FR 2649122 A1 19910104 FR 8908873 A 19890703 La présente invention est relative & un per- fectionnement apporté aux techniques d'amplification d'acides nucléiques par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). La réaction de polymérise-ion en chaîne (PCR) a été développée par SAIKI R. et al. (Science, 1985, 230, 1350). Cette technique permet notamment d'amplifier des séquences d'ADN simple brin ou double brin et- est basée sur le fonctionnement cyclique d'une ADN polymérase, la- quelle enzyme est capable de copier un brin d'ADN, uti- lisé comme matrice, en un brin complémentaire par élonga- tion à partir de l'extrémité 3' OH libre d'une amorce oligonucléotidiqué. La technique PCR consiste à effectuer n cycles successifs d'amplification, au cours desquels deux amorces dirigent l'amplification de la séquence d'ADN double brin qu'elles encadrent. Un cycle d'amplification est composé de trois étapes permettant de réaliser suc- cessivement la dénaturation de l'ADN (à une température comprise entre 90 et 95'C), l'hybridation des amorces (par exemple à une température comprise entre 37 et 75 C) et l'élongation des brins d'ADN par l'ADN polymérase. La PCR permet ainsi d'amplifier des séquences d'acides nucléiques des milliers de fois. Cette technique d'amplification est plus par- ticulièrement décrite dans la Demande de Brevet européen CETUS 201 184, qui spécifie notamment que les deux amorces oligonucléotidiques mises en oeuvre dans la PCR sont de préférence simple brin et doivent être suffisam- ment longues pour amorcer la synthèse du produit d'extension en présence de l'ADN polymérase. Pour éviter l'addition d'enzymes à chaque cycle, une ADN polymérase pouvant résister à 100'C, la Taq ADN polymérase, décrite dans la Demande de Brevet eu- ropéen CETUS 258 017, est ajoutée dès le début du procédé et permet de réaliser jusqu'à 40 cycles d'amplification consécutifs. La Taq polymérase a permis d'une part d'automatiser le procédé d'amplification et d'autre part d'augmenter la spécificité de l'amplification. Les séquences amplifiées sont ensuite détec- tées; plusieurs techniques de détection ont été propo- sées. On peut citer en particulier l'hybridation entre une sonde de détection et la séquence d'acide nu- cléique cible amplifiée, sur support solide (dot blot, Southern blot), comme décrit dans la Demande de Brevet européen CETUS 200 362 qui décrit la technique d'amplification, associée à une méthode d'hybridation, pour la détection d'une séquence d'acide nucléique. - La Demande de Brevet européen CETUS 229 701 décrit un procédé de détection de virus par amplification et hybridation soit sur support solide, soit en solution. Dans ce dernier cas, par exemple, la séquence d'acide nu- cléique amplifiée et hybridée en solution à une sonde oligonucléotidique marquée, s'hybride spécifiquement à la séquence cible, ladite sonde étant détectée par la tech- nique de restriction oligomérique. Le fragment de sonde marquée obtenu par clivage dé l'enzyme de restriction ap- propriée est séparé sur gel d'électrophorèse et le gel est autoradiographié. Ces deux demandes européennes, ne permettent pas d'éviter les faux positifs dus aux fragments cibles spécifiques préalablement amplifiés dits fragments conta- minants. En effet, alors que les contaminations par sé- quences homologues, débris cellulaires ou plasmides peu- vent être évitées dans les laboratoires dédiés au diagnostic, la contamination due à la présence des sé- quences spécifiques à détecter issues dans la majorité des cas, d'amplifications antérieures, qui génèrent un grand nombre de copies et entraînent une accumulation de ces fragments cibles amplifies, est particulièrement difficile à éviter et aboutit notamment à la présence ubiquitaire des séquences & détecter dans le laboratoire. Comme le précise Y.A.D. LO et al., dans Lancet, 1988, ii, 679, cette contamination est un incon- vénient de la grande sensibilité de la PCR. LO et al. décrivent plus particulièrement un exemple de contamina- tion dans un diagnostic de séquences HBV et montrent un résultat positif obtenu à partir d'échantillons néga- tifs: des séquences HBV ont été amplifiées à partir d'échantillons négatifs,une vérification de l'absence de séquences à détecter dans l'échantillon ayant été réali- sée par un Southern Blot. LO et al. ont analysé ce résultat comme une contamination des amorces utilisées par des plasmides contenant l'insert HBV (plasmide pHBV130), car lorsque l'on se débarrasse des amorces contaminées, il n'y a plus d'amplifications faussement positives dans les échantil- lons négatifs. LO et al. suggèrent que, dans la mesure o la PCR est de plus en plus utllisée dans le diagnostic, le problème des faux positifs, par