FR 2679910 A1 19930205 FR 9209380 A 19920729 LIGANDS DE KIT SOLUBLES La présente invention concerne des Ligands de Kit (ou ci-après Kit Ligands, en abrégé KL) solubles comprenant le domaine de liaison au récepteur extracellulaire du KL naturel et dépourvus des domaines cytoplasmique et transmembranaire, des vecteurs d'expression et transformants exprimant les KL solubles et des méthodes pour la production de KL solubles utilisant une technologie à l'ADN recombinant En outre la présente invention concerne l'utilisation de KL solubles comme agents à activité thérapeutique pour le traitement de maladies hématopoïétiques et pour améliorer la guérison hématopoïétique après radio et chimiothérapie chez des patients cancéreux avec ou sans greffe de moelle osseuse autologue ou allogénique. Le Kit-C, qui est la contrepartie cellulaire de l'oncogène rétroviral Kit-V, code pour un récepteur de tyrosine kinase transmembranaire qui est un membre d'une importante famille de récepteurs de cytokine (Besmer et al., Nature 320, 415-421 l 1986 l; Qin et al, EMBO J 7, 1003-1011 l 1988 l; Yarden et al, EMBO J 6, 3341-3351 l 1987 l; Majumder et al, Mol Cell Biol 8, 4896-4903 l 1988 l) Le ligand pour ce récepteur Kit Ligand ou en abrégé KL est aussi une protéine transmembranaire comprenant un domaine extracellulaire, une région transmembranaire et un domaine cytoplasmique (Nocka et al, EMBO J 9, 3287-3294 l 1990 l; Huang et al, Cell 63, 225-233 l 1990 l; Martin et al, Cell 63, 203-211 l 1990 l). On dispose d'informations sur l'intérêt fonctionnel du Kit-C et du KL à partir d'études poussées de souris avec des mutations soit sur le tachage achromique (W), soit sur le locus,steel" (Si) Les mutations en W affectent spécifiquement l'hématopoïèse, la mélanogenèse et la gamétogenèse pendant le développement embryonnaire, ainsi que durant la vie de l'adulte (Russell, Adv Genet 20, 357-459 l 1979 l) Le gène Kit- C/W fonctionne dans les populations de cellules souches immatures et dans les types de cellules plus mûres Dans le système hématopoïétique les mutations en W affectent le compartiment de cellule souche, les précurseurs érythrocitaires et les mastocytes des tissus (Russell, dans "Regulation of hematopoiesis", A S Gordon, éd, New York: Appleton, pages 649-675 l 1970 l; Kitamura et al, Blood 53, 493 2-497 l 1978 l; Nocka et al, genes dev 3, 816-826 l 1989 l La caractérisation récente des lésions moléculaires de plusieurs allèles (gènes allélomorphes) mutants indiquait qu'il y a des mutations qui perturbent l'activité normale ou l'expression du récepteur de Kit C (Nocka et al, EMBO J 9, 1805-1813 l 1990 l). Les mutations sur le locus "steel" (Sl) ont pour résultat des caractéristiques phénotypiques qui sont très semblables à celles rencontrées chez les souris portant des mutations en W, c'est-à-dire qu'elles affectent l'hématopoïèse, la gamétogenèse et la mélanogenèse (Bennett, J Morphol 98, 199-234 l 1956 l; Russell, supra). On connaît de nombreux allèles sur le locus Sl; ce sont des mutations semi-dominantes et les différents allèles varient quant à leurs effets sur les différentes lignées cellulaires et leur degré d'intensité (Russell, supra). L'allèle original de Sl est une mutation importante Des homozygotes Sl/51 sont déficients en cellules germinales, sont dépourvus de pigment d'enrobage et meurent à la naissance d'anémie macrocytaire (Bennett, supra; Sarvelle et Russell, J Hered 47, 123-128 l 1956 l) Les souris homozygotes pour l'allèle Sld, bien que viables, souffrent d'une grave anémie macrocytaire, sont dépourvues de pigment de revêtement et sont stériles Tant l'hétérozygote Sl+ que l'hétérozygote Sld/+ ont une couleur de revêtement diluée et une anémie macrocytaire modérée, mais sont fertiles, bien que leurs gonades soient de taille réduite Contrairement aux mutations en W, les mutations sur Si ne sont pas autonomes vis-à-vis des cellules et on pense qu'elles sont provoquées par un défaut dans le microenvironnement des cibles de ces mutations (Mayer et Green, Dev biol 1, 68-75 l 19681; McCulloch et al, blood 26, 399-410 l 1965 l; Dexter et Moore, Nature 269, 412-414 l 1977 l) En raison des caractéristiques parallèles et complémentaires des souris portant des mutations en 51 et en W, on avait émis l'hypothèse que le produit du gène 51 est le ligand du récepteur de kit-c (Russell, supra; Chabot et al, Nature 335, 88-89 l 1988 l). Plus récemment, il a été démontré que le KL se lie spécifiquement au récepteur de kit-c (Huang et al, supra) et stimule les mastocytes et les progéniteurs érythrocytaires (Nocka et al, EMBO J 9, 3287-3294 l 1990 l) La structure primaire et l'expression fonctionnelle du KL de rat et du KL humain ont été décrites (Huang et al, supra; Martin et al, supra; Demande de brevet européen, publication No 0423980) Sur le fondement de la structure primaire, également des formes tronquées de protéines de rats et d'humains ont été exprimées dans des cellules d TE coli et de mammif ères et se sont avérées posséder une activité biologique, c'est-à- dire qu'elles sont aptes à accroître la prolifération des progéniteurs hématopoïétiques aussi bien myéloïdes que lymphoïdes dans des cultures de moelle osseuse et présentent des activités synergiques fortes en conjonction avec les facteurs stimulants de colonies, avec pour résultat des nombres accrus de colonies et une plus grande taille de colonie (Martin et al, supra; Demande de brevet européen, publication No 0423980). La forme la plus grande de KL humain consiste en 273 acides aminés de la séquence: + 1 25 MKKTQTWILT CIYLQLLLFN PLVKTEGICR NRVTNNVKDV TKLVANLPKD + 26 YMITLKYVPG MDVLPSHCWI SEMVVQLSDS LTDLLDKFSN ISEGLSNYSI + 76 IDKLVNIVDD LVECVKENSS KDLKKSFKSP EPRLETPEEF FRIFNRSIDA + 126 FKDFVVASET SDCVVSSTLS PEKDSRVSVT KPFMLPPVAA SSLRNDSSSS + 176 NRKAKNPPGD SSLHWAAMAL PALFSLIIGF AFGALYWKKR QPSLTRAVEN + 226 IQINEEDNEI SMLQEKEREF QEV incluant un peptide signal de 25 résidus (résidus -25 à -1), un domaine extracellulaire de 189 résidus (résidus + 1 à + 189), une région transmembranaire de 23 résidus (résidus + 190 à + 212) et un domaine cytoplasmique de 36 résidus (résidus + 213 à + 248). L'extrémité carboxy-terminale des formes natives les plus courtes des protéines de KL de rats et d'humains a été déterminée comme étant Ala 164. Afin d'évaluer la contribution de l'extrémité carboxy-terminale de l'activité biologique, on a produit une série de mutants de délétion comprenant le domaine de liaison de récepteur extracellulaire du KL naturel, n'ayant pas les domaines cytoplasmique et transmembranaire du KL naturel et structurellement différents des formes tronquées décrites par Martin et al, supra, et demande de brevet européen, publication No 0423980 (ci-après désignés par "Kit Ligands solubles ou KL solubles"). Tous les Kit Ligands solubles tronqués ont à peu près la même activité biologique que le KL humain consistant en les acides aminés 1-164 (ciaprès désigné par "Kit Ligand soluble de longueur totale" ou "Kit Ligand soluble total"). La présente invention procure donc des kit Ligands solubles ayant 1 à 26 acides aminés perdus sur l'extrémité C-terminale, par comparaison avec la forme tronquée de la protéine de KL humain décrite par Martin et al, supra. En outre il est vraisemblable que les Kit Ligands solubles, ainsi que les Kit Ligands solubles totaux décrits plus haut, qui sont au surplus tronqués sur ltextrémité N-terminale (qui a été déterminée comme étant Glu-Gly-Ile-Cys) conservent leur activité biologique De fait, on a trouvé que la suppression du résidu glutamine N-terminal (Glu 1) du Kit Ligand soluble total n'altère pas l'activité biologique Ainsi, compte tenu de ce qui précède, il est clair que la présente invention comprend non seulement des Kit Ligands solubles ayant l'extrémité N-terminale Glu- Gly-Ile-Cys (résidus d'acides aminés 1 à 4), mais également des Kit Ligands solubles et des Kit Ligands solubles totaux dans lesquels les acides aminés 1 à environ 4 sont supprimés sur l'extrémité N-terminale On désigne ci-après ces Kit Ligands solubles et Kit Ligands solubles totaux à extrémité N-terminale par "Kit Ligands solubles ou KL solubles". Les Kit Ligands solubles peuvent contenir en option un résidu méthionine additionnel sur leur extrémité N-terminale Le résidu méthionine additionnel provient du signal AUG d'initiation de traduction d'AR Nm qui code pour l'acide aminé méthionine. Dans le gène humain parental ce signal d'initiation de traduction est situé en face du peptide signal Ce peptide signal est clivé dans le processus post-traduction, conjointement avec la méthionine dérivée du signal d'initiation de traduction conduisant à du KL humain mature exempt de méthionine. Des hôtes procaryotes ne sont pas aptes à cliver le peptide signal en face du polypeptide de KL humain mature à la bonne position Par conséquent, la séquence codante pour le peptide signal doit être éliminée