FR 2647017 A1 19901123 FR 8914226 A 19891030 AGENT ANTITUMORAL ET AGENT ANTIMETASTATIQUE CONTENANT UN INHIBITEUR DE LA RIBONUCLEASE COMME COMPOSANT ACTIF La présente invention concerne un agent antitumoral (ou agent antinéoplasique) et un agent antimétastatique (empêchant la métastase des cellules tumorales) contenant comme composant actif un inhibiteur de la ribonucléase. Plus particulièrement, l'invention concerne un agent antitumoral contenant ur inhibiteur de la ribonrueléase ccwne cemiosant actif et en particulier un agent antitumoral capable de présenter un effet remarquable sur les tumeurs solides. L'invention concerne de plus un agent antimétastatique qui permet d'espérer un effet d'inhibition de la métastase des cellules tumorales à partir des ilots primaires, tels que les cancers du poumon, du sein et du colon, et en particulier la métastase des cellules des tumeurs du poumon aux poumons. Actuellement, les procédés de traitement du cancer comprennent le traitement chirurgical (chirurgie), la radiothérapie, la chimiothérapie et l'immunothérapie. Parmi eux, la chirurgie et la radiothérapie sont nettement les traitements d'éradication les plus efficaces. Cependant, comme la chirurgie et la radiothérapie sont tous deux des traitements locaux, ces traitements sont utiles tant que les tumeurs sont localisées dans une région, mais des limites importantes apparaissent lorsque les tumeurs sont de nature évolutive et tendent à se disséminer hors de la région locale, ou que les atteintes sont générales. D'autre part, la chimiothérapie et l'immunothérapie présentent les caractéristiques des traitements généraux. Toutes deux appartiennent à un domaine relativement récent de la thérapeutique, mais évoluent si remarquablement qu'on peut prévoir encore leur développement dans l'avenir. La chirurgie, la radiothérapie et l'immunochimiothérapie sont des traitements dont les principes diffèrent mutuellement les uns des autres et ont donc des effets et des limitations qui leurs sont propres. Donc, une combinaison appropriée de ces divers traitements peut être utile pour accroître l'effet bénéfique, par suite d'une action coopérative mutuelle et d'une compensation mutuelle des insuffisances. De telles polythérapies intensives à 2647 0 1 7 facettes multiples pourraient, pour la première fois, améliorer le traitement des tumeurs malignes. Dans une telle polythérapie, un sujet d'intérêt immédiat est l'établissement d'une thérapeutique reposant sur le nouveau principe d'inhibition de la néovascularisation des cellules tumorales. La chimiothérapie classique du cancer a été principalement pratiquée avec des associations d'agents, utilisant principalement un agent inhibiteur de la synthèse des acides nucléiques ou des protéines, tel que le 5-fluoro-uracile (5-FU), la mitomycine (MMC), le cisplatine (CDDP) ou l'adriamycine (ADR). Cependant, ces agents ont des effets secondaires importants, si bien que la chimiothérapie demeure un traitement auxiliaire, et également les quantités utilisées sont très limitées par suite des effets secondaires. Donc, dans les conditions existantes, on ne peut pas obtenir de résultats thérapeutiques satisfaisants. D'autre part, ces dernières années, on a tenté de traiter le cancer par renforcement du mécanisme d'exclusion des corps étrangers, qui est un mécanisme immunologique de défense naturel des organismes. On sait que les médicaments typiques utilisés à cet effet comprennent diverses lymphokines, y compris les interférons et les interleukines. Cependant, par nature, ces substances sont toutes produites localement uniquement lorsqu'un corps étranger a envahi un organisme pour provoquer localement diverses réactions biologiques, si bien qu'il est fréquent qu'un effet secondaire, tel qu'une pyrexie médicamenteuse, apparaisse par suite de l'administration générale de ces substances pour le traitement du cancer. Cependant, probablement du fait que les cellules cancéreuses sont difficilement reconnues comme des corps étrangers par les organismes, les cancers auxquels ce traitement peut être appliqué sont très limités. Donc, dans les conditions existantes, on ne peut pas dire que les résultats thérapeutiques soient très bons. Comme exposé ci-dessus, les agents antitumoraux, comprenant un agent inhibant la synthèse des acides nucléiques ou des protéines, classiquement utilisés dans les domaines cliniques, ont des effets secondaires importants et ne sont pas non plus satisfaisants du point de vue de l'effet. Les agents antitumoraux utilisant une action d'immuno- potentiation de l'organisme, que l'on appelle préparations modificatrices de la réponse biologique (MRB), ont également des effets secondaires, tels qu'une pyrexie médicamenteuse et, de plus, le type des tumeurs à traiter est très limité. Un but de la présente invention est de fournir un agent antitumoral et un agent antimétastatique gui comprennent une substance de faible toxicité provenant de composants de l'organisme pour permettre le traitement du cancer et qui utilisent des mécanismes