FR 2648463 A1 19901221 FR 8907857 A 19890614 La présente invention est relative & de nou- veaux polysaccharides sulfatés, obtenus par lyse ménagée des fucanes extraits des Phéophycées (algues brunes), à leur procédé d'obtention, ainsi qu'à un nouvel agent anti- coagulant et un nouvel agent anticomplémentaire. Le médicament anticoagulant le plus utilisé ac- tuellement est l'héparine, qui est un polysaccharide sul- faté constitué d'unités glucosamine et acide glucuronique 0lo liées en 1-4, dans lesquelles les groupes sulfate sont pré- sents sur la fonction amine de la glucosamine, et/ou sur des fonctions alcool de la glucosamine et de l'acide uro- nique. L'héparine agit sur la coagulation en potentialisant l'action anticoagulante de deux inhibiteurs plasmatiques. Le premier qui est l'antithrombine III (AT III) agit à la fois sur la thrombine et (également connue sous le nom de facteur IIa) et sur le facteur X activé (ou facteur Xa); le second, appelé deuxième cofacteur de l'héparine (HC II), agit sur le facteur IIa, et non sur le facteur Xa. Les hé- parines de bas poids moléculaire, obtenues par dépolymé- risation, sont principalement utilisées dans la prévention des thromboses; elles potentialisent surtout l'activité inhibitrice de l'AT III vis-à- vis du facteur Xa, et sont faiblement actives vis-à-vis du facteur IIa. L'héparine est également connue pour ses pro- priétés anticomplémentaires; elle agit comme inhibiteur de l'activation du complément par son interaction avec la C3 convertase. Il a été montré que cette activité anti- complémentaire de l'héparine est totalement indépendante de son activité antithrombique et qu'elle est liée à la pré- sence sur la fonction amine d'un groupe sulfate ou acétyle, contrairement à l'activité anticoagulante qui n'est pas ob- servée si le substituant de la fonction amine n'est pas un groupe sulfate. Il apparaît également que la présence d'un groupe sulfate sur une des fonctions alcool de l'acide uro- nique joue un rôle important dans l'activité anticomplémen- taire [KAZATCHINE et al.; J. Clin. Invest.; 67, (1981)]. D'autres polysaccharides sont également connus pour leurs propriétés anticoagulantes; il s'agit des der- matanes sulfates qui agissent en inhibant la thrombine, par la potentialisation de l'effet inhibiteur du cofacteur HC II; en revanche ils n'agissent pas par l'intermédiaire du cofacteur AT III, et sont sans effet sur le facteur Xa. Le pentosane polysulfate, largement utilisé dans la préven- tion des thromboses, agit également en catalysant o10 l'inhibition de la thrombine par l'HC II. En revanche ces polysaccharides ne présentent pas d'activité anticomplémentaire comparable & celle de l'héparine; KAZATCHINE et al. ont montré, dans la publica- tion citée plus haut, que le dermatane sulfate, dans lequel la fonction amine de la galactosamine est acétylée mais dont les fonctions alcool de l'acide uronique ne sont pas sulfatées, est, sur ce plan, quatorze fois moins actif que l'héparine. Les fucanes sont des polysaccharides sulfatés, de poids moléculaire élevé (100 à 800 kDa), extraits des thalles d'algues brunes. Ce sont des polymères d'a 1,2-L- fucose-4-sulfate pouvant contenir également du D-xylose, du D-galactose et des acides uroniques. Les acides uroniques des fucanes ne sont pas sulfatés, contrairement à ceux de l'héparine. En outre, les fucanes diffèrent à la fois de l'héparine et du dermatane sulfate, en ce qu'ils ne contiennent pas d'amino-sucres. Les propriétés anticoagulantes des fucanes ont été démontrées dès 1957 par SPRINGER et al. et confirmées depuis lors par de nombreux auteurs IbERNARDI et SPRINGER the Journal of Biological Chemistry; 237.1 (1962j, ZHORI et al.; Marine Algae in Pharmaceutical Science; 2; 19827. Une étude réalisée par les inventeurs, sur le mécanisme de l'action anticoagulante des