FR 2645175 A1 19901005 FR 8904306 A 19890331 -1 - La présente invention concerne la préparation de protéines hétérologues, et plus particulièrement d'hirudine, par des souches de levures S. cerevisiae recombinantes. Par protéine hétérologue, on entend une protéine qui n'est ni produite naturellement par la levure, ni nécessaire à sa croissance. Les levures sont des organismes eucaryotes unicellulaires; le genre de levure Saccharomyces comprend des souches dont la biochimie et la génétique sont étudiées intensivement en laboratoire; il comprend également des souches utilisées dans l'industrie alimentaire (pain, boissons alcoolisées...) et produites par conséquent en très grande quantité. La facilité avec laquelle on peut manipuler la génétique des cellules de Saccharomyces cerevisiae et la longue histoire industrielle de cette espèce en font donc un hôte de choix pour la production de protéines étrangères en utilisant les techniques de 1'ADN recombinant. Lors de la préparation de protéines par les levures recombinantes, on a souvent pu constater que la protéine produite à partir de la souche de levure n'est pas parfaitement homogène, ce qui conduit à des rendements souvents insuffisants pour des protéines d'intérêt industriel destinées à être produites en grande quantité. -2- La demanderesse s'est déjà particulièrement intéressée à la production d'hirudine par des souches de S. cerevisiae recombinantes, décrites dans des publications européennes de brevet EP-A-0252854 et EP-A-0273800. L'hirudine dont la source principale se trouve dans les glandes salivaires des sangsues médicinales sous forme d'un mélange de peptides de 65 et 66 acides aminés est un inhibiteur très spécifique et très efficace de la thrombine. Il s'agit donc d'un agent thérapeutique très intéressant dont l'utilisation en clinique exige une tès grande pureté du produit, et qui est donc un candidat intéressant à la production par génie génétique. Un certain nombre de variants naturels de l'hirudine ont été identifiés et désignés par HVl, HV2, HV3. Leur structure est décrite dans la figure 1. Par la suite ces variants naturels ainsi que d'autres analogues ont été préparés par génie génétique, en particulier par fermentation de souches de S. cerevisiae comme cela est décrit par exemple dans les publications européennes de brevet déjà citées EP-A-0252854 EP-A-0273800 au nom de la Demanderesse. La Demanderesse a observé que l'hirudine produite à partir de la souche de levure décrite dans la publication européenne de brevet EP-A-0252854 n'est pas totalement homogène. En particulier la forme majeure et correcte qui comprend 65 acides aminés est contaminée par deux formes -3- qui éluent d'une colonne HPLC très près du pic principal et qui correspondent à des produits de clivage ayant perdu 1 ou 2 acides aminés à l'extrémité C-terminale. La présence de ces deux formes de 63 et 64 acides aminés rend difficile la purification de la forme correcte à 65 acides aminés. C'est pourquoi l'invention se propose de fournir de nouveaux moyens pour l'obtention à partir d'une souche de S. cerevisiae d'une plus grande quantité d'hirudine correspondant à la forme correcte, non clivée. Dans la suite de la description, on emploiera le terme "hirudine" pour désigner toutes les hirudines variants naturels ou analogues ayant subi une ou plusieurs mutations, délétions, tout en conservant leur activité antithrombotique. En effet, l'invention peut concerner la production de toutes les hirudines, même si les exemples ciaprès concerneront plus particulièrement l'analogue désigné par rHV2Lys47 (c'est-a-dire un variant HV2 recombinant ayant subi une mutation de l'amino acide Asp en position 47 en amino acide Lys). L'invention peut également concerner toutes les protéines hétérologues produites par des souches de S. cerevisiae recombinantes pour lesquelles on recontre le problème de défaut d'homogénéité du à la présence de formes clivées mentionné plus haut. _4_ L'invention-a donc pour objet une souche de S. cerevisiae recombinante productrice d'une protéine hétérologue, transformée par un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN codant pour la protéine hétérologue, caractérisée en ce qu'elle comporte une suppression de la fonction protéolytique codée par le gène PRCl. Les souches de S. cerevisiae présentent un certain nombre de fonctions protéolytiques qui s'expriment, dans la cellule de levure, dans des endroits