FR 2663540 A1 19911227 FR 9107840 A 19910621 La présente invention concerne le traitement de maladies résultant de hauts niveaux de formation d'oxalate endogène et, en particulier, le traitement de calculs rénaux et la goutte. L'oxalate de calcium, avec des variations variables de phosphate de calcium, est le facteur majeur dans 70 % de tous les calculs rénaux dans les pays riches ( 1-3) Depuis de nombreuses années, on a considéré que l'oxalate urinaire prove- nait largement de l'oxalate qui est naturellement présent dans les aliments et qui est absorbé à partir du ventre ( 1). Cependant, avec l'exception possible de patients qui ont des syndromes relatifs à des maladies et/ou de raccourcissement de l'intestin provoqué par la chirurgie, seuls 2 à 8 % des 1,0 à 1,5 mmoles d'oxalate ingérées journellement sont absorbées par l'intestin Si tout cet oxalate absorbé était éliminé dans l'urine, il ne compterait que pour 10 à 15 % de l'oxalate sortant urinaire quotidien de 0,16 à 0,56 mmol par jour chez l'humain ( 4) Bien qu'il y ait encore des controverses sur la contribution exacte de la production endogène sur l'excrétion totale d'oxalate urinaire, il ne fait aucun doute que la production endogène d'oxalate est un des facteurs qui contribue à l'hyperoxalurie vue chez beaucoup de patients avec des calculs d'oxalate de calcium iodiopathique ( 5) En conséquence, si on peut contrôler la production endogène d'oxalate, on peut inhiber ou empêcher la formation de calculs d'oxalate de calcium. Les études ont montré que la production d'oxalate, prove- nant d'une variété de sources d'aliments, peut être contrôlée par le cheminement commun suivant lequel le glycolate et le glyoxyla- te (les précurseurs immédiats de l'oxalate) sont métabolisés Les réactions impliquées sont communes à tous les cheminements proposés de formation d'oxalate et le contrôle de ces réactions apparaîtrait important dans la régulation de la formation d'oxa- late On a suggéré que l'inhibition d'un ou de plusieurs enzymes catalysant ces réactions peut avoir un rôle thérapeuthi- que dans la réduction des maladies par calculs rénaux ( 6). Cependant, le travail a indiqué qu'il restait des doutes sur le fait qu'inhiber ces enzymes clés pouvait être -considéré comme un mécanisme réaliste pour empêcher la formation d'oxalate ( 7). Dans un autre effort pour limiter la production endogène d'oxala- te, on a étudié les réactions qui écartent le glyoxylate de la production d'oxalate Le glyoxylate est un composé très réactif qui peut participer à de nombreuses réactions dans les tissus des mammifères ( 1) Parmi les réactions qui écartent le glyoxyla- te de la production d'oxalate, les deux plus importantes sont la décarboxylation et la transamination La décarboxylation du glyoxylate est catalysée par le carboligase 2-oxoglutarate: glyo- xylate dans lequel le 2-oxoglutarate et le glyoxylate sont décarboxylés par synergie La réaction a lieu dans les mitochon- dries et est associée au complexe multienzyme déhydrogènase 2oxoglutarate La transamination du glyoxylate vers la glycine est catalysée par un certain nombre d'enzymes péroxisomales avec beaucoup d'acides aminés agissant comme le donneur aminé. La transamination par l'aminotransférase alanine-glyoxylate (EC 2.6 1 44) est la plus importante de ces réactions et on a montré qu'une déficience de cette enzyme dans le foie humain était la cause sous-jacente de l'hyperoxalurie ( 8) En utilisant des hépatocytes de rat isolés, on a trouvé que, comparées à la transamination alanine-glyoxylate, la plupart des autres réactions de transamination n'avait pas d'effet significatif sur la formation d'oxalate à partir de glyoxylate, sauf certains composés sulfydryles (en particulier, la cystéine)) et des dérivés de cystéine qui entraînait une réduction sensible de la formation d'oxalate L'examen des produits de réaction de la cystéine avec le glyoxylate, en utilisant la chromatographie sur papier, a montré qu'outre le produit de transamination normal, la glycine, il se formait un autre produit stable On a supposé que ce produit pouvait être un ajout de glyoxylate-cystéine, qui empê- chait le glyoxylate d'être encore oxydé en oxalate. Suivant la