FR 2666583 A1 19920313 FR 9011044 A 19900906 i La présente spirol 4 5 ldécane, pharmaceutiques les Elle concerne formule générale I: 1 - invention a pour objet de nouveaux dérivés du leur procédé de préparation et les compositions renfermant. particulièrement les dérivés du spirol 4 5 ldécane de R 3 R 5 (I) R 1 Z NH X C A N | | 1 Y C=T R 2 dans laquelle: X représente un atome d'oxygène ou de soufre ou une liaison simple; A représente un radical hydrocarboné contenant de 1 à 10 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée renfermant éventuellement une double liaison et/ou éventuellement substitué par un radical hydroxy; Y représente un atome d'oxygène, ou de soufre ou un radical CH 2; T représente un atome d'oxygène ou de soufre; Z représente: * soit un groupe CH-R 7 dans lequel R 7 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle contenant de 1 à 3 atomes de carbone, * soit un groupe carbonyle; -2 2666583 Rl et R 3 * soit représentent chacun simultanément un atome d'hydrogène, * soit forment ensemble un pont (CH 2)n dans lequel N prend les valeurs 1 ou 2, * soit Rl représente un radical méthyle et simultanément R 3 représente un atome d'hydrogène; R 2 et R 6, identiques ou différents représentent chacun un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, et R 4 et R 5, identiques ou différents, représentent chacun un radical alkyle contenant de 1 à 6 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée. L'état antérieur de la technique dans ce domaine est illustré notamment par: le brevet français N O 1 441 575 qui concerne des dérivés du spirol 4 5 ldécane de formule R-K CH 2 0 NH c dans laquelle R représente, entre autres, un groupe Ar-A' dans lequel Ar peut être notamment un radical phényle mono ou disubstitué par des radicaux alkyles ou hydroxy; et A' peut être notamment une chaîne -0-CH 2-CH 2; -3- et le B S M no 4463 M qui mentionne les propriétés analgésiques, anti inflammatoires et broncholytiques de ces dits dérivés, ainsi que leur utilisation à titre de médicaments pour le traitement des états inflammatoires, des bronchospasmes et de la douleur. Les modifications de structure notamment au niveau du substituant R ont conduit aux dérivés (I) de la présente invention, lesquels se différencient des dérivés les plus proches de l'art antérieur non seulement par leur structure chimique mais aussi par leur profil pharmacologique, et leur application thérapeutique, comme le prouve l'étude pharmacologique ci-après exemplifiée. La présente invention a également pour objet le procédé de préparation des dérivés de formule générale I caractérisé en ce que l'on condense un dérivé de formule générale II: R 5. R 6 Rl R 1 X -C -A -W R 2 (II) dans laquelle: X, A, R 1, R 2, R 3, R 4, R 5, et R 6 ont les significations précédemment définies, W représente un atome de chlore ou de brome ou un radical tosyloxy, et R représente un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur facilement hydrolysable tel qu'un groupement acylé ou silylé; R 4 -4- avec un dérivé de formule générale III Z-NH HN | (III) Y C=T dans laquelle Y, Z et T ont les significations précédemment définies et, dans le cas o R est autre qu'hydrogène, on hydrolyse le dérivé ainsi obtenu. La condensation des dérivés II et III est réalisée de façon particulièrement