FR 2679920 A1 19930205 FR 9109854 A 19910802 LEVURES RECOMBINANTES HAUTEMENT STABLES POUR LA PRODUCTION DE PROTEINES RECOMBINANTES LEUR PREPARATION ET LEUR UTILISATION La présente invention concerne le domaine des biotechnologies, et plus particulièrement celui des fermentations industrielles de microorganismes recombinés. Encore plus particulièrement, elle concerne un couple hôte/vecteur hautement stable en milieu complexe, sa préparation, et son utilisation en fermen- tation industrielle. Les progrès accomplis dans le domaine de la biologie moléculaire ont permis de modifier des microorganismes pour leur faire produire des protéines recombinantes déterminées, préférentiellement des protéines hétérologues En particulier, de nombreuses études génétiques ont porté sur la bactérie L coli Plus récemment, les levures telles que Saccharomyces, Kluyveromnyces, Pichia, ou en- core Hansenula, sont apparues comme des organismes hôtes prometteurs pour ce mode de production de protéines. Toutefois, l'application industrielle de ces nouveaux modes de pro- duction est encore limitée, notamment par les problèmes d'efficacité d'expression des gènes dans ces microorganismes recombinés, et par la difficulté d'obtenir des cellules recombinées stables dans des conditions industrielles de fermentation. L'une des contraintes essentielles d'exploitation est en effet liée à la stabilité ségrégationnelle d'un vecteur d'expression dans l'hôte utilisé A l'échelle indus- trielle, un vecteur doit posséder une grande stabilité sur au moins 25 générations successives, qui représentent approximativement le nombre de générations nécés- saire pour aller jusqu'à la fin d'un fermenteur industriel de type "fed batch" de m I ("Principles of Fermentation Technology" Stanburry et Whitaker, Perga- mon Press, Oxford, 1984) La stabilité du vecteur doit être encore plus grande dans le cas d'une fermentation en continu, o elle doit atteindre au moins une centaine de générations. Chez les bactéries, la solution la plus courante utilisée en laboratoire consiste à insérer sur le plasmide utilisé un gène de résistance à un antibiotique, qui leur confère la capacité de survivre et de pousser dans un milieu sélectif contenant ledit antibiotique Cependant, en raison des contraintes de sécurité et des réglementations dans le domaine des biotechnologies, il est indispensable au niveau industriel de pouvoir éviter l'utilisation de gènes de résistance à des anti- biotiques. Chez les levures, le procédé le plus couramment utilisé consiste à cul- tiver des cellules déficientes dans une voie de biosynthèse d'acides aminés (Trp, Leu, His) ou de bases puriques (adénine) ou pyrimidiques (uracilé) transformées avec un vecteur contenant un gène capable de complémenter cette déficience. Cependant, cette approche nécessite l'emploi de milieux dépourvus de l'acide aminé ou de la base pour lesquels la souche hôte est auxotrophe L'emploi de tels milieux synthétiques présente de nombreux désavantages En particulier, ces mi- lieux sont onéreux, ce qui est incompatible avec une utilisation à l'échelle indus- trielle, et de plus ils conduisent à une croissance plus lente des cellules et à une biomasse moins élevée. Une solution a été proposée pour éviter l'emploi d'un milieu synthé- tique ou de gènes de résistance à des antibiotiques, consistant à (i) muter dans la cellule hôte un gène essentiel à sa survie dans un milieu complexe et (ii) intro- duire une copie intacte dudit gène sur le plasmide d'expression utilisé Ce sys- tème, dont le principe est de forcer la cellule hôte à conserver son plasmide, a permis d'augmenter la stabilité du couple hôte/vecteur Ce système a en particu- lier été décrit chez E coli pour le gène dpie codant pour la têtrahydropicolinate- N-succinyl transférase (EP 258 118), le gène y Si I dont le produit est une enzyme nécessaire à la synthèse protéique (Skogman et Nilsson, Gene j ( 1984) 117), et pour le gène eh, dont le produit est indispensable à la réplication de l'ADN et à la survie de la cellule (Porter et al, Bio/technology vol E ( 1990) 47) Ferrari et al ont également décrit l'utilisation du gène de l'alanine racémase pour stabiliser un plasmide dans un mutant de B subtilis dans lequel ce gêne n'était pas fonctionnel (Bio/technology vol 3 ( 1985) 1003) La demande WO 86/01224 décrit un système de sélection comparable adapté à la levure S cerevisiae Ce système utilise la levure S cerevisiae mutée dans 2 gènes impliqués dans la biosynthèse de l'uracile. Il consiste à (i) inactiver un des gènes de synthèse de l'uracile, (i) transformer ladite cellule par un vecteur portant le gêne actif, et (iii) bloquer l'autre voie métabolique par mutagénèse. Une autre approche pour obtenir des systèmes d'expression stables en milieux complexes consiste à utiliser des vecteurs intégrés dans le génome de la cellule hôte Toutefois, ce système ne permet d'obtenir qu'un faible nombre de copies du vecteur par cellule recombinée, et de plus, la fréquence de transforma- tion est plus faible Dans ces conditions, les niveaux d'expression de gènes hétéro- logues ne sont pas toujours satisfaisants Une méthode permettant l'amplification d'un gène intégré dans le génome a par ailleurs été développée chez S cerevisiae, en dirigeant l'intégration vers les gènes codant pour les protéines ribosomiques présents en multiples copies dans le génome Cependant, ce système s'avère instable lorsque les gènes intégrés sont exprimés à des niveaux élevés, qu'il s'agisse de gènes homologues ou hétérologues. Aujourd'hui, l'utilisation de nouvelles levures, différentes de S.cerevisiae, pour la production de protéines recombinantes nécessite le dévelop- pement d'outils adaptés à ces microorganismes, pour résoudre notamment les problèmes de stabilité de vecteurs d'expression de gènes hétérologues Plus préci- sément, les levures taxonomiquement apparentées au genre Kluyveromyces sem- blent posséder une capacité de sécrétion de protéines recombinantes particulière- ment avantageuse Ceci a été observé notamment dans le cas de la levure Mactis, pour la production de chymosine (EP 96430), d'IL-1 B, ou de sérum-albumine humaine (EP 361991) Cependant, il n'existe pas de vecteurs d'expression à copies multiples suffisamment stables chez cet organisme pour permettre son utilisation dans des procédés industriels Il n'existe pas en particulier de vecteurs stables en milieux complexes, permettant d'envisager des procédés à grande echelle, et notamment en continu, au moyen de cet organisme En effet, bien que certains vecteurs stables chez Klactis aient été décrits (EP 361991), l'introduction sur ces vecteurs d'une cassette d'expression d'un gène hétérologue produit un effet déstabilisant important, et plus spécialement en condition d'induction de la production. Il a maintenant été trouvé un moyen particulièrement efficace pour stabiliser des couples hôte/vecteur dans lesquels l'hôte est une levure du genre Kluyveromyces. Un objet de l'invention réside donc dans un couple hôte/vecteur hau- tement stable en milieu complexe caractérisé en ce que l'hôte est une levure du genre Kluyveromvces dans laquelle un gène essentiel pour sa croissance sur ledit milieu