FR 2673643 A1 19920911 FR 9102872 A 19910305 La présente invention concerne de nouvelles séquences ADN de peptide de transit, de nouveaux gènes chimères et leur utilisation dans les plantes pour leur conférer une tolérance accrue à des herbicides de la famille des phosphonométhylglycines Elle concerne également les cellules végétales transformées à l'aide de ces gènes, les plantes transformées régénérées à partir de ces cellules ainsi que les plantes issues de croisements utilisant ces plantes transformées. Le glyphosate,le sulfosate ou la fosamétine sont des herbicides systémiques à large spectre de la famille des phosphonométhylglycines Ils agissent essentiellement comme inhibiteurs compétitifs de la 5- enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EC 2 5 1 19) ou EPSPS vis à vis du PEP(phosphoenolpyruvate) Après leur application sur la plante,ils sont véhiculés dans la plante o ils s'accumulent dans les parties à croissance rapide, notamment les apex caulinaires et racinaires,provoquant l'altération jusqu'à la destruction des plantes sensibles. L'EPSPS plastidiale, cible principale de ces produits est une enzyme de la voie de biosynthèse des acides aminés aromatiques,qui est codée par un ou des gènes nucléaires et synthétisée sous forme d'un précurseur cytoplasmique puis importée dans les plastes o elle s'accumule sous sa forme mature. La tolérance des plantes au glyphosate et aux produits de la famille est obtenue par introduction stable dans leur génome d'un gène d'EPSPS d'origine végétale ou bactérienne mutée ou non quant aux caractéristiques d'inhibition par le glyphosate du produit de ce gène Etant donné le mode d'action du glyphosate et le degré de tolérance au glyphosate du produit des gènes utlisés, il est intéressant de pouvoir exprimer le produit de la traduction de ce gène de façon à permettre son accumulation importante dans les plastes. Il est connu,par exemple d'après le brevet américain 4 535 060,de conférer à une plante une tolérance à un herbicide du type ci-dessus,en particulier la N-phosphonométhylglycine ou glyphosate,par introduction dans le génome des plantes d'un gène codant pour une EPSPS portant au moins une mutation rendant cette enzyme plus résistante à son inhibiteur compétitif(le glyphosate)après localisation de l'enzyme dans le compartiment plastidial Ces techniques demandent cependant à être améliorées pour obtenir une plus grande fiabilité dans l'emploi de ces plantes en conditions agronomiques. Dans la présente description,on entend par "plante" tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse et par "cellule végétale" toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals ou des tissus différenciés tels que des embryons ou des parties de plantes des plantes ou des semences. La présente invention a pour objet la production de plantes transformées ayant une tolérance accrue aux herbicides de la famille des phosphonométhylglycines par régénération de cellules transformées à l'aide de nouveaux gènes chimères comportant un gène de tolérance à ces herbicides L'invention concerne également ces nouveaux gènes chimères, les nouveaux peptides de transit qu'ils contiennent ainsi que les plantes les contenant rendues plus tolérantes par une accumulation de l'enzyme mutée, sous sa forme mature, dans les plantes. Plus particulièrement l'invention a pour objet un gène chimère pour conférer aux plantes une tolérance accrue vis à vis d'un herbicide ayant pour cible l'EPSPS, comprenant, dans le sens de la transcription, une zone promotrice,une zone peptide de transit,une séquence d'un gène codant pour une enzyme de tolérance au glyphosate et une zone signal de polyadénylation non traduite en 3 ',caractérisé en ce que la zone peptide de transit comprend, dans le sens de la transcription, un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale,puis un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale. L'invention concerne également toute séquence ADN de la zone peptide de transit définie ci-dessus. Les peptides de transit utilisables dans la zone de peptide de transit peuvent être en soi connus,d'origine végétale,par exemple issus de maïs, de tournesol, de pois, de tabac ou autres Le premier et le second peptide de transit peuvent identiques,analogues ou différents Ils peuvent en outre comprendre chacun une ou plusieurs unités peptide de transit De