par génie génétique afin que le KL humain s'exprime sous forme mature ou mûre Le codon d'ATG directement en face de la5 séquence codante pour la protéine mûre donne la méthionine N-terminale présente dans le KL humain recombiné Dans des systèmes d'expression tels que E coli, cette méthionine n'est pas toujours écartée On a trouvé que la méthionine N-terminale additionnelle n'altère par l'activité10 biologique des KL solubles recombinés. Plus précisément la présente invention procure des Kit Ligands solubles de formule X-Y-CRNRVTNNVKDVTKLVANLPKDYMITLKYVPGMDVLPSHCWISE MVQLSDSLTDLLDKFSNISEGLSNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENSSKDL KKSFKSPEPR Lr::'J'; FI Ffh NRSIDAFKDFVVASETSDC-Z o X est la méthionine ou l'hydrogène, Y est EGI, et Z est V, VV,20 VVS, VVSS VVSST, VVSSTL, VVSSTLS, VVSSTLSP, VVSSTLSPE, VVSSTLSPEKD, VVSSTLSPEKDS, VVSSTLSPEKDSR, VVSSTLSPEKDSRV, VVSSTLSPEKDSRVS, VVSSTLSPEKDSRVSV, VVSSTLSPEKDSRVSVT, VVSSTLSPEKDSRVSVTK, VVSSTLSPEKDSR Vb VT 1 VVS, vvss, WVVSS, VVSST, VVSSTL, VVSSTLS, VVSSTLSP, VVSSTLSPE, VVSSTLSPEKD, VVSSTLSPEKD, WVVSSTLSPEKDS, WVVSSTLSPEKDSR, WVVSSTLSPEKDSRV, VVSSTLSPEKDSRVS, WVVSSTLSPEKDSRVSV, VVSSTLSPEKDSRVSVT, WVVSSTLSPEKDSRVSVTK, WVVSSTLSPEKDSRVSVTKP, VVSSTLSPEKDSRVSV'r%'i ', VVSSTLSPEKDSRVSVT'lKPF'M, VVSSTLSPEKDSRVSV'TK 1 KYFML, 'WSSTLSPEKDSR Vb V'r MFM:LP, VVSSTLSPEKDSRVSVTKPFMLPP, WVVSSTLSPEKDSRVSVTK'FMLPPV, VVSSTLSPEKDSRVSV'TKJPFMLPPVA,ou hydroxy. Lors de l'élimination microbienne de la méthionine N-terminale dans les KL solubles recombinés, o Y est EGI, le résidu de glutamine N- terminale nouvellement généré peut se cycliser en la forme pyroglutamate, là encore sans qu'apparemment cela altère l'activité biologique. Les KL solubles de la présente invention peuvent contenir des substitutions d'acides aminés, si de telles substitutions n'altèrent pas de manière générale leur activité biologique et leur solubilité Des substitutions d'acides aminés dans les protéines et les polypeptides, qui n'altèrent pas notablement l'activité biologique sont connues de l'homme du métier et décrites, par exemple par H Neurath et R L Hill dans "The Proteins", Academic Press, New York ( 1979), en particulier dans la figure 6 de la page 14 Les substitutions d'acides aminés les plus fréquemment observées sont Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly et vice versa Les KL solubles selon la présente invention peuvent en outre contenir des séquences de plusieurs acides aminés pour lesquelles codent des séquences "lieuses" (c'est-à-dire "de liaison") Ces séquences proviennent des vecteurs d'expression utilisés pour l'expression des KL solubles comme décrit plus haut. Les KL solubles de la présente invention peuvent aussi contenir des séquences spécifiques qui se fixent de préférence à un produit support d'affinité Des exemples de telles séquences sont les séquences contenant au moins deux résidus histidine adjacents (voir à ce sujet: Demande de brevet européen, publication No 0282042) De telles séquences se fixent sélectivement à des résines de chélate acide nitrilotriacétique nickel (Hochuli et Dôbeli, Biol. Chem Hoppe-Seyler 368, 748 ( 1987); demande de brevet européen, publication No 0253303) Des KL solubles contenant une telle séquence spécifique peuvent, par conséquent, être séparés sélectivement des polypeptides restants La séquence spécifique peut être liée soit à l'extrémité C-terminale, soit à l'extrémité N-terminale des séquences d'acides aminés du KL soluble. On peut également combiner les KL solubles de la présente invention avec défférents polypeptides d'immuno- globuline à chaîne lourde ou à chaîne légère cela conduit à des polypeptides d'immunoglobuline KL soluble chimériques, qui pourraient avoir une demi-vie accrue in vivo On a pu démontrer une demi-vie accrue in vivo, par exemple pour des polypeptides chimériques consistant en les deux premiers domaines ou parties de domaines de la molécule de CD 4 humaine et différents domaines des régions constantes de la chaîne lourde ou de la chaine légère d'une immunoglobuline de mammifère (voir Traunecker et al., Nature 331, 84-86 l 1988 l et Demande de brevet européen, publication No 0394827). Les KL solubles peuvent également être couplés à des polymères, par exemple du polyéthylène glycol ou du polypropylène glycol ayant une masse moléculaire de 500 à 000 daltons Cela conduit à des compositions de KL soluble protégées qui pourraient être pratiquement non- immunogènes Plusieurs modes de couplage du polymère avec le polypeptide sont disponibles et décrits, par exemple, dans le bbrevet US No 4179337. Les KL solubles de la présente invention peuvent aussi être conjugués avec des agents appropriés pour l'imagerie Les agents appropriés pour l'imagerie sont bien connus de l'homme du métier et peuvent être, mais sans y être limités, des radioisotopes, des colorants ou des enzymes telles que la peroxydase ou la phosphatage alcaline Les radioisotopes appropriés comprennent, mais sans y être limités, 125 I, 32 p et 355. Ces polypeptides conjugués sont utiles pour la détection de la présence de cellules, in vitro ou in vivo, qui expriment la protéine du récepteur kit-c Lorsque la détection est effectuée in vitro, un échantillon de la cellule ou du tissu à tester est mis en contact avec le polypeptide conjugué dans des conditions appropriées telles que le polypeptide conjugué se lie au récepteur de kit-c présent sur la surface de la cellule ou du tissu; ensuite on élimine le polypeptide conjugué non lié et on détecte la présence du polypeptide conjugué, lié; on détecte ainsi les cellules ou tissus qui expriment la protéine de récepteur de kit-c. De plus les KL solubles selon la présente invention peuvent être conjugués à un agent thérapeutique tel que des toxines, des agents chimiothérapeutiques ou des radioisotopes Ainsi, lorsqu'on l'administre à un patient en une quantité efficace, la molécule conjuguée agit comme un système de délivrance spécifique du tissu pour délivrer l'agent thérapeutique à la cellule exprimant le récepteur de kit-c. La présente invention procure également des séquences d'ADN qui codent pour les KL solubles de la présente invention, des vecteurs d'expression qui contiennent ces séquences d'ADN, des cellules hôtes contenant de tels vecteurs pour la production des KL et des procédés pour la production de telles séquences d'ADN, de tels vecteurs recombinants, et de telles cellules hôtes Des méthodes pour l'expression, l'isolement et la purification des KL solubles sont également décrites. Du fait que la séquence d'ADN complète du gène codant pour le KL naturel n'est pas connue (Martin et al, supra), des séquences d'acides aminés codant pour les KL solubles de la présente invention peuvent être chimiquement synthétisées au moyen de méthodes standard connues de ol'homme du métier, de préférence des méthodes à l'état solide, telles que les méthodes de Merrifield (J. Am Chem Soc 85, 2149-2154 ( 1963 l) En variante on peut produire les KL solubles de la présente invention en utilisant des méthodes de technologie de recombinaison de l'ADN (génie génétique) (Maniatis et al, dans n Molecular Cloning a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor il Laboratory ( 1982 l de préférence une séquence d'ADN codant pour un KL soluble de la présente invention est préparée à partir d'ADN codant pour le KL naturel et ensuite incorporée dans un vecteur d'expression approprié qui produit les signaux d'expression requis. Des vecteurs d'expression appropriés pour un usage dans des cellules hôtes procaryotes sont mentionnés, par exemple, dans le manuel susmentionné de Maniatis et al Des vecteurs particulièrement appropriés sont les plasmides de la famille p DS lBujard et al, Methods in Enzymology, éds Wu et Grossmann, Academic Press, Inc, vol 155, 416-433 ( 1987)l. De tels vecteurs d'expression procaryotes qui contiennent les séquences d'ADN codant pour les KL solubles de la présente invention liés de façon opérationnelle à une séquence d'expression témoin peuvent être incorporés au moyen de méthodes classiques dans une quelconque cellule hôte procaryote appropriée la sélection d'une cellule hôte procaryote appropriée est déterminée par différents facteurs qui sont bien connus de l'homme du métier C'est ainsi, par exemple, que la compatibilité avec le vecteur choisi, la toxicité du produit d'expression, les caractéristiques d'expression, les nécessaires précautions quant à l'innocuité biologique et les coûts jouent un rôle et qu'il faut trouver un compromis entre tous ces facteurs. Des organismes hôtes procaryotes appropriés sont notamment les bactéries gram négatives et Gram positives, par exemple les souches E coli et B subtilis On préfère tout particulièrement en tant qu'organismes hôtes procaryotes selon la présente invention la souche d'E coli M 15 (décrite comme souche OZ 291 par Villarejo et al dans J Bacteriol 120, 466-474 l 1974 