FR 2656867 A1 19910712 FR 9000147 A 19900109 La présente invention concerne un nouveau dérivé de la thymidine de formule générale: o R 1 -N CH 3 o | (I) HO) R 2 dans laquelle R 1 représente un radical amino et R 2 représente un radical azido ou un atome de fluor, ou bien R 1 représente un radical alcoylamino dont la partie alcoyle est éventuellement substituée par le reste d'un acide carboxylique, phosphonique ou arsonique ou un radical alcoylureido, guanidino, cyanamido, acylamido ou aminoacylamido, les radicaux et portions alcoyle et acyle citées cidessus étant droites ou ramifiées et contenant 1 à 4 atomes de carbone, et R 2 représente un radical azido, ainsi que ses sels, sa préparation et les compositions thérapeutiques qui les contiennent. La demande de brevet européen 196 185 a décrit l'azido-3 ' désoxy-3 ' thymidine qui manifeste une activité anti HIV. Le brevet belge 731 271 décrit la désoxy-3 ' fluoro-3 ' thymidine. Les nouveaux dérivés de la thymidine selon la présente invention sont de puissants agents anti-HIV et présentent de plus l'avantage considérable d'une moindre toxicité sur la moelle osseuse. Selon l'invention, les dérivés de la thymidine de formule générale (I) peuvent être préparés à partir d'un produit de formule générale: O HN CH 3 0 LN HO (II) R 2 dans laquelle R 2 est défini comme précédemment, par traitement de l'alcoolate correspondant par l'acide hydroxylamine 0-sulfonique en milieu basique ou par une O-aryl hydroxylamine ou une 0-arylsulfonyl hydroxylamine, suivi le cas échéant de la substitution du radical amino introduit sur la thymine. La réaction s'effectue généralement, à une température comprise entre O et 25 C Lorsque l'on utilise l'acide hydroxylamine 0-sulfonique, il est avantageux d'opérer en présence d'une base telle qu'un hydroxyde alcalin (potasse, soude) Lorsque l'on opère en présence d'une 0-aryl hydroxylamine ou une 0-arylsulfonyl hydroxylamine, ce réactif est avantageusement choisi parmi l'0-(dinitro-2,4 phényl) hydroxylamine, l'0- (diphénylphosphinyl) hydroxylamine lG BOSCHE, Tet Lett 25, 5399 ( 1982)l ou les réactifs cités par Y TAMURA et coll, Synthesis, ( 1977), 1. La subtitution du radical amino en position -3 s'effectue selon les méthodes habituelles qui n'altèrent pas le reste de la molécule. A titre d'exemple, lorsque R 1 est un radical alcoylamino éventuellement substitué, on fait agir le dérivé halogéné correspondant sur le dérivé de la thymidine de formule générale (I) pour lequel R 1 est un radical amino On opère généralement en présence d'un agent accepteur d'acide comme par exemple un hydroxyde de métal alcalin ou une base organique azotée, dans un solvant tel que par exemple le tétrahydrofuranne, le diméthylformamide ou un mélange de ces solvants, à une température comprise entre 20 C et la température de reflux du mélange réactionnel; lorsque R 1 est un radical acylamido ou aminoacylamido, on opère par acylation du dérivé de la thymidine de formule générale (I) pour lequel R 1 est un radical amino, au moyen de l'acide ou d'un dérivé réactif de l'acide (pour lequel, le cas échéant, le radical amino est préalablement protégé), en présence d'un accepteur d'acide tel qu'une base organique azotée dans un solvant tel que le diméthylformamide par exemple, à une température comprise entre O et C, ou bien en milieu hydroorganique en présence d'un agent alcalin de condensation comme un carbonate ou un bicarbonate de métal alcalin ou alcalino-terreux, à une température comprise entre et 20 C Le cas échéant, la protection du radical amino s'effectue selon les méthodes connues qui n'altèrent pas le reste de la molécule; Notamment on opère selon les méthodes décrites par T W. GREENE, protective groups in Organic Synthesis, A. Wiley-Interscience Publication ( 1981), ou par Mc OMIE, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum press ( 1973); lorsque R 1 est un radical alcoyluréido, on opère par action de l'isocyanate correspondant sur le dérivé