FR 2666590 A1 19920313 FR 9011230 A 19900911 i ADN recombinant codant pour un précurseur de l'endothiapepsine, vecteur d'expression, bactéries et cellules eucaryotes transfor- mées. La présente invention concerne un nouvel ADN recombinant codant pour un précurseur de l'endothiapepsine, un vecteur d'expression comprenant cet ADN recombinant, des bactéries trans- formées par ce vecteur, des cellules eucaryotes contenant cet ADN recombinant avec les moyens nécessaires à son expression, un procédé de production de cette protéine dans une souche Cryphonectria parasitica transformée par cet ADN recombinant, un procédé pour rendre cette souche déficiente en endothiapepsine, ainsi qu'un procédé d'amplification de cet ADN recombinant dans les cellules fongiques. Le champignon filamenteux Cryphonectria parasitica, éga- lement appelé Endothia parasitica, qui appartient au groupe des ascomycètes, sécrète naturellement une aspartylprotéase: l'endo- thiapepsine, capable de faire coaguler le lait en hydrolysant spécifiquement les micelles de caséine et donc utile dans la fabri- cation de certains fromages, en particulier les fromages à pâte cuite de type Emmental Cette enzyme, dont la séquence de 330 acides aminés a été décrite par Barkolt V, 1987, Eur J. Biochem 167, 327-338, remplace alors la chymosine. On produit actuellement cette enzyme à l'échelle indus- trielle par des procédés de fermentation de souches Cryphonectria parasitica choisies pour leur bon niveau d'expression de l'endo- thiapepsine. Ces procédés présentent des inconvénients et notamment celui d'une immobilisation d'un volume de réacteur important car la quantité d'endothiapepsine par unité de biomasse, donc la quantité d'endothiapepsine par unité de volume du réacteur pour une quantité de biomasse donnée, sont faibles. Les techniques classiques de mutation-sélection ne permettent d'augmenter que d'environ 30 % la quantité d'endothia- pepsine produite par unité de biomasse. La demanderesse a donc entrepris des recherches en vue d'obtenir à l'aide des techniques de génie génétique des souches Cryphonectria parasitica surproductrices d'endothiapepsine avec un facteur de surproduction: rapport entre la quantité d'endothiapep- sine produite par la souche transformée surproductrice et la quan- tité de cette protéine produite par la souche témoin non transfor- mée, pour une même quantité de biomasse, au moins égal à 2. A cet effet, el Le a préparé l'ADN génomique de la souche Cryphonectria parasitica SEBR 103, déposée à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes CNCM sous le n I-997, à partir d'un bouillon de culture de cette souche, criblé cet ADN préalablement hydrolysé et fixé sur filtre de nitrocellulose à L'aide de sondes construites à partir de peptides choisis dans la séquence décrite par Barkolt, isolé ainsi, cloné et séquencé un fragment d'ADN d'environ 2,1 kb, appelé fragment A Ce fragment contient la séquence codant pour une préproendothiapepsine, interrompue par trois introns et précédée d'une partie de promoteur comprenant une séquence TATAA, appe Lée boite TATA, mais pas de région d'activation amont Aucune surproduction d'endothiapepsine n'a été constatée chez les transformants obtenus par transformation de La souche Cryphonectria parasitica SEBR 103 par le fragment A. La demanderesse a donc préparé l'ADN génomique de cette souche par extraction de celui-ci à partir de protoplastes issus d'un bouillon de culture de celle-ci, construit une banque cosmidique de cet ADN génomique, criblé celle-ci à l'aide du fragment A utilisé comme sonde et ainsi isolé un fragment d'ADN d'environ 32,6 kb, appelé fragment B, qui contient le fragment A Elle a ensuite établi un profil de restriction du fragment B, isolé et cloné un sous- fragment du fragment B d'environ 9 kb, appelé fragment C, qui contient le fragment A, et établi une carte de restriction du fragment C, laquelle montre que l'extrémité 5 ' du fragment C est située à environ 4 kb du codon d'initiation de la traduction situé sur le fragment A Un clone de la souche d'Escherichia coli K 12 RRI transformée par un plasmide portant le fragment C a été déposé à la CNCM sous le N I-998 La demanderesse a ensuite cotransformé la souche Cryphonectria parasitica SEBR 103 avec un plasmide portant un marqueur de sélection d'une part et soit un cosmide portant le fragment B, soit un p Lasmide portant Le fragment C d'autre part, et sélectionné des transformants issus de La cotransformation avec Le fragment B surproducteurs d'endothiapepsine avec un facteur de surproduction voisin de 2 et des transformants issus de La cotrans- formation avec Le fragment C surproducteurs d'endothiapepsine avec un facteur de surproduction voisin de 3, pour dans chaque cas une même quantité de biomasse Ces résultats indiquent notamment que Le fragment C contient un promoteur fonctionnel donc une égion activa- trice dans la partie du fragment C non commune avec Le fragment A et en 5 ' de celui-ci. La demanderesse a constaté qu'il était possible après purification par sporu Lation d'éliminer le marqueur de sélection, ce qui rend possible L'amp Lification du gène de La préproendothia- pepsine par transformations successives et donc doit permettre L'obtention de souches surproductrices d'endothiapepsine avec un facteur de surproduction supérieur à 3 EL Le a d'autre part, montré qu'il était possible d'obtenir une souche Cryphonectria parasitica déficiente en endothiapepsine par transformation de cette souche par le gène de l'endothiapepsine rendu non fonctionnel Une telle souche serait utile pour la production d'une protéine hétéro Logue dans C parasitica, en particulier pour Les protéines susceptibles d'être dégradées. La demanderesse a d'autre part amplifié, à L'aide de la technique de La réaction de po Lymérase en chaîne (PCR), L'ADN complémentaire codant pour la préproendothiapepsine, construit un vecteur d'expression et de clonage de celui-ci, séquencé ce dernier, exprimé cet ADN dans Escherichia coli. L'invention concerne donc un nouvel ADN recombinant, caractérisé en ce qu'il code pour un précurseur, comportant une séquence peptidique pré et une séquence peptidique pro, de l'endo- thiapepsine, de séquence (P 1) suivante: Ser Thr Gly Setr A La Thr Thr Thr Pro I Le Asp Ser Leu Asp Asp Ala Tyr Ile Thr Pro Va L G Ln Ile Gly Thr Pro A La Gln Thr Leu Asn Leu Asp Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Leu Trp Val Phe Ser Ser Glu Thr Thr Ala Ser Glu Val Asp Gly Gin Thr Ile Tyr Thr Pro Ser Lys Ser Thr Thr Ala Lys Leu Leu Ser Gly Ala Thr Trp Ser Ile Ser Tyr Gly Asp Gly Ser Ser Ser Ser Gly Asp Val Tyr Thr Asp Thr Val Ser Val Gly Gly Leu Thr Val Thr Gly Gin Ala Val Glu Ser Ala Lys Lys Val Ser Ser Ser Phe Thr Glu Asp Setr Thr Ile Asp Gly Leu Leu Gly Leu Ala Phe Setr Thr Leu Asn Thr Val Setr Pro Thr Gin Gln Lys Thr Phe Phe Asp Asn Ala Lys Ala Setr Leu Asp Ser Pro Val Phe Thr Ala Asp Leu Gly Tyr His Ala Pro Gly Thr Tyr Asn Phe Gly Phe Ile Asp Thr Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Ile Thr Tyr Thr Ala Va L Ser Thr Lys Gln Gly Phe Trp Glu Trp Thr Ser Thr Gly Tyr Ala Val Gly Ser Gly Thr Phe Lys Ser Thr Setr Ile Asp Gly Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu Tyr Leu Pro Ala Thr Val Val Ser Ala Tyr Trp Ala Gin Val Setr Gly Ala Lys Setr Setr Setr Ser Val Gly Gly Tyr Val Phe Pro Cys Setr Ala Thr Leu Pro Setr Phe Thr Phe Gly Val Gly Setr A La Arg Ile Val Ile Pro G Ly Asp Tyr Ile Asp Phe Gly Pro Ile Setr Thr Gly Setr Setr Ser Cys Phe G Ly Gly Ile Gln Setr Setr Ala Gly Ile Gly Ile Asn Ile Phe Gly Asp Val Ala Leu Lys Ala Ala Phe Val Val Phe Asn Gly Ala Thr Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ala Setr Lys. La séquence peptidique pré, également appelée peptide- signa L, est une séquence d'un type bien connu de l'homme de l'art qui est nécessaire pour la sécrétion de la protéine. De préférence, la séquence peptidique pré est la séquence (P 2) suivante: Met Ser Ser Pro Leu Lys Asn Ala Leu Val Thr Ala Met Leu Ala Gly Gly Ala Leu Ser. Un ADN recombinant apprécié est alors celui dont la séquence codant pour la séquence (P 2) est la séquence (N 2) sui- vante: ATGTCTT CCCCTCTCAA GAACGCCTTG GTGACCGCCA TGTTGGCTGG TGGTGCTCTC AGC La séquence peptidique pro, séquence située entre la séquence peptidique pré et la protéine mature, est également une séquence d'un type bien connu de l'homme de l'art, qui a vraisem- blablement pour fonction d'inhiber l'endothiapepsine, probablement toxique pour la cellule hâte, avant son exportation vers le milieu extérieur, à la suite de laquelle cette séquence pro est clivée. De préférence, la séquence peptidique pro est la séquence (P 3) suivante: Ser Pro Thr Lys Gln His Val Gly Ile Pro Val Asn Ala Ser Pro Glu Val Gly Pro Gly Lys Tyr Ser Phe Lys Gln Val Arg Asn Pro Asn Tyr Lys Phe Asn Gly Pro Leu Ser Val Lys Lys Thr Tyr Leu Lys Tyr Gly Val Pro Ile Pro Ala Trp Leu Glu Asp Ala Val Gln Asn Ser Thr Ser Gly Leu Ala Glu Arg. Un ADN recombinant intéressant est alors celui dont la séquence codant pour la séquence (P 3) est la séquence (N 3) sui- vante: TCGCCTA CAAAGCAACA CGTTGGAATT CCTCTCCTGA AGTTGGCCCC GGAAAGTACT CGTTCAAGCA CCCAACTACA AGTTCAACGG GCCTCTGTCG GTCAAGAAGA GTACGGCGTG CCGATCCCAG CCTGGCTGGA GGATGCTGTC CCTCGGGCCT GGCTGAGCGC CCCGTCAACG AGTCCGGAAC CGTACCTCAA CAGAACTCTA Un ADN recombinant particulièrement apprécié pour une expression dans un micro-organisme procaryote, tel que Escherichia coli ou une bactérie lactique, ou dans une cellule eucaryote ne possédant vraisemblablement pas la machinerie cellulaire nécessaire pour épisser les introns de la séquence codante de l'ADN génomique de Cryphonectria parasitica, telle que par exemple Saccharomyces cerevisiae, est celui qui comprend la séquence (Nla) suivante: ATGTCTT TGGTGCTCTC CCTCTCCTGA CCCAACTACA GTACGGCGTG CCTCGGGCCT GACAGCCTCG GCAGACTCTG TCAGCAGCGA CCCAGCAAGA TCCTACGGAG CTCGGTTGGA AGGTTTCTTC CTGGCCTTCA CTTCGACAAT TTGGCTACCA GCCTACACGG CTGGGAGTGG CGACTTCCAT CCTGCCACCG CAGCTCTTCC CCTTCACCTT ATTGATTTCG CCAGTCCAGC AGGCTTTGTC CCAAG CCCCTCTCAA AGCTCGCCTA AGTTGGCCCC AGTTCAACGG CCGATCCCAG GGCTGAGCGC ATGATGCTTA AACCTGGACT GACTACAGCC GCACCACCGC ACGGTAGCTC GGCCTTACCG CAGCTTCACC GCACCCTGAA GCGAAGGCGT TGCCCCTGGT GCTCCATCAC ACTTCGACCG CGACGGCATC TCGTGTCGGC GTCGGCGGCT CGGCGTTGGC GCCCCATCTC GCTGGTATCG GTCTTCAACG GAACGCCTTG CAAAGCAACA GGAAAGTACT GCCTCTGTCG CCTGGCTGGA TCGACCGGTT CATCACTCCG TTGACACTGG AGCGAGGTCG CAAGCTGCTG TTCCAGCGGC TGACGGGCCA GAGGACTCGA CACTGTGTCG CCTTGGACTC ACCTACAACT CTACACCGCT GCTACGCCGT GCTGACACTG CTACTGGGCC ACGTCTTCCC TCAGCTCGCA CACTGGAAGC GCATCAACAT GGGCTACAAC GTGACCGCCA CGTTGGAATT CGTTCAAGCA GTCAAGAAGA GGATGCTGTC CTGCGACCAC GTTCAGATCG ATCTTCGGAT ATGGGCAGAC TCGGCGCTAC GATGTCTACA GGCTGTCGAG CCATTGACGG CCTACCCAGC GCCTGTGTTC TCGGCTTCAT GTCTCGACCA CGGCTCCGGC GCACGACCCT CAGGTCTCGG CTGCAGCGCG TTGTGATTCC TCGTCTTGCT CTTCGGTGAT TCCCACTCTT TGTTGGCTGG CCCGTCAACG AGTCCGGAAC CGTACCTCAA CAGAACTCTA AACTCCCATC GCACCCCTGC CTGTGGGTCT CATCTACACC CTGGTCCATC CTGACACCGT TCGGCCAAGA TCTCCTGGGC AAAAGACTTT ACGGCTGATC CGATACCACT AGCAAGGGTT ACCTTCAAGT CCTGTACCTC GCGCCAAGTC ACCCTGCCTT TGGCGACTAC TTGGCGGCAT GTCGCTCTGA GGCTTTGCTT ou une séquence légèrement modifiée par rapport à la séquence (Nla), de façon à avoir en aval de l'ATG un environnement nuc Léo- tidique plus conforme à celui habituellement rencontré dans un gène endogène de la cellule hôte. Pour une expression dans une cellule eucaryote capable d'épisser ces introns, telle que celle d'un autre champignon fila- menteux du groupe des ascomycètes, par exemple du genre Aspergillus, Neurospora, Podospora, Trichoderma ou Cryphonectria, on préfère, car son expression est meilleure, un ADN recombinant qui comprend la séquence (Nla) interrompue par un ou plusieurs introns que la cellule est capable d'épisser. Un ADN recombinant particulièrement intéressant pour une expression dans Cryphonectria parasitica est celui qui comprend la séquence (Nlb) suivante: CCTTGGTGAC CAACACGTTG GTACTCGTTC AGACCAACGC ATTATACTTT TCGGTCAAGA GGAGGATGCT GTTCTGCGAC CCGGTTCAGA TGGATCTTCG TTGGTCAACC TAATCAGAAT ACCATCTACA TACCTGGTCC ACACTGACAC GAGTCGGCCA CGGTCTCCTG AGCAAAAGAC TTCACGGCTG TATACTTTTT ATTGTTTGTA CTGCCTACAC TTCTGGGAGT GTCGACTTCC TCCCTGCCAC TCCAGCTCTT TTCCTTCACC ACATTGATTT ATCCAGTCCA GAAGGCCGCC TTGCTTCCAA CGCCATGTTG GAATTCCCGT AAGCAAGGTG AAAAAGAAGA TGAAGTCCGG *AGACGTACCT GTCCAGAACT CACAACTCCC TCGGCACCCC GATCTGTGGG CTCGCCCGCA ACTAACATTG CCCCCAGCAA ATCTCCTACG CGTCTCGGTT AGAAGGTTTC GGCCTGGCCT TTTCTTCGAC ATCTTGGCTA GATGAATCTT TCTACAGCTG GGGCTCCATC GGACTTCGAC ATCGACGGCA CGTCGTGTCG CCGTCGGCGG TTCGGCGTTG CGGCCCCATC GCGCTGGTAT TTTGTCGTCT G AT GTCTTCCCCT GCTGGTGGTG CTCTCAGCTC CAACGCCTCT CCTGAAGTTG AGTAGAGCTG CTTCTGTGTG GGTCAAGGCA AGACGGATAT AACCCCAACT ACAAGTTCAA CAAGTACGGC GTGCCGATCC CTACCTCGGG CCTGGCTGAG ATCGACAGCC TCGATGATGC TGCGCAGACT CTGAACCTGG TCTTCAGCAG CGAGACTACA TTTTATTGCA TACATTTTTA GGAATTTCCC AACTGTAGGT GAGCACCACC GCCAAGCTGC GAGACGGTAG CTCTTCCAGC GGAGGCCTTA CCGTGACGGG TTCCAGCTTC ACCGAGGACT TCAGCACCCT GAACACTGTG AATGCGAAGG CGTCCTTGGA CCATGCCCGT GAGTGACCCC GTTGGAGAAG CATTCCCCAC GTACCTACAA CTTCGGCTTC ACCTACACCG CTGTCTCGAC CGGCTACGCC GTCGGCTCCG TCGCTGACAC TGGCACGACC GCCTACTGGG CCCAGGTCTC CTACGTCTTC CCCTGCAGCG GCTCAGCTCG CATTGTGATT TCCACTGGAA GCTCGTCTTG CGGCATCAAC ATCTTCGGTG TCAACGGGGC TACAACTCCC CTCAAGAACG GCCTACAAAG GCCCCGGAAA TTGCAACAGA TTTACTGACA CGGGCCTCTG CAGCCTGGCT CGCTCGACCG TTACATCACT ACTTTGACAC GCCAGCGAGG GTTTTTTTGG CGATGGGCAG TGTCGGGCGC GGCGATGTCT CCAGGCTGTC CGACCATTGA TCGCCTACCC CTCGCCTGTG TCTTGATACA TAATATGGAA ATCGATACCA CAAGCAAGGG GCACCTTCAA CTCCTGTACC GGGCGCCAAG CGACCCTGCC CCTGGCGACT CTTTGGCGGC ATGTCGCTCT ACTCTTGGCT L'ADN recombinant de l'invention sera situé entre un pro- moteur et un terminateur fonctionnels Un exemple de promoteur intéressant pour une expression dans les cellules eucaryotes, et notamment dans Cryphonectria parasitica, est celui qui comprend une partie portant la boite TATA de la séquence (N 4) suivante: AAGCTTATCC GCCGCCGGCG GGGGAATTCT ATTGAACTTG TTCGAATCAT TGGTCCGTGG TCTTTTCGTC CATGCGGGCT CCGCTGGCGG ATGAATGACC TTCTGGCTTC TAGCCTGGCG AAGCGATGTT ACTCTGTTGT CTATACTATA CGATATGGTC AAGAGAGCAC ATGTGCCGCC AGATGAAGAC ATGTATATAA AAGGAGTGGC CTCGACGGTT GCTCAACCAT CTTCTGTCTG TCCCAACGCC ATCGACTCTT CAACTTCTCC TTCGTGTTCC ACCACCATCA CCTTGCTCCA GACTTAGGAC TTTCAGCAAC CTTCAAAG et en amont de la séquence (N 4) un segment E du fragment C, compris entre l'extrémité 5 ' du fragment A et un nucléotide situé entre l'extrémité 5 ' du fragment A et l'extrémité 5 ' du fragment C, choisi de façon que le segment E contienne une région activatrice. L'invention concerne aussi un tel promoteur. Une localisation plus précise de cette région activatrice pourra être déterminée par l'obtention d'une série de sous- fragments