FR 2681076 A1 19930312 FR 9111072 A 19910906 ADN recombinant codant pour une protéine à activité endochitinase L'invention concerne un nouvel ADN recombinant codant pour une nouvelle protéine à activité endochitinase ou pour un pré- curseur de cette dernière, une bactérie, une levure ou un champignon contenant cet ADN recombinant, une cellule végétale, une plante, ou une partie de plante, en particulier une semence végé- tale, qui contiennent cet ADN recombinant, un procédé pour rendre les plantes résistantes aux agents pathogènes tels que des champi- gnons, des bactéries, ainsi que des arthropodes, notamment des insectes, et des nématodes, qui comprend une étape de transforma- tion par ce gène, ainsi que cette nouvelle protéine et un procédé pour la préparer. Les plantes cultivées sont soumises à des attaques par des agents pathogènes, tels que des champignons et des bactéries, ainsi que des arthropodes, notamment des insectes, et des néma- todes, lesquelles sont responsables de pertes importantes de récoltes Le principal moyen actuel de lutte contre ces agents réside dans l'utilisation de substances chimiques à activité fongi- cide ou bactéricide On sait aujourd'hui que les plantes réagissent naturellement à ces attaques par divers mécanismes de défense, mal- heureusement en général à déclenchement trop tardif et d'intensité trop faible pour être suffisamment efficaces L'un de ces méca- nismes comprend l'induction d'une enzyme appelée chitinase EC 3.2 1 14 (A Toppan et al, 1982, Agronomie, 2, 829-834) Cette induction peut être artificiellement stimulée par des substances, telles que l'éthylène avec comme conséquence l'augmentation de la résistance aux agents pathogènes de la plante traitée (Boller T, 1988, Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, 5, 145- 174). La chitine est un polymère linéaire polysaccharidique, constitué d'unités N-acétylglucosamine associées par des liaisons p-1,4 Celui-ci est un composé structural présent dans la paroi de la plupart des champignons pathogènes, dans l'exosquelette des arthropodes, en particulier des insectes, et dans l'enveloppe externe des oeufs et des cystes de nématodes Les enzymes appelées chitinases sont capables de dégrader la chitine On distingue parmi celles-ci deux groupes différents définis selon leur mode d'attaque de la chitine: les exochitinases capables de libérer l'unité N- acétylglucosamine située aux extrémités non réductrices des chaînes et les endochitinases capables de fragmenter les chaînes, qui sont les seules chitinases capables d'inhiber in vitro la croissance des hyphes mycéliennes'(Roberts W K et al, 1988, Gen Microbiol, 134, 169-176) Les chitinases végétales connues sont en grande majorité de type endo, contrairement aux chitinases bactériennes connues qui sont de type exo (Roberts W K et al, 1988, Gen Microbiol, 134, 169-176). Des séquences d'ADN codant pour des exochitinases bacté- riennes ont déjà été isolées et clonées (Jones J D G et al, 1986 EMBO J, 5, 467-473 et Sundheim L et al, 1988, Physiol Molec. Plant Pathol, 33, 483-491) Le brevet US-A-4 751 081 décrit l'iso- lement et le clonage du gène complet codant pour la chitinase de Serratia marcescens ainsi que la transformation par ce gène des bactéries Pseudomonas fluorescens NZ 130 et Pseudomonas putida MK 280 Ces bactéries transformées sont capables de dégrader légère- ment une chitine colloidale dispersée dans le milieu de culture bactérien Les travaux de Harpster M H et a L, 1989, Nucl Ac. Res, 17, 5395 ont montré que ce gène code pour une exochitinase, ce qui explique la faible efficacité de dégradation observée (cf. tableau 2, col 13 et 14 de ce document) La publication de Jones J D G et al ( 1988), Mol Gen Genet, 212, 536-542, men- tionne la transformation de plantes de tabac par Agrobacterium tumefaciens contenant un gène chimérique comprenant la partie codante de l'exochitinase de Serratia marcescens, sous contrôle de différents promoteurs végétaux Ce document ne donne aucune indica- tion sur l'éventuelle augmentation de la résistance aux pathogènes conférée par l'expression de cette exochitinase. Des séquences d'ADN génomique et/ou d'ADN complémentaire codant pour certaines endochitinases végétales ont d'autre part été isolées et clonées (Broglie K E, 1986, Proc Ntl Acad Sci USA, 83, 6820-6824 et Hedrick S A, 1988, Plant Physiol, 86, 182-186). La demande de brevet W O 90/07001 décrit la construction d'un plasmide portant un ADN complémentaire de l'endochitinase de haricot Phaseolus vulgaris sous le contrôle d'un promoteur fort, la transformation à l'aide d'Agrobacterium tumefaciens, la régénéra- tion du tabac transformé, des essais montrant la résistance accrue aux champignons, Rhizoctonia solani et Botrytis cinerea des plantes régénérées, l'obtention de plantes de tomates transgéniques expri- mant la chitinase de haricot ainsi que l'obtention à l'aide de ce gène de plantes de colza transgéniques ayant un niveau d'activité chitinase et une résistance à Rhizoctonia solani accrues par rap- port aux plantes de colza non transformées. On n'a jamais isolé jusqu'à présent une séquence d'ADN génomique et/ou d'ADN complémentaire codant pour une chitinase de champignon filamenteux La seule chitinase de champignon fila- menteux partiellement isolée et caractérisée est l'endochitinase d'Aphanocladium album (Kuntz, 1991-Thèse de Doctorat de l'Univer- sité de P et M Curie-Paris). La présente invention concerne un nouvel ADN recombinant caractérisé en ce qu'il code pour une protéine à chitinase ou pour un précurseur de cette dernière, activité endochitinase comprenant la séquence d'ac suivante: activité endo- cette protéine à ides aminés (al) Gly Gly Val Ser Gly Phe Arg Asn Phe Leu Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Leu Asp Ala Gln Asn Ala Val Tyr Pro Ala Asp Phe Met Asn Tyr Ala Asp Val Gly Thr Lys Lys Gin Trp Thr Trp Ser Asn Thr Asn Arg Tyr Ala Va L Glu Leu Arg Phe Pro Thr Asn Trp Gly Ala Ser Glu Ala Asp Gly Lys His Tyr Tyr Gly Cys Asn Met Lys Asn Phe Pro Ala Val Ala Val Met Ala Lys Thr Gly Ile Tyr Ile Thr His Ile Phe Ser Asp Ser Trp G Ln Leu Tyr Leu Ser Ile Ala Ser Ser Ala Leu Gly Gly Ala Thr Arg Lys Thr Phe Ala Gln Ser Ala Val Gly Phe Met Lys Asp Trp Gly 120 125 Phe Asp Gly Ile Asp Ile Asp Trp Glu Tyr Pro Ala Asp Ala Thr Gln 135 140 Ala Gln Asn Met Val Leu Leu Leu Gln Ala Val Arg Ser G Lu Leu Asp 150 155 160 Ser Tyr Ala Ala Gln Tyr Ala Lys Gly His His Phe Leu Leu Ser Ile 170 175 Ala Ala Pro Ala Gly Pro Asp Asn Tyr Asn Lys Leu Lys Phe Ala Glu 180 185 190 Leu G Ly Lys Val Leu Asp Tyr Ile Asn Leu Met Ala Tyr Asp Tyr Ala 200 205 Gly Ser Trp Ser Asn Tyr Thr Gly His Asp Ala Asn Ile Tyr Ala Asn 210 215 220 Pro Gln Asn Pro Asn Ala Thr Pro Tyr Asn Thr Asp Asp Ala Val Gln 225 230 235 240 Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Val Pro Ala Asn Lys Ile Val Leu Gly Met 245 250 255 Pro Ile Tyr Gly Arg Ser Phe Gln Gln Thr Glu Gly Ile Gly Lys Pro 260 265 270 Tyr Asn Gly Ile Gly Ser Gly Ser Trp Glu Asn Gly Ile Trp Asp Tyr 275 280 285 Lys Ala Leu Pro Lys Ala Gly Ala Thr Val Lys Cys Asp Asp Thr Ala 290 295 300 Lys Gly Cys Tyr Ser Tyr Asp Pro Ser Thr Lys Glu Leu Ile Ser Phe 305 310 315 320 Asp Thr Pro Ala Met Ile Ser Thr Lys Val Ser Trp Leu Lys Gly Lys 325 330 335 Gly Leu Gly Gly Ser Met Phe Trp Glu Ala Ser Ala Asp Lys Lys Gly 340 345 350 Ser Asp Ser Leu Ile Ser Thr Ser His Gln Gly Leu Gly Ser Gln Asp 355 360 365 Ser Thr Gln Asn Tyr Leu Asp Tyr Pro Asn Ser Lys Tyr Asp Asn Ile 370 375 380 Lys Lys Gly Met Asn ou une séquence présentant un degré d'homologie éLevé avec la séquence (al). Un degré d'homologie éLevé signifie ici une homologie (rapport entre les acides aminés identiques et le nombre total d'acides aminés) d'au moins 60 %, et de préférence d'au moins 80 %, des séquences d'acides aminés, torsqu'elles sont alignées d'après l'homologie maximale, selon la méthode d'alignement optimal des séquences de Need Leman et Wunsch, 1970, J Mol Biol, 48, 443-453. Cette méthode est notamment utilisée dans le logiciel UWGCG de l'Université du Wisconsin: Devereux et al, 1984, Nucl Ac Res, 12, 8711-8721 option GAP. La séquence peptidique de chitinase déjà connue la plus proche de la séquence (al) est celle de la chitinase de Serratia marcescens (Jones J D G et al, 1986, EMBO J, 5, 467-473) avec une homologie d'environ 33 % (Kuntz, 1991, Thèse de Doctorat - Université P et M Curie, Paris); cette dernière chitinase est une exochitinase. Cet ADN recombinant peut servir à l'expression de cette protéine à activité endochitinase, soit dans le but de conférer à une plante ou une partie de plante qui exprime celle-Là, une résis- tance accrue aux agents pathogènes, soit dans le but de produire cette protéine à l'aide de cellules eucaryotes, notamment des asco- mycètes tels que la levure par exemple Saccharomyces cerevisiae, des champignons filamenteux, par exemple, Cryphonectria parasitica, ou des cellules végétales, ou des micro-organismes procaryotes, tels que par exemple Escherichia coli. Cet ADN recombinant comporte de préférence en amont de la séquence codant pour la séquence (al) ou de la séquence présentant un degré d'homologie éLevé avec la séquence (al), une séquence signal, choisie en fonction de la cellule hôte, qui a pour fonction de permettre l'exportation de la protéine hors du cytoplasme. Pour une expression dans les micro-organismes pro- caryotes, tels que par exemple Escherichia coli, cette séquence signal peut être, soit une séquence dérivée d'un précurseur naturel d'une protéine exportée par un micro-organisme procaryote (par exemple Le peptide signa L Omp A, Ghrayeb et a L, 1984, EMBO Journa L, 3, 2437- 2442) ou ce Lui de La phosphatase a Lca Line (J Bact 1983, 154, 366-374), soit une séquence non endogène provenant d'un pré- curseur eucaryote (par exemp Le Le peptide signal de L'un des pré- curseurs naturels de L'hormone de croissance humaine), soit un pep- tide signa L synthétique (par exemp Le ce Lui décrit dans la demande de brevet FR N 2 636 643). Pour une expression dans les cellules eucaryotes te L Les que Les ascomycètes, par exemp Le La Levure Saccharomyces cerevisiae ou le champignon filamenteux Cryphonectria parasitica, cette séquence signa L est de préférence une séquence dérivée d'un pré- curseur nature L d'une protéine sécrétée par ces cellules, par exemple pour la levure ce Lui de L'invertase (demande de brevet EP 0 123 289) (demande de ce Lui de La ou celui de la séquence prépro de la phéromone brevet DK 2484/84), ou pour Cryphonectria alpha parasitica, séquence prépro de l'endothiapepsine, de séquence: Met Gly Ala Ser Ser Pro Ala Leu Ser Ser Pro Glu Asn Pro Asn Leu Lys Asn Leu Ser Lys Asn Ala Leu Pro Thr Lys Val Gly Pro Tyr Lys Phe Tyr Gly Va L Ser Thr Ser G Ly Pro Leu Asn I Le Gly Gly G Ln Lys Val His Thr Ala Met Leu Val Gly Ile Tyr Ser Phe Pro Leu Ser Pro Ala Trp Leu Val Glu Lys Lys Ala Gly Pro Val Asn G Ln Va L Arg Lys Thr Tyr Asp A La Va L G Ln A La G Lu Arg Pour une expressi lise comme séquence signal, on dans Les cellules végétales, on uti- soit une séquence codant pour le pep- tide signa L d'une protéine de cel Lu Le végéta Le connue pour être exportée, par exemp Le, celle de l'endochitinase de tomate (Thèse de Doctorat es Sciencesspécialité:biologie mo Léculaire végétale, 1986, de M Durant- Université de Paris Sud) Met Arg Arg Thr Ser Lys Leu Thr Thr Phe Ser Leu Leu Phe Ser Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Ser Ala Ala Leu Ala soit une séquence signal codant pour le peptide signal (a 2) suivante Met Leu Ser Phe Val Lys Lys Ser Ile Ala Leu Val Ala Ala 1 5 10 Ala Val Thr Ala Leu Ala de séquence Leu Gln le peptide signal codé par la séquence signal pouvant ment être séparé de la séquence (al) dans la protéine ou plusieurs acides aminés, en particulier par le éventuelle- codée par un peptide de séquence (a 3) suivante: Thr Pro Ile Ser Ser Glu Ala Gly Val Glu Lys Arg 1 5 10 Les séquences d'acides aminés (al), (a 2) et (a 3) peuvent par exemple être codées par les séquences nucléotidiques (Nal), (Na 2) et (Na 3) ci-après. (Nal): GGTAGTGGTT TTGCAAATGC CGTCTACTTC ACCAACTGGG GCATTTATGG CCGCAACTTC CAGCCTGCCG ACCTTCCTGC CTCGGAGATT CGCGCAGATG GGTGACTCTT CTCAAGAAGC ACCAACTTCC GTTGGCTTCA GATGCCACTC TCCTACGCTG GCACCATCTT GGAACGATGT AGAACCGCAA CCGCTGCCGC TGAAGGACTG AGGCTCAGAA CCCAGTACGC TTCCGGTGAT GGGCACGAAC CATGAAGGTG CAGCTCGGCT GGGTTTCGAC TATGGTTCTC CAAGGGTCAC ACTCACGTAC ACCTATGCCG GCTTACGGTT ATGCTGTCGA GCTACCCGAA GGTATTGATA TTGCTACAGG CACTTCCTGC TCTACTCCTT ACTACGAGAA GTGTTAAGCA TTGGTGGTTG AGACTTTTGC TCGACTGGGA CTGTCCGCAG TTTCAATTGC CATGAATGTC GCACTACGCT ACTTTATCTT GACATGGTCT TCAGTCTGCT GTACCCCGCC TGAGCTCGAC CGCCCCTGCT GGACCTGACA AACCTCATGG ATATACGCAA GCCTATATCA CGATCCTTCC TGGGAGAACG GACGATACCG GATACGCCGG AGCATGTTCT CACCAAGGTC TACGACAACA ATTATAACAA CTTAGATTACGATTA ACCCGCAGAA ACGGCGGCGT AGCAAACCGA GTATCTGGGA CCAAGGGATG CTATGATCAG GGGAGGCTTC