FR 2656799 A1 19910712 FR 9000167 A 19900109 La présente invention concerne la microbiologie et vise plus spécialement un procédé d'obtention d'un levain bactérien pour la fabrication de produits diététiques à effet curatif Elle peut trouver des applications dans l'industrie alimentaire, notamment dans la fabrication de laits fermentés. On connaît un procédé d'obtention d'un ferment pour la fabrication de laits fermentés du type "ryazhenka", "prostokvasha" (laits caillés), dans lequel on a recours à des bactéries thermophiles à fermentation lactique: Lactobacillus thermophilus 175, Streptococcus thermophilus 8, le streptocoque mésophile Streptococcus lactis subsp diacetilactis 13 c 65-80 (SU, A, 389 771). Le rapport entre les constituants du ferment est de 2:2:1 Toutefois, le ferment en question n'a ni vertu diététique ni curative et ne peut être utilisé pour inhiber les agents infectieux provoquant des maladies gastrointestinales. On connaît aussi un ferment constitué de Lactobacillus bulgaricus 176, de Streptococcus thermophilus 108, de Streptococcus lactis subsp. diacetilactis 13 c 65 et 13 c 65-64, le rapport entre les constituants étant de 1:3:3:3 (SU, A, 971 213), et un procédé pour son obtention, qui prévoit l'incubation d'un mélange de ces bactéries. Ledit ferment manifeste une activité antibiotique contre 4 cultures de test: Escherichia coli, Salmonella paratyphi B, Salmonella typhi, Shigella dysentheriae sonnei. L'éventail de son action antibiotique est donc peu étendu Le pouvoir de formation d'acide dudit ferment est élevé et l'accumulation d'aldéhydes, du diacétyle, d'acides gras volatils est relativement faible, ce qui déprécie les qualités biologiques et nutritives des produits obtenus à l'aide de ce ferment. L'invention est basée sur une solution du problème consistant à élaborer, par un choix judicieux des constituants d'un mélange de bactéries à fermentation lactique de départ, un procédé d'obtention d'un levain bactérien servant à la fabrication de produits diététiques à effet curatif, d'un spectre d'activité antibiotique large, ledit levain ayant des caractéristiques améliorées du point de vue du traitement et de la prévention de la salmonellose, de la dysenterie aiguë, de l'infection par les staphylocoques, des maladies intestinales aiguës et des dysbactérioses, et les produits diététiques à effet curatif obtenus à l'aide de ce levain présentant des qulités nutritives et biologiques améliorées. Le problème ainsi posé est résolu du fait que, dans un procédé d'obtention d'un levain bactérien servant à la fabrication de produits diététiques à effet curatif, qui prévoit la culture, sur du lait, d'un mélange de bactéries à fermentation lactique de départ comprenant Lactobacillus bulgaricus 176, Streptococcus thermophilus 108 et Streptococcus lactis subsp diacetilactis 13 c -64, selon l'invention, ledit mélange est additionné supplémentairement de Lactobacillus acidophilus 180, souche déposée le 11 07 1988 à Vsesojuzny nauchno- issledovatelsky institut genetiki i selektsii promyshlennykh mikroorganizmov (Institut fédéral de génétique et de sélection de micro- organismes industriels) sous le numéro de collection BKIIMB-4423, et de Streptococcus thermophilus 66-1413, souche déposée le 11 07 1988 à Vsesojuzny nauchno-issledovatelsky institut genetiki i selektsii promyshlennykh mikro-organizmov sous le numéro de collection BKIIM B-4422, le rapport entre les bactéries du genre Streptococcus et celles du genre Lacobacillus étant de 2:1 à 6:1, les parties s'entendant en poids Cela dit, il est souhaitable que les bactéries du genre Streptococcus soient introduites dans le mélange indiqué ci-dessus de façon que le rapport entre Streptococcus thermophilus 108, Streptococcus lactis subsp diacetilactis 13 c-65-64 et Streptococcus 