FR 2668163 A1 19920424 FR 9013145 A 19901018 La présente invention concerne un procédé de production de béta-cyclodextrine. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de production de béta-cyclodextrine qui comprend la réaction de la cyclodextrine-glycosyltransférase produite par le Bacillus ohbensis (FERM P 1990) (désigné ci-après par "enzyme B O ") avec de l'amidon, pour décomposer l'amidon et recueillir ensuite la béta-cyclodextrine formée (désignée ci-après par B-CD). La B-CD est une molécule cyclique bien connue, composée de 7 unités glucopyranoses liées en 1-4 Cette molécule présente une cavité centrale hydrophobe permettant la réalisation de composés d'inclusion avec des molécules hôtes Les liaisons mises en jeu sont de faible énergie: le phénomène d'inclusion est donc réversible. La B-CD trouve un champ d'application particulièrement intéressant notamment pour l'encapsulation d'arômes, vitamines, colorants, acides gras, principes actifs pharmaceutiques, pesticides et fongicides. Il est connu dans la technique de produire de la B-CD en utilisant l'enzyme B O Une nouvelle alpha-amylase, à savoir l'enzyme B O, a été pour la première fois décrite dans le brevet japonais 90415 En outre, ce brevet indique la préparation de béta- cyclodextrine et d'alpha-cyclodextrine (molécule cyclique composée de 6 unités cyclopyranoses liées en 1-4) par réaction de l'amidon liquéfié ou hydrolysé avec l'enzyme B.O. L'article intitulé "Determination of CG Tase from Bacillus ohbensis and its optimum p H using HPLC" paru dans le journal "Agricultural and Biological chemistry ( 49 ( 4), 1189 à 1191, 1985) enseigne que le p H optimal de l'enzyme B.O se situe à p H 5,5 Egalement, cet article précise que l'analyse par chromatographie liquide à haute pression (HPLC) permet de mesurer directement la quantité de cyclodextrine formée, et qu'en outre cette méthode d'analyse est la plus fiable. L'article intitulé "Comparative studies of CG Tases from Bacillus ohbensis, Bacillus macerans, Bacillus circulans and production of cyclodextrins using those CG Tases" paru dans le journal "J Jpn Soc Starch Sci " p 144 à 151 ( 1986) enseigne que: le p H optimum de l'enzyme B O se situe à p H 5,5; l'enzyme B O lorsqu'elle est amenée à réagir sur l'amidon liquide produit de la B-CD et de la gamma- cyclodextrine (molécule cyclique composée de 8 unités glucopyranoses liées en 1-4), à partir d'amidon liquéfié et d'enzyme B O, un rendement de 21,6 % en poids de B-CD est obtenu à p H variant entre 5 et 10. La demande de brevet européen 220719 décrit un procédé de préparation de cyclodextrine (d, B et Y) selon lequel on fait réagir l'amidon liquéfié avec l'enzyme B O à un p H de préférence compris entre 6,5 et 7,5. Les cyclodextrines formées sont extraites du milieu réactionnel par adsorption sur une résine insoluble dans l'eau et possédant un ligand de dimension telle qu'il puisse se loger dans la cavité centrale des cyclodextrines et ainsi réaliser des composés d'inclusion. Ce procédé permet de déplacer la réaction de formation des cyclodextrines tout en purifiant ces produits qui sont ensuite élués à l'eau chaude ou à l'aide d'un mélange d'eau et d'alcool: la concentration en cyclodextrines de ces solutions aqueuses n'excède pas 8 g/l. Un but de l'invention est de proposer un procédé de préparation de B-CD qui soit productif et relativement simple à mettre en oeuvre. De façon surprenante, pour atteindre ce but, on a trouvé un procédé de production de béta-cyclodextrine caractérisé en ce qu'on fait réagir de l'amidon avec la cyclodextrine-glycosyl-transférase produite par le Bacillus ohbensis (FERM P 1990), dans une solution aqueuse à p H compris entre 7,5 et 8,8 et en ce que la béta-cyclodextrine 3 produite est extraite du milieu réactionnel par ultrafiltration. Avantageusement, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre de façon continue. Ce procédé présente l'avantage de permettre la production de 1-CD avec un rendement par rapport à l'amidon mise en oeuvre élevé et voisin de 40 %, voire supérieur. L'une des caractéristiques principales de l'invention réside dans le fait que la réaction est effectuée à partir d'amidon "brut", c'est-à-dire non traité chimiquement, thermiquement ou à l'aide d'une enzyme telle qu'une - amylase En effet, contrairement aux procédés bien connus, grâce au procédé selon l'invention, l'amidon n'a pas besoin d'être traité (gélatinisé, liquéfié ou dextrinisé) préalablement