FR 2673632 A1 19920911 FR 9102804 A 19910308 L'invention concerne un procédé de préparation d'un concentré de facteur von Willebrand humain de grande pureté et à très haute activité spécifique, destiné notamment à un usage thérapeutique. Le facteur von Willebrand (fv W)est la plus grande molécule en circulation dans le plasma Il est constitué d'un ensemble de sous- unités dont l'élément de base a un poids moléculaire voisin de 260 kilodaltons (K Da) et qui forme des polymères dont le poids moléculaire peut atteindre 20 millions de daltons Ce facteur joue un rôle essentiel dans l'hémostase par deux fonctions distinctes: comme protéine d'adhésion il permet l'adhérence des plaquettes sanguines au sous- endothelium vasculaire (et participe ainsi au processus de cicatrisation rapide des vaisseaux lésés) et, d'autre part, il assure le transport du Facteur VIII dans la circulation sanguine. Une déficience congénitale en fv W ou une anomalie structurale de ce facteur entraine la maladie de Willebrand qui se manifeste par des hémorragies surtout cutanées et des muqueuses Cette maladie est très hétérogène dans son expression clinique et pose de graves problèmes en cas d'intervention chirurgicale Le traitement de la maladie de Willebrand s'impose pour corriger les anomalies de l'hémostase primaire (temps de saignement) et de la coagulation (temps de céphaline activée et activité coagulante du Facteur VIII). La maladie se traite par thérapie de substitution par des dérivés de plasma humain enrichis en fv W (par exemple la fraction cryoprécipitée du plasma ou des concentrés de Facteur VIII contenant suffisamment de fv W associé à celui-ci). Toutefois les fractions peu purifiées de plasma sanguin ne sont pas exemptes de risques de contamination virale parce qu'elles sont difficiles à stériliser et, en outre, elles entraînent une surcharge en protéines contaminantes dont le patient n'a pas besoin et qui peuvent entraîner des réactions immunologiques après des injections multiples. Le Facteur VIII purifié, au contraire, peut être parfaitement stérilisé mais son procédé de purification a été optimisé en vue du traitement de l'hémophilie A et non en vue de la production du fv W. Ainsi les procédés de préparation du Facteur VIII récemment mis au point sont de plus en plus performants et produisent des concentrés qui ne contiennent plus suffisamment de fv W pour être efficaces dans le traitement de la maladie de Willebrand. C'est pour combler ce besoin que la Demanderesse a mis au point un nouveau procédé de purification du facteur von Willebrand qui permet de rentabiliser au mieux l'extraction de diverses molécules plasmatiques En particulier il permet, dans une étape, la préparation d'un concentré de Facteur VIII (selon un procédé décrit dans la demande de brevet européen 89 400348 2) et, ultérieurement, d'un concentré de facteur von Willebrand de très haute pureté. La complexité de la molécule du facteur von Willebrand rend sa préparation très difficile Des méthodes de purification à petite échelle, dans des buts d'étude analytique ont déjà été décrites mais ces méthodes n'ont pas pu être adaptées à l'échelle industrielle (Thorell et al. Thromb Res 35, 1984, 431-450). Le facteur von Willebrand a été purifié par solubilité différentielle sur des composés sulfatés, en présence de glycine (Berntorp etal Vox Sang 56, 1989, 212- 217; Winkelman et al Vox Sang 57, 1989, 97-103) et par différentes méthodes de séparations chromatographiques, par tamisage moléculaire (Perret et al Haemostasis 14, 1984, 289-295) ou par échange -d'ions (Austen et al Thromb Haemostas 48, 1982, 46-48; Harrison et al Thromb Res 50, 1988, 295-304), mais ces techniques montrent d'assez faibles rendements en facteur von Willebrand ou une faible capacité du gel ce qui les rendent moins intéressantes pour une application industrielle. De plus l'activité spécifique de ces produits peut être faible ce qui indique la présence de formes dénaturées et inactives à côté des formes multimériques actives, ce qui les rend moins efficaces pour un usage thérapeutique dans la maladie de Willebrand. La présente invention concerne un procédé de préparation de concentré de facteur von Willebrand à usage thérapeutique, ledit procédé permettant de préparer des lots standardisés dérivant chacun de très grands volumes de plasma ( 4000 litres ou plus). Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un concentré de facteur von Willebrand qui comprend la combinaison de trois étapes successives de chromatographie Le matériau de départ est la fraction cryoprécipitée du plasma humain, soumise à une étape classique de prépurification par adsorption sur hydroxyde d'aluminium Ce matériau est ensuite soumis à une inactivation virale, par exemple par un traitement par solvant-détergent, avant sa purification. Le procédé de purification selon la présente invention comprend une combinaison de trois étapes successives de chromatographie, les deux premières étant des chromatographies d'échanges d'ions et la troisième étant une chromatographie d'affinité. Les deux chromatographies d'échanges d'ions sont effectuées sur la même résine de polymère vinylique greffé de groupements DEAE, plus particulièrement sur des colonnes de DEAE-Fractogel(M) (Merck), équilibrées avec du tampon comprenant du citrate trisodique 0,01 M, du chlorure de sodium 0,11 M, du chlorure de calcium 0,001 M, de la glycine 0,12 M et de la lysine 0,016 M. La fraction cryoprécipitée du plasma, prépurifiée et ayant subi un traitement d'inactivation virale, est appliquée sur la première colonne de chromatographie qui retient une grande partie du facteur von Willebrand Celui-ci est ensuite élué par une augmentation de la concentration de chlorure de sodium du tampon à 0,15 M. La fraction ainsi éluée, enrichie en facteur von Willebrand, est appliquée sur la deuxième colonne de chromatographie, dans les mêmes conditions que sur la première Le fraction injectée sur cette deuxième colonne étant déjà débarrassée de beaucoup de contaminants, la capacité d'absorprion du fv W sur la colonne est beaucoup plus grande (puisqu'il n'y a plus de compétition pour les sites d'adsorption) Après élimination du filtrat et rinçage de la colonne avec le tampon d'équilibrage, le fv W adsorbé est élué par une augmentation de la concentration de chlorure de sodium du tampon à 0,17 M. La fraction ainsi éluée est soumise à une chromatographie d'affinité sur colonne de gélatine- sépharose, dans le même tampon d'équilibrage; cette colonne retient les molécules de fibronectine résiduelle qui contaminaient encore le fv W. Le facteur von Willebrand hautement purifié passe dans le filtrat et peut être directement conditionné et lyophylisé, sans addition d'autre agent stabilisant. Le concentré de facteur von Willebrand obtenu par le procédé selon la présente invention présente un taux de purification de > 10 000 fois par rapport au plasma de départ et son activité spécifique est de 345 U CBA/mg de protéines (unités de mesure de l'activité de liaison du collagène) et de > 100 U R Co/mg de protéines (unités d'activité de cofacteur de ristocétine). L'amélioration de la qualité du produit au cours des étapes successives de purification a été surveillée tout particulièrement par la proportion des molécules à l'état de multimères de haut poids moléculaire (c'est-à- dire des formes moléculaires à haute activité biologique) L'analyse révèle un enrichissement progressif en multimères qui représentent 79 % du fv W dans la préparation finale, par rapport à 70 % dans le plasma natif et alors que la cryoprécipitation en fait perdre la moitié De manière inattendue, c'est la chromatographie sur DEAE-Fractogel(R) qui favorise cette rétention sélective des multimères de très grande taille et élimine dans le filtrat les formes de petite taille, de structure anormale (ayant subi une protéolyse partielle) et de faible activité. Le concentré de fv W de grande pureté et haute activité spécifique obtenu par le procédé selon la présente invention est donc particulièrement bien adapté à un usage thérapeutique dans les différentes formes de la maladie de Willebrand. Des tests in vitro ont confirmé l'identité de ses propriétés biochimiques et physiologiques avec celles de la molécule native, en particulier, -sa capacité de fixer les plaquettes sanguines dans un dispositif de perfusion, et -sa capacité de se lier au Facteur VIII. Des tests cliniques préliminaires ont montré que ce concentré (additionné ou non du Facteur VIII en fonction de la nature de la déficience du patient à traiter) entraînait un raccourcissement efficace du temps de saignement au cours des épisodes hémorragiques. La haute pureté du concentré de facteur von Willebrand obtenue par le procédé selon la présente invention permet également d'envisager son application dans divers usages de laboratoire (d'analyse fine