FR 2635770 A1 19900302 FR 8911298 A 19890828 ELIMINATION DES IONS METALLIQUES D'UNE SOLUTION AQUEUSE La présente invention concerne la biochimie et la protection de l'environnement. L'invention est le résultat d'un contrat passé avec le Ministère de l'Energie (Department of Energy - Contract N W-7405- ENG-36). De nombreuses opérations industrielles génèrent des courants d'eaux usées contenant des métaux lourds, comme le cadmium et le cuivre. Les métaux sont toxiques pour la vie animale et végétale et doivent être enlevés avant de déverser les courants d'eaux usées dans l'en- vironnement. Il existe également de nombreux endroits o l'on a déversé de l'eau contenant des métaux lourds toxiques; ces endroits doivent être nettoyés ou, au minimum, les sites doivent être stabilisés pour empêcher les rejets de migrer pour contaminer un environnement plus large. Le cadmium est un exemple de métal toxique qui doit être exclu de l'environnement; il s'accumule faci- lement dans les systèmes vivants et, chez l'homme, est impliqué comme cause de troubles rénaux, insuffisance pulmonaire, lésions osseuses, hypertension et cancer. L'Agence de protection de l'environnement des Etats- Unis (U.S. Environmental Protection Agency) limite la quantité de cadmium qui peut être présente dans l'eau potable à 10 parties par milliard. Des courants d'eaux usées contenant du cadmium sont générés dans des opérations industrielles comme le raffinage du zinc, la fabrication des piles, la galvanoplastie et la fabrication des pigments. L'invention est un procédé pour enlever les métaux lourds d'une solution aqueuse, une composition utilisée pour effectuer ledit retrait, et un appareil employé à cet effet. On immobilise un ou plusieurs polypeptides, poly(e-glutamylcystéinyl)glycines, sur une matière inerte sous forme particulaire. Au contact avec une solution aqueuse contenant des métaux lourds, les polypeptides séquestrent les métaux, les enlevant de la solution. On observe une sélectivité des poly(à-glutamylcystéinyl)- glycines ayant un nombre particulier d'unités monomériques répétées pour des métaux particuliers. Les polypeptides sont facilement régénérés par contact avec une faible quantité d'un acide organique, si bien qu'on peut les réutiliser pour enlever les métaux lourds de la solution. Ceci aboutit également à l'élimination des métaux de la colonne sous une forme concentrée. Dans un mode de réalisation large, l'invention est un procédé pour enlever les métaux lourds d'une solution aqueuse dans lequel on met en contact une solution aqueuse avec une substance solide constituée de matière polymérique Insoluble dans l'eau & laquelle sont attachées des molécules de poly(y-glutamylcystéinyl)glycines pendant une durée efficace pour que les métaux se fixent auxdites poly- (ï-glutamylcystéinyl)glycines et on sépare ladite solution aqueuse, qui est appauvrie en métaux, de ladite subs- tance solide. Le dessin montre la formule développée d'une poly- (d-glutamylcystéinyl)glycine ayant deux unités monomé- riques répétitives. Une molécule de poly( ' -glutamylcystéinyl)glycine de l'invention est un polypeptide qui se compose d'une chaîne d'unités monomériques répétitives à laquelle est fixé l'acide aminé glycine. Chaque unité monomérique répétitive consiste en deux acides aminés, glutamate et cystéine, réunis par une liaison peptidique, ou gamma. Les poly(f-glutamylcystéinyl)glycines sont fréquemment représentées par (Glu-Cys)nGl, o n est égal au nombre d'unités monomériques répétitives. Dans une expérimen- tation associée à l'invention, on a produit des poly- (e-glutamylcystéinyl)glycines ayant 2, 3, 4 et 5 unités répétitives et l'on pense que le nombre d'unités répé- titives que l'on peut utiliser dans la pratique de l'in- vention peut aller jusqu'à 10 ou plus. Les poly(C-glutamylcystéinyl)glycines de l'invention ont une affinité pour les métaux toxiques lourds cadmium, cuivre et zinc et se combinent avec ces métaux en solution- aqueuse. Outre ces trois métaux, qui ont fait l'objet d'une expérimentation, on compte que les poly(y-glutamyl- cystéinyl)glycines auront également une affinité pour le plomb, le mercure et le nickel. Certaines poly(C- glutamylcystéinyl)glycines sont sélectives pour des métaux particuliers. Il a été démontré par expérimentation que la poly(Q-glutamylcystéinyl) glycine ayant deux unités répétitives tend à séquestrer le cadmium de préférence aux autres métaux. En outre, le composé ayant trois unités répétitives favorise le cuivre. On compte que des sélectivités additionnelles existent, de sorte que la connaissance du courant aqueux à traiter permette de choisir une poly(e-glutamylcystéinyl)glycine particu- lière. S'il s'agit d'éliminer deux métaux, on peut uti- liser deux ou plusieurs poly(Y-glutamylcystéinyl)glycines. D'un autre côté, il peut être souhaitable de n'enlever qu'un métal d'un courant contenant deux ou plusieurs métaux. Dans ce cas on utiliserait la poly(Y-glutamyl- cystéinyl)glycine qui est sélective pour ce métal. 