fucanes, montre que les fucanes agissent exclusivement sur la thrombine (facteur IIa), et ce principalement en potentialisant l'effet de l'inhibiteur HCII (à mime concentration que l'héparine), et celui de l'antithrombine III (à des concentrations 30 fois supérieures & celles de l'héparine). En revanche, les fucanes n'ont, contrairement à l'héparine, aucune activité anti Xa, Des observations similaires ont été faites par d'autres auteurs tCHURCH et al. The Journal of Biological Chemistry; 264.6 (1989)3. Les fucanes pourraient donc constituer une nou- velle catégorie de médicaments anticoagulants originaux car ils potentialisent l'activité inhibitrice de l'HC II, et également celle de l'AT III vis-à-vis de la thrombine, contrairement au dermatane sulfate qui potentialise exclu- sivement l'activité inhibitrice de l'HC II. En revanche, les fucanes, comme le dermatane sulfate et contrairement à l'héparine, n'ont aucun effet sur l'inhibition du facteur Xa; ils sont des inhibiteurs exclusifs de la thrombine. Or, il semble de plus en plus probable que même les médica- ments à activité anti-Xa élevée, comme les héparines de bas poids moléculaire, exercent essentiellement leur action dans la prévention des thromboses, par leur faible activité anti-IIa résiduelle. Les Inventeurs ont également constaté que, de façon surprenante, les fucanes, bien qu'ils ne contiennent ni amino-sucres, ni acides uroniques O-sulfatés, ont la propriété d'inhiber l'activation du complément. Les inhibiteurs de l'activation du complément peuvent jouer un rôle dans la prévention des phénomènes de rejet des greffes; leur utilisation a également été suggé- rée dans le traitement des dialysés rénaux et des convales- cents d'infarctus du myocarde. L'activité anticomplémen- taire peut également être mise à profit pour inhiber l'activation du complément dans les dispositifs de circula- tion extra-corporelle Malgré leur intérêt potentiel, les fucanes n'ont pas pu, jusqu'alors, être utilisés en thérapeutique, d'une part à cause de leur teneur en protéines résiduelles relativement élevée, qui risque de provoquer des phénomènes immunogènes, et d'autre part à. cause de leur masse molécu- laire élevée qui a pour conséquence une mauvaise solubilité interdisant leur utilisation & de fortes concentrations. Ceci est particulièrement gênant dans certaines applica- tions d'un traitement anticoagulant. En effet, par exemple pour la prévention des thromboses -veineuses les agents anticoagulants peuvent être administrés par voie sous-cu- tanée, ce qui nécessite leur emploi sous des formes très concentrées. Il est connu, par exemple pour l'héparine, que le poids moléculaire approprié est, dans ce cas, inférieur à 40 kDa. Or, les études réalisées jusqu'à présent sur l'action anticoagulante des fucanes, suggéraient que cette activité anticoagulante était précisément liée à la grande taille des molécules de fucane [USUI et al. Agr., Biol. Chem.; 44-8; (198017. Il ressortait en outre, des ré- sultats du fractionnement des fucanes non dégradés, que l'activité anticoagulante augmentait en fonction de la masse molaire des fucanes; une activité significative n'était conservée que pour des fractions de poids molécu- laire moyen supérieur à 20 kDa [V. GRAUFFEL, Thèse de Phar- macie 1987, Université PARIS Vy. D'autres travaux, ayant également pour objet l'étude des propriétés des fractions obtenues à partir de fucanes non dégradés ont également mis en évidence cette limite de 20 kDa [NISINO et al.; -Carbohydrate Research, 186 (1989), 119-1292. En outre, il n'avait pas été possible de mettre au point un procédé de dégradation des fucanes permettant d'obtenir des fractions de poids moléculaire intermédiaire; en effet, les procédés utilisés aboutissaient soit à une dégradation insuffisante, donnant des fractions de poids moléculaire