FR 2676751 A1 19921127 FR 9106263 A 19910524 COMPOSITION APPROPRIEE A LA CONSERVATION DE SPORES FONGIQUES ACTIVEES La présente invention concerne une composition à base de microorganismes et plus particulièrement de moisissures sous forme de spores prégermées et/ou spores germées, appropriée à la conservation prolongée desdits microorganismes. Les moisissures sont des champignons dont l'appareil végétatif ou thalle est pourvu d'une paroi Ce sont des hétérotrophes qui se nourrissent par absorption Ils peuvent se présenter sous la forme de spores ou conidies qui assurent la reproduction assexuée desdites moisissures. Au cours de leur évolution métabolique les spores peuvent germer et conduire ainsi à des spores prégermées et/ou spores germées On entend par spores pré-germées des spores qui présentent une croissance sphérique (renflement) et qui n'ont pas encore développé un bourgeon germinatif et par spores germées des spores comportant au moins un tube germinatif. Les champignons tels les moisissures à l'état non germinatif, sont utilisés notamment en tant que ferment dans l'industrie alimentaire, par exemple en fromagerie pour transformer des produits comme le lait en fromage et en salaison pour la fabrication du saucisson. Ces moisissures sont généralement commercialisées sous forme de spores, soit en milieu liquide, soit sous une forme congelée ou sous forme de poudres lyophilisées. Les spores sont très résistantes et présentent l'avantage d'une excellente stabilité dans le temps Lors de leur utilisation les spores sont généralement pulvérisées et/ou incorporées dans les produits à transformer. Les spores germent et se développent sous forme d'une couverture mycénienne. Toutefois, pendant la période de formation du mycélium à partir des spores, il existe un risque important de contamination des produits à transformer, par des microorganismes indésirés. De plus, cette période nécessaire au développement de la moisissure correspond à une perte économique pour l'utilisateur due à une commercialisation retardée et un investissement important de stockage des produits à transformer. De manière à diminuer cette période de formation du mycélium, on peut envisager l'emploi direct des spores prégermées et/ou spores germées. Toutefois, l'utilisation et la commercialisation de ce type de spores beaucoup moins stables et résistantes que les spores d'origine, ont été jusqu'ici limitées par le fait que l'on ne connaissait pas de moyen pour les conserver pendant une longue période de temps, sans les dégrader et sans qu'elles perdent leur activité. Un premier objet de l'invention consiste donc en une composition permettant notamment une longue conservation de moisissures, lorsqu'elles se présentent sous forme de spores prégermées et/ou spores germées. Un deuxième objet de l'invention est l'utilisation dans l'industrie alimentaire de ladite composition. Un dernier objet de l'invention est un procédé de conservation desdites spores de moisissures mettant en oeuvre ladite composition. La présente invention concerne une composition à base de microorganismes caractérisée en ce qu'elle comprend une phase aqueuse contenant au moins un composé protéique, au moins un polyalcool et éventuellement au moins un glucide et en ce que lesdits microorganismes sont des spores fongiques activées. On entend désigner de manière générale, par spore fongiques activées, des spores de moisissures prégermées et/ou des spores de moisissures germées. Toutefois, la présente invention s'applique plus particulièrement à la conservation des spores dites pré-germées. La concentration en microorganismes de la composition selon l'invention varie en fonction de l'utilisation ultérieure En général la composition comporte plus de 106 microorganismes/ml et de préférence de 107 à 101 i microorganismes/ml. Les moisissures préférées sont celles du genre Penicillium et Geotrichum. Parmi les Penicillium, on utilise plus particulièrement en fromagerie P. camenbertii, P caseicolum et P roquefortii En salaison, on