FR 2683723 A1 19930521 FR 9113999 A 19911114 NOUVEAUX MEDICAMENTS ANTIVIRAUX ACTIFS SUR LE VIRUS VIH La présente invention est relative à l'utilisation d'aminol-désoxy-l-cétoses dérivés de macrolides polyéniques et en particulier de l'amphotéricine B comme inhibiteurs de la réplication de VIH. Depuis l'identification du virus VIH-1 comme agent causal du SIDA, de nombreuses recherches ont été faites dans le but de comprendre le mécanisme de l'infection virale, et d'obtenir des traitements anti-vi- raux efficaces. Jusqu'à présent, des analogues de nucléosides tels que l'AZT ( 3 '-azido2 ',3 '-didéoxythy midine) et le dd I ( 2 ',3 '-didéoxyinosine) ont été utilisés pour le trai- tement du SIDA et ont abouti à une amélioration l'état clinique des patients Malheureusement, des effets secon- daires sévères du traitement par 1 'AZT, en particulier une dégénérescence de la moelle osseuse, ont été rapportés, et en outre, de nombreux patients tolèrent mal la drogue ou deviennent réfractaires à ses effets bénéfiques. En ce qui concerne le dd I, son utilisation n'est encore qu'au stade expérimental, et son efficacité demande une évaluation complémentaire. I 1 a, par ailleurs, été montré que l'Amphotéricine B (Am B) et certains de ses dérivés sont actifs in vitro contre plusieurs virus à ADN et ARN à en- veloppe lipidique, et contre différentes souches d'herpes virus Le méthylester de l'Amphotéricine B lSCHAFFNER et al, Biochem Pharm, 35, 4110-4113, 1986 l, ainsi que l'Amphotéricine B encapsulée dans les liposomes lPONTANI et al, Antiviral Res 11, 119-126 ( 1989)l ont également été décrits comme inhibiteurs de la mort cellulaire et de l'expression virale dans des cellules T infectées in vitro par VIH-1. Les mécanismes d'action antivirale de l'amphotéricine B et de ses dérivés ne sont pas connus. Il a été supposé que l'amphotéricine B agirait sur le cholestérol de l'enveloppe virale, ce qui aurait pour effet de prévenir la pénétration du virus dans les cellules cibles. L'Amphotéricine B est actuellement utilisée chez les patients atteints de SIDA, dans le traitement des infections à germes opportunistes dues à des mycoses profondes qui surviennent fréquemment chez ces malades. Des études cliniques ont montré qu'une thérapie antifon- gique doit être maintenue de façon indéfinie afin de pré- venir les rechutes, ou même utilisée de manière préven- tive Cependant, des effets secondaires fréquents telles que la fièvre ou une néphrotoxicité grave sont associés au traitement à long terme par l'Amphotéricine B. En recherchant des antifongiques plus actifs, bénéficiant d'une toxicité réduite et d'une efficacité améliorée, l'équipe des Inventeurs a récemment obtenu une série de nouveaux dérivés d'Amphotéricine B dont la solu- bilité était améliorée, et la toxicité faible; ces déri- vés sont décrits dans la Demande de Brevet européen n'428 440. Or, les Inventeurs ont maintenant fait la constatation de l'efficacité particulière de certains de ces dérivés comme inhibiteurs de l'infection par VIH-1. La présente invention a pour objet l'utilisation de dérivés de formule générale (I), PRA -R X NH Ré Ol- N dans laquelle: Rl représente la partie macrocyclique d'un macrolide polyénique, de préférence l'amphotéricine B, R 2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, et R 3 représente un groupe méthyle, éthyle, propyle, phényle, pour l'obtention de médicaments antiviraux, actifs sur le virus VIH et sur le virus de la rhinite humaine.10 Un dérivé préféré pour l'utilisation conforme à la présente invention est le 1-déoxy-l-amino-4,6-0- benzylidène-D- fructosyl-Am B. L'action des dérivés d'Am B de formule géné- raie (i) a été étudiée sur des cellules T Jurkat et CEM, et sur des lymphocytes sanguins normaux (PBM Cs) infectés par le virus VIH in vitro. Les Inventeurs ont montré que ces dérivés inhibent