supérieur à 40 kDa, soit à une dégradation trop poussée des fucanes, donnant des fragments de poids moléculaire inférieur à 6 kDa et dépourvus d'activité anticoagulante. (V. GRAUFFEL, Thèse de Pharmacie 1987, Université PARIS V] (COLLIEC et al., IVèmes Journées d'hémostase et de thrombose, Paris, Mars 19887; /CISCHER et al., International Congress on S thrombosis (Athens), Mai 19887; CCOLLIEC et al., PFolymers in Medicine, Varsovie, Octobre 1988]. La présente invention a en conséquence, pour but de pourvoir à des fractions polysaccharidiques de poids moléculaire relativement faible obtenues par lyse mé- nagée à partir des fucanes d'algues brunes; elle a égale- ment pour but de pourvoir à des agents anticoagulants par- ticulièrement intéressants en ce que leur activité s'exerce par inhibition du facteur IIa et en ce qu'ils ne possèdent pas d'activité anti-Xa, qu'ils sont obtenus à partir des algues brunes qui sont des matières premières disponibles aisément en grande quantité, et à faible coût, et qu'ils ne présentent pas les effets secondaires dus au poids molécu- laire élevé et à la haute teneur en protéines résiduelles des fucanes bruts. Elle a également pour but de pourvoir à un nouvel agent anticomplémentaire obtenu à partir des fu- canes d'algues brunes. La présente invention a pour objet des polysac- charides sulfatés, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par lyse ménagée à partir des fucanes de Phéophycées, en ce que leur poids moléculaire, déterminé par filtration sur gel par rapport à un étalon polysaccharidique, est supé- rieur à 10 et inférieur à 40 kDa, en ce que leur teneur en soufre est supérieure à celle du fucane d'origine, en ce qu'ils contiennent moins de 0,15% de protéines contami- nantes et en ce qu'ils sont plus solubles que les fucanes d'origine. Selon un mode de réalisation préféré de la pré- sente invention, la teneur en soufre des polysaccharides sulfatés tels que définis plus haut, est supérieure de 2% à 20% à celle des fucanes d'origine. Selon un mode de réalisation préféré des poly- saccharides sulfatés selon la présente invention, ils sont obtenus par hydrolyse acide ménagée à partir des fucanes extraits de Fucus vesiculosus, leur teneur en soufre est supérieure d'environ 15% à. 20% à celle des fucanes d'origine et leur teneur en protéines est inférieure à 0,05%. Selon un autre mode de réalisation préféré des polysaccharides sulfatés selon la présente invention, ils sont obtenus par hydrolyse acide ménagée à partir des fu- canes extraits d'Ascophyllum nodosum, leur teneur en soufre est supérieure d'environ 2% & 5% à celle des fucanes d'origine et leur teneur en protéines est inférieure à 0,05%. Selon un autre mode de réalisation des polysaccharides sulfatés selon la présente invention, ils sont obtenus par hydrolyse acide ménagée à partir des fu- canes extraits de Pelvetia canaliculata, leur teneur en soufre est supérieure d'environ 15% à 20% à celle des fu- canes d'origine et leur teneur en protéines est inférieure. à 0,05%. Selon encore un autre mode de réalisation des polysaccharides sulfatés selon la présente invention, ils sont obtenus par hydrolyse acide ménagée à partir des fu- canes extraits de Undaria pinnatifida, leur teneur en soufre est supérieure d'environ 10% à 15% à celle des fucanes d'origine et leur teneur en protéines est infé- rieure à 0,05%. La présente invention a également pour objet un agent anticoagulant actif aussi bien in vitro qu'in vivo, activateur des co-facteurs HCII et AT III, caractérisé en ce qu'il comprend des polysaccharides sulfatés tels que définis plus haut. La présente invention a en outre pour objet un procédé d'obtention des polysaccharides sulfatés tels que définis plus haut, caractérisé en ce que l'on procède à une lyse ménagée d'un fucane brut issu de Phéophycées, en ce que l'on fractionne le lysat obtenu par filtration sur gel, et en ce que l'on recueille les fractions de poids mo- léculaire supérieur & 10 et inférieur à 40 kDa. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du pro- cédé selon la présente invention, la lyse ménagée du fucane est réalisée par action de H2S04 0,5 à 1N, à une tempéra- ture comprise entre 40 et 50'C pendant 2 à 4 heures. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon la présente invention, la lyse ménagée du fucane est réalisée par radiolyse, en soumettant le fucane à une irradiation, notamment par rayons gamma. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon la présente invention, la lyse mé- nagée du fucane est réalisée par hydrolyse enzymatique. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon la présente invention, la lyse mé- nagée du fucane est réalisée par des procédés physiques, notamment par sonication. La présente invention permet d'obtenir des polysaccharides sulfatés dont le poids moléculaire autorise la solubilisation, même à concentration élevée, dans le plasma et dans les solutions injectables et qui en outre contiennent, par rapport aux fucanes bruts un faible pour- centage de protéines contaminantes. Il est donc possible d'utiliser ces produits chez l'homme comme médicaments anticoagulants, en particulier par voie sous-cutanée, essentiellement dans la prévention des thromboses vei- neuses, ce qui était impossible avec les fucanes non frac- tionnés; il est également possible de les utiliser par voie orale et transdermique. Les fractions d'un poids moléculaire compris entre 5 et 100 kDa, obtenues à partir des fucanes, possè- dent en outre une activité antlcomplémentaire égale ou su- périeure à celle des fucanes non fractionnés. La présente invention a donc également pour ob- jet un agent inhibiteur de l'activation du complément, ca- ractérisé en ce qu'il comprend des fucanes extraits de Phéophycées et/ou leurs fractions. Selon un mode de réalisation préféré de l'agent inhibiteur de l'activation du complément conforme à la pré- sente invention, il comprend une fraction de poids molécu- laire supérieur à 50 kDa, obtenue & partir d'un fucane ex- trait de Phéophycées. Selon un mode de réalisation préféré de l'agent inhibiteur de l'activation du complément conforme à la pré- sente invention, il comprend une fraction de poids molécu- laire moyen compris entre 5 et 50 kDa obtenue à partir d'un fucane extrait de Phéophycées. Selon encore un mode de réalisation préféré de l'agent inhibiteur de l'activation du complément conforme à la présente invention, il comprend des polysaccharides sul- fatés tels que définis plus haut. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, et qui se réfère à des exemples d'obtention de fractions conformes à la présente invention à partir de fucanes extraits de différentes algues brunes et de démonstration des activités de ces fractions. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. L__ O BTENI/_IDE__I ACTION.S PA/SACJ/EUI OQUE$ SULFATXE$ GONE.QRMES A LIIEiTIQE Exeap.e 1:_rmc.tionnement _safcaa etpurifLic ati=des fr.action_. obtenues A) Extraction de fucanes d'algues brunes. Les fucanes sont extraits à partir du matériel pariétal des thalles d'algues brunes, par une procédure classique d'extraction organique. Cette procédure [procédure de BLACK et al.; J. Sci. Food Agric. (1952)3, et ses variantes sont décrites dans la littérature. B) Fractionnement des fucanes extraits. lre.