FR 2667325 A1 19920403 FR 9011977 A 19900928 PROCEDE DE SEQUENCAGE RAPIDE DE SEQUENCES BIOLOGIQUES LI- NEAIRES ET ORDONNEES. La présente invention est relative à un pro- cédé de séquençage rapide de séquences biologiques li- néaires et/ou préalablement linéarisées et ordonnées, no- tamment des protéines et des acides nucléiques. Les méthodes actuelles de détermination tant des protéines que des acides nucléiques sont lourdes à mettre en oeuvre. Pour la détermination des protéines, on peut citer notamment la méthode d'Edman. Pour la détermination de la séquence d'un acide nucléique, il existe à l'heure actuelle, schémati- quement deux grands types de méthodes: les méthodes chi- miques et les méthodes enzymatiques. La méthode chimique, représentée essentielle- ment par la méthode de Maxam et Gilbert, est basée sur l'obtention de fragments dont la taille permet de définir la position d'une des quatre bases Avant toute détermi- nation, l'ADN est purifié sous forme simple-brin, puis marqué à l'une de ses extrémités par le 32 P Il est alors séparé en quatre sous-ensembles qui subissent chacun un traitement chimique différent, qui altère de façon abso- lument spécifique un type de base (modification de la base, élimination de la base modifiée et coupure du brin au niveau du résidu sucré) et entraîne le clivage de la- dite séquence en deux fragments Les paramètres chimiques sont choisis de façon à ce que chaque fragment ait en moyenne une seule base modifiée, puis éliminée Après clivage, chaque sous-ensemble contient donc une popula- tion de fragments marqués de taille variable, ayant tous une même extrémité et se terminant par un même type de base dans la séquence. Après séparation électrophorétique et révéla- tion par autoradiographie, la longueur du segment observé est égale à la distance entre le point de coupure et le 2 point de marquage Comme la résolution des gels de poly- acrylamide utilisés est d'une base, l'enchaînement des fragments sur l'autoradiogramme correspond à l'enchaîne- ment des bases dans le fragment d'ADN.5 La lecture est directe et une séquence de 100 à 400 bases peut être lue sur un seul gel. Cette méthode est plutôt adaptée aux fragments de l'ordre de 500 pb, présents en assez grande quantité et pour lesquels les structures secondaires sont impor- tantes. La méthode enzymatique, essentiellement repré- sentée par la méthode de Sanger, consiste à faire synthétiser par une enzyme appropriée (polymérase ou transcriptase réverse), le brin complémentaire au brin que l'on désire séquencer et qui doit être intégré dans un vecteur simple ou double-brin susceptible de se répliquer. La synthèse du second brin est effectuée en présence des 4 désoxyribonucléotides (d ATP, d CTP, d TTP, d GTP), dont au moins un doit être marqué radioactivement, et d'une amorce qui va s'hybrider à une région juste en amont du fragment à séquencer. Le principe de cette technique consiste en l'addition d'un didésoxynucléotide spécifique différent (dd ATP, dd CTP, dd TTP ou dd GTP) dans quatre tubes de réac- tion Ces dd NT Ps peuvent être incorporés dans la chaîne en élongation, mais ne possédant pas de groupement hydroxyle en 3 ', leur incorporation arrête l'élongation du brin Chaque tube réactionnel contient donc, en fin de réaction, une population de fragments de taille variable ayant tous la même extrémité 5 ' et se terminant par le même didésoxynucléotide (dd NTP) La taille des fragments synthétisés, donc la taille des fragments détectables par autoradiographie après électrophorèse est égale à la dis- tance entre le début de l'amorce et la base o s'est ar- rêtée la réplication. Il est possible, par cette technique, de déterminer des séquences de 300 à 800 bases suivant la longueur et la qualité des gels de polyacrylamide qui servent à la séparation. D'autres méthodes ont été proposées pour per- mettre de réduire les étapes de sous-clonage (séquençage du fragment double-brin, utilisation de la PCR, séquen- çage en shot gun, par exemple). La méthode en shot gun, en particulier, consiste à cloner des fragments du gène à séquencer au hasard dans M 13 sans avoir aucune information sur leur organisation dans le génome. Les fragments sont ensuite séquences et leur agencement se fait par recoupement