FR 2668473 A1 19920430 FR 9113212 A 19911025 La présente invention se situe dans le domaine des matériaux à base de silice, qui sont revêtus, et l'inven- tion concerne plus particulièrement des récipients, chambres et autres structures servant en électrophorèse. Des éléments solides jouent divers rôles dans des systèmes pour électrophorèse et chromatographie Dans cer- tains systèmes ou appareils, des éléments solides servent de sites pour le partage de solutés, alors que, dans d'autres systèmes ou appareils, ils servent de parois de retenue destinées à loger des milieux servant à une sépara- tion Les éléments solides se présentent ainsi sous forme de particules, de tubes et de plaques, selon le mécanisme de séparation à utiliser ainsi que selon l'agencement, la taille et la forme du milieu pour séparation Des exemples de systèmes ou appareils ou dispositifs utilisant des élé- ments solides pour une séparation sont représentés par des appareils pour une chromatographie d'affinité, une chroma- tographie avec inversion de phase, une chromatographie avec échange d'ions, une chromatographie par exclusion selon les tailles, et les diverses formes d'électrophorèse, ce qui comprend une électrophorèse sur un gel en plaque, une élec- trophorèse sur un gel en tube, une électrophorèse dans un tube capillaire (du type sur gel ou du type en solution), de l'isotachophorèse et une focalisation ou concentration isoélectrique Dans certains cas, l'élément solide joue un rôle actif dans le partage et, dans d'autres cas, il joue un rôle passif. Un phénomène qui se produit dans un grand nombre de ces systèmes ou dispositifs, en particulier ceux dans les- quels l'élément solide est un matériau contenant de la silice, est une électro-endosmose, également appelée cou- rant ou écoulement électro-osmotique, qui provient de l'existence d'un potentiel électrocinétique entre la paroi de l'élément solide et le milieu, en forme de liquide ou de gel, voisin de la paroi et servant à la séparation Le courant ou écoulement que ce potentiel provoque est un écoulement en masse qui se produit lorsqu'un champ élec- trique, tangent à la surface solide, est appliqué au milieu destiné à réaliser la séparation Dans de nombreux systèmes ou dispositifs, cet écoulement est considéré comme gênant le processus de séparation. Si un courant ou écoulement électro-osmotique peut se produire dans l'une quelconque de ces configurations, il est particulier gênant dans des tubes capillaires, en rai- son de leur rapport élevé entre l'aire de surface de paroi et le volume interne, et en raison de la proximité étroite de la paroi avec les constituants de l'échantillon soumis à séparation Les tubes capillaires ont une importance parti- culière puisqu'ils permettent l'analyse d'échantillons extrêmement petits avec une détection spectroscopique dis- posée sur le circuit, ainsi que l'utilisation de tensions élevées, ce qui permet de réaliser des séparations à grande vitesse. Donc, la suppression d'un courant ou écoulement électro-osmotique dans des systèmes ou dispositifs de chro- matographie et en particulier d'électrophorèse, constitue l'un des buts visés par la présente invention. La présente invention vise également un phénomène rencontré lors de la séparation de protéines à l'aide de telles techniques Les protéines ont une tendance inhérente à s'adsorber sur les surfaces en silice Dans la plupart des procédés de séparation, cette adsorption n'est pas souhaitable, puisqu'elle conduit à un élargissement et une asymétrie des pics, et qu'elle nuit ainsi à la résolution, en diminuant la précision et la reproductibilité des analyses. L'adsorption des protéines constitue un souci parti- culier dans des systèmes et dispositifs susceptibles d'être soumis à un courant ou écoulement électro-osmotique, puis- que la protéine adsorbée influe sur les caractéristiques des parois, ce qui comprend le potentiel zéta Des varia- tions de la quantité ou de la distribution de la protéine adsorbée sur la paroi vont provoquer une variation de la contribution électro- osmotique de l'écoulement, aussi bien au sein d'un essai unique qu'entre des essais successifs, ce qui aggrave encore les difficultés rencontrées pour réaliser des comparaisons et déterminations fiables et significatives Ces soucis sont particulièrement aigus encore dans le cas des systèmes et dispositifs comportant des tubes capillaires, en raison de la forme géométrique des tubes capillaires et de la grande influence de la paroi d'un tube capillaire. Divers procédés pour diminuer ou éliminer l'adsorption des protéines par les surfaces en silice sont décrits ou cités dans la littérature En général, ces procédés impliquent l'une des deux approches suivantes: ( 1) la création d'une répulsion coulombienne entre les protéines et la silice, par un choix approprié du p H et de la force ionique d'un tampon; et ( 2) la fixation, par liaison chimique, d'une matière neutre à la surface de la silice pour éliminer les charges superficielles jouant le rôle de sites d'adsorption. Des exemples de la première approche sont cités par McCormick, R M, Anal Chem 60:2322-2328 ( 1988), qui décrit l'utilisation de tampons de phosphate à faible p H pour diminuer la charge négative de la silice fondue et distribuer des groupes phosphates sur la surface de silice, sous forme d'un écran protecteur L'utilisation de tampons à p H élevé, avec addition de modificateurs ioniques, est citée par Lauer, H H, et al, Anal Chem 58:166-170 ( 1986) et par Walbroehl, Y et al, J Microcolumn Sep 1:41-45 ( 1989) Comme indiqué par ces auteurs, les tampons trans- forment les