préférence on utilise une séquence issue de la PSU du gène de la ribulose-1,5-bis phosphate carboxylase oxygénase(Ru Bis Co). La partie de séquence de la partie mature N terminale est issue d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale,comme par exemple un gène de maïs,de tournesol,de pois ou autres,l'espèce végétale d'origine pouvant être identique,analogue ou différente de celle dont sont issus respectivement le premier et le second peptide de transit Par ailleurs la partie de séquence de la partie mature peut comprendre un nombre variable d'acides aminés,généralement de 10 à ,de préférence de 18 à 33 De préférence on utilise une séquence issue de la PSU du gène de la ribulose-1,5-bis phosphate carboxylase oxygénase(Ru Bis Co). La construction de l'ensemble de la zone de transit peut être effectuée de manière en soi connue,notamment par fusion ou tout autre moyen convenable Cette zone caractéristique a comme rôle de permettre le relargage d'une protéine mature et native avec une efficacité maximale. La séquence codante pour la tolérance herbicide utilisable dans le gène chimère selon l'invention code pour une EPSPS mutée ayant un degré de tolérance au glyphosate Cette séquence obtenue notamment par mutation du gène EPSPS peut être d'origine bactérienne, par exemple issu de Salmonella typhymurium (et nommée dans la suite "gène Aro A"), ou végétale, par exemple de pétunia ou de tomate Cette séquence peut comprendre une ou plusieurs mutations,par exemple la mutation Pro 101 en Ser ou encore les mutations Gly 96 en Ala. La zone promotrice du gène chimère selon l'invention peut être composée avantageusement d'au moins un promoteur d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes c'est à dire de promoteurs d'origine virale tels que celui de l'ARN 35 S du virus de la mosaïque du choux (Ca MV 35 S) ou d'origine végétale tels que la petite sous unité du gène de la ribulose-1,5- bisphosphate carboxylase(Rubis CO) d'une culture comme le maïs ou le tournesol. La zone signal de polyadénylation,non traduite en 3 ' du géne chimère selon l'invention peut être d'origine quelconque,par exemple bactérienne telle que celle du gène de nopaline synthase,ou végétale telle que celle de la petite sous unité de la Rubis CO du maïs ou du tournesol. Le gène chimère selon l'invention peut comprendre, en plus des parties essentielles ci-dessus, une zone intermédiaire non traduite(linker) entre la zone promotrice et la séquence codante et qui peut etre d'origine quelconque,bactérienne,virale ou végétale. EXEMPLE:1:CONSTRUCTION D'UN GENE CHIMERE: On effectue la construction du gène chimère selon l'invention à partir des éléments suivants: 1)Promoteur" double Ca MV"(c'est à dire dont une partie a été dupliquée): le promoteur Ca MV 35 S a été isolé par Odell et al( 1985) Un clone,p JO 5-2 contenant environ 850 bp en amont du site d'initiation de la transcription a été coupé par Eco RI-Hind III, les extrémités de ce fragment isolé ont été rendues franches par la polymérase de Klenow et le fragment inséré au site Hinc II du vecteur p UC 19 (Yannish-Perron et al,1985) Ce promoteur a été digéré par Cla I, les extrémités remplies par la polymérase de Klenow,puis redigéré par Hind III Un fragment Hind III-Eco RV,isolé à partir du même promoteur initial,a été introduit entre ces deux sites Le promoteur ainsi obtenu possède une double zone amplificatrice en amont des éléments de régulation du promoteur Ca MV 35 S Il a été introduit sous forme d'un fragment Hind III-Eco RI dans le vecteur p RPA-BL 150 A alpha 2, décrit dans la demande de brevet français 88/04130, coupé par Hind III et Eco RI. 2)Zone de transfert:les deux peptides de transit ainsi que les éléments de protéines matures utilisés proviennent de l'AD Nc cloné de la petite sous unité du gène de la Rubis CO de maïs,dont le gène a été décrit par Lebrun et al( 1987), et de l'AD Nc cloné de la petite sous unité du gène de la Rubis CO de tournesol, isolé par Waksman et al( 1987) Plus précisément,la zone de transit,appelée peptide de transit optimisé, comprend,dans le sens de la traduction: -un peptide de transit de la petite sous unité de la Ru Bis CO de tournesol, -une séquence N terminale de 22 acides aminés de la partie mature de la petite sous unité de la Ru Bis CO de maïs, -un peptide de transit de la petite sous unité de Ru Bis CO de maïs. La construction utilisant ce peptide de transfert optimisé est nommée p RPA-BL 410. D'autres séquences analogues peuvent être utilisées qui contiennent respectivement des séquences de 10 à 40 et de préférence 18 et 33 acides amines. Afin de fournir un élément comparatif,une autre construction a été effectuée avec un premier peptide de transit et la même partie de séquence mature mais sans second peptide de transit,selon l'art antérieur(p RPA-BL 294). 