FR 2658917 A3 19910830 FR 9002445 A 19900227 PAPIER EN NITROCELLULOSE OU EN NYLON, POUR ESSAIS IMHUNOLOGIQUES EN TACHES L'invention consiste en un papier de nitrocellulose ou de nylon, pour simplifier et accélérer le déroulement d'un diagnostic sérologique par essais immunologiques en taches (EIT) En utilisant ce papier en nitrocellulose ou en nylon pour effectuer des EIT, on peut réaliser ces essais de façon très simple en n'utilisant que des micro- pipettes multicanaux et des plaques à puits, sans avoir besoin d'un laveur ELISA, d'un lecteur ELISA ou d'un quelconque autre instrument spécial La vitesse de réalisation des EIT simples ( 1 à 2 heures) est plus grande que celle des essais réalisés habituellement ( 6 à heures) La charge de travail pour un technicien de laboratoire peut être diminuée de façon importante. Le mécanisme et le procédé de l'essai EIT sont presque les mêmes que ceux de l'essai ELISA, qui est un essai très fiable, très sensible et qui donne beaucoup d'informations, et que l'on utilise pour réaliser des diagnostics sérologiques en médecine vétérinaire. Dans ce qui suit, on décrit le procédé de l'essai ELISA. On utilise une plaque d'essai ELISA, en polystyrène, qui présente 96 ( 8 x 12) puits La surface des puits présente une bonne aptitude à l'absorption d'un virus, d'une protéine ou de toute autre substance immunogène. Généralement, on place, dans un puits 51 de la plaque 5 d'essai ELISA (voir figure 2 A), 100 Ml desdits antigènes immunogènes, dilués dans une solution de fixation d'antigènes, et on attend pendant une nuit Les antigènes se fixent sur la paroi interne du puits (voir figure 2 B), et la solution contenue dans le puits est évacuée (voir figure 2 C) Ensuite, on lave le puits 51 trois fois à l'aide d'un laveur pour ELISA (voir figure 2 D), on verse dans le puits une solution de blocage, contenant une protéine ou un sérum non immunogène, pour bloquer les autres sites de fixation de protéines de la surface interne, et empêcher ainsi des interférences dans la suite du procédé de l'essai Ensuite, on lave les puits avec une solution de lavage pour ELISA, de 3 à 5 fois, pour éliminer toute autre protéine ou antigène non fixé (voir figure 2 F). On ajoute ensuite successivement, dans le puits 51, pl d'un échantillon dilué de sérum contenant un anticorps primaire 611, et on le laisse ainsi pendant 1 à 2 heures (voir figure 2 G) pour laisser l'antigène et l'anticorps réagir complètement; puis on lave le puits 51 avec une solution de lavage pour ELISA, 3 à 5 fois, pour éliminer l'anticorps primaire en excès non fixé (voir figure 2 H), puis on ajoute 100 pl d'un complexe d'anticorps secondaire lié a une enzyme, et on laisse reposer pendant 1 à 2 heures (voir figure 2 I) pour faire réagir l'anticorps primaire 611 Ensuite, on lave le puits 51 avec une solution de lavage pour ELISA, 3 fois (voir figure 2 J) Enfin, on ajoute dans les puits 25 pl d'une solution de substrat, et on laisse reposer pendant à 10 minutes (voir figure 2 K) A la fin de l'essai, on ajoute dans le puits 50 pl d'une solution d'arrêt, afin que l'action enzymatique ne se poursuive pas On lie le résultat de l'essai grâce à la densité de coloration dans chaque puits, à l'aide d'un lecteur ELISA coûteux. Le procédé ELISA décrit ci-dessus peut être résumé en étapes, comme suit: 1 Préparer et fixer l'antigène sur la surface interne des puits pendant une nuit; 2 Laver le puits 3 à 5 fois avec une solution de lavage pour ELISA; 3 Bloquer l'autre partie des sites actifs de fixation de protéine situés à la surface interne du puits, et qui n'ont pas fixé de protéine; 4 Laver le puits 3 à 5 fois; Laisser reposer 1 à 2 heures pour la réaction entre l'anticorps primaire et l'antigène; 6 Laver le puits 3 à 5 fois; 7 Laisser reposer pour la réaction de liaison de l'anticorps secondaire et de l'anticorps primaire 8 Laver le puits 3 à 5 fois; 9 Ajouter la solution de substrat et laisser reposer pendant 15 minutes; Ajouter la solution d'arrêt: Il Lire le résultat à l'aide du lecteur ELISA. Les inconvénients du procédé connu ELISA en onze étapes sont les suivants: 1 La fixation des protéines à la plaque de polystyrène pour ELISA est inférieure à celle qui s'effectue