FR 2648713 A1 19901228 FR 8908444 A 19890626 La présente invention est relative & des pro- téines hybrides entre une enzyme extracytoplasmique et une autre protéine, notamment un antigène ou un fragment va- riable (Fv) simple d'un anticorps, & leur procedé de prépa- ration, alnsi qu'à& leur appllcation comme agent de diagnos- tic. La présente invention est également relative aux séquencee d'ADN codant pour lesdites protéines hy- brides, aux plasmldes recombinants contenant lesdites sé- O quences, & des vecteurs d'expresslon comprenant lesdits plasmides, à des souches de bactérles ou de levures aptes & être hôtes desd;ts plasmides et/ou vecteurs ainsi qu'à leur application pour la production et la sécrétlon desdites protéilnes hybrides. Dans la l1ttérature, un certain nombre de pro- téines hybrldes on: été décrites alnsi que leur procédé de production Or. peut clter notamment les Brevets américains 4 411 994 et 4 338 397, qui décrlvent l'utlllsatlon du gène de la pén-cll.inase dans le plasmide pBR322 pour produlre des proteines de fusion, qul sont transportées dans l'espace pérlplasmlque par la séquence "leader" de la pénl- cillinase. en utlllsant des séquences d'ADNc codant pour la preproinsuline, insérées au nlveau du site PstI du plasmide pBR322. On peut citer également la Demande de Brevet européen 196 864, qui décrlt l'utilisation de la séquence "leader" ce la phosphatase alcaline (phoA), sulvie en aval et en phase de lecture, par la séquence codante pour la o protéine désiree. Le système d'expresslon de ladite séquence in- clut un promoteur approprié (par exemple phoA), lié de ma- nière operat:onne!le & ladite séquence codante hybride et en aval de ladite séquence, un terminateur approprié, no- tamment.e terminateur phoA. Cette Demande de Brevet européen 196 864 fait D ORIINA- BAD ORIGINAL o> apparaître que seules les protéines dites sensibles peuvent être fusionnées à la partie N terminale de la phosphatase alcaline et exportées; il est, de plus, précisé qu'une protéine est considérée comme sensible lorsqu'elle comporte une séquence en amino-acides qui interagit avec les sé- quences dérivées du "leader" phoA et donne lieu à la sécré- tion de ladite séquence. I1 est également préclsé que la sensibilité de la protéine, sans doute due à la nature de sa séquence en i amino-acides qul permet cette coopération entre les deux séquences, n'est pas comprise actuellement. Il est toute- fois clair que certaines protéines hétérologues sont ca- pables d'interagir avec la séquence signal dérivée d'un certain nombre de "leader" bactériens, alors que d'autres protéines sont incapables de cette interaction. Cette Demande européenne décrit plus particu- lièrement, comme protéines sensibles, l'hGH et le TNF, alors que l'IL-2 est considérée comme une protéine non sen- sible, c'est-à-dire non exportée. Les protéines hybrides décrites dans cette Demande, sont destinées à produire no- tamment de l'hGH ou du TNF en quantités industrielles, par un procédé de recombinaison génétique, la séquence signal de la phosphatase alcaline servant uniquement au transport de la protéine étrangère. La Demande de Brevet européen 242 243 décrit une protéine hybride comprenant une enzyme contenant un épitope, inséré de telle sorte dans la chaîne peptldlque de l'enzyme, que l'épitope est exposé de manière à ce que lorsque la protéine hybride est en contact immunologique avec des anticorps dirlgés contre l'épltcpe, un complexe est formé entre ladite protéine hybride et lesdits anti- corps et l'activité enzymatique de ladite enzyme est pré- servée soit dans l'état non complexé, soit dans l'état com- plexé. La protéine hybride décrite dans cette Demande euro- péenne est repliée dans la membrane externe d'une bactérie, de telle sorte que l'épltope choisi soit exposé à la sur- face de la bactérie; des souches de E. Coli portant à leur surface externe des récepteurs modifiés du phage lambda contenant, exposées & la surface, les protéines hybrides ci-dessus déflnies sont également décrites dans cette De- mande. Les protéines hybrides décrites dans cette Demande, peuvent éventuellement comprendre la phosphatase alcaline, la peroxydase ou la 8-galactosidase. Il existe d'autres documents qui décrivent des protéines de fusion permettant d'obtenir le produit recher- !0 ché, sécrété ou exporté. On peut citer en particulier l'article au nom de T.P. HOPP et al., paru dans Biotech- nol., 1988, 6, 1204-1210, qui décrit une séquence de fusion N-terminale courte utilisée comme marqueur pour l'ldentlflcatlon et la purification de protéines recombi- i5 nantes; l'éllmlnatlon dudlt marqueur a l'avantage de ne