FR 2650182 A1 19910201 FR 9009333 A 19900720 Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique sous forme de microparticules L'invention a pour objet un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique se présentant sous forme de microparticules, la composition ainsi obtenue et son utilisation pour la préparation de suspensions injectables. L'invention a plus précisément pour objet un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la libération prolongée et contrôlée de substance médicamenteuse, se présentant sous forme de microparticules de copolymère d'acide lactique et glycolique incorporant à titre de substance active un pamoate, tannate, stéarate ou palmitate d'un peptide naturel ou sythétique, plus particulièrement un peptide comprenant de 3 à 45 acides aminés. Diverses solutions ont été proposées à ce jour pour la préparation de compositions à libération prolongée et contrôlée de substances médicamenteuses, mettant en oeuvre la fabrication d'implants biodégradables, la microencapsulation ou la préparation de matrices poreuses biodégradables se présentant, par exemple, sous forme de microparticules de dimensions diverses. On peut citer à ce propos EP-A0052510 pour la microencapsulation et EP-A-005848i ou US-A-3.976.071 pour la préparation d'implants ou de matrices poreuses biodégradables. Ces techniques font toutes appel à la dissolution préalable dans un solvant organique, du polymère ou copolymère biodégradable utilisé comme support, le cas échéant à la dissolution de la substance médicamenteuse elle-même. Si, dans de tels cas, la dispersion de la substance active au sein de la masse biodégradable est satisfaisante, on rencontre toujours le problème des traces de solvant résiduel qui peuvent compromettre l'utilisation de telles compositions à titre thérapeutique. Le choix de solvants peu toxiques ou l'élimination poussée de traces de solvant peut être parfois complexe et coûteux, et peut entraîner une baisse de pureté inacceptable du produit. Il a été également proposé le mélange à sec, c'est à dire sans solvant, d' une substance protéique (Bovine Serum Albumine) et d'un copolymère biodégradable d'acide lactique et glycolique sous forme pulvérulente, suivi de la compression à la température de fusion du mélange obtenu (J.D. Gresser et al., Biopolymeric Controlled Release System Vol. II, p. 136). Cette technique ne s'est pas avérée satisfaisante, notamment quant à 1' homogénéité de la distribution de la substance protéique (BSA) au sein de la masse. Contre toute attente, il a été trouvé que l'on pouvait parvenir à surmonter ces divers obstacles bien que partant du même type de polymères ou copolymères biodégradables et de peptides naturels ou synthétiques, tels des octa-, nona-, ou décapeptides, plus généralement de peptides comportant de 3 à 45 acides aminés, par la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Le procédé, objet de l'invention est défini à la revendication 1. Selon l'invention, on utilise les peptides naturels ou synthétiques sous forme de sels, plus précisément sous forme de pamoates, tannates, stéarates ou palmitates, le pamoate étant utilisé de préférence. On peut noter à ce propos que ces sels de peptides sont insolubles dans l'eau. 265O182 Les sels susmentionnés, tout comme les copolymères d'acide lactique (L- ou D,L- lactique) et d'acide glycolique, sont utilisés sous forme pulvérulente, en fait sous forme de microparticules de dimensions moyennes inférieures à 200 microns environ. De bons résultats on été obtenus avec des microparticules de copolymère de l'ordre de 180 microns ou moins, le sel peptidique pouvant être d'une granulométrie encore plus réduite. Le mélange de ces matières s'effectue à sec dans tout appareil approprié, par exemple un moulin à boules, à la température ambiante (env. 25 C) voire à une température inférieure, par exemple 5 à 10 C. Les proportions des constituants pulvérulents peuvent varier de façon étendue, par exemple de 0,1 à 15% en poids de sel peptidique, en fonction des effets thérapeutiques recherchés. Selon l'invention, un fois le mélange déterminé dûment homogénéisé, celui-ci est soumis à une compression progressive et, simultanément, à un chauffage progressif avant d'être extrudé. Ces deux opérations, de même que le transport du mélange vers la zone de précompression et de préchauffage peuvent être avantageusement réalisées à l'aide d'une vis sans fin, convenablement dimensionnée. Le taux de compression peut varier en fonction de nombreux facteurs tels que la géométrie de l'appareillage ou la granulométrie du mélange pulvérulent. Plus déterminant à maîtriser est le préchauffage et son évolution du fur et à mesure de l'avancement du mélange: fonction de