FR 2649991 A2 19910125 FR 8908897 A 19890703 ! Le brevet principal décrit la préparation de la sérum albumine humaine (SAH) en utilisant les levures comme cellules d'expression, et plus particulièrement les levures du genre Kluyveromyces. Parmi les systèmes d'expression décrits, figure notamment un système impliquant un plasmide circulaire isolé de K. drosophilarum, dit pKDl. Les recherches effectuées dans le but de produire l'albumine ont conduit à mettre en évidence l'intérêt et l'importance de certaines 1 0 des séquences de pKD1 dans l'efficacité et surtout la stabilité des plasmides d'expression les incorporant. La présente addition concerne plus particulièrement l'utilisation de ces éléments essentiels de pKD1 dans l'expression de protéines autres que l'albumine, notamment l'activateur tissulaire du I 5 plasminogène (tPA), l'inhibiteur des métalloprotéinases (TIMP), et les interleukines, par exemple l'interleukine-15 (Il-1l), ces protéines n'étant à considérer que comme des exemples destinés à démontrer que l'utilisation des dérivés du plasmide pKD1 est "générique", c'est-à- dire peu ou pas dépendante de la nature des protéines que l'on cherche 2 0 à faire exprimer et/ou sécréter. Plus particulièrement, la présente addition concerne des vecteurs d'expression d'une protéine déterminée, utilisables dans les levures du genre Kluyveromyces pouvant être obtenus à partir des plasmides pKan707 ou pCXJ1 qui font l'objet des revendications 28 et 2 5 29 du brevet principal, caractérisés en ce qu'ils comportent la séquence complète de pKD1, ainsi que la séquence codante pour ladite protéine sous le contrôle d'éléments génétiques assurant son expression dans la souche hôte. Plus particulièrement, on utilisera les séquences du plasmide 3 O pKD1 complet en veillant à ce que les séquences répétées inversées (SRI), l'origine de réplication et les gènes A, B et C soient intacts, par exemple en utilisant le pKD1 sous forme d'un fragment de restriction EcoRI. I1 est également possible d'utiliser comme zone de dclonage dans 3 5 pKDI la région de 197 nucléotides définie par les sites SacI (SstI) et MstII de pKD1, ou le site unique SphI. 22- Les vecteurs d'expression selon la présente addition sont plus particulièrement destinés à assurer la sécrétion de la protéine, c'est pourquoi les séquences codant pour les protéines peuvent être sous forme de séquences codant pour la pré-protéine ou la prépro-protéine ou bien comporter une séquence d'exportation (séquence signal) hétérologue, ou toute séquence améliorant la sécrétion de la protéine sous forme mature qui ne corresponde pas à la séquence signal de la protéine naturelle. Pour ce qui concerne les éléments assurant l'expression des 1 0 séquences codantes, ceux-ci sont déjà décrits en détail dans le brevet principal. Il s'agira notamment des promoteurs et terminateurs de gènes des levures Saccharomyces ou Kluyveromyces, par exemple les promoteurs et terminateurs des gènes tels que PGK, PHO, GPD ou LAC4. 1 5 D'autres éléments sont présents dans ces vecteurs, notamment des gènes marqueurs déjà décrits dans le brevet principal, par exemple des gènes de résistance comme le gène aph(3')-I du transposon Tn903 qui confère la résistance à la généticine (G418) ou des gènes complémentant des auxotrophies tels que URA3. 2 0 La présente addition concerne également les souches de Kluvveromvces transformées avec ces vecteurs, ainsi qu'un procédé pour préparer la protéine en cause. Parmi les souches qui peuvent être transformées avec les plasmides selon la présente addition, il faut citer plus particulièrement 2 5 les souches des espèces K. marxianus, K. wickerhamii K. waltii et notamment K. bulgaricus K. drosophilarum K. fragilis et K. lactis. L'invention concerne également un procédé de préparation desdites protéines mettant eri oeuvre la culture des souches de levures recombinantes dans un milieu approprié et dans lequel la protéine 3 0 déterminée est récupérée, soit au cours de la croissance pour les procédés continus, soit en fin de croissance pour les cultures en lots. Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente addition. Toutes les méthodes de biologie moléculaire telles que la 3 5 centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium- bromure d'éthidium, la digestion par les enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gels d'acrylamide ou d'agarose, l'électroélution des 3- fragments d'ADN, les remplissages des extrémités cohésives, la déphosphorylation, les ligatures, la transformation dans E. coli et dans K. lactis les gels PAGE-SDS colorés au bleu de coomassie, les immunoblots, la mutagénèse dirigée, etc... ont été réalisés tels qu'ils sont décrits dans le brevet principal. Exemple 1: Construction de vecteurs d' expression de l'interleukine-19 1 0 E.I.1.: Synthèse du gène structural de l'IL1p3. La synthèse chimique du gène structural correspondant à l'IL- 1 P3 a déjà été décrite (Jung et coll. 1988): en bref, le gène de structure a été assemblé à partir de 14 oligodésoxynucléotides synthétiques et se 1 5 présente sous la forme d'un fragment de restriction NdeI-HindIII. Par rapport à la séquence publiée par Auron et coll. (1984) le gène synthétique utilisé dans la présente addition contient les modifications suivantes: i) changement du codon AGC (Ser) en position 483 pour le codon TCC afin de supprimer le site HindIII; ii) substitution d'un T 2 0 par un C en position 506 pour éliminer le site NdeI; iii) création d'un site EcoRI suivi d'un site NdeI en position 435 (GAATTCATATG) incluant la méthionine initiatrice de la traduction; iv) addition de la séquence AAGCTT en position 896 pour introduire un site HindIII immédiatement en aval du codon de fin de traduction. 2 5 Le gène structural codant pour l'IL-1li recombinante est ainsi disponible sous forme d'un fragment de restriction EcoRI-HindIII contenu sur un dérivé du plasmide pUC19 désigné pCI131. E.1.2: Construction d'un vecteur de sécrétion contenant l'IL-1.3 sous 3 0 contrôle du promoteur PGK. de S. cerevisiae. Un fragment d' ADN correspondant au signal de sécrétion (région "pré") du gène de la toxine du plasmide killer K3 de K. lactis (Stark et Boyd, 1986) a été synthétisé sous forme des deux. 3 5 oligodesoxynucléotides suivants: ÀSqA: 5'AATTATGAATATATTTTACATATTTTTGTTTTTGC TGTCATTCGTTCAAGGTAAAAG-3' 264999'1 SqB: 5'-AATTCTrTTACCTTGAACGAATGACAGCAAAAAC AAAAATATGTAAAATATATTCAT-3' Ces deux oligodésoxynucléotides ont été hybridés, reconstituant ainsi la séquence signal de la toxine killer suivie d'un dipeptide LysArg qui représente un site de coupure potentiel reconnue par une endopeptidase, produit du gène KEXI de K. lactis (Tanguy- Rougeau et coll., 1988). Cette séquence est flanquée d'extrémités cohésives compatibles avec celles d'un site EcoRI. Dans cette construction seule l'extrémité située en aval de la séquence signal peut 1 O régénérer un site EcoRI fonctionnel. Ce fragment d'ADN a été cloné dans l'orientation désirée dans le site unique EcoRI du plasmide pEPGK41 générant ainsi le plasmide pSPGK1 (figure 1). pEPGK41 contient une cassette SalI-BamHI contenant le promoteur et le terminateur du gène PGK de S. cerevisiae identique à celle présente 1 5 dans le plasmide pYG12 (déjà décrit dans le brevet principal) à l'exception du site de clonage HindHI qui a été remplacé par un site EcoRI (voir la séquence donnée en figure 1). Du fait de la stratégie utilisée, le plasmide pSPGK1 possède donc un site EcoRI unique permettant le clonage de gènes de structure en aval de la séquence 2 0 signal synthétique. En vue d'obténir le gène de structure codant pour l'IL-11$ sous forme d'un fragment de restriction EcoRI, le plasmide pCI131 (voir chapitre E.1. 1) a été linéarisé avec l'enzyme HindIlI, traité avec le fragment Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli pour rendre les 2 5 extrémités franches, et ligaturé avec un linker EcoRI synthétique (5'- GGAATTCC-3'). Après coupure avec l'enzyme EcoRI, le fragment correspondant à la Met-IL-ltg a été purifié par électroélution et cloné dans le site EcoRI du plasmide pSPGK1 pour générer le plasmide pSPGK-IL17 (figure 2). Dans cette construction, la séquence codant pour 3 0 l'IL-11$ se trouve en phase traductionelle avec le signal de sécrétion dérivé de la toxine killer. Le début du gène d'IL-11$ mature (AlaProVal....) est séparé du site de coupure reconnu par la signal peptidase (GlnGly^) par le pentapeptide LysArglleHisMet. Le plasmide pSPGK-IL17 est la source d'un fragment de 3 5 restriction SalI-HindIII correspondant à la cassette d'expression (promoteur PGK / signal de sécrétion - ILi[ / terminateur PGK); ce fragment a été purifié par électroélution et cloné dans le plasmide -5 pCXJ1 (décrit dans la demande principal) coupé par les mêmes enzymes pour générer le plasmide pSPGK-IL21 (figure 3). Le plasmide pUC4K (Pharmacia) est la source du gène de résistance à la généticine (G418) qui a été purifié par électroélution sous la forme d'un fragment de restriction SalI. Ce fragment a été ensuite cloné dans le site SalI du plasmide pSPGK-IL21 pour générer le plasmide d'expression pSPGK- IL31 (figure 4). E.1.3: Construction d'un vecteur de sécrétion contenant l'IL-19 sous 1 0 contrôle du promoteur PHO5 de S. cerevisiae. Le plasmide de base pEPHO contient un fragment de restriction BamHI-PstI d'une taille de 0,94 kb constitué des régions promotrices et terminatrices du gène PHO5 de S. cerevisiae. Ce fragment provient ! 