FR 2687687 A1 19930827 FR 9302100 A 19930224 PROCEDE POUR MESURER LA TAILLE DE FRAGMENTS D'ADN Contexte de l'invention Cette invention se rapporte à l'analyse de l'ADN et, plus particulièrement, à l'analyse de la distribution par taille et au tri de fragments d'ADN. Cette invention est le résultat d'un contrat avec le "Department of Energy" (contrat NI W-7405-ENG-36). Le génome humain comprend quelques trois milliards de nucléotides formant les 22 paires de chromosomes plus 2 autosomes, chacun avec des morceaux d'ADN continus de 50-500 millions de nucléotides L'organisation et la séquence de l'ADN formant le génome humain contiennent des informations uniques sur la source qui fournit l'ADN Un procédé pour avoir accès à ces informations est de fragmenter l'ADN à des sites avec des caractéristiques connues et ensuite d'analyser la distribution des tailles de fragments, c'est-à-dire le nombre de nucléotides dans chaque fragment entre chacun des sites Des polymorphismes dans la structure du génome conduisent à une variation importante de la taille des fragments obtenus à partir de la fragmentation de morceaux d'ADN et permettent de différencier une personne d'une autre ou de former une base d'évaluation de la susceptibilité d'une personne à des maladies génétiques L'analyse de ces polymorphismes est souvent désignée sous le nom de cartographie de l'ADN. La cartographie de l'ADN est un outil important de diagnostic médical, avec des applications additionnelles pour l'identification légale, la génétique médicale, le contrôle des effets de mutagènes de l'environnement et la recherche biologique moléculaire de base Une forme de cartographie de l'ADN met en jeu le "polymorphisme de longueurs de fragments de restriction" (restriction fragment length polymorphism RFLP) o des enzymes de restriction sont utilisées pour couper un morceau d'ADN provenant d'une source spécifique en morceaux plus courts, ou fragments, d'ADN Ce polymorphisme de restriction fournit un profil unique de fragments d'ADN contenant une séquence unique d'ADN ordonnée selon la taille des fragments (la carte de l'ADN) lorsqu'un spécimen d'ADN est digéré avec des enzymes de restriction Il existe de nombreuses enzymes de restriction connues et chacune reconnaît une séquence d'ADN spécifique de quatre à douze paires de bases à laquelle elle coupe l'ADN, ayant pour conséquence des fragments d'ADN plus petits. Une fois que le morceau d'ADN a été coupé en de nombreux fragments, une électrophorèse est traditionnellement utilisée pour séparer les fragments par taille Un champ électrique est placé au travers d'un gel contenant les fragments, causant le déplacement plus rapide des fragments plus petits par rapport aux plus grands L'électrophorèse sur gel est une technique bien connue qui a été utilisée pour produire des profils de bandes de fragments d'ADN qui forment une carte, pour identifier la source individuelle du morceau d'ADN qui est analysé Les profils de bandes de séquences d'ADN spécifiques sont traditionnellement visualisés en liant des sondes d'ADN radioactives aux fragments d'ADN séparés et en exposant un film approprié aux fragments radioactifs marqués Voir, par exemple, de J I Thornton, "DNA Profiling", C&EN, pp 18-30 ( 20 novembre 1989); de K Heine, "DNA on Trial", Outlook 26:4, pp 8-14 ( 1989) Dans une variation, les extrémités des fragments sont marquées avec un colorant fluorescent de telle sorte que le temps de migration d'un fragment sur une longueur de parcours connue dans un gel électrophorétique peut être déterminé par détection de fluorescence automatique Voir, par exemple, de A V Carrano, "A High-Resolution, Fluorescence-Based, Semiautomated Method for DNA Fingerprinting", 4 Genomics, pp 129-136 ( 1989). Il existe, cependant, plusieurs limitations à l'utilisation de l'électrophorèse sur gel, en particulier quand de grandes tailles de fragments et le marquage radioactif sont impliqués Dans les deux cas, le processus de séparation électrophorétique prend un temps considérable pour fournir une résolution pour des fragments de grande taille Le développement d'images à partir de sondes radioactives est une étape additionnelle de longue durée, et des risques pour la santé et des inquiétudes sur l'environnement sont associés aux matériaux radioactifs De plus, la distribution des taillesde fragments est logarithmique de telle sorte que la séparation, c'est-à-dire la résolution, pour de grands fragments est inférieure à celle pour de petits fragments L'électrophorèse exige aussi des quantités relativement importantes d'ADN pour obtenir un profil reconnaissable. Il est souhaitable de fournir une technique d'analyse de la taille des fragments d'ADN qui utilise seulement de petites quantités d'ADN (peutêtre seulement un brin unique), fournit des informations de taille en un temps court, et a une résolution élevée pour les tailles des fragments Ceux-ci et d'autres problèmes de la technique antérieure sont traités par la présente invention, dans laquelle des techniques basées sur la cytométrie