FR 2647465 A1 19901130 FR 8906738 A 19890523 Procédé de conservation d'embryons végétaux La présente invention a trait à un procédé de conserva- tion d'embryons végétaux somatiques ou zygotiques. De nombreuses espèces peuvent être cryoconservées sous forme de suspensions cellulaires, de cals ou bien de méristèmes. La conservation à basse température des embryons se justifie dans de nombreux cas, par exemple pour réguler la production de plantules lorsqu'elle est saisonnière ou pour assurer le maintien d'une lignée clonale. La cryoconservation des embryons offre la possibilité de bloquer temporairement le développement des embryons, le temps nécessaire à leur transport jusqu'au semis ou à leur stockage, ainsi que la possibilité de création de banques de génotypes afin d'éviter une dépréciation pro- gressive du patrimoine génétique. Les embryons somatiques présentent certains avantages pour la multiplication des plantes. Ils proviennent en principe d'une seule cellule et donnent des plantes gé- nétiquement uniformes. Les embryons somatiques présen- tent dès le début de leur formation une structure bipo- laire: ils possèdent les deux méristèmes de tige et de racine nécessaires pour produire une plante. L'embryo- génèse somatique apparaît donc comme une alternative intéressante pour la propagation des plantes: elle pour- rait permettre la multiplication rapide d'espèces ayant un coût de production élevé, ou celle d'individus particulièrement performants provenant de cultures in vitro, ou celle de plantes transformées difficilement manipulables par voie sexuée, par exemple. - 2 - Les problèmes posés par la conservation des embryons sont complexes. Il s'agit en particulier de conserver vivants les deux pôles méristématiques susceptibles d'assurer la reprise de l'élongation et de l'organogénèse de la racine et de la tige. Il existe différents procédés connus de cryoconservation d'embryons. L'un de ces procédés consiste en une préculture des em- bryons sur un milieu enrichi en sorbitol, en proline ou en mannitol, suivie d'une imprégnation à 0 C dans le milieu de culture additionné de diméthylsulfoxyde et/ou de glycérol, puis d'une congélation induite et lente jusqu'à -40 C et enfin d'une congélation rapide dans l'azote liquide. La reprise de l'embryogénèse après dé- congélation nécessite l'ajout d'acide 2,4 dichlorophéno- xyacétique au milieu de culture. Un autre procédé, applicable à des embryons somatiques cultivés sur un milieu gélosé, consiste en une précul- ture d'une semaine sur un milieu enrichi en saccharose, suivie d'une congélation directe dans l'azote liquide des embryons placés à sec dans un cryotube. Encore un autre procédé connu consiste en une préculture des embryons somatiques sur un milieu auquel on ajoute graduelleient au moins 2,5% de diméthylsulfoxyde, suivie d'une congélation lente jusqu'à -100 C puis d'une con- gélation rapide dans l'azote liquide. La reprise de l'embryogénèse est facilitée par une culture sur un milieu contenant 0,1 mg 1-1 d'acide 2,4 dichlorophénoxy- acétique. Le rôle des substances cryoprotectrices, telles que le diméthylsulfoxyde ou le glycérol, est de prévenir la formation de la glace lors de la congélation. Toutefois l'utilisation de telles substances peut présenter cer- tains inconvénients. D'une part, elles ne sont généra- lement pas facilement sublimables, et ne peuvent donc -3- laisser espérer un traitement ultérieur de lyophilisa- tion, d'autre part elles peuvent s'avérer cytotoxiques. Le rôle des auxines comme l'acide 2,4 dichlorophénoxy- acétique est de conserver les cellules à l'état indif- férencié en phase de callogénèse, et de favoriser la reprise de la prolifération cellulaire après décongéla- tion des embryons. Or l'arrêt par congélation du déve- loppement des embryons induit souvent une reprise anor- male de leur croissance. Les auxines peuvent favoriser la formation d'embryons adventifs par division cellu- laire lors de la reprise de l'embryogénèse, et augmenter les risques d'embryogénèse secondaire. Afin de pallier les inconvénients de l'art antérieur, la présente invention a pour but de proposer un procédé de conservation d'embryons végétaux somatiques ou zygotiques permettant d'assurer l'arrêt par congélation du développement des embryons, puis la reprise du développement