FR 2636739 A1 19900323 FR 8812285 A 19880920 PROCEDE ET INSTALLATION D'IDENTIFICATION DES BASES D'UN ADN. DESCRIPTION L'invention se rapporte à un procédé et une installation d'identification des motifs d'une molécule organique complexe et en particulier d'une molécule biologique complexe telle qu'un acide nucléique, une protéine, un peptide, un polymère. Elle s'applique dans les domaines du génie génétique, de la biologie, de la pharmacologie, tant au stade de L'expérimentation, de la recherche fondamentale qu'industrielle. Le procédé de l'invention s'applique de façon 1c générale à toute molécule constituée d'une succession d'acides aminés, de nucléotides, de groupes d'atomes et, plus spécialement, aux acides nucléiques, tels que l'ADN (acide désoxyribonucléique) et l'ARN (acide ribonu- cléique). L'identification des séquences ou de l'ordre des nucléotides de l'ADN ou l'ARN est connue sous le nom de séquençage. Le séquençage des acides nucléiques a pris une réelle importance dans le domaine de la biologie moléculaire et de la biotechnologie. En particulier, le séquencage de l'ADN permet l'analyse des génomes animaux, végétaux et viraux dans des gènes particuliers. Puisque La fonction d'une molécule biologique est déterminée par sa structure, la définition de La structure d'un gène est cruciale pour la manipulation éventuelle de cette unité de base d'information. On rappelle qu'un nucléotide est formé par une base, un sucre et un phosphate. Pour les acides nucléiques, les bases sont des bases azotées possédant une structure hétérocyclique du type purique ou pyrimidique; elles sont au nombre de 4. Le sucre est Le ribose pour l'ARN et le désoxyri- bose pour L'ADN et le phosphate l'acide phosphorique. Généralement, Les nucléotides des acides nucléi- ques utilisés sont triphosphatés car c'est ce type de molécules qui fournit l'énergie nécessaire au fonctionnement des enzymes dans de nombreuses réactions biochimiques, en particulier celles intervenant dans la polymérisation des ADN. L'ARN et l'ADN présentent trois bases communes: l'adénine (A) et la guanine (G) qui sont des purines et la cytosine (C) qui est une pyrimidine. L'autre base pyrimidique est la thymine (T) pour l'ADN et l'ura- cile (U) pour l'ARN. Pour l'ADN, les quatre types de nucléotides sont Le désoxy adénosine triphosphate ou dATP, le désoxy guanine triphosphate ou dGTP, le désoxy cytosine triphos- phate ou dCTP et le désoxy thymine triphosphate ou dTTP. On les note ci-après dXTP avec X = A, G, C ou T. L'ADN contient l'information génétique complète nécessaire à la fabrication des protéines, éléments constitutifs de tout organisme vivant. En particulier, chaque succession de trois bases est Le code, par l'in- termédiaire des ARN messagers, d'un acide aminé qui entre dans la composition d'une protéine. Le séquençage a pour but d'obtenir l'ordre des bases constituant un brin d'ADN ou d'ARN. Les méthodes de séquençage de l'ADN comportent essentiellement 5 étapes qui sont (a) la fragmentation du génome, (b) Les réactions chimiques de séquençage pour former des chaSnes de nucléotides, (c) le marquage des chaines de nucléotides, (d) la séparation des chai- nes marquées et (e) la détection. Etape a Un génome ou ensemble des secteurs de L'ADN est constitué par un grand nombre de paires de bases (13 x 106 pour la levure et 3 x 109 pour l'homme). Le génome, du fait de sa longueur, ne peut être directe- ment soumis aux réactions de séquençage. L'ADN est scindé en fragments d'environ 1000 à 30000 bases qui sont ensuite multipliés par clonage. Par exemple, cette fragmentation peut être effectuée par l'utilisation d'enzymes de restriction qui coupent L'ADN au niveau de certaines séquences ou par l'utilisation des ultra-sons, comme exposé dans l'article "Current Approaches to DNA Sequencing" de J.C. Moores Analytic Biochemistry 163, 1-8 (1987). EtaDe b Elle consiste à appliquer aux chaines obtenues en (a) quatre séries de réactions chimiques spécifiques des quatre bases de t'ADN. Ces réactions conduisent à L'obtention de quatre familles de chatnes d'ADN dont l'une des extrémités est communément fixée et l'autre est constituée d'une base spécifique de l'une des quatre séries de réaction. Deux méthodes sont communément utilisées pour obtenir les 4 familles de chalnes d'ADN ci-dessus. L'une, dévelopée par Maxam et 6ilbert (Maxam A.M. et Gilbert W., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., vol. 74, NO 2, pp 560-564 de 1977, "A new method for sequencing DNA") fait appel à une procédure de dégradation chimiqVe des chaÂnes et l'autre, introduite par Sanger (Sanger F. et al., Proc. Natl.- Acad. Sci. USA 74, pp. 5453-5467 de Décembre 1977 "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors") est une méthode enzymatique et emploie un procédé de terminaison de chalnes didésoxy. Dans La méthode de Sange., chacune des quatre réactions de séquencage met en jeu un grand nombre d'exemplaires d'ADN monocaténaire à séquencer; un amor- ceur (ou en terminologie anglo-saxonne primer) qui est un acide-nucléique complémentaire de l'une des extrémi- tés de l'ADN à séquencer; les quatre nucleotides dXTP; une enzyme qui permet la fabrication du brin complémen- taire de l'ADN à séquencer, à partir des nucléotides et en commençant par l'amorceur et enfin un seul des quatre di-désoxy nucléotides appelé nucléotide terminal et noté ddXTP. Ce ddXTP est un nucléotide auquel il manque le groupement OH du carbone 3' du désoxyribose. L'amorceur se lie à l'ADN à séquencer par complémentarité puis l'enzyme