FR 2672895 A1 19920821 FR 9101830 A 19910215 PROCEDE DE PURIFICATION D'UNE PROTEINE FORTEMENT GLYCOSYLEE La présente invention concerne un procédé de purification d'une protéine fortement glycosylée. Par définition, une protéine est essentiellement constituée d'une chaîne d'acides aminés De plus, dans un grand nombre de cas, cette chaîne porte en quantité plus ou moins importante des groupements glucidiques de taille variable Les protéines portant de tels groupements sont appelées protéines glycosylées. D'une manière générale, il est connu que des métaux tels que le zinc, le cuivre, le cobalt, le calcium ou le nickel peuvent se complexer à des composés de nature protéique. Ainsi ces métaux sont couramment utilisés dans des procédés de purification de protéines; soit en tant qu'agent de couplage, par exemple lors d'une chromatographie d'affinité; soit pour précipiter des protéines en milieu liquide. De manière surprenante, il a maintenant été trouvé que des protéines fortement glycosylées ne sont pas capables de se complexer aux métaux mentionnés ci-dessus. En conséquence, l'invention propose un procédé pour purifier une protéine fortement glycosylée à partir d'une préparation brute qui comprend l'acte (i) d'ajouter à ladite préparation un ion métallique bivalent en quantité suffisante de manière à former un mélange qui précipite et (ii), après précipitation, de récolter ladite protéine dans le surnageant du mélange - -2- Par protéine tortement glycosylée, on entend une protéine ayant un taux de glycosvlation d'au moins 20 %, de préférence d'au moins 30 %, de manière tout à fait préférée, d'au moins 40,,o Le taux de glycosylation est le rapport entre la masse de la glycosylation et la masse totale de la protéine, exprimé en pourcentage La fétuine, Ics g lycoprotéines gp I 20 () et gp 16 O du virus HIV, les mucines, l'interleukine-2 humaine, les protéines "glycophorine like" et l'alpha-l-glycoprotéine acide présente dans le sérum sont par exemple des protéines présentant naturellement un fort taux de glycosylation. Par préparation brute d'une protéine fortement glycosylée, on entend tout fluide contenant ladite protéine en mélange avec n'importe quel autre constituant. De nos jours de nombreuses protéines hétérologues sont produites en culture de cellules grâce aux techniques de I'ADN recombinant Il convient donc de purifier de telles protéines a partir d'un extrait acellulaire dérivé d'une culture de cellule Ce type de preparation brute comprend bien évidemment un grand nombre de constituants "parasitesl'. en particulier de nature protéique, qu'il est souhaitable d'éliminer pour obtenir une proteine hétérologue sous forme substantiellement purifiée. Dans le cadre de la présente invention, une protéine fortement glycosvlée est avantageusement punrtiée à partir d'un extrait acellulaire dérivé d'une culture dc cellules cucaryotes de préférence d'une culture de cellules de mammifèzre Cet extrait acellulaire peut être un surnageant de culture de cellules dans les cas o soit la protéine est sécrétée dans le milieu de culture soit les cellules sont, en cours de culture, lysées par un virus. De manière alternative l'extrait accllulaire peut être aussi obtenu à partir d'une suspension cellulaire soumlse à un traitement lytique de type chimique, mécanique ou enzymatique ct dont l'élément liquide cst ensuite séparé des débris cellulaires. Pour usage dans le cadre de la présente invention, un ion métallique bivalcnt est avantagtcusement sélcctionné parmi le Zn 2 +, Cu 2 +, Co 2 + , Ni 2 + et Ca 2 + De préférencc cet ion ()O mctallique cst ajouté stous lorme saline A titre d'exemple, on cite le Zn CI 2, le Cu SO, le Co SO 4, le Ni SO et le Ca CI,. D'une