l et E coli HB 101 lManiatis et al, supral) En plus des souches d'E coli susmentionnées, toutefois, on peut également utiliser d'autres souches d'E coli accessibles de manière générale, telles que E coli 194 (ATCC No 31446), E coli RR 1 (ATCC No 31343) et E coli W 3110 (ATCC No 27325). Les vecteurs d'expression appropriés pour une utilisation dans des cellules hôtes de mammifères comprennent, mais sans y être limités, les p BC 12 MI, p BC 12 BI, p SV 2 dh Fr, p 91023 (B), pc D Vl, p RS Vcat, p GA 291, p GA 293, p GA 296, p BC 12/HIV/IL-2, p GA 300, p K 21 et p SV 2-DHFR. Les vecteurs p K 21 et p SV 2-DHFR sont préférés De tels vecteurs sont de préférence introduits dans les cellules hôtes mammaliennes appropriées par transfection. Les cellules hôtes de mammifères (mammaliennes) que l'on peut utiliser comprennent par exemple les cellules humaines Hela, H 9 et Jurkat, les cellules murines NIH 3 T 3 et C 127, les cellules rénales du singe vert africain CV 1, les cellules de caille QC 1-3, les cellules d'ovaire de hamster chinois (OHC), les cellules murines L et les lignées cellulaires COS On préfère la lignée cellulaire COS-1. La manière selon laquelle on effectue l'expression des KL solubles de la présente invention dépend du système vecteur d'expression/cellule hôte choisi. Usuellement on cultive les organismes hôtes procaryotes qui contiennent un vecteur d'expression souhaité dans des conditions qui sont optimales pour la croissance des organismes hôtes procaryotes A la fin de la croissance exponentielle, lorsque l'augmentation du nombre de cellules par unité de temps diminue, on induit l'expression du KL soluble désiré, cest-à-dire que l'ADN codant pour le KL soluble désiré est transcrit et l'AR Nm transcrit est traduit On peut effectuer l'induction en ajoutant un inducteur ou un dérépresseur du milieu de croissance ou en modifiant un paramètre physique, par exemple en effectuant un changement de température Dans les vecteurs d'expression utilisés dans les modes de mise en oeuvre préférés de la présente invention, l'expression est commandée par le répresseur lac Par addition d'isopropyl-1-D- thiogalactopyranoside (IPTG) la séquence de commande d'expression est déréprimée et la synthèse du KL soluble désiré se trouve ainsi induite. Les cellules hôtes de mammifères qui contiennent un vecteur d'expression souhaité sont cultivées dans des conditions qui sont optimales pour la croissance des cellules hôtes de mammifères Un vecteur d'expression typique contient l'élément promoteur, qui est le médiateur de la transcription de l'AR Nm, la séquence codant pour la protéine, et les signaux requis pour la terminaison et la polyadénylation efficaces du produit de la transcription. Des éléments additionnels peuvent comprendre des activateurs et des introns liés par des sites donneurs et accepteurs d'épissage. La plupart des vecteurs utilisés pour l'expression transitoire d'une séquence codante donnée portent l'origine Sv 40 de réplication, qui leur permet de se répliquer en un nombre de copies élevé dans des cellules (par exemple des cellules COS) qui, de par leur constitution, expriment l'antigène T requis pour initier la synthèse d'ADN viral L'expression transitoire n'est pas limitée à des cellules COS Toute lignée cellulaire de mammifères qui peut être transfectée peut être utilisée à cette fin Des éléments commandant une transcription hautement efficace sont notamment les promoteurs précoces et tardifs de SV 40 et les longues répétitions terminales (LTR) des rétrovirus, par exemple RSV, HIV, HTLV-I. Cependant on peut aussi utiliser des signaux cellulaires (par exemple le promoteur de S-actine humaine) En variante des lignées cellulaires stables portant un gène intéressant intégré dans le chromosome peuvent être choisies dans la co-transfection avec un marqueur que l'on peut choisir, tel que gpt, dhfr, néomycine ou hygromycine. Or, le gène transfecté peut être amplifié pour exprimer de grandes quantités d'une protéine étrangère La dihydrofolate réductase (DHFR) est un marqueur utile pour le développement de lignées de cellules portant plus de 1000 copies du gène intéressant Les cellules de mammifères sont cultivées dans des quantités croissantes de méthotrexate Ensuite, lorsque le méthotrexate est éliminé, les lignées cellulaires contiennent le gène amplifié intégré dans le chromosome dans les vecteurs d'expression utilisés dans les modes de mise en oeuvre préférés de la présente invention, l'expression est régulée par le virus du sarcome de Rous LTR. Le système vecteur de baculovirus-cellule d'insecte peut aussi être utilisé pour la production des KL solubles de la présente invention (pour une revue sur ce point, voir Luclow et Summers, Bio/technology 6, 47-55 l 1988 l Les Kl solubles produits dans des cellules d'insectes infectés avec du baculovirus recombinant peuvent donner lieu à un processus post-traductionnel incluant une N-glycosylation (smith et al, Proc Nat. Acad Sci USA 82, 8404-8408) et une 0-glycosylation (Thomsen et al, 12 ème Réunion de travail internationale sur l'herpès virus, Université de Philadelphie, Pennsylvanie). Pour l'isolement de faibles quantités de KL solubles exprimées dans des cellules hôtes procaryotes à des fins analytiques, par exemple pour une électrophorèse sur gel de polyacrylamide, les cellules hôtes peuvent être dissociées par traitement avec un détergent, par exemple du dodécyl sulfate de sodium (SDS) De plus grandes quantités de ces KL soluble peuvent être obtenues par des traitements mécanique lCharm et al, Meth Enzymol 22, 476-556 ( 1971)l, enzymatique (traitement au lysozyme) ou chimique (traitement par un détergent, traitement à l'urée ou au chlorhydrate de guanidinium, etc), suivis par l'utilisation de méthodes connues, par exemple par centrifugation à différentes gravités, précipitation avec du sulfate d'ammonium, dialyse (sous pression normale ou sous pression réduite), isoélectrofocalisation préparative, électrophorèse préparative sur gel ou par diverses méthodes chromatographiques telles que la filtration sur gel, la chromatographie liquide haute performance (HPLC), la chromatographie sur échangeurs d'ions (par exemple sur Sepharose R Blue CL-6 B ou sur des anticorps monoclonaux liés à un support, qui sont dirigés contre du KL natif et les KL solubles de la présente invention). Une méthode préférée pour l'isolement de grandes quantités de KL solubles exprimés dans des cellules hôtes procaryotes comprend les étapes suivantes: (I) Dissociation des cellules et extraction des protéines avec du chlorhydrate de guanidine; (II) Repliage des protéines; (III)Chromatographie au chélate de cuivre; et (IV) Chromatographie sur une colonne échangeuse d'anions. Les KL solubles exprimés dans des cellules hôtes de mammifères ou dans le système vecteur de baculovirus- cellules d'insectes peuvent être isolés à partir du milieu cellulaire hôte au moyen de méthodes de purification des protéines standard. Les KL sollubles peuvent être utilisés pour les préparations de compositions pharmaceutiques, pour le traitement de troubles hématopoïétiques et pour améliorer le rétablissement hémotapolétique après radio et chimiothérapie chez des patients cancéreux, avec ou sans greffe de moelle osseuse autologue ou allogénique Les KL solubles peuvent être utilisés soit seuls, soit avec un ou plusieurs facteurs hématopoïétiques additionnels, tels que EPO, G-CSF ou GM-CSF. Il existe des dérèglements de celllules souches tels que l'anémie aplasique, l'hémoglobinurie paroxystique nocturne (PNH), la polycythémie vraie, la leucémie myéloïde chronique, la mataplasie myéloïde, la thrombocythémie primaire et les leucémies aiguës, qui peuvent être traités avec les KL solubles selon la présente invention. Il existe de nombreuses autres affections que l'on peut traiter avec les KL solubles, tels que le syndrome immunodéficitaire acquis (SIDA), la myélofibrose, la myélosclérose, l'ostéopétrose, le carcinome métastatique, le myélome multiple, la malaria et la carence en vitamine B 12 et en acide folique. Les KL solubles peuvent également être mutés de telle sorte que l'activité biologique qui a pour médiation la liaison d'un ligand fonctionnel au récepteur de kit-c soit détruite, tandis que l'aptitude à se lier au récepteur de kit-c est préservée Ainsi, ces KL mutés peuvent aussi être utilisés pourr le traitement d'allergies. Les KL solubles sont utiles pour stimuler la prolifération des mastocytes chez les patients ayant une masse de moelle fonctionnelle réduite à la suite d'une chimiothérapie ou d'un traitement par irradiation. Les KL solubles sont également utiles pour développer des progéniteurs hématopoïétiques précoces dans une greffe de moelle osseuse autologue ou allogénique. Les KL solubles de la présente invention, ainsi que les KL humains existant naturellement et isolés et les Kl solubles totaux, sont utiles pour enrichir des