2.6357 7 0 Etant donné que les poly(-glutamylcystéinyl)glycines sont solubles dans l'eau, elles doivent être immobilisées,. ou rendues insolubles. On le fait en attachant les molé- cules de poly(Q-glutamylcystéinyl)glycine à une matière polymérique inerte, qui est généralement sous forme de perles, qui peuvent avoir de 0, 01 à 20 mm ou plus de diamètre. On peut utiliser n'importe quel polymre Inerte possédantdes sites chimiques auxquels s'attache le groupe amino libre du groupe glutamate sur une extrémité de la chaîne. On a employé un polysaccharide dans l'expé- rimentation. On met dans un récipient, teL qu'un vase cylindrique vertical allongé, la substance solide constituée de la matière polymérique à laquelle sont attachées les poly('-glutamylcystéinyl)glycines, et on laisse la solu- tion aqueuse contenant du métal s'écouler à travers la substance solide par gravité. Lorsque la substance solide a atteint sa capacité à absorber les métaux, on la régénère, c'est- à-dire qu'on la prépare pour réutilisation dans l'ex- traction des métaux, en y faisant passer une faible quantité d'un acide organique à haut poids moléculaire. Ainsi, 3 ml d'acide oxalique suffisent pour régénérer une colonne ayant extrait des métaux à partir de 1000 ml de solution. On peut utiliser des oxydes orga- niques volumineux ayant un faible pH et de faibles pro- priétés de chélation, comme l'acide citrique et l'acide maléique. On peut envisager de préparer les polypeptides de l'invention par des moyens chimiques, mais il est plus intéressant de les préparer en cultivant certaines substances en présence d'un métal lourd. Bien qu'on utilise un métal particulier pour stimuler la production de polyC(-glutamylcystéinyl) glycines, la matière produite a des affinités pour d'autres métaux, comme il est dit ci-dessus. Les paragraphes suivants décrivent une partie de l'expérimentation réalisée. On choisit des cultures cellulaires en suspension de Datura innoxia pour leur résistance à diverses concen- trations de CdC12 en utilisant un protocole de sélection par étapes. Diverses lignées cellulaires conservent leur aptitude à croltre dans des concentrations norma- lement toxiques de Cd après croissance en son absence pendant plus de sept cents générations. La résistance au Cd est en corrélation avec la synthèse de grandes quantités de petits complexes de Cd riches en cystéine. On cultive des cultures cellulaires de Datura innoxia tolérantes au cadmium dans des milieux de culture cellu- laire végétale standard contenant 250 M CdC12 pendant au moins 48 heures, tout en agitant à 30"C. La croissance dans ces conditions aboutit à la synthèse de grandes quantités de poly( y -glutamylcystéinyl)glycines, qui s'accumulent dans les cellules. Pour extraire les polypeptides, on lave les cellules une fois dans un tampon glacé contenant 10 mM Tris- HC1, pH 7,4, 10 mM KC1, 1,5 mM MgCl2 et 20 mM 2-mercaptoéthanol. On recueille les cellules à partir du tampon par centrifugation à faible vitesse pendant minutes, on les remet en suspension dans le même tampon par centrifugation à faible vitesse pendant 10 minutes, on les remet en suspension dans le même tampon, et on les brise avec un homogénéiseur. On centrifuge l'extrait résultant pendant 15 minutes à 15 000 g pour enlever la matière insoluble et onr fait passer le sur- nageant résultant à travers une colonne de Sephadex 26 35770 G 50 (fine), qui sépare les polypeptides de la majorité de la matière cellulaire restante. Les fractions re- cueillies à partir de la colonne qui contiennent les poly- peptides sont identifiées par la présence du cadmium lié. On rassemble ces fractions et on lave et on concentre les polypeptides par ultrafiltration. On utilise la préparation résultante comme source de poly(y-glutamyl- cystéinyl)glycines à attacher aux perles