la nature des produits à traiter (copolymère, peptide) on s'efforce de maintenir un gradient de température dont le maximum est de l'ordre de 80 C. La température initiale à laquelle est soumise le mélange pulvérulent peut être de 25 C, soit plus soit moins selon les cas. Le mélange ainsi précomprimé et préchauffé est alors soumis à extrusion, à une température le plus généralement comprise entre env. 80 et 100 C, la limite supérieure de cet intervalle étant dictée par la nature de la substance médicamenteuse (peptide) qu'il convient de ne pas détériorer. L'extrusion peut s'opérer à une pression variant fortement, de 50 à 500 kg/cm2, l'essentiel étant de faire jouer température et pression d'extrusion avec la viscosité du produit. Pression et température adéquates favorisent bien entendu la parfaite homogénéisation des ingrédients, en particulier la distribution régulière du sel peptidique au sein de la masse de copolymère. L'extrusion proprement dite s'effectue à l'aide d'une buse de forme et dimensions standard, placée er. fin de course de la vis sans fin mentionnée plus haut. Le refroidissement du produit extrudé est effectué à l'aide de tout moyen approprié, air ou gaz stérile refroidi ou par simple déperdition de chaleur. Selon l'invention, le produit d'extrusion convenablement refroidi est alors pulvérisé à basse température, de préférence à une température inféreure à 0 C, voire nettement plus inférieure, -10 ou -30 C par exemple. On utilise avantageusement la pulvérisation cryogénique, une technique en soi connue. Le produit ainsi pulvérisé est ensuite soumis à un tri des microparticules en fonction de leurs dimensions moyennes, celles de dimension inférieure à 200 microns, de préférence inférieure ou égale à 180 microns étant alors retenues, conformément au procédé de l'inventioh. Ce tri des microparticules peut être, par exemple, effectué par tamisage. Les microparticules triées et rassemblées sont alors prêtes à l'emploi. Conformément au procédé de l'invention, les étapes décrites ci-dessus se déroulent successivement, sans temps mort excessif d'une phase à l'autre. L'avantage de ce procédé c'est qu'il peut aussi bien se dérouler en continu toutes les opérations s'enchaînant l'une après l'autre, par simple transfert du mélange traité. Selon l'invention, à titre de copolymère d'acide lactique et glycolique, on utilise tout type de copolymère biodégradable constitué sur cette base là, de préférence un copolymère d'acide L- ou D,L- lactique contenant de 45 à 90 % (mole) de motifs acide lactique respectivement de 55 à 10% (mole) de motifs acide glycolique. De tels polymères sont aisément préparés conformément à la littérature citée précédemment ou peuvent être obtenus auprès du commerce spécialisé. Les sels de peptides, naturels ou synthétiques, ainsi incorporés au sein de la masse de copolymère sont de préférence des sels de peptides comprenant de 3 à 45 acides aminés, plus particulièrement des sels de LHRH (Luteinizing Hormone - Releasing Hormone), de somatostatine, de GH-RH (Growth Hormone - Releasing Hormone) ou de calcitonine, ou de leurs homologues ou analogues synthétiques. Plus particulièrement', ce sont des pamoates de LH- RH, ou de somatostatine ou de l'un de leurs homologues ou analogues choisis parmi I i D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH, D-Phe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Trp-NH2,. 1I D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2, -6 I I D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2, r 1 D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-ValCys-Trp-NH2, 1I AcPhe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2, I AcPhe-Cys-TyrD-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2, (pyro) Glu-His-Trp-D-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHR1, (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHR1, (pyro) Glu-HisTrp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 ou (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-PheLeu-Arg-Pro-Gly-NH2 (R1 = alkyle inférieur), cette énumération n'étant pas limitative. Les microparticules obtenues conformément au procédé de l'invention à partir des ingrédients susmentionnés sont alors utilisées, après une stérilisation adéquate, pour la préparation de suspensions injectables. Les exemples ci-après illustrent l'invention de façon plus détaillée sans pour autant la limiter. Exemple 1 20 g de copolymère 50:50 (mole %) d'acide D,L- lactique et glycolique sous forme de granules de l'ordre de 3 à 5 mm de diamètre ont été premièrement broyés à basse température et tamisés jusqu'à l'obtention de microparticules de dimension moyenne de 180 microns ou moins. A cette masse pulvérulente on a ajouté 