FR 2692590 A1 19931224 FR 9307275 A 19930616 CHAMPIGNONS POUR REDUIRE LA TENEUR EN POIX ET LEUR PREPARATION Cette invention concerne des champignons possédant des propriétés d'ensemble particulièrement intéressantes pour réduire la teneur en poix de bois à pâte et de pâtes, ainsi que la préparation et l'utilisation de ces champignons. Dans la demande de brevet européen publiée EP-A 2- 0 387 187, il est décrit l'application de certains champignons pénétrant le bois à des bois à pâte et à des pâtes pour réduire leur teneur en poix Des champignons tout aussi utiles ont une virulence de croissance analogue à celle d'isolats naturels, mais sont de couleur plus claire et ceux que l'on préfère utiliser dans ce procédé sont décrits dans la demande de brevet européen publiée EP-A 2-0 470 929. Ces champignons, qui appartiennent aux classes Ascomy- cetes et Deuteromycetes, sont appliqués ou distribués sur des formes de bois à pâte telles que copeaux de bois, sciure de bois ou buches, ou sur une pâte mécanique de premier stade, et le substrat traité qui en résulte est maintenu dans des conditions o le champignon se développe, pendant suffisamment longtemps pour réduire la teneur en poix du bois à pâte Un tel procédé est considéré comme présentant une importance considérable pour réduire l'importance du temps d'arrêt machine causé par les dépôts et les accumulations de poix dans la pâte et dans les papeteries et les autres industries qui transforment les bois à pâte, et s'est déjà avéré commercialement rentable Des indications figurent aussi à propos de l'amélioration des propriétés physiques ou de la résistance mécanique des produits finis tels que le papier, qui se traduisent par des taux de production plus importants, et le procédé offre d'autres avantages pratiques. Une espèce de champignon que l'on préfère pour ce type de procédé est Ophiostoma Diliferum et les isolats C-1 D 84 et WZ 58 qui sont identifiés dans la demande de brevet européen EP-A 2-0 470 929 sous les n' d'accès NRRL 18678 et 18755 sont des souches mutantes naturelles (Ascospore) qui poussent de couleur claire, mais de façon virulente, sur des substrats de bois à pâte non stériles Ces champignons poussent efficacement sur une grande variété de bois et sont particu- lièrement utiles sur le pin, par exemple le pin jaune du Sud, et sur certains bois durs Un isolat tel que C-1 D 84 et WZ 58 peut être employé pour améliorer la blancheur sur des substrats non stériles, lesquels, en l'absence de tout trai- tement, subiraient une perte de blancheur au cours du stockage du fait de l'infestation naturelle par les champignons. Il existe toutefois toujours un besoin de dépasser de façon significative la capacité de décomposition de WZ 58 sur le pin et, tout particulièrement, de dépasser l'étalon foncé TAB 28 (n' d'accès NRRL 18690) dans un champignon poussant en étant essentiellement blanc ou incolore, qui aurait aussi au moins la virulence de croissance souhaitable de WZ 58 Il existe aussi un besoin d'améliorer la capacité de décomposi- tion de la poix de WZ 58 contre les bois durs importants comme le tremble. Selon l'invention, on a découvert que l'accouplement de deux souches non blanches de Ophiostoma Diliferum, identifiées ici sous les noms de TAB 28 et TAB 51 (ne d'accès NRRL 18690 et 18754) peut produire des souches intermédiaires non blanches, à croissance virulente, représentées ici par la souche identifiée sous le nom de D 3, présentantune améliora- tion significative sur la capacité de décomposition par rap- port aux deux parents et aux taux obtenus antérieurement, et que cet intermédiaire peut ensuite être accouplé avec WZ 58 à croissance blanche pour donner des champignons à croissance blanche, virulente, possédant au moins la capacité de décom- position de la poix que possède l'intermédiaire non blanc D 3. On a aussi découvert que l'accouplement d'une telle souche intermédiaire peut produire des champignons à croissance blanche, virulente, possédant une capacité de décomposition de la poix qui dépasse même celle du champignon intermédiaire, laquelle est déjà améliorée de façon significative. La présente invention a donc pour objet de nouvelles souches de O Dhiostoma Diliferum qui sont caractérisées non seulement par le fait qu'elles poussent blanches ou incolores et qu'elles possèdent une croissance de bonne virulence, mais qui présentent aussi d'exceptionnelles propriétés de décomposition de la poix. Sous un aspect particulier, les champignon Ophiostoma piliferum qui font l'objet de l'invention poussent blancs ou incolores avec au moins la même virulence de croissance que WZ 58 sur le bois à pâte de pin jaune du Sud stérilisé, tout en réduisant sa teneur en poix considérablement mieux que WZ 58, le degré d'amélioration étant d'au moins 10 %. Ces champignons présentent de même une meilleure réduc- tion de la teneur en poix par rapport à l'étalon foncé TAB 28 et peuvent se comporter mieux sur certains bois durs tels que le tremble que d'autres isolats blancs tels que WZ 58, l'amélioration sur le tremble étant de l'ordre d'au moins 5 %, habituellement d'environ 10 %, par rapport audit WZ 58. Grâce à la production des nouveaux champignons à crois- sance blanche, on peut aussi obtenir de nouveaux champignons intermédiaires non blancs, typiquement de couleur grise, par exemple gris moyen à foncé, dont un exemple est ici la souche D 3, avec une bonne virulence de croissance et une capacité de réduction de la teneur en poix supérieure à la fois à TAB 28 et à WZ 58 sur le pin jaune du Sud. Des dépôts ont été effectués auprès du Northern Regional Research Center (NRRL) de Peoria, Illinois, U S A, des champignons suivants indiqués ici, auxquels on a attribué les numéros d'accès suivants, qui