FR 2684999 A1 19930618 FR 9115601 A 19911216 i Procédé de fabrication d'un concentré de facteur VII activé de haute pureté essentiellement dépourvu des facteurs vitamine K dépendants et des facteurs VIIIC et VIIIC Ag. La présente invention concerne essentiellement le procédé de fabrication d'un concentré de facteur VII activé de haute pureté essentiellement dépourvu des facteurs vitamine K dépendants et des facteurs VIIIC et VIII Cag, ainsi que le produit obtenu par ce pro- cédé. Le facteur de la coagulation responsable du rétablisse- ment de l'hémostase chez les hémophiles ayant des anticorps circu- lants est connu comme étant le facteur VII activé Celui-ci rentre dans la composition de concentrés prothrombiniques activés comme par exemple le FEIBA ou L'AUTOPLEX . Différents documents tels que WO-A-89/12097, WO-A- 83/00016, EP-A-O 225 160, US-A-4 637 932 et FR-A-2 622 108 ont mis en évidence le rôle effectif du facteur VI Ia En particulier, dans le document EP-B 1-0 225 160, il est démontré l'efficacité du facteur VI Ia dans le rétablissement d'une hémostase normale dans le cas de désordres hémorragiques non provoqués par des déficiences en facteur VIII ou par des inhibiteurs. Ces documents, ainsi que d'autres, décrivent différentes techniques de purification du facteur VII et du facteur VI Ia. Cependant, les techniques utilisées sont très complexes, néces- sitent de nombreuses étapes et sont difficilement applicables à l'échelle industrielle et médicale, ou nécessitent un coût élevé. Par exemple, PANCHAM décrit dans US-A-4 637 932 un pro- cédé de purification de facteurs VII et de facteurs VI Ia à partir d'une solution aqueuse contenant des protéines plasmatiques par adsorption de ces protéines sur un gel portant des sels de métal divalent ayant une affinité pour les protéines se fixant au cal- cium, tels que le phosphate tricalcique sous forme d'hydroxy- apatite de la Société Biorad (que l'on désorbe ensuite à l'aide d'un tampon contenant des sels capables de déplacer les protéines fixées. Une purification complémentaire est ensuite réalisée à l'aide d'une chromatographie d'échange d'ions type DEAE (Di Ethyl- Amine Ethyle) par exemple disponible dans le commerce sous la déno- mination commerciale DEAE Sephadex ()selon la procédure décrite dans US-A-3 717 708. Un enseignement similaire est décrit par CHABBAT et al. dans WO-A89/12097, mais avec en outre addition d'antithrombine III dans la solution contenant un méLange de facteur VII et de fac- teur VII activé qui sera chromatographié sur QAE Sepharose, afin d'inhiber la thrombine générée au cours de l'inactivation virale et de la chromatographie sur QAE Sepharose. D'autres part, MICHALSKY et al dans FR-A-2 622 108 décrivent un procédé de purification du facteur VII par chromato- graphie d'adsorption sur DEAE Sepharose ( suivie d'une éLution avec une solution tampon à 0,18-0,20 M de Na Cl qui conduit à l'obtention d'un facteur VII ayant une activité spécifique comprise entre 0,8 et 1, ce qui constitue un très faible taux de purification. Enfin, dans l'article de HEDNER et KIESEL dans J Clin. ( 1983), 71, p 1836-1841, on décrit l'utilisation de facteur VII activé humain dans le traitement de deux patients souffrant d'hémo- philie A avec une forte proportion d'inhibiteurs Dans leur traite- ment, ces auteurs utilisent comme facteur VII activé, un fac- teur VII qui a été purifié par chromatographie d'échange d'ions, (voir p 1837 colonne de gauche), à l'aide d'une colonne DEAE- Sepharose en éluant avec des solutions tampons contenant du chlo- rure de calcium Le facteur VII est activé par emploi de facteur XII activé lui-même obtenu grâce à une activation par la kallikréine humaine en présence de sulfate de dextran Cette pro- cédure