de régulation inhérents aux organismes. Pour atteindre ce but, l'invention fournit un agent antitumoral et un agent antimétastatique, ayant comme composant actif un inhibiteur de la ribonucléase qui est une substance particulièrement efficace comme agent antitumoral pour le traitement de la leucémie lymphocytaire des tumeurs du cerveau, du cancer des poumons, du cancer du sein, du cancer du foie, du cancer de l'estomac et du cancer du gros intestin, ainsi que contre les cellules des mélanomes et autres, ou une substance efficace comme agent antimétastatique contre la métastase aux poumons et la métastase aux ganglions lymphatiques. La substance de l'invention a une forte activité antitumorale et présente un effet remarquable contre les cancers solides, tels que le cancer du sein et le cancer du colon. Elle est également efficace contre les métastases aux poumons et les métastases aux ganglions lymphatiques, qui posent un problème lorsqu'un cancer solide dans ces ilots primaires a été enlevé chirurgicalement, si bien qu'elle convient bien pour éviter des métastases après une opération. De plus, par suite de sa très faible toxicité, elle présente également la caractéristique de pouvoir être utilisée pendant une période prolongée. Egalement, comme elle est soluble dans l'eau, elle est facile à manipuler et permet d'obtenir une préparation très stable. L'invention sera mieux comprise à la lecture des modes de réalisation décrits ci-après en regard de la figure unique annexée qui est un graphique illustrant les activités antitumorales de l'inhibiteur de la ribonucléase contre la multiplication de cellules humaines de tumeur du colon (Co-4) transplantées à des souris nude. L'inhibiteur de la ribonucléase est une substance capable de former un complexe avec une enzyme de coupure de l'ARN, c'est-à-dire une ribonucléase, pour inhiber spécifiquement son activité. On considère que c'est une substance qui existe fondamentalement dans tous les organes et tous les tissus des organismes et qui participe à la synthèse des protéines des organismes et concerne donc fortement la régulation de la multiplication cellulaire. Actuellement, l'inhibiteur de la ribonucléase est utilisé dans le domaine du génie génétique comme réactif empêchant que l'ARN messager soit décomposé par une ribonucléase lorsque l'ARN messager est recueilli à partir d'une cellule. On estime que l'inhibiteur de la ribonucléase a un pouvoir de multiplication aussi rapide que celui des cellules tumorales, mais que, contrairement aux cellules tumorales, il est contenu en grande quantité dans un tissu fortement contrôlé. Comme matières pour sa préparation, on utilise de préférence des placentas humains. Plus particulièrement, on peut purifier l'inhibiteur de la ribonucléase à partir d'un placenta humain par chromatographie d'affinité en utilisant du ribonucléase-Sepharose selon la méthode de Blackburn (J. Biol. Chem., Vol. 252, pp. 5904-5910, 1977). L'inhibiteur de la ribonucléase est également commercialisé par exemple sous forme de RNasin (Promega Biotec Co., USA), Human placental ribonuclease inhibitor (Amersham Co., Grande-Bretagne) et Ribonuclease inhibitor (Takara Shuzo K.K.), et il est donc facile de se le procurer. L'inhibiteur de la ribonucléase est une substance dont la structure primaire a été déterminée par le groupe des présents inventeurs et le groupe de Vellee et coll., bien que sa structure N-terminale ne soit pas totalement identifiée (Biochemistry, Vol. 27, pp. 8545-8553, 1988). Dans la présente invention, on utilise cet inhibiteur de la ribonucléase comme agent antitumoral et agent antimétastatique et la 2647 0 1 7 forme d'administration peut être une forme quelconque convenant à l'administration intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire ou intratumorale. Comme véhicule pour l'administration de l'inhibiteur de la ribonucléase, on peut par exemple utiliser une solution salée tamponnée avec du phosphate de sodium et stérilisée, contenant 10 mM de glutathion réduit. Il n'y a pas de limitation particulière à la posologie de l'inhibiteur de la ribonucléase. Cependant, comme l'indiquent les exemples décrits ciaprès, une dose de 5 à 1 000 ng/souris est efficace dans tous les cas. Donc, l'effet prévu peut être obtenu par utilisation d'une très faible quantité. La dose théorique peut être de 0,25 à 50 kg/kg pour 1 kg de poids corporel. Il semble que cette dose assure un effet suffisant chez l'homme. En ce qui concerne la toxicité de l'inhibiteur de la ribonucléase, comme l'indiquent les exemples décrits ci-après, aucune diminution du poids corporel ni changement du brillant du poil n'est observé dans aucun exemple dans les limites des gammes posologiques utilisées chez la souris dans ces expériences. Il est donc confirmé que l'inhibiteur de la ribonucléase a une très faible toxicité. Donc, on peut prévoir peu d'effets secondaires dans la gamme posologique efficace. La substance selon l'invention est particulièrement efficace comme agent antitumoral pour le traitement de la