FR 2659349 A1 19910913 FR 9003105 A 19900312 Virus herpès recombinants notamment pour la réalisation de vaccins, leur procédé de préparation, les plasmides réalisés au cours de ce procédé et les vaccins obtenus. La présente invention concerne des virus herpès recombinants pouvant être notamment utilisés dans des vaccins contre des maladies à virus de l'homme et des animaux, leur procédé de préparation, les plasmides réalisés au cours de ce procédé ainsi que les vaccins obtenus Elle concerne encore une séquence nucléotidique correspondant à une partie du génome du virus herpès de la dinde (HVT) qui est susceptible d'être utilisée pour la préparation de tels virus. Le virus herpès de la dinde (HVT) de la sous-famille des gamma-herpèsvirinae est un virus naturellement apathogène et non-oncogène, relié sérologiquement au virus oncogène de la maladie de Marek, agent responsable d'une maladie lymphoproliférative des volailles, d'une importance économique considérable t Ces deux virus possèdent de nombreuses homologies de séquence tout au long de leur génome et les données récentes publiées montrent, en outre, une similarité 2- avec les génomes des virus herpès simplex (HSV) ou varicelle (VZV), ce qui suggère actuellement leur classification dans la famille des alpha-herpèsvirus, plutôt que celle des gamma-herpèsvirus, o ils étaient classés en raison de leur tropisme ( 1) (Pour les référence bibliographiques, voir annexe 1). Pendant de nombreuses années, la vaccination à l'aide du virus HVT a été très efficace pour contrôler la maladie de Marek Néanmoins, l'émergence de nouvelles souches hautement virulentes montre la nécessité d'utiliser des vaccins plus proches antigéniquement du virus sauvage. Dans ce contexte, les vaccins obtenus par manipulation génétique sont une possibilité intéressante. De plus en plus se développent des vecteurs viraux vivants, tels que des souches atténuées de poxvirus ou d'herpèsvirus Ainsi, les virus HSV, ou de la maladie d'Aujeszky (PRV) ont été utilisés comme vecteurs pour l'expression de gènes étrangers ( 26,34) Pour cela, les gènes étrangers ont été insérés dans des fragments clonés de régions non essentielles des génomes herpès, puis introduits dans le vecteur viral par recombinaison homologue Cette dernière étape est effectuée simplement par cotransfection, puisque les AD Ns des virus herpès sont naturellement infectieux. Le virus HVT est un canditat de choix pour le développement d'un tel vecteur viral dans le domaine aviaire, puisqu'il présente le double avantage de pouvoir être utilisé pour ses propriétés vaccinales et comme vaccin d'autres maladies De plus, ce virus entraîne une virémie permanente et peut être utilisé en embryo-vaccination. Il est possible d'insérer à l'intérieur du génome HVT des gènes codant pour des immunogènes du virus de la maladie de Marek, potentialisant ainsi le rôle protecteur du virus HVT Il est possible également d'insérer à l'intérieur du génome HVT des gènes codant pour des immunogènes d'agents pathogènes viraux, bactériens ou -3- parasitaires d'autres maladies aviaires telles que la maladie de Marek (MDV), la bronchite infectieuse (IBV), la maladie de Newcastle (NDV), la peste aviaire, la maladie de Gumboro (IBDV), l'anémie aviaire (CAA), le syndrome chute de ponte, la coccidiose, la variole aviaire, la rhinotrachéite infectieuse, la colibacillose, la pasteurellose et l'hémophilose Le virus HVT se présenterait alors comme une chimère multivalente. Le matériel génétique des herpèsvirus est constitué par un ADN bicaténaire contenant 100 000 à 180 000 paires de bases Différentes régions de ce génome ont été montrées comme étant non essentielles à la réplication virale, et sont donc des sites potentiels d'insertion de gènes étrangers, ou de délétion pour la création de nouvelles souches plus atténuées. Certaines de ces régions sont associées à la virulence et leur modification provoque une diminution de la pathogénicité des virus Ainsi, l'inactivation de la thymi- dine kinase rend l'herpès simplex humain non pathogène et n'empêche pas la croissance virale in vitro ( 3, 8, 21, 33); il en va de même pour le virus PRV ( 30) De plus, il a été montré que l'atténuation de la souche Bartha du virus PRV est liée à une délétion de la glycoprotéine g I dont le gène se trouve dans le petit fragment Us ( 18). D'autres gènes des virus herpès ont été identifiés comme non essentiels à la croissance virale, sans que pour autant ils soient associés à des phénomènes de virulence Parmi ces gènes, on peut citer le gène UL 24 du virus HSV ( 23), différents gènes du virus HSV situés dans le petit fragment Us ( 35), le gène de la glycoprotéine g III du virus (BHV) de la rhinotrachéite infectieuse bovine ( 9), le gène de la glycoprotéine g X du virus PRV ( 34). La ribonucléotide réductase est une enzyme importante de la chaîne de biosynthèse de l'ADN, responsable de la réduction des ribonucléotides en désoxyribonucléotides Les herpèsvirus possèdent une -4- activité ribonucléotide réductase propre, répondant à des critères de régulation différents de ceux de l'enzyme cellulaire ( 12, 13) Tout comme l'enzyme bactérienne ou de mammifère, la ribonucléotide réductase des virus herpès consiste en 2 sous-unités hétérologues dont l'interaction est nécessaire à l'activité enzymatique: la grande sous- unité RR 1 et la petite sous-unité RR 2. Les gènes codant pour ces protéines ont été localisés et séquences pour le virus herpès simplex (HSV), le virus de la varicelle (VZV), le virus d'Epstein-Barr (EBV) et leur mode de transcription, étudié dans le cas du virus HSV ( 15, 16, 27, 28) Récemment Goldstein et Weller ( 1988), en insérant le gène lac Z de la bêta-galactosidase en phase dans la région terminale du gène codant pour la grande sous-unité de la ribonucléotide réductase du virus HSV ont montré le caractère non essentiel de ce gène Des mutants délétés dans ce même gène du virus HSV ont été construits et leur étude prouve que la ribonucléotide réductase n'est pas nécessaire à la multiplication virale dans des cellules en phase exponentielle de croissance, l'enzyme d'origine cellulaire pouvant alors compenser cette délétion ( 4, 5). Néanmoins, même lorsqu'ils sont cultivés sur des cellules possédant une activité ribonucléotide réductase transcomplémentante, les mutants délétés voient leur croissance modifiée ( 5) Ce phénomène est considérablement amplifié lorsque ces mutants sont cultivés à 39,5 C ou sur des cellules privées de sérum ( 20) Plus récemment encore, il a été montré que la délétion de la grande sous-unité de la ribonucléotide réductase entraîne une diminution