FR 2636633 A1 19900323 FR 8812264 A 19880920 La présente invention concerne un nouveau procédé de synthèse de composés oligoribonucléotides alpha. De tels composés ont été décrits dans I'état de la technique, notamment dans la demande de brevet FR 87 04339 au nom de la présente demanderesse. Ces composés oligoribonucléotides alpha consistent de des enchainements de nucléotides d'acides ribonucléiques possédant la configuration anomérique alpha non naturelle, par opposition à la configuration naturelle bêta. Ces composés peuvent être facultativement liés à un agent effecteur, notamment par une liaison covalente. Ces agents effecteurs sont maintenant bien connus dans la technique touchant aux acides nucléiques. Il s'agit principalement de radicaux intercalants, de radicaux chimiques porteurs d'une fonction réagissant directement ou indirectement avec les chaines de nucléotides ou de marqueurs dont la présence permet une détection facile, les radicaux chimiques pouvant également constituer des agents intercalants. Plus précisément, la présente invention a pour objet un procédé de préparation par synthèse sur support solide par la méthode au phosphoramidite, de composés oligoribonucléotides alpha. Des synthèses par la méthode au phosphoramidite sur support solide ont déjà été proposées pour préparer des composés oligodéoxy- ribonucléotides alpha, notamment dans la demande de brevet FR 87 04339. En revanche, les composés oligoribonucléotides alpha n'ont jamais été préparés par synthèse sur support solide dans l'état de la technique, notamment à l'aide de synthétiseurs automatisés. La préparation des composés oliribonucléotides alpha a été proposée dans l'état de la technique notamment dans la demande de brevet FR 87 04339, selon une technique en solution, par le procédé dit au phosphotriester en solution. La présente invention apporte désormais une solution au problème clé de la protection des groupes hydroxyle en position 2' des riboses dans le cadre d'une synthèse sur support solide, en proposant les deux groupes TBDMS (Terbutyldiméthylsilyl) et Ctmp: (chloro-2 méthyl-4 phényl)-l méthoxy-4 pipéridinyl-4. Le groupement Ctmp présente l'intérêt d'être compatible avec l'utilisation du groupement Dmtr (dimethoxytrityl) utilisé pour la protection des groupements hydroxyle en 5' du ribose, car il reste intact dans les conditions de déprotection de celui-ci dans un procédé de préparation sur support solide contrairement par exemple au groupement méthoxy-4 tétrahydropyrannyl-4 (Mthp). L'autre groupement protecteur proposé selon la présente invention, à savoir le TBDM.S, offre l'avantage d'une synthèse du monomère réactif plus facile et d'une élimination très aisée par un traitement aux ions fluorures, notamment par le fluorure de tétrabutylammonium dans le THF anhydre. Le procédé en phase solide selon la méthode au phosphorami- dite, objet de la présente invention, comporte les étapes essentielles suivantes - On immobilise un dérivé ribonucléoside alpha protégé, par l'intermédiaire d'une de ses fonctions hydroxyle en 2' ou 3' sur un support solide. - On assemble sur ce support dans un réacteur'synthétiseur manuel ou automatique la chaîne d'oligoribonucléotide alpha protégée par condensation de monomères constitués de ribonucléosides alpha protégés substitués par des groupes phosphoramidites en 3', la fonction hydroxyle en 2' des riboses étant protégée par les groupes Ctmp ou TBDMS. - Les oligoribonucléotides alpha sont obtenus après décrocha- ge de l'oligomère obtenu du support et élimination des groupes protecteurs. De façon appropriée, l'assemblage de l'oligoribonucléotide alpha se fait par condensation, en présence d'un agent activateur, desdits monomères entre leur fonction en 3' et la fonction hydroxyle-5' du composé ribonucléoside alpha immobilisé pour le premier monomère ou d'un composé intermédiaire polyribonucléotide alpha protégé fixé sur ledit composé ribonucléoside alpha immobilisé pour les monomères suivants. Notamment, l'agent activateur pour la condensation desdits monomères peut être choisi parmi le tétrazole et ses dérivés, tels que le paranitro-phényl tétrazole. Avantageusement, le groupe phosphoramidite en 3' desdits monomères est un groupe N,N dialkylaminophosphoramidite de formule _ / N(R 1)2 OR2 avec R1 qui représente un alkyle en C1 à C7 éventuellement substitué identique ou différent,tel que CH3, (CH3)2CH R2 qui représente un alkyle en C1 à C7 éventuellement substitué, tel que CH3, CH2CH2CN. En particulier, le groupe phosphoramidite en 3' desdits monomères est le diisopropylaminophosphoramidite de méthyle (R1 = (CH3)2CH et R2 = CH3) ou le diisopropylaminophosphoramidite de cyano-2 éthyle (R 1 = (CH3)2CH et R2 = CH2CH2CN). De façon appropriée, les groupes hydroxyles desdits monomè- res et dudit composé ribonucléoside alpha immobilisé peuvent être protégés en 5' par le groupe Dmtr. Le composé ribonucléoside alpha immobilisé peut être fixé sur le support solide via un groupe divalent sjccinyle entre un de ses groupements OH en 2' ou 3' qui se trouve ainsi estérifié, et un groupement amino du support. Le support solide peut être constitué par une longue chaîne alkylamine fixée sur un polymère, un gel de silice ou des billes de verre poreuses. Lorsque l'on veut préparer un oligoribonucléotide alpha lié à un radical effecteur, on -peut coupler la fonction hydroxylée 5' terminal de l'oligoribonucléotide alpha protégé lié au support solide, avec un monomère substitué par un radical effecteur tel qu'un groupe intercalant, un groupe chimiquement activable ou un groupe photoactivable. L'oligoribonucléotide alpha protégé lié au radical effecteur est ensuite décroché du support solide puis des groupes protecteurs sont éliminés. Selon l'invention, il est également possible de coupler la fonction hydroxyle 3' ou 5' terminal de l'oligoribonucléotide alpha préparé après décrochage et élimination des groupes protecteurs avec un radical effecteur selon les techniques connues de l'homme de l'art en particulier via une chaîne alcoylène. Ainsi, il est possible selon le procédé objet de la présente invention de préparer des composés de formule générale B H OH -OH OH R-L T-O P O O P --O -OR' II 1 O O n dans laquelle Les radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide ribonucléique éventuellement modifiée et rattachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique alpha non naturelle; Les radicaux X peuvent être identiques ou différents et représentent chacun un oxoanion O, un thioanion S, un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, un groupe aminoalkyle, un groupe aminoalcoxy, un groupe thioalkyle, Y-Z. R et R', qui peuvent être