manière générale la quantité d'ion métallique qu'il convicnt d'ajouter à la preparation brute dépcnd de la nature même de l'ion métallique et des constituants que l'on souhaite éliminer L'homme du métier saura bien évidemment adapter la concentration finale optimale cn fonction des donnéies spécifiqucs Toutefois, on indique que les contaminants présents dans la préparation brute peuvcnt précipiter dès que l'on ajoute l'ion métallique à une concentration finale d'au moins 10 m M, avantageusement d'au moins 40 m M, de préférence d'au moins 60 m M, de manière tout à fait préférée d'au moins 80 () m M Bien qu'il soit possible d'ajouter l'ion métallique en quantité, il n'est 3 - généralement pas nécessaire de dépasser une concentration finale d'environ 100 à m M. Avantageusement lc procédé selon l'invention est effectué à un p H acide ou proche de la neutralité, en général de 7,5 ou inférieur à 7,5 De préférence, le procédé est effectué à un p H légèrement acide compris entre 6 et 7. Après précipitation le surnageant est avantageusement récolté par centrifugation du mélange et décantation successive. Un tel procédé permet entre autre d'éliminer, de manière simple et efficace, les virions qui peuvent se trouver présents dans la préparation brute puisque ceux-ci comportent une capside (coque) protéique non ou faiblement glycosylée qui peut se complexer à un ion métallique bivalent Si nécessaire, la purification de la protéine fortement glycosylée présente dans le surnageant de précipitation peut être par la suite poursuivie de manière plus fine selon des méthodes varices. Selon un aspect particulier, l'invention propose un procédé de purification de la gp I 20 du virus HIV ou d'un variant soluble de la gpl 6 O du virus HIV Certains variants de la gp I 6 O sont décrits, par exemple, dans la demande de brevet EPA 245 136 La gp I 20 ou un variant soluble de la gpl 6 O peut être notamment produit par les techniques de l'ADN recombinant Un vecteur destiné à cette production est par exemple un virus de la vaccine dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour la gp 120 ou un variant soluble de la gp 16 O celui-ci étant placé sous le contrôle de régions appropriées permettant son expression (transcription et traduction). Enfin de manière alternative l'invention concerne un procédé pour purifier ou concentrer un poxvirus à partir d'un lysat cellulaire obtenu par infection d'une culture de cellules infectées par ledit poxvirus, qui comprend l'acte (i) d'ajouter à ladite préparation un ion métallique bivalent en quantité suffisante de manière à former un mélange qui précipite et (ii) après précipitation, de récolter ledit poxvirus sous forme d'un précipitai -4- Exemple 1: A Production de la gp 120 de HIV 1-BRU en culture de cellules infectées par un virus de la vaccine recombinant: Des cellules BHK-21 sont cultivées dans un milieu GMEM (Gibco) supplémenté avec 10 % de sérum de veau tfoetal (SVF) Lorsque les cellules sont à confluence ( 5,8 x 106 cellules/ml) le milieu de culture est enlevé et le tapis cellulaire est lavé 2 fois avec 50 ml de PBS (Dubelcco's phosphate buffer salt; Seromed) Puis du milieu GMEM frais sans SVF est rajouté On ajoute alors le virus de la vaccine VVTG 1132, décrit dans la demande de brevet EPA 245 136, à une intfectivité de 10-' ufp (unité formant plages), et l'infection est poursuivie pendant 72 h Le lysat est alors centrifugé 20 min à 10 000 g pour éliminer les débris cellulaires et on récupère le surnageant contenant entre autre la gp 120 et des virions. B Purification de la gp 120: A 20 ml de surnageant de culture obtenu comme précédemment décrit, on ajoute 1,3 ml d'une solution de chlorure de zinc (Zn CI) à 1 M