êtapedêg&datipnde l'extrai t brut. a) par hydrolyse acide L'extrait acide est dissous à 10 mg/ml dans une solution d'HzSO4 1N et la température fixée à 45'C. La dé- gradation suivie par viscosimétrie, (viscosimétre de type Ubbelohde de diamètre de capillaire d'écoulement de 0,5 mm) est arrêtée par ajout de soude (NaOH M) avant l'hydrolyse totale du fucane. Au cours de la dégradation, la viscosité spécifique réduite ( spec./c) est calculée toutes les 30 minutes. La solution d'extrait acide dégradé est concen- trée, ultrafiltrée en utilisant une membrane ayant un seuil de coupure de 1 000 daltons et enfin lyophilisée. b) par radiolyse L'hydrolyse radiochimique est réalisée sous ir- radiation à partir d'une source de cobalt 60 de 60.000 Ci. Les fucanes bruts sont irradiés à température ambiante pen- dant 88 heures avec un débit de dose de 1890 rads/minute soit une dose d'irradiation de 10 MRads. 2.ême.....taPeL..../a.tionnemen.t__par_6a....t.i.f___e 1.'.extzai.t..... br.ut.gradé a) à l'échelle du laboratoire 500 mg de lyophilisat repris dans 5 ml de NaCl 0,2 M sont déposés sur une colonne (hauteur 35 à 45 cm x 4,8 cm) de gel de fractionnement, (Sephacryl S-200 ou S- 300). Le débit linéaire est de 3,33 cm/heure. Une double détection est réalisée à la sortie de la colonne à l'aide d'un réfractomètre différentiel et d'un détecteur UV à 280 nm. La colonne a été calibrée à l'aide d'étalons poly- 0o saccharidiques. Les signaux sont enregistrés sur un enregistreur double voie. Apres étude des chromatogrammes, les différentes fractions obtenues à la sortie de la co- lonne (5 ml) sont réunies en 3 ou 4 fractions. Chaque frac- tion est concentrée, ultrafiltrée sur une membrane ayant un seuil de coupure 10 000 daltons pour la première fraction, et une membrane de seuil de coupure 1 000 daltons pour les autres fractions, et lyophilisée. b) à l'échelle semi-pilote g de lyophilisat repris dans 125 ml de NaCl 0,2 M sont déposés sur une colonne de Sephacryl S-200 (hau- teur 60 cm x diamètre 11,3 cm), le débit linéaire est de cm/heure. Une double détection est réalisée à la sortie de la colonne, à l'aide d'un réfractomètre différentiel et d'un détecteur UV à 280 nm. Les signaux sont enregistrés sur un enregistreur double voie. Après étude des chromato- grammes, les différentes fractions obtenues à la sortie de la colonne (30 ml) sont réunies en 3 ou 4 fractions. Chaque fraction est concentrée, ultrafiltrée sur une membrane ayant un seuil de.coupure de 10 000 daltons pour la pre- mière fraction, et une membrane de seuil de coupure de 1000 daltons pour les autres fractions, et lyophilisée. La figure i représente le fractionnement prépa- ratif sur gel Sephacryl S-200 (domaine de fractionnement 250 x 103 à 5 x 103 daltons) de l'extrait acide de fucane dégradé par H2S04 1N à 45'C: Al = lère fraction (PM>20kDa) ; A2 = 2ème fraction (20 kDa>PM>lOkDa); A3 = 3ème fraction (PM courbe en pointillés (......) représente la quantité de ma- tériel élué mesurée par réfractométrie différentielle. La courbe en trait plein () représente la quantité de protéines mesurée par absorption UV à 280 nm. ExemLle_2 Cr&cZ r.A timn_pJt cmlu._eslraó/.oss bt.enues Spectre infrarouge: La figure 2 représente les spectres infra-rouge du fucane brut (2a) extrait des parois de Fucus vesiculosus, et d'une fraction A2 (2b) de poids moléculaire moyen 13 x 103 obtenue par hydrolyse acide ménagée de cet extrait acide. Le pic à 1240 cm-' est caractéristique des groupes sulfuryle. Le pic à 850 cm-' montre que la majorité des groupes sulfate est en C4 sur le L-Fucose; une partie de ces groupes sulfate est cependant en C6 comme le montre l'épaulement à 820 cm-I La majeure partie des fonctions carboxyliques sont sous forme non dissociée comme le montre le pic à 1720 cm-', comparé au faible épaulement à 1420 cm-' qui représente les fonctions carboxyliques sous forme dissociée. Détermination du poids moléculaire: La détermination du poids moléculaire en g/mole des fractions de fucane est réalisée en chromatographie li- quide haute performance analytique (HPLC) sur une colonne Si-Diol 500 (domaine de fractionnement 5000 à 106 daltons) par injection de 50 pl de polysaccharides