à l'aide d'un ordina- teur; toutefois, cette méthode nécessite le séquençage direct d'au moins 20 % des séquences que l'on n'a pas pu replacer par recoupage. Etant donné la difficulté d'obtention des sé- quences manquantes, des adaptations plus performantes ont été mises au point; on peut citer brièvement la méthode de séquençage par clonage et délétions enzymatiques et la méthode de séquençage par délétions provoquées par un transposon. Toutefois, toutes ces méthodes sont lourdes à mettre en oeuvre. La Demande Internationale PCT WO 89/03432 dé- crit, pour sa part, une méthode de séquençage rapide d'ADN et d'ARN, dans laquelle un fragment simple brin d'ADN ou d'ARN éventuellement fixé sur un support solide est mis dans un liquide en flux et est clivé par une exo- nucléase, à partir de l'une de ses extrémités, de manière à former une suite de bases dans l'échantillon en flux. Les bases sont ensuite détectées lors de leur passage séquentiel à travers un détecteur, pour reconstruire la séquence en bases dudit fragment d'ADN ou d'ARN à déter- miner Dans un mode de réalisation particulier, le brin complémentaire à la séquence à déterminer, est synthétisé en présence de nucléotides modifiés et possédant chacun une caractéristique spécifique (fluorescence différente). Le fragment synthétisé est ensuite mis sur un support5 solide dans l'échantillon liquide en flux et les différents nucléotides identifiables sont clivés séquentiellement et détectés. Cependant, dans un tel procédé, l'ensemble des bases ne peut pas en fait être marqué, notamment pour des raisons d'encombrement stérique. L'invention a pour objet un procédé de séquen- çage de séquences biologiques linéaires ou linéarisées et ordonnées qui réponde mieux aux nécessités de la pratique que les procédés de l'Art antérieur, notamment en permet- tant d'obtenir beaucoup plus rapidement que dans les pro- cédés antérieurement décrits la séquence complète, à par- tir de fragments marqués partiellement. L'invention propose à cet effet un procédé de séquençage des éléments constituant une séquence bio- logique linéaire ou linéarisée et ordonnée, le procédé consistant notamment à extraire, à purifier et éventuel- lement à fragmenter et/ou à amplifier une séquence biolo- gique pour obtenir une pluralité de séquences identiques, à associer aux éléments de ces séquences des marqueurs spécifiques appropriés, puis à identifier séquentielle- ment et dénombrer les marqueurs associés auxdits éléments pour en déduire une séquence complète d'éléments, carac- térisé en ce qu'il consiste à marquer lesdites séquences par l'ensemble des marqueurs spécifiques précités, l'efficacité du mar- quage étant inférieure à 100 %, à détecter et identifier séquentiellement les marqueurs associés aux éléments dans lesdites séquences, pour obtenir des séquences lacunaires ou in- complètes d'éléments marqués, qui diffèrent les unes des autres par les éléments marqués, qui comprennent chacune % un nombre d'éléments marqués inférieur au nombre N d'éléments constituant ladite séquence complète, et dans chacune desquelles les intervalles entre éléments marqués ont des longueurs inconnues, et5 à reconstituer la suite ordonnée d'éléments constituant la séquence complète, en calculant à partir desdites séquences lacunaires les probabilités de pré- sence des éléments dans la séquence complète, et en rete- nant les éléments dont les probabilités de présence sont voisines de 1 ou égales à 1 tandis que les probabilités de présence des autres éléments sont voisines de O ou égales à 0. On entend par séquence biologique linéaire ou linéarisée, au sens de la présente invention, aussi bien les protéines, dont les éléments sont les acides aminés naturels, que les acides nucléiques (ADN et ARN), dont les éléments sont les bases ou nucléotides: adénine, cytosine, guanine, thymidine, symbolisées par les lettres A, C, G et T pour l'ADN et A, C, G et U (uracile) pour 1 'ARN Pour des raisons de simplicité, dans la suite, l'ARN sera symbolisé par les mêmes lettres que l'ADN. Selon une autre caractéristique de l'invention, ce procédé consiste également à calculer les probabilités de présence des éléments dans la séquence complète en partant de valeurs initiales prédéterminées de ces