FR 2673641 A1 19920911 FR 9202747 A 19920306 PROCEDE D'IMMUNISATION IN VITRO ET PROCEDE D'ESSAI DE L'ACTIVITE DE STIMULATION DE L'IMMUNISATION Cette invention porte sur un procédé pour l'immunisation in vitro extrêmement efficace de lymphocytes, en vue de la production d'un anticorps spécifique de l'antigène, ainsi que sur un procédé d'essai de l'activité de stimulation de l'immunisation par l'application du système de culture cellulaire employé ci-dessus. Depuis que Kôhler et Milstein ont mis au point, en 1975, un procédé de production de lignées cellulaires d'hybridome de souris produisant des anticorps monoclonaux in vitro (Nature 1975, 256, 495-497), une infinité d'anticorps monoclonaux d'origine murine, dirigés contre divers antigènes, ont été développés, et bon nombre d'entre eux sont couramment employés pour l'utilisation diagnostique in vitro, telle que l'utilisation sérodiagnostique Bien que des anticorps monoclonaux humains puissent également être obtenus par l'application de la méthode de Kohler et Milstein et que l'on puisse prévoir ces anticorps d'origines murine et humaine pour l'utilisation thérapeutique, aucun anticorps monoclonal n'a jamais été employé en thérapie pratique. C'est une conception généralement acceptée que les anticorps monoclonaux d'origine humaine sont préférables pour l'administration aux êtres humains à ceux d'origine murine. Cependant, les applications d'anticorps monoclonaux humains à l'utilisation clinique ont été jusqu'ici en partie entravées en raison du manque de méthodes efficaces pour fournir des lymphocytes humains immunisés par les antigènes requis, lesquels sont indispensables pour la production des hybridomes en question, et en partie à cause de la raison éthique que les immunisations par des antigènes favorables chez l'homme ne sont pas possibles Dans ce contexte, des efforts importants sont réalisés pour mettre au point des procédés d'immunisation in vitro efficaces pour surmonter les difficultés ((J Immunol 1985, 135, 3831- 3838; Hybridome Humain et Anticorps Monoclonal (Human Hybridoma and Monoclonal Antibody) Plenum Press, 1985, pages 71-91). La présente invention propose un procédé établi pour l'immunisation in vitro, spécifique d'un antigène et efficace, de lymphocytes, qui puisse faciliter la production d'hybridomes d'origines humaine et animale produisant des 5 anticorps monoclonaux spécifiques d'un antigène Au cours de cette invention, un procédé simple d'essai de l'activité de stimulation de l'immunisation a été développé. Conformément à un mode de réalisation du procédé d'immunisation in vitro de la présente invention, le procédé comprend l'immunisation d'un lymphocyte capable de répondre de façon spécifique à un antigène, par culture d'un lymphocyte en contact avec un antigène dans un milieu contenant un adjuvant et une lymphokine, en l'absence d'un activateur polyclonal.15 Conformément à un autre mode de réalisation du procédé d'immunisation in vitro de la présente invention, le procédé comprend l'immunisation d'un lymphocyte capable de répondre de façon spécifique à un antigène, par culture d'un lymphocyte en contact avec un antigène dans un milieu20 contenant un adjuvant et une lymphokine, en l'absence d'un activateur polyclonal, en faisant suivre par l'immortali- sation du lymphocyte immunisé. Le procédé d'essai de l'activité d'immunisation conforme à la présente invention comprend la culture d'un lymphocyte en contact avec un antigène dans un milieu contenant un adjuvant, une lymphokine et une substance d'essai, en l'absence d'un activateur polyclonal, et la détection d'une immunoglobuline produite par le lymphocyte immunisé. La présente invention est basée sur les découvertes que le lymphocyte peut être immunisé de manière efficace in vitro dans le mode spécifique d'un antigène, dans le milieu de culture contenant un adjuvant et une (ou des) lymphokine(s) en l'absence d'activateur polyclonal Le lymphocyte immunisé peut être immortalisé si on le souhaite. L'efficacité la plus élevée de