FR 2674026 A1 19920918 FR 9203059 A 19920313 La présente invention concerne des méthodes de dosage biospécifique dans lesquelles des réactifs spécifiques sont utilisés dans des réactions biospécifiques (réactions de bio- affinité). L'invention concerne également un produit destiné à ces dosages biospécifiques, qui peut être par exemple une plaque formée d'une ou de plusieurs parties intégrées ensemble en une plaque et contenant une ou plusieurs rangées, contenant chacune le même nombre de puits. Arrière-plan technologique de l'invention Il existe une demande continue pour des méthodes de dosage immunochimique rapides prêtes à l'emploi sur le marché. Les méthodes de dosage radioimmunologique convention- ne L Les sont d'abord conduites en solution utilisant des tubes à essais et des méthodes de séparation compliquées Après l'introduc- tion des techniques en phase solide sur le marché, différents agents de marquage ont remplacé les radioisotopes et spécialement des anticorps monoclonaux ont été appliqués dans une mesure de plus en plus croissante. Ces améliorations ont diversifié les méthodes de dosage immunologique conventionnelles (par exemple voir dosage immunolo- gique alternatif, Ed W P Collins, Wiley, Chichester 1985) Les dosages en phase solide sont devenus des méthodes de routine dans le domaine des dosages compétitifs et non compétitifs et le tube à essai traditionnel a souvent été remplacé par des phases solides alternées En 1984, une plaque de microtitrage a été introduite en tant que phase solide pour les dosages d'hormones de routine lorsque Wallac Oy (Turku, Finlande) a introduit sa technologie de DELFIA sur le marché Des phases solides similaires ont été appliquées ultérieurement par d'autres entreprises commerciales (par exemple Amerlite, Amersham International U K) pour des tests de routine correspondants, même lorsqu'elles sont basées sur d'autres techniques de marquage Les méthodes de dosage immuno- logique basées sur l'uti Lisation des plaques de microtitrage employaient jusqu'à présent la plaque soit comme réceptacle seu- lement, soit comme phase solide pour un composant de dosage immobilisé Tous Les autres composants de dosage doivent être ajoutés individuellement dans les puits individuels de microtitrage de la plaque Comme conséquence, les produits commerciaux (Kits) basés sur les modes de réalisation de plaque de microtitrage doivent contenir une pluralité de plusieurs récipients (bouteilles) qui contiennent les composants requis par le dosage La quantité des composants dépend bien entendu des dosages et de leur principe Toutefois, un utilisateur doit toujours conduire plusieurs étapes de travail et plusieurs opérations de pipettage en vue d'effectuer le dosage. Ces facteurs rendent les dosages immunologiques à base de plaque de microtitrage difficiles à utiliser et à automatiser Par conséquent, des proprositions ont été faites pour incorporer chaque composant spécifique de la réaction biospécifique dans le même produit, de préférence sur la même tache par exemple dans un tube à essai ou dans un puits d'une plaque de microtitrage Ces propo- sitions sont présentées par exemple dans les brevets U S. o o n 4 017 597 et 4 162 003 et dans le brevet Finlandais N 84301. La combinaison des réactifs est basée sur la cryodessication d'un second réactif ajouté sur la tache sur laquelle un premier réactif a été préalablement immobilisé La fabrication de ces produits requiert une installation de cryodessication, et dans Les cas o le second réactif est ajouté sous la forme d'une solution sur l'autre réactif, des mesures spéciales doivent être prises en vue d'effectuer une cryodessication rapide Le brevet Finlandais 84301 propose l'addition du second réactif sous forme obtenue par cryo- dessication de particules sphériques La fabrication de ces particules requiert des méthodes spéciales et une installation de cryodessication. Sommaire de l'invention La présente invention fournit une méthode de dosage et un produit pour la mise en oeuvre de la méthode qui ne requiert pas de mesures spéciales pour combiner les réactifs d'une réaction biospécifique sur la même tache avant le dosage La méthode confor- mément à l'invention est caractérisée essentiellement