FR 2659449 A1 19910913 FR 9102741 A 19910307 La présente invention a pour objet une méthode de sérodiagnostic pour la détection de cancers et un kit utilisé pour la mise en oeuvre de cette méthode de sérodiagnostic La méthode de sérodiagnostic de la présente invention et le kit destiné à sa mise en oeuvre sont caractérisés par l'utilisation de cytochrome c ou d'au moins l'une des histones Hl, H 2 A, H 2 B, H 3 et H 4. Les marqueurs de tumeurs utilisés jusqu'à présent pour le sérodiagnostic de cancers comprennent des protéines carcinoembryonnaires telles que l'afoetoprotéine (AFP) et l'antigène carcinoembryonnaire (CEA), des substan- ces de groupes sanguins, des antigènes associés aux tumeurs, des hormones et des iso-enzymes En ce qui concerne le sérodiagnostic du cancer du poumon, le CEA, l'antigène associé au carcinome épidermoïde (SCC) et l'énolase spécifique des neurones (NSE) ont été utilisés presque exclusivement L'un des avantages du sérodiagnostic est la possibilité d'une analyse de nombreux échantillons de manière simple en une seule fois Une autre caractéris- tique importante du sérodiagnostic est que ce sérodiag- nostic est utile non seulement pour le dépistage de cancers, mais également pour le contrôle des -effets thérapeutiques et post-opératoires. Bien que les marqueurs classiques de tumeurs ci-dessus aient été utilisés avec succès pour la détection de cancers, le pourcentage détectable de patients cancéreux au moyen de ces marqueurs de tumeurs n'est pas suffisamment élevé Pour autant que cela concerne la détection courante du cancer du poumon, il est possible de détecter seulement 30 à 50 % de la population atteinte d'un cancer du poumon même avec les marqueurs potentiels tels que le CEA, le SCC et la NSE, et il apparaît inévitablement des pourcentages relativement élevés ( 10 à 20 %) de résultats faussement positifs Ces difficultés pourraient être attribuées au fait que tous ces marqueurs de tumeurs proviennent de tissus humains et qu'ils sont présents de manière plus ou moins uniforme dans les tissus d'un sujet sain Ces méthodes analytiques nécessitent le marqueur de tumeurs purifié, en une concentration connue, comme substance de référence pour le dosage Cependant, il n'est pas aisé d'obtenir une quantité suffisante des marqueurs de tumeurs d'origine humaine pour l'utilisation en diagnostic de routine. La présente invention utilise des substances, en rapport avec le cancer, d'origine animale ou issues de micro-organismes à la place des substances d'origine humaine et dose les anticorps réactifs avec ces substances. Ainsi, une méthode nouvelle de diagnostic sensible et économique des cancers aux stades précoces de développe- ment des cancers a été élaborée. Lors de recherches de substances utilisables pour le sérodiagnostic de cancers, notamment du cancer du poumon, la Demanderesse a sélectionné un certain nombre de substances issues de sources autres que l'homme, et a trouvé que des cytochromes issus d'organismes inférieurs et des histones d'origine animale convenaient à cette fin et a ainsi mené à bonne fin la présente invention. Un des traits caractéristiques de la présente invention est que le sérodiagnostic est basé sur le dosage d'un anticorps engendré chez le patient en réponse à la présence d'un marqueur associé aux tumeurs, plutôt que du marqueur de tumeur proprement dit Cette caractéristique de la présente invention présente un avantage remarquable pour le sérodiagnostic consistant en la possibilité, même avec une quantité limitée du marqueur de tumeur, qui est indétectable pour la méthode classique de dosage de marqueurs de tumeurs, de détecter le cancer du poumon par un mécanisme utilisable qui consisterait en une amplifica- tion de l'anticorps induit contre le marqueur de tumeur, ce qui permet la détection sensible de cancers à leurs stades précoces de croissance Bien que des méthodes nouvelles de diagnostic