protéines en une espèce à charge négative, qui est repoussée par les parois à charge négative des capillaires. La seconde approche a été adoptée par J W Jorgenson et al, Science 222:266-272 ( 1983), qui a fixé des matières, contenant du glycol, sur de la silice fondue. S J Hjerten, J Chromatogr 347:191-198 ( 1985) a cité l'utilisation de méthylcellulose et d'un polyacrylamide non réticulé, relié à l'aide d'un réactif de type organosilane. L'utilisation d'un revêtement en poly(vinylpyrrolidinone), appliqué à l'aide d'une fixation de groupe organosilane sur la surface, a été citée par McCormick (référence ci-dessus) et l'utilisation d'un revêtement en polyéthylèneglycol est citée par G J M Bruin et al, J Chromatogr 471:429-436 ( 1989). Si chacune de ces approches présente certains avan- tages ou mérites, elle a également des inconvénients, dûs en particulier à des limites affectant leurs intervalles de possibilités d'application Des approches impliquant une variation ou manipulation du p H et de la force ionique d'un tampon sont limitées en termes de l'intervalle de p H dans lequel la séparation peut être réalisée et, donc, des pro- téines pouvant ainsi être séparées Des approches impli- quant le revêtement de la surface en silice rencontrent des problèmes de stabilité à long terme, notamment dans des conditions alcalines La technique largement utilisée d'assurer une liaison globale à l'aide de liaisons chimi- ques de type siloxane (Si-0-Si-C), par exemple, tend à présenter un clivage nucléophile dans des conditions basiques. Pour la séparation de protéines, il est important de pouvoir choisir parmi une large gamme de tampons et de valeurs de p H, en raison des vastes différentes existant entre des protéines et de la forte influence du p H sur les charges des molécules des protéines et, donc, sur leurs caractéristiques de migration Certains mélanges se sépa- rent mieux à un p H bas (inférieur au point isoélectrique des protéines), alors que d'autres mélanges donnent de meilleures séparations à des valeurs du p H supérieures au point isoélectrique des protéines en cause Le système ou dispositif idéal sera donc un système à la fois stable et capable de servir dans des régimes de p H aussi bien élevés que faibles. Pour résumer l'invention, on pourrait indiquer que l'on vient de découvrir un nouveau procédé pour supprimer ou éliminer les charges électrostatiques à la surface d'un matériau contenant de la silice, le résultat obtenu demeu- rant effectif et stable dans une large gamme de conditions et pendant des périodes prolongées de temps Selon ce procédé, on applique sur la surface de silice un revêtement polymère, qui est lié à la surface par des liaisons chimiques Si-C sans le fragment siloxane intermédiaire de l'art antérieur On applique la couche de revêtement en transformant tout d'abord les groupes silanols présents à la surface en des groupes halogénures de silicium, puis en faisant réagir ces groupes avec un réactif organométallique comportant un fragment éthényle terminal, de préférence un halogénure de vinyl ou d'allyl-lithium ou un halogénure de vinyl ou d'allyl-magnésium, pour convertir les groupes halogénures de silicium en des groupes Si-R dans lesquels le fragment R conserve le fragment éthényle terminal, et, finalement en faisant réagir ces groupes éthényles, nouvel- lement fixés à la surface, avec un monomère organique neutre, dans une réaction de polymérisation par addition, pour former sur la surface une couche monomoléculaire de polymère non réticulé La couche du polymère que l'on obtient ainsi est liée à la silice directement par des liaisons chimiques Si-C, qui sont stables dans une large gamme de conditions de p H. On place ainsi des liaisons éthényles accessibles sur des sites occupés à l'origine par des groupes silanols, puis l'on effectue une réaction d'addition sur la liaison éthényle à l'aide d'une espèce appropriée pour former et lier par covalence la couche polymère L'expression "liaison éthényle" sert dans le présent exposé à désigner le groupe répondant à la formule N / C ====C On réalise la fixation dé la liaison éthényle accessible, en utilisant un réactif organométallique portant un frag- ment éthényle terminal. Les liaisons fixant le polymère à la surface en silice sont stables dans une large gamme de p H allant d'un p H fortement acide à un p H fortement basique, et elles demeurent stables pendant des périodes prolongées de temps. Le revêtement résultant diminue ou élimine aussi bien le courant ou écoulement électro-osmotique que les sites d'adsorption à la surface en silice, en donnant à la silice une large possibilité d'utilisations variées en termes de son application à différents types de protéines, ainsi que la possibilité de réaliser une résolution à l'aide de pics élevés et d'effectuer des séparations efficaces. D'autres caractéristiques, objets et avantages de l'invention ressortiront notamment de la description sui- vante, faite en regard des dessins sur lesquels: les figures la et lb sont des tracés de détecteurs représentant des séparations par électrophorèse réalisées dans des tubes capillaires, revêtus et non revêtus, selon l'invention, dans des conditions de p H élevé; et les figures 2 a et 2 b sont des tracés de détecteurs, similaires à ceux des figures la et lb, que l'on obtient en utilisant cependant un mélange de protéines différentes et en opérant dans des conditions de bas p H. Voici une description plus détaillée de l'invention et de ses modes préférés de mise en oeuvre. Selon l'invention, on convertit tout d'abord des groupes silanols, présents à la surface du matériau