FR 2664703 A1 19920117 FR 9108381 A 19910704 La présente invention se situe dans le domaine géné- ral des essais et dosages biochimiques ainsi que des méthodes de détection, en s'intéressant plus particulière- ment aux méthodes de marquage d'espèces chimiques et à la détection des marqueurs En particulier, l'invention con- cerne la détection de macromolécules, impliquant des méthodes de marquage ne faisant pas appel à des isotopes radioactifs. Un mode opératoire essentiel pour tous les labora- toires étudiant la biologie moléculaire consiste en la détection et en la visualisation de macromolécules Cela sert dans les essais de dosage de protéines, dans le séquençage de l'acide désoxyribonucléique (ADN), la déter- mination et la connaissance des cartes génétiques ("carto- graphie de gènes"), et dans un certain nombre d'autres expériences et déterminations Le procédé le plus couram- ment utilisé consiste à marquer, à l'aide d'une espèce radioactive, la molécule ou la séquence intéressantes, puis à enregistrer sur une pellicule d'enregistrement de rayons X, une image autoradiographique de l'émission radioactive. Des inconvénients associés à l'utilisation d'espèces radioactives consistent en ce que leur manutention présente des risques pour le technicien de laboratoire, en ce qu'il est difficile de s'en débarrasser, et en ce que leur décroissance radioactive exige leur remplacement périodique par les matières fraîches Des marqueurs n'impliquant pas une espèce radioactive ne parviennent pas facilement dans des images spatiales sur une pellicule ou un écran, et ils ont de manière générale une plus faible sensibilité que les marqueurs radioactifs correspondants. Les pellicules et films pour enregistrement de rayons X ont également leurs limitations La gamme dynami- que d'une pellicule typique pour enregistrement de rayons X est d'environ 50 fois, ce qui limite le degré auquel on peut obtenir à partir du film une information quantitative. De même, il faut de façon générale de longs temps d'exposi- tion pour obtenir une image satisfaisante, en raison de la sensibilité limitée de la pellicule aux émissions de parti- cules D servant dans la plupart des marqueurs radioactifs. En outre, une certaine dose de variabilité est potentielle- ment introduite dans le développement de la pellicule, puisque ce développement exige un certain nombre d'étapes impliquant des solutions instables. Il vient d'être développé un procédé pour utiliser des écrans phosphorescents en combinaison avec de la chimio- luminescence pour déceler et visualiser des macromolé- cules, ce qui évite la nécessité de faire appel à des radio- isotopes et les remplace Les macromolécules peuvent maintenant être sélectivement marquées à l'aide d'une espèce induisant une réaction de chimioluminescence dans un substrat, et le substrat peut être exposé à un écran phosphorescent, capable de répondre à l'émission de chimioluminescence et d'en indiquer l'apparition d'une manière facilement décelable. Ainsi, on marque des macromolécules immobilisées, comme des protéines ou des séquences d'acides nucléiques, en utilisant pour le marquage des marqueurs induisant une réaction de chimioluminescence dans un substrat en phase liquide Pendant que la réaction se produit, le substrat est exposé à un écran phosphorescent qui absorbe l'émission chimioluminescente dans une image représentant la cons- titution et des formes générales des macromolécules. L'énergie absorbée est ensuite dégagée et lue, en donnant des renseignements qualitatifs, et éventuellement quanti- tatifs, concernant les macromolécules immobilisées. Ainsi, un procédé proposé par la présente invention pour déceler des macromolécules immobilisées sur une matrice comprend les étapes suivantes: (a) le marquage sélectif desdites macromolécules à l'aide d'une espèce capable d'induire une réaction de chimio- luminescence dans un substrat chimioluminescent en phase liquide; (b) le placement de ladite matrice, comportant les macromolécules ainsi marquées, au contact dudit substrat chimioluminescent en phase liquide, pour induire ladite réaction de chimioluminescence; (c) pendant que la matrice et ledit substrat chimio- luminescent en phase liquide sont ainsi en contact, l'expo- sition dudit substrat chimioluminescent en phase liquide à un écran phosphorescent pour y exciter les substances phos- phorescentes et former ainsi une image correspondant aux- dites macromolécules sur ladite matrice; et (d) la détection de ladite image constituant une indication de la présence desdites macromolécules sur cette matrice. Selon d'autres particularités de l'invention ledit substrat chimioluminescent en phase liquide émet, et les substances phosphorescentes sont excitées par, de la lumière se situant à au moins une longueur d'onde comprise dans l'intervalle allant d'environ 400 nm à environ 600 nm. Les macromolécules présentes sur la matrice peuvent comprendre plusieurs groupes distincts et l'étape (a) ci- dessus peut alors comprendre le marquage sélectif de chaque groupe