sans apparition d'autres formes de morphogénèse telles que l'embryogénèse secondaire ou la callogénèse. A cet effet, le procédé selon la présente invention est caractérisé par le fait que: - les embryons sont prétraités sur un milieu de prétraitement contenant un agent de pression osmotique, puis - les embryons prétraités sont refroidis et con- gelés à une température comprise entre -15 C et -400C. Les embryons congelés à -15/-40 C peuvent être conservés à cette température, ou plongés ultérieurement dans un fluide frigorifique et conservés à une température plus basse. - 4 - 2647465 Un avantage de ce procédé est d'éviter l'emploi de sub- stances cryoprotectrices toxiques et/ou non sublimables. Un autre avantage est d'éviter l'emploi d'auxines dans les milieux de culture utilisés avant congélation et après décongélation lors de la reprise de croissance. Un autre avantage est de permettre la conservation à une température faible (-15/-40 C) donc facilement acces- sible (dans un congélateur ménager par exemple) sans avoir à employer de matériel coûteux. Un autre avantage est de proposer un procédé de conser- vation rapidement et facilement réalisable. Un autre avantage est de permettre une éventuelle lyo- philisation ultérieure des embryons. Le présent procédé de conservation permet d'obtenir des embryons ayant une reprise de croissance normale, ne nécessitant aucun apport de substance de croissance, et ne présentant pas de prolifération adventive, d'o une qualité améliorée de la semence produite. En effet, l'embryogénèse secondaire est préjudiciable à une distribution industrielle du produit car on peut obtenir des semences multigermes indésirables. Les embryons utilisés dans la présente invention peuvent être de toute espèce et d'origine diverse. Ces embryons sont, par exemple, des embryons de carotte. Les embryons peuvent être des embryons somatiques ou des embryons zygotiques. Les embryons somatiques peuvent être obtenus par l'in- termédiaire de suspensions cellulaires indifférenciées. Dans ce cas, des semences de parent d'hybride par exem- ple peuvent être mises à germer aseptiquement. Les hy- pocotyles peuvent être coupés puis placés sur un milieu de culture contenant des auxines. Les cals obtenus peu- vent être ensuite dissociés dans un milieu de culture liquide. On obtient alors une suspension cellulaire - 5 - indifférenciée dont les cellules, après plusieurs repi- quages, peuvent être transférées sur un milieu de cul- ture. Après une dizaine de jours, la suspension cellu- laire peut être filtrée afin de ne retenir que les agré- gats cellulaires de dimension désirée. Ces agrégats peu- vent être cultivés sur un milieu de culture exempt d'au- xine pendant quelques jours, afin d'induire la formation d'embryons. Les embryons zygotiques peuvent être obtenus par prélèvement par dissection sur la graine au stade mature ou légèrement immature. Les embryons somatiques et zygotiques obtenus peuvent être triés en fonction de leur stade de développement. On choisit de préférence les embryons aux premiers stades de leur développement, lorsqu'ils présentent une taille comprise entre environ 150 et 600 Pm, car ils sont alors plus résistants à la congélation. Ces dimensions correspondent aux stades de développement de coeur (150-300 jm) ou de torpille (300 -600 inm) des embryons somatiques. Les embryons obtenus sont ensuite prétraités sur un mi- lieu de culture, dit milieu de prétraitement. Ce milieu peut être un milieu habituel dans le domaine de la cul- ture d'embryons, tel qu'un milieu de Murashige et Skoog, par exemple, auquel on ajoute un agent de pression osmotique et auquel on peut également ajouter certaines substances organiques, telles que la vitamine B1, l'acide nicotinique ou l'adénine. Il est nécessaire, lors d'un processus de cryoconser- vation, de prévenir la formation de glace intracellu- laire qui, même si elle n'endommage pas directement les embryons pendant la congélation, peut induire une re- cristallisation destructrice pendant la décongélation. Dans le présent procédé, afin de réduire les éventuels - 6 - dommages subis par les embryons, on les déshydrate par- tiellement grâce à un prétraitement sur un milieu con- tenant un agent de pression osmotique. Cet agent peut être choisi par l'homme du métier parmi les