FR 2680518 A1 19930226 FR 9110476 A 19910821 La présente invention concerne le domaine de la biologie moléculaire Plus particulièrement, elle concerne une nouvelle séquence d'ADN présentant une activité de promoteur transcriptionnel, des vecteurs d'expression contenant cette séquence, et son utilisation pour la production de protéines recombinantes, et par exemple de protéines hétérologues L'invention concerne aussi les cellules recombinées contenant cette séquence d'ADN. Les progrès accomplis dans le domaine de la biologie moléculaire ont permis de modifier des microorganismes pour leur faire produire des protéines hétérologues En particulier, de nombreuses études génétiques ont porté sur la bactérie E coli Toutefois, l'application industrielle de ces nouveaux modes de production est encore limitée, en particulier par les problèmes d'efficacité d'expression des gènes dans ces microorganismes recombinés Aussi, dans le but d'augmenter les performances de ces systèmes de production, des recherches ont été effectuées afin d'isoler des promoteurs forts, permettant d'obtenir des niveaux élevés d'expression de protéines hétérologues Chez E coli, on peut citer en particulier les promoteurs des opérons tryptophane et lactose. Plus récemment, chez la levure S cerevisiae, des études ont porté sur des promoteurs dérivés de gènes impliqués dans la glycolyse On peut citer notamment les travaux sur le promoteur du gène de la 3- phosphoglycérate kinase PGK (Dobson et al, Nucleic Acid Res 10 1982, 2625; Hitzeman et ai, Nucleic Acid Research 1982, 7791), sur celui du gène de la glyceraldéhyde-3-phosphate deshydrogénase GAPDH (Holland et al, J.Biol Chem 254 1979, 9839; Musti et al, Gene 2, 1983, 133), sur celui du gène de l'alcool deshydrogénase 1 ADH 1 (Bennentzen et al, J Biol Chem. 257, 1982, 3018; Denis et al, J Biol Chem 2, 1983, 1165), ou sur celui du gène de l'enolase 1 ENO 1 (Uemura et al, Gene 45, 1986, 65). Récemment, des outils génétiques ont été développés afin de se servir de la levure Kluyveromyces comme cellule hôte pour la production de protéines recombinantes La mise en évidence d'un plasmide de type 2- micron originaire de K drosophilarum (plasmide p K Dl EP 241 435) a permis d'établir un système hôte/vecteur très efficace pour la production de protéines recombinantes (EP 361 991) Cependant, -2 - les promoteurs utilisés dans ce système n'ont jamais été optimisés En particulier, il s'agit essentiellement de promoteurs hétérologues, c'està- dire provenant d'autres microorganismes, tel que notamment S. cerevisiae Cette situation peut engendrer différents inconvénients, et notamment limiter l'activité du promoteur à cause de l'absence de certains éléments de la machinerie transcriptionnelle (par exemple de trans-activateurs), présenter une certaine toxicité pour la cellule hôte due à une absence de régulation, ou affecter la stabilité du vecteur. Dans ces conditions, le manque de promoteurs homologues forts chez Kluyveromyces constitue un facteur limitant dans l'exploitation industrielle de ce système d'expression. La Demanderesse a maintenant identifié, cloné et séquencé une région du génome de Kluyveromyces lactis présentant une activité de promoteur transcriptionnel (voir figure 1) Plus précisément, cette région correspond au promoteur du gène ADH 4 de K lactis (KIADH 4) codant pour l'alcool déshydrogénase IV Cette région, ou des dérivés ou fragments de celle-ci, peut être utilisée de manière très performante pour la production de protéines recombinantes chez les levures du genre Kluyveromyces Il est entendu que cette séquence peut également être utilisée dans d'autres organismes hôtes. Par ailleurs, l'analyse de la région du génome de Kluyveromyces obtenue a permis de mettre en évidence une activité promotrice bidirectionnelle Cette observation indique que le brin complémentaire de la région présentée sur la figure 1 possède également une activité promotrice agissant dans l'autre orientation. De plus, un autre avantage de l'activité promotrice obtenue réside dans son caractère régulable De ce fait, selon les conditions d'utilisation (milieu, souche), il est possible de contrôler l'activité du promoteur, et donc de déclencher ou de réprimer l'expression d'un gène recombiné. Un autre avantage de la région promotrice obtenue réside dans l'absence de répression par le glucose Ce résultat est surprenant puisqu'il s'agit du premier exemple de promoteur dérivé d'un gène ADH induit par l'éthanol et non réprimé par le glucose En effet, dans le cas de S. cerevisiae, le gène ADH 2 est exprimé sur différentes sources de carbone non fermentescibles (glycérol, éthanol, lactate, pyruvate), mais, -3 - contrairement à Kl ADH 4, l'expression de ce gène est très fortement réprimée lorsque du glucose est ajouté au milieu (Denis et al, J Mol Biol. 148 ( 1981) 355) De même, l'expression du gène alc A qui code pour une alcool deshydrogénase I chez Aspergillus nidulans est induite par l'éthanol, mais sensible à la répression par le glucose (Falenbok, J.Biotechnol 17 ( 1991) 11). Un objet de la présente invention réside donc dans une séquence d'ADN comprenant tout ou partie de la séquence présentée à la figure 1 ou de son brin complémentaire, ou d'un dérivé de celles-ci, et possédant une activité de promoteur transcriptionnel. Au sens de la présente invention, on entend par dérivé, toute séquence obtenue à partir de la séquence donnée dans la figure 1 par modifications structurales (mutations, délétions, substitutions, additions, fragmentations) conservant une activité de promoteur En particulier, les mutations peuvent porter sur un ou plusieurs nucléotides, et les additions et/ou substitutions peuvent porter sur des éléments de régulation, ou des régions activatrices telles que les "UAS". Lorsqu'un dérivé est réalisé, son activité de promoteur transcriptionnel peut être mise en évidence de plusieurs façons, et en particulier en plaçant sous le contrôle de la séquence étudiée, un gène de résistance ou un marqueur de complémentation Toute autre technique connue de l'homme de l'art peut bien évidemment être utilisée à cet effet. Comme exemples de dérivés selon l'invention, on peut citer plus particulièrement un promoteur comprenant le fragment Sac I-Bam HI de 500 pb environ dont la séquence est présentée sur la figure 2 ou un fragment Sal J-Hind III de 700 pb environ dont la séquence est présentée sur la figure 3, ou le fragment Bg III-Sac I