contenant de la silice, en des groupes halogénures de silicium pour les préparer à une réaction avec un réactif de Grignard On peut y parvenir par des procédés traditionnels connus de l'homme du métier On peut utiliser en général des atomes d'halogène On préfère le chlore et le brome, et l'on préfère tout particulièrement utiliser du chlore. Un procédé préféré de chloration passe par l'utili- sation du chlorure de thionyle Cette réaction est effec- tuée de manière générale en atmosphère inerte, en phase liquide, à des températures élevées qui de préférence excèdent 50 O C Si l'on peut utiliser un solvant, on peut également effectuer la réaction en l'absence d'un solvant. Les sites halogénés de la surface sont ensuite traités par un agent organométallique portant un groupe aliphatique ayant un fragment éthényle terminal Des com- posés organométalliques préférés sont des composés d'orga- nolithium, d'organomagnésium et d'organosodium On préfère particulièrement des composés d'organolithium et d'organo- magnésium, et ils répondent respectivement à la formule générale R-Li et R-Mg-X Dans ces formules, R représente un groupe aliphatique contenant un fragment éthényle terminal, et X est un halogène Des groupes R préférés sont des groupes linéaires ayant 5 atomes de carbone ou moins de 5 atomes de carbone, et l'on préfère particulièrement les groupes allyle et vinyle et tout particulièrement le groupe vinyle L'atome X représente, dans la formule du composé d'organomagnésium, des halogènes en général Les halogènes préférés sont le chlore, le brome et l'iode, on préfère beaucoup des chlorures et bromures et l'on préfère surtout des bromures Des exemples de réactifs organométalliques préférés sont représentés par du vinyl lithium, de l'allyl lithium, du bromure de vinyl magnésium, du chlorure de vinyl magnésium, du bromure d'allyl magnésium et du chlo- rure d'allyl magnésium. La réaction avec le composé organométallique est généralement conduite,de méme,en atmosphère inerte sèche. On utilise généralement le réactif organométallique en solution dans un solvant liquide polaire, notamment un éther tel que l'éther de diéthyle ou le tétrahydrofuranne, et l'on conduit de manière générale la réaction à une tem- pérature élevée, de préférence égale ou supérieure à 50 'C environ. La réaction avec le réactif organométallique con- vertit les groupes halogénure de silicium en des groupes Si-R, avec conservation de la liaison éthényle terminale du groupe R On fait ensuite réagir la surface avec une espèce capable d'une polymérisation par addition sur le groupe éthényle, pour former une couche monomoléculaire de poly- mère à la surface de la silice et qui lui est liée par covalence aux sites précédemment occupés par les groupes silanols L'espèce utilisée dans cette phase du procédé peut être de nature extrêmement variable Des exemples en sont des acrylates, de l'acrylamide, des acrylamides subs- titués et des éthylènes à substituant alkyle, aryle et halogéno Parmi eux, on préfère des acrylates, de l'acrylamide et des acrylamides substitués, l'acrylamide étant le composé que l'on préfère surtout Dans le cas de l'acrylamide, le résultat obtenu est une couche monomolécu- laire de polyacrylamide non réticulé. On effectue la réaction d'addition selon des tech- niques traditionnelles, en utilisant des conditions de réaction et des réactifs supplémentaires que l'homme du métier connaît bien La réaction est effectuée en général en présence d'un catalyseur de polymérisation, qui, dans le cas du polyacrylamide est un catalyseur basique Des exemples sont constitués par des bases aminées comme la N,N,N',N'tétraméthyléthylènediamine ("TEMED" ou "TMEDA"), le diméthylaminopropionitrile et la triéthanolamine En plus du catalyseur, un amorceur de polymérisation est géné- ralement présent Des exemples notables d'amorceurs de la polymérisation sont constitués par des amorceurs généra- teurs de radicaux libres, comme les peroxydes, les persul- fates ou les composés azoïques Des exemples sont repré- sentés par le peroxyde de benzoyle, le peroxyde de ter- tiobutyle, l'hydroperoxyde de tertiobutyle, le perbenzoate de tertiobutyle, le peroxyde de cumyle, le peroxyde d'acé- tyle, le peroxyde de lauroyle, le 2,2 '-azobisisobutyro- nitrile, le phényl-azo-triphénylméthane et des persulfates comme le persulfate de potassium et le persulfate d'ammo- nium Un choix du catalyseur et de l'amorceur les meilleurs va dans chaque cas dépendre de l'espèce que l'on fait réa- gir et éventuellement des conditions de réaction L'homme du métier connaît en général les conditions dans lesquelles ces réactions se produisent, et elles sont également appli- cables dans le présent procédé. La présente invention est applicable de manière générale à des surfaces contenant de la silice Des exemples sont représentés par de la silice fondue, du verre et du quartz L'invention est encore applicable à une large gamme de formes géométriques, ce qui comprend des plaques, des tubes, des perles, et d'autres contours, formes et échelles de taille Comme mentionné ci-dessus, l'invention est particulièrement intéressante dans le cas de son appli- cation à des tubes capillaires, avec application d'un revê- tement à la paroi intérieure du tube capillaire Les dimen- sions du capillaire vont varier selon le choix, en fonction des nécessités du procédé de séparation à y effectuer Dans la plupart des cas, le tube capillaire aura un diamètre interne compris entre environ 5, um et environ 250 1 dm, de préférence entre environ 20 iam et environ 100 pm De même, dans la plupart des cas la longueur du tube capillaire