FR 2677040 A1 19921204 FR 9206482 A 19920527 1 - Procédé pour la production de glycosyltransférases, vecteur hybride et souches de levures utilisés à cette fin L'invention concerne le domaine de la technologie de l'ADN recombinant et fournit un procédé amélioré pour la production de glycosyltransférases au moyen de souches de levures transformées. Les glycosyltransférases catalysent le transfert de fragments glucidiques d'un substrat donneur activé, habi- tuellement un sucre nucléotidique, à un sucre accepteur spécifique, pour former une liaison glycosidique En fonc- tion du type de sucre transféré, ces enzymes sont groupées en familles, par exemple les galactosyltransférases, sialyl- transférases et fucosyltransférases Etant des protéines membranaires résidentes principalement localisées dans l'ap- pareil de Golgi, les glycosyltransférases ont en commun une structure de domaines constituée d'une courte queue cyto- plasmique amino-terminale, d'un domaine d'ancrage-signal, et d'une région de tige étendue qui est suivie d'un grand domaine catalytique carboxy-terminal Le domaine d'ancrage- signal joue le rôle à la fois de peptide signal indisso- ciable et de domaine de recouvrement de la membrane, et oriente le domaine catalytique de la glycosyltransférase dans la lumière de l'appareil de Golgi La région de l'espa- ceur ou de la tige au voisinage de la lumière est supposée servir d'amarre flexible, ce qui permet au domaine cataly- tique de glycosyler des groupes glucidiques de protéines solubles, et liées à la membrane, de la chaîne sécrétoire, 2 - se dirigeant vers l'appareil de Golgi En outre, on a décou- vert que la région de la tige fonctionnait comme signal de rétention pour maintenir l'enzyme liée à la membrane de l'appareil de Golgi (demande PCT n 91/06635) On suppose que ces glycosyltransférases solubles proviennent d'une libération protéolytique, par des protéases endogènes, à partir des formes correspondantes des enzymes liées à la membrane, probablement par coupure entre le domaine cataly- tique et le domaine trans-membranaire. La synthèse enzymatique de structures glucidiques offre l'avantage d'une grande stéréosélectivité et d'une grande régiosélectivité, ce qui fait des glycosyl- transférases un outil précieux pour la modification et la synthèse de glycoprotéines, glycolipides et oligo- saccharides Contrairement aux méthodes chimiques, l'intro- duction de groupes protecteurs, qui prend beaucoup de temps, est alors superflue. Etant donné que les glycosyltransférases ne sont présentes dans la nature qu'en très faibles quantités, l'isolement à partir de sources naturelles et la purifica- tion subséquente sont difficiles En conséquence, on a étu- dié la production mettant à profit la technologie de l'ADN recombinant Par exemple, des galactosyltransférases ont été exprimées dans E coli (PCT 90/07000) et des cellules d'ovaire de hamster d'Asie (CHO) lD F Smith et coll ( 1990) J Biol Chem, 265, 6225-6234 l, des sialyltransférases ont été exprimées dans des cellules CHO lE U Lee ( 1990) Diss. Abstr Int B 50, 3453-3454 l et des cellules COS-1 lJ.C Paulsen et coll ( 1988) J Cell Biol 107, O 10 Al, et des fucosyltransférases ont été produites dans des cellules COS-1 lS E Goelz et coll ( 1990) Cell, 63, 1349-1356; R.D Larsen et coll ( 1990) Proc Natl Acad Sci USA, 87, 6674-6678 l et des cellules CHO lB Potvin ( 1990) J Biol. Chem, 265, 1615-1622 l Compte tenu des faits que l'expres- sion hétérologue chez les procaryotes a l'inconvénient de fournir des produits non glycosylés, les glycosyl- transférases étant cependant des glycoprotéines, et que la production de glycosyltranférases au moyen d'hôtes mamma- liens est très coûteuse et très compliquée, en raison de la présence de nombreuses glycosyltransférases endogènes conta- minant le produit recherché, il est nécessaire de pouvoir disposer de procédés améliorés, permettant la production économique de glycosyltranférases à grande échelle. Un objet de la présente invention est de fournir un tel procédé. La présente invention fournit un procédé pour la production de glycosyltransférases biologiquement actives, par la technologie de l'ADN recombinant, à l'aide d'un sys- tème d'expression comprenant un vecteur de type levure. Plus précisément, la présente invention fournit un procédé pour la production d'une glycosyltransférase liée à la membrane, choisie parmi une galactosyltransférase, une sialyltransférase et une fucosyltransférase, ou une variante de celles-ci, respectivement, ledit procédé comprenant la culture d'une souche de levure ayant été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression compre- nant un promoteur et une séquence d'ADN codant pour ladite glycosyltransférase ou variante, lequel ADN est contrôlé par ledit promoteur, et la récupération de l'activité enzyma- tique. Dans un premier mode de réalisation, l'invention concerne un procédé pour la production d'une glycosyl- transférase liée à la membrane, choisie parmi une galactosyltransférase, une sialyltransférase et une fucosyl- transférase, ou une variante de celles-ci, respectivement, ledit procédé comprenant la culture d'une souche de levure ayant été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur, une séquence d'ADN codant pour ladite glycosyltransférase ou variante, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur, 4 et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure, et la récupération de l'activité enzymatique. Dans un second mode de réalisation, l'invention con- cerne un procédé pour la production d'une glycosyl- transférase liée à la membrane, choisie parmi une galactosyltransférase, une sialyltransférase et une fucosyl- transférase ou une variante de celles-ci, respectivement, ledit procédé comprenant la culture d'une souche de levure ayant été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur fonctionnelle- ment lié à une première séquence d'ADN codant pour un pep- tide signal, liée dans le cadre de lecture adéquat à une seconde séquence d'ADN codant pour ladite glycosyl- transférase ou variante, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure, et la récupération de l'activité enzymatique. Tel qu'utilisé précédemment ou ci-après, le terme "glycosyltransférase" est destiné à englober la famille des galactosyltransférases, la famille des sialyltransférases et la famille des fucosyltransférases Lesdites glycosyl- transférases sont des enzymes existant dans la nature, d'origine mammalienne, par exemple bovine, murine ou humaine On préfère des glycosyltransférases humaines com- plates, existant dans la nature, y compris les enzymes dési- gnées ci-après par leurs numéros EC. Les galactosyltransférases liées à la membrane et leurs variantes, qui peuvent être obtenues selon le procédé de l'invention, catalysent le transfert d'un résidu galac- tose, d'un donneur activé, habituellement un donneur activé nucléotidique tel que l'uridine diphosphate-galactose (UDP-Gal), à un groupe glucidique. Comme exemples de galactosyltransférases liées à la membrane, on peut citer l'UDP-galactose:a-galactoside "( 1-3)-galactosyltransférase (EC 2 4 1 151) qui utilise le - galactose en tant que substrat accepteur, en formant une liaison "( 1-3), et l'UDP-galactose:1-N-acétylglucosamine P( 1-4)-galactosyltransférase (EC 2 4 1 22) qui transfère le galactose à la N-acétylglucosamine (Glc N Ac) en formant une liaison P( 1-4), y compris leurs variantes, respectivement. En présence d'a-lactalbumine, ladite O( 1-4)-galactosyl- transférase accepte également le glucose en tant que sub- strat accepteur, pour catalyser ainsi la synthèse du lac- tose. La galactosyltransférase liée à la membrane qui est particulièrement préférée est l'enzyme ayant la séquence d'aminoacides représentée dans l'appendice ID SEQ no 1. Les sialyltransférases liées à la membrane et leurs variantes, pouvant être obtenues selon le procédé de l'in- vention, catalysent-le transfert d'acides sialiques lpar exemple l'acide N-acétylneuraminique (Neu Ac)l, d'un donneur active, habituellement un acide cytidine monophosphate- sialique (CMP-SA), à un fragment accepteur glucidique Un exemple d'une sialyltransférase liée à la membrane, pouvant être obtenue selon le procédé de l'invention, est la CMP-Neu Ac:p-galactoside "( 2-6)sialyltransférase (EC 2 4 99 1) qui constitue la séquence Neu Ac-a( 2-6)Gal- f( 1-4)Glc N Ac commune à de nombreux groupes glucidiques liés à l'azote. La sialyltransférase lié à la membrane qui est parti- culièrement préférée est l'enzyme ayant la séquence d'amino- acides représentée dans l'appendice ID SEQ n 3. Les fucosyltransférases liées à la membrane et leurs variantes, pouvant être obtenues selon le procédé de l'in- vention, catalysent le transfert d'un résidu fucose, d'un donneur active, habituellement un donneur activé nucléoti- dique, tel que le guanosine diphosphate-fucose (GDP-Fuc), à un groupe glucidique Comme exemples de telles glucosyl- transférases, on peut citer la GDP-fucose:3-galactoside "( 1-2)fucosyltransférase (EC 2 4 1 69) et la 6 - GDP-fucose:N- acétylglucosamine "( 1-3/4)-fucosyltransférase (EC 2 4 1 65). La fucosyltransférase liée à la membrane qui est particulièrement préférée est l'enzyme ayant la séquence d'aminoacides représentée dans l'appendice ID SEQ n 5. Tel qu'on l'utilise ici, le terme "variantes" est destiné à englober à la fois les variantes liées à la membrane et les variantes solubles des glycosyltransférases liées à la membrane d'origine mammalienne, existant dans la nature, à condition que ces variantes aient une activité enzymatique On préfère les variantes d'origine humaine. Par exemple, le terme "variantes" est destiné à inclure des variantes liées à la membrane, existant dans la nature, de glycosyltransférases liées à la membrane, rencon- trées au sein d'une espèce particulière, par exemple une variante d'une galactosyltransférase qui diffère de l'enzyme ayant la séquence d'aminoacides représentée dans l'appendice ID SEQ n 1, par le fait qu'elle est dépourvue de sérine à la position 11 et comporte les aminoacides valine et tyro- sine au lieu d'alanine et leucine aux positions 31 et 32, respectivement Une telle variante peut être codée par un gène apparenté de la même famille génique ou par une variante allèle d'un gène particulier Le terme "variantes" englobe également des glycosyltransférases produites à par- tir d'un ADN qui a été soumis à une mutagénèse in vitro, à condition que la protéine codée par ledit ADN ait l'activité enzymatique de la glycosyltransférase native De telles modifications peuvent consister en une addition, un rempla- cement et/ou une délétion d'aminoacides, le dernier cas conduisant à des variantes raccourcies. Les variantes préférées selon le procédé de l'inven- tion sont des variantes raccourcies, en particulier des variantes solubles, c'est-à-dire des variantes qui ne sont pas liées à la membrane Les variantes raccourcies com- prennent par exemple des formes solubles de glycosyl- 7 - transférases liées à la membrane et leurs variantes liées à la membrane, par exemple les variantes mentionnées ci- dessus, qui peuvent être sécrétées par une souche de levure transformée, utilisée dans le procédé selon l'invention. Selon la présente invention, ces enzymes solubles sont les variantes tronquées préférées. L'invention concerne également un procédé pour la production d'une variante soluble d'une glycosyltransférase liée à la membrane, choisie parmi une galactosyltransférase, une sialyltransférase et une fucosyltransférase, ledit pro- cédé comprenant la culture d'une souche de levure ayant été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur fonctionnellement lié à une première séquence d'ADN codant pour un peptide signal, liée dans le cadre de lecture adéquat à une seconde séquence d'ADN codant pour ladite variante, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure, et l'isolement de ladite variante. Par définition, la forme soluble d'une glycosyl- transférase est une variante raccourcie qui diffère de la forme complète correspondante, c'est-à-dire la forme liée à la membrane, à l'état naturel localisée dans le réticulum endoplasmique du complexe de Golgi, par l'absence de la queue cytoplasmique, du domaine d'ancrage-signal et éven- tuellement d'une partie de la région de la tige Telle qu'on l'utilise ici, l'expression "partie de la tige" est définie comme étant une partie mineure du côté N-terminal de la région de la tige, composée de jusqu'à 12 aminoacides En d'autres termes, les variantes solubles préparées selon le procédé de la présente invention consistent essentiellement en la région de la tige dans son ensemble et le domaine catalytique. Les variantes solubles sont des enzymes à activité enzymatique, qui diffèrent des formes complètes correspon- dantes par l'absence d'un peptide NH 2-terminal constitué de 8 - 26 à 67, en particulier de 26 à 61 résidus aminoacides, étant entendu que les formes dépourvues d'une partie de la région de la tige ne sont dépourvues que de la partie mineure de celle-ci, définie plus haut On préfère des variantes solubles qui peuvent être obtenues à partir des glycosyltransférases liées à la membrane, identifiées précé- demment par leur numéros EC, ainsi que des variantes solubles pouvant être obtenues à partir de la fucosyl- transférase liée à la membrane, ayant la séquence représen- tée dans l'appendice ID SEQ n 5. Les variantes solubles préférées de galactosyl- transférases se distinguent des formes complètes correspon- dantes par le fait qu'elles sont dépourvues d'un peptide NH 2-terminal constitué de 37 à 55, en particulier de 41 à 44 aminoacides La variante soluble particulièrement préfé- rée obtenue selon le procédé de l'invention est l'enzyme ayant la séquence d'aminoacides représentée dans l'appendice ID SEQ n 2. Les variantes solubles préférées de sialyl- transférases sont privées d'un peptide NH 2-terminal consti- tué de 26 à 38 aminoacides, par comparaison avec la forme complète La variante soluble particulièrement préférée selon le procédé de l'invention est l'enzyme comportant la séquence d'aminoacides représentée dans l'appendice ID SEQ n 4 De même, on préfère la variante soluble dési- gnée par ST(Lys 27-Cys 406) constituée des aminoacides 27 à 406 de la séquence d'aminoacides donnée dans l'appendice ID SEQ no 3. Les variantes solubles préférées de fucosyl- transférases diffèrent des enzymes complètes correspondantes par le fait qu'elles sont dépourvues d'un peptide NH 2- terminal constitué de 56 à 67, en particulier de 56 à 61 aminoacides On préfère en particulier la variante soluble désignée par FT(Arg 62-Arg 405), composée des amino- acides 62 à 405 de la séquence d'aminoacides donnée dans 9 _ l'appendice ID SEQ N O 5. Les souches hôtes de levures et les composants des vecteurs hybrides sont tels que spécifié ci-après. Les souches de levures transformées sont cultivées au moyen de méthodes connues dans la technique. Ainsi, les souches de levures transformées selon l'in- vention sont cultivées dans un milieu liquide contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels miné- raux. Diverses sources de carbone peuvent être utilisées. Comme exemples de sources de carbone préférées, on peut citer des glucides assimilables, tels que le glucose, le maltose, le mannitol, le fructose ou le lactose, ou un acé- tate tel que l'acétate de sodium, qui peuvent être utilisés seuls ou en mélanges appropriés Les sources d'azote appro- priées comprennent, par exemple, des aminoacides, tels que l'hydrolysat acide de caséine, des peptides et des protéines et leurs produits de dégradation, tels que la tryptone, la peptone ou des extraits de viande, en outre, l'extrait de levure, l'extrait de malt, la liqueur de trempage du maïs, ainsi que des sels d'ammonium, tels que le chlorure, sulfate ou nitrate d'ammonium, qui peuvent être utilisés seuls ou en mélanges appropriés Les sels minéraux qui peuvent être utilisés comprennent, par exemple, des sulfates, chlorures, phosphates et carbonates de