pour avoir une concentration finale cn Zn CI 2 de 60 m M Le p H de ce mélange est d'environ 6,8 Le mélange est laissé i h dans de la glace puis le surnageant de précipitation est récupéré après centrifugation à () t, min pendant 20 ( min dans une centrifugeuse Minifuge RF Heracus Celui-ci contient la quantité initiale de gp I 20 trouvée dans le surnageant de culture mais ne contient plus entre autre dc virion Pour analyse, on effectue une quantification des protéines totales et de la gp 120 ainsi qu'une titration de virus de la vaccine par les méthodes décrites ci-dessous Ces quantifications sont laites en parallèle sur le surnageant de culture brut non traité au Zn CI,. 3 ( O La quantification dcs protéines totales s'etffectue comme suit selon la méthode du Biuret décrite par Kadenbach B l Biochcm Z ( 1966), 344, 49-75 l: 3 ml de surnageant obtenu après précipitation par le Zn CI 2 sont traités avec 300 -tl d'acide trichloracétique (TCA) 3 M Après 1 h à 20 C les protéines sont précipitées et la solution cst ccntrifugée 20 min à 3000 tours par minute dans une centrifugeuse Minifuge RF Heraus Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans 1 ml de solution Biurct ( 12 m M de sulfaitc de cuivre (Cu SO 4, 5 H 2,0), 31,89 m M tartrate de sodium potassium (K Na Tartrate) 2001 m M dc soude (Na OH) et 30,12 m M de iodure de potassium (IK)) Après 15 min les protéines sont dissoutes dans la solution de Biuret et on rajoute I ml d'eau Milli-Q La densité optique (DO) à 546 nm est mesurée dans des cuvettes de 4 ( O I cm contre l'air On mesure également la DO d'un témoin d'absorption dans lequel -5- seules la solution de Biuret et l'eau ont été rajoutées La valeur de la DO est notée DO E pour les échantillons ou DO T pour le témoin d'absorption 50 à 100 mg de cyanure de potassium (KCN) sont alors rajoutés dans les cuvettes et mélangés dans la solution à l'aide d'une spatule Aprés 2 à 5 min la DO à 546 nm est mesurée et sa valeur est notée DO E/KCN pour les échantillons et DO T/KCN pour le témoin d'absorption La quantité totale de protéines dans les échantillons (Q) se calcule alors par la formule suivante Q = 7 x (DO E DO E/KCN) (DO T DO T/KCN) La quantification de la gp 120 s'effectue par test ELISA en utilisant deux anticorps monoclonaux anti-gp I 20 comme premier et deuxième anticorps, le second étant biotinilé. La marge d'incertitude associée à une telle méthode d'estimation est de l'ordre de + 20 % La titration du virus s'effectue sur des cellules BHK21 2 ml de milieu GMEM contenant 10 % de SVF sont ensemencés avec i 06 cellules BHK-21 La culture se fait à 37 C dans des boites de 35 x 10 mm Après 24 h le milieu est enlevé et 200 F Ll d'une dilution du virus de la vaccine dans du PBS sont rajoutés sur les cellules L'adsorption se fait pendant I h à 37 C, puis on ajoute 2 ml de milieu GMEM contenant 5 % de SVF et l'infection est poursuivie pendant 24 h à 37 C Le milieu est alors retiré et on colore les cellules avec I ml de rouge neutre (Gibco) On compte les plages de lyse restées blanches. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Echantillons Concentration des Concentration Titration du protéines totales de la gp I 20 virus de la (Lg/ml) ( tg/ml) vaccine (ufp/ml) Surnageant de culture 257 0,202 106 Surnageant après 61,3 0,206 O précipitation au Zn CI 2 Ces résultats montrent que la protéine gp 120 n'est pas précipitée par le Zn CI 2 alors que la majorité des protéines contaminantes le sont De même le virus de la vaccine est éliminé dans le culot de précipitation. Grâce à ce procédé, il est donc possible d'éliminer en une seule étape les virions ainsi que plus de 50 % des protéines contaminantes. -6- Exemples 2 à 6: Un extrait