FR 2653446 A1 19910426 FR 9013159 A 19901022 L'inveition concerne un procédé d'obtention, par fermentation) d'acide citrique à partir d'hydrates de carbone à l'aide d'un micro-organisme du genre Aspergillus niger dans un substrat renfermant du zinc et de- l'héxacyanoferrate. Lors de la fermentation immergée de l'acide citrique avec utilisation d'Aspergillus niger> à partir de matériaux d'hydrates de carbone relativement impurs, l'influence gênante des ions fer dans le substrat est connu déjà depuis longtemps. Alors quepar utilisation d'hydrates de Carbone très purs, une teneur de 2, 0 ppm de Fer dans le substrat, est encore tolérable sans plus, déjà 0,2 ppm de Fer pour des hydrates de Carbone relativement impurs peuvent être de trop et il se forme de grandes quantités de mycélium 15. d'Aspergillus niger qui ne produit pas d'acide, alors que la production d'acide citrique chute d'une manière dramatique. On rapporte cette circonstance à la présence des soi-disants "potentialisateurs de Fer" dans le substrat qui proviennent des hydrates de Carbone impurs par exampLe des amino- acides, et qui multipLient l'action négative du fer dans Le sens de la formation de myceLium qui produit des substances non acides. On a)par conséquent cherché comme procédé qui utilise des hydrates de Carbone relativement impursdes antagonistes du Fer, et le brevet US 2.970.084 décrit la mise en oeuvre de jusqu'à 500 ppm de Cuivre dans le substrat, de façon à éliminer l'action des potentialisateurs. Cette façon de procéder efficace en soiproduit cependantcomme manifestation secondaire très désagréable, l'enrichissement en grandes quantités de sels de Cuivre hautement toxiques dans les boues d'épuration. Dans le brevet US 2.492.673 1on a décrit un autre antagoniste du Fer, principalement le zinc. Selon cette publication;en vue de la fermentation d'acide citrique à partir de mélasse invertie avec Aspergillus niger, la mélasse invertie est débarassée des cations, à l'aide d'un échangeur de cations (forme H) grâce à quoi la teneur en Fer est abaissée à environ 2-4 ppm et --2 -- ensuite,1O à 30 parties en masse de zinc par partie de masse sont ajoutée. s grâce à quoi> la teneur globale en zinc ne dé;passe pas ppm. D'une façon semblable, les sels de zinc ne constituent pas} cependant, un constituant particulièrement désiré des boues d'épuration, quoiqu'il soit mieux tolérable que le Cu. A partir du brevet suisse 342.1911 on peut retirer une comparaison entre le Cuivre et le Zinclen tant qu'antagonistes du Fer, dans lequel on a indiqué que} pour des hydrates de Carbone relativement impurs, en particulier pour ceux non désionisés en ce qui concerne les cations, la amise en oeuvre du zn est désavantageuse par rapport à celle du Cuivre. Le proc4d selon l'invention concerne un substrat qui contient aussi bien des ions zinc, que des ions hexacyanofe rrate. Les hexacyanoferratespar exemple,[FE(CN/6]Ku 3H20, sont des inhibiteurs connus de croissance du mycelium pour la production d'acide citrique par fermentation} au moyen d'Aspergillus nigerTet sont ajoutés} de préférenceen quantités de Autrichiens 295.448 et 296.194). Dans le brevet autrichien 307.346, un milieu de fermentation d'acide citrique est décrit, qui renferme 1,5ppm S04Zn, 7H20 et Les brevets autrichiens concernant l'utilisation commune d'héxacyano- ferrates et d'ions zinc, se rapportent à l'utilisation de solutions de sucre pré-purifiées au moins partiellement (décationisées), dans Lesquelles.le zinc agit comme promoteur de croissance) alors que l'hexacyanoferrate a une influence comme inhibiteur du développement du Myc lium, A présent, il a été trouvé}/de façon inatendue, que des solutions d'hydrate de Carbone qui n'ont pas été pré-traitéesainsi que celles sans clarification par précipitation et sans traitement par échangeur d'ions, peuvent être travaillées d'une manière favorable dans un substrat contenant de l'hexacyanoferrate et des ions Zn, lorsqu'on travaille un substrat qui contient entre 30 et 250 ppm de Zn et entre et 500 ppm d'hexacyanoferrate. -3- Ainsi des rendements en acide citrique extremement avantageux peuvent être obtenus pour un déroulement sans problème du procédé, sans nécessité d'une surveillance du processus et sans mesure de contr8le cdhimique ou physique (par exemple sans régulation permanente du pH).En outre, il se produit, pour des concentrations élevées en sels dans le substrat, une boue d'épuration tolérable. De préférence, le Zn et l'hexacyanoferrate sont mis en jeu respectivement en quantité d'environ 