FR 2658204 A1 19910816 FR 9001596 A 19900212 Nouvelles compositions de cycline A humaine, séquence nucléotidique correspondante, et agents de détection ou de diagnostic de mutations hépatocellulaires induites par le virus HBV. La présente invention a trait à de nouvelles compositions contenant, à une concentration élevée et/ou à un degré de pureté élevé, une cycline A humaine, lesdites compositions pouvant être utiles notamment pour préparer des agents de détection de la cycline, tels que notamment des antisérums. L'invention a également trait à un procédé permettant la préparation de ces compositions. L'invention a également trait à une séquence nucléotidique codant pour la cycline A humaine ainsi qutà des vecteurs d'expression incorporant cette séquence pour exprimer la cycline A et à un procédé de préparation de cycline A et de compositions la contenant par expression de ces vecteurs. L'invention a également trait à des agents permettant la détection et/ou le diagnostic de la mutation hépatocellulaire induite par le virus de lthépatite B (HBV). Enfin l'invention permet d'envisager des agents thérapeutiques susceptibles d'inhiber la multiplication du virus HBV et/ou d'inhiber la multiplication tumorale de cellules hépatiques mutantes et notamment de carcinomes hépatocellulaires. On sait que l'infection chronique par le virus de lthépatite B (HBV) est un facteur de risque du développement du carcinome hépatocellulaire (22-24) et il a été établi que 1'ADN proviral du virus HBV s'intègre fréquemment dans le génome de cellules humaines tumorales du cancer primaire du foie (1-4). Toutefois, le rôle joué par cette intégration dans la carcinogénèse du foie n'est pas encore éclairci et les preuves d'un rôle directes du virus dans la transformation cellulaire sont rares. Plus particulièrement, les effets de l'intégration de 1'ADN viral dans le génome cellulaire sont controversés. Chez la marmotte d'Amérique HCC, le virus de l'hépatite de la marmotte (WEV) s'est avéré agir souvent par dérégulation du MYC après l'insertion virale (25).Chez l'homme, l'intégration de HBV induit fréquemment, d'une manière non spécifique semble-t-il, des délétions et translocations (3, 26-28). Il a cependant été suggéré que l'intégration sur le chromosome 11 (3) ainsi que le réarrangement sur un locus du chromosome 4q (29, 30) se produisent de façon non aléatoire. L'intégration de HBV au voisinage d'un gène cellulaire a été démontrée uniquement dans une tumeur dans laquelle 1'ADN viral a interrompu la région codant pour le récepteur béta de l'acide rétinoque (31, 32). La présente invention a permis d'établir qu'il existe un site individualisé d'intégration de 1'ADN du virus HBV dans le génome humain (chromosome 4q27) et plus précisément dans un gène codant pour une cycline A humaine dont l'existence a été découverte à la même occasion, et que cette intégration était présente dans les cellules hépatiques à un état précoce du développement tumoral sans réarrangement chromosomique notable, ne présentant aucune des caractéristiques histologiques de l'hépatite chronique ou de la cirrhose, dans une prolifération clonale d'une cellule contenant une seule intégration de HBV, absente dans le tissu hépatique adjacent, de sorte qu'il est plus que vraisemblable, par le dérèglement de la fonction de la cycline A qui en résulte, que cette insertion est directement impliquée dans la carcinogénèse hépatique. Conformément à l'invention, on a cloné et séquencé 1'ADN correspondant au locus d'insertion et on a construit des vecteurs d'expression permettant de produire en grande quantité la cycline A codée et l'invention a également pour objet un procédé de préparation de cycline A humaine par expression génétique ainsi que de nouvelles compositions concentrées en cycline A humaine à un degré de pureté