FR 2650506 A1 19910208 FR 8909305 A 19890711 1i 2650506 La présente invention concerne du galactanne à faible poids moléculaire extraits de Klebsiella, son procédé d'obtention, son application à titre de médicament, en particulier comme immunostimulant-. La demande de brevet français FR 2 574 429 décrit des acylglycannes extraits de KlebsieLla constitués d'environ 80% d'oses neutres, 20% de lipides, moins de 2% de protéines, ayant un poids moléculaire d'environ 12500 et renfermant ur.encha!nement de galactoses liés en 1-3. Ils sont doués de propriétés antiallergiques et immunomodulatrices. La présente invention concerne du galactanne extrait de KlebsieLla, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué d'oses neutres. La composition en oses neutres est déterminée par chromatographie en phase gazeuse après méthanolyse selon la méthode de ZANETTA J. Chromato. (1972) 69, p. 291 ou la méthode de KAMERLING (Biochem J. (1975), 151 p. 491). La présente invention concerne plus particulièrement du galactanne, caractérisé en ce qu'il est constitué-d'un enchaînement linéaire de galactoses en 1-3 et ont un poids moléculaire compris entre 4000 et 10000. Ces polysaccharides sont exempts de lipides et de protéines. La composition en galactose est déterminée par chromatographie en phase gazeuse, après réduction et méthanolyse. Les lipides sont dosés par chromatographie en phase gazeuse après méthanolyse. Les protéines sont dosées par la méthode de LOWRY (J.B.C. (1951), 193, p. 265-273). La séquence d'enchaînement des galactoses est déterminée par les méthodes classiques de méthylation, analyse par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectométrie de masse, oxydation périodique, RMN de 1H et 13C. Les résultats montrent que le galactanne est formé d'une chaîne linéaire de résidus de galactoses reliés par des liaisons alpha (1-3) 50% et bêta (1-3) 50%, avec un motif de répétition constitué de 8 résidus galactopyranose et 1 résidu galactofuranose. Le galactanne se-présente sous forme d'une poudre blanche lyophilisée hydrosolub le. Le galactanne de l'invention peut être extrait de-différentes espèces de Klebsiella. On retient particulièrement ceux qui proviennent de Klebsiella pneumoniae et tout particulièrement ceux qui proviennent de la souche déposée à l'Institut Pasteur à Paris ou Collection Nationale de Culture de Microorganismes sous les numéros 52145 et 1-163, et à la National Culture Type Collection sous le nu 5055. Cette souche est depuis longtemps commercialisée et librement disponible auprès du public, notamment auprès de l'Institut Pasteur à Paris sous le nu 52145; cette souche a de plus été 2 2650506 déposée par la demanderesse le 25 juin 1981 sous le nm 1-163 à l'Institut Pasteur à Paris (CNCM) Collection Nationale de Culture de Microorganismes. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention du galactanne, tel que défini ci-dessus, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on traite un acylglycanne extrait de Klebsiella, essentiellement constitué d'environ 80% d'oses neutres, 20% de lipides, moins de 2% de protéines et ayant un poids moléculaire d'environ 12500, par hydrolyse douce, chromatographie à haute performance sur échangeur d'anions, récupère la fraction non retenue, soumet à une filtration sur gel, récupère la fraction contenant le galactanne de poids moléculaire compris entre 4000 et 10000. Le galactanne de Klebsiella de départ peut être obtenu à partir d'un extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella par chauffage puis fraction- nement chromatographique. De telles préparations ont déjà été décrites dans la demande de brevet francais FR 2 574 429 et le brevet allemand DE 3 543 267. L'extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella a été préparé