FR 2655045 A1 19910531 FR 8915789 A 19891130 La présente invention concerne de nouveaux marqueurs, utilisables pour le marquage de composés organiques en particulier de composés biologiques, comportant des groupements -SH, -NH-, -NH 2, ou -COO-, en vue de la détection de ces composés par chimiluminescence ou fluorescence dans des procédés de dosages tels que les dosages par chroma- tographie liquide, ou des techniques immunochimiques. On sait que le dosage par chromatographie liquide d'amines, d'acides et de leurs anhydrides correspondants, dépourvus de propriétés spectrales nécessite, pour atteindre une grande sensibilité, de transformer ces composés à l'aide de réactifs marqueurs pour leur conférer des propriétés d'absorption, de fluorescence ou de chimiluminescen- ce. L'utilisation de marqueurs de ce type pour la détection de dérivés carboxyliques ou d'amines est décrite en particulier par H Cisse, R Farinotti, S Kirkiacharian et A Dauphin dans Journal of Chromatography, 225 ( 1981), p 509-515; par M Tsitini Tsamis, A M Mange, R Farinotti et G Mahuzier dans Journal of Chromatography 277 ( 1983), p 61-69; par N Kubab, R Farinotti et G Mahuzier dans Analusis, 1986, v 14, n 3, p 125-130; et par D Amir et E Haas dans Int. J Peptide Protein Res 26 ( 1986), p 7-17. Dans les procédés de dosage par chromato- graphie liquide,on recherche en particulier des marqueurs chimiluminescents car l'analyse par chimiluminescence est en plein développement et permet d'améliorer la sensibilité du dosage En effet, les méthodes par chimiluminescence permettent d'atteindre une limite de détection de l'ordre de la femtomole, alors que, dans les méthodes par spectrofluorimétrie, la limite de détection atteinte est couramment de l'ordre de quelques centaines de femtomoles. Une méthode de détection par chimilumines- cence en chromatographie en phase liquide est décrite en particulier par M Tod, R Farinotti et G Mahuzier dans "Analusis, 1986, v 14, n 6, p 271-280 ". Les marqueurs chimiluminescents actuel- lement utilisés tels que l'ortophtalaldéhyde, la fluorescamine et les dérivés anthracéniques et dansylés, présentent certains inconvénients. Ainsi l'orthophtalaldéhyde et la fluorescamine sont peu sensibles Les dérivés anthracéniques sont inhibés par l'oxygène dissous et les dérivés dansylés sont inhibés par certains produits de la réaction d'excitation De plus, certains de ces marqueurs chimiluminescents présentent une toxicité non négligeable, c'est le cas en particu- lier des dérivés anthracéniques et des dérivés dansy Lés. A la suite de recherches récentes, on a découvert que des noyaux coumariniques présen- taient un certain intérêt car ce sont des composés ayant une sensibilité équivalente aux produits les plus performants, qui ne présentent ni toxicité, ni sensibilité vis-à-vis des inhibiteurs usuels tels que l'oxygène dissous, les halogénures et les dérivés nitrés Par ailleurs, ils sont faciles à mettre en oeuvre dans des conditions d'excitation et de chromatographie variées. Ainsi, M Tod et al ont décrit dans Anal Chem Acta, 223, ( 1989), p 309317, un nouveau dérivé de 7-amino coumarine, la Luminarine- 1, utilisable comme marqueur des amines primaires et secondaires, qui répond à la formule: O CH 2-COO-O (X) Bien que les propriétés de la Luminarine-1 soient très intéressantes, les recherches ont été poursuivies pour trouver notamment d'autres dérivés qui, d'une part, aient une meilleure hydrosolubilité que la Luminarine-1 et, d'autre part, soient plus adaptés au marquage de molécules biologiques telles que les anticorps et les sondes oligonucléotidiques et autres ligands d'affinité. La présente invention a précisément pour objet de nouveaux dérivés coumariniques qui sont des dérivés de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H- ( 1)benzopyrano( 6,7,8 ij)quinolizinone-11 présentant ces propriétés améliorées. Selon l'invention, les dérivés de de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H-( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11 répondant à la formule: o Il CH 2-C-R 1 (I) o O dans Laquelle R 1 représente: té NH-(CH 2)n-NH-C-CH 2 X avec N étant un nombre entier allant de I à 20 et X représentant I, Br ou Cl, ou NH (CH 2 CH 20) m-CH 2-CH 2 NHR 2 avec m étant un nombre entier allant de 1 à 30 et R 2 représentant un atome d'hydrogène ou le radical de formule CO-(CH 2) p-COON' O' dans laquelle p est un nombre entier allant de 1 à 10. Dans ces nouveaux dérivés, l'utilisation du noyau coumarinique de formule: permet d'obtenir des propriétés de fluorescence et de chimiluminescence améliorées; par ailleurs, le choix d'un groupement -CO- R 1 approprié fixé sur ce noyau coumarinique, permet d'obtenir des marqueurs susceptibles d'être utilisés pour un grand nombre de composés organiques et notamment de substances biologiques. Ainsi, les nouveaux dérivés de L'invention ont l'avantage d'avoir une bonne sensibilité, de pouvoir être utilisés comme marqueurs pour différents composés, d'être utilisables en phase normale ou inversée, de ne pas être inhibés par les quenchers usuels tels que l'oxygène dissous, les halogénures et les nitrates, de ne pas présenter de toxicité et de réagir rapidement avec les composés à marquer dans des conditions relativement douces. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, les dérivés de de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H-( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11, répondent à la for- mule: o II CH 2 _CNH (CH 2)n-NH-CO-CH 2 X (II) dans laquelle N est un nombre entier allant de 1 à 20 et X représente I, Br ou Cl. De préférence dans ce premier mode de réalisation N est un nombre allant de 1 à 12, et X représente I. A titre d'exemple d'un tel dérivé, on peut citer celui pour lequel N est égal à 4. Ces dérivés qui comportent un groupement terminal halogéno acétamido, par exemple iodo-acéta- mido, sont très intéressants car ils sont suscepti- bles de marquer des groupements sulfhydryle (ou thiol) soit dans de petites molécules telles que des médicaments comme le Captopril, la cystéine, et la cystéamine, soit dans des protéines possédant le même groupement. En effet, ils peuvent réagir avec des composés comportant ce groupement thiol Le dérivé formé par cette réaction peut être séparé, par exemple par chromatographie en phase liquide et détecté par absorptiométrie, par fluorimétrie ou par chimiluminescence. Selon un second mode de réalisation de l'invention, les dérivés de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H-( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11, répondent à la for- mule: No Il CH 2-C-NH-(CH 2 CH 20)n-CH 2-CH 2-NH 2 (III) dans laquelle m est un nombre entier allant de 1 à 30. De préférence m est un nombre allant de 1 à 6. A titre d'exemple de tels dérivés, on peut citer celui pour lequel m est égal à 5. Ces dérivés peuvent réagir avec les composés comportant une fonction carboxylique, leurs anhydrides et leurs esters, en particulier avec les acides sous forme activée, par exemple avec la NHS biotine de formule: % N LIN O OC-CH 24 r ou avec la NHS-LC-biotine. Ceci est très intéressant car la biotine est extrêmement utilisée en biologie (immunologie, etc) en mettant à profit sa forte affinité ( 1015 M-1) pour l'avidine qui est une glycoprotéine tirée du blanc d'oeuf ayant une masse de 66000, et composée de quatre sous-unités identiques qui sont capables de fixer chacune une molécule de biotine. Ainsi, on peut utiliser les dérivés de formule (III) pour détecter un composé comportant un groupement -COO-. Dans ce cas, on fait réagir le dérivé de formule (III) avec le composé à détecter, pour former un dérivé du composé à détecter, que l'on détecte par absorptiométrie, fluorimétrie ou chimiluminescence, en utilisant la chromatographie en phase liquide, ou des méthodes biochimiques mettant ou non en jeu des ligands spécifiques. Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, les dérivés de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H-( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11, répondent à la formule (IV): o o Il CH 2-C-NH-(CH 2 CH 220) -CH 2-CH 2-NH-CO CH 2)p-coo-/M ( a n(IV) N o dans laquelle m est un nombre entier allant de 1 à 30 et p est un nombre entier allant de 1 à 10. De préférence m est un nombre allant de O à 6 et p est un nombre allant de 1 à 3. A titre d'exemple de tels dérivés, on peut citer celui pour lequel m est égal à 5 et p est égal à 2. Ces dérivés peuvent réagir avec les composés comportant des fonctions amine primaire ou secondaire et le dérivé formé après cette réaction peut être détecté par absorptiométrie, fluorimétrie ou chimiluminescence, en utilisant la chromatographie en phase liquide, ou des méthodes biochimiques mettant ou non en jeu des ligands spécifiques. Dans ce dernier cas qui correspond à la sensibilité maximale, la réaction d'excitation peut utiliser un ester oxalique et du peroxyde d'hydrogène qui forment le peroxyoxalate, intermé- diaire réactionnel à haute énergie, qui transfère son énergie au dérivé formé qui se désexcite en émettant de la lumière Ce dosage par chimilumines- cence peut être appliqué à des molécules d'intérêt biochimique ou pharmacologique en vue d'études de métabolisme ou de pharmacocinétique, notamment aux dosages des acides aminés, des amines biogènes du type histamine, des neuromédiateurs du type catécholamine, des polypeptides hormonaux et des métabolites des phénothiazines, des imipraminiques etc. Dans le cas des applications en biologie, les produits (IV) peuvent réagir sur des substances biologiques aminées, par exemple anticorps, oligonucléotide modifié par un groupement aminé, ou autre ligand d'affinité portant un groupement aminé Les produits marqués ainsi formés peuvent réagir en phase homogène (la liquide), ou en phase solide-liquide, sur un support approprié, sur un ligand complémentaire. Les produits (III) peuvent réagir sur les groupements acide, anhydride d'acide et acide activé, par exemple ester d' hydroxysuccinimide, des substances biologiques. On peut utiliser les dérivés de formules (II) de l'invention pour détecter des composés et des substances biologiques comportant des groupements SH. Le marquage de tels composés biologiques avec un marqueur de type (III) ou (IV) à longue chaîne "polyoxyéthane diyl", (CH 2 CH 20)m, permet