l'immunisation in vitro peut être obtenue lorsqu'à la fois l'adjuvant et la (ou les) lymphokine(s) en combinaison sont inclus dans le milieu simultanément Lorsque l'activateur polyclonal est ajouté au mélange ci-dessus, l'efficacité de l'immunisation diminue d'une manière significative L'application n'est pas limitée aux lymphocytes provenant de tissus spéciaux, mais tout lymphocyte peut être appliqué à l'immunisation in vitro de la présente invention. Le lymphocyte immunisé in vitro produisant l'anticorps monoclonal spécifique d'un antigène peut être immortalisé soit par hybridation avec des cellules ou une lignée lymphocytaire appropriée, soit par infection par le virus d'Epstein-Barr, ce qui peut faciliter la production efficace de l'anticorps monoclonal spécifique d'un antigène. Les applications des anticorps monoclonaux humains ont été entravées jusqu'ici en raison des difficultés à obtenir une spécificité suffisamment élevée pour l'antigène cible souhaité, de même qu'en raison de leur production insuffisante La présente invention ouvre des possibilités prometteuses dans les applications étendues des anticorps monoclonaux pour la prévention, le diagnostic et la thérapie, en facilitant la production rapide et efficace des anticorps monoclonaux spécifiques d'un antigène désirés. Le procédé d'essai de l'activité de stimulation de l'immunisation peut faciliter l'exploration de divers matériels efficaces rehaussant l'efficacité de 1 ' immunisation par mesure de leurs effets sur la réponse d'immunisation pendant la culture de lymphocytes dans les milieux contenant les matériels d'essais en présence d'un adjuvant, de lymphokines et d'un antigène.30 Dans la présente invention, on emploie, de préférence, des antigènes insolubles, tels que des cellules cancéreuses de lignées établies et des particules de latex sur lesquelles sont adsorbés des antigènes solubles. Pour l'adjuvant, on utilise, de préférence, soit le muramyl dipeptide (MDP), soit OK-432, qui est disponible auprès de Chugai Pharmaceutical Co, Ltd, Japon Des concentrations de MDP dans le milieu de culture se situant dans la plage de 0,1-1000 gg/ml, et de façon davantage préférée 0,5-50 pg/ml, sont employées avec succès En ce qui concerne OK-432, des concentrations efficaces dans le milieu de culture se situent dans la plage de 25-25 000 ng/ml, et,5 de façon davantage préférée, dans la plage de 50- 000 ng/ml. En ce qui concerne la lymphokine, on utilise au moins l'une parmi les interleukines (I Ls)-2 et -6 ou leurs combinaisons Les concentrations efficaces d'I Ls dans le10 milieu de culture sont: pour IL-2, 1-1000 unités/ml, et, de façon davantage préférée, 2-500 unités/ml; pour IL-6, 1-1000 unités/ml, et, de façon davantage préférée, 2-500 unités/ml. Une efficacité extrêmement élevée de l'immunisation in vitro peut être obtenue par l'utilisation en combinaison d'I Ls-2 et -6. Bien que la culture soit effectuée avec succès dans les milieux tels que le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), F 12 de Ham, RPMI 1640, RDF (un mélange 2: 1: 1 de RPMI 1640, DMEM et F 12 de Ham), et ERDF (RDF dans lequel les teneurs des acides aminés et des vitamines sont enrichies), les deux derniers milieux sont préférés. Des lymphocytes frais, de n'importe quelle origine, tels que le sang périphérique, les noeuds lymphatiques et les rates disséqués par chirurgie, peuvent être employés avec succès pour l'immunisation in vitro conformément au présent procédé. Dans ce procédé pour l'immunisation in vitro des lymphocytes, des diminutions significatives de l'efficacité d'iimmunisation sont observées en la présence d'un activateur polyclonal, tel que les endotoxines, le dextran sulfate et les lectines, comprenant la phytohémagglutinine, le mitogène de phytolacca, la concanavaline A, etc, lesquels sont habituellement employés dans les procédés classiques Par conséquent, il est essentiellement requis, pour l'iummunisation in vitro de la présente invention, d'employer des milieux de culture qui sont dépourvus de 1 