de cancers à leurs stades précoces de dévelop- pement aient été désirées ardemment, une telle méthode présentant une efficacité satisfaisante n'a pas été révélée La méthode de la présente invention utilisant des substances, en rapport avec le cancer, d'origine animale ou issues de micro-organismes ouvre de nouveaux horizons en sérodiagnostic pour la détection sensible de cancers à leurs stades précoces de développement Le concept nouveau d'application de substances, en rapport avec le cancer, d'origine animale ou issues de microorganismes au sérodiagnostic d'un cancer humain a permis d'établir une méthode largement et couramment utilisable avec une grande sensibilité et une reproductibilité excellente à un coût raisonnable. ( 1) Identification des marqueurs ou antigènes de tumeurs: Un antigène spécifique de tumeurs présent dans le tissu de cancer pulmonaire humain a été identifié de la manière décrite ci-dessous en utilisant un anticorps monoclonal humain HB 4 C 5 spécifique du cancer du poumon (Ig M dans la classification des immunoglobulines) (In Vitro Cellular and Developmental Biology, 21, 593 ( 1985)). Le HB 4 C 5 a été déposé le 12 mai 1988 à la Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, et il lui a été attribué le numéro de dépôt FERM BP-1879 Ce dépôt a été fait conformément au Traité de Budapest sur la Reconnaissance Internationale du Dépôt d'un Micro-organisme à des Fins de Procédure de Dépôt de Brevet. Le tissu de cancer pulmonaire humain a été extrait au moyen d'un surfactant et soumis à une électro- phorèse sur gel de polyacrylamide au dodécylsulfate de sodium (Laemmli, Nature, 227, 680 ( 1970)) sur des gels présentant un gradient ( 4 à 20 %) Après électrophorèse, les substances présentes sur le gel ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose et soumises à une immunocolora- tion avec l'anticorps HB 4 C 5 de la manière décrite en détail ci-dessous. Avant la réaction immunologique, les sites d'adsorption non spécifiques éventuels sur la membrane de nitrocellulose ont été bloqués par immersion de la membrane dans un mélange de sérum physiologique tamponné avec un phosphate (STP)/0,05 % de Tween 20/1 % de sérum-albumine bovine pendant 1 heure La membrane a été immergée dans la solution de HB 4 C 5 pendant 1 heure, lavée avec un mélange STP/0,05 % de Tween 20 pendant 30 minutes, puis amenée à réagir pendant une heure avec un anticorps anti-Ig M humaine conjugué avec de la peroxydase Après lavage avec un mélange STP/0, 05 % de Tween 20 pendant 30 minutes, la membrane a été mise à incuber avec du tétrachlorhydrate de 3,3 ' -diaminobenzidine (DAB), un substrat pour la peroxyda- se, pendant 15 minutes, et la bande d'antigène ayant réagi avec le HB 4 C 5 a été visualisée. L'analyse de la séquence d'amino-acides de la protéine, qui avait été identifiée comme étant un antigène spécifique de HB 4 C 5 par la méthode de formation d'immuno- empreintes décrite ci-dessus, a révélé que la protéine antigénique présente dans l'extrait de tissu du cancer du poumon était identique à l'histone H 2 B en ce qui concerne lesdits résidus amino-terminaux. Ainsi, il a été démontré que l'histone H 2 B était un antigène pour l'anticorps monoclonal humain HB 4 C 5 spécifique du cancer du poumon A cet égard, un séro- diagnostic mesurant le taux d'anticorps anti-histone H 2 B dans le sérum a été élaboré en utilisant l'histone H 2 B comme antigène Des possibilités de sérodiagnostics similaires ont été explorées également avec d'autres membres connus de la catégorie des histones, comprenant les histones H 1, H 2 A, H 3 et H 4, et il a été trouvé que l'histone H 3 pouvait permettre de parvenir au plus haut taux de détection du cancer du poumon, parmi les histones testées Les histones d'origine animale, telles que celles issues du thymus de veau, peuvent servir réellement de substances convenables pour le sérodiagnostic de la présente