substances susceptibles de pénétrer les tissus et d'assurer une bonne pression osmotique afin d'obtenir une déshydratation correcte de la cellule, sans en in- fluencer la perméabilité membranaire. Cet agent ne doit pas, de plus, présenter de risque de toxicité vis-à-vis des embryons. Cet agent peut être un sucre, tel que le saccharose ou le tréalose, ou toute autre substance con- nue pouvant remplir les mêmes fonctions. La concentration en agent de pression osmotique du mi- lieu de prétraitement ne doit par être trop faible afin d'assurer une déshydratation correcte de la cellule. Elle ne doit pas être non plus trop forte afin de ne pas détériorer les embryons ou empêcher leur reprise de croissance après la décongélation. Dans une forme de réalisation préférée du présent pro- cédé de conservation, le milieu de prétraitement con- tient du saccharose à une concentration comprise entre -25 75 et 190 g1 et de prfrence entre 100 et 150 gl 1 75 et 190 gl, et de préférence entre 100 et 150 gl1 On a constaté que ce seul prétraitement suivi d'une éta- pe de congélation aux températures indiquées, permet d'atteindre, de manière simple, efficace et sûre, le but recherché. Le prétraitement peut durer de 30 secondes à 36 heures. Ce prétraitement ne doit pas être trop court afin de permettre à l'agent de pression osmotique de déshydrater partiellement les cellules et d'en accroître la résistance à la congélation. Le prétraitement ne doit pas non plus durer trop long- temps. On peut observer une diminution de la résistance --7 -- des embryons à la congélation, illustrée par une dimi- nution du nombre d'embryons encore vivants après décon- gélation, lorsque le prétraitement dépasse 36 heures. Il est possible que lors d'un prétraitement prolongé, l'em- bryon subisse des modifications morphologiques qui pour- raient amoindrir sa résistance à la congélation, ceci étant dû au fait que l'embryon continue de croître et atteint alors un stade moins compatible avec un traite- ment de congélation. D'autre part, la diminution de l'action protectrice de l'agent de pression osmotique lors de longues durées de prétraitement pourrait aussi s'expliquer par une accou- tumance de l'embryon au milieu de prétraitement, ce qui entraînerait une diminution de l'effet de la pression osmotique. Le prétraitement peut s'effectuer de préférence à tem- pérature ambiante, c'est-à-dire à environ 18-24 C, et sous un éclairement moyen de environ 150-250 lux, par exemple. Les embryons prétraités sont refroidis puis congelés à une température comprise entre -15 C et -40 C. Ils sont congelés de préférence à une température de environ -20oC. Cette congélation peut s'effectuer en transférant les embryons avec le milieu de prétraitement dans des cryo- tubes et en plaçant ces cryotubes dans un congélateur ménager par exemple. La vitesse de refroidissement imposée lors de la congé- lation influe sur la rapidité d'apparition de la glace et le degré de déshydratation des embryons au moment de cette prise en glace. On a constaté qu'il est préférable que la vitesse de refroidissement, pour la zone de tem- pérature située entre -6 C et -40 C, soit modérée, de l'ordre de 0,1-1 C par minute, afin de favoriser la re- prise de croissance ultérieure des embryons. Pour le passage de la température ambiante à une température de -- 8 -- -60C, la vitesse de refroidissement peut être plus.ra- pide, par exemple comprise entre 1 et 5 C par minute. Les embryons congelés à une température comprise entre -15 et -40 C peuvent être conservés tels quels pendant au moins 1 mois. Pour des durées de conservation supérieures, il est pré- férable de conserver les embryons à une température plus basse, par exemple dans un fluide frigorifique. En effet, il semble qu'une conservation prolongée à -15/-40 C soit incompatible avec la reprise de crois- sance, donc la viabilité des embryons après décongéla- tion. Il semble que la température de -15/-40 C soit trop élevée pour assurer un arrêt complet du métabolisme de l'embryon. Si l'on désire une conservation prolongée, la congéla- tion à -15/-40 C est à considérer comme une première étape qui peut être suivie d'une congélation dans un fluide frigorifique à plus basse température. Dans ce cas, les embryons sont de préférence maintenus à -15/-40 C pendant un certain