FR 2679565 A1 19930129 FR 9209045 A 19920722 ANALOGUES DE L'HIRUDINE, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN THERAPEUTIQUE La présente invention porte sur des polypeptides analogues de l'hirudine, sur un procédé permettant de les préparer, et sur des compositions pharmaceutiques les contenant. L'hirudine, isolée tout d'abord à partir de la sangsue Hirudo medicinalis, est bien connue comme inhibiteur polypeptidique de la thrombine (Markwardt, F, Methods in Enzymology, 19, page 924; Markwardt, F, 1985, Biomed. Biochim Acta 44, page 1007). En particulier, l'hirudine accomplit son activité anticoagulante en se liant à la thrombine par l'intermédiaire d'interactions ioniques, empêchant de cette manière la conversion du fibrinogène en fibrine et la formation résultante du caillot. Dans des études effectuées sur des animaux, l'hirudine s'est révélée comme étant efficace dans la prévention des thromboses veineuses, des occlusions vasculaires et de la coagulation induite par la thrombine intravasculaire disséminée. En outre, l'hirudine est caractérisée par une faible toxicité et par une propriété antigénique qui n'est guère existante ou qui est absente, et également, elle est rapidement éliminée de la circulation (Markwardt, F et al, 1982, Thromb Haemostasis 47, page 226). On connaît trois variants naturels de l'hirudine. La séquence d'un premier variant, appelé H Vl, a été déter- minée par Dodt et al, FEBS 165 ( 1984) 180-184. La séquence d'acides aminés du variant H Vl est la suivante (Eur J Biochem 138, 9-37, 1984): Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln- Asn-Leu-Cys Leu 30 Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu Gly-Ser-AspGly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr 60 Z Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro Glu-GluTyr-Leu-Gln. I SOH Un second variant, appelé HV 2, a été décrit par Dodt et al, Biol Chem Hoppe-Seyler 367 ( 1986) 803-811 et un troisième variant, appelé HV 3, a été décrit par Harvey et al., Proc Natl Acad Sci USA ( 1986) 1084-1088. La présente invention a pour objet un polypeptide dérivé de l'hirudine ayant la formule suivante (I): P-(Gly)n-X (I) dans laquelle: P est une fraction polypeptidique de HV 1 ou de HV 1 (Val 65), ayant les séquences d'acides aminés telles que définies à la Figure 1; (Gly) est le radical bivalent de la glycine -NH-CH 2-CO; X représente -OH ou -NH 2; et N vaut zéro ou 1; avec la condition que, lorsque P représente H Vl et N vaut zéro, X représente seulement -NH 2, et que, lorsque N vaut 1, X représente seulement -OH. La présente invention comprend également les sels pharmaceutiquement acceptables des composés de la formule (I). Des exemples de sels pharmaceutiquement acceptables peuvent être les sels avec des acides minéraux pharmaceu- tiquement acceptables, par exemple, l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique, et les sels avec des acides organiques pharma- ceutiquement acceptables, par exemple, l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide succinique, l'acide ascorbique et l'acide tartrique. D'autres exemples de sels pharmaceutiquement acceptables peuvent être les sels avec des bases minérales pharmaceutiquement acceptables, par exemple, les sels de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium ou d'ammonium, ou les sels avec des bases organiques qui ont un azote sali- fiable, couramment utilisés dans la technique pharmaceutique. En outre, étant donné que les polypeptides dérivés de l'hirudine conformes à l'invention contiennent simulta- nément des groupes carboxyliques libres et des groupes amino libres, ils peuvent également former des sels internes. Les composés qui font l'objet de la présente invention peuvent être préparés par un procédé comprenant: (a) la préparation d'un vecteur d'expression, comprenant une molécule d'ADN codant pour un polypeptide