invention car elles possèdent pratiquement la même structure que celles d'origine humaine, à l'exception d'hétérogénéités secondaires Ainsi, un sérodiagnostic de routine du cancer du poumon utilisant des histones, économiquement avantageux, est devenu possible. D'autre part, il a été trouvé de manière indépendante un autre groupe de substances spécifiquement réactives avec l'anticorps HB 4 C 5, à savoir des cytochromes c de micro-organismes, tels que Candida krusei et Sac- charomvces cerevisiae Ces cytochromes c issus de micro- organismes se sont révélé être spécifiquement réactifs avec des anticorps sériques de patients atteints d'un cancer du poumon, dans la méthode de sérodiagnostic de la présente invention, en présentant des résultats excellents avec des pourcentages élevés de détection du cancer du poumon Ces cytochromes c issus de micro-organismes, qui sont également disponibles en de grandes quantités à un coût relativement modique, sont devenus ainsi utiles et peuvent jouer un rôle intéressant dans le sérodiagnostic de routine du cancer du poumon. ( 2) Méthode de sérodiagnostic Les substances, en rapport avec le cancer, d'origine animale ou issues de micro-organismes, utilisées dans la présente invention sont diluées à une concentration finale de 50 gg/ml avec un mélange de tampon au carbonate m M (p H 9,5)/0,05-0,1 % de sérum de veau foétal (SVF)/0,02 % d'azothydrure de sodium On ajoute dans chaque puits d'une immunoplaque à 96 puits une portion aliquote de pl de la solution diluée de substance en rapport avec le cancer, décrite ci-dessus, et on la soumet à une incubation pendant une heure à 37 C pour revêtir le puits avec les protéines Les puits-témoins, soumis à une analyse de routine pour garantir la dépendance de l'analyse vis-à- vis des histones, sont traités de manière similaire avec la solution décrite ci-dessus, de laquelle une histone est exclue Les puits-témoins sont inutiles pour l'analyse avec le cytochrome c La plaque est lavée deux fois avec du STP, puis est mise à incuber avec un mélange de 10 % de SVF/STP pendant 1 heure à 37 C pour le blocage. Chaque portion aliquote de 50 Ml des sérums de patients et d'individus sains normaux, dilués à 1:200 (avec un mélange STP/0,05 % de Tween 20/0,1 % de sérum-albumine bovine (SAB) pour l'analyse avec une histone) ou à 1:500- 5000 (avec un mélange 10 % de SVF/STP pour l'analyse avec le cytochrome c) , est introduite rapidement dans les puits et mise à incuber pendant 1 heure à 37 C L'anticorps présent dans le sérum est lié à la phase immobile par l'inter- médiaire de l'histone ou du cytochrome c déposé. On lave trois fois les puits avec un mélange de STP/0,05 % de Tween 20, puis on y introduit des portions aliquotes de 100 pl d'une anti-Ig G ou Ig M humaine conjuguée avec une peroxydase ( 1-20 pg) dans un mélange STP/0,05 % de Tween 20/0,1 % de SAB Puis la plaque est mise à incuber pendant 1 heure à 37 C. Après lavage des puits à trois reprises avec un mélange de STP/0,05 % de Tween 20, une portion aliquote de g 1 de la solution de substrat contenant un sel de diammonium de 2,2 '-azinobis(acide 3-éthylbenzothiazoline-6- sulfonique) (ABTS) est introduite dans chaque puits et mise à incuber pendant 15 minutes à température ambiante La réaction enzymatique est terminée par introduction d'une portion aliquote de 100 j 1 de solution à 1,5 % d'acide oxalique dans chaque puits et l'absorbance à 415 nm est mesurée par spectrophotométrie Des dépendances linéaires des doses sont observées jusqu'à 1,5 en absorbance à 415 nm avec les anticorps présents dans les sérums des échantil- lons La réaction, dépendante de la substance en rapport avec le cancer, de l'analyse est calculée en soustrayant l'absorbance du puits-témoin de celle du puits d'essai correspondant. Le sérodiagnostic conforme à la présente invention peut être mis en oeuvre avantageusement par exemple au moyen du kit de sérodiagnostic