FR 2645157 A1 19901005 FR 9004079 A 19900330 Inhibition sélective de L'ADN polymérase La présente invention démontre que les antisérums de deux peptides terminaux carboxy,distincts,du virus de L'herpes simplex type 1 (HSV-1, restes 1100-1108 et 1216-1224) peuvent neutraliser spécifiquement l'activité ADN poLymérase du HSV-1 et du virus de L'herpes simplex type 2 (HSV-2).Ces séquences de peptides sont propres au virus de l'herpes sim- plex (HSV) et ne se retrouvent pas dans d'autres virus -de L'herpès ou dans Les polymérases eucaryotes. Deux peptides, P6 et P7, présentant La séquence d'acides aminés APGDEPAPPY et AGATAEETRY, ont été utilisés pour obtenir des anticorps préparés contre eux, anticorps qui neutralisent spécifiquement l'ADN polymérase de HSV-1 et de HSV-2. La présente invention a également pour objet un pro- céde de triage des inhibiteurs de l'ADN polymérase de HSV-1 et de HSV-2, faisant appel à ces anticorps. Sur Les dessins ci-joints: La figure 1 représente un essai ELISA de compé- tition entre peptides. La figure 2 représente l'immunoprécipitation de l'activité ADN polymérase de HSV. La figure 3 représente la neutralisation de l'activité de L'ADN polymérase de HSV-1. La figure 4 représente une neutralisation de HSV comparative. La figure 5 représente La neutralisation d'une activité alpha polymérase endogène. La figure 6 représente la compétition entre pep- tides dans une neutralisation d'enzyme polymérase de HSV. On a utilisé des peptides synthétiques corres- pondant à des séquences d'acides aminés présentes dans le polypeptide de l'ADN polymérase du virus de l'herpes simplex type 1 (HSV-1)(souche KOS) et de HSV-2 (souche 186) pour produire des antisérums polyclonaux de lapin de spécificité définie. Ces peptides étaient identifiés à partir de séquen- ces de poLymérase de HSV publiées CGibbs, J.S. et aL., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 82: 7969-7973 (1985); Knopf, C.W.,Nucleic Acids Res. 14:82258226 (1986); Larder, B.A. et al., EMBO J. 6:169-175 (1987); Quinn, J.P. et ai., Nucleic Acids Res. 13: 8143-8163 (1985); et Tsurumi, T. et aL., Gene 52: 129-137 (1987), qui décrivent Le cadre de Lecture ouvert de La poly- mérase de HSV-1 et de HSV-2 comme ayant une longueur de 1235 et 1240 acides aminés, respectivement. Les peptides étaient choisis à partir de plusieurs critères: 1) spécificité vis-à-vis du virus de l'herpès; 2) conservation des souches; et 3) pouvoir hydrophile reLatif. On a étudié trois peptides. Deux de ces peptides, désignés par P6 et P7, représentant Les restes acides aminés 1100-1108 et 1216-1224 de la séquence HSV-1 déduite, ont produit des antisérums qui pouvaient neu- traliser L'activité de L'ADN polymérase de HSV-1 en fonction de la dose. Ces antisérums pouvaient également neutraliser l'ADN paLymérase de HSV-2, mais moins efficacement. L'acti- vité endogène d'alpha polymérase de mammifère était complète- ment réfractaire à L'effet inhibiteur de ces anticorps. Par contre, L'antisérum du peptide P3 (restes 548-556) était incapable d'immunoprécipiter et ne neutraLisait pas L'activité d'ADN polymérase de HSV-1, malgré une activité anti-peptide comparable à celLe des antisérums P6 et P7. On a constaté que La position de deux sites de neutralisation, se composant de neuf acides aminés ou moins, se trouvait à l'intérieur du domaine des terminaisons car- boxy de L'ADN polymérase de HSV-1 et de HSV-2. Production et soécificité d'anticorps antipeoti- des. Les séquences des trois peptides utilisés dans cette étude pour produire des anticorps antipeptides sont repré- sentées dans le TabLeau 1. 