probabilités et en tenant compte des éléments mar- qués présents dans une première séquence lacunaire, puis à modifier les probabilités ainsi obtenues en tenant compte des éléments marqués présents dans une deuxième séquence lacunaire, et ainsi de suite, jusqu'à arriver à des probabilités égales à 1 ou voisines de 1 pour chaque élément de la séquence complète. Selon encore une caractéristique de l'invention, le procédé consiste en outre à effectuer les calculs précités en procédant élément par élément et emplacement par emplacement de la séquence complète, en 6 calculant la probabilité de présence de chaque élément possible pour un emplacement donné, puis la probabilité de présence de chaque élément possible pour l'emplacement suivant dans la séquence complète, et ainsi de suite.5 Cette façon de faire simplifie les calculs et réduit largement le temps de traitement sur un ordinateur ou un micro-ordinateur. La probabilité de présence d'un élément Bj en un emplacement i dans la séquence complète est alors don- née par la formule suivante i Pp-B (Bj) P (Sp/Bj) Pp (Bj) = ________ 4 Y P (Bj) P (S /Bj) j= 1 p -1 Pp (Bj) étant la probabilité de la présence de l'élément Bj à l'emplacement i de la séquence complète après considération de p séquences lacunaires, i Pp-, (Bj) étant la probabilité de la présence de l'élé- ment Bj à l'emplacement i de la séquence complète après considération de (p-1) séquences lacunaires, P(Sp/Bj) étant la probabilité de la séquence lacunaire S Pl connaissant l'élément Bj à l'emplacement i. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, le procédé consiste préalablement à détermi- ner le nombre N d'éléments de la séquence complète. Selon encore une autre caractéristique avanta- geuse de l'invention, le procédé consiste préalablement à déterminer, pour chaque type d'élément, le nombre total d'éléments de ce type dans la séquence complète, et ce, indépendamment de leur position dans la séquence. Selon une disposition avantageuse de l'invention, le nombre d'éléments de chaque type dans la séquence complète est déterminé par voie chimique. On peut ainsi initialiser le calcul des 7 probabilités à partir du nombre d'éléments de chaque type dans la séquence complète, la valeur initiale de la probabilité d'un élément Bj en un emplacement étant égale à nj/N, nj étant le nombre total d'élément Bj dans la sé- quence complète et N le nombre total d'éléments dans cette séquence. Pour que le calcul puisse s'effectuer assez rapidement, le nombre N est choisi par exemple compris entre 10 et 30 environ. Dans le cas d'une séquence biologique qui com- prend un grand nombre d'éléments, on considère des séquences complètes de N éléments qui se recouvrent mutuellement à leurs extrémités, N étant compris entre 10 et 30 environ et on détermine, de la façon précitée, les suites d'éléments constituant ces séquences successives, ce qui permet de reconstituer la séquence biologique com- plète considérée. L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci appa- raîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés, dans lesquels les figures l A et 1 B représentent les principales étapes du procédé selon l'invention, appliqué au séquençage d'un acide nucléique. Une première étape du procédé, désignée par la référence 10 en figure l A, consiste de façon classique à extraire et à purifier un fragment d'acide nucléique, et éventuellement à l'amplifier lorsqu'il est présent en très petites quantités, par exemple par la méthode PCR. La seconde étape du procédé, désignée par la référence 12, consiste à associer aux bases des fragments d'acide nucléique des marqueurs spécifiques qui, pour des raisons d'encombrement stérique, ne pourront pas être associés à toutes les bases de ces fragments. On peut, de façon connue, procéder à des copies du fragment d'ADN par une polymérase appropriée, t 'I en présence des nucléotides A, C, G et T et d'analogues des nucléotides marqués spécifiquement par des fluoro- chromes différents appelés ci-après a, c, g et t: a marque spécifiquement l'adénine, c marque spécifiquement la cytosine, g marque spécifiquement la guanine et t marque spécifiquement la thymidine. On obtient ainsi un ensemble de fragments d'ADN qui sont marqués partiellement et