FR 2695827 A1 19940325 FR 9310926 A 19930914 Solution de perfusion, de conservation et de reperfusion d'organes. La présente invention a trait à des solutions de perfusion, de conservation (ou stockage), et de reperfusion d'organes, y compris pour transplantations cardiaques Elle a également trait à un procédé de mise en oeuvre de ces solutions appliquées aux différentes phases d'une transplantation. L'une des principales cause d'échec des transplantations cardiaques provient des risques de dégradation, voire de nécrose, du greffon qui se manifestent lors de la réoxygénation de l'organe transplanté, et qui sont liés à l'ischémie généralement prolongée entre le début de l'explantation chez le donneur et la fin de l'implantation chez le receveur. Une ischémie de quatre à cinq heures constitue, par exemple dans la cas du coeur, la limite supérieure tolérable et n'exclut pas de nombreux accidents. Pour limiter ce risque, de nombreux auteurs ont proposé et utilisé des solutions protectrices, tant pour la perfusion de l'organe à explanter, que pour sa conservation à basse température, et sa reperfusion lors de la transplantation. Des exemples de ces solutions sont les solutions HTK de Bretschneider COLLINS ST THOMAS UW Stanford. Ces solutions ne présentent cependant que des avantages limités et n'offrent qu'une protection au plus partielle contre les risques qui apparaissent lors de la reperfusion et que l'on attribue en partie à la production métabolique de radicaux libres de l'oxygène produits en quantités abondantes, notamment lors de la réoxygénation de l'organe ischémique. Le risque de dégradations oxydatives cellulaires et membranaires provenant de la production de ces radicaux a fait l'objet de plusieurs études dans le domaine de la protection myocardique par cardioplégie Ces différents travaux ont suggéré d'introduire, dans les solutions protectrices utilisées, des substances antioxydantes. Différents composés ont été proposés, les uns, tels que les déferoxamine, allopurinol, catalase, peroxydase, comme étant susceptibles de s'opposer à la production des radicaux libres, d'autres, tels que la superoxyde dismutase, pouvant détruire ces radicaux, d'autres encore, tels que la vitamine E ou des équivalents (Trolox) étant susceptibles de "neutraliser" les radicaux libres. Parmi ces derniers composés figurent également des molécules porteuses de groupements thiols comme la N-acétylcystéine ou le glutathion réduit (GSH), lequel a été considéré comme "piégeur" (scavenger) de radicaux libres. Cependant, la littérature est partagée sur l'intérêt du glutathion Voir: G W Standeven et al, J Thorac Cardiovasc. Surg 1979, 78, 893-907 Cold-Blood potassium cardioplegia; M Bernier et al, Reperfusion-induced Arrhythmias and Oxygen-derived Free Radicals, Circulation Research, Vol 58, n 3, Mars 1986, 331-340; J C Chatham et al, Depletion of Myocardial Glutathione: Its effects on heart function and metabolism during ischaemia and reperfusion, Cardiovascular Research, 1988, 22, 833-839; A Blaustein et al, Myocardial Glutathione Depletion Impairs Recovery After Short Periods of Ischaemia, Circulation, Vol 80, n 5, Novembre 1989; A Singh et al, Relation Between Myocardial Glutathione Content and Extent of Ischaemia Reperfusion Injury, Circulation, Vol 80, n 6, décembre 1989, 1795-1803; W N Wicomb et al, Role of Glutathione in 24-hour Heart Storage by Microperfusion Using a New Polyethylene Glycol Solution, J Mol Cell Cardiol 22 (supplément V) 1990, p 82; V Kantamneni et al, Extended Preservation of Canine Myocardium Using UW Solution, J Mol Cell Cardiol. 1990 (Suppl V); 22: 22 (Abstr). L'adjonction de N-acétylcystéine est étudiée par M B Forman, Glutathione Redox Pathway and Reperfusion Injury, Circulation, Vol 78, n 1, Juillet 1988, 202-213. Il suggère qu'un traitement par la N-acétylcystéine (NAC) avant la reperfusion, peut améliorer la récupération postischémique. S'il peut donc apparaître intéressant d'utiliser des substances agissant contre la production ou l'effet des radicaux libres dans le myocarde dans le cadre de la protection cardioplégique, le choix du composé et les modalités de mise en oeuvre n'apparaissait pas évidents et l'adjonction de ces composés, y compris le glutathion, dans les solutions de