FR 2678601 A1 19930108 FR 9108174 A 19910701 PROCEDE DE PREPARATION DE SULFURES ET D'ACIDES AMINES MARQUES AU SOUFRE 35 L'invention est relative à un nouveau procédé de préparation de sulfures marqués au soufre 35, et à la préparation d'acides aminés et de leurs dérivés marqués au soufre 35, à haute activité spécifique. Les acides aminés soufrés L-cystéine et L-méthionine jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, et en particulier sont incorporés dans des protéines très diverses L'initiation de la bio- synthèse d'une chaîne polypeptidique nécessite la pré- sence de L-méthionine; la L-cystéine est nécessaire dans la formation des ponts disulfures qui stabilisent la structure tertiaire des protéines, et intervient égale- ment au site actif de nombreuses enzymes. Les acides aminés soufrés marqués au soufre , et en particulier la méthionine, sont donc très fré- quemment utilisés pour l'étude de processus biologiques. Pour cette utilisation, il est nécessaire de disposer de produits à haute activité spécifique, supérieure à 29,6 Tbq à 37 Tbq/mmole ( 800 à 1000 Ci/mmole). Deux types de procédés permettant l'obtention de L-cystéine et de Lméthionine marquées au soufre 35, sont connus: la voie chimique, et la voie microbiolo- gique. Les procédés de synthèse par voie chimique sont peu utilisés actuellement, car leur rendement est faible; ils nécessitent un appareillage important, de nombreuses étapes manipulatoires, et ne sont pas adaptés à la manipulation des très faibles quantités de réactifs qui sont utilisées pour la fabrication d'un produit final à très haute activité spécifique. Par exemple, le procédé décrit dans la publi- cation HEISE et MITTAG lKernenergie, 8, 181-184 ( 1965)l aboutit à de la L-méthionine 35 S dont l'activité spéci- fique est de 2775 Mbq/mmole ( 75 m Ci/mmole). La L-cystéine et la L-méthionine marquées au soufre 35, que l'on trouve actuellement dans le commerce sont préparées par la voie microbiologique. Plusieurs publications décrivent ce procédé d'obtention; à titre d'exemple on citera les travaux d'ALBAHARI et SKAKUN-TODOROVIC lJournal of labelled compounds and Radiopharmaceuticals, XIV, 5, 727-733 ( 1978)l, de GRAHAM et STANLEY lAnalytical Biochemistry 47, 505-513, ( 1972)l, de BRETSCHER et SMITH lAnalytical Biochemistry, 47, 310-312, ( 1972)l. Des microorganismes (levures ou bactéries) sont cultivés en milieu minimum, la seule source de soufre étant procurée par du sulfate de sodium ou d'ammonium, marqué au soufre 35, à haute activité spéci- fique. Le soufre 35 est incorporé dans les protéines, qui sont ensuite hydrolysées et les acides aminés soufrés sont purifiés, à partir de l'hydrolysat, par chro- matographie Cette étape de chromatographie ne parvient toutefois pas à éliminer totalement la contamination par d'autres acides aminés non marqués (par exemple L-valine, L-leucine), ainsi que par la D-méthionine 355. Chacun de ces contaminants représente 2 à 3 % de la préparation de L-méthionine 35 S obtenue. D'autre part, ce procédé de préparation est relativement long; il faut au moins 24 heures pour que le soufre soit incorporé dans les protéines; un autre délai de 24 heures est nécessaire pour que l'hydrolyse des protéines soit complète. Or les préparations d'acides aminés marqués au soufre 35 doivent être renouvelées fréquemment, car la période de demi-vie du soufre 35 est relativement courte, et la L-méthionine 35 S est peu stable chimiquement et s'oxyde très rapidement en L-méthionine sulfoxyde. Il est donc particulièrement souhaitable de disposer d'une méthode simple et aisée à mettre en oeuvre, qui peut permettre de préparer ces composés à la demande. Les Inventeurs, en cherchant à résoudre ce problème, ont orienté leurs travaux vers la mise au point d'une méthode de synthèse enzymatique. Différentes voies métaboliques qui conduisent à la synthèse des acides aminés soufrés sont connues, ainsi