FR 2666244 A1 19920306 FR 9110012 A 19910806 La présente invention concerne de façon générale des procédés de séparation de matières biologiques Plus parti- culièrement, la présente invention concerne un procédé et un appareil de chromatographie pour purifier de grandes quantités d'anticorps, en opérant de manière rapide et efficace. Dans l'art de la purification de protéines com- plexes, comme des anticorps polyclonaux et monoclonaux, l'attention s'est concentrée sur la facilité et la rapidité d'obtention de solutions d'anticorps purifiés Dans une description très générale, on peut caractériser un procédé de purification de ces substances à partir d'un fluide d'ascites comme étant un procédé de chromatographie en trois étapes La première étape peut consister à appliquer le fluide des ascites à une colonne de chromatographie par adsorption, garnie de particules d'hydroxyapatite (HA). Cette matière, qui est semblabe au sel complexe dont l'os est constitué et qui peut être identique à ce sel, possède la capacité spéciale d'adsorber des protéines, tout en laissant passer d'autres molécules, biologiques et non biologiques Cette étape sépare des protéines complexes et simples d'avec des lipides, des graisses, des sels, des nucléotides et des polysaccharides. La seconde étape peut consister à purifier encore davantage les molécules d'anticorps, comme les immunoglo- bulines G (Ig G) par un procédé d'échange d'ions La chroma- tographie d'échange d'ions tire avantage des charges exis- tant sur des protéines pour les lier à des perles d'un milieu de support chargé, comme des particules de "Sephadex", matière sur laquelle sont fixés des groupes DEAE (diéthylaminoéthyle) ou QAE (aminoéthyle quaternaire). Dans une chromatographie d'échange d'anions, les protéines sont appliquées à un p H basique, par exemple égal à 8,6, auquel elles sont chargées négativement (albumine, ac-1, a-2 et P-globulines (comme la transferrine), qui sont des anions), ou bien elles n'ont pas de charge nette (gamma- globulines, également appelées immunoglobulines) Les protéines neutres traversent immédiatement une matrice de colonne d'échange d'anions En traversant un tampon présen- tant une forte concentration en sel, les anions du sel déplacent le milieu du support en permettant aux protéines 5 de s'éluer de la colonne Quand on utilise un gradient progressivement croissant de la concentration du sel dans le tampon d'élution, on peut encore purifier davantage, selon la charge, les protéines complexes Cependant, une purification supplémentaire est souvent nécessaire. Si la protéine intéressante présente une tendance spécifique à la liaison, comme dans le cas d'une immunoglo- buline à l'égard d'un antigène, une troisième étape peut être constituée par de la chromatographie d'affinité Cela constitue un outil très puissant pour ne choisir, parmi toutes les immunoglobulines présentes dans un échantillon, que celles spécifiques qui se fixent sur l'antigène lié par covalence au milieu de support Après avoir éliminé par lavage toutes les protéines non adhérentes, on élue la matière à haute affinité, en utilisant pour cette solution une concentration très élevée en sel ou un dénaturant chi- mique, comme l'urée. Les immunoglobulines peuvent également être adsorbées à l'aide de la protéine de staphylocoque A couplée à de la "Sepharose" Par exemple, le brevet US-A- 4 704 366 ldélivré à Juarez Salinas et Ott, et cédé à Bio- Rad Laboratories, Inc, Richmond, Californie, Etats-Unis d'Amériquel décrit une liaison inhabituellement forte de Ig G sur de la protéine A, que l'on obtient en mettant ces composants en contact en présence d'un milieu contenant une concentration élevée en du sel Le brevet précité indique qu'une application particulièrement utile de la chromato- graphie d'affinité réside dans la purification d'anticorps monoclonaux provenant d'un fluide d'ascites De cette façon, on peut préparer des coupes spécifiques de sous- classes d'immunoglobulines, par exemple Ig G 1, Ig G 2 A et Ig G 2 B Ce procédé est également connu sous le nom de "chromatographie d'interaction hydrophobe". Comme indiqué ci-dessus, l'intérêt de l'art anté- rieur s'est concentré sur des perfectionnements concernant la vitesse et la facilité de purification et/ou de concen- tration d'anticorps monoclonaux Des modes opératoires automatisés ont été développés, et ils utilisent la tech- nologie la plus récente du logiciel et du matériel Dans la première étape, la séparation de protéines d'avec une autre matière biologique et non biologique, des progrès ont été obtenus par la diminution de la quantité de pression néces- saire pour faire circuler de force de plus grandes quanti- tés de solutions d'échantillon dans les colonnes garnies de HA Bukovsky et Kennett (Hybridoma, volume 6, no 2, 1987) décrivent un procédé de purification, simple et rapide, d'anticorps monoclonaux provenant des liquides surnageant une culture de cellules et des fluides d'ascites, par chro- matographie d'adsorption sur HA, à des échelles d'analyse et de préparation Ils décrivent l'utilisation d'un "Bio- Gel" (R) HT (Bio-Rad) à grand débit, plutôt que l'HA en poudre fine, de qualité convenant bien pour l'ADN Il est indiqué que le HA de qualité convenant bien pour ADN pro- duit un débit trop faible pour pouvoir servir au traitement de grands volumes d'échantillons De même, une combinaison d'élutions par étapes, utilisant du phosphate présent en un gradient linéaire, donne une pureté très fortement accrue des anticorps monoclonaux. Le mode opératoire de Bukovsky et Kennett est déclaré avoir deux avantages par rapport aux autres sys- tèmes de chromatographie d'adsorption sur HA Tout d'abord, le procédé est déclaré réaliser une séparation n'exigeant qu'une faible contrepression, et n'exigeant seulement qu'une pompe péristaltique sur une colonne fonctionnant à l'échelle d'une préparation, avec un débit de 2 à 3 ml/min. Des contre-pressions de 276 à 414 k Pa ( 40 à 60 psi), pour un débit de 0,5 à 0,8 ml/min sur des colonnes fonctionnant à l'échelle analytique, sont également décrites En second lieu, le procédé utilise des débits relativement élevés, de sorte que l'on peut purifier en huit heures 500 ml d'un fluide de culture de cellules Bukowsky et Kennett décri- vent une concentration de trente fois en des anticorps monoclonaux, que l'on obtient en utilisant une élution avec