utilise plus particulièrement les espèces P nalgiovensis, P chrysogenum et, dans une moindre mesure P camembertii et P caseicolum. La phase aqueuse peut-être constituée par un soluté aqueux comme de l'eau de ville ou une solution aqueuse de chlorure de sodium, et/ou par un milieu de culture des microorganismes, ces derniers pouvant être préalablement concentrés ou non, par exemple par décantation ou centrifugation du milieu de culture De tels milieux de culture sont définis ci-dessous. Ledit composé protéique peut être une protéine entière, hydrolysée ou partiellement hydrolysée telles que les protéines du lait comme les lactalbumines ou les caséines, les protéines de l'oeuf comme l'ovalbumine, les protéines de poissons, les protéines d'origine végétale comme les protéines de soja, la sérumalbumine ou la gélatine Ledit composé protéique peut encore être une glycoprotéine ou un milieu biologique comportant au moins une protéine et/ou une glycoprotéine tels l'oeuf entier, le blanc d'oeuf commercial, montant ou non, les farines de poisson ou les farines d'origine végétale comme les farines de soja, le lait entier, dégraissé, partiellement dégraissé ou en poudre. Le polyalcool peut être un hexitol comme le sorbitol ou le mannitol, ou avantageusement le glycérol. La composition selon l'invention peut également comporter un glucide qui peut être un ose tels le glucose, le fructose, le galactose ou un oside tels le lactose, le maltose, le saccharose, ou les amidons, les maltodextrines et les dextrines, les sirops de glucose hydrogénés. Généralement, on peut obvier dudit glucide lorsque dans la composition on utilise à titre de composé protéique une glycoprotéine ou un milieu biologique comportant une glycoprotéine ou une protéine ainsi qu'un glucide De tels milieux biologiques sont par exemple le lait ou l'oeuf entier. La composition selon l'invention est généralement constituée de 60 à 95 % en poids, de préférence de 70 à 90 % en poids de ladite phase aqueuse, de à 40 % en poids, de préférence de 10 à 30 % en poids, dudit composé protéique, de 0,5 à 4 % en poids, de préférence de 1 à 3 % en poids dudit polyalcool et d'une manière avantageuse de 5 à 45 % en poids, de préférence de 10 à 30 % d'un composé glucidique. La composition de l'invention peut comporter d'une manière avantageuse au moins un agent antioxydant A titre d'agent antioxidant on peut citer les acides citrique, ascorbique et glutamique ainsi que leurs sels alcalins ou alcalino-terreux, en particulier les sels de sodium, potassium, calcium et magnésium On utilise généralement de 0,1 à 2 % en poids, de préférence de 0,4 à 1 % en poids dudit agent antioxydant par rapport au poids de la composition. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition comporte en outre un composé hydrophobe et se présente alors sous une forme d'émulsion Il s'agit d'une émulsion eau dans l'huile, stable dans le temps et supportant la congélation. A titre de composé hydrophobe avantageux dans le cadre de la présente invention, on peut citer les huiles telles que les huiles d'origine animale comme l'huile de foie de morue, ou les huiles d'origine végétale comme les huiles de soja, de colza, d'olive, d'arachide, de maïs ou de tournesol. En présence de ce composé hydrophobe, la composition selon l'invention peut contenir indifféremment à titre de spores activées, des spores prégermées et/ou spores germées. En particulier la présente invention se rapporte également à une composition constituée de 15 à 50 % en poids, de préférence de 25 à 41 % en poids de ladite phase aqueuse, de 35 à 80 % en poids, de préférence de à 70 % en poids dudit composé hydrophobe, de 2 à 8 % en poids, de préférence de 3 à 6 % en poids d'au moins un composé protéique,de 0,5 à 4 % en poids, de préférence de 1 à 3 % en poids d'au moins un polyalcool et de O à 3 % en poids d'au moins un glucide. Les spores activées utilisées selon la présente invention peuvent être préparées par inoculation d'un milieu de culture (ou milieu de