FR 2658521 A1 19910823 FR 9001964 A 19900219 BIPEPTIDES SYMETRIQUES COMPORTANT UN RESTE POLYALKYLENE- GLYCOL, PROCEDE DE PREPARATION ET UTILISATION DANS LE DOSAGE DES PROTEASES DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne, en tant que produits industriels nouveaux, les composés bipeptidiques de formule I ci-après Elle concerne également leur pro- cédé de préparation et leur utilisation dans le domaine du dosage d'enzymes appartenant à l'ensemble des protéases et peptidases, en particulier en tant que substrats dans le domaine du dosage quantitatif de telles enzymes notamment les enzymes de la classe E C 3 4 4 (à présent nouvelle classe "E C 3 4 21 ", selon l'ouvrage "Enzyme Nomenclature", elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam 1973, pages 238 et suivantes). ART ANTERIEUR On sait que les enzymes de la classe sus-visée sont des substances qui scindent les liaisons amides du squelette protéique ou peptidique du côté du groupe carboxyle des restes Arg, Lys, Orn et His Il s'agit là d'un mécanisme de clivage bien connu de l'homme du métier et qui est amplement exemplifié dans les documents anté- rieurs cités ci-après. Les substrats d'enzymes de ladite classe actuel- lement utilisés sont des composés essentiellement tri ou tétrapeptidiques dont l'extrémité N-terminale est généra- lement substituée par un groupe de blocage tel que benzoyle, benzyloxycarbonyle, t-butyloxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle, tosyle, acétyle ou analogue, et dont 2 2658521 l'extrémité C-terminale est amidifiée par un groupe aminé pouvant être un reste radioactif ou un reste capable de conférer, avant ou (mieux) après clivage, une coloration ou une fluorescente notamment un groupe p-nitroaniline. Voir à cet effet, les documents FR-A-2 546 163, FR-A-2 372 798, EP-A-O 004 256, US-A-4 508 644, US-A-4 448 715, FR-A-2 471 411, FR-A-2 317 280 et FR-A-2 459 226. Il se trouve que les dérivés peptidiques anté- rieurement connus ont peu d'affinité pour l'eau Ils sont peu solubles ou peu dispersables dans l'eau, par suite il est quelquefois nécessaire de leur adjoindre un solvant organique pour pouvoir les utiliser Les systèmes compre- nant des solvants mixtes ne sont guère compatibles, d'une manière générale, avec les milieux biologiques: ils entraînent soit une diminution de l'activité du substrat, soit encore, dans certains cas, une détérioration de l'enzyme que l'on veut doser De plus, la faible affinité pour l'eau de ces substrats entraîne une diminution de la sensibilité des méthodes de dosage des edzymes. On connaît de FR-A-2 546 163 précité une solution technique pour améliorer l'hydrosolubilité des substrats enzymatiques selon laquelle le peptide comporte sur l'extrémité N-terminale un groupe polyhydroxycarbonyle. On connaît également de EP-A-O 025 190 un composé polypeptidique comprenant un reste de polyéthylèneglycol monoéthérifié par un groupe alkyle (cf page 8, lignes 6- 8), à savoir le produit de formule Me-PEG 600-CO-(CH 2)2-CO-Val-Arg-Val-p Na (voir page 10, ligne 35), ou PEG 600 désigne le reste de polyéthylèneglycol ayant un poids moléculaire de l'ordre de 600 environ. On connalt enfin de EP-A-O 280 160 des substrats dipeptidiques dont l'extrémité N-terminale comporte un reste alkyloxycarbonylalkylènecarbonyle tel que le reste méthyloxymalonyle. SOLUTION DE L'INVENTION Selon l'invention, on préconise une nouvelle solution technique, qui est différente de celle proposée par FR-A-2 546 163, d'une part, et de celle envisagée par EP-A-O 025 190, d'autre part, en ce sens qu'elle fait appel à un composé comprenant deux chatnes monoaminoaci- des ou peptidiques qui sont chacune liées par leur extré- mité N-terminale à un groupe polyalkylèneglycol divalent par l'intermédiaire d'un pont carbonyle CO. Plus précisément, cette nouvelle solution techni- que repose sur le choix d'un groupe polyalkylèneglycol appartenant à l'ensemble des polyéthylèneglycols et poly- propylèneglycols lié à deux chaines de monoaminoacide ou deux chaînes peptidiques, chaque extrémité O-terminale du reste polyalkylèneglycol étant reliée par l'intermédiaire d'un groupe CO à l'extrémité N-terminale d'une chalne monoacide ou peptidique pour conférer l'hydrosolubilité ou l'hydrodispersabilité nécessaire pour la sensibilité des dosages d'enzymes Le fait que le reste polyalkylène- glycol est lié à deux chaînes augmente la sensibilité du dosage. OBJET DE L'INVENTION Suivant l'invention, on préconise de nouveaux composés appartenant à l'ensemble des aminoacides et des peptides contenant un reste d'aminoacide relié au reste d'un polyalkylèneglycol et ayant une grande affinité pour l'eau, lesdits composés, qui sont différents par leur structure des peptides antérieurement connus notamment en tant que substrats enzymatiques, étant caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi l'ensemble constitué par: (i) les aminoacides et peptides symétriques de formule: R-A-B-CO-Q-CO-B-A-R (I) dans laquelle Q est un reste de polyalkylèneglycol choisi parmi les restes de polyéthylèneglycol et polypropylèneglycol de formule: -O lCH(X)CH 20 ln- o X est H ou Me, et N est un nombre entier supé- rieur ou égal à 1, B représente une simple liaison, un reste de monoaminoacide ou une chaîne peptidique comprenant de 2 à 9 restes monoaminoacides, A est un reste de monoaminoacide basique choisi parmi l'ensemble comprenant les restes d'e-aminoacides comportant un groupe basique sur une chaîne latérale, R est un moyen de marquage permettant la révéla- tion de la substance enzymatique à identifier ou doser; et (ii) leurs sels d'addition. ABREVIATIONS Dans la présente description, on a utilisé les abréviations suivantes par commodité: pour les restes d'aminoacide ACC = 1-amino-cyclohexane-l-carbonyle AHX = E-aminohexanoyle Aib = 2aminoisobutyryle (ou 2-méthylalanyle) Ala =i -alanyle -Ala = -alanyle Arg = arginyle Asn = asparaginyle Asp P-Asp ATC Aze Abu 4 Abu CHA CHG CHT Cle Cys Dbu Gln Glu -Glu Gly His 3 Hyp 4 Hyp Ile Leu Lys Me Gly Met Nle Nva Orn Phe Phg Pip Pro Pyr = "-aspartyle = p-aspartyle = thiazolidine-4carbonyle (ou thioprolyle) = azétidine-2-carbonyle = 2-aminobutyryle = 4aminobutyryle = 3-cyclohexylalanyle = O-cyclohexylglycyle = 3-( 4hydroxycyclohexyl)alanyle = cycloleucyle (ou 1-amino-cyclopropane-1- carbonyle) = cystéyle = 2,4-diaminobutyryle = glutamyle = glutaminyle = 3 '-glutaminyle = glycyle = histidyle = 3-hydroxyprolyle (ou 3-hydroxy-2-pyrroli- dinecarbonyle) = 4-hydroxyprolyle (ou 4-hydroxy-2-pyrroli- dinecarbonyle) = isoleucyle = leucyle = lysyle = N-méthylglycyle (ou sarcosyle) = méthionyle = norleucyle = norvalyle = ornithinyle = phénylalanyle = phénylglycyle = pipécolinoyle = prolyle = pyroglutaminyle (ou 2-pyrrolidone-5- carbonyle) Ser = séryle Thr = thréonyle Tyr = tyrosyle Val = valyle pour les autres abréviations: Ac = acétyle Ac OH = acide acétique Adoc = adamantyloxycarbonyle Aoc = t-amyloxycarbonyle Boc = t-butyloxycarbonyle Bu = n-butyle Bop = hexafluorophosphate de l-(benzotria- zolyl)oxy-tris(diméthylamino)phosphonium (autre nomenclature réactif de CASTRO) de formule OP lN(CH 3)2 l 3 lPF 6 l- N N Bz Bzl Cbo CCM o-Cl-p NA DCCI DCHU DIEA DMF Et Et 3 N Et O 3 b Fmoc = benzoyle = benzyle = carbobenzoxy = chromatograhie sur couche mince = o-chloro-p-nitroanilino lou ( 2-Cl)p NAl = dicyclohexylcarbodiimide = dicyclohexylurée = diisopropyléthylamine = diméthylformamide = éthyle = triéthylamine = éthoxy = 9fluorènylméthyloxycarbonyle l Foc HMPT HOBT H-TFA Iboc i Bu i Pr Me Me O Mor OD O Su PAG PEG Ph p H Pl PM p NA PPG Pr Py RT t Bu TEA THF Tos z Z(p-Cl) Z(p-O Me) = furfuryloxycarbonyle = N,N,N',N',N",N"-hexaméthylphosphoro- triamide = 1-hydroxybenzotriazole = acide trifluoroacétique (ou encore HTFA) = isobornyloxycarbonyle = isobutyle = isopropyle = méthyle = méthoxy = 1-morpholinyle = densité optique = N-oxysuccinimide ou ( 2,4-dioxopyrroli- din-l-yl)oxy = polyalkylèneglycol = polyéthylèneglycol = phényle = cologarithme de la concentration en ions H+ = 1-pipéridinyle = poids moléculaire = p-nitroanilino ou ( 4-N 02)C 6 H 4 NH = polypropylèneglycol = n-propyle = 1-pyrrolidinyle = température ambiante ( 15-20 C) = tbutyle = triéthanolamine = tétrahydrofuranne = p-toluènesulfonyle (ou tosyle) = benzyloxycarbonyle = p-chlorobenzyloxycarbonyle = p-méthoxybenzyloxycarbonyle. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Le groupe Q est un reste de polyalkylèneglycol (PAG) Il comprend les restes de polyéthylèneglycol (PEG) quand X = H et de polypropylèneglycol (PPG) quand X = Me. Dans le groupe Q chaque extrémité O-terminale est reliée à l'extrémité N-terminale de l'une des deux chaînes monoaminoacides ou peptidiques par un groupe carbonyle. De façon avantageuse, le reste PAG aura un poids moléculaire moyen compris entre environ 60 et environ 1000 et de préférence compris entre 200 et 600 De façon préférée Q représentera un reste de polyéthylèneglycol (PEG) plut 8 t qu'un reste de polypropylèneglycol (PPG). Par commodité et soucis d'homogénéité, on a utilisé ci- après les expressions "reste de polyalkylèneglycol" et "reste de polyéthylèneglycol" même quand dans la formu- le I le nombre N est égal à 1. Le groupe A représente, comme indiqué ci-dessus, le reste d'unamonoaminoacide basique I 1 provient d'un monoaminoacide ayant un p H supérieur à 7, c'est-à-dire comportant une fonction acide COOH et, en plus de la fonction basique en O latérale Parmi les restes d'o-aminoacides qui convien- nent, on peut mentionner notamment les restes Dbu, Arg, Lys, His et Orn Les restes A préférés sont des restes d'o-L-aminoacides, notamment L-Arg, L-Lys et L-Orn, le reste le plus intéressant selon l'invention étant L-Arg. Le groupe B représente comme indiqué plus haut une simple liaison, un reste monoaminoacide ou une chaîne peptidique renfermant de 2 à 9 aminoacides Les aminoaci- des qui intervienennt dans le groupe B peuvent être quelconques, notamment naturels ou synthétiques En particulier, quand B représente un reste de monoamino- acide, ledit reste sera soit un reste dépourvu d'atome de carbone asymétrique (tel que notamment Aib, Cle, Gly, Me Gly et 4 Abu) soit un reste comportant un atome de carbone asymétrique et étant de configuration L ou D, le ou les autres restes aminoacides de la chaîne peptidique étant chacun un aminoacide dépourvu d'atome de carbone asymétrique ou un aminoacide comportant un atome de carbone asymétrique et étant de configuration L. Lorsque B est un reste de monoaminoacide, il pro- vient d'un aminoacide naturel ou synthétique ayant un p H inférieur ou égal à 7 ou d'un aminoacide ayant un p H supérieur à 7 mais convenablement substitué pour bloquer essentiellement son caractère basique et atteindre un p H inférieur ou égal à 7. B englobe donc alors 1) les restes d'aminoacides naturels ou synthéti- ques qui comprennent une seule fonction basique, 2) les restes d'aminoacides naturels ou synthéti- ques qui comprennent une seule fonction basique et plus d'une fonction acide et dans lesquels chaque fonction acide latérale (n'entrant pas ou n'intervenant pas dans la liaison peptidique) est susceptible d'être bloquée notamment sous forme amide ou ester, et 3) les restes d'aminoacides naturels ou synthéti- ques qui comprennent une seule fonction acide et plus d'une fonction basique et dans lesquels chaque fonction basique latérale est convenablement substituée pour blo- quer et supprimer essentiellement son caractère basique. Bien entendu les restes d'aminoacides sus-visés, qui sont notamment énumérés dans le chapitre abréviation ci-dessus, peuvent comporter des groupes hydroxyle (OH) ou thiol (SH) latéraux qui sont susceptibles d'être blo- qués, le cas échéant, par un groupe protecteur éther ou ester. Conviennent en particulier pour B, les restes provenant dtaminoacides: naturels non basiques dits "neutres" tels que notamment Ala, e-Ala, Cys, Gin, 4 Hyp, 3 Hyp, Leu, Met, Nle, Nva, Phe, Pro, Me Gly, Ser, Tyr, Val, o le groupe OH latéral des restes 4 Hyp, 3 Hyp, Ser, Thr, Tyr est protégé ou non par un groupe protecteur éther ou ester, et o le groupe SH latéral du reste Cys est protégé ou non par un groupe protecteur thioéther ou thioester; naturels acides tels que notamment Asp, /-Asp, Glu, r-Glu, dans lesquels la fonction acide latérale est libre ou bloquée sous forme amide ou ester, notamment sous forme d'ester benzylique ou t- butylique; naturels initialement basiques dans lesquels la ou les fonctions basiques latérales n'entrant pas dans la liaison peptidique sont bloquées par un groupe acide convenable éliminant pratiquement le caractère basique tel que Adoc, Aoc, Boc, Cbo, Foc, Fmoc, Iboc, Z, Z(p-Cl) et Z(p-O Me) etc, lesdits restes d'aminoacide étant notamment les restes Arg, Lys, His et Orn convenablement bloqués notamment par un groupe Cbo; synthétiques non basiques dits "neutres" tels que notamment ACC, AHX, Aib, ATC, Aze, Abu, 4 Abu, CHA, CHG, CHT (o le groupe OH latéral est protégé le cas échéant sous forme éther ou ester), Cle, Phg, Pip, Pyr; synthétiques initialement