FR 2662355 A1 19911129 FR 9006399 A 19900522 Utilisation de la 1-E 2-( 2-naphtyl)éthyll-4-( 3-trifluorométhyl- phényl)-1,2,3,6-tétrahydropyridine pour la préparation de médica- ments destinés au traitement de troubles cérébraux et neuronaux. La présente invention concerne L'utilisation de la 1-l 2- ( 2-naphtyl)-éthyll-4-( 3-trifluorométhylphényl)-1,2,3,6-tétrahydro- pyridine de formule suivante: CF N-CH 2-CH 2 o I ou de ses sels d'addition avec des acides pharmaceutiquement accep- tables, pour la préparation de médicaments destinés au traitement et/ou à la prophylaxie des maladies cérébrales et neuronales. Plus particulièrement, La présente invention concerne l'utilisation du composé de formule I ou de ses se Ls d'addition pharmaceutiquement acceptables pour La préparation de médicaments destinés au traitement des maladies associées à une dégénérescence neuronale. Le composé de formule I, sous forme de base libre ou de sels d'addition,ainsi que sa préparation ont été décrits dans la demande de brevet européen EP-A- 101381 Parmi les sels d'addition du composé de formule I pharmaceutiquement acceptables, on peut citer ceux formés avec les acides minéraux, tels que par exemple les acides chlorhydrique, bromohydrique, phosphorique ou sulfu- rique, ou avec les acides organiques tels que l'acide acétique, formique, propionique, benzoique, maléique, succinique, tartrique, fumarique, citrique, glyoxylique, aspartique, méthanesulfonique, éthanesulfonique, benzènesulfonique, p-toluènesulfonique, etc. Dans la demande de brevet européen cité ci-dessus on signale une activité anorexigène du produit. On a maintenant trouvé, de façon tout à fait inattendue, que le composé de formule I est en mesure d'exercer une action neurotrophique sur le système nerveux, semblable à celle du facteur de croissance nerveuse (NGF de l'ang Lais Nerve Growth Factor) et peut rétablir Le fonctionnement des cellules nerveuses endommagées ou présentant des anomalies dans leurs fonctions physiologiques. Cette activité neurotrophique a été d'abord mise en évi- dence dans un test de neuritogénèse in vitro. Evaluation pharmacologique in vitro Le test de neuritogénèse in vitro a été conduit en utili- sant des neurones iso Lées à partir de dissections de la région septale des embryons de rats selon des procédures conventionnelles qui permettent d'obtenir des suspensions neuronales enrichies (de à 98 %) (S E Bottenstein: "Growth and differenciation of neural cells in defined media" dans Cell Culture in the Neuroscience, p 3-43, 1985, Eds: S E Bottenstein, G Sato). Plus particulièrement, on a prélevé la région septale des embryons de rats âgés de 17 jours sous microscope à dissection en maintenant, pendant toute la durée du prélèvement, les structures à 4 C dans le milieu suivant: DME/F 12 (v:v) 12 glucose 5 % fungizone 1 % gentamycine 0,5 %. On a dissocié les cellules par traitement pendant minutes, à 370 C, avec trypsine-EDTA, puis on a centrifugé deux fois et on a lavé au PBS La dissociation est complétée à la pipette pasteur dans du milieu de Hanks Cette étape est suivie par 3 centrifugations Le culot obtenu a été repris dans un milieu sérique (H W Muller et N Seifert, J Neurosc Res, 8, 195204, 1982): DME/F 12 (v:v) K Cl 34 m M sérum de veau foetal 5 % sérum de cheval 5 % glutamine 0,1 % fungizone 1 % gentamycine 0,5 %. Cette suspension cellulaire est placée dans un flacon de culture et maintenue à l'étuve pendant 90 minutes à 37 C sous 5 % de C 02. Les cellules non nerveuses vont rapidement adhérer sur le plastique du flacon, et la suspension est donc enrichie en neurones ( 95 à 98 %) Ces suspensions ont été centrifugées et les culots ont été repris dans un milieu de culture non sérique: DME/F 12 (v:v) transferrine 1 Pg/ml triiodotyroxine 3 m M insuline 5 pg/ml hydrocortisone 20 p M glutamine 0,1 % fungizone 1 % gentamycine 