de 700 pb environ correspondant au fragment compris entre les nucléotides 1 et 723 du brin complémentaire de la séquence présentée sur la figure 1. La construction de ces promoteurs est décrite en détail dans les exemples. La séquence présentée sur la figure 1 a été obtenue à partir d'un fragment Bam HI de 8 kb environ, obtenu par criblage d'une banque d'ADN génomique total de Kluyveromyces lactis au moyen d'une sonde -4 - hétérologue provenant du gène de structure ADH 2 de S cerevisiae La Demanderesse a en effet montré qu'il est possible de cloner une région promotrice chez Kluyveromyces, par hybridation à partir de sondes hétérologues correspondant à un gène de S cerevisiae Les détails du clonage de la séquence sont donnés dans les exemples Les dérivés selon l'invention peuvent ensuite être préparés à partir de ces séquences, comme indiqué dans les exemples. Un autre objet de l'invention concerne un ADN recombinant comprenant une séquence d'ADN telle que définie ci-dessus. Cet ADN recombinant peut contenir par exemple la séquence promotrice présentée à la figure 1 ou un dérivé de celle-ci, dans laquelle est inséré un site de restriction, facilitant l'utilisation de cette séquence comme promoteur "portable". Préférentiellement, cet ADN recombinant contient en outre un ou plusieurs gènes de structure En particulier, il peut s'agir de gènes codant pour des protéines d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire A titre d'exemple, on peut citer les enzymes (tels que notamment la superoxide dismutase, la catalase, les amylases, les lipases, les amidases, la chymosine etc), les dérivés sanguins (tels que la sérum-albumine, l'alpha ou la béta- globine, le facteur VIII, le facteur IX, le facteur de von Willebrand, la fibronectine, l'alpha-i antitrypsine etc), l'insuline et ses variants, les lymphokines (telles que les interleukines, les interférons, les facteurs de stimulation des colonies lG-CSF, GM-CSF, M-CSF l, le TNF, le TRF etc), les facteurs de croissance (tels que l'hormone de croissance, l'érythro- poiétine, le FGF, l'EGF, le PDGF, le TGF etc), les apolipoprotéines, des polypeptides antigéniques pour la réalisation de vaccins (hépatite, cyto- mégalovirus, Eppstein-Barr, herpes etc), ou encore des fusions de poly- peptides telles que notamment des fusions comportant une partie active fusionnée à une partie stabilisatrice (par exemple des fusions entre l'albumine ou des fragments d'albumine et le récepteur ou une partie d'un récepteur de virus lCD 4, etc D. Encore plus préférentiellement, l'ADN recombinant contient également des signaux permettant la sécrétion du produit d'expression du ou desdits gènes de structure Ces signaux peuvent correspondre aux -5- signaux naturels de sécrétion de la protéine considérée, mais ils peuvent également être d'une origine différente En particulier des signaux de sécrétion dérivés de gènes de levure peuvent être utilisés, tels que ceux des gènes de la toxine killer (Stark et Boyd, EMBO J 5 ( 1986) 1995) ou de la phéromone alpha (Kurjan et Herskowitz, Cell 30 ( 1982) 933; Brake et al, Yeast 4 ( 1988) 5436). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'ADN recombinant fait partie d'un plasmide d'expression, qui peut être à réplication autonome ou intégratif. En particulier, des vecteurs à réplication autonome peuvent être obtenus en utilisant des séquences à réplication autonomes chez l'hôte choisi Notamment, chez la levure, il peut s'agir d'origines de réplication dérivées de plasmides (p KD 1, 2 g, etc), ou bien de séquences chromo- somiques (ARS). Les vecteurs intégratifs peuvent être obtenus notamment en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur. Un autre objet de l'invention concerne les cellules recombinées contenant une séquence d'ADN telle que définie ci-avant. Avantageusement, les cellules sont choisies parmi les levures, et encore plus préférentiellement, parmi les levures du genre Kluyveromyces i est entendu cependant que l'invention couvre toutes les cellules recombinées dans lesquelles les régions promotrices de l'invention sont actives. Ces cellules peuvent être obtenues par toute méthode permettant d'introduire un ADN étranger dans une cellule l peut s'agir notamment de transformation, électroporation, ou toute autre technique connue de l'homme de l'art. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une séquence telle que précédemment définie pour l'expression de gènes recombinés. Comme l'illustrent les exemples, les séquences d'ADN selon l'invention permettent en effet une production à des niveaux élevés de protéines recombinantes. -6 - Par ailleurs, l'activité promotrice bidirectionnelle des séquences de l'invention permet une utilisation particulièrement avantageuse. Notamment, il est possible d'utiliser ces séquences pour l'expression simultanée de plusieurs gènes recombinés dans les deux orientations opposées. Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'une séquence telle que précédemment définie pour l'expression simultanée de deux gènes recombinés insérés de part et d'autre du promoteur, dans les deux orientations opposées. Avantageusement, les séquences de l'invention peuvent être utilisées pour l'expression de gènes codant pour des protéines d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire A titre d'exemple, on peut citer les protéines énumérées précédemment. La présente invention permet également la réalisation d'un procédé de production de protéines recombinantes, selon lequel on cultive une cellule recombinée telle que définie ci-avant et on récupère la protéine produite A titre d'exemple de protéine, on peut citer les protéines énumérées précédemment. Préférentiellement, le procédé de l'invention est applicable à la production de sérum-albumine humaine, ou un de ses variants moléculaires On entend par variant moléculaire de l'albumine, les variants naturels résultant du polymorphisme de l'albumine, les formes tronquées, ou toute protéine hybride à base d'albumine. Par ailleurs, un aspect particulièrement avantageux de l'invention réside dans la possibilité de réguler l'activité des promoteurs La deman- deresse a en effet montré que l'activité promotrice était spécifiquement induite par l'éthanol A cet effet, l'éthanol inducteur peut soit être ajouté directement au milieu de culture, soit être produit intracellulairement par la souche hôte, selon ses capacités de fermentation, à partir de la source de