2645 1 5 7 TABLEAU 1. Anticorps antipeptides de L'ADN polymérase de HSV Antisérum Séquence Restes Activité Anticorps2 de peptide aminoacides Peptide Polymérase apparenté de HSV-1 Témoin _ _0 0 P3 LKDKKKDLSY 548-556 10.000 0 P6 APGDEPAPPY 1100-1108 12.000 2.000 P7 AGATAEETRY 1216-1224 12.000 2.000 n utilise un code acide aminé à une seule lettre: L=Leucine, K=lysine, D=aspartate, S=sérine, Y=tyrosine, A=alanine, P=proLine, G=glycine, E=glutamate, T=thréonine et R=arginine. Le reste tyrosine (Y) a été ajouté pour faciliter le couplage à la sérum albumine de boeuf (BSA) et à la thyroglobuline. On peut utiliser n'importe quel résidu convenable pour faciliter le couplage. N'importe quel acide aminé convenable peut être utilise en remplacement à condition que l'anticorps produit ait la même fonction que l'anticorps produit contre le peptide parent. 2Inverse de la dilution au point f naL, déterminé par l'essai ELISA. On a couplé les peptides à la BSA et à la thyro- globuline comme décrit dans l'Exemple 2, et on les a utilisés pour inoculer des lapins sur une période de plusieurs mois. Le couplage peut également se faire avec n'importe quel autre porteur convenable ou bien, dans une autre forme de réalisa- tion de l'invention, il n'est pas nécessaire de coupler le peptide au porteur par covalence, mais on peut plutât l'utili- ser seul ou le faire absorber passivement par un immunogène convenable. A deux lapins, on a inoculé l'antigéne porteur seul pour produire des sérums témoins hyperimmuns. On a trié les sérums obtenus pour la présence d'anticorps antipeptides par l'essai ELISA en utilisant des peptides (1 Mg) direc- tement absorbés par les aLvéoles de microtitrage. Le point final de l'essai ELISA était arbitrairement défini comme un signal trois à quatre fois plus important-que celui des sérums pre-immuns et hyperimmuns correspondants (dilution -4 1:100). Les activités anticorps engendrées contre chaque peptide sont représentées dans le Tableau 1. Ces antisérums n'étaient pas réactifs avec des peptides non apparentés,même lorsqu'on Les essayait à une dilution de 1:100. On a ensuite utilisé ces anticorps dans une série d'essais ELISA (voir l'Exemple 3) en utilisant des alvéoles de microtitrage revê- tus d'ADN poL-ymérase de HSV purifiée (souche mP) (voir Exem- ple 7). Les sérums P3 et témoins hyperimmuns n'étaient pas réactifs dans cet essai; Les sérums antipeptides P6 et P7 avaient tous deux des titres d'environ 1:1 000 à 1:2000 pour cet antigène (Tableau 1). Pour mieux démontrer la spé- cificité de ces antisérums, on a procédé à des essais ELISA de compétition entre peptides. Dans ces expériences, on a fait subir une incubation préalable à des immuno-gamma- globulines (IgG) totales purifiées provenant des sérums hyperimmuns, antipeptide 6 et anti-peptide 7, avec le peptide correspondant, pendant 30 minutes, avant leur addition aux alvéoles revêtus de polymérase. La quantité d'IgG choisie pour cet essai était suffisante pour produire un signal appréciable (0,250-0,300 QO.D.) quand elle était utilisée seule. Sur la figure 1, Les IGG totales de Lapin (2,5 pg environ) avaient incubé avec 0,01, 0,1, 1,0 ou 10,0 yg des peptides correspondants pendant 30 minutes à la température ambiante dans un volume de 100 pl). Au bout de 30 minutes, on