de la virulence du virus HSV chez la souris ( 7). Il n'existe, à ce jour, aucune donnée publiée concernant le rôle essentiel de la ribonucléotide réductase du virus HVT Aucune séquence n'existe concernant la petite sous-unité RR 2 du gène de la ribonucléotide réductase du virus HVT. - L'invention a donc pour objectif de fournir des virus recombinants ou virus chimères susceptibles de se multiplier de façon normale, notamment pour la réalisation de vaccins efficaces. Le clonage et le séquençage de la partie du génome du virus herpès de la dinde (HVT) qui correspond au gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase ont d'abord été réalisés. De façon surprenante, le gène codant pour la petite sous-unité RR 2 a pu être muté ou totalement délété et remplacé par une séquence codante, sans que le mutant ainsi créé présente une altération en ce qui concerne sa croissance Il a ainsi été démontré que le virus HVT peut être effectivement utilisé comme vecteur d'expression, en insérant un gène étranger dans le gène de la petite sous- unité RR 2 et cela notamment sous le contrôle du ou des promoteurs de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase. L'invention se propose également d'utiliser différents virus herpès naturellement apathogènes et non- oncogènes ou éventuellement des virus herpès rendus apathogènes et nononcogènes comme vecteurs viraux vivants pour la réalisation de virus recombinants à taux de croissance satisfaisant et éventuellement de vaccins recombinants. L'invention a donc pour objet la séquence nucléotidiqueet ses variantes_, qui correspond au gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase du virus HVT. Cette séquence peut être associée à d'autres fragments usuels tels que promoteurs, signaux d'initiation ou d'arrêts ou entrons ou autres séquences non codantes à l'extrémité 3 ' et/ou 5 ' Elle inclut également les variantes obtenues notamment par substitution de codons ou de nucléotides conservant la signification du code, ou par substitutions, insertions ou délétions codant pour un -6- polypeptide équivalent et notamment conservant l'antigénici- té du polypeptide Elle inclut également tout fragment permettant l'expression d'un polypeptide conservant cette antigénicité. L'invention concerne également les différents fragments de restriction ou synthétiques, provenant de la séquence selon l'invention et notamment tout fragment capable de s'hybrider sur le gène de la petite sous-unité RR 2 de HVT ou tout autre virus herpès. L'invention a également pour objet un virus recombinant HVT comprenant un gène hétérologue inséré dans la région du génome du virus correspondant au gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase, de façon à pouvoir être exprimé Par gène hétérologue, on entend notamment un gène codant pour une protéine ou glycoprotéine immunogène d'un agent pathogène viral, bactérien ou parasitaire Dans le cas d'un vecteur viral constitué du virus HVT, le gène hétérologue pourra être notamment un gène codant pour un immunogène du virus de la maladie de Marek, de la bronchite infectieuse aviaire, de la maladie de Newcastle, de la peste aviaire, de la maladie de Gumboro, de l'anémie aviaire, du syndrome chute de ponte, de l'agent de la coccidiose, de la variole aviaire, de la laryngotrachéite infectieuse, de la colibacillose, de la pasteurellose ou de l 1 hémophilose. Par gène hétérologue, on entend également tout autre gène étranger au virus HVT et codant pour un peptide ou protéine, par exemple, hormones, facteurs de croissance, etc. L'invention s'applique également à un virus recombinant, choisi parmi le virus de la maladie d'Aujeszky (PRV), de la rhinotrachéite infectieuse bovine (BHV), de la rhinotrachéite infectieuse féline (FHV), de la rhinopneumonie équine (EHV), de l'herpès canin (CHV), de l'herpès du canard, comprenant un gène hétérologue inséré dans la région de génome du virus considéré correspondant au -7- gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase. L'invention s'applique encore aux virus herpès simplex humain (HSV) recombinants, de la varicelle (VZV), du cytomégalovirus (CMV) et de Epstein-Barr (EBV) comprenant un gène hétérologue inséré de la même façon que ci-dessus. Le gène hétérologue inséré est exprimé de préférence sous le contrôle des séquences régulatrices de la transcription du gène de la petite sousunité RR 2 On peut cependant faire en sorte que cette expression soit sous la dépendance de séquences promotrices, provenant du virus considéré ou d'autres virus herpès, rapportées dans le génome dudit virus considéré Le gène est placé en aval des signaux d'initiation dans un cadre de lecture correct pour son expression. De préférence, on substitue les codons d'initiation et de terminaison du gène RR 2 par ceux du gène à insérer. L'invention a encore pour objet un procédé de préparation d'un virus HVT recombinant, dans lequel on insère le gène hétérologue dans la région, du génome de HVT, qui correspond au gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un virus recombinant à partir d'un virus choisi parmi les autres virus herpès, notamment PRV, BHV, FHV, EHV, CHV, HSV, dans lequel on insère le gène hétérologue dans la région du génome dudit virus, qui correspond au gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase. On peut avantageusement localiser le gène codant pour la petite sousunité de la ribonucléotide réductase de l'un de ces virus en utilisant une sonde ADN ou ARN marquée comprenant le gène RR 2 HVT dans son ensemble ou en partie et en hybridant la sonde avec l'ARN génomique du -8- virus herpès candidat digéré après séparation par la technique Western Blot en utilisant des conditions faiblement stringeantes Les fragments ainsi reconnus peuvent être clonés et séquences pour réaliser la construction du virus recombinant. De préférence, on isole la partie du génome viral enfermant le gène de la petite sous-unité RR 2, on réalise, de préférence, une délétion partielle ou totale de ce gène et l'on insère le gène hétérologue dans la région correspondant audit gène avant d'introduire le fragment ADN ainsi obtenu dans le génome du virus par cotransfection et recombinaison homologue. De préférence, on conserve les signaux d'initiation et de terminaison de transcription du gène de la petite sous-unité RR 2 Cette expression peut aussi se faire sous la dépendance de séquences promotrices, provenant du virus considéré, par exemple le promoteur du gène RR 1, du gène TK, du gène g A, du gène g B, ou d'autres virus herpès, par exemple le promoteur du gène g I du virus BHV ou du gène g II du virus PRV, rapportées