FR 2661834 A1 19911115 FR 9005775 A 19900509 Procédé de fabrication d'immunogènes de rétrovirus et de vaccins contre les infections rétrovirales, notamment HIV, et immunogènes et vaccins obtenus. La présente invention a trait à un procédé de fabrication d'immunogènes de rétrovirus et de vaccins contre les infections rétrovirales ainsi qu'aux immunogènes et aux vaccins obtenus L'invention s'applique notamment aux virus de l'immunodéficience humaine (HIV) mais peut également s'appliquer à d'autres rétrovirus humains, notamment HTLV-1 et HTLV-2, et animaux, par exemple BLV. L'extraordinaire effort de recherche qui a été provoqué par l'apparition et le développement, sur le mode d'une pandémie, des infections à HIV, a abouti à l'isolation ou la construction de nombreux antigènes dérivant de HIV et d'autres rétrovirus Cependant, si ces résultats ont fait faire des progrès importants dans le domaine de la détection des infections rétrovirales, et notamment HIV, la recherche d'un vaccin protecteur a abouti à de nombreuses déceptions. 2- Une nouvelle approche du problème a été proposée dans la demande de brevet PCT WO 88/09670 Jonas SALK et Dennis J CARLO qui a abouti à la réalisation d'un immunogène constitué de virions non infectieux, en fait inactivés, et dépourvus de glycoprotéines d'enveloppe Dans le cas du virus HIV, ces immunogènes, qui seront appelés ci- après de type SALK, sont dépourvus de glycoprotéines d'enveloppe gp 160 ou gp 120 Il est renvoyé à cette demande PCT, ainsi qu'aux autres publications intervenues, pour l'énoncé des considérations théoriques à la base de cette approche et qui peuvent se résumer, en première approximation, à l'intérêt d'éviter l'induction d'anticorps antienveloppe dont le rôle facilitant l'infection est maintenant reconnu et à la recherche d'une protection à médiation cellulaire. La demande de brevet précitée propose également un procédé de fabrication de ces immunogènes et vaccins HIV (qui englobent non seulement HIV-1 mais également HIV-2) par culture de cellules infectées par HIV, dans un milieu convenable, en l'occurrence le milieu RPMI 1640 en présence de 10 % de sérum de veau foetal en tampon m M HEPES, additionné d'antibiotiques Après filtration du surnageant, il est procédé à une inactivation à la béta- propiolactone pendant 5 heures à p H sensiblement neutre à 370 C à une concentration au 1:4000 Le surnageant congelé est ensuite soumis à une gamma irradiation puis, après décongélation, concentré par ultrafiltration, puis purifié par une succession d'ultracentrifugations, l'étape de gamma irradiation pouvant d'ailleurs également suivre les étapes de purification. Ce procédé, au demeurant contrôlé par des vérifications poussées, permet d'obtenir, à partir d'un litre de surnageant, une dizaine de doses de type SALK comprenant environ 100 ug/ml de protéines totales. Ce procédé, qui doit être mis en oeuvre par des techniciens hautement qualifiés, ne se prête pas à une -3- exploitation industrielle, non seulement à cause de son faible rendement, mais encore à cause des risques qui peuvent être liés à une disparition incomplète des propriétés infectieuses, notamment dans le cas du traitement de très grands volumes, sans parler de la nécessité d'obtenir, dans le but de présenter un vaccin pouvant être administré systématiquement, et notamment un vaccin de prévention, une pureté extrêmement poussée. Il est d'ailleurs à remarquer que, compte tenu du principe même des immunogènes de type SALK, il est extrêmement difficile et même apparemment contradictoire de vouloir augmenter à la fois le rendement, la pureté, la certitude de l'absence d'infectivité et le pouvoir immunogène et protecteur. La présente invention se propose de fournir un tel procédé de fabrication d'immunogènes de rétrovirus et de vaccins contre les infections rétrovirales, notamment HIV, pouvant être mis en oeuvre de façon industrielle dans des conditions de sécurité optimales pour le personnel, en obtenant un rendement très important, un degré de pureté extrêmement poussé et une certitude d'absence de caractère infectieux, et ceci sans perturber les propriétés immunogènes et protectrices de la préparation particulaire antigénique obtenue. L'invention a pour objet un procédé de fabrication d'immunogènes de rétrovirus et vaccins contre les infections rétrovirales, notamment HIV, de type SALK, dans lequel on produit, par culture de cellules infectées, une récolte, de préférence dans un surnageant, de particules rétrovirales comprenant leur enveloppe, on