synthétise le brin complémentaire jusqu'à ce qu'elle incorpore le ddXTP arrêtant l'élongation de la chaîne. L'incorporation du nucléotide terminal peut se produire n'importe quand au cours de la synthèse ce qui se traduit, à la fin de l'opération de séquençage spécifique d'une base X donnée, par la présence d'une famille d'ADN représentant toutes les longueurs possibles depuis l'amorceur jusqu'à environ 400 nucléotides. Appliquée en parallèle pour les quatre ddXTP, la série de quatre réactions conduit à un ensemble de quatre familles de chaines d'ADN; les chaînes de chaque famille étant représentatives d'une base X donnée sont ensuite déposées sur un gel d'électrophorèse. Dans la méthode de Maxam et Gilbert, des chaînes d'ADN de dimensions adaptées et analogues à celles issues du procédé de Sanger sont produites par un traitement chimique d'ADN purifié. Cette opération permet de séquen- cer un ADN mono- ou bicaténaire marqué avec un phosphate radioactif à l'une de ses extrémités. Pour chacune des quatre séries de réaction de séquençage, l'ADN est soumis à un jeu de deux réac- tions chimiques. la première réaction chimique modifie et retire la base de son sucre, la seconde coupe l'ADN en retirant le sucre ainsi exposé. On obtient ainsi des chaînes commençant à un endroit fixé et se terminant s par une base connue. Les conditions de réaction sont ajustées de façon à produire des chalnes de toutes les longueurs possibles comportant typiquement de 1 à 400 nucléotides. Etape c - Les chaines obtenues en (b) sont marquées préaLablement, ou au cours des restrictions, avec des marqueurs radioactifs. Les marqueurs radioactifs utilisés sont le 32p ou le 35S, le tritium, le 14C qui sont des émetteurs de rayonnements P-. Dans Le cadre de la méthode de Sanger, il est possible de marquer l'amorceur, Les dXTP ou Les ddXTP. Etane d Les chaÂnes d'ADN marquées sont alors séparées suivant leur longueur, les plus petites migrant le plus vite et les plus grandes Le plus lentement. Ce gel d'é- lectrophorèse qui est en général un gel de polyacrylamide permet de différencier les molécules de longueur N et N+1 avec N variant de 1 à 400 environ. L'éLectrophorèse dure de 4 à 12 heures suivant la longueur du gel qui est ensuite séché. Etape e Le gel est ensuite placé contre un film sensible au rayonnement bêta. Les marqueurs radioactifs incorporés dans Les chaînes d'ADN sont utilisés pour développer une image auto-radiographique de chaque tracé électro- phorétique. L'auto-radiographie est développée après 12 heures ou plus d'exposition au rayonnement. La position relative des bandes qui apparaissent sur l'image autoradiographique, au sein des quatre colonnes correspondant aux quatre famiLLes de réactions, permet la détermination de La séquence des bases de L'ADN de départ. Après la lecture, L'examen et l'interprétation de l'auto-radiographie, la séquence est entree dans La mémoire d'un ordinateur pour une analyse et un assem- blage ultérieurs. Ces deux méthodes de séquençage d'ADN précédem- ment décrites sont largement utilisées et comportent chacune plusieurs variantes. Bien que très performantes et efficaces, ces méthodes demandent une mise en oeuvre très complexe qui comporte de sérieux inconvénients. C'est en réalité un très gros travail, délicat, qui doit être extrêmement bien standardisé pour que la source de connaissances et la comparaison des migrations élec- trophorétiques soient fiables. Par ailleurs, la lecture des électrophorèses des chaînes radioactives se fait après auto-radiographie. Là aussi, une parfaite reproductibilité est de rigueur tant dans le développement de ces auto-radiogrammes que dans leur lecture. En effet, l'image sur film d'une bande de gel radioactif est plus large que la bande elle-même et la comparaison des positions des bandes entre les quatre pistes différentes de l'électrophorèse (qui peuvent induire un comportement non uniforme quant aux mobilités des chaînes) peut limiter la résolution effectivement observée sur l'auto-radiogramme et donc réduire la lon- gueur de la séquence qui peut être lue à partir des gels. Typiquement, de 200 à 400 bases peuvent être lues à partir d'un simple jeu de tracés. De plus, les irrégularités survenant d'un tracé à un autre peuvent rendre difficile la lecture automa- tique des auto-radiogrammes par des techniques d'imagerie existantes (par exemple densitomètres à balayages) car l'oeil humain peut actuellement mieux discriminer ces irrégularités que ne le font les ordinateurs. La nécessité d'un soin intensif quant à l'ana- lyse "manuelle" des auto-radiogrammes demande donc du temps et est sujette à des erreurs. Par ailleurs, l'utilisation de marqueurs radio- actifs présente de sérieux inconvénients quant à la manipulation (système de protection complexe des opéra- teurs et décontamination périodique des installations), au stockage des produits durant l'analyse et au stockage des déchets en fin d'analyse. Enfin, il n'est pas possible d'observer les bandes au sein du gel pendant l'électrophorèse afin de contrôler L'opération en cours, mais il faut néces- sairement terminer l'électrophorèse à un moment déterminé et attendre le développement de l'auto-radiogramme avant de pouvoir lire la séquence. Aussi, plusieurs procédés ont déjà envisagé la détection en temps réel des chaînes d'ADN pendant leur migration au cours de l'électrophorèse. Les uns s'intéressent par exemple à la détection du rayonnement p- émis par les chaînes marquées au 32p, les autres s'intéressent à la détection de l'émission de