66-1413 soit compris entre 0, 5:1:0,5 et 2:2:2, les parties s'entendant en poids En outre, il est recommandé d'introduire les bactéries du genre Lactobacillus dans le mélange mentionné des bactéries à fermentation lactique de départ de façon que le rapport entre Lactobacillus bulgaricus 176 et Lactobacillus acidophilus 180 soit égal à 0,5:0,5, les parties s'entendant en poids Le levain obtenu selon le procédé de l'invention est d'un large spectre d'activité antibiotique Il inhibe la croissance et la propagation des agents suivants, responsables de maladies gastro-intestinales: Escherichia coli, Micrococcus lysodecticus, Serratia marcescens, Salmonella paratyphi B, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae sonnei, Shigella dysenteriae flexneri, Staphylococcus aureus. L'acidité totale du levain obtenu par le procédé proposé est modérée Le levain contient des quantités considérables d'aldéhydes, de diacétyle, d'acides gras volatils Grâce à la protéolyse du lait jusqu'aux peptides et acides aminés libres, surtout indispensables, les produits laitiers résultant de la fermentation produite par le levain de l'invention sont facilement assimilables. Le procédé proposé d'obtention d'un levain bactérien permet d'effectuer la culture du levain dans un large intervalle de températures (de 35 à 45 C), tout en réduisant la durée de la fermentation. En outre, le levain obtenu selon le procédé de l'invention conserve longtemps ses propriétés biologies et physico-chimiques. A noter que l'introduction des bactéries du genre Streptococcus dans le mélange des bactéries à fermentation lactique de départ à un rapport entre Streptococcus thermophilus 108, Streptococcus lactis subsp diacetilactis 13 c-65-64, Streptococcus thermophilus 66-1413 compris entre 0,5:1:0,5 et 2:2:2, o les parties s'entendent en poids, permet d'obtenir des produits présentant des qualités gustatives, curatives et diététiques améliorées Avec un rapport entre les bactéries à fermentation lactique de départ Lactobacillus bulgaricus 176 et Lactobacillus acidophilis 180 égal à 0,5:0,5, o les parties s'entendent en poids, on obtient l'acidité voulue et une haute activité antibiotique. Le procédé proposé d'obtention d'un levain bactérien pour la fabrication de produits diététiques à effet curatif est réalisé de la manière suivante: les bactéries à fermentation lactique de départ Streptococcus thermophilus 108, Streptococcus lactis subsp. diacetilactis 13 c-65-64, Streptococcus thermophilus 66-1413, Lactobacillus bulgaricus 176, Lactobacillus acidophilus 180 sont mélangées à un rapport de 2:1 à 6:1, placées dans un récipient contenant du lait stérile, brassées et cultivées dans un thermostat réglé par exemple entre 35 et 45 C jusqu'à la formation d'un caillot (par exemple, pendant 2 à 5 heures), le lait caillé qui en résulte étant ensuite maintenu à une température de 3 à 10 C jusqu'à l'obtention du produit final. Le contr 8 le du levain en cours de préparation est effectué par des méthodes courantes d'après les caractères morphologiques, l'allure du caillage du lait, l'acidité de titration totale et les caractéristiques organoleptiques Les bactéries à fermentation lactique utilisées comme constituants du mélange de départ présentent les caractéristiques culturelles, morphologiques et biochimiques suivantes Streptococcus thermophilus 108 a été déposé le 23 Septembre 1980 à Vsesojuzny nauchnoissledovatelsky institut genetiku i selektsii promyshennykh mikroorgnaizmov sous le numéro de collection B-2180 La culture a été isolée à partir d'un lait fermenté ("katyk"l) par sélection selon le dégagement d'arôme Elle donne des diplocoques, des streptocoques de 0,5 à 0,7 micron de diamètre, gram-positifs. Sur la gélose hydrolysée, elle forme des colonies rondes aux bords