leucémie lymphocytaire, des tumeurs du cerveau, du cancer des poumons, du cancer du sein, du cancer du foie, du cancer de l'estomac et du cancer du gros intestin, ainsi que contre les cellules des mélanomes et autres, ou comme substance efficace comme agent antimétastatique contre les métastases aux poumons et les métastases aux ganglions lymphatiques. L'activité antitumorale de la substance selon l'invention peut également être accrue par son utilisation en association avec des substances actives connues. Dans l'invention, l'action de l'inhibiteur de la ribonucléase et le mécanisme par lequel il peut avoir un effet antitumoral et inhibiteur de la métastase des cellules tumorales, n'ont pas été élucidés. Cependant, on peut proposer l'hypothèse suivante. L'inhibiteur de la ribonucléase est une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 50 000 qui forme un complexe 1/1 avec l'angiogénine. D'autre part, Lobb et coll. indiquent (dans Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 84, p. 2338, 1987) que l'inhibiteur de la ribonucléase peut fortement inhiber l'activité de néovascularisation de l'angiogénlne et peut simultanément inhiber l'extension des vaisseaux nouvellement produits qui apportent des substances nutritives aux cellules tumorales. Il semble donc que l'inhibiteur de la ribonucléase ait pour effet d'inhiber la néovascularisation attribuable à l'angiogénine et inhibe ainsi l'activité ribonucléasique, et il semble que l'effet antitumoral et l'inhibition de la métastase des cellules tumorales résultent de cette action. Selon les expériences effectuées par les présents inventeurs, l'inhibiteur de la ribonucléase n'a pas d'influence sur la réplication des cellules de tumeur mammaire en culture ni des cellules endothéliales normales, si bien que l'on peut également présumer que la substance n'a pas d'action directe sur les cellules. Cependant, on observe de façon remarquable un effet d'inhibition de la multiplication des cellules tumorales et de prolongation de la vie et on a pu observer une guérison complète après administration d'une petite quantité par voie intrapéritonéale, sous-cutanée ou intratumorale à des animaux cancérisés, tels que des souris porteuses de cellules du sarcome Meth A, de cellules de tumeur mammaire ou de cellules de mélanome, et à des êtres humains porteurs de cellules de tumeur mammaire, de cellules de tumeur du colon ou de cellules de tumeur du poumon. Il est de plus possible d'utiliser la substance comme agent antimétastatique afin d'éviter la métastase des cellules tumorales après une opération chirurgicale. Ainsi, dans un système modèle de la métastase aux poumons utilisant des cellules de la tumeur du poumon de Lewis de la souris, une combinaison d'un traitement avec l'inhibiteur de la ribonucléase et d'une opération chirurgicale d'un îlot primaire a assuré une inhibition significative de la métastase aux poumons et de la métastase aux ganglions lymphatiques. La présente invention est illustrée de façon plus détaillée par les exemples ci-après. L'inhibiteur de la ribonucléase utilisé dans les exemples suivants a été purifié à partir d'un placenta humain par chromatographie d'affinité avec du ribonucléase-Sepharose selon la méthode de Blackburn (J. Biol. Chem., Vol. 252, pp. 5904-5910, 1977). Pour l'administration de l'inhibiteur de la ribonucléase, on utilise comme véhicule une solution salée tamponnée au phosphate de sodium et stérilisée, contenant lOmM de la forme réduite du glutathion et lmg/ml de sérum-albumine bovine (SAB). L'invention vise également l'utilisation d'un agent antitumoral décrit précédemment pour l'obtention d'un médicament pour le traitement d'une leucémie lymphocytaire, d'un cancer notamment de tumeurs du cerveau, de cancer des poumons, de cancer du sein, de cancer du foie, de l'estomac ou de l'intestin ou de cellules de mélanomes, ou pour le traitement de métastases de cellules tumorales, en particulier de métastases aux poumons ou aux ganglions lymphatiques. 26470 1 7 Exemple 1 (Effet d'inhibition de la multiplication tumorale et de prolongation de la vie de l'inhibiteur de la ribonucléase relativement à des cellules du sarcome Meth A de souris) On transplante par voie intradermique 2,0 x 105 cellules du sarcome Heth A à des souris femelles Balb/c (âgées de 6 semaines) et on administre l'inhibiteur de la ribonucléase par voie intratumorale ou intrapéritonéale à une dose de 10 ng/souris, 100 ng/souris et 1 000 ng/souris, 7 fois successives, du 10ème jour au 16ème jour pendant la période o les cellules de sarcome constituent une tumeur ayant un volume de 200 à 300 mm3, puis on mesure les variations du volume de la tumeur et les moyennes des jours de survie. A titre comparatif, on effectue des expériences semblables avec un agent cancérostatique connu, le 5-FU, par administration intrapéritonéale à la dose de 20 mg/kg.j. Les résultats obtenus figurent dans les tableaux 1 et 2. On observe un effet d'inhibition de la multiplication tumorale pendant l'administration des diverses doses. En