adéquate en opérant dans un solvant approprié tel que par exemple l'acétonitrile, le méthyléthyl cétone, le tétrahydrofurane, le diméthylformamide, l'éthanol ou le propanol, a une température comprise entre 80 et 1000 C, en présence d'un accepteur de l'acide formé au cours de la réaction Comme accepteur, on peut utiliser par exemple un carbonate alcalin, la triéthylamine ou un excès du dérivé de formule III utilisé dans la réaction. Les dérivés ainsi obtenus peuvent être purifiés par chromatoflash sur silice ( 35 70 i') en utilisant comme éluant: H 3 CCOOC 2 Hs ou CH 2 Cl 2/CH 30 H, par exemple, ou par formation de sels et cristallisation de ceux-ci. Les matières premières de formule II et III utilisées dans le procédé précédement décrit sont soit des produits connus soit des produits préparés à partir de substances connues selon des procédés décrits dans la littérature pour préparer des produits analogues. Les dérivés de formule générale I donnent des sels avec les acides physiologiquement tolérables sels qui sont à ce titre inclus dans la présente invention. De plus, lorsque dans la formule I, Rl est différent de R 2, et/ou R 7 est autre qu'un atome d'hydrogène, et/ou A est une chaîne ramifiée, il existe selon les cas une ou plusieurs chiralités qui font que les dérivés I se présentent sous forme d'énantiomères ou de diastéréoisomères, lesquels font également partie de la présente invention. -5- Les dérivés de la présente invention possèdent des propriétés pharmacologiques et thérapeutiques intéressantes En particulier, pour ces dérivés, ont été mises en évidence, d'une part in vitro et ex vivo leur capacité à protéger les LDL humaines (lipoprotéines de faible densité assurant le transport du cholestérol) vis à vis des modifications oxydatives induites par le cuivre et par les cellules endothéliales, et d'autre part leur effet protecteur in vitro sur la nécrose oxydative de cellules cardiaques. Les modifications oxydatives des LDL apparaissent actuellement constituer un mécanisme important de la formation et de l'extension des lésions vasculaires athéromateuses Aussi les propriétés anti oxydantes, notamment au niveau des LDL, des dérivés de la présente invention permettent leur utilisation comme médicament dans le traitement: des dyslipidémies pour prévenir leurs complications notamment vasculaires, de l'athérosclérose avec ses différentes localisations vasculaires périphériques, coronaires, cérébrales, mais aussi des pathologies dans lesquelles une peroxydation lipidique membranaire joue un rôle initiateur et/ou aggravant telles les cardiopathies ischémiques, la reperfusion d'organes, y compris transplantés, les pathologies ischémiques traumatiques ou dégénératives du système nerveux central ou périphérique, les maladies inflammatoires aig es ou chroniques et les maladies auto-immunes. La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques contenant comme principe actif un composé de formule générale I ou un de ses sels physiologiquement tolérable, mélangé ou associé à un excipient pharmaceutique approprié comme, par exemple, le glucose, le lactose, l'amidon, le talc, l'éthylcellulose, le stéarate de magnésium ou le beurre de cacao. Ces compositions pharmaceutiques se présentent généralement sous forme dosée et peuvent contenir