FR 2682609 A1 19930423 FR 9112872 A 19911018 La présente invention concerne un nouveau support destiné à la préparation de colonnes permettant la séparation de substances biologiques ou leur purification à partir d'un mélange, constitué par un polymère ou copolymère déposé sur un solide poreux, tel qu'un oxyde minéral, un procédé pour sa préparation, ainsi que son application en chromatographie. On sait qu'il est possible de déposer des polymères sur divers supports minéraux en vue de préparer des colonnes de séparation de diverses substances Le dépôt de polymères synthétiques sur de la silice, de l'alumine ou de l'oxyde de titane a été décrit dans diverses publications Les polymères neutres utilisés sont, par exemple, le polyoxyéthylène glycol, la polyvinylpyrrolidone, les silicones, le polyvinylimidazole comme dans le brevet FR 2 598 512 ou le polydiméthyl acrylamide décrit dans le brevet FR 2 631 849 Le brevet US 4 517 241 décrit un support inerte à la surface duquel est fixé un poly- succinimide, que l'on peut modifier chimiquement pour l'adapter à une utilisation en chromatographie en phase liquide pour la séparation de protéines. La présente invention concerne un support réactif destiné à la préparation de colonnes pour la séparation o la purifica- tion de molécules biologiques et en particulier de protéines, en réduisant leur adsorption irréversible, procurant une effi- cacité de séparation améliorée par rapport aux produits usuels de la technique Le support selon l'invention comporte un solide poreux, tel qu'un oxyde minéral, sur lequel est déposée une pellicule de polymère ou de copolymère Cette pellicule peut être adsorbée à la surface du support, ou fixée de façon covalente En outre, des réactions de réticulation peuvent être effectuées sur les fonctions réactives du polymère ou du copo- lymère. L'invention concerne aussi un procédé pour préparer un support du type décrit ci-dessus, destiné à la séparation et à la purification de diverses substances, ainsi que son applica- tion en chromatographie pour la séparation et la purification des protéines. Le support suivant la présente invention se distingue en ce que le polymère ou le copolymère comporte des fonctions halogénoformiate, ou des fonctions dérivées constituées par des groupes partant, telles que le carbonate de N-hydroxysuccini- mide ou de phénol. Les polymères ou copolymères utilisés dans la présente invention sont de préférence du type comportant les motifs de formule générale: l CH CH 2 n o C= O X dans laquelle X est un atome d'halogène, tel que le chlore, ou un groupe partant choisi parmi un reste succinimido, phénol, imidazole ou thiosulfate, et N est un entier compris entre 10 et 10 000, et de préférence entre 1 000 et 5 000. L'expression "groupe partant" utilisée ici désigne les groupes susceptibles de se séparer suivant les règles clas- siques dans une réaction nucléophile. Le polymère ainsi obtenu est par exemple un polychloro- formiate de vinyle, un polyvinyloxycarbonyl thiosulfate de sodium, ou encore un polyvinyl carbonate de N-hydroxysuccini- mide. Le monomère copolymérisable peut être un dérivé à insatu- ration éthylénique de formule CH 2 = CR 1 R 2 dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, et R 2 un groupement hydrophile comportant une ou plusieurs fonctions ester, amide, carbamate, époxy, imidazole ou encore un reste silanolique de formule Si Y 3 dans laquelle Y est un atome d'halogène ou d'hydrogène ou un groupe alcoxy de 1 à 4 atomes de carbone (de préférence un groupe méthoxy), ou un groupe acétoxy ou phénoxy. R 2 peut être par exemple un groupe alcoxy inférieur de 1 à 3 atomes de carbone, tel que méthoxy, éthoxy ou n-propoxy, un groupe cyano, ou un groupe de formule COOR 3 dans laquelle R 3 est un groupe alkyle inférieur de 1 à 4 atomes de carbone tel qu'un groupe méthyle ou éthyle, ou un groupe époxyalkyle tel qu'un groupe époxyéthyle ou 2,3-époxypropyle. En outre, R 1 et R 2 peuvent aussi former un cycle avec l'atome de carbone qui les porte, tel que le cycle pyrrolido- nyle, imidazolyle, ou morpholinyle et d'une manière plus