FR 2650840 A1 19910215 FR 8910802 A 19890811 1- La presente invention est relative a un procède de détection et/ou d'ldenttlication d'une seule base sur une séquence d'acide nucléielque. alnsl qu'a ses applica- tions, notamment dans le diagnostic des maladies génétiques et dans le contrôle d'une hybridation. L'hybridation d'acide nucléique a été utillsée pour étudier l'identité et établir la présence d'acides nu- cléiques. L'hybridation. est basée sur l'appariement de bases complémentaires. Lorsque des acides nucléiques simple brin complémentaires sont incubés ensemble, lesdits acides nucléiques simple brin s'apparient pour former une molécule" hybride double brin. La capacité de l'ADN simple brin ou de l'ARN à former une structure avec une séquence d'acide nu- cléique complémentaire est utilisée comme méthode d'analyse et de diagnostic. La disponibilité de nucléosides trlphos- phates radioactifs ayant une activité spécifique importante et le marquage de l'ADN au 32P en présence d'enzymes à fonction polymérase, par exemple la T4 kinase, a permis d'identifier, d'isoler et de caractériser de nombreuses sé- quences d'acides nucléiques d'intérêt biologique. L'hybridation représente un critère- important dans la détection de la présence de séquence d'acide nucléique particulières comme par exemple: - dans les maladies génétiques humaines ou ani- males o une modification héréditaire du patrimoine géné- tique a des conséquences morbides (par insertion, délétion ou mutation ponctuelle d'une séquence particulière); - dans les maladies cancéreuses, o des réar- rangements de l'ADN génomique sont observés; - au cours des infections o l'on décèle la présence de génomes étrangers tels que celui des microorga- nismes (bactéries, champignons et virus par exemple); - pour l'identification des individus en général: 35. en médecine légale (paternité, filiation par exemple), dans le domaine agroallmentalre (plantes, contrble sanitaire par exemple). Cependant, l'hybridation comme outil de dia- r gnostic peut être limitée par la difficulté de sa mise en oeuvre (techniques lourdes) ou par l'absence de spécificité de l'hybridation (protocole opératoire). En effet, l'étude chlmique de l'hybridation a mis en évidence l'influence de la concentration de chacun 1O des brins d'acides nucléiques impliqués, de leurs lon- gueurs, de leurs compositions en bases, de la température, du pH, de la force ionique, de la viscosité du milieu. La température notamment, est critique et doit rester inférieure à la température de fusion (Tm: tempéra- ture à laquelle 50- % des séquences sont sous forme double' brin). En solution, la température optimale d'hybridation est 25 C en dessous de la Tm pour une sonde de 150 nucléo- tides et légèrement plus basse pour les sondes plus courtes. Ainsi lorsque l'on veut détecter un mutation portant sur une seule base, on peut généralement utiliser, selon les cas, deux types de sondes: des sondes d'acide nucléique dites longues, supérieures à 150 nucléotides en général, ou des sondes d'acide nucléique dites courtes entre 17 et 24 nucléotides en général. Si la mutation intervient dans un site reconnu spécifiquement par une enzyme dite de restriction, on peut utiliser la technique de Southern: celle-ci comporte les étapes d'isolement de i'ADN, de digestion par l'enzyme de restriction, d'électrophorèse sur gel, de transfert sur une membrane et d'hybridation à l'aide d'une sonde longue intéressant la région de la mutation; après lavage et autoradiographie, l'analyse des tailles des fragments obtenus permet d'infirmer ou confirmer la présence de la mutation. Le pro- Z5 cédé très lourd nécessite que la mutation intéresse un site de restriction. Si ce n'est pas le cas, on peut synthétiser une sonde courte oligonucléotldlque de 17 à 24 nucleotldes dont le centre coïncide avec la mutation que l'on veut de- tecter. En choisissant des conditions appropriées d'hybridation et de rinçage (spécifique de chaque systeme), on ne peut obtenir une hybridation à l'aide de l'oligonucléotide marquée qu'en cas d'homologie parfaite (une seule différence nucléotidique, notamment à l'endroit de la mutation, entraîne la déstabilisation de l'hybridation). Cependant, ces différentes méthodes présentent un certain nombre d'inconvénients: - conditions de température difficiles à