FR 2649335 A1 19910111 FR 8909275 A 19890705 PROCEDE ET DISPOSITIF DE PRODUCTION DIRECTE DE LIPOSOMES La présente invention concerne la préparation, obtention, ou production de liposomes incorporant une substance active. Les liposomes sont des vésicules, ou capsules, ou sphères artifi- ciels, ayant un diamètre de l'ordre d'une centaine de nanomètres, bien connus dans différents domaines techniques, notamment la pharmacie. Ces liposomes sont mis en oeuvre pour incorporer une substance active, soit dans un milieu aqueux remplissant le volume intraliposomial, soit dans la paroi du liposome, et transporter la même substance active vers un site o la substance active sera libérée et utilisée à différentes fins. Par "substance active", au sens de la présente invention, on entend toute matière, produit, composé, ou matériau, susceptible d'être encapsulé selon les techniques usuelles de préparation des liposomes, et présentant une utilité, ou fonction technique, ou résultat, dans un processus, procédé, ou méthode, de nature physique, chimique, physico- chimique, thérapeutique, pharmacologique, biologique, bio.chimique, etc... Ressortent de cette définition -les principes actifs médicamenteux -du matériel biologique, tels que des enzymes, ou fragments d'ADN ou ARN -des produits cosmétiques, nutritifs -des produits phyto-sanitaires -des agents de modification ce l'aspect, du goût, ou de la texture d'un aliment. Les liposomes sont maintenant bien connus, et ont été décrits et étudiés, dans quelques ouvrages ou publications de référence, auxquels on se reportera utilement, et parmi lesquels, on peut citer Les liposomes, applications thérapeutiques, de F. PUISIEUX et 3. DELATTRE, aux Editio.ns Techniques et Documentation - LAVOISIER. 30.Les liposo.nes en biologie cellulaire et pharmacologie, de Patrick MACHY et Lee LESERMAN, aux éditions INSERM. En particulier, les liposomes ont été classés en différentes caté- gories, au rang desquelles on peut distinguer: -les vésicules multilamellaires, en abrégé MLV -les grandes vésicules unilamellaires, en abrégé LUV -les petites vésicules unilamellaires, en abrégé SUV Les matières premières nécessaires à la préparation ou synthèse de ces liposomes sont essentiellement les suivantes: a) Un composé amphiphile, constitutif de la paroi du liposome, tel que Les phospholipides, comme la lécithine, les phosphatidylcho- lines naturelles ou synthétiques, les sphingomyélines, les phosphatidyli- nositols, les phosphatidylsérines, les lysophosphatidylcholines, les dicétyl- phosphates. Les détergents de synthèse ou naturels. b) Eventuellement un composé de rigidification de la paroi du liposome, tel que: Un composé polycyclique comportant une chaine ramifiée, tel qu'un stérol, comme le cholestérol, les phytostérols, la fluorescéine acide et ses esters. Certaines amines aromatiques. Certains sucres, comme les polyoses, la streptomycine. c) Eventuellement un composé conférant une charge positive ou négative à la surface de la membrane des liposomes, tel que: Le dipalmitoyl phosphatidylglycérol, pbur obtenir une charge négative. La stéarylamine, pour obtenir une charge positive. d) Eventuellement un agent antioxydant du composé amphiphile, et/ou du composé de rigidification, tel que le DL (- tocophérol. e) La substance active pouvant être solubilisée en milieu aqueux, ou dans le composé amphiphile, ou dans un milieu organique approprié. Ces différentes matières sont solubilisées ou mises en suspension dans différents milieux, aqueux et/ou organiques, afin de préparer les liposomes selon différentes méthodes ou voies d'obtention faisant inter- venir ces milieux. Sans entrer dans les détails et le classement des différentes méthodes de préparation, la plupart de celles-ci opèrent par étapes. La première étape consiste à former une pseudo-membrane cellulaire, et à transformer cette membrane en une vésicule stable. La deuxième étape consiste à améliorer les liposomes obtenus selon la première étape, en les triant ou sélectionnant par différents moyens physiques, tels que passage dans une presse de FRENCH, un filtre, une sonication, etc... Cette étape permet par exemple de transformer des populations plurimodales de liposomes de différentes tailles, en des liposomes de petites tailles unilamellaires. La troisième et dernière étape consiste à éliminer les matières premières non utilisées dans le processus d'encapsulation, ainsi que le ou les milieux de solubilisation ou suspension, par exemple par centrifu- gation, chromatographie. Toutes ces techniques présentent en commun un certain nombre d'inconvénients que l'on peut énumérer comme suit: -Leur rendement est globalement faible, aussi bien en ce qui concerne