en ce que l'échantillon d'essai est ajouté à une tache de réaction tandis que le second réactif biospécifique est à l'état sec sur un support solide qui est séparé de la phase solide de la tache contenant le premier réactif biospécifique Le support solide est insoluble dans l'eau mais est capable d'absorber une solution aqueuse contenant le réactif biospécifique et capable de libérer ce composant pour la réaction biospécifique lorsqu'un milieu, tel qu'un tampon ensemble avec l'échantillon est ajouté sur le support Le produit confor- mément à l'invention est caractérisé en ce que le second réactif de la réaction biospécifique est à L'état sec sur un support solide placé sur la tache de réaction contenant le premier réactif bio- spécifique en phase solide La fabrication de ces produits par exemple sous la forme de plaques de microtitrage est facile et le fait d'amener le second réactif biospécifique à un état non réactif est facilement réalisé par imprégnation du support, qui peut être un matériau approprié absorbant un milieu liquide contenant le second réactif biospécifique, après quoi le support est séché et placé sur la tache de réaction, telle que le puits d'une plaque de microtitrage au sommet de la phase solide. Plus particulièrement, la présente invention concerne une méthode de dosage biospécifique telle qu'une méthode de dosage immunologique spécifique, une méthode de dosage d'hybridisation de l'acide nuc Léonique ou une méthode de dosage d'un récepteur, utilisant des réactifs qui sont spécifiques pour une réaction biospécifique avec un premier réactif biospécifique dans une phase solide, ledit dosage étant conduit par addition d'un échantillon sur une tache de réaction qui contient ledit premier réactif dans une phase solide prête à l'emploi et un second réactif bio- spécifique de la réaction biospécifique séchée sur la même tache de réaction pour être prête à l'emploi, caractérisée en ce que la tache de réaction contient le second composant biospécifique à l'état séché sur un support qui est séparé de la phase solide et insoluble à l'échantillon liquide ajouté sur la tache, et ensuite le second composant biospécifique est libéré du support pour effectuer le dosage. Les composants spécifiques incluent un composant marqué capable de donner une indication mesurable de La réaction, la mesure étant conduite dans la tache de réaction par fluorométrie, telle que fluorométrie à temps de résolution, photométrie, luminométrie, ou par compteur à rayons gamma ou bêta. La présente invention concerne plus particulièrement un produit à utiliser dans les dosages biospécifiques, tels que dosage immunologique spécifique, dosage dihybridisation d'acide nucléonique ou dosages de récepteur ayant une tache de réaction contenant un premier réactif de la réaction biospécifique dans une phase solide et un second réactif de la réaction biospécifique sur la même tache de réaction, ledit réactif biospécifique étant séché sur la tache de réaction pour être prêt à l'emploi, ladite tache étant prévue pour l'addition d'un échantillon pour effectuer la réaction biospécifique, caractérisé en ce que le second réactif biospécifique est séché sur un support qui est séparé de la phase solide et est insoluble à un échantillon liquide ajouté sur la tache. Le support séparé peut être un matériau capable d'absorber une solution aqueuse, tel qu'un matériau filtrant de cellulose, de matière plastique, de nitrocellulose ou de fibres de verre. Par ailleurs, le produit est sous la forme d'une plaque de microtitrage contenant une pluralité de puits formant lesdites taches de réaction pour la réaction biospécifique. Description détaillée de l'invention L'invention sera décrite en plus amples détails dans ce qui suit en référence aux dessins ci-joints sur lesquels: la figure 1 montre une plaque de microtitrage confor- mément à l'invention. La figure 2 montre une autre plaque de microtitrage conformément à l'invention. La figure 3 montre une courbe standard et une courbe de reproductibilité d'un dosage de h TSH automatisé. La figure 4 montre la relation entre un dosage DELFIA traditionnel employant un kit de réactifs dans des récipients externes et un dosage à plaque de microtitrage prête à