est non-fonctionnel, et en ce que le vecteur porte une copie fonctionnelle dudit gène. Au sens de la présente invention, on entend par milieu complexe tout milieu de fermentation industriel compatible avec les contraintes économiques d'une exploitation à grande échelle Notamment, il s'agit de milieux contenant des matières premières de type industriel: extrait soluble de maïs, extrait de levure, mélasse, ou "distillers" par exemple, par opposition aux milieux synthétiques définis, et supplémentés (comme par exemple d'antibiotiques) Il est entendu tou- tefois que la présente invention peut également être utilisée sur des milieux syn- thétiques, bien que ce mode de mise en oeuvre soit moins avantageux. Par ailleurs, il est entendu que le gène fonctionnel présent sur le vec- teur peut être un gène homologue ou hétérologue. Comme gènes essentiels à la croissance de la cellule hôte sur milieu complexe, on peut citer plus particulièrement des gènes impliqués dans le méta- bolisme d'une source carbonée présente dans le milieu (galactose, lactose, glu- cose, etc), des gènes intervenant dans la division cellulaire, dans la synthèse membranaire, dans la synthèse protéique, la réplication ou la transcription des ADN. Plus préférentiellement, l'invention réside donc dans un couple hôte/vecteur hautement stable en milieu complexe caractérisé en ce que l'hôte est une levure du genre Kluyveromyces dans laquelle un gène impliqué dans la gly- colyse est non-fonctionnel, et en ce que le vecteur porte une copie fonctionnelle dudit gène. Il a en effet été montré que l'on peut obtenir, chez Kluvveromvces, des couples hôte/vecteur très stables en milieu complexe compatible avec une exploitation industrielle, en rendant la cellule hôte dépendante de son plasmide lorsqu'elle doit faire intervenir une étape de la glycolyse pour métaboliser les sources de carbone du milieu. Plus préférentiellement, la présente invention concerne les couples hôte/vecteur dans lesquels l'hôte est choisi parmi les levures Kluyveromyces lactis et Kluyveromyces fragilis. La glycolyse implique chez la levure une succession d'étapes enzy- matiques et chimiques complexes conduisant à la formation de molécules d'ATP 2679920 et d'éthanol Les principales enzymes impliquées dans cette voie sont connues, et certains des gènes codant pour ces enzymes ont été identifiés et clonés: Notam- ment, les gènes codant pour la phosphofructo kinase (Kopperschlager et al, Eur J Biochem 81 ( 1977) 317); la pyruvate kinase (Aust et al, J Biol Chem 2 ( 1978) 7508); la phosphoglycérate kinase (Scopes, Meth Enzymol 42 ( 1975) 134); la phosphoglycérate mutase (Price et al, FEBS Letters 143 ( 1982) 283); la triose phosphate isomérase (Alber et al, J Biol Chem 25 ( 1981)'1356); la pyru- vate décarboxylase (Gounarb et al, Biochim Biophys Acta 405 ( 1975) 492) ou encore la phosphoglucose isomérase (Noltmann, The enzymes, vol VI, Academic Press, N Y, 271, 1972) ont été identifiés chez S cerevisiae Certains gênes glyco- lytiques ont également été clonés chez K lactis Il s'agit plus précisément des gènes RAG 1 et RAG 2 codant respectivement pour une protéine transporteur de sucre (Goffrini et al, Nucl Acid Res a 18 ( 1990) 5294) et pour une phosphoglu- cose isomérase (Wésolowski-Louvel, Nucl Acid Res 1 ( 1988) 8714); et de gènes codant pour des alcool deshydrogénases, ADH (Saliola et al, Yeast ( 1990) 193-204; Saliola et al, Yeast 7 ( 1991) 391-400). Cependant, ces gènes ne peuvent être utilisés efficacement pour stabi- liser des vecteurs d'expression dans les levures du genre Kluyveromyces En effet, le gène RAG 1 et les gènes ADH ne sont pas indispensables à l'utilisation du glu- cose De plus, les premiers travaux sur Kluyveromyces ont montré que le gène RAG 2 dont l'équivalent I est connu comme étant essentiel pour la croissance de la levure S cerevisiae sur un milieu contenant du glucose, ne l'était pas chez Kluvveromyces (Wésolowski-Louvel précitée; Goffrini et al, Yeast 5 ( 1989) 99- 106) Ce résultat indiquait une différence de comportement des levures Saccha- romvces et Kluyveromyces vis-à-vis de l'utilisation du glucose, qui ne permettait pas la réalisation, chez cette dernière, d'un couple hôte/vecteur stable en utilisant les gènes glycolytiques comme marqueurs de sélection. Dans ces conditions, l'utilisation de ces gènes pour la stabilisation de vecteurs d'expression dans les levures du genre Kluyveromvces n'était ni décrite ni suggérée, ni possible. De manière surprenante, la demanderesse a maintenant montré que certains gènes glycolytiques peuvent être nécessaires à la croissance et/ou la sur- vie de levures du genre Kluyveromyces dans un milieu complexe, et qu'ils peu- vent permettre la réalisation de couples hôte/vecteur particulièrement stables En particulier, des systèmes stables et efficaces peuvent être obtenus lorsque le gène glycolytique choisi est un gène unique dont le produit est indispensable pour que la levure puisse métaboliser les sources de carbone du milieu En effet, certaines étapes de la glycolyse font intervenir des activités pouvant être codées par plu- sieurs gènes C'est le cas notamment chez S cerevisiae des activités énolase (ENO), phosphofructokinase (PFK), glycéraldéhyde-3-phosphate deshydrogénase (GAPDH) ou alcool deshydrogénase (ADH), qui sont codées par plusieurs gènes. Dans ce cas, l'inactivation d'une de ces activités enzymatiques nécessiterait l'inac- tivation de tous les gènes susceptibles de la coder. Préférentiellement, dans le couple hôte/vecteur de l'invention, le gène impliqué dans la glycolyse est un gène unique dont le produit est indispensable pour que la levure puisse métaboliser les sources de carbone du milieu. Encore plus préférentiellement, il s'agit d'un gène choisi parmi les gènes codant pour la phosphoglycérate kinase (PGK), la phosphoglycérate mutase (GPM), la pyruvate kinase (PYK), et la triose phosphate isomérase (TPI). Le gène sélectionné peut être rendu non-fonctionnel dans la levure hôte de différentes manières Notamment, il est possible d'utiliser des techniques de mutagénèse non spécifiques Plus particulièrement, les levures peuvent être traitées par des agents physiques (rayons X; Ultra- Violet,) ou chimiques (agents intercalants, agents alkylants ou bialkylants) Les levures ainsi traitées sont en- suite sélectionnées sur différents milieux, selon la mutation recherchée. Il est également possible d'utiliser des outils de mutagénèse spéci- fiques, et notamment les techniques d'insertions mutationnelles sur l'ADN ou de remplacement de gènes par recombinaison homologue (Rothstein, Meth Enzymol. j X ( 1983) 202) A cet effet, 2 voies de mutagénèse sont possibles: remplacement du gène à déléter par un marqueur de sélection domi- nant de type marqueur de résistance à un antibiotique (généticine, fluomycine, etc) Cette stratégie peut être appliquée directement sur une souche sauvage; remplacement du gène à déléter par une copie intacte d'un gène complémentant une auxotrophie (ura 3, pl, leu 2, etc) de la souche utilisée Cette stratégie peut être appliquée sur toute souche présentant une auxotrophie, ou sur une souche sauvage préalablement rendue auxotrophe. Préférentiellement, dans