de 5 à 250 mg de principe actif. -6- Elles peuvent revêtir par exemple, la forme de comprimés, dragées, gélules, suppositoires, solutions injectables ou buvables et être selon les cas administrées par voie orale, rectale ou parentérale à dose de 5 à 500 mg en 1 ou 2 prises quotidiennes. Les exemples suivants illustrent la présente invention, les points de fusion étant déterminés à la platine chauffante de Kôfler (K) ou au tube capillaire (cap). Exemple 1: (R,S)-8-l 3-( 3,5-ditert butyl-4-hydroxy phénylthio)-2-hydroxy propyll-1- oxa-2-oxo-3,8-diaza spirol 4 5 ldécane: C(-CH 3)3 HO HSCH 2-CHCH 2 H-CH 2 N OH O C ' C(-CH 3)3 Il On chauffe pendant 20 heures à reflux une suspension de 6,5 g de 3- ( 3,5-ditert butyl-4-hydroxy phénylthio)-2-hydroxy-1-chloropropane fondant (K) à 202 C, dans 200 ml d'acétonitrile en présence de 0,5 g d'iodure de potassium. Lorsque la réaction est terminée, on refroidit et filtre le sel insoluble La solution est évaporée et le résidu dissout dans CH 2 C 12 La solution obtenue est lavée avec H 20 et Na HCO 3 à 10 % Après évaporation, on chromatographie sur silice et élue avec CH 2 C 12/CH 30 H ( 95/5) Après évaporation des éluats on obtient 4 g de (R,S)-8-l 3-( 3,5-ditert butyl- 4-hydroxy phénylthio)-2-hydroxy-propyll-1-oxa-2-oxo-3,8-diaza spiro l 4 5 l décane, sous forme de cristaux beiges fondant (K) à 170 C. Le dérivé cloré de départ a été préparé par réaction de l'épichlorhydrine sur le 3,5-di tert butyl-4-hydroxy thiophénol dans tétrahydrofurane en présence de BH 4 NO F O D comme catalyseur. -7- Exemple 2: 8-l 3-( 2,3,5-triméthyl-4-hydroxy phénoxy) propyll-1-oxa-2-oxo-3,8- diaza spirol 4 5 ldécane: CH 3 HO O -CH 2 CH 2 CH 2 N NH CH 3 CH 3 l l On chauffe pendant 20 heures à reflux une solution de 5,04 g de 3-( 4- acétoxy-2,3,5-triméthyl phéxoxy)-1-bromo propane fondant (K) à 54 C, et de g de 1-oxa-2-oxo-3,8-diaza spirol 4 5 l décane dans 300 ml d'acétonitrile en présence de 1,2 g d'iodure de potassium Lorsque la réaction est terminée, on évapore le solvant sous pression réduite et reprend le résidu par Na HC 03 à 10 % et CH 2 C 12 On décante la couche organique et la lave plusieurs fois à l'eau. Après évaporation du solvant, on chromatographie le résidu sur 300 g de silice et élue avec le système CH 2 C 12/CH 30 H ( 93/7) Après évaporation des éluats, on recueille 5,2 g de produit acétylé sous forme d'huile. On hydrolyse 4,57 g de ce produit en solution dans 120 ml d'éthanol avec 47 ml d'H Cl 4 N, par chauffage à reflux pendant deux heures Après évaporation du solvant, on reprend le résidu avec CH 2 C 12 et Na HCO 3 à %, décante et évapore la phase organique. On purifie par chromatographie sur 200 g de silice en éluant avec CH 2 C 12/CH 3 OH ( 90/10) Après évaporation des éluats on recueille 3, 6 g de cristaux de 8-l 3-( 2,3,5-triméthyl-4-hydroxy phénoxy) propyll-1-oxa-2oxo- 3,8-diaza spiro-l 4 5 l décane, fondant (K) à 155 C. Exemples 3 à 30: En opérant comme décrit dans l'exemple 1, ont été préparés les dérivés objet des exemples regroupés dans le tableau I suivant: TABLEAU I Dérivés de formule I: R 4 HO R 3 R ZRNH R 5 1 1 X O AN-q 1 Y C=T R 6 R 2 ( 1) l OO O Exemple No X A Ri R 3 R 2 R 6 RI 4 R 5 Y T Z PF( C) 3 S (CH 2)2 H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 O O CH 2 (K) 152 4 S (CH 2)4 