est également complexe et exige l'apport de protéines éxo- gènes, dont le facteur XII activé et la kallikréine, qu'il est nécessaire d'éliminer en fin d'étape de purification pour obtenir un facteur VII activé de très haute pureté. La présente invention a donc pour but principal de résoudre le nouveau prob Lème technique consistant en la fourniture d'une solution permettant de fabriquer du facteur VII activé de haute pureté, essentiellement dépourvu des facteurs vitamine K dépendants et des facteurs VIIIC et VIIIC Ag. La présente invention a encore pour but de résoudre ce nouveau problème technique par l'emploi d'une solution n'impliquant pas l'emploi de protéines exogènes pour l'activation du fac- teur VII. La présente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique énoncé ci-dessus avec une solution simple, notamment dans l'étape d'activation du facteur VII, et éga- lement dans les étapes de purification proprement dites. La présente invention résout pour la première fois ce problème technique énoncé ci-dessus d'une manière simple, relative- ment peu coûteuse, utilisable à l'échelle industrielle et médicale tout en aboutissant à un facteur VII activé de haute pureté essen- tiellement dépourvu des facteurs vitamine K dépendants et des fac- teurs VIIIC et VIIIC Ag. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention fournit un procédé de fabrication d'un concentré de facteur VII activé de haute pureté comprenant l'emploi de plasma dépourvu de cryoprécité, de préférence d'origine humaine, ainsi qu'au moins une étape de purification par au moins une chromatographie sur résine d'échange d'anions ainsi qu'une étape d'activation du fac- teur VII, caractérisé en ce qu'on réalise tout d'abord l'activation directe du facteur VII dans le plasma dépourvu de cryoprécipité, sans apport de protéines éxogènes. De préférence, l'activation du facteur VII est réalisée selon l'invention par emploi de sulfate de dextran sous forme pul- vérulente, insoluble dans ledit plasma De préférence, le sulfate de dextran est utilisé sous forme de billes La dimension des billes n'est pas critique et l'on pourra utiliser des billes de sulfate de dextran disponibles dans le commerce telles que les billes commercialisées par la société Sigma, référence D 5650 Il est à noter qu'aucun traitement spécial de ces billes n'est néces- saire avant l'utilisation, ce qui constitue également un avantage important de l'invention. Selon une autre caractéristique avantageuse du procédé selon l'invention, L'étape d'activation du facteur VII, de préfé- rence par le sulfate de dextran est réalisée à une température con- trôlée, avantageusement comprise entre O C et + 4 C, ce qui permet d'assurer une très bonne activation du facteur VII en facteur VI Ia. Selon une autre caractéristique avantageuse du procédé selon l'invention, après l'étape d'activation précitée, on procède à une chromatographie d'échange d'anions de type DEAE du plasma dépourvu de cryoprécipité contenant le facteur VII activé ainsi que du facteur VII non activé, de manière à adsorber sélectivement essentiellement tous les facteurs vitamine K dépendants, c'est-à- dire comprenant principalement le facteur VII activé, le fac- teur VII non activé, le facteur IX, le facteur X et le facteur II. Ainsi, le but de cette adsorption sélective est d'éliminer une partie significative des protéines indésirables telles que l'albu- mine. Selon encore une autre caractéristique avantageuse du procédé selon l'invention, on réalise une désorption non sélective de tous les facteurs vitamine K dépendants adsorbés sur la colonne d'échange d'ions DEAE précitée Pour ce faire, on peut éluer avec toute solution tampon d'élution bien connue de l'homme de l'art pour