FR 2658418 A1 19910823 FR 9001999 A 19900220 i La présente invention a pour objet des compositions phar- maceutiques à base de phospholipides. L'intégrité de l'épithélium de la muqueuse respiratoire dépend d'un équilibre entre les facteurs d'agression et les mécanismes de défense dont elle dispose La première ligne de défense de l'arbre trachéo- bronchique est représentée par le mucus qui forme à la surface des cellules épithéliales respi- ratoires un film protecteur mobilisé en permanence par l'ac- tivité ciliaire. Au cours des phénomènes inflammatoires bronchiques, aigus ou chroniques, l'hypersécrétion de mucus s'accompagne drune modification de ses propriétés rhéologiques avec un accrois- sement de la viscosité et de l'adhérence Ces anomalies se traduisent par une diminution de l'épuration muco-ciliaire et une stase du mucus avec obstruction bronchique Le transport du mucus par la toux peut alors suppléer la déficience de la clairance muco-ciliaire Il est donc très important de pré- server l'efficacité de cette toux qui dépend non seulement des propriétés de viscosité et de visco-élasticité du mucus, mais qui peut être également largement influencée par les propriétés interfaciales entre le mucus et la muqueuse respi- ratoire. Jusqu'à présent, les thérapeutiques visant à corriger l'hy- persiécrétion du mucus et ses anomalies se sont toutes déve- loppées en partant du concept de base que le traitement de l'hypersécrétion devait avant tout porter sur la modification de la viscosité du mucus considérée comme seul facteur physi- que à l'origine de la stase du mucus et de l'obstruction bronchique Ce concept a donné naissance à la mise au point de nombreuses molécules à activité mucolytique agissant in vi tro ou in vivo et ayant pour but de normaliser l'hypervis- cosité du mucus. En fait, au cours des infections bronchiques aiguës et/ou bronchiques, les sécrétions adhèrent fortement à la muqueuse et leur élimination par l'activité ciliaire, et plus encore par la toux, ne peut être que difficilement améliorée par la simple prescription d'une thérapeutique mucolytique En effet, ces mucolytiques, qu'ils soient actifs in vivo ou in vitro, n'interviennent que sur la structure fibrillaire de la phase gel du mucus et n'ont aucune activité au niveau des propriétés tensio- actives du mucus. Le mucus possède des constituants naturels biochimiques parmi lesquels figurent les phospholipides qui sont susceptibles de modifier les propriétés interfaciales mucus-muqueuse. Il a été démontré dans de nombreuses études, en particulier dans le syndrome de détresse respiratoire aigu du nouveau-né, qu'un poumon immature pauvre en surfactant, c'est-à-dire en matériel tensio-actif, pouvait être rendu fonctionnel par la simple injection de surfactant artificiel ou naturel Un grand nombre d'études ont également montré la présence de phospholipides, en particulier de phosphatidylcholine, dans le mucus respiratoire et les expectorations, aussi bien chez les sujets sains que chez les sujets atteints de maladies respiratoires avec hypersécrétion. Les phospholipides, incluant les phospholipides à proriétés tensioactives, se sont vus attribuer un rôle de stabilisant des petites voies aériennes On leur a également attribué, en tant qu'agents tensio-actifs présents à l'interface phase sol-phase gel du mucus et grâce à leur propriétés hydropho- bes, un rôle de régulation du contenu en eau de la phase sol. Par contre, malgré les hypothèses émises, aucun travail n'a montré jusqu'à maintenant, comment par leur présence à l'in- terface phase sol-phase gel du mucus, ces phospholipides pouvaient effectivement jouer un rôle protecteur de la mu- queuse respiratoire et un rôle lubrifiant dans le transport de la phase gel sur la phase sol par le tapis ciliaire ou par le mécanisme de la toux. En pathologie bronchique comme la mucoviscidose, des travaux antérieurs ont permis de montrer que dans les expectorations, certaines