étalons (Pullulane des laboratoires POLYMER LABORATORIES LTD.) ou de la fraction de fucane étudiée, à 2 mg/ml dans du NaCl 0,2 M, le débit étant de 1 ml/mn et la détection réalisée par réfractomètrie. Les chromatogrammes sont stockés puis analysés grace à un microordinateur possédant un programme GPC (chromatographie d'exclusion stérique sur gel per- méable), les résultats sont enregistrés sur une imprimante. Teneur en Set N: La teneur en S et N des fractions de fucane est donnée en % (en poids de produit pur) par analyse élémen- taire. Teneur en protéines: La teneur en protéines est estimée en % (en poids de produit pur), par le test colorimétrique du Brad- ford (test "Bio-Rad") en prenant comme référence l'albumine bovine. Le tableau I permet d'établir une comparaison entre les propriétés physicochimiques du fucane brut, c'est-à-dire de l'extrait acide (EA) non fractionné, et des polysaccharides sulfatés conformes à la présente invention, représentés par la fraction A2 obtenue par hydrolyse acide à partir des fucanes bruts extraits de 4 algues brunes: (Ascophyllum nodosum (An), Fucus vesiculosus (Fv), Pelvetia canaliculata (Pc), Undaria pinnatifida (Up). Tableau I Poids S protéine rendement moléculaire s moyen % % % EA(An) 7 x 105 8,9 0, 36 A2(An) 15 x 103 9,1 O10EA(Fv) 8 x 105 7,8 0,85 - A2(Fv) 13 x 103 9,2 EA(Up) 48 x 104 7,2 0,26 - A2(Up) 14 x 103 8,0 vesiculosus (Fv), Pelvetia canaliculata (Pc). Tableau II __________________________________________________________ Poids S protéine rendement moléculaire moyen % % % _______________ EA(An) 7 x 105 8,9 0,36 A2(An) 17 x 103 7,8 0,11 46 EA(Fv) 8 x 105 7,8 0,85 - A2(Fv) 17 x 103 8,6 EA(Up) 48 x 104 7,2 0,26 - A2(Up) 14 x 103 8,0 0,11 36 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -........................ - - - - I.L [__C.OMPAPAI[ON D[QA1TI IVZ1IIE_.iOLQGI QU-DE__ F.UCANES BRUTS STDZET ATIQOQBTEM SPAR LXSE.MENAGEE JE _CEUX=- óI E.xenllpie L3:Actixit ê n. Q 1ulaeLn yiftro:; L'activité anticoagulante du fucane non dégradé et de fractions. de fucane dégradé de poids moléculaire com- pris entre 10 et 20 kDa est évaluée par un temps de céphaline-kaolin (TCK). L'activité est donnée en unités in- ternationales par mg de produit (UI/mg), par la relation suivante: (pente de la droite relative de la fraction de fucane/pente de la droite relative de l'héparine étalon) x activité en UI/mg de l'héparine étalon. La pente est calculée à partir de la droite ob- tenue en reportant le logarithme du temps de coagulation en secondes, en fonction de la concentration en anticoagulant (concentration d'héparine 0, 5 à 1 mg/ml de plasma, et de fucane 10 à 50 Mg/ml). Le tableau III permet d'établir une comparaison entre l'activité coagulante de l'extrait acide (EA), ou fu- * cane brut et de la fraction Az (obtenue par hydrolyse acide) des algues brunes: Ascophyllum nodosum (An), Fucus vesiculosus (Fv), Pelvetia canaliculata (Pc) et Undaria pinnatifida (Up). Tableau III ___________________________________________________________ Activité anticoagulante* (UI/mg) EA(An) 4,5 A2(An) 6,6 EA(Fv) 5,0 A2(Fv) 5,8 EA(Pc) 4,0 A2(Pc) 2,0 EA(Up) ND A2(Up) 1,3 * Activité anticoagulante déterminée en prenant pour réfé- rence une héparine étalon H108 à 173 UI/mg. Exemple_.4 actiYiUantióoagulantte Din vivo L'activité anticoagulante des fractions poly- saccharidiques conformes à la présente invention est éva- luée sur le lapin. Une fraction de poids moléculaire moyen de 15 000 Da préparée selon le procédé d'hydrolyse acide décrit dans l'exemple 1 est injectée à des lapins de 3 kg. Les lapins sont saignés à intervalles réguliers et les pa- ramètres de la coagulation sont évalués sur le sang pré- levé, par la mesure du temps de thrombine (TT) et celle du temps de céphaline kaolin (TCK). Les tableaux IV, V, VI et VII montrent l'évolution des paramètres