gradients de phophate, opération suivie d'une élution, effectuée par étapes, avec concentration de phosphate. Les procédés de Bukovsky et Kennett sont impression- nants; mais il est souhaitable de parvenir à des débits encore plus élevés et en utilisant des contre-pressions encore plus faibles Il serait en particulier souhaitable de pouvoir obtenir des débits supérieurs et de fonctionner avec de plus faibles contre-pressions, sans devoir déve- lopper de nouvelles phases mobiles En outre, il est sou- haitable d'avoir des supports fixes solides pour colonnes de chromatographie, que l'on puisse réutiliser de nombreuses fois et qui conservent essentiellement les mêmes caractéristiques d'écoulement (ou de débit) et de pression. Un garnissage traditionnel de colonnes par HA (hydroxy- apatite) permet à des colonnes "fraîchement garnies" en "Bio-Gel" (R) HT, de réaliser initialement un écoulement élevé à de faibles contrepressions, mais, au bout de six ou sept essais, le garnissage de la colonne doit être remplacé par la personne effectuant la chromatographie, car le débit diminue très nettement avec, simultanément, une augmentation de la chute de pression Cela est dû à la nature de l'hydroxyapatite (ou apatite hydroxylée) elle- même la forme hydratée a pour formule Ca 10 (PO 4)6 (OH)2. Comme les particules cristallines sont hydratées dans la configuration tradionnelle de garnissage de colonnes, ces particules se dilatent légèrement Dans des colonnes garnies traditionnelles, cela provoque le frottement de particules adjacentes Lorsque les particules cristallines hydratées sont exposées à une solution typique de tampon de phosphate, l'ion phosphate provoque un compactage du lit de HA Cette dilatation et ce compactage nuisent au lit, en provoquant un bouchage par des "fines" Cela entraîne habi- tuellement l'enlèvement de la vieille cartouche de HA pour colonnes et son remplacement par une nouvelle cartouche, ce qui entraîne des pertes de temps dues à la mise temporaire hors service d'une cartouche. Un procédé développé actuellement pour résoudre un problème similaire de bouchage en chromatographie d'échange d'ions consiste en l'utilisation de "frittes de compensa- tion de volume" dans les cartouches Cette technique est décrite dans le brevet US-A-4 871 463, délivré à Taylor et Rogler-Brown et cédé à Sepratech, Carlsbad, Californie (Etats-Unis d'Amérique) Le brevet décrit l'utilisation de frittes de compensation de volume, qui se dilatent et se contractent lorsque les particules de résine d'échange d'ions, constituant le garnissage, varient de volume par exposition à des solutions présentant diverses caractéris- tiques de p H et de force ionique Le brevet revendique également l'utilisation d'un distributeur d'écoulement, qui distribue l'écoulement sur la totalité de la section trans- versale de la phase stationnaire solide, et d'un collecteur d'écoulement, qui collecte l'écoulement sur la totalité de la section transversale de la phase stationnaire solide. Il a été développé des feuilles composites, formées de diverses matières comprenant du polytétrafluoréthylène (PTFE) comportant de la matière particulaire variée entre- mêlée de manière permanente Par exemple, dans le brevet US-A-4 460 642 (délivré à Errede et al et cédé à Minnesota Mining and Manufacturing Company, St Paul, Minnesota, Etats-Unis d'Amérique), il est décrit des feuilles compo- sites gonflables à l'eau et comprenant des fibrilles de PTFE auxquelles des matières particulaires, comme des résines d'échange de cations BioRad, sont entremêlées de façon permanente Le brevet précité indique que ces feuilles composites peuvent servir pour la chromatographie en phase gazeuse ou en phase liquide, en raison de leur nature poreuse et de leur distribution très uniforme du substrat, ce qui évite "la formation de cheminements préfé- rentiels", mais n'évite cependant pas un écoulement en spirale entre les membranes, sauf si les espaces entre les membranes sont réduits à leur valeur minimale Les parti- cules adsorbantes sont réparties et entremêlées de façon poussée dans les fibrilles de PTFE, de sorte que la quasi- totalité des particules sont contenues dans les fibrilles et elles ne se séparent pas à l'état humide ou sec Le PTFE est présent à la surface des feuilles composites Les par- ticules adsorbantes ne sont pas à la surface du composite, mais elles sont fortement entremêlées dans les fibrilles tenaces de PTFE Il y a peu de chance que la matière parti- culaire se sépare et chute La surface comportant des fibrilles de PTFE n'est pas rendue adhésive par d'autres matières, parce qu'elle est revendiquée comme étant non adsorbante et non mouillée en raison de sa tension superfi- cielle exceptionnellement basse, bien que des composites de ces matières puissent être très hydrophiles Le brevet précité ne décrit pas l'utilisation de l'hydroxyapatite (HA) Cependant, ce brevet précité révèle que, dans le cas de feuilles composites fortement gonflables à l'eau, les feuilles composites sont plus raides et moins flexibles que les feuilles qui gonflent moins Le brevet précité suggère l'addition d'une proportion, pouvant aller jusqu'à 70 % en poids, d'une matière particulaire, formée par des parti- cules non gonflables ou légèrement gonflables à l'eau, pour conférer une plus grande flexibilité et plus de souplesse auxdits composites tout en leur permettant de conserver une bonne résistance et solidité mécaniques Des exemples de particules "de dilution" ainsi décrites comprennent du kaolin, du talc, de la silice, de la bentonite et de la vermiculite Le brevet précité décrit ces "diluants" comme étant de la matière inerte n'ayant aucun effet sur une séparation chromatographique. Dans l'art de la production de feuilles composites, on prépare, en utilisant la technologie de fabrication du papier, des feuilles composites comportant du verre, une matière polymère et de la silice ainsi que des fibres de cellulose Ces papiers fibreux servent à des applications courantes de filtration Ahlstrom Filtration, Inc, Mt Holly Springs, Pennsylvanie (Etats-Unis d'Amérique) produit de telles feuilles composites obtenues par des méthodes connues en pratique Les feuilles composites peuvent être produites à partir de plusieurs types de fibres inertes et de particules absorbantes, de façon à présenter jusqu'à 98 % de rétention Les feuilles compo- sites