0,5 %. Les neurones ont été mises en culture dans des p Laques de 96 puits ( 5 x 104 cel Lu Les viab Les par puits). Chaque puits a été traité à la poly-L-lysine ( 10 pg/ml) afin de former une matrice indispensable à l'adhésion, la survie et la différenciation des neurones Des échantillons de 130 p L de milieu non sérique contenant soit le produit à tester de formule I aux doses choisies, soit le so Lvant du produit (diméthylsulfoxyde) aux concentrations correspondantes, ont été distribués dans les puits Après ensencement des neurones, les plaques ont été main- tenues à l'étuve ( 37 C-5 % CO 2) pendant 18 heures Les ce Llules, après fixation dans un méLange glutaraldéhyde/paraformaldéhyde, ont été comptées de la façon suivante: dans chaque puits ensemencé on compte, pour un champ microsco- pique donné, le nombre total de cellules observées et le nombre de cellules ayant au moins un neurite (neurite = prolongement) > de deux fois le diamètre de la cellule), on compte cinq champs par puits et pour chaque dose de produit testé on ensemence deux puits, en obtenant donc dix valeurs pour chaque dose, les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules à neurites sur le nombre total de cellules comptées Chaque lot est comparé à son contrôLe par une analyse non paramétrique de Kruskall- Wallis. Les résultats obtenus sont les suivants: TABLEAU I % DE CELLULES A NEURITES Composé de formule I:2,4 n M 44,8 + 3,45 ContrôLe (DM 50 10-6) 30,2 + 1, 68 Composé de formule I:24 n M 39,2 + 2,39 Contrôle (DM 50 10) 29,4 + 1, 64 Composé de formule I:240 n M 44,1 + 2,02 ContrôLe (DMSO 10 4) 34,3 + 1, 82 Dans le même test, en utilisant le NGF, on résultats suivants: obtient les % DE CELLULES A NEURITES NGF:1,6 n M 51,7 + 1,61 Contrôle 40,6 + 2,08 Le mécanisme par lequel le composé de formule I exerce cette activité neurotrophique n'a pas été éclairci. De toute façon on peut exclure qu'il implique un effet sérotoninergique parce que le composé de formule I n'a montré aucune affinité pour les différents récepteurs de la sérotonine autres que le récepteur 5-HT 1 A (c'est-à-dire les récepteurs 5-HT 1 B, -HT Ic, 5-HT 1 D, 5-HT 2 et 5-HT 3) et d'autre part des composés connus en tant que 5-HT 1 A agonistes ou agonistes partiels, y compris la buspirone, l'ipsapirone et la 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tétra- Line ( 80 H-DPAT), se sont revéLés complètement inactifs dans le modèLe décrit ci-dessus. Evaluation pharmacologique in vivo Pour confirmer l'intérêt de ces résultats très positifs in vitro, on a mis au point un nouveau modèLe expérimental qui a permis l'évaluation in vivo de l'activité neurotopique/ neuroprotectrice du composé de formule (I) dans des processus de dégénérescence neuronale. Un modèLe expérimental pour ce type d'évaluation a été récemment proposé par Y Nakagawa et a L (Brain Research, 1987, 408, 57-64). Dans l'étude qu'ils ont conduite, ils ont mis en évidence la ressemblance entre les modifications neurochimiques et comporta- mentales, provoquées par infusion d'un agent neurotoxique, notam- ment de colchicine, dans L'ippocampe et celles qu'on retrouve dans les patients atteints de la maladie d'Alzheimer Sur la base des résultats publiés par Y Nakagawa et en tenant compte des évidences bibliographiques du rôle de L'hippocampe dans les phénomènes mnémo- niques on a essayé de mettre au point un modèLe expérimental de meilleure faisabilité qui soit encore plus proche de la physio- pathologie rencontrée dans la maladie d'Alzheimer. Le modèLe qu'on a mis en place répond aux questions sui- vantes: bonne faisabilité et Lésions, irréversibles, très spéci- fiques pour le système cholinergique septohippocampique. En particulier, on a provoqué des Lésions des neurones septaux par injection locale de vincristine en tant que poison de fuseau. Par rapport aux autres poisons de