carbone introduite dans le milieu La régulation peut donc être obtenue dans plusieurs conditions: soit en cultivant la cellule recombinée dans un milieu contenant une source carbonée différente de l'éthanol et non transformable en éthanol par la cellule Dans ce cas, l'activité du -7- promoteur est induite par addition d'éthanol dans le milieu. Par exemple, dans le cas de K lactis 2359/152 et K lactis MW 98- 8 C, le promoteur KIADH 4 est inactif lorsque les cellules sont cultivées sur un milieu contenant du glycérol, mais il est induit après addition d'éthanol. soit en cultivant, dans un milieu contenant une source carbonée fermentescible (par exemple le glucose), une cellule recombinée présentant une déficience au niveau de son métabolisme fermentatif, et de ce fait, incapable de produire de l'éthanol à partir de cette source carbonée Dans ce cas, l'activité du promoteur est induite soit par addition d'éthanol dans le milieu, soit par addition d'un autre sucre fermentescible intervenant dans une étape en aval de celle déficiente, et capable d'être métabolisé en éthanol en dépit de ladite déficience A titre d'exemple, on peut utiliser une souche présentant une mutation rag 2 et de ce fait ne possédant pas l'activité phosphoglucose isomérase Dans ce cas, le promoteur Kl ADH 4 est inactif sur milieu glucose, et l'activité du promoteur peut être induite par addition d'éthanol ou de fluctose. D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Figure 1: Figure 2: Figure 3: LEGENDE DES FIGURES Séquence nucléotidique du fragment de 1,2 kb correspondant au promoteur K 1 ADH 4 de K lactis. Séquence nucléotidique du fragment Sac I-Bam HI de 0,5 kb environ, correspondant au promoteur KIADH 4 tronqué dans le vecteur p P 4-15 Kan. Séquence nucléotidique du fragment Sal I-Hind III de 0,7 kb environ, correspondant au promoteur KIADH 4 tronqué dans les vecteurs p YG 129 et p YG 130. -8- Figure 4: Figure 5: Figure 6: Figure 7: Figure 8: Figure 9: Figure 10: Figure 11: Figure 12: Figure 13: Figure 14: Figure 15: Figure 16: Représentation schématique du plasmide p 6-4-98 et construc- tion des plasmides p 6-2200-2 et p P 4-33. Représentation schématique du plasmide p SK-Kan 401 et construction des plasmides p P 4-Kan et p P 4 R-Kan. Construction et représentation des plasmides p P 4-GUS et p SK- GUS. Représentation schématique du plasmide p Kan 707 et con- struction des dérivés du phage M 13, p YG 64 et p YG 65. Construction et représentation des plasmides p YG 69 et p YG 70. Construction et représentation du plasmide p YG 72. Représentation schématique du plasmide p YG 404 et construction du plasmide p YG 404 AH. Construction et représentation du plasmide p YG 128. Construction et représentation des plasmides p YG 131 et p YG 132. Construction et représentation des plasmides p P 4-15 Kan et p P 4-60 Kan. Construction et représentation des plasmides p YG 129 et p YG 130. Gel de polyacrylamide natif ( 5 %) coloré selon le protocole décrit dans l'exemple 7 1 2 et démontrant l'expression de l'activité 9- glucuronidase dans la souche MW 98-8 C transformée avec le plasmide p P 4-GUS (lignes 1-6 corres- pondant à 6 clones indépendants) Les résultats obtenus à partir de la souche MW 98-8 C transformée avec le plasmide p SK-GUS (témoin) sont donnés aux lignes C. Gel de polyacrylamide-SDS à 8,5 % après coloration au bleu de Coomassie démontrant la sécrétion de la sérum albumine humaine à partir de la souche MW 98-8 C transformée avec le vecteur p YG 132 Pistes a-c, albumine extrait du plasma humain (Sigma) utilisée comme standard et déposée à des concentrations croissantes ( 0,5, 1,0 et 1,5 gg par piste) Les autres pistes correspondent à 25 gl de surnageant de culture obtenus à partir des milieux décrits dans ltexemple 7 2 1 Glu, -9- Figure 17: Figure 18: Tableau 1: Tableau 2: glucose; Glu/Et OH, glucose/éthanol; Gly, glycerol; Gly/Et OH, glycerol/éthanol. Gel de polyacrylamide-SDS à 8,5 % après coloration au bleu de Coomassie démontrant la sécrétion de la sérum albumine humaine à partir de la souche CB 5293 91 transformée avec le vecteur p YG 132 Pistes a-c, albumine extrait du plasma humain (Sigma) utilisée comme standard et déposée à des concentrations croissantes ( 0,5, 1,0 et 1,5 gg par piste) Les autres pistes correspondent à 25 gl de surnageant de culture obtenus à partir des milieux décrits dans l'exemple 7 2 1 Glu, glucose; Glu/Et OH, glucose/éthanol; Gly, glycerol; Gly/Et OH, glycerol/éthanol. Gel de polyacrylamide-SDS à 8,5 % après coloration au bleu de Coomassie démontrant la sécrétion de la sérum albumine humaine à partir de la souche CB 5293 91 transformée avec le vecteur p YG 130 Pistes a-b, albumine extrait du plasma humain (Sigma) utilisée comme standard et déposée à des concentrations croissantes ( 0,5 et 1,0 gg par piste) Les autres pistes correspondent à 25 Bl de surnageant de culture obtenues à partir des milieux décrits dans l'exemple 7 2 1 Glu, glucose; Glu/Et OH, glucose/éthanol. Résumé des différentes constructions effectuées à partir du promoteur KIADH 4 entier (fragment de 1,2 kb, soit sous forme d'un fragment Bgl IIBam HI lp P 4-Kan, p P 4 R-Kan, et p P 4-GUSl, soit sous forme d'un fragment Sal I-Hind III lp YG 131 et p YG 132 l). Résumé des différentes constructions effectuées à partir du promoteur K 1 ADH 4 tronqué (fragment Sac I-Bam HI de 0,5 kb dont la séquence nucléotidique est donnée à la figure 2 lp P 4- Kanl; fragment Bgl II-Sac I de 0,7 kb correspondant aux positions 1-723 de la séquence nucléotidique donnée à la figure 1 lp P 4-60 Kanl; fragment Sal I-Hindl I de 0,67 kb dont la séquence nucléotidique est donnée à la figure 3 lp YG 129 et p YG 130 l). -10- Tableau 3: Etude de la régulation de l'expression du gène K 1 ADH 4 La présence ou absence de l'activité enzymatique ADH IV mise en évidence selon le protocol décrit dans l'exemple 5 est indiquée par les symboles + ou -. TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium - bromure d'éthidium, la digestion par les enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gel, l'électroélution des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose, la transformation dans E coli etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis et al, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y, 1986; Ausubel et al., (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York 1987). La mutagénése dirigée in vitro par oligodésoxynucléotides