FR 2671098 A1 19920703 FR 9107977 A 19910627 MILIEU HAUTE DENSITE POUR CULTURE DE CELLULES ANIMALES La présente invention porte sur un milieu haute densité pour la culture de cellules animales et sur la culture cellulaire.5 Ces dernières années, l'apparition de diverses techniques de culture cellulaire, reposant, pour la plupart, sur l'application de méthodes d'immobilisation, a permis à la culture haute densité in vitro de cellules de mammifères de pouvoir être mise en pratique (Merten, O W Concentration10 des Cellules de Mammifères I Culture de Cellules Animales à Grande Echelle) (Concentrating Mammalian Cells I Large Scale Animal Cell Culture) Trends Biotechnol 5, 230-237 ( 1987); Altshuler, G L et al Croissance d'Hybridomes en Continu et Production d'Anticorps Monoclonaux dans des Réacteurs-Séparateurs à Fibre Creuse (Continuous Hybridoma Growth and Monoclonal Antibody Production in Hollow Fiber Reactors-Separators) Biotechnol Bioeng 28, 646-658 ( 1986); Jarvis, A P et al Croissance Cellulaire et Synthèse d'Hémoglobine dans des Cellules Erythroleucémiques Murines Propagées dans une Culture Haute Densité en Micro- capsules (Cell Growth and Hemoglobin Synthesis in Murine Erythroleukemic Cells Propagated in High Density Microcapsule Culture) In Vitro 22 ( 10), 589-596 ( 1986); Velez, D et al. Comparaison des Méthodes de Propagation Cellulaire pour Leur Effet sur le Rendement en Anticorps Monoclonaux dans des Fermenteurs (Comparison of Cell Propagation Methods for Their Effect on Monoclonal Antibody Yield in Fermenters) J. Immunol Methods 86, 61-69 ( 1986); Shirai, Y et al. Production Continue d'Anticorps Monoclonaux avec des Cellules d'Hybridome Immobilisées dans un Fermenteur à Lit Expansé (Continuous Production of Monoclonal Antibody with Immobi- lized Hybridoma Cell in an Expanded Bed Fermenter) Appl. Microbiol Biotechnol 26, 495-499 ( 1987); Konrad, W G. & Hubertus, A Support pour la Culture de Cellules Humaines et/ou Animales dans un Fermenteur (Trager fur die Kultivierung von Menschlichen und/oder Tierischen Zellen in einem Fermenter) Brevet européen EP-0 205 790 ( 30 décembre 1986); Putnam, J E Production d'Anticorps Monoclonaux dans une Matrice en Matière Céramique (Monoclonal Antibody Production in a Ceramic Matrix) Dans: Commercial Produc- tion of Monoclonal Antibodies, Seaver, S S (Ed) Marcel Dekker, New York, pages 119-138 ( 1986). Cependant, ces techniques ont été spécifiquement mises au point pour tenter de résoudre les problèmes complexes sous-jacents des cellules in vitro De plus, ces techniques ont fondamentalement quelques problèmes de dyna- mique des fluides Par ailleurs, la méthode de culture en suspension ne présente pas de tels problèmes d'une manière relative et a de nombreux avantages fondamentaux pour l'industrialisation des systèmes de cultures de cellules de mammifères De plus, ce peut être une meilleure méthode pour s'opposer clairement à quelques problèmes dans la réalisation in vitro de caractéristiques cellulaires in vivo et ce peut également être un meilleur outil pour résoudre de tels problèmes (Dodge, T C et al Perte de Viabilité dans la Culture de Cellules d'Hybridome Une Etude Cinétique (Loss of Viability in Hybridoma Cell Culture A Kinetic Study). Enzyme Microb Technol 9, 607-611 ( 1987); Backer, M P et al Production à Grande Echelle d'Anticorps Monoclonaux dans une Culture en Suspension (Large-Scale Production of Monoclonal Antibodies in Suspension Culture) Biotechnol. Bioeng 32, 993-1000 ( 1988)). De nombreuses expérimentations préalables ont été effectuées dans l'espoir que le supplément combiné de sources d'énergie, d'acides aminés et de vitamines, puisse conduire à une augmentation de la densité maximale de cellules viables au-delà de la concentration critique, autrement dit, aux environs de ( 1-3) x 106 cellules/ml dans une culture en discontinu (Birch, J R & Boraston, R C Culture de Cellules Animales (Animal Cell Culture) Brevet PCT WO 87/00195 ( 15 janvier 1987); Luan, Y T et ai Stratégies pour Prolonger la Longévité d'Hybridomes en Culture et Favoriser le Rendement en Anticorps Monoclonaux (Strategies to Extend Longevity of Hybridomas in Culture and Promote Yield of Monoclonal Antibodies) Biotechnol Lett 9 ( 10), 691-696 ( 1987); Howarth, W et al Milieu de Culture Cellulaire pour une Croissance Cellulaire, une Longévité de Culture et une Expression des Produits, augmentées (Cell