FR 2657260 A1 19910726 FR 9000722 A 19900123 PROCEDE ET COMPOSITION PERMETTANT DE PURIFIER L'AMPHOTERICINE B La présente invention concerne un procédé et une composition permettant de purifier et de cristalliser l'ampho- téricine B. L'amphotéricine B, puissant agent antifongique, est un membre d'une famille de composés appelés polyène macrolides, qui sont des antibiotiques Ces composés se caractérisent par un grand cycle lactone qui comporte une chaîne de doublesliaisons conjuguées. L'amphotéricine B, ainsi que son procédé de préparation à partir de Streptomyces nodosus, est décrite par Dutcher et al dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 2 908 611, publié le 13 octobre 1959 On sait maintenant que la structure de l'amphotéricine B est la suivante OH OH OH HO O OH OH OH OH HO y / COOH //C 3 O CH 3 OH NE 2 HO Les procédés qui sont décrits par Dutcher et al. pour l'extraction et la cristallisation de l'amphotéricine font intervenir: a la formation d'une suspension épaisse de l'amphotéricine brute dans un alcool avec un acide, puis la neutralisation avec une base forte; ou b la formation d'une suspension épaisse de l'amphotéricine brute avec du diméthylformamide, et le traitement de cette suspension par un alcool aqueux ou une cétone aqueuse. Michel et al, dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 177 265, décrivent un procédé de purifica- tion de l'amphotéricine B qui fait appel à un milieu de solubilisation comprenant de l'iodure de sodium ou du thio- cyanate de sodium et de l'acétone ou du méthanol L'emploi de l'un quelconque de ces milieux améliore spectaculairement la solubilité de l'amphotéricine B, qui sinon n'a qu'une solubilité limitée dans l'acétone ou le méthanol seuls. On a cherché de nouveaux procédés et de nou- velles compositions utilisables pour la purification de I'amphotéricine B, donnant un rendement plus uniforme en produit très cristallin. Conformément à la présente invention, il est décrit un nouveau procédé et une nouvelle composition de cristallisation convenant à la purification de l'amphotéri- cine B, en donnant un rendement uniformément plus élevé en produit cristallin La nouvelle composition d'amphotéricine B comprend de l'amphotéricine B en solution avec du méthanol, du diméthylformamide, du chlorure de méthylène et de l'eau. Le nouveau procédé consiste ô" dissoudre de l'amphotéricine B brute, partiellement purifiée ou contaminée, dans une solu- tion de méthanol, de diméthylformamide et d'un acide; à séparer le mélange extrait résultant des constituants inso- lubles éventuels; à combiner l'extrait purifié avec un mélange de solvants composé de chlorure de méthylène et d'eau; à faire cristalliser l'amphotéricine B; et à récu- pérer le produit cristallin. On a maintenant découvert qu'il était possible d'améliorer notablement l'uniformité du mode opératoire de préparation de I'amphotéricine B, et la nature cristalline du produit, en utilisant le système de solvants quaternaire du présent procédé Ce système de solvants quaternaire com- prend le diméthylformamide et le méthanol, dans lesquels on dissout initialement l'amphotéricine B, et du chlorure de méthylène et de l'eau, que l'on ajoute après filtration de la solution initiale La composition résultante de cristal- lisation de l'amphotéricine B comprend l'amphotéricine B, et un acide qui formera un sel avec l'amphotéricine B, dans ces quatre solvants De plus on a constaté que, après puri- fication, cristallisation, filtration et lavage, si le produit est séché de manière à conserver au moins 2 % en poids d'eau, et de préférence entre environ 2 et 6 % en poids d'eau, on obtient un produit cristallin plus stable. Le tableau ci-dessous illustre les avantages du présent procédé On trouve dans ce tableau une compa- raison entre les produits d'amphotéricine B selon le pro- cédé Dutcher et al décrit dans le brevet E U A N 