différemment, les bases marquées n'étant pas les mêmes dans les différents fragments, les nombres de bases marquées différant égale- ment d'un élément à l'autre. L'étape suivante du procédé, désignée par la référence 14, consiste à détecter ou à lire les bases marquées On peut pour cela étaler les différents frag- ments d'ADN sur une lame de microscope, et détecter les marqueurs associés à des bases par exemple au moyen d'un microscope à effet tunnel ou par holographie conosco- pique. On obtient ainsi, comme représenté en 16, un ensemble de séquences lacunaires Sl, 52, 53,, Sp,, de bases marquées, dans lequel une séquence lacunaire va différer d'une autre par le nombre de bases marquées, les emplacements des bases marquées, et les intervalles entre bases marquées. Selon l'invention, la connaissance de cet ensemble de séquences lacunaires ou incomplètes de bases marquées permet de remonter à la séquence complète de bases constituant le fragment d'acide nucléique étudié. On va, pour cela, calculer la probabilité de présence de chaque base possible A, C, G ou T en chaque emplacement i d'une base dans la séquence complète à par- tir des informations contenues dans les séquences lacu- naires précitées, qui sont des suites incomplètes, mais ordonnées de bases marquées Théoriquement, la formule de BAYES permet de calculer la probabilité d'une combinaison quelconque Ck de N éléments, connaissant un ensemble S de suites partielles d'éléments tirées d'une combinaison particulière: P(Ck) P(S/Ck) P(Ck/S) = ú P(Ck) P(S/Ck) k avec P(Ck/S) = probabilité d'une combinaison quelconque Ck connaissant S P(Ck) = probabilité d'une combinaison Ck P(S/Ck) = probabilité de S connaissant Ck L'application de cette formule dans le cas présent est pratiquement impossible, en raison du volume de calculs à effectuer: si l'on considère en effet une séquence de N bases, le nombre de combinaisons Ck est égal à 4 N, c'est-à-dire qu'il est supérieur à 106 lorsque N est supérieur à 10. L'invention prévoit donc de simplifier ces calculs, afin de réduire largement leur durée sur un sys- tème de traitement de l'information, en procédant par exemple de la façon suivante: on effectue les calculs en considérant chaque séquence lacunaire 51, 52,, Sp, l'une après l'autre, au lieu de considérer l'ensemble S de ces séquences lacunaires, on calcule, non pas la probabilité d'une sé- quence possible de N bases, mais la probabilité de chaque base possible en chaque emplacement de base du fragment d'acide nucléique considéré. Ces deux simplifications permettent d'arriver à la formule suivante i Pp(Bj) P(Sp/Bj) P (Bj) Plp-j(Bj)-P(Sp/Bj) j= 1 avec Pl (Bj) = probabilité de la base Bj à l'emplacement i de la séquence complète après considération des p premières séquences lacunaires. i Pp-F(Bj) = probabilité de la base Bj à l'emplacement i de la séquence complète après considération des (p-1) premières séquences lacunaires. P(Sp/Bj) = probabilité de la séquence lacunaire Sp connaissant la base Bj à l'emplacement i de la séquence complète. Bj = A, C, G ou T. Un tel calcul est réalisable sans difficulté sur un micro-ordinateur pour des valeurs de N comprises entre 10 et 30 environ, N étant le nombre de bases de la séquence complète recherchée. On peut initialiser ce calcul en considérant que toutes les bases ont des probabilités égales ( 1/4) de se trouver en un emplacement donné de la séquence. Il est cependant plus avantageux d'initialiser le calcul en partant de probabilités qui sont plus proches de la réalité On peut pour cela déterminer, par exemple par un procédé chimique, les nombres n A, n C, n G, n T et le nombre N total de bases A, C, G, T dans la séquence étudiée. Cette étape est désignée par la référence 18 en figure l A. 1 l L'étape suivante du procédé, réalisée sur un micro-ordinateur par exemple, consiste à appliquer la formule précitée. Comme indiqué en 20 en figure l A, on calcule donc les probabilités de présence de chaque base possible en chaque emplacement de la séquence complète, à partir des nombres de bases de chaque type n A, n C, n G, n T et de la première séquence lacunaire Si Les résultats de ce calcul peuvent être présentés sous forme d'un tableau ou10 d'une matrice de valeurs, dans lequel la première ligne