peuvent contenir entre 40 et 90 % en poids de parti- cules adsorbantes, tout en conservant une bonne résistance ou une bonne solidité mécanique à sec La résistance méca- nique à l'état humide est médiocre, à moins d'ajouter des liants à la feuille composite HA n'a pas servi sous forme de particules adsorbantes dans des feuilles composites. Dans la recherche de méthodes destinées à obtenir un écoulement uniforme dans des colonnes ayant la taille voulue pour des essais de préparation, des feuilles compo- sites ont servi dans une configuration d'enroulement en spirale (brevet US-A-4 743 373 délivré à Rai et al) Ce brevet précité décrit une "matrice gonflable sous forme de feuilles" avec des "moyens formant entretoises entre chaque couche" des feuilles enroulées en spirale, pour permettre un gonflement réglé de la matrice gonflable Cela peut se classer comme étant une variante de la structure des "frittes pour compensation de volume" du brevet Taylor/Rogler-Brown délivré par la suite et décrit ci- dessus Rai et al décrivent, dans le brevet US-A-4 743 373 précité, leur phase stationnaire solide comme assurant une distribution régulière de l'écoulement des échantillons sans augmentation de la chute de pression, en comparaison d'une phase stationnaire n'utilisant pas les éléments d'es- pacement ou entretoises. Jusqu'à présent, il n'a pas été développé de système pour la séparation rapide de protéines à partir de fluides d'ascites sans utilisation de frittes pour compensation de volume ni de moyens formant entretoises entre des milieux poreux, sensiblement non gonflables, enroulés en spirale ou enroulés en forme de noyaux ou à empilement ou garnissage simple ou multiple, pour chromatographie, sans variation de débit ni de chute de pression, en utilisant des techniques d'adsorption sur HA (hydroxyapatite). Il vient d'être découvert que l'on peut obtenir une séparation chromatographiquepar adsorption et à capacité élevée et constante sur HA, de protéines que l'on sépare ainsi d'autres molécules en utilisant des particules de HA cristallines en entremêlement permanent dans une feuille poreuse, sensiblement non gonflable, et cela sans utiliser de compensation de volume ou en n'utilisant qu'une compen- sation résiduelle de volume Telle qu'elle sert ici, l'expression "feuille sensiblement non gonflable" signifie que les feuilles sont efficacement entassées serrées dans les cartouches servant ici à l'état sec, puis qu'elles gonflent légèrement pour épouser les contours internes de la cartouche Les feuilles peuvent ensuite se compacter légèrement pour revenir à leur état d'entassement efficace à sec, d'origine, lorsqu'elles sont mises au contact de solutions tampons décrites ici. Un avantage de cette disposition est la grande dimi- nution de contre-pressions nécessaires pour obliger des échantillons à traverser la cartouche Typiquement, il suffit d'une seringue Un autre avantage est qu'au lieu de six ou sept essais par cartouche, comme dans le cas des colonnes à lit de garnissage traditionnel, l'utilisation des particules de HA entremêlées en permanence dans une matière comme du polytétrafluoréthylène (PTFE) ou des fibres de verre permet d'effectuer des dizaines d'essais par cartouche De même, les propriétés de surface non gon- flable de PTFE permettent d'exposer la totalité de la sur- face d'une feuille composite à un écoulement d'entrée d'échantillon dans un dispositif chromatographique, ce qui amplifie la capacité d'écoulement au point que l'on peut traiter des litres d'échantillon en une fraction du temps nécessaire en cas d'utilisation de colonnes traditionnelles à lit de garnissage par HA Et, ce qui est peut être plus important, la feuille poreuse, essentiellement non gon- flable, permet aux particules de HA de s'hydrater et de se déshydrater sans que cela produise des fines, et l'aire de surface spécifique des particules est maintenue constante en vue de son contact avec l'échantillon introduit, qui contient des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. D'autres améliorations, avantages, formes de réali- sation et aspects de l'invention ressortiront de la des- cription détaillée suivante, faite en regard des dessins annexés sur lesquels: la figure 1 est une élévation latérale, avec coupe partielle, d'une forme de réalisation de la cartouche de chromatographie selon l'invention; la figure 2 est une section transversale agrandie, le long de la ligne 2-2 de la figure 1, la figure 3 est une vue en perspective éclatée de toutes les parties de la cartouche de chromatographie représentée sur la figure 1: la figure 4 est une section transversale agrandie le long de la ligne 4-4 de la figure 1; la figure 5 est une élévation latérale avec coupe partielle d'une autre forme de réalisation de la cartouche de chromatographie selon l'invention; la figure 6 est une vue en perspective éclatée de toutes les parties de la cartouche de chromatographie re- présentée sur la figure 5; la figure 7 montre la grille pour distribution d'écoulement ou pour collecte d'écoulement, imprimée sur les surfaces internes de la cartouche de chromatographie représentée sur les figures 5 et 6; la figure 8 est un chromatogramme (abscisses temps, en min; ordonnées: absorptance à 280 nm) obtenu à l'exemple 1; la figure 9 est un chromatogramme (abscisses: temps en min; ordonnées absorptance à 280 nm), obtenu à l'exemple 2; et la figure 10 est un chromatogramme (abscisses temps en min; ordonnées: absorptance à 280 nm), obtenu à l'exemple 3. Les définitions qui suivent sont présentées afin de permettre une compréhension complète de l'invention et, lorsqu'on utilise ici chaque terme ou expression que l'on décrit ci-après, ce terme ou cette expression a le sens que l'on indique ci-après: "Protéine(s)": molécules biologiques comprenant une chaîne continue d'atomes de carbone et d'azote reliés ensemble par des liaisons de peptide entre des amino- acides adjacents, et l'expression englobe toutes les structures primaires, secondaires, tertiaires et quaternaires de ces molécules; "Protéines simples": protéines qui ne comprennent pas de groupe prosthétique non protéinique, par exemple de l'albumine et la transferrine; "Proteines complexes": conjugés de protéines ana- logues à des anticorps, dans lesquels au moins deux pro- téines sont reliées pour former un complexe biologiquement actif; de même, ce sont des protéines