FR 2671560 A1 19920717 FR 9200347 A 19920115 La présente invention est relative à la production d'éthanol, et plus particulièrement, à un procédé de production d'éthanol selon des rendements élevés, à partir de la levure Brettanomyces custersii fermentant le cellobiose, en mettant en oeuvre un procédé de fermentation et de saccharification simultanées utilisant des matières cellulosiques comme substrat. Dans le passé, l'éthanol était produit selon un procédé consistant à faire réagir une cellulase sur de la cellulose comme substrat, afin de saccharifier par voie enzymatique la cellulose en glucose, et à faire réagir ensuite séparément le glucose résultant avec un micro-organisme producteur d'éthanol, afin de produire de l'éthanol Toutefois, en mettant en oeuvre ce procédé classique, la conversion de la cellulose en glucose à l'aide d'une cellulase est faible et, en conséquence, on obtient d'importantes quantités d'un résidu cellulosique non converti On obtient donc de faibles rendements en éthanol, en soumettant le liquide saccharifié à une fermentation. L'éthanol présente néanmoins un important intérêt pour une large variété d'industries, en raison des situations de crise d'énergie passées et futures potentielles, et la conversion de ces matières cellulosiques en des combustibles utiles, notamment l'éthanol, présente un intérêt particulier. La cellulose et l'hémicellulose sont les deux composés organiques bruts les plus abondants et renouvelables dans le monde, et elles représentent ensemble environ 70 pour cent de la biomasse végétale de l'ensemble du monde, par rapport au poids à sec. Ces matières premières sont largement disponibles dans les résidus dérivés de l'agriculture, des forêts, des légumes et de l'industrie alimentaire, et la conversion efficace de ces résidus en produits utiles tels que l'éthanol, contribuerait à réduire les problèmes de rejet et procurerait une source abondante et peu coûteuse de combustible Une autre biomasse contenant de la cellulose peut être cultivée de manière spécifique pour procurer une matière première pour la production d'éthanol, et assurer une production d'éthanol à grande échelle pour une utilisation comme combustible. De manière plus-spécifique, la biomasse végétale contient en général de 40 à 50 pour cent de cellulose et de 30 à 40 pour cent d'hémicellulose, le reste consistant en lignine Si l'on pouvait élaborer un procédé de conversion de la cellulose et de l'hémicellulose disponibles en éthanol selon des rendements élevés, ce procédé fournirait de manière presque illimitée, un combustible liquide destiné à des utilisations pour le transport. La cellulose est facilement décomposée en ses hydrolysats de glucose et de cellobiose, par hydrolyse acide ou hydrolyse enzymatique Tandis que le glucose est facilement fermentable en éthanol par l'intermédiaire de nombreux micro-organismes, le cellobiose s'est avéré, au mieux, difficile à convertir en éthanol Même dans ce cas, il peut être converti en éthanol seulement selon de très faibles rendements ou concentrations Voir R. Dekker dans Biotechnology Letters, Volume 4, N O 7, pages 411 à 416, 1982; et R Maleska et al dans Biotechnology Letters, Volume 4, N O 2, pages 133 à 136, 1982. L'hémicellulose est également facilement et rapidement convertie en ses divers hydrolysats, par hydrolyse acide douce ou hydrolyse enzymatique, et les produits résultants comprennent divers pentoses (le xylose et l'arabinose étant les principaux dérivés), des hexoses (le mannose et le galactose) et des sucres acides Le D-xylose est de loin le principal sucre résultant de l'hydrolyse de l'hémicellulose, et il constitue d'environ 60 à 80 pour cent de la totalité des hydrolysats produits à partir de celle-ci. On a étudié et décrit dans la littérature divers procédés qui mettent en oeuvre différentes levures pour fermenter le xylose en éthanol Une motivation principale de ces recherches consiste en ce que la fermentation de sucres à 5 atomes de carbone dérivés de l'hémicellulose est très importante afin d'utiliser complètement la matière de biomasse pour produire de l'éthanol Des exemples de tels documents techniques antérieurs comprennent les brevets US-A-4 511 656, 4 368 268, 4 359 534 et 4 477 569 Ces