression. Les exemples suivants expliquent l'invention de façon plus détaillée en liaison avec les dessins. A ce propos, la figure 1 montre la séquence d'ADN de p ASK 46 ainsi que les séquences d'aminoacides pour laquelle elle code dans les trois cadres de lecture, et indique les sites de coupure de restriction uniques; la figure 2 représente une carte de restriction de p ASK 46; la figure 3 représente le décèlement de produits de fusion protéine- peptide selon l'invention dans un essai sandwich sur filtre avec à chaque fois 4 colonies d'E coli transformées avec différents plasmides; la figure 4 représente le décèlement d'un produit de fusion protéine- peptide selon l'invention dans une analyse par immuno-empreinte (transfert Western); la figure 5 montre les signaux de liaison pour un conjugué de streptavidine observés dans un essai ELISA avec des séries de dilutions de fractions cytoplasmiques de cellules d'E coli TG 1 induites, transformées avec des plasmides qui codent pour différents produits de fusion selon l'invention constitués par un fragment d'anticorps et un peptide ayant une affinité pour la streptavidine; la figure 6 A représente les profils d'élution de la chromatographie d'affinité avec la streptavidine avec des fractions cytoplasmiques comme dans la figure 5; la figure 6 B représente une chromatographie d'affinité avec la streptavidine analogue à la figure 6 A, dans laquelle on a ajouté l'antigène lysozyme à la fraction cytoplasmique; la figure 7 est une carte de restriction de p ASK 60-Strep; la figure 8 présente la séquence d'ADN de p ASK 60-Strep avec les séquences d'aminoacides pour lesquelles elle code dans les trois cadres de lecture, ainsi que les sites de coupure de restriction uniques; et la figure 9 est la séquence commentée du lieur multisite de p ASK 60- Strep. Techniques générales A) Méthodes de génie génétique, réactifs On a effectué les manipulations d'ADN selon des méthodes de génie génétique courantes (Sambrook J, Fritsch, E F et Maniatis T ( 1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) Pour le clonage et l'expression, on a utilisé les souches d'Escherichi coli K 12 TG 1 (sup E, hsd A 5, thi, A(lac-pro AB) lF, tra D 36, pro AB, lac Iq ZAM 15 l) (Gibson, T J ( 1984) Ph D Thesis, Cambridge University, Angleterre) et d'Escherichia coli K 12 JM 83 (ara, A(lac-pro AB), rps L (=str A), 80, Lac ZAM 15) (Yanisch- Perron, C, Vieira, J et Messing, J ( 1985), Gene 33, 103-119) Les enzymes de restriction ont été foumrnies par Boehringer Mannheim, New England Biolabs et Gibco BRL, I'ADN polymérase Taq par Promega La digestion par les enzymes de restriction et la réaction de polymérisation en chaîne (RPC) ont été effectuées dans les conditions recommandées par les fabricants Pour la mutagénèse dirigée, on a utilisé une technique de Kunkel modifiée (Geisselsoder, J, Witney, F et Yuckenberg, P ( 1987), Biotechniques 5, 786-791) On a effectué la synthèse d'oligodésoxynucléotides à l'aide d'un synthétiseur automatique d'ADN d'Applied Biosystems Le conjugué covalent streptavidine- phosphatase alcaline a été fourni par Amersham et l'agarose- streptavidine provenait de chez Biomol ou Sigma Tous ces réactifs contenaient la streptavidine-noyau, une forme raccourcie par protéolyse de la protéine (Bayer, E A, Ben-Hur, H, Hiller, Y et Wilchek, M ( 1989) Biochem J. 259,369-376). B) Construction des plasmides Le plasmide p ASK 46 utilisé dans ce travail a été assemblé à partir de constructions de gènes antérieures pour l'expression du fragment Fv de D 1 3 dans E. coli (Ward E S, G ssow, D, Griffith, A D, Jones, P T et Winter, G ( 1989) Nature 341, 544- 546) et à partir de p ASK 40 (Skerra, A, Pfitzinger, I et Plickthun, A. ( 1991) Bio/Technology, 9, 273-278). La séquence d'ADN entière de p ASK 46 est représentée à la figure 1 La figure 2 montre une carte de restriction