dérivé de l'hirudine, représenté par la formule (I>, dans laquelle, dans les conditions mentionnées ci-dessus, X représente -OH, qui est capable de conduire la synthèse dudit polypeptide dans un microorganisme hôte approprié; b'D L'introduction dudit vecteur d'expression dans ledit microorganisme hôte approprié; (c) l'expression, la sécrétion et l'isolement dudit polypeptide à partir dudit microorganisme hôte, permettant ainsi d'obtenir un composé de la formule (I), dans laquelle, dans les conditions mentionnées ci- dessus, P, -(Gly> et N sont tels que définis ci-dessus et X représente - OH; et (d) si on le désire, la conversion enzymatique d'un composé de la formule (I) dans laquelle, dans les conditions mentionnées ci-dessus, N vaut 1 et X représente -OH, en un composé correspondant de la formule (I) dans laquelle, dans les conditions mentionnées ci-dessus, n vaut zéro et X représente -NH 2, par une enzyme d'amidation appropriée et, si on le désire, la conversion d'un composé de la formule (I) en un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci. Dans la présente invention, par le terme "AMORCE", on entend faire référence à un NUCLEOTIDE AMORCE. Les dérivés polypeptidiques de la formule (I), dans laquelle N vaut 1 et X représente -OH lmutant H Vl (Gly 66) et mutant HV 1 (Val 65 Gly 66)l ont été réalisés d'après le schéma opérationnel rapporté ci-après conjointement avec les détails techniques respectifs et les différents modes opératoires utilisés. Synthèses d'oliqonucléotides synthéti Ques, auelaues-uns contenant les mutations importantes, à utiliser comme amorces pendant le procédé d'amplification. En partant de la séquence de l'hirudine H Vl, les oligonucléotides suivants ont été obtenus: Mutant HV 1 (GLY 66) Glv '-GTC GAC GGA TCC TTA CTA ACC TTG CAG G-TA TTC TTC 3 ' Mutant HV 1 (VAL 65 GLY 66) Gly Val '-GTC GAC GGA TCC TTA CTA ACC AAC CAG GTA TTC TTC 3 ' Les triplets codant pour l'acide aminé différent qui caractérise le mutant lui-même ont été soulignés. Une seconde amorce complémentaire d'une région présente dans les plasmides p FC 84 et p FC 85, a été utilisée pour l'obtention des deux mutants: '-CAC GAG GCC CTT TCG TCT TC 3 ' p FC 84 peut également être identifié par le nom p FC HV 1 l, qui est le nom adopté également sur les Figures. Dans l'article de P de Taxis du Poet, et al: "Production of the H Vl variant of hirudin by recombinant DNA methodology"; Blood, Coagulation and Fibrinolysis, 1991, vol 2, pages 113-120, sont donnés tous les détails concernant la construction du plasmide p FC 84, permettant à l'homme du métier de reproduire ledit plasmide. En ce qui concerne p FC 85, sa structure est presque identique à celle de p FC 84, la seule différence étant le gène du variant de l'hirudine inséré dans celui-ci: p FC 84 porte le gène pour l'hirudine HV 1, alors que dans le cas de p FC 85, le variant est HV 2. Par conséquent, p FC 85 peut aisément être obtenu à partir de p FC 84 par simple séparation du gène de H Vl et remplacement de celui-ci par le gène de HV 2. Ceci peut être obtenu en profitant des sites de restriction situés dans des positions critiques le long du plasmide p FC 84. Etant donné que le polypeptide ainsi que la séquence nucléotidique de HV 2 sont déjà connus et en prenant en considération les enseignements de l'Article de P de Taxis et al ci-dessus, le plasmide p FC 85 peut être obtenu par l'homme du métier sans expérimentation excessive ni apport inventif. Amplification des différents fragments par la Polymérase Taq En partant des oligonucléotides qui ont été décrits, des fragments d'ADN ont été amplifiés avec utilisation, comme matrice, du plasmide p FC H Vl contenant le gène de l'hirudine HV 1 (Figures 2 et 3). L'amplification doit conduire à l'obtention d'un fragment d'environ 400 bp comprenant la séquence promoteur Ptrp, le RBS et la séquence signal Omp A et les gènes