FR 2650292 A1 19910201 FR 8910143 A 19890727 La présente invention concerne un procédé de production d'une protéine déterminée chez les bactéries du genre Bacillus, en particulier Bacillus subtilis, ainsi que des souches de Bacillus, notamment Bacillus subtilis utiles dans le procédé et leur procédé de préparation desdites souches. On a décrit dans FR 84 06701 (2 563 533) un procédé de préparation d'une souche de Bacillus dans le chromosome de laquelle un gène déterminé a été amplifié, c'est-à-dire est présent à plusieurs exemplaires, dans lequel a) on effectue l'intégration dans le chromosome de ladite souche d'au moins une séquence d'ADN dite d'intégration comportant au moins une séquence d'ADN dite unité amplifiable de structure -D-M-D-, ledit gène M et à chaque extrémité comportant deux séquences identiques D dans le sens direct, ces séquences D assurant l'intégration du gène M dans un gène non essentiel de Bacillus, l'unité amplifiable comportant en outre un gène sélectionnable. b) on sélectionne ensuite les souches de Bacillus obtenues par culture sur un milieu de sélection correspondant au gène - sélectionnable et on sélectionne les souches dont le génome correspond à la présence d'un nombre de copies dudit gène accrû par rapport à la population bactérienne avant sélection. Ainsi, on a pu obtenir une unité d'amplification comportant outre la séquence dupliquée, le gène de résistance à la kanamycine (Kmr), le gène de résistance au chloramphénicol (Cmr). Une amplification des deux Kmr r gènes Kmr ou Cmr a été obtenue en sélectionnant les souches résistantes à des concentrations élevées d'antibiotique. Mais aucune production de protéine n'a été décrite avec des souches selon ce procédé. Le but de la présente invention est d'induire de plus hauts niveaux d'amplification d'un fragment du génome de Bacillus subtilis d'une part, et d'autre part que la machinerie cellulaire soit encore capable d'assurer la transcription et la traduction de toutes les séquences ainsi amplifiées et la sécrétion des protéines codées le cas échéant par un gène amplifié. Selon la présente invention, on a découvert un nouveau procédé d'amplification d'une souche de Bacillus susceptible de produire une protéine déterminée en quantité importante dans le chromosome de laquelle un gène déterminé codant ladite protéine a été amplifié. Ce procédé est caractérisé en ce que a) on effectue l'intégration dans le chromosome de ladite souche d'au moins une séquence d'ADN dite d'intégration comportant au moins un système de réplication ou réplicon inductible ou conditionnel en amont, une unité amplifiable de structure - D-M-D-, les séquences D orientées en sens direct assurant l'intégration du gène MN dans un gène non essentiel de ladite souche, le gène MN comprenant le gène de structure de ladite protéine mis sous le contrôle d'éléments - d'expression et de sécrétion inductibles de ladite protéine chez Bacillus, l'unité amplifiable comportant en outre éventuellement un gène sélectionnable; b) on effectue éventuellement une culture sur un milieu de sélection correspondant au gène sélectionnable, et c) dans un milieu de culture approprié, on induit l'activation dudit réplicon. Compte tenu du fait que l'amplification par activation du réplicon est suffisamment élevée, on peut en effet obtenir 40 à 80 copies du gène après une nuit d'activation du réplicon, on peut supprimer éventuellement l'étape b) de sélection sur milieu correspondant au gène sélectionnable auparavant nécessaire. En cumulant les deux types d'amplification b) et c), on peut obtenir jusqu'à 250 copies du gène alors que le procédé par la seule pression de sélection en présence d'un gène sélectionnable donnait une amplification fournissant seulement de 20 à 30 copies du gène. La présente invention a donc pour objet un procédé de production d'une protéine déterminée dans lequel l'amplification et l'activation des éléments d!expression et de.sécrétion de ladite protéine ont lieu simultanément, c'est-à-dire un procédé caractérisé en ce que, à partir d'une souche du genre Bacillus dans le chromosome de laquelle ont été intégrés dans un gène non essentiel de ladite souche: a) une unité amplifiable comportant une séquence d'ADN déterminée M encadrée par deux séquences d'ADN identiques et orientés en sens direct D, la séquence M comprenant le gène de structure de ladite protéine mis sous le contrôle d'éléments d'expression et sécrétion inductibles chez Bacillus de ladite protéine et facultati- vement un gène sélectionnable, et b) un système de réplication ou réplicon inductible ou conditionnel également intégré dans ledit gène non essentiel du chromosome de la souche en amont de l'unité amplifiable: 1. on sélectionne éventuellement les clones amplifiés - obtenus par culture sur un milieu de sélection correspondant au gène sélectionnable et l'on prélève les souches dont le génome correspond à la présence d'un nombre de copies dudit gène accru par rapport à la population bactérienne avant sélection 2. dans un milieu de culture approprié, on induit ou conditionne une amplification gènique par l'activation du réplicon, et on induit l'expression et la sécrétion de la protéine par l'activation desdits éfémens d'expression 3. on récupère ladite protéine exprimée. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une souche de Bacillus utile dans le procédé de production d'une protéine selon l'invention dans le chromosome de laquelle un gène déterminé codant ladite protéine a été intégré, éventuellement amplifié, caractérisé en ce que a) on effectue l'intégration dans le chromosome de ladite spuche d'au moins une séquence d'ADN dite d'intégration comportant au moins: un système de réplication ou réplicon inductible ou conditionnel en amont, À une unité amplifiable de structure -D-M-D-, les séquences D orientés en sens direct assurant l'inté- gration du gène M dans un gène non essentiel de ladite souche, le gène MN comprenant le gène de structure de ladite protéine mis sous le contrôle d'éléments d'expres- sion et sécrétion inductibles de ladite protéine chez Bacillus, l'unité amplifiable comportant en outre éventuel- - lement un gène sélectionnable; b)-On sélectionne éventuellement les souches de Bacillus obtenues par culture éventuellement sur un milieu de sélection correspondant au gène sélectionnable et c) on prélève les souches stables dont le génome correspond à la présence d'un nombre de copies dudit gène accrû par rapport à la population bactérienne avant sélection. Le procédé de préparation de souche selon l'invention permet d'obtenir une souche hyperproductrice de la protéine codée par le gène hétérologue intégré qui est stable sans qu'il soit nécessaire de maintenir une pression de sélection. Dans les procédés de préparation de souches ou de production de protéines selon l'invention, le système de réplication sera de préférence issu d'un plasmide bactérien bien que cela ne soit pas indispensable. Le système ou origine de réplication est situé au voisinage, de préférence à moins de 50 kb, de la duplication et orienté vers celle-ci. On notera que l'origine de réplication ne fait pas partie des séquences amplifiées. A titre de réplicon conditionnel ou inductible, on pourra utiliser un réplicon thermosensible tel que' le plasmide pE194 dont la réplication est naturellement thermosensible active à 37 C et inactivée à 51 C. L'unité amplifiable sera comprise de séquences non réplicatives chez Bacillus, de préférence issues d'un plasmide bactérien bien que cela ne soit pas non plus indispensable. En particulier, les séquences D peuvent provenir du plasmide pBR322. De façon générale, le gène sélectionnable sera un gène de 'résistance à un composé chimique, en particulier un antibiotique: kanamycine, ou chloramphénicol, par exemple. Dans ces conditions, la sélection de la souche est aisée puisqu'il suffit de sélectionner une souche très résistante à