qui comprennent un groupe prosthétique non protéinique, ce qui peut inclure des co-enzymes comme des flavines et des nucléotides pyridiniques, ainsi que des lipides et des polysaccharides; "anticorps" tel qu'il sert ici, ce terme entend inclure des gamma-globulines spéciales (en règle générale) ou des bêta-globulines (parfois) formées au sein d'un corps vivant, pour réagir contre et par suite d'une stimulation par des antigènes spécifiques Le terme entend inclure des chaînes "lourdes" et "légères" d'anticorps, des fragments de telles chaînes, et des complexes entre des fragments de chaînes, des chaînes et des anticorps; le terme comprend Ig M, Ig A, Ig G, Ig D et Ig E provenant d'immunoglobulines et tous les allotypes et les idiotypes provenant, sans que cette liste soit limitative, d'une espèce humaine, de souris, de chèvres, de bovins ou de lapins; "Appareil chromatographique" et "dispositif chroma- tographique": tout appareil ou toute configuration d'éléments composants (ce qui comprend des colonnes chroma- il tographiques traditionnelles) qui sépare des molécules en se fondant sur la différence de leurs propriétés physiques, chimiques ou structurelles; "milieu chromatographique" et "moyen de séparation chromatographique": telle qu'elle sert ici, cette expres- sion désigne l'élément chromatographiquement actif dans un appareil chromatographique ou un dispositif chromatogra- phique, c'est-à-dire l'élément qui effectue la répartition de molécules en se fondant sur les différences de pro- priétés physiques, chimiques ou structurelles; "tampon de p H": c'est un liquide qui "maintient en équilibre" le p H du moyen de séparation chromatographique ou du milieu chromatographique; "particules d'hydroxyapatite cristalline hydratée" hydroxyapatite qui, sous sa forme essentiellement cristal- line, est hydratée à un degré ou niveau quelconque d'hydra- tation et présente une taille particulaire se situant entre environ 1 et environ 300 pm; "phase stationnaire solide": milieu pour chromato- graphie, que traverse une phase mobile; "emprisonnées ou enrobées en permanence", "entre- mêlées en permanence" et "immobilisées en permanence" telles qu'elles servent ici, ces expressions désignent des particules qui peuvent subir une modification de forme et de taille physique mais non pas de position spatiale au sein d'une feuille poreuse, essentiellement non gonflable, ce qui évite une séparation et un affaissement important des particules et la formation de fines par suite du frot- tement, les particules pouvant être maintenues physiquement et/ou chimiquement au sein de la feuille; "feuille poreuse, essentiellement non gonflable" telle qu'elle sert ici, cette expression désigne une feuil- le de matière dont l'épaisseur se situe entre environ 0,127 mm ( 0,005 pouce) et environ 6,35 mm (environ 0,25 pouce), qui a des pores dont la taille se situe entre envi- ron 0,2 pim et environ 15 pm; "anticorps monoclonaux": telle qu'elle sert ici, cette expression désigne des anticorps hautement spécifi- ques, produits par des cellules clonées provenant d'une cellule hybride simple, le produit de la fusion d'un lym- phocyte producteur d'anticorps et d'une cellule de lympho- cyte maligne immortelle productrice d'anticorps, des exemples étant des anticorps monoclaux de Ig M, Ig G; "gradient de phosphate": cette expression désigne des méthodes d'élution dans lesquelles la concentration de l'ion phosphate est progressivement abaissée ou élevée pour éluer de particules d'hydroxyapatite une protéine qui y est liée. En se référant maintenant plus particulièrement au dessin, on voit que la figure 1 montre, sous forme assem- blée, un grand nombre des composants de cartouches de chro- matographie, dans le cas d'une forme de réalisation Des contre- pressions égales ou inférieures à 690 k Pa ( 100 psi) et égales ou inférieures à 345 k Pa ( 50 psi) sont préféra- bles pour toutes les formes de réalisation La contre- pression sera sensiblement inférieure à environ 172,5 k Pa (environ 25 psi) pour le maintien ou l'entretien d'une cartouche de capacité constante, dans la forme préférée de réalisation de l'invention La cartouche 25, assemblée pour chromatographie, comprend une embouchure 1 d'entrée, une embouchure ou buse 2 de sortie, un corps 3 formant enceinte annulaire de confinement, un collecteur ou manifold 5 pour la distribution de l'écoulement provenant de l'embouchure 1 d'entrée, une garniture 10 d'étanchéité à l'entrée et une garniture 15 d'étanchéité à la sortie La forme de réalisa- tion de la cartouche, montrée assemblée sur la figure 1, pour colonnes de chromatographie comprend également une fritte 30 annulaire pour compensation de volume, une fritte de support central ou cylindrique pour compensation de volume, une feuille 60 enroulée en spirale ou enroulée en forme de coeur ou de noyau, qui est poreuse et essentielle- ment non gonflable et contient des particules 62 d'une hydroxyapatite cristalline hydratée, particules qui sont entremêlées de manière permanente à la feuille 60 La figure 1 montre également l'écoulement 20 d'entrée qui emprunte l'embouchure 1 d'entrée et le collecteur 5 de distribution d'écoulement pour produire plusieurs courants de solution contenant l'anticorps à purifier La garniture d'étanchéité à l'entrée empêche l'échantillon 20, qui arrive, de traverser directement la colonne 25 en emprun- tant le support central 40 La garniture 10 d'étanchéité à l'entrée, en coopération avec le collecteur 5 de distribu- tion d'écoulement, oblige l'écoulement à se diriger vers la fritte 30 annulaire de compensation de volume. Dans la forme préférée de réalisation de l'inven- tion, la fritte 30 annulaire de compensation de volume est remplacée par une feuille 60 composite, poreuse, non gon- flable, plus enroulée en spirale ou en forme de noyau ou de coeur, et par une mince couche de fritte ou de toile poreuse et rigide Dans les deux configurations, après avoir traversé le collecteur 5 de distribution d'écoulement et avoir pénétré dans la fritte 30 annulaire, l'échantillon qui arrive vient au contact de la surface 61 la plus ex- terne de la feuille 60 enroulée en spirale ou en forme de noyau et cet échantillon recouvre entièrement cette surface 61 Cela est dû au fait que la feuille elle-même confère une faible pression différentielle entre ses surfaces. Après son contact avec la surface 61 la