est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al (Nucleic Acids Res 13 ( 1985) 8749-8764) en utilisant le kit distribué par Amersham Le séquenyage de nucléotides est réalisé selon la technique des didéoxy décrite par Sanger et al (Proc Natl Acad Sci USA, 74 ( 1977) 5463- 5467). L'amplification enzymatique de fragments d'ADN spécifiques est effectuée par réaction de PCR ("Polymerase-catalyzed Chain Reaction") dans les conditions décrites par Mullis et Faloona (Meth Enzym, 155 ( 1987) 335-350) et Saiki et al (Science 230 ( 1985) 1350-1354), en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) en suivant les recom- mandations du fabricant. EXEMPLES Plasmides et souches utilisés dans les exemples. -11 - Les plasmides suivants ont servi aux différentes étapes de clonage, ou lors de la construction de vecteurs d'expression. Vecteur de remplacement Lambda-L 47: Loenen et Brammar, Gene 10 ( 1980) 249-259; Plasmide p BR 322 (Pharmacia, Uppsala, Suède); Plasmide p TZ 19 (Pharmacia, Uppsala, Suède); Plasmide p SK-Kan 401: Chen et Fukuhara, Gene 69 ( 1988) 181- 192; Plasmide p BI 221 (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA); Plasmide p BC SK +/ (Stratagène, La Jolla, CA, USA); Plasmide p YG 404 (EP 361 991); Plasmide p Kan 707 (EP 361 991); Bactériophage M 13 mp 7: Messing et al, Proc Natl Acad Sci. USA 74 ( 1977) 3652. Les souches suivantes ont été utilisées pour le clonage, la construction et l'utilisation des promoteurs de l'invention. K lactis CB 52359/152 (n CB 5289 91) K lactis MW 98-8 C (n CB 5579 88) K lactis CB 5293 91 V Isolement du promoteur K 1 ADH 4 de K lactis. La séquence présentée sur la figure 1 a été obtenue par criblage d'une banque d'ADN génomique total de Kluyveromyces lactis CB 52359/152 au moyen d'une sonde hétérologue provenant du gène ADH 2 de S cerevisiae Plus précisément, la banque a été obtenue par clonage au site Bam HI du vecteur de remplacement Lambda-L 47 du produit d'une digestion partielle par l'enzyme Sau 3 A de l'ADN de K. lactis CB 52359/152 La sonde utilisée pour l'hybridation est un fragment Eco RV- Bam HI de 980 bp comprenant la région codante du gène de structure ADH 2 de S cerevisiae, à l'exception des 70 premières pb (sonde A) Ce fragment est obtenu par digestion enzymatique à partir d'un plasmide nommé p BR 322 ADR 2 B Sa (Williamson et al, Cell 23 ( 1981) 605-614; Russell et al, J Biol Chem 258 ( 1983) 2674-2682). -12- Un fragment de 8 kb environ a ainsi été isolé et sous-cloné au site Bam HI du plasmide p BR 322 pour générer le plasmide p 6-4-98 (figure 4). L'insert Bam HI porté par ce plasmide a ensuite été cartographié au moyen d'enzymes de restriction, et la région promotrice du gène K 1 ADH 4 a été localisée sur ce fragment par hybridations différentielles en utilisant la sonde A ainsi qu'une deuxième sonde correspondant au fragment Bam HI-Eco RV de 1100 pb environ du plasmide p BR 322 ADR 2 B Sa (sonde B). Dans une seconde étape, le plasmide p 6-4-98 a été digéré par l'enzyme Hind III et un fragment de 2,2 kb a été isolé Ce fragment a ensuite été purifié par des techniques standard et sous-cloné au site Hind III du plasmide p TZ 19 pour générer le plasmide p 6-2200-2 (figure 4). L'analyse du fragment sous-cloné révèle qu'il contient les 14 premiers codons du gène K 1 ADH 4 et la région située en amont de celui-ci, comprenant les éléments de régulation de l'expression. La partie comprise entre le site Bgl II et le codon d'initiation de la traduction ATG (fragment de 1,2 kb environ) a été séquencée en utilisant la méthode de terminaison de chaine (Sanger et al, Proc Nat Acad Sci 74 ( 1977) 5463) La séquence de ce fragment est présentée sur la figure 1. 2/ Construction d'un promoteur K 1 ADH 4 portable (Bgl II-Bam HI) Un promoteur portable a été préparé par insertion sur le fragment Hind II de 2,2 kb présent sur le plasmide p 6-2200-2 d'un site de restriction Bam HI en position -16 par rapport au codon ATG du gène K 1 ADH 4. L'insertion de ce site permet de générer un fragment Bgl II-Bam HI de 1, 2 kb comprenant exclusivement la région promotrice Kl ADH 4 Elle permet également d'introduire en aval du promoteur ainsi obtenu tout gène que l'on désire exprimer. Le site Bam HI a été introduit en position -16 par rapport au site d'initiation de la traduction (ATG) du gène K 1 ADH 4 par mutagénèse dirigée en utilisant la technique de double amorce (Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab Press, 1989) La séquence des oligodésoxynucléotides synthétiques utilisés pour cette mutagénèse est donnée ci-dessous Le site Bam HI généré est -13 - souligné, I'ATG est indiqué en italiques et les astérisques désignent les bases modifiées par rapport à la séquence initiale SI = Séquence initiale; SM = Séquence modifiée. 5 '-CTCCCCCACCAACAACACAACATACAACACACGCAATGTTCAGATT-3 ' (SI) ** * '-CTCCCCCACCAACAACACAGGATCCAACACACGCAATGTTCAGATT-3 ' (SM) 3 ' -GAGGGGGTGGTTGTTGTGTCCTAGGTTGTGTGCGTTACAAGTCTAA-5 ' (SM) Le plasmide ainsi obtenu est appelé p P 4-33 (figure 4). 3/ Construction de vecteurs de clonage ou d'expression contenant le promoteur entier. Le tableau 1 rassemble les constructions décrites dans cet exemple. 3.1 Construction d'un vecteur d'expression du gène aph: L'ADN du plasmide p P 4-33 (Cf exemple 2) a été digéré par Bgl Il et Bam HI pour générer le fragment de 1,2 kb contenant le promoteur K 1 ADH 4 Ce fragment a ensuite été introduit au site Bam HI du plasmide p SK-Kan 401, en amont du gène reporteur aph codant pour l'amino- glycoside-3 '-phosphotransférase (I) (Oka et al, J Mol Biol 147 ( 1981) 217) dépourvu de son propre promoteur, qui, lorsqu'il est exprimé, confère à la levure la résistance à la généticine (G 418) (Jimenez et Davies, ref) Après amplification chez E coli, 2 plasmides recombinants ont été obtenus, différant au niveau de l'orientation de l'insert Dans le plasmide p P 4-Kan le fragment de 1,2 kb est dans la même orientation par rapport au gène ph que celle observée dans le contexte ADH 4, alors qu'il se trouve dans l'orientation opposée sur le plasmide p P 4 R-Kan (voir figure 5). 