l'antibiotique. Grâce au procédé selon l'invention, on peut obtenir une souche. hyperproductrice de la protéine codée par le gène hétérologue intégré, qui est stable sans qu'il soit nécessaire de maintenir-une pression de sélection. Des vecteurs intégratifs ont été construits dans le but d'intégrer des gènes étrangers dans le chromosome de Bacillus subtilis. Ces vecteurs se caractérisent essentiellement par l'existence de segments homologues du chromosome de Bacillus subtilis qui. assure l'intégration. Sur le plan technique, ces vecteurs sont connus dans leurs principes et leurs réalisations. En particulier notamment dans FR 84 06701 (2 563 533), il est nécessaire pour que l'intégration puisse se faire que le vecteur présente une séquence d'ADN identique à celle du chromosome de la souche de Bacillus. Dans certains cas, on utilise des vecteurs portant des fragments du chromosome de Bacillus sauvage, par exemple tout ou partie du gène thy B, ou d'un gène qui sera nommé X. On peut également intégrer d'abord dans le chromosome une séquence déterminée provenant, par exemple, d'un plasmide bactérien tel que pBR322, dans ce cas il suffit ensuite d'utiliser un vecteur d'intégration portant la même séquence. Dans le cas de Bacillus subtilis, le système de réplication et l'unité amplifiable -D-M-D- seront avantageusement intégrés entre les séquences thy et X de Bacillus subtilis à la place du gène ilvA de ladite souche. Dans un mode de réalisation particulier des procédés selon l'invention, les éléments d'expression et de sécrétion du gène codant pour ladite protéine consistent dans le promoteur du gène sacB accompagné de la région sacR inductible par le saccharose. On utilisera de préférence la partie du locus sacRB de Bacillus subtilis qui contient 1) le locus sacB contenant le promoteur et la région de régulation du gène sacB. et 2) la région de sacB codant la séquence signal de la lévane-saccharase. En particulier, on a intégré le gène celA de clostridium thermocellum codant pour l'endoglucanase A. L'endoglucanase A a été choisie comme modèle de protéine pour tester l'efficacité du système. Cette protéine a été choisie compte tenu de sa taille et de son activité enzymatique qui sont facilement détectables. De- préférence, on utilisera une souche de Bacillus subtilis 1h présentant la mutation sacU favorisant la production de lévane-saccharase. On a observé que l'expression des gènes amplifiés et la sécrétion de la protéine est plus importante lorsque la culture arrive en phase stationnaire, ce jusqu'à 24 heures après induction de l'amplification génique à 37 C. Ainsi, le gène celA mis sous le contrôle de signaux d'expres- sion et de sécrétion du "système sacB" chez Bacillus subtilis aboutit à une hyperproduction de P'EGA après induction de l'expression par le saccharose et ceci à un niveau particulièrement élevé dans un contexte génétique sacUh. Après induction de l'amplification génique par réplication de pE194 et induction de l'expression de celA par le saccharose, le surnageant des cultures de Bacillus subtilis ainsi obtenu contenait le produit du gène celA, protéine dite endoglucanase A, cette protéine étant largement majoritaire dans le surnageant (plus de 90 % des protéines). Sa concentration a été évaluée à environ 10 mg/l par unité de densité optique, soit environ 10 fois supérieur au rendement obtenu lorsque le clonage de celA était effectué sur plasmide multicopie tel que pC194. L'analyse de la séquence NH2-terminale de la protéine a montré que celle-ci était correctement maturée lors de sa sécrétion. Enfin, un test d'activité enzymatique a permis de montrer que la protéine sécrétée était active. La présente invention a également pour objet les souches de Bacillus, en particulier de Bacillus subtilis obtenues par la mise en oeuvre du procédé de préparation de souche selon l'invention, en particulier la souche AP551 telle que représentée à la figure 9. D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre faits en référence à des figures. Figures La figure I représente le tableau I de l'exemple I dans lequel sont énumérés les souches et plasmides utilisés. La figure 2 représente le tableau présentant les résultats d'activité CMCase dans des surnageants de culture de différentes souches transformées de Bacillus subtilis (exemple 1). La figure 3 représenté la construction de pGJl. Les lignes en caractère gras représentent les fragments d'ADN de pBS430. Les rectangles hachurés représentent les régions codant le gène celA. Les rectangles blancs représentent les régions de pCTI05 flanquant le gène celA. Les flèches indiquent le sens de transcription des gènes. La figure 4 représente l'expression du gène celA du plasmide pGJ2 dans différentes souches de Bacillus subtilis. La courbe en caractère gras représente la croissance bactérienne. Les symboles correspondent à l'activité spécifique CMC-ase quand les souches hôtes étaient: o, sacU; , sacSh;1, sacSc;0, type sauvage. L'activité spécifique a été calculée comme unité d'activité CMC-ase par mg de protéine. La concentration de protéine a été correllée à l'absorbance de la culture cellulaire, une unité d'identité optique à 660 nm correspondant à.250 pg de protéine bactérienne par ml. La figure 5 représente la fusion de la région codant la séquence mature de l'EGA à la région codant la séquence signal de la Lvs par mutagénèse dirigée. DGF3 est l'amorce mutagénique. La séquence délétée de PGJ3 (figure 6) est présentée en épingle à cheveux. La figure 6 représente la construction de pG33. Les symboles utilisés sont comme dans la figure 1. DGF3 correspond à l'amorce mutagénique et SELI à l'amorce de sélection. La figure 7 représente l'électophorèse sur gel de polyacryla- mide SDS. Les aliquotes (25 pl) du surnageant de Bacillus subtilis QBI36 après culture en phase logarithmique, concentrés x 25 sur une membrane Amricon, ont été appliqués sur un gel de polyacrylamide 10 6. Sur la figure sont représentés des tracés de densitomètre de gel coloré au bleu de Coomassie: a, QB136; b, QB136 (pGJ2); c, des marqueurs de référence de poids moléculaire, phosphorylase b (94 kdal), la sérum albumine bovine (67 kdal), la lévane-saccharase (50 kdal), l'ovalbumine (43 kdal) etl'anhydrase carbonique (30 kdal). La figure 8 représente le tableau 3 de l'exemple 2 énumérant les souches et plasmides utilisés. a: des modifications génétiques dues à l'insertion de plasmides dans le chromosome de Bacillus subtilis sont les suivantes (1) ins suivi par un "plasmide" représente le plasmide inséré. (2) del ou dup suivi du "gène ou de la séquence" représentent des délétions ou duplications respectivement, résultant de l'insertion du plasmide. (3) pBR322A 81 représente des séquences de pBR322 présentes dans pHV33à8l. Le phénotype sacUh conduit à l'hyperproduction de Lvs. CMC représente la faculté d'une souche à hydrolyser la carboxyméthyl- cellulose. La figure 9 représente la construction des souches APO et AP551. Les symboles utilisés sont: M gène de résistance au chloramphénicol Cmr gène celA de fusion contenant le promoteur du gène de la lévane-saccharase de Bacillus subtilis et la région codant sa séquence signal fusionnée en phase de lecture avec la séquence codant la séquence mature de l'endoglucanase A de C. thermocellum séquences pBR322 de 3,9 kbp I plasmide pE194 portant le gène de résistance à l'éPrythro- mycine Emr, la flèche indique le sens de réplication. Les lignes représentent les séquences chromosomiques adjacen- tes: X et thy se réfèrent à un segment chromosomique de contenu génétique indéterminé, et le gène chromosomique thyB, respectivement. L'unité d'amplification (AU) est indiquée. Les sites de restriction PvulI et Sacl utilisés pour caractériser les structures amplifiées sont indiqués. La figure 10 représente l'amplification génique dans AP551 et AP551i. L'ADN chromosomique a été extrait de 4 clones sélectionnés sur pg/ml de