en flux sont utilisées pour obtenir une distribution de la taille de fragments d'ADN à partir d'un morceau d'ADN. En conséquence, il est un objet de la présente invention de fournir une détermination rapide de la taille de fragments d'ADN. Il est un autre objet de la présente invention d'obtenir une résolution élevée de fragments d'ADN, en particulier de fragments longs. Un autre objet de la présente invention est d'exiger seulement un petit échantillon d'ADN pour fournir des cartes précises des tailles de fragments d'ADN. Un autre objet encore de la présente invention est de permettre la détection de la longueur de fragments sans l'utilisation d'indicateurs radioactifs. Un objet supplémentaire de la présente invention est d'utiliser des intensités de fluorescence pour déterminer la longueur de fi gments d'ADN. Un autre objet toujours de la présente invention est d'utiliser les capacités de tri associées à la cytométrie en flux pour trier les fragments par taille, c'est-à-dire par longueur, pour une étude ultérieure. D'autres objets, avantages et caractéristiques nouvelles de l'invention seront exposés en partie dans la description qui suit, et deviendront en partie apparents aux experts en la matière lors de l'examen de ce qui suit ou peuvent être appris par la pratique de l'invention Les objets et avantages de l'invention peuvent être réalisés et atteints au moyen des objets et combinaisons désignés en particulier dans les revendications annexées. Résumé de l'invention Pour réaliser les objets précédents et d'autres objets, et en accord avec les buts de la présente invention, tels que réalisés et décrits dans les grandes lignes ici, le procédé de cette invention peut comprendre l'utilisation d'une fluorescence induite pour quantifier la longueur de fragments d'ADN Un morceau d'ADN est fragmenté à des sites choisis à l'avance pour produire une pluralité de fragments d'ADN Tous les fragments d'ADN sont traités avec un colorant efficace pour colorer de façon stoechiométrique les nucléotides le long des fragments d'ADN Les fragments d'ADN colorés sont ensuite examinés par rapport à leur fluorescence pour générer un signal de sortie fonctionnellement en rapport avec le nombre de nucléotides dans chacun des fragments d'ADN A la sortie, l'intensité des émissions de fluorescence provenant de chaque fragment est directement proportionnelle à la longueur du fragment. Description détaillée de l'invention En accord avec la présente invention, les polymorphismes de l'ADN sont caractérisés, c'est-à-dire "cartographiés", en utilisant des techniques basées sur la cytométrie en flux pour fournir une analyse rapide de la taille de fragments d'ADN obtenus en fragmentant un morceau d'ADN choisi avec une ou plusieurs enzymes choisies pour cliver l'ADN à des sites de séquence connus Un exemple de procédure pour la mesure de la taille est le suivant: 1 Un morceau d'ADN provenant d'une source choisie est fragmenté par digestion par une enzyme pour fournir une solution de fragments d'ADN Les nucléotides compris dans le morceau d'ADN peuvent être colorés, c'est-à-dire marqués, avec un colorant fluorescent approprié avant ou après que le morceau d'ADN soit fragmenté. 2 Les fragments d'ADN colorés sont passés à travers un appareil de détection à une concentration et une vitesse efficaces pour fournir seulement un fragment dans le volume d'excitation de la fluorescence à un moment quelconque. 3 Chaque fragment d'ADN coloré est excité, par exemple, avec un rayonnement laser, dans le volume d'excitation et l'intensité de la fluorescence résultante est mesurée, l'intensité de la fluorescence induite étant une mesure du montant de la coloration sur le fragment et de la longueur concomitante du fragment. 4 Le nombre de fragments à chaque intensité différente fournit une analyse du nombre de fragments de chaque longueur produits à partir du morceau d'ADN par l'enzyme ou les enzymes choisie(s). Un morceau d'ADN peut d'abord être choisi à partir d'une source quelconque convenable, par exemple, du sang, des échantillons de tissu, du sperme, des spécimens de recherche en laboratoire, etc Le morceau d'ADN est ensuite fragmenté en utilisant une enzyme choisie pour une application particulière de l'analyse. Un type d'enzyme particulièrement utile est une endonucléase de restriction qui reconnaît des sites spécifiques, c'est-à-dire des séquences de nucléotides spécifiques, et qui clive le morceau d'ADN au niveau de la séquence identifiée Par exemple, l'enzyme Eco RI coupe au niveau du site de reconnaissance du brin double: GAATTC CTTAAG Des centaines d'enzymes de restriction différentes et leurs sites de clivage respectifs sont connus Il sera apprécié que des morceaux d'ADN identiques provenant d'une source unique peuvent être digérés avec des enzymes différentes pour donner une famille de cartes Comme alternative, un morceau d'ADN peut être digéré avec des enzymes multiples pour particulariser davantage l'analyse de la distribution de la taille des fragments. La fragmentation, c'est-à-dire la