FR 2660931 A1 19911018 FR 9004860 A 19900413 La présente invention concerne des plasmides porteurs d'au moins un mécanisme de résistance aux phages, Les bactéries lactiques contenant ces plasmides, en particulier les lactocoques appartenant à l'espèce Lactococcus lactis, l'utilisation de certains de ces derniers pour transférer, notamment par conju- gaison, un mécanisme de résistance aux phages à des souches d'intérêt industriel, en particulier dans l'industrie laitière, et à l'emploi de certaines souches Lactococcus lactis pour obtenir ces plasmides. Les bactéries lactiques sont impliquées dans l'élabo- ration et la conservation d'un grand nombre de produits alimen- taires, tels que les fromages, le beurre, les yaourts, le saucisson ou la choucroute Parmi ceux-ci les produits laitiers occupent une place particulièrement importante La transformation industrielle du lait est faite dans des cuves de fermentation de p Lus en plus grandes, dans lesquelles l'apparition de phages des bactéries lactiques peut avoir des conséquences graves, voire catastro- phiques: variation des caractéristiques, notamment organo- leptiques, du produit final; perte du produit présent dans la cuve et nécessité de décontaminer cette dernière ainsi que les installations environnantes Il existe donc dans l'industrie laitière un besoin impérieux de nouveaux moyens et de nouvelles méthodes permettant de rendre les bactéries lactiques plus résistantes aux phages. La Demanderesse a donc entrepris des recherches à cet effet Elle a constitué une collection de 22 bactériophages, hautement représentative de L'ensemble des bactériophages suscep- tibles d'être rencontrés lors des accidents de fermentation; elle a caractérisé partiellement ceux-Là notamment par leur classifi- cation, à l'aide d'une étude d'hybridation ADN/ADN, dans les groupes d'homologie décrits par RELANO P (RELANO P et a L ( 1987) J Gen Microbiol 133, 3053-3063), et crib Lé, dans une étude de lysotypie utilisant cette collection de bactériophages, un ensemble de 45 souches de bactéries lactiques de diverses origines possédant la capacité de métaboliser le lactose, de façon à retenir 20 souches possédant une résistance partielle ou totale à tous les phages de la collection Elle a ensuite utilisé ces souches comme donneuses, dans un premier cycle de conjugaison, avec une souche réceptrice ne métabolisant pas le lactose et sensible aux phages et elle a constaté l'obtention, pour cinq de ces dernières, de transconjugants capables de métaboliser le lactose et résistants aux phages, et l'aptitude de ceux-ci dans un deuxième cycle de conjugaison de transférer la capacité de métaboliser le lactose et la résistance aux phages à une souche réceptrice appropriée, avec une meilleure efficacité que celle de la transmission de ces carac- tères dans le premier cycle de conjugaison Elle a mis en évidence, pour le premier cycle de conjugaison, notamment par curage plasmidique des souches donneuses et des transconjugants, que le transfert de ces caractères était lié à celui d'un ou de plusieurs plasmides de la souche donneuse vers la souche réceptrice avec éventuellement une recombinaison génétique de ceux-ci (par exemple par formation de cointégrats) Pour chacune des cinq donneuses donnant au premier cycle de conjugaison des transconjugants capables de métaboliser le lactose et résistants aux phages, la Demanderesse a choisi un clone de transconjugant particulier et analysé L'ADN génomique de celui-ci, par hydrolyse à l'aide d'enzymes de restriction et migration par électrophorèse en champ pulsé sur gel d'agarose Elle a ainsi été en mesure d'isoler puis de caractériser, par leur profil de restriction et éventuellement leur carte de restriction, cinq plasmides de 66, 72, 107, 118 et 144 kb, porteurs tous d'au moins un mécanisme de résistance aux phages et, pour certains d'entre eux, d'éléments génétiques conférant la capacité de métaboliser le lactose ou une activité bactéricide aux souches qui les portent. L'invention concerne donc un nouveau plasmide comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être contenu dans les transconjugants issus du croisement d'une souche donneuse choisie parmi les souches ci-après: souches Lactococcus lactis ssp cremoris déposées à la CNCM le 12 avril 1990 sous les N I-939 et I-943; la souche Lactococcus lactis ssp lactis déposée à la CNCM le 12 avril 1990 sous le N I-940; les souches Lactococcus lactis ssp lactis var. diacetylous déposées à la CNCM le 12 avril 1990 sous les N I-941 et I-942 et d'une couche réceptrice. Ces souches donneuses sont résistantes aux phages (Rap), capables de métaboliser le lactose (Lac) et sensibles à l'érythro- mycine (Ery) ainsi qu'à la streptomycine (Str) On sait que chez les lactocoques la capacité de métaboliser le lactose est en général portée par un plasmide non conjugatif, lequel peut être transféré dans une autre souche sous la forme d'un cointégrat avec un autre plasmide conjugatif IL est donc commode pour la sélection des transconjugants que la souche réceptrice ne soit pas capable de métaboliser le lactose (Lac) et porte un gène de résistance à au moins un de ces antibiotiques Une souche réceptrice pratique est R par exemple la souche Lactococcus lactis ssp Lactis 545, Lac, Ery (plasmidique) et Str R (chromosomique), laquelle permet de faire la sélection des transconjugants par la capacité de métaboliser le lactose et la résistance à l'érythromycine, la résistance à la streptomycine servant à différencier les donneuses et les réceptrices. Le ou les mécanismes de résistance aux phages portés par ce plasmide confèrent aux souches contenant celui-ci une résistance partielle ou totale à une température de 300 C contre les phages du groupe I d'homologie et les phages du groupe III d'homologie, phages virulents représentatifs de tous ceux susceptibles d'être rencontrés dans les accidents de fermentation (RELANO P et a L ( 1987) J Gen Microbiol, 133, 3053-3063). A une température de 40 O C certains de ceux-Là continuent de conférer une résistance partielle ou totale contre ces phages. Ce plasmide, introduit par conjugaison dans la souche réceptrice, porte un ou plusieurs gènes lui conférant un caractère conjugatif Il est donc susceptible d'être transféré par conju- gaison, mécanisme naturel, dans d'autres souches, par exemple des souches d'intérêt industriel. Ce plasmide porte éventuellement un ou plusieurs gènes conférant à la bactérie lactique le contenant la capacité de métabo Liser Le lactose. Ce plasmide peut également porter un ou plusieurs gènes conférant à la bactérie lactique le contenant une activité bactéricide (vis-à-vis de laquelle elle est immune) Ce caractère est un avantage pour une culture pure ou une culture mixte de bactéries qui contiennent toutes ce plasmide, car il évite la prolifération de bactéries contaminantes. Un plasmide particulièrement prisé est celui qui a les caractéristiques d'un plasmide choisi parmi: lactis ss n O I-948; n 1-948; lactis ss n O I946; n 1-946; le plasmide p PF 66 contenu dans la souche Lactococcus p lactis déposée à la CNCM le 12 avril 1990 sous le le plasmide p PF 72 contenu dans la souche Lactococcus p lactis déposée à la CNCM le 12 avril 1990 sous le lactis ss N I-947; lactis ss o n I-944; lactis ss o n I-945; ou dont l le plasmide p PF 107 contenu dans souche Lactococcus p lactis déposée à la CNCM le 12 avril 1990 sous le le plasmide p PF 118 contenu dans la souche Lactococcus p lactis déposée à la CNCM le 12 avril 1990 sous le le plasmide p PF 144 contenu dans la souche Lactococcus p lactis déposée à la CNCM le 12 avril 1990 sous le la séquence présente un degré d'homologie éLevé avec celle de l'un des plasmides ci-dessus. Chacun des 5 plasmides mentionnés ci-dessus, respecti- vement de 66, 72, 107, 118 et 144 kb, a été iso Lé, par digestion enzymatique de l'ADN génomique et analyse de ce dernier par électrophorèse en champ pu Lsé sur gel d'agarose, dans un clone de transconjugant obtenu par croisement d'une souche donneuse choisie parmi les souches déjà citées, déposées à La CNCM de l'Institut Pasteur sous