entre autre, d'éloigner les groupements hydrophobes (le noyau quinolizinone) de la proximité immédiate de la molécule biologique et de favoriser aussi la formation de liaisons hydrogène Cet effet est bénéfique notamment au niveau de la liaison anticorps-antigène ou en hybridation moléculaire (sondes nucléiques). Les dérivés de l'invention trouvent donc de nombreuses utilisations. Les nouveaux dérivés coumariniques de l'invention peuvent être préparés par des procédés classiques. Ainsi, on peut préparer le dérivé de formule (II) par un procédé consistant à faire réagir un dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H- ( 1) benzopyrano formule ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11 CH 2-CO-NH-(CH 2) nNH 2 (V) o O avec un anhydride halogéno acétique, en présence d'une trialkyl amine telle que la triéthylamine. Ceci correspond à la réaction suivante: o CH 2 CNH-(CH 2)n NH 2 0 XCH 2 C O XCH 2 C, Il CH 2 C-NH-(CH 2)n NHC-CH 2 X I o o o XCH 2 C l \o Le dérivé de formule (V) peut être préparé par un procédé comprenant les étapes successives suivantes: 1 ) faire réagir la 8-hydroxyjulolidine de formule: de 1 1 (VI) avec un ester alkylique de l'acide oxo-3-glutarique de formule: R 300 c-CH 2-C-CH 2-COOR 3 I dans laquelle R 3 est un radical alkyle, pour former un composé de formule: CH 2-COOR 3 o O o (VII) 2 ) hydrolyser l'ester alkylique de formule (VII) obtenu précédemment pour obtenir l'acide de formule: CH 2-COOH (VIII) o 3 ) faire réagir l'acide de formule (VIII) ainsi obtenu avec l'oxalate de dihydroxysuc- cinimide de formule: OCCOON (IX) pour former le dérivé de formule CH 2-COO-1 M J o 0 X) (X) ) faire réagir le dérivé de formule (X) avec un diamino a Lcane de formule: H 2 N-(CH 2)n-NH 2 (XI) dans laquelle N a la signification donnée ci-dessus. Dans ce dernier procédé, la première étape peut être effectuée en portant au reflux sous agitation la 8-hydroxyjulolidine avec l'ester alkylique de l'acide oxo-3-glutarique, en présence de chlorure de zinc anhydre, et en solution alcooli- que Le composé de formule (VII) obtenu peut être séparé par extraction au moyen d'un solvant organi- que tel que l'acétate d'éthyle. L'ester alkylique de l'acide oxo-3-glutarique est de préférence l'ester méthylique ou éthylique. Dans la deuxième étape du procédé, on peut réaliser l'hydrolyse de l'ester alkylique de formule (VII) par une solution aqueuse de soude dans une solution alcoolique constituée par exemple de méthanol. La troisième étape du procédé peut être réalisée par exemple en faisant réagir l'acide de formule (VIII) avec l'oxalate de dihydroxysucci- nimide dans un solvant organique anhydre, en présen- ce de triéthylamine anhydre Dans ces conditions, on peut obtenir le dérivé coumarinique de formule (X) avec un degré de pureté élevé, d'environ 90 %. Les dérivés coumariniques répondant à La formule: O I CH 2-C-NH-(CH 2 CH 20) -CH 2-CH 2-NH 2 t ué 35 (III) dans laquelle m est un nombre entier allant de I à 30, peuvent être préparés par un procédé consis- tant à faire réagir le composé de formule: CH 2-COO-1 o o E J (X) avec un excès de poly(oxy-1,2 éthane diyl) diamine de formule: H 2 N-(CH 2 CH 20)m-CH 2-CH 2 NH 2 (XII) dans laquelle m a la signification donnée ci-dessus. Les dérivés coumariniques répondant à la formule: o CH 2-c-NH- 0 O ) faire réagir un composé de formule: CH 2-C-NH-(CH 2 CH 20)m-CH 2-CH 2NH 2 (III) dans laquelle m a la signification donnée ci-dessus avec un anhydride de diacide de formule: (CH 2)p o-1 l N -l o (XIII) pour obtenir un acide de formule: CH 2-CO-NH-(CH 2 CH 20)m-CH 2-CH 2 NHCO(CH 2)p COOH (XIV) N O 2 ) faire réagir ensuite l'acide de formule (XIV) avec l'hydroxysuccinimide en présence d'un agent de couplage pour former le dérivé de formule (IV). L'agent de couplage peut être par exemple le dicyclohexylcarbodiimide. Les dérivés de formule (IV) notamment ceux pour Lesquels p=l peuvent aussi être prépares par réaction du dérivé de formule (III) avec le monoester benzylique de l'acide dicarboxy Lique de formule: HOOC-(CH 2)p- COOCH 2 C 6 H 5 suivie d'une débenzylation par hydrogénation pour obtenir l'acide de formule (XIV) que l'on fait réagir ensuite comme précédemment avec l'hydroxysuc- cinimide. La préparation de l'acide (XIV) correspond au schéma suivant: (III) + HOOC (CH 2)p COOCH 2 C 6 H 5 CH 2-CO-NH-(CH 2 CH 20)m-CH 2-CH 2 NHCO(CH 2)p COOCH 2 C 6 H 5 H 2 > (XIV) Les produits de départ utilisés dans ces différents modes de préparation des dérivés coumariniques de l'invention sont des produits du commerce ou peuvent être préparés par des procé- dés classiques à partir de produits du commerce. Comme on l'a indiqué précédemment, les dérivés coumariniques de l'invention peuvent réagir avec différents composés organiques, par exemple des amines, des thiols, des acides carboxyliques, leurs anhydrides ou leurs esters. Aussi, ces dérivés coumariniques peuvent être utilisés comme marqueurs de composés organiques comportant des fonctions amine primaire ou secondai- re, thiol, ou acide carboxylique, et servir à la détection de ces composés dans des méthodes de dosage, par exemple par chromatographie en phase liquide ou dans des méthodes