FR 2642768 A1 19900810 FR 8900597 A 19890119 La présente invention concerne notamment un procédé perfectionné pour l'expression de la biotine dans Bacillus sphaericus. La biotine ou vitamine H est l'un des composants du "bios", système complexe de facteurs de croissance chez les levures. A l'intérieur de la cellule la biotine peut être à l'état libre ou fortement liée à des proté- ines; souvent de manière covalente au résidu lysine de certains enzymes. Elle est impliquée dans les processus de transfert du dioxyde de carbone en tant que groupe prosthétique de nombreuses carboxylases (Pyruvate carbo- xylases, acétyl CoA carboxylases) ou décarboxylases (Mé- thyle malonyle CoA décarboxylase) (Handbook of vitamins, 403 (1984)). La biotine a été décrite comme un facteur cruci- al pour la fermentation industrielle de l'acide glutami- que par les bactéries (Amino acid - nucleic acid, 120 (1968)). Il existe une relation entre sa concentration dans le milieu de culture et la composition des membranes cellulaires et donc de la perméabilité cellulaire qui en résulte. La biotine est synthétisée par de nombreux mi- croorganismes. Néanmoins, les quantités produites varient de façon importante en fonction de l'espèce considérée. Parmi les bactéries, Bacillus sphaericus est un bon can- didat potentiel pour la production de biotine à partir de l'acide pimélique (précurseur de sa biosynthèse) au cours de fermentations industrielles car on observe une accumu- lation importante dans le milieu de culture des diffé- rents intermédiaires qui conduisent à la biotine (appelés par la suite "vitamères") (Bull. Inst. Chem. Res. 58 (1980)). La figure 1 représente schématiquement le chemin biosynthétique de la biotine. 2 2642768 La production de la biotine reste néanmoins encore en-dessous des besoinr industriels (Agr. Biol. Chem. 29 n 10 (1965)). Ceci s'explique d'une part parce que la biotine produite réprime les gènes codant pour sa propre synthèse et d'autre part parce que le rendement de la conversion du DTB (desthiobiotine) en biotine est faible. Ce faible rendement de bioconversion a été amé- lioré en amplifiant le gène bioB codant pour la biotine synthétase sur un plasmide multicopie de B. sphaericus comme décrit dans la publication japonaise de brevet JP 44889. Pour supprimer la répression exercée par la biotine sur l'expression du gène bioB, la séquence codant pour la biotine synthétase a été fusionnée au promoteur de l'a-amylase de B. licheniformis. Un procédé de culture adapté a été décrit dans le brevet US 4563426. Dans ce procédé, l'acide pimélique est ajouté à la fin de la phase exponentielle de croissance de manière à minimiser les mécanismes de répression liés à la production de biotine lors de la phase de production de la biomasse. Toutefois, ce procédé ne fait que minimiser le phénomène de répression. La présente invention concerne la construction d'une souche de B. sphaericus déréprimée. L'utilisation des mutants déréprimés permet d'optimiser le niveau d'expression de tous les gènes de biosynthèse de la biotine. En effet, pour une souche non déréprimnée, même sans biotine dans le milieu de culture, la synthèse endogène de biotine est suffisante pour aug- menter de façon significative sa concentration intracel- lulaire et donc entraîner la répression de l'expression des gènes de la biosynthèse. Au contraire, chez les mutants déréprimés selon l'invention, tous les flux métaboliques entre l'acide pimélique et la biotine peuvent être augmentés et la 3 2642768 production de biotine accrue. De plus, l'utilisation de mutants déréprimés selon l'invention permet le-développe ment de nouveaux procédés de fermentation dans lesquels l'acide pimélique ajouté au début de la culture permet aux cellules de synthétiser de la biotine lors de la phase de croissance exponentielle, dans des conditions optimales pour les flux métaboliques. De nombreuses