3)Gène de structure:il provient du gène muté à la position (Pro 101 en Ser) de l'EPSPS de Salmonella tvphymurium isolé par Stalker et al( 1985) Le clone p MG 34-2 (fourni par Calgene)a été linéarisé par Xba I puis traité à la nucléase de Vigna radiata Après recoupure par Sma I les deux extrémités franches ont été ligaturées Le clone obtenu possède un site Nco I sur l'ATG initiateur ainsi qu'un site Sal I à 17 pb en aval du codon stop Ce clone a été nommé p RPA-BL 104. 4) Zone signal de polvadénylation:le fragment provient du gène de la nopaline synthase de p Ti 37 (Bevan et al,1983) Ce site est contenu dans un fragment Mbo I de 260 pb(Fraley et al,1983;demande de brevet PCT 84/02913) qui a été traité par la polymérase de Klenow et cloné dans le site Sma I de M 13 mp 18 pour introduire des sites Bam HI et Eco RI respectivement aux extrémités 5 ' et 3. Après coupure par Bam HI et traitement à la nucléase de Viena radiata puis coupure Eco RI et traitement par la polymerase de Klenow,le fragment résultant a ét introduit dans le vecteur p-BL 20 (cf demande de brevet français 88/04130), coupé par Xba I et Bam HI traités à la polymerase de Klenow Après recoupe par Sal I et Sst I,on obtient un fragment d'environ 0,4 kpb contenant la séquence nos 3 ' du côté du site Sal I et la bordure droite de l'ADN-T du côté du site Sst I. L'assemblage des différents éléments a été effectué de la façon suivante: Fusion" peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A": Le peptide de transit de la PSU du gène de la Ru Bis CO de maïs provient d'un fragment Eco RI-Sph I de 192 pb;issu de l'AD Nc correspondant au gène de la PSU du gène de la Ru Bis CO de maïs,décrit par Lebrun et al( 1987),possédant un site Nco I recouvrant le codon initiateur de la traduction et un site Sph I correspondant au site de clivage du peptide de transit. Par traitement de l'extrémité Sph I avec la polymerase du bactériophage T 4 et en la ligaturant avec l'extrémité Nco I,traitée à la polymérase de Klenow,du gène Aro A de p RPA-BL 104 recoupé Eco RI,on obtient la fusion traductionelle entre le peptide de transit de maïs et le gène de l'EPSPS bactérienne. Fusion peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/séquence de 22 acides aminés de la partie mature de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/ gène Aro A: De façon similaire un fragment Eco RI-Hind II de 228 bp de l'AD Nc de la PSU du gène de la Rubis CO de maïs est ligaturé avec l'extrémité Nco I traitée à la polymerase de Klenow du gène Aro A de p RPA-BL 104 et recoupé par Eco RI On obtient une fusion traductionnelle entre le peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs,les 22 acides aminés de la partie mature de la PSU de la Ru Bis CO de maïs et le gène de l'EPSPS bactérienne. Peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol: Le fragment est issu de l'AD Nc isolé par Waksman et Freyssinet( 1987) Un site Sph I a été créé selon la méthode de Zoller et Smith( 1984 au site de clivage du peptide de transit Le peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol ainsi obtenu est un fragment Eco RI-Sph I de 171 pb. Fusion peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la partie mature de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/ gène Aro A: La construction contenant la fusion peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de maïs de la partie mature du gène de maïs a été coupée par Eco RI- Sph I de 171 pb correspondant au peptide de transit de la PSU dedu gène de la Ru Bis CO de tournesol Une construction résultante présente une substitution des fragments Eco RI-Sph I et est une fusion traductionnelle "peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la partie mature de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A. Le fragment Eco RI-Sal I a été ligaturé avec le fragment Sal I-Sst I contenantla séquence nos 3 ' et la bordure droite de l'ADN-T Le fragment Eco RI-Sst