sur le papier de nitrocellulose, et par conséquent, l'opération de fixation de l'antigène prend beaucoup plus de temps; 2 Le procédé ELISA est un essai qui demande beaucoup de temps, en particulier pour les étapes de lavage qui sont reprises au moins 10 à 15 fois, à l'aide d'une machine de lavage, et ce travail est très routinier; 3 Pour effectuer cet essai, il est essentiel de disposer d'un lecteur ELISA et d'un laveur ELISA, qui sont des appareils chers, et par conséquent, la réalisation des essais est coûteuse en raison du coût élevé des instruments et de la grande charge de travail; 4 La place que prend la plaque ELISA est beaucoup plus grande que celle que prend le papier de nitrocellulose, ce qui signifie que des plaques o un antigène est fixe prennent beaucoup plus de place que du papier de nitrocellulose, lors du stockage en congélateur ou d'un transport; 5 On peut fixer l'antigène de diagnostic en beaucoup plus de points que sur la plaque ELISA; 6 En outre, Bio-rad a récemment commercialisé une trousse pour essais immunologiques en taches, permettant d'effectuer ces essais sur du papier de nitrocellulose, mais cette trousse est chère, la réalisation du procédé à l'aide de cette trousse est laborieuse et on ne pervient pas parfois à séparer complètement la solution d'échantillon de sérum de l'essai. En conséquence, un but de la présente invention est de fournir un papier amélioré pour EIT, qui permettra de surmonter les inconvénients mentionnés ci-dessus. Ce but est atteint, selon l'invention, grâce à un papier pour EIT, qui comprend une feuille de papier en nitrocellulose ou en nylon, au dos de laquelle est fixée, grâce à une couche de colle épaisse, une feuille de carton resistant à l'eau Cette feuille de papier est ensuite imprimée en relief, avec un composé d'impression en relief permanent, et cela donne une feuille présentant plusieurs puits séparés, disposés de façon régulière, dans lesquels on pourra fixer divers antigènes pour détecter en une seule opération la présence, dans le sérum, de divers anticorps possibles, caractérisant une maladie. Dans les dessins joints la figure 1 est une vue en perspective d'une plaque connue pour essai ELISA, avec une vue en coupe agrandie de l'un des puits; la figure 2 présente le procédé connu d'essai ELISA; et les figures 3 et 4 présentent divers modes de réalisation de papier en nitrocellulose pour essais immunologiques en taches, conformes à l'invention. Ce qui suit est une description détaillée des modes de réalisation de l'invention envisagés présentement. Cette description ne doit pas être prise dans un sens limitatif, et elle n'est donnée que dans le but d'illustrer les principes généraux de l'invention. D'après les figures 3 et 4, un papier de nitrocellulose pour essais immunologiques en taches comporte une feuille de papier en nitrocellulose ou en nylon, au dos de laquelle est collée, à l'aide d'une couche de colle épaisse, une feuille de carton 2 résistant à l'eau Cette feuille de papier est ensuite imprimée en relief avec de l'encre, mélangée avec un composé d'impression en relief permanent, ce qui donne des formes comme indiqué dans les figures 3 et 4, puis on fait fondre le composé dans un four pour faciliter l'absorption du composé sur le papier. Une multiplicité de puits isolés 4, alignés longitudinalement et transversalement et disposés de façon à empêcher la diffusion des sérums ou des solutions d'échantillons de tissus individuels d'un puits dans les autres puits et donc le mélange des deux solutions qui pourrait conduire à des interférences dans les résultats, sont régulièrement placés dans le papier 2 pour EIT, qui portent des chiffres et/ou des lettres d'indication imprimés dans la marge, qui servent de référence lors de la réalisation du procédé ELISA. Au cours de l'opération, on peut préparer un papier en nitrocellulose de la présente invention, pour essais immunologiques en taches, en fixant divers antigènes immunogènes dans les puits 4, et en lavant les puits 4 avec une solution de lavage pour ELISA, pour éliminer l'antigène non fixé On traite le puits avec une solution de blocage pour ELISA, pour bloquer les sites actifs de fixation de protéine, situés au