FR 2636074 A1 19900309 FR 8811263 A 19880826 La présente invention a été faite à l'Institut Jacques MONOD - Université de PARIS VII - Unité associée au CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE N. UM 3. Elle est relative à un nouveau système eucaryote multifonction- nel in vitro constitué par des extraits de cellules germi- nales de Xénope et à leurs applications notamment pour la réalisation de mutagénèses in vitro, la synthèse d'acides nucléiques, la ligation- de l'ADN et la synthèse de pro- téines in vitro. Dès 1969 [GURDON JR, BIRNSTEIL ML, SPEIGHT VA, BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA 1174 (1969), p. 614-6187 on avait observé la réplication in vivo d'ADN purifié introduit par micro-injection dans du cytoplasme d'oeufs de Xénope et dès 1978[BENBOW et Al. CELL, 13 (1978) p. 307-318 on a proposé des systèmes acellulaires dérivés d'oeufs de Xénope pour étudier la réplication de l'ADN, cependant avec des résul- tats non concluants puisqu'ils n'ont pas permis de faire la distinction entre la synthèse réparatrice d'ADN et la replication semi-conservatrice. ATTARDI et Al. NATURE 2_Q (1977) p. 754-756j et BENBOW & Al.[CELL, 12 (1977) p. 191- 204Jont également montré que la recombinaison est favorisée par les extraits d'ovocytes ou d'oeufs. M. MECHALI & R.M. HARLAND (CELL, Vol. 30, p. 93-101, Août 1982) ont décrit un système eucaryote dérivé d'oeufs de Xénopus laevis, qui convertit in-vitro de l'ADN circulaire monocaténaire en la forme double- brin complète fermée par covalence, dans le cadre d'une réaction ribonu- cléoside-triphosphate-dépendante. Ils ont décrit, dans cet Article, la conservation et la ligation d'ADN par des homo- genats d'oeufs de Xénope, ainsi que la formation en pré- sence de ces derniers, d'ADN superhélicoïdal et l'aptitude desdits extraits d'oeufs de Xénope à favoriser'la synthèse d'ADN in vitro. Cet Article indique cependant que si la synthèse du brin complémentaire est commencée de façon efficace sur l'ADN monocaténaire, par contre il n'a pas été observé de replication avec une matrice d'ADN double-brin. Z De plus, M. ALMOUZNI et M. MECHALI LTHE EMBO JOURNAL, VOL. 7, N' 3, p. 665-672 (1988 ont montré que cette replication est couplée à l'assemblage en chromatine de l'ADN en cours de replication. La replication de l'ADN double-brin a éga- lement été observée par BLOW et LASKEY [CELL, 47 (1986) p. 577-587] dans des extraits centrifugés à basse vitesse, mais avec des rendements très faibles.- Les traceurs radio-actifs sont d'utilisation routinière dans la recherche fondamentale et appliquée. La recherche de gènes et de leurs expressions nécessite de tels traceurs permettant de les identifier de façon spéci- fique. Ainsi, pour détecter et isoler une séquence géné- tique spécifique, on essaie de l'hybrider avec une séquence complémentaire que l'on a préalablement rendue radio-active afin de faciliter son repérage. C'est une telle opération qui est faite dans les expériences de SOUTHERN BLOT permet- tant d'identifier des gènes spécifiques au niveau d'un tissu ou d'un organisme donné. De même, lorsque l'on re- cherche l'expression d'un gène donné enARN, on détecte cet ARN grace à une séquence complémentaire d'ADN radio-active. Différentes méthodes de fabrication de ces sé- quences ou matrices radio-actives ont été utilisées dont la nicktranslation (RIGBY & Ai., J. MOL. BIOL. (1977) 113, p. 237), le random-priming (FEINBERG & VOGELSTEIN, ANAL. BIOCH. (1983) 132, P. 6-13). Ces méthodes utilisent dans tous les cas des DNA polymérases bactériennes purifiées, le plus souvent la DNA polymérase 1 d'E. COLI (nick transla- tion) ou la DNA polymérase 1 d'E. COLI fragment KLENOW (random-priming), nécessitent l'addition de DNase 1 (pour la nick translation), l'addition des 4 désoxynucléotides, et l'addition d'un tampon contenant principalement du Tris, du MgCl2, et du NaCl. Ces méthodes donnent satisfaction mais requiè- rent l'intervention de réactifs multiples et de nombreuses manipulations. Par ailleurs, la ligation de 1'ADN in vitro est la base même du génie génétique. Chaque fois que l'on cherche à cloner un gène ou à l'analyser, il faut l'insérer dans un vecteur recombinant. Cette opération n'est possible qu'en effectuant des ligations de cette séquence avec le vecteur hôte. La ligation est une opération qui permet éga- lement la formation de l'ADN super-hélicoïdal à partir d'ADN circulaire ouvert. Il est très fréquent de nécessiter un ADN plasmidique ou de phage sous sa forme native, c'est- à-dire super-hélicoïdal. Or, après purification, l'ADN est sujet à des coupures simple-brin qui le transforment en ADN