pas nécessiter de traitements drastiques de la protéine de fusion. Il faut noter que, dans cet article T.P. HOPP et al., précisent que la réalisation de protéines de fusion présente, à l'heure actuelle, un certain nombre d'inconvénients; en effet, il n'est pas évldent d'obtenir des protéines de fusion qul présentent une structure qua- ternalre qul correspond à celle de la protéine native et qul conservent l'activité blologlque de cette dernière. La Demanderesse s'est donné pour but de pour- 2- voir à une protéine hybride directement exportée ou sécré- tée sous sa forme hybride et constituée par une enzyme et une autre protéine, ladite protéine hybride conservant les propriétés des deux protéines et pouvant être utilisée comme réactif de diagnostic et/ou de dépistage dans le cadre de dosages ELISA; une telle protéine hybride répond mieux aux nécessités de la pratique que les protéines hy- brides de l'Art antérieur. notamment en ce que ladite pro- téilne hybride exportée ou sécrétée est directement utill- sable comme réactif de diagnostic, sans étape de purifica- Z3C tlon. La présente invention a pour objet une séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle est consti- tuée par une séquence hybride comprenant successivement le fragment leader du gène de structure d'une enzyme exportée ou sécrétée par un microorganisme, notamment choisi dans le groupe qul comprend les bactéries et les levures, un frag- ment de la séquence mature de ladite enzyme, une séquence d'acide nucléique codant pour une autre protéine, dont l'extrémité N-terminale libre et/ou l'extrémité C-termlnale libre ne sont pas essentlelles à la structuration et à l'expression de certaines de ses activités blologlques, puis un fragment codant pour au moins un fragment de la sé- quence mature de ladite enzyme, l'ensemble de ces fragments étant en phase de lecture et codant pour une protéine hy- bride présentant à la fois les propriétés de l'enzyme et 1_ certaines propriétés de ladite protéine. notamment celle d'interagir spécifiquement avec un anticorps ou un antl- gène. On entend par aclde nucléique aussi bien l'ADN que l'ARN correspondant. 2$ Selon un mode de réallsatlon avantageux de la séquence conforme à l'invention, l'enzyme est choisie dans le groupe qul comprend notamment la phosphatase alcaline, la phosphatase acide, la glucose phosphatase acide et la phosphodlestérase cycllque. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la séquence conforme à l'invention, elle comprend suc- cessivement le fragment leader du gène de structure de la phosphatase alcaline, un fragment codant pour, au plus, les 29 aminoacldes Nterminaux de la phosphatase alcaline, une séquence d'ADN codant pour une protéine, puis un fragment codant pour, au moins, les 421 aminoacides restants C- terminaux de la phosphatase alcaline, l'ensemble de ces fragments étant en phase de lecture et formant une séquence d'ADN hybride codant pour une protéine hybride présentant à la fois les propriétés de la phosphatase alcaline et cer- taines des propriétés de la protéine différente de l'enzyme, notamment celle d'interagir spécifiquement avec un antigène ou un anticorps. Selon un autre mode de réalisatlon avantageux de la séquence conforme A l'invention, le fragment de sé- quence codant pour la protéine est choisie dans le groupe qui comprend notamment les séquences codant pour un frag- ment simple cha ne analogue au fragment variable des lmmu- noglobullnes (immunoglobullnes recombinantes) et les sé- quences codant pour une toxine. De tels fragments sont notamment décrits dans Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1988, 85, 5879-5883. Selon une disposition de ce mode de réallsa- tlon, la toxine est avantageusement une neurotoxine. La séquence codant pour la neurotoxlne est no- tamment, et ce de manière non limitative, une séquence co- dant pour l'une des neurotoxînes suivantes: la latlcauda colubrlna II, la laticauda colubrlna c, la latlcauda colu- brlna d, la latlcauda latlcauda a, la latlcauda laticauda b, la latlcauda latlcauda c, la laticauda crockeri a, la latlcauda crockeri b, la laticauda crockerl c, l'érabutoxlne a, l'érabutoxlne b, l'érabutoxine c, l'astrotla stokesii a, l'Hc hydrophltoxlne a, l'Hc hydro- phltoxlne b, la toxlne Es 4, l'hydrophis lapemoides a, l'aipysurus laevis a, l'aipysurus laevls b, l'aipysurus laevls c, la pseudechls australîs a, l'acantophls antarctl- cus c, la toxlne Nm d, la toxine Nn a, la toxine Nn a, la toxine Nn 6, la toxlne Nhh CM-10a, la Cobrotoxine Nna, la toxlne Nnp, la toxlne Nno II, la neurotoxlne Nmm I, la neurotoxine Nmm III, la toxlne Nha CM-14, la