FR 2662685 A1 19911206 FR 9106465 A 19910529 METHODE D'EXTRACTION D'ATOMES DE METAL ET D'EXPLOSIFS D'UNE SOLUTION AQUEUSE A L'AIDE DE CELLULES VEGETALES EN SUSPENSION DONNEES DE BASE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte généralement à la purification de l'eau, et plus particulièrement à l'utilisation de cellules végétales en suspension pour extraire les atomes métalliques et les explosifs d'une solution aqueuse Cette invention fait suite au contrat n O W-7405-ENG-36 existant entre les membres du conseil de l'Université de Californie et le ministère de l'Energie des Etats-Unis. L'ion baryum (Ba 2 ") est largement utilisé dans la fabrication d'explosifs conventionnels dans la formulation du Baratol, mélange explosif coulable à base de 2,4,6-trinitrotoluène (à base de TNT) qui consiste en 76 % (p/p) de terre de nitrate de baryum ayant une grosseur de particule spécifique et 24 % de TNT Les explosifs sont habituellement mis en route sous l'eau, ce qui provoque la pollution de la solution aqueuse avec du Ba 2 et du TNT. Des recherches portant sur quatre familles d'oxydes de céramique supraconducteurs à haute-température sont actuellement en cours Trois de ces familles contiennent d'importantes quantités de Ba 2 + L'impact écologique de la fabrication à grande échelle de tels matériaux comprend certainement la production d'effluents contenant de fortes concentrations de baryum et d'autres ions métalliques toxiques. Le baryum est toxique pour les humains et les autres espèces et doit être extrait avant décharge dans le milieu naturel des effluents provenant des équipements de production Les normes actuelles du ministère de l'Environnement et de la Nature exigent l'extraction de cet ion jusqu'à ce que la concentration soit inférieure à 100 ppm De nouvelles directives pourraient exiger des concentrations de Ba 2 " beaucoup plus basses Les méthodes actuelles d'extraction du baryum comprennent la conversion de nitrate de baryum en un sulfate de baryum moins soluble qui peut être précipité dans les eaux d'effluents avant leur élimination Le précipité en résultant est ensuite enterré Le procédé est relativement cher dans son ensemble et des restes de baryum sont encore dégagés dans le milieu naturel. Le TNT, ses produits d'oxydation, et d'autres matériaux explosifs solubles sont également présents dans ces eaux d'effluent La plupart de ces composés sont de toxicité semblable et leur concentration doit être réduite à des niveaux acceptables pour le milieu naturel avant que l'eau soit éliminée La technique actuelle passe par l'extraction par étapes du Ba" puis par l'extraction de ces composés explosifs avec du charbon actif et l'incinération du charbon Il faut un procédé plus simple et plus efficace, qui extrait également d'autres matériaux toxiques de l'ef fluent, pour le traitement de grandes quantités d'effluent avant décharge dans le milieu naturel. Le traitement du plutonium de l'eau et d'autres éléments d'actinides est un problème également connu de l'industrie nucléaire et du complexe des armes nucléaires Des recherches portant sur des procédures d'extraction simples, peu coûteuses et efficaces sont également en cours et devraient permettre à ces industries de se conformer aux règlements sur l'environnement, dont la sévérité ne cesse de croître, et aux demandes du public. Des cultures de cellules végétales en suspension peuvent être choisies pour se développer dans des concentrations de certains ions métalliques qui sont toxiques pour de nombreuses autres espèces La survie peut résulter de la production de polypeptides petits, se liant au métal, qui se fixent étroitement à tous les ions toxiques entrant dans les cellules Voir, par exemple, P J Jackson, C J Unkefer, J A Watt, et N J Robinson, "Poly(r-glutamylcystéinyl)glycine: Its Role In Cadmium Resistance In Plant Cells," Proc Natl. Acad Sci USA 84, 6619 ( 1987) Par ailleurs, la tolérance peut être associée à la capacité d'exclusion des ions métalliques des cellules Voir, par exemple, C D Foy, R L Chaney, et M C White, "The Physiology Of Metal Toxicity In Plants," Annu Rev. Plant Physiol 29, 511 ( 1978) Cette dernière référence décrit l'absorption des métaux par des plantes entières et laisse penser que les plantes entières ont un rôle dans le nettoyage du milieu naturel et la stabilisation des lieux pollués, mais aucune action parallèle n'a été observée ou prévue pour des cultures de cellules végétales Certaines plantes sont déjà utilisées pour stabiliser les sites pollués par des traces toxiques