présente invention, il est prévu une composition pharmaceutique ou vétérinaire, pour le traitement ou la préven- tion de maladies résultant de défauts d'excrétion d'oxalate, comprenant un composé sulfhydryle (en particulier, la cystéine) ou un dérivé de la cystéine, dans un véhicule pharmaceutique convenable. Suivant un autre aspect de l'invention, il est prévu une méthode de traitement ou de prévention de maladies résultant de défauts d'excrétion d'oxalate, comprenant l'administration d'un composé sulfhydryle (en particulier, la cystéine) ou d'un dérivé de la cystéine, soit par lui-même, soit sous la forme d'une composition pharmaceutique ou vétérinaire (comme décrit ci-après). Les composés utilisés dans la présente invention sont des composés sulfhydryles comme la cystéine, le dithiothreitol et le glutathione; des agents libérant de la cystéine, comme la N-acé- tyl-cystéine, la cystéinyl-glycine et le 2-oxothiazolidine-4-carboxylate; et d'autres dérivés de cystéine, comme la cystéamine et la pénicillamine Des composés préférés sont la cystéine (en particulier), la cystéamine et le 2-oxothiazolidine-4-carboxylate. Quand on peut les appliquer, les deux isomères D et L sont à inclure dans la portée de l'invention (par exemple,la cystéine D- et L-, et ses dérivés). Le composé sulfhydryle ou le dérivé de cystéine inhibe la formation endogène d'oxalate et est donc efficace dans le traite- ment ou la prévention de ces désordres comme les calculs rénaux et la goutte. TESTS PHARMACOLOGIQUES MATIERES ET METHODES Matières On a acheté l,-14 Cl -glyoxylate chez Amersham, Sydney, NSW, Australie La cystéine et le 2-mercaptoéthanol venaient de Sigma Chemical Co, Mo, USA, la N-acétyl-cystéine, le dithiothreitol et le glutathione de Boehringer-Mannheim, North Ryde, NSW, Australie, et le thioglycolate de Ajax Chemicals, Adélaide, SA, Australie Le captopril ( 1 ( 2 S)-3 mercapto-2-méthyl- propionyl -L-proline) est un agent antihypertenseur de E R. Squibb et Sons Pty Ltd, Melbourne, VIC, Australie Les sources de tous les autres produits chimiques et réactifs ont été décrites antérieurement ( 7, 9, 10). Méthodes Les préparations d'homogénates de foie de rat ( 10) et d'hépatocytes ( 7) ont déjà été décrites. Pour la préparation d'homogénates de foie de rat, le foie était rincé dans une solution de sel refroidi dans de la glace pour enlever le sang, coupé en tranches fines et placé dans deux volumes d'un tampon au phosphate de sodium à 10 mmol/l refroidi dans de la glace, avec un p H de 7,4, contenant 0,15 mol/1 de KCL et 0,8 mmol/l de Mg C 12 L'homogénate était alors préparé avec une coup de pilon en Téflon (marque déposée) dans un homogénéiseur de Patter-Elvehjem et filtré à travers une couche de mousseline Les hépatocytes isolés étaient préparés à partir de rats Porton mâles alimentés ( 250 à 350 gm) par la perfusion de collagénase des foies Les cellules étaient diluées dans un tampon de phosphate de sodium à 10 mmol/l, avec un p H de 7,4, contenant 140 mmol/l de chlorure de sodium, 5,4 mmol/l de K Cl et une mmol/l de Mg SO 4 et à travers lequel 100 % de 02 avaient fait des bulles pendant 10 min La viabilité des cellules était de 85 à 95 %, comme estimée par l'exclusion de Trypan Blue Des cellules ont été examinées à une concentration de 107 cellules/ml Dans les études avec des homogénates et des hépato- cytes, on a mis en oeuvre des réactions dans des fioles en verre à scintillation qui étaient balayées par de l'oxygène, bouchées et incubées pendant 30 min à 37 C dans un bain d'eau en étant secouées alternativement Dans ces réactions, les deux réactifs glyoxylate et sufhydryle ont été testés à une concentration de cinq mmol/l A la fin de l'incubation, le 14 C 02 produit à partir de,l-14 CJ-glyoxylate a été recueilli dans de l'hydroxyde Hyami- ne par incubation pendant 2 heures, puis la fiole d'incubation examinée pour le 14 C-oxalate en ajoutant 0,1 ml de 0,4 mol/l d'acide citrique, avec un p H de 4,5, contenant 0,4 unités de décarboxylase d'oxalate (EC 4 1 1 2) par ml, et en déterminant le 14 C 02 libéré L'oxalate urinaire a été mesuré en utilisant une méthode d'oxidase d'oxalate immobilisé et des analyses biochimi- ques de plasma déterminés