figurent ainsi que leurs dates de dépôt. Champianon n' d'accès Date de dépôt TAB 28 (Os viliferum) NRRL 18690 23 juillet 1990 C-1 (O Diliferum) NRRL 18691 27 juillet 1990 TAB 51 ( ODiliferum) NRRL 18754 24 janvier 1991 WZ 58 (QLpiliferum) NRRL 18755 24 janvier 1991 D 97 (_Q piliferum) NRRL 18917 12 novembre 1991 D 3 (Q viliferum) NRRL 18918 12 novembre 1991 Les dépôts ont été faits dans le cadre du Traité de Budapest pour cette demande Cependant, le NRRL a reçu l'ins- truction de mettre à la disposition du public, lors du dépôt, les champignons C-1 et TAB 28 En ce qui concerne les dépôts ci-dessus, D 3 est aussi identifié sous le nom de T 28 T 5103 et D 97 est aussi identifié sous le nom de WZ 5803 D 97. Les champignons des espèces Ophiostoma piliferum, qui possèdent une grande puissance de décomposition de la poix et qui ont une bonne virulence de croissance et une capacité à pousser blancs et/ou pratiquement incolore sur un substrat de bois, s'obtiennent, selon l'invention, par: a) accouplement de deux parents fongiques à croissance foncée identifiés ici par TAB 28 et TAB 51, b) sélection d'un descendant non blanc ascospore accouplable avec le champignon identifié ici sous le nom de Wz 58 possédant une capacité améliorée à réduire la teneur en poix du bois stérilisé par rapport aux deux parents en pas plus de 21 jours de croissance, de préférence en pas plus de 14 jours de croissance, tout en poussant de façon au moins aussi virulente que les deux parents sur le substrat stérilisé, l'évaluation étant faite dans la période de 10 à 11 jours de croissance, c) accouplement de ce descendant avec le champignon à croissance blanche identifié ici sous le nom de WZ 58, et d) sélection d'au moins un descendant ascospore issu de l'accouplement de c) ci-dessus, caractérisé par i) une croissance blanche sur le substrat stérilisé, ii) une croissance au moins aussi virulente que ledit descendant non blanc sur le substrat stérilisé, l'évaluation étant faite dans la période de croissance de 10 à 11 jours, et iii) une capacité à réduire le taux de poix dans le substrat stérilisé au moins aussi efficace que ledit descendant non blanc sélectionné, après pas plus de 21 jours de croissance, de préférence pas plus de 14 jours de croissance Le substrat stérilisé primaire à utiliser dans les évaluations requises dans le procédé ci- dessus est le pin jaune du Sud, sous forme de copeaux de bois. Lorsqu'on l'utilise ici en se référant à la couleur pro- duite sur les copeaux de bois, le terme "blanc" entend inclure à la fois la couleur essentiellement blanche et la couleur essentiellement incolore et les effets mélangés du blanc et de l'incolore Le terme "non blanc" désigne une couleur distinctement plus foncée que le blanc, allant de tons de gris, en passant par des bleus, des marrons,des noirs bleutés et jusqu'au noir, ces deux derniers étant typiques des champignons de souche native bleue. Dans l'étape b) ci-dessus, le descendant non blanc pré- sente de préférence une amélioration d'au moins 5 % de la réduction de la teneur en poix par rapport au meilleur de ses parents, de préférence au moins 10 % De tels descendants ont de préférence une teinte variant du gris moyen à la couleur plus foncée des souches natives bleues typiques, par exemple gris foncé, noir bleuté ou noir, ou peuvent être d'une couleur mutante, telle que marron moyen à foncé, lorsqu'ils poussent sur le substrat stérilisé pendant 10 à 11 jours. Dans l'étape d), on constate que l'on peut obtenir des champignons blancs qui décomposent la poix à un taux au moins % supérieur à celui du meilleur des parents accouplés dans l'étape a), de préférence à un taux au moins 10 % supérieur. Mieux encore, on choisit une ascospore présentant une amélioration plus importante d'au moins 5 % par rapport à la capacité de décomposition de la poix du descendant sélectionné dans l'étape b), ou bien l'ascospore finale possède une telle capacité améliorée d'au moins 15 % par rapport au meilleur des parents accouplés dans l'étape a) Bien que la virulence soit mesurée ci-dessus sur du bois stérile, il est souhaitable que les ascospores finales sélectionnées dans l'étape d) présentent une virulence de croissance au moins à peu près égale à celle des parents d'origine dans l'étape a) et du descendant sélectionné dans l'étape b) sur un bois frais, non stérile, tel que décrit ci-dessous. L'invention englobe non seulement les isolats d'asco- spores individuels et leurs champignons résultants, mais aussi tous les dérivés supplémentaires que l'on peut obtenir à partir d'eux, en particulier ceux qui atteignent au moins le degré de propriétés souhaitables de l'ascospore parente Un champignon ascospore finalement sélectionné peut être accouplé pour donner une souche hétérocaryote de champignon utilisable dans la décomposition de la poix, mais cela n'est pas préféré, car on a constaté que les hétérocaryons avaient tendance à être instables quant à une ou plusieurs des propriétés souhaitées au cours de la croissance répétée ou de la croissance à grande échelle L'ascospore peut aussi être mutée pour fournir d'autres dérivés souhaitables, y compris des mutations artificielles, et l'invention inclut aussi celles qui permettent d'obtenir au moins substantiellement les propriétés améliorées voulues de l'ascospore sélectionnée dans l'étape d). Les procédés de production, de séparation générale, de dispersion et d'isolement individuel des ascospores et de croissance et d'isolement des champignons créés sont bien connus Une référence bibliographique représentative est, par exemple, H P Upadhyay ( 1981), A Monograph of Ceratocystis and Ceratocystiopsis; University of Georgia Press, Athens, pages 28-29 Une publication faisant spécifiquement référence aux