contamination par des sé- quences identiques à celles à détecter, ne peut être né- gligé. LO et al. suggèrent également de réaliser systéma- tiquement un témoin dit négatif consistant uniquement en réactifs pour la PCR pour évaluer la contamination plasmidique éventuelle de ces réactifs. LO et al. proposent également de vérifier l'existence d'une contamination plasmidique par amplifi- cation en présence d'amorces placées de part et d'autre de la jonction vecteur-insert dudit plasmide. Cette pro- cédure est spécialement nécessaire si des résultats conflictuels sont obtenus par les méthodes convention- nelles telles que le Southern Blot. Les précautions suggérées ci-dessus par LO et al. permettent d'éviter éventuellement la contamination plasmidique des réactifs de la PCR. Il faut noter cepen- dant que le problème de la contamination par la présence d'un plasmide vecteur du fragment cible ne se pose que dans les laboratoires de recherche alors que les labora- toires de diagnostic (laboratoires d'analyses médicales par exemple), effectuant des identifications en routine, disposent de réactifs prêt àl'emploi et qu'en ce cas, il- est important d'éviter la contamination de la matrice par des produits autres que des plasmides (produits de -la PCR, virus libres par exemple) pour la réalisation d'un diagnostic fiable, cette contamination ne pouvant être évitée. de l'avis de LO et al, à l'heure actuelle. C'est pourquoi, la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à un procédé de réaction de polymé- rlsation en chaîne (PCR) modifié, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés antérieurs, notamment en ce qu'il permet d'empêcher l'amplification exponentlelle des acides nucléiques double brin contami- nants, c'est-à-dire des séquences identiques aux sé- quences à détecter amplifiées lors de précédents diagnos- tics au laboratoire, qui pourraient entraîner la produc- tion de faux positifs. La présente invention a pour objet un procédé de détection et/ou d'identification d'une séquence d'acide nucléique ou d'un mélange de séquences d'acides nucléiques par amplification enzymatique et hybridation, caractérlsé en ce que ladite détection comprend les étapes suivantes: (1) une étape de destruction des extrémités ' des séquences d'acide nucléique double brin pour em- pêcher l'amplification exponentielle des séquences-double brin contaminantes (séquences préalablement amplifiées), par mise en contact avec une 5' exonucléase appropriée active à une température comprise entre 37 et 42 (ther- mosensible); (2) une étape d'amplification proprement dite par mise en contact de l'échantillon obtenu en (1) avec les réactifs appropriés de la PCR, notamment des amorces appropriées à la détection, en présence d'une ADN polymé- rase thermorésistante; (3) une étape de détection des séquences spé- cifiques amplifiées. Selon un mode de mise er oeuvre avantageux de l'invention, l'étape (2) dudit procédé est réalisée, en outre, en présence d'une ADN polymérase thermosensible. Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux de l'invention, la 5' exonucléase est la 5' lambda exonucléase. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, les amorces mises en oeuvre pour l'amplification sont phosphorylées à leurs extrémités 5'. Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux dudit procédé, l'étape (1), à savoir l'étape de dé- struction des extrémités 5' des séquences d'acide nu- cléique double brin, n'est réalisée qu'une fois alors que l'étape (2) est répétée au moins une fois. Un tel procédé a l'avantage de modifier, en début de réaction, les fragments cibles amplifiés lors de précédentes manipulations (contaminants), sans modifica- tions importantes de l'ADN plasmidique ou génomlque. Après ce traitement, le fragment cible amplifié préexis- tant ne peut plus servir de matrice pour une amplifica- tion exponentielle, alors que l'ADN plasmidique ou géno- mique reste toujours la matrice de départ. La 5' exonucléase détruit les extrémités 5' des ADN double brin formés comme produits d'extension d'amorce, alors que l'ADN simple brin, les amorces et l'ADN dénaturé ne sont pas détruits par l'ADN 5' exonu- cléase. La présente invention a également pour objet une composition enzymatique pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection conforme à l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend une 5' exonucléase thermosensible et une ADN polymérase thermorésistante. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend, en outre, une ADN polymérase active à 37-42'C (thermosensible). La présente invention a, en outre, pour objet un coffret, kit ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons et réactifs convenables, d'au moins une paire d'amorces appropriée et éventuellement d'au moins une sonde appropriée, des doses appropriées d'une compo- sition enzymatique comprenant une 5' exonucléase, une ADN polymérase thermorésistante et éventuellement une ADN polymérase active à 37-42 'C. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se ré- fère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être blen entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. De manière générale, le procédé conforme à l'invention permet d'éliminer les faux positifs dus à la contamination par des séquences identiques aux séquences à détecter, préalablement amplifiées au laboratoire. Dans une amplification classique, telle que décrite dans les Demandes de Brevets CETUS par exemple, les séquences contaminantes la plupart du temps présentes au laboratoire, sont en fait amplifiées exponentiellement et conduisent à l'obtention de faux positifs, comme vi- sible sur la figure 1. Par contre, lors de la mise en oeuvre du pro- cédé conforme à l'invention, les séquences contaminantes, en présence de 5' exonucléase ne conduisent pas à l'obtention de faux positifs, car elles ne sont ampli- fiées que linéairement, comme visible sur la figure 2; en effet, les extrémités des fragments amplifiés sont très importantes pour les hybridations avec les amorces et les extrémités 5' ne peuvent pas être réparées par la 5'-3' polymérase: la destruction spécifique des extrémi- tés 5' des fragments préalablement amplifiés (contami- nants), ne permet plus à ceux-ci d'être à l'origine d'une amplification exponentielle. ExmpII:1 Détection de Chlamydia trachoma- tis par le procédé conforme à l'invention, en présence d'ADN polymérase thermorésistante. Des échantillons d'ADN de Chlamydia sont sou- mis A une amplification dans un milieu de réaction conte- nant en un volume total de 50 pl: 1 MM de chacune des amorces appropriées phosphorylées en 5', 200 pM de chacun des 4 désoxyribonucléodides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10 mM de Tris, pH 8, 50 mM de KCl, 5mM de- MgCl2, 1 unité de 5'3' polymérase thermorésistante et une unité de 5' lambda exonucléase thermosensible. 20.Le. protocole est le suivant: les échantillons sont chauffés à 37'C pendant minutes (action de l'exonucléase) et sont ensuite sou- mis à une' amplification de 25 cycles comme suit:-chauf- fage à 92'C pendant 15 secondes, refroidissement à 55'C pendant une minute puis chauffage à 72 C pendant une mi- nute. Les échantillons sont alors conservés à 72'C pen- dant 10 minutes. Les produits de la PCR sont séparés par élec- trophorèse sur gel d'agarose (1,4 %) coloré au bromure d'éthidium. L'ADN est alors détecté par exposition aux rayons U.V.. La figure 3 montre le résultat obtenu en co- lonne 2. On obtient une tâche qui correspond à la pré- sence d'ADN de Chlamydia. !x*mIe 2: Détection de Chlaaydia par ampli- fication classique. On procède comme dans l'exemple 1. Toutefois, l'on n'ajoute pas de 5' lambda exonucléase. La figure 3 montre le résultat obtenu en colonne 1. L'on voit donc que la présence de 5' lambda exonucléase n'influe pas sur l'amplification elle-même. xezffln 3: Mise en évidence du rôle de la contamination par des séquences identiques & celles à dé- tecter, dans le diagnostic de faux positifs: rôle du procédé conforme à l'invention. 1. Amplification d'éventuels contaminants pour pouvoir les visualiser en gel d'agarose, en présence d'amorces phosphorylées. - On réalise un milieu de réaction contenant en un volume total de 50 41: i jM de chacune des amorces appropriées pour Chlamydia, phosphorylées en 5', 200 jM de chacun des quatre désoxyribonucléotides triphosphates, mM de Tris, pH 8, 50 mM de KCl, 5 mM'de MgClz et une unité de 5'3' polymérase thermoréslstante. Les échantillons sont soumis à une amplifica- tion de 25 cycles comme suit: chauffage à 92 C pendant secondes, refroidissement à 55'C pendant une minute, puis chauffage à 72 C pendant une minute. Les échantil- lons sont alors conservés à 72 C pendant 10 minutes. - On prélève 10 jl de l'échantillon amplifié obtenu et l'on procède comme dans l'exemple i (voir fi- gure 3, colonne 4). - On réalise simultanément un témoin sans ajout d'exonucléase (figure 3, colonne 3). La figure 3- montre les résultats obtenus, co- lonnes 3 et 4: la colonne 3 correspond à une amplification classique (sans 5' exonucléase): on observe une légère bande correspondant aux fragments amplifies spécifiques de Chlamydia,. alors que l'échantillon de départ ne contient pas de Chlamydia. On observe en dessous de cette bande, une autre bande correspondant à des fragments non spécifiques, habituellement retrouvée lors d'amplifica- tions conduites en l'absence d'une quelconque matrice d'ADN; la colonne 4 correspond à une amplification conforme à la présente invention (en présence d'exonucléase): on n'observe aucune bande spécifique de Chlamydia; seule la bande correspondant aux fragments non spécifiques, habituellement retrouvée lors d'amplifications conduites en l'absence d'une quelconque matrice d'ADN est observée. 