fluorescence induite par un faisceau laser. Dans le premier cas, la détection en ligne (ou temps réel) des bandes radioactives au cours de l'électrophorése peut permettre une certaine simplifica- tion, par une certaine réduction du nombre des opérations à effectuer, pour l'ensemble du procédé. Cependant, il faut tenir compte de la courte période de demi-vie du phosphore 32 et par conséquent de l'instabilité des réactifs de marquage radioactif. En outre, comme dans les méthodes pLus traditionnelles de Sanger ou Maxam et Gilbert, il demeure que des problèmes sont posés par l'élimination et la manipulation des produits radioactifs. En outre, le temps de passage des chaînes devant le détecteur étant très réduit, cela implique une plus faible efficacité de collection des rayonnements, ce qui peut entraÂner des problèmes de sensibilité et de résolution. La détection de l'émission de fluorescence induite par un faisceau laser a été proposée par Ansorge (voir DE-A-3 618 605 et l'article Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 13(1986), pp 315-323, "A nonradioactif automated method for DNA sequence determi- nation"). Cette méthode utilise un seul fluorophore pour marquer l'amorceur (ou primer) dans le cadre de la méthode de Sanger. Dans ce cas, les quatre séries de réactions de séquençage conduisent, comme décrit précédemment, à quatre familles de chaînes d'ADN déposées sur quatre pistes parallèles d'un gel d'électrophorèse, qui est traversé entièrement, suivant sa largeur, par un faisceau laser. Au sein du gel, les chaînes d'ADN marquées sont excitées les unes après les autres, dans l'ordre de la séquence, lorsqu'elles passent dans le faisceau laser, au cours de l'électrophorèse. Pour chaque piste d'électrophorèse associée à une famille de réactions donnée, la lumière de fluores- cence est collectée par une optique adaptée et conduite, après filtrage, à un détecteur de type photomultipli- cateur. Un avantage offert par cette technique est l'absence de toute partie mobile au sein de l'appareil de détection grâce aux détecteurs fixes qui permettent une détection continue sur les quatre pistes d'électro- phorèse. Toutefois, l'utilisation d'un seul fluorophore conduit inévitablement à l'utilisation de quatre pistes en parallèle, sur le gel d'électrophorèse, pour l'étude d'une seule séquence, ce qui limite les oossibilités d'évolution sensible et de simplification ultérieures. Il en est de même lors de la détection en temps réel des chaînes d'ADN marquées par du phosphore 32. Ces systèmes de détection en temps réel nécessi- tent aussi une grande fiabilité quant à la comparaison des mobilités électrophorétiques d'une piste à l'autre. Or, en pratique, plusieurs difficultés peuvent. être rencontrées; en particulier, la formation de gradient thermique et la présence d'impuretés au sein du gel peuvent induire des distorsions locales des chaînes au sein du gel, et par suite, compromettre directement l'attribution des bases dans la séquence cherchée. D'autres procédés de détection en temps réel proposent l'utilisation de plusieurs fluorophores afin d'identifier individuellement chaque famille de chaînes. Ce type de procédé présente l'avantage, dans son concept, d'offrir la possibilité de séparer des chaînes d'ADN issues des réactions de séquençage, sur une seule et même piste d'électrophorèse. Ces systèmes utilisent une série de quatre fluorophores, ce qui semble répondre aux divers problèmes soulignés précédemment. Toutefois, la mise en oeuvre spécifique de chacun de ces systèmes ne rend ces approches que partiellement réussies. Un premier système a été proposé par L.M. Smith et al. (voir FR-A-2 558 262), dans le cadre des réactions de séquençage de Sanger. Dans cette technique, les réac- tions de séquençage doivent s'effectuer dans quatre tubes séparés, chacun comprenant un marqueur fluorescent différent lié au "primer". L'appareil de détection décrit par Smith et al. utilise une série de filtres interféren- tiels à bande étroite afin de sélectionner les longueurs d'onde spécifiques d'émission de chacun des fluorophores. A partir de ce procédé relativement simple, le type de système qui en résulte comporte au demeurant certaines imperfections. En particulier, de sérieux problèmes sont engendrés par l'utilisation de molécules fluorescentes de charges et de tailles très différentes. Cette situation se traduit par l'existence de perturbations au cours de l'électrophorèse dues aux différences de mobilités électrophorétiques des diverses chaînes marquées différemment. En effet, malgré l'élabo- ration conjointe d'un logiciel lourd et assez complexe de traitement et de correction des données, ces phénomè- nes peuvent entraîner certains recouvrements voire des inversions de chaînes au cours de l'électrophorèse, empêchant ou même faussant l'identification de certaines bases le long de la séquence. Par ailleurs, cette technique requiert obliga- toirement l'utilisation de quatre "primers" spécifiques marqués. Ceci entraîne, dans les cas o d'autres vecteurs sont employés, la nécessité d'entreprendre des processus longs et complexes de synthèse et de purification de quatre nouveaux "primers" fluorescents. Un second système proposé par J.M. Prober et al. (voir EP-A-O 252 683) repose, toujours dans le cadre des réactions Sanger, sur l'utilisation de quatre fluoro- phores liés aux quatre ddXTP. Ce marquage différent des ddXTP procure un certain nombre d'avantages. En particulier, les quatre réactions de séquençage peuvent s'effectuer dans un même tube, un amorceur