circulaire après un temps de stockage variable. Cette transformation est extrêmement accélérée si l'ADN est radio-actif, en raison de la radiolyse. La ligation requiert l'intervention de l'ADN ligase, le plus souvent l'ADN ligase purifiée de cellules infectées par le bacté- riophage T4, d'ATP et d'un tampon, la multiplicité des réactifs mis en oeuvre impliquant de nombreuses manipula- tions. ^20 L'isolement et la caractérisation des gènes a amené à rechercher les relations entre la structure du gène et sa régulation ou son'expression. De même, la séquence d'une protéine étant déduite de la séquence d'ARN, de très nombreuses recherches visant à modifier les protéines, et donc leurs activités, ont été menées aussi bien sur le plan fondamental que sur le plan des applications. Ces études nécessitaient la production systéma- tique de mutants du gène considéré. L'altération de la sé- quence d'ADN par mutagénèse in-vitro est maintenant devenue un moyen très utilisé pour analyser les rapports entre structure et fonction de l'ADN et les protéines pour les- quelles il code (SHORTLE et Al., ANN. REV. GENET., 1980, , p. 265; SMITH, ANN. REV. GENET., 1985, 19, p. 423). De façon idéale, les altérations doivent être produites avec une efficacité maximum et avec un minimum de manipulations, car il est nécessaire dans ce type de re- cherches d'obtenir un très grand nombre de mutants diffé- rents. Un certain nombre de techniques ont déjà été dé- crites à ce jour qui, dans tous les cas, font appel à plu- sieurs enzymes procaryotes et nécessitent une certaine ex- pertise au niveau des différentes manipulations de ces en- zymes (ZOLLER et SMITH, METHODS IN ENZYMOLOGY (1983) Q100, p. 468-500). Les systèmes classiques proposés actuellement utilisent, pour obtenir de l'ADN muté, la DNA-pclymerase de KLENOW et la DNA-ligase, les quatre désoxynucléotides triphosphates, l'ATP et un tampon contenant du Tris, du MgCl2, du NaCl, du 2-mercaptoéthanol (ZOLLER et SMITH, Loc. cité), c'est-à-dire de nombreux réactifs et des manipula- tions multiples. La synthèse d'ARN in-vitro s'avère nécessaire pour différentes opérations classiques en biologie molécu- laire fondamentale et appliquée, comme la fabrication de traceurs ARN radio-actifs, la fabrication de protéines in- vitro, la recherche de signaux spécifiques de régulation portés par la séquence ARN. Il ressort de la rapide revue qui précède que chacune des réactions fondamentales en biologie moléculaire dont il vient d'être fait mention nécessite l'utilisation de plusieurs réactifs et de nombreuses manipulations. La possibilité de disposer d'un seul système eucaryote permettant de réaliser in vitro les plus impor- tantes réactions utilisées en biologie moléculaire et en génie génétique, telles que la synthèse d'acides nu- cléiques, la synthèse de protéines, la ligation de l'ADN et la mutagénèse dirigée in vitro, constituerait un progrès important dans ce domaine. C'est ce progrès qu'est apte à procurer un sys- tème eucaryote constitué par un extrait de cellules ger- minales de Xénope, qui permet de réaliser totalement in vi- tro et en un minimum d'étapes, à la fois la synthèse de matrices d'ADN ou d'ARN, la ligation de l'ADN, la mutagé- nèse dirigée in vitro et la synthèse de protéines in vitro. Un tel extrait contient de façon active in vitro tous les composants ioniques et non-ioniques nécessaires à la réali- sation de l'ensemble de ces réactions, en sorte qu'il constitue à lui seul un kit complet utilisable dans des réactions biologiques très différentes, avec une grande efficacité et une grande simplicité d'utilisation. L'extrait de cellules germinales de Xénope est d'obtention facile et il est stable pendant au moins 6 mois à - 70'C sans perte d'activité et à partir de la ponte d'un seul animal on peut obtenir jusqu'à environ 10 ml d'extrait d'oeufs de Xénope. Il présente en outre l'avantage de constituer le premier système eucaryote permettant de réaliser une mu- tagénèse in vitro, seuls des systèmes bactériens proca- ryotes, ayant été proposés à ce jour. La présente invention a pour objet un nouveau système eucaryote multifonctionnel in vitro, apte à per- mettre à lui seul la réalisation in vitro d'importantes réactions utilisées en biologie moléculaire et en génie génétique, notamment la synthèse d'acides mucléiques, la synthèse de protéines, la ligation de l'ADN, la mutagénèse dirigée in vitro, lequel système eucaryote est caractérisé en ce qu'il est constitué par un extrait de cellules germi- nales de Xénope. - La présente invention a également pour objet un procédé de production d'extraits d'oeufs-de Xénope à partir d'oeufs récoltés résultant de la ponte de Xénopes femelles préalablement traitées par de l'hormone chorionique gonado- trope, caractérisé en ce que les oeufs; préalablement dégé- lifiés et rincés par un tampon d'extraction approprié, sont soumis à une centrifugation unique à 2'C, à 14 000 g pen- dant 20 minutes, à la suite de laquelie l'extrait final est recueilli et stocké à basse température (congélation à - 80'C ou sous azote liquide). Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, les oeufs de Xénope, préalablement dégélifiés et rincés de façon appro- priée, sont soumis à une première centrifugation à 14000 g, pendant 20 minutes à + 2'C, puis à une deuxième centri- fugation de l'extrait collecté au-dessus du culot de la première centrifugation, à 140 000 g pendant 45 minutes à 2'C environ. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, la ou les centrifugations susdites est/sont précédée(s) d'une centrifugation de brève durée à faible vitesse, de l'ordre de 30 à 50 g pendant 40 à 60 secondes, avantageusement dans une huile neutre de densité intermédiaire entre l'oeuf et l'eau, destinée à éliminer le tampon d'extraction des oeufs. La présente invention a en outre pour objet un procédé de réalisation de plusieurs réactions fondamentales en biologie moléculaire à l'aide d'un seul et unique sys- tème multifonctionnel eucaryote, notamment de réalisation de la synthèse d'acides nucléiques, de la synthèse de pro- téines, de la ligation de l'ADN, de la mutagénèse dirigée in-vitro, caractérisé en ce qu'on incube un acide nucléique de départ avec de l'extrait de cellules germinales de Xénope, éventuellement en présence d'un précurseur ou d'un oligo-nucléotide mutagène, pour récupérer, selon le cas, une matrice d'ADN ou d'ARN, éventuellement marquée de manière froide ou radio-active, ou un ADN recombinant ou un ADN superhélicoïdal, ou un ADN muté, ou une protéine codée par un gène déterminé. Selon un mode de mise en oeuvre de ce procédé appliqué à la synthèse d'ADN in-vitro, de 1'ADN est incubé avec de l'extrait de cellules germinales de Xénope, à une température, à des concentrations et pendant une durée appropriées, pour récupérer une quantité significative d'ADN synthétisé. Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, de l'ADN simple-brin est incubé avec de l'extrait de cellules germinales de Xénope, pendant une du- rée appropriée comprise de préférence entre 0 h 30 et 2 h. avantageusement à une température comprise entre 20'C et 37'C, à une concentration de l'ordre de 0,2 microgrammes à 2 milligrammes d'ADN par millilitre d'extrait, pour récupé- rer 1,5 à 5 microgrammes d'ADN synthétisé pour 100 micro- litres d'extrait. Selon une autre modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, on incube de l'ADN simple-brin et un précurseur marqué approprié, avec de l'extrait de cellules germinales de Xénope, pendant une durée appropriée, de pré- férence comprise entre 0 h 30 et 2 h environ, à une tempé- rature comprise entre 20'C et 37C et à une concentration de l'ordre de 0, 2 à 10 microgrammes d'ADN simple-brin par ml d'extrait, pour obtenir une matrice d'un ADN marqué sous sa forme native. Selon une disposition avantageuse de cette modalité, le précurseur marqué est un deoxynucléotide- triphosphate radiomarqué (32p ou 3H notamment) judicieuse- ment choisi. Selon une autre modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'ADN mis en oeuvre pour synthétiser la matrice d'ADN sous forme native, est un ADN double-brin. Selon une disposition avantageuse de cette modalité, l'ADN double-brin est préalablement incubé avec de la désoxyribonucléase avant d'être mis en présence de l'extrait de cellules germinales de Xénope. L'on obtient ainsi un ADN double-brin dont chacun des deux brins est marqué. Selon un autre mode da mise en oeuvre du pro- cédé conforme à la présente invention appliqué à la liga- tion trans d'ADN in vitro, des séquences d'ADN à rabouter sont incubées dans de l'extrait de cellules germinales de Xénope pendant une durée appropriée, avantageusement de l'ordre de 2 à 16 heures, à des températures appropriées, avantageusement comprises entre 12'C et 20'C et à une concentration de 0,2 à 5 microgrammes d'ADN par ml d'extrait, pour obtenir un ADN recombinant. Selon un mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention appliqué à la ligation cis d'ADN in vitro, de l'ADN circulaire double-brin contenant des coupures - ou nicks - est incubé avec de l'extrait de cellules germinales de Xénope pendant une durée appropriée, avantageusement comprise entre 4 h et 16 h environ, à la température ambiante, à une concentration pouvant aller jusqu'à 100 microgrammes d'ADN nické/ml d'extrait, pour obtenir un ADN ligaturé superhélicoïdal. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention appliqué à la mutagénèse dirigée d'ADN in vitro, de l'ADN simple-brin est incubé avec un oligonucléotide mutagène, dans de l'extrait de cellules germinales de Xénope, pendant une durée appro- priée, qui n'est généralement pas supérieure à 2 h. à la température ambiante, puis la réaction est arrêtée par addition de réactifs appropriés, l'ADN est récupéré et éventuellement purifié. Selon un autre mode de mise en oeuvre du pro- cédé conforme à la présente invention appliqué à la syn- thèse d'ARN in vitro, on fait incuber de l'ADN double-brin dans de l'extrait de cellules germinales de Xénope, pendant environ deux heures à la température ambiante, à une concentration avantageusement de l'ordre de 20 à 100 micro- grammes d'ADN par ml d'extrait, après quoi l'on extrait i'ARN synthétisé. Bien entendu, l'on peut obtenir de l'ARN mar- qué, en introduisant dans le milieu réactionnel un précur- seur marqué. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, appliqué à la synthèse de protéines in vitro, l'extrait de cellules germinales de Xénope est préalablement traité, au cours d'une première étape, par une nucléase, puis, au cours d'une deuxième étape, on ajoute de l'ARN exogène à cet extrait traité, après quoi l'on extrait la protéine recher- chée. Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'incubation de l'ARN exogène avec l'extrait traité de cellules germinales de Xénope, est effectuée pendant une à deux heures à la température ambiante, à une concentration de 10 à 20 microgrammes d'ARN par ml d'extrait. Selon une autre modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, dans le cas o l'on cherche à synthéti- ser une protéine marquée, l'incubation est effectuée en présence d'un précurseur marqué approprié, tel qu'un amino- acide marqué, notamment. Selon encore une autre modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'extrait de cellules germinales de Xénope est traité au cours de la première étape par la nucléase micrococcale de Staphylococcus aureus en présence de CaCl2, puis l'action de la nucléase est stoppée, au bout de 15 minutes environ, par addition d'un inhibiteur approprié. Selon une autre modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'extrait de cellules germinales de Xénope est traité au cours de la première étape par de la ribonucléase, avantageusement d'origine pancréatique, à une température comprise entre 8C et 15'C, pendant environ 30 minutes au bout desquelles l'action de la ribonucléase est stoppée à l'aide d'un inhibiteur approprié. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation de l'extrait de cellules germinales de Xénope et d'application à différentes réactions fondamentales du domaine de la biologie moléculaire. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLES EEP& EABRIGATIQNDEL.XTRAIDQ.EU._DEXENQP l) RrpratiQnNe_dimaux Les animaux sont élevés comme décrit par GURDON dans "METHODS IN DEVELOPMENTAL BIOLOGY, (1967), pp. 75-85. 150 unités d'hormone chorionique gonadotrope sont injectées dans les sacs lymphatiques dorsaux de xénopes femelles. Huit heures plus tard une deuxième injection de 600 unités d'hormone est réalisée. Les animaux sont alors places pendant une nuit dans des bacs contenant du HSB 1X (15 mM Tris pH 7,6, NaCl 110 mM, KCl 2mM, MgS04 lmM, Na2HPO4 0,5 mM). 2) Q.lete et a clIc Qeua. Les oeufs sont récoltés dans un bêcher. Chaque femelle pond 10 000 à 15 000 oeufs. Les oeufs' sont rincés dans l'eau du robinet, puis l'eau distillée pendant environ 3 mn. Puis ils sont transférés dans une solution 2 % cys- téine dans 0,8X Barth, pH 7,95. Une agitation lente permet de dissoudre la gelée entourant les oeufs. Après dissolu- tion de la gelée, les oeufs sont rincés quatre fois dans du Barth 0,8X puis triés sous la loupe binoculaire afin de re- tirer les oeufs éventuellement endommagés. 