en utilisant un Technicon SMAC Il. Pour les études in vivo, on a logé des rats dans des cages par groupes de quatre ou cinq La prise ad libitum de nourritu- re et de fluide était mesurée quotidiennement, comme le poids de corps de chaque rat Pendant la collecte d'urine de 24 heures, on a placé les rats dans des cages métaboliques individuelles et l'urine recueillie dans 0,5 ml de 5 mol/l d'H Cl. Des rats ont été rendus hyperoxaluriques en administrant soit 0,25 % (v/v) , soit 0,75 % (v/v) de glycol d'éthylène dans leur eau de boisson ( 11, 12) On a donné aux rats traités à la cystéine journellement des injections intrapéritonéales de 2 ml de cystéine à 10 % (W:V) dans une solution salée physiologique On a injecté aux groupes non traités 2 ml de solution salée. RESULTATS I Effet des composés sulfhydryles sur CO 2 et production d'oxalate L'effet des composés sulfhydryles sur CO 2 et la production d'oxalate à partir de glyoxylate par des homogénates et des hépatocytes est montré dans le Tableau 1 ci-dessous Tous des composés testés ont quelques effets inhibiteurs sur la forma- tion de CO 2 par des homogènates, la plus grande inhibition par addition de cystéine Dans les études de formation de CO 2 par des hépatocytes, seules la cystéine et la cystéine N-acétyle ont entraîné une inhibition sensible. Les composés sulfhydryles, dithiothreitol, 2-mercaptoéthanol, glutathione et captopril, inhibaient la formation d'oxalate par homogènates à des degrés divers, mais la cystéine entraînait une inhibition supérieure à 50 % Avec les hépatocytes, tous les composés du type cystéine inhibaient la production d'oxalate, tandis que le glutathione n'avait aucun effet L'inhibiteur le plus significatif était la cystéine qui produit presque la totale inhibition de production d'oxalate Aucun de ces composés n'a d'effet sur la période d'incubation, sur la viabilité des hépatocy- tes, comme déterminé par l'exclusion de Trypan Blue. Tableau 1 Effet des composés sulfhydryles sur la production de CO 2 et la formation d'oxalate Homogenate Heocatocyt-es CO Oxalaa Composé CO 2 Oxalae (% Activité résiduel) cvszeine 19 7 _ 8 0 47 3 _ 15 8 N-acetyl cvsteine 76 O 17 1 101 3 6 9 doithiochzeitol 53 O 5 4 74 7 13 8 glu- athice 88 3 9 1 103 7 6 0 thioglycolate 69 0 _ 11 3 94 7 11 1 2- mercaptoethanol 57 O 4 1 64 7 7 3 captopri 59 7 9 9 81 3 4 O CO 2 11.7 6 5 27.0 _ 9 3 99.7 _ 23 O 93.0 9 1 91.3 13 8 112 7 + 21 5 86.7 _ 17 5 Oxalate 4. 7.3 _ 10 4 69.5 _ 5 5 55.0 17 9 99.7 -_ 17 2 44.0 t 9 9 67.0 _ 25 7 65.3 _ 9 O r - On a montré les résultats (moyenne + ou SD) par rapport au contrôle sans addition, et pour 3 différentes préparations d'homogénate et d'hépatocyte qui ont été essayées en double. La production contrôlée de CO 2 a été de 0,043 pmol/min/gm de poids humide par des homogénates et de 0,015 umol/min/107 dans des hépatocytes, et la production d'oxalate de 0,025 pmol/min/gm de poids humide par des homogénates et de 0,016 pjmol/min/107 cellules dans des hépatocytes. Différant significativement des contrôles: p Il Effet de la concentration de cystéine in vitro Comme la plus cohérente et la plus grande inhibition de la production d'oxalate par ces composés sulfhydryles était obtenue avec la cystéine, on a examiné l'effet de faire varier la concentration de cystéine sur la production de CO 2 et sur la formation d 'oxalate par les hépatocytes (Fig 1) Quand la concentration en cystéine augmente, il y a décroissance dans à la fois la production de C 02 et la formation d'oxalate La viabilité des hépatocytes, mesurée par l'exclusion de Trypan Blue, n'était pas affectée par ces concentrations en cystéine. III Effet de la cystéine in vivo L'hyperoxalurie était induite dans les rats en leur administrant 0,25 % ou 0,75 % de glycol d'éthylène dans leur eau de boisson ( 13, 14) Initiale- ment, la cystéine était aussi mise dans l'eau, mais on a trouvé que les rats n'aimaient pas le goût, et donc la cystéine était administrée par injection intrapéritonéale quotidienne Un groupe de contrôle, qui ne recevait pas de glycol d'éthylène, recevait par injection de la cystéine seule Il n'y avait pas de différence significative statistiquement dans les prises de nourri- ture, les poids