5 d'un fragment génomique BamHI-PstI de 2,03 kb (Bajwa et coll., 1984) dans lequel le gène de structure codant pour la phosphatase acide a été délété entre la position -4 (par rapport à l'ATG d'initiation de traduction) et l'unique site Sau3A localisé en aval du codon TAG de fin de traduction. A la jonction entre promoteur et terminateur un polysite de clonage EcoRI/SmaI/BamHI a été inséré permettant l'introduction d'un gène de structure incluant son codon d'initiation de traduction. L'intérêt du promoteur PHO5 reside dans le fait qu'il représente un système d'expression inductible chez K. lactis: comme 2 5 chez S. cerevisiae ce promoteur est reprimé en haute concentration de phosphate inorganique et induit en- milieu carencé en phosphate (Chen et Fukuhara, 1988). Le fragment EcoRI correspondant au signal de sécrétion du gène de la toxine du plasmide killer K1 de K. lactis (voir chapitre E.1.2) 3 0 a été cloné dans l'orientation désirée dans le site EcoRI du plasmide pEPHO pour générer le plasmide pSPHO4 (figure 5). Le fragment de restriction EcoRI correspondant à la Met-IL1l3 a été purifié à partir du plasmide pSPGK-IL17 (figure 2) et cloné dans le site EcoRI du plasmide pSPHO4 pour générer le plasmide pSPHO-IL14 (figure 6). Ce plasmide 3 5 est la source d'un fragment de restriction SalI-HindIII correspondant à la cassette d'expression (promoteur PHO5 / signal de sécrétion - IL1M / terminateur PHO5); ce fragment a été purifié par électroélution et clone dans le plasmide pCXJ1 coupé par les mêmes enzymes pour générer le plasmide pSPHO1L23 (figure 7). Le fragment de restriction SalI codant pour le gène de résistance à la généticine (G418) a été purifié par électroélution à partir du plasmide pUC4K puis clone dans le site SalI du plasmide pSPHOIL23 pour générer le plasmide d'expression pSPHO-IL35 (figure 8). Exemple 2: Stabilité des plasmides pSPGK-IL31 et pSPHO-IL35 dans la souche MW98-8C en conditions non sélectives de 1 0 croissance La stabilité mitotique des plasmides pSPGK-IL31 et pSPHO-IL35 a été suivi en fonction du temps et a été définie comme le pourcentage de cellules qui ont maintenues la capacité de pousser sur milieu 1 5 minimum sélectif (non supplémenté avec de l'uracile) après croissance d'un nombre de générations défini en milieu non sélectif. Comme l'indique la figure 9, ces 2 plasmides sont remarquablement stables bien qu'il existe une différence de stabilité entre la construction utilisant le promoteur PGK par rapport à la construction contenant le promoteur 2 0 PHO5: après 40 générations cellulaires en milieu non sélectif, 75% (promoteur induit) à 93% (promoteur non induit) des cellules ont maintenu le plasmide pSPHO- IL35, alors que le plasmide pSPGK-IL31 est retenu dans seulement 44% des cellules. Ces résultats montrent l'intérêt d'un système d'expression inductible découplant la phase de 2 5 croissance d'une culture de levure de la phase de production d'une protéine hétérologue en vue de l'exploitation industrielle de vecteurs d'expression dérivés du plasmide pKD1. Exemple 3: Sécrétion de l'II-lfl Les constructions pSPGK-IL31 et pSPHOIL35 ont été transférées dans la souche MW98-8C de K. lactis, selon les techniques déjà décrites dans le brevet principal. Après sélection des transformants en milieu minimum dépourvu d'uracile, quelques clones ont été ensemencés en 3 5 milieu YPD contenant 200 g.g/ml de G418 et leur faculté à sécréter l'IL- 113 a été étudiée. -7 Des échantillons du surnageant de culture ont été traités avec de l'éthanol (60 minutes à -20 C à une concentration finale de 60%) pour précipiter IL-lB sécrétée. Le matériel précipité a été récupéré par centrifugation (20 minutes à 15 000 g) et resolubilisé par chauffage à 95 C pendant 15 minutes dans un dixième du volume de départ avant d'être déposé. sur un gel de polyacrylamide à 12.5%. Après éléctrophorèse des échantillons la sécrétion d'IL-l a été détectée soit en gels dénaturants colorés au bleu de coomassie (figure 10), soit par détection immunologique après transfert du gel sur membrane de 1 0 nitrocellulose et utilisation d'anticorps polyclonaux dirigés contre l'IL- 1B humaine (Genzyme), avec ou sans traitement préalable des échantillons par l'endoglycosidase H selon les spécifications du fabricant (Boehringer Mannheim). Le signal immunologique obtenu à partir des surnageants de 1 5 levures transformées par les constructions correspondant à l'IL-19 est sensible au traitement par l'endoglycosidase H (diminution du poids moléculaire apparent de 24 kD à 19 kD), démontrant que l'IL-lB recombinante de levure est glycosylé. Ce résultat est conforme à la présence d'un site potentiel de N-glycosylation dans la partie N- 2 0 terminale de l'IL-1B (Asn en position 7). 