ascospores de Ohiostoma est C M Brasier et J N Gibbs ( 1976), Inheritance of Pathogenicity and Cultural Characters in Ceratocvstis ulmi: Hybridization of Aggressive and Non- Aggressive Strains; Ann Appl Biol 83, 31-37 On se réfère aussi à la demande de brevet européen EP-A 2-0 470 929, dont la description est citée ici à titre de référence. On a constaté que l'on peut obtenir des numérations très élevées et convenables d'ascospores viables des champignons décomposant la poix faisant l'objet de l'invention en reprenant ou en dispersant les ascospores dans leur vecteur hydrophobe, tel que récupéré de la culture fongique, dans une huile non toxique qui dissout efficacement la matière hydrophobe pour libérer les spores dans l'huile et qui est consommable (en tant qu'aliment ou source de carbone) par le champignon, de préférence une huile végétale telle que l'huile de maïs, puis en traitant l'huile contenant les ascospores avec un agent non toxique (pour le champignon ou ses spores) dispersant d'huile, qui peut être n'importe lequel parmi les types connus pour disperser ces huiles, comme le Triton X-100 bien connu L'étalement de l'huile traitée par l'agent dispersant conduit à un grand nombre de gouttelettes de ladite huile contenant des ascospores viables, discrètes, et, en outre, l'huile est consommée et éliminée des boîtes de Petri lorsque le champignon pousse, en laissant des colonies fongiques discrètes que l'on peut facilement récupérer et cultiver pour les évaluer Le grand nombre de champignons ascospores viables que l'on obtient pour la sélection par le procédé d'isolement indiqué est important pour atteindre ces objectifs, car seul un très faible pourcentage ou nombre d'un très grand nombre de champignons ascospores est indiqué pour offrir les propriétés améliorées que l'on recherche. L'inoculum à utiliser dans l'invention peut être n'im- porte quelle forme cellulaire des champignons à croissance blanche fournis par l'invention qui conduise à une croissance du champignon placé sur un substrat tel que le bois Parmi ces formes, on peut citer les mycéliums, les spores et la totalité ou une partie des cultures du champignon, et des formes sèches, telles que des poudres lyophilisées et analogues Les inoculums peuvent renfermer différents additifs tels que des conservateurs et des supports, qui peuvent être des supports solides ou liquides Les formes sèches telles que les poudres lyophilisées peuvent être employées telles quelles, mais sont de préférence diluées dans de l'eau. on déterminera, à l'échelle du laboratoire, si les cri- tères de cette invention sont ou non remplis Bien que l'on puisse s'appuyer dans certains cas pour se guider sur les exemples, on fera la détermination en fonction de la des- cription et de la discussion suivantes, et les expériences des exemples ne correspondent pas forcément exactement en tout point à la description de cette détermination. En ce qui concerne la réduction de la teneur en poix, on réalise les évaluations sur des substrats stériles pour éliminer l'influence d'autres organismes qui infectent natu- rellement les substrats non stériles Les évaluations sont faites dans les 14 jours après l'inoculation. En ce qui concerne toute évaluation concernant la blan- cheur, ces évaluations sont avantageusement réalisées dans des buts de sélection sur des substrats stériles pour éliminer ici aussi l'influence d'organismes qui infectent naturellement les substrats non stériles et obtenir une appréciation plus absolue de l'influence sur la couleur du candidat Ces évaluations seront réalisées après une croissance de 21 jours. Les déterminations de la virulence de la croissance peu- vent être faites à la fois sur un substrat stérile et sur un substrat non stérile et sont faites 10-11 jours après l'inoculation, pour refléter les champignons voulus fournis par l'invention Ces déterminations sont faites selon la description de EP 470 929, p 5-6 Pour les présents besoins de sélection, la détermination est faite sur un substrat stérilisé. Les champignons préférés de l'invention sont ceux qui donnent les résultats voulus sur au moins le pin jaune du Sud, à des doses ne dépassant pas 1010 CFU/kg, en particulier à des doses ne dépassant pas 109, et en particulier ne dépassant pas 108. Les champignons ascospores fournis par l'invention que l'on préfère particulièrement sont ceux qui présentent au moins à peu près la même virulence de croissance que TAB 28 sur un subtrat non stérile, mais qui poussent essentiellement blancs sur un substrat stérilisé, par exemple un substrat de pin jaune du Sud, et qui réduisent la teneur en poix du substrat stérilisé d'au moins 10 % de plus que TAB 28. Une forme de produit convenable des champignons de l'invention s'obtient par séchage en lit fluide d'un mélange d'un concentré de fermentation contenant des spores, remis en suspension dans de l'eau, et d'un solide inerte qui n'affecte pas de façon négative la stabilité des spores, par exemple une argile comme le kaolin Une autre forme de produit convenable, de préférence sans ajout de support, est produite par des techniques de lyophilisation, et de tels produits peuvent, pendant des périodes acceptables, être stables à la température ambiante s'ils sont conservés sous vide. Pour mettre en oeuvre l'invention afin d'isoler les cham- pignons ascospores recherchés remplissant les critères selon l'invention, on effectue différentes évaluations comparatives sur des substrats de bois à pâte pour déterminer la réduction de la teneur en poix, la blancheur et la virulence Celles-ci sont réalisées à l'échelle du laboratoire Lorsque le substrat peut être de différentes formes de bois à pâte, l'étalon et la forme la plus adaptée des critères est la forme de copeaux