ajoutait les mélanges réactionnels à des alvéoles de microtitrage que l'on avait revêtus de polymérase de HSV purifiée, et on déterminait l'activité résiduelle par l'essai ELISA. Comme le montre la figure 1, quand on fait subir aux IgG une incubation préalable avec leurs peptides respectifs, le signal ELISA est réduit au fur et à mesure que la quantité de peptide augmente: Les rectangles noirs sont les résultats obtenus avec Les IgG de P6 et Les peptides P6, et Les rectangles blancs sont Les résultats obtenus avec Les IgG de P7 et les peptides P7. L'incubation préalable de sérums anti-P6 avec P7 ou de sérums anti-P7 avec P6 n'ont 2645 1 57 pas réduit Le signal ELISA. Immunoorécipitation et neutralisation de l'activité ADN poly- mérase. L'objet de ces expériences était de déterminer si les anticorps qui reconnaissent spécifiquement la polymérase de HSV dans l'essai ELISA pourraient avoir un effet sur l'acti- vité de la polymérase de HSV dans deux types d'essais. Dans les premières expériences, l'activité de l'ADN polymérase était totalement enlevée des extraits par immunoprécipitation. Sur la figure 2, des extraits de cellules infectées (fractions de 5 pL) avaient incubé séparément avec plusieurs concentra- tions de l'antisérum approprié pendant une heure. On faisait précipiter Les complexes avec la protéine A de Stachylococcus aureus (Staph A) et on déterminait l'activité de la polymé- rase de HSV résidueLLe dans les surnageants. La figure 2 montre L'activité de polymérase résiduelLe après que l'on eut fait subir aux extraits une immunoprécipitation avec les sero hyperimmuns témoins, anti- P3, anti-P6 ou anti-P7. L'activité de polymérase témoin standard (100 %) était déterminée à par- tir d'extraits auxquels on n'avait pas ajouté d'IgG. Ces résultats indiquent que l'addition de 2,0 pg de témoin hyper- immun aux IgG de P3 peut réduire l'activité d'environ 25 à 30%, respectivement. Par contre, 2 Mg de l'IgG antipeptide (P6 et P7) peuvent réduire l'activité de 70 et 65 %, respectivement. Ces résultats concordent avec l'essai ELISA de la polymé- rase et suggèrent une reconnaissance spécifique de la poly- mérase de HSV par les IgG anti-P6 et anti-P7. Cependant, ce type d'expérience est compliqué par le fait que le rendement de la précipitation facilitée par Staph A est variable; par ailleurs, même avec du Staph A pre-adsorbé, des réactions non spécifiques et une adsorption par les parois des cellu- les peuvent avoir pour résultat une réduction apparente de l'activité de la polymérase même quand on utilise les anti- sérums d'antigènes non apparentes. Un tel résultat pourrait être observé avec le témoin hyperimmun ou l'IgG de P3. Afin d'éviter ces problèmes et d'évaluer un effet de neutralisa- tion direct de ces IgG, on a fait subir aux extraits d'enzy- mes une incubation préalable avec L'IgG purifiée avant d'ajouter Les autres produits réagissants de L'essai de L'ADN polymérase. Sur la figure 3, des extraits de ceLLuLes infectées par- HSV-1 avaient subi une incubation préalable avec 1, 2 ou 4 pg d'IgG d'hyperimmun témoin, d'antiP6 et d'anti-P7, pendant 1 heure, sur de La gLace. Dans certaines réactions, 0,5, 1,0 et 2,0 yg d'IgG d'anti-P6 et d'anti-P7 étaient ajoutés simultanément pour donner des concentrations totales d'IgG de 1, 2, et 4 jg. Apres incubation, on ajoutait les autres composants de la réaction et on déterminait Le degré d'incorporation de 3H-dTTP. On mesurait ensuite