le taux de matière amphiphile consommée dans le pro- cessus d'encapsulation, qu'en ce qui concerne le taux de substance active incorporée dans les liposomes; ce rendement relativement faible allonge corrélativement les temps de production. -Elles mettent en oeuvre des solvants organiques de disso- lution, suspension, ou dispersion, qu'il faut ensuite éliminer; ceci génère des contraintes de sécurité, toxicité, etc..., et passe par des traitements thermiques consommateurs d'énergie. -Les liposomes obtenus présentent souvent une grande dispersion, quant à leur forme finale, et à la répartition de leurs dimen- sions unitaires. La présente invention a pour objet une technique nouvelle de préparation, ou obtention de liposomes, en une seule étape, et autorisant la suppression de tout milieu organique de solubilisation, suspension, ou dispersion. De manière générale, selon la présente invention -On obtient un liquide de préparation par mélange d'au moins un composé amphiphile, d'un milieu aqueux, et de la substance active soluble ou dispersable dans le composé amphiphile ou le milieux aqueux, pouvant exclure toute phase organique de solubilisation ou suspen- sion. -On soumet le liquide de préparation en mouvement à une alternance de surpressions et dépressions. Par dépression et surpression, on entend toutes pressions respecti- vement inférieure et supérieure à la pression statique du liquide de prépa- ration, notamment un vide partiel pour la dépression. Lorsque le liquide de préparation est en écoulement, il s'agit de pressions locales respecti- vement inférieure et supérieure à la pression statique de la veine du liquide en mouvement. Par milieu aqueux, on entend toute phase aqueuse à l'état pur, ou comportant des sels en solution, par exemple, une solution isotonique apyrogène. Différentes voies physiques peuvent être utilisées pour soumettre le liquide de préparation en mouvement à une succession de surpressions et dépressions. Selon un mode préféré d'exécution de l'invention, on utilise le phénomène bien connu de cavitation, en général nuisible au bon fonction- nement ou aux performances de différents organes ou machines, tels que pompes, hélices, etc... Mais ici, selon la présente invention, ce phéno- mène sera volontairement reproduit, maîtrisé et contrôlé, pour aboutir à une alternance répétée de surpressions et dépressions du liquide de préparation. On sait en effet que la cavitation d'un liquide s'analyse comme la génération au sein de la masse dudit liquide, de zones ou espa- ces locaux, sous dépression ou vide partiel, et de zones ou espaces locaux en surpression. La littérature technique décrit également de nombreuses voies de cavita- tion d'un liquide, sans qu'il soit besoin de les reprendre ici toutes. Ainsi, le phénomène de cavitation peut être généré et obtenu par saturation d'un gaz inerte dans le liquide de préparation, et de saturation du même gaz, lequel provoque alors la cavitation rechechée. Un mode préféré d'exécution de la présente invention, sous son aspect cavitation, consiste à faire circuler une veine ou un écoulement du liquide de préparation, et à soumettre cette veine au phénomène de cavitation, selon le processus dit "coup de bélier" déjà bien étudié, par le choix approprié de conditions opératoires ou paramètres mécaniques ou de construction. Il s'établira ainsi dans la veine un régime permanent de cavitation générant d'une extrémité à l'autre de la veine, des oscillations de pression, c'est-à-dire des noeuds de surpression et dépression, ayant une position relativement stable. Un dispositif de production directe de liposomes, selon l'invention, com- prend: - une cuve de traitement - une pompe dont l'entrée d'aspiration communique avec la cuve - un circuit de cavitation extérieur à la cuve, communiquant à une extrémité avec la sortie de refoulement de la pompe, et à l'autre extrémité avec une entrée de recyclage dans la cuve, au sein de la charge du liquide de préparation - des moyens pour alimenter la cuve en liquide de préparation - des moyens pour évacuer de la cuve la suspension de liposomes obtenus Egalement, selon l'invention, la pression statique du liquide de préparation en mouvement est ajustée en-dessous du seuil de cavitation dudit liquide. Les paramètres opératoires et mécaniques choisis pour l'écou- lement du liquide de préparation, soumis aux oscillations de pression, sont corrélés par l'équation suivante dans laquelle a = vitesse de propagation des oscillations de pression, en m/s = masse volumique du liquide de préparation en kg/m3 C = module d'élaticité de volume dudit liquide, en N/m2 D = diamètre de la veine de l'écoulement, en m e = épaisseur de la paroi