FR 2659076 A1 19910906 FR 9002689 A 19900302 La présente invention concerne un procédé biologique pour la dénitrification de milieux liquides Elle a égale- ment pour objet un appareillage pour la mise en oeuvre d'un tel procédé L'accumulation de nitrates dans l'eau est un problème grave dans de nombreux pays et plus particulièrement dans lespays à agriculture intensive Parmi les différentes techni- ques disponibles pour l'élimination des nitrates de l'eau, seules les techniques de dénitrification par échange d'ions et la dénitrification bioloqigue sont considérées comme étant possibles à mettre en oeuvre à grande échelle. De nombreuses difficultés pratiques sont rencontrées dans le cas des procédés par échange d'ions, notamment l'encrassement des résines, ainsi que la production de grandes quantités de déchets,les nitrates n'étant pas élimi- nés La dénitrification biologique apparaît donc comme la technique la plus adaptée à l'élimination des nitrates Dans la plupart des cas, une source carbonée organique doit être ajoutée à l'effluent L'éthanol et l'acide acétique sont utilisés communément à cet usage Cependant, en raison des contaminations microbiologiques et chimiques, cette techni- que de dénitrification conduit à des effluents de mauvaise qualité, nécessitant ainsi des traitements ultérieurs afin de garantir la qualité de l'eau, et en particulier de l'eau destinée à la consommation humaine. L'immobilisation des microorganismes effectuant la dénitrification permet de supprimer en partie les effets né- fastes de ce type de traitement, en réduisant la fuite des microorganismes dans le milieu traité Différentes études sur la dénitrification de l'eau par des microorganismes im- mobilisés ont déjà été publiées (Nilsson et al) European J Appl Microbiol, 1980, 10: 261-274; Vossoughi et al, Water Res, 1982, 16: 995-1002; Lemoine et al, Biotechnol. Lett, 1988, 10 399-402),Kokusuta et al J Ferment Technol. 1986, 64,533-538). Un procédé original a été développé dans lequel les microorganismes sont piégés dans une couche d'agar associée a une membrane microporeuse Dans ce système qui est une ap- plication de l'invention ayant fait l'objet du brevet français 86 05 633, la membrane joue le rôle de filtre évi- tant ainsi la fuite des microorganismes (bactéries de l'espèce Pseudomonas putrefaciens),du gel de polysaccharide durant les périodes d'incubation (Lemoine et al Biotechnol. Lett, 1988, 10, 399-402) De l'eau contenant un fort taux de nitrate ( 3 m M) complétée avec du méthanol comme source de carbone est traitée et on observe une disparition des nitra- tes sans production d'ions ammonium Les taux de dénitrifi- cation dans cette étude sont,lors de l'utilisation de méthanol comme source de carbone, de 90 micro moles d'ions nitrate éliminés par jour et par gramme de gel d'agar. Le système de dénitrification décrit dans cette pu- blication ne résoud cependant pas le problème de la contami- nation de l'eau à épurer par la source de carbone Des réacteurs à double flux sont déjà connus dans l'art antérieur dans des utilisations qui sont différentes de la dénitrification de l'eau et qui ne permettent pas l'immobilisation de microorganismes La demande de brevet GB 2 164 663 décrit un réacteur à double flux dans lequel des enzymes ou des bactéries sont retenues dans l'espace formé par deux membranes microporeu- ses, ces membranes étant au contact des deux flux contenant les réactifs Outre le fait qu'aucune application ne soit réellement décrite concernant des microorganismes, il n'est pas fait mention d'immobilisation d'enzymes ou de microorga- nismes En effet, selon une mise en oeuvre préférentielle de cette invention, les enzymes sont simplement adsorbées sur une surface appelée "spacer" située dans l'intervalle compris entre les deux membranes Cet appareillage, avec ou sans "spacer ", ne permet donc en aucune façon une immobi- lisation effective des agents biologiquement actifs. L'immobilisation des microorganismes présente de nom- breux avantages qui ont été largement décrits dans l'art an- térieur et notamment dans la demande de brevet française 86 05 633 En particulier, lorsque des microorganismes sont immobilisés dans un support permettant leur croissance,la population cellulaire interne augmente quand les microorga- nismes sont mis en présence d'un substrat On peut ainsi parvenir à haut niveau d'activité enzymatique cellulaire En outre, il est bien établi que l'immobilisation assure une stabilisation dans le temps de l'activité cellulaire L'objet de la présente invention est de permettre la dénitrification de liquides et notamment