presque complètement la réplication de VIH-1 dans tous les types cellulaires, à des concentrations très inférieures aux concentrations cytotoxiques. C'est ainsi, par exemple que le 1-déoxy-1- amino-4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B inhibe à 98 % la production de particules virales, mesurée par l'activité de la Transcriptase inverse (RT) et le dosage de la pro- téine p 24 dans les surnageants de culture Parallèlement à cette inhibition, on observe une diminution de l'expression de la protéine gp 120 à la surface cellu- laire, ainsi que le maintien de la présence de CD 4. Le 1-déoxy-1-amino-4,6-O-benzylidène-D-fruc- tosyl-Am B prévient la diminution quantitative du sous- groupe CD 4 des cellules mononucléaires du sang périphé- rique qui est observée pendant l'infection. Par ailleurs, les cellules infectées traitées par ce dérivé récupèrent la capacité de répondre à l'activation par un anticorps anti-CD 3, qui est perdue dans les cellules infectées par VIH. En outre, le l-déoxy-l-amino-4,6-O-benzyli- dène-D-fructosyl-Am B est capable d'inhiber la réplication de mutants du VIH résistant à l'AZT. D'autre part, dans des cultures à long terme de thymocytes humains infectés, le 1-déoxy-1-amino-4,6-O- benzylidène-D-fructosyl-Am B est capable de maintenir un rapport normal entre les cellules CD 4 + et CD 8 +, ce qui renforce l'intérêt potentiel de cette molécule dans le traitement des enfants nés de mère séropositive. Les Inventeurs ont observé que le prétraite- ment des cellules par les dérivés d'Am B de formule géné- rale (I) avant l'infection, ou le prétraitement du virus lui-même n'ont aucun effet inhibiteur sur la réplication virale Contrairement à ce qui a donc été proposé pour l'Amphotéricine B, ces dérivés de formule générale (I) n'inhibent donc pas la phase de pénétration virale. Les Inventeurs ont également observé une inhi- bition des effets cytopathologiques du virus de la rhi- nite humaine (HRV 14, qui n'est pas un virus enveloppé) dans des cultures de cellules Hela-Ohio Ceci confirme que le mécanisme d'action des dérivés de formule générale (I) est différent de celui qui a été proposé pour d'autres dérivés de l'Am B, et porte sur une autre étape que la pénétration du virus D'autre part, le 1 déoxy-1- amino-4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B n'inhibe pas l'activité transcriptase inverse in vitro et comme indiqué plus haut, il agit sur des mutants de VIH AZT-résistants La transcriptase inverse ne semble donc pas la être la cible des dérivés de formule générale (I). Les Inventeurs supposent actuellement que les dérivés de formule générale (I) agiraient en inhibant la protéase pl O du HIV, et que cette activité serait en relation avec la présence d'un groupement hémi-acétal dans ces molécules. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples montrant l'activité sur HIV d'un dérivé de formule générale (I). Il va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. I PROTOCOLES GENERAUX Le sel de N-méthyl glucamine du 1-déoxy- 1-amino-4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B, est préparé comme décrit dans la Demande Européenne n' 428 440 Il est dissous dans une solution stérile de glucose à 5 % dans l'eau, puis dilué dans du milieu de culture. Les cellules T (Jurkat et CEM) utilisées sont très permissives à l'infection par le VIH Elles sont cultivées dans du milieu RPMI 1640 complémenté avec 10 % de sérum de veau foetal, 2 m M de glutamine et un mélange de pénicilline et streptomycine Les cellules mononu- cléaires du sang périphérique, sont obtenues à partir du sang de donneurs sains, isolées sur un gradient de Ficoll Hypaque et stimulées avec 10 gg/ml de Phytohémagglutinine A (PHA), pendant deux jours, dans du milieu RPMI 1640 auquel sont ajoutés préalablement à l'infection par VIH, de l'amikacine et de