02908611 et ceux obtenus selon le présent procédé On a mesuré,pour chaque produit, la puissance microbiologique, le rendement, la pureté (mesurée sur le résidu après combustion totale du produit), et la stabilité. Puissance Pureté microbiologique Rendement (résidu après combustion) 884 pg/mg 80 % 2,5 pour cent en poids Stabi 1 i té (perte d'activité/année) à 5 C -15 % Présent procédé 1000 oog/mg 97 % Bien qu'on ne connaisse pas exactement le méca- nisme permettant d'obtenir ces améliorations, on pense que le chlorure de méthylène et l'eau, qui sont ajoutés à l'am- photéricine B, au méthanol et au diméthylformamide, amélio- rent la structure cristalline, et augmentent ainsi l'acti- vité microbiologique, la pureté et la stabilité de 1 'ampho- téricine B résultante. L'amphotéricine B que l'on utilise comme produit de départ dans le procédé de purification peut contenir de I'amphotéricine B brute, partiellement purifiée ou contami- née Par "amphotéricine B contaminée", on entend que l'ampho- téricine B contient des impuretés physiques telles que des particules de saleté, de la matière fibreuse et d'autres élé- ments particulaires qui pourraient rendre l'amphotéricine B inacceptable pour les utilisations pharmaceutiques. La première étape du procédé est l'extraction de l'amphotéricine B de départ par mise en suspension dans un mélange de méthanol et de diméthylformamide, dans un ordre quelconque, et addition de l'acide à ce mélange L'acide peut être n'importe quel acide qui forme sans difficulté un sel avec l'amphotéricine B, tel que l'acide citrique, chlor- hydrique, sulfurique ou un acide similaire La température n'est pas cruciale, mais on procédera de préférence à l'ex- traction en ajustant la température du mélange ainsi formé à 15-20 'C environ et en agitant jusqu'à ce que l'amphotéri- cine B de départ soit dissoute. On procède à la séparation du mélange extrait en faisant appel à des modes opératoires bien connus dans la technique De préférence, on aura recours à une filtration pour séparer l'extrait d'amphotéricine B des matières inso- lubles. On combinera ensuite l'extrait d'amphotéricine B purifié avec un mélange de solvants comprenant du chlorure de méthylène et de l'eau Les températures et l'ordre d'addition du chlorure de méthylène et de l'eau ne sont pas cruciaux, mais l'eau sera de préférence refroidie à une température de à 100 C environ On ajuste le p H de ce mélange à une valeur comprise entre 5 et 7 environ, de préférence à 6 environ, à l'aide d'une base aqueuse, la triéthanolamine aqueuse par exemple, ou à l'aide de n'importe quelle autre base appro- priée Ce mélange fait précipiter le produit amorphe, et la suspension épaisse résultante (de produit amorphe et de solvants) forme un milieu convenable pour favoriser la trans- formation de l'amphotéricine B en matière cristalline. On transforme la suspension d'amphotéricine B amorphe en matière cristalline en la chauffant à une tempé- rature d'environ 400 C à environ 600 C, de préférence d'envi- ron 450 C à environ 550 C Le cas échéant, on peut ajouter à la suspension de petites quantités de cristaux amorces pour accélérer la cristallisation. La récupération de l'amphotéricine B cristalline peut se faire par des modes opératoires classiques, centri- fugation ou filtration par exemple La matière isolée peut être lavée avec un solvant convenable, le cas échéant, avant séchage De préférence, la matière cristalline isolée doit être séchée de manière à conserver au moins 2 %, et dans le meilleur des cas, 2 à 6 % en poids d'eau Des exemples de solvants pour l'étape de lavage sont: l'acétone; des mélan- ges d'acétone et d'eau; le méthanol; des mélanges de métha- nol et d'eau; l'eau; ou des combinaisons des précédents. Les conditions opératoires de mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus peuvent être choisies de manière à donner un produit stérile. La