fuseau (colchicine et vinblastine) et aux différents sites d'injection (intraventricu- Laire et intrahippocampique) qu'on a testés, on a ainsi obtenu les meilleurs résultats soit en terme de spécificité de blocage de la voie cholinergique septohippocampique soit en terme d'irréversibi- lité des lésions. PROTOCOLES EXPERIMENTAUX Méthode de production des lésions Les animaux (rats mâles, Sprague Dawley d'environ 250 g) sont anesthésiés au pentobarbital ( 10 mg/kg i p), puis placés sur un appareil de stéréotaxie En accord avec les coordonnées de l'atlas Paxinos et Watson, l'injection dans le septum médian se fait selon le point de coordonnées suivantes: antériorité 8,9 latéralité O (le point O correspond au lambda) ventralité 6,4 La vincristine est mise en solution dans un liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) ayant la composition suivante: Na Cl Ca CL 2 Mg SO 4 K 2 HPO 4 glucose p H 7,4 m M 1,8 m M 1,2 m M 2 m M m M à raison de 0,6 pmole de vincristine par ml. 1 pl de cette solution ( 0,6 nmole injecté localement dans le septum médian en 1 de vincristine) est minute. Méthode d'évaluation des Lésions Evaluation morphologique (observation histoenzymologique l'A Ch E) de Les animaux sont perfusés par l'aorte avec un mélange fixateur (glutaraldéhyde/paraformaldéhyde) à la vitesse de perfu- sion de 25 ml/min pendant 5 minutes. Le cerveau est préLevé, la fixation poursuivie pendant 1 heure; cette étape est suivie par le lavage et la cryoprotection dans du saccharode à 20 % dans un tampon phosphate Le cerveau est alors coupé du cryostat, les coupes de 30 pm d'épaisseur sont pré- levées au niveau du septum et de l'hippocampe et montées sur lame. Les lames sont incubées environ 15 heures dans le méLange suivant ml d'une solution stock 925 ml eau distillée 781 mg Cu 504 750 mg glycine 2, 89 g acétate de sodium 230 mg iodure d'acétylthiocholine mg d'éthopropazine La réaction est ensuite révéLée par passage dans du sul- fure d'ammonium à 2 % et amplifiée par Ag NO 3 à 0,25 %. Les sites à acétylcholinestérases (en général associés aux synapses cholinergiques) sont révéLés sous forme d'un précipité brun. Evaluation biochimique (détermination de l'activité CAT) La détermination de L'activité CAT a été conduite selon la méthode de Fonnum (J Neurochem, 24 ( 1975), 407-409) Les tissus sont homogénéisés dans un potter (à 4 C) Chaque échantillon est ramené à 1 mg de protéines/ml 10 p L d'homogénéisat sont incubés en présence de 1,5 m M de choline, 70 p M d'acétyl Co A, 30 p M d'acétyl Co A marqué au 14 C, en présence d'ésérine 0,15 m M L'incuba- tion dure 7 minutes 30 " à 37 C. L'arrêt de la réaction se fait au bain de glace avec 5 ml de tampon phosphate. Après addition de 2 ml de tétraphénylboron/acétone et de ml de scintillateur, l'acétylcholine marquée au 14 C est comptée au compteur à scintillations Chaque échantillon est dosé en tri- plicate Chaque lot est comparé au lot contrôle correspondant par le test de Student. Evaluation comportamentale Cette étude porte sur des groupes d'animaux réservés à cet effet, les rats étant mis en cycle inversé Les rats utilisés dans ce cas sont de souche Wistar, lésés selon la même méthode décrite ci-dessus. Mémoire sociale (A Perio et a Il, Psychoparmacology, 1989, 97, 262-268). Selon ce test, les animaux à tester sont mis en présence d'un rat juvénile, la durée de la relation sociale (qui se traduit par des reniflements) est mesurée en secondes (T 1) Les animaux sont séparés pendant 15 minutes et le même rat juvénile lui est présenté à nouveau On mesure de la même façon le temps de contact T 2 Dans le cas d'animaux normaux, le souvenir de la première rencontre se traduit par un rapport T 2/T 1 mémoire le rapport est T 2/T 1 > 1. Test du labyrinthe en T (conduit selon la même méthode décrite par P Soubrié et al, J Pharmacol (Paris), 1977, 8, 3, 393-403 