culture Medium for Enhanced Cell Growth, Culture Longevity and Product Expression. Brevet PCT WO 90/03430 ( 5 avril 1990)) Néanmoins, ces essais ont réussi juste à prolonger la phase stationnaire de la croissance des hybridomes, ce qui a conduit à une augmentation relative du rendement global en produit Le désaccord avec l'attente initiale a été conclu imprudemment comme étant déraisonnable, sans aucune explication scienti- fique Cependant, si l'on considère l'équilibre nutritionnel maintenu in vivo, ces méthodes semblent ne pas tenir compte de l'équilibre et de plusieurs conditions de base importantes15 pour la propagation cellulaire in vitro, et auraient besoin d'un milieu renforcé par des substances nutritives, approprié pour une culture haute densité. En principe, des interactions complexes se produisent parmi les composants qui satisfont les exigences de croissance individuelle de n'importe quel type donné de cellules Dans des conditions de croissance se situant au- dessous des conditions optimales, le taux de multiplication cellulaire est déterminé par un facteur de première limi- tation (Ham, R G Formulation de Milieux Nutritifs de Base (Formulation of Basal Nutrient Media) Dans: Méthodes de Culture Cellulaire pour Biologie Moléculaire et Cellulaire (Cell Culture Methods for Molecular and Cell Biology) Vol l. Barnes, D W, Sirbasku, D A & Sato, G H (Eds) Alan R. Liss Inc, New York, pages 3-21 ( 1984)) Par conséquent, nous pensons que la considération nutritionnelle totale doit être prioritaire pour réaliser in vitro les caractéristiques cellulaires in vivo Cependant, ceci pourrait être excessi- vement simplifié si nous comptons juste sur quelques subs- tances nutritives ou sur des règles empiriques essayant diverses combinaisons de suppléments nutritifs En conclu- sion, il est critique d'équilibrer tous les composants dans la confection d'un milieu de culture haute densité. Dans cette invention, nous avons mis en évidence des preuves solides que des cellules de mammifères ayant des caractéristiques typiques de croissance cellulaire peuvent être cultivées jusqu'à près de 1 x 107 cellules/ml par le renforcement de tous les composants d'un milieu de culture cellulaire classique Nos exemples expérimentaux, qui sont décrits en détail dans le passage concernant les modes de réalisation préférés de l'invention, démontrent qu'une formu- lation récente de milieu de culture cellulaire a pu être re-10 formulée et renforcée encore de manière équilibrée pour une culture haute densité, sur la reconnaissance de l'ineffica- cité de l'utilisation de substances nutritives in vitro. Egalement, le renforcement des milieux peut nous permettre d'étudier des aspects physiologiques de cellules de mammi-15 fères in vivo par simulation d'un système réel Par exemple, l'effet douteux de métabolites dits d'inhibition, tels que l'acide lactique et l'ion ammonium, doit être réexaminé minutieusement avec l'application de ce système réel Nos résultats expérimentaux révèlent que le facteur décisif majeur qui empêche les cellules de se propager au-delà de la densité critique n'est pas constitué par ces métabolites d'inhibition, parce que la densité cellulaire critique est maîtrisée par l'apport de substances nutritives renforcées de manière équilibrée. La méthode de culture en suspension offre de nombreux avantages fondamentaux dans le passage à une grande échelle D'autres études et applications de cette méthode de renforcement en substances nutritives dans le passage à une grande échelle avec les avantages de la méthode de culture en suspension devraient créer une voie simple et améliorée vers l'industrialisation du système de culture en suspension haute densité. La présente invention porte sur le développement de milieux haute densité fortifiés de manière équilibrée pour la culture de cellules animales et sur l'obtention d'une culture en suspension haute densité à l'aide desdits milieux. Autrement dit, la présente invention porte sur la confection d'une série de milieux haute densité (MBRI 40-01, -02 et 40-03), dans lesquels tous les composants nutritifs du milieu RPMI 1640 classique, à l'exception des sels minéraux, ont été renforcés comme résumé dans le Tableau 1, et sur des procédés de culture de cellules en suspension haute densité à l'aide desdits milieux. La présente invention confère des valeurs supérieures aux productions de divers produits