du fragment C (préparés par exemple par digestion à l'aide d'endonucléases ou d'exonucléases) comprenant le fragment A flanqué en 5 ' de segments de différentes tailles de la partie du fragment C comprise entre l'extrémité 5 ' du fragment A et un nucléotide situé entre l-'extrémité 5 ' du fragment A et l'extrémité ' du fragment C, transformation de Cryphonectria parasitica SEBR 103 par ces sous-fragments et sélection des transformés expri- mant la protéase recombinante. L'invention a trait également à un vecteur d'expression qui porte, avec les moyens nécessaires à son expression, l'ADN recombinant défini précédemment. Pour une expression dans les micro-organismes proca- ryotes, en particulier dans Escherichia coli, la séquence codante doit être insérée dans un vecteur d'expression comportant notamment un promoteur fonctionnel, suivi d'un site de fixation des ribosomes en amont du gène à exprimer, ainsi qu'une séquence d'arrêt de transcription fonctionnelle en aval du gène à exprimer Ce plasmide doit également comporter une origine de réplication et un marqueur de sélection Toutes ces séquences doivent être choisies en fonction de la cellule hôte. Pour une expression dans les cellules eucaryotes, telle que la levure, par exemple Saccharomyces cerevisiae (qui appartient au groupe des ascomycètes), le vecteur d'expression selon l'inven- tion porte l'ADN recombinant défini précédemment avec les moyens nécessaires à son expression, à sa réplication dans les cellules eucaryotes et à la sélection des cellules transformées De préfé- rence, ce vecteur porte un marqueur de sélection, choisi par exemple pour complémenter une mutation des cellules eucaryotes réceptrices, qui permet la sélection des cellules qui ont intégré l'ADN recombinant en un nombre de copies élevé soit dans leur génome, soit dans un vecteur multicopie Il convient d'autre part d'insérer la séquence codante entre, d'une part, des séquences reconnues comme promoteur fonctionnel, d'autre part, un terminateur de transcription L'ensemble promoteur-séquence codante-termina- teur, appelé cassette d'expression, est cloné soit dans un vecteur plasmidique (monocopie ou polycopie) pour la levure, soit intégré en multicopie dans le génome de la levure. Pour une expression dans les cellules eucaryotes telles que celles des champignons filamenteux, du groupe des ascomycètes, par exemple ceux des genres Aspergillus, Neurospora, Podospora, Trichoderma ou Cryphonectria, le vecteur d'expression selon l'invention porte - l'ADN recombinant défini précédemment avec les moyens nécessaires à son expression, et éventuellement un marqueur de sélection et/ou des séquences télomériques Il est en effet possible de sélectionner les transformants ayant intégré un ADN d'intérêt à l'aide d'un marqueur de sélection situé soit sur le même vecteur que l'ADN d'intérêt, soit sur un autre vecteur, ces deux vecteurs étant alors introduits par cotransformation L'ADN recombinant de l'invention peut être soit intégré au génome des champignons filamenteux, soit conservé sous forme extrachromoso- mique grâce à des séquences permettant la réplication et la partition de cet ADN, ces séquences pouvant être introduites soit sur le même vecteur que l'ADN de l'invention, soit sur un vecteur différent (cotransformation). L'invention concerne également les bactéries qui sont transformées par ce vecteur d'expression et les cellules eucaryotes qui contiennent, avec les moyens nécessaires à son expression, l'ADN recombinant défini précédemment Celui-ci peut avoir été introduit par transformation par le vecteur d'expression ci-dessus ou par l'ADN recombinant de l'invention dépourvu de signaux d'expression, lequel peut parfois être intégré directement au génome en un locus qui permet son expression. De telles ce Llules eucaryotes de choix sont celles qui appartiennent au groupe des ascomycètes, en particulier celles des champignons filamenteux Parmi ces derniers, on apprécie Cryphonectria parasitica Une souche intéressante de cette espèce est la souche SEBR 103 ou un mutant soit spontané, soit induit de cette souche. L'invention a également trait à un procédé pour obtenir de l'endothiapepsine, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de culture de cellules Cryphonectria parasitica qui contiennent, avec les moyens nécessaires à son expression, l'ADN recombinant défini précédemment, suivie d'une étape d'isolement et de purification de cette protéine. L'invention concerne aussi un nouveau procédé pour obtenir une souche Cryphonectria parasitica déficiente en endothia- pepsine, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de cotransfor- mation de Cryphonectria parasitica par un marqueur de sélection et l'ADN recombinant défini précédemment rendu non fonctionnel par détection d'une partie de la séquence codante ou de la séquence promotrice, suivie d'une étape de sélection des transformants défi- cients en endothiapepsine. Une telle souche déficiente en endothiapepsine sera uti- lisée de préférence pour l'expression d'une protéine hétérologue dans Cryphonectria parasitica, en particulier dans le cas o l'on sait que cette protéine hétérologue est susceptible d'être dégradée par l'endothiapepsine. L'invention a également trait à un procédé pour intro- duire l'ADN recombinant défini précédemment dans des cellules fongiques susceptibles de produire des spores unicuclées, caracté- risé en ce qu'il comprend au moins deux cycles comportant une étape de cotransformation par cet ADN recombinant et un marqueur de sélection, suivie d'une étape de purification par sporulation permettant d'éliminer le marqueur de sélection. Cet ADN recombinant et le marqueur de sélection peuvent être portés par un fragment d'ADN linéaire ou circulaire L'étape de cotransformation comprend d'abord la sélection des transformants ayant intégré le marqueur de sélection, puis le criblage de ces transformants pour isoler les cellules surproduisant l'endothia- pepsine. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ci- après: Une grande partie de l'ensemble des techniques ci-après, bien connues de l'homme de l'art, est exposée en détail dans l'ouvrage de Maniatis et al: "Molecular cloning: a Laboratory manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New York ( 2 e édition). La synthèse des oligonucléotides est réalisée à l'aide d'un synthétiseur d'ADN Biosearch 4600. EXEMPLE 1: Isolement du fragment A, fragment d'ADN génomique d'en- viron 2,1 kb, contenant la séquence codante du précur- seur de l'endothiapepsine. 1) Préparation de l'ADN génomique La souche appelée SEBR 103 a été identifiée par le Centraal Bureau Voor Schimellcultures comme appartenant à l'espèce Cryphonectria parasitica et déposée à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes C N C M sous le n I- 997 A partir de conidiospores de la souche Cryphonectria parasitica SEBR 103, récoltées à la surface d'une boite de Petri contenant un milieu gélosé, appelé milieu G et dont la composition est précisée dans le tableau 3 ci-après, préalablement inoculé par un implant mycéLien ou par une suspension de conidiospores de cette même souche, puis incubé pendant 4 semaines à température ambiante et à la lumière, on ensemence par étalement d'une goutte de suspension de conidiospores une boite de Petri contenant 25 ml d'un milieu géLosé, appelé milieu A, dont la composition est donnée dans le tableau 1 ci-après Après 3 jours d'incubation à 300 C, le mycélium obtenu est utilisé pour ensemencer une fiole de 1 I conte- nant 100 ml d'un milieu liquide, appelé milieu B, dont la composi- tion est précisée dans le tableau 2 ci-après Au bout de 24 h d'incubation à 28 C sous agitation à 220 tr/min, 25 ml du bouillon de culture servent à ensemencer 250 ml de milieu B neuf contenu dans une fiole de 1 l Le lendemain, après incubation dans les conditions déjà définies, la totalité du bouillon de culture ( 250 ml) est centrifugée à 5 000 g pendant 5 min Le culot est remis en suspension dans une solution d'acétate de sodium 0,15 M contenant 1 m M d'EDTA Le mycélium est récupéré par filtration sur papier Whatman 3 MM, congelé dans l'azote liquide et réduit en poudre au pilon dans un mortier. On reprend 10 g de poudre de mycélium dans 40 ml de solu- tion d'acétate de sodium 0,15 M contenant 4 % de sodium lauroyl- sarcosine de p H 5 On ajoute, après 30 min d'agitation douce à température ambiante, du chlorure de sodium à 0,1 M final Au bout de 30 min d'agitation douce, à température ambiante, on extrait les protéines avec une solution de phénol ( 49 % v/v) contenant de l'alcool isoamylique ( 2 % v/v) et du chloroforme ( 49 % v/v) Après 3 extractions avec ce mélange, on extrait avec une solution de chloroforme contenant de l'alcool isoamylique ( 96 % de chloro- forme 4 % d'alcool isoamylique) Après 2 extractions de ce type, on soumet la phase aqueuse à l'addition de 2 volumes d'éthanol Les 2 solutions sont mélangées doucement par retournement, ce qui provoque l'apparition d'un filament d'ADN précipité Ce filament est prélevé à l'aide d'une pipette Pasteur et déposé dans un tube Eppendorf On centrifuge ce tube pendant 5 min à 100 g Le culot est lavé dans une solution d'éthanol à 70 % puis séché sous vide. Le culot est repris dans I ml du tampon, appelé tampon TE, de com- position lTris (HCL) 10 m M, p H 8; EDTA 1 m Ml. TABLEAU 1 Composition du mi Lieu A G Lucose anhydre 50 g/l Farine de soja (Soyoptim de Société Industrielle des 20 g/L Oléagineux) Nitrate de calcium 9 g/l Agar (Bacto-agar de Difco) 15 g/l Solution saline 1 (composition précisée ci-après) 0,5 g/l Vérifier ou ajuster le p H à 6,0 à l'aide de H Cl 1 N ou Na OH 1 N Composition de la solution sa Line 1 H 3 B 03 30 ml Mn CL 2, 4 H 20 79 ml Zn CL 2 200 ml Na 2 Mo O 4, 2 H 20 20 m L Fe CL 3 anhydre 50 ml Cu 504, 5 H 20 200 m L Eau distillée qsp 500 ml (Cette suspension est conservée au maximum un mois à + 4 C) TABLEAU 2 Composition du milieu B Glucose 10 g/L Thiamine 2 mg/l Solution saline 2 (composition donnée ci-après) 62,5 ml/l Extrait de levure (Difco) 2,5 g/l Extrait de malt (Difco) 7,5 g/l Vérifier ou ajuster le p H à 6,0 à l'aide de HCL 1 N ou Na OH 1 N. Stériliser 30 min à 110 C. Composition de la solution saline 2 NH 4 NO 3 24 g/l KH 2 PO 4 16 g/l Na H 254 4 g/l K Cl 8 g/l Mg SO 4, 7 H 20 2 g/l Ca CL 2 1 g/l Solution saline I 8 ml/l (composition précisée dans le tableau 1) TABLEAU 3 Composition du milieu G Partie A Extrait de malt Extrait de levure Agar Eau g 2 g 16 g 1 l Ajuster le p H à 5,5 Autoclaver 20 min à 1200 C Partie B Acide aspartique Biotine Eau 1 000 mg mg 1 l Diluer au 1/10 la partie B, 0,2 M par fractions de 1 ml et Au moment de l'emploi, ajoutez 1 ml de la partie A en surfusion à 45 C boîte de Petri. la répartir en filtrant à la conserver à -20 C. de la partie B diluée à 1 l puis répartir l'ensemble en 2) Préparation de la sonde 1 et de la sonde 2 Ces sondes sont des pools d'oligonucléotides de synthèse, comprenant l'ensemble des séquences codantes pour deux peptides choisis dans la séquence d'acides aminés de l'endothiapepsine mature exportée dans le milieu de culture de C parasitica, décrite par VBARKHOLT, 1987, Eur J Biochem, 167, 327-338, représentée sur la figure 1 Les peptides choisis dans cette séquence appelés peptide 1 et peptide 2 et correspondant respectivement à la sonde 1 et à la sonde 2 sont les suivants: Peptide 1: Val-Asp-Gly-G Ln-Thr Peptide 2: Gly-Phe-Trp-G Lu-Trp-Thr A ces peptides correspondent respectivement 256 ( 43 x 22) et 64 ( 42 x 22) o Ligonuc Léotides codant pour ceux-ci, représentés par Les formu Les ci-après. A A A C C C G C GT GA GG CA AC sonde 1 G T G A G T T T A A C C A C GG TT TGGGA TGGAC sonde 2 G T G G T T 3) Marquage de la sonde 1 et de la sonde 2 Les sondes sont marquées à la termina Le désoxynucléotide transférase (Td T) (commercialisée par Stratagene, réf: 600 132). La réaction s'effectue sur 100 ng d'un mélange d'oligonu- cléotides en solution dans du tampon de réaction "Cobalt" (fourni 10 fois concentré par IBI inc: 1,4 M de cocodylate de potassium- p H 7,2, 300 m M de dithiothréitol, 1 p L d'enzyme désoxynuc Léotidyl- terminal-transférase (Stratagene) et 50 p Ci de désoxycytidyltri- phosphate d CTP marqué au 32 P. La réaction se fait à 370 C pendant 10 min puis est arrêtée en ajoutant 1 pl d'EDTA 0,5 M. On extrait au phénol et on dialyse sur colonne de po Ly- acrylamide Biogel P 10 (Biorad: 150-1050). On obtient ainsi la sonde 1 radiomarquée et la sonde 2 radiomarquee. 4) Hydrolyse de L'ADN génomique de Chryphonectria parasitica L'ADN génomique obtenu à l'issue de 1) a été soumis sépa- rément à une digestion par chacune des enzymes de restriction sui- vantes: Eco RI, Hind III et Bam HI Dans chaque cas, 10 pg du produit de digestion ont été déposés sur gel d'agarose 0,8 % et soumis à une électrophorèse en présence d'une gamme de tailles radiomarquée (Amersham réf SJ 5000) L'ADN a ensuite été transféré sur un filtre de nitrocellulose (Biorad, réf 162-0117) suivant la technique bien connue de l'homme de l'art sous le nom de Southern Blot, décrite dans Maniatis, op cit, cette opération étant répétée de façon à obtenir deux filtres de nitrocellulose destinés à être hybridés l'un avec La sonde 1, l'autre avec la sonde 2. ) Hybridation Chaque filtre de nitrocellulose traité selon les techniques habituelles (Maniatis et a L, op cit) a tout d'abord été lavé dans une solution de préhybridation contenant 6 x SSC; x Denhardt's et 100 pg d'ADN de sperme de saumon soniqué et dénaturé (Sigma D 9156) pendant quelques heures à 42 C, puis incubé dans la même solution et dans les mêmes conditions que celles indi- quées précédemment en présence de l'une des sondes marquées 1 et 2. L'hybridation dure une nuit La solution 6 x SSC s'obtient par dilution d'une solution 20 x SSC La préparation du tampon 20 x SSC est décrite dans Maniatis, op cit En résumé, ce tampon contient 175,3 g/L de Na CL; 88,2 g/L de citrate de sodium et est ajusté à p H 7 par quelques gouttes de Na OH 1 N La solution 10 x Denhardt's contient 1 g de Fico LL, 1 g de polyvinytpyrrolidone, 1 g de sérum- a Lbumine bovine pour 500 m L de volume final. Après l'hybridation, chacun des filtres est lavé indivi- duellement dans une solution contenant 0,5 SSC à 42 C Les filtres sont ensuite exposés à un film photographique (Kodak XAR 5) pendant la nuit L'analyse du film révéLé montre, dans le cas de l'hydro- lysat obtenu avec l'enzyme Hind III, qu'une bande dont le poids moléculaire correspond approximativement à un fragment de taille légèrement supérieure à 2,1 kb répond positivement avec les deux sondes radiomarquées. 