de bois La description détaillée se trouve dans EP 470 929, p. , lignes 5-31, à l'exception des variantes suivantes Chaque évaluation est faite sur des substrats de la même espèce de bois et sur des échantillons de substrats obtenus sur le même tronc ou sur la même bûche et au même moment après l'abattage de l'arbre Une collection de ces substrats est mélangée intimement pour disperser les morceaux isolés qui peuvent être naturellement infectés ou plus lourdement infectés par des microorganismes Les évaluations sur des substrats non stériles peuvent démarrer 7 jours après l'abattage de l'arbre. Les évaluations comparatives sur des substrats stériles commencent pratiquement en même temps ou un peu plus tard, de préférence après que les copeaux de bois provenant des coupes aient été stérilisés et refroidis complètement à la température ambiante (environ 20 'C) L'inoculum est appliqué sous forme de concentré ou de dilution dans de l'eau déminéralisée à partir d'une culture à une concentration d'inoculum qui, avec la manière de l'utiliser pour l'inoculation, n'introduira pas plus d'environ 1 ml d'eau pour g de substrat La dose elle-même sera exprimée en unités formant des colonies (CFU) représentant la numération par des méthodes normalisées du total des mycéliums viables et/ou des spores viables de l'inoculum La dose appliquée est la même et n'excède pas le critère maximal de 1010 CFU/kg de substrat (avant la stérilisation dans le cas de l'échantillon stérilisé) L'inoculum se trouve sous une forme aussi similaire que possible pour le champignon parent référencé et le champignon ascospore évalué Par conséquent, si l'inoculum de l'un est essentiellement constitué seulement de mycéliums, l'inoculum de l'autre sera essentiellement constitué seulement de mycéliums et récolté à un stade de croissance équivalent. D'une façon analogue, les mélanges de spores et de mycéliums seront dans les mêmes proportions Si le champignon peut don- ner une proportion élevée de spores ( 75 % ou plus de CFUJ) dans la culture, comme c'est habituellement le cas, on utilisera un inoculum constitué de 75 % ou plus de spores de caractérisation analogue Par conséquent, si le champignon forme une forte proportion de blastospores, on utilisera un tel inoculum. Chaque évaluation, telle qu'elle est décrite ci-dessus, est effectuée en trois exemplaires et la moyenne des résultats est calculée, et chaque série de trois exemplaires est encore répétée trois fois de plus (au total quatre séries de trois exemplaires), mais avec, dans chaque série, des échantillons 1 1 d'arbres différents d'une même espèce et d'une même variété dans le même endroit d'une forêt. La teneur en poix des substrats est déterminée selon la méthode de la norme TAP Pl T 204 OS-76 et peut être exprimée en mg de poix par g de substrat extrait au DCM (c à d chlorure de méthylène) Lorsqu'on l'utilise sur un substrat comme des copeaux de bois, on fend les copeaux traités avec un sécateur pour avoir une largeur d'environ 1 cm, puis on les sèche pendant une nuit à 60 'C, puis on les broie pour obtenir de la sciure à l'aide d'un broyeur intermédiaire de Thomas-Wiley, équipé d'un tamis de maille 10 mesh et on les sèche une nouvelle fois pendant une nuit à 60 'C On combine 3 g de sciure séchée à environ 30 ml de DCM et on agite le mélange résultant pendant une nuit (environ 15 heures) à la tempéra- ture ambiante On pipette le milieu liquide du mélange, on le filtre à travers un filtre organique de 0,45 gm, on laisse le liquide s'évaporer pendant une nuit à la température ambiante (pendant environ 15 heures) dans un récipient pré-pesé, et on chauffe le résidu dans un four à 60 'C pendant 30 minutes pour éliminer encore du DCM Le poids du résidu est déterminé en mg comme étant la teneur en poix et exprimé soit en mg de poix par g de substrat, soit en pourcentage de poix dans le substrat initial (% matières extraites). La blancheur du substrat est déterminée sur une sciure de calibre 10 mesh et les substrats, tels que les copeaux de bois, sont d'abord fendus à l'aide d'un sécateur jusqu'à en- viron 1 cm, puis broyés à l'aide d'un broyeur intermédiaire de ThomasWiley, équipé d'un tamis de maille 10 mesh, avec des séchages intermédiaires à 60 'C, comme ci-dessus. La blancheur est mesurée sur un instrument de mesure de la réflexion photovoltaïque, Photovolt Reflection meter, modèle 670 L'instrument est une unité séparée de la cellule photoélectrique et la cellule photoélectrique peut être re- tournée sens dessus dessous si nécessaire En utilisant l'ins- trument ci-dessus, le mode d'emploi est le suivant: 1 Etalonner l'instrument de réflexion avec une plaque d'émail dont la blancheur a été étalonnée ( 75,0) Placer la plaque sur une boîte de Petri et la présenter devant l'unité de recherche (cellule photoélectrique) Ajuster la lecture de l'instrument à la valeur de la plaque d'émail On peut régler de cette manière la lecture étalon ou bien en plaçant l'étalon à l'intérieur de la boîte de Petri jusqu'à ce qu'il arrive au niveau du plastique Sa distance d'avec la boîte de Petri est quelconque. 