FR 2646082 A1 19901026 FR 8905195 A 19890419 La présente invention concerne l'obtention d'un médica- ment utile pour la prophylaxie et le traitement thérapeutique du SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise) et de syndromes associés [ARC (AIDS related complex)]. Par prophylaxie nous sous-entendons le traitement de sujets qui ont été exposés aux virus HIVs (human immunodeficiency virus), en particulier les séropositifs asymptoma- tiques, qui présentent le risque de développer la maladie dans les mois et les années à venir après la primoinfection. Selon l'invention, ce médicament contient un ou plusieurs produits de la classe des tétracyclines et répondant à la formule générale: R4 R1 R2 R5 N(CH3)2 OH (I) OH O OH 0 dans laquelle: - R1 et R2 représentent des atomes d'hydrogène ou des radicaux hydroxy ou méthyle ou forment ensemble un radical méthylène, - R3 représente un radical carbamoyle éventuellement substitué par un reste pyrrolidinyl-1 méthyle ou (amino-5 carboxy-5 pentylamino) méthyle, - R4 représente un atome d'hydrogène ou un radical diméthylamino et - R5 représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy, à l'état libre ou le cas échéant sous forme de sel. On a trouvé que les produits de formule générale (I) inhibent l'effet cytopathogène du virus HIV en cultures cellulaires à des concentrations dépourvues d'effet cytostatique. Cet effet est sélectif à l'égard des cellules infectées. Il a également été trouvé que les cellules ainsi proté- gées de l'effet cytopathogène, arrêtent la production du virus après environ 2 mois de culture. La présente invention concerne l'obtention d'une compo- sition pharmaceutique capable de maintenir en vie les cellules infectées par le virus HIV et d'arrêter la production virale à long terme et donc de réduire la progression vers le SIDA ou de diminuer sa gravité chez les sujets déjà infectés. Ladite composition est administrable par voie parenté- rale, rectale, intralymphatique ou orale. Dans le cas de l'adminis- tration par voie orale la dose journalière chez l'homme sera comprise entre 0,1 et 4 g. Ces doses sont bien tolérées et donnent lieu à des pics de concentrations sériques qui sont au moins dix fois supérieures aux concentrations minimales actives anti-HIV. Un autre avantage de ces produits est lié à leur longue demi-vie dans le sérum. Leur temps de demivie est en effet de plusieurs heures, le plus souvent proche de 18 heures. Dans ce qui suit on décrit les résultats de ces produits sur l'effet cytopathogène du virus HIV dans une lignée cellulaire permissive (cellules lymphoblastoïdes humaines CEM) ainsi que dans les lymphocytes humains des cellules sanguines périphériques. ACTIVITE DE TETRACYCLINES VIS-A-VIS DE L'EFFET CYTOPATHOGENE DU VIRUS HIV EN CULTURES CELLULAIRES Le test est réalisé sur la lignée lymphoblastoïde CEM clone 13. Dans une microplaque de 96 puits on dépose 25 il/puits d'une solution de produit à tester ou de tampon phosphate isoto- nique (TPI) dans le cas des contrôles. Les produits sont étudiés à différentes concentrations (souvent 8), à raison de 4 puits par concentration. On ajoute alors 125 V1 d'une suspension de cellules CEM dans le milieu RPMI contenant 10 % de sérum de veau foetal, 40 U/ml de pénicilline, 40 Ig/ml de streptomycine et 5 lg/ml de polybrène (3500 cellules par puits) et les microplaques sont incu- bées une heure à 370C, sous une atmosphère contenant 5 % de gaz carbonique. Pour chaque concentration, l'essai est partagé en 2 parties: une partie sur cellules infectées, pour la détermination de l'activité antivirale et l'autre partie sur cellules non infec- tées, pour déterminer la cytotoxicité des produits. On infecte alors la première série avec HIV (100 il par puit d'une suspension de virus LAV-1BRU contenant 200-300 TCID50) tandis que l'autre série reçoit 100 pl de milieu RPMI tel que défini précédemment. Au bout de 7 jours d'incubation, 175 l de surnageant sont prélevés et rejetés. La viabilité cellulaire