FR 2669638 A1 19920529 FR 9113837 A 19911108 PROCEDE DE PREPARATION DE DIPEPTIDES La présente invention a pour objet un procédé de pré- paration de dipeptides et, plus particulièrement, un procédé de préparation de dipeptides représentés par la formule (I) suivante: H H X NH C CO NH C COOY CH 2 COOH CH 2 - qui comprend la réaction d'acide aspartique N-protégé repré- senté par la formule (II) suivante: H I X NH C COOH (I) CH 2 COOH avec un ester d'un alkyle inférieur de phénylalanine repré- senté par la formule suivante (III): H NH 2 C COOY (III) CH 2 - formules dans lesquelles: X est un groupe protecteur utilisé en synthèse peptidi- que; et Y est un groupe alkyle inférieur, en présence d'un mélange de solvant organique et d'un enzyme immobilisé. Il est généralement bien connu que la protéase peut être utilisée pour former des liaisons peptidiques dans la réaction inverse de décomposition protéinique Un nombre de méthodes classiques ont été proposées pour favoriser la réac- tion inverse pour la synthèse de dipeptides USP 4 165 311 (Isowa et al) décrit un procédé de production d'un composé d'addition qui inclut la réaction d'un dipeptide d'un ester d'amino-acide en milieu aqueux en présence d'une protéase. Cependant, seul un enzyme soluble peut être utilisé Généra- lement, un tel enzyme soluble est non seulement cher mais est instable sous forme soluble si bien qu'il ne peut être uti- lisé que dans des applications industrielles très limitées. Afin d'éviter ces limitations, des recherches ont été faites depuis plusieurs années Le résultat est qu'il est possible d'améliorer la stabilité de l'enzyme par des techniques d'immobilisation Cependant, dans un tel système de forma- tion d'un composé d'addition, il est pratiquement impossible d'utiliser n'importe quel type d'enzymes immobilisés à cause des difficultés de séparation d'enzyme de ce système USP 4 284 721 (Oyama et al) décrit qu'une métallo-protéinase immobilisée contenant de l'eau dans un solvant organique non miscible à l'eau est utilisée pour favoriser la formation de liaison peptidique J Org Chem; 46, page 5241 ( 1981) publié par Oyama et al décrit que, à cause d'un transfert immédiat du produit vers le solvant organique non miscible à l'eau, la vitesse de- réaction ainsi que le rendement à l'équilibre sont relativement bons bien qu'ils soient inférieurs à ceux en milieu aqueux. De plus, bien que la référence d'Oyama et al emploie un enzyme immobilisé et stable en solvant organique, dans la mesure o l'enzyme nécessite certaine teneur en eau, le sol- vant organique non miscible à l'eau doit inévitablement conte- nir deux phases Cependant, un tel milieu à deux phases limite une opération continue des procédés de synthèse, particulière- ment un procédé en réacteur à colonne à garnissage et en réacteur agité continu Dans le réacteur agité continu, une attrition de l'enzyme a nécessairement lieu De plus, bien que l'enzyme soit sous forme immobilisée, il n'est pas stable de façon satisfaisante. Pour éviter ces inconvénients du milieu solvant non miscible à l'eau, l'emploi d'un solvant organique miscible à l'eau a été proposé Cependant, dans un tel milieu, un chan- gement du micro-environnement entre l'eau située autour des enzymes immobilisés et le solvant organique provoque une inhibition en retour si bien que la vitesse de réaction dé- croit inévitablement. D'autre part, le fait qu'un cosolvant organique puisse inverser la réaction de formation de peptide réversible en une synthèse a été reporté par Homandbert et al lBiochem 17 ( 24), 5220 ( 1978)l. Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé amélioré de préparation de dipeptides afin d'éviter les in- convénients mentionnés ci-dessus. Un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé de fabrication de dipeptides de formule suivante (I): H H I I X NH C Co NH C Cooy () I CH 2 COOH CH 2 qui comprend la réaction d'acide aspartique N-substitué (ou N-protégé)- de formule suivante (II): H X NH C COOH (II) CH 2 COOH avec un ester d'alkyle inférieur de phénylalanine de formule suivante (III): H NH 2 C COOY (III) CH 2 formules dans lesquelles: X est un groupe protecteur qui est généralement utilisé en synthèse peptidique; et Y est un groupe alkyle inférieur, dans un mélange de solvant miscible à l'eau en présence d'une métallo-protéase immobilisée. Des exemples préférés de groupe X sont des groupes uréthanes sont tels que benzyloxycarbonyle, p-méthoxybenzyloxycarbo- nyle, t-butoxycarbonyle, benzoyle, et autres Des exemples préférés de groupe Y sont les groupes alkyles en C 1 à C 4, de préférence les groupes méthyles ou éthyles Les acides aspar- tiques protégés de formule (II) et les esters d'alkyle infé- rieur de phénylalanine de formule (III) sont préparés par des méthodes connues en elles-mêmes. Un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé de préparation de dipeptides qui comprend la four- niture d'un milieu solvant miscible à l'eau qui procure une séparation du produit et une préparation de substrat avanta- geusement plus aisées en provoquant des propriétés de solu- bilité améliorées. D'autres objets et un autre champ d'application de la présente invention seront apparents à partir de la descrip- tion détaillée donnée ci-après Il doit être compris cepen- dant que la description détaillée des exemples spécifiques, bien qu'indiquant des modes de réalisation préférés de la présente invention, sont donnés seulement à titre d'illus- tration, puisque divers changements et modifications dans l'esprit et dans la portée de l'invention seront apparents à l'homme de l'art à partir de cette description détaillée. De façon brève, la présente invention a pour objet une amélioration dans un procédé de fabrication de dipeptides par couplage d'acide aspartique N-protégé et d'un ester d'alkyle inférieur de phénylalanine dans un milieu contenant un mélange de solvant organique miscible à l'eau, en présence d'une métallo-protéase immobilisée, de sorte qu'une réaction conti- nue est établie avec une activité enzymatique très stable. Les enzymes employés dans la présente invention sont des protéases, de préférence des métallo-protéases des espè- ces Bacillus telles que subtiles, stearothermophilus, et autres. Dans la présente invention, les enzymes sont utilisés sous forme immobilisée Les procédés sont basés sur des tech- niques générales incluant les procédés d'absorption physique, de liaison covalente, d'inclusion et de réticulation. La réaction est mise en oeuvre dans un milieu aqueux qui contient jusqu'à environ 70 %, de préférence de 10 à 70 %, avantageusement de 5 à 40 %, d'un solvant organique ou une combinaison de plusieurs solvants Les solvants organiques préférés sont les alcanols, par exemple méthanol et éthanol, les glycols par exemple l'éthylèneglycol et les polyéthylène- glycols de poids moléculaire compris entre 200 et 2 000, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, l'acétonitrile et le tétrahydrofuranne De plus, il est nécessaire que le milieu aqueux contenant le solvant organique ou une combinaison des solvants organiques ait la capacité de dissoudre à la fois les composés de départ de formules (II) et (III) de la réac- tion et le produit de formule (I) Le milieu aqueux choisi de préférence permet une vitesse de réaction et un rendement à l'équilibre aussi élevés que possible La stabilité enzyma- tique doit aussi être maintenue dans le même milieu. Il est préférable d'employer des concentrations élevées pour chacun des matériaux de départ selon la présente inven- tion, puisque des concentrations supérieures permettent une vitesse de réaction plus élevée Les concentrations de chacun des matériaux de départ sont telles que les matériaux de départ et le produit restent solubles dans le milieu, de préférence dans des intervalles de concentration d'environ 0,25 à 1,0 M. La quantité d'acide aspartique N-substitué et d'ester d'alkyle inférieur de phénylalanine employée selon