FR 2643559 A1 19900831 FR 8902992 A 19890228 EXTRAITS DE CYANOBACTERIES FILAMENTEUSES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEUR ACTIVITE EN TANT QUE FACTEUR DE CROISSANCE La présente invention est relative à des extraits de cyanobactéries filamenteuses, à leur procédé de préparation et à leurs applications théra- peutiques et/ou dermocosmétiques en raison de leurs effets analogues à ceux d'un facteur de croissance. L'utilisation des algues est bien connue depuis l'antiquité pour leurs propriétés cicatrisantes. Ainsi, Lesage a utilisé avec succès, en médecine vétérinaire, les propriétés de certaines algues. En 1952, Lefevre a mis en évidence les propriétés cytostimulantes de certaines cyanobactéries. En utili- sant un filtrat de culture d'algues, obtenu par filtration stérilisante, il a constaté qu'il obtenait aussi bien sur les cellules végétales en cultures que sur les cellules animales, une stimulation de la multiplication cellulaire. Ces travaux, confirmés par des études pharmacologiques et cliniques, n'ont pas permis alors d'apporter de précisions sur les mécanismes d'action (voir "Cyanostimulines et cicatrisation", M. Lefevre, G. Laporte, O. Flandre, Colloq. Intern. CNRS, Paris, nO 145, 217-227, 1963 et "Sur la sécrétion par certaines cyanophycées de substances stimulant la multiplication cellulaire", C.R. Acad. Sci., t, 256, pp. 254-260). L'invention concerne les extraits de cyanobactéries filamenteuses obte- nues à partir de cultures in vitro. Les travaux ont porté sur diverses cyanobactéries filamenteuses du type Oscillatoria et LPP groupe A et plus particulièrement sur l'espèce identifiée sous le nom de Phormidium, isolée dans les bassins de la Compagnie Thermale de Dax. L'invention a encore pour objet un procédé de préparation des extraits actifs à partir de cultures des espèces de cyanobactéries ci-dessus dénom- mées. Ces cyanobactéries sont soumises, en vue de libérer, d'extraire, d'isoler et de concentrer la fraction active responsable de l'activité, aux traitements suivants. 2 2643559 Schéma du procédé Extrait Brut A Traitement 1000C - 10 mn Centrifugation Culot Et1.Ltrait Thbermostable B (surnagepn) Précipitation milieu alcoolique 60 Z Centrifugation Surnageant C/S -=Précipité C/P 1. Préparation de l'Extrait Brut A. Après lavage des filaments et rinçage à l'eau distillée, on procède à un craquage des cellules par sonication. Une première centrifugation est effec- tuée pendant une heure (10 000 g) puis le surnageant est recueilli et est à nouveau centrifugé pendant une heure (10 000 g). Le surnageant, selon le degré de purification souhaité, peut alors être soumis à une dialyse afin d'éliminer les constituants de poids moléculaire inférieur à 10 Kd, puis à une lyophilisation. Orn obtient la fraction A de couleur bleue due à des pigments de type PhycobiliAes, et qui presente les carac[,riz.iques $uivA'eçv: - Spectre: maximum d'absorption à 610 r.mn; - Microanalyse: N = 12 % et O = 33 %; - Rendement moyen 0,02 à 0,10 g par litre de milieu de culture. 2. Préparation de l'Extrait B. L'extrait brut A lyophilisé est remis en solution aqueuse à 1%. La solution est alors chauffée à 100 C pendant 10 minutes afin de provoquer par la dénaturation thermique la précipitation d'une fraction des constituants de l'extrait A. 70 % des protéines sont ainsi éliminées. Le liquide surnageant est récupéré par centrifugation (10 000 g) et lyophilisé. On obtient ainsi l'extrait thermostable B avec un rendement de % par rapport à l'extrait A. Cet extrait présente les caractéristiques physico-chimiques suivantes - Spectre visible: absence d'absorption à 610 nm - Microanalyse: N = 4 % (12 % dans l'extrait A) O = 46 % (33 % dans l'extrait A). Cette analyse témoigne d'un enrichissement de l'extrait B en fractions osidiques. L'électrophorèse sur gel d'acrylamide, gradient 6/15 %, en présence de sodium dodecyl sulfate, après révélation par le Bleu de Comassie, permet de caractériser des bandes de polypeptides de l'extrait B. Par rapport à l'extrait A il y a disparition des bandes spécifiques des pigments bleus et un enrichissement dans la bande spécifique des poids moléculaires élevés. La nature glycoprotéique de certaines fractions est révélée par leur coloration avec le réactif de Schiff. 3. Préparation de l'Extrait C. L'extrait B lyophilisé est remis en solution aqueuse à 1 %. 