H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 O O CH 2 (K) 146 O (CH 2)4 H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 O O CH 2 (K) 166 (n Oa Exemple N ExempleX A R 1 R 3 R 2 R 6 R 4 R 5 Y T Z PF( C) 6 O (CH 2)2 H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 O O CH 2 (K) 192 7 O -CH-CH 2 H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 O O CH 2 (K) 200 OH 8 (CH 2)2 H H H H -C(CH 3)3 - C(CH 3)3 O O CH 2 (cap)180-182 9 O -CH-CH 2 H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 O S CH 2 (Meringue) OH S -CH-CH 2 H H H H C(CH 3)3 -C(CH 3)3 O S CH 2 (Meringue) I OH 11 O (CH 2)2 H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 O S CH 2 (Meringue) 12 O -CH-CH 2 H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 CH 2 O C = O (Meringue) I OH 13 S -CH-CH 2 H H H H -C(CH 3)3 - C(CH 3)3 CH 2 O O C = O (Meringue) OH 14 S (CH 2)2 H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 O S CH 2 o l lw K 1 On al O =D O O ú((HO)D)(H) H H H (ZHO) S EZ O = O O ú(>HO)DD(HO H H H E(ZHO) O t Z -H 3 HO EHD O O (EHO)Dú(EHD)D H H H ZH 3-H S OZ -HO HO úHO O O ú(EHD)Dú(HD)OD H H H H 3 O-HO O 6 L -HO- I úHO O O E(úHO)Dú(EHD)D H H H H (HO) S 9 -HO- t H 3O O E(EHH 3)DD(HO) H H H o(EHO)O Ll O = O ZH 3ú(EH 3)Dú(úHO)D H H H H (EH 3) S 9 L O = O O ZHD ú(úHHO)D)(HO)D H H H H((ZHO) O z x u b U 9 U eu EH tu Vx adxo N a Tdwax 3 r, o T- c D CD w"- ZHO O úHo H O úHO úHO Z( ZH) ZHD O H Oú ZHO HúHOH EHO E(EHD) EHO O 6 Z úHO I ZHD-D; OHO O O H 3 O EH 3 EHO H H H EH) 95 EHO O O úHO EHO EHO úHO H úHO Z(ZHO) O Le HO I EH 3O O e HlE HO E HO H H H ZHO-H 3 O 9 Z ZH 3O O EHO úHO EHO H H H Z( ZHD) O EZ HO 0 = O O ú ( úHD)Dú(EHD)D H H H H ZHO-H 3 S Z HO O = 3 O O ú(úH)D E(EH 3)3 H H H H ZHO-HD O Z Z 1 À a li 9 H H EH v X ayd Oax N eidwex 3 rco ui (O l I Les matières premières utilisées pour préparer les dérivés de la présente invention sont regroupées dans les tableaux II et III ci-après: T A B L E A U II Dérivés de formule II: R 4 RO R 3 R 1 R 5 \X -C A W R 6 R 2 (II) Caractéris Méthode de X R R 1 R 3 R 2 R 6 R 4 R 5 A W tiques préparation physique (*) _ H H H H H - C(CH 3)3 -C(CH 3)3 (CH 2)2 Br PF:58 600 C) (cap) O H H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 (CH 2)2 Br PF(K)= -36 C O H H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 (CH 2)4 Br Huile S H H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 (CH 2)2 Br Huile (n oa Caractéris Méthode de X R R 1 R 3 R 2 R 6 R 4 R 5 A W tiques préparation physiques (*) S H H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 (CH 2)4 Br Huile S H | H | H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 CH-CH 2 Cl PF(K)= 68 o C OH S | H H H H H -C(CH 3)3 -C(CH 3)3 CH- (CH 2)2 Br PF(K)= 1250 C) OH O C O H 3 H H H CH 3 CH 3 CH 3 (CH 2)2 Br PF(cap)= -Si-C- C(CH 3)3 45-460 C CH 3 O| -CO CH 3 H H H CH 3 CH 3 CH 3 (CH 2)2 Br PF(K)= 54 C O O -CH 2-0-C 2 H 5 (CH 2)2 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 2 Toxy Huile loxy w w (n oa W -14- (*) Méthodes de préparation: 3 Bromuration de l'alcool correspondant avec (C 6 H 5)3 P Br 2 dans le DMF. XH + Br CH 2-A-Br (en excès K 2 CO 3 l II Ac CN ) T YOSHIOKA et Coll J med chem 32, 421-428,( 1989) OH + Br-CH 2-A-Br (en excès) K 2 CO 3 > II Ac CN Tosylation de l'alcool préparé selon J SCOTT et Coll J am oil. chem Soc 51, ( 5), 