identiques ou différents, représen- tent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z. Y représente un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical choisi parmi E E -C-alk-, -C-NH-alk-, -P-U-alk-, -P-alk-, II Il I1 1t E E 00 00 E E -alk-C-N-alk-, -P-U-alk-N-C-alk- et -P-Ualk-C-N-alk- I I I I {I t II I OH O HO O OH avec U = O, N ou S. ou bien un radical -Y"-O-Y' o Y" ou Y' peuvent avoir les significations données pour Y E peut avoir les mêmes significations que X, excepté Y-Z. Z est un radical correspondant à un agent effecteur. n est un nombre entier y compris O. L représente un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe -NH-. Dans cette formule générale, on utilise la représentation condensée des nucléosides suivante Boc OH -O -O 2636 633 qui correspond à la formule développée (5') -O CH2 \/O B I I O OH (3') sur laquelle ont été mentionnées les extrémités (3') et (5'). Il convient de remarquer que la formule générale représente un enchainement de nucléotides qui peuvent être identiques ou différents, n indiquant simplement le nombre de nucléotides compris dans la molécule; n est de préférence un nombre compris entre 1 et 100, et de préférence encore entre 1 et 50. Les radicaux effecteurs correspondent à des agents effecteurs qui sont des composés connus dans les techniques touchant aux acides nucléiques. Il s'agit par exemple des composés capables de "s'intercaler" dans la structure des ADN ou des ARN. Ces agents d'intercalation sont, engénéral, constitués par des composés polycycliques ayant une configuration plane tels que l'acridine, la furocoumarine, la daunomycine, la 1,10-phénanthroline, la phénanthri- dinium, les prophyrines, les dérivés de la dipyrido (1,2-a: 3', 2'-d) imidazole, l'ellipticine ou l'ellipticinium et leurs dérivés. Ces agents effecteurs peuvent aussi être des radicaux chimiques réactifs tels que des radicaux chimiques de scission, c'est-à-dire que ces radicaux peuvent directement ou indirectement réagir pour scinder une chaîne de nucléotides. De préférence, ces radicaux chimiques réactifs seront activables, par exemple par voie chimique ou photochimique. Les groupes réactifs de scission activables sont, par exemple, des dérivés de composés tels que: l'acide éthylène-diamine-tétracétique, l'acide diéthylène-triamine-pentaacétique, les porphyrines, - la 1,10phénanthroline, le psoralène et autres groupes aromatiques absorbant les radiations du proche U.V. et du visible. Ces groupements chimiquement activables en présence d'ions métalliques, d'oxygène et d'un agent réducteur, induisent des coupures dans O des séquences d'acides nucléiques situées dans leur voisinage. Le radical B est constitué par une base d'acide ribonucléique liée à la partie sucre du nucléOtide par une configuration anomérique alpha. Ce peut être l'adénine, la cytosine, la guanine ou l'uracile. Miais il est également possible d'utiliser des bases d'acides ribonucléiques modifiées, notamment halogénées ou azidées, par exemple la 5-bromo- uracile ou la 8-azidoadénine; ou des dérivés aminés comme la 2- aminoadénine et ses dérivés substitués, par exemple sur le N par un groupe aminoalkylène ou par un groupe azidophénylalkylène; ou la guanine substituée sur le 06, par exemple par un groupe (w-alkylène)-9-acridine ou la 8-(W-aminoalkyl)amino-adénine et ses dérivés substitués sur le NH2 en X par un groupe acridine. Selon la présente invention, peuvent donc être considérées les bases usuelles, ainsi que la possibilité d'introduction de bases modifiées. Des "bases effectrices", susceptibles de se lier par covalence à un brin) complémentaire, pourront être introduites. Ainsi, la fonctionnalisation de C par un groupement aziridine en position 4 conduit à la formation de pontages covalents CH2-CH2 entre les deux brins complémentaires sur G. Donc, plus particulèrement, le radical B est chosi parmi l'adénine, la cytosine, guanine, la 4-azido-cytosine et la 8-azido-adénine, l'uracile, la 5 bromo-uracile. le radical -alk- est de préférence un radical alcoylène droit ou ramifié ayant de 1 à 10 atomes de carbone. En particulier, à partir des fonctions alcool terminales 3' ou 5' de l'oligomère alpha, l'effecteur peut donc être introduit via une chaîne (CH2)n liée à une fonctionnalisation Z' de natures diverses à la partie osidique de l'oligomère. A partir de la formule suivante 3' ou -O-ZI-(CH2)n-Z ' on obtiendra, selon ce que représente Z1, par exemple 15. un phosphate ou méthyl phosphonate de formule 3' O 31 0 ou -O- ( P - U) (-CH2 -)-- Z ' OH ou CH3 avec U = O, N ou S un éther de formule 3' ou -O--(CH2-4(CH2)n,---Z ' un ester de formule -OICO)U - (CH2)n-rZ ou encore un carbamate de formule générale -O.-(CO NH)(CH2)-n- Z La présente invention concerne également la synthèse des composés précédents sous forme de sel avec des bases ou des acides, et les composés sous forme racémique, ou sous forme isomères R ou S optiques purifiés ou en mélange, de formule générale précédente. Enfin, la présente invention a également pour objet des composés utiles notamment dans le procédé selon l'invention. Ces composés sont les monomères ribonucléosides alpha substitués par un groupe phosphoramidite en position 3' dont la fonction hydroxyle en 2' est protégée par un groupe, tel que le groupe Ctmp ou le groupe TBDMS. Plus particulièrement, ces composés sont les monomères répondant à la formule suivante p22 p os(Il) op3 01 formule dans laquelle pl = un groupe protecteur de la fonction hydroxyle tel que Ctmp, TBD.MS p2 = H, ou un groupe protecteur de la fonction hydroxyle tel que Dmtr P3 un groupe phosphoramidite tel qu 'un groupe N,N dialkylamino phosphoramidite de formule (1) / N(R1)2 -P (I) OR2 avec R1 qui représente un alkyle en C1 à C7 éventuellement substitué identique ou différent, tel que CH3, (CH3)2CH, R2 qui représente un alkyle en C1 à C7 éventuellement substitué tel que CH3, CH2CH2CN B = une base d'acide ribonucléique en configuration anomérique alpha par rapport au cycle glycosidique, base choisie parmi U, A, C, G et lesdites bases modifiées et/ou protégées. La présente invention a également pour objet des composés ribonucléosides alpha immobilisés ou destinés à être immobilisés sur un support solide par l'intermédiaire de leur fonction hydroxyle en 2' ou 3'. On peut citer comme composés ribonucléosides alpha immobilisés ou destinés à être immobilisés sur le support solide, objets de l'invention, les composés répondant à la formule générale (III) P2 F0 OOX (III) OR3 OP' 3 formule dans laquelle B et p2 ont les significations données précédemment - l'un de R3 et R'3 représente H ou un groupe protecteur de la fonction hydroxyle tel que le groupe benzoyle, Il - l'autre de R3 et R'3, un groupe fonctionnel permettant la fixation à un support solide par l'intermédiaire d'une fonction terminale, ou ledit groupe fonctionnel lié au support solide. On peut citer comme groupe fonctionnel permettant la fixation ou étant lié sur support solide dôté d'un groupe amino, le groupe de formule -C-(CH) -CR, (IV) O O avec p = I à 5 dans lequel R4 représente OH, OH activé par un groupe d'activation tel que C6C15 ou un radical NH lié à un support solide tel que le radical NH d'une chaîne alkylamine fixée sur polymère, gel de silice ou billes de verre poreuses. Les schémas I et 2 ci-après illustrent le procédé de préparation des monomères ribonucléosides alpha protégés substitués par des groupes phosphoramidites en 3' avec respectivement le groupe protecteur Ctmp et le groupe protecteur TBDMS en 2'. Dans ces schémas, B représente une base d'acide ribonucléique éventuellement modifiée et/ou protégée. Ainsi, les guanine, cytidine et adénrine alpha sont mis en oeuvre avec une protection benzoyle en position 2, 4 et 6 respectivement de la base. SCHEMA I I n H -- 0 O "o.o. OH OH 5S-O OH 1 a ( 2a 0Ho 0O si Oz-0O Ctrnp OH Octrip 4a / / 3a DmtrO S -mtrO O DO Cmpr 0' DmtrO- B H Octmp 6a 9 OCtmp a R20 N(R1) SCHEMA 2 HO çO0 DmIrO ç OH OH OH OH 2b j omtrO 0 Dmtr OSLO -TBisO 01 OH Dmtr Q \' 'HB 3b 2b OHO I DmlrO O ç 4\ - HO Oras b Dmtr 5b j B8 Dlmti*O O R3OR' p O'N(,) 6b 2 1. Préparation des monomères (5a) (voir schéma 1 pl = Ctmp) Ils sont préparés à partir des ribonucléosides alpha (la) obtenus selon des méthodes décrites dans la littérature. L'introduction sélective du groupement protecteur acidolabile Ctmp est effectuée selon la méthode suivante. Après traitement du composé (la) par le tétraiso- propyl-l,l,3,3 dichloro-1,3 disiloxane dans un mélange diméthylfor- mamide-pyridine, le dérivé obtenu (2a) est traité par la [(chloro-2 méthyl-4) phénvl]-l méthoxy-4 tétrahydro-l, 2, 5, 6 pyridine en présence d'acide trifluoroacétique pour donner le composé (3a) dans du dioxane anhydre. Après purification, ce composé est soumis à un traitement par une solution de Et4 NBr et KF dans du CH3CN à 50 C pendant 1 heure. La protection tétraisopropyl-l,l,3,3 disilyle est ainsi sélectivement ôtée et on obtient le composé (4a). Le dérivé nucléosidique (5a) est obtenu après tritylation du composé (4a) par le chlorure de diméthoxy-4,4' trityle en milieu pyridine. 2. Préparation des synthons nucléosidiques 5b (voir schéma 2) (pl = TBDMS) Les dérivés nucléosidiques (2b) sont obtenus après protection, par exemple après tritylation des dérivés (lb) correspondant par le chlorure de diméthoxy -4,4' trityle en milieu pyridine. On obtient ensuite le dérivé (3b) substitué en position 3' après réaction avec le chlorure de terbutyldiméthylsilyl en présence d'imidazole dans de la pyridine anhydre. Les dérivés (5b) sont enfin obtenus à partir des dérivés (3b) par migration intramoléculaire du groupement TBDMS en présence de triéthylamine dans du méthanol. 3. Préparation des ribonucléoside-phosphoramidites alpha (6a-b) (voir schéma I et 2 respectivement) Les ribonucléoside-phosphoramidites alpha Nprotégés (6a-b) ont été obtenus à partir des O-diméthoxytrityl-5' ribonucléosides alpha N- protégés correspondants (Sa-b). Le dérivé nucléosidique (5a) a été traité par de la chloro N,N-diisopropylaminométhoxyphosphine en présence de N,N,N-diisopropyléthylamine (DIEA) dans le dichlorométhane, sous atmosphère inerte, pour donner le dérivé 6a pour lequel R2 = CH3. Le dérivé nucléosidique (5b) a été traité par le N,N,N',N'- tétraisopropyl-phosphorodiamidite de 2-cyanoéthyle (1,1 équivalent molaire) en présence de tétrazolure de diisopropylammonium (0,5 équivalent molaire) dans le dichlorométhane anhydre, pour donner le dérivé 6b pour lequel R2 = CH2-CH2-CN. 4. Préparation des synthons nucléosidiques 7 constituant les extrémités 2' ou 3' des oligoribonucléotides fixés sur le support solide (voir schéma 2) Les synthons nucléosidiques 7, constituant l'extrémité 3' des oligonucléotides sont obtenus en deux étapes à partir des dérivés 1. Ces deux étapes sont: a) la tritylation sélective de l'hydroxyle-5' des dérivés I par le chlorure de diméthoxy-4,4' trityle pour donner les dérivés 2b, puis b) la benzoylation des hydroxyles en position 2' ou 3' des dérivés 2b par le chlorure de benzoyle. 5. Greffage des synthons 7 sur support solide (schéma 3) Ce greffage est illustré sur le schéma 3. On fait réagir une solution de mélange isomérique monobenzoylé-2' (ou 3') (7), d'anhydride succinique et de diméthylaminopyridine (DMAP) dans la pyridine. On obtient le composé (8) comportant un groupe succinyle en position 2' ou 3' l'autre hydroxyle vicinal étant protégé par un groupe benzoyle. Le dérivé (8) est ensuite transformé en dérivé pentachlorophényle succinate 3' ou 2' lequel est ensuite mis en réaction avec le groupement amino d'une longue chaîne alkylamine fixée par exemple sur billes de verre poreuses (LCA-CPG) pour donner le composé (10) fixé sur le support solide. SCHEMA 3 Dmtr O' J DttOuL 7\ deus mtrO_ ci 'ci C-(CH,)ICOOH, 6} eC(CH,)IC.O CII CrS ^{ 4 o'O' 0 I CI CI 8 9 cci10 6. Assemblage des oligoribonucléotides alpha entièrement protégés Le composé (10) lié de façon covalente au support LCA-CPG est introduit dans un petit reacteur. L'élongation de l'oligorigonucléotide alpha est effectuée par une succession de cycles de synthèse. Outre les lavages, chaque cycle comprend une détritylation, une condensation, une acétylation et une oxydation. Au terme du nombre de cycles requis, le support est traité par mélange thiophénol/ triéthylamine/dioxane (1/2/32 v/v/v) pendant une heure pour enlever le groupement méthyle ou cyanoéthyle des phosphates. Puis le support est traité avec de l'ammoniaque concentré afin d'enlever les groupement protecteurs des amines hétérocycliques et détacher les produits nucléo- tidiques du support solide. L'oligoribonucléotide désiré, portant encore le groupement diméthoxytrityl à son extrémité 5' est purifié par chromato- graphie liquide haute performance sur colonne. Un traitement par de l'acide acétique permet de déprotéger son extrémité 5'. De tels cycles de synthèses sont bien connus dans les techniques touchant à la synthèse des oligonucléotides. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre. EXEMPLE I Préparation du synthon phosphoramidite entièrement protégé de l'uridine alpha a) Protection de l'uridine alpha a.l) Protection du 5'OH du ribose par le groupement acido-labile diméthoxy-4,4' trityle (Dmtr) a. 2) Protection du 2'OH du sucre L'utilisation de 2 groupements protecteurs a été envisagée Le groupement acido-labile 1-[(2-chloro-4-méthyl)phényl]-4- méthoxypiperidin-4-yl (ou Ctmp) proposé dans un autre contexte proposé par C.B. Reese Nucléosides, Nucléotides, N 6, P 121, 1987. OCH3 I C_ -j CH3 Ce groupement présente l'intérêt d'être compatible avec l'utilisation du Dmtr car il reste intact dans les conditions de déprotection de celui-ci, contrairement au groupement 4-méthoxytétrahydropyrane-4-yl (Mthp). Cependant, la synthèse du réactif selon C.B. Reese Tet. Letters. Vol 27, N 20, P 2291 (1986) nécessite de nombreuses étapes aux rendements très moyens. On a donc envisagé l'utilisation d'un autre groupement protecteur. Le groupement tert-butyldiméthylsilyl (TBDMS) proposé dans une autre application par K.K. Ogilvie et al. Can. 3. Chem. 57, 2230 (1979). Celui-ci est éliminé par un traitement aux ions F c'est-à-dire par le fluorure de tétrabutylammonium (TBAF) dans le THF anhydre. b) Synthèse de l'uridine alpha entièrement protégée pour l'élonga- tion de l'oligoribonucléotide alpha b.l. Utilisation du groupement protecteur Ctmp pour le 2'OH du sucre 2' H lpr 0 H résidu est versé dans une solution aqueuse saturée de bicar- bonate de sodium (20 ml) et le mélange est extrait avec du dichlorométhane (40 ml et 2 x 20 ml). Les phases organiques rassemblées sont séchées sur sulfate de sodium et filtrées. Le filtrat est évaporé sous pression réduite puis coévaporé avec du toluène (3 x 20 ml). Le résidu est chromatographié sur colonne de gel de silice et le produit désiré est élué avec un mélange de méthanol (de 0 à 10%) et de dichlorométhane. Les fractions contenant le produit désiré pur sont rassemblées et évaporées sous pression réduite. Le résidu est redissous IG dans du benzène puis lyophilisé. On obtient 3,3 g d'une poudre blanche. Rendement 90%. RMN 1H (CDCl3) 6 9,03 (s, 1H, NH); 7,46 (d, 1H, H6, J5-6 8,15 Hz); 6,14 (d, 1H, Hl., J1.-2. 2,76 Hz); 5,69 (d, 1H, H5); 4,47 (m, 2H, H2. et H3.); 4,17 (m, 1H, H4.); 4,03 (m, 2H, Hs. et Hs.); 3,13 (s, 1H, OH2.); 1,06 (m, 28H, CHet CH3 du groupement TIPS). Références: D.H. Shannahoff et R.A. Sanchez, J. Org. Chem. 38, 593 (1973). 2- W.T. Markiewicz, J. Chem. Res., Synop., 24 (1979); J. Chem. Res., 181 (1979. 0 0 O 3 o j si 30H X3, _Si O 6 I - - I - u HI0 Si OH 86 % - i 1 r H3, CN fH c CH3 Dans un ballon contenant une solution de [chloro-2 méthyl-4) phényl]-1 méthoxy-4 tétrahydro-1,2,5,6 pyridinex (3,46 g, 14,54 mmoles) et de 0-(tétraisopropyl-1,1,3,3 disi- loxane diyl-1,3)-3',5' a-uridine (0,782 g, 1,615 mmoles) dans du dioxanne anhydre (8 ml) on ajoute 0,55 ml d'acide trifluoroacétique. Le mélange est agité pendant 5 heures à température ambiante puis est neutralisé par addition de triéthylamine (1,5 ml). Le mélange est immédiatement évaporée à sec sous pression réduite et le résidu huileux est chromatographié sur une colonne de gel de silice. L'élution est effectuée avec des proportions croissantes d'acétone (0 à 10%) dans du dichlorométhane. Les fractions contenant le produit désiré pur sont rassemblées et évaporées à sec sous pression réduite. On obtient une mousse jaune-pAle (l g, 85,5%). RMN 'H (CDC13), 6 8,53 (d, 1H, NH, 'J,-_5 2,25 Hz); 7,52 (d, 1H, H6, J5.6 8,17 Hz); 6,86-7,16 (m, 3H, H aromatiques du groupement Ctmp); 6,26 (d, 1H, H1. Jl,.-2. 3,63 Hz); 5,75 (dd, 1H, H5); 4,62 (pseudo t, 1H, H2.); 4, 42 (m, 1H, H3.); 3,9-4,15 (m, 3H, H4., H5. et H5.); 3,17 (s, 3H, OCH3); 1, 55-3,1 (m, 8H, CH2 du pyridinyl); 2,26 (s, 3H, CH3 du toluyl); 1,1 (m, 28H, CH et CH3 du groupement TIPS). Références: - _ C.B. Reese, H.T. Serafinowska et G. Zappia, Tet. Lett., 27, 2291 (1986). Et4NBIr, KF S\(i 1 des mélanges de méthanol (0,5 à 10%) et de dichlorométhane. Les fractions contenant le produit désiré pur sont rassemblées et évaporées à sec. On obtient un résidu mousseux incolore (0,51 g, 77%). RMN 'H (CDC13) S 8,85 (s, 1H, NH); 7,75 (d, 1H, H6, J5-6 8,18 Hz); 6,88-7, 15 (m, 3H, H aromatiques du groupement Ctmp); 6,48 (d, 1H, Hl., J.-2. 6, 82 Hz); 5,71 (d, 1H, H5s); 4,86 (pseudo t, 1H, H2.); 4,40 (m, 1H, H3.); 4, 24 (m, 1H, H4.); 3,6-3,9 (m, 2H, H5. et H5.); 3,27 (s, 3H, OC H3); 3,03 (m, 1H, OH3.); 2,75-3,1 (m, 4H, 2CH2 du groupement Ctmp); 2,33 (m, 1H, OHs.); 2,26 (s, 3H, CH3 du toluyl); 1,75-2,15 (m, 4H, 2CH2 du groupement Ctmp). Références: - T. Kamimura, M. Tsuchiyan K. Urakami, K. Koura, M. Sekine, K. Shinozaki, K. Miura et T. Hata, J. Amer. Chem. Soc., 106, 4552 (1984). OC3 HO Y. i pyridine anhydre 0 O r I AisDmr - -Ci m__i/ " /\ DO. HO OctmX chlorure de diméthoxytrityle (0,430 g, 1,27 mmoles). Le mé- lange est agité pendant 1,5 heure à température ambiante puis on ajoute du méthanol (2 ml). Apres 5 minutes d'agitation, le mélange réactionnel est versé sur une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium (30 ml) et les produits sont extraits avec du dichlorométhane (3 x ml). Les phases organiques rassemblées sont séchées sur sulfate de sodium et filtrées. Le filtrat est évaporé à sec sous pression réduite et le résidu estchromatographié sur une colonne de gel de silice. L'élution est effectuée avec un mélange de méthanol (0 à 10%) dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le produit désiré pur sont regroupées et évaporées à sec. Le résidu est précipité dans de l'éther de pétrole. On obtient, après séchage, une poudre incolore (0,645 g, 78%). RMN 1H (CDC13 & 8,3 (d, 1H, NH, J N-H 2,23 Hz); 7,74 (d, 1H, H6, J5-6 8, 22 Hz); 6,75-7,5 (m,16H, aromatiques); 6,6 (d, 1H, H1,., J1'-2' 7,07 Hz); 5,69 (dd, 1H, H5); 5,15 (m, 1H, H2.); 4,46 (m, 1H, H3.); 4,10 (m, 1H, H4.) ; 3,79 (s, 6H, OCH3 du groupement Dmtr); 3,30 (s, 3H, OCH3 du groupe- ment Ctmp); 3,05-3,50 (m, 2H, H5. et Hs.); 2,86-3,05 (m, 4H, 2CH2 du groupement Ctmp); 2,78 (s, 1H, OH3.); 2,27 (s, 3H, CH3 du groupement Ctmp); 1,7-2,05 (m, 4H, 2CH2 du grou- pement Ctmp). * DmtrO 0 CH30 DIEA CH30i --/ a/ UP-C1C2C12 anhydre Dmtr O o HO 0 Ctmp (iPr) 2N 92 % U O OC tp /Pk P I (ipr) 2N OCH3 A une solution du composé précédemment obtenu (1,853 g, 2, 36 mmoles) dans du dichlorométhane anhydre (7 ml) on ajoute de la N,N,Ndiisopropyléthylamine (1,65 ml, 9,44 mmoles) et de la chloro N,Ndiisopropylaminométhoxyphosphine (1,15 ml, 5,9 mmoles). Le mélange est agité pendant 30 minutes à température ambiante, sous atmosphère d'argon, puis est versé dans une ampoule à décanter contenant de l'acétate d'éthyle (80 ml). La solution résultante est lavée avec de la saumure (4 x 50 ml). La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée à sec sous pression réduite. Le résidu est chromatographié sur colonne de gel de silice et l'élution a lieu avec des mélanges de cyclohexane, de dichlorométhane et de triéthylamine (99/0/1 A 0/99/1, v/v/v). Les fractions contenant le produit désiré pur sont