de corps et la prises de glycol d'éthylène entre les groupes à solution salée et le groupe traité à la cystéine (déterminée par analyse de variance) Les rats n'ont pas augmenté leurs poids de corps pendant la durée de l'expérimenta- tion, mais l'augmentation était la même pour tous les groupes A l'autopsie, il n'y avait pas de différence de taille, ni d'appa- rence des reins et des foies des divers groupes De -lus, à la dissection, les reins apparaissaient macroscopiquement normaux et aucun calcul ne fut détecté Au contraire, quand la concentra- tion de glycol d'éthylène passait à 1 %, il y avait une augmentation significative dans le dépôt de cristaux visibles ( 12) Des analyses biochimiques du plasma collecté à la fin des traitements ne montraient pas de changements significatifs dans les électrolytes, la créatinine, le glucose, l'acide urique, le calciul ou le phosphate dans aucun des trois groupes. La différence majeure entre les groupes était l'effet de l'administration de cystéine sur l'excrétion d'oxalate des ani- maux traités au glycol d'éthylène On a montré à la Fig 2 uniquement les résultats pour les rats traités au glycol d'éthylè- ne à 0,75 % Les résultats pour ceux traités au glycol d'éthylène à 0,25 % sont semblables, sauf que le niveau d'excrétion urinaire d'oxalate était environ la moitié de celle des rats traités au glycol d'éthylène à 0,75 % Dans les deux cas, on a une drastique réduction d'excrétion d'oxalate étant donné le traitement à la cystéine chez les rats traités au glycol d'éthylè- ne Cette réduction d'excrétion d'oxalate arrive rapidement et est maintenue pendant la durée des expérimentations. On a obtenu des résultats semblables avec des rats rendus hyperoxaluriques par injection de glycolate ou de glyoxylate On leur a aussi injecté de l'eau salée ou de la cystétine et on a mesuré l'excrétion urinaire d'oxalate Il fallait l'injection intra- péritonéale de cystéine car les rats ne toléraient pas la cystéine dans leur eau de boisson Le traitement des rats avec le glycolate ou le glyoxylate entraîne une augmentation supérieure à 3 fois d'excrétion urinaire d'oxalate Cependant, en présence de cystéine, l'excrétion urinaire d'oxalate diminue de 3 à 4 fois dans les trois groupes (Tableau 2). Taleau 2 Les effets de la cystéine sur la formation d'oxalate in vivo Substrate Cystéine Oxalate Inhibition u M/jour aucun additif 6 8 + 4 5 + 2 9 _ 0 5 57 6 Glycolate 25 8 7 3 + 9 9 1 6 61 7 Glyoxylate 22 2 _ 2 3 t 5 4 _ 3 0 75 7 Les résultats d'oxalate sont donnés comme moyenne + SD (n = 8) p 40 001 - Administration orale On a vu une réduction appréciable d'excrétion normal d'oxalate quand les rats sont d'abord mis dans des cages métaboliques, quand ils s'adaptent à leur environnement nouveau et au régime d'alimentation Cette réduction arrive pendant les 2 premiers jours après lesquels l'excrétion d'oxalate s'est stabili- sée Donc, les changements dans l'oxalate urinaire comme résul- tat de l'administration de sulfhydryle sont pris à partir du jour 2, étant donné que les rats varient pendant la période de réglage initiale On a montré les résultats à la Fig 3. Seules les doses orales de L-oxothiazolidine-4-carboxylate (L-OTC) et de L-cystéine avaient un effet significatif sur l'excré- tion d'oxalate chez les rats en diètes normales Pendant les 2 premiers jours de diète en supplément à la L-OTC, les rats n'ont pas montré de changement significatif en oxalate urilaire Au troisième jour du traitement à la L-OTC (jour 5), les excrétions- urinaires d'oxalate étaient réduites sensiblement, un effet qui était aussi observé au dernier jour du traitement OTC Quand les rats sont revenus à une diète normale au jour 7 de l'expérimenta- tion, l'excrétion sur 24 heures d'oxalate augmentait et au jour 8 était sensiblement supérieure aux contrôles. Les résultats avec les rats traités à la L-cystéine étaient semblables à ceux traités au L-OTC Les 3 premiers jours du traitement à la L-cystéine n'affectaient pas l'excrétion d'oxalate des rats, mais au quatrième jour du traitement (jour 6) l'oxalate urinaire était réduit de 2,22 >mol/24 hrs Quand on a supprimé à ces rats le supplément de cystéine, on a eu encore un effet de