direc- tement La neutralisation de L'activité de la polymérase. La figure 3 montre Les résultats quand on ajoute aux extraits cellulaires 0, 1, 2 ou 4.g de témoin hyperimmun, et 1, 2 ou 4 pg d'IgG anti-P6 ou anti-P7. L'addition de jusqu'à 4 jg de l'IgG du témoin hyperimmun n'a pas réduit substantielle- ment ou uniformément le degré d'activité de la polymérase. Qn a obtenu des résultats sembLables avec l'IgG de P3 (don- nées non représentées). Par contre, les IgG d'anti-P6 et d'anti-P7 réduisaient progressivement l'activité de la poly- mérase à environ 49 % et 35 %, respectivement, quand on en ajoutait 4 yg. Par ailleurs, quand on ajoutait les IgG d'anti-P6 et d'anti-P7 à des concentrations équivalentes pour parvenir à des concentrations finales de 1, 2, et 4 yg, la neutralisation paraissait additive avec une réduction finale de L'activité de la polymérase de HSV à environ 80- Y. de la valeur témoin. Etant donné que Les séquences de P6 et de P7 sont communes à HSV-1 et à H.SV-2, on a procédé à une expé- rience pour vérifier si l'enzyme polymérase de HSV-2 pou- vait aussi être neutralisée-avec ces IgG. On a fait incuber des extraits cellulaires Libres de ceLLules infectées par HSV-1 et HSV-2 avec 4 yg d'IgG pendant 1 heure sur de la glace. Apres cette incubation, on a ajouté les autres compo- sants de La réaction et on a mesuré Le degré de radioacti- vité incorporé dans L'ADN précipitable par des acides. La figure 4 montre une comparaison de l'activité de La polymé- rase entre HSV-1 (rectangle blanc) et HSV-2 (rectangle noir) après préincubation avec témoin hyperimmun, IgG anti-P6 et IgG anti-P7. La différence d'incorporation totale entre cette expérience et les expériences précédentes reflète la diffé- rence entre les concentrations de protéines des extraits cellulaires. Ces résultats montrent que Les IgG anti-P6 et anti-P7 (4 pg) peuvent neutraliser l'activité polymérase de HSV-1 et de HSV-2, encore que l'activité de HSV-2 soit réduite dans une moindre mesure. Afin de démontrer la spécificité de séquence des IgG anti-P6 et anti-P7, on a évalué l'aptitude de ces réactifs à neutraliser l'activité alpha polymérase endogène dans les extraits selon l'invention. On a fait incuber des extraits cellulaires non infectés avec 1, 2 ou 4 yg d:hyper- immun témoin, et d'IgG anti-P6 ou anti-P7, pendant 1 heure sur de la glace. Apres incubation, on a ajouté Les autres composants de la réaction et on a déterminé le degré d'incor- poration de 3H-dTTP. La figure 5 montre l'effet obtenu en ajoutant 0, 1, 2 ou 4 pg d'IgG témoin hyperimmun ou 1, 2, ou 4 yg d'IgG anti-P6 ou anti- P7 à des réactions effectuées en milieu alpha polymérase. A la différence des résultats obtenus pour l'activité de polymérase de HSV-1 et de HSV-2, aucune des préparations d'IgG n'a neutraLisé de manière significative L'activité alpha polymérase dans les lysats selon l'invention. Ces résultats étaient attendus, étant donné L'absence des séquences P6 et P7 dans La séquence alpha polymérase déduite (Wong, S.W. et aL., EMBO J. 7:37-47 (1988)). Enfin, pour mieux vérifier la spécificité de La réaction de neutralisation, on a examiné L'aptitude des peptides a concurrencer spécifiquement La neutralisation des enzymes. On a fait subir une incubation préalable à. l'IgG témoin hyperimmun, et aux IgG anti-P6 et anti-P7 (4), sans peptides ou avec les peptides P3, P6 ou P7 (5 jg), pendant 30 minutes sur de La glace. Après la pré-incubation, on a