toxine Nha CM- 10, la toxine Nha CM-12, la toxine Hh II, la toxine Hh IV, la Bm abungarotoxine, la toxine ns III-4, la toxine Oh a, la toxine Oh b, la latlcauda colubrina a, la latlcauda co- lubrlna b, la latlcauda semifasciata III, l'astrotla sto- kesi1 b, l'astrotia stokesil c, l'acantophls antarcticus b, - la toxlne Nm b, la toxine Nm 3.9.4., la toxine Nh III, la toxine Nhh CM-5, la toxine Nhh Desert VII, la Nns toxine 3, la Nnn toxine 4, la Nnn toxine 3, la Nnn toxine 3WP, la Nn toxine a, la Nn toxine b, la Nn toxine c, la Nn toxlne e et la Nno neurotoxlne I et toutes autres neurotoxlnes. Selon une modallté avantageuse de cette dispo- sltlon, ladite séquence d'ADN hybride comprend successlve- ment la séquence leader de la phoA, la séquence codant pour les 29 aminoacldes Ntermlnaux de la phosphatase alcaline, un fragment de la séquence codant pour l'érabutoxine a (ea) mature, et la séquence codant pour les 421 amlnoacldes C- termlnaux de la phoA. Conformément à l'invention la séquence codant pour l'érabutoxlne a comprend 192 paires de bases et deux sites de restriction Sau 3 AI supplémentalres. Ladlte séquence hybride comprend la formule I cl-après: R T P Fragment leader du gène de structure de la phoA-CGG ACA CCA E M P V L E N R A A Q G D I T GAA ATG CCT GTT CTG GAA AAC CGG GCT GCT CAG GGC GAT ATT ACT A P G A R R L T G D Q P R I C GCA CCC GGC GGT GCT CGC CGT TTA ACG GGT GAT CCC AGG ATA TGT F N H Q S S Q P Q T T K T C S TTT AAC CAT CAG TCA TCG CAA CCG CAA ACC ACT AAA ACT TGT TCA P G E S S C Y N K Q W S D F R CCT GGG GAG AGC TCT TGC TAT AAC AAG CAA TGG AGC GAT TTC CGT G T I I E R G C G C P T V K P GGA ACT ATA ATT GAA AGG GGA TGT GGT TGC CCC ACA GTG AAG CCC G I K L S C C E S E V C N NT4GD GGT ATT AAA CTC AGT TGT TGC GAA TCA GAG GTC TGC AAC AAT GAT Q T CAG ACT-fragment codant pour au moins les 421 aminoacldes restants C-terminaux de la phoA. La première flèche correspond au début de l'lnsert contenant l'érabutoxîne a; la deuxième flêche correspond à la fin dudlt lnsert. La séquence complète du gène de structure de la phoA est décrite dans GENE, 1986, 44, 121-125. La présente invention a également pour objet une famille de plasmldes recombinants, caractérisée en ce que chaque plasmide contient au molns une séquence hybride d'ADN conforme à l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il présente les propriétés sulvantes: - il comprend 6,1 kb; - il est obtenu par ligation du plasmide pJC2431 portant le gène de structure de la phosphatase alcaline et le gène de résistance à l'ampic1lline (ApR), - ledlt plasmide étant linéarisé par l'enzyme de restriction Bcl I située au niveau du codon 28 dudlt gène de structure de la phosphatase alcaline, -avec le fragment Sau 3AI-Sau 0 3AI de 192 paires de bases codant pour l'érabutoxine a. Ce plasmlde a été dénommé pEP1726 par les In- venteurs. Le plasmide pJC2431 est décrit dans l'article de JC. LAZZARONI et al., paru dans J. Bacteriol., 1985, 164, 1376-1380. La présente invention a également pour objet un mlcroorganisme obtenu par transformation génétique, carac- térlsé en ce qu'il est obtenu par transformation d'une souche appropriée d'E. Coli par un plasmide conforme à l'inventlon. Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit microorganlsme est avantageusement une souche CCl18 d'E. Coli transformée par le plasmide pEP1726. Une telle souche transformée par ledit plasmide b a été déposée en date du 2 juln 1989 sous le numéro 1-862 auprès de la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur. Ladite souche est dénommée SEP 1726 par les In- venteurs. 3 La présente invention a également pour objet une protéine, caractérlsée en ce qu'elle est constituée par une séquence hybride comprenant au moins un fragment d'une enzyme exportée ou sécrétée par un microorganlsme notamment choisi dans le groupe qui comprend les bactéries et les levures et une protéine appropriée dont l'extrémité N-terminale libre et/ou l'extrémité C-terminale libre ne Bont pas essentielles à sa structura- tion et à l'expression de certaines de ses activités blolo- giques, ladite protéine hybride possédant à la fols les propriétés de l'enzyme et certaines propriétés de la pro- téilne, notamment celle d'interagir spécifiquement avec un anticorps ou un antigène. Selon un mode de réalisation avantageux de la protéine hybride conforme à l'invention, elle contient une enzyme choisle dans le groupe qui comprend notamment la îo phosphatase alcaline, la phosphatase acide et la phospho- diestérase cyclique, ladite enzyme étant associée A une protéine notamment choisle dans le groupe qul comprend les fragments simple chaîne analogues aux