complets du H Vl modifiés au niveau de l'extrémité terminale C ou les gènes de H Vl (Gly 66) et H Vl (Val 65 Gly 66) Pour un tel objectif, une méthode standard, rapportée dans ce qui suit, a été suivie. Méthode d'amplification par PCR La Solution Mère utilisée était: x Tampon 500 m M K Cl m M Tris-Cl p H 8,3 0,01 Gel (P/V) 1,25 m M mélange d NTP m M Mg C 12 Amorces 400 ng/pl* Matrice: ADN plasmidique, p FC 84, 0,1 ng/pl Polymérase Taq (Perkin Elmer: Cetus) 5 u/pl Le Schéma Réactionnel est le suivant: Amorce u Tampon d NTPS (mélange de nucléotides) AMORCE A (H Vl Gly 66 ou HV 1 Val 65 Gly 66) AMORCE B Mg C 12 Polymérase Taq H 20 jusqu'à un volume final de p 1 l p 1 16 pl 2 pl 2 pl 2 pl 0,5 pl pl Couvrir le mélange réactionnel à l'aide d'un bouchon de paraffine (quelques gouttes) pour éviter l'évaporation Soumettre les échantillons à des cycles de dénaturation appropriés, et à un allongement. Le cycle utilisé par nous comprend 1 x 2 min 30 sec à 94 C (temps d'attente) 30 x 1 min 30 sec à 940 C (dénaturation) 2 min 30 sec à 720 C (couplage et allongement) 1 x 7 min à 72 C (temps d'attente) repos à 250 C (conservation) Purification des fraqments amplifiés, restriction et 1 C isolement de ceux-ci Après avoir vérifié l'efficacité du procédé d'amplification par analyse par électrophorèse sur gel d'agarose, préparé d'après les instructions données par Maniatis et al (Maniatis T, Fritsch E et Sambrook J, 1982, Clonage moléculaire, un manuel de laboratoire Cold Spring Harbor Laboratory), les produits amplifiés ont été purifiés conformément au procédé rapporté dans ce qui suit. Purification de fragments d'ADN après amplification par PCR En évitant de retirer la paraffine, recueillir le mélange réactionnel à la fin du cycle d'amplification. Ensuite, procéder à une extraction par un mélange phénol/chloroforme, en ajoutant dans chaque Eppendorf le même volume de phénol/CH Cl 3. Passer au vortex et centrifuger pendant 5 minutes. Récupérer la phase de surnageant (environ 90 pl), ajouter de l'acétate de Na 3 M p H 5 dans un rapport 1/10 et 1,5 volume de Et OH froid à 95 %. Mélanger et placer à -80 'C pendant 20 minutes. Centrifuger pendant 15 secondes dans un Eppendorf à 4 C. Eliminer le surnageant et sécher le dépôt. Remettre le dépôt en suspension dans H 20 stérile. Des restrictions enzymatiques ont été effectuées sur les fragments ainsi purifiés, lesquelles restrictions ont donné naissance à de nouveaux fragments plus courts, à utiliser dans les sous-clonages suivants pour la fabrication des gènes finals ayant subi une mutagenèse. Les restrictions sont effectuées à l'aide des enzymes Hind III et Bam HI en suivant les conditions standards suggérées par la société fournisseur elle-même (Boehringer). L'efficacité de la coupure de restriction a été vérifiée par l'analyse des différents ADN par déplacement électrophorétique sur gel d'agarose. Toujours par déplacement électrophorétique, les fragments spécifiques comprenant le RBS, la séquence signal Omp A et les gènes totaux, ont ensuite été isolés à partir des portions additionnelles d'ADN qui sont présentes dans le fragment d'origine amplifié (Ptrp). Liaison des fragments amplifiés dans le vecteur DFC H Vl (Figures 4 et 5) La liaison est effectuée par l'enzyme T 4 ADN ligase qui est capable de connecter les extrémités cohésives en pràsence d'ATP Le rapport vecteur/fragment est généralement de 1/5, mais il peut être porté même à 1/10. Les différentes réactions de liaison sont effectuées conformément aux conditions optimales suggérées par la société fournisseur (Boehringer) Les vecteurs d'expression p FC H Vl (Gly) (Figure 4) et p FC HV 1 (Val Gly) (Figure 5) sont le résultat de la liaison. Introduction du vecteur d'expression, sécrétion et isolement du mutant HVI (Gly 66) ou du mutant HV 1 (Val 65 Glv 66). Le vecteur d'expression p FC HV 1 (Gly) ou le vecteur d'expression p FC