réguliers, ayant une surface lisse, d'une structure homogène, de couleur blanche, d'une taille de 1,0 à 1,5 mm. Cultivée sur du lait écrémé, elle donne un caillot homogène dense Elle fermente bien le glucose, le galactose, le lactose, le maltose, le xylose, l'arabinose, le glycérol, le mannitol Elle fermente faiblement le saccharose, l'amidon, le sorbitol, le dulcitol Elle ne décompose pas la cellulose, ne liquéfie pas la gélatine La culture forme du diacétyle ( 0, 6 mg/%), de l'acétoine ( 0,6 à 0,7 mg/%), des acides gras volatils ( 3,6 ml de Na OH 0,1 N), manifeste une activité protéolytique L'activité limite est de 90 à 100 T On a mis en évidence une activité antibiotique contre Salmonella typhi, Salmonella paratyphi. Streptococcus lactis subsp diacetylactis 13 c-65-64 a été déposé le 23 septembre 1980 à Vsesojuzny nauchno-issledovatelsky institut genetiki i selektsii promyslennykh mikroorganizmov sous le numéro de collection B2182 Les cellules sont globuleuses, d'une taille de 0,7 à 1,0 mm, grampositives Une souche mutante a été obtenue par irradiation aux rayons gamma émis par Cd 60 en dose de 95 kilorem Incubée sur du lait écrémé, elle forme un caillot homogène dense, sans dégagement de gaz ni peptonisation Elle fermente intensément le glucose, le maltose, le lévulose, le galactose, ne fermente pas le mannitol, le dulcitol, le sorbitol, le saccharose, ne décompose pas la cellulose. La souche forme du diacétyle ( 0,4 mg%), de l'acétolne ( 1,6 mg%), des aldéhydes ( 22,0 ml/litre) et manifeste une activité protéolytique L'indice d'acidité est de 80 à 90 T. La souche manifeste une activité antibiotique vis-à-vis de Salmonella typhi, de Shigella dysenteriae. Streptococcus thermophilus 66-1413 a été déposé le 11 Juillet 1988 à Vsesojuzny nauchno-issledovatelsky institut genetiki i selektsii promyshlennykh mikroorganizmov sous le numéro de collection BKIIM B-4422. La culture a été obtenue par mutagenèse à partir de la souche Steptococcus thermophilus 66 avec la mise en oeuvre de rayons gamma émis par Co 60 ( 0,5 krem). Elle forme, sur la gélose hydrolysée, de petites colonies ( 0,5 à 1,5 mm) aux bords réguliers, à la surface lisse et brillante, au profil bombé d'une structure à grains fins: les colonies immergées revêtent l'aspect de petites lentilles La souche est une bonne productrice de diacétyle ( 0, 59 mg%) et de substances antibiotiques actives contre Escherichia coli et Salmonella typhi et paratyphi; l'indice d'acidité limite est de 72,8 T Elle fermente le glucose, le galactose, le lévulose, le lactose, le maltose, le raffinose, le rhamnose, ne fermente pas le saccharose, le xylose, l'arabinose. Lactobacillus bulgaricus 176 a été déposé le 23 Septembre 1980 à Vsesojuzny nauchno-issledovatelsky institut genetii i selktsii promyshlennykh mikroorganizmov sous le numéro B-2179. La culture a été isolée à partir d'un lait fermenté ("Katyk") par sélection en se guidant sur le pouvoir de formation d'acides Des bâtonnets se forment, gram-positifs ( 0,8 à 0,9; 2,6 à 12,7 microns) Cultivée sur du lait hydrolysé, elle donne des colonies de forme irrégulière au profil bombé, ayant une surface lisse, de couleur bleuâtre, d'une taille de 0,5 à 0,7 mm. La culture fermente bien le glucose, le lévulose, le saccharose, le lactose, le xylose, l'arabinose, fermente faiblement le galactose, ne fermente pas l'amidon, ne décompose pas la cellulose, ne liquéfie pas la gélatine L'indice d'acidité limite est de 180 à 190 T, l'acidité volatile équivaut à 1,2 ml de Na OH 0,1 N La culture manifeste une activité protéolytique et une activité antibiotique contre Escherichia coli, Salmonella typhi et paratyphi. Lactobacillus acidophilus 180 a été déposé le 11 Juillet 1988 à Vsesojuzny nauchno-issledovatelsky institut genetiki i selektsii promyshlennykh mikroorganizmov