FR 2666096 A1 19920228 FR 9010700 A 19900821 4 * - La présente invention concerne un nouveau procédé de dosage de microquantités d'acide désoxyribonucléique (ADN) présent en position 'extracellulaire dans un milieu liquide. Un tel dosage présente un grand intérêt dans de nombreuses circonstances 1 D'un point de vue physiologique, la présence d'ADN en po- sition extracellulaire dans un organisme vivant peut dépendre de deux types de phénomènes D'une part, la mort cellulaire est un phénomène normal et permanent qui entraine la libéra- tion dans le milieu extracellulaire de produits de dégrada- tion de la chromatine (et donc d'ADN) et dont le rôle dans les phénomènes de développement de l'organisme et de matura- tion de divers systèmes fonctionnels (en particulier, système immunitaire) est maintenant bien établi D'autre part, cer- tains auteurs ont émis l'hypothèse que la libératio N d'ADN dans le secteur extracellulaire dépendrait d'un processus cellulaire actif d'excrétion et représenterait un mécanisme de communication intercellulaire. 2 D'un point de vue pathologique, tout processus s'accompa- gnant de phénomènes de destruction d'une structure vivante contenant de l'ADN, qu'il s'agisse de cellules d'un organisme pluricellulaire ou de particules infectieuses (bactériennes, virales ou parasitaires) se traduit par la libération dans le milieu extracellulaire avoisinant d'ADN (et/ou d'ARN) La signification de ce phénomène, l'intérêt de son étude et les méthodologies mises en oeuvre pour l'explorer ne sont pas univoques (Fournié, Eurorhumatology, Tagas and son press, Athens, 1987, pp 9-13) Al Au cours de certaines affections, en particulier infec- tieuses ou héréditaires, de l'r ADN spécifique d'un agent pa- thogène on d'un processus pathogène peut être présent dans un liquide extracellulaire La détection et l'identification de cet ADN peut alors revêtir un intérêt étiologique Dans ces situations, il est fait le plus souvent appel à la technique d'hybridation Le principe de cette technique est de mettre en présence l'ADN éventuellement présent dans l'échantillon à tester (préalablement purifié et dénaturé par la chaleur et fixé sur un support solide) et une sonde dr ADN complémentaire li -2- préalablement marquée soit par une substance radioactive soit par un marqueur froid, comme par exemple la biotine L'immo- bilisation de 1 'ADIS sur un support solide se fait le plus souvent sur membrane (nylon ou nitrocellulose par exemple). Cette méthode est relativement longue et n'est que semi- quantitative, mais permet de détecter de l'ADN spécifique au niveau du picogramme, même en utilisant un marquage "froid" de l'ADN (Barraud-Hadidane et al, Arch Toxicol, 1987, Suppl 11, 200-205) Une technique quantitative utilisant comme sup- port solide une plaque de microtitration et une sonde dr ADN marquée à la biotine a également été décrite par Nagata et al (FEBS, 1985, 183, 379-382). B/ A l'opposé, dans de nombreuses circonstances, il peut être important de détecter et de doser de l'ADN indépendemment de sa spécificité, i e des caractéristiques moléculaires de sa structure primaire: 1/ En pathologie humaine, le dosage de l'ADN peut revêtir suivant les circonstances, soit un intérêt diagnostique et/ou pronostique, soit un intérêt physiopathologique: a/ La libération d'ADN dans le secteur extracellulaire est le reflet et le témoin de processus de mort cellulaire et peut permettre de déceler et de quantifier cette mort cellu- laire in vivo dans l'organisme entier La détection et le do- sage de l'ADN peut donc, dans diverses situations de patholo- gie expérimentale ou humaine, revêtir un intérêt diagnostique ou pronostique C'est le cas par exemple de la maladie throm- boembolique (Vargo et al, Chest, 1990, 97, 63-68) ou des vas- cularites (Steinman, Arthritis Rheum, 1982, 25, 1425-1430). b/ Il est possible que l'ADN circulant puisse jouer un rôle pathogène Différents mécanismes peuvent être mis en jeu : (i) du fait de ses propriétés physicochimiques, en particu- lier de sa viscosité et de sa charge électrique, l'ADN circu- lant peut perturber le fonctionnement normal de la circula- tion et/ou se déposer de manière préférentielle dans certains tissus ou organes; (ii) l'ADN extracellulaire peut activer divers systèmes biologiques, tels les systèmes du complément et de la coagulation; (iii) il peut également jouer un rôle pathogène du fait de sa nature et de ses propriétés '1 géni- 3 - ques" en s'intégrant au génome de l'hôte; (iv) enfin il peut être à l'origine de la formation de complexes macromoléculai- res en présence d'autoanticorps, mécanisme impliqué dans le développement des lésions glomérulaires chez les patients at- teints de lupus érythémateux disséminé (Fournié, Kidney Int, 1988, 33, 487-497). 