ce qui concerne la posologie optimale, on obtient un effet maximal pour l'administration intratumoraleà la dose de 100 ng/souris, l'effet antitumoral étant meilleur que celui de l'agent cancérostatique 5-FU connu (20 mg/kg.j, ip x 7). Même pour l'administration intratumorale à la dose de 10 ng/souris, on observe un effet d'inhibition de la multiplication tumorale égal à celui du 5-FU et également on constate l'absence totale de toxicité. D'autre part, en ce qui concerne l'effet de prolongation de la vie, on n'observe un effet significatif que pour l'administration intratumorale de ng/souris et l'administration intrapéritonéale de 1 000 ng/souris relativement au témoin. Dans le groupe d'administration intratumorale de ng/souris, 1/8 des souris étudiées survit pendant 90 jours ou plus, une disparition complète des tumeurs étant observée. Ce sont des résultats significatifs indiquant qu'un effet thérapeutique peut être obtenu par l'administration de l'inhibiteur de la ribonucléase même dans le cas o les tumeurs ont atteint un stade o elleú se scnt multipliées à un certain niveau. Tabl eau I liffet antitumoral de l'inhibiteur de la ribonucléase sur des cellules de sarcome Meth de la soturis Variationde l '_ Dose poids au Volume moyen des turmeurs (mn - ET) Doe poids au Traite- (ng/ jour () Jotur 14 Jour 18 Jour 21 Jour 75 Jour 51 ment sour is) jour ((, roupetraitér/tàmoin) T6moin - +1.91 504+162 1176+285 2091+438 2662+696 6670+1195 HPRI (intratumorai): 1000 +1145 212+110**** 660+327*** 1296+582 1833+738* 4739f1662* ( 42,1) (56,1) (62,0) (68,6) (71,0) +117 56+27**** 124+117**** 471+425**** 647+507**** 2111+1237**** o (11,1) (10,5) (22,5) (24,3) (31.6) +1,46 183+12**** 538+326**** 1067+545**** 1399+629*** 3015+939**** (3673) (45.7) (51.0) (52.6) (45,2) HPRI (intraperitonéal): 1000 +1.57 128+96**** 302+309**** 595+530**** 941+754*** 2624+1724**** (2574) (2577) (28,5) (35.3) (39t1) -FU: -0122*** 223+89**** 610+89**** 1040+45**** 1048+382**** 2954+656**** mg/kg (44-2) (51,9) (4971) (40-6) (44,3) HPRI inhibiteur de la ribonucléase Dirférence significative des groupes traités relativenent au té sin * P Tableau 2 Effet de prolongation de la vie de l'inhihiteur de la ritnnucl,%qse sur des celidles cd sarrom. lvth A de la souris Taux de pro- Variation longation deNombre de de poids la vie guérisons au 186me Jours de survie des Jours moyens (groupe trai- complètes/ Traite- Dose jour individus de sturvie té/témoin.) total ment (ng/ souris) (g) (j) (j t ET) _ Témoin: - +1 91 31,32,32,33,33, 33,7+0 1 6 - 0/10 34,35,35,36,36 HPRI (intratumoral) 1000 +1,45 31,31,32,35,38, 36,641;8 11819 0/8 39,42,44 - +1117 23,39,42,42,42, 4210+319* 13618 1/8 42,52,60 3 +1t46 25,30,32,33,35, 3419+2/5 113r4 0/8 37, 38,49 HPRI (intrapéritonéal): 1000 +1t57 33,37,42,44,52 4116+312* 135f5 0/5 FU: 20 mg/Kg -0;22 24,32,36,36,37, 3518+210 11614 0/8 37,42,42 HPRI: inhibiteur de la ribonucl]ase * Différence significative des groupes traités relativement au témnin: 26 4 7017 Exemple 2 (Effet d'inhibition de la multiplication tumorale par administration de l'inhibiteur de la ribonucléase relativement à des cellules de la tumeur mammaire MM46 de la souris) On transplante par voie intradermique 5 x 105 cellules de la tumeur mammaire MM46 à des souris femelles C3H/He et on administre l'inhibiteur de la ribonucléase par voie intratumorale ou intrapéritonéale à une dose comprise entre 50 et 1 000 ng/souris, de façon continue, 9 fois du 10ème au 18ème jour après la transplantation. On tue les souris le 42ème jour après la transplantation et on prélève les tumeurs pour les peser. A titre comparatif, on effectue des expériences semblables avec un agent cancérostatique connu, la nimustine, par administration intrapéritonéale à la dose de 5 mg/kg.j. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 3. Pour l'administration intratumorale de 50, 100 ou 500 ng/souris de l'inhibiteur de la ribonucléase, on observe un effet inhibiteur puissant correspondant à un taux d'inhibition de la multiplication tumorale de 72, 9 % à 88,9 %. D'autre part, on observe également un taux d'inhibition de 80,3 % pour l'administration intrapéritonéale de 500 ng/souris. D'autre part, on n'observe pas d'effet significatif d'inhibition de la multiplication tumorale avec la nimustine (5 mg/kg.j, ip x 9), ce fait confirmant que l'inhibiteur de la ribonucléase est efficace par administration intratumorale comme par administration intrapéritonéale. Tableau 3 Efret antitumoral de l'inhibiteur de la ribonucléase sur des cellules de tumeur mammaire MMI'6 de la souris Variation Puids Groupe Nombre de de poids au moyen des traité/ guérisons *Traite- Dose 20ème jour Poids des tumeurs au 42ème jour tumeurs témoin complètes/ ment (ng/souris) (g) mg) ( E)a (mg: ET) Control: - +O040 3632,3801,3849,5220,7284, 6912+842 -- 0/10 7802,8111,8271,10320,10830 HPRI (intratumor al): 500 +Or080 0,0,262,383,507, 767+365**** 11 1 2/8 1716,2515,8812# +1f03 0,0,0,65,86, 1323+496**** 19,1 3/10 1515,1679,2250,3462,4178 +0,83 0,778,1160,1172,1429, 1597+469**** 27 