géné- rale tout cycle hydrophile dépourvu d'atome d'hydrogène réac- tif. Le monomère copolymérisable peut être plus particulière- ment choisi parmi la vinylpyridine, le vinylimidazole, la N- vinylpyrrolidone, la N-vinylmorpholine, l'acrylamide, un acry- lamide alkyl substitué tel que le diméthylacrylamide, le N- vinylméthylacétamide, et les acrylates ou méthacrylates d'al- kyle ayant une chaîne de 1 à 10 atomes de carbone. Les polymères et les copolymères utilisés dans la présente invention peuvent être préparés à partir des halogénoformiates de vinyle par des méthodes connues, comme par exemple celle décrite par Meunier et al lPolymer, Vol 23 ( 1982) p 849 l Ils doivent être préparés et utilisés dans des solvants aprotiques secs Ces polymères et copolymères peuvent être modifiés pour adapter ou améliorer leurs propriétés en fonction de l'applica- tion envisagée, et par exemple, ils donnent des polycarbonates actifs après réaction des produits précédents avec le N-hydroxysuccinimide, ou des phénols, de préférence activés par un ou plusieurs groupements activateurs tels que -NO 2 ou -F. Les polycarbonates actifs ainsi obtenus peuvent réagir en milieu aqueux sur des composés organiques nucléophiles ou sur les groupements nucléophiles des protéines. Le procédé de préparation du support suivant la présente invention consiste à imprégner le solide poreux préalablement séché par une solution de polymère ou de copolymère, contenant les motifs chloroformiate et/ou des fonctions dérivées et à rincer ensuite avec le solvant Il est préférable que le poly- mère ou le copolymère soit soluble à concentration élevée (supérieure à 5 % en poids) dans le solvant pour assurer une bonne adsorption sur le solide poreux Les solvants utilisés peuvent être des composés dépourvus d'hydrogène actif et de fonctions nucléophiles Des exemples de solvants utiles sont les halogénures d'alkyle ou d'aryle, l'acétone, l'acétonitrile, le tétrahydrofuranne. Le solide poreux est de préférence un oxyde minéral tel que la silice, l'alumine ou l'oxyde de titane ou de zirconium. Suivant l'invention on utilise de préférence la silice Cet oxyde peut avoir subi un traitement préalable à l'aide d'un silane réactif tel que ceux décrits dans le brevet US 4 415 631, c'est-à-dire comportant des groupements amine, hydroxy, époxy, ester ou thiol On peut utiliser par exemple une silice de granulométrie comprise entre 1 Am et 1 mm environ et de diamètre de pores compris entre 2 et 500 nm environ. Le cas échéant le polymère ou copolymère déposé peut être réticulé par les techniques connues, par exemple par traitement avec une solution d'éthylènediamine. Il est ainsi possible d'utiliser le support conforme à l'invention pour fixer des groupements chimiques ou des compo- sés permettant ensuite de séparer des protéines ou des poly- mères hydrophiles en faisant intervenir un mécanisme d'exclu- sion par la taille, d'échange d'ions, hydrophobe, d'interac- tions avec des colorants ou des métaux complexés, ou d'interac- tions avec des ligands spécifiques (chromatographie d'affinité ou d'immunoaffinité). Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limi- ter la portée. EXEMPLE 1 POLYMERISATION DU CHLOROFORMIATE DE VINYLE Le chloroformiate de vinyle (VCF) a été polymérisé selon la méthode décrite par MEUNIER et al lPolymer Vol 23 ( 1982) p 849 l. Une solution à 10 % en poids de VCF dans le dichlorométhane est portée à 350 C par reflux du solvant L'initiateur est le peroxydicarbonate de dicyclohexyle qui est ajouté dans une proportion de 1,2 % par rapport au monomère Le milieu réaction- nel est maintenu sous azote sec Après réaction pendant 48 heures, le polymère est précipité par de l'éther puis filtré et séché sous vide à température ambiante pendant 12 heures. Le polymère est ensuite caractérisé par analyse infra- rouge (bandes C= O à 1770 cm-1 et C-Cl à 680 cm'1) et analyse élémentaire: Cl%: 32,8 (théorie: 33,3 %); C%: 34,1 (théorie: 33,7 %). EXEMPLE 2 COPOLYMERISATION DU CHLOROFORMIATE DE VINYLE ET DE LA N-VINYLPYRROLIDONE (VP) Les deux monomères sont mis en solution dans le dichloro- méthane