respectivement les N: D 114, D 94, D 96, D 77 et D 91, et de la souche réceptrice Lactococcus lactis ssp lactis 545. Ces plasmides, dont certains sont manifestement des produits de recombinaison génétique, par exemple des cointégrats, des plasmides de la souche donneuse, ont été caractérisés par leur profil de restriction et éventuellement leur carte de restriction. Chacun de ces plasmides est porteur d'au moins un mécanisme de résistance aux phages, conférant à la bactérie lactique qui le porte une résistance partielle ou totale à 30 C contre les phages du groupe I d'homologie et les phages du groupe III d'homologie, cette résistance étant en général conservée à 40 C Certains de ces plasmides possèdent de plus des éLéments génétiques conférant aux bactéries lactiques qui les contiennent la capacité de métaboliser le lactose ou une activité bactéricide. Certains des autres plasmides qu'il sera possible d'isoler dans d'autres clones de transconjugants obtenus à partir des mêmes souches donneuses auront une séquence présentant un degré d'homologie éLevé avec, et/ou comprenant une partie importante de la séquence des 5 plasmides ci-dessus D'autres de ces plasmides n'auront ni homologie ni sous-séquence commune avec les 5 plasmides ci-dessus mais présenteront également un mécanisme de résistance aux phages, codé par d'autres séquences que celles de ces derniers. L'invention a également trait à une bactérie lactique, de préférence appartenant à l'espèce Lactococcus lactis, qui contient au moins un plasmide tel que défini ci-dessus. Une bactérie de ce type particulièrement appréciée est celle qui est choisie parmi les souches Lactococcus lactis ssp o lactis déposées à la CNCM sous les N 1-944, 1-945, 1-946, I-947 et 1-948. L'invention concerne aussi l'utilisation d'une souche choisie parmi les 5 souches mentionnées au paragraphe précédent, les souches Lactococcus lactis ssp cremoris déposées à la CNCM o sous les N I-939 et 1-943, la souche Lactococcus lactis ssp lactis déposée à la CNCM sous le N I-940 et les souches Lactococcus lactis ssp lactis var diacetylous déposées à la CNCM sous les o n I-941 et I-942 pour transmettre par conjugaison, transformation, transduction, fusion de protoplastes ou une autre méthode de transfert de gènes, un mécanisme de résistance aux phages à une souche d'intérêt industriel Ce mécanisme peut être porté par un plasmide ou par une autre partie du génome de la bactérie Lorsque celui-Là est porté par un p Lasmide i L est avantageux de le transférer par conjugaison. L'invention a également trait aux souches d'intérêt industriel résistantes aux phages ainsi obtenues. L'invention concerne aussi l'utilisation d'une souche choisie parmi les souches Lactococcus lactis ssp cremoris déposées à La CNCM sous les N I939 et 1-943, la souche Lactococcus lactis ssp lactis déposée à la CNCM sous le N I-940 ainsi que les souches Lactococcus lactis ssp lactis var diacetylous déposées à la CNCM sous les N I-941 et 1-942, pour obtenir Le plasmide défini ci-dessus. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ci-après. Exemple 1: Criblage de souches de Lactocoques très résistantes à un large spectre de bactériophages. 1) Constitution d'une collection de bactériophages et caractérisation partielle de ceux-ci. On a constitué une collection de bactériophages isolés à partir de lactosérums d'accidents de fermentation, comprenant les phages suivants: phage St I 1décrit par PARADA J L et a L dans Appl. Environ Microbiol, 1984, 47, 1352-1354; phage 01358 décrit par JARVIS A W et a L dans Appl. Environ Microbiol, 1984, 47, 1031-1038; phage 0936 décrit par JARVIS A W et a L dans Appl. Environ Microbiol, 1984, 47, 343-349; phage P 008 décrit par ENGEL G et a L dans Kieler Milchwirtschafliche Forschungsberichte, 1975, 27, 25-48; phages 027, 029, 030, 031, 044, 049, 054, 055, 056, 057, 058, 059, 064, 065, 070 décrits par RELANO P et a L dans J. Gen Microbiol, 1987, 133, 3053-3063; phages issus de collections privées appe Lés ici 053, et 040. Ces phages ont fait l'objet d'une caractérisation au niveau mo Léculaire: spectre d'hôte, morphologie étudiée au microscope électronique, composition en protéines, profils de restriction de l'ADN et hybridation ADN-ADN. Ces phages appartiennent aux 3 grands groupes d'homologie (I), (II) et (III), sur la base d'études par hybridation ADN/ADN (RELANO P et a L ( 1987), J Gen Microbiol 133, 3053-3063) Les groupes (I) et (III) comprennent uniquement des phages virulents. Le groupe (II) comprend des phages virulents et des phages tempérés A l'intérieur d'un même groupe les homologies sont fortes et, d'un groupe à l'autre, les homologies sont très faibles Les phages du groupe (I) ont une nuc Léocapside oblongue alors que les phages des groupes (II) et (III) ont une nuc Léocapside isométrique. Cette collection de 22 phages est hautement représenta- tive de l'ensemble des bactériophages que l'on peut rencontrer lors des accidents de fermentations dans les industries laitières. 2) Obtention d'un nouveau stock de phages à partir d'un stock de phages plus ancien. Chacun des phages de la collection a été multiplié sur sa souche indicatrice (souche sensible au phage considéré) de la façon suivante: 1 ml du milieu de culture de la bactérie indicatrice de densité optique à 600 nm (ci-après DO 600) d'environ 0,6 (phase exponentielle) est préLevé et mis en présence de 100 pl d'un stock de phages et de chlorure de calcium à 10 m M L'adsorption du phage sur la bactérie est effectuée pendant 15 min à 30 C selon la bactérie considérée Puis le tout est dilué quatre fois par du milieu M 17 (TERZAGHI et a L ( 1975), Appl Environ Microbiol 29, 807-813) contenant du chlorure de calcium à 10 m M, de telle sorte que la DO 600 fina Le n'excède pas 0,15 L'ensemb Le est p Lacé à D 600 fnl 'x 6 eps 01 Lesml S lc l'étuve à 30 C jusqu'à ce que la lyse bactérienne soit obtenue Ce nouveau stock de phages est ensuite centrifugé et le surnageant placé à + 4 C en présence de quelques gouttes de chloroforme afin d'éviter le développement de bactéries Cette méthode donne de bons résultats: on obtient en général entre 109 et 5 1010 phages/ml Si la lyse n'a pas été obtenue après 6 h d'incubation, 100 p L du surnageant ci-dessus sont préLevés et la manipulation est recommencée à partir de l'adsorption du phage sur la bactérie. 3) Lysotypie. Souches de lactocoques utilisés: 21 souches Lactococcus lactis ssp cremoris 14 souches Lactococcus lactis ssp lactis souches Lactococcus lactis ssp lactis var diacety- lous issues de collections privées. Protocole de lysotypie: Des cultures de nuit de souches de lactocoques en milieu M 17 ont servi à ensemencer des tubes de milieu M 17 de telle sorte qu'il y ait une phase exponentielle de croissance (D 0600 = 0,5) 300 pl de chaque culture sont méLangés avec 3 m L d'agar mou M 17 et du chlorure de calcium à 10 m M. L'ensemble est éta Lé sur une boîte de milieu M 17 géLosé contenant du chlorure de calcium à 10 m M 5 pl de stock de phages dans du milieu de culture sont déposés sur ces tapis Ces boites sont déposées en étuve à 30 C pendant une nuit Dans tous Les cas o une lyse est observée, 5 pl d'une dilution au 1/100 me sont également testés Lorsque aucune lyse n'est observée à cette dilution, deux tests sont effectués: pl de stock de phages sont méLangés directement avec 300 p L de culture bactérienne en phase exponentielle de croissance et du chlorure de calcium à 10 m M et éta Lés sur une boîte de milieu géLosé contenant du chlorure de calcium Les boîtes sont ensuite placées à l'étuve pendant une nuit: on observe l'apparition éventuelle de plages de lyse. le surnageant de culture de la bactérie ayant servi à faire le stock de phages est stérilisé par un passage à travers un filtre de 0,45 pm Il est ensuite testé sur un tapis de bactéries comme un stock de phages L'apparition ou non d'un halo est ensuite déterminée. Résultats: sur l'ensemble des 45 souches de lacto- coques testées, 12 souches sont complètement résistantes à tous Les phages testés, ( 7 L lactis ssp cremoris, 2 L lactis ssp Lactis, 3 L lactis ssp