plus externe de la feuille 60 enroulée en spirale ou en forme de noyau, le fluide de l'échantillon traverse les couches de la feuille en une combinaison d'écoulements se dirigeant axialement et radialement vers l'intérieur, jusqu'à atteindre le sup- port 40 central poreux, sur lequel ladite feuille 60 est enroulée La feuille 60 peut être fixée au support 40 cen- tral poreux par des méthodes bien connues en pratique, bien que ce ne soit pas indispensable Le support 40 central poreux peut être réalisé en n'importe quelle matière poreuse, qui est inerte à l'égard du fluide de l'échantil- lon et du ou des fluides à utiliser pour l'élution De préférence, le support 40 est en polypropylène poreux, dans le cas de la forme préférée de réalisation o l'on n'uti- lise pas de compensation annulaire de volume; en variante, le support 40 central poreux peut être réalisé en une ma- tière cellulosique pour filtre profond Dans les deux cas, le support 40 peut jouer le rôle d'un moyen pour compensa- tion de volume résiduel Le fluide de l'échantillon Srécoule ensuite, du support central poreux vers l'embou- chure 2 de sortie que ce fluide emprunte A l'embouchure 2 de sortie est associé un raccord ou embout 7 mâle "Luer- Lock", dans la forme préférée de réalisation; dans ce cas, un embout mâle "Luer-Lock" comportant des filets 8. La figure 2 est une section transversale, agrandie, effectuée le long de la ligne 2-2 de la forme de réalisa- tion représentée sur la figure 1 On voit que la cartouche 25 pour chromatographie comporte un corps 3 formant en- ceinte annulaire de confinement, une fritte 30 annulaire de compensation de volume, qui est remplacée, dans la forme préférée de réalisation, par un plus grand nombre de feuilles 60 enroulées en spirale ou formant un noyau ou coeur La figure 2 montre également le support 40 central poreux. La feuille 60 essentiellement non gonflable, enrou- lée en spirale ou formant un coeur ou noyau, est représen- tée avec des particules 62 d'hydroxyapatite cristalline hydratée qui y sont entremêlées de façon permanente La taille des particules d'hydroxyapatite n'est pas fondamen- tale, et elle peut se situer entre environ 1 et 300,um. Cependant, il vaut mieux utiliser une hydroxyapatite de type ou qualité pour ADN, qui présente une taille particu- laire moyenne comprise entre environ 48 et 52 iim et a une distribution des tailles des particules se situant entre environ 15 et environ 60 pm Les feuilles que l'on utilise dans la présente invention ont une taille des pores se situant entre environ 0,2 et environ 15,um, et elles sont mouillées de sorte que l'hydroxyapatite cristalline est hydratée Les feuilles sont également mises en équilibre avec un tampon de p H, ayant un p H compris entre environ 5,5 et environ 10, et ayant une concentration en phosphate comprise entre environ 0,001 et environ 0,45 M. La figure 3 est une vue en perspective éclatée de l'ensemble des parties d'une forme de réalisation d'un appareil à cartouche de chromatographie selon la présente invention L'embouchure 1 d'entrée est reliée à un collec- teur 5 de distribution d'écoulement La fritte 30 annulaire pour compensation de volume est montrée placée coaxialement à l'intérieur du corps 3 formant enceinte annulaire de confinement L'embouchure d'entrée est reliée par une ex- trémité au corps 3, cependant que l'embouchure 2 de sortie est reliée à l'extrémité opposée du corps 3 formant en- ceinte annulaire de confinement La fritte 30 annulaire de compensation de volume, qui consiste en des tours spéciaux d'une feuille poreuse enroulée en spirale, dans la forme préférée de réalisation, est représentée placée coaxiale- ment au sein du corps 3 formant enceinte annulaire de con- finement La feuille 60, enroulée en spirale ou enroulée pour former un coeur ou une partie centrale, est placée au sein de la fritte 30 annulaire de compensation de volume. La fritte 30 peut être remplacée par une mince couche de polypropylène rigide La figure 3 montre en outre un sup- port 40 central poreux, une garniture 10 d'étanchéité à l'entrée et une garniture 15 d'étanchéité à la sortie Les garnitures 10 et 15 d'étanchéité peuvent être réalisées en n'importe quelle matière inerte et non poreuse, par exemple en du polyéthylène ou en du caoutchouc naturel. La figure 4 montre, de manière agrandie, une section transversale effectuée le long de la ligne 4-4 de la figure Cette figure montre un collecteur ou manifold 5 destiné à distribuer l'écoulement et une garniture 10 d'étanchéité à l'entrée Le collecteur 5 et l'embouchure d'entrée (non représentée) sont collés ou reliés d'une autre façon à la garniture 10 d'étanchéité à l'entrée. Les embouchures d'entrée et de sortie, le moyen annulaire de confinement et les embouts ou raccords de type "Luer-Lock" peuvent être en n'importe quelle matière qui est inerte à l'égard des solutions des échantillons et des solutions pour élution, et à l'égard des pressions et tem- pératures appliquées à la cartouche pour colonnes de chro- matographie Une matière préférée est une matière plasti- que, comme du polyéthylène, du polypropylène ou du polycarbonate. La vue présentée sur la figure 5 montre certains des composants d'une cartouche pour chromatographie constituant une seconde forme de réalisation, la cartouche étant sous forme assemblée La quantité de la contre-pression sera, dans la seconde forme préférée de mise en oeuvre de l'in- vention, nettement inférieure à 172,5 k Pa environ ( 25 psi environ) pour maintenir une capacité constante de car- touche La cartouche 125 pour chromatographie, assemblée, comprend une embouchure 101 d'entrée, une embouchure 102 de sortie, un corps 103 formant enceinte annulaire de-confine- ment, un collecteur 104 pour distribuer l'écoulement, et un collecteur 105 pour collecter l'écoulement La forme de réalisation de la cartouche assemblée pour chromatographie, présentée sur la figure 5, inclut également une feuille 106, simple ou empilée, poreuse, essentiellement non gon- flable, contenant, entremêlées en permanence dans cette feuille, des particules 107 d'hydroxyapatite cristalline hydratée. La figure 6 est une vue en perspective éclatée mon- trant toutes les parties de la seconde forme de réalisa- tion La feuille simple ou empilée, poreuse, sensiblement non gonflable, est placée entre la partie supérieure du corps 126 formant enceinte annulaire