FR 2651680 A1 19910315 FR 8912038 A 19890914 I La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de microparticules lipidiques d'aspect microcristallin. Par "aspect cristallin" on n'entend pas que la structure cristalline soit nécessairement obtenue stricto sensus. Ce type de microparticules a été décrit par la Demanderesse notamment dans la demande de brevet européen n 270 460. Plus précisément, il s'agit de microparticules d'une substance insoluble dans l'eau présentant une affinité pour les phospholipides et d'au moins un phospholipide. Il faut entendre par "substance insoluble dans l'eau" une substance peu ou pas soluble dans l'eau et par "substance présentant une- affinité pour les phospholipides" un composé chimique plus particulièrement capable d'interagir avec les phospholipides par voie physico-chimique. Ces microparticules offrent principalement l'avantage d'obtenir une microsuspension stable en solution aqueuse d'une substance par ailleurs insoluble en phase aqueuse, ce qui permet de l'administrer notamment lorsqu'il s'agit d'un médicament sous forme injectable ou pulvérisable. En outre, vraisemblablement en vertu d'un effet de pilotage accrû notamment vers les macrophages d'une part, et d'un effet de libération progressif de la substance active d'autre part, des préparations de microparticules donnent des résultats d'activité thérapeutique et de toxicité nettement plus intéressants que les vésicules lipidiques de type liposome. On a décrit dans la demande EP 270 460 un procédé de préparation relativement complexe de ces microparticules inspiré des procédés utilisés pour la préparation des liposomes. Le procédé décrit dans EP 270 460 comporte essentiellement les étapes suivantes: a) on évapore les solvants d'une solution de phospholipide dans le chloroforme'et de ladite substance dans le méthanol, b) on remet le film obtenu après évaporation desdits solvants en suspension dans une solution aqueuse après agitation vigoureuse. Pour remettre le film obtenu à l'étape b) en suspension, ceci était effectué par traitement aux ultrasons. Dans le cadre d'une application industrielle du procédé, la complexité de celui-ci, avec notamment la présence d'une étape d'agitation vigoureuse et notamment de traitement aux ultrasons, constitue un inconvénient majeur. La Demanderesse a maintenant découvert que ces micro- particules pouvaient être préparées par un procédé beaucoup plus simple et avec un bien meilleur rendement. En particulier, selon le procédé objet de la présente invention, l'étape de sonication est supprimée et l'on n'Utilise plus de chloroforme pour solubiliser le phospholipide. En effet, la présente invention a pour objet un procédé de préparation de microparticules lipidiques d'aspect microcristallin d'une substance insoluble dans l'eau présentant une affinité pour les phospho- lipides, et d'au moins un phospholipide, microparticules stables en suspension dans une solution aqueuse, caractérisé en ce que: a) on dissout ladite substance et le ou lesdits phospholipides dans un solvant organique commun de ladite substance et du ou desdits phospholipides, b) on mélange la solution obtenue de ladite substance et du ou desdits phospholipides à une solution aqueuse dans une quantité telle qu'on observe une insolubilisation sous forme de précipité, c) on élimine le solvant organique pour récupérer une solution aqueuse contenant les microparticules sous forme de microsuspensions. L'élimination du solvant organique peut se faire par évaporation, centrifugation ou ultrafiltration. La simplicité du procédé selon la présente invention provient du fait que des complexes substance-phospholipides dans un rapport molaire 1:1 sont vraisemblablement formés dès la mise en présence des différents constituants résultant d'une interaction physico-chimique. L'apport de la solution aqueuse entraîne la précipitation sous forme de microparticules desdits complexes. Selon la présente invention, on obtient des microparticules d'aspect, de structure et de taille identiques et présentant les mêmes propriétés pharmacologiques avantageuses que celles obtenues par le procédé précédemment décrit dans EP 270 460. Comparé à la préparation de liposomes et à la préparation des microparticules selon le procédé antérieur, le procédé selon la présente invention est beaucoup plus simple et plus économique. On obtient en particulier beaucoup moins de substances libres dans la solution finale et donc un meilleur rendement et les préparations de microparticules obtenues ont une plus grande pureté que celles obtenues par le précédent procédé. Elles sont essentiellement dépourvues d'amphotéricine B libre ou de phospholipide libre. En outre, les microparticules obtenues sont aussi stables que celles obtenues par l'ancien procédé et donc beaucoup plus stables que les liposomes qui souffrent d'une