cellules souches sanguines myéloïdes et lymphoïdes précoces chez des cancéreux avant une radio et chimiothérapie Un patientcancéreux est traité avec du KL, comme décrit plus haut, seul ou en combinaison avec d'autres facteurs hématopoïétiques, en particulier G-CSF, GM-CSF, IL-3 ou IL-6, avant une radio et chimiothérapie pour qu'augmente le nombre de cellules souches sanguines circulantes Après une radio et/ou chimiothérapie, ces cellules souches sanguines enrichies sont ensuite injectées à des patients souffrant d'un cancer. Un traitement in vivo avec du KL soluble est utile comme renforçateur du système immunitaire pour la lutte contre le cancer. Les KL solubles sont aussi utiles pour renforcer l'efficacité d'une thérapie génique fondée sur la transfection ou l'infection de cellules souches hématopoïétiques avec un vecteur rétroviral Ils permettent la culture et la multiplication des cellules souches hématopoïétiques précoces qui sont à transfecter. la culture peut être réalisée avec du KL soluble seul ou en combinaison avec un ou plusieurs facteurs hématopoïétiques additionnels Une fois transfectées, ces cellules sont ensuite injectées dans une greffe de moelle osseuse chez des patients souffrant de troubles génétiques Des exemples de gènes qui sont utiles dans le traitement de troubles génétiques comprennent l'adénosine- désaminase, la glucosyl-céramidase, l'hémoglobine et la fibrose kystique. En outre, les KL solubles peuvent être utiles durant des procédures de fécondation in vitro ou dans le traitement d'états de stérilité. les KL solubles peuvent être administrés seuls ou avec un ou plusieurs facteurs hématopoïétiques additionnels dans des compositions et selon des posologies orales, injectables ou topiques, pharmaceutiquement acceptables l'administration se fait à une dose telle que la quantité de la composition chez le patient soit efficace pour modifier la fonction biologique associée à la fonction du KL. Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention contiennent des KL solubles en association avec un produit support ou vecteur compatible, pharmaceuti- quement acceptable On peut utiliser un quelconque produit support classique Le produit support peut être un produit organique ou minéral pour administration entérale, percutanée ou parentérale Des supports appropriés sont notamment l'eau, la gélatine, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, les huiles végétales, les polyalkylène-glycols, la vaseline et analogues En outre, les préparations pharmaceutiques peuvent contenir d'autres agents à activité pharmaceutique Des additifs supplémentaires tels que des agents de flaveur, des conservateurs, des agents stabilisants, des agents émulsifiants, des tampons et autres peuvent être ajoutés en conformité avec les pratiques reconnues pour l'élaboration des compositions pharmaceutiques. Les préparations pharmaceutiques peuvent être élaborées sous une quelconque forme classique: a) une forme solide pour administration orale telle que des comprimés, capsules, pilules, poudres, granules et autres; b) une forme liquide pour administration orale telle que des solutions, sirops, suspensions, élixirs et autres; c) des préparations pour administration parentérale telles que des solutions, suspensions ou émulsions stériles; et d) des préparations pour administrations topiques telles que des solutions, suspensions, pommades, crèmes, gels, poudres micronisées, aérosols et autres Les préparations pharmaceutiques peuvent être stérilisées et/ou peuvent contenir des adjuvants tels que des conservateurs, des agents stabilisants, des agents mouillants, des émulsifiants, des sels pour modifier la pression osmotique et/ou des tampons. Les formes de dosage parentérales peuvent être des perfusions ou des solutions injectables que l'on peut injecter par voie intraveineuse ou intramusculaire Ces préparations peuvent aussi contenir d'autres substances à activité médicinale Des additifs complémentaires tels que des conservateurs, des agents stabilisants, des agents émulsifiants, des tampons et autres peuvent être ajoutés en accord avec des pratiques reconnues pour l'élaboration des compositions pharmaceutiques. De plus, des anticorps peuvent être élevés contre les KL solubles de la présente invention Ces anticorps peuvent être utilisés d'une manière bien connue à des fins diagnostiques ou thérapeutiques, ainsi qu'à des fins de purification On peut produire de tels anticorps par injection à un mammifère ou à un animal aviaire une quantité suffisante d'une formulation de vaccin comprenant un KL soluble selon la présente invention et un support pharmaceutique compatible pour obtenir la production d'anticorps contre ledit KL La quantité appropriée du KL soluble qui serait nécessaire est connue de l'homme du métier et peut être déterminée par une expérimentation de routine Tel qu'il est utilisé en relation avec la présente invention, le terme "support pharmaceutique" peut signifier soit les compositions standard qui sont appropriées pour l'administration humaine, soit les adjuvants typiques employés dans les vaccinations des animaux. Des adjuvants appropriés pour la vaccination des animaux comprennent, mais sans y être limités, l'adjuvant complet ou incomplet de Freund (ne convenant pas pour un usage chez l'homme ou les animaux sur pied) L'Adjuvant , contenant de l'huile d'arachides, du monooléate de mannide et du phosphate d'aluminium et de l'alun; des agents de surface tels que l'hexadécylamine, l'octadécylamine, la lysolécithine, le bromure de diméthyldioctadécylammonium, la N 1,N-dioctadécyl-N',N-bis- ( 2-hydroxyéthylpropanediamine), le méthoxyhexadécyl- glycérol, et les polyols de type pluronics; des polyanions tels que le pyranne, le sulfate de dextrane, le poly IC, l'acide polyacrylique, le carbopol; des peptides tels que le dipeptide de muramyle, la dimentylglycine, la tufsine; et des émulsions huileuses On peut aussi administrer les KL solubles après incorporation dans des liposomes ou d'autres microsupports, ou après conjugaison à des polysaccharides, d'autres protéines ou d'autres polymères ou en combinaison avec du Quil- A pour former des "Iscoms" (complexes immunostimulants) (Morein et al, Nature 308, 457 l 1984 l). En pratique, la vaccination initiale est suivie quelques semaines plus tard par une ou plusieurs vaccinations de rappel, dont l'effet global est la production de titres élevés d'anticorps contre les KL solubles que l'on peut récolter de la manière usuelle. Une autre méthode consiste à utiliser la technique bien connue de Koehler et Milstein pour la production d'anticorps monoclonaux Afin de trouver différents anticorps monoclonaux qui soient dirigés contre le même antigène, mais contre différents épitopes, on peut utiliser la méthode de Stâhli et al lJ of Immunological Methods 32, 297-304 ( 1980)l. Enfin, les KL solubles de la présente invention sont utiles dans des méthodes de triage pour l'identification d'agonistes ou d'antagoniste de kit-c. L'invention a jusqu'ici été décrite en termes généraux; elle sera mieux comprise en référence aux exemples spécifiques qui suivent à des fins d'illustration seulement et n'ont aucun caractère limitatif, sauf indication contraire, en relation avec les figures ci- après: Figure 1 représente la séquence de nucléotides complète du plasmide d'expression d'E coli p OC 56/RBS II, Neo I dans la séquence nucléotidique les sites de reconnaissance pour les enzymes de restriction Neo I et Hind III sont indiqués. Figure 2 représente la séquence de nucléotides de la séquence codante du KL soluble total codant partiellement optimisée pour des préférences pour le codon d'E coli et la séquence d'acides aminés du Kl soluble total Dans la séquence nucléotidique les sites de reconnaissance pour les enzymes de restriction Neo I, Sma I et Hind III sont indiqués. Figure 3 représente la séquence nucléotidique complète du plasmide p REP 4. Figure 4 eprésente les séquences nucléotidiques des amorces 3 ' utilisées pour la formation des KL solubles tronqués à l'extrémité carboxy-terminale M 1-M 9. Figure 5 représente les séquences d'acides aminés des KL solubles Ml-M 10. Figure 6 représente l'inhibition de 125 I-KL se liant à des cellules HEL 92 1 7 par des KL solubles tronqués M 2, M 5, M 7 et M 10. Figure 7 représente l'incorporation de 3 H-thymidine dans des cellules TF-1 en fonction des concentrations de KL (a., KL soluble total et b e, KL solubles tronqués M 2, MS, M 7 et M 10). Exemole 1 Expression de KL solubles dans des cellules d'E coli A PréDaration de Dlasmides codant Dour des séquences de K Lh total et total soluble 1 Préparation de 1 'ADNC de Kit Ligand humain (K Lh) L'AD Nc codant pour le K Lh a été obtenu par l'amplification en chaîne par polymérase (PCR, ou en français ACP) avec 4 amorces différentes dérivées de la séquence de K Lh et de I'AR Nm dd'une lignée cellulaire de fibroblaste