procédés ne convertissent toutefois pas le D-xylose en éthanol selon des rendements suffisants et selon des vitesses suffisamment élevées pour être efficaces et économiques. Le brevet US-A-4 385 117 est relatif à un procédé de production continue d'éthanol de telle façon qu'un substrat puisse être ajouté dans un milieu de fermentation, et que l'éthanol puisse être éliminé de celui-ci au cours d'une fermentation, selon lequel on soumet un milieu aqueux nutritif contenant le substrat selon une concentration en substrat dans le milieu de fermentation supérieure à 1 pour cent (p/v),le substrat comprenant de l'amidon, de la pectine, des monosaccharides et des disaccharides, dans des conditions anaérobies et thermophiles, à l'action de fermentation d'un dérivé du micro-organisme Thermoanaerobacter ethanolicus Ce brevet est toutefois relatif à un micro-organisme thermophile plutôt que mésophile mis en oeuvre avec des substrats selon une concentration supérieure à 1 pour cent, et il s'avère qu'il existe une nette diminution de la tolérance à l'éthanol avec des concentrations en amidon supérieures à 1 pour cent, celle-ci étant bien entendu une très faible concentration en substrat dans un procédé de saccharification et de fermentation. Le brevet US-A-4 464 471 est relatif à un plasmide d'ADN recombinant comprenant un vecteur de clonage auquel est lié de manière covalente un segment d'insertion d'ADN codant pour la production de béta-glucosidase, le segment d'insertion d'ADN codant pour la production de bétaglucosidase étant isolé à partir de Esherichia adecarboxylata, mais ce brevet est relatif à un micro-organisme modifié par génie génétique par codage dans un plasmide, et celui-ci n'est pas un organisme naturel et il n'a pas été mis en oeuvre dans des opérations de saccharification et de fermentation simultanées. Le brevet US-A-4 472 501 est relatif à un procédé de production d'éthanol, selon lequel on cultive un micro-organisme appartenant au groupe des micro-organismes ayant les caractéristiques d'identification de Kluyveromyces cellobiovorus NRRL Y-12509, et un micro-organisme ayant les caractéristiques d'identification de Kloeckera apiculata NRRL Y-12510 capable de produire de l'éthanol et d'assimiler au moins une source de carbone choisie parmi le xylose et le cellobiose, dans un milieu contenant une source assimilable de xylose et/ou de cellobiose, jusqu'à ce que l'on obtienne une quantité récupérable d'éthanol dans la liqueur de culture, et on récupère ensuite l'éthanol à partir de celle-ci Les micro-organismes sont toutefois différents de ceux de la présente invention, et ces micro-organismes sont comparés eu égard à leur efficacité, à un agent de fermentation du glucose (Saccharomyces cerevisiae) bien que l'un de ces organismes ait donné lieu à un faible rendement en éthanol sur de la cellulose cristalline, et que les autres aient résulté en une fermentation sur le glucose, le xylose et/ou le cellobiose. Dans le brevet US-A-4 840 903, on décrit un procédé de production d'éthanol à partir de biomasse végétale, en formant un substrat à partir de cette biomasse, le substrat comprenant les hydrolysats de la cellulose et de l'hémicellulose, après quoi on sélectionne et on isole une espèce de champignon Paecilomyces ayant la capacité de fermenter tant le cellobiose que le xylose en éthanol Le substrat est inoculé avec ce champignon, et le substrat inoculé est fermenté dans des conditions favorables à la viabilité des cellules et à la conversion des hydrolysats en éthanol, et l'éthanol est récupéré à partir du substrat fermenté La conversion du cellobiose et du xylose en éthanol est toutefois effectuée selon le processus d'un champignon et non d'une levure, et les rendements ainsi que les taux d'éthanol ne sont pas suffisants pour que le procédé de saccharification simultanée soit économiquement susceptible d'être mis en oeuvre. Un but de la présente invention consiste à procurer des taux et des rendements en éthanol améliorés selon un procédé de saccharification et de fermentation simultanées, et la présente invention atteint ce but en incorporant une levure qui peut fermenter non seulement le glucose, mais également le cellobiose, dans la mesure o elle produit sa propre