FR 2645174 A1 19901005 FR 8904305 A 19890331 -1 - La présente invention concerne un perfectionnement apporté à la préparation de protéines hétérologues par des levures recombinantes, telles que Saccharomyces cerevisiae et plus particulièrement à la préparation d'hirudine. Elle concerne en premier lieu une nouvelle souche de levure productrice de la protéine hétérologue transformée par un vecteur permettant l'expression de la protéine sous forme mature. Les levures sont des organismes eucaryotes unicellulaires; le genre de levure Saccharomyces comprend des souches dont la biochimie et la génétique sont étudiées intensivement en laboratoire; il comprend également des souches utilisées dans l'industrie alimentaire (pain, boissons alcoolisées...) et produites par conséquent en très grande quantité. La facilité avec laquelle on peut manipuler la génétique des cellules de Saccharomyces cerevisiae et la longue histoire industrielle de cette espèce en font donc un hôte de choix pour la production de protéines étrangères en utilisant les techniques de l'ADN recombinant. Lorsque l'on cherche à obtenir des protéines d'intérêt industriel, destinées à être produites en grande quantité, il est souhaitable, afin qu'elle conserve les propriétés désirées, que la protéine soit produite essentiellement sous forme mature, c'est-à-dire dépourvue de tout acide _-2 aminé ou séquence peptidique supplémentaire demeurée fusionnée & la protéine. Ceci est particulièrement souhaitable dans le cas de l'hirudine. En effet, l'hirudine dont la source principale se trouve dans les glandes salivaires des sangsues médicinales sous forme d'un mélange de peptides de 65 à 66 acides aminés, est un inhibiteur très spécifique et très efficace de la thrombine. Il s'agit donc d'un agent thérapeutique très intéressant dont l'utilisation en clinique exige une très grande pureté d'un produit actif. Un certain nombre de variants naturels de l'hirudine ont été identifiés et désignés par HVl, HV2, HV3. Leur structure est indiquée à la figure 1. Par la suite.ces variants naturels ainsi que d'autres analogues ont été préparés par génie génétique, en particulier par fermentation de souches de S. cerevisiae comme cela est décrit par exemple dans les publications européennes de brevet EP-A-0252854 EP-A-0273800 au nom de la Demanderesse. Comme cela a déjà été indiqué, la levure S. cerevisiae est donc particulièrement intéressante pour la production de protéines hétérologues, c'est-à-dire de protéines qui ne sont ni produites naturellement par la levure, ni nécessaires à sa croissance. En effet, cette levure est elle-même capable de sécréter quelques protéines dans le milieu de culture, correctement processées c'est-à-dire --3-- sous une forme mature. On trouve par exemple, dans le milieu de culture d'une souche de Saccharomvces cerevisiae de type sexuel alpha la phéromone sexuelle alpha. La phéromone sexuelle alpha de levure est un peptide de 13 amino acides. Kurjan et Herskowitz (1982, Cell. 30, 933-934) ont clone le gène structural du précurseur de la phéromone alpha (MFalphal) et on déduit de la séquence de ce gène que ce facteur alpha de 13 amino-acides était synthétisé sous forme d'une pré-pro-protéine précurseur de 165 aminoacides. Le précurseur contient une séquence signal hydrophobe aminoterminale de 19 résidus suivis d'une séquence "pro" de 64 acides aminés contenant 3 sites de glycosylation elle même suivie de la séquence LysArg précédant 4 copies du facteur alpha séparés par des peptides espaceurs. Il a été démontré que la séquence signal est effectivement clivée au niveau du réticulum endoplasmique par une peptidase spécifique. La séquence "pro" subit une N-glycosylation initiée dans le réticulum endoplasmique. La première étape de clivage protéolytique est effectuée par le produit du gène KEX2, c'est-à-dire l'endo-protéase yscF, au niveau des signaux spécifiques Lys-Arg ou