procédures ont été décrites pour accroître la quantité de biotine et de vitamères produite par B. sphaericus en utilisant des souches mutantes (Agr. Biol. Chem. 47, 1011 (1983)). Y. Yamada a isolé une col- lection de mutants résistant à des analogues structuraux de la biotine, l'acide valérique 5-(2-thiényl) et l'acide actithiazique. Pour les mutants les plus intéressants, la production de biotine est accrue d'un facteur 12 et celle des vitam&res totaux atteint 350 4g/ml (Agr. Biol. Chem. 37, 1079 (1973)). Néanmoins, la nature exacte de ces mutations reste encore inconnue et il n'existe aucune donnée expérimentale en faveur de mutations dérégulées (Agr. Biol. Chem. 47, 1011 (1983)). Bien que alpha-dHB (alpha déhydrobiotine), un autre analogue de la biotine, ait permis l'isolement de mutants déréprimés pbur la synthèse de la biotine chez E. coli (Mol. Gen. Genet. 134, 345 (1974>) aucune donnée décrivant l'obtention de mutants déréprimés stables de B. sphaericus n'a été publiée. Pour sélectionner des mutants déréprimés on a souvent utilisé des antagonistes de métabolites comme par exemple la canavanine pour la biosynthèse de l'arginine (Quant. Biol. 26, 11 (1961)), comme le tryptophane 5- méthyle pour celle du tryptophane (J. Biol. Chem. 235, 1098 (1960)), comme le pyrithiamine pour celle de la thiamine (J. Biochem. 65, N 3 (1959)) et comme la pyri- 4 2642768 midine 3-acétyle pour celle de l'acide nicotinique (Nature, 202, 826 (1964)). La présente invention repose sur une nouvelle approche pour sélectionner des mutants déréprimés. Il s'agit d'un procédé de sélection d'organismes déréprimés dans l'expression de métabolites primaires ou secondai- res, à partir d'une souche de base de cet organisme réprimé, caractérisé en ce que: - on transforme ladite souche de base avec un plasmide portant un gène marqueur sous le contrôle de la séquen- ce d'ADN impliquée dans la régulation de l'expression dudit métabolite, - on soumet ies souches ainsi transformées à un traite- ment mutagène, et - on sélectionne les souches positives exprimant ledit marqueur en présence dudit métabolite à une concentra- tion réprimant en totalité l'expression dudit marqueur chez la souche de base transformée, - parmi ces souches positives, on sélectionne les souches hyperproductrices de métabolite, éventuellement après avoir été débarrassées de leurs plasmides. Dans le caire de la présente invention, le mar- queur est de préférence le gène xylE qui a déjà été dé- crit dans des tests colorimétriques (PNAS, 80, 1101 (1983)) et l'organisme sélectionné est de préférence une bactérie, notamment Bacillus sphaericus et son métabolite la biotine dont l'intérêt a déjà été décrit précédemment. On entend désigner par "déréprimée" une souche dans laquelle la concentration en métabolite primaire ou secondaire influe peu ou pas sur la production dudit métabolite, en tout cas par rapport à la souche de base réprimée. 2642768 Les techniques permettant la mise en oeuvre de ce procédé sont connues de l'homme de métier et certaines seront décrites plus en détail dans les exemples. Ce procédé, notamment lorsqu'il est appliqué à B. sphaericus pour la production de la biotine, permet d'obtenir un grand nombre de souches déréprimées, on choisit de préférence celles qui produisent les plus grandes quantités de biotine, bien que ce critère ne soit pas forcément déterminant. Il est en particulier impor- tant que la forte production de biotine soit conservée lorsque le plasmide de sélection est éliminé car il pour- rait jouer le rôle de piège à répresseur et fausser les résultats. La présente invention concerne également la sou- che ainsi obtenue en tant que telle ou en tant que souche hôte pour des transformations plasmidiques ainsi que les souches de B. sphaericus qui peuvent être obtenues par la mise en oeuvre de ce procédé et qui hyperproduisent de la biotine. La présente invention