basiques dans les- quels chaque fonction basique latérale est protégée par un groupe convenable éliminant substantiellement le caractère basique, notamment le reste Dbu, o la fonc- tion basique latérale est bloquée par un groupe tel que Cbo. Parmi les restes d'aminoacides synthétiques qui conviennent également, on peut mentionner (i) les restes d'aminoacides cycloaliphatiques o le groupe amino et le groupe carboxy sont situés sur le même atome de carbone cyclique (tels que le groupe Cle sus-visé) ou sur deux atomes de carbone cycliques différents et (ii) les restes d'aminoacides aromatiques tels que notamment les restes o-, m et p-aminobenzoyle, et, les restes d'aminoacides aralkyliques tels que notamment les p-aminobenzylcarbony- le, m-aminobenzylcarbonyle. De façon avantageuse, le reste monoaminoacide de B, selon l'invention, sera un reste d't-aminoacide tel que ACC, Aib, Ala, ATC, Asp, Aze, But, CHA, CHG, Cle, Glu, Gly, 4 Hyp, 3 Hyp, Ile, Leu, Met, Nle, Nva, Phe, Pip, Pro, Me Gly, Ser, Thr, Tyr, Val, un reste -aminoacide tel que f-Ala, un reste CHT, 4 Hyp, 3 Hyp, Ser, Thr, Tyr dans lequel le groupe OH latéral est protégé sous forme éther ou ester, ou un reste Asp ou Glu dans lequel le groupe OH de la fonction acide carboxylique latérale est remplacé par un groupe OR 3, NH 2, NHR 4 ou NR 4 R 5 o R 3 est alkyle en C 1-C 4 (de préférence Me, Et, i Bu, Bu), hydroxyalkyle en C 1-C 4 (de préférence CH 2 CH 20 H), cycloalkyle en C 3-C 6 (tel que cyclopropyle, cyclopentyle ou cyclohexyle) ou u)-aminoalkyle lo le fragment alkyle est en C 2-C 4 et o le groupe amino peut être monoalkylé (NHR 4), dialkylé (NR 4 R 5) ou inclus dans un cycle (NR 4 R 5 = groupe hétérocyclique)l, R 4 et R 5, identiques ou différents, représentent chacun un groupe alkyle en C 1-C 4, R 4 et R 5 considérés ensemble pouvant former avec l'atome d'azote, auquel ils sont liés, un groupe N-hétérocyclique choisi parmi l'ensemble constitué par les groupes pyrrolidino, pipéridino, morpholino, thiomorpholino, pipérazino, 4-( 2- hydroxyéthyl)pipérazino, 4-méthylpipérazino, 4-( 4-chloro- phényl)pipérazino et hexaméthylèneimino. Le reste monoaminoacide B comprend donc des restes d'aminoacides tels que Aib, P-Ala, Cle, Gly, Me Gly et 4 Abu dépourvus d'atome de carbone asymétrique, et des restes d'aminoacides présentant un atome de carbone asymétrique. Lorsque l'unique aminoacide présent dans B comporte un atome de carbone asymétrique, le reste dudit aminoacide sera de préférence de configuration L, car l'expérience montre que les tripeptides de formule I dans lesquels B est un reste monoaminoacide de configuration D sont en général moins actifs en tant que substrats. Le groupe monoaminoacide B sera de préférence choisi parmi l'ensemble constitué par (i) les restes Aib, L-Ala, A-Ala, L-ATC, L-Aze, L-Abu, LCHA, L-CHG, L-CHT, Cle, Gly, L-4 Hyp, L-3 Hyp, L-Asp, L-Glu, L-Ile, L-Leu, L-Nle, L-Nva, L-Phe, L-Pip, L-Pro, Me Gly, L-Ser, L-Thr, L-Tyr et L-Val, (ii) les restes L-CHT, L-4 Hyp, L-3 Hyp, L-Ser, L-Thr et L-Tyr o le groupe OH latéral est protégé sous la forme d'un groupe ester ou éther, (iii) les restes L-Arg, L-Lys, L-His, L-Orn et L-Dbu o le groupe basique latéral est substitué par un groupe approprié pour éliminer substantiellement le caractère basique dudit groupe latéral, ledit groupe approprié provenant d'un groupe acide, notamment Cbo et (iv) les restes LAsp ou L-Glu o le groupe acide carboxylique latéral est estérifié ou amidifié. Lorsque B est un groupe peptidique renfermant de 2 à 9 restes aminoacides, chacun des aminoacides de la chalne peptidique sera choisi parmi les restes aminoaci- des énumérés ci-dessus en ce qui concerne le groupe B = monoaminoacide De préférence, la chaîne peptidique constituée par B ne comportera dans ce cas que des restes o(-aminoacides. De façon également préférée, l'aminoacide dont l'extrémité N-terminale de ladite chaîne peptidique, liée au groupe Q par l'intermédiaire d'un pont carbonyle, sera un reste Maminoacide choisi parmi l'ensemble constitué par (i) les restes o-aminoacides dépourvus d'ato- me de carbone asymétrique, tels que Aib, Cle et Gly, et (ii) les restes caminoacides présentant un atome de carbone asymétrique, et étant de configuration D ou L, le ou les autres restes aminoacides de ladite chaine peptidique étant de préférence (a) Aib, Cle, Gly ou (b) un ou des restes d'X-aminoacide de configuration L. De plus, de façon avantageuse, lorsque B repré- sentera une chaîne peptidique, ladite chaine peptidique comportera 2 ou 3 aminoacides, c'est-à-dire que les composés de formule I seront alors des bis(tripeptides) ou des bis(tétrapeptides). Par ailleurs, quand B est une chaine peptidique comportant 2 à 3 restes aminoacides, on recommande en particulier que le reste aminoacide en position 2, c'est- à-dire celui qui est directement lié au reste aminoacide comportant l'extrémité N-terminale de B-A, soit Asp ou Glu, le groupe carboxy latéral de chaque reste Asp ou Glu pouvant, le cas échéant, être estérifié ou amidifié, comme indiqué ci-dessus, pour former des composés de formule I particulièrement utiles dans le domaine de la détermination du facteur Xa intervenant dans l'hémostase. Le moyen de marquage R est bien connu dans la technique des dosages biologiques et microbiologiques, voir à cet effet l'art antérieur précité et notamment le document US-A-4 448 715 Ledit moyen de marquage sera de préférence choisi parmi l'ensemble des groupes aminés NH-R' qui (i) induisent une modification de coloration, (ii) induisent une modification de fluorescence ou (iii) comportent au moins un élément radioactif (par exemple un groupe anilino ou benzylamino marqué par un radiosotope 14 C ou 3 H) Convient au but de l'invention tout groupe amino NH-R' donnant pendant ou après la réaction enzymatique un signal susceptible d'être amplifié pour être détecté (par exemple par mesure de la densité optique sous une longueur d'onde donnée, ou encore par mesure de la radioactivité) La quantité de produit H-R obtenu par clivage lors de l'hydrolyse enzymatique est proportionnelle à la quantité d'enzyme utilisée Ladite quantité de H-R est déterminable photométriquement, spectrophotométriquement, fluorospectrophotométriquement ou électrochimiquement. Le groupe R que l'on recommande suivant l'invention est un groupe chromogène, de façon typique un groupe nitrophénylamino (dans lequel le reste phényle est susceptible d'être substitué par un groupe COOH, F, Cl, Br, CH 3, OCH 3, CN, CF 3, et/ou 503 H), ou un groupe