par un marqueur distinct; l'étape (b) comprend le placement de la matrice au contact d'un mélange en phase liquide de plusieurs substrats chimioluminescents, chacun desdits substrats pouvant être induit, par l'un desdits marqueurs, en vue de subir une réaction de chimiolumines- cence émettant de la lumière à une longueur d'onde dis- tincte de celle des autres substrats de ce genre; et l'écran phospho- rescent de l'étape (c) peut contenir un mélange de subs- tances phosphorescentes, dont chacune peut être sélective- ment excitable par de la lumière à l'une desdites longueurs d'ondes. L'image obtenue à l'étape (c) peut être une image latente, et l'étape (d) comprend alors la stimulation des- dites substances phosphorescentes par un rayonnement élec- tromagnétique consistant en de la lumière visible, des rayons X, un rayonnement ultraviolet ou un rayonnement infrarouge, pour engendrer des signaux représentatifs de cette image latente. Dans l'étape (c), l'exposition du substrat chimio- luminescent en phase liquide audit écran phosphorescent peut s'effectuer à travers une barrière transparente, à rôle de retenue de liquide. L'espèce utilisée comme marqueur à l'étape (a) peut être conjuguée à un organe de liaison, susceptible d'une inter- action de liaison,de type affinité,avec lesdites macromo- lécules, l'étape (a) comprenant alors la mise en contact de cet organe de liaison et de la matrice pour lier ledit organe de liaison à l'une quelconque des macromolécules présentes sur la matrice. L'espèce servant de marqueur dans l'étape (a) peut être de la phosphatase, la réactionde chimioluminescence étant une réaction enzymatique et le substrat chimioluminescent étant un substrat dans lequel la vitesse de la réaction de chimioluminescence est amplifiée par une phosphatase. Le substrat chimioluminescent à phase liquide peut être une solution aqueuse d'un composé hydrosoluble capable de subir une réaction de chimioluminescence. La matrice que l'on utilise peut être une membrane sur laquelle les macromolécules sont immobilisées en un réseau plan; le substrat chimioluminescent à phase liquide peut être retenu dans un réceptacle ayant une paroi trans- parente plane et, dans l'étape (b), on peut immerger cette membrane dans ce réceptacle avec le réseau plan de macromo- lécules voisin de la paroi transparente plane; l'écran phosphorescent de l'étape (c) peut former une surface solide plane et l'étape (c) peut comprendre le maintien de l'écran phosphorescent près de la paroi transparente plane et à l'extérieur dudit réceptacle. L'étape (b) du procédé peut comprendre la mise en contact de la matrice avec une quantité du substrat chimio- luminescent à phase liquide suffisante pour provoquer la poursuite des émissions de la lumière chimioluminescente pendant au moins 24 h environ. L'utilisation du substrat comme élément intermé- diaire entre le marqueur et la pellicule ou l'écran permet de maîtriser la formation de l'image et l'intensité du signal et, ainsi, la sensibilité de l'expérience, tout en 5 évitant le risque lié aux matériaux radioactifs En outre, le substrat est sous forme de liquide, ce qui procure des avantages supplémentaires en termes d'amplification de son contact avec le marqueur et parce que cela offre des para- mètres supplémentaires à utiliser pour la maîtrise et la formation de l'image, ces paramètres pouvant comprendre la concentration, la transmissivité de la lumière et l'apti- tude à pouvoir tenir compte de variations de l'agencement physique et de la configuration des éléments solides du système. L'utilisation de l'écran phosphorescent fournit une image ayant un degré élevé de sensibilité, de contraste et de reproductibilité, avec des temps d'exposition relative- ment brefs D'autres avantages comprennent le fait que les écrans phosphorescents n'exigent pas de traitement chimique pour être lisibles et le fait qu'ils peuvent "conserver" ou "emprisonner" une émission chimioluminescente lors de la réception de cette émission et retenir l'énergie de l'émis- sion jusqu'à stimulation par une source externe, comme de la lumière infrarouge, l'écran émettant alors sa propre émission correspondante. D'autres caractéristiques, avantages et formes pré- férées de réalisation de l'invention ressortiront de la description détaillée suivante, faite en regard du dessin annexé sur lequel: la figure 1 représente schématiquement une expé- rience conduite selon la présente invention et dans laquelle une forme d'immobilisation macromoléculaire est transférée à un écran phosphorescent; et la figure 2 représente schématiquement un système optique pour engendrer et déceler des signaux mettant la forme apparaissant sur l'écran phosphorescent à l'état visuellement lisible, c'est-à-dire donnant une visualisation. Les éléments fondamentaux de l'invention comprennent notamment le marqueur, le substrat chimioluminescent et l'écran phosphorescent L'exposé détaillé va ainsi com- mencer avec une description du marqueur et du substrat chimioluminescent. Le marqueur et le