du même plasmide. On a préparé six dérivés de p ASK 46, qui codent pour quatre peptides différents à l'extrémité C-terminale de VH et deux peptides à l'extrémité C-terminale de VL du fragment Fv de D 1 3 (Boulot, G, Eiselé, J -L, Bentley, G A, Bhat, T N, Ward, E S, Winter, G et Poljak, R J ( 1990), J Mol Biol, 213, 617- 619). Constructions avec des marqueurs peptidiques sur V Hii On a remplacé la séquence d'ADN comprenant les paires de bases 686 - 706 sur le p ASK 46 par les séquences indiquées ci-dessous, ayant chacune une longueur de 30 paires de bases, qui codent pour des nonapeptides. 686 706 I I p ASK 46: 5 ' TCCTCA-TAATAAGAGCTATGGGAGCTT-GCATGCAAATTCTA Ser Ser-End End p ASK 46-plll H: 5 ' TCCTCA- GCGTGGAGGCATCCACAGTTCGGGGGCTAA-GCATGCAAATTCTA Ser Ser-Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gl Yy End p ASK 46 p 141 H: 5 ' TCCTCA- CAGTGGCTGCATCCACAG'ITCGGTGGCTAA-GCATGCAAATTCTA Ser Ser-Gln Trp Leu His Pro Gln Phe Gly Gly End p ASK 46-p ll XH: 5 ' TCCTCA-GCGTGGAGGCATCCACAGTTCGAGCGCTAA-GCATGCAAATTCTA Ser Ser-Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Glu Arg End p ASK 46-p 14 XH: 5 ' TCCTCA CAGTGGCTGCATCCACAGTTCGAGCGCTAA-GCATGCAAATTCTA Ser Ser-Gln Trp Leu His Pro Gln Phe G 1 lu Arg End Constructions avec des marqueurs peptidiques sur VL On a remplacé la séquence d'ADN comprenant les paires de bases 1127 - 1169 sur le p ASK 46 par les séquences indiquées ci-dessous, ayant des longueurs de 36 et 44 paires de bases. 1127 1169 I I p ASK 46: 5 ' ATCAAA-CGGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATTAATAA- TGATC Ile Lys-Arg G 1 lu Gln Lys Leule Ser G 1 lu G 1 lu Asp Leu Asn End End p ASK 46-plll L: 5 '-ATCAAA-TCAGCGTGGCGTCATCCACAGTTCGGTGGCTAAGCT- TGATC Ile Lys Ser Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly End p ASK 46-p ll XL: 5 ' -ATCAAA-TCAGCGTGGCGTCATCCACAGTTCGAGCGCTAAGCATGCAAGCT-TGATC Ile Lys-Ser A 1 la Trp Arg His Pro Gln Phe G 1 lu Arg End C) Croissance des cellules, induction et désagrégation des cellules Pour la production des protéines recombinées, on a fait incuber les cellules d'E coli transformées avec le plasmide d'expression correspondant à 22 C dans du milieu LB qui contenait 100 /ug/ml d'ampicilline, jusqu'à l'obtention d'une DO 550 de 0,5 On a alors ajouté de l'IPTG jusqu'à une concentration finale de 1 m M, on a éventuellement baissé la température à 20 C et on poursuivi l'induction de l'expression de la protéine pendant 3 heures On a ensuite centrifugé les cellules et on les a remises en suspension dans un tampon convenable Pour préparer la fraction cellulaire cytoplasmique, on a remis les cellules d'l litre de culture en suspension dans 10 ml de Tris 50 m M p H 8,0, saccharose 500 m M, EDTA 1 m M et on les a mises à incuber pendant 30 minutes sur de la glace On a sédimenté les sphéroplastes par centrifugation, et on a soumis avant son utilisation ultérieure le surnageant à une filtration stérile Dans le cas o l'opération était prévue pour la purification avec une colonne d'agarose-streptavidine, on a ajouté de l'avidine jusqu'à une concentration finale de 40 Mg/ml pour complexer les groupes biotine libres On a concentré la solution de protéine par ultrafiltration jusqu'à un volume final d'environ 1 ml et on l'a dialysée une nuit contre 1 1 de Tris 50 m M, p H 8,0 à 4 C On a éliminé avant la chromatographie sur colonne de petites quantités de précipité par centrifugation (Microfuge, 14000 tours/min, 10 minutes, 4 'C) ou par filtration avec une unité de filtration Spin-X (Costar) Pour préparer la partie soluble de la protéine cellulaire totale, on a remis les cellules d'1 litre de culture en suspension dans 10 ml de Tris 50 m M, p H 8,0, et on les a désagrégées à l'aide d'un homogénéisateur à haute pression (French pressure cell) à 18000 psi On a centrifugé le produit homogénéisé ( 45000 g, minutes, 4 C) et on a ajouté au