lactis var diacetylous), 9 souches sont relati- vement sensibles aux phages mais ne permettent pas le développement de ceux-ci, (les 5 pl de stock de phages inhibent le développement des bactéries lorsque ceux-ci sont déposés sous forme d'une goutte mais si ces derniers sont méLangés au tapis bactérien aucune plage de lyse n'est détectée) ( 6 L lactis ssp cremoris, 1 L lactis ssp lactis, 2 L lactis ssp lactis var diacetylous) et 24 souches sont sensibles à au moins un phage. Exemple 2: Transfert par conjugaison d'éléments génétiques impliqués dans la résistance aux phages Obtention de clones de 5 transconjugants résistants aux phages. A) Principales techniques expérimentales utilisées: 1) conjugaison (premier cycle de conjugaison): souche réceptrice: Lactococcus Lactis ssp lactis 545, Lac Ery, Str contenant 1) le plasmide p VA 838 (MACRINA F L et al ( 1982), Gène, 19, 345-353) qui porte la résistance à l'érythro- mycine Ery, et 2) un marqueur chromosomique: la résistance à la Streptomycine Str. La souche 545 a été obtenue à partir de la souche 5124 (elle-même obtenue à partir de la souche L lactis ssp lactis C 2 comme exposé à l'exemple 3) de la façon suivante. La souche 5124 a été traitée aux ultraviolets selon le protocole décrit par L L Mc KAY (L L Mc KAY et al ( 1973) Appl. Microbiol 25, 682-684) de façon à être curée des deux prophages décrits par J D EFSTATHIOU et LL Mc KAY (J D EFSTATHIOU et LL. Mc KAY ( 1977) Journal of Bacteriology, 257-265) En a ensuite étalé la souche sur des boîtes de milieu M 17 (TERZAGHI B E et al ( 1975) App L Env Microbiol 29, 807-813) géLosé contenant 500 pg/ml de streptomycine et 0,5 % de glucose Un clone résistant à la streptomycine a été transformé par le plasmide p VA 838 selon une technique proche de celle décrite par POWELL I B et a L (POWELL I B et a L ( 1988) Appl Environ Microbiol, 54, 655) Le protocole précis utilisé est exposé ci-après La souche obtenue est la souche 545. Protocole de transformation ml de milieu M 17 à 20 m M de DL thréonine sont ensemencés avec 200 pl d'une culture de nuit L'incubation est réalisée à 30 C jusqu'à une densité optique à 600 nm d'une valeur de 0,4 Puis cette culture est centrifugée à 3 000 tr/min pendant min Le culot est repris par 10 ml de tampon SMP (saccharose 240 m M, Mg C 121 m M, tampon phosphate 7 m M p H 6,5) L'ensemble est centrifugé à 3 000 tr/min pendant 15 min Le culot est resuspendu dans 900 p L de tampon SMP 800 pl de cellules sont prélevées auxquelles sont ajoutés 5 pl d'une quantité connue d'ADN: l'ensemble est disposé dans une cuve à électrode et laissé 2 min à + 40 C Le choc électrique est réalisé avec 25 p F et 2,5 k V ("Gene pulser", Bio Rad) Les cellules sont laissées 10 min à + 40 C, puis 0,8 ml de M 17 x 2 contenant du glucose à 0,4 % est ajouté et le tout est disposé dans un tube Eppendorf L'incubation est effectuée pendant 1 h à + 300 C puis les cellules sont centrifugées pendant s Le culot est resuspendu dans le liquide résiduel, mélangé à de la gélose molle contenant du milieu de culture, du glucose à 0,4 % et l'antibiotique approprié est étalé sur une boîite de milieu gélosé contenant également glucose et antibiotique L'incubation est effectuée pendant 24 h à 300 C. souches donneuses: les 12 souches de l'exemple 1 complétement résistantes à tous les phages testés 8 des 12 souches de l'exemple 1 sensibles aux phages mais ne permettant pas le développement de ceux-ci (une souche de ce type a été éliminée car elle n'avait pas une croissance suffisante). Ces 20 souches portent le caractère de résistance aux phages Rap et La capacité de fermenter le Lactose Lac Elles sont Rap, Lac, Ery et Strs. parmi ces 20 couches, les souches Lactococcus lactis ssp cremoris 577 et 5114, la souche Lactococcus lactis ssp lactis 591 ainsi que les souches Lactococcus lactis ssp lactis var. diacetylous 594 et 596 ont été retenues (v B) ci-après pour leur capacité de donner des transconjugants portant les caractères Rap et Lac Elles ont été déposées auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes de l'Institut Pasteur) respectivement sous les N 1-939, 1-943, 1-940, I-941 et 1-942. Certaines caractéristiques de ces souches sont exposées ci-après dans le tableau I ci-après. Tableau 1 Caractéristiques biochimiques des souches 577, 591, 594, 596 et 5114 testées avec la galerie A Pl 50 CH CA Pl S A l et le milieu A Pl 50 CHL CA Pl S A l Souce hydrate de arbone 4 5 6 10 11 12 13 18 22 24 25 26 27 28 29 32 36 39 577 E+l + + + + El + + E+l + + 591 E+l + + + + + + + + + E+ l + + + + E+l 594 + + + + + + E+l + + + + + + E+l 596 + + + + + + E+l + + + + + + + + 5114 + + + + + 4: L Arabinose 5: Ribose 6: S Xylose 10: Galactose 11: Glucose 12: Fructose 13: Mannose 18: Mannitol 22: N acétylglucosamine 24: Arbutine 25: Esculine 26: Salicine 27: Cellobiose 28: Maltose 29: Lactose 32: Trebalose 36: Amidon 39: Gentiobiose +: Utilisation de l'hydrate de carbone par le micro-organisme après 24 h d'incubation en anaérobiose E+ l: Utilisation partielle de l'hydrate de carbone par le micro-organisme après 24 h d'incubation en aérobiose Les hydrates de carbone de la galerie A Pl 50 CH ne correspondant pas aux numéros cités ci-dessus ne sont pas métabolisés * moyen bien connu de l'homme de métier pour caractériser les souches par leurs propriétés biochimiques. K) M M G (D w F La souche 591 possède une bonne cinétique de croissance à et 40 C en milieu M 17, mais a une Légère inhibition de croissance en présence de 4 % Na Cl à 300 C en milieu M 17. * les souches 594 et 596 possèdent une bonne cinétique de croissance à 300 C en milieu M 17 A 40 C, cette croissance est très faible, de même qu'en présence de 4 % Na Cl à 300 C en milieu M 17. Les souches 577 et 5114 ont une faible cinétique de croissance à C en milieu M 17 On n'observe pas de croissance à 400 C, ni même en présence de 4 % de Na Cl à 30 C en milieu M 17. La sélection des transconjugants se fait par la capacité de fermenter le lactose et la résistance à l'érythromycine, la résistance à la streptomycine servant à différencier les donneuses et les réceptrices. Protocole de conjugaison: A partir de culture de nuit en milieu M 17, avec une quantité de glucose variant selon la souche considérée, des souches réceptrice et donneuse, 66 Hl de la souche réceptrice et 133 Pl de la souche donneuse sont méLangés Ces bactéries sont ensuite éta Lées sur des boîtes de Pétri contenant du lait écrémé à 11 %, du glucose à 0,4 % et de l'agar L'incubation est effectuée pendant 16 h à 300 C, afin que la conjugaison s'effectue 1 ml de lait écrémé reconstitué à 11 % contenant 4 % de lactose est éta Lé puis le lait contenant les bactéries est préLevé Des fractions de 200 Pl ou des dilutions sont enfin éta Lées sur des boîtes de milieu Elli 1, milieu Elliker modifié (de composition et préparation: bactotryptone 20 g, extrait de levure 5 g, protéose peptone 2,5 g, Dl+l lactose 10 g, Na Cl 4 g, acétate Na 1,5 g, acide ascorbique 0,5 g, agar 15 g, H 20 q s p 1 l, p H 6,8, stérilisation 15 min à + 1200 C cf ELLIKER P R et a L ( 1956), J Dairy Sci, 39, 1611-1612), additionné d'Erythromycine à 5 pg/ml afin de séLec- tionner les souches réceptrices et du pourpre de bromocrésol (KAY Mc et a L, ( 1972) Appl Microbiol 23, 1090-1096) afin de repérer + parmi les réceptrices les transconjugants Lac de couleur jaune. Ces expériences permettent notamment de déterminer l'efficacité théorique de conjugaison définie comme le rapport entre le nombre de transconjugants obtenus et le nombre de cellules réceptrices ajoutées au début de l'expérience de conjugaison ainsi que d'estimer l'efficacité réelle de conjugaison égale à l'efficacité théorique de conjugaison multipliée par l'inverse du facteur de multiplication des réceptrices pendant la conjugaison. 