perfusion et de reperfusion myocardique en pratique hospitalière quotidienne n'avait pas permis d'aboutir à des résultats décisifs. Ph Menasché et al, dans les Piégeurs de Radicaux Libres dans la Protection Myocardique en Chirurgie Cardiaque, Ann Cardiol Angéiol; 1986, 35 (n 7 bis), 747- 452, concluent cependant que la préservation de la fonction ventriculaire gauche post-ischémique, due à une solution cardioplégique donnée, pouvait être améliorée significativement par l'addition d'antioxydants capables de prévenir la formation des radicaux libres ou de les détruire ou neutraliser Par contre, le choix de l'antioxydant le plus efficace entre, les nombreux candidats dont la superoxyde dismutase SOD, la peroxydase et le glutathion n'était pas évident, sans parler des effets secondaires ou toxiques éventuels A fortiori lorque l'on passe du domaine de la cardioloplégie, dans lequel les durées d'ischémie sont relativement courtes, au domaine de la transplantation, la littérature ne fournissait aucune indication réellement utilisables sur la choix et les modalités de mise en oeuvre de solutions protectrices. réellement efficaces. Ph Menasché et al, ont alors décrit, dans la demande de brevet belge BEA-009101067 des solutions de perfusion et de conservation et/ou de reperfusion d'organes, y compris l'organe cardiaque, caractérisées par l'inclusion d'au moins un composé antioxydant, lequel peut être notamment piégeur de radicaux libres de l'oxygène, notamment le glutathion à l'état réduit, ou un analogue, tel que la N-acetylcystéine, et par une pression partielle d'oxygène nulle ou très abaissée et se maintenant sensiblement à cette valeur abaissée jusqu'à l'utilisation. Cependant les différentes solutions connues se prêtent mal à l'utilisation, à la fois, pour la perfusion et le stockage, et pour la reperfusion, de sorte que, dans la pratique, les équipes chirurgicales sont obligées d'utiliser au moins deux solutions différentes, l'une pour la perfusion puis le stockage de l'organe explanté, l'autre pour la reperfusion de l'organe en cours d'implantation. La présente invention se propose de résoudre ces problèmes et de fournir des solutions protectrices remarquablement efficaces pour la préservation des organes, en vue d'interventions chirurgicales et en particulier de transplantation Les organes visés comprennent le coeur, ainsi que les autres organes et, notamment, le foie, le poumon et le rein. La présente invention a donc pour objet une solution unique de perfusion, stockage et reperfusion, ayant sensiblement la composition suivante: Constituant (par exemple Concentration en poches de 1 ou 2 1) g/l mmol/litre K+ 15 t 5 % Na+ 100 10 % Mg++ 13 5 % Ca++ 0 25 E 5 % Chlorures 41 5 i 5 % Chlorure de calcium, 2 H 20 0,037 Chlorure de potassium 1,118 + 5 % Chlorure de magnésium 2,642 Histidine (base) 4,650 30 t 10 % Mannitol 10, 930 60 i 5 % Lactobionate (acide) 28,664 80 4 5 % Glutamate (acide) 2,942 20 + 10 % Eau (quantité pour un litre réajusté à p H 7,30 0,10 à + 200 C) Osmolalité théorique 360 m Osm/kg Glutathion (réduit GSH) ou équivalent 0,5 à 10 mmol/l, (de préférence 3) le glutathion réduit, ou équivalent, étant en solution sous pression partielle d'oxygène réduite ou nulle et se maintenant sensiblement à cette valeur jusqu'à l'utilisation. Cette solution peut être utilisée pendant toutes les phases d'une transplantation, par exemple en tant que solution cardioplégique pour arrêter le coeur du donneur, en tant que solution de stockage pour le transport et le stockage hypothermique de l'organe pendant la réimplantation, soit sous forme de solution colloïde, soit, de préférence, après dilution avec le sang. Dans cette solution, la prévention de la surcharge en calcium dans les cellules est assurée par la présence du composant glutamate qui possède la capacité d'activer 'ATP dans les conditions d'anaérobie, la faible concentration en calcium qui réduit le transfert par diffusion passive, la concentration élevée de sodium qui limite l'échange sodium- calcium, le transfert de calcium par les canaux dépendant du potentiel électrique étant limité par la faible concentration en potassium ainsi que par la teneur en magnésium Cette formulation ionique de type extra- cellulaire est rendue possible par la