digestion, d'un morceau d'ADN avec une enzyme choisie est un processus bien connu, o les conditions de digestion optimales sont spécifiées par le fabricant de l'enzyme Un processus générique d'enzyme de restriction à utiliser avec 0,2-1 gg d'ADN est donné par J Sambrook et al, Molecular Cloninc, pp 5 28-5 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989): 1 Placer la solution d'ADN dans un tube microfuge stérile et mélanger avec suffisamment d'eau pour donner un volume de 18 iul. 2 Ajouter 2 Rl d'un tampon de digestion par enzyme de restriction approprié et mélanger en tapotant le tube Un exemple de tampon peut être formé comme suit m M de glutamate de potassium 50 m M de Tris- acétate (p H 7,5) m M d'acétate de magnésium gg/ml de sérum-albumine bovine (Fraction V; Sigma) 1 m M de 9-mercaptoéthanol. 3 Ajouter 1-2 unités d'enzyme de restriction et mélanger en tapotant le tube, o 1 unité d'enzyme est définie comme le montant requis pour digérer 1 gg d'ADN jusqu'à 1 'achèvement en 1 heure dans le tampon recommandé et à la température recommandée dans 20 g 1 de mélange réactionnel. 4 Incuber le mélange à la température appropriée pendant la période de temps requise. 5 Arrêter la réaction en ajoutant 0,5 M d'EDTA (p H 8,0) jusqu'à la concentration finale de 10 m M. L'ADN peut être fragmenté par une diversité d'autres techniques en plus de la digestion par une enzyme de restriction: 1 Sites d'hypersensibilité à la D Nase (cartographie par la D Nase): la digestion de la chromatine par là D Nase produira des fragments de diverses longueurs dues à des différences des protéines qui se lient à 1 DN et empêchent la coupure de l'ADN par une D Nase aux sites o une protéine est liée (D J. Galas et al, Nucleic Acids Res, 5:3157 ( 1987)). 2 Clivage par l'AR Nase des défauts d'appariement à base unique Une sonde d'ARN fluorescente est synthétisée pour être complémentaire d'une séquence d'ADN normal, ou de type sauvage, donnée Cette sonde complémentaire est ensuite réunie à l'ADN cible qui doit être analysé Pour déterminer si un défaut d'appariement à un seul nucléotide existe entre le brin de la sonde fluorescente et le brin d'ADN cible, l'hybride ARN/ADN est traité avec l'AR Nase A L'AR Nase A clive spécifiquement des régions à brin unique d'ARN, clivant donc la région de défaut d'appariement à base unique dans le brin d'ARN fluorescent de l'hybride ARN/ADN (Voir, R M Myers et al, Science 230:1242 ( 1985) et, E F Winter et al, Proc Natl. Acad Sci 82:7525 ( 1985)). 3 Clivage par une endonucléase de restriction aidé par Rec A Des oligonucléotides courts couverts par la protéine Rec A sont réunis à la séquence d'ADN cible complémentaire L'hybride ADN/oligonucléotide est traité avec une enzyme Eco RI méthylase Les sites de l'Eco RI qui ne sont pas protégés par l'oligonucléotide sont méthylés tandis que les sites de l'Eco RI protégés par l'oligonucléotide restent inchangés L'endonucléase de restriction Eco RI clivera seulement les sites protégés (c'est-à-dire non méthylés) Ce procédé a été utilisé pour engendrer des fragments de plus de 500 000 paires de bases (L J Ferrin, Science, 254:1494 ( 1991)). 4 La fragmentation de l'ADN peut aussi être accomplie par des techniques différentes de la digestion par une enzyme Par exemple, une excitation ultrasonore à différentes fréquences pourrait être utilisée pour produire une famille de distributions de tailles Divers produits chimiques réagissent aussi avec les nucléotides et peuvent être utilisés pour fragmenter des morceaux d'ADN. Les fragments d'ADN doivent être colorés avec un colorant fluorescent pour l'analyse cytométrique en flux Un colorant fluorescent est choisi pour se lier de façon stoechiométrique aux fragments d'ADN Le complexe peut être formé de manières différentes, c'est- à-dire ADN à brin unique, ADN à doubles brins, paires de bases spécifiques, etc Des colorants bien connus incluent des colorants de bromure d'éthidium, acridine orange, iodure de propidium, DAPI, Hoechst, chromomycine, mithramycine, 9-amino-acridine, bromure d'éthidium hétérodyne, cyanine asymétrique, ou des combinaisons de ces colorants pour un transfert d'énergie Le colorant ou les colorants choisi(s) se lient aux oligonucléotides de façon stoechiométrique le long de la séquence d'ADN, c'est-à-dire que les sites de liaison le long des fragments sont tels que le nombre total de molécules de colorant sur une longueur quelconque d'ADN est proportionnel au nombre de paires de bases (pb) formant l'ADN Par exemple, avec le protocole de coloration exposé ci-dessous, le nombre de molécules de bromure d'éthidium liées à un fragment d'ADN est stoechiométrique et peut valoir jusqu'à la moitié du nombre de paires de bases Voir, par exemple, de C R Cantor et al, "Binding of Smaller Molecules to Nucleic Acids", dans Biophysical Chemistry, Part III: The Behavior of Biolocical Macromolecules, p 1251, W H. Freeman and Company, 1980. Un exemple de procédure pour colorer avec du bromure d'éthidium est: Ajouter un échantillon d'ADN à une solution contenant 1-5 gg