germination) par des spores Le milieu de culture peut comporter outre de l'eau, une source azotée, une source carbonée, des ions phosphates, et éventuellement des oligoéléments. La source azotée peut consister en une ou plusieurs protéines ou en un hydrolysat total ou partiel de protéines telles celles décrites ci-dessus, en un ou plusieurs acides aminés, en un lysat ou un autolysat de levures et/ou en une source d'azote minérale comme les sels d'ammonium ou les nitrates par exemple le nitrate de potassium ou le nitrate de sodium. La source carbonée peut être constituée par au moins un glucide comme le glucose, le saccharose, le fructose, le lactose, les amidons, les dextrines ou les maltodextrines ou par un hexitol. Les ions phosphates peuvent être apportés par un sel monobasique de potassium ou de sodium, tels les dihydrogénophosphates de potassium ou de sodium. Le milieu de culture peut également comporter des oligoéléments tels le cuivre, le manganèse, le fer, le cobalt, le zinc ou le magnésium Ces oligoéléments peuvent être apportés sous forme de sulfates. Généralement le milieu de culture comporte de 0,15 à 0,80 % en poids, de préférence de 0,20 à 0,40 % en poids d'azote amené par la source azotée, de 2 à 15 % en poids, de préférence de 4 à 10 % en poids de la source carbonée et de 5 à 25 mmoles de préférence de 10 à 15 mmoles/l d'ions phosphates. Le milieu de culture peut également comporter de O à 200 mg/i d'oligoéléments Le p H du milieu de culture est de préférence compris entre 4 et 7, de préférence entre 4 et 6 Le p H dudit milieu peut être ajusté par exemple au moyen d'un acide tels l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique, l'acide orthophosphorique, l'acide lactique ou l'acide tartrique. La température de germination est généralement comprise entre 10 C et 300 C. La germination s'effectue sous agitation et sous aération. La durée de germination peut être comprise entre 8 et 16 heures, plus particulièrement entre 10 et 12 heures Généralement on introduit dans le milieu de culture une quantité de spores suffisante pour obtenir une concentration finale de spores activées comprise entre 106 et 1010 /ml. En utilisant un tel milieu de culture, on obtient une quantité de spores activées supérieure à 90 %, et généralement supérieure à 95 % Le dénombrement des spores peut se faire par comptage à l'hématimètre, ou sur milieux de dénombrement tel que PDA ou MEA. La présente invention concerne également un procédé de préparation des compositions décrites ci-dessus et qui consiste à mélanger les microorganismes avec ladite phase aqueuse, au moins un composé protéique, au moins un polyalcool et éventuellement au moins un glucide, au moins un agent antioxydant et/ou au moins un composé hydrophobe. Les microorganismes peuvent être incorporés dans la composition par exemple sous une forme lyophilisée, mais d'une manière avantageuse, pour les spores activées de moisissures la phase aqueuse est constituée du milieu de culture comportant les microorganismes, ce dernier pouvant ou non être préalablement concentré Si nécessaire, il est possible de compléter la phase aqueuse constituée par le milieu de culture par ajout d'un soluté aqueux tels ceux décrits ci-dessus. De préférence, on mélange la phase aqueuse contenant les microorganismes avec au moins un composé protéique, au moins un polyalcool et éventuellement au moins un glucide, au moins un agent antioxydant et/ou au moins un composé hydrophobe. Le mélange est généralement réalisé sous agitation selon des moyens classiques, par exemple une turbine d'agitation Lorsque la composition selon l'invention contient en outre un composé hydrophobe, l'agitation est adaptée pour permettre la formation d'une émulsion. Le mélange peut être réalisé à une température comprise entre environ 5 et 300 C et de préférence entre environ 15 et 250 C. L'invention concerne également un procédé de conservation de ladite composition selon lequel la composition est conservée à une température de + 4 VC ou congelée à