FR 2687788 A1 19930827 FR 9202081 A 19920224 Matériel pour la mise en évidence, en phase solide, de complexes antigènes-anticorps par des hématies indicatrices, sa méthode de préparation et son utilisation. L'invention concerne un matériel prêt à l'emploi, pour la mise en évidence de complexes antigènes-anticorps à l'aide d'anticorps ou de cellules phénotypées immobilisés sur un support solide, et d'hématies indicatrices sur lesquelles sont fixées des antiglobulines polyvalentes et, plus particulièrement, des anti-Ig G et des anti-C 3 d. L'invention est plus particulièrement destinée au domaine de l'immunohématologie et de la sécurité transfusionnelle (groupage sanguin ABO-D, épreuve de compatibilité, phénotypage érythrocytaire, recherche des anticorps irréguliers), mais elle peut également s'appliquer à la détection indirecte d'autres anticorps ou antigènes en rapport avec diverses maladies. Les divers tests de groupage sanguin et de compatibilité transfusionnelle ont été mis au point en phase liquide Bien qu'universellement utilisées dans les laboratoires d'immuno-hématologie, ces réactions d'agglu- tination en phase liquide comportent cependant un certain nombre d'inconvénients Elles sont très subjectives, peu quantitatives et peu sensibles L'autre inconvénient majeur est l'impossibilité de lecture, au point final objectif de la réaction. C'est pourquoi plusieurs laboratoires ont cherché à mettre au point des tests plus simples et plus fiables; les progrès les plus significatifs ont été apportés par les tests appelés "en phase solide" c'est-à-dire avec un des éléments (anticorps ou cellules phénotypées) fixé de manière stable à un support en matière plastique, généralement une microplaque (à 96 puits) du type de celles conçues pour les cultures cellulaires, et la révélation indirecte de la réaction antigène- anticorps par immuno-adhérence d'hématies. Les dispositifs adaptés au remplissage et à la manipulation de ces microplaques de manière automatique sont couramment disponibles. Les tests d'immuno-adhérence décrits récemment sont basés sur des procédés décrits pour la première fois dans les années 1950 Les premières approches dérivent des travaux de Coombs (Coombs R R A and Bedford D Vox Sang. 1955; 5, 11) qui utilise des réactions d'agglutination mixte, pour mettre en évidence des antigènes de groupe sanguin sur les plaquettes (Ashurst D E Bedford D and Coombs R R A Vox Sang 1956; 1, 235). Bien qu'initialement le développement de cette technique d'agglutination mixte ait été réalisé en phase liquide, plus tard elle fut exploitée comme une méthode en phase solide, en médecine légale (Coombs R R A and Dodd B.E Med Sci Law 1961; 1, 359). La découverte de l'hémadsorption par certains virus sur les cellules infectées a constitué une autre étape préalable (Hogman C Vox Sang 1959; 4, 12) à la réalisation de la première réaction en phase solide par Hogman, qui combinait l'agglutination mixte et l'hémadsorption (Hogman C Vox Sang 1959; 4, 319) Des cultures cellulaires sont sensibilisées par l'anti-A ou l'anti-B et l'adhérence des globules rouges indicateurs révèle la présence de l'antigène sur les cellules cultivées. Dans ce modèle, la cellule étudiée et la cellule indicatrice doivent partager le même antigène. Dès 1961, Fagraeus et Espmarck combinent l'agglu- tination mixte et la réaction d'hémadsorption (Nature 1961; 190, 370 et Fagraeus A Espmarck J A and Johnson J. Immunology 1965; 9, 161) Le nouvel aspect de cette technique est l'utilisation de globules rouges indicateurs sur lesquels on a fixé de l'antiglobuline Une variante technique du "marquage" à l'antiglobuline fut développée par Coombs qui utilisa du chlorure de chrome pour fixer directement l'antiglobuline ou d'autres protéines sur les globules rouges (Coombs R R A Assays utilizing red cells as markers In "Immunology for the 80 's" Voller A, Ed MTP Press, Lancester 1981). En 1967, Catt et Tregear (Science 1967; 158, 1570), font l'importante observation que les molécules d'anticorps peuvent s'adsorber sur du polystyrène ou du polypropylène sans perdre leur activité immunologique Cette découverte a permis l'extension des tests en phase solide. Enfin, la possibilité d'utiliser des monocouches de globules rouges en sérologie a été documentée par