sodium, potassium, magnésium et calcium En outre, le milieu nutritif peut également conte- nir des stimulateurs de croissance Les substances qui sti- mulent la croissance comprennent, par exemple, des oligo- éléments, tels que le fer, le zinc, le manganèse et simi- laires, ou des aminoacides individuels. En raison de l'incompatibilité entre l'ADN 2 g endo- gène et les vecteurs hybrides portant son réplicon, les cellules de levures transformées par de tels vecteurs hybrides ont tendance à perdre ce dernier De telles cel- lules de levures doivent être cultivées dans des conditions - sélectives, c'est-à-dire des conditions qui exigent pour la croissance l'expression d'un gène codé par un plasmide Les marqueurs les plus sélectifs actuellement utilisés et pré- sents dans les vecteurs hybrides selon l'invention (voir plus loin) sont des gènes codant pour des enzymes de la biosynthèse de purines ou d'aminoacides Cela rend néces- saire l'utilisation de milieux minimaux synthétiques défi- cients en l'aminoacide ou la base purique correspondants. Toutefois, on peut également utiliser des gènes conférant la résistance à un biocide approprié (par exemple un gène con- férant la résistance à l'amino-glycoside G 418) Des cellules transformées par des vecteurs contenant des gènes de résis- tance à des antibiotiques sont cultivées en milieux com- plexes contenant l'antibiotique correspondant, ce qui permet d'atteindre de plus grandes vitesses de croissance et de plus fortes densités cellulaires. Des vecteurs hybrides comprenant l'ADN 2 g complet (comprenant une origine fonctionnelle de réplication) sont maintenus de façon stable dans des souches de Saccharomyces cerevisiae qui sont dépourvues de plasmides 2 g endogènes (souches dites cira), de sorte que la culture peut être effectuée dans des conditions de croissance non sélectives, c'est-à-dire dans un milieu complexe. Les cellules de levures contenant des plasmides hybrides avec un promoteur constitutif expriment l'ADN codant pour une glycosyltransférase, ou une variante de celle-ci, contrôlée par ledit promoteur, sans induction. Toutefois, si ledit ADN est sous le contrôle d'un promoteur régulé, il faut adapter la composition du lieu de croissance de manière à obtenir des taux maximaux de transcrits d'AR Nm, par exemple lorsqu'on utilise le promoteur PE 05, le milieu de croissance doit contenir une faible concentration de phosphate minéral, pour la dérépression de ce promoteur. La culture est effectuée au moyen de techniques clas- siques Les conditions de culture, telles que la tempéra- il - ture, le p H du milieu et la durée de fermentation, sont choisies de manière que des concentrations maximales de la protéine hétérologue soient produites Une souche de levure choisie est de préférence cultivée dans des conditions aéro- bies, en culture submergée avec secouement ou agitation, à une température d'environ 25 à 35 WC, de préférence aux envi- rons de 280 C, à un p H de 4 à 7, par exemple à environ p H 5, et pendant au moins 1 à 3 jours, de préférence aussi long- temps que sont obtenus des rendements satisfaisants en pro- téine. Après expression dans la levure, la glycosyl- transférase, ou sa variante, est soit accumulée dans les cellules, soit sécrétée dans le milieu de culture, et on l'isole par des moyens classiques. Par exemple, la première étape consiste habituelle- ment en la séparation des cellules d'avec le bouillon de culture par centrifugation Dans le cas o la glycosyl- transférase ou sa variante s'est accumulée dans les cel- lules, la protéine doit être libérée de l'intérieur de la cellule par lyse des cellules Les cellules de levures peuvent être lysées de différentes façons bien connues dans la technique, par exemple par application de forces méca- niques, telles que secouement avec des billes de verre, par vibration ultrasonique, choc osmotique et/ou par digestion enzymatique de la paroi cellulaire Dans le cas o la glycosyltransférase ou sa variante à isoler est associée ou liée à une fraction membranaire, on peut atteindre une con- centration plus poussée, par exemple, par centrifugation différentielle de l'extrait cellulaire, et, éventuellement, traitement subséquent de la fraction particulière par un détergent, tel que le Triton Des procédés appropriés à la purification de la glycosyltransférase brute ou de sa variante comprennent des techniques chromatographiques clas- siques, telles que la chromatographie d'affinité, par exemple avec un support approprié, des anticorps ou la 12 - concanavaline A, la chromatographie d'échange d'ions, la filtration sur gel, la chromatographie de partage, la HPLC, l'électrophorèse, des étapes de précipitation telles que la précipitation au sulfate d'ammonium et d'autres processus, en particulier ceux connus d'après la littérature. Dans le cas o la glycosyltransférase, ou sa variante, est sécrétée par la cellule de levure dans l'es- pace périplasmique, on peut utiliser un protocole d'isole- ment simplifié: la protéine est recueillie sans lyse cellu- laire, par élimination enzymatique de la paroi cellulaire ou par des agents chimiques, par rexemple des réactifs de type thiol ou l'EDTA, qui donnent naissance à des endommagements de la paroi cellulaire permettant la libération de la glycosyltransférase produite Dans la cas o la glycosyl- transférase ou sa variante est sécrétée dans le bouillon de culture, elle peut être recueillie directement à partir de celui-ci et purifiée au moyen des méthodes spécifiées plus haut. Afin de déceler l'activité de la glycosyltransférase, on peut utiliser des essais connus dans la littérature Par exemple, l'activité de la galactosyltransférase peut être mesurée par détermination de la quantité de galactose radio- marqué, incorporé dans une molécule d'accepteur approprié, tel qu'une glycoprotéine ou un reste glucidique libre De même, l'activité de la sialyltransférase peut être dosée, par exemple, par l'incorporation d'acide sialique dans des substrats appropriés, et l'activité de la fucosyltransférase peut être dosée par le transfert de fucose à un accepteur approprié. Les cellules hôtes de levures transformées selon l'invention peuvent être obtenues par des techniques d'ADN recombinant, comprenant les étapes suivantes: construction d'un vecteur hybride comprenant un promoteur de levure et une séquence d'ADN codant pour une glycosyl- transférase liée à la membrane, ou une variante de celle- 13 - ci, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promo- teur, transformation d'une souche hôte de levure à l'aide dudit vecteur hybride et sélection de cellules de levures transformées pour les séparer des cellules de levures non transformées. Vecteurs d'expression Le vecteur hybride de levure selon l'invention com- prend une cassette d'expression comprenant un promoteur de levure et une séquence d'ADN codant pour une glycosyl- transférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur. * Dans un premier mode de réalisation, le vecteur hybride de levure selon l'invention comprend une cassette d'expression comprenant un promoteur de levure, une séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la mem- brane, ou une variante de celle-ci, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure. Dans un second mode de réalisation, le vecteur hybride de levure selon l'invention comprend une cassette d'expression comprenant un promoteur de levure fonctionnel- lement lié à une première séquence d'ADN codant pour un peptide signal, liée dans le cadre de lecture adéquat à une seconde séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure. Le promoteur de levure est un promoteur régulé ou constitutif, provenant de préférence d'un gène de levure fortement exprimé, en particulier d'un gène de Saccharomyces cerevisiae Ainsi, il est possible d'utiliser le promoteur du gène TRP 1, du gène ADHI ou ADHII, du gène de la phospha- tase acide (PH 05), un promoteur des gènes de phéromone d'ap- 14 - pariement de levure, codant pour le facteur a ou a, ou un promoteur provenant d'un gène codant pour une enzyme glycolytique, tel que le promoteur des gènes de l'énolase, de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAP), de la 3-phosphoglycérate kinase (PGK), de l'hexokinase, de la pyruvate décarboxylase, de la phosphofructokinase, de la glucose-6-phosphate isomérase, de la 3-phosphoglycérate mutase, de la pyruvate kinase, de la triosephosphate isomérase, de la phosphoglucose isomérase ou de la gluco- kinase On peut en outre utiliser des promoteurs hybrides comprenant des séquences d'activation en amont (UAS = upstream activation sequences) d'un gène de levure et des éléments de promoteur en aval, comprenant une boite TATA fonctionnelle d'un autre gène de levure, par exemple un promoteur hybride comprenant le ou les UAS du gène PH 05 de levure et des éléments de promoteur en aval comprenant une boîte TATA fonctionnelle du gène GAP de levure (promoteur hybride PH 05-GAP) Un promoteur préféré est le promoteur du gène GAP, en particulier des fragments fonctionnels de celui-ci, partant des nucléotides situés entre les positions -550 et -180, en particulier du nucléotide -540, - 263 ou -198, et se terminant au niveau du nucléotide -5 du gène GAP Un autre promoteur préféré du type régulé est le promo- teur de PH 05 En tant que promoteur constitutif, on préfère un promoteur raccourci de PH 05 de la phosphatase acide, dépourvu des éléments régulateurs amont (UAS) comme par exemple l'élément promoteur PH 05 (-173)commençant au niveau du nucléotide -173 et se terminant au niveau du nucleotide -9 du gène PH 05. La séquence d'ADN codant pour un peptide signal ("séquence signal") provient de préférence d'un gène de levure codant pour un polypeptide qui est normalement sécrété On peut également choisir d'autres séquences signal de protéines hétérologues qui sont normalement sécrétées. Des séquences signal de levure sont, par exemple, les - séquences signal et prépro des gènes de l'invertase, du fac- teur a, de la phéromone peptidase (KE Xl), de la "toxine tueuse" et de la phosphatase acide répressible (PH 05) de levure et la séquence signal de glucoamylase provenant de Aspergillus avamori Une autre possibilité consiste à con- struire des séquences signal fusionnées, par ligature d'une partie de la séquence signal (si elle est présente) du gène qui, à l'état naturel, est lié au promoteur utilisé (par exemple PH 05), avec une partie de la séquence signal d'une autre protéine hétérologue On préfère les combinaisons qui permettent une coupure précise entre la séquence signal et la séquence d'aminoacides de la glycosyltransférase Des séquences supplémentaires, telles que les séquences pro ou espaceur, qui peuvent ou non porter des signaux de matura- tion spécifiques, peuvent également être incluses dans les constructions, pour faciliter une maturation exacte de molé- cules de précurseur Ou bien, on peut produire des protéines fusionnées contenant des signaux de maturation internes qui permettent une maturation adéquate in vivo ou in vitro Par exemple, les signaux de maturation contiennent Lys-Arg, qui est reconnu par une endopeptidase de levure localisée dans les membranes de l'appareil de Golgi La séquence signal préférée selon la présente invention est celle du gène de l'invertase de levure. Si une glycosyltransférase complète, ou une variante de celle-ci liée à la membrane, est exprimée dans une levure, le vecteur hybride de levure préféré comprend une cassette d'expression comprenant un promoteur de levure, une séquence d'ADN codant pour ladite glycosyltransférase ou variante, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure Si l'ADN code pour une enzyme liée à la membrane, une séquence signal supplé- mentaire n'est pas nécessaire. 16 - Lorsqu'une variante soluble d'une glycosyltransférase liée à la membrane est exprimée dans une levure, le vecteur hybride de levure préféré comprend une cassette d'expression comprenant un promoteur de levure fonctionnellement lié à une première séquence d'ADN codant pour un peptide signal, liée dans le cadre de lecture adéquat à une seconde séquence d'ADN codant pour ladite variante, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure. De l'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci, peut être préparé par des méthodes connues dans la technique et comprend de l'ADN génomique, par exemple isolé à partir d'une banque d'ADN génomiques mammaliens, provenant par exemple de cel- lules bovines, humaines, de rat ou de souris Si néces- saire, les introns existant dans l'ADN génomique codant pour l'enzyme sont supprimés En outre, de l'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci, comprend de l'AD Nc qui peut être isolé à partir d'une banque d'AD Nc mammaliens ou produit à partir de l'AR Nm correspondant La banque d'AD Nc peut provenir de cellules de différents tissus, par exemple des cellules placentaires ou des cellules hépatiques La préparation d'AD Nc par la voie de l'AR Nm est réalisée au moyen de méthodes classiques, telles que la réaction en chaine par polymérase (PCR = polymerase chain reaction). Par exemple, en suivant des méthodes classiques con- nues dans la technique, on effectue l'isolement d'ARN- poly(A)" à partir de cellules mammaliennes, par exemple de cellules He La, et la synthèse subséquente du premier brin d'AD Nc A partir de cette matrice d'ADN synthétisée, on peut utiliser la PCR pour amplifier la séquence cible, à savoir l'ADN codant pour la glycosyltransférase ou un fragment de celui-ci, tandis que l'amplification des séquences non cibles, numériquement dominantes, est réduite au minimum A 17 - cette fin, il faut connaître la séquence d'un petit groupe de nucléotides de chaque côté de la séquence cible Ces séquences adjacentes sont utilisées pour construire deux oligonucléotides amorces monocaténaires synthétiques, dont la séquence est choisie de manière que chacun ait une com- plémentarité de paires de bases avec sa séquence adjacente respective La PCR débute par dénaturation du brin hybride d'ADN-AR Nm, suivie de la soudure des amorces aux séquences encadrant la cible L'addition d'une ADN polymérase et de désoxynucléotide triphosphates provoque la formation de deux fragments d'ADN bicaténaires, commençant chacun au niveau de l'amorce et s'étendant le long de la séquence cible, copiant ainsi cette dernière Chacun des produits nouvellement syn- thétisés peut servir de matrices pour hybridation d'amorces et d'extensions (cycle suivant), conduisant ainsi à un accroissement exponentiel de fragments bicaténaires de bonne longueur. En outre, on peut synthétiser chimiquement ou enzyma- tiquement de l'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci Une variante d'une glycosyltransférase liée à la membrane, ayant une activité enzymatique et comportant une séquence d'amino- acides dans laquelle un ou plusieurs aminoacides sont sup- primés (fragments d'ADN) et/ou remplacés par un ou plusieurs autres aminoacides, est codée par un ADN mutant De plus, un ADN mutant peut comprendre un mutant silencieux dans lequel un ou plusieurs nucléotides sont remplacés par d'autres nucléotides, les nouveaux codons codant pour le(s) même(s) aminoacide(s) Une telle séquence mutante est également une séquence d'ADN dégénérée Des séquences d'ADN dégénérées sont dégénérées, dans le sens du code génétique, du fait qu'un nombre illimité de nucléotides sont remplacés par d'autres nucléotides sans que cela entraîne une modification de la séquence d'aminoacides initialement codée De telles séquences d'ADN dégénérées peuvent être utiles, en raison de 18 - leurs sites de restriction différents et/ou de leur fré- quence différente de codons particuliers qui sont préférés par l'hôte spécifique, pour l'obtention d'une expression optimale d'une glycosyltransférase ou d'une variante de celle-ci De telles séquences d'ADN ont de préférence l'em- ploi de codons préférés par la levure. Un ADN mutant peut également être obtenu par mutation in vitro d'un AD Nc ou d'un ADN génomique existant dans la