Arg-Arg. Cette maturation a probablement lieu dans l'appareil de Golgi. Il a été clairement établi que des souches de S. cerevisiae ayant subi des mutations dans le gène KEX2 ne parvenaient plus à sécréter une forme active de la protéine - 4- killer (Leibowitz and Wickner (1976) PNAS USA 2061-2065) ou de la phéromone alpha (Julius et al. (1984) Cell 37, 10751089) du fait d'une maturation défectueuse de ces protéines. L'invention propose, à partir de ces travaux de nature fondamentale, d'amplifier un gène KEX2 fonctionnel dans une souche de levure productrice d'une protéine hétérologue afin d'obtenir une protéine mature. L'invention propose en particulier des moyens pour augmenter la quantité d'hirudine mature sécrétée par une souche de levure telle que Saccharomyces cerevisiae en favorisant le processus de maturation; L'invention a ainsi pour objet une souche de levure productrice d'une protéine hétérologue sous forme mature comprenant au moins le bloc d'expression suivant: - une séquence d'ADN (Str) comportant les signaux assurant la transcription par la levure de la séquence codant pour un précurseur de la protéine maturable - une séquence d'ADN (Spr) codant pour un peptide signal pre et/ou un peptide pro; - une séquence d'ADN (Scl) codant pour un peptide comprenant un site de clivage protéolytique par le produit de tout ou partie du gène KEX2, - une séquence d'ADN codant pour la protéine hétérologue, qui avec la séquence Spr forme le précurseur, -5caractérisé en ce qu'elle comporte une ou plusieurs copies de tout ou partie du gène KEX2 menant à une augmentation de l'activité protéolytique de l'endoprotéase yscF. Comme indiqué précédemment, l'invention s'applique tout particulièrement bien à la production d'hirudine, notamment du variant rHV2Lys47. Le gène KEX2 peut être obtenu, comme cela sera décrit ci-après, par clonage à partir d'une banque d'ADN totale de levure. La séquence du gène est indiquée à la figure 2. Elle n'a pas été reprise dans la description pour ne pas l'alourdir mais il doit être entendu que cette figure 2 fait intégralement partie de la description. Différents fragments de ce gène peuvent être utilisés selon l'invention: soit la totalité de la séquence indiquée à la figure 2 à partir de la base 381 qui correspond à la totalité de l'ADN génomique du gène KEX2; soit uniquement la séquence fonctionnelle de ce gène, c'est-à-dire celle comprise entre les bases numérotées 1349 et 5793 (délimitée par les codons ATG et TGA d'initiation et de terminaison de traduction) sur la figure 2; soit même une partie seulement de la séquence codante, par exemple la partie comprise entre les bases numérotées 1349 et 3488 sur la figure 2. L'amplification de l'expression du gène peut être réalisée de plusieurs façons. Dans une première variante, une ou plusieurs copies de tout ou partie du gène KEX2 sont -6- intégrées directement dans le gènome de la levure. Dans une seconde variante, une ou plusieurs copies de tout ou partie du gène KEX2 sont insérées dans le vecteur d'expression de la protéine hétérologue, en dehors du bloc d'expression proprement dit. Dans la suite de la description on s'intéressera plus particulièremet à la seconde variante. Le produit du gène KEX2 effectue les clivages protéolytiques de façon spécifique. C'est pourquoi les séquences Scl doivent être choisies parmi un nombre limité de séquences possibles. On choisira préférentiellement les peptides Lys-Arg ou Arg-Arg ou même Ser-Leu-Asp. Ces séquences Scl peuvent être ou non précédées d'une séquence "pro" c'est-à-dire qu'elles peuvent être on non associées à un système de sécrétion complexe. En effet, dès lors que le site de clivage protéolytique par le produit du gène KEX2 est présent on peut s'attendre à ce que la maturation de la protéine ait lieu, quel que soit le système de sécrétion utilisé: une séquence codant pour un peptide signal pré ou une telle séquence