3) O.eaion___l/_erai0 Les étapes ultérieures sont réalisées à 4'C. Les oeufs sont déposés dans des tubes à centrifuger SORVALL de 40 ml, ou équivalent, à 4'C. Ils sont rincés 1l trois fois avec un tampon d'extraction présentant la composition suivante: Hépès 20mM, pH 7,6, acétate de potassium 70 mM, DTT 2mM, EDTA 0,1 mM, PMSF 1 mM, métabisulfite de sodium 5 mM, pepstatine 1 M, 5 % saccharose, MgCl2 2 mM, CaCl2 0,1mM. Puis on les laisse reposer pendant 2 mn et l'excès de tampon au-dessus des oeufs est totalement éliminé. Pour parfaire cette élimination du tampon extra-cellulaire, on peut procéder à une courte centrifugation des oeufs à basse vitesse (30 à 50 g, 40 à 60 sec.) sur un coussin d'huile de silicone, ou autre huile neutre de densité intermédiaire entre l'oeuf et l'eau. Après centrifugation, les excès d'huile et de tampon sont éliminés. Les tubes contenant les oeufs sont alors centrifugés à 2'C, à 14 000 g pendant 20 mn, et l'extrait est collecté au-dessus du culot. Une deuxième centrifugation à 140000 g pendant 45 mn à 2'C, peut être effectuée dans un rotor à angle fixe SORVALL 50 TI. Cette centrifugation permet de clarifier davantage l'extrait sans altérer ses capacités de replication de l'ADN simple-brin. L'extrait final est congelé à - 80'C ou bien sous azote li- quide par petites fractions. L'extrait ainsi obtenu est stable pendant une période d'au moins six mois. On peut obtenir à partir de la ponte d'un seul animal, jusqu'à environ 10 ml d'extrait. L'extrait obtenu contient de façon active in vitro, tous les composants ioniques et non-ioniques nécessaires à la réalisation des réactions fondamentales de la biologie moléculaire et notamment une activité de replication de l'ADN simple-brin en ADN double-brin, couplée à une activité d'assemblage en chromatine de l'ADN en cours de replication (décrite dans ALMOUZNI et MECHALI, 1988, Loc. cité); des activités ligases ATP-dépendantes qui permettent de refermer des nicks qui se sont produits sur de l'ADN purifié à partir de plasmides ou de phages; etc... EXEMPLEIIT SYNTHIXE.DI2AD1{J3LVLTRQ A. Prnu&iondm mari&esrsdioati.@ d-ADN 32p O5 Conformément à la présente invention, la seule addition d'ADN dans de l'extrait d'oeufs de Xenope tel qu'obtenu conformément à l'Exemple I, en présence d'un précurseur radio-actif, permet de fabriquer une matrice radio-active. Il s'agit de la seule méthode in-vitro connue o à ce jour qui permette d'obtenir une matrice radio-active d'un ADN sous sa forme native. Dans un microtube, on ajoute: 100 mlcrolitres d'extrait + I microgramme d'ADN simple brin + 50 microcuries d'ATP t 32P, 6000 curies par millimole (AMERSHAM). On incube à 20'C pendant 2h. On peut augmenter la vitesse de réaction en incubant à 37'C. Dans ces conditions, on obtient environ 15 x 106 cpm incorporés. On peut augmenter la quantité de radio-activité incorporée en augmentant la quantité d'ATP 32p dans le milieu, ou bien en dialysant au préalable l'extrait contre le tampon d'extraction décrit à l'Exemple I. Dans ce cas on ajoute des déoxy- et des ribonucléotides froids à une concentration 0,2 mM, l'ATP 2 mM, et le ou les nucléotide(s) radlo-actif(s) à une concentration inférieure ou égale à 10 micromolaires dans le milieu d'incubation. Les matrices d'ADN 32p obtenues de la sorte présentent une activité spécifique optimum de 108 à 2 x 109 cpm par microgramme, qui sont blen adaptées à l'hybridation moléculaire sur SOUTHERN ou NORTHERN BLOT. B.rn dmatrices a aiYe d'ADN 3H On procède comme décrit en A. ci-dessus, à ceci près que le précurseur radio-actif mis en oeuvre est le deoxynucleotide 3H. Les matrices d'ADN 3H obtenues présentent une activité spécifique optimum de 5 x 107 cpm par microgramme. C. r mati r -CtiYe apartir_-4 AIDdQuh1le-krin On incube au préalable l'ADN double-brin avec 2 nanogrammes/ml DNase I pendant 20 minutes à la tempéra- ture ambiante (20-22'C), puis on ajoute l'extrait et l'on poursuit comme décrit en-A. ou B. ci-dessus. EXEMPEIII STESE D_ AT EDAD RIDES Le processus est très proche de celui décrit à l'Exemple II ci-dessus, à ceci près qu'on ajoute uniquement l'ADN simple-brin à l'extrait d'oeufs de Xénope, à une concen- tration de 10 à 50 microgrammes d'ADN/ml d'extrait. On incube à 20'C pendant deux heures. On obtient 1,5 à 5 microgrammes d'ADN synthétisé pour 100 microlitres d'extrait. EXEMPLEI5T .URIEI.ATIQNDESMATMIGES._ARES_.TNT/ESE A 100 microlitres de milieu d'incubation conte- nant la matrice d'ADN synthétisée, on ajoute: microlitres "Stop Mix"' (EDTA 200 mM, SDS 5 %, pH 7,9) 6 microlitres Protéinase K, 10 mg/ml 75 microlitres TNE (tampon Tris 15 mM, pH 7,8, NaCl 20 mM, EDTA 1 mM) microlitres Phénol-Chloroforme. On mélange vigoureusement pendant 20 à 30 secondes. Puis on centrifuge 6mn dans une centrifugeuse, à 14 000 g, à température ambiante. On prélève la phase aqueuse et on la met de côté. On réextrait la phase phénolique avec 100 microlitres TNE et on mélange la phase aqueuse avec la première. On réextrait les phases aqueuses (300 microlitres) avec 300 microlitres chloroforme-alcool isoamylique (24/1). On prélève la phase aqueuse et on ajoute 15 microlitres d'acétate de sodium 3M + 2 volumes éthanol '100 %. On laisse la solution à -20'C pendant 1 heure, puis on centrifuge 15 mn à vitesse maximum dans une centrifugeuse