ajoute à la suspension de particules, au besoin préalablement filtrée, un agent inactivant viral usuel dégradant l'enveloppe, tel que la béta-propiolactone par exemple, on concentre la suspension, on la soumet à une gamma-irradiation et on la purifie, caractérisé en ce qu'aux étapes de traitement de l'enveloppe par ledit agent et d'irradiation, on associe une -4- étape de chauffage de longue durée et une étape de purification permettant l'élimination des glycoprotéines extérieures d'enveloppe. Conformément à une caractéristique préférée de l'invention, on prévoit une étape de traitement à l'aide d'un agent dégradant l'enveloppe virale, de préférence la béta-propiolactone, comprenant une première étape d'incubation, de longue durée à faible température, suivie d'une deuxième étape d'élévation de température La première étape peut permettre à l'agent, tel que la béta- propiolactone, de dissocier l'enveloppe rétrovirale et d'agréger les protéines extérieures d'enveloppe, telles que gp 120 ou gp 160 pour HIV, pendant une durée importante, de préférence supérieure ou égale à 16 heures à une température basse, de préférence de 4 à 80 C, alors que la deuxième étape de chauffage, de préférence à une température de l'ordre de 37 + 10 C, pendant une durée d'au moins 3 heures, assure une dégradation de l'agent inactivant tout en préservant les éléments antigéniques désirables des particules virales. Conformément à une caractéristique préférée de l'invention, la gammairradiation est effectuée à une dose de l'ordre de 45 k Gray. Conformément à une caractéristique également préférée de l'invention, l'étape de chauffage est effectuée en milieu liquide pendant une durée d'au moins une heure à une température de l'ordre de 60 C et l'on peut parvenir à l'inactivation totale de la transcriptase inverse rétrovirale tout en conservant les propriétés antigéniques recherchées. Les étapes de purification proprement dites sont destinées, comme dans le procédé antérieurement décrit, à éliminer les protéines étrangères, et notamment les protéines en provenance du milieu de culture Cependant, conformément à une caractéristique préférée de l'invention, ces étapes comprennent une étape d'élimination des glycoprotéines rétrovirales extérieures d'enveloppe, -5- effectuée dans des conditions de p H très acide et l'on préfère, à cette fin, une étape de diafiltration à p H de l'ordre de 4,50 ou 4,70, par exemple en acétate de sodium m M en présence de Na CI 2 M, cette étape étant de préférence suivie par une étape de diafiltration destinée au rééquilibrage du p H et de la force ionique. L'ordre de succession des quatre étapes de traitement à la bétapropiolactone ou d'un autre agent, de préférence, classique, de dégradation d'enveloppe, par exemple le formaldéhyde, de gammairradiation, de chauffage et de purification éliminant les glycoprotéines extérieures d'enveloppe, peut être quelconque. Cependant, on préférera que l'étape de traitement par la bétapropiolactone ou autre agent précède l'étape de purification de façon à mettre à profit la formation d'agrégats de protéines externes plus faciles à éliminer. L'étape de gamma-irradiation sera effectuée à un moment quelconque du cycle, en fonction, en fait, des nécessités techniques. Quant à l'étape de chauffage, on préférera la mettre en oeuvre dans une phase finale du procédé afin de faire porter le chauffage sur un produit déjà hautement purifié et dépourvu de protéines exogènes et, de préférence, dans les récipients utilisés dans l'installation dans laquelle on effectue l'ajustement de la concentration en protéines virales. Outre la dégradation irréversible de la transcriptase inverse, l'étape de chauffage provoque encore, s'il en est besoin, la rupture de la capside et la dégradation de l'enveloppe et de ses constituants glycoprotéiques. De préférence, on procède, à plusieurs étapes du procédé selon l'invention, à des congélations suivies de décongélations destinées à provoquer la rupture des formations protéiques de l'enveloppe et de la capside rétrovirales, les étapes de congélations pouvant en outre être utilisées pour le transport de la préparation en cours de traitement entre différentes installations, et notamment vers l'installation de gamma-irradiation, en général extérieure à l'installation o s'effectue l'essentiel des étapes de fabrication. Comme cela a été précisé, les étapes de purification, qui peuvent avantageusement mettre à profit des étapes précédentes, notamment de traitement à la béta- propiolactone et de concentration