le couple hôte/vecteur de l'invention, la copie fonctionnelle du gène essentiel présente sur le vecteur est placée sous le contrôle d'un promoteur faible Ce mode avantageux de réalisation favorise la stabilité du couple et l'augmentation du nombre de copies du vecteur par cellule hôte, et, de ce fait, tend à augmenter le niveau d'expression d'un gène recombinant A titre d'exemple de promoteur faible utilisable à cet effet, on peut citer notamment le promoteur bidirectionnel du gène de la toxine killer (Tanguy-Rougeau et al, Gene 21 ( 1990) 43) ou celui d'un gène hétérologue tel que le promoteur du gène de la phosphatase acide de S cerevisiae en condition de répression (milieu de cul- ture contenant du phosphate) Dans un autre mode préféré de l'invention, la copie fonctionnelle du gène essentiel présente sur le vecteur est soit entièrement dépourvue de promoteur, soit placée sous le contrôle d'un promoteur défectif, que ce soit à la suite d'une mutation du promoteur même ou à la suite de l'inactivation d'un gène impliqué dans l'activation transcriptionnelle dudit promoteur Dans un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, le gène essentiel présent sur le vec- teur peut être un gène défectif dans certaines conditions, comme par exemple des conditions de température Notamment, il peut s'agir d'un gène thermosensible. Préférentiellement, dans le couple hôte/vecteur de l'invention, le vec- teur comprend en outre une sequence d'ADN comportant un gène de structure au moins codant pour une protéine recherchée et des signaux permettant son expres- sion. Dans un mode préféré de l'invention, le gène de structure code pour une protéine d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire. A titre d'exemple, on peut citer les enzymes (tels que notamment la superoxide dismutase, la catalase, les amylases, les lipases, les amidases, la chy- mosine etc), les dérivés sanguins (tels que la sérum-albumine ou des variants ou précurseurs de celle-ci, l'alpha ou la béta-globine, le facteur VIII, le facteur IX, le facteur von Willebrand ou des domaines de celui-ci, la fibronectine, l'alpha-i antitrypsine etc), l'insuline et ses variants, les lymphokines ltelles que les inter- leukines, les interférons, les facteurs de stimulation des colonies (GCSF, GM-CSF, M-CSF), le TNF, le TRF, les MIP, etc l, les facteurs de croissance (tels que lhormone de croissance, l'érythropoiétine, le FGF, l'EGF, le PDGF, le TGF etc), les apolipoprotéines, des polypeptides antigéniques pour la réalisation de vaccins (hépatite, cytomégalovirus, Eppstein-Barr, herpes etc), les récepteurs viraux, ou encore des fusions de polypeptides telles que notamment des fusions comportant une partie active fusionnée à une partie stabilisatrice (par exemple des fusions entre l'albumine ou des fragments d'albumine et le récepteur ou une partie d'un récepteur de virus (CD 4, etc)). Par ailleurs, de manière avantageuse, la séquence d'ADN comprend en outre des signaux permettant la sécrétion de la protéine recombinante Ces signaux peuvent correspondre aux signaux naturels de sécrétion de la protéine considérée, mais ils peuvent également être d'une origine différente En particulier des signaux de sécrétion dérivés de gènes de levure peuvent être utilisés, tels que ceux des gènes de la toxine killer ou de la phéromone alpha. Préférentiellement, le gène de structure code pour la sérum-albumine humaine, ses précurseurs ou ses variants moléculaires On entend par variant mo- léculaire de l'albumine les variants naturels résultant du polymorphisme de l'al- bumine, les dérivés structuraux possédant une activité de type albumine, les formes tronquées de l'albumine, ou toute protéine hybride à base d'albumine. Dans un autre mode de réalisation, le ou les gènes de structure codent pour des polypeptides intervenant au niveau génétique ou biochimique dans la biosynthèse d'un métabolite En particulier, il peut s'agir de gènes impliqués dans la biosynthèse d'acides aminés, d'antibiotiques ou de vitamines. Généralement, les signaux permettant l'expression du gêne de struc- ture sont choisis parmi les promoteurs et les terminateurs de transcription Il est entendu que ces signaux sont choisis en fonction du gêne de structure et du résul- tat recherché En particulier, il peut être préférable dans certains cas d'utiliser un promoteur régulable de manière à pouvoir découpler les phases de croissance de l'hôte et celle d'expression du gêne De même, pour des raisons de force et de compatibilité, il peut être préférable d'utiliser dans certains cas les promoteurs naturels des gènes de structure, et dans d'autres cas, des promoteurs d'origine dif- férente. Préférentiellement, les promoteurs utilisés sont dérivés de gènes de levure, et encore plus préférentiellement, de gènes glycolytiques de levure D'un intérêt tout particulier sont les promoteurs dérivés de gènes glycolytiques des levures du genre Saccharomvces ou K Iwyveromyces Notamment, on peut citer les promoteurs des gènes codant pour la phosphoglycerate kinase (P(K), la Glyce- raldehyde-3-phosphate deshydrogenase (GPD), les énolases (LNQ), ou les alcool- deshydrogenases (ADH) On peut également citer des promoteurs dérivés de gènes fortement exprimés tels que le gène de la lactase (LAC 4) de la phosphatase acide (PH 5), ou de facteurs d'élongation (IEE). Par ailleurs, ces régions promotrices peuvent être modifiées par muta- génèse, par exemple pour ajouter des éléments supplémentaires de contrôle de la transcription, tels que notamment des régions UAS ("Upstream Activating Sequence") A titre d'exemple, un promoteur hybride entre les promoteurs des gènes PGK et GA Ll/GAL 10 de S cerevisiae donne de bons résultats. Les couples hôte/vecteur de l'invention peuvent être utilisés dans des procédés de production de protéines recombinantes Ils permettent ainsi la réali- sation de systèmes de production particulièrement efficaces chez les levures du genre Kluyveromvces. A cet égard, un autre objet de l'invention concerne un procédé de pro- duction d'une protéine recombinante selon lequel on cultive un couple hôte/vecteur tel que défini ci-avant comprenant le gène de structure codant pour ladite protéine sous le contrôle de signaux permettant son expression, et on récu- père la protéine produite. Un tel procédé permet la production de protéines d'intérêt pharma- ceutiques ou agroalimentaires, telles qu'énoncées ci-avant Il est particulièrement adapté, bien que non limité, à la production de sérum-albumine humaine, ses pré- curseurs et variants moléculaires. Les couples hôte/vecteur de l'invention peuvent également être utilisés directement comme catalyseurs dans des réaction de bioconversion. Un autre objet de l'invention concerne les vecteurs d'expression pour les levures du genre Kluyveromyces portant une copie fonctionnelle d'un gène essentiel à la croissance de la levure Kluyveromvces sur milieu complexe. Plus préférentiellement, le gène essentiel est un gène intervenant dans rune des fonctions précédemment citées Ce gêne peut être obtenu par toute méthode connue de l'homme du métier (clonage par hybridation en utilisant des sondes hétérologues, clonage par complémentation