surnageant de l'avidine jusqu'à une concentration de 40,g/ml pour complexer les groupes biotine libres Après une incubation de 30 minutes à 4 C, on a filtré la solution protéinique dans des conditions stériles et on l'a appliquée sur la colonne d'agarose-streptavidine Pour l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE) de la protéine cellulaire totale, on a remis les cellules de 4 ml de culture d'E coli en suspension dans 400,ul de Tris 50 m M, p H 8,0, et on a ajouté 100 /Ul de 5 x le tampon d'application de la SDS-PAGE (voir plus loin). On a fragmenté l'ADN chromosomique par traitement aux ultrasons avant l'électrophorèse en gel. Exemple 1 Essai sandwich sur filtre On a effectué l'essai sandwich sur filtre en s'appuyant sur une stratégie qui a été décrite antérieurement par Skerra et coll (Skerra, A, Dreher, M L et Winter, G. ( 1991) Anal Biochem 196, 151-155) On a étalé ou appliqué ponctuellement les cellules d'E coli transformées sur une membrane de filtre en nitrocellulose (diamètre de 82 mm, Schleicher & Schuell) qui se trouvait sur une plaque d'agar (avec du milieu LB qui contenait 100 jug/ml d'ampicilline et 10 mg/ml de glucose) On a mis la plaque à incuber à 37 C pendant environ 8 heures, jusqu'à ce qu'apparaissent de petites colonies On a parallèlement chargé une seconde membrane de filtre en nitrocellulose pendant 6 heures avec une solution de 5 mg/ml de lysozyme de blanc d'oeuf de poule (Sigma), qui est l'antigène de l'anticorps D 1 3, dans du tampon PBS (KH 2 PO 4 4 m M, Na 2 HPO 4 16 m M, Na CI 115 m M) puis on l'a bloquée pendant 2 heures dans du tampon PBS avec 3 % en masse/volume de BSA (Sigma, fraction V) et 0,5 % v/v de Tween 20 (Sigma) On a lavé deux fois cette membrane "piège à anticorps" avec du PBS, on l'a imprégnée de milieu LB liquide qui contenait 100, ug/ml d'ampicilline et de l'I'TG 1 m M (l 3-D-thiogalactopyranoside d'isopropyle, Biomol), on l'a appliquée sur une plaque d'agar ayant la même composition de milieu et on l'a recouverte de la première membrane portant les colonies d'E coli On a mis les cellules à incuber sur cet empilement de filtres pendant une nuit ( 14 h) à la température ambiante pour obtenir une expression des fragments Fv ayant un marqueur peptidique Cterminal. On a ensuite enlevé la membrane supérieure et on l'a placée sur une plaque d'agar-LB frais, qui contenait 100 /ug/ml d'ampicilline et 10 mg/ml de glucose, pour conserver les colonies d'E coli à 4 C en vue d'un développement ultérieur On a séparé la membrane "piège" de l'agar et on l'a lavée trois fois avec du PBS/Tween (PBS avec 0,1 % v/v de Tween) La mise en évidence de fragments Fv immobilisés porteurs des peptides à activité de liaison de la streptavidine a été effectuée par une incubation d'une heure avec un conjugué streptavidine-phosphatase alcaline (dilué à 1:2000 dans du PBS/Tween), en présence de 2 ug/ml d'avidine (Polyscience) qui avait été ajoutée minutes auparavant Après l'avoir bien lavée ( 3 x PBS/Tween; 2 x PBS), on a mis la membrane à incuber dans 10 ml de tampon AP (Tris 100 m M p H 8,8; Na CI m M; Mg C 12 5 m M), auquel on avait ajouté 30 ul de solution de base de BCIP' ( 50 mg/ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate de 4-toluidine (Biomol) dans du diméthylformamide) et 5 ul de solution de base de NBT ( 75 mg/ml de bleu de p- nitrotétrazolium (Biomol) dans du diméthylformamide à 70 % v/v) (Blake, M S, Johnston, K H, Russel-Jones, G J et Gotschlich, E C ( 1984) Anal Biochem, 136, -179) On a arrêté la réaction chromogène au bout de 30 60 minutes par plusieurs lavages à l'eau distillée et on a séché le filtre à l'air. La figure 3 montre à chaque fois 4 colonies d'Escherichia coli TG 1, transformées avec les plasmides p ASK 46-pl 41 H ( 1), p ASK 46-plll H ( 2), p ASK 46 ( 3) (en tant que témoin négatif), et p ASK 46-plll L ( 4) Mis à part