chloramphénicol à partir de AP551i (lignes 4), et de 3 clones sélectionnés de la même façon à partir de AP551, puis cultivés une nuit à 37 C (lignes 5). Après restriction par PvulI et séparation par électro- phorèse, une bande fluorescente de 8.9 kb est révélée dans ces échantillons. Elle est absente dé l'ADN chromosomique de AP551 avant amplification (ligne 3) et correspond à la taille de l'U.A. (pHV551 linéarisé, ligne 2). Ligne: lambda HindilIl. La-figure 11 représente un SDS-PAGE suivi par une coloration pour l'activité cellulase. Des aliquots (20 pi) de surnageants de la phase h stationnaire de la souche sacU AP551 de Bacillus subtilis induite, concentrés 20 fois sur une membrane Amicon, ont été appliqués sur une gel de polyacrylamide 10 %. La colonne a, protéine à droite d'un jeu de marqueurs de masse moléculaire: phosphorylase b (94 kdali, sérum albumine bovine (67 kdal), lévane-saccharase (50 kdal), ovalbumine (43 kdal), anhydrase carbonique (30 kdal). Colonne b, activité selon Béguin52. La figure 12 représente les données concernant l'extrémité NH2-terminale de l'EGA. Les flèches indiquent les sites de clivage dans la 2 h protéine sécrétée dans Bacillus subtilis sacU AP551. Le pourcentage de chaque produit est indiqué. La figure 13 représente la relation cinétique entre l'amplifi- cation génique et l'expression. Les différents symboles utilisés sont densité optique O nombre de copies de l'unité d'amplification À activité spécifique CAT a activité spécifique CMC-ase. EXEMPLE I: Sécrétion inductible de cellulase de Clostridium thermocellum dans Bacillus subtilis sans amplification Un système hôte-vecteur pour la sécrétion inductible pendant la phase logarithmique de croissance dans Bacillus subtilis a été développé. Le promoteur du gène de la lévane-saccharase de Bacillus subtilis et la région codant sa séquence signal ont été utilisés. L'endoglucanase A de Clostridium thermocellum a été utilisée comme modèle de protéine pour tester l'efficacité du système. Une sécrétion inductible efficace d'endo- glucanase A a été observée en utilisant soit la séquence signal de la lévane-saccharase, soit sa propre séquence signal. Divers protéines hétérologues ont été sécrétées dans Bacillus subtilis et la plupart des vecteurs de sécrétion développés utilisait le système de sécrétion de l'alpha amylase 28 29, 31 bien que plus récemment des systèmes d'exportation de protéases aient été utilisés 14, 15, 29 36, 38 Toutefois, l'expression à partir de ces systèmes intervient pendant la phase stationnaire quand la plupart des enzymes sécrétés de Bacillus subtilis y compris les protéases majoritaires sont sécrétés. Ici, est décrit un vecteur de sécrétion basé sur le système de la lévanesaccharase de Bacillus subtilis qui est actif pendant la phase de croissance logarithmique. La lévane- saccharase est codée par le gène sacB et exprimée à partir d'un promoteur fort inductible par le saccharose qui est situé dans le locus sacR à proximité. Le contrôle de son expression a été abondamment étudié 2, 34 h h h et plusieurs mutants de régulation sont disponibles: sacQh, sacsh, sacUh 20, 21 L'endoglucanase A extracellulaire (EGA; l,4-bêta-D-glucan glucanohydrolase EC 3.2.1.4) de la bactérie thermophile anaérobie Clostridium thermocellum codée par le gène celA a été utilisée comme l modèle de protéine pour tester l'efficacité du système de sécrétion sacB dans Bacillus subtilis. Cette protéine a été choisie pour sa taille qui est approprié 23 et son activité enzymatique qui est facilement détectable directement sur boîte de Petri 10 En outre I'EGA a été caractérisée et purifiée 23,32 et la séquence d'ADN 5 de son gène et les sites d'inition de la transcription 7 sont connus. Le poids moléculaire calculé de la séquence - mature de l'EGA est de 49 125, mais sur gel de polyacrylamide SDS de surnageants de culture de C. thermocellum, il apparaît une bande de 56 000 qui est attribuée à une glycosylation 5. Ces facteurs facilitent l'utilisation de cette protéine comme modèle pour la sécrétion hétérologue dans Bacillus subtilis. - - On a montré que Bacillus subtilis peut sécréter l'EGA active enzymatiquement dans le milieu de culture après transformation avec des plasmides hybrides après induction par. le saccharose. On compare également l'efficacité des séquences signal de la lévane-saccharase et de I'EGA lorsqu'elles sont fusionnées avec le gène. de structure de l'EGA. I. Matériel et méthodes 1.1 Souches, phage, plasmides et milieux Les souches et plasmides utilisés sont énumérés dans le tableau I de la figure 1. Le phage M13mplS-am4 a été utilisé pour la mutagenèse dirigée. Pour la croissance d'E. coli, un milieu nutritif Luria a été utilisé supplémenté avec l'ampicilline (Ap) (100 pg/ml) du chloram- phénicol (Cm) (10 pg/ml), de la kanamycine (Km) (50 pg/ml) ou de la tétracycline (Tc) (10 pg/ml). Pour la croissance de Bacillus subtilis, un milieu nutritif de sporulation 30a été utilisé supplémenté avec Cm (5 pg/ml) ou Km (5 pg/ml) pour la sélection et 2 % (w/v) de saccharose pour l'induction du promoteur de sacB. La transformation de E. coli a été effectuée selon Cohen et al. 9 et la transformation de Bacillus subtilis a été effectuée tel que décrit par Anagnostopoulos et Spizizen2. 1.2 Activité endoglucanase A La carboxyméthylcellulose (CMC) (N C-4888 milieu visqueux, Sigma CO) a été utilisée comme substrat pour I'EGA. La détection de l'activité endoglucanase par le dosage au rouge Congo sur boîte de Petri, a été effectuée tel que décrit par Cornet et al. 10. Tout dosage d'enzyme a été effectué dans un tampon PC (50 mM K2HPO4, 12 mM d'acide citrique, pH 6,3) à 60 C. L'activité carboxyméthylcellulase (CMCase) a été mesurée selon Béguin et al.6 Une unité d'activité a été définie comme la quantité d'enzyme qui libérait 1 pmole d'équivalent glucose par minute. La détection d'activité cellulase dans des gels de polyacrylamide en utilisant le rouge Congo a été -4 effectuée selon Béguin. 1.3 Mutagénèse dirigé La procédure utilisée a été décrite par Carter et al.8 PGJ3 (figure 6) a été utilisé pour produire une matrice monobrin qui a été amorcée avec une amorce mutagénique DGF3 (5'AAAAGGCACACCT- GCGGCAAACGCTTGAGT 3') et une amorce de sélection SEL1 (5' AAGGAGTCTGTCCATCAC 3') utilisée pour reverser la mutation "ambre" présente dans un des gènes essentiels du phage M13 mpl8-am4. La transfection dans des cellules HB2154 qui sont déficientes dans leur système de réparation permet la récupération du simple brin possédant la mutation introduite par DGF3. Les 15 nucléotides 5' de l'amorce mutagénique DGF3 sont complémentaires des premiers 15 nucléotides de la séquence mature de EGA et les 15 nucléotides 3' sont complémentaires des derniers nucléotides de la séquence signal de la lévane-saccharase (Lvs) contenue dans pAEIúl11. Des mutants contenant la fusion en phase de lecture entre la séquence signal de la Lvs et la séquence nature de EGA ont été hybridés fortement à DGF3 après un lavage stringent. La mutation. correspondant à une délétion des 19 nucléotides de la séquence signal de EGA a été vérifiée par séquençage au didésoxynucléotide27 utilisant l'amorce synthétique DGF4 (5' TCGGCAATAGAAGTAGG 3') qui s'hybride en aval de la région délétée. 