dans le génome du virus considéré. Dans un mode de réalisation appliqué au virus HVT, un procédé de construction d'un virus recombinant peut comprendre les-étapes suivantes; a) on isole un fragment Bam HI Kl du génome de HVT par digestion du génome par l'enzyme de restriction Bam HI, b) on digère ce fragment par l'enzyme de restriction Hind III, pour obtenir un fragment correspondant à la partie 5 ' du gène RR 2 et à la région en amont incluant le promoteur et un fragment correspondant à la partie 3 ' du gène RR 2 et à la région en aval de ce gène, c) on clone les deux fragments ainsi obtenus en b) respectivement dans les vecteurs p UC 18 et p UC 19, d) on digère ces plasmides respectivement par les couples d'enzymes de restriction Hind III Aat II 9 - et Xmn I Aat II pour générer un nouveau plasmide comportant une délétion entre les sites Hind III et Xmn I, e) on crée par mutagénèse dirigée des sites de restriction dans le plasmide obtenu en d), permettant l'insertion correcte du gène à exprimer, f) on clone dans ces sites de restriction un gène hétérologue, notamment un gène codant pour un immunogène associé à une maladie aviaire, et g) on insère le fragment d'ADN obtenu en f) dans le génome du virus HVT par cotransfection et recombinaison homologue. L'invention a encore pour objet un virus recombinant obtenu par le procédé selon l'invention. L'invention a encore pour objet un plasmide comportant une partie du génome, du virus HVT, qui renferme le gène de la petite sous-unité RR 2. L'invention a également pour objet un plasmide comportant une partie du génome, d'un virus herpès, choisi de préférence parmi PRV, BHV, EHV, FHV, CHV, HSV, qui renferme le gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase dudit virus. De préférence, la partie de génome contenu dans le plasmide comprend une délétion dans la région correspondant au gène de la petite sous-unité RR 2 De préférence encore, un gène hétérologue, par exemple un gène codant pour un immunogène, est inséré dans ladite région correspondant au gène de la petite sous-unité RR 2. Dans le cas du virus HVT, l'invention a encore pour objet un plasmide comportant le fragment Bam HI KI, du virus HVT, renfermant le gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase De préférence, ce fragment comprend une délétion de 766 bases entre les sites initiaux Hind III et Xmn I De préférence encore un gène hétérologue codant pour un immunogène de maladie aviaire est inséré dans la région, de ce fragment, qui correspond au gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide 10- réductase. L'invention a encore pour objet des virus recombinants HVT comprenant le fragment de génome recombiné du plasmide réalisé à partir du génome dudit virus. L'invention concerne aussi des virus recombinants PRV, BHV, EHV, FHV, CHV, HSV, comprenant le fragment de génome recombiné du plasmide réalisé à partir du génome du virus considéré. L'invention a encore pour objet un vaccin comprenant un virus recombinant obtenu comme précédemment. Les excipients et diluants seront notamment ceux utilisés habituellement pour la préparation de tels vaccins, notamment des vaccins vivants concernés. L'invention va être maintenant décrite plus en détail On va d'abord décrire le clonage et le séquençage du gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase du virus HVT, puis l'introduction d'une délétion dans le gène de la petite sous-unité de HVT et la démonstration du caractère non essentiel de cette petite sous-unité dans la multiplication virale On verra ensuite l'insertion de gènes hétérologues dans le vecteur viral et leur expression. La description détaillée sera faite en reférence au dessin annexé dans lequel la figure 1 représente la carte de restriction du génome du virus HVT et la localisation du gène RR 2; la figure 2 représente un schéma expliquant l'introduction d'une délétion dans la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase; la figure 3 représente un schéma expliquant la création de sites de clonage par mutagénèse dirigée dans -le gène délété de la petite sous-unité RR 2; la figure 4 représente un schéma expliquant l'insertion du gène Lac Z à la place du gène codant pour la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase; -11- la figure 5 représente un schéma expliquant l'introduction d'un "polylinker" à la place du gène RR 2; et la figure-6 représente un schéma expliquant l'insertion de l'AD Nc du gène de la protéine fusion du virus de la maladie de Newcastle. MATERIEL ET METYHODES De manière générale, les techniques utilisées pour la construction des plasmides recombinants sont celles décrites par T Maniatis et al ( 17) Pour toutes les étapes de clonage ou de sous-clonage, le vecteur linéarisé par les enzymes de restriction appropriées est déphosphorylé avant ligation. La purification des fragments d'ADN à partir d'un gel d'agarose est faite selon la technique décrite par le fabricant: "Geneclean" (Bio 101, San Diego, Californie, USA). Souche virale La souche FC 126 du virus HVT a été isolée en 1968 par le Dr Witter du Regional Poultry Research Laboratory (USDA, East Lansing, Michigan, USA), dans un troupeau de dindes de 23 semaines ( 36). Elle a été ensuite passée 10 fois sur des fibroblastes de canard, puis, a subi 9 passages supplémentaires sur des fibroblastes d'embryons de poulets EOPS. L'ADN viral utilisé pour ce travail a été extrait à partir de virus ayant fait l'objet au total de 23 à 24 passages à partir de l'isolat d'origine - Culture cellulaire Les fibroblastes d'embryons de poulets sont cultivés en milieu F 1 O-199 (Rhône-Mérieux, Lyon, France) supplémenté de sérum de veau foetal. Les cellules destinées à produire le virus -12- utilisé pour purifier 1 'ADN ont été cultivées en flacons roulants. Pour les expériences de transfection, les cellules ont été cultivées en boites de Pétri de 10 cm ou sur des boîtes à 24 puits. Isolement d'ADN du virus HVT pour le clonage Les monocouches confluentes de fibroblastes de poulet sont infectées par le virus HVT et laissées en incubation pendant 1 à 3 jours à 39 C + 1 C Lorsque l'effet cytopathique dû au virus est jugé optimum, les cellules infectées sont décollées des parois des flacons roulants puis centrifugées Les culots de cellules infectées sont remis en suspension dans un stabilisateur contenant du saccharose et de l'albumine bovine La suspension cellulaire ainsi préparée est plongée dans un bain- marie glacé, puis traitée aux ultrasons La suspension est ensuite clarifiée par centrifugation à basse vitesse et centrifugée 1 h à 000 tr/mn avec un rotor Ti 45 (Beckmann, Palo