100 ppm. En particulier, on ajoute au substrat au moins autant d'ions Zn et d'ions hexacyanoferrate) qu'il se forme un produit de précipitation. Ce produit de précipitation n'est pas séparé. Comme Hydrates de Carbone non traités, on met en oeuvre de préférence, des mono- et/ou des disaccharides, en particulier du glucose. L'ajoût d'autres sources d'hydrates de Carbone par exemple, des m&lasses de roseau ou de navet, est possible. C'est une caractéristique du procédé selon l'invention, que toutes les manipulations nécessaires en vue de la production économique d'acide citriquedoivent être entreprises au début de la fermentation. Une surveillance continuelle de la fermentation et des prélèvements sur la base de paramètres chimiques ou physiques différents comme la valeur du pH et la forme du mycélium, ne sont pas nécessaires. L'acide citrique ainsi obtenupeut être isolé parmi des procédés habituels ordinairement connus et être transformé ultérieurement. La fermentation est conduite en immersion. Les exemples suivants servent à une compréhension plus précise de l'invention. Ils ont été effectués avec le micro-organisme Aspergillus niger 6074, lequel;en conformité avec le traité de BUDAPEST, a été déposé à la collection allemande des Micro-organismes le 16 Août 1989 et a obtenu le N? DSM 5484, ainsi qu'il est défini par les caractéristiques suivantes: - le mycélium à plusieurs noyaux, comportant plusieurs septum, possède un grand nombre de conidiophores. - il faut remarquer la formation typique de petites têtes (capitules), par suite d'hyphènes élargis en forme de bulles, sur la surface desquellesse trouvent des stérigmes avec des conidies disposées en forme d'arceaux de perlesnoires à brun noir. -- 4-- - morphologie des colonies: Au début blanc à jaunâtre d'une consistance cotonneuse. Après quelques jours par suite de la formation de conidies, noir à brun noir. - diamètre des hyphènes 2-8 pm - longueur des conidiophores: jusqu'à 6 pm - diamètre des conidies: 4-6 pm avec des surfaces crevassées. Dans des conditions appropriées de culture, le micro-organisme mis en oeuvre, Aspergillus niger DSM 5484, possède un poids de spores étonnamment élevé de 1-3.1010 spores individuelles/g qui se situe} pour d'autres représentants de ce genre, de l'ordre de grandeur de 8-11.1010 spores individuelles. Cette caractéristique est explicable par le diamètre des conidies; qui s'élève pour les souches utilisées habituellement pour la production d'acide citrique à 3.7-4.7 mm. Ainsi, on doit souligner que le poids des spores et le diamètre est obtenu) de préférence)par culture sur des milieux dont la source d'hydrate de Carbone est constituéede matières premières pures comme>par exemple> le glucose ou le Saccharose!et n'est pas atteinte par l'addition de substances de croissance complexes comme par exemple)la mélasse. Au contraire de l'organisme décrit dans le brevet US 2.492.667? Aspergellus niger ATCC 1015, la mise en oeuvre de la souche DSM 5484 n'est pas dépendante> selon le procédé conformément à l'invention, de l'arrêt d'un cycle de transfert de 5 à 7 jours par exemple, mais peut se produire dans n'importe quel intervalle de temps. EXEM1PLES1 fi 3 A une solution nutritive définie avec le milieu1jon a ajouté des spores du champignon Aspergellus niger à une concentration de 109 spores par litre de liquide de culture, ce qui correspond environ à une quantité de 10 à 15 g de spores par m3. L'incubation du bouillon ainsi inoculé} s'effectue dans les conditions décrites d'une manière générale et connues habituellement pour la production d'acide citrique, comme l'introduction d'air et le contrôle des températures. -5- Milieu 1: Dextrose 150 g SO4 (NH4)2 1,5 g SO04 Mg 0,6 g * PO4 H2K 0, 12 g - par litre d'eau de boisson Pour l'exemple 1, on n'a ajouté ni Zinc, ni Hexacyanoferrate. 2+ Pour l'exemple 2, on a ajouté 100 ppm de Zn sous forme de S04Zn 7 H20 Pour l'exemple 3, on a additionné 100 ppm d'hexacyanoferrate II, de potassium. Les résultats obtenus à partir de ces essais/sont répertoriés dans le Tableau 1 exprimés en % en Acide citrique rapporté au glucose mis en oeuvre. TABLEAU 1 K:::,4Fe (cN)] I z20 100 0 1% 18% 100 14 % Tableau 1: rendement en acide citrique Ainsi qu'il ressort des exemples, une production économique de l'acide citrique dans les conditions choisies n'est pas possible sans ou avec seulement une des substances additives zinc et Hexacyanoferrate. EXEMPLES 4 à 16 Commne explicité dans les exemples 1 à 3, on a ajouté à la solution nutritive le milieu 1, du zinc