indique les probabilités de présence de la base A aux divers emplacements de bases dans la séquence complète, la deuxième ligne indique les probabilités de présence de la base C aux divers emplacements de la séquence com- plète, la troisième ligne indique les probabilités de présence de la base G aux divers emplacements de cette séquence complète, et la quatrième ligne indique les pro- babilités de présence de la base T aux divers emplace- ments de la séquence complète. Par itérations successives et en considérant successivement les séquences lacunaires 52,, Sp, on arrive à un tableau qui va être composé uniquement de 1 et de O (ou de chiffres très voisins de 1 et de chiffres très voisins de 0), les 1 identifiant les bases présentes aux divers emplacements à la séquence complète, les O confirmant que d'autres bases ne se trouvent pas à ces mêmes emplacements. Les séquences lacunaires précitées peuvent bien entendu être considérées dans un ordre quelconque. Il est cependant plus avantageux de les considérer par ordre décroissant de nombre de bases marquées, afin de bénéficier d'un maximum d'informations dès le début des calculs. Il est intéressant également, après avoir effectué les calculs correspondant à un certain nombre de séquences lacunaires, de continuer ces calculs en 12 reprenant les séquences lacunaires les plus riches en informations. Il en résulte une réduction du temps de calcul qui peut être relativement importante. Le nombre de séquences lacunaires à considérer pour la reconstitution d'une séquence complète, varie avec l'efficacité du marquage des bases de cette séquence complète Pour une efficacité de marquage de l'ordre de 30 %, il faudra considérer une vingtaine de séquences lacunaires quelconques, ce nombre pouvant être réduit si l'on selectionne les séquences lacunaires les plus riches en informations La durée des calculs sur un micro-ordi- nateur de type classique peut varier de quelques minutes à quelques dizaines de minutes, selon les cas. Les séquences complètes étudiées peuvent être de longueur quelconque Si le procédé selon l'invention est mis en oeuvre à l'aide d'un microordinateur, il sera avantageux de limiter ce nombre à 30 environ Dans le cas o l'on étudie des séquences de bases relativement longues, il suffit de décomposer ces séquences complètes en séquences successives de 20 à 30 bases environ qui se chevauchent à leurs extrémités, et de déterminer la constitution de ces séquences successives. De façon générale, l'invention est applicable chaque fois que l'on doit reconstituer une séquence bio- logique linéaire et ordonnée à partir d'informations or- données, mais incomplètes Elle s'applique donc aussi bien au séquençage des acides nucléiques qu'à celui des protéines. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien- nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve- nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 Procédé de séquençage des éléments consti- tuant une séquence biologique linéaire ou linéarisée et ordonnée, telle par exemple qu'un fragment d'ADN, ce pro- cédé consistant notamment à extraire, à purifier et éven- tuellement à fragmenter et/ou amplifier ladite séquence biologique pour obtenir une pluralité de séquences iden- tiques, à associer aux éléments constituant ces séquences des marqueurs spécifiques appropriés, puis à identifier séquentiellement et dénombrer les marqueurs associés auxdits éléments pour en déduire une séquence complète d'éléments, caractérisé en ce qu'il consiste à marquer lesdites séquences par l'ensemble des marqueurs spécifiques précités, l'efficacité de ce marquage étant inférieure à 100 %, à détecter et identifier séquentiellement les marqueurs associés aux éléments desdites séquences, pour obtenir des séquences lacunaires ou incomplètes d'éléments marqués, qui diffèrent les unes des autres par les éléments marqués, qui comprennent chacune un nombre d'éléments marqués inférieur au nombre N d'éléments constituant ladite séquence biologique, et dans chacune desquelles les intervalles entre éléments marqués ont des longueurs inconnues, et à reconstituer la suite ordonnée d'éléments constituant la séquence complète, en calculant à partir desdites séquences lacunaires les probabilités de pré- sence des éléments dans la séquence complète, et en rete- nant les éléments dont les probabilités de présence sont voisines de 1 ou égales à 1 tandis que les probabilités de présence des autres éléments sont voisines de O ou égales à 0. 