fluorogène, de façon typique un groupe naphtylamino (dans lequel le reste naphtyle est susceptible d'être substitué par un groupe OCH 3, COOH, 503 H ou CH 3), et les groupes 4- méthylcoumaryl-7-amino, 4-trifluorométhylcoumaryl-7-amino et analogues. Parmi les groupes aminés chromogènes et fluorogè- nes, qui convienent suivant l'invention, on peut notamment citer les groupes p-nitroanilino (en abrégé p NA), 2-carboxy-4-nitroanilino et 3-carboxy-4-nitroanili- no, 2-halogéno-4-nitroanilino et 3-halogéno-4-nitroanili- no (o l'halogène est F, C 1 ou Br), 2-méthoxy-5-méthyl-4- nitroanilino, 2-hydroxysulfonyl-4-nitroanilino, 4-tri- fluorométhyl-2-nitroanilino, 4-trifluorométhyl-3-nitro- anilino, 4-cyano-2-nitroanilino, 2-naphtylamino, 4-hydro- xysulfonyl-l-naphtylamino, quinolylamino, nitroquinolyl- amino et analogues. Le groupe R préféré suivant l'invention est un groupe chromogène à savoir, d'une part, p NA qui convient d'une manière générale à la détermination quantitative des enzymes protéolytiques sus-visées et est particuliè- rement adapté la détermination du Facteur Xa, de la protéine C et/ou de la plasmine, et d'autre part, les groupes analogues, o le noyau phényle de p NA est substi- tué en position 2 ou 3, et répondant à la formule -NH NO 2 (Il) dans laquelle Y' est Br, Cl, F, CF 3, COOH, COOW, CONH 2, CONHW, CONW 2, CONH(CH 2)m N Me 2, OH ou OW, o W est un grou- pe alkyle en C 3-C 6, aryle en C 6-C 10, aralkyle en C 7-Cll ou alicyclique en C 3-C 8 et m est un nombre entier ayant pour valeur 1 à 10. De tels groupes de formule II o le noyau phényle du groupe p NA est substitué sont notamment décrits dans le document EP-A-O 110 306. Les sels d'addition suivant l'invention sont essentiellement des sels d'addition d'acide obtenus par réaction d'un composé de formule I avec un acide minéral ou organique. Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention consiste à utiliser comme substrat un composé bipeptide symétrique choisi parmi l'ensemble constitué par (i) les composés de formule p NA-Arg-B-CO-OlCH 2 CH 20 lnCO 0-B-Arg-p NA(Ia) dans laquelle B est une simple liaison; un reste Aib, Cle, Gly ou un reste de monoaminoacide de configuration L; ou, un reste di ou tripeptidique dans lequel le reste aminoaci- de de l'extrémité N-terminale de la chaîne peptidique qui est liée au pont carbonyle CO, est Aib, Cle, Gly ou de configuration L ou D, le ou les autres restes aminoacides étant Aib, Cle, Gly ou de configuration L; n est un nombre entier supérieur ou égal à 1 tel que le poids moléculaire moyen du groupe O lCH 2 CH 20 ln soit compris entre environ 60 et environ 600 et mieux entre et 400; et, (ii) leurs sels d'addition. D'un point de vue pratique, dans le cadre du meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention, il est particulièrement avantageux que le poids moléculaire moyen du groupe OlCH 2 CH 2 ln soit de l'ordre de 200-400, c'est-à-dire que le groupe OlCH 2 CH 2 ln provienne d'un composé PEG ayant une masse moléculaire de 200-400, d'une part, et que le groupe B soit un reste di ou tripepti- dique, d'autre part. De façon non limitative, on a consigné dans le tableau I ci-après un certain nombre de composés peptidi- ques selon l'invention, les plus intéressants étant en particulier: (a) PEG 200 (CO-Gly-L-Pro-L-Arg-p NA)2 (b) PEG 600 (CO-Gly-L-Pro-L-Arg-p NA)2 (c) PEG 200 (CO-D-Glu(O Bzl)-L-Pro-L-Arg-p NA)2 (d) PEG 200 (CO-D-Nle-LCHA-L-Arg-p NA)2 (e) PEG 200 (CO-D-Leu-Gly-L-Arg-p NA)2 (f) PEG 200 (CO-DCHA-Gly-L-Arg-p NA)2 (g) PEG 300 (CO-D-Leu-Gly-L-Arg-p NA)2 (h) PEG 400 (CO-D-Leu-Gly-L-Arg-p NA)2 (i) PEG 200 (CO-D-Nle-Gly-L-Arg-p NA)2, et (j) leurs sels d'addition. Comme les substrats antérieurement connus, les composés symétriques de formule I ou Ia et leurs sels d'addition selon l'invention, donnent par hydrolyse enzy- matique une quantité de H-R proportionnelle à la quantité d'enzyme présente dans l'échantillon à tester En revan- che, par rapport auxdits substrats antérieurement connus, les composés selon l'invention présentent une cinétique d'hydrolyse enzymatique différente. ov H X v (y) b | Tnpoad ROZ)YZ sav-'l oozf)aél oz Xà HOZ)VZ 2 av-rl 00,7 o 6 T XSI HODVZ 99,i-ri XHV-q-(Izq)aql-a oozggd si X 21 Ln oozoad Co HO'jvz ?av-rj VAN-q-elv-a LT xâ ui HODVZ sav-rj e TN-q-VHD-Q 00 '7 f)gd 91 xa HODYZ ?av-rl DIV-q-(oqo-3)o Xq-a oozoad 91 X 21 HOZ)VZ 8 jl'V-rl d Td-q- &Io ( O f)Rd T XSI HOZ)YZ gav-rl d Td-q- &T 5 oozf)ad úT Xâ HO'DVZ 8 av-rl d XHú-I-VHO-G oozf)aa ZT xa HOZ)YZ git-v-rl oad-q- &ID 00, f)Hd TT Xa HODVZ 21,v-rl X 15-e TN-G oozosél OT Xa HODVZ SXV-rl TO-nal- a fflosa 6 X 21 HODYZ ?,Xv-rl ÀTO-nal-a OOCO Rd 8 Xg HODYZ ?jtv-rl TD- VHD-a oozf)ad L XR HODYZ gav-rl XTO-nal-a oozf)Sld 9 X 51 HODYZ gav-rl VHD-q-elx-a oozf)Rd X 21 Co HODVZ Zzry-rj oad-q-(TZRO)nlo-a oozf)5 lèl X 2 l ri HODVZ ?av-rl oad-q-XTD 009 f)ad xs HODYZ sitv-fl oad-q-úTD oozf) aa Z xq Vdi,-HZ ?av-rl oad-1-À TD oozoad T X 21 t bd- -g-OO-b-OD-G- - Nx I rivaliay 1 i.g-a R-a voidna-q (o 3 za) I- VTH-VH Dn-a VHO-q-n BI-r I ( TZEI) 3 q T-(I o T 1-na I-a old-r I-O=c-( VHD-J-e Tn-a oztj-q (oq D-3)S q- Vo H-r I-na-( nqv-q-DHD-a dne I Hq-q-e IV-G naq-q (IZE) lés-a na-q_ ( oqo X);X-( naq-q-n- aq c-"I-Xlg OVH x v ( I)g b |Tnpoa (TI qi Tn) I l Val Vi u-I Co ui t O O 4 0) Saw-r I uzro-r I Siy-ql I{ODVZ HOZVZ HODJVZ HODZ)V HODVZ HOZ)VZ Ho Dy Z HODZ)V HOZDVZ HODYZ HODZZ HODVZ HOZ)VZ HODVZ HODYVZ HODVZ HODVZ 9 ú xa 9 Xg zç xs o U xs oc X 51 6 Z Xa úz Xa 9 Z xs 9 z x 2 t 17 Z xs úZ Xa ZZ Xa oozc Jsd (OO Zf)Hà OOZf)a 0017 fs J o VH x y (T) b i Tnpo 3 a N HOOVZs TH-a J-Is 9 e N Ol Sx H O o VZS o 3 d--q Yv-a TE-a 8 a 5 H O DV Z2 J qoz V-a _ a q q 9 d 5 x HO 3 YZSvq VED--q F-9 D-o 3O O ff;)d g 5 x 3 H Oo VZ rqHODVZ STH-ri 1 (O)nl TOUA Q o A-qa O O L 6 XZ HOZ)-Z S xq oad-(q-q -a 89 sa 8 g xa HOOVZ 2 av-V e q D_@Ra-a 00 tssa Laxa HOZ)YZ sav-r 19 loa)ds-q-a I I-ne O vtoa i 9 g xa HOIDVZ gav- _q AT 9 s VHD-q-q TV-g HD-a OO Zfa) ú x S H Oo VZ ?a V- 19 Io-(nlo O)nlo- q-el I-a 00 ')89 a Z xs HODVZ 2 a V- XD d _n O-1-91 I-a 00 tsa xa HO 3 Z)ZBsi' ( 8 T O)-n-a 00 %)a 8 09 x HOOVZ 2 avq 005-B^K 6 'a XS EOID-Z 00( 1 o)nl o a-sa 06 xs cm 3 VZ 3 a V-q HO-O-( 00 'sa)E 8 C x H HOVZ 2 ziv Ho 00,10 a 8 S Xs HOZ)VZ av-ri &XI( d D-q-a T 00 'f)a 8L ilxg HODVZ 8 l j X D ( N)T T O)c 2 HOZ)VZ a V-ql XI-(an)ds-q-el I-a 00 ')2 l 8 9 l xa HODYZ ?v-ri XIO-(T)O-TV-GI 00 'f)g 8Z 1 xa HOZ)V a V-q:1 y ( e NO)IO ANI 00 'oa) T 8 x S H Oo)VZ 81 4 11 DQ 010 07 X H Oo VZ gl -j&f-H O O d 6 2 HOVVZ ?ZlV-ql XO-OHD-G 00 ')E 8 8 x (z al Tns) I fll E 11 g; HODVZ 