de formule générale (I) pour lequel R 1 est amino, dans les conditions décrites par T S Hin et coll, J Med Chem, 29, 862 ( 1986). lorsque R 1 est un radical cyanamido, on opère par action du bromure de cyanogène sur le dérivé de formule générale (I) pour lequel R 1 est amino, puis, lorsque l'on veut obtenir un produit pour lequel R 1 est un radical guanidino, transforme le produit obtenu par addition d'ammoniac selon la méthode décrite par F C SCHAEFER et A.P KRAPCHO, J Org Chem, 27, 1255 ( 1962). La préparation du dérivé de la thymidine de formule générale (II) pour lequel R 2 est un radical azido a été décrite dans la demande de brevet européen 196 185 La préparation du dérivé de la thymidine de formule générale (II) pour lequel R 2 est un atome de fluor a été décrite dans le brevet belge 731 271. Le nouveau produit de formule générale (I) selon l'invention peut être purifié le cas échéant, par des méthodes physiques telles que la cristallisation ou la chromatographie. Le nouveau dérivé de la thymidine de formule générale (I) peut être transformé en sel d'addition avec un acide selon les méthodes connues en soi Ces sels peuvent être obtenus par action d'un acide dans un solvant approprié, ou par réaction d'échange avec un autre sel Le sel formé précipite après concentration éventuelle de sa solution, il est séparé par filtration, décantation ou lyophilisation. Le nouveau dérivé de la thymidine de formule générale (I) est particulièrement utile pour la prophylaxie et le traitement thérapeutique du SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise) et de syndromes associés lARC (AIDS related complex)l Par propylaxie nous sous entendons le traitement des sujets qui ont été exposés aux virus HI Vs (Human Immunodeficiency Virus), en particulier les séropositifs asymptomatiques, qui présentent le risque de développer la maladie dans les mois et les années à venir après la primoinfection. Les produits selon l'invention inhibent la multiplication du virus HIV en cultures cellulaires à des concentrations dépourvues d'effet cytotoxiques ou cytostatique. Dans ce qui suit on décrit les résultats sur l'effet cytopathogène et la multiplication du virus HIV dans une lignée cellulaire permissive (cellules lymphoblastoïdes humaines CEM). Le test est réalisé sur la lignée lymphoblastoïde CEM clone 13 Dans une microplaque de 96 puits on dépose 25 pl/puit d'une solution de produit à tester ou de tampon phosphate isotonique (TPI) dans le cas des contrôles Les produits sont étudiés à différentes concentrations (souvent 8), à raison de 4 puits par concentration On ajoute alors 125 pl d'une suspension de cellules CEM dans le milieu RPMI contenant 10 % de sérum de veau foetal, U/ml de pénicilline, 40 pg/ml de streptomycine et 5 lig/ml de polybrène ( 3500 cellules par puit) et les microplaques sont incubées une heure à 37 C, sous une atmosphère contenant 5 % de gaz carbonique L'essai est fait en double: une partie sur cellules infectées, pour la détermination de l'activité antivirale et l'autre partie sur cellules non infectées, pour déterminer la cytotoxité des produits On infecte la première série avec HIV ( 100 pl par puit d'une suspension de virus LAV-1BRU contenant 200-300 TCID 50) tandis que l'autre série reçoit 100 -gl de milieu RPMI tel que défini précédemment Après 7 jours d'incubation, 175 pl de surnageant sont prélevés et seront utilisés par la suite pour le dosage de la reverse transcriptase La viabilité cellulaire est déterminée selon une modification de la technique décrite par R PAUWELS et coll, J. Virol Meth, 20, 309-321 ( 1988). Les puits, contenant encore les cellules (infectées ou non infectées), reçoivent 10 pl d'une solution de MTT (méthylthiazole- tétrazolium) à 5 mg/ml dans du tampon phosphate isotonique Pendant une période d'incubation de 4 heures, le MTT est converti en un sel de formazan (bleu) à l'intérieur des cellules vivantes et proportionnellement à leur nombre, alors que rien n'apparaît