de l'eau destinée à la consommation humaine,en évitant la pollution de ces liquides par les microorganismes et par la source carbonée indispensable à une dénitrification par ces micro- organismes tout en procurant aux microorganismes des condi- tions physiologiques adéquates. Selon l'invention, on a constaté qu'une telle déni trification pouvait être mise en oeuvre à l'aide d'un systè- me à double flux permettant ainsi la séparation des flux de liquide à dénitrifier et de liquide contenant la source carbonée Il est d'autre part apparu de manière surprenante que, outre les effets positifs sur les microorganismes pré- cédemment cités, l'immobilisation des microorganismes dans ce système à double flux permettait un contrôle de leur ac- tivité et donc une optimisation de la dénitrification micro- biologique et que l'activité de ce système dépendait de facteurs liés à la diffusion des effecteurs du système bio- logique, et en particulier des substrats, dans le support. La présente invention a donc pour objet un procédé biologique pour la dénitrification de milieux liquides par réduction des nitrates à l'aide d'une source de carbone et d'un système biologique immobilisé capable d'assurer la dé- nitrification avec lequel on met en contact le liquide à dé- nitrifier, caractérisé en ce que les nitrates et la source de carbone sont fournis sous la forme de deux flux liquides audit système biologique et en ce qu'on fixe à une valeur comprise entre deux seuils prédéterminés, l'épaisseur de la couche d'immobilisation du système biologique. Pour chaque situation on déterminera par une expé- rience de routine les seuils limites,qui dépendent de la na- ture et de la concentration du gel et des substrats. Le fait de fournir sous la forme de flux séparés les nitrates et la source de carbone évite la contamination des milieux liquides contenant ces nitrates par des composés carbonés nuisant à la qualité des milieux dénitrifiés. Le système biologique de dénitrification peut être immobilisé par piégeage dans un support situé entre les deux flux liquides qui peut être circonscrit par deux mem- branes au contact respectif des deux flux liquides et ayant une porosité permettant la libre circulation des substrats et des produits de la réaction de dénitrification tout en retenant le système biologique Le piégeage du système bio- logique permet d'éviter sa déssimination dans les deux flux de milieux contenant des nitrates et des sources de carbone et a aussi une influence sur son activité. Le fait que ce support soit circonscrit par deux membranes, permet de réduire encore plus la fuite du sys- tème biologique dans les milieux. L'immobilisation dans un support homogène du système biologique permet une autorégulation de l'activité de ce système en fonction de l'intensité des deux flux. Ce système biologique de dénitrification peut notam- ment être au moins un microorganisme et préférentiellement des bactéries du genre Pseudomonas en particulier Pseudomonas denitrificans Tout autre type de microorgani- smes capable de respirer les nitrates en anaérobiose convient, par exemple ceux cités par Knowless (Microbiol Review, 1982, 46, 43-70) Dans ce cas, les mi- croorganismes développent leur activité maximale dans la zo- ne du support o les deux flux vont se rencontrer et il se forme un gradient de dénitrification dans l'épaisseur de support présentant une activité minimale le long des mem- branes Contrairement aux procédés dans lesquels les mi- croorganismes ne sont pas immobilisés, ou sont adsorbés de manière non homogène, le procédé de la présente invention permet une modulation dans l'espace de l'activité du système biologique Il est ainsi possible de contrôler le rapport des deux flux afin de permettre une activité optimale du système de dénitrification en influant sur le débit de l'un ou de l'ensemble des deux flux. Le support dans lequel est piégé le système biologi- que peut notamment être un gel de polysaccharides et en par- ticulier un gel d'agar et la membrane peut avoir une taille de pores comprises entre 0,2 et 1 micron environ. La source de carbone peut être du méthanol, de l'acide acétique,des sucres réducteurs, des composés aroma- tiques, ou toute source de carbone organique servant de don- neurs d'électrons et notamment des effluents industriels ou eaux usées contenant des composés organiques Dans ce cas, l'utilisation de ces effluents permettra une épuration à moindre coût des milieux à dénitrifier et l'épuration des- dits effluents par baisse de la DBO (Demande Biochimique en Oxygène). Les milieux à dénitrifier peuvent notamment être