l'emploi (TSH, à accès sélectif, c'est-à-dire RAS-TSH). La figure 5 montre la courbe standard () et la courbe de reproductibilité (+) d'un dosage de T 4 automatique. La figure 6 montre la relation entre un dosage RIA con- ventionnel commercial employant des tubes à essais et un kit de réactifs dans des récipients externes et entre un dosage à plaque de microtitrage prête à l'emploi (RAS-T 4). La figure 7 montre la courbe standard et la courbe de reproductibilité d'un dosage de h TSH. La figure 8 montre la courbe standard et la courbe de reproductibilité d'un dosage de 17-x-OH-progestérone. La figure 9 montre la courbe standard et la courbe de reproductibilité d'un dosage de h CG. Une plaque de microtitrage prête à l'emploi pour un dosage spécifique est fabriquée par revêtement des puits de la plaque par un composant en phase solide, c'est-à-dire, un premier réactif biospécifique requis pour la réaction biospécifique La méthode d'immobilisation du composant sur le support solide et le composant dépendent du dosage spécifique et de ses principes, qui sont évidents pour l'homme du métier. Après avoir immobilisé le premier réactif biospécifique sur le support solide, le second réactif doit être ajouté sur la même tache, c'est-à-dire dans le même puits de la plaque de micro- titrage Après l'addition, le produit doit être prêt à l'emploi de façon telle que seulement un échantillon (un échantillon à tester ou un standard) et le tampon de l'échantillon doivent être ajoutés sur la tache pour effectuer le dosage Le second réactif biospéci- fique est ajouté sur la même tache par séchage sur un support séparé pour éviter la liaison du réactif au premier réactif Par exemple, dans le cas d'un dosage non compétitif, un immunocomposant marqué (anticorps) est ajouté à un puits de microtitrage revêtu par séchage du composant marqué quantitativement sur un papier filtre, à partir duquel des disques contenant une quantité prédéterminée du composant marqué sont découpés, et Les disques sont placés dans Les puits de microtitrage Lorsque Le dosage est conduit, Le tampon contenu dans L'échanti L Lon ajouté au puits dissout rapidement Le composant marqué séché sur Le papier et Le disque de papier peut OS être enlevé du puits de microtitrage dans La première étape de Lavage Le papier filtre peut être un papier de cellulose, mais tout autre matériau inerte capable d'absorber Le composant, tel que Les matières p Lastiques, La nitroce L Lu Lose ou Les fibres de verre qui est communément utilisé comme matériau filtrant peut être utilisé comme support. Les plaques de microtitrage prêtes à l'emploi pour un dosage spécifique peuvent être standardisées durant l'étape de fabrication de sorte que seuls les échantillons et les standards sont analysés lorsque le produit (kit) est utilisé L'agent de marquage appliqué dans le produit peut être directement mesuré sur la tache de réaction, par exemple dans le puits d'une plaque de microtitrage L'invention est destinée spécialement à la fluoro- métrie à temps de résolution et pour l'utilisation des chéLates de Lanthanides comme agents de marquage pour le second réactif bio- spécifique, et dans un tel cas la lecture qualitative ou quantita- tive est obtenue après le dosage immunologique Toutefois, l'invention est applicable également à l'utilisation d'autres agents de marquage qui peuvent donner une indication mesurable du degré auquel la réaction biospécifique a eu lieu, tels que les radioisotopes, les enzymes, les fluorophores traditionnels et les agents producteurs de chimioluminescence La mesure peut être ainsi conduite par un compteur de rayons bêta ou gamma, un photo- mètre, un fluoromètre ou un luminomètre. Quelques plaques de microtitrage applicables à la présente invention sont montrées sur les figures 1 et 2 Les plaques peuvent contenir par exemple 8 x 12 puits 1, contenant chacun les réactifs biospécifiques, le premier réactif immobilisé dans la phase solide 2 dans le puits et le second composant séché sur le support séparé 3 placé dans le puits 1 Les plaques peuvent être fabriquées à partir d'une seule pièce ou par assemblage ensemble de bandes contenant les puits. Les figures 1 et 2 montrent également la possibilité de formation des puits