2 Remplir la boîte de Petri avec une couche uniforme de sciure, d'environ 10 g ou moins, et présenter la boîte devant l'unité de recherche et effectuer cinq mesures sur différents endroits de la boîte La moyenne des cinq mesures est la blancheur de la sciure On utilise une nouvelle boîte de Petri pour chaque échantillon et chaque nouvelle mesure. La croissance ou la virulence d'un champignon est mesurée à titre comparatif parmi les champignons et toutes les conditions possibles, sauf indication contraire, seront une fois encore rendues aussi identiques que possible pour la comparaison Le procédé est décrit dans EP 470 929, p 6, lignes 6-32. Le terme "bois à pâte" que l'on emploie ici signifie toute forme récoltée (abattue) d'un bois utilisé dans la fa- brication du papier, du carton ou de tout autre produit cel- lulosique tel que la viscose, mais, avant la fabrication de la pâte, et englobe les formes telles que tronc, bûches, copeaux de bois, sciure et analogues Le terme "bois à pâte raffiné" signifie un bois à pâte résultant de l'application de forces mécaniques et/ou de forces de cisaillement sur les formes entières de bois à pâte, telles que des bûches, pour donner une multiplicité de petits morceaux de grande surface spécifique, comme des copeaux de bois et de la sciure, que l'on peut introduire dans un procédé de fabrication d'une pâte Le terme pâte mécanique de premier stade signifie une pâte, obtenue par un procédé mécanique de fabrication de pâte, qui contient au moins 60 % de lignine dans le substrat avant la mise en pâte. Les champignons qui font l'objet de l'invention peuvent être utilisés pour réduire la teneur en poix des bois à pâte et des pâtes mécaniques de premier stade comme décrit dans les brevets et les demandes de brevets incorporés ici à titre de référence Brièvement, un inoculum d'au moins un des champignons est appliqué sur le(s) substrat(s) et le(s) substrat(s) inoculé(s) maintenu(s) à une température de crois- sance du champignon, par exemple de 1,7-32,2 'C ( 35-90 'F), pendant suffisamment longtemps pour décomposer la teneur en poix du substrat, par exemple 5-14 jours Les bois à pâte raffinés sont en général accumulés, par exemple en tas, après l'inoculation qui sera avantageusement distribuée de façon représentative dans toute l'accumulation Une telle accumulation peut se trouver sous la forme de tas de copeaux de bois typique ou dans un récipient ou un espace fermé, comme un wagon, un bâteau, ou analogue, pour permettre à la réduction de la teneur en poix de s'effectuer au cours du transport Les troncs, les buches et analogues peuvent être traités de nombreuses façons pour amorcer la croissance dans la majeure partie ou plus dudit substrat, par exemple les troncs ou les buches peuvent être entaillés dans le sens de la longueur et l'inoculum appliqué dans l'entaille, ou même les extrémités coupées peuvent être inoculées La pâte mécanique de premier stade est un substrat stérilisé et l'invention peut s'appliquer de façon générale à la fois aux substrats stérilisés et aux substrats non stériles Cependant, on obtiendra bien entendu des avantages particuliers et sou- haitables lorsqu'on utilisera l'invention sur des bois à pâte non stériles, y compris les bois à pâte raffinés non stériles. La dose appliquée dans la mise en oeuvre de la présente invention ne dépasse pas 1010 CFU/kg de substrat avec les bois à pâte raffinés, et de préférence ne dépasse pas 109 CFU/kg, et on peut utiliser des doses inférieures avec les modes de réalisation particulièrement préférés. Les champignons de la présente invention appartiennent à l'espèce O Dhiostoma piliferum et peuvent être identifiés en tant que tels par les méthodes taxonomiques établies Le cas échéant, on peut confirmer l'identité exacte et totale de souches particulières, comme celles déposées auprès du NRRL en rapport avec celles-ci, par des méthodes connues de polymorphisme de la longueur des fragments de restriction (RFLP) L'utilisation de ces méthodes dans l'identification des champignons a été décrite dans la littérature, par exemple par Raeder et coll, Comparison of Lignin Degrading White Rot Fungi Phanerochaete Chrysosporium and Sporotrichum pul- verulentum at the DNA Level, Curr Genet 8: 499-506 ( 1984); par Wildeman et coll, A CAT Family of Repetitive DNA Sequences in Saccharomyces cerevisiae, J Biol Chem 261, 13401-13403 ( 1986); et par Ali et coll, DNA Fingering By Oli- gonucleotide Probes Specific For Simple Repeats, Human Gene- tics, 74, 239-243 ( 1986) On a constaté que les enzymes de restrictionconvenant habituellement le mieux à O Dhiostoma Diliferum étaient Pst I, Hind III et Bam HI, la séquence ré- currente étant habituellement (CAT)5. Le système de vaporisation en ligne servant à distribuer l'inoculum dans les opérations à grande échelle comprend un réservoir de 190 litres ( 50 gallons), une hélice entraînée par un moteur et une pompe Le réservoir de 190 litres sert de réservoir à l'inoculum Une hélice située dans le réservoir est utilisée pour-l'agitation nécessaire pour maintenir en suspension les cellules fongiques La pompe soutire l'inoculum du réservoir et distribue le liquide à un débit de 95 litres/minute ( 25 gallons/minute) dans une série de 7 tuyères raccordées de manière à mieux uniformiser les déversements de chaque tuyère Les tuyères sont fixées à 90 cm ( 3 ') au-dessus d'un transporteur à vis possédant quatre vis de diamètre 30 cm ( 1 '), en parallèle dans un lit de 1,5 m ( 5 ') de largeur et de 1,2 m ( 4 ') d'épaisseur Les sept tuyères sont placées en quinconce, en deux rangées de quatre et trois tuyères, la distance entre les deux rangées étant de 45 cm ( 1,5 ') Les copeaux sont avancés à environ 18 m/min ( 60 '/min) Les copeaux inoculés sont déchargés de la courroie pour être stockés pour l'évaluation en un point situé 1,2 m ( 4 ') après la dernière rangée de tuyères (de 3 tuyères). Exemples Mode opératoire général Des ascospores de Ophiostoma piliferum sont produites en structures de reproduction spécialisées appelées périthèces. Les ascospores sont produites dans les asques au sein de la base du périthèce A mesure du mûrissement des ascospores, les asques subissent une autodéliquescence et les ascospores sont sécrétées dans une gouttelette de matière hydrophobe visqueuse au sommet du périthèce L'isolement des ascospores peut être effectué avec du pinène, comme le recommande