fond des puits de la feuille de papier de nitrocellulose, puis on lave à nouveau les puits 41 avec une solution de lavage pour ELISA, et on conserve la feuille dans une enceinte de refroidissement maintenue aux environs de 20-C Le papier de nitrocellulose est alors prêt pour recevoir 50 pl d'un anticorps primaire dilué, en tant que solution d'échantillon, dans les puits 4, et ensuite, au bout d'environ une heure, on élimine les résidus de solutions dans les puits 4, tout simplement en plongeant et en agitant le papier de nitrocellulose 1 dans une solution de lavage pour ELISA pendant deux ou trois minutes Le papier de nitrocellulose est alors plongé pendant une heure dans la solution d'anticorps secondaire marqué avec une enzyme, puis on nettoie encore le puits avec une solution de lavage pour ELISA, comme mentionné ci-dessus. On retire ensuite le papier de nitrocellulose et on le plonge dans la solution de substrat pour ELISA pendant 10 à 30 minutes On peut lire rapidement les résultats du diagnostic en comparant la densité de couleur présentée par les endroits des puits 4 auxquels s'est fixé l'antigène avec une série de feuilles colorées témoins. Les avantages de la présente invention résident dans les traits suivants: 1 On peut préparer plusieurs feuilles de papier en nitrocellulose, comportant un antigène fixé et traité avec une solution de blocage, et les conserver, prêtes à l'emploi, dans une enceinte de congélation Lorsque l'on a besoin d'effectuer un essai immunologique en taches, on peut les sortir pour effectuer le test à n'importe quel moment; 2 On peut utiliser un accessoire pour fixer en séquence des antigènes dans les puits de la feuille de papier en nitrocellulose, de façon à accélérer la fixation des antigènes; 3 Il est simple de laver les puits d'une feuille de papier de nitrocellulose en la plongeant et en l'agitant dans une solution de lavage pour ELISA; 4 La fixation des protéines, des antigènes ou des anticorps sur un papier pour EIT, en nitrocellulose ou en nylon, est meilleure que celle observée sur une plaque connue de polystyrène pour ELISA, ce qui signifie que la fixation des antigènes sur le fond des puits de la feuille de papier d'essai en nitrocellulose est plus rapide et plus facile que celle que l'on observe sur la plaque pour ELISA; Plusieurs puits isolés sont situés sur la feuille de papier en nitrocellulose, ce qui permet de fixer divers antigènes pour détecter dans le sérum divers anticorps possibles, caractéristiques de diverses maladies, séparément et en une seule manipulation; 6 Il n'y a pas d'interférences mutuelles entre différents sérums contenant des anticorps, placés dans des puits isolés voisins de la feuille de papier en nitrocellulose, ce qui permet à la manipulation de donner un résultat précis; 7 En utilisant le papier de nitrocellulose, on peut réaliser les essais ELISA sans instruments accessoires coûteux, comme la machine de lavage ELISA et le lecteur ELISA, mentionnés plus haut; et 8 Le papier de nitrocellulose est très mince et ne prend que peu de place, ce qui facilite son stockage dans une enceinte de congélation. Comme un spécialiste pourra s'en apercevoir sans peine, on peut apporter quelques modifications aux modes de réalisation indiqués ci-dessus, à la lumière de la description précédente, sans sortir du cadre de l'invention. i REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'un papier en nylon ou nitrocellulose, pour essais immunologiques en taches, caractérisé en ce qu'il comprend: ( 1) la préparation d'un papier en nitrocellulose ou en nylon; ( 2) l'étalement d'une couche de colle épaisse au dos dudit papier; ( 3) l'adhésion d'un carton résistant à l'eau, au dos dudit papier; ( 4) l'impression en relief dudit papier associé au carton résistant à l'eau, avec de l'encre mélangée avec un composé d'impression en relief permament, ce qui donne des formes ayant une multiplicité de puits séparés et disposés de façon régulière. 2 Papier en nitrocellulose ou en nylon, pour essais immunologiques en taches, produit selon le procédé revendiqué dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins une série de chiffres et/ou de lettres est imprimée dans la marge du papier.