mai- triser, pour obtenir une hybridation appropriée; - éventuellement présence obligatoire d'un site de restriction;. - immobilisation de l'acide nucléique sur mem- brane (Southern blot). Le Brevet Américain AMERSHAM n' 4 656 127, a permis de pallier certains de ces inconvénients, notamment en ce qu'il permet de détecter une mutation présente à un endroit ne présentant pas de site de clivage par une enzyme de restriction. Ce Brevet Américain n' 4 656 127, décrit une méthode de détection de la mutation d'une base nucléotique spécifique dans un fragment d'acide nucléique (ADN ou ARN) cible par: (a) hybridation d'une sonde avec la séquence cible pour former un hybride d'acide nucléique, dans lequel une extré- mité de la sonde est hybridée de manière adjacente à la base nucléotidique spécifique; (b) mélange de l'hybride avec un dérivé nucléotidique dans des conditions appropriées à l'élongation de la sonde, de manière à permettre la jonction dérivé nucléotidique - ex- trémité de la sonde, seulement si la base spécifique dans la séquence cible est (ou n'est pas) la mutation à détec- ter, une sonde associée audit dérivé nucléotidique étant k résistante a une digestion dans des conditions partlcu- lieres; (c) digestion de l'hybride par une exonucléase dans des conditions telles que le fragment double brin est progres- sivement digéré à partir de l'extrémité de la sonde a moins que ladite extrémité ait été mise en jonction avec ledit dérivé nucléotidique; (d) élimination des portions de la sonde qui ne sont plus hybridées à la chaîne d'acide nucléique; (e) et détection d'une mutation de la base nucléotidique spécifique dans la séquence cible par détection de la pré- sence ou de l'absence de la sonde après digestion. Ce procédé implique en particulier en plus de la sonde, l'utilisation d'un dérivé nucléotidique ayant des propriétés particulières et comporte de ce fait encore de nombreuses étapes. De plus, il nécessite, pour sa réalisa- tion, une immobilisation de l'acide nucléique sur une mem- brane et également un marquage (de la sonde ou du dérivé nucléotidique). La présente invention s'est en -conséquence, donné pour but de pourvoir à un procédé -d'identification d'une base nucléotidique spécifique, aisé et rapide à mettre en oeuvre, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés de l'Art antérieur, notamment en ce que le procédé conforme à l'invention ne nécessite pas un protocole opératoire complexe, c'est-à-dire ne nécessite ni immobilisation de l'ADN, ni marquage de la sonde, et s'applique à la détection de séquences d'acide nucléique particulières, notamment dans les maladies génétiques, les maladies cancéreuses, les infections, l'identification d'individus humains, animaux ou végétaux. La présente invention a pour objet un procédé de détection et/ou d'identification d'une base nucléoti- dique spécifique présente sur une séquence d'acide nu- cléique, caractérisé en ce que (1) on hybride la séquence sur laquelle se trouve la base à identifier avec un nucléotide de longueur suffisante pour permettre une hybridation correcte, quelle que soit la tem- pérature de réaction, ledit nucleotide s'hybrldant avec la séquence cible, de- manlere à ce que son extremlté 3' soit adjacente à la base nucléotidique spécifique à détecter et/ou à identifier; (2) on débute la synthèse du brin complémentaire de l'hybride obtenu en (1), - ledit nucléotide servant d'amorce -, en présence: - d'une polymérase sans action exonucléase 3'5' et - d'au moins une base nucléotidique modifiée, de manière à être incorporable dans le produit d'extension de l'amorce, ladite incorporation bloquant l'élongation dudit produit d'extension; (3) on détecte la base nucléotidique bloquante incorporée par tout moyen approprié, ladite détection permettant d'identifier la base nucléotidique spécifique complémen- taire présente sur la séquence cible à analyser. On entend par nucléotide, au sens de la pré- sente invention, aussi bien un oligonucléotide,qui comprend de 10 à 50 bases qu'un nucléotide pouvant comprendre plus de cent bases. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du- dit procédé, les bases nucléotidiques bloquantes sont des didésoxynucléotides. Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux dudit procédé, lesdites bases nucléotidiques blo- quantes sont marquées de manière appropriée notamment par - un marqueur choisi dans le groupe qui comprend des sub- stances radioactives, des enzymes, des produits chimiques chromophores fluorescents ou chimioluminescents et des an- ticorps appropriés. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le marqueur est identique ou différent pour chacune des bases nucléotidiques bloquantes. Selon une modalité de cette disposition, C lorsque les quatre bases bloquantes sont marquées a l'aide de marqueurs différents, la detection des quatre nucleo- tides bloquants est avantageusement slmultanee. Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux dudit procédé, lorsque les quatre bases bloquantes sont marquées de manière identique ou bien lorsqu'elles ne sont pas marquées, la détection des quatre nucléotides blo- quants est réalisée successivement et/ou séparément. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, on détecte,. de manière appropriée, le pyro- phosphate formé lors de la réaction de polymérisation. En effet, -la réaction de polymérisation génère la production d'un pyrophosphate, comme suit: matrice - amorce + dNTP ---> matrice - (amorce + dNMP) + PPi. En mesurant le pyrophosphate dans chaque tube de réaction, il est possible de déterminer pour laquelle des bases une réaction de polymérisation s'est produite. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, on détecte chaque base nucléoti- dique marquée. En effet, chaque tube de réaction contient, en ce cas, une seule base nucléotidique marquée, les trois autres ne l'étant pas; la mesure de la base marquée (par fluorescence, radioactivité...) permet de déterminer pour laquelle des bases une réaction de polymérisation s'est produite, les bases marquées non incorporées étant élimi- nées par lavage. Le procédé conforme à l'invention a notamment l'avantage de permettre de définir les conditions opéra- toires, indépendamment de la base nucléotidique à identi- fier et de ne pas nécessiter d'immobilisation de l'acide nucléique sur une membrane. La présente invention a également pour objet un kit ou coffret de diagnostic, prêt à l'emploi, pour la mise -en oeuvre du procédé conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend outre les quantités convenables de reac- tifs et tampons adaptés a la mlse en oeuvre du procédé: - des quantites approprlees d'un nucléotlde (servant d'amorce) capable de s'hybrlder avec la sequence cible de manlere à ce que son extrémité 3' solt adjacente à la base nucléotidique spécifique à détecter; - des quantités appropriées de quatre bases nucléotidiques modifiées de manière à être incorporables dans le produit d'extension de l'amorce tout en bloquant l'élongation dudit ]O produit d'extension; et - des quantités appropriées d'une polymérase sans action" exonucléase 3'5'. Selon un mode de réalisation avantageux dudit kit ou coffret, les bases nucléotidiques modifiées sont des s5 didésoxynucléotides (ddTTP, ddGTP, ddATP, ddCTP). Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit kit ou coffret, les bases nucléotidiques modifiées sont marquées de manière appropriée notamment par un mar- queur choisi dans le groupe qui comprend des substances ra- dioactives, des enzymes, des produits chimiques chromo- phores fluorescents ou chimioluminescents et des anticorps appropriés. Selon encore un autre mode de réalisation avan- tageux dudit kit ou coffret, il comprend, en outre, des ré- actifs appropriés pour le dosage du pyrophosphate. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui res- sortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la pré- sente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1: diagnostic de la drépanocytose par le procéde conforme a l'invention (mesure des dldésoxynucléotldes fluorescents). La drépanocytose ou anémle falclforme est due à s une mutation dans l'un des exons du gène B codant pour la chaîne B de l'hémoglobine (Hb). Cette mutation consistant en une substitution d'une adénine (A) par une thymine (T), modifie le codon GAG, traduit en un acide glutamique (en position G) dans l'Hb normale, en codon GTG, traduit en une valine dans l'Hb anormale (HbS). L' ADN qui a été utilisé dans cet exemple correspond à une séquence d' ADN amplifié slmple-brln. alBlca.e... des immoe_ ' _aQd ifDa.t1 o * mélanger dans un tube de microcentrifugation, pour