fractions lipidiques étaient augmentées et si- gnificativement corrélées à la viscosité (cholestérol, glyco- sphingolipides, sphingomyéline) et pourraient donc être considérées comme des facteurs "rigidifiants" A l'opposé, il a été montré que certaines fractions phospholipidiques, comme le phosphatidylglycérol, étaient au contraire négativement corrélées à la viscosité Il apparaissait que le phosphati- dylglycérol, bien que retrouvé en faible quantité dans les sécrétions bronchiques ( 10 % des phospholipides totaux), était susceptible de faciliter le transport du mucus par le mouvement des cils de la muqueuse respiratoire ou par le phénomène de la toux en modifiant les propriétés visco-élas- tiques du mucus (référence: Galabert et al, Clin Chim. Acta, 1987, 164: 139-149). Les Demanderesses ont étudié le rôle des différentes frac- tions phospholipidiques, connues au niveau alvéolaire pour abaisser la tension de surface, dans les modifications des propriétés tensio-actives du mucus au niveau des voies aériennes Les travaux ont débuté par une étude chez des patients atteints de mucoviscidose et de bronchopathies chroniques obstructives, chez lesquels ont été mesurés en parallèle le contenu en fractions phospholipidiques des expectorations et les propriétés de surface des fractions phospholipidiques Le lien entre les données biochimiques et les propriétés physiques des expectorations étudiées a été analysé. Le recueil des expectorations est fait en évitant toute contamination salivaire Les patients sont répartis en deux groupes composés de dix-huit mucoviscidosiques et de seize hypersécrétants bronchitiques chroniques avec obstruction. Les lipides ont été séparés et identifiés par des techniques classiques; pour cela, les expectorations sont immédiatement congelées, puis lyophilisées: l'extraction des lipides se fait à partir du matériel lyophilisé. L'extraction quantitative des lipides est effectuée suivant la méthode de Bligh E G and Dyer W J: A rapid method of total lipid extraction and purification Can J Biochem. Physiol, 1959, 37, 911-917: 100 mg de matériel lyophilisé sont réhydratés dans 1 ml d'eau distillée Les lipides sont alors extraits par un mélange chloroforme/méthanol (lv/2 v), puis dans un deuxième mélange chloroforme/méthanol ( 1 v/lv). Après addition d'eau, la phase chloroformique est séparée. Trois extractions complémentaires par addition de 2,5 ml de chloroforme sont ensuite effectuées Les différentes phases chloroformiques sont alors réunies, évaporées à sec sous azote et P 205, puis pesées avant d'être remises en solution dans du chloroforme. Les phospholipides totaux et les fractions phospholipidiques séparées par chromatographie en couche mince bidimensionnelle ont été dosés par la méthode de Rouser et al (Lipids, 1970, , 494-496) dont le principe est le microdosage du phosphore après minéralisation des phospholipides par l'acide perchlo- rique et séparation par chromatographie en couche mince bidi- mensionnelle. A partir du dosage des phospholipides dans ces sécrétions, il a été montré que les phospholipides totaux étaient significa- tivement plus élevés dans la mucoviscidose que dans les bronchopathies chroniques obstructives (respectivement 4,40 % contre 2,96 % de poids sec du mucus (p I) Les pourcentages relatifs de sphingomyéline et de phos- phatidylsérine + phosphatidylinositol sont signficativement plus élevés (p bronchopathies chroniques obstructives (Tableau I). TABLEAU I pourcentage des principales fractions phospholipidiques par rapport aux phospholipides totaux PG PC SM PS+Pl Mucoviscidose 4,41 36,32 22,24 15,10 Bronchopathies 7,48 46,47 12,44 11,76 PC: phosphatidylcholine; PG: phosphatidylglycérol; SM: sphingomyéline; PS+Pl: phosphatidylsérine + phosphati- dylinositol. Dans le cas de la mucoviscidose, o les sécrétions sont très adhérentes et très visqueuses, on trouve moins de fractions tensioactives (phosphatidylcholine, phosphatidylglycérol) et