Alto, Californie, USA). Le culot viral, repris en tampon (Tris m M; Na Cl 136 m M; KC 1 2,6 m M; Mg C 12 20 m M; Ca C 12 1,8 m M) et purifié par centrifugation sur gradient zonal de saccharose ( 30 %, 50 % p/v) pendant 20 h à 23 000 tr/mn avec un rotor SW 28 (Beckmann) Le virus obtenu dans la fraction correspondant à une densité de saccharose correspondant à une concentration d'environ 48 % est récupéré Après dilution en tampon Tris 50 m M EDTA 10 m M, le virus est sédimenté par centrifugation pendant 40 mn à 40 000 tr/mn avec un rotor SW 41 (Beckmann) L'ADN viral est alors extrait en traitant le virus purifié par la protéinase K à raison de pg/ml pendant 2 h à 37 C en présence de SDS à 0,5 %, puis purifié par un traitement au phénol suivi de 3 traitements au chloroforme-alcool isoamylique ( 24:1) L'ADN viral est ensuite précipité par de l'éthanol à -20 C. -13- Isolement d'ADN infectieux pour les expériences de transfection. Le virus HVT associé aux cellules est inoculé à des monocouches confluentes de fibroblastes de poulets à une multiplicité d'infection d'environ 0,001 ufp (unité formatrice de plaques) par cellule. Les cellules infectées sont incubées à 37 C en milieu F 10-199 supplémenté avec 2 % de sérum de veau foetal. Lorsque l'effet cytopathique est maximum ( 2 à 3 jours), le milieu est éliminé et les cellules infectées sont récoltées après trypsination, puis sédimentées par centrifugation à basse vitesse. Le culot renfermant les cellules infectées est repris en tampon Tris 10 m M EDTA 1 m M, p H 8, renfermant 0,5 % (p,v) de Triton X 100 et 0,5 % (p,v) de NP 40 à raison de 2 108 cellules infectées par ml de tampon et traitées comme décrit par Lee et coll, 1980 ( 14). Le virus est ensuite obtenu par centrifugation sur gradient de saccharose 15 % 30 % (p/v) pendant 24 mn à 22 000 tr/mn comme indiqué par Lee et coll. L'ADN viral est extrait des virus purifiés par traitement à la protéinase K ( 400 ug/ml final) et SDS 0,5 % (p,v) pendant 1 nuit à 37 C, puis purifié par centrifugation zonale sur gradient de glycérol 10 % 30 % (v,v), pendant 4 h 30 à 38 000 tr/mn avec un rotor SW 41. L'ADN viral est ensuite précipité par l'alcool et repris en tampon Tris 10 m M, EDTA 1 m M, p H 7,5. Clonage de l'ADN L'ADN viral a été digéré par l'enzyme de restriction Bam HI et les fragments ont été clonés dans le plasmide p UC 18 ( 38) digéré préalablement par Bam HI et déphosphorylé. Les bactéries E coli NM 522 ( 6) ont été transformées selon la procédure au chlorure de calcium, puis cultivées en présence d'ampicilline et d'Xgal. -14- Les colonies blanches ont été cultivées en petits volumes et l'ADN plasmidique a été extrait. Les clones ont été sélectionnés en fonction de la taille des inserts déterminée par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8 % après digestion par Bam HI. Séquençage. Les séquences nucléotidiques ont été déterminées selon la technique des didésoxynucléotides décrite par Sanger, 1977 ( 24), à l'aide du kit Sequanase version 2 (USB, Cleveland, Ohio, USA) selon le protocole décrit par le fabricant ( 29), en utilisant des oligonucléotides synthétiques spécifiques (Applied Biosystems, Forster City, Californie, USA). Mutagénèse dirigée. Les fragments d'ADN clones dans le phage M 13 ont été mutagénisés selon la technique décrite par le fabricant du kit de mutagénèse in vitro (Amersham, Buckinghamshire, Grande-Bretagne) ( 19, 31, 32). Les fragments d'ADN clones dans le vecteur Blue Script SK+ (Stratagene, La Jolla, Californie, USA) ont été mutagénisés après séparation des ADN simple brin à l'aide du phage helper R 408 (Stratagene, La Jolla, USA) ( 22) La procédure de mutagénèse et de sélection des mutants en utilisant la souche CJ 236 dut ung d'E coli (In Vitrogen, San Diego, Californie, USA), a été décrite par T. Kunkel et al ( 10,11). Transfection. Les cellules primaires d'embryons de poulets cultivées jusqu'à confluence ( 24 h) ont été cotransfectées par l'ADN viral HVT et l'ADN d'un plasmide renfermant le gène à insérer, flanqué en 5 ' et 3 ' de régions du génome HVT de façon à permettre la recombinaison homologue. La technique utilisée est celle de la -15- Lipofectine décrite par le fabricant (BRL, Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, Madison, USA) ( 2). 1 g d'ADN viral a été mélangé avec 1 à 10 g d'ADN du plasmide linéarisé, sous un volume de 50 l, puis ajouté à 50 u 1 de réactif Lipofectine. L'ensemble a été laissé 30 mn à température ambiante, puis ajouté aux cellules préalablement rincées par du milieu sans sérum L'adsorption a été réalisée pendant 5 h à 37 C sous ambiance C 02 en présence de 3 ml de milieu sans sérum (optimum de BRL) Après 5 h, du sérum de veau foetal a été ajouté à 8 % final et la culture a été poursuivie pendant 72 h ou plus. Les premières figures d'effet cytopathogène sont apparues au bout de 72 h. Les cellules ont parfois été trypsinées après 72 h, puis réinoculées ( 1:1 ou 1:2) en un passage secondaire, en milieu F 10-199, et incubées à 37 C jusqu'à apparition des plages de lyse ( 72 h au minimum), cela pour augmenter l'effet cytopathogène. 200 plages en moyenne par pg d'ADN HVT ont été obtenues. Après apparition des foyers viraux, le milieu est éliminé puis remplacé par du milieu F 10-199 supplémenté par 2 % de sérum de veau foetal et renfermant 1 % d'agarose Les cellules infectées ont été récupérées par carottage, dissociées par addition d'une goutte de solution de trypsine ( 0,4 %) et inoculées à une culture cellulaire. EXEMPLE 1. CLONAGE DU GENE DE LA RIBONUCLEOTIDE REDUCTASE ET DETERMINA- TION DE SA SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE Il a été montré par Buckmaster et coll que le gène de la grande sousunité de la ribonucléotide -16- réductase du virus HVT pouvait être localisée soit au niveau du fragment de restriction Bam HI K 1, soit au niveau du fragment Bam HI K 2 ( 1). Les plasmides p UC 18 renfermant un insert d'une taille correspondant à celle du fragment K 1/K 2 (soit 4,2 kilobases) décrits ci-dessus (clonage de l'ADN), ont donc été sélectionnés, puis les extrémités des inserts séquencées Les séquences obtenues ont été comparées, à l'aide d'un programme d'analyse de sequences Microgenie (Beckmann), aux séquences publiées de la ribonucléotide réductase des virus VZV, HSV, EBV L'homologie de séquence a permis de retenir le plasmide p HVT K 1 Ce plasmide contient la totalité du gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase et la régon 3 ' du gène de la grande sous-unité RR 1. La séquence du gène de la ribonucléo- tide réductase est repérée SEQ ID NO: 1 dans la liste des séquences annexée (annexe 2) La phase de lecture correspondant au gène de la petite sous-unité RR 2 commence à la position 1965 et se termine à la position 2759. La séquence RR 2 obtenue présente une homologie de 54 % au niveau nucléotides avec la séquence correspondante du virus VZV Cette homologie n'est plus que de 30 % avec le virus EBV, ce qui montre h nouveau une plus grande homologie des séquences du virus HVT avec celles des alpha-herpèsvirus. EXEMPLE 2. INSERTION DU GENE Lac Z DANS LE VECTEUR HVT La possibilité d'utiliser le gène de la petite sous-unité de la ribonucléotide réductase comme site d'insertion de gènes étrangers peut être démontrée en lui substituant tout d'abord un gène marqueur, par exemple le gène lac Z de la bêta-galactosidase. Si le site est bien non essentiel, le virus -17- mutant HVT Lac RR 2 $ après recombinaison in vivo donnera en présence d'Xgal une coloration bleue. 