immunochimiques mettant ou non en jeu des ligands spécifiques. La détection peut être effectuée par absorptiométrie, fluorimétrie ou chimilumines- cence, en utilisant les méthodes classiques telles que celles décrites par M Tsitini Tsamis et ai dans Journal of chromatography, 277,( 1983), 61-69; par D Amir et E Haas dans Int J Peptide Protein Res 26, 1986, p 7- 17; par H Cisse et ai dans Journal of Chromatography, 225, ( 1981), p 509- 515 et par M Tod et ai dans Analusis, 1986, v 14, n 6 p 271-280. Aussi, l'invention a également pour objet un procédé de détection d'un composé compor- tant une fonction amine primaire ou secondaire, qui consiste à faire réagir le composé à détecter avec un dérivé répondant à la formule O CH 2-C-NH (CC 2 CH 20) -CH 2-CH 2-NH-CO-CH 2)p -coo-00 (IV) dans laquelle m est un nombre entier de 1 à 30 et p est un nombre entier allant de I à 10, pour former un dérivé du composé à détecter, à réaliser ensuite une séparation de ce dérivé et à détecter ensuite ce dérivé par absorptiométrie, fluorimétrie, ou chimiluminescence. On peut détecter par le même procédé un composé comportant un groupe SH, ou un groupe -COO en utilisant respectivement les dérivés de formule (II) ou de formule (III). Dans tous les cas, on réalise de préféren- ce la détection par chimiluminescence en utilisant un ester oxalique et du peroxyde d'hydrogène. A titre d'exemple, l'ester oxalique peut être le bis-(trichloro-2,4,6 phényl)oxalate (TCPO)ou le bis-(dinitro-2,4 phényl)oxalate (DNPO). L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples suivants, donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence au dessin annexé sur lequel: La figure 1 représente le spectre de masse de la Luminarine-6, la figure 2 représente le spectre de masse du dérivé obtenu par réaction de l'anhydri- de succinique avec la Luminarine-6, la figure 3 représente le spectre de masse de la Luminarine-7, Exemple I: Synthèse de la Luminarine-5 répondant à la formule: 0 o Ii CH 2-C-N H(CH 2)4 NCH 2 i M(I Ia) Ce dérivé répond à la formule (II) avec n= 4 et X=I. 1 i Préparation du dérivé de formule (V) avec n= 4 (Va) a) préparation du composé de formule (VII) avec R 3 représentant le radical éthyle (VI Ia) La réaction effectuée ici correspond au schéma réactionnel suivant Q;} 1 4 CH 2-COOC H LO cooc, OH (VI) + COOC 2 H 1 CH 2-COO C 2 H 5 ( on extrait par 2000 ml, puis 100 m L d'acétate d'éthy- le On lave la phase organique à l'eau, on la sèche sur sulfate de magnésium et on la concentre à sec On recristallise ensuite dans 5 parties d'acétate d'éthyle On obtient ainsi l'ester éthyli- que de formule (VII) avec un rendement de 56 %. b) Hydrolyse de l'ester éthylique de formule (VI Ia)obtenu précédemment. On introduit dans un récipient 2 g de l'ester éthylique obtenu précédemment avec 42 m L d'une solution aqueuse de Na OH à 1,2 % P/V et 40 ml de méthanol, puis on porte à 45 C pendant une heure Après refroidissement, on extrait le milieu réactionnel par 50 ml, puis 40 ml de chloroforme. Après dégazage, on acidifie la phase aqueuse avec 16 ml d'acide chlorhydrique 3 N, puis on maintient le mélange réactionnel sous agitation pendant min On ajuste alors le p H à 6,5 avec 13 ml de soude 2, 5 N On filtre alors le précipité formé, on le rince à l'eau et on le sèche On obtient ainsi l'acide de formule (VIII) avec un rendement de 90 %. c) Obtention du dérivé de formule (X) Luminarine-1. Dans cette troisième étape, on fait réagir l'acide de formule (VIII) obtenu dans l'étape précédente avec l'oxalate de dihydroxysuccinimide selon le schéma réactionnel suivant: ml COOH (VII 1) _NCOO (IX) (X) CX) HÈoc COOH On introduit dans un récipient 11,26 g ( 0,0377 mol) de l'acide de formule (VIII), 10,62 g ( 0,0415 mol) de carbonate de dihydroxysuccinimide, 3,81 g ( 0,0377 mol) de triéthylamine anhydre et 560 ml d'acétonitrile anhydre On maintient le mélange sous agitation, à l'abri de l'humidité, pendant une heure à la température ambiante, puis pendant une heure à une température de 35-40 C. On filtre alors un léger insoluble, puis on concen- tre sous vide et on purifie par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme solvant d'élu- tion le mélange dichlorométhane / tétrahydrofuranne (THF) avec un rapport en volume de 1/1 On concentre les fractions 11 à 14, et l'on obtient ainsi le dérivé de formule (X), Luminarine-1, avec un rende- ment de 21 %. d) Obtention du dérivé de formule (Va) avec n= 4. On part directement du dérivé de formule (X), Luminarine-1 purifiée que l'on fait réagir sur le diamino-1,4 butane selon le schéma réaction- nel suivant: o \\ o CH 2-5 O-N' H 2 N-(CH 2)4-NH 2 C 1 H 2-COO -N óX) 0 û 0// O O Il CH 2-CO-NH-(CH 2)4 -NH 2 o 35 S (Va) MS o Dans un ballon d'un litre, on fait réagir 16,5 g de Luminarine-1 (X) ( 41,6 mmoles) et 18,3 g de 1,4-diaminobutane ( 107 mmoles) dans 400 ml de THF anhydre, sous agitation durant 24 heures. On filtre un insoluble marron. On concentre à sec les eaux mères; on reprend le résidu dans 100 ml de dichlorométhane et on extrait par 5 x 100 ml d'eau pour éliminer l'excès de 1-4 diaminobutane. On concentre le solvant à sec. Le résidu est mis sous agitation dans ml de