associée à une séquence pro (séquence pré-pro). Une construction particulièrement intéressante pour la production d'hirudine est celle qui associe la séquence pré-pro de la phéromone alpha de levure au site de clivage Lys-Arg ou éventuellement Arg-Arg. Enfin, il est également intéressant d'utiliser comme séquence Strun promoteur fort dans la levure, de façon à transcrire une quantité -7- importante d'ARNm correspondant au précurseur de la protéine maturable et à utiliser le gène KEX2 avec un maximum d'efficacité. Comme promoteur fort, on peut citer par exemple le promoteur de la phéromone alpha de levure ou encore le promoteur PGK de levure. Enfin, les vecteurs d'expression pourront présenter, après la séquence d'ADN codant pour la protéine mature, une séquence de terminateur de levure, par exemple celui du gène PGK. Les vecteurs d'expression seront en général des plasmides a replication autonome. Ces plasmides comporteront des éléments assurant leur replication, c'est-a-dire une origine de réplication telle que celle du plasmide 2g de levure. En outre, le plasmide pourra comporter des éléments de sélection tels que le gène URA3 ou LEU2 qui assurent la complémentation des mutants de levure ura3 ou leu2. En particulier on pourra avantageusement utiliser le gène URA3 délété de son promoteur. Ces plasmides peuvent également comporter des éléments assurant leur réplication dans E. coli, lorsque le plasmide doit être un plasmide navette, par exemple une origine de réplication telle que celle du pBR322, un gène marqueur tel que ApR et/ou d'autres éléments connus de l'homme du métier. -8- Parmi toutes les souches de levure envisageables on utilisera de préférence les souches du genre Saccharomvces notamment de l'espèce cerevisiae. Lorsque le promoteur est celui du gène MFalphal, la levure sera de préférence de type sexuel MATalpha. on utilisera, par exemple, une souche de génotype ura3 ou leu2 ou autre, complémentée par le plasmide pour assurer le maintien du plasmide dans la levure par une pression de sélection appropriée. Enfin, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'une protéine hétérologue mature, par des levures selon lequel on met en culture dans un milieu approprié les souches selon l'invention et on récupère la protéine mature sécrétée dans le milieu de culture. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de sécrétion de l'hirudine notamment le variant rHV2Lys47, sous forme mature à partir des souches de levures selon l'invention. Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Ces exemples seront illustrés par les figures suivantes: - la figure 1 représente la séquence des variants HVl, HV2, HV3 de l'hirudine. - la figure 2 représente la séquence de l'ADN génomique du gène KEX2 de la levure, -9-- - la figure 3 représente schématiquement le plasmide pTG2958. - la figure 4 représente schématiquement la structure des vecteurs M13TG3839 et M13TG3841. - la figure 5 représente schématiquement la carte de restriction des fragments du gène KEX2 utilisés. -10- EXEMPLE 1: Clonage du gène KEX2 Ce clonage est réalisé par complémentation phénotypique d'une souche mutée kex2-1. La mutation du gène KEX2 se manifeste dans une souche de levure MATalpha par la l'absence de sécrétion de phéromone alpha active et dans une souche de levure possédant l'ARN killer (K+) par l'absence de sécrétion de la toxine killer. La souche TGY38.1 est utilisée comme souche réceptrice pour le clonage du gène KEX2. Pour obtenir cette souche, les souches 80 (MATa, kex2-1, adel, ural, [KIL-k] K- R+) [Yeast Genetic Stock Center, Berkeley CA 94720] et TGYlsp4 (MATalpha, his3, ura3) sont tout d'abord croisées. Le diploïde obtenu TGY33 est mis à sporuler. Une spore TGY33.1 est ensuite caractérisée, son génotype est MATa, his3, ura3, kex2-1. Un croisement en retour est effectué avec TGYlsp4. Le diploïde obtenu TGY38 est mis à sporuler. Apres germination, un