de Sepharose. La quantité de polypeptide présente est déterminée en dosant la quantité de groupes sulfhydryle présente en utilisant une réaction d'Ellman. On lave du Sepharose 4B (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) dans un grand excès d'eau triplement distillée. On met alors en suspension le Sepharose hydraté dans un volume égal de solution 5 M de phosphate de potassium et on refroidit sur de la glace. On ajoute goutte à goutte 0,4 volume d'une solution contenant 100 mg/ml de CNBr (bromure de cyanogène) dans l'eau distillée pendant une période de 2 minutes. On agite doucement la suspension pendant l'addition du CNBr et on la laisse réagir pendant huit minutes sur de la glace. On lave alors le Sepharose activé avec CNBr avec cinq volumes d'une solution contenant NaHCO3 0,25 M, pH 9,0. On mélange alors le Sepharose activé avec CNBr avec une solution contenant une quantité connue de poly- (-glutamylcystéinyl)glycine. On laisse cette suspension réagir pendant la nuit à la température ambiante. On verse alors la suspension ci-dessus dans une colonne de verre ou de plastique contenant du verre fritté au fond, laissant le passage pour le liquide mais non pour la matrice liant le métal. Au fur et à mesure que le liquide s'écoule à partir de la colonne (on peut l'enlever en utilisant un écoulement par gravité ou par pompage), on lave la matrice par addition d'au moins cinq volumes de solution contenant NaHCO3 0,25 M, pH 9,0. Ensuite on lave la colonne avec cinq volumes de la même solution contenant NaCl 1 M et cinq volumes d'une solution contenant de l'éthanolamine 1 M, pH 9,0 (pH ajusté avec HCl). On peut conserver la colonne dans cette dernière solution, puis la laver à nouveau avec NaHCO3 0,25 M, suivi par de L'eau distiLLée. On lave alors la colonne avec cinq volumes d'une solution contenant de l'acide oxalique 0,1 M. Ceci enlève le cadmium qui était lié par les polypeptides tandis que les polypeptides étaient toujours dans les cellules. L'opération libère également les sites de liaison des polypeptides pour lier une plus grande quantité d'ions métalliques. On fait passer une solution de réserve contenant CdCl2 5 eM contenant une faible quantité de 109Cd radioactif à travers la colonne et on recueille les fractions à partir du fond de la colonne et on y dose la présence du cadmium radioactif. On ne détecte aucun cadmium ra- dioactif jusqu'à ce que tous les sites de liaison métalli- que sur la colonne soient saturés. La connaissance de l'activité spécifique de la solution de cadmium permet la détermination de la quantité de cadmium lié par une charge spécifique de matrice de liaison du métal. On enlève le cadmium lié à la colonne en lavant à nouveau la colonne avec un faible volume d'une solution contenant de l'acide oxalique 0,1 M. Ce lavage libère l'ion cadmium de la colonne dans une solution concentrée et aboutit à la régénération des sites de liaison du cadmium sur la colonne. Le résultat final est une concentration significative du cadmium à partir de la solution aqueuse 26 7 70 de départ. On identifie tout d'abord les polypeptides par leur aptitude à lier le cadmium radioactif. On fait passer des extraits de cellules de Datura innoxia to- lérantes envers Cd à travers une colonne de Sephadex G-50 qui sépare les molécules surtout sur la base de leur taille. On dose le cadmium dans les fractions pro- venant des colonnes et l'on trouve que certaines fractions contiennent plus de 90% du cadmium dont on sait qu'il se trouve dans les cellules. On recueille ces fractions et on les purifie encore par chromatographie d'affinité sur Thiopropyl Sepharose 6B, qui lie les composés qui sont riches en cystéine (on savait d'après des expériences de marquage d'acides aminés que la cystéine était l'un des principaux composants des fractions liant le cadmium). On trouve que les composants des fractions ne contiennent que trois acides aminés différents (par analyse des acides.aminés de la matière purifiée): cystéine, glu- tamate et glycine dans un rapport proche de 3:3:1. On s'efforce de déterminer la séquence des polypeptides en utilisant la dégradation d'Edman, mais ceci n'aboutit pas à la dégradation des polypeptides, ce qui suggère ou bien que les liaisons peptidiques sont bloquées, ou qu'elles ne sont pas liées entre elles via le groupe c-carboxyle. On détermine la séquence des polypeptides en utilisant une combinaison