3.2 Construction d'un vecteur d'expression des gènes GUS et ah: Le plasmide p P 4 R-Kan a été utilisé pour construire un vecteur d'expression dans lequel 2 gènes hétérologues privés de leurs promoteurs -14- respectifs sont placés de part et d'autre du promoteur K 1 ADH 4 de 1,2 kb. Les gènes hétérologues utilisés sont plus spécifiquement: le gène aph dont l'expression confère la résistance au G 418, et le gène de la igglucuronidase de E coli (gène GUS), dont l'expression peut être mise en évidence par réaction enzymatique. Pour réaliser cette construction, le plasmide p P 4 R-Kan a été digéré par Eco RI et Bam HI Par ailleurs, à partir du plasmide p BI 221, le gène de la fg-glucuronidase de E coli a été isolé sous forme d'un fragment Bam HI- Eco RI de 2,1 kb Ce dernier a ensuite été introduit par ligation dans le plasmide p P 4 R-Kan linéarisé comme indiqué pour générer le plasmide p P 4-GUS (voir figure 6) Parallèlement, un plasmide contrôle a été préparépar insertion du fragment Bam HI-Eco RI de 2,1 kb issu du plasmide p BI 221 portant le gène GUS dans le plasmide p SK-Kan 401 préalablement digéré par Bam HI et Eco RI Le plasmide ainsi obtenu est appelé p SK-GUS (figure 6) Cette construction diffère du plasmide p P 4- GUS uniquement par l'absence du promoteur Kl ADH 4 de 1,2 kb. 3.3 Construction d'un vecteur d'expression du gène codant pour la sérum albumine humaine (HSA): Pour construire différents vecteurs d'expression de la sérum- albumine humaine, un dérivé du plasmide p YG 404 (Cf EP 361 991) a été préparé, contenant: un réplicon de levure (séquence quasiment entière du plasmide naturel p KD 1), le gène codant pour la prépro- albumine humaine (HSA) sous contrôle du promoteur du gène LAC 4 de K lactis et suivi du terminateur du gène PGK de S cerevisiae; le gène de structure codant pour la HSA est précédé par une séquence de 25 nucléotides correspondant à la région directement en amont du gène PGK de S cerevisiae, le gène aph conférant la résistance à la généticine (G 418) à la levure, et -15 - un réplicon et un marqueur de sélection (gène bla conférant la résistance à l'ampicilline) pour E coli. Ce plasmide, nommé p YG 404 AH, diffère de p YG 404 uniquement par la destruction du site Hind III, localisé dans le gène aph, par mutagénèse dirigée Cette modification a ensuite permis de substituer le promoteur LAC 4 présent dans le plasmide p YG 404 AH sous forme d'un fragment Sal I-Hind III par différents variants du promoteur K 1 ADH 4 égalements construits comme promoteurs portables sous forme de fragments Sal I-Hindl. 3.3 1 Construction du plasmide p YG 404 z H (figures 7-10). Pour effectuer la délétion du site Hind Ill dans le vecteur de clonage p YG 404, différentes étapes de sous-clonage ont été effectuées, donnant lieu à une construction intermédiaire: p YG 72 (figure 9) Ce vecteur correspond au plasmide p Kan 707 (EP 361 991) dans lequel le fragment Sac I contenant le gène URA 3 a été éliminé ainsi que le site unique Hind HI présent dans le gène aph Pour effectuer la mutagénèse dirigée sur ce site, le fragment Pstl de 1,3 kb portant le gène alph a été sous- cloné à partir du plasmide p Kan 707 dans le bactériophage M 13 mp 7 pour donner le vecteur p YG 64 (figure 7) Le site Hind III a été détruit par mutagénèse dirigée (Cf techniques générales de clonage) en utilisant l'oligodésoxynucléotide suivant: 5 '-GAA ATG CAT AAG CTC TTG CCA TTC TCA CCG-3 ', permettant le remplacement du triplet CTT codant pour la leucine 185 par le triplet CTC Ce changement ne modifie pas la séquence protéique résultante Le plasmide obtenu a été appelé p YG 65 (figure 7) Pour construire le plasmide p YG 72, la partie contenant le réplicon bactérien du vecteur p Kan 707 a été isolée par digestion avec l'enzyme Eco RI et recircularisation avec la T 4 DNA ligase, générant le plasmide intermédiaire p YG 69 Le fragment Pst I présent dans celui- ci contenant le gène aph a ensuite été remplacé par le fragment équivalent muté provenant du plasmide p YG 65 Cette construction a été appelée p YG 70 (figure 8) La séquence de p KD 1 de 4,7 kb comprise entre les sites Eco RI et Sac I a ensuite été introduite dans ce vecteur pour obtenir p YG 72 (figure 9). -16- Le vecteur p YG 404 AH a été obtenu en insérant la cassette d'expression provenant du plasmide p YG 404 (EP 361 991) sous forme d'un fragment Sal I-Sac I aux sites correspondants de p YG 72 (figure 10). 3 3 2 Construction d'un promoteur KIADH 4 portable lSal I- Hind IIIl (figure 11): Le promoteur Kl ADH 4 porté sur le fragment Bgl II-Bam HI provenant du plasmide p P 4-33 (exemple 2) a été modifié de la manière suivante pour l'adapter à l'utilisation dans des vecteurs d'expression dérivés du plasmide p YG 404 AH: Après digestion du plasmide p P 4-33 par les enzymes Bgl II et Bam HI suivi d'un traitement à la nucléase 'Mung Bean' pour rendre les extrémités franches, le fragment de 1,2 kb portant le promoteur K 1 ADH 4 a été isolé à partir d'un gel d'agarose et sous-cloné dans le vecteur p BC SK+ (STRATAGENE, La Jolla, CA, USA) préalablement linéarisé avec l'enzyme Cla I et traité à la nucléase 'Mung Bean' ainsi qu'à la phosphatase alkaline de veau (CIP) Le plasmide obtenu de cette manière (p YG 128, figure 11) permet l'isolement du promoteur KIADH 4 sous forme d'un fragment Sal I-Hind III de 1,2 kb. 3.3 3 Construction des vecteurs p YG 131 et p YG 132 (figure 12): La digestion du vecteur d'expression p YG 404 AH (exemple 3 3 1) par les enzymes Sal I et Hind III permet le remplacement du promoteur LAC 4 par le promoteur K 1 ADH 4 décrit ci-dessus. Pour effectuer ce clonage, le fragment Sal I-Hind III de 8,7 kb contenant la partie p KD 1 et les marqueurs de sélection ainsi que le fragment Hind III-Hind HI de 1,9 kb portant le gène codant pour la prépro- HSA ont été isolés à partir du vecteur p YG 404 AH et religués en présence du fragment Sal I-Hindl I de 1,2 kb provenant du plasmide p YG 128 et portant le promoteur K 1 ADH 4 Deux plasmides ont été obtenus de cette manière: -17- p YG 131 (figure 12), correspondant à un vecteur de clonage permettant l'insertion au site Hind III unique de tout gène que l'on désire exprimer sous contrôle du promoteur K 1 ADH 4, et p YG 132 (figure 12), qui est identique au plasmide p YG 131 sauf qu'il contient le gène de la prépro-HSA introduit au site Hind Hi I. 4/ Construction de vecteurs de clonage ou d'expression contenant des dérivés tronqués du promoteur KIADH 4. Le tableau 2 rassemble les constructions décrites dans cet exemple. 