Rosenfield en 1978 Les hématies étant fixées sur du plastique à l'aide de fibrinogène et de poly-D-lysine (Rosenfield R E New technical approaches to red cell serology XV Congr Int Soc Blood Transfusion Paris 1978), la monocouche d'hématies-tests pouvait ensuite adsorber l'anticorps spécifique en solution (sérum) Puis l'anticorps fixé était détecté soit par le biais d'une hémolyse immune (après addition de sérum AB, source de complément) Après incubation et lavage, les hématies intactes restantes étaient lysées et le taux d'hémoglobine mesuré. Une autre méthode consistait à ajouter de l'anti- globuline après avoir lysé les hématies sensibilisées La quantification était réalisée après lyse des cellules indicatrices fixées, par mesure de l'absorbance de l'hémoglobine libérée. En 1982, Moore décrit un autre test à l'antiglobuline en phase solide (Moore H H and Conradie J.D Transfusion 1982; 22, 540) Après sensibilisation des hématies-tests par les sérums en phase liquide, les hématies sont lavées puis transférées dans une microplaque o a été fixée de l'antiglobuline humaine Après centrifugation, des réactifs peroxydasiques sont ajoutés pour détecter les hématies sensibilisées. La plupart des tests en phase solide dérivent des méthodes originales décrites ci-dessus L'application de ces tests à la détermination des groupes sanguins ABO-D a été adaptée à partir des techniques de Mage (Mage M G, MC Hugh L L and Rothstein T L, J immunol Methods 1977; 15, 47) et de Wysocki (Wysocki L J and Sabo V L Proc Natl Acad. Sci U S A 1978; 75, 2844). La contre-épreuve du groupe ABO est une modification de la technique de culture tissulaire de Hogman ( 1959, cité plus haut). De même, la recherche des anticorps irréguliers est basée sur l'agglutination mixte de Hogman aussi, et l'hémadsorption mixte de Fagraeus ( 1961, 1965). On trouve la description de tests pour le groupage sanguin en microplaque dans les brevets O 084 102 de la Société Biotest et 4 608 246 de la Société Immucor. Le matériel Biotest impose d'effectuer plusieurs centrifugations aux différentes étapes du test ce qui ne représente pas une simplification par rapport aux tests traditionnels en tubes; de plus la nécessité de transférer les hématies sensibilisées d'une première microplaque à la microplaque-test représente une source potentielle d'erreur de manipulation trop dangereuse pour le domaine des transfusions sanguines. Le matériel Immucor est d'une utilisation plus simple et plus fiable mais les hématies indicatrices ne portent que de l'antiglobuline-anti-Ig G Ce test ne peut donc détecter ni les Ig M ni les Ig G faibles fixant le complément. La Demanderesse a maintenant découvert qu'il était possible de réaliser un nouveau modèle qui permet également de détecter les Ig M et le complément, tout en reposant sur les mêmes principes théoriques de réaction immunologique en phase solide et de révélation des complexes antigènes- anticorps par immuno-adhérence d'hématies indicatrices. La Demanderesse a ainsi pu préparer des hématies indicatrices portant à la fois de l'antiglobuline anti-Ig G et de l'anti-complément, plus particulièrement de l'anti-C 3 d monoclonal, et qui sont, de manière surprenante, suffisamment stables pour être conditionnées, transportées et utilisées en laboratoire, à grande échelle Ainsi il est possible d'effectuer la totalité des tests de compatibilité sanguine à l'aide d'un seul réactif (les hématies indicatrices) et d'une seule microplaque préalablement recouverte de la batterie d'anticorps et/ou d'hématiestests ou de leurs membranes. L'invention concerne également la méthode de préparation des hématies indicatrices portant l'anti-Ig G et l'anti-C 3 d Celle-ci comprend 3 étapes: les 2 premières sont estinées à fixer les 2 marqueurs sur les hématies pour donner ce qu'on appelles des hématies "sensibilisées", la dernière est destinée à fixer les antiglobulines sur ces marqueurs. Les hématies indicatrices proviennent d'un "pool" d'hématies O Rh positif D Cc Ee. La première étape consiste à fixer le complément (on utilise un pool de sérum AB frais comme source de complément) sur les hématies, réaction qui est provoquée par l'addition de saccharose dans la solution de tampon à basse force ionique. Le complément ainsi adsorbé est au stade C 