1 1/10 1853,1859,4522,4522,10570# HPRI (intrapéritondal): 1000 +1,49 0,0,104,1616,1711, 2191+968*** 31f7 2/8 3010,4038,7050 500 +0,80 276,276,475,479,488, 1363+582**** 19,7 0/10 1119,1527,1852,5766,10813# Nimustine: mg/Kg +0t88 819,827,2929,4131,4515, 4316+977 62r4 0/8 6088,6452,8673 HPRI: inhibiteur de la ritonucléase Difrérence significative des groupes traités relativenment au témoin *** P #: Abandonné Exemple 3 (Effet d'inhibition de la multiplication tumorale et effet de prolongation du temps de vie par administration de l'inhibiteur de la ribonucléase relativement à des cellules de tumeur mammaire MM46 chez la souris) On implante par voie sous-cutanée 2 x 105 cellules de la tumeur mammaire MM46 à des souris femelles C3H/He (âgées de 6 semaines) et on administre l'inhibiteur de la ribonucléase par voie intrapéritonéale à une dose comprise entre 10 et 1 000 ng/souris, de façon continue, 9 fois du ler jour au 9ème jour après la transplantation. On mesure le volume des tumeurs au 14ème jour après la transplantation et on observe les moyennes des jours de survie. A titre comparatif, on effectue des expériences semblables avec un agent cancérostatique connu, la nimustine, par administration intrapéritonéale à la dose de 5 mg/kg/jour. Les résultats obtenus figurent dans les tableaux 4 et 5. - Pour l'administration intrapéritonéale de 10 ng/souris de l'inhibiteur de la ribonucléase, on n'obtient pas un effet très puissant, le taux d'inhibition de la multiplication tumorale étant de 35,8 %. On observe un taux d'inhibition de 75 % ou plus lorsqu'on effectue l'administation intrapéritonéale à des doses de ng/souris, 500 ng/souris et 1 000 ng/souris. De même que l'effet d'inhibition de la multiplication tumorale, on observe un effet de prolongation de la vie de 166,8 % ou plus pour l'administration d'urne dose au moins égale à 50 ng/kg, ce qui est supérieur à l'effet obtenu avec la nimustine (5 mg/kg.j, ip x 9). En particulier, dans le groupe auquel l'inhibiteur de la ribonucléase est administré par voie intrapéritonéale à la dose de 50 ng/souris, 7/9 des souris étudiées survivent 60 jours ou plus et toutes les souris survivantes sont des animaux totalement guéris. Donc, les cellules de la tumeur mammaire MM46'de la souris se révèlent être également une souche de cellules tumorales très sensible à l'administration intrapéritonéale de l'inhibiteur de la ribonucléase. Tableau 4 Effet antitumoral de l'inhibiteur de la ribonucléase sur des cellules de tumeur mammaire MM46 de la souris Nombre de Variation Nombre de de poids Volume Groupe guérisons de poids au ème jour Volume des tumeurs moyen den traité/ complètes/ Traite- Dose ( 14ème iour) tumeurs témoin total ment (ng/souris) (mmg)3 (mmm3 ET) (60ème jour) Témoin - +2167 507,827,914,945, 1146 967+131 0/6 HPRI: 1000 +2,16 0,0,0,0,0,54,163,261, 210+64**** 21r7 3/8 _ 389,440,513,703 500 +2t22 0,0,0,102,175,254, 233+74**** 2411 3/10 467,488,614,1118# +215 0,0,0,69,175,183,254, 129+42**** 12,5 3/9 286,793# +2,64 339,362,5088,609,689, 622+73* 64r3 0/8 721,861,888 Nimustine: mg/Kg +0t55 143,200,345,379,769 376+110* 38,0 0/5 HPRI: inhibiteur de la ribonucl(-hse Diffémrence significative des groures traités relativement au tAmnin: * P #: Abandonné o Tabl eau 5 Effet de prolongation de la vie de l'inhibiteur de la rihontuclWase sur des cellules do tumeur mammaire MMi46 de Taux de pro- Nombre de longat ion de guérisons Var iat i on la vie complètes/ Dosede poids au Joulrs moyens (groupe trni- total Dose Traite- (ng/ lOème jour Jours de;uil'vie d(e survie té/tmoin, %) ment souris) (g) (60ème jour) __ (J - ET) (j - IT) Témoin: - +2 t 67 13,13,13,13,14,14,15, 14,2+0 14 -- 0/10 ,16,16 HPRI: 1000 +2,16 20,23,31,34,60,60,60, 49p8+415**** 350f7 9/13 ,60,60,60,60,60 500 +2 1 22 20,25,25,29,31,31,60, 37 8+5 6**** 266,8 3/9 ,60 +2151 34,35,60,60,60,60,60, 5413+3,7**** 382 t6 7/9 ,60 +2,64 15,15,17,23,25,35,60# 2117+3 2*** 15215 1/7 Nimustine: mg/Kg +0,55 25,28,29,30,35 2914+1,5**** 207 0 0/5 HPRI: inhibiteur de la rilomncrléase Différence significative des groupes traités relativement au tétmin *** P 34#: Abandonné Exemple 4 (Effet d'inhibition de la multiplication tumorale et effet de prolongation du temps de vie par administration de l'inhibiteur de la ribonucléase relativement à des cellules de mélanome B16 de la souris) On transplante par voie sous-cutanée 1 x 105 cellules de mélanome à des souris femelles BDFI (âgées de 6 semaines) et on administre par voie intrapéritonéale l'inhibiteur de la ribonucléase à une dose comprise entre 5 et 500 ng/souris, de façon continue, 20 fois du ler au 20ème jour après la transplantation. On mesure le volume des tumeurs au 21ème jour après la transplantation et on détermine les jours moyens de survie. A titre comparatif, on effectue des expériences semblables avec les agents cancérostatiques connus que sont le cisplatine et l'acétate de cortisone, que l'on administre aux doses indiquées. Les résultats obtenus figurent dans les tableaux 6 et 7. Pour l'administration de l'inhibiteur de la