6) C Lonage d'un fragment d'ADN Hind III-Hind III, d'environ 2,1 kb, s'hybridant avec les sondes radiomarquées 1 et 2: a) Constitution d'une banque d'ADN génomique. pg de l'ADN de Cryphonectria parasitica sont hydro- lysés par l'enzyme Hind III et les fragments sont séparés par éLec- trophorèse sur gel d'agarose 0,8 % La région qui correspond aux fragments de taille Légèrement supérieure à 2,1 kb est découpée et l'ADN est purifié par adsorption sur lait de silice (Geneclean Tm, Biolad P O Box 2284, La Jolla, California 92038-2284) Ces frag- ments sont ligués à l'aide de la ligase d'ADN du phage T 4 (Gibco- BRL) dans p BR 322 hydrolysé par Hind III et déphosphorylé (Biolabs Réf; 321) Des cellules compétentes (c'est-à-dire capables d'être transformées) (cellules RRI, Gibco BRL, Réf 520-8261 SA) sont transformées, comme indiqué par le fournisseur, par la solution de ligation et étalées sur milieu gélosé, appelé milieu géLosé LB (Maniatis, op cit) de composition précisée dans le tableau 4 ci- après L'ensemble des colonies obtenues est la banque d'ADN géno- mique. TABLEAU 4 Composition du mitieu LB gélosé Hydrolysat de caséine Bactotryptone (Difco) 10 g/L Extrait de levure Bacto (Difco) 5 g/L Na CL 10 g/l Ajuster le p H à 7,0 à l'aide de Na OH 5 N Agar Bacto (Difco) 15 g/L Autoclaver 20 min à 1200 C b) Sélection des clones qui portent le fragment Hind III-Hind III s'hybridant avec les sondes radiomarquées 1 et 2, appelé fragment A. Les colonies obtenues après transformation sont absorbées sur un filtre de nitrocellulose (Schleicher et Schull, Réf 40117) et répliquées sur deux autres filtres de nitrocellulose Une première série de filtres est hybridée avec la sonde 1 radiomarquée et une deuxième série de filtres est hybridée avec la sonde 2 radiomarquée Les conditions de préhybridation, hybridation et lavage sont les mêmes que celles utilisées précédemment (cf 5 ci- dessus). Les clones qui répondent positivement avec les deux sondes sont purifiés L'ADN plasmidique de l'un de ces clones est isolé Le plasmide correspondant est appelé p 472 Après s'être assuré qu'il s'hybridait bien avec chacune des deux sondes radio- marquées 1 et 2, le fragment Hind III-Hind III de 2,1 kb porté sur ce plasmide a été isolé, subcloné dans M 13 mp 19 (Pharmacia) Ce fragment est appelé fragment A Il a été séquencé par la technique du cyclone ("Cyclone I Biosystem" de IBI). La séquence nucléotidique du fragment A est représentée sur la figure 2, laquelle indique également la numérotation des nucleotides, choisie arbitrairement, de façon à attribuer le n 1 au nucléotide de l'extrémité 5 ' du fragment A, ainsi que la séquence d'acides aminés traduite. 7) Description de la séquence du fragment A (cf figure 2)): Le fragment A porte la séquence nucléotidique codant pour la séquence peptidique de l'endothiapepsine mature exportée dans le milieu de culture décrite par Barkolt (cf figure 1), laquelle commence au nucléotide 694 et se termine au nucléotide 1861 et est interrompue par deux introns situés aux nucléotides 850-938 et 1279-1367 En amont du nucléotide 694, la phase ouverte continue jusqu'au nucléotide 566 o se trouve un signal caractéristique de la fin d'un intron: AG Aux nucléotides 468-469 se trouve un signal caractéristique du début d'un intron: GT On remarquera que la séquence à cheval sur le début de L'intron et La fin de L'exon: AAGGTGAGT, correspond à La séquence consensus 5 ' de la jonction d'épissage décrite par Mount S M, 1982, Nuc L Ac Res, 10, 459- 472 En amont du nucléotide 468, il n'y a qu'une seule phase ouverte (phase non interrompue par un codon stop) comportant au moins un ATG Celle-ci comporte un ATG à la position 365-367 (dont l'environnement nuc Léotidique est compatible avec M Kozak, 1984, Nuc L Ac Res 12, p 2) et un ATG à la position 329-331, cette phase de lecture étant interrompue par le codon stop TAG à la posi- tion 305-307 Le logiciel U W G C G de l'Université de Wisconsin: Devereux et a L, 1984, Nuc L Ac Res, 12, 8711-8721-Option: Recherche de peptide-signal d'après la méthode de G von Heijne, 1986, Nuc L; Ac Res, 14, 483-490, prévoit dans cette phase ouverte une seule séquence codant pour un peptide signal, la séquence ci-après, appe Lée séquence nuc Léotidique pré (commençant au nucléotide 329): ATGTCTT CCCCTCTCAA GAACGCCTTG GTGACCGCCA TGTTGGCTGG TGGTGCTCTC AGC codant pour le peptide signal de 20 acides aminés de séquence sui- vante, appe Lée séquence peptidique pré: Met Ser Ser Pro Leu Lys Asn Ala Leu Va L Thr Ala Met Leu Ala Gly Gly Ala Leu Ser Un peptide-signal est attendu par l'homme de l'art car l'endothiapepsine est une protéine sécrétée, ce qui exige la *présence d'un peptide-signal. Entre la séquence codant pour le peptide-signal ci-dessus et celle codant pour la protéine mature, il y a la séquence nuc Léo- tidique, suivante, appe Lée séquence nuc Léotidique pro (commençant au nucléotide 389): TCGCCTA CAAAGCAACA CCTCTCCTGA AGTTGGCCCC GGAAAGTACT CCCAACTACA AGTTCAACGG GCCTCTGTCG GTACGGCGTG CCGATCCCAG CCTGGCTGGA CCTCGGGCCT GGCTGAGCGC CGTTGGAATT CGTTCAAGCA GTCAAGAAGA GGATGCTGTC CCCGTCAACG AGTCCGGAAC CGTACCTCAA CAGAACTCTA codant pour la séquence peptidique peptidique pro. suivante, appelée séquence Ser Pro Thr Lys Gln Gly Pro Gly Lys Tyr Asn Gly Pro Leu Ser Pro Ala Trp Leu Glu Arg His Val Gly Ser Phe Lys Val Lys Lys Asp Ala Val Ile Pro Gln Val Thr Tyr G In Asn Val Asn Arg Asn Leu Lys Ser Thr Ala Ser Pro Glu Val Pro Asn Tyr Lys Phe Tyr Gly Val Pro Ile Ser Gly Leu Ala Glu Une séquence peptidique ( 389-693) pro est également attendue par l'homme de l'art car elle a pour fonction d'inhiber l'endothiapepsine, probablement toxique pour C parasitica, avant son exportation vers le milieu extérieur à la suite de laquelle cette séquence est clivée. Il y a donc en amont thiapepsine mature la séquence prépro suivante: Met Ala Pro Tyr Val Leu Ser Leu Glu Lys Pro Ala Ser Pro Ser Ser Val Gly Phe Asn Ile Pro Glu Arg Leu Pro Pro Gly Ala Lys Thr Gly Pro Trp Asn Lys Lys Leu Leu Ala Gln Tyr Ser Glu de la séquence codant pour l'endo- codant pour la séquence peptidique Leu Val Thr Ala Met Leu His Val Gly Ile Pro Val Ser Phe Lys Gln Val Arg Val Lys Lys Thr Tyr Leu Asp Ala Val Gln Asn Ser Ala Asn Asn Lys Thr Gly Ala Pro Tyr Ser Gly Ser Asn Gly Gly La séquence nucléotidique commençant au nucléotide 329 (figure 2) et se terminant au nucléotide 1861 (figure 2), interrom- pue par trois introns, est représentée sur la figure 5, les introns étant soulignés, code donc pour la préproendothiapsine, dont la séquence d'acides aminés est représentée sur la figure 3. Le fragment A comprend de plus une séquence de 328 nucléotides en 5 ' de L'ATG ( 329-331) d'initiation et une séquence de 275 nucléotides en 3 ' du codon stop TAA ( 1862-1864), qui comporte plusieurs sites potentiels de polyadénylation. La partie du fragment A en 5 ' de l'ATG d'initiation comprend d'une part l'extrémité 5 ' non traduite de l'ARN messager et d'autre part en amont de celle-ci une séquence TATAA ( 187-191), habituellement appelée boite TATA, séquence consensus présente dans la plupart des promoteurs des eucaryotes (Ballance D J, 1986, Yeast, 2, 229-236) Par contre, cette partie ne comprend apparem- ment pas de séquence de type de celles habituellement appelées séquences d'activation amont (UAS: Upstream Activating Sequence) ou séquences de régulation amont (URS: Upstream Régulatory Sequence), qui sont présentes par exemple chez Saccharomyces (Guarente L, 1988, al, 52, 303-305) et chez Neurospora (Frederick G D, 1990, Mol Gen Gent, 221, 148-i 54) Il n'y a donc vraisemblablement pas dans le fragment A de région d'activation du promoteur en amont de la boîte TATA. EXEMPLE 2: Isolement du fragment B, fragment d'ADN génomique d'en- viron 32,6 kb contenant la séquence codante du précur- seur de l'endothiapepsine. 1) Préparation de l'ADN de C parasitica. L'ADN génomique de C parasitica SEBR 103 a été préparé selon un protocole proche de celui 'décrit par B TURCQ (Thèse d'Université: spécialité Sciences de la vie, soutenue le 6 janvier 1989 à l'Université de BORDEAUX II), résumé ci-après. Préparation de protoplastes Le mycélium provenant de 250 ml du bouillon de culture de la souche Cryphonectria parasitica SBR 103, préparé comme décrit à l'exemple 1, est filtré sur de la gaze, puis rincé avec 50 ml de Mg SO 1 M Après incubation pendant 30 min à 37 C, on filtre à nouveau sur de la gaze et on reprend le mycélium dans 20 ml de Mg SO 4 1 M On ajoute alors 20 ml de Mg SO 4 1 M contenant 10 mg/L du mélange enzymatique CAYLASE C 3 (Société CAYLA) constitué de chiti- nases, de B 1,3, 1,6, d'a 1,3 et c 1,4 glucanases ainsi que d'autres polysaccharidases, et on incube pendant 1 h 30 à 37 O C sous faible agitation Après filtration du mélange, le filtrat est centrifugé pendant 10 min à 3 000 g, puis le culot de protoplastes obtenu est repris dans 20 ml d'un tampon, appelé tampon ST, de composition: sorbitol 0,8 M, Tris H Cl 100 m M, p H: 7,5. Extraction de l'ADN génomique des protoplastes Après une nouvelle centrifugation pendant 10 min à 3 000 g, le culot de protoplastes est repris avec 14 ml de tampon de lyse (Tris H Cl 100 m M p H 9, EDTA 35 m M p H 8; SDS 4 % (poids/ volume); protéinase K (Sigma) 600 pg/ml, puis le mélange est incubé pendant 1 h à 50 O C Après une centrifugation pendant 10 min à 12 000 g, le volume de surnageant est ajusté à 15,5 ml avec du tampon TE de composition Tris H Cl 10 m M, p H 8 EDTA I m M, puis addi- tionné de 19,53 g de Cs CL Après une ultracentrifugation ( 16 h à 000 tr/min dans un rotor vertical), le gradient est collecté par fractions qui sont dialysées contre du tampon de composition: Tris H Cl 10 m M, p H 8 EDTA 1 m M, et analysées sur gel d'agarose 0,8 % La fraction présentant un rapport spectrométrique entre l'absorption à 260 nm et l'absorption à 280 nm voisin de 1,8 a été conservée. Construction de la banque cosmidique Environ 10 lg d'ADN génomique de la fraction ci-dessus ont été soumis à une digestion partielle par l'enzyme de restric- tion Mbo I et ligués à l'aide de la ligase T 4 au cosmide p HC 79-ura 5 vecteur cosmidique d'environ 8 kb, construit en insérant le fragment Eco RI-Eco RI contenant le gène ura 5, (Begueret et al, 1984, Gene, 32 487-492) au site Eco RI du cosmide p HC 79 disponible commercialement (commercialisé par BRL et construit par HOHN B et al., 1980, Gene, 11, 291-298), le cosmide p HC 79-ura 5 ayant été au préalable linéarisé par l'endonucléase Bam HI et déphosphorylé à la phosphatase alcaline (Promega réf CIP M 204). Le mélange de ligation a été empaqueté dans les parti- cules phagiques à l'aide du kit "Gigapack plus" de Stratagene, et a servi à transformer la souche réceptrice E coli LE 392 (Murray et al, 1977, Mol gen Genet 150, p 53), disponible dans le commerce et distribuée par Genofit Après étalement sur milieu gélosé LB (cf tableau 4) additionné de 100 mg/l d'ampicilline. Environ 4 500 clones résistants à l'ampicilline ainsi obtenus ont été repiqués individuellement sur des plaques de microtitration contenant du milieu liquide LB de composition précisée dans le tableau 4, mais sans agar, et conservés à -80 C On a montré, par digestion de cosmides extraits de quelques 12 clones pris au hasard, que la taille moyenne des inserts de la banque était d'environ 37 kb. 2) Criblage de la banque par hybridation avec le fragment A Le fragment A contenant le gène de structure de l'endo- thiapepsine a été utilisé comme sonde pour des expériences d'hybri- dation Dans un premier temps, les clones contenus dans les plaques de microtitration ont été répliqués dans des boîtes de Petri conte- nant du milieu LB gélosé (cf tableau 4) additionné d'ampicilline puis transférés sur des membranes de Nylon (Hybond N, Amersham). Les bactéries ont alors été Lysées à l'aide d'une solution conte- nant 1,5 M Na CL et 0,5 M Na OH Après traitement avec une solution de protéinase K (Sigma) pendant 30 min à 37 C, les filtres sont lavés avec du 2 x SSC (Na CL 17,5 g/l, citrate de sodium 8,82 g/L p H 7) et préhybridés à 42 C pendant 20 min Les filtres sont hybridés à 42 C pendant une nuit avec le fragment A isolé à l'exemple 1 marqué à la peroxydase de raifort (Amersham) et révélés avec le kit à sondes chemiluminescentes ECL "Système de détection de gène" (RPN 2101, Amersham) Les signaux d'hybridation obtenus sont visualisés sur un film approprié Sur les 4 500 clones de la banque, 2 clones ont donné un signal positif Ces deux clones, dénommés ci-après 8 H 12 et 41 H 7 et contenant respectivement les cosmides appelés p 8 H 12 et p 41 H 7, ont été repiqués sur milieu liquide LB contenant 100 mg/l d'ampicilline Après une culture de nuit à 37 C, les cosmides sont extraits par La méthode de lyse en milieu alcalin, purifiés par ultracentrifugation au chlorure de césium et bromure d'éthidium selon les techniques décrites dans Maniatis, op cit Les cosmides ainsi purifiés ont été digérés par l'enzyme Hind III et les fragments obtenus ont été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose 0,8 % Un Southern Blot sur une membrane en Nylon a été effectué et le filtre a été hybridé avec le fragment A à l'aide de la technique décrite précédemment La présence de ce fragment dans chacun des cosmides p 8 H 12 et p 41 H 7 a ainsi été confirmée. 