chaque ADN matrice: - 100 ng d' ADN (slmplebrin amplifié) - 7 pl de tampon Sequenase 5X (= Tris-HCl pH 7,5, mM; NaCl, 250 mM; MgCl2, 100 mM) - H20 qsp 22 pil 2o * agiter à l'aide d'un vortex et centrifuger rapidement * incuber au bain-marie à 95 C pendant 2 minutes. * enlever vite et placer au bain-marie à 37'C pendant 10 minutes. * préparer le tampon de réaction pour un échantillon d' ADN, constitué de: 2,5 pl DTT 0,1 M - 1 pl d'un mélange de ddNTP,dilué au 1/400 (ddTTP: 112 pM; ddGTP: 1,12 pM; ddATP: 3,36.M; ddCTP: 8,96 pM); et o30 - H20 qsp 6,5 pl - Sequénase 1 pl (3 unités) * enlever les tubes du bain-marie et centrifuger rapide- ment, * ajouter le tampon de réaction et mélanger, * placer au bain-marie à 37 C, pendant 5 minutes, * enlever les tubes et les placer dans la glace. b) Elimination des didésoxynucléotldes froids en exces On utlllse les systemes de microseparation Centrlcon 3 ou (Amlcon) qui,- par filtration sur membrane accéléree par centrifugation, permettent de retenir des espèces molécu- laires de poids moléculaire supérieur à 3 000 ou 10 000 Daltons (par exemple: un nucléotide correspond à 330 D et un oligonucléotide de synthèse de 20 meres correspond à 6 600 D). - disposer le volume réactionnel issu de a) dans un "Cen- lO tricon" 3 ou 10 et diluer si nécessaire, - centrifuger à moins de 5 000 g en suivant les instruc- tions du fabricant, de façon à récupérer un volume minimal, - inverser le système "Centricon", - centrifuger pour récupérer le volume réactionnel, - ramener le volume obtenu à 12 pl. c) Microsêquençage (procédé conforme à l'invention) * Pour chaque tube d' ADN, ajouter aux 12 pl: -15 ng d'oligonucléotide 5' CATGGTGCACCTGACTCCTG 3' (OA), correspondant à la séquence s'arrêtant à la base adjacente à la position de la mutation - 7 pl de Tampon Sequénase 5X tel que défini en a) ci-des- sus et procéder comme dans a); puis * préparer le tampon de réaction constitué pour chaque échantillon de: - - 2,5 pi DTT O,1 M - 1 pl d'une dilution au 1/400ème d'un mélange de ddNTP fluorescents (ddTTP*: 112pM; ddGTP*: 1,12pM; ddATP*: 3,36pM;ddCTP*: 8,96gM). Les didésoxynucléotides fluores- cents sont vendus par Du Pont (GenesisTH 2000 DNA Analysis Systemrn); H20 qsp 6,5 pil - Sequenase lpl (3 unités) * enlever les tubes du bainmarie, centrifuger rapidement, * ajouter le tampon de réaction, mélanger, Z5 * placer au bain-marie à 37'C, pendant 5 mns, * enlever les tubes et placer les dans la glace. d) Lavage des didesoxynucleotldes fluorescents en excès: * passer les échantillons sur colonne de Sephadex G50, * récupérer les éluats. e) Détection _5 La détection se fait pour chaque échantillon après migration électrophorétique et excitation par une source telle qu'un laser. Le signal est analysé par un fluoromètre. On obtient les courbes a (témoin) et b (ma- lade), comme visible sur la figure 1, qui permet de détec- ter au niveau de la position correspondant à une éventuelle mutation, l'incorporation d'un ddATP en a, pour l'individu sain et pour l'individu malade homozygote en b, l'incorporation d'un ddTTP. 1s.E.E.xeR.ple2 =...icroa.sq_ncg.__'u4e: base.. sur u.ns quence d'açcidç nuc1lique4.. xI d ?ateQphageY1l3 iMp8). a) Mat.riel de départ * ADN simple brin de bacteriophage M13mp8 * Oligonucléotide de synthèse dit Primer Universel de sé- quence: 3'TGACCGGCAGCAAAATG5' La première base incorporée sur l'amorce dans le sens '-->3' est un G. Le protocole est équivalent au protocole de dé-- tection de mutation ponctuelle à partir de l'étape c de l'exemple 1. Les étapes a et b sont inutiles, 1' ADN du phage M13 étant non contaminé par des oligonucléotides. En variante, le protocole est le suivant: - 3 gg d' A.D.N. simple-brin M13 - 15 ng d'oligonucléotide primer universel - 7.1 de Tampon 5X Sequenase H2O qsp 22 p1 La détection révèle l'incorporation sur le pri- mer d'un dideoxy GTP, ce qui correspond au résultat at- tendu, comme visible sur la figure 2, qui montre les résul- tats obtenus avec deux dilutions différentes des ddNTP (1/200 (a) et 1/400eme (b)>. Alnsl que cela ressort de ce qui precede, l'invention ne se limite nullement a ceux de ses modes de mises en oeuvres, de réalisation et d'application qui vien- nent d'être décrits de façon plus explicite;- elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATION3 1) Procede de