substrat peuvent être constitués par n'importe quelles matières tendant à produire par leur contact une émission chimioluminescente, ce qui comprend la large variété d'espèces connues dans l'art de la chimiolumi- nescence Le marqueur et le substrat peuvent, par exemple, être des corps pouvant réagir et dont la combinaison donne un état excité qui dégénère spontanément jusqu'à l'état stable en dégageant une émission fluorescente ou phos- phorescente, ou bien il peut s'agir de corps destinés à réagir, qui se combinent pour former un intermédiaire, lequel se décompose spontanément pour parvenir à un état excité qui subit ensuite la même conversion et le même dégagement d'énergie En variante, la réaction peut être entièrement contenue dans le substrat Dans le cas d'une telle réaction, le substrat peut être constitué par une seule espèce et la réaction est une conversion ou une décomposition entraînant une émission, ou bien le substrat peut être constitué par un mélange d'espèces entrant dans une réaction dont le résultat est constitué par l'émission en cause. Pour des réactions contenues dans un substrat, le marqueur peut être un catalyseur ou une enzyme On préfère les marqueurs de type catalyseur et de type enzyme et par- ticulièrement les marqueurs de type enzyme, en raison de leur interaction successive et continue avec les molécules du substrat pouvant réagir Cela permet la poursuite des émissions pendant des périodes prolongées, en facilitant l'enregistrement et la détection, et cela fournit une amplification de signal que l'on peut maîtriser et régler gràce à la quantité de substrat devenue disponible, ou rendue disponible, au marqueur. On connaît des catalyseurs et enzymes très variés, capables d'induire une réaction de chimioluminescence, et convenant donc pour servir dans la pratique de la présente invention Des exemples de catalyseurs sont représentés par divers métaux et par des espèces ou composés comme de l'adénosine triphosphate Des exemples d'enzymes sont représentés par de la lactate déshydrogénase, de la luci- férase et des phosphatases comme de la phosphatase alcaline (PA) On préfère les enzymes, et l'on préfère tout particu- lièrement des phosphatases, parmi lesquels une phosphatase alcaline est particulièrement préférée. On peut utiliser dans la présente invention n'importe quelle réaction connue de chimioluminescence Les réactions de décomposition de peroxydes constituent une classe commode Des réactions préférées dans cette classe sont représentées par des décompositions de 1,2-dioxétannes, ce qui comprend des décompositions de 1,2-dioxétannones (a-peroxylactones) et de 1,2-dioxétannediones (peroxyoxa- lates) Des exemples d'autres classes sont représentés par des réactions impliquant le luminol ( 3-aminophtalhydrazide) et ses analogues, et des composés organométalliques comme le bromure de p-chlorophénylmagnésium. Des réactions particulièrement préférées sont cons- tituées par des décompositions de 1,2-dioxétannes régulées par des enzymes Des composés contenant le groupe 1,2-dioxétanne ainsi qu'un groupe ester d'un acide ortho- phosphorique constituent un exemple d'une classe de com- posés répondant à cette description La décomposition de ces composés est catalysée par une phosphatase Un exemple particulier est représenté par le substrat 3-( 2 '-spiroa- damantane)-4-méthoxy-4-( 3 "-phosphoryloxy)phényl-l,2- dioxétanne, avec l'enzyme phosphatase alcaline Le dioxé- tanne particulier est disponible à l'échelle commerciale chez Tropix Corporation, Bedford, Massachusetts et chez Lumigen Corporation, Détroit, Michigan (Etats-Unis d'Amérique) et l'enzyme est disponible commercialement chez une large gamme de sources et de fournisseurs possibles. Le substrat sera en phase liquide Donc, les substrats les plus commodes seront des substances hydroso- lubles, et la phase liquide sera une solution aqueuse On comprend que la quantité de substrat qui va subir la réac- tion ne soit pas facilement déterminable, puisque la pré- sence et la quantité de la ou des espèces macromolécu- laire(s), et donc du marqueur qui y est ou leur attaché, peuvent ne pas être connues Néanmoins, on va chercher à inclure un excès de substrat, prévu en se basant sur la quantité attendue ou sur la limite supérieure de l'espèce macromoléculaire que l'on cherche à déceler, de sorte que la totalité du marqueur, immobilisé par fixation sur l'espèce macromoléculaire, entre bien en réaction et que l'on puisse établir une relation entre le niveau d'émission et la quantité de marqueur Avec des marqueurs qui sont des catalyseurs ou des enzymes, on préfère un grand excès du substrat, de sorte que les émissions d'une lumière par chimioluminescente se poursuivent pendant suffisamment de temps pour permettre d'effectuer les étapes restantes du mode opératoire pendant qu'une lumière d'intensité suffi- sante continue à -être émise Dans des systèmes particuliè- rement préférés, le substrat est inclus en une quantité suffisante pour obtenir que les émissions de lumière par