élevée. L'invention concerne également la séquence nucléotidique isolée codant pour la cycline A humaine et à des vecteurs contenant et/ou exprimant la séquence codant pour la cycline A. L'invention concerne notamment la séquence repérée No.: 1 sur la liste des séquences annexée. Cette séquence peut être associée à d'autres ensembles usuels tels que promoteurs, signaux d'initiation ou d'arrets ou introns ou autres séquences non codantes à l'extrémité 3' et/ou 5'. Elle inclut également les variantes obtenues notamment par substitution de codons ou de nucléotides conservant la signification du code, ou par substitutions, insertions ou délétions codant pour un polypeptide équivalent et notamment conservant l'antigénicité du polypeptide. Elle inclut également tout fragment permettant l'expression d'un polypeptide conservant cette antigénicité. Enfin, la séquence s'étend également au gène de la cycline A humaine, incorporant ou non certains ou tous les éléments d'un opéron, et dépourvue de séquences flanquantes naturelles, et à tout fragment permettant l'expression d'un polypeptide conservant une antigénicité de la cycline A. L'invention concerne également des agents de détection ou de diagnostic permettant de détecter des concentrations significatives de cycline A humaine y compris lorsqu'elles sont associées à un dérèglement tumoral. Ces agents peuvent avantageusement être constitués d'anticorps anticycline A, par exemple des antisérums animaux, induits par immunisation par la cycline A humaine. L'invention a également trait à des sondes d'ADN permettant la détection ou le diagnostic de l'insertion de 1'ADN HBV dans un génome cellulaire. Ces sondes peuvent être marquées de toute façon, comme cela est actuellement bien connu pour le marquage des sondes destinées à la détection ou au diagnostic par hybridation. Enfin, l'invention a également pour objet des agents thérapeutiques susceptibles d'inhiber la multiplication du virus HBV ou la prolifération de cellules, notamment hépatiques, contenant une insertion d'ADN viral de l'hépatite B dans le site pertinent du locus relatif à la cycline A. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif et se référant au dessin annexé dans lequel la figure 1 représente, - en A, la carte de restriction de la région d'intégration de HBV dans une cellule tumorale ; la bote ouverte représente l'insert viral de 3,1 kb indiquant l'orientation du virus (+) ; les sites de restriction sont : B, Bam HI Bg, Bgl II ; E, Eco RI ; H, Hind III ; P, Pst I ; S, Sst I - en B, des sous-clones dérivés des séquences génomiques tumorales représentées en A, tous libres de séquences répétitives ; A est un fragment Sst I/Bgl II de 2,2 kb ; B est un fragment Eco RI/Bgl II de 1,1 kb ; les fragments X (0,5 kb Bgl II) et Y (0,7 kb Bam HI/Pst I) contiennent les sites gauche et droit de recombinaison - en C, la carte de restriction du locus d'intégration de HBV dans sa configuration naturelle ;La flèche indique le site d'intégration virale ; les lignes interrompues indiquant des fragments identiques de restriction - en D, la séquence des jonctions virus-hôte dans le locus, - en E, une analyse par Northern blot d'ARN hépatique de nouveau-nés humains après hybridation par le clone B (ligne B de la figure 1) ; A- : 50 ug d'ARN poly A- ; A+ : ug d'ARN poly A+ ; tailles en kb. la figure 2 représente, - en A, un alignement de comparaison des séquences d'acides aminés de cycline A de S. solidissima (Clam A) (4), D. melanogaster (Drosophila A) (5) et de l'homme ; les acides aminés identiques sont reliés par des traits et les substitutions conservatives par un astérisque (*), - en B, un alignement des séquences de cycline de la cycline B de S. solidissima (Clam) (15), de la cycline B humaine (12) et de la cycline A humaine. Mise en évidence de l'insertion. On a analysé