unique non marqué peut alors être utilisé et les produits de réac- tion peuvent être séparés au sein d'une même colonne d'électrophorèse. Cependant, Le fait de greffer au ddXTP des marqueurs extrinsèques, c'està-dire les fluorophores, qui sont des molécules assez complexes et très volumi- neuses, peut entraîner des décalages imprévisibles dans les mobilités de certaines chaînes au cours de l'électro- phorèse et surtout restreindre fortement le choix d'en- zymes de complémentarité; ceci élimine la possibilité d'utilisa ion des enzymes courantes comme amorceur, comme par exemple le fragment de Klenow d'ADN polymérase. Les fluorophores utilisés sont généralement les dérivés de la fluorescéine. L'invention a donc pour objet un procédé d'iden- tification des séquences d'un ADN permettant de remédier à la plupart des inconvénients donnés précédemment. Des problèmes similaires apparaissant dans le séquençage $ de tout autre acide nucléique et, en particulier, dans les ARN, l'invention s'applique aussi à toute autre molécule complexe protéine ou peptide). L'invention a pour objet un procédé d'identification de la séquence des bases d'un acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes suivantes: A) production de fragments de l'acide nucléique, 8) réactions chimiques spécifiques des bases pour former des familles de chaÂnes de taille différente, chaque famille comportant à une extrémité une base spécifique, C) marquage spécifique desdites familles de chaînes, D) introduction une à une des chalnes marquées dans des moyens d'atomisation et d'ionisation, E) atomisation et ionisation de chaque chaÂne marquée à l'aide desdits moyens, F) détection en temps réel des ions formés par spectrométrie de masse, et G) traitement des signaux issus de la spectrométrie de masse, ces signaux permettant de déterminer la longueur de chaque chaîne et le marquage spécifique de chaque famille de chaînes. Le fonctionnement en temps réel est lié au fait que, dans l'invention, les ions sont détectés au fur et à mesure de leur formation. L'ionisation des chaînes marquées puis la détection de ces chaînes par un spectromètre ou analyseur de masse facilite considérablement la détection des chaÂnes marquées et donc l'identification des bases de l'acide nucléique. Le procédé selon l'invention s'applique parfai- tement bien au séquençage de l'ADN. Ce procédé de séquençage fonctionne en continu et ne comporte pas d'étape de radiographie ni d'éLectro- phorèse selon l'art antérieur. En outre, les chaînes de nucléotides marquées sont examinées et analysées une par une et non globalement selon l'art antérieur. De façon préférentielle, on effectue un marquage de tous les nucléotides de chaque chaîne; la détection des marqueurs de chaque nucléotide donne l'information de la longueur de ces chaînes alors que la détection du marquage spécifique donne l'information de la famille de chaines. Enfin, l'ionisation et la spectrométrie de masse permettent L'utilisation de marqueurs liés de manière intrinsèque ou extrinsèque aux différents nucleo- tides, ce qui autorise l'application de ce procédé aux diverses méthodes chimiques de séquençage les plus répan- dues, et en particulier, celle de Sanger et de ses variantes. De façon avantageuse, le marquage spécifique de chaque famille de chaÂnes et/ou le marquage de tous les nucleotides de chaque chaîne sonteffectués avec des isotopes ou des petites molécules. Par petites molécules, il faut comprendre des composés chimiques pouvant être liés aux nucléotides et qui comportent au moins un élément marqueur identifiable par spectrométrie de masse, tel que CF4, Si(CH3)3, en utilisant par exemple une technique décrite dans l'article Tetrahedron letters vol. 26, N 40, pp. 4915-4918 (1985), C.D. Pein, D. Cech. Le procédé selon l'invention, grâce à l'utilisation de trois, quatre ou plusieurs 3 isotopes ou petites molécules stables, c'est- à-dire non radioactives, donc non dangereuses pour les opérateurs, facilite considérablement les interventions humaines dans le procédé d'identification. L'invention a aussi pour objet une installation pour l'identification des bases d'un acide nucléique comportant essentiellement: - une source de familles de chaînes de bases de longueur différente, chaque famille de bases étant spécifiquement marquée, - des moyens d'atomisation de chaque chaSne marquée, - des moyens pour introduire une à une dans les moyens d'atomisation les chaînes marquées, - des moyens d'ionisation des chaînes individualisées et atomisées, - un spectrométre de masse équipé de plusieurs détecteurs pour sélectionner et détecter les ions formés, et des moyens de traitement des signaux fournis par les détecteurs, ces signaux permettant de déterminer La longueur de chaque chaîne marquée et le marquage spécifique de chaque famille de chaînes. Comme on l'a dit précédemment, l'invention s'appLique à toute autre molécule complexe que l'ADN et L'ARN. Aussi, l'invention a encore pour objet un procédé d'identification des motifs d'une molécule organique complexe ou d'un fragment de cette molécule, comportant essentiellement les étapes suivantes: - réactions chimiques spécifiques desdits motifs pour former des chaÂnes de longueur différente, comportant, à une première extrémité, un motif spécifique, - marquage spécifique desdites chaînes, introduction une à une des chaînes marquées dans des moyens d'atomisation et d'ionisation, - atomisation et ionisation de chaque chaîne marquée à l'aide desdits moyens, - détection en temps réel des ions formés par