rassemblées, évaporées à sec et le résidu redissous dans du benzène est soumis à lyophilisation. On obtient une poudre incolore (2,056 g, 92 %). RMN 31P (CD3CN) & 158,52 et 155,78. DEr O O (iPr) 2N CH2C12 % C IS- P-0-CH -OE -E 2anhydre aittrD O U XP{>{H2-CH2-CH2---I i 1 U HO O Ctnp ( r 97 % O O cp(iPr)2N O O Ctmp P CNE N/ (iPr)2 A un mélange de O-Dmtr-5' -Ctmp-3' =-uridine (0,644 g, 0,821 mmole) et de tétrazolure de diisopropylammonium (0,070 g, 0,41 mmole) est ajouté successivement une solution de N,N,N',N'-tétraisopropylphosphorodiamidite de 2-cyanoéthylea (0,272 g, 0,9 mmole) dans du dichlorométhane anhydre (1 ml) et du dichlorométhane anhydre (3,1 ml). La solution est agitée pendant 4 heures & température amblante et une quantité supplémentaire de phosphoramidite est ajoutée (...). La solution est agitée pendant une période supplémentaire de 18 heures puis est chauffée à 50 C pendant 7 heures. Le mélange réactionnel est alors versé sur une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium (10 ml). A ce mélange est ajouté de l'acétate d'éthyle (20 ml) et la phase organique est lavée avec de la saumure (3 x 10 ml), séchée sur sulfate de sodium et filtrée. Après évaporation des solvants, le résidu est chromatographié sur colonne de gel de silice, en utilisant le même éluant que précédemment. Après lyophylisation, le composé désiré est recueilli sous forme d'une poudre incolore (0,789 g, 97%). RMN 31p (CD3CN) 6 152,35 et 149,68. Références:. J. Nielsen et 0. Dahl, Nucl. Acid. Res., 15, 3626 (1987). b.2 Utilisation du groupement protecteur TBDMS pour le 2'OH du sucre / pyridine anhydre Dmtr O O\ 2 O HO--i/' \' + _rCl > > \ /)j I I O Dmtr3O " HO OH HO O 3' 2 AgNOK, imidazole /TBDMS 0 OH O pyriine anhydre,tI Dratr Onz/xz + TIDM.S UH 2 I I HO 0OTBDMS Réf. K.K. Ogilvie, K.K. Schifman and C.L. Penny, Can. J. chem. 57, 2230 (1979) S.S. Jones and C.B. Reese, 3. Chem. Soc. Perkin I 1979 p 2762 K.K. Ogilvie, Carbohydrate Research, 89 (1981) 203-210 W.L. Sung, S.A. Narang, Can. J. Chem. 60, 111 (1982) Dans des conditions identiques à celles décrites plus haut, l'action du chlorure de diméthoxytrityle sur de l'auridine a fourni la 0-diméthoxytrityle-5 a-uridine avec un rendement de 73%. A une solution de ce composé (0,546 g, i mmole) dans du tétrahydrofuranne anhydre (10 ml) on ajoute successivement de la pyridine (0,3 ml, 3,7 mmoles), du nitrate d'argent (0,204 g, 1,2 mmoles) et du chlorure de tertiobutyldiméthylsilyle (TBDMS-C1, 0,196 g, 1,3 mmoles). Le mélange réactionnelest agité à température ambiante pendant 25 heures puis est filtré. Le filtrat est versé dans une ampoule à décanter contenant une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium (10 ml). Les produits sont extraits avec du dichlorométhane (2 x 20 ml). Les phases organiques sont rassemblées et évaporées à sec sous pression réduite. Le résidu est chromatographié sur colonne de gel de silice en utilisant comme éluant un mélange de méthanol (O à %) et de dichlorométhane). La 0-dimethoxytrityl-5' 0-tertiobutyldiméthylsilyl-3' a- uridine (0,514 g) est obtenue avec un rendement de 78%. RMN:H (CDC13) 6 8,73 (s, 1H, NH); 7,55 (d, 1H, H6, J5.6 8,17 Hz); 6,80-7, 50 (m, 13H, H aromatiques); 6,34 (d, 1H, H1., J1. 2. 4,38 Hz); 5,72 (d, 1H, Hs); 4,44 (m, 1H, H2.); 4,35 (m, 1H, H3.); 4,23 (m, 1H, H4.); 3,80 (s, 6H, (OCH3)2) 3,0-3,5 (m, 2H, H5. et Hs.); 2,74 (d, 1H, OH2.); 0,82 (s, 9H, (CH3)3C); 0,02 et - 0,07 (2s, 6H, Si(CH3)2)' Ce dernier composé (0, 435 g, 0,66 mmole) est dissous dans une. solution de triéthylamine (0,009 ml) dans du méthanol (44 ml). Le mélange est agité à température ambiante pendant 24 heures puis les solvants sont évaporés sous pression réduite. Le résidu qui est un mélange des deux isomères TBDMS-3' et TBDMS-2' est chromatographié sur une colonne de gel de silice. Après élution par un mélange de méthanol(3 à 4%) et de dichlorométhane, les fractions contenant l'isomère substitué en 2' sont rassemblées et évaporées à sec. Le résidu mis en solution dans du benzène est soumis à lyophilisation. On recueille une poudre incolore (0,095 g). Les fractions contenant l'isomère substitué en 3' (isomère plus polaire) sont rassemblées et évaporées. Le résidu est soumis à nouveau à un traitement par une solution de triéthylamine dans le méthanol puis à une purification par 2' chromatographie comme précédemment. Ainsi, on recueille en deux lots (0,204 g, 47%) de l'isomète O-diméthoxytrityl-5' O-tertiobutyldiméthylsilyl-2' a-uridine. RMN 1'H (CDC13) & 8,57 (s, 1H, NH); 7,59 (d, 1H, H6, J5-6 8,15 Hz); 6,837,41 (m, 13H, H aromatiques); 6,49 (d, Hi., Ji.-2. 5,94 Hz); 5,69 (d, 1H, Hs); 4,85 (m, 1H, H2.), 4,35 (m, 1H, H4), 4,07 (m, 1H, H3.); 3,79 (s, 6H, (OCH3)2); 3,06-3,52 (m, 2H, H5. et H5.); 2,54 (d, 1H, OH3.); 0,85 (s, 9H, (CH3)2); 0,06 et -0,13 (2s, 6H, Si(CH3)2). DIEA, DMAP tr O O CH30 TOF anhyd re/ Dmtr 0 o 0 l + P-Cl 01,S' /I U {iPr) 2N p HO 0 TDMS (iPr; 2N OCH3 RMN31p 6 = 152,65 et 151,58 EXEMPLE 2 Préparation du synthon uridine alpha 3' terminal (fixé sur le support LCA-CPG) lDntr O O BzCl/CH2Ci2 anhydre D*ntr o. O pyridine anhydre U 'J OR OR' HO OH 70 %R R'=H ou Bz Une solution de O-diméthoxytrityl-5' c-uridine (0, 796 g, 1,46 mmoles) dans de la pyridine anhydre (7,3 ml), gardée sous atmosphère d'argon, est refroidie & - 45C. On y aJoute, goutte à goutte et par l'intermédiaire d'une seringue, une solution de chlorure de benzoyle1 (0,186 ml 1,61 mmoles) dans du dichlorométhane anhydre (0,58 ml). L'addition dure 5 minutes et le mélange réactionnel est conservé à une température de -45 C pendant 30 mn puis à une température de -20 C pendant 3 heures supplémentaires. De l'eau (0,2 ml) est ajoutée au mélange réactionnel qui est ensuite versé dans une ampoule à décanter contenant une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium (35 ml). Les produits sont extraits avec du dichlorométhane (30 ml et 2 x 15 ml). Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec de l'eau (20 ml) et évaporées à sec. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice. L'élution a lieu avec un mélange d'acétone (0 à 15%) dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le mélange de 0-diméthoxytrityl5' O-benzoyl 2' (ou 3') a-uridine sont rassemblées et évaporées à sec. Le résidu est précipité dans de l'éther de pétrole pour donner une poudre incolore (0,652 g, 70%). Références: 1. T. Kempe, F. Chow, W.I. Sundquist, T.J. Nardi, B. Poulson et S.M. Peterson, NucI. Acid Res., 10, 6695 (1982). , DMAP, Et3N - Dmtr O pyridine anhydre Dmtr 0 _ ' Rendement quantitatif OR I iOR OR' OR OR' RR'=BZ ou. 3R (CH2)2u -C-05' H 'Et3 R=R' =H ou Bz i 22 0 0 La O-diméthoxytrityl-5' O-benzoyl-2'(ou 3') O-succinyl-3'(ou 2') auridine a été obtenue à partir du composé précédemment décrit selon un procédé identique à. celui décrit par T. Tanaka et al.x. Rendement quantitatif. Références:. T; Tanaka, S. Tamatsukuri et M? Ikehara, NuclI. Acid. Res., 14, 6265 (1986). Cl l DCC, HO Q 1 Dmtr Q- ci C Cl DrO- Bz,-(CH -C-0 HN Et3 o 2 Bz,-C-(CH2)2 -C- Cl Cl. L'ester de pentachlorophényle correspondant au succinate précédemment reporté a été obtenu par condensation en présence de dicyclohexylcarbodiimide, selon un procédé identique à celui décrit par Gough et al.2- Rendement 71%. Références: G.R. Gough, M.J. Brunderer et P.T. Gilham, Tetrahedron Lett., 22, 4177 (1981). 