3 bi; on peut provoquer son activation au stade C 3 d par un traitement à la trypsine (Cette étape n'est pas indispensable parce que l'antiglobuline anti-C 3 d reconnaît aussi le fragment C 3 bi). Les hématies sensibilisées au C 3 d ainsi obtenues sont ensuite mises en présence d'immunoglobulines de classe Ig G dressées contre un marqueur antigénique des hématies On utilise de préférence une immunoglobuline monoclonale pour obtenir une meilleure reproductibilité et, par exemple, on utilise de l'Ig G anti-D. Les hématies indicatrices sont donc sensibilisées au C 3 d et aux Ig G La troisième étape consiste à fixer les antiglobulines correspondantes sur ces deux marqueurs, par immuno-adhérence Les concentrations d'antiglobuline anti- Ig G et anti-C 3 d doivent être ajustées pour permettre la fixation des hématies indicatrices sur les complexes antigènes-anticorps dans la microplaque du test, mais pour ne pas permettre une agglutination des hématies indicatrices, entre elles. L'utilisation d'anticorps monoclonaux permet une bonne standardisation des procédés de préparation et en assure la reproductibilité, alors qu'avec les anticorps d'origine humaine, la constante d'affinité peut varier de 1 à 103 d'un donneur à l'autre. La solution d'hématies indicatrices préparées par cette méthode fait également partie de l'invention; elle est prête à l'emploi, pour les tests d'immuno-hématologie en phase solide et pourrait aussi trouver son application en phase liquide Cette solution d'hématies indicatrices est stable pendant au moins 4 semaines, c'est-à-dire qu'on n'observe aucune désorption des antiglobulines. Cette solution d'hématies est le premier réactif polyvalent mis au point Son utilisation permet ainsi de réaliser le test de Coombs en phase solide, sur une seule microplaque. Son utilisation permet de détecter à la fois les Ig G fixant ou non le complément et les Ig M fixant le complément, et, ainsi, de détecter toutes les classes d'anticorps irréguliers L'utilisation de ce réactif est donc particulièrement adaptée aux tests de compatibilité sanguine préalables aux transfusions ainsi qu'au diagnostic de maladies hémolytiques et d'accidents transfusionnels Ces utilisations sont également l'objet de la présente invention. L'exemple suivant illustre l'invention sans en limiter la portée. Exemple La mise en oeuvre de l'invention comprend plusieurs phases: la préparation du support (microplaque); la préparation des hématies indicatrices; l'utilisation et la lecture du test. L'exemple suivant s'applique plus particulièrement à la recherche des anticorps irréguliers, pour des tests de compatibilité sanguine. A Préparation du support On utilise comme support des microplaques à 96 puits du type utilisé couramment pour les cultures cellulaires. Les hématies-tests phénotypées proviennent de donneurs de sang réguliers et bénévoles qui ont été phénotypés au minimum 2 fois dans la plupart des systèmes de groupes sanguins Ces hématies sont suspendues dans une solution de conservation (de type Alsever) qui assure une stabilité de 28 jours. Ces hématies-tests sont fixées au fond des puits des microplaques, soit par une liaison covalente, en déposant au fond des puits de la poly-Llysine de poids moléculaire supérieur à 300 000 ou de la glutaraldéhyde, soit par une liaison immunologique, par le biais d'un anticorps spécifique (anti-I, anti-N, anti-glycophorine A) d'un antigène présent sur les hématies-tests. Les microplaques ainsi traitées sont stables au moins deux mois. De la même manière, on peut fixer des anticorps au fond des puits. A.1 Exemple de traitement à la poly-L-lysine Le support (la microplaque) est traité pendant une heure à 37 C à l'étuve avec une solution à 0,2 % en eau distillée de poly-L-lysine de poids moléculaire supérieur à 300 000 d (d'après K Carroll, B Lannon and R O'Kennedy. J of Imm Méthods 1990; 129, 71). Le support est ensuite lavé 3 fois à l'eau distillée avant d'être conservé à l'abri de la lumière et de l'humidité Ce support, ainsi traité, est stable au minimum 3 mois à température ambiante Puis, il suffit d'ajouter 100 microlitres d'hématies-tests natives ou traitées par les enzymes protéolytiques, en suspension à 0,5 % Le support est centrifugé 2 minutes à 120 g et lavé 3 fois en solution saline 