spectrométrie de masse, et - traitement des signaux issus de la spectrométrie de masse, ces signaux permettant de déterminer la longueur de chaque chaÂne et leur marquage spécifique. D'autres caractéristiques et avantages de l'in- vention ressortiront de la description qui suit, donnée à titre illustratif et non limitatif aux dessins annexés, dans lesquels: la figure 1 représente un schéma d'ensemble des étapes de séquençage automatisé d'ADN selon L'inven- tion, - la figure 2 représente un schéma d'ensemble d'une installation automatisée pour le séquençage d'ADN conforme à l'invention, - la figure 3 représente le type de données produites par un séquençage d'ADN selon l'invention. La description qui va suivre se réfère au sé- quençage de l'ADN, bien que comme on l'a dit précédem- ment, l'invention s'applique à tout acide nucléique (ARN par exemple) et même à toute molécule organique complexe (protéine, peptide). La premièere étape du procédé, en référence à la figure 1, consiste à fragmenter un génome d'ADN (étape a), conformément à l'art antérieur cité. Cette étape de fragmentation porte La référence 2 sur la figure 1. Les chaînes obtenues sont alors soumises aux réactions de séquençage (étape b) selon les méthodes de Sanger, si ce n'est que l'échelle peut être augmentée en cas de besoin pour fournir une intensité de signal adéquate pour la détection de chaque famille de chaînes. Aucun nucleotide radio marqué n'a besoin d'être incdu dans les réactions de séquençage. Les réactions de sé- quençage sont symbolisées par le bloc 4 sur la figure 1. Selon l'invention, tous les nucléotides incor- porés selon Sanger au cours de la synthèse des chaînes nucléotidiques complémentaires du fragment d'ADN à sé- quencer sont marqués ou bien comportent une caractéris- tique identifiable par spectromérie de masse. En outre, un marquage spécifique de chaque famille de chaines issue des réactions de séquençage doit être effectué. Le marquage des chaînes nucléotidiques, symbo-. lisé par le bloc 6, peut être réalisé en utilisant un isotope ou une combinaison d'isotope stable, constituants éventuels de petites molécules stables, afin de marquer spécifiquement chaque nucléotide de chaque chaîne ainsi que l'extrémité de ces chaines en fonction de la base terminale de ces chaines. Le marquage spécifique de la famille de chaîne peut être réalisé sur l'amorceur, comme décrit dans le document FR-A-2 558 262, ou sur le didésoxy nucléotide, comme décrit dans le document EP-A-0 252 683, mais en utilisant des isotopes ou petites molécules stables. Grâce à ce double système de marquage, chaque chaîne d'ADN issue des réactions chimiques de séquençage comporte une double information: 1) la détection du nombre de marqueurs et donc du nombre de nucléotides constituant chaque chaÂne, qui donne l'information taille de la chaîne (comme le faisait antérieurement l'électro- phorèse -étape d-), 2) la détection du marqueur stable spécifique de la famille qui donne le type de nucleotide, et donc de base, existant à l'une des extrémités de la chaîne (comme le faisait antérieurement les fluorophores ou les isotopes radioactifs -étape c-). Le marquage isotopique selon l'invention des chalnes d'ADN peut être réalisé au niveau de l'un des trois composés chimiques constituant les nucleotides, c'est-à-dire la base, le sucre ou le groupement triphos- phate ou éventuellement sur un groupement alpha-thio- phosphaté dans lequel l'atome d'oxygène lié au premier phosphore est remplacé par un atome de soufre. Le marquage des chaînes peut être réalisé de façon intrinsèque sur le carbone, l'hydrogène, l'azote, l'oxygène ou même le soufre entrant dans la constitution des trois composés chimiques d'un nucléotide. L'utilisa- tion d'isotopes naturels stables, selon l'invention, offre un choix plus important que les isotopes radioac- tifs généralement utilisés (32p, 35S, 14C, 3H) pouvant entrer dans la constitution des différents composés nucléotidiques. Une liste de ces isotopes stables, incluant leur abondance naturelle relative, est donnée dans le *tableau 1. Tableau: Isotopes naturels stables pour marquage intrinsèque des composés nucléotiques Isotopes Abondance relative (%) D 0,015 13C 1,10 N 0,37 170 0,038 0,20 32S 95,02 33S 0,75 34S 4,21 36S 0,02 Du point de vue chimique, les réactions pour incorporer un isotope stable ou un isotope radioactif sont les mêmes. Les divers procédés de marquage de molécules biologiques par des isotopes stables existent et sont largement répandus (voir à cet effet l'article "The preparation of purines, pyrimidines, nucleotides and related compounds labelled with 170 and other stable isotopes", E. Petreanu, J.S. Cohen and D. Samuel, Proceedings of the 2nd International Conference on methods of preparing and storing labelled compounds, pp. 489-497). Différentes molécules marquées, en particulier les nucléotides peuvent être produites par voie de synthèse ou par voie enzymatique. En particulier, de nombreux composés nucléotidiques marqués avec des isotopes stables sont disponibles sur le marché pour des applications en biologie et en pharmacologie différentes de celles de l'invention (voir par exemple l'article Dehalogenation reactions in fast atom bombardment mass-spectrometry, Anal. Chem. 1984.56, 1975.77). Des exemples de nucleotides marqués à l'aide d'isotopes naturels sont donnés dans les annexes I et I. Ces exemples ont uniquement pour but d'illustrer des moyens de marquage possibles utilisables dans l'in- vention. Comme données dans ces annexes I et II, le - marquage