instabilité qui en limite considérablement les possibilités d'emploi. A titre de solvants organiques utiles dans le procédé selon l'invention, on peut citer plus particulièrement les solvants de polarité intermédiaire tels que le méthanol ou le diméthylformamide (DMF), le diméthylacétamide (DMA), ou le propylène glycol. Comme solution aqueuse utile dans le procédé selon la présente invention, on utilisera avantageusement l'eau pure ou des solutions salines telles qu'une solution de NaCI, par exemple à concentra- tion de 0,5 à 1 %, par exemple 0,9 % (poids/volume) ou une solution de saccharose de I à 10 % (poids/volume), par exemple du lactose ou du glucose sont particulièrement appropriés en vue d'une lyophilisation ultérieure. Selon la présente invention, le rapport molaire phospholipide(s)/ substance engagés dans le procédé peut être compris entre 0,1 et 10. - Comme on l'a vu, les microparticules selon l'invention résultent vraisemblablement d'une complexation substance-phospholipide dans un rapport'molaire proche de 1/1. C'est pourquoi, si le rapport molaire est inférieur ou égal à 2, c'est-à-dire par exemple entre 0,5 et 2, de préférence entre 0,8 et 1,4, on observe une interaction spécifique avec production homogène optimum de microparticules dont la taille moyenne est inférieure à 1 p. Dans les préparations de microparticules obtenues par le procédé selon l'invention, la taille des microparticules est en général comprise entre 0,15 et 2 p. Selon l'invention, on utilisera de préférence comme phospho- lipide de la phosphatidylcholine. La phosphatidylcholine peut être préparée à partir de lécithine de jaune d'oeuf, de soja hydrogénée ou non ou de tout autre source industrielle de lécithine. Comme autres phospholipides utiles dans le procédé, on peut utiliser la dimyristoylphosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylsérine, la phsophatidylinositol, la phosphatidylglycérol, la 3'- O-lysylphosphatidylglycérol, la diphosphatidylglycérol, cette liste n'étant bien entendu pas limitative. Certaines substances présentent une plus grande solubilité en solution organique dans un solvant donné lorsqu'on se trouve en milieu acide ou basique et sous forme de sel et qu'elles sont ionisées. Dans ce cas, on prépare avantageusement les microparticules selon l'invention de la manière suivante: a) on dissout ladite substance et le ou lesdits phospholipides dans leur solvant organique commun en milieu basique ou acide, b) on mélange la solution obtenue avec une solution aqueuse pour obtenir un précipité, et on neutralise la solution par addition d'acide ou de base respectivement, la neutralisation pouvant se faire avant ou après addition de la solution aqueuse. c) on élimine le solvant pour récupérer une phase aqueuse contenant les microparticules sous forme de microsuspensions. On peut également laver les microparticules à l'eau par des cycles répétés de centrifugation et d'élimination du surnageant afin d'éliminer le maximum de solvant organique. A l'étape a), on introduira de façon appropriée de I à 1,5 équivalent de base ou d'acide le cas échéant par rapport à ladite substance, et on neutralisera par la même quantité d'acide ou de base respectivement. On observe un début de précipitation à l'étape a). Le procédé selon l'invention est particulièrement intéressant pour préparer des microparticules de médicaments antimycotiques macrolides polyènes, tels que la nistatine et l'amphotéricine B et leurs dérivés qui présentent également une activité antifongique. Lorsque dans le procédé selon l'invention, ladite substance est l'amphotéricine B et le phospholipide est de la phosphatidylcholine, avanta- geusement ces deux constituants sont mis en présence en quantité équimolaire pour former des microparticules lipidiques d'aspect cristallin. Dans le cas o la substance active est un macrolide de type polyène tel que l'amphotéricine B ou la nystatine, lorsqu'elle est dissoute dans du méthanol ou du propylène glycol, la solution initiale de la substance et du phospholipide sera avantageusement une solution basique, par exemple une solution comportant de I à 1,5 équivalent de base tel que NaOH ou KOH par rapport à la substance active. On neutralise ultérieu- rement la solution par addition de I à 1,5 équivalent d'acide tel que HCI. L'équivalent représente en l'espèce autant de moles de base ou d'acide que de moles d'amphotéricine. Dans le cas o la substance active est un macrolide de type polyène tel que l'amphotéricine B ou la nystatine et lorsqu'elle est dissoute dans une solution de DMF, avantageusement la solution initiale de la substance et du phospholide sera une solution acide, par exemple une solution comportant de I à 1,5 équivalent d'acide tel que HCL par rapport à la substance active. On neutralise ultérieurement la solution dans le procédé par addition de 1 à 1,5 équivalent