HV 1 (Val Gly) est introduit dans un hôte approprié. Les cellules receveuses sont transformées par le gène codant pour le mutant HV 1 (Gly 66) ou pour le mutant HV 1 (Val 65 Gly 66). Les cellules transformées par l'hôte sont cultivées, par exemple, dans des conditions telles qu'elles aident l'expression du mutant HVI (Gly 66) ou du mutant HV 1 (Val 65 Gly 66). N' importe quel système compatible hôte-vecteur peut être utilisé L'hôte transformé peut être procaryote, notamment, une bactérie, par exemple, E coli ou B subtilis, ou eucaryote, par exemple, une levure S cerevisiae. L'un des hôtes que l'on préfère le plus du type bactérien est une souche d'E coli du type B. Comme variante, des cellules d'insecte peuvent être utilisées et, dans un tel cas, un système d'expression de type "baculovirus" est approprié. Les cellules d'insecte couramment utilisées sont ides cellules de Spodoptera Frugiperda. 3 iuomme autre possibilité, des cellules provenant de lignées cellulaires de mammifères peuvent être utilisées Un animal transgénique peut être utilisé, par exemple, un mammifère non-humain dans lequel de l'hirudine est produite. Le mutant HV 1 (Gly 66) ou le mutant HV 1 (Val 65 Gly 66), qui est exprimé dans les systèmes cellulaires mentionnés ci-dessus, peut être isolé et purifié conformément à des techniques bien connues. Comme déjà indiqué ci-dessus, les souches du type B de la bactérie E coli sont les cellules hôtes, préférées pour l'expression et la sécrétion dans le périplasme de l'hirudine et de ses dérivés. En fait, l'insertion du plasmide p FC HV 1 (Gly) ou du plasmide p FC H Vl (Val Gly) dans les souches du type B de la bactérie E coli, conduit à un niveau élevé de production du mutant H Vl (Gly 66) ou du mutant HV 1 (Val 65 Gly 66), contrairement aux autres souches d'E coli qui sont moins efficaces. Un certain nombre de souches de type B d'E coli sont disponibles et elles peuvent être utilisées pour la production de HV 1 (Gly 66) ou de HV 1 (Val 65 Gly 66). Les souches préférées sont: ATCC 12 407, ATCC 11 303 et NCTC 10 537. Par exemple, on a préparé des cellules appropriées de la souche NCTC 10 537 en utilisant le procédé au chlorure de calcium de Mandel et Higa (Mandel et Higa, 1970, J Mol. Biol, 53, page 154). Environ 200 pl d'une préparation desdites cellules à raison de 1,10 gramme de cellules/ml, avec 2 pl de plasmide ADN (concentration approximative: 5 pg/ml) ont été transformés. Les cellules transformantes ont été sélectionnées sur des plaques d'agar L contenant 100 pg/ml d'ampicilline. Deux petites colonies ont été "entrainées" par deux cure-dents (trois lamelles d'environ 1 cm de longueur ont été obtenues) sur de l'Agar L contenant le même antibiotique. Après 12 heures d'incubation à 37 C, certaines des parties de la tache ont été examinées pour vérifier la production du HV 1 (Gly 66) et du HV 1 (Val 65 Gly 66), en inoculant 10 ml de milieu LB (contenant de l'ampicilline à une concentration de 100 pg/ml) et en faisant incuber les cultures à 37 C pendant une nuit. Le jour suivant, les cultures ont été diluées au 1: 100 dans du milieu M 9 contenant la même concentration d'ampicilline, et incubées pendant 6 heures à 37 C. ml desdites cultures ont été centrifugées à 12 000 x g, à 4 C, pendant 10 minutes. Le dépôt bactérien a été remis en suspension dans 2 ml d'H Cl 33 m M, Tris p H 8; un volume égal d'une seconde il solution d'EDTA 33 m M, 40 % de sucrose a été ensuite ajouté, et le mélange final a été incubé sous une agitation modérée à 37 C pendant 10 minutes. Apres la centrifugation, les cellules rendues perméables ont été remises en suspension dans 2 ml d'eau froide et on les a laissées pendant 10 minutes dans la glace. Le surnageant résultant a été isolé par centrifugation, et il représente la fraction périplasmique des cellules bactériennes. En utilisant un essai chromogène qui est basé sur