différents. Il semble que les protéases vacuolaires jouent un rôle particulier dans le défaut d'homogénéité des protéines hétérologues, et en particulier de l'hirudine, produites par des souches de S. cerevisiae. L'invention repose dans sur la mise en évidence du rôle précis joué par la fonction protéolytique codée par le gène PRCl, et correspondant à une protéase endogène vacuolaire de levure la carboxypeptidase yscY, dans le défaut d'homogénéité de l'hirudine. La suppression de la fonction protéolytique codée par le gène PRC1 peut être effectuée de différentes façons. On peut citer par exemple une ou plusieurs mutations dans le gène de structure correspondant, et en particulier une délétion partielle-ou totale du gène. Pour éviter toute réversion de la mutation, il peut être avantageux de procéder par délétion. -5 - Toutes les souches de S. cerevisiae utilisables industriellement pour la production de protéines hétérologues peuvent faire l'objet de l'invention dès lors qu'elles présentent la déficience indiquée. D'une manière générale, les souches utilisées peuvent être des souches haploides de S. cerevisiae, qui portent la mutation ho, conférant l'hétérothallisme, qui sont de type conjugant alpha, et qui présentent des mutations affectant le gène URA3 ainsi que différents gènes de la biosynthèse d'acides aminés. L'intérêt d'utiliser des souches hétérothalliques est de permettre de conserver la souche sous forme haploide et non sporulante. En effet, lorsqu'on utilise pour la synthèse d'hirudine le promoteur MFalphal de levure, on a constaté que ce promoteur fonctionnait de façon optimale dans les souches non sporulantes de type conjugant alpha. Chez les levures de type sauvage HO, l'haplophase est un état transitoire qui disparaît après une ou deux divisions. Les levures de laboratoire sont des mutants ho chez qui l'haplophase est stable. Bien entendu, d'autres promoteurs que celui de la phéromone alpha peuvent être utilisés, qui ne requièrent pas nécessairement des souches hétérothalliques. On peut citer par exemple, les promoteurs de levures dont la fonctionalité a été confirmée par la transcription de gènes codant pour des protéines hétérologues: le promoteur PGK, PHO5, GALl etc... -6- L'utilisation de mutants ura3 permet la transformation des souches par un vecteur convenant pour l'expression d'hirudine, ainsi que la sélection de cellules transformées et productrices d'hirudine par la composition du milieu de culture, qui doit être dépourvu de pyrimidine (essentiellement uracile, cytosine, uridine). Plus particulièrment, on peut citer des souches qui présentent un génotype pep4-3 (gène appelé PRA1 ou PEP4). La protéase yscA est également de localisation vacuolaire et est synthétisée sous forme de précurseur inactif. Le précurseur peut être activé par clivage soit spontanément, soit de façon enzymatique grâce à la protéase yscA elle-même. Par son activité protéolytique, la protéase yscA est impliquée dans l'activation d'un certain nombre de protéines vacuolaires, générant ainsi protéases, RNases, etc... L'inactivation de la protéase yscA par mutation génétique a comme effet l'accumulation.de tous ces zymogènes inactifs aux dépens des formes actives. Ainsi, le mutant pep4-3 présente une diminution de plusieurs activités enzymatiques de la vacuole, ce qui contribue & l'effet souhaité selon l'invention. Enfin, l'invention concerne également un procédé de préparation d'hirudine par fermentation d'une souche de S. cerevisiae recombinante selon lequel on met en culture une souche de S. cerevisiae selon l'invention dans un milieu approprié et on récupère 1l'hirudine obtenue. -7- D'autres caractéristiques et avantages-de l'invention apparaîtront au cours de la description détaillée suivante, qui illustre l'invention par des exemples de production du variant rHV2Lys47 de l'hirudine par une souche de S. cerevisiae selon l'invention accompagnés des figures 1 à 5 suivantes: - la figure 1 représente les séquences des variants HV1, HV2 et HV3 de l'hirudine. - la figure 2 représente schématiquement la carte de restriction du gène PRCl dans sa forme chromosomique et du fragment contenant le gène HIS3 inséré. - la figure 3 représente la structure du plasmide PTG2958. - la figure 4 représente le profil HPLC obtenu à partir des surnageants de culture des souches TGYlsp4 et TGYlsp4 prcl-d::HIS3 transformées par le plasmide pTG2958. - la figure 5 représente le profil HPLC