chimioluminescence se poursuivent durant 1 h au moins, et encore mieux durant au moins 24 h environ. Pour l'écran phosphorescent, on peut utiliser des matières phosphorescentes très diverses Le choix appro- prié, dans chaque application particulière, va dépendre de la matière chimioluminescente, les matières phospho- rescentes étant choisies de façon à recevoir, et à répondre à, l'émission produite par la matière chimioluminescente particulière. Les matières phosphorescentes que l'on utilise dans la pratique de l'invention peuvent être choisies dans la pleine gamme de matières connues pour posséder le pouvoir de phosphorescence En général, ce sont des matières qui absorbent de la lumière et entrent, par suite de cela, dans un état d'excitation,puis elles subissent une relaxation jusqu'à l'état de base tout en émettant de la lumière, à 5 une intensité ou à une fréquence différentes ou à une échelle différente de temps, ou bien à une intensité et une fréquence différentes et également en une échelle de temps différente Les matières répondant à cette descrip- tion comprennent des matières minérales, des composés bio-10 logiques et des matières préparées par synthèse, ainsi que des mélanges de telles matières Des exemples sont repré- sentés par des halogénophosphates de métaux, comme Ca 5 (PO 4)3 (F,Cl):Sb(III), Mn(II), Sr 5 (PO 4)3 (Cl):Eu(II), Sr 5 (P 04)3 (F, Cl):Sb(III),Mn(II) et lSr Eu(II)l 5 (P 04)3 C 1; d'autres matières phosphorescentes activées par des terres rares comme Y 203:Eu(III), Sr B 407:Eu(II), Ba Mg 2 A 116027 Eu(II), Y(V 04):Eu(III), Y(V 04)P 04:Eu(III), Sr 2 P 207:Eu(II), Sr Mg P 207:Eu(II), Sr 3 (P 04)2:Eu(II), Sr 5 4 C 6010:Eu(II), Ba 2 Mg Si 207:Eu(II), Gd OS:Tb(III), La OS:Tb(III), La O Br:Tb(III), La O Br:Tm(III) et Ba(F, Cl)2:Eu(II); d'autres matières phosphorescentes ayant un aluminate comme hôte, comme Ce 0,65 Tb 0,35 Mg Al 1019; des matières phosphorescentes ayant du silicate comme hôte, comme Zn 2 Si O 4:Mn(II); et des matières phosphorescentes ayant un fluorure comme hôte, comme Y 0,79 Yb 0,20 Er 0,01 F 3, La 0,86 Yb 0, 12 Er 0,02 F 3, et Y 0,639 Yb 0,35 Tm 0,001 F 3 Les matières phosphorescentes qui demeurent à l'état excité jusqu'à leur libération par une stimulation externe présentent un intérêt particulier Elles comprennent un grand nombre des matières énumérées ci-dessus, plus d'autres matières Des exemples préférés sont représentés par des sulfures et séléniures de métaux alcalino-terreux, dopés par de l'oxyde, du sulfure ou du fluorure de samarium et d'europium ou de cérium, et contenant en outre un sel fusible comme du fluorure de lithium, du sulfate de baryum, ou les deux, servant de fondant On trouve des listes et des descriptions de telles matières dans les brevets US-A- 4 812 660 ( 14 mars 1989), US-A-4 822 520 ( 18 avril 1989) et US-A-4 830 875 ( 16 mai 1989), tous délivrés à Lindmayer, J. (Quantex Corporation), et l'on pourra s'y référer pour plus de détails La stimulation qui libère l'énergie peut être sous forme de chaleur ou d'un rayonnement électromagné- tique, comme de la lumière visible, des rayons X, un rayonnement ultraviolet et un rayonnement infrarouge, selon le type de matière phosphorescente. Le substrat et les matières phosphorescentes seront choisis de façon à émettre et à absorber, respectivement, à la même longueur d'onde, en étant ainsi complémentaires l'un de l'autre en termes d'émission d'énergie et de réponse L'énergie d'une émission unique prendra générale- ment la forme d'une bande de longueurs d'onde, dont la largeur n'a pas une importance critique dans le cas géné- ral Dans certaines applications, comme décrit plus en détail ci-après, des largeurs de bandes étroitement défi- nies vont jouer des rôles spécifiques En ce qui concerne les longueurs d'onde des émissions, dans la plupart des applications se situant dans le cadre prévu de la présente invention, on utilisera des émissions présentant des lon- gueurs d'onde de crête ou de pic se situant entre environ 350 nm et environ 700 nm, de préférence entre environ 400 nri et environ 600 nm. L'utilisation de matières phosphorescentes mélan- gées, avec un mélange correspondant de systèmes de mar- queur(s)/substrat(s), offre d'autres possibilités pour une plus ample utilisation de l'invention Par exemple, le luminol, qui est un substrat chimioluminescent courant actuellement disponible, émet de la lumière à 428 nm lors- qu'il est activé, et divers napthyldioxétannes isomères, actuellement disponibles, émettent de la lumière à des longueurs d'onde variant entre 463 nm et 560 nm Parmi les diverses matières phosphorescentes disponibles chez Quantex Corporation, la matière phosphorescente appelée "Q-16 " va répondre à des longueurs d'onde de 470 nm mais pas à des longueurs d'onde supérieures, cependant que la matière il phosphorescente appelée "Q-42 " va répondre à des longueurs d'onde allant jusqu'à environ 600 nm. Avec ces matières phosphorescentes combinées sur un écran unique, ou avec n'importe quelle autre combinaison pouvant effectuer une