2/ En pharmaco-toxicologie, le dosage de l'ADN circulant peut permettre de déceler in vivo la cytotoxicité d'une sub- stance médicamenteuse ou toxique (Bret et al, Toxicology, 1990, 61, 283292) Il pourrait donc être utile dans la phase de développement d'un médicament, dans la sélection, au sein d'une même famille pharmacologique, de la substance douée du meilleur rapport efficacité/toxicité Par ailleurs, il pour- rait être utilisé au cours des essais cliniques de phase I chez l'homme pour déceler plus précocement une toxicité médi- camenteuse non prévisible à partir des données pharmacotoxi- cologiques expérimentales Enfin le dosage de l'ADN présent en position extracellulaire dans divers liquides biologiques dont en particulier les urines, pourrait être utile en prati- que courante pour le dépistage des effets toxiques de diffé- rents xénobiotiques et médicaments. 3/ Dans le domaine de l'étude de la biocompatibilité de di- vers systèmes de circulation extracorporelle utilisés en pra- tique médicale, en particulier des systèmes d'hémodialyse, le dosage de l'ADN permet d'analyser in vivo l'intensité des phénomènes de mort cellulaire liés à l'éventuelle bio- incompatibilité du système (Fournié et al, Amer J Nephrol, 1989, 9, 384-391). 4/ Dans le domaine des biotechnologies, le dosage d'ADN ré- siduel, contaminant les milieux contenant des substances bio- logiques actives obtenus par exemple par génie génétique est important pour en contrôler l'inocuité (WHO expert commitee on biological standardisation, 1982). Compte tenu des intérêts que présente le dosage de l'ADN circulant et de l'ADN présent en position extracellu- laire dans divers liquides biologiques, différentes techni- ques colorimétriques, fluorimétriques, immunologiques et bio- 4 - logiques ont été développées Ces techniques présentent des limites en particulier lorsque 1 'ADN doit être dosé dans des liquides biologiques complexes tels le plasma Ces limites concernent la spécificité, la sensibilité et le caractère quantitatif des dosages d'une part, la nécessité d'un traite- ment préalable de l'échantillon dans lequel le dosage doit être effectué d'autre part: 1/ La spécificité de certaines techniques n'est pas assurée du fait des interactions entre diverses substances autres que l'ADN présentes dans l'échantillon à doser et les réactifs utilisés dans la méthode de dosage C'est le cas des techni- ques fluorimétriques et calorimétriques, mais également des techniques immunologiques et des méthodes utilisant des sub- stances fixant l'ADN Le contrôle de la spécificité du dosage impose le recours systématique à un dosage complémentaire après digestion de l'ADN dosé à l'aide d'un enzyme spécifique tel la désoxyribonucléase I (Steinman, J Clin Invest, 1975, 56, 512-515). 2/ Les limitations de sensibilité et l'absence de caractère quantitatif des techniques sont liées à divers facteurs (i) le principe même de certaines techniques, (e g la contreim- munoélectrophorèse) ne permet pas dans certains cas un dosage quantitatif; (ii) la taille variable des molécules d'ADN à doser: le nombre de molécules dr ADN de tailles différentes est variable pour une même quantité, alors que le signal dé- celé est fonction du nombre de molécules d'ADN réactives (et non pas de la quantité absolu d'ADN telle que l'on peut l'ex- primer en nombre de nucléotides ou de paires de bases); (iii) les pertes d'ADN liées aux faibles rendements lorsque les quantités d'ADN à purifier sont faibles. 3/ Le traitement de l'échantillon avant dosage, pour purifier et éventuellement concentrer l'ADN nécessaire dans certaines techniques, est souvent laborieux et parfois aléatoire, en- trainant comme précédemment mentionné des limitations dans la récupération quantitative de l'ADN présent dans l'échantillon de départ, à moins de recourir à des méthodes difficiles à mettre en oeuvre en pratique, telle l'ultracentrifugation (Shapiro, Anal Biochem, 1881, 110, 229-231). - Pour surmonter ces limites et difficultés, il a été proposé de nouvelles méthodes de récupération et de purifica- tion de l'ADN et l"utilisation de méthodes et de matériels issus des techniques de biologie moléculaire pour réaliser un dosage quantitatif de l'ADN. 