concerne également un pro- cédé de production de biotine par culture d'une souche de B. sphaericus produisant ladite biotine dans un milieu de culture, caractérisé en ce qu'on cultive une souche selon l'invention qui a été transformée par au moins un plasmide exprimant le gène bioB et en ce qu'on ajoute l'acide pimélique ou l'un de ses dérivés au milieu de culture. Le gène bioB est l'un des gènes principaux dont le produit contrôle la dernière étape de biosynthèse de la biotine, mais il est possible d'obtenir sur le même plasmide ou sur d'autres plasmides auxiliaires d'autres gènes de la chaîne de biosynthèse de la biotine sous le contrôle de séquences régulatrices tel que cela est dé- 6 2642768 crit dans la publication de brevet: EP-A-0266240. Les conditions de fermentation sont connues de l'homme de métier et dans le cas présent on a pu mettre en évidence une augmentation de la production de biotine lorsque l'acide pimélique, ou ses dérivés, sont ajoutés au début de la culture, avant ou pendant la phase exponentielle de croissance. D'autres caractéristiques et avantages de l'in- vention apparaîtront au cours de la description détaillée suivante. Les exemples seront décrits en se référant aux figures suivantes: Figure 1: Chemin biosynthétique de la biotine. Figure 2: Construction de pTG2414. Figure 3: Schématisation de pTG2414. Fiaure 4: Construction de pTG2416. Fiaure 5: Schématisation de pTG2416. Figure 6: Construction de pBHB5022. Figure 7: Construction de pTG498. Figure 8: Expression de bioB sur gel polyacrylamide. Exemple 1 Construction des plasmides pTG2414 et pTG2416: vecteurs de sélection pour l'isolement des mutants déréprimés. a) Description du plasmide pTG2414 Ce vecteur gram positif contient la fusion du gène XylE et de la région régulatrice de l'opéron bioDAYB suivant la publication européenne de brevet EP-A-266240 déjà citée dont le contenu est ici incorporé par référence. Le fragment SsiI, 799 pb, contenant la région du promoteur de l'opéron bioDAYB a été isolé du plasmide pTG1400 et inséré dans le site PstI du phage t4M13TG131 (Gene 26 (1983)). Le phage recombinant est appelé M13TG431. A partir du vecteur pTG445 (Genetics and Biotechnology of Bacilli 309 (1984)), le fragment BamHI, EcoRI contenant le gène XylE est inséré en aval du promoteur bioDAYB au niveau des sites BamHI et EcoRI du phage M13TG431 (Figure 2).. Le phage recombinant est appelé M13TG433. Au moyen d'oligo- nucléotides de synthèse, le gène XylE est ensuite fusion- né au site potentiel de liaison aux ribosomes du gène bioD, comme présenté Figure 3. Le fragment BglII-EcoRI contenant cette fusion a été ligué au réplicon pUBllO (J. Bact. 134, 318, 1978), pré- digéré avec les enzymes BamHI et EcoRI. Le mélange est ensuite incubé en présence de la souche de B. subtilis: BGSC 1A92 argA2 aroG932 bioBl41 sacA321 suivant le proto- 1-5 cole décrit par Chang et Cohen (Mol. Gen. Genetic, 168, 1979). Les transformants sont ensuite sélectionnés sur le milieu DM3 supplémenté avec 100 g/ml de Kanamycine et transférés à l'aide d'un cure-dent sur des plaques TBAB (Tryptose blood Agar base) contenant 5 gl/ml de Km. Après vaporisation des boites avec une solution de 0,5 M de catéchol, on analyse le plasmide des colonies se colorant en jaune en utilisant le procédé d'extraction alcaline rapide (Nucl. Ac. Res., 7, 1513, 1979). Le plasmide recombinant contenant la fusion promoteur DAYB-gène XylE sur le réplicon pUB11O a été appelé pTG2414. b) Construction du vecteur pTG2416 Le plasmide pTG1418 est digéré simultanément par les enzymes HindIII et XmnI. Le fragment de 1553 pb contenant la région régulatrice de l'opéron bioXWF est inséré dans les sites HindIII-EcoRV de M13TG131. Ce phage recombinant M1413TG432 est ensuite digéré par les enzymes EcoRI et SmaI et ligué au fragment EcoRI-BamHI de pTG445. Après 18 h d'incubation à 15 C l'ADN est précipité par l'isopropanol (50:50), puis-incubé en présence de la polymérase Klenow (commercialisée par Boehringer) dans les conditions standard décrites par le fabricant. L'ADN est ensuite précipité dans les mêmes conditions que ci- dessus et incubé avec la ligase T4 pendant 18 heures à 150C. Le phage recombinant est appelé t4M13TG441 (Figure 4). A l'aide d'un oligonucléotide de synthèse, le frag- ment contenant le promoteur XWF est fusionné au gène structural XylE comme le montre la figure 5. La fusion portée sur un fragment BglII-EcoRI du phage M13TG442 a été insérée au niveau des sites EcoRI, BamHI de pUB10, donnant le vecteur pTG2416. Exemple 2 Transformation de B. sphaericus. La souche de B. sphaericus IFO 3525 a été choi- sie comme souche réceptrice des plasmides pTG2414 et pTG2416. Le protocole de transformation décrit par Orzech (J. Gen. Microb. 130, 203, 1984) a été légèrement modi- fié. En effet, le lysozyme a été remplacé par la N- acétylmuramidase SG par l'obtention de protoplastes. Les transformants ont été ensuite sélectionnés sur le milieu le régénération DM'44 contenant 150 4g/ml de Km. D:44 cor- respond à DM3 (Mol. Gen. Genetic., 168, 111, 1979) légè- rement modifié, et contient 0,66 M d'acide succinique disodique et du glycérol au lieu d'acide succinique mono sodique et de glucose respectivement. Finalement, les transformants ainsi sélectionnés ont été transférés sur milieu GP (pour 1 litre: glycérol, 20 g; protéose pep- tone, 30 g; acide casamino sans vitamine, 5 g; K2HPO4, 1 g; KCL, 0.5 g; MgSO4.7H20, 0.5 g; FeSO4.7H20, 0.01 g; MnSO,.4H20, 0,001 g, pH 6.8-7; thiamine-HCl, ug) supplémenté avec Km (5 gg/ml). Exemple 3 Analyse du phénotype lié à l'expression du gène XylE en fonction de la concentration de biotine dans le milieu. Les clones qui expriment le gène XylE deviennent jaunes après vaporisation avec une solution de catéchol 0,5 M. Cette coloration est attribuée à la transformation intracellulaire du substrat en un produit jaune: la semi-aldehyde 2-hydroxy musconique. Les cinétiques d'ap- parition de ce produit dépendent à la fois de l'espèce et du niveau d'expression du gène XylE à I'intérieur de la cellule. L'activité spécifique de l'enzyme encodé par ce gène, la catéchol 2,3 oxygénase (C2,30) peut être mesu- rée facilement, après broyage des cellules, par un dosage spectrophotométrique. Les transformants de la souche IFO 3525 sont incubés à 37 C sur le milieu solide GP contenant diffé- rentes concentrations de biotine, Tableau la. Au-delà d'une concentration de 50 ng/ml l'expression du gène XylE est sévèrement réprimée. La détermination de l'activité spécifique de C2,30 sur -milieu liquide confirme ce résultat Tableau lb. Tableau 1: Expression du gène XylE en présence de biotine. a. Sur milieu solide: GP + Km 5 gg/ml Phénotype XylE: les colonies deviennent jaunes après vaporisation au catéchol. Biotine en ng/ml 0 5 10 20 30 40 50 60 80 100 Expression du gène XylE (coloration + + + + + - - _ jaune des cellules) 1l b. Sur milieu liquide: GP + Kn 5 ug/ml Mesure de l'activité du produit du gène XylE (C2 30) de cellules détruites cultivées en présence de concentration croissante de biotine. Biotine en ng/ml 0 1 2 5 10 50 100 Activité spé- 91 41 30 32 24 25 1 cifique de C 30 en Exemple 4 Isolement d'une souche déréprimée. Pour isoler une souche déréprimée il faut obte- nir une collection de mutants capable d'texprimer le gène XylE constitutivement, en partant des transformants de IFO 3525 contenants soit pTG2414 soit pTG2416. Ainsi, les transformants contenant pTG2414 ont été culti- vés dans le milieu GP liquide pendant 4 à 5 heures et les cellules collectées ont été mises en suspension dans un tampon phosphate 0.01 M. Puis elles ont été traitées avec 100.g/ml de NN' nitrosoguanidine pendant 5 à 10 minutes a 37 C. Après ce traitement mutagène, les cellules ont été lavées dans du tampon phosphate, collectées et éta- lées sur le