le témoin négatif, on observe dans tous les cas un fort signal de liaison pour le conjugué de streptavidine On a décelé un signal de liaison quelque peu plus faible avec les plasmides p ASK 46-pll XH, p ASK 46-pll XL et p ASK 46-p 14 XH (non représentés). Exemple 2 SDS-PAGE et analyse par immuno-empreinte (transfert de Western) On a effectué la SDS-PAGE dans des compartiments de gels plats verticaux en utilisant le système tampon de Fling, S P et Gregerson, D S (( 1986) Anal Biochem, 155, 83-88) Pour l'analyse par immuno-empreinte (transfert de Western), on a imprégné le gel après l'électrophorèse avec un tampon de transfert (tampon de fonctionnement de l'électrophorèse avec 20 % (v/v) de méthanol) On a transféré la protéine par la technique "semi-dry" sur une membrane Immobilon-P (Millipore) à une intensité de courant constante de 1 m A/cm 2 en l'espace d'une heure à 4 C On a ensuite bloqué la membrane avec du PBS qui contenait 0,5 % v/v de Tween et 3 % de BSA m/v, pendant une heure à la température ambiante Après l'avoir lavée trois fois avec du PBS/Tween, on a mis la membrane à incuber pendant 10 minutes avec de l'avidine ( 2 Ml/ml dans du PBS/Tween), pour complexer la biotinecarboxyl- protéine support On a ensuite fait incuber avec un conjugué streptavidine- phosphatase alcaline dilué à 1:4000 dans du PBS/Tween pendant une heure Après l'avoir bien lavé ( 3 x PBS/Tween, 2 x PBS), on a développé le transfert à l'aide du protocole BCIP/NBT (voir l'exemple 1). La figure 4 montre la mise en évidence des produits de fusion protéine- peptide correspondants dans l'analyse par immuno-empreinte On a séparé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE) des parties aliquotes égales des fractions cytoplasmiques de cellules d'Escherichia coli TG 1 induites, transformées avec les plasmides p ASK 46-p 141 H ( 1), p ASK 46-plll H ( 2), p ASK 46- plll L ( 3) et p ASK 46 (comme témoin négatif) Après le transfert des protéines sur une membrane Immobilon-P, on a décelé de façon spécifique le produit de fusion protéine-peptide avec le conjugué de streptavidine Dans une expérience analogue, les plasmides p ASK 46-pll XH, p ASK 46- p 11 XL et p ASK 46-p 14 XH ont donné un signal quelque peu plus faible (non représenté) On a obtenu des résultats comparables en séparant la protéine cellulaire totale en SDS-PAGE. Exemple 3 ELISA On a chargé sept séries de plaques de microtitrage de 96 puits (Falcon #3912) avec 100,ll d'une solution de 3 mg/ml de lysozyme dans Na HCO 3 50 m M, p H il 9,6, à 4 C pendant une nuit On a ensuite effectué un blocage à la température ambiante avec du lait sec sans matière grasse (Biorad) à 2 % m/v dans du PBS pendant deux heures Après les avoir lavées à fond ( 3 x PBS/Tween) on a ajouté à la pipette des portions de 50 /ul des fractions cellulaires cytoplasmiques des clones correspondants sous forme d'une série de dilutions dans du PBS/I\Tween et on a mis à incuber pendant 1 heure Les concentrations des fragments Fv dans les fractions non diluées s'élevaient à environ 50 100 /ug/ml (estimées par SDS-PAGE) Après lavage ( 3 x PBS/Tween), on a ajouté 50 /u 1 de conjugué streptavidine-phosphatase alcaline à une dilution de 1:1000 dans du PBS/Tween et on a fait incuber pendant 1 heure On a éliminé le conjugué non Iié par deux lavages à chaque fois avec du PBS/Tween et du PBS et on a ajouté à la pipette 100 l I de solution de NPP ( 0,5 mg/ml de phosphate de p-nitrophényle; diéthanolamine 0,9 M, p H 9,6; Mg CI 2 1 m M) On a développé le signal coloré pendant 5-10 minutes et on l'a arrêté paraddition de 100 /l d'EDTA 10 m M, p H 8,0 On a déterminé les valeurs d'absorption à l'aide d'un photomètre de plaques de microtitrage, et on a enregistré pour chaque dilution les données sous forme des valeurs de la différence A 405 A 450 après avoir soustrait la valeur à blanc. Les valeurs à