la bibliographie. Cependant, l'isolement des ascospores avec le pinène est considérablement inférieur à celui que l'on souhaite et on a découvert, à la place, qu'un traitement par une huile végétale stérile et un détergent produisait un très haut degré de dispersion souhaitée des ascospores et était non toxique En fait, l'huile végétale est consommée par le champignon comme un aliment apparent (source de carbone) d'une manière jugée analogue à la consommation de poix, ce qui fait que le procédé peut être appliqué à tout champignon consommant de la poix La consommation d'huile est aussi une manière très fortuite d'éliminer le solvant (huile) de la matière hydrophobe. Les ascospores sont diluées 100 fois dans de l'huile de maïs stérile, puis deux dilutions supplémentaires séparées, de fois et 100 fois, dans une solution stérile à 10 % de Triton X-100, sont effectuées à titre de comparaison l'une avec l'autre Des aliquots de 100 gl des deux dilutions sont étalés en boîtes de Petri, sur de la levure au malt gélosée, pour donner des densités d'étalement de 100 et 10 spores par boîte. On utilise le Triton X-100 pour disperser l'huile de maïs et empêcher la ré-agrégation des gouttelettes d'huile à la surface de la gélose. Les champignons éliminent l'huile des plaques à mesure qu'ils poussent En présence d'huile/détergent, les colonies demeurent discrètes et très compactes et atteignent lentement une taille que l'on peut recueillir, et sont prêtes au bout de 7 jours Lorsque les colonies individuelles sont suffisamment grandes pour permettre un ré-ensemencement, toutes les colonies des boîtes de dilution inférieure, quelle que soit leur taille ou leur coloration, sont transférées dans de la levure au malt gélosée fraîche et cultivées pendant une semaine avant que l'on dose la production de périthèces (état d'homocaryon). Les isolats sont triés pour éliminer autant d'hétéro- caryons que possible. On réalise le triage en ensemençant chaque isolat sur de la gélose de copeaux de bois et en contrôlant la production de périthèce pendant une durée de 2 mois. Les isolats qui ne produisent pas de périthèce sont écartés. Exem Dle 1 Isolement et croissance des souches Parmi les isolats foncés (gris foncé à noir), 20 des isolats apparemment les plus virulents sont sélectionnés pour la virulence de leur croissance et la réduction de la teneur en poix sur des copeaux de bois de pin jaune du Sud stérilisés, par les méthodes d'essai décrites ici Le résultat de cette sélection permet de sélectionner l'isolat appelé D 3, qui est un isolat qui pousse de façon aussi virulente que TAB 28, le plus virulent des parents, et qui présente une capacité significativement accrue à décomposer la poix par rapport aux deux parents. L'ascospore D 3 est ensuite accouplé avec WZ 58 par le même procédé que celui employé pour accoupler TAB 51 et TAB 28, sauf que la suspension examinée dans l'enceinte de numération de l'hémocytomètre présente lx 106 cellules/ml, dont 97 % sont des ascospores simples. Aucun isolat n'est écarté à l'issue de l'évaluation des périthèces comme étant un hétérocaryon, mais plusieurs pous- sent mouchetés, avec à la fois des hyphes noirs et des hyphes blancs, et sont écartés (en tant que possibles hétérocaryons inacceptables, bien que non auto-fertiles) Parmi les isolats d'ascospores sains restants, 53 sont noirs, 3 sont gris et 43 sont blanc-gris et/ou essentiellement incolores Les isolats blancs sont ensuite sélectionnés pour leur capacité à décomposer la poix et la virulence de leur croissance, et plusieurs candidats sont sélectionnés pour une sélection plus fine. Pour la sélection plus fine, chaque isolat est cultivé dans un milieu de levure au malt à la température ambiante, à tours/min pendant 62 heures Les blastospores (ayant environ 5 % de mycéliums) sont récoltés par centrifugation et remis en suspension dans de l'eau stérile jusqu'à un nombre de O CFU viables d'environ 10 /ml La viabilité de chaque inoculum est testée et on trouve qu'elle est de 50 % ou plus. Il est à noter que le champignon ascospore D 3 est du même type d'accouplement que son descendant identifié ici sous le nom de D 97 (notre type d'accouplement A), alors que WZ 58 est du type d'accouplement opposé (type B) Le champignon D 3 peut donc être encore accouplé avec D 97 le cas échéant. Tous les copeaux employés sont des copeaux de pin jaune du Sud et des aliquots de 100 g de copeaux de bois stériles (copeaux passés à l'autoclave) sont inoculés en double exem- plaire avec 1,0 ml de suspension fongique Les copeaux ino- culés sont stockés à la température ambiante dans l'obscurité. La croissance est contrôlée dans le temps pendant une période de onze jours Les résultats sont indiqués sur le tableau A (dans lequel les isolats numérotés D 37 ou plus sont sélectionnés pour l'accouplement de WZ 58 et de D 3). 21 ZT ne a Ln AI ap n TTM e S Up su a AT 1 lno uos x Tod -1 ap uo TD Tsod C Io Dop ap sa O UaTadxa xne u-e Aas suoubduieq D sq x Toa e 1 ap UO Tr S Oa Ulsoao Dg z CL Ua X ITOU u saa Anooaa xneedoo sap % 001 T ++++ a UOJ ST i 5*; szaa Anoole xnreedoo sap %SL +++ STY 15' sla Anooaa xnreadoo Sep % O G ++ Tel To s Ta 5- o'b sqaanoeai xneadoo sep % Z + ulq'q alq Ts TA a OU Pss T Oa D aun Dnl - en Rb Iuo aoue SSTO:o ap analno D t' ++ 4-i- G 4 tl ti H-- q t' q i- i-+ q q ++ q q t' o S/q q u 4-+ 4-I- q +++ u ++ 4-4- +++++ q t' t' q q 4 '-++ q ± + q q q Se E IS xnwadoo sap +++, q + q _ _ _Ej4 4 q++ q q q q + - - q ++++_ 0,-+_. q.:::: s=no L S xn Ba Qoo sap q -r±p, i-+ q+/ q - q T-:-± q ++++/+++ q ___:+ q ++++ q :q ++ q-l: 2ST: /++ O q++ +:.1 ':/::- q %:I:::+, s:no L h rts ouess o;l) )alnaafno D : apuabaq Z 6 a ú 80 z 9 G 990 i 9 a cea ú 90 6 LG SZG 9 G-O Lú $.c Z Al u Tomg suouoameq O nes Iqel I ú 07 ( -UTO 1 MG- Sxi O-uz Dc Liuxq 2 MD Te-lUT- Z 69 Z I 1 Oz 0 oz ç - température ambiante, à 200 tours/min pendant 3 jours Les cellules (environ 95 % de blastospores) sont récoltées par centrifugation et remises en suspension dans de l'eau stérile, jusqu'à un nombre de CFU viables d'environ 1 x 108/ml Quatre exemplaires de sacs de 400 g de copeaux de bois de pin jaune du Sud stérilisés sont inoculés avec 4,0 ml de suspension fongique Les sacs inoculés et les sacs témoins sont incubés à la température ambiante dans l'obscurité pendant deux semaines Les résultats sont indiqués ci-dessous sur le tableau B, ainsi que la mesure de la blancheur des isolats. Tableau B Décom Dosition de la poix % Substances extraites Blancheur Souche 4 exem Dlaires Movenne moyenne Témoin 4,53 N D TAB 28 2,G 5 35, 4 WZ 58 2,82 75,5 D) 3 2,51 N D DC)59 2,59 N D D 62 2,86 74,5 D 97 2 r 24 72,9 Les isolats blancs présentant une réduction améliorée de la teneur en poix du pin jaune du Sud sont aussi soumis à une sélection pour la réduction de la teneur en poix du tremble. Les résultats sont indiqués sur le tableau C ci-dessous. Tableau C % Substances extraites - Souche Movenne Blancheur Témoin 2,86 67,7 TAB 28 2,12 43,3 WZ 58 2,42 677,2 D 59 2,46 65 r 4 D 97 2,22 69,2 Les souches D 59 et D 97 sont les premières souches blanches à présenter une réduction significativement plus importante de la teneur en poix que WZ 58 sur le pin jaune du Sud (tableau B) La souche D 97 est la seule souche dont la ré- duction de la teneur en poix est encore améliorée par rapport à l'intermédiaire D 3 (tableau B) La souche D 97 est aussi la seule souche blanche présentant une réduction si- gnificativement plus importante de la teneur en poix que WZ 58 sur le tremble (tableau C). Exem Dle 3 Virulence de la croissance sur des substrats non stériles Des bois de pin jaune du Sud non stériles, préparés de la manière indiquée ci-dessus, sont inoculés avec D 97, que l'on récolte au bout de 62 heures ( 108 CFU/ml) à raison de 108 CFW par kg de copeaux de bois L'évaluation de la croissance est indiquée ci-dessous sur le tableau D, avec d'autres champignons, à titre de comparaison. Tableau D Cham Dianon 7 jours 10 jours T Ae 28 1::b/g n D 3 g n WZ 58 ±l+ -s b - / b D 97 HEP}: b ++ -/++ b Sur le tableau E, environ 25 % des copeaux de bois traités avec WZ 58 et D 97 présentent une croissance grise à noire. Exem Dle 4 Fermentation et formulation Des cellules (blastospores) de D 97 sont fermentées à 25 C (fermenteur de 50 litres) dans des milieux contenant 200 g par litre d'extrait de malt et 20 g par litre d'extrait de levure, jusqu'à ce que la densité des cellules soit de 3 x 109 cellules/ml de milieu de fermentation (environ 36-48 heures), aérés (taux d'oxygène proches de la saturation, à savoir non limitatifs à aucun moment de la fermentation) On laisse le milieu de fermentation s'élever à p H 6,0-6,5 ou on l'ajuste à ce niveau avec de l'hydroxyde de sodium. La biomasse produite dans le fermenteur est récoltée par centrifugation; le p H est mesuré et ajusté, le cas échéant, à 6,0-6,5, et les cellules ( 15-20 % de matières solides) sont mélangées à de l'argile, à raison de 1 partie de biomasse mouillée (environ 20 % de matières solides) pour 2 parties de kaolin sec La teneur en eau du mélange de biomasse et d'argile varie de 25 à 30 % Le mélange fluide est chargé dans un sécheur Aeromatics à lit fluide et soumis à un séchage à la température ambiante jusqu'à une teneur en eau finale de 5- % La température de l'air de sortie est maintenue au- dessous de 35 C La durée du séchage est de 20 à 40 minutes. La matière séchée en lit fluide conserve sa viabilité et sa capacité à pousser sur des copeaux de bois non stériles et à réduire les teneurs en poix après un stockage prolongé de la matière séchée à -15 'C Les résultats de stabilité sont indiqués ci-dessous sur le tableau E. Tableau E Durée du stockage (jours) Unités formant des colonies/g o 5 xl O 9 à 7 xl O 9 166 2 xl O 9 à 3 xl O 9 Le nombre de cellules est déterminé à l'aide de tech- niques de dosage normalisées, avec un Hémocytomètre, muni d'un système à charge en V, Neubauer, à quadrillés de 0,1 mm, au- dessous d'une lame de verre de 0,4 mm, et avec un microscope de recherche à phase fluorescente Olympus, modèle BHS, muni d'un cube d'excitation ultraviolette avec des raies lumineuses à 334 et 365 mm pour la coloration au Leucophor S B 150 et un cube d'excitation bleue avec des raies lumineuses à 435 mm et des régions spectrales proches de 490 mm, ainsi qu'un filtre jaune d'excitateur à une longueur d'onde de 455 mm pour la coloration à l'acétate de fluorescéine. Exem Dle 5 Fermentation et formulation Des blastospores de D 97 sont fermentés à 25 C dans un fermenteur de 250 litres Le milieu contient 200 g/litre d'extrait de malt et 20 g/litre d'extrait de levure Les cel- lules sont fermentées pendant 64 heures et le taux d'oxygène est maintenu à saturation On laisse le milieu de fermentation s'élever à p H 6,0-6,5 ou on l'ajuste à ce niveau avec de l'hydroxyde de sodium. * Les cellules sont récoltées avec une centrifugeuse Westphalia SB 7 Le culot cellulaire, après vérification du p H et ajustement à 6-6,5 le cas échéant, est congelé par aliquots de 1 g, dans un congélateur réglé à -70 'C Des échantillons sont ensuite séchés pendant 8 heures sur le lyophilisateur Labconco, à une température interne réglée dans l'intervalle de -50 'C à -150-C (la teneur en eau finale est de 10 %) Les échantillons sont ensuite conservés à -15 'C et on constate qu'ils demeurent essentiellement stables sur une période d'au moins 60 jours. On pense que les restrictions concernant le matériel dont on a disposé limitent les températures de lyophilisation au voisinage de -50 'C à -70 'C