canalisant l'écoulement, en m E = module d'élasticité de ladite paroi en N/m2 Préférentiellement, on choisit selon l'invention de travailler avec une vitesse linéaire de l'écoulement au moins égale à 100 m/s, et/ou une pression statique du liquide en écoulement au moins égale à 100 bars. De telles conditions permettent en particulier dans un circuit fermé de recycler le liquide de préparation, un grand nombre de fois par unité de temps dans les zones de dépression. Toujours selon l'invention, et afin de rester en phase aqueuse, on prépare un lait de stabilisation par mélange d'un composé de rigidifi- cation de la paroi de liposomes, tel qu'un composé polycyclique à chaîne ramifiée, avec un milieu aqueux de dispersion, et on ajoute ce lait aqueux au liquide de préparation. CUn dispositif de production directe de liposomes, conforme à la présente invention, est maintenant décrit par référence aux dessins annexes dans lesquels: La figure I représente de manière schématique un dispositif selon l'invention. La figure 2 représente de manière schématique un écou- lement du liquide de préparation soumis de manière contrôlée au phéno- mène de cavitation. Un dispositif selon l'invention comporte -Une cuve de traitement (1), résistant à des pressions importantes, par exemple de l'ordre de 100 à 200 bars, pourvue d'un couvercle (2), pouvant être fixé de manière amovible et étanche sur la cuve (1); ce couvercle (2) sert à la fois pour alimenter la cuve en liquide de préparation, et pour évacuer de cette dernière la suspension de liposomes obtenue. -Une pompe (3) dont l'entrée d'aspiration (3a) communique 3 avec le fond de la cuve (1). -Un circuit de cavitation (4), extérieur à la cuve (1), commun iquant à une extrémité avec la sortie de refoulement (3b) de la pompe, et à l'autre extrémité, par un détendeur (5), avec une entrée (la) de recyclage dans la cuve (1), au sein de la charge du liquide de préparation. Pour la mise en oeuvre du dispositif précédemment décrit, le couvercle (2) étant ouvert, la cuve (1) est remplie complètement avec le liquide de préparation, obtenu comme décrit précédemment, et éven- tuellement le lait de stabilisation également discuté précédemment. Puis le couvercle (2) est refermé, de manière à opérer ultérieurement en l'absence de tout air ambiant. La pompe (3) est alors mise en fonction- nement, les différents paramètres opératoires et/ou mécaniques du dispositif selon la figure (1) ayant été préalablement réglés, comme discuté précédemment, pour générer et contrôler le phénomène de cavitation dans la boucle (4). Comme montré à la figure 2, dans le circuit de cavita- tion (4) dessiné de manière droite et développée, on obtient dans la veine (6) de circulation du' liquide de préparation, des oscillations de surpression et dépression, respectivement (6a) et (6b), s'établissant selon un régime stationnaire, et pouvant se matérialiser par des bosses et des creux de la paroi (4a) du circuit (4), montrés en traits pointillés à la figure 2, ceci dans le cas o cette paroi (4a) présente une certaine souplesse tout en résistant à la pression. Ce sont dans les noeuds de dépression (6b) que s'effectue l'évaporation du milieux aqueux, et corrélativement la formation des liposomes, et dans les noeuds de surpression (6a) que s'effec- tue l'incorporation des produits lipophiles. Au plan expérimental, on a utilisé un dispositif selon la figure 1, ayant les caractéristiques suivantes -Une cuve de traitement (1) ayant un volume de 18 litr-s. -Une pompe (3) ayant un débit nominal de 950 litres/ht ure et une pression de refoulement de 175 bars. -Un tuyau constituant la boucle (4), ayant une longueur de 8 m, résistant à une pression de 250 bars; le volume du circuit (4) et de la pompe (3) représentant un volume de 2 litres. Avec un dispositif tel que précédemment décrit, on a préparé des liposomes de vitamine E, et de bleu trypan. EXEMPLE I S'agissant des liposomes de vitamine E. pour le volume global de 20 litres du dispositif précédemment décrit. on a utilisé Is proportions et matières premières suivantes -phosphatidylcholine de soja: 1000 g - cholestérol: 80 g -DLe(topophérol: 100 g -acétate de tocophérol (Vitamine E): 100 g -ascorbate de sodium: 2 g -eau apyrogène en quantité suffisante pour 20 litres Les conditions opératoires étaient les suivantes: - pression de refoulement de la pompe: 150 bars -vitesse de circulation de la pompe: 600 1/h -température ambiante Au bout de 5 minutes, un prélèvement effectué revèle que 50 % de la lécithine n'est pas encore sphérisée, mais ce taux baisse avec le temps, pour aboutir à un rendement pratiquement de 100 % au bout de 40 minutes. EXEMPLE 2 S'agissant des liposomes de bleu