de bromure d'éthidium par ml de solution et à un tampon TE 8,0 Un tampon convenable est disponible auprès de GIBCO et est composé de 10 m M de Tris-H Cl et 1 m M d'EDTA, p H 8,0 La réaction est complète en -10 minutes à température ambiante. Les fragments d'ADN colorés sont ensuite analysés en utilisant des techniques de détection sensibles à la fluorescence pour déterminer l'intensité de la fluorescence provenant de chaque fragment passant à travers une région de détection et ayant une résolution élevée pour distinguer les tailles de fragments voisines Théoriquement, bien que seulement un morceau unique d'ADN soit nécessaire pour obtenir l'analyse de distribution souhaitée, une solution typique sera formée à partir de nombreux morceaux d'ADN et une distribution relative de la taille des fragments d'ADN est obtenue. Les fragments d'ADN auront de façon typique des tailles allant de 100 pb à 500 000 pb. Comment former un flux séquentiel de particules pour une utilisation dans un cytomètre en flux ou un appareil de détection sensible à la fluorescence similaire est bien connu Voir, par exemple, le brevet des Etats-Unis NO 3,710,933, publié le 16 janvier 1973, de Fulwyler et al, et Flow Cytometry and Sortinc, 2nd Ed., ed M R Melamed et al, Wiley-Liss, New York, 1990, incorporé ici à titre de référence Une solution diluée des fragments d'ADN est formée jusqu'à une concentration faible efficace pour fournir des fragments espacés les uns des autres dans le flux, de telle sorte que seulement un fragment unique est présent dans le volume d'excitation La solution de fragments d'ADN est ensuite injectée dans une gaine de flux laminaire, pour passer à travers la chambre de détection pour l'excitation au laser d'un fragment à la fois Les débits de l'échantillon et de la gaine sont ajustés pour maintenir une séparation entre les particules et pour fournir le temps optimal pour chaque particule dans la source d'excitation Un temps optimal est déterminé à partir de la considération du taux de dimensionnement, de la sensibilité de la détection et de la photostabilité des marqueurs colorés Une source d'excitation convenable est choisie pour amorcer la fluorescence dans le colorant utilisé pour colorer les fragments d'ADN Par exemple, un laser à argon à 488 nm est efficace pour causer la fluorescence du bromure d'éthidium dans une bande aux environs de 600 nm. La sensibilité du système de cytométrie en flux classique est améliorée en fournissant un petit volume d'excitation, par exemple, de 10-20 gm de diamètre et 100 gm de longueur, avec un faisceau laser étroitement focalisé Voir, par exemple, de J H Hahn et al., "Laser-Induced Fluorescence Detection of Rhodamine- 6 G at 6 x 10-15 MI", Appl Spectrosc 45:743 ( 1991), décrivant un volume de sonde de 11 pl, incorporé ici comme référence Le petit volume de la sonde réduit de beaucoup le montant de l'émission du fond, c'est-à- dire du bruit, dans le signal de sortie. L'excitation laser peut provenir d'un laser pulsé avec une impulsion de, par exemple, environ 70 ps de largeur, avec un déclenchement dans le temps pour différencier les photons d'émission du colorant (retardés) des photons de diffusion Raman (instantanés). il Voir, par exemple, de E B Shera et ai, "Detection of Single Fluorescent Molecules", Chem Phys Lett 174:553 (novembre 1990) Les photons diffusés instantanément sont produits pendant la durée d'impulsion du laser tandis que les émissions du colorant s'évanouissent avec une durée de vie de plusieurs nanosecondes, de telle sorte qu'une fenêtre retardée est efficace pour discriminer les photons de fluorescence des photons de diffusion Raman. Comme alternative, le laser peut être un laser continu Voir, par exemple, de S A Soper, "Single- Molecule Detection of Rhodamine-6 G in Ethanolic Solutions Using Continuous Wave Laser Excitation", Anal. Chem 63:432 ( 1991) Le nombre de photons émis peut être accru en accroissant le temps de transit des fragments d'ADN à travers le faisceau laser et en choisissant un colorant et un solvant avec une photostabilité élevée pour le colorant Le nombre de photons détectés (photoélectrons) est aussi accru en accroissant la sensibilité de l'appareil de détection En outre, la présente invention implique des fragments d'ADN plutôt que des molécules uniques, de telle sorte que plus le fragment est long, plus l'intensité de fluorescence de sortie obtenue est grande. On comprendra aussi que la solution peut contenir un peu de colorant qui n'a pas été lié aux fragments d'ADN Ce colorant sera excité conjointement avec le colorant lié et le système doit discriminer la fluorescence provenant du colorant non lié et du colo- rant lié Dans un mode de réalisation, un laser puisé et une technique de détection à déclenchement peuvent être utilisés pour fournir cette discrimination Par exemple, les durées de vie des états excités pour le bromure d'éthidium non lié et lié valent 2 ns et 23 ns, respectivement Donc, le système de détection peut être déclenché pour détecter seulement la fluorescence