d'ions métalliques (Voir, par exemple, R R Gemmel, "Colonization of Industrial Wasteland" (Arnold Publishing Company, Londres, 1977)). Fletcher et coll ont démontré dans "Metabolism of 2-chlorobiphenyl by Suspension Cultures of Paul's Scarlet Rose," par J S Fletcher, A W Groeger, et J C McFarlane, Bull Environ Contam Toxicol 39, 960 ( 1987) que des cultures de rose en suspension extraient les diphénylènes surchlorés de la solution et les modifient chimiquement. En conséquence, un objectif de la présente invention est de réduire substantiellement la concentration d'ions métalliques choisis dans une solution aqueuse. Un autre objectif de l'invention est de réduire substantiellement la concentration de TNT dans une solution aqueuse. Un autre objectif encore de l'invention est de réduire substantiellement la concentration d'autres explosifs et de produits de l'oxydation d'explosifs dans une solution aqueuse. Des objectifs et avantages supplémentaires, et des caractéristiques nouvelles de l'invention seront exposés en partie dans -la description qui suit, et seront reconnus par les spécialistes de l'art à l'examen de ce qui suit ou peuvent être compris par la pratique de l'invention Les objectifs et avantages de l'invention peuvent être réalisés et atteints au moyen des instruments et combinaisons particulièrement décrits ici. RESUME DE L'INVENTION Pour réaliser les objectifs précédents et d'autres objectifs, et en conformité avec les objectifs de la présente invention, tels que représentés et largement décrits ici, la présente méthode peut comprendre le mélange d'une solution aqueuse d'un ion métallique ciblé et/ou d'explosifs devant en être extraits à l'aide d'une suspension de cellules végétales, et la séparation des cellules végétales du liquide après écoulement d'un temps d'interaction suffisant De préférence, les cellules végétales comprennent du Datura innoxia (D innoxia) Il est également préférable que les cellules soient choisies pour être mises en culture dans des concentrations de l'ion métallique ciblé et/ou d'explosif. Les bénéfices et avantages de la présente invention comprennent l'extraction efficace et économique des métaux toxiques et radio-actifs, des explosifs dangereux et de leurs produits d'oxydation d'une solution aqueuse à l'aide de cellules végétales abondantes, facilement créées et disponibles. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS Les dessins suivants, qui sont annexés à la description et en font partie, illustrent une application de la présente invention et, aux côtés de la description, servent à expliquer les principes de l'invention Dans les dessins: La.FIGURE l illustre par graphique la croissance de cellules de D innoxia dans des suspensions aqueuses contenant des concentrations de Ba 2 + allant de 0 à 1000 p M de Ba(NO 3), L'étroit chevauchement des courbes empêche l'identification en détail et la séparation des cinq concentrations étudiées. La FIGURE 2 illustre par graphique l'extraction du Ba 2 " d'une solution aqueuse en faisant rapidement croître des cultures de cellules de D innoxia en suspension dans des milieux contenant différentes concentrations initiales de Ba(NO 3)2 La FIGURE 3 illustre par graphique la vitesse d'absorption du Ba 2 " au cours du temps par des cellules de D innoxia. La FIGURE 4 illustre par graphique la stabilité de fixation au métal d'extraits de cellules de D innoxia dans des solutions contenant différentes concentrations de H+. La FIGURE 5 illustre par graphique la fixation du Ba 2 " par des extraits de D innoxia dans des solutions contenant différentes concentrations de Na+. La FIGURE 6 illustre par graphique l'extraction des composés explosifs par des cellules de D innoxia. DESCRIPTION DETAILLEE DES APPLICATIONS P Rhtthu LS DE L'INVENTION Brièvement, la présente invention comprend l'utilisation de cultures végétales en suspension pour extraire des espèces métalliques ioniques, des explosifs à base de TNT et leurs produits d'oxydation d'une solution aqueuse Plusieurs lignées végétales ont fait l'objet de recherches, comme D innoxia, Citrus citrus, et le mais noir mexicain (BMS) Toutes ont présenté une capacité importante à extraire les ions métalliques Les ions extraits à des concentrations sub-ppm comprennent le baryum, le fer et le plutonium. Les cellules de D innoxia cultivées dans des milieux contenant un effluent d'armes pollués par du Ba 2 l extraient également le TNT, d'autres explosifs, et leurs produits d'oxydation de la solution. Actuellement, la technique de croissance