TCGGTAGCCA TCAAGAAGGG GCTGAAGTTT GCTGAGCTTG CGCTGGATCT TGGAGCAACT CCCCAACGCC ACCCCTTACA CCCTGCCAAC AAGATCGTCC GGGTATCGGT AAGCCTTACA CTACAAGGCT-CTCCCCAAGG CTACAGCTAC GATCCAAGCA CACCAAAGTT AGCTGGCTCA TGCCGACAAG AAGGGCTCGG GGACAGCACT CAGAACTACC CATGAAC GCAAGGTTCT ACACTGGCCA ACACGGACGA TTGGTATGCC ATGGTATTGG CTGGTGCCAC CTAAGGAGCT AGGGCAAGGG ACTCTCTTAT TCGACTACCC CGATTACATT CGATGCCAAC TGCTGTCCAG AATCTACGGC CTCTGGTAGC CGTCAAGTGC TATTTCTTTC CCTTGGCGGC TAGCACCAGC TAACTCCAAG (Na 2): ATGTTGAGCT CTGGCC TTGTCAAAAA GTCGATCGCC TTGGTGGCGG CCCTGCAGGC GGTCACTGCC (Na 3): ACGCCAATCT CCAGTGAAGC TGGTGTTGAG AAGCGC L'invention concerne aussi une unité d'expression de L'ADN recombinant défini précédemment, portée avantageusement par un vecteur, dit vecteur d'expression. Pour une expression dans les micro-organismes proca- ryotes, en particulier dans Escherichia coli, l'ADN recombinant doit être inséré dans une unité d'expression comportant notamment un promoteur efficace, suivi d'un site de fixation des ribosomes en amont du gène à exprimer, ainsi qu'une séquence d'arrêt de trans- cription efficace en aval du gène à exprimer Cette unité doit éga- lement comporter un marqueur de sélection ou être introduite dans la cellule hôte en même temps qu'une unité d'expression d'un marqueur de sélection (par exemple à l'aide d'un vecteur d'expres- sion qui porte ces deux unités) Toutes ces séquences doivent être * choisies en fonction de la cellule hôte. Pour une expression dans Les ce L Lu Les eucaryotes te L Les que Les ascomycètes, l'unité d'expression se Lon l'invention com- prend L'ADN recombinant défini précédemment avec Les moyens néces- saires à son expression. Pour une expression dans les cellules ascomycètes telles que la levure, par exemple Saccharomyces cerevisiae, il convient d'insérer l'ADN recombinant entre, d'une part, des séquences reconnues comme promoteur efficace, d'autre part, un terminateur de transcription L'unité d'expression porte un marqueur de sélection ou est introduite dans la cellule hôte en même temps qu'un marqueur de sélection De préférence, ce marqueur de sélection est un marqueur auxotrophe (qui comp Lémente une mutation des cellules réceptrices) qui permet la sélection des cellules qui ont intégré l'ADN recombinant en un nombre de copies éLevé, soit dans leur génome, soit dans un vecteur multicopie. Pour une expression dans les cellules ascomycètes telles que celles des champignons filamenteux, par exemple ceux des genres Aspergillus, Neurospora, Podospora, Trichoderma ou Cryphonectria, l'unité d'expression selon l'invention porte l'ADN recombinant défini précédemment avec les moyens nécessaires à son expression, et éventuellement un marqueur de sélection et/ou des séquences télomériques Il est en effet possible de sélectionner les trans- formants ayant intégré un ADN d'intérêt à l'aide d'un marqueur de sélection situé soit sur la même unité que l'ADN d'intérêt, soit sur une autre unité, ces deux unités étant alors introduites par cotransformation L'ADN recombinant de l'invention peut être, soit intégré au génome des champignons filamenteux, soit conservé sous forme extrachromosomique grâce à des séquences permettant la rép Li- cation et la partition de cet ADN. Pour une expression dans les cellules végétales, il con- vient d'insérer l'ADN recombinant défini précédemment entre un pro- moteur et un terminateur efficaces dans les végétaux. Le promoteur est de préférence un promoteur constitutif fort, par exemple le promoteur 35 S du virus de la mosaïque du chou- fleur, ou un promoteur commandant une expression tissu ou organe spécifique comme le promoteur de la petite sous-unité de la ribu- lose 1,5-bisphosphate carboxylase-oxygénase qui s'exprime préféren- tiellement dans les feuilles et tout particulièrement les tissus du mésophylle (Kuhlemeier et al, 1987, Ann Rev Plant Physiol 38: 221-257) On peut également utiliser un promoteur spécifique com- mandant par exemple une expression dans les graines ou au cours d'un stade précis du développement de la plante, ou un promoteur inductible à la suite d'un choc thermique, d'une blessure ou de l'interaction entre la plante et des parasites (Kuhlemeier et al, 1987 référence citée ci-dessus) si une expression de l'ADN recombi- nant est recherchée dans ces situations. On utilise la séquence terminatrice, comportant des sites de polyadénylation, pouvant être isolée de gènes végétaux ou de gènes s'exprimant dans les végétaux, comme par exemple le termina- teur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens. L'invention concerne également une bactérie, par exemple de l'espèce d'Escherichia coli, une levure, par exemple Saccharomyces cerevisiae ou un champignon filamenteux, par exemple Cryphonectria parasitica ou Fusarium oxysporum, qui contient l'ADN recombinant défini précédemment, avec les moyens nécessaires à sa réplication et son expression Cette bactérie, cette levure ou ce champignon filamenteux peut être utilisé dans la préparation d'une protéine à activité endochitinase. L'invention a également trait à une bactérie, par exemple de l'espèce Escherichia coli, qui contient l'ADN recombinant défini ci-dessus avec les moyens permettant sa réplication, laquelle donc, peut servir au clonage de cet ADN recombinant, et ainsi qu'à une bactérie susceptible d'infecter une plante avec transfert de maté- riel génétique, par exemple de l'une des espèces Agrobacterium rhizogenes et Agrobacterium tumefaciens, qui contient cet ADN dans un contexte permettant sa réplication et donc peut servir à trans- former des cellules végétales La transformation des cellules végé- tales par l'ADN recombinant ci-dessus peut également être effectuée par une autre méthode biologique telle que la voie du tube polli- nique (Zhong-xun Luo et al, Plant Molec Biol Rep, 1988, 6, 165- 176) et la transformation directe de graines en germination (Toepfer R et al, 1989, The Plant Cell, 1, 133-139), ou par une méthode physique telle que L'utilisation de polyéthylèneglycol, l'électroporation (Chistou P et al, 1987, Proc Ntl Acad Sci. USA, 84, 3662-3699) et le bombardement à l'aide de microprojectiles (Klein T M et al, 1988, Proc Ntl Acad Sci USA, 85, 8502- 8505) L'invention concerne également une cellule végétale, caractérisée en ce qu'elle est transformée par l'ADN recombinant défini précédemment, avec les moyens nécessaires à son expression. Cette cellule végétale peut provenir d'une espèce de grande cul- ture, telle que par exemple le mais, le soja, la betterave, le blé, l'orge, le pavot, le colza, le tournesol, la luzerne et le sorgho, d'une espèce florale telle que le rosier, l'oeillet, le gerbera ou d'une espèce potagère telle que la carotte, la tomate, la salade, la chicorée, le poivron, le melon et le chou Des espèces particu- lièrement appréciées sont le colza Brassica napus, le tournesol Helianthus annuus et le tabac Nicotiana tabacum. L'étape de transformation qui concerne une ou quelques cellules est suivie d'une étape de multiplication de ces cellules transformées de façon à obtenir des cals, lesquels peuvent donner naissance à des plantes transformées, par des processus d'organo- génèse ou d'embryogénèse. L'invention concerne donc aussi une plante ou une partie de plante, caractérisée en ce qu'elle contient, avec les moyens nécessaires à son expression, l'ADN recombinant défini précédem- ment Une partie de plante particulièrement appréciée est la partie apte à former une nouvelle plante complète, notamment après semis, enfouissement ou repiquage, ou à produire des semences Une telle partie est par exemple un grain, une graine, une semence, une bou- ture, une marcotte, etc Ces plantes peuvent être l'une quelconque des espèces ci-dessus et plus particulièrement des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus. L'invention a également trait à un procédé pour obtenir des plantes résistantes aux parasites, tels que les champignons phytopathogènes et les bactéries ainsi que les arthropodes, notam- ment les insectes, et les nématodes, qui comprend une étape de transformation de cellules végétales par cet ADN recombinant, suivie d'une étape de multiplication des cellules transformées et d'une étape de régénération des plantes. De préférence, l'étape de transformation des cellules végétales est effectuée in vitro à l'aide d'une agrobactérie (c'est-à-dire d'une bactérie du-genre Agrobacterium) ayant intégré l'ADN recombinant d'intérêt. L'invention concerne aussi les plantes résistantes aux agents pathogènes susceptibles d'être obtenues à l'aide du procédé défini ci-dessus. L'invention a également trait à l'utilisation d'une plante contenant, avec les moyens nécessaires à son expression, l'ADN recombinant défini précédemment, comme géniteur dans un pro- gramme de sélection pour créer de nouvelles variétés végétales. L'invention concerne aussi une nouvelle protéine à acti- vité endochitinase, susceptible d'être obtenue à l'aide de l'ADN recombinant défini précédemment Cette protéine comprend de préfé- rence la séquence (al) ou une séquence présentant un degré d'homo- logie élevé avec la séquence (al) Elle a avantageusement un poids moléculaire apparent de 39 + 3 ou 41 + 3 k Da Elle peut être N- glycosylée si elle est exprimée dans une cellule qui permet la glycosylation. Cette protéine présente un intérêt comme principe actif d'un nouveau médicament destiné à soigner des affections, telles que par exemple les mycoses. L'invention a également trait à un procédé de préparation de cette protéine qui comprend la mise en culture de cellules végé- tales, de cals végétaux, de plantes ou de parties de plantes conte- nant l'ADN recombinant défini précédemment, la lyse de ceux-ci, l'isolement et la purification de cette protéine. L'invention sera mieux comprise à l'aide de l'exposé ci- après, divisé en sections, qui comprend des résultats expérimentaux et une discussion de ceux-ci Certaines de ces sections concernent des expériences effectuées dans le but de réaliser l'invention, d'autres des exemples de réalisation de l'invention, donnés bien sûr à titre purement illustratif. Une grande partie de l'ensemble des techniques ci-après, bien connues de l'homme de l'art, est exposée en détail dans l'ouvrage de Sambrook et al: "Molecular Cloning: a Laboratory manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New York ( 2 e édition). La description ci-après sera mieux comprise en se rappor- tant aux figures 1 à 5. La figure 1 représente la séquence nucléotidique de l'ADN complémentaire pleine longueur codant pour la chitinase d'Aphanocladium album et la séquence peptidique de la protéine tra- duite, le site de clivage entre la séquence peptidique pré et la séquence peptidique pro, ainsi que le site de clivage entre la séquence peptidique pro et la protéine mature étant représentés par des flèches en dessous de la séquence peptidique, les différents sites de restriction utilisés dans les constructions ultérieures étant indiqués par une barre verticale en pointillé au-dessus de la séquence nucléotidique, et les sites potentiels de N-glycosylation étant soulignés. La figure 2 représente la séquence nucléotidique de l'ADN génomique codant pour la chitinase d'Aphanocladium album, les nucléotides des introns étant représentés en minuscules, et la séquence peptidique de la protéine traduite. La figure 3 représente la séquence peptidique de la pro- téine mature. Les figures 4 et 5 représentent les séquences codantes respectivement des plasmides p BR 61 et p BR 62 (vecteurs d'expression dans les cellules végétales), encadrées par les sites de restric- tions Bam HI et Sac I. Section 1: Préparation des anticorps contre la chitinase d'Aphanocladium album a) Purification de la chitinase d'Aphanocladium album Une chitinase du champignon filamenteux Aphanocladium album a été purifiée jusqu'à homogénéité à partir de milieu de cul- ture d'A album comme décrit ci-après: La souche d'Aphanocladium album utilisée est le mutant surproducteur de chitinase E 3 obtenu par mutagénèse UV de la souche sauvage ETHM 483 selon le protocole décrit par Vasseur et al, 1990, J Gen Microbiol, 136, 12, 2561-2568 Cette souche a été cultivée sur un milieu de malt-agar dans les conditions décrites par Forrer H R, Phytopath Z 88, ( 1977), 306 Des fragments pré- levés de cette culture servent à ensemencer un milieu de culture liquide contenant 1 % de chitine (Srivastava A K et a L, Experien- tia 41, ( 1985), 1612-1613) La protéine est purifiée à partir du milieu de culture par chromatographie en phase liquide selon la techyique FPLC de Pharmacia sur la colonne échangeuse de cations à base de polymère synthétique (Mono S de Pharmacia), et chromato- graphie d'exclusion (de tamisage mo Léculaire) sur un agarose réti- cu Lé selon le protocole décrit ci-après: Etape 1: Le milieu de culture est concentré 40 fois contre du polyéthy Lèneglycol (Carbowax 20 MTouzart