provenant du bromure d'éthidium lié et, donc, fournir un signal de sortie fonctionnellement en rapport avec la longueur-du fragment d'ADN Comme alternative, un colorant qui fournit une fluorescence ou des longueurs d'onde d'absorption différentes dans les états lié et non lié,peut être choisi Par exemple, une série de colorants à la cyanine asymétrique est rapportée par I.D Johnson et al, "Asymmetric Cyanine Dyes for Fluorescent Staining and Quantification of Nucleic Acids", Fluorescence Spectroscopy, Abstract 1806, FASEB J 6:A 314, NO 1 (janvier 1992). L'émission de fluorescence polarisée fournit aussi un moyen de discrimination des molécules de colorant liées et non liées La polarisation de la fluorescence de colorants non liés à l'ADN est inférieure ou égale à 0,05, alors que la polarisation de la fluorescence de fluorochromes liés à l'ADN peut être comprise entre 0,20 et 0,30 Voir, par exemple, de L S Cram et al, "Fluorescence Polarization and Pulse Width Analysis of Chromosomes by a Flow System", J Histochem Cytochem. 27:445, NO 1 ( 1979); de T M Jovin, "Fluorescence Polarization and Energy Transfer: Theory and Application", Flow Cytometry and Sortinci, Ed M R. Melamed et al, pp 156, John Wiley & Sons ( 1979) La discrimination est accomplie en utilisant une source d'excitation polarisée et en détectant les émissions à travers un filtre polarisant placé devant un détecteur de fluorescence Le filtre polarisant est aligné avec la direction de polarisation parallèle à la direction de polarisation de la source d'excitation. Pour l'excitation continue par un laser continu, un schéma du type à transfert d'énergie peut être utilisé pour distinguer des molécules de colorant liées et non liées Si un deuxième colorant est aussi lié à l'ADN, les molécules liées du premier colorant utilisées pour la mesure de la taille des fragments se trouveront à proximité immédiate des molécules du deuxième colorant de telle sorte que l'excitation des molécules du deuxième colorant aura pour conséquence un transfert d'énergie des molécules du deuxième colorant aux molécules du premier colorant Les molécules non liées des premier et deuxième colorants dans le fluide environnant ne seront pas assez proches pour que s'effectue un transfert d'énergie Donc, seules les molécules liées du premier colorant seront fluorescentes pour la détermination de la longueur des fragments lorsque les molécules du deuxième colorant sont excitées. A titre d'exemple, les colorants de Hoechst et de chromomycine spécifiques de l'ADN peuvent transférer de l'énergie Lorsque des molécules de colorant de Hoechst sont excitées, elles peuvent transférer de l'énergie à des molécules de chromomycine dans un rayon de transfert de quelques dizaines de nanomètres (quelques angstrôms). Cette paire de transfert d'énergie est utilisée dans l'analyse de la fluorescence de chromosomes par cytométrie en flux Voir, par exemple, de R G. Langlois et al, "Cytochemical Studies of Metaphase Chromosomes by Flow Cytometry", Chromosoma 77:229 ( 1980) L'excitation par transfert d'énergie peut aussi être faite en excitant les nucléotides à environ 260 nm avec un transfert d'énergie subséquent aux molécules de colorant liées Voir, par exemple, de J B Lepecq et al., "A Fluorescent Complex between Ethidium Bromide and Nucleic Acids", J Mol Biol 27:87 ( 1967). L'appareil du type à cytométrie en flux fournit aussi une résolution élevée pour distinguer des longueurs de fragments voisines En effet, la résolution est généralement limitée par le bruit de grenaille dans les photons provenant des émissions de fluorescence et la résolution en pour-cent s'accroît au fur et à mesure que le nombre de paires de bases (pb) formant les fragments d'ADN s'accroît. La résolution en pour-cent (R) est déterminée par la longueur du fragment (L), la fraction du fragment marquée (f), le nombre de photoélectrons recueillis par marqueur (b) (b vaut de façon typique 30 environ), et le nombre de fois que la taille d'un fragment est mesurée (N) L'intensité moyenne est données par g La résolution en pour-cent, R, pour un écart type de 3 G, est donnée par: R (%) = 3 * 100 *N*(L*f*b*)>/(L*f*b*), o g = L*f*b; = g. Par exemple, considérons le cas d'un fragment long de 1000 bases L= 1000, f= 0,5 (par exemple, bromure d'éthidium), b= 30 Pour N= 1, g= 15 000, c= 122,474 et R= 2,45 % La résolution varie comme Ni Pour N= 1000, a= 3,87 et R= 0,0775 % Mesurer la taille de 10, 100 ou même 10 000 fragments identiques n'est pas un problème. Il y a bien plus que 10 000 fragments dans une bande d'électrophorèse typique Donc, on peut voir que la résolution peut être bien meilleure que 1 % sur un fragment de 100 000 pb, alors qu'une résolution de seulement 10-20 % pourrait être escomptée pour la séparation de fragments dans la zone de 100 000 pb par électrophorèse sur gel et la résolution se dégrade davantage au fur et à mesure que la longueur du fragment s'accroit. La cartographie de l'ADN selon la présente invention peut aussi être faite très rapidement Une carte d'ADN typique