de base tel que NaOH ou KOH. Lorsque le solvant est le DMA, on peut également avoir recours à une solution acide bien que cela ne soit pas obligatoire, la solubilité des macrolides polyènes tels que l'amphotéricine B dans le DMA étant suffisante pour éviter l'utilisation d'un acide. Il demeure que la- solubilité de l'amphotéricine B est améliorée en solution acide dans le DMA. Le' traitement des infections mycotiques causées par Candida et Aspergillus est difficile et habituellement mal toléré. Peu de médicaments sont actifs contre ces deux types de microorganismes. Les antimycotiques macrolides polyènes tels que la nystatine et l'amphotéricine B sont les produits les plus utilisés et caractérisés par une activité tant sur l'espèce Aspergillus que l'espèce Candida. L'utilisation clinique de l'amphotéricine B est très fortement limitée par deux inconvénients majeurs: - en premier lieu, sa grande insolubilité qui nécessite son administration en solution dans du désoxycholate de sodium, - en second lieu, la toxicité intrinsèque de désoxychlotate qui s'additionne à l'activité toxique de l'amphotéricine B proprement dite et qui s'exerce surtout au niveau des reins et de la moelle osseuse. Cependant, quels que soient ses effets secondaires, cet antibiotique reste efficace dans les infections fongiques qui auraient un pronostic mortel sans ce traitement. Dans ce contexte, il est apparu important de diminuer la toxicité de l'amphotéricine B en modifiant sa pénétration intracellulaire. En effet, un facteur très important pour l'efficacité des antimycotiques en général, et pour l'amphotéricine B en particulier, est la nécessité d'induire une action antibiotique qui soit synergique avec celle des cellules hôtes, responsables des défenses anti-infectieuses de l'organisme. Il a en effet été démontré que les polymorphonucléaires et les macrophages peuvent maîtriser avec succès, des infections mycotiques dans la mesure o ces cellules peuvent phagocyter les microoganismes et les contrôler dans leur système lysosomial. Des médicaments antimycotiques doivent dès lors, non seulement réduire la multiplication des agents infectieux présents dans le milieu extracellulaire mais pouvoir exercer également leur action à l'intérieur des phagosomes et lysosomes de polymorphonucléaires et macrophages. Or, très peu de choses sont connues de la pénétration intracellulaire des macrolides polyènes et tout laisse supposer par ailleurs que ces substances s'accumulent au niveau des membranes pericellulaires et ne parviennent dès lors à atteindre les compartiments lysosomiaux intracellulaires que grâce au flux membranaire de la surface vers les espaces intracellulaires. L'invention a apporté une solution à ces problèmes en proposant une nouvelle forme galénique de l'amphotéricine B basée sur l'interaction de ce médicament avec la phosphatidylcholine pour former une suspension de microparticules évoquée ci-dessus. Cette formule galénique permet en premier lieu d'administrer l'amphotéricine B sans avoir recours à du désoxycholate et elle permet de décroître très significativement la toxicité aiguë des produits après injection intraveineuse. Ces microparticules ont la même activité que l'amphotéricine solubilisée par du désoxycholate contre des Candida extracellulaires et sont plus actifs in vitro dans les infections intra- cellulaires à macrophages. Les propriétés des microparticules d'amphotéricine B ont également été comparées avantageusement à celles des liposomes contenant le même macrolide polyène et qui sont également préconisées comme transporteur capable de réduire les effets secondaires de l'amphotéricine. Ces résultats sont présentés dans la demande de brevet FR 89 07781. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description qui va suivre faisant référence à des figures. Les figures 1 et 2 représentent les courbes de stabilité de l'amphotéricine B en milieu acide et basique respectivement, à diverses concentrations et à température ambiante. Les figures 3 à 16 représentent les profils de densité des centrifugations en gradient de sucrose pour différentes fractions de préparation d'amphotéricine B selon les procédures 1 à 14 respectivement. EXEMPLE 1: Microparticule d'amphotéricine B et de phosphatidylcholine I. Solubilité de l'amphotéricine B L'amphotéricine B est une composé amphotère présentant à la fois une partie de sa structure qui est polaire (avec des groupes acide et des groupes amine) et une partie non polaire. Excepté dans le DMSO et le DMF, l'amphotéricine B se dissout faiblement dans la plupart des solvants organiques. Toutefois, l'ionisation des groupes acide et amine augmente sa solubilité (voir tableau 1) Tableau 1 Solubilité de l'amphotéricine B dans différents solvants pH H20 CH3OH Diméthylformamide neutre insoluble 0,2-0,4 mg/ml 2,0-4,0 mg/ml acide 0,1 mg/ml 3,0-5,0 mg/ml 60,0-80,0 mg/ml basique 0,1 mg/ml 2,0-3,0 mg/ml ---- Deux lots différents d'amphotéricine B ont été utilisés pour les tests décrits ci-après: - amphotéricine B pour application topique, - amphotéricine B pour injection i.v. 1.1 Solubilité de l'amphotéricine B "grade topique" Solvant Solubilité (mg/ml) CH3 OH 0,13 CH3OH + 1,5 eq. HCI 5,00* 25. CH3 OH + 1,5 eq.NaOH 5,00 * voir 2.3 1.2 Solubilité d'amphotéricine B "grade i.v." Solvant Solubilité (mg/ml) CH3 OH 0,150 CH3OH + 1,0 eq. HCI 5,00* CH 3 OH + 1,0 eq. NaOH 5,00 * dissolution voir 2.3 L'acide acétique et l'ammoniac NH3 dans le méthanol ne dissolvent pas l'amphotéricine B (5 mg/ml dans CH3OH) après addition de deux équivalents desdits réactifs. 