temps, de l'ordre de 18 -24h, afin que la congélation soit complète. Les embryons peuvent être ensuite immergés directement dans un fluide frigorifique, par exemple dans un bain de méthanol à -70 C ou un bain d'azote liquide à -196 C, ou refroidis à une température très basse, par tout autre moyen. Les embryons congelés peuvent alors être conservés pen- dant de longues périodes, pouvant durer plusieurs an- nées. Les embryons congelés peuvent aussi être ultérieu- rement enrobés dans des polymères artificiels ou natu- rels, par exemple de type alginate, afin d'obtenir des semences artificielles. - 9 - La décongélation des embryons peut s'effectuer, par exemple, par trempage des cryotubes dans un bain-marie à C pendant 2 minutes. Les tubes peuvent être retirés du bain-marie avant fusion complète de la glace, afin d'éviter une élévation de température trop rapide. Après complète décongélation, les embryons peuvent être débarrassés du milieu de prétraitement par simple la- vage, puis les embryons lavés peuvent être placés sur un milieu de culture habituel dans le domaine de la culture d'embryons, tel qu'un milieu de Murashige et Skoog par exemple. Ce milieu peut contenir un substrat carboné assimilable, tel que du saccharose à une concentration de 1 à 10 gl-1 par exemple. Ce milieu de culture est remarquable par le fait qu'il est exempt d'auxines. Après cette remise en culture, les embryons reprennent un développement comparable à celui d'embryons non con- gelés. La survie après congélation et remise en culture se tra- duit par une croissance bipolaire des embryons. Il y a bien maintien de l'intégrité de la structure de l'em- bryon au cours de son développement ultérieur sans au- cune autre forme de morphogénèse telle que callogénèse ou embryogénèse adventive. Le présent procédé de conservation d'embryons permet donc bien d'obtenir d'une part la survie des embryons dans leur intégrité morphologique, d'autre part un bon maintien de leur capacité à régénérer une plantule. La présente invention est illustrée plus en détail dans les exemples ci-après. - 10 - Ces exemples sont précédés par un exemple de préparation traditionnelle d'embryons somatiques, par la description d'un test de viabilité et par le tableau 1 qui donne la composition d'un milieu de prétraitement et de culture préféré. Exemple de préparation d'embryons somatiques Une suspension cellulaire indifférenciée de cellules de carottes Daucus carota L. est repiquée tous les 12 jours, à raison de 1 gramme de biomasse pour 100 ml de milieu, sur un milieu de culture liquide de Murashige et Skoog de composition identique à celle donnée dans le tableau 1, auquel on a ajouté 20 g 1-1 de saccharose et 0,1 mg 1-1 d'acide 2,4 dichlorophénoxyacétique. Toutes les manipulations sont effectuées sous hotte à flux laminaire, dans des conditions aseptiques. La suspension est placée sur un agitateur animé d'un mouvement giratoire excentré de 100 tours par minute, et est cultivée à 24 C, sous un éclairement de 200 lux avec une photopériode de 16 heures. Apres 8 à 10 jours de culture, la suspension cellulaire est filtrée afin de ne retenir que les agrégats cellu- laires ayant une taille comprise entre 50 et 180)im. Ces agrégats de faible taille représentent un stade proem- bryonnaire des embryons qui poursuivront leur dévelop- pement jusqu'aux stades coeur, torpille et plantule. Les agrégats sont lavés et placés sur un milieu de Mu- rashige et Skoog ne contenant pas d'acide 2-4 dichloro- phénoxyacétique, à raison de environ 1,5.103 agrégats par ml de milieu. Après 10 jours de culture, des embryons se sont formés. On filtre la suspension de manière à ne retenir que les embryons ayant une taille comprise entre 150 et 600jum. -il - 2647465 Test de viabilité Un test de viabilité, rapide et simple dans sa mise en oeuvre, a été établi afin d'évaluer le taux de viabilité des embryons après congélation. Parmi les différents critères utilisables pour apprécier le taux de viabilité des embryons, on retient principalement: - l'augmentation de la taille des embryons et - l'apparition d'une coloration chlorophyllienne. L'appréciation de ces critères peut être effectuée de différentes manières, par exemple par dénombrement vi- suel ou à l'aide de tests biochimiques (test de colora- tion par exemple). Selon le