rebondissement, l'excrétion urinaire d'oxalate augmentant à des niveaux sensiblement supérieurs à ceux du groupe de contrôle. La cystéamine et la N-acétylcystéine n'ont pas d'effet sensible sur l'oxalate urinaire en 24 heures. Ces études et d'autres chez les poulets ont montré que L-OTC est d'un goût agréable et est un précurseur stable de la cystéine qui est utilisée effectivement, indépendamment des erre- ments d'administration. IV Etudes de transamination On a mesuré la transamination du glyoxylate par radiochi- mie et la formation de l 14 Cl-glycine à partir de l 1-14 Cj C-glyoxy- late ( 15) Après incubation, on ajoutait en excès du peroxyde d'hydrogène pour oxyder le Il-14 Cl-glyoxylate en 14 C 02, suivi d'additon d'acide perchlorique pour enlever le 14 CO 2 La quanti- té du produit stable acide est une mesure de la transamination. Chromatographie papier Les produits de la réaction de transamination étaient examinés par chromatographie papier Après incubation, on arrê- tait la réaction par addition d'acide perchlorique, puis on centrifugeait à 5000 g pendant 5 min 30 pjl de surnageant qui était marqué sur le papier chromatographique no 4 de Whatman et on développait le chromatograme en utilisant du phénol dans de l'eau à saturation comme solvant Après une marche pendant 9 h, le papier était séché à l'air, puis pulvérisé avec de la ninhydrine ( 0,25 % dans de l'acétone) pour trouver les acides aminés Avec ce système, les valeurs Rf étaient glycine, 0,54; alanine, 0,68; cystéine, 0,43 et glutamate, 0,41 De plus, le chromatograme était coupé en bandes de 1 cm et on déterminait la radioactivité. Réactions de transamination avec le glyoxylate la transamination au glyoxylate avec divers acides aminés a été mesurée en homogènates en déterminant les produits stables acides après avoir arrêter la réaction avec du péroxyde d'hydro- gène On a montré dans la tableau 3 les résultats relatifs à l'alanine, qui est l'acide aminé le plus actif dans cette réaction de transamination. Tabeau 3 Réactions de transamination d'homogènate de foie de rat avec du glyoxylate Acide Aminé Rapport Acide Amine * d'activité d'activité Alanine 100 Serine 15 0 + 8 2 Acide Glutamique 53 1 + 14 3 Tryptophan 3 2 + 2 4 Methionine 38 9 + 6 2 Isoleucine 5 9 + 3 6 Phetnylalanine35 5 + 10 8 Valine 2 6 + 0 4 Glutamine 49 0 + 12 5 Hydroxyproline 3 4 + 2 2 Histidine 21 1 + 12 2 Proline 0 6 + 1 0 Leucine 26 3 + 8 9 Threonine 5 0 + 2 0 Asparagine 33 6 + 6 9 Tyrosine 9 0 _+ 8 2 Acide Aspartique 11 2 + 3 7 Glycine 2 3 + 1 9 Arginine 6 7 + 3 0 Cystéine 93 0 + 7 1 Lysine 3 0 _+ 4 0 L.es résultats (moyenne _+ SD:n = 4) sont par rapport à la transamination alamine: glyoxylate Plusieurs des acides aminés testés formaient des produits stables acides, mais la réaction la plus significative et la moins attendue était avec la cystéine, qui apparaissait aussi active que l'alanine. L'effet de la transamination sur la production de CO 2 et d'oxalate à partir de glyoxylate a été étudié en hépatocytes en incubant 1 m M de glyoxylate en présence de 20 m M d'acide aminé Les résultats de CO 2 et d'oxalate sont montrés à la Fig. 4 relatifs au contrôle sans addition d'acide aminé La production de CO 2 a varié entre 80 et 120 % du contrôle, sauf pour l'alanine qui augmentait la production de C 02 jusqu'à 160 % du contrôle et la cystéine qui la réduisait à 25 % De plus, bien que la plupart des acides aminés n'ont que peu d'effet sur la production d'oxalate, la cystéine causait une inhibition de 80 %. Pour encore examiner cet effet inhibiteur de la cystéine, on a étudié les produits de la réaction de transamination entre le glyoxylate et la cystéine Après incubations des hépatocytes avec les réactifs, on a séparé les produits par la chromatographie papier On a pulvérisé le chromatograme avec de la ninhydrine pour déterminer la position des acides aminés, et, simultanément, on a déterminé le lieu de la radioactivité Les résultats montrent (Fig 5) que, dans toutes ces réactions, il y a eu un point de glyoxylate radioactif non réactif De plus, avec l'alanine et la cystéine, il y a eu des comptes qui correspondent au point de la glycine qui est le produit espéré de la réaction Cependant, en présence