1.4 Construction de pAEú19, un plasmide pour la délétion de la région sacRB dans Bacillus subtilis La région sacRB a été délétée par recombinaison. Le plasmide pBS4131 contient la région sacRB sur des fragments Hindilll contigus. Le plasmide a été linéarisé avec Clal qui coupe dans le gène sacB et a été traité avec l'exonucléase Bal31 pour déléter la région sacRB complète. Le fragment a ensuite été ligaturé au gène aphA3 de Streptococcus faecalis pour donner pAEI 19 qui n'est pas réplicatif dans Bacillus subtilis. Le gène aphA3 utilisé est inclus dans un fragment ClaI de 1,5 kbp de pAT21 2. Résultats 2.1 Expression du gène celA dans Bacillus subtilis sous le contrôle de la région sacR Une construction pour l'expression de l'EGA a été faite en procédant à une ligature à trois fragments entre (a) le vecteur pUC8 coupé avec BamHl et Hindill (b) BamHI-RsaI de 440 bp de la région sacR contenant le promoteur de sacB et sa région -de régulation issue de pBS4303'7 et'(c) un fragment Dral-HindIII de 2,2 kbp du plasmide pCT10510 contenant le site de fixation de ribosomes, la région codant EGA (séquence signal et séquence mature5) et le site de terminaison-du gène7 (figure 3). La construction recherchée pGJ31 a été isolée sous forme d'un transformant Apr de E. coli présentant le phénotype CMC dans le test sur boîte de Petri1. Pour tester la sécrétion de l'EGA dans Bacillus subtilis, pC19416 un plasmide de 2,91 bp ayant une origine de réplication fonctionnelle de Bacillus subtilis et un gène de résistance à un antibiotique (Cm) a été ligaturé à pGJI au site HindIll. Le plasmide résultant pGJ2 a été introduit c dans différentes souches de Bacillus subtilis: 168 (type sauvage), sacS, h h C r sacS et sacU (figure 1). Les transformants Cm de Bacillus subtilis portant le gène celA de C. thermocellum sur le plasmide multicopie pC194 ont été identifiés par des zones élargies de l'hydrolyse de CMC après induction' par le saccharose. La taille des halos toutefois varie, dépendant de la souche hôte. Les dosages de l'endoglucanase des surnageants de culture liquides ont montré une sécrétion d'EGA inductible par le saccharose (figure 4,-figure 2). Ces résultats indiquent que la régulation de l'expression du gène celA est la même que celle du gènre sacB. Aucune expression du gène celA n'a été détectée en l'absence de saccharose dans les souches inductibles. Le plus haut niveau de sécrétion de EGA a été obtenu avec le mutant sacUh qui hypersécrétent aussi la lévane-saccharase en produisant environ 100 fois plus de cette enzyme que des cellules du type sauvage. La sécrétion d'EGA dans une souche sacUh est seulement environ 10 fois supérieure que dans une souche sauvage hébergeant la même construction. Cependant l'expression du gène provient d'un plasmide multicopie. Or l'expression dans une souche sacUh de sacB sur un plasmide multicopie est seulement 5 à 10 fois plus forte que le niveau obtenu dans un mutant sacU*. Bacillus subtilis possède une activité bêta-1,4- endoglucanase endogène25. Toutefois, dans une souche de Bacillus subtilis sacUh (pGJ2) qui présente une activité endogène plus importante que la souche de type sauvage, cette activité représente seulement environ 2 % de l'activié CMC-ase. Les dosage d'endoglucanase ont montré que les extraits cellulaires de souche sacUh (pGJ2) contiennent environ 20 % de l'activité EGA totale indiquant que la plupart de l'EGA était sécrétée dans le milieu (80 o) 2.2 Sécrétion de l'EGA par la séquence signal de la lévane- saccharase et la région de régulation sacR La- région de l'ADN codant la séquence signal de la lévane-saccharase et portant sacR a été fusionnée à la région codant la séquence mature de l'EGA par mutagénèse dirigée dans le vecteur M138 (figure 5). Le vecteur Ml3mpl8-am4 qui a une mutation "ambre" dans un gène essentiel du phage a été coupé avec BamHI et HindlII et ligaturé à (a) 1l un fragment BamHI-NaeI de 0,55 kbp du plasmide pAEIOIl portant sacR et la séquence signal de la lévanesaccharase (b) un fragment Nael-HindII de 2,14 kbp du plasmide pCTIO510 contenant l'ADN codant la séquence mature EGA ef 19 nucléotides de la séquence signal de EGA (figure 6). Le plasmide résultant a été dénommé pGJ3. Les 19 nucléotides appartenant. la séquence signal de EGA ont été délétés de pG33 et des constructions contenant la séquence recherchée ont été dénommés pGJ4. Toutefois les plasmides contenaient une insertion d'environ 0,9 kbp dans M13mpl8 à la place des 2,7 kbp attendus, correspondant à une délétion d'environ 1,8 kbp dans la région 3' de l'insert. Ceci a été vérifié par séquençage avec l'amorce universelle. Le gène de fusion complet a été reconstruit. Trois fragments (a) 0,58 kbp du fragment BamHI-AvalI de pGJ4 contenant la fusion en phase avec la séquence signal de la Lvs et de la séquence mature de EGA (b) le fragment Avall-Hindill partiel de 2,09 kbp de pCTI05 (figure 3) et (c) le vecteur pUC8 coupé avec BamHI-HindIII, ont été ligaturés ensemble. Le plasmide résultant tContenant la fusion sacB-celA a été dénommé pG35. Pour tester la sécrétion par Bacillus subtilis de EGA par cette fusion, le plasmide pCl94 a été ligaturé au site HindlII de pGJ5. Le plasmide résultant pGJ6 a été introduit dans Bacillus subtilis sacUh (QB 136). Tous les transformants Cmr testés possédaient un phénotype CMC+ inductible par le saccharose. Le surnageant de I clone a été dosé quant à son activité sur CMC après induction par le saccharose, et le niveau d'activité dans le surnageant était le même que celui de QB 136 (pGJ2). Ces résultats indiquent que les séquences signal de la Lvs et I'EGA sont également efficaces pour la sécrétion dans Bacillus subtilis. 2.3 Poids moléculaire et stabilité de l'EGA sécrétée par Bacillus subtilis Lanalyse des surnageants de Bacillus subtilis QB 136 induit par le saccharose portant pGJ2 ou pGJ6 par gel de polyacrylamide SDS a révélé une bande de protéine avec une masse moléculaire de 46 000 qui n'était pas détectée dans les contrôles (figure 7). Cette bande possède une activité CMC-ase par transfert sur gel d'agarose contenant de la CMC4. La masse moléculaire de la protéine correspondant à cette bande est compatible avec la masse moléculaire calculée de la séquence mature EGA, 49 125, tel que l'on peut la déduire de la séquence nucléotidique5. Les souches QB136 et QB136(pG32) ont été induites avec du saccharose et des surnageants ont été dosés pour leur activité Lvs. Les souches non transformées produisent trois fois plus d'activité Lvs que les souches portant pG32. Ce résultat est en accord avec les courbes de densitomètre des gels de polyacrylamide au bleu de Coomassie (figure 7) et semble indiquer une compétition entre le gène sacB et le gène hétérologue sacB/celA pour l'expression ou la sécrétion (ou les deux). 2.4 Expression du gène de fusion sacB-celA dans un contexte délété en sacRB Pour tester si l'expression de sacB à partir du gène chromosomique interfère avec une surproduction de celA, la région sacRB a été délétée du chromosome des souches hôtes. Pour ce faire, les souches- hôtes ont été transformées avec pAE1 19 (voir matériels et méthodes) et des tranformants Kmr ont été sélectionnés. Dans plus de 98% des transfor- mants, la région sacRB a été remplacée par aphA3 par un double crossing over. Le plasmide pG32 a été introduit dans Bacillus subtilis QB671 dans lequel la région sacRB avait été délétée tel que décrit ci-dessus. QB671 est isogénique avec QB90720 excepté qu'elle est sacA+ (le saccharose inhibe la croissance dans les souches sacA--sacB-). Les souches QB671 (pGJ2) et QB671. sacRB (pGJ2) ont été mises en croissance dans des milieux appropriés et induites avec le saccharose. Les activités CM.C-ase des surnageant ont été dosées et il n'a pas été possible des les distinguer. 