principe de ce test, les embryons décongelés sont placés sur un milieu de culture liquide. On relève après 10 jours de culture, le nombre d'embryons dont la taille a augmenté et présentant des signes de coloration chlorophyllienne. Le rapport de ce nombre au nombre total d'embryons pre- sents permet de déterminer le taux de viabilité des em- bryons. Les embryons peuvent ensuite être placés sur un milieu de culture solide de même composition que le milieu li- quide précédent afin de poursuivre leur développement vers le stade plantule. Après 10 jours de culture sur ce milieu solide, on dé- termine le taux de régénération comme étant le rapport entre le nombre d'embryons ayant évolués vers le stade plantule au nombre total d'embryons. - 12 - Tableau 1 Composition du milieu de Murashige et Skoog (pH 5,8-6) Macroéléments mg 11l NH4NO3 1650 CaCl2,2H20 440 MgSO4,7H20 370 KNO3 1900 KH2PO4 170 Microéléments CoCl2 0,025 CuSO4,5H20 0,025 FeSO4,7H20 27,8 Na2 -EDTA 37,3 MnSO4, 4H20 22,3 KI 0,83 Na2MoO4 0,25 ZnSO4, 7H20 10,6 *H3BO3 6,2 Autres éléments Acide nicotinique 5 Thiamine (vit.B1) 5 Adénine 2 + agent de pression osmotique (milieu de prétraitement) ou substrats carbonés assimilables (milieu de culture) -13- - 12647465 Exemple 1 Des embryons somatiques de carotte, obtenus comme décrit ci-dessus, au stade torpille, d'une taille moyenne de 550.m=, sont placés dans des boîtes de Pétri, sur un milieu de prétraitement liquide de Murashige et Skoog contenant 135 g1-1 de saccharose et exempt d'auxines, à raison d'environ 100 embryons pour 10 mi de milieu. Ces embryons sont prétraités pendant 1 heure, à 20 C et sous un éclairement de 200 lux. Ils sont ensuite transférés dans des cryotubes contenant 1,8 ml de milieu de prétraitement. Les cryotubes sont placés dans un congélateur ménager, o leur contenu est refroidi à une vitesse de l'ordre de 1 C/min jusqu'à 6 C, puis à une vitesse de l'ordre de 0,4 C/min de -6 C à -20 C. Après 24 heures à -20 C, les cryotubes sont séparés en deux lots. Le premier lot est décongelé, en plongeant les cryotubes congelés dans un bain-marie à 40 C, pen- dant 2 minutes. Le second lot est plongé dans l'azote liquide à -196 C o il reste 1 heure, avant d'être dé- congelé de la même manière que le premier lot. Après totale décongélation, les embryons sont lavés du milieu de prétraitement et placés sur un milieu de cul- ture liquide de Murashige et Skoog contenant 5 gl-1 de saccharose et exempt d'auxines, pendant 10 jours. Ils sont ensuite transférés sur un milieu de culture solide, de même composition. Des embryons témoins, n'ayant subi ni prétraitement, ni congélation sont placés sur les mêmes milieux de cul- ture. - 14 - Après 10 jours de culture sur milieu solide, on compare la capacité des embryons à régénérer des plantules de carotte. Parmi les embryons témoins, 46% sont aptes à régénérer une plantule. Pour les embryons congelés à 20 C et à -196 C, les taux de régénération sont de 44% et 43%. La capacité des embryons à régénérer des plantules n'est donc pas altérée par la congélation s'ils ont préala- blement subi un prétraitement. Exemple 2 On sélectionne deux populations d'embryons somatiques de carotte Daucus carota L. Une population est constituée d'embryons au stade coeur de taille moyenne de 300 pm, l'autre population est constituée d'embryons au stade torpille de taille moyenne de 500 pim. On prélève 5 échantillons (A,B,C,D et témoin) contenant environ 100 embryons chacun sur chaque population d'em- bryons. Les échantillons Ac, Bc et Cc d'embryons au stade coeur, et les échantillons At, Bt et Ct d'embryons au stade torpille sont prétraités sur un milieu de Murashige et Skoog contenant 135 gl-1 de saccharose, pendant 1 heure, à 20 C et sous un éclairement de 200 lux. Les échantillons Ac, Bc, At et Bt sont ensuite refroidis à -20 C à une vitesse de l'ordre de 0,5 C/min. Ils sont maintenus à -20 C pendant 24 heures. Les échantillons Ac et At sont décongelés, alors que les échantillons Bc et Bt sont plongés dans l'azote liquide - 15 - à -1960C o ils restent pendant 1 heure avant d'être décongelés. Pour comparaison, les échantillons Cc et Ct sont direc- tement plongés dans l'azote liquide à -1960C après le prétraitement. Ils sont décongelés après 1 heure. Pour comparaison, les échantillons Dc et Dt sont refroi- dis