FR 2681875 A1 19930402 FR 9112148 A 19910926 La présente invention concerne de nouvelles molécules d' ADN recombinants codant notamment pour une chaîne Vf 17 du récepteur pour l'antigène des cellules T, leur procédé de préparation, des anticorps et les médicaments les renfer- mant. Il serait intéressant de développer facilement un panel d'anticorps dirigé contre les différentes chaînes de récepteurs pour l'antigène des cellules T (ci-après TCR) humaines, afin par exemple d'obtenir une discrimination et une numération précise entre les différentes sous-popula- tions de cellules T humaines. L'étude facile du déséquilibre entre les sous-populations permettrait alors le diagnostic différentiel des maladies provoquant une prolifération de cellules T Cette dernière pourrait aussi être le témoin d'une réponse immunitaire spécifique contre un tissu particulier, pathogène tel qu'une tumeur par exemple On sait en particulier que des anticorps contre les antigènes CD 4 et CD 8 qui distinguent deux populations de cellules T, sont témoins d'une série de maladies immunitaires dont le SIDA. Ces anticorps devraient pouvoir être réalisés facilement et en grande quantité. La demanderesse a découvert de nouveaux ADN recombinants permettant la préparation de nouveaux vecteurs d'expression eucaryote qui étaient de remarquables agents de transfec- tion de cellules eucaryotes, lesquelles cellules transfec- tées étaient d'excellents immunogènes conduisant à des anticorps, notamment monoclonaux, dirigés vers la chaîne VP 17 des TCR humains.30 Il est à noter que la séquence concernée est appelée VP 19 dans la nomenclature de Wilson et al dans Immunol Rev. 1988. C'est pourquoi la présente demande à pour objet un ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique chimère codant pour une chaîne du récepteur pour l'antigène des cellules T, ladite séquence étant constituée: d'une séquence provenant d'un mammifère et codant pour la totalité de la partie variable VP 17 et de préférence sa séquence de tête, diversité DP et de jonction Jo 6, et d'une séquence d'origine murine codant pour la partie complémentaire constante (Cp 1 ou C 0/2) absente de la séquence de mammifère ci-dessus, les deux séquences étant liées au niveau d'un site de restriction naturel ou créé artificiellement Dans ce qui suit, on appellera ce site "site sélectionné". Par ADN recombinant l'on entend une séquence de nucléotides artificiellement crée. Par chimère l'on entend que l'ADN recombinant comprend au moins deux séquences provenant d'origines différentes, par exemple 3, 4 ou 5 et de préférence 2 séquences de deux origines différentes. Ces séquences proviennent de deux espèces différentes et l'origine de l'une d'entre elles est murine; l'autre (ou les autres) proviendra notamment d'un primate et de préférence de l'homme. Le récepteur aiq des cellules T, est une protéine hétérodi- mère composée de deux chaînes polypeptidiques, a et À, reliées par un pont disulfure Le récepteur est exprimé à la surface des cellules T en association avec le complexe CD 3 Le locus correspondant à une chaîne particulière du TCR comprend une importante sélection de segments géniques distincts, incluant de nombreux segments V différents, plusieurs segments J et un ou deux segments constants C. Ces segments peuvent subir des réarrangements somatiques pendant la maturation thymique des cellules T produisant ainsi un gène unique, qui est transcrit et contenant un segment V, un segment J, un segment C et, le cas échéant, un segment D entre les segments V et J. Dans l'ADN recombinant chimère ci-dessus décrit, la totalité de la séquence codant pour la partie C 0/ peut provenir d'un murin et dans ce cas la séquence de l'autre mammifère ne comprend aucun nucléotide correspondant à la partie Cp De préférence, la séquence provenant d'un autre mammifère comprend une courte partie C/3, de préférence inférieure à 100 nucléotides et notamment environ 60 nucléotides; de ce fait, seule une large partie CP de la chimère provient du murin (cette partie étant la partie complémentaire absente de la séquence de l'autre mammifère ci-dessus) et le reste provenant du dit autre mammifère. Les deux séquences d'origines différentes sont liées au niveau d'un site de restriction sélectionné, en phase dans le cadre de lecture. La séquence de l'autre mammifère comprendra nécessairement en plus des parties Vp 17, Jp et Dp et une partie de CP, la totalité de la séquence de tête. Le site de restriction sélectionné peut être naturellement présent sur chacune des deux séquences ou présent naturel- lement sur une seule des deux séquences, ledit site de restriction étant artificiellement créé sur l'autre séquence Le site de restriction ci-dessus doit être unique sur le segment Cp 3 ou CP 2 murin et de préférence unique sur le segment de l'autre mammifère. Lorsque le site de restriction sélectionné est crée artificiellement, il peut être réalisé par exemple par délétion ou adjonction de nucléotides ou de préférence par mutation selon les méthodes connues en elles-mêmes, notamment par mutagénèse dirigée L'altération ainsi réalisée de l'ADN permet l'introduction d'un site de restriction normalement absent En particulier, un site Bgl II, présent naturellement au niveau de l'ADN codant pour la région Cp 1 et C 0,2 humaine, mais absent du gène codant pour la chaîne du TCR de la souris, peut être introduit dans le gène Cp 1 ou CP 2 de la souris par mutagénèse dirigée, mais éventuellement mutagénèse par polymérisation en chaîne (PCR) La mutation permet de conserver le maximum d'homologie avec la ou les séquences de départ Le site de restriction ainsi créé sera de préférence placé au niveau d'un site homologue au site au niveau duquel le site de restriction est naturellement présent chez le mammifère considéré, particulièrement l'homme, de manière à permettre la coupure, tant de la séquence murine que de la séquence