présente invention va maintenant être décrite dans l'Exemple suivant, mais ne doit pas être considérée comme limitée par les détails de cet Exemple. Exemple I A environ 565 1 de méthanol on a ajouté environ kb(kilogrammes de base, c'est-à-dire kilogrammes de matière active pure) d'amphotéricine B et 225 1 de diméthyl- formamide On a ajouté environ 18,5 kg d'acide citrique monohydraté (ou la quantité équivalente d'acide anhydre). On a agité le mélange, maintenu à 15-20 %C, jusqu'à ce que le produit de départ soit pratiquement dissous On a ensuite éclairci la solution riche par filtration. Ensuite, on a ajouté au filtrat environ 140 1 de chlorure de méthylène On a ajouté environ 225 1 d'eau, refroidie à environ 5-100 C On a ensuite ajusté le p H à une valeur de 6 environ pour faire précipiter 1 'amphotéricine B. On a utilisé pour cet ajustement de la triéthanolamine aqueuse à 40 % en volume On a ensuite chauffé la suspension épaisse résultante à 44-460 c environ, pendant 30 minutes environ Après que le produit eut cristallisé, ce que l'on a déterminé par examen au microscope, on a refroidi le mélange à 100 C environ pendant 2 à 3 heures On a ensuite isolé par filtration le produit purifié et on l'a lavé avec environ 85 litres de méthanol aqueux froid à 40 % en volume On a ensuite délayé le gâteau de filtration humide dans environ 140 1 d'acétone Après filtration, on a lavé le gâteau avec environ 28 1 d'acétone puis on l'a séché jusqu'à ce que son taux d'humidité soit compris entre 2 % et 6 % On a récupéré environ 9 7 kb d'amphotéricine B. REVENDICATIONS 1 Composition d'amphotéricine B comprenant de l'amphotéricine B, et un acide capable de former un sel avec ladite amphotéricine B, dans une solution comprenant du méthanol, du diméthylformamide, du chlorure de méthylène et de l'eau. 2 Composition selon la revendication 1, comprenant en outre un agent convenable pour ajuster le p H de ladite composition entre 5 et 7 environ. 3 Procédé de purification et de cristallisation de l'amphotéricine B, qui consiste a à former une solution d'amphotéricine B dans du méthanol, du diméthylformamide et un acide capable de former un sel avec ladite amphotéricine B; b à séparer l'extrait d'amphotéricine B des matières insolubles; c à combiner ledit extrait d'amphotéricine B avec un mélange de solvants comprenant du chlorure de méthy- lène et de l'eau; d à ajuster le p H de la combinaison ainsi formée entre 5 et 7 environ; e à chauffer la suspension résultante pour accélérer la formation de matière cristalline; et f à récupérer l'amphotéricine B cristalline. 4 Procédé selon la revendication 3, dans lequel on procède à la récupération de la matière cristalline de la façon suivante: i en séparant la matière cristalline formée dans l'étape (e) du reste du solvant; et ii en lavant et séchant les cristaux séparés, les cristaux étant séchés de manière à conserver entre environ 2 et 6 % en poids d'eau. Procédé selon la revendication 3, dans lequel on réalise l'étape (a) à une température comprise entre 15 et 20 environ. 6 Procédé selon la revendication 3, dans lequel, dans l'étape (a), on mélange ladite amphotéricine B, ledit méthanol et ledit diméthylformamide, et on ajoute ensuite ledit acide citrique. 7 Procédé selon la revendication 3, dans lequel ladite séparation se fait par filtration. 8 Procédé selon la revendication 3, dans lequel, dans l'étape (c), on ajoute ledit chlorure de méthylène audit extrait, et on ajoute ensuite ladite eau,à une tempé- rature comprise entre 5 et 100 C environ, audit chlorure de méthylène et audit extrait. 9 Procédé selon la revendication 3, dans lequel, dans l'étape (d), on ajuste le p H de la combinaison à 6 environ. Procédé selon la revendication 3, dans lequel on chauffe ladite amphotéricine 8 amorphe à une température comprise entre 40 et 600 C environ pour la transformer en amphotéricine B cristalline.