selon les procédés décrits dans les brevets FR 2 490 496 et EP 49182. Selon des conditions-préférentielles de mise en oeuvre du procédé selon l'invention: - L'hydrolyse acide douce de l'acylglycanne est effectuée dans une solution à 1% d'acide acétique par chauffage à 100cC pendant 90 minutes; le précipité formé, qui renferme la fraction lipidique, est éliminé par centrifugation, par exemple 30 minutes à 2000 G. Le surnageant qui renferme le galactanne est recueilli et peut être lyophilisé. - Le galactanne est alors séparé du surnageant par fractionnement chromatographique. On recueille la fraction constituée d'oses neutres. Ce fractionnement peut être effectué par chromatographie sur échangeurs d'anions, de préférence par chromatographie haute performance, par exemple sur Magnum 9SAX Whatman. La chromatographie à haute performance sur échangeur d'anions consiste à séparer le galactanne par élution à l'eau. La fraction intéressante, constituée d'oses neutres, est repérée par défection spectro- photométrique à 200 nm et à 492 nm après coloration au test phénol-acide sulfurique, selon la méthode de DUBOIS (Anal. Chem. (1956) 28, p. 350). - Ladite fraction, constituée d'oses neutres, est soumise à une filtration sur gel qui permet de récupérer la fraction contenant du galactanne de poids moléculaire compris entre 4000 et 10000. La filtration sur gel est effectuée sur des supports commercialisés, par exemple sur Sephadex ou Biogel agarose; on utilise de préférence Biogel A-1.5M. La présente invention a également pour objet le galactanne obtenu par le procédé décrit ci-dessus. Le galactanne extrait de Klebsiella, objet de la présente invention, 3 -2650506 possède de très intéressantes propriétés pharmacologiques; il est doué notamment de remarquables propriétés immunostimulantes ainsi que d'une bonne tolérance. Il possède notamment la propriété de stimuler la production d'Il1 et de TNF au niveau des macrophages et surtout de stimuler la génération de radicaux libres (polynucléaires). Il permet également de synergiser l'effet du GM-CSF (granulomonocyte-Colony Stimulating Factor). Ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie expérimentale. Ces propriétés justifient l'utilisation du galactanne extrait de Klebsiella tel que défini ci-dessus à titre de médicaments. Ces médicaments trouvent, par exemple, leur emploi dans le traitement ou la prévention chez l'homme des immunodépressions, des maladies infectieuses causées par les bactéries ou les virus, dans le traitement des maladies à parasites, des toxi-infections, dans le traitement des infections posthospitalières et postchirurgicales et des allergies de toutes origines. Ces médicaments peuvent également être utilisés très avantageusement dans le traitement des greffes de moelle osseuse et des aplasies médullaires post- chimiothérapiques. La dose usuelle, variable selon le produit utilisé, le sujet traité et l'affection en cause, peut être par exemple de 0,5 à 5 mg par jour, par voie orale. L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques'qui renferment le galactanne extrait de Klebsiella tel que défini ci-dessus, à titre de principe actif. A titre de médicaments, le galactanne extrait de Klebsiella tel que défini ci-dessus, peut être incorporé dans des compositions pharmaceutiques destinées à la voie digestive, parentérale ou locale. Les compositions pharmaceutiques correspondantes peuvent être, par- exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par exemple, les comprimés, simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les solutions, les sirops, les suppositoires, les préparations injectables lyophilisées ou-non, les ovules, les crèmes, les pommades, les lotions, les gouttes, les collyres, les aérosols; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employes dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs. Il va être donné maintenant à titre non limitatif, des exemples de mise 4 2650506 en oeuvre de l'invention. ExewpLe 1: préparation du gaLactanne. On soLubilise 334 mg d'acyLgLycannes de KLebsiella (obtenus comme indiqué à L'exemple 1 de La demande française n= 2 574 429 à partir de La souche déposée à L'Institut Pasteur sous Le nu 1-163) dans 33,4 cm3 de solution d'acide acétique à 1% et l'on chauffe à 100C pendant 90 minutes. Apres refroidissement, on sépare le précipité contenant la fraction lipidique par centrifugation à 2000 G pendant 30 minutes. On lyophilise le surnageant et isole 200 mg de résidu que l'on redissout dans 4 cm3 d'eau. On chromatogra- phie, par fractions de 1 cm3, sur une colonne pour chromatographie à haute performance d'échangeur d'anions Whatman Magnum 9 SAX (9,4 mm *50 cm), en éluant par l'eau pendant 30 minutes, sous un débit de 2 cm3/minute en détectant à 200 nm. On isole la fraction renfermant les oses neutres repérées à 492 nm, après le test au phénol-sulfurique. On isole par lyophilisation 55 mg de fraction neutre. Exemple 2: isolement du galactanne. Le lyophilisat précédent est dissous dans du tampon eau-acide acétique- pyridine (973-7-20), puis on soumet à une filtration sur gel par chromatogra- phie sur colonne de Biogel A.1.5M (2 cm *1.5m), équilibrée avec le même tampon et en éluant sous un débit de 12 cm3/heure avec le même tampon. On recueille la fraction détectée au test phénol-sulfurique. On stérilise par filtration sur membrane 0.22 y, puis on lyophilise et obtient 22 mg du galactanne attendu. ExempLe 3: On a préparé des comprimés répondant à la formule: - Produit de l'exemple 2....................................... 1 mg - Excipient q.s. pour un comprimé terminé à................... 100 - mg. (Détail de l'excipient: lactose, amidon, talc, stéarate de magnésium). Exemple 4: On a préparé des aérosols délivrant des doses contenant chacune: - Produit de l'exemple 2...................................... 0,5 mg Emulsifiant.................................................. 0,15 mg - Propulseur.50 mg. - Propulseur.................................................. 50 mg. Exemple 5: On a préparé une crème répondant à la formule: - Produit de l'exemple 2... ................................. 1 mg - Excipient: alcool 2-octyldodécanol, alcool cétostéarylique, cétostéaryl sulfate de sodium, parahydroxybenzoate de méthyle et..DTD: de propyle,.eau purifiée...................................... 10 mg. ETUDE PHAMACOLOGIQUE 1.- Activation de poLy.orphonuclêaires in vitro. Méthode: On utilise la technique de chimiluminescence décrite par B. DESCAMPS- LATSCHA Eann. immunol Institut Pasteur (1982) 1330, 349-3643 pour évaluer l'activation du métabolisme oxydatif phagocytaire des polynucléaires péritonéaux élicités chez la souris au thioglycolate, puis isolés par centrifugation à 500 G, par incubation in vitro avec le galactanne suivie d'une incubation avec le zymozan A. Résultats: Par incubation de 1.5 *106 cellules par ml, pendant 20 minutes à 37uC avec le galactahne à tester à la concentration de 1 à 100 lig/ml, puis 10 minutes à 37tC avec le zymozan A à la concentration de 2 g/litre, on mesure le rapport de stimulation propre du galactanne, parallèlement à celui de lipopolysaccharide de Klebsiella. TABLEAU I l b!!l Il! Concentration! RS ----------à----------------I---------- galactanne I pg/ml! 0,96 ! 10 ! 0,94 ! 100! 2,30 ------------!----------------!---------1 LPS de Kb! 0,4 ng/ml! 1,20 I |! 4!.0,80 ! 40 ! 1,06 l! -! - 2.