de mammifère à l'aide de ladite enzyme, pour ensuite, par ligation en phase dans le cadre de lecture, créer la chimère désirée De ce qui précède, on comprend que si l'on choisit une enzyme de restriction donnée, un seul site de restriction correspondant doit au plus être présent sur le segment C 131 ou C 132 murin et de préférence unique sur le segment de l'autre mammifère et de plus, au niveau de la séquence codant pour la partie Cp 1 ou CP 2, à un emplacement permettant la transcription en phase d'un ADN codant notamment la chaîne du TCR. Des ADN recombinants préférés selon l'invention sont caractérisés en ce que le site de restriction est naturel sur la séquence codant pour la partie C du mammifère. Des chimères tout particulièrement préférées selon l'inven- tion ont une partie mammifère caractérisée en ce que sa séquence provenant d'un mammifère est la séquence codant pour des segments Vp 17, D:, Jp humains, et une courte partie CP jusqu'au site unique Bgl II de Cp. La partie murine des chimères notables selon l'invention est caractérisée en ce que le site de restriction, notamment Bgl II est artificiellement créé sur la chaîne d'origine murine. L'ADN recombinant selon l'invention peut se présenter sous forme d'une séquence nucléotidique mono ou simple brin, limitée aux parties V, D, J et C, ci-dessus, ou comportant d'autres nucléotides, par exemple et notamment ceux constituant la séquence de tête. C'est ainsi que la séquence ci-dessus peut en particulier être incluse dans un vecteur d'expression, et dans ce cas de préférence dans un vecteur d'expression eucaryote. La séquence ci-dessus peut également être incluse en vue de sa réplication dans un autre vecteur, par exemple dans un plasmide tel que par exemple BLUESCRIPT Comme vecteur d'expression eucaryote on peut citer tout particulièrement p Hp Prl-Néo On peut citer également p Hp Prlgpt et générale- ment tout vecteur d'expression eucaryote possédant les signaux de régulation promoteur et un signal de polyadény- lation permettant l'expression de l'AD Nc Bien évidemment, le choix du couple vecteur-hôte est de la compétence de l'homme de l'art. Des ADN recombinants tout particulièrement préférés selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils se présentent sous forme d'un vecteur d'expression eucaryote, lequel étant de préférence dérivé de p Hp Prl-Néo. L'ADN recombinant ci-dessus, notamment sous forme de vecteur d'expression eucaryote, peut être utilisé pour transfecter dans un hôte approprié la séquence codant pour le TCR Des cellules hôtes ainsi transfectées, éventuelle- ment traitées, par exemple préalablement transfectées avec la chaîne CD 3 Zeta pour obtenir une meilleure expression, peuvent être utilisées comme immunogène, de préférence chez la souris. On peut ainsi classiquement préparer des anticorps, notamment monoclonaux, le criblage des hybridomes obtenus à partir de cellules de myélome et de cellules de rate du murin utilisé pouvant se faire par la reconnaissance de la lignée transfectée, versus la non-reconnaissance de la lignée de départ. C'est pourquoi la présente demande a également pour objet les anticorps, notamment monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont préparés par mise en oeuvre d'un ADN recom- binant ci-dessus décrit. La présente invention a aussi pour objet les anticorps anti chaîne VP 17 du récepteur de cellules T humaines. Les anticorps ci-dessus présentent de remarquables propriétés car ils sont parfaitement caractérisés vis à vis des chaînes j de TCR, et particulièrement vis à vis des régions variables VP 17 des chaînes de TCR, mais aussi vis- à-vis des régions Df et Jp dans leur réarrangement typique. Ces anticorps sont donc capables de distinguer les éléments V,317 de la population des cellules T humaines et ainsi spécifiquement reconnaître, par exemple une maladie ou une déficience donnée. Dans les anticorps ci-dessus décrits on préfère les anticorps anti partie variable, notamment VP 17, qui présen- tent de remarquables propriétés à la fois pour le diagno- stic et la thérapie, curative ou préventive, chez l'homme ou l'animal, des maladies auto-immunes et des maladies septiques, notamment celles dues aux staphylocoques. Les anticorps selon l'invention peuvent à cette fin être utilisés directement ou, si désiré, couplés selon les méthodes connues en ellesmêmes, par exemple à l'aide d'un agent hétérobifonctionnel comme le SMCC, à une toxine ou un principe actif cytotoxique auxquels sont sensibles les cellules T. C'est pourquoi la présente invention a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles renferment au moins un des anticorps tels que définis ci-dessus. Les compositions pharmaceutiques peuvent se présenter notamment sous les formes parentérales, notamment injec- tables, couramment utilisées en médecine humaine, par exemple pour la voie sous cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. Les anticorps ci- dessus peuvent également être utilisés pour soigner les maladies immunes ou provoquant une prolifération des cellules T porteuses de chaînes VP 17, ainsi que les leucémies à cellules T porteuses de chaîne VP 17, par injection des anticorps ci-dessus. Les anticorps ci-dessus peuvent aussi être couplés à des produits radioactifs, selon des méthodes connues en elles- mêmes (Chelatants de métaux comme l'Indium, substitution d'Iode, etc). Les anticorps selon l'invention trouvent leur emploi notamment dans le traitement des maladies auto-immunes telles que l'arthrite rhumatoïde, le diabète, la maladie de Sjôgren ou le lupus erythémateux. La dose usuelle, variable selon le produit utilisé, le sujet traité et l'affection en cause, peut être par exemple de 0,001 à 25 mg par jour et par kg de poids corporel chez l'homme d'un anticorps monoclonal selon l'invention couplé à la ricine A à titre de cytotoxique, et de préférence de 0,05 à 0,2 mg/kg/jour. Etant donné que