milieu GP contenant 10 gg/ml de biotine et incubées 13 h à 37"C. Les boîtes ont été ensuite vapori- sées avec la solution de catéchol 0,5 M, les cellules devenant jaunes représentaient des potentiels mutants dérégulés. Les colonies colorées en jaunes ont été isolées et chaque colonie a été mise en culture 2 jours à 37 C dans du milieu GP contenant I mg/ml d'acide pimélique. La quantité de biotine accumulée pour chaque souche est donnée dans le tableau 2. Tableau 2: Production de biotine par les souches déréprimées. Souche Biotine 4g/ml TK 105-1 0,34 TK 105-3 - 0,50 TK 212-1 0,58 TK 212-3 0,73 TK 212-4 0,87 TK 226-1 0,50 TK 226-10 0,46 TK 502-2 1,00 TK 502-6 0,82 TK 502-8 0,90 IFO 3525/pTG2414 max 0,1 IFO 3525 0,11 Parmi les souches mutantes qui produisent plus de biotine que la souche sauvage IFO 3525, TK 502-2 a été soumis au protocole décrit ci-dessous afin de la curer de son plasmide. Après incubation dans du milieu LB à 37 C pendant 18 heures, 1/100 volume de la culture a été inoculé à un autre milieu LB fraîchement préparé et supplémenté avec de 0 à 10 gg/ml de novobiocine et incubé 13 heures. Les cultures qui présentent une croissance légèrement retardée par rapport à celles sans novobiocine ont été étalées sur le milieu solide GP et incubées 18 heures à 37 C. Ensuite, les colonies qui ne se colorent pas en jaune après traitement au catéchol 0,5 r ont été sélec- tionnées et 1'ADN extrait de chaque souche analysé par électrophorèse. Les souches qui ont perdu pTG2414 ont été testées quant A leur capacité à accumuler de la biotine et la souche TK 502-2-C5 a été retenue. Exemple 5 Analyse de la souche dérégulée. Nous avons limité notre étude à la souche TX 502-2-C5 en raison de son aptitude à produire de la biotine après mise en culture en présence de précurseur dès le début de la culture et en absence du plasmide pTG2414 (qui pourrait agir comme un piège à répresseur). Cette souche, dans laquelle pTG2414 et pTG2416 ont été réintroduits exprime encore le gène XylE de manière cons- titutive en présence de biotine, vérifié par le jaunisse- ment en présence de catéchol des colonies transformées sur milieu GP. Cette expérience établit clairement qu'une modification de la souche sauvage a eu lieu et que la mutation est localisée au niveau chromosomique et que la dérégulation touche les deux opérons bioDAYB et bioXWF. Pour quantifier le niveau de dérépression d'une telle souche, nous avons mesuré l'activité spécifique de la -23O à partir de cellules cultivées en présence ou en absence de biotine sur milieu GP. Le tableau 3 appelle deux conclusions: - L'activité spécifique de C2,30 est faiblement influencée par la présence de biotine chez TK 502-2- C5 par rapport à la souche sauvage. - L'activité spécifique de C2, 30 est amplifiée même en absence de biotine. Tableau 3: Activité spécifique de C2, 30 de la souche B. sphaericus TK 502-2-C5. Activité spécifique de C230 mU/mg Souche Plasmide... dans milieu dans milieu GP GP + biotine (10 pg/ml) IFO 3525 pTG2414 85 2 TK 502-2-C5 pTG2414 480 340 IFO 3525 pTG2416 60 1 TK 502-2-C5 pTG2416 140 45 Ces résultats suggèrent que l'activité spécifique de chaque enzyme de la biotine a augmenté chez ce mutant. Exemple 6 Amplification du gène bioB dans la souche dérégulée de B. sphaericus. Les vecteurs d'expression de bioB, pBHB5022 et pTG498 ont été construits comme décrit par les figures 6 et 7. TK 502-2-C5 a été transformé par ces vecteurs et la quantité de biotine produite par les transformants est présentée dans le tableau 4. Deux conclusions principales peuvent être tirées: - L'amplification du gène bioB est un bon facteur pour augmenter le rendement de biotine dans une souche dérégulée. - La conversion de DTB en biotine est importante pendant la phase exponentielle de croissance et il est plus aisé d'ajouter l'acide pimélique dès le début de la culture. Tableau 4: Production de biotine par