l'inhibition de l'aptitude de la thrombine à cliver un dérivé de synthèse S-2238 (Krstenanski, J K et Mao, S J T, 1987 FEBS Lett 211, page 10), la présence de l'activité antithrombine dans la fraction périplasmique des cellules productrices de H Vl (Gly 66) et du HV 1 (Val 65 Gly 66) a été mesurée. Il n'a pas été noté d'activité dans les fractions périplasmiques témoins. Pour extraire et purifier le mutant H Vl (Gly 66) et le mutant H Vl (Val 65 Gly 66), des techniques classiques couramment utilisées par l'homme du métier ont été utilisées. Lesdits mutants peuvent être utilisés, si on le désire, comme substrat idéal pour la réaction d'amidation suivante qui permet de convertir un composé de la formule (I), dans laquelle, dans les conditions mentionnées ci- dessus, N vaut 1 et X représente -OH, en un composé correspondant de la formule (I) dans laquelle N vaut zéro et X représente NH 2. Conversion enzvmatique d'amidation De nombreux peptides biologiquement actifs sont protégés à leur extrémité carboxylique par amidation, l'amidation étant essentielle pour la reconnaissance des récepteurs et/ou l'activité biologique (J F Rehfeld, 1981, Am J Physiol 240, 6251-6266). L'amidation au niveau de la fraction carboxylique terminale (ou amidation en a) donne une stabilité à la plupart des carboxyeptidases et similaires, elle prolonge la demi-vie et aide à la sélectivité aux récepteurs desdits peptides (G S Wand et al, 1985, Neuroendocrinol 41, 482- 489). L'amidation en a représente l'un des changements de post- traduction des peptides de sécrétion dans les organismes eucaryotes. L'amidation en a peut être effectuée, par exemple, par une enzyme appelée monooxygénase peptidyl-glycine a-amidante (PAM), qui convertit l'extrémité carboxylique terminale, à laquelle est ajoutée la glycine d'un peptide, en l'amide peptide correspondant privé de la glycine à l'extré- mité carboxylique de celui-ci, avec la formation concomitante de l'acide glyoxylique (A F Bradbury et al, 1982, Nature 289, 686, 688). La réaction catalytique a lieu en présence d'oxygène, et elle peut nécessiter la présence, comme co- facteurs, d'ions cuivre et ascorbate (B Eipper et al, 1983, Proc Natl Acad Sci USA, 80, 5144-5148). Dans la présente invention, les analogues poly- peptidiques de l'hirudine de la formule (I), dans laquelle P représente HV 1 ou HV 1 (Val 65), N vaut 1 et X représente -NH 2 lH Vl-NH 2 et HV 1 (Val 65)-NH 2 l, peuvent être préparés en partant des composés correspondants de la formule (I>, dans laquelle P représente HV 1 ou HV 1 (Val 65), N vaut 1 et X représente -OH lmutant HV 1 (Gly 66) et mutant H Vl (Val 65 Gly 66)l, obtenus comme ci-dessus, par l'action d'une enzyme d'amidation appropriée comme, par exemple, une monooxygénase peptidylglycine a-amidante (PAM). En particulier, le mutant HV 1 (Gly 66) ou le mutant HVI (Vai 65 Gly 66) a été incubé avec une préparation semi-purifiée de l'enzyme PAM exempte de protéase, par35 exemple, avec la préparation obtenue à partir du carcinome médulaire de la thyroïde de rat (N M Mehta et al 1988, Arch Biochem Biophys 261, 44-54), ou à partir du milieu conditionné des cellules issues de ladite tumeur (J P. Gilligan et al, 1989, Endocrinol 124, 2729-2736). L'enzyme amidante peut également être obtenue par des techniques d'ADN recombinant. La réaction enzymatique a été effectuée dans un tampon aqueux comme le TES à p H = 7, contenant des ions cuivre, des ions ascorbate, de la catalase, de l'iodure de potassium, SDS et Tween 20. La fin de la réaction d'amidation a été contrôlée par la méthode de Corbett et Corbett (J Org Chem 1980, 45, 2834-2839), basée sur la détermination de l'acide glyoxylique, après obtention du dérivé avec le nitroso- benzène. Le produit amidé H Vl-NH 2 ou HV 1 (Val 65)-NH 2 a été purifié à l'aide de techniques classiques. En variante, la réaction d'amidation qui permet d'obtenir HV 