3) Analyse physique des cosmides positifs p 8 H 12 et p 41 H 7 On a constaté que les profils de restriction des cosmides p 8 H 12 et p 41 H 7, effectués à l'aide des enzymes Not I, Sma I, Sfi I, Xba I, Bam HI et Pvu I, étaient identiques, ce qui indique que cette région de l'ADN génomique contenant le gène codant pour l'endothia- pepsine de C parasitica a été clonée sans réarrangement pour ces deux clones Le profil de restriction pour le cosmide p 8 H 12, cosmide retenu, pour la suite de l'étude, est donné dans le tableau 5 ci-après. TABLEAU 5 Profil de restriction du cosmide p 8 H 12 Enzyme de Nombre de sites Taille TOTAL restriction de coupure en kb en kb Not I 1 non déterminée Sma I 2 non déterminée - Sfi I 3 20; 16; 4,1 40,1 Xba I 4 23; 14; 2,9; 1,2 41,1 Bam HI 5 15; 9; 7; 7; 2,6 40,6 Pvu I 5 23; 7,4; 6,4; 2,1; 40,4 1,5 Moyenne 40,6 Ce profil permet de calculer la taille moyenne du cosmide p 8 H 12, égale à environ 40,6 kb, donc celle de l'insert génomique égale à environ 40,6 8,0 = 32,6 kb Cet insert génomique est appelé fragment B. On a montré d'autre part, par Southern Blot sur membrane de Nylon, que le fragment Bam HI- Bam HI d'environ 9 kb (cf. tableau 5), appelé ci-après fragment C, était le seul fragment Bam HI-Bam HI à s'hybrider avec le fragment A utilisé comme sonde, donc qu'il contenait en totalité ce fragment. EXEMPLE 3: Clonage du fragment C, fragment d'ADN génomique d'envi- ron 9 kb contenant la séquence codante du précurseur de l'endothiapepsine. ig du cosmide p 8 H 12 ont été digérés par l'endonuc Léase Bam HI et les différents fragments ont été séparés sur gel d'agarose 0,8 %. Le produit de la digestion par l'enzyme Bam HI contenant le fragment C a été ligué à l'aide de la ligase d'ADN T 4 (Gibco- BRL) au plasmide p BR 322 ouvert au site Bam HI et déphosphorylé (commercialisé par Biolabs réf 320) Le produit de la ligation a servi à transformer des cellules compétentes de La souche E coli K 12 RR 1 (Gibco-BRL réf 520-8261 A) Après étalement du mélange de transformation sur des boites de Petri contenant du milieu LB gélosé additionné d'ampicilline ( 100 pg/ml) et incubation des boites à 37 C pendant 24 h, les colonies sont répliquées sur des membranes de Nylon; les bactéries sont alors lysées puis les membranes sont hybridées avec le fragment A, comme décrit précédem- ment à l'exemple 2 2) 18 colonies contenant de l'ADN s'hybridant avec le fragment A ont ainsi été mises en évidence Leur contenu en ADN p Lasmidique a été extrait et analysé sur gel d'agarose 0,8 % après digestion par l'endonucléase Bam HI On a ainsi vérifié que toutes ces colonies contenaient un plasmide dérivé de p BR 322 ayant inséré au site Bam HI un fragment de 9 kb environ On a choisi pour la suite de l'étude un clone appelé SEBR 3104, contenant le plasmide dénommé p Ep 1 Le clone SEBR 3104 a été déposé à la C.N C M sous le n 1-998. On a soumis Le plasmide p Ep 1 à des digestions simples et/ou multiples à l'aide des enzymes Bam HI, Hind III, Pst I, Sac I, Bgl II et Sca I La carte de restriction obtenue est représentée sur la figure 4, les symboles B, H, P, C, G et S représentant respecti- vement Bam HI, Hind III, Pst I, Sac I, Bgl II ainsi que Sca I, le frag- ment A étant hachuré, le codon d'initiation du gène de l'endothia- pepsine de C parasitica étant indiqué par un i et la flèche indi- quant le sens de la transcription du gène de l'endothiapepsine. Il apparaît que le site Bam HI (B) qui forme l'extrémité en 5 ' du fragment C est situé à environ 4 kb du codon d'initiation et que le site Bgl II (G) en 5 ' est situé à environ 3 kb du codon d'initiation Il semble donc intéressant d'isoler et de cloner le fragment Bgl II-Bgl II d'environ 5,1 kb contenant la totalité du fragment A, appelé fragment D, et qui contient vraisemblablement l'information nécessaire à l'expression du précurseur de l'endo- thiapepsine. EXEMPLE 4: Transformation de C parasitica par chacun des vecteurs contenant l'un des fragments A, B et C. Préparation de protoplastes Le mycélium provenant de 250 ml du bouillon de culture de la souche C parasitica SEBR 103, préparé comme décrit à l'exemple 1, est rincé avec 50 ml de Mg SO 4 1 M Après incubation pendant 30 min à 37 C, on filtre sur de la gaze et on reprend le mycélium dans 20 ml de Mg SO 4 1 M On ajoute alors 20 ml de Mg SO 4 1 M contenant 10 mg/L du mélange enzymatique CAYLASE C 3 (Société CAYLA) constitué de chitinases, de p 1,3, P 1,6, d'oc 11,3 et 1 l,4 glucanases ainsi que d'autres polysaccharidases, et on incube pendant 1 h 30 à 37 C sous faible agitation Après filtration du mélange, le filtrat est centrifugé pendant 10 min à 3 000 g, puis le culot de proto- plastes obtenu est repris dans 15 ml du tampon, appelé tampon ST, de composition: sorbitol 0,8 M, Tris HCL 100 m M, p H: 7,5 Après une nouvelle centrifugation pendant 10 min à 3 000 g, le culot est repris dans 10 ml d'un tampon, appelé tampon STC 10, de composi- tion: sorbitol 0,8 M, Tris; H Cl 100 m M p H: 7,5, Ca C 12 10 m M Les protoplastes sont alors dénombrés à l'aide d'une cellule Malassez de façon à ajuster leur concentration à 108/ml après centrifugation pendant 10 min à 3 000 g et reprise du culot dans un tampon, appelé tampon STC 50, de composition: sorbitol 0,8 M, Tris HCL 100 m M p H: 7,5, Ca CL 2 50 m M. Cotransformation des protoplastes par le cosmide p 8 H 12 et le plasmide p BT 3 Le cosmide p 8 H 12 ne porte pas de marqueur de sélection dominant (utilisable pour la sélection directe) Le plasmide p BT 3 décrit par Orbach M J et al, 1986, Mol Cell Biol, 6, 2452-2461, qui porte un gène muté de la p-tubuline de Neurospora crassa (cham- pignon filamenteux ascomycète) conférant la résistance au bénomyl (marqueur de sélection dominant) a donc été utilisé conjointement avec le cosmide p 8 H 12 (méthode de cotransformation: voir les travaux sur la cotransformation d'Aspergillus niger de Wernars K. et al, 1987, Mol Gen Genet, 209, 71-77). Un mélange composé de 1 pg du plasmide p BT 3, préalable- ment purifié par ultracentrifugation dans un tamon contenant du chlorure de césium et du bromure d'éthidium selon les techniques décrites dans Maniatis, op cit, et de 4 pg du cosmide p 8 H 12, purifié de la même façon, dans 10 ml de tampon TE, de composition (Tris H Cl 10 m M p H 8, EDTA 1 m M), est incubé pendant 20 min à O O C avec 100 ml de la préparation de protoplastes préparée ci-dessus (soit 107 protoplastes) Après addition de 1 ml d'une solution constituée de 60 % (poids/volume) de PEG 4000 (polyéthylèneglycol de masse moléculaire 4000) et du tampon de composition: Tris-H Cl m M p H 7,5; Ca CL 2 100 m M, et incubation du mélange pendant min à température ambiante, on mélange avec ce dernier 1 ml du tampon STC 10 (défini précédemment) Les protoplastes ainsi traités sont inclus dans 60 ml de milieu gélosé contenant 1 mg/l de Benlate (antifongique commercialisé par Dupont Nemours), appelé milieu D, dont la composition est précisée dans le tableau 6 ci-après, maintenu en surfusion à 45 C Le mélange en surfusion est étalé sur des boites de Petri contenant un milieu gélosé additionné de 1 mg/l de Benlate (antifongique commercialisé par Dupont Nemours qui contient 50 % de bénomyl), appelé milieu C et dont la composition est précisée dans le tableau 7 ci-après Les boîtes de Petri sont incubées à 28 C pendant le temps nécessaire à l'apparition de protoplastes régénérés résistants au bénomyl Les transformants régénérés ainsi obtenus sont appelés 29 Pn, N désignant le numéro du clone considéré La résistance au bénomyl des clones est confirmée par repiquage d'implants mycéliens de chaque clone sur le milieu B rendu géLosé par l'addition de 20 g/L d'agar et additionné de 1 mg/L de Benlate. Seuls les clones se développant sur ce milieu sont mis en sporulation suivant la méthode décrite à l'exemple 1) 1 Les coni- diospores obtenues étant récoltées en masse dans un tampon conte- nant au moins 15 % du glycérol et conservées à -80 C. TABLEAU 6 Composition du milieu D Saccharose 250 g/l Glucose 20 g/L Thiamine 2 g/L Asparagine 100 mg/l Extrait de malt 0,2 g/L Agar 20 g/L Solution saline I (composition précisée dans 62,5 ml le tableau 2) Ajuster le p H à 6,0 à l'aide de H Cl 1 N ou Na OH 1 N, Autoclaver 30 min à 110 C, puis Ajouter 1 mg/L de Benlate au milieu refroidi à 60 C TABLEAU 7 Composition du milieu C Milieu D 750 ml/l Tampon STC 10 250 ml/l (de composition: sorbitol 0,8 M, tris HCL 100 m M p H 7,5, Ca CL 2 10 m M) Ajuster le p H à 6,0 Ajouter 1 mg/l de Benlate au milieu autoclavé à 600 C Cotransformation des protoplastes par le plasmide p 472 et le plasmide p BT 3 d'une part, ainsi que par le plasmide p Ep 1 et le plasmide p BT 3 d'autre part: Les plasmides p 472 et p Ep 1 ne portent pas non plus de marqueur de sélection directe. La souche C parasitica SEBR 103 a été cotransformée selon un protocole identique à celui décrit dans le paragraphe précédent, avec les mélanges de plasmides suivants: 4 pg de p Ep 1 et 1 pg de p BT 3, 4 pg de p 472 et 1 pg de p BT 3 Les transformants ainsi obtenus sont appelés 30 Pn pour la cotransformation par les plasmides p Ep 1 et p BT 3, et 31 Pn pour la cotransformation par les plasmides p 472 et p BT 3, N désignant le numéro du clone considéré. EXEMPLE 5: Sélection de souches transformées surproductrices d'endothiapepsine. 1) Méthode générale a) SéLection sur milieu gélosé contenant de la caséine. Des implants mycéliens d'environ 100 colonies résistantes au bénomyl ont été repiqués sur un milieu gélosé contenant de la caséine, appe Lé milieu E, dont la composition est précisée dans le tableau 8 ci-après Sur ce milieu, les colonies de Cryphonectria parasitica qui produisent la protéase donnent naissance à un halo de précipitation dont la surface est proportionnelle à la quantité d'endothiapepsine sécrétée. Les souches surproductrices sont retenues sur la base d'un rapport entrele diamètre de halo de précipitation et le diamètre de la colonie, significativement plus élevé que celui de la souche témoin non transformée Une préparation de conidiospores de ces souches surproductrices est effectuée selon la méthode uti- Lisée dans l'exemple 1 1) De plus, on a vérifié par l'addition au milieu E de 5 pg/ml de pepstatine, substance inhibitrice spécifique des aspartyl-protéases, que l'accroissement des halos observé chez les souches surproductrices était réduit Ce résultat indique qu'il s'agit bien d'une surproduction d'une aspartyl-protéase. b) Sélection en milieu liquide. c) Etude en fioles: Pour confirmer ce résultat, des essais de production en fioles ont été réalisés de la façon suivante: ensemencement des fioles de 250 ml contenant 40 ml de milieu F dont la composition est précisée ci-après On incube ensuite les fioles à 28 C sur un agitateur rotatif excentrique réglé à 220 tr/min pendant 48 h Pour chaque souche, les cultures ont été réalisées dans 3 fioles diffé- rentes et la moyenne des résultats de dosage d'activité coagulante pour les 3 fioles a été calculée Le témoin est constitué par la souche Cryphonectria parasitica SEBR 103 non transformée Le dosage de l'activité coagulante est réalisé selon la méthode officielle de détermination de la teneur en enzyme des solutions coagulantes publiée au Journal Officiel de la République Française du mars 1981 (paragraphe C), résumée ci-après: 1 ml de surnageant de culture dilué avec de l'eau de façon à avoir un temps de coagulation compris entre 5 et 10 min est ajouté à 10 ml de lait standardisé (fourni par l'INRA Station Expérimentale Laitière 39800 POLIGNY), placé dans un flacon approprié; on mesure le temps de coagulation repéré par l'apparition d'une floculation du lait sur la paroi du flacon en rotation dans un bain-marie à 30 C; l'activité coagulante appelée AC, exprimée en mg/l, est donnée par la formule: K AC = x T-a avec K et a facteurs dépendant du lait et de l'enzyme considérés (exprimés respectivement en mgs/l et en s). T: temps de coagulation (exprimé en secondes) ": facteur de dilution. P) Etude en fermenteur: La production d'endothiapepsine a été évaluée en fermen- teur de 2 I (Biolaffite) contenant 1,2 I d'un milieu de culture obtenu par concentration du milieu F, stérilisé par autoclavage pendant 45 min à 120 C Les conditions de culture sont les sui- vantes: agitation à 800 tr/min; aération: 2 vvm (vvm: volume d'air par volume de milieu par min) Le fermenteur est ensemencé à 5 % (v/v) avec une préculture en fiole telle que décrite ci-dessus (en a) La température est maintenue à 28 C La mesure de l'acti- vité coagulante est effectuée après environ 90 h de fermentation suivant la méthode de dosage précédemment décrite. On a vérifié par détermination du poids sec de la culture que la quantité de biomasse produite par les transformants surpro- ducteurs ne diffère pas significativement de celle produite par La souche témoin. TABLEAU 8 Composition du milieu E KH 2 PO 4 Na 2 HPO 4, 2 H 20 Mg SO 4, 7 H 20 Na Cl Hydrolysat de caséine (casaminoacids de Difco) Caséine (Hammarsten) Ca CL 2 Solution saline 2 (composition précisée dans le tableau 2 de l'exemple 2) 0,36 g/l 0,71 g/l 0,50 g/l 0,10 g/l 0,05 g/l 6,0 g/l 0,06 g/l ml/l Laisser sous agitation 15 min de façon à éviter La formation de mousse. Ajouter 15 g d'Agar (Bacto-agar de Difco). Ajuster le p H à 6,2 à l'aide de HCL 1 N ou Na OH 1 N. Autoclaver 20 min à 120 C. TABLEAU 9 Composition du milieu F Farine de germes de coton Glucose Ca(NO 3) Ca CO 3 Huile de lin Oléate de sodium g/l g/l 3,5 g/l 0,75 g/l 2,5 ml/l 1,5 g/l Ajuster le p H à 6,20 à l'aide de H Cl 1 N ou Na OH 1 N. Autoclaver 45 min à 120 C. Analyse de l'enzyme sécrétée par Les transformants Le moût de fermentation obtenu après culture (soit en fioles, soit en fermenteurs) des transformants surproducteurs et de la souche témoin C parasitica SEBR 103 non transformée a été soumis à une centrifugation de façon à éliminer la masse mycé- lienne Après dénaturation des protéines du surnageant en présence de SDS pendant 5 min à 100 C, on a effectué une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS On observe, apres colora- tion au bleu de Coomassie, une bande majoritaire de masse molécu- laire voisine de 36 k Da, qui correspond à la masse moléculaire de l'endothiapepsine mature déduite de sa séquence (cf figure 1), de coloration plus intense pour les transformants surproducteurs que pour la souche témoin; et des bandes minoritaires identiques pour les transformants surproducteurs et la souche témoin. On a vérifié, d'autre part, par réaction antigène-anti- corps (kit Rennetest, France Biochem) sur les surnageants de culture des transformants surproducteurs et de la souche témoin non transformée, que l'enzyme sécrétée est identique à celle de Cryphonectria parasitica conformément à la méthode d'identification décrite dans le Journal Officiel de la République Française du mars 1981. De plus, on a évalué le rapport entre l'activité coagu- lante et l'activité protéolytique de l'enzyme sécrétée L'activité coagulante exprimée en g/L est mesurée suivant la méthode décrite précédemment au paragraphe b) a); l'activité protéolytique exprimée en milliéquivalent glycine par litre est mesurée à l'aide du réactif TNBS, décrit par R Fields, Biochem J ( 1971) 124 581-590, par dosage des groupements aminés apparus après prétéolyse de la diméthylcaséine. Ce rapport est compris entre 0,045 et 0,050 pour les transformants surproducteurs, ce qui est très proche de celui obtenu avec la souche témoin non transformée On peut conclure de ces trois études que c'est bien la production d'endothiapepsine qui a été spécifiquement augmentée chez les transformants surproduc- teurs. c) Vérification de l'intégration du fragment A, B ou C par Southern Blot. L'ADN génomique des transformants sélectionnés est préparé selon un protocole proche de celui décrit par Raeder et Broda, 1965, Letters in Applied Microbiology 1, 17-20, résumé ci- apres: Le mycélium provenant d'une culture en fioles, effectuée comme décrit dans l'exemple 1 1), est lyophilisé et filtré sur gaze Après rinçage dans une solution 20 m M EDTA p H 8, le mycélium est filtré à nouveau puis congelé à -80 C et lyophilisé 50 mg du lyophilisat obtenu sont alors broyés puis remis en suspension dans 500 pl du tampon d'extraction suivant: Tris HCL 200 m M, p H 8,5, Na CL 250 m M, EDTA 25 m M, SDS 0,5 %, protéinase K (Sigma) 200 pg/ml. Le tout est incubé pendant 45 min à 45 C, puis l'ADN est extrait au phénol chloroforme, puis précipité à l'isopropanol Le culot est alors repris dans 100 pl de TE (Tris HCL 10 m M p H 8, EDTA 1 m M). L'ADN est ensuite digéré par les endonucléases appro- priées et les fragments obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8 % Les fragments sont transférés par capillarité sur membrane de Nylon (Hybond N+ Amersham) selon la méthode préconisée par le fabricant Les filtres sont alors hybridés à 42 C pendant une nuit avec successivement le fragment A et le fragment Hind III-Hind III contenant le gène muté de la i tubuline de Neurospora du plasmide p BT 3, marqués à la peroxydase de raifort (Amersham et révélés avec le kit à sondes chemiluminescentes ECL "Système de détection de gène" (RPN 2101, Amersham) Les signaux d'hybridation obtenus sont visualisés sur un film approprié. 