les anticorps, notamment monoclonaux, ci- dessus trouvent aussi leur utilisation à des fins dia- gnostiques, pour la détection, l'identification ou le dosage des TCR ou de parties de TCR à chaînes Vp 17, la présente invention a également pour objet l'utilisation desdits anticorps à la détection, l'identification ou le dosage des antigènes ci-dessus, ainsi que les compositions diagnostiques (ou produits de diagnostics, destinés à une telle visualisation). Les anticorps ci-dessus trouvent également leur utilisation dans la purification des produits renfermant la partie antigénique correspondant à des chaînes de TCR. Les anticorps ci-dessus peuvent être utilisés à fins diagnostiques en cytofluorimétrie et dans ce but peuvent être couplés, par des méthodes connues en elles-mêmes, à des marqueurs fluorescents tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou la phycoérythrine, technique plus avantageuse que l'étude par PCR. On peut, par exemple, détecter la présence d'une population de cellules T portant la chaîne VP 17 en détectant le segment variable VP 17 au niveau des tissus souffrant par exemple d'une infection, d'un cancer ou d'une maladie auto- immune, et en détectant sa présence selon des méthodes connues en elles-mêmes. On peut également marquer les anticorps ci-dessus décrits, à l'aide d'enzymes On peut citer par exemple, la glucose 6 phosphate deshydrogénase, l'acétylcholinéstérase, la glucoseoxydase ou la bétagalactosidase. Les anticorps totaux ci-dessus peuvent également être couplés à un radiomarqueur tel que l'indium 111, pour utilisation dans l'imagerie des populations de cellules T comportant la région VP 17, au niveau des parties malades du corps humain. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des ADN recombinants ci-dessus décrits, caractérisé en ce qu'on ligue une séquence nucléotidique constituée d'au moins la totalité de la séquence codant pour les parties Vj 37, Dp et Jp d'une chaîne du récepteur de l'antigène des cellules T d'un mammifère jusqu'au niveau d'un site de restriction, avec une séquence nucléotidique d'origine murine comprenant l'homologue de la partie complémentaire de la partie C 01 absente de la séquence de chaîne de mammifère ci-dessus, à partir du même site de restriction que ci-dessus, ledit site de restriction étant artificiellement créé sur l'une, l'autre ou les deux séquences, pour obtenir la chimère attendue, puis si désiré, ligue une séquence comprenant la totalité des parties VP 17, D:, Jp et CP ci- dessus avec un vecteur d'expression eucaryote, puis si désiré, isole la nouvelle chimère obtenue. Dans des conditions préférentielles, le procédé décrit ci- dessus, est caractérisé en ce qu'en outre l'on transfecte une cellule eucaryote comportant tous les éléments permettant la synthèse du récepteur de l'antigène des cellules T, à l'exception de la chaîne homologue à la chaîne codée par la séquence chimère ci-dessus, utilise comme antigène les cellules ainsi transfectées chez la souche murine correspondante, et fusionne des cellules de rate prélevées sur les murins auxquels a été administré l'antigène à des cellules de myélome pour préparer, selon les méthodes connues en elles-mêmes, des anticorps dirigés contre le produit de la séquence variable du mammifère. Le procédé ci-dessus décrit peut notamment être réalisé comme suit: La séquence nucléotidique codant pour les parties VP 17, Dp et J 13 d'une chaîne du TCR de mammifère et notamment un ADN double brin linéaire comportant la séquence codant pour les parties Vp 17, Jp, Dp et éventuellement C 0/ en partie, d'une chaîne de TCR de mammifère, de même que son gène de tête, est obtenue par coupure à l'aide de deux enzymes de restriction différentes: l'enzyme correspondante au site de restriction sélectionné au niveau de la partie Cp, par exemple Bgl II et une autre enzyme clivant la séquence du côté opposé, après le gêne de tête, par exemple Eco RI à partir d'une séquence d'ADN double brin linéaire comportant ladite séquence L'ADN ainsi obtenu est ligué à un vecteur traité par les mêmes deux enzymes de restriction, ce vecteur comportant la séquence codant pour le segment CP 2 (ou C 0/1) de la chaîne de TCR murin, et les mêmes sites de restriction que ci-dessus, par exemple Bgl II et Eco RI On obtient ainsi le gène chimère attendu Celui-ci n'est toutefois pas exprimable tel quel C'est pourquoi d'une part le vecteur comportant la chimère est traité par deux enzymes de restriction coupant de part et d'autre du gène chimère codant pour le TCR chimère; d'autre part, on traite par les mêmes deux enzymes de restriction un vecteur d'expression eucaryote Par ligation du gène obtenu ci-dessus codant pour le TCR chimère avec ledit vecteur d'expression eucaryote, on obtient un nouveau vecteur chimère d'expression eucaryote Ledit vecteur d'expression eucaryote doit comporter les éléments nécessaires pour assurer la transcription correcte du gène chimère codant pour le TCR A cet égard, on peut citer par exemple comme vecteur p HI 3 Prl-Néo, qui peut être scindé par Bam HI et Sal I, et comprend notamment le gène de résistance à la néomycine utilisé comme un marqueur de sélection, une séquence promotrice eucaryote du gène de la P actine, ainsi qu'un signal polyadenylation à proximité du site Bam HI Le nouveau vecteur chimère obtenu est avantageusement utilisé pour transfecter des cellules eucaryotes, de préférence des cellules T de souris, notamment des lignées cellulaires comportant tous les éléments pour l'expression du TCR à l'exception du gène apporté par le vecteur chimère On peut citer par exemple, la lignée de souris DOI 519 ou celle du nom de DS 23 27 4 De telles cellules permettent une sélection facile des cellules exprimant la chimère qui seules sont capables d'exprimer le TCR à la surface de la cellule. Bien entendu, chaque ligation (ci-dessus et ci-après) est suivie de la transfection d'un hôte