pour séparer les puits de réaction et les puits de réactifs La rangée de puits de réaction est indiquée par les lettres A, C, E et G (figure 1) et par les nombres 1, 3, 5, 7, 9 et 11 (figure 2) Les rangées de puits de réactifs sont indiquées par les lettres B, D, F et H et par les nombres 2, 4, 6, 8, 10 et 12 dans la figure 1 et dans la figure 2 respectivement Les puits de réaction contiennent seulement le premier réactif biospécifique préparé comme décrit précédemment Les puits de réactifs séparés contiennent le second réactif biospécifique de la réaction biospé- cifique, tel qu'un réactif marqué et éventuellement certains réactifs de blocage, les substances étant sous une forme sèche, facilement soluble ou en solution Durant le dosage, le tampon est ajouté dans les puits de réactifs pour dissoudre les composants, et les contenus des puits de réactifs sont transférés ensuite dans le puits de réaction en vue de conduire la réaction biospécifique. L'échantillon est soit ajouté au puits de réaction ensemble avec le tampon ou séparément du tampon dans le puits de réaction, selon la méthode de dosage. De plus, dans le cas d'une méthode de dosage immunolo- gique compétitif, les réactifs peuvent être incorporés sur la même tache, par exemple dans le même puits, sans utiliser un support séparé Le second réactif, tel qu'un haptène marqué, peut être ajouté directement dans le puits contenant le premier réactif dans la phase solide et il peut être simplement séché Là-dessus Du fait que le dosage est basé sur l'établissement d'un nouvel état d'équi- libre, étant donné que l'immunocomposant dans l'échantillon et le haptène marqué sont en compétition pour l'immunocomposant de la phase solide, la liaison du second réactif marqué à la phase solide lors du séchage n'affecte pas le résultat du dosage Dans ce cas, l'immunocomposant marqué peut être séché à partir d'une forme de solution sur la phase solide sans séchage par cryodessication en laissant le solvant s'évaporer de la solution. La méthode de dosage utilisant le produit conformément à l'invention contenant le second réactif sur un support séparé peut comprendre les étapes successives suivantes: Dosage non compétitif en une seule incubation. 1 Pipettage de L'échanti L Lon et du tampon dans Les puits de réaction. 2 Incubation et secouage à la température ambiante ou à 35 C. 3 Lavage des puits de réaction (dosage immunologique complété). 4 Mesure des puits de réaction. Les exemples qui suivent servent à illustrer la méthode conformément à l'invention (exemples 1 et 2) ainsi que d'autres méthodes (exemples 3 à 5) applicables avec les plaques de micro- titrage des figures 1 et 2. Exemple 1 Dosage fluoroimmunologique à temps de résolution non compétitif du h TSH préparé en une seule incubation utilisant des puits de réaction d'une plaque de microtitrage qui contiennent un anticorps marqué sur un disque de papier filtre. Les puits contiennent l'anticorps anti-h TSH monoclonal à l'état séché et immobilisé sur les parois des puits En outre, les puits contiennent chacun un disque de papier filtre contenant un autre anticorps anti- h TSH monoclonal à l'état séché est marqué par un chélate d'europium fluorescent. Le dosage automatisé comprend les étapes suivantes: 1 50 pl d'un tampon de dosage obtenu en grande quantité et 50 pl d'un échantillon sont pipettes dans les puits. 2 La plaque de microtitrage est incubée pendant 60 min avec secouage continu à la température ambiante. 3 Les puits sont lavés (dosage immunologique complété). 4 200 pl d'une solution détachant le chélate d'europium fluorescent de la surface des puits sont ajoutés. La fluorescence de l'europium est mesurée dans les puits en utilisant la fluorométrie à temps de résolu- tion. La courbe standard et la courbe de reproductibilité du dosage de h TSH sont présentées sur la figure 7. Exemple 2 Dosage fluoroimmunologique à temps de résolution en une seule incubation non compétitif de h CG conduit dans des puits de réaction prêts à l'emploi qui contiennent l'anticorps marqué sous forme séchée sur des disques plastiques. L'anticorps monoclonal vis-à-vis du h CG qui a été marqué par un chélate d'europium fluorescent est dilué dans une solution de séchage et la solution