sous le numéro de collection BKIIM B-4423, isolé à partir des matières fécales d'un enfant sain par repiquage sur une gélose hydrolysée Sur ce dernier milieu, la croissance est lente, les colonies sont de forme irrégulière aux bords laineux ayant une surface rugueuse et un profil plat, d'une taille de 1,5 à 2,5 mm, la structure interne est à gros grains, de couleur grisâtre Les colonies immergées revêtent l'aspect de petites lentilles Les cellules sont longues, sous forme de bâtonnets minces, fragmentés La culture fermente le glucose, le galactose, le lactose, le maltose, ne fermente pas l'arabinose, le raffinose, le rhamnose, le saccharose, le xylose La souche est une bonne productrice d'acides ( 340 T), en sécrétant des acides lactiques volatils, elle manifeste une activité antibiotique contre Escherichia coli, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae flexneri, Micrococcus lysodecticus, Staphylococcus aureus et fait vite tourner le lait. Toutes les cultures décrites sont incubées sur du lait écrémé et une gélose hydrolysée contenant les principaux ingrédients suivants, en % en poids: lait hydrolysé 15, peptone 10, glucose 1,0, citrate de potassium 0, 5, gélose 2, parmi d'autres constituants. A noter que si le rapport entre les bactéries du genre Streptococcus et celles du genre Lactobacillus est supérieur à 6:1, le temps nécessaire pour faire tourner le lait et former les acides s'accroit, d'o une complication technologique du procédé d'obtention d'un levain bactérien et une dépréciation des qualités gustatives de ce dernier. Si le rapport des bactéries du genre Streptococcus à celles du genre Lactobacillus est inférieur à 2:1, il en résulte une baisse de l'activité antibiotique du levain bactérien obtenu, ce qui compromet l'intérêt curatif du produit préparé à l'aide de ce levain. En partant du levain bactérien obtenu par le procédé de l'invention, et en procédant par des techniques classiques, on prépare un produit diététique à effet curatif Un produit laitier préparé en mettant en oeuvre divers milieux nutritifs peut notamment être un tel produit diététique à effet curatif Comme milieu nutritif, on peut notamment utiliser le lait, un substrat laitier riche en protides, un substrat laitier riche en corps gras, etc Les produits obtenus à l'aide de ce levain présentent un intérêt nutritif et biologique accru, ainsi que des qualités diététiques et curatives améliorées. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation du procédé d'obtention d'un levain bactérien pour la fabrication d'un produit diététique à effet curatif et de l'utilisation de ce levain, selon l'invention. Exemple 1 On place les bactéries à fermentation lactique de départ ( 2 g de Streptococcus thermophilus 108, 2 g de Streptococcus lactis subsp diacetilactis 13 c 65-64, 2 g de Streptococcus thermophilus 66-1413, 0,5 g de Lactobacillus bulgaricus 176, 0,5 g de Lactobacillus acidophilus 180) dans un flacon de 250 ml contenant 100 ml de lait stérile, on les mélange et on les fait incuber dans un thermostat, à une température de 350 C, jusqu'à formation du caillot, en maintenant ultérieurement le lait caillé obtenu entre 3 et 50 C. Le levain ainsi obtenu présente les caractéristiques suivantes (déterminées par des méthodes classiques) Morphologiques: on voit, au microscope, des diplocoques, des streptocoques, moins nombreux sont les bâtonnets filiformes longs de 9 à 20 microns; l'acidité de titration totale est de 85 à 950 T Organoleptiques: une saveur pure de lait caillé, un arôme épicé, le caillot est légèrement étirable A partir du levain obtenu par le procédé de l'invention, on prépare un produit laitier diététique à effet curatif, en utilisant comme substrat un lait pasteurisé On a déterminé les caractéristiques du produit laitier