1/ Raptis et Ménard (J Clin Invest 1980, 66, 1391-1399) ont été les premiers à réaliser une détection de l'ADN circulant chez des patients atteints de lupus érythémateux disséminé après l'avoir purifié et marqué in vitro par un isotope ra- dioactif en utilisant la technique de déplacement de coupure haplotomique ("Nick translation") elle même décrite précé- demmnt par Rigby et collaborateurs (J Mol Biol 1977, 113, 237-251) La lourdeur des techniques de préparation du maté- riel à doser (dilution de l'échantillon, digestion enzymati- que, extraction organique, dialyse, purification sur colonne, précipitation à l'éthanol) ne permettait pas d'appliquer cet- te méthode à la détection et au dosage de 1 'ADN en pratique courante. 2/ Fournié et al (Anal Biochem 1986, 158, 250-256) ont décrit un nouveau procédé de récupération et de dosage de microquan- tités d'ADN dans un liquide biologique acellulaire Cette mé- thode basée sur l'extraction d'ADN par un traitement au phé- nol, sa récupération par précipitation à l'éthanol en utili- sant la gélatine comme agent coprécipitant et son dosage quantitatif à l'aide de la technique de déplacement de cou- pure haplotomique a permis de résoudre le problème d'un trai- tement simultané de plusieurs échantillons compatible avec l'utilisation de cette méthode dans certaines applications en pratique Les limitations de cette méthode sont: (i) la né-30 cessité d'extraction de l'échantillon avant son dosage qui impose plusieurs étapes de centrifugation à des températures différentes, une étape de lyophilisation ou d'évaporation sous vide et une étape de redissolution de l'échantillon; (ii) le recours à un marquage radioactif de l'ADN; (iii) les étapes de lavages des filtres sur lesquels ont été déposés les échantillons pour séparer l'ADN radiomarqué du nucléotide libre marqué au tritium (étapes qui peuvent difficilement être utilisées en cas de marquage d'ADN par la biotine ou 1 1 e 6 - tout autre marqueur "froid" du fait de la difficulté à éluer l'ADN adsorbé sur le filtre). 3/ Briggs et al (IBL Juin 1989 pp 18-25) ont décrit un "total DNA assay system" qui autorise un dosage enzymatique de l'ADN au niveau du picogramme ( 2-200 pg) Selon cette méthode l'ADN purifié et dénaturé par la chaleur, est fixé sur une membrane par l'intermédiaire d'une protéine fixant l'ADN monocaténai- re, et est quantifié à l'aide d'un anticorps monoclonal anti- ADN monocaténaire couplé à un enzyme (uréase) à l'aide d'un biocapteur potentiométrique développé par Molecular Devices Corp (Menlo Park, Californie, USA) Les limitations de cette méthode sont multiples, en particulier: (i) l'utilisation d'un appareillage particulier et couteux (> 200 000 FF) pour réaliser le dosage; (ii) le caractère non quantitatif, le "rendement" de dosage étant fonction de la taille des molécu- les d'ADN; (iii) la nécessité de réaliser un prétraitement "adapté" à chaque type d'échantillon (dénaturation de l'ADN à la chaleur, préfiltration sur nitrocellulose et digestion à la protéinase K suivi éventuellement d'une séparation en fonction de la taille de l'ADN). Ces deux dernières techniques peuvent être mises en oeuvre sur de faibles volumes et permettent de doser l'ADN extracellulaire indépendemment de sa nature au niveau du pi- cogramme, mais elles sont inutilisables pour le but que s'est fixé la présente invention, à savoir le dosage de quantités d'ADN de l'ordre de quelques picogrammes dans des liquides biologiques complexes (i) ne nécessitant pas d'extraction préalable de l'ADN avant dosage, (ii) ne nécessitant pas le recours à des isotopes radiactifs, (iii) réalisable sur sup- port solide, en particulier sur plaque de microtitration, (iv) permettant d'obtenir le résultat en moins de deux heu- res. La présente invention a pour but de pourvoir à un pro- cédé de dosage de l'ADN qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés proposés dans l'Art antérieur En effet, le nouveau procédé conforme à la présente invention: A: -7- est réalisable sur un support solide conventionnel type "plaque de microtitration", sur lequel sont effectuées les différentes réactions nécessaires à la réalisation du dosage, ne nécessite pas d'extraction de l'ADN avant les étapes de dosage proprement dit, en particulier lorsque les échantil- lons sont des prélèvements de plasma sanguin, ne nécessite pas le recours à des substances radioactives, ne nécessite pas d'appareillage spécifique, la lecture du signal pouvant se faire à l'aide d'un