2. Amplification d'éventuels contaminants en présences d'amorces appropriées à Chlamydia, non phospho- rylées. On procède comme dans 1 ci-dessus. La figure 3 montre les résultats obtenus en colonnes 5 et 6: la colonne 5, qi correspond à une amplifi- cation classique (sans 5' exonucléase) contient deux bandes comme dans la colonne 3; la colonne 6 est identique à la colonne 5: on voit que lorsque les amorces ne sont pas phosphory- lées, l'exonucléase est nettement moins sensible et ne permet pas systématiquement d'éliminer les contaminants. Exemple-,4: Détection de Chlamydia trachoma- tis par le procédé conforme à l'invention, en présence d'une ADN polymérase thermorésistante et d'une ADN poly- mérase thermosensible. La réaction est mise en oeuvre comme suit: Des échantillons d'ADN dénaturé par la cha- leur sont ajoutés à un tampon contenant 10 mM Tris, pH 8, mM KCl, 5 mM MgCl2, dXTP: 200 M de chaque, amorce: 1 MM de chaque, 0,5 unité d'ADN lambda exonucléase, 0,25 3 unité d'ADN polymérase active à 37-42'C (transcriptase reverse) et 0,5 unité d'ADN polymérase thermorésistante. Les échantillons sont chauffés à 37'C pendant minutes et subissent une amplification de 25 cycles comme suit: les échantillons sont chauffés à 90'C pen- dant 15 secondes, refroidis & 55'C pendant une minute et chauffés à 72'C pendant une minute. Les échantillons sont alors conservés à 72'C pendant 10 minutes. Les produits de la PCR sont séparés sur gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium. L'ADN est alors détecté par exposition aux rayons U.V.. Les tranferts Southern sont réalisés sur Hybond N (Amersham). Un ARN simpl ' brin marqué au 32p et spécifique des séquences cibles amplifiées est hybridé au filtre. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de 1 mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien- nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve- nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écar- ter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. 11. NEEDICMTIOHS 1.) Procédé de détection et/ou d'identification d'une séquence d'acide nucléique ou d'un mélange de séquences d'acides nucléiques par amplifica- tion enzymatique et hybridation, caractérisé en ce que ladite détection comprend les étapes suivantes: (1) une étape de destruction des extrémités ' des séquences d'acide nucléique double brin pour em- pêcher l'amplification exponentielle des séquences double brin contaminantes (séquences préalablement amplifiées), par mise en contact avec une 5' exonucléase appropriée active à une température comprise entre 37 et 42' (ther- mosensible); (2) une étape d'amplification proprement dite par mise en contact de l'échantillon obtenu en (1) avec les réactifs appropriés de la PCR, notamment des amorces appropriées à la détection, en présence d'une ADN polymé- rase thermorésistante; (3) une étape de détection des séquences spé- cifiques amplifiées. 2') Procédé selon la revendication 1, carac- térist en ce que l'étape (2) dudit procédé est réalisée, en outre, en présence d'une ADN polymérase thermosen- sible. 3') Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la 5' exonucléase est la 5' lambda exonucléase. 4') Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 A 3, caractérisé en ce que les amorces mises en oeuvre pour l'amplification sont avantageusement phosphorylées à leurs extrémités 5'. ') Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 A 4, caractérisé en ce que l'étape (1), à sa- voir l'étape de destruction des extrémités 5' des sé- quences d'acide nucléique double brin, n'est réalisée qu'une fois alors que l'étape (2) est répétée au moins une fois. 6') Composition enzymatique pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend une 5' exonucléase thermosensible et une ADN po- lymérase thermorésistante. 7) Composition selon la revendication 7, ca- ractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, une ADN polymérase active à 37-42'C (thermosensible). 8') Coffret, kit ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications i à 5, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons et réactifs convenables, d'au moins une paire d'amorces ap- * propriée et éventuelLement d'au moins une sonde appro- priée, des doses appropriées d'une composition enzyma- tique comprenant une 5' exonucléase, une ADN polymérase thermorésistante et éventuellement une ADN polymérase ac- tive à 37-42 C.