0,15 M. A. 2 Préparation de membranes d'hématies-tests On peut remplacer les hématies par leurs membranes, préparées selon une technique décrite par Steck (Meth of enzym; 1974: 31; 172-180). On utilise comme tampon d'hémolyse un tampon hypotonique au phosphate de sodium additionné de sulfate de magnésium. Les microplaques centrifugées à 120 g pendant 2 minutes avec les suspensions d'hématies à 0,5 % sont vidées par retournement, agitées pour décoller les "boutons" d'hématies en excès au fond des puits Elles sont ensuite lavées 3 fois, doucement et jusqu'à disparition complète de la coloration rouge, avec le tampon, à l'aide d'une pipette à multicanaux ( 200 gl par puits à chaque lavage). Les membranes fixées dans les puits et lysées in situ sont ensuite stabilisées dans une solution de glycérol à 40 % additionnée de 40 g/l de saccharose Les microplaques sont incubées 2 heures à + 40 C avec cette solution puis vidées, séchées, mises en sachet avec un dessiccateur et conservées à + 40 C. Dans ces conditions, les membranes sont stables environ 5 semaines. B Préparation des hématies indicatrices. B.1 Fixation du complément. Un pool de 3 types d'hématies O Rh positif D Cc Ee est lavé 6 fois en eau physiologique puis 500 gl de culot globulaire lavé sont additionnés de 500 gl d'eau physiologique, dans un tube, puis de 8,5 ml de tampon phosphate saccharose et 300 gl d'un pool de sérum AB frais (comme source de complément). Préparation du tampon phosphate saccharose solution K 2 HPO 4 1,0 M 17, 4 g/100 ml eau distillée solution KH 2 PO 4 1,0 M 13,6 g/100 ml eau distillée solution A 0,5 ml de K 2 HPO 4 IM/100 ml eau distillée solution B 0,5 ml de KH 2 PO 4 1 M/100 ml eau distillée tampon phosphate saccharose Additionner A dans B jusqu'à obtention du p H 6,1 (tampon phosphate) Ajouter 9,24 g saccharose/100 ml de tampon phosphate Aliquoter par 5 ml et congeler à -20 'C. Cette solution de saccharose a pour effet d'entraîner la fixation et l'activation directe du complément sur les hématies par la voie alterne. Après incubation du tube au bain-marie à 370 C pendant 30 minutes, l'activation du complément en est au stade C 3 bi La suspension des hématies sensibilisées par le complément est centrifugée puis le culot globulaire est lavé à nouveau 4 fois jusqu'à disparition de l'hémolyse Puis 1 ml de trypsine à 0,1 % est ajouté et le tube est à nouveau incubé au bain-marie à 370 C pendant 30 minutes; la trypsine entraîne l'activation et le clivage du C 3 bi en C 3 d. Les hématies O Rh positif recouvertes désormais de C 3 d sont de nouveau lavées 4 fois en eau physiologique (jusqu'à disparition de l'hémolyse). B 2 Fixation d'immunoglobuline monoclonale IglG A 150 gl de culot d'hématies recouvertes de C 3 d sont ajoutés 200 jl d'immunoglobuline monoclonale Ig G anti-D et 1 ml d'eau physiologique, dans un tube. Celui-ci est incubé au bain-marie à 37 C pendant 30 minutes pour permettre la fixation de l'Ig G anti-D Puis les hématies sensibilisées sont à nouveau lavées 4 fois en eau physiologique. B.3 Fixation des antiglobulines anti-Ig G et anti-C 3 Au culot d'hématies O Rh positif recouvert de C 3 d et d'anti-D sont ajoutés 300 g 1 d'antiglobuline anti-Ig G et 1 ml d'antiglobuline anti-C 3 d Une dernière incubation est effectuée à température ambiante et sous agitation modérée mais permanente de façon à empêcher l'agglutination des hématies Après 4 nouveaux lavages en eau physiologique, le culot d'hématies revêtu des 2 antiglobulines est suspendu en solution de conservation dans des tubes de verre stérile. Des essais de stabilité ont été réalisés: ces globules rouges ayant fixé l'anti-Ig G et l'anti-C 3 d sont utilisables pendant 4 semaines sans qu'une désorption importante des antiglobulines soit observée. La difficulté de cette préparation réside dans l'équilibre des concentrations en hématies, en anticorps, en complément et en antiglobuline pour qu'il y ait sensibilisation des hématies sans qu'ril y ait agglutination. On utilise environ 100 Jg/ml de l'anti-D Ig G monoclonal (souche HM-16), 2,6 mg/ml d'antiglobuline anti- Ig G et 2,7 mg/ml de protéines totales d'antiglobuline anti- C 3 d (d'activité spécifique environ égale à 30 %). L'anticorps Ig G anti-D utilisé est un anticorps monoclonal dont la lignée productrice a