de mutants, etc). Avantageusement, les vecteurs de l'invention sont dépourvus de toute séquence bactérienne Il a en effet été montré qu'il est possible de transformer in vitro les levures Kluyveromyces avec de tels vecteurs Ce système présente l'avantage de permettre rutilisation de vecteurs plus petits, donc plus maniables et capables de recevoir des séquences d'ADN recombiné plus importantes. Comme exemples de tels vecteurs, on peut citer notamment les vec- teurs p YG 1023, p YG 1033 et p YG 1033 A Sfi I, qui sont décrits dans les exemple. Par rapport aux systèmes de l'art antérieur, les avantages de l'inven- tion sont notamment: la stabilisation très efficace de plasmides dans les levures du genre Kluvveromyces; la possibilité de cultiver les cellules recombinantes sur milieu peu couteux et facilement accessible en grandes quantités; ou encore, la possibilité de détecter de manière très simple les cellules recombi- nées, ce qui rend inutile l'emploi de marqueurs de sélection supplémentaires En effet, il est généralement nécessaire, pour identifier et/ou sélectionner les cellules recombinantes, d'utiliser un ou plusieurs marqueurs Le plus souvent il s'agit de gènes conférant la résistance à des antibiotiques, tel que notamment la généticine (gène ph), ou à d'autres composés toxiques pour la cellule tels que les ions cuivre (gène LCUP) Il peut également s'agir de gènes complémentant des auxotrophies de la cellule hôte (gènes URA 3, TRPI, LEUJ 2, etc) Les couples hôte/vecteur de l'in- vention permettent d'éviter l'emploi de tout autre marqueur de sélection. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples suivants, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES Figure 1: Carte de restriction du plasmide p YG 600 bla = gène de la B-lactamase conférant la résistance à l'ampicilline. Figure 2: Stratégie de construction du plasmide p YG 70 aph = gêne de la 3 '-aminoglycoside phosphotransférase conférant la résistance à la généticine (G 418); prom = promoteur; IR = séquence répétée inversée; ORI = origine de réplication; Lac Z' = gène de structure de la B-galactosidase. Figure 3: Stratégie de construction du plasmide p YG 70-2 Pour la 1 1 légende, voir figure 2 Les sites marqués d'une (*) possèdent des extrêmités com- patibles avec les sites correspondants sans reconstituer, après ligation, de sites de coupure reconnus par lesdites enzymes. Figure 4: Séquence des oligodésoxynucléotides de synthèse A-H ayant servi à la construction des adaptateurs 1 à 3 et à la réaction de PCR pour contrôler le génotype des mutants k (exemple 3 2 (ii)). Figure 5: Stratégie de construction du plasmide p YG 70-3 Pour la légende, voir figure 2 term = terminateur Figure 6: Stratégie de construction du plasmide p YG 1003 Pour la légende, voir figure 2. Figure 7: Stratégie de construction du plasmide p YG 1023 Pour la légende, voir figure 2. Figure 8: Stratégie de construction du plasmide p YG 1033 S=Sma I, H=Hind HI, P=Pvu II, Af=Af IIH, Av=Avr II. Figure 9: Représentation des vecteurs p YG 1033 et p YG 1033 A Sfi I. Pour la légende, voir figure 2. Figure 10 Stratégie de clonage, et modification du gène URA 3 de K.lactis CB 52359. Figure 11: Stratégie de construction du plasmide p YG 1012. Figure 12 Stratégie de construction du plasmide p YG 1013 et repré- sentation du fragment Eco RI-Spe I portant le gène K K l modifié. Figure 13: Cette figure présente la production d'albumine humaine par la levure FB 05 D transformée par le plasmide p YG 1023, sur 200 générations de culture en milieu complexe de type industriel, et, parallèlement, la stabilité du plasmide p YG 1023 dans cette levure au cours de la même période La stabilité et la production d'albumine sont définies dans les exemples correspondants. TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que la centri- fugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium bromure d'éthi- dium, la digestion par les enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gel, l'élec- troélution des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose, la transformation dans E Qoli, etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis et al, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y, 1986; Ausubel et al, (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York 1987). La mutagénèse dirigée in vitro par oligodésoxynucléotides est effec- tuée selon la méthode développée par Taylor et al (Nucleic Acids Res ià ( 1985) 8749-8764) en utilisant le kit distribué par Amersham Le séquençage de nucléo- tides est réalisé selon la technique des didéoxy décrite par Sanger et al (Proc. Natl Acad Sci USA, 74 ( 1977) 5463-5467) L'amplification enzymatique de fragments d'ADN spécifiques est effectuée par réaction de PCR ("Polymerase- catalyzed Chain Reaction") dans les conditions décrites par Mullis et Faloona (Meth Enzym, 155 ( 1987) 335-350) et Saiki et al (Science 23 Q ( 1985) 1350- 1354), en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) en suivant les recommandations du fabricant. EXEMPLES UTILISATION DU GENE PGK DE K LACTIS COMME MARQUEUR DE SELECTION Cet exemple décrit la réalisation d'un couple hôte/vecteur dans lequel le gène permettant d'augmenter la stabilité du plasmide à copies multiples est le gène codant pour la 3-phosphoglycérate kinase (PGK) de K lactis. Le couple ainsi obtenu est stable dans un milieu complexe de type in- dustriel tel que précédemment défini. 1 Isolement du gène p de K lactis. Le gène PGK a été isolé chez K lactis CB 52359 par criblage d'une banque génomique partielle avec une sonde hétérologue correspondant à la partie N-terminale du gène PGK de S cerevisiae (Dobson et al, Nucl Acid Res 10 ( 1982) 2625-2637) Plus précisément, la sonde utilisée correspond au fragment Pvu I-Eco RI de 1,3 kb. En Southern Blot (Southern et al, J Biol Chem 28 ( 1975) 503), la sonde utilisée s'hybride notamment à une séquence d'ADN contenue dans un fragment Hind IH-Hind HI de 4 kb Cette séquence a été isolée par hybridation sur colonies au moyen de la sonde précédente Pour cela, une banque restreinte d'ADN génomique de la souche CB 52359, constituée de fragments Hind I d'une taille comprise entre 3 et 5 kb introduits au site Hindn I du plasmide p UC 18, a été préparée et criblée. Un clone portant le plasmide p YG 600 (figure 1) a ainsi été isolé La séquence du gène PGK porté par ce plasmide a été décrite par Fournier et al. (Nucl Acid Res 18 ( 1990) 369). * 2 Construction de vecteurs d'expression d'une protéine recombinante portant le gène PGK de K lactis. 