enzyme béta-glucosidase. Un autre but de la présente invention consiste à procurer une levure qui fermente le cellobiose selon un procédé de saccharification et de fermentation simultanées, sans avoir besoin de mettre en oeuvre en plus dans le procédé, une quantité importante et coûteuse d'enzyme bétaglucosidase, afin d'éviter de faibles taux et rendements en éthanol. Encore un autre but de la présente invention consiste à procurer des souches de levure fermentant le cellobiose destinées à être employées dans des procédés de saccharification et de fermentation simultanées, qui ne sont caractérisées ni par une faible tolérance à l'éthanol, ni unefaible vitesse de production d'éthanol. Encore un autre but de la présente invention consiste à procurer une levure qui puisse fermenter non seulement le glucose, mais également le cellobiose, dans la mesure o elle produit sa propre enzyme béta-glucosidase. Le procédé de la présente invention atteint les buts précités en employant Brettanomyces custersii (CBS 5512) comme agent de fermentation du cellobiose dans un procédé de saccharification et de fermentation simultanées, cette levure ayant une tolérance à l'éthanol élevée (à savoir environ 94 grammes par litre) et une plage de température tolérée élevée ( 30 C-37 'C), et elle procure des vitesses et des rendements de conversion en éthanol élevés. Les dessins annexés qui sont incorporés et font partie de la description, illustrent des modes de réalisation préférés de la présente invention, et ils servent en combinaison avec la description, à expliquer les principes de la présente invention. Sur les dessins: la figure 1 est un graphique comparatif représentant les rendements et les vitesses de production d'éthanol en employant la levure Brettanomyces custersii fermentant le cellobiose, par comparaison à d'autres souches de levure, selon un procédé de saccharification et de fermentation simultanées mettant en oeuvre la cellulose et une enzyme cellulase. La figure 2 est un graphique comparant la production d'éthanol à partir de cellobiose à 15 %, par la levure B custersii sélectionnée à 37 *C, par comparaison à une autre levure de fermentation dans les mêmes conditions. Dans un procédé de saccharification et de fermentation simultanées, la saccharification provoque la décomposition de la cellulose en sucres plus simples à l'aide d'une enzyme cellulase Un tel sucre est le cellobiose, sucre qui comprend deux molécules de glucose, ultérieurement décomposé en glucose L'enzyme cellulase a, de manière caractéristique, une quantité suffisante de béta- glucosidase constituant la fraction de l'enzyme cellulase qui décompose le cellobiose en glucose Le cellobiose inhibe les enzymes endo et exo- glucanases, et ceci réduit la vitesse ainsi que le rendement de production globale d'éthanol dans un procédé de saccharification et de fermentation simultanées. Il existe des souches de levure industrielles disponibles dans le commerce qui fermentent le glucose et le maltose, mais pas le cellobiose, et ceci rend nécessaire de compléter le procédé de saccharification et de fermentation simultanées avec une importante quantité d'enzymes béta-glucosidase afin d'éviter de faibles vitesses de production d'éthanol et de faibles rendements en éthanol, et ce procédé complété est très coûteux Par ailleurs, dans les cas o l'on avait trouvé des souches de levure fermentant le cellobiose, elles avaient en général une faible tolérance à l'éthanol etune faible vitesse de production d'éthanol. La souche de levure Brettanomyces custersii (CBS 5512) s'est avérée très bien fermenter le cellobiose à une température d'environ 37 OC lorsqu'elle est employée dans un procédé de saccharification et de fermentation simultanées, et elle procure tant une vitesse de production d'éthanol plus élevée, qu'un rendement en éthanol plus élevé par rapport à une autre levure de fermentation du cellobiose connue. La base de la présente invention réside dans ce que ce procédé est capable de produire des rendements et des concentrations élevés en éthanol à partir d'une large variété de sucres à six atomes de carbone dérivés de la cellulose et de l'hémicellulose Selon la présente invention, on fermente plus particulièrement des