nature, selon des méthodes connues dans la technique Par exemple, l'ADN partiel codant pour une forme soluble d'une glycosyltransférase peut être excisé de l'ADN complet codant pour la glycosyltransférase correspondante, liée à la mem- brane, au moyen d'enzymes de restriction La disponibilité d'un site de restriction approprié est avantageuse à cette fin. Une séquence d'ADN contenant des signaux de terminai- son de transcription de levure est de préférence la séquence adjacente en 3 ' d'un gène de levure qui contient des signaux adéquats pour la terminaison de la transcription et la poly- adénylation Des séquences adjacentes en 3 ' qui sont appro- priées sont par exemple celles du gène de levure lié à l'état naturel au promoteur utilisé La séquence adjacente préférée est celle du gène PHO 5 de levure. Le promoteur de levure, la séquence d'ADN facultative codant pour le peptide signal, la séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci, et la séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure, sont fonctionnelle- ment liés en un arrangement en tandem, c'est-à-dire qu'ils sont juxtaposés de manière que leurs fonctions normales soient maintenues L'arrangement est tel que le promoteur effectue une expression adéquate de la séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci (éventuellement précédée d'une séquence signal), les signaux de terminaison de transcrip- 19 - tion effectuent une terminaison adéquate de transcription et de polyadénylation, et la séquence signal facultative est liée dans le cadre de lecture adéquat à la séquence d'ADN mentionnée plus haut, de manière que le dernier codon de la séquence signal soit directement lié au premier codon de ladite séquence d'ADN, et que la sécrétion de la protéine se produise Si le promoteur et la séquence signal proviennent de gènes distincts, le promoteur est de préférence lié à la séquence signal au niveau d'un site localisé entre le point de départ majeur de l'AR Nm et l'ATG du gène soudé à l'état naturel au promoteur La séquence signal devrait avoir son propre ATG pour l'initiation de la traduction La jonction de ces séquences peut être effectuée au moyen de segments de liaison oligodésoxynucléotidiques portant la séquence de reconnaissance d'une endonucléase. Les vecteurs appropriés pour la réplication et l'ex- pression dans une levure contiennent une origine de réplica- tion de levure Des vecteurs hybrides qui contiennent une origine de réplication de levure, par exemple le segment chromosomique à réplication autonome (ars), sont conservés extrachromosomiquement dans la cellule de levure après transformation, et sont répliqués de façon autonome au cours de la mitose On peut également utiliser des vecteurs hybrides qui contiennent des séquences homologues à l'ADN plasmidique 2 g de levure De tels vecteurs hybrides sont intégrés par recombinaison dans des plasmides 2 g déjà pré- sents à l'intérieur de la cellule, ou se répliquent de façon autonome. De préférence, les vecteurs hybrides selon l'inven- tion comprennent un ou plusieurs, en particulier un ou deux marqueurs génétiques sélectifs pour levure et un tel mar- queur est une origine de réplication pour un hôte bactérien, notamment Escherichia coli. En ce qui concerne les marqueurs génétiques sélectifs pour levure, on peut utiliser tout gène marqueur qui faci- - lite la sélection de transformants en raison de l'expression phénotypique du gène marqueur Des marqueurs appropriés pour levure sont, par exemple, ceux exprimant une résistance à un antibiotique, ou, dans le cas de mutants auxotrophes de levure, des gènes qui complètent des lésions de l'hôte Les gènes correspondants confèrent, par exemple, une résistance aux antibiotiques G 418, hygromycine ou bléomycine, ou réa- lisent la prototrophie dans un mutant auxotrophe de levure, par exemple le gène URA 3, LEU 2, LY 52 ou TRP 1. Etant donné que l'amplification des vecteurs hybrides est commodément effectuée dans E coli, un marqueur géné- tique de E coli et une origine de réplication de E coli sont avantageusement inclus On peut les obtenir à partir de plasmides de E coli, tels que p BR 322, ou d'un plasmide p UC, par exemple p UC 18 ou p UC 19, qui contiennent l'un et l'autre l'origine de réplication de E coli et un marqueur génétique de E coli conférant la résistance à des antibiotiques tels que l'ampicilline. Les vecteurs hybrides selon l'invention sont con- struits par des méthodes connues dans la technique, par exemple par assemblage de la cassette d'expression consti- tuée d'un promoteur de levure et une séquence d'ADN codant pour une glycosyltransfêrase, ou une variante de celle-ci, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur, ou des divers constituants de la cassette d'expression, et des fragments d'ADN contenant des marqueurs génétiques sélectifs pour la levure et pour un hôte bactérien, et des origines de réplication pour la levure et pour un hôte bac- térien, dans l'ordre préétabli. Les vecteurs hybrides de l'invention sont utilisés pour la transformation des souches de levures décrites ci- dessous. Souches de levures et transformation de celles-ci Des organismes hôtes de type levure appropriés sont des souches appartenant au genre Saccharomyces, en particu- 21 - lier des souches de Saccharomyces cerevisiae Lesdites souches de levures comprennent des souches qui ont été éven- tuellement privées de plasmides 2 g endogènes et/ou qui éventuellement sont dépourvues d'activité(s) de peptidase de levure, par exemple d'activité peptidase ysca, ysc A, ysc B, ysc Y et/ou ysc S. L'invention concerne en outre une souche de levure qui a été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur et une séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci, lequel ADN est con- trôlé par ledit promoteur. Dans un premier mode de réalisation, la souche de levure selon l'invention a été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur de levure, une séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane ou une variante de celle-ci, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure. Dans un second mode de réalisation, la souche de levure selon l'invention a été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression constituée d'un promoteur de levure fonctionnellement lié à une première séquence d'ADN, codant pour un peptide signal, liée dans le cadre de lecture adéquat à une seconde séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase liée à la membrane, ou une variante de celle-ci, et une séquence d'ADN contenant des signaux de terminaison de transcription de levure. Les souches de levures de l'invention sont utilisées pour la production d'une glycosyltransférase liée à la mem- brane, ou d'une variante de celle-ci. La transformation de la levure par les vecteurs hybrides selon l'invention est réalisée par des méthodes connues dans la technique, par exemple selon les méthodes 22 - décrites par Hinnen et coll lProc Natl Acad Sci USA ( 1978), 75, 1929 l et Ito et coll lJ Bact ( 1983), 153, 163-168 l. Les glycosyltransférases liées à la membranes, et leurs variantes, produites par le procédé selon l'invention, peuvent être utilisées d'une façon connue en soi, par exemple pour la synthèse et/ou la modification de glyco- protéines, oligosaccharides et glycolipides (US-A-4 925 796; EP-A-414 171). L'invention concerne en particulier le procédé pour la production de glycosyltransférases liées à la membrane, et de leurs variantes, les vecteurs hybrides, les souches de levures transformées et les glycosyltransférases pouvant être obtenues selon le procédé de l'invention, comme décrit dans les exemples. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après Dans les exemples, on utilise les abréviations suivantes: GT = galactosyltransférase (EC 2 4 1 22); PCR = amplification en chaîne par polymérase; ST = sialyltransférase (EC 2 4 99 1); FT = fucosyltransférase. Exemple 1 Clonage de l'AD Nc codant pour la galactosyl- transférase (GT) provenant de cellules He La On isole par la méthode d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) de l'AD Nc GT à partir de cellules He La lG Watzele et E G Berger ( 1990), Nucleic Acids Res, 18, 7174 l: 1.1 Préparation d'AR Npoly(A) à partir de cellules He La Pour la préparation d'ARN, on cultive des cellules He La en culture monocouche sur 5 plaques ( 23 x 23 cm). L'isolement rapide et efficace d'ARN à partir de cellules cultivées est effectué par extraction à l'aide de guanidine- H Cl, comme décrit par R J Mac Donald et coll lHeth. Enzymol ( 1987), 152, 226-227 l En général, les rendements 23 - vont d'environ 0,6 à 1 mg d'ARN total par plaque de cellules confluentes On effectue l'enrichissement de l'AR Npoly(A) par chromatographie d'affinité sur oligo(d T)-cellulose, selon la méthode décrite dans le manuel de Maniatis lJ Sambrook, E F Fritsch et T Maniatis ( 1989), Molecular Cloning: A laboratory Manual ( 2 e edition), Cold Spring Harbor Labora- tory Press, Cold Spring Harbor, USAl, en injectant 4 mg d'ARN total dans une colonne de 400 gl On recueille 3 % de l'ARN introduit, sous forme d'AR Npoly(A)+ enrichi, qui est conservé jusqu'à l'emploi en parties aliquotes précipitées avec 3 volumes d'éthanol à -70 C. 1.2 Synthèse d'AD Nc premier brin pour PCR L'AR Npoly(A)+ (AR Nm) est inversé-transcrit en ADN à l'aide de la transcriptase inverse H R Nase du virus de la leucémie murine de Moloney (TI H de VLM-M) (BRL) Dans la préparation du mélange réactionnel de 20 Ll, on suit le protocole fourni par BRL, avec de légères variations: on chauffe pendant 10 minutes à 70 C 1 ug d'AR Npoly(A) de cellules He La et 500 ng d'oligo(d T)12-18 (Pharmacia) dans 11,5 gl d'eau stérile et on refroidit ensuite rapidement le mélange sur de la glace On ajoute ensuite 4 gl de tampon de réaction fourni par BRL ltris-H Cl 250 m M (p H 8,3), K Cl 375 m M, Mg C 12 15 m Ml, 2 El de dithiothréitol 0,1 M, 1 El de d NTP mélangés ( 10 m M chaque de d ATP, d CTP, d GTP, TTP, Pharmacia), 0,5 gl ( 17,5 U) de RN Aguard (inhibiteur de R Nase de Pharmacia) et 1 il ( 200 U) de TI H de VLM-M On effectue la réaction à 42 C et on la fait cesser au bout de 1 heure en chauffant le tube pendant 10 minutes à 95 C. Afin de contrôler l'efficacité de la réaction, on met à incuber une partie aliquote ( 5 gl) du mélange en présence de 2 U Ci d'a-32 P-d CTP En mesurant le d CTP incorpore, on calcule la quantité d'AD Nc synthétisé Le rendement de la synthèse du premier brin est habituellement compris entre 5 et 15 %. 24 - 1.3 Amplification en chaîne par polymérase (PCR) Les amorces oligodésoxynucléotidiques utilisées pour la PCR sont synthétisées in vitro par la méthode au phosphoramidite lM H Caruthers dans Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments (Synthèse chimique et enzyma- tique de fragments de gène), H G Gassen et A Lang édi- teurs, Verlag Chemie, Weinheim, RFAl sur un synthétiseur Applied Biosystems modèle 380 B Elle sont énumérées dans le tableau 1. Tableau 1 Amorces pour PCR Corres- pondant à pb dans Amorce Séquences ( 5 ' à 3 ')1) l'AD Nc de GT 2) Plup (Kpn I) cgcggt ACCCI -Cl IAAAGCGGCGGCGGGAAGATG (-26) 3 Pl (Eco RI) gccgaattc ATGAGGCITCGGGAGCCG Cr CCTGAGCG 1 28 P 3 (Sac I)CTGGAGCTCGTGGCAAAGCAGAACCC 448 473 P 2 d (Eco RI) gccgaa Tr CAGTCTC Tr ATCCGTGTACCAAAACGC CTA 1222 1192 P 4 (Hind I) cccaa Rct TGGAATGATGATGGCCACC Tr GTGAGG 546 520 Les lettres majuscules représentent des séquences prove- nant de la GT, les lettres minuscules représentent des séquences supplémentaires, les sites pour enzymes de restriction sont soulignés Les codons pour "le départ" et "l'arrêt" de la traduction de l'ARN apparaissent en gras. 2) Séquence d'AD Nc de GT provenant du placenta humain, telle que publiée dans Gen Bank (n de dépôt M 22921). Les conditions normales de PCR pour un mélange d'in- cubation de 30 Ml sont les suivantes: 1 gl du mélange réac- tionnel de transcriptase inverse (voir exemple 1 2), conte- nant environ 5 ng d'AD Nc premier brin, 15 pmoles chaque des amorces concernées, 200 9 moles chaque des quatre désoxy- - nucléoside triphosphates (d ATP, d CTP, d GTP et TTP) dans du tampon PCR ltris-H Cl 10 m M (p H 8,3) (à 23 C), K Cl 50 m M, Mg Cl 2 1,5 m M, 0,001 % de gélatinel et 0,5 U de polymérase Ampli Taq Polymerase (Perkin Elmer) On effectue l'amplifica- tion dans l'appareil Thermocycler 60 (Biomed) en utilisant les conditions suivantes: 0,5 minute de dénaturation à 95 C, 1 minute d'hybridation à 56 C et 1 minute 15 secondes d'ex- tension à 72 C, pour un total de 20-25 cycles Dans le der- nier cycle, l'extension d'amorce à 72 C est effectuée pen- dant 5 minutes. Pour le séquençage et le sous-clonage, l'AD Nc de GT de He La est amplifié en deux segments se chevauchant, au moyen de différentes combinaisons d'amorces: ( 1) Fragment P 1-P 4: on utilise les amorces Pl et P 4 pour amplifier un fragment d'ADN de 0,55 kb couvrant les positions de nucléotides 7-556 dans l'AD Nc de GT de He La (ID SEQ n 1). ( 2) Fragment P 3-P 2 d: on utilise les amorces P 3 et P 2 d pour amplifier un fragment de 0,77 kb couvrant les positions de nucléotides 457 1 232 (ID SEQ n 1). Afin d'éviter des erreurs au cours de l'amplifica- tion, on effectue quatre PCR indépendantes pour chaque frag- ment On utilise également l'amorce Plup (Kpn I) en associa- tion avec l'amorce P 4, pour déterminer la séquence d'ADN suivie du codon d'initiation. Après l'amplification en chaîne par polymérase, le fragment P 1-P 4 est digéré à l'aide des enzymes de restric- tion Eco RI et Hind III, analysé sur un gel d'agarose à 1,2 %, élué du gel par GENECLEAN (BIO 101) et sous-cloné dans le vecteur p UC 18 (Pharmacia) ayant été digéré à l'aide des mêmes enzymes Le fragment P 3- P 2 d est digéré à l'aide de Sac I et Eco RI, analysé sur un gel à 1,2 %, élué et sous- cloné dans p UC 18 qui a été digéré par Sac I et Eco RI Les sous-clones résultants sont p UC 18/P 1-P 4 et p UC 18/P 3-P 2 d, respectivement Pour le sous-clonage, la ligature et la 26 - transformation de la souche DH 5 " de E coli, on suit les modes opératoires classiques tels que décrits dans l'exemple 2 On utilise des minipréparations des plasmides p UC 18/P 1-P 4 et p UC 18/P 3-P 2 d pour le séquençage didésoxy d'ADN bicaténaire dénaturé, à l'aide du nécessaire de séquençage à la polymérase de T 7 (Pharmacia) Des amorces de séquençage de M 13/p UC et des amorces de séquençage inverse (Pharmacia) sont appliquées au séquençage de fragments che- vauchants produits à partir des deux brins d'ADN, par diges- tion par diverses enzymes de restriction Un nouveau sous- clonage de fragments de restriction du gène GT est néces- saire pour le séquençage poussé de fragments chevauchants des deux brins La séquence de fragments amplifiée par plu- sieurs PCR indépendantes montre que l'erreur d'amplification est inférieure à 1 pour 3 000 nucléotides La séquence nucléotidique complète de l'AD Nc de GT de cellules He La qui est donnée dans ID SEQ n 1 est homologue à 99,2 % à celle du placenta humain (n de dépôt Genbank M 22921) On constate trois différences: (a) trois paires de bases supplémentaires aux posi- tions des nucléotides 37-39 (ID SEQ n 1) ayant pour résul- tat un aminoacide supplémentaire (Ser) dans la partie N-terminale de la protéine; (b) les bases 98 à 101 sont "CTCT" au lieu de "TCTG" dans la séquence du placenta humain, ce qui conduit à deux remplacements d'aminoacides conservateurs (Ala Leu au lieu de Val Tyr) aux positions d'aminoacides 31 et 32 dans le domaine de recouvrement de membrane de GT; (c) de "A", le nucléotide à la posi- tion 1 047 est changé en "G", sans entraîner un changement de la séquence d'aminoacides. Les deux fragments d'ADN chevauchants P 1-P 4 et P 3-P 2 d codant pour l'AD Nc de GT de He La sont assemblés par le site de restriction Not I à la position de nucléotide 498, qui est présent dans les deux fragments. 