est déterminée selon une modifi- cation de la technique décrite par R. Pauwels et coll., J. Virol. Meth., 20, 309-321 (1988). Les puits, contenant encore les cellules (infectées ou non infectées), reçoivent 10 gl d'une solution de MTT (méthylthia- zoletétrazolium) à 5 mg/ml dans du tampon phosphate isotonique. Pendant une période d'incubation de 4 heures, le MTT est converti en un sel de formazan (bleu) à l'intérieur des cellules vivantes et proportionnellement à leur nombre, alors que rien n'apparaît dans les puits ne contenant plus que des cellules mortes. On ajoute alors 120 l1 d'isopropanol (contenant 0,04 mole/l d'acide chlor- hydrique) et les microplaques sont agitées jusqu'à la solubilisa- tion du bleu de formazan. L'absorption à 540 nm est lue avec un lecteur automatique de réactions ELISA en microplaques. Pour les essais de plus longue durée, on procède comme décrit précédemment jusqu'au jour 7. A ce moment, 100 pl de cellu- les sont prélevés pour mesurer la proportion de cellules vivantes et le restant est remis en culture avec du milieu frais contenant les produits aux mêmes concentrations. Cette opération est répétée tous les 4 jours. Les résultats obtenus au jour 7 sont donnés dans le tableau I ci-après. Les essais sont poursuivis jusqu'aux jours 9, 14 et 18. Le tableau II montre les résultats obtenus aux jours 14 et 18: l'activité protectrice de l'effet cytopathogène est maintenue. TABLEAU I Conoentration Cellules Cellules non infectées infectées Exemple R1 R2 R3 R4 R5 ig/ml Densité Densité optique optique 1 -CH3 -OH -CONH2 -H -H 0 0,360 1,000 (tétracycline) 0,03 0,350 1,025 0,08 0,350 1,080 0,25 0,340 1,050 0,74 0,420 1,100 2,22 0,510 1,040 6,67 0,620 0,900 0,400 0,460 0,1 0,1 2 -H -CH3 -CONH2 -H -OH O 0,820 1,550 (doxycycline) 0,01 0,820 1,530 0,04 0,785 1,34 0,12 0,720 1,53 0,37 1,000 1,60 1,11 1,240 1,50 3.33 1,370 1,50 0,660 0,740 0,200 0,2 3 =CH2 -CONH2 -H -OH O 0,590 1,350 (métacycline) 0,01 0,570 1,100 0,04 0,640 1,380 0,12 0,680 1,300 0,37 0,730 1,230 1,11 0,780 1,180 3,33 1,060 1,320 0,770 0,960 0,1 0,1 4 -CH3 -OH -CoNHCHE2NH(C2)4 -H -H O 0,8 1,65 (lymecycline) 1 0,01 0,75 1, 75 -0-C00H- H 0,04 1,25 1,80 0,12 1,21 -1,90 0,37 1,20 - 1,75 1,11 1,28 1,80 3,33 1,40 1,85 1,55 1,85 1,05 1,05 -H --H -COHNH2 -N(CH3)2 -H O 0,750 1,550 (minocycline) 0,01 0,660 1,590 0,04 0,720 1,650 0,12 0,890 1,750 0,37 1,210 1,670 1,11 1,510 1,760 3,3 1,340 1,650 0,450 0,480 0,320 0,420 Les résultats des produits des exemples 2 et 5, obtenus au jour 7, sont illustrés par la figure 1. TABLEAU II JOUR 14 I JO 18 Concentration du Cellules Cellules Cellules Cellules produit étudié infectées non infectées Iinfectées non infectées ug/ml Oens1té I Densité Densité Deet Pg/mi eni Densit6 optique optique optique | optique t i i _ _ I _ _ _ Doxycycline 0 0.250 i 1,o000 0,200 1,050 0,01 0,250 0,980 0,240 j 1,100 prouit de 0.04 0,300 0,950 0.275 1,050 l'exemole 2 0,12 0,450 1, 020 0,250! 1,020 0,37 0,550 1,00o 0,300 1,000 1,11 0,880 0,960! 0,700 j 1. 020 3.33 0,750 i 0,950 ( 0.750 0,950 _ 10 0t0 100 0,10 0,100 0 o,100 Minocycline O 0,250 1,050 0.200 1.100 0,01 0.300 1,100 0,250 1,050 produit de 0,04 0,450 1,250 0,250 1,050 l'exemple 5 0,12 0,620 1,200 0, 450 1,100 0,37 1,250 1,250 1,000 1,150 1,11 1,250 1,200 0,950 1,100 3,33 0,400 0,350: 0,350 0,400oo 0,100 0,100 0,100 0,100 Dans une autre expérience, des cellules CEM protégées de l'effet cytopathogène du virus HIV, par 1,2 ig/ml de minocycline (produit de l'exemple 5) ou de doxycycline (produit de l'exemple 2), sont cultivées à partir du jour 18 après l'infection, dans des flacons de culture de 25 cm3. Chaque échantillon est divisé en 2 parties, l'une recevant à nouveau le produit étudié et l'autre cultivée en l'absence de produit. Les cellules sont cultivées pendant 2 mois. Les 2 séries de culture restent protégées vis-à-vis de l'effet cytopathogène du virus (mêmeen l'absence de produit). En conclusion, l'effet cytoprotecteur apporté par les produits de formule générale (I) entre le jour 7 et le jour 18, est maintenu indéfiniment. Il ressort de ces essais que les tétracyclines de formule générale (I) exercent un effet protecteur contre l'effet cytopathogène du virus HIV à des concentrations dépourvues de toute toxicité sur cellules saines (non infectées). Cette cytoprotection est persistante après suppression des produits. Il est très important de rappeler que ces concentrations actives sont facilement atteintes dans le plasma de patients après administration de ces médicaments à des posologies approuvées par la pharmacopée et donc non toxiques. DETERMINATION DE LA REVERSE TRANSCRIPTASE Les cellules infectées traitées ou non de manière conti- nue par la minocycline ou la doxycycline ont été examinées en ce qui concerne la production de virus. La technique utilisée pour la détermination virale a été celle du dosage de la reverse trans- criptase du virus HIV. L'activité de la reverse transcriptase est mesurée direc- tement sur 50 il de surnageant de culture. 10 1l de tampon conte- nant 0,5 M de KC1, 5 mM de dithiotreitol '(DTT) et 0,5 % de Triton X-100 sont ajoutés à tous les micropuits contenant les 50 pl de surnageant à tester. 40 4l de tampon contenant 1,25 mM d'éthylène glycol-bis(Baminoéthyl éther) (EGTA), 0,125 N de Tris.HCl pH 7,8, 12,5 mN de MgCl2, 3 pCi de (3H) Thymidine triphosphate (TTP), 0,05 D0260 d'acide polyadénylique - acide thymidylique (poly rA-oligo dT) sont ajoutés ensuite. La microplaque est couverte au moyen d'un film plastique et incubée 60 minutes à 37 C. On arrête la réaction en ajoutant 20 il d'une solution glacée de 120 mM de Na4P207 dans 60 % d'acide trichloracétique et les échantillons sont placés 15 minutes sur un lit de glace. Les précipités sont filtrés sur fibres de verre en uti- lisant un laveur de cellules (Skatron) et les filtres sont lavés avec une solution de 12 mM de Na4P207 dans 5 % d'acide trichlora- cétique. Les filtres sont séchés et la radioactivité est comptée après ajout d'un liquide scintillant. Les essais sont faits en triple. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau III ci-après. La figure 2 illustre ces résultats. Entre 20 et 50 jours après l'infection, une quantité importante [20 000 à 37 000 coups par minute (cpm)] de reverse transcriptase est décelée dans les surnageants. A partir du jour 53, la production de reverse transcriptase diminue pour arriver à des valeurs négligeables quelques jours après. En conclusion, les cellules protégées, entre les jours O et 18 par les produits selon l'invention, cessent leur production de virus HIV à partir du jour 56. TABLEAU III Activité de la Jour après reverse transcriptase coups/mn x 10-3 infection Minocycline 27 20 21 39 (présente du jour 37 42 0 au jour 18) 19 46 21 49 t{ 17 53 3 56 -2 60 - f I 3 80 Doxycycline 21 20 39 (présente du jour i 31 42 0 au jour 18) 21 46 24 49 14 53 2 56 3 60 tÀ 2 80 - -t Minocycline 25 20 33 39 (présente du jour 33 42 0 à la fin de 29 46 l'expérience) 37 49 14 53 2 56 2 60 80 Doxycycline 25 20 26 39 (présente du jour 31 42 0 à la fin de 27 46 l'expérience) 18 49 ! 10 53 _ _ _ _ _ _ _ _ _i1,4 60 !__ _ _ _2 80 Les tétracyclines selon l'invention entraînent à long terme un arrêt de la production de virus par les cellules. INHIBITON DE L'EFFET CYTOPATHOGENE DU VIRUS HIV EN CULTURE DE LYMPHOCYTES HUMAINS Préparation de la suspension cellulaire La source des leucocytes humains est un stock congelé en N2 liquide (100 x 106 cellules/ampoule) de leucocytes obtenus sur cytaphérèse d'individus (donneurs) sains. Au moment de l'essai, les cellules sont décongelées, mises en suspension dans 80 % de sérum de veau foetal (SVF) et 20 % de diméthylsulfoxyde et centrifugées à 1000 rpm (10 minutes). Le culot est mis en suspension dans un mi- lieu RPMI [contenant 10 % Lymphocult (Interleukine 2 en provenance de Biotest Diagnostic), 10 % de SVF, pénicilline et streptomycine, respectivement 40 U/ml et 40 pg/ml], à raison de 1 x 106 cellu- les/ml. Habituellement, on utilise