fait incuber Le méLange peptidesanticorps avec des extraits cellulaires. On a ensuite ajouté Les autres compo- sants de La réaction de La poLymérase et on a déterminé Le degré d'incorporation de 3H-dTPP. Comme Le montre La figure 6, seule L'incubation préalable des sérums anti-peptides avec Le peptide apparenté a abouti au rétablissement de L'acti- vité poLymérase à un niveau proche du niveau témoin. L'incuba- tion préalable des extraits avec Les peptides seuLs (5 pg) n'a pas inhibé L'incorporation (données non représentées). Etant donné que Les anticorps qui fixent Les épitopes P6 ou P7 de L'ADN poLymérase de HSV peuvent neutraLi- ser L'activité poLymérase, on pourrait utiLiser Les peptides P6 et P7 comme réactifs d'affinité immobilisés pour con- centrer ou purifier des composés d'extraits de produits natu- reLs qui se fixent sur et neutralisent L'ADN poLymérase de HSV. Ou bien, étant donné que Les anticorps anti-P6 et anti-P7 reconnaissent deux déterminants sur L'ADN poLy- mérase de HSV, qui sembLent entrer en jeu dans La neutraLi- sation, Les anti-corps anti-idiotypiques des anticorps anti- P6 et anti-P7 pourraient être utilisables comme réactifs d'affinité pour concentrer ou purifier, à partir d'extraits de produits natureLs, des composés qui fixent P6 ou P7. Dans La forme de réalisation préférée de L'in- vention, on utiLise des anticorps P6 et P7 pour trier des composés qui se fixent sur Les épitopes P6 et P7 et empê- chent ensuite La fixation de L'anticorps apparenté. Etant donné que La fixation de L'anticorps sur L'un des épitopes P6 ou P7 aboutit à La neutralisation de L'activité ADN poLy- mérase de HSV, cet essai d'inhibition est utiLisabLe pour identifier de nouveaux agents antiviraux. Dans La forme de réalisation préférée, on adsorbe séparément Les peptides P6 et P7 sur des plaques de microtitrage. Chaque peptide (6 ou 7) est un témoin pour La spécificité de La réaction avec l'autre peptide (7 ou 6, respectivement). Apres blocage, on fait incuber les plaques soit avec un tampon isolé, soit avec des extraits tamponnés de produits naturels ou de composés synthétiques. Apres Lavage complet, on ajoute L'anticorps pri- maire (témoin hyperimmun, anti-P6 et anti-P7) à une dilution appropriée, dans les alvéoles revêtus, et on le fait incuber. Apres lavage complet, on ajoute un anticorps secondaire conjugué pour détecter La quantité d'anticorps primaire fixé. On compare les signaux obtenus des alvéoles qui avaient reçu le tampon seul, et de ceux qui avaient reçu Les produits synthétiques ou naturels. Il existe bien d'autres manières de mener cet essai. Dans une autre forme de réalisation, l'antigène uti- lisé pour le revêtement pourrait être le HSV ou l'alpha ADN polymérase au lieu des peptides. L'essai aurait lieu sur des membranes et non des aLvéoles de microtitrage. L'anti- corps secondaire pourrait être soit marqué par enzyme soit être conjugué à une molécule indicatrice. L'extrait tamponné de produits naturels ou de composés synthétiques pourrait être ajouté après l'anticorps primaire. Exemple t Virus et cellules On a fait se prooager HSV-1 (souches Schooler ou KOS) et HSV-2 (186) et on Les a titrées dans des mono- couches cellulaires Vero.Le virus a été purifié sur plaque à deux reprises avant utilisation. Exemole 2 Preéoaration de sérums anti-oeotides de laDin On a coupLé des peptides à un mélange de sérum albumine de boeuf (BSA) et de thyroglobuline porcine par l'intermédiaire