2 ml de surnageant de culture de K. lactis MW98-8C, transformé avec le plasmide pSPHO-IL35 et cultivé en erlen en milieu carence en phosphate inorganique (Chen et Fukuhara, 1988), ont été directement appliqués sur une colonne de phase inverse dans le but de 2 5 purifier l'IL-ll sécrétée: le pic d'élution correspondant à 35 % d'acétonitrile a été collecté et correspond à l'interleukine recombinante. La quantité de matériel purifié par cette technique a été déterminée par spectrophotométrie et permet d'estimer que P'IL-1B est sécrétée par K. lactis à raison de 35 mg par litre de surnageant de 3 0 culture. Le séquençage de la partie N-terminale de l'IL-lB purifiée (dégradation d'Edman automatisée, Applied Biosystems) indique l'absence totale de la région "pré". de la toxine killer, et donc la maturation efficace par la souche K. lactis MW98-8C au site de coupure 3 5 GlnGly^ qui serait reconnu par une signal peptidase de levure (Stark et Boyd, 1986). Du fait de la stratégie utilisée dans la construction de la cassette d'expression d'IL-1B présente dans le plasmide pSPHO-IL35, - 8 - l'extrémité Nterminale de l'IL-113 recombinant ne peut pas être identique à L'IL-lB humain mature: l'enchainement des 11 premiers résidus déterminé par microséquençage (LysArgIleHisMetAlaProVal ArgSerLeu) confirme comme attendu la présence de plusieurs acides aminés supplémentaires (LysArgIleHisMet) en amont de la séquence correspondant à l'ILl[3 humain mature et démontre en particulier que le site potentiel de coupure par r' enzyme KEX1 de K. lactis (LysArg^) n'est pas reconnu dans ce contexte de séquence. La création par mutagénèse dirigée d'une jonction correcte entre le signal de sécrétion 1 0 de la toxine killer et le gène de structure de l'IL-lf mature (GlnGly^AlaProVal) devrait donc permettre l'obtention d'une IL-lE sécrétée correctement maturée. Exemple 4: Construction des vecteurs d'expression de l'albumine. du 1 5 tPA et du TIMP Les plasmides d'expression utilisés dans les exemples concernant l'albumine, le tPA et le TIMP ont été préparés selon une stratégie générale de clonage décrite ci-après: schématiquement, des 2 0 adaptateurs HindIII sont positionnés immédiatement en amont et en aval des gènes à exprimer. Ces gènes sont ensuite clones "dans la bonne orientation" (définie comme l'orientation qui place le codon initiateur de traduction de façon proximale par rapport au promoteur PGK de S. cerevisiae) dans le site Hindili du plasmide pYG208. Comme 2 5 indiqué à la figure Il le plasmide pYG208 dérive du plasmide pYG12 par l'insertion d'un adaptateur BamHI/SalI (5'-GATCCGTCGACG-3') en aval du terminateur PGK. La cassette d'expression SalI que l'on peut exciser des vecteurs ainsi obtenus est ensuite clonée dans le site correspondant unique du plasmide pKan707 dont la structure et la 3 0 préparation ont été décrites dans le brevet principal. Les constructions des vecteurs d'expression des gènes codant pour l'albumine, le tPA et le TIMP sont décrites en détail dans ce qui suit. E.4.1: SAH Le fragment HindIII codant pour la prépro-albumine a été purifié par électroélution à partir du plasmide pXL869 (prépro-SAH) 9- déjà décrit dans le brevet principal, puis cloné dans la bonne orientation dans le site HindI]I du vecteur pYG208 pour générer le plasmide pYG210; la cassette d'expression SalI ainsi générée (promoteur PGK/préproalbumine/terminateu.r PGK) a ensuite été purifiée par électroélution et clonée dans le site SalI du plasmide pKan7O7 pour donner les plasmides d'expression pYG221A et pYG221B qui ne se distinguent entre eux que par l'orientation relative de la cassette d'expression SalI vis à vis du vecteur pKan707. Dans le plasmide pYG221B, l'orientation de la cassette d'expression SalI par 1 0 rapport au gène Kmr codant pour la résistance au G418 est identique à celle de la cassette d'expression SalI-SaI portée par le plasmide pYG19 comme décrit dans le brevet principal. E.4.2: tPA 1 5 Le gène de structure codant pour le tPA a été isolé à partir des plasmides pXL348 (Met-tPA) et pXL459 (prépro-tPA) (Sarmientos et coll., 1989), dont les cartes de restriction sont représentées à la figure 12. En partant du plasmide pXL348 (Met-tPA), et en opérant selon 2 0 le schéma ci-après, on obtient les plasmides pYG224 A/B (Met-tPA) et pYG225 A/B (prépro-tPA): - 10 - pXL348 (Met-tPA) insertion d'un site Hindlil au niveau du site Xholl localisé immédiatement en aval du _ g bne de structure insertion d'un site HindIll gne de structure immédiatement