Il est indiqué que les températures de lyophilisation peuvent être considérablement plus basses, par exemple de -90 'C à -300 'C et que l'on peut préférer des températures plus basses dans une opération à grande échelle en disposant d'un équipement capable d'une telle opération Dans de telles opérations à grande échelle, des suspensions cellulaires ou des pâtes cellulaires, par exemple une suspension de 15 % de matières solides, peuvent être congelées en feuilles minces dans des cuves en l'espace d'au moins 4 heures, de préférence d'au moins 8 heures, à -50 'C La matière congelée, telle quelle ou écrasée, est en- suite lyophilisée dans un lyophilisateur sous vide à refroi- dissement interne pendant 24-36 heures Les teneurs en eau finales peuvent être réduites jusqu'à 3 % ou même moins Les produits de la lyophilisation, sous forme de produits tels que des poudres lyophilisées, peuvent présenter une stabilité à la température ambiante si on les conserve sous vide (emballage sous vide> pendant des périodes raisonnables, par exemple d'au moins 30 jours. R E V E N D I C A T I O N S 1 Composition comprenant un inoculum d'un champignon de l'espèce Ophiostoma Diliferum qui pousse blanc ou incolore sur des copeaux de bois de pin jaune du Sud stériles et qui possède au moins les caractéristiques de décomposition de la poix et de virulence de la croissance sur des copeaux de bois de pin jaune du Sud stériles que possède le champignon de n' d'accès NRRL 18918. 2 Inoculum selon la revendication 1, dans lequel le cham- pignon possède au moins les caractéristiques de décomposition de la poix et de virulence de la croissance sur des copeaux de bois de pin jaune du Sud stériles que possède le champignon de n' d'accès NRRL 18917. 3 Inoculum selon la revendication 2, dans lequel le cham- pignon possède aussi au moins l'effet de décomposition de la poix sur des copeaux de bois de tremble stériles que possède le champignon de n' d'accès NRRL 18917. 4 Inoculum selon la revendication 3, dans lequel le cham- pignon possède les caractéristiques de réduction de la teneur en poix et de virulence de la croissance sur des copeaux de bois de pin jaune du Sud stérilisés que possède le champignon de n' d'accès NRRL 18917. Inoculum selon la revendication 4, dans lequel le cham- pignon possède les caractéristiques d'identification du champignon de n' d'accès NRRL 18917. 6 Inoculum selon la revendication 1, dans lequel Le cham- pignon possède les caractéristiques de réduction de la teneur en poix et de virulence de la croissance sur des copeaux de bois de pin jaune du Sud que possède le champignon de n' d'accès NRRL 18918. 7 Procédé d'obtention d'un champignon de l'espèce Ophio- stoma piliferum possédant des propriétés améliorées de dé- composition de la poix couplées à une bonne virulence de croissance et à une bonne capacité à pousser blanc ou incolore sur un substrat de bois, comprenant les étapes suivantes: a) accouplement des deux souches TAB 28 et TAB 51 de Ophiostoma miliferum, b) sélection, à partir dudit accouplement, d'un descendant ascospore non blanc accouplable avec la souche WZ 58 de Ophiostoma Diliferum et possédant une capacité améliorée, par rapport à celle des deux parents, à réduire la teneur en poix de copeaux de bois de pin jaune du Sud stérilisés en 14 jours de croissance, tout en présentant une croissance au moins aussi virulente que le meilleur des deux parents sur les copeaux de bois de pin jaune du Sud, l'évaluation étant faite dans la période de 10 à 11 jours après l'inoculation, c) accouplement d'une ascospore sélectionnée dans l'étape b) avec la souche WZ 58, et d) sélection d'au moins un descendant ascospore issu de l'accouplement de l'étape c), caractérisé par i) une croissance blanche ou incolore sur les copeaux de bois de pin jaune du Sud stérilisés, ii) une croissance au moins aussi virulente, sur les copeaux de bois de pin jaune du Sud, que l'ascospore non blanche sélectionnée dans l'étape b), l'évaluation étant faite dans la période de 10 à 11 jours après l'inoculation, et iii) une capacité à réduire le taux de poix dans les copeaux de bois de pin jaune du Sud stérilisés au moins aussi efficace que ledit descendant non blanc sélectionné, l'évaluation étant faite dans les 14 jours de croissance. 8 Procédé d'obtention d'un champignon de l'espèce O chio- stoma niliferum possédant des propriétés améliorées de dé- composition de la poix couplées à une bonne virulence de croissance et à une bonne capacité à pousser blanc ou incolore sur un substrat de bois, comprenant les étapes suivantes: a) accouplement des deux souches D 3 et WZ 58 de Ophiostoma ciliferum, et b) sélection, à partir dudit accouplement, d'au moins un descendant ascospore caractérisé par i) une croissance blanche ou incolore sur des copeaux de bois de pin jaune du Sud stérilisés, ii) une croissance au moins aussi virulente sur les copeaux de bois de pin jaune du Sud que D 3, l'évaluation étant faite au cours de la période de 10 à 11 jours après l'inoculation, et iii) une capacité à réduire le taux de poix dans les copeaux de bois de pin jaune du Sud au moins aussi efficace que la souche D 3, l'évaluation étant faite dans les 14 jours de croissance. 9 Procédé de réduction de la teneur en poix de bois à pâte ou de pâte mécanique de premier stade, comprenant l'ap- plication, au bois à pâte ou à la pâte, d'une composition selon la revendication 1, et le maintien du bois à pâte ino- culé ou de la pâte inoculée dans des conditions permettant la croissance du champignon pendant suffisamment longtemps pour réduire la teneur en poix du bois à pâte ou de la pâte. Souche de Ophiostoma piliferum possédant les caracté- ristiques d'identification des champignons de nô d'accès NRRL 18197 ou 18918.