est appliquée sur une surface plastique par distribution d'un courant constant à travers un tube capillaire en acier inoxydable Le tube capillaire est en contact avec la surface du film plastique durant l'application, donnant une ligne continue de solution de traceur avec une concentration de traceur constante dans le temps La solution distribuée est séchée sur la surface du film par un courant d'air intensifié Après séchage, des disques ronds sont découpés du film centré sur la ligne de traceur. Le diamètre du disque plastique est de 3 mm et le volume de solution séchée sur un disque est de 0,2 pl Les disques sont transférés dans les puits des bandes préalablement revêtues d'un anticorps monoclonal vis-à-vis du h CG et séchés. pl de standards de h CG sont pipettes dans les puits de bande 100 pl d'un tampon de dosage sont ajoutés à chaque puits. Les bandes sont incubées à la température ambiante pendant 1 heure avec secouage lent Après l'étape d'incubation, les disques sont enlevés des puits de réaction avec une buse de suction reliée à une source de vide Chaque bande est aspirée et lavée à six reprises. pl de solution de mesure sont ajoutés et les bandes sont secouées lentement pendant 3 min pour libérer le chélate d'europium fluorescent dans la solution La fluorescence est mesurée avec un appareil Platefluoromètre, et les résultats sont montrés dans la figure 9. Exemple 3 Dosage fluoroimmunologique à temps de résolution automa- tisé non compétitif du h TSH utilisant une incubation et des puits de réaction et des puits de réactifs séparés. Les puits de réaction d'une plaque de microtitrage contiennent l'anticorps anti-h TSH monoclonal à l'état immobilisé et séché sur les parois des puits Les puits de réactifs contiennent un autre anticorps anti-h TSH monoclonal à l'état séché et marqué par un chéLate d'europium. Le dosage automatisé comprend les étapes suivantes: 1 75 pl d'un tampon de dosage obtenu en grande quanité et 75 pl d'un échantillon sont pipettes dans les puits de réactifs. 2 L'anticorps séché, marqué dans les puits de réactifs est dissous par secouage rapide. 3 100 pl du méLange sont transférés de chaque puits de réactifs dans le puits de réaction correspondant. 4 La plaque de microtitrage est incubée pendant 15 min en continu par secouage à 35 C. Les puits de réaction sont lavés (dosage immunologique complété). 6 200 pl d'une solution de développement sont ajoutés à chaque puits de réaction. 7 La fluorescence de l'europium est mesurée dans chaque puits de réaction en utilisant la fluorométrie à temps de résolution. Les résultats du dosage de h TSH automatisé précédent sous la forme de la courbe standard et de la courbe de reproducti- bilité sont montrés dans la figure 3 La relation entre le dosage de DELFIA conventionnel utilisant le kit de réactifs dans des réceptacles externes et le dosage par plaque de microtitrage prêt à l'emploi (RAS-TSH) est montré dans la figure 4. Exemple 4 Dosage fluoroimmunologique à temps de résolution auto- matisé compétitif de la thyroxine (T 4) avec une plaque de micro- titrage prête à l'emploi utilisant des puits de réaction et des puits de réactifs. Les puits de réaction d'une plaque de microtitrage contiennent un anticorps anti-T 4 monoclonal et un autre anticorps antisouris, qui sont immobilisés sur les parois des puits à l'état sec Les puits de réactifs contiennent la T 4 marquée par un chélate d'europium et des bloqueurs nécessaires, à l'état sec. Le dosage automatisé utilisant la plaque de microtitrage prête à l'emploi préparée, comprend les étapes suivantes: 1 100 pl d'un tampon de dosage obtenu en grande quantité sont pipettes dans chaque puits de réactif. 2 Les composants séchés dans les puits de réactif sont dissous par secouage rapide. 3 45 pl du mélange provenant de chaque puits de réactif et 5 pl d'un échantillon sont transférés dans le puits de réaction correspondant. 4 La plaque de microtitrage est incubée pendant 15 min par secouage continu à 35 C. Les puits de réaction sont lavés (dosage immunologique complété). 6 200 pl d'une solution de développement sont ajoutés dans chaque puits de réaction. 