de cultures de cellules végétales en suspension dans des ferments progresse rapidement (Voir, par exemple, W J Treat et W A Aldred, "An Inexpensive Chamber for Selecting and Maintaining Phototropic Plant Cells," Biotech. Techniques 4, 97 ( 1989)) La disponibilité d'une source abondante, relativement peu coûteuse, de cellules donne à penser que ces dernières pourraient être utiles à l'extraction de certains composés de gros volumes de solutions complexes d'effluents La possibilité d'utilisation de cellules mortes, déshydratées peut aussi fournir un moyen de traitement direct des déchets. Référence est maintenant faite en détail aux applications actuelles préférées de l'invention, dont des exemples sont illustrés par les dessins qui suivent. A Préparation et entretien de cultures végétales en suspension, Des cultures en suspension de D innoxia ont été maintenues dans l'obscurité à 30 'C par lots de ou 100 ml de cultures en suspension comme cela a été décrit précédemment par Paul J Jackson, E Jill Roth, Peter McClure, et Cleo M Naranjo, dans "Selection, Isolation, and Characterization of Cadmium-Resistant Datura innoxia Suspension Cultures," Plant Physiol. , 914 ( 1984) Le volume du récipient a été maintenu à un rapport volume du récipient/volume de culture de 5 pour 1 de façon à permettre une oxygénation appropriée des cellules par aération Les cellules ont été cultivées dans le milieu modifié de Gamborg 1 B 5 auquel sont ajoutées des vitamines Dans ces conditions, le nombre de cellules double toutes les 24 heures environ. B Mesure de la croissance et de la division des cellules végétales. Le nombre de cellules végétales a été mesuré indirectement en déterminant la modification de l'hématocrite de la culture Cinq ml de culture cellulaire ont été centrifugés pendant 1 minute à 200 g et l'hématocrite a été déterminé. C Conversion des cellules en protoplastes Un volume égal de cellules a été mélangé avec une solution de protoplastes (KNO 3 600 m M, Ca Cl 2 3 m M, KH 2 PO 4 1 m M, p H ajusté à 5,5 avec KOH) contenant 0,5 % (p/v) de Cellulysine (Cal Biochem, La Jolla, CA) et 0,05 % de pectylase (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) La suspension a été mise en incubation à 30 OC pendant une heure sous légère agitation Les protoplastes ont été extraits des cellules restantes par filtration au travers d'un tamis de 45 microns en nylon. D Mesures de l'absorption du baryum L'absorption du baryum a été mesurée dans le milieu de culture cellulaire et dans les solutions résiduaires Une méthode semblable a été utilisée pour le plutonium La mesure de l'extraction du baryum des milieux faisait suite à l'addition de concentrations connues de Ba(NO 3)2 et de 1-33 Ba 2 + L'extraction du Ba 2 + a été mesurée comme abaissement de la radio-activité présente dans le milieu dont les cellules ont été extraites. Cela a été confirmé par la mesure d'un accroissement de radio-activité chez les cellules extraites du milieu. Dans toutes les expériences, la quantité de radio- activité associée aux cellules se situait à 10 % de la quantité de radioactivité extraite du milieu La mesure de radio-activité a été réalisée par spectrophotométrie à scintillation à la suite de l'addition d'un cocktail scintillant aqueux (Formule 963, Dupont New England Nuclear, Boston, MA) aux échantillons. E Fractionnement des composants cellulaires Des cellules ont été prélevées dans les milieux par centrifugation pendant 1 minute à 200 g et lavées deux fois dans un tampon glacé contenant du Tris-H Cl 10 m M, p H 7,4, K Cl 10 m M et Mg Cl 2 1,5 m M Les pastilles ont été remises en suspension dans la moitié du volume de culture d'origine du même tampon contenant du 2-mercaptoéthanol 20 m M et homogénéisées dans un broyeur de tissus Elvehjem Le produit d'homogénéisation a ensuite été centrifugé à 12 000 g pendant 15 minutes et le surnageant a été prélevé La mesure du 2- 33 Ba 2 a été effectuée en mesurant la radioactivité de l'extrait total, puis celle du surnageant à la suite de la centrifugation pour extraire les composés insolubles La radio-activité de la pastille a été confirmée par la remise en suspension de la pastille dans le tampon ci-dessus et en testant la radio-activité d'un volume connu de cette suspension. F Mesures du poids des cellules à sec et préparation de cellules déshydratées Des cellules ont été prélevées dans un milieu de culture par centrifugation pendant 1 minute à 200 g, lavées une fois dans un milieu de culture neuf et à nouveau prélevées par centrifugation Les pastilles