suivant. Kit de sérodiagnostic: Le kit peut permettre les dosages de 48 à 96 échantillons COMPOSANTS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Microplaque en polystyrène munie de 96 puits à fond plat Cytochrome c ( 2 mg/ml, 375 Al) ou histone ( 2 mg/ml, 200 1 l) Solution de tampon au carbonate (p H 0,5, 15 ml) Poudre de sérum physiologique tamponnée avec un phosphate ( 11,3 g) Solution de Tween 20 ( 2 ml) Sérum de veau foétal ( 10 ml) Sérum de référence ( 5 pl) Solution d'anticorps anti-Ig G ou Ig M humaine conjuguée avec une peroxydase ( 20 1 l) Sérum-albumine bovine ( 20 mg) Sel de diammonium de 2,2 '-azino- bis-(acide 3-éthylbenzothiazoline- 6 sulfonique) ( 6 mg) Solution de tampon citrate- phosphate (p H 4,0, 20 ml) Solution d'acide oxalique ( 1,5 %, ml) Couvercle de microplaque 1 plaque 1 flacon 1 flacon 1 flacon 1 flacon 1 flacon 4 flacons 2 flacons 2 flacons 1 flacon 1 flacon 1 flacon 1 feuille La présente invention est décrite à présent plus en détail par référence aux exemples suivants. EXEMPLE 1 La réactivité du cytochrome c de Candida krusei a été examinée avec des sérums d'individus sains et de patients atteints d'un cancer du poumon, conformément à la méthode de la présente invention Les résultats sont présentés sur le tableau 1. TABLEAU 1 Sérum Réactivité (A 415) Ig G Ig M Cancer du poumon 1 0,240 0,049 2 0,087 0,205 3 1,343 0,046 4 0,218 0,053 0,385 0,151 Témoin sain normal 1 0,066 0,057 2 0,053 0,045 3 0,064 0,059 4 0,044 0,043 0,036 0,039 Une expérience similaire, répondant à la description précitée, a été conduite en utilisant le cytochrome c de Saccharomyces cerevisiae Ces cytochromes c issus de microorganismes sont disponibles dans le commerce Les résultats sont présentés sur le tableau 2. TABLEAU 2 Réactivité (A 415) Sérum Candida krusei Saccharomyces cerevisiae Ig G Ig M Ig G Ig M Cancer du poumon B-3 1,134 0,056 0,964 0,122 K-45 0,392 0,048 0,529 0,139 K-55 0,498 0,061 0,321 0,095 J-5 1,456 0,055 1,580 0,113 J-9 1,236 0,043 1,379 0,088 B-11 0,062 0,143 0,216 0,217 J-4 0,047 0,237 0,153 0,304 Témoin sain normal 96 0,071 0,072 0,196 0,136 97 0,098 0,089 0,294 0,167 98 0,087 0,051 0,239 0,109 99 0,098 0,041 0,223 0,100 100 0,073 0,040 0,126 0,098 EXEMPLE 2 Un sérodiagnostic a été effectué avec des sérums de patients présentant des types tissulaires différents de cancer du poumon conformément à la méthode revendiquée, utilisant le cytochrome c de Candida krusei. Les sérums présentant une valeur de A 415 excédant de 2 E.T (écart-type) la moyenne des témoins sains normaux ont été considérés comme étant positifs Les résultats présentés sur le tableau 3 indiquent que la méthode de sérodiagnostic de la présente invention permet de parvenir à de plus hauts taux de détection et à une plus faible incidence de détection faussement positive (inférieure à %; c'est-à-dire 5 sur 110) que les méthodes prévalant actuellement qui utilisent le CEA, le SCC ou la NSE. TABLEAU 3 Histologie du cancer Nombre de Taux de résultats du poumon sérums positifs (%) Carcinome épidermoïde 16 56 Carcinome à petites cellules 5 80 Carcinome à grandes cellules 2 100 Adénocarcinome 19 37 EXEMPLE 3 Un sérodiagnostic a été effectué conformément à la méthode revendiquée en utilisant le cytochrome c de Candida krusei avec des sérums de patients atteints de cancers dans des organes différents Les résultats présentés sur le tableau 4 indiquent que les sérums provenant d'un cancer du poumon, d'un cancer des canaux biliaires et d'un cancer oesophagien sont détectés avec de fortes incidences par cette méthode. il TABLEAU 4 Nombre de Taux de résultats Cancer sérums positifs (%) Cancer du poumon 42 52 Cancer des canaux biliaires 4 75 Cancer oesophagien 3 67 Cancer du foie 8 25 Cancer pancréatique 6 33 Cancer du rectum il 27 Cancer gastrique 48 23 Cancer du colon 7 O Cancer du sein 3 O Troubles bénins 32 9 EXEMPLE 4 Un sérodiagnostic a été effectué