27 - L'AD Nc complet de GT de cellules He La (ID SEQ n 1) est cloné sous forme d'un fragment de restriction Eco RI- Eco RI de 1,2 kb dans le plasmide p IC-7, un dérivé de p UC 8 à sites de restriction supplémentaires dans le site de clonage multiple lJ L Marsh, M Erfle et E J Wykes ( 1984), Gene, 32, 481-485 l, ce qui donne le vecteur p 4 AD 113 Afin de créer la cassette d'expression GT, on supprime comme suit le site de restriction Eco RI (pb 1 227) à l'extrémité 3 ' de la séquence d'AD Nc: le vecteur p 4 AD 113 est d'abord linéarisé par digestion par Eco RV, et ensuite traité par de la phos- phatase alcaline On fait en outre digérer partiellement pendant 1 heure à 37 C, avec 0,25 U de Eco RI, 1 gg de l'ADN plasmidique linéarisé Après électrophorèse en gel d'aga- rose, un fragment correspondant à la taille du plasmide linéarisé ( 3, 95 kb) est isolé du gel au moyen de GENECLEAN (Bio 101) L'extrémité Eco RI saillante est complétée à l'aide du fragment de Klenow de la polymérase, comme décrit dans le manuel de Maniatis (voir plus haut) Après phénoli- sation et précipitation à l'éthanol, le plasmide est religa- turé et utilisé pour transformer E coli DH 5 o (Gibco/BRL). On effectue des minipréparations de plasmides à partir de six transformants Les plasmides obtenus sont contrôlés par analyse de restriction, en ce qui concerne l'absence des sites de restriction Eco RI et Eco RV à l'extrémité 3 ' de l'AD Nc de GT de cellules He La On choisit pour l'expérimen- tation suivante le plasmide désigné par p 4 A E 113, car sa séquence d'ADN est identique à celle du plasmide p 4 AD 113, mis à part que les pb 1 232 1 238 avec les sites de res- triction Eco RI-Eco RV sont supprimés. Exemple 2 Construction de cassettes d'espression pour GT complète Pour l'expression hétérologue dans Saccharomyces cerevisiae, on soude la séquence complète d'AD Nc de GT de cellules He La (ID SEQ n 1) à des signaux de régulation de transcription de levure, pour un départ et une terminaison 28 - efficaces de transcription Les séquences promotrice et terminatrice partent du gène de la phosphatase acide de levure (PH 05) (EP-100 561) Le promoteur PH 05 complet est régulé par l'apport de phosphate inorganique dans le milieu de culture De fortes concentrations de Pl conduisent à une répression du promoteur, tandis qu'une faible concentration de Pl agit par induction On peut également utiliser un court fragment promoteur PH 05 de 173 pb qui est dépourvu de tous éléments régulateurs et par conséquent se comporte comme un promoteur constitutif. 2.1 Construction d'une cassette d'expression inductible par le phosphate La séquence d'AD Nc de GT est associée au promoteur PH 05 de levure et aux séquences terminatrices de transcrip- tion, comme suit: (a) séquence complète d'ADNC de GT de cellules He La: On fait digérer par les enzymes de restriction Eco RI et Bgl II le vecteur p 4 AE 113 comportant la séquence complète d'AD Nc de GT Les fragments d'ADN sont séparés par électro- phorèse sur un gel d'agarose à 1 % On isole du gel, par adsorption sur glasmilk, en utilisant le nécessaire GENECLEAN (Bio 101), un fragment d'ADN de 1,2 kb contenant la séquence complète d'AD Nc codant pour la GT de cellules He La Sur ce fragment, le codon d'initiation "ATG" pour la synthèse protéique de la GT est localisé directement en arrière du site de restriction pour Eco RI, tandis que le codon d'arrêt "TAG" est suivi de 32 pb apportées par la région non traduite en 3 ' de la GT de cellules He La, et le site de clonage multiple du vecteur, comportant le site de restriction Bgl II. (b) Vecteur pour l'amplification dans E coli: Le vecteur pour l'amplification, le plasmide p 31 R (voir EP-10 O 561), un dérivé de p BR 322, est digéré à l'aide des enzymes de restriction Bam HI et Sal I Les fragments de restriction sont séparés sur un gel d'agarose à 1 %, et un 29 - fragment vecteur de 3,5 kb est isolé du gel comme décrit précédemment Ce fragment d'ADN contient le grand fragment vecteur Sal I- Hind III du dérivé de p BR 322, ainsi qu'une séquence terminatrice de transcription de PH 05 de 337 pb, au lieu de la séquence Hind III-Bam HI de p BR 322. (c) Séquence du promoteur PH 05 inductible: Le fragment promoteur PH 05 contenant les éléments régulateurs (UA Sp) pour l'induction par un phosphate est isolé du plasmide p 31 R (voir EP-100 561) par digestion à l'aide des enzymes de restriction Sal I et Eco RI Le fragment d'ADN Sal I-Eco RI de 0,8 kb comprend la séquence Sal I-Bam HI de p BR 322 de 276 pb et le fragment promoteur PH 05 Bam HI- Eco RI de 534 pb, avec le segment de liaison Eco RI ( 5 '-GAATTC-3 ') introduit à la position -8 de la séquence du promoteur PH 05. (d) Construction du plasmide p GTA 1132 Les trois fragments d'ADN (a) à (c) sont ligaturés dans 12 gl d'un mélange de ligature: on ligature 100 ng de fragment d'ADN (a) et 30 ng chaque de fragments (b) et (c), pendant 18 heures à 15 C, en utilisant 0,3 U d'ADN ligase de T 4 (Boehringer) dans le tampon pour ligase fourni ltris-H Cl 66 m M (p H 7, 5), dithioérythritol 1 m M, Mg Cl 2 5 m M, ATP 1 m M) On utilise la moitié du mélange de ligature pour transformer des cellules compétentes de E coli souche DH 5 " (Gibco/BRL) Pour la préparation de cellules compétentes et pour la transformation, on suit le protocole classique tel que donné dans le manuel de Maniatis (voir plus haut) On étale les cellules sur du milieu LB sélectif, additionné de gg/ml d'ampicilline, et on les met à incuber à 37 C On obtient environ 120 transformants On effectue des mini- préparations de plasmide à partir de six transformants indé- pendants, en utilisant le protocole de lyse alcaline modifié de H C Birnboim et J Doly, tel que décrit dans le manuel de Maniatis (voir plus haut) Les plasmides isolés sont caractérisés par analyse de restriction à l'aide de quatre - enzymes différentes (Eco RI, Pst I, Hind III et Sal I, également en association) Les six plasmides présentent tous les frag- ments de restriction attendus On choisit l'un des clones et on le désigne par p GTA 1132 Le plasmide p GTA 1132 contient la cassette d'expression comportant l'AD Nc complet de GT de cellules He La sous contrôle du promoteur PH 05 régulé par le phosphate, et la séquence terminatrice de transcription de PH 05 Cette cassette d'expression peut être excisée de p GTA 1132, sous forme d'un fragment Sal I-Hind III de 2, 35 kb, dénommé "fragment d'ADN (l A)". 2.2 Construction d'une cassette d'expression constitutive Pour la construction d'une cassette d'expression comportant un promoteur constitutif non régulé, on utilise un fragment promoteur PH 05 tronqué en 5 ', dépourvu d'élé- ments régulateurs par phosphate, qui est isolé à partir du plasmide p 31/PHO 5 (-173)RIT. (a) Construction du plasmide p 31/PHO 5 (-173)RIT Le plasmide p 31 RIT 12 (EP-288 435) comprend le promo- teur PH 05 complet régulé lavec un site Eco RI introduit à la position de nucléotide -8 sur un fragment Bam HI-Eco RI de 534 pb, suivi de la séquence codante pour la séquence signal de l'invertase de levure (Eco RI-Xho I de 72 pb) et du signal de terminaison de transcription de PH 05 (Xho I-Hind III de pb) cloné dans un arrangement en tandem entre Bam HI et Hind III sur le vecteur dérivé de p BR 322 l. L'élément promoteur PH 05 (-173) constitutif, provenant du plasmide p JDB 207/PHO 5 (-173)-YHIR (EP-340 170) comprend la séquence nucléotidique du promoteur PH 05 de levure, de la position de nucléotide -9 à -173 (site de restriction Bst EII) mais ne comporte pas de séquences régulatrices en amont (UA Sp) Le promoteur PH 05 (-173) se comporte par consé- quent comme un promoteur constitutif Cet exemple décrit le remplacement du promoteur PH 05 régulé dans le plasmide p 31 RIT 12 par le court élément promoteur PH 05 (-173) constitu- tif, dans le but d'obtenir le plasmide p 31/PHO 5 (-173)RIT. 31 - On fait digérer par les endonucléases de restriction Sal I et Eco RI les plasmides p 31 RIT 12 (EP-288 435) et p JDB 207/PHO 5 (-173)-YHIR (EP-340 170) Les fragments Sal I- Eco RI respectifs, de 3,6 kb et 0,4 kb, sont isolés sur un gel d'agarose à 0,8 %, élués du gel, précipités à l'éthanol et remis en suspension dans H 20 à une concentration de 0,1 pmole/gl On ligature les deux fragments d'ADN et on mélange des parties aliquotes de 1 il du mélange de liga- ture, pour transformer des cellules compétentes de E coli HB 101 (ATCC) Des colonies résistantes à l'ampicilline sont cultivées individuellement dans du milieu LB additionné d'ampicilline ( 100 gg/ml) On isole l'ADN plasmidique selon la méthode de D S Holmes et coll lAnal Biochem ( 1981), 144, 193 l et on l'analyse par digestions de restriction à l'aide de Sal I et Eco RI Le plasmide d'un clone comportant les fragments de restriction corrects est désigné par p 31/PH 05 (-173)RIT. (b) Construction du plasmide p GT B 1135 On fait digérer par les enzymes de restriction Eco RI et Sal I le plasmide p 31/PHO 5 (-173)RIT Apres séparation sur un gel d'agarose à 1 %, un fragment Sal I-Eco RI de 0,45 kb est isolé du gel à l'aide de GENECLEAN (Bio 101) Ce frag- ment contient la séquence Sal I-Bam HI de 276 pb de p BR 322 et le fragment promoteur PH 05 constitutif Bam HI(Bst EII)-Eco RI de 173 pb On soude le fragment Sal I-Eco RI de 0,45 kb à l'AD Nc de GT Eco RI-Bgl II de 1,2 kb lfragment (a)l et à la partie de vecteur Bam HI-Sal I de 3, 5 kb pour amplification dans E coli avec le terminateur de PH 05 lfragment (b)l décrit dans l'exemple 2 1 On effectue la ligature et la transformation de E coli souche DH 5 ", comme décrit plus haut, pour obtenir 58 transformants Des plasmides sont isolés par des minipréparations à partir de six colonies indépendantes, et caractérisés par analyse de restriction. Les six plasmides présentent tous les fragments attendus Un clone correct est désigné par p GTB 1135 et utilisé pour 32 - d'autres essais de clonage, pour donner la cassette d'ex- pression codant pour la GT de cellules He La, sous contrôle du fragment promoteur PH 05 (-173) constitutif Cette cassette d'expression peut être excisée du vecteur p GTB 1135, sous forme d'un fragment Sal I-Hind III de 2 kb dénommé fragment d'ADN (l B). Exemple 3 Construction des vecteurs d'expression p DPGTA 8 et p DPGTB 5 Le vecteur de levure utilisé pour l'expression hété- * rologue est le vecteur épisomique p DP 34 ( 11,8 kb), qui est un vecteur navette levure-E coli comportant le marqueur de résistance à l'ampicilline pour E coli et les marqueurs sélectifs de levure URA 3 et d LEU 2 On fait digérer par l'en- zyme de restriction Bam HI le vecteur p DP 34 (voir EP-340 170) On isole à l'aide de GENECLEAN le vecteur linéarisé, et on complète les extrémités saillantes par traitement par le fragment de Klenow de la polymérase, comme décrit dans le manuel de Maniatis (voir plus haut) On met fin à la réaction au bout de 30 minutes, par chauffage à 65 C pendant 20 minutes en présence de 10 m M d'EDTA Après précipitation à l'éthanol, on fait digérer le plasmide par Sal I et on le soumet à une électrophorèse en gel sur un gel d'agarose à 0,8 % Le vecteur p DP 34 coupé par Sal I, à extré- mités franches (Bam HI) est isolé du gel, à l'aide du néces- saire GENECLEAN, sous forme d'un fragment d'ADN de 11,8 kb. Par analogie avec la préparation de vecteurs, on fait digérer les plasmides p GTA 1132 et p GTB 1135 chacun par Hind III Les extrémités saillantes des plasmides linéarisés sont complétées par traitement par le fragment de Klenow de la polymérase, et on les soumet ensuite à une digestion par Sal I, pour obtenir ( 2 A) un fragment Sal I-extrémité franche(Hind III) de 2,35 kb, comportant la cassette d'expression régulée par le phosphate, ou 33 - ( 2 B) un fragment Sal I-extrémité franche(Hind III) de 2,0 kb, comportant la cassette d'expression constitutive. On effectue la ligature de la partie de vecteur p DB 34 Sal I-extrémité franche avec le fragment 2 A ou le fragment 2 B, et la transformation de cellules compétentes de E coli souche DH 5 a, comme décrit dans l'exemple 2, en utilisant ng de la partie de vecteur et 40 ng de fragment 2 A ou 2 B, respectivement On obtient respectivement 58 et 24 trans- formants A partir de chaque transformation, six plasmides sont préparés et caractérisés par analyse de restriction. Pour la construction avec la cassette d'expression régulée (fragment 2 A), deux plasmides présentent le profil de res- triction attendu L'un des clones est choisi et désigné par p DPGTA 8 Pour la construction avec la cassette d'expression constitutive (fragment 2 B), un plasmide présente le profil de restriction attendu, et est désigné par p DPGTB 5. Exemple 4 -Transformation de la souche BT 150 de S cerevisiae On prépare de l'ADN purifié au Cs Cl des vecteurs d'expression p DPGTA 8 et p DPGTB 5, en suivant le protocole de R Treisman dans le manuel de Maniatis (voir plus haut) Les souches de S cerevisiae protéase- déficientes BT 150 (MAT", his 4, leu 2, ura 3, pral, prbl, prcl, cpsl) et H 449 (MA Ta, prbl, cpsl, ura 3 A 5, leu 2-3,2-112, cir ) sont transformées chacune avec 5 gg de chacun des plasmides p DPGTA 8, p DPGTB 5 et p DP 34 (régulation sans cassette d'expression) selon la méthode de transformation à l'acétate de lithium (H Ito et coll, voir plus haut) Des transformants Ura+ sont isolés et criblés en ce qui concerne l'activité GT (voir plus loin) Des cellules de levures transformées individuelles sont sélectionnées et dénommées comme suit: Saccharomyces cerevisiae BT 150/p DPGTA 8 Saccharomyces cerevisiae BT 150/p DPGTB 5 Saccharomyces cerevisiae BT 150/p DP 34 Saccharomyces cerevisiae H 449/p DPGTA 8 34 - Saccharomyces cerevisiae H 449/p DPGTB 5 Saccharomyces cerevisiae H 449/p DP 34. Exemple 5 Activité enzymatique de GT complète exprimée dans une levure 5 1 Préparation d'extraits cellulaires Des cellules de souches transformées de Saccharomyces cerevisiae BT 150 et H 449 sont cultivées chacune sous sélec- tion à l'uracile, dans des milieux minimaux pour levure (Difco) additionnés d'histidine et de leucine La vitesse de croissance des cellules n'est pas affectée par l'introduc- tion de l'un quelconque des vecteurs d'expression Des cel- lules en croissance exponentielle (à Do 578 = 0,5) ou des cellules stationnaires sont recueillies par centrifugation, lavées une fois avec du tampon tris-H Cl 50 m M (p H 7,4) (tam- pon 1), puis remises en suspension dans du tampon 1, à une concentration correspondant à 0,1-0,2 DO 578 On effectue une lyse mécanique des cellules par secouement énergique sur un agitateur à vortex, avec des billes de verre ( 0,45-0,5 mm de diamètre) pendant 4 minutes, avec refroidissement intermit- tent Les extraits bruts sont utilisés directement pour la détermination de l'activité enzymatique. Le fractionnement des composants cellulaires est réalisé par centrifugation différentielle de l'extrait En premier lieu, on centrifuge l'extrait à 450 g pendant 5 minutes; en second lieu, on centrifuge le surnageant obtenu à 20 000 g pendant 45 minutes. On recueille le surnageant et on remet les culots en suspension dans du tampon 1. Pour l'induction par le phosphate de l'expression de la GT sous le contrôle du promoteur PH 05 inductible, on transfère en masse les cellules de transformants BT 150/p DPGTA 8 et H 449/p DPGTA 8, respectivement, dans un milieu minimal à faible teneur en phosphate lB Meyhack et coll, Embo J ( 1982) 1, 675-680 l Les extraits cellulaires sont préparés comme décrit plus haut. - 5.2 Dosage de protéine La concentration de protéine est déterminée au moyen du nécessaire de dosage de protéine BCA (Pierce). 