dans les puits ne contenant plus que des cellules mortes On ajoute alors 120 pl d'isopropanol (contenant 0,04 mole/l d'acide chlorhydrique) et les microplaques sont agitées jusqu'à la solubilisation du bleu de formazan L'absorption à 540 nm est lue avec un lecteur automatique de réactions ELISA en microplaques. Dans ces conditions les cellules infectées sont lysées à environ 60-70 % par rapport aux cellules non infectées On établit la concentration du produit qui inhibe l'effet cytopathogène du virus de 50 % (CE 50) On détermine également celle qui inhibe de 50 % la croissance des cellules non infectées (CC 50) Le rapport entre CC 50 et CE 50 est défini comme l'indice de sélectivité antivirale i. Les résultats figurent dans le tableau I ci-après et sont illustrés dans la figure 1 qui donne la CC 50 et la CE 50 dans le cas du produit de l'exemple 1. Il ressort de ces essais que les inhibitions du virus HIV sont exercées à des concentrations dépourvues de toute toxicité sur cellules saines (non infectées). TABLEAU 1 Produit Concentrations Cellules infectées cellules non infectées pg/ml densité optique densité optique DO 600 DO 600 Exemple 1 O 0 293 0 954 0.0003 0 311 0 935 0.001 0 359 0 888 0.003 0 456 0 882 0.01 0 565 0 884 0.03 0 577 0 901 0.1 0 596 0 928 0.3 0 838 0 931 1 0 926 0 909 3 0 865 0 892 0 441 0 368 0 007 0 004 Dans le cas du produit de l'exemple 1, la CC 50 et 10 pg/ml et la CE 50 est 0,01 pg/ml. L'indice de sélectivité est i = CC 50/CE 50 = 1000. La multiplication virale a été déterminée par dosage de la réserve transcriptase du virus HIV. L'activité de la transcriptase inverse est mesurée directement sur 50 4 l de surnageant de culture 10 11 de tampon contenant 0,5 M de K Cl, 5 m M de dithiotreitol (DTT) et 0,5 % de triton X-100 sont ajoutés à tous les micropuits contenant les 50 41 de surnageant à tester 40 11 de tampon contenant les 1,25 m M d'éthylène glycol-bis(B-aminoéthyl éther) (EGTA), 0,125 m M de Tris H Cl p H 7,8, 12,5 m M de Mg C 12, 3 p Ci de ( 3 H) thymidine triphosphate (TTP), 0,05 D 0260 d'acide polyadénylique acide thymidylique (poly r A-oligo d T) sont ajoutés ensuite La microplaque est couverte au moyen d'un film plastique et incubée 60 minutes à 37 C. On arrête la réaction en ajoutant 20 11 d'une solution glacée de 120 m M de Na 4 P 207 dans 60 % d'acide trichloracétique et les échantillons sont placés 15 minutes sur le lit de glace. Les précipités sont filtrés sur fibres de verre en utilisant un laveur de cellules (Skatron) et les filtres sont lavés avec une solution de 12 m M de Na 4 P 207 dans 5 % d'acide trichloracétique. Les filtres sont séchés et la radioactivité est comptée après ajout d'un liquide scintillant. Le produit de l'exemple 1 donne 80 % d'inhibition à 0,1 pg/cm 3 l 44558 coups par minute (cpm) par rapport à 204363 cpm dans le cas de cultures infectées non traitéesl. Enfin, les produits selon l'invention manifestent un intérêt considérable du fait de leur absence de toxicité à des concentrations élevées à l'égard des précurseurs hématopoietiques de la moelle humaine. Il est en effet connu que l'un des problèmes majeurs associés au traitement par certains produits de cette classe, est la toxicité sur les précurseurs erythrocytaires et granulocytaires/ macrophagiques de la moelle osseuse, qui se traduit du point de vue clinique dans des sévères anémies et leucopénies lD D RICHMAN et al., N Engl J Med, 317, 192-197, ( 1987) R YARCHOAN et al, Lancet i, 575-580, ( 1986)l Cette toxicité peut être mise en évidence au niveau du laboratoire par des tests in vitro, sur des précurseurs erythrocytaires et granulocytaires/macrophagiques de la moelle osseuse (J P SOMMADOSSI et R CARLISLE, Antimicro Ag. Chemother, 31, 452-454, ( 1987) L'étude est mise en oeuvre dans les techniques de D THIERRY et al, Acta Radiol, 24, 521-526, ( 1985) et D METCALF, Hematopoietic Colony Stimulating factors, p 88-89, Elsevier ( 1984). Dans le test CFU-G/M, la concentration inhibitrice