en amont du site pYG205 Ndel puis clonage du fragment Hindill dans pYG206 (pUC8ANdel) _ substitution du fragment Ndel-Sstl de pYG211 (Met-tPA) par le fragment Ndel-Sstl pYG211 de pXL459 (prépro-tPA) I pYG219 clonage du fragment HindIli de clonage du fragment Hindill pYG211 (Met-tPA) dans de pYG219 (prépro-tPA) pYG208 dans pYG208 pYG222 pYG223 introduction des cassettes d'expression Sall de pYG222 et pYG223 dans le plasmide pKan707 pYG224 A/B pYG225 A/B (Met-tPA) (prépro-tPA) Le plasmide pXL348 est coupé par l'enzyme XhoII et le mélange de restriction est mis à ligaturer avec un adaptateur XhoII- HindIII phosphorylé (oligodésoxynucléotide synthétique 5'-GATCAAGCTT-3'); le mélange est ensuite coupé par l'enzyme HindIf et le fragment de restriction codant pour le Met-tPA est cloné dans le site HindIII du vecteur pUC8 pour générer le plasmide intermédiaire pYG204. Ce 1 0 plasmide est coupé par l'enzyme NdeI et mis à ligaturer avec un mélange équimolaire des oligodésoxynucléotides de synthèse phosphorylés suivants: 5'-TAAGCTTCA-3' et 5'-TATGAAGCT-3'; après ligature in vitro le mélange est coupé par l'enzyme HindmI et le - il - fragment de restriction codant pour le Met-tPA est purifié par électroélution et cloné dans le site Hindmi du vecteur pYG206 pour générer le plasmide pYG211. Le vecteur pYG206 correspond au plasmide pUC8 dans lequel l'unique site NdeI a été détruit par coupure avec l'enzyme NdeI et remplissage des extrémités cohésives par le fragment Klenow de la polymérase I dEscherichia tcoli avant religature du vecteur sur lui-même; le plasmide pYG211 comporte donc un fragment Hindi codant pour le Met-tPA dans lequel existe un site de restriction NdeI unique localisé au niveau du codon initiateur ATG du 1 0 Met-tPA. Conmme attendu la séquence nucléotidique en amont du codon initiateur de traduction est la suivante: 5'-AAGCITCATATG....- 3'. Le plasmide pYG211 est à l'origine du plasmide pYG219 qui comporte un fragment HindII codant pour le prépro-tPA. Ce plasmide 1 5 a été construit en substituant le fragment NdeI-SstI de pYG211 par le fragment NdeI-SstI du plasmide pXL459 qui contient la partie N- terminale du prépro-tPA (figure 12); les plasmides pYG211 (Met-tPA) et pYG219 (prépro-tPA) sont donc strictement isogéniques à la différence près que le plasmide pYG211 code pour la forme mature du tPA immédiatement précédée du codon initiateur, alors que dans le plasmide pYG219 la séquence du tPA mature est précédée par sa séquence d'exportation naturelle "prépro". Les fragments HindIE codant pour le Met-tPA et le prépro-tPA ont été purifiés par électroélution à partir des plasmides pYG211 et 2 5 pYG219 et clonés dans la bonne orientation dans le vecteur pYG208 coupé par la même enzyme de restriction, ce qui génère les plasmides intermédiaires pYG222 et pYG223. Ces plasmides comportent une cassette d'expression disponible sous la forme d'un fragment de restriction IalI qui a ensuite été dcloné dans le vecteur pKan707 pour 3 0 générer les plasmides pYG224 A/B (Met-tPA) et pYG225 A/B (prépro- tPA). Les orientations A et B des cassettes SalI par rapport au vecteur ont été définies comme précédemment pour les plasmides pYG221 A/B (prépro-SAH). 3 5 E_4.3: TIMP Le gène de structure codant pour le TIMP a été isolé à partir du plasmide pPV2-TIMP. Ce vecteur est constitué du cDNA complet du - 12 - TIIMP disponible sous la forme d'un fragment de restriction HindII (Kaczorek et coll. 1987). Ce fragment de restriction a été purifié par électroélution et cloné dans la bonne orientation dans le site Hindm de la construction intermédiaire pYG208 pour générer le plasmide pYG220. Ce plasmide est la source d'un fragment SalI correspondant à la cassette d'expression (promoteur PGK / TRIMP / terminateur PGK) qui a été dclonée dans le site SalI du vecteur pKan707 pour générer les plasmides d'expression pYG226 A/B qui ne se distinguent entre eux que par l'orientation de ce fragment SalI par rapport au vecteur. Les 1 0 orientations A et B des plasmides pYG226 A/B ont été définies comme précédemment pour les plasmides pYG221 A/B (prépro-SAH), pYG224 A/B (Met-tPA) et pYG225 A/B (prépro-tPA). Exemple 5: Sécrétion de l'albumine humaine Les constructions pYG221 A/B (prépro-SAH) ont été transférées notamment dans la souche MW98-8C de K. lactis, selon les techniques déjà décrites dans le brevet principal. Après séle,.on des cellules en milieu YPD supplémenté en G418, quelques clones ont été ensemencés 2 0 en milieu liquide YPD sélectif et leur faculté à exprimer et sécréter l'albumine recombinante a été étudiée selon les techniques déjà décrites dans le brevet principal. Les constructions pYG221 A/B introduites