embryonnaire humain qui produit K Lh La séquence des amorces pour la réaction d'ACP était la suivante: Amorce 5 ' ( 1): 5 ' GGGATCCACCATGAAGAAGACACAAACTTGG-3 ' Amorce 3 ' ( 2): 5 ' GGGAGATCTGATACAAGCCACAATTTACAC-3 ' Amorce 5 ' ( 3): 5 ' GGGCCATGGAAGGTATCTGCAGGAATCG-3 ' Amorce 3 ' ( 4): 5 ' GGGAAGCTTATGCAACAGGGGGTAACAAAATGG 3 ' Les amorces i et 2 étaient conçues pour amplifier la séquence codante du K Lh total (résidus d'acides aminés -25 à 248) L'amorce 1 a en plus de la séquence complémentaire de la séquence du K Lh une extension 5 ' contenant une séquence de Kozak optimisée (CCACCATG), un Bam HI (GGATCC) et la moitié d'un site de restriction Sma I (GGG) L'amorce 3 ' 2 contient dans son extension un site Bg III et là encore la moitié d'un site Sma I. Les amorces 3 et 4 d'autre part étaient conçues pour amplifier la séquence codant pour les résidus d'acides aminés 1-164 du K Lh seulement L'amorce 3 a une extension qui fournit un codon dd'initiation de traduction ATG précédant le résidu d'acide aminé 1 du K Lh Cet ATG est implanté dans un site Nco I L'amorce 3 contient en outre la moitié d'un site de restriction Sma I L'amorce 4 est conque pour introduire un codon d'arrêt TAA suivant le codon pour le résidu d'acide aminé 164 du K Lh En outre, la saillie de l'amorce 4 contient un Hind III et la moitié d'un site de restriction Sma I. L'ACP a été effectuée conformément aux modes opératoires standard avec 30 cycles comprenant i minute de dénaturation à 95 C, i minute d'annelage à 55 C et 2 minutes d'extension à 72 C Les amplicons de ces réactions (fragment amplifié) ont été analysés en électrophorèse sur gel d'agarose. 2 Construction de plasmide K Lp codant pour du K Lh total (résidus d'acides aminés -25 à 248). L'amplicon de la réaction d'ACP utilisant les amorces 1 et 2 a été purifié par électrophorèse sur gel sur de l'agarose à bas point de fusion (LMA) Les extrémités en saillie du fragment obtenu ont été remplies avec de l'ADN polymérase de Klenow dans des conditions standard Après traitement à la kinase des extrémités 51, le fragment a été à nouveau purifié au moyen d'une électrophorèse sur gel de LMA. Le plasmide p UC 18 a été linéarisé avec l'enzyme Sma I, traité avec de la phosphatase alcaline et purifié par électrophorèse sur LMA L'amplicon purifié des amorces 1 et 2 a été cloné dans le vecteur p UC linéarisé pour donner le plasmide K Lp codant pour le K Lh total (résidus d'acides aminés -25 à 248). Des cellules HB 101 d'E coli transformées avec du plasmide K Lp ont été déposées à la Deutsche Sammlung von Microorganismen de braunschweig le 7 juin 1991, conformément au Traité de Budapest lE coli HB 101 (K Lp), DSM No 6570 l. 3 Construction de plasmide m K Lp codant pour du K Lh soluble total a Construction du plasmide mnl K Lp L'amplicon de la réaction d'ACP avec les amorces 3 et 4 a été purifié au moyen d'une électrophorèse sur LMA, digéré avec Nco I et Hind III et purifié à nouveau sur LMA. Le plasmide p D 556/RBSII, Nco I (Stfber et al dans Immunological methods, vol IV, pages 121-152 l 1990 l, Academic Press) a été digéré avec Nco I et Xba I, traité avec de la phosphatase alcaline et le squelette vecteur a été purifié sur LMA Dans une seconde digestion le plasmide p D 556/RBSII, Nco I a été digéré avec Xba I et Hind III et le fragment codant pour le gène CAT a été isolé sur LMA Dans une ligature à trois voies, le squelette vecteur Nco I-Xba I, le fragment Xba I-Hind III contenant le gène CAT et le fragment Nco I-Hind III codant pour le K Lh soluble total (amplicon purifié des amorces 3 et 4) ont été ligaturés pour donner le plasmide mnl K Lp. b Construction du plasmide d'expression d'E coli p OC 56/RBSII, Nco I le plasmide p OC 56/RBSII, Nco I a été élaboré à partir du plasmide p D 556/RBSII, Nco I par délétion de la séquence codant pour CAT La séquence de p D 556/RBSII, Nco I qui se situe entre les sites de restriction Hind III et Xba I a été éliminée et remplacée par un fragment Hind III- Xba I contenant uniquement le terminateur to Le plasmide résultant a été désigné p OC 56/RBSII, Nco I Sa séquence d'ADN complète est indiquée sur la figure 1. c Construction du plasmide mn 2 K Lp Le plasmide mnl K Lp a été digéré avec les enzymes Nco I et Hind III et le fragment codant pour le KL a été isolé au moyen d'une électrophorèse sur gel de LMA Le plasmide p OC 56/RBSII, Nco I a aussi été digéré avec Nco I et Hind III, traité avec de la phosphatase alcaline et isolé au moyen d'une électrophorèse sur gel de LMA Le fragment codant pour le KL soluble total a été ligaturé dans le plasmide p OC 56/RBSII, Nco I digéré par Nco I et Hind III, ce vecteur donnant le plasmide mn 2 K Lp. d Construction du plasmide m K Lp On a construit le plasmide m K Lp en remplaçant les codons pour les résidus d'acides aminés 1-34 (du site Nco I dans le site Sma I dans la séquence codante du K Lh) du K Lh par de l'ADN synthétique codant pour la séquence identique, mais prenant en compte les préférences du codon d'E coli La séquence de la région codante de K Lh résultante qui est partiellement optimisée pour les préférences du codon dd'E coli est indiquée sur la figure 2 Pour la construction du m K Lp, on a fait digérer du plasmide mn 2 K Lp avec Nco I et Sma I, qui libère la partie 5 ' de la séquence codante du K Lh Après traitement avec de la phosphatase alcaline on a isolé le squelette en utilisant du LMA Les deux oligonucléotides synthétiques ont été kinasés, ecuits et ligaturés dans du vecteur digéré mn 2 K Lp pour former le plasmide m K Lp codant pour le KL soluble total avec les acides aminés Met-1-164. Des cellules M 15 d'E coli transformées avec du plasmide m K Lp ont été déposées à la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen de Braunschweig le 17 juin 1991, conformément au Traité de Budapest lE coli M 15 (Pk LM), DSM No 6572 l. B Expression de K Lh soluble total Des cellules M 15 d'E coli contenant le répresseur lac produisant le plasmide p REP 4 (dont la séquence complète est indiquée dans la figure 3) ont été transformées avec du plasmide m K Lp Les cellules ont été cultivées dans du mielieu TB ( 12 g/1 de bactotryptone, 24 g/I d'extrait de levure, 4 ml/l de glycérol, KH 2 PO 4 0,017 M et K 2 HPO 4 0,072 M) contenant 100 mg/1 d'ampicilline et 25 mg/L de kanamycine A une densité optique de 600 nm d'environ 0,6 à 1,0, on a ajouté de l'IPTG à une concentration finale de 2 m M Après avoir poursuivi la culture pendant encore 2,5 à 5 h à 37 C on a récolté les cellules par centrifugation La présence de la protéine de K Lh soluble total a été établie par SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium) dans des conditions réductrices et non-réductrices (en présence ou en l'absence de 9- mercaptoéthanol) comme décrit dans la littérature (Laemmli, Nature 227, 680-685 l 1970 l). C Expression de KL solubles tronaués à l'extrémité carboxv terminale 1 Préparation de plasmides m K Lp M 1-M 9 codant pour les KL solubles tronqués à l'extrémité carboxy terminale. On a produit des formes tronquées à l'extrémité carboxy terminale de KL soluble par ACP en utilisant l'amorce 5 ': 5 '-ACAATTTCACACAGAATTCA-3 ', et des oligonucléotides correspondant à différentes parties de la séquence de K Lh comme amorces 3 ' Les amorces 3 ' étaient conçues pour introduire des codons d'arrêt en différentes positions dans la séquence codante du K Lh, donnant ainsi des formes tronquées à l'extrémité carboxy terminale de KL soluble La séquence des amorces 3 ' utilisée pour la formation des KL solubles tronqués à l'extrémité carboxy terminale est indiquée dans la figure 4 Les conditions d'ACP étaient de 30 cycles avec 1 minute de dénaturation à C, 1 minute de annelage à 47 C et une extension pendant 2 minutes à 72 C Les amplicons de ces réactions d'ACP ont été à nouveau purifiés sur du LMA, traités avec de l'ADN polymérase de Klenow et tous les 4 nucléotides et ensuite kinasés Les amplicons ont ensuite été digérés avec de l'enzyme Nco I pour donner des fragments ayant une saillie Nco I et une extrémité franche respectivement Ces fragments ont été à nouveau purifiés avec du LMA. * Du plasmide p OC 56/RBSII, Nco I contenant une calbindine D 9 insérée entre le site Nco I et le site Hind III a été digérée avec Hind III et la saillie a été remplie avec de l'ADN polymérase de Klenow Après purification le vecteur linéarisé a encore été digéré avec Nco I qui libère la séquence d'insertion de calbindine D 9. Après traitement avec de la phosphatase alcaline le squelette du vecteur a été isolé au moyen d'une électrophorèse sur gel de LMA Les fragments d'ACP codant pour les KL solubles tronqués à l'extrémité carboxy terminale ont été ligaturés dans ce vecteur Les plasmides résultants ont été désignés: m K Lp M 1, codant pour le KL soluble avec les acides aminés Met-I-138 M 1); m K Lp M 2, codant pour le KL soluble avec les acides aminés Met-I-141 (M 2); m K Lp M 3, codant pour le KL soluble avec les acides aminés Met-I-144 (M 3); m K Lp M 4, codant pour le KL soluble avec les acides aminés Met-I-147 (M 4); m K Lp M 5, codant pour le KL soluble avec les acides aminés Met-I-150 (M 5); m K Lp M 6, codant pour le KL soluble avec les acides aminés Met-l I-153 (M 6); m K Lp M 7, codant pour le KL soluble avec les acides aminés Met-I-156 (M 7); m K Lp M 8, codant pour le KL soluble avec les acides aminés Met-I-159 (M 8); et m K Lp M 9, codant pour le KL soluble avec les acides aminés Met-I-162 (M 9). Les séquences d'acides aminés de ces KL solubles Ml-M 9 sont indiquées dans la figure 5 dans le code à une lettre. 