par électrophorèse a environ 50 bandes A 1000 fragments par bande, 50 bandes exigerait seulement environ 8,3 minutes pour développer une carte avec une vitesse d'analyse des fragments de 100 fragments par seconde Si seulement une bande unique est exigée pour la résolution souhaitée, le temps d'analyse serait seulement d'environ 1 seconde Si la résolution souhaitée exige 100 fragments par bande, alors l'analyse de 50 bandes prendrait seulement environ 50 secondes. Dans une adaptation de la présente invention, des sondes d'hybridation peuvent être liées aux fragments de restriction de l'ADN et associées à des longueurs différentes des fragments Les sondes d'hybridation contiennent traditionnellement un colorant de la sonde et sont hybridées avec des fragments d'ADN par appariement de paires de bases provenant du morceau d'ADN qui est étudié L'excitation des fragments d'ADN hybridés peut ensuite être conçue pour exciter à la fois le colorant de mesure de la taille et le colorant de la sonde, de telle sorte qu'une corrélation des sorties de fluorescence associe la sonde à diverses longueurs de fragments L'hybridation d'une sonde à l'ADN in situ est examinée dans Methods in Cell Biolocry, Vol 33, de Z. Darzynkiewicz et al Ed, Academic Press, Inc (New York, 1990), Chapter 37, "Fluorescence In Situ Hybridization with DNA Probes", pp 383. En plus de la détermination de longueur, il est possible de déduire des informations grossières sur la composition en bases à partir des brins d'ADN Par exemple, le colorant de Hoechst spécifique de l'ADN se lie de préférence à des régions de l'ADN riches en éléments AT et la chromomycine se lie de préférence à des régions riches en éléments GC En excitant la fluorescence de ces deux colorants, comme il est fait dans l'analyse des chromosomes à deux variables (voir, de Langlois, Supra), les rapports AT/GC pour des fragments peuvent être déterminés Ce rapport fournit des informations de cartographie supplémentaires, en plus de la longueur desfragments D'autres colorants de liaison avec différentes spécificités pour les séquences peuvent être utilisés pour la caractérisation desbasesdes fragments. De plus, la synthèse d'un morceau d'ADN en présence de précurseurs nucléotides marqués par fluorescence marquera le morceau d'ADN en fonction de sa composition en bases et cette information peut être associée ultérieurement à l'analyse par fluorescence de la longueur des fragments. Par exemple, la réplication d'un morceau d'ADN en utilisant trois nucléotides normaux et un nucléotide C marqué par fluorescence donnera donc des informations concernant le nombre de nucléotides G dans le morceau original, puisque les nucléotides C marqués se lieront seulement aux nucléotides G. Une capacité additionnelle du système peut être fournie en utilisant divers systèmes de tri associés aux cytomètres en flux Voir, par exemple, le brevet des Etats-Unis NO 3,710,933, supra, et Flow C Vtometrv and Sorting, supra Une capacité de tri permet de trier une taille de fragment ou plus à partir du flux pour un traitement ou une étude additionnel(le) Si des sondes d'hybridation sont utilisées, le tri peut séparer les fragments hybridés du flux. Un appareil de tri traditionnel, tel que décrit dans le brevet des EtatsUnis NO 3,710,933 et dans, de T Lindmo, "Flow Sorters for Biological Cells", Flow Cvtometry and Sortinq Second Edition, Ed; M Melamed et al. , pp 145-169, John Wiley & Sons ( 1990), utilise les signaux de sortie de fluorescence décrits ci-dessus. Après que les fragments sont passés à travers le volume d'excitation pour générer la sortie, le flux hydrodynamique est brisé en gouttelettes par, par exemple, des vibrations ultrasonores, chaque goutte ne contenant pas plus d'un fragment Les gouttes contenant des fragments d'ADN qui ont une réponse de fluorescence choisie à une excitation sont chargées par l'application d'une impulsion de tension élevée à travers les gouttes, qui passent ensuite à travers des plaques chargées qui génèrent un champ électrostatique pour dévier sélectivement les gouttes chargées La charge appliquée aux gouttes choisies est contrôlée par des éléments de circuit qui sont sensibles aux émissions de fluorescence provenant du volume d'excitation dans le cytomètre en flux, o l'impulsion de charge est activée pour produire une déviation de gouttes contenant une matière émettant de la fluorescence à une longueur d'onde et une intensité choisies. Bien que la description ci-dessus a concerné des morceaux d'ADN, le processus est également applicable à des brins d'ARN Toute référence à l'ADN dans ce cas devra être interprétée pour inclure l'ARN De même, la forme du signal détecté est enseignée comme étant de la fluorescence Cependant, toute forme d'émission lumineuse peut être obtenue, en fonction du colorant spécifique, de sorte que le terme "fluorescence" devra être interprété pour inclure la phosphorescence et la luminescence De plus, l'ADN ou l'ARN cartographié peut ne pas provenir obligatoirement d'un être humain, puisque tous les