acellulaire contenant la gp 120 est obtenu comme décrit dans l'Exemple IA De même, la gp I 20 est purifiée selon des procédés similaires à celui présenté à l'Exemple l B dans lequel seule la concentration finale en Zn C 12 peut varier de 5 m M à m M Les résultats dc ces expériences sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 Echantillons Concentration Concentration Titration du en protéines en variant virus de la totales ( g/ml) gp 120 vaccine (ufp/ml) (lg/ml) Contrcle Surnazcant de 257 0, 202 106 culture Surnagcant après Ex 2 precipitation 87 0,161 2 x 104 avec 5 m M de Zn C 2 I, Surnageant après Ex 3 précipitation 74 0,182 103 avec 1 ( O m M de Zn CI, Surnageant après Ex 4 precipitation 72 0,184 5 x 102 avec 20 n M dc Zn CI, Surnageant après Ex 5 précipitation 63 ( 0,248 50 avec 40 n M de Zn CI, Surnageant après Ex 6 précipitation 69 0,254 compte tenu de la marge d'incertitude de + 20 % associée à la méthode d'estimation. Exemple 7: A 20 ml de surnageant de culture contenant la gp 120 obtenu comme précédemment décrit dans l'exemple 1 A, on ajoute 1,3 ml d'une solution de chlorure de calcium (Ca CI 2) à 1 M pour avoir une concentration finale en Ca CI 2 de 60 m M Le p H de ce mélange est d'environ 6,8 Le mélange est laissé 1 h dans de la glace puis le surnageant de précipitation est récupéré après centrifugation à 3000 t/min pendant 20 min dans une centrifugeuse Minifuge RF Heraeus Celui-ci contient la quantité initiale de gp 120 trouvée dans le surnageant de culture mais ne contient plus entre autre de virion Pour analyse, on effectue une quantification des protéines totales et de la gp 120 ainsi qu'une titration de virus de la vaccine par les méthodes décrites dans l'exemple l B Ces quantifications sont faites en parallèle sur le surnageant de culture brut non traité au Ca CI 2. Les résultats de ces expériences sont rapportés dans le tableau 3 cidessous. Tableau 3 Echantillons Concentration des Concentration Titration du protéines totales de la gp 120 virus de la (.tg/m 1) (pg/ml 1) vaccine (ufp/ml) Surnageant dc culture 218 0,360 1,5 10 s Surnageant après 139 0,374 virus de la vaccine alors que la gp 120 reste en solution. précipite la majorité du Exemples 8 à 10: Un extrait acellulaire contenant la gp 120 est obtenu comme décrit dans l'Exemple 1 A De même, la gp I 20 est purifiée selon des procédés similaires à celui présenté à l'Exemple 7 dans lequel seule la concentration finale en Ca CI 2 peut varier de 20 m M à -8- m M Les résultats de ces expériences sont rapportés dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4 Echantillons Concentration Concentration Titration du en protéines en variant virus de la totales (tg/ml) gp 120 vaccine (ufp/ml) (j Lg/ml) Contrôle Surnageant de 218 0, 280 1,5 x 105 cellules Surnageant après Ex 8 précipitation 163 0,282 7 x 103 avec 20 m M de Ca CI, Surnageant après Ex 9 précipitation 149 0,330 commencent à précipiter dès 1 ( O m M de Ca CI 2. Exemple Il: Un extrait acellulaire contenant un variant soluble de la gp 160 de HIV 1-BRU, est obtenu après infection de cellules BHK-21 par le virus de la vaccine VVTG 1163 décrit dans la demande dc brevet EPA 245 136, selon la méthode décrite dans l'exemple i A. A 20 ( ml de surnageant de culture contenant le variant soluble de la gp 160 obtenu comme précédemment décrit, on ajoute 0,88 ml d'une solution de Zn CI 2 à 1 M pour avoir une concentration finale cn Zn CI, de 4 ( O m M Le mélange est laissé 1 h dans de la glace puis le surnageant de précipitation est récupéré après centrifugation à 3000 t/min pendant -9- min dans une centrifugeuse Minifuge RF Heraeus La quantité du variant gp 160 présente dans le surnageant après précipitation au Zn C 12 est comparable à celle trouvée dans le surnageant de culture; par contre la majorité des protéines contaminantes sont éliminées ainsi que la totalité des virions. - REVENDICATIONS 1 Un procédé pour purifier une protéine fortement glycosylée à partir d'une préparation brute qui comprend l'acte (i) d'ajouter à ladite préparation un ion métallique bivalent en quantité suffisante de manière à former un mélange qui précipite et (ii), après précipitation, de récolter ladite protéine dans le surnageant du mélange. 