'V Ndgv-q-HD-q-nq-a H: ado Hoovz 'yd-z V-q-nq-q-g Hz-a-H: Z ao H Oo V 'V Nd-3 V--T-n I-G OSON: T do : uos sasdmo D ap si Tnpoid o D a T Xuoqiez quod ns aleu Tmuau-N gl Tmgalxa uos aed 9 TT Isa i To ap TO Uou T Mw aa Tmwad aq (y) 8 sa ON H-lg-naq-a TO-a 8 N-a TO-nal-a X 1 T (T Fa)nnl D-q-'TA-a ú 10 ( TF) ds V-qnaq-a nqq (Tzg) -ql-ll&TD VHD-1-nel-q-X 1 g oad-q (oqg-)sî q q Tv oad-q-DHD-I-q TV Og Ioad ard 09 tfià O 9 offa OO Zo Zf OOZOa OO Zofa oozgga OVH x v ( 1) b |Tnpoad ú 9 Xf 99 xa 59 Xa 879 XS E 9 x S Z 9 xa T 9 x S 09 xa x H 89 x S u I. co On (' HODVZ HODVZ HODVZ HOZDVZ HOD)VZ HODVZ IIODVZ IIODVZ HOYZ)V HOOYZ 2.xv-r I ?.IV-r I 8 av-r I 2 zvyr I 8 zv-rl 23 v-r I say-r I (UTJ) 1avalavi Les composés de formule I selon l'invention peuvent être préparés selon une méthode connue en soi par application de mécanismes réactionnels classiques. Le procédé que l'on préconise ici est caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un composé aminoacide ou peptidique de formule: H-B-A-R (IV) o B, A et R sont définis comme indiqué ci-dessus, avec un dihalogénoformiate de polyalkylèneglycol de formule Hal-CO-Q-CO-Hal (V) dans laquelle Hal représente un atome d'halogène, notamment F, Cl, Br et, de préférence, Cl, et, Q est défini comme indiqué ci-dessus, suivant la réaction: 2 (H-B-A-R) + Hal-CO-Q-CO-Hal > I Les composés de départ de formules IV et V sont obtenus selon des méthodes classiques bien connues de l'homme de métier En particulier, le composé IV, quand B est différent d'une simple liaison, est obtenu selon une des méthodes usuelles de la synthèse peptidique. De façon avantageuse, on fera réagir 2 moles de IV avec 1 à 1,3 moles (de préférence 1 à 1,1 moles) de V dans un solvant inerte (notamment DMF ou THF) à une température comprise entre O et 401 C pendant au moins 0,25 h, en présence d'un moyen accepteur de protons, notamment une amine tertiaire telle que Et 3 N ou DIEA intervenant égale- ment en tant que co-solvant du milieu réactionnel De préférence, on utilisera un excès d'amine tertiaire par rapport aux conditions stoechiométriques, notamment selon un rapport molaire amine tertiaire/composé IV de 1,7/1 à 2,6/1 et mieux de 2/1 à 3,1/1. Les composés tripeptides de formule I et leurs sels d'addition sont utiles dans la détermination des enzymes intervenant dans l'hémostase Ils constituent notamment des substrats spécifiques du Facteur Xa de la plasmine ou de la thrombine Le procédé de détermination de ces enzymes que l'on préconise est caractérisé en ce que l'on met en contact dans un milieu liquide aqueux approprié tel qu'un sérum physiologique tamponné, une quantité donnée d'un tripeptide de formule I ou l'un de ses sels d'addition (à une concentration de l'ordre de 10 mg/ml) et un échantillon à tester (éventuellement dilué) susceptible de contenir l'enzyme cible, pendant au moins 0,5 h à une température compris entre RT et 400 C, notamment 37 C. L'activité des tripeptides suivant l'invention vis-à-vis d'enzymes intervenant au niveau de l'hémostase a été déterminée selon des méthodes classiques, telles que décrites dans EP-A-O 280 160 (voir page 14), en appréciant la vitesse d'hydrolyse par la variation de la densité optique dans le temps ( 60 D/min) Les résultats qui ont été obtenus ont été consignés dans le tableau II ci-après o par commodité, l'activité de produits de référence (CP 1 à CP 3) est précisée comme étant égale à 100 % D'autres avantages et caractéristiques de l'inven- tion seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation et de résultats d'essais compa- ratifs Bien entendu, l'ensemble de ces éléments n'est nullement limitatif mais est donné à titre d'illustration. PREPARATION I Obtention de PEG 200 (D-Leu-Gly-L-Arg-p NA)2, 2 Ac OH (Exemple 6) a) Z-L-Arg-p NA, H Cl On dissout 344 g ( 1 mole) de Z-L-Arg-OH, H Cl dans du HMPT anhydre (fraîchement distillé et séché sur tamis moléculaire) à RT, puis on ajoute 139 ml ( 1 mole) de Et 3 N à RT sous agitation A la solution résultante, on ajoute 328 g ( 2 moles) de pnitrophénylisocyanate Le milieu réactionnel résultant est maintenu sous agitation pendant 24 h à RT, puis est évaporé sous vide et repris avec une quantité minimale de Ac OH avant d'être dilué avec Ac O Et. La solution résultante est ensuite extraite successivement trois fois avec de petites quantités de Na HC 03 0,5 M, trois fois avec une solution de KHSO 4 à 50 g/1 puis plusieurs fois avec H 20 à demi-saturée en Na Cl La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de sodium anhydre Apres filtration (élimination de Na 2504), on évapore le solvant et recristallise le résidu d'évaporation dans le mélange Ac O Et/Me O Me ( 3/7) v/v On obtient 350 g du produit attendu sous la forme d'une *poudre de couleur blanche. F = 128-130 C. Analyse (CCM sur gel de silice): Rf = 0,5 dans Ac O Et/pyridine/Ac OH/H 20 ( 20/4,513/1) v/v; Rf = 0,69 dans CHC 13/Me OH/Ac OH ( 5/3/1) v/v. b) H-L-Arg-p NA, 2 H Br Dans un appareillage en verre et téflon, on charge g ( 0,215 moles) de Z-L-Arg-p NA, HC 1 On ajoute, sous atmosphère inerte (courant d'azote), successivement 800 ml de Ac OH glacial, 200 ml d'anisole, 1000 ml de H Br en solution dans Ac OH glacial On laisse réagir pendant 1 h à RT sous atmosphère d'azote Apres ce laps de temps, le mélange réactionnel, qui est devenu homogène au cours de la déprotection, est précipité dans 20 1 d'éther (Me O Me ou Et O Et) Apres décantation, le surnageant est écarté et le précipité est lavé plusieurs fois à l'éther On recueille le précipité par filtration, le sèche sous vide sur KOH pendant 24 h On obtient 94,2 g (rendement: 96 %) du produit attendu Analyse (CCM sur gel de silice): Rf = 0,04 dans Ac O Et/pyridine/Ac OH/H 20 ( 20/4,5/3/1,5) v/v Rf = 0,38 dans Bu OH/Ac OH/H 20 ( 3/1/1) v/v. c) Boc-Gly-L-Arg-p NA, H Br On dissout 1 g ( 2,19 mmoles) de H-L-Arg-p NA, 2 H Br dans 10 ml de DMF puis on ajoute 0,854 ml ( 6,57 mmoles) de DIEA Dans un autre récipient, on neutralise 384 mg ( 2,19 mmoles) de Boc-GlyOH dissous dans 5 ml de DMF au moyen d'une quantité de 0,285 ml de DIEA On mélange les deux solutions ainsi obtenues et au milieu résultant, on ajoute 970 mg de Bop tout en le maintenant à RT; on maintient également le p H à une valeur comprise entre 7 et 8 par ajout de petites portions de DIEA au cours de la réaction. Au bout d'une heure, la réaction est complètement terminée et on évapore à sec sous vide le milieu réactionnel; on reprend le résidu d'évaporation par un mélange Ac O Et/Me OH et extrait au moyen d'une solution