de structure, d'étude de fonctionalité, de diagnostic) et de production d'anticorps. Le concentré selon la présente invention peut également être utilisé comme stabilisant au cours de la production du Facteur VIII par des cellules transformées par génie génétique et au cours des étapes de purification du Facteur VIII ainsi produit. L'exemple suivant illustre un mode de réalisation de la présente invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE Matériau de départ. Le cryoprécipité est préparé à partir de plasma frais récolté en présence de citrate de sodium ( 4 %) et congelé au plus tard 6 heures après son prélèvement Le plasma est congelé à -60 'C puis conservé à - 350 C Les lots de plasma contiennent de 1800 à 2000 litres et sont rassemblés par lots de 4000 litres pour chaque mise en ouvre du procédé En vue de la décongélation, le plasma est placé dans une chambre à -70 C pendant 24 heures pour assurer un réchauffement lent et régulier puis il est dégelé dans une enceinte thermostatée à O 20 C, sous agitation constante. Le cryoprécipité (qui représente environ 9 g/litre de plasma) est récupéré par centrifugation à froid. Après centrifugation, le cryoprécipité récupéré est remis en solution et adsorbé sur hydroxyde d'aluminium pour éliminer les principaux contaminants, c'est-à-dire les composants du complexe prothrombinique (particulièrement le Facteur VII), le Facteur XII Le surnageant est ensuite refroidi (ce qui élimine en partie le fibrinogène et la fibronectine). Ce traitement permet une récupération de 80 à 86 % du mélange Facteur VIII facteur von Willebrand du cryoprécipité; l'activité spécifique du Facteur VIII est de 0,7 UI/mg et celle du fv W de 0,6 U R Co/mg (activité cofacteur de ristocétine) et de 1,2 U CBA/mg (activité de liaison du collagène). Traitement d'inactivation virale. La solution contenant le Facteur VIII facteur von Willebrand est soumise à un traitement par solvant- détergent connu pour son efficacité contre les virus à enveloppe lipidique (Horowitz et al, 1985, Trasfusion, 25, 516-522) et qui comprend une incubation de 8 heures à 250 C en présence de 0,3 % tri-n- butyl phosphate (Tn BP) et de 1 % de Tween 80. Après ce traitement on retrouve 95 % de l'activité des Facteurs VIII et von Willebrand mesurée à l'étape précédente L'électrophorèse permet de contrôler que le fv West toujours sous forme multimérique. Procédé de séparation chromatogranhique. La purification du facteur von Willebrand apparaît comme une dérivation du procédé de purification du Facteur VIII décrit par la Demanderesse dans la demande de brevet européen 89 400 348 2. La première chromatographie est réalisée sur une colonne de DEAEFractogel TSK 650 (M) (Merk) Le tampon d'équilibrage contient du citrate trisodique ( 0,01 M), du chlorure de calcium ( 0,001 M),de la glycine ( 0,12 M) et de la L-lysine ( 0,016 M) Le facteur von Willebrand, le Facteur VIII et la fibronectine sont retenus par la colonne; les protéines contaminantes (principalement le fibrinogène) faiblement ou pas fixées par la colonne et les résidus du traitement d'inactivation virale sont éliminés par plusieurs lavages successifs avec le même tampon. La colonne est utilisée avec une vitesse de flux linéaire de 100 cm/heure. Dans ces conditions d'utilisation, la colonne utilisée présente une capacité de rétention du fv W de environ 75 % (mesuré sous forme d'antigène, Ag), le reste étant perdu dans le filtrat. Cette capacité de fixation correspond à 45 U d'Ag fv W/mg de gel. Le facteur von Willebrand est désorbé de la colonne par une augmentation de la concentration en Na Cl du tampon à 0,15 M La fraction de fv W récoltée contient 30 à % du fv W initial mais 40 % de celui-ci reste co-adsorbé avec le Facteur VIII et sera co-élué avec celui-ci par une seconde augmentation de la concentration du tampon à 0, 25 M et sera co-purifié avec celui-ci. La fraction contenant le fv W élué de cette première colonne est réinjectée sur une seconde colonne, identique à la première et dans les mêmes conditions. La fraction injectée étant déjà débarrassée de contaminants et du Facteur VIII qui entraient en compétition pour la capacité de fixation de la première colonne, on observe pour la seconde une capacité de fixation de 320 U d'Ag fv W/ml de gel. Le fv W adsorbé est élué par une augmentation de la concentration en Na Cl du tampon à 0,17 M. Cette deuxième chromatographie permet un facteur de concentration