la souche déréprimée TK 502-2-C5 de B. sphaericus. Biotine en gg/ml Souche Acide pimélique Acide pimélique ajouté à t = 0 ajouté à t = 24 h IFO 3525 0,01 0,50 IFO 3525/pBHB5022 nd 13,30 TK 502-2-C5 1,50 0,60 TK 502-2-C5 /pG498 10-30 4,50 TK 502-2-C5/pBHB5022 20-45,5 9,10 Après inoculation, les cultures se sont développées pendant 1 jour dans le milieu GP, à 30 C puis à 37 C pendant 2 jours. La production de biotine dans le surnageant est évaluée par le dosage microbiologique de L. Plantarum ATCC8014. Dans le cas des souches déréprimées les cultures ont été maintenues à 37 C dès le début des expériences. Acide pimélique 0,5 mg/ml, nd = non déterminé. Analyse de l'expression de bioB sur gel de polyacrylamide Les cellules de B. sphaericus, TK 502-2-C5 (pTG498) sont incubées 18 h à 37 C dans le milieu GP contenant 10 gg/ml de kanamycine. 100 g1 de culture ont été centrifugés dans un tube eppendorf et le culot après lavage a été traité suivant le protocole décrit par Peschke (J. Mol. Biol. 186, 1985). 5.1 ont été testés sur gel de polyacrylamide 13 %. Après 5 h de migration à 20 mA, le gel est fixé dans une solution contenant de l'acide acétique: 7,5 % - méthanol: 5 % - bleu de Coomassie 0,25 % et révèlé dans une solution d'acide acétique 7,5 % - méthanol: 5 %. La figure 8 montre l'apparition d'une nouvelle bande avec une masse moléculaire apparente de 37 kD obtenue à partir- de l'extrait contenant le gène bioB amplifié. Ces résultats démontrent la bonne corrélation entre l'augmentation de la production de biotine et l'expressi- on de la biotine synthétase. La souche B. sphaericus TK502-2-C5 a été déposée le 8 novembre 1988 à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de l'Institut Pasteur, 28 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex, sous le n 1-808. REVENDICATIONS 1) Procédé de sélection d'organismes déréprimés dans l'expression de métabolites primaires ou secondai- res, a partir d'une souche de base de cet organisme normalement réprimé, caractérisé en ce que: - on transforme ladite souche de base avec un plasmide portant un gène marqueur sous le contrôle de la séquence d'ADN impliquée dans la régulation de l'ex- pression dudit métabolite, - on soumet les souches ainsi transformées à un traite- ment mutagène, et - on sélectionne les souches positives exprimant ledit marqueur en présence dadit métabolite à une concentra- tion réprimant en totalité l'expression dudit marqueur chez la souche de base transformée, - parmi ces souches positives, on sélectionne les sou- ches hyperproductrices de métabolite, éventuellement après avoir été débarrassées de leurs plasmides. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le métabolite est la biotine et le gène mar- queur est le gène xylE, la souche étant Bacillus sphaericus. 3) Souche d'organismes déréprimés obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 et 2. 4) Souche de B. sphaericus déréprimée dans l'ex- pression de la biotine pouvant être obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 2. ) Procédé de production de biotine par culture d'une souche de B. sphaericus produisant ladite biotine dans un milieu de culture, caractérisé en ce qu'on cul- tive une souche selon la revendication 4 qui a été transformée par au moins un plasmide exprimant le gène bioB et en ce qu'on ajoute l'acide pimélique ou l'un de ses dérivés au milieu de culture. 6) Procédé de production de biotine selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite souche a été transformée par un plasmide exprimant d'autres gènes de la chaîne de biosynthèse de la biotine. 7) Procédé selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que l'acide pimélique, ou ses dérivés, est ajouté au début de la culture, avant ou pendant la phase exponentielle de croissance. 8) Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que la souche est la souche de B. sphaericus n I-808.