2) Recherche de transconjugants résistants aux phages. Chaque transconjugant issu du croisement par conjugaison entre une souche donneuse et une souche réceptrice est réiso Lé sur boite de milieu Elli-1 additionné de 5 ig/ml d'Erythromycine et de pourpre de bromocrésol, afin d'obtenir une culture pure Puis 300 pl de cette dernière en phase exponentielle de croissance (D 0600 = 0,5) sont éta Lés, en présence de 3 ml de milieu M 17 géLosé contenant du chlorure de calcium 10 m M, sur une boîte de milieu M 17 contenant du chlorure de calcium 10 m M 5 pl de stock de phages ou pl de différentes dilutions de ce stock de phages, sont déposés sur ce tapis de cellules La même expérience est réalisée avec la souche réceptrice témoin 545, la seule différence étant qu'on rajoute du glucose à 0,5 % dans le milieu de culture Ces boites sont déposées à l'étuve à 300 C pendant une nuit Un mécanisme de résistance à un phage particulier dans le transconjugant est visualisé par la différence du titre de phages entre le transcon- jugant et la souche 545 pour ce phage, et également par la différence de la taille des plages de lyse pour ce phage Le titre de phages T, également appe Lé titre phagique, qui représente le nombre de phages actifs sur la souche testée par ml de stock de phages déposé sur le tapis de ce Llules, exprimé en PFU/ml (PFU = Plaque Forming Unit) est calculé à l'aide de la formule T = N x 2 x 10 x+ 2 dans laquelle N représente Le nombre de plages de lyse obtenues à la dilution 10, x étant le paramètre de dilution. Le diamètre des plages de lyse est par ailleurs mesuré Ce paramètre donne des indications quantitatives sur le rendement unitaire, nombre de phages obtenus après un cycle de multiplication phagique pour un phage qui infecte une bactérie Plus la plage de lyse est grande plus le rendement unitaire est éLevé. Les phages utilisés pour mettre en évidence Les mécanismes de résistance aux phages sont Les phages 053 et 024 (groupe I d'homologie ainsi que le phage 059 (groupe III d'homologie). B) Résultats. 1) Transfert par conjugaison de la capacité de fermenter le lactose. On a observé comme Mc Kay et a L (Mc KAY et a L ( 1980) Appl Env Microbio L 40, 84-91) que toutes les souches ne sont pas capables de transférer la capacité de fermenter le lactose Sur les croisements effectués en premier cycle de conjugaison, seuls 6 croisements ont donné des transconjugants, 2 avec les souches L. lactis ssp lactis 588 et 591), 2 avec les souches L lactis ssp cremoris 577 et 5114, ainsi que 2 avec les souches L lactis ssp lactis var diacetylous 594 et 596 Le tableau 2 ci-après précise l'efficacité théorique Et de transfert de la capacité de fermenter le lactose, définie comme le rapport entre le nombre de transconjugants obtenus et le nombre initial de réceptrices, pour les 6 souches ci-dessusLe témoin est constitué par la souche 545 seule. Tableau 2 Efficacité théorique du transfert par conjugaison de la capacité de fermenter le lactose. | Souche donneuse Et 577 5,5 x 107 591 4 x 108 596 1,5 x 10 5 588 4 x 108 594 1,2 x 10 5114 4 x 108 545 plasmide p VA 838. Un seul des 6 transconjugants, celui issu de croisement 588 x 545, s'est révéLé sensible à l'action de la streptomycine: il semb Le qu'il y ait eu transfert du plasmide p VA 838, en principe non conjugatif, de la souche 545 vers la souche 588 Ce transcon- jugant a été éliminé. On a retenu pour les analyses ultérieures les 5 transcon- jugants issus des croisements 577 x 545, 591 x 545, 596 x 545, 594 x 545 et 5114 x 545, appe Lés par la suite 545-77, 545-91, 545-96, 545-94 et 545-114. 2) Recherche de transconjugants résistants aux phages: Les principaux résultats obtenus avec les transconjugants retenus, en mettant en oeuvre la technique décrite en A)2), sont rassemblés dans le tableau 3 ci-après, lequel précise pour ces derniers et la souche 545 (témoin) le titre phagique et le diamètre de la plage de lyse. Tableau 3 + Résistance aux phages des transconjugants Lac à une température de C. Souche Phage titre phagique (nombre de phages/ml)/dia- mètre de la plage de lyse (mm) 024 053 059 (groupe I) (groupe I) (groupe III) 545-91 c Lone 1 0/0 4 x 107/ vis-à-vis des phages 024 et 053. Remarquons par ailleurs que, pour le transconjugant 545-77, 13 clones ont été testés parmi Lesquels seuls 2 (dont le clone 6) présentaient un mécanisme de résistance aux phages Ce dernier n'est donc pas forcément transféré en même temps que la capacité de fermenter le lactose Celle-ci, probablement présente sur un plasmide, n'est pas nécessairement sur le même plasmide que le mécanisme de résistance aux phages, lequel étant conjugatif mobilise lors de la conjugaison le plasmide portant la capacité de fermenter le lactose par formation d'un cointégrat. Les transconjugants 545-91 clone 1, 545-96 clone 1, 545-77 c Lone 6, 545114 c Lone 1 et 545-94 c Lone 1 ont été déposés auprès de la CNCM (Collection Nationale de Culture de Micro- organismes de l'Institut Pasteur) respectivement sous les n 1-945, 1-947, 1-944, I-948 et 1-946. Exemple 3: Mise en evidence des plasmides portant des mécanismes de résistance aux phages. A) Principales techniques expérimentales utilisées. 1) Curage des souches de leurs plasmides. Une gamme de concentrations en novobiocine dans du milieu M 17 contenant du glucose à 0,4 % est constituée Chacun de ces tubes est ensemencé de telle sorte qu'il y ait 10 cellules/ml. L'incubation est effectuée pendant 18 h à + 30 C Puis le contenu des 2 tubes dont la concentration est la plus proche de la concentration minimale inhibitrice (CMI), est étalé à l'anse de platine sur du milieu M 17 contenant du glucose à 0,4 % Apres incubation, les clones sont testés pour différents caractères comme exposé ci-après: 2) Test des caractères après traitement à la novobiocine sur plaque de microtitration. Dans des plaques de microtitration ( 96 cuves de 500 pl, COSTAR) 100 pl de milieu M 17 contenant du glucose et un clone préLevé à l'anse de platine sont placés dans chaque cupule. L'incubation est effectuée à l'étuve de telle sorte que l'on ait une phase exponentielle de croissance. Puis, par réplique, 2 à 3 pl de chaque culture sont déposés sur des boites de Pétri contenant différents milieux- tests: milieu Elli-1 + pourpre de bromocrésol ( 0,004 %): test de la capacité à fermenter le lactose; milieu M 17 = 5 pg/ml érythromycine + glucose ( 0,4 %): test de la résistance à l'érythromycine; milieu M 17 + 500 pg/ml streptomycine + glucose ( 0,4 %): test de la résistance à la streptomycine; milieu M 17 + Ca C 12 + 10 phages 059 (groupe III) étalés à l'anse de platine + glucose ( 0,4 %): test de la résistance aux phages. Ce phage a été choisi car tous les mécanismes de résistance aux phages sont totalement actifs vis-à-vis de ce phage (cf exemple 2). 3) Extraction des plasmides des souches. Les plasmides sont extraits par une technique de lyse alcaline Une culture de nuit des couches est effectuée dans 5 ml de milieu de culture M 17 en présence ou non d'antibiotiques et/ou de glucose à 0,4 % (poids/vo Lume) Le même volume de milieu M 17 x 2 est ajouté et les cultures sont laissées à l'étuve pendant 1 h. Elles sont ensuite centrifugées à 3 000 tr/min pendant 10 min Le culot est resuspendu dans le liquide résiduel Le tout est recentrifugé en centrifugeuse à tubes Eppendorf pendant 1 min Le surnageant est jeté et le culot est resuspendu à la pointe de pipette avec 900 p L de TES (Tris 100 m M, EDTA 20 m M, saccharose 20 %) contenant du lysozyme à 4 mg/ml; une incubation est effectuee min à 370 C puis les cellules sont centrifugées pendant 1 min Le culot est repris par 300 pl de SDS 1 % Na OH 0,15 N et méLangé à la pointe de pipette puis laissé 10 min à + 250 C Puis sont ajoutés 225 pl d'acétate de sodium 3 M, p H 4,8: 10 min à + 4 C L'ensemble est centrifugé pendant 10 min à + 4 C Le surnageant est traité volume à volume avec un méLange phénol/CHCL 3/alcool isoamylique ( 24/23/1) puis centrifugé 1 min à + 25 C La phase aqueuse est précipitée avec 2,5 volumes d'éthano L pendant 30 min à -70 C Le mélange est centrifugé 10 min à + 40 C, le culot est lavé avec de l'éthanol à 70 % puis lyophilisé et repris par 50 pl d'eau 5 pl de plasmides sont déposés sur gel d'agarose Cet ADN est suffisamment pur pour être traité par des enzymes de restriction. 