1 Construction d'un plasmide p HVT 002 renfermant le gène lac Z à la place du gène de la petite sous-unité de la ribonucléotide réductase. Ce plasmide a été construit en 3 étapes introduction d'une délétion dans le gène de la petite sous-unité de la ribonucléotide réductase: plasmide p HVT 001; création de sites de restriction par mutagénèse dirigée pour le clonage du gène hétérologue; insertion du gène lac Z de la bêtagalactosidase: plasmide p HVT 002. 1 1 Construction du plasmide p HVT 001 (figure 2). Le plasmide p HVT K 1, qui renferme le fragment de restriction Bam HI K 1, a été digéré par Bam HI Ce fragment de 4,2 kilobases a été purifié par électrophorèse sur gel d'agarose Il a ensuite été digéré par Hind III. Le fragment Bam HI-Hind III de 1374 paires de bases a été sous-cloné dans le vecteur p UC 18 préalablement linéarisé pour donner le plasmide p 18 HVT RR 1. Le fragment Hind III-Bam HI de 2826 paires de bases a été sous-cloné dans te vecteur p UC 19 ( 38) préalablement linéarisé pour donner le plasmide p 19 HVT RR 2. Le plasmide p 18 HVT RR 1 a été digéré par Hind III Les extrémités de l'ADN ainsi linéarisé ont été remplies grâce à l'ADN polymérase (fragment Klenow) Une deuxième digestion par l'enzyme Aat II a ensuite été réalisée Le fragment de 3578 paires de bases ayant une extrémité franche et l'autre extrémité correspondant au site Aat II a été purifié par électrophorèse sur gel d'agarose. Le plasmide p 19 HVT RR 2 a été digéré par l'enzyme de restriction Xmn I, puis par l'enzyme de restriction Aat II Le fragment de restriction de 2700 paires -18- de bases Aat II-Xmn I, après purification sur gel d'agarose, a été ligué avec le fragment de 3578 paires de bases décrit au paragraphe précédent pour donner le plasmide p HVTOO 1 Ce plasmide comporte une délétion de 766 paires de bases entre les sites initiaux Hind III et Xmn I. 1.2 Création de sites de clonage par mutagénèse dirigée (figure 3) Le fragment de restriction Bam HI de 3440 paires de bases issu du plasmide p HVT 001 a été purifié par électrophorèse, puis digéré par Eco RI Les 2 fragments Bam HI Eco RI de respectivement 1340 paires de bases et 2100 paires de bases environ ont été clonés dans le phage M 13 mp 19 ( 38) Les clones obtenus sont respectivement nommés mp 19 RR 1 et mp 19 RR 29. Un site Sma I a été créé par mutagénèse dirigée dans le phage mp 19 RR 1, en 3 ' de l'ATG, à l'aide de l'oligonucléotide désigné par SEQ ID NO: 3 dans la liste des séquences annexée. Le phage ainsi obtenu est dénommé: mp 19 RR 1 Sma. Un site Sal I a été introduit dans le phage mp 19 RR 2 e en 5 ' du signal de polyadénylation du gène de la petite sous-unité à l'aide de l'oligonucléotide désigné par SEQ ID NO: 4. Le phage ainsi obtenu est dénommé mp 19 RR 2 e Sal. 1.3 Création du plasmide p HVT 002 (figure 4). Le fragment muté Bam HI-Eco RI de 1340 paires de bases contenu dans le vecteur mp 19 R Rl Sma, tel que décrit à la figure 3, a été purifié par électrophorèse après digestion par Pst I et Sma I I 1 a ensuite été cloné dans le vecteur p MC 1871 (Pharmacia-LKB, Uppsala, Suède) ( 25) entre les sites Pst I et Sma I, pour donner le plasmide p MC 1871 RR 1. -19- Ce plasmide renferme les 1000 bases 3 ' terminales du gène de la grande sous-unité RR 1 de la ribonucléotide réductase et le gène Lac Z en phase avec 1 'ATG de la petite sous-unité RR 2. Le fragment muté Bam HI-Eco RI d'environ 2100 paires de bases provenant du phage mp 19 RR 2 e Sal tel que décrit à la figure 3, a été cloné dans le vecteur p BR 322 ( 37) entre les sites Bam HI et Sal I pour donner le plasmide p BR RR 2 e Les deux nouveaux plasmides p MC 1871 RR 1 et p BR RR 2 E ont été digérés par Xma III et Sal I. Le fragment Xma III-Sal I de 3665 paires de bases isolé à partir du plasmide p MC 1871 RR 1 a été purifié par électrophorèse De la même façon, le fragment Xma III- Sal I de 6200 paires de bases environ isolé à partir du plasmide p BR RR 2 a été purifié Ces deux fragments ont ensuite été ligués pour donner le plasmide p HVT 002. Ce plasmide renferme donc les 200 paires de bases de la partie 3 ' du gène RR 1, les 33 paires de bases non codantes jusqu'à 1 'ATG du gène RR 2, puis le gène Lac Z inséré en phase, et enfin la région 3 ' non codante du gène RR 2. 2 Obtention d'un virus HVT muté RR 29 Lac Z Des cellules primaires d'embryons de poulet ont été cotransfectées avec 1 à 10 gg de plasmide p HVT 002 et 1 ug d'ADN génomique HVT infectieux selon la technique de la Lipofectine Après 72 à 96 h de culture à 37 C sous ambiance C 02, de nombreuses figures d'effet cytopathique sont observées Le milieu a alors été éliminé et remplacé par une surcouche d'agarose à 1 % en milieu F 10-199 renfermant 0,5 % d'Xgal La culture a été poursuivie pendant 24 h Au bout de 4 à 5 h, des plages bleues nettement identifiables ont été obtenues. Les cellules ont alors été prélevées par carottage et le tapis cellulaire restant au fond du puits a -20- été repris par addition d'une goutte de trypsine L'ensemble a été inoculé à des cellules saines Un effet cytopathique a été observé après 72 à 96 h Après addition d'Xgal, les cellules infectées présentent des lésions du tapis cellulaire colorées en bleu. EXEMPLE 3 INSERTION DU GENE FUSION DU VIRUS DE LA MALADIE DE NEWCASTLE L'insertion du gène fusion de la maladie de Newcastle a été réalisée en deux étapes. 1) Construction du plasmide p HVT 003 comprenant la délétion du gène RR 2 et l'insertion de plusieurs sites de clonage. 2) Construction du plasmide p HVT 004 contenant le gène fusion à la place du gène RR 2. 