de confinement et la partie inférieure du corps 127 formant enceinte annulaire de confinement. La figure 7 montre les canaux d'écoulement que l'on trouve sur les surfaces du collecteur 104 de distribution de l'écoulement et du collecteur ou manifold 105 de col- lecte de l'écoulement. Les particules d'hydroxyapatite cristalline hydratée peuvent être emprisonnées ou enrobées physiquement dans une feuille poreuse, sensiblement non gonflable Ces particules ont une surface spécifique initiale disponible pour fixer des anticorps monoclonaux et la feuille poreuse et non gonflable empêche, pendant la purification, les particules de modifier sensiblement leur emplacement spatial au sein du noyau, enroulé en spirale ou enroulé autour ou en forme d'un noyau, pour séparation chromatographique Le corps 3 ou 103, en forme d'enceinte annulaire de confinement, des- tiné à relier axialement l'embouchure 1 ou 101 d'entrée à l'embouchure 2 ou 102 de sortie, comporte une surface annu- * laire interne qui ne vient pas au contact de la surface cylindrique externe du moyen, enroulé en spirale, ou enve- loppé sur ou en forme de noyau, pour séparation chromatographique. Les particules d'hydroxyapatite cristalline hydratée représentent au moins 40 % environ en poids et, mieux, au moins environ 75 % en poids du milieu pour chromatographie, et la distribution de leur taille particulaire se situe entre environ 15 et environ 60 pm. Dans la pratique du procédé de l'invention, un procédé préférable pour séparer des protéines complexes à partir d'un échantillon comprend: (a) la combinaison, dans un dispositif pour chroma- tographie, en présence d'un tampon de p H, d'un liquide contenant des protéines complexes avec un milieu pour chro- matographie, comprenant des particules d'hydroxyapatite cristalline hydratée, ayant une aire de surface spécifique initiale disponible pour fixer des protéines complexes, les particules étant immobilisées en permanence dans une feuil- le poreuse et sensiblement non gonflable, cette feuille permettant aux particules de l'hydroxyapatite cristalline hydratée d'interagir avec le liquide de façon que la combi- naison de la surface spécifique liée aux protéines com- plexes et de la surface spécifique non liée soit sensible- ment égale à la surface spécifique initiale, en formant ainsi plusieurs complexes protéines complexes/particules d'hydroxyapatite; et (b) la dissociation des protéines complexes d'avec les complexes de protéines complexes/particules d'hydroxy- apatite, par combinaison des complexes avec au moins une solution d'élution s'écoulant environ à la même vitesse et au même débit dans le milieu pour chromatographie, du début à la fin de la dissociation. Telle qu'elle sert ici, l'expression "sensiblement égale à" signifie, en se référant à la surface spécifique des particules initiales d'hydroxyapatite, que les fines d'hydroxyapatite produites sont négligeables De préfé- rence, la feuille poreuse, sensiblement non gonflable, est choisie dans l'ensemble constitué par du polytétrafluoro- éthylène et du papier de fibres de verre, et cette feuille a un format ou une disposition choisi parmi des feuilles enroulées en spirale, enroulées autour d'un noyau ou for- mant un noyau, plissées et empilées; le tampon a un p H compris entre environ 5,5 et environ 10, et a une concen- tration en phosphate comprise entre environ 0,001 et environ 0,10 M; et l'échantillon contenant les protéines contient au moins une classe d'anticorps, de préférence des anticorps monoclonaux L'homme du métier comprendra que la matière "enroulée en noyau ou formant un noyau" comprend des anneaux concentriques d'une matière en feuille. Dans ce procédé, les particules d'hydroxyapatite cristalline hydratée représentent de préférence au moins t du poids du milieu pour chromatographie et elles ont une distribution de la taille particulaire comprise entre environ 15 et environ 60 pm On préfère particulièrement le cas o les particules d'hydroxyapatite cristalline hydratée représentent au moins 75 % du poids du milieu pour chroma- tographie et ont une distribution de la taille particulaire comprise entre environ 15 et 60 pm. La solution pour élution comprend un gradient de phosphate correspondant à une concentration croissante en phosphate et ayant de préférence une concentration termi- nale d'au moins 0,14 M environ, mieux au moins 0,45 M environ. Telle qu'elle sert ici, l'expression "surface spéci- fique initiale disponible pour la liaison" signifie la surface spécifique approximativement nécessaire pour effec- tuer la séparation, ce que l'on pense se situer dans le cadre des connaissances de l'homme du métier, des composi- tions de feuilles typiques étant présentées dans les exemples. En outre, l'expression "environ le même débit" signifie, en se référant au débit d'écoulement, que le débit diminue de manière négligeable pendant toute la sépa- rationcependant que, de façon correspondante, n'apparais- sent que de faibles variations de la contre-pression L'ex- pression "sensiblement pas de modification de la chute de pression" a un sens similaire quand on l'utilise ici. Les exemples qui suivent sont présentés à titre illustratif seulement et ne sont nullement destinés à limi- ter d'une façon quelconque l'appareil et le procédé de l'invention. EXEMPLE 1 On a assemblé, selon la figure 1, une cartouche pour chromatographie, contenant 80 cm 2 d'une feuille composite polytétrafluoréthylène/hydroxyapatite cristalline hydratée (PTFE-HA), constituée de 20 % en poids de PTFE et de 80 t en poids de HA, l'hydroxyapatite HA étant constituée de 72 % en poids de "Bio-Gel HTP", de qualité pour ADN et de 28 t en poids de "Bio-Gel HTP" On a relié la cartouche à un système pour chromatographie de liquide avec gradient et l'on a soumis à mise en équilibre, à un débit de 1,0 ml/min, tout d'abord avec du tampon de phosphate de sodium 0,40 M, p H 6,8 (B), puis avec du tampon de phosphate de sodium 0,01 M, p H 6,8 (A) On a arrêté la pompe du sys- tème pour chromatographie et l'on a appliqué au dispositif par une valve Luer à trois voies, en utilisant une seringue d'l ml, 250 1 l d'un mélange de protéines simples consistant en 1 mg de sérum albumine de bovins, 1 mg de lysozyme, et 1 mg de cytochrome C de cheval, dans (A) On a fait dé- marrer la pompe et l'on a délivré à la cartouche un gra- dient concave durant 30 min pour