présence simultannée d'imperméants efficaces Le mannitol possède la capacité duale de se comporter comme un agent osmotique et comme un piégeur de radicaux libres Le lactobionate assure une prévention plus efficace du gonflement cellulaire que le mannitol seul et la concentration totale en imperméants est équivalente à celle des protéines intra-cellulaires et des anions non transferables qui excercent une pression depuis l'extérieur vers l'intérieur des cellules. Le p H est, de préférence, faiblement acide ( 7, -7,40) du fait qu'il a été découvert que cette valeur améliore en outre la prévention de la surcharge calcique et, de plus, que, contrairement à des valeurs plus alcalines, elle améliore la protection des cellules pendant l'arrêt ischemique hypothermique La' solution est avantageusement tamponnée à l'histidine car il a été découvert que parmi les tampons utilisables chez l'homme, l'histidine est le seul qui reste véritablement efficace aux basses températures. Bien entendu les différents composants de la solution peuvent être remplacés par des équivalents, sous réserve que ceux-ci assurent pratiquement les mêmes fonctions. Parmi les équivalents du glutathion à l'état réduit (GSH) on compte ses précurseurs ou substances apparentées, ses analogues, notamment le glutathion monoester et la N-acétylcystéine Cependant d'autres composés à fonction thiol qui manifesteraient les mêmes propriétés pourraient être utilisés. Les solutions conformes à l'invention peuvent être prévues pour être stockées, sous forme d'une préparation unique prête à l'emploi et contenant simultanément la totalité des composants de la solution. Dans ce cas, et conformément à l'invention, les solutions sont préparées et conservées à l'abri de l'oxygène de l'air, en étant par exemple préparées en solutions dégazées, de préférence sous atmosphère d'azote Le stockage et la conservation des solutions selon l'invention s'effectuent en récipients imperméables à l'air tels que flacons ou, de préférence, poches en matière plastique imperméables à l'air, par exemple en composites feuilletés de type en soi connu. Cependant, dans une autre forme de réalisation de l'invention, la solution selon l'invention peut être stockée sous forme de deux préparations séparées, à savoir une solution contenant le glutathion réduit, préparée et conservée à l'abri de l'oxygène de l'air, par exemple dans une seringue, et une solution pour les autres composants, qui n'a pas à être nécessairement conservée à l'abri de l'oxygène de l'air et qui peut donc être contenue dans des poches usuelles. De préférence la solution contenant le glutathion réduit GSH a la composition suivante (pour un litre): Glutathion (réduit GSH) 185, 4 g/l 600 t 10 % mmol/l Histidine 4,650 g/l 30 i 10 % mmol/l Dans ce cas la solution est avantageusement présentée sous forme d'un kit comprenant une solution contenant, dans une poche ou autre récipient, par exemple une poche de deux litres, les différents anions et cations, le mannitol, le lactobionate, le glutamate et, de préférence, l'histidine, une solution contenue dans un récipient étanche à l'oxygène de l'air, de préférence une seringue, et contenant le glutathion réduit ou analogue, et de préférence de l'histidine à la même concentration, et des instructions pour assurer, lors de l'utilisation, le mélange ou l'injection de la solution séparée contenant le glutathion dans la solution contenant les autres composants. Dans ce dernier cas, si la solution contenant les autres composants n'est pas elle-même à une pression d'oxygène réduite ou nulle, la notice d'instruction précise avantageusement que la solution finale, maintenant prête à l'emploi, doit être utilisée dans un faible délai de quelques heures, par exemple trois ou quatre heures. De façon avantageuse, les solutions selon l'invention peuvent encore comporter, outre le glutathion réduit, un composé s'opposant à la formation des radicaux tel que chélateurs des métaux et en particulier la déféroxamine (DCI). Par valeur réduite de la concentration d'oxygène conformément à l'invention, on entend, de préférence, une concentration maximale en oxygène dissous inférieure à 0,1 ppm. Pour réaliser, à titre d'exemple, une solution selon l'invention on prépare, dans un milieu aqueux