et Matignon), puis dialysé pendant une nuit à 4 C contre une solution tampon d'acétate de sodium 100 m M de p H 5,0 La quantité totale de protéines est déterminée par la méthode de Bradford (Bradford M M, 1976, Anal. Biochem, 72, 248-254). Etape 2: Le milieu de culture concentré est ensuite fractionné par chromatographie sur une colonne d'échange d'ions à base de polymère synthétique (colonne Mono S de Pharmacia) selon la technique FPLC de Pharmacia L'extrait, préalablement dilué dans une solution tampon d'acétate de sodium 10 m M de p H 5,2, est déposé sur la colonne MONO S (HR 5/5), équilibrée avec un tampon acétate de sodium 10 m M de p H 5,2 Les protéines retenues sur la colonne sont éLuées par un gradient linéaire de 10 à 500 m M d'acétate de sodium p H 5,2. Etape 3: Les fractions contenant la chitinase d'Aphanocladium album sont concentrées par ultrafiltration sur membrane Centricon (Amicon) La purification de la protéine est poursuivie par chromatographie d'exclusion sur un agarose réticulé (colonne Superose 12 Pharmacia), l'élution étant réalisée par une solution tampon d'acétate de sodium 500 m M de p H 5,2. A chaque étape, la chitinase est identifiée par son poids moléculaire (électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 12,5 % en présence de SDS révélation à l'argent) et son activité enzyma- tique, mesurée par la méthode radiochimique décrite ci-après utili- sant la chitine marquée au tritium comme substrat (Molano et al. ( 1977) Anal Biochem 83, 648-656). A l'issue de la purification, on isole une protéine de poids moléculaire apparent de 41 + 3 k Da qui présente une activité endochitinase (thèse de C Kuntz, Université de Pierre et Marie Curie, 1991) Cette protéine possède une activité chitino- lytique mesurée par la méthode radiochimique au tritium décrite ci-après. b) Caractérisation de la chitinase d'Aphanocladium album bl Mesure de l'activité enzymatique de la chitinase d'Aphanocladium album L'activité endochitinase de la chitinase est mesurée par une méthode radiochimique permettant d'estimer la quantité de mono- mères ou d'oligomères libérés par l'enzyme à partir d'un substrat (la chitine tritiée) Cette méthode, décrite par Molano et al. ( 1977, Anal Biochem, 83, 648-656), est résumée ci-après. A un volume d'extrait protéique de 10 pl sont ajoutés pl de chitine tritiée d'activité spécifique 0,58 M Bq/ml Le volume final est ajusté à 300 pl avec du tampon d'acétate de sodium 0,2 M de p H 5,0 Après 90 min d'incubation à 300 C, la réaction d'hydrolyse de la chitine est arrêtée par 100 pl d'acide trichlor- acétique à 20 % Les tubes réactionnels sont ensuite centrifugés pendant 10 min à 12 000 g Une partie aliquote de 100 pl du sur- nageant renfermant Les oligomères solubles de chitine est préLevée et la radioactivité correspondante est mesurée par scintillation liquide en présence de 5 ml de mélange scintillant On exprime l'activité chitinolytique spécifique en dpm/p Jg de protéine. b 2 Détermination de la séquence aminoterminale de la chitinase d'Aphanocladium album Le séquençage de l'extrémité aminoterminale de la pro- téine isolée a été réalisé comme décrit ci-après Les échantillons à traiter sont portés à la surface d'un filtre PVDF ("polyvinyli- dènedifluoride": dilfuorure de polyvinylidène) qui est introduit dans un séquenceur de protéines (Modèle 470 A, commercialisé par la Société Applied Biosystems E U A) équipé d'un chromatographe (Modèle 430 d'Applied Biosystems) qui analyse en continu les dérivés phénylthiohydantoiques formés après chaque cycle de dégra- dation. La séquence aminoterminale déterminée est la séquence suivante: Gly Ser Gly Phe Ala Asn Ala Val Tyr Phe Thr Asn Trp Gly Ile Tyr 1 5 10 15 Gly Arg Asn Phe Gln Pro Ala c) Préparation d'anticorps polyclonaux Pour préparer un immunsérum, on a injecté à des lapins pg de chitinase purifiée dans 500 pl d'adjuvant complet de Freund Trois injections de rappel de 25 pg dans l'adjuvant incomplet de Freund ( 500 pl) ont été réalisées à 3 semaines d'intervalle L'immunsérum a été prélevé 3 semaines après la der- nière injection. Cet immunsérum reconnaît spécifiquement la chitinase d'Aphanocladium album Il permet de révéler cette dernière protéine notamment par la technique de Western Blot (décrite dans la section 8) à partir d'un extrait de protéines totales d'une souche d'Aphanocladium album cultivée dans les conditions décrites ci- dessus. Section 2: Construction de la banque d'ADN complémentaire d'Aphanocladium album a) Préparation d'ARN messagers extraits d'Aphanocladium album Les ARN totaux de mycélium de la souche d'Aphanocladium album précédente cultivée pendant 2 jours sur un milieu en présence de 1 % de chitine, ont été extraits selon la méthode de Logeman et al., Analytical Biochemistry, 1987, 163, 16-20. Le mycélium est séparé du milieu de culture par filtra- tion, lavé par de l'eau stérile, puis broyé au mortier dans de l'azote liquide; les ARN totaux sont ensuite extraits par la méthode à l'hydrochlorure de guanidine en suivant les recommanda- tions de Logeman et al (réf ci-dessus) Après une étape de préci- pitation éthanolique, les ARN totaux sont dissous dans une solution tamponnée. + Les ARN messagers poly (A) ont été isolés après 2 cycles de chromatographie sur une colonne d'oligo (d T) cellulose comme décrit dans Sambrook et al, (op cité) La quantification des ARN messagers (AR Nm) est réalisée par spectrophotométrie à 260 nm. b) Synthèse des ADN complémentaires Les ADN complémentaires ont été synthétisés à l'aide du kit "Riboclone c DNA Synthesis System" de Promega (réf: C 2100) en suivant les recommandations du fournisseur Ce kit utilise la méthode décrite Okayama et al, 1982, Mol and Cell Biol 2, 161- et modifiée par G bler et Hoffman, 1983, Gene, 25, 263-269, qui favorise la synthèse et le clonage d'AD Nc complets Les ADN complé- mentaires ont été clones au site Eco RI dans le vecteur Xgt 11 en suivant la procédure du système de clonage d'Amersham Le nombre de recombinants a ensuite été estimé par comptage des plages de lyse obtenues sur un tapis de bactéries de la souche E coli Y 1090 (Sambrook et al, op cité) Environ 105 clones ont été obtenus, dont 80 % sont des clones recombinants. Section 3: Criblage immunologique de la banque d'ADN comp Lémen- taires construite à partir des ARN messagers d'Aphanocladium album La réalisation d'une banque dans le vecteur Xgt 11 permet de réaliser l'expression des AD Nc clones sous forme de protéines codées par les AR Nm qui ont servi à construire cette banque Cette synthèse se fait après induction à l'isopropyl thio-p-D-galactoside (IPTG); les protéines synthétisées peuvent alors être reconnues par des anticorps préalablement obtenus contre la protéine recherchée (section 1) Les clones peuvent être repérés et isolés selon un protocole connu de l'homme de l'art et décrit par exemple par Sambrook et al (op cité). La banque est amplifiée par infection de la souche E coli Y 1090 à L'aide d'une suspension de phages contenant 10 particules capables de former des plages de lyse Cette étape est réalisée dans des boîtes de Pétri de 90 mm de diamètre L'incuba- tion est réalisée à 42 C pendant 16 h et permet une amplification de 107 fois. La banque amplifiée est ensuite éta Lée sur un tapis bac- térien de la souche E coli Y 1090 à une densité de 10 particules capables de former des plages de lyse Les bactéries sont éta Lées dans 5 boites de Pétri de 150 mm de diamètre et incubées à 42 C pendant 5 h Un fi Ltre de cellulose (Sch Leicher et Schuell, BA 85) imprégné d'IPTG ( 10 m M) est déposé sur la surface des boîtes et laissé en contact avec le milieu géLosé pendant 5 h à la tempéra- ture de 37 C, puis remplacé par un second filtre qui est laissé pendant 16 h sur le même milieu Les filtres sont traités par un tampon dit de blocage composé de 10 % de lait en poudre (Regilait) dans du tampon TNT ( 10 m M Tris p H 8,0, 150 m M Na Cl, 0,05 % Tween) pendant 30 min et incubés avec l'antisérum décrit précédemment, di Lué au 1/100 dans le milieu TNT Le protocole d'incubation et de révélation à la phosphatase alcaline est celui décrit par le "Protoblot immunoscreening system" de Promega réf 53710 Les clones positifs apparaissent colorés en bleu-violet après révéla- tion. Les plages de lyse positives, c'est-à-dire correspondant à des clones qui synthétisent la chitinase, sont alors repérées sur la boite de Pétri et les bactériophages sont préLevés pour être purifiés grâce à un criblage immunologique secondaire, conduit de façon strictement identique au criblage primaire qui vient d'être décrit Dix-sept clones ont été-obtenus correspondant à 7 groupes d'hybridation différents Un groupe d'hybridation de 9 clones d'environ 230 pb fournit un signal particulièrement fort L'un de ces clones, dénommé CH 3 C, a été retenu pour la suite de l'étude. La séquence de l'ADN du clone CH 3 C a été déterminée selon la méthode des désoxyribonuc Léotides (Sanger et al, 1977, Proc. Ntl Acad Sci USA, 14, 5463-5467) Ce clone ne renferme pas l'ADN complémentaire "pleine longueur", car sa taille est trop petite. Section 4: Construction de la banque d'ADN génomique d'Aphanocladium album a) Préparation et encapsidation de l'ADN total d'Aphanocladium album L'ADN total a été préparé par la méthode de Daboussi et al Curr Genet, ( 1989),15, 453-456 L'ADN d'A album a ensuite été partiellement digéré par l'enzyme de restriction Sau 3 AI et fractionné selon la taille sur un gradient de saccharose Les frag- ments d'une taille comprise entre 12 et 20 kb ont été insérés dans le phage EMBL 4 après coupure de ce dernier au site Bam HI L'encap- sidation dans les particules phagiques est réalisé in vitro en uti- lisant le kit "c DNA cloning system" d'Amersham, réf: RPN 1280, et la transfection est réalisée sur un tapis de bactéries de la souche E coli LE 292 (Sambrook et al, op cité) La taille de la banque est de 1,2 x 106 plaques et possède 50 % de phages recombinants. b) Crib Lage de la banque génomique d'Aphanocladium album bl Préparation des répliques sur filtre Après amplification de la banque par infection de la souche E coli NM 539 (Sambrook et al, op cité) selon les techniques connues de l'homme de l'art, on étale 10 phages à une densité de 20 000 pfu par boite sur un tapis de bactéries de la souche NM 539 L'incubation dure 16 h à 370 C Les boites sont refroidies et 2 répliques sont effectuées en déposant successive- ment 2 filtres de Nylon (Hybond N, Amersham réf RPN 203 N) Le pre- mier est laissé en contact avec les plages de lyse pendant 45 s, le second pendant 90 s. Les répliques sur membrane sont déposées avec l'ADN vers le haut, sur une feuille de papier Whatman 3 MM saturée avec une solution de dénaturation de composition: Na OH 0,5 M; Na CL 1,5 M, pendant 7 min, ce qui permet de fixer l'ADN Les répliques sur mem- brane sont ensuite posées sur une seconde feuille de Whatman 3 MM saturée cette fois avec une solution neutralisante de composition: Na Cl 1,5 M, Tris-H Cl p H 7,4 0,5 M, pendant 3 min Les répliques sur membranes sont ensuite plongées dans une solution de 2 x SSC (Na Cl 0, 30 M; citrate de sodium 0,030 M), puis séchées à l'air libre, la face ayant fixé l'ADN étant dirigée vers le haut. b 2 Préparation de la sonde radioactive utilisée pour repérer les clones positifs et hybridation des répliques La sonde utilisée est l'ADN du clone CH 3 C obtenu précé- demment (section 3), dont 100 ng d'ADN sont marqués à l'aide de d CTP 32 P ( 3 000 Ci/mmol Amersham) par marquage au hasard ("ramdom priming") en utilisant le kit de marquage de Boehringer Manneheim Gmb H (réf: 1004 760), utilisé selon les recommandations du fabri- cant L'activité spécifique obtenue est de 1 x 109 dpm/pg d'ADN. Les répliques sur membrane sont préhybridées pendant 1 h à 65 C dans un tampon de composition: 6 x SSC; 5 x solution de Denhardt; 0,5 % SDS et 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué Les répliques sur membrane sont hybridées avec la sonde préparée précédemment pendant 16 h dans le même tampon, puis sont lavées pendant 20 min à 20 C dans un tampon 2 x SSC; 0,1 % SDS, puis pendant 40 min dans un tampon 2 x SSC; 0,1 % SDS à 65 C, et enfin pendant 40 min dans un tampon 0,2 x SSC; 0,1 % SDS à 65 C, puis séchées et autoradiographiées En résumé, le tampon 20 x SSC contient 175,3 gfl de Na CL; 88,2 g/l de citrate de sodium et est ajusté à p H 7 par quelques gouttes de Na OH 10 N La solution 10 x Denhardt contient 1 g de Fico LL 400, 1 g de polyvinylpyrrolidone, 1 g d'albumine sérique bovine pour 500 ml de volume final Cinq phages ont été purifiés en trois étapes Quatre d'entre eux pré- sentent un profil de digestion identique pour les enzymes de res- triction Eco RI, Hind III et Bam HI. b 3 Clonage et séquençage d'un fragment renfermant un gène d'Aphanocladium album codant pour une chitinase L'ADN de l'un de ces 4 phages a été