I résultant comprenant"peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la partie mature de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A/nos 3 '/Bordure droite ADN-T" est substitué au fragment Eco RI-Sst I contenant la bordure droite de l'ADN- T du plasmide 150 A alpha 2 contenant le promoteur double Ca MV La fusion transcriptionelle "double Ca MV/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la partie mature de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A/nos 3 ' dans le vecteur 150 A alpha 2 a été nommé p RPA-BL 294. Fusion"peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A": La construction ci-dessus est coupée par Nco I-Hind III libérant le gène Aro A Puis elle est mise en ligation avec un fragment Nco I-Hind III de 1,5 kpb contenant la fusion"peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A" Une construction résultante présente une substitution des fragments Nco I-Hind III et est une fusion traductionelle "peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de la partie mature du gène de maïs /peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A". Le fragment Eco RI-Sal I a été ligaturé avec le fragment Sal I-Sst I contenantla séquence nos 3 ' et la bordure droite de l'ADN-T Le fragment Eco RI-Sst I résultant comprenant"peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de la partie mature du gène de maïs /peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A/nos 3 '/Bordure droite ADN-T" est substitué au fragment Eco RI-Sst I contenant la bordure droite de l'ADN- T du plasmide 150 A alpha 2 contenant le promoteur double Ca MV La fusion transcriptionelle "double Ca MV/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de la partie mature du gène de maïs/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A/nos 3 ' dans le vecteur 150 A alpha 2 a été nommé p RPA-BL 410. EXEMPLE 2:RESISTANCE DES PLANTES TRANSFORMEES 1 Transformation: Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium EHA 101 (Hood et al,1987)porteuse du cosmide p TVK 291 (Komari et al,1986) La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh et al( 1985). 2 Régénération: La régénération du tabac PBD 6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog(MS) comprenant 30 g/1 de saccharose ainsi que 200 ug/ml de kanamycine Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires(Science 1985,Vol 227,p 1229-1231) en trois étapes successives:la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30 g/l de saccharose contenant 0 05 mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de g/1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone,pendant 10 jours Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucres et ne contenant pas d'hormone Au bout d'environ jours,les pousses enracinées sont passées en terre. 3 'Mesure de la tolérance au glyphosate: a)in vitro:la tolérance est mesurée par pesée de la masse de cals extrapolée pour 100 disques foliaires de 0,5 cm de diamètre, au bout de 30 jours de croissance, sur un milieu MS additionné de 30 g/l de sucrose,de 0,05 mg/l d'acide naphtalène acétique et de 2 mg/lde BAP contenant 35 ppm de glyphosate et 200 microg/ml de kanamycine Dans ces conditions on observe que, pour les plants de tabac modifiés par le gène chimère de p RPA BL 410 selon l'invention, la masse de cals est de 34 g,alors que pour les plants modifiés par le gène chimère sans second peptide de transit la masse n'est que de 12 g. b)in vivo:30 plants issus de la régénération des tabacs transformés respectivement par p RPA-BL 294 et p RPA-BL 410 sont passés en serre et traités au stade 5 feuilles par pulvérisation avec une suspension aqueuse à une dose correspondant à 0,6 kg/ha de glyphosate(Round up) Au bout de 21 jours on effectue une observation phénotypique des plants par rapport à des plants témoins non transformés Dans ces conditions on constate que les plantes transformées par p RPA-BL 410 présentent une phytotoxicité négligeable alors que les plants témoins sont complètement détruits;de plus les plants transformés avec un gène chimère différent du précédent par l'absence de second peptide de transit présentent une phytotoxicité au moins égale à 30 % de destruction. Ces résultats montrent clairement l'amélioration apportéé par utilisation d'un gène chimère selon l'invention pour un même gène codant pour la tolérance au glyphosate. Les plantes transformées selon l'invention peuvent être utilisées comme parents pour l'obtention de lignées et d'hybrides ayant une tolérance accrue au glyphosate REVENDICATIONS 1) Séquence ADN végétale zone peptide de transit caractérisée en ce qu'elle comprend, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale. 2) Séquence ADN codant pour le peptide de transit selon la revendication 1,caractérisé en ce que la séquence codant pour le second peptide de transit est issue de la même plante que la séquence codant pour le premier peptide de transit. 