10 ml de cette solution, maintenus à une température de 0 C, sont additionnés de ml d'alcool éthylique à 90 (correspondant à une précipitation en milieu alcoolique à 66 ). Par centrifugation (10 000 g) pendant 30 minutes, le précipité recueilli forme l'extrait C; il représente 30 % par rapport à l'extrait B. Ses caractéristiques physico-chimiques sont les suivantes - Microanalyse: N = 5 % (léger enrichissement par rapport à l'extrait B); - Electrophorèse: elle permet d'établir la nature glycoprotéique des constituants. En effet, une fraction importante de nature protéique a été éliminée avec le surnageant. Etude toxicologique Cette étude a mis en évidence la parfaite tolérance locale et générale des extraits de l'invention et leur absence de toxicité in vitro et in vivo. Administrés aussi bien en applications locales sur la peau et les muqueuses qu'en injections intradermiques, ils n'ont provoqué aucune réac- tion ni aucun phénomène tel que rougeur, inflammation ou allergie. Etude pharmacologique a. Evaluation de l'effet stimulant de croissance in vitro. L'activité des différents extraits de l'invention a été mesurée par le test de croissance sur Fibroblastes murins L 929 (Adolphe, M., Pointet, Y. , 4 2643559 Renot, X., Wepierre, J. "Use of fibroblast cell culture for the study of wound healing drugs", Int. J. Cosmetic Science, 6, 55-58, 1984, modifiée par Hodara et Lefort-Tran, 1986). Le produit à tester est ajouté dans le milieu de culture carencé en sérum de veau nouveau-né et le pourcentage relatif de croissance est évalué par rapport au témoin (milieu enrichi par 0,5 % de sérum de veau). 1. Extrait A: à la concentration de 200 pg/ml, on obtient un pourcen- tage relatif de croissance de 144 %. 2. Extrait B: à la concentration de 200 pg/ml, le pourcentage obtenu est de 145 %. 3. Extrait C: à la concentration de 100 iig/ml, le pourcentage est de %. Ce test permet de constater que l'extrait B conserve intégralement son activité après traitement par la chaleur et que la précipitation en milieu alcoolique enrichit de manière considérable l'extrait C en principe actif. Activité sur la prolifération cellulaire Les essais ont permis de mettre en évidence l'activité biologique des extraits de l'invention. En premier lieu, les extraits possèdent une activité sur la croissance cellulaire qu'ils stimulent. Cet effet est comparable à celui obtenu avec le sérum de veau nouveau-né; il exprime la présence dans les extraits d'une substance assimilable à un facteur de croissance. L'analyse en cytométrie de flux de la population cellulaire qui permet de répartir et de dénombrer cette population en fonction des différentes phases classiques du cycle (GO, S, G1 et M) a montré une nette accélération du passage de la phase G1 à la phase S, ceci confirme l'effet stimulant de l'extrait sur une phase précise du cycle. Activité réparatrice sur la morphologie des cellules fibroblastiques L'effet stimulant de la croissance s'accompagne d'une activité réparatrice sur les cellules des cultures carencées en sérum, qui subissent des modifica- tions importantes au niveau morphologique (cellules à plusieurs prolonge- ments). L'addition de l'extrait entraîne un retour rapide à la forme en fuseau. Evalué sur les cultures asynchrones et synchrones, cet effet sur la morphologie se manifeste par une modification de la répartition de la popula- tion cellulaire 2643559 - diminution des classes de cellules à 3, 4 ou 5 prolongements augmentation de la classe des cellules fusoTdes - forte augmentation des mitoses dès 24 heures, caractérisée par le nombre élevé de cellules arrondies. Cet effet sur la morphologie cellulaire a été confirmé par l'observation du réseau d'actine constituant du cytosquelette et un facteur essentiel de l'acquisition et de la conservation des formes des cellules euraryotiques. Il a été constaté, dans les cellules cultivées en présence de 0,5 % de sérum de veau nouveau-né, la désorganisation du réseau d'actine et l'effet réparateur de l'extrait de l'invention. De nombreux essais ont été effectués sur différents types de cellules autres que les Fibroblastes murins L 929. Les mêmes actions stimulante et réparatrice ont été mises en évidence. Activité agrégative Il a été constaté en outre que l'extrait A de l'invention induit sur les cultures de