se situera entre environ 5 cm et environ 500 cm, de préférence entre environ 10 cm et environ 100 cm. Les procédés de séparation que l'on peut conduire à l'aide d'une surface ainsi traitée vont largement varier également Des tubes capillaires traités selon l'invention peuvent servir dans des procédés d'électrophorèse en géné- ral, ce qui comprend une électrophorèse sur gel e L/ou en phase liquide et ces tubes sont particulièrement utiles dans la séparation de mélanges de protéines Ainsi, pour séparer un mélange de protéines dans un échantillon liquide et en obtenir les constituants, le procédé comprend le passage de cet échantillon dans un tube capillaire formé d'un matériau contenant de la silice, le passage étant effectué dans des conditions favorisant une séparation par électrophorèse de ces protéines dans le capillaire, dont la paroi interne est revêtue d'une couche de polyacrylamide liée par covalence, audit matériau contenant de la silice, par des liaisons reliant des atomes de Si du capillaire directement à des atomes de C du polyacrylamide. Les exemples suivants sont offerts à titre illustra- tif et ne doivent en principe pas limiter l'invention. EXEMPLE 1 Mode opératoire de traitement de tubes capillaires Réactifs, solvants et capillaires: Les protéines et les tampons, ainsi que la N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et l'acryl- amide de qualité pour électrophorèse, ont été achetés chez Sigma Chemical Co (St Louis, Missouri, Etats-Unis d'Amé- rique) Voici des sources des autres réactifs et solvants. Le persulfate d'ammonium, de qualité réactif, a été acheté chez Mallinkrodt Inc (Paris, Kentucky, Etats-Unis d'Amé- rique); le bromure de vinylmagnésium ( 1,0 M dans du tétra- hydrofuranne) a été acheté chez Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wisconsin, Etats-Unis d'Amérique); le chlorure de thionyle (à 99 % de pureté) a été acheté chez EM Science (Cherry Hill, New Jersey, Etats- Unis d'Amérique) et a été distillé avant utilisation; et le tétrahydrofuranne (THF) a été acheté chez J T Baker, Inc (Phillipsburg, New Jersey, Etats-Unis d'Amérique) et a été déshydraté sur du tamis moléculaire. On a utilisé de l'eau distillée pour la préparation des tampons, et tous les tampons ont été filtrés sur des filtres à membrane en "Nylon 66 " de 0,2 pm (Alltech Associates, Deerfield, Illinois, Etats-Unis d'Amérique) On a préparé des solutions échantillons en dissolvant les protéines dans de l'eau, à des concentrations d'environ 0,2 mg/ml. On a soumis des tubes capillaires en silice fondue ( 50 pm de diamètre interne, environ 1 m de longueur) tout d'abord à du rinçage durant 30 min avec Na OH 1 M, puis avec de l'eau distillée durant 30 min On a séché les tubes capillaires à 110 'C en y faisant passer une purge d'azote durant une nuit. A Chloration en surface On a placé un flacon de chlorure de thionyle, de 2 ml, dans une petite chambre de pressurisation que l'on a ensuite balayée à l'azote durant 15 min pour enlever tout l'oxygène On a ensuite inséré une extrémité du tube capil- laire dans la chambre et l'on a fait passer de l'azote dans ce tube capillaire durant plusieurs minutes On a ensuite abaissé dans le chlorure de thionyle l'extrémité du tube capillaire insérée et l'on a fait passer un courant cons- tant d'azote dans la chambre, qui a été maintenue en un état pressurisé et avec un bon étanchement, ce qui obli- geait le chlorure de thionyle à pénétrer dans le tube capillaire Une fois le tube capillaire empli de chlorure de thionyle, on a fermé de manière étanche, à l'aide d'un petit chalumeau au propane, le tube capillaire en un point voisin de la chambre de pressurisation On a ensuite fixé rapidement l'extrémité opposée du tube capillaire sur un appareil à dépression et l'on a fait le vide dans le tube capillaire que l'on a maintenu sous un vide correspondant à une valeur égale ou inférieure à 60 millitorrs ( 8 k Pa) durant environ 30 min, pendant lesquelles on a maintenu le tube capillaire à 60 a C par immersion dans un bain de chauffage On a ensuite fermé de manière étanche, à l'aide d'un chalumeau au propane, l'extrémité du capillaire voi- sine de la connexion avec le conduit de dépression, et l'on a placé le tube capillaire ainsi fermé de manière étanche dans un bain de chauffage à 70 'C durant 12 h. B Traitement par un réactif de Grignard Dans un flacon de 10 ml, sous purge d'azote et équipé d'une membrane de fermeture en caoutchouc, on a placé 5 ml de tétrahydrofuranne (THF) anhydre On a fait barboter durant plusieurs minutes de l'azote dans le THF du flacon Puis l'on a ajouté au THF, à l'aide d'une seringue sèche, 1 ml de bromure de vinylmagnésium, et l'on a purgé à l'azote la solution résultante. On a séparé, en la cassant à l'aide d'une pince, une extrémité du capillaire chloré, scellé, provenant de la section A du présent exemple, pendant que le tube capil- laire était immergé dans du THF anhydre On a placé rapi- dement l'extrémité ouverte ainsi formée dans la solution de bromure de vinylmagnésium/THF On a ensuite séparé en la cassant l'autre extrémité du capillaire que l'on a immédia- tement connectée à un conduit de dépression On a ainsi aspiré le bromure de vinylmagnésium/THF dans le capillaire, sous l'effet de la dépression On a fait passer par aspira- tion la solution dans le capillaire durant plusieurs minutes, après quoi on a scellé ou fermé de manière étanche, à l'aide d'un chalumeau au propane, l'extrémité du capillaire dans la solution, prés de la membrane d'obtura- tion du flacon On a ensuite placé le tube capillaire dans un bain de chauffage à 50 O C, et l'on a