FR 2696463 A1 19940408 FR 9211746 A 19921005 PROCEDE D'OBTENTION DE LA DESACETYL-10 BACCATINE m 1 La présente invention concerne un procédé pour obtenir sélectivement des intermédiaires utiles pour la préparation par des procédés semi- synthétiques du taxol, du Taxotère ou de leurs analogues à partir des différentes parties de plantes contenant ces intermédiaires. Plus particulièrement, l'invention concerne robtention de la désacétyl-10 baccatine m I à partir de récorce, du tronc, des racines ou des feuilles de différentes espèces d'ifs. Le taxol et le Taxotère ainsi que leurs analogues de formule générale: R-O O O-R' R 1-CO-NH O (I) Ar _O" OH HO OCOCH 3 OCOC 6 H 5 qui manifestent des propriétés anticancéreuses et antileucémiques remarquables, constituent des agents chimiothérapeutiques remarquables pour le traitement d'un certain nombre de cancers tels que par exemple les cancers du sein, de la prostate, du colon, de l'estomac, du rein ou des testicules et plus spécialement le cancer de rovaire. Notamment, dans la formule générale (I), Ar peut représenter un radical phényle éventuellement substitué, R peut représenter un atome d'hydrogène ou un radical acétyle ou un radical carbamoyle N-substitué, R' représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle N-substitué et R 1 peut représenter un radical phényle ou un radical R 2-O dans lequel R 2 représente un radical alcoyle, alcényle, alcynyle, cycloalcoyle, cycloalcényle, bicycloalcoyle, phényle ou hétérocyclyle. Le taxol correspond au produit de formule générale (I) dans laquelle Ar et R 1 représentent un radical phényle et R représente un radical acétyle et R' représente un atome d'hydrogène et le Taxotère corespond au produit de formule générale (I) dans laquelle Ar représente un radical phényle, R et R' représentent un atome d'hydrogène et R 1 représente un radical t butoxy. Le taxol, qui existe à l'état naturel dans différentes espèces d'ifs dans lesquelles il se trouve en faibles quantités, est difficile à isoler sans procéder à la destruction complète de la plante Par exemple, le taxol peut être isolé selon la méthode de C H O HUANG et coll J Natl Prod, 49, 665 ( 1986) qui consiste à traiter récorce broyée de Taxus brevifolia par le méthanol, à concentrer l'extrait, extraire le concentrat par le dichlorométhane, à concentrer à nouveau, à disperser le résidu dans un mélange hexane-acétone ( 1-1 en volumes), à purifier la partie soluble par chromatographie sur une colonne de Florisil pour obtenir le taxol brut qui est purifié par recristallisations successives dans des mélanges méthanol- eau et hexane- acétone puis par chromatographie et nouvelle cristallisation Les quantités de taxol ainsi extraites peuvent représenter de 0,005 à 0,017 % de la partie de la plante mise en oeuvre. Le Taxotère qui n'existe pas à l'état naturel peut être préparé par hémi- synthèse à partir de la désacétyl-10 baccatine Im de formule: HO"' OH HO,' 3 (- HO _ OCOCH 3 OCOC 6 H 5 selon les procédés qui sont décrits, par exemple, dans les brevets américains US 4,814,470 ou US 4,924,012 ou dans la demande internationale PCT WO 92/09589. Le taxol peut aussi être préparé par des procédés qui font intervenir la mise en oeuvre de la désacétyl-10 baccatine III soit par passage par l'intermédiaire du Taxotère dans les conditions décrites dans le brevet américain US 4,857,653 soit par estérification de la baccatine III dans les conditions décrites dans les brevets européens EP 400,971 ou EP 428,376 soit par estérification de la désacétyl-10 baccatine HI et acétylation dans les conditions décrites dans les brevet américain US 4,924,011. Les différentes variétés d'ifs (Taxus baccata, Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cupidata,Taxus floridana, Taxus media et Taxus wallichiana) contiennent des dérivés du taxane dont les principaux sont essentiellement le taxol et la désacétyl-10 baccatine