discrimination semblable, on peut utiliser de multiples systèmes marqueur/substrat dont les longueurs d'onde correspondent à celles auxquelles les matières phosphorescentes sont réceptives Les marqueurs peuvent être sélectivement placés sur des groupes choisis10 au préalable et distincts de macromolécules, et les substrats peuvent être combinés en formant un seul mélange de substrats. Puisque les matières phosphorescentes vont elles- mêmes émettre de la lumière à des longueurs d'onde dis- tinctes, on peut réaliser de diverses façons une discrimi- nation dans le procédé de lecture, selon le procédé parti- culier de lecture que l'on utilise Quand on utilise une détection dans l'infrarouge pour la lecture, par exemple, un tube photomultiplicateur peut, grâce à l'utilisation de20 filtres, effectuer une discrimination entre les émissions de lumière par "Q-16 ", qui sont vertes, et les émissions de lumière par "Q-42 ", qui sont oranges. Comme autre exemple de systèmes combinés mettant en oeuvre la présente invention, on peut signaler l'utilisa- tion de matières phosphorescentes mixtes présentant à la fois des émissions chimioluminescentes et des émissions radioactives dans un système à plusieurs signaux Par exemple, on peut marquer un groupe de molécules du type acide nucléique (ou d'autres macromolécules) avec un mar- queur tel qu'une phosphatase alcaline qui induit une réac- tion de chimioluminescence dans le substrat, comme une réaction qui émet de la lumière à 600 nm, et un autre groupe marqué par du phosphore 32, ou par quelque autre radio-isotope, et qui émet des émissions de radioactivité35 Ps On peut alors utiliser un écran comportant un mélange de matières phosphorescentes, comme une combinaison de "Q-16 " et de "Q-42 " Puisque la matière phosphorescente "Q-42 " est insensible aux émissions de radioactivité A, les macromo- lécules marquées par du phosphore 32 ne seront visualisées que par "Q-16 " La matière phosphorescente "Q-42 " sera cependant sensible aux émissions à 600 nm provenant du substrat chimioluminescent En opérant de la façon décrite dans le paragraphe précédent, un tube photomultiplicateur pourrait effectuer une discrimination entre les émissions de lumière provenant des deux matières phosphorescentes. L'utilisation de mélanges de matières phosphores- centes, dans ces systèmes combinés et dans d' autres systèmes combinés, permet une variété non limitée de comparaisons et de discriminations Par exemple, on peut effectuer une discrimination entre des groupes distincts de macromolé- cules présents dans un échantillon unique ou bien effectuer des comparaisons avec un étalon interne D'autres possibi- lités apparaîtront facilement à l'homme du métier. Le procédé de l'invention peut servir de méthode de détection, de méthode quantitative ou de méthode assurant à la fois une détection et une quantification Le procédé peut servir dans des essais de dosage ou dans d'autres déterminations dans diverses configurations et divers agen- cements, qui apparaîtront facilement à l'homme du métier. En général, l'invention est applicable à n'importe quel mode opératoire destiné à déceler ou à quantifier une macromolécule immobilisée ou une portion d'une macromo- lécule L'invention est particulièrement intéressante pour la visualisation de réseaux tridimensionnels, ou spatiaux, de macromolécules, puisqu'on peut conduire les opérations d'une façon qui fournit une information localisée Une telle visualisation est intéressante pour des réseaux spa- tiaux engendrés par divers modes opératoires de labora- toire, ce qui comprend des électroferrogrammes, des chroma- togrammes, des essais à la touche ou des absorptions par points, ou n'importe quel autre agencement de solutés séparés ou d'espèces séparées. Le terme "immobilisé" sert dans le présent exposé à désigner la rétention d'une espèce à un endroit fixe sur une surface ou matrice non liquide, de manière que l'espèce ne soit pas délogée ou détachée par son contact avec le substrat chimioluminescent en phase liquide La surface ou matrice non liquide peut être un gel en plaque ou barre, comme un gel de polyacrylamide ou de gélose, une membrane absorbante comme de la nitrocellulose ou un dérivé de "Nylon", ou une surface solide et massive, comme du verre revêtu ou une plaque en matière plastique pour des microtitrages. Le marquage sélectif de la macromolécule intéres- sante, par le marqueur, peut être réalisé par l'un quelcon- que des divers moyens connus dans le domaine biochimique. La fixation peut être une liaison de covalence, une liaison de type affinité, une interaction hydrophobe, une inter- action du type hybridation ou n'importe quel autre moyen de fixation La sélectivité peut être inhérente au moyen de fixation, comme dans le cas des interactions par covalence, hydrophobes et d'hybridation, ou bien elle peut être le résultat de la spécificité de liaison de type immunologique ou d'un autre comportement spécifique de liaison Des interactions préférées sont représentées par des inter- actions