de benzedine bis-diazotee, essentiellement comme décrit par Bassiri (Bassiri, R. et al., pages 46-47, de B.M. Jaffee et H.R. Behrman (ed.), Methods of Hormone Radioimmunoassay, Academic Press, Inc., New York (1979). Pour l'immunisation initiale, on a inocuLé ces conjugués à des Lapins de NouveLLe-ZéLande, en de nombreux endroits sous- cutanés et intradermiques, dans un adjuvant de Freund com- plet. On a saigné Les lapins environ 2 et 5 semaines après l'immunisation. On a fait précipiter La fraction IgG avec du suLfate d'ammonium et on L'a purifiée par chromatographie d'affinité avec Les protéines A sur des colonnes PerfLex (DuPont), essentieLLement comme spécifié par Le fabricant. ExemoLe 3 Essais ELISA Pour Les essais ELISA de peptides standardon a séché à l'air des peptides (l ug/100 Pl) sur des alvéoles Immulon-2 (Dynatech) et on Les a fixés avec du méthanol selon La méthode de Norrby (Norrby-E. et aL., Proc. NatL. Acad. Sci. USA 84:6572-6576 (1987)). Pour Les essais ELISA de poly- mérase standard, on a revêtu des aLvéoLes Immulon-1 (Dyna- tech) avec de la poimérase purifiée (mP) (Voit Exemple 7) dans un tampon de carbcnate (pH 9,6) pendant une nuit à 4:C. Avant utilisation, on a lavé les deux types de plauues sensibilisées avec une solution de lavage =ISA (Kirkegaard Perry Laboratories, KPL) et on les bLoquées à 370C pendant 1 heure avec un tampon de blocage à La casé- ine (KPL). Après Le lavage, on a ajouté Les anticorps pri- maires dans un tampon de caséine et on a fait réagir pendant une heure à 37 C. On a Lavé Les plaques et on a ajouté, en une heure, L'IgG antiLapin de chèvre purifiée par affinité conjuguée avec de La phosphatase aLcaline (KPL). On a Lavé soigneusement les plaques et on a ajouté Le substrat de p- nitrophénylphosphate en 30 minutes à La température ambiante. On a lu l'absorbance immédiatement, sans stabilisation, à 405 nm (MultiScan). Le point finaL ELISA était arbitraire- ment défini comme un signal trois à quatre fois plus impor- tant que celui obtenu avec Les sérums pré-immuns correspon- dants (1:100) avec Les peptides, ou avec Les sérums hyper- immuns (1:100) en l'absence de peptide. Exemole 4 Extraits d'ADN Polymérase On a prépare des extraits cellulaires faussement ou réellement infectés, essentiellement comme décrit par Karkas et aI. (Karkas, J.D. et aL., J. Med. Chem. 29:842-848 (1986).Pour l'essentiel, des cellules HeLa S3 étaient fausse- ment ou réellement infectées avec HSV-1 (Schooler ou KOS) ou HSV-2 (186) à une multiplicité d'infections de 10 unités de formation de plaque par cellule, et on les récoltait 16 heures après l'infection. On a congelé à - 800C des agglo- mérats de cellules (1xlO cellules). On a décongeLé les cel- lules sur de la glace et on les a remises en suspension dans I ml de solution hypotonique (10mM K2P04, pH 7,0; 10mM KCl; 1 mM PMSF; lmM dithiothréitol ((DTT)) et on les a fait incu- ber sur de la glace pendant 30 minutes en les faisant tour- billonner de temps en temps. On a ajouté un volume égal de 700mM de K2P04; pH 7,0; 28 % de glycérol; 6mM de DTT; 0,4 X de NP-40; lmM de PMSF, et on a fait incuber le mélange sur de la glace pendant encore 30 minutes, en faisant tourbil- lonner de temps en temps. On a centrifugé le mélange pendant une heure à 125 000 g et on a ajouté du NP-40 au surna- geant jusqu'a une concentration finale de 0,4 %. On a main- tenu les fractions à -80 C. La concentration finale en pro- teines des