de l'eau destinée à la consommation humaine ou des eaux de ré- génération des colonnes de dénitrification échangeuses d'ions Le système biologique peut aussi être un complexe multi-enzymatique comprenant les enzymes nécessaires à la dénitrification des milieux liquides. Afin d'assurer une activité optimale du système de dénitrification le rapport C/N de la quantité molaire de source de carbone par rapport à la quantité molaire de ni- trates doit être comprise préférentiellement entre 2 et 6 et en particulier entre 2,5 et 3,5 Ce rapport est ajusté par réglage de la quantité de l'un ou l'autre des flux. L'invention a d'autre part pour objet un appareilla- ge pour la mise en oeuvre du procédé de dénitrification comprenant deux compartiments séparés par une couche de sup- port homogène ( 1) du système biologiquement actif, circons- crite sur chacune de ses deux faces par une membrane microporeuse ( 2) et au moins deux orifices d'entrée ( 6) et de sortie ( 7) respectifs des flux dans les compartiments. Préférentiellement, le support est constitué d'une couche d'un gel de polysaccharide et en particulier d'un gel d'agar, d'une épaisseur comprise entre 1 et 10 mm et de préférence entre 2 et 5 mm. L'épaisseur de la couche de support est importante dans ce type de réacteur à% double flux du fait des contrain- tes de diffusion qui empêchent la pénétration des substrats en profondeur dans le support La description qui suit donne à titre illustratif et non limitatif des exemples d'application de l'invention. La figure 1 est une vue éclatée d'un appareillage de type bioréacteur destiné à la dénitrification de milieux aqueux. La figure 2 représente une coupe schématique longi- tudinale de cet appareillage. La figure 3 représente l'évolution en fonction du temps, de la concentration en ions nitrate, nitrite dans le compartiment des milieux à dénitrifier et en acétate dans le compartiment de la source de carbone. EXEMPLE 1 Procédé et dispositif de dénitrification a) souche de bactéries et conditions de culture. Une souche de Pseudomonas denitrificans déposée au- près de la Collection Nationale de l'Institut Pasteur sous le n 63-54, est cultivée sur le milieu de Mueller-Hinton solide et incubée à 300 C durant 36 heures. Les colonies obtenues sont repiquées et resuspendues dans 70 ml de milieu de Mueller-Hinton liquide et incubées à 30 C dans un bain marie à agitation Après incubation les cultures sont centrifugées 10 minutes à 2000 g, et le culot obtenu est resuspendu dans de l'eau distillée stérile. b) immobilisation des bactéries. 0,36 g d'agar est dissous dans 19 cm 3 d'eau distil- lée par chauffage de la suspension à 100 C Après refroidis- sement à 45 C la solution est mélangée avec 1 cm 3 d'une suspension cellulaire dense. 11 cm 3 de ce mélange sont versés dans la cavité rec- tangulaire d'un moule obtenu en superposant deux plaques de plastique rigide, la partie supérieure de ce dispositif ayant une ouverture rectangulaire Le moule est fermé par une autre plaque rigide de plastique avant que le mélange cellules-agar ne durcisse La couche d'agar biocatalytique obtenue a les caractéristiques suivantes: contenu en agar: 1,8 % en poids/ volume longueur: 185 mm largeur: 20 mm épaisseur: de 3 à 7 mm surface: 37 cm 2 contenu cellu: laire: environ 108 cellules/cm 3 de gel correspondant à environ 0,02 mg de cellules en poids sec par cm 3 de gel c)prétraitement de la couche d'agar La couche d'agar est incubée dans le milieu de Mueller Hinton durant 36 heures à la température ambiante. L'ensemble du dispositif est alors lavé par immersion durant 24 heures dans de l'eau de source. d)description de l'appareillage Les figures 1 et 2 représentent un bioréacteur cons- titué d'une couche de support homogène ( 1) circonscrite sur chacune de ses deux faces par des membranes microporeuses ( 2) sur lesquelles sont positionnées des pièces intercalai- res ( 3) assurant la libre circulation des flux liquides ap- portés par les orifices d'entrée ( 6) et de sortie ( 7) des flux aménagés dans les pièces de maintien ( 4) Ces deux piè- ces intercalaires forment ainsi deux compartiments A et B correspondant respectivement au compartiment de l'eau à dé- nitrifier et au compartiment de la solution aqueuse conte- nant la source de carbone. Les membranes microporeuses ont une taille de pores de 0,45 microns (Millipore type Durapore). e)conditions expérimentales Les solutions sont stockées dans des réservoirs ex- ternes, dans lesquels un barbotage d'hélium assure des conditions d'incubation anaérobies Les expérimentations sont mises en oeuvre à la température ambiante ( 200 C). L'acide acétique est utilisé comme source de carbone à une concentration comprise entre 2,5 m M et 15 m M selon le rapport carbone/azote (C/N)voulu. Durant les expériences préliminaires effectuées dans le but de déterminer l'épaisseur optimale de la couche d'agar, les solutions contenant l'acétate et les nitrates sont recyclées en utilisant une pompe péristaltique ayant un débit de 40 cm 3 par heure Pour les autres essais, les cir- cuits sont ouverts et les solutions aqueuses circulent de manière continue sans recyclage, le milieu frais étant in- jecté à la base des compartiments Dans toutes ces expéri- mentations le même débit est appliqué dans les deux chambres. Le milieu à dénitrifier consiste en de l'eau de source en bouteille (p H 7) complémentée avec du Na NO 3 à 2,5 m M L'acide acétique est dilué dans de l'eau distillée sté- rile Le p H des solutions est ajusté à 6,3. f)procédure d'analyse Les quantités de nitrate et de nitrite dans les mi- lieux liquides sont déterminées à l'aide d'une colonne HPLC à échange d'anions (Hamilton PRPX 100) La phase mobile est constituée par le sel de sodium de l'acide para hydroxy- benzoique à une concentration de 4 m M, à p H 8,5. La colonne HPLC est couplée à un détecteur conductrimétrique de type LDC Milton-Roy La quantité d'acétate dans les milieux liquides est détectée par le même équipement, avec une phase mobile composée d'hydroxyde de potassium à une concentration de 3,2 m M, à p H 11,5. EXEMPLE 2: Détermination de l'épaisseur optimale de la couche d'agar Le tableau 1 résume les résultats obtenus avec dif- férentes épaisseurs de la couche d'agar,l'expérimentation ayant été effectuée en circuit fermé. On remarque que l'on obtient la meilleure activité dénitrifiante avec une couche d'agar d'une épaisseur de 3 mm tandis qu'aucune consommation de nitrate n'est détectée avec une couche d'agar de 7 mm. TABLEAU I Influence de l'épaisseur de la couche d'agar sur le taux de dénitrification Conditions d'incubation Na NO 3 2 5 m M, acide acétique 7 5 m M (C/N= 3). I I -I- Epaisseur de la couche | I I d'agar (mm) J 3 5 J 7 I mg NO 3 hl 0,8 0,3 O taux maximum de dénitri-J l I I fication micromol NO 3 h-l J 13,0| 5,1 | O ___________________________________________________________ EXEMPLE 3: Cinétique de la réaction L'évolution de la concentration des ions nitrates et nitrites dans l'eau traitée est montrée sur la figure 3 représentant l'évolution des concentrations en nitrate(O)en nitrite (o) dans le compartiment A et en acétate (I) dans le compartiment B en fonction du temps exprimé en heures, dans un système en continu On remarque sur cette figure que la concentration en nitrate décroît durant la première semaine de l'expérience et se stabilise ensuite Cette activité dénitrifiante est stable durant 18 jours sans contamination microbienne nota- ble de l'eau traitée. L'évolution en fonction du temps de la concentration en acétate dans le compartiment B est à peu près similaire à celle des nitrates dans le compartiment A. La diminution de la concentration en nitrate dans le compartiment A est accompagnée d'une augmentation de la concentration en ions nitrites (NO 2-). EXEMPLE 4 Influence du rapport C/N sur l'efficacité du réacteur Afin d'étudier l'effet du rapport C/N sur le procédé d'élimination des nitrates, le réacteur est utilisé en continu avec différentes valeurs de ce paramètre Les ré- sultats sont présentés dans le tableau 2. La capacité du réacteur exprimée en micromoles d'ions nitrate (N 03-) complètement réduits par jour et par cm 2 de surface active est calculée à partir du niveau d'activité rémanente. On remarque sur ce tableau qu'un rapport C/N de 3 est optimal en ce qui concerne l'activité du réacteur Avec un débit pour les deux solutions de 7,5 cm 3 par heure, le dispositif réduit complètement 5,2 micromoles d'ions nitrate par jour et par cm 2 de surface active avec une efficacité de 43 %. il TABLEAU 2 Effet de différents rapports C/N sur les performances du réacteur ( débit: 7 5 cm 3 h-1). à Ià I rapport C/N (mol/mol) 1 21 3 4 61 à l l taux de dénitrifi mg N 0-3 h-1 I 0,351 0,51 0,38 | 0,35 cation rémanent micromol No 3 h-1 5,6 8,0 6,1 5,6 capacité du micromol NO-3/ I l I réacteur | cm 2/jour 3,6 5,2 3,9 3,6 efficacité % | 30 | 43 32 30 EXEMPLE 5 Influence du débit des liquides sur les performances du réacteur. Ces expérimentations sont mises en continu avec une couche d'agar d'une épaisseur de 3 mm et un rapport C/N de 3. Une faible influence du débit sur les performances du réac- teur a été remarquée comme l'indique le tableau 3 Dans les conditions