de cellules ont été remises en suspension dans une solution contenant 70 % d'éthanol (v/v) et 30 % d'eau distillée. Des solutions épaisses de cellules ont été versées dans des nacelles de pesage prépesées et placées à 42 'C dans un four à sécher Les cellules ont été considérées complètement déshydratées lorsque plus aucune modification de poids n'était détectée au cours d'un chauffage supplémentaire. Après la description d'ensemble de l'invention et des procédures expérimentales utilisées dans la vérification de son fonctionnement, leurs applications spécifiques sont démontrées dans les exemples suivants. EXEMPLE I EXTRACTION DU BARYUM: Le baryum est toxique pour la plupart des espèces vivantes Toutefois, des cultures de cellules végétales de D innoxia en suspension peuvent grandir en présence de concentrations de cet ion métallique qui sont très supérieures à celles qui sont toxiques pour les mammifères La tolérance à de fortes concentrations de Ba 2 l donne à penser que les cellules ont un mécanisme qui exclut le baryum, ou qui le séquestre sous une forme non toxique ou moins toxique Environ 1 pmole de Ba 2 l peut être lié à chaque cellule Cela suggère que le composant se liant au métal est très abondant ou qu'il peut fixer de grandes quantités de Ba 2 + Plus de % du poids à sec des cellules cultivées dans de fortes concentrations de Ba(NO 3)2 est du Ba 2 +. A Croissance de cellules de D innoxia dans différentes concentrations de Ba 2 + De façon à déterminer quelles sont les concentrations de Ba 2 + toxiques pour les cultures de cellules en suspension de D innoxia, des cellules en croissance exponentielle ont été soumises à différentes concentrations de cet ion En ce qui concerne les figures, la Figure 1 illustre la croissance de cellules de D innoxia dans différentes concentrations de Ba 2 + pendant différentes périodes Les cultures de cellules de D innoxia en suspension à croissance rapide ont été transférées à un milieu neuf contenant 0, 100, 250, 500 et 1000 p M de Ba(N 03)2 Des mesures de la croissance cellulaire ont été déterminées en mesurant l'hématocrite (PCV) de 5 ml de culture à différents moments après l'addition de Ba 2 l Les cellules ont été transférées dans un milieu neuf contenant la concentration originale de Ba 2 " toutes les 48 heures pour maintenir une division cellulaire rapide Il est clair qu'il n'existe pas de différence significative entre le temps de doublement et le volume cellulaire des cellules grandissant dans toute concentration de Ba 2 " jusqu'à 2 m M Au-dessus de cette concentration, l'ion métallique précipitait de la solution Toutefois, si des cellules sont cultivées dans des milieux contenant du Ba 2 + précipité, le précipité disparaît au bout de deux jours, ce qui laisse penser que l'extraction de l'ion soluble par les cellules déplace l'équilibre, provoquant la solubilisation du baryum précipité La croissance des cellules sur de longues périodes dans du Ba(N 03)2 1 ou 2 m M n'inhibe pas la croissance et la division cellulaires La croissance en culture dans ces concentrations pendant plus de 350 générations ne montre pas de modification dans les temps de doublage cellulaires par comparaison avec les mêmes cellules se développant en l'absence de ce Ba 2-. B Extraction du Ba 2 + du milieu de culture cellulaire Afin de pouvoir mesurer l'absorption de Ba 2 +dans les cellules, des cultures contenant 2 x 106 cellules/ml se développant dans des milieux ne contenant pas de baryum supplémentaire ont été transférées dans des milieux contenant différentes concentrations de Ba(N 03)2 + 133 Ba(NO 3)2 ' 0,1 p Ci/ml il sans porteur et mises à développer pendant 24 heures. Pendant cette période, le nombre de cellules double environ Les cellules ont ensuite été prélevées dans le milieu par centrifugation, lavées deux fois et homogénéisées Le milieu, l'homogénat total et le surnageant suivant l'extraction du matériau insoluble ont ensuite été testés quant à leur radio-activité La Figure 2 représente la répartition du Ba 2 l dans les différentes fractions après extraction par les cellules de D innoxia en croissance Les valeurs sont tracées par rapport à la quantité totale de Ba(NO 3)2 initialement présent dans le milieu. La Figure 2 a présente le baryum fixé aux cellules, la Figure 2 b ce baryum fixé au composant insoluble, et la Figure 2 c du baryum restant dans le milieu Presque % de l'ion Ba 2 " est associé aux cellules après croissance dans du Ba 2# 1 m M Presque tous les ions métalliques associés aux cellules sont fixés à un composant