200-203, ( 1974) T A B L E A U III Dérivés de formule III: Z -NH HN | Y C=T (III) Y T Z Caractéristiques Méthode de préparation physiques O O CH 2 PF(K) = 202 C G REGNIER et Coll Chimie Thérap ( 1969)( 3), 185-194 O o CH 3 PF(cap)= J MAILLARD et Coll Chim Thérap ( 1973)( 4), 393-397 -CH 245-246 C O S CH 2 PF(K) = 2400 C Détritylation (H Cl) du dérivé 8- tritylé correspondant PF(K) = 248-2500 C O O C = O PF(cap) = 3380 C Préparation du dérivé 8-benzylé selon Y NAGAI Chem Pharm Bull 24 ( 6), 1179-1188 ( 1976) et débenzylation par H 2/Pd-C CH 2 O C = O PF(K) = 240 C Préparation du dérivé 8-benzylé PF(K): 187 C, à partir de: COOH C 6 H 5-CH 2-N + urée, selon MC ELVAIN et Coll Am Soc. C, 901, ( 1949), et débenzylation par H 2/Pd-C 71, 901, ( 1949), et débenzylation par H 2/Pd-C I lv (n al -16- Exemple 31: Etude pharmacologique L'action des dérivés de la présente invention a été démontrée sur des LDL humaines et animales L'activité inhibitrice des composés vis à vis de la modification oxydative des LDL, induite par le sulfate de cuivre et par des cellules endothéliales d'aorte de lapin, a été démontrée tant in vitro qu'après administration par voie orale chez le lapin Watanabe L'activité des composés a été testée de façon comparative au probucol et à la vitamine E pris comme produits de référence. 1 ETUDE IN VITRO 1.1 Matériels et méthodes 1.1 1 Modification des LDL par le sulfate de cuivre Les LDL humaines sont incubées 24 heures en présence de sulfate de cuivre ( 5 10-5 M ou 5 10-6 M) et en absence ou en présence des composés testés ( 10-7 M à 10-4 M). Après incubation, la peroxydation des LDL est évaluée par électrophorèse sur gel d'agar et par la formation de l'un des produits de la peroxydation lipidique: le malondialdéhyde (MDA)(Parthasarathy S, Young S G, Witztum J L, Pittman R C, et Steinberg D;J Clin Invest. 77; 641-644, 1986). L'activité des composés testés est évaluée par le calcul des concentrations réduisant de 50 % (IC 50) la production de MDA par rapport aux expériences contrôles en absence de produit. -17- 1.1 2 Modification des LDL par les cellules endothéliales Les LDL humaines sont incubées 24 heures en présence de cellules endothéliales d'aorte de lapin (lignée RECL B 4 fournie par le Professeur Steinberg, USA), et en absence ou en présence des composés testés ( 10-7 M à 10-4 M). Après incubation, la peroxydation des LDL est évaluée par électrophorèse sur gel d'agar et par la formation de l'un des produits de la peroxydation lipidique: le malondialdéhyde (MDA) (Steinbrecher U P, Parthasarathy S, Leake D S, Witztum J L, et Steinberg D; Proc Nat. Acad Sci USA 81 3883-3887, 1984). L'activité des composés testés est évaluée par le calcul des concentrations réduisant de 50 % (IC 50) la production de MDA par rapport aux expériences contrôles en absence de produit. 