pharmaceu- tiques et de diverses substances biologiquement actives produites par l'intermédiaire d'une culture de cellules animales, en permettant une culture cellulaire haute densité à l'aide desdits milieux. La présente invention est avantageuse pour la minimisation des problèmes rencontrés durant le passage à une grande échelle pour l'industrialisation de procédés, en permettant une simplification et une réduction des procédés de culture classiques et de leurs étapes de purification. La présente invention diffère des procédés de culture haute densité classiques, tels que la culture par perfusion, par le fait qu'elle emploie seulement la série desdits milieux haute densité et, par conséquent, une culture cellulaire haute densité est possible sans autres équipements spécialement mis au point pour la culture cellulaire haute25 densité En conséquence, une réduction remarquable des investissements et des frais d'entretien pour équipements spéciaux, est vraisemblable. La présente invention a donc d'abord pour objet une série de milieux haute densité dans lesquels tous les compo- sants nutritifs d'un milieu classique ont été renforcés de manière équilibrée dans l'objectif de cultiver des cellules de mammifères indépendantes de l'ancrage. L'invention a également pour objet des milieux de culture cellulaire tels que définis ci-dessus qui sont caractérisés par le fait qu'ils ont été confectionnés par la prise en considération de facteurs tels que les proportions molaires de chaque composant, les concentrations des substances nutritives respectives dans le sérum, les concen- trations inhibitrices de certains composants vis-à-vis de la croissance cellulaire, les rapports molaires de composants étroitement apparentés et de sels minéraux, et l'osmolalité des milieux finals confectionnés. Conformément à d'autres caractéristiques de l'invention le glucose et la glutamine ont été renforcés respectivement 2,5 fois et 5 fois, et d'autres composants nutritifs des milieux ont été renforcés 5 fois, par comparai- son avec ces concentrations dans un milieu RPMI 1640; le glucose et la glutamine ont été renforcés respectivement 2,5 fois et 5 fois, et d'autres composants nutritifs des milieux ont été renforcés 10 fois par comparaison avec ces concentrations dans un milieu RPMI 1640; le glucose et la glutamine ont été renforcés respectivement 2,5 fois et fois, et d'autres composants nutritifs ont été renforcés fois par comparaison avec ces concentrations dans un milieu RPMI 1640; l'osmolalité finale a été maintenue entre 250-320 mos/kg d'eau, en contrôlant la concentration du chlorure de sodium sans modifier les concentrations des autres sels minéraux, par _comparaison à celles d'un milieu RPMI 1640. Les milieux de culture cellulaire selon 1 ' invention peuvent être utilisés pour les cultures de cellules de mammifères indépendantes de l'ancrage, telles que des cellules d'hybridomes murines, des cellules lymphoblastoides humaines et des cellules de myélome humaines. L'invention a également pour objet un procédé pour faire croître des cellules caractérisé par le fait qu'on utilise les milieux de cultures ci-dessus Elle a également pour objet un procédé pour faire croître des cellules, sui- vant un mode continu, dans lequel on utilise des combinai- sons desdits milieux pour obtenir des produits biochimiques exprimés de façon continue par les cellules de mammifères; ces combinaisons peuvent être choisies pour maintenir la concen- tration en glucose résiduel du surnageant de culture au-delà de 1 g/l; une opération à long terme est effectuée jusqu'à 2500 heures; et/ou lesdits milieux sont apportés de façon à représenter environ 10 % du volume de travail d'une culture. Sur le dessin annexé: la Figure 1 représente des profils de croissance de l'hybridome 2 c 3 1 dans le milieu RPMI 1640 et dans les milieux MBRI 40-01 & 40-02 renforcés en substances nutritives. La Figure 2 représente des profils de production d'anticorps monoclonaux anti-H Bs produits par l'hybridome 2 c 3 1 dans le milieu RPMI 1640 et dans les milieux MBRI 40-01 renforcés en substances nutritives. La Figure 3 représente des profils de croissance de la leucémie lymphoblastique aiguë humaine CCRF-CEM dans un milieu RPMI 1640 et dans les milieux MBRI 40-01 & 40-02 renforcés en substances nutritives. La Figure 4 représente des profils de croissance du myélome humain RPMI 8226 dans le milieu