7 La fluorescence de l'europium est mesurée dans chaque puits de réaction en utilisant la fluorométrie à temps de résolution. Les résultats sont montrés dans la figure 5 sous la forme d'une ocurbe standard () et d'une courbe de reproductibilité (+) de dosage de la T 4 automatisé complété La figure 6 montre la relation entre un dosage RIA du commerce traditionnel utilisant des tubes à essais et un kit de réactifs dans des réceptacles externes et le dosage par plaque de microtitrage prête à l'emploi (RAS-T 4). Exemple 5 Dosage de la 17-o-OH-progestérone compétitif utilisant une plaque de microtitrage prête à l'emploi avec des puits de réaction. Les puits de réaction de la plaque contiennent un anti- corps antilapin-17-x-OH-progestérone et un autre anticorps anti- lapin, qui sont immobilisés sur les parois des puits à l'état sec. De plus, une quantité requise d'un dérivé de 17-o-OH-progestérone marqué par un chéLate d'europium fluorescent est séchée dans chaque puits pour être prête à l'emploi. Le dosage de la 17-x-OH-progestérone est conduit en utilisant les étapes suivantes: 1 50 pl d'un tampon de dosage obtenu en grande quantité et 50 pl d'un échantillon sont pipettes dans les puits de réaction. 2 La plaque de microtitrage est secouée pendant 15 min, et ensuite l'incubation se poursuit à la température ambiante pendant une nuit. 3 Les puits de réaction sont lavés (dosage immunolo- gique complété). 4 200 pl d'une solution détachant le chéLage d'europium fluorescent des surfaces des puits de réaction sont ajoutés. La fluorescence de l'europium est mesurée dans chaque puits de réaction en utilisant la fluorométrie à temps de résolution. Les résultats sont montrés dans la figure 8 montrant les courbes standards et de reproductibilité du dosage précédent de la 17-c-OH- progestérone. REVENDICATIONS 1 Méthode de dosage biospécifique telle qu'une méthode de dosage immunologique spécifique, une méthode de dosage d'hybri- disation de l'acide nucléonique ou une méthode de dosage d'un récepteur, utilisant des réactifs qui sont spécifiques pour une réaction biospécifique avec un premier réactif biospécifique dans une phase solide, ledit dosage étant conduit par addition d'un échantillon sur une tache de réaction qui contient ledit premier réactif dans une phase solide prêt à l'emploi et un second réactif biospécifique de la réaction biospécifique séché sur la même tache de réaction pour être prête à l'emploi, caractérisée en ce que la tache de réaction contient le second composant biospécifique à l'état séché sur un support qui est séparé de la phase solide et insoluble à un échantillon liquide ajouté sur la tache, et ensuite le second composant biospécifique est libéré du support pour effectuer le dosage. 2 Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les composants spécifiques incluent un composant marqué capable de donner une indication mesurable de la réaction, la mesure étant conduite dans la tache de réaction par fluorométrie, telle que fluorométrie à temps de résolution, photométrie, luminométrie, ou par compteur à rayons gamma ou bêta. 3 Produit à utiliser dans les dosages biospécifiques, tels que dosage immunologique spécifique, dosage d'hybridisation de l'acide nucléonique ou dosage de récepteur ayant une tache de réaction ( 1) contenant un premier réactif de la réaction biospéci- fique dans une phase solide ( 2) et un second réactif de la réaction biospécifique sur la même tache de réaction, ledit réactif bio- spécifique étant séché sur la tache de réaction ( 1) pour être prêt à l'emploi, ladite tache étant fournie pour l'addition d'un échan- tillon pour effectuer la réaction biospécifique, caractérisé en ce que le second réactif biospécifique est séché sur un support ( 3) qui est séparé de la phase solide ( 2) et est insoluble à un échantillon liquide ajouté sur la tache ( 1). 4 Produit selon la revendication 3, caractérisé en ce que le support séparé ( 3) est un matériau capable d'absorber une solution aqueuse, tel qu'un matériau filtrant de cellulose, de matière plastique, de nitrocellulose ou de fibres de verre. Produit selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que le produit est sous la forme d'une plaque de microtitrage contenant une pluralité de puits formant lesdites taches de réaction ( 1) pour la réaction biospécifique.