à une concentration globale de 10 % en poids et dans un rapport VCF/VF de 25/75 en mole. L'initiateur de polymérisation est l'azobis-isobutyroni- trile (AIBN) à la concentration molaire de 1,5 % par rapport aux monomères La température de polymérisation est de 35 C et la durée de la polymérisation est de 48 heures Le milieu réac- tionnel est maintenu sous azote sec Après polymérisation le copolymère est précipité à l'éther, filtré puis séché. Le polymère est analysé par spectroscopie infra rouge (Bande C= O du chloroformiate à 1770 cm-1) L'analyse élémen- taire indique 16 % de motifs chloroformiate et 84 % de motifs pyrrolidone. EXEMPLE 3 COPOLYMERISATION DU CHLOROFORMIATE DE VINYLE AVEC LE DIMETHYL ACRYLAMIDE (DMA) Le mode opératoire est comparable à celui du copolymère précédent Le DMA et le VCF sont dissous dans le dichloromé- thane à la concentration de 10 % en poids et dans un rapport molaire DMA/VCF de 40/60. La polymérisation radicalaire est amorcée par l'AIBN (concentration molaire de 1,5 % par rapport aux monomères) La durée de polymérisation est seulement de 3 heures en raison de la vitesse de polymérisation plus élevée que dans le cas précé- dent Le copolymère précipite au cours de la polymérisation et est alors dissous dans le toluène Le copolymère est alors précipité à l'éther puis filtré et séché sous vide à tempéra- ture ambiante pendant 12 heures. La caractérisation est effectuée par spectroscopie infra rouge (bande C= O de VCF à 1770 et C= O du DMA à 1640 cm-1) et l'analyse élémentaire indique une composition de 88 % en mole de DMA et de 12 % en mole de VCF. EXEMPLE 4 DEPOT DE L'HOMOPOLYMERE OU DES COPOLYMERES SUR LA SILICE La silice poreuse, par exemple Nucleosil de MACHEREI-NAGEL de granulométrie 10 gm et de diamètre de pores 30 nm est séchée à 150 C sous vide pendant 12 heures Le polymère (ou copoly- mère) est dissous dans le dichlorométhane à la concentration de % en poids 1 g de silice est mis en suspension dans 10 ml de la solution de polymère (ou copolymère) Le mélange est homogé- néisé et dégazé par un agitateur à ultrasons pendant 5 minutes puis la suspension est agitée pendant 4 heures à la température ambiante. La silice imprégnée est filtrée sur membranes de cellulose régénérée dans une cellule de filtration sous azote; le produit est alors remis en suspension et lavé au dichloromé- thane La silice est ensuite séchée sous vide à la température ambiante et conservée sous atmosphère inerte. Le dépôt des polymères peut être apprécié par spectrosco- pie infrarouge effectuée sur les billes de silice imprégnée et on observe la présence des bandes de vibration C= O à 1770 cm'1 correspondant au VCF. La quantité de polymère ou de copolymère est mesurée par analyse élémentaire. Les résultats sont les suivants: Polymère Quantité adsorbée mg/g Polymère VCF 175 Copolymère VCF/VP 150 Copolymère VCF/DMA 130 EXEMPLE 5 MODIFICATION CHIMIQUE DES FONCTIONS CHLOROFORMIATE PAR LE N-HYDROXYSUCCINIMIDE Le N-hydroxysuccinimide (NHS) est dissous dans le dimé- thylformamide (DMF) à la concentration de 0,52 mol/l. Cette solution est versée sur une suspension de silice enrobée (selon le mode opératoire précédent) dans le dichloro- méthane La suspension contient 20 g de silice par litre de solvant On verse un excès de 3 moles de NHS pour 1 motif chlo- roformiate et simultanément on ajoute une solution de pyridine dans le dichlorométhane ( 0,33 mol/litre) jusqu'à une quantité de 1,3 mole de pyridine par mole de NHS La température est maintenue à O C et une agitation douce est effectuée toutes les minutes La silice est alors filtrée, rincée avec un mélange 50/50 en volume de dichlorométhane/DMF, et avec le dichloromé- thane pur, puis le produit est séché sous vide à température ambiante. L'analyse élémentaire indique un taux de conversion des fonctions chloroformiate de 95 % L'analyse spectroscopique infrarouge indique l'apparition de la bande C= 0 carbamate à 1744 cm-1. EXEMPLE 6 REACTION DE L'ACIDE AMINOMETHANE SULFONIQUE (AMS) SUR UNE COLONNE DE SILICE REACTIVE Une colonne chromatographique de 5 cm de long et de 4 mm de