digéré par l'enzyme Bam HI Les fragments de restriction obtenus ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1 % L'ADN a été transféré selon la méthode de Southern blot (Southern, E M ( 1975), J Mol Biol, 98, 503-517) sur un filtre de Nylon (Hybond N Amersham) et hybridé avec l'ADN du clone CH 3 C marqué au d CTP 32 P (cf section 4 b 2) Les membranes sont ensuite lavées et révélées selon le protocole recom- mandé par Amersham et autoradiographiées avec un film XAR (Kodak). Un signal d'hybridation très fort sur une bande unique est mis en évidence La taille de ce fragment d'ADN est estimée à environ 7 kb Ce fragment, appelé fragment f BL 1, est ensuite isolé par éLectroélution après électrophorèse selon la méthode décrite dans l'ouvrage "Plant Molecular Biology Manual", Gelvin et al, Kluwer Academic Press, 1988, puis ligué dans un vecteur p UC 13 ouvert au site Bam HI et déphosphorylé (Pharmacia réf: 27-4969-01) Le plasmide obtenu est appelé plasmide p BL 1 Ce vecteur est introduit dans E coli (DH 5 a F') selon le protocole décrit par Sambrook et al, op cité Le clone obtenu est appe Lé BL 1. Séquençage: Après une préparation de L'ADN double brin, selon les techniques connues de l'homme de L'art, une partie de l'insert de 7 kb a été séquencé selon la méthode de didéoxyribonucléotides (Sanger et al, Proc Ntl Acad Sci USA, 14, 5463-5467, 1977) à l'aide du kit de Fharmacia "T sequencing kit", réf: 27-1 682-01. On utilise comme amorce le mélange des oligonucléotides de formule ci-après, appelé mélange d'oligonucléotides N 1, corres- pondant aux séquences déduites de la séquence aminoterminale de la protéine purifiée (cf section 1) Ce mélange a été obtenu par syn- thèse chimique à l'aide d'un appareil Biosearch 4600. GGI TTT/C GCI AAT/C GCI GTI TAT/C TTT/C AC Gly Phe Ala Asn Ala Val Tyr Phe (I représente l'inosine) A partir de la séquence obtenue au moyen de ces premières amorces, d'autres amorces ont été déduites afin de pouvoir séquencer le reste du brin En synthétisant des amorces dans le sens inverse, la séquence du brin complémentaire a été obtenue. Elle a permis de confirmer la séquence représentée dans la figure 2, qui sera commentée dans la section 7. Section 5: Obtention d'un ADN complémentaire pleine longueur de la chitinase d'Aphanocladium album a) Constitution d'une banque d'ADN complémentaire A partir des ARN messagers isolés comme décrit dans la section 2, on a réalisé une banque d'ADN complémentaire dans le secteur p TZ 19 R (commercialisé par Pharmacia) Ce vecteur est un plasmide comprenant un polylinker contenant des sites uniques de restriction. La technique de clonage utilisée est celle décrite par Caput et al, Proc Ntl Acad Sci (USA), ( 1986), 83, 1670-1674. Elle consiste d'une part à digérer le vecteur par Pst I, ajouter une queue de polyd C sur l'extrémité 3 ' protubérante, puis à digérer le plasmide ainsi obtenu par Bam HI Le fragment correspon- dant au vecteur est purifié sur colonne de Sépharose CL 4 B (Pharmacia) Il comprend donc une queue polyd C à une extrémité, l'autre extrémité étant cohésive, du type Bam HI D'autre part, les ARN messagers sont soumis à La transcription inverse à partir d'une amorce dont la séquence est la suivante 5 ' complémentaire de l'extrémité cohésive Bam HI. Les hybrides ARN-ADN obtenus par action de la transcrip- tase inverse sont soumis à une hydrolyse alcaline qui permet de se débarrasser de l'ARN Les ADN complémentaires simple brin sont alors purifiés par 2 cycles sur colonne de Sépharose CL 4 et soumis à un traitement à la terminal transférase de façon à ajouter des polyd G en 3 ' Les ADN complémentaires sont insérés sous forme simple brin dans le vecteur préparé comme décrit plus haut Un second oligonuc Léotide appelé l'adaptateur ("adapter") comp Lémen- taire de l'amorce est nécessaire pour générer une extrémité cohé- sive Bam HI à L'extrémité 5 ' des ADN complémentaires Après hybrida- tion du vecteur, de l'ADN complémentaire et de l'adaptateur, les mo Lécules recombinantes sont circularisées par l'action de la ligase du phase T 4 Les régions simple brin sont alors complétées en double brin grâce à l'ADN polymérase du phage T 4. Le pool de plasmides ainsi obtenu sert à transformer la souche MC 1061 (Casabadan, Chou et Cohen J Bact ( 1980), 143, 9971-9980) et les bactéries recombinantes sont sélectionnées pour la résistance à l'ampicilline. b) Criblage de la banque Préparation des sondes marquées: Trois sondes déduites de la séquence du clone d'ADN com- plémentaire CH 3 C et du clone d'ADN génomique BL 1 (section 4) ont été synthétisées à l'aide d'un synthétiseur d'ADN Biosearch 4600. Les sondes sont les suivantes: ( 1) 5 'CAA ATG CCG TCT ACT TCA CC 3 ' ( 2) 5 'CCT CAT GGC TTA CGA TTA CG 3 ' ( 3) 5 'TCC AAC CTC GAG CAT CAA TC 3 ' Elles codent respectivement pour des séquences situées au début, au milieu et en aval de la séquence codante de la chitinase d'Aphanocladium album Les sondes sont marquées par couplage à la peroxydase. Hybridation et détection des colonies contenant l'ADN complémen- taire de la chitinase d'Aphanocladium album: Environ 100 000 colonies sont criblées par la technique d'hybridation in situ mise au point par Grunstein et Hogness ( 1975, Proc Ntl Acad Sci (USA), 72, 3961) Environ 10 000 bactéries sont étalées sur 10 boîtes de Pétri de façon à obtenir des colonies isolées Après incubation pendant 24 h à 370 C, chaque boîte est répliquée sur 2 filtres de Nylon Hybond N (Amersham), chaque filtre étant destiné à être traité avec les trois sondes. Les répliques sur membrane sont déposées avec les colonies vers le haut sur une feuille de Whatman 3 MM saturée avec une solution de composition: Na OH 0,5 M; Na Cl 1,5 M, pendant min, puis les membranes sont déposées sur une solution neutrali- sante de composition: Na Cl 1,5 M; Tris-H Cl p H 8,0 0,5 M, pendant min Les répliques sont ensuite plongées dans une solution de 2 x SSC (Na Cl 0,30 M, citrate de sodium 0,030 M). On traite ensuite les répliques sur membrane avec de la protéinase K (Boehringer Mannheim Gmb H) à 100 pg/ml dans une solu- tion de composition: Tris-H Cl 10 m M p H 8; EDTA 10 m M; Na Cl m M; SDS 0,1 % à raison de 20 ml par membrane On incube pendant 30 min à 37 C avec agitation Les répliques sur membrane sont de nouveau plongées dans une solution de 2 x SSC et les débris bac- * tériens sont partiellement éliminés en frottant doucement avec un papier de la marque Kim Wipes Les membranes sont alors traitées pendant 5 min dans une solution de Na OH 0,4 M, puis rincées briève- ment dans une solution de 2 x SSC On obtient ainsi, pour chaque boîte, deux répliques sur membrane. Les filtres sont mis à préhybrider dans un tampon conte- nant 0,1 % SDS, 6 x SSC, 10 x Denhardt et 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué et dénaturé (Sigma) La température de préhybri- dation est de 42 C et la durée de 6 h. L'hybridation est réalisée à 42 C pendant 16 h en ajou- tant 60 ng/ml du mélange des 3 sondes marquées à la peroxydase. Le lavage des membranes est assuré dans la solution 2 x SSC; 0,1 % SDS à 22 C pendant 2 fois 5 min, puis pendant min, puis par 2 lavages de 15 min dans la solution 0,1 x SSC + 0,1 % SDS à 42 C et enfin 3 min dans une solution à 2 x SSC à 220 C. La révélation se fait à l'aide du kit ECL d'Amersham (réf RPN 2110) selon le protocole du fabricant en utilisant les films Xomat AR (Kodak). colonies présentaient une très forte hybridation avec le méLange des 3 sondes. L'ADN plasmidique de 15 de ces 35 colonies a été préparé et digéré par les enzymes Hind III et Bam HI Après électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %, les doubles digestions permettent de libérer un fragment dont la taille est d'environ 1,6 kb dans 4 cas sur les 15. Section 6: Détermination de la séquence de l'ADN complémentaire pleine longueur de la chitinase d'Aphanocladium album On a recloné un des fragments de 1,6 kb dans l'ADN de la forme réplicative du phage M 13 L'ADN des clones M 13 contenant le fragment de 1,6 kb a été soumis à une digestion exonucléasique de manière à générer une série de clones M 13 chevauchants (procédure "Cyclone I Biosystem" de IBI) Ces derniers ont été séquencés par la méthode des didéoxyribonucléotides (Sanger et al, 1977, Proc. Ntl Acad Sci USA, 14, 5463-5467). a) Analyse de la séquence de l'AD Nc de la chitinase d'Aphanocladium album La description ci-après sera mieux comprise à l'aide de la figure 1 Cette séquence renferme une seule phase de lecture ouverte (non interrompue par un codon stop) compatible avec Le poids mo Léculaire apparent de la protéine observé par éLectropho- rese sur gel de polyacrylamide 12,5 %: la séquence commençant par un codon ATG en position 97 et terminée par le codon stop TAA en position 1366, codant pour une protéine de 423 acides aminés et de poids mo Léculaire'd'environ 46 k Da. Un peptide signal est attendu par l'homme de l'art car les chitinases sont des protéines qui peuvent être naturellement sécrétées par les cellules de champignon, ce qui exige la présence d'un peptide signal. Le logiciel UWGCG de L'Université du Wisconsin: Devereux et al, 1984, Nucl Ac Res, 12, 8711-8721 option Recherche de peptide signal d'après la méthode de G Von Heijne, 1986, Nucl Ac. Res, 14, 483-490, prévoit dans cette séquence une partie codant pour un peptide signal reconnu par les cellules eucaryotes ou pro- caryotes, la séquence (Na 2) suivante, appe Lée séquence nuc Léoti- dique pré (commençant au nucléotide 97 et se terminant au nuc Léo- tide 162): ATGTTGAGCT TTGTCAAAAA GTCGATCGCC TTGGTGGCGG CCCTGCAGGC GGTCACTGCC 60 CTGGCC 66 codant pour le peptide signal de 22 acides aminés de séquence (a 2) suivante: Met Leu Ser Phe Val Lys Lys Ser Ile Ala Leu Val Ala Ala Leu Gln I 5 10 15 Ala Val Thr Ala Leu Ala Entre la séquence codant pour le peptide signal ci-dessus et celle codant pour la protéine mature, il y a la séquence nuc Léo- tidique (Na 3), suivante, appe Lée séquence nuc Léotidique pro, com- mençant au nucléotide 163 et se terminant au nucleotide 198. ACGCCAATCT CCAGTGAAGC TGGTGTTGAG AAGCGC codant pour la séquence peptidique (a 3) suivante, appelée séquence peptidique pro Thr Pro Ile Ser Ser Glu Ala Gly Val Glu Lys Arg -10 -5 -1 Il y a donc, en amont de la séquence codant pour la chitinase d'Aphanocladium album mature la séquence codant pour la séquence peptidique prépro (a 4) suviante: Met Leu Ser Phe Val Lys Lys Ser Ile Ala Leu Val Ala Ala Leu Gln 1 5 10 15 Ala Val Thr Ala Leu Ala Thr Pro Ile Ser Ser Glu Ala Gly Val Glu 25 30 Lys Arg La protéine mature est la protéine de 389 acides aminés d'un poids moléculaire voisin de 42,8 k Da qui commence par la séquence aminoterminale (bl) déterminée dans la section 1 Le poids moléculaire apparent observé d'environ 41 + 3 k Da correspond, compte tenu de la marge d'erreur expérimentale, au poids molécu- laire de 42,8 k Da calculé de la protéine déduite de l'ADN complé- mentaire Cette protéine possède deux sites potentiels de N- glycosylation (soulignés sur la figure 1). Comparaison de la séquence peptidique (al) aux autres séquences peptidiques déjà connues La comparaison a porté sur les chitinases végétales de classes I, II et III, définies par Shinshi et al, 1990, Plant. Mol Biol, 14, 357-368 et sur les chitinases bactériennnes de Bacillus circulans, Serratia marcescens et Streptomyces erythraeus. La comparaison a été effectuée à l'aide du logiciel UWGCG de l'Université du Wiscosin: Devereux et al, 1984, Nucl Ac, Res. 12, 8711- 8721, option GAP Cette méthode algorithmique considère tous les alignements possibles et crée un alignement dans lequel le plus possible d'acides aminés identiques sont appariés et le nombre de trous dans les séquences alignés est minimal. La séquence peptidique la plus proche de la séquence (al) déduite de l'ADN complémentaire d'A album est celle de la chiti- nase de Serratia marcescens (Jones J D G et al, 1986, EMBO J, 5, 467-473) avec une homologie d'environ 33 % Cette dernière chiti- nase est une exochitinase (Kuntz, 1991, Thèse de Doctorat - Université P et M Curie, Paris). Section 7: Analyse de la séquence de l'ADN génomique de la chiti- nase d'Aphanocladium album La description ci-après sera mieux comprise à l'aide de la figure 2 L'alignement de cette séquence avec la séquence d'AD Nc de la figure 1 montre que ce gène code pour la même séquence pepti- dique que l'ADN complémentaire cloné et met en évidence trois introns de petite taille La séquence commence par un codon ATG en position 126 et se termine par un codon stop TAA en position 1552. Le premier intron commence en position 266 et se termine en posi- tion 320 Le deuxième intron commence en position 420 et se termine en position 472 Le troisième intron commence en position 523 et se termine en position 571 Cette séquence code pour une protéine de 423 acides aminés. Section 8: Expression de la chitinase