permettant de préférence l'élimination d'une quantité importante des protéines étrangères, par exemple les protéines bovines, comportent un ensemble d'étapes de diafiltration assurant l'élimination des protéines rétrovirales externes d'enveloppe Ces étapes de diafiltration comprennent, de préférence, un premier stade de diafiltration permettant l'élimination des protéines bovines, par exemple à p H 7,25, puis le stade d'élimination des glycoprotéines d'enveloppe, de préférence en tampon acide à p H très acide, et enfin un troisième stade de rééquilibrage de la force ionique et du p H. Cependant, dans d'autres modes de mise en oeuvre, moins préférés, de l'invention, une élimination de glycoprotéines extérieures d'enveloppe peut être obtenue par dissociation par des détergents anioniques, tels que Triton, SDS, Tween, NP 40 ou des solvants organiques du type ether/chloroforme, suivie d'une séparation. De façon avantageuse, on peut ensuite procéder à une gel-filtration permettant l'élimination de l'albumine bovine restante, suivie, si nécessaire, d'un passage sur échangeur d'ions permettant l'élimination des protéines résiduelles. Une ultracentrifugation peut ensuite être mise à profit pour éliminer le tampon utilisé lors de la récupération des éléments d'origine virale sur la colonne échangeuse et provoquer une nouvelle concentration, le culot étant ensuite repris en milieu liquide stérile, ajusté si -7- besoin à la concentration désirable, puis soumis, de préférence à ce stade, à l'étape de chauffage On obtient à ce niveau un produit dit produit final vrac PFV constitué d'une suspension d'antigènes purifiés, avec un rendement de plus de 50 doses par litre de surnageant initial. Le procédé selon l'invention peut être complété par des opérations d'élimination des débris d'acides nucléiques, par exemple par ultracentrifugations successives. Le produit final vrac peut alors être conditionné soit sous forme de doses vaccinales après addition d'un adjuvant, soit sous forme de doses de test d'intradermoréaction (IDR) aux dilutions appropriées. Le procédé selon l'invention peut partir d'un surnageant de culture de rétrovirus sur des cellules convenablement infectées Les modalités et conditions de cultures ne sont pas déterminantes. Dans le cas de HIV, il est intéressant d'utiliser une lignée cellulaire infectée mais viable ayant intégré le provirus rétroviral. A titre d'exemple, on peut utiliser une lignée CEM dérivant de lymphocytes T humains infectés par le virus HIV LAV, disponible chez le Professeur Montagnier à l'Institut Pasteur La lignée CEM a fait l'objet d'un dép 8 t ATCC no CCL 119. Cette lignée peut également être infectée par d'autres souches de virus HIV-1 D'autres lignées cellulaires chroniquement infectées par HIV peuvent être utilisées, par exemple la lignée HB 2 ou A 102. L'invention a également pour objet les immunogénes de rétrovirus, y compris de rétrovirus HIV-1 ou HIV-2, de HTLV I, HTLV II ou d'autres rétrovirus humains ou animaux, obtenus par le procédé selon l'invention et se caractérisant par leur immunogénicité. Ces immunogénes peuvent être utilisés, par exemple, pour la détermination par intradermoréaction de la 8- réponse immunitaire de l'organisme Les différentes dilutions pour V'IDR peuvent être par exemple de 0,1, 1 et jug par ml de protéines totales dont l'essentiel est d'origine virale. L'invention a également pour objet les vaccins obtenus par le procédé selon l'invention, notamment des vaccins anti-HIV, et ces vaccins étant de préférence adjuvés à l'aide d'adjuvants classiques tels que par exemple adjuvant incomplet de Freund et conditionnés par exemple sous dose de 1 ml adjuvé avec une teneur de préférence de l'ordre de l O Oug/ml de protéines totales. Dans le cas du virus HIV, on peut, si on le souhaite, mélanger les immunogènes provenant de souches différentes de virus HIV. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif relatif à la préparation d'immunogènes et de vaccins de type SALK à partir de HIV-1. 1 Lignée cellulaire infectée. La lignée cellulaire utilisée est une lignée cellulaire appelée CEM/HIV-1 Cette lignée est obtenue à partir de la lignée CEM, dérivée de lymphocytes T humains, no ATCC CCL 119 infectée par le virus LAV 1 fourni le Professeur Montagnier. Pour obtenir la lignée CEM/HIV-1, on infecte un certain nombre de cellules de CEM avec des concentrations différentes de LAV 1 et l'on constate, de f açon reproductible, que la culture infectée avec une faible concentration de virus (virus dilué 1/105)permet d'obtenir, après criblage, un ou des clones viables, c'est-à-dire ayant intégré le provirus LAV dans leur génomes. Le stock CEM/HIV-1 conservé en azote liquide forme la banque cellulaire de travail. 