fibroblastes, une tendance agrégative mise en évidence par une analyse statistique de la répartition cellulaire. Cette tendance au regroupement cellulaire en présence d'extrait pourrait être due à une modification de la motilité cellulaire et cette propriété pourrait être utilisée pour prévenir la migration des cellules transformées. Cette activité est le signe de la présence d'un facteur thermolabile de nature protéique; elle est faible ou nulle avec les extraits B ou C. b. Evalutation de l'activité in vivo. L'activité des extraits de l'invention a été mise en évidence chez le rat et le lapin. On a ainsi constaté leur action stimulante sur les tissus nécrosés présentant un retard de cicatrisation. On observe une accélération de la réduction de la surface de la plaie et une reconstitution rapide des tissus cutanés normaux en même temps qu'une atténuation des phénomènes inflamma- toires. Les études qui viennent d'être rapportées ont mis en évidence la bonne tolérance des extraits de l'invention ainsi que leurs intéressantes propriétés qui les rendent très utiles en thérapeutique humaine et vétérinaire ainsi qu'en dermocosmétique. Selon le but recherché, cn pourra utiliser les extraits A et B, doués de la même activité, ou l'extrait C, deux fois plus actif. Les compositions de l'invention peuvent être présentées sous forme de pommades, crèmes ou lotions pour l'administration locale, en association avec des excipients thérapeutiquement administrables. Dans ces formes, le pour- centage en principe actif est compris entre 0,01 % et 10 %, de préférence 0,2 à %. Exemples de formulation Gel topique Extrait A 0,1 g Methycellulose 3 g Eau purifiée qsp 100 g Conservateurs, parfum QS Solution injectableintradermique Extrait C 0,5 inmg Soluté physiologique 1 ml Préparation stérile (filtration stérilisante) Crème grasse Extrait B 0,5 g Eau purifiée 5 ml Lano-vaseline qsp 100 g Conservateurs, parfum QS (appliquée tel quel ou tulle gras) Emulsion Extrait B 0,2 g Monostearate de PEG 1500 5 g Monostearate de PEG 300 2 g Huile de paraffine fluide 5 g Eau purifiée qsp 100 g Conservateurs, parfum QS Les compositions de l'invention sont utilisées avec profit. Elles sont plus partculièrement indiquées a. en dermocosmétique, dans les applications suivantes - régénération cellulaire: vieillisement cutané, rides - soins corporels: vergetures, raffermissement. b. en thérapeutique, aussi bien chez l'adulte que chez l'enfant, dans les applications suivantes: - réparation tissulaire: érythème solaire, piqures - inflammations superficielles: UV, radiothérapie, acné - cicatrisation des plaies: ulcères, escarres, plaies torpides, retard de cicatrisation, brûlures; - en ophtalmologie: plaies et brûlures de la cornée, ulcères troma- tiques, keratites - stimulation des défenses: infections et surinfections microbiennes et virales. c. en laboratoire, comme facteur de croissance pour les cultures cellu- laires ou tissulaires. 8 2643559 R E V E N D I C A T IO N S 1. Extraits de cyanobactéries filamenteuses de type Oscillatoria et LPP groupe A. 2. Extraits selon la revendication 1, CARACTERISES EN CE QUE les cyanobactéries filamenteuses appartiennent à l'espèce Phormidium. 3. Procédé de préparation des extraits selon la revendication 2, CARACTERISE EN CE QUE les cyanobactéries filamenteuses Phormidium sont soumises à des opérations successives d'extraction et de fractionnement. 4. Procédé de préparation selon la revendication 3, CARACTERISE EN CE QU'un premier extrait A est obtenu par craquage à l'aide des ultra-sons et centrifugation. 5. Procédé de préparation selon les revendications 3 et 4, CARAC- TERISE EN CE QU'un deuxième extrait B est obtenu par chauffage à 100 C du premier extrait A et centrifugation. 6. Procédé de préparation selon les revendications 3, 4 et 5, CARAC- TERISE EN CE QU'un troisième extrait C est obtenu par précipitation alcoo- lique du deuxième extrait B et centrifugation. 7. Composition CARACTERISEE EN CE QU'elle contient, à titre de principe actif, un extrait selon l'une des revendications 1 ou 2. 8. Composition selon la revendication 7, CARACTERISEE EN CE QU'elle est présentée sous une forme appropriée à l'administration locale ou générale. 9. Composition selon la revendication 7, CARACTERISEE EN CE QUE la concentration en principe actif est comprise entre 0,01 % et 10 %.