d'Aphanocladium album dans Fusarium oxysporum La cotransformation, qui repose sur la comp Lémentation d'une souche réceptrice du champignon filamenteux Fusarium oxysporum f sp melonis de phénotype nitrate réductase moins (nia-), est effectuée par le méLange d'un plasmide portant un gène codant pour une nitrate réductase d'Aspergillus nidulans et par le plasmide p BL 1 défini précédemment, porteur de l'ADN génomique de la chitinase d'Aphanocladium album La sélection des transformants s'opère sur un milieu contenant une source de nitrate permettant aux seuls transformants ayant intégré le gène de la nitrate réduc- tase de survivre et de se développer Certains de ces transformants ontégalement intégré le fragment f BL 1 C'est parmi ces doubles transformants que sont recherchés ceux qui expriment une activité chitinase. a) Transformation de Fusarium oxysporum La souche réceptrice de F oxysporum f sp melonis est la souche Fom 150 nia 9 décrite par Daboussi et al, 1989, Curr. Genet, 15, 453-456. Le gène niad codant pour la nitrate réductase d'Aspergillus nidulans porté sur un fragment Sau 3 A de 11 kb est inséré dans le plasmide p FB 39 qui dérivé de p UC 19 Ce plasmide uti- lisé pour la transformation de F oxysporum porte le nom de p AN 301. Sa construction est décrite par Malardier et al, 1984, Gene 78: 147-156. La cotransformation est réalisée en utilisant un méLange de plasmide p AN 301 et de plasmide p BL 1 décrit précédemment dans un rapport 1/1 Les conditions expérimentales utilisées pour assurer la transformation des protoplastes de F oxysporum, et la sélection des transformants sur nitrate sont celles décrites par LANGIN T et al., ( 1990), Curr Genet, 17: 313-319. On a ainsi obtenu quatre cotransformants, appelés Tr 5, Tr 6, Tr 7 et Tr 8. b) Expression de la chitinase d'Aphanocladium album par les co- transformants de Fusarium oxysporum Une analyse selon la méthode de Western blot a été effectuée sur ces 4 cotransformants de la façon décrite ci-après. Les protéines du milieu de culture sont concentrées contre du poly- éthylèneglycol (Carbowax 20 M-Touzart et Matignon) et l'extrait est ensuite dialysé contre un tampon acétate de sodium 0,2 M p H 5,0, puis dilué dans un tampon de charge de composition suivante: 0,125 M Tris-H Cl p H 6,8 4 % dédocylsulfate de sodium % glycérol 0, 002 % bleu de bromophénol % P-mercaptoéthanol puis le mélange est porté à 100 C pendant 10 min 10 pg de pro- téines solubilisées sont déposés sur un gel d'électrophorèse de SDS polyacrylamide selon le protocole décrit par Laemmli (Laemmli, Nature, 227, 1970, 680-685) Après électrophorèse, les protéines du gel sont transférées sur une membrane Immobilon (en PVDF) par éLectrotransfert selon la technique de H Towbin et al, Proc. Natl Acad Sci USA, 76, 1979, 4350-4354. L'immunddétection est réalisée selon un protocole qui comprend les étapes suivantes: saturation de la membrane PVDF sur laquelle les protéines ont été transférées par incubation pendant au minimum 2 h à 37 C dans une solution de gélatine à 3 %, 3 lavages dans du tampon phosphate salin contenant 0,05 % de détergent Tween 20, incubation (pendant 1 h à 370 C) en présence de l'immunsérum pré- paré précédemment (contenant les anticorps polyclonaux reconnais- sant la chitinase d'Aphanocladium album dilué au 1/10 000 dans du tampon phosphate salin), 3 lavages dans du tampon phosphate salin contenant 0,05 % de détergent Tween 20. Le complexe antigène-anticorps est ensuite révélé à l'aide d'un système streptavidine-biotine conjugé à la phosphatase alcaline avec le kit RPN 23 d'Amersham ("Blotting detection kit"), utilisé selon les indications du fabricant. L'empreinte obtenue montre pour les cotransformants Tr 8 et Tr 7 la présence d'une protéine d'environ 41 + 3 k Da de même poids moléculaire apparent que la chitinase d'A album purifiée obtenue dans la section 1, absente pour la souche témoin. La non-expression pour les cotransformants Tr 5 et Tr 6 résulte probablement de l'insertion du gène recombinant dans un contexte ne permettant pas la transcription. L'activité chitinase de la souche F oxysporum sauvage (témoin) et celles des cotransformants Tr 7 et Tr 8 sont mesurées par la méthode radiochimique de Molano et al ( 1977, Anal Biochem, 83, 648-656), résumée au paragraphe (b) de la section 1 La quan- tité totale de protéines est déterminée par la méthode de Bradford (Bradford M M, 1976, Anal Biochem, 72, 248-254) Les résultats sont rassemblés sur le tableau (I) ci-après On constate que le milieu de culture du cotransformant Tr 8, qui exprime le mieux la chitinase d'A album, voit son activité chitinolytique spécifique augmenter d'un facteur de 25 à-30 par comparaison avec la souche témoin De plus, l'activité de la chitinase extracellulaire des co- transformants Tr 8 et Tr 7 diminue lorsqu'on ajoute les anticorps antichitinase d'Aphanocladium album (préparés dans la section 1). TABLEAU I Comparaison de l'activité chitinolytique spécifique entre les cotransformants Tr 8 et Tr 7 exprimant la chitinase d'A album et la souche témoin Activité chitinolytique spécifique (dpm/pq de protéine) souche témoin Tr 8 Tr 7 Expl 52 1493 402 Exp 2 83 2019 760 Exp 3 83 135 157 * Pour chacune de ces souches deux extraits protéiques de filtrats de culture indépendants ont été préparés et leur activité chitino- lytique déterminée 3 fois de façon indépendante par la méthode radiochimique de Molano et al; les valeurs figurant dans le tableau représentent les moyennes de ces trois mesures Expl est la valeur obtenue pour le premier extrait et Exp 2 celle pour le 2 extrait Exp 3 représente la valeur obtenue pour le premier extrait après incubation de ce dernier pendant 1 h 30 dans le sérum antichitinase préparé dans la section 1. Section 9: Expression de la chitinase d'Aphanocladium album mature dans E coli a) Construction du plasmide intermédiaire p EMR 680 Le plasmide p UC 18 (Clontech) qui comprend un polylinker portant notamment les sites Pst I, Sal I et Bam HI est Linéarisé par coupure à l'aide des endonuc Léases Pst I et Sal I Le fragment Pst I- Sal I portant l'origine de réplication est purifié. A partir de L'AD Nc (cf section 6 et figure 1), par cou- pure à l'aide des enzymes de restriction Pst I et Xho I, on génère un fragment Pst I-Xho I d'environ 1 250 paires de bases Ce fragment a été purifié sur gel d'agarose, puis ligué à l'aide de la polymérase T 4 au fragment Pst I-Sal I précédent (les sites Sal I et Xho I dispa- raissent par ligation) Le méLange de ligation sert à transformer la souche E coli RRI. Le plasmide obtenu est appe Lé plasmide p EMR 680 Ce plas- mide renferme un fragment incomplet dans sa partie 5 ' de l'AD Nc codant pour la préprochitinase d'Aphanocladium album IL manque 47 paires de bases entre le site Pst I et le codon ATG marquant le début de la traduction. b) Construction du vecteur d'expression dans E coi: le plasmide p EMR 682 L'hydrolyse partielle du plasmide p EMR 680 par l'enzyme Acc I et totale par l'enzyme Bam HI permet de libérer un fragment d'environ 1100 pb Ce fragment code pour une partie 3 ' de la séquence codante de la chitinase d'A album mature (cf figure 1). L'oligonuc Léotide de synthèse de séquence (Nt 1) sui- vante: ' TAT GGG TAG TGG TTT TGC AAA TGC CGT 3 ' A CCC ATC ACC AAA ACG TTT ACG GCA GA permet de reconstituer l'extrémité 5 ' de la chitinase d'A album mature Le premier acide aminé de la séquence de la protéine mature (codé par GGT) est précédé par l'extrémité cohésive d'un site Nde I portant un codon ATG initiateur de la traduction. Le plasmide p AR 3040 (Studier F U et al, 1986, J Mol. Biol, 189, 113-130) porte un fragment de p BR 322 comprenant l'ori- gine de réplication dans E coli et dans le gène codant pour la résistance à l'ampicilline, un fragment d'ADN portant le gène 10 du phage T 7 ainsi que son promoteur et son terminateur Le gène 10 peut être facilement remplacé par tout autre gène d'intérêt puis- qu'il est borné par les séquences reconnues par les enzymes de res- triction Nde I et Bam HI. Le plasmide p AR 3040 est hydrolysé par les enzymes Nde I et Bam HI et le fragment portant l'origine de réplication dans E coli, le gène de résistance à l'ampicilline ainsi que le promoteur et le terminateur du gène 10 du phage T 7 est purifié L'assemblage par ligation de l'oligonuc Léotide de séquence (Ntl), du fragment de 1100 pb du plasmide p EMR 680 et du fragment du p Lasmide p AR 3040 con- duit, après transformation du méLange de ligation dans la souche d'E coli RRI à un plasmide appe Lé plasmide p EMR 682. c) Expression de la chitinase mature dans E coli Le promoteur du gène 10 du phage T 7 n'est pas reconnu par l'ARN polymérase d'E coli Il convient donc d'apporter à la souche E coli RRI portant le plasmide p EMR 682, appe Lée souche RRI/ p EMR 682, une ARN polymérase qui reconnait le promoteur du gène 10 du phage T 7 Le moyen qui est choisi pour effectuer cette opération est d'utiliser le phage recombinant CE 6 (Studier et al, référence ci-dessus) qui porte dans son génome le gène codant pour l'ARN polymérase du phage T 7. Constitution d'un stock de phages CE 6 Cette expérience, bien connue de l'homme de l'art, est décrite dans Sambrook et al, op cité Elle consiste à infecter pl de la bactérie ED 8739 cultivée dans un milieu contenant 5 g d'extrait de levure, 10 g de bactotryptone, 5 g de Na CL, 10 m M Mg SO 4 et 0,4 % de maltose par le phage CE 6 de manière que la sus- pension soit composée de 1 phage pour 6 bactéries Cette suspen- sion, méLangée à 3 ml d'un milieu appelé Top Agar dont la composi- tion est la même que celle indiquée ci-dessus, complémentée par 7 g/L d'agar Le mélange maintenu à une température de 500 C est éta Lé sur une boite de Pétri contenant le même milieu, mais complé- menté par 15 g/L d'agar Après une nuit d'incubation à une tempéra- ture de 37 C, la gélose est recouverte de plages de lyse contenant les phages Les phages sont élués en raclant le Top Agar et en le mélangeant avec 3 ml de Mg SO 4 10 m M par boite de Pétri pendant 1 h à température ambiante Le mélange est ensuite centrifugé pendant 10 min à 15 000 g et le surnageant, qui contient les phages à une concentration de 2 1010 phages par ml de surnageant, est appelé stock de phages Le stock de phages est conservé à une température de 4 C. Expression de la chitinase La souche RRI/p EMR 682 est cultivée dans un milieu de com- position identique à celle du milieu utilisé pour faire le stock de phages, mais sans agar Après une incubation sous agitation à une température de 37 C cette culture est diluée 50 fois dans le même milieu et incubée à une température de 37 C afin d'obtenir une den- sité cellulaire de 109 cellules par ml (DO = 1) Les phages sont ajoutés à la culture de telle manière que le mélange soit composé de 10 phages pour une bactérie Le mélange est incubé pendant 2 h à une température de 42 C Le culot bactérien est ensuite obtenu par centrifugation pendant 10 min à 15 000 g. d) Analyse de la chitinase produite Gel de polyacrylamide Un culot bactérien issu d'une culture de 1 ml ayant atteint une densité optique mesurée à 600 nm de 0,2 est mis en sus- pension dans un tampon dont la composition est la suivante: 0,125 m M de Tris HCL p H 6,8, 4 % dodécylsulfate de sodium, 20 % glycérol, 0,002 % bleu de bromophénol et 10 % P-mercaptoéthanol Le mélange est immergé pendant 10 min dans de l'eau bouillante, ce qui permet la lyse des bactéries et la solubilisation des protéines Le mélange est ensuite soumis à une électrophorèse sur gel de poly- acrylamide 12,5 % (Laemmli UK, 1970, Nature, 227, 680-685) en pré- sence d'un marqueur de taille et de la chitinase d'A album purifiée obtenue dans la section 1 Après décoloration du gel, préalablement co Loré au bleu de Coomassie, on constate qu'il existe pour la souche RRI/p EMR 682 une bande supplémentaire représentant approximativement 20 % de protéines totales par rapport à la souche RRI/p BR 322 mise en témoin et traitée dans les mêmes conditions. Cette bande présente un poids mo Léculaire apparent de l'ordre de 39 + 3 k Da, légèrement inférieur au poids mo Léculaire apparent de la chitinase d'A album purifiée, obtenue dans la section 1. Immunoempreinte Les conditions d'électrophorèse décrites au paragraphe précédent sont maintenues Le gel n'est pas coloré au bleu de Coomassie; mais les protéines sont transférées sur un filtre de nitrocellulose selon la technique décrite par Towbin et al, 1979, Proc Ntl Acad Sci-USA, 76, 4350-4354 et l'immunodétection est réalisée selon le protocole décrit dans la section 8. L'empreinte obtenue montre que la protéine supplémentaire de poids mo Léculaire apparent d'environ 39 + 3 k Da, légèrement inférieur à celui de la chitinase d'A album, est iso Lée dans la section 1 Cette protéine présente dans la souche RRI/p EMR 682 et absente dans la souche témoin est reconnue par les anticorps dirigés contre la