optimales, c'est-à-dire avec un débit de 17 cm 3 / heure, on observe une faible pollution du compartiment A par l'acide acétique, correspondant à 5 % de la concentration mesurée dans le compartiment B. De plus, aucun ion nitrate n'est retrouvé dans le com- partiment contenant l'acide acétique (compartiment B) La présence des ions nitrites est détectée dans les deux com- partiments à raison d'environ 11 mg /dm 3. - TABLEAU 3 Performances du réacteur pour différents débits àà-I à I I _ _ Débit d'eau (cm 3 h-1) j 6,6 J 7,5 9,8 J 13,5 j 17 O -l_i 1 J 1 taux de déni mg NO-3 h-1 0,40 0,50 0,45 0,431 0,60 trification micromol NO-3 h 6, 5 J 8,0 O 7,3 7 O 9,6 rémanant | _ capacité du micro NO-3/jour/ 3,0 5,2 4, 7 4,5 J 6,2 mol cm 2 l l l I réacteur | efficacité % 39 143 30 o 20 123 ____________________________________________________________ Les résultats décrits ci-dessus montrent que le procédé de dénitrification selon l'invention permet d'obtenir une élimination des nitrates comparable à celle observée précédemment dans des réactions à simple flux, quoique l'on observe des taux de dénitrification rémanents inférieurs à ceux précédemment observés Ces différences sont probablement dues aux limitations de diffusion des deux substrats à travers les membranes microporeuses et la couche d'agar. En ce qui concerne les contaminations chimiques de chacun des compartiments par les substrats de l'autre compar- timent, on remarque que la fuite d'acétate dans le comparti- ment des nitrates (compartiment A) est négligeable Les ions nitrites sont retrouvés dans les deux compartiments du réac- teur Plusieurs réacteurs peuvent être mis en série afin d'obtenir une eau destinée à la boisson présentant des concentrations en ions répondant aux normes. REVENDICATIONS l.Procédé biologique pour la dénitrification des mi- lieux liquides par réduction des nitrates, à l'aide d'une source de carbone, par un système biologique immobilisé ca- pable d'assurer la dénitrification avec lequel on met en contact le liquide à dénitrifier caractérisé en ce que les nitrates et la source de carbone sont fournis sous la forme de deux flux liquides audit système biologique et en ce qu'on fixe à une valeur comprise entre deux seuils prédé- terminés l'épaisseur de la couche d'immobilisation du systè- me biologique 2.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le système biologique est immobilisé par piégeage dans un support situé entre les deux flux liquides. 3.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le support est circonscrit par deux membranes au contact respectif des deux flux liqui- des, les pores de ces membranes ayant des diamètres permet- tant la libre circulation des substrats et des produits de la réaction de dénitrification tout en retenant le système biologique 4.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le système biologique est au moins un microorganisme capable de respirer les nitrates en anaérobiose. 5 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le microorganisme est un Pseudomonas et en parti- culier Pseudomonas denitrificans. 6.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le support est un gel de poly- saccharides et en particulier un gel d'agar 7.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la membrane a une taille de pores comprise entre 0,2 et 1 micron environ. 8.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la source de carbone est du méthanol ou de l'acide acétique 9.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la source de carbone est cons- tituée par des effluents industriels ou des eaux usées contenant des composés organiques. l O.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le système biologique est un complexe multi-enzymatique. 11 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le rapport molaire C/N de la source de carbone et des nitrates est compris entre 2 et 6 et préférentiellement 2, 5 et 3,5 et est ajusté par réglage de la quantité de l'un ou l'autre des flux. 12.Appareillage pour la mise en oeuvre du procédé se- lon la revendication ll,caractérisé en ce qu'il comprend deux compartiments A et B séparés par une couche de support ( 1) circonscrite sur chacune de ses deux faces par une membrane microporeuse ( 2) et au moins deux orifices d'entrées ( 6) et de sortie ( 7) respectifs des flux de liqui- de à dénitrifier et de source de carbone dans les comparti- ments 13 Appareillage selon la revendication 12, caracté- risé en ce que le support est constitué d'une couche d'un gel d'une épaisseur préférentiellement comprise entre 10 mm et en particulier entre 2 et 5 mm.