peut être effectué sur les formes désoxytri- phosphate (annexe I) ainsi que sur leurs analogues alpha-thiotriphosphate (annexe II) pour le marquage de chaque nucleotide et peut être effectué sur les formes didésoxytriphosphate (annexe I) ainsi que sur leurs analogues alpha-thiotriphosphate (annexe II) pour le marquage spécifique de la famille. Comme autre nucléotide marqué intrinsèquement utiLisable pour l'information de taille des chalnes issues des réactions de Sanger, on peut citer le 1 ou 3-15NdATP, l'Io-180dCTP, le 4-180dTTP, le 2-13CdATP ou dCTP, le 8-13CdATP, le 5'-13CdATP, l"t-SdATP, lI-SdGTP, l 32, 34, 33 ou 36, le méthyl 13CdTTP. Il est aussi possible, selon l'invention, d'ef- fectuer un marquage extrinsèque des nucléotides de chaque chaîne, des didésoxy nucleotides de ces chaînes ou même des amorceurs. Ce type de marquage comporte l'avantage de pouvoir lier au nucléotide des atomes (sous forme mono ou polyatomique) qui ne sont pas naturellement présents dans ces molécules. Ces marqueurs sont consti- tués d'éléments ou de petits complexes moLéculaires d'éléments alcalins, alcalino-terreux ou halogéniques. Dans le cadre des réactions de séquençage, le marquage extrinsèque selon l'invention présente moins de risque de dénaturer les propriétés physiques et chimi- ques des nucléotides, contrairement à l'adjonction selon l'art antérieur de grosses molécules telles que les chromophores ou fluorophores qui ne peuvent être liées que par l'intermédiaire de bras spécifiques relativement complexes. Ainsi, les éléments ou petits complexes molé- culaires selon l'invention peuvent être directement greffés au nucléotide en profitant des liaisons covalen- tes disponibles au sein de la base ou du sucre de chaque nucléotide (voir par exemple l'article d'Anal. Chem. cité en dernier). Des exemples de marquage extrinsèques selon l'invention sont donnés en annexe III. Cet exemple donne un jeu complet de bases nucléotidiques de L'ARN et ADN marquées extrinsèquement. En particulier, X représente un atome de fluor, de chlore, de brome ou d'iode. Comme nucléotide marqué par des halogènes utili- sables dans l'invention, on peut citer le 8-bromo dGTP, le 5-bromo dCTP, le 3'-bromo, chloro ou iodo dTTP, le -bromo iodo ou fluoro dTTP, le 3'FdGTP. En tenant compte de l'existence de plusieurs isotopes stables possibles des différents marqueurs extrinsèques (éléments halogènes par exemple), les possi- bilités de marquage isotopiques des nucleotides sont fortement accrues. Une liste des différents isotopes stables d'élé- ments halogènes est présentée dans le tableau 2, accompa- gnés de leur abondance naturelle relative. Tableau 2: Isotopes naturels stables des éléments halo- gènes pour le marquage extrinsèque Isotopes Abondance relative (Z) 19F 100 Cl 75,77 37Cl 24,23 79Br 50,69 81Br 49,31 127 1 100 Conformément à l'invention, il est possible d'effectuer des marquages multiples des nucleotides de chaque chaîne issue des réactions de séquençage (in- formation taiile), des didésoxy nucleotides et amorceurs (information famille) de ces chaines, ces marquages étant des marquages intrinsèques et/ou extrinsèques. En premier lieu, on peut citer des possibilités d'incorporer plusieurs isotopes marqueurs de m&me type sur un nucléotide donné. Comme nucléotide marqué de ce type, on peut citer par exemple le 1,3-15N dATP, le 1,315NdCTP, le 2,8-dichloro ou dibromo ou difluoro dATP, le 5,5-dibromo dCTP. Ceci permet d'accroÂtre d'au- tant la 'sensibilité obtenue Lors de la détection et de l'identification des chaÂnes nucléotidiques. En second Lieu, plusieurs marqueurs différents peuvent tre incorporés au sein d'un même nucleotide afin d'affiner sa signature. De plus, la détection simultanée de plusieurs marqueurs augmente considérable- ment les combinaisons de marquages possibles. L'exemple suivant montre que trois types de marqueurs isotopiques stables suffisent à l'identifica- tion de quatre nucléotides différents: 13C seul NucLéotide de type A 13C + 170. l "l G 13C + 15N..." C N + 170 "i go T Ainsi, les marquages intrinsèques et extrinsè- ques des nucléotides à l'aide d'isotopes stables peuvent être combinés et offrent de réelles possibilités multi- pies et variées. Cette méthode de marquage s'avère plus souple et plus riche d'évolution que les marquages radio-iso- topiques ou par fluorophores selon l'art antérieur qui restent forcément plus limités dans leurs possibilités. De plus, la plupart des inconvénients rencontrés avec ces derniers lors de leur manipulation et de leur utili- sation sont évités voire complètement éliminés. Les chaînes d'ADN marquées sont alors placées dans une source d'échantillon 8 appropriée à leur introduction individuelle dans une source d'ions. Cette étape est réalisée grâce à la formation de microgouttelettes contenant au plus une molécule marquée. Celles-ci sont ensuite introduites successivement une à une dans une source d'ions chargée de l'atomisation et de l'ionisation. Cette étape porte la référence 10 sur la figure 1 et correspond à l'étape D et E. Les ions formés pour chaque chaTne marquée sont alors sélectionnés puis détectés par spectrométrie de masse, comme indiqué en 12, et les signaux issus de la spectrométrie de masse sont traités, comme indiqué en 14 en vue de reconstituer l'ADN de départ (étape G). L'installation permettant le séquençage automa- tisé de l'ADN, conformément à l'invention, est schéma- tisée sur La figure 2. La fragmentation du génome, les réactions chimiques de séquençage et le marquage étant effectués de façon