ribonucléase à une dose de 5 à 500 ng/souris, on obtient un taux d'inhibition de la multiplication tumorale d'environ 50 % seulement, qui n'est pas supérieur à l'effet du cisplatine (1 mg/kg.j, ip x 20) et de l'acétate de cortisone (50 mg/kg.j, sc x 20). Cependant, pour l'administration de l'inhibiteur de la ribonucléase à des doses de ng/souris.jour, ip x 20 et 100 ng/souris.jour, ip x 20, on observe un effet significatif de prolongation de la vie, qui est cependant légèrement inférieur à celui du cisplatine et de l'acétate de cortisone. Tableau 6 Effet antitumnoral de l'inlinhillit eur d(e la rihouie]'n'e sur des cel lules de mélanomne B16i de la soouris Variation Volume Groupe de poids au Volume den tumeurs moyen des traité/ Traite- Dose 12ème jour _,(2lme_jnur) ___ tumeurs témoin ment (rng/souris m) (g)3m3 _ _ __ _ - -ET(mm) (MM____) Témoin - +2129 1025,1113,1162,1564,1629 1853+223 -- 1943,1995,2138,2969,2988 HPRI: c. 500 +2r30 58,133,294,466,753,843, 786+208*** 42t4 1175,1532,1831 +3f50 478,749,961,1386,1476, 1233+157* 6616 +3T83 29,450,554,1099,1133, 1229, 918+182*** 49y5 1376,1493 +3127 487,823,841,943,1020,1403, 916+171*** 49>4 Cysplatine: 1 mg/Kg -0f71 0,0,159,218,240,344,459, 254+78**** 13,7 605,112 HPRI: inhibiteur de la ribcnuc16mase Différence significative des groupes traités relativement au témain: * P Tableau 7 E.ffet de prolongation de la vie de l'inhibiteur de la ribonucléase sur des cellules de melanome Bl6 de souris Variation Taux de prolonga- tion de la vie de poids au Jours moyens (groupe traite/ Traite- Dose 21ème jour Jours de survie de survie tbmoin) (%) ment (ng/ souris (g) (j - ET) (jI T) Thmoin - +2129 14#,21,21,21,21,21, 21 t 6+02 -- 22,22,22,23HPRI: 500 +2]30 21,21,23,23,24,31, 2810+2,4** 12919 34,34,41 +3150 28,29,29,31,32,34, 31;8+ 10**** 14713 34,37 +3183 28,29,29,31,32,32, 3116+1 2**** 146t7 34,38 +3 27 22,22,23,23, 29,34, 2718+2t 1*** 128r7 34,35 Cysplat ine: 1 mg/Kg -0171 20,31,34,34,36, 36, 3414+1 8**** 159r6 HPRI inhlibiteur de la ribonucléase Dif'emnce sigificative des groues traités relativement au témoin:. * P Exemple 5 (Effet d'inhibition de la multiplication tutorale de l'inhibiteur de la ribonucléase relativement à des cellules de tumeur humaine du colon (Co-4) transplantées dans les capsules surrénales) On transplante dans les capsules surrénales de souris femelles BDFI (àgées de 6 semaines) une masse de cellules de 10 mm3 d'une souche de cellules de tumeur du colon humaine et on admistre par voie intrapéritonéale l'inhibiteur de la ribonucléase à une dose comprise entre 10 et 1 000 ng/souris, de façon continue, 5 fois du ler jour au 5ème jour après la transplantation. On tue les souris le 6ème jour après la transplantation des tumeurs et on mesure les petits axes et grands axes des tumeurs avec un microscope stéréoscopique pour calculer le volume des tumeurs. A titre comparatif, on effectue des expériences semblables avec les agents - cancérostatiques connus que sont le 5-FU, la mitomycine C, la nimustine, l'adriamycine et le cisplatine, que l'on administre aux doses indiquées. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 8. L'inhibiteur de la ribonucléase assure un taux d'inhibition compris entre environ 30 et 35 % pour l'administration d'une dose quelconque, l'effet d'inhibition de la multiplication tumorale étant cependant légèrement inférieur à celui des agents cancérostatiques connus. Pour l'administration à une dose de 1 000 ng/souris, ip x 5, il présente cependant un effet comparable a celui de la nimustine (10 mg/kg.j, ip x 2). Effet antitumoral de l'inhihiteur de la ribonucléase sur une tumeur humaine du gros inlestin (Co-4) par implantation dans les capsules surrénales Schéma Variation d'adminis- de po.ds au Rapport des volumes des Moyenne du rapport Groupe Traite- Dose urdii d oisu tumeurs (t aille au 6ème jour/ des volumes-des traité ment (ng/souris) traion 6myg tail]e initiale) tumeurs témoin Témoin - +Or 80 lt500,1t375,lr8l2,11342 1, 507+0r 107 -- HPRI 1000 1j -j5 +0r97 0r950,01937,1t000 0t 962+0,019*** 638 3 jl-j5 +0,33 1,047,1,125,1,083,0,909 1 1041+0,049*** 69,0 - jil-j5 +0 40 0 954,1 t105,1p023,1 085 1,041+Ot 034*** 69t1 -FU: mg/Kg jil & ji'J 00 0r857,0 791,0,900,07833 0 845+0,022**** 56,0 Mitomycine: 2 mg/Kg jl & j4 +0195 01857,01782,0,809,01880 0r832+0rO,22**** 55 1 Nimuistine: mg/Kg jl & jil +3r8 01952,0.695,1rll7,1t000 Or941+0,089**** 62/4 Adriamycin e: mg/Kg jl &,j4 -0 83 01894,01875,0t879,0 1 900 0 869+ 0r0O20*** 57 6 Cysplatine: 2 mg/Kg jl-j5 -0r45 0,894,01789,0,826,0F772 Or820+0,027**** 54?4 HPRI: inhibiteur de la ribnmnclas.e ITié'rerîce signuificative d(es groupes traités re]ativenent au troin: ** P Exemple 6 (Activité antitumorale de l'inhibiteur de la ribonucléase contre la multiplication de cellules de tumeur du colon humain (Co-4) transplantées à des souris nude) On transplante des fragments de tumeurs Co-4 de 200 à 250 mm3 à des souris femelles Balb/c nu/nu(-) et on effectue une étude comparative entre un groupe auquel on administre l'inhibiteur de la ribonucléase par