disaccharides tels que le saccharose, le maltose, le lactose et le cellobiose, mais pas le mélibiose ni le tréhalose), des polysaccharides tels que l'amidon et des hexoses tels que le glucose, le fructose, le sorbose, le mannose et le galactose On peut ainsi obtenir des rendements élevés en éthanol à partir de l'ensemble des produits d'hydrolyse de la cellulose et de l'hémicellulose, ainsi que de certains des sucres dérivés de celles-ci, ce qui procure ainsi un procédé très économique de production d'éthanol. La présente invention a en particulier pour objet un procédé mettant en oeuvre la souche de levure Brettanomyces custersii pour produire de l'éthanol par fermentation La solution destinée à être fermentée peut comprendre un mélange des hydrolysats de cellulose comprenant le Dcellobiose et le D-glucose, et des solutions de sucres à base de mannose et de D-galactose dérivés de l'hémicellulose. En mettant en oeuvre le procédé de la présente invention, il est possible de fermenter les combinaisons des sucres mentionnées ci-dessus ainsi que d'autres sucres apparentés. Une espèce du genre en question a été isolée à partir d'un échantillon de terre, et entretenue dans une boîte de gélose et de dextrose de pomme de terre. Cette souche de levure spécifique était biologiquement pure, et elle a été identifiée comme étant Brettanomyces custersii (CBS 5512) Un échantillon de cette souche a été déposé à la collection de cultures de l'American Type Culture Collection, et elle est disponible au public sous le numéro ATCC 34447. Le milieu de culture employé pour la fermentation selon la présente invention, peut être une quelconque composition de culture connue comprenant des sources d'azote, des compléments minéraux, des vitamines et des sources de carbone appropriés Ces sources de carbone peuvent comprendre des hexoses (le D-glucose, le D-galactose et le mannose) et des disaccharides (le D-cellobiose) On a inoculé des échantillons du milieu de culture avec Brettanomyces custersii, et on les a laissé fermenter pour produire de l'éthanol L'éthanol a été analysé en mettant en oeuvre des techniques de chromatographie en phase gazeuse standard. On a largement fait varier la pression d'oxygène dans le procédé de fermentation, et la pression d'oxygène peut être micro-aérophile pour une fermentation discontinue, ou le substrat inoculé peut être aspergé avec une faible quantité d'air dans les techniques de fermentation en continu. En outre, on peut également mettre en oeuvre une fermentation anaérobie La technique dépend de la densité de cellules initiale, de la concentration en substrat, et des conditions d'incubation de l'inoculum. Le p H du milieu de fermentation peut varier d'environ 3,5 à 6,0. La température du procédé de fermentation de la présente invention, peut également varier de manière importante d'environ 28 C à environ 42 OC La plage préférée est toutefois d'environ 30 O C à 39 OC. L'espèce de levure Brettanomyces custersii (CBS 5512) de la présente invention est capable de fermenter une large variété de sucres en tant que sources de carbone dans le milieu de culture décrit ci-dessus. Des exemples de fermentation spécifique mettant en oeuvre le procédé de la présente invention, sont mentionnés ci-dessous. SACCHARIFICATION ET FERMENTATION SIMULTANEES 8 % de cellulose 1 % d'extrait de levure 2 % de peptone Milieu: 5 ml/l de lipides* 2 ml/l d'antibiotiques* *Lipides Solution de base 50 mg de Tween 80 50 mg d'Ergostérol 1) Dissolution de l'ergostérol dans un volume minimal d'éthanol à 95 % ( 2 à 3 ml) 2) Mélange de la solution d'ergostérol et d'éthanol dans 50 mg de Tween 80 ( 0,8 % d'acide oléique non estérifié) il 3) Evacuation et purge avec N 2. Concentration finale dans le milieu = Ergostérol: 5 ml/l; acide oléique: 30 ml/1 *Antibiotiques: Pénicilline: 10 mg/l ( 16 500 U) Streptomycine: 10 mg/l Solution de base: 500 mg de pénicilline (stérilisée sur 500 mg de streptomycine filtre) 100 ml de H 20 SACCHARIFICATION ET FERMENTATION SIMULTANEES A GRANDE ECHELLE Exemple 1 On a ajouté un milieu cellulosique dans un récipient de 6 1 contenant 1 1 d'eau, et le volume a été amené jusqu'à environ 2 500 ml afin de ménager de la place aux inoculums Le milieu a été mélangé dans un fermenteur, et