chitinase d'A album. Mise en évidence d'une activité chitinolytique dans E coli L'activité chitinolytique des extraits de la souche RRI/ p EMR 682 et celle de la souche témoin est mesurée par la méthode radiochimique de Molano et al résumée au paragraphe bl) de la sec- tion 1 Les résultats, rassemblés dans le tableau II ci-dessous, montrent que la souche RRI/p EMR 682 présente, contrairement à la souche témoin, une activité chitinolytique. TABLEAU II Comparaison de l'activité chitinolytique de la souche RRI/p EMR 682 et de La souche témoin pour un extrait protéique à DO = 1 qui comporte 10 Jg de protéines totales (quantité mesurée par la méthode de Bradford) Activité chitinolytique (dpm/pg de protéine) Souche témoin Souche RRI/p EMR 682 1 re expérience 128 260 2 expérience 145 1 150 i 3 e expérience | 130 410 e 4 experience 185 600 expérience 195 564 6 expérience 120 583 Section 10: Expression de la chitinase d'Aphanocladium album dans la levure (Saccharomyces cerevisiae) et sécrétion à l'aide du peptide signal de la phéromone î a) Construction du plasmide p EMR 698, vecteur d'expression de la chitinase d'Aphanocladium album mature: Le plasmide p EMR 583 est décrit dans le document EP-0 273 800 IL comprend notamment un fragment du plasmide p BR 322 portant l'origine de réplication dans E coli et le gène de résis- tance à l'ampicilline, un fragment du plasmide 2 p qui permet la réplication dans la levure, les gènes comp Lémentant l'auxotrophie de la leucine, ainsi qu'une cassette d'expression de l'IL-8 compor- tant un promoteur hybride Ga 17-ADH 2, le peptide signal de la phéro- mone x, une séquence codante pour l'IL-8 mature et un terminateur. Le plasmide p EMR 583 est hydrolysé par les enzymes Hind III et Bam HI et le grand fragment Hind III-Bam HI est purifié; ce frag- ment porte le système d'expression nécessaire dans la levure Il est assemb Lé et ligué avec le fragment Acc I-Bam HI issu du plasmide p EMR 680 décrit à la section 9 et avec un oligonuc Léotide synthé- tique Hind III-Acc I de séquence (Nt 2) suivante et qui reconstitue la séquence 3 ' de la région prépro de la phéromone î de S cerevisiae manquant au grand fragment Hind III-Bam HI issu du plasmide p EMR 583 et l'extrémité 5 ' de la chitinase mature d'A album manquant au fragment Acc I-Bam HI. (Nt 2) (Hind III) AGC TTG GAT AAA AGA GGT AGT GGT TTT GCA AAT GCC GT AC CTA TTT TCT CCA TCA CCA AAA CGT TTA CGG CAG A (Acc I) Le méLange de ligation a servi à transformer une souche E coli RRI Le plasmide p EMR 698 est obtenu. b) Transformation de la souche de levure EMY 761 par le plasmide p EMR 698 avec sélection pour la prototrophie de leucine La souche EMY 761 est une souche de levure Mats, leu 2, ura 3, his 3 et gal qui dérive de la souche GRF 18 bien connue de l'homme de l'art (Gerry Fink, MIT, USA) par croisements successifs de cette souche avec une souche ura 3 obtenue à partir de la souche FL 100 (déposée à l'ATCC sous le N 28 383) et avec la souche 20 812 (Mato, trpl, pep 4) décrite par E W Jones, 1987, Genetics, 85, 23. Cette souche peut s'obtenir par curage plasmidique de la souche déposée à la CNCM le 27 12 1990, sous le N I 1022. La technique de transformation utilisée est une variante de celle décrite par Beggs et al (Beggs et al, ( 1978), Nature, 275, 104-109) Elle consiste à soumettre les levures à un traite- ment de protoplastisation en présence d'un stabilisant osmotique, le sorbitol en concentration 1 M. Le protocole précis de transformation est précisé ci- après: a) 200 ml du milieu YPG liquide (cf tableau III ci- après) sont inoculés avec environ 5 x 106 cellules d'une culture en phase stationnaire et la culture ainsi inoculée est placée une nuit sous agitation à 30 C. b) Lorsque la culture atteint environ 107 cellules par millilitre, les cellules sont centrifugées à 4 000 tr/min pendant 5 min et le culot est lavé avec du sorbitol 1 M. c) Les cellules sont suspendues dans 5 ml de solution de sorbitol 1 M contenant 25 m M EDTA et 50 m M de dithiothréitol et incubées pendant 10 min à 30 C. d) Les cellules sont lavées une fois avec 10 ml de sor- bitol 1 M et suspendues dans 20 ml de sorbitol De la zymolyase- l OOT (préparation obtenue par purification partielle sur colonne d'affinité du surnageant de culture d'Arthobacter luteus et conte- nant de la p-1,3-glucane-laminaripentahydrolase, commercialisée par SEYKAGAKU KOGYO Co Ltd) est ajoutée à une concentration finale de 20 pg/ml et on incube la suspension à température ambiante pendant environ 15 min. e) Les cellules sont resuspendues dans 20 ml d'un milieu contenant du sorbitol appelé milieu YPG sorbitol (cf tableau III ci-après) et incubées pendant 20 min à 30 C sous agitation douce. f) On centrifuge pendant 3 min à 2 500 tr/min. g) On resuspend dans 9 ml de tampon de transformation (sorbitol 1 M, tris-HCL de p H 7,5 10 m M et Ca CL 2 10 m M). h) On ajoute 0,1 ml de cellules et 5 pl de solution d'ADN (environ 5 pg) du plasmide p EMR 698 et on laisse la suspension obtenue pendant 10 à 15 min à température ambiante. i) On ajoute 1 ml de la solution: polyéthylèneglycol PEG 4000 20 %, trisH Cl de p H 7,5 10 m M et Ca C 12 10 m M. j) On verse 0,1 ml de la suspension obtenues en i) dans un tube contenant du milieu solide de régénération sans leucine (cf tableau III ci-après) préalablement fondu et maintenu liquide à environ 45 C On verse la suspension sur une boîte de Pétri con- tenant une couche solidifiée de 15 ml de milieu de régénération solide sans leucine. k) On répète l'étape j) avec le reste de la suspension cellulaire obtenue en i). Les transformants commencent à apparaître au bout de 3 jours. Le transformant retenu est appe Lé EMY 761/p EMR 698 TABLEAU III Principaux milieux utilisés dans les sections 10 et 11 milieu solide sans leucine 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés (Yeast nitrogen base without Amino Acids de DIFCO) mg d'adénine mg d'uracile mg de 1-tryptophane 20 mg de l-histidine mg de l- arginine mg de 1-méthionine mg de 1-tyrosine mg de l-isoleucine 30 mg de l-lysine mg de l-phénylalanine mg de l-acide glutamique mg de 1-valine 400 mg de l-leucine 20 g de glucose g d'agar mélanger tous les ingrédients dans l'eau distillée Compléter le volume final à 1 I avec de l'eau distillée Autoclaver 15 min à C Après autoclavage, ajouter 200 mg de l-thréonine et 100 mg d'acide l-aspartique. milieu solide de régénération sans leucine utiliser la formule du milieu solide sans leucine en mélangeant 30 g d'agar au lieu de 20 et en ajoutant au méLange 182 g de sor- bitol. milieu liquide sans leucine utiliser la formule du milieu solide sans leucine en omettant l'agar Autoclaver 15 min à 1200 C Après autoclavage, ajouter mg de l-thréonine et 100 mg d'acide 1-aspartique. milieu YP liquide g d'extrait de levure (Bacto-yeast extract de DIFC 0) g de peptone (Bacto-peptone de DIFCO) méLanger les ingrédients dans de l'eau distillée Compléter le volume final à 1 I avec de l'eau distillée Autoclaver 15 min à C. milieu YPG liquide utiliser la formule du milieu YP liquide auquel on ajoute, après autoclavage, du glucose à une concentration de 20 g/L. milieu YP éthanol-glycérol-galactose utiliser la formule du milieu YP liquide Après autoclavage, ajouter 10 ml d'éthanol 100 %, 30 g de glycérol et 30 g de galac- tose. c) Expression de la chitinase d'A album par la souche EMY 761/ p EMR 698 Les précultures se font dans du milieu de composition: milieu YP liquide 1,4 %, glucose 3 %, histidine 50 pg/ml et uracile 50 pg/ml Au bout de 24 h, on centrifuge les cultures et on reprend le culot dans 40 ml de milieu de composition: milieu YP liquide 1,4 %, éthanol 1 %, casaminoacides 1 %, uracile 100 pg/ml, gly- cérol 3 % et galactose 1 %. * d) Analyse des protéines présentes dans le milieu de culture préparation des échantillons Au bout de 24 h de culture, les cellules cultivées en c) ont été centrifugées pendant 20 min et le surnageant a été recueilli A 10 ml de surnageant, 5 ml d'acide trichloroacétique à % contenant 2 mg/ml de déoxycholate ont été rajoutés. Le mélange a été mis à + 4 C pendant 30 min, puis centri- fugé pendant 30 min Le culot a été repris dans environ 1 ml d'acé- tone froid (+ 4 C) et de nouveau centrifugé 30 min Le culot, après avoir été séché, est repris dans environ 20 pl d'un tampon dénommé tampon de charge constitué de Tris-H Cl 0,125 p H 6,8 SDS 4 %, bleu de bromophénol 0,002 %, g Lycérol 20 %, 3-mercaptoéthanol 10 % (selon protocole décrit par Laemmli ( 1970)) Le culot est solubi- lisé par ébullition pendant 15 min, puis neutralisé en ajoutant de la soude 10 N. L'analyse des protéines par électrophorèse en gel SDS dénaturant est réalisée selon la méthode décrite dans la sec- tion 9 d). Le profil obtenu montre la présence d'une bande large surnuméraire présente dans la souche EMY 761/p EMR 698 et absente de la souche témoin (souche EMY 761 non transformée) Cette bande a un poids moléculaire compris entre 39 et 46 k Da La largeur de cette bande résulte probablement de différents degrés de glycosylation de la protéine, qui possède (cf figure 1) deux sites de N-glycosy- lation potentiels On montre par Western blot que cette protéine est reconnue par les anticorps dirigés contre la chitinase d'Aphanocladium album. e) Mise en évidence d'une activité chitinolytique dans le surna- geant de culture de Saccharomyces cerevisiae L'activité chitinolytique des extraits de surnageant de culture de la souche EMY 761/p EMR 698 et de la souche témoin est mesurée par la méthode radiochimique de Molano ( 1977, Anal. Biochem, 83, 648-656), résumée au paragraphe bl de la section 1. Les résultats, rassemblés dans le tableau IV ci-après, montrent que l'activité chitinolytique du surnageant de culture de la souche transformée par le plasmide p EMR 698 est supérieure à celle du surnageant de culture enregistrée dans la souche témoin. TABLEAU IV Comparaison de l'activité chitinolytique de la souche de levure EMY 761/p EMR 698 et de la souche témoin, pour un extrait de surna- geant de culture concentré par diafiltration qui comporte 10 pg de protéines totales (quantité mesurée selon la méthode de Bradford). Chaque valeur est la moyenne de 4 mesures indépendantes. ACTIVITE CHITINOLYTIQUE (dpm/pg de protéine) Souche témoin Souche EMY 761/p EMR 698 expérience 1 156 730 expérience 2 270 560 expérience 3 120 750 Section 11: Expression de la chitinase d'A album dans la levure et sécrétion à l'aide de son propre peptide signal a) Construction du plasmide p EMR 697, vecteur d'expression de la préprochitinase d'Aphanocladium album Le plasmide p EMR 473 est décrit dans la demande de brevet EP-O 408 461 Il comprend notamment un fragment du plasmide p BR 322 portant l'origine de réplication dans E coli et le gène de résis- tance à l'ampicilline, un fragment du plasmide 2 p qui permet la réplication dans la levure, les gènes complémentant l'auxotrophie de la leucine, ainsi qu'une cassette d'expression de l'urate oxy- dase d'Aspergillus flavus comportant un promoteur hybride Ga 17- ADH 2, une séquence codante pour l'urate oxydase d'A flavus et un terminateur. Le plasmide p EMR 473 est hydrolysé partiellement par Cla I et complètement par Bam HI Le grand fragment Bam HI-Cla I purifié est le plasmide entier délété du gène codant pour l'urate oxydase Ce fragment est ligué en présence de l'oligonuc Léotide synthétique de séquence (Nt 3) ce qui permet l'association entre l'extrémité 3 ' non codante de l'ADN complémentaire de l'urate oxydase, la partie 5 ' de la séquence prépro de la chitinase d'A album et le fragment Pst I- Bam HI du p EMR 680 qui porte la partie 3 ' de la séquence codante de la chitinase d'A album Le méLange de ligation est utilisé pour transformer E coli RRI Le plasmide résultant est le p EMR 697. (Nt 3) CGA TAT ACA CAA TGT TGA GCT TTG TCA AAA AGT CGA T ATA TGT GTT ACA ACT CGA AAC AGT TTT TCA GCT TCG CCT TGG TGG CGG CCC TGC A AGC GGA ACC ACC GCC GGG b) Transformation de la souche de levure EMY 761 par le plasmide p EMR 697 avec sélection pour la prototrophie de leucine. cf Section 10 b) Le transformant est appe Lé EMY 761/p EMR 697 c) Culture de la souche EMY 761/p EMR 697 cf Section 10 c) d) Analyse des protéines présentes dans le milieu de culture cf Section 10 d) e) Mise en évidence d'une Saccharomyces cerevisiae activité chitinolytique dans cf Section 10 e) Les résultats sont rassemblés dans Le tableau V ci-après. TABLEAU V Comparaison de L'activité chitinolytique de La souche de levure EMY 761/p EMR 697 et de la souche témoin pour un extrait de sur- nageant de culture qui comporte 10 pg de protéines tota Les (quantité mesurée se Lon La méthode de Bradford) Activité chitino Lytique (dpm/pg de protéine) Souche témoin Souche EMY 761/p EMR 697 expérience 1 156 624 expérience 2 270 2 819 expérience 3 120 350 Section 12: Construction de deux vecteurs d'expression de la chi- tinase d'Aphanocladium album