de l'homogénat cellulaire insoluble Ces résultats laissent penser que les cellules sont capables de séquestrer de grandes quantités de Ba 2 +. Ils suggèrent aussi que la liaison au métal est plutôt faible ou que le nombre de points potentiels de liaison est proche de la saturation lorsque les cellules ont grandi dans du Ba 2 + 1 m M Le fait que cette concentration de baryum ne paraisse pas toxique pour les cellules laisse penser qu'elle est probablement bonne Une très grande partie du Ba 2 " est extraite par les cellules dans des milieux contenant du Ba 2 " jusqu'à 500 p M Au-dessus de cette concentration, des quantités importantes de Ba 2 restent dans les milieux. L'extraction des cellules contenant du Ba 2 + suivie par l'addition de nouvelles cellules a pour conséquence la diminution de l'ion baryum en solution jusqu'au même pourcentage d'extraction environ Des traitements successifs provoquent la chute de l'ion baryum en dessous de la limite détectable de 1 ppb Ce comportement donne à penser qu'il existe une saturation de tous les points de liaison du Ba dans le premier jeu de cellules Les résultats révèlent une liaison étroite de Ba 2 + à une fraction insoluble des cellules. C Identification du composant cellulaire se liant au Ba 2 + Les mesures de la vitesse d'absorption du Ba 2 + sont représentées dans la Figure 3 Des cellules de D innoxia ont été placées dans des milieux contenant Ba(N 03)2 1 m M et du 133 Ba sans porteur pendant différentes longueurs de temps Les cellules ont ensuite été prélevées du milieu par centrifugation et les milieux et l'homogénat cellulaire testés quant à l'activité du 133 Ba Les résultats révèlent une interaction presque immédiate du Ba 2 + soluble avec un composant des cellules La nature rapide de cette interaction laisse penser que l'ion métallique ne passe pas au travers des membranes cellulaires Ces données suggèrent donc fortement que le Ba 2 + se lie à un composant externe des cellules, peut-être un composant de la paroi cellulaire ou de la membrane Les cellules de D innoxia se développant en l'absence de Ba 2 " ont été transférées dans des milieux contenant Ba(NO 3)2 500 m M et L 33 Ba 2 0,2 p Ci/ml et cultivées pendant 24 heures supplémentaires Les cellules ont ensuite été converties en protoplastes En deux heures, 95 t de la population cellulaire était convertie tandis que les parois étaient digérées A différents moments suivant l'exposition aux enzymes, des échantillons ont été prélevés, filtrés au travers de cribles de 45 microns, les protoplastes lavés ont été prélevés de la suspension par centrifugation pendant 3 minutes à g, et la quantité totale de baryum testée Les protoplastes seront passés au travers d'un tel tamis, tandis que les cellules et les agglutinats cellulaires ne le pourront pas La mesure de la quantité totale de baryum trouvée dans les cellules et les protoplastes a révélé une perte de liaison du Ba 2 + par les protoplastes Se reporter au Tableau 1 Les données présentées proviennent de quatre expériences indépendantes Les 5 % restants des cellules ont fixé plus des deux tiers du Ba 2 + présent Ces résultats suggèrent qu'un composant de la paroi cellulaire est impliqué dans la fixation au Ba 2 " L'ajout de cellulose purifiée aux milieux contenant du Ba 2 +, toutefois, n'a pas entraîné l'extraction rapide de cet ion de la solution (données non représentées), un autre facteur à l'intérieur de la paroi serait responsable de la liaison au métal. Tableau 1 Association de Ba 2 + à des cellules végétales et des protoplastes végétaux. Exp No % de Ba 2 " total associé à des Cellules Milieux Protoplastes 1 68,7 24,2 7,1 2 71,6 21,5 6,9 3 63,6 20,6 15,8 4 68,7 26,8 4,5 D Stabilité de la liaison du Ba De façon à caractériser plus avant le(s) composant(s) de liaison et à déterminer la stabilité de la liaison au métal dans différentes conditions, l'effet du p H sur la liaison du métal a été déterminé Des échantillons de dix ml de cellules cultivées dans Ba 2 1 m M et 1-33 Ba 0,1 p Ci/ml sans porteur pendant 24 heures ont été prélevés et extraits après avoir été lavés deux fois avec des milieux ne contenant pas de Ba 2 " ajouté, et chaque extrait a été ajusté à un p H différent Les échantillons ont ensuite été mis en incubation pendant une nuit à 22 O C Les échantillons obtenus ont été centrifugés pour séparer les phases aqueuse et insoluble, et le surnageant a été testé quant à sa teneur en '33 Ba La Figure 4 démontre que la liaison du métal est assez stable avec un p H allant de 1 à 10. Ces résultats