1 Construction du plasmide p HVT 003 (figure 5) Le phage recombinant muté mp 19 R Rl Sma décrit à la figure 3 a été digéré par Sma I et Bam HI Le fragment libéré de 1110 paires de bases, qui contient une partie du gène RR 1 et le codon ATG du gène RR 2, a été cloné dans le vecteur Blue Script SK+ au niveau des sites de restriction Sma I et Banm HI pour donner le plasmide p SK+RR 1 Par mutagénèse dirigée, un site de restriction Nco I a été introduit au niveau du signal ATG à l'aide de l'oligonucléotide SEQ ID NO: 5, générant ainsi le plasmide p SK+ R Rl Nco. Le phage recombinant muté, mp 19 RR 2 e Sal, décrit figure 3, a été digéré par Bam HI et Sal I Le fragment libéré de 2,1 kilobases environ a été cloné dans le vecteur M 13 mp 18 au niveau des sites de restriction Bam HI et Sal I Le clone obtenu a été appelé mp 18 RR 2-Sal. Le fragment de 2,1 kilobases environ a été libéré du phage mp 18 RR 2-Sal par digestion par Kpn I et Sal I, -21- puis introduit au niveau de ces sites dans le plasmide p SK+ R Rl Nco, linéarisé par les enzymes Kpn I et Sal I Un plasmide p HVT 003 a ainsi été construit Il renferme une partie du gène RR 1, la région 3 ' non codante de ce gène, le codon ATG du gène RR 2, une séquence comprenant plusieurs sites de restriction uniques et enfin la région 3 ' non codante du gène RR 2. 2 Construction du plasmide p HIVT 004 qui renferme le gène fusion du virus de la maladie de Newcastle, inséré à la place du gène RR 2. L'AD Nc du gène fusion a été cloné dans le vecteur p BR 322 au site Sca I, ce qui correspond au plasmide p NDV 108 La séquence du gèhe fusion est donnée en annexe SEQ ID NO: 2 Le plasmide p NDV 108 a été digéré par Bst EII, les extrémités remplies par l'ADN polymérase (fragment Klenow) puis par Sph I L'insert de 1786 paires de bases ainsi libéré a été cloné dans le phage M 13 mp 19 linéarisé par Sma I et Sph I pour donner le phage mp 19 F 5 Ce phage est ensuite mutagénisé à l'aide de l'oligonucléotide SEQ ID NO: 6, pour donner le phage muté mp 19 F 5 Nco. Le phage mp 19 F 5 Nco a été digéré par Acc I et Nco I, et le fragment de 852 paires de bases ainsi obtenu a été cloné dans le vecteur p HVT 003 linéarisé par Nco I et Sma I pour donner le plasmide p HVT 003 F 5 Nco. Ce plasmide insère donc la région 3 ' terminale du gène RR 1, les 33 bases non codantes en 3 ' de ce gène, puis 852 bases du gène fusion inséré en phase, une séquence "polylinker" et enfin la région non codante située en 3 ' du gène RR 2. Le plasmide p NDV 108 a été digérépar Pst I et Bam HI Le fragment de 1765 paires de bases obtenu a été -35 cloné dans le phage M 13 mp 19 linéarisé par Pst I et Bam HI pour donner le phage mp 19 F 3, puis mutagénisé à l'aide de -22- l'oligonucléotide SEQ ID NO: 7, pour donner le phage mp 19 F 5 Eco RV Ce phage a été digéré par Pst I et Eco RV, et le fragment de 1567 paires de bases ainsi libéré à été cloné dans le plasmide p HVT 003 F 5 Nco, linéarisé par Pst I et Eco RV, pour donner le plasmide p HVT 004. Ce plasmide contient la région 3 ' du gène RR 1, les 33 bases non codantes en 3 ' de ce gène, puis le gène fusion du virus de la maladie de Newcastle inséré en phase, et enfin la région 3 ' non codante du gène RR 2. INSERTION DU GENE FUSION DANS LE VIRUS VECTEUR HVT Le plasmide p HVT 004 a été utilisé dans des expériences de cotransfection de cellules de fibroblastes d'embryons de poulet avec 1 'ADN infectieux du virus HVT On peut ainsi obtenir un virus recombinant HVT exprimant le gène fusion du virus de la maladie de Newcastle. La petite sous-unité de la ribonucléotide réductase peut donc être utilisée pour insérer des gènes dans le génome du virus HVT et les promoteurs de la ribonucléotide réductase sont efficaces pour permettre leur expression. On peut ainsi insérer des gènes codant pour des immunogènes associés à la maladie de Marek, à la bronchite infectieuse aviaire, à la maladie de Newcastle, à la peste aviaire, à la maladie de Gumboro, à l'anémie aviaire au syndrome chute de ponte, à la coccidiose, à la variole aviaire, à la rhinotrachéite infectieuse, à la colibacillose, à la pasteurellose ou à l'hémophilose. Les virus recombinants ainsi obtenus pourront être utilisés comme vecteurs d'expression du gène inséré, dans des vaccins dits vaccins chimères Le virémie permanente dont est responsable le virus HVT doit permettre une bonne dissémination des immunogènes exprimés et ainsi provoquer la réponse immunitaire souhaitée. Quoique le procédé ait été décrit à propos du virus HVT, on comprend qu'il suffit notamment d'adapter -23- les enzymes de restriction pour transposer ce procédé à d'autres virus herpès apathogènes et non-ocogènes ou rendus tels et ainsi proposer des vaccins, utilisant des virus recombinants, pour l'homme et d'autres espèces animales. Bien entendu, les virus recombinants selon l'invention peuvent comporter ensuite, en plus du ou des gènes insérés dans le gène de la petite sousunité RR 2, un ou plusieurs gènes insérés en d'autres endroits du génome, par exemple dans la grande sous-unité RR 1 ou dans le gène codant pour la thymidine kinase. 24 2659349 ANNEXE 1: INDEX BIBLIOGRAPHIOUE 1 A E BUCKMASTER, S D SCOTT, M J SANDERSEN, M E G. BOURSNELL, L J N ROSS, M H Bl NNS ( 1988) J Gen Virol, 69, 2033-2042 2 P L FELGNER, T R GADEK, M HOLM, R ROMAN, H W CHAN, M WENZ, J P NORTHROP, G M RINGOLD and M DANIELSEN ( 1987) Proc Natl Acad Sci, USA, 84, 7413 3 H FIELD, P WILDY ( 1987) J Hygiene (Cambridge), 81, 267-277 4 D J GOLDSTEIN, S K WELLER ( 1988) J Virol, 62, 196-205 D J GOLDSTEIN, S K WELLER ( 1988) Virology, 166, 41-51 6 J GOUGH et N MURRAY ( 1983) J Mol Biol, 166, 1-19 7 J G JACOBSON, D A LEIB, D J GOLDSTEIN, C L BOGART, P.A SCHAFFER, S K WELLER, D M COEN ( 1989) Virology, 173 ( 1), 276-283 8 A T JAMIESON et all ( 1974) J Gen Virol, 24, 465-480 9 EP-A-0 316 658 T KUNKEL ( 1985) Proc Natl Acad Sci, 82, 488-492 11 T KUNKEL, J ROBERTS, B ZAKOUR ( 1987) In Methods in Enzymology, 154, 367-382 Acad Press 12 Y LANGELIER, G BUTTIN ( 1981) J Gen Virol, 57, 21-31 13 H LANKINEN, A GAASLUND, L THELANDER ( 1982) J Virol, 41, 893-900 14 LEE et al ( 1980) J Gen Virol, 51, 245-253 J McLAUCHLAN, J B CLEMENTS ( 1983) The Embo Journal, 2, ( 11), 1953-1961 16 J McLAUCHLAN, J B CLEMENTS ( 1983) J Gen Virol, 64, 997-1006 17 T MANIATIS, E F FRITSCH, J SAMBROOK ( 1982) "Molecular cloning: A laboratory manual"' Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y. 18 C T METTENLEITER, C SCHREURS, F ZUCKERMANN, T BEN PORAT ( 1987) J Virol, 61, 4030-4032 19 K NAKAMAYE and F ECKSTEIN ( 1985) Nucleic Acid Res, 13, 9679-9698 V G PRESTON, A J DARLING, I M McDOUGALL ( 1988) Virology, 167, 458-467 21 B ROIZMAN et al ( 1983) Cold Spring Harbor Conference on New Approaches to Viral Vaccines, September 1983 22 M RUSSEL, S KIDD, M KELLEY ( 1986) Gene, 45, 333-338 