dans la souche K. lactis MW98-8C permettent d'obtenir des niveaux de SAH sécrétée comparables à ceux obtenus avec le plasmide 2 5 pYG19 décrit dans ce même brevet. Exemple 6: Sécrétion du tPA Les constructions pYG224 A/B (Met-tPA) et pYG225 A/B 3 0 (prépro-tPA) ont été transférées notamment dans la souche MW98-8C de K. lactis selon les techniques déjà décrites dans le brevet principal. Après sélection des cellules en présence de G418, quelques clones ont été ensemencés en milieu YPD sélectif et leur faculté à exprimer et sécréter le tPA a été étudiée selon les techniques suivantes: (i) en gels 3 5 dénaturants colorés au bleu de coomassie; (ii) par détection immunologique après transfert du gel sur membrane de nitrocellulose et utilisation d'anticorps primaires dirigés contre le tPA extrait - 13- d'utérus humain (Biopool), avec ou sans traitement préalable des fractions cellulaires par des enzymes déglycosylantes, endoglycosidase H ou glycopeptidase F, qui ont été utilisées selon les spécifications du fabricant (Boehringer Mannheim); (iii) en test d'activité sur boites indicatrices de composition suivante: agarose 1%, fibrinogène (KabiVitrum) 0,1%, thrombine (Sigma) 0,2 unité/ml, dissous dans une solution de PBS dont la composition est indiquée dans le brevet principal. Les résultats de ces expériences démontrent qu'aucun signal 1 0 immunologique spécifique n'est décelable dans les surnageants de culture non déglycosylés in vitro (construction pYG225B), ainsi que dans les extraits cellulaires. La méthode de détection n'est pas à mettre en cause puisque les constructions pYG224 A/B (Met-tPA) donnent un signal spécifique important (entre I et 10 mg/litre de culture) dans les l 5 extraits cellulaires et plus particulièrement dans la fraction correspondant aux protéines insolubles. L'utilisation d'enzymes déglycosylantes est une condition nécessaire à la 'étection immunologique du prépro-tPA exprimé et sécrété par K. lactis sous contrôle du promoteur PGK de S. cerevisiae (la situation est différente sous contrôle du promoteur PHO5 de S. cerevisiae résultat non documenté). Cette observation peut être expliquée du fait d'une hyperglycosylation de cette protéine lorsqu'elle est exprimée dans cette souche sous contrôle de ce promoteur. Cette hyperglycosylation pourrait être responsable la faible antigénicité du 2 5 tPA recombinant de levure exprimé à partir du promoteur PGK. La figure 13 démontre l'existence d'une activité enzymatique dans les surnageants de culture de K. lactis MW98-8C transformé avec le plasmide pYG225B (prépro-tPA) alors qu'elle est absente des surnageants de culture de la souche MW98-8C transformée avec les plasmides pKan707 (vecteur témoin) ou pYG224B (Met-tPA). La détection d'une activité tPA sécrétée démontre donc que la séquence "prépro" du tPA est fonctionnelle chez la levure K. lactis MW98-8C. Le test d'activité tPA sur boites indicatrices démontre également la présence d'activité dans les fractions intracellulaires de la souche 3 5 MW98-8C transformée par la construction Met-tPA (résultat non documenté). - 14 - Exemple 7: Influence de la souche hôte pour la sécrétion du tPA Le choix de la cellule hôte est un facteur primordial en ce qui concerne les niveaux de sécrétion du tPA par les levures capables de répliquer les dérivés du plasmide pKan707. La capacité des levures du genre Kluyveromyces à sécréter le tPA cloné dans le vecteur pKan707 a été testée comme précédemment sur boites indicatrices de fibrinogène- agar: les souches ATCC 34609 et ATCC 34610 de K. lactis, ATCC 36906 (K.drosophilarum), et ATCC 36534 et ATCC 36907 de K. fragilis ont un 1 0 potentiel de sécrétion du tPA du même ordre de grandeur que celui de la souche MW98-8C de K. lactis, alors que des essais réalisés dans les mêmes conditions sur les souches ATCC 12424 (K. fragilis), ATCC 24178 (K. wickerhamii) et ATCC 56500 (K. waltii) n'ont pas permis la détection d'activité tPA dans les surnageants de culture. Exemple 8: Sécrétion du TIMP Les constructions pYG226 A/B (TIMP) c &. transférées dans la souche MW98-8C de K. lactis selon les techniques déjà décrites dans 2 0 le brevet principal. Après sélection des cellules en présence de G418, quelques clones ont été ensemencés en milieu YPD sélectif et leur faculté à exprimer et sécréter le TIMP a été étudiée, soit en gels dénaturants colorés au bleu de coomassie, soit par détection immunologique après transfert du gel sur membrane de nitrocellulose 2 5 et utilisation d'anticorps primaires dirigés contre le TIMP humain (RhônePoulenc Santé), avec ou sans traitement préalable des fractions cellulaires par l'endoglycosidase H. Un signal immunologique correspondant