fermenté ainsi obtenu Les résultats sont présentés au tableau qui va suivre. Exemple 2 Le procédé proposé d'obtention d'un levain bactérien pour la fabrication d'un produit diététique à effet curatif, la détermination de ses caractéristiques, ainsi que la préparation d'un produit laitier fermenté le contenant ont été réalisés comme à l'exemple 1, à cette différence près qu'on a utilisé, à ces fins, 0,5 g de Streptococcus thermophilus 108, 3 g de Streptococcus lactis subsp diacetilactis 13 c 65-64, 0,5 g de Streptococcus thermophilus 66-1413, 0,5 g de lactobacillus bulgaricus 176, 0,5 g de Lactobacillus acidophilus 180 et qu'on a effectué l'incubation du mélange ainsi obtenu de bactéries à fermentation lactique à une température de 42 C. Le levain bactérien qui en résulte présente les caractéristiques suivantes Morphologiques: on voit au microscope des bâtonnets filiformes, longs de 9 à 20 microns, des bâtonnets à structure granuleuse et fragmentée, des diplocoques, des streptocoques (groupant à 8 cellules); l'acidité de titration totale est de à 110 T Organoleptiques: une saveur pure de lait caillé, un ar 8 me épicé, le caillot est homogène et dense. Le produit laitier obtenu a été essayé en le faisant figurer parmi les aliments fournis à des malades (enfants et adultes, 90 personnes en tout) On a établi qu'il exerçait un effet bénéfique sur 11 enfants atteints de salmonellose, 9 enfants et 19 adultes atteints de disenterie aiguë, 11 enfant et 19 adultes atteints d'affections intestinales aiguës, 20 enfants atteints de disbactériose On a déterminé les caractéristiques du produit laitier obtenu Les résultats sont chiffrés au tableau qui va suivre. Exemple 3 Le procédé proposé d'obtention d'un levain bactérien pour la fabrication d'un produit diététique à effet curatif, la détermination de ses caractéristiques, ainsi que l'obtention d'un produit laitier le contenant ont été réalisés comme à l'exemple 1, à cette différence près qu'on a utilisé, à ces fins, lg de Streptococcus thermophilus 108, lg de Streptococcus lactis subsp. diacetilactis 13 c 65-64, 2 g de Streptococcus thermophilus 66-1413, 0,5 de Lactobacillus bulgaricus il 176, 0,5 g de Lctobacillus acidophilus 180 et qu'on a effectué l'incubation du mélange ainsi obtenu de bactéries à fermentation lactique à une température de 400 C Le levain bactérien qui en résulte présente les caractéristiques suivantes Morphologiques: on voit au microscope des bâtonnets filiformes longs de 9 à 20 microns, des bâtonnets à structure granuleuse et fragmentée, des diplocoques, des streptocoques (groupant à 8 cellules); l'acidité de titration totale est de 90 à 1000 T Organoleptiques: une saveur pure de lait caillé, un arôme épicé, le caillot est homogène et dense. En outre, pour préparer, à base de ce levain bactérien, un produit laitier, on utilise comme milieu nutritif un substrat laitier riche en protides, contenant comme principaux ingrédients, en % en poids: protides 4 à 8, corps gras 1,2 à 2,4, hydrates de carbone 2,5 à 5,0, substances minérales 0,58 à 1,16, ainsi que des vitamines On a déterminé les caractéristiques du produit laitier ainsi obtenu Les résultats sont résumés dans le tableau qui va suivre Le produit laitier obtenu a été essayé en le faisant figurer parmi les aliments fournis à des malages atteints d'hépatite chronique ( 75 enfants). On a constaté que le produit laitier en question pouvait être recommandé aux personnes souffrant de cette maladie. Exemple 4 Le procédé proposé d'obtention d'un levain bactérien pour la fabrication d'un produit diététique à effet curatif, la détermination de ses caractéristiques, ainsi que la préparation d'un produit laitier le contenant ont été réalisés comme à l'exemple 1, à cette différence près qu'on a utilisé à ces fins 0,5 g de Streptococcus