d'hybridation comme l'utilisation de sondes de ADN ou d'ARN (acide désoxyribonucléique ou acide ribonu- cléique), et des interactions de liaison spécifiques, comme des interactions antigènes-anticorps et des interactions avidine-biotine. Dans ces interactions préférées, le marqueur est conjugué à un élément ou organe approprié de liaison qui se fixe sur la macromolécule immobilisée Cette dernière est ainsi "marquée" avec la sélectivité du marqueur, c'est-à- dire à l'exclusion de la surface ou de la matrice elle-même et des autres macromolécules qui n'ont pas les caractéris- tiques spécifiques de liaison impliquées dans l'attraction. Le conjugué est formé d'une manière traditionnelle par une liaison de covalence, ce qui comprend dans certains cas un agent de liaison croisée, lorsqu'on le souhaite ou que cela est avantageux. On met en oeuvre le procédé de l'invention en immer- geant la phase solide, sur laquelle les macromolécules intéressantes sont immobilisées, dans le substrat à phase liquide, les macromolécules étant marquées par les mar- queurs décrits ci-dessus, de sorte que la réaction de chimioluminescence se produise entre le marqueur et le substrat et qu'une énergie lumineusesoit émise Le substrat liquide, avec la phase solide ainsi immergée dans ce substrat, est exposé à la surface de l'écran phospho- rescent, et il est maintenu ainsi pendant une longueur suffisante de temps pour permettre l'enregistrement ou la détection de la forme d'émission On effectue cela de pré- férence à l'aide d'une barrière transparente de retenue de liquide, la phase solide et l'écran étant suffisamment proches pour que ce dernier forme une image bien définie représentant étroitement le réseau de la ou des sources sur la phase solide. Un agencement commode est un agencement dans lequel la phase solide est placée dans un réceptacle creux enfermé, empli de la solution de substratde manière que la forme de macromolécule soit en face d'une paroi transpa- rente du réceptacle, avec interposition d'une mince couche de la solution entre la macromolécule et la paroi L'écran est maintenu contre le côté opposé de la paroi pendant la longueur de temps précitée Les durées minimales et opti- males sont des matières d'une expérimentation de routine qui va facilement apparaître à l'homme du métier et que celui-ci pourra facilement déterminer. L'invention peut servir dans une large gamme d'essais, de dosages et de modes opératoires de labora- toire Des exemples notables sont des essais de détermi- nation du dosage de protéines, des essais de détermination et de dosage d'anticorps, des modes opératoires de dépis- tage, d'identification et de tri ("criblage"), des études par dilution, du séquençage d'acide désoxyribonucléique (ADN) et la cartographie de gènes ou la formation de cartes génétiques D'autres applications apparaîtront facilement à l'homme du métier. Si l'on regarde maintenant les dessins, on s'aper- çoit que la figure 1 est une représentation d'un procédé pour provoquer une réaction de chimioluminescence selon l'invention et pour recevoir les émissions résultantes sur une matière réceptrice, et la figure 2 est un diagramme d'un agencement de composants pour stimuler la matière réceptrice afin qu'elle émette des signaux correspondant à 1 rémission qu'elle a reçue, et pour déceler les signaux et les convertir en une forme lisible. La figure 1 montre un support 11 sur lequel est ou sont immobilisée(s) une ou des espèce(s) macromoléculaire(s). Comme indiqué ci-dessus, il peut s'agir d'un gel en plaque, d'une membrane de filtre ou d'une surface pleine ou solide, selon le type de mode opératoire que l'on conduit L'espèce macromoléculaire 12 elle-même est localisée à la surface du support en un réseau ou agencement plan distinct, et elle a été marquée par le marqueur 13 La totalité du support est placée dans un réceptacle transparent, comme un sac ou sachet 14 en matière plastique étanche à du liquide et empli de la solution 15 du substrat chimioluminescent. Comme indiqué dans la description générale ci-dessus, le marqueur est de préférence une enzyme, et la solution du substrat contient de préférence suffisamment de substrat pour que les émissions puissent se poursuivre durant au moins 24 h. Un écran phosphorescent 16 est placé sur le sac ou sachet 15 en matière plastique, directement au- dessus de la forme d'immobilisation sur le support, et cet écran est maintenu dans cette position pendant une période de temps suffisante pour recevoir suffisamment d'émission pour être décelable et montrer cependant le même agencement spatial que la forme d'immobilisation sur le support Dans cet exemple illustratif, la matière phosphorescente est une matière qui emprisonne l'énergie de l'émission et ne la dégage que lorsqu'elle est stimulée par une source externe, comme de la lumière infrarouge. Une fois les matières phosphorescentes, présentes sur l'écran 16, suffisamment excitées, l'écran est retiré de son contact avec le sachet 14 de matière plastique et cet écran est placé dans l'agencement