5.3 Dosage de l'activité de la GT On peut mesurer l'activité de la GT à l'aide de méthodes radiochimiques, en utilisant en tant que substrats accepteurs soit de l'ovalbumine, une glycoprotéine qui expose seulement Glc N Ac en tant que site accepteur, soit du Glc N Ac libre Les extraits cellulaires (nombre de cellules correspondant à DO 578 = 1-2) sont dosés pendant 45 ou minutes à 37 C, dans 100 il de milieu d'incubation contenant 100 m M de tris-H Cl (p H 7,4), 50 n Ci d'UDP 14 C-Gal ( 325 m Ci/mmole), 80 nmoles d'UDP-Gal, 1 gmole de Mn C 12, 1 % de Triton X-100 et 1 mg d'ovalbumine ou 2 gmoles de Glc N Ac en tant qu'accepteur Dans le cas o l'on utilise un substrat accepteur de type glycoprotéine, on met fin à la réaction par précipitation à l'acide de la protéine et on détermine la quantité de 14 C-galactose incorporée dans l'ovalbumine par comptage de scintillations en milieu liquide lE G Berger et coll ( 1978) Eur J Biochem, 90, 213-222 l Lorsqu'on utilise du Glc N Ac en tant que substrat accepteur, on met fin à la réaction par addition de 0,4 ml d'eau glacée et on sépare l'UDP-14 C- galactose inutilisée des produits 4 C sur une colonne à anions échangés (AG Xl-8, Bio Rad) comme décrit lA S Masibay et P K Qasaba ( 1989), Proc Natl Acad Sci USA, 86, 5733-5737 l On effectue les dosages avec ou sans molécules acceptrices, pour déterminer le degré d'hydrolyse d'UDP-Gal par les nucleotides pyro- phosphatases Les résultats sont donnés dans le tableau 2. 36 - Tableau 2 Activité de la GT dans la souche de S cerevisiae BT 150 transformée par différents plasmides Activité spécifique de la GT (m U/mg de protéine) Haute teneur Faible teneur Plasmide Promoteur PHO 5 en Pl en P. p DP 34 _ p DPGTA 8 régulé par phosphate 0,1 0,6-1 p DPGTB 5 constitutif 0,6 n d) Non déterminé. L'activité GT de cultures que l'on a fait passer à des conditions inductibles (milieu minimal à faible teneur en Pi) est approximativement la même que l'activité de cul- tures en milieux minimaux exprimant la GT de façon constitu- tive (tableau 2) Comme on s'y attendait, on ne trouve aucune activité enzymatique dans les cellules transformées par le vecteur seul. Au cours du fractionnement, la majeure partie de l'activité GT ( 70-90 %, voir tableau 3) et la plus forte activité spécifique se trouvent toujours dans le culot obtenu par centrifugation à grande vitesse ( 20 000 g) L'ac- tivité de l'enzyme peut être accrue par l'addition de 1-2 % de Triton X100 au mélange de dosage enzymatique Ces deux faits suggèrent que la GT recombinante est liée à la mem- brane dans les cellules de levures, comme elle l'est dans les cellules He La. 37 - Tableau 3 Distribution de l'activité de la GT au cours du fractionnement de cellules BT 150/p DPGT 5 Activité GT cpm d'U Dp-14 C-Gal Fraction incorporé dans Glc N Ac % Extrait brut 19 400 Culot ( 400 g) 1 000 4,6 Culot ( 20 000 g) 15 800 72,5 Surnageant ( 20 000 g) 5 000 22,9 total: 21 800 100 Exemple 6 Purification de la GT recombinante Afin de libérer l'enzyme liée à la membrane, la frac- tion de culot, obtenue par centrifugation à 20 000 g, de cellules BT 150/p DPGTB 5 est traitée par 1 % (p/v) de Triton X-100 pendant 10 minutes à la température ambiante, et équilibrée avec 50 m M de tris-H Cl (p H 7,4), 25 m M de Mg C 12, 0,5 m M d'UMP et 1 % (p/v) de Triton X- 100 On filtre ( 0,2 Mm) le surnageant obtenu après centrifugation, puis on le fait passer dans une colonne de Glc N Ac-p-aminophényl- Sepharose lE G Berger et coll ( 1976), Experientia, 32, 690-691 l, avec un volume de lit de 5 ml, à un débit de 0,2 ml/min, à 4 C L'enzyme est éluée avec 50 m M de tris-H Cl (p H 7,4), 5 m M de Glc N Ac, 25 m M d'EDTA et 1 % de Triton X-100 Un seul pic d'activité enzymatique est élué dans 5 fractions (taille: 1 ml) Ces fractions sont réunies et dialysées contre 2 x 1 1 de tris-H Cl 50 m M (p H 7,4), 0,1 % de Triton X-100 La GT purifiée est enzymatiquement active. Exemple 7 Construction d'une cassette d'expression codant pour la GT soluble La galactosyltransférase exprimée dans une levure peut être sécrétée dans le milieu de culture si un promoteur de levure est fonctionnellement lié à une première séquence 38 - d'ADN codant pour la séquence signal du gène d'invertase de levure SUC 2 liée, dans le cadre de lecture adéquat, à un AD Nc codant pour la GT soluble. (a) Séquence partielle d'AD Nc de GT de cellules He La L'AD Nc de GT est excisé du plasmide p 4 AD 113 (exemple 1) par digestion par Eco RI On isole le fragment de 1,2 kb, contenant l'AD Nc complet de GT, puis on le fait digérer partiellement par Mvn I (Boehringer) en coupant la séquence de la GT aux positions 43, 55, 140 et 288 de la séquence de nucléotides représentée dans l'ID SEQ n 1 Lors de la digestion de 0, 2 gg du fragment Eco RI-Eco Ri par 0,75 U de Mvn I pendant 1 heure, l'AD Nc de GT n'est coupé qu'une fois à la position de nucléotide 134, pour donner un frag- ment Mvn I-Eco RI de 1,1 kb (b) Vecteur pour amplification dans E coli On fait digérer le plasmide p UC 18 (Pharmacia) par Bam HI et Eco RI dans le site de clonage multiple On traite ensuite le plasmide par de la phosphatase alcaline, comme décrit dans le manuel de Maniatis (voir plus haut), on le soumet à une électrophorèse en gel d'agarose, puis on l'isole du gel, sous forme d'un fragment d'ADN de 2,7 kb. (c) Promoteur PHO 5 (-173) constitutif et séquence signal SUC 2 On fait digérer par les enzymes de restriction Bam HI et Xho I le vecteur p 31/PHO 5 (-173)RIT (exemple 2) On isole un fragment Bam HI-Xho I de 0, 25 kb, comportant le promoteur PHO 5 (-173) constitutif et la séquence codante adjacente pour la séquence signal de l'invertase (ss inv) On recoupe ensuite le fragment à l'aide de Hga I (Bio Labs) La séquence de reconnaissance Hga I est sur le brin d'ADN antisens L'en- zyme de restriction coupe en amont de la séquence de recon- naissance, de telle façon que l'extrémité en gradin du brin antisens coïncide avec l'extrémité de la séquence codante de la séquence signal de l'invertase Le fragment d'ADN coupé par Bam HI et Hga I, de 0,24 kb, contient la séquence promo- trice PHO 5 (-173) constitutive liée à la séquence signal de 39 - l'invertase de levure. (d) Segment de raccord Le fragment (a) est lié au fragment (c) au moyen d'une séquence de raccord qui est préparée à partir de quan- tités équimolaires des oligonucléotides synthétiques (Microsynth) 5 'CTGCACTGGCTGGCCG 3 ' et 5 'CGGCCAGCCAG 3 ' pour le brin complémentaire Les oligonucléotides sont hybridés l'un à l'autre tout d'abord par chauffage à 95 C et ensuite lent refroidissement jusqu'à 20 C Le segment de raccord hybridé est conservé à l'état congelé. (e) Construction du plasmide ps GT Pour la ligature, le vecteur (b) linéarisé, le frag- ment (a) d'AD Nc de GT, le fragment (c) contenant le promo- teur et la séquence codant pour le peptide signal, et le segment de raccord (d) sont utilisés en un rapport molaire de 1:2:2:30-100 La ligature est effectuée dans 12 U 1 de tampon de ligase ltris-H Cl 66 m M (p H 7,5), dithioérythritol 1 m M, Mg C 12 5 m M, ATP 1 m M) pendant 18 heures à 16 C On utilise le mélange de ligature pour transformer des cel- lules compétentes de E coli souche DH 5 a, comme décrit plus haut On effectue des minipréparations de plasmide à partir de 24 transformants indépendants Les plasmides isolés sont caractérisés par analyse de restriction, à l'aide de quatre enzymes différentes (Bam HI, Pst I, Eco RI, Xho I, également en association) Un clone unique ayant le profil de restriction attendu est désigné par ps GT. La séquence correcte au niveau du site de fusion de la séquence codant pour le peptide signal de l'invertase, avec l'AD Nc codant pour la GT soluble, est confirmée pour le plasmide ps GT, au moyen du nécessaire de séquençage T 7 (Pharmacia) et de l'amorce 5 '-AGTCGAGGTTAGTATGGC-3 ' commen- çant à la position -77 dans le promoteur PH 05 (-173) consti- tutif. - Séquence Mvn I pour ADN': 5 ' AAA ATA Tct gca ctg gct ggc cg C GAC CTG AGC 3 ' 3 ' TTT TAT AGA CGT gac cga ccg gc G CAG GAC TCG 5 ' Protéine: Lys Ile Ser Ala J Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser 16 19 42 ss inv séquence de la GT site de coupure pour l'endopeptidase signal l> Les lettres minuscules représentent la séquence de rac- cord. La cassette d'expression pour la GT sécrétée, conte- nant le promoteur PH 05 (-173) constitutif, la séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'invertase et l'AD Nc par- tiel de GT provenant du plasmide ps GT, peut être excisée sous forme d'un fragment Sal I(Bam HI)-Eco RI de 1,35 kb La cassette d'expression est encore dépourvue des séquences terminatrices de PH 05, à ajouter dans l'étape suivante de clonage. Exemple 8 Construction du vecteur d'expression p DPGTS Pour la construction du vecteur d'expression pour la GT Soluble, on combine les fragments suivants: (a) Partie de vecteur Le plasmide p DP 34 est digéré et prétraité comme décrit dans l'exemple 3, ce qui donne un fragment de vecteur Sal I-extrémité franche de 11,8 kb. (b) Cassette d'expression On linéarise d'abord le plasmide ps GT par digestion par Sal I (dans le site de clonage multiple) et on le fait ensuite digérer partiellement par Eco RI On isole un frag- ment d'ADN de 1,35 kb, contenant le promoteur PH 05 (-173) constitutif, une séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'invertase de levure, et l'AD Nc partiel de GT. 41 - (c) Séquence terminatrice de PH 05 On isole la séquence terminatrice de PH 05 à partir du plasmide p 31 qui est construit à partir du plasmide p 30, comme décrit dans EP-100 561 Apres digestion par l'enzyme de restriction Hind III, les extrémités saillantes sont com- plétées par traitement par le fragment de Klenow de la poly- mérase, comme décrit plus haut On fait ensuite digérer le plasmide par Eco RI et on isole un fragment Eco RI-extrémité franche de 0,39 kb, comportant les séquences terminatrices de PH 05. On effectue comme décrit dans l'exemple 2 la ligature des fragments (a), (b) et (c) et la transformation de cel- lules compétentes de E coli souche DH 5 a A partir des transformants obtenus, on isole des plasmides et on les caractérise par analyse de restriction Le plasmide d'un clone comportant les fragments de restriction corrects est désigné par p DPGTS. Exemple 9 Expression de la GT soluble dans une levure Par analogie avec l'exemple 4, on utilise de l'ADN, purifié au Cs Cl, du vecteur d'expression p DPGTS, pour trans- former des souches BT 150 et H 449 de S cerevisiae On isole des transformants Ura+ et on les crible en ce qui concerne l'activité GT Dans chaque cas, un transformant est sélec- tionné et dénommé Saccharomyces cerevisiae BT 150/p DPGTS et Saccharomyces cerevisiae H 449/p DPGTS, respectivement En utilisant l'essai décrit dans l'exemple 5, on constate la présence d'activité GT dans les bouillons de culture des deux transformants. Exemple 10 Clonage de l'AD Nc de la sialyltransférase (ST) à partir de cellules Hep G 2 humaines On isole de l'AD Nc ST à partir de cellules Hep G 2 par CPR, par analogie avec l'AD Nc de GT La préparation d'AR Npoly(A)+ et la synthèse d'AD Nc premier brin sont effec- tuées comme décrit dans l'exemple 1 Pour la PCR, on utilise les amorces (Microsynth) énumérées dans le tableau 5. 42 - Tableau 5 Amorces pour PCR Correspondant à pb dans Amorce Séquence ( 5 ' à 31)1) l'AD Nc de ST 2) Pst I/Eco RI SI Al cgctgcagaattcaaa ATGAITCACACCAACCTGAAGAAAAAGT I 28 Bamn HI SIA 3 cgcg at CCTGTGCTTAGCAGTGAATGGTCCGGAAGCC 1228 1198 Les lettres majuscules représentent des séquences prove- nant de la ST, les lettres minuscules représentent des séquences supplémentaires comportant des sites pour enzymes de restriction (soulignées) Les codons codant pour "le départ" et "l'arrêt" de la synthèse de protéine sont indiqués en gras. 2) Séquence d'AD Nc de ST provenant du placenta humain ( 27) telle que publiée dans EMBL Data Bank (n de dépôt X 17247). On peut amplifier l'AD Nc de ST provenant de Hep G 2, sous forme d'un fragment d'ADN de 1,2 kb, en utilisant les amorces SI Al et SIA 3 La PCR est effectuée comme décrit pour l'AD Nc de GT, dans des conditions de cycle légèrement modi- fiées: 0,5 minute de dénaturation à 95 C, 1 minute secondes d'hybridation à 56 C et 1 minute 30 secondes d'extension à 72 C, pour un total de 25-35 cycles Dans le dernier cycle, l'extension d'amorce à 72 C est effectuée pendant 5 minutes. Après PCR, le fragment de 1,2 kb est digéré par les enzymes de restriction Bam HI et Pst I, analysé sur un gel d'agarose à 1,2 %, élué du gel et sous-cloné dans le vecteur p UC 18 Le sous-clone résultant est dénommé p SIA 2. 43 - Exemple 11 Construction de la cassette d'expression de ST constitutive Pour l'expression hétérologue constitutive, on liga- ture l'AD Nc de ST au fragment promoteur PH 05 (-173) constitu- tif et aux séquences terminatrices de PH 05. Le plasmide p SIA 2 est d'abord linéarisé par digestion par l'enzyme de restriction Bam HI, et ensuite digéré par- tiellement par Eco RI Etant donné que l'AD Nc de ST contient également un site de restriction interne pour l'enzyme Eco RI (à 144 pb), un fragment de 1,2 kb comportant l'AD Nc complet de ST (ID SEQ n 3) est créé par digestion partielle par Eco RI, à l'aide de 1 mg d'ADN et de 0, 25 U de Eco RI ( 1 heure, 37 C) Après électrophorèse en gel, on isole le fragment Eco RI-Bam HI de 1,2 kb, comprenant l'AD Nc complet de ST (ID SEQ n 3) Sur ce fragment d'ADN, le codon d'initia- tion "ATG" pour la traduction de la ST est localisé au voi- sinage du site de restriction Eco RI Trois adénosine phosphates (voir amorce SI Al pour PCR) fournissent un "A" à la pb position 12, qui se trouve dans la séquence consensus entourant l"'ATG" provenant de gènes fortement exprimés dans la levure lR Hamilton et coll ( 1987) Nucleic Acids Res, 14, 5125-5149 l Le codon d'arrêt "TAA" et 5 pb de la région non traduite en 3 ' du gêne sont suivis du site Bam HI. On ligature le fragment d'AD Nc de ST Eco RI-Bam HI de 1,2 kb au fragment Sal I-Eco RI de 0,45 kb, contenant le pro- moteur PH 05 (-173) constitutif lexemple 2 2 (b)l et une partie de vecteur Bam HI-Sal I de 3,5 kb, pour amplification dans E coli contenant la séquence terminatrice de PH 05 lvoir exemple 2 1, fragment (b)l La ligature et la transformation de E coli souche DH 5 a sont effectuées comme décrit dans l'exemple 2 1 Un clone présentant le profil de restriction attendu est désigné par p ST 2. Le vecteur p ST 2 comprend la cassette d'expression codant pour la ST de Hep G 2, sous contrôle du promoteur PH 05 (-173) constitutif, sous forme d'un fragment Sal I- 44 - Hind III de 2,0 kb, dénommé "fragment d'ADN (l C)". Exemple 12 Expression de la ST dans une levure On fait digérer par l'enzyme de restriction Bam HI le vecteur p DP 34 (voir EP-340 170) Onisole à l'aide de GENECLEAN le vecteur linéarisé et on complète les extrémités saillantes par traitement par le fragment de Klenow de la polymérase, comme décrit dans le manuel de Maniatis (voir plus haut) Au bout de 30 minutes, on met fin à la réaction par chauffage à 65 C pendant 20 minutes en présence de 10 m M d'EDTA Après précipitation à l'éthanol, on fait digérer le plasmide par Sal I et on le soumet à une électrophorèse en gel sur un gel d'agarose à 0,8 % Le vecteur p DP 34 coupé par Sal I-extrémité franche(Bam HI) est isolé à l'aide du néces- saire GENECLEAN, sous forme d'un fragment d'ADN de 11,8 kb. On fait digérer le plasmide p ST 2 par l'enzyme de restriction Hind III, et, par analogie avec la préparation de la partie de vecteur, on la complète au niveau du site Hind III par traitement par le fragment de Klenow de la poly- mérase On soumet le produit à une digestion par Sal I, pour obtenir un fragment Sal I-extrémité franche(Hind III) de 2,0 kb, comprenant la cassette d'expression de ST constitu- tive ( 2 C). On effectue comme décrit dans l'exemple 2 la ligature de 80 ng du vecteur p DP 34 avec 40 ng de fragment 2 C, et la transformation de cellules compétentes de la souche DH 5 a de E coli Un clone présentant le profil de restriction attendu est choisi et désigné par p DPST 5. Pour la transformation d'une levure, on prépare de l'ADN, purifié par Cs Cl, du vecteur d'expression p DPST 5, en suivant le mode opératoire classique donné dans le manuel de Maniatis (voir plus haut) Les souches BT 150 et H 449 de S cerevisiae sont transformées chacune à l'aide de 5 mg d'ADN plasmidique, selon la méthode de transformation à l'acétate de lithium (H Ito et coll, voir plus haut) Des transformants Ura+ sont sélectionnés et criblés en ce qui - concerne l'activité ST Un transformant positif est sélec- tionné dans chaque cas, et on les désigne par, respective- ment, Saccharomyces cerevisiae BT 150/p DPST 5 et Saccharomyces cerevisiae H 449/p DPST 5. Exemple 13 Activité enzymatique de la ST complète exprimée dans la levure 13.1 Préparation d'extraits cellulaires On cultive des cellules de Saccharomyces cerevisiae BT 150/p DPST 5 dans des conditions de sélection par l'uracile, en milieux minimaux pour levure, additionnés d'histidine et de leucine Des cellules en croissance exponentielle (à une DO 578 de 0,5) ou des cellules stationnaires sont recueillies par centrifugation, lavées une fois avec du tampon imidazole m M (p H 7,0) (tampon 1) puis remises en suspension dans du tampon 1, à une concentration correspondant à une DO 578 de 0,1-0,2 La lyse mécanique des cellules est effectuée par secouement énergique sur un mélangeur à vortex, avec des billes de verre ( 0,45 et 0,5 mm de diamètre) pendant 4 minutes, avec refroidissement intermittent. On peut mesurer l'activité ST dans les extraits bruts, en utilisant le dosage décrit ci-dessous. 