0 0 Dmutr OIACG mr0 O U pyridine anhYdre I O O O BZ,-C-(CH2)-C-0- BZ,-C (CH2) -C O OOO C1 C1 identtue a cluidcrit ci ogeta. Le support "long chain alkylamine controlled pore glass" (Pierce) (0,5 g) est activé avec de la triéthylamine (0,03 ml) dans de la pyridine anhydre (2 ml). Après évaporation des solvants, le résidu est mis en suspension dans une solution de l'ester actif précédemment reporté (0,152 g, 0,15 mmole) dans de la pyridine anhydre (1,5 ml). Le mélange est agité pendant 72 heures à température ambiante puis les billes de verre sont essorées, lavées avec de la pyridine (2 ml) et du dichlorométhane (3 x 2 ml) et séchées sous vide. Ensuite, ces billes de verre sont mises en suspension dans une solution (2,4 ml) préparée à partir d'un mélange de N,N-diméthylamino-4 pyridine (180 mg) dans du tétrahydrofuranne anhydre (2 ml), d'anhydride acétique (0,0187 ml, 0,198 mmole), de lutidine (0,0198 ml, 0,171 mmole) et du tétrahydrofuranne (1 ml). Le mélange est agité pendant 10 minutes et le matériau insoluble est essoré, lavé avec du tétrahydrofuranne (2 x 2 ml), du dichlorométhane (4 x 2 ml), et séché sous vide. Le dosage spectrophotométrique du cation diméthoxytrityle, libéré par traitement (à l'aide d'une solution décimolaire d'acide paratoluènesulfonique dans l'acétonitrile) d'un échantillon de billes de verre ainsi fonctionnalisées, indique une fonctionnalisation de 26 pmoles par gramme. EXEMPLE 3 Préparation du synthon phosphoroamidite entièrement protégé de N-benzoyl-4 alpha-cytidine a) Synthèse de N-benzovl-4 alpha-cytidine o O HO 0 (CH3) 3SiC, BzCl 3 3 HO HHO aik pyridine anhydre N NH2 HO H00kN" H ] a=0 O La N-benzoyl-4 a-cytidine a été obtenue à partir de l'a-cytidine selon un procédé identique à celui décrit par Sung et Narangl pour l'isomère 0 correspondant. Après chromatographie sur gel de silice des produits de la réaction, le produit désiré a été obtenu sous forme cristalline avec un rendement de 26%. PF: 182-184 C (méthanol). UV (éthanol) Az, 305 et 260 rnm, À,n 285 et 229 nm. RMN 1H (DMSO-d6) 11,05 (s, 1H, NH); 7,31-8,04 (m, 7H, Hs, H6 et H aromatiques); 6,09 (d, 1H, H., J,. 2. 3,95 Hz; 5,40 (d, 1H, OH2.); 5,04 (d, 1H, OH 3') 4,79 (m, 1H, OH5.) 4,20 (m, 1H, H2.); 4,09 (m, 2H, H3. et H4.); 3,44-3,69 (m, 2H, H5. et Hs5.). Références:. W.L. Sung et S.A Narang, Can. J. Cherm., 60, 111 (1982). b)svnthèse de cvtidine alpha entièrement protégée pour l'élongation de l'oligoribonucléotide alpha b.l. Utilisation du groupement protecteur Ctmp pour le 2'OH du sucre b.2. Même enchaînement de réactions que pour la synthèse de alpha uridine entièrement protégée et phosphorylée en 3' o TIPD SiC12, pyridine H \ anhydre 0_ o_ X cZ I1 C 94 C HO OH Si-O OH Selon un procédé identique à celui décrit plus haut pour l'obtention de O-(tétraisopropyl-1,1,3,3 disoloxane diyl-l,3)-3',5' auridine, la O-(tétraisopropyl-l,1,3,3 disoloxane diyl-1,3)-3',5' Nbenzoyl-4 a-cytidine a été obtenue sous forme d'une poudre incolore après lyophilisation avec un rendement de 94%. RMN 'H (DMSO-d6) & 11,15 (s, 1H, NH); 7,34-8,02 (m, 7H, H5, H6 et H aromatiques); 6,08 (d, 1H, Hl., J.- 2. 3,36 Hz); ,51 (d, 1H, OH2.); 4,38 (m, 1H, H3.); 4,28 (m, 1H, H2.); 4,18 (m, 1H, H4.); 3,88-4,07 (m, 2H, H5. et H5.); 0,9-1,14 (m, 28H, CH et CH3 du groupement TIPS). OCH3 /Y ' CF3 OOH Selon0 un0oèéietqeàclidci lshu O-t 0rasoroy \1+, N i dioxanre slci d'un0 OH e anhydre 0 0 Ct si 1 s 1121,H)15% ist CH3 Selon un procédé identique & celui décrit plus haut pour l'obtention de l'analogue de l'a-uridine, la O-(tétraisopropyl-1,1,3,3 disiloxane dlyl-1,3)-3',5' 0-Ctmp-2' Nbenzoyl-4 a-cytidine a été obtenue sous forme d'une poudre jaune pâle avec un rendement de 15%. RMN 'H (DMSO-d6) & 11,21 (s, 1H, NH), 6,91-8,08 (m, 10H, Hs, H6 et H aromatiques); 6,29 (d, HI., J,.-2. 3,4 Hz); 4,59 (m, 1H, H2.); 4,48 (m, 1H, H.); 4,24 (m, 1H, H4.); 3,87-4,07 (m, 2H, H5. et Hs.); 3,10 (s, 3H, OCH3); 2,93 et 2,63 (2m, 4H, 2CH. du groupement (Ctmp); 2,15 (s, 3H, CH3 du groupement Ctmp); 1,70-1,94 (m, 4H, 2CH2 du groupement Ctmp); 0,94-1, 08 (m, 28H, CH et CH3 du groupement TIPS). Et4NBr, KF V O CH3CN,50 C, th HO 1\1 si z \ / - l ez89 %. \ OH HO O Ctmp Selon un procédé analogue à celui décrit plus haut pour l'obtention de l'analogue de l'a-uridine, la O-Ctmp-2' N-benzoyl-4 acytidine a été obtenue avec un rendement de 89%. RMN 'H (DMSO-d6) 6 11,15 (s, 1H, NH); 6,90-8,45 (m, 10H, H5, H6 et H aromatiques); 6,43 (d, 1H, H', ., J1,.2. 6,8 Hz); ,46 (d, 1H, OH3.); 4,97 (m, 1H, OH5.); 4,70 (m, 1H, H2. ); 4,18 (m, 2H, H3. et H4.); 3,49 (m, 2H, H5. et H5.); 3,19 (s, 3H, OCH3); 2,67-2,83 (m, 4H, 2CH2 du groupement IG Ctmp); 2,15 (s, 3H, CH3 du groupement Ctmp); 1,66-1,85 (m, 4H, 2CH2 du groupement Ctmp). nDmtr C1 HO- O, pyridine anhydre Dmtr O O z cBz v Z 773 % C HO 0 Ctmp HO C Ctmp Selon un procédé identique à celui décrit plus haut pour l'obtention de l'analogue de l'a-uridine, la O-diméthoxytrityl-5' O-Ctmp- 2' N-benzoyl-4 a-cytidine a été obtenu sous forme d'une poudre incolore après précipitation dans de l'éther de pétrole avec un rendement de 73%. RMN 'H (DMSO-d6) 6 11,15 (s, 1H, NH); 6,8-8,5 (m, 23H, Hs, H6 et H aromatiques); 6,57 (d, 1H, H1., Jl.-2. 6,92 Hz); 5,54 (d, 1H, OH3.); 4,91 (pseudo t, 1H, H2.); 4,32 (m, 1H, H4.); 4,09 (m, 1H, H3.); 3,74 (s, 6H, 20CH3 du groupement Dmtr); 3,21 (s, 3H, 2 OCH3 du groupement Ctmp); 3,04 (m, 2H, Hs. et H5.); 2,60-2,90 (m, 4H, 2CH2 du groupement Ctmp); 2,15 (s, 3H, CH3 du groupement Ctmp); 1,60-1,90 (m, 4H, 2CH2 du groupement Ctmp). DMtrntx0 cHDmtrO Bz 30 DIEA HO OCpP-C1 CH2C12 anhydre Ctmp (ilr) 2N 91 % p (ilr)2N OCH3 Selon un procédé identique & celui décrit plus haut l0 pour l'obtention de l'analogue de l'c-uridine, le dérivé O- diméthoxytrityl-5' O-Ctmp-2' N-benzoyl-4 *-cytidine phosphoramidite-3' a été obtenu sous forme d'une poudre incolore avec un rendement de 91%. RMN 31p (CD3CN) & 154,06 et 151,15. 