dichlorométhane. Rendement: 10,6 g ( 69 %). On vérifie par spectrométrie de masse et RMN la structure du composé obtenu. ) Préparation de la Luminarine-5, dérivé de formule (I Ia). On part du dérivé (Va) que l'on fait réagir avec l'anhydride iodoacétique en présence de triéthylamine selon le schéma suivant 0 0 0 O o O Il Il Il CH 2 CNH(CH 2)4 NH 2 CH 2 CNH(CH 2)4 NHCCH 2 I L' 1 1 t Va) On dissout dans lml de diméthylformamide, 158 mg du dérivé (Va) ( 0, 4 mmol), 212,4 mg d'anhydride * iodoacétique et 841 L ( 0,6 mmol) de triéthylamine. On laisse réagir 2 heures à température ambiante, à l'abri de la lumière On précipite par ajout de 4 ml d'eau distillée, puis on essore sous vide. On sèche sur anhydride phosphorique On obtient ainsi la Luminarine-5 avec un rendement de 76 %. Analyse élémentaire: I calculé = 23,6 % I trouvé = 22,96 % C C M (chromatographie surcouche mince) Silice fluorescente Système Bu OH/Ac OH/H 20 70/20/10 1 spot fluorescent (Rf = 0,75). Exempte 2 Utilisation de la Luminarine-5 pour le marquage de la fonction thiol de la cystéamine. On fait réagir dans un tampon borate à p H 8 (lml), 5,3 mg de Luminarine5 ( 1 10-2 mmol) et 7,7 mg de cystéamine ( 0,1 mmol); après une heure de réaction, on observe en C C M la disparition totale de la Luminarine-5 et la formation du dérivé fluorescent (Rf= 0,4) du thiol qui a réagi suivant la réaction o CH 2 CNH(CH 2)4 NHCCH 2 SCH 2 CH 2 NH 2 NH 2 CH 2 CH 2 SH O (I Ia) > Exempte 3: Synthèse de la Luminarine-6 de formule: o I CH 2-C-NH-(CH 2 CH 20) 5-CH 2-CH 2-NH 2 (Illa) Ce dérivé répond à la formule (III) avec m= 5. On fait réagir la Luminarine-1, dérivé (X), obtenue dans l'étape c) de l'exemp Le 1 avec le 1,17-diamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadécane (XI Ia), dans le dichlorométhane: CH 2-COO-1 o O 0 o // (X) + 2 HN-(CH 2 CH 2 O)5 CH 2 CH 2 NH 2 (XI Ia) (II Ia) Dans un tube bouché à l'abri de la lumiè- re, on met sous agitation durant 24 heures à la température ambiante 139 mg ( 0,35 mmol) de Luminarine-1 (X) et 392 mg ( 1,4 mmol) de 1,17 diamino 3,6,9,12,15 pentaoxaheptadécane (XI Ia) dans 2 ml de dichlorométhane. On évapore le dichlorométhane et on reprend par 10 ml d'eau, ce qui élimine une impureté non hydrosoluble; on extrait par 10 ml de dichlorométhane (le produit (II Ia) passe dans le dichlorométhane et l'excès d'amine reste dans la phase aqueuse). On sèche, puis on évapore la phase organi- que, on obtient ainsi la Luminarine-6 (II Ia)sous la forme d'une huile jaune avec un rendement de 53 %. C C M: silice fluorescente système Bu OH/Ac OH/H 20 70/20/10 1 spot fluorescent et révélé à la ninhydrine (Rf= 0,35) Spectrométrie de masse (ionisation chimique à l'ammoniaque), appareil NERMAG: on retrouve bien le pic moléculaire + 1 à 562 sur la figure 1 qui représente le spectre obtenu. Exemple 4: Utilisation de la Luminarine-6 pour le marquage de la biotine. La biotine ou vitamine H est extrêmement utilisée en biologie (immunologie, etc), en mettant à profit ses propriétés de très forte affinité ( 1015 M-1) pour une protéine tirée, en particulier, du blanc d'oeuf, l'avidine, ou une autre tirée du "streptomyces avidinii", la streptavidine Dans les méthodes de diagnostic biologique, on peut par exemple marquer soit l'avidine, soit la biotine par un marqueur fluorescent ou chimiluminescent. On fait réagir ici la biotine, activée par un groupement hydroxysuccinimide avec la Lumina- rine-6, selon la réaction suivante: o O CH 2 CNH (CH 2 o)5-C 2 CH 22 NH O F| H o O i O S CH 2 CH(CH 2 c H 20) 5 c H 2 c H 2 MHC(C 2 NC(CH 2) 41 NH N C O'9 Sos N 1 O -OC 1(CH'I) 5 N'C(CH-I) 4It (z:r a) > H o O s O '2 CH 2 NH (Ct'{ 2 H 20) 5 C" 2 CH 2 NH 4 (CI-I 2 5 I"-C (CH" 2) 4 N Dans un tube Eppendorf contenant 1,7 mg de biotine LC NHS (de Pierce), on introduit 1,7 mg de Luminarine-6 dissoute dans 100 Pl de solution de bicarbonate 0,05 M (p H 8,5) On fait réagir durant 1 heure à 4 C On contrôle l'efficacité du marquage par CCM, et on stocke à -20 C, pour faire réagir, sans autre traitement, avec de l'avi- dine, au moment voulu. Contrôle de marquage: C C M: silice fluorescente Système Bu OH/Ac OH/H 20 60/20/20: On observe la disparition du spot de la Luminarine-6 (fluorescent et révélé à la ninhydrine Rf= 0,35) et l'apparition d'un spot de (biotine-Luminarine) de Rf= 0,5, fluorescent et révélé à l'iodoplatinate (réactif spécifique du noyau biotine). Exempte 5: Synthèse de la Luminarine-7 de formule: 2 CNH (CH 2 CH 20) 5 CH 2 C 2 I'NH-COE 2 CH 2 -CN (I Va) O O/ O On part de la Luminarine-6 décrite dans l'exemple 3 et on réalise les deux réactions suivan- tes: a) Action de l'anhydride succinique sur la Luminarine-6. La réaction correspond au schéma réaction- nel suivant: il 9 '2 M (C 2 ca 2 O) 5 OE 2 E 2 2 O' (II Ia) t M 2 (c H 2 CH 2 o) 5 c H 2 H 2 NH c H 2 CH 2 C-OH (\ 1/0 é,> (XI Va) Nié) On met sous agitation durant 7 heures à 20 C, à l'abri de la lumière et de l'humidité, 784 mg ( 1,39 mmol) de Luminarine-6 et 140 mg ( 1,4 mmol)d'anhydride succinique dissous dans 10 ml de dichlorométhane. On lave à l'eau, on sèche, et on évapore à sec. On obtient une huile marron que l'on utilisera telle quelle pour le stade suivant. C C M: silice fluorescente système Bu OH/Ac OH/H 20 70/20/10 On observe la disparition du spot de Luminarine-6 et la formation d'un nouveau spot fluorescent de Rf= 0,55. Spectrométrie de masse (ionisation chimique à l'ammoniaque) On retrouve bien le pic moléculaire à M= 661 comme le montre la figure 2 qui représente le spectre du dérivé (XI Va). b) Couplage de l'acide (XI Va) avec l'hydroxy succi- nimide en présence de dicyclohexyl carbodiimide, suivant le schéma suivant: 2 CHC (CH 2 CH 20)CH 2 CH 2CH 2 CH 2 -C-OH (XI Va) DOCI O 00 DCCI o o % CH 2 CNH (CH 2 CH 20)5 CH 2 CHI 2 NH-C-CH 2 CH 2-C-N (I Va) o Dans un mélange de 250 mg ( 0,377 mmol) du dérivé (XI Va) dans lml de diméthylformamide anhydre, on introduit 43 mg ( 0,377 mmol) d'hydroxysuc- cinimide On refroidit à O C et on ajoute 93 mg de dicyclohexyl carbodiimide ( 0,45 mmol). On agite durant 2 heures puis on filtre la dixyclohexyl-urée formée Le produit restant, la Luminarine-7 est conservé en solution dans le diméthylformamide Il se conserve pendant plusieurs mois à -20 C sans altération (en présence de P 205) Une partie aliquote mise à sec présente une hydrosolubilité totale. C C M: silice en phase inversée C 18 Système Et OH/H 20/NH 40 H 70/25/5 Spot fluorescent à Rf= 0,84 Contrôle de réactivité: le produit, mis en présence de 3 équivalents de pentylamine durant 2 heures, réagit et conduit à un nouveau produit fluorescent de Rf= 0,72 (même système de C C M). Spectrométrie de masse (ionisation chimique à l'ammoniaque) Le pic de plus grande masse trouvée est de M= 661, comme le montre la figure 3 qui représente le spectre de la Luminarine-7 Ceci correspond bien au mode de fragmentation des esters d'hydroxysuccinimide. 2 c N -(c 2 c 2 o) 2 CH 2 NH (CH 2 CH 20) 5 CE 2 CH 2 îHCH C 2 NC car en dehors du pic à M= 661, les deux chromatogram- mes ne sont pas superposables. Exemple 6: Utilisation de la Luminarine-7 pour le marquage de l'avidine. On réalise le marquage de groupements aminés de la protéine (avidine) selon le schéma réactionnel suivant (rapport molaire avidine/Luminarine-7, 1/4,7): 0 0 0 0 Il Il CH 2 CNH (CH 2 CH 2 ) 5 c H 2 c H 2 NH "Cc H 2 c 2 C'N 1 5 2 11 CH (I Va) N 5N û ja |Avidine (Av-NH 2) O O O If fi I CH 2 CNH(CH 2 CH 20)5 CH 2 CH 2 NH-C-22 X-C NH-Av - O On prépare les solutions stocks suivantes: avidine: 10 mg/1 ml, tampon bicarbonate 0,05 M; p H 8,5 Luminarine 250 mg/1 ml, DMF anhydre. On introduit I ml de la solution d'avidine dans un tube Eppendorf On ajoute 2,12 pl de la solution de Luminarine, sous bonne agitation. On laisse une heure à 4 C à l'abri de la lumière. On sépare ensuite les produits sur une colonne de gel G 25 "fine grade" de Pharmacia, équilibrée et éluée avec du tampon bicarbonate La fraction de tête, contenant l'avidine marquée, est contrôlée, partagée en parties aliquotes, et conservée à -20 o C. Le contrôle est effectué par CCM. C C M: silice fluorescente système Bu OH/Ac OH/H 20 60/20/20 Sur le chromatogramme on n'observe plus le spot de la Luminarine-7 à Rf 0,48 On observe seulement un spot non migré, ayant le comportement de l'avidine, et jaune fluorescent, attestant la fixation de la Luminarine. Exemple 7. Pour mettre en évidence les propriétés améliorées des Luminarines de l'invention, on a effectué des mesures de fluorescence, d'absorbance et de chimiluminescence en utilisant comme fluoro- phore des coumarines de l'art antérieur qui sont la coumarine-1 l, diméthylamino-7 méthyl-4 coumarine (DEMC) de formule: i H 3 (c 2 5)2 et la coumarine-311 , diméthylamino-7 méthyl-4 coumarine (DMMC) de formule: (CH 3)2 pour les comparer avec la coumarine-102 , tétrahy- dro-2, 3, 5, 6, 7, 1 H, 5 H, 11 H-( 1) benzopyrano ( 6, 7, 8 ij) méthyl-9 quinolizinone-11 (TBMQ) qui est le noyau de base des dérivés de l'invention de formule w Les mesures de fluorescence sont effec- tuées avec un spectrofluorimètre Perkin Elmer L 55 avec des largeurs de fentes de 2 nm pour les deux monochromateurs. Les mesures d'absorbance sont effectuées avec un spectrophotomètre Jobin Yvon JY 3 Les mesures de chimiluminescence sont obtenues en utilisant un spectrofluorimètre Jobin Yvon JY 4 en utilisant des largeurs de fentes de 10 nm La cellule d'échantillons liquides est une cuvette de quartz de 10 x 10 mm d'une capacité de 3 ml remplie de 2 ml de solution, ce qui correspond à un volume réel de solution exposée au photomu Ltiplicateur de 1,35 ml. Mesures de fluorescence et d'absorbance. Ces mesures ont été effectuées à 20 + 2 C, et on a déterminé les rendements quantiques de fluorescence RF des coumarines-1, 311 et 102 par rapport au bisulfate de quinine dont le rende- ment quantique de fluorescence est de 0,546, en suivant la méthode de Parker décrite dans Analyst, , ( 1960), p 587, avec une solution de bisulfate de quinine à 2 mg/L dans H 2504 0,1 N. Pour les coumarines, on a utilisé une solution d'acétone et d'acétate d'éthyle dans un rapport en volume 75/25 avec une concentration en coumarine de 10-6 mol/L en assurant dans chaque cas une absorbance inférieure à 0,05. Mesures de chimi Luminescence. Pour déterminer les rendements quantiques de chimiluminescence RC, on a estimé l'intensité en fonction du temps au