2 Procédé de séquençage selon la revendica- tion 1, caractérisé en ce qu'il consiste à calculer les probabilités de présence des éléments dans la séquence complète, en partant de valeurs initiales prédéterminées de ces probabilités et en tenant compte des éléments mar- qués présents dans une première séquence lacunaire, puis à modifier les probabilités ainsi obtenues en tenant compte des éléments marqués présents dans une deuxième séquence lacunaire, et ainsi de suite, jusqu'à arriver à des probabilités égales à 1 ou voisines de 1 pour chaque élément de la séquence complète. 3 Procédé de séquençage selon la revendica- tion 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il consiste en outre à effectuer les calculs précités en procédant élément par élément et emplacement par emplace- ment de la séquence complète, en calculant la probabilité de présence de chaque élément possible pour un emplace- ment donné, puis la probabilité de présence de chacun des15 éléments possibles pour l'emplacement suivant dans la séquence complète, et ainsi de suite. 4 Procédé de séquençage selon l'une quel- conque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la probabilité de présence d'un élément Bj en un emplacement i dans la séquence complète est égale à i Pp_ 1 (Bj)P(Sp/Bj) p (Bj) =à __i 4 i X Pp-l(Bj) P(Sp/Bj) Pp (Bj) étant la probabilité de la présence de l'élément Bj à l'emplacement i de la séquence complète après considération de p séquences lacunaires, Pp-î (Bj) étant la probabilité de la présence de l'élé- ment Bj à l'emplacement i de la séquence complète après considération de (p-1) séquences lacunaires, P(Sp/Bj) étant la probabilité de la séquence lacunaire Sp connaissant l'élément Bj à l'emplacement i dans la séquence complète. 5 Procédé de séquençage selon l'une quel- A à conque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'après exécution des calculs de probabilité correspon- dant à un certain nombre de séquences lacunaires, il consiste à poursuivre ces calculs en reprenant celles de ces séquences lacunaires qui présentent le plus grand nombre d'éléments marqués. 6 Procédé de séquençage selon l'une quel- conque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste préalablement à classer les séquences lacunaires par nombre décroissant d'éléments marqués et à commencer les calculs de probabilité en considérant d'abord les séquences lacunaires qui présentent le plus grand nombre d'éléments marqués. 7 Procédé de séquençage selon l'une quel- conque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste à déterminer préalablement le nombre N d'éléments de la séquence complète. 8 Procédé de séquençage selon l'une quel- conque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il consiste à déterminer préalablement, pour chaque type d'élément, le nombre total d'éléments de ce type dans la séquence complète. 9 Procédé de séquençage selon la revendica- tion 8, caractérisé en ce que les nombres d'éléments de chaque type dans la séquence complète sont déterminés par voie chimique. Procédé de séquençage selon la revendica- tion 8 ou la revendication 9, caractérisé en ce qu'on initialise le calcul des probabilités à partir des nombres d'éléments de chaqude type dans la séquence com- plète, la valeur initiale de la probabilité de la pré- sence d'un élément Bj en un emplacement donné étant égale à nj/N, nj étant le nombre total d'éléments Bj dans la séquence complète et N le nombre total d'éléments dans cette séquence. 11 Procédé de séquençage selon l'une quel- conque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que N est compris entre 10 et 30 environ. 12 Procédé de séquençage selon l'une quel- conque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il consiste à considérer dans une séquence biologique des séquences complètes de N éléments qui se recouvrent mutuellement à leurs extrémités, et à déterminer de la façon précitée les suites d'éléments constituant ces séquences successives, N étant compris entre 10 et 30 environ. I 1 i