4.1 Construction de vecteurs d'expression du gène aph. Les plasmides p P 4-Kan et p P 4 R-Kan (exemple 3 1) ont été utilisés pour préparer des constructions contenant des formes réduites du promoteur Pour cela, les plasmides p P 4-Kan et p P 4 R-Kan ont été digérés par l'enzyme Sac I puis religaturés, selon le schéma décrit sur la figure 13. Cette manipulation a permis: d'exciser du plasmide p P 4-Kan le fragment Sac I de 0,7 kb environ situé du coté opposé au gène aph Dans le plasmide obtenu (p P 4-15 Kan) le gène aph est donc sous le contrôle d'un promoteur réduit correspondant au fragment Sac I-Bam HI de 0,5 kb dont la séquence est donnée sur la figure 2, dans la même orientation que celle observée dans le contexte ADH 4. d'exciser du plasmide p P 4 R-Kan le fragment Sac I de 0,5 kb environ situé du coté opposé au gène aph Dans le plasmide obtenu (p P 4-60 Kan) le gène aph est donc sous le contrôle d'un promoteur réduit correspondant au brin complémentaire du fragment Bgl II-Sac I de 0,7 kb (nucléotides 1 à 723) qui fait partie de la séquence donnée sur la figure 1. 4.2 Construction d'un vecteur d'expression du gène de la prépro- HSA: -18- 4.2 1 Construction d'un promoteur KIADH 4 tronqué portable lSa II-Hind IIIl (figure 14): Un dérivé tronqué du fragment Bgl II-Bam HI de 1,2 kb provenant du plasmide p P 4-33 et portant le promoteur K 1 ADH 4 entier a été obtenu par amplification enzymatique (PCR) d'une partie de ce promoteur, située entre le site Bsm AI en position 541 sur la séquence donnée sur la figure 1 et le site Bam HI en position -16 par rapport à l'ATG du gène ADH 4 Les oligodesoxynucléotides utilisés pour la réaction PCR étaient: 5 '-GGGGTCGACGCGAGACAACACTATTGTGAG-3 ', introdui- sant un site Sal I (séquence soulignée) juste en amont du site Bsm AI précité, et '-GGGAAGCTTTGTGTTGTTGATGGGGGAG -3 ', remplaçant le site Bam HI présent dans la construction p P 4-33 par un site Hind IH (séquence soulignée). 4.2 2 Construction des vecteurs p YG 129 et p YG 130 Le fragment de 672 bp obtenu par PCR a été digéré par les enzymes Sal I et Hind III, purifié à partir d'un gel d'agarose et ligué avec le fragment Sal I-Hind III de 8,7 kb contenant la partie p KD 1 et les marqueurs de sélection provenant du vecteur p YG 404 AH Cette ligation a été effectuée en présence du fragment Hind III-Hind III de 1,9 kb portant le gène codant pour la prépro-HSA isolé à partir du même vecteur Deux plasmides ont été obtenus de cette manière: p YG 129 (figure 14), correspondant à un vecteur de clonage permettant l'insertion au site Hind III unique de tout gène que l'on désire exprimer sous contrôle du promoteur tronqué K 1 ADH 4, et p YG 130 (figure 14), qui est identique au plasmide p YG 129 sauf qu'il contient le gène de la prépro-HSA introduit au site Hind III. La séquence nucléotidique du fragment Sal I-Hind III de 0,7 kb environ correspondant au promoteur Kl ADH 4 tronqué utilisé dans ces deux constructions est donnée sur la figure 3. 19 - 51 Etude de la régulation de l'expression du gène Kl ADH 4. Cette étude a été réalisée avec les souches K lactis MW 98-8 C et K. lactis 2359/152. La souche MW 98-8 C présente un phénotype Rag 2 dû à une mutation (rag 2) au niveau du gène codant pour la phosphoglucose isomérase (PGJ), qui la rend incapable de produire de l'éthanol sur un milieu glucose La souche 2359/152 est Rag 2 +. L'activité du promoteur ADH 4 a été déterminée dans différentes conditions de culture, par mise en évidence de l'activité ADH IV en utilisant la technique décrite par Lutstorf et Megnet (Archiv Biochem. Biophys 126 ( 1968) 933) Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 3. Ces résultats indiquent que l'activité du promoteur K 1 ADH 4 est spécifiquement induite par l'éthanol et non déreprimée en l'absence du glucose En effet, nous avons trouvé, d'une manière surprenante, que, contrairement aux promoteurs d'autres alcool deshydrogénases tel que ADH 2 de S cerevisiae ou alc A d'A nidulans, le promoteur KIADH 4 n'est pas reprimé par le glucose (tableau 3) L'éthanol inducteur peut soit être ajouté au milieu de culture soit être produit intracellulairement par fermentation d'une source carbonée tel que le glucose ou le fructose (tableau 3). Nous avons également montré qu'une souche mutée dans un gène impliqué dans la glycolyse et pour cette raison incapable de produire de l'éthanol à partir du glucose peut être avantageusement utilisée comme hôte pour les vecteurs d'expression de l'invention En effet, le promoteur Kl ADH 4 est inactif dans un milieu contenant du glucose comme seule source de carbone dans des souches tels que MW 98-8 C (rag 2) dont le gène codant pour la phosphoglucose isomérase est défectif Dans cette souche, l'activation du promoteur KIADH 4 s'effectue par l'addition d'éthanol au milieu de culture. Par ailleurs, nous avons trouvé, d'une manière surprenante, que dans les souches CB 52359/152 et MVW 98-8 C le promoteur K 1 ADH 4 est inactif dans un milieu contenant du glycerol comme seule source de carbone Ce résultat diffère de ce qui est connu du promoteur du gène de -20 - l'alcool deshydrogénase II de S cerevisiae (ADH 2) qui est actif sur différentes sources de carbone non fermentescibles incluant le glycerol. Ces résultats montrent donc que certaines souches tel que CB 52359/152, même avec un phénotype Rag+, peuvent permettre l'obtention d'une expression régulée du promoteur Kl ADH 4: les cellules cultivées en présence de glycerol comme seule source de carbone ne produisent pas la protéine dont le gène est placé sous contrôle du promoteur K 1 ADH 4 (promoteur non-induit) tandis qu'elles peuvent être induite pour la production de cette protéine en ajoutant de l'éthanol au milieu de culture. 6/ Transformation de Kluyveromyces. Différentes techniques permettant l'introduction d'ADN dans la levure peuvent être utilisées. Avantageusement, les différentes souches de Kluyveromyces utilisées ont été transformées en traitant les cellules entières en présence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol, selon la technique décrite par Ito et al (J Bacteriol 153 ( 1983) 163-168) La technique de transfor- mation décrite par Durrens et al (Curr Genet 18 ( 1990) 7) utilisant l'éthylène glycol et le diméthylsulfoxyde a également été utilisée Il est aussi possible de transformer le levures par électroporation, par exemple selon la méthode décrite par Karube et al (FEBS Letters 182 ( 1985) 90). * Un protocole alternatif a encore été décrit en détail dans la demande EP 361 991. 7/ Utilisation de vecteurs d'expression pour la production de protéines recombinantes. 7 1Production de protéines bactériennes. 