discrète ou de façon indépendante dans le temps, ne sont pas représentés sur la figure 7. L'installation représentée comporte une source 18 de chalnes marquées d'ADN à l'aide d'isotopes stables selon l'invention, placée sous pression et contenant une cuve 20 destinée à recevoir l'échantillon 22 des chalnes marquées d'ADN diluées dans une solution tampon. Un tube 24 plongeant dans l'échantillon 22 assure l'introduction des chaînes d'ADN marquées dans une source d'ions 26. Le cristal piézoélectrique 28 permet la nébulisation en microgouttelettes de l'affluent du tube 24. Elles sont alors introduites une à une dans une source à plasma 32 équipée de bobines électromagnétiques 33 reliées à un générateur radiofréquence 34. Dans la zone 32a la plus chaude du plasma, o La température atteint 7000 à 8000 K, Les molécules d'ADN sont atomisées et ionisées. La torche à plasma est la source préférée d'io- nisation selon l'invention car elle permet l'atomisation complète des molécules et induit une simplicité maximale dans le spectre de masse obtenu après analyse d'éléments simples. Les ions formés sont aLors pris en charge par l'optique d'entrée 36 d'un spectromètre de masse 38 qui peut être du type à secteur magnétique o un vide différentiel s'installe grâce à des pompes primaires et secondaires 39; La pression au niveau de l'optique ionique 36 est de l'ordre de 10-4 torr (10-2Pa) et la pression au niveau des pièces polaires 40 du spectromètre est de l'ordre de 10-6 torr (10-4 Pa). Le premier rôle du spectromètre de masse 38 est de sélectionner et d'identifier grâce à son optique ionique 36 et ses pièces polaires 40, la présence des masses spécifiques obtenues grâce au traceur isotopique utilisé précédemment. Le spectromètre de masse 38 peut opérer en mode sélectif ce qui consiste à balayer uni- quement les masses caractéristiques dues à la présence du marqueur isotopique, afin de fournir un maximum de sensibilité. La détection par spectrométrie de masse permet à la fois de détecter les chaînes d'ADN marquées au fur et à mesure de leur sortie de la source de fragments 18, d'identifier, grâce à leurs marqueurs spécifiques, à quelle famille elles correspondent ainsi que de déterminer leur taille grâce au comptage du nombre de nucléeotides. Les molécules ionisées et sélectionnées par le spectromètre de masse sont alors détectées à l'aide d'une série de détecteurs 42 situés à la sortie du spec- tromètre 38, du type multiplicateur d'électrons et qui sont sensibles à l'impact d'un seul ion. Les ions sélec- tionnés peuvent donc être détectés individuellement, ce qui favorise l'obtention d'une sensibilité maximale de l'installation totale de séquençage. Le signal de comptage fourni par chaque détecteur 42 est alors reçu dans un micro-ordinateur 46 du type PC qui gère automatiquement, à la fois le pilotage des divers sous-ensembles (18, 26, 38) de l'installation, le traitement et la représentation des données. Pour chaque chaîne marquée, l'événement correspondant à son identification par spectrométrie de masse est caractérisé par la détection simultanée: 1) d'un marqueur caractérisant la famille de la chaîne, 2) d'un certain nombre d'autres marqueurs associés à chaque nucléotide de la chaîne. Ce nombre est directement relié à la quantité de nucléotides constituant la chaîne, donc à sa longueur (autant de marqueurs que de nucléotides par exemple). Au bout d'un certain temps, de nombreuses chaînes sont passées une à une dans L'ensemble de détec- tion. Une statistique est alors constituée afin d'éta- blir des diagrammes tels que représentés sur la figure 3. Les diagrammes de la figure 3 correspondent à l'ADN hypothétique TGACTGCACGTA. Le nombre d'événements associés à la présence d'un marqueur spécifique stable d'une famille (sur le didésoxy par exemple) est porté en ordonnée: isotope 1 pour les chaînes terminées par l'adénine (famille A); isotope 2 pour les chaÂnes terminées par la guanine (famille G); isotope 3 pour les chaines terminées par la cytosine (famille C) et isotope 4 pour les chaines terminées par la thymine (famille T). L'unité des ordon- nées est arbitraire. Le nombre de marqueurs stables associés aux nucléotides et détectés simultanément lors des événements est porté en abscisse. Ce nombre est directement relié (voire proportionnel) au nombre de nucléotides (n, n+l, n+2... avec n variant de I à 400 environ) constituant les chaÂnes détectées dans l'ensemble du système de détection. Les diagrammes établis pour les quatre types de familles donnent alors les informations nécessaires pour déterminer l'ensemble de la séquence de l'ADN de départ. A titre illustratif, on donne, ci-après, trois exemples de marquage des différentes chaines de l'ADN hypothétique TGACTGCAACGTA. Au cours des réactions de séquençage selon Sanger, tous les nucléotides libres présents (désoxy et didésoxy) sont marqués. Leur incorporation dans les bras synthétisés engendrent des chaines de la forme: didésoxy nucLéotide marqué (*) X X X X X X X XX X X *x désoxy nucléotides marqués (X) EXEMPLE 1 désoxy nucléotides marqués didésoxy nucléotides marqués au 13C: marqués spécifiquement: 2 - 13C dATP 2,8 dicloro ddATP (35Cl) 8 - 13C dGTP 5,5 dibromo ddCTP (79Br) 2 - 13C dCTP 8,3' difluoro ddGTP (19F) méthyl 13C dTTP 5,3' diiodo ddTTP (127I) Chaines marquées T G A C T G T G A C T I I I '19F I I I I 127I 13c 13c 13c 13c 13c 3c 13c 13c 13c T G A C T G C A 13C 13C 13C 13C 13C 13C 13C T G A C T G C I I I I I t i 79Br 13C 13 13C 13C 13C 13c 13C EXEMPLE 2 désoxy nucleotides didésoxy nucléotides