approprié et la sélection des cellules contenant la chimère désirée. Les cellules transfectées peuvent être administrées à titre d'antigène de préférence à des souris, par exemple par injection intrapéritonéale On peut ainsi prélever des cellules de rate des murins ainsi traitées, cellules capables de secréter les anticorps recherchés pour les fusionner à des cellules immortelles, telles que le myélome Les hybridomes sélectionnés produisant les anticorps recherchés permettent ainsi la préparation d'anticorps notamment monoclonaux dirigés contre la chaîne V 117 du TCR du mammifère choisi, notamment l'homme. L'ADN double brin codant pour la chaîne du récepteur de l'antigène des cellules T de mammifère peut par exemple être préparé comme suit: L'étude de la séquence des gènes codant pour la chaîne VP 17 permet de sélectionner un site de restriction déjà présent sur une partie constante CP, soit alors amène à créer sur ladite séquence un tel site et permet la synthèse de nouveaux oligonucléotides utilisables pour synthétiser il l'ADN complémentaire à partir de l'ARN messager. On purifie à partir de lymphocytes T de mammifère (par exemple humains) 1 'AR Nm codant pour une chaîne TCR donnée. On synthétise l'ADN complémentaire à l'aide d'un oligonu- cléotide, par exemple OHCP, spécifique d'un gène de mammifère donné et contenant le cas échéant le site unique de restriction sélectionné à l'aide d'une transcriptase reverse, synthétise le deuxième brin à partir d'un oligonucléotide spécifique de la chaîne, par exemple OL 17, à l'aide d'une polymérase, et amplifie le gène obtenu par réactions de polymérisation en chaîne (PCR) en effectuant par exemple une trentaine de cycles. On obtient ainsi une grande quantité d'ADN double brin linéaire codant On peut alors couper par les enzymes appropriées, par exemple Bgl II et Eco RI, les fragments produits par PCR, de manière à éliminer tout ou partie de la séquence codant pour la partie Cp, à partir du site sélectionné et de manière à conserver les séquences Vf 17, Do et Jp, ainsi que la totalité de la séquence de tête. La séquence nucléotidique d'origine murine comprenant la partie complémentaire de la partie Cp absente de la séquence de chaîne de mammifère ci-dessus, dans le cas o celle-ci se trouve sous la forme d'un vecteur comportant ladite séquence, peut être préparée comme suit: On isole un AD Nc complet contenant toute la partie codante de la chaîne P du TCR choisi à partir d'une banque d'AD Nc provenant d'une lignée cellulaire murine, par exemple KB 5 C 20, à l'aide d'une sonde connue; on clone cet AD Nc dans un plasmide approprié, par exemple PU C 19, puis on transfecte le plasmide résultant appelé dans ce cas p U Cm CP 2 dans un hôte, par exemple la souche bactérienne DH 1 de E. coli. On pourra ensuite cloner le fragment intéressant d'ADN murin dans un phage Pour cela, on peut digérer p U Cm CI 32 par des enzymes de restriction appropriées, par exemple Eco RI et Hind III, de manière à obtenir trois fragments dans le cas ci-dessus On purifie le fragment contenant toute la séquence codante de la chaîne CP 2 (ou Ci 1) murine désirée (dans le cas des enzymes précitées, Eco RI coupe dans la partie V de la séquence) On obtient ainsi une séquence codant pour une partie de la partie V, ainsi que la totalité des parties Dp, Jf et C O On ligue alors ladite séquence avec un phage approprié, par exemple M 13 mpl 8, ouvert avec les mêmes enzymes de restriction Dans ce cas, l'ADN phagique existe sous deux formes: simple brin pour le phage encapsidé et double brin pour sa forme réplica- tive On hybride un oligonucléotide complémentaire de la région à muter, sauf pour la mutation désirée, avec la forme simple brin du phage Le brin complémentaire est synthétisé in vitro par une ADN polymérase utilisant le même oligonucléotide pour initier la réaction On ferme le nouveau brin sur lui-même à l'aide d'une ligase Le double brin complètement homologue est alors transfecté par exemple dans E coli, notamment JM 101 Les colonies mutantes sont sélectionnées, par exemple par hybridation avec un oligonucléotide radio-marqué. Pour des détails sur la mutagénèse dirigée, se référer à MANIATIS et al ( Molecular Cloning; Elaboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press). On purifie l'ADN double brin d'un sous-clone comportant la mutation désirée et dont le reste de la séquence codant pour la partie CP 2 (ou Cp 1) est resté intègre, et le coupe par des enzymes appropriées, par exemple Eco RI et Eco RV pour isoler le fragment renfermant le gène désiré On ligue alors ce fragment dans un plasmide adapté, qu'il soit30 possible de séquencer et comportant des sites de res- triction permettant d'extraire facilement la séquence insérée pour l'introduire dans un vecteur d'expression et préalablement ouvert par des enzymes compatibles présentes dans son site de liaisons multiples, par exemple par Eco RI35 et Sma I Comme à l'accoutumée,le produit de la ligation peut alors être transfecté dans un hôte approprié, par exemple une souche bactérienne E coli DH 1 En analysant, par exemple, par coupure avec deux couples d'enzymes tels que Eco RI-X Ba I et Eco RI-Bgl II, on peut sélectionner un clone fournissant en électrophorèse les bandes attendues. Le plasmide purifié comprend la séquence nucléotidique d'origine murine attendue complémentaire de la partie C absente de la séquence de chaîne de mammifère ci-dessus à partir du même site de restriction de manière à permettre la ligation en phase dans le cadre lecture. Les différentes techniques utilisées ci-dessus sont bien connues de l'homme de l'art et ont fait l'objet de nombreuses publications faisant partie de l'état de la technique. Les exemples qui suivent illustrent la présente invention sans toutefois la limiter. La Figure 1 représente les comparaisons des AD Nc de chaînes C 0/2 de souris et C Pl humaines de TCR. La Figure 2 représente