une température d'environ 50 C à 80 'C et de préférence entre environ 5 *C et 300 C. Un tel procédé permet de conserver des spores activées de moisissures pendant au moins un mois, à + 40 C et généralement pendant au moins 4 mois à 100 C, sans endommager lesdites spores. Au moment de l'utilisation des microorganismes, et s'agissant d'une composition congelée, la décongélation ne nécessite aucune précaution particulière, si ce n'est le retour à une température trop élévée, c'est à dire excédant environ 450 C D'une manière avantageuse la température de décongélation se situe entre 4 et 25 O C S'agissant d'une préparation conservée à + 40 C, celle-ci peut être utilisée telle quelle. En présence d'un composé hydrophobe la température de congélation de ladite composition est bien entendu abaissée Dans ce cas, on congèle la composition à une température d'environ 30 à 180 'C et de préférence entre environ 30 et 800 C D'une manière avantageuse, on congèle ladite composition en abaissant la température de 0,10 C à 10 C/min et de préférence de 0,1 PC à 30 C/min et plus particulièrement de 0,40 C à 1,50 C/min. Les compositions selon l'invention ayant subi ou non un procédé de conservation, peuvent être utilisées directement ou après dilution à une teneur désirée en microorganismes, dans l'industrie alimentaire, en particulier en fromagerie ou en salaison Lesdites compositions peuvent par exemple être répandues ou incorporées dans les produits à transformer tels les fromages ou les produits de salaison. Les exemples donnés ci-après à titre non limitatif permettront de mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention. EXEMPLE 1 a) Germination Dans un fermenteur on introduit un milieu l'acide chlorhydrique et comportant: glucose dihydrogénophosphate de potassium autolysat de levure sulfate de cuivre ( 5 H 20) sulfate de manganèse (H 20) sulfate de magnésium ( 7 H 20) eau potable qsp aqueux stérile à p H 5,1 ajusté à g 2 g g 0,7 mg mg mg 1000 ml On introduit ensuite dans le fermenteur des spores de Penicillium candidum à raison de 6 108 spores/ml On place le milieu sous aération et agitation à 21 'C pendant 12 heures. En fin de germination, on obtient un milieu comportant 95 % de spores dites pré-germées. On concentre ce milieu par simple décantation pendant une heure au moins de manière à obtenir une concentration en spores de 2 109 ml. b) Formulation A l'aide d'une turbine d'agitation, on mélange 500 ml dudit milieu concentré avec: lait en poudre glycérol acide ascorbique glutamate de sodium 32,50 g ,00 g 2,50 g 2,50 g L'agitation se fait à 1 800 tours/min, minutes. à une température de 20 C, pendant Après conditionnement de la composition ainsi obtenue, dans plastique, on la congèle à une température de 10 C, ou on + 4 C. des flacons en la conserve à Certains flacons sont stockés à + 4 C et les autres à 10 C. La stabilité, c'est-à-di-e le nombre de spores pré-germées viables par rapport au nombre de spores pré-germées introduites initialement est supérieure à 95 % au bout d'un mois pour la composition stockée à + 4 C, et au bout de 3 mois pour celle stockée à 10 C. EXEMPLE 2 On mélange comme indiqué dans l'exemple 1, une suspension aqueuse de 000 ml de spores pré-germées de Penicillium Candidum obtenue dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1 et contenant également 2 109 g de spores pré-germées / ml, avec: glycérol lait en poudre blanc d'oeuf montant 83,30 g ,00 g 500,00 g On introduit la composition dans des flacons, composition à 10 C Après 4 mois on la décongèle que la stabilité des spores activées est supérieure et on congèle la et on peut constater à 95 %. EXEMPLE 3 Comme indiqué dans l'exemple 1, on mélange 500 ml d'une suspension aqueuse de spores pré-germées de Penicillium obtenue dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1, mais contenant 3 109 spores/ml, avec: glycérol 8,33 g lait en poudre 41,66 g blanc d'oeuf montant 41,66 g acide ascorbique 2, 50 g glutamate de sodium 2,50 g On introduit la composition dans