fragments variables des immunoglobullnes et les toxines. ' Selon une disposition de ce mode de réalisa- tion, ladite protéine hybride comprend avantageusement la phosphatase alcaline associée à une neurotoxine. Selon une modalité avantageuse de cette dispo- sition, la neurotoxlne est l'érabutoxine a (ea) et présente la séquence déduite selon la formule I ci-dessus. La présente invention a l'avantage d'exprimer, de manière inattendue, à la fois une protéine fonctlonnel- le, insérée au sein d'une autre protéine (enzyme) et cette dernière. La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression d'une protéine hybride conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) une origine de réplicatlon dans un microorganisme hôte approprié, notamment une bactérie ou une levure; _ (b) un gène de structure d'une enzyme exportée ou sécrétée par une bactérie appropriée, dans lequel est insérée une séquence d'acide nucléique appropriée; (c) un promoteur approprié; (d) un signai de terminaison approprié. Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur d'expression, il comprend notamment: (a) une origine de réplication dans E. Col; (b) un vecteur pJC2431 comprenant au niveau d'un site de restriction approprié de la partie codante du gène de structure de la phoA codant pour la partie NH2 terminale de celle-ci, une séquence appropriée d'acide nucléique. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence d'acide nucléique est une sé- quence hybride conforme à l'invention. i1 Selon une modalité préférée de cette disposi- tion, ledit vecteur est avantageusement un plasmide conforme à l'invention. De tels vecteurs expriment directement la pro- téine hybride lorsqu'ils sont présents dans un microorga- nlsme approprié, lesquels vecteurs sont dit charges. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence d'acide nucléique est un polyllnker, apte à recevoir au molns une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine appropriée. Un tel vecteur est dit non chargé. Conformément à l'invention, le promoteur est choisi dans le groupe qui comprend le promoteur du gène phoA et tout promoteur plus fort que le promoteur du gène phoA. Le plasmlde recombinant, dénommé pEP1726, est obtenu par l1néarisation du plasmide pJC2431, par digestion partielle par l'enzyme de restriction Bcl I, déphosphoryla- tion puis ligation du fragment ainsi obtenu avec le frag- ment de restriction Sau 3A I-Sau 3A I dé 192 paires de bases codant pour l'érabutoxine a (gène ea). La présente invention a également pour objet un processus d'expression d'une protéine hybride conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un vec- teur d'expression tel que défini cl-dessus dans un micro- organisme conforme à l'invention. Deux propriétés de cet hybride doivent être soulignées: (1) l'extrême slmpllcité de sa production et l'absence d'étapes longues et difficiles de purification; (2) sa stabilité, pulsque l'activité enzymatique persiste pendant plusieurs heures en présence du substrat. La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il est consti- tué par une protéine hybrlde conforme à l'invention. La présente invention a également pour objet un procédé de dosage immunoenzymologlque de protéines, carac- térlsé en ce qu'il consiste à détecter des protéines pré- sentes dans un fluide blologlque en mettant en présence le- dlt fluide blologlque avec le réactif de diagnostic conforme à l'invention, la lecture du résultat étant dl- recte. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du- dit procédé, lesdltes protéines sont des antigènes. Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux dudit procédé, lesdites protéilnes sont des anticorps. La présente invention a, en outre, pour objet une trousse prête à l'emploi pour dosage enzymoimmunolo- glque, caractérisée en ce qu'elle comprend outre les quan- tités appropriées de tampons et réactifs utiles pour la mise en oeuvre dudit dosage, des quantités appropriées du réactif conforme à l'invention. Le réactif conforme à l'invention présente l'avantage d'être directement utilisable alors que habl- tuellement, dans le cadre d'un dosage ELISA, l'antigène ou l'anticorps est lié de façon covalente à une enzyme, le couplage étant réalisé par voie chimlque. Pour être effl- cace, un tel couplage dolt être réalisé à partir de deux composants hautement purifiés. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui res- sortlront de la description qui va suivre, qul se réfère à 1 1 des exemples de mlse en oeuvre du procédé objet de la pré- sente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement A titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Lxemple _.;Proc&e_eprQoductiQx _desplasmides pEP1726 et pEP1727. - préparation du fragment Sau 3A I-Sau 3A I lt codant pour l'érabutoxlne a: le fragment de restriction Sau 3A I-Sau 3A I de 192 paires de bases codant pour l'érabutoxine sans séquence signal, a été préparé A partir de la forme réplicative du phage M13mpl9 (-2 GAT, -1 CCC, +63 GAT)Ea contenant le gène Ea portant des mutations au nlveau de 3 codons, ces modificatlons entraînant la formation de deux nouveaux sites de restriction Sau 3 AI dans le gène: -2 TAC (Tyr) devient GAT (Asp); -1 ACC (Thr) devient CCC (Pro); +63 TAG (AMB) devient GAT (Asp) (voir formule I) et incubé en présence du vecteur pJC2431 _C ouvert et d'ADN l1gase. Les ligations ont été effectuées dans le tampon 50 mM Trls-HCl pH 7,4; 10 mM MgCl2 10 mM DTT; 0,5 mM ATP; 100 pg/ml BSA; avec 1 U d'ADN ligase du phage T4 et un rapport de concentrations vecteur/insert de 1/10. Les déphosphorylations des vecteurs ont été réalisées d'après Maniatis et al. - La figure 1 représente la carte de restric- tion du plasmide pJC2431 portant le gène de structure de la phosphatase alcaline sous le contrôle de son propre promo- teur (Lazzaronl et al., 1985). Ce plasmlde présente trois Sc sites de restrictions Bcl I: Bcl I situé en amont du promoteur de phoA, Bcl I2 et Bcl I3 situés respectivement au niveau des codons +28 et +363 du gène phoA, ainsi que les cartes de restriction des différents plasmides obtenues par insertion du gène ea dans le gène phoA; on obtient ainsi trois plasmides différents (pEP1726, pEP1727, pEP1730), seul le plasmide pEP1726 présentant un intérêt pour la production d'une protéine hybride conforme à l'invention. L'enzyme Bcl I ne pouvant couper l'ADN au nl- veau des sites de restriction méthylés par la dam-méthy- lase, une souche dam- GM2163 est transformée par pJC2431, afin de préparer du plasmide non méthylé. On procède en- suite à une digestion partielle de pJC2431 par Bcl I, et à * une déphosphorylation. L'ADN correspondant au plasmlde ou- vert (une seule coupure par Bcl I sur les trols possibles) est ensuite isolé sur un gel d'agarose à bas point de fu- sion sulvant le protocole de Manlatls et al. (1982). Exemple 2: Expression.. de-.la-protéine hybride phoA:ea. La souche CC118 (LphoA20) a été transformée avec ce mélange de ligation. Les transformants Apr (résls- tants à l'amplcllline) obtenus ont été purifiés sur mllleu inducteur de la phosphatase alcaline contenant du XP et de 1'Ap. Le mllleu inducteur est le TEB, (solution de: 2c (NH4)2SO4 2 g/1; FeSO4,7H20 0,5 mg/l; KC1 75 mg/1; trié- thanolamine 7,5 g/l; ajustée à pH 7,5). L'addltlon du sub- strat chromogène 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (XP 0,4 g/l) à ce milieu permet de révéler l'activité phospha- tase alcaline sur boîte de pétri, le XP conférant une colo- ration bleu foncé aux colonies qui l'hydrolysent. Trois types de transformants ont été distingués suivant leur capacité à hydrolyser le XP: des clones blancs, des clones bleus et enfin des clones bleus très foncés. Ces deux dernières catégories présentent donc une activité phosphatase alcaline due au plasmlde qu'elles contiennent. L'analyse des fragments de restriction de l'ADN plasmldlque de ces différents transformants nous a permis de déterminer le site et l'orientation de l'insertion du gène ea dans chaque cas. Les clones bleu foncé correspondent à des in- sertions d'un ou deux fragments Sau 3A I-Sau 3A I au niveau du site Bcl Il, c'est-à-dire en amont du gène phoA et de son promoteur. L'activité phosphatase alcaline de ces clones est identique à celle de la souche CC118 (pJC2431). Les clones bleus moins prononcé correspondent à des insertions en phase d'une ou deux copies du gène ea au niveau du site Bcl Iz2 (pEP1726 et pEP1727). Les clones blancs proviennent de l'insertion du gène ea au nlveau du site Bcl I2 mais dans l'orientation O inverse de celle du gène phoA (pEP1730). Le protocole utilisé pour l'extraction des pro- téines pérlplasmiques par choc osmotique est celui décrit par Dvorak et al. (1967). Exemple 3 -.; _.Analyse des propriétés..des protéine5--hybrides- Ba-phoA - dosage de l'activité phosphatase alcaline. a) Sur desbactriesentres: La concentration en protéines de la culture bactérienne est déterminée à partir de son absorbance à 546 nm et d'une courbe-étalon réalisée par dosage des pro- téilnes sur des sonlcats par la méthode de Bradford (Bradford, 1976). 