un oligonucléotide complémentaire de l'AD Nc codant pour la chaîne C 0/2 du TCR murin sauf au niveau des deux bases nécessaires pour introduire le site Bgl II. La -figure 3 représente un oligonucléotide spécifique des chaînes VP 17 de TCR humain. La figure 4 représente les profils de cytométrie de flux obtenus avec un anticorps anti CD 3 de souris de transfec- tants de DOI 519 appelés FRN 17 4 14 (profil noir) obtenus avec un ADN chimérique de l'invention contenant un V/317 humain, par rapport à la lignée de départ DOI 519 (profil blanc). La figure 5 montre l'analyse du transfectant VP 17 FRN 17.4 14 (profils noirs) par le surnageant de E 175 F 3 15 (histogrammes de droite) et par le monoclonal anti CD 3 murin (histogrammes de gauche) par rapport à la lignée de départ DOIS 19 (profils blancs). La figure 6 représente le marquage en double couleur (anti CD 3 humain d'IMMUNOTECH marqué à la phycoérythrine, E 175 F 3 15 révélé par Ig chèvre anti-souris marquée au FITC) des lymphocytes de sang périphériques. PARTIE EXPERIMENTALE EXEMPLE 1 On tire parti de l'existence d'un site Bgl II sur le gène codant pour les chaînes p 1 et P 2 du TCR humain dans leur région C, à proximité de la région J, et de celle d'un site identique à l'exception de deux bases dans la partie homologue de la souris (cf Figure 1). A) Préparation de la séquence nucléotidique codant pour la chaîne C 62 murine mutée contenant un site Bgl II dans la séquence homologue humaine correspondant au site Bgl II présent sur les chaînes Cpi et CP 2 humaines sous forme d'un vecteur comportant ladite séquence. 1 Chaîne Cr 2 murine La séquence de la chaîne CP 2 murine est décrite en détail dans Malissen M et al ( 1984), Cell 37: 1101-1110 Un AD Nc complet contenant toute la partie codante de C 02 a été obtenu à partir d'une banque d'AD Nc de la lignée cel- lulaire murine KB 5 C 20 (décrite dans Albert et al ( 1982), Immunogenetics 16: 533-549) Cet AD Nc a été cloné dans le plasmide p UC 19 Le plasmide résultant p U Cm Cp 2 a été transfecté dans la souche bactérienne DH 1 La bactérie recombinante a été déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) à Paris le 12 Février 1991 sous le n 1-1032 et disponible sans restriction. 2 Mutagénèse dirigée de l'AD Nc codant la chaîne Ca 2 murine. Principe: La procédure de mutagénèse dirigée choisie utilise le phage filamenteux M 13 mp 18 BIORAD Ce bac- tériophage est décrit précisément dans Norrander et al ( 1983) Gene 26: 101-106 Il est disponible commercialement chez plusieurs fabricants, notamment BIORAD Le principe de la manipulation est le suivant: on clone le fragment d'ADN à modifier dans le site de liaisons multiples du phage Ce vecteur phagique existe sous deux formes au cours de son cycle de vie La forme réplicative, dans la bactérie, est essentiellement double brin, la forme encapsidée est simple brin L'ADN des deux formes est purifiable Un oligonucléotide complémentaire de la région à muter, sauf pour la mutation désirée, est hybridé avec la forme simple brin du phage Le brincomplémentaire est ensuite synthétisé in vitro par une ADN polymérase, utilisant l'oligonucléotide comportant la mutation souhaitée pour initier la réaction Une ligase est utilisée pour fermer le nouveau brin sur lui même, à l'extrémité 5 ' de l'oligonucléotide Le double brin complètement homologue, sauf pour la mutation voulue, est transfecté dans E Coli résultant en deux classes de colonies mutantes et non mutantes Les colonies mutantes sont ensuite sélectionnées. Pour introduire le site Bgl II dans l'AD Nc de la chaîne C 02 de souris, on clone cet AD Nc dans le phage M 13 mp 18 On utilise l'oligonucléotide de la figure 2 pour faire la mutagénèse Cet oligonucléotide est complémentaire de l'AD Nc codant pour le gène C 62 murin sauf pour les deux bases nécessaires pour introduire le site Bgl II Ces deux bases sont soulignées sur la figure 2. Les procédures de clonage, transfection, étalement, analyses des colonies, purification des formes simples et doubles brins pour le phage M 13 mp 18 sont décrites précisé- ment par Maniatis et al (déjà cité) L'hôte bactérien utilisé est la souche JM 101 de E coli. Expérimentation: a) Clonage de C 02 murin dans M 13 mp 18 On digère p U Cm Cp 2 par Eco RI et Hind III Cette digestion fournit 3 fragments distinguables par électrophorèse d'Agarose On purifie le fragment intermédiaire de 1000 paires de bases (pb) environ contenant toute la séquence codante de C 62 murine Ce fragment est ligué dans l'ADN double brin du phage M 13 mp 18 préalablement ouvert par Eco RI et Hind III, sites présents dans le site de liaisons multiples de ce vecteur On transfecte alors des colonies de E coli JM 101. De l'analyse de colonies isolées, on retient le clone M 13 EHC/7 pour la suite, on purifie la forme simple brin de M 13 EH Cp 7. b) Mutagénèse de C 32 de souris La procédure utilisée est précisément décrite dans Maniatis et al On doit cependant préciser les points suivants: L'oligonucléotide de la figure 2 est synthétisé sur l'appareil Applied Biosystems 380 B, puis purifié sur colonne sep Pak C 18. On hybride 0 2 Mg du simple brin de M 13 EHCP 7 avec 3 pmoles de Oh CP kinase Aucun autre oligonucléotide n'est utilisé. La température initiale de la réaction d'hybridation est C. La polymérase utilisée est la T 4 ADN polymérase ( 1 unité par réaction) pour compléter en double brin. La transfection est effectuée dans la souche E coli JM 101. La sélection des colonies mutantes se fait par hybridation avec l'oligonucléotide de la figure 2 radiomarqué La température d'hybridation est 42 C Deux lavages de 10 mn à 4 C ont été suffisants pour discriminer les colonies mutantes par autoradiographie. L'ADN d'un sous-clone appelé mu Cp 215 d'une colonie repérée par hybridation radioactive a été digérée par Bgl II, puis séquencé par la méthode de Sanger pour confirmation de la mutation désirée et intégrité du reste de la séquence C 02 murine L'ADN double brin de ce sous-clone est purifié et35 utilisé dans la suite des expériences. 