de 8 à 10 fois par rapport à la précédente ce qui évite des étapes supplémentaires de concentration par ultrafiltration, par exemple Dans les différents systèmes de mesure habituels, l'éluat contient les taux ou activités de fv W suivants: antigène (Ag) 119 + 12 U/ml cofacteur de ristocétine: 101 + 17 U/ml capacité de fixation au collagène (CBA): 186 + 15 U/ml. Le rapport CBA/Ag de 1,56 montre que l'activité du fv W est bien préservée. L'analyse électrophorétique de cet éluat du fv W révèle la présence d'une légère contamination par de la fibronectine et de l'inter-alpha trypsine inhibiteur (ITI). Il est soumis à une troisième étape de purification sur colonne de gélatine-Sepharose CL 4 B (Pharmacia) équilibrée avec le tampon d'élution de la colonne précédente. Cette étape de chromatographie d'affinité a une capacité de rétention de la fibronectine de > 5 mg/ml ce qui permet de réduire ce contaminant à des quantités indétectables ( Le fv W purifié se retrouve dans le filtrat de cette dernière étape et peut être directement conditionné et lyophilisé. l'analyse électrophorétique ne détecte plus aucun contaminant, le contenu en fv W est de 205 U Ag/mg de protéine, son activité spécifique est de 345 U CBA/mg de protéine et 180 U R Co/mg de protéine. Le degré total de purification par rapport au plasma initial est de > 10 000 fois. Le fv W obtenu en fin de purification est constitué à 60 à 80 % de multimères de haut poids moléculaire, c'est-à-dire un taux comparable à celui du plasma de départ qui est de 70 %. La stabilité du concentré a été étudiée à l'état liquide à température ordinaire pendant 24 heures: on ne détecte aucune trace de protéolyse ni de changement d'activité spécifique. L'absence totale d'activité thrombogène du concentré a été contrôlée par les tests classiques (NAPTT) et l'absence totale de thrombine, de PKA et de kallikréine a été démontrée. Le concentré final obtenu ne nécessite aucune addition de stabilisant. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un concentré du facteur von Willebrand humain à partir d'une fraction cryoprécipitée de plasma, prépurifiée sur hydroxyde d'aluminium, caractérisé en ce qu'il comprend une combinaison de trois étapes successives de séparation chromatographique, les deux premières étant des chromatographies d'échange d'ions sur une résine de type polymère vinylique à larges pores portant des groupements DEAE et la troisième étant une chromatographie d'affinité sur gélatine-sépharose. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les deux chromatographies d'échange d'ions sont réalisées sur colonnes de DEAEfractogel(M) équilibrées avec du tampon comprenant du citrate trisodique 0,01 M, du chlorure de sodium 0,11 M, du chlorure de calcium 0,001 M, de la glycine 0,12 et de la lysine 0,016 M. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la fraction cryoprécipitée et prépurifiée de plasma est appliquée sur la première colonne de chromatographie et que le facteur von Willebrand qui s'est adsorbé sur celle-ci est élué par une augmentation de la concentration de chlorure de sodium du tampon à 0,15 M. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'éluat de la première chromatographie, enrichi en facteur von Willebrand, est appliqué sur la deuxième colonne de chromatographie et que le facteur von Willebrand qui s'est adsorbé sur celle-ci est élué par une augmentation de la concentration de chlorure de sodium du tampon à 0,17 M. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'éluat de la deuxième chromatographie, enrichi en facteur von Willebrand, est appliqué sur une colonne de chromatographie de gélatine- sépharose équilibrée dans le même tampon que le tampon d'élution précédent et qui adsorbe par affinité sélective la fibronectine résiduelle. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le facteur von Willebrand présent dans le filtrat de la colonne de gélatine-sépharose est récolté, conditionné et lyophilisé. 7. Concentré de facteur von Willebrand de très grande pureté et à haute activité spécifique obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8. Concentré de facteur von Willebrand selon la revendication 7, caractérisé par un rapport activité (mesuré en unités CBA) sur quantité d'antigène au moins égal à 1,5. 9. Concentré de facteur von Willebrand selon la revendication 7 ou 8, constitué à plus de 60 à 80 % par des formes multimériques de haut poids moléculaire.