de cystéine, il y a un point extra radioactif qui est unique pour la cystéine et qui n'a pas été trouvé pour d'autres acides aminés. DISCUSSION ET CONCLUSIONS On a montré que la cystéine et un certain nombre de ses dérivés inhibaient les formations de CO 2 et d'oxalate par les homogènates et les hépatocytes de foies de rats Il est possible que ces composés inhibent les enzymes clés régulateurs, l'oxyda- se de glycolate et la déhydrogènase de glycolate L'inhibition la plus significative survient avec la cystéine et ceci est fonction de la concentration A des concentrations assez élevées, la cystéine empêche complètement la formation d'oxalate dans les hépatocytes (Fig 1). L'hyperoxalurie est l'un des facteurs de risques majeurs pour la formation de calculs urinaires d'oxalate de calcium ( 16) et des changements mineurs dans la concentration d'oxalate urinaire ont une plus importante action déterminante sur la supersaturation en oxalate de calcium urinaire que le calcium urinaire Bien qu'on ait questionné l'utilisation de glycol d'éthy- lène donné à des rats comme modèle pour l'hyperoxalurie en ces moments là, on considère encore que c'est le modèle le plus approprié ( 11, 12) Avec les concentrations de glycol d'éthylène qui furent utilisées ( 0,25 % et 0,75 %), il n'y a pas eu de changements différents dans l'apparence et la taille des reins et des foies de l'un des groupes traités par rapport aux groupes non traités. Le traitement à la cystéine des rats hyperoxaluriques a entraîné et marqué une réduction de la durée du traitement ( 28 jours) Sur cette période, le niveau d'excrétion d'oxalate urinai- re de ces rats traités) l'éthylène approchait celle des contrôles. On a aussi pu montrer que les rats ayant reçu des injections de glycolate et de glyoxylate avaient réduit leur excrétion d'oxalate quand on leur appliquait des injections de cystéine Un examen des produits de réaction de transamination entre la cystéine et le glyoxylate a montré qu'un autre produit, outre la glycine, se formait Bien qu'on ne désire pas être lié par des spéculations préliminaires, il est probable que cet autre composé est un ajout de cystéine-glyoxylate qui a déjà été décrit ( 13, 14). Ho\ O coo SH S CH CH c + CH 2 CH CHCOO O COOH-CH NH 2 HOOC N H glyoxylate cysteine Ajout 2-carboxy-4-thiazolidine carboxylate Il se peut que la réduction de production d'oxalate était due à la formation de l'additif empêchant le glyoxylate d'être encore métabolisé en oxalate Les résultats présents sont aussi cohérents avec l'explication, car le métabolisme du glycol d'éthy- lène en oxalate se fait par l'intermédiaire du glyoxylate qui permettrait à l'additif de se former ( 17) Une autre preuve de la formation de l'additif est que la réduction de formation de C 02 suggère que le métabolisme normal du glycol d'éthylène a été empêché d'arriver L'important de ces observations est qu'elles démontrent qu'on peut limiter la production d'oxalate métabolique et indiquent que la cystéine et d'autres composés similaires ont un potentiel comme agent thérapeutique pour empêcher les calculs rénaux. Le glyoxylate forme des additifs avec un certain nombre de nucéophiles, comprenant les thiols, les amines primaires et les alcools ( 14) L'additif initial formé par l'addition de tout nucléophile au glyoxylate est un acide-hydroxy, mais beaucoup d'entre eux peuvent alors réagir encore pour former d'autres composés (y compris des structures cycliques stables) A un p H neutre et à 370 C, le temps nécessaire pour former ces additifs est de l'ordre de quelques secondes au moins, à quelques minutes La formation est favorisée pour les thiols d'environ un ordre de grandeur par rapport aux amines et de trois ordres de grandeur supérieur à celui pour les alcools Dans ces travaux sur les additifs de glyoxylate, Hamilton suggère qu'ils sont les vrais substrats physiologiques de diverses oxydases peroxysoma- les, comme l'oxydale acide D-amino, l'oxydale D-aspartate et l'oxydase acide L-hydroxy, et qu'à la fin les produits enzymati- ques s'hydrolysent pour former l'oxalate ( 14) Cependant, les produits enzymatiques sont stables à l'hydrolyse non enzymatique sous conditions physiologiques pendant de