la pré- sente invention est généralement comprise dans un intervalle de rapport molaire d'environ 1/1 à 1/5, puisqu'il est préfé- rable d'avoir une concentration molaire supérieure en ester de phénylalanine qu'en acide aspartique N-substitué. La présente invention n'inclue aucune restriction par- ticulière en ce qui concerne la quantité d'enzyme immobilisé utilisé dans la réaction puisque ceci affecte seulement le temps de réaction. Le p H du mélange réactionnel est maintenu dans un in- tervalle qui fournit l'activité enzymatique maximale dans le milieu de réaction choisi Généralement, ceci est dans un intervalle d'environ 5 à 8, de préférence d'environ 5,5 à 7,0 Le p H peut être ajusté par ajout de Na OH avant la réac- tion. la température de réaction est généralement dans l'in- tervalle d'environ 5 à 50 C, de préférence de 30 à 500 C. Le temps de réaction dépend de la température de réac- tion, la concentration des matériaux de départ, et la quan- tité d'enzyme immobilisé Généralement, un temps de réaction d'environ 0,5 à 10 heures est suffisant. Le procédé selon la présente invention est mis en oeu- vre dans une colonne garnie avec l'enzyme immobilisé par introduction des matériaux de départ dans le milieu solvant aqueux Le procédé permet de mettre en oeuvre la réaction en continu et il est donc particulièrement avantageux pour une application à l'échelle industrielle Le procédé peut aussi être mis en oeuvre dans un réacteur conventionnel avec agi- tation bien que le réacteur agité puisse causer une attrition possible de l'enzyme immobilisé. Le produit ester dipeptide produit est habituellement séparé du mélange réactionnel et récupéré sous forme solide. Le produit-est obtenu avec une pureté élevée sans autres étapes de purification Les composants amino-acides n'ayant pas réagi, le produit dipeptide non séparé et l'enzyme immo- bilisé peuvent être récupérés, recyclés et réutilisés Parti- culièrement, l'enzyme dans la colonne peut être utilisé de façon répétitive pendant un long temps. Le groupe protecteur de l'acide aspartique N-substitué peut être facilement retiré du dipeptide par des méthodes connues d'hydrogénation telles que la catalyse en présence de palladium. La présente invention est particulièrement utile pour le procédé de production d'aspartame lorsqu'un groupe méthyle est employé en tant que groupe alkyle inférieur de l'ester alkylique inférieur de phénylalanine L'aspartame est utile en tant qu'édulcorant dans la nourriture et possède comme nom chimique l'ester méthylique d'a-L-aspartyl-L-phénylalanine. Les exemples suivants sont inclus afin simplement d'ai- der à la compréhension selon l'invention et des variantes peuvent être faites sans sortir du champ d'application de la présente invention. EXEMPLE 1 De la résine XAD-7 (Rohm & Haas) est lavée puis équili- brée avec du tampon Tris ( 20 m M, p H 7,0 contenant 10 m M Ca C 12) 12,5 g de Thermoase (Daiwa Kasei, 10 000 lPUl dans lequel une unité est définie comme l'activité du matériau de libération qui a une absorbance à 280 nm dans la caséine équivalent à 1 micromole de tyrosine en 1 minute à 35 C) sont ajoutés à 100 ml de résine et agités pendant 5 heures Après la charge, les lits sont fixés avec une solution à 10 % de glutaraldéhyde et lavés avec le tampon. 1,19 g ( 5,0 mmoles) d'acide N-benzoyl-L-aspartique et 1,79 g ( 10,0 mmoles) d'ester méthylique de L-phénylalanine sont ajoutés au récipient qui contient 50 ml d'acétonitrile à 50 % dans l'eau contenant 5 m M de Ca Cl 2 Le p H de la solution %dan l'au ontnan 5 M d Ca 12 Lep H de la solution est ajusté à 6,0 avec Na OH 10 M La solution est mélangée avec 4 g d'enzyme de succion filtré immobilisé préparé ci- dessus Ensuite, la réaction est mise en oeuvre avec agita- tion pendant 4 heures à 40 C A l'issue de la réaction, l'en- zyme immobilisé est séparé par filtration Le p H du filtrat est ensuite ajouté à 3,7 à l'aide d'acide chlorhydrique 10 M. La bouillie résultante est filtrée et