23 P J; SANDERS ( 1982) J Gen Virol, 63, 277-295 * 24 F SANGER, S NICKLEN, A R COULSON ( 1977) Proc Natl Acad, USA, 74, 5463-5467 S K SHAPIRA et al ( 1983) Gene, 25, 7182 26 M F SHIH, M ARSENAKIS, P THIOLLAIS, B ROIZMAN ( 1984) Proc Natl Acad Sci, USA, 81, 5867-5870 27 S SIMPSON, J McLAUCHLAN, J B CLEMENTS ( 1989) 14th International Herpesvirus Workshop, Nyborg-strand, Denmark ( 1989) 28 M A SWAIN, D A GALLOWAY ( 1986) J Virol, 57, ( 3), 802-808 29 S TABOR and C C RICHARDSON ( 1987) Proc Natl Acad Sci, USA, 84, N 14, 4767-4771 G TATAROV ( 1968) Zentralbl Vet Med, 15 B, 848-853 31 J W TAYLOR et al ( 1985) Nucleic Acid Res, 13, 8749-8764 32 J W TAYLOR, J OTT, F ECKSTEIN ( 1985) Nucleic Acid Res, 13, 8764-8785 33 R L THOMPSON, E K WAGNER, J G STEVENS ( 1983) Virology, 131, 180-192 34 D R THOMSEN, C C MARCHIOLI, R J; YANCEY ( 1987) J Virol, 61, 229-232 P C WEBER ( 1987) Science, 236, 576-579 36 R L WITTER et al ( 1970) Am J Vet Res, 31, 525538 37 BOLIVAR F et al, Gene 1977, 2, 95-113 38 YANNISCH-PERRON C et ai, Gene 1985, 33, 103-119. ANNEXE 2: LISTE DES SEQUENCES SEQ ID NO:1 Longueur de la séquence: 3 278 paires de bases Type de molécule séquencée: ADN génomique Origine de la molécule: Virus herpès de la dinde (HVT) souche FC 126 Source expérimentale: Plasmide p HVT K 1 Caractéristiques: de 1 à 1 662 paires de bases: gène RR 1 de 1 663 à 1 694 paires de bases: région non codante de 1 695 à 2 759 paires de bases: gène RR 2 de 2 760 à 3 278 paires de bases: région non codante r m r-, "+'1 1 1. C -1 'r H 3: -'o G 1 G C -IO " + G 1 'I O- c-t " i Z 3 >;:'n m Gi I G 1 l: C- -o I m'c I c I TG 1 CD' Gi 'a n: tri_ :' G 1 U 1:: m I:::,::1 cl C Gi CG 1 H m C -"H - > C'G 1 > > PJ C-3 _ 1 _ 9 r Li'f -r Gs 1 _ _ i 3 H 'J' -I -"H Z'H (o A H -'i 3 > r 7:1 > _ 3 > À-' - C 3 cri Gi ai H 13 > :r o i-3-1 Gi S Gi 1 * > ?i'- _ ::1 î H OHJl H 2 > zr -. 3 > I> 1 1 Pi> Giel I Tl -or D:: PJ q,rl 3: m > 'r:1 À cri t'ri m OJH 3 > 3 > ".4 Cil -?i ' - -I,",O: 1::l: ":' Z? 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P i > It'H -'-' Gi Gai 3 > Gi P'121 :' G 1 I> Gi to - -r C Gi mt H- r-"> -.I Ot c:' G' c-:l " 3 > c-> F c:' r D' H G 1 C-i m Z '- Gi G 1 " G 1 uil 1:> C i _ 3 0 H -r rD" u'_ l> 1)G 1 Gi: Gi "o ' G'i Gm Ci À Z 3 T' HH, G 1 Gi -.3 >CT' = 3 > a H r-o m ':. C 1 r-> :: 3 > p> 3 t' I -r r TI c-:I Ci 3 0 O H P> G 1 r C 3 ki 3 > ?l '" 1 l;:' 111 Gi _ H n' m 2;' r-H- n C 3 > /" 3:: r-> - *, p. r' o r-c ' r c-> B-3 G i a T q t B 3 n G 3:> o J' Gi a 3 l - II -i'H n 2: m -::' G Ti À-. 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GC AAI- Ala TACY T A r Ii'Y I Ter AAT Asn 6 CAA Gis r A 1 a. A It. îl' TCT Ser AGA Arg 6 G S CAA G n ATT Ile TC-A Ser s AGC TGT ATC CGT S Ser Cys lie Arg i GCT GCA GGG ATC A 1 a A 1 a G 1 y Ie ACC TCA TICC CAG Thr Ser -er Gin ATG CCC AAG G C- Met Pro Lys Asp TAC AAC AGG ACA Tyr Asn Arg Thr ATC CGC AGG ATA Ile Arg Ar I le CAG AGA C-GC TITT Gln Ar-g Arg Phe GTT GCG ACA G-CT V Jal Ala Thr Ala G 'C AAC CAG AAT Ala As-n Gin Asn GCT GCA ACC AAT Ala Ala Thr Asrn CAA CTA GCA GITG Gi, N Leu Ala V al CTE Leu Ga Tl: GT 6 Val 1 h r ACA Thri AAA Lys CTG Leu L-AA 1 n ATA 1 1 e Ala A 1 a SIAA 6 CA 1 A i'-A Ala TTT GTC AAT GAC CAG TTC AAT AAT ACA ACA i Thr Val GAG GI u ACT Th r Glu c A -GT riy 1 n GCC Ala GCT Ala GTA Val l i- I GCG AGC TCT -'er Ser A C A G G 6 A Thr Gi y TCA ATC Ser Iie i 6-T T T ACT TTA Thr Leu TICT GTG S Rer Val GCC ATT Ala lie ATA ACA lie Thr A-A ATC Air, "lie- Asn Ile I GTG CAC Va.l His GGG AAG G 1 y L y S CAA AA Ile CTT Leu I i_ I J G.AT Asp ATA Ile GCA A, 1,. CTC Le u A CT Th r ATC A-i T i Tie G CA i a CTC Leu GAG 3 lu ATG let Arg GAT ASP L s GTT v l=t;f _ys ACC& Thr LCT Thr Aia Ce ha r- AS A A 1 h r- A c T Tihr GCT lal A l,li CGG Ar-g TTC V 1 a I CAA ln Th :,Giyc Al a. z Pr-o S-t A(T Ser CII Le ACT 1 h r- *,1 d Pro CAG Gin TC Cz CT Tr Thr G CA 6 i.,l n TTG GAC TGT Phe Val Asn Asp Gin Phe Asnr, Asn Thr Ala Gin Glu Leu Asp Cys 43: -14 88 8 f 89 CI l 2 l 1 5 -i -,- 9:37 2.68 7:82 89 L 83 79-) 9 ' a, 98 _ 2 2 & 8,A i ATA AAA ATT GCA CAG Ile Lys lle Ala Gln A(i MI TI TT LE Le Ans CT Le C'T I -? f Yú Pr Ai r t. T.I Il Thi AI( il E -i Thr SI n AT Asn TTT GTT V 7 E Val ETC Val AAC i 3 l n Asn GCT AI -i *Tr CT GAA TTG hr T Glu L u l A Ai T GAG eu Thr Giln îT AITG G-AT :n Met Asp FC AGC TCA :u Saer -Smr G TAC -GAC u Tyr Asp T T Ci A GTT o Ser Val C TTA TCT r Leu Ser A AAA GTG la> 1 i CA TAC Se T ATA -i G * 3 * M L'- e Val Thr F AAT ACA A Asn Thr - At C CCA A Thr Pro I 'TGI ACA e C Leu Thr l AAT TAT E Asn Tyr SGTC TTA T Y.a Leu - GAT GCA A Asp Ala T ATA GTG A ie Vmal T AAC -AAC T Asn Asn n AGC AAA C' Ser Lys Li CTC ATT Ai Leu Tl e Tl A(c Th CI- Le TT Le je GG( Gi G Ti a Il GTE Lal TG'T Cys TC Phe GSA Sier CAT Tyr Thr GA -er hr- CA CA aer TA h r ST ACA r Thr G At CT :u Thr C TTG r Leu A ATT u Lie A CAG r Giln G AAC Y Asn A AGC I Ser 3 ACA l Tihr lie -C T -AT. Pr-,-, T GCT G -i ul 1 l AIA l IA G 3 ATA C M., r TGT - GSC A Glu A :TTA ieu A TAT n Tyr G 3 Gi C A. Giy A Tlie S, i AC A Asp T L, TA Ct A: T'.-'r Il CAGS GTC G( G 1 N Val Gi ST t.h- fa AT il CT Le G 1 A Cf Thi CTI Le. AC- Thr Sir lnn 31 i: ATG C/s C Tt" r,SI S AGA v g i-s :CT lla Ai' i AI rln i AT S Fl GT sar AAA ys ET le FA TTT i Phe e Gln L e P-li Ci ACT u Thr i T AGC y Ser T CAG r Giln n AAT u Asn A ACC r Thr SITC r ai -i 2 v *l -'s 3 A Cal ACC: f Thr i Ti T : S=er : ATG Met i CTI t at 9 t.,T Ci T f Gv G AAG A Cys A tIsifi A CTT G Leu A AAT G Asn A Val A 6 T.iv tr GTT T' Va Jl La t-I G Gi G 1 Ai T Gi AI T' AA L- GG. A Ai As, Pr c A At Ly -r ce, G Gr GA CCT i a A T s-n Ty AAA r fg sn A la TA au ATR i AT TA e U GGT i GTA Ci TT AGC CTG GTT CTA GCA Giy Vwal Leu Si 3 e r Le Val Leu Ala ST GTA GAA y Val Gelu f'CA CAA y Pr-o Gin _': CTT TAC 1 g Lu Tyr t G TTA -GT s Leu G Iy i C TTG ATC y Leu 1 e C TTG GST e Leu Gly T ATG CGT Rn Met Ar-g i GA TTT s 5 y Phe T TCC GTG TTG,GAT p Leu Asp l GIT ATT *(àG 1 _le 51 T-i Wfliat TICA AAG G GGC TCA GAT CCC Asp Pro F TTA ATA t Lau il e AC CT TG Thr Lu A TC TCT A ATA TCA A I Lae Ser T GTI AAT A Leu A-sn L IGTC AAA C Val Lys L ACT TC A' Thr Va l I TGC TAG C' :ys Tlyr Lf CTC AAC Tl Leu Asn Le ATC A Ci T TC Ilie Thr Se AAT ITA C Asn Leu A 1 GTA G -G A 41 éïl v, cml -s ACC CA(-,5 G-,A Thr G, 1 A-s A Tf Ai_,AGT ile Gin Va i GCC ACC Tl A Ala T Ihr Tyl GC Ci TCA G Ci Al Sear Al I ATA GAA GA Ile Glfu Gi. TTA TAC Te-1 Lmu T r C s î;r:fr-ai T AT TCT Te, T Yr Setr C s ACT GAA G:f S Thr Gl u El, TT ATT Gt C al 1 le A CA GGT ATC Fr-o uîG _le f AT A G G CA C -sp Ar,g His AG C Tf C AGT Ir-g Leu S Er-r h TA CTA GAT l e L'u Asp CT GAG CTT hr Gi u L u AG TTA GAG ys Leu Glu TG ACC AGC eu Thr Ser TA TCT CTT le S Ber Leu