la vancoinycine ( 10 mg/ml), du poly- brène ( 1 mg/ml) et du sérum anti-interféron-gamma ( 5 U/ml) Après infection, les PMB Cs sont cultivés ( 105 par puits) dans des plaques de 96 puits à fond plat dans le même milieu RPMI 1640 ( 200 g 1 par puits). Des préparations infectieuses de la souche LAV/Bru de VIH-1 sont obtenues à partir de surnageants de cultures de cellules CEM (clone 13) infectées de façon chronique, filtrés à travers un filtre de 0,45 gm. Pour l'infection, des cellules fraîches de type Jurkat ou CEM sont centrifugées et le culot est incubé pendant 2 heures à 37 C avec la préparation virale ( 10000 cpm d'activité transcriptase inverse/106 cellules, ce qui correspond à une multiplicité d'infection de 0,04 à 0, 1) Les cellules sont alors lavées et resuspendues ( 0,5 x 106/ml) dans du milieu de culture frais. L'activité transcriptase inverse est déterminée à des temps précis après l'infection, à partir du surnageant acellulaire des cellules infectées. Les cellules PBM Cs ( 2 x 106/ml) sont infectées avec les mêmes virus et dans les mêmes conditions que les cellules Jurkat ou CEM Elles sont ensuite lavées et resuspendues dans du milieu de culture frais, dans des plaques de 96 puits à fond plat ( 105 cellules par puits dans 200 ml). L'activité transcriptase inverse est déter- minée aux temps indiqués, à partir du surnageant de culture, selon le protocole décrit par REY et al, Biochem Res Comm 121, 126-133 ( 1984). L'antigène viral p 24 a été quantifié, dans le surnageant de cellules infectées, par essai radioimmunologique, en utilisant le protocole préconisé par le fabricant (ABBOTT, Division Diagnostic). L'expression membranaire du CD 4 et de la Gp 120 est mesurée à l'aide respectivement des anticoprs mono- clonaux 110-4 ( 2 gg/ml), OKT 4 ( 0,5 gg/ml), révélé par un anticorps de chèvre anti-rg de souris conjugué à l'isothiocyanate de fluorescéine. La fluorescence est mesurée à l'aide d'un compteur de cellules FACSTAR (BECTON DICKINSON, MOUNTAIN VIEW, CA) Les résultats sont exprimés en intensité moyenne de fluorescence. L'anticorps monoclonal OKT 4 spécifique de CD 4 a été acheté auprès de ORTHO PHARMACEUTICAL CORPORATION, (Raritan, NJ). L'anticorps monoclonal 110 4 (GENETIC SYSTEMS CORP, Seattle, WA), dirigé contre la gpll O reconnait également la gp 120 à la surface des cellules T. II) ACTION DU 1-DEOXY-1-AMINO-4,6-O- BENZYLIDENE-D-FRUCTOSYL- AMB (DABFA) SUR LA REPLICATION DE VIH-1 Les cellules T de type Jurkat et CEM sont infectées avec la souche de VIH-1 LAV/BRU. EXEMPLE 1 Action sur l'activité transcri Dtase inverse L'infection virale et la réplication sont sui- vies par mesure de l'activité transcriptase inverse dans les surnageants de cultures. Comme le montre la figure 1, l'activité trans- criptase inverse est décelable à partir du 4 ème jour d'infection pour les deux types cellulaires et un pic im- portant d'activité, à 3,2 x 106 et 1,5 x 106 cpm/ml, est observé au 7 ème et 8 ème jour après l'infection, respecti- vement dans les cellules Jurkat (Figure la) et CEM (Figure lc) L'activité transcriptase inverse décroît alors jusqu'à un plateau (environ 0,2-0,4 x 106 cpm/ml). Ce plateau reste stable pendant plus de 2 mois, et reflète une infection chronique des cellules T Les cel- lules infectées demeurent viables, et dans les deux mois qui suivent l'infection on n'observe ni mort cellulaire, ni inhibition de la croissance cellulaire significatives. Pour mesurer l'activité anti-VIH du 1-déoxy-1- amino-4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B, des cellules infectées sont cultivées en présence de doses croissantes (entre 0,1 p M et 100 g M) du produit; celui-ci est ajouté juste après l'inoculation, et les concentrations sont maintenues constantes pendant l'infection, en diluant de moitié, tous les 3 jours, les cellules en croissance dans du