0,490 g de pamoate de D-Trp6-LH-RH (formule du peptide: (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2) finement pulvérisé. Le produit se présente sous forme de microparticules de dimension de 10 microns environ et de structure amorphe. Le mélange résultant a été homogénéisé à température ambiante, dans un moulin. Le mélange homogénéisé a ensuite été placé dans un appareil muni d'une vis sans fin accouplée à une buse d'extrusion conventionnelle. La vis sans fin peut avoir une longueur de 25 cm environ et un diamètre de 1,5 cm environ. Elle comporte une première zone servant exclu- sivement au déplacement du mélange, voisine d'une secon- de zone réservée à la compression et au préchauffage. TOut au long de son parcours, le mélange est porté de 25 à environ 80 C, la vitesse de déplacement étant adaptée pour que cette phase soit de l'ordre de 5 min. environ. L'extrusion proprement dite a lieu à 98 C, la buse d'extrusion comportant un orifice de l'ordre de 1,5 mm de diamètre. Les filaments ainsi obtenus sont ensuite laissés à refroidir à température ambiante, coupés en petites por- tions et finalement broyés à -30 C. Après tamisage, on receuille les microparticules de dimension moyenne de 180 microns ou moins. L'analyse chimique effectuée sur des échantillons de produit extrudé et broyé confirme la parfaite homogé- - néité de la dispersion de la substance active au sein de la masse de copolymère. 8- Les microparticules obtenues ci-dessus ont été soumises à une stérilisation par rayons gamma et mises ensuite en suspension dans un véhicule stérile approprié. Les tests in vivo (dosage du taux de testostérone sanguin chez des souches de rats mâles) confirment la libération régulière de la substance acti- ve sur au moins 25 jours, ce qui se traduit par un effondrement du taux de testostérone à des valeurs de castration. Exemple 2 On a procédé conformément à l'exemple 1, pour pré- parer des microparticules de copolymère d'acide D,L- lactique-glycolique 50:50 (mole %) contenant, à un dosa- ge comparable un pamoate de l'un des décapeptides sui- vants: (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (pyro) GluHis-Trp-D-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHR1, ou (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-DTrp-Leu-Arg-Pro-NHR1 (R1 = éthyle) Les tests d'activité in vivo confirment une libé- ration régulière de la substance active sur plusieurs semaines. Exemple 3 13.85 g.de copolymère 75:25 (mole %) d'acide D,L- lactique et glycolique sous forme de granules de l'ordre de 3 à 5 mm de diamètre ont été premièrement broyés à basse température et tamisés jusqu'à obtention de micro- particules de dimension moyenne de 180 microns ou moins. -9- A cette masse pulvérulente, on a ajouté 1.15 g de pamoate de D-Trp6LH-RH (formule du peptide: (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-ProGly-NH2) finement pulvérisé. Le produit se présente sous forme de microparticules de dimension de 10 microns environs et de structure amorphe. Le mélange résultant a été homogé- néisé à température ambiante, dans un moulin et finalement soumis au traitement décrit à l'Exemple 1. Après cryopulvérisation, tamisage et finalement stérilisation par rayons gamma, les microparticules ont été mises en suspension dans un véhicule stérile approprié. Les tests in vivo (dosage du taux de testos- térone sanguin chez des souches de rats mâles) confir- ment la libération régulière de la substance active sur au moins 40 jours, ce qui se traduit par un effondrement du taux de testostérone à des valeurs de castration. Exemple 4 On a procédé conformément à l'Exemple 1, partant de 18 g de copolymère 50:50 (mole %) d'acide D,L - lactique et glycolique et 2,85 g de pamoate d'un ana- logue de la somatostatine - formule du peptide: ! l D-Phe-Cys-Tyr-D-TrpLys-Val-Cys-Trp-NH2 pour obtenir des microparticules présentant la granu- lométrie souhaitée. - 10 - L'analyse chimique effectuée sur des échantillons de produit extrudé et broyé confirme la parfaite homogé- néité de la dispersion de la substance active au sein de la masse copolymère. Les tests in vivo, en outre, confirment la libé- ration contrôlée de la substance active (analogue de so- matostatine) sur une période d'au moins 7 jours. Exemple 5 On a répété le procédé de l'Exemple 4, partant cette fois-ci de 13.50 g de copolymère 75:25 d'acide D,L- lactique-glycolique et de 1.50 g du pamoate d'analogue de somatostatine identifié ci-dessus. Les microparticules ainsi obtenues, une fois stérilisées au moyen de rayons gamma ont été finalement mises en suspension dans un véhicule stérile approprié. Les tests in vivo (dosage de la quantité d'analogue de somatostatine dans le sérum sanguin de rats ayant subi une injection unique à to) indiquent une libération contrôlée de la substance active sur un minimum de 15 jours. Exemple 6 On a procédé comme à l'exemple 4, pour obtenir des microparticules de cooplymère d'acide D,L- lactique- glycolique 50:50 (mole %) contenant à un dosage comparable un pamoate de l'un des octapeptides suivants: 2650 182 - 11 - PeCsPe -TpL.