obtenu à partir des surnageants de culture des souches TGY20.3 et TGY20.3 prcl-d::HIS3 transformées par le plasmide pTG2958. Les caractéristiques génotypiques et phénotypiques des souches de référence et l'historique de leur construction sont détaillés ci-dessous: 1. Souche de référence TGYlsp4 - Génotype: MATalpha, ura3-251,-328,-273, his3-11,-15 (le gène URA3 qui est défectif correspond à l'enzyme OMPdécarboxylase; ce défaut est corrigé en présence d'un plasmide porteur du gène ura3. Cette complémentation constitute le système de sélection du vecteur d'expression de l'hirudine, la souche portant le pIasmide pouvant se multiplier en milieu minimum + casaminoacides, sans uracile). phénotype: ura- his-; signe sexuel alpha - Historique de la souche: La souche TGYlsp4 est le résultat du croisement de deux souches de collections, FL ura3 MATa x GRF18 MATalpha. La souche aFL ura3 a été sélectionnée par F. Lacroute (Université de Strasbourg) comme mutant nécessitant de l'uracile pour la croissance; elle est isogénique de la souche FL100 (souche de l'ATCC, 28383) dont elle dérive et ne se distingue que par le caractère ura-; ce caractère est dû à trois mutations: ura3-251,-328,-373. La souche alphaGRF 18 a été sélectionnée par G. Fink (USA) et est utilisée dans de nombreux laboratoires. Son utilisation, dans les manipulations génétiques par transformation, est décrite par exemple par M. Rudolph, I. Koenig-Rauseo et A. Hinnen (Gene 36, 1985, 87-95). Le génotype de la souche GRF 18 est: MATalpha, his3-11,-15, leu2-3,-112. 2. Souche de référence TGY20.3 - Génotype: MATalpha, ura3-251,-373,-328, his3-11,-15, leu2-3,-112, pep4-3. - 9- - Phénoptype: ura-, his-, leu-, croise avec les souches de type MATalpha: ne sporule pas; présente une importante diminution des activités protéinases yscA, yscB et carboxypeptidase yscY. - L'historique de la souche est schématisé ci-dessous GRF 18(a) FL ura3(b) MATalpha, his3-11,-15 MATa, ura3-251,-328,-373 TGY2sp2c x 20B-12(c) MATa, ura3-251,-358,-373, MATalpha, leu2-3,112 trpl, pep4-3 TGYlsp4 x TGY14-1 MATalpha, ura3-251,-373,-328, MATa, ura3-251,-373,-328, his3-11,15 I pep43, leu2-3-112 TGY20.3 MATalpha, ura3-251,-373,-328, leu2-3,-112, his3-11,-15, pep4-3 a) souche sélectionnée par G. Fink (voir plus haut) -10- b) souche sélectionnée par F. Lacroute, isogénique de la souche FL100 (voir plus haut). c) souche provenant du "Yeast Genetic Stock Center" (Berkeley, CA 94720) et décrite par E.W. Jones (1977, Genetics 95, 23). EXEMPLE 1: Construction des souches contenant une le gène PRCl patiellement délété A. Clonage du gène PRC1 La séquence du gène PRC1 a été publiée par Valls, L.A. et al. [Cell, 48 p 887-897 (1987)]. Deux oligonucléotides sont construits à partir de cette séquence. Le premier est complémentaire de la région 5' du gène et sa séquence est la suivante: ' AAG AAA GAC TGG GAC TTT GTG 3' Le second est complémentaire de la région 3' du gène et sa séquence est la suivante: ' GAT TGG ATG AAG CCT TAC CAC 3' A partir d'une banque génomique de levure (fragments d'ADN chromosomique partiellement digéré par Sau3A insérés dans le site BamHI de pFLl [Parent, S.A. et al. Yeast 1 83-138 (1985)] et par hybridation avec ces deux oligonucleotides on sélectionne un clone de E. coli contenant le gène PRCl inséré dans pFL1. B. Création de la délétion partielle dans le gène PRC1 (figure 2) Dans le gène PRC1 on trouve un site BglII dans la séquence codante. Par mutagénèse dirigée un second site BglII est introduit en amont du site BglII naturel à 549 paires de bases de ce dernier c'est à dire toujours dans la séquence codante. Cette mutagénèse est réalisée en utilisant l'oligonucléotide suivant: ' CGATGTGGAGATCTTGGCC 3' Ensuite ce fragment BglII est excisé et remplacé par un fragment BamHI de 1,2 kb contenant la séquence du gène HIS3 de la levure [Struhl K. (1985) Nucl. Acids Res. 13 8587-8601], et obtenu après isolement et clonage dans M13mp8. On élimine ainsi le site actif du produit du gène PRCl. C. Sélection des souches contenant le gène muté prcl-d::HIS3 décrit en B Les souches de S. cerevisiae TGYlsp4 (MATalpha, his3, ura3) et TGY20.3 (MATalpha, his3, ura3, leu2, pep4-3) sont transformées avec un fragment BamHI d'environ 1,7 kb permettant de générer l'allèle muté prcl-d::HIS3 par échange chromosomique. Les clones prototrophes en histidine sont sélectionnés et quatre transformés de chaque souche ensuite analysés pour la stabilité du caractère