'activateur polyclonal. L'immunisation in vitro est effectuée au cours de la culture pendant 4- 10 jours après qu'une suspension de lymphocytes dans le milieu de culture contenant un adjuvant et une (ou des) lymphokine(s) soit ajoutée à l'antigène insoluble, tels que des cellules cancéreuses et un antigène lié à un latex comme décrit ci-dessus. Les lymphocytes ainsi cultivés pour l'immunisation in vitro sont récoltés, et, si nécessaire, immortalisés, soit par hybridation avec des cellules d'une lignée lymphocytaire appropriée, soit par infection par le virus d'Epstein-Barr. Par l'immortalisation, de nouvelles lignées cellulaires qui produisent des anticorps monoclonaux spécifiques d'un antigène peuvent être établies d'une manière infinie, facilitant la production d'anticorps monoclonaux. L'immunisation in vitro avec des lymphocytes humains conduit à la production de lignées cellulaires produisant des anticorps monoclonaux humains; cependant, ceux avec des lymphocytes d'origine animale conduisent à la création de lignées cellulaires produisant des anticorps monoclonaux animaux de l'espèce animale correspondante utilisée. L'essai de l'activité de stimulation de l'immunisation peut être effectué par la coloration immunologique in situ d'anticorps, qui avaient été sécrétés par des lymphocytes immunisés et liés à l'antigène, dans les puits du récipient de culture L'effet de stimulation du matériau d'essai sur l'efficacité de l'immunisation peut être évalué en termes de la différence du nombre de taches colorées par immunologie d'anticorps liés à l'antigène appliqué en revêtement pendant la culture des lymphocytes en30 présence et en l'absence du matériel d'essai La présente invention est exposée en détail ci-après avec les exemples. EXEMPLES Exemple 1 Les effets des adjuvants et des lymphokines sur l'immunisation in vitro de lymphocytes sont présentés. L'immunisation in vitro de lymphocytes par des cellules antigéniques a été effectuée comme décrit ci-après. Des cellules de la lignée A 549 (une lignée cellulaire de carcinome de poumon humain, ATCC CCL-185), mises en suspension dans le milieu ERDF contenant 10 % de sérum de veau foetal (FCS) à une densité de 1 x 104 cellules/ml, ont été distribuées en parties aliquotes de 1 ml dans une plaque à 24 puits et cultivées pendant 36 heures à 370 C Les lymphocytes normaux, ajustés à une densité de 2 x 106 cellules/ml, lesquels avaient été préparés par le fractionnement du sang périphérique provenant d'un volontaire sain avec du Ficoll-Paque (disponible auprès de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Upsala, Suède), en faisant suivre par un lavage à quatre reprises avec du milieu ERDF, ont été ajoutés en parties aliquotes de 0,5 ml à la culture ci-dessus des cellules A 549 dans les puits Au même moment, MDP, OK-432, I Ls-2 et -6 (disponible auprès de Genzyme Corp MA, U S A), dans diverses combinaisons de concentrations, comprenant une combinaison respectivement à 250 ng/ml, 10 lg/ml, 100 unités/ml, 10 unités/ml, ont été inclus dans la culture. La culture a été poursuivie pendant 4 jours à 37 C. Les activités de stimulation de l'immunisation des adjuvants et des lymphokines ont été testées in situ avec les lymphocytes ainsi cultivés Après l'élimination du milieu surnageant conjointement avec les cellules lymphocytaires de la culture décrite ci-dessus, les cellules A 549 ayant adhéré au puits ont été fixées par du glutaraldéhyde à 0,06 % pendant minutes à 40 C, et l'on a fait suivre par un lavage à trois reprises par du ERDF Les puits contenant les cellules antigéniques immobilisées, auxquelles avaient été liés les anticorps spécifiques d'un antigène, sécrétés par les lymphocytes immunisés, ont été à nouveau lavés à trois reprises avec une solution saline de tampon phosphate (PBS) contenant 0,05 % de Tween 20, en faisant suivre par un blocage par un mélange de gélatine à 0,2 %-sérum albumine bovine à 0,5 % dans du PBS pendant 2 heures à 37 C Après avoir mis au rebut la solution de blocage, un mélange d'Ig G