des flacons. On stocke la composition pendant 4 mois à 18 C et on la décongèle La stabilité des spores activées est supérieure à 95 %. EXEMPLE 4 Comme indiqué dans l'exemple 1, on mélange 3000 ml d'une suspension aqueuse de spores pré-germées de Penicillium Candidum obtenue dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1, et contenant 2 109 spores/ml avec: glycérol 50,00 g lait en poudre 250,00 g blanc d'oeuf non montant 250,00 g licazym 750,00 ml (sirop de glucose hydrogéné). On introduit la composition dans des flacons en plastiques qui sont stockés à + 4 C, 10 C et 80 C La stabilité des spores pré- germées est la suivante: % à 1,5 mois de stockage à + 4 C 95 % à 4 mois de stockage à 10 C % à 4 mois de stockage à 80 C il EXEMPLE 5 a) Germination On cultive dans un fermenteur comportant le milieu de culture décrit en exemple 1 des spores de Penicillium candidum à raison de 5 107 spores/ml. En fin de germination le milieu obtenu est concentré de manière à obtenir une concentration en spores activées de 2 108/ml. b) Formulation A l'aide d'une turbine d'agitation, on mélange 500 ml dudit milieu concentré avec lait en poudre 18,75 g blanc d'oeuf montant 62,50 g glycérol 25,00 g acide ascorbique 5,00 g glutamate de sodium 5,00 g A ce mélange, on ajoute, toujours sous agitation, 1 000 ml d'huile de tournesol. L'agitation se fait à 1 800 tours/min, à une température de 20 'C, pendant minutes. Après conditionnement de la composition ainsi obtenue, dans des flacons en plastique, on la congèle à une température de 350 C suivant une cinétique régulière de descente en température de 0,5 C/min. Certains flacons congelés sont stockés à 30 'C et les autres à 800 C. La stabilité, c'est à dire le nombre de spores germées viables après décongélation de la composition par rapport au nombre de spores germées introduites initialement est supérieure à 95 % au bout de 1 mois pour la composition stockée à 30 'C, et au bout de 6 mois pour celle stockée à 80 'C. EXEMPLE 6 On mélange comme indiqué dans l'exemple 5, une suspension aqueuse de 000 ml de spores germées de Penicillium Candidum obtenue dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 5 et contenant également 2 108 spores germées/ml, avec: glycérol 250 g lait en poudre 187,5 g blanc d'oeuf montant 625 g Puis on rajoute à ce mélange 9 000 ml d'huile de tournesol et 1 000 ml d'huile de germe de maïs. On introduit la composition dans des flacons, et on la congèle à 80 'C par abaissement progressif de la température de 10 C par minute On stocke la composition à 80 'C Après 6 mois on la décongèle et on peut constater que la stabilité des spores activées est supérieure à 95 %. EXEMPLE 7 Comme indiqué dans l'exemple 5, on mélange 500 ml d'une suspension aqueuse de spores germées de Penicillium obtenue dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 5, mais contenant 2,5 108 spores/ml, avec: glycérol 25 g lait en poudre 18,75 g blanc d'oeuf montant 62,50 g acide ascorbique 5 g glutamate de sodium 5 g Puis on rajoute à ce mélange 1 000 ml d'huile de tournesol et on abaisse progressivement la température de 0,50 C/min jusqu'à 350 C. On introduit la composition dans des flacons. On stocke la composition pendant 6 mois à 80 C et on la décongèle La stabilité des spores germées est supérieure à 95 %. REVENDICATIONS 1 Composition à base de microorganismes caractérisée en ce qu'elle comprend une phase aqueuse contenant au moins un composé protéique, au moins un polyalcool et éventuellement au moins un glucide et en ce que les microorganismes sont des spores fongiques activées. 2 Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que les spores fongiques activées sont de préférence des spores fongiques pré- germées. 3 Composition selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisée en ce qu'elle comporte plus de 106 microorganismes/ml, et de préférence environ de 107 à 1010 microorganismes/ml. 4 Composition selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que les microorganismes sont de préférence des spores activées de moisissures du genre Penicillium ou Geotrichum. Composition selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que la phase aqueuse est constituée par un soluté aqueux et/ou un milieu de culture desdits microorganismes. 