organismes ont un génome qui détermine leurs caractéristiques spécifiques. La description précédente des modes de réalisation préférés de l'invention a été présentée à des fins d'illustration et de description Elle n'est pas destinée à être exhaustive ou à limiter l'invention à la forme précise décrite et, évidemment, de nombreuses modification et variations sont possibles à la lumière de l'enseignement ci-dessus Les modes de réalisation ont été choisis et décrits afin de mieux expliquer les principes de l'invention et son application pratique, pour permettre par ce moyen aux experts en la matière de mieux utiliser l'invention dans divers modes de réalisation et avec diverses modifications selon ce qui convient pour l'utilisation particulière envisagée Le cadre de cette invention est intentionnellement défini par les revendications qui y sont annexées. REVENDICATIONS 1 Procédé pour mesurer la taille de fragments d'ADN, chacun contenant un certain nombre de nucléotides, par fluorescence induite, comprenant les étapes de: fragmentation d'un morceau d'ADN à des sites choisis à l'avance dans ledit morceau d'ADN pour produire une pluralité de fragments d'ADN; coloration dudit morceau d'ADN ou desdits fragments d'ADN avec un premier colorant efficace pour colorer de façon stoechiométrique lesdits nucléotides; et examen de la fluorescence desdits fragments d'ADN après la coloration pour générer un signal d'intensité de la fluorescence à partir dudit premier colorant, qui est fonctionnellement en rapport avec le nombre de nucléotides dans chacun desdits fragments d'ADN. 2 Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape de fragmentation dudit morceau d'ADN comprend l'étape de soumission dudit morceau à une enzyme de restriction choisie pour cliver ledit morceau à une combinaison connue de paires de bases. 3 Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape de fragmentation dudit morceau d'ADN inclut les étapes de: liaison d'une séquence choisie d'ADN audit morceau d'ADN pour identifier des sites choisis le long dudit morceau; et clivage dudit morceau d'ADN auxdits sites choisis pour former ladite pluralité de fragments d'ADN. 4 Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape de coloration dudit morceau d'ADN ou desdits fragments d'ADN avec un premier colorant inclut l'étape d'addition dudit morceau d'ADN ou desdits fragments d'ADN à une solution contenant un colorant choisi à partir du groupe consistant en bromure d'éthidium, acridine orange, iodure de propidium, DAPI, Hoechst, chromomycine, mithramycine, 9-amino-acridine et acridine d'éthidium hétérodyne. Procédé selon la revendication 2, dans lequel l'étape de coloration dudit morceau d'ADN ou desdits fragments d'ADN avec ledit premier colorant inclut l'étape d'addition desdits fragments d'ADN à une solution contenant un colorant choisi à partir du groupe consistant en bromure d'éthidium, acridine orange, iodure de propidium, DAPI, Hoechst, chromomycine, mithramycine, 9-amino-acridine et acridine d'éthidium hétérodyne. 6 Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'étape de coloration dudit morceau d'ADN ou desdits fragments d'ADN avec ledit premier colorant inclut l'étape d'addition desdits fragments d'ADN à une solution contenant un colorant choisi à partir du groupe consistant en bromure d'éthidium, acridine orange, iodure de propidium, DAPI, Hoechst, chromomycine, mithramycine, 9-amino-acridine et acridine d'éthidium hétérodyne. 7 Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape de l'examen de la fluorescence desdits fragments d'ADN inclut les étapes de: formation d'un flux desdits fragments d'ADN en série espacés les uns des autres dans ledit flux; illumination dudit flux avec un laser efficace pour causer la fluorescence dudit premier colorant; et mesure de l'intensité de la fluorescence totale provenant de chacun desdits fragments d'ADN dans ledit flux. 8 Procédé selon la revendication 7, dans lequel ladite étape de mesure de ladite intensité de la fluorescence totale inclut de plus l'étape de différentiation des molécules de colorant liées auxdits fragments d'ADN des molécules de colorant non liées. 9 Procédé selon la revendication 2, dans lequel l'étape de l'examen de la fluorescence desdits fragments d'ADN inclut les étapes de: formation d'un flux desdits fragments d'ADN en série espacés les uns des autres dans ledit flux; illumination dudit flux avec un laser efficace pour causer la fluorescence dudit premier colorant; et mesure de l'intensité de la fluorescence totale provenant de chacun desdits fragments d'ADN dans ledit flux. 10 Procédé selon la revendication 9, dans lequel ladite étape de mesure de ladite intensité de la fluorescence totale inclut de plus l'étape de différentiation des molécules de colorant liées auxdits fragments d'ADN des molécules de colorant non liées. 