un carcinome hépatocellulaire primaire (HCC) précoce bien différencié développé sous forme d'un petit nodule isolé sans cirrhose d'accompagnement chez une femme présentant des anticorps contre l'antigène de surface de l'hépatite B. On a extrait, selon la procédure classique, l'ADN cellulaire d'une part du tissu tumoral et d'autre part du tissu adjacent non tumoral. Les Southern blots de ces ADN ont été sondés par 1'ADN de HBV. Alors que 1'ADN de HBV, dans le tissu non tumoral, n'était présent que sous forme de molécules libres, 1'ADN tumoral a formé une bande unique correspondant à l'intégration d'une seule copie de génome HBV par cellule. On a construit une librairie phagique de l'ADN tumoral qui a permis d'isoler plusieurs clones chevauchants identifiés par une sonde spécifique HBV. La librairie a été construite par digestion partielle de 1'ADN tumoral par Hind III et ligation dans les branches Hind III du phage L 47. Une population de clones de phages chevauchants a été isolée en utilisant HBV cloné comme sonde. Le sous-clonage a été effectué à l'aide de vecteurs Bluescript (Stratagene). L'allèle naturel (figuré 1 C) a été cloné à partir d'une librairie EMBL 3 faite d'ADN placentaire, partiellement digéré par Sau 3A I. Le séquençage a été effectué par le procédé décrit dans la référence (39). L'ADNc a été isolé à partir d'une librairie construite à partir d'ARNm de foie humain adulte amorcé par oligo(dT) (32). La carte de restriction, qui en résulte, du provirus HBV et des séquences cellulaires flanquantes dans la tumeur est représentée sur la figure 1A. La figure 1B montre les sous-clones A, X, Y, B, dépourvus de séquences répétitives, qui ont été dérivés des clones phagiques. Le séquençage des fragments X et Y (figure 1B) de la jonction provirus-hôte, avec l'analyse de restriction détaillée de l'insert proviral, ont confirmé l'obtention d'un génome viral sans réarrangements majeurs.Les jonctions viruscellules sont toutes deux situées dans les régions d'extrémité de HBV (nucléotides 1840 et 1617 dans le noyau viral et les cadres de lecture ouverts X, respectivement (1)) (figure 1D). L'hybridation de Southern blots constitués à partir d'ADN tumoral par les sondes A et B de la figure 1B a confirmé la configuration génomique représentée à la figure lA. Avec la sonde B, c'est-à-dire un fragment EcoR I/Bgl II de 1,1 kb, on a balayé la librairie phagique du génome humain normal et isolé plusieurs clones chevauchants. La carte de restriction de la région où s'effectue l'intégration de HBV, dans sa configuration native, a été représentée à la figure 1C. Une comparaison des cartes de restriction des figures 1A et 1C montre que l'intégration virale dans la tumeur n'a pas entraîné de réarrangements majeurs dans son voisinage. L'hybridation du clone B par Northern blots d'ARN polyadénylé et non polyadénylé de foie de nouveau-né normal a permis d'identifier deux molécules polyadénylées d'ARN transcrit de 1,8 kb et 2,7 kb (figure 1E). Le criblage consécutif d'une librairie phagique d'ADNc de foie humain normal a permis l'isolation de 5 clones d'ADNc qui, d'après leurs cartes de restriction, représentent la même molécule d'ARN. La séquence d'ADNc de l'insert cloné le plus long (1641 bp) est représentée sur la liste des séquences (No.: 1) qui montre un cadre de lecture ouvert (ORF) avec une capacité de codage d'une protéine de 431 acides aminés et une masse moléculaire relative Mr = 47.954. Dans le cadre de lecture du codon d'initiation AUG supputé se trouve un codon stop à 30 bp en amont. L'ADNc ne contient pas de zone poly A ni de signal consensus de polyadénylation. Une recherche comparative effectuée sur ordinateur a montré que la protéine déduite de cet insert contient une région de 150 acides aminés (aa position 209358) connue comme bote cycline (9) qui constitue le