que les enzymes qui interviennent à chacune des étapes de cette synthèse: pour revue d'ensemble, voir par exemple Methods in Enzymology, volume 143, ( 1987), Editeurs W B Jakoby and Griffith. Le soufre organique de la cystéine et de la méthionine provient de soufre inorganique qui peut être assimilé par certains microorganismes et in fine, réduit15 sous forme de sulfures Les sulfures réagissent avec la sérine ou l'homosérine (ou leurs dérivés 0-acylés) pour donner la cystéine et l'homocystéine. Différentes enzymes peuvent catalyser cette réaction lpour revue détaillée, Cf SODA, Methods in Enzymology 143 453-457 ( 1987)l. On peut citer par exemple l'O-acétylsérine sulfhydrylase, (EC 4 2 99 8), la cystathionine 5-synthase (EC 4 2 1 22), l'O-acétyl homosérine (thiol) lyase (EC 4. 2.99 10) etc Bien que ces enzymes soient connues et aient été purifiées, leur utilisation pour l'obtention d'acides aminés marqués au soufre 35, et à haute activité spécifique, n'a jamais été proposée. En effet, bien que les réactions catalysées par ces enzymes soient aisément réalisables in-vitro en présence de substrats non radio-marqués, et lorsque l'on n'a aucune exigence particulière quant au rendement de la réaction ou à la qualité du produit final, il n'en va toutefois pas de même lorsque ces réactions doivent être effectuées en présence de substrats radiomarqués, et en assurant au produit final une activité spécifique élevée, ainsi qu'une grande pureté chimique et radiochimique. Les problèmes à résoudre pour parvenir à ce but sont nombreux, car il faut limiter au maximum le nombre d'étapes nécessaires, chaque étape devant, en outre, être compatible avec l'étape précédente et la suivante. Ce problème principal qui doit être résolu pour permettre la mise en oeuvre de la réaction enzyma- tique avec les meilleurs résultats, est celui de l'utilisation d'un substrat approprié marqué, à haute activité spécifique. Le problème ne se pose pas dans les méthodes d'obtention d'acides aminés marqués par voie bactériolo- gique, car le soufre 35 utilisé dans ces méthodes, obtenu à partir de l'irradiation du chlorure de potassium selon la réaction 35 Cl(n,p)35 S, est purifié sous forme de sulfate assimilable par les bactéries. Or, les enzymes synthétisant les acides aminés soufrés utilisent comme substrat les sulfures, et non les sulfates Il est donc nécessaire de procéder, préalable- ment à la réaction enzymatique, à la réduction du sulfate en sulfure Or, cette étape peut conduire à une diminu- tion importante de l'activité spécifique. Les Inventeurs ont maintenant sélectionné un mélange réducteur, et mis au point des conditions de réaction permettant la réduction du sulfate en sulfure avec un bon rendement, et sans perte d'activité spéci- fique. La présente Invention a pour objet un procédé de préparation de sulfures marqués au soufre 35, à haute activité spécifique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend: une étape au cours de laquelle on prépare un mélange réducteur comprenant de l'acide chlorhydrique, de l'acide iodhydrique et de l'acide hypophosphoreux, et l'on prétraite ledit mélange afin d'éliminer les ions sulfate présents dans celui-ci; une étape au cours de laquelle l'on procède à la réduction, par ledit mélange, de sulfate marqué au soufre 35, et l'on récupère le sulfure marqué au soufre 35 obtenu à l'issue de cette réduction. Au sens de la présente Invention, on entend par sulfure, le sulfure d'hydrogène, ou un de ses sels (par exemple sulfure métallique) et par sulfate, l'acide sulfurique ou un de ses sels. Selon un mode préféré de mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention, le mélange réducteur est prétraité par chauffage sous courant d'un gaz inerte (azote, hélium, etc) Les ions sulfate présents dans le mélange réducteur sont réduits et entrainés, sous forme de sulfure d'hydrogène, par le courant de gaz inerte. Selon une disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, ledit mélange réducteur est prétraité par chauffage pendant 30 minutes à 3 heures, à une tempéra-20 ture comprise entre 90 et 150 C. Selon un autre mode mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'Invention, ledit mélange comprend entre 40 et 60 % en volume d'acide iodhydrique pur, entre et 30 % en volume d'acide chlorhydrique pur, entre 20 et 30 % en volume d'eau, et entre 10 et 15 % d'acide hypo- phosphoreux en solution à 50 % (P/P) dans l'eau. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'Invention, on réduit le sulfate marqué au soufre 35, par chauffage sous courant de gaz inerte, en présence du mélange réducteur pré- traité, et l'on récupère le sulfure marqué au soufre 35 qui se dégage, sous forme de sulfure d'hydrogène. Selon une disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, le sulfure marqué au soufre 35 est recueilli par barbotage du sulfure d'hydrogène dans une solution aqueuse d'une base forte, le rapport molaire base forte/soufre 35, étant compris entre 5/1 et 80/1. Le sulfure marqué au soufre 35 obtenu à l'issue de la réduction, possède la même activité spéci- fique que le sulfate de départ Il peut être utilisé comme substrat pour une réaction enzymatique Dans ce but, il peut être ajouté au milieu réactionnel, soit sous forme du sel, formé lors du barbotage, de la base forte précitée, soit directement, par dégagement du sulfure d'hydrogène dans le milieu réactionnel.10 La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'acides aminés marqués au soufre 35, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on procéde à la sulfhydrylation de la sérine ou de l'homosérine, ou de15 l'un de leurs dérivés O-acylés, par un sulfure marqué au soufre 35 obtenu par le procédé conforme à l'Invention, en présence d'une enzyme apte à catalyser ladite réaction de sulfhydrylation. Comme il a été dit plus haut, différentes enzymes peuvent utiliser les sulfures comme substrat pour la synthèse d'acides aminés soufrés. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente Invention, l'on utilise l'enzyme O-acétyl- L-homosérine sulfhydrylase, en présence d'O-acétyl-25 L-sérine ou d'O-acétyl-L-homosérine. Cette enzyme peut être purifiée à partir de S Cerevisiae selon la méthode décrite par YAMAGATA lMethods in Enzymology 143, 478-483, ( 1987)l Elle peut également être obtenue à partir d'autres microorganismes la contenant lPASZEWSKI et GRABSKI, Acta Biochimica Polonica, 23, 321-324 ( 1976)l. Cette enzyme également dénommée O-acétyl- L-sérine-O-Acétyl-L-homosérine sulfhydrylase catalyse les réactions suivantes: O-acétyl-L-sérine + H 2 S L-cystéine + CH 3 COOH OAcétyl-L-homosérine + H 2 S -% L-homocystéine + CH 3 COOH. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente Invention, on purifie le produit de la réaction enzymatique, marqué au soufre 35, par chromato- graphie en phase inverse du mélange réactionnel. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente Invention, l'on procède, pour obtenir de la méthionine marquée au soufre 35, à la méthylation de l'homocystéine obtenue à l'issue de la réaction enzyma- tique, préalablement à la purification par chromatographie. Cette méthylation peut être effectuée de manière connue en elle- même, par voie chimique, par exemple par l'iodure de méthyle, ou par voie enzymatique par exemple, en utilisant l'homocystéine S-méthyltrans- férase décrite par SHAPIRO et al lThe Journal of Biological Chemistry, 239, 5, 1551-1556,( 1964)l. Si l'on souhaite préparer de la L-cystine 355 ou la L-homocystine 35 S, l'on procède à l'oxydation de L-cystéine 35 S ou de la L-homocystéine 35 S obtenue à l'issue de la réaction enzymatique. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention. Il va de soi, toutefois, que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont il ne constitue en aucune manière une limitation. EXEMPLE DE SYNTHESE DE LA METHIONINE 35 S, PAR LE PROCEDE CONFORME A L'INVENTION 1) REDUCTION DE L'ACIDE SULFURIOUE 35 S OU DE L'UN DE SES SELS EN HYDROGENE SULFURE 355 L'acide sulfurique 35 S d'activité spécifique de 46,2 Tbq/mmole ( 1250 Ci/mmole), ou l'un de ses sels, obtenu de façon connue en elle-même, par exemple par irradiation du K Cl selon la réaction nucléaire Cl(n,p)35 S, est réduit quantitativement en hydrogène sulfuré 35 S en présence d'un mélange réducteur dont la composition est la suivante: ,3 ml d'eau distillée et désionisée ( 18 mégohms) 4,7 ml d'acide chlorhydrique (d = 1,19) ml d'acide iodhydrique (d = 1,7) 2,5 ml d'acide hypophosphoreux en solution à 50 % Après préparation du mélange réducteur, 5 ml de celui-ci sont introduits dans un réacteur sous atmo- sphère inerte d'hélium. Dans ces conditions les ions sulfate présents dans les réactifs constituant ce mélange, sont réduits en ions sulfures et éliminés du milieu au fur et à mesure de leur formation sous forme d'un gaz, (H 2 S), par chauffage vers 110 'C pendant 45 mn sous courant d'hélium à un débit de 0,9 1/h La solution est alors refroidie à température ambiante Les ions sulfate sont ainsi éliminés à plus de 99 %. Après refroidissement, 200 g 1 ( 14,86 Gbq = 400 m Ci) de la solution contenant l'acide sulfurique 355 ( 2 Ci/ml) ou l'un de ses sels, sont introduits dans le mélange réducteur prétraité, et sont traités par chauf- fage sous courant d'hélium, comme décrit ci-dessus, à un débit d'hélium de 0,4 1/h. L'hydrogène sulfuré 35 S est obtenu avec une activité spécifique identique à celle de l'acide sulfu- rique de départ, et est recueilli dans une solution aqueuse refroidie dans la glace, contenant de la soude ( 20 pmoles de soude pour environ 0, 3 gmole de 355) Le rendement de la réaction de réduction est de 99,8 %; c'est-à-dire qu'on ne retrouve dans le mélange réducteur, à l'issue de la réaction, que 0,2 % de l'activité intro- duite dans le mélange réactionnel D'autre part, 85 % de l'activité totale de l'acide sulfurique 35 S sont présents dans la solution de soude ayant servi au piégeage de l'hydrogène sulfuré. REACTION ENZYXATIOUE Après addition de 5 g 1de Tris-H Cl ( 1 M) p H = 7,8 dans la solution contenant le sulfure de sodium 35 S, celle-ci est neutralisée par une solution d'acide chlorhydrique diluée ( 0,1 N), jusqu'à p H = 7,8. Les produits suivants nécessaires, pour la réaction enzymatique sont alors introduits dans la solu- tion radioactive: 1 g 1 de pyridoxal phosphate ( 5,3 mg/ml) g 1 de Oacétyl L-homosérine ( 16,1 mg/ml) 2 g 1 de dithiothréitol ( 154 mg/ml) 5 g 1 d'une préparation à 2,4 mg de protéine/ml, d'enzyme 0- acétyl L-homosérine sulfhydrylase (Activité spécifique: 0,135 pmol d'homocystéine/mn/mg de protéine). Le volume total du mélange réactionnel est d'environ 1 ml. Le p H est vérifié et ajusté à 7,8 si néces- saire avant introduction de l'enzyme. La O-acétyl-L-homosérine sulfhydrylase a été purifiée selon la méthode décrite par YAMAGATA (publication précitée) à partir d'une souche de Saccharomyces cerevisiae, par précipitation fractionnée en milieu contenant du sulfate d'ammonium puis par pas- sage sur colonne de DEAE-cellulose Cette enzyme est relativement stable et peut être conservée au froid à -80 'C durant de nombreux mois sans perte importante de son activité. Après addition de l'enzyme, le milieu réactionnel est laissé à température ambiante durant 1 heure. REACTION DE METHYLATION Après la réaction enzymatique, 5 g 1 d'iodure de méthyle pur, agent de méthylation, puis 25 p 1 de soude IN sont ajoutés directement au milieu réactionnel Celui-ci est laissé à température ambiante pendant 30 minutes. PURIFICATION DE LA L-METHIONINE 355 Après la réaction de méthylation, le milieu réactionnel est directement injecté sans traitement préa- lable, sur une colonne semi-préparative de 25 cm de lon- gueur (ZORBAX C 