2 1 Construction du plasmide p YG 70 (figure 2). Le plasmide p YG 70 dérive du plasmide p Kan 707 (voir EP 361 991) par élimination des fragments Eco RI contenant le gène URA 3 et la séquence du plasmide p KD 1, ainsi que du site Hindn I unique présent dans le gène ah, pour faciliter les étapes ultérieures de clonage Le gène ph code pour l'aminoglycoside 3 '-phosphotransférase (I) (Oka et al, J Mol Biol 147 ( 1981) 217), et est utilisé comme marqueur de résistance à la généticine (G 418) chez la levure Le fragment Pst I du plasmide p Kan 707 contenant le gène ph a été sous-cloné dans le bacté- riophage M 13 mp 7 Le site Hindn I présent dans ce gène a ensuite été détruit par mutagénèse dirigée selon la méthode décrite par Taylor et al (Cf techniques géné- rales de clonage), pour générer le plasmide p YG 65 (voir figure 2) L'oligodé- soxynucléotide suivant a été utilisé pour réaliser cette mutagénèse: '-GAA ATG CAT AAG CTC ITG CCA TC TCA CCG-3 ' Cet oligodésoxynucléotide a permis de remplacer le triplet CIT co- dant pour Ia leucine 185 en CTC Ce changement ne modifie pas la séquence protéique résultante. Pour obtenir le plasmide p YG 70, la partie contenant le réplicon bac- térien de p Kan 707 a été isolée par digestion avec l'enzyme Eco RI et recircularisée avec la T 4 DNA ligase pour former le plasmide p YG 69 (figure 2) Le fragment Pst I présent dans ce dernier contenant le gène ph a ensuite été remplacé par le fragment équivalent muté provenant de p YG 65. Le plasmide p YG 70 ainsi obtenu contient donc: un réplicon et un marqueur de sélection (gène bla conférant la résis- tance à l'ampicilline) pour E coi, un marqueur de sélection pour la levure (gêne ph muté) sous contrôle du promoteur kl de la toxine Killer. 2 2 Modification des sites de restriction du plasmide p YG 70 (figure 3). Pour faciliter les étapes ultérieures de clonage, certains sites de res- triction ont été supprimés (i) et 2 adaptateurs ont été ajoutés (ii et iii) sur le plas- mide p YG 70. (i) Elimination du site Sph I. Le plasmide p YG 70 a été digéré par Sph I, et les extrémités cohésives ont ensuite été éliminées par digestion en présence d'ADN polymérase du phage T 4 Après ligation en présence de ligase, le plasmide p YG 70 A Sph I a été obtenu (voir figure 3). (ii) Insertion de l'adaptateur 1. L'adaptateur 1 a été obtenu par hybridation des oligodésoxynucléo- tides de synthèse A et B présentés sur la figure 4 Pour cela, 2 Zg de chaque oli- godésoxynucléotide ont été incubés dans un tampon d'hybridation qsp 20 j 1 (tampon Tris-H Cl 30 m M p H 7,5; Na CI 30 m M; Mg CI 2 7,5 m M; ATP 0, 25 m M; DIT 2 m M; EDTA 0,2 m M), puis la température a été élevée à 80 C pendant 10 minutes, et ramenée lentement à température ambiante. L'adaptateur ainsi obtenu contient des sites de coupure pour les en- zymes suivantes: Sac I; Sal I; Mlu I; Bss HII et Sfi I, et permet d'éliminer, lors de son introduction, le site Sal I présent sur le plasmide p YG 70 A Sph I Cet adaptateur a été introduit par ligation dans le plasmide p YG 70 A Sph I préalablement digéré par les enzymes Sal I et Sac I. Le plasmide obtenu est appelé p YG 70-1. (iii) Insertion de l'adaptateur 2. L'adaptateur 2 a été réalisé en suivant le protocole décrit pour l'adapta- teur 1, en utilisant les oligodésoxynucléotides C et D décrits sur la figure 4 Cet adaptateur contient des sites de coupure pour les enzymes suivantes: Sfi I; Aat II; Sph I; Nar I et Sac I et permet d'éliminer, lors de son introduction, le site Eco RI présent sur le plasmide p YG 70- 1 Il a été introduit par ligation dans le plasmide p YG 70-1 préalablement digéré par les enzymes Eco RI et Sac I, pour former le plasmide p YG 70-2 (figure 3). 2.3 Introduction d'une cassette d'expression de la sérum-albumine humaine. La cassette d'expression de la sérum-albumine humaine utilisée com- prend: le promoteur inductible du gène LAC 4 de K lactis, le gène de structure codant pour la sérum-albumine humaine (forme prépro), et le terminateur du gène PGK de S cerevisiae. Cette cassette a été isolée du plasmide p YG 404 (EP 361 991) sous forme d'un fragment Sal I-Sac I, puis introduite par ligation dans le plasmide p YG 70-2 préalablement digéré par les enzymes correspondantes. Le plasmide obtenu est appelé p YG 70-3 (figure 5). 2.4 Insertion du gène PGEK de K lactis. Le gène K lactis a été isolé du plasmide p YG 600 (figure 1), sous-cloné dans le plasmide p YG 1002 pour générer le plasmide p YG 1003, puis isolé de ce dernier sous forme d'un fragment Mlu I-Bss HII. Le sous-clonage dans p YG 1002 a permis d'obtenir le gène PGK K.lactis dépourvu de son promoteur, et sous forme d'un fragment Mlu I- Bss HII. Le plasmide p YG 1003 a été obtenu de la manière suivante (figure 6): Le plasmide p IC 20 H (Marsh et al, Gene 32 ( 1984) 481) a été digéré par Bgl II et Eco RI de façon à introduire l'adaptateur 3 Cet adaptateur, qui apporte les sites Eco RI, Bss HII, Cla I, Nhe I, Mlu I et Bgl II a été obtenu comme décrit précédemment ( 2 2 (ii)), par hybridation des oligodésoxynucléotides E et F (figure 4) Le plasmide résultant est appelé p YG 1002 Le gène GK de lactis a été introduit dans ce nouveau plasmide sous forme d'un fragment Cla I-Nhe I, issu du plasmide p YG 600 Le plasmide obtenu est appelé p YG 1003 (figure 6). Le fragment Mlu I-Bss HH issu du plasmide p YG 1003 portant le gène PGK de K lactis a ensuite été introduit dans les sites correspondants sur le plas- mide p YG 70-3, pour générer le plasmide p YG 70-4 (figure 7). Sur ce plasmide, le gène PGK de K lactis est désormais placé sous le contrôle du promoteur bidirectionnel kl de la toxine Killer. 2.5 Insertion du réplicon levure. Les plasmides p YG 70-4 (figure 7) et p KD 1 (EP 361 991) ont été digérés par Sph I et ligués ensemble en présence de ligase A l'issue de cette liga- tion, 4 vecteurs peuvent être obtenus, selon la conformation du plasmide p KD 1 (forme A ou forme B) et l'orientation de la partie correspondant au plasmide p YG 70-4 par rapport à p KD 1. L'une de ces constructions à été sélectionnée et appelé p YG 1023 (figure 7) Ce vecteur comprend: la séquence entière du plasmide p KD 1, qui fait de p YG 1023 un plasmide à copies multiples, stable, et capable de se répliquer chez les Ievures et préférentiellement les levures du genre (luyveromyces, une cassette d'expression de la sérumn- albumine humaine comportant le gène de structure codant pour la forme prépro sous contrôle du promoteur inductible du gène LAC 4 de K lactis, et du terminateur du gène PGK de S cerevisiae, un réplicon et un marqueur de sélection (gène bk conférant la résis- tance à l'ampicilline) pour coli, deux marqueurs de sélection pour la souche K lactis FB 05 D (Cf exemple 3): le gène Uh muté sous contrôle du promoteur bidirectionnel kl de la toxine Killer et le gène PGK de K lactis sous contrôle du même promoteur mais transcrit de façon divergente par rapport au gène Ih. 2.6 Construction du vecteur p YG 1033 A Sfi I. Une construction dérivée du plasmide p YG 1023 a été réalisée, dans Ie but d'obtenir, une fois introduite dans la levure, des vecteurs d'expression dépour- vus de réplicon bactérien et des marqueurs de résistance à l'ampicilline et à la généticine, et sur lesquels le promoteur K 1 situé en amont du gène úp K est éliminé Cette construction a été réalisée de la manière suivante: (i) Modification du terminateur PGK. Cette étape est facultative Toutefois elle a été réalisée, dans le but d'éviter tout risque de recombinaison au sein même du vecteur d'expression, qui conduirait à la diminution des capacités productrices du couple h te/vecteur En effet, le fragment utilisé comme terminateur dans le plasmide p YG 1023 contient le terminateur PGK de S cerevisiae et également la partie C-terminale du gène de structure PGEK de S cerevisiae, et présente de ce fait une homologie