3 Sous-clonage de la chaîne mutée dans p Bluescript SK+ p Bluescript SK+ est un plasmide entièrement caractérisé et disponible commercialement chez la société STRATAGENE. L'ADN double brin de mu CP 215 est coupé par Eco RI et Eco RV et le plus petit des deux fragments purifié sur gel d'Agarose Ce fragment est ligué dans p Bluescript préalablement ouvert par Eco RI et Sma I, deux sites présents dans le site de liaisons multiples de ce plasmide, et transfecté dans la souche d'E coli DH 1 servant d'hôte à la chimère Des colonies isolées sont analysées par coupure avec deux couples d'enzymes Eco RI-Xba I et Eco RI-Bgl II Un clone, appelé p B Smu Cp 215, fournit les bandes attendues (respectivement 1 0 kb et 0 5 kb environ) en électropho- rèse Ce plasmide est purifié et utilisé dans la suite des expériences. B) Obtention d'AD Nc humain codant pour la chaîne du TCR La technique de polymérisation en chaîne (PCR) est choisie pour les raisons citées cidessous: beaucoup de gènes codant pour la chaîne du TCR incluant différentes régions V sont publiés, dont le segment VP 17, rapidité d'obtention d'AD Nc par cette technique, sûreté d'avoir des gènes complets en 5 ', comprenant le codon ATG d'initiation, facilité d'intégrer des sites de restriction en 5 ' du gène pour faciliter le clonage. Obtention d'AR Nm de cellules T humaines On utilise un mélange de lymphocytes périphériques d'individus caucasiens obtenus auprès du Centre de Transfusion Sanguine de Marseille Apres Ficoll, les lymphocytes sont ajustés à 1 million de cellules par millilitre en milieu RPMI, 10 % sérum de veau foetal 20 m M glutamine, lm M pyruvate de sodium, 500 UI de pénicilline, et stimulés à la phytohémagglutinine A ( 10 Mg/millilitre de concentration finale) pendant 3 jours 200 millions de cellules sont utilisées pour purifier leur ARN total. Le protocole utilisé est décrit exactement dans Maniatis et al Environ 50 Mg de RNA sont obtenus par cette méthode. 4 Réactions de PCR Un oligonucléotide Oh CI spécifique des deux chaînes humaines C,02 et C,01 et contenant le site unique Bgl II présent sur les segments géniques C,6 l et C,02 est syn- thétisé de manière analogue à Om Cf. Un oligonucléotide OL 17 spécifique de la séquence de tête de V/17 d'après la définition des sous-familles Vp de Kimura et al ( 1987), Eur J Immunol; 17: 375-383 est également synthétisé. Cet oligonucléotide est présenté en figure 3. Une réaction de PCR a été effectuée avec le couple d'oligonucléotides Oh CP-OL 17. La procédure expérimentale est décrite en détail dans Kawasaki et al ( 1989) PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification; Stockton Press, Henry. A Ehrlich Edition pages 89 et suivantes Les précisions suivantes sont utiles: La quantité d'ARN de départ est de 1 gg pour la synthèse du brin complémentaire d'AD Nc. Pour la réaction de PCR proprement dite, 10 pmoles d'oligo- nucléotides OL 17 et Oh Cp, sont utilisés. Le cycle de PCR est: 1 mn de dénaturation à 95 C, 1 mn d'hybridation à 52 C, 1 minn d'extension à 72 C, et 30 cycles sont effectués sur le ADN Thermalcycler Version 2 2 de Perkin Elmer. Le produit de la réaction est déposé sur gel d'Agarose 1.4 % pour électrophorèse Après coloration au bromure d'éthidium, une bande distincte d'environ 500 pb est découpée et l'ADN électroélué On obtient environ 30 ng d' ADN. 1 ng de cet ADN est amplifié une seconde fois par PCR On purifie de la même manière que précédemment la bande spécifique et 300 ng d'ADN sont obtenus. C) Construction des gènes chimériques Principe: On construit les gènes chimériques en clonant le fragment produit de PCR, coupé par Eco RI et Bgl II dans le grand fragment obtenu de la digestion de p B Smu Cp 215. On coupe p B Smu Cf 215 par Eco RI et Bgl II et le grand fragment appelé Fp B Smu CP 215 est purifié sur gel d'Agarose et électroélué. ng du produit d'amplification obtenu avec les oligonu- cléotides OL 17, Oh CP sont coupés par Eco RI et Bgl II. On ligue ces deux fragments et le produit de la ligation est transfecté dans DH 1. L'analyse de colonies isolées BSGP 17 1, BS Gf 17 11 par coupure Bgl II-Eco RI fournit le fragment attendu d'environ 500 pb Tous les clones sont séquences entre le site Eco RI et le site Bgl II. Le clone BSGP 17 4 est retenu pour la suite des expériences Ce clone possède la séquence d'acides aminés V,17 telle que décrite dans Kimura et al (déjà cité) Il possède par contre des régions D et J différentes. EXEMPLE 2: Expression des gènes chimériaues Principe: La chaîne du TCR est une protéine membranaire qui est exprimée à la surface si, et seulement si, les autres chaînes du complexe du TCR qui lui sont associées (ie chaîne a et complexe CD 3) sont présentes. Pour obtenir l'expression des gènes chimériques précédem- ment construits, on utilise la lignée cellulaire murine DOI S 19 développée par Letourneur F et ai ( 1989) Eur J Immunol: 19: 2269-2274 DOI S 19 est un mutant d'un hybridome T de souris qui possède tous les composants du TCR sauf la chaîne j 3 Cette lignée n'exprime donc pas de TCR à sa surface La transfection d'une chaîne, exogène induit l'expression d'un récepteur fonctionnel dans les cellules tranfectées Le gène chimérique de l'invention contenu dans BSG,17 4 a été transfecté dans cette cellule suivant les protocoles décrits ci-après: 1) Sous- clonage des gènes chimériques dans un vecteur d'expression eucaryote Principe: Le vecteur d'expression choisi est le plasmide p Hp Prl-néo. I 1 est décrit précisément dans Gunning P et al ( 1987) Proc Natl Acad Sci USA; 84: 4831-4835 Le gène à exprimer est sous-cloné en aval du promoteur p actine et en amont d'un site de polyadénylation présents sur ce plasmide Ces deux signaux assurent la synthèse d'un RNA messager fonctionnel du gène inséré Par ailleurs, ce plasmide