RPMI 1640 et dans les milieux MBRI 40-01 & 40-02 renforcés en substances nutritives. La Figure 5 représente le profil de concentration en glucose résiduel pendant la culture en continu- discontinu de l'hybridome 2 c 3 1 employant des milieux MBRI 40-02 & 4003 et le schéma d'apport du milieu d'apport selon la présente invention. La Figure 6 représente un profil de croissance de l'hybridome 2 c 3 1 pendant la culture en continu- discontinu employant des milieux MBRI 40-02 & 40-03. La Figure 7 est un profil de production d'anti-H Bs produits pendant la culture en continu-discontinu de l'hybridome 2 c 3 1 employant des milieux MBRI 40-02 & -03. Dans la première étape visant le renforcement équilibré du milieu RPMI 1640 pour culture d'hybridome haute densité, nous avons adopté les proportions molaires origi- nales de chaque composant en tant que tel, parce que le milieu avait déjà été développé par des modes opératoires d'optimisation des substances nutritives (Ham, R G. Formulation de Milieux de Substances Nutritives de Base (Formulation of Basal Nutrient Media) Dans: Méthodes de Culture Cellulaire pour Biologie Moléculaire et Cellulaire (Cell culture Methods for Molecular and Cell Biology) Vol. 1, Barnes, D W, Sirbasku, D A & Sato, G H (Eds) Alan R Liss Inc, New York, pages 3-21 ( 1984); Moore G E et al. Culture de Leucocytes Humains Normaux (Culture of Normal Human Leukocytes) J Amer Med Assoc 199, 519-524 ( 1967)). En plus des proportions molaires de chaque composant, plusieurs autres aspects ont été considérés comme étant importants Ceux-ci sont les concentrations des substances nutritives respectives dans le sérum, les concentrations d'inhibition de certains composants vis-à-vis de la croissance cellulaire, les rapport molaires des compo- sants étroitement apparentés et des sels minéraux, et l'osmo- lalité dans le milieu final confectionné, etc (Schwartz, W. B et ai Partie XX Maladies du Métabolisme (Diseases of Metabolism) Dans: Textbook of Medicine Beeson, P B, McDermott, W & Wyngaarden, J B (Eds) W B Saunders, Philadelphie, pages 1949-1997 ( 1979)) La combinaison de tous ces aspects pour renforcer le milieu permet de spécifier les formulations finales comme décrit dans le Tableau 1. Tableau 1 - Comparaison des compositions des milieux haute densité avec le milieu RPMI 1640 (mg/1) COMPOSANTS RPMI MBRI MBRI MBRI 1640 40-01 40-02 40-03 SELS MINERAUX: Ca(NO 3) 4 H 20 KC 1 l Mg SO 4 7 H 20 Na Cl Na HCO 3 Na 2 HPO 4 AUTRES COMPOSANTS: Glutathion (réduit) Rouge de Phénol D-Glucose ACIDES AMINES: L-Arginine (base libre) L-Asparagine Acide L-Aspartique L-Cystine Acide L-Glutamique L-Glutamine L-Glycine L-Histidine (base libre) LHydroxyproline L-Isoleucine (exempte d'allo) L-Leucine (exempte de méthionine) L-Lysine HC 1 l L-Méthionine L-Phenylalanine L-Proline (exempte d'hydroxy L-proline) L-Sérine L-Thréonine (exempte d'allo) LTryptophane L-Tyrosine L-Valine VITAMINES: Biotine D-Ca pantothénate Chlorure de choline Acide folique i-Inositol Nicotinamide Acide para- aminobenzoïque Pyridoxine HC 1 Riboflavine Thiamine HC 1 l Vitamine B 12 0,20 0,25 3,00 1,00 ,00 1,00 1,00 1,00 0,20 1,00 0,005 1,00 1,25 ,00 ,00 ,00 ,00 1,00 ,00 1,00 ,00 0,025 2,00 2,50 ,00 ,00 350,00 ,00 ,00 ,00 2,00 ,00 0,050 ,0 12,5 ,0 ,0 1750,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 0,250 En résumé, le milieu RPMI 1640 a été renforcé cinq fois en concentrations d'acides aminés, de vitamines et de gluta- thion, et deux fois et demi en concentration en glucose dans le milieu MBRI 40-01 Les concentrations des sels minéraux n'ont pas du tout été modifiées, excepté le chlorure de sodium (réduit de 6 g/l à 4 g/l) Par conséquent, l'osmola- lité finale résultante a été contrôlée à 270 m Os/kg d'eau. Tous les mêmes composants nutritifs du milieu RPMI 1640 ont été renforcés dix fois dans le milieu MBRI 40-02, alors que les concentrations de glucose, de glutamine et de sels minéraux étaient telles que dans le milieu MBRI 40-01 Le milieu MBRI 40-03 a été conçu pour être utilisé pour un milieu d'apport dans une culture en continu- discontinu Il était composé de composants nutritifs du milieu RPMI 1640 renforcés cinquante fois, alors que les concentrations des sels minéraux étaient telles que celles dans le milieu RPMI 1640 En réduisant les concentrations de Na Cl (de 6 g/l à 4 g/l pour les milieux MBRI 40-01 & 40-02 et jusqu'au-dessous de 2 g/l pour le milieu