2. Stabilité des solutions d'amphotéricine B 2.1 Méthode La stabilité des solutions d'amphotéricine B a été enregistrée par analyse HPLC en utilisant une colonne à phase inverse (C18 Bondapak de 25 x 0,5 cm, Waters Associates). On a utilisé comme éluant un système CH3CN/tampon acétate 10 mM, pH 7 (39:61). On a effectué l'enregistrement U.V. à 404 et 362 nm. Le débit était de 2 ml/min. Le temps de rétention (R.T.) de l'amphotéricine B est de 9,5 minutes. Des résultats ont été- exprimés comme le pourcentage de la surface des pics. 2.2 Solutions de CH 3OH neutre A une concentration de 0,1 mg/ml, l'amphotéricine B est stable pendant plusieurs jours à 4 C. L'amphotéricine B grade topique a une pureté de 88,5 % (contamination de 7,6 % avec un temps de rétention de 4,5 minutes). L'amphotéricine B de grade i.v. a une pureté de 94,5 % (contamination de 3,5 % avec un temps de rétention de 4,5 minutes). 2.3 Solutions de méthanol en milieu acide Les essais avec l'amphotéricine B grade topique ont montré que le composé est stable à une concentration de 0,1 mg/ml en présence de 1,5 eq. de HCI dans la solution méthanolique, mais se dégrade dans ce milieu acide à une concentration de 5 mg/ml (voir figure 1). Les résultats HPLC obtenus pour une solution d'amphotéricine B de 0,1 mg/ml sont reproduits dans le tableau 2 ci-après. La neutralisation a été effectuée par contrôle du pH. L'addition d'un excès de NaOH n'affecte pas la stabilité du composé (tableau 2). Tableau 2 AEhatlo=Amphotéricine B Contamination Echantillon H (%) R.T.: 9,5 min (%) R.T.: 4,5 min pH Ampho. B 0,1 mg/ml 7,1 89,1 7,6 id. + 1,5 eq. HCI 3,7 88, 2 7,7 id. + 1,5 eq. NaOH 7,1 87,3 8,1 id. + excès de NaOH 7,5 87,3 8,1 id. + excès de NaOH 9,5 87,3 8,1 Afin d'étudier l'effet de l'addition de HCI sur la stabilité de l'amphotéricine B, des quantités croissantes d'amphotéricine B (grade i.v.) ont été dissoutes dans le méthanol en présence d'un équivalent de HCI (solution méthanolique). La dégradation en milieu acide de la substance de l'amphotéricine B augmente fortement quand la concentration d'ampho- téricine B est supérieure à 2 mg/ml (voir figure 1) et ceci même quand l'addition de HCI en solution méthanolique a été faite à 0 C (avec une contamination de 31 %). Pour obtenir une solution d'amphotéricine B/HCI à une concentration de 5 mg/ml sans dégradation de l'amphotéricine B, l'amphotéricine B a été dissoute dans du méthanol en présence d'un équivalent de HCI à une concentration de 2 mg/ml. Le solvant a ensuite été évaporé et le sel d'acide de l'amphotéricine B a été redissous dans le volume requis d'alcool. 2.4 Solutions de CH3OH basique Des quantités croissantes d'amphotéricine B (grade i.v.) ont été dissoutes dans du méthanol en présence d'un équivalent de NaOH (solution méthaholique). Les solutions ont été ensuite analysées par HPLC. Comme il apparaît sur la figure 2, l'amphotéricine B a une bonne stabilité en solution méthanolique de NaOH jusqu'à une concentration de 5 mg/ml. La neutralisation avec de l'HCI méthanolique n'a pas d'effet sur la stabilité du produit. I1 3. Dosage de l'amphotéricine B Pour doser l'amphotéricine B par analyse U.V., la valeur E a été déterminée en mesurant l'absorbance à 404 nm pour des quantités croissante d'amphotéricine B dissoutes dans du DMF. L'amphotéricine B (mg/ml): (Abs. / 49,8) x facteur de dilution. Des contrôles appropriés ont montré que les phospholipides et le sucrose n'interfèrent pas avec le dosage de l'amphotéricine B. 4. Préparation des microparticules 4.1 Introduction Dans le but d'améliorer la préparation des microparticules, différents procédés ont été comparés. Plusieurs paramètres ont été évalués: a) l'addition de NaOH ou HCI pour augmenter la solubilité d'amphotéricine B dans le méthanol, b) l'effet de la dissolution du phospholipide dans du chloroforme avant l'addition de la solution méthanolique d'amphotéricine B, c) l'effet de la formation d'un film de phospholipide préalablement à l'addition de la solution méthanolique d'amphotéricine B. La centrifugation en gradient de densité a été choisie comme méthode analytique pour déterminer la qualité des microparticules. 