à température ambiante. On reprend le culot dans le volume TNE désiré. L'ADN ainsi obtenu est majoritairement sous forme bicaténaire hélicoïdale (ADN forme I). L'ADN peut ensuite être manipulé à volonté: utilisation comme matrice ADN natif, fragmentation par enzymes de restriction ou enzymes de modification, dénaturation, etc... La synthèse du brin complémentaire de l'ADN permet d'obtenir un ADN superhélicoïdal in-vitro avec une efficacité voisine de 100 %. C'est une réaction particuliè- rement intéressante lorsque l'on désire obtenir rapidement un ADN sous forme native in-vitro. Cette méthode est égale- ment très efficace lorsqu'on cherche à obtenir un ADN double-brin radioactif sous forme native permettant d'étudier la chromatine ou l'interaction de facteurs spécifiques avec l'ADN. C'est la seule méthode in-vitro permettant d'obtenir ce type de réaction. Lorsqu'une matrice radio-active est synthétisée à partir de l'ADN simplebrin, la matrice radio-active ainsi obtenue est asymétrique: un seul des deux brins de l'ADN est radio-actif. Cette propriété est extrêmement utile lorsqu'il est nécessaire de détecter une séquence spécifique d'un seul des deux brins de l'ADN, ou de recher- cher un ARN transcrit de l'un ou l'autre brin de l'ADN. EXEMLL.N LIGATION DE L'AD INJMITRD A. Ligation en cidumn ADN circulaire douabLe- hrin contenatdsLnicks On incube l'ADN nické avec l'extrait d'oeufs de Xénope, à une concentration pouvant aller jusqu'à 100 microgrammes/ml d'extrait, pendant quatre heures à 20'C. On peut laisser incuber la réaction pendant 16 heures sans * dommage. On extrait l'ADN comme décrit à l'Exemple IV. L'ADN obtenu est ligaturé et super-hélicoïdal. B. Lig&tiqn en trans Ce type de ligation est extrêmement utilisé pour cloner et isoler des séquences d'ADN. La ligation per- met d'insérer la séquence désirée dans un vecteur bactérien ou eucaryote. L'utilisation d'extrait d'oeufs de Xénope per- met de réaliser la ligation en trans en une seule addition des séquences à rabouter dans l'extrait. La réaction se fait en incubant l'ADN à une concentration de 1 à 5 micro- grammes d'ADN/ml d'extrait, à la température ambiante, pen- dant 2 h, ou 12 à 15'C pendant 2 h à 16 h. On extrait l'ADN recombinant commme décrit à l'Exemple IV. Les ligations effectuées dans l'extrait sont indifféremment à bouts francs (blunt-ended) ou à bouts cohésifs (cohesive ends). EXEMPLEVI MNGAQENESE.-.II.EEINVITR Les extraits d'oeufs de Xénope constituent le premier système totalement eucaryote permettant de réaliser la mutagénèse dirigée in-vitro, et ce en une seule addi- tion. De plus l'extrait permet de réaliser une mutagénèse dirigée invitro, avec une efficacité au moins 10 à 15 fois supérieure aux systèmes classiques utilisant la DNA polymé- rase de KLENOW et la DNA ligase. La réaction ne nécessite que l'ADN et l'oligonucléotide mutagène et s'effectue en l'espace d'une seule journée. Cette technique utilise les différents consti- tuants cellulaires présents dans l'extrait et maintenus ac- tifs dans les différentes réactions nécessaires à l'obtention de 1'ADN muté, alors que dans tous les systèmes SO30 connus à ce jour, l'obtention de l'ADN muté nécessite l'addition d'ADN polymérase purifiée de E. COLI, de la DNA ligase, des quatre déoxynucléotides-triphosphates, de l'ATP et d'un tampon contenant du Tris, du MgCl2, du NaCl et du 2-mercaptoéthanol. L'ADN simple-brin (0,5 microgramme) est hybridé avec 5 picomoles du primer mutagène (17 A 30 mers) et ajouté dans 50 microlitres d'extrait pendant 2 h à 20-22'C. La réaction est stoppée par 30 mM EDTA, SDS 0,1 % et trai- tée à la protéinase K, 600 microgrammes/ml, pendant 1 h à 37'C. L'ADN est alors extrait par le phénol-chloroforme, puis précipité à l'éthanol, comme décrit à l'Exemple IV. L'ADN est repris dans 25 microlitres TNE. On peut purifier encore l'ADN par mini-colonnes de NACS Prepacs (BRL) ou GENE CLEAN (BIO 101) ou QIAGEN (MALLET) pour augmenter l'efficacité de transformation, mais sans cependant augmen- lO ter la proportion de mutants obtenus. Des aliquots de 0,1, 1 et 10 microlitres sont utilisés pour transformer des bac- téries compétentes BMH 71-18 mut L, qui est une souche réparation déficiente (RADMAN et WAGNER ANN. REV. GENET. 