à sa conversion enzymatique L'amidon "brut" utilisé peut se présenter sous forme pulvérulente ou sous la forme d'un lait d'amidon, c'est-à-dire d'une suspension aqueuse Quand l'amidon est sous forme pulvérulente, on choisit de préférence de l'amidon de granulométrie n'excédant pas p Sinon, on prévoit un système de protection du système d'ultrafiltration permettant d'éviter l'obstruction de ce dernier. N'importe quel amidon peut être utilisé A titre d'exemple on peut citer l'amidon de pomme de terre, l'amidon de maïs et l'amidon de blé De préférence, on utilise la fécule de pomme de terre Avantageusement, la concentration d'amidon dans le milieu réactionnel n'excède pas 15 % en poids, et de préférence encore elle est comprise entre 8 et 10 % en poids. Conformément au procédé selon l'invention, le p H du milieu réactionnel doit se situer entre 7,5 et 8,8 En deçà, il se produit une diminution importante du débit d'ultrafiltration qui provient du colmatage de la membrane35 d'ultrafiltration Par voie de conséquence, la productivité chute également. Les meilleurs rendements et productivités de B-CD ont été atteints avec un p H compris entre 8 et 8,5. Pour empêcher une inactivation prématurée de l'enzyme B.0, la température réactionnelle ne doit pas dépasser C, et on la maintient de préférence entre 55 et 60 C. De préférence, l'activité de l'enzyme B O dans le temps est stabilisée à l'aide de sels de calcium tels que le chlorure de calcium L'apport en calcium dans le milieu réactionnel peut être réalisé en utilisant de l'eau non déminéralisée ou en ajoutant des sels de calcium, à raison d'environ 0,01 % en poids. Pour bénéficier d'une bonne activité enzymatique, et par conséquent assurer une bonne productivité en B-CD, la concentration en enzyme B O est de préférence comprise entre 20 et 200 unités par gramme d'amidon mis en oeuvre: une unité d'enzyme B O est définie comme la quantité d'enzyme produisant 1 micromole de cyclodextrines en 1 minute à 50 C. L'enzyme B O est plus spécifique de la production de B-CD Toutefois, l'amidon soumis à l'action de l'enzyme B.O produit également la gammacyclodextrine (ou l-CD); la Y-CD est une molécule cyclique, composée de 8 unités glucopyranoses liées en 1-4. Le procédé selon l'invention peut être utilisé pour la production de 2-CD Par contre la production d'alpha- cyclodextrines à partir d'amidon et d'enzyme B O est pratiquement nulle. Au fur et à mesure de leur formation, les cyclodextrines (B et Y) sont extraites du milieu réactionnel par ultrafiltration, tandis que l'enzyme, l'amidon et l'amidon dextrinisé par l'enzyme B O sont retenus dans le milieu réactionnel. La quantité d'eau dans le milieu réactionnel est maintenue quasiment constante dans le réacteur et on peut maintenir la concentration en amidon par addition slcces-sive ou addition en continu. L'ultrafiltration est généralement réalisée à l'aide d'un dispositif d'ultrafiltration associé au réacteur dans lequel s'effectue la conversion enzymatique. Le dispositif d'ultrafiltration comprend essentiel- lement une membrane, de préférence tllhlil R ire, dont le point de coupure est supérieur à la masse moléculaire de la Y-CD et inférieur à la masse moléculaire de l'enzyme B O De préférence, on choisit une membrane dont le point de coupure est situé entre 2000 et 30 000 dalton La membrane d'ultrafiltration convenant à l'invention peut être organique ou minérale En outre, la membrane d'ultrafiltration peut être plane ou constituée de fibres creuses. Parmi les membranes minérales convenant au procédé selon l'invention, on peut citer les membranes constituées d'un support en carbone et d'un filtre en zircone ou les membranes en céramiques. Parmi les membranes organiques convenant à l'invention, on peut citer les membranes en polysulfone, polyacrylonitrile, polymères fluorés ou cellulosiques, par exemple les membranes planes, de dénomination commerciale DDS dont le point de coupure est supérieur à 2000 dalton, ou les fibres creuses de dénomination commerciale ROMICON. La productivité optimum du système constitué du réacteur et du système d'ultrafiltration est obtenue pour des débits d'ultrafiltration élevés et des concentrations en B-CD dans le perméat maintenus à des valeurs comprises entre 10 et 20 g/l C'est en effet dans ces conditions que les meilleurs résultats sont obtenus De préférence, on impose à la membrane d'ultrafiltration une pression transmembranaire comprise entre 