maximum de l'émission. Lorsque la décroissance de l'intensité est assez basse, le spectre d'émission est tracé, puis l'intensité en fonction du temps est suivie jusqu'à ce que l'intensité soit tombée à 2 % de l'intensité maximale. Les autres paramètres de luminescence sont mesurés directement, il s'agit de l'intensité maximale (Imax), du temps pour atteindre l'intensité maximale (Tmax), et du temps pour atteindre la moitié de l'intensité maximale après le temps maximal (T 1/2). Le rendement de chimiluminescence RC est calculé en suivant la méthode de Rauhut décrite dans J Am Chem Soc, 88, 15 ( 1966), 3604. Le rendement d'excitation Rex est détermi- né à partir de la formule: RC = Rex x RF Pour les mesures de chimiluminescence avec le TCPO, on ajoute à lml de la solution conte- nant 10-3 mol/l de coumarine, 0,5 ml d'une solution à 2 10-3 mol/l de TCPO dans de l'acétate d'éthyle, 0,5 ml d'une solution à 2 10-2 mol/l de H 202 dans l'acétone et 10 11 d'un tampon imidazole nitrate, p H 7,5, à 0, 1 mol/l Lorsqu'on utilise le DNP 0, on ajoute à la même solution de coumarine dans l'acétone, 0,5 ml d'une solution à 10-3 mol/l de DNPO dans l'acétate d'éthyle et 0,5 ml d'une solution à 10-2 mol/l de H 202 dans de l'acétone. Les propriétés de fluorescence et d'absor- bance de ces coumarines sont données dans le tableau 1, et les résultats de chimiluminescence sont donnés dans le tableau 2. Au vu des tableaux I et 2, on remarque que le noyau coumarinique utilisé dans l'invention qui correspond à la coumarine 102, présente les meilleures propriétés de fluorescence, d'absorbance et de chimiluminescence. Dans le tableau 3, on a donné les résul- tats obtenus en ce qui concerne le rendement de chimiluminescence RC en utilisant TCPO et H 202 en fonction de la concentration en coumarine-102, ainsi que les valeurs de Imax, Tmax et T 1/2. Au vu de ces résultats, on constate que le rendement de chimiluminescence augmente avec la concentration en coumarine-102. Dans le tableau 4, on a donné les varia- tions du rendement de chimiluminescence, de Imax, de Tmax et de T 1/2, en fonction du p H de la solu- tion. Les résultats obtenus montrent que le rendement de chimiluminescence cro;t jusqu'à p H 6 et qu'il décroît ensuite. En revanche les valeurs de Tmax et de T 1/2 décroissent lorsque le p H augmente au-delà de 5 L'intensité maximale augmente de façon impor- tante avec le p H. TABLEAU 1 E S RF 1 365 r' 103 COUMARINE-102 0,57 23 100 36 COUMARINE-1 0,55 38 000 57 COUMARINE-311 0,52 26 900 40 = rendement quantique de fluorescence. = coefficient d'extinction moléculaire = sensibilité de fluorescence TABLEAU 2 RF E S DMPO I I RC 102 E mol-1 RE TCPO RC 02 E mol-1 COUMARINE-102 0,26 0,45 0,37 0,65 COUMARINE-1 0,18 0,33 0,37 0,67 COUMARINE-311 0,13 0,24 0,17 0,32 RC = rendement quantique de chimiluminescence RE = rendement d'excitation DNPO = bis-(dinitro-2,4 phényl)oxalate TCPO =-bis-(trichloro-2,4,6 phényl) oxalate. RE TABLEAU 3 (C 102) RC x 104 Imax Tmax T 1/2 E mo L 1 E mo L 1 A U minin. 1.4 x 10-3 12,0 301 0,2 0,10 1.4 x 10-6 4,14 75 0,2 0,15 1.4 x 10-7 2,31 31 0,2 0,12 1.4 x 10-8 0,40 3,2 0,2 0,10 1.4 x 10-9 0,20 0,3 0,2 0,08 TABLEAU 4 p H Rc x 104 Imax Tmax T 1/2 E mol-1 A U min min. 4 1,52 24 0,8 5,0 1,58 17 1,0 6,0 6 2,34 25 0,8 5,6 7 2,23 110 0,4 1,8 8 1,60 245 0,2 0,4 REVENDICATIONS. 1 Dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H- ( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11 répon- dant à la formule: I 1 CH 2- C'Rl (I) o O dans laquelle R 1 représente: NH-(CH 2)n-NH-C-CH 2 X II o avec N étant un nombre entier allant de 1 à 20 et X représentant I, Br ou Cl, ou NH-(CH 2 CH 20)m-CH 2-CH 2 NHR 2 avec m étant un nombre entier allant de 1 à 30 et R 2 représentant un atome d'hydrogène ou le radical de formule CO-(CH 2)p- dans laquelle p est un nombre entier allant de 1 à 10. 2 Dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H- ( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11, caractérisé en ce qu'il répond à la formule: i CH 2-C-NH (CH 2)n-NH-CO-CH 2 X H 2 CH(II) N dans laquelle N est un nombre entier allant de 1 à 20 et X représente I, Br ou Cl. 3 Dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H- ( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11 selon la revendication 2, caractérisé en ce que N est égal à 4. 4 Dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H- ( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11, caractérisé en ce qu'il répond à la formule: o Il CH 2-C-NH ( CH 2 CH 20)m -CH 2-CH 2-NH 2 CIII dans laquelle m est un nombre entier allant de 1 à 30. Dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H- ( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11 selon la revendication 4, caractérisé en ce que m est égal à 5. 6 Dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H- ( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11, caractérisé en ce qu'il répond à la formule (IV) o O H CH 2-C-NH CCH 2 CH 20) -CH 2 _CH 2 NHCO C CH 2 >)-C Ol j (IV) o O dans laquelle m est un nombre entier allant de 1 à 30 et p est un nombre entier allant de 1 à 10. 