au TIMP est décelable dans les extraits intracellulaires non déglycosylés (fraction des 3 0 protéines insolubles), mais pas dans les surnageants de culture non déglycosylés (figure 14). Ce signal immunologique est sensible à un traitement par des enzymes déglycosylantes, démontrant que le TIMP recombinant de levure est N- glycosylé. La sécrétion du TIMP recombinant est également démontrée après déglycosylation in vitro 3 5 d'un surnageant de culture de la souche MW98- 8C transformée avec le plasmide pYG226B (figure 14), indiquant que la séquence d'exportation naturelle du TIMP est fonctionnelle chez K. lactis MW98-8C. - 15 - BIBLIOGRAPHIE Auron P.E., Webb A.C., Rosenwasser L.J., Mucdti S.F., Rich A., Wolff S.M. and Dinarello C.A. (1984) Nucleotide sequence of human monocyte interleukine-1 precursor cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 81:7907-7911. Bajwa W., Meyhack B., Rudolph H., Schweingruber A.-M. and Hinnen 1 0 A. (1984) Structural analysis of the two tandemly repeated acid phosphatase genes in yeast. Nucl. Acid Res. 12: 7721-7739. Chen X.J. and Fukuhara H. (1988) A gene fusion system using the 3'- aminoglycoside phosphotransferase gene of the kanamycin 1 5 resistance transposon Tn903: use in the yeasts Kluyveromyces - lactis and Saccharomyces cerevisiae. Gene 369: 181-192. Jung G., Der.èfle P., Becquart J. and Mayaux J.-F. (1988) High-cell density fermentation studies of recombinant Escherichia coli strains espressing human interleukin-1l. Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 139: 129-146. Kaczorek M., Honoré N., Ribes V., Dehoux P., Cornet P, Cartwright T., and Streeck R.E. (1987) Molecular cloning and synthesis of 2 5 biologically active human tissue inhibitor of metalloprotein- ases in yeast. Bio/Technol. 5: 595-598. Sarmientos P., Duchesne M., Denèfle P., Boiziau J., Fromage N., Delporte N, Parker F., Lelièvre y., Mayaux J.-F. and Cartwright 3 0 T. (1989) Synthesis and purification of active human tissue plasminogen activator from Escherichia coi. Bio/Technology 7: 495-501. Stark, M.J.R. and Boyd, A. (1986) The killer toxin of Kluyveromyces 3 5 lactis: characterization of the toxin subunits and identification of the genes which encode them. EMBO J. 5: 1995-2002. - 16 - Tanguy-Rougeau C., Wésolowski-Louvel M. and Fukuhara H. (1988) The Kluyveromyces lactis KEX1 gene encodes a subtilisin-type serine proteinase. FEBS Letters 234: 464-470. DESCRIPTION DES FIGURES Les représentations des plasmides indiqués dans les figures suivantes ne sont pas traçées à l'échelle et seuls les sites de restriction l 0 importants pour la compréhension des constructions réalisées ont été indiqués. Figure 1: Construction du plasmide pSPGK1 et représentation de la séquence nucléotidique du fragment EcoRI -synthétique 1 5 utilisée comme signal de sécrétion. Figure 2- Construction du plasmide pSPGK-IL17 et représentation de la séquence nucléotidique correspondant à la jonction entre la séquence signal et la Met-IL1l[. Figure 3: Construction du plasmide pSPGK-IL121. 2 0 Figure 4: Construction du plasmide pSPGK-IL31. Figure 5: Construction du plasmide pEPHO4. Figure 6: Construction du plasmide pSPHO-IL14. Figure 7: Construction du plasmide pSPHO--L23. Figure 8: Construction du plasmide pSPHO-IL35. 2 5 Figure 9: Courbes de stabilité des plasmides pCXJ1, pSPGK-IL31 et pSPHO-IL35 dans la souche MW98-8C en conditions non- sélectives: carrés pleins, pCXJ1; triangles pleins, pSPHO- IL35 (promoteur non induit); triangles vides, pSPHO-IL35 (promoteur induit);.carrés vides, pSPGK-IL31. 3 0 Figure 10: Sécrétion d'IL-1li dans la souche MW98-8C. Chaque dépôt correspond à 0,2 ml de surnageant de la souche K. lactis MW98-8C transformée par le plasmide pKan707 (vecteur témoin, piste 1), pSPGK-IL31 (piste 2) ou pSPHO-IL35 (piste 3); la piste 4 correspond à I gg de Met- 3 5 ILlf produit chez E. coli (Rhône-Poulenc Santé). Les cellules transformées ont été cultivées pendant trois jours en milieu YPD supplémenté avec 200 gLg/ml G418. Les - 17- surnageants ont été concentrés par précipitation comme indiqué dans le texte. Figure 11: Construction du plasmide pYG208. Figure 12: Carte de restriction des plasmides pXL348 (Met-tPA) et pXL459 (prépro-tPA). Figure 13: Test d' activité du tPA sécrété. gl de surnageant de culture de la souche MW98-8C de K. lactis transformée par le plasmide pYG225B (prépro-tPA, piste 1), pYG224B (Met-tPA, piste 2) ou pKan707 (vecteur, 1 0 piste 3) sont déposés sur boite indicatrices d'activité tPA après 5 jours de croissance en milieu YPD sélectif. Figure 14: Expression et sécrétion du TIMP dans la souche MW98-8C transformée par les plasmides pYG226B ou pKan707. 