HIS+. Finalement 1'ADN chromosomique de ces transformés est analysé par hybridation de Southern afin de vérifier que l'allèle sauvage PRCl a bien été échangé avec l'allèle muté prcl-d::HIS3. On obtient ainsi deux souches TGYlsp4 prcl-d::HIS3 et TGY20.3 prcl-d::HIS3. EXEMPLE 2: Construction du plasmide pTG2958 Le plasmide pTG2958 (figure 3) est peu différent du plasmide pTG1833 décrit dans la publication européenne de brevet EP-A-252854 porteur de la séquence codante pour rHV2Asp47. Le plasmide pTG2958 ne contient pas le site de restriction HindIII artificiellement introduit. Le plasmide pTG2958 contient: - un fragment de 547 paires de bases correspondant à la région 5' du gène MFalphal (contenant le promoteur, la séquence codant pour le peptide signal, la région "pro" et une séquence codant por le peptide Lys-Arg), un fragment de 234 paires de bases contenant l'ADN complémentaire de rHV2Lys47, - un fragment de 243 paires de bases comprenant le terminateur PGK de levure, - le fragment PvuII-EcoRI de pBR322 comprenant entre autres l'origine de réplication de ce plasmide et le gène de résistance à l'ampicilline (2292 paires de bases), - le fragment EcoRI-HindIII du plasmide 2M de la levure (forme B), contenant le gène LEU2 de levure, sous forme délétée et inséré dans le site PstI, - un fragment HindIII-SmaI du gène URA3 de levure. EXEMPLE 3: Production de rHV2Lys47 par les souches précédemment obtenues contenant le gène PRC1 sous une forme délétee Les souches de levure sont transformées par le plasmide pTG2958 par la méthode de l'acétate de lithium [Ito, H. et al. J. Bactériol. 153; 1983] et les clones prototrophes en uracile sont sélectionnés. Ils sont ensuite mis en culture en erlenmeyer à 30 C sur un milieu sélectif (0,7% de bases azotées pour levures (Yeast Nitrogen Base), 0,5% de casamino acides et 1% de glucose). Apres 48 heures de culture, on sépare cellules et surnageant par centrifugation et la quantité de rHV2Lys47 est déterminée dans le surnageant par séparation sur une colonne HPLC (colonne Nucléosil C83gm SFCC N333 équipée d'une précolonne cartouche C8 5gm Nucléosil PSF35-1) et intégration du pic correspondant à la forme 65 acides aminés (figures 4 et 5). Le tableau 1 présente les résultats de ces dosages (les quantités sont données en gg de rHV2Lys47 par unité de densité optique (A600) des cellules obtenues après récolte en phase stationnaire). Tableau 1 Souche Génotype Production de rHV2Lys47 Significatif en gg/A600 TGYlsp4 PRAl PRCl 0,055 - PRAl prcl-del::HIS3 0,255 TGY20.3 pep4-3 PRCl 0,024 pep4-3 prcl-del::HIS3 0,072 Les dosages de rHV2Lys47 par les mettent clairement en évidence une augmentation de la production de rHV2Lys47 par un facteur d'environ quatre pour les souches dont le gène PRCl a été délété selon l'invention. Le dosage immunologique à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques dirigés contre la partie C-terminale (permettant de discriminer entre les formes dégradées et la forme correcte) confirme ces résultats. La souche TGYlsp4 prcl-d::HIS3 transformée par le plasmide pTG2958 a été déposée le 31 mars 1989 auprès de la C.N.C.M. rue du Dr. Roux 75724 PARIS sous le numéro 1-854. REVENDICATIONS 1. Souche de Saccharomyces cerevisiae recombinante productrice d'une protéine hétérologue, transformée par un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN codant pour la protéine hétérologue, caractérisée en ce qu'elle comporte une suppression de la fonction protéolytique codée par le gène PRC1. 2. Souche selon la revendication 1 caractérisée en ce que la suppression est obtenue par une mutation opérée sur le gène PRC1. 3. Souche selon la revendication 2 caractérisée en ce que la suppression est obtenue par une délétion dans le gène PRCl. 4. Souche selon la revendication 3 caractérisée en ce qu'elle présente le génotype prcl-d::HIS3. 5. Souche selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce qu'elle comporte la mutation pep4-3. 6. Souche selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisee en ce que le protéine hétérologue est l'hirudine. 7. Souche selon la revendication 6 caractérisée en ce que la protéine hétérologue est le variant rHV2Lys47 de l'hirudine. 8. Procédé de préparation d'hirudine recombinante par fermentation d'une souche de S. cerevisiae concerné en ce que l'on met en culture dans un milieu approprié une souche selon l'une des revendidations 6 ou 7 et on récupère l'hirudine obtenue.