aqueuse de Na HCO 3 0,5 M On sèche la phase organique sur sulfate de sodium, la concentre sous vide puis précipite dans l'éther (Me O Me ou Et O Et) On obtient 874 mg (rendement: 75 %) de produit attendu. Analyse (CCM sur gel de silice): Rf = 0,53 dans CH C 13/Me OH/Ac OH ( 10/3/1) v/v. d) H-Gly-L-Arg-p NA, 2 H-TFA On charge dans un réacteur 874 mg ( 1,64 mmoles) de Boc-Gly-L-Arg-p NA, H Br puis ajoute successivement 6,6 ml de CH 2 C 12 et 6,6 ml de H-TFA Apres 0,25 h de réaction à RT, on précipite directement le mélange réactionnel dans l'éther Il se forme un précipité blanc floconneux que l'on filtre et sèche On obtient 910 mg (rendement: 96 %) de produit attendu. Analyse (CCM sur gel de silice): Rf = 0,09 dans CH C 13/Me OH/Ac OH ( 5/3/1) v/v. e) Boc-D-Leu-Gly-L-Arg-p NA, H-TFA En suivant les modalités opératoires de la prépa- ration Ic, on fait réagir un mélange réactionnel compre- nant (i) 910 mg ( 1,57 mmoles) de H-Gly-L-Arg-p NA, 2 H-TFA, (ii) 363 mg ( 1,57 moles) de Boc-D-Leu-OH, (iii) 1,2 ml de DIEA et (iv) 695 mg ( 1,57 mmoles) de Bop dans le DMF, et on maintient le mélange réactionnel à RT sous agitation pendant 2 h Après évaporation à sec sous vide, le résidu d'évaporation est chromatographié sur gel de silice avec comme éluant un gradient de CHC 13/Me OH/Ac OH de ( 20/3/1) à ( 10/3/1) v/v On réunit les fractions homogènes recueil- lies et évapore l'éluant Par lyophilisation, on obtient 785 mg (rendement: 80 %) de produit pur attendu. Analyse (CCM sur gel de silice): Rf = 0,33 dans CHC 13/Me OH/Ac OH ( 10/3/1) v/v. f) H-D-Leu-Gly-L-Arg-p NA, 2 H-TFA On fait réagir 785 mg ( 1,25 mmoles) de Boc-D-Leu- Gly-L-Arg-p NA, H-TFA obtenu selon la préparation Ie avec ml de CH 2 C 12 et 5 ml de H-TFA à RT Au bout de 0,25 h, le mélange réactionnel est directement précipité dans l'éther On obtient un précipité blanc que l'on filtre, lave à l'éther et sèche On recueille 779 mg (rendement: %) du produit attendu. Analyse (CCM sur gel de silice): Rf = 0,2 dans CH C 13/Me OH/Ac OH ( 5/3/1) v/v. g) PEG 200 (D-Leu-Gly-L-Arg-p NA)2, 2 Ac OH A 779 mg ( 1,12 mmoles) de HD-Leu-Gly-L-Arg-p NA, 2 H-TFA, obtenu comme indiqué ci-dessus, on ajoute 15 ml de DMF et 0,345 ml ( 2,47 mmoles) de Et 3 N Le mélange résul- tant est refroidi dans de la glace sous agitation On ajoute ensuite goutte à goutte 182 mg ( 0,563 mmole) de dichloroformiate de PEG 200 lobtenu selon la préparation VIII ci-après et répondant à la formule développée: Cl-CO-O(CH 2 CH 20)n-CO-Cl o N est tel que le PM du fragment O(CH 2 CH 20)n ait une valeur de 200 environl dans 5 ml de DMF On laisse ensuite le mélange réactionnel résultant se réchauffer lentement jusqu'à RT en 2 h On filtre pour éliminer le sel de triéthylammonium qui s'est formé et on évapore le filtrat Le résidu d'évaporation est chromato- graphié sur une résine échangeuse d'ions (AMBERLITER IRA 4015) avec comme éluant un mélange Me OH/H 20 ( 3/2) v/v On réunit les fractions homogènes obtenues Par évaporation puis lyophilisation, on obtient 460 mg (rendement: 63 %) du produit attendu. Analyse (GCM sur gel de silice): Rf = 0,34 dans CHC 13/Me OH/Ac OH ( 5/3/1) v/v. PREPARATION II Obtention de PEG 300 (D-Leu-Gly-L-Arg-p NA)2, 2 Ac OH (Exemple 8) En suivant le mode opératoire donné à la prépara- tion Ig et en remplaçant le dichloroformiate de PEG 200 par le dichloroformiate de PEG 300, on obtient le produit attendu. PREPARATION III Obtention de PEG 400 (D-Leu-Gly-L-Arg-p NA)2, 2 Ac OH (Exemple 9) En suivant le mode opératoire donné à la prépara- tion Ig et en remplaçant le dichloroformiate de PEG 200 par le dichloroformiate de PEG 400, on obtient le produit attendu. PREPARATION IV Obtention de PEG 200 (D-Nle-Gly-L-Arg-p NA)2, 2 Ac OH (Exemple 10) En suivant le mode opératoire donné à la prépara- tion I mais en remplaçant au stade Ie l'aminoacide de for- mule Boc-D-Leu-OH par l'aminoacide de formule Boc-D-Nle-OH on obtient le produit attendu. PREPARATION V Obtention de PEG 200 (D-Nle-L-CHA-L-Arg-p NA)2, 2 Ac OH (Exemple 5) En suivant le mode opératoire donné à la prépara- tion I mais en remplaçant au stade Ic le Boc-Gly-OH par le Boc-L-CHA-OH et au stade Ie le Boc-D-Leu-OH par l'amino- acide de formule Boc-D-Nle-OH, on obtient le produit attendu. PREPARATION VI Obtention de PEG 20 o(Gly-L-Pro-L-Arg-p NA), 2 Ac OH (Exemple 2) a) Z-L-Arg-p NA, H Cl On dissout 100 g ( 0,724 mole) de H-p NA dans 1,5 1 de pyridine Le mélange sous agitation est refroidi jus- qu'à -20 C On ajoute goutte à goutte 64 ml ( 0,724 mole) de PC 13 préalablement refroidi à -20 C et maintient le mélange réactionnel à 20 C pendant 1 h On ajoute ensuite 223 g de Z-L-Arg-OH en maintenant la température à -20 C pendant 1 h puis on laisse le mélange réactionnel se réchauffer jusqu'à la température ambiante que l'on maintient pendant 12 h Le mélange réactionnel ainsi obtenu est transféré dans 10 litres d'eau glacée, le précipité surnageant est filtré puis repris par un mélange Ac OH/Ac O Et et lavé successivement ( 3 fois) par une solution aqueuse de Na HCO 3 0,5 M, une solution aqueuse de KHSO 4 à 50 g/l puis de l'eau à demi-saturée en Na Cl La phase organique est séchée sur Na 2 SO 4 puis évaporée et concentrée Le concentrat ainsi obtenu est chromatographié sur une colonne de silice au moyen d'un système gradient CH C 13/Me OH/Ac OH de ( 20/3/1) à ( 5/3/1) v/v Les fractions homogènes sont réunies, évaporées et précipitées dans l'éther On obtient 222 g (rendement: 66 %) du produit attendu F = 128-130 C Analyse (CCM sur gel de silice): Rf = 0, 76 dans CH C 13/Me OH/Ac OH ( 5/3/1) v/v; Rf = 0,2 dans CH C 13/Me OH/Ac OH ( 20/3/1) v/v. b) H-L-Arg-p NA, 2 H Br On procède comme indiqué à la préparation Ib. c) Boc-Gly-L-Pro-OH A 1,15 g ( 10 mmoles) de proline dans 50 ml de DMF on ajoute 1,4 ml ( 11 mmoles) de N-méthylmorpholine On refroidit le mélange au moyen d'un bain glace puis ajoute 3,06 g ( 10 mmoles) de Boc-Gly-O Su et ajuste pendant la durée de la réaction ( 14 h) le p H entre 6 et 7 par additions successives de petites quantités de N- méthylmorpholine (cette substance intervient comme accepteur de protons) On évapore le DMF et reprend le résidu d'évaporation par Ac O Et; par précipitation dans l'éther de pétrole puis filtration, on recueille le produit attendu. Analyse (CCM sur gel de silice): Rf = 0,53 dans Bu OH/Ac OH/H 20 ( 3/1/1) v/v; Rf = 0,42 dans Ac O Et/pyridine/Ac OH/H 20 ( 20/4,5/3/1,5) v/v. d) Boc-Gly-L-Pro-L-Arg-p NA, H Br A 4 g ( 8,8 mmoles) de H-L-Arg-p NA, 2 H Br dans 25 ml de DMF, on ajoute 1,35 ml de