lavée avec de l'eau pour donner l'ester méthylique de N-benzoyl-L-aspartyl-L- phénylalanine. Le cristal ainsi obtenu est soumis à une analyse par chromatographie en phase liquide à haute performance pour montrer que le rendement de la réaction en produit est de 82,4 %. Les conditions utilisées pour l'analyse HPLC sont don- nées ci-dessous: colonne Econosphere (Alltech) C 18, 250 x 4,6 mm, microns éluant tampon de phosphate 0,1 M contenant 25 % d'acétonitrile et 12 % de méthanol, p H 3,5 débit 1,0 ml/mn détecteur: UV 254 nm EXEMPLE 2 La procédure de l'exemple 1 est suivie à l'exception du fait que la quantité d'acide N-benzoyl-L-aspartique est de 2,38 g ( 10,0 mmoles) et que du diméthylsulfoxyde est utilisé à la place d'acétonitrile L'ester méthylique de N-benzoyl- L-aspartyl-L-phénylalanine est obtenu avec un rendement de 52,1 %. EXEMPLE 3 La procédure de l'exemple 2 est suivie à l'exception du fait que le p H est ajusté à 6,5 et que le temps de réaction est de 8 heures à 30 C L'ester méthylique de N-benzoyl-L- aspartyl-L-phénylalanine est obtenu avec un rendement de 46,7 %. EXEMPLE 4 La procédure de l'exemple 1 est suivie à l'exception du fait que 1,35 g ( 5,0 mmoles) d'acide N-benzyloxycarbonyl-L- aspartique sont utilisés et le temps de réaction est de 3 heu- res L'ester méthylique de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L- phénylalanine est obtenu avec un rendement de 83,5 %. EXEMPLE 5 La procédure de l'exemple 1 est suivie à l'exception du fait que la quantité de Thermoase est de 5 g et que le temps de réaction est de 13 heures L'ester méthylique de N-benzoyl- L-aspartyl-L-phénylalanine est obtenu avec un rendement de 78,9 %. EXEMPLE 6 La procédure de l'exemple 1 est suivie à l'exception du fait que du diméthylformamide à 50 % est utilisé à la place d'acétonitrile et que le temps de réaction est de 6 heures. L'ester méthylique de N-benzoyl-L-aspartyl-L-phénylalanine est obtenu avec un rendement de 65,7 %. EXEMPLE 7 La procédure de l'exemple 1 est suivie à l'exception du fait qu'à la place d'acétonitrile, on utilise 40 % de diméthyl- formamide et 15 % d'éthylèneglycol, le p H est ajusté à 5,8 et le temps de réaction est de 6 heures L'ester méthylique de N-benzoyl-L-aspartyl-L-phénylalanine est obtenu avec un ren- dement de 57,6 %. EXEMPLE 8 La procédure de l'exemple 4 est suivie à l'exception du fait qu'à la place d'acétonitrile, on utilise 45 % de diméthyl- sulfoxyde et 15 % de polyéthylèneglycol 400, le temps de réac- tion est de 5 heures et le p H de 6,2 L'ester méthylique de Nbenzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine est obtenu avec un rendement de 85,1 %. EXEMPLE 9 La procédure de l'exemple 1 est suivie à l'exception du fait qu'à la place d'acétonitrile, on utilise 30 % d'acéto- nitrile et 25 % de polyéthylèneglycol 600, le temps de réac- tion est de 6 heures et le p H est ajusté à 6,5 L'ester méthy- lique de N-benzoyl-L-aspartyl-L-phénylalanine est obtenu avec un rendement de 78,5 %. EXEMPLE 10 La procédure de l'exemple 9 est suivie à l'exception du fait que la quantité d'acide N-benzoyl-L-aspartique est de 2,85 g ( 10 mmoles) et celle l'ester méthylique de L-phényl- alanine est de 2,69 g ( 15 mmoles), et qu'au lieu de poly- éthylèneglycol 600, on utilise du polyéthylèneglycol 200 et que le temps de réaction est de 7 heures L'ester méthylique de N-benzoyl-Laspartyl-L-phénylalanine est obtenu avec un rendement de 64,2 %. EXEMPLE 11 La procédure de l'exemple 10 est suivie à l'exception du fait qu'au lieu d'acétonitrile, on utilise le diméthyl- formamide, le temps de réaction est de 5 heures, le p H est ajusté à 6,2 L'ester méthylique de N-benzoyl-L-aspartyl-L- phénylalanine est obtenu avec un rendement de 52,4 %. EXEMPLE 12 La procédure de l'exemple 11 est suivie à l'exception du fait qu'à la place d'agitation, on utilise une colonne garnie avec un enzyme immobilisé comme dans l'exemple 1, les matériaux de départ sont à la même concentration que dans l'exemple 