de dégradation enzymatique des polypeptides, en partant de l'extrémité carboxyle. La présence de liaisons X-carboxamide est tout d'abord suggérée par la stabilité des polypeptides vis-à-vis de la dégradation d'Edman et est confirmée par 13C RMN. L'expérimentation est conduite aux températures ambiantes, mais les polypeptides sont stables sur un intervalle de température d'au moins 4 à 85 C. La sé- lectivité des polypeptides peut varier avec la température; ceci serait utile dans la mise au point d'un procédé commercial. Le Sepharose utilisé dans les expériences a une taille hydratée de 60 à 140 microns. TABLEAU Concentration de Cd, Cd lié, micromolaire moles de Cd/moles de polypeptide i 0,2 1,41 20 1,66 47,5 1,91 2,01 Le tableau montre les résultats d'une série d'ex- périences dans lesquelles on fait passer des solutions aqueuses ayant des concentrations variables de Cd à travers une colonne de 2,5 cm de DI x 20 cm de longueur contenant une quantité estimée de 12,45 mg de poly( Y glutamylcystéinyl)glycines sur Sepharose. On régénère la colonne après passage de chacune des cinq solutions. Une faible quantité de Cd radioactif est présente dans chaque solution afin de déterminer la quantité totale de Cd liée par la colonne. On voit que la capacité de Cd de la colonne dépend de la concen- tration de Cd dans la solution. REVENDICATIONS 1. Procédé d'élimination des métaux lourds d'une solution aqueuse dans lequel on met en contact une solution aqueuse avec une substance solide contituée de matière poly- mérique insoluble dans l'eau à laquelle sont attachées des molécules de poly(y-glutamylcystéinyl)glycines pendant une durée efficace pour que les métaux deviennent attachés auxdites poly('-glutamylcystéinyl)glycines et on sépare ladite solution aqueuse, qui est appauvrie en métaux, d'avec ladite substance solide. 2. Procédé de la revendication 1, dans lequel le poids moléculaire de la poly(Y-glutamylcystéinyl)glycine par- ticuli&re utilisée dans ledit procédé est établi par référence au métal particulier qui doit être enlevé de ladite solution aqueuse. 3. Procédé de la revendication 1, dans lequel le nombre d'unités monomériques répétitives des dites poly( - glutamylcystéinyl)glycines est de 2 à environ 10. 4. Procédé de la revendication 1, dans lequel lesdits métaux sont le cadmium, le cuivre, le zinc, le mercure, le plomb et le nickel. 5. Procédé de la revendication 1, dans lequel ladite matière polymérique est sous la forme de sphères ayant un diamètre allant d'environ 0,01 à environ 20 mm. 6. Procédé de la revendication 1, dans lequel ladite matière polymérique est un polysaccharide. 7. Procédé de la revendication 1, dans lequel lesdites molécules de poly(e-glutamylcystéinyl)glycine ont -pra- tiquement le même poids moléculaire. 8. Procédé de la revendication 1, dans lequel le nombre d'unités monomériques répétitives de ladite poly - ( -glutamylcystéinyl)glycine est de deux et le métal ll à extraire de ladite solution aqueuse est le cadmium. 9. Procédé de la revendication 1 dans lequel le nombre d'unités monomériques répétitives de ladite PolY( y- glutamylcystéinyl)glycine est de trois et le métal à extraire de ladite solution aqueuse est le cuivre. 10. Procédé de la revendication 1, dans lequel en outre on régénère ladite substance solide en mettant en contact ladite substance solide avec un acide organique à haut poids moléculaire pendant une durée efficace pour que lesdits métaux entrent en solution. 11. Procédé de la revendication 10 dans lequel ledit acide organique volumineux est l'acide oxalique. 12. Composition constituée d'une matière polymérique insoluble dans l'eau à laquelle sont attachées des mo- lécules de poly(Y-glutamylcystéinyl)glycines. 13. Appareil pour extraire les métaux d'une solution aqueuse comprenant: a. un récipient cylindrique allongé en position verticale; b. une matière polymérique insoluble dans l'eau sous forme de particules discrètes située à l'intérieur dudit récipient, o à ladite matière polymérique sont attachées des molécules de poly(-glutamylcystéinyl)- glycines; c. un moyen pour fournir une solution aqueuse contenant un métal au sommet dudit récipient; d. un moyen pour distribuer ladite solution aqueuse à la surface horizontale de ladite matière. polymérique au sommet dudit récipient; et e. un moyen pour recueillir ladite solution aqueuse, qui est appauvrie en métaux, au fond dudit récipient.