apyrogène stérilisé, de préférence dégazé, une composition ayant la teneur suivante: Constituant Concentration g/l mmol/litre K+ 15 Na+ 100 Mg++ 13 Ca++ 0 25 Chlorures 41 5 Chlorure de calcium, 2 H 20 0,037 Chlorure de potassium 1,118 Chlorure de magnésium 2,642 Histidine (base) 4,650 30 Mannitol 10,930 60 Lactobionate (acide) 28,664 80 Glutamate (acide) 2,942 20 Eau (quantité pour un litre réajusté à p H 7,30 Osmolalité théorique 360 m Osm/kg Dans un milieu aqueux apyrogène stérile dégazé, et dans des conditions protégées de l'oxygène athmosphérique, on réalise une solution ayant la teneur suivante, par litre Concentration g/l mmol/litre Glutathion (réduit GSH) 185,4 600 Histidine 4,650 30 la Cette solution est conditionnée sous forme de seringues protégées de l'oxygène de l'air et ayant une contenance de 10 ml -de solution pour une poche de deux litres ou de 5 ml pour une poche de un litre. De préférence l'ensemble est présenté sous forme d'un kit contenant, d'une part, une solution dans une poche de deux litres, et d'autre part une seringue d'une teneur de ml. Pour l'utilisation on injecte le contenu de la seringue dans la poche de façon à diluer le contenu de seringue dans la poche et l'on aboutit à une concentration de glutathion réduit de l'ordre de 3 mmol/l. La solution ainsi préparée est rapidement utilisée pour assurer la perfusion de l'organe à explanter pour obtenir l'arrêt cardiaque Un volume suffisant de solution identique préparé de la même façon est utilisé pour la conservation de l'organe. Lors de l'implantation on utilise encore une solution identique pour les opérations de reperfusion, la solution étant avantageusement mélangée au sang du patient. REVENDICATIONS 1 Solution unique de perfusion, stockage et reperfusion, ayant sensiblement la composition suivante: Constituant Concentration g/l mmol/litre K+ 15 i 5 % Na+ 100 110 % Mg++ 13 i 5 % Ca++ 0 25 + 5 % Chlorures 41 5 + 5 % Chlorure de calcium, 2 H 20 0,037 Chlorure de potassium 1,118 + 5 % Chlorure de magnésium 2,642 Histidine (base) 4,650 30 t 10 % Mannitol 10,930 60 i 5 % Lactobionate (acide) 28,664 80 d 5 % Glutamate (acide) 2,942 20 + 10 % Eau (quantité pour un litre réajusté à p H 7,30 0,10 à + 20 C) Osmolalité théorique 360 m Osm/kg Glutathion (réduit GSH) ou équivalent 0,5 à 10 mmol/l, (de préférence 3) le glutathion réduit, ou équivalent, étant en solution sous pression partielle d'oxygène réduite ou nulle et se maintenant sensiblement à cette valeur jusqu'à l'utilisation. 2 Solution selon la revendication 1 sous forme d'une préparation unique prête à l'emploi et contenant préparée et conservée à l'abri de l'oxygène de l'air en récipients imperméables à l'air tels que flacons ou poches en matière plastique imperméables à l'air. 3 Solution selon la revendication 1 préparée et stockée sous forme de deux préparations séparées, à savoir une préparation contenant le glutathion réduit, préparée et conservée à l'abri de l'oxygène de l'air et une préparation contenant les autres composants en solution. 4 Solution selon la revendication 3 caractérisée en ce que la préparation contenant le glutathion réduit GSH a la composition suivante (pour un litre): Glutathion (réduit GSH) 185,4 q/l 600 i 10 % mmol/l Histidine 4,650 g/l 30 * 10 % mmol/l Solution selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisée en ce que* la préparation contenant le glutathion réduit est conditionné dans une seringue étanche à l'air, notamment de 10 ml. 6 Solution selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme d'un kit contenant une préparation contenant, dans une poche ou autre récipient, les différents anions et cations, le mannitol, le lactobionate, le glutamate et l'histidine, une préparation contenue dans une seringue étanche à l'oxygène de l'air, contenant le glutathion réduit ou analogue, et de l'histidine, et des instructions pour assurer, lors de l'utilisation, le mélange ou l'injection de la solution séparée contenant le glutathion dans la solution contenant les autres composants. 7 Solution selon l'une des revendications t à 6 caractérisée en ce qu'elle contient, outre le glutathion réduit, un composé s'opposant à la formation des radicaux tel que chélateurs des métaux et notamment particulier la déféroxamine (DCI).