optique représenté sur la figure 2 Pour permettre un plein balayage bidimensionnel de l'écran, l'écran est placé sur un appa- reil 21 de translation qui réalise une translation selon10 les axes X et Y (de coordonnées) Le composant 22 de trans- lation selon l'axe des X et le composant 23 de translation selon l'axe des Y, sont commandés par un appareil 24 de commande des organes ou composants de translation selon les axes X et Y. L'écran 16 phosphorescent est stimulé par une énergie lumineuse provenant d'un laser 25 à infrarouge comme, par exemple, un laser à Nd:YAG émettant de la lumière à 1060 nm Le faisceau sortant du laser est colli- maté par des lentilles 26 collimatrices et il est dévié par un miroir 27 à YAG (YAG: grenat yttrium-aluminium) Le faisceau est ensuite focalisé sur l'écran 16 phosphorescent par une lentille, comme un objectif 28 de microscope grandis- sant 20 fois (à grandissement 20 x), commandé par un micro- mètre 29 agissant sur l'axe des Z L'appareil 21 de trans- lation contraint le faisceau à explorer la totalité de la surface de l'écran. * L'énergie libérée par l'écran phosphorescent, sous l'effet de la stimulation par l'infrarouge, est déviée par un miroir 30 froid, elle passe par un filtre 31 et se dirige vers un tube 32 photomultiplicateur alimenté par une source 33 d'énergie à haute tension Le signal provenant du tube photomultplicateur est dirigé vers un oscilloscope 34 et un voltmètre 35 de numérisation à grande vitesse La lecture du voltmètre est mise sous une forme visible par un affichage 36 de graphiques et de courbes, sous la commande d'un ordinateur 37 L'affichage 36 de graphiques et de courbes permet une pleine lecture et la détermination de la présence, de l'emplacement et de la quantité de la macromolécule immobilisée sur la phase 11 de support repré- sentée sur la figure 1. Tous les composants présentés dans cet exemple illustratif peuvent être fournis par un équipement tradi- tionnel et des appareils et instruments traditionnels, qui sont bien connus et largement utilisés dans les labora- toires de biologie moléculaire On souligne une fois encore que cet agencement sert tout simplement à illustrer un procédé de mise en pratique de l'invention D'autres agen- cements viendront facilement à l'esprit de l'homme du métier cherchant à adapter le concept à un système, à un environnement ou des composants disponibles particuliers. L'exemple suivant est offert à titre illustratif et nullement limitatif de l'invention. EXEMPLE On a effectué la synthèse d'un brin d'ADN (acide désoxyribonucléique) en opérant de façon à utiliser un nombre limité de nucléotides UTP (uridine triphosphate) auxquels des molécules de biotine étaient fixées par covalence, à la place de nucléotides TTP (thymidine triphosphate) dans une réaction de marquage statistique ou aléatoire primaire On a ensuite préparé une dilution en série de l'ADN, et l'on a placé une goutte de chaque dilution, sous forme de points, sur une25 membrane en "Nylon" cationisée ("Zeta-Probe"; Bio-Rad Laboratories, Hercules, Californie, Etats-Unis d'Amérique). Les points résultants contenaient l O Opg, l Opg, lpg, O,lpg et O,Olpg, respectivement On a ensuite fait incuber la membrane avec un conjugué steptavidine-phosphatase alcaline (PA), ce qui a eu pour résultat de marquer par la phospha- tase alcaline l'ADN présent dans tous les points On a ensuite placé la membrane dans un sachet de matière plas- tique empli d'une solution aqueuse de 3-( 2 '-spiroadaman- tane)-4-méthoxy-4-( 3 "-phosphoryloxy)phényl-1,2-dioxétanne (AMPPD) qui, en subissant une réaction de chimiolumi- nescence, émet de la lumière à 470 nm, à la concentration de 0,2 m M et dans un volume total de 5 ml. On a ensuite placé une pellicule pour rayons X ("Kodak X-omat") contre le sachet en matière plastique, directement sur les points, comme montré sur la figure 1, et l'on a ensuite exposé à l'AMPPD durant 10 min On a ensuite développé la pellicule par des opérations tradi- tionnelles et courantes de développement d'une pellicule pour rayons X L'observation de lrécran a indiqué que l'on pouvait aisément déceler des images correspondant aux points représentant l O Opg, 10 pg et lpg Une image corres- pondant au point à O,lpg a pu être à peine décelée, et l'on n'a pas pu déceler du tout l'image du point à 0,01 pg. On a ensuite placé le même sachet de matière plas- tique et son contenu contre un écran phosphorescent "Quantex Q- 16 " qui avait été préparé sur un substrat en alumine, de la même façon que la pellicule pour rayons X, et l'on a exposé de même durant 10 min L'écran est composé d'une base en sulfure de strontium, avec de l'oxyde de samarium et de cérium comme dopes,et du sulfate de baryum ainsi que du fluorure de lithium comme fondants, avec une sensibilité à l'infrarouge allant de 1120 nm à 1220 nm, la courbe d'émission de lumière présentant un pic maximal à 510 nm, et cet écran est chargé par de la lumière à 470 nm. Après l'exposition, on a soumis l'écran à une exploration de balayage par laser