1-NH 2 ou H Vl (Val 65)-NH 2 peut être effectuée par voie chimique sur les composés correspondants H Vl et HV 1 (Val ), à l'aide de méthodes connues dans la technique. Les polypeptides analogues de l'hirudine conformes à l'invention ont la capacité d'inhiber tous les effets protéolytiques de la thrombine, par exemple, la conversion du fibrinogène en fibrine et l'activation des facteurs V et VIII. Par conséquent, ils peuvent être utilisés, par exemple, comme médicaments anticoagulants ou antithrombo- tiques dans le traitement de pathologies thrombo-embolitiques comme, par exemple la coagulation intravasculaire disséminée, l'embolie cérébrale, les thromboses veineuses profondes et, également, dans la prophylaxie anticoagulante et antithrom- binique par exemple, dans la thérapie de l'infarctus aigu du myocarde. Une autre utilisation possible des ces polypeptides dérivés de l'hirudine est une utilisation extérieure au corps humain ou animal, dans les préparations qui sont utilisées, par exemple, comme anticoagulant pour le sang soumis à une circulation ou à un traitement extracorporel, par exemple dans le cas de dialyse rénale ou de dialyse pour l'élimi- nation des graisses en excès du sang. L'activité des composés de l'invention a été vérifiée dans les essais biologiques rapportés ci-après conformément aux modes opératoires recommandés. ACTIVITE ANTITHROMBINE SPECIFIOUE Ltactivité antithrombe spécifique des composés qui font l'objet de la présente invention a été déterminée sur la base de la réaction spécifique et stoechiométrique rapide de l'hirudine avec la thrombine. Ladite activité a été évaluée quantitativement par titration avec une solution standardisée de thrombine (Lundblad R L, Kingsdon H S et Hann K G, Methods in Enzymology, 45, 156-161, 1976). L'activité antithrombine des composés de l'invention a été comparée avec l'activité de l'hirudine HV 1 recombinante (r HV 1), qui a été obtenue avec des techniques d'ADN recombinant dans E coli. L'activité de la thrombine a été standardisée dans les "Unités de l'Institut National de la Santé (unités NIH - National Institute of Health) en utilisant une Préparation Internationale Standard de thrombine (c 70/157), fournie par l'Institut National pour les standards et témoins biologiques" de Londres (Royaume Uni). L Iactivité de neutralisation de la thrombine des composés testés a été exprimée en Unités antithrombine (U-AT) une U-AT est la quantité du composé testé qui neutralise une unité NIH de thrombine. L'essai a été effectué comme suit. Une solution de f ibrinogène humain standardisée (Kabi Vitrium, Suède) a été incubée en présence de concen- trations connues des composés testés. Le fibrinogène ne se coagule pas dans ces conditions avant que la thrombine suffisante pour neutraliser toute l'hirudine présente ait été ajoutée. L'addition d'un excès de thrombine est mise en évidence en l'espace de quelques secondes avec l'apparition du caillot de fibrine. Des quantités aliquotes de 0,01 à 0,1 ml de la solution des composés testés avec 0,2 ml d'une solution de fibrinogène à 0,05 % dans du tampon Tris H Cl p H = 7,4 ont été mélangées. Une solution de thrombine standardisée (thrombine bovine avec un degré de pureté élevé, Sigma), à une concentration de 100 unités NIH/ml, dans des parties aliquotes de 0, 005 ml ( 0,5 unités NIH) a ensuite été progressivement ajoutée à des intervalles d'une minute et mélangée instantanément au mélange contenant le fibrinogène et le composé testé. Lorsque le fibrinogène coagule en 1 minute, le point final de titration a été atteint. L'activité des composés testés a été exprimée en U-AT/mg de protéine. La teneur en protéine des composés testés a été déterminée par l'analyse des acides aminés. ESSAI DE SUBSTRAT CHROMOGENE La méthode est basée sur l'activité inhibitrice de l'hirudine dans la réaction entre la thrombine et son Substrat spécifique chromogène de synthèse S-2238 (Wiman et al, BBA, 579, 142-154, 1979). L'activité inhibitrice des composés qui font l'objet de la présente invention a été comparée avec l'activité inhibitrice du composé de référence hirudine HV 1 recombinant (r HV 1). Le mode opératoire suivant a été suivi. 