thermophilus 108, lg de Streptococcus lactis subsp diacetilactis 13 c 65-64, 0,5 g de Streptococcus thermophilus 66-1413, 0,5 g de Lactobacillus bulgaricus 176, 0,5 g de Lactobacillus acidophilus 180 et qu'on a effectué l'incubation à une température de 370 C Le levain bactérien qui en résulte présente les caractéristiques suivantes Morphologiques on voit au microscope des bâtonnets filiformes longs de 9 à 20 microns, des bâtonnets à structures granuleuse et fragmentée, des diplocoques, des streptocoques (groupant à 8 cellules); l'acidité de titration totale est de 90 à 1050 T Organoleptiques: une saveur pure de lait caillé, un arôme épicé, le caillot est homogène et dense. En outre, pour préparer, à base de ce levain bactérien, un produit laitier fermenté, on a utilisé, comme milieu nutritif, un substrat laitier riche en corps gras,qui contenait les principaux ingrédients suivants, en % en poids: protides 2 à 3, corps gras 3,5 à 7,0, hydrates de carbone 2,5 à 5,0, substances minérales - 0,58 à 1,16 Les caractéristiques du produit obtenu sont présentées au tableau ci-après. Caractéristiques biochimiques des produits laitiers obtenus à partir du levain bactérien Levain bacté- rien obtenu selon le procédé de l'in- vention Acidité de titration, OT d'acides gras vo- latils, ml de Na OH 0,1 N Quantité d'al- déhy- des, mg% de di- acé- tyle, mg% Activité antibiotique (rayon de la zone, mm) d'azote des groupes aminés libres (le taux du lait témoin étant de ,6 micro- grammes), % Esche- richia coli Serra- tia marces- cens Sal- mo- nel- la typ- himu- rium Shi- gel- la dyse- nte- riae Exemple 1 90 à 95 1,30 54 0,30 40,0 2,0,/8,5 * 2,6 2,0 Exemple 2 95 à 105 2,00 58 0,45 49,9 3,1/10,1 * 3,0 4,0/11,0 * 3,7 4,1/7,4 * 3,9 Exemple 3 75 à 85 0,65 50 0,15 30,6 2,0/5,5 * 2,5 2,5 3,0 3,5/6,5 * 2,5 Exemple 4 105 à 110 1,20 190 0,20 28,5 2,5/9,5 * 3,5 2,6 4,1 5,0/8,0 * 4,7 Remarque:* Le numérateur est le rayon de la zone d'action bactéricide, le dénominateur est celui de la zone d'action bactériostatique. Micro- coc- cus lyso- dec- ticus Sta- phy- lococ- cus au- reus K O 0 n (D (D REVEND I CAT I ONS 1 Procédé d'obtention d'un levain bactérien pour la fabrication d'un produit diététique à effet curatif, qui prévoit l'incubation d'un mélange de bactéries à fermentation lactique constitué de Lactobacillus bulgaricus 176, de Streptococcus thermophilus 108, de Streptococcus lactis subsp. diacetilactis 13 c 65-64 sur du lait, caractérisé en ce que, dans le mélange mentionné des bactéries à fermentation lactique de départ, on introduit supplémentairement Lactobacillus acidophilus 180, souche déposée le 11 07 88 à Vsezojuzny nauchno-issledovatelsky institut genetiki i selektsii promyshlennykh mikroorganizmov sous le numéro de collection BKIIM B-4423, et Streptococcus thermophilus 66-1413, souche déposée le 11 07 88 à Vsesojuzny nauchno-issledovatelsky institut genetiki i selektsii promyshlennykh midroorganizmov sous le numéro de collection BKIIM B-4422, le rapport entre les bactéries du genre Streptococcus et celles du genre Lactobacillus étant de 2:1 à 6:1, o les parties s'entendent en poids. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on introduit, dans le mélange précité, les bactéries du genre Streptococcus de façon que le rapport entre Streptococcus thermophilus 108, Streptococcus lactis subsp diacetilactis 13 c 65-64, Streptococcus thermophilus 66-1413 soit compris entre 0,5:1:0,5 et 2:2:2, o les parties s'entendent en poids. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on introduit, dans le mélange indiqué de bactéries à fermentation lactique de départ, les bactéries du genre Lactobacillus de façon que le rapport entre Lactobacillus bulgaricus 176 et Lactobacillus acidophilus 180 soit égal à 0,5:0,5, o les parties s'entendent en poids.