MBRI 40- 03), les osmolalités de tous les milieux haute densité ont été contrôlées entre 270-320 m Os/kg d'eau. Une culture haute densité d'une grande diversité de cellules indépendantes de l'ancrage(" anchorage-independent cells") peut être possible avec l'application de la série de milieux de culture haute densité de la présente invention. En général, n'importe quelles cellules indépendantes de l'ancrage peuvent être étudiées pour la culture haute densité Ainsi, l'invention peut être utilisée pour augmenter la croissance cellulaire et la production de produits biochimiques pour n'importe quelles cellules spécifiques indépendantes de l'ancrage. L'invention peut être davantage illustrée par les exemples suivants. EXEMPLE 1 L'hybridome 2 c 3 1 a été cloné par la fusion de cellules de myélome CRL 1580 (P 3 63 Ag 8 653), avec des cellules spléniques de souris Balb c immunisées avec des H Bs Ag humains il purifiés ( 200 mg/ml, produit de Korea Green Cross) La lignée de cellules d'hybridome a été déposée auprès du Centre Coréen de Culture de Microorganismes (KCCM) conformément au Traité de Budapest et désignée comme étant KCCM-10003 On a fait croître les cellules d'hybridome dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par FBS à 10 % à 37 C dans une atmosphère de % de CO 2 dans l'air, et celles-ci sécrétaient de façon stable des anticorps monoclonaux anti-H Bs du sous-type Ig G 1. Le système par lots d'ensemencement a été adopté pour une culture en récipient centrifuge à chaque fois afin de maintenir la stabilité de la lignée, cellulaire. Une estimation quantitative de la concentration en glucose résiduel a été faite à l'aide d'un analyseur de glucose YSI. Les anticorps monoclonaux (Mab) produits ont été quantifiés par une méthode ELISA, dont le protocole standard est le suivant; les anti-H Bs standards ont été incubés dans des bandes de polystyrène enrobées de H Bs Ag à 37 C pendant 2 heures Des anti-H Bs standards purifiés par affinité ont été dilués' avec du PBS 0,15 M (p H 7,2) contenant 5 % de sérum albumine bovine pour preparer des solutions standards de 4,5 à 300 UI/ml Après l'incubation, la bande de polystyrène a été lavée trois fois avec 0,1 ml de PBST à 0,1 % et incubée à 37 C pendant 1 heure avec 100 ng de conjugué H Bs Ag-HRP dilué avec 0,1 ml de sérum humain normal Ensuite, elle a été lavée à nouveau cinq fois avec PBST à 0, 1 % La solution de substrat chromogène était 0,1 ml/puits à la température ambiante, et l'on a fait suivre par l'addition de 0,1 ml d'une solution d'arrêt dans chaque puits une heure plus tard. Finalement, le développement de la couleur dans chaque puits a été mesuré par un lecteur de plaque (SLT Lab) à 405 nm. Les anti-H Bs standards utilisés pour la quantification des M Ab produits ont été purifiés par affinité avec des surnageants de culture d'hybridome 2 c 3 1 (Adachi, H et al. Essai Immunoenzymatique en Sandwich d'Antigène H Bs Ag. (Sandwich Enzymoimmunoassay of H Bs Ag Antigen) Dans: Essai Immunoenzymatique (Enzyme Immunoassay), Ishikawa, E,Kawai, T & Miyai, K (Eds) IGAKUSHOIN, Tokyo, pages 212-216 ( 1981)). Dans 100 ml de milieux RPMI 1640, renforcé en substances nutritives ou original, les cellules d'hybridome ont été cultivées avec des densités d'inoculum de 1 x 105 cellules/ml et de 1 x 106 cellules/ml dans des récipients de centrifugation Bellco de 250 ml, avec agitation à 50 tpm sur un agitateur biologique (Techne) à 370 C dans un incubateur à C 02 humidifié Le milieu a été supplémenté avec 10 % de sérum foetal de boeuf (Hyclone) Le p H a été contrôlé aux environs de 7,0 pendant 1 culture avec addition intermittente d'une solution stérile d'hydroxyde de sodium 0,4 N La viabilité a été déterminée par la méthode d'exclusion par colorant utilisant du bleu Trypan Avec le milieu MBRI 40-01, une15 lignée de cellules d'hybridome 2 c 3 1 a été cultivée avec succès jusqu'à une concentration de 9,3 x 106 cellules/ml en partant de 1 x 106 cellules/ml, alors que des cellules cultivées dans le milieu RPMI 1640 normal ont été colorées rapidement après simplement 22 heures de culture (Figure 1). Avec le milieu MBRI 40-02, la densité cellulaire maximale était de 1,2 x 107 cellules/ml, laquelle a été accrue de 30 % par comparaison avec celle dans le milieu MBRI 40-01 Ces données révèlent de manière très nette que les milieux nutritifs renforcés de manière équilibrée contribuent beaucoup à