de la coagulation en fonction du temps, après. injection de 0,5 ml d'une solution de polysaccharides sulfatés conformes à la présente invention (fraction A2 -d'Ascophyllum nodosum, obtenue par hydrolyse acide), à 100 mg/ml (tableau IV), 40 mg/ml (tableau V) mg/ml (tableau VI), et à titre de comparaison après in- jection d'héparine à 2 mg/ml (tableau VII). Tableau IV: ___________________________________________________________ Temps de TT TCK prélèvement (secondes) (secondes) 0 35 23,3 mn >240 115 mn >240 88,4 4h30 31 32,4 Tableau V Temps de TT TCK prélèvement (secondes) (secondes) 0 48 30 lOmn >240 73,4 30mn >240 58,8 4h30 23,4 25 Tableau VI Temps de TT TCK prélèvement (secondes) (secondes) 0 76 42 mn >300 59,2 mn 123,6 47 4h30 20,3 24 à. . ....- Tableau VII Temps de TT TCK prélèvement (secondes) (secondes) 0 28,4 23 mn >240 52 mn >240 60 4h30 - - 10. xemp._ -.: D.t-erminatiQnn-el'at-iyit-- a-n-co--mpl-m-eniL-_e desf Bucans et._eletus...iactio.nn.. L'activité anticomplémentaire est déterminée par dosage du CH50 (complément hémolytique total) qui ap- précie l'activité fonctionnelle globale de la voie clas- sique du système du complément du sérum humain. Ce test consiste à déterminer la plus petite quantité de sérum hu- main fraîchement recueilli capable d'entraîner la lyse de 50 % d'un nombre donné de globules rouges de mouton sensi- bilisés de façon optimale par des anticorps de lapin anti- globules rouges de mouton. Les protéines de la voie classique du système du complément reconnaissent ces globules rouges comme un élément étranger et s'activent par clivages successifs pour réagir sur ces globules rouges. Il est possible de détermi- ner les propriétés d'inhibition d'un polymère tel que l'héparine ou le fucane en effectuant ce test en présence ou non du polymère. La capacité d'inhibition est donnée par la concentration en pg/ml du polymère capable d'inhiber 50% de la lyse des cellules, en établissant une courbe dose-ré- ponse de la lyse des cellules en fonction de la concen- tration en polymère. Plus celle-ci est faible, plus le po- lymère est un bon agent anticomplémentaire. Pour mesurer l'activitéanticomplémentaire des fucanes, l'extrait acide (fucane brut) ainsi que des fractions de différents poids moléculaires obtenues par hydrolyse acide dudit fucane brut ont été utilisés. Il a été ainsi montré que le fucane brut ainsi que des fractions de poids moléculaire moyen compris entre 5 et -100 kDa, inhibent totalement l'activation du complément et possèdent une activité anticomplémentaire su- périeure & celle de l'héparine. En effet, alors qu'il'faut dans le cas de l'héparine, 250 ng/ml de polymère pour inhi- ber 50 % de la lyse des cellules, il ne faut que 20 à 60 ng (suivant le poids moléculaire) de fucanes bruts ou frac- tionnés, pour obtenir le même effet. Il a été ainsi observé que des fractions de poids moléculaire moyen 15 000 kDa, préparées comme décrit à l'exemple 1, inhibent 50% de la lyse des cellules à une concentration de 60 ng/ml et que des fractions de poids moléculaire moyen compris entre 5 et kDa inhibent 50% de la lyse des cellules à une concen- tration de 20 ng/ml. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien- nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVBNDICAT.LORS 1) Polysaccharides sulfatés obtenus à partir des fucanes de Phéophycées, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par lyse ménagée des fucanes, en ce que leur poids moléculaire est supérieur & 10 kDa et inférieur à 40 kDa, en ce que leur teneur en soufre est supérieure à celle du fucane d'origine, en ce qu'ils contiennent moins de 0,15% de protéines contaminantes et en ce qu'ils sont plus solubles que les fucanes d'origine. 2') Polysaccharides sulfatés selon la Revendi- cation 1, caractérisés en ce que leur teneur en soufre est supérieure de 2% à 20% à celle des fucanes d'origine. 