milieu frais contenant la concentration souhaitée. Les résultats correspondants sont illustrés par les figures lb et ld: en ordonnée est représentée l'activité transcriptase inverse, mesurée au 8 ème jour de l'infection virale, et en abscisse la concentration en 1- déoxy-l-amino-4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B. L'inhibition de l'activité transcriptase inverse est observée aussi bien dans les cellules Jurkat (Figure lb) que dans les cellules CEM (Figure ld), à partir de 5 p M et l'activité est complètement inhibée (inhibition de 88 %, N = 4) à 10 g M de l-déoxy-l-amino- 4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B Cette dernière concen- tration a donc été choisie pour la suite des études sur l'activité anti-VIH du produit Aucune inhibition signi- ficative n'est observée pour des concentrations de 1- déoxy-l-amino-4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B infé- rieures à 1 JM. La viabilité cellulaire a été estimée en parallèle A des concentrations supérieures à 100 p M, aucun effet cytotoxique du 1-déoxy-l-amino-4,6-O-15 benzylidène-D-fructosyl-Am B n'a été observé, ni sur les cellules Jurkat ni sur les cellules CEM Il apparaît donc que le 1-déoxy-l-amino-4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B inhibe la réplication de VIH, à des doses dépourvues de cytotoxicité. Il a été vérifié que le l-déoxy-l-amino-4,6-O- benzylidène-D-fructosyl-Am B n'a aucune action directe sur l'activité transcriptase inverse, et que, en conséquence, la décroissance de cette activité ne peut être due à une inhibition directe de l'enzyme par le l-déoxy-l-amino- 4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B. EXEMPLE 2 Action sur l'expression de l'antigène viral soluble p 24 L'expression de l'antigène viral soluble p 24 a été recherchée parallèlement à l'activité transcriptase inverse, dans les surnageants de cultures cellulaires. Les cellules Jurkat, ainsi que les cellules CEM non traitées produisent de grandes quantités de p 24 au 8 ème jour après l'infection. De même que pour l'activité transcriptase inverse, l'addition continue de 1-déoxy-l-amino-4,6-O- benzylidène-D-fructosyl-Am B à une concentration de 10 M, maintenue constante pendant 12 jours après l'infection, décroît fortement la quantité d'antigène p 24 ( 88 % d'inhibition, N = 3) dans les deux lignées cellulaires. Ces résultats sont illustrés dans la figure 2 qui représente la production d'antigène p 24 4 jours et 8 jours apres l'infection: M Cellules infectées non traitées Cellules traitées par le 1-déoxy-l-amino-4,6-O- benzylidène-D-fructosyl-Am B a Cellules traitées par l'Am B( 10 PM). Le traitement par l'Am B est effectué dans les mêmes conditions que le traitement par le 1-déoxy-1- amino-4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B Ces résultats montrent que l'efficacité du 1-déoxy-l-amino-4,6-O-15 benzylidène-D- fructosyl-Am B sur la multiplication du VIH est très supérieure à celle de l'Am B. Une inhibition significative est observée pour les concentrations en 1-déoxy-l-amino-4,6-O-benzylidène- D-fructosyl-Am B supérieures à 5 i M. Dans une autre expérience, 10 M de 1-déoxy-1- amino-4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B sont ajoutés ou bien en prétraitement 24 heures avant l'infection, ou bien pendant les 2 heures de l'étape d'inoculation, ou bien en traitement continu, comme décrit précédemment, pendant les 12 jours suivant l'infection. Dans ce cas, l'addition de 1-déoxy-l-amino- 4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B préalablement à l'in- fection, ou bien pendant l'étape de 2 heures qui cor- respond à l'adsorption virale, n'entraine aucune inhibi- tion significative de la secrétion de p 24, ou de l'activité transcriptase inverse Ce résultat montre que le 1-déoxy-l-amino-4,6-Obenzylidène-D-fructosyl-Am B est capable