0,5 ml de culture sont centrifugés, le culot est repris dans 0,5 ml de tampon Tris-HCl pH 8,8 mM contenant du p-nltro phényl phosphate (pNPP) 25 mM. Après 15 min d'incubation à 37'C, la réaction est arrêtée par l'addition de 1 ml de NaOH 1M. L'échantillon est cen- trlfugé pour éliminer les corps bactériens et son absor- bance est lue à 410 nm (coloration jaune due à la formation de pNPOH). L'activité enzymatique spécifique (AS), en nmoles de pNPP hydrolysé par minute par mg de protéines, est donnée par la formule: A410.5,55 AS ---------------------- A410 = 5,5 -5 (mg protéines/ ml).0,5 pour 1 nmole de pNPOH dans 1 ml b) Sur des extrait s obrenus u shQc osmotique: La concentration en protéines de l'extralt est déterminée par le dosage de Bradford. L'actlvité est mesu- rée selon le protocole précédent sur 20 pl d'extralt. L'actlvité spéciflque est calculée par la formule: A410. 5,55 AS =----------------------- i, (mg protéines/ml).2.10-2 - l'actlvlté spéclflque (AS) phosphatase alca- line de la souche CC118 contenant respectivement les plas- mides pJC2431 (phoA), pEP1726 (Ea::phoA) et pEP1727 (ea::ea::phoA) a été dosée: -5 sur des bactérles sur des extraits entières pérlplasmlques. plasmlde AS AS relative AS AS relative pJC2431 2035 100 147200 100 :pEP1726 688 34 17600 12 ipEP1727 197 10 800 0,5. On observe donc une diminution de l'AS relative des souches possédant les plasmides pEP1726 ou pEP1727, entre les mesures effectuées sur des extralts totaux (34 % et 10 %) et celles réallsées sur les extraits pérlplas- mlques (12 % et 0,5 %). Les rendements globaux d'extraction des protéines pérlplasmlques sont cependant semblables pour les 3 souches (20 %). Pour détermlner si, dans les protéines hybrides Ea-phoA et Ea-Ea-phoA, les domalnes correspondant à 0 l'érabutoxîne sont correctement structurés, on a procédé à un dosage radio-lmmunologlque (RIA) sur les extraits péri- plasmiques concentrés, conformément aux protocoles précé- demment développés (Boulaln et al., 1982). La toxine a trl- tiée (Ménez et al., 1971) de Naja nigricollis ou l'érabutoxine b de Lat:cauda semifasciata, marquées par sI (Sato et Tamîya, 1970; Ménez, 1977) ont été utllisées comme traceurs radioactifs. L'anticorps monoclonal Ma2-3 (Boulain et al. 1982) ou des sérums spéclfiques de la toxine dénaturée constituent les sondes structurales. Les deux protéines hybrides Ea-phoA et Ea-Ea-phoA sont recon- nues par des anticorps spécifiques des toxines déstructu- rées. Par contre, seul l'hybride Ea-phoA est également re- connu par l'anticorps monoclonal Ma2-3 spéclfique des formes structurées des toxines. La protéine phoA ne pré- sente aucune actlvlté de liaison sur ces deux types d'anticorps. Ces premiers résultats lndlquent clairement oc que la protéine hybride EaphoA est stable, qu'elle conserve une activité phosphatase alcaline et des proprié- tés antigènlques caractéristiques d'une neurotoxlne natu- relle structurée. Exemple..:4. Dosage enzymo-immunQlQgique à l'aide du réactif dediagnostic conforme -.Linvention. L'anticorps Ma2-3 (5 wg/ml dans un tampon Trls- HC1 pH 7,4 50 mM) est adsorbé sur des plaques NUNC ELISA. La solution d'anticorps est incubée une nuit) 4'C. Les puits sont alors saturés par une solution de sérum albumine -D bovine (BSA) à 0,3 % puis lavées 5 fols avec un tampon Tris-HCl/BSA 0,1 %. Le substrat de l'enzyme (pNPP 10 mM dl- lué dans un tampon Tris-HCl pH 8,2 0',IM; NaCl 2M; MgCl2 1 mM; ZnCl2 0,1 mM; triéthylamlne 3 mM) est additionné et l'incubation s'effectue durant une heure à température am- biante. La densité optique est mesurée à 405 nm. Les expériences de compétition sont réalisées suivant le même protocole. Des concentrations croissantes d'érabutoxine a et une quantité fixe d'hybride phosphatase alcaline-érabutoxine a, déterminée d'après l'expérience 3o précédente, sont introduites simultanément dans les puits. Une quantité d'extralt périplasmlque provenant de 0,5 ml de culture bactérienne permet d'obtenir après une heure d'incubation en présence du substrat, une coloration ayant une denslté optlque de 0,7 à 405 nm. Cette valeur d'absorption est divisée par deux en présence de 2,2 10-12 moles (soit 15 ng) d'érabutoxlne a. Il est donc possible dans ces conditions de détecter la présence d'environ une picomole de toxlne. Cette valeur, déjà très falble, ne constitue cependant pas un seuil de détection absolu. En effet, le protocole utilisé dans ce test enzymo-lmmunolo- gique ne permet pas d'atteindre les seuils de détection les plus faibles. Cette expérience a pour unique but de démon- trer que l'hybride produit par voie génétique est utill- sable dans des conditions satisfaisantes en enzymo-détec- tion. 0 Alnsi que cela ressort de ce qul précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vlen- nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venlr