blanc ont été déterminées par une série de dilutions de la fraction cellulaire cytoplasmique qui contenait le fragment Fv de D 1 3 sans marqueur peptidique, et se sont révélées constantes dans tout l'intervalle de dilutions (A 405 - A 450 = 0,199 0,009). La figure 5 montre les signaux de liaison observés pour le conjugué de streptavidine avec des séries de dilutions des fractions cytoplasmiques de cellules d'Escherichia coli TG 1 induites, transformées avec les plasmides correspondants. Exemple 4 Purification de la protéine par chromatographie d'affinité avec la streptavidine On a équilibré une colonne chargée de 6 ml d'agarosestreptavidine (environ 1 mg de streptavidine par ml de gel) avec 10 volumes de Tris 50 m M, p H 8,0 On a appliqué la fraction cellulaire cytoplasmique de 0,5 1 des cellules d'E coli transformées avec le plasmide correspondant sur la colonne et on l'a lavée avec le tampon Tris On a ensuite élué de façon spécifique le fragment Fv de D 1 3 hybride avec une solution d'iminobiotine 1 m M (Sigma) ou d'acide lipoique 5 m M (Sigma) dans le même tampon Comme ces analogues de biotine se lient de façon beaucoup plus faible à la streptavidine que la biotine elle-même (Green, N M ( 1975) Adv. Protein Chem, 29, 85-133), on a pu régénérer la colonne par simple lavage avec 10 volumes de tampon Tris Toutes les étapes chromatographiques ont été effectuées à un débit de 30 ml/h à une température de 4 C La chromatographie d'affinité avec la streptavidine de la partie soluble de la protéine cellulaire totale a été effectuée à un débit d'environ 20 ml/h dans des conditions identiques par ailleurs Le rendement en fragment Fv hybride purifié était normalement autour de 0,5 mg/l DO 550 de culture d'E coli Pour la purification par affinité avec la streptavidine du complexe Fv de D 1 3-lysozyme, on a ajouté à une fraction cellulaire cytoplasmique, qui contenait le fragment Fv de D 1 3 (plll L) et qui avait été dialysée contre Na H 2 PO 4 50 m M, p H 7, 0, Na CI 115 m M, EDTA i m M, une quantité à peu près triple en moles de lysozyme Après avoir procédé à une incubation d'une heure puis à une centrifugation, on a soumis la solution de protéine obtenue à la chromatographie d'affinité sur agarose-streptavidine (comme ci-dessus), en utilisant le dernier tampon cité. La figure 6 A montre les profils d'élution (absorption à 280 nm) de la chromatographie d'affinité avec la streptavidine qui a été effectuée avec les fractions cytoplasmiques des cellules d'Escherichia coli TG 1 transformées avec p ASK 46- p 111 H et p ASK 46-plll L Des gels de polyacrylamide SDS colorés avec du bleu brillant de Coomassie (Serva) des fractions obtenues après l'application d'une solution d'iminobiotine sont reproduits au- dessous On peut voir sur cette figure que les deux sous-unités du fragment Fv ont été éluées simultanément sous forme pure et de façon spécifique, bien que dans chaque cas une seule chaîne de la protéine hétérodimère ait été fusionnée avec le peptide ayant une affinité pour la streptavidine Dans le cas du p ASK 46-plll L, les deux chaînes avaient la même mobilité par électrophorèse sur gel de polyacrylamide- SDS (SDS-PAGE) On a donc de plus mis en évidence la fonctionnalité de la protéine purifiée par un essai ELISA (comme dans l'exemple 3). Lors d'une chromatographie effectuée de façon analogue dans laquelle on a appliqué la protéine cellulaire totale de cellules d'Escherichia coli TG 1 transformées avec p ASK 46-p 111 H, on a également obtenu la protéine recombinée en tant qu'hétérodimère intact sous forme pure. La figure 6 B représente une chromatographie d'affinité avec la streptavidine analogue, dans laquelle on avait ajouté du lysozyme, l'antigène du fragment Fv de D 1 3, à la fraction cytoplasmique de cellules d'Escherichia coli TG 1 transformées avec p ASK 46-plll L Le gel de polyacrylamide-SDS