2 Expression des KL solubles tronqués à l'extrémité carboxy terminale dans E coli Des cellules M 15 d'E coli contenant le plasmide p REP 4 ont été transformées avec des plasmides m K Lp M 1-M 9. Ces cellules ont été cultivées dans du milieu TB ( 12 g/l de bactotryptone, 24 g/l d'extrait de levure, 4 ml/l de glycérol, KH 2 PO 4 0,017 M et K 2 HPO 4 0,072 M) contenant 100 mg/l d'ampicilline et 25 mg/l de kanamycine A une densité optique à 600 nm d'environ 0,6 à 1,0 on a ajouté de l'IPTG à une concentration finale de 2 m M Après poursuite de la culture pendant encore 2,5 à 5 h à 37 C, on a récolté les I 0 cellules par centrifugation La présence des KL solubles a été révélée par SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium) dans des conditions réductrices et non-réductrices (en présence ou en l'absence de 9-mercaptoéthanol) comme décrit dans la littérature (laemmli, Nature 227, 680-685 l 1970 l). D Expression du KL soluble troncué à l'extrémité amino terminale 1 Préparation de plasmide m K Lp M 10 codant pour du KL soluble tronqué à l'extrémité amino terminale On a produit du KL soluble tronqué à l'extrémité amino terminale par ACP en utilisant l'amorce 5 ': 5 '- GGTATTTGTCGTAACCGTGT-3 ' La séquence de l'amorce 3 ' utilisée était 5 '-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3 ' Les conditions de l'ACP étaient de 20 cycles avec 1 minute de dénaturation à 95 C, 1 minute de annelage à 52 C et une extension de 2 minutes à 72 C L'amplicon de cette réaction d'ACP (K Lh 2-164) a à nouveau été purifié sur du LMA traité avec de l'ADN polymérase de Klenow et tous les 4 nucléotides et a ensuite été kinasé Le fragment a ensuite été digéré avec Hind II et purifié au moyen de LMA, traité avec de l'ADN polymérase de Klenow et ensuite kinasé L'amplicon a ensuite été digéré avec Hind III et à nouveau purifié au moyen de LMA. Du plasmide p OC 56/RBSII, Nco I contenant un insert de calbindine D 9 entre le site Nco I et le site Hind III a été digéré avec Nco I et la saillie résultante a été comblée avec de 1 'ADN polymérase de Klenow Après purification le vecteur linéarisé a en outre été digéré avec Hind III et traité avec de la phosphatase alcaline Le squelette du vecteur a à nouveau été purifié au moyen d'une électrophorèse sur gel de LMA. Le fragment d'ACP codant pour le K Lh 2-164 a ensuite été ligaturé dans ce vecteur Le plasmide résultant a été désigné m K Lp M 10, codant pour un KL soluble avec les acides aminés Met-2-164 (M 10) La séquence d'acides aminés de ce KL soluble est indiquée dans la figure 5 dans le code à une lettre. 2 Expression de KL soluble tronqué à l'extrémité amino terminale dans E coli Des cellules M 15 d'E coli contenant le plasmide p REP 4 ont été transformées avec du plasmide m K Lp M 10 Les cellules ont été cultivées dans du milieu TB ( 12 g/l de bactotryptone, 24 g/l d'extrait de levure, 4 ml/l de glycérol, KH 2 PO 4 0,017 M et K 2 HPO 4 0,072 M) contenant 100 mg/l d'ampicilline et 25 mg/l de kanamycine A une densité optique à 600 nm d'environ 0,6 à 1,0 on a ajouté de i'IPTG à une concentration finale de 2 m M Après avoir poursuivi la croissance de la culture pendant encore 2,5 à 5 h à 370 C on a récolté les cellules par centrifugation la présence de KL soluble a été révélée par SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodim) dans des conditions réductrices et non-réductrices (en présence ou en l'absence de 9-mercaptoéthanol) comme décrit dans la littérature (Laemmli, supra). Exem Dle 2 px Dression de KL solubles dans des cellules de mammifères A Préparation de fracments codant Dour du KL soluble et fraqments de celuici On a obtenu des fragments contenant différentes longueurs de KL en utilisant la réaction d'amplification en chaîne par polymérase, en abrégé "ACP" (Saiki et al. 1985, Science 230, 1350-1354 l 1985 l) L'ACP est fondée sur l'amplification enzymatique d'un fragment d'ADN Deux amorces oligonucléotidiques qui sont orientées avec leurs extrémités 3 ' pointant l'une vers l'autre son hybridées sur des brins opposés de la qéquence cible Des cycles répétés de dénaturation thermique de la matrice, un annelage des amorces à leurs séquences complémentaires et une extension des amorces annelées avec une ADN polymérase ont pour résultat l'amplification du segment défini par les extrémités 5 ' des amorces d'ACP L'addition de sites d'enzyme de restriction à l'extrémité 5 ' de chaque amorce facilite le clonage du produit final d'ACP (Scharf et al, Science 33, 1076-1078 l 1986 l). Les oligonucléotides suivants ont été utilisés pour amplifier des fragments d'ADN codant pour différentes longueurs de KL: a Amorce 5 ' 5 '-CCAAGTTTGTTCAACATGAAGAAGACACAAACTTGGATTC-3 ' b amorce 3 ' fragment A (KL total) 5 '-CCGGATCCTT&CACTTCTTGAAACTCTCTCTCTT fragment B (dernier acide aminé: Ala 164) 'GGCGGATCCTTATCATGCAACAGGGGGTAACATAAATGG fragment C (dernier acide aminé: Val 140) 'CCCGGATCCTTAAACCACACAATCACTAGTTTCAGATG Les fragments amplifiés ont été isolés à partir d'un gel dd'agarose au moyen d'un kit "Geneclean" du commerce (BIO 101 Inc, La Jolla, Ca, USA) Les fragments ont ensuite été digérés avec les endonucléases Hind III et Bam HI (les sites de restriction dans les amorces sont soulignés) et ensuite purifiés à nouveau comme décrit plus haut Cela a donné le fragment A codant pour le KL total, avec la séquence d'acides aminés: + 26 + 76 + 126 + 176 + 226 MKKTQTWILT CIYLQLLLFN PLVKTEGICR NRVTNNVKDV TKLVANLPKD YMITLKYVPG MDVLPSHCWI SEMVVQLSDS LTDLLDKFSN ISEGLSNYSI IDKLVNIVDD LVECVKENSS KDLKKSFKSP EPRLFTPEEF FRIFNRSIDA FKDFWVVASET SDCWSSTLS PEKDSRVSVT KPFMLPPVAA SSLRNDSSSS NRKAKNPPGD SSLHWAAMAL PALFSLIIGF AFGALYWKKR QPSLTRAVEN IQINEEDNEI SMLQEKEREF QEV, le fragment B codant pour la séquence d'acides aminés: + 26 + 76 + 126 MKKTQTWILT CIYLQLLLFN PLVKTEGICR NRVTNNVKDV TKLVANLPKD YMITLKYVPG MDVLPSHCWI SEMVVQLSDS LTDLLDKFSN ISEGLSNYSI IDKLVNIVDD LVECVKENSS KDLKKSFKSP EPRLFTPEEF FRIFNRSIDA FKDFWVVASET SDCVVSSTLS PEKDSRVSVT KPFMLPPVA (résidus d'zacices-aai 25 to 164), et le fragment C codant pour la séquence dd'acides aminés: MKKTQTWILT CIYLQLLLFN PLVKTEGICR NRVTNNVKDV TKLVANLPKD + 26 YMITLKYVPG MDVLPSHCWI SEMVVQLSDS LTDLLDKFSN ISEGLSNYSI * 5 76 IDKLVNIVDD LVECVKENSS KDLKKSFKSP EPRLFTPEEF FRIFNRSIDA + 126 FKDFVVASET SDCVV (résidus d'acides aminés 25 to 140), Tous les fragments amplifiés contiennent le codon d'initiation traductionnel authentique du KL, ATG (voir amorce 5 '), précédé par 9 nucléotides dérivés du gène de préproinsuline de rat Un codon d'arrêt traductionnel (TAA) a été inséré dans l'ossature derrière le dernier acide aminé de tous les édifices, suivi par un site de reconnaissance pour l'endonucléase de restriction Bam HI (indiqué dans les trois amorces 3 ' par TTA du fait de l'orientation). B PréDaration de fraaments de vecteur 1 plasmide p K 21 Le plasmide p K 21 contient le promoteur fort de la longue répétition terminale (LTR) du virus du sarcome de Rous suivi par une région lieuse multisite ayant la séquence suivante: ' AAGCTTGGCCAGGATCCAGCTGACTGACTGATCGCGAGATC 3 ' 3 ' TTCGAACCGGTCCTAGGTCGACTGACTGACTAGCGCTCTAG 5 ' qui permet 1 'intégration de gènes intéressants derrière les sites de clonage des gènes, le plasmide contient l'intron 3 ', le site de polyadénylation et le signal de terminaison du gène de préproinsuline du rat. Des cellules HB 101 d'E coli transformées avec le plasmide p K 21 ont été déposées à la Deutsche Sammlung von Mikroorganismende Braunschqeig le 17 juin 1991, conformé- ment au Traité de Budapest lE coli HB 101 (p K 21), DSM No. 6571 l. 2 Préparation du fragment de vecteur V 1 Le plasmide p K 21 a été digéré avec Hind III et Bam HI et ensuite traité avec de la phosphatase alcaline d'intestin de veau pour éliminer les phosphates des extrémités 5 ' des fragments d'ADN Le vecteur déphosphorylé (Vl) a ensuite été isolé à partir d'un gel d'agarose comme décrit plus haut. C Préparation de Dlasmides codant Dour le KL soluble et des fragments de celui-ci Chacun des fragments A, B et C a été ligaturé avec le fragment de vecteur Vl. Les cellules HB 101 d'E coli ont ensuite été transformées et les transformants contenant les fragments A, B et C ont été identifiés par cartographie de l'enzyme de restriction et séquençage Les plasmides résultants ont été désignés p N 298, p N 300 et p N 301. D PréDaration de Dlasmides d'ex Dression 1 Préparation des cassettes d'expression Les cassettes d'expression contenant le promoteur de RSVfort, les gènes de KL modifiés, l'intron 3 ' et le signal poly A du gène de préproinsuline de rat ont été chacun isolés par coupure des plasmides p N 298, p N 300 et p N 301 avec les enzymes de restrivtion Xho I et Xba I Les extrémités en saillie ont ensuite été remplies avec de l'enzyme de Klenow à l'aide de conditions standard On a pour finir isolé les trois fragments comme décrit plus haut et obtenu ainsi les fragments A' (KL total), fragment B' (acides aminés -25 à 164) et fragment C' (acides aminés -25 à 140). 