FR 2685345 A1 19930625 FR 9115917 A 19911220 I La présente invention concerne un procédé de production d'acide anthranilique naturel et d'anthranilate de méthyle par emploi de mutants de Saccharomyces cerevlsiae et utilisation de ces mutants dans l'élaboration de boissons fermentées. L'anthranîlate de méthyle, molécule à haute valeur aromatl- que (note organoleptique "fleur d'oranger"), est un dérivé de l'acide anthranilique largement utilisé dans l'élaboration de certains arômes alimentaires L'industrie des arômes emploie 27 tonnes d'anthranilate de méthyle par an ( 1), mais aucune source naturelle de cette molécule n'est actuellement disponible Le seul procédé biotechnologique de production d'anthranilate de méthyle existant à ce jour consiste en une déméthylation microbiologique du N-méthylanthranilate de méthyle isolé de l'huile essentielle de mandarinier "petit grain" ( 2) Ce procédé est coûteux et les disponibilités d'anthranilate de méthyle ainsi préparé semblent limitées. Par ailleurs, la biosynthèse de dérivés anthraniliques a été observée dans des cultures de Poria cocos ( 3) et de Pycnoporus cinnabarînus ( 4) Cependant, aucun procédé de production basé sur ces basidiomycètes n'a été mis au point jusqu'à présent, compte tenu des très faibles rendements obtenus, de l'ordre du milligramme par millilitre. L'anthranilate de méthyle a été décelé également dans différents cépages de raisin de l'espèce Vitis labrusca (Niagara, Concord); à des concentrations de 0,5 3 mg/l, il serait responsable du goût foxé de certains vins américains ( 5). On a découvert, de façon surprenante, selon la présente invention, que l'on pouvait obtenir un rendement très élevé de production d'acide anthranilique (jusqu'à 500 mg/ml) par la fermentation avec un mutant de Saccharomyces cerevisiae. Plus précisément, le mutant selon l'invention est un mutant auxotrophe pour le tryptophane, bloqué dans l'étape catalysée par la 5-Pribosylanthranilate transférase et présentant une anthranilate synthase insensible à la rétroinhibition par le tryptophane. La présente invention est basée sur le fait que l'acide anthranilique est un intermédiaire de la voie de biosynthèse du tryptophane (fig 1); des mutants de Saccharomyces cerevisiae bloqués dans l'étape catalysée par la 5-P-ribosylanthranilate transférase (trp 4) accumulent et excrètent de l'acide anthranilique. Le flux métabolique sur la voie du tryptophane est régulé au niveau de l'anthranilate synthase, enzyme sensible à la rétroinhibition par le produit final de la voie, le tryptophane Un excès de cet acide aminé entraîne l'inhibition de l'anthranilate synthase et l'acide anthranilique, ainsi que tous les autres intermédiaires de la voie, n'est plus synthétisé Or, les mutants trp 4, étant auxotrophes pour le tryptophane, nécessitent précisément un apport de tryptophane exogène qui, à son tour, inhibe l'anthranilate synthase. Des mutants à anthranilate synthase insensible à l'inhibition par le tryptophane ont cependant été décrits Une souche susceptible d'accumuler de l'acide anthranilique selon l'invention doit donc porter la mutation trp 4 et, en même temps, posséder une anthranilate synthase insensible à l'inhibition par le tryptophane Des mutants de ce type représentent une source potentielle d'acide anthranilique naturel qui peut également servir à la préparation de l'anhranilate de méthyle selon l'invention. De préférence, la souche est une souche diploïde homozygote pour la mutation trp 4 et/ou l'insensibilisation de l'anthranilate synthase à l'inhibition par le tryptophane. La présente invention a donc également pour objet un procédé de production d'anthranilate de méthyle par estérification de l'acide anthranilique obtenu par le procédé selon l'invention, avec du méthanol naturel d'origine agricole. D'autre part, S