suggèrent que la liaison est assez complexe, puisque la liaison ionique d'une entité isolée, simple entraînerait une perte d'affinité du point de liaison pour l'ion métallique lors d'une variation de p H autour du p Ka de ce site spécifique. Des extractions contenant différentes concentrations de Na+ ont révélé une stabilité relative aux différentes concentrations de sel Toutefois, à des concentrations supérieures, la liaison du Ba est perdue Cela démontre que l'interaction entre cet ion métallique et le composant cellulaire est de nature ionique Cela est illustré dans la Figure 5 qui montre la fixation du baryum par des composants cellulaires à différentes concentrations de Na+ Des cellules de D innoxia ont été cultivées à 4 x 106 cellules par ml, puis transférées dans des solutions contenant du Ba(N 03)2 500 p M, du 133 Ba 0,1 p Ci/ml sans porteur et différentes concentrations de Na Cl Les suspensions ont été mélangées pendant 24 heures, puis séparées par centrifugation Les pastilles de cellules ont été lavées dans un tampon contenant la même concentration d'ion Na+, puis extraites. E Extraction du Ba 2 + de solutions résiduaires complexes Si les cellules végétales doivent présenter une solution pour la technique actuelle d'extraction de solutions de Ba 2 +, la fixation de cet ion par des cellules dans les conditions se trouvant dans ces solutions doit être démontrée Des échantillons d'un tel résidu ont donc été obtenus et des essais de Ba 2 l et d'autres composants réalisés La quantité de Ba 2 " fixée par les cellules variait suivant la quantité originale présente dans l'échantillon de rejet testé. Le "poids à sec en pour-cent' = le poids de Ba 2 " fixé divisé par le poids total des cellules et du Ba 2 + Des cultures de D innoxia en suspension datant de deux jours ( 8 x 106 cellules/ml) ont été prélevées par centrifugation La moitié des cellules ont été lavées deux fois avec de l'éthanol à 70 %, puis déshydratées par chauffage à 42 O C Les cellules vivantes et les échantillons déshydratés ont ensuite été remis en suspension dans 50 ml de solution résiduaire stérilisée par filtre contenant des quantités connues de Ba(N 03)2 et de " 33 Ba* 0,1 p Ci/ml sans porteur Les suspensions ont été mises en incubation et agitées à 22 OC pendant une nuit, puis prélevées du résidu par centrifugation. La quantité de baryum fixée aux cellules et laissée dans le résidu a été mesurée La quantité de baryum trouvée dans les différentes fractions d'un extrait des cellules vivantes a également été déterminée Le Tableau 2 présente l'extraction du Ba 2 + radio-actif des solutions résiduaires Ce renseignement a été confirmé par un essai indépendant de Ba 2 " à l'intérieur des échantillons (données non représentées) L'ajout de cellules mortes, déshydratées au résidu a également provoqué l'extraction du Ba 2 " de la solution La mesure de radio-activité et des poids à sec suivant l'extraction du Ba 2 + de la solution démontre que pas moins de 5, 3 % du poids à sec des cellules est du baryum après exposition à du résidu contenant cet ion métallique. Tableau 2 Extraction du Ba 2 des solutions résiduaires par des cellules végétales vivantes et des cellules déshydratées cultivées en suspension. Cellules vivantes Cellules déshydratées Associé à des cellules (%): 93,75 (+ 5,25) 96,10 ( 5,86) Ba 2 restant dans la solution résiduaire (%): 6,25 (+ 0,35) 5,9 ( 0,36) Portion insoluble d'extrait cellulaire: 90,10 (+ 2,47) non mesurée Portion soluble d'extrait cellulaire: 2,65 (+ 0,07) non mesuré Poids sec en pour-cent: non mesuré 2,8 5,3 * EXEMPLE II EXTRACTION DU PLUTONIUM: L'expérience de fixation du Pu est très semblable à celle de la fixation du Ba La plus grande différence est que le Pu(IV) est facilement hydrolysé et donne un matériau polymère à des concentrations acides inférieures à 0,1 N et par conséquent la présence d'agents complexants est nécessaire dans la solution aqueuse pour maintenir le Pu(IV) sous forme soluble dans une gamme de p H comprise entre 1 et 10 Une large gamme de p H représentative des conditions du milieu naturel et de quelques cours d'eau provenant de la fabrication ainsi que la fixation compétitive du Pu(IV) par du citrate et de l'EDTA, de très puissants chélateurs, ont été examinées Les solutions tests ont été "piquées" avec une petite quantité de Pu(IV) dans HC 1 pour donner les solutions présentées dans le Tableau 3Un hématocrite ( 2-3 ml) a été mis en suspension dans chaque solution et la concentration de plutonium dans le surnageant a été contrôlée par