extraits était d'environ 5,0 mg/ml, d'après l'es- sai Bio-Rad Bradford. Exemole 5 Immunoorécipitation de l'activité ADN Polymérase On a prétraité du Stachylococcus aureus contenant des protéines A (Pansorbin, Behring Diagnostics) avec de la BSA pour réduire au minimum la fixation non spécifique, en faisant incuber 150 ?l de suspension de cellules avec 300 pg de BSA pendant une nuit à 4 C. Le lendemain, on a formé des agglomérats des cellules, on les a rincés et on les a remis en suspension dans 125 El de 25 mM Tris-HCl pH 8,0. On a fait incuber les extraits cellulaires infectés par HSV (5 pl) avec 2 pg de IgG purifiee,sur de la glace pendant une heure. On a ajouté la suspension de StaphyLococcus pré-adsorbée (5 pL) et on a continué l'incubation sur La glace pendant une heure. On a centrifugé le mélange à 6 500 toursfminute (3 000 g environ) dans une microcentrifugeuse Eppendorf et on a mesuré, de La façon décrite ci- dessous, l'activité ADN poLymérase du surnageant. On a fait la moyenne des résuLtats des essais menés soit sans IgG soit sans IgG ni Staohvlococ- cus aureus, et on a utilisé cette moyenne comme vaLeur témoin (100 %). ExemDle 6 Essai de l'ADN Polymérase L'essai d'activité de l'alpha ADN polymérase a été exécuté essentiellement de la façon décrite précédemment (Haffey, M.L. et aL., J. ViroL. 62:4493-4498 (1988); Karkas, J.D. et aL., J. Med. Chem. 29:842-848 (1986)). Les mélanges réactionnels contenaient S pl d'extrait cellulaire (25 pg de protéines) dans 10 mM de Tris-HCL; pH 7, 5; 1OmM de MgCL; mM de (NH4)2S04; 0,1mM de DTT; 100 yM de dATP, de dCTP et de dGTP; 100 pM de H-TTP (10 cpm/pmoL); 40 pg/ml d'ADN de thymus de veau coupé; 2 mM de spermidine dans un volume final de 50 pL. On a mesuré l'activité ADN polymérase de HSV dans mM de Tris-HCL pH 8,5, 5mM de MgCL2, 1mM de DTT, 100 mM de (NH4)2S04, 5 FM de dATP, de dCTP, et de dGTP, 5PM de ( H)dTTP (200 cpm/pmol), 30 yg/ml d'ADN de thymus de veau activé par DNA polymérase I et 10 pg/ml de BSA dans un volume final de 50 ML. Tous Les essais d'ADN polymérase ont été exécutés en faisant incuber les produits réagissants pendant minutes à 37 C; on a déposé des points des méLanges réac- tionnels sur des filtres en fibre de verre et on Les a sta- bilisés en leur ajoutant 10 mM de pyrophosphate de sodium dans du TCA à 5 %. On a lavé Les fiLtres à trois reprises dans du HCL 1N, une fois dans de l'éthanol à 95 %, et on a déterminé les quantités par comptage par scintillation en utilisant un compteur LKB 1214 Rackbeta à un rendement de 63 %. Tous Les essais ont été menés en double. Pour les essais d'immunoprécipitation, on faisait incuber L'anticorps et l'extrait sur de La glace pendant 70 minutes, puis après l'addition de S aureus contenant Les protéines A, pendant encore 60 minutes, on a clarifié les extraits dans une micro- centrifugeuse Eppendorf (6 500 tours/minute, 3 000 g environ), et on a mesuré l'activité polymérase résiduelle dans Le sur- nageant. Pour les essais de neutralisation d'enzymes, on faisait subir aux extraits une incubation préalable avec l'anticorps désigné dans les Légendes de la figure pendant minutes sur de la glace avant d'ajouter les autres compo- sants. Pour les essais de compétition, on faisait incuber Les anticorps et Les peptides Les uns avec Les autres sur de La glace pendant 60 minutes, avant de les ajouter au cocktail de réaction. Exemple 7 Ré actifs On a acheté des peptides à la société BioSearch et