2) Sélection de surproducteurs parmi les transformants 29 Pn (conte- nant le cosmide p 8 H 12 qui porte le fragment B cf exemple 4) 164 colonies résistantes au bénomyl ont été obtenues lors de la cotransformation par le cosmide p 8 H 12 et le plasmide p BT 3. 127 clones ont été choisis au hasard parmi ces dernières pour le test de sélection sur milieu gélosé contenant de la caséine, lequel a permis de retenir 14 clones Parmi ces derniers, 7 choisis au hasard ont été soumis au test de sélection en milieu liquide On a ainsi retenu 3 clones; les clones 29 P 1, 29 P 2 et 29 P 3 présentant après culture en fioles une activité coagulante respectivement de 0,9, 1,07 et 0,94 g/l alors que la souche témoin non transformée présente une activité de 0,62 g/l (le facteur de surproduction: rapport entre l'activité coagulante de la souche surproductrice et l'activité coagulante de la souche témoin est donc respectivement 1,45, 1,73 et 1, 54) Les clones 29 P 2 et 29 P 3 ont alors été testés en fermenteur 2 I et on produit respectivement une activité coagu- Lante de 1,76 et 2,19 g/l, la souche témoin ne produisant que 1, 20 g/L (le facteur de surproduction est donc de + 1,47 et + 1,83). Le clone 29 P 3 et la souche témoin C parasitica SEBR 103 ont été cultivés dans un fermenteur de 20 I dans des conditions expérimentales moins limitantes en particulier en ce qui concerne l'agitation, l'aération et le transfert de masse, et proches des conditions utilisées dans le procédé industriel. Cet essai a permis d'obtenir une quantité d'endothia- pepsine égale à environ 2 fois la quantité produite par la souche témoin. Les 7 clones précédemment choisis au hasard ont été ana- lysés par Southern Blot Leur ADN génomique et celui de la souche témoin C parasitica SEBR 103 non transformée ont été digérés par L'enzyme Sma I qui génère seulement deux sites de coupure dans le cosmide p 8 H 12 et aucun dans le fragment A Après hybridation avec ce dernier, on a observé deux bandes d'hybridation avec les clones 29 P 1, 29 P 2, 29 P 3 et une seule bande d'hybridation, de taille iden- tique à l'une des deux bandes précédemment citées, avec la souche témoin et les autres clones non retenus après le test de sélection en milieu liquide Les trois clones surproducteurs 29 P 1, 29 P 2, 29 P 3 ont donc intégré une copie du cosmide p 8 H 12 à un locus différent de leur génome car les bandes surnuméraires observées sont de taille différente Enfin, le Southern Blot obtenu ci-dessus a été hybridé avec le fragment Hind III du plasmide p BT 3 qui confère la résistance au bénomyl, ce qui a permis de constater que les 7 clones résis- tants au bénomyl ont tous reçu au moins une copie du plasmide p BT 3, car ils présentent plusieurs bandes d'hybridation supplémentaires par rapport à la souche témoin, celle-ci ne présentant qu'une bande correspondant au gène de la f tubuline endogène (la p tubuline est une protéine structurale présente chez les champignons filamenteux, en particulier Neurospora crassa et C parasitica). Ces résultats montrent que le fragment B contient donc les signaux nécessaires à l'expression (et la sécrétion) de l'endo- thiapepsine Il contient donc un gène fonctionnel de l'endothia- pepsine c'est-à-dire une séquence codant pour un précurseur de l'endothiapepsine encadrée par un promoteur et un terminateur fonc- tionnels Ce promoteur fonctionnel comprend donc une région activa- trice située en amont de la boite TATA localisée dans le fragment A (cf exemple 1). L'addition d'une copie supplémentaire de ce fragment au génome de la souche C parasitica SEBR 103 par transformation permet d'obtenir des souches transformées qui surproduisent l'endo- thiapepsine avec un facteur voisin de 2. 3) Sélection de surproducteurs parmi les transformants 30 Pn (conte- nant le plasmide p Ep 1 qui porte le fragment C: (cf exemple 4) 663 colonies résistantes au bénomyl ont été obtenues lors de la cotransformation par le plasmide p Ep 1 et le plasmide p BT 3. 108 clones ont été choisis au hasard parmi ces dernières pour le test de sélection en milieu gélosé contenant de la caséine, lequel a permis de retenir 32 clones On remarquera que ce test a permis de retenir un taux de surproducteurs parmi les transformants 30 Pn nettement plus élevé ( 32/108) que celui obtenu pour les transfor- mants 29 Pn ( 14/127) Ceci indique que la fréquence de cotransfor- mation obtenue avec le plasmide p Ep 1 d'environ 13,4 kb est plus grande que celle obtenue avec le cosmide p 8 H 12 d'environ 40,6 kb. Parmi ces 32 clones, 12 clones choisis au hasard ont été soumis au test de sélection en milieu liquide On a ainsi retenu 7 clones: les clones 30 P 1, 30 P 2, 30 P 3, 30 P 4, 30 P 5, 30 P 6, 30 P 7 présentant après culture en fioles une activité coagulante respec- tivement de 1,12; 1,06; 0,96; 1,12; 1,05; 0,88 et 0,90 g/l, alors que la souche témoin non transformée présente une activité de 0,62 g/L (le facteur de surproduction est donc compris entre + 1,42 et + 1,81). Les clones 30 P 1, 30 P 2, 30 P 5 ont alors été testés dans un fermenteur de 2 I et ont produit une activité coagulante respecti- vement de 3,05, 3,0 et 3,04 g/l, la souche témoin ne produisant que 1,20 g/L (le facteur de surproduction est donc respectivement de + 2,54, + 2,50 et + 2,53). il est probable (cf 2 ci-dessus) que, dans les condi- tions expérimentales non limitantes du fermenteur de 20 l, il serait possible d'atteindre un facteur de surproduction d'environ 3. Les 7 clones précédemment choisis au hasard ont été ana- lysés par Southern Blot Leurs ADN génomiques et celui de la souche témoin: C parasitica SEBR 103 non transformée, ont été digérés par l'enzyme Sac I, choisie car elle ne génère qu'un seul site de coupure dans le plasmide p Ep 1, site localisé dans le fragment C en dehors du fragment A (cf figure 4) Après hybridation pour chacun des 7 clones avec le fragment A, on a observé au moins deux bandes d'hybridation ( 2 à 4 selon le clone), dont la bande du gène endo- gène de l'endothiapepsine présente également pour la souche témoin, le profil étant différent pour chacun des clones Pour les clones P 1, 30 P 2, 30 P 5, on observe parmi celles-ci une bande d'hybrida- tion de taille identique à celle du plasmide p Ep 1 linéarisé, ce qui indique l'intégration en tandem probable d'au moins deux copies supplémentaires de ce plasmide. Il est en effet bien connu de l'homme de l'art que l'intégration en tandem de plusieurs copies d'un plasmide après transformation est un événement fréquent chez les champignons fila- menteux (Fincham J R S, mars 1989, Microbiological Reviews, 148- 170) et que la digestion de l'ADN génomique dans lequel le plasmide s'est ainsi intégré, par une endonucléase ne générant qu'un seul site de coupure dans ce plasmide, libère ce plasmide. Ces résultats montrent que le fragment C contient tous les signaux nécessaires à l'expression (et la sécrétion) de l'endo- * thiapepsine Il contient donc un gène fonctionnel de l'endothia- pepsine, donc un promoteur complet fonctionne L La région d'activa- tion du promoteur est donc située dans le fragment C L'addition d'au moins deux copies supplémentaires de ce fragment au génome de la souche C parasitica SEBR 103 permet d'obtenir des souches transformées qui surproduisent l'endothia- pepsine avec un facteur voisin de 3. 4) Sélection de surproducteurs parmi les transformants 31 Pn (conte- nant le plasmide p 472 qui porte le fragment A: cf exemple 4) 840 colonies résistantes au bénomyl ont été obtenues lors de la cotransformation par le plasmide p 472 et le plasmide p BT 3. 108 clones ont été choisis au hasard pour le test de sélection sur milieu gélosé contenant de la caséine Contrairement aux résultats obtenus précédemment avec les cotransformants 29 Pn et 30 Pn, aucun surproducteur n'a pu être mis en évidence Néanmoins, 5 clones P 1, 30 P 2, 30 P 3, 30 P 4, 30 P 5, choisis parmi ceux donnant un halo d'hydrolyse de grande taille mais non significativement supérieure à celle du halo de la souche témoin non transformée, ont été soumis au test de sélection en milieu liquide Les clones précités présentent respectivement, après culture en fioles, une activité coagulante de 0,38; 0,66; 0,66; 0,56 et 0,65 g/L alors que la souche témoin présente une activité de 0,62 g/L (la différence constatée est donc de -38, + 6, + 6, + 6, -22 et + 4 %) Aucune surpro- duction significative n'est mise en évidence par ce test en milieu liquide, ce qui confirme le résultat négatif du test de sélection en milieu gélosé caséine. L'analyse par Southern Blot a montré que les 5 clones ont intégré au moins une copie du plasmide p BT 3 et 3 clones sur 5 sont réellement cotransformés par le plasmide p BT 3 et le plasmide p 472. L'addition d'une copie supplémentaire du fragment A contenu dans le plasmide p 472 ne conduit donc pas à une surproduction d'endothia- pepsine, ce qui indique que des séquences d'ADN essentielles pour l'expression de l'endothiapepsine font défaut sur ce fragment Le fragment A ne contient donc pas de gène fonctionnel de l'endothia- pepsine, ce qui confirme qu'il manque au fragment A une région d'activation amont du promoteur nécessaire pour rendre celui-ci fonctionnel (cf exemples 1-7). La région d'activation amont du promoteur est donc située dans le fragment C entre son extrémité 5 ' (site Bam HI) et celle 5 ' (site Hind III) du fragment A qu'il contient. Une localisation plus précise de cette région activatrice pourra être déterminée par l'obtention d'une série de sous- fragments du fragment C (préparés par exemple par digestion à l'aide d'endonucléases ou d'exonucléases) comprenant le fragment A flanqué en 5 ' de segments de différentes tailles de la partie du fragment C comprise entre l'extrémité 5 ' du fragment A et un nucléotide situé entre l'extrémité 5 ' du fragment A et l'extrémité ' du fragment C, transformation de Cryphonectria parasitica SEBR 103 par ces sousfragments et sélection des transformés exprimant la protéase recombinante. EXEMPLE 6: Méthode d'amplification par transformations successives du gène codant pour le précurseur de l'endothiapepsine 1) Généralités: Il est connu (cf notamment Fincham J R S, mars 1989, Microbiological Reviews, 148-170) que les cellules fongiques comprennent plusieurs noyaux, contenant en général le même matériel génétique Les protoplastes obtenus après digestion enzymatique de leurs parois peuvent être anucléés (incapables de se régénérer), uninucléés ou polynucléés Apres transformation de ces derniers, on peut donc obtenir des cellules transformées de type hétérocaryons, contenant des noyaux transformés, éventuellement de différentes sortes (selon le mode d'intégration et la nature du matériel intégré, qui peuvent varier) et des noyaux non transformés Dans le cas de C parasitica les conidiospores sont uninucléées (Puhalla J.E et a I, Phytopathology, 1971, 61, 169-173). Les travaux décrits ci-après utilisent ces caractéris- tiques des cellules fongiques pour construire des souches contenant uniquement l'ADN recombinant d'intérêt et non le marqueur de sélec- tion. 2) Purification du transformant 29 P 3 (élimination du marqueur de sé- lection) en vue de la recherche de surproducteurs bénomyl-sensibles: Une préparation de conidiospores du transformant initial surproducteur d'endothiapepsine 29 P 3 (cf exemple 1 1) et exemple 5 2)), suffisamment diluée pour obtenir des colonies isolées, a servi à ensemencer des boites de Petri contenant du milieu B (cf. tableau 2 ci-dessus) rendu gélosé par l'addition de 20 g/L d'agar. Après incubation pendant 5 jours à 30 C, des implants mycéliens de colonies ont été repiqués en parallèle sur le même milieu B gélosé et sur ce dernier additionné de 1 pg/ml de Benlate (conte- nant 50 % de bénomyl) Après incubation pendant 5 jours à 30 C, 6 clones présentent une croissance normale sur le milieu B gélosé et une croissance nulle sur le milieu B gélosé additionné de Benlate Ces 6 clones bénomyl-sensibles, issus chacun de la germi- nation d'une spore, sont de type homocaryon, donc purs. On a soumis les 6 clones et le transformant initial 29 P 3 au test de sélection de surproduction d'endothiapepsine sur milieu gélosé contenant de la caséine (cf exemple 5 1) a)), ce qui a permis de sélectionner un clone bénomyl-sensible appelé 29 P 3 bens qui présente une surproduction non significativement différente de celle du transformant initial On a soumis le clone 29 P 3 bens, le clone 29 P 3 et la souche témoin C parasitica SEBR 103, après sporu- lation, au test de sélection en milieu liquide Les clones 29 P 3 et 29 P 3 ben S produisent une activité coagulante identique (compte tenu de la marge d'erreur expérimentale), mais nettement supérieure à celle de la souche témoin De plus, un Southern Blot, effectué sur ces deux clones et la souche témoin, après digestion de leur ADN génomique par l'endonucléase Sma I, montre pour chacun des deux clones le même profil d'hybridation avec le fragment A comme sonde, lequel comporte une bande surnuméraire par rapport au témoin (cf. exemple 5 2)), ce qui indique que dans les deux clones l'intégra- tion du gène fonctionnel de l'endothiapepsine est identique, et un profil d'hybridation différent avec le fragment Hind III-Hind III du plasmide p BT 3 qui confère la résistance au bénomyl (cf exemple 4), le transformant initial 29 P 3 présentant plusieurs bandes d'hybri- dation avec ce fragment et le clone 29 P 3 bens ainsi que la souche témoin présentant une seule bande d'hybridation de taille identique (correspondant au gène endogène de la p turbuline). Ces résultats montrent que la méthode de purification a permis d'obtenir un transformant pur (en ce qui concerne son géno- type), dépourvu du marqueur de sélection (gène conférant la résis- tance au bénomyl) et que le caractère surproducteur d'endothia- pepsine est intégré de façon stable dans le clone 29 P 3 bens car il est issu de la germination d'une conidiospore uninucléée et toutes les cellules mycéliennes possèdent des noyaux ayant intégré le cosmide p 8 H 12 dans leur ADN. 3) Amplification: Des protoplastes préparés à partir du clone 29 P 3 bens ont été transformés par le plasmide p BT 3, selon le protocole décrit à l'exemple 4 On a obtenu 400 clones bénomyl-résistants pour 1 pg d'ADN plasmidique. Il est donc possible d'obtenir, après cotransformation par un cosmide contenant le gène fonctionnel de l'endothiapepsine et d'un plasmide contenant un marqueur de sélection, un transfor- mant surproducteur d'endothiapepsine dépourvu du marqueur de sélec- tion, capable d'être transformé à nouveau On peut donc, en effec- tuant plusieurs cycles successifs comprenant une étape de cotrans- formation à l'aide des deux vecteurs ci-dessus, suivie d'une étape de purification permettant d'éliminer le marqueur de sélection, amplifier sélectivement dans C parasitica le gène codant pour le précurseur de l'endothiapepsine. L'homme de l'art comprendra aisément que, dans l'étape de cotransformation décrite ci-dessus, il est possible d'utiliser, à la place du cosmide contenant le gène fonctionnel de l'endothia- pepsine, un fragment d'ADN linéaire contenant ce gène fonctionnel et, à la place du plasmide portant le marqueur de sélection, un fragment d'ADN linéaire contenant ce marqueur de sélection Un tel fragment peut être obtenu par exemple par digestion du plasmide p Ep 1 à l'aide de l'endonucléase Bam HI ou d'une autre enzyme appro- priée, puis purification du fragment contenant le gène fonctionnel de l'endothiapepsine ainsi généré. Il est évident pour l'homme de l'art que le gène fonc- tionnel de l'endothiapepsine peut être remplacé par une ou plusieurs séquences d'ADN d'intérêt destinées à être intégrées au génome de cette souche au cours de plusieurs cycles de transforma- tion-purification Par exemple, il est possible d'amplifier par ce procédé un gène fonctionnel codant pour une préprochymosine Il est également possible d'introduire plusieurs gènes différents ou des séquences d'ADN destinées soit à marquer la souche, soit à rendre non fonctionnels un ou plusieurs gènes de la souche, tels que par exemple les gènes responsables de la phytopathogénicité. Il est évident également pour l'homme de l'art que le procédé défini cidessus est susceptible d'utilisation dans des cellules fongiques de genre ou d'espèce différentes de C. parasitica, susceptibles de produire des spores uninucléées. EXEMPLE 7: Recherche de souches déficientes dans la production d'endothiapepsine après transformation de la C parasi- tica SEBR 103. Une analyse exhaustive des clones bénomyl-résistants obtenus après la cotransformation (cf exemple 4) de la souche C. parasitica SEBR 103 avec le cosmide p 8 H 12 et le plasmide p BT 3 a permis d'obtenir un clone ne produisant pas de halo d'hydrolyse sur le milieu E gélosé contenant de la caséine Ce clone a été purifié suivant la méthode décrite dans l'exemple 6 et de nombreux clones bénomyl-sensibles et ne produisant pas de halo d'hydrolyse ont été obtenus Un clone, dénommé 29 P(end-), a été choisi au hasard parmi ces clones bénomyl- sensibles Après culture en fiole, le clone 29 P(end-) présente une activité coagulante inférieure à 0,01 g/L alors que la souche témoin Cryphonectria parasitica SEBR 103 non transformée présente une activité coagulante de 0,62 g/l (la baisse de production constatée est donc d'au moins 99 %) On a de plus observé que les caractéristiques morphologiques et physiologiques de ce clone sont modifiées par rapport à celles de la souche de C. parasitica SEBR 103. L'analyse par Southern Blot de l'ADN génomique du clone 29 P(end-) et de la souche témoin SEBR 103, après hybridation avec le fragment A d'une part et le fragment contenant Le gène de résis- tance au bénomyl du plasmide p BT 3 d'autre part, n'a pas montré de différences. Ces résultats montrent que le clone 29 P(end-) sélectionné et purifié a été rendu déficient pour la production d'endothia- pepsine après cotransformation de la souche C parasitica avec le cosmide de p 8 H 12 et le plasmide p BT 3 Il apparait évident pour l'homme de l'art que des tranformants déficients dans la production d'endothiapepsine pourraient être obtenus par cotransformation de C parasitica SEBR 103 avec un marqueur de sélection, tel que le plasmide m BT 3, et un ADN comportant le gène de la préproendothia- pepsine rendu non fonctionnel, par exemple par délétion d'une partie de La séquence codante, puis par sélection des transformants bénomyl résistants ne produisant pas de halo d'hydrolyse de la caséine Un tel ADN portant un gène non fonctionnel peut être obtenu facilement par linéarisation de l'ADN du plasmide p Ep 1, par exemple en effectuant une double digestion Sca I et Sfi I puis en purifiant le plus grand fragment par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8 % et enfin en traitant les extrémités de ce fragment à La polymérase klenow en présence des quatre désoxyribonuc Léotides triphosphates d NTP pour permettre une religation du vecteur et obtenir ainsi un plasmide portant un gène non fonctionnel de l'endothiapepsine. L'homme de L'art comprendra aisément que, pour la produc- tion d'une protéine hétérologue dans C parasitica, on utilisera de préférence une souche déficiente en endothiapepsine. EXEMPLE 8: Amp Lification par la technique PCR de l'ADN comp Lémen- taire codant pour le précurseur de l'endothiapepsine 1) Isolement des ARN messagers de Cryphonectria parasitica La souche de Cryphonectria parasitica SEBR 103 a été cultivée dans des conditions de production de l'endothiapepsine Le mycéLium a été récupéré par filtration sur gaze, lavé à l'eau et congelé dans l'azote liquide. g de mycéLium (poids humide) congelés sont mis en suspension dans 45 ml de tampon de lyse puis repris dans un même volume de billes ( 0,45 pm de diamètre) Le tampon de lyse est constitué de thiocyanate de guanidine 4 M, Tris HCL 10 m M p H 7,6, EDTA 10 m M, P-mercaptoéthanol 50 ml/L La suspension mycélienne est broyée pendant 5 min. Le broyat est récupéré et les billes décantées Environ ml de surnageant sont prélevés, additionnés de 3 M final de chlorure de lithium et conservés à O C. Après deux jours, on centrifuge la solution précédente pendant 60 min à 10 000 tr/min On prélève le surnageant et on reprend le culot dans 40 ml de Li CL 3 M La suspension obtenue est recentrifugée à 10 000 tr/min pendant 1 h 30 On ajoute de la protéinase K (SIGMA) 40 pg/ml, du SDS ( 0,1 % p/v) et de l'EDTA 20 m M On incube à 37 C pendant 3 h On précipite avec 2 volumes d'éthanol, puis on effectue un lavage à l'éthanol 70 % On reprend le culot dans 0, 5 ml de tampon TE (Tris H Cl 10 m M, EDTA I m M p H 7,5), on extrait 2 fois au chloroforme, on précipite à l'étha- nol Les ARN sont conservés à -80 C dans l'éthanol. 2) Purification de la fraction poly A des ARN Environ 1 mg d'ARN est précipité 20 min à 4 C ( 15 000 tr/min), puis lavé avec de l'éthanol 70 %, puis séché Le culot est repris dans 1 m L de tampon TE et mis en suspension par agitation au vortex L'oligo d T- cellulose type 3 (commercialisé par Collaborative Research Inc, Biomedicals Product Division) est préparé suivant les recommandations du fabricant L'ARN est déposé sur l'oligo d T, agité doucement pour remettre en suspension les billes, puis chauffé pendant 1 min à 65 C. La suspension est ajustée à 0,5 M Na Cl puis mise à agiter doucement pendant 10 min La suspension est alors centrifugée pendant 1 min à 1 000 tr/min, le surnageant est éliminé, le culot est lavé 2 fois avec 1 ml de tampon TE contenant 0,5 M Na Cl Les surnageants sont éliminés L'élution de la fraction polyadénylée des ARN (constituée des ARN messagers) est obtenue par suspension des billes dans 1 ml de tampon TE, puis chauffage de cette suspen- sion à 60 C pendant 1 min, suivie d'une agitation pendant 10 min sur plaque basculante On centrifuge ensuite 1 min à 1 000 tr/min, ce qui permet de récupérer d'une part le surnageant contenant des AR Nm libres en solution et d'autre part le culot de billes de cellulose L'ensemble des opérations ci-dessus (à partir de l'élu- tion) est répété Les surnageants ainsi obtenus sont rassemblés, on élimine l'excès de billes par centrifugation et on précipite le surnageant à l'éthanol contenant du Na CL suivant les techniques habituelles (Maniatis: op cit). 3) Description de la technique de la réaction polymérase en chaîne (Polymerase chain reaction PCR) La technique de la réaction de polymérase en chaîne (PCR) est une méthode bien connue de l'homme de l'art qui permet de copier simultanément les deux brins d'une séquence d'ADN préalable- ment dénaturé en utilisant deux oligonucléotides comme amorces (cf. notamment l'ouvrage de H A Erlich: "PCR Technology: Principles and Applications for DNA amplification" publié en 1989 par les édi- tions Macmillan Publishers Ltd, Royaume-Uni et celui de M A INNIS et al "PCR Protocols" publié en 1990 par Academic Press Inc San Diego, Californie 92101, USA)) Le principe de cette technique est résumé ci-après. De nombreux cycles, dont chacun est constitué de trois étapes, provoquent l'amplification des brins d'ADN d'intérêt; ces trois étapes sont: a) dénaturation de la matrice b) hybridation des amorces sur la matrice c) extension des amorces Après quelques heures de cycles, des centaines de milliers de copies de la matrice originale ont été produites à l'aide d'une ADN polymérase thermostable de Thermus aquaticus, habituellement appelée polymérase Taq. La technique du PCR est basée sur la répétition de trois étapes. a) Dénaturation de la matrice: L'ADN double brin est dénaturé en ADN simple brin par incubation à haute température (de 92 C à 96 C) pendant approxima- tivement 2 min. b) Hybridation des amorces: Ces amorces sont une paire d'oligonucléotides synthé- tiques qui s'hybrident avec les extrémités de la région à ampli- fier Les deux amorces s'hybrident avec les brins opposés Les amorces sont ajoutées en excès, de façon que la formation du complexe amorce-matrice soit favorisée. c) Extension des amorces: L'étape au cours de laquelle la polymérase Taq assure l'extension du complexe amorce-matrice de 5 ' vers 3 ' est effectuée à 72 C. Dans la technique du PCR, le produit d'intérêt apparaît au troisième cycle et il est alors amplifié de manière significa- tive Au cours du déroulement des cycles, le produit d'amplifica- tion devient rapidement la matrice majeure avec laquelle les amorces s'hybrident. 4) Description des amorces utilisées On a préparé deux oligonucléotides synthétiques à partir de la séquence du fragment A (cf figure 2). Le premier oligonucléotide, appelé amorce 1, dont la séquence est la suivante: ' AGAAAGCTTGIGAGGAGCGAGGGCCC 3 ' région 1 région 2 possède deux régions distinctes: la région 1, qui porte un site de clonage AAGCTT correspondant au site de reconnaissance de l'endo- nuc Léase Hind III et la région 2, qui est une région destinée à s'hybrider avec la région non codante du brin codant du fragment A, située en 3 ' de la séquence codant pour la préproendothiapepsine (cf figure 2 position 1870-1881). Le deuxième oligonucléotide, appelé amorce 2, dont la séquence est la suivante: ' GCAGAATTCACATATG TCTTCCCCTCTCAAG 3 ' région 1 région 2 est également constitué de deux régions distinctes: la région 1 qui porte un site de clonage CATATG correspondant au site de recon- naissance de l'endonucléase Nde I, dans lequel est comprise la séquence du codon initiateur ATG, et la région 2 qui porte une séquence nuc Léotidique identique à celle codant pour les cinq premiers acides aminés de la préproendothiapepsine, qui suivent la méthionine initiale Cette région est destinée à s'hybrider avec le brin non codant du fragment A. 5) Obtention du fragment amplifié représentant l'ADN complémentaire de l'endothiapepsine. On utilise comme matrice un pool d'ARN messagers, dont on sait qu'il contient l'ARN messager codant pour l'endothiapepsine; une réaction enzymatique utilisant la transcriptase inverse est effectuée sur l'ARN messager avant l'amplification. a) Mise en évidence de la présence de l'ARN messager codant pour l'endothiapepsine dans la préparation d'ARN total. a) Le Northern Blot: La technique du northern est utilisée (Maniatis) Elle consiste essentiellement à séparer, par électrophorèse, sur gel d'agarose 1,0 % en conditions dénaturantes (MOPS 20 m M p H 7, acé- tate de sodium 5 m M, EDTA lm M, formaldéhyde 6,6 %) approximative- ment 10 pg d'ARN total Les ARN ainsi séparés sont transférés sur une feuille de nitroce L Lulose (Maniatis op cit) On prépare ainsi deux filtres de nitrocellu Lose différents qui sont hybridés l'un avec La sonde radiomarquée 1 et l'autre avec la sonde radiomarquée 2 (cf exemple 1 2) et 3) pour la préparation des sondes et leur 3 marquage au 32 P). f) Hybridation avec la sonde radiomarquée 1 et la sonde radio- marquée 2: Les conditions d'hybridation sont Les mêmes que celles décrites dans l'exemple 1 5) Après L'hybridation, chacun des filtres est lavé individuellement dans une solution contenant 0,5 x SSC à 42 C Les filtres sont ensuite exposés à un fi Lm photogra- phique (Kodak XAR 5) pendant la nuit. L'analyse des films montre qu'une population d'ARN répond de manière spécifique aux deux sondes, ce qui indique ainsi que l'ARN messager codant pour L'endothiapepsine est présent dans la préparation. b) La réaction utilisant La transcriptase inverse. On effectue La réaction de la transcriptage inverse avec 1 pg d'ARN messager en présence de dithiothréito L DTT 10 m M, de R Nasine (inhibiteur de RN Ase Genofit) 0,0040 U/p L, de méLange des quatre désoxyribonuc Léotidy Ltriphosphates d NTP 10 m M, du tampon de composition: 50 m M Tris HCL p H 8,3, 20 m M KCL et 10 m M Mg CL 2, de 0,7 unité de transcriptase inverse (Stratagene) et de 0,1 ng de L'amorce 1 ainsi que 0,1 ng de L'amorce 2 pour un volume final de p L Après une demi-heure d'incubation à 46 C, La réaction est arrêtée en ajoutant 20 m M d'EDTA puis Le mélange est incubé pendant min à 65 C. c) La réaction de PCR. Le mélange préalablement décrit est soumis à une chroma- tographie sur colonne de gel de po Lyacrylamide P 10 afin d'éliminer les molécules de petite taille (nucléotides, EDTA, etc) La solu- tion alors obtenue est incubée pendant 2 min à 92 C afin de déna- turer la matrice composée d'un brin d'ADN complémentaire et d'un brin d'ARN messager Dans Le tube, on ajoute alors 100 ng de l'amorce 1, 100 ng de l'amorce 2, 2 m M Mg C 12, 0,2 m M de d NTP, 5 p L de mélange réactionnel concentré 10 fois (quantité finale: 67 m M Tris H Cl p H 8,8, 16,6 m M (NH 4)2 SO 4, 1 m M P mercaptoéthanol, 6,7 m M EDTA, 0,15 % Triton X 100, 200 g/ml de gélatine). Le volume du mélange est ensuite porté à 50 pl en ajou- tant de l'eau. Le mélange réactionnel ainsi obtenu est incubé 4 min à 94 C puis amené à la température de 41 C qui est maintenue pendant 4 min La température de 41 O C correspond à la température de demi- dénaturation de l'oligonucléotide diminuée de 5 degrés, calculée avec une formule empirique bien connue de l'homme de l'art. On ajoute alors 0,5 pl soit 2,5 unités de polymérase Taq (réf) On coupe alors le mélange réactionnel avec de la paraffine afin d'éviter l'évaporation de la solution aqueuse. L'amplification se fait au cours de 30 cycles réaction- nels dont les étapes d'un cycle sont les suivantes: 2 min à 92 C) dénaturation 2 min à 41 C) hybridation 2 min à 720 C > polymérisation. Après les 30 cycles, la réaction enzymatique est arrêtée par l'addition de 20 m M EDTA. Le fragment d'ADN ainsi amplifié, qui présente la taille attendue d'environ 1 300 pb, est ensuite isolé et purifié sur gel d'agarose 1 %, dialysé sur colonne p 10 puis hydrolysé simultanément par les enzymes Nde I et Hind III selon les techniques habituelles bien connues de L'homme de l'art (Maniatis, op cit) afin de former les extrémités cohésives Nde I et Hind III Après hydrolyse, le fragment est purifié sur colonne p 10. EXEMPLE 9: Construction du plasmide p 572, vecteur de clonage et d'expression de l'ADN complémentaire codant pour le précurseur de l'endothiapepsine, dans E coli Détermi- nation de la séquence de cet ADN complémentaire et expression de ce dernier. 