l'activité cellulaire pour surmonter la limitation de la croissance cellulaire in vitro en proposant un environnement approprié pour ces cellules d'hybridome. Lorsque la concentration cellulaire initiale était de 1 x 105 cellules/ml, ce qui est une densité d'inoculum habituelle, les cellules se sont développées jusqu'à 8 x 106 cellules/ml dans le milieu MBRI 40- 01 (Figure 1) La valeur est également comparable à celle avec un inoculum supérieur. Les résultats prouvent que la culture en discontinu haute densité est possible quelle que soit la densité d'inoculum. Comme résultat de la culture haute densité obtenue avec le milieu renforcé en substances nutritives, nous avons acquis une production 6 à 8 fois supérieure d'anticorps monoclonaux (anti-H Bs, Ig Gl; Figure 2) Avec un inoculum de 1 x 106 cellules/ml, 340 pg/ml d'anti-H Bs ont été obtenus après 118 heures de culture par comparaison aux 56 Mg/ml dans le milieu RPMI 1640 normal Des concentrations même supérieures d'anticorps monoclonaux, 450 gg/ml, ont été produites dans la culture avec 1 x 105 cellules/ml d'inoculum après 161 heures de culture On peut s'attendre à cette augmentation significative dans la production d'anticorps monoclonaux du fait que la production d'anticorps monoclonaux est reliée de façon linéaire à la densité de cellules d'hybridome viables et à la longueur de la période pendant laquelle les cellules restent viables A cet égard, il est certain que l'hybridome 2 c 3 1 a été alimenté avec largement assez de types et de concentrations de substances nutritives appropriées pour une culture haute densité dans un mode en discontinu, pour éprouver une augmentation significative des anticorps monoclonaux anti-H Bs. EXEMPLE 2 Les cellules de leucémie lymphoblastique aiguë humaine (CCRF-CEM; ATCC CCL 119) ont été sous-cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10 % de FBS à 37 C dans une atmosphère de 5 % de C 02 dans l'air Dans 100 ml de milieux RPMI 1640, MBRI 40-01 et MBRI 40-02, les cellules ont25 été respectivement cultivées avec des densités d'inoculum de ( 1,3-1,5) x 106 cellules/ml dans des récipients pour centrifugation Bellco de 250 ml, avec agitation à 50 tpm sur un agitateur biologique (Techne) à 370 C dans un incubateur à C 02 humi- difié Le milieu a été supplémenté par 10 % de sérum de boeuf foetal (Hyclone) Le p H a été contrôlé aux environs de 7,0 pendant la culture avec addition intermittente d'une solution stérile d'hydroxyde de sodium 0,4 N La concentration de cellules viables a été déterminée par la méthode d'exclusion par colorant utilisant du bleu Trypan. Avec les milieux MBRI 40-01 et MBRI 40-02 renforcés en substances nutritives, les cellules ont été cultivées avec succès jusqu'à des concentrations de 8,1 x 1 o 6 cellules/ml et 8,9 x 106 cellules/ml après 96 heures de culture, alors que les cellules cultivées dans le milieu RPMI 1640 normal ont été colorées rapidement après avoir atteint 3,9 x 106 cellules/ml après 42 heures de culture (Figure 3) Nos résultats expérimentaux (Figure 3) révèlent de manière très nette que l apport de substances nutritives renforcées de manière équilibrée contribue beaucoup à l'activité cellulaire pour surmonter la limitation de la croissance cellulaire in vitro en fournissant un environnement approprié pour ces cellules Les résultats prouvent que la culture en discontinu haute densité est également possible pour la lignée de cellules de leucémie lymphoplastique aiguë humaine. EXEMPLE 3 Les cellules de myélome humain (RPMI 8226; ATCC CCL 155) ont été souscultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10 % de FBS à 370 C dans une atmosphère de 5 % de C 02 dans l'air Dans 100 ml de milieux RPMI 1640, MBRI -01 et MBRI 40-02, les cellules ont été respectivement cultivées avec une densité d'inoculum de 1,3 x 106 cellules/ml dans 250 ml de récipient de centrifugation Bellco, avec agitation à 50 tpm sur un agitateur biologique (Techne) à 370 C dans un incubateur à C 02 humidifié Le milieu a été supplémenté par 10 % de sérum de boeuf foetal (Hyclone) Le p H a été contrôlé aux environs de 7,0 pendant la culture avec addition intermittente d'une solution stérile d'hydroxyde de sodium 0,4 N La concentration de cellules viables a été déterminée par la méthode d'exclusion par colorant utilisant du bleu Trypan. Avec les milieux MBRI 40-01 et MBRI 40-02 renforcés en substances nutritives, les cellules