spectrométrie par scintillation après extraction des cellules par centrifugation Des solutions témoins sans cellules ajoutées ont été utilisées pour vérifier que le Pu(IV) n'avait pas formé une espèce polymère qui pourrait être extraite de la solution lors de l'étape de centrifugation. uif (O (O (O N 6 '0 Z 9 'ZE ú 8 ú 8 6 L H- L'61 8 E 1 '0 E ( 6 w) se In T Is O sep Des v sp T Od Tú 6 t 8 úZ ZI LLLE C 6 t 8 o C Iv SOZE O 6 TI> EE Zú OII tú 9 06 I Z> 9 Z 8 úú 96 L P 90 t PE 9 e Tvaxs nld np nd ap % I Tu TU Wd O T 655 8 E Tg ILES 8 úUS 9 Lg 861 t ZSOP 9 Lzt 00 I 88 I 89 Z 96 Zt 896 ú 686 ú nd np B Te TUT Wd O ú'T S 'O T 'I S'ú g' 9 'IS 0 '0 T O '01 0 '8 0 '8 6 'S 0 '1 0 '1 S 'S 9,S IT Tnb 9 Hd N 1 '0 e N ap e:Iga TD N I'0 s N ap esuoqa Do TE N l'0 IDH CI-r neg u Tomg: N I O '0 (e SON) le u To 9 q% w N 'O VI Sa BN u To,,,9 % N I'O e N ap e 4 euoqaeo Tq a.ea TO u Towmg N T O '0 mn Tpos u To'" 94 N t'0 ITOH u Tomg:, nsa ET-V *uo T%:nlos ú neua Tqel Les cellules de D innoxia (non viables dans ces solutions) ont extrait 80-90 % de l'activité du Pu de la solution dans une large gamme de valeurs de p H ( 1-8) Le degré d'extraction du Pu pourrait être plus élevé puisque l'activité a est en partie due à l'américium contenu dans l'oxyde de plutonium original. Le citrate et l'EDTA, qui forment des complexes très forts avec le Pu(IV), ont montré qu'ils réduisaient de manière significative l'absorption du Pu par le matériau cellulaire végétal Un grand excédent de Ba n'a pas empêché de façon remarquable l'absorption de Pu Les mesures de la concentration du Pu prises au bout d'une heure de contact montrent que les solutions se trouvant proches du p H 1 sont essentiellement en équilibre à ce moment-là, alors que les solutions à un p H plus élevé ont besoin de plusieurs heures pour atteindre l'équilibre Les temps d'équilibre les plus longs à un p H plus élevé sont probablement le résultat d'une cinétique ralentie d'échange de ligand due aux ligands plus fortement complexants nécessaires pour maintenir le Pu(IV) en solution. Les solutions 1-6 ( 10 ml) ont été piquées avec pl d'une solution de Pu(IV) 10-4 M dans H Cl 1 N et les comptes "finals" de Pu ont été obtenus au bout de 75 heures d'agitation avec le matériau cellulaire Les solutions 7-10 ( 10 ml) ont été piquées avec 100 pl de Pu(IV) 10-4 M dans H Cl 12 N et les comptes "finals" de Pu ont été obtenus au bout de 24 heures d'agitation avec le matériau cellulaire La concentration de départ du Pu(IV) était donc de 5 x 10-7 = 500 n M pour les premières solutions et de 1 p M pour les dernières solutions. EXEMPLE III EXTRACTION DU FER: Des cellules ont été mises en incubation dans du 59 Fe 0,19 p M ( 15 p Ci) pendant 24 heures, après quoi elles ont été récoltées du milieu de culture par centrifugation, lavées deux fois dans une solution contenant du Tris-H Cl 10 m M, p H 7,4, Mg Cl 2 10 m M, K Cl 1,5 m M, et du 2- mercaptoéthanol 50 m M, remises en suspension dans la même solution, et homogénéisées Il s'est révélé que 77,8 % de la totalité du Fe 2 + du milieu contenant le fer étaient séquestrés par les cellules, 14,4 % étant retrouvés dans la fraction soluble de l 1 homogénat cellulaire, et 85,6 % dans les composants insolubles, très certainement la paroi cellulaire. EXEMPLE IV EXTRACTION DE L'EXPLOSIF: La Figure 6 présente trois traces de chromatographie liquide en haute pression (Temps de rétention (minutes) et densité optique à 254 nm) de solutions aqueuses contenant des composés explosifs et quelques uns de leurs sous-produits La Figure 6 a est la trace d'une solution résiduaire typique contenant plusieurs explosifs et des compositions associées Des quantités de DNB (dinitrobenzène) ou de TNB (trinitrobenzène), de TNT, de RDX, et de HMX La Figure 6 b est une trace chromatographique de la solution représentée dans la Figure 6 a après traitement avec D innoxia pendant quatre heures La Figure 6 c est une trace chromatographique de la portion soluble d'un extrait des cellules de D innoxia utilisées pour traiter la solution caractérisée dans la Figure 6 a. L'extrait cellulaire a été mélangé ( 1:1) avec un tampon contenant de l'acétonitrile, dans lequel les molécules explosives sont très solubles Le gros pic correspondant au temps de rétention court dans la Figure 6 b est dû au saccharose présent dans le milieu de cellules végétales Le gros pic ayant essentiellement le même temps de rétention dans la Figure 6 c est dû au saccharose et à d'autres matériaux non identifiés émis par les cellules pendant le processus d'extraction Le HMX