ségrégeant TGY38.1 (MATa, ura3, his3, kex2-1) ayant une meilleure efficacité de transformation est isolé. Un clone génomique, pTG2809 est obtenu à partir de la banque génomique de levure (fragments d'ADN chromosomique partiellement digéré par Sau3A insérés dans le site BamHI de pFL1 [Parent, S.A. et ai. Yeast 1 (1985)]. Ce clone (un (K+) parmi dix mille transformants URA+ de la souche TGY38.1) est isolé sur la base de sa capacité à supprimer le défaut fonctionnel dû à la mutation kex2-1: sécrétion d'une protéine killer active. _-11- En analysant la séquence d'ADN (figure 2) on confirme que la séquence codante de 2442 paires de base est contenu dans l'insert (délimitée par les codons d'initiation et de terminaison de traduction sur la figure 2). La séquence correspond à la séquence publiée du gène KEX2 [Mizuno K. et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 156 (1988)]. L'analyse de la séquence codante du gène KEX2 révèle une information correspondant a un polypeptide de 814 acides aminés. La protéine contiendrait une séquence signal putative d'environ 21 acides aminés. Une partie hydrophobe de 21 acides aminés localisée près de la partie C- terminale peut être mise en évidence (position 679-699). Le fragment EcoRI qui complémente la déficience due à la mutation kex2-1, code pour une forme tronquée en C-terminal du produit du gène KEX2 représentant la partie comprise entre les bases numérotees 1349 et 3488 (figure 2). EXEMPLE 2: Construction des plasmides pTG3848, pTG3855, pTG3887, pTG3890 et pTG3872 A. Construction de M13TG3841 Le plasmide pTG2958 (figure 3) est peu différent du plasmide pTG1833 décrit dans la publication européenne de brevet EP-A-252854 porteur de la séquence codante pour rHV2Asp47. Le plasmide pTG2958 ne contient pas le site de restriction HindIII artificiellement introduit. Le plasmide pTG2958 contient: --12- - un fragment de 547 paires de bases correspondant à la région 5' du gène MFalphal (contenant le promoteur, la séquence codant pour le peptide signal, la région "pro' et une séquence codant por le peptide Lys-Arg), un fragment de 234 paires de bases contenant l'ADN complémentaire de rHV2Lys47, - un fragment de 243 paires de bases comprenant le terminateur PGK de levure, - le fragment PvuII-EcoRI de pBR322 comprenant entre autres l'origine de réplication de ce plasmide et le gène de résistance à l'ampicilline (2292 paires de bases), - le fragment EcoRI-HindIII du plasmide 2g de la levure (forme B), contenant le gêne LEU2 de levure, sous forme délétée et inséré dans le site PstI, - un fragment HindIII-SmaI du gêne URA3 de levure. Le fragment NcoI-NcoI du vecteur pTG2958 qui porte les séquences LEU2-d, 2g et URA3 est remplacé par le fragment NcoI-NcoI de pTG2800 décrit dans la publication européenne de brevet EP-A-0268501 qui porte les séquences du plasmide 2g et du gène URA3 délété de son promoteur (URA3-d) pour donner pTG2877. Le vecteur M13TG3839 (figure 4) dérive de M13TGl03 [Kieny, M.P. et al. Gene 26 (1983)] dans lequel le fragment HindIII-HindIII de pTG2877 est introduit dans le même site. Un site de restriction SalI est introduit dans ce -13- vecteur en aval du codon de terminaison de traduction de la région codant pour rHV2Lys47 par mutagénèse dirigée à l'aide de l'oligonucléotide suivant: ' CAATGAAAAATGGTCGACTATCAATCATAG pour donner M13TG3839 SalI. Un site de restriction SphI est alors introduit en amont de la cassette d'expression en éliminant la séquence URA3-d par mutagénèse dirigée à l'aide de l'oligonucléotide suivant: ' GACGGCCAGTGAATTGGCATGCTATTGATAAGATTTAAAG pour donner M13TG3840. Le vecteur M13TG131 [Kieny M.P. et al. Gene 26 (1983)] est clivé par PstI, les extrémités rendues. franche par traitement à l'aide du fragment Klenow de l'ADN polymérase I pour être ensuite religué sur lui même pour donner M13TG3160. Ce vecteur est ensuite clivé par SmaI et EcoRV puis religué pour donner