630 pl d'une solution 0,5 m M de S-2238 dans du tampon Tris 0,05 M, p H 8,3, contenant Na Cl 0,14 M et de l'aprotinine, à 100 KUI/ml, ont été incubés à 250 C pendant 10 minutes dans une cellule thermostatique. Après ladite période de préincubation, 70 pl d'une solution de thrombine à 2 UI/ml dans du tampon phosphate de sodium 0,025 M, p H 6,6, contenant Na Cl 0,3 M et de l'albumine bovine 0,5 % ont été ajoutés au mélange. 70 pl de tampon ont été utilisés comme témoin. Les lectures cinétiques ont été effectuées immédiatement après l'addition de thrombine. Le spectrophotomètre a été étalonné de façon à lire les variations d'absorption à une longueur d'onde de 405 nm toutes les minutes, en l'espace d'une période de temps de 6 minutes. pi de la solution des composés testés ont ensuite été ajoutés aux cuvettes, puis les lectures ont été effectuées à nouveau toutes les minutes pendant 6 minutes. La concentration finale de composés testés était de 1,25; 2,5; 7,5; 10 et 15 ng/ml. Le tampon de dilution qui avait été utilisé était du phosphate de sodium 0,025 M, p H 6,6, contenant Na Cl 0,3 M. Le pourcentage d'inhibition de la réaction entre la thrombine et le substrat chromogène a été calculé pour chaque échantillon, en faisant le rapport entre la moyenne de A Abs/min obtenu après avoir ajouté les composés testés et la moyenne de A Abs/min obtenu avant leur addition. Une courbe standard a été obtenue en traçant un graphe donnant le pourcentage d'inhibition en fonction de la concentration inhibitrice. Les résultats finals ont été exprimés sous la forme de la concentration finale des composés testés qui induit une inhibition de 50 % (C I 50 %) de la réaction entre la thrombine et le substrat chromogènes. ACTIVITE ANTICOAGULANTE L'activité anticoagulante des composés qui font l'objet de la présente invention a été évaluée en calculant le temps de thrombine (T T). L'essai a été effectué à l'aide d'un coagulomètre de recherche automatique (ACL 300 Research, Instrumentation Laboratory, Italie). L'activité anticoagulante des composés de l'invention a été comparée avec l'activité anticoagulante du composé de référence hirudine HV 1 recombinant (r HV 1). Des concentrations croissantes des composés testés ont été ajoutées au plasma humain au citrate normal (concentration finale de 0,38 %). Les échantillons ont ensuite été amenés à sédimenter dans le coagulomètre automatique qui permet de déterminer le temps de thrombine par addition automatique au plasma d'une solution de thrombine humaine (Fibrindex; Ortho Diagnostics, Italie), jusqu'à ce qu'une concentration finale de 5 UI/ml ait été atteinte. Le temps de coagulation, qui a été déterminé pour chaque composé testé, aété enregistré et porté sur un diagramme en fonction de la concentration finale respective de chaque composé testé. Les résultats finals ont été exprimés sous la forme de la concentration finale du composé testé qui double la valeur normale du temps de thrombine. (Echantillon témoin composé seulement de plasma). Dans les essais ci-dessus, les composés de l'invention se sont révélés actifs et présentaient une activité supérieure à celle du composé de référence r H Vl. Par exemple, en particulier, en ce qui concerne le composé HV 1 (Val 65 Gly 66) de l'invention, les données rapportées dans le Tableau suivant ont été obtenues, montrant pour ledit composé une supériorité biologique évidente par rapport au standard de référence. TABLEAU Composé U-AT/mg C 1 50 % T T. rapport= 2 r HV 1 il 000 5,47 ng/ml 0,132/ml rapport= 2 Mutant HV 1 (Val 65 19 000 0,57 ng/ml 0,058/ml Gly 