4) Deuxième cycle de conjugaison: souche réceptrice: Lactococcus lactis ssp lactis 5124, Lac, Ery R, Str contenant le plasmide p VA 838. La souche 5124 a été obtenue à partir de la souche Lactococcus ssp lactis C 2 (LL Mc KAY et a L ( 1977) J Bacteriol. 257-265) de la façon suivante. La souche L lactis ssp lactis C 2 a été traitée à la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, comme cela est décrit par Mc. Kay et ses collaborateurs ( 1970) (LL Mc KAY et a L J Bacteriol. 102, 804-809) Les cellules traitées ont été éta Lées sur le milieu Elli-1 + pourpre de bromocrésol + lactose 0,5 % pour sélectionner les Lac Une souche Lac, ayant perdu les 5 plasmides que possédait la souche C 2, a été transformée avec le plasmide p VA 838 selon Le protocole de transformation exposé à l'exemple 2 La nouvelle souche obtenue est appe Lée 5124. Souches donneuses: certaines souches transcon- jugantes du premier cycle de conjugaison portant un mécanisme de résistance aux phages, curées du plasmide p VA 838. La sélection des transconjugants se fait par la capacité de fermenter le lactose et la résistance à l'érythromycine, la résistance à la streptomycine servant à différencier les donneuses et les réceptrices. Le protocole de conjugaison est celui utilisé à l'exemple 1. B) Résultats. 1) Curage plasmidique des transconjugants: L'éLimination des plasmides par la novobiocine doit apporter au moins deux informations importantes: si un caractère disparaît après curage, un gène ou plusieurs des gènes responsables de ce caractère sont probablement portés par un ou des plasmides; la ségrégation de la capacité à fermenter le lactose par rapport à la résistance aux phages, indépendante ou dépendante, peut nous indiquer que le ou les gènes responsables de ces deux phénotypes ne sont pas ou sont, respectivement portés par le même plasmide. Après traitement à la novobiocine pour chaque souche testée, on a examiné, dans au moins 100 clones de chacun des trans- conjugants retenus précédemment, trois caractères: capacité à fermenter le lactose, résistance à l'érythromycine portée par le plasmide p VA 838, résistance au phage 059 (groupe III d'homo Logie). La résistance à l'érythromycine sert de témoin interne de curage. Les résultats obtenus pour les transconjugants retenus, la souche 545 (témoin) et les souches donneuses, traités à la novobiocine (cf b) ci-après sont rassemblés dans le tableau 4 suivant: Tableau 4 Pourcentage du nombre de clones possédant après traitement à la novobiocine un phénotype particulier par rapport au nombre total de clones testés. Souche Phénotype Rap Lac Rap Lac Rap Lac Rap Lac Ery Erys 545-91 clone 1 48 52 0 O 72 28 545-96 c Lonel 100 O 0 0 43 57 Tableau 4 (suite) Souche Phénotype l + + Lac +La _ + | R | s Rap Lac Rap Lac Rap Lac Rap Lac Ery R Ery 545-77 c Lone 6 96 4 O O 78 22 545-114 *clone 1 O 44 12 44 74 26 545-94 clone 1 112 87 O 37 63 545 O 100 O O 39 61 591 38 O 62 0 596 46 O 54 O I 577 100 O O O 5114 100 O O O 594 42 O 58 O Rap: résistance aux phages; Lac: capacité de fermenter le lactose; R Ery: résistance à l'érythromycine; Erys: sensibilité à l'érythromycine. On constate à La lecture du tableau 4: Les caractères Rap et Lac sont présents dans tous les clones du transconjugant 545-96 clone 1 On ne peut toutefois en déduire que les gènes responsables de ces deux phénotypes ne sont pas portés par des plasmides: il arrive en effet que certains plasmides soient résistants au traitement à la novobiocine. L'efficacité de la novobiocine ne peut être mise en cause par le curage du plasmide p VA 838 s'est effectué dans de bonnes proportions ( 57 %). Les transconjugants 545-91 clone 1, 545-77 clone 6, 545-114 clone 1 et 545-94 clone 1 ont effectivement perdu après curage, dans une certaine proportion, les deux caractères Ces résultats indiquent l'origine plasmidique probable des caractères Lac et Rap chez ces 4 transconjugants. Les transconjugants 545-91 clone 1, 545-96 clone 1 et 545-77 clone 1 ne donnent après curage aucune cellule Rap Lac ou Rap Lac Cette ségrégation des deux caractères laisse supposer que les gènes responsables des phénotypes Lac et Rap sont portés par un seul et même plasmide. Les transconjugants 545-94 et 545-114 donnent après curage des souches Rap Lac et/ou Rap Lac Cette ségrégation indique que les gènes responsables des caractères Lac et Rap ne sont pas portés par le même plasmide. 2) Curage plasmidique des souches donneuses. Les souches 577 et 5114 (toutes deux L lactis ssp cremoris) sont insensibles au curage à la novobiocine. Les souches 591, 596 et 594 peuvent perdre par curage semble-t-il de façon partielle la capacité à fermenter le lactose (ce caractère n'est pas complètement perdu car après 24 h d'incubation à + 30 C les clones Lac développent une teinte jaune pâle sur milieu Elli-1: il subsiste donc une activité Lac résiduelle chez ces souches) mais elles conservent leur résistance aux phages. 3) Extraction plasmidique des souches donneuses et des transconjugants et analyse par électrophorèse. Les extractions plasmidiques et analyse sur gel d'élec- trophorèse effectués selon la technique décrite en A)5), n'ont pas permis de visualiser les plasmides responsables des caractères Lac et Rap (ces résultats s'expliquent par La grande taille de ces plasmides, lesquels ne peuvent être analysés que par la technique de champ pu Lsé exposée dans l'exemple 4). 4) Transfert par conjugaison de la capacité de fermenter le lactose au deuxième cycle de conjugaison. Le tableau 5 ci-après précise l'efficacité théorique Et de transfert de la capacité à fermenter le lactose, définie comme le rapport entre le nombre de transconjugants obtenus et le nombre initial de réceptrices, ainsi que l'efficacité réelle Er de transfert de la capacité à fermenter le lactose, égale à l'effica- cité théorique multipliée par l'inverse du facteur de multipli- cation des réceptrices pendant la conjugaison, pour 5 clones de + + transconjugants Lac et Rap Le témoin est constitué par la souche 5124 seule. Tableau 5 Efficacités théoriques et réelles du transfert par conjugaison de la capacité de fermenter le lactose. Souche donneuse Et Er 545-77 clone 6 1 2 x 10-1 545-91 clone 1 2,4 x 10-1 2,3 x 10-2 545-96 clone 1 7,3 x 10-1 7 x 102 545-94 clone 1 6,1 x 10-7 5, 7 x 10-8 Tableau 5 (suite) Souche donneuse Et Er 545-114 clone 1 3,8 x 10 4 x 10 S 124 le lactose est considérablement plus importante avec ces transcon- jugants qu'avec les souches donneuses du premier cycle de conjugaison, résultat particulièrement net avec les transconjugants 545-77 clone 6, 545-91 clone 1 et 545-96 clone 1 On a par ailleurs vérifié sur 20 clones de ces transconjugants la résistance aux phages 059 (ainsi que la sensibilité à la streptomycine caractère porté par la souche réceptrice 5124) Les caractères Rap et Lac sont donc transférés simultanément Ces résultats étayent l'hypo- thèse (cf notamment exemple 2 ci-dessus) selon laquelle le premier cycle de conjugaison a sélectionné un événement relativement rare: la formation d'un cointégrat entre deux plasmides, l'un porteur de la capacité de fermenter le lactose et l'autre d'un mécanisme de résistance aux phages Le cointregrat étant formé, son transfert par conjugaison est plus fréquent, d'o une plus grande efficacité de transfert au deuxième cycle de conjugaison. L'efficacité réelle du transfert de ces caractères est comprise entre environ 2 et 20 % pour les transconjugants 545-77 clone 6, 545-91 clone 1 et 545-96 clone 1. Exemple 4: Isolement et caractérisation des plasmides portant des mécanismes de résistance aux phages. A) Principa Les techniques expérimentales utilisées. 