Et 3 N On refroidit au moyen d'un bain glace puis ajoute successivement 2,38 g de dipeptide Boc-Gly-LPro-OH, 2,67 g ( 17,5 mmoles) de HOBT, 2,7 g (environ 3,15 mmoles) de DCCI, le p H étant ajusté entre 6 et 7 par addition de Et 3 N On maintient le milieu réactionnel sous agitation à RT pendant 12 h Le milieu réactionnel est ensuite filtré (pour écarter la DCHU formée) et le filtrat est évaporé sous vide Par précipi- tation au moyen de Et O Et, on obtient un précipité blanc que l'on reprend au moyen d'une quantité minimale de CHC 13/Me OH/Ac OH ( 8/3/1) v/v On chromatographie la solu- tion résultante sur gel de silice au moyen du même système solvant On récupère et évapore les fractions homogènes obtenues et par lyophilisation obtient 4,7 g (rendement: %) du produit attendu. Analyse (CCM sur gel de silice): Rf = 0,64 dans Bu OH/Ac OH/H 20 ( 3/1/1) v/v; Rf = 0,76 dans CHC 13/Me OH/Ac OH ( 5/3/1) v/v. e) H-Gly-L-Pro-L-Arg-p NA, 2 H-TFA En procédant comme indiqué à la préparation If et en remplaçant le Boc-D-Leu-Gly-L-Arg-p NA, H-TFA par 4, 7 g de Boc-Gly-L-Pro-L-Arg-p NA, H Br, on obtient après précipi- tation dans l'éther 5 g du produit attendu. Analyse (CCM sur gel de silice): Rf = 0,12 dans CHC 13/Me OH/Ac OH ( 5/3/1) v/v. f) PEG 200 (Gly-L-Pro-L-Arg-p NA)2, 2 Ac OH A partir du H-Gly-L-Pro-L-Argp NA, 2 H-TFA, on obtient selon les modalités opératoires décrites à la pré- paration If le produit attendu. PREPARATION VII Obtention de PEG 200 (D-Glu(O Bzl)-L-Pro-L-Arg-p NA)2, 2 Ac OH (Exemple 4) En procédant comme indiqué dans la préparation VI en remplaçant au stade V Ic le Boc-Gly-O Su par le Boc-D- Glu(O Bzl)-O Su, on obtient le produit attendu. PREPARATION VIII Obtention du dichloroformiate de PEG 200 Dans un réacteur maintenu à -30 C contenant du phosgène, on introduit goutte à goutte au moyen d'une am- poule de coulée 1 g ( 5 mmoles) de PEG 200 et 1,4 ml ( 10 mmoles) de Et 3 N dissous dans du THF, de façon que le phosgène soit toujours dans un large excès par rapport au diol On laisse le mélange sous agitation pendant 2 h à -30 C puis on laisse réchauffer jusqu'à RT L'excès de phosgène est balayé totalement par un courant d'azote pendant plusieurs heures pour éliminer ledit phosgène Le mélange réactionnel résultant est ensuite évaporé sous vide On obtient 1,59 g (rendement: 98 %) du produit attendu sous la forme d'un liquide visqueux. Analyse (spectre IR): disparition des bandes alcool à 3300 cm-1; apparition des bandes chloroformiate à 1776 et 1152 cm-1 On obtient également selon ce procédé les dichlo- roformiates des autres PEG. ESSAIS COMPARATIFS Le tableau II ci-après résume les résultats des essais comparatifs qui ont été entrepris à des doses équi- molaires avec les produits de l'invention et des substances étalons dont l'activité a été prise comme étant égale à 100 % TABLEAU II A Cl Iv ITES Produit Xa Thrombine Plasmine Ex 2 6 % 34 % 130 % Ex 3 10 % 50 % 122 % Ex 4 11 % 45 % 289 % Ex 5 20 Z 110 % 15 % Ex 6 105 % 23 % 188 % Ex 7 45 % 21 % 112 % Ex 8 60 % 25 % 150 % Ex 9 74 % 34 % 165 % CP 1 100 % 18 % 30 % CP 2 14 % 100 % 77 % CP 3 14 % 10 % 100 % Lesdits résultats mettent en évidence que, vis-à- vis de la plasmine, les composés selon l'invention Ex 2- Ex 4 et Ex 6 Ex 9 sont plus sensibles que le substrat de référence CP 3 de ladite plasmine, et que le produit Ex 5 est plus sensible que le substrat de référence CP 1 vis-à- vis de la thrombine Par ailleurs, le produit de l'exemple 6 est utilisable pour la détermination du Facteur Xa quand un inhibiteur de la plasmine est introduit dans l'échan- tillon à tester. On préconise enfin selon l'invention, un nécessai- re, kit ou trousse de dosage destiné à la détermination d'enzymes intervenant au niveau de l'hémostase, notamment la plasmine, qui est caractérisé en ce qu'il renferme au moins un peptide choisi parmi l'ensemble constitué par les composés de formule I et leurs sels d'addition selon l'in- vention, et le cas échéant, des échantillons étalons d'enzymes et de milieux tamponnés de dilution. REVENDICATIONS 1 Composé appartenant à la famille des aminoacides et des peptides comportant un reste d'aminoacide lié à un reste de polyalkylèneglycol, ledit composé étant carac- térisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par: (i) les aminoacides et peptides symétriques de formule: R-A-B-CO-Q-CO-B-A-R (I) dans laquelle Q est un reste de polyalkylèneglycol choisi parmi les restes de polyéthylèneglycol et polypropylèneglycol de formule: -0 lCH(X)CH 20 ln- o X est H ou Me, et N est un nombre entier supé- rieur ou égal à 1, B représente une simple liaison, un reste de monoacide ou une chaine peptidique comprenant de 2 à 9 restes monoacides, A est un reste de monoaminoacide basique choisi parmi l'ensemble comprenant les restes d' -aminoacides comportant un groupe basique sur une chatne latérale, R est un moyen de marquage permettant la révéla- tion de la substance enzymatique à identifier ou doser; et (ii) leurs sels d'addition. 2 Composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que Q est un reste de polyéthylèneglycol de formule -0 lCH 2 CH 20 ln ayant un poids moléculaire moyen de 60-1000. 3 Composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que Q est un reste de polyéthylèneglycol de formule -OlCH 2 CH 20 ln ayant un poids moléculaire moyen de 200-800. 4 Composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que B est un reste de monoaminoacide choisi parmi l'en- semble constitué par les restes: naturels non basiques dits "neutres" tels que notamment Ala, (-Ala, Cys, Gln, 4 Hyp, 3 Hyp, Leu, Met, Nle, Nva, Phe, Pro, Me Gly, Ser, Tyr, Val, o le groupe OH latéral des restes 4 Hyp, 3 Hyp, Ser, Thr, Tyr est protégé ou non par un groupe protecteur éther ou ester, et o le groupe SH latéral du reste Cys est protégé ou non par un groupe protecteur thioéther ou thioester; naturels acides tels que notamment Asp, /-Asp, Glu, >-Glu, dans lesquels la fonction acide latérale est libre ou bloquée sous forme amide ou ester, notamment sous forme d'ester benzylique ou t-butylique; naturels initialement basiques dans lesquels la ou les fonctions basiques latérales n'entrant pas dans la liaison peptidique sont bloquées par un groupe acide convenable éliminant pratiquement le caractère basique tel que Boc, Cbo, Adoc, Aoc, Fmoc, Foc, Iboc, Z, Z(p-Cl), Z(p- O Me), lesdits restes d'aminoacide étant notamment les restes Arg, Lys, His et Orn convenablement bloqués notamment par un dit groupe acide convenable; synthétiques non basiques