a le même temps de rétention que le saccharose Toutefois, des expériences indépendantes ont démontré qu'au moins une partie du HMX est extraite de la solution. La description précédente de plusieurs applications préférées de l'invention a été présentée à des fins d'illustration et de description Elle n'est pas destinée à être exhaustive ni à limiter l'invention sous la forme précise décrite, et bien évidemment de nombreuses modifications et variations en sont possibles à la lumière de ce qui a été décrit. Les applications ont été choisies et décrites de façon à expliquer le mieux possible les principes de l'invention et son application pratique pour permettre à d'autres spécialistes de l'art d'utiliser au mieux l'invention en diverses applications et de la soumettre à diverses modifications selon l'utilisation particulière envisagée La portée de l'invention est définie par les revendications ci-annexées. REVENDICATIONS 1 Une méthode de réduction de la concentration d'ions métalliques en solution aqueuse comprenant les étapes d'addition d'une suspension de cellules végétales à la solution aqueuse, et de séparation des cellules végétales de la solution après écoulement d'un temps d'interaction suffisant pour que les ions métalliques interagissent avec les cellules végétales. 2 La méthode telle que décrite dans la Revendication 1, dans laquelle les cellules végétales sont choisies dans le groupe consistant en Citrus citrus, en maïs noir mexicain et D innoxia. 3 La méthode telle que décrite dans la Revendication 1, comprenant de plus l'étape de déshydratation des cellules végétales avant ladite étape d'addition à la solution aqueuse. 4 Une méthode de réduction de la concentration d'explosifs liés au TNT et de leurs sous-produits en solution aqueuse comprenant les étapes d'addition d'une suspension de cellules végétales à la solution aqueuse, et de séparation des cellules végétales de la solution après écoulement d'un temps d'interaction suffisant pour que les explosifs interagissent avec les cellules végétales. 5 La méthode telle que décrite dans la Revendication 4, dans laquelle les cellules végétales sont choisies dans le groupe consistant en Citrus citrus, en maïs noir mexicain et D innoxia. 6 La méthode telle que décrite dans la Revendication 4, comprenant de plus l'étape de déshydratation des cellules végétales avant ladite étape d'addition à la solution aqueuse. 7 Une méthode de réduction de la concentration du Ba 2 en solution aqueuse comprenant les étapes d'addition d'une suspension de cellules végétales à la solution aqueuse, et de séparation des cellules végétales de la solution après écoulement d'un temps d'interaction suffisant pour que le Ba 2 interagisse avec les cellules végétales. 8 La méthode telle que décrite dans la Revendication 7, dans laquelle les cellules végétales sont choisies dans le groupe consistant en Citrus citrus, en maïs noir mexicain et D innoxia. 9 La méthode telle que décrite dans la Revendication 7, comprenant de plus l'étape de déshydratation des cellules végétales avant ladite étape d'addition à la solution aqueuse. Une méthode de réduction de la concentration des ions de plutonium en solution aqueuse comprenant les étapes d'addition d'une suspension de cellules végétales à la solution aqueuse, et de séparation des cellules végétales de la solution après écoulement d'un temps d'interaction suffisant pour que les ions de plutonium interagissent avec les cellules végétales. 11 La méthode telle que décrite dans la Revendication 10, dans laquelle les cellules végétales sont choisies dans le groupe consistant en Citrus citrus, en maïs noir mexicain et D innoxia. 12 La méthode telle que décrite dans la Revendication 10, comprenant de plus l'étape de déshydratation des cellules végétales avant ladite étape d'addition à la solution aqueuse. 13 Une méthode de réduction de la concentration du Fe 2 en solution aqueuse comprenant les étapes d'addition d'une suspension de cellules végétales à la solution aqueuse, et de séparation des cellules végétales de la solution après écoulement d'un temps d'interaction suffisant pour que le Fe 2 + interagisse avec les cellules végétales. 14 La méthode telle que décrite dans la Revendication 13, dans laquelle les cellules végétales sont choisies dans le groupe consistant en Citrus citrus, en maïs noir mexicain et D innoxia. La méthode telle que décrite dans la Revendication 13, comprenant de plus l'étape de déshydratation des cellules végétales avant ladite étape d'addition à la solution aqueuse.