avec la région corespondante du gène PGK de K jlactis utilisé comme marqueur de sélection Ce terminateur a donc été modifié de la manière suivante. Le fragment Pvu II de 3,6 kb isolé à partir de p YG 1023 a dans un premier temps été sous cloné dans les sites correspondants du vecteur p UC 18 pour former le plasmide p YG 1027 Le fragment Sma I-Hindl II de 427 pb de ce plas- mide portant la région terminateur PGK a ensuite été remplacé par un fragment de 325 pb correspondant à la région 3 ' non codante du gène PGK de S cerevisiae. (c'est-à-dire ne contenant aucun element du gène de structure) Ce fragment de 325 pb a été obtenu par réaction d'amplification PCR (Cf techniques générales de clonage) sur le terminateur PGK présent sur le plasmide p YG 1023 en utilisant les oligodésoxynucléotides suivants: 5 '-GGAAAGCITCGGACCGTAAAITGAATGAA Tr GAAATC-3 ' '-CCATCCCGGGAGCTCATCCGAAITAATCCCAGC-3 ' puis digéré avec les enzymes Sma I et Hind M Le vecteur obtenu a été désigné p YG 1028 (figure 8) La digestion de celui-ci avec les enzymes Avr Il et Af II permet l'isolement d'un fragment de 1,1 kb, qui a été utilisé pour remplacer le fragment correspondant dans p YG 1023 Le plasmide obtenu a été désigné p YG 1033 (figure 9). (ii) Délétion du fragment Sfi I. Le plasmide p YG 1033 a ensuite été soumis à une digestion en pré- sence de l'enzyme Sfi I pour exciser le fragment de 3,5 kb contenant le réplicon bactérien et les marqueurs de résistance, puis à une ligation en présence de ligase pour générer le plasmide p YG 1033 A Sfi I (figure 9). 3 Isolement d'un mutant pgk de K lactis. Cet exemple décrit la préparation d'un mutant gk à partir d'une souche sauvage de K lactis en évitant l'utilisation de gènes de résistance à des antibiotiques Deux étapes ont été effectuées successivement: (i) préparation d'une souche auxotrophe ura 3 (exemple 3 1), et (ii) remplacement du gène PGK ("gene replacement", Rothstein préci- tée) par un fragment d'ADN portant le gène PGK modifié par substitution d'une partie interne du gène par un fragment d'ADN portant le gène UJRA 3 de S.cerevisiae Le mutant p a ainsi été préparé par élimination dirigée de la quasi totalité de la phase ouverte de lecture (ORF) du gène PGK dans le génome de la souche ura 3 (Cf exemple 3 2). Cette technique de mutagénèse permet d'éviter l'emploi d'agents mu- tagéniques non spécifiques, qui pourraient altérer d'autres régions du génome de la cellule Elle permet également d'éviter tout événement génétique de réversion risquant de corriger les modifications effectuées sur le gène PG, 3.1 Construction d'un mutant ura 3 de K lactis. (i) Clonage et modification du gène URA 3 de Klactis CB 52359 (figure 10). Le gène URA 3 de Klactis codant pour l'orotidine-5-phosphate decar- boxylase (Shuster et al, Nucl Acid Res 15 ( 1987) 8573) a été cloné sous forme d'un fragment Bam HI-Pst I de 1,2 kb en utilisant la technique de PCR (Cf tech- niques générales de clonage), à partir d'un extrait d'ADN génomique (Rose et al, "Methods in Yeast Genetics" Cold Spring Harbor Laboratory Press, N Y, 1990) de K lactis CB 52359 au moyen des oligodéoxynucléotides suivants: 5 '-GGAAGCITGGCTGCAGGAA Tr GTCG Tr CATGGTGACAC-3 ' et '-CCGAATTCCCGGATCCCATAATGAAAGAGAGAGAGAGAAGCAAAC-3 '. Le fragment obtenu a ensuite été sous-cloné dans les sites Ban HI et Pst I du plasmide p IC 20 H pour donner le plasmide p YG 1007 (figure 10) Le gêne URA 3 a ensuite été modifié par délétion d'un fragment Sty I interne à l'ORF com- prenant 286 pb Ceci a été effectué sur p YG 1007, par digestion avec renzyme Sty I puis ligation en présence de ligase Ce nouveau plasmide est appelé p YG 1010 (figure 10). (ii) Tranformation de lactis CBS 293 91 par le gène URA 3 délété. La souche CBS 293 91 a été transformée selon le protocole décrit par Durrens et al (Curr Genet 18 ( 1990) 7) par 10 p g du fragment Pst I- Bam HI isolé par électroélution du plasmide p YG 1010, qui contient le gne-URA 3 délété. Après un saut de température à 42 C ("heat shock") et 2 lavages successifs à l'eau, 600 pi de milieu YPD (extrait de levure 10 g/l; peptone 20 g/l; glucose 20 g/l) ont été ajoutés et les cellules ont été incubées une nuit Les cellules ont ensuite été étalées sur milieu synthétique minimal SD ("bacto-yeast nitrogen base" sans acides aminés (Difco) 6,7 g; glucose 20 g; Bacto-agar 20 g, eau distillée 1000 ml) en présence d'uracile ( 100 pg/ml), d'uridine ( 100 pg/ml) et de 5-fluoro orotate ( 5 FO) 15 m M. Des clones sont apparus au bout de 4 à 5 jours Ils ont été repiqués sur milieu YPD de manière à obtenir des colonies isolées. A partir du ler repiquage, 3 clones issus de la colonie initialement apparue sur milieu SD+ 5 FO ont été réisolés sur milieu YPD (repiquage secon- daire). Les clones issus du repiquage secondaire ont ensuite été testés pour le phénotype Ura 3 en utilisant le test en goutte sur milieu SD et SD+uracile (Jund et Lacroute, J of Bact 102 ( 1970) 607-615; Bach et Lacroute, Mol Gen Genet. ( 1972) 126-130) Le génotype ura 3 des clones ainsi obtenus a été contrôlé par: réaction de PCR en utilisant les oligodéoxynucléotides décrits pour le clonage en 4 1, ce qui permet d'identifier les clones portant le gêne URA 3 délété ou intact par différence de taille du produit d'amplification ( 0,9 et 1,2 kb respectivement); complémentation au moyen du plasmide p Kan 707 (EP 361 991) portant le gène URA 3 intact de S cerevisiae, connu pour sa capacité à complé- menter la mutation ura 3 chez Klactis (De Louvencourt précitée); et Southern blot sur l'ADN génomique des clones identifés, en utilisant comme sonde le gène URA 3 de K lactis isolé dans l'exemple 4 1 marqué au 32 p selon la technique décrite par Feinberg et Vogelstein (Anal Biochem 132 ( 1983) 6) Cette étape permet d'identifier les clones portant le gêne URA 3 délété ou intact, par différence de taille du fragment révélé par hybridation. Le mutant ura 3 sélectionné est appelé K lactis Y 616. 3.2 Construction d'un mutant gj de K lactis Y 616. Un fragment d'ADN a été préparé, contenant le gène GK modifié par substitution d'une partie interne du gène par un fragment d'ADN portant le gène URA 3 de S cerevisiae Ce fragment a ensuite été utilisé pour remplacer la copie génomique intacte du gêne PGK, par double recombinaison homologue (Rothstein précitée). (i) Construction d'un fragment d'ADN contenant le gène PK modifié (figures 11 et 12). Dans le but d'augmenter la fréquence de recombinaison homologue, le gène PGK a dans un premier temps été reconstitué bordé de régions flanquantes plus importantes En particulier, les régions situées en amont du gêne PGK ont été clonées, puis ligaturées au fragment porté par le plasmide p YG 600 (figure 1). Clonage de la région en amont du gêne PGK. Le criblage de la banque décrite à l'exemple 1 a également permis de mettre en évidence par "Southern blot" un fragment génomique Xba I de 2, 5 kb environ Ce fragment a été isolé par criblage d'une banque génomique restreinte de K lactis CB 52359, constituée de fragments d'ADN coupés par Xba I, d'une taille comprise entre 2 et 3 kb, introduits dans le site Xba I du plasmide p UC 18. Une banque de 500 clones a ainsi été constituée, puis criblée avec la sonde