detection et/ou d'identlflcatlon d'une base nucleotidlque specifique presente sur une sé- quence d'acide nucléique, caractérisé en ce que: (1) on hybride la séquence sur laquelle se trouve la base à identifier avec un nucléotide de longueur suffisante pour permettre une hybridation correcte, quelle que soit la tem- pérature de réaction, ledit nucléotide s'hybridant avec la séquence cible, de manière à ce que son extrémité 3' soit adjacente à la base nucléotldique spécifique à détecter et/ou à identifier; (2) on débute la synthèse du brin complémentaire de l'hybride obtenu en (1), - ledit nucléotide servant d'amorce -, en présence: 1.5 - d'une polymérase sans action exonucléase 3'5' et - d'au moins une base nucléotidique modifiée, de manière à être incorporable dans le produit d'extension de l'amorce, ladite incorporation bloquant l'élongation dudit produit d'extension; (3) on détecte la base nucléotidique bloquante incorporée par tout moyen approprié, ladite détection permettant d'identifier la base nucléotidique spécifique complémen- taire présente sur la séquence cible à analyser. 2') Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les bases nucléotidiques bloquantes sont des didésoxynucléotides. 3') Procédé selon la revendication 1 ou la re- vendication 2, caractérisé en ce que lesdites bases nucléo- tidiques bloquantes sont marquées de manière appropriée, notamment à l'aide d'un marqueur choisi dans le groupe qui comprend des substances radioactives, des enzymes, des pro- duits chimiques chromophores fluorescents ou chimiolumines- cents et des anticorps appropriés. 4') Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que le marqueur est identique ou différent pour chacune des bases nucléotidiques bloquantes. ) Procédé selon la revendication 4, caracté- risé en ce que lorsque les quatre bases bloquantes sont marquées à l'aide de marqueurs différents, la détection des quatre nucléotides bloquants est avantageusement slmulta- née. 6') Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 4, caractérisé en ce que lorsque les quatre bases bloquantes sont marquées de manière identique ou bien lorsqu'elles ne sont pas marquées, la détection des quatre nucléotides bloquants est réalisée successivement et/ou sé- parément. 7 ) Procédé selon la revendication 6, caracté- risé en ce qu'on dose, de manière appropriée, le pyrophos- phate formé lors de la réaction de polymérisation, ledit dosage de pyrophosphate permettant de déterminer pour la- quelle des bases une réaction de polymérisation s'est pro- duite. 8 ) Procédé selon la revendication 6, caracté- risé en ce qu'on détecte chaque base nucléotidique blo- quante marquée. 9') Kit ou coffret de diagnostic, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend outre les quantités convenables de réactifs et tampons adaptés à la mise en oeuvre du procédé: - des quantités appropriées d'un nucléotide, servant d'amorce, capable de s'hybrider avec la séquence cible de manière à ce que son extrémité 3' soit adjacente à la base nucléotidique spécifique à détecter; - des quantités appropriées de quatre bases nucléotidiques modifiées, de manière à être incorporables dans le produit d'extension de l'amorce tout en bloquant l'élongation dudit produit d'extension; et - des quantités appropriées d'une polymérase sans action exonucléase 3'5'. ') Kit ou coffret selon la revendication 9, caractérise en.ce que les bases nucleotidiques modifiees sont des didesoxynucleotldes. 11) Kit ou coffret selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce que les bases nu- cléotidiques modifiées sont marquées de manière appropriée, notamment à l'aide d'un marqueur choisi dans le groupe qui comprend des substances radioactives, des enzymes, des pro- duits chimiques chromophores fluorescents ou chimiolumlnes- cents et des anticorps appropriés. 12') Kit ou coffret selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, des réactifs appropriés pour le dosage du pyrophos- phate. 13') Application du procédé selon l'une quel- i5 conque des revendications 1 à 8, à la détection de la pré- sence de séquences d'acides nucléiques particulières asso- ciées à des maladies, telles que maladies génétiques ou ma- ladies cancéreuses, à des infections, ou propres.à per- mettre l'identification d'individus humains, animaux ou vé- gétaux.