1) Electrophorèses en champ pu Lsé. Elles ont été réalisées grâce au système "Pu Lsaphor Plus" (LKB-Pharmacia) Les gels sont constitués d'agarose 1 %, 110 ou ml selon les cas La cuve contient 2,6 l de tampon TBE (composition: Tris HCL 30 m M p H 8,5, acide borique 50 m M, EDTA 1 m M) La migration s'effectue à 300 V constants, avec un temps de pulsation et une durée de migration déterminés à l'avance selon la séparation désirée des fragments d'ADN. 2) Préparation de marqueurs de taille. Les oligomères d'ADN de phage Lambda ont été prepares comme cela est décrit par Waterbury et Lane (WATERBURY P G et LANE M.G ( 1987) Nucleic Acids Res, 15, 3930). Un stock de phages lambda purifiés sur chlorure de césium est dosé à 260 nm Considérant qu'une D 0260 de valeur 1 correspond à 50 pug/ml d'ADN, 75 pg d'ADN, ramenés à 500 pl de tampon TMN (Tris-H Cl 50 m M p H 8, Mg CL 2 10 m M, Na Cl 10 m M), préchauffé à 37 C, sont méLangés à 500 pl d'agarose à bas point de fusion à 1,5 % dans du tampon TMN maintenu à 450 C; le méLange est immédiatement réparti dans des matrices en plastique de 125 Pl prévues à cet effet, et refroidi à + 40 Cpendant 15 min Les "inserts" ainsi constitués sont suspendus dans une solution composée de: EDTA 0,5 M, SDS 1 %, protéinase K 1 mg/ml, Tris-H Cl m M p H 9, pendant 4 h à 55 C avec une faible agitation, les "inserts" sont ensuite dialysés contre 50 ml de Tris-H Cl 10 m M p H 8, EDTA 10 m M, 2 x 1 h à + 250 C. 3) Préparation des ADN genomiques. Ils ont été préparés non par la méthode classique de Mc Clelland et a L (Mc CLELLAND et a I ( 1987) Nucleic Acids Res 15, 5985-6005) mais par une technique dérivée de cette dernière exposée ci-après, permettant d'inclure 10 fois plus d'ADN génomique dans un volume donné d'agarose à bas point de fusion que cette méthode: Une culture de nuit des souches en présence ou non d'antibiotiques et/ou de glucose à 0,4 % est effectuée Cette culture sert à ensemencer 15 ml de milieu de culture M 17 à raison de 2 % (volume/volume) L'incubation est réalisée à l'étuve jusqu'à ce qu'il y ait une densité optique de 0,5 à 0,8 à 600 nm Puis la culture est centrifugée à 3 000 tr/min pendant 10 min (rotor S 534, SORVALL) Le culot est lavé 1 fois avec 5 ml de tampon SMC (saccharose 0,5 M; ma Léate 0,02 M; chlorure de calcium 0,05 M; p H 6,5) Les cellules sont centrifugées à 3 000 tr/min pendant 15 min et le culot est repris par 15 ml de tampon SMC contenant du lysozyme à 4 mg/ml pendant 2 h à 370 C Les cellules sont centrifugées à 3 000 tr/min pendant 15 min et le culot est repris par 450 pl de tampon SMC Les cellules sont incubées pendant min à 37 C puis 500 pl sont préLevés et méLangés à 500 pl d'agarose à bas point de fusion à 2 % dans du tampon SMC, maintenu en surfusion à 500 C Immédiatement, cette solution est répartie dans des matrices en plastique prévues à cet effet, par partie aliquote de 125 pl L'agarose se solidifie pendant 15 min à + 4 C. Les "inserts" ainsi obtenus sont placés dans 2,5 ml de tampon de lyse (Tris-C Hl 10 m M p H 9, EDTA 100 m M, EGTA 10 m M, 1 % SDS, protéinase K 1 mg/ml) pendant 24 h à 55 O Cavec une faible agitation Les "inserts" sont ensuite dialysés dans 50 ml de tampon (Tris-HCL 10 m M p H 8; EDTA 10 m M) avec 250 pl de PMSF (Phénylméthylsulfonylfluoride) à 20 m M pendant 1 h, à + 250 C Deux autres dialyses sont ensuite réalisées dans les mêmes conditions, mais sans PMSF Les "inserts" peuvent aussi être ainsi conservés au moins 6 mois à + 4 C dans du TE (Tris-C Hl 10 m M p H 8; EDTA 10 m M). La méthode de Mc Clelland et a L ( 1987) consiste, pour sa part, à inclure les cellules en phase exponentielle de croissance dans de l'agarose à faible point de fusion et ensuite de faire le traitement au lysosyme puis à la protéinase K et au SDS Le traitement des cellules au lysozyme avant leur inclusion dans l'agar permet d'augmenter la concentration d'ADN dans l'agarose. 4) Hydrolyse de l'ADN par une enzyme de restriction. Un tiers ou un quart d"'insert" est place dans un tube Eppendorf en présence de 1 ml de tampon d'hydrolyse préconisé par le fabricant Les "inserts" sont incubés 15 min à 37 C en bain- marie Puis 800 à 850 pl de tampon sont préLevés selon la taille de l'"insert" et 25 unités d'enzyme de restriction sont rajoutés au tampon restant Les "inserts" sont incubés 24 h à la température d'activité optimale de l'enzyme. 5) Profils de restriction de plasmide en champ pu Lsé. IL est nécessaire d'utiliser des "inserts" préparés selon la technique qui permet d'avoir 10 fois plus d'ADN (voir 3) ci-dessus) Après hydrolyse de l'ADN et migration en champ pu Lsé, les fragments d'ADN sont préLevés à partir du gel d'agarose Ces morceaux d'agarose sont ensuite traités par des enzymes de restriction comme un "insert" classique. 6) Mise en évidence des plasmides sous forme circulaire en champ pu Lsé. L'ADN hydrolysé par l'enzyme de restriction Apa I d'une souche bactérienne migre en champ pu Lsé Le gel est décollé et l'ADN subit une seconde migration en champ continu à 900 de la direction initiale après irradiation aux ultra-violets pendant min Cette technique, dérivée d'une méthode classique (Hintermann et col, ( 1981) Plasmid 5, 371-373) permet, d'une part de repérer l'ADN sous forme superenrou Lée qui migre différemment de l'ADN linéaire, d'autre part de libérer du plasmide sous forme circulaire rel chée. B) Résultats. 1) Analyse des ADN génomiques des transconjugants curés et non curés: L'intérêt principal de la technique d'électrophorèse sur gel d'agarose en champ pu Lsé est de permettre la séparation de fragments d'ADN de grande taille, en particulier d'une taille supérieure à 20 kb. Les ADN totaux des transconjugants 545-91 clone 1, 545-96 clone 1, 545-77 clone 6, 545-114 clone 1 et 545-94 clone 1 ainsi que de la souche réceptrice (témoin), curés et non curés ont été hydrolysés à l'aide de l'enzyme de restriction Apa I et les fragements de grande taille obtenus ont été analysés par électro- phorèse en champ pulsé sur gel d'agarose On a ainsi mis en évidence des fragments surnuméraires, présents dans les transconjugants et non dans la souche réceptrice. Le tableau 6 ci-après précise pour les transconjugants la taille approximative (en kb) de ces fragments surnuméraires: Tableau 6 Corrélation entre les phénotypes obtenus avant et après curage à la novobiocine et les fragments surnuméraires visibles après migration en chamo oulsé. Transconjugant Phénotype Fragment surnuméraire (kb) + + 545-91 clone 1 non curé Rap Lac 144 curé Rap Lac O 545-96 clone 1 non curé Rap Lac | 107 545-77 clone 6 non curé Rap Lac+ 118 curé Rap Lac O 545-114 clone I non curé Rap Lac+ 66 curé Rap Lac O curé Rap Lac 66 + curé Rap Lac O O + + 545-94 clone 1 non curé Rap Lac 57 + 72 curé Rap Lac O curé Rap Lac 72 Rap: résistance lactose. aux phages; Lac : capacité de fermenter le On constate: Les transconjugants 545-91 clone 1 et 545-77 clone 6 + + présentent Le phénotype Rap Lac en présence d'un fragment surnuméraire de 144 kb et (respectivement) d'un fragment surnumé- raire de 118 kb Après curage ils présentent le phénotype Rap Lac en l'absence de fragment surnuméraire Les caractères Lac et Rap sont donc portés par chacun de deux fragments surnuméraires ci-dessus. Le transconjugant 545-96 clone 1 ne présente que le + + phénotype Rap Lac Lié à la présence d'un fragment surnuméraire de 107 kb, qu'il n'est pas possible de curer à la novobiocine. Celui-ci porte donc les caractères Rap et Lac. + + Le transconjugant 545-114 clone 1 Rap Lac présente un fragment surnuméraire de 66 kb On peut corréLer la disparition du phénotype Rap après curage à celle de ce fragment surnuméraire. Celui-ci porte donc un mécanisme de résistance aux phages (le caractère Lac est probablement porté par un autre fragment surnu- méraire non détecté). + + Le transconjugant 545-94 clone 1 Rap Lac présente deux fragments surnuméraires de 57 et 72 kb On peut corréLer la + disparition du phénotype Rap après curage à celle du fragment + surnuméraire de 72 kb (et celle du phénotype Lac à celle du fragment surnuméraire de 57 kb). Le fragment surnuméraire de 72 kb porte donc un mécanisme de résistance aux phages (et le fragment surnuméraire de 57 kb le caractère Lac). Les fragments surnuméraires de 144 kb, 107 kb, 118 kb, 66 kb et 72 kb sont donc porteurs d'un mécanisme de résistance aux phages Par la suite ils seront appe Lés respectivement p PF 144, p PF 107, p PF 118, p PF 66 et p PF 72. 