hétéro- logue utilisée dans l'exemple 1 Par hybridation sur colonies, un clone a été iden- tifié et son ADN plasmidique séparé Ce plasmide, nommé p YG 610 (figure 11), contient un fragment d'ADN génomique de 2,5 kb L'analyse de la séquence de ce fragment montre qu'il contient une partie codant pour la région N-terminale de la protéine Pgk de K lactis ( 0,3 kb), et 2,2 kb correspondant à la région située en amont du gène Construction du plasmide p YG 1012 (figure 11). Les fragments Afl Il-Hind III du plasmide p YG 600 et Eco RI-Afl I du plasmide p YG 610 ont été isolés par électroélution, puis introduits ensemble par ligation dans le plasmide p UC 9 préalablement digéré par Eco RI et Hindil Le plasmide obtenu est appelé p YG 1012. Modification du gène PGK. Le fragment Sal I-Sac I interne au gène PGK porté par le plasmide p YG 1012 a été remplacé par digestion puis ligation par le fragment Sal I- Sac I issu du plasmide p YG 1011, portant le gène URA 3 de S cerevisiae, pour générer le plasmide p YG 1013 (figure 12). Le plasmide p YG O 111 a été construit par insertion d'un fragment Hind I isolé à partir du plasmide Y Ep 24 (ATCC n 37051) contenant le gène URA 3 de S cerevisiae, dans les sites correspondants du bactériophage M 13 tg 130 (Kieny et al, Gene 26 ( 1983) 101). Le plasmide p YG 1013 contient donc, sous forme d'un fragment Eco RISpel, le gène URA 3 de S cerevisiae, bordé d'un coté par la région 5 ' non codante et les 500 premières paires de bases du gêne de structure PGK de K lactis, et de l'autre par les 100 dernières paires de bases du gêne de structure PGK de K lactis et son terminateur (figure 12). (ii) Transformation de K lactis Y 616 par le gène PGK modifié La souche Y 616 (ura 3) a été transformée selon la méthode décrite par Durrens et al (précitée), avec 10 xg du fragment Eco RI-Spe I isolé à partir du plasmide p YG 1013. Après transformation, les cellules contenant le gène URA 3 fonction- nel ont été sélectionnées sur milieu synthétique minimal SD dans lequel le glu- cose a été remplacé du glycérol ( 3 %) et de l'éthanol ( 2 %) Ce milieu permet la croissance des mutants p gk. Les colonies transformées ainsi obtenues ont ensuite été repiquées sur milieu complexe YPD, dans lequel les mutants Xgk sont incapables de pousser. %o des souches obtenues ont présenté dans ce test un phénotype Pgk-. Sur les colonies ainsi identifiées, la mutation au niveau du gène PGK a été contrôlée par réaction d'amplification PCR en utilisant les oligodésoxynu- cléotides G et H décrits sur la figure 4 Ces 2 oligodésoxynucléotides permettent d'amplifier: une région de 0,9 kb environ sur le gène EPK de K actis intact, et une région de 1,3 kb environ sur le gène K de K lactis modifié comme décrit ci-dessus (i). L'amplification a été réalisée sur cellules entières présentant le phéno- type Pgk- Après 30 cycles d'amplification, les surnageants ( 10 pi) ont été déposés sur gel d'agarose ( 0,8 %) afin de déterminer la taille des bandes Les témoins ont été constitués par amplification au moyen des mêmes oligodésoxynucléotides sur les plasmides p YG 600 (gène intact) et p YG 1013 (gène modifié). Les résultats obtenus montrent que dans les souches Pgk-, une bande de 1,3 kb est amplifiée Ces souches possèdent donc bien un gène PGK modifié. Parmi celles-ci, un mutant pgk a été sélectionné et appelé K actis FB 05 D. 4 Transformation de la souche K lactis FB 05 D par les plasmides p YG 1023 et p YG 1033 A Sfi I. Le vecteur p YG 1023 a été introduit par transformation dans la souche K.lactis FB 05 D en utilisant la technique éthylène glycol/diméthylsulfoxyde (Durrens et al précitée) Les levures transformées ont été sélectionnées pour le phénotype Pgk+ que confère le plasmide p YG 1023 sur milieu complexe YPD. Le vecteur p YG 1033 A Sfi I a été introduit dans la souche K lactis FB 05 D par électroporation, selon la technique décrite par Meilhoc et al. (Biotechnologie 8 ( 1990) 223) Après transformation, les cellules ont été étalées sur milieu YPD et cultivées à 30 C pendant 3 jours Les cellules capables de croitre sur ce type de milieu (contenant donc une copie fonctionnelle du gène PGK) ont ensuite été testées pour leur résistance à la généticine 60 o d'entre-elles sont incapables de pousser sur milieu YPD en présence de 200 pg/ml de G 418. Ces résultats montrent que le vecteur introduit a perdu le marqueur G 418, et qu'il est capable de complémenter la mutation pgk de la souche FB 05 D. Etude de la stabilité du plasmide p YG 1023 et de la production d'al- bumine. 5.1 Etude de stabilité. Les cellules transformées ont été précultivées en erlenmeyers dans un milieu complexe de type industriel M 9 C 520 lMilieu M 9 (Maniatis et al précitée) supplémenté de 20 g/1 d'extrait soluble de maïs (Solulys L, Roquette) en présence d'acétate d'ammonium 2 g/Il et de lactose 20 g/ll à 28 C sous agitation. Cette préculture a ensuite été utilisée pour inoculer, à une dilution de -3 (erlen 1) et de 10-6 (erlen 2), 2 erlenmeyers de 300 ml contenant 50 ml de milieu M 9 C 520 Les cellules ont ensuite été cultivées comme précédemment sous agitation ( 200 tours/min) pendant 3 jours A ce stade, les cellules de l'erlen 1 ont subi 10 divisions cellulaires (temps 10 générations), et les cellules de l'erlen 2 ont subi 20 divisions cellulaires (temps 20 générations). La culture de 1 'erlen 2 a ensuite été utilisée à son tour pour inoculer, à une dilution de 10-3 (erlen 3) et de 10-6 (erlen 4), 2 autres erlenmeyers Les cel- lules ont ensuite été cultivées comme précédemment pendant 3 jours A ce stade, les cellules de l'erlen 3 ont subi 30 divisions cellulaires (temps 30 générations), et les cellules de l'erlen 4 ont subi 40 divisions cellulaires (temps 40 générations). Cette opération a été répétée encore 8 fois, de manière à obtenir les erlens 5-20 contenant des cultures ayant subi de 50 jusqu'à 200 divisions cellu- laires. A la fin de chaque culture, un échantillon a été prélevé dans les erlenmeyers, de manière à réaliser une suspension à 103 cellules/ml 200 p I de ces suspensions ont ensuite été étalés sur 2 types de boites: boite YPGE (extrait de levure 10 g/il, peptone 20 g/l, glycérol 30 g/I, ethanol 20 g/l) Ce milieu permet la croissance de toutes les cellules. boite YPD en présence de G 418 ( 200 pgfml) Sur ce type de boite, seules les cellules contenant le plasmide p YG 1023 portant le gène de résistance au G 418 et le gène M sont capables de pousser. La stabilité du plasmide p YG 1023 a ainsi été déterminée pour chaque culture Les résultats sont présentés sur la figure 13, dans laquelle la stabilité est définie par le rapport du nombre de colonies présentes sur les boites YPD/G 418 sur le nombre de colonies présentes sur les boites YPGE Ces résultats démontrent les avantages de l'invention par rapport à l'art antérieur En effet, bien que des plasmides stables basés sur p K Dl aient déjà été décrits, l'introduction de cassettes d'expression dans ceux-ci permettant la produc- tion de protéines recombinantes s'est toujours accompagnée d'une baisse de sta- bilité Ceci a en particulier été observé pour l'albumine et l'interleukine-l B (EP 361 991) La présente invention permet d'éliminer cette perte de stabilité, puisque, dans des conditions dinduction de l'expression (lactose), les vecteurs sont mainte- nus dans 100 % des cellules transformées après 200 générations de culture. 