marqués au 32S marqués spécifiquement - 32S dATP 1,3 15N ddATP c0 32S dGTP 2,4 13C ddCTP C0 32S dCTP 2,4 180 ddTTP c 32S dTTP C T G A C T G T 6 A C T i I I I I \70 I I I I 180 32s 32s 32s 32s 32s 32s 32s 32s 32s T G A C T G C A I I I I I I I 15N 32S 32S 32S 32S 32S 32S-32S T G A C T G C 1 1 3C 32s 32s 32s 32s 32s 32s EXEMPLE 3 désoxy nucleotides marqués didésoxy nucleotides au 79Br marqués spécifiquement: 8 bromo dATP - 32S ddATP 8 bromo dGTP 0 - 33S ddGTP bromo dCTP 0 - 34S ddCTP bromo dTTP e- 36S ddTTP ChaÂnes marquees T 6 A C T G i I I I '33s 79Br 79Br 79Br 79Br 79Br T 6 A C T I I ' I I SI 36s 79Br 79Br 79Br 79Br T G A C T G C A I I I I I I I 32S 79Br 79Br 79Br 79Br 79Br 79Br 79Br T G A C T G C i I I I I I \ 34s 7 ?9Br 79Br 79Br 79Br 79Br L'invention ayant été décrite en détail, il est évident que d'autres analyses telles que l'analyse de l'ARN ou d'autres types de molécules complexes organiques peuvent être effectuées grâce au procédé et à l'installation selon l'invention. ANNEXE I 0f O 10Si-oo C/) o dI -I 1 tl'A T po lcl O '-t o-P- -I-h-,- I,IIlI II o- - P-C-P -C$) oo-P-ao- oo--o-c 0 I,', c'oo oo O'Ca "'J 8C(cl) ci &TP3_(ci)c rp R14 R i Hd, JXTP -1,1 X-Tp o "O ANNEXE IlI o O O Il 11 11l I-o |- _ -o--o_ Il, a luxé - t,, a) ( SrT* P Es 52 -s - s *' 5,I-5,X R = i-i do, aI X1rP ANNEXE I I I NH2 I NtN3,CHN Ox-.N ADENINE IJMACI A URACIL jS%1 z N H HNH H2, NHN H N N SUAMINE CYTOSINE REVENDICATIONS 1. Procédé d'identification de la séquence des bases d'un acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes suivantes: A) production (2) de fragments de l'acide nucléique, B) réactions chimiques spécifiques (4) des bases pour former des familles de chaînes de taille différente, chaque famille comportant à une extrémité une base spécifique, C) marquage spécifique (6) desdites familles de chaînes, D) introduction (24) une à une des chaînes marquées dans des moyens d'atomisation et d'ionisation (26, 28, 30, 32), E) atomisation et ionisation (10) de chaque chaîne marquée à l'aide desdits moyens, F) détection (12) en temps réel des ions formés par spectrométrie de masse, et G) traitement (14) des signaux issus de la spectrométrie de masse, ces signaux permettant de déterminer la Longueur de chaque chaÂne et le marquage spécifique de chaque famille de chaînes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on marque en outre chaque nucléotide de chaque chaîne. 3. Procédé selon la revendication I ou 2, caractérisé en ce que le marquage est effectué avec des isotopes ou des petites molécules stables. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le marquare est réalisé de façon intrinsèque avec au moins un isotope choisi parmi D, 13C, 15N, 170, 180, 32S, 33S, 34S et 36S. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisé en ce que le marquage est réalisé de façon extrinsèque avec au moins un isotope choisi parmi 19F, 35Cl, 37Cl, 79Br, 81Br et 127I. 6. Procédé d'identification selon l'une quelconque des revendications I à 5, caractérisé en ce que l'acide nucléique est l'ADN. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape B) consiste à synthétiser une chalne de nucleotides complémentaire d'un fragment dudit acide nucléique à partir d'un amorceur jusqu'à ce qu'elle incorpore un didésoxynucléotide. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le marquage est effectué sur un élément choisi parmi la base, le sucre et le triphosphate du didésoxy nucleotide et l'amorceur. 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que chaque nucléotide incorporé au cours de la synthèse de chaque chaÂne est marqué. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'étape G consiste à compter le nombre de nucléotides marqués de chaque ion détecté pour déterminer la longueur des chalnes et à identifier le marquage spécifique de chaque famille de chaînes. 11. Installation pour l'identification des bases d'un acide nucléique comportant essentiellement: - une source (18) de familles de chaînes de bases de longueur différente, chaque famille de bases étant spécifiquement marquée, - des moyens (24) pour intrOduire une à une dans les moyens d'atomisation les chaines marquées, - des moyens (26, 28, 30) d'atomisation de chaque chaÂne marquee, - des moyens (32) d'ionisation des chaînes individualisées et atomisées, - un spectromètre de masse (38) équipé de plusieurs détecteurs (42) pour sélectionner et détecter les ions formés, et - des moyens (46) de traitement des signaux fournis par les détecteurs (42), ces signaux permettant de déterminer la longueur de chaque chaîne marquée et le marquage spécifique de chaque famille de chaînes. 12. Installation selon la revendication 11, caractérisée en ce que les moyens d'ionisation comportent une torche à plasma (32). 13. Procédé d'identification des motifs d'une molécule organique complexe ou d'un fragment de cette molécule, comportant essentiellement les étapes suivantes: - réactions chimiques spécifiques (4) desdits motifs pour former des chaînes de longueur différente, comportant, à une première extrémité, un motif spécifique, - marquage spécifique (6) desdites chalnes, - introduction une à une des chaînes marquées dans des moyens d'atomisation et d'ionisation (26, 28, , 32), - atomisation et ionisation (10) de chaque chaîne marquée à l'aide desdits moyens, - détection (12) en temps réel des ions formés par spectrométrie de masse, et - traitement (14) des signaux issus de la spectrométrie de masse, ces signaux permettant de déterminer la longueur de chaque chaîne et leur marquage spécifique.