conformément à la présente invention en utilisant l'histone H 2 B du thymus de veau avec les sérums de patients souffrant de cancers d'organes différents et de troubles bénins, ainsi qu'avec les sérums provenant d'individus sains normaux Les résultats sont présentés sur le tableau 5 Les sérums provenant d'un cancer cervical, d'un cancer du poumon, d'un cancer pancréatique et d'un cancer du rectum étaient détectables avec de fortes incidences. TABLEAU 5 Nombre de Taux de résultats Cancer sérums positifs (t) Cancer cervical 9 78 Cancer du poumon 51 35 Cancer pancréatique 8 50 Cancer du rectum 12 42 Cancer du foie 6 33 Cancer gastrique 52 17 Cancer du sein 3 33 Troubles bénins 31 19 EXEMPLE 5 Une expérience similaire à celle décrite dans l'exemple 4 a été effectuée avec des sérums provenant de patients présentant des types histologiques différents de cancer du poumon Les résultats sont présentés sur le tableau 6. TABLEAU 6 Histologie du cancer Nombre de Taux de résultats du poumon sérums positifs (%) Adénocarcinome 23 26 Carcinome épidermoïde 18 44 Carcinome à petites cellules 3 33 Carcinome à grandes cellules 1 O Tuberculome 1 100 Tumeur carcinoïde centrale 1 100 TABLEAU 7 Histologie du cancer Nombre de Taux de résultats du poumon sérums positifs (%) Adénocarcinome 23 39 Carcinome épidermoïde 18 61 Carcinome à petites cellules 3 33 Carcinome à grandes cellules 1 100 Tuberculome 1 100 Tumeur carcinoïde centrale 1 100 EXEMPLE 6 Une expérience similaire à celle de l'exemple 5 a été effectuée avec l'histone H 3, à la place de l'histone H 2 B Les résultats présentés sur le tableau 7 indiquent que les plus fortes incidences de détection sont obtenues avec l'histone H 3, tableau 6). EXEMPLE 7 comparativement à l'histone H 2 B (voir Le sérodiagnostic a été effectué avec chacune des cinq histones du thymus de veau, comprenant les histones Hi, H 2 A, H 2 B, H 3 et H 4, séparément à chaque fois, au moyen des mêmes sérums Les résultats sont présentés sur le tableau 8, qui indique que les histones Hi, H 2 A et H 4 peuvent être utilisées également de manière efficace dans la méthode de sérodiagnostic de la présente invention. TABLEAU 8 Sérum Réactivité (A 415) Hi H 2 A H 2 B H 3 H 4 Cancer du poumon 1 0,489 0,634 0,523 0,811 0,498 2 0,715 0,492 0,720 0,913 0,522 3 0,307 0,336 0,316 0,484 0,354 4 0,535 0,420 0,415 0,511 0,433 0,676 0,484 0,743 0,872 0,526 Témoin sain normal 1 0,034 0,108 0,072 0,149 0,118 2 0,011 0,084 0,072 0,075 0,107 3 0,079 0,136 0,130 0,119 0,163 Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1 Méthode de sérodiagnostic pour la détection de cancers, caractérisée en ce qu'elle comprend l'utilisa- tion de cytochromes c. 2 Méthode de sérodiagnostic suivant la revendication 1, caractérisée en ce que les cytochromes c sont obtenus à partir de micro-organismes, comprenant des micro-organismes du genre Candida et une levure. 3 Méthode de sérodiagnostic suivant la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que l'anticorps réagissant avec le cytochrome c dans le sang est dosé. 4 Méthode de sérodiagnostic suivant l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'un anticorps marqué avec un enzyme est utilisé. Méthode de sérodiagnostic pour la détection de cancers, caractérisée en ce qu'elle comprend l'utilisa- tion d'histones. 6 Méthode de sérodiagnostic suivant la revendication 5, dans laquelle l'histone est l'une des histones Hl, H 2 A, H 2 B, H 3 et H 4. 7 Méthode de sérodiagnostic suivant la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisée en ce que l'anticorps réagissant avec les histones dans le sang est dosé. 8 Méthode de sérodiagnostic suivant l'une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce qu'un anticorps marqué avec un enzyme est utilisé. 9 Kit de sérodiagnostic, caractérisé en ce qu'il est destiné à la mise en oeuvre de la méthode de sérodiagnostic suivant l'une des revendications précé- dentes.