à l'esprit du technlclen en la matière, sans s'écarter du cadre, nl de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS l') Séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence hybride compre- nant successivement le fragment leader du gène de structure d'une enzyme exportée ou sécrétée par un microorganisme, notamment choisi dans le groupe qui comprend les bactéries et les levures, un fragment de la séquence mature de ladite enzyme, une séquence d'acide nucléique codant pour une autre protéine, dont l'extrémité N-termlnale libre et/ou l'extrémité C-terminale libre ne sont pas essentielles à la structuration et à l'expression de certaines de ses actlvl- tés biologiques, puis un fragment codant pour au moins un fragment de la séquence mature de ladite enzyme, l'ensemble de ces fragments étant en phase de lecture et.codant pour une protéine hybride présentant à la fols les propriétés de l'enzyme et certaines propriétés de ladite protéine, notam- ment celle d'interagir spécifiquement avec un anticorps ou un antigène. 2') Séquence selon la revendication 1, caracté- c0 risée en ce que l'enzyme est choisie dans le groupe qui comprend notamment la phosphatase alcaline (phoA), la phos- phatase acide, la glucose phosphatase aclde et la phospho- dlestérase cyclique. 3') Séquence selon la revendication 1 ou la re- vendlcation 2, caractérisée en ce qu'elle comprend succes- slvement le fragment leader du gène de structure de la phosphatase alcaline, un fragment codant pour, au plus, les 29 aminoacides Ntermlnaux de la phosphatase alcaline, une séquence d'ADN codant pour une protéine, puis un fragment codant pour, au moins, les 421 aminoacides restants C- terminaux de la phosphatase alcaline, l'ensemble de ces fragments étant en phase de lecture et formant une séquence d'ADN hybride codant pour une protéine hybride présentant à la fols les propriétés de la phosphatase alcaline et cer- _5 taines des propriétés de la protéine différente de l'enzyme, notamment celle d'interagir spécifiquement avec la un antlgène ou un anticorps. 4') Séquence selon l'une quelconque des reven- dications 1 & 3, caractérisée en ce que le fragment de sé- quence codant pour la protéine est cholsie dans le groupe qul comprend notamment les séquences codant pour un frag- ment simple chaîne analogue au fragment variable des immu- noglobullnes (immunoglobulines recombinantes) et les sé- quences codant pour une toxine. ') Séquence selon la revendlcation 4, caracté- rlsée en ce que la toxlne est avantageusement une neuro- toxlne. 6') Séquence selon l'une quelconque des reven- dlcatlons 1 à 5, caractérlsée en ce qu'elle comprend suc- cesslvement la séquence leader de la phoA, la séquence co- dant pour les 29 amlnoacldes N-termlnaux de la phosphatase alcallne, un fragment de la séquence codant pour l'érabutoxlne a (ea) mature, et la séquence codant pour les 421 amlnoacldes C-termlnaux de la phoA. 7')j Séquence selon la revendlcatlon 5 ou la re- vendlcatlon 6, caractérlsée en ce que le fragment codant pour l'érabutoxlne a comprend 192 palres de bases et deux sites de restriction Sau 3 AI supplémentalres. 8) Séquence hybrlde selon la revendicatlon 7, caractérisée en ce qu'elle contient la formule I cl-après: R T P Fragment leader du gène de structure de la phoA-CGG ACA CCA E M P V L E N R A A Q G D I T GAA ATG CCT GTT CTG GAA AAC CGG GCT GCT CAG GGC GAT ATT ACT A P G A R R L T G D 4 Q P R I C GCA CCC GGC GGT GCT CGC CGT TTA ACG GGT GAT CCC AGG ATA TGT F N H Q S S Q P Q T T K T C S TTT AAC CAT CAG TCA TCG CAA CCG CAA ACC ACT AAA ACT TGT TCA P G E S S C Y N K Q W S D F R CCT GGG GAG AGC TCT TGC TAT AAC AAG CAA TGG AGC GAT TTC CGT G T I I E R G C G C P T V K P GGA ACT ATA ATT GAA AGG GGA TGT GGT TGC CCC ACA GTG AAG CCC G I K L S C C E S E V C N N 4 D GGT ATT AAA CTC AGT TGT TGC GAA TCA GAG GTC TGC AAC AAT GAT Q T CAG ACT-fragment codant pour au moins les 421 aminoacldes 26487 13 restants C-terminaux de la phoA. (I) 9) Famille de plasmides recombinants, caracté- rlsée en ce que chaque plasmide contlent au moins une sé- quence hybrlde d'aclde nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. ') Plasmide selon la revendication 9, dénommé pEP1726, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés suivantes: - il comprend 6,1 kb; - il est obtenu par ligatlon du plasmide pJC2431 portant le gène de structure de la phosphatase al- callne et le gène de résistance à l'ampicllllne (Ape), -le- dit plasmlde étant linéarlsé par l'enzyme de restriction Bcl I située au nlveau du codon 28 dudit gène de structure de la phosphatase alcaline, avec le fragment Sau 3AI-Sau 3AI de 192 paires de bases codant pour l'érabutoxlne a. 11') Microcrganisme obtenu par transformation génétique, caractérisé en ce qu'il est obtenu par transfor- 2o mation d'une souche appropriée d'E. Coli par un plasmlde selon la revendication 9 ou la revendication 10. 