20 Culture. Un certain nombre de tubes de la banque -9- cellulaire de travail sont décongelés et les cellules mises en culture en suspension dans un milieu RPMI-1640 en présence de 5 % de sérum de veau foetal et de 2 g/l de bicarbonate et en l'absence d'antibiotique Après amplification, on ensemence un biogénérateur de 10 1 à raison de 5 109 cellules CEM/HIV-1, la densité initiale étant donc de 0,5 106/ml. La culture est effectuée à 37 C dans le même milieu et l'on constate qu'à trois à quatre jours, la concentration cellulaire est de 1 à 1,5 106/ml A ce moment, on procède à un soutirage d'environ 8 litres et l'on remplace le surnageant ainsi soutiré par un milieu de culture neuf et l'on continue le processus un certain nombre de fois. Les surnageants soutirés sont mélangés en pool. 3 Préparation du produit final vrac (immunogène purifié) On se réfère au tableau I. a) filtration 1 de surnageant de culture sont soumis à deux filtrations consécutives à 5 pm puis 0,45 pm, formant 1 de récolte brute Activité infectieuse 106 doses infectieuses/ml Activité transcriptase inverse 106 cpm/ml. b) inactivation Les 100 1 de surnageant sont inactivés par la bétapropiolactone à 4 C pendant 16 heures à une concentration en béta PL au 1/4000 Après 16 heures, la suspension est amenée à 37 C et maintenue à cette température pendant au moins trois heures. Activité infectieuse non détectable. Activité RT 105 cpm/ml. c) ultrafiltration. Les 100 1 de suspension inactivés sont soumis à une ultrafiltration tangentielle à une température comprise entre 4 et 10 C sur un ultrafiltre 300 000 daltons. -10- Cette étape élimine la plupart des protéines bovines et aboutit à un ultrafiltrat qui a été concentré 50 fois. L'ultrafiltrat est congelé à 70 C. d) gamma irradiation. Les deux litres d'ultrafiltrat congelés sont amenés à l'installation d'irradiation et soumis à l'irradiation aux rayons gamma de 45 k Gray L'ultrafiltrat toujours congelé, est ramené et décongelé. Activité infectieuse non détectable Activité RT 5 103 cpm/ml e) diafiltration Les deux litres, décongelés à une température entre + 4 C et 10 C, sont diafiltrés (seuil de coupure: 300 000 daltons) successivement en trois tampons: 1) Tris HC 1 25 m M, p H = 7,25, Na Cl 10 m M. 2) La diafiltration est ensuite poursuivie en milieu acétate Na 100 m M, p H = 4,65, Na Cl 2 M. 3) La diafiltration est ensuite poursuivie en milieu acétate Na 50 m M p H = 6,5 On obtient un litre de suspension concentrée deux fois, dépourvue de la plus grande part des produits d'origine bovine et dont les glycoprotéines externes d'enveloppe de type gp 120, gp 160 sont pratiquement totalement éliminées. Activité infectieuse indétectable Activité RT 5 103 cpm/ml. Un Western Blot confirme l'élimination des gp 120, 160. f) poursuite de la purification La suspension provenant de la diafiltration, d'un volume de 1 1, est soumise à une gel-filtration sur Sephacryl 5500 HR (Pharmacia) en tampon acétate de 100 m M p H = 6,6 Cette étape poursuit l'élimination de l'albumine bovine et aboutit à un volume de 5 1 de suspension purifiée. La suspension de 5 1 obtenue est ensuite soumise à un passage sur échangeur d'ions CM Sepharose Fast Flow On effectue le premier passage en acétate de Na 100 m M -11- p H = 6,5 pour la fixation des antigènes et l'élution des protéines résiduelles On procède ensuite à un rinçage de la colonne en tampon phosphate de Na 10 m M, p H = 6,5 et l'on procède enfin à l'élution des antigènes en tampon phosphate de Na 200 m M, p H = 7,5 La suspension formée par l'éluat présente un volume d'environ 1 1. Cette suspension est soumise à une ultracentrifugation en coussin de saccharose (sucrose) à 30 % à 28000 tr/min pendant 1 heure à + 4 C sur rotor SW 28 ou TI 45 Le culot, contenant les antigènes recherchés, est ensuite repris en soluté apyrogène Na Cl 9/1000 stérile, puis ajusté à 200 /ug/ml de protéines totales correspondant à un volume de suspension d'environ 2,5 1 La suspension est légèrement opalescente. g) chauffage. La suspension ajustée est chauffée une heure à 60 C. Activité infectieuse indécelable-Activité RT indécelable. La suspension chauffée qui forme le produit final vrac peut être congelée. 