11 Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'étape de l'examen de la fluorescence desdits fragments d'ADN inclut les étapes de: formation d'un flux desdits fragments d'ADN en série espacés les uns des autres dans ledit flux; illumination dudit flux avec un laser efficace pour causer la fluorescence dudit premier colorant; et mesure de l'intensité de la fluorescence totale provenant de chacun desdits fragments d'ADN dans ledit flux. 12 Procédé selon la revendication 11, dans lequel ladite étape de mesure de ladite intensité de la fluorescence totale inclut de plus l'étape de différentiation des molécules de colorant liées auxdits fragments d'ADN des molécules de colorant non liées. 13 Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'étape de l'examen de la fluorescence desdits fragments d'ADN inclut les étapes de: formation d'un flux desdits fragments d'ADN en série espacés les uns des autres dans ledit flux; illumination dudit flux avec un laser efficace pour causer la fluorescence dudit premier colorant; et mesure de l'intensité de la fluorescence totale provenant de chacun desdits fragments d'ADN dans ledit flux. 14 Procédé selon la revendication 13, dans lequel ladite étape de mesure de ladite intensité de la fluorescence totale inclut de plus l'étape de différentiation des molécules de colorant liées auxdits fragments d'ADN des molécules de colorant non liées. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'étape de l'examen de la fluorescence desdits fragments d'ADN inclut les étapes de: formation d'un flux desdits fragments d'ADN en série espacés les uns des autres dans ledit flux; illumination dudit flux avec un laser efficace pour causer la fluorescence dudit premier colorant; et mesure de l'intensité de la fluorescence totale provenant de chacun desdits fragments d'ADN dans ledit flux. 16 Procédé selon la revendication 15, dans lequel ladite étape de mesure de ladite intensité de la fluorescence totale inclut de plus l'étape de différentiation des molécules de colorant liées auxdits fragments d'ADN des molécules de colorant non liées. 17 Procédé selon la revendication 6, dans lequel l'étape de l'examen de la fluorescence desdits fragments d'ADN inclut les étapes de: formation d'un flux desdits fragments d'ADN en série espacés les uns des autres dans ledit flux; illumination dudit flux avec un laser efficace pour causer la fluorescence dudit premier colorant; et mesure de l'intensité de la fluorescence totale provenant de chacun desdits fragments d'ADN dans ledit flux. 18 Procédé selon la revendication 17, dans lequel ladite étape de détection de ladite fluorescence totale inclut de plus l'étape de différentiation des molécules de colorant liées auxdits fragments d'ADN des molécules de colorant non liées. 19 Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'étape de différentiation desdites molécules de colorant inclut les étapes de: coloration desdits oligonucléotides de l'ADN avec un deuxième colorant efficace pour un transfert d'énergie audit premier colorant; excitation dudit deuxième colorant pour un transfert d'énergie audit premier colorant; et mesure de l'intensité de la fluorescence provenant dudit premier colorant pour sortir un signal fonctionnellement en rapport avec la taille dudit fragment d'ADN. Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'étape de différentiation desdites molécules de colorant inclut les étapes de: excitation dudit premier colorant avec une source polarisée; et détection de la fluorescence provenant dudit premier colorant à travers un filtre polarisant orienté dans une direction de polarisation parallèle à la polarisation de ladite source polarisée. 21 Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'étape de différentiation desdites molécules de colorant inclut les étapes de: réglage d'une première fenêtre de détection en rapport avec la durée de vie de la fluorescence des molécules de colorant qui ne sont pas liées auxdits fragments d'ADN; réglage d'une deuxième fenêtre de détection après ladite première fenêtre de détection et en rapport avec la durée de vie de la fluorescence desmolécules de colorant qui sont liées auxdits fragments d'ADN; et mesure de l'intensité de la fluorescence totale détectée dans ladite deuxième fenêtre. 22 Procédé selon la revendication 1, incluant de plus les étapes de: formation de sondes d'hybridation ayant une séquence de nucléotides prédéterminée avec un marqueur coloré fluorescent; hybridation desdites sondes d'hybridation auxdits fragments d'ADN; et examen de la fluorescence desdits marqueurs colorés fluorescents pour déterminer l'association desdites sondes à la taille desdits fragments. 23 Procédé selon la revendication 1, incluant de plus l'étape de tri desdits fragments d'ADN colorés en fonction dudit signal d'intensité de la fluorescence. 24 Procédé selon la revendication 1, incluant de plus les étapes de: coloration dudit brin d'ADN ou desdits fragments d'ADN avec un troisième colorant qui se lie à des oligonucléotides choisis; et examen de la fluorescence desdits fragments d'ADN pour les émissions provenant dudit troisième colorant, pour rapporter la teneur en lesdits oligonucléotides choisis à la taille desdits fragments.