1986, ZO, 523-538). Les cellules compétentes sont préparées par la méthode de HANAHAN (DNA CLONING, A PRACTICAL APPROACH, 1985, VOL. I, p. 109-135). Les bactéries trans- formées sont mises à pousser sur un tapis de bactéries de type sauvage BMH71-18, et les mutants sont alors caractéri- sés. EXEMPELII L'ADN est ajouté dans de l'extrait d'ovocytes de Xénope à une concentration de 20 à 100 microgrammes d'ADN/ml d'extrait et en présence de 10 à 50 microcuries de GTP 32p. La réaction est incubée 2 h à la température ambiante, puis traitée comme décrit à l'Exemple IV pour l'extraction de 1'ARN. Au cas o l'ARN doit être séparé de l'ADN, le milieu d'incubation est traité selon la technique de AUFFRAY et ROUGEON (EUR. J. BIOCHEM 1980, 107, p. 303- 314). EXEMPE VNI S YNTHF _1 E_ =DIS IN-KrVTRQ A. M/hQe CaQl-EQTA L'extrait est traité au préalable par 5000 uni- tés/ml de nucléase micrococcale de Staphylococcus aureus en présence de 3 mM CaCl2 pendant 15 mn. Puis on ajoute 10 mM EGTA, 2 mM ATP, et 3 mM MgCl2. L'extrait est alors prêt pour l'addition d'ARN exogène (10 à 20 microgrammes/ml), et de précurseur radio-actif (35S méthionine) si l'on souhaite synthétiser une protéine radio-active. La réaction est incubée I à 2 h à 20'C et les protéines sont caractérisées (Methods in Enzymology, Vol 152). B. AheXeihieueRae L'extrait est traité par la RNase pancréatique (1 microgramme/ml) pendant 30 mn à 10'C. Puis on ajoute 600 unités/ml "RNasin" (PROMEGA) ou 10 unités "Inhibit-ACE" (MALLET SA). L'extrait est alors prêt pour l'addition d'ARN exogène comme décrit en A ci-dessus. Il ressort des exemples qui précèdent que l'extrait de cellules germinales de Xénope qui constitue le système eucaryote multifonctionnel in-vitro conforme à la présente invention, permet de réaliser totalement in vitro, en un minimum d'étapes et avec un nombre réduit de réac- tifs, à la fois la synthèse de matrices d'ADN ou d'ARN, la ligation de l'ADN, la mutagénèse dirigée in vitro et la synthèse de protéines in vitro. La possibilité de réaliser in vitro des réactions multiples et différentes dans un extrait qui constitue un système unique efficace pour toutes ces réactions, sans modification aucune, est tout à fait nouvelle. OC 1. Nouveau système eucaryote multifonctionnel in vitro, apte à permettre à lui seul la réalisation in vitro d'importantes réactions utilisées en biologie moléculaire et en génie génétique, notamment la synthèse d'acides nucléiques, la synthèse de protéines, la ligation de l'ADN, la mutagénèse dirigée in vitro, lequel système eucaryote est caractérisé en ce qu'il est constitué par un extrait de cellules germinales de Xénope. 2. Procédé de production d'extraits d'oeufs de Xénope à partir d'oeufs récoltés résultant de la ponte de Xénopes femelles préalablement traitées par de l'hormone chorionique gonadotrope, caractérisé en ce que les oeufs préalablement dégélifiés et rincés par un tampon d'extraction approprié, sont soumis à une centrifugation unique à 2'C, à 14 000 g pendant 20 minutes, à la suite de laquelle l'extrait final est recueilli et stocké à basse température (congélation à - 80'C ou sous azote liquide). 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la centrifugation à 14000 g est suivie d'une deuxième centrifugation de l'extrait collecté au-dessus du culot de la première centrifugation, à 000 g pendant 45 minutes à 2'C. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendication 2 et 3, caractérisé en ce que ladite ou lesdites centrifugation(s) est(sont) précédée(s) d'une centrifugation de brève durée à faible vitesse, de l'ordre de 30 à 50 g pendant 40 à 60 secondes, avantageusement dans une huile neutre, de densité intermédiaire entre l'oeuf et l'eau, destinée à éliminer le tampon d'extraction des oeufs. 5. Procédé de réalisation de plusieurs réac- tions fondamentales en biologie moléculaire à l'aide d'un seul et unique système multifonctionnel eucaryote, notamment de réalisation de la synthèse d'acides nucléiques, de la synthèse de protéines, de la ligation de l'ADN, de la mutagénèse dirigée in-vitro, caractérisé en ce qu'on incube un acide nucléique de départ avec de l'extrait de cellules germinales de Xénope, éventuellement en présence d'un précurseur ou d'un oligo-nucléotide mutagène, pour récupérer, selon le cas, une matrice d'ADN ou d'ARN, éventuellement marquée de manière froide ou radio-active, ou un ADN recombinant ou un ADN super- hélicoïdal, ou un ADN muté, ou une protéine codée par un gène déterminé.. 6. Procédé selon la revendication 5, appliqué à la synthèse d'ADN in vitro, caractérisé en ce que de l'ADN est incubé avec de l'extrait de cellules germinales de Xénope, à une température, à des concentrations et pendant une durée appropriées, pour récupérer une quantité significative d'ADN synthétisé. 7. Procédé selon la revendication 6, caracté- risé en ce que de l'ADN simple-brin est incubé avec de l'extrait de cellules germinales de Xénope, pendant une durée appropriée comprise de préférence entre 0 h 30 et 2 h, avantageusement à une température comprise entre 20'C et 37'C, à une concentration de l'ordre de 0,2 microgrammes à 2 milligrammes d'ADN par millilitre d'extrait, pour récupérer 1,5 à 5 microgrammes d'ADN synthétisé pour 100 microlitres d'extrait. 