- Ih D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH, I' I D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Trp-NH2, I_ I D-Trp Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2, D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-CysThr-NH2, AcPhe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2, AcPhe-Cys-Tyr-D-Trp-LysVal-:ys-Trp-NH2. L'analyse chimique effectuée sur des échantillons de produit extrudé et broyé confirme la parfaite homogé- néité de la dispersion de la substance active au sein de la masse de copolymère. * * * * * * * * * Au cours des expérimentations décrites ci-dessus, il a été observé que les filaments extrudés, une fois coupés en bâtonnets de longueur appropriée, pouvaient être directement utilisés comme implants, après stérili- sation. De tels implants assurent également la libéra- tion prolongée et contrôlée de la substance active. - 12 - REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la libération prolongée et contrôlée de substance médicamenteuse, se présentant sous forme de microparticules de copolymère d'acide lactique et glycolique incorporant à titre de substance active un pamoate, tannate, stéarate ou palmitate d'un peptide 'naturel ou synthétique, caractérisé en ce que a) on mélange à sec le copolymère et la substance active choisis, présents tous deux sous forme de microparticules de dimension moyenne inférieure à environ 200 microns; b) on comprime progressivement et chauffe progressi- vement jusqu'à environ 80 C le mélange pulvérulent obtenu; c) on soumet le mélange précomprimé et préchauffé à extrusion à une température comprise entre environ 80 et 100 C; d) on pulvérise à basse température le produit ré- sultant de l'extrusion, puis on sélectionne et finalement recueille les microparticules présen- tant une dimension inférieure à 200 microns envi- ron. 2. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que le microparticules de copolymère présen- tent une dimension moyenne inférieure ou égale à 180 mi- crons. 26S0182 - 13 - 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que la précompression et le préchauffage du mélange s'effectuent simultanément, à l'aide d'une vis sans fin. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'extrusion s'effectue à une pression comprise entre 50 et 500 kg/cm2. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la pulvérisation du produit résul- tant de l'extrusion est une pulvérisation cryogénique. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la sélection des microparticules résultant de la pulvérisation s'effectue par tamisage. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le copolymère d'acide lactique et- glycolique est un copolymère d'acide L- ou D, L- lactique contenant de 45 à 90% (mole %) de motifs acide lactique, respectivement de 55 à 10 % (mole) de motifs acide glyco- lique. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la substance active est un pamoate, tannate, stéàrate ou palmitate d'un peptide naturel ou synthétique comprenant de 3 à 45 acides aminés, notamment de LH-RH, de somatostatine, de GH-RH ou de calcitonine ou de leur analogues ou homologues synthétiques. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la substance active est un pamoate de LH-RH, de somatostatine ou de l'un de leurs analogues ou homologues synthétiques choisis parmi - 14 - D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH, D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-CysTrp-NH2, D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2, D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-LysVal-Cys-Thr-NH2, t I D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2, AcPhe-CysPhe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2, I I AcPhe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2, (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-TrpLeu-Arg-Pro-Gly-NH2, (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (pyro) Glu-His-Trp-D-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHR1, ou (pyro) Glu-HisTrp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHR1 (R1 = alkyle inférieur). 10. Composition pharmaceutique sous forme de mi- croparticules obtenues au moyen du procédé selon l'une des revendications 1 à 9. 11. Utilisation d'une composition pharmaceutique selon la revendication 10 pour la préparation de suspension injectables.