M13TG3149. Le fragment SphI-SalI de M13TG3840 (décrit ci-dessus) portant la cassette d'expression de rHV2Lys47 (sans séquence terminatrice de transcription) est introduit dans le site SphI-SalI de M13TG3149 pour donner M13TG3841 (figure 4). B. Construction du plasmide pTG3848 Le plasmide pTG848 décrit dans la publication européenne de brevet EP-A-0252854 est digéré par BglII puis religué pour donner pTG2886. Le grand fragment HindIII-EcoRI de pTG2886 est ligué en présence de ligase T4 au fragment HindIII-EcoRI de 2,1 kb du plasmide pFLl -14- [Parent, S.A. et al. Yeast 1 1985] qui porte la séquence du plasmide 2g de S. cerevisiae pour donner le plasmide pTG2886 LEU2-d, URA3-d. Le fragment HindIII de 0,9 kb du plasmidepTG2800 décrit dans la publication européenne de brevet EP-A-0258501 portant le gêne URA3-d est alors inséré dans le site HindIII de ce plasmide pour donner pTG2886 URA3-d, delta LEU2-d. Le fragment SmaI-BglII de M13TG131 [Kieny et al. Gene 26; 1983] qui possède plusieurs sites de restriction est ensuite introduit dans ce plasmide pour donner pTG3828. Le plasmide pTG3828 est digéré par les enzymes de restriction SphI-SalI puis le fragment SphI-SalI du vecteur M13TG3841 (figure 4) est inséré dans ce site pour donner le plasmide pTG3848. Ce plasmide comporte: - la séquence du gène URA3 délétée de son promoteur, - le promoteur du gène MFalphal, - la séquence pré-pro de MFalphal, - la séquence codant pour rHV2Lys47 - le terminateur de transcription du gène PGK de levure - un fragment de pBR322 qui permet la réplication et la sélection chez Escherichia coli, - un fragment du plasmide 2g qui possède les éléments structuraux nécessaires à la réplication et à l'équipartition mitotique dans la levure. C. Construction de pTG3855, pTG3887, pTG3890 et pTG3872 Ces plasmides dérivent de pTG3848 ouvert au site EcoRI. Un site artificiel BamHI est créé en aval du codon stop du gène KEX2 par mutagénèse dirigée à l'aide de l'oligonucléotide suivant: 5' TAAAAGGGGAGGATCCAATTAATGC 3' Le fragment XhoI-BamHI (coordonnées 538 à 4011, figure 2) de pTG2809 comprenant tous les éléments structuraux du gène KEX2 (figure 5[1]) dont les extrémités sont rendues franches par l'ADN polymérase de Klenow est inséré dans le site EcoRI de pTG3848 ayant subi le même traitement pour donner le plasmide pTG3855. Le fragment XhoI-EcoRI (coordonnées 538 à 3488, figure 2) de pTG2809 (figure 5[2]) dont les extrémités sont rendues franches par l'ADN polymérase de Klenow pour être inséré dans le site EcoRI de pTG3848 ayant subi le même traitement pour donner le plasmide pTG3887. Afin de déléter la partie du gène KEX2 comprise entre le site EcoRI et le TGA, une mutagénèse dirigée est réalisée en utilisant l'oligonucléotide de séquence: 5' AAGAGCGGAAACGTATGAATGATTCGATATGTACAGAAAG 3' Le fragment XhoI-BamHI artificiel (coordonnées 538 à 4011, figure 2) de pTG2809 ainsi transformé (figure 5[3]) dont les extrémités sont rendues franches par 1'ADN polymérase de Klenow est ensuite inséré dans le site EcoRI de pTG3848 ayant subi le même traitement pour donner le plasmide pTG3890. L'insert EcoRI-EcoRI de pTG2809 contenant le -16- fragment Sau3AEcoRI du gêne KEX2 (coordonnées 381 à 3488, figure 2)(figure 5[4]) est inséré dans le site EcoRI de pTG3848 pour donner le plasmide pTG3872. EXEMPLE 3: Production de rHV2Lys47 en fonction du plasmide utilisé Une souche de levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae de génotype MATalpha, ura3-251,373,328, leu2-3,112, his3, pep4-3 est transformée par les plasmides pTG3848, pTG3872, pTG3855, pTG3887 et pTG3890 par la méthode de l'acétate de lithium [Ito, H. et al. J. Bactériol. 