6 Composition selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que le composé protéique est une glycoprotéine ou un milieu biologique comportant au moins une protéine et/ou une glycoprotéine. 7 Composition selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le polyalcool peut être un hexitol, et est de préférence le glycérol. 8 Composition selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le glucide est un ose tels le glucose, le fructose, le galactose ou un oside, tels le lactose, le maltose, le saccharose, ou les amidons, les maltodextrines et les dextrines, ou les sirops de glucose hydrogénés. 9 Composition selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce qu'elle est constituée de 60 à 95 % en poids, de préférence de 70 à 90 % en poids de ladite phase aqueuse, de 5 à 40 % en poids, de préférence de à 30 % en poids dudit composé protéique, de 0,5 à 4 % en poids, de préférence de 1 à 3 % en poids dudit polyalcool et de 5 à 45 % en poids, de préférence de 10 à 30 % en poids dudit glucide. Composition selon l'une des revendications de 1 à 9 caractérisée en ce qu'elle comporte en outre au moins un agent antioxydant, tels l'acide citrique, l'acide ascorbique ou l'acide glutamique ou les sels alcalins ou alcalino-terreux de ces acides. Il Composition selon la revendication 10 caractérisée en ce qu'elle comporte environ de 0,1 à 2 % en poids, et de préférence environ de 0,4 à 1 % en poids dudit agent antioxydant. 12 Composition selon l'une des revendications 1 à 8 et 10 à 11 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un composé hydrophobe et en ce qu'elle se présente sous la forme d'une émulsion eau dans l'huile. 13 Composition selon la revendication 12 caractérisée en ce que le composé hydrophobe est une huile, et de préférence une huile d'origine animale ou végétale. 14 Composition selon l'une des revendications 12 et 13 caractérisée en ce qu'elle est constituée de 15 à 50 % en poids, de préférence de 25 à 41 % en poids de ladite phase aqueuse, de 35 à 80 % en poids, de préférence de 50 à 70 % en poids dudit composé hydrophobe, de 2 à 8 % en poids, de préférence de 3 à 6 % en poids d'au moins un composé protéique, de 0,5 à 4 % en poids, de préférence de 1 à 3 % en poids d'au moins un polyalcool et de O à 3 % en poids d'au moins un glucide. Procédé de préparation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisé en ce que l'on mélange les microorganismes avec la phase aqueuse, au moins un composé protéique, au moins un polyalcool et éventuellement au moins un glucide, au moins un composé hydrophobe et/ou au moins un agent antioxydant. s i 16 Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que l'on mélange la phase aqueuse contenant les microorganismes avec au moins un composé protéique, au moins un polyalcool et éventuellement au moins un glucide, au moins un composé hydrophobe et/ou au moins un agent antioxydant. 17 Procédé de conservation de microorganismes caractérisé en ce que l'on conserve une composition selon l'une des revendications 1 à Il à une température de + 40 C ou on congèle ladite composition à une température d'environ 5 C à 800 C, de préférence entre environ 50 C et 300 C. 18 Procédé de conservation de microorganismes caractérisé en ce que l'on congèle une composition selon l'une des revendications 12 à 14 à une température comprise entre environ 30 'C et 180 'C, de préférence entre environ 300 C et 800 C. 19 Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'on congèle ladite composition en abaissant la température de 0,1 à 10 'C/min, de préférence de 0,1 à 30 C, plus préférentiellement de 0,4 à 1,50 C/min. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 14 dans l'industrie alimentaire, en particulier en fromagerie et en salaison.