à -20 C à une vitesse de l'ordre de 0,5 C/min, sans avoir subi de prétraitement. Ils sont décongelés après 24 heures. Les échantillons témoin coeur et torpille ne subissent aucun prétraitement et aucune congélation. Les différents échantillons d'embryons sont alors remis en culture sur un milieu liquide de Murashige et Skoog contenant 5 gl-1 de saccharose. Après 10 jours de culture, on obtient les résultats sui- vants: Taux de viabilité des embryons (%) Echantillon comparaison Stade A B C D Témoin Coeur 88 71 0 0 90 Torpille 84 67 0 0 91 On remarque qu'en l'absence de prétraitement, les em- bryons congelés à -20 C (D) ne survivent pas, alors qu'une imprégnation d'une heure dans le milieu de pré- traitement permet la survie de presque tous les embryons de stade coeur et torpille congelés à -200C (A). - 16 - Les embryons ne survivent pas non plus à une immersion directe dans l'azote liquide, même après un prétraite- ment d'une heure (C). Les embryons congelés à -196 C après prétraitement et congélation à -20 C (B), présentent un taux de viabilité très satisfaisant. Il est donc nécessaire, si l'on souhaite conserver les embryons à -196 C, de passer par les phases de prétrai- tement et de congélation à -20 C. Les embryons sont ensuite placés sur un milieu de cul- ture solide, de même composition que le milieu liquide. Après 10 jours de culture, la plupart des embryons des échantillons A et B, ainsi que les échantillons témoins, ont évolué en plantule présentant à la fois une pointe racinaire et un apex cotylédonnaire chlorophyllien bien différenciés. Ces embryons ne présentent aucune trace de callogénèse ou d'embryogénèse secondaire. Exemple 3 Des embryons somatiques de carotte, au stade coeur et au stade torpille sont prétraités sur un milieu liquide de Murashige et Skoog contenant 135 gl-1 de saccharose, à C et sous un éclairement de 200 lux, pendant une du- rée variable. Ces embryons sont ensuite refroidis à -20 C à une vites- se de l'ordre de 0,5 C/min. Après 24 heures à -20 C une partie est plongée dans l'azote liquide et y est main- tenue pendant 1 heure. Après décongélation, les embryons sont placés sur un mi- lieu de culture liquide de Murashige et Skoog contenant g1-1 de saccharose. - 17 - Des embryons témoins n'ayant subi ni prétraitement, ni congélation sont aussi cultivés. On relève, après 10 jours de culture, le taux de viabilité des embryons. On obtient les résultats suivants: Taux de viabilité des embryons au stade coeur (%) durée du prétraitement comparaison j30 min lh 24h 48h 72h Embryons congelés à -20 C 89 88 87 56 40 Embryons congelés à -1960C 73 72 68 42 32 Les embryons témoins ont un taux de viabilité de 90%. Taux de viabilité des embryons au stade torpille (%) durée du prétraitement comparaison min lh 24h 48h 72h I Embryons congelés à -20oC 85 84 82 56 34 Embryons congeles à -196 C 1 78 77 78 46 36 Les embryons témoins ont un taux de viabilité de 91%. On remarque que le taux de viabilité après 10 jours de culture est quasi identique pour une période de - 18 - prétraitement de 30 min, de lh ou-de 24h, aussi bien pour les embryons au stade coeur que pour les embryons au stade torpille. Par contre, au-delà de 24h, le taux de viabilité diminue progressivement en fonction de l'allongement de la durée du prétraitement. Ce taux n'est plus que d'environ 35% après 72h de prétraitement. On observe donc une diminu- tion de la résistance des embryons à la congélation lors des prétraitements prolongés. Exemple 4 Des embryons somatiques de carotte au stade torpille sont prétraités sur un milieu liquide de Murashige et Skoog contenant 135 g1-1 de saccharose, à 20 C et sous un éclairement de 200 lux pendant une durée variable. Ces embryons sont refroidis et congelés à -20 C à une vitesse de l'ordre de 0,50C/min. Après 72 heures à -20 C, les embryons sont décongelés et placés sur un milieu de culture liquide de Murashige et Skoog contenant 5 gl 1 de saccharose. Des embryons témoins n'ayant subi ni prétraitement, nicongélation sont aussi cultivés. On relève, après 10 jours de culture, le taux de viabi- lité des embryons. On obtient les résultats suivants: Durée du prétraitement 1 15 30 45 60 Témoin (minute) Taux de viabilité (%) 86 85 73 68 83 80 - 19 - On remarque que le taux de viabilité des embryons après congélation à 