ont été cultivées avec succès jusqu'à des concentrations de 3,8 x 106 cellules/ml et 3,9 x 106 cellules/ml après 76 heures de culture, alors que les cellules cultivées dans le milieu RPMI 1640 normal ont été colorées rapidement après avoir atteint 1,3 x 106 cellules/ml après 28 heures de culture (Figure 4) Nos résultats expérimentaux (Figure 4) révèlent de manière très nette que la fourniture de substances nutritives renforcées de manière équilibrée contribue beaucoup à l'activité cellulaire pour surmonter la limitation de lacroissance cellulaire in vitro en fournissant un environnement approprié pour ces cellules Les résultats prouvent que la culture en discontinu haute densité est également possible pour la lignée de cellules de myélome humain. EXEMPLE 4 Dans 100 ml de ce milieu RPMI 1640, renforcé ou original, les cellules d'hybridome ont été cultivées avec des densités d'inoculum de 1 x 106 cellules/ml dans des récipients de centrifugation Bellco de 250 ml, avec agitation à tpm sur un agitateur biologique (Techne) à 370 C dans un incubateur à C 02 humidifié Le milieu a été supplémenté par 10 % de sérum de boeuf foetal (Hyclone) Le p H a été contrôlé aux environs de 7,0 pendant la culture avec addition inter- mittente d'une solution stérile d'hydroxyde de sodium 0,4 N. La viabilité a été déterminée par la méthode d'exclusion par colorant utilisant du bleu Trypan. Avec le milieu MBRI 40-02, une culture en continu- discontinu de la lignée de cellules d'hybridome 2 c 3 1 a été amorcée avec une densité d'inoculum de 1 x 1 o 6 cellules/ml (Figure 6) Le milieu d'alimentation était un milieu MBRI -03 supplémenté par du glucose, de la glutamine et 10 % de FBS Les concentrations de glucose et de glutamine étaient respectivement de 2,5 g/l et de 750 mg/l L'opération en continu-discontinu a été effectuée en fonction de la concen- tration résiduelle de glucose pendant la culture comme indiqué sur la Figure 5 Autrement dit, la concentration en glucose résiduel a été maintenue au-delà de 1 g/l en alimen- tant le milieu continu-discontinu Le volume des milieux d'alimentation était d'environ 10 % du volume de travail au moment o l'apport a été effectuée La concentration de cellules viables a atteint 1,2 x 107 cellules/ml après5 environ 70 heures de culture et elle a été maintenue aux environs de ( 0,7-1,0) x 107 cellules/ml pendant plus de 2500 heures de culture comme illustré sur la Figure 6. Comme résultat, la production d'anticorps monoclonaux a été améliorée de façon remarquable et une production élevée a été maintenue pendant environ 2000 heures après avoir atteint 1 q/l de production monoclonale comme illustré sur la Figure 7 La concentration maximale de M Ab produits était de 1,5 g/l On peut s'attendre à cette augmentation significative dans la production d'anticorps15 monoclonaux par le fait que la production d'anticorps monoclonaux est reliée de façon linéaire à la densité de cellules d'hybridome viables et à la durée de la période pendant laquelle les cellules restent viables A cet égard, il est certain que l'hybridome 2 c 3 1 a été alimenté avec largement20 assez de types et de concentrations de substances nutritives appropriées pour une culture haute densité dans un mode en continu-discontinu, pour éprouver une augmentation signifi- cative des anticorps monoclonaux anti-H Bs. Tous les résultats sont résumés dans le Tableau 2. Les concentrations cellulaires maximales dans toutes les cultures ont augmenté de 2,1-5,2 fois par comparaison avec celles dans la culture témoin dans un milieu RPMI 1640 La production d'anticorps monoclonaux a été augmentée d'un facteur de 6-8 par rapport à celle dans la culture témoin.30 En effectuant une culture en continu-discontinu d'un hybridome 2 c 3 1, la croissance cellulaire et la production d'anticorps ont été augmentées respectivement de 3,0-5,2 fois et 27 fois, par rapport aux valeurs dans la culture en continu témoin La possibilité d'une opération à long terme35 a été confirmée en réalisant la culture jusqu'à 2500 heures. Tableau 2 Comparaison des augmentations de croissance cellulaire et rendement en produit par la culture haute densité de diverses cellules de mammifères Temps Croissgnce Cellulaire Concentra- Lignées Méthodes de (x 10 cellules/ml) tion en Rapports (Milieux MBRI/RPM 11640) N Milieux Culture produit Celulares de (h) Densité Densité (mg/1) Densité Rendement Cetllulaires C r