voie intrapéritonéale, 8 fois un jour sur deux du 2ème jour au 16ème jour après la transplantation des O tumeurs, et un groupe auquel on administre l'inhibiteur de la ribonucléase par voie intrapéritonéale, chaque jour, du 25ème jour au 34ème jour après la transplantation. Les résultats obtenus sont illustrés par la figure unique annexée. On administre l'inhibiteur de la ribonucléase à une dose de 250 ng/souris ou 500 ng/souris. On observe un effet remarquable d'inhibition de la multiplication pour les deux doses lors de l'administration initiale, et l'effet d'inhibition de la multiplication tumorale se maintient, même dans le cas o l'administration ne commence qu'après le 25ème jour, tant que l'on poursuit l'administration intrapéritonéale de l'inhibiteur de la ribonucléase. Cela suggère qu'il peut y avoir une corrélation entre l'effet d'inhibition de la multiplication des cellules de tumeur du colon humain et la présence d'inhibiteur de la ribonucléase dans les organismes. Exemple 7 (Activité antitumorale de l'inhibiteur de la ribonucléase contre la multiplication de cellules de tumeur mammaire humaine (MX-1) transplantées à des souris nude) On transplante des fragments de tumeur MX-1 mesurant 2 x 2 mm à des souris femelles Balb/c nu/nu(-) et on les examine en fixant comme ler jour le moment o le volume des tumeurs atteint 532 139 mm3 le 13ème jour après la transplantation, et on administre l'inhibiteur de la ribonucléase par voie intrapéritonéale, 6 fois par semaine à une dose de 5 à 500 ng/souris.jour, en poursuivant cette administration pendant 4 semaines. Les résultats, qui figurent dans le tableau 9, ont été 2647 0 1 7 obtenus par pesée des tumeurs le 28ème jour après l'administration dans les groupes auxquels l'inhibiteur de la ribonucléase était administré par voie intrapéritonéale. A titre comparatif, on effectue des expériences semblables avec des agents cancérostatiques connus, l'acétate de cortisone et la nimustine, administrés aux doses indiquées. Les résultats obtenus figurent également dans le tableau 9. Dans le groupe auquel l'inhibiteur de la ribonucléase a été administré par voie intrapéritonéale à une dose de 100 ng/souris.jour, on observe un meilleur effet antitumoral que dans les groupes auxquels l'acétate de cortisone (50 mg/kg.j, ip x 24) et la nimustine (2 mg/kg.j, ip x 24) ont été administrés. Le tableau 10 indique les changements typiques de volume des tumeurs dans le groupe auquel l'inhibiteur de la ribonucléase a été administré par voie intrapéritonéale à une dose de ng/souris.jour. Dans ce tableau, on observe l'évolution de la multiplication tumorale exprimée par le rapport du volume de la tumeur (To) avant l'administration au volume de la tumeur (Tt) après l'administration. Comme le montre le tableau 10, l'administration intrapéritonéale de 100 ng/souris assure un remarquable effet d'inhibition de la multiplication tumorale pendant l'administration par rapport au témoin. Tableau 9 Effet antitumoral de l'inlhibiteur de la rionl;lésE sur dles rel lules fio tumruir mammai nr humaines (souche MX-1) transplantêes,à des souris nuilde Variation Po i:; G'otupf dle poids au Poids des tumfrurs, tmoyonl dr traitio/ Treat- Dose 28ème jour 28 ème jour!ltft"ui' t.fmoin ment (ng/mouse) (g) (mg) (M Témo in - +7 70 5561,6074,7699;8878, 9371+992 10119,11324,12050,13265 HPRI: 500 +6 155 4750,7172,11666,13549 9286+2017 99, 1 +3109*** 2770,3776,4661,6021, 4714+675*** 50r3 6332,11393# +7129 5573,6005,6116,9905, 8233+1545 87r8 +5t44 3871,5585,8231,10355, 8299+1217 88/6 10361,11291 Nimustine 2 mg/Kg +3,. 29*** 3496,5455,7644,8440, 4783+398*** 51t0 HPRI: inhibiteur de la ribonuclMF.Se Différence significative des groupes traitAs relativement au téRmin: ** P Tableau 10 Effet d'inhibition de la multiplication tumorale de l'inhibiteur de la ribonucléase sur des cellules de tumeur mammaire humaines (souche MX-1) transplantées à des souris nude Dose Rapport des poids des tumeurs (volume avant traitement/vo]ume * ET avant traitement) Trai'te- { rg/ Tratesouris) Jour 5 Jour 8 Jour 10.Jour 12 Jour 15 (%, rapport en volume des tumeurs du groupe traité/rapport en volume des tumeurs du témoin) Témoin: - 3 158+0T25 5131+0141 6t255+0160 8108+1t 29 10/61+1,57 HPRI: 2ó65+0t19* 2 60+0711**** 3130+0,15*** 3t48+0,52** 5,27+0,28* (ipx6/sem.,4 sem.) (74f0) (49/0) Dose..