trypan, on utilise les mêmes conditions opératoires, la vitamine E ou acétate de topophérol étant remplacé par la même quantité de bleu trypan. La solution liposomiale obtenue finalement montre que la quantité de colorant encapsulé dans la phase hydrophile est de 46 %. On élimine le colorant non encapsulé par chromatographie sur une résine Séphadex G 50. Par éllution des liposomes pendant 24 heures, on constate que ces derniers ont gardé 100 % de leur colormnt, ce qui démontre leur stabilité et imperméabilité. En définitive, le procédé selon l'invention permet en outre d'obte- nir les avantages significatifs suivants. Tout d'abord, ce procédé s'avère indépendant de la température de transition du composé amphiphile, et on peut donc travailler à toutes températures, au voisinage de la tempé- rature ambiante par exemple, et par conséquent traiter toutes substances actives sensibles à l'action de la température, par exemple en termes- de dégradation. L'étude physique des liposomes obtenus selon l'invention, montre que leurs dimensions et leurs histogrammes de répartition sont peu sensi- bles à l'action de la température. Pour terminer, le phénomène de cavitation permet de travailler uniquement en présence de la vapeur du liquide de preparation, ou celle d'un gaz inerte volontairement dissout, et donc en général en atmosphère inerte, non susceptible d'oxyder les matières premières sensibles à une dégradation par oxydation. REVENDICATIO NS 1) Procédé de production directe de liposomes incorporant une sub- stance active, caractérisé en ce qu'on obtient un liquide de préparation par mélange d'au moins un composé amphiphile, d'un milieu aqueux, et de la substance active soluble -ou dispersable dans le composé amphi- phile ou le milieu aqueux, pouvant exclure toute phase organique de solubi- lisation ou suspension, et on soumet le liquide de préparation en mouvement à une alternance de surpressions et de dépressions. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on génère le phénomène de cavitation dans une masse du liquide de préparation en mouvement. 3) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la pression statique du liquide de préparation en mouvement est ajustée en-dessous du seuil de cavitation dudit liquide. 4) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on produit un écoulement du liquide de préparation avec des paramètres opératoires générant des oscillations de pression, c'est-à-dire des surpressions et dépressions alternatives, dans ledit écoulement. ) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les para- mètres opératoires et mécaniques choisis pour l'écoulement du liquide de préparation, soumis à des oscillations de pression,, sont cQrrélés par l'équation suivante a= \ / ' fE dans laquelle a = vitesse de propagation des oscillations de pression, en m/s = masse volumique du liquide de préparation en kg/m3 t= module d'élasticité de volume dudit liquide, en N/m2 D = diamètre de la veiné de l'écoulement, en m e = épaisseur de la paroi canalisant l'écoulement, en m E = module d'élasticité de ladite paroi en N/m. 6) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le phé- nomène de cavitation est obtenu par un écoulement du liquide de prépa- ration, ayant une vitesse linéaire d'au moins 100 m/s. 7) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le phé- - nomene de cavitation est obtenu par un écoulement du liquide de prépa- ration, sous une pression statique au moins égale à 100 bars. 8) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le liquide de préparation est mis en circulation dans une boucle fermée, comprenant une pompe, une cuve de traitement, et un circuit extérieur de cavitation à la cuve. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le liquide recyclé par la pompe est injecté dans la cuve au sein de la charge liquide présente dans cette dernière. ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute au liquide de préparation un lait de stabilisation, obtenu par mélange d'un composé de rigidification de la paroi des liposomes. tel qu'un composé polycyclique à chaine ramifiée avec un milieux aqueux de dispersion. 11) Dispositif de production directe de liposomes incorporant une substance active, comprenant -Une cuve de traitement. -Une pompe dont l'entrée d'aspiration communique avec la cuve. -Un circuit de cavitation extérieur à la cuve, communiquant à une extré- mité avec la sortie de refoulement de la pompe, et à l'autre extrémité avec une entrée de recyclage dans la cuve, au sein de la charge du liquide de préparation -Des moyens pour alimenter la cuve en liquide de préparation. -Des moyens pour évacuer de la cuve la suspension de liposomes obtenue.