passer de (A) à (B) On a surveillé l'effluent de la cartouche, à une longueur d'onde d'ultraviolets de 280 nm Les trois protéines simples (sérum albumine, puis lysozyme, puis cytochrome C) ont élué de la cartouche dans les 50 min, comme représenté sur la figure 8 (abscisses le temps en min; ordonnées absorp- tance à 280 nm). EXEMPLE 2 On a assemblé, selon la figure 6, une cartouche pour chromatographie, contenant cinq couches de cercles de 25 mm ( 24,5 cm 2) dtune feuille composite formée de polytétra- fluoréthylène et d'hydroxyapatite cristalline hydratée (PTFE-HA), feuille constituée de 20 % en poids de PTFE et de 80 % en poids de HA, et dans laquelle l'hydroxyapatite HA était constituée de 72 t en poids de "Bio-Gel HTP" de qualité pour ADN, et de 28 % en poids de "Bio-Gel HTP" On a relié la cartouche à un système de chromatographie de liquide avec gradient et l'on a effectué une mise en équi- libre à un débit de 1,0 ml/min, tout d'abord avec du tampon de phosphate de sodium 0,40 M, p H 6,8 (B) puis avec du tam- pon de phosphate de sodium 0,01 M, p H 6,8 (A) On arrêté la pompe du système pour chromatographie et l'on a appliqué au dispositif, par une valve Luer à trois voies, en utilisant une seringue de 1 ml, 250 pl d'un mélange de protéines simples consistant en 2,5 mg de sérum albumine de bovins, 2,0 mg de lysozyme de poulet et 2,2 mg de cytochrome C de cheval, dans (A) On a fait démarrer la pompe et l'on a appliqué un gradient en quatre étapes Après une brève continuation à O t de B, la première étape a utilisé 10 % de B, la seconde étape 21 % de B, la troisième étape 32 - de B et la quatrième étape 68 % de B On a surveillé l'effluent de la cartouche, à une longueur d'onde en ultra- violet de 280 nm Les trois protéines simples (sérum albumine; lysozyme; et cytochrome C) ont été éluées de la cartouche, comme représenté sur la figure 9 (abscisses temps, en min; ordonnées: absorptance à 280 nm). EXEMPLE 3 On a assemblé, selon la figure 6, une cartouche pour chromatographie, contenant cinq couches de cercles ou dis- ques de 25 mm ( 24,5 cm 2) d'une feuille composite fibres de verre/hydroxyapatite cristalline hydratée (FV/HA), consti- tuée de 50 % en poids de fibres de verre (FV) et de 50 % en poids d'hydroxyapatite (HA), composite dans lequel l'hy- droxyapatite était constituée de 100 t de "Bio-Gel HTP" de qualité pour ADN On a relié la cartouche à un système pour chromatographie de liquide avec gradient, et l'on a provo- qué une mise en équilibre, à un débit de 1,0 ml par minute, tout d'abord avec du tampon de phosphate de sodium 0,40 M, p H 6,8 (B) puis avec du tampon de phosphate de sodium ( 0,Ol M, p H 6,8 (A) On a arrêté la pompe du système pour chromatographie et l'on a appliqué au dispositif, à l'aide d'une valve Luer à trois voies et en utilisant une seringue de 1 ml de capacité, 250 pl d'un mélange de protéines sim- ples consistant en 2,5 mg de sérum albumine de bovin, 2,0 mg de lysozyme de poulet et 2,2 mg de cytochrome C de cheval, dans (A) On a fait démarrer la pompe et l'on a appliqué un gradient en trois étapes Après avoir briève- ment continué à O % de B, la première étape a consisté en 15 % de B, la seconde étape a utilisé 34 % de B et la troi- sième 68 % de B On a surveillé l'effluent de la cartouche, à une longueur d'onde dans l'ultraviolet de 280 nm Les trois protéines simples (sérum-albumine; lysozyme; cyto- chrome C) ont été éluées de la cartouche, comme représenté sur la figure 10 (abscisses: temps en min; ordonnées absorptance à 280 nm). EXEMPLE 4 On a assemblé selon la figure 6 une cartouche pour chromatographie, contenant trois couches de disques ou cercles de 47 mm ( 47,7 cm 2) d'une feuille composite de polytétrafluoréthylène/hydroxyapatite cristalline hydratée (PTFE/HA), feuille composée de 20 % en poids de PTFE et de % en poids d'hydroxyapatite (HA), dans laquelle l'hy- droxyapatite était constituée de 72 % en poids de "Bio-Gel HTP" de qualité pour ADN et de 28 % en poids de "Bio-Gel HTP", et l'on a relié la cartouche au conduit de sortie d'une jauge de pression On a relié la jauge de pression à une pompe péristaltique et l'on a relié la pompe à un ré- servoir de tampon de phosphate de sodium O,01 M à p H 6,8 On a relié la sortie de la cartouche à un débitmètre étalonné pour surveiller le débit La pression en tête correspondait approximativement à 107,5 k Pa ( 15,6 psi) à un débit de 3 ml/min, sans signe de formation ni d'accumulation de fines, ce qui se manifesterait par une augmentation de la pression en tête ou une diminution du débit. EXEMPLE 5 On a connecté la cartouche pour chromatographie de l'exemple 4 au conduit de sortie d'une jauge de pression. On a connecté la jauge de pression à une pompe péristalti- que et l'on a relié la pompe à un réservoir de tampon con- tenant de l'urée 8 M et du phosphate de sodium 0,O 1 M, p H 6,8 On a relié la sortie de la cartouche à un débit- mètre étalonné pour surveiller le débit La pression en tête a été approximativement de 152,4 k Pa ( 22,1 psi) à un débit de 3 ml/min, avec, pour la pression et le débit d'écoulement, un comportement semblable à celui indiqué à l'exemple 4. EXEMPLE 6 On a assemblé selon la figure 6, une cartouche pour chromatographie contenant trois couches de disques ou cercles de 47 mm ( 47,7 cm 2) d'une feuille composite de fibres de verre/hydroxyapatite cristalline hydratée (FV-HA), constituée de 50 % en poids de fibres de verre (FV) et de 50 % en poids d'hydroxyapatite HA, cette hy- droxyapatite étant constituée de 100 % en poids de "Bio-Gel HTP" de qualité pour ADN, et l'on a relié la cartouche ainsi formée au conduit de sortie d'une jauge de pression. On a relié la jauge de pression à une pompe péristaltique et l'on a relié la pompe à un réservoir de tampon de phos- phate de sodium 0,01 M, p H 6,8 On a relié la sortie de la cartouche à un débitmètre étalonné, pour surveiller le débit La pression de tête a été d'environ 34,5 k Pa ( 5 psi) à un débit de 3 ml/min, sans variation importante de débit ni de pression de tête. EXEMPLE 7 On a relié la cartouche de chromatographie, utilisée à l'exemple 6, au conduit de sortie d'une jauge de pres- sion On a relié la jauge de pression à une pompe péristal- tique et l'on a relié la pompe à un réservoir d'un tampon contenant de l'urée 8 M et du phosphate de sodium O,Ol M, à p H 6,8 On a relié la sortie de la cartouche à un débit- mètre