de 50 % de la formation des clones est de 30 pg/ml Dans le test BFU-E, le produit de l'exemple 1 s'est montré dépourvu de toxicité à des concentrations élevées ( 108 ig/ml). Le produit selon l'invention peut être utilisé à l'état libre ou à l'état de sel pharmaceutiquement acceptable Par exemple à l'état de sel d'addition avec les acides minéraux tels que chlohydrate, bromhydrate, sulfate, nitrate, phosphate, ou organiques tel que acétate, propionate, succinate, maléate, fumarate, méthanesulfonate, p toluènesulfonate, iséthionate ou dérivés de substitution de ces composés. Les exemples suivants illustrent la présente invention. EXEMPLE 1 A 60 mg d'azido-3 ' désoxy-3 ' thymidine ( 0,22 mmol) dissous dans le méthanol ( 2 cm 3) on additionne à température ambiante 0,31 cm 3 d'une solution de méthanolate de sodium dans le méthanol ( 0,8 N: 0,24 mmol) et on laisse agiter pendant 12 heures Le méthanol est évaporé et le solide dissous dans le diméthylformamide (préalablement séché sur tamis moléculaire et distillé) et on ajoute à température ambiante l'O-(dinitro2,4) phényl hydroxylamine ( 52 mg; 0,26 mmol) préparé selon le protocole décrit par Sheradsky lJ Het Chem, 4, 413 ( 1967)l Après une heure d'agitation à température ambiante le diméthylformamide est évaporé sans chauffer. Le mélange réactionnel est adsorbé sur alumine et chromatographié sur colonne d'alumine (alumine 90 Merck 1093; 70-230 Mesh) par un gradient hexane/acétate d'éthyle puis par un mélange acétate d'éthyle/ méthanol 8/1 en volumes On isole 54 mg d'azido-3 ' amino-3 désoxy-3 ' thymidine (Rdt = 85 %) fondant à 75 C après 2 recristallisations successives dans l'acétate d'éthyle progressivement saturé en hexane puis dans l'éthanol progressivement saturé à l'éther éthylique. SPECTRE DE RMN DU PROTON ( 400 M Hz, chloroforme) 1,95 (s, 3 H, CH 3 en 5); 2,40 (m, 1 H, H-2 a', J 2 a'-l' = 6; J 2 b'-l' = 6); 2,60 (m, 1 H, H2 b'); 3,80 (d, 1 H, H-5 a', J 5 a'-5 b' = 10); 3,95 (m, 2 H, H-5 b'& H-4 '); 4,40 (m, 1 H, H-3 '); 6,10 (t, 1 H, H-1 '); 7,25 (s, 1 H, H en 6). Spectre infra rouge (CH 2 C 12), bandes caractérisques en cm-1: 1480, 1680-1730, 2150, 3300. EXEMPLE 2 A 60 cm 3 d'une solution aqueuse d'azido-3 ' désoxy-3 ' thymidine ( 800 mg; 3 mmol) et d'hydroxyde de potassium ( 400 mg; 7,1 mmol) à O C, on additionne l'acide hydroxylamine-0-sulfonique ( 500 mg; 4,1 mmol) en solution dans l'eau ( 2 cm 3) et le mélange est maintenu à 80 C pendant 2 heures à l'abri de la lumière On ajoute successivement de l'hydroxyde de potassium ( 400 mg) et de l'acide hydroxylamine-0-sulfonique ( 500 mg) et on laisse réagir dans ces mêmes conditions pendant encore 2 heures L'addition des deux réactifs précédemment cités est répétée encore quatre fois sur une période de 8 heures La réaction bien qu'incomplète est stoppée en neutralisant à O C avec une solution d'acide chlorhydrique 0, 1 N La solution est alors saturée en chlorure de sodium et l'on extrait à l'acétate d'éthyle Après chromatographie sur colonne de gel de silice (MERCK 9385; 230-400 Mesh) en éluant par l'acétate d'éthyle, on isole 440 mg d'azido-3 ' amino-3 désoxy-3 ' thymidine (R % = 52 %) dont les caractérisques sont identiques à celles du produit obtenu à l'exemple 1. La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques qui contiennent comme produit actif au moins un produit de formule générale (I) à l'état pur (sous forme libre ou sous forme de sel), ou sous forme d'une association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables Ces compositions peuvent être utilisées par voie parentérale ou orale. Les compositions stériles pour administrations parentérale peuvent être de préférence des solutions aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions Comme solvant ou véhicule, on peut employer l'eau, le propylèneglycol, un polyéthylèneglycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, des esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle ou d'autres solvants