1.1 3 Nécrose oxvdative des cellules cardiaques Les cellules cardiaques de rats nouveau-nés sont utilisées entre les ème et 6 ème jours après la mise en culture La nécrose oxydative est induite par le système enzymatique producteur de radicaux libres hypoxanthine (HX, lm M) et xanthine-oxydase (XO, 10 m U/ml) La nécrose est évaluée 4 heures après l'adjonction de XO/HX en mesurant spectrophotométriquement l'activité cytosolique a-hydroxy- butyrate deshydrogénase (a-HBDH) libérée dans le surnageant Deux molécules de référence (probucol, vitamine E) et 3 molécules représentatives de la présente invention (correspondant aux exemples 1, 3 et 4) ont été testées. Les cellules sont traitées avec les molécules 16 heures et 1 heure avant le début de l'expérimentation après renouvellement du milieu En début d'expérience, le traitement est renouvelé une dernière fois. -18- 1.2 Résultats 1.2 1 Effet sur la modification des LDL: Le tableau A rassemble les IC 50, appréciant le pouvoir inhibiteur de la peroxydation lipidique des LDL humaines, obtenues avec un échantillon des dérivés de l'invention et les produits de référence: probucol et vitamine E, sur les deux tests d'incubation d'oxydation des LDL: par le sulfate de cuivre (Cu 2 +) ou par les cellules endothéliales (EC). TA B L E A U A IC 50 (M) COMPOSES Cu 2 + EC Exemple 1 3 o 10-7 3 10-8 Exemple 3 3 10-7 5 10-8 Exemple 4 8 o 10-7 2 10-8 Exemple 5 7 10-7 Exemple 6 3 10-7 Exemple 7 2 10-6 Exemple 8 3 10-6 PROBUCOL 3 10-6 4 10-6 VITAMINE E > 10-4 4 10-6 Ces résultats indiquent clairement la plus grande puissance notamment des composés des exemples 1, 3, 4, 5 et 6 par rapport au probucol ou à la vitamine E à protéger les LDL humaines vis à vis des modifications induites par le sulfate de cuivre et les cellules endothéliales. -19- Ces composés, dont les IC 50 vis à vis de la peroxydation induite par le sulfate de cuivre ( 5 10-6 M) se situent entre 3 10-7 et 8 10-7 M, sont fois plus puissants que le probucol sur ce test; concernant le test utilisant les cellules endothéliales ces dérivés avec des IC 50 comprises entre 2 10-8 M et 5 10-8 M, s'avèrent 100 fois plus puissants que le probucol. A titre d'exemple, les effets du dérivé de l'exemple 1 ont été illustrés par les figures 1 et 2 ci-après: -FIGURE 1 - PEROXYDATION DES LDL PAR LE Cu SO 4 5 10-6 M COMPARAISON DES EFFETS DU PROBUCOL ET DU DERIVE DE L'EXEMPLE 1 % Peroxydation Probucol u _ Dérivé de | 100 O O^ l'exemple 1 -8 10-7 o 10-6 10-5 10-4 Concentration en Moles -20- -FIGURE 2 - PEROXYDATION DES LDL PAR LES CELLULES ENDOTHELIALES COMPARAISON DES EFFETS DU PROBUCOL ET DU DERIVE DE L'EXEMPLE 1 % Peroxydation E _ ta Probucol _ a Dérivé de l'exemple 1 -8 o 10-7 10-6 o 10-5 10-4 Concentration en Moles 1.2 2 Effet sur la nécrose oxvdative des cellules cardiaques: Le tableau B regroupe les index de nécrose de cellules cardiaques induite par le système hypoxanthine/xanthine-oxydase seul ou en présence de concentrations croissantes des dérivés de l'invention ou des produits de référence: probucol et vitamine E. -21 - Les dérivés des exemples 1, 3 et 4 (particulièrement représentatifs de l'invention), aux concentrations de o 10-6 M et 10-5 M, réduisent respectivement de plus de 80 % et 95 % la nécrose oxydative des cardiomyocytes et sont nettement supérieurs aux produits de référence, dont l'activité, plus faible, n'apparait qu'à 10-5 M. Le dérivé de l'exemple 1 se distingue particulièrement par un effet protecteur de plus de 50 % dès la concentration de 10-7 M. TA B L E AU B EFFET SUR LA NECROSE OXYDATIVE DE CELLULES CARDIAQUES Dérivés Vitamine E Probucol Exemple 1 Exemple 3 Exemple 4 contrôle XO+HX ,0 + 12,5 ,0 + 6,2 ,0 + 6,5 ,0 12,4 ,0 + 6,9 -7 M X O +HX 83,5 8,0 103,0 2,0 42,8 11,3 ,6 17,1 79,1 8,0 L'index de nécrose 100 correspond à une libération de 43,6 1,0 % en 4 heures du contenu cytosolique en a-HBDH dans le surnageant. Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne sem ( 4 ns 5, 3 répétitions par expérience). -6 M XO+HX 79,0 7,4 68,8 3,9 19,1 7,3 12,0 4,4 2,1 1,0 -5 M XO+HX 61,1 2,5 26,6 6,3 3,8 1,9 4,2 i 2,7 2,6 0,7 ILLUSTRATION GRAPHIQUE DES RESULTATS: EFFET DES DERIVES DE L'INVENTION SUR LA NECROSE OXYDATIVE DE CARDIOMYOCYTES (xanthine-oxydase 10 m U/ml; hypoxanthine 1 m M) INDEX DE NECROSE EN 4 heures (BASE 100) Vitamine E Index 100 = 43,6 + 1,0 % a-HBDH libéré Probucol * Dérivé de l'exemple 1 0 Dérivé de l'exemple 3 E Dérivé de l'exemple 4 o o CONCENTRATION (p M) 77 - lisez -23- 2 ETUDE EX VIVO 2.1 Matériels et méthodes Des lapins Watanabe (lapins génétiquement hyperlipidémiques), de poids variant de 3 kg à 5 kg, sont utilisés Les animaux sont traités par voie orale soit par le véhicule des composés testés (groupe contrôle) soit par les produits testés à la dose de 250 mg/kg/jour pendant 3 jours. En fin de traitement, les LDL de ces animaux sont préparées par ultracentrifugation et soumises à une oxydation par le sulfate de cuivre ( 5 1 o-6 M) La peroxydation lipidique des LDL est appréciée, après différents temps d'incubation avec le sulfate de cuivre (de 2 à 24 heures) par la mesure de la formation de MDA. 2.2 Résultats Le tableau C rassemble les valeurs de production de MDA selon le temps d'incubation avec le sulfate de cuivre des LDL provenant des animaux contrôles et traités par le dérivé de l'exemple 1 ou le probucol. T A B L E AU C PRODUCTION DE MDA (n M/mg protéines) Temps d'incubation des LDL avec le sulfate de COMPOSES NOMBRE cuivre (heures) COMPOSES DANMU D'ANIMAUX 2 4 6 8 24 Contrôle 6 3,31 4,84 13,41 26,04 28,06 0,41 0,59 2,29 2,82 2,87 Exemple 1 6 0,2 1,27 O O 1,02 + 0,2 0,91 0,53 Probucol 5 1,85 3,5 4,9 12,26 23,81 0,27 0,27 + 0,89 2,45 0,37 -24- D'après ces résultats, également illustrés par la figure 3, la peroxydation des LDL des lapins Watanabe traités par le probucol est retardée d'environ 2 heures par rapport à celle des animaux contrôles. Le dérivé de l'exemple 1, contrairement au probucol, dans les mêmes conditions expérimentales, inhibe totalement la peroxydation des LDL * induite par le sulfate de cuivre et ce durant au moins 24 heures. -FIGURE 3 - COMPARAISON DES EFFETS DU PROBUCOL ET DU DERIVE DE L'EXEMPLE 1 ADMINISTRES PER OS SUR LA MODIFICATION DES LDL DE LAPINS WATANABE ( 250 mg/kg/j pendant 3 Jours) PEROXYDATION LIPIDIQUE _q Placebo n M MDA/mg protéines * Probucol Dérivé de l'exemple 1 O s 2 il 7 A 16 24 incubation (h) -25 2666583 3 CONCLUSION Les résultats rapportés démontrent d'une part que les composés de l'invention protègent les LDL humaines in vitro vis à vis des modifications oxydatives de manière beaucoup plus puissante que le probucol et la vitamine E, d'autre part qu'après administration chez l'animal, par voie orale, ces composés provoquent une protection des LDL très nettement supérieure et de plus longue durée d'action par rapport au probucol. De plus les composés de l'invention protègent également les cellules cardiaques, de façon plus puissante que le probucol et la vitamine E, vis- à-vis de la nécrose oxydative induite in vitro. -26- REVENDICATIONS 1 Les dérivés du spirol 4 5 ldécane de formule