plus de fractions "rigidifiantes" (sphingomyéline) dans les expectorations que dans les autres bronchopathies. Une étude physique de ces sécrétions a été effectuée en parallèle La propriété physique choisie est la mouillabilité des sécrétions qui renseigne sur la capacité d'une sécrétion à mouiller une surface La mouillabilité est évaluée par un paramètre physique appelé angle de contact L'angle de con- tact peut être défini comme l'angle existant entre la tan- gente à une goutte de liquide déposée sur un support solide (à l'interface liquide-air) et la surface du solide (à l'in- terface solide-liquide) au point triple Tp (Fig 1). L'angle de contact est dépendant du solide, de la nature du liquide et de l'interaction entre eux Dans cette étude, nous avons étudié le comportement des sécrétions bronchiques lorsqu'elles sont mises en contact avec un support qui simule la muqueuse bronchique L'angle de contact est un index de mouillabilité qui renseigne sur les propriétés tensio-actives du liquide pour un solide donné: plus l'angle de contact est grand, moins le liquide s'étale et moins il est mouillant. Une technique de mesure automatique de l'angle de contact basée sur le traitement d'image associé à un traitement informatique a été développée Dans les mesures de mouil- labilité des sécrétions, il a été choisi de mesurer l'angle de contact d'une goutte calibrée ( 5 pil) de sécrétion mise en contact avec un support de verre parfaitement propre, chargé électronégativement et placé dans une enceinte saturée en vapeur d'eau pour éviter les phénomènes de déshydratation. (référence: S Girod et al I T B M, 1988, 9 402 = 412). Le phosphatidylglycérol apparaît comme un phospholipide important contrôlant la mouillabilité des sécrétions bronchi- ques et susceptibles d'influencer leur transport et leur comportement lorsqu'elles sont en contact avec la muqueuse. Les Demanderesses ont donc étudié l'influence de différents phospholipides sur les propriétés de mouillabilité du mucus respiratoire et sur sa capacité à être mobilisé et transporté par le mécanisme de la toux Une expérimentation visant à étudier l'effet in vitro de différentes fractions phospholi- pidiques sur la mouillabilité et le transport par la toux de mucus considérés comme "normaux" a donc été mise en oeuvre. Les mucus sont prélevés sur la muqueuse du palais de gre- nouille considérée comme un bon modèle représentatif de la muqueuse respiratoire humaine La mouillabilité de ces mucus est mesurée comme il a été décrit précédemment La clairance par la toux de ces mucus a été mesurée à l'aide d'une machine à tousser Le principe de cette machine est le suivant: le support sur lequel la goutte de mucus est déposée est placé comme plancher d'un tube en plexiglas qui simule la trachée. Ce tube en plexiglas d'une section rectangulaire ( 20 mm x 10 mm) est connecté à une enceinte fermée par une électrovanne. La pression dans l'enceinte est amenée à 0,6 bar, puis l'é- lectrovanne est ouverte et le débit d'air que subit la goutte est de 6 lis On mesure le déplacement de la goutte sur le support sous l'influence du courant d'air ainsi provoqué qui simule le mécanisme de la toux. Les supports utilisés sont soit des lames de verre simples, soit des lames de verre recouvertes d'une monocouche de phospholipides grâce à une balance à film de Langmuir: 10 mg de chaque fraction phospholipidique sont dissous dans un mélange chloroforme/méthanol ( 9:1) et 16 il de cette solution sont déposés dans la cuve de la balance à film remplie d'eau tridistillée Une barrière de téflon comprime le film phos- pholipidique jusqu'à la pression de collapse propre à chaque phospholipide, o toutes les molécules de phospholipide sont en contact sans trou dans la monocouche Le support de verre préalablement immergé dans la cuve est ensuite retiré à une vitesse constante et, parallèlement, la barrière de téflon avance de façon à maintenir également