5.2 Etude de la production d'albumine. A la fin de chaque culture obtenue selon la procédure décrite en 5 1, j t de surnageant dépourvu de cellules ont été prélevés dans chaque erlen, et mélangés à un volume équivalent de tampon Laemmli 2 X (Laemmli, Nature 2 M ( 1970) 680) Après chauffage à 960 C pendant 10 minutes, les protéines de l'échantillon ont été séparées sur gel de polyacrylamide SDS 8,5 % La production d'albumine a ensuite été révélée par coloration du gel au bleu de Coomassie, et évaluée par densitométrie en utilisant un densitomètre Shimazu C 5930 (marge d'imprécision de cette technique: +/ 20 %) La figure 13 montre la variation de la production d'albumine en fonction du nombre de générations de culture en condi- tion d'induction (milieu contenant du lactose) Les valeurs sont données en pour- centage de production par rapport à la production moyenne mesurée sur les 200 générations. Ces résultats confirment la stabilité importante du couple hôte vecteur décrit, et sa capacité à produire à des niveaux constants et élevés, en condition d'induction, une protéine recombinante sur 200 générations de culture au moins en milieu complexe de type industriel. Un échantillon des souches Klactis Y 616 et lactis FB 05 D a été déposé le 11 juin 1991 auprès du Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) à Baam aux Pays-Bas dans les conditions du Traité de Budapest, sous les numéros respectifs CBS 294 91 et CBS 295 91 La souche K lacti 5 CBS 293 91 correspond à la souche CB 51065 redéposée le 11 juin 1991 selon les conditions du Traité de Budapest. REVENDICATIONS 1 Couple hôte/vecteur hautement stable en milieu complexe caracté- risé en ce que l'hôte est une levure du genre Kluyveromyces dans laquelle un gène essentiel pour la croissance dans ledit milieu est nonfonctionnel, et en ce que le vecteur porte une copie fonctionnelle dudit gène. 2 Couple hôte/vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce que le gène essentiel est choisi parmi les gènes impliqués dans le métabolisme d'une source carbonée présente dans le milieu (galactose, lactose, glucose, etc), les gènes intervenant dans la division cellulaire, dans la synthèse membranaire, dans la synthèse protéique, dans la réplication ou la transcription de l'ADN. 3 Couple hôte/vecteur selon la revendication 2 caractérisé en ce que le gène essentiel est un gène impliqué dans la glycolyse. 4 Couple hôte/vecteur selon la revendication 3 caractérisé en ce que le gène impliqué dans la glycolyse est un gène unique dont le produit est indis- pensable pour que la levure puisse métaboliser les sources de carbone du milieu. Couple hôte/vecteur selon la revendication 4 caractérisé en ce que le gène impliqué dans la glycolyse est choisi parmi les gênes codant pour la phos- phoglycérate kinase (PGK), la phosphoglycérate mutase (GPM), la pyruvate kinase (PYK), et la triose phosphate isomérase (TPI). 6 Couple hôte/vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce que la copie fonctionnelle du gène essentiel présente sur le vecteur est soit placée sous le contrôle d'un promoteur faible, soit entièrement dépourvue de promoteur, soit placée sous le contrôle d'un promoteur défectif. 7 Couple hôte/vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce que le gène essentiel présent sur le vecteur est défectif dans certaines conditions, comme par exemple de température (gène thermosensible). 8 Couple hôte/vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'hôte est choisi parmi les levures Kluyveroniyces lactis et Kluyveromyces fragilis. 9 Couple hôte/vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce que le vecteur comprend en outre une sequence d'ADN comportant un gène de struc- ture au moins codant pour une protéine recherchée et des signaux permettant son expression. Couple hôte/vecteur selon la revendication 9 caractérisé en ce que le gène de structure code pour une protéine d'intérêt pharmaceutique ou agroali- mentaire. 11 Couple hôte/vecteur selon la revendication 10 caractérisé en ce que le gène de structure code pour une protéine choisie parmi les enzymes (tels que notamment la superoxide dismutase, la catalase, les amylases, les lipases, les amidases, la chymosine), les dérivés sanguins (tels que la sérum-albumine ou des variants de celle-ci, l'alpha ou la béta-globine, le facteur VIII, le facteur IX, le facteur von Willebrand ou des domaines de celui-ci, la fibronectine, l'alpha-1 antitrypsine), l'insuline et ses variants, les lymphokines ltelles que les interleu- kines, les interférons, les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF, M-CSF), le TNF, le TRF, les MIP), les facteurs de croissance (tels que l'hormone de croissance, l'érythropoiétine, le FGF, 'EGF, le PDGF, le TGF), les apolipopro- téines, des polypeptides antigéniques pour la réalisation de vaccins (hépatite, cytomégalovirus, Eppstein-Barr, herpes etc), des récepteurs viraux, ou encore des fusions de polypeptides telles que notamment des fusions comportant une partie active fusionnée à une partie stabilisatrice. 12 Couple hôte/vecteur selon la revendication 9 caractérisé en ce que la séquence d'ADN comprend en outre des signaux permettant la sécrétion de la protéine recombinante. 13 Couple hôte/vecteur selon la revendication 9 caractérisé en ce que les signaux permettant l'expression du gène de structure sont choisis parmi les promoteurs et les terminateurs de transcription. 14 Couple hôte/vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce que les promoteurs utilisés sont des promoteurs de gènes de levure, éventuelle- ment modifiés, et encore plus préférentiellement, de gènes glycolytiques de levure ou de gènes de levure fortement exprimés. 15 Procédé de production d'une protéine recombinante caractérisé en ce que lon cultive un couple hôte/vecteur tel que défini dans les revendications 9 à 14, et on récupère la protéine produite. 16 Procédé selon la revendication 15 pour la production de protéines d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire. 17 Procédé selon la revendication 16 pour la production de protéines telles que définies dans la revendication 11. 18 Procédé selon la revendication 17 pour la production de sérum- albumine humaine, ses précurseurs et variants moléculaires. 19 Utilisation d'un couple hôte/vecteur tel que défini dans les reven- dications 9 à 14 comme catalyseur dans des réactions de bioconversion. Vecteur d'expression pour les levures du genre Kluyveromyces portant une copie fonctionnelle d'un gène essentiel à la croissance de la levure Kluyveromvces sur milieu complexe. 21 Vecteur selon la revendication 20 caractérisé en ce que le gène essentiel est défini selon lune des revendications 2 à 5. 22.Vecteur selon la revendication 20 caractérisé en ce qu'il est dépourvu de séquences bactériennes. 23 Les vecteurs p YG 1023, p YG 1033 et p YG 1033 iv Sfil, tels que décrits sur les figures 7 et 9. 24 Levure du genre Kluyveromvces présentant le phénotype Pgk-. La levure K lactis FB 05 D N O CBS 295 91.