13.2 Dosage de l'activité ST On peut déterminer l'activité ST en mesurant la quan- tité d'acide sialique radiomarqué qui est transférée de l'acide CMPsialique à un accepteur glycoprotéique Apres avoir mis fin à la réaction par précipitation à l'acide, on sépare le précipité par filtration au moyen de filtres à la fibre de verre (Whatman GFA), on le lave complètement avec de l'éthanol glacé, puis on détermine sa radioactivité par comptage de scintillations en milieu liquide lHesford et coll ( 1984), Glycoconjugate J, 1, 141-153 l On dose les extraits cellulaires pendant 45 minutes dans un mélange d'incubation contenant 37 g 1 d'extraits cellulaires corres- pondant à environ 0,5 mg de protéine; 3 gl de tampon imida- zole 50 m M (p H 7,0); 50 n M de CMP-acide N-acétylneuraminique aouanbas Ie ap gq Tm 1 aaxa,l Da AQ ap Tou Too suas Tque u T 2 q g E np g u Tp Qa B ua 9,TUI 92 xa,l anb aa Tu UI allae ap 'aue Uss Twu -U Ooai ap asuanbas Ul ap quomu ua adnoo uo Tq D Tasa 2 ap aui Lz -ua,l -suas Tque NGV,P u T 2 q al ans a Anoiq as I 6 H a D Uess Twu -uoosa ap aouanb 9 S wi (sqwbo IT) Ivb H awd 9 dnooaa aq Tnsua sa quau Saet; aq '(Aut ss) es U SAUT,T ap Ilue Bs souanbs o -e anod quupoo 's;usoaoepe sauepoo aouanbes -e qa j Tnqqtsuo D (úALI-)SO Hd ina;ouroad el quuqiodmoo q X SZ'o ap Io Xx-IH{u I que M 5 i U; un al OST uo a In(LT-)so Hd/Túd ns Da A al I OTX;a I Hu MS uo To Tqasaa ap sa I_ zue sal ed 6 aaag Tp q; T u O Z On S TE Ub TS aouanabgs a j F Tnf TF Suoo (ELI-)SO Hd anarouioad (o) SZ q X L'Z ap NGV,P uau 16 Swj un,p au Lao; snos 'la B np a OST,IT uo s Tnd 'asoa Eb E,p lab us asasoqdoaqoea I aun;auinos al uo '(qneq sn Id a TOA) S Tqe T Ue WN ap lanuuwm al suwp Taoap amuuoo 'au TTE Ile as Eqgdsoqd UT ap ed ap Tiseid al aq Tnsua aq Tea; u O - ald T;înui abeuolo ap aq FS al suep ( séquence signal de l'invertase de levure. (d) Segment de raccord On soude le fragment (a) au fragment (c) au moyen d'une séquence de raccord qui est préparée à partir de quan- tités équimolaires des oligonucléotides synthétiques 'CTGCAAAATTGCAAACCAAGG-3 ' et 5 '-AATTCCTTGGTTTGCAATTT-3 ' pour le brin complémentaire Les oliginucléotides sont hybridés l'un à l'autre d'abord par chauffage à 95 C et ensuite lent refroidissement jusqu'à 20 C Le segment de raccord hybridé est conservé à l'état congelé. (e) Construction du plasmide ps ST Pour la ligature, on utilise le vecteur (b) linéa- risé, le fragment d'AD Nc de la ST (a), le fragment (c) con- tenant le promoteur et la séquence codant pour le peptide signal, et le segment de raccord (d), en un rapport molaire de 1:2:2:30-100 La ligature est effectuée pendant 18 heures à 16 C dans 12 gl de tampon de ligase I Tris-H Cl 66 m M (p H 7,5), dithioérythritol 1 m M, Mg C 12 5 m M, ATP 1 m Ml On utilise le mélange de ligature pour transformer des cel- lules compétentes de E coli souche DH 5 a, comme décrit plus haut On effectue des minipréparations de plasmide à partir de 24 transformants indépendants Un clone unique, présen- tant le profil de restriction attendu, après caractérisation par analyse de restriction à l'aide de quatre enzymes diffé- rentes (Bam HI, Pst I, Eco RI, Xho I, également en association) est dénommé ps ST. La séquence correcte au niveau du site de fusion de la séquence codant pour le peptide signal de l'invertase, avec l'AD Nc codant pour la ST(Lys 39-Cys 406) soluble est confirmée pour le plasmide ps ST au moyen du nécessaire de séquençage T 7 (Pharmacia) et de l'amorce 5 'ACGAGGTTAATGGC-3 ' partant de la position -77 dans le promoteur PHO 5 (-173) 48 - constitutif. Séquence pour ADN': 5 ' AAA ATA Tct gca aaa ttg caa acc aag g AA 3 ' 3 ' TTT TAT AGA GTG ttt aac gtt tgg ttc ctt 5 ' Protéine: Lys Ile Ser Alai Lys Leu Gln Thr Lys Glu 16 19 39 ss inv séquence de la ST site de coupure pour endopeptidase signal Les lettres minuscules représentent la séquence de rac- cord. La cassette d'expression pour la ST sécrétée, conte- nant le promoteur PH 05 (-173) constitutif, la séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'invertase et l'AD Nc de ST partiel provenant du plasmide ps ST, peut être excisée sous forme d'un fragment S Al I(Bam HI)-Eco RI de 1,35 kb La cas- sette d'expression est encore dépourvue des séquences termi- natrices de PH 05, à ajouter dans l'étape suivante de clonage. Exemple 15 Construction du vecteur d'expression p DPSTS Pour la construction du vecteur d'expression pour la ST(Ly 39-Cys 406) soluble, on combine les fragment suivants: (a) Partie de vecteur Le plasmide p D 34 est digéré et prétraité comme décrit dans l'exemple 3, ce qui donne un fragment vecteur Sal I- extrémité franche de 11,8 kb. (b) Cassette d'expression Le plasmide ps ST est d'abord linéarisé par digestion par Sal I (dans le site de clonage multiple) et ensuite par- tiellement digéré par Eco RI On isole un fragment d'ADN de 1,35 kb, contenant le promoteur PH 05 (-173) constitutif, une séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'invertase de levure, et l'AD Nc partiel de la ST. 49 - (c) Séquence terminatrice de PH 05 On isole la séquence terminatrice de PH 05 à partir du plasmide p 31 qui est construit à partir du plasmide p 30, comme décrit dans EP-100 561 Après digestion par l'enzyme de restriction Hind III, on complète les extrémités sail- lantes par traitement par le fragment de Klenow de la poly- mérase, comme décrit plus haut On fait ensuite digérer le plasmide par Eco RI et on isole un fragment Eco RI-extrémité franche de 0,39 kb comportant les séquences terminatrices de PH 05. On effectue comme décrit dans l'exemple 2 la ligature des fragments (a), (b) et (c) et la transformation de cel- lules compétentes de E coli souche DH 5 a A partir des transformants obtenus, on isole des plasmides et on les caractérise par analyse de restriction Le plasmide d'un clone comportant les fragments de restriction corrects est dénommé p DPSTS. Exemple 16 Expression de la ST soluble dans une levure Par analogie avec l'exemple 4, on utilise de l'ADN, purifié par Cs Cl, du vecteur d'expression p DPSTS, pour transformer les souches BT 150 et H 449 de S cerevisiae On isole des transformants Ura et les crible en ce qui con- cerne l'activité ST On sélectionne un transformant dans chaque cas, et ces transformants sont dénommés Saccharomyces cerevisiae BT 150/p DPSTS et Saccharomyces cerevisiae H 449/p DPSTS En utilisant l'essai décrit dans l'exemple 13, on constate la présence d'acticvité ST dans les bouillons de culture des deux transformants. Exemple 17 Construction d'une cassette d'expression pour la ST(Lys 27-Cys 406) soluble La ST soluble, dénommée ST(Lys 27-Cys 406) est une variante tronquée à l'extrémité N-terminale qui contient le domaine catalytique et toute la région de la tige, et con- siste en 380 aminoacides, à savoir les aminoacides 27 à 406 de la séquence d'aminoacides donnée dans l'ID SEQ n 3. - (a) Séquence d'AD Nc partielle de la ST de Hep G 2 On fait digérer le plasmide p SIA 2 par Eco RI et on isole un fragment Ec ORI-Eco RI de 1,1 kb (b) Vecteur pour amplification dans E coli On fait digérer par Bam HI et Eco RI le plasmide p UC 18 (Pharmacia) dans le site de clonage multiple Le plasmide est ensuite traité par de la phosphatase alcaline, comme décrit dans le manuel de Maniatis (voir plus haut), sousmis à une électrophorèse en gel d'agarose, puis isolé du gel sous forme d'un fragment d'ADN de 2,7 kb. (c) Promoteur PH 05 (-173) constitutif et séquence signal SUC 2 On fait digérer par les enzymes de restriction Bam HI et Xho I le vecteur p 31/PH 05 (-173)RIT (exemple 2) On isole un fragment Bam HI-Xho I de 0, 25 kb, comportant le promoteur PH 05 (-173) constitutif et la séquence codante adjacente pour la séquence signal de l'invertase (ss inv) Le fragment est ensuite recoupé par Hga I (Bio Labs) La séquence de recon- naissance Hga I se trouve sur le brin d'ADN antisens L'en- zyme de restriction coupe en amont de la séquence de recon- naissance, de telle manière que l'extrémité 5 en gradin du brin antisens coïncide avec l'extrémité de la séquence codante de la séquence signal de l'invertase Le fragment coupé par Bam HI et Hga I, de 0,24 kb, contient la séquence promotrice PH 05 (-173) constitutive liée à la séquence signal de l'invertase de levure. (d) Segment de raccord Le fragment (a) est soudé au fragment (c) au moyen d'une séquence de raccord qui est préparée à partir de quan- tités équimolaires des oligonucléotides synthétiques 5 '-CTGCAAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGG-3 ' *et '-AATTCCTTGTTGCAATTTAAAGGAATCATAGTAACTCCCTTTCTTCTTTTCCTT-3 ' pour le brin complémentaire Les oligonucléotides sont hybridés l'un à l'autre d'abord par chauffage à 95 C et ensuite lent refroidissement jusqu'à 20 C Le segment de 51 - raccord hybridé est conservé à l'état congelé. (e) Construction du plasmide ps T 1 Pour la ligature, on utilise le vecteur (b) linéa- risé, le fragment (a) d'AD Nc de la ST, le fragment (c) con- tenant le promoteur et la séquence codant pour le peptide signal, et le segment de raccord (d), en un rapport molaire de 1:2:2:30-100 On effectue la ligature pendant 18 heures, à 16 C, dans 12 l de tampon de ligase ltris-H Cl 66 m M (p H 7,5), dithioérythritol 1 m M, Mg Cl 2 5 m M, ATP 1 m M On utilise le mélange de ligature pour transformer des cellules compétentes de E coli souche DH 5 c comme décrit plus haut. On effectue des minipréparations de plasmide à partir de 24 transformants indépendants Un clone unique présentant le profil de restriction attendu, après caractérisation par analyse de restriction au moyen de quatre enzymes diffé- rentes (Bam HI, Pst I, Eco RI, Xho I, également en association) est dénommé ps ST 1. On confirme pour le plasmide ps ST 1 la séquence correcte au niveau du site de fusion de la séquence codant pour le peptide signal de l'invertase, comportant l'AD Nc codant pour la ST(Lys 27-Cys 406) soluble, en utilisant le nécessaire de séquençage T 7 (Pharmacia) et l'amorce '-AGTCGAGTAGTATGGC-3 ' commençant à la position -77 dans le promoteur PH 05 (-173) constitutif. Séquence pour ADN: 5 ' AAA ATA Tct gca aag gaa aag aag aaa ggg 3 ' 3 ' TTT TAT AGA GTG ttc ctt ttc ttc ttt ccc 5 ' Protéine: Lys Ile Ser Alai Lys Glu Lys Lys Lys Gly 16 19 27 ss inv séquence de la ST site de coupure pour endopeptidase signal Les lettres minuscules représentent la séquence de rac- cord. 52 - La cassette d'expression pour la ST(Lys 27-Cys 406) sécrétée, contenant le promoteur PH 05 (-173) constitutif, la séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'invertase, et l'AD Nc partielle de ST provenant du plasmide ps ST 1, peut être excisée sous forme d'un fragment Sal I(Bam HI)-Eco RI de 1,35 kb La cassette d'expression est encore dépourvue des séquences terminatrices de PH 05, à ajouter dans l'étape suivante de clonage. Exemple 18 Construction du vecteur d'expression p DPST 51 Pour la construction du vecteur d'expression pour la ST(Lys 27-Cys 406) soluble, on combine les fragments suivants: (a) Fragment vecteur Le plasmide p DP 34 est digéré et prétraité comme décrit dans l'exemple 3, pour donner un fragment vecteur Sal I-extrémité franche de 11,8 kb. (b) Cassette d'expression Le plasmide ps ST 1 est d'abord linéarisé par digestion par Sal I (dans le site de clonage multiple) et ensuite digestion partielle par Eco RI On isole un fragment d'ADN de 1,35 kb contenant le promoteur PH 05 (-173) constitutif, une séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'invertase de levure, et l'AD Nc partiel de ST. (c) Séquence terminatrice de PH 05 La séquence terminatrice de PH 05 est isolée à partir du plasmide p 31, qui est construit à partir du plasmide p 30, comme décrit dans EP-10 O 561 Après digestion par l'enzyme de restriction Hind III, on complète les extrémités sail- lantes par traitement par le fragment de Klenow de la poly- mérase, comme décrit plus haut On fait ensuite digérer le plasmide par Eco RI et on isole un fragment Eco RI-extrémité franche de 0,39 kb, comportant les séquences terminatrices de PH 05. On effectue comme décrit dans l'exemple 2 la ligature des fragments (a), (b) et (c) et la transformation de cel- lules compétentes de E coli souche DH 5 a A partir des 53 - transformants obtenus, on isole des plasmides et on les caractérise par analyse de restriction Le plasmide d'un clone comportant les fragments corrects de restriction est dénommé p DPST 51. Exemple 19 Expression de la ST(Lys 27-Cys 406) soluble dans une levure Par analogie avec l'exemple 4, on utilise l'ADN, purifié par Cs Cl, du vecteur d'expression p DPST 51, pour transformer les souches BT 50 et H 449 de S cerevisiae Les transformants Ura+ sont isolés et criblés en ce qui concerne l'activité de la ST On sélectionne un transformant dans chaque cas, et ceux-ci sont dénommés Saccharomyces cerevisiae BT 150/p DPST Sl et Saccharomyces cerevisiae H 449/p DPST 51 A l'aide de l'essai décrit dans l'exemple 13, on constate la présence de l'activité ST dans les bouillons de culture des deux transformants. Exemple 20 Clonage de l'AD Nc de FT à partir de la lignée cellulaire HL 60 humaine Sur la base de la séquence d'AD Nc publiée lS E Goelz et coll ( 1990) Cell, 63, 1349-1356 l pour la ELFT (fucosyl- transférase à ligand ELAM-1) codant pour l'a( 1-3)fucosyl- transférase, on synthétise les amorces oligonucléotidiques suivantes pour amplifier par la méthode PCR un fragment d'ADN englobant le cadre de lecture ouvert de l'AD Nc de ELFT: 5 '-CAGCGCTGCCTGTTCGCGCCAT-3 ' (ELFT-1 B) et '-GGAGATGCACAGTAGAGGATCA-3 ' (ELFT-2 B) ELFT-1 B amorce aux paires de bases 38-59 de la séquence publiée, et ELFT-2 B amorce aux paires de bases 1 347 1 346 de l'antisens On utilise les amorces pour amplifier un fragment de 1,3 kb, au moyen du nécessaire Taq polymérase Cetus Perkin-Elmer Le fragment est amplifié à partir d'AD Nc de HL 60 neuf, en pré- sence de 5 % de DMSO et 2 m M de Mg C 12, avec le cycle sui- vant: C, 5 minutes 25 x ( 1 minute à 95 C, 1 minute à 60 C, 1,5 minute à 72 C) 54 - x ( 1 minute à 95 C, 1 minute à 60 C, 1,5 minute + s/cycle à 72 C). L'électrophorèse en gel d'agarose révèle une bande princi- pale de 1,3 kb qui, une fois digérée par Sma I ou Apa I, donne la structure prédite par la séquence publiée La bande de 1,3 kb est purifiée au moyen d'un nécessaire GENECLEAN (Bio 101) et est sous-clonée dans le vecteur p CR 1000 (Invitrogen) Un clone unique comportant le segment d'inser- tion correct de 1,3 kb est sélectionné et dénommé BRB ELFT/p CR 1000- 13 L'AD Nc de FT est inséré dans le vecteur en orientation inversée par rapport au promoteur T 7 Le cadre de lecture ouvert de l'AD Nc de Ft a été complètement séquencé et est identique à la séquence publiée (ID SEQ n 5). Exemple 21 Construction de plasmides pour l'expression inductible et constitutive de la FT(Arg 62-Arg 405) soluble dans une levure La FT(Arg 62-Arg 405) soluble est exprimée à partir de l'AD Nc de FT partant de la position de nucleotide 241 (site de restriction Nru I) avec omission de la région N-terminale codant pour la queue cytoplasmique et le domaine de recou- vrement de la membrane (voir ID SEQ n 5). On fait