2.5 Conclusion La protéine hétérologue EGA de C. thermocellum a été exprimée et sécrétée à partir de Bacillus subtilis en utilisant le promoteur de sacB après induction par le saccharose. La sécrétion de EGA intervient durant la phase de croissance logarithmique et s'accumule dans le milieu. la concentration en EGA est plus grande durant la phase stationnaire indiquant que la protéine est sécrétée sous une forme stable. Une sécrétion a été obtenue en utilisant soit la séquence signal de Lvs, soit sa propre séquence signal. L'analyse de ces deux séquences signal n'a montré aucune différence significative par rapport à des séquences signal typiques de bactéries gram positives. L'expression de l'enzyme dans différents environnements génétiques de Bacillus subtilis (sacSc, sacSh, sacUh) a montré que sa régulation était comme celle du gène sacB et on retrouve une forte activité enzymatique dans le surnageant de culture d'une souche sacUh de Bacillus subtilis. La taille de la protéine (environ 46 kilodaltons) est compatible avec le poids moléculaire déduit de la séquence de la protéine mature. Le niveau de sécrétion de Lvs diminue quand le gène celA est exprimé à partir du promoteur sacB sur vecteur multicopie pC194 semblant indiquer une compétition entre le système homologue et le système hétérologue pour l'expression ou la sécrétion (ou les deux). Toutefois, dans une souche 4_sacRB, le niveau de EGA sécrété n'est pas augmenté. On peut présumer en conséquence que la présence d'une unique copie du gène sacB sur le chromosome n'entre pas en compétition de manière significative avec l'expression de gène à partir du promoteur de sacB sur un plasmide multicopie. L'activité EGA dans le surnageant d'une souche sacUh était de 0,8 U/ml. Comme l'activité spécifique d'EGA purifiée est de 140 U/mg24 ceci correspond à une concentration de protéine d'environ I mg/l/unité DO0. Cette valeur se compare avantageusement avec celle obtenue pour 660' la production de EGA dans C. thermocellum et E. coli0. EXEMPLE 2: Hypersécrétion d'une cellulase de Clostridium thermocellum dans Bacillus subtilis par induction de l'amplification de l'ADN chromosomique 1. Résumé Le-fragment d'ADN contenant le promoteur du gène de la lévane-saccharase (Lvs) de Bacillus subtilis et la région codant sa séquence signal, fusionné en phase avec la séquence codant la séquence mature de l'endoglucanase A de Clostridium thermocellum a été introduit et amplifié à un site spécifique du chromosome de Bacillus subtilis. L'amplification d'ADN induite par la réplication du plasmide pE194 thermosensible a permis d'augmenter le nombre de copies du gène jusqu'à 250 copies par chromosome. Cette amplification d'ADN a conduit à la synthèse et à la sécrétion d'endoglucanase A active dans Bacillus subtilis. La protéine hétérologue sécrétée représente la protéine majoritaire du surnageant de culture de la souche Bacillus subtilis sacUh. La séquence NH2-terminale a révélée trois sites de clivage différents dans le voisinage de la séquence de reconnaissance de la signal peptidase. Il apparaît que le nombre de copies du gène n'est pas un facteur limitant pour l'expression de gènes hétérologues. On a décrit à l'exemple I l'expression inductible par le saccharose du gène celA de Clostridium thermocellum dans Bacillus subtilis sur le vecteur multicopie pC194 en utilisant les signaux de régulation et de sécrétion de la lévanesaccharase de Bacillus subtilis. Cette expression est régulée par au moins trois loci: sacQ, sacS et sacU21. Le produit du gène celA, l'endoglucanase A a été sécrété et une haute activité enzymatique a été retrouvée dans le surnageant de culture d'une souche de Bacillus subtilis sacUh transformée et induite par le saccharose (exemple 1). Ces constructions ont révélé une instabilité structurale importante qui peut être due à l'intermédiaire simple brin de pC194 généré durant sa réplication dans Bacillus subtilis 40. Cette instabilité du plasmide complique les développements biotechnologiques et peut être évitée en introduisant les constructions dans le chromosome o il a été montré que la recombinaison est 1000 fois moins fréquente que dans des plasmidesl En outre, l'amplification d'un gène hétérologue dans le chromosome vise à augmenter l'expression. On sait qu'une construction dans le chromosome de Bacillus subtilis consistant en un marqueur génétique encadré directement par des séquences dupliquées, peut conduire à une amplification du marqueur et d'une des ces séquences dupliquées (constituant ainsi une unité d'amplification) après application d'une pression de sélection43 44. Un maximum de 20 à 50 copies d'unités d'amplification par chromosome peut être obtenu en utilisant une sélection avec un marqueur antibiotique. L'amplification de gène chromosomique dans Bacillus subtilis peut être stimulée par induction de la réplication du plasmide pE194 adjacent qui contient une origine de réplication fonction- nelle dans Bacillus subtilis naturellement thermosensible. Cette amplifica-' tion intervient sans pression de sélection et donne un nombre de copies d'unités d'amplification jusqu'à 250.copies par chromosome. Selon l'invention, un fragment de 2,7 kbp d'ADN du plasmide pGJ5 (exemple 1) a été inséré dans l'unité d'amplification introduite dans le chromosome de Bacillus subtilis sacUh (souche déposée à la CNCM n 1-744). Ce fragment d'ADN contient le promoteur du gène de la lévane-saccharase Bacillus subtilis (sacB) et la région codant sa séquence signal, fusionné en phase à.la séquence codant la séquence mature de l'EGA de C. thermocellum. On se réfère à ce fragment d'ADN ci-après comme étant le gène de fusion celA. On a observé qu'une hypersécrétion de l'EGA était obtenue avec de hauts niveaux d'amplification génique. L'EGA constitue dans ce cas la protéine majoritaire sécrétée par Bacillus subtilis sacUh. L'analyse de la partie NH2-terminale de l'EGA sécrétée a révélé trois sites de clivage différents au voisinage de la séquence de reconnais- sance de la signal-peptidase. Les cinétiques d!amplification ont été suivies en déterminant le nombre de copies de l'unité d'amplification. L'activité enzymatique des protéines codées par la structure amplifiée a révélé un délai entre le début de l'amplification des gènes et leur expression. 2. Amplification dû gène celA Deux stratégies d'amplification de I'ADN chromosomique ont été développées pour augmenter le nombre de copies du gène dans Bacillus subtilis comme alternative à des vecteurs multicopies qui sont souvent instables. 2.1 Amplification du gène dans la souche AP551i Cette souche contient le gène de résistance au chloram- phénicol (Cmr)- et le gène de fusion celA encadrés par des copies de pBR322 (voir ci-après 6. le protocole expérimental) (figure 9). Dans cette souche, l'origine de réplication de.pEl94 est inactive, comme l'indique le "i" suivant le label de la souche. La structure est intégrée dans la région thyB du chromosome de Bacillus subtilis sacUh 5. Des duplications de ce type produisent des structures amplifiées stables mais à faible friéquence. Les clones amplifiés peuvent être sélectionnés44. Des cellules de AP551i ont été étalées sur du chloramphénicol (50 pg/ml) pour sélectionner les cellules amplifiées et les cellules résistantes ont été isolées (I pour 105). L'ADN chromosomique de 4 clones sélectionnés a été analysé et on a constaté qu'il contenait 20 à 30 copies de l'unité d'amplificatiori tel que visualisé par électrophorèse sur gel après hydrolyse avec PvuI1 (figure 10). Cette enzyme de restriction clive une seule fois l'unité d'amplification conduisant à une bande fortement fluorescente de 8,9 kbp qui se distingue des autres bandes faiblement fluorescentes dans chaque ADN amplifié et qui est absente dans la souche parentale. L'expression du gène celA amplifié a été dosée après induction par le saccharose. L'intensité de la bande d'amplification (voir protocole expérimentale) (figure 10) des clones testés a été correlée avec les tailles de halo résultant de l'hydrolyse de la CMC (voir protocole expérimental) autour des colonies visualisées par le test au rouge Congo sur boîte de Petri. La stabilité des clones a été analysée dans le milieu liquide en présence de saccharose avec et sans pression de sélection (Cm). Les activités CMC-ase des surnageants ont été dosées et étaient indistinctes pour chaque isolat en présence ou en l'absence de Cm, confirmant la stabilité de l'amplification. L'activité EGA dans le surnageant des clones présentant le plus grand nombre de copies de l'unité d'amplification était de 0,8 U/ml. 2.2 Amplification de gène dans la souche AP551 Cette souche est isogénique avec la souche AP551i excepté qu'elle contient une copie du plasmide