dans les cellules végé- tales a) Préparation d'un gène codant pour la chitinase d'A album mature précédée d'un peptide signal, Construction 1: gène codant pour la préprochitinase d'A album. L'ADN complémentaire de la préprochitinase d'A album, portant la séquence codante a été obtenu par coupure du vecteur p EMR 697, décrit dans la section 11, à l'aide des enzymes de res- triction Cla I et Bam HI Le fragment obtenu a été purifié par électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion Ce fragment porte la séquence codante de l'ADN complémentaire de la prépro- chitinase d'Aphanocladium album, l'ATG initiateur étant précédé d'un fragment de 11 pb portant le site Cla I Ce fragment a été ligué d'une part en 5 ' avec l'oligonuc Léotide de séquence (Nt 4) ci- après, porteur en 5 ' d'un site Bam HI et en 3 ' d'un site Cla I, afin de reconstituer un site Bam HI, et d'autre part en 3 ', avec l'oligo- nuc Léotide de séquence (Nt 5) ci-après porteur en 5 ' d'un site cohésif compatible avec le site Bam HI et en 3 ' d'un site Sac I, afin de reconstituer un site Sac I Le fragment obtenu contient la séquence codante de L'ADN complémentaire de La préprochitinase d'Aphanoc Ladium album entouré par un site Bam HI en 5 ' et un site Sac I en 3 ' Ces deux sites permettront u Ltérieurement une insertion avec un promoteur et un terminateur. La séquence des oligonuc Léotides utilisés est fournie ci-après, les sites de restriction étant indiqués entre paren- thèses: (Nt 4) (Bam HI) GATCCGCTAA CTGACAT GCGATT GACTGTAGC (Cla I) (Nt 5) (compatible avec Bam HI) GATCGAACTG TACCGAGCT CTTGAC ATGGC (Sac I) La ligation est réalisée à l'aide de l'ADN ligase T 4. Construction 2: Gène codant pour la chitinase d'Aphanocladium album mature précédée du peptide signal d'une chi- tinase de haricot L'ADN complémentaire portant une partie de la séquence codante de la chitinase d'Aphanocladium album mature a été obtenu à partir du plasmide p EMR 680 décrit dans la section 9 par digestion partielle à l'aide des endonuc Léases Acc I et Bam HI Le fragment obtenu d'environ 1 100 paires de bases, qui contient la partie codante de la chitinase d'A album mature à l'exception des 23 pre- mières paires de bases, est ligué d'une part en 5 ' avec l'oligo- nucléotide de séquence (Nt 6) ci-après et, d'autre part, en 3 ', avec l'oligonuc Léotide de séquence (Nt 5) L'oligonuc Léotide (Nt 6) con- tient en 5 ' un site Bam HI, la séquence codante pour le peptide signal d'une chitinase de haricot (Brogie K E et al, 1986, Proc. Ntl Acad Sci USA, 83, 6820-6824), les 23 premières paires de bases manquantes de la chitinase mature d'A album et un site Acc I en 3 ' Le fragment obtenu contient la séquence codante de la chitinase d'Aphanocladium album mature fusionnée à la séquence codante du peptide signal d'un chitinase de haricot, entourée d'un site Bam HI en 5 ' et d'un site Sac I en 3 '. La séquence de l'oligonuc Léotide utilisé (Nt 6) est fournie ci- après, les sites de restriction étant indiqués entre parenthèses: (Nt 6) (Bam Hi) GATCCATGAA GAAGAATAGG ATGATGATGA TGATATGGAG CGTAGGAGTG GTGTGGATGC 60 1 _ + + + + + + GTACTT CTTCTTATCC TACTACTACT ACTATACCTC GCATCCTCAC CACACCTACG TGTTGTTGGT TGGAGGAAGC TACGGAGGTA GTGGTTTTGC AAATGCCGT 109 61 + + + + ACAACAACCA ACCTCCTTCG ATGCCTCCAT CACCAAAACG TTTACGGCAG A (Acc I) b) Préparation de la séquence promotrice comprenant le promoteur S du virus de la mosa;que du chou-fleu A partir du plasmide p BI 121 (Clontech) par coupure à l'aide des endonuc Léases Hind III et Bam HI, puis électrophorèse sur gel d'agarose, le fragment Hind III-Bam HI d'environ 900 pb contenant le promoteur 35 S est iso Lé Ce fragment est recoupé par Hind II Le fragment d'environ 410 pb, portant le site Bam HI, est traité par l'ADN ligase T 4 en présence d'un linker Hind III (séquence synthé- tique contenant un site Hind III) Après coupure par l'endonuc Léase Hind III et électrophorèse sur gel d'agarose, le fragment Hind III- Bam HI résu Ltant (d'environ 420 pb) est isolé et purifié. c) Préparation de la séquence terminatrice comprenant le termina- teur de la nopaline synthase (NOS) d'Agrobacterium tumefaciens A partir du plasmide p BI 121 (Clontech) par coupure à l'aide des enzymes de restriction Sac I et Eco RI, puis électro- phorèse sur gel d'agarose, un fragment de 250 pb environ, renfer- mant Le terminateur de la nopaline synthase, a été isolé. Clonage dans le vecteur binaire p BIN 19 On a ligué à l'aide de l'ADN ligase T 4 la séquence pro- motrice, (cf section 12 b), la séquence codante de l'ADN complé- mentaire de la chitinase des constructions 1 et 2 et la séquence terminatrice (cf section 12 c) dans le vecteur binaire p BIN 19 ouvert à l'aide des endonucléases Hind III et Eco RI Ce vecteur porte deux gènes de résistance à la kanamycine, l'un pouvant s'exprimer dans les bactéries, l'autre situé immédiatement en amont du gène recombinant complet (cf Bevan, 1984, Nucl Ac Res, 12, 8711-8721) pouvant être transféré aux cellules végétales Le gène de résistance à la kanamycine servira de marqueur de sélection au cours des étapes de transformation et d'analyse de la descendance des plantes transformées. Le vecteur obtenu est appelé plasmide p BR 61 lorsqu'il contient la construction 1 et plasmide p BR 62 lorsqu'il contient la construction 2 La séquence nucléotidique du gène recombinant complet a été vérifiée par séquençage pour chacun des plasmides p BR 61 et p BR 62 La séquence codante de ce gène, encadrée par les sites de restriction Bam HI et Sac I est représentée sur la figure 4 pour le plasmide p BR 61 et sur la figure 5 pour le plasmide p BR 62. Ces plasmides sont clonés dans la souche E coli JM 109 (Stratagène). Section 13: Transfert dans Agrobacterium tumefaciens des plasmides p BR 61 et p BR 62 contenant un gène codant pour la chiti- nase d'Aphanocladium album a) Transfert dans Agrobacterium tumefaciens Ce transfert est réalisé comme décrit ci-après par conju- gaison triparentale entre la souche E coli JM 109 (Sambrook et al, op cité) contenant les vecteurs p BR 61 ou p BR 62 et la souche Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (Clontech) à l'aide de la souche E coli HB 101 contenant le plasmide mobilisateur p RK 2013 (D.M Figurski et al, 1979, Proc Ntl Acad Sci USA, 76, 1648- 1652). La souche E coli JM 109 contenant le plasmide p BR 61 ou p BR 62 et une souche E coli HB 101 (Clontech) contenant le plasmide mobilisateur p RK 2013 sont cultivées à 37 C dans du milieu Luria (Gibco) en présence de 25 mg/l de kanamycine. La souche Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 est cultivée à 28 C dans du milieu Luria (Gibco) en présence de 100 mg/l de rifampicine (elle est résistante à cet antibiotique); 200 pl de chacune des trois cultures sont méLangés, éta Lés sur du milieu Luria géLosé (Gibco) et incubés pendant une nuit à Z 8 C Les bac- téries sont ensuite remises en suspension dans 5 ml de milieu Luria et des parties aliquotes sont éta Lées sur des boites de Pétri con- tenant un milieu minimum géLosé (décrit dans "Plant Molecular Biology Manual", Gelvin et al, Kluwer Academic Press, 1988) en présence de 100 mg/L de rifampicine et 25 mg/L de kanamycine Dans ces conditions, seules poussent les colonies d'Agrobacterium tumefaciens ayant intégré le plasmide p BR 61 ou p BR 62 (les souches d'E coli ne peuvent pas pousser dans ces conditions) Celles-ci contiennent le gène recombinant de chitinase dans un contexte per- mettant sa réplication. La résistance aux deux antibiotiques des colonies séLec- tionnées est vérifiée en repiquant celles-ci sur le même milieu de séLection deux fois de suite La présence du gène recombinant de chitinase dans Agrobacterium tumefaciens est vérifiée par la méthode de Southern Blot sur une préparation d'ADN total (Lyse des cellules, purification de L'ADN par extraction à l'aide du méLange phénol/chloroforme, selon le protocole décrit par Gelvin dans l'ouvrage cité ci-dessus, coupure de l'ADN purifié à l'aide d'enzymes de restriction, électrophorèse sur gel d'agarose, trans- fert sur membrane et hybridation selon les techniques bien connues de l'homme de l'art). b) Transfert dans Agrobacterium rhizogenes Ce transfert est réalisé de la même façon que le trans- fert dans Agrobacterium tumefaciens décrit en a), avec la souche Agrobacterium rhizogenes A 4 décrite par GUERCHE et al, ( 1987), Mol gen genet, 206, 382. Section 14: Obtention de plantes de tabac transformées Du tabac Nicotiana tabacum cultivé in vitro a été infecté par Agrobacterium tumefaciens contenant le plasmide p BR 61 ou p BR 62 selon la procédure de Horsch et al, bien connue de l'homme du métier (Horsch R B et al, 1985, Science, 227, 1229-1231), dont les principales étapes sont exposées ci-après. Des disques de feuilles de plantes axéniques de tabac N tabacum (variété Wisconsin Havana 38 sensible aux champignons pathogènes) sont incubés dans une culture d'A tumefaciens héber- geant le plasmide p BR 61 ou p BR 62 Les disques égouttés sur papier Whatman ont été transférés sur des milieux de culture en boîtes de Pétri afin de multiplier les cellules transformées de façon à obtenir des cals. Section 15: Mise en évidence de l'expression de la chitinase d'A album dans les cals de tabac transformés a) Préparation des extraits bruts de protéines de cals de tabac transformés Les fragments de tissus ont été congelés dans l'azote liquide, réduits en poudre et stockés à -20 C La poudre a été extraite à 40 C en présence d'un tampon acétate d'ammonium 0,1 M p H 5,2 et soumise à une centrifugation à 10 000 g La concentration des protéines totales a été déterminée sur les surnageants, appelés ci-après les extraits bruts de protéines, en suivant la technique de Bradford (Bradford, M M, 1976, Anal Biochem, 72, 248-254). b) Mise en évidence de La chitinase recombinante par immuno- empreinte (Western blot) On soumet les extraits bruts de protéines de différents cals transformés et des cals non transformés (témoins) à un Western blot, technique bien connue de l'homme de l'art et décrite notam- ment par H Towbin et al, Proc Ntl Acad Sci USA, 76, 1979, 4350-4354, qui comprend les étapes suivantes: dénaturation par chauffage à 100 pendant 10 min dans un tampon, dénommé tampon de charge constitué de Tris H Cl 0,125 M p H 6,8, SDS 4 %, bleu de bromophénol 0,002 %, glycérol 20 %, p-mercapto- éthanol 10 % (selon le protocole décrit par Laemmli, U K. Laemmli, Nature, 227, 1970, 680-685); séparation électrophorétique des différentes protéines contenues dans le solubilisat selon le protocole décrit par Laemmli (réf. ci-dessus); électrotransfert desdites protéines contenues dans le gel sur une membrane en PVDF (selon la technique de H Towbin et al, Proc. Natl Acad Sci USA, 76, 1979, 4350-4354). L'immunodétection est réalisée selon un protocole qui comprend les étapes suivantes: saturation de la membrane PVDF sur laquelle les protéines ont été transférées par incubation pendant au minimum 2 h à 37 C dans une solution de gélatine à 3 %, 3 lavages dans du tampon phosphate salin contenant 0,05 % de détergent Tween 20, incubation (pendant 1 h à 37 C) en présence de l'immunsérum pré- paré précédement (contenant les anticorps polyclonaux reconnais- sant la protéine recombinante) dilué au 1/10 000 dans du tampon phosphate salin, 3 lavages dans du tampon phosphate salin contenant 0,05 % de détergent Tween 20. Le complexe antigène-anticorps est ensuite révélé à l'aide d'un système streptavidine-biotine conjugué à la phosphatase alcaline avec le kit RPN 23 d'Amersham ("Blotting detection kit"), utilisé selon les indications du fabricant. L'empreinte obtenue montre la présence d'une protéine de poids moléculaire apparent d'environ 41 + 3 k Da pour les cals transformés, absente des cals témoins Cette protéine a le même poids moléculaire apparent que la chitinase d'A album purifiée, obtenue dans la section 1. c) Mise en évidence de l'activité chitinolytique de la chitinase recombinante L'activité chitinolytique des 5 extraits bruts de pro- téines de cals de tabac transformés et de 5 extraits bruts de pro- téines de cals de tabac non transformés est mesurée selon la méthode radiochimique de Molano et al, décrite section 1 bl). Compte tenu de l'activité chitinolytique endogène, un moyen simple de montrer l'activité chitinolytique de la chitinase recombinante est d'inactiver spécifiquement celle-ci par des anticorps et de constater la baisse d'activité chitinolytique totale des extraits. pl de ces extraits bruts sont mis en présence, pendant min à température ambiante, de 1 pl des anticorps polyclonaux dirigés contre la chitinase d'A album (préparés dans la sec- tion 1 c)) L'activité chitinolytique de ces mélanges extraits bruts/anticorps est également mesurée par la méthode radiochimique de Molano et al (section 1 b). L'activité chitinolytique des extraits bruts de protéines de cals transformés est