réaliser cette désorption sur ce type de gel. Ensuite, l'éLuat obtenu contenant tous Les facteurs vita- mine K dépendants est à nouveau passé sur une colonne d'échange d'anions spécifique type amine quaternaire, de préférence de type Q Sépharose Fast Flow de chez PHARMACIA qui se présente sous forme de billes d'agarose, réticulée à environ 6 % et comprenant de pré- férence un petit bras espaceur en C 1-C 6, de manière à adsorber sélectivement tous Les facteurs vitamine K dépendants. Cette adsorption des facteurs vitamine K dépendants de manière spécifique sur cette colonne permet ainsi d'éliminer d'autres protéines contaminantes comme l'oc-antitrypsine et la céruloplasmine. Cette adsorption sélective sur colonne type amine quater- naire constitue une caractéristique brevetable du procédé, indépen- dante de l'activation du facteur VII Il en est de même pour la désorption sélective qui est mentionnée ci-après De préférence, la solution d'adsorption sélective est une solution tampon Na CL m M, citrate trisodique 4 m M et p H 6. On procède ensuite à une désorption sélective du facteur VII activé et du facteur VII non activé en procédant à une éLution de la colonne avec une solution tampon dite de désorption séLec- tive, ayant la composition suivante: Na CL 250 m M citrate trisodique 4 m M p H 6 L'éluat obtenu contenant essentiellement le facteur VII activé et le facteur VII non activé sous forme aqueuse, essentiel- lement dépourvu des autres facteurs vitamine K dépendants, subit ensuite une étape d'inactivation virale de manière connue, par exemple par l'emploi d'un méLange de TNBP/Tween en observant la proportion relative de 0,3 % en TNBP et 1 % en Tween par rapport à la concentration totale de la solution de facteur VII activé/ facteur VII, de préférence pendant 6 h à 24 C sous agitation con- formément au procédé décrit dans le document EP-A-O 131 740 ou USA 4 540 573. Après inactivation, il est nécessaire d'éliminer le mélange d'inactivateurs TNBP/Tween résiduel et on procède à nouveau à une adsorption sur la même colonne précitée de Q Sépharose FAST FLOW-' avec une solution tampon permettant l'adsorption sélective, à savoir Na Cl 150 m M, citrate trisodique 4 m M et p H 6. Cette adsorption est ensuite suivie de la désorption avec la même solution de désorption (Na Cl 250 m M, citrate trisodique 4 m M, p H 6) en obtenant ainsi un éluat contenant le facteur VII activé de haute pureté, et le facteur VII non activé essentielle- ment dépourvu de facteurs vitamine K dépendants ainsi que des fac- teurs VIIIC et VIIIC Ag. On peut ensuite encore diafiltrer cet éluat contre un tampon de préférence compatible à l'injection chez l'homme (tel qu'un tampon Na Cl 100 m M, citrate trisodique 4 m M, lysine 3 g/l, p H 7) que l'on peut avantageusement concentrer à un taux de 5 000 UI en facteur VI Ia activé par flacon de 20 ml que l'on peut filtrer stérilement par filtration sur un filtre stérilisant à une dimen- sion de pores de 0,2 micromètre, puis procéder à une lyophilisation si cela est souhaité. Il est à noter que le procédé selon l'invention permet non seulement d'obtenir un facteur VII de haute pureté, mais égale- ment un taux d'activation très élevé du facteur VII. De ce fait, l'expression "facteur VII activé de haute pureté" signifie dans la description et dans les revendications que le rapport facteur VI Ia/facteur VII est supérieur à 5, de préfé- rence supérieur à 7 et encore de préférence voisin de 10, tandis que l'activité spécifique du facteur VII activé est supérieure à UI/mg de protéine L'activité thrombogénique est négative à 6 h à 37 C selon le test de la thrombine libre. L'invention couvre également le facteur VII activé de haute pureté obtenu par le procédé précédemment décrit. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'inven- tion apparaîtront clairement à la lumière de la description expli- cative qui va suivre faite en référence à deux exemples de fabrica- tion donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention Dans les exemples tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indica- tion contraire. Exemple 1 l de plasma dépourvu de cryoprécité, maintenu à 4 C sont ajustés à une force ionique On ajoute, en batch, 0,1 g de billes de sulfate de dextran (Sigma D 5650) par litre de plasma Après 1 h d'agitation à 4 C, on décante et le surnageant est récupéré pour être incubé pen- dant 90 min avec 0,5 g/L de DEAE Sephadex A 50 Après décantation, le gel sur lequel se sont fixés tous les facteurs vitamine K dépen- dants est lavé avec 1 I de tampon citrate trisodique 4 m M, Na CL 140 m M, p H 7 qui permet d'éliminer entre autres l'albumine Les facteurs vitamine K dépendants sont ensuite élués avec ce même tampon dont la force ionique a été augmentée à 500 m M en Na CL On récupère 500 ml d'éluat I. Cet éLuat I est diafiltré et concentré à 250 ml avec une cassette d'un seuil de coupure de 10 Kd contre un tampon citrate trisodique 4 m M, Na CL 150 m M, p H 6. Cette solution est chromatographiée sur une colonne de 9 cm de diamètre contenant 300 ml de gel Q Sépharose Fast Flow R (Pharmacia) équilibrée avec le même tampon 5 l de ce tampon vont permettre d'éliminer l'-antitrypsine et la céruloplasmine Les facteurs VII/VI Ia vont être désorbés spécifiquement en augmentant la force ionique à 250 m M en Na Cl, on récupère environ 2 L d'éLuat II. L'éLuat II subit ensuite une étape d'inactivation virale par un méLange de TNBP/Tween tel que la concentration finale dans la solution de facteurs VII/VI Ia soit de 0,3 % en TNBP et 1 % en Tween pendant 6 h à 240 C sous agitation. Après inactivation, la solution est diafiltrée et con- centrée à 250 ml contre le tampon servant à l'équilibration de la colonne de Q Sépharose FAST FLOW R précédemment citée (citrate tri- sodique 4 m M, Na Cl 150 m M, p H 6) La solution est à nouveau chroma- tographiée sur Q Sépharose FAST FLOW R avec 2 l de solution de lavage identique au tampon d'équilibration, ce qui permet d'éLi- miner le méLange d'inactivateurs en le faisant passer dans la frac- tion non retenue Avec le tampon citrate trisodique 4 m M, Na CL 250 m M, p H 6, on éLue sélectivement les facteurs VII/VI Ia relative- ment aux autres facteurs vitamine K dépendants pour obtenir un éLuat III Cet éLuat de 2 L est ensuite diafiltré contre un tampon compatible à l'injection chez l'homme (citrate trisodique 4 m M, Na CL 100 m M, lysine 3 g/l, p H 7) et concentré à un taux de 5 000 UI en facteur VI Ia par flacon de 20 ml, puis lyophilisé. Les résultats obtenus par le procédé selon l'invention à l'échelle pilote sur 4 expériences portant chacune sur 5 l de plasma dépourvu de cryoprécipité ainsi qu'à titre de comparaison sur un lot dit témoin selon le même procédé mais avec la suppres- sion de l'étape d'activation en sulfate de dextran sont rapportés au tableau I. tableau procédé tableau Les résultats sont exprimés en unité internationale I Les déterminations sont effectuées à divers stades comme cela est bien compréhensible à la considération I, pour l'homme de l'art. au du du TABLEAU I Lot témoin VII VI Ia VI Ia/VII Rd VII % Rcd VI Ia %VII VI Ia VI Ia/VII PDC 4212 7400 1,7 100 100 3250 5000 2 + 318 + 1030 + 0,3 APRES SULFATE 5415 35275 6,9 127 500 DEXTRAN + 616 + 3985 + 1,3 + 10 + 81 APRES 4292 54167 13 99 657 1850 3600 2 DEAE + 253 + 9610 + 2,8 + 9 + 93 APRES 1960 26313 15,8 44,7 359 1050 2030 2 Q 1 + 390 + 3870 + 3,3 + 6,4 + 31 APRES 1500 17062 11,7 33 234 940 1800 2 Q 2 +LYO+ 244 + 4320 + 2 + 4,5 + 54 *PDC = plasma dépourvu de cryoprécipité Q 1: 1 re chromatographie d'adsorption sur Q Sepharose Fast Flow Q 2: 2 e chromatographie d'adsorption sur Q Sepharose Fast Flow LYO: lyophilisation. Caractéristiques biologiques du concentré de facteur VI Ia après reconstitution par 20 ml d'eau distillée: VI Ia VII : 172 + 27 UI/ml : 14,3 + 1,4 UI/ml VI Iag VI Ia/VII Taux de protéines AS VI Ia AS VII II/I Ia IX/I Xa X/Xa VIIIC VIII Cag : 0,88 + 0,22 UI/ml :12 + 2,5 :0,82 + 0,07 :208 + 36 :17,5 + 1,6 : coagulation d'un plasma déficient pour un facteur manquant Ce fac- teur sera apporté par l'échantillon. Le degré d'activation du facteur VII est déterminé par l'utilisation de thromboplastine humaine et de thromboplastine bovine selon la méthode décrite par Van Deijk et a L, Haemostasis 13,1983. Le facteur VII activé a une affinité plus grande pour la thromboplastine bovine que le facteur VII, alors qu'i Ls ont la même affinité pour la thromboplastine humaine Le degré d'activation est exprimé par le rapport: Facteur VII avec thromboplastine bovine Facteur VII avec la thromboplastine humaine Par référence, ce rapport est de 1 dans un plasma humain normal. Exemple 2: Résultats obtenus sur un lot industriel de 300 L de plasma. On procède comme décrit à l'exemple 1 si ce n'est que l'on utilise au départ 300 l de plasma. Les résultats obtenus sont exprimés au tableau II ci- après. TABLEAU II VI Ia VII AS VI Ia AS VII PDC 391300 301154 0,034 0,022 APRES 2530000 361507 0,24 0,029 SULFATE DE DEXTRAN APRES 1282500 157800 8,3 1,02 DEAE APRES 1399650 150500 73 7,8 Q 1 APRES 965000 98800 244 32,5 Q 2 + LYO PDC, Q 1, Q 2 et LYO: significations voir tableau I. Caractéristiques biologiques du concentré de facteur VI Ia après reconstitution par 20 ml d'eau distillée: VI Ia: 244 UI/ml VII: 32,5 UI/ml VI Ia/VII: 7,5 Taux de protéines: 1 g/L AS VI Ia: 244 AS VII: 32,5 II/I Ia: normal. 1 1 Par ailleurs, l'invention permet, en plus du fait de l'obtention d'un très bon rapport d'activation, d'obtenir un excel- lent taux de purification du facteur VII avec un procédé extrême- ment simple, aisé à mettre en oeuvre, avec une très bonne reproduc- tibilité. Par ailleurs, le produit selon l'invention présente une trèsfaible activité thrombogénique En effet, le test de la throm- bine libre (PHARMACOPEE Européenne 2 édition, 554) est négatif à 6 h et à 37 C avec le produit de l'invention, ce qui constitue une caractéristique essentielle préférée du produit de l'invention qui le distingue des produits de l'art antérieur En effet, les con- centrés de facteur VII activés obtenus par d'autres procédés ainsi que les concentrés prothrombiniques activés de la technique anté- rieure comme par exemple le FEIBA lou L'AUTOPLEX'ont une acti- vité thrombogénique positive avant 6 h. IL est également à noter que le concentré de facteur VII activé selon l'invention n'est pas traité à l'antithrombine III en raison de sa pureté et ne présente donc aucun risque de coagulation prématurée. Par ailleurs, notamment en vue de la lyophilisation, le concentré de facteur VII activé selon la présente invention, en raison de sa pureté, ne nécessite pour sa stabilisation que l'emploi de lysine alors que les produits antérieurs nécessitaient pour la lyophilisation l'emploi d'albumine, ce qui diminue le coût et évite d'injecter une protéine inutile pour le patient. REVENDICATIONS 1 Procédé de fabrication d'un concentré de facteur VII activé de haute pureté comprenant l'emploi d'un plasma dépourvu de cryoprécipité, de préférence d'origine humaine, ainsi qu'au moins une étape de purification par au moins une chromatographie sur résine d'échange d'anions ainsi qu'une étape d'activation du fac- teur VII, caractérisé en ce qu'on réalise tout d'abord l'activation directe du facteur VII dans le plasma dépourvu de cryoprécipité, sans apport de protéines exogènes. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activation du facteur VII est réalisée par l'emploi de sul- fate de dextran sous forme pulvérulente, insoluble dans ledit plasma. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le sulfate de dextran est utilisé sous forme de billes. 4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caracté- risé en ce que l'étape d'activation du facteur VII, de préférence par le sulfate de dextran, est réalisée à une température con- trôlée, avantageusement comprise entre O C et + 4 C. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caracté- risé en ce que, après l'étape d'activation précitée, on procède à une chromatographie d'échange d'anions de type DEAE, du plasma dépourvu de cryoprécipité contenant le facteur VII activé ainsi que du facteur VII non activé, de manière à adsorber sélectivement tous les facteurs vitamine K dépendants. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on réalise une désorption non sélective de tous les facteurs vitamine K dépendants adsorbés sur la colonne d'échange d'ions DEAE précitée. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'éluat obtenu contenant les facteurs vitamine K dépendants est à nouveau passé sur une colonne d'échange d'anions spécifiques type amine quaternaire, de préférence de type Q Sepharose Fast Flow R de chez PHARMACIA, qui se présente sous forme de billes d'agarose réticulées à environ 6 %, et comprenant de préférence un petit bras espaceur en C 1-C 6, de manière à adsorber sélectivement tous les facteurs vitamine K dépendants. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on procède ensuite à une désorption sélective du facteur VII activé du facteur VII non activé en procédant à une élution de la colonne avec une solution tampon dite de désorption sélective, ayant la composition suivante: Na Cl 250 m M citrate trisodique 4 m M p H 6 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'éluat obtenu contenant essentiellement le facteur VII activé et le facteur VII non activé résiduel sous forme aqueuse, essen- tiellement dépourvu des autres facteurs vitamine K dépendants, subit ensuite une étape d'inactivation virale, par exemple par l'emploi d'un mélange de TNBP/Tween en observant la proportion relative de 0,3 % en TNBP et 1 % en Tween par rapport à la concen- tration totale de la solution de facteur VII activé/facteur VII, de préférence pendant 6 h à 24 C sous agitation, le mélange d'inacti- vation est ensuite éliminé par adsorption sur la même colonne avec la même solution tampon permettant l'adsorption sélective (Na Cl 150 m M, citrate trisodique 4 m M avec la même solution tampon de Procédé selon la qu'on réalise une diafiltration compatible à l'injection chez l' citrate trisodique 4 m M, lysine 11 Procédé selon la qu'on réalise une concentrat facteur VI Ia activé par flacon rilement par filtration sur un et p H 6), avec désorption sélective désorption sélective précitée. revendication 9, caractérisé en ce comprenant un tampon, de préférence homme tel qu'un tampon Na Cl 100 m M, 3 g/l, p H 7. revendication 10, caractérisé en ce ion à un taux de 5 000 UI en de 20 ml que l'on peut filtrer sté- filtre stérilisant à une dimension de pores de 0,2 micromètre, puis éventuellement on procède à une lyophilisation. 12 Facteur VII activé de haute pureté, en particulier tel qu'obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce qu'il présente un rapport fac- teur VI Ia/facteur VII supérieur à 5, de préférence supérieur à 7 et encore de préférence voisin de 10, tandis que l'activité spécifique du facteur VII activé est supérieure à 200 UI/mg de pro- téine.