pE194 fonctionnelle dans le chromosome46. L'orientation de pE194 dans AP551 est telle que sa réplication qui est unidirectionnelle47, progresse vers la duplication (figure 9). Quand la réplication de pE194 est active à 37 C, on observe que - l'amplification de l'ADN de l'unité d'amplification est induite. Pour augmenter le nombre de copies de gènes celA, l'amplification de la souche AP551 a été effectuée en deux étapes. Dans la première étape, on a isolé des souches AP551 contenant environ 20 copies de l'unité d'amplification obtenue par sélection comme décrit ci-dessus pour AP55Ii. Cette étape a été effectuée à 51 C, température à laquelle le réplicon pE194 est inactif. Dans la seconde étape, ces isolats ont été incubés dans le milieu liquide à 37 C sans antibiotique en présence de saccharose. A cette température, le réplicon pE194 est actif et une amplification de l'ADN est induite. Une moyenne de 250 copies de l'unité d'amplification par chromosome est observée après 25 heures. Ceci est visualisé par électrophorèse sur gel de l'ADN chromosomique hydrolysé avec PvuII, révélant une bande fluorescente particulièrement forte de la taille attendue de l'unité d'amplification (figure 10). L'activité EGA des surnageants a été dosée et était d'environ 3,6 U/ml pour tous les clones testés. 3. Analyse de 1'EGA sécrétée L'analyse des surnageants de culture de souches de Bacillus subtilis AP551 induite par. le saccharose, par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (PAGE) a révélé une bande de protéine majoritaire avec une masse molécuJaire estimée à 46 000 (figure 11). La masse moléculaire de cette bande est compatible avec celle calculée de la séquence mature de EGA qui est de 49 125 telle que déduite à partir de la séquence nucléotidique5. Cette bande est apparue comme etant celle de l'EGA par séquençage de l'extrémité NH2-terminale après SDS-PAGE et transfert comme décrit par Matsudaira48. Le transfert du gel de polyacrylamide sur un gel d'agarose contenant de la CMC a montré que la protéine est dotée d'activité CMC-ase (figure 11). Les données'concernant la séquence NH2-terminale (figure 12) indiquent qu'il y a plusieurs sites de clivage aux extrémités NH2-terminale de la protéine mature et seulement 30 % du produit est clivé au site exact prevu. Troissites de clivage du peptide signal majoritaires ont été détectés, et dans tous les cas le site de clivage était à l'extrémité COOH-terminal d'un résidu alanine et dans le voisinage du site de reconnaissance de la signal peptidase. Les deux derniers résidus phénylalanine-asparagine de la séquence signal de lévane-saccharase sont présents pour 45 % du produit. Dans 25 % du produit, un résidu était manquant en comparaison à la séquence de l'EGA mature (figure 12). L'activité CMC-ase des surnageants de culture a été correlée avec l'activité spécifique de EGA et l'analyse des surnageants par SDS-PAGE semble indiquer que les trois formes de la protéine sont actives. Mime dans un mutant sacUh qui est connu pour surproduire des protéases45 il n'y a pas eu de perte d'activité- CMC-ase observée pendant une incubation de 25 heures des cellules eri croissance jusqu'en phase stationnaire. Ceci indique que I'EGA était résistante à la dégradation protéolytique. L'EGA est donc sécrétée dans le milieu de culture sous une forme active et stable. Dans la souche AP551, le gène de structure de la lévane- saccharase sacB est présent. Le surnageant de culture de AP551 induit par saccharose a été dosé par son activité de lévane-saccharase endogène avant et après amplification. Les isolats amplifiés produisent au moins 20 fois moins d'activité lévane-saccharase que les isolats non amplifiés. Ceci confirme l'analyse SDS-PAGE qui montre que la lévane-saccharase est la protéine sécrétée majoritaire dans les souches contrôles (résultat non présenté) mais n'est pas détectée dans la souche AP551 amplifiée (figure Il 1). Ceci traduit un effet de compétition entre le gène sacB et le gène de fusion celA recombinant pour son expression ou sa sécrétion (ou les deux). 4. Relation cinétique entre l'amplification du gène et l'expression L'expression de deux gènes, le gène de fusion celA et le gène Cmr, tous deux contenus dans l'unité d'amplification, a été analysée. Le gène Cmr code pour la chloramphénicol acétyltransférase (CAT) de pC194 i5 qui est intracellulaire 9. On a fait croître des cellules AP551 dans un milieu nutritif supplémenté en saccharose sans antibiotique pendant 25 heures à 37 C, température à laquelle l'amplification est induite. Les aliquotes ont été retirés après 0, 2, 3, 4, 5, 17 et 25 heures de croissance. Le contenu en- ADN, l'activité CAT dans les extraits cellulaires et l'activité EGA dans les surnageants ont été analysés. Les résultats sont présentés figure 13. Le nombre de copies de l'unité d'amplification a augmenté rapidement de 25 à 200 copies par chromosome pendant les cinq premières heures de croissance à 37 C. Ensuite, le taux d'amplification a ralenti et une moyenne de 250 copies par chromosome a été atteinte après 25 heures. L'activité CAT est restée constante pendant les premières heures de croissance et a ensuite augmenté correspondant à une augmentation totale de l'activité CAT d'un facteur 50. Un décalage de quelques heures se produit aussi avant l'augmentation de l'activité EGA. L'augmentation totale en activité EGA a été de 10 fois. 5. Discussion Nous avons étudié l'expression du gène de fusion celA après amplification dans le chromosome de Bacillus subtilis. Le gène de fusion celA et le gène marqueur Cmr ont été introduits dans la région thyB du chromosome de Bacillus subtilis sacUh encadré par une séquence dupliquée de 3,9 kbp. L'amplification a été réalisée dans deux souches isogéniques AP551 et AP551i différant entre elles par la présence ou l'absence respectivement d'une origine de réplication conditionnelle, dans le voisinage de la duplication. Dans les deux cas, une amplification d'un facteur 20 des gènes a été obtenue par sélection des clones résistants à pg/ml de Cm sur des boîtes de Petri. Dans la souche AP551, l'activation de l'origine de réplication pE194 a permis une amplification additionnelle passant de 20 à 250 copies des gènes par chromosome sans pression de sélection. La structure amplifiée représente environ 50 % du chromosome (l'unité d'amplification et le chromosome ayant respectivement 9 kbp et 5000 kbp). De tels niveaux d'ADN amplifiés par cellules n'ont jamais été obtenus dans Bacillus subtilis auparavant et peuvent être comparés au niveau de l'amplification observée dans l'espèce Streptomyces50 Les plus hauts niveaux d'amplification de gène conduisent aux plus hauts niveaux d'expression de EGA sécrétée. Dans le surnageant des isolats amplifiés, l'activité CMC-ase de l'enzyme peut être correlée à son activité spécifique2 (140 U/mg) et correspondait à une concentration de protéine d'environ 10 mg/l/unité DO660, ce qui est 10 fois plus que les taux obtenus précédemment avec la même construction génique sur un vecteur plasmidique multicopies (voir exemple 1). L'analyse de la séquence NH2-terminale de EGA a révélé trois sites de clivage, et le clivage exact a lieu dans 30 % des cas. Toutes les autres formes correspondent à des hydrolyses au niveau d'alanine présentes au voisinage de la zone declivage (figure 12). Les conséquences de l'amplification de l'ADN induites par la replication de pE194 sur l'expression du gène de fusion celA et du gène marqueur Cmr ont eté analysées. L'activité des deux enzymes augmente lentement pendant les premiers stades d'amplification, ce qui correspond à la croissance logarithmique. Toutefois, avec l'entrée en phase stationnaire et le ralentissement de l'amplification, les niveaux d'expression des deux gènes ont augmenté fortement. Il apparaît donc y avoir un temps de retard entre l'augmentation du nombre de copies de gènes et l'augmentation de l'expression. Il