7.1 1 Production de l'aminoglycoside 3 '-phosphotransférase () Les plasmides d'expression p P 4-Kan et p P 4 R-Kan (exemple 3 1) ainsi que le plasmide de clonage p SK-Kan 401 (témoin) ont été utilisés -21- pour transformer la levure K Iactis MW 98-8 C Les cellules transformées par p P 4-Kan et p P 4 R-Kan possèdent la résistance au G 418 dans un milieu YPD (extrait de levure 10 g/l; peptone 20 g/l; glucose 20 g/l) contenant 2 % d'éthanol et des doses de généticine allant de 200 à 400 Rg/ml, alors que les cellules transformées par le plasmide p SK-Kan 401 sont sensibles à la généticine. Ce résultat indique: que le gène aph est exprimé dans les levures transformées par les plasmides p P 4-Kan et p P 4 R-Kan, ce qui démontre que le fragment de 1,2 kb porte bien une activité promotrice fonctionnelle, et, que ce fragment porte donc bien une activité promotrice bidirectionnelle, puisque le gène aph est exprimé dans les deux constructions, c'est-à-dire quelle que soit l'orientation du fragment Bam HI-Bgl II de 1,2 kb contenant le promoteur K 1 ADH 4. Les plasmides p P 4-15 Kan et p P 4-60 Kan confèrent, après transformation, la résistance à la généticine à la souche MW 98-8 C cultivée dans un milieu YPD contenant 2 % d'éthanol et des doses de généticine supérieure à 200 gg/ml. Ce résultat indique clairement que des dérivés actifs du promoteur Kl ADH 4 porté par le fragment 1,2 kb peuvent être obtenus par fragmentation Il confirme l'activité bidirectionnelle de ce promoteur. 7 1 2 Production de la f 3-glucuronidase (figure 15) Les plasmides p P 4-GUS et p SK-GUS (exemple 3 2) ont été utilisés pour transformer la souche K lactis MW 98-8 C (ura 3 lys A arg A) en sélectionnant les cellules recombinées pour leur prototrophie vis-à-vis de l'uracile sur un milieu synthétique SD ('yeast nitrogen base w/o amino acids' 0,67 %, glucose 2 %) supplémenté avec de l'arginine ( 20 mg/l) et de la lysine ( 30 mg/l). Les cellules recombinées ont été cultivées dans 10 ml de YPD jusqu'à la phase stationnaire Les cellules ont ensuite été cassées au moyen de billes de verre dans des tubes Eppendorf, centrifugées, et les -22- surnageants analysés par electrophorèse sur minigel ( 5 % d'acrylamide) en conditions non-dénaturantes Les gels et tampons utilisés ont été décrits par Williamson et al (Nature 283 ( 1980) 214-216). Des échantillons correspondant à 20-40 gg de protéines ont été séparés par électrophorèse sur gel d'acrylamide ( 5 %) La migration a été réalisée à 4 C pendant 60 minutes sous un courant de 20 m A. L'activité f-glucuronidase est mise en évidence en trempant les gels dans une solution colorante contenant 50 m M Na 2 HPO 4, p H 7,0 et 50 gg/ml de bromo-5-chloro-4-indoyl-3 glucuronide (X-Glu) dans 5 mg/ml de diméthylformamide (Jefferson R A, Plant Mol Biol Report 5 ( 1987) 387-405). Les gels ont été maintenus à 37 C dans cette solution jusqu'à apparition des bandes. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 15 Le gel représenté montre clairement une bande dans les lignes 1 à 6, correspondant aux cellules MW 98-8 C transformées par le plasmide p P 4- GUS, et aucun signal dans les lignes C correspondant aux cellules MW 98- 8 C transformées par le plasmide p SK-GUS, qui ne contient pas de région promotrice de l'invention. Par ailleurs, les cellules transformées avec les plasmides p P 4-GUS et p SK-GUS ont également été cultivées sur un milieu YPD supplémenté par de la généticine ( 200 mg/1) Les transformants contenant p P 4-GUS ont acquis la résistance contre cette antibiotique tandis que la souche contrôle contenant p SK-GUS reste sensible. Ces résultats confirment l'activité promotrice bidirectionnelle du fragment 1,2 kb Ils montrent de plus que ce fragment peut être utilisé pour l'expression simultanée de deux gènes hétérologues insérés de part et d'autre du promoteur Kl ADH 4, dans les 2 orientations opposées. 7 2Production de protéines mammifères: 7.2 1 Expression du gène de la prépro-HSA sous contrôle du promoteur KIADH 4 entier (figures 16-17): 23- Le plasmide d'expression p YG 132 a été utilisé pour transformer les souches de levures K lactis MW 98-8 C (Rag 2-, incapable de produire de l'éthanol à partir de glucose) et CB 5293 91 (Rag 2 +, métabolisant le glucose pour produire de l'éthanol) Après sélection des cellules recombinantes sur milieu YPD supplémenté par de la généticine ( 200 mg/l), les transformants ont été précultivés pendant 20 heures environ dans des flacons Erlenmeyer dans un milieu M 9 EL 10 (milieu M 9 lManiatis et al, précitél supplémenté de 10 g/l d'extrait de levure) en présence de glucose ( 20 g/l) à 28 C sous agitation Cette préculture a ensuite été utilisée pour inoculer, à une dilution de 10-3, des Erlenmeyers de 300 ml contenant 50 ml de milieu M 9 EL 10 en présence de différentes sources de carbone (soit glucose seul l 20 g/ll, soit glucose l 20 g/ll plus éthanol l 20 g/ll, soit glycerol seul l 20 g/il, soit glycerol l 20 g/ll plus éthanol l 20 g/ll). Après culture des cellules recombinantes pendant 5 jours à 28 C sous agitation, des échantillons du surnageant de chaque culture, dépourvus de cellules, ont été prélevés et mélangés à un volume équivalent de tampon Laemmli 2 X (Laemmli, Nature 227 l 1970 l 680). Après chauffage à 96 C pendant 10 minutes, les protéines contenues dans un équivalent de 25 gl de surnageant on été séparées ( 25 m A) sur gel de polyacrylamide SDS 8,5 % La sécrétion d'albumine a ensuite été révélée par coloration du gel au bleu de Coomassie, et évaluée par densitométrie (densitomètre Shimazu C 5930). La figure 16 montre le résultat obtenu avec la souche MW 98- 8 C/p YG 132 pour laquelle on observe une sécrétion d'albumine à haut niveau quand les cellules ont été cultivées en présence d'éthanol ajouté au milieu de culture Par contre, on ne détecte pas de HSA dans le surnageant quand les cellules ont été cultivées en présence de glucose ou de glycerol. Contrairement aux résultats obtenus avec la souche MW 98- 8 C/p YG 132, les transformants CB 5293 91/p YG 132 sont capables de produire de la HSA dans toutes les conditions de cultures évoquées ci- dessus (figure 17) Néanmoins, la production d'albumine est 2 à 3 fois plus élevée dans une culture contenant de l'éthanol ajouté au milieu par rapport à une culture o l'éthanol est le produit du métabolisme cellulaire. 