pour le test du Labyrinthe en Y) Test de la planche à trous (S.E File et a I, Pharmacol Biochem Behav, 1985, 22, 941-44). Evaluation des lésions L'administration intraseptale de vincristine entraîne une chute rapide (une semaine après l'injection) et importante (de 60 à 70 %) des marqueurs cholinergiques dans l'hippocampe (choline acétyltransférase (CAT) et acétylcholinestérase (A Ch E)) ainsi qu'une dégénérescence des neurones du septum médian, qui se révèle maximale deux semaines après l'injection, et qui est associée à une diminution des marqueurs cholinergiques Cette dégénérescence semble être irréversible, puisqu'on la retrouve trois mois après l'injection de vincristine, et comporte des altérations fonction- nelles. Parmi les altérations fonctionnelles consécutives à l'administration de vincristine, on a relevé principalement un déficit très important et irréversible des fonctions mnémoniques (test de mémoire sociale) Des évaluations parallèles ont mis en évidence, entre autres, une réduction des capacités d'exploration ("Labyrinthe en T" et "Planche à trous"). TRAITEMENTS Dans ce modèle, on a évalué les effets de l'administra- tion du composé de formule I aux animaux lésés en comparaison aux effets obtenus avec le NGF. Le composé de formule I est administré, per os, 2 à 3 heures après l'injection de vincristine, en suspension dans la carboxyméthylcellulose 1 %, en raison de 10 ml de suspension par kg Le lot contrôle est traité avec le véhicule Le traitement est chronique, le produit est administré une fois par jour pendant 11 jours Le composé de formule I a été administré à trois doses différentes: 2,5 mg/kg, 5 mg/kg et 10 mg/kg à des groupes de 8 animaux chacun, et 24 heures après l'arrêt du traitement les animaux sont sacrifiés. Le NGF, au contraire, est administré par perfusion intra- ventriculaire en solution dans le ACSF, contenant de l'albumine de rat en raison de 0,01 % et de la gentamycine ( 1 ml/15 ml), selon la méthode décrite par W Fisher, et al dans Nature, 1987, 329 ( 6134), 65-8 La concentration en NGF de la solution est calculée de telle sorte qu'en fonction du débit de diffusion ( 0,44 + 0,02 pl/h) les animaux ( 7 rats) reçoivent 50 n M de NGF en dose totale sur deux semaines de perfusion Pour le lot contrôle, le NGF est remplacé par une protéine de poids moléculaire équi- valent (environ 130 000) ne possédant aucune activité neurotro- phique: le cytochrome C Deux semaines après la lésion et le début du traitement, les animaux sont sacrifiés Un groupe d'animaux sacrifiés est perfusé pour une évaluation histoloenzymologique de l'A Ch E, les autres animaux sont utilisés pour effectuer un dosage CAT dans l'hippocampe et Le septum. RESULTATS Evaluation morphologique Dans les animaux lésés et non traités, on n'observe presque aucun précipité brun tandis que, dans les animaux traités avec 5 mg/kg du composé de formule I, les bourgeonnements hippocam- piques observés donnent une image de la structure proche de celle observée chez un animal normal On obtient ainsi des résultats similaires à ceux obtenus avec le NGF. Evaluation biochimique La Lésion entraîne une chute très significative de l'activité CAT dans L'hippocampe qui augmente en fonction de la dose du composé de formule I administré jusqu'à une récupération totale à un dosage de 10 mg/kg, comparable à la récupération qu'on obtient dans le groupe d'animaux perfusés avec le NGF Aussi bien dans l'hippocampe que dans le septum, la Lésion entraîne une chute de l'activité CAT dont la récupération suit la dose du com- posé de formule I administré Dans le cas d'animaux perfusés avec le NGF les résultats ne sont pas significatifs; ceci peut être dû au fait qu'à la nécrose septale associée à l'injection de vincris- tine se surajoute une nécrose supplémentaire consécutive à la canu- Lation dans un ventricule proche du