3') Polysaccharides sulfatés selon la Revendi- cation 1, 'caractérisés en ce qu'il sont obtenus par hydro- lyse acide ménagée à partir des fucanes extraits de Fucus vesiculosus, en ce que leur teneur en soufre est supérieure d'environ 15% à 20% à celle des fucanes d'origine et en ce leur teneur en protéines est inférieure à 0,05%. 4') Polysaccharides sulfatés selon la Revendi- cation 1, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par hydro- lyse acide ménagée à partir des fucanes extraits de Ascophyllum nodosum, en ce que leur teneur en soufre est supérieure d'environ 2% à 5% à celle des fucanes d'origine et en ce leur teneur en protéines est inférieure à 0,05%. 5') Polysaccharides sulfatés selon la Revendi- cation 1, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par hydro- lyse acide ménagée à partir des fucanes extraits de Pelvetia canaliculata, en ce que leur teneur en soufre est supérieure d'environ 15% à 20% à celle des fucanes d'origine et en ce que leur teneur en protéines est infé- rieure à 0,05%. 6') Polysaccharides sulfatés selon la Revendi- cation 1, caractérisés en ce qu'il sont obtenus par hydro- lyse acide ménagée à partir des fucanes extraits de Undaria pinnatifida, en ce que leur teneur en soufre est supérieure d'environ 10% à 15% à celle des fucanes d'origine et en ce que leur teneur en protéines est inférieure à 0,05%. 7') Agent anticoagulant, actif in vivo et in vitro, activateur des co-facteurs HCII et AT III, caracté- risé en ce qu'il comprend des polysaccharides sulfatés, selon l'une quelconque des Revendications i à 6. 8') Procédé d'obtention des polysaccharides. sulfatés selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'on procède à une lyse ménagée d'un fucane brut issu -de Phéophycées, en ce que l'on fractionne le lysat obtenu par filtration sur gel, et en ce que l'on recueille les frac- tions de poids moléculaire supérieur à 10 kDa et inférieur à 40 kDa. 9') Procédé selon la Revendication 8, caracté- risé en ce que la lyse ménagée du fucane est réalisée par action de H2S04 0,5 à 1N, à une température comprise entre et 50'C pendant 2 à 4 heures. ') Procédé selon la Revendication 8, caracté- risé en ce que la lyse ménagée du fucane est réalisée par radiolyse, en soumettant le fucane à une irradiation, no- tamment par rayons gamma. t1') Procédé selon la Revendication 8, caracté- risé en ce que la lyse ménagée du fucane est réalisée par hydrolyse enzymatique. 12') Procédé selon la Revendication 8, caracté- risé en ce que la lyse ménagée du fucane est réalisée par des procédés physiques, notamment par sonication. 13') Agent inhibiteur de l'activation du com- plément, caractérisé en ce qu'il comprend des fucanes ex- traits de Phéophycées et/ou leurs fractions. 14') Agent inhibiteur de l'activation du com- plément selon la Revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend une fraction de poids moléculaire supérieur à kDa obtenue à partir d'un fucane extrait de Phéophycées. ') Agent inhibiteur de l'activation du com- plément selon la Revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend une fraction de poids moléculaire moyen compris entre 5 et 50 kDa, obtenue à partir d'un fucane extrait de Phéophycées. 16') Agent inhibiteur de l'activation du com- plément selon la Revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend les polysaccharides sulfatés selon l'une quel- conque des Revendications i & 6. 17') Application des fucanes extraits de Phéophycées, et/ou de leurs fractions, à la fabrication de médicaments utilisés comme inhibiteurs de l'activation du complément. 18') Application des polysaccharides sulfatés selon l'une quelconque des Revendications 1 à 6, à la fabrication de médicaments utilisés comme inhibiteurs de l'activation du complément et/ou anticoagulants.