un flacon de culture cellulaire contenant 40 à 60 ml de cette suspension cellulaire. Les cellules sont incubées 4 jours en présence de phytohémagglutinine PHA (0,1 % DIFCO), à 37 C sous une atmosphère contenant 95 % d'air et 5 % de gaz carbonique. Les cellules sont alors centrifugées, lavées une fois dans du milieu frais (ci-dessus) et remises en suspension dans le même milieu à 1 x 106 cellules/ml [(RPMI 10 % de SVF, 10 % de Lymphocult-antibiotiques ci-dessus) mais contenant 10 U/ml d'anti- corps anti-interferon (IFN ca) 5 pg/ml de prolybrène. Réalisation du test il de cette suspension cellulaire (200.000 cellules) sont déposés dans des puits d'une microplaque de cultures (à 96 puits). A chaque puits, on ajoute 25 pl du produit à tester [dilué fois dans du tampon phosphate isotonique (PBS)] ou 25)1 du solvant PBS pour le contrôle. L'essai est fait en 2 séries: sur cellules infectées (pour déterminer l'activité antivirale) et sur cellules non infectées pour déterminer l'activité antiproliférative (cytotoxicité). On infecte alors avec 25 pl du virus HIV (souche LAV-BRU), alors que l'autre série reçoit (par puits) 25 41 du milieu (ci-dessus). Les cultures sont incubées 7 jours à 370C (95 % d'air, 5 % de C02). 200 lI de surnageant sont alors prélevés, reje- tés ou utilisés pour la détermination de l'activité transcriptase inverse. Les cellules du fond (sous 50 4l) sont alors soit testées pour leur viabilité (test MTT), soit additionnées de 200 4l de milieu frais (cidessus). Dans ce dernier cas, l'incubation est prolongée pendant encore 7 jours (test au jour 14). L'opération peut être répétée une semaine après (test au jour 21). Les résultats obtenus 21 jours après infection sont indiqués dans le tableau IV et illustrés par la figure 3. TABLEAU IV Concentration du Cellules Cellules produit à tester infectées non infectées pg/ml Densité optique Densité optique ! 0 0,355 0,702 Minocycline 0,04 0,530 0,836 0,12 0,435 0,775 0,37 0,640 0,850 1,11 0,835 0,980 3,33 0,750 0,900 0,540 0,833 _ 10 Doxycycline 0,04 0,530 0,775 0,12 0,590 0,765 0,37 0,550 0,853 1,11 0,773 0,835 3,33 non déterminée 0,670 I 10 0,125 0,103 2646082- t1 Les dérivés de tétracycline de formule générale (I> peu- vent exister à l'état de sels pharmaceutiquement acceptables. Parmi ces sels peuvent notamment être cités les sels d'addition avec les acides organiques ou minéraux tels que notam- ment les chlorhydrates, bromhydrates, iodhydrates, sulfates, nitra- tes, phosphates, ou organiques tels que acétates, propionates, succinates, maléates, fumarates, citrates, tartrates, gluconates, adamantoates, méthanesulfonates, p.toluènesulfonates, iséthionates ou pénicillinates ou des dérivés de substitution de ces composés, ainsi que les sels avec les métaux alcalins tels que les sels de sodium, de potassium, de lithium, ou avec les métaux alcalino-ter- reux tel que les sels de calcium ou de magnésium, ou tout autre sel pharmaceutiquement acceptable connu pour être utile dans le domaine des tétracyclines. I1 est entendu que les tétracyclines de formule générale (I) peuvent aussi exister à l'état d'hydrates et que ces hydrates entrent également dans le cadre de la présente invention. La présente invention concerne donc l'obtention d'un médicament contenant au moins un produit de formule générale (I) sous forme libre ou sous forme de sel, ce (ou ces) produit(s) pou- vant être à l'état pur ou sous forme d'une composition pharmaceu- tique en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables. Les compositions stériles pour administration parentérale peuvent être de préférence des solutions aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer l'eau, le propylèneglycol, un polyéthylèneglycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, des esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle ou d'autres solvants organiques convenables. Ces compositions peuvent éga- lement contenir des adjuvants, en particulier des agents