2 Préparation du fragment vecteur V 2 Le plasmide DSV 2-DHFR (pouwels et al dans "Cloning Vectors A laboratory Manual", Elsevier, Amsterdam New York Oxford l 1988 l) a été linéarisé avec l'enzyme de restriction Pvu II et ensuite traité avec de la phosphatase alcaline d'intestin de veau Le vecteur déphosphorylé (V 2) a ensuite été isolé à partir d'un gel d'agarose comme décrit plus haut Chacun des fragments A', B', C' a ensuite été ligaturé avec le vecteur V 2. On a ensuite transformé des cellules HB 101 d'E coli Les transformants contenant les cassettes d'expression ont été identifiés par analyse à l'enzyme de restriction et séquençage On n'a utilisé pour la suite des études que les clones dans lesquels les fragments A', B' et C' sont transcrits dans la même orientation que le gène dhfr On les a désignés par p N 298 ' (contenant le fragment A'), p N 300 ' (contenant le fragment B') et p N 301 ' (contenant le fragment C') On a rejeté les clones ayant les cassettes d'expression intégrées dans l'autre orientation. E Ex Dression de KL dans des cellules CO 51 transfectées On a transfecté des cellules CO 51 (ATCC CRL 1650) avec de la lipofectine (Felgner et al, PNAS USA 84, 7413- 7414 l 1987 l) Après trois joursen culture les surnageants ont été récoltés par centrifugation ( 10 minutes à 12000 tours/minute) et analysés pour l'expression du KL comme décrit dans l'exemple 5 A On a employé comme témoin des cellules CO 51 transfectées avec des plasmides p SV 2-dhfr et p K 21, o n'était pas intégré de gène ou de fragment de celui-ci. Tableau 1 Inhibition de la liaison (Surnageants de cellules CO 51) Plasmide p K 21 p SV 2-dhffr p N 298 ' p N 300 ' p N 301 ' (témoin négatif) (témoin négatif) (total) (fragment B) (fragment C) KL purifié ( 1,3 gg/ml, témoin positif) 2448/2422 Toutes les cellules transfectées avec des plasmides exprimant du KL ou des fragments de celui-ci présentent une activité de liaison dans les surnageants. Exem Dle 3 Purification de KL recombinant exorimé dans E coli On a effectué l'expression de KL humain soluble total (K Lh 1-164) dans E coli 294 conformément à l'exemple l B 150 g de pâte cellulaire congelée ont été mis en suspension dans 1050 ml de chlorhydrate de guanidinium 8 M Tris 50 m M Na H 2 PO 4 20 m M 2 % de Tween-20 (p H 5,5) cpm et agités sous azote a température ambiante Après lh le p H de la suspension a été corrigé et amené à p H 5,5 et on a poursuivi l'agitation sous azote pendant encore 5 heures. A des fins de repliage/oxydation on a ensuite dilué l'extrait sous agitation dans 28,8 1 ( 4 C) de chlorhydrate de guanidinium 0,24 M Na Cl 150 m M Na 2 HP 04 20 m M 0,1 % de Tween-20 (p H 8,0) ce qui donnait une concentration finale de 0,6 M en chlorhydrate de guanidinium Le p H a été directement ajusté à 8 La suspension a été agitée pendant 16 h à 4 C sous exposition à l'air Le produit précipité a été éliminé par filtration sur un élément filtrant Zetaplus o 10 S ( 0,35 m 2) ( 4 c). L'extrait clarifié a été analysé par RP-HPLC. L'analyse a été effectuée au moyen d'une colonne analytique Nucleosil 300-5 C 4 ( 4,5 x 30 cm; Macherey- Nagel) différentes formes de pliages ont été séparées par un gradient par paliers à partir de tampon A ( 30 % d'acétonitrile, 0,2 % d'acide trifluoroacétique) avec une vitesse d'écoulement de 1 ml/min La forme de plissage la plus importante, qui correspond à la forme biologiquement active est éluée à environ 60 % d'acétonitrile D'autres formes de plissage sont éluées à des concentrations en acétonitrile supérieures. Dans SDS-PAGE (non-réduit) la forme principale de plissage de KL obtenue par la technique de repliage/- oxydation correspond à une bande à 17000 D relative aux marqueurs protéiniques réduits, tandis que sous réduction par du mercaptoéthanol la bande était déplacée à environ 19000 D. Le rendement total en la forme renaturée et la forme active était de 448 mg selon la RP-HPLC. Le filtrat a été introduit dans une colonne "Chelating Sepharose Fast Flow" (Pharmacia, 14 cm de diamètre x 10 cm, 60 cm/h), qui avait été chargée avec des ions cuivre et était prééquilibrée avec chlorhydrate de guanidinium 0,6 M Na Cl 150 m M Na H 2 PO 4 20 m M (tampon C) 0,1 % de Tween-20 (p H 8,0) En suivant le même type d'application, on a effectué un lavage de la colonne avec 4,5 volumes de colonne de tampon C (( 60 cm/h) et 2,8 volumes de colonne de tampon D, Na H 2 PO 4 20 m M Na Cl 150 m M 0,1 % de Tween-20 (tampon D) (p H 8,0) suivi d'un lavage utilisant un mélange de 25 % de tampon D et 75 % de tampon E, CH 3 COOH 50 m M Na Cl 50 m M (tampon E) 0,1 % de Tween-20 ajusté avec Na OH à p H 3,0 On a ensuite utilisé un gradient de 25 % de tampon D/75 % de tampon E à 70 % de tampon D/30 % de tampon E pendant 4 heutres 42 minutes pour l'élution de la protéine ( 30 cm/h), qui s'élue entre p H 4,9 et 4,2 Les fractions considérées comme contenant le KL ont été directement ajustées à p H 7 et des échantillons ont été analysés par SDS-PAGE (non-réduit et réduit) et par RP-HPLC. En utilisant cette technique d'élution à gradient de p H il était possible de séparer la forme active de formes mal repliées, tandis qu'on pouvait aussi séparer la majeure partie du produit dimère (masse moléculaire apparente en SDS-PAGE: 35-38 k D) Le rendement était de 363 mg conformément à la RP-HPLC. Les fractions réunies issues de chromatographie au chélate de cuivre ( 5, 0 1) ont été diluées à l'eau jusqu'à 14 1 ( 4 C), le p H a été ajusté à 7 et la solution protéinique a été introduite dans une colonne Q- Sepharose Fast Flow (Pharmacia, 7 cm de diamètre x 16 cm, à vitesse dd'écoulement de 115 cm/h). La colonne a été lavée par 10 volumes de colonne de tris/H Cl 20 m M, p H 7,0 (tampon F), et la protéine a été éluée selon un gradient par paliers de 100 % de tampon F à Tris/H Cl 20 m M, Na Cl 0,5 M, p H 7,0 (tampon G) La vitesse d'écoulement était de 40 cm/h. Le KL s'éluait entre 22 et 24 % de tampon G Les fractions éluées ont été analysées par SDS-PAGE non-réduit et réduit et RP-HPLC Le rendement était de 262 mg. Les fractions contenant du KL pur ( 1250 ml) ont été concentrées jusqu'à 220 ml par un système d'ultrafiltration Minitan utilisant 4 cassettes de PTGC (Millipore) Le volume a encore été réduit par une cellule d'agitation dotée d'une membrane Amicon YM 10 Le volume final était de 38 ml. Des portions de 3 ml de la solution concentrée ont été introduites dans une colonne Superdex 75 de qualité pour préparation (Pharmacia, 2,6 cm de diamètre x 60 cm, 30 cm/h) Les fractions éluées ont été caractérisées par SDS-PAGE (non-réduit et réduit)et RP-HPLC La réunion des fractions de 12 séries avait une pureté supérieure à 98 % selon le SDS-PAGE non-réduit, supérieure à 98 % selon le SDS-PAGE réduit et de 97 % selon la RP-HPLC Le rendement final était de 138 mg de K Lh 1-164. Exem Dle 4 Activité du KL soluble total et des KL solubles tronqués M 2, M 5, M 7 et M 10 A Radioliqand liant à une licnée celulaire de leucémie monomvélocvtaire humaine Un tube en polypropylène de 10 ml a été revêtu au fond du tube avec 50 kg d'IODO-GEN (Pierce, Rockford, IL, USA, No de cat 28600) 50 gl d'une solution à 1 mg/ml dans le chloroforme ont été séchés sous un courant faible d'azote, tandis qu'on faisait tourner le tube Une solution de 6 kg de KL dans 600 g 1 de solution saline tamponnée au phosphate, p H 7,2 (PBS) a été ajoutée dans le tube et refroidie sur de la glace 10 g 1 d'une solution de Iodure de sodium (Amersham UK, No de cat IMS 30) ont été ajoutés Le tube a été maintenu en rotation sur de la glace pendant 10 min La solution a été transférée au sommet d'une colonne de gel (Bio-Rad, Richmond, CA, USA: Econo-Pac 10 DG), qui avait été préalablement équilibrée avec une solution d'albumine sérique bovine à 1 % (Sigma St Louis, MO, USA: Fraction V, No de Catalogue 14503) dans le PBS et soumise à un lavage poussé avec du PBS On a fait fonctionner la colonne sous gravité avec du PBS à température ambiante et les fractions de volume vide contenant la protéine radioiodée ont été détectées au moyen d'un détecteur de rayonnement gamma Les fractions contenant la radioactivité associées avec le volume vide ont été collectées ( 3,0 ml), et 0,5 ml d'une solution à 1 % de BSA