coloré avec du bleu brillant de Coomassie (Serva) reproduit sous le profil d'élution montre la fraction de produit ( 2) obtenue par élution avec la solution d'iminobiotine et à titre de comparaison le lysozyme purifié ( 3) ainsi que le fragment de Fv recombiné purifié séparément ( 4) La trace ( 1) reproduit des références de masses moléculaires On peut voir que le complexe immunologique constitué par le fragment Fv recombiné et l'antigène lysozyme a été purifié de façon spécifique. Exemple 5 Construction et utilisation de p ASK 60-Strep On a préparé p ASK 60- Strep à partir de p ASK 40 (Skerra, A, Pfitzinger, I. et Plickthun, A ( 1991) Bio/Technology, 9, 273-278) en utilisant la mutagénèse dirigée et la PCR Les figures 7 et 8 présentent une carte de restriction et la séquence d'ADN entière de p ASK 60-Strep Le lieur multisite de p ASK 60- Strep contient un ensemble de sites de coupure de restriction uniques amélioré, comprenant deux sites de coupure de restriction qui sont situés directement à l'extrémité 3 ' de la région codant pour le peptide signal de Omp A, et est suivi d'une séquence d'ADN codant pour l'un des peptides de liaison à la streptavidine "(Ser-Ala-)Trp-ArgHis-Pro- Gln-Phe-Gly-Gly" (cf figure 9) On peut obtenir l'expression directe d'un gène étranger dans E coli, c'est-à-dire sans utiliser la séquence signal de Omp A, en utilisant le site de coupure de Xba I et en reconstruisant le domaine comprenant 16 paires de bases entre le codon d'arrêt du mini-cistron de lac Z et le codon d'initiation du gène de structure (auparavant la séquence signal de Omp A) Pour préparer en revanche un produit de fusion à l'aide de la séquence signal de Omp A dont la séquence codante est située sur p ASK 60-Strep, on peut cloner directement le gène de structure à l'aide des sites de coupure de Stu I ou de Bsa I Stu I (séquence reconnue "AGG CCT") produit une extrémité franche après le premier nucléotide du dernier codon (Ala) de la séquence signal On peut donc créer une fusion précise à l'aide d'un site de restriction compatible (par exemple Stu I, Pvu II, Nru I) directement avant le gène de structure Bsa I est une enzyme de restriction de type I Ia, dont le site de coupure est éloigné du site de reconnaissance ("GAGACC", souligné dans la figure 9) Par coupure avec cette enzyme, on produit une extrémité d'ADN saillante en 5 ' ("GGCC" imprimée en petits caractères dans la figure 9) qui est située à la dernière extrémité 3 ' de la séquence signal, sans pénétrer dans la région codante de la partie mature du gène à cloner On peut ligaturer cette extrémité cohésive avec les extrémités qui sont produites par les enzymes de restriction Eae I et Eag I En outre il est possible, par exemple par PCR au cours de la préparation du fragment d'ADN à cloner, d'introduire un site de restriction compatible qui n'altère pas la région codante amino-terminale mature du gène, lorsque la séquence reconnue par Bsa I (ou par une autre enzyme de type Hia comme Bsp MI, etc) est placée sur le côté opposé de l'extrémité cohésive qui doit être produite La fusion du gène de structure à la région codant pour le peptide de liaison à la streptavidine peut s'effectuer à l'aide du site de coupure de restriction d'Eco 47 III (séquence reconnue "AGC GCT"), ce qui donne une coupure franche directement entre le codon de Ser ("AGC", imprimé en petits caractères à la figure 9) et le codon d'Ala avant la séquence peptidique proprement dite de la revendication 1 Si on veut rétablir le codon de Ser, on peut utiliser des sites de restriction différents pour obtenir une extrémité compatible, par exemple aussi Sca I et Nru I, en-dehors d'Eco 47 III. Exemple 6 Expression et décèlement d'un domaine soluble du récepteur de LDL avec p ASK 60-Strep Le récepteur de lipoprotéines de basse densité humain est constitué, abstraction faite d'une