maintenu la dépres- sion (pression égale ou inférieure à 8 k Pa, 60 millitorrs) durant 30 min On a scellé l'autre extrémité du capillaire près de la connexion avec le conduit de dépression, et l'on a placé le capillaire ainsi scellé dans un bain de chauffage à 70 'C, durant 12 h. C Formation d'un revêtement en polyacrylamide On a cassé les extrémités du tube capillaire scellé, obtenu à la section B du présent exemple, et l'on a rincé durant plusieurs minutes, avec THF, le capillaire ainsi ouvert On a ensuite enlevé le THF et l'on a rincé le tube capillaire à l'eau distillée durant plusieurs minutes, après quoi on a enlevé l'eau. On a préparé une solution d'acrylamide en mélangeant 0,3 ml d'acrylamide à 10 %, 0,7 ml d'eau, 1 pl de TEMED et pi de persulfate d'ammonium à 10 %, et l'on a désaéré le mélange résultant On a ensuite empli le tube capillaire avec la solution Au bout de 30 min, on a enlevé l'excès d'acrylamide du capillaire, par rinçage à l'eau, ce qui a laissé une couche chimiquement liée d'acrylamide (polymérisé, mais non réticulé) sur les parois intérieures du capillaire. D Reproductibilité du traitement On a revêtu de polyacrylamide cinq capillaires, en opérant de la manière décrite ci-dessus On a ensuite soumis chacun de ces capillaires à des essais avec de l'a- lactalbumine, dans les conditions suivantes: tampon: glutamine 0,05 M, triéthylamine (p H 9,5); capillaire 50 iim de diamètre interne x 60 cm ( 45 cm jusqu'au détecteur); injection hydrodynamique; 5 S avec une différence de hauteur de 20 cm; champ appliqué; 20 k V, 15 li A, polarité négative (cathode à l'extrémité d'injection). On a déterminé pour chaque essai le nombre de plateaux théoriques, en utilisant la formule (premier moment)2 N = second moment formule dans laquelle N représente le nombre de plateaux théoriques On a ensuite déterminé les écarts types rela- tifs pour les deux temps de migration et le nombre de pla- teaux théoriques, et les deux valeurs obtenues ont été inférieures à 5 % pour les capillaires revêtus Pour les capillaires non revêtus, les écarts types relatifs ont été tous deux inférieurs à 3 %. Les exemples 2 et 3 mettent en évidence l'utilisa- tion de capillaires préparés selon le mode opératoire de l'exemple 1, et des comparaisons de ces capillaires avec des capillaires non revêtus. Voici l'équipement et les méthodes que l'on utilise dans les exemples 2 et 3. On a utilisé une source d'énergie à tension élec- trique élevée ( 0-30 k V), achetée chez Spellman High Voltage Electronics Corporation (Plainview, New-Jersey, Etats-Unis d'Amérique) On a effectué une détection avec un détecteur à absorptance d'ultraviolets à des longueurs d'onde variables ("UVIDEC-100-V", Jasco, Tokyo, Japon), appareil que l'on a fait fonctionner à 214 nm Les capillaires uti- lisés étaient des tubes capillaires en silice fondue (Polymicro Technologies, Phoenix, Arizona, Etats-Unis d'Amérique) présentant un diamètre interne de 50 pm et un diamètre externe de 187 pm On a formé dans chaque capil- laire une fenêtre optique en enlevant un petit tronçon du revêtement de polyacrylamide Les échantillons avaient un volume d'environ 1,2 nl, ce qui correspond à environ 240 pg d'une protéine individuelle On a introduit les échantil- lons par écoulement hydrodynamique, et l'on a calculé les volumes des échantillons en utilisant les temps connus d'injection et la vitesse mesurée de l'écoulement hydrody- namique, comme décrit par D J Rose et al, J Chromatogr. 438:23-34 ( 1988). On a soumis les capillaires non revêtus à des rin- çages successifs avec Na OH O,1 M et du tampon durant 2 min environ à chaque fois entre les essais, cependant que l'on a rincé par du tampon seulement, entre les essais, les capillaires revêtus On a conduit les essais pour un écou- lement électro-osmotique en utilisant de l'acétone (solu- tion aqueuse à 2 %) comme marqueur neutre On a conduit de tels essais aumoins deux fois par jour, ou bien lorsque cela a semblé nécessaire quand on a suivi les effets de divers systèmes de tampons sur le revêtement des capil- laires La collecte des données et résultats et les opéra- tions de traitement ont été effectuées sur un ordinateur individuel IBM. EXEMPLE 2 Séparations de protéines sous p H élevé A Effet du traitement d'une paroi sur la résolution On a effectué des séparations sur le mélange des protéines suivantes, à p H 9,5, en utilisant aussi bien des capillaires non revêtus que des capillaires revêtus selon la présente invention. TABLEAU 1 Mélange échantillon pour les figures l A et 1 B Protéine Poids Point moléculaire isoélectrique 1 Chaîne A d'insuline (de porc) 2 500 4,3 2 Sérum albumine (de bovin) 66 000 4,7 3 Ovalbumine (oeuf de poule) 45 000 4,7 4 Insuline (de porc) 6 000 5,4 a- lactalbumine (lait de bovin) 14 200 4,8 6 P-caséine (lait de bovin) 24 000 4,5 7 Chaîne B d'insuline (de porc) 3 500 7,6 Voici les conditions appliquées pour une séparation: tampon: glutamine 0,05 M, triéthylamine (p H 9,5); tube capillaire: diamètre interne: 50 pm x 60 cm ( 45 cm jusqu'au détecteur); injection: hydrodynamique; 5 S avec une différence de hauteur de 20 cm; champ appliqué: capillaires revêtus: 20 k V, 15 p A, polarité négative (cathode à l'extrémi- té d'injection); capillaires non revêtus: 10 k V, 7 p A, polarité positive (anode à l'extrémité d'injection) On note que la tension électrique appliquée pour les essais effectués avec des tubes capillaires revêtus a été nettement supérieure à la tension électrique appliquée lors d'essais avec des capillaires non revêtus Puisqu'il n'y avait pas d'écoulement électro-osmotique dans les essais effectués à l'aide