12') Microorganisme selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il correspond à une souche CC118 d'E. Coli transformée par le plasmlde pEP1726 selon la revendi- cation 10. 13') Microorganisme selon la revendication 12, dénommé SEP 1726, caractérisé en ce qu'il a été déposé en date du 2 juin 1989 sous le numéro 1-862 auprès de la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur. 14') Protéine, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence hybride comprenant au moins un fragment d'une enzyme exportée ou sécrétée par un micro- organlsme notamment choisi dans le groupe qui comprend les bactéries et les levures et une protéine appropriée, dont l'extrémité N-terminale libre et/ou l'extrémité C-terminale libre ne sont pas essen- tielles à sa structuration et & l'expression de certaines de ses activités biologlques, ladite protéine hybride pos- sédant à la fois les propriétés de l'enzyme et certaines propriétés de la protéine, notamment celle d'interagir spé- cifiquement avec un anticorps ou un antigène. ') Protéine hybride selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle contient une enzyme cholsle dans le groupe qul comprend notamment la phosphatase alca- 1G line, la phosphatase aclde et la phosphodiestérase cy- clique, ladite enzyme étant associée à une protéine notam- ment cholsle dans le groupe qui comprend les fragments simple chaîne analogues aux fragments variables des lmmuno- globullnes et les toxines. 16') Protéine hybride selon la revendication 14 ou la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle comprend la phosphatase alcaline associée à une neurotoxlne. 17') Protéine hybride selon la revendication 16, caractérisée en ce que la neurotoxine est l'érabutoxlne a (ea) et présente la séquence en aminoacides déduite de la formule I selon la revendication 8. 18') Vecteur d'expression d'une protéine hy- bride selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) une origlne de réplicatlon dans un micro- organisme h8te approprié, notamment une bactérie ou une le- vure; (b) un gène de structure d'une enzyme exportée ou sécrétée par une bactérie appropriée, dans lequel est 3C insérée une séquence d'acide nucléique appropriée; (c) un promoteur approprié; (d) un signal de terminaison approprié. 19') Vecteur d'expression selon la revendlca- tion 18, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) une origine de réplication dans E. Coli; (b) un vecteur pJC2431 comprenant au niveau d'un site de restriction approprié de la partie codante du gène de structure de la phoA codant pour la partie NH2 ter- mlnale de celle-cl, une séquence appropriée d'acide nu- cléique. 20') Vecteur selon la revendication 18 ou la revendication 19, caractérisé en ce que ladlte séquence d'acide nucléique est une séquence hybride selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 21') Vecteur selon l'une quelconque des reven- Ic dlcatlons 18 à 20, caractérisé en ce qu'il correspond à un plasmide selon la revendication 9 ou la revendication 10. 22) Vecteur selon la revendication 18 ou la revendication 19, caractérisé en ce que ladite séquence d'aclde nucléique est un polyllnker, apte à recevoir au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une pro- téilne appropriée. 23') Processus d'expression d'une protéine hy- bride selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 18 à 22 dans un mlcroorganlsme selon l'une quelconque des reven- dlcations 11 à 13. 24') Réactif de diagnostic, caractérisé en ce qu'il est constitué par une protéine hybride selon l'une - quelconque des revendications 14 à 17. ') Procédé de dosage immunoenzymologique de protéines, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter des protéines présentes dans un fluide biologique en mettant en présence ledit fluide biologique avec le.réactlf de dia- gnostic selon la revendication 24, la lecture du résultat étant directe. 26') Procédé selon la revendication 25, carac- térisé en ce que lesdites protéines sont des antigènes. 27') Procédé selon la revendication 25, carac- térisé en ce que lesdites protéines sont des anticorps. 28') Trousse prête à l'emploi pour dosage enzymoimmunologique, caractérisée en ce qu'elle comprend outre les quantités appropriées de tampons et réactifs utiles pour la mise en oeuvre dudit dosage, des quantités appropriées du réactif selon la revendication 24.