66) Les peptides analogues de l'hirudine conformes à l'invention peuvent être administrées sous la forme de compositions pharmaceutiques les contenant en tant que principe actif, en tant que tels ou sous la forme de sels pharmaceutiquement acceptables, conjointement avec un ou plusieurs excipients, par exemple, des supports et/ou diluants et/ou liants pharmaceutiquement acceptables. * L'administration desdites compositions pharma- ceutiques peut être effectuée, par exemple, par voie parentérale (intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée) ou par voie topique, de préférence, par voie parentérale. Dans ce cas, en plus du principe actif, la compo- sition pharmaceutique injectable contiendra, par exemple, de l'eau stérile, du tampon, du chlorure de sodium, du mannitol ou du sorbitol. De préférence, une solution injectable par voie endoveineuse contiendra un support, par exemple, de l'eau stérile ou une solution saline isotonique stérile. Les compositions pharmaceutiques pour une appli- cation topique, telles que, par exemple, des crèmes, des lotions, des gels, des pâtes, des solutions ou des suspensions huileuses, contiendront comme excipients, par exemple, des substances huileuses, des émulsifiants ou des gélifiants, couramment utilisés dans la technique. Généralement, les, compositions pharmaceutiques conformes à l'invention peuvent être préparées par des techniques bien connues, conformément à des modes opératoires usuels dans le domaine des préparations galéniques. Le dosage efficace dépend de la pathologie à traiter, du type de formulation utilisé, de l'état du patient et de la période de traitement. REVENDICATIONS 1 Polypeptide dérivé de l'hirudine, ayant la formule suivante (I): P(Gly)n-X (I) dans laquelle: P représente une fraction polypeptidique de HV 1 ou de HV 1 (Val 65), ayant les séquences d'acides aminés telles que définies à la Figure 1; (Gly) est le radical bivalent de la glycine -NH-CH 2-CO; X représente -OH ou -NH 2; et N vaut zéro ou 1; avec la condition que, lorsque P représente H Vl et N vaut zéro, X représente seulement NH 2, et que, lorsque N vaut 1, X représente seulement -OH; et ses sels pharmaceutiquement acceptables. 2 Procédé de préparation d'un polypeptide tel que défini à la revendication 1, comprenant: (a) la préparation d'un vecteur d'expression, comprenant une molécule d'ADN codant pour un polypeptide dérivé de l'hirudine, représenté par la formule (I), dans laquelle, dans les conditions mentionnées ci-dessus, X représente -OH, qui est capable de conduire la synthèse l.:dit polypeptide dans un microorganisme hôte approprié; (b) l'introduction dudit vecteur d'expression dans ledit microorganisme hôte approprié; (c) l'expression, la sécrétion et l'isolement dudit poly- peptide à partir dudit microorganisme hôte, permettant ainsi d'obtenir un composé de la formule (I) dans laquelle, dans les conditions mentionnées ci-dessus, P, -(Gly) et N sont tels que définis ci-dessus et X représente -OH; et (d) si on le désire, la conversion enzymatique d'un composé de la formule (I) dans laquelle, dans les conditions mentionnées ci-dessus, N vaut 1 et X représente OH, en un composé correspondant de la formule (I) dans laquelle, dans les conditions mentionnées ci-dessus, n vaut zéro et X représente -NH 2, par une enzyme d'amidation appropriée, et, si on le désire, la conversion d'un composé de la formule (I) en un sel pharmaceutiquemement acceptable de celui-ci. 3 Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables et, comme principe actif, un polypeptide de formule (I) tel que défini10 à la revendication 1. 4 Utilisation d'un polypeptide de formule (I) tel que défini à la revendication 1, en tant qu'agent anti- coagulant ou antithrombotique. 5 Utilisation d'une composition pharmaceutique telle que définie à la revendication 3, comme agent anti- coagulant ou antithrombotique.