153; 1983] et les prototrophes Ura+ sont sélectionnés. Ils sont ensuite mis en culture en erlenmeyer à 30 C sur un milieu sélectif (0,7% de bases azotées pour levures (Yeast Nitrogen Base), 0,5% de casamino acides et 1% de glucose). Apres 48 heures de culture, on sépare cellules et surnageant par centrifugation et l'activité inhibitrice de la thrombine est déterminée dans le surnageant en utilisant le test colorimétrique (activité protéolytique sur un substrat synthétique, le chromozyme TH - Boehringer Mannheim). Le tableau 1 présente les résultats des dosages; chaque valeur correspond à la moyenne de deux expériences indépendantes. L'activité de rHV2Lys47 est exprimée en ATU/A600 des cellules (1-2x107 cellules/ml correspondent à 1 unité A600 nm). -17 - Tableau 1 Plasmide KEX2 ATU/A600 pTG3848 - 8 pTG3872 [4] 23 pTG3855 [1] 34 pTG3887 [23 34 pTG3890 [3] 40 La présence du gène KEX2 sur les constructions selon l'invention permet une augmentation de la production de rHV2Lys47 sous forme active d'un facteur cinq. - 18- REVENDICATIONS 1. Souche de levure productrices d'une protéine hétérologue comprenant au moins le bloc d'expression suivant: - une séquence d'ADN (Str) comportant les signaux assurant la transcription par la levure de la séquence codant pour un précurseur de la protéine maturable, - une séquence d'ADN (Spr) codant pour un peptide signal pre et/ou un peptide pro, - une séquence d'ADN (Scl) codant pour un peptide comprenant un site de clivage protéolytique par le produit de tout ou partie du gène KEX2, - une séquence d'ADN codant pour la protéine hétérologue, qui avec la séquence Spr forme le précurseur, caractérisé en ce que la souche comporte une ou plusieurs copies de tout ou partie du gène KEX2 menant à une augmentation de l'activité protéolytique de l'endoprotéase yscF. 2. Souche selon la revendication 1 caractérisée en ce que ladite protéine-est l'hirudine. 3. Souche selon la revendication 2 caractérisée en ce que l'hirudine est le variant rHV2Lys47. 19 - 4. Souche selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la ou les copies de tout ou partie du gène KEX2 sont intégrées directement dans le génome de la levure. 5. Souche selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la ou les copies du gène KEX2 sont insérées dans le vecteur d'expression de la protéine hétérologue, en dehors du bloc d'expression proprement dit. 6. Souche selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que elle comporte la partie du gène KEX2 dont la séquence est représentée à la figure 2. 7. Souche selon la revendication 6 caractérisée en ce que elle comporte la séquence fonctionnelle du gène KEX2, comprise entre les bases numérotées 1349 et 3793 sur la figure 2. 8. Souche selon la revendication 7 caractérisée en ce que elle comporte la séquence fonctionnelle du gène KEX2 comprise entre les bases numérotées 1349 et 3488 sur la figure 2. 9. Souche selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Saccharomyces cerevisiae. 10. Souche selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le vecteur d'expression de la protéine hétérologue est un plasmide à réplication autonome. -20 - 11. Souche selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que la séquence Scl est une séquence codant pour un peptide Lys-Arg ou Arg-Arg. 12. Souche selon l'une des revendication 1 à 11 caractérisée en ce que la séquence Str est un promoteur fort dans la levure. 13. Souche selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'il s'agit du promoteur de la phéromone alpha de levure. 14. Souche selon l'une des revendications 2 à 13 caractérisée en ce que la séquence Spr est la séquence pré-pro du gène MFalphal de levure. 15. Souche selon la revendication 14 caractérisée en ce que la séquence Spr est suivie d'une séquence codant pour un peptide Lys-Arg ou Arg-Arg. 16. Procédé de préparation d'hirudine mature par des levures caractérisé en ce qu'on met en culture, dans un milieu approprié, une souche de levure selon l'une des revendications 2 à 15 et on récupère l'hirudine mature obtenue. 17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que l'hirudine est le- variant rHV2Lys47.