on a ajouté une solution lipidique de base de 5 ml/l d'ergostérol et de 30 ml/l d'acide oléique, après quoi le mélange a été traité dans un autoclave à une température d'environ 120 C pendant environ 35 à 40 minutes On a ajouté un mélange d'antibiotiques contenant 500 mg (à 10 mg/l) de pénicilline et 500 mg (à 10 mg/1 l) de streptomycine, et le p H a été contrôlé pour s'assurer qu'il était d'environ 4,5 à environ 5,0 L'enzyme cellulase a ensuite été ajoutée, et on a ajouté un inoculum de Brettanomyces custersii (CBS 5512) d'une densité cellulaire de 2 x 107 selon une quantité suffisante pour porter le volume jusqu'à la graduation de 3 1 avec de l'eau stérile L'enzyme a décomposé la cellulose en sucre glucose que la levure a fermenté en éthanol, et l'éthanol a ensuite été séparé du substrat fermenté. La figure 1 illustre les données comparatives d'un procédé de saccharification et de fermentation simultanées avec la levure Brettanomyces custersii (CBS 5512) de la présente invention par comparaison à d'autres souches de levure, à savoir T molishiana, H glucozyma H holstii, B anomalus, S. diastaticus, S cerevisiae n 67, K marxianus et S. cerevisiae D 5 A Après seulement environ 5 jours, environ 33 g/l d'éthanol ont été produits en employant la souche de levure Brettanomyces custersii (CBS 5512), et ceci correspond à une vitesse et un rendement nettement meilleurs que dans le cas des au- tres levures. Ainsi que cela est illustré sur la figure 2, avec la levure Brettanomyces custersii (CBS 5512) sélectionnée à 37 C avec du cellobiose à 15 %, on a obtenu 65 g/l d'éthanol, et ce rendement est nettement meilleur que celui obtenu en employant B. clausenii, H glucozyma, H holstii et C lusitaniae. Ainsi qu'on peut le remarquer d'après ce qui précède, le procédé de fermentation de la présente invention utilisant la levure Brettanomyces custersii (CBS 5512) est capable de fermenter la cellulose et des compositions de sucre à base de cellobiose en éthanol Ce qui est le plus important consiste en ce que les composants glucidiques à 6 atomes de carbone dérivés de la cellulose et de l'hémicellulose, c'est- à-dire le cellobiose et le glucose, sont tous capables d'être facilement fermentés pour produire des rendements importants en éthanol En outre, d'autres hexoses qui sont présents selon des quantités moins importantes dans la biomasse végétale, sont également facilement convertibles en éthanol en mettant en oeuvre le procédé de la présente invention. Compte tenu de ce qui précède, le procédé de la présente invention permet de produire d'importantes quantités d'éthanol de façon économique, et à partir d'une source presque illimitée de matière La présente invention procure ainsi un procédé très utile et économique pour produire un combustible De plus, les composants à base d'hémicellulose d'une quelconque biomasse végétale, n'ont pas besoin d'être séparés avant hydrolyse et fermentation de leurs sous-produits. La levure de la présente invention peut être employée pour fermenter de nombreux mélanges de sucres pour produire de l'éthanol, ce qui procure ainsi un procédé nettement plus économique eu égard au rendement, au temps nécessaire pour produire l'éthanol et aux substrats qui peuvent être employés. On considère que la description ci-dessus illustre seulement les principes de la présente invention Par ailleurs, puisque de nombreuses modifications et variantes apparaîtront facilement à l'homme de l'art, on ne souhaite pas limiter la présente invention à la réalisation et la mise en oeuvre exactes décrites ci-dessus, et les modifications ainsi que les équivalents appropriés sont en conséquence compris dans la portée de la pré- sente invention telle que définie par les revendica- tions annexées. REVENDICATIONS 1 Procédé de saccharification et de fermentation simultanées pour l'obtention de rendements et de taux d'éthanol améliorés à partir de matières de biomasse, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant: à former un substrat à partir de matières de biomasse choisies parmi la cellulose, l'hémicellulose et l'amidon; à ajouter à ce substrat, un acide hydrolytique ou une enzyme hydrolytique choisie parmi les celluloses, les 6-glucosidases, les amylases et les glycoamylases; à sélectionner et à isoler une espèce de levure Brettanomyces custersii (CBS 5512), cette espèce ayant la capacité de fermenter tant le cellobiose que le glucose en éthanol; à inoculer ce substrat avec l'espèce de levure choisie, pour obtenir une saccharification et une fermentation simultanées dans des conditions favorables à la viabilité des cellules et à la conversion des hydrolysats en éthanol; et à récupérer l'éthanol à partir de ce substrat. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la saccharification et la fermentation du substrat sont effectuées à une température d'environ 28 OC à 42 C. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la température varie de 30 O C à 39 C. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le p H du substrat inoculé est maintenu à environ 3,5 jusqu'à 6,0 au cours de la saccharification et de la fermentation. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la biomasse comprend de la cellulose et de l'hémicellulose, et en ce que la saccharification et la fermentation sont effectuées sur la cellulose et l'hémicellulose. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la saccharification est effectuée par hydrolyse acide. 7 Procédé de saccharification et de fermentation simultanées pour l'obtention de taux et de rendements améliorés en éthanol, à partir d'un substrat à base de cellulose ou d'amidon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant: à former un substrat choisi parmi les hexoses, les disaccharides comprenant le saccharose, le maltose, le cellobiose et le lactose, ainsi que les mélanges de ceux-ci; à ajouter à ce substrat, une enzyme hydrolytique choisie parmi les cellulases p- glucosidase et les amylases glucoamylase; à inoculer ce substrat avec une espèce de la levure Brettanomyces custersii (CBS 5512) pour effectuer une saccharification et une fermentation simultanées dans des conditions favorables à la viabilité des cellules et à la conversion des hydrolysats en éthanol; et à récupérer l'éthanol à partir de ce substrat. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la fermentation du substrat inoculé, est effectuée à une température d'environ 28 OC à 42 O C. 9 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le p H du substrat inoculé est d'environ 3,5 à 6,0 au cours de sa fermentation. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les hexoses sont choisis parmi le D-glucose, le mannose, le D- galactose, le fructose, le sorbose et les mélanges de ceux-ci. 11 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le disaccharide est choisi parmi le D-cellobiose, le saccharose, le maltose, le lactose et les mélanges de ceux-ci. 12 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le substrat est un disaccharide. 13 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le substrat comprend un mélange d'au moins du glucose et du cellobiose. 14 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les hexoses comprennent des sucres venus d'hydrolyse de la cellulose et de l'hémicellulose. Procédé de saccharification et de fermentation simultanées en éthanol d'une solution aqueuse contenant des sucres, caractérisé en ce qu'on inocule la solution avec une espèce de la levure Brettanomyces custersii (CBS 5512). 16 Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la fermentation est effectuée jusqu'à ce que la fermentation des sucres présents dans la solution soit à peu près complète. 17 Procédé de saccharification et de fermentation simultanées pour l'obtention de rendements et de taux améliorés d'éthanol à partir d'une matière de biomasse contenant de la cellulose, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape consistant: à ajouter une enzyme cellulase en combinaison avec une espèce de levure Brettanomyces custersii (CBS 5512) à un substrat à base de cette matière de biomasse au sein d'un bouillon, de telle façon que la levure fermente en éthanol les sucres formés dans ce bouillon, ces sucres étant produits par hydrolyse avec la cellulase. 18 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que lesdits sucres sont choisis parmi le D-glucose, le D-galactose, le maltose, le méthyl-a-D-glucoside, le saccharose, l'a,a-tréhalose, le cellobiose et le mélézitose.