0,25 gg de TIMP humain (Rhône-Poulenc Santé, piste 1); 1 5 expression intracellulaire du TIMP recombinant de levure (plasmide pYG226B) non déglycosylé (piste 2) ou après traitement par l'endoglycosidase H- (piste 3); échantillon de TI-MP recombinant d'E. coli (Rhône-Poulenc Santé, piste 4); fractions intracellulaires de la souche MW98-8C 2 0 transformée par le vecteur témoin pKan707: échantillon non déglycosylé (piste 5) ou après traitement par l'endoglycosidase H (piste 6); surnageant de culture concentré non déglycosylé: soucheMW98-8C transformée par les plasmides pKan707 (piste 7) ou pYG226B (piste 8); 2 5 surnageant de culture concentré puis traité par l'endoglycosidase H: souche MW98-8C transformée par les plasmides pKan707 (piste 9) ou pYG226B (piste 10); 0,25 iig de TIMP humain (Rhône-Poulenc Santé, piste 11). - 18 - REVENDICATIONS 1/ Plasmide d'expression d'une protéine déterminée, dans les levures du genre Kluyveromvces pouvant être obtenu à partir des plasmides pKan707 ou pCXJ1 qui font l'objet des revendications 28 et 29 du brevet principal, caractérisé en ce qu'il comporte au moins l'origine de réplication du plasmide pKD1, les séquences répétées inversées (SRI) du plasmide pKD1 et le gène A du plasmide pKD1 complet, ainsi que la séquence codante pour ladite protéine sous le contrôle de séquences assurant son expression dans une souche de Kluyveromvces. 2/ Plasmide d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte l'ensemble du génôme de pKD1, les séquences répétées inversées, l'origine de réplication et le gène A étant intacts. 3/ Plasmide d'expression selon la revendication 2, caractérisé en ce que les gènes B et C sont également intacts. 4/ Plasmide d'expression, caractérisé en ce que le génôme de pKD1 est inséré dans le plasmide d'expression sous forme de fragment de restriction EcoRI. / Plasmide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence codante pour ladite protéine est insérée dans une région de 197 nucléotides définie par les sites SacI et MstII de pKD1, ou le site SphI de pKD1. 6/ Plasmide selon l'une des revendications I à 5, caractérisé en ce que leg séquences permettant l'expression du gène de structure sont choisies parmi les promoteurs dérivés des gènes de levures du genre Saccharomyces ou Kluvveromyces. 7/ Plasmide selon la revendicaton 6, caractérisé en ce que ces promoteurs sont dérivés des gènes glycolytiques de levures du genre Saccharomvces ou Kluyveromyces. 8/ Plasmide selon la revendication 6, caractérisé en ce que les séquences permettant l'expression du gène de structure sont choisies parmi les gènes codant pour la phosphoglycérate kinase (PGK), la glycéraldéhyde-3phosphate déshydrogénase (GPD), les énolases (ENO), les alcool déshydrogénases (ADH), la lactase (LAC4) ou la phosphatase acide (PHO5). - 19- 9/ Plasmide selon la revendication 6, caractérisé en ce que les séquences permettant l'expression du gène de structure sont choisies parmi les gènes codant pour la phosphoglycérate kinase (PGK) ou la phosphatase acide (FHO5). / Plasmide selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les séquences codant pour ladite protéine sont précédées d'une séquence d'exportation de la protéine qui est choisie parmi l'extension N-terminale naturelle de ladite protéine. 11/ Plasmide selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la séquence codant pour ladite protéine est précédée d'une séquence d'exportation différente de la séquence naturelle. 12/ Plasmide selon la revendication 11, caractérisé en ce que la séquence codant pour l'exportation de ladite protéine est la séquence obtenue à partir des gènes de levures codant pour la phéromone alpha ou la toxine "killer". 13/ Plasmide selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la protéine est choisie parmi: les interleukines les albumines le tPA le TIMP 14/ Plasmide selon la revendication 13, caractérisé en ce que la séquence codant pour la protéine déterminée est choisie parmi les séquences codant pour: IL-18 prépro-SAH Met-SAH prépro-tPA Met-tPA TIMP / Levure du genre Kluyveromyces transformée par un plasmide selon l'une des revendications 1 à 14. 16/ Levure selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche des espèces K. marxianus, K. wickerhamii, K. waltii. - 20 - 17/ - Levure selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de K. bulgaricus, K. drosophilarum K. fragilis ou K. lactis. 18/ Procédé de préparation d'une protéine déterminée par culture d'une souche de levure, caractérisé en ce que l'on cultive une souche de levure Kluyveromyces selon l'une des revendications 15 à 17 dans un milieu approprié et que l'on récupère la protéine en cause.