2) Caractérisation des fragments d'ADN surnuméraires: Les fragments surnuméraires p PF 144, p PF 107, p PF 118, p PF 66 et p PF 72, ont été hydrolysés par l'enzyme de restriction Apa I et soumis au traitement décrit en A)6) Cette expérience a permis de montrer qu'ils sont tous linéaires dans les morceaux de gels d'agarose préLevés. a) Cartes de restriction des fragments surnuméraires p PF 144, p PF 107, p PF 66 et p PF 72: Afin d'établir leurs cartes de restriction, les fragments surnuméraires p PF 144, p PF 107, p PF 66 et p PF 72 ont été soumis à des digestions simples, doubles ou triples à l'aide de différentes enzymes de restriction, notamment les enzymes Apa I, Bam HI, Bg II, Sac I, Sac II et Sa II et les fragments obtenus ont été analysés sur gel d'agarose en champ pu Lsé Quand cela a été possible, l'ADN génomique des transconjugants a d'autre part été digéré à l'aide d'autres enzymes que Apa I afin de linéariser les fragments surnumé- raires à un autre endroit, et analysé par électrophorèse en champ pu Lsé Ceci a permis de confirmer les cartes de restriction et de démontrer pour les fragments surnuméraires p PF 107, p PF 144 et p PF 66 le caractère circulaire initial Ceux-ci sont donc des plasmides. Les tableaux 8, 9, 10 et 11 ci-après précisent les profils de restriction obtenus pour les fragments p PF 144, p PF 107, p PF 66 et p PF 72. Fragments de restriction Tableau 8 obtenus avec l le plasmide p PF 144. Enzymes de restriction Nombre de fragments Taille en kb Apa I Bam HI 2 86, 58 Apa I Bg II 3 50, 50, 44 Apa I Sa II 2 79, 65 Apa I Sac II 2 86, 58 Apa I Sma I 2 127, 17 Tableau 8 (suite) Enzymes de restriction Nombre de fragments Taille en kb Sac II Bg II 3 94, 36, 14 Sac II Sa II 2 137, 7 Sac II Apa I 2 86, 58 Sac II Sma I 2 103, 41 Sac II Bam HI 1 144 (La première enzyme (Apa I ou Sac II) est celle utilisée pour linéariser le plasmide p PF 144, lors de la digestion de l'ADN total du transconjugant La seconde enzyme a été utilisée pour digérer le fragment obtenu lors de la digestion avec la première enzyme). Tableau 9 Fragments de restriction obtenus avec le plasmide p PF 107. Enzymes de restriction Nombre de fragments Taille en kb Apa I Sa II 3 64, 27, 16 Apa I Bam HI 3 71, 27, 9 Apa I Bg II 3 77, 27, 3 Apa I Sma I 2 91, 16 Apa I Sac II 3 80, 17, 10 Tableau 9 (suite) Enzymes de restriction Nombre de fragments Tai L Le en kb Bg II Sa II 2 61, 43 Bg II Bam HI 2 98, 6 Bg II Apa I 2 77, 27 Bg II Sma I 2 61, 43 Bg II Sac II 2 87, 17 (La première enzyme (Apa I ou Bg II) est celle utilisée pour linéariser le plasmide p PF 107, lors de la digestion de l'ADN total du transconjugant La seconde a été uti Lisée pour digérer le fragment obtenu lors de la digestion avec la première enzyme). Fragments de restriction Tableau 10 obtenus avec le plasmide p PF 66. Enzymes de restriction Nombre de fragments Taille en kb Apa I Sa II 4 31, 26, 7, 2 Apa I Bam HI 2 45, 21 Apa I Bg II 2 33, 33 Bam HI Sa II 4 26, 19, 12, 9 Bam HI Apa I 2 45, 21 Bam HI Bg II 2 54, 12 (La première enzyme (Apa I ou Bam HI) est celle utilisée pour linéariser le plasmide p PF 66, lors de la digestion de l'ADN total du transconjugant La seconde enzyme a été utilisée pour digérer le fragment obtenu après la digestion par la première enzyme). Fragments de restriction Tableau 11 obtenus avec l E e plasmide p PF 72. Enzyme de restriction Nombre de fragments Taille en kb Apa I Sa II 5 ou 4 31, 26, 11, 2, 2 Apa I Bam HI 3 42, 21, 9 Apa I Sac I 2 45, 27 Apa I Sac II 2 62,5, 9,5 Ces profils de restriction ont permis notamment d'établir des cartes de restriction des fragments p PF 144, p PF 107, p PF 66 et p PD 72, représentées respectivement sur les figures 1, 2, 3 et 4, les chiffres vis-à-vis des sites de restriction symbolisant le nombre de kb àpartir du site Apa I, pris arbitrairement comme origine Sur ces figures sont représentés au même endroit les sites que la sensibilité de la méthode d'analyse n'a pas permis de séparer. b) Profil de restriction du fragment surnuméraire p PF 118. Le fragment surnuméraire p PF 118 déjà digéré par Apa I a été soumis à une digestion simple à l'aide des enzymes Bam HI, Xho I, Bg II et Sa II Le tableau 12 ci-après rassemble les profils de restriction obtenus. Tai Lle des fragments (kb) (déjà digéré par Apa I). Tableau 12 obtenus par digestion du fragment p PF 118 p PF 118 Bam HI Xho I Bg II Sa II 66 95 71 46 36 26 28 42 16 17 36 16 23 c) Caractère plasmidique des fragments p PF 72 et p PF 118: Il a été possible de curer les souches 545-94 clone 1 et 545-77 clone 6 des fragments p PF 72 et p PF 118 (cf ci-dessus tableau 3 de l'exemple 2), ce qui montre le caractère extra chromosomique de ces fragments On a d'autre part constaté par analyse à l'aide de la technique d'électrophorèse en champ pulsé l'absence de fragment linéaire dans l'ADN génomique non digéré de ces souches et la présence des fragments linéaires p PF 72 et p PF 118 dans l'ADN génomique de ces souches digéré par Apa I Ces deux fragments extra chromosomiques sont donc sous forme circulaire dans les souches 545-94 clone 1 et 545-77 clone 6. Les fragments surnuméraires p PF 72 et p PF 118 sont donc également des plasmides. d) Positionnement du gène de la P-6-galactosidase sur les plasmides p PF 144 et p PF 107 Présence de ce gène sur le plasmide p PF 118 et absence de celui-là sur les plasmides p PF 66 et p PF 72. Le gène de la P-f-galactosidase, enzyme impliquée dans le métabolisme du lactose, doit être présent sur les plasmides p PF 144 et p PF 107, porteurs du caractère Lac Ce gène a été cloné par B BOIZET et al dans le plasmide p UCB 25 (B BOIZET et al ( 1988) Gene, 62, 249-261) Ce dernier a été utilisé comme sonde pour positionner par hybridation le gène de la Pp-galactosidase dans les plasmides ci-dessus. On a ainsi montré que le gène de la P-p-galactosidase est situé sur les plasmides p PF 114 et p PF 107dans la partie qui comprend le site Apa I Ce résultat n'est pas étonnant car la séquence publiée de ce gène (B BOIZET et a I ( 1988) Gene, 62, 249-261) comprend un site Apa I. L'application de la technique décrite ci-dessus au fragment p PF 118 et aux plasmides p PF 66 ainsi que p PF 72 a d'autre part permis de vérifier la présence du gène de la P-galactosidase dans le plasmide p PF 118 et son absence dans les plasmides p PF 66 et p PF 72. Exemple 5 Caractérisation partielle des mécanismes de résistance aux phages - Thermosensibilité Etude de l'adsorption phagique. 1) Thermosensibilité des mécanismes de résistance: Afin de déterminer la résistance à la température de ces différents mécanismes de résistance aux phages, le test suivant a été effectué sur les transconjugants: Les bactéries à tester sont cultivées jusqu'à une phase exponentielle de croissance (DO 600 0,5) Puis ces bactéries sont préchauffées à la température que l'on veut tester pendant 15 min de même que les boîtes de milieu gélosé Ensuite un tapis de ces bactéries est coulé avec de la gélose molle contenant du Ca C 12 O m M et des gouttes de phages à différentes dilutions sont déposées sur ce tapis La boîte Pétri est ensuite immédiatement mise à la température testée, dans une étuve appropriée. Le tableau 13 ci-après rassemble les résultats obtenus pour les titres phagiques pour les 5 transconjugants retenus en 1) et la souche 545 (témoin) à une température de 30 C et de 40 C. Tableau 13 +Résistance aux phages des transconjugants Lac aux températures de 30 C et 40 C Résistance aux phages des transconjugants Lac aux températures de 30 C et 40 C Souche Phage r 30 Cl Phage r 40 Cl Titre phagique Cnombre de phages/mll/ Titre phagique Cnombre de phages/mll/ diamètre de La plage de lyse lmml diamètre de la plage de lyse rmml 024 053 059 024 053 059 lgroupe Il Egroupe Il Egroupe IIIl Egroupe Il Egroupe Il Egroupe IIIl 54591 clone 1 0/0 4,107/ 545 2,109/2 2,10/3/2 2,102 2,109/22,110/3 2,109/2 w K) M M G (D w F On constate à la lecture du tableau ci-dessus: la souche 545-96 clone 1, totalement résistante aux phages à la température de 30 O C devient pratiquement aussi sensible que la souche témoin à une température de 40 C Le mécanisme de résistance aux phages mis en jeu est donc très thermosensible. Les souches 545-91 clone 1, 545-77 clone 6 et 545-114 clone 1 ont une résistance (partielle) aux phages à une température de 400 C inférieure à celle qu'elles ont à une température de 300 C. Les mécanismes de résistances aux phages portés par ces souches sont donc moyennement thermosensibles. La souche 545-94 clone 1 est aussi résistante à une température de 400 C qu'à une température de 300 C Son mécanisme de résistance aux phages est donc peu thermosensible. Les résultats rapportés ci-dessus laissent supposer que différents types de mécanismes, certains plus thermosensibles que d'autres, sont impliqués dans la résistance aux phages. 