digérer le plasmide BRB ELFT/p CR 100-13 par Hind III, qui coupe dans la région 3 ' de clonage multiple de l'élément d'insertion d'AD Nc de FT Les extrémités cohésives sont converties en extrémités franches dans une réaction avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase Des segments de liaison Xho I ( 5 '-CCTCGAGG-3 ', Bio Labs) sont soumis à la kinase, hybridés et ligaturés aux extrémités franches du plasmide, au moyen d'un excès de 100 M de segments de liai- son Les segments de liaison n'ayant pas réagi sont éliminés par précipitation à l'isopropanol de l'ADN, qui est encore digéré par Xho I et Nru I (coupure à la position de nucléo- tide 240 de l'AD Nc de FT, selon l'ID SEQ n 5) Le frag- ment (a) Nru I-Xho I de 1,1 kb contient la séquence d'AD Nc de - la FT dépourvue de la région codant pour la queue cyto- plasmique et le domaine de recouvrement de la membrane, allant jusqu'à l'aminoacide 61. On fait digérer chacun par Sal I et Xho I les plasmides p 31 RIT 12 et p 31/PHO 5 (-173)RIT (voir exemple 2) Les frag- ments de 0,9 kb et 0,5 kb, respectivement, sont isolés et coupés par Hga I Les extrémités cohésives résultantes sont complétées à l'aide du fragment de Klenow de l'ADN polymé- rase Les extrémités franches créées coïncident avec l'ex- trémité 3 ' de la séquence codante pour la séquence signal de l'invertase de levure La coupure subséquente par Bam HI libère un fragment (b) Bam HI-extrémité franche de 596 pb, qui comprend le promoteur PH 05 inductible et la séquence signal de l'invertase, avec son propre codon ATG, ou un fragment (c) Bam HI-extrémité franche de 234 pb, comperenant le court promoteur PH 05 (-173) constitutif et la séquence signal de l'invertase. Le plasmide p 3 l RIT 12 est linéarisé à l'aide de l'en- donucléase de restriction Sal I La digestion partielle par Hind III, en présence de bromure d'éthidium, donne un frag- ment Sal I-Hind III de 1 kb comprenant la séquence Sal I-Bam HI de p BR 322 de 276 pb, le promoteur de 534 pb de la phospha- tase acide PH 05 de la levure, la séquence signal de l'inver- tase de levure (codant pour 19 aminoacides) et le termina- teur de transcription de PH 05 Le fragment Sal I-Hind III de 1 kb de p 3 l RIT 12 est cloné dans le vecteur navette de levure-E coli p JDB 207 lJ D Beggs dans: Molecular Genetics in yeast (Génétique moléculaire chez la levure), Alfred Benzon Symposium 16, Copenhague, 1981, p 383- 389 l, qui a été coupé par Sal I et Hind III Le plasmide résultant, contenant l'élément d'insertion de 1 kb, est dénommé p JDB 207/PHO 5-RIT 12. On fait digérer le plasmide p JDB 207/PHO 5-RIT 12 par Bam HI et Xho I et on isole le grand fragment (d) Bam HI-Xho I de 6,8 kb Ce fragment contient l'ensemble des séquences du 56 - vecteur p JDB 207 et le terminateur de transcription de PH 05. En utilisant des conditions courantes pour ligature d'extrémités franches, on ligature le fragment (b) Bam HI- extrémité franche de 596 pb, le fragment (a) Nru I-Xho I de 1,1 kb et le fragment vecteur (d) Xho I-Bam HI de 6,8 kb On utilise des parties aliquotes du mélange de ligature pour transformer des cellules compétentes de E coli HB 101 On analyse par digestions de restriction l'ADN plasmidique provenant de colonies résistantes à l'ampicilline Un clone unique comportant le plasmide d'expression correct est dénommé p JDB 207/PHO 5-I-FT La ligature des fragments d'ADN (c), (a) et (d) conduit au plasmide d'expression p JDB 207/PHO 5 (-173)-I-FT Les cassettes d'expression de ces plasmides comprennent la séquence codante de la séquence signal de l'invertase, soudée, en cadre de lecture, à celle de l'x( 1-3)fucosyltransférase soluble qui est exprimée sous le contrôle du gène PH 05 inductible ou du promoteur PH 05 (-173) constitutif, respectivement Les cassettes d'ex- pression sont clonées dans le vecteur navette de levure- E coli p JDB 207, entre les sites de restriction Bam HI et Hind III La séquence de nucleotides au niveau du site de la fusion entre la séquence signal de l'invertase et l'AD Nc codant pour la FT soluble, est confirmée par séquençage d'ADN sur l'ADN plasmidique bicaténaire, au moyen de l'amorce 5 '-AGTCGAGGTTAGTATGGC-3 ' représentant la séquence nucléotidique aux positions -77 à -60 du PH 05, ainsi que du promoteur PH 05 (-173) La jonction correcte est la suivante: ' AAA ATA TCT GCA CGA CCG GTG 3 ' 3 ' TTT TAT AGA CGT GCT GGC CAC 5 ' Lys Ile Ser Ala Arg Pro Val 19 62 FT ss inv site de coupure pour peptidase signal 57 - Exemple 22 Construction de plasmides pour l'expression inductible et constitutive de la FT liée à la membrane dans la levure Ces constructions utilisent la séquence codante de l'AD Nc de FT, avec son propre codon ATG La séquence de nucléotides immédiatement en amont de l'ATG est toutefois plutôt défavorable pour l'expression dans la levure, en raison de sa forte teneur en G-C En utilisant des méthodes PCR, on a remplacé cette région par une séquence riche en A-T En même temps, un site de restriction Eco RI est intro- duit au niveau des nouvelles positions de nucleotides -4 à -9. Tableau 6 Amorces pour PCR Correspondant à pb Amorce Séquence ( 5 ' à 3 ')1) dans l'AD Nc de FT 1 % Fi T cgagaattcata ATGGGGGCACCGTGGGGC 58 à 75 FT 2 ccgctcqaq GAGCGCGGCTTCACCGCTCG 1285 à 1266 Les lettres majuscules représentent des nucléotides pro- venant de la FT, le lettres minuscules sont de nouvelles séquences supplémentaires; les sites de restriction sont soulignés; les codons d"'initiation" et d"'arrêt" sont indiqués en gras. On utilise des conditions normales de PCR pour ampli- fier l'AD Nc de FT avec les amorces F Tl et FT 2 (voir tableau 6) en 30 cycles de synthèse d'ADN (ADN polymérase Taq, Perkin-Elmer, 5 U/gl, 1 minute à 72 C), de dénaturation ( 10 secondes à 93 C) et d'hybridation ( 40 secondes à 60 C). Le fragment d'ADN de 1,25 kb résultant est purifié par extraction au phénol et précipitation à l'éthanol, puis digéré par Eco RI, Xho I et Nru I Le fragment (e) Eco RI-Nru I 58 - de 191 pb est isolé sur un gel d'agarose préparatif à 4 % Nusieve 3:1 (FMC Bio Products, Rockland, ME, USA) dans du tampon Tris-borate p H 8,3, élué du gel et précipité à l'éthanol Le fragment (e) comprend la partie 5 ' du gène de la FT codant pour les aminoacides 1 à 61 L'ADN a une exten- sion en 5 ' avec le site Eco RI, comme dans l'amorce FT 1 pour PCR. On fait digérer chacun par Eco RI et Xho I les plas- mides p 31 RIT 12 et p 31/PHO 5 (-173)RIT Les grands fragments vecteurs (f et g, respectivement) sont isolés sur un gel d'agarose préparatif à 0,8 %, élués et purifiés Le frag- ment (f) Xho I-Eco RI de 4,1 kb comprend le vecteur dérivé de p BR 322, le promoteur PH 05 de 534 pb (site Eco RI en 3 ') et le terminateur de transcription de PH 05 de 131 pb (site Xho I en 5 ') Le fragment (g) Xho I-Eco RI de 3,7 kb ne diffère que par le court promoteur constitutif PH 05 (-173) de 172 pb (site Eco RI en 3 ') au lieu du promoteur PH 05 complet. On ligature le fragment (e) Eco RI-Nru I de 191 pb, le fragment (a) Nru I-Xho I de 1,1 kb et le fragment (f) Xho I- Eco RI de 4,1 kb On utilise une partie aliquote de 1 il du mélange de ligature pour transformer des cellules compé- tentes de E coli HB 101 On analyse l'ADN plasmidique prove- nant de colonies résistantes à l'ampicilline L'ADN plasmi- dique provenant d'un seul clone est dénommé p 3 l R/PHO 5-ss FT. La ligature des fragments d'ADN (e), (a) et (g) con- duit au plasmide p 31 R/PHO 5 (-173)-ss FT Ces plasmides com- prennent la séquence codante de la FT liée à la membrane, sous le contrôle du gène PH 05 inductible ou du promoteur PH 05 (-173) constitutif, respectivement. Exemple 23 Clonage des cassettes d'expression de la FT dans p DP 34 Les plasmides p 3 l R/PHO 5-ss FT et p 3 l R/PHO 5 (-173)-ss FT sont digérés par Hind III, qui coupe en 3 ' du terminateur de transcription de PH 05 Après une réaction avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase, on fait digérer l'ADN par 59 - Sal I On isole les fragments Sal I-extrémité franche de 2,3 kb et 1,9 kb, respectivement. On fait digérer partiellement les plasmides p JDB 207/PHO 5-I-FT et p JDB 207/PHO 5 (-173)-I-Ft par Hind III en présence de 0,1 mg/ml de bromure d'éthidium (pour éviter la coupure en un site Hind III supplémentaire dans la séquence signal de l'invertase) et on les traite ensuite par le frag- ment de Klenow de l'ADN polymérase et Sal I, comme ci-dessus. On isole les fragments de 2,1 kb et 1,8 kb, respectivement. Les quatre fragments d'ADN sont ligaturés chacun au fragment vecteur Sal I-extrémité franche de 11,8 kb de p DP 34 (voir exemple 3) Après transformation de cellules compé- tentes de E coli HB 101 et analyse de l'ADN plasmidique de transformants individuels, quatre plasmides d'expression corrects sont dénommés p DP 34/PHO 5-I-FT; p DP 34/PHO 5 (-173)-I-FT; p DP 34 R/PHO 5- ss FT et p DP 34 R/PH 05 (-173)-ss FT. On transforme les souches BT 150 et H 449 de S cerevisiae au moyen de 5 gg chaque des quatre plasmides d'expression (ci-dessus) selon l'exemple 4 Des colonies de levures transformées individuelles sont sélectionnées et reçoivent les dénominations suivantes: Saccharomyces cerevisiae BT 150/p DP 34/PHO 5-I-FT; " " BT 150/p DP 34/PHO 5 (-173)-I-FT; BT 150/p DP 34 R/PHO 5-ss FT; " " BT 150/p DP 34 R/PHO 5 (-173)-ss FT; "' " H 449/p DP 34/PHO 5-I-FT; " " H 449/p DP 34/PHO 5-(-173)-I-FT; " " H 449/p DP 34 R/PHO 5-ss FT; " H 449/p DP 34 R/PHO 5 (-173)-ss FT. On effectue comme dans l'exemple 5 la fermentation et la préparation des extraits cellulaires En utilisant un essai analogue à celui décrit par Goelz et coll (voir plus haut), on constate la présence d'activité FT dans les extraits bruts préparés à partir des souches - BT 150/p DP 34 R/PHO 5-ss FT, BT 150/p DP 34 R/PHO 5 (-173)-ss FT, H 449/p DP 34 R/PHO 5-ss FT et H 449/p DP 34 R/PH 05 (-173)-ss FT et dans le bouillon de culture des souches H 449/p DP 34/PHO 5-I-FT, H 449/p DP 34/PH 05 (- 173)-I-FT, BT 150/p DP 34/PH 05-I-FT et BT 150/p DP 34/PHO 5 (-173)-I- FT. Dépôts de micro-organismes Les souches suivantes de micro-organismes ont été déposées à la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 16, D-3300 Braunschweig (dates de dépôt et numéros donnés ci-après): Escherichia coli JM 109/p DP 34: 14 mars 1988; DSM 4473 Escherichia coli HB 101/p 30: 23 octobre 1987; DSM 4297 Escherichia coli HB 101/p 31 R: 19 décembre 1988; DSM 5116 Saccharomyces cerevisiae H 449: 18 février 1988; DSM 4413 Saccharomyces cerevisiae BT 150: 23 mai 1991; DSM 6530. 61 - Annexes Identification des séquences ID SEQ n 1 Type de séquence: nucléotide avec protéine correspondante Longueur de la séquence: 1 265 pb5 Nombre de brins: bicaténaire Topologie: linéaire Type de molécule: recombinante Source expérimentale directe: plasmide p 4 AD 113 de E coli DH 5 a/p 4 AD 113 Caractéristiques: de 6 à 1 200 pb Séquence d'AD Nc codant pour la galactosyltransférase de cellules He La de 1 à 6 pb site Eco RI de 497 à 504 pb site Not I de 1 227 à 1 232 pb site Eco RI de 1 236 à 1 241 pb site Eco RV de 1 243 à 1 248 pb site Bgl II Propriétés: fragment Eco RI-Hind III provenant du plasmide p 4 AD 113 com- prenant l'AD Nc de cellules He La codant pour la galactosyl- transférase complète (EC 2 4 1 22). GAATTC ATG AGG CTT CGG GAG CCG CTC CTG AGC GGC AGC Met Arg Leu Arg Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser 10 GCC GCG ATG CCA GGC GCG TCC CTA CAG CGG GCC TGC CGC Ala Ala Met Pro Gly Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg 20 CTG CTC GTG GCC GTC TGC GCT CTG CAC CTT GGC GTC ACC Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu His Leu Gly Val Thr 30 35 CTC GTT TAC TAC CTG GCT GGC CGC GAC CTG AGC CGC CTG Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser Arg Leu 45 50 62 - CAA CTG GTC GGA GTC TCC Gln Leu Val Gly Val Ser AAC AGT GCC GCC GCC ATC Asn Ser Ala Ala Ala Ile 70 CGG ACC GGA GGG GCC CGG Arg Thr Gly Gly Ala Arg TCC TCC CAG CCG CGC CCG Ser Ser Gln Pro Arg Pro GTG GAT TCT GGC CCT GGC Val Asp Ser Gly Pro Gly GTC CCA GTG CCC CAC ACC Val Pro Val Pro His Thr TGC CCT GAG GAG TCC CCG Cys Pro Glu Glu Ser Pro 135 ACA CCG CTG CAG GGC GGC Thr Pro Leu Gln Gly Gly GGG CAG TCC TCC GGG GAG Gly Gln Ser Ser Gly Glu CCG CCG CCT CCT CTA GGC Pro Pro Pro Pro Leu Gly GGT GGC GAC TCC AGC CCA Gly Gly Asp Ser Ser Pro CCC GCT AGC AAC TTG ACC Pro Ala Ser Asn Leu Thr 115 ACC GCA CTG TCG CTG CCC Thr Ala Leu Ser Leu Pro CTG CTT GTG GGC CCC ATG Leu Leu Val Gly Pro Met CTG ATT GAG TTT AAC ATG CCT GTG GAC CTG GAG CTC GTG Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val 150 AAG CAG AAC CCA AAT GTG AAG ATG GGC GGC CGC TAT Lys Gln Asn Pro Asn Val Lys Mer Gly Gly Arg Tyr 165 CCC Pro TCG Ser CTC Leu GCC Ala GTC Val TCG Ser GCC Ala GCA Ala 63 - GCC CCC AGG GAC TGC GTC TCT CCT CAC Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro His 175 ATC ATT CCA TTC CGC AAC CGG CAG GAG Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu TGG CTA TAT TAT TTG CAC CCA GTC CTG Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu 200 CTG GAC TAT GGC ATC TAT GTT ATC AAC Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn 210 215 ACT ATA TTC AAT CGT GCT AAG CTC CTC Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu 220 225 CAA GAA GCC TTG AAG GAC TAT GAC TAC Gln Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp Tyr 235 240 TTT AGT GAC GTG GAC CTC ATT CCA ATG Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met GCG TAC AGG TGT TTT TCA CAG CCA CGG Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg 260 265 GCA ATG GAT AAG TTT GGA TTC AGC CTA Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu 275 280 CAC ATT His Ile TCC GTT Ser Val CCT TAT GTT CAG Pro Tyr Val Gln AAG GTG Lys Val CAC CTC His Leu CAG CGC Gln Arg CAG GCG Gln Ala AAT GTT Asn Val ACC TGC Thr Cys AAT GAC Asn Asp GCC Ala AAG Lys CAG Gln GGA Gly GGC Gly TTT Phe CAT His ATC Ile TAC Tyr CAG Gln GAC Asp TTT Phe GTG Val AAT Asn 64 - TAT TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA AGT AAA CAA CAG TTT 897 Tyr Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe 285 290 295 CTA ACC ATC AAT GGA TTT CCT AAT AAT TAT TGG GGC TGG 936 Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp 300 305 310 GGA GGA GAA GAT GAT GAC ATT TTT AAC AGA TTA GTT TTT 975 Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe 315 320 AGA GGC ATG TCT ATA TCT CGC CCA AAT GCT GTG GTC GGG 1014 Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly 325 330 335 AGG TGT CGC ATG ATC CGC CAC TCA AGA GAC AAG AAA AAT 1053 Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn 340 345 GAA CCC AAT CCT CAG AGG TTT GAC CGA ATT GCA CAC ACA 1092 Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr 350 355 360 * AAG GAG ACA ATG CTC TCT GAT GGT TTG AAC TCA CTC ACC 1131 Lys Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr 365 370 375 TAC CAG GTG CTG GAT GTA CAG AGA TAC CCA TTG TAT ACC 1170 Tyr Gln Val Leu Asp Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr 380 385 CAA ATC ACA GTG GAC ATC GGG ACA CCG AGC TAGGACTTTT 1210 Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser 390 395 - GGTACAGGTA AAGACTGAAT TCATCGATAT CTAGATCTCG AGCTCGCGAA AGCTT 66 - ID SEQ n 2 Type de séquence: protéine Longueur de la séquence: 357 aminoacides Type de molécule: fragment C-terminal de la galactosyl- 5 transférase complète de cellules He La Propriétés: galactosyltransférase soluble (EC 2 4 1 22) provenant de cellules He La Gly Arg Asp Leu Ser Arg Leu Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gln Gly Gly Ser Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Thr Gly Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ser Gln Pro Arg Pro Gly Gly Asp Ser Ser Pro Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser Asn Leu Thr Ser Val Pro Val Pro His Ala Cys Pro Glu Glu Ser Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro Pro Leu Leu Val Gly Pro Met Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Gln Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Leu Ala Pro Gln Leu Arg Glu Ala Ser Ala Lys 67 - Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro His Lys Val Ala Ile 135 Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu His Leu Lys Tyr 145 150 Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg Gln Gln 160 165 Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Asp 175 Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe 185 190 Gln Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val 200 Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp His Asn 205 210 215 Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile Ser Val 220 225 230 Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln 235 240 Tyr Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe 245 250 255 Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp 260 265 Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe 270 275 280 68 - Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gln Val Leu Asp Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser 69 - ID SEQ n 3 Type de séquence: nucléotide avec protéine correspondante Longueur de la séquence: 1 246 pb Nombre de brins: bicaténaire Topologie: linéaire Type de molécule: recombinante Source expérimentale directe: plasmide p SIA 2 de E coli DH 5 a/p SIA 2 Caractéristiques: de 15 à 1 232 pb séquence d'AD Nc codant pour la sialyl- transférase de cellules Hep G 2 de 1 à 6 pb site Pst I de 6 à 11 pb site Eco RI de 144 à 149 pb site Eco RI de 1 241 à 1 246 pb site Bam HI Propriétés: fragment Pst I-Bam HI provenant du plasmide p SIA 2 comprenant l'AD Nc de Hep G 2 codant pour la sialyltransférase complète (EC 2 4 99 1) CTGCAGAATT CAAA ATG ATT CAC ACC AAC CTG AAG AAA Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys AAG TTC AGC TGC TGC GTC CTG GTC TTT CTT CTG TTT GCA Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val Phe Leu Leu Phe Ala 15 20 GTC ATC TGT GTG TGG AAG GAA AAG AAG AAA GGG AGT TAC Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly Ser Tyr 30 TAT GAT TCC TTT AAA TTG CAA ACC AAG GAA TTC CAG GTG Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gln Thr Lys Glu Phe Gln Val 40 45 - TTA AAG AGT CTG GGG AAA TTG GCC ATG GGG Leu Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly 55 CAG TCT GTA TCC TCA AGC AGC ACC CAG GAC Gln Ser Val Ser Ser Ser Ser Thr Gln Asp 70 GGC CGC CAG ACC CTC GGC AGT CTC AGA GGC Gly Arg Gln Thr Leu Gly Ser Leu Arg Gly 80 GCC AAA CCA GAG GCC TCC TTC CAG GTG TGG Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gln Val Trp 95 AGC TCT TCC AAA AAC CTT ATC CCT AGG CTG Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu 105 TGG AAG AAT TAC CTA AGC ATG AAC AAG TAC Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr 120 TAC AAG GGG CCA GGA CCA GGC ATC AAG TTC Tyr Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe 135 GCC CTG CGC TGC CAC CTC CGG GAC CAT GTG Ala Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His Val 145 TCT GAT TCC Ser Asp Ser CCC CAC AGG Pro His Arg CTA GCC AAG Leu Ala Lys AAC AAG GAC Asn Lys Asp CAA AAG ATC Gln Lys Ile AAA GTG TCC Lys Val Ser AGT GCA GAG Ser Ala Glu AAT GTA TCC Asn Val Ser ATG GTA GAG GTC ACA GAT TTT CCC TTC AAT ACC TCT GAA Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe Asn Thr Ser Glu 160 71 - TGG GAG GGT TAT CTG CCC AAG GAG AGC ATT AGG ACC AAG 545 Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr Lys 170 175 GCT GGG CCT TGG GGC AGG TGT GCT GTT GTG TCG TCA GCG 584 Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala 185 190 GGA TCT CTG AAG TCC TCC CAA CTA GGC AGA GAA ATC GAT 623 Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile Asp 200 GAT CAT GAC GCA GTC CTG AGG TTT AAT GGG GCA CCC ACA 662 Asp His Asp Ala Val Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr 205 210 215 GCC AAC TTC CAA CAA GAT GTG GGC ACA AAA ACT ACC ATT 701 Ala Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly Thr Lys Thr Thr Ile 220 225 CGC CTG ATG AAC TCT CAG TTG GTT ACC ACA GAG AAG CGC 740 Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu Lys Arg 230 235 240 TTC CTC AAA GAC AGT TTG TAC AAT GAA GGA ATC CTA ATT 779 Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile 245 250 255 GTA TGG GAC CCA TCT GTA TAC CAC TCA GAT ATC CCA AAG 818 Val Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys 260 265 TGG TAC CAG AAT CCG GAT TAT AAT TTC TTT AAC AAC TAC 857 Trp Tyr Gln Asn Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr 270 275 280 72 - AAG ACT TAT CGT AAG CTG CAC CCC Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His Pro ATC CTC AAG CCC CAG ATG CCT TGG Ile Leu Lys Pro Gin Met Pro Trp 295 300 CTT CAA GAA ATC TCC CCA GAA GAG Leu Gln Glu Ile Ser Pro Glu Glu 310 315 CCA TCC TCT GGG ATG CTT GGT ATC Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile CTG TGT GAC CAG GTG GAT ATT TAT Leu Cys Asp Gln Val Asp Ile Tyr 335 340 AAG CGC AAG ACT GAC GTG TGC TAC Lys Arg Lys Thr Asp Val Cys Tyr TTC GAT AGT GCC TGC ACG ATG GGT Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly 360 365 CTC TAT GAG AAG AAT TTG GTG AAG Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys 375 380 ACA GAT GAG GAC ATC TAC CTG CTT Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu AAT Asn GAG Glu ATT Ile ATC Ile GAG Glu TAC Tyr GCC Ala CAT His GGA Gly CAG CCC TTT TAC Gln Pro Phe Tyr CTA TGG GAC ATT Leu Trp Asp Ile CAG CCA AAC CCC Gln Pro Asn Pro ATC ATG ATG ACG Ile Met Met Thr TTC CTC CCA TCC Phe Leu Pro Ser TAC CAG AAG TTC Tyr Gin Lys Phe TAC CAC CCG CTG Tyr His Pro Leu CTC AAC CAG GGC Leu Asn Gln Gly AAA GCC ACA CTG Lys Ala Thr Leu 73 - CCT GGC TTC CGG ACC ATT CAC TGC TAAGCACAGG ATCC Pro Gly Phe Arg Thr Ile His Cys 400 405 74 - ID SEQ n 4 Type de séquence: protéine Longueur de la séquence: 368 aminoacides Type de molécule: fragment C-terminal de la sialyl-5 transférase complète Propriétés: sialyltransférase soluble (EC 2 4 99 1) prove- nant de cellules Hep G 2 humaines Lys Leu Gln Thr Leu Lys Ser Lys Glu Leu Gly Lys Phe Gln Val Leu Ala Met Gly Gln Ser Val Ser Ser Ser Ser Thr Gln Asp Pro His Gly Arg Gln Thr Leu Gly Ser Leu Arg Gly Leu Ala Lys Ala Lys Pro Ser Ser Ser Trp Lys Asn Tyr Lys Gly Ala Leu Arg Cys Met Val Glu Glu Ala Ser Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Pro Gly Pro His Leu Val Thr Asp Phe Gln Val Trp Ile Pro Arg Leu Met Asn Lys Tyr Gly Ile Lys Phe - Arg Asp His Val Phe Pro Phe Asn Asn Lys Asp Gln Lys Ile Lys Val Ser Ser Ala Glu Asn Val Ser Thr Ser Glu Ser Asp Ser Arg Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys 145 Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gln Asp His Asp Ala Val Leu Arg Ala Asn Phe Gln Gln Asp Val 185 Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr 205 210 Val Trp Asp Pro Ser Val Tyr Glu Ser Ile Arg Thr Lys Ala Val Val Ser Ser Ala Leu Gly Arg Glu Ile Asp Phe Asn Gly Ala Pro Thr Gly Thr Lys Thr Thr Ile Val Thr Thr Glu Lys Arg Asn Glu Gly Ile Leu His Ser Trp Tyr Gln Asn Pro Asp Tyr Asn Phe Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His Pro Asn 245 250 Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Leu Gln Glu Ile Ser Pro Glu 270 275 Trp Glu Asp Ile Pro Phe Asn Asn Gln Pro Phe Ile Lys Tyr Tyr Leu Trp Asp Ile Glu Ile Gln Pro Asn Pro 76 - Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr Leu Cys Asp Gin Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val Cys Tyr Tyr Tyr Gin Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala Tyr His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gln Gly Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Pro Gly Phe Arg Thr Ile His Cys 77 - ID SEQ n 5 Type de séquence: séquence nucléotidique avec protéine cor- respondante Longueur de la séquence: 1 400 pb Nombre de brins: bicaténaire Topologie: linéaire Source expérimentale directe: BRB ELFT/p CR 1000-13 Caractéristiques: de 58 à 1 272 pb séquence d'AD Nc codant pour 1 'a( 1-3)- fucosyltransférase humaine de 238 à 243 pb site Nru I Propriétés: AD Nc de cellules HL 60 codant pour l'a( 1-3)- fucosyltransférase complète CGCTCCTCCA CGCCTGCGGA CGCGTGGCGA GCGGAGGCAG CGCTGCCTGT 50 TCGCGCC ATG GGG GCA CCG TGG GGC TCG CCG ACG GCG GCG 90 Met Gly Ala Pro Trp Gly Ser Pro Thr Ala Ala 10 GCG GGC GGG CGG CGC GGG TGG CGC CGA GGC CGG GGG CTG 129 Ala Gly Gly Arg Arg Gly Trp Arg Arg Gly Arg Gly Leu 15 20 CCA TGG ACC GTC TGT GTG CTG GCG GCC GCC GGC TTG ACG 168 Pro Trp Thr Val Cys Val Leu Ala Ala Ala Gly Leu Thr 25 30 35 TGT ACG GCG CTG ATC ACC TAC GCT TGC TGG GGG CAG CTG 207 Cys Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Ala Cys Trp Gly Gln Leu 40 45 50 CCG CCG CTG CCC TGG GCG TCG CCA ACC CCG TCG CGA CCG 246 Pro Pro Leu Pro Trp Ala Ser Pro Thr Pro Ser Arg Pro 55 60 78 - GTG GGC GTG CTG CTG TGG TGG GAG CCC TTC GGG GGG Val Gly Val Leu Leu Trp Trp Glu Pro Phe Gly Gly 70 75 GAT AGC GCC CCG AGG CCG CCC CCT GAC TGC Asp Ser Ala Pro Arg Pro Pro Pro Asp Cys 85 TTC AAC ATC AGC GGC TGC CGC CTG CTC ACC Phe Asn Ile Ser Gly Cys Arg Leu Leu Thr 95 TCC TAC GGA GAG GCT CAG GCC GTG CTT TTC Ser Tyr Gly Glu Ala Gln Ala Val Leu Phe 110 GAC CTC GTG AAG GGG CCC CCC GAC TGG CCC Asp Leu Val Lys Gly Pro Pro Asp Trp Pro 125 GGC ATC CAG GCG CAC ACT GCC GAG GAG GTG Gly Ile Gln Ala His Thr Ala Glu Glu Val 135 CGG Arg GAC Asp CAC His CCG Pro GAT Asp CTG Leu CGC Arg CAC His CCC Pro CTG Leu GTG TTG GAC TAC GAG GAG GCA GCG GCG GCG Val Leu Asp Tyr Glu Glu Ala Ala Ala Ala 150 CTG GCG ACC TCC AGC CCC AGG CCC CCG GGC Leu Ala Thr Ser Ser Pro Arg Pro Pro Gly 160 GTT TGG ATG AAC TTC GAG TCG CCC TCG CAC Val Trp Met Asn Phe Glu Ser Pro Ser His 175 GCA GAA GCC Ala Glu Ala CAG CGC TGG Gln Arg Trp TCC CCG GGG Ser Pro Gly CGC Arg CGC Arg GCG Ala CGC Arg TGG Trp CGC Arg 79 - CTG CGA AGC CTG GCA AGT AAC CTC TTC AAC TGG ACG CTC 636 Leu Arg Ser Leu Ala Ser Asn Leu Phe Asn Trp Thr Leu 190 TCC TAC CGG GCG GAC TCG GAC GTC TTT GTG CCT TAT GGC 675 Ser Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Val Phe Val Pro Tyr Gly 200 205 TAC CTC TAC CCC AGA AGC CAC CCC GGC GAC CCG CCC TCA 714 Tyr Leu Tyr Pro Arg Ser His Pro Gly Asp Pro Pro Ser 210 215 GGC CTG GCC CCG CCA CTG TCC AGG AAA CAG GGG CTG GTG 753 Gly Leu Ala Pro Pro Leu Ser Arg Lys Gln Gly Leu Val 220 225 230 * GCA TGG GTG GTG AGC CAC TGG GAC GAG CGC CAG GCC CGG 792 Ala Trp Val Val Ser His Trp Asp Glu Arg Gln Ala Arg 235 240 245 GTC CGC TAC TAC CAC CAA CTG AGC CAA CAT GTG ACC GTG 831 Val Arg Tyr Tyr His Gln Leu Ser Gln His Val Thr Val 250 255 GAC GTG TTC GGC CGG GGC GGG CCG GGG CAG CCG GTG CCC 870 Asp Val Phe Gly Arg Gly Gly Pro Gly Gln Pro Val Pro 260 265 270 GAA ATT GGG CTC CTG CAC ACA GTG GCC CGC TAC AAG TTC 909 Glu Ile Gly Leu Leu His Thr Val Ala Arg Tyr Lys Phe 275 280 TAC CTG GCT TTC GAG AAC TCG CAG CAC CTG GAT TAT ATC 948 Tyr Leu Ala Phe Glu Asn Ser Gln His Leu Asp Tyr Ile 285 290 295 - ACC GAG AAG CTC TGG CGC AAC GCG TTG Thr Glu Lys Leu Trp Arg Asn Ala Leu 300 305 GTG CCG GTG GTG CTG GGC CCA GAC CGT Val Pro Val Val Leu Gly Pro Asp Arg CGC TTT GTG CCC CGC GGC GCC TTC ATC Arg Phe Val Pro Arg Gly Ala Phe Ile 325 330 TTC CCA AGT GCC TCC TCC CTG GCC TCG Phe Pro Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser 340 345 CTC GAC CGC AAC CCC GCG GTC TAT CGC Leu Asp Arg Asn Pro Ala Val Tyr Arg 350 355 TGG CGC CGG AGC TAC GCT GTC CAC ATC Trp Arg Arg Ser Tyr Ala Val His Ile 365 370 GAC GAG CCT TGG TGC CGG GTG TGC CAG Asp Glu Pro Trp Cys Arg Val Cys Gln GCT GGG GAC CGG CCC AAG AGC ATA CGG Ala Gly Asp Arg Pro Lys Ser Ile Arg 390 395 CTC Leu GCC Ala CAC His TAC Tyr CGC Arg ACC Thr GCT GGG GCG Ala Gly Ala AAC TAC GAG Asn Tyr Glu GTG GAC GAC Val Asp Asp CTG CTT TTC Leu Leu Phe TAC TTC CAC Tyr Phe His TCC TTC TGG Ser Phe Trp GCT GTA CAG AGG Ala Val Gln Arg AAC TTG GCC AGC Asn Leu Ala Ser TGG TTC GAG CGG TGAAGCCGCG CTCCCCTGGA AGCGACCCAG Trp Phe Glu Arg 81 - GGGAGGCCAA GTTGTCAGCT TTTTGATCCT CTACTGTGCA TCTCCTTGAC 1352 TGCCGCATCA TGGGAGTAAG TTCTTCAAAC ACCCATTTTT GCTCTATG 1400 Les souches mentionnées dans la description ont été déposées-au nom de CIBA-GEIGY AG auprès de Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen Mascheroder Weg 1 b D 3300 Braunschweig REFERENCE 1 ) HB 101/p 30 2 ) H 449 3 ) JM 109/p DP 34 4 ) HB 101/p 31 R ) 5/ BT 150 DATE DE DEPOT 23 octobre 1987 18 février 1988 14 mars 1988 19 décembre 1988 23 mai 1991 N DE DEPOT DSM 4297 DSM 4413 DSM 4473 DSM 5116 DSM 6530 82 - REVENDICATIONS 1 Procédé pour la production d'une glycosyl- transférase mammalienne liée à la membrane, choisie parmi une galactosyltransférase, une sialyltransférase et une fucosyltransférase ou une variante de celles-ci, respective- ment, comprenant la culture d'une souche de levure qui a été transformée par un vecteur hybride comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur et une séquence d'ADN codant pour ladite glycosyltransférase ou variante, lequel ADN est contrôlé par ledit promoteur, et la récupération de l'activité enzymatique. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la glycosyltransférase est d'origine humaine. 3 Procédé pour la production d'une variante selon la revendication 1, caractérisé en ce que la variante dif- fère de la glycosyltransférase complète correspondante par l'absence de la queue cytoplasmique, du domaine d'ancrage- signal et, éventuellement, d'une partie mineure de la région de la tige. 4 Procédé pour la production d'une variante selon la revendication 3, comprenant la culture d'une souche de levure comprenant une cassette d'expression comprenant un promoteur fonctionnellement lié à une première séquence d'ADN codant pour un peptide signal, liée dans le cadre de lecture adéquat à une seconde séquence d'ADN codant pour ladite variante, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur, et la récupération de l'activité enzyma- tique. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la glycosyltransférase est une galactosyltransférase. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la galactosyltransférase est choisie parmi l'UDP- galactose: -galactoside-a ( 1-3)-galactosyltransférase (EC 2 4 1 151) et l'UDP-galactose: -N-acétylglucosamine- 1 ( 1-4)-galactosyltransférase (EC 2 4 1 22). 83 - 7 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la galactosyltransférase comporte la séquence d'aminoacides représentée dans l'ID SEQ n 1. 8 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la galactosyltransférase comporte la séquence d'aminoacides représentée dans l'ID SEQ n 2. 9 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la glycosyltransférase est une sialyltransférase. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la sialyltransférase est la CMP-Neu Ac:p-galactoside- "( 2-6)-sialyltransférase (EC 2 4 99 1). 11 Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la sialyltransférase comporte la séquence d'amino- acides représentée dans l'ID SEQ n 3. 12 Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la sialyltransférase est désignée par ST(Lys 27-Cys 406) et consiste en les aminoacides 27 à 406 de la séquence d'aminoacides énumérée dans l'ID SEQ n 3. 13 Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la sialyltransférase comporte la séquence d'amino- acides représentée dans l'ID SEQ n 4. 14 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la glycosyltransférase est une fucosyltransférase. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la fucosyltransférase est choisie parmi la GDP-fucose: -galactoside ( 1-2)fucosyltransférase (EC 2 4 1 69) et la GDP-fucose:N-acétylglucosamine-a ( 1-3/4) - fucosyltransférase (EC 2 4 1 65). 16 Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la fucosyltransférase comporte la séquence d'aminoacides représentée dans l'ID SEQ n 5. 17 Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la fucosyltransférase est désignée par FT(Arg 62-Arg 405) et consiste en les aminoacides 62 à 405 de la séquence d'aminoacides représentée dans i'ID SEQ n 5. 84 - 18 Vecteur hybride de levure comprenant une cas- sette d'expression comprenant un promoteur de levure et une séquence d'ADN codant pour une glycosyltransférase mamma- lienne liée à la membrane, choisie parmi une galactosyl- transférase, une sialyltransférase et une fucosyl- transférase, ou une variante de celles-ci, respectivement, laquelle séquence d'ADN est contrôlée par ledit promoteur. 19 Souche de levure qui a été transformée par un vecteur hybride selon la revendication 18.