1 et 2 bar De préférence, on prévoit un réacteur dans lequel on peut ajuster le volume de réaction dans un rapport de l'ordre de 1 à 5 par rapport au volume total du réacteur, ce qui permet d'obtenir, suivant les conditions opératoires, le temps de séjour optimum De préférence encore, on prévoit un système d'ultrafiltration tel que le temps de renouvellement du volume de réaction soit de 1/2 heure à 2 heures, la concentration moyenne en B-CD dans le perméat étant maintenue à une valeur comprise entre 8 et 15 g/l Dans ces conditions, le procédé selon l'invention permet d'atteindre une productivité supérieure à 0,5 kg de B- CD par heure et par m 2 de membrane installée et pouvant atteindre 1 kg/h m 2. Conformément à un second mode de réalisation de l'invention, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre de façon discontinue de la manière suivante: on met en contact 1 ' amidon en suspension agitée dans l'eau avec l'enzyme B O: la température et le p H sont régulés aux valeurs désirées et la concentration en amidon est ajustée à la valeur voulue Cette première étape assure une parfaite maîtrise des paramètres de procédé et permet d'éviter, grâce au contrôle de l'addition d'amidon, la formation d'un gel qui dans certains cas peut conduire à la prise en masse dans le réacteur. Quand la viscosité souhaitée est atteinte, on met en service le système d'ultrafiltration et on régule la concentration dans le réacteur par addition d'eau et on extrait en continu les cyclodextrines produites dans le perméat On n'ajoute plus d'amidon, ce qui conduit à réduire progressivement le volume de réaction. Le perméat obtenu est une solution aqueuse comprenant essentiellement de la B-CD ainsi que de la & -CD et des dextrines de faible masse mol(cu 1 laire. Après élimination partielle d'eau du perméat-, on obtient une solution aqueuse concentrée en B-CD, 'Y -CD et dextrines: cette solution peut être utilisée telle quelle pour préparer des complexes d'inclusion. De préférence toutefois, on extrait la B-CD du perméat La récupération de B-CD du perméat peut être effectuée par concentration du perméat suivie d'une cristallisation La concentration du perméat peut être réalisée par évaporation sous pression réduite ou par osmose inverse La cristallisation est réalisée par évaporation suivie d'un refroidissement. Après séparation des cristaux de B-CD, les -CD peuvent être extraites des eaux-mères de cristallisation. D' autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront a la lecture des exemples qui suivent, donnés & titre illustratif et non limitatif de l'invention. EXENPLE 1 Dans un réacteur, sous agitation, on met progressivement en suspension dans de l'eau brute 3680 g de fécule de pomme de terre, correspondant à une concentration à 8 % en poids d'amidon On régule la température à 580 C 2 C et le p H à 8,2 +/ 0,2 et on introduit l'enzyme à raison de 80 unités/gramme d'amidon. Dès la production de cyclodextrine dans le milieu réactionnel, on alimente à partir du réacteur un système d'ultrafiltration La membrane d'ultrafiltration utilisée est une membrane minérale dont le support est à base de carbone et dont le filtre est en zircone Elle possède un point de coupure de 15 000 dalton et un débit à l'eau de 800 l/h m 2 sous 4 bar à 25 C On règle la pression de sorte à obtenir un débit moyen d'ultrafiltration de 65 l/h m 2 Le débit d'ultrafiltration reste stable dans le temps. Le rétentat d'ultrafiltration est recyclé dans le réacteur et on récupère les cyclodextrines dans le perméat. Dans le réacteur, on maintient le niveau de la solution constituant le milieu réactionnel par addition d'eau et on maintient Cgiliment la concentration par addition d'amidon. Le perméat est concentré par évaporation puis on cristaili e les cyclodextrines dans un cristllliseur On obtient 1100 g de B-CD en cristaux blancs. Le rendement de production de B-CD sur l'amidon mis en oeuvre est égal à 29,9 % après 7 heures de réaction. EXEMPLE 2 Le mode opératoire suivi dans cet exemple est le même que celui de l'exemple 1 avec les différences suivantes: amidon mis en oeuvre: 262 kg (soit 10 % en poids dans le milieu réactionnel) enzyme B O: 100 unités/gramme débit moyen d'ultra- filtration: 56,4 1/h m 2 de membrane Les résultats obtenus sont les suivants: 104 kg de B-CD après 40 heures de réaction rendement en B- CD égal à 39,7 % par rapport à l'amidon mis en oeuvre. Simultanément à la production de B-CD, il y