4.2 Matériels et méthodes * Matériels La L-alpha phosphatidylcholine a été préparée à partir de lécithine de jaune d'oeuf (pureté: 99 %, masse molaire 789) ou de soja. L'amphotéricine B était celle de grade i.v. (pureté 94 %, masse molaire: 924). L'évaporation a été effectuée en utilisant un évaporateur du type Buchi evaporateur rotatif (sauf indication contraire). * Procédés de préparation Toutes les préparations décrites ci-après contenaient de l'amphotéricine B à une concentration finale de 5 mg/ml. Procédure 1: Préparation de suspension d'amphotéricine B mg d'amphotéricine B on été dissous dans du méthanol (0,1 mg/ml). Le solvant a été évaporé et le résidu sec a été repris dans 5 ml d'une solution saline de tampon phosphate de pH 7,4 (PBS).L'échantillon a été soniqué. Procédure 2 Les préparations de microparticules d'Amphotéricine B ont été réalisées en utilisant un évaporateur à film ascendant de QUICK FIT. Dans un erlen de 5 Litres, on dissout 1 gramme d'Amphoté- ricine B et 0,85 grammes de L-alpha-phosphatidylcholine (egg lécithine pureté supérieure à 99 %) dans 1,5 litres d'un mélange de chloroforme- méthanol (1:I en volume), auxquels on rajoute, quand la solution est limpide, 100 ml de NaCl 0,9 %. Les solvants sont éliminés sous vide dans l'évaporateur à film ascendant. La température maximale de la solution, en haut de l'évapora- teur est de 35 -45 C. Après séparation des phases, on récupère la phase aqueuse contenant les microparticules, que l'on soumet à un deuxième cycle d'évaporation. Le système est rincé à l'aide d'eau distillée et le volume final est amené à 200 ml à l'aide d'un évaporateur rotatif, dont le bain chauffant ne dépasse pas 40 C. On récupère généralement 82 à 86 % de l'amphotéricine sous forme d'une suspension de microparticules à la concentration comprise entre 4 et 5 mg/ml. Procédure 3 mg d'amphotéricine B ont été dissous dans du méthanol (5 mg/ml) en présence d'un équivalent de NaOH (205 p1 d'une solution méthanolique 0,132 M). 21,2 mg de phosphatidylcholine ont été introduits dans le mélange. Ceci correspond à un rapport molaire 1:1 entre l'amphotéricine B et la phosphatidylcholine. La préparation a été agitée jusqu'à complète dissolution. 5 ml de NaCI 0,9 % en poids ont été ajoutés. La formation d'un précipité jaune est observée. Le mélange est ensuite neutralisé par addition d'un équivalent d'acide (30,7 pll d'une solution 0,88 M HC1 dans le méthanol). Le méthanol a ensuite été évaporé et le volume final a été ajusté à 5 ml avec une solution de NaCl 0,9 % en poids. Procédure 4 21,2 mg de phosphatidylcholine ont été déposés sous forme de film au fond d'un ballon de 500 ml par rotoévaporation du chloroforme d'une solution chloroformique du phospholipide. Le film a été solubilisé dans 250 ml d'une solution d'amphotéricine B dans le méthanol (25 mg à 0, 1 mg/ml) et à nouveau évaporé à l'évaporateur rotatif, jusqu'à obtention d'un film fin. Après addition de 5 ml de solution PBS, le mélange a été soniqué pendant 0,5 heures. Procédure 5 Le même procédé que la "procédure 3" a été suivi excepté le fait que le phospholipide était dissous dans le chloroforme avant l'addition de la solution d'amphotéricine B. Dans ce cas, aucun précipité n'a été observé après addition de la solution aqueuse PBS (2 ml). Toutefois un solide jaune précipite durant l'évaporation des solvants. Procédure 6 Un procédé identique à celui de la "procédure 4" a été suivi en utilisant toutefois de la lécithine de soja à la place de la lécithine de jaune d'oeuf. Procédure 7 Une procédure identique à la "procédure 3" a été suivie en utilisant de la lécithine de soja hydrogénée à la place de la lécithine de jaune d'oeuf. Procédure 8 Une procédure identique à la "procédure 3" à été suivie en utilisant de l'eau à la place d'une solution de NaCI 0,9 %. Procédure 9 Une procédure identique à la "procédure 3" a été suivie en utilisant un solution de lactose 5 % à la place de la solution de NaCI 0, 9 %. Procédure 10 Une procédure identique à la "procédure 3" a été suivie excepté le fait que seulement 1 ml d'une solution de NaCI 0,9 % a été ajouté à la solution. Dans ce cas, la précipitation n'était pas complète lors de l'apport de la solution aqueuse. Cette précipitation était parachevée lors de la phase de neutralisation. Procédure 11 Même procédure que la "procédure 3" excepté que le mélange a été neutralisé par addition d'un équivalent de HCI en solution méthanolique avant l'addition de la solution de NaCI 0,9 %. Procédure 12 25 mg d'amphotéricine B ont été dissous en présence d'un équivalent de HC1 dans une solution méthanolique à une concentration de 2 mg/ml dans le but d'obtenir une solution à 5 mg/ml de médicament sans trop de dégradation. Le solvant a été évaporé et le composé dissous dans le volume requis de méthanol. 