TG ATGI TAC eu Mei Tyr SG TAC CTA 1 t 072 u Tyr Leu 03 t C C T C GCC 1117 r Pr-o Ala 31; T GGT GGT 1162 a G Iy Gl - t-, 'Miii Cf,-AAC AA 12 óf)7 * n Asn Gln 348 C CCI AT ATT it 2 n Pro i 11 e 3 A CT TTG 1297 I Thr Leu i 7- CTG GAGJ 1342 L u Glu ICTT STC 137 L:u Val 408 CTT GAC 1432 J Lau Asp 42- ACA AG-A 1 Thr Ar ci 4 CTI AGC i Leu S rep '-' i CA CTT 1 _ 57 A 7 -t'U' * 1 '" "- e ATT G C -i _ 1 o AAT TFC 1612 is N s= 4,53 ATA TCG -1657 i l e l:;ó? r 498 TCA TGC 1-702 f GGG CAA 1747 Gi,:i 1 u5 ' o TCT C A A t 5, Se rln 5 f 4 G G 3 AAT 1837, G 1 y Asn '- GAA AGC 188 & 2 G 1 u Ser 7 ACA TCT 1927 Thr S-Br 588 GTT TTT I 972 Va Phe 603 AAG CAA 2017 Lys Gin 618 AAG GCA CAA CAA AAG ACC TTG TTA TGG CTT GGG AAT AAT ACC CTT 2062 Lys Ala Gin Gln Lys Thr Leu Leu Thp Leu Gly Asn Asn Thr Leu 633 GAT CAG ATG AGA GCC ACT ACA AAA ATA TGAATACAAACGAGAGGCGGAGG 2112 Asp Gin Met Arg Ala Thr Thr Lys Ile 642 TATCCCCAATAGCAATTTGCGTGTAAATTCTGGCAACCTGTTAATTAGAAGAATTAAGAA 2172 Z AAAA SEQ ID NO: 3 TYPE DE SEQUENCE: oligonucléotide LONGUEUR DE LA SEQUENCE: 21 bases TYPE DE MOLECULE: ADN ' GCAGCATGCCCGGGGTTGTTG 3 ' Sma I SEQ ID NO: 4 TYPE DE SEQUENCE: oligonucléotide LONGUEUR DE LA SEQUENCE: 21 bases TYPE DE MOLECULE: ADN ' CCGATTCACGTCGACTTTAGG 3 ' Sal I SEQ ID NO: 5 TYPE DE SEQUENCE: oligonucléotide LONGUEUR DE LA SEQUENCE: 21 bases TYPE DE MOLECULE: ADN ' GGGTTGTCCATGGCGGCTATA 3 ' Nco I SEQ ID NO: 6 TYPE DE SEQUENCE: oligonucléotide LONGUEUR DE LA SEQUENCE: 22 bases TYPE DE MOLECULE: ADN ' CAAGGTGCACCATGGGCTCCAG 3 ' Nco I SEQ ID NO: 7 TYPE DE SEQUENCE: oligonucléotide LONGUEUR DE LA SEQUENCE: 25 bases TYPE DE MOLECULE: ADN ' GCTATTGGGGATATCTCCGCCTCTC 3 ' Eco RV _ 37 _ REVENDICATIONS. 1 Virus recombinant choisi parmi HVT, PRV, BHV, EHIV, FHV, CIHV, herpès du canard, HSV, VZV, CMV et EBV, comprenant au moins un gène hétérologue inséré dans la région, du génome dudit virus, correspondant au gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase, de façon à pouvoir être exprimé. 2 Virus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène hétérologue code pour un immunogène viral, bactérien ou parasitaire. 3 Virus recombinant HVT, comprenant au moins un gène hétérologue qui est inséré dans la région, du génome de HVT, correspondant au gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase et qui code pour des immunogènes provenant d'agents pathogènes associés notamment à la maladie de Marek, à la bronchite infectieuse aviaire, à la maladie de Newcastle, à la peste aviaire, à la maladie de Gumboro, à l'anémie aviaire, au syndrome chute de ponte, à la variole aviaire, à la laryngotrachéite infectieuse, à la coccidiose, à la colibaccillose, à la pasteurellose ou à l'hémophilose. 4 Virus recombinant selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que le gène hétérologue inséré est susceptible d'être exprimé sous le contrôle des séquences régulatrices de la transcription du gène de la petite sous- unité RR 2. Virus recombinant selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que le gène hétérologue inséré est susceptible d'être exprimé sous la dépendance de séquences promotrices, du virus considéré ou d'autres virus herpès, rapportées dans le génome du virus considéré. 6 Virus recombinant selon lrune des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que les codons d'initiation et de terminaison du gène RR 2 sont remplacés par ceux du gàne à insérer. 38 - 7 Procédé de préparation d'un virus recombinant à partir d'un virus choisi parmi les virus herpès HVT, PRV, BHV, EHV, FHV, CHV, herpès du canard, HSV, VZV, CMV, EBV, caractérisé en ce qu'on insère au moins un gène hétérologue dans la région, du génome dudit virus, qui correspond au gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase, de telle façon que ledit gène hétérologue puisse être exprimé. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on isole une partie du génome viral renfermant le gène de la petite sous-unité RR 2, on réalise une délétion partielle ou totale de ce gène et on insère le gène hétérologue dans la région correspondant audit gène avant d'insérer la séquence ADN obtenue dans le génome du virus par cotransfection et recombinaison homologue. 9 Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que le gène inséré est sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription du gène RR 2. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que le gène inséré est sous la dépendance de séquences promotrices, du virus considéré ou d'autres virus herpès, rapportées dans le génome du virus considéré. 11 Procédé selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que l'on substitue les codons d'initiation et de terminaison du gène RR 2 par ceux du gène à insérer. 12 Procédé de préparation d'un virus recombinant HVT, caractérisé en ce que: a) on isole un fragment Bam HI K 1 du génome de HVT par digestion du génome par l'enzyme de restriction Bam HI b) on digère ce fragment par l'enzyme de restriction Hind III, pour obtenir un fragment correspondant à la partie ' du gène RR 2 et à la région en amont incluant le promoteur et un fragment correspondant à la partie 3 ' du gène RR 2 et à la région en aval de ce gène, c) on clone les deux fragments 5 ' et 3 ' obtenus en b) respectivement dans les vecteurs p UC 18 et p U C 19, d) on digère ces plasmides respectivement par les couples d'enzymes de restriction Hind III Aat II et Xmn I Aat II puis on les ligue ensemble pour donner un nouveau plasmide comportant une délétion entre les sites initiaux Hind III et Xmn I, e) on crée par mutagénèse dirigée des sites de restriction dans le plasmide obtenu en d), f) on clone dans ce site de restriction un gène hétérologue, et g) on insère le fragment d'ADN obtenu en f) dans le génome du virus HVT par cotransfection et recombinaison homologue. 13 Pro- cédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le gène hétérologue code pour un immunogène provenant d'agents pathogènes associés à une maladie aviaire telle que la maladie de Marek, la bronchite infectieuse aviaire, la maladie de Newcastle, la peste aviaire, la maladie de Gumboro, l'anémie aviaire, le syndrome chute de ponte, la variole aviaire, la laryngotrachéite infectieuse, la coccidiose, la colibacillose, la pasteurellose ou l'haemophilose. 14 Virus recombinant obtenu selon l'une quelconque des revendications 7 à 13. 15 Vaccin comprenant un virus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et 14. 16 Séquence nucléotidique référencée SEQ ID NO: 1, et ses variantes et fragments, et correspondant au gène de la petite sous-unité RR 2 de la ribonucléotide réductase du virus IHVT.