III, les autres dérivés étant plus particulièrement la céphalomannine, la désacétyl-10 céphalomannine ou la baccatine III éventuellement liés à des sucres. Alors que le taxol se trouve principalement dans le tronc et lécorce, la désacétyl-10 baccatine III est présente essentiellement dans les feuilles Par ailleurs, la teneur en désacétyl-10 baccatine DI dans les feuilles est généralement très supérieure à celle du taxol, que celui-ci soit présent dans l'écorce, le tronc ou dans les feuilles. Il en résulte qu'il est particulièrement important de pouvoir disposer de désacétyl-10 baccatine Im qui est essentielle à la préparation de quantités de taxol beaucoup plus importantes que par extraction directe à partir des ifs ainsi qu'à la préparation du Taxotère. En extrayant la désacétyl-10 baccatine Im à partir des feuilles d'ifs, on n'est pas conduit à une destruction totale de la plante dont les feuilles peuvent être utilisées à nouveau après chaque cycle de croissance. Généralement, les méthodes connues d'extraction des dérivés du taxane contenus dans les différentes parties de l'if (écorce, tronc, racines, feuilles,) nécessitent la mise en oeuvre de techniques chromatographiques longues et coûteuses qui ne permettent pas une séparation totale et quantitative des dérivés du taxane présents initialement dans la plante. Selon le procédé décrit dans le brevet américain US 4,814,470 qui met en oeuvre une macération des aiguilles dans l'éthanol, une extraction par un solvant organique tel que le chlorure de méthylène et des chromatographies successives, il est possible d'isoler environ 40 % de la désacétyl-10 baccatine RI contenue dans les feuilles. Les différents constituants dérivés du taxane présents dans les différentes parties de l'if peuvent aussi être séparés par des méthodes mettant en oeuvre la chromatographie en phase liquide "reverse" qui sont décrites, en particulier dans la demande international PCT WO 92/07842 Ces procédés consistent essentiellement à traiter les extraits bruts d'ifs par chromatographie en phase liquide "reverse" sur un adsorbant sur lequel se fixent les dérivés du taxane, à éluer les dérivés du taxane et à les isoler Selon ce procédé, il est possible d'isoler environ 25 % de la désacétyl-10 baccatine m contenue dans les feuilles. Il a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait lobjet de la présente invention, que la désacétyl-10 baccatine Im peut être extraite sélectivement à partir des différentes parties de l'if, et plus particulièrement des feuilles, par un procédé simple ne mettant pas en oeuvre des techniques chromatographiques Par exemple, il est possible d'extraire environ 75 % de la désacétyl-10 baccatine HI présente dans les feuilles. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention consiste: 1) à traiter les parties broyées de l'if (Taxus sp) par un alcool aliphatique de façon à obtenir un extrait alcoolique contenant la désacétyl-10 baccatine m I, 2) à diluer à l'eau l'extrait alcoolique éventuellement concentré, 3) à séparer par filtration, décantation ou centrifugation les insolubles présents dans la solution hydro-alcoolique obtenue, 4) à éliminer la quasi totalité de l'alcool de la solution hydro-alcoolique, ) à extraire la désacétyl-10 baccatine II de la phase aqueuse ainsi obtenue par un solvant organique convenable, 6) à éliminer le solvant de l'extrait organique ainsi obtenu contenant la désacétyl-10 baccatine II, 7) à faire cristalliser sélectivement la désacétyl-10 baccatine II, à partir du résidu ainsi obtenu, dans un solvant organique, 8) à isoler la désacétyl-10 baccatine III purifiée. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre sur toute partie appropriée de l'if telle que l'écorce, le tronc, les racines ou les feuilles L'if utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention appartient de préférence à la variété Taxus baccata, Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cupidata, Taxus floridana, Taxus media ou Taxus wallichiana Il est particulièrement avantageux d'utiliser les feuilles d'if (Taxus baccata, Taxus brevifolia) qui généralement sont plus riches en désacétyl-10 baccatine Im Pour une meilleure mise en oeuvre du procédé, il est préférable d'utiliser les différentes parties de l'if sous forme broyée et éventuellement séchée Les fragments utilisés peuvent avoir des dimensions variant de 0,5 à quelques millimètres Pour des questions de commodité, il peut être avantageux d'utiliser des fragments dont les dimensions moyennes sont inférieures à 1 mm Les parties broyées et éventuellement séchées de l'if peuvent être obtenues par des opérations de broyage et éventuellement de séchage qui, éventuellement, précèdent ou suivent des opérations de congélation et de décongélation des parties fraîches de la plante ou s'intercalent dans des opérations de congélation et de décongélation des parties fraîches de la plante. L'extrait alcoolique est obtenu en agitant un mélange, éventuellement chauffé, des parties broyées et éventuellement séchées de l'if avec un alcool généralement choisi parmi le méthanol, 'éthanol, le propanol, l'isopropanol et le t.butanol Il est particulièrement avantageux d'utiliser le méthanol. L'extrait alcoolique contenant la désacétyl-10 baccatine HI est dilué par addition d'eau pour donner une solution hydro-alcoolique. Pour la mise en oeuvre du procédé, il est avantageux de se placer dans des conditions particulières de dilution et de teneur en alcool dans la phase aqueuse, de façon à éviter les pertes en désacétyl-10 baccatine Im et à éliminer la plus grande quantité possible de produits insolubles Dans ces conditions, il peut être nécessaire de concentrer l'extrait alcoolique contenant la désacétyl-10 baccatine III préalablement à la dilution par leau. Plus particulièrement, la dilution par addition d'eau dans lextrait alcoolique éventuellement concentré par distillation, de préférence sous pression réduite, doit être faite de telle manière que le rapport entre le poids du mélange diluant et le poids de la matière sèche contenue dans l'extrait alcoolique soit compris entre 4 et 8, le mélange diluant eau-alcool contenant 10 à 30 % en poids d'alcool. Les produits insolubles dans la solution hydro-alcoolique ainsi obtenue sont éliminés selon les techniques habituelles et de préférence par filtration, par décantation ou par centrifugation Lorsque l'élimination est effectuée par filtration, il peut être avantageux d'opérer en présence d'un agent de filtration tel que la terre d'infusoire (célite) et d'un agent floculant. De préférence, l'élimination de lalcool de la solution hydro-alcoolique ainsi obtenue est effectuée par distillation, de préférence sous pression réduite, éventuellement en présence d'un agent antimousse, de façon à éviter ou à limiter la dégradation thermique des constituants du milieu. Généralement, la désacétyl-10 baccatine III contenue dans solution aqueuse ainsi obtenue, dans laquelle la teneur en alcool est généralement inférieure à 1 %, est extaite, en une ou plusieurs fois, par un solvant organique choisi parmi les éthers tels que le méthyl t butyléther, l'éthyl t butyléther, le méthyl n butyléther, le méthyl n amyléther, l'éthyl t amyléther, le t butyl isopropyléther, l'éthyl isobutyléther, le t.butyl n propyléther ou l'éthyl n hexyléther et les esters aliphatiques tels que l'acétate d'éthyle, l'acétate de propyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n butyle, l'acétate de t butyle, le t butylacétate de méthyle, le propionate de t butyle ou l'acétate de t amyle. D'un intérêt tout particulier sont le méthyl t butyléther, l'éthyl t butyléther, l'acétate d'éthyle ou l'acétate de n butyle Plus spécialement encore, il est avantageux d'utiliser l'acétate d'éthyle ou l'acétate de n butyle. Les extraits