septum. Evaluation comportamentale Mémoire sociale Une fois lésés avec la vincristine, les animaux pré- sentent des altérations de la mémoire sociale qui semblent irréver- sibles (elles sont encore présentes 50 jours après l'injection de vincristine). Le composé de formule I a été essayé à la dose de mg/kg per os en comparaison avec le NGF à la dose de 500 n M, et on a effectué ce test au 7 e jour de la Lésion Dans les deux cas, on a observé un effet protecteur très important en obtenant un rap- port T 2/T 1 compris entre 0,6 et 0,7. Labyrinthe en T Les valeurs obtenues chez les animaux lésés et non traités sont significatives d'une altération des capacités d'explo- ration qui par contre sont récupérées à un niveau normal par trai- tement avec le composé de formule I à la dose de 10 mg/kg Ce test a été effectué en aveugle, 7 jours après l'arrêt du traitement. Planche à trous Dans le lot contrôle, la majorité ( 6 rats) des animaux ont perdu toute capacité d'exploration, seuls deux rats montrent une hyperactivité exploratoire Le traitement avec le composé de formule I à la dose de 10 mg/kg apporte une normalisation du com- portement exploratoire en se référant à des valeurs moyennes d'animaux normaux Ce test a été effectué, également en aveugle, 11 jours après l'arrêt des traitements. Compte tenu des résultats obtenus dans ce modèle, le com- posé de formule I ainsi que ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables sont utilisables dans le traitement et/ou la prophy- laxie de toutes les maladies qui impliquent une dégénérescence neuronale Plus particulièrement, le composé de formule I ainsi que ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables sont utilisables notamment dans les indications suivantes: troubles de la mémoire, démence artérosclérotique, troubles post-encéphalitiques, troubles post-apoplectiques, syndromes post-traumatiques dus à un trauma- tisme crânien, troubles dérivant d'anoxies cérébrales, maladie d'Alzheimer, démence sénile, démence subcorticale, telle que la chorée de Huntington et la maladie de Parkinson, neuropathies dérivées de morbidité ou dommage des nerfs sympatiques ou senso- riels, et maladies cérébrales, telles que l'oedème cérébral, et les dégénérescences spinocérébelleuses. L'administration du composé de formule I ou de ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables peut être convenablement effectuée par voie orale, parentérale, sublinguale ou trans- dermique La quantité de principe actif à administrer dans le trai- tement des troubles cérébraux et neuronaux selon la méthode de la présente invention dépend, comme toujours, de la nature et de la gravité des affections à traiter ainsi que du poids des malades. Néanmoins, la dose unitaire de dosage comprendra généralement de 2 à 300 mg, allant de préférence de 5 à 150 mg, comprise par exemple entre 5 et 50 mg, à savoir 5, 10, 20, 30, 40 et 50 mg, de produit. Ces doses unitaires seront administrées normalement une ou plu- sieurs fois par jour, par exemple 2, 3, 4 ou 5 fois par jour, de préférence une à trois fois par jour, la dose globale chez l'homme étant variable entre 2 et 900 mg par jour, par exemple de 3 à 500 mg, plus convenablement de 10 à 300 mg par jour. Pour un emploi thérapeutique et/ou prophylactique selon la présente invention, le composé de formule I et ses sels d'addi- tion pharmaceutiquement acceptables sont de préférence éLaborés dans des compositions pharmaceutiques Les compositions pharmaceu- tiques de l'invention renferment une quantité efficace pour le traitement ou la prophylaxie des troubles cérébraux et neuronaux d'au moins un produit choisi parmi le composé de formule I et ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables, en association avec un véhicule pharmaceutique inerte. En ce qui concerne l'administration par voie orale ou sublinguale, on