20 C est bon pour toutes ces durées du prétraitement. La tolérance à la congélation des embryons s'acquiert donc très rapidement. Exemple 5 Des embryons somatiques de carotte au stade torpille, de taille moyenne de 550jm sont prétraités et congelés à -20 C, une partie étant ensuite plongée dans l'azote li- quide, selon la méthode décrite dans l'exemple 1. Les embryons sont conservés à ces températures pendant un temps variable. Ils sont ensuite décongelés et placés sur un milieu de culture liquide de Murashige et Skoog contenant 5 g1 1 de saccharose. On détermine le taux de viabilité des embryons en fonction de leur durée de conservation à -20 C ou -196 C. Les embryons témoins n'ayant subi ni prétraitement, ni congélation ont un taux de viabilité de 72%. On obtient les résultats suivants: Pour les embryons congelés à -20 C: Durée de conservation 24h 1 mois 2 mois Taux de viabilité (%) 64 69 0 Pour les embryons congelés à -196 C: Durée de conservation lh 1 mois 2 mois Taux de viabilité (%) 66 67 67 - 20 - Le taux de viabilité moyen après congélation à -20WC ou à -196 C est d'environ 67% pour des durées de conserva- tion d'un jour ou moins. Ce taux reste inchangé après un mois de conservation à -20 C ou à -196 C. Après 2 mois de conservation, on n'observe plus aucune survie parmi les embryons conservés à -20 C, alors que le taux de viabilité est toujours le même pour les em- bryons conservés à -196 C. Exemple 6 Des embryons somatiques de carotte, au stade torpille, d'une taille moyenne de 500 pm, sont prétraités sous un éclairement de 200 lux, à 20 C et pendant 1 heure sur des milieux liquides de Murashige et Skoog ayant une concentration en saccharose variant de 35 gl 1 à 205 gl1. Les embryons sont ensuite refroidis et congelés à -200C. Après 1 heure à -20 C, les embryons sont décongelés et placés sur un milieu de culture liquide de Murashige et Skoog contenant 5 gl-1 de saccharose. Des embryons témoins, n'ayant subi ni prétraitement, ni congélation sont aussi cultivés. On détermine le taux de viabilité des embryons après 10 jours de culture, en fonction de la concentration en saccharose du milieu de prétraitement. - 21 - On obtient les résultats suivants: Saccharose 35 68 100 135 170 205 Témc (g1-1) Taux de viabilité (%) 22 41 77 82 65 14 88 Le taux de viabilité des embryons prétraités sur un mi- lieu contenant 135 g1-1 de saccharose est comparable à celui des embryons témoins. Ce taux est encore assez élevé pour une concentration en saccharose de 100 ou 170 g11. La viabilité des embryons est altérée lorsque la con- centration en saccharose devient trop élevée (205 gl-1) ou trop faible (35 gl-1). - 22 - Revendications 1. Procédé de conservation d'embryons végétaux, ca- ractérisé en ce que les embryons sont prétraités sur un milieu de prétraitement contenant un agent de pression osmotique, puis les embryons prétraités sont refroidis et congelés à une température comprise entre 15 et -40oC. 2. Procédé sel6n la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de pression osmotique est du saccharose. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le milieu de prétraitement contient le saccharose à une concentration de 75-190 g1-1. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les embryons congelés à -15/-40 C sont plongés dans un fluide frigorifique. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le prétraitement a une durée comprise entre 30 se- condes et 36 heures. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la vitesse de refroidissement entre -6 C et -40 C est comprise entre 0,1 et 1 C/min. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de prétraitement est un milieu de Mura- shige et Skoog auquel on ajoute un agent de pression osmotique. 8. Application du procédé selon l'une des revendications 1-7, pour la production de plantules, caractérisée en ce que les embryons congelés sont décongelés et lavés du milieu de prétraitement, et les embryons lavés sont - 23 - cultivés sur un milieu de culture, pour être développés en plantules. 9. Application du procédé selon l'une des revendications 1-7, pour l'obtention de semences artificielles, carac- térisée en ce que les embryons congelés sont enrobés dans des polymères artificiels ou naturels. 10. Semence artificielle obtenue selon la revendi- cation 9.