d'inhiber la réplication de VIH dans les cellules infectées, mais ne bloque pas les étapes initiales d'adsorption et de pénétration de VIH-1. EXEMPLE 3 Action sur l'ex Dression de l'antigène viral a D 120 et l'antiaène cellulaire CD 4 La réplication de VIH-1 peut également être suivie par l'expression de la glycoprotéine d'enveloppe gp 120 à la surface des cellules infectées, ainsi que par la diminution de l'antigène de membrane CD 4. Des analyses d'immunofluorescence sont effec- tuées au 8 ème jour de l'infection afin de vérifier si l'inhibition de la réplication de VIH par le l-déoxy-1- amino-4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B a pour résultat une expression membranaire réduite des antigènes viraux. Au 8 ème jour d'infection dans les cellules Jurkat et CEM non traitées, on observe des niveaux élevés de gp 120 et des niveaux réduits de CD 4 (ce qui est véri- fié par l'utilisation des anticorps monoclonaux 110 4 et OKT 4 respectivement). Un traitement continu avec 10 p M de l-déoxy-1- amino-4,6-O-benzylidène-D-fructosyl-Am B diminue considé- rablement l'expression membranaire de gp 120 dans les deux lignées cellulaires Parallèlement, le niveau de l'antigène de membrane CD 4 dans les cellules infectées traitées au 1-déoxy-l-amino-4,6-O-benzylidène-D-fructo- syl-Am B augmente jusqu'à atteindre celui des cellules non infectées. Le niveau de l'antigène de membrane CD 3 est inchangé dans les cellules infectées traitées ou non traitées. EXEMPLE 4 Action du l-déoxv-l-amino-4,6-O-benzvlidène- D-fructosyl-Am B sur la réulication du VIH dans les PBMC Des PBM Cs sont isolés d'individus sains, et infectés par VIH-1 La production d'antigène p 24, ainsi que l'activité transcriptase inverse peuvent être détec- tées dans les surnageants des cultures infectées, 3 jours après l'infection Le maximum d'activité transcriptase inverse et de synthèse de p 24 sont observées respective- ment entre le 6 ème et 7 ème jour, et le 5 ème et le 6 ème i jour Aucune mortalité cellulaire n'est observée à ce moment-là. Les PBMC infectés sont traités de façon continue comme décrit précédemment pour des cellules Jurkat et CEM, par des concentrations croissantes de 1-déoxy-l-amino-4,6-O-benzylidène-D- fructosyl-Am B. L'effet du l-déoxy-l-amino-4,6-O-benzylidène- D-fructosyl-Am B sur l'activité transcriptase inverse et sur la sécrétion de P 24 est évalué au 6 ème jour. Comme dans le cas des cellules Jurkat et CEM, le produit inhibe presque totalement l'activité trans- criptase inverse, ainsi que la synthèse de P 24 ( 92 ,4 et 88 ,6 % d'inhibition respectivement, N = 3) à une concen- tration de 10 p M. Des concentations inférieures à 1 p M ne produisent qu'une faible inhibition, tandis que des concentrations supérieures à 20 pm n'ont pas pour effet une action anti VIH plus significative. D'autre part, le l-déoxy-l-amino-4,6-O- benzylidène-D-fructosyl-Am B est dépourvu d'effet cytotoxique sur les PBMC à des concentrations allant jusqu'à 10-3 M. Il apparaît donc que le 1-déoxy-1-amino-4,6-O- benzylidène-D-fructosyl-Am B inhibe de façon efficace la réplication de VIH-1 dans des cellules T humaines normales et à des concentrations non cytotoxiques. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'Invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente Invention. REVENDICATIONS 1) Utilisation de dérivés de formule générale ORA (z) O o :H -o N VI dans laquelle: Rl représente la partie macrocyclique d'un macrolide polyénique, R 2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, et R 3 représente un groupe méthyle, éthyle, propyle, phényle, pour l'obtention de médicaments antiviraux, actifs sur le virus VIH et sur le virus de la rhinite humaine. 2) Utilisation selon la Revendication 1, caractérisée en ce que le dérivé utilisé est le 1-déoxy-1-amino-4,6-0 benzylidène-D-fructosyl-Am B. t