4 Utilisation du Produit Final Vrac Le produit final vrac ( 2,5 1 à 200 pg/ml de protéines totales) est mélangé volume pour volume, à un adjuvant incomplet de Freund Le mélange est ensuite réparti en doses unitaires de 1 ml adjuvé contenant 100 ug de protéines virales antigéniques formant la dose vaccinale. Pour faire un produit de test cutané IDR, on utilise le produit final vrac non adjuvé, conditionné en dilutions de 0,1, 1, et 10 upg/ml de protéines totales. -12- | Soutirage L I Filtrations 1 100 1 Inactivation -8 PL 11/4000 i 1 1 OO 1 1 u; 0,45/e > 7 16 h 4-8 C puis 3 h 37-1 C Ultrafiltration 300000 4 C 1 2 1 I Congélation À t, b irradiation L décongé lation I 2 1 Diafiltration 1 300000 h 1 11 2) 2) Gel filtration 1 5 1 Echange 2 1 11 d' ions I ultracentrifugation| j culot reprise du culot et ajustement I 12,5 1 | Chauffage i PFV Tris H Cl 25 nm M p H = 7,25 Na Cl 10 n M Acétate de Na 100 rr M Na Cl 2 M p H = 4,65 Acétate de Na 50 m M p H = 6,5 Acétate de Na 100 m M p H = 6,5 Acétate de Na- m M p H 6,5 Phosphate Na 10 n M p H = 6,5 Phosphate Na 200 m M p H = 7,5 28009 RPM Saccharose 30 % lh SW 28 + 4 C Na Cl 9 / > 1 h 60 C I I 13 - REVENDICATIONS 1 Procédé de fabrication d'immunogènes de rétrovirus ou de vaccins contre les infections rétrovirales, notamment HIV, dans lequel on produit, par culture de cellules infectées, une récolte de particules rétrovirales comprenant leur enveloppe, en supension, on ajoute à la suspension de particules, un agent inactivant viral usuel dégradant l'enveloppe, on concentre la suspension, on la soumet à une gamma irradiation et on la purifie, caractérisé en ce qu'aux étapes de traitement de l'enveloppe par ledit agent et d'irradiation, on associe une étape de chauffage de longue durée et une étape de purification permettant l'élimination des glycoprotéines extérieures d'enveloppe. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape de traitement d'inactivation s'effectue à l'aide de la bétapropiolactone, avec une première étape d'incubation de longue durée à faible température suivie d'une deuxième étape d'élévation de température permettant d'inactiver l'agent. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on effectue une inactivation à une température de l'ordre de 4 à 80 C pendant une durée supérieure ou égale à 16 h suivie d'une élévation de température de l'ordre de 370 C pendant une durée d'au moins trois heures. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on effectue l'étape de gamma-irradiation à une dose de l'ordre de 45 k Gray. 5 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape de chauffage est effectuée en milieu liquide pendant une durée d'au moins une heure à une température de l'ordre de 60 C. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on effectue l'étape de chauffage après les autres étapes. -14 - 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de purification assurant l'élimination des glycoprotéines rétrovirales extérieures d'enveloppe dans des conditions de p H acide. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite étape d'élimination comprend une étape de diafiltration à un p H de 4,50 à 4,70. 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on effectue ladite étape de dialyse en acétate de sodium 100 m M en présence de Na Cl 2 M, p H = 4,65. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'étape d'inactivation précède l'étape de purification. 11 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on procède à des congélations suivies de décongélations provoquant la rupture des formations protéiques de l'enveloppe et de la capside rétrovirales. 12 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'après une étape de diafiltration assurant l'élimination des protéines rétrovirales externes d'enveloppe, on procède à une gel filtration dans des conditions éliminant les protéines exogènes, suivie, si nécessaire, d'un passage sur échangeur d'ions. 13 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'on élimine le tampon utilisé lors de l'échange d'ions par ultracentrifugation en milieu saccharose. 14 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la suspension de particules est concentrée par ultrafiltration après le traitement par l'agent inactivant. Prépration d'immunogènes, notamment HIV, -15- caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14. 16 Préparation de test IDR, caractérisée en ce qu'elle comporte un immunogène selon la revendication 15. 17 Vaccin contre les infections rétrovirales, notamment HIV, caractérisé en ce qu'il contient une préparation selon la revendication 15. 18 Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comporte un adjuvant.