mouil- lants, isotonisants, émulsifiants, dispersants et stabilisants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple par filtration aseptisante, en incorporant à la composition des agents stérilisants, par irradiation ou par chauffage. Elles peuvent également être préparées sous forme de compositions solides stéri- les qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans un milieu stérile injectable. Les compositions pour administration rectale sont les suppositoires ou les capsules rectales, qui contiennent outre le principe actif des excipients tels que le beurre de cacao, des glycérides semi-synthétiques ou des polyéthylèneglycols. Les compositions administrables par voie intralymphatique sont préparées comme les compositions stériles pour administration parentérale. A titre d'exemple, par dissolution d'une quantité convenable d'une tétracycline de formule générale (I) dans un solvant stérile pour injection, tel qu'une solution aqueuse isoto- nique de chlorure de sodium ou de mannitol. Comme compositions solides pour administration orale peuvent être utilisés des comprimés, des pilules, des poudres ou des granulés. Dans ces compositions, le produit actif selon l'inven- tion (éventuellement associé à un autre produit pharmaceutiquement compatible) est mélangé à un ou plusieurs diluants ou adjuvants inertes, tels que saccharose, lactose ou amidon. Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les di- luants, par exemple un lubrifiant tel que le stéarate de magnésium. Comme compositions liquides pour administration orale,-on peut utiliser des émulsions pharmaceutiquement acceptables, des solutions, des suspensions, des sirops et des élixirs contenant des diluants inertes tels que l'eau ou l'huile de paraffine. Ces compo- sitions peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édulcorants ou aromatisants. Les exemples suivants illustrent des compositions conte- nant des produits de formule générale (I). EXEMPLE A On prépare des flacons de poudre stérile destinée à une administration par voie intra-veineuse et des ampoules de solvant, en effectuant la répartition suivante: - Flacon de poudre stérile: Minocycline sous forme de chlorhydrate... 100 mg - Ampoule de solvant: Eau pour préparation injectable.......... 5 cm3 EXEMPLE B On prépare des flacons de poudre stérile destinée à une administration par voie intra-musculaire et des ampoules de sol- vant, en effectuant la répartition suivante: - Flacon de Doudre stérile: Minocycline sous forme de chlorhydrate... 100 mg - Ampoule de solvant: Chlorhydrate de lidocaïne................ 40 mg Gluconate de magnésium.... ............. 15 mg Hydroxyde de sodium............... q.s.p. 6,5 On prépare des gélules destinées à une administration par voie orale ayant la composition suivante: Ninocycline sous forme de chlorhydrate... 100 mg - Excipient: Amidon de maïs Stéarate de magnésium Silice colloïdale REVENDICATIONS 1 - Application d'un produit appartenant à la classe des tétracyclines et répondant à la formule générale: R4 R R2R5 (CH3)2 OH R3 dans laquelle: - R1 et R2 représentent des atomes d'hydrogène ou des radicaux hydroxy ou méthyle ou forment ensemble un radical méthylène, - R3 représente un radical carbamoyle éventuellement substitué par un reste pyrrolidinyl-1 méthyle ou (amino-5 carboxy-5 pentylamino) méthyle, - R4 représente un atome d'hydrogène ou un radical diméthylamino et - R5 représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy, à l'état libre ou le cas échéant sous forme de sel ou d'hydrate pour obtenir un médicament destiné au traitement ou à la prévention du SIDA ou de syndromes analogues. 2 - Procédé de préparation d'une composition pharmaceu- tique destinée au traitement ou à la prévention du SIDA ou de syndromes analogues, caractérisé en ce que l'on mélange au moins un produit de la classe des tétracyclines tel que défini dans la revendication 1, avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compa- tibles et pharmaceutiquement acceptables.