2 Un procédé selon la revendication 1, pour purifier une protéine fortement glycosylée à partir d'une préparation brute qui est un extrait acellulaire dérivé d'une culture de cellules qui comprend l'acte (i) d'ajouter à ladite préparation un ion métallique bivalent en quantité suffisante de manière à former un mélange qui précipite et (ii), après précipitation, de récolter ladite protéine dans le surnageant du mélange. * Un procédé selon la revendication 2, pour purifier une protéine fortement glycosylée à partir d'une préparation brute qui est un extrait acellulaire dérivé d'une culture de cellules infectées par un virus de la vaccine exprimant ladite protéine fortement glycosylée, qui comprend l'acte (i) d'ajouter à ladite préparation un ion métallique bivalent en quantité suffisante de manière à former un mélange qui précipite et (ii), après précipitation de récolter ladite protéine dans le surnageant du mélange. 4 Un procédé selon l'une quelconque des revendications I à 3, pour purifier à partir d'une préparation brute une protéine dont le taux de glycosylation est d'au moins % qui comprend l'acte (i) d'ajouter à ladite préparation un ion métallique bivalent en quantité suffisante de manière à former un mélange qui précipite et (ii) après précipitation de récolter ladite protéine dans de surnageant du mélange. Un procédé selon n'importe laquelle des revendications 1 à 4, pour purifier une protéine fortement glycosylée à partir d'une préparation brute qui comprend l'acte d'ajouter à ladite préparation un ion métallique bivalent pour former un mélange dans lequel l'ion métallique a une concentration finale d'au moins 10 m M. 0 Un procédé selon la revendication 5, pour purifier une protéine fortement glycosylée à partir d'une préparation brute qui comprend l'acte d'ajouter à ladite préparation un ion métallique bivalent pour former un mélange dans lequel l'ion métallique a une concentration finale d'au moins 20 m M. il - 7 Un procédé selon n'importe laquelle des revendications 1 à 6, pour purifier une protéine fortement glycosylée à partir d'une préparation brute qui comprend l'acte d'ajouter à ladite préparation un ion métallique bivalent sélectionné parmi le zinc, le cuivre, le cobalt ou le nickel. 8 Un procédé selon n'importe laquelle des revendications 1 à 7, pour purifier une protéine fortement glycosylée à partir d'une préparation brute qui comprend l'acte d'ajouter à ladite préparation un ion métallique bivalent sous forme saline. 9 Un procédé selon n'importe laquelle des revendications 1 à 8, dans lequel la protéine fortement glycosylée est la protéine gp I 20 du virus HIV. Un procédé selon n'importe laquelle des revendications 1 à 8, dans lequel la protéine fortement glycosylée est un variant soluble de la protéine gpl 6 O du virus HIV. 11 Un procédé pour purifier ou concentrer un poxvirus à partir d'un lysat cellulaire obtenu par infection d'une culture de cellules infectées par ledit poxvirus, qui comprend l'acte (i) d'ajouter à ladite préparation un ion métallique bivalent en quantité suffisante de manière à former un mélange qui précipite et (ii), après précipitation de récolter ledit poxvirus sous forme d'un précipita.