séquence signal N-terminale qui est séparée dans le récepteur mature, de cinq domaines protéiniques dont le quatrième représente la fraction transmembranaire Pour cloner le premier domaine protéinique N-terminal qui comprend les aminoacides i à 292, on a utilisé le plasmide p LDLR 3 (ATCC n' 57004) f(Yamamoto, T, Davis, C G, Brown, M S, Schneider, W J, Casey, M L, Goldstein, J L et Russell, D W ( 1984) Cell 39, 27-28) On a amplifié par PCR le fragment d'ADN correspondant à l'aide des amorces oligodésoxynucléotidiques " 5 '-TAG CAA CGG CCG CAG TGG GCG ACA GAT GT" (pour l'extrémité N- terminale, avec le site de coupure de restriction Eag I) et " 5 '-TTC GTT AGT ACT GCA CTC TIT GAT GGG TTC" (pour l'extrémité C-terminale, avec le site de coupure de restriction Sca I), on l'a isolé et on l'a coupé avec les enzymes de restriction Eag I et Bsa I On a cloné ce fragment d'ADN dans p ASK 60-Strep par l'intermédiaire de ses sites de coupure de restriction Bsa I et Eco 47 III en utilisant la souche K 12 JM 83 d'Escherichia coli Après avoir vérifié le plasmide obtenu par analyse de restriction et séquençage de l'ADN, on a préparé une culture à partir d'un clone et on a induit l'expression de la protéine de la façon décrite ci-dessus On a séparé la protéine cellulaire totale des cellules obtenues dans une SDS-PAGE à 15 % et on l'a transférée par immuno-empreinte sur une membrane d'Immobilon P On a pu mettre en évidence de façon spécifique le domaine du récepteur recombiné d'environ 40 000 daltons à l'aide du conjugué streptavidine-phosphatase alcaline (cf exemple 2). REVENDICATIONS 1 Peptide comprenant la séquence d'aminoacides Trp X His Pro Gln Phe Y Z, dans laquelle X représente un aminoacide quelconque et Y et Z signifient tous deux Gly, ou Y signifie Glu et Z signifie Arg ou Lys. 2 Protéine de fusion, caractérisée en ce qu'elle est constituée par la séquence d'aminoacides d'une protéine entière, d'un mutant d'une protéine tel qu'un mutant par délétion ou un mutant par substitution, ou d'une partie de protéine, liée à la séquence du peptide selon la revendication 1. 3 Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il contient une séquence d'ADN codant pour un peptide selon la revendication 1, pouvant s'exprimer sous le contrôle d'un promoteur et éventuellement d'un opérateur convenables, ainsi qu'un site de coupure de restriction dans la direction 5 ' et/ou 3 ' à la suite de cette séquence d'ADN, qui permet l'insertion d'une autre séquence d'ADN codant pour une protéine ou une partie de protéine à exprimer. 4 Procédé de préparation d'une protéine recombinée par expression d'une séquence d'ADN codant pour cette protéine dans des cellules hôtes convenables par des méthodes connues en soi, caractérisé en ce que l'on utilise une séquence d'ADN qui code pour une protéine de fusion selon la revendication 2, et en ce qu'éventuellement on décèle la présence du produit d'expression à l'aide d'un conjugué de streptavidine et d'un marqueur et on effectue la séparation de la protéine désirée sous forme d'une protéine de fusion par chromatographie d'affinité avec la streptavidine. 5 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on utilise un conjugué de streptavidine et d'un marqueur enzymatique. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on utilise une phosphatase alcaline comme marqueur enzymatique. 7 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on utilise une matrice d'agarose-streptavidine pour la chromatographie d'affinité. 8 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, dans la chromatographie d'affinité, on élue la protéine de fusion en ajoutant des ligands naturels de la streptavidine, en particulier la biotine, des dérivés synthétiques de la biotine, en particulier la 2-iminobiotine ou l'acide lipoique, ou des peptides synthétiques selon la revendication 1.