organiques sont éventuellement lavés au moyen d'une solution aqueuse d'une base faible (solution aqueuse de carbonate de sodium par exemple) et/ou à l'eau Après séchage, le solvant organique de l'extrait est éliminé selon les méthodes habituelles et en particulier par distillation éventuellement sous pression réduite, pour donner un résidu généralement solide dont on isole la désacétyl-10 baccatine II. La cristallisation sélective de la désacétyl-10 baccatine IR est effectuée à partir d'une solution du résidu obtenu dans un solvant organique ou dans un mélange de solvants organiques Comme solvants permettant la cristallisation sélective de la désacétyl-10 baccatine II peuvent être avantageusement utilisés les nitriles tels que l'acétonitrile ou le propionitrile, éventuellement en mélange avec un alcool aliphatique tel que le méthanol, l'éthanol, le propanol, l'isopropanol ou le n butanol ou un ester aliphatique tel que l'acétate d'éthyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n.butyle ou l'acétate de t butyle ou une cétone telle que l'acétone, la méthyl éthylcétone, la méthyl propylcétone, la méthyl n buylcétone et la méthyl isobutylcétone I 1 est particulièrement avantageux d'effectuer la cristallisation sélective dans l'acétonitrile éventuellement en présence d'éthanol et/ou d'acétone et/ou d'acétate d'éthyle et/ou d'acétate de n butyle. La désacétyl-10 baccatine II qui précipite peut être isolée par filtration, décantation ou centrifugation. La désacétyl-10 baccatine m I obtenue selon la procédé d'extraction de la présente invention peut être utilisée pour préparer le taxol ou le Taxotère ou leurs dérivés dans les conditions décrites plus particulièrement dans les brevets EP 0 253 738, EP 0 253 739, EP 0 336 840, EP 0 336 841, WO 92 09589, EP 0 400 971 et EP 0 428 376. Les exemples suivants illustrent le procédé selon l'invention EXEMPLE 1 Dans un percolateur, on place 200 litres de méthanol, 1,4 kg de laine de verre et 250 kg de feuilles d'if (Taxus baccata) broyées dont la taille moyenne des particules est voisine de 0,8 mm On ajoute 400 litres de méthanol pur La percolation est effectuée en alimentant le percolateur en solvant frais par le haut, au débit de 870 litres/heure, et en recueillant l'extrait méthanolique au bas du percolateur La percolation dure 5 heures à 20 C La solution méthanolique recueillie est évaporée sous pression réduite ( 70-80 k Pa) à 40 C dans un évaporateur pour obtenir un concentrat dont la teneur en matière sèche est comprise entre 40 et 80 % en poids. On utilise un extrait méthanolique (préparé dans les conditions décrites ci- dessus) contenant 353 g d'extrait sec, 420 g de méthanol et 40 g d'eau, la quantité de désacétyl-10 baccatine m I présente étant de 1130 mg. Dans un réacteur de 2 litres, on introduit l'extrait méthanolique puis, en agitant, 1590 cm 3 d'eau Le mélange est agité pendant 1 heure puis on ajoute successivement 35 g de célite en agitant pendant 1 heure et 25 cm 3 de floculant "ZETAG 87 " La suspension finale obtenue est filtrée sur verre fritté N 4 de 130 mm de diamètre Les produits insolubles et la célite sont lavés par 100 g d'un mélange eau-méthanol ( 8-2 en poids). Le filtrat est placé dans un réacteur de 2 litres puis on ajoute 2 cm 3 de SILICONE 426 R Le mélange est distillé sous pression réduite ( 7, 3-11 k Pa) à une température comprise entre 35 et 42 C, la température du bain extérieur étant comprise entre 45 et 50 C On obtient un distillat ( 909 g) et un concentrat ( 1432 g) contenant 0,5 % de méthanol. Le concentrat est extrait 1 fois par 700 cm 3 d'acétate d'éthyle puis 2 fois par 350 cm 3 d'acétate d'éthyle Les phases organiques réunies sont lavées 2 fois par 700 cm 3 d'une solution 0,1 M de carbonate de sodium puis par 1 fois 350 cm 3 d'eau. Le p H est égal à 8 La phase organique ( 1049 g) est concentrée à sec sous pression réduite ( 1,33-21,3 k