1 5 EXEMPLE 4 Synthèse d'oligoribonucléotides alpha sur support solide par la méthode au phosphoramidite (échelle = 1 pmole) 1. Synthèse de alpha-[(Up)7U] sur support solide par la méthode au phosphoroamidite a) Conditions de synthèse * Synthon phosphoroamrnidite rU alpha utilisé dans la synthèse de alpha-[(Up)7U] DmrtrO U -1t)> Concentration utilisée = 0. 2 M(20e) 3C220N i r2 CNCH2CH 2 N(iPr)2 Agent activateur utilisé pour les condensations: le p-nitro phényl tétrazole à la concentration de 0.2 M (40e) (soluble à chaud environ 450C) b)Cycle de synthèse et rendements de condensation - Etapes impliquées dans un cycle d'élongation No Etape Solvant ou Réactif Iremps(s) i Lavage et Purge CH3CN, Argon 52 2 Détrltylation 3% TCA dans CH2CI2 1 00 3! Lavage et Purge CH3CN, Argon 225 4 |Condensation 0O.2M% amidite (20eq) dans CH3CN + 0.2 MN pNO2 phényl tétrazole 9 31 (40e) dans CH3CN 5 Purage Argon 10 6 Cappage 6,5 9% DMNAP dans THF + Ac2O/lutidine/THF 143 I I 8 7 Purage Argon 20 8 Oxydation O.1 M 12 dans THF/Pyr H20 (40/10/1) 55 9 Lavage CH3CN 110 Les rendements de condensation sont calculés par le dosage spectrophotométrique à) = 498 nm du cation diméthoxytrityl libéré au cours de l'étape de détritylation. Rendement global: 70 96 Rendement moyen par étape = 95 % c) déprotection et purification d'alpha-[(Up)7U] - décrochage du support par NH4OH 32 % pendant 3 fois 30 min, - traitement par NH4OH 32 % pendant 1 heure à 550C (élimination du groupement Benzoyle présent sur le premier nucléoside fixé au support), - traitement par HCI 0.01 M (pH = 2) pendant 24 heures à témpérature ambiante (élimination du Ctmp), - purification par colonne DEAE-Sephadex. On obtient 19 unités d'absorbance à 260 nm, - l'analyse par HPLC du mélange brut obtenu indique une pureté de 82 O%. 2. Synthèse de alpha-[(Up)5U] sur support solide par la méthode au phosphoroamidite a) Conditions de synthèse * synthon phosphoroamidite rU alpha utilisé dans la synthèse de alpha-[(Up) U]. O r1/tr O U\ Concentration utilisée 0.2 M 0 0 ctmp P OCi30 N (iPr)2 * agent activateur utilisé pour les condensations: le pnitrophényl tétrazole à la concentration de 0.2 M (soluble à chaud environ 45 C) N- ON g n 2 C H H b) Cycle de synthèse et rendements de condensation Etapes impliquées dans un cycle d'élongation N Etape Solvant ou Réactif remps(s) Lavage et Purge CH3CN, Argon 52 2 Détritylation 3% TCA dans CH2C12 100 3 Lavage et Purge CH3CN, Argon 231 4 Condensation O.2M amidite (20eq) dans CH3CN + 0. 2 M pNO2 phényl tétrazole 9 3 7 (40e) dans CH3CN 5 Purge Argon 10 6 Cappage 6,5 % DMAP dans THF Ac2O/lutidine/THF 143 1 / 1 /8 7 Purge Argon 20 8 Oxydation 0.1 M 12 dans THF/Pyr1 H20O (40/10/1) 55 9 Lavage CH3CN 110 Rendement moyen par étape 97 6 Rendement global pour alpha-[(Up)5U]: 85 % c) déprotecteur et purification d'alpha-[(Up)5U] déprotection des phosphates par une solution thiophénol Et3N/dioxanne (1/1/2 v/v/v) pendant 30 min à température ambiante, - décrochage de l'oligoribonucléotide sur le support par NH4 OH 32 % pendant 3 fois 30 minutes à température ambiante, puis chauffage à 55 C pendant t heure, déprotection des 2'OH des sucres par une solution HCI 0.01 M pendant 24 heures à température ambiante. Quantité d'oligoribonucléotide alpha-[(Up) 5U] obtenue = 42 unités d'absorbance à 260 nm, - purification par colonne DEAE-Sephadex. Quantité d'oligo- nucléotide alpha obtenue = 12 unités d'absorbance à 260 nm, - analyse HPLC de rU6 alpha pour vérification de pureté: 74 %. EXEMPLE 5 Propriétés biophysiques I - Mise en évidence de l'hybridation de l'oligoribonucléotide î-[(Up)7U] avec du poly A. Les expériences d'hybridation ont été effectuées à l'aide d'un spectrophotomètre Uvikon 810 (Kontron) interfacé avec un micro-ordinateur IBM PC compatible. Le contrôle de la température a été opéré à l'aide d'un programmateur de température Huber PD415 connecté à un bain d'eau réfrigéré à circulation (Huber Ministat). Les cellules ont un trajet optique de 1 cm et leur compartiment est balayé par un flux d'azote tout au long de l'expérience. Auparavant, les deux brins d'oligonucléotides étudiés sont mélangés et chauffés à 80 C pendant 30 minutes. Les valeurs digitalisées d'absorbance et de température sont accumulées par l'ordinateur. Dans une expérience typique, l'ordinateur collecte les valeurs chaque 30 secondes alors que la variation de température est de 0,75eC/min. 200 points sont donc collectés pour chaque courbe entre 5'C et 80eC. La 2 formation ou la dénaturation de l'hybride se traduit par une variation rapide de l'absorbance (à 260 nm dans nos expériences). Les Tm correspondent à la température de demi-transition (point d'inflexion). L'oligonucléotide a-[(Up),U] et le poly (A) ont été utilisés à une concentration (exprimée en base) de 40 M dans un tampon NaCl (100 mM), cacodylate de sodium (10 mM) ajusté à pH 7,0. Dans ces conditions, on obtient une température de demi-transition: T = 32 C. a Conclusion les ARN alpha ont un appariemment très stable avec les ARN beta. Les applications biologiques qui peuvent en découler sont donc nombreuses notamment à titre de sondes d'acides nucléiques ou a titre d'agents thérapeutiques. II - Comparaison de la stabilité des oligoribonucléotides a- et 3-[(Up)sU] vis-à-vis de nucléases. Conditions d'analyses HPLC. Les analyses ont été effectuées sur colonne Radial-Pak Cl8 (10 izm) placée dans un module RCM-100 (Waters). Le matériel se compose d'un injecteur U6K (Waters), de deux pompes 6000A (Waters), d'un programmateur de gradient M720 (Waters), d'un détecteur multicannal Pye Unicam PU 4021 et d'une console de contrôle Pye Unicam PU 4850. L'élution est effectuée selon un gradient linéaire (de O & 12,5%) d'acétonitrile dans un tampon d'acétate d'ammonium 0,1M (pM 5,9) et à un débit de 3 ml min'. La détection est effectuée à 254 nm. 1. Dégradation par la phosphodiesterase de venin de crotalus durissus terrificus (3'-exonucléase). Une solution d'oligonucléotide (20 et, 2 unités d'absorbance à 260 nm) est diluée dans un tampon Tris-HCl 0,1 M (pH 9), MgCl2 0.01 M (100 g). On ajoute une solution commerciale de phosphodiestérase (2 >i, 3 unités/ml). Le mélange est incubé à 37 C. A des temps déterminés, des fractions aliquotes (10 >t) sont prélevées, chauffées à 1006C pendant 2 minutes et analysées. L4 de- Temps t X t S te 2mn 120 mn rU6 beta 6,5 % 0 rU6 alpha 94 9 42 9 2. Dégradation par la phosphodiestérase de rate de veau (5'-exonucléase). Une solution d'oligonucléotide (20 Et, 2 unités d'absorbance à 260 nm) est dilué dans un tampon d'acétate d'ammonium 0,125 M (pH 7,0), d'EDTA 2, 5 mM et de Tween 80 0,0625% (80 "ú). On ajoute une solution commerciale de phosphodiesterase (2 Et, concentration finale 0,013 unités/ml) et le mélange est incubé à 370C. A des temps déterminés, des fractions aliquotes sont prélevées (10 