diamètre intérieur est remplie avec de la silice modifiée par le procédé décrit dans l'exemple 5 ci-dessus. Une solution aqueuse d'acide aminométhane sulfonique (AMS) (NH 2-CH 2- SO 3 Na) à la concentration de 0,1 M, équilibrée à p H = 7,4 par du tampon phosphate 0,67 M percole en continu au travers de la colonne) La densité optique à 260 nm est enre- gistrée et indique la libération du NHS qui cesse lorsque la réaction est terminée Cette expérience permet de calculer la quantité de NHS libérée, qui est de 7,5 10-5 mole. A titre de comparaison, la percolation d'une solution à p H = 7,4 dépourvue d'AMS indique la libération de la NHS selon un processus beaucoup plus lent que dans le cas précédent. La mesure de la capacité ionique de la colonne ayant fixé l'AMS a été effectuée par l'analyse frontale d'une solution de pyridine amenée par de l'acide citrique à p H = 3 La capacité a été trouvée de 5 10-5 eq/g. EXEMPLE 7 UTILISATION DU SUPPORT MODIFIE PAR L'AMS POUR LA SEPARATION DES PROTEINES Le support modifié par le procédé de l'exemple 6 ci-dessus contient des fonctions sulfonate qui constituent des sites échangeurs de cations Ce matériau peut être utilisé pour la séparation des protéines selon un procédé d'échange d'ions. La figure 1 donne l'exemple de la séparation de deux protéines (a-chymotrypsinogène et lysozyme) chargées positive- ment, éluées à p H = 3 par l'addition graduée d'une solution de Na Cl de concentration 1 M, au moyen d'une colonne de 5 cm de long et 4,2 mm de diamètre intérieur (injection de protéines: 0,67 g/l; 50 gl; tampon citrate l Om M) contenant le support de l'exemple 6 ci-dessus. Le chromatogramme montre que l'a-chymotripsinogène ( 1) et le lysozyme sont parfaitement séparés (Fig 1). EXEMPLE 8 UTILISATION DU SUPPORT MODIFIE POUR LA FIXATION COVALENTE DE PROTEINE Le support modifié décrit à l'exemple 5, comportant des fonctions carbonate de NHS, est placé dans une colonne chroma- tographique comme dans le cas précédent (hauteur 8 cm; diamètre 4,2 mm). Une solution aqueuse d'albumine (conc > 2 g/1) à p H = 7,4 (tampon phosphate 0,67 M) percole au travers de la colonne. La fluorescence (Xex = 287 nm, Xem = 328 ni) de l'effluent est enregistrée et permet d'établir par analyse frontale la quantité d'albumine qui a été fixée par la colonne; on trouve une quantité de 5 mg/g de support. Pour vérifier la présence de l'albumine immobilisée sur le support, l'injection d'un composé tel que la warfarine ayant une affinité pour cette protéine a été effectuée Après injec- tion du composé à différentes concentrations, les chromato- grammes obtenus sont caractéristiques d'une affinité de la warfarine pour l'albumine Des essais similaires effectués sur un support imprégné de l'un des polymères décrits ci-dessus mais dépourvu d'albumine ne révèlent aucune affinité du support pour la molécule de warfarine. EXEMPLE 9 PREPARATION D'UN SUPPORT D'AFFINITE POUR LA PURIFICATION DES ENZYMES Un copolymère contenant des motifs aminobenzamidine a été préparé en faisant réagir un copolymère VCF-VP ( 50-50 en moles) décrit ci-dessus sur l'aminobenzamidine (ligand spécifique des sérine protéases), 7 NH H 2 N / XN NH 2 selon le mode opératoire suivant: 3,9 g d'aminobenzamidine sont dissous dans 200 ml de diméthylformamide (DMF) additionné de 8 ml de triéthylamine (TEA). 1 g de silice enrobée de copolymère contenant des motifs chloroformiate, préparée comme indiqué dans l'exemple 4, est introduit dans la solution précédente La réaction est effec- tuée pendant 20 heures à la température ambiante. Le solide est alors filtré, puis rincé avec du DMF puis un mélange 50/50 (vol/vol) de DMF et de dichlorométhane, puis le dichlorométhane pur est enfin séché La mesure de la quantité de motifs benzamidine est réalisée par l'analyse frontale d'une solution de nitrate de sodium L'augmentation de la densité optique à 280 nm après l'écoulement d'un certain volume de solution permet de calculer la quantité de sites amidine initiaux Le nombre de motifs benzamidine fixé a été ainsi trouvé de 3,7 10-5 motif/g de silice. EXEMPLE 10 UTILISATION DU SUPPORT CONTENANT