est intéressant de noter que l'amplification d'ADN intervient activement pendant la phase de croissance exponentielle tandis que l'expression efficace des gènes amplifiés intervient durant la phase stationnaire. Bien qu'il soit difficile de comparer le niveau d'expression des deux gènes exprimés à partir de différents promoteurs et soumis à différents mécanismes de régulation, les nombres de copies de gènes et les niveaux d'expression ne semblent pas être proportionnels. En outre, l'augmentation de l'activité exprimée à partir des deux gènes n'est pas semblable. L'activité CAT augmente d'un facteur 50 en 25 heures, tandis que l'activité EGA augmente seulement d'un facteur 10, suggérant que d'autres facteurs limitants peuvent moduler l'efficacité du procédé. En conclusion, il apparaît qu'une amplification d'ADN selon l'invention est une bonne alternative au vecteur d'expression multicopie classique, spécialement dans Bacillus subtilis o ceux-ci sont souvent instables. Les résultats présentés ci-dessus indiquent qu'il est possible d'augmenter le nombre de copies de gènes hétérologues dans Bacillus subtilis à de très hauts niveaux et que la machinerie cellulaire est capable de transcrire et traduire cet ADN additionnel. Ce système permet donc l'amplification de gènes hétérologues à des niveaux o le nombre de copies de gènes n'est pas un facteur limitant pour l'expression de ces gènes. 6. Le protocole expérimental Plasmides et souches bactériennes Ces plasmides et souches sont énumérés dans le tableau 3 (figure 8). Leurs constructions sont décrites ci-après. 6.1 Transformation et milieux Pour la croissance d'Escherichia coli un milieu nutritif Luria22 supplémenté avec de l'ampicilline (Ap) (100 pg/ml) ou du chloramphénicol (Cm) (10 pg/ml) a été utilisé. Pour la croissance de Bacillus subtilis, un milieu nutritif de sporulation30 a été utilisé, supplémenté avec du Cm (5-50 pg/ml) ou de l'érythromycine (0,3 pg/ml) comme approprié. Le saccharose a été ajouté aux milieux pour l'induction du promoteur sacB dans Bacillus subtilis à une concentration finale de 2 %6 (w/v). La transformation de E. coli a été effectuée selon Cohen et al9 et la transformation de Bacillus subtilis a été effectuée tel que décrit par Anagnostopoulos et Spizisen2. 6.2 Dosages d'enzyme La carboxyméthylcellulose (CMC) (N C-4888 viscosité moyenne, sigma Co) a été utilisée comme substrat pour le dosage de l'activité EGA. -La détection d'activité endoglucanase par le test au rouge Congo sur boîtes de Petri a été effectuée tel que décrit par Cornet et al0. Le dosage quantitatif de EGA a été effectué dans un tampon PC (50 mM K2HPO4, 12 mM acide citrique, pH 6,3) à 60 C. L'activité carboxyméthyl- cellulase (CMC-ase) a été mesurée selon Béguin et al6. Une unité d'activité est définie comme la quantité d'enzyme qui libère I pmole d'équivalent de glucose par minute. L'activité spécifique CMC-ase a été exprimée en unité par mg de protéine cellulaire totale. La détection de l'activité cellulase dans des gels de polyacrylamide par réplique et coloration au rouge Congo a été effectuée tel que décrit par Béguin. L'activité chlorarnphénicol acétyltransférase (CAT) a été mesurée par dosage spectrophotométrique tel que décrit par Shaw49. L'activité spécifique CAT a été exprimée en nmoles par minute par mg de protéine. 6.3 Constructions des souches La souche AP551 a été construite en deux étapes, selon le schéma figure 9. 6.3.1 Construction de la souche APO (figure 9) Le plasmide pHV1220 47 est composé de - pE194cop6, plasmide de Bacillus subtilis conférant la résistance à l'érythromycine (Emr). Ce plasmide est thermosensible, sa réplication est inactivée à 51 C. Il est représenté par un rectangle noir sur la figure, la flèche indiquant le sens de la réplication, - pBR322, dont aucune séquence n'est connue pour s'exprimer chez Bacillus subtilis. Il est représenté par une large flèche blanche sur la figure. - thv et X, deux fragments proches, mais non adjacents du chromosome de Bacillus subtilis, clonés dans la même orientation, l'un par rapport à l'autre, que sur le chromosome. Thy porte le gène thyB situé à 195 - sur la I15 carte génétique. Thy et X sont représentés par une ligne noire sur la f igure. Après transformation des cellules compétentes de SB202 par pHVI225, les transformants ont été sélectionnés pour la résistance à l'érythromycine, à 51 C. A cette température en effet, pHVI220 n'étant pas réplicatif, il se comporte comme un vecteur intégratif dans Bacillus subtilis : ce vecteur est capable de recombiner avec le chromosome bactérien dans les régions homologues, thv et X. Lorsque le vecteur s'intègre par double crossing over, entre les séquences "thv" et "X" respectivement, il y a délétion de la partie du chromosome comprise entre les deux loci, et en particulier du gène ilvA. A cette étape de la construction, seuls les transformants issus d'une intégration par double crossing over (détectés par leur phénotype Ilv, 50 % du total) ont été retenus. La souche ainsi contruite a été nommée AP0. 6.3.2 Construction de la souche AP551 (figure 9) pHV551 est un plasmide hybride composé de: - pBR322, - le gène de résistance au chloramphénicol de pC194 (Cmr), - le gène de dégradation de la cellulose celA cloné sous contrôle du promoteur sacB, inductible par le saccharose. Sa construction a été *décrite dans l'exemple 1. Au cours de la transformation de AP0 par pHV551, I'ADN h chromosomique d'une souche sacU a été ajouté. Les transformants ont été sélectionnés pour la résistance au chloramphénicol, à 51 C. Parmi les h transformants, ceux ayant acquis par congression la mutation sacU ont été retenus. Cette mutation permet un niveau d'activation du promoteur sacB supérieur à l'allèle sauvage. Le plasmide pHV551 a été obtenu par ligature de pHV33_813 avec le fragment EcoRI-Hindil de 2,7 kbp de pGJ5 (exemple 1). Le plasmide pHV33_ 81 est constitué par une partie de pBR322 et le gène de résistance au chloramphénicol de pC194 16. Le pHV33_81 se réplique dans Escherichia colimais pas dans Bacillus subtilis. Le fragment EcoRI-Hindll de pGJ5 contient le promoteur et la région codant la séquence signal de la lévanesaccharase de Bacillus subtilis, fusionnée en phase à la séquence codant la séquence mature de l'EGA de C. thermocellum. Le plasmide résultant appelé pHV551 a été intégré dans le chromosome de Bacillus subtilis souche APO et a généré la souche AP551 (figure 9) par transformation et sélection des transformants Cm. pHV551 n'est pas réplicatif dans Bacillus subtilis. Il se comporte donc en vecteur intégratif, capable de recombiner avec le chromosome bactérien de AP0 dans la région d'homologïe, pBR322. Lorsque. le plasmide s'intègre, par simple crossing over, il y a duplication de sa région d'homologie, pBR322. 30. La souche résultante AP551 comporte donc, dans la région thyB de son chromosome: - le plasmide pE194 cop6, dont la réplication est inactivée à 51 C, et fonctionnelle à 37 C, - les gènes celA et Cmr encadrés par une duplication de 3,9 kb des séquences de pBR322. Cette duplication délimite l'unité d'amplification (A.U.), composée d'une des séquences répétées et des deux marqueurs celA et Cmr. C'est cette unité d'amplification qui est amplifiée jusqu'à 250 fois dans les expériences décrites précédemment. Plus précisément, la souche AP551 porte dans la région thvB de son chromosome une structure comprenant: (a) le plasmide pE194 cop-6 (ciaprès pE194) qui est naturellement thermosensible pour la réplication46; (b) une séquence dupliquée de 3,9 kbp de pBR322 (pBR322 ne se réplique pas dans Bacillus subtilis5#; (c) un segment de 2,3 kbp contenant le gène de résistance au Cm et (d) un segment de 2,7 kbp contenant le gène de fusion celA. Les deux séquences de (b) sont situées de part et d'autre de (c) et (d) et définissent l'unité d'amplification, un élément de 8,9 kbp composé d'un segment de pBR322 et des gènes Cmr et gène de fusion celA. L'orientation de pE194 dans les cellules AP551 est telle que la réplication initiée à son origine progresse en direction de la réplication47. La souche AP551i a été construite selon la même procédure: cette souche est isogénique avec la souchç AP551 excepté le fait que l'origine de réplication pE194 est inactivée suite à une délétion de 200 bp dans sa region 7. En outre, la mutation sacUh a été introduite dans les souches AP551 et AP551i par congression avec l'ADN chromosomique de la souche sacUh QB 136. Les mutants sacUh ont été isolés par criblage sur des milieux révélant une surproduction de protéase et lévane, caractéristique des mutants sacUh 5. La construction correcte des souches AP551 et AP551i a été vérifiée par analyse selon Southern de l'ADN chromosomique en utilisant pHV338l comme sonde. Des études ont été effectuées avec des clones portant avant amplification seulement une copie de pHV551. 