7 Dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H- ( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11 selon la revendication 6, caractérisé en ce que m est égal à 5 et p est égal à 2. 8 Procédé de préparation d'un dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H-( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11 répondant à la formule: o O CH 2-C-NH-(CH 2)n-NH-CO-CH 2 X I$ (Il) dans laquelle N est un nombre entier al Lant de 1 à 20 et X représente I, Br ou Cl, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un Dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H-( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11 de formule CH 2-CO-NH-(CH 2)n-NH 2 CV) avec un anhydride halogéno acétique, en présence d'une trialkyl amine. 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on prépare le dérivé de formule (V) en effectuant les étapes successives suivantes: 1 5 1 01 )faireréagir la 8-hydroxyjulolidine de formule: (VI) OH avec un ester alkylique de l'acide oxo-3-glutarique de formule: R 300 C-CH 2-,-CH 2-COOR 3 o O dans laquelle R 3 est un radical alkyle, pour former un composé de formule: CH 2-COOR 3 o J o (VII) 2 ) hydrolyser l'ester formule (VII) obtenu précédemment l'acide de formule: alkylique de pour obtenir CH 2-COOH (VIII) o 3 ) faire réagir l'acide de formule (VIII) ainsi obtenu avec l'oxalate de dihydroxysuc- cinimide de formule: COO -o (IX) pour former le dérivé de formule CH 2-COO-N/ (X) 4 ) faire réagir le dérivé de formule (X) IN I CH 2-COO-N (X) avec un diamino alcane de formule: H 2 N-(CH 2)n-NH 2(XI) dans laquelle N a la signification donnée ci-dessus. Procédé de préparation d'un Dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1 H,5 H,11 H-( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11 de formule: CH 2-C-NH-( CH 2 CH 20) -CH 2-CH 2-NH 2 lN OIII ( CIII dans laquelle m est un nombre entier allant de I à 30, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir le composé de formule: O CH 2-COO-N/ (X) avec un excès de poly(oxy-1,2 éthane diy L) diamine de formule: H 2 N(CH 2 CH 20)m-CH 2-CH 2 NH 2 (XII) dans laque L Le m a la signification donnée ci-dessus. 11 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'on prépare le composé de formule (X) en effectuant les étapes successives suivantes: 1 ) faire réagir la 8-hydroxyjulolidine de formule: (VI) OH avec un ester alkylique de l'acide oxo-3-glutarique de formule: R 300 C-CH 2-C-CH 2-COOR 3 Il dans laquelle R 3 est un radical alkyle, pour former un composé de formule: CH 2-COOR 3 (VII) o 2 ) hydrolyser l'ester alkylique de formule (VII) obtenu précédemment pour obtenir l'acide de formule: CH 2-COOH (VIII) o 3 ) faire réagir l'acide de formule (VIII) ainsi obtenu avec l'oxalate de dihydroxysuc- cinimide de formule: 0 o 00 C COO pour former le dérivé de formule CH 2-COO- a NJ o X (X) o O 12 Procédé de préparation d'un dérivé de tétrahydro-2,3, 6,7,1 H,SH,11 H-( 1) benzopyrano ( 6,7,8,ij) quinolizinone-11 O O C.2-CNH-{CC c H 2 o 0) -CH 2-CH 2-NH-CO-( CH 2)p-C Oo-N (IV) O dans Laquelle m est un nombre entier allant de 1 à 30 et p est un nombre entier allant de 1 à , caractérisé en ce qu'il consiste: 1 ) à faire réagir un composé de formule o\\ Ns (IX) R CH 2-C-NH-(CH 2 CH 20)* -CH 2-CH 2-NH 2 (III dans laquelle m a la signification donnée ci-dessus avec un anhydride de diacide de formule: C (CH 2)p I O O o (XIII) pour obtenir un acide de formule: CH 2-CO-NH-(CH 2 CH 20)m-CH 2-CH 2 NHCO(CH 2)p COOH (XIV) N O 2 ) à faire réagir ensuite l'acide de formule (XIV) avec l'hydroxysuccinimide en présence d'un agent de couplage pour former le dérivé de formule (IV). 13 Procédé de détection d'un composé comportant une fonction amine primaire ou secondai- re, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir le composé à détecter avec un dérivé répondant à la formule: q 0 o il CH 2-C-NH-( C C Hz 2 >CH 20)-C 2-CH 2-NH-C 0-(CH 2)p-CO 0-N @ O dans laquelle m est un nombre entier de 1 à 30 et p est un nombre entier allant de I à 10, pour former un dérivé du composé à détecter, et à détecter ensuite ce dérivé par absorptiométrie, fluorimétrie, ou chimiluminescence. 14 Procédé de détection d'un composé comportant un groupe SH, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir le dérivé de formule: o Il CH 2-C-NH(CH 2)n-NH-co-c H 2 x D û (Il) dans laquelle N est un nombre entier allant de I à 20 et X représente I, Br ou Cl, pour former un dérivé du composé à détecter, et à détecter ensuite ce dérivé par absorptiométrie, fluorimétrie, ou chimiluminescence. Procédé de détection d'un composé comportant un groupe -COO-, caractérisé en ce que l'on fait réagir ce composé avec un dérivé de formule: CH 2-C-NH-(CH 2 CH 20) -CH 2-CH 2-NH 2 (III dans laquelle m est un nombre entier de 1 à 30, pour former un dérivé du composé à détecter, et en ce que l'on détecte ensuite ce dérivé par absorptiométrie, fluorimétrie, ou chimilumines- cence. 16 Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que l'on réalise la détection par chimiluminescence en utilisant un ester oxalique et du peroxyde d'hydrogène. 17 Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'ester oxalique est le bis-(trichloro-2,4,6 phényl)oxalate ou le bis- (dinitro 2,4 phényl)oxalate.