1) Construction du plasmide p 572 Le plasmide p 572 a été préparé à partir du plasmide p 466, vecteur de clonage et d'expression de l'ADN complémentaire de l'urate oxydase d'Aspergillus flavus dans E coli, décrit dans la demande de brevet PCT-FR-90-00532, qui comprend un fragment du plasmide p BR 327 incluant l'origine de réplication et le gène de résistance à l'ampicilline, un promoteur synthétique d'E coli (R. RODRIGUEZ et M CHAMBERLIN "Promoters-Structure and function ( 1982) Preager), une séquence de Shine-Dalgarno, suivie d'un polylinker présentant les sites uniques Nde I et Hind III, un terminateur de transcription (dérivé du phage fd) et le gène lac i. a) Construction du plasmide p 466. On a préparé le plasmide p 466, vecteur d'expression dans E co Li Ce dernier comprend un fragment de p BR 327 incluant l'origine de réplication et le gène de résistance à l'ampicilline, il comprend également un promoteur synthétique d'E coli (R. RODRIGUEZ et M CHAMBERLIN "Promoters-Structure and function ( 1982) Preager), une séquence de Shine-Dalgarno, suivi d'un polylinker présentant les sites uniques Ndel et Kpnl, un terminateur de trans- cription (dérivé du phage fd) et le gène lac i. Ce plasmide a été construit à partir d'un plasmide d'expression de l'h GH dans E coli (p 462) par substitution d'un fragment portant le gène de l'h GH par l'AD Nc de l'urate oxydase. La construction du plasmide p 466 va maintenant être décrite plus en détail dans l'exposé ci-après dans lequel il sera fait référence aux figures 6, 7, 8, 9, 10. La figure 6 représente plasmide p 163,1 Les différents marqués de manière arbitraire se Lon une carte de restriction du segments de restriction sont la Légende ci-dessous: = Segment d'ADN issu du plasmide p BR 322 = Localisation de l'origine de réplication (ORI) = Segment d'ADN contenant la séquence codant pour un précurseur naturel de l'h GH = Segment d'ADN du phage fd contenant un terminateur de transcription = Segment d'ADN contenant un promoteur-opérateur hybride tryptophane- Lactose UV 5 = Segment d'ADN codant pour La p-lactamase résistance à L'ampicilline). (Ap R: La figure 7 représente la carte de restriction d'un plasmide p 160 dont les fragments Pvu I-Xho I-Bam HI( 1) et Pvu I-ORI- Bam HI( 2) proviennent respectivement des plasmides p 163,1 et p BR 327 et dont le petit fragment Bam HI( 2)-Bam HI( 1) est le fragment 3 décrit ci- après. I////// e, 'a , ,, -. : - e (, La figure 8 représente La carte de restriction du p Lasmide p 373,2 Les différents segments de restriction sont marqués de manière arbitraire selon La Légende ci-dessous: + + = Séquence Pvu I-Bam HI issue du plasmide p BR 327 __ = Séquence II/,:// s= Séquence C La L Nde L Pst I (Hinc II) ** O Ce " k S E Pvu I-Xho I issue du plasmide p 163,1 Xho I-Hinc II issue du ptasmide p 163, 1 Fragment 4 décrit ci-après = Fragment 3 décrit ci-après -' 't = Segment d'ADN du phage fd contenant un terminateur "":' ': de transcription La figure 9 représente une carte de restriction du plasmide p 462, le fragment synthétique Bgl II-Hind III défini ci- après étant représenté par:///// xx xxx x La figure 10 représente une carte de restriction du plasmide p 466, le fragment Nde I-Kpn I comprenant Le gène codant pour l'urate oxydase étant représenté par A AÀ 1 A* A ' 1) Construction du plasmide p 373,2 La stratégie mise en oeuvre fait appel à des fragments obtenus à partir de plasmides préexistants accessibles au public et à des fragments préparés par voie de synthèse selon les techniques maintenant couramment utilisées Les techniques de clonage employées sont celles décrites par T MANIATIS EF, FRITSCH et J. SAMBROOK, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1982) La synthèse des oligonuc Léotides est réalisée à l'aide d'un synthétiseur d'ADN Biosearch 4 600. On a soumis le plasmide p 163,1 (figure 6), décrit dans la demande de brevet EP-A-0245138 et déposée à la CNCM sous la réfé- rence I-530 le 17 février 1986, à une digestion par les enzymes Pvu I et Bam HI Ce plasmide contient le gène codant pour L'h GH Le fragment Pvu I-Bam HI ci-après fragment 1 contenant le site d'action de l'enzyme de restriction Xho I, représenté sur la figure 6, a été purifié. De même, on a soumis le plasmide p BR 327, bien connu de l'homme de l'art, (cf SOBERON, X et al, Gene, 9 ( 1980) 287-305) à une digestion par les enzymes Pvu I et Bam HI Le fragment Pvu I-Bam HI ci-après fragment 2 -, contenant l'origine de réplication, a été purifié. Puis on a préparé le fragment 3, qui est un fragment synthétique Bam HI( 1)-Bam HI( 2) contenant le gène lac i et son promo- teur dont la séquence est la suivante sur laquelle les deux extré- mités du brin sont repérées par les nombres 1 et 2 pour préciser l'orientation du fragment dans les plasmides décrits aux figures 7 et 8. FRAGMENT 3 Bam HI( 1) ' GATCC GAGCTAACTT GAAACCTGTC GGCGGTTTGC CGGGCAACAG AAGCGGTCCA GGTTAACGGC CTACCGAGAT ATTGCGCCCA GATGCCCTCA TCCAGTCGCC TATTTATGCC GCCCGCTAAC CGCCCAGTCG GTCTGGTCAG TTCCACAGCA CACTGACGCG ACGCCGCTTC GGCGCGAGAT GACTGGAGGT TGTGCCACGC TTTTTCCCGC AAACGGTCTG ACTGGTTTCA TGCCATACCG GCGGAAGCAT ACATTAATTG GTGCCAGCTG GTATTGGGCG CTGATTGCCC CGCTGGTTTG GGGATATAAC ATCCGCACCA GCGCCATCTG TTCAGCATTT TTCCCGTTCC AGCCAGCCAG AGCGCGATTT CGTACCGTCT AGACATCAAG *ATGGCATCCT TTGCGCGAGA GTTCTACCAT TTAATCGCCG GGCAACGCCA GGTTGGGAAT GTTTTCGCAG ATAACAGACA CATTCACCAC CGAAAGGTTT AAAGTGTAAA CGTTGCGCTC CATTAATGAA CCAGGGTGGT TTCACCGCCT CCCCACCACC ATGAGCTGTC ACGCGCAGCC ATCGTTGGCA GCATGGTTTG GCTATCGGCT ACGCAGACGC GCTGGTGACC TCATGGGAGA AAATAACGCC GGTCATCCAG AGATTGTGCA CGACACCACC CGACAATTTG ATCAGCAACG GTAATTCAGC AAACGTGGCT CCGGCATACT CCTGAATTGA TGCGCCATTC GCCTGGGGTG ACTGCCCGCT TCGGCCAACG TTTTCTTTTC GGCCCTGAGA CGAAAATCCT TTCGGTATCG CGGACTCGGT ACCAGCATCG TTGAAAACCG GAATTTGATT GCCGAGACAG CAATGCGACC AAATAATACT GGAACATTAG CGGATAGTTA CCGCCGCTTT ACGCTGGCAC CGACGGCGCG ACTGTTTGCC TCCGCCATCG GGCCTGGTTC CTGCGACATC CTCTCTTCCG GATGGTGTCC CCTAATGAGT TTCCAGTCGG CGCGGGGAGA ACCAGTGAGA GAGTTGCAGC GTTTGATGGT TCGTATCCCA AATGGCGCGC CAGTGGGAAC GACATGGCAC GCGAGTGAGA AACTTAATGG AGATGCTCCA GTTGATGGGT TGCAGGCAGC ATGATCAGCC ACAGGCTTCG CCAGTTGATC TGCAGGGCCA CGCCAGTTGT CCGCTTCCAC ACCACGCGGG GTATAACGTT GGCGCTATCA G Bam HI( 2) 3 ' Les fragments 1, 2 et 3 ont été alors ligués de manière à obtenir le plasmide p 160 représenté sur la figure 7. Ce plasmide a été soumis à une digestion partielle par les enzymes de restriction Hinc II et Pst I Le grand fragment Hinc II-Pst I, contenant l'origine de réplication et représenté sur la figure 7, a été ensuite ligué au fragment 4, représenté ci- après, qui est un fragment synthétique d'ADN portant une séquence codant pour les 44 premiers acides aminés d'un précurseur naturel de l'h GH et en amont de cette séquence des signaux de régulation. J S A q) 3 9 d I A V 3 3 d 3 9 9 W 19 V VV 311 H 319 113 311 199 9 V 1 VIV 993 113 113 WVVV 313 319 V 3 913 311 V 31 l V 1 9 W 9 V W 9 VV 9 W V 33 31 V IVI 339 9 W 9 V V 13 9 V 9 9 V 3 IP Sd ú A I1 J V 1) H 1 d H V M 1 W V N a 31 V 991 913 WV 993 3 V 9 319 919 3 V 9 V 39 V 19 993 939 9 V 9 3 V 1 V 93 911 913 3 V 1 33 V 3 V 9 Ii 339 913 9 V 3 3 V) 913 193 1 V 33 DD 9 393 313 91 V 139 3 W 3 V 9 SZ t 1- J 1 a S i d I 1 d J V S 9 3 O 1 M d y W VV 9 131 V 9 V 1 W 999 W 1 991 199 9 W 993 V 31 933 313 119 W 9 33 V 999 I I 13 V 9 V 131 Vfl 3 D 33 IV 33 V V 33 3 Dl 339 19 V 399 9 V 9 W li 3 991 > 33 oz à Ieq X 9 Z- i 3 1 9 J V 1 i 1 S I a S 9 I V W y 3 V 993 V D 3 V 93 V 9933 W VV 93 3 V 99 V 93 V 9 V 31 V 91 DD 33999 V 133991 V 93 3 V 151 913 391 313 913 399 1 1 i 139 913 313 913 19 V 13 V 993 331 V 99 33 V 139 91 V V 191 V 1 V 13133 t I 311 VWV 911 IWV 3191919 WVVIL 91 V 1339313 V 3 WI 133 V 3 V 3 Vfl V 1 V 931 V O L 1 V 3 VIVIV 9 V 9 V 9 WJL 3 VWJ_ LL V 3 V 3 V 3 II W 3 Wl IV 939 V 919 I VV 391919 WI Jlv V 1939 VI Ia PN 139 V 191 VV 1 V 1 VV 93 VV 3 V 9913 V 913 V 93139 V so V 931 VDV 11 V 1 V 1139119133 V 913 V 9139 V 931 Iel D 9 1 N 3 W 9 VUJ 069999 Z Dans ce fragment, Les acides lettres selon Le code suivant: A = Alanine C = Cystéine D = Acide aspartique E = Acide glutamique F = Phény Lalanine G = Glycine H = Histidine I = Isoleucine K = Lysine L = Leucine aminés sont désignés par des M = Méthionine N = Asparagine P = Proline Q = Glutamine R = Arginine S = Sérine T = Thréonine V = Valine W = Tryptophane Y = Tyrosine Sont successivement soulignées dans ce fragment les séquences -35 (TTGCTT) et -10 (TATAAT) de la séquence promotrice, et la séquence de Shine et Dalgarno bien connue de l'homme de l'art. Le plasmide p 380,1 a été ainsi obtenu. Le plasmide p 380,1 a été ensuite soumis à une digestion par Les enzymes de restriction Cla I et Nde I de manière à en éliminer le petit fragment Cla I-Nde I du fragment 4 ci-dessus et à lui substituer Le fragment Cla I-Nde I ci-après: Cla I CGATAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA TATCGCATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGT Nde I ATTTCACACAGTTTTTCGCGAAGAAGGAGATATACA TAAAGTGTGTCAAAAAG C GCTTCTTCCTCTATATGTAT ' Le plasmide résultant est le plasmide p 373,2 (figure 8). 2) Construction du plasmide p 466: ' Le plasmide p 373,2 a été soumis à une double digestion par Les enzymes Bg LII et Hind III Le grand fragment issu de cette digestion a été purifié et Ligué avec un fragment d'ADN synthé- tique, dont La séquence donnée ci-après est destinée à reconstituer la fin du gène de l'h GH suivie en 3 ' des sites de clonage Kpn I et Sna BI. B g I I GATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGAT _+ + + + + AAGTTCGTCTGGATGTCGTTCAAGCTGTGTTTGAGTGTGTTGCTA GACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTC + + + + + + CTGCGTGATGAGTTCTTGATGCCCGACGAGATGACGAAGTCCTTCCTGTACCTGTTCCAG F s p I GAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGTAA + + + + + + CTCTGTAAGGACGCGTAGCACGTCACGGCGAGACACCTCCCGTCGACACCGAAGATCATT H i S n K N d p a I n B I I I I GGTACCCTGCCCTACGTACCA + à CCATGGGACGGGATGCATGGTTCGA Ce fragment comprend Les extrémités cohésives Bg LII et Hind III Le nouveau p Lasmide ainsi formé p 462 (Cf Fig 9) comprend ainsi un site Kpn I et un site Nde I qui vont servir au clonage du fragment portant l'AD Nc de l'urate oxydase dans le vecteur d'expression. Le p Lasmide hybride dérivé de p TZ 19 R portant l'AD Nc d'environ 1,2 Kb (clone 9 C), de l'urate oxydase comprend un site Kpn I unique Ce site est localisé quelques paires de bases en aval du site de clonage de l'AD Nc D'autre part l'AD Nc de l'urate oxydase contient un site Acc I situé à proximité de l'extrémité 5 '. On a donc isolé et purifié le fragment Acc I-Kpn I compre- nant la plus grande partie de cet AD Nc D'autre part on a synthé- tisé deux oligonuc Léotides complémentaires dont la séquence donnée ciaprès: '-TATGTCTGCGGTAAAAGCAGCGCGCTACGGCAAGGACAATGTTCGCGT ACAGACGCCATTTTCGTCGCGCGATGCCGTTCCTGTTACAAGCGCAGA-5 ' est destinée à reconstituer l'extrémité 5 ' de l'AD Nc Ce fragment synthétique ainsi obtenu possède une extrémité Nde I et une autre Acc II Le fragment et la séquence synthétique ont été ligués avec Le vecteur d'expression coupé par Kpn I et par Nde I Cette ligation à trois fragments permet d'obtenir le vecteur d'expression nommé p 466, de L'urate oxydase pour E coli (Cf figure 10) Ce plasmide a été soumis à une série d'hydrolyses enzymatiques par des enzymes de restriction, qui a permis de vérifier la présence des sites de restriction attendus, en particulier ceux portés par le gène codant pour l'urate oxydase. Le plasmide p 466 contient donc par construction un gène codant pour l'urate oxydase de séquence ci-après: ATGTCTGCGG CAAGGTTCAC CCGTCTGTGT GACAACAGCG CACCGCCAAG TGGGCACACA AACATTGTCT CCCTCACTCC ACGTGGTCGA ACCGTGCTGA GTACACCACA ATGCCACTTG CACGTGCCTA GAAGACTTTT AGATGGCAGA TACTCGTTGC GGGCCTCCAA ACCCCAACGG AAATTG. TAAAAGCAGC AAGGACGAGA GCTTCTGGAG TCATTGTCGC CAGAACCCCG CTTCATTGAG GCCACCGCTG TTCATCCGCG GGGCAAGGGC AGAGCACCAA CTTAAGGAGA GCAGTGGAAG AGTTCGATGC GCTGAAGATA GCAAATCCTG CTAACAAGCA AACACCGGCA GCGCTACGGC AGACCGGTGT GGTGAGATTG AACCGACTCC TTACTCCTCC AAGTACAACC GACCCGGATG ACAGCGAGGA ATCGATATCA CTCGCAGTTC CCTGGGACCG AATTTCAGTG TACCTGGGCC ACAGTGCCAG GCGCGCCAGC CTATTTCGAA AGAACGCCGA AAGGACAATG CCAGACGGTG AGACCTCTTA ATTAAGAACA CGAGCTGTTC ACATCCATGC GACATTGACG GAAGCGGAAT AGTCGTCTCT TGGGGCTTCC TATCCTGAGC GACTCCAGGA ACTGCTCGCG CGTGCAGGCC AGCTGATCGA ATCGACCTGA GGTCTTCGCT TTCGCGTCTA TACGAGATGA CACCAAGGCC CCATTTACAT GGCTCCATCC CGCTCACGTC GCAAGCCACA GTGCAGGTGG GTCCGGCCTG TGCGTGACGA ACCGACGTCG GGTCCGCTCG AGGTCACTCT ACTATGTACA GACTGTCGAG GCTGGCACAA CCTCAGTCGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT (Les nucléotides différents des nucléotides de L'AD Nc iso Lé d'A. flavus sont soulignés dans la séquence ci-dessus Ces différences ont été introduites sur le fragment synthétique Acc I-Kpn I de façon à avoir en aval de l'ATG une séquence nucléotidique plus conforme à celles habituellement rencontrées dans un gène procaryote). Le plasmide p 466 a été hydrolysé par les enzymes Nde I et Hind III et le fragment portant le gène lac i, l'origine de réplica- tion et le gène codant pour la résistance à l'ampicilline a été purifié selon les techniques connues de l'homme de l'art (Maniatis, op cit). Ce fragment a été ligué au fragment d'ADN complémentaire amplifié préalablement hydrolysé par les endonucléases Nde I et Hind III Le produit de cette ligation a servi à transformer dans la souche E coli K 12 RRI (Gibco-BRL réf: 520-8261 SA) On a retenu un transformant, appelé clone 512, qui contient le plasmide appelé p 572. * 2) Détermination de la séquence de l'ADN complémentaire Le plasmide p 572 a été hydrolysé d'une part par les endo- nucléases Cla I et Kpn I, d'autre part par les enzymes Kpn I et Hind III (L'endonucléase Kpn I coupe la séquence codante du fragment A) Le fragment Cla I-Kpn I portant l'extrémité 5 ' de l'ADN codant pour la protéine et le fragment Kpn I-Hind III portant l'extrémité 3 ' de l'ADN codant pour la protéine ont été clones dans le phage M 13 mp 19 (Pharmacia) et séquences par la technique du cyclone ("Cyclone I Biosystem" de IBI). La séquence nuc Léotidique de l'ADN complémentaire ainsi obtenue est représentée sur la figure 11 On constate que la séquence codante de l'ADN complémentaire est exactement identique à celle de l'ADN génomique, à la différence près que cette dernière est interrompue par trois introns, lesquels ont été correctement localisés (cf exemple 1 7)). 