et de l'hexacyanoferrate aux concentrations suivantes: -6 - Zn2+ [K4Fe(CN) 6] [ppml [ ppm] EXEMPLE 4 30 100 EXEMPLE 5 50 100 EXEMPLE 6 50 150 EXEMPLE 7 100 100- EXEMPLE 8 100 150 EXEMPLE 9 100 200 EXEMPLE io 150 100 EXEMPLE 11 150 150 EXEMPLE 12 150 300 EXEMPLE 13 200 100 EXEMPLE 14 200 400 EXEMPLE 15 250 100 1 5 EXEMPLE 16 250 500 La fermentation a été conduite dans les mêmes conditions que dans les exemples précédents. Les rendements en acide citrique ainsi obtenus sont les suivants: _ _S 2 X -,K4 Fe (CN) Zn2 100 150 200 300 400 500 iPPM] 69 % 50 82 % 79 % 86 % 77 % 72 % 79 % 71% 75% 63 % 63 % 250 57 % = 65 % Comme il est apparent, de très intéressants rendements d'un point de 2+ vue économique;peuvent être obtenus par addition de 100 ppm Zn2+ et 100 ppm de Fe(CN)6K4. Sur la base de deux essais) l'influence des précipitations qui se produisent peut être d6montrée. EXEMPLES17 et 18 Pour l'exemple 17, 50 ppm de Zn2+ et 100 ppm d'hexacyanoferrate II de potassium ont été ajouté au milieu 1 correspondant à l'exemple 5; pour --7 -- l'exemple 18, 100 ppm Zn2+ et 100 ppm d'hexacyanoferrate II de potassium au milieu correspondant à l'exemple 7. Le précipité qui survient a été éliminé cependantpar opposition aux exemples 5 et 7, par centrifugation1 et la solution claire qui demeure a été inoculée de la nmanière déjà décrite} avec des spores et est soumise au processus de fermentation. Résultats Exemple 17: 46 % de rendement en acide citrique Exemple 18: 57 % de rendement en acide citrique En comparaison avec les résultats obtenus à partir des exemples 5 et 7, pour lesquels les substances troubles n'ont pas été éliminées et dont les rendements se sont élevés à 82% et à 86 %, aucun doute ne peut exister sur l'importance des précipitations pour la formation de produit dans le système décrit. Pour clôturer, un procédé va être décrit d'une manière détaillée) à l'exemple 19;pour lequel la croissance de l'inoculat s'est effectuée sur la base des données techniques particulières obtenues dans un fermenteur autre que celui de la production. EXEZPLE 19 Les sels nutritifs énumérés dans les exemples précédents ont été dissouts dans de l'eau de boisson, stérilisés à une valeur de pH de 3,0 pendant 30 mn à 121"C,i puis, après refroidissement, 100 ppm de Zn2+ sous la forme de SO4Zn.7H20, ainsi que 100 ppm de [Fe(CN)6] K41ont été ajoutés et inoculés avec des sporesd'une manié recorrespondant à 109 spores par litre. Les conditions de culture ont été choisies avec un réglage-de température à 30 C,une correction de pH à 3,0 au moyen d'ammoniac et une introduction d'air de 2VVM pour une vitesse de rotation de l'agitateur à disques de 200 t/mn, de telle sorte, qu'après 20 à 30h, suffisamment d'inoculats se soient dvelopp4s, pour inoculer un fermenteur de production. Comme quantité d'inoculation, on a choisi, pour l'essai décrit, 3%. -Le milieu nutritif du fermenteur de production a été préparé de la même façon qu'indiqué ci-dessus, la tempé6rature a 6t6 maintenue constante,et l'admission de l'air et l'agitation ont été régulées d'une manière correspondant à la viscosité du milieu. Pour cet essai, un rendement de 70% en acide citrique a pu être obtenu) en prenant en considération la totalité des hydrates de Carbone mis en jeu. -9- REVENDICATIONS 1- Procédé pour la production, par fermentation d'acide citrique à partir d'hydrates de Carbone,à l'aide d'un micro organisme du genre Aspergillus niger dans un substrat contenant des ions Zinc et des ions Hexacyanoferrate, caractéris6 en ce que des hydrates de Carbone non purifiés au préalable;sont mis en oeuvre et que la teneur en Zn du substrat est ajustée à 30 - 250 ppm et celle de l'hexacyanoferrate dans le substrat à 100 - 500 ppm. 2 - Procédé selon la revendication 1' caractérisé en ce que la teneur en Zinc et la teneur en hexacyanoferrate sont ajustés respectivement à environ 100 ppm. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'on ajoute autant d'ions Zinc et d'ions hexacyanoferrate au moins pour qu'il se forme un produit de précipitation. - Pocédé selon une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre, comme hydrate de Carbone, des mono et/ou disaccharides, en particulier du glucose. - Procédé selon une des revendications 1 à 4;caractérisé en ce que la souche d'Aspergillus niger 6074 (DSM N0 5484 du 16 Août 1989) est mise en oeuvre. 6 - Procédé selon une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la fermentation est conduite en immersion. 71- La souche d'Aspergillus niger 6074 (DSM N 5484 du 16 Août 1989)