anti-humaine biotinylée et d'Ig M anti- humaine biotinylée a été ajouté et incubé pendant 1 heure à 37 C Après avoir lavé abondamment les puits, le conjugué avidine-peroxydase a été ajouté et la réaction s'est déroulée pendant 1 heure à 370 C, on a procédé5 à un lavage, et finalement les taches d'anticorps liés aux cellules antigéniques ont été visualisées par le dépôt de matières colorées formées par l'activité de la peroxydase utilisant la diamino- 3,3 ' benzidine (DAB) comme substrat. Les activités de stimulation de l'immunisation des adjuvants10 ainsi que celles des I Ls ont été déterminées par le comptage au microscope du nombre de taches colorées dans chaque puits autrement dit, du nombre de lymphocytes produisant les immunoglobulines spécifiques de l'antigène. Les effets des adjuvants et des lymphokines sur l'immunisation in vitro sont résumés dans les Tableaux 1 et 2. Tableau 1 Effets des adjuvants et des vitro (jeu expérimental 1) lymphokines sur l'immunisation in Nombre de taches Lymphocyte OK-432 MDP IL-2 IL- 6 colorées par immunologie o + 11 + + 5 1 + + + 15 + 2 + + + 8 + 2 + + + + 14 + 2 + + + + 26 + 5 Tableau 2 Effets des adjuvants et des vitro (jeu expérimental 2) lymphokines sur l'immunisation in Nombre de taches Lymphocyte OK-432 MDP IL-2 IL- 6 colorées par immunologie + O + + 9 5 + 2 1 + + 9 4 + + + 14 + 3 + + + 22 + 5 Les Tableaux 1 et 2 montrent que l'addition d'un adjuvant et d'une (ou de) lymphokine(s) en combinaison est bien plus efficace que chaque addition indépendante des additifs, en particulier dans la combinaison de MDP, IL-2 et IL-6, pour l'apparition de lymphocytes produisant des anticorps réagissant avec les cellules A 549 Exemple 2 Une expérience analogue à l'Exemple 1 a été effectuée avec les lymphocytes issus de noeuds lymphatiques de deux patients cancéreux ainsi qu'avec ceux issus du sang périphérique de trois volontaires sains. Tableau 3 Immunisation in vitro par des lymphocytes provenant de différents tissus Nombre de taches colorées par immunologie Origine des lymphocytes Pas Addition de Addition de d'addition OK-432 + MDP + IL-2 + IL-2 + IL-6 IL-6 Noeuds lymphatiques 1 O 30 4 26 3 2 1 O 14 2 24 2 Sang périphérique 1 O 20 5 32 5 2 O 14 5 26 9 3 O 9 4 18 2 Comme cela est montré dans le Tableau 3, aucune différence significative dans l'efficacité d'immunisation in vitro ne peut être observée entre les lymphocytes issus de noeuds lymphatiques et ceux issus du sang périphérique, indiquant que les lymphocytes provenant de n'importe quel tissus peuvent être également applicables à l'immunisation in vitro de la présente invention. Exemple 3 Les effets des activateurs polyclonaux tels que les lectines et les lipopolysaccharides sur l'immunisation in vitro ont été examinés Les conditions expérimentales étaient les mêmes que celles de l'Exemple 1, excepté que 1 % du mitogène de phytolacca (PWM) ou 25 pg/ml de lipopoly- saccharide (LPS) ont été inclus dans le milieu de culture. Tableau 4 Effets des activateurs polyclonaux sur l'immunisation in vitro Addition Nombre de taches colorées par PWM LPS OK-432 + MDP + IL-2 immunologie IL-2 + IL-6 + IL-6 + 1 + O + 7 + 2 + + 4 + 1 + 14 + 3 _ _ _ + 22 5 + + + 5 + O + + + 6 + 1 Les résultats présentés dans le Tableau 4 indiquent que les activateurs polyclonaux inhibent de façon significative la présente immunisation in vitro, bien que ces activateurs soient généralement requis pour les procédés d'immunisation in vitro classiques. Exemple 4 Cet exemple montre que la production efficace d'hybridomes humains sécrétant des anticorps spécifiques d'un antigène dans les milieux de culture peut être obtenue par l'immortalisation des lymphocytes qui ont été immunisés in vitro conformément au présent procédé. Des lymphocytes provenant du sang périphérique d'un volontaire sain ont été cultivés dans un milieu contenant du MDP, de 1 'IL-2 et de 1 'IL- 6, en présence de cellules A 549 en tant qu'antigène Les lymphocytes ainsi immunisés ont été 5 recueillis et hybridés par le procédé classique employant