domaine majeur de conservation de toutes les cyclines connues (4, 5, 7, 9, 12). La comparaison par alignement est représentée sur la figure 3 et présente une grande ressemblance avec les cyclines A de S. solidissima (4) et D. melanogaster (5). Du fait qu'elle ne possède que 54 positions d'acides aminés, sur les 150 communes aux cases cycline des cyclines B de S. solidissima (1) et de l'homme (12), la protéine déduite est une cycline A humaine. L'extrémité N-terminale de la protéine ne montre pas d'homologie sensible à d'autres protéines connues, y compris d'autres cyclines, ce qui est une caractéristique commune à toutes les cyclines connues. Le fragment A (figure 1B) s'est avéré réagir par hybridation avec l'ADNc (figure 1). On a donc partiellement séquencé les fragments A et B et trouvé des séquences à partir des extrémités 5' et 3' de l'ADNc respectivement. L'orientation qui s'en déduit du gène de la cycline A est de gauche à droite sur la figure 1. L'étude de la séquence montre alors que la cycline A possède plusieurs exons et, du fait que les séquences cellulaires des fragments de jonction virus-hôte X, Y (figure 1B) ne sont pas retrouvées dans l'ADNc, il résulte que l'intégration de l'ADN du virus HBV s'effectue dans un intron du gène. L'insertion virale dans le locus ainsi découvert dérègle le fonctionnement du gène de la cycline A, ce qui parait avoir des conséquences décisives sur la régulation de la croissance cellulaire. Pour plus de détails sur les cyclines A et B, et leur importance dans la mitose, voir (5-21, 33-38). Production de la cycline A humaine par expression génétique. La molécule d'ADNc cloné, représentée sur la liste, est inséré dans un vecteur d'expression bactérien ou de préférence eukaryote, par exemple par clonage de l'ADNc dans le vecteur de clonage Bluescript, insertion dans le vecteur plasmidique d'expression pET-3b, transfection d'un hôte, par exemple bactérien, les bouts de la séquence étant déterminés par les enzymes de restrictions Eco RI et Sma I. Pour une description détaillée de cette technique Voir Gene - 1987 ; 56 : 125-135. Une préparation de cycline A peut être obtenue à partir de la culture bactérienne par purification sur gel. Préparation d'un antisérum anti-cycline A. La préparation de cycline A obtenue par purification sur gel est injectée au lapin en vue de l'obtention d'un anti-sérum de lapin. La détection avec quantification de la cycline humaine peut être, par exemple, réalisée par Western Blot ou immunohistochimie. Préparation de sondes d'ADN d'hybridation pour la détection de l'insertion de HBV dans le locus cycline A. On prépare, selon la procédure classique une sonde constituée de l'ADNc marqué, par exemple par marquage radio-actif ou de fragments de l'ADNc ou fragments génomiques tels que A et V3. On effectue l'hybridation par la méthode classique de la sonde et de 1'ADN extrait des cellules hépatiques, permettant de détecter la présence, ou l'abscence de remaniement du gène cycline A. References 1 . TIOLLAIS, P., POURCEL, C. & DEJEAN, A. Nature 317,489-496 (1985). 2 . BRECHOT, C., POURCEL, C., LUISE, A, RAIN, B. & TIOLLAIS, P. Nature 286,533-535(1980). 3 . NAGAYA, T. et al. Genes and Deveiopment 1,773-782 (1987). 4. YAGINUMA, K et ai. J. Virol. 61,1808-1813 (1987). 5 . SWENSON, K.I. ,FARRELL; K.M. & RUDERMAN, J.V. Cell 47,861-870 (1986). 6 . LEHNER, C.F. & O'FARRELL, P. Cell 56, 957-968 (1989). 7 . STANDART, N., MINSHULL, J., PINES, J. & HUNT, T. Dev. Biol. 124,248-258 (1987). 8. MINSHULL, J., BLOW. J.J. & HUNT,T.Cell. 56,947-956 (1989). 9 . MEIJER, L. et al. EMBO J. 8,2275-2282( 1989). 10 . 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Liste des séquences. SEQ ID No. : 1 TYPE DE-SEQUENCE : Nucléotide et sa protéine correspondante LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 1647 pb NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc ORIGINE ORGANISME : humain CARACTERISTIQUES : 1293 paires de bases peptide. PROPRIETES : codant pour la cycline A humaine. 