nombreux jours, et les enzymes nécessaires pour catalyser ces réactions N 'ont pas été trouvés Ainsi, il apparaît que ces produits seront excrétés avant qu'une hydrolyse importante prenne place, empêchant ainsi l'accumulation d'oxalate La diversité des résultats avec les réactifs sulfhydryles rapportée dans les présentes peut être une mesure du point de formation des additifs, résultant en différen- tes quantités de glyoxylate disponibles pour d'autres métabo- lismes. Les résultats ci-dessus suggèrent que la cystéine et d'au- 13 2663540 tres composés similaires agissent comme des agents abaissant l'oxalate urinaire en empêchant l'oxydation du glyoxylate en oxalate Dans les expériences sur les rats, il n'y a pas eu d'effets secondaires dues à la formation de l'additif glyoxylate- cystéine. REFERENCES 1 Hodgkinson, A: Acide Oxalique en biologie et en médecine. New York: Academic Press, 1984; 325 pp. 2 Robertson, W G: Calculs urinaires En métabolisme des cal- culs et des maladies rénales Edité par B E C Nordin P. 271 Churchill Livingstone, Edinburgh, 1984. 3 Rofe, A M, Conveys, R A J et Thomas, D W: Calculs et Maladies rénales en South Australia Med J Aust, 2:158, 1981. 4 Potezny, N, Bais, R, O'Loughlin, P D, et al: Détermina- tion d'oxalate urinaire par utilisation d'oxydase d'oxalate immobilisé dans un système à courant continu Clin Chem, 29:16 1983 Yendt, E R, Cohamin, M: Glycolate urinaire augmenté dans une néphrolithiase idiopathique d'oxalate de calcium En urolithiase Edité par V R Walker, R A L Sutton, E C B. Cameron, C Y C Pak, W G Robertson P 439 Plenum Press, New York et LONDRES, 1989. 6 Rooney, C S, Randall, W C, Streeter, K B, Ziegler, C, Cragoe, E J, Schwam, H, Michelson, S R, Williams, H W R, Eichler, E, Duggan, D E, Ulm, E H et Noll, R M: Inhibition d'oxydase acide glycolique Dérivés 4-substitué-3- hydroxy-l H-pyrrole-2,5-dione J Medicinal Chem, 26:700, 1983 7 Bais, R, Rofe, A M et Conyers, R A J: Inhibition de production d'oxalate endogène; considérations des rôles de l'oxydase glycollate et de la déhydrogénase lactate Clin. Science, 76:303, 1989. 8 Danpure, C J et Jennings, P R: Alanine péroxysomale; défi- cience en aminotransferase de glyoxylate dans l'hyperoxalu- 2663540 rie primaire de type I; FEBS Letters, 201:20, 1986. 9 Bais, R, James, H M, Rofe, A M et Conyers, R A J: Les purification et propriétés de la kétohexokinase de foie hu- main Un rôle pour la kétohexokinase et l'aldolase de- fructose-biphosphate dans la production métabolique d'oxalate à partir de xylitol Biochem J, 230:53, 1985. James, H M, Williams, S G, Bais, R, Rofe, A M, Edwards, J.B et Conyers, R A J: La production métabolique d'oxalate à partir de xylitol: activités des transketolase, transaldola- se, fructokinase et aldolase dans le foie, les reins, le cerveau et les muscles du rat, de la souris, du cochon d'inde, du lapin et de l'homme Int J Vit Nutr Res, suppl 28:29, 1985. 11 Rofe, A M, Bais, R et Conyers, R A J: L'effet des sucres raffinés diététiques et des alcools de sucre sur le dépôt d'oxalate de calcium rénal dans des rats traités au glycol d'éthylène Food Chem Toxicol, 24:397, 1986. 12 Khan, S R, Shevock, P N et Hackett, R L: Enzymes urinai- res et urolithiase d'oxalate de calcium J Urol, 142:846, 1989. 13 Rao, N A N et Ramakrishnan, T: L'interaction du glyoxyla- te avec la cystéine et son application à l'essai d'isocitrate et de transaminases impliquant le glyoxylate Biochim Bio- phys Acta 58:262, 1962. 14 Hamilton, G A: Okydases péroxysomales et suggestions pour le mécanisme d'action de l'insuline et d'autres hormones. *Adv Enzymol, 57:85, 1985. Nakamura Y, Tolbert N E: Réactions d'aminotransférase de sérine:glyoxylate, alanine:glyoxylate, et glutamate:glyoxylate dans les péroxymoses à partir de feuilles d'épinard J Biol. Chem 258:7631-7638, 1983. 16 Robertson, W G, Peacock, M, Ouimet, D, Hleyburn, P J et Rutherford, A: Le facteur de risque principal pour la maladie des calculs d'oxalate de calcium chez l' homme: hypercalciurie ou hyperoxalurie douce Dans; la recherche d'urolithiase, clinique et basique Edité par L H Smith, W.G Robertson et B Finlayson P 3 Plenum Publishing, New York, 1981. 