- Taihte- (ng/ Jour 17 Jour 21.Jour 23.Jour 25) Jour 28 ment soupriE) mn _ _ r)(%, rlpport en voliume des tumilurs du groupe traité/rapport en volume des tumeurs du témoin) Témoin - 13,43+1188 15/22+3,04 17,09+3/50 18r63+3120 19 99+3t 17 HPRI: 6r56+0r52** 7/81+0 59 8 45+0t55 10/39+0 72 12 39+0/73 (ip x 6 sem., 4 sem.9)(489 513 495 (557) (2; HPRI: inldbiiteur de la ribonucléare Difúérence siFnificative des roupes traités relativement au têmoirn,: * P o4 26 4 7017 Exemple 8 (Effet antimétastatique de l'inhibiteur de la ribonucléase contre des cellules de tumeur pulmonaire de Lewis) On transplante par voie intradermique des cellules de tumeur pulmonaire de Lewis dans les oreilles droites de souris femelles BDFI (âgées de 5 semaines) et on administre l'inhibiteur de la ribonucléase par voie intrapéritonéale à une dose de 10 à 1 000 ng/souris, de façon continue pendant 10 jours, à partir du ler jour suivant la transplantation des tumeurs. On excise chirurgicalement les îlots primaires le 14ème jour après la transplantation des tumeurs. Ensuite, on tue les souris au 2lème jour et on détermine la métastase des cellules tumorales aux poumons et aux ganglions lymphatiques pulmonaires par mesure du poids des ganglions lymphatiques métastatiques et du nombre des ganglions présentant une métastase pulmonaire. A titre comparatif, on effectue des expériences semblables avec les agents cancérostatiques connus que sont le 5-FU, le lentinane et l'acétate de cortisone administrés aux doses indiquées. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 11. - Pour l'administration de l'inhibiteur de la ribonucléase à une dose de 10 à 1 000 ng/souris, on n'observe pas d'effet d'inhibition de la multiplication tumorale au 14ème jour et on observe une inhibition de 51, 7 % de la métastase aux poumons et de 56,0 % de la métastase aux ganglions lymphatiques dans les conditions optimales d'administration de 50 ng/souris.jour. D'autre - part, on observe une inhibition de la métastase aux poumons de 49,5 % pour l'administration du 5-FU (5 mg/kg.j, ip x 10) mais la métastase aux poumons est doublée pour l'administration de l'acétate de cortisone (50 mg/kg.j, ip x 10). La raison de cet accroissement de la métastase aux poumons est incertaine, mais il est possible que l'accroissement résulte de l'effet immunosuppresseur produit par l'acétate de cortisone. Egalement, du fait que l'on observe aucun effet d'inhibition de la métastase aux poumons pour l'administration du lentinane, qui est ce qu'on appelle un agent d'immunopotentiation (1 mg/kg.j, ip x 10), l'effet d'inhibition de la métastase aux 26470 1 7 poumons et aux ganglions lymphatiques, attribuable à l'inhibiteur de la ribonucléase, ne semble pas résulter uniquement d'un mécanisme d'immunopotentiation. Tableau 1 1 Effet antimétastatique de l'inhibiteur de la rihonicléa; e sur le cancer du poumion de Lewis Poids moyen des Nombre moyen dos Poids moyen des métastases aux ganglions ganglinns lymphatiques tumeutrs.!ymplatiqiha __es métastasés Variation 14me (groupe 21eme jour, (groupe 21 fme jour (groupe Dose de poids au jour trai té/ (mg - ET) trait!/ (nombre- traité/ Traite(ng/ 2lème,jour Nombre (mg - ET) tmoin) t miloin) ET) témoin) ment souris) __(g) Témoin: - +1;70 21 767+76 - 714+018 - 24 1+317 - Solution tampon: c +2100 8 617-+165 80,4 576+1 3 78,1 20 9+210 86,7 HPRI: 1000 +1,95 6 548+97 71 4 719+1,0 103,7 13t8+3,8 57,5 500 +0,85 6 786+207 102,4 28+1,3 38_3 0+106 956 ++1y47 6 913+227 119t0 4r712,0 63 2 13,2+12* 54y9 +1,39 8 481+70* 62,7 3f 3+0 8*** 44,0 11 6+2, 7** 48,3 +2122 8 781+114 10118 4,4+1,3 59_9 17103r8 70,7 -FU: mg/Kg +1,85 7 534+944 69t6 3,3+0,8*** 4415 12,1+3,4* 50,5 Lentinane 1 mg/Kg +1;80 8 1098+179 143,1 617+1,8 8613 2410+5,6 99,8 Acétate de cortisone: mg/Kg -0t38 8 433+106 56f5* 413+1 1* 57t5 50r3+ 8r3*** 208,9 HPRI: inhibiteur de la ribonucléase Di[iérence significative des groupes traités relativement au téroin:. * P N REVENDICATIONS 1. Agent antitumoral, caractérisé en ce qu'il comprend comme composant actif un inhibiteur de la ribonucléase. 2. Agent antitumoral selon la revendication 1, utilisé pour traiter la leucémie lymphocytaire. 3. Agert antitumoral selon la revendication 1, utilisé pour traiter une tumeur du cerveau. 4. Agent antitumoral selon la revendication 1, utilisé pour traiter un cancer des poumons. 5. Ager.t antitumoral selon la revendication 1, utilisé pour traiter un cancer du sein. 6. Agent antitumoral selon la revendication 1, utilisé pour traiter un cancer du foie. 7. Agent antitumoral selon la revendication 1, utilisé pour traiter un cancer de l'estomac et un cancer du gros intestin. 8. Agent antitumoral selon la revendication 1, utilisé pour traiter des cellules de mélanome. 9. Agent antimétastatique, caractérisé en ce qu'il comprend comme composantactif un inhibiteur de la ribonucléase. 10. Agent antimétastatique selon la revendication 9, utilisé pour inhiber la métastase aux poumons et la métastase aux ganglions lymphatiques. 11. Médicament caractérisé en ce qu'il comprend comme composant actif un inhibiteur de la ribonucléase en une dose suffisante pour traiter un cancer notamment pour traiter des métastases de cellules tumorales. 12. Médicament selon la revendication 11, caractérisé en ce que le composant actif est présent en une dose de 0,25 à 50g/kg, de préférence en une dose de 2,5 à 5pg/kg. 13. Utilisation d'un agent antitumoral selon la revendication 1 pour l'obtention d'un médicament pour le traitement d'une leucémie lymphocytaire, de cancers notamment des poumons, du sein, du foie, de l'estomac, de l'intestin ou de cellules de mélanomes, ou pour le traitement de métastases de cellules tumorales, en particulier de métastases aux poumons ou dans les ganglions lymphatiques.