21,2 mg de phosphatidylcholine de jaune d'oeuf ont été introduits dans le mélange. La préparation a été agitée jusqu'à complète dissolution. 5 ml de solution de NaCI 0,9 % ont été ajoutés. La formation d'un précipité jaune a été observée. Le mélange a été neutralisé par addition d'un équivalent d'acide. Le méthanol a été évaporé et le volume final ajusté à 5 ml avec une solution de NaCI 0,9 %. Procédure 13 Même procédure que la "procédure 12" excepté que le mélange a été neutralisé par addition d'un équivalent de NaOH dissous dans du méthanol avant l'addition de la solution de NaCI 0,9 %. Procédure 14 Même procédure que la "procédure 13", excepté que le phospholipide a' été dissous dans le chloroforme avant l'addition de la solution d'amphotéricine B. Aucun précipité n'a été observé après l'addition de NaCI 0,9 % (2 ml). Un précipité jaune apparaît durant l'évaporation des solvants. Procédure 15 Même procédure que pour la "procédure 3" excepté que la lécithine est remplacée par un mélange de 1, 2 - dimiristoyl - sn - glycerol (3) phosphocholine (12,84 mg) et de 1,2 dimiristoyl - sn - glycero (3) phospho (1) - rac - glycérol (5.59 mg). Procédure 16 2 g d'amphotéricine B en suspension dans 500 ml de méthanol sont dissous par addition d'un équivalent de NaOH en solution dans le méthanol. 1.7 g de lécithine d'oeuf (1 équivalent) sont ajoutés à la solution limpide. Cette dernière est agitée jusqu'à dissolution complète du lipide. Sous agitation énergique, l'addition de 300 à 500 ml d'eau suivie de- l'ajustement du pH de la solution à pH 7,8 entraine la précipitation des microparticules. Le méthanol est évaporé sous vide en utilisant un évaporateur à film ascendant (Quick Fit). La température maximale au haut de la colonne d'évaporation est de 35 à 45 C. * Méthodes Centrifugation en gradient de densité (A. S. Janoff, L.T. Boni, M.C. Popescu, S.R. Minchey, P.R. Cullis, T.D. Madden, T. Taraschi, S.M. Gruner, E. Shyamsunder, M.W. Tate, R. Mendelsohn, and D. Bonner, Proc. Nat. Acad. Sci USA 85, 6122-6126 (1988) 500 p1 d'un échantillon ont été déposés sur un gradient de sucrose continu(d = 1.0 à 1.18 g/ml) dans une solution de NaCI 150 mM/Hepes 20 mM, pH 7,4. Le gradient a été centrifugé pendant 21 heures à 22 C dans un rotor SW-41 (Beckman) à 230 000 x g. Après centrifugation, le gradient est fractionné en fraction de 0,53 ml et dosé quant au continu d'amphotéricine B et de phospholipide. Dosage du phospholipide (M. Takayama, S. Itom, T. Nagasaki, I. Tanimizu, Clinica Chimica Acta, 79 (1977) 93-98 "A new Enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids") Classiquement, 20 pl d'un échantillon ont été mélangés avec 3 ml d'une solution d'enzyme (Boehringer Mannheim Gmbh, kit 691844) et incubés à 37 C pendant 10 minutes. L'absorbance de l'échantillon a été mesurée à 500 nm. La solution de chlorure de choline (correspondant à 3 mg de PC/ml) a été utilisée comme témoin. 4.3 Résultats 4.3.1 Détermination de phospholipide dans les micro- particules Des microparticules ont été préparées à partir de 4,15 mg de lécithine d'oeuf et 5 mg d'amphotéricine B. Les microparticules ont été mises en suspension dans une solution de Doc 1 % et ont été dosées quant à leur contenu total en phospholipide. Plusieurs dilutions de microparticules ont été préparées dans une solution de Doc 1 % pH 11,3 et dosées quant à leur contenu en phospholipide. Le dosage est précis à partir de 0,1 mg de phospholipide/ml jusqu'à au moins 5 mg/ml. 4.3.2 Précision des profils de densité Un gradient de saccharose de 0 à 41 % en poids de sucrose a été obtenu en utilisant un générateur de gradient LKB (volume total: 11 ml). Le tube a été fractionné en aliquots de 0,53 ml et la densité des différentes fractions a été déterminée par gravimétrie. Il apparaît un gradient linéaire qui s'étale de I à 1,18 g/ml. Une expérience de contrôle a montré que le profil de densité est le même après centrifugation de 230 000 x g. 4.3.3 Dosage de phospholipide et l'amphotéricine B dans les microparticules obtenues selon les procédures 1 à 5 Comme il apparaît au tableau 3 ci-après, l'amphotéricine et le phospholipide sont récupérés à peu près complètement quel que soit le procédé suivi. Tableau 3 Echantillon Phospholipide %* Amphotéricine mg/ml mg/ml I 0,00 --- 4,15 83,0 2 3,99 n.d.