pour infrarouge, en utilisant l'appa- reil représenté sur la figure 2 Les résultats ont indiqué que l'écran phosphorescent était capable de nettement vi- sualiser les points correspondant à 1 O Opg, 10 pg, lpg, et 0,lpg, mais pas le point correspondant à 0,01 pg. Les détails présentés ci-dessus le sont principa- lement à titre illustratif et nullement limitatif Il appa- raîtra en effet facilement à l'homme métier que l'on peut apporter diverses variations, substitutions et alternatives ou remplacements sans s'écarter de l'esprit et de la portée de l'invention. REVENDICATIONS 1 Procédé pour déceler les macromolécules immobi- lisées sur une matrice, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: (a) marquer sélectivement lesdites macromolécules avec une espèce capable d'induire une réaction de chimiolu- minescence dans un substrat chimioluminescent en phase liquide; (b) placer ladite matrice, comportant lesdites molé- cules ainsi marquées, au contact dudit substrat chimiolumi- nescent en phase liquide pour induire la réaction de chi- mioluminescence; (c) pendant que la matrice et le substrat chimioluminescent en phase liquide sont ainsi en contact, exposer ce substrat chimioluminescent à phase liquide à un écran phosphorescent pour y exciter les matières phosphorescentes que cet écran comporte et former ainsi une image correspon- dant auxdites macromolécules sur ladite matrice; et (d) déceler ladite image à titre d'indication de la présence desdites macromolécules sur la matrice. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat chimioluminescent en phase liquide émet, et les matières phosphorescentes sont excitées par, de la lumière à au moins une longueur d'onde se situant dans l'intervalle compris entre environ 400 nm et 600 nm. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les macromolécules sur ladite matrice comprennent plusieurs groupes distincts; l'étape (a) comprend le mar- quage sélectif de chacun de ces groupes à l'aide d'un mar- queur distinct; l'étape (b) comprend le placement de ladite matrice au contact d'un mélange en phase liquide comportant plusieurs substrats chimioluminescents, dont chacun peut subir sélectivement une induction par l'un desdits marqueurs de façon à subir une réaction de chimio- luminescence avec émission d'une lumière à une longueur d'onde distincte de celle d'autres substrats de ce genre; et l'écran phosphorescent de l'étape (c) contient un mélange de matières phosphorescentes dont chacune peut être sélectivement excitable par de la lumière à l'une desdites longueurs d'onde. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'image formée à l'étape (c) est une image latente, et l'étape (d) comprend la stimulation des matières phos- phorescentes, par un rayonnement électromagnétique consis- tant en de la lumière visible, des rayons X, un rayonnement ultraviolet ou un rayonnement infrarouge, afin d'engendrer des signaux représentatifs de ladite image latente. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (c) comprend l'exposition du substrat chimioluminescent à phase liquide audit écran phospho- rescent, à travers une barrière transparente retenant le liquide. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'espèce utilisée à l'étape (a) est conjuguée à un élément ou organe de liaison capable d'une interaction de liaison, du type affinité, avec lesdites macromolécules, et l'étape (a) comprend la mise en contact de cet élément de liaison et de la matrice pour lier cet élément de liaison à l'une quelconque desdites macromolécules présentes sur la matrice. 7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'espèce utilisée à l'étape (a) est une phosphatase, la réaction de chimioluminescence est une réaction enzyma- tique et le substrat chimioluminescent est un substrat dans lequel la vitesse de la réaction de chimioluminescence est amplifiée par une phosphatage. 8 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat chimioluminescent en phase liquide est une solution aqueuse d'un composé hydrosoluble capable de subir une réaction de chimioluminescence. 9 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matrice est une membrane sur laquelle lesdites macromolécules sont immobilisées en un réseau ou un agen- cement plan; ledit substrat chimioluminescent en phase liquide est retenu dans un réceptacle ayant une paroi transparente plane; l'étape (b) comprend l'immersion de la membrane dans ledit réceptacle, avec le réseau plan de macromolécules voisin de la paroi transparente plane;5 l'écran phosphorescent utilisé à l'étape (c) forme une surface solide plane; et l'étape (c) comprend le maintien de l'écran phosphorescent au voisinage de la paroi trans- parente plane, à l'extérieur dudit réceptacle. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (b) comprend la mise en contact de la matrice avec une quantité du substrat chimioluminescent en phase liquide suffisante pour provoquer la poursuite, pen- dant au moins 24 h environ, des émissions de la lumière de chimioluminescence.