dans le PBS a été ajouté La radioactivité spécifique était de 55000 cpm/gl, 95 % de la radioactivité étant précipitables par un acide On a prélevé des parties aliquotes de la solution de 125 I-KL et on les a congelées à -80 C jusqu'à utilisation. On a maintenu des cellules HEL 92 1 7 (No d'accès ATCC TIB 180) dans du milieu RPM 11640 (GIBCO Grand Island, NY, USA) avec 1:100 de glutamine et 1:100 de pénicilline/streptomycine (toutes deux de la société GIBCO) et 10 % de sérum de cheval (KC Biological, Lanexa, KS, USA). Les cellules cultivées sous une forte densité ( 2 x 105/ml) ont été lavées avec du PBS froid Pour l'essai de fixation, le milieu de croissance pour les cellules HEL 92 1 7 a été complété avec 1:100 de HEPES (GIBCO), 0,05 % d'azide de sodium (Fluka, Buchs/Suisse) et les échantillons de protéines de KL concurrentes aux concentrations indiquées (Fig 1) On a ajouté du 125 I-KL à 8 x 105 cpm/ml 2 x 106 cellules HEL 92 1 7 ont été incubées pendant 2 heures sur de la glace humide avec 0,5 ml de milieu contenant du 125 I-KL et un tube en plastique de 4,5 ml (falcon) On a fait passer la suspension cellulaire à travers un filtre de 5 mm (Millipore, Bedford, MA, USA: No de catalogue SVLP 02500) préhumidifié avec 1 % de BSA dans du PBS Les cellules ont été lavées sur le filtre avec 2 x 10 ml de PBS à 4 C La radioactivité liée au filtre a été mesurée dans un compteur de rayonnement gamma (Kontron Gammamatic) Toutes les expériences ont été faites en triple Les résultats de ces expériences sont indiqués sur la Fig 6. B Essai de Drolifération sur celllules de TF-1 On a maintenu des cellules de TF-1 (T Kitamura et al., J Cell Physiol 140: 323-334 l 19891) dans du RPM 1640 (GIBCO) avec 1:100 de glutamine et 1:100 de pénicilline/streptomycine (toutes deux de la société GIBCO), complété avec 10 % de sérum bovin foetal (Flow Laboratories, Irvine/Ecosse), 100 U/ml d'IL-3 recombinant humain (Genzyme, Cambridge, MA, USA: No de catalogue HIL- 3 C) et 0,4 U/ml d'érythropoïétine recombinante humaine (Boehringer Mannheim/Allemagne: No de catalogue 1 120 166) Les cellules ont été lavées une fois avec du PBS et mises en suspension dans un milieu de culture complet sans IL-3 et érythropoïétine Les cellules ont été déposées sur une plaque de culture de tissus à 96 alvéoles (Costar) à raison 104 cellules dans 200 gl/alvéole en mélange avec de la protéine de KL aux concentrations indiquées (Fig 2). Les cellules ont été cultivées pendant 48 heures, de la 3 H-thymidine (Amersham, No de catalogue TRA 120) a été ajoutée ( 25 gl/alvéole du stock dilué à 1:25 dans le milieu de culture) et on a incubé pendant encore 3 heures. Les cellules ont été récoltées au moyen d'un récolteur de cellules (LKBWallac 1295-001) et on a mesuré l'incorporation de la 3 H-thymidine dans un lecteur de rayonnement bêta (LKB-Wallac 1205) Toutes les expériences ont été faites en triple Les résultats de ces expériences sont indiqués dans la figure 7. C Essai de formation de colonie de moelle osseuse humaine On a dilué 3 ml de moelle osseuse humaine normale avec 6 ml de PBS à 15 C et on a étalé sur 2 x 3 ml de ficoll (LSM de la société Litton Bionetics, Charleston, SC, USA) dans deux tubes de 14 ml Les tubes ont été centrifugés pendant 20 minutes à 500 x g et 15 C Les cellules à l'interface ont été recueillies et lavées trois fois avec du PBS ( 1 x 45 ml et 2 x 12 ml) à 15 C Les cellules ont été remises en suspension à raison de 6,5 x 105 cellules/ml dans du millieu de dilution (GIBCO, No de catalogue 3826 SA: Kit de prolifération de cellules souches de moelle osseuse humaine) avec 6 U/ml d'érythropoiétine humaine (GIBCO, No de catalogue 3826 SA: Kit de prolifération de cellules souches de moelle osseuse humaine) 200 g 1 de la suspension de cellules ont été mélangés avec 20 g 1 des échantillons de KL dans le milieu de dilution ou de milieu de dilution seul dans un tube de 10 ml 2 ml de milieu de croissance (GIBCO, No de catalogue 3826 SA: Kit de prolifération de cellules souches de moelle osseuse humaine) ont été ajoutés au moyen d'une seringue de 2 mi. On a soumis la suspension à un vortex pendant 5 x 15 secondes pour assurer un mélange complet On a aspiré 2 ml de la suspension en utilisant une seringue de 2 ml et on a réparti uniformément sur le fond d'une alvéole dans un ensemble pour culture de tissus C 6 (Costar) On a protégé l'ensemble contre l'évaporation avec un film de Saran Wrap et on a maintenu dans l'incubateur ( 5 % de C 02, 370 C) sans perturbation Après 14 jours le nombre de colonies dans chaque alvéole a été évalué sous microscope par deux expérimentateurs indépendants Les nombres de colonies au 14 ème jour (BFU-e et CFU-GMM) formées à partir de cellules de moelle osseuse humaine en présence d'érythropolétine et de protéines de Kl sont indiqués dans le tableau 2 ci- dessous: Tableau 2: Essai de formation de colonie de moelle osseuse humaine Concentration ng/ml BFU-e CFU-GMM KL soluble 51,7 61 62 total 17,2 46 36 ,7 24 25 1,9 18 18 0,6 4 6 0 2 6 M 2 118,8 62 2 39,6 65 23 13,2 43 M 5 M 7 4,4 1,5 o O 91,9 ,6 ,2 3,4 1,1 i o 123,3 41,1 13,7 4,6 1,5 o 93, 2 31,1 ,4 3,5 1,2 o O M 1 O REVENDICATIONS 1 Ligand de Kit (kit Ligand) soluble de formule X-Y-CRNRVTNNVKDVTKLVANLPKDYMITLKYVPGMDVLPSHCWISE MVQLSDSLTDLLDKFSNISEGLSNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENSSKDL KKSFKSPEPR Ln'ri i:E:F 1 IFNRSIDAFKDFVVASETSDC-Z o X est la méthionine ou l'hydrogène et Y est I GI, ou EGI, et Z est V, VV, VVS, vvs, vvss,, VVSST, WVVSSTL, WVVSSTLS, VVSSTLSP, VVSSTLSPE, VVSSTLSPEKD, WVVSSTLSPEKDS, VVSSTLSPEKDSR, VVSSTLSPEKDSRV, VVSSTLSPEKDSRVS, WVVSSTLSPEKDSRVSV, WVVSSTLSPEKDSRVSVT, VVSSTLSPEKDSRVSVTK, WVVSSTLSPEKDSRVS Vf TKPF, VVSSTLSPEKDSRVSV'r 1 i FIM, VVSSTLSPEKDSRVSV'T Ktl FMLPPV, ou hydroxy ou dans laquelle X est la méthionine ou l'hydrogène, Y est I ou GI, et Zest V VV, VVS, VVSS, VVSST, VVSSTL, WVVSSTLS, WVVSSTLSP, VVSSTLSPE, VVSSTLSPEK, VVSSTLSPEKD, WVVSSTLSPEKDS, VVSSTLSPEKDSR, VVSSTLSPEKDSRV, VVSSTLSPEKDSRVS, VVSSTLSPEKDSRVSV, VVSSTLSPEKDSRVSVT, VVSSTLSPEKDSRVSVTK, VVSSTLSPEKDSRVSVTKP, WVVSSTLSPEKDSR Vs VT'KL' VVSSTLSPEKDSRVSV'TKPFMLPPV, VVSSTLSPEKDSRVSVT Kk'F'K MLPPVA, ou hydroxy. 2 Kit Ligand soluble selon la revendication 1, dans lequel X est la méthionine, Y est EGI et Z est VVS, VVSSTL, VVSSTLSPE, WVVSSTLSPEKDS, VVSSTLSPEKDSRVS, VVSSTLSPEKDSRVSVTK, VVSSTLSPEKDSRVSV'T Kkl-'M,ou hydroxy. 3 Kit Ligand soluble selon la revendication 1, dans lequel X est la méthionine, Y est GI et Z est VVSSTLSPEKDSRVSVTKPFMLPPVA. 4 Kit Ligand soluble selon l'une des reven- dications 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il est une protéine M 1, M 2, M 3, M 4, MS, M 6, M 7, M 8 ou M 10. 5 Séquence d'ADN codant pour un Kit Ligand solu- ble selon l'une quelconque des revendications i à 4. 6 Vecteur d'expression comprenant une séquence d'ADN selon la revendication 5 et capable de diriger l'expression de la séquence d'ADN dans une cellule hôte compatible, procaryote ou de mammifère. 7 Cellule hôte procaryote ou de m Ammifère trans- formée avec un vecteur d'expression selon la revendication 6. 8 Cellule hôte procaryote, de préférence cellule d'E coli, transformée avec un vecteur d'expression selon la revendication 6. 9 Cellule hôte de mammifère, de préférence cellule COS, transformée avec un vecteur d'expression selon la revendication 6. 10 Méthode pour la production d'un Kit Ligand soluble selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant la culture d'une cellule hôte transformée procaryote ou de mammifère dans un milieu approprié de façon à ce que ledit Kit Ligand soit exprimé et la purification et le repliage du dit Kit Ligand. 11 Kit Ligand soluble selon l'une quelconque des revendications 1-4 comme agent à activité thérapeutique. 12 Kit Ligand soluble selon l'une quelconque des revendications 1-4 comme agent à activité thérapeutique pour le traitement d'affections hématopoïétiques et pour l'amélioration de la récupération hématopoïétique après radio et chimiothérapie chez les patients cancéreux. 13 Composition pharmaceutique comprenant un Kit Ligand soluble selon l'une quelconque des revendications 1-4 et un produit support pharmaceutiquement acceptable compatible. 14 Utilisation d'un Kit Ligand soluble selon l'une quelconque des revendications 1-4 pour la prépara- tion de compositions pharmaceutiques. 15 Utilisation d'un Kit Ligand soluble selon l'une quelconque des revendications 1-4 pour la prépara- tion de compositions pharmaceutiques pour le traitement des affections hématopoïétiques et pour l'amélioration de la récupération hématopoïétique après radio et chimiothérapie chez les patients cancéreux. 16 Utilisation d'un Kit Ligand soluble selon l'une quelconque des revendications 1-4 pour l'identification d'agonistes ou d'antagonistes de kit-c. 17 Anticorps poly et/ou monoclonaux élevés contre un Kit Ligand soluble selon l'une quelconque des revendications 1-4.