de capillaires revêtus, la tension élec- trique plus élevée a servi à favoriser une migration plus rapide des protéines, dans leur traversée du capillaire, vers la cathode Dans les capillaires non revêtus, il s'est produit un fort écoulement ou courant électro-osmotique en direction de la cathode, et cela a constitué la force migratoire dominante exercée sur les ions de l'échantillon, cependant que la force d'électrophorèse s'exerçait dans la direction opposée, servant à séparer les ions et à réaliser la résolution limitée de pics que l'on pouvait obtenir Le résultat a été dans chaque cas une séparation optimisée. Les résultats obtenus sont présentés sur les figures l A et l B, qui montrent un tracé typique de détecteur, obtenu à l'aide d'un capillaire revêtu dans le cas de la figure la et un tracé obtenu à l'aide d'un capillaire non revêtu dans le cas de la figure lb, dans les conditions décrites ci-dessus L'identité de la protéine représentée par chaque pic est indiquée par un numéro, en concordance avec le tableau 1 ci- dessus Il ressort clairement d'une combinaison des deux tracés que le capillaire revêtu permet une séparation nettement améliorée. B Effet d'un traitement de paroi sur la reproductibilité du temps de migration En utilisant cinq essais pour les capillaires revêtus et cinq essais pour les capillaires non revêtus, on a déterminé l'écart type relatif du temps de migration de chacune des protéines Les résultats obtenus sont présentés au tableau II ci-dessous. TABLEAU II Ecarts-types pour le temps de migration % d'écarts types relatifs (n = 5) capillaire capillaire Protéine revêtu non revêtu Chaîne A d'insuline (de porc) 0,11 3,51 Sérum albumine (de bovin) 0,18 2,69 Ovalbumine (oeuf de poule) 0,19 3,03 Insuline (de porc) 0, 12 2,23 a-l-a;ctalbumine (lait de bovin) 0,32 2,56 P- caséine (lait de bovin) 0,25 1,93 Chaîne B d'insuline (de porc) 0,20 1,64 Comme les résultats présentés au tableau II l'indi- quent, le revêtement du capillaire, effectué selon la présente invention, crée une amélioration de la reproducti- bilité d'environ un ordre de grandeur, ce qui peut être attribué aux effets que l'écoulement ou le courant électro- osmotique et l'adsorption des analytes ont sur les temps de migration. Pour confirmer l'absence d'un écoulement électro- osmotique dans le capillaire revêtu, on a effectué, en opérant comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus, des essais d'écoulement électroosmotique, en utilisant de l'acétone comme marqueur neutre Dans un essai conduit après trois heures d'exposition aux conditions alcalines, avec réglage de l'alimentation en énergie à une polarité positive de 20 k V, le marqueur neutre n'est pas apparu au niveau du détecteur Le coefficient d'écoulement électro-osmotique, en m 2/V-s peut être déterminé par l'équation suivante, selon J W Jorgenson et al, J Chromatogr 53:1298-1302 ( 1981): L L tot sep pueo V'to équation dans laquelle 1 'eo = coefficient d'écoulement électro-osmotique Ltot = longueur totale du capillaire Lsep = longueur du capillaire de l'extrémité d'in- jection jusqu'au détecteur V = tension électrique appliquée t O = temps de migration du marqueur neutre. En appliquant cette équation, on a trouvé que l'écoulement électroosmotique mesuré dans le capillaire revêtu était, au bout de 3 h, inférieur à 1,25 x 10-9 m 2/V-s, cependant que l'écoulement se produisant dans le capillaire non revêtu était de 5,4 x 10-8 m 2/V-s. C Effet du traitement de paroi sur l'efficacité de la séparation et la forme d'un pic On a déterminé, en utilisant de l'a-lactalbumine et de l'albumine de bovin, le nombre des plateaux théoriques et la déformation ou l'obliquité des pics, dans le cas des capillaires revêtus et des capillaires non revêtus Les calculs de détermination de ces paramètres ont été effec- tués selon les méthodes décrites par J J Kirkland et al, J Chromatogr Sci 15:303-316 ( 1977), comme suit (N = nombre de plateaux théoriques): (premier moment)2 N = second moment troisième moment déformation de pic = (second moment)3/2 Les résultats obtenus sont énumérés au tableau III. TABLEAU III Décompte des tableaux théoriques et obliquité ou déformation de pics pour des protéines séparées à p H 9,5 Plateaux théoriques, Déformation de pics (a) par mètre Protéine Tension (k V) Courant (p A) Tube tube non revêtu revêtu tube tube non revêtu revêtu a-lactalbumine Albumine de bovin 293 000 251 000 *216 000 194 000 259 000 233 000 209 000 107 000 71 000 59 000 42 000 39 000 69 000 56 000 48 000 42 000 0,049 0,061 0,077 0,079 0,059 0,078 0,081 0,087 0,939 0,996 1,075 1,101 1,018 1,024 1,108 1,117 O (a) des valeurs de déformation de pics comprises entre O et 0,002 indiquent des pics gaussions parfaits Des valeurs de déformation de pics excédant 1,0 indiquent une forte formation de queues. K O M 4 Les résultats présentés au tableau III indiquent que le capillaire revêtu se comporte de manière supérieure à celle du capillaire non revêtu, aussi bien pour le nombre de plateaux théoriques que pour la déformation des pics En particulier, les valeurs correspondant à une déformation de pics dans le cas du capillaire revêtu indiquent très peu de présence de déformation par retard ou queue Cela indique que chaque adsorption de protéines qui se produit est réversible et qu'une mise en équilibre se produit à une vitesse rapide. Le tampon utilisé pour obtenir les résultats présentés sur les figures 2 A et 2 B a été le tampon de glu- tamine/triéthylamine précité Pour étudier des effets pos- sibles des constituants du tampon sur les efficacités ou rendements, on a utilisé, dans des essais parallèles, un