6.4 Analyse d'ADN L'ADN chromosomique a été extrait des lysats cellulaires avec du phénol-chloroforme suivi d'une précipitation avec de l'isopropanol et un traitement à la RNase des acides nucléiques. La détection d'ADN amplifié a été effectuée par analyse de restriction de l'ADN chromosomique. L'hydrolyse avec PvulI fournit un fragment de 8,9 kbp correspondant à l'unité d'amplification qui, quand le niveau d'amnplication est élevé, peut être distinguée sous forme d'une bande séparée sur gel d'agarose (figure 10). Le niveau d'amplification de l'ADN a été mesuré par "dot blots". Pour de hauts niveaux d'amplification (plus de 20 copies par chromosome), des échantillons d'ADN ont été dilués 10 à 100 fois dans de I'ADN chromosomique du type sauvage avant l'analyse. pC l94 qui est homologue en partie de l'unité d'amplification, a été utilisé comme sonde et le gène sacA55 a été utilisé comme sonde chromosomique de référence, correspondant à une copie par chromosome du gène de la saccharase de Bacillus subtilis. 6.5 Abréviation Le-gène celA est le gène de structure pour l'endoglucanase préalablement purifiée à partir de C. thermocellum NCIBI068223 qui est désignée endoglucanase A. La carboxyméthycellulose (CMC) est un substrat spécifique des endoglucanases. L'activité endoglucanase A est assimilée à l'activité carboxyméthylcellulase (CMC-ase). LITTERATURE CITEE I. Amory, A., F. Kunst, E. Aubert, A. Klier, and G. Rapoport. 1987. Characterization of the sacQ genes from Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis. 3. Bacteriol. 169:324-333. 2. Anagnostopoulos, C., and J. Spizizen. 1961. Requirements for tranforma- tion in Bacillus subtilis. 3. Bacteriol. 81:741-746. 3. Aymerich, S., G. Gonzy-Tréboul, and M. Steinmetz. 1986. 5'-Non-coding region sacR is the target of all identified regulation affecting the levansucrase gene in Bacillus subtilis. 3. Bacteriol. 166:993-998. 4. Béguin, P. 1983. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gel using Congo red stained agar replicas. Anal. Biochem. 131:333-336. 5. Béguin, P.,P. Cornet, and J.-P.- Aubert. 1985. Sequence of a cellulase gene of the thermophilic bacterium Clostridium thermocellum. 3. 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Procédé de production d'une protéine déterminée caracté- risé en ce qu'à partir d'une souche du genre Bacillus dans le chromosome de laquelle ont été intégrés dans un gène non essentiel de ladite souche: a) une unité amplifiable comportant une séquence d'ADN - déterminée M encadrée par deux séquences d'ADN identiques D orientées en sens direct, la séquence M comprenant le gène de structure de ladite protéine mis sous le contrôle d'éléments d'expression et sécrétion inductibles chez Bacillus de ladite protéine et facultative- ment un gène sélectionnable, et b) un système de réplicatlon ou réplicon inductible ou conditionnel également intégré dans ledit gène non essentiel du chromosome de la souche en amont de l'unité amplifiable; I. on sélectionne éventuellement les clones amplifiés obtenus par culture sur un milieu de sélection correspondant au gène sélectionnable et l'on prélève les souches dont le génome correspond à la présence d'un nombre de copies dudit gène acrrû par rapport à la population bactérienne ayant sélection; et 2. dans un milieu de culture approprié. on induit ou conditionne une amplification gènique par l'activation du réplicon, et on induit l'expression et la sécrétion de la protéine par l'activation desdits éléments d'expres-. sion. 3. on récupère ladite protéine exprimée. 2. Procédé de préparation d'une souche de Bacillus utile dans le procédé de production d'une protéine selon la revendication I dans le chromosome de laquelle un gène déterminé codant ladite protéine a été intégré, éventuellement amplifié, caractérisé en ce que a) on effectue l'intégration dans le chromosome de ladite souche d'au moins une séquence d'ADN dite d'intégration comportant au moins un système de réplication ou réplicon inductible ou conditionnel en amont, 10.. une unité amplifiable de structure -D-M-D-, les séquences D orientées en sens direct assurant l'intégration du gène M dans un gène non essentiel de ladite souche, le gène M comprenant le gène de structure de ladite protéine mis sous le contrôle d'éléments d'expression et sécrétion inductibles de ladite protéine chez Bacillus, l'unité amplifiable comportant en outre éventuellement un gène sélectionnable - b) On sélectionne éventuellement' les souches de Bacillus -obtenues par culture éventuellement sur un milieu de sélection correspondant au gène sélectionnable; et c) on prélève les souches stables dont le génome correspond à la présence d'un nombre de copies dudit gène accrû par rapport à la population bactérienne avant sélection. 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le réplicon provient d'un plasmide bactérien. 4. ' Procédé selon l'une des - revendications précédentes, caractérisé en ce que l'activation du réplicon est thermosensible. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le réplicon provient du plasmide pEi94. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la souche est une souche de Bacillus subtilis. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le système de réplication et l'unité amplifiable DMD sont intégrés entre les séquences thy et X après délétion du gène ilvA de Bacillus subtilis. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les séquences D proviennent d'un plasmide bactérien tel que le plasmide pBR322. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gène sélectionnable est un gène de résistance à un composé chimique tel que le chloramphénicol ou la kanamycine. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les éléments d'expression et de sécrétion de Bacillus subtilis consistent dans le promoteur sacB accompagné de la région sacR inductible par le saccharose. Il. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les éléments d'expression et de sécrétion chez Bacillus subtilis consistent en la partie du locus sacRB de Bacillus subtilis qui contient 1) le locus sacR contenant le promoteur et la région de régulation du gène sacB, et 2) la région de sacB codant la séquence signal de la lévane-saccharase. 12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, h caractérisé en ce que la souche est une souche mutante sacU. 13. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on récupère la protéine exprimée lorsque la culture est en phase stationnaire. 14. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite protéine est l'endoglucanase A (EGA) dont le gène de structure est le gène celA isolé chez Clostridium thermocellum qui est mis sous le contrôle d'éléments d'expression et de sécrétion chez Bacillus subtilis. 15. Souches obtenues par le procédé de préparation de souches selon l'une des revendications 2 et suivantes. 16. Souche selon la revendication 15, qui consiste dans la souche AP551 tel que représentée à la figure 9.