a production de Y-CD La solubilité de la B-CD dans l'eau étant différente de celle de à-CD, on sépare la B-CD de la e-CD par concentration et cristallisation du perméat. On obtient 25 kg de l-CD dans les eaux-mères de cristallisation. le rendement en e-CD par rapport à l'amidon mis en oeuvre est égal à 9,5 %. EXEMPLE 3 Le mode opératoire suivi dans cet exemple est le même que celui de l'exemple 1 avec les différences suivantes: amidon mis en oeuvre: 350 kg (soit 10 % en poids dans le milieu réactionnel) enzyme B O: 100 unités/gramme débit moyen d'ultra- filtration: 61,1 1/h m 2 de membrane Les résultats obtenus sont les suivants: - 132 kg de B-CD après 48 heures de réaction le rendement en B-CD par rapport à l'amidon mis en oeuvre est égal à 37,7 %. Simultanément à la production de B-CD, il y a production de -CD La solubilité de la B-CD dans l'eau étant différente de celle de la Y-CD, on sépare la B-CD de la (-CD par concentration et cristallisation du perméat. On obtient 31,7 kg de K -CD dans les eaux-mères de cristallisation. Le rendement en -CD par rapport à l'amidon mis en oeuvre est égal à 9,0 %. EXEMPLE 4 Le mode opératoire suivi dans cet exemple est le même que celui de l'exemple 1 avec les différences suivantes: amidon mis en oeuvre (poids sec): 1 322 g enzyme B O: 100 unités/g p H: 8,2 température: 58 C débit moyen d'ultrafiltration: 15 l/h m 2 de membrane Egalement diffère la nature de la membrane qui est dans cet exemple une membrane organique DDS à point de coupure égal à 6 000 Dalton. Les résultats de cet exemple sont: B-CD: 476 g le rendement en B-CD par rapport à l'amidon mis en oeuvre est égal à 36 % après 6 heures 30 de réaction. EXEMPLE 5 Le mode opératoire suivi dans cet exemple est le même que celui de l'exemple 1 avec les différences suivantes: amidon mis en oeuvre (poids sec): 3555 g enzyme B O: 100 unités/g d'amidon p H: 8,6 température: 58 C débit moyen d'ultrafiltration: 26 l/h m 2 de membrane Egalement diffère la nature de la membrane qui est dans cet exemple une membrane de dénomination commerciale SCT en céramique dont le diamètre moyen des pores est de 200 Angstr Sms. Les résultats de cet exemple sont: 824 g de B-CD produite après 5 h de réaction. le rendement en B-CD par rapport à l'amidon consommé est égal à 42 % après 5 h de réaction. EXEMPLE 6 Le mode opératoire suivi dans cet exemple est le même que celui de l'exemple 1 avec les différences suivantes: amidon mis en oeuvre : 435 kg (soit 10 % en poids dans le milieu réactionnel) enzyme B O: 100 unités/gramme débit moyen d'ultrafiltration: 59 1/h m 2 de membrane p H : 7,2 Les résultats obtenus sont les suivants: kg de B-CD après 38 heures de réaction le rendement en B-CD par rapport à l'amidon mis en oeuvre est égal à 8 %. REVENDICATIONS i Procédé de production de béta-cyclodextrine caractérisé en ce qu'on fait réagir de l'amidon "brut", c'est-à- dire non traité, avec la cyclodextrine-glycosyl- transferase produite par le Bacillus ohbensis (FERM P - 1990), dans une solution aqueuse à p H compris entre 7,5 et 8,8 et en ce que la béta-cyclodextrine est extraite du milieu réactionnel par ultrafiltration. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme amidon l'amidon de pomme de terre, l'amidon de maïs ou l'amidon de blé. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on utilise une concentration d'amidon n'excédant pas 15 % en poids, et de préférence comprise entre 8 et 10 % en poids. 4 Procédé selon la revendication 1, 2, ou 3 caractérisé en ce que la réaction est effectuée à p H compris entre 8 et 8,5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la réaction est effectuée à une température n'excédant pas 65 C, et de préférence comprise entre 55 et 60 C. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à , caractérisé en ce que la réaction est effectuée avec une concentration en enzyme de Bacillus ohbensis comprise entre 20 et 200 unités par gramme d'amidon mis en oeuvre. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le système constitué par le réacteur et le système d'ultrafiltration permet d'ajuster le temps de séjour moyen de l'amidon mis en oeuvre et permet d'ajuster le temps de renouvellement du volume de réaction à une valeur comprise entre 1/2 h et 2 h, la concentration moyenne en B-CD dans le S perméat étant maintenue à une valeur comprise entre 8 et 15 g/l. 8 Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 7 à la production de gamma-cyclodextrine.