11 La charge entre dans la colonne de manière continue à un débit (vitesse spatiale) de 0,9 h 1 La concen- tration d'ester méthylique de N-benzoyl-L-aspartyl-L-phényl- alanine dans la solution de produit est de 115 m M Les maté- riaux de départ n'ayant pas réagi sont séparés du produit par la même technique que dans' l'exemple 1 et sont recyclés pour être ultérieurement utilisés L'opération dans le bioréacteur est mise en oeuvre en continu pendant un mois. EXEMPLE 13 La procédure de l'exemple 12 est suivie à l'exception du fait qu'à la place de diméthylformamide, on utilise 40 % de diméthylsulfoxyde, le débit est de 1,2 h 1, les concentra- tions en acide N-benzoyl-L-aspartique et en ester méthylique de L-phénylalanine sont de 100 m M et 200 m M respectivement. La concentration d'ester méthylique de N-benzoyl-L- aspartyl-L-phénylalanine dans la solution de produit est de m M L'opération en bioréacteur est mise en oeuvre en continu pendant 2 mois. La présente invention étant décrite, de nombreuses variantes apparaissent à l'homme de l'art Ces variantes ne doivent pas être considérées comme s'éloignant de l'esprit et de la portée de l'invention, et toutes ces modifications qui seront apparentes à l'homme de l'art sont incluses dans la portée des revendications suivantes. il REVENDICATIONS 1. Un procédé de préparation de dipeptides d'ester alkylique inférieur de N-substitué-L-aspartyl-L-phénylalanine de formule suivante (I): H H I I I i X NH C CO NH C COOY (I) CH 2 COOH CH 2 - qui comprend la réaction d'acide L-aspartique N-substitué de formule suivante (II): H I X NH C COOH (II) CH 2 COOH avec un ester d'alkyle inférieur de phénylalanine de formule (III): H NH 2 C COOY (III) * CH 2 - dans lesquelles: X est un groupe protecteur; et Y est un groupe alkyle inférieur, dans un milieu ayant un composant organique d'un solvant organique ou une combinaison de solvants organiques miscibles à l'eau, en présence d'eau et d'une métallo-protéase immobi- lisée. 2 Le procédé selon la revendication 1, dans lequel l'acide L-aspartique N-substitué et l'ester d'alkyle infé- rieur de phénylalanine sont soumis à un contact avec la métallo-protéase immobilisée, conduisant ainsi au couplage des deux composants. 3 Le procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel X est choisi parmi le groupe consistant en: benzoyle, benzyloxycarbonyle, p-méthoxybenzyloxycarbonyle et t-butoxy- carbonyle; et Y est choisi dans le groupe consistant en: mé- thyle, éthyle, propyle et butyle. 4. Le procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, dans lequel le composant organique dudit milieu est choisi dans le groupe consistant en: alcool méthylique, alcool éthylique, acétonitrile, diméthylformamide, diméthyl- sulfoxyde, tétrahydrofuranne, éthylèneglycol et polyéthylène- glycol de poids moléculaire compris entre 200 et 2 000. 5. Le procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4, dans lequel le composant organique dudit milieu comprend une combinaison des solvants organiques consistant en 2 ou 3 solvants. 6. Le procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 5, dans lequel la concentration totale dudit compo- sant organique dans le milieu de réaction est de 10 à 70 % en poids. 7. Le procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 4 à 6, dans lequel la combinaison des solvants organi- ques inclut l'éthylèneglycol ou le polyéthylèneglycol à une concentration de 5 à 40 % en poids. 8. Le procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 7, dans lequel la métallo-protéase est l'enzyme issu d'une culture de l'espèce Bacillus choisi dans le groupe consistant en subtiles et stearothermophilus. 9 Le procédé selon la revendication 8, dans lequel la métallo-protéase est la Thermolysine ou Thermoase. 10. Le procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 9, dans lequel le rapport molaire acide L-aspar- tique N-substitué/ester alkylique inférieur de phénylalanine est compris entre 1/1 et 1/5.