utilise en particulier des comprimés, simples ou dragéifiés, des gélules granulées éventuellement à libération retardée, des gouttes ou encore des liposomes En ce qui concerne l'administration par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intra- musculaire, on fait recours à des solutions stériles ou stérili- sables, tandis que l'on peut utiliser des patches conventionnelles pour l'administration par voie transdermique. Les compositions pharmaceutiques selon la présente inven- tion peuvent être préparées selon des méthodes usuelles, telles que ce L Les décrites dans EP-101381 Le principe actif peut y être incorporé à des excipients habituellement employés dans ces compo- sitions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, Les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végéta Le, Les dérivés paraffiniques, les g Lycols, Les différents agents moui L Lants, dis- persants, ou ému Lsifiants, Les conservateurs, etc. Les compositions pharmaceutiques de L'invention peuvent avantageusement contenir Le composé de formule I ou un de ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables en association avec un ou plusieurs autres médicaments connus et communément utilisés dans Les mêmes indications thérapeutiques. REVENDICATIONS 1 Utilisation de la 1-E 2-( 2-naphtyl)éthyll-4-( 3-tri- fluorométhylphényl)-1,2,3,6-tétrahydropyridine ou de ses sels d'addition avec des acides pharmaceutiquement acceptables pour la préparation de médicaments destinés au traitement et/ou à la pro- phylaxie des maladies cérébrales et neuronales. 2 Utilisation selon la revendication 1 pour la prépara- tion de médicaments destinés au traitement et/ou à la prophylaxie des maladies qui impliquent une dégénération neuronale. 3 Utilisation selon la revendication 2 pour la prépara- tion de médicaments destinés au traitement et/ou à la prophylaxie des troubles de la mémoire, de la démence artériosclérotique, des troubles post-encéphalitiques, des troubles post-apoplectiques, des syndromes posttraumatiques dus à un traumatisme crânien, des troubles dérivant d'anoxies cérébrales, de la maladie d'Alzheimer, de la démence sénile, de la démence subcorticale telle que la chorée de Huntington et la maladie de Parkinson, des neuropathies dérivées de la morbidité ou de dommage des nerfs sympatiques ou sensoriels, de l'oedème cérébral ou des dégénérations spinocéré- belleuses. 4 Utilisation selon la revendication 3 pour la prépara- tion de médicaments destinés au traitement de la démence artéros- clérotique, de la démence sénile et de la maladie d'Alzheimer. 5 Utilisation selon une quelconque des revendications 1 à 4, o le médicament est une composition pharmaceutique sous forme de dosage unitaire. 6 Utilisation selon la revendication 5, dans laquelle la forme de dosage unitaire comprend de 2 à 300 mg du principe actif. 7 Utilisation selon la revendication 6, dans laquelle la forme de dosage unitaire comprend de 5 à 150 mg du principe actif. 8 Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle la forme de dosage unitaire comprend de 5 à 50 mg du principe actif. 9 Une méthode pour le screening pharmacologique de substances actives au niveau neuronal qui comprend: la production des lésions neuronales aux animaux destinés à l'exoérimentation pharmacologique, par injection dans le septum médian des animaux mêmes d'une quantité de vincristine efficace à ce but; l'administration de la substance à tester aux animaux ainsi lésionés selon le protocole convenablement choisi, et l'évaluation des effets du traitement dans des tests morphologiques/biochimiques et/ou comportamentaux. 10 Une méthode pour provoquer des lésions neuronales aux animaux destinés à l'expérimentation pharmacologique qui est carac- térisée en ce qu'on injecte dans le septum médian des animaux une quantité de vincristine efficace à ce but.