organiques convenables Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, en particulier des agents mouillants, isotonisants, émulsifiants, dispersants et stabilisants La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple par filtration aseptisante, en incorporant à la composition des agents stérilisants, par irradiation ou par chauffage Elles peuvent également être préparées sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans un milieu stérile injectable. Comme composition solides pour l'administration orale peuvent être utilisés des comprimés, des pilules, des poudres ou des granulés Dans ces compositions, le produit actif selon l'invention (éventuellement associé à un autre produit pharmaceutiquement compatible) est mélangé à un ou plusieurs diluants ou adjuvants inertes, tels que saccharose, lactose ou amidon Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple un lubrifinat tel que le stéarate de magnésium. Comme compositions liquides pour l'administration orale, on peut utiliser des émulsions pharmaceutiquement acceptables, des solutions, des suspensions, des sirops et des élixirs contenant des diluants inertes tels que l'eau ou l'huile de paraffine Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édulcorants ou aromatisants. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont capables d'inhiber la réplication du virus HIV et donc de réduire la progression vers le SIDA ou de diminuer sa gravité chez les sujets déjà infectés. D'une manière générale, le médecin déterminera la posologie qu'il estime la plus appropriée en fonction de l'âge, du poids et des facteurs propres au produit et au sujet à traiter. Généralement les doses sont comprises entre 0,5 et 2,5 g par jour, par voie orale. Les exemples suivants illustrent des compositions contenant des produits de formule générale (I). EXEMPLE A On prépare des flacons de poudre stérile destinée à une administration par voie intra-veineuse et des ampoules de solvant, en effectuant la répartition suivante: facon de poudre stérile: azido-3 ' amino-3 désoxy-3 ' thymidine 200 mg ampoule de solvant: eau pour préparation injectable 5 ml EXEMPLE B On prépare des gélules destinées à une administration par voie orale ayant la composition suivante: azido-3 ' amino-3 désoxy-3 ' thymidine 200 mg Excipient: Amidon Stéarate de magnésium Cellulose microcristalline Glycolate d'amidon sodique REVENDICATIONS I Un nouveau dérivé de la thymidine caractérisé en qu'il répond à la formule générale R 1-N CH 3 04 N HO R 2 dans laquelle R 1 représente un radical amino et, R 2 représente un radical azido ou un atome de fluor, ou bien R 1 représente un radical alcoylamino dont la partie alcoyle est éventuellement substituée par le reste d'un acide carboxylique, phosphonique ou arsonique ou représente un radical alcoylureido, guanidino, cyanamido, acylamido ou aminoacylamido, les radicaux et portions alcoyle et acyle citées ci-dessus étant droites ou ramifiées et contenant 1 à 4 atomes de carbone, et R 2 représente un radical azido, ainsi que ses sels d'addition avec les acides. 2 Un procédé de préparation d'un dérivé de la thymidine selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait agir l'acide hydroxylamine 0-sulfonique en milieu basique ou une 0-aryl hydroxylamine ou une 0-arylsulfonyl hydroxylamine sur l'alcoolate d'un produit de formule générale: HN/ CH 3 04 X N HO Ho R 2 dans laquelle R 2 est défini comme dans la revendication 1, puis transforme éventuellement le radical amino introduit sur la thymidine en un radical alcoylamino éventuellement substitué, alcoylureido, guanidino, cyanamido, acylamido ou aminoacylamido, par toute méthode connue qui n'altère pas le reste de la molécule, et transforme éventuellement le produit obtenu en un sel. 3 Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un produit selon la revendication 1, l'état pur ou sous forme d'une association avec tout diluant ou adjuvant compatible et pharmaceutiquement acceptable.