tampon de borate (borate de sodium 0,05 M; p H 9,5) au lieu du tampon de glutamine/triéthylamine Le tampon de borate a donné des valeurs du nombre de plateaux théoriques et de déformations de pics qui étaient très semblables à celles obtenues, ou même légèrement meilleures que celles obtenues dans le cas du tampon de glutamine/triéthylamine, bien que la résolution, dans le cas de l'utilisation du tampon de borate, ait été moins satisfaisante La similarité des valeurs obtenues pour N (nombre de plateaux théoriques) et pour la déformation ou le retard ou queue de pic, constitue une indication que des interactions entre les protéines et les constituants du tampon ne sont pas une cause probable d'élargissement d'un pic Cela indique également que la triéthylamine n'a pas un rôle de masquage des groupes silanols résiduels du capillaire revêtu, et que la diminu- tion de la charge (électrique) en surface du capillaire résulte bien de la présence du revêtement polymère. D Stabilité à long terme Après quatre semaines d'utilisation en continu avec des tampons à p H 9,5 (le tampon étant remplacé par de l'eau durant la nuit), ce qui comprenait plus de 150 injections, des essais de détermination de l'écoulement ou du courant électro-osmotique ont indiqué que cet écoulement électro- osmotique n'était pas revenu à un niveau mesurable et que les temps de migration des protéines demeuraient constants d'un jour à l'autre, avec un écart-type relatif inférieur à 2 %,0 pour une période de cinq j ours Cela a indiqué que la matière du revêtement est demeurée intacte et que les parois des capillaires ont conservé leur caractère neutre pendant ce temps. En outre, on a exposé les parois des capillaires à des tampons à p H 10,5 durant cinq jours, sans observer de signes de détérioration du revêtement des capillaires Une détérioration du revêtement a cependant été provoquée par deux jours de rétention d'un tampon à p H 11 dans le capil- laire, temps au bout duquel un essai de détermination de l'écoulement du courant électro-osmotique a indiqué un coefficient de courant électro-osmotique de 6,8 x 10-9 m 2/V-s Cette valeur, tout en étant considéra- blement inférieure à celle mesurée dans le capillaire non revêtu, constitue une indication du fait que le revêtement de polyacrylamide a été partiellement enlevé, ce qui a provoqué la mise à nu ou l'exposition de groupes silanols libres à la surface du capillaire. EXEMPLE 3 Séparations de protéines à faible p H A Effet du traitement de paroi sur la résolution Des séparations à faible p H sont particulièrement utiles lorsqu'on est en présence de protéines très basiques, comme celles ayant des points isoélectriques supérieurs à 10,0 La séparation de telles protéines, sous forme d'anions, exigerait un tampon à un p H de l'ordre de 11-12 Cela n'est pas pratique à réaliser en termes de stabilité de capillaire ou, dans de nombreux cas, aussi, en termes de la stabilité des constituants de l'échantillon. Cependant, à un faible p H, les protéines peuvent acquérir une charge positive et migrer vers la cathode. Pour vérifier des séparations de protéines basiques à faible p H, on a utilisé le mélange suivant de protéines: TABLEAU IV Mélange d'échantillons pour les figures 2 A et 2 B Protéine Poids molé Point iso- culaire électrique 11 Cytochrome C (coeur de cheval) 12 400 10,7 12 Lysozyne (blanc d'oeuf de poule) 14 100 11,1 13 Trypsine (pancréas de bovin) 24 000 10,1 14 Trypsinogène (pancréas de bovin) 23 700 8,7 Inhibiteur de trypsine (soja) 20 100 4,5 Les conditions appliquées pour la séparation étaient les suivantes: tampon: acide citrique 0,03 M (p H 2,7; ajusté avec Na OH 1 M); capillaire: diamètre interne: 50 pm x 60 cm ( 45 cm jusqu'au détecteur); injection: hydrodynamique; 5 S avec une différence de hauteur de 20 cm; champ appliqué: pour les capillaires revêtus k V, 10 p A; pour les capillaires non revêtus 12 k V, 5 p A, polarité positive dans les deux cas. Comme dans le cas des expériences à p H élevé, on a utilisé une tension électrique plus élevée pour le capil- laire revêtu, afin d'accélérer la séparation. Les résultats obtenus sont présentés sur les figures 2 A et 2 B, qui montrent un tracé typique de détecteurs, obtenu dans le cas d'un capillaire revêtu pour la figure 2 A et un tracé obtenu dans le cas d'un capillaire non revêtu pour la figure 2 B, en opérant dans les conditions décrites ci-dessus L'identité de la protéine représentée par chaque pic est indiquée par son numéro, en conformité avec le tableau IV ci-dessus. Il ressort clairement d'une comparaison des deux tracés que le capillaire revêtu fournit une séparation nettement améliorée, dans des conditions de fonctionnement à faible p H aussi bien qu'à p H élevé Dans ce cas égale- ment, on n'a pas pu déceler de courant ou d'écoulement électro-osmotique dans le cas du capillaire revêtu. Le coefficient de courant électro-osmotique a été, dans le capillaire non revêtu, et en effectuant un calcul selon la formule indiquée ci- dessus, de 2,4 x 10 _ 8 m 2/V-s, ce qui représente une valeur environ deux fois plus lente que celle apparaissant dans le capillaire non revêtu de l'exemple 2 ci-dessus à p H 9,5 Malgré cette diminution du courant électro-osmotique et un plus long temps de sépara- tion, la résolution, dans le cas du capillaire non revêtu, a encore été inférieure à celle obtenue dans le capillaire revêtu En outre, la meilleure forme de pic obtenue avec le capillaire revêtu indique une diminution d'interaction électrostatique entre les protéines et les parois du capil- laire revêtu. B Effet du traitement de paroi sur la reproductibilité