on a constaté la présence d'un pic majeur dans la partie peptide de la courbe suivant la chromatographie en phase inversée (C18, Vydac). On a démontré que le poids moLécu- laire réel des peptides synthétiques était égal au poids moléculaire prédit par FAB-MS (G.C. DiDonato, Department of Analytical Chemistry, Squibb institute for Medical Research). L'ADN polymérase de HSV purifiée (souche mP) utilisée dans les expériences ELISA était un don généreux de W. Ruyechan (Uniformed Services University). Les caractéristiques de cette préparation ont déjà été décrites (Ruyechan, W. et aL., J. Virol. 52:727-733 (1984). REVENDICATIONS 1. Peptide (P6) présentant la séquence d'acides aminés APGDEPAPPY dans laquelle Y est un reste convenable queLconque ajouté pour faciliter le couplage et le fonction- nement. 2. Peptide (FC7) présentant La séquence d'acides aminés AGATAEETRY dans laquelle Y est un reste convenable quelconque ajouté pour faciliter Le couplage et Le fonction- nement. 3. Anticorps préparés contre les peptides de la revendication 1, ou anticorps anti-peptides 6, anticorps qui neutralisent spécifiquement L'ADN polymérase de HSV-1 et de HSV-2. 4. Anticorps préparés contre Les peptides de La revendication 2, ou anticorps anti-peptides 7, anticorps qui neutralisent spécifiquement L'ADN polymérase de HSV-1 et HSV-2. 5. Procédé de neutralisation d'une ADN polymé- rase de HSV-1 et de HSV-2, comprenant l'opération d'addition, à la polymérase, d'anticorps anti-peptides 6. 6. Procédé de neutralisation d'une ADN polymé- rase de HSV-1 et de HSV-2,-comprenant l'opération d'addition, à la polymérase, d'anticorps anti-peptides 7. 7. Procédé de triage d'inhibiteurs de L'ADN polymérase de HSV-1 et de HSV2, comprenant l'opération d'interférence avec la fixation des anticorps anti-peptides 6 sur le peptide 6, ou avec La polymérase, par addition d'un inhibiteur potentiel, et la mesure de la quantité d'anticorps anti-ceptides 6 qui est ensuite fixée. 8. Procédé de triage d'inhibiteurs de L'ADN polymérase de HSV-1 et de HSV2, comprenant l'opération d'interférence avec la fixation d'anticorps anti-peptides 7 sur le peptide 7, ou avec la polymérase, par addition d'un inhibiteur potentiel, et la mesure de la quantité d'anticorps anti-peptides 7 qui est ensuite fixée. 9. Procédé de triage d'inhibiteurs de L'ADN polymérase de HSV-1 et de HSV2, comprenant l'opération d'interférence avec La fixation d'anticorps anti-peptides 6 déja fixes sur Le peptide 6, ou avec La poLymérase, par addition d'un inhibiteur potentiel, et la mesure de la quan- tité d'anticorps Libérée. 10. Procédé de triage d'inhibiteurs de l'ADN polymérase de HSV-1 et de HSV-2, comprenant l'opération d'interférence avec La fixation d'anticorps anti-peptides 7 déjà fixes sur le peptide 7, ou avec La polymérase, par addition d'un inhibiteur potentiel, et la mesure de la quan- tité d'anticorps libérée. 11. Variantes fonctionnelles des peptides selon Les revendications 1 et 2. 12. Procédé de concentration de composés qui fixent l'ADN polymérase de HSV, consistant à utiliser les peptides P6 et P7 comme réactifs d'affinité immobilisés, et à faire passer lesdits composés sur lesdits réactifs. 13. Procéde de concentration de composés qui se fixent sur l'ADN polymérase de HSV, consistant à utiliser des anticorps anti-idiotypiques des anticorps anti-P6 et anti-P7 comme réactifs d'affinité immobilisés, et à faire passer lesdits composés sur Lesdits réactifs.