3) Expression de l'ADN complémentaire de la préproendothiapepsine La souche E coli K 12 RRI (Gibco BRL-Réf: 520-8261 A) a été transformée pour la résistance à l'ampicilline avec le plasmide p 572 portant L'ADN complémentaire de la préproendothiapepsine, dont on a déterminé laséquence en 2), et avec un plasmide témoin négatif p BR 322. Des colonies résistantes à l'ampicilline ont été obtenues dans les deux cas. 1 colonie de chaque type a été mise en culture dans du milieu LB liquide (de composition précisée dans le tableau 4, mais sans agar) additionné d'ampicilline 100 pg/m L Après une nuit à 37 C sous agitation, les deux cultures ont été diluées 100 fois dans du milieu liquide LB additionné d'ampicilline 100 pg/m L Après 1 h de culture, on ajoute de l'IPTG (Isopropyl P-D Thiogalactoside) jusqu'à 1 m M pendant 3 h. Immunodétection de la préproendothiapepsine par Western Blot: a) Mode opératoire On prélève du milieu de culture obtenu après 3 h d'induc- tion à l'IPTG une fraction aliquote correspondant à 0,2 ml à DO = 1 On centrifuge cette dernière et on élimine le surnageant On soumet ensuite le culot à un Western Blot, technique bien connue de l'homme de l'art, qui comprend les étapes suivantes: Solubilisation du culot par ébullition pendant 10 min dans un tampon dénommé tampon de charge constitué de Tris H Cl 0,125 M p H 6,8 SDS 4 %, bleu de bromophénol 0,002 %, glycérol 20 %, p-mer- captoéthanol 10 % (selon le protocole décrit par LAEMMLI (U K. LAEMMLI, Nature, 227 ( 1970), 680-685)), Séparation électrophorétique des différentes protéines contenues dans le solubilisat selon le protocole décrit par LAEMMLI (U K. LAEMMLI, Nature, 227, ( 1970), 680-685), Transfert desdites protéines contenues dans le gel sur un filtre de nitrocellulose (selon la technique de H TOWBIN et a I Proc. Natl Acad Sci USA 76 ( 1979) 4350-4354), Immunodétection, réalisée se Lon la technique de BURNETTE (W W. BURNETTE Ana Biochem 112 ( 1981) 195-203), elle implique successi- vement: Le rinçage du filtre de nitrocellulose pendant 10 min avec un tampon de composition Tris-H Cl 10 m M, Na CL m M, KCL 1 m M. La mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant min à 37 C avec du tampon A additionné de sérum albu- mine bovine à raison de 3 g pour 100 ml. La mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant 1 h à 37 C avec les anticorps polyclonaux du kit Rennetest France Biochem, conformément à la méthode d'identification de l'endothiapepsine décrite dans le Journal Officiel de la République Française du mars 1981. Le rinçage du filtre de nitrocellulose avec le tampon A, additionné de 3 g/100 ml de sérum albumine bovine. La mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant 1 h à 37 C avec une solution de protéine G marquée à l'iode 125 à 0,1 microcurie/mi. Le rinçage du filtre avec le tampon A. Le séchage du filtre entre deux feuilles absorbantes. La mise en contact d'un film radiographiqueo. La révélation du film. b) Résultats: On constate que la souche transformée par le plasmide p 572 surproduit une protéine de poids moléculaire apparent d'environ 43 k Da correspondant à la masse moléculaire attendue de la préproendothiapepsine, qui est reconnue par les anticorps dirigés contre l'endothiapepsine qui est absente dans la souche témoin. REVENDICATIONS 1 ADN recombinant, caractérisé en ce qu'il code pour un précurseur comportant une séquence peptidique pré et une séquence peptidique pro, de L'endothiapepsine, de séquence (P 1) suivante: Ser I Le Asp G Lu Leu Ser G Ly Ser Ser Ser Phe Val Gly Thr Val Ser Ile Cys Asp Thr Thr Thr Thr Val Leu Gly Gln Thr Pro Pro Gly Ser Ser Thr Ser Ala Pro Phe Val Leu Gly Pro Gly Asp Ser Asp Ala Ile Thr Val Phe Thr Gly Leu Gly Thr Gly Gly Ala Gly Ser Va L Ser G Ly G Ly Val Val Asp G Ln Phe Ile Lys Thr Leu Ala Leu Asp G Ly Leu Phe Ala Gln Ser Gln Ala Tyr Glu G Ly Gln Thr Asp Gln Phe Tyr Lys Pro Tyr Ile Lys Ala Thr Ile Asp Thr Thr Thr Ser Leu Lys Ala Thr Gly Lys Leu Ser Ser Ile Gln Ala Ser Thr Thr Gly Thr Leu Trp Ile Tyr Trp Ser Asp Thr Ala Lys Leu Gly Thr Phe Asp Leu Thr Ala Phe Trp Ser Thr Pro Ala Ser Ser Phe Thr Asp Phe Ser Ser Ala Phe Lys. Pro Pro Val Thr Ile Val Lys Leu Phe Gly Tyr Glu Ser Thr Ser Phe Gly Ala Val Ile Ala Phe Pro Ser Ser Val Ala Asp Tyr Thr Trp Ile Val Va l Gly Pro Gly Val Asp Gln Ser Ser Tyr Val Ser Phe Asn His Gly Thr Asp Val Gly Val Ile Ile Phe Ser Thr Ser Lys G Ly G Ly Ser Ser A La Ala Ser Ser G Ly Ser G Ly Gly Ser G Ly Asn Leu Leu Glu Ser Asp G Ly Ser Thr Lys Pro I Le Thr Ile A La Tyr Ser Thr Ile Gly Asp Asn Thr Thr Gly Leu Phe Leu Ala Gly Thr Gly Ala Tyr Val Ala Gly Asn Ala Asp Leu Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Thr Tyr Tyr Asp Trp Phe Arg Ser Ile Thr Ala Asp Ala Ala Ser Val Glu Thr Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Pro Ile Ser Phe Thr Tyr Phe Ser Lys Ser Thr Asp Val Asp Asn Ala Val Gly Gln Cys Val Ser Gly Pro en ce vante: 2 ADN recombinant selon que la séquence peptidique la revendication 1, pré est la séquence caractérisé (P 2) sui- Ser Pro Leu Lys Asn Ala Leu Ser. Val Thr Ala Met Leu Ala Gly Gly Met Ser Ala Leu 3 ADN recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence codant pour la séquence (P 2) est la séquence (N 2) suivante: ATGTCTT CCCCTCTCAA GAACGCCTTG TGGTGCTCTC AGC 4 ADN recombinant selon caractérisé en ce que la séquence (P 3) suivante: GTGACCGCCA TGTTGGCTGG l'une des revendications 1 à 3, peptidique pro est la séquence Ser Pro Thr Lys G Ln His Val Gly Ile Gly Pro G Ly Lys Tyr Ser Phe Lys Gln Asn Gly Pro Leu Ser Val Lys Lys Thr Pro Ala Trp Leu Glu Asp Ala Val Gln Arg. Pro Val Asn Ala Ser Val Arg Asn Pro Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Asn Ser Thr Ser Gly Pro Glu Val Tyr Lys Phe Val Pro Ile Leu Ala Glu ADN recombinant en ce que la séquence codant (N 3) suivante: TCGCCTA CCTCTCCTGA AGTTGGCCCC CCCAACTACA AGTTCAACGG GTACGGCGTG CCGATCCCAG CCTCGGGCCT GGCTGAGCGC selon la revendication 4, caractérisé pour la séquence (P 3) est la séquence CAAAGCAACA CGTTGGAATT CCCGTCAACG GGAAAGTACT CGTTCAAGCA AGTCCGGAAC GCCTCTGTCG GTCAAGAAGA CGTACCTCAA CCTGGCTGGA GGATGCTGTC CAGAACTCTA 6 ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la séquence pré-pro est la séquence sui- vante: Met Ser Ser Pro Leu Lys Asn Ala Leu Val Thr Ala Met Leu Ala Gly Gly Ala Leu Ser Ser Pro Thr Lys Gln His Val Gly Ile Pro Val Asn Ala Ser Pro Glu Val Gly Pro Gly Lys Tyr Ser Phe Lys Gln Val Arg Asn Pro Asn Tyr Lys Phe Asn Gly Pro Leu Ser Val Lys Lys Thr Tyr Leu Lys Tyr Gly Val Pro I Le Pro Ala Trp Leu Gtu Asp A La Val G Ln Asn Ser Thr Ser G Ly Leu A La Glu Arg 7 ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence (Nla) suivante: ATGTCTT TGGTGCTCTC CCTCTCCTGA CCCAACTACA GTACGGCGTG CCTCGGGCCT GACAGCCTCG GCAGACTCTG TCAGCAGCGA CCCAGCAAGA TCCTACGGAG CTCGGTTGGA AGGTTTCTTC CTGGCCTTCA CTTCGACAAT TTGGCTACCA GCCTACACGG CTGGGAGTGG CGACTTCCAT CCTGCCACCG CAGCTCTTCC CCTTCACCTT ATTGATTTCG CCAGTCCAGC AGGCTTTGTC CCAAG CCCCTCTCAA AGCTCGCCTA AGTTGGCCCC AGTTCAACGG CCGATCCCAG GGCTGAGCGC ATGATGCTTA AACCTGGACT GACTACAGCC GCACCACCGC ACGGTAGCTC GGCCTTACCG CAGCTTCACC GCACCCTGAA GCGAAGGCGT TGCCCCTGGT GCTCCATCAC ACTTCGACCG CGACGGCATC TCGTGTCGGC GTCGGCGGCT CGGCGTTGGC GCCCCATCTC GCTGGTATCG GTCTTCAACG GAACGCCTTG CAAAGCAACA GGAAAGTACT GCCTCTGTCG CCTGGCTGGA TCGACCGGTT CATCACTCCG TTGACACTGG AGCGAGGTCG CAAGCTGCTG TTCCAGCGGC TGACGGGCCA GAGGACTCGA CACTGTGTCG CCTTGGACTC ACCTACAACT CTACACCGCT GCTACGCCGT GCTGACACTG CTACTGGGCC ACGTCTTCCC TCAGCTCGCA CACTGGAAGC GCATCAACAT GGGCTACAAC GTGACCGCCA CGTTGGAATT CGTTCAAGCA GTCAAGAAGA GGATGCTGTC CTGCGACCAC GTTCAGATCG ATCTTCGGAT ATGGGCAGAC TCGGCGCTAC GATGTCTACA GGCTGTCGAG CCATTGACGG CCTACCCAGC GCCTGTGTTC TCGGCTTCAT GTCTCGACCA CGGCTCCGGC GCACGACCCT CAGGTCTCGG CTGCAGCGCG TTGTGATTCC TCGTCTTGCT CTTCGGTGAT TCCCACTCTT TGTTGGCTGG CCCGTCAACG AGTCCGGAAC CGTACCTCAA CAGAACTCTA AACTCCCATC GCACCCCTGC CTGTGGGTCT CATCTACACC CTGGTCCATC CTGACACCGT TCGGCCAAGA TCTCCTGGGC AAAAGACTTT ACGGCTGATC CGATACCACT AGCAAGGGTT ACCTTCAAGT CCTGTACCTC GCGCCAAGTC ACCCTGCCTT TGGCGACTAC TTGGCGGCAT GTCGCTCTGA GGCTTTGCTT 8 ADN recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence (Nal) interrompue par au moins un intron. 9 ADN recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence (Nlb) suivante: CCTTGGTGAC CAACACGTTG GTACTCGTTC AGACCAACGC ATTATACTTT TCGGTCAAGA GGAGGATGCT GTTCTGCGAC CCGGTTCAGA TGGATCTTCG TTGGTCAACC TAATCAGAAT ACCATCTACA TACCTGGTCC ACACTGACAC GAGTCGGCCA CGGTCTCCTG AGCAAAAGAC TTCACGGCTG TATACTTTTT ATTGTTTGTA CTGCCTACAC TTCTGGGAGT GTCGACTTCC TCCCTGCCAC TCCAGCTCTT TTCCTTCACC ACATTGATTT ATCCAGTCCA GAAGGCCGCC TTGCTTCCAA CGCCATGTTG GAATTCCCGT AAGCAAGGTG AAAAAGAAGA TGAAGTCCGG AGACGTACCT GTCCAGAACT CACAACTCCC TCGGCACCCC GATCTGTGGG CTCGCCCGCA ACTAACATTG CCCCCAGCAA ATCTCCTACG CGTCTCGGTT AGAAGGTTTC GGCCTGGCCT TTTCTTCGAC ATCTTGGCTA GATGAATCTT TCTACAGCTG GGGCTCCATC GGACTTCGAC ATCGACGGCA CGTCGTGTCG CCGTCGGCGG TTCGGCGTTG CGGCCCCATC GCGCTGGTAT TTTGTCGTCT G AT GCTGGTGGTG CAACGCCTCT AGTAGAGCTG GGTCAAGGCA AACCCCAACT CAAGTACGGC CTACCTCGGG ATCGACAGCC TGCGCAGACT TCTTCAGCAG TTTTATTGCA GGAATTTCCC GAGCACCACC GAGACGGTAG GGAGGCCTTA TTCCAGCTTC TCAGCACCCT AATGCGAAGG CCATGCCCGT GTTGGAGAAG GTACCTACAA ACCTACACCG CGGCTACGCC TCGCTGACAC GCCTACTGGG CTACGTCTTC GCTCAGCTCG TCCACTGGAA CGGCATCAAC TCAACGGGGC GTCTTCCCCT *CTCTCAGCTC CCTGAAGTTG CTTCTGTGTG AGACGGATAT ACAAGTTCAA GTGCCGATCC CCTGGCTGAG TCGATGATGC CTGAACCTGG CGAGACTACA TACATTTTTA AACTGTAGGT GCCAAGCTGC CTCTTCCAGC CCGTGACGGG ACCGAGGACT GAACACTGTG CGTCCTTGGA GAGTGACCCC CATTCCCCAC CTTCGGCTTC CTGTCTCGAC GTCGGCTCCG TGGCACGACC CCCAGGTCTC CCCTGCAGCG CATTGTGATT GCTCGTCTTG ATCTTCGGTG TACAACTCCC CTCAAGAACG GCCTACAAAG GCCCCGGAAA TTGCAACAGA TTTACTGACA CGGGCCTCTG CAGCCTGGCT CGCTCGACCG TTACATCACT ACTTTGACAC GCCAGCGAGG GTTTTTTTGG CGATGGGCAG TGTCGGGCGC GGCGATGTCT CCAGGCTGTC CGACCATTGA TCGCCTACCC CTCGCCTGTG TCTTGATACA TAATATGGAA ATCGATACCA CAAGCAAGGG GCACCTTCAA CTCCTGTACC GGGCGCCAAG CGACCCTGCC CCTGGCGACT CTTTGGCGGC ATGTCGCTCT ACTCTTGGCT ADN recombinant selon L'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend en amont de la séquence codant pour un précurseur de l'endothiapepsine, un promoteur comprenant une partie portant la boite TATA de la séquence (N 4) suivante: AAGCTTATCC GCCGCCGGCG GGGGAATTCT ATTGAACTTG TTCGAATCAT TGGTCCGTGG TCTTTTCGTC CATGCGGGCT CCGCTGGCGG ATGAATGACC TTCTGGCTTC TAGCCTGGCG AAGCGATGTT ACTCTGTTGT CTATACTATA CGATATGGTC AAGAGAGCAC ATGTGCCGCC AGATGAAGAC ATGTATATAA AAGGAGTGGC CTCGACGGTT GCTCAACCAT CTTCTGTCTG TCCCAACGCC ATCGACTCTT CAACTTCTCC TTCGTGTTCC ACCACCATCA CCTTGCTCCA GACTTAGGAC TTTCAGCAAC CTTCAAAG et en amont de La séquence (N 4), un segment E du fragment C compris entre l'extrémité 5 ' du fragment A et un nuc Léotide situé entre l'extrémité 5 ' du fragment A et l'extrémité 5 ' du fragment C, choisi de façon que Le segment E contienne une région activatrice. 11 Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend, avec les moyens nécessaires à son expression, un ADN recombinant selon L'une des revendications 1 à 10. 12 Bactéries, caractérisées en ce qu'el Les sont trans- formées par un vecteur d'expression selon la revendication 11. 13 Ce Llu Les eucaryotes, caractérisées en ce qu'e L Les contiennent, avec les moyens nécessaires à son expression, un ADN recombinant se Lon l'une des revendications 1 à 10. 14 Ce L Lules eucaryotes selon la revendication 13, carac- térisées en ce qu'e Lles sont transformées par un vecteur d'expres- sion selon la revendication 11. Ce Llules eucaroytes selon la revendication 13, carac- térisées en ce qu'e L Les appartiennent au groupe des ascomycètes. 16 Cellu Les eucaryotes selon la revendication 15, carac- térisées en ce qu'e L Les sont des champignons filamenteux. 17 Cellules eucaryotes selon la revendication 16, carac- térisées en ce qu'e L Les appartiennent à l'espèce Cryphonectria parasitica. 18 Cellules eucaryotes selon la revendication 17, carac- térisées en ce qu'elles appartiennent à la souche Cryphonectria parasitica SEBR 103 ou un mutant soit spontané, soit induit de cette souche. 19 Procédé pour obtenir de l'endothiapepsine, caracté- risé en ce qu'il comprend une étape de culture des cellules euca- ryotes selon l'une des revendications 17 et 18 suivie d'une étape d'isolement et de purification de cette protéine. Procédé pour obtenir une souche Cryphonectria parasitica déficiente en endothiapepsine, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de cotransformation de Cryphonectria parasitica par un marqueur de sélection et un ADN selon l'une des revendica- tions 1 à 10 rendu non fonctionnel, suivie d'une étape de sélection des transformants déficients en endothiapepsine. 21 Procédé pour introduire un ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 10 dans des cellules fongiques suscep- tibles de produire des spores uninucléées, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux cycles comportant une étape de cotransfor- mation par cet ADN recombinant selon l'une des revendications 1 à 10, et un marqueur de sélection, suivie d'une étape de purification par sporulation permettant d'éliminer le marqueur de sélection. 22 Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que les cellules fongiques appartiennent à l'espèce Cryphonectria parasitica. 23 Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que les cellules fongiques appartiennent à la souche Cryphonectria parasitica SEBR 103 ou un mutant soit spontané, soit induit de cette souche.