Culture d'Inoculum Cellulaire Cellulaire en produit Maximale Maximale Culture en discontinu RPMI 1640 118 1,0 2,3 56 - Hyrdml MBRI 40-01 161 0,1 8,0 450 3,5 6,1 Hybridome 1Murinl 2 c 1 "il 118 1,0 9,3 340 4,0 8,0 Murin 2 c 3 1 MBRI 40-02 139 1,0 12 5,2 Culture en MBRI 40-02 2500 1,0 12 1500 ( 3,0 = 5,2) 27,0 continu & 40-03 discontinu Leucémie Culture en Lymphoblastique discontinu RPMI 1640 166 1,3 3,9 2 Aiguë Humaine (CCRF-CEM) MBRI 40-01 1,5 8,1 2,1 " l MBRI 40-02 1,5 8,6 2,2 Culture en Myélome discontinu RPMI 1640 97 1,3 1,5 3 Humain (RPMI 8226) MBRI 40-01 97 1,3 3,8 2,9 MBRI 40-02 146 1,3 3,9 3,0 t O o D REVENDICATIONS 1 Milieux de culture cellulaire haute densité, dans lesquels tous les composants nutritifs d'un milieu classique ont été renforcés de manière équilibrée dans l'objectif de cultiver des cellules de mammifères indépendantes de l'ancrage. 2 Milieux de culture cellulaire selon la revendication 1, caractérisés par le fait que le glucose et la glutamine ont été renforcés respectivement 2,5 fois et 510 fois, et d'autres composants nutritifs des milieux ont été renforcés 5 fois, par comparaison avec ces concentrations dans un milieu RPMI 1640. 3 Milieux de culture cellulaire selon la revendication 1, caractérisés par le fait que le glucose et la glutamine ont été renforcés respectivement 2, 5 fois et 5 fois, et d'autres composants nutritifs des milieux ont été renforcés 10 fois, par comparaison avec ces concentrations dans un milieu RPMI 1640. 4 Milieux de culture cellulaire selon la revendication 1, caractérisés par le fait que le glucose et la glutamine ont été renforcés respectivement 2,5 fois et 5 fois, et d'autres composants nutritifs ont été renforcés 50 fois, par comparaison avec ces concentrations dans un milieu RPMI 1640.25 5 Milieux de culture cellulaire selon l'une des revendications 2, 3 et 4, caractérisés par le fait que l'osmolalité finale a été maintenue entre 250-320 mos/kg d'eau, en contrôlant la concentration du chlorure de sodium sans modifier les concentrations des autres sels minéraux, par comparaison à celles d'un milieu RPMI 1640. 6 Milieux de culture cellulaire selon la revendication 1, caractérisés par le fait qu'ils peuvent être utilisés pour les cultures de cellules de mammifères indépendantes de l'ancrage, telles que des35 d'hybridomes murines, des cellules lymphoblastoïdes humaines et des cellules de myélome humaines. 7 Procédé pour faire croître des cellules, caractérisé par le fait qu'il comprend la mise en contact desdites cellules avec le milieu de culture cellulaire tel que défini à la revendication 2. 8 Procédé pour faire croître des cellules, caractérisé par le fait qu'il comprend la mise en contact desdites cellules avec le milieu de culture cellulaire tel que défini à la revendication 3. 9 Procédé pour faire croître des cellules, caractérisé par le fait qu'il comprend la mise en contact desdites cellules avec le'milieu de culture cellulaire tel que défini à la revendication 4. Procédé selon l'une des revendications 7, 9 et 9, caractérisé par le fait que lesdites cellules sont des cellules sécrétant des anticorps. 11 Produits biochimiques obtenus à partir de cellules que l'on a fait croître dans les milieux tels que définis à la revendication 2. 12 Produits biochimiques obtenus à partir de cellules que l'on a fait croître dans les milieux tels que définis à la revendication 3. 13 Produits biochimiques obtenus à partir de cellules que l'on a fait croître dans les milieux tels que définis à la revendication 4. 14 Procédé pour faire croître des cellules selon l'une des revendications 7, 8 et 9, caractérisé par le fait qu'on l'effectue dans un mode continu en utilisant des combinaisons desdits milieux pour obtenir des produits biochimiques exprimés de façon continue par les cellules de mammifères. Procédé pour faire croître des cellules selon la revendication 14, caractérisé par le fait que l'on introduit une combinaison desdits milieux pour maintenir la concentration en glucose résiduel du surnageant de culture 3 l au-delà de 1 g/l. 16 Procédé pour faire croître des cellules selon la revendication 14, caractérisé par le fait qu'une opération à long terme est effectuée jusqu'à 2500 heures. 17 Procédé pour faire croître das cellules selon la revendication 14, caractérisé par le fait que ledit milieu est apporté de façon à représenter environ 10 % du volume de travail d'une culture.