du polyéthylène glycol avec des cellules de RF-Sl (déposées auprès du Fermentation Research Institute sous le n FERM BP- 3751), laquelle est une lignée cellulaire mutante lymphocytaire issue de myélomes d'origines humaine et murine.10 Les lymphocytes après l'hybridation par les cellules RF-Sl ont été distribuées et cultivées dans des plaques à 96 puits. Les milieux épuisés ont été testés pour les anticorps spécifiques des antigènes par un essai par immunosorbant lié à une enzyme Les milieux épuisés que l'on a distribué dans les puits d'une plaque à 96 puits, dans laquelle des cellules A 549, qu'on avait fait croître jusqu'à confluence, avaient été fixées par du glutaraldéhyde et bloquées de la même manière que celle exposée en détail à l'Exemple 1, ont été incubés pendant 1 heure à 37 C, et l'on a fait suivre par une20 autre incubation avec le conjugué avidine-peroxydase La quantité d'immunoglobulines liées à la phase immobile a été déterminée par la mesure de l'activité de peroxydase liée, par voie photométrique, à l'aide du sel diammonique de 1 'acide azino-2,2 ' bis (éthyl-3 benzothiazoline) sulfonique-6 (ABTS) comme substrat Les puits présentant des développe- ments de couleur positifs, autrement dit, ceux contenant des anticorps réagissant de façon spécifique avec l'antigène de A 549 ont été comptés. Tableau 5 Apparition d'anticorps spécifiques des cellules A 549 dans les milieux épuisés après culture d'hybridomes produits par l'hybridation de lymphocytes immunisés in vitro et de cellules RF-Sl Puits Puits Immunisa Puits présentant présentant Expérience tion in ensemencés une des vitro croissance anticorps cellulaire réactifs 1 _ 192 192 O + 192 192 1 2 96 96 O + 96 68 1 3 _ 192 100 O + 288 86 2 Les résultats présentés dans le Tableau 5 indiquent que des taux significativement élevés dans la production d'hybridomes produisant des anticorps monoclonaux spécifiques d'un antigène peuvent être obtenus par le présent procédé d'immunisation in vitro. REVENDICATIONS 1 Procédé pour l'immunisation in vitro de lymphocytes, caractérisé par le fait que l'immunisation est spécifique de l'antigène et que la culture ds lyçphocyes est réalisée en présence de cet antigène dans un milieu contenant un adjuvant et une (ou des) lyrphokine(s) en l'absence d'activateurs polyclonaux. 2 Procédé pour l'immunisation in vitro de lymphocytes, caractérisé par le fait que l'immunisation est spécifique de l'antigène et que la culture des lymphocytes est réalisée en présence de cet antigène dans un milieu contenant un adjuvant et une (ou des) lynphdcne(s) en l'absence d'activateurs polyclonaux, suivie de l'immortalisation des lymphocytes immunisés. 3 Procédé d'immunisation in vitro selon la revendication 2, caractérisé par le fait que ladite immortalisation est effectuée soit par hybridation avec des cellules d'une (ou des) lignée(s) lymphocytaire(s), soit par infection par le virus d'Epstein-Barr. 4 Procédé d'immunisation in vitro selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que ledit adjuvant est le muramyl dipeptide et OK-432. Procédé d'immunisation in vitro selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que ladite lymphokine comprend l'une parmi les interleukines-2 et -6, et leurs combinaisons. 6 Procédé d'immunisation in vitro selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que ledit antigène comprend des cellules cancéreuses et les formes insolubilisées des matières solubles. 7 Procédé d'immunisation in vitro selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que lesdits lymphocytes comprennent des lymphocytes issus du sang, de noeuds lymphatiques et de rates. 8 Procédé d'essai de l'activité de stimulation de l'immunisation, caractérisé par le fait qu'il comprend la détection d'iimmunoglobulines produites par les lymphocytes immunisés, qui est obtenue par culture des lymphocytes sur la couche d'antigène dans les milieux contenant un adjuvant et une (ou des) lymphokine(s) ainsi que le matériel d'essai en l'absence d'activateurs polyclonaux.