18) contenant un support phase inverse, muni d'une précolonne de 2 cm de longueur contenant le même support L'éluant utilisé est de l'eau distillée et désionisée ( 18 méghoms), à un débit de 3 ml/mn On procède sous atmosphère d'hélium La fraction radioactive conte- nant la L-méthionine 35 S à haute activité spécifique est collectée à froid sous atmosphère d'argon. La méthionine 35 S est éluée au bout de 8 à 10 minutes, dans les conditions de chromatographie indiquées ci-dessus. L'analyse de la fraction contenant la L-méthionine 35 S par diverses techniques chromatogra- phiques montre qu'elle ne contient pas d'autres acides aminés, marqués ou non marqués. Le rendement en L-méthionine 35 S purifiée à partir de l'acide sulfurique 35 S est de l'ordre de 10 à % de l'activité totale de l'acide sulfurique soit 40 à m Ci L'activité spécifique de la L-méthionine purifiée est identique à celle de l'acide sulfurique de départ. il REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation de sulfures marqués au soufre 35, à haute activité spécifique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend: une étape au cours de laquelle on prépare un mélange réducteur comprenant de l'acide chlorhydrique, de l'acide iodhydrique et de l'acide hypophosphoreux, et l'on prétraite ledit mélange afin d'éliminer les ions sulfate présents dans celui-ci;10 une étape au cours de laquelle l'on procède à la réduction, par ledit mélange, de sulfate marqué au soufre 35, et l'on récupère le sulfure marqué au soufre obtenu à l'issue de cette réduction. 2) Procédé selon la Revendication 1, caracté- risé en ce que le mélange réducteur est prétraité par chauffage sous courant d'un gaz inerte. 3) Procédé selon la Revendication 2, caracté- risé en ce que ledit mélange réducteur est prétraité par chauffage pendant 30 minutes à 3 heures, à une tempéra- ture comprise entre 90 et 150 C. 4) Procédé selon l'une quelconque des Revendi- cations 1 à 3, caractérisé en ce que ledit mélange com- prend entre 40 et 60 % en volume d'acide iodhydrique pur, entre 20 et 30 % en volume d'acide chlorhydrique pur, entre 20 et 30 % en volume d'eau, et entre 10 et 15 % d'acide hypophosphoreux en solution à 50 % (P/P) dans l'eau. ) Procédé selon l'une quelconque des Revendi- cations 1 à 4, caractérisé en ce que l'on réduit le sul- fate marqué au soufre 35, par chauffage sous courant d'un gaz inerte, en présence du mélange réducteur prétraité et l'on récupère le sulfure marqué au soufre 35 qui se dégage, sous forme de sulfure d'hydrogène. 6) Procédé selon la Revendication 5, caracté- risé en ce que le sulfure marqué au soufre 35 est recueilli par barbotage du sulfure d'hydrogène dans une solution aqueuse d'une base forte, le rapport molaire base forte/soufre 35, étant compris entre 5/1 et 80/1. 7) Procédé de préparation d'acides aminés ou de leurs dérivés marqués au soufre 35, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on procéde à la sulfhydrylation de la sérine ou de l'homosérine, ou de l'un de leurs dérivés O-acylés, par un sulfure marqué au soufre 35, obtenu par le procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 6, en présence d'une enzyme apte à catalyser ladite réaction de sulfhydrylation. 8) Procédé selon la Revendication 7, caracté- risé en ce que l'on utilise l'enzyme O-acétyl- L-homosérine sulfhydrylase, en présence d'O-acétyl- L-sérine ou d'O-acétyl-L-homosérine. 9) Procédé selon l'une quelconque des Revendi- cations 7 à 8, caractérisé en ce que l'on purifie le pro- duit de la réaction enzymatique, marqué au soufre 35, par chromatographie en phase inverse du mélange réactionnel. 10) Procédé selon l'une quelconque des Reven- dications 7 à 9, caractérisé en ce que l'on procède, pour obtenir de la méthionine marquée au soufre 35, à la méthylation de l'homocystéine obtenue à l'issue de la réaction enzymatique, préalablement à la purification par chromatographie.