8. Procédé selon la revendication 6, caracté- risé en ce qu'on incube de l'ADN simple-brin et un précur- seur marqué approprié, avec de l'extrait de cellules germinales de Xénope, pendant une durée appropriée, de pré- férence comprise entre 0 h 30 et 2 h environ, à une tempé- rature comprise entre 20'C et 37'C et à une concentration de l'ordre de 0, 2 à 10 microgrammes d'ADN simple-brin pour microlitres d'extrait, pour obtenir une matrice d'un ADN marqué, sous sa forme native. 9. Procédé selon la revendication 8, caracté- risé en ce que le précurseur marqué est un précurseur radio-actif tel qu'un deoxynucléotide-triphosphate radiomarqué (32p ou 3H) judicieusement choisi. 10. Procédé selon la revendication 6, caracté- risé en ce que l'ADN mis en oeuvre pour synthétiser la matrice d'ADN sous forme native, est un ADN double-brin. 11. Procédé selon la revendication 10, caracté- risé en ce que l'ADN double-brin est -préalablement incubé avec de la désoxyribonucléase avant d'être mis en présence de l'extrait de cellules germinales de Xénope. 12. Procédé selon la revendication 5, appliqué à la ligation trans d'ADN in vitro, caractérisé en ce que des séquences d'ADN à rabouter sont incubées dans de l'extrait de cellules germinales de Xénopes pendant une durée appropriée, avantageusement de l'ordre de 2 à 16 heures, à des températures appropriées, avantageusement comprises entre 12'C et 20'C et à une concentration de l'ordre de 0,2 à 5 microgrammes d'ADN par ml d'extrait, pour obtenir un ADN recombinant. 13. Procédé selon la revendication 5, appliqué à la ligation cis d'ADN in vitro, caractérisé en ce que de l'ADN circulaire double-brin contenant des coupures - ou nicks - est incubé avec de l'extrait de cellules germinales de Xénope pendant une durée appropriée, avantageusement comprise entre 4 h et 16 h environ, à la température ambiante, à une concentration pouvant aller jusqu'à 100 microgrammes d'ADN nické/ml d'extrait, pour obtenir un ADN ligaturé superhélicoidal. 14. Procédé selon la revendication 5, appliqué à la mutagénèse dirigée d'ADN in vitro, caractérisé en ce que de l'ADN simple-brin est incubé avec un oligonucléotide mutagène, dans de l'extrait de cellules germinales de Xénope, pendant une durée appropriée, qui n'est générale- ment pas supérieure à 2 h, à la température ambiante, puis la réaction est arrêtée par addition de réactifs appro- priés, l'ADN est récupéré et éventuellement purifié. 15. Procédé selon la revendication 5, appliqué à la synthèse d'ARN in vitro, caractérisé en ce qu'on fait incuber de 1'ADN double-brin dans de l'extrait de cellules germinales de Xénope, pendant environ deux heures à la tem- pératurè ambiante, à une concentration de 20 à 100 microgrammes d'ADN par ml d'extrait, après quoi l'on extrait l'ARN synthétisé. 16. Procédé selon la revendication 5, appliqué à la synthèse de protéines in vitro, caractérisé en ce que l'extrait de cellules germinales de Xénope est préalable- ment traité, au cours d'une première étape, par une nucléase, puis, au cours d'une deuxième étape, on ajoute de l'ARN exogène à cet extrait traité, après quoi l'on extrait la protéine synthétisée. 17. Procédé selon la revendication 16, caracté- risé en ce que l'incubation de l'ARN exogène avec l'extrait traité de cellules germinales de Xénope, est effectuée pen- dant une à deux heures à la température ambiante, à une concentration de 10 à 20 microgrammes d'ARN par ml d'extrait. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 et 17, caractérisé en ce que dans le cas o l'on cherche à synthétiser une protéine marquée, l'incubation est effectuée en présence d'un précurseur marqué approprié, tel qu'un amino-acide marqué, notamment. 19. Procédé selon la revendication 16, caracté- risé en ce que l'extrait de cellules germinales de Xénope est traité, au cours de la première étape par la nucléase micrococcale de Staphylococcus aureus, en présence de CaCl2, puis l'action de la nucléase est stoppée, au bout de minutes environ, par addition d'un inhibiteur approprié. 20. Procédé selun la revendication 16, caracté- risé en ce que l'extrait de cellules germinales de Xénope est traité au cours de la première étape par de la ribonu- cléase, avantageusement d'origine pancréatique, à une tem- pérature comprise entre 8C et 15 C, pendant environ 30 minutes, au bout desquelles l'action de la ribonucléase est stoppée à l'aide d'un inhibiteur approprié.