24 - Ces résultats confirment la capacité des couples hôte/vecteurs décrits dans les exemples précédents à produire à des niveaux élevés, en condition d'induction, une protéine recombinante, qu'elle soit d'origine bactérienne ou mammifère Par exemple, la production d'albumine en Erlenmeyers dans la souche CB 5293 91/ p YG 132 dans un milieu contenant du glycerol ou du glucose en présence d'éthanol (figure 17) a été estimée par densitométrie à 190 200 mg/l. Ces résultats confirment également l'absence de répression du promoteur Kl ADH 4 par le glucose puisque la production d'albumine n'est pas réduite en présence de celui-ci. 7.2 2 Expression du gène de la prépro-HSA sous contrôle du promoteur KIADH 4 tronqué (figure 18): Le plasmide d'expression p YG 130 a été utilisé pour transformer la souche K lactis CB 5293 91 (Rag 2 +) Après sélection des cellules recombinantes sur milieu YPD supplémenté par de la généticine ( 200 mg/l), les transformants ont été précultivés et cultivés comme décrit dans l'exemple précédent La sécrétion d'albumine a été évaluée par électrophorèse d'échantillons de surnageants de culture comme décrit sous 7 2 1 Le résultat obtenu avec le dérivé tronqué du promoteur Kl AD H 4 est montré à la figure 18: le couple hôte/vecteur CB 5293 91/p YG 130 est clairement capable de produire et sécréter de l'albumine recombinante Comme dans l'exemple du plasmide p YG 132 (promoteur K 1 ADH 4 entier) on observe une production d'albumine dans le milieu contenant du glucose comme seule source de carbone, mais à un niveau moins élevé par rapport au promoteur entier Par contre, la culture des cellules dans un milieu contenant du glucose plus de l'éthanol augmente la production de HSA d'un facteur 2 à 3 (figure 18). Un échantillon de la souche K lactis 2359/152 a été déposé le 4 juin 1991 auprès du Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) à -25- Baarn aux Pays-Bas dans les conditions du Traité de Budapest, sous le numéro CBS 289 91 La souche K lactis CBS 293 91 correspond à la souche CB 51065 redéposée le 11 juin 1991 selon les conditions du Traité de Budapest.5 _ + + + _ (_Z?) 38-866 I _ + + + + (+Z 2 BU) Zg I/69 úZ Iou isoo Io Jao XID asopn Tg +asoanl O Iouu'3 esoonl D no, \ aiqono S ú nvalavi L VSH -| L 9 '0 | t NVEN 1 L 9 'O O 1 qd I l I tqd E | g'O III Pu Hvt IVO Dod IIIPUT H Vt O It Dxd l Otu>I-N Sd I Ot U>D-X Sd Oú 1 oÀd 6 ZID Ad trexo 9- cd u'>c Ig-lcld ute DNO 9 i 7 dd g.T T IAVN NOISSI Xau LxsW u L 3 SSVD 3 GI Ns Wi J Mf L 3 DSA VSH Z In P Ul H Vtop Dd Zú 1 D Ad I II Ipuvtoo Dd I o Ad I sn Z'I de 1I O -Sd Sn O- ad 1 i I O 7 X-S I Z O 1qdg Ot'UN-l Sd u- e Xi 7 dd l qd) t Z 1 I Olruu X-N Sd uu X-9 acd JTTAVN NOI Ss Mad Xg a 9 USLSS Ve D SOEMSVIJ af 3 N 3 A T rl Vora'1 i L 8 T 0899 Z -27- REVENDICATIONS 1 Séquence d'ADN comprenant tout ou partie de la séquence présentée à la figure 1 ou de son brin complémentaire, ou d'un dérivé de celles-ci, et possédant une activité de promoteur transcriptionnel. 2 Séquence d'ADN selon la revendication 1 comprenant tout ou partie du fragment Sacl-Bam HI de 0,5 kb environ présenté sur la figure 2 ou du fragment Sal I-Hindill de 0,7 kb environ présenté sur la figure 3. 3 Séquence d'ADN selon la revendication 1 comprenant tout ou partie du fragment Bglll-Sacl de 0,7 kb environ correspondant au fragment compris entre les nucléotides 1 et 723 du brin complémentaire de la séquence donnée sur la figure 1. 4 ADN recombinant comprenant une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 5 ADN recombinant selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il contient en outre un ou plusieurs gènes de structure. 6 ADN recombinant selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il contient également des signaux permettant la sécretion du produit d'expression du ou desdits gènes de structure. 7 ADN recombinant selon les revendications 5 et 6 caractérisé en ce que le ou les gènes de structure codent pour des protéines d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire. 8 ADN recombinant selon la revendication 7 caractérisé en ce que le ou les gènes de structure codent pour des protéines choisies parmi les enzymes (tels que notamment la superoxide dismutase, la catalase, les amylases, les lipases, les amidases, la chymosine etc), les dérivés sanguins (tels que la sérum-albumine, I'alpha ou la béta-globine, le facteur VIII, le -28- facteur IX, le facteur de von Willebrand, la fibronectine, I'alpha-1 antitrypsine etc), l'insuline et ses variants, les lymphokines (telles que les interleukines, les interférons, les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF, M-CSF), le TNF, le TRF etc), les facteurs de croissance (tels que I'hormone de croissance, l'érythropoiétine, le FGF, I'EGF, le PDGF, le TGF etc), les apolipoprotéines, des polypeptides antigéniques pour la réalisation de vaccins (hépatite, cytomégalovirus, Eppstein-Barr, herpes etc), ou encore des fusions de polypeptides telles que notamment des fusions comportant une partie active fusionnée à une partie stabilisatrice (par exemple des fusions entre l'albumine ou des fragments d'albumine et le récepteur ou une partie d'un récepteur de virus (CD 4, etc)). 9 ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 4 à 8 caractérisé en ce qu'il fait partie d'un plasmide d'expression, qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Cellule recombinée contenant une séquence d'ADN ou un ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes. 11 Cellule recombinée selon la revendication 10 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure. 12 Cellule recombinée selon la revendication 11 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure du genre Kluyverornryces. 13 Utilisation d'une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour l'expression de gènes recombinés. 14 Utilisation selon la revendication 13 pour l'expression simultanée de gènes recombinés insérés de part et d'autre du promoteur dans les 2 orientations opposées. -29- Utilisation selon l'une des revendications 13 ou 14 pour l'expression de gènes codant pour des protéines d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire. 16 Procédé de production de protéines recombinantes caractérisé en ce que l'on cultive une cellule recombinée selon l'une quelconque des revendications 10 à 12 et on récupère les protéines produites. 17 Procédé selon la revendication 16 pour la production de protéines d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire. 18 Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que la protéine est préférentiellement la sérum-albumine humaine ou un de ses variants moléculaires.