du temps de migration En utilisant cinq essais pour un capillaire revêtu et cinq essais pour un capillaire non revêtu, on a déter- miné l'écart type relatif du temps de migration pour chacune des protéines Les résultats obtenus sont présentés au tableau V ci-après. TABLEAU V Ecarts-types pour le temps de migration % d'écarts-types relatifs (n = 5) Protéine Capillaire Capillaire revêtu non revêtu Cytochrome C (coeur de cheval) 0,21 1,84 Lysozyme (blanc d'oeuf de poule) 0,24 2,13 Trypsine (pancréas de bovin) 0,28 2,36 Trypsinogène (pancréas de bovin) 0,31 2,84 Inhibiteur de trypsine (soja) 0,25 3,12 Dans ce cas également, les résultats présentés sur le tableau indiquent que le revêtement du capillaire, effectué selon la présente invention, a pour résultat d'améliorer la reproductibilité d'environ un ordre d'amplitude. C Effet du traitement de la paroi sur l'efficacité d'une séparation et la forme des pics On a déterminé, en utilisant des cytochromes C et du trypsinogène, le nombre de plateaux théoriques et la défor- mation du pic, dans le cas de capillaires revêtus et dans le cas de capillaires non revêtus. Les résultats obtenus sont représentés au tableau VI. TABLEAU VI Nombre de plateaux théoriques et déformations de pics pour des protéines séparées à p H 9,5 Plateaux théoriques, Déformation de pics (a) par mètre Protéine Tension (k V) Courant (p A) Tube tube non revêtu revêtu tube tube non revêtu revêtu Cytochrome C Trypsogène 317 000 298 000 235 000 194 000 297 000 276 000 220 000 187 000 76 000 62 000 54 000 51 000 73 000 63 000 59 000 000 0,041 0,057 0,071 0,077 0,035 0,049 0,063 0,079 1,006 1,027 1,116 1, 127 0,904 0,930 1,018 1,079 en Les résultats présentés au tableau VI indiquent cette fois encore que l'on observe un bien plus grand nombre de plateaux théoriques dans le cas du capillaire revêtu que dans le cas du capillaire non revêtu, et les valeurs concernant la déformation des pics dans le capil- laire revêtu n'indiquent qu'une légère formation de queue ou un léger retard, en comparaison d'un fort retard ou d'une forte formation de queue dans le cas du capillaire non revêtu. D Stabilité à long terme On a utilisé durant deux semaines à p H 2,7 un capil- laire revêtu, sans noter de signe de détérioration, comme on peut en déceler par des essais quotidiens de courant ou écoulement électroosmotique On a ensuite utilisé le capillaire à p H 2,0 durant une semaine, sans constater de courant électro-osmotique mesurable Les meilleures sépara- tions ont été obtenues à p H 2,7. REVENDICATIONS 1 Procédé pour traiter une surface solide, portant des groupes silanols exposés, afin de diminuer la présence de charges électrostatiques sur ces groupes, procédé carac- térisé en ce qu'il comprend les opérations consistant à: (a) traiter ladite surface pour transformer les groupes silanols exposés en des groupes halogénure de silicium; (b) faire réagir ladite surface, ainsi traitée, avec un composé organo-métallique qui comprend un groupe R ali- phatique contenant un fragment éthényle terminal, pour convertir les groupes halogénures de silicium en des groupes Si-R avec conservation de ladite liaison éthényle terminale; et (c) faire réagir ces groupes Si-R avec un composé ou une espèce organique neutre, capable de subir une polyméri- sation par addition sur le groupe éthényle terminal pour former une couche polymère, fixée ou liée par covalence à ladite surface. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé ou l'espèce neutre que l'on utilise à l'étape (c) est un composé monomère choisi parmi des acry- lates, l'acrylamide, des acrylamides substitués, et des éthylènes à substituant(s) alkyle(s), -aryle(s) et halogéno. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé ou l'espèce neutre que l'on utilise à l'étape (c) est I'acrylamide. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé organométallique est choisi dans l'ensemble constitué par R-Li et R-Mg-X, -formules dans lesquelles X représente un atome d'halogène et R représente le groupe éthényle. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé organométallique a pour formule R-Mg-X, dans laquelle R représente un groupe éthényle, et X repré- sente un halogène, qui est un ion chlorure ou bromure. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'halogénure des groupes halogénures de silicium de l'étape (a) est choisi parmi un anion chlorure et un anion bromure. 7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (a) comprend le traitement de la surface par du chlorure de thionyle, pour convertir les groupes sila- nols exposés en des groupes chlorures de silicium. 8 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la surface solide que l'on traite est une surface en silice fondue. 9 Application du procédé selon la revendication 1 au revêtement, par un polymère organique, de la surface interne d'un tube capillaire en un matériau contenant de la silice. Procédé pour séparer un mélange de protéines, dans un échantillon liquide, en des constituants, procédé caractérisé en ce qu'il comprend le passage dudit échantil- lon dans un tube capillaire en un matériau contenant de la silice, ledit capillaire ayant été revêtu, par application selon la revendication 9 du procédé de la revendication 1, ce passage étant conduit dans des conditions favorisant une séparation par électrophorèse desdites protéines dans ce tube capillaire dont la paroi interne est revêtue d'une couche de polyacrylamide fixée ou liée par covalence, au matériau contenant de la silice, par des liaisons reliant les atomes de Si du tube capillaire directement à des atomes de C du polyacrylamide.