Et), chauffées à 100 C pendant 2 minutes et analysées. os J de incuba- 2mn 60 mn substratest ar res rU6 beta 89 % 13 % rU6 alpha 100 % 100 % 3. Dégradation enzymatique par le nucléase Sl de Aspergillus Oryzae (endonucléase spécifique du simple brin),. A une solution d'oligonucléotide (20 t, 2 unités d'absorbance à 260 nm) on ajoute du tampon acétate d'ammonium 0,5 M (pH 4,7), NaCl 3M et acétate de zinc 0.i M (10 Fe) et de l'eau (70 Fe). On ajoute une solution d'ensyme (2 gú, 2 unités, obtenue par dilution d'une solution commerciale dans le méme tampon). Le mélange est incubé à 37 C. A des temps déterminés, des fractions aliquotes (10 >t) sont prélevées, diluées dans du tampon phosphate de potassium 0,1M (pH 6,5, i0 ú) et analysées. !5 d de - d'incbation substrat restant Ihue5hue ! heure 5 heures rU6 beta 68 %14 % rU6 alpha 100 % 100 % 4. Dégradation enzymatique par la RNase A de pancréas de bovin (ribonucléase). Une solution d'oligonucléotide (20 Fe, 2 unités d'absorbance & 260 nm) est diluée dans un tampon NaCl 0,3M, Tris 0,01M (pH 7,4) et EDTA 0,005M (120 4). On ajoute une solution d'enzyme (2 Fe, 4.10-2 unités), et le mélange est incubé à 37 C. A des temps déterminés, des fractions aliquotes (50 Iú) sont prélevées et immédiatement analysées. % d'incuba- | substrat:tion mn 35 mn susrarestn rU6 beta 0,3 % 0 % rU6 alpha 100 % 100 % Conclusion: les oligoribonucléotides alpha sont beaucoup plus stables vis-à-vis de la résistance aux nucléases que les oligoribonucléotides beta I O correspondants. REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse de composés oligoribonucléotides alpha caractérisé en ce qu'on effectue une synthèse du type au phosphoramidite sur support solide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on assemble des monomères ribonucléosides alpha protégés, substitués par des groupes phosphoramidites en 3', la fonction hydroxyle en 2' du ribose dudit monomère étant protégée par le groupe Ctmp ou TBDMS. 3. Procédé selon la revendication I ou 2, caractérisé en ce que un composé ribonucléoside alpha protégé est tout d'abord immobilisé sur un support solide par l'intermédiaire d'une de ses fonctions hydroxyle en 2' 1 5 ou 3'. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit composé ribonucléoside alpha immobilisé a une fonction hydroxyle libre 3' ou 2' respectivement, protégée par un groupe protecteur tel que le groupe benzovie. 5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que l'assemblage de l'oligoribonucléotide alpha se fait par condensation, en présence d'un agent activateur, desdits monomères entre leur fonction en 3' et la fonction 5' du composé ribonucléoside alpha immobilisé pour le premier monomère ou d'un composé intermédiaire polyribonucléotide alpha protégé fixé sur ledit composé ribonucléoside alpha immobilisé pour les monomères suivants. 4 S 6. Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que le groupe phosphoramidite en 3' desdits monomères est un groupe N. N dialkylaminophosphoramidite de formule (1) À5! _pN(Ri)2 OR2 a\ec Rl qui représente un alkyl en CI à C7 éventuellement substitué, identique ou différent, tel que CH3, (CH3)2CH, lR., qui représente un alkyl en C1 à C7 éventuellement substitué tel que CHq. HCH-CHC. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le roupe phosphoramidite en 3' desdits monomères et le diisopropyl- 1 anuinopnosphoramidite de méthyle (R = (CH3)2CH et R2 = CH3) ou le cisoprop\laminophosphoramidite de cyano-2 éthyle R1 = (CH3)2CH et R2 tH CH, CN). S. Procédé selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisé en Ce qcue les groupes hyvdroxyle desdits monomères et dudit composé ribonucléoside alpha immobilisé sont protégés en 5' par le groupe Dmtr. 9. Procédé selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que l'agent activateur pour la condensation desdits monomères est choisi parmi le tétrazole et ses dérivés, tels que le paranitro phényl tétrazole. 10. Procédé selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisé en ce que le composé ribonucléoside alpha immobilisé est fixé sur le support solide via un groupe divalent du type succinyle entre un de ses groupements OH en 2' ou 3' qui se trouve ainsi estérifié, et un groupement amino 'u support. I 1. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support solide est constitué par une longue chaîne alkylamine fixée sur un polymère, un gel de silice ou des billes de verre poreuses. 12. Composés utiles dans le procédé selon l'une des revendica- tions I à 1'l, caractérisés en ce qu'ils consistent en un monomère alpha ribonucléoside substitué par un groupe phophoramidite en 3' et dont la fonction hydroxyle en 2' est protégée par un groupe protecteur tel que le iO groupe Ctmp ou TBDMIS. 13. Composés utiles dans le procédé selon l'une des revendica- tions I à 11. caracterisés 'en ce qu'il répondent à la formule (11) p2 osos Z0 dans laquelle B est une base rattachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique alpha choisie parmi U, A, C, G, et lesdites bases modifiées et/ou protégées. Pl un groupe protecteur de la fonction hydroxyle telle que Ctmp, TBDMS. p2H, un goupe protecteur de la fonction hydroxyle telle que Dmtr. P3 un groupe phosphoramidite tel qu'un groupe N,N dialkylaminophosphor- amidite de formule (I) /N(Ri)2 -P (I) OR! avec R. qui représente un alkyl en CI à C7 éventuellement substitué, identique ou différent, tel que CH3 (CH3)2CH, R2 qui représente un alkyle en C1 à C7 éventuellement substitué tel que CH3y CH2CH2CN. 14. Composés utiles dans le procédé selon l'une des revendica- tions I à 11, caractérisés en ce qu'ils consistent en un ribonucléoside alpha immobilisé sur un support solide par l'intermédiaire de sa fonction hydroxvle en 2' ou 3'. 15. Composés utiles dans le procédé selon l'une des revendications I à 11, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale (111) 2 0 OR3 OR' 3 dans laquelle B et p2 ont les significations données précédemment. - L'un de R3 et R 3 représente H ou un groupement protecteur de la fonction hydroxyle tel que le groupement benzoyl, - l'autre de R3 et R'3 représentant un groupe fonctionnel permettant la fixation à un support solide par l'intermédiaire d'une fonction terminale, ou ledit groupe fonctionnel lié au support solide. 16. Composés selon la revendication 14, caractérisés en ce que R3 ou R' représente le groupe de formule 3 3 -C-(CH2) -CR4 hi. 2 p il 4, O O (IV) S avec p = I à 5 avec R4: qui représente OH, OH activé par un groupe d'activation tel que - C6Ci 5, ou un radical -NH lié à un support solide tel que le radical -NH d'une chaîne alkylamine fixée sur polymère, gel de silice ou billes de verre poreuses. !5 Eto