Pa) à 40 C On obtient ainsi 16,2 g d'extrait sec. EXEMPLE 2 Dans un ballon de 500 cm 3, on introduit 45,5 g d'extrait sec contenant 9,3 % de désacétyl-10 baccatine HI obtenu dans les conditions décrites dans rl'exemple 1 puis on ajoute 18 cm 3 d'acétate d'éthyle Le mélange homogène est agité et chauffé à C On ajoute alors 136 cm 3 d'acétonitrile en 15 minutes à 50 C La suspension est agitée pendant environ 1 heure puis elle est refroidie à une température voisine de C en environ 3 heures Le précipité est séparé par filtration sur verre fritté N 3 (diamètre: 35 mm) puis il est lavé par 20 cm 3 d'acétonitrile puis par 2 fois 20 cm 3 de diisopropyléther Le produit est séché sous pression réduite ( 1,33 k Pa) à 40 C pendant 20 heures On obtient ainsi 5,2 g d'un produit blanc contenant 75,8 % de désacétyl-10 baccatine Im. Le rendement de la cristallisation est de 93,6 %. EXEMPLE 3 Dans un ballon de 1 litre, on introduit 275,2 g d'une solution dans l'acétate d'éthyle de 39,6 g de matière sèche contenant 3,48 g de désacétyl-10 baccatine III. Cette solution est concentrée sous pression réduite ( 6,0 k Pa) On recueille 164 g d'acétate d'éthyle Au concentrat, on ajoute 36 cm 3 d'éthanol puis on refroidit à 10 C. On ajoute alors lentement ( 1/2 heure environ) en agitant ( 30 tours/minute) 60 cm 3 d'acétonitrile La suspension est agitée pendant 1 heure à 10 C puis on ajoute rapidement 84 cm 3 d'acétonitrile On agite pendant 15 heures à 10 C Le précipité est séparé par filtration sur verre fritté N 3 (diamètre: 35 mm) puis il est lavé par 2 fois cm 3 d'acétonitrile puis par 2 fois 20 cm 3 de diisopropyléther Le produit est séché pendant 12 heures sous pression réduite ( 0,27 k Pa) à 40 C On obtient ainsi 2,85 g d'une poudre blanche cristallisée contenant 93,8 % de désacétyl-10 baccatine II. Les eaux-mères de cristallisation et les lavages ( 247 g) sont concentrés sous pression réduite ( 2,7 k Pa) à 40 C On obtient ainsi 36 g de substance sèche qui est reprise par 18 cm 3 d'éthanol On ajoute alors lentement 72 cm 3 d'acétonitrile Le mélange est agité pendant 15 heures à un température voisine de 20 C Le précipité est séparé par filtration et est Iavé par 2 fois 5 cm 3 d'acétonitrile et par 2 fois 5 cm 3 de diisopropyléther Après séchage, on obtient 0,662 g d'une poudre fine contenant 62,7 % de désacétyl-10 baccatine II. REVENDICATIONS 1 Procédé d'obtention de la désacétyl-10 baccatine II à partir des différentes parties de l'if (Taxus sp) caractérisé en ce que: 1) on traite les parties broyées de l'if par un alcool aliphatique de façon à obtenir un extrait alcoolique contenant la désacétyl-10 baccatine II 2) on dilue à l'eau l'extrait alcoolique éventuellement concentré, 3) on sépare par filtration, décantation, centrifugation les insolubles présents dans la solution hydro-alcoolique obtenue, 4) on élimine la quasi totalité de l'alcool de la solution hydro-alcoolique obtenue 5) on extrait la désacétyl-10 baccatine II contenue dans la phase aqueuse ainsi obtenue par un solvant organique convenable, 6) on élimine le solvant de l'extrait organique ainsi obtenu, 7) on cristallise sélectivement la désacétyl-10 baccatine HI à partir du résidu ainsi obtenu, puis 8) on isole la désacétyl-10 baccatine m I purifiée. 2 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on obtient l'extrait alcoolique en agitant les parties broyées et éventuellement séchées de l'if dans un alcool aliphatique choisi parmi le méthanol, l'éthanol, le propanol, l'isopropanol et le t.butanol. 3 Procédé selon la revendication 2 catactérisé en ce que l'alcool aliphatique est le méthanol. 