étalonné, pour surveiller le débit La pression de tête était d'environ 34,5 k Pa ( 5 psi) à un débit de 3 ml/min, cette fois encore sans variation importante de la pression de tête ni du débit. La description ci-dessus est présentée principa- lement à titre illustratif Il apparaîtra à l'homme du métier que l'on peut introduire d'autres modifications, variantes etc, concernant les matières, les configura- tions, les agencements et les formes des divers éléments de la structure pour colonnes de chromatographie, sans pour cela s'écarter de l'esprit et du cadre ou de la portée de l'invention Par exemple, on pourrait utiliser une car- touche de section carrée ou rectangulaire dans le procédé de l'invention On pourrait également utiliser ou dévelop- per, pour certaines applications, d'autres tampons de p H, comme des tampons à base de sulfates ou de carbonates. On notera que les "Biogel HTP" sont des hydroxy- apatites en poudre, que leur fabricant expédie sous forme de suspension dans du tampon de phosphate 0,l OM Le "Biogel HTP'l, qualité pour ADN, permet notamment une bonne sépara- tion de l'Acide Desoxyribonucléique (ADN)à double brin d'avec l'ADN à brin unique Ces hydroxyapatites ont de grandes capacités d'adsorption d'acides nucléiques et de protéines Leur surface spécifique est d'environ 50 m 2/g. REVENDICATIONS 1 Procédé pour séparer par chromatographie des protéines complexes, à partir d'un échantillon, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: (a) combiner, dans un dispositif de chromatographie, en présence d'un tampon de p H, un liquide contenant des protéines complexes avec un milieu pour chromatographie comprenant des particules d'hydroxyapatite cristalline hydratée ayant une surface spécifique initiale disponible pour lier lesdites protéines complexes, ces particules étant immobilisées de façon permanente dans une feuille poreuse, essentiellement non gonflable, cette feuille per- mettant auxdites particules d'hydroxyapatite cristalline hydratée, d'interagir avec le liquide de manière que la combinaison de la surface spécifique liée aux protéines complexes et de la surface spécifique non liée soit essen- tiellement égale à ladite surface spécifique initiale, en formant ainsi plusieurs complexes de protéines complexes/particules d'hydroxyapatite; et (b) dissocier lesdites protéines complexes desdits complexes de protéines complexes/particules d'hydroxy- apatite, en combinant lesdits complexes avec au moins une solution pour élution, cette solution pour élution s'écou- lant approximativement au même débit dans ce milieu pour chromatographie, du début à la fin de la dissociation. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la feuille poreuse, essentiellement non gonfable, est choisie parmi du polytétrafluroéthylène et du papier de fibres de verre; le tampon de p H a un p H compris entre environ 5,5 et environ 10 et une concentration en phosphate comprise entre environ 0,001 et environ 0,10 M; et lesdites protéines contiennent au moins une classe d'anticorps. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'au moins une classe d'anticorps consiste en des anti- corps monoclonaux. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les particules d'hydroxyapatite cristalline hydratée représentent au moins 40 % environ du poids du milieu pour chromatographie et ont une distribution des tailles parti- 5 culaires comprise entre environ 15 et environ 60 pm. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins une solution pour élution comprend un gra- dient de phosphate ayant une concentration terminale égale à au moins 0,14 M environ. 6 Appareil de chromatographie pour purifier des anticorps, cet appareil étant caractérisé en ce qu'il comprend: une embouchure ( 1; 101) d'entrée; un moyen ( 5; 104) pour distribuer l'écoulement et recevoir l'écoulement provenant de l'embouchure ( 1; 101) d'entrée; une garni- ture ( 10) d'étanchéité à l'entrée; un moyen, enroulé en spirale ou enveloppé en forme de noyau ou autour d'un noyau pour séparation chromatographique, qui est annulaire et comporte une surface cylindrique interne et une surface cylindrique externe, ce moyen comprenant des particules ( 62; 107) d'hydroxyapatite cristalline hydratée physique- ment enmprisonnées dans une feuille ( 60; 106) poreuse, essentiellement non gonflable, ces particules ( 62; 107) ayant une surface spécifique initiale disponible pour fixer des anticorps monoclonaux et la feuille ( 60; 106) empê- chant, pendant la purification, les particules ( 62; 107) de modifier sensiblement leur emplacement spatial au sein dudit moyen, enroulé en spirale ou enveloppé en noyau ou autour d'un noyau, pour séparation chromatographique; un support ( 40) central poreux sur lequel est enveloppé ledit moyen, enroulé en spirale ou enveloppé en noyau ou autour d'un noyau, pour séparation chromatographique; une garni- ture ( 15) d'étanchéité à la sortie; une embouchure ( 2) de sortie; et un moyen ( 3; 103), en forme d'enceinte annu- laire de confinement, destiné à relier axialement l'embou- chure ( 1) d'entrée et l'embouchure ( 2) de sortie, ce moyen comportant une surface annulaire interne qui ne vient pas au contact de la surface cylindrique externe du moyen, enroulé en spirale ou enveloppé en noyau, pour séparation chromatographique, et qui contient le moyen ( 5; 104) de distribution de l'écoulement, les garnitures ( 10, 15)5 d'étanchéité à l'entrée et à la sortie, le support ( 40) central poreux et le moyen pour séparation chromatographique. 7 Appareil selon la revendication 6, caractérisé en ce que la feuille ( 60; 106) poreuse et sensiblement non gonflable est en polytétrafluoréthylène. 8 Appareil selon la revendication 7, caractérisé en ce que le support ( 40) central est en polypropylène poreux. 9 Appareil selon la revendication 6, caractérisé en ce que les particules ( 62; 107) d'hydroxyapatite cristal- line hydratée représentent au moins 40 % environ en poids du milieu pour chromatographie et ont une distribution des tailles particulaires se situant entre environ 15 pm et environ 60 pm. Appareil selon la revendication 6, caractérisé en ce que les particules ( 62; 107) d'hydroxyapatite cris- talline hydratée représentent au moins 75 % environ du poids dudit milieu pour chromatographie et ont une distri- bution de la taille particulaire se situant entre environ et environ 60 pm.