spectrophotomètre, d'un spectrofluorimètre ou d'un biocapteur conventionnel, ne requiert que quelques microlitres d'échantillon, est spécifique de l'ADN, est d'une grande sensibilité, peut être mis en oeuvre simultanément sur plus de cent échantillons et permet d'obtenir le résultat du dosage en moins de deux heures La présente invention a pour objet un procédé de dosage de microquantités dr ADN présentes en position extracelluaire dans un liquide biologique, en particulier le plasma sanguin, qui est caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivan- tes: une étape dradsorption de l'ADN à doser sur un support so- lide, une étape de marquage de cet ADN par incorporation de un ou plusieurs désoxyribonucléotides triphosphates marqués mettant en jeu un ou des enzymes spécifiques de l'ADN, une étape de dosage de l'ADN par toute méthode appropriée révélant le marqueur incorporé à l'ADN, ces étapes pouvant être séparées les unes des autres par des étapes de lavages. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé con- forme à la présente invention, l'adsorption de l'ADN sur le support solide se fait par l'intermédiaire de substances constitués par la gélatine ou de complexes macromoléculaires cationiques présentant une forte affinité pour l'ADN. Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, les substances utilisées pour adsorber l'ADN sont représentées par une ou des protéines histoniques. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le support solide est sensibilisé par incubation d'un mélange de protéines histoniques en tampon carbonate 0,05- -O,M p H environ 9,6, plusieurs heures, quelle que soit la température d'incubation. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé con- forme à la présente invention, l'adsorption de l'ADN présent dans l'échantillon est réalisée au cours d'une incubation de quelques minutes à plusieurs heures quelle que soit la tempé- rature d'incubation. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé con- forme à la présente invention, le support solide subit un ou plusieurs lavages après adsorption de l'ADN. Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le ou les lavages du support solide sont effectués en tampon trishydroxyaminométhane 2,5 m M p H 8, EDTA lm M. Selon une autre modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le ou les lavages du support solide sont effectués en tampon Borate (force ionique environ 0,1), 0,1 % Tween 20, p H 8-8,5. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé con- forme à la présente invention, le marquage de l'ADN adsorbé est réalisé à l'aide d'une réaction de biologie moléculaire mettant en jeu un ou plusieurs enzymes spécifiques de l'ADN permettant l'incorporation d'au moins un désoxyribonucléotide triphosphate marqué chimiquement par une substance pouvant être ultérieurement révélée, par exemple à l'aide d'une réac- tion enzymatique. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le marquage de l'ADN est réalisé à l'aide d'une réac- tion de déplacement de coupure haplotomique ("Nick transla- tion") par incorporation d'au moins un désoxyribonucléotide triphosphate marqué chimiquement par une substance pouvant être ultérieurement révélée, par exemple à l'aide d'une réac- tion enzymatique. f -9 Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le marquage au cours de la deuxième étape peut être réalisé au cours d'une incubation de quelques minutes à plu- sieurs heures, en particulier de 15 à 240 minutes (par exem- ple 60 minutes) à température de 15 à 40 Celsius environ (par exemple 30 Celsius). Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le ou les nucléotides incorporés dans l'ADN sont mar- qués par la biotine et l'enzyme utilisé pour sa ou leur dé- tection est lié à l'avidine ou à la streptavidine. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, la mar- quage par déplacement de coupure haplotomique est effectué par incubation de l'ADN adsorbé sur le support solide avec 10 à 100 picomoles d'un ou plusieurs désoxyribonucléotides tri- phosphates marqués, éventuellement environ 10 à 100 picomoles de désoxyribonucléotides triphosphates non marqués, environ 0,04 unités d'ADN polymérase et environ 4 picogrammes de désoxyribonucléase I, en présence d'un tampon tel que le trishydroxyaminométhane ( 0,5-5 m M), de chlorure de magnésium ( 2-5 m M), et éventuellement de bêta mercaptoéthanol ( 7-15 m M), et d'albumine bovine sérique ( 20-60 microgrammes/ml). Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé con- forme à la présente invention, le support solide subit un ou plusieurs lavages avant la révélation du marqueur incorporé quantitativement dans l'ADN. Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le ou les lavages éventuels sont effectués en tampon Phosphate 0,2 M Citrate 0,l M p H 5,4 Tween 20 0,1 %. Selon une autre modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le ou les lavages du support solide sont effectués en tampon Borate (force ionique environ 0,1), 0,1 % Tween 20, p H 8-8,5. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé con- forme à la présente invention, la révélation du marqueur in- corporé dans l'ADN se fait à l'aide d'une réaction enzymati- que en utilisant un substrat dont la réaction en présence de l'enzyme correspondant est responsable de l'émission d'un si- - gnal quantifiable à l'aide de l'appareillage convenable. Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le marqueur' incorporé à l'ADN étant la biotine, la révélation de ce marqueur incorporé dans l'ADN se fait par addition au cours d'une troisième étape d'un composé avidi- ne/enzyme ou streptavidine/enzyme. Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'enzyme couplé à l'avidine ou à la streptavidine est la peroxydase. Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le complexe streptavine/peroxydase préalablement di- lué à la concentration adéquate en tampon Phosphate 0,2 M Ci- trate 0,l M p H 5,4 4 % polyéthylène glycol ( 6000) est incubé 5 à 30 minutes à température d'environ 4 à 370 Celsius. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé con- forme à la présente invention, l'activité enzymatique de la peroxydase est déterminée quantitativement après lavages du support solide par addition d'un substrat dont la modifica- tion sous l'effet de l'enzyme donnera un signal mesurable. Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le ou les lavages éventuels sont effectués en tampon Phosphate 0,2 M Citrate 0,1 M p H 5,4 Tween 20 0,1 %. Selon une autre modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le ou les lavages du support solide sont effectués en tampon Borate (force ionique environ 0,1), 0,1 % Tween 20, p H 8-8, 5. Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'activité enzymatique de la peroxydase est détermi- née quantitativement après des lavages du support solide en tampon Phosphate 0,2 M Citrate 0,l M p H 5,4 Tween 20 0,1 % par addition de 3 3 ' 5 5 ' tétraméthylbenzidine, et la lecture de la réaction colorée est effectuée quelques minutes plus tard après arrêt de la réaction par addition d'acide sulfurique 2- 4 N à l'aide d'un spectrophotomètre à 450 nm. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention com- prend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. il - La présente invention vise plus particulièrement (i) le nouveau procédé de dosage de l'ADN présent dans un liquide biologique en position extracellulaire, conforme aux disposi- tions qui précèdent, (ii) les analyses biologiques utilisant ce procédé, ainsi que (iii) les situations physiologiques et pathologiques élucidées et (iv) les diagnostics établis grâce au procédé conforme à la présente invention. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre et d'application du procédé objet de la pré- sente invention Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet d'invention, dont ils ne constituent en aucune maniè-15 re une limitation. Exemple 1: détection d'ADN circulant dans le plasma sensibilisation de la plaque de microtitration: 50 /ul de protéines histoniques à 10 /ug/ml en tampon carbonate 0,1 M p H 9,6 Incubation 24 heures à 4 C suivie de trois lavages en tampon Borate ( 0,1 de force ionique) 0,1 % Tween 20. adsorption de l'ADN sur le support solide: incubation de 50 /ul de plasma 15 minutes à 30 C. marquage de l'ADN: après 3 lavages en tampon trishydroxya- minométhane 2,5 m M p H 8 lm M EDTA (acide éthylènediamine tétra- acétique), addition de 50 /ul de milieu réactionel 0,5 m M Trishydroxyaminométhane 0,1 M p H 8, 3 m M Mg C 12, 50 /ug/ml BSA, 9 m M bêta 2 mercaptoéthanol et contenant 40 pico Moles de bioti- ne 14-d ATP, 20 pico Moles de d GTP, d TTP et d CTP, 0,04 unités de DNA polymérase et 4 picogrammes de désoxyribonucléase pan- créatique I, et incubation 1 heure à 30 C. révélation du marquage: après trois lavages en tampon Phosphate 0,2 M/Citrate 0,l M p H 5,4 Tween 20 0,1 %, addition de /ul de conjugué streptavidine-peroxydase (Amersham) dilué l + 12 - au 1/1000 en tampon Phosphate/Citrate 4 % polyéthylèneglycol. Après 15 minutes d'incubation à 30 C et quatre lavages en tampon Phosphate 0,2 M/Citrate 0,1 M p H 5,4 Tween 20 0,1 %, addi- tion de 50 /ul de substrat ( 3 3 ' 5 5 ' tétraméthylbenzidine). Après quelques minutes, la réaction colorée est arrêtée par addition de 50 /ul de H 2 SO 4 4 N et la lecture est effectuée à 450 nm dans un spectrophotomètre "Multiscan Flow". Exemple 2: détection d'ADN circulant dans le plasma d'une souris injecté par endotoxine bactérienne (ou lipopolysaccha- ride: LPS) et dans le plasma d'une souris normale, en utili- sant comme support solide une plaque de microtitration sensi- bilisée par des protéines histoniques (Tableau I). sensibilisation de la plaque de microtitration: 50 /ul de protéines histoniques à 10 /ug/ml en tampon carbonate 0,1 M p H 9,6 Incubation 24 heures à 4 C suivie de trois lavages en tampon Borate ( 0,1 de force ionique) 0,1 % Tween 20, p H 8,3. adsorption de l'ADN sur le support solide: incubation de /ul de plasma de souris à différentes dilutions, 120 minu- tes à 30 C. marquage de l'ADN: après 3 lavages en tampon trishydroxya- minomérhane 2,5 m M p H 8 lm M EDTA (acide éthylènediamine tétra- acétique), addition de 35 /ul de milieu réactionel 0,5 m M Trishydroxyaminométhane 0,1 M p H 8, 3 m M Mg C 12, 50 /ug/ml BSA, * 9 m Mn bêta 2 mercaptoéthanol et contenant 40 pico Moles de bio- tine 14-d ATP, 20 pico Moles de d GTP, d TTP et d CTP, 0,04 unités de DNA polymérase et 4 picogrammes de désoxyribonucléase pan- créatique I, et incubation 2 heures à 30 C. révélation du marquage: après trois lavages en tampon Phosphate 0,2 M/Citrate 0,1 M p H 5,4 Tween 20 0,1 %, addition de /ul de conjugué streptavidine-peroxydase (BRL) dilué au 1/1000 en tampon Phosphate/citrate 4 % polyéthylèneglycol. Après 30 minutes d'incubation à 30 C et quatre lavages en i 13 - tampon Phosphate 0,2 M/Citrate 0,1 M p H 5,4 Tween 20 0,1 %, addi- tion de 50 /ul de substrat ( 3 3 ' 5 5 ' tétraméthylbenzidine). Après quelques minutes, la réction colorée est arrêtée par addition de 50 /ul de H 2 SO 4 4 N et la lecture est effectuée à5 450 nm dans un spectrophotomètre "Multiscan Flow". Tableau I Détection d'ADN circulant dans le plasma d'une souris injectée par LPS et dans le plasma d'une souris normale Unités DO 1 (D Ox 1000) dilution puits sensibilisés par histones puits non sensibilisés plasma "LPS" 2 plasma normal 3 1/15 1: DO = densité optique 2: plasma de souris femelle OF 1 agée de huit semaines injec- tée huit heures avant la saignée par voie intrapéritonéale par 100 microgrammes de LPS de Salmonella minnesota Re 595 dilué dans 0,15 M Na Cl ( 0,2 ml) 3: souris femelle OF 1 agée de huit semaines injectée huit heures avant la saignée par 0,2 ml de 15 M Na Cl. 1/3 1/15 1/3 14 - Exemple 3: détection d'ADN circulant dans le plasma d'une souris injectée par endotoxine bactérienne dosé à différentes dilution dans du plasma de souris normale, en utilisant comme support solide une plaque de microtitration sensibilisée par des protéines histoniques (Tableau II). La méthodologie est identique à celle décrite dans l'exemple 2 Les résultats obtenus ont été corrigés pour la valeur obtenue en DO dans le plasma de la souris normale. Tableau II Effet des dilutions dilution' DO 21/5,6 1412 1/22 1063 1/90 523 1/360 192 1/1400 76 1/5700 26 1 dilution du plasma de souris injectée par endotoxine bac- térienne (LPS) dans du plasma de souris normale (NMP). 2: DO: densité optique Les résultats sont exprimés par la différence en unités DO (D Ox 1000) entre la valeur donnée par le plasma de souris injectée par LPS dilué en NMP et celle donnée par le NMP. - Exemple 4: dosage d'ADN d'origines différentes. (Tableau III). La méthodologie utilisée pour doser des quantités iden- tiques d'ADN d'origines différentes est identique à celle utilisée dans les exemples 2 et 3. Les dosages ont été effectués sur 35 /ul d'ADN à 731 ng/ml de 4 origines différentes: Tableau III Dosage d'ADN de différentes origines ADN 1 unités DO A 1127 B 1007 C 991 D 1195 /2 182 1: Origine des ADN dosés: A: bactériophage (MP 2, Boerhinger Mannheim) B: plasmide (PBR 322, Boerhinger Mannheim) C: thymus de veau (type V Sigma) D: mononucléosome extraits de cellules de hamster CHO 2: / = contrôle négatif (Na Cl 0,15 M) 16 - Exemple 5: dosage de l'ADN dans du plasma de souris injectée par LPS dilué au 1/4 dans du plasma normal de souris(NMP). Effet des temps des'étapes d'adsorption et de marquage Con- trôle de la spécificité du dosage ( Tableau IV). La méthodologie utilisée est décrite dans l'exemple 1. Deux temps d'adsorption ( 15 et 60 minutes) et quatre temps de marquage ( 15, 30, 60, 120 minutes) ont été testés La spéci- ficité du dosage a été contrôlée en omettant les enzymes spé- cifiques de l'ADN dans le milieu réactionnel de marquage de 1 'ADN. Tableau IV Effet des temps des étapes d'adsorption et de marquage et contrôle de la spécificité du dosage. Unités DO (D Oxl O 0) durée de l'étape (minutes) plasma de souris injectée par LPS adsorption marquage + 1 1: +: enzymes spécifiques de l'ADN présents. 