2) Etude de l'adsorption phagique. On se place dans des conditions o la bactérie provient d'une culture de nuit Puis dans un tube Eppendorf sont déposés: 600 pl de culture bactérienne; pl de Ca C 12, 1 M; 600 pl de phages (à 10 /ml). L'ensemble est laissé à l'étuve à 30 C pendant exactement 12 min, puis l'adsorption est arrêtée en plongeant le tube Eppendorf dans la glace Le tube est centrifugé dans une microfuge à tubes Eppendorf pendant 5 min à + 4 C pour se débarrasser des bactéries et des phages adsorbés Le surnageant est prélevé, dilué à 4 C; le nombre de phages non adsorbés est ainsi déterminé sur des tapis de la souche 545. Ce test a été effectué sur les 5 transconjugants retenus et la souche 545 (témoin) avec comme phages 053 (groupe I d'homologie), phage contre lequel les transconjugants sont partiel- lement résistants, et avec 059 (groupe III d'homologie), phage contre lequel les transconjugants sont résistants (cf tableau 2 ci-dessus). Aucune différence d'adsorption phagique significative n'a été constatée, contrairement aux observations de SANDERS M E et ai et de DE VOS W M et ai (SANDERS M E et ai ( 1983), Appl Environ Microbiol 46, 1125-1133 et DE VOS W M et ai ( 1984), Microbiol. Lett, 23, 175-178). L'adsorption phagique n'est donc pas impliquée dans les mécanismes de résistance portés par ces souches. Exemple 6: Recherche d'activité bactéricide Il est intéressant d'avoir des souches de lactocoques possédant une activité bactéricide (provoquée par des bactério- cines) car celles-ci inhibent le développement de bactéries conta- minantes On a donc recherché des activités bactéricides dans les transconjugants retenus. a) Protocole. 7 pl d'une culture de nuit de la souche étudiée sont déposés sur une boîte de milieu gélosé sous forme d'une goutte. L'incubation dure 16 h à la température optimale de croissance. Puis sur ce milieu est étalée la souche bactérienne sensible, Lactococcus lactis ssp lactis 545, mélangée à de la gélose molle à 500 C, du milieu et du glucose à 0,4 % L'incubation est effectuée de nouveau pendant 16 h L'apparition d'un halo clair autour de la goutte de culture laisse présumer la présence d'une bactériocine (Van BELKUM et a I ( 1989) Appl Environ Microbiol 55, 1187-1191). b) Résultats: Le protocole décrit ci-dessus a été mis en oeuvre pour les souches ci-après: les transconjugants (non curés) 545-91 clone 1, 545-96 clone 1, 545-77 clone 6, 545-114 clone 1, 545-94 clone 1; le transconjugant curé 545-114 clone 1 présentant les phénotypes Rap Lac, Rap Lac et Rap Lac et le transconjugant + curé 545-94 clone 1 présentant les phénotypes Rap Lac et Rap Lac; les souches donneuses 591, 594, 596, 5114 et 577; la souche réceptrice 545 (témoin). Les souches ci-après présentent une activité bactéri- cide: les souches donneuses 594 et 5114, les transconjugants 545-94 clone 1 et 545-114 clone 1, le transconjugant curé 545-94 clone I présentant le phénotype Rap Lac et le transconjugant curé 545-114 clone 1 présentant le phénotype Rap Lac- Ces transcon- jugants curés ou non contiennent tous l'un ou l'autre des plasmides p PF 72 et p PF 66 Chacun de ceux-ci possède donc une activité bactéricide. Des expériences complémentaires ont montré que les souches possédant le plasmide p PF 66 sont résistantes à l'activité bactéricide des souches possédant le plasmide p PF 72 et vice versa. Or on sait que les bactéries sont résistantes aux bactériocines qu'elles produisent Les modes d'action des mécanismes de résistance aux bactériocines sont donc voisins. REVENDICATIONS 1 Plasmide comprenant au moins un mécanisme de résis- tance aux phages, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être contenu dans les transconjugants issus du croisement d'une souche donneuse choisie parmi les souches: souches Lactococcus lactis ssp cremoris déposées à la CNCM sous o les N I-939 et 1-943, souche Lactococcus lactis ssp lactis déposée à la CNCM sous le n 1-940, souches Lactococcus lactis ssp lactis var diacetylous déposées à la CNCM sous les N I-941 et 1-942, et d'une souche réceptrice. 2 Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ou les mécanismes de résistance aux phages confèrent à une température de 30 C une résistance partielle ou totale contre les phages du groupe I d'homologie, et les phages du groupe III d'homo- logie. 3 Plasmide selon l'une des revendications 1 à 2, carac- térisé en ce qu'il comprend également un ou plusieurs gènes confé- rant à la bactérie lactique le contenant la capacité de métaboliser le lactose. 4 Plasmide selon l'une des revendications 1 à 3, carac- térisé en ce qu'il comprend également un ou plusieurs gènes confé- rant à la bactérie lactique le contenant une activité bactéricide. Plasmide selon l'une des revendications 1 à 4, carac- térisé en ce qu'il a Les caractéristiques d'un plasmide choisi parmi: le plasmide p PF 66 contenu dans la souche Lactococcus lactis ssp lactis déposée à la CNCM sous le N 1-948, le plasmide p PF 72 contenu dans la souche Lactococcus lactis ssp lactis déposée à la CNCM sous le N 1-946, le plasmide p PF 107 contenu dans la souche Lactococcus lactis ssp lactis déposée à la CNCM sous le N 1-947, le plasmide p PF 118 contenu dans la souche Lactococcus lactis ssp lactis déposée à la CNCM sous le N 1-944, le plasmide p PF 144 contenu dans la souche Lactococcus lactis ssp lactis déposée à la CNCM sous le N 1-945. 6 Plasmide, caractérisé en ce que sa séquence présente un degré d'homologie éLevé avec et/ou comprend une partie impor- tante de la séquence d'un plasmide selon la revendication 5. 7 Plasmide selon l'une des revendications 1 à 5, carac- térisé en ce que la souche réceptrice est la souche Lactococcus lactis ssp lactis 545. 8 Bactérie lactique résistante aux phages, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un plasmide selon l'une des reven- dications 1 à 7. 9 Bactérie lactique selon la revendication 8, caracté- risée en ce qu'elle appartient à l'espèce Lactococcus lactis. Bactérie lactique selon la revendication 9, caracté- risée en ce qu'elle est choisie parmi les souches Lactococcus o lactis ssp Lactis déposées à la CNCM sous les N 1-944, 1-945, 1-946, I-947 et 1-948. 11 Utilisation d'une souche choisie parmi les souches Lactococcus lactis ssp lactis déposées à la CNCM sous les N 1-944, 1-945, 1-946, I-947 et 1948, les souches Lactococcus lactis ssp cremoris déposées à la CNCM sous les N I-939 et 1-943, la souche Lactococcus lactis ssp lactis déposée à la CNCM sous le N 1-940, et les souches Lactococcus lactis ssp lactis var diacetylous déposées à la CNCM sous les N I-941 et I-942 pour conférer un mécanisme de résistance aux phages à une souche d'intérêt indus- triel. 12 Souche d'intérêt industriel résistante aux phages, caractérisée en ce qu'elle porte un mécanisme de résistance aux phages transféré selon un procédé utilisant une souche choisie parmi les souches Lactococcus lactis ssp lactis déposées à la CNCM o sous les N 1-944, 1-945, 1-946, I947 et 1-948, les souches Lactococcus lactis ssp cremoris déposées à la CNCM sous les o n I-939 et 1-943, la souche Lactococcus lactis ssp lactis déposée à la CNCM sous le N I-940 et les souches Lactococcus lactis ssp o lactis var diacetylous déposées à la CNCM sous les N I-941 et 1-942. 13 Utilisation d'une souche choisie parmi Les souches Lactococcus Lactis ssp cremoris déposées à La CNCM sous Les N D 77 et D 114, La souche Lactococcus Lactis ssp Lactis déposée à La CNCM sous Le n D 91 ainsi que Les souches Lactococcus Lactis ssp Lactis var diacetylous déposées à la CNCM sous les N D 94 et D 96, pour obtenir un plasmide selon l'une des revendications 1 à 7.