1 CGGCAGCCAGCCTATTCTTTGGCCGGGTCGGTGCGAGTGGTCGGCTGGGCAGAGTGCAC 60 GCTGCTTGGCGCCGCACGTGATCCCGCCGTCCACTCCCGGGAGCAGTGATGTTGGGCAAC' M L G N 4 120 TCTGCGCCGGGGCCTGCGACCCGCGAGGCGCTCGGCGCTGCTAGCATTGCAGCAGACGGC S A P G P A T R E A L G A A S I A A D G 24 180 GCTCCAAGAGGACCAGGAGAATATCAACCCGGAAAAGGCAGCGCCCGTCCAACAACCGCG A P R G P G E Y Q P G K G S A R P T T A 44 240 GACCCGGGCGCGCZGGCGGTACTGAAGTCCGGGAACCCGCGGGGTCTAGCGCACGAGCAG D P G A L A V L K S G N P R G L A H E Q 64 300 AGGCCGAAGACGAGACGGGTTGCACCCCTTAAGGATCTTCCTGTAAATGATGAGCATGTC R P K T R R V A P L K D L P V N D E H V 84 360 ACCGTTCCTCCTTGGAAAGCAAACAGTAAACAGCCTGCGTTCACCATTCATGTGGATGAA T V P P W K A N S K Q P A F T I H V D E 104 420 GCAGAAAAAGAAGCTCAGAAGAAG CCAG CTGAATCTCAATAGAGCGTGAAGATGCC A E K E A Q K K P A -E S Q K I E R E D A 124 480 CTGGCTTTTAATCAGCCATTAGTTTACCTGGACCCAGAAAAACCATTGGTCCCTCTTGAT L A F N S A I S L P G P R K P L V P L D 144 540 TATCCAATGGATGGTAGTTTTGAGTCACCACATACTATGGACATGTCAATTGTATTAGAA Y P M D G S F E S P H T M D M S I V L E 164 600 GATGAAAAGCCAGTGAGTGTTAATGAAGTACCAGACTACCATGAGGATATTCACACATAC D E K P V S V N E V P D Y H E D I H T Y 184 660 CTTAGGGAAATGGAGGTTAAATGTAAACCTAAAGTGGGTTACATGAAGAAACAGCCAGAC L R E M E V K C K P K V G Y M K K Q P D 204 720 ATCACTAACAGTATGAGAGCTATCCTCGTGGACTGGTTAGTTGAAGTAGGAGAAGAATAT I T N S M R A I L V D W L V E V G E E Y 224 780 AAACTACAGAATGAGACCCTGCATTTGGCTGTGAACTACATTGATAGGTTCCTGTCTTCC K L Q N E T L H L A V N Y I D R F L S S 244 840 ATGTCAGTGCTGAGAGGAAAACTTCAGCTTGTGGGCACTGCTGCTATGCTGTTAGCCTCA M S V L R G K L Q L V G T A A M L L A S 264# 900 AAGTTTGAAGAAATATACCCCCCAGAAGTAGCAGAGTTTGTGTACATTACAGATGATACC K F E E I Y P P E V A E F V Y I T D D T 284 960 TACACCAAGAAACAAGTTCTGAGAATGGAGCATCTAGTTTTGAAAGTCCTTACTTTTGAC Y T K K Q V L R N E H L V L K V L T F D 304 1020 TTAGCTGCTCCAACAGTAAATCAGTTTCTTACCCAATACTTTCTGCATCAGCAGCGTGCA L A A P T V N Q F L T Q Y F L H Q Q P A 324 1080 AACTGCAAGTTGAAGTTTTTAGCAATGTTTTTGGGAGAATTAAGTTTGATAGATGCTGAC N C K V E S L A H F L G E L S L I D A D 344 1140 CCATACCTCAAGTATTTGCCATCAGTTATTGCTGGAGCTGCcTTCATTTAGCACTCTAC P Y L K Y L P S V I A G A A F H L A L Y 364 1200 ACAGTCACGGGACAAAGCTGGCCTGAATCATTAATACGAAAGACTGGATATACCCTGGAA T V T G Q S W P E S L I R K T G Y T L E 384 1260 AGTCTTAAGCCTTGTCTCATGGACCTTCACCAGACCTACCTCAAAGCACCACAGCATGCA S L K P C L M D L H Q T Y L K A P Q H A 404 1320 CAACAGTCAATAAGAGAAAAGTACAAAAATTCAAAGTATCATGGTGTTTCTCTCCTCAAC Q Q S I R E K Y K N S K Y H G V S L L N 424 1380 CCACCAGAGACACTAAATCTGTAACAATGAAAGACTGCCTTTGTTTTCTAAGATGTAAAT P P E T L N L * (431) 1440 CACTCAAAGAGTATGGTGTACAGTTTTTAACTTAGGTTTTTAATTTTACAATCATTTCTG 1500 AATACAGAAGTTGTGGCCAAGTACAAATTATGGTATCTATTACTTTTTAAATGGTTTTAA 1560 TTTGTATATCTTTTGTATATGTATCTGTCTTAGATATTTGGCTAATTTTAAGTGGTTTTG 1620 TTAAAGTATTAATGATGCCAGCTGCCG REVENDICATIONS. 1. Une séquence de nucléotides codant pour tout ou partie de la cycline A humaine. 2. Une séquence d'ADNc selon la revendication 1. 3. La séquence selon la revendication 2 et représentée sur la liste des séquences sous le No.: 1. 4. Vecteurs d'expression exprimant la séquence selon l'une des revendications 1 à 3. 5. Vecteur selon la revendication 4 composé par le plasmide pET-3b insérant une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 6. Préparation concentrée et/ou purifiée de cycline A humaine. 7. Préparations d'anticorps anticycline A humaine pour la détection ou le diagnostic. 8. Antisérum selon la revendication 7. 9. Sondes ADN marquées pour la détection ou le diagnostic de l'insertion du génome HBV dans le locus cycline A humaine. 10. Sonde selon la revendication 9 ayant la séquence représentée sur la liste des séquences sous le No. : 1 ou une partie de cette séquence.