2: (-): enzymes spécifiques de l'ADN absents NMP + 17 - Il ressort des exemples d'application qui précèdent que le procédé qui fait l'objet de la présente invention permet de doser quantitativement l'ADN dans le plasma et d'une ma- nière générale dans un milieu biologique contenant de l'ordre de 1000 fois plus de protéines que d'ADN et constitue un pro- cédé facile à mettre en oeuvre ne requérant qu'un appareilla- ge pour la lecture en densité optique dans le spectre visi- ble Le procédé conforme à la présente invention est repro- ductible et suffisamment sensible pour détecter de l'ADN dans des échantillons de quelques microlitres à des concentrations de l'ordre du nanogramme par millilitre. En outre, le procédé conforme à la présente invention est plus rapide et permet de doser simultanément au moins 10 fois plus d'échantillons que les procédés proposés dans l'art antérieur. Le procédé conforme à la présente invention devrait en raison des avantages qu'il présente, dont certains ont été précisés dans ce qui précède, permettre une meilleure comphé- hension de la signification physiologique et physiopathologi- que de l'augmentation des taux d'ADN plasmatique chez l'homme aussi bien que dans des conditions expérimentales et devrait être un outil de grande valeur pour l'étude de toute situa- tion o il est en pratique important de quantifier les phéno- mènes de mort cellulaire ou de détecter la contamination d'un échantillon biologique par de l'ADN. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon explicite; elle embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la pré- sente invention. 18 - REVENDICATIONS 1 Procédé de'dosage d'ADN présent en position extra- cellulaire dans un milieu, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: la fixation de l'ADN présent dans le milieu, sur un sup- port. l'incorporation dans l'ADN fixé d'au moins un désoxyribonu- cléotide marqué. la révélation directe ou indirecte du marqueur incorporé. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fixation de l'ADN sur le support se fait par adsorp- tion. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la fixation de l'ADN se fait par adsorption sur un sup- port solide tel une plaque de microtitration ou une membrane. 4 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la fixation de l'ADN se fait par adsorption à l'aide d'u- ne substance présentant une affinité particulière pour l'ADN que celle- ci soit elle même directement fixé sur le support, ou qu'elle soit fixée indirectement. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la substance présentant une affinité particulière pour l'ADN à l'aide de laquelle se fait la fixation de l'ADN sur le support est prise dans les groupes des substances conte- nues dans la gélatine ou des substances cationiques. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la substance présentant une affinité particulière pour l'ADN à l'aide de laquelle se fait la fixation de l'ADN sur le support est représentée par une ou des protéines histoni- ques, qu'elle que soit leur provenance. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la fixation de l'ADN sur le support est réalisée après sensibilisation du support solide par incubation d'un mélange35 de protéines histoniques en tampon carbonate 0,05-0,1 M p H en- viron 9,6, plusieurs heures, quelle que soit la température d'incubation. 8 Procédé selon l'une des revendications 2 à 7 carac- 19 - térisé en ce que l'adsorption de l'ADN présent dans l'échan- tillon est réalisée au cours d'une incubation de 15 à 120 mi- nutes quelle que soit la température d'incubation. 9 Procédé selon l'une des revendications 3 à 8, carac- térisé en ce que le support solide subit un ou plusieurs la- vages avant le marquage de l'ADN adsorbé. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le support solide subit un ou plusieurs lavages en tampon Tris 2,5 m M p H 8, EDTA lm M, avant le marquage de 1 'ADN adsor- bé. 11 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le marquage de l'ADN adsorbé se fait à l'aide d'enzy- mes spécifiques de l'ADN. 12 Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le marquage de l'ADN est réalisé à l'aide d'une réac- tion de déplacement de coupure haplotomique ("Nick transla- tion") ou à l'aide de toute autre technique de marquage de l'ADN tels un "marquage par amorce" ou un "marquage terminal" par incorporation, au cours d'une incubation de 15 à 240 mi- nutes, à température de 15 à 40 Celsius environ, d'au moins un désoxyribonucléotide marque. 13 Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le ou les nucléotides incorporés dans l'ADN sont mar- qués par la biotine et l'enzyme utilisé pour sa ou leur dé- tection est lié à l'avidine ou à la streptavidine. 14 Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractéri- sé en ce que le marquage par déplacement de coupure haploto- mique est effectué par incubation de l'ADN adsorbé sur le support solide avec 10 à 100 picomoles environ d'un ou plu- sieurs désoxyribonucléotides triphosphates marqués, éventuel- lement environ 10 à 100 picomoles de désoxyribonucléotides triphosphates non marqués, environ 0,04 unités d'ADN polymé- rase et environ 4 picogrammes de désoxyribonucléase I, en présence d'un tampon tel que le Tris-hydroxyri-aminométhane ( 0,5-5 m M), de chlorure de magnésium ( 2-5 m M), et éventuelle- ment de bêta-mercapto-éthanol( 7-15 m M), et d'albumine bovine sérique ( 20-60 microgrammes/ml). Procédé selon l'une des revendications 3 à 14, ca- - ractérisé en ce que, après marquage de l'ADN, le support so- lide subit un ou plusieurs lavages avant l'étape de révéla- tion du marqueur incorporé quantitativement dans l'ADN. 16 Procédé selon la revendications 15, caractérisé en ce que, après marquage de l'ADN adsorbé sur le support soli- de, le ou les lavage(s) sont effectués en tampon Phosphate 0,2 M Citrate 0,1 M p H 5,4 Tween 20 0,1 %. 17 Procédé selon l'une des revendications 1 à 16 ca- ractérisé en ce que la révélation du marqueur incorporé dans l'ADN se fait à l'aide d'une réaction enzymatique. 18 Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que le marqueur incorporé est la biotine et que la révélation de ce marqueur incorporé dans l'ADN se fait par addition d'un composé avidine/enzyme ou streptavidine/enzyme, dénommé con- jugué. 19 Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que l'enzyme couplé à l'avidine ou à la streptavidine est de la peroxydase. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que la peroxydase couplée à l'avidine ou à la streptavidine est préalablement diluée à la concentration adéquate en tam- pon Phosphate 0,2 M Citrate 0,1 M p H 5,4 4 % polyéthylène glycol ( 6000). 21 Procédé selon la revendication 20 caractérisé en ce que la peroxydase couplée à l'avidine ou à la streptavidine est incubé 5 à 30 minutes à température d'environ 4 à 370 Cel- sius en présence de l'ADN marqué à la biotine. 22 Procédé selon l'une des revendications 18 à 21 ca- ractérisé en ce que, après incubation du conjugué, le support solide subit un ou plusieurs lavages. 23 Procédé selon la revendication 22 caractérisé en ce que, après incubation du conjugué, le ou les lavages du sup- port solide sont réalisés en tampon Phosphate 0,2 M Citrate 0,1 M p H 5,4 Tween 20 0,1 %. 24 Procédé selon l'une des revendications 17 à 23 ca- ractérisé en ce que la présence du conjugué est révélée à l'aide de tout substrat dont la réaction en présence du con- jugué est responsable de l'émission d'un signal quantifiable 21 - à l'aide d'un appareillage approprié tel qu'un spectophotomè- tre, un spectrofluorimètre ou un biocapteur en particulier. Procédé selon l'une des revendications 19 à 24 ca- ractérisé en ce que l'activité enzymatique de la peroxydase est déterminée quantitativement par addition de 3 3 ' 5 5 ' té- traméthyl benzidine qui sous l'effet de la peroxydase donne une réaction colorée. 26 Procédé selon la revendication 25 caractérisé en ce que la dite réaction colorée est l'objet d'une lecture effec- tuée quelques minutes plus tard après arrêt de la réaction par addition d'acide sulfurique 2-4 N, à l'aide d'un spectro- photomètre à 450 nm. 27 Procédé selon l'une des revendications 9, 15 et 22 caractérisé en ce que le ou les lavages sont effectués en tampon Borate environ 0,1 de force ionique, 0,1 % Tween 20, p H 8,3.