dits "neutres" tels que notamment ACC, AHX, Aib, ATC, Aze, Abu, 4 Abu, CHA, CHG, CHT (o le groupe OH latéral est protégé le cas échéant sous forme éther ou ester), Cle, Phg, Pip, Pyr; synthétiques initialement basiques dans lesquels chaque fonction basique latérale est protégée par un groupe convenable éliminant substantiellement le caractère basique, notamment le reste Dbu, o la fonction basique latérale est bloquée par un groupe tel que Boc, Cbo, Adoc, Aoc, Fmoc, Foc, Iboc, Z, Z(p-Cl) et Z(p-O Me). Composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que B est ACC, Aib, Ala, ATC, Asp, Aze, But, CHA, CHG, Cle, Glu, Gly, 4 Hyp, 3 Hyp, Ile, Leu, Met, Nle, Nva, Phe, Pip, Pro, Me Gly, Ser, Thr, Tyr, Val, e-Ala, un reste CHT, 4 Hyp, 3 Hyp, Ser, Thr, Tyr dans lequel le groupe OH latéral est protégé sous forme éther ou ester, ou un reste Asp ou Glu dans lequel le groupe OH de la fonction acide carboxylique latérale est remplacé par un groupe OR 3, NH 2, NHR 4 ou NR 4 R 5 o R 3 est alkyle en C 1-C 4 (de préférence Me, Et, i Bu, Bu), hydroxyalkyle en C 1-C 4 (de préférence CH 2 CH 20 H), cycloalkyle en C 3-C 6 (tel que cyclopropyle, cyclopentyle ou cyclohexyle) ou w-aminoalkyle lo le fragment alkyle est en C 2-C 4 et o le groupe amino peut être monoalkylé (NHR 4), dialkylé (NR 4 R 5) ou inclus dans un cycle (NR 4 R 5= groupe hétérocyclique)l, R 4 et R 5, identiques ou différents, représentent chacun un groupe alkyle en C 1-C 4, R 4 et R 5 considérés ensemble pouvant former avec l'atome d'azote, auquel ils sont liés, un groupe N-hétérocyclique choisi parmi l'ensemble constitué par les groupes pyrrolidino, pipéridino, morpholino, thiomorpholino, pipérazino, 4-( 2-hydroxyéthyl)pipérazino, 4-méthylpipérazino, 4-( 4-chlorophényl)pipérazino et hexa- méthylèneimino. 6 Composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que B est choisi parmi l'ensemble constitué par (i) les restes Aib, L-Ala, ,3-Ala, L-ATC, L-Aze, L-Abu, L-CHA, L-CHG, L-CHT, Cle, Gly, L-4 Hyp, L-3 Hyp, L-Asp, L-Glu, L-Ile, L-Leu, L-Nle, L-Nva, L-Phe, L-Pip, L-Pro, Me Gly, L-Ser, L-Thr, L-Tyr et L-Val, (ii) les restes L-CHT, L-4 Hyp, L-3 Hyp, L-Ser, L- Thr et L-Tyr o le groupe OH latéral est protégé sous la forme d'un groupe ester ou éther, (iii) les restes L-Arg, L-Lys, L-His, L-Orn et L- Dbu o le groupe basique latéral est substitué par un groupe approprié pour éliminer substantiellement le caractère ba- sique dudit groupe latéral, ledit groupe approprié provenant d'un groupe acide, notamment Boc, Cbo, Adoc, Aoc, Fmoc, Foc, Iboc, Z, Z(p-Cl) et Z(p-O Me) (iv) les restes L-Asp ou L-Glu o le groupe acide carboxylique latéral est estérifié ou amidifié. 7 Composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que B est un reste peptidique, l'aminoacide comportant l'extrémité N-terminale dudit reste peptidique, qui est liée au groupe Q par l'intermédiaire d'un pont carbonyle, est un reste o(-aminoacide choisi parmi l'ensemble constitué par (i) les restes (-aminoacides dépourvus d'ato- mes de carbone asymétrique, tels que Aib, Cle et Gly, et (ii) les restes "-aminoacides présentant un atome de carbone asymétrique, et étant de configuration D ou L, le ou les autres restes aminoacides de la chaine peptidi- que B étant de préférence (a) Aib, Cle, Gly ou (b) c- aminoacide de configuration L. 8 Composé suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 et 7, caractérisé en ce que B est un reste dipeptidique ou tripeptidique. 9 Composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est un bipeptide symétrique choisi parmi l'ensemble constitué par (i) les composés de formule p NA-Arg-B-C 0-0 lCH 2 CH 20 lm-C 0-B-Arg-p NA (Ia) dans laquelle B est une simple liaison; un reste Aib, Cle, Gly ou un reste de monoaminoacide de configuration L; ou un reste di ou tripeptidique dans lequel le reste aminoacide comportant l'extrémité N- terminale de la chaîne peptidique liée au pont carbonyle CO, est Aib, Cle, Gly ou o-amino- acide de configuration L ou D, le ou les autres restes aminoacides de ladite chaîne petidique étant un ou des restes Aib, Cle, Gly ou oaminoacide de configuration L; n est un nombre entier supérieur ou égal à 1 et tel que le poids moléculaire moyen du groupe O lCH 2 CH 20 ln soit compris entre 60 et 600 environ; et, (ii) leurs sels d'addition. Composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par (a) EG 200 (CO-Gly-L-Pro-L-Arg-p NA) (b) PEG 600 (C 0-Gly-L-Pro-L-Arg-p NA)2 (c) PEG 200 (CO-D-Glu(O Bzl)-L-Pro-LArg-p NA)2 (d) PEG 200 (CO-D-Nle-L-CHA-L-Arg-p NA)2 (e) PEG 200 (CO-D-LeuGly-L-Arg-p NA)2 (f) PEG 200 (CO-D-CHA-Gly-L-Arg-p NA)2 (g) PEG 300 (CO-DLeu-Gly-L-Arg-p NA)2 (h) PEG 400 (CO-D-Leu-Gly-L-Arg-p NA)2 (i) PEG 200 (CO-D-Nle-Gly-L-Arg-p NA)2, et (j) leurs sels d'addition. 11 Procédé de détermination d'un enzyme intervenant au niveau de l'hémostase, caractérisé en ce que l'on met en contact dans un milieu biologique aqueux une quantité donnée d'un composé de formule I ou de l'un de ses sels d'addition selon la revendication 1 avec un échantillon à tester contenant ledit enzyme. 12 Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on met en contact dans un milieu biologique aqueux une quantité donnée d'un composé de formule I ou l'un de ses sels d'addition selon la revendication 1 avec un échantillon à tester contenant ledit enzyme, pendant au moins 0,25 h, à une température comprise entre 15 et 401 C. 13 Procédé de préparation d'un composé de formule I et de ses sels d'addition selon la revendication 1, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend la réaction d'un composé aminoacide ou peptidique de formule: H-B-A-R (IV) o B, A et R sont définis comme indiqué dans la revendica- tion 1 ci-dessus, avec un dihalogénoformiate de polyalkyl- èneglycol de formule: Hal-CO-Q-CO-Hal (V) dans laquelle Hal représente un atome d'halogène, notamment F Cl, Br et, de préférence, Cl, et Q est défini comme indiqué dans la revendication 1 ci-dessus. 14 Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce que l'on fait réagir 2 moles de IV avec 1 à 1,3 mo- les de V dans un solvant inerte, à une température de O à 401 C, en présence d'une amine tertiaire accepteur de pro- tons, selon un rapport molaire amine tertiaire/composé IV de 1,7/1 à 3,6/1. Nécessaire de dosage pour la détermination d'enzy- mes intervenant au niveau de l'hémostase, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé choisi parmi l'ensemble constitué par les composés de formule I et leurs sels d'addition selon la revendication 1.