** n.d. n.d. 3 4,64 109,0 4,74 94,8 4 4,24 99,8 4,46 89,2 5 5, 05 118,8 5,06 101,2 * exprimé en pourcentage de la valeur théorique ** valeur théorique non disponible 4.3.4 Profil de densité des centrigugations en gradient de sucrose Les figures 3 à 16 montrent des profils de densité de sucrose isopycniques de 14 préparations d'amphotéricine B. Les microparticules obtenues dans les procédure 3 et 10 (figures 5 et 12 respectivement) donnent lieu à des profils de densité dans lesquels l'amphotéricine B est étroitement associé à la phosphatidylcholine dans une unique bande (1,131,15 g/ml). Les couches sont minces et sont nettement distantes du fond du tube. Le rapport molaire amphotéricine B/phospholipide et la densité de ces bandes uniques suggèrent que l'on a bien à faire à un complexe d'amphotéricine B/lipide. Les largeurs de couches de micro- particules et les rapports molaires amphotéricine B/phospholipides observés pour ces différentes procédures sont reportés au tableau 4 ci-après. Dans la procédure 1 (figure 3), l'amphotéricine a migré au fond du tube. Ce résultat indique que la centrifugation de gradient de- densité est utile pour distinguer des microparticules d'amphotéricine B/phospholipide d'agrégats d'amphotéricine B libre. Les microparticules obtenues selon la procédure 5 (figure 7), la procédure 6 (figure 8) et la procédure 14 (figure 16) ont montré une distribution de densité bimodale très proche. La grande majorité de l'amphotéricine B était située au fond du tube avec une partie du lipide. Les phospholipides restants flottaient sous forme de couche opalescente. Pour ces échantillons, il est difficile de démontrer la présence de microparticules. Les résultats obtenus avec des lécithines de soja et de soja hydrogénés (procédure 7, figure 9 et procédure 8, figure 10 respectivement) sont très proches de ceux observés avec les microparticules obtenues selon les procédures 3 et 10, mais les microparticules sont légèrement moins homogènes. Les microparticules ont été obtenues quand on a ajouté une quantité inférieure de NaCl 0,9 % (procédure 11, figure 13), quand la neutralisation intervenait avant l'addition de la solution aqueuse NaCl 0,9 % (procédure 13, figure 15) ou quand l'amphotéricine B était dissoute dans un milieu acide (procédure 14, figure 16). Tableau 4 Procédure Largeur de Rapport molaire AmphoB/ couche (cm) phospholipide ** 2 0,4 1,37 3 0,1 1,15 +0,04 (n =4) 6 0,6* 1,04 7 0,4* 0,87 8 0,8 0,99 9 0,1 0,97 1,3 0,97 I1l 0,8 0,74 12 0,4 0,87 13 0,3 0,82 14_ _ ___.1___ __ _ lI * mesuré après lyophilisation ** rapport calculé pour la fraction de gradient contenant la quantité la plus important de microparticules 5. Lyophilisation Les microparticules sont conservées sous forme lyophilisée. la reconstitution après lyophilisation de la suspension de microparticules en solution auqueuse conduit à des particules présentant les mêmes caracté- ristiques physicochimiques et biologiques qu'avant la lyophilisation. Afin de conserver l'intégrité des microparticules, la lyophili- sation doit se faire en présence de divers excipients tels que le glucose, le * lactose, tampon phosphate, tris, albumine, carboxyméthylcellulose. 6. Conclusions Les préparations les plus homogènes ont été obtenues suivant les procédures 3 et 10, c'est-à-dire dissolution de l'amphotéricine B à une concentration de 5 mg/ml en présence d'un équivalent de base, utilisation de phosphatidylcholine de jaune d'oeuf et addition de solution de NaCI 0,9 % ou de lactose 5% (1 ml pour 5 mg d'amphotéricine B) avant neutralisation du mélange. La préparation à base de lécithine de soja ou de lécithine de soja hydrogéné était légèrement moins homogène. Des microparticules ont aussi été préparées par neutralisation du mélange avant l'addition de la solution NaCl 0,9 % ou par dissolution de l'amphotéricine dans le méthanol en utilisant un équivalent de HCI. Selon cette dernière procédure, le mélange a été neutralisé avant ou après l'addition de la solution NaCI 0,9 %. Dans toutes ces préparations, les microparticules étaient moins homogènes comme le montre la centrifu- gation en gradient de sucrose. Aucune microparticule n'a été obtenue quand du chloroforme était utilisé pour préformer un film de lécithine de jaune d'oeuf ou pour dissoudre le phospholipide avant l'addition de la solution méthanolique basique d'amphotéricine B. EXEMPLE 2: Microparticules préparées avec d'autres solvants A) Utilisation du DMF 50 mg d'amphotéricine B sont dissous à 0 C dans 1 ml de diméthylformamfiide en présence d'un équivalent d'HCI dans le méthanol (47 pl d'une solution 0,87 M) 42,5 mg (1 équivalent) de phosphatidylcholine sont introduits dans la solution. La préparation est agitée jusqu'à complète dissolution, l'addition d'l ml d'eau entraîne la précipitation des micro- particules. La solution est neutralisée par addition d'l équivalent de NaOH. La diméthylformamide est éliminée en majorité par trois cycles de centrifugation-élimination du surnageant et resuspension en solution aqueuse. B) Utilisation du propane diol 1.2 1 g d'amphotéricine B est dissous dans 250 ml de propane diol 1.2 (4 mg/ml) en présence de I équivalent de KOH (10 ml d'une solution à 0,1 M de KOH dans l'éthanol). 850 mg de phosphatidylcholine en solution dans 3 ml d'éthanol sont introduits dans la solution; ceci correspond à un rapport molaire 1:1 entre l'amphotéricine B et la phosphatidylcholine. La solution est agitée à 800 tours/minute à température ambiante et neutralisée à l'aide de 10 ml de HCI 0,1 M (1 équivalent). 