été développée par la Demanderesse, mais d'autres anticorps, de préférence monoclonaux, auraient aussi pu être utilisés. C, Utilisation et lecture du test Les sérums à tester sont distribués dans les microplaques portant les cellules phénotypées (ou leurs membranes) ou des anticorps choisis. On utilise généralement 50 microlitres de sérum par puits, éventuellement additionnés de 10 microlitres de "tampon de basse force ionique" (BFI, comme dans les tests classiques en tubes). Les microplaques sont incubées 35 min à 37 C (ou 15 min en présence de BFI) puis elles sont lavées 3 fois en solution saline 0,15 M. En cas de groupage sanguin ABO-D ou de phénotypage il Rh-K, ce sont les hématies à tester qui sont ajoutées sur un complexe spécifique antigène- anticorps fixé au fond des puits (ex hématies-tests D positif sensibilisées faiblement par un anti-D: si l'hématie à tester est D positive, elle réagira avec le complexe fixé au fond du puits). Pendant l'incubation, les anticorps présents se fixent sur les antigènes correspondants et, éventuellement, entraînent l'activation du complément. Cette réaction antigène-anticorps est visualisée indirectement par l'addition des hématies indicatrices décrites plus haut. Ce test permet de détecter l'ensemble des anticorps irréguliers: Ig G ne fixant pas le complément, Ig G fixant le complément (lorsqu'il sont en très faible quantité, ils sont parfois détectés uniquement par l'activation du complément et la fixation de l'anti-complément, anti-C 3 d), Ig M fixant le complément. A ce jour, 11 205 sérums de patients, 417 anticorps et 24 spécificités ont été étudiés. Le tableau suivant montre la plus grande sensibilité du test réalisé en phase solide en comparaison avec le test classique en tube en présence également d'anti- C 3 d et d'anti-Ig G. Nombre d'anticorps détectés SPEFICITES TOTAL en PHASE SOLIDE en TUBE ANTI CW 6 6 5 D 112 112 98 C 1 11 E 40 40 29 c 25 25 22 e 1 1 0 D+C 21 21 20 D+C+E 1 1 1 c+E 5 5 5 K 66 66 59 Kpa 2 2 2 Fya 14 14 13 Jka 6 6 6 Jkb 3 3 3 M 5 5 3 Lua 1 1 1 S 2 2 1 s 1 1 1 Lea 76 76 68 Leb 14 14 13 Lea+Leb 1 1 1 E+K+Fya 1 1 1 E+K 1 1 1 c+K 1 1 1 c+S 1 1 1 Tja 1 1 1 Pl 1 1 1 Wra 1 1 1 Vel 4 4 4 Kna 1 1 O Luke 1 1 1 Yta 1 1 1 _ _ REVENDICATIONS 1. Matériel d'immuno-hématologie prêt à l'emploi utilisant des hématies indicatrices, pour la détection en phase solide de complexes antigènesanticorps, caractérisé en ce que les hématies indicatrices portent à la fois de l'antiglobuline anti-Ig G et de l'antiglobuline anti-C 3 d. 2. Méthode de préparation des hématies indicatrices utilisables dans un matériel selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend une première étape de fixation du complément et d'activation de son fragment C 3 d pour donner des hématies sensibilisées au C 3 d. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que la fixation du complément est réalisée en présence de saccharose. 4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que l'activation du fragment C 3 d est obtenue par un traitement à la trypsine. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend une deuxième étape de fixation d'immunoglobuline Ig G dressée contre un marqueur antigénique des hématies indicatrices pour donner des hématies sensibilisées aux Ig G. 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'immunoglobuline est une Ig G monoclonale anti-D. 7. Méthode selon l'une quelconque des reven- dications 2 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend une troisième étape de fixation par immuno-adhérence d'antiglobuline anti-C 3 d et d'antiglobuline anti-Ig G sur les hématies sensibilisées obtenues par la méthode selon les revendications 2 et 5. 8. Hématies indicatrices prêtes à l'emploi, caractérisées en ce qu'elles sont préparées par la méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 7. 9 Hématies indicatrices selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles sont stables pendant au moins 4 semaines. 10. Utilisation des hématies selon la revendication 8 ou 9 dans le matériel selon la revendication 1, pour la détection d'Ig G fixant ou non le complément et d'Ig M fixant le complément. 11 Utilisation selon la revendication 10 pour les tests de compatibilité sanguine préalables aux transfusions ou à but diagnostique.