possède le gène de résistance néomycine qui confère la résistance à une série d'antibiotiques, dans l'exemple préféré l'antibioti- que G 418, aux cellules ayant intégré le plasmide. De plus, une origine de réplication et un gène de résis- tance à l'ampicilline sont également présents permettant la sélection et la réplication dans E coli. Expérimentation: On coupe le plasmide BSGP 17 4 par les enzymes Bam HI et Sal I et le plus petit des deux fragments ( 1 2 kb) est purifié sur gel d'Agarose Ce fragment comportant la totalité de la séquence codante du gène chimérique est ligué au plasmide30 p HB Prl-néo préalablement ouvert par Bam HI et Sal I Le produit de ligation est transfecté dans E coli DH 1 et de l'analyse de colonies isolées par la coupure Bam HI et Sal I, on retient le clone appelé néo G 317 4 qui fournit le fragment de 1 2 kb attendu sur l'électrophorèse d'Agarose. Néo GP 17 4 a été déposé à la CNCM le 24 Septembre 1991 sous le n I 1144. 2 Transfection des gènes chimériques dans DOI 519 La procédure de transfection choisie est l'électroporation. Le plasmide néo GP 17 4 est purifié sur gradient de chlorure de Césium tel que décrit dans Maniatis et al (déjà cité), et repris dans du TE (Tris 10 m M, EDTA 1 m M p H 8), à raison de 1 mg/ml Les cellules DOI 519 sont cultivées en milieu complet (Dubelco modified Eagle Medium, (DMEM) 10 % de serum veau foetal (SVF), 2 m M glutamine, 1 m M sodium pyruvate, 500 IU penicilline, 500 IG streptomycine, 50 g M P mercaptoéthanol) 10 millions de cellules DOI 519 en phase exponentielle de croissance sont lavées 3 fois en tampon phosphate salé (PBS: 0,14 M Na Cl, 10 m M phosphate de sodium p H 7,2) Les cellules sont reprises dans 500 M 1 de PBS dans une cuve d'électroporation (Biorad), 0,4 cm entre les électrodes On ajoute 10 Ml de plasmide à transfecter ( 10 gg) et on incube 10 mn à température ambiante Le choc électrique est effectué conformément aux instructions du constructeur sur un appareil Biorad (Gene Pulser Apparatus) suivant les conditions suivantes: voltage à 250 V, capacité à 250 micro Farad Après le choc, les cellules sont incubées 10 mn à température ambiante puis reprise en milieu complet Les cellules sont ensuite incubées 24 h à 37 C en atmosphère humide à 7 % CO 2 On distribue alors les cellules à raison de 5 104 cellules par ml en plaques 24 puits (Falcon) en milieu complet supplémenté à 3 mg/ml *d'antibiotiques G 418 (GIBCO). Après 15 jours les colonies résistantes à l'antibiotique sont analysées en cytométrie de flux Avec le plasmide néo GP 17 4 on obtient les clones résistants FRN 17 4 1 FRN 17 4 30 Ces clones sont analysés en cytométrie de flux avec un anticorps anti CD 3 murin (anticorps 2 Cll décrit dans Leo et ( 1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 1374). Pour chaque clone, 105 cellules dans une solution de DMEM 4 % SVF, 0,02 % azide de sodium (milieu de FACS) et 15 Mg/ml d'anticorps anti CD 3 murin sont incubés pendant 45 mn à 4 C sous agitation Après trois lavages en milieu de FACS, on incube les cellules avec un anticorps polyclonal de chèvre anti-immunoglobuline de rat marqué au FITC (Réactif Immunotech à 15 Mg/ml en milieu de FACS pendant 30 mn à 4 C sous agitation Après 3 lavages en milieu de FACS, les cellules sont fixées en PBS à 1 % formaldéhyde et analysées sur l'appareil de cytométrie de flux Facscan de Becton Dickinson 105 cellules DOI S 19 sont traitées de la même façon et servent de contrôle négatif. Les profils obtenus pour le meilleur expresseur de la transfection (FRN 17 4 14) sont montrés en figure 4 (profil noir) par rapport au profil de DOI 519 (profil blanc) La lignée cellulaire FRN 17 4 14 a été retenue pour l'immunisa- tion. 3 Immunisation des souris Balb/c Trois souris Balb/c sont immunisées avec FRN 17 4 14 Le protocole d'immunisation est le suivant: Jour O: 10 millions de cellules FRN 17 4 14 injectées par voie intrapéritonéale. Jour 20: 10 millions de cellules FRN 17 4 14 injectées par voie intrapéritonéale. Jour 40: 5 millions de cellules injectées par voie intraveineuse. Jour 43: Prélèvement des rates pour fusion. 4 Fusion par hybridation lymphocytaire On fusionne les splénocytes de deux souris immunisées avec le myélome X 63 Ag 8 653 suivant le protocole décrit par Kohler et Milstein ( 1975) Nature 256; 495-497. L'analyse des surnageants des clones résultant de la fusion se fait par cytométrie de flux sur FRN 17 4 14 versus DOI 519. p 1 de surnageant de chaque clone sont prélevés 50 Ml sont incubés avec 50 gl de milieu de FACS contenant 105 cellules FRN 17 4 14 Les 50 p 1 restant sont incubés avec 50 g 1 de milieu de FACS mais contenant 105 cellules DOI 519. Le protocole est le même par ailleurs que celui utilisé pour l'analyse des transfectants. Des 300 surnageants testés, quatre surnageants marquent FRN 17 4 14 et ne marquent pas DOI 519 Un monoclonal, E 175 F 3 15, est analysé de manière plus complète dans la suite. 5 Analyse du monoclonal E 175 F 3 15 a Cytométrie de flux sur le transfectant FRN 17 4 14 La figure 5 montre les profils obtenus sur le transfectant FRN 17 4 14 et DOI S 19 avec le surnageant E 175 F 3 15 suivant le protocole décrit pour le screening des anticorps comparés aux profils obtenus avec l'anti CD 3 murin On constate que E 175 F 3 15 marque de façon comparable par rapport à l'anti CD 3 les lignées FRN 17 4 14 et DOI 519. b Cytométrie de flux sur des transfectants portant d'autres VB humains De la même manière que pour le transfectant FRN 17 4 14, on a obtenu des transfectants FRN 3 4 17 exprimant un gène chimèreÀ contenant VP 3 1; FRN 8 1 2 exprimant un gène chimère portant Vf 8 1; FRN 2 7 6 exprimant un gène chimère portant VP 2 3 en transfectant les gènes chimères correspon- dant dans DOI S 19 Le surnageant E 175 F 3 15 ne marque pas ces différentes lignées. c Cytométrie de flux sur sang total Si les anticorps reconnaissent bien la chaîne Vp 17, une sous