cerevisiae étant considéré comme microorga- nisme GRAS (generally recognized as safe), des mutants de ce type peuvent être utilisés en vinification, en vue d'une production d'anthranllate de méthyle au cours de la fermentation Des vins ayant le goût foxe, caractéristique de certains vins américains très prisés, peuvent être ainsi obtenus, à partir de cépages autres que Niagara et Concord. La présente invention a donc aussi pour objet une boisson fermentée riche en acide anthranilique caractérisée en ce qu'elle a été fermentée par une souche mutante de Saccharomyces cerevisiae auxotrophe pour le tryptophane, bloqué dans l'étape catalysée par la 5-P-ribosylan- thranilate transférase et présentant une anthranilate synthase insensible à la rétroinhibition par le tryptophane. En particulier, la présente invention a pour objet une boisson fermentée au goût foxé notamment à base de raisin, pomme ou malt, l 10 caractérisée en ce qu'elle a été fermentée par une souche mutante de Saccharomyces cerevisiae conforme au procédé selon la présente invention. Les mutants selon l'invention peuvent être obtenus par tous moyens conventionnels biotechnologiques de mutagenèse et sélection de souches mutantes bien connus de l'homme de l'art en particulier. D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée d'un mode de réalisation qui va suivre. La figure 1 représente la voie de biosynthèse du tryptophane. La voie de biosynthèse du tryptophane et les relations gène - enzyme chez S cerevisiae Abréviations: PRA = 5-P-riboxylanthranilate CDRP = l'-( 0-carboxyphénylamino)-1 '-désoxyribulose 5 P; IGP = indolegly- cerol phosphate. 1 Construction d'une souche mutante selon l'invention 1.1 Plusieurs auxotrophes trp spontanés ont été isolés à partir de la souche de laboratoire FL 100 (sauvage, haploîde, de signe a) Parmil ces auxotrophes, l'un a été identifié comme trp 4 par des tests de complémentation et par analyse enzymatique (souche PR 250). 1.2 Parmi les descendants mélotiques d'une souche oenologique industriel- le, plusieurs clônes à anthranilate synthase insensibles à l'hinhibîtlon par le tryptophane ont été identifiés par la résistance au 5-méthyle- tryptophane et par la mesure in vitro de l'activité anthranîlate synthase en présence de tryptophane Le clône L 116-5 b a été retenu pour les étapes suivantes. 1.3 Le diploiïde PR 250 x L 116-5 b a été mis à sporuler et de nombreuses asques ont été disséquées Dans toutes les tétrades complètes, le caractère trp 4, ainsi que la résistance de l'antranilate synthase ségrègent 2: 2 et de manière indépendante Les clônes recombinants 9 (signe a) et 2 (signe alpha) ont servi à la construction du diploïde 2 x 9, qui a été utilisé par la suite dans toutes les expériences. 1.4 Dans les différentes étapes de cette procédure, les phénotypes des souches, et notamment l'excrétion d'acide anthranilique, sont révélés sur boîtes de Petri grâce à la fluorescence de l'acide anthranîlique en UV. 2 Production d'acide anthranilique sur différents milieux Des précultures sont effectuées en milieu YPG pendant 24 heures à 25 sous agitation ( 140 rpm) Les différents milieux de culture sont stérilisés à 120 pendant 20 mn (à l'exception du milieu R, qui est stérilisé par addition de 400 pl/l de diméthyle-dicarbonate) et inoculés avec 106 cpm Les cultures sont incubées 7 jours à 25 sous agitation ( 140 rpm) et l'acide anthranilique est dosé dans les milieux par CLHP (colonne RP 18 Merck, volume injecté 20 pl, température 25 , éluant H 20: acétonitrile 50: 50, détecteur UV-VIS X = 326 nm, débit 0,8 ml/mn) et par CPG après extraction au dichlorométhane (chromatographe HP 5880, colonne FFAP) La production d'acide anthranilique dans les différents milieux testés est présentée dans le tableau 1 pour le diploïde 2 x 9 en comparaison avec les souches parentales 