générale I: R 4 HO R 3 Rl 1 Z-NH (I) R 5 X C A Y C=T R 6 R 2 dans laquelle: X représente un atome d'oxygène ou de soufre ou une liaison simple; A représente un radical hydrocarboné contenant de 1 à 10 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée renfermant éventuellement une double liaison et/ou éventuellement substitué par un radical hydroxy; Y représente un atome d'oxygène, ou de soufre ou un radical CH 2; T représente un atome d'oxygène ou de soufre; Z représente: * soit un groupe CH-R 7 dans lequel R 7 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle contenant de 1 à 3 atomes de carbone, * soit un groupe carbonyle; R 1 et R 3: * soit représentent chacun simultanément un atome d'hydrogène, * soit forment ensemble un pont (CH 2)n dans lequel N prend les valeurs 1 ou 2, * soit R 1 représente un radical méthyle et simultanément R 3 représente un atome d'hydrogène; -27- R 2 et R 6, identiques ou différents représentent chacun un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, et R 4 et RS, identiques ou différents, représentent chacun un radical alkyle contenant de 1 à 6 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée, et, quand ils existent, les énantiomères et diastéréoisomères correspondants. 2 Les sels physiologiquement tolérables des dérivés de la revendication 1, avec des acides appropriés. 3 le (R,S) 8 l 3 ( 3,5 ditert butyl 4 hydroxy phénylthio) 2 - hydroxy propyll-1-oxa-2-oxo-3,8-diaza spirol 4 5 ldécane. 4 Le 8 l 3 ( 3,5 ditert butyl 4 hydroxy phénylthio) propyll - 1 oxa 2 oxo 3,8 diaza spirol 4 5 ldécane. Le 8 l 5 ( 3,5 ditert butyl 4 hydroxy phénylthio) pentyll - 1 oxa 2 oxo 3,8 diaza spirol 4 5 ldécane. 6 Le 8 l 5 ( 3,5 ditert butyl 4 hydroxy phénoxy) pentyll 1 - oxa-2-oxo-3,8-diaza spirol 4 5 ldécane. 7 Le 8 l 3 ( 3,5 ditert butyl 4 hydroxy phénoxy) propyll 1 - oxa 2 oxo 3,8 diaza spirol 4 5 ldécane. 8 Le procédé de préparation des dérivés de la revendication 1 caractérisé en ce que l'on condense: un dérivé de formule générale II: R 4 (II) R 5 ' R 6 R 1 X C A W R 2 dans laquelle: -28- X, A, R 1, R 2, R 3, R 4, Rs, et R 6 ont les significations définies dans la revendication 1, W représente un atome de chlore ou de brome ou un radical tosyloxy, et R représente un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur facilement hydrolysable tel qu'un groupement acylé ou silylé, avec un dérivé de formule générale III: Z -NH HN I Y C=T (III) dans laquelle Y, revendication 1; Z et T ont les significations définies dans la et, dans le cas ainsi obtenu. o R est autre qu'hydrogène, on hydrolyse le dérivé 9 Le procédé de préparation selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'on effectue la condensation des dérivés II et III dans un solvant approprié, à une température comprise entre 80 et 1000 C, en présence d'un accepteur de l'acide formé au cours de la réaction. Les compositions pharmaceutiques contenant comme principe actif un dérivé selon les revendications 1 à 7, avec des excipients pharmaceutiques appropriés. 11 Les compositions pharmaceutiques selon la revendication 10, présentées sous une forme convenant notamment pour le traitement des dyslipidémies, de l'athérosclérose et des pathologies dans lesquelles une peroxydation lipidique membranaire joue un rôle initiateur et/ou aggravant.