population de lymphocytes T périphériques exprimant Vf 317 doit être marquée spécifiquement par ces anticorps. Des doubles marquages ont été effectués sur sang périphéri- que avec l'anticorps E 175 F 3 15 révélé par un polyclonal marqué au FITC, et l'anticorps SPVT 3 b spécifique du CD 3 humain (réactif Immunotech) marqué à la phycoérythrine. Expérimentation Le sang est prélevé sur EDTA ( 10 m M final) pour éviter la coagulation 100 pi de sang sont centrifugés et le culot cellulaire est repris par 200 Ml de surnageant E 175 F 3 15 et incubé 30 mn à température ambiante Deux lavages sont effectués en milieu de FACS et le culot cellulaire est repris par 100 pl de milieu de FACS contenant 15 pg/ml d'un anticorps polyclonal de chèvre anti-immunoglobuline de souris (réactif Immunotech) Deux lavages sont effectués en milieu de FACS Le culot cellulaire est repris en milieu de FACS contenant 15 Mg/ml d'un anticorps de souris distinct (réactif de contrôle Ig G 2 a d'Immunotech) On incube 2 mn à température ambiante On effectue deux lavages supplémen- taires en milieu de FACS et le culot cellulaire est repris dans 200 Ml de milieu de FACS contenant 10 Mg/ml de l'an- ticorps SPVT 3 b marqué à la phycoérythrine (réactif Immunotech) On incube 15 mn à température ambiante On effectue deux lavages en milieu de FACS On ajoute 1 ml de tampon de lyse préchauffé à 25 C (dilution 1/25 du réactif de lyse d'Immunotech) et l'on mélange vivement aussitôt. Après la lyse, on ajoute 250 il de fixateur (réactif Immunotech) On centrifuge et on reprend le culot dans 0,5 ml de PBS à 0,5 % de formaldéhyde Les cellules sont analysées sur Facscan de Becton Dickinson Le résultat obtenu avec le surnageant E 175 F 3 15 est présenté en figure 6. On constate qu'environ 3 % des cellules T sont marquées par l'anticorps E 175 F 3 15. Par le même protocole, on effectue des marquages sur le sang d'autres individus à l'aide de l'anticorps E 175 F 3 15. Cet anticorps marque entre 1 et 3 % des cellules T périphé- riques pour les individus testés. De ces manipulations ont déduit que E 175 F 3 15 est spécifi- que du segment Vf 17 humain. EXEMPLE 3 On a préparé une préparation injectable comprenant: Anticorps monoclonaux de l'exemple 2 5 mg eau pour préparations injectables 1 ml REVENDICATIONS -1 ADN recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique chimère codant pour la chaîne i du récepteur pour l'antigène des cellules T, ladite séquence étant constituée: d'une séquence provenant d'un mammifère et codant pour la totalité d'une partie variable (VP 17) et sa séquence de tête, diversité (DP) et de jonction (Jo), et d'une séquence d'origine murine codant pour la partie complémentaire constante (Cpi ou C 02) absente de la séquence de mammifère ci-dessus, les deux séquences étant liées au niveau d'un site de restriction naturel ou créé artificiellement. 2 ADN recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce que Jle site de restriction est naturel sur la séquence codant pour la partie C 0. 3 ADN recombinant selon la revendication 1 ou 2 carac- térisé en ce que la séquence provenant d'un mammifère est la séquence codant pour une chaîne VP 17 d'origine humaine et en ce que le site de restriction est Bgl Ii. 4 ADN recombinant selon l'une quelconque des revendica- tions 1 et 3 caractérisé en ce que le site de restriction est créé artificiellement sur la chaîne d'origine murine. ADN recombinant selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur d'expression eucaryote. 6 ADN recombinant selon la revendication 5 caractérisé en ce que le vecteur d'expression eucaryote est un plasmide dérivant de Php Prl-Néo. 7 Anticorps caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par une succession d'étapes dans lesquelles intervient un ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8 Anticorps anti chaîne VP 17 du récepteur des cellules T. 9 Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles renferment des anticorps selon la revendication 7 ou 8 - Produits de diagnostic caractérisés en ce qu'ils- renferment des anticorps selon la revendication 7 ou 8. 11 Procédé de préparation d'un ADN recombinant tel que défini à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on ligue une séquence nucléotidique constituée d'au moins la totalité de la séquence codant pour les parties Vfi 17, D: et JP d'une chaîne du récepteur de l'antigène des cellules T d'un mammifère jusqu'au niveau d'un site de restriction, avec une séquence nucléotidique d'origine murine comprenant l'homologue de la partie complémentaire de la partie C 01 absente de la séquence de chaîne de mammifère ci-dessus, à partir du même site de restriction que ci-dessus, le-dit site de restriction étant artificiellement créé sur l'une, l'autre ou les deux séquences, pour obtenir la chimère attendue, puis si désiré, ligue une séquence comprenant la totalité des parties V,617, D 13, JP et Cp ci- dessus avec un vecteur d'expression eucaryote, puis si désiré, isole la nouvelle chimère obtenue. 12 Procédé de préparation d'anticorps mettant en oeuvre initialement le procédé selon la revendication il qui comporte une étape de préparation de 1 'ADN recombinant défini à la revendication 5 caractérisé en ce qu'en outre l'on transfecte une cellule eucaryote comportant tous les éléments permettant la synthèse du récepteur de l'antigène des cellules T, à l'exception de la chaîne homologue à la chaîne codée par la séquence d'ADN chimère ci-dessus, utilise comme antigène les cellules ainsi transfectées chez la race murine correspondante, fusionne des cellules de rate prélevées sur les murins auxquels a été administré l'antigène à des cellules de myélome pour préparer, selon les méthodes connues en elles-mêmes, des anticorps et sélectionne les anticorps contre le produit de la séquence variable du mammifère à l'aide des cellules eucaryotes transfectées à l'aide des ADN chimères ci-dessus.