2 et 9, étant bien entendu que les souches initiales FL 100 et la souche oenologique ne produisent de l'acide anthranilique sur aucun milieu. Les meilleures performances sont obtenues avec le diploïde 2 x 9, vraisemblablement par un effet de dosage génique, l'allèle trp 4 étant représenté en dose double. (A/A) %ú IOJ Oa DÀI '%,Z O '0 aueqdo 4 dÀal %Z 9 '0 sp TD ou Tuwe o/m aseq uaooa Tu jsea A-o J Deq o 96,Z aso Dnl S '%Zo'0 o aueqdodaj %Z 9 '0 spi D 2 o U Twe o/M Gs Pq u G Ooa Tu so Xsa-oo Dg (Og ZH 17 osi H l/S 'l G Olm O 4,ap Tp Toe 'aeons ap 1/2 561) UIS Tea ap snú %ú ll T W ap l Tleixx %Z'0 O g U Oa Al '%p Z PUITA ap Te 2:X 2 "I % 6 I ouoldadola 9,61 auao De %l 981 1 aa 4 xa 3 sa A lo Z 981 SZ ÀT îs ç Tç 98 ú O úQ 7 l-j S çZT 811 011 T 16 z Zi 8 1 N #9 Z #17 Z 161 A çz 19 95 J 3 d A 9 ú 5 ld A 61 171 El Dd A 6 X 6 Z na T' j W (I/2 iw) anb Tlu Tueq IuGPTDV at Dpno S J fl Vg-o V l stúE 99 Z ú : al OS : d I : : A : Z 2 d A : Xl Dd A : Dd A (A/A) % 6 ú Joueql (A/A) 96 { 10 o a DÀTD o,%oz so Dn ID OZ 3 Préparation de l'acide anthranilique et de l'anthranilate de méthyle L'acide anthranilique est préparé à partir de cultures de 7 jours du diploïde 2 X 9 en milieu S Dtr, par extraction avec 1,5 volumes d'acétate d'éthyle, suivie d'une évaporation à sec La préparation d'acide anthranilique ainsi obtenue est utilisée dans les essais d'estérification avec du méthanol: 100 mg d'acide anthranilique sont suspendus dans 20 ml de méthanol d'origine agricole En présence de catalyseur acide, le chauffage du milieu réactionel conduit à la formation d'anthranilate de méthyle caractérisé en CPG/MS conformément aux lois d'estérification bien connues. 4 Fermentation du jus de raisin avec la souche 2 X 9 Du jus de raisin frais contenant 195 g/l de sucre (acidité totale 4,5 g/l H 2 SO 4) est inoculé avec 108 cpm et incubé en stationnaire à 20 pendant 3 semaines En fin de fermentation, la totalité du sucre est épuisée et le taux d'alcool est d'environ 4 % Le produit fermenté présente une forte odeur d'anthranilate de méthyle, détectée sans ambiguiïté par analyse sensorielle et une quantité d'acide anthranilique de 150 mg/l. REFERENCES 1 Welsh et al ( 1989) Critical Reviews in Biotechnology 9, 105 2 Page et al ( 1989) Brevet international WO 89/00203 3 Berger et al ( 1987) Symp Bioflavors W rzburg, 415 4 Gross-Falconnier ( 1991) Thèse Paris-Sud, Orsay Miozzari et al ( 1978) J Bacteriol 134, 48 6 Nakahara et al ( 1945) Sci Papers Inst Phys Chem Res. (Tokyo) 42, 39. REVENDICATIONS 1 Procédé de production d'acide anthranilique naturel par fermentation, caractérisé en ce qu'on utilise pour la fermentation un mutant d'une souche de levure Saccharomyces cerevisiae auxotrophe pour le tryptophane, bloqué dans l'étape catalysée par la 5-P-ribosylanthranilate transférase et présentant une anthranilate synthase insensible à la rétroinhibition par le tryptophane. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche est une souche diploïde homozygote pour la mutation bloquant l'étape catalysée par la 5-P-ribosylanthranilate transférase et/ou la mutation insensibilisant l'anthranilate synthase à l'inhibition par le tryptophane. 3 Procédé de production d'anthranilate de méthyle par estérification de l'acide anthranilique obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, avec du méthanol naturel d'origine agricole. 4 Boisson fermentée riche en acide anthranilique caractérisée en ce qu'elle a été fermentée par une souche mutante de Saccharomyces cerevisiae auxotrophe pour le tryptophane, bloquée dans l'étape catalysée par la 5-P-ribosylanthranilate transférase et présentant une anthranilate synthase insensible à la rétroinhibition par le tryptophane. Boisson fermentée selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une boisson au goût foxé à base de raisin, pomme ou malt.