significativement plus élevée que celle d'extraits équivalents de cals non transformés Après incubation en présence d'anticorps contre la chitinase d'A album, l'activité des extraits de cals transformés diminue alors que celle des extraits de cals non transformés n'est pas affectée. La chitinase d'A album recombinante exprimée dans le tabac possède donc une activité chitinolytique. Section 16: Obtention de plantes de colza transformées La transformation est réalisée selon le protocole de P Guerche et al (P Guerche et al, 1987, Mol Gen Genet, 206, 382) Les différents milieux de culture sont ceux décrits par Pelletier et al (Pelletier et al, 1983, Mol Gen Genet, 191- 244) Leur composition sera explicitée par la suite (tableau VI). a) Obtention de racines transformées Des segments de tige sont prélevés sur l'extrémité api- cale de plantes de colza (Brassica napus: variétés de printemps Brutor, Westar et variétés d'hiver) de 1 m de haut environ Ces segments sont stérilisés en surface, rincés dans de l'eau stérile, découpés en segments de 1,5 cm de long environ et placés dans un tube contenant le milieu A. L'inoculation de l'extrémité de ce segment est effectuée par dépôt d'une suspension de la souche d'Agrobacterium rhizogenes contenant le plasmide p BR 61 ou p BR 62. Des racines transformées apparaissent sur le segment de tige au bout de 1 à 2 semaines, elles sont prélevées et placées sur le milieu B gélosé ( 15 g/l) et complémenté par 500 pg de céfotaxime/ml). b) Régénération de plantes transformées Des fragments de racines sont incubés pendant 15 jours sur le milieu D contenant 3 mg/l d'acide 2,4-dichlorophénoxy- acétique, puis placés sur le milieu RCC d'induction de bourgeons. Des plantes racinées sont ensuite obtenues par passage des bour- geons sur les milieux F et G (tableau VI ci-après). TABLEAU VI Composition des différents milieux utilisés pour l'obtention de plantes de colza transformées. \ Milieu | Compostion I A B RCC F G (mg/l) | NH 4 NO 3 1 650 1 650 1 650 825 | KNO 3 |I 900 2 500 1 900 1 900 950 I(NH 4)2 SO 4 | 134 Na H 2 PO 4 150 KH 2 P 04 170 170 170 85 Ca C 122 H 2 20 440 750 440 440 220 Mg 50471 t 20 370 250 370 370 185 H 3 BO 03 12,4 3 12,4 6,2 6,2 Mn 5044 H 20 33,6 I 10 33,6 22,3 22,3 Zn 5047 t 120 21 2 21 8,6 8,6 KI 1,66 0,75 1,66 0,83 0,83 Na 2 Mo O 42 H 20 0,5 0,25 0,5 0,25 0,25 Cu SO 45 H 20 0,05 0,025 0,05 0,25 0,25 COC 126 H 20 0,05 0,025 0,05 0,25 0,25 Fe SO 47 H 20 22,24 27,8 27,8 27,8 22,24 I I I I I I TABLEAU VI (suite 1) Milieu Composition A B RCC F G I (mg/1) I I I I I I I Na 2 EDTA 29,84 37,3 37,3 37,3 29,84 Inositol 100 100 100 100 100 Acide nicotinique 0,5 1 0,5 1 0,5 Pyridoxine HCL 0,5 1 0,5 1 0,5 Thiamine 10 10 Glycine 2 2 2 Glucose 110 000 20 000 I 10 000 Saccharose 110 000 110 000 10 000 D-mannitol 70 000 110 000 NAA 1 1 0,1 0,1 BA 1 0,5 0,5 2,4-D 0,25 Adénine sulfate IPA 0,5 GA 3 0,02 Tween 80 10 I I I I I I I O I I I I II I Tableau VI (suite 2) p H 5,3 5,8 Gentamicine (sulfate) 10 NAA = acide naphtatlène acétique BA = acide benzyt-6-aminopurine 2,4 D = acide dichtoro-2,4-plihnoxyacétiqtue 6 2 IPA = N 6-(A 2 Iso-pentérinyt)adénine GA 3 = acide gibbéret(ique EDTA = acide éthylênediaminetétraacétiqtie. Section 17: Mise en évidence de l'expression de la chitinase d'A album dans des racines transformées de colza a) Préparation des extraits bruts de protéines de racines trans- formées de colza Les extraits sont préparés comme indiqué dans la sec- tion 15 a). b) Mise en évidence de la chitinase recombinante par immuno- empreinte (Western blot) Le protocole suivi est celui décrit précédemment dans la section 15 b). L'empreinte obtenue montre la présence d'une protéine de poids mo Léculaire apparent d'environ 41 + 3 k Da présente dans les racines transformées par le plasmide p BR 61 ou le plasmide p BR 62, absente des extraits de racines non transformées servant de témoin. Cette protéine a Le même poids mo Léculaire apparent que la chiti- nase nature L Le d'A cladium purifiée, obtenue dans la section 1. c) Mise en évidence de l'activité chitinolytique de la chitinase recombinante L'activité chitinolytique des 5 extraits bruts de pro- téines de racines transformées de colza et de 5 extraits bruts de racines non transformées est mesurée par la méthode radiochimique de Molano et al, décrite section 1 bl) Compte tenu de l'activité chitinolytique endogène, un moyen simple de montrer l'activité chitinolytique de la chitinase recombinante est d'inactiver celle-ci par des anticorps et de constater la baisse d'activité chitinolytique des extraits. 10 pl de ces extraits bruts sont mis en présence, pendant min à température ambiante, de 1 pl des anticorps polyclonaux dirigés contre la chitinase d'A album (préparés section 1 c)). L'activité chitinolytique de ces méLanges extraits bruts/anticorps est également mesurée par la méthode radiochimique de Molano et al. (cf section 1 b). L'activité chitinolytique des extraits bruts de protéines de racines transformées est significativement plus éLevée que celle d'extraits équivalents de racines non transformées Après incuba- tion en présence d'anticorps contre la chitinase d'A album, l'activité des extraits des racines transformées diminue alors que celle des extraits des racines non transformées n'est pas modifiée. La chitinase d'A album recombinante exprimée dans le colza possède donc une activité chitinolytique. REVENDICATIONS 1 ADN recombinant, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine à activité endochitinase ou pour un précurseur de cette dernière, qui comprend la séquence (al) suivante: Gly Ser Gly Phe Ala Asn Ala Val Tyr Phe Thr Asn Trp Gly Ile Tyr 1 5 10 15 Gly Arg Asn Phe Gln Pro Ala Asp Leu Pro Ala Ser Glu Ile Thr His 20 25 30 Val Leu Tyr Ser Phe Met Asn Val Arg Ala Asp Gly Thr Ile Phe Ser 40 45 Gly Asp Thr Tyr Ala Asp Tyr Glu Lys His Tyr Ala Gly Asp Ser Trp 55 60 Asn Asp Val Gly Thr Asn Ala Tyr Gly Cys Val Lys Gln Leu Tyr Leu 70 75 80 Leu Lys Lys Gln Asn Arg Asn Met Lys Val Met Leu Ser Ile Gly Gly 90 95 Trp Thr Trp Ser Thr Asn Phe Pro Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Thr 100 105 110 Arg Lys Thr Phe Ala Gln Ser Ala Val Gly Phe Met Lys Asp Trp Gly 120 125 Phe Asp Gly Ile Asp Ile Asp Trp Glu Tyr Pro Ala Asp Ala Thr Gln 135 140 Ala Gln Asn Met Val Leu Leu Leu Gln Ala Val Arg Ser Glu Leu Asp 150 155 160 Ser Tyr Ala Ala Gln Tyr Ala Lys Gly His His Phe Leu Leu Ser Ile 170 175 Ala Ala Pro Ala Gly Pro Asp Asn Tyr Asn Lys Leu Lys Phe Ala Glu 180 185 190 Leu G Ly Lys Val Leu Asp Tyr Ile Asn Leu Met Ala Tyr Asp Tyr Ala 200 205 Gly Ser Trp Ser Asn Tyr Thr Gly His Asp Ala Asn Ile Tyr Ala Asn 210 215 220 Pro Gln Asn Pro Asn Ala Thr Pro Tyr Asn Thr Asp Asp Ala Val Gln 230 235 Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Val Pro Ala Asn Lys Ile Val Leu Gly Met 245 250 255 Pro Ile Tyr Gly Arg Ser Phe Gin Gln Thr Glu Gly Ile Gly Lys Pro 260 265 270 Tyr Asn Gly Ile Gly Ser Gly Ser Trp Glu Asn Gly Ile Trp Asp Tyr 275 280 285 Lys Ala Leu Pro Lys Ala Gly Ala Thr Val Lys Cys Asp Asp Thr Ala 290 295 300 Lys Gly Cys Tyr Ser Tyr Asp Pro Ser Thr Lys Glu Leu Ile Ser Phe 305 310 315 320 Asp Thr Pro Ala Met Ile Ser Thr Lys Val Ser Trp Leu Lys Gly Lys 325 330 335 Gly Leu Gly Gly Ser Met Phe Trp Glu Ala Ser Ala Asp Lys Lys Gly 340 345 350 Ser Asp Ser Leu Ile Ser Thr Ser His Gln Gly Leu Gly Ser Gln Asp 355 360 365 Ser Thr Gln Asn Tyr Leu Asp Tyr Pro Asn Ser Lys Tyr Asp Asn Ile 370 375 380 Lys Lys Gly Met Asn 385 ou une séquence présentant un degré d'homologie éLevé avec la séquence (al). 2 ADN recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte, en amont de la séquence (al) ou de la séquence présentant un degré d'homologie éLevé avec la séquence (al), une séquence signal. 3 ADN recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence signal est une séquence codant pour le pep- tide signal de séquence (a 2) suivante: Met Leu Ser Phe Val Lys Lys Ser Ile Ala Leu Val Ala Ala Leu Gln I 1 5 10 15 Ala Val Thr Ala Leu Ala 20 4 ADN recombinant se Lon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que Le peptide signal codé par La séquence signal est séparé de La séquence (al) de La protéine codée, par Le peptide de séquence (a 3) suivante: Thr Pro Ile Ser Ser Glu Ala Gly Val Glu Lys Arg ADN recombinant selon L'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence promotrice comportant le promoteur 35 S du virus de La mosaique de chou-fleur. 6 ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence terminatrice compor- tant le terminateur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens. 7 ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la séquence nuc Léotidique codant pour la séquence d'acides aminés (al) est la séquence (Nal) suivante: GGTAGTGGTT CAGCCTGCCG CGCGCAGATG GGTGACTCTT CTCAAGAAGC ACCAACTTCC GTTGGCTTCA GATGCCACTC TCCTACGCTG GGACCTGACA AACCTCATGG ATATACGCAA GCCTATATCA CGATCCTTCC TGGGAGAACG GACGATACCG TTGCAAATGC ACCTTCCTGC GCACCATCTT GGAACGATGT AGAACCGCAA CCGCTGCCGC TGAAGGACTG AGGCTCAGAA CCCAGTACGC ATTATAACAA CTTACGATTA ACCCGCAGAA ACGGCGGCGT AGCAAACCGA GTATCTGGGA CCAAGGGATG CGTCTACTTC CTCGGAGATT TTCCGGTGAT GGGCACGAAC CATGAAGGTG CAGCTCGGCT GGGTTTCGAC TATGGTTCTC CAAGGGTCAC GCTGAAGTTT CGCTGGATCT CCCCAACGCC CCCTGCCAAC GGGTATCGGT CTACAAGGCT CTACAGCTAC ACCAACTGGG ACTCACGTAC ACCTATGCCG GCTTACGGTT ATGCTGTCGA GCTACCCGAA GGTATTGATA TTGCTACAGG CACTTCCTGC GCTGAGCTTG TGGAGCAACT ACCCCTTACA AAGATCGTCC AAGCCTTACA CTCCCCAAGG GATCCAAGCA GCATTTATGG TCTACTCCTT ACTACGAGAA GTGTTAAGCA TTGGTGGTTG AGACTTTTGC TCGACTGGGA CTGTCCGCAG TTTCAATTGC GCAAGGTTCT ACACTGGCCA ACACGGACGA TTGGTATGCC ATGGTATTGG CTGGTGCCAC CTAAGGAGCT CCGCAACTTC CATGAATGTC GCACTACGCT ACTTTATCTT GACATGGTCT TCAGTCTGCT GTACCCCGCC TGAGCTCGAC CGCCCCTGCT CGATTACATT CGATGCCAAC TGCTGTCCAG AATCTACGGC CTCTGGTAGC CGTCAAGTGC TATTTCTTTC GATACGCCGG CTATGATCAG CACCAAAGTT AGCTGGCTCA AGGGCAAGGG CCTTGGCGGC 1020 AGCATGTTCT GGGAGGCTTC TGCCGACAAG AAGGGCTCGG ACTCTCTTAT TAGCACCAGC 1080 CACCAAGGTC TCGGTAGCCA GGACAGCACT CAGAACTACC TCGACTACCC TAACTCCAAG 1140 TACGACAACA TCAAGAAGGG CATGAAC 1167 8 ADN recombinant selon l'une des revendications 3 à 4, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a 2) est la séquence (Na 2) suivante: ATGTTGAGCT TTGTCAAAAA GTCGATCGCC TTGGTGGCGG CCCTGCAGGC GGTCACTGCC 60 CTGGCC 66 9 ADN recombinant selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a 3) est la séquence (Na 3) suivante: ACGCCAATCT CCAGTGAAGC TGGTGTTGAG AAGCGC 36 Bactérie, caractérisée en ce qu'elle contient, avec les moyens nécessaires à sa réplication et son expression, l'ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 9. 11 Levure, caractérisée en ce qu'elle contient, avec les moyens nécessaires à sa réplication et son expression, l'ADN recom- binant selon l'une des revendications 1 à 9. 12 Champignon filamenteux, caractérisé en ce qu'il con- tient, avec les moyens nécessaires à sa réplication et son expres- sion, l'ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 9. 13 Ce Llule végétale, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 9, avec les moyens nécessaires à son expression. 14 Cellule végétale selon la revendication 13, caracté- risée en ce qu'elle appartient à l'une des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus. Plante ou partie de plante, caractérisée en ce qu'elle contient un ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 9, avec les moyens nécessaires à son expression. 16 Plante ou partie de plante selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle appartient à l'une des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus. 17 Partie de plante selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisée en ce qu'elle est apte à former une nouvelle plante complète ou à produire des semences. 18 Partie de plante selon la revendication 17, caracté- risée en ce qu'elle est une semence. 19 Protéine à activité endochitinase, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue à l'aide d'un ADN recombi- nant selon l'une des revendications 1 à 9. Protéine selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence (al) ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (al). 21 Protéine selon l'une des revendications 19 et 20, caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire apparent de 41 + 3 k Da. 22 Protéine selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisée en ce qu'elle est N-glycosylée. 23 Protéine selon l'une des revendications 19 et 20, caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire apparent de 39 + 3 k Da. 24 Procédé pour préparer la protéine selon l'une des revendications 19 et 20, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules végétales, de cals végétaux, de plantes, ou de parties de plantes contenant, avec les moyens nécessaires à son expression, un ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 9, la lyse de ceux-ci, l'isolement et la purification de cette pro- téine.