3) Séquence ADN codant pour le peptide de transit selon l'ne des revendications-1 et 2, caractérisée en ce que la séquence codant pour le second peptide de transit est issu d'une plante différente de celle du premier peptide de transit. 4) Séquence ADN codant pour le peptide de transit selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'au moins une séquence codant pour un des peptides de transit est issu de PSU du gène de la Ru Bis CO. ) Séquence ADN codant pour le peptide de transit selon l'une des revendications 1 à 4,caractérisé en ce que la séquence de la partie mature N terminale provient de la PSU du gène de la Ru Bis CO. 6) Séquence ADN codant pour le peptide de transit selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'au moins une séquence codant pour un des peptides de transit-est issue du même gène que celui d'origine de la séquence de la partie mature. 7) Séquence ADN codant pour le peptide de transit selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu'au moins une séquence codant pour un des peptides de transit est issu d'un gène du maïs. 8) Séquence ADN codant pour le peptide de transit selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'au moins une séquence codant pour un des peptides de transit est issu d'un gène du tournesol. 9) Séquence ADN codant pour le peptide de transit selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la séquence de la partie mature est issue d'un gène de maïs. ) Séquence ADN codant pour le peptide de transit selon l'une des revendications i à 7, caractérisée en de que la séquence de la partie mature est issue d'un gène de tournesol. 11) Séquence ADN codant pour le peptide de transit selon la revendication 10, caractérisée en ce que la séquence de la partie mature comprend de 10 à 40 acides aminés. 12) Séquence ADN codant pour le peptide de transit selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que la séquence de la partie mature comprend de 18 à 33 acides aminés. 13)Gène chimère pour conférer aux plantes une tolérance accrue vis à vis d'un herbicide ayant pour cible l'EPSPS, comprenant, dans le sens de la transcription,une zone promotrice,une zone peptide de transitune séquence codante pour la tolérance au glyphosate et une zone signal de polyadénylation non traduite en 3 ',caractérisé en ce qu'il comprend une zone peptide de transit selon l'une des revendications 1 à 12. 14)Gène chimère selon la revendications 13, caractérisé en ce que la séquence codante de la tolérance au glyphosate est d'origine bactérienne. )Gène chimère selon la revendication 13, caractérisé en ce que la séquence codante de la tolérance au glyphosate est d'origine végétale. 16)Vecteur pour la transformation des plantes, caractérisé en ce qu'il comprend un gène chimère selon l'une des revendications 13 à 15. 17)Agrobacterium sp caracterisé en ce qu'elle contient un vecteur selon la revendication 16. 18)Cellule végétale transformée, caractérisée en ce qu'elle contient un gène chimère selon l'une des revendications 13 à 15. 19)Plante transformée de tolérance améliorée au glyphosate, caractérisée en ce qu'elle-a été obtenue à partir d'une cellule selon la revendication 18. 20)Plante selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle est une dicotylédone. 21)Plante selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle est une monocotylédone. 22)Procédé de construction d'un gène chimère selon l'une des revendications 13 à 15 caractérisé en ce qu'on isole respectivement au moins deux zones de peptide de transit et au moins une séquence de partie mature de gènes végétaux plastidiaux appropriés, ainsi qu'au moins une séquence codant pour la tolérance au glyphosate et une zone signal de polyadénylation appropriée et que ensuite on les assemble dans le sens de la transcription du gène de tolérance.