4 Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3 caractérisé en ce que les parties broyées et éventuellement séchées de l'if sont obtenues par des opérations de broyage et éventuellement de séchage qui, éventuellement précèdent ou suivent des opérations de congélation et de décongélation des parties fraîches de la plante ou s'intercalent dans des opérations de congélation et de décongélation des parties fraîches de la plante. Procédé selon rune des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'on dilue à reau rextrait méthanolique éventuellement concentré de façon que le rapport entre le poids du mélange diluant et le poids de la matière sèche contenu dans rextrait alcoolique soit compris entre 4 et 8 et que le mélange diluant eau-alcool contienne 10 à 30 % d'alcool pour obtenir une solution hydro-alcoolique. 6 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les insolubles sont séparés de la solution hydro-aleoolique par filtration, décantation ou centrifugation. 7 Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'on élimine l'alcool de la solution hydro-alcoolique par distillation éventuellement sous pression réduite. 8 Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'on extrait la désacétyl-10 baccatine HI de la phase aqueuse, obtenue après élimination de l'alcool, par un solvant organique. 9 Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le solvant organique est choisi parmi les les éthers et les esters aliphatiques. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que les ethers sont choisis parmi le méthyl t butyléther, l'éthyl t butyléther, le méthyl n butyléther, le méthyl n amyléther, l'éthyl t amyléther, le t butyl isopropyléther, l'éthyl isobutyléther, le t butyl n propyléther et l'éthyl n hexyléther. 11 Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que les esters aliphatiques sont choisis parmi l'acétate d'éthyle, l'acétate de propyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n butyle, l'acétate de t butyle, le t butylacétate de méthyle, le propionate de t butyle et l'acétate de t amyle. 12 Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le solvant organique est l'acétate d'éthyle ou l'acétate de n butyle. 13 Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'on cristallise sélectivement la désacétyl-10 baccatine III dans un solvant organique choisi parmi les nitriles aliphatiques éventuellement en mélange avec un alcool aliphatique ou un ester aliphatique ou une cétone aliphatique. 14 Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que les nitriles aliphatiques sont choisis parmi l'acétonitrilé et le propionitrile. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que l'alcool aliphatique est choisi parmi le méthanol, l'éthanol, le propanol, l'isopropanol et le n.butanol il 16 Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que l'ester aliphatique est choisi parmi lacétate d'éthyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n butyle et l'acétate de t butyle. 17 Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que la cétone est choisie parmi l'acétone, la méthyl éthylcétone, la méthyl propylcétone, la méthyl n.buylcétone et la méthyl isobutylcétone. 18 Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que la cristallisation sélective est effectuée dans l'acétonitrile éventuellement associé à l'éthanol et/ou l'acétate d'éthyle ou de n butyle et/ou l'acétone 19 Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la désacétyl-10 baccatine Im purifiée est isolée par filtration, décantation ou centrifugation. Procédé selon l'une des revendications 1 à 19 caractérisé en ce que l'on extrait la désacétyl-10 baccatine HI à partir des feuilles de l'if. 21 Procédé selon la revendication 20 caractérisé en ce-que l'if appartient à la variété Taxus baccata, Taxus brevifloria, Taxus canadensis, Taxus cupidata, Taxus floridana, Taxus media ou Taxus wallichiana. 22 Utilisation de la désacétyl-10 baccatine III obtenue selonr le procédé de rune des revendications 1 à 21 pour la préparation du taxol, du Taxotère ou de leurs dérivés. 23 La désacétyl-10 baccatine III lorsqu'elle est obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 21