17 Parry, M F et Wallach, R: Ethylene glycol poisoning. Amer J Med, 57:143, 1974. DESCRIPTION DES DESSINS Fig 1 montre l'effet de faire varier la concentration de cystéine sur le CO 2 et la formation d'oxalate par des hépatocy- tes Des hépatocytes isolés ont été incubés en variant les concentrations de cystéine et le 14 C 02 libéré (-) et l 14 Cl -oxalate formé (o) à partir de 5 mmol/l ll 1-14 Cl -glyoxylate déterminé comme décrit dans le texte Les résultats sont montrés selon une moyenne + SD (n= 3). Fig 2 montre l'excrétion d'oxalate urinaire à partir de rats traités avec la cystéine (A), le glycol d'éthylène (*) et le glycol d'éthylène plus de la cystèine (B) Des détails du modèle d'expérimentation sont donnés dans le texte Les résultats sont montrés selon une moyenne + SD (n> 4). Fig 3 montre l'effet d'administrer orallement divers compo- sés sulfhydryle d'excrétion d'oxalate Les résultats sont montrés selon une moyenne = SEM (n= 6) A = p Fig 4 montre les effets de 5 m N d'acides amino sur la formation de CO 2 (a) et d'oxalate (b) à partir de l-14 Cl -glyoxylate par des hépatocytes de rats isolés Les résultats sont montrés par rapport au contrôle sans addition d'acide amino exprimés selon une moyenne+ SD (n= 3). Fig 5 montre la chromatographie papier des produits réactifs de la réaction de la transamination du glyoxalate catalysé par des hépatocytes 30 pil de produits de la réaction ont été marqués à l'origine et le chromatograme développé comme décrit dans le texte Après le séchage, le chromatograme a été coupé en bandes de 1 cm et la radioactivité déterminée. REVENDICATIONS 1 Composition pharmaceutique et vétérinaire, pour le traite- ment ou la prévention des maladies résultant de défauts d'excré- tion d'oxalate, comprenant, comme ingrédient actif, un composé sulfydryle ou un dérivé de la cystéine, dans un véhicule pharmaceutique convenable. 2 Composition pharmaceutique ou vétérinaire selon la reven- dication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend, comme ingré- dient actif, la cystéine, le dithiothréitol, le glutathione, le N-acétyl-cystéine, la cystéinyl-glycine, le 2-oxothiazolidine-4- carboxylate, la cystéamine ou la pénicillamine. 3 Composition pharmaceutique ou vétérinaire selon la reven- dication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend, comme ingrédient actif, la cystéine, la cystéamine ou le 2-oxothia- zolidine-4-carboxylate. 4 Composition pharmaceutique ou vétérinaire, pour le trai- tement ou la prévention des calculs rénaux ou la goutte, caractérisée en ce qu'elle comprend, comme ingrédient actif, de la cystéine, le dithiothreitol, le glutathione, le N-acétyl-cystéi- ne, la cystéine-glycine, le 2-oxothiazolidine-4-carboxylate, la cystéamine ou la pénicillamine. 6 Composition pharmaceutique ou vétérinaire selon la reven- dication 4 ou 5, caractérisée en qu'elle comprend, comme ingré- dient actif, la cystéine, la cystéamine ou le 2-oxothiazolidine-4- carboxylate. 7 Méthode de traitement o' de prévention d'une maladie résultant de défauts d'excrétion d'oxalate, caractérisée en ce qu'elle comprend l'administration d'un composé sulfydryle ou d'un dérivé de la cystéine. 8 Méthode selon la revendication 7, caractérisé en ce que le composé de sulfydryle ou le dérivé de la cystéine est la cystéine, le dithiothreitol, le glutathione, le N-acétyl-cystéine, la cystéinyl-glycine, le 2-oxothiazolidine-4-carboxylate, la cystéa- mine ou la pénicillamine. 9 Méthode selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que le composé de sulfydryle ou le dérivé de cystéine est la cystéine, la cystéamine ou le 2-oxothiazolidine-4-carboxylate. Méthode de traitement ou de prévention des calculs rénaux ou de goutte, caractérisée en ce qu'elle comprend l'admi- nistration d'un composé sulfhydryle ou un dérivé de cystéine. 11 Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend l'administration de la cystéine, le dithiothrei- tol, le glutathione, le N-acétyl-cystéine, la cystéinyl-glycine, le 2-oxothiazolidine-4-carboxylate, la cystéamine ou la pénicillamine. 12 Méthode selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce qu'elle comprend l'administration de la cystéine, de la cystéamine ou du 2-oxothiazolidine-4-carboxylate.