DE LA BENZAMIDINE POUR LA CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE Le support précédent a été utilisé pour purifier un échan- tillon de trypsine Un volume de 1 ml de solution de trypsine déjà purifiée (T 8128 Sigma 45 U I par mg de protéine) conte- nant une quantité de protéine de 1,12 mg est injectée sur le support élué par une solution de tampon phosphate 10 m M à p H = 7,4 (éluant A). Après élution d'une fraction des protéines injectées sous forme d'un pic non retenu, une solution de tampon glycine ( 50 m M p H = 2,8, Na Cl 50 m M) est injectée en continu sur une colonne (éluant B) Deux pics correspondant à la trypsine initialement fixée apparaissent Seul le deuxième présente une activité enzymatique (fig 2) et contient 0,46 mg de protéine. La mesure précise de l'activité enzymatique fait appa- raître un taux de purification de 4 ( 165 U I par mg de protéine) L'étude de l'influence d'un compétiteur du ligand vis à vis de la trypsine a été effectuée en établissant des chromatogrammes correspondant à l'injection de la trypsine éluée par une solution de L-arginine à différentes concentra- tions Les résultats obtenus font apparaître la diminution du volume de rétention de la trypsine avec une concentration croissante de L-arginine, mettant en évidence l'affinité de la protéine pour le support. Sur la figure 2, la courbe en traits pleins correspond à l'injection d'l ml de trypsine pure, et la courbe en pointillés correspond à la mesure de l'activité enzymatique de la tryp- sine. il REVENDICATIONS 1 Support pour la préparation de colonnes chromatogra- phiques, comportant un solide poreux sur lequel est déposée une pellicule de polymère ou de copolymère, caractérisé en ce que le polymère ou copolymère comprend des fonctions halogénofor- miate, ou des fonctions dérivées constituées par des groupe partants. 2 Support selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère ou copolymère comprend l'unité récurrente de formule générale: l CH CH 2 ln I lql e uate 'lè,eqeeh= O X dans laquelle X est un atome d'halogène, tel que le chlore, ou un groupe partant tel qu'un reste succinimido, phénol, imida- zole ou thiosulfate, et N est un entier compris entre 10 et 10.000. 3 Support selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le polymère est choisi parmi le polychloroformiate de vinyle, le polyvinyloxycarbonyl thiosul- fate de sodium, et le polyvinyl carbonate de N-hydroxysuccini- mide. 4 Support selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le copolymère est obtenu à partir d'un monomère copolymérisable de formule CH 2 = CR 1 R 2 dans laquelle R 1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, et R 2 un groupement hydrophile comportant une ou plusieurs fonctions ester, amide, carbamate, époxy, imidazole, ou un reste silanolique de formule Si Y 3 dans laquelle Y est un atome d'halogène ou d'hydrogène ou un groupe alcoxy de 1 à 4 atomes de carbone, ou un groupe acétoxy ou phénoxy. Support selon la revendication 4, caractérisé en ce que R 1 et R 2 forment, avec l'atome de carbone qui les porte, un cycle choisi parmi les groupes pyrrolidonyle, imidazolyle et morpholinyle. 6 Support selon la revendication 4, caractérisé en ce que le monomère copolymérisable est choisi parmi la vinylpyri- dine, le vinylimidazole, la N-vinylpyrrolidone, la N- vinylmorpholine, l'acrylamide, le N-vinylméthylacétamide, et les acrylates ou méthacrylates d'alkyle ayant une chaîne de 1 à atomes de carbone. 7 Procédé de préparation d'un support selon la revendi- cation 1, caractérisé en ce que il consiste à imprégner le solide poreux, préalablement séché, par une solution de poly- mère ou copolymère comprenant des fonctions halogénoformiate, et à rincer ensuite avec le solvant. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le solvant est choisi parmi les halogénures d'alkyle ou d'aryle, l'acétone, l'acétonitrile, le tétrahydrofuranne. 9 Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 et 8, caractérisé en ce que le polymère ou copolymère est traité par le N-hydroxysuccinimide, un acide sulfonique, ou un phénol activé.