250 ml de H2 O sont ajoutés au mélange entraînant la précipitation des microparticules. L'élimination du propane diol 1.2 a été conduite par filtration tangentielle. C) Utilisation du diméthylacétamide (DMA) La solubilité de l'amphotéricine B dans le DMA (6 mg/ml) est suffisante pour éviter l'utilisation d'une base ou d'un acide. 300 mg d'amphotéricine B sont dissous dans 50 ml de DMA (6 mg/ml), 255 mg de lécithine d'oeuf dans l'éthanol (1 ml) sont ajoutés à la solution. Le mélange est agité à 1000 tours/minute et 75 ml d'eau sont ajoutés au mélange entraînant la précipitation des microparticules. Le DMA est éliminé par centrifugation vu l'incompatibilité des membranes de filtration avec le DMA. Centrifugation en gradient de sucrose La centrifugation sur gradient de sucrose montre pour les préparations obtenues dans la DMF, le propane diol 1.2 et le DMA, une bande située à mi-hauteur du tube et caractérisée par un rapport molaire - amphotéricine B/phospholipide compris entre 0,8 et 1,4. Aucune trace d'amphotéricine B libre ou phospholipide libre n'est observée. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de microparticules lipidiques d'aspect microcristallin d'une substance insoluble dans l'eau présentant une affinité pour les phospholipides, et d'au moins un phospholipide, microparticules stables en suspension dans une solution aqueuse, caractérisé en ce que: a) on dissout ladite substance et le ou lesdits phospholipides dans un solvant organique commun de ladite substance et du ou desdits phospholipides, b) on mélange la solution de ladite substance et du ou desdits phospho- lipides à une solution aqueuse dans une quantité telle qu'une insolubilisation sous forme de précipité se produit, c) on élimine le solvant pour récupérer une solution aqueuse contenant les microparticules sous forme de microsuspensions. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le rapport molaire entre le ou les phospholipides et ladite substance est inférieur à 2, de préférence compris entre 0,8 et 1,4. 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite substance est choisie parmi les agents antimycotiques, macrolides polyènes. 4. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ladite substance est choisie parmi la nystatine, l'amphotéricine B et leurs dérivés antifongiques. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le phospholipide est de la phosphatidylcholine ou une dimyristoylphosphatidylcholine. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le solvant organique de la solution de phospholipide et de ladite substance sont choisis parmi les solvants organiques de polarité intermédiaire tels que le méthanol, le DMF, le DMA ou le propylène glycol. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution aqueuse est de l'eau pure, une solution saline ou une solution de saccharide. 8. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la solution aqueuse est une solution de NaCI à 0,9 % en poids. 9. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la solution aqueuse est une solution de lactose de 1 à 10 % en poids, notamment 5 % en poids. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lorsque la substance présente une plus grande solubilité en solution organique quand elle est ionisée par un acide ou une base a) on dissout ladite substance et le ou lesdits phospholipides dans leur solvant organique commun en milieu basique ou acide, b) on mélange la solution obtenue avec une solution aqueuse pour obtenir un précipité, c) on neutralise la solution par addition d'acide ou de base respectivement, d) on élimine le solvant pour récupérer une phase aqueuse contenant les microparticules sous forme de microsuspensions. Il. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite substance est choisie parmi les agents antimycotiques, macrolides du type polyènes tels que l'amphotéricine B ou la nystatine et à l'étape a) est dissoute dans une solution méthanolique ou une solution de propylène glycol en milieu basique ou dans une solution de DMF en milieu acide, ou encore dans une solution de DMA en milieu neutre ou acide. 12. Procédé selon l'une des revendications 10 ou l, caractérisé en ce qu'à l'étape a) la quantité d'acide ou de base utilisée est de 1 à 1,5 équivalent d'acide ou de base par rapport à la quantité de substance active, et à l'étape c) on neutralise avec une même quantité de base ou d'acide respectivement. 13. Microparticule obtenue par un procédé selon l'une des revendications précédentes, constituée par ladite substance et le ou lesdits phospholipides dans un rapport molaire voisin de 1. 14. Préparation de microparticules obtenue par le procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement dépourvue en substance active libre et en phospholipide libre.