constante la tension de surface du film ainsi prélevé; le support de verre ainsi obtenu présente en surface une monocouche orientée de phos- pholipides accrochés par leur tête polaire au verre et ex- posant à l'air leurs groupements apolaires (en contact avec le mucus). Les phospholipides choisis pour cette étude sont le phospha- tidylglycérol (di C 18:1) (Sigma 9399) et le phosphatidylglycé- rol (di C 18:0) (Sigma 9524): les deux fractions ont donc la même tête polaire, la même longueur de chaînes apolaires mais des degrés de saturation différents On garde comme témoins des lames de verre non recouvertes de phospholipides. Il ressort que le phosphatidylglycérol (di C 18:0) améliore significativement la clairance par la toux du mucus de gre- nouille et diminue significativement sa mouillabilité, en comparaison avec les lames de verre non recouvertes (p phosphatidylglycérol (di C 18:1) (p Le phosphatidylglycérol (di C 18:0) semble être la fraction phospholipidique qui en diminuant les propriétés d'adhésion du mucus en améliore sa clairance par la toux (la fraction la plus lubrifiante). La phosphatidylcholine sous forme de dipalmitoyl-phosphati- dyl-choline (di C 16:0) a également été étudiée sur la mouil- labilité et la capacité de transport par la toux. Compte tenu de ces études, les Demanderesses revendiquent des compositions pharmaceutiques contenant, un ou plusieurs phospholipides, seul(s) ou en association avec des excipients appropriés. Le ou les phospholipides) peuvent être choisis parmi les phosphatidylcholines, les phosphatidylglycérols et les acides phosphatidiques. Les phospholipides cités ci-dessus contiennent de préférence, comme radicaux acyles, les radicaux saturés palmitoyle C 16:0 et stéaroyle C 18:0 et/ou les radicaux insaturés oléoyles C 18 1 et C 18:2- Les radicaux acyles des phospholipides peuvent éventuellement contenir plusieurs doubles liaisons. Les phospholipides utilisés selon l'invention peuvent con- tenir des radicaux acyles identiques ou différents, saturés ou non. Les phospholipides utilisés dans les compositions de l'inven- tion contiennent tout particulièrement deux radicaux acyles saturés identiques. Les phospholipides peuvent être utilisés seuls ou, de préfé- rence, en mélange entre eux dans des proportions variables. Les compositions de l'invention peuvent être présentées sous la forme de suspensions micellaires ou sous la forme de suspensions de liposomes Elles peuvent être administrées par voie orale ou par voie aérienne, par exemple par inhalation (sous la forme d'aérosols) ou par instillation. Les compositions de l'invention sont préparées à l'aide des excipients appropriés à leurs formes d'administration. Les compositions de l'invention peuvent également contenir des agents thérapeutiques connus par leur activité dans le domaine des maladies bronchopulmonaires, tels que des an- tibiotiques, des antiinfectieux ou des antioxydants (dérivés de cystéine, a-tocopherol). Les compositions de l'invention sont utilisées pour le trai- tement des maladies bronchopulmonaires. Revendications 1 Compositon pharmaceutique à base de phospholipides utile pour le traitement de l'obstruction des voies aériennes, composition caractérisée en ce qu'elle contient, seul ou en association, un ou plusieurs phospholipides, tels que les phosphatidylcholines, les phosphatidylglycérols, ou les acides phosphatidiques. 2 Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle contient la dipalmitoyl- phosphatidylcholine. 3 Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle contient le phosphatidylgly- cérol di C 180. 18:0 ' 4 Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle contient le phosphatidylgly- cérol di C 18:1. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait qu'elle est présentée sous la forme de suspension micellaire. 6 Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait qu'elle est présentée sous la forme de suspension de liposomes.