- Etude sur des celLuLtes médullaires totales. cellules de moelle osseuse sont mises en culture en agar en présence de 10-4mg/ml de GM-CSF humain avec ou sans galactanne (produit obtenu à l'exemple.). Les colonies granulocytaires monocytaires sont comptées après 14 jours d'incubation à 37mC. Le nombre de colonies indiqué est la moyenne de 2 boites. Les résultats obtenus figurent dans le tableau II ci-après. lnas s3-wE) ne;3oddeJ Jed euuei.eleS 0ú ep Sd L'o + 1S3-W9 ep aDuesgJ'd ua saLuolo3 sap ajqwou np aALeDLLU.BLS uoL;e;uawne aun.u.Leqo uo,l enb. uaJ;uou snuaeqo sze1lnsaJ sel I i i i i i i I IZL i S'IZL i 5'u i 5'Li.0 i O iú dx3 z i----- i- -i -- i----.. ...i--..-.---.I IrOL i 6 L i 6r L'O; i i I I euuesele9 + S3-W S-W9;S-9i auueoele9 1 i o OZ III nV318Vi sqJde- LO III nealqe:. el suep:uaJn5L4 snua:qo s:eilnsJ sal -amin ap aj:kL.Lll. Lw Jed sainllao OOL'Z ap aJqwou ne sazauawasua sLnd lloL4 jed sagJedgs; uos asnasso allaow ap saalonuouow salnllao sal s *-euLeUnq asnsso lla0O ap salonuouou sainlla3 sap Jns eapn;3 -ú euueoele5 ap uoL:kLppe saJde seLuoloO sap aJqwou np eAL:eDL.LU.LS SqJ uoL:;euewfne aun;uaL:qo uo,1 enb; ueajuow snueaqo s;eZInsaj sae I i i i i T I 0i Zú i S- i Z/ i S'úú i O i O Z dx3 I i i i i i i I 9ú i 5'úú i Lú i ZZ i iLdx3 6r O1; i L i Bd 6L' 0 i i i S I auue2;e1e9 + Asi-WD i sD-w9i auue;ele e 0j1 i SOSQS9ZII 9l SOS9Z 9 7 2650506 REVENDICATIONS 1.- Le galactanne extrait de Klebsiella, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué d'oses neutres. 2.- Le galactanne selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un enchaînement linéaire de galactose en 1-3 et a un poids moléculaire compgis entre 4000 et 10000. 3.- Le galactanne selon les revendications 1-ou 2, caractérisé en ce qu'il provient de Klebsiella pneumoniae. 4.- Le galactanne selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il provient de la souche déposée à l'Institut Pasteur à Paris ou Collection Nationale de Culture de Microorganismes sous les nupéros 52145 et 1-163 et à la National Culture Type Collection sous le nu 5055. 5.- Procédé d'obtention du galactanne, tel que défini à l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on traite un acylglycanne extrait de Klebsiella, essentiellement constitué d'environ 80% d'oses neutres, 20% de lipides, moins de 2% de protéines et ayant un poids moléculaire d'environ 12500, par hydrolyse acide douce, chromatographie à haute performance sur échangeur d'anions, récupère la fraction non retenue, soumet à une filtration sur gel, récupère la fraction contenant les galactannes de poids moléculaire compris entre 4000.et 10000. 6.- Procédé d'obtention du galactanne, tel que défini à l'une des revendications 1 à 4, dans lequel on prépare un acylglycanne à partir d'un extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella par chauffage puis fractionnement chromatographique, caractérisé en ce que l'on traite ledit acylglycanne par hydrolyse acide douce, chromatographie à haute performance sur échangeur d'anions, récupère la fraction non retenue, soumet à une filtration sur gel, récupère la fraction contenant les galactannes de poids moléculaire compris entre 4000 et 10000. 7.- Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que l'hydrolyse acide douce est effectuée dans une solution à-1% d'acide acétique par chauffage à 100mC pendant 90 minutes, - la chromatographie à haute performance-sur échangeur d'anions consiste à repérer le galactanne par élution à l'eau. 8.- Le galactanne obtenu par le procédé selon l'une des revendications , 6 ou 7. - 9.- Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par le galactanne tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 4. 10.- Médicaments, caractérisés en ce qu'ils-sont constitués par le galactanne tel que défini à la revendication 8. 11.- Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment, à titre de principe actif, l'un au moins des médicaments tels que définis à l'une quelconque des revendications 9 ou 10.