FR 2640643 A1 19900622 FR 8816664 A 19881216 BIOCAPTEUR A ENZYME DESTINE A LA MESURE DIRECTE D'AU MOINS UN PARAMETRE BIOCHIMIQUE DE LA PEAU, PROCEDE DE PREPARATION DE LA MEMBRANE ENZYMATIQUE ASSOCIEE ET PROCEDE DE MESURE CORRESPONDANT. La présente invention porte sur un biocapteur à en- zyme destiné à la mesure directe des paramètres biochimiques de la peau, ainsi que sur le procédé de mesure correspondant et le procédé de préparation de la membrane enzymatique néces- saire. On connait un grand nombre de techniques permettant de mesurer in vivo, de façon non invasive, des paramètres phy- siques de la peau. Si beaucoup de données sont disponibles sur ces paramètres physiques, peu le sont en revanche sur les si- gnaux biologiques directement accessibles sur le stratum cor- neum, et les méthodes de dosage permettant l'acquisition di- recte de tels signaux sont pratiquement inexistantes à l'heure actuelle. Ces facteurs biochimiques présentent cependant un in- térêt de diagnostic. Ainsi, par exemple, le métabolisme énergé- tique de la peau comporte un cycle anaérobie prépondérant avec formation d'acide lactique à partir d'acide pyruvique; cet acide lactique se retrouve dans les couches suprabasales de l'épiderme, ainsi qu'au niveau du stratum corneum. L'un des r8les décrits pour le lactate exogène est celui d'agent natu- rel d'hydratation de la peau en raison de ses propriétés hy- groscopiques (Van Scott et al, J. Am. Acad. Dermatol. 1984, 11. 869; et Takahashi et al, J. Soc. Cosmet. Chem. 1985, 36, 177). On sait, par ailleurs, qu'une augmentation du taux de lactate est un signe d'hyperprolifération cellulaire dans les couches profondes. L'intérêt d'un dispositif réalisant, dans les meil- leures conditions, une mesure du lactate sur la peau serait donc, notamment, de pouvoir juger de l'importance de ce méta- bolite sur l'hydratation de la peau et de son possible r8le diagnostic ou curatif. Les meilleures conditions, dont il est question ci-dessus, sont celles d'une mesure directe, sans étape de prélèvement et sans apport de réactif sur la peau. De plus, il peut s'avérer intéressant de pouvoir réaliser des mesures répétées sur un même site, par exemple, à une minute d'intervalle, afin d'observer des phénomènes d'épuisement ou de diffusion facilitée du lactate cutané. En réalité, il serait utile, d'une manière générale, de disposer de moyens de mesure directe sur le revêtement cu- tané de toutes les molécules d'intérêt dermatologique ou cos- métique, comme, par exemple, l'urée, le cholestérol ou les acides aminés. Les études à mener peuvent aussi, également de façon générale, concerner. la rémanence, l'absorption et le relargage d'un des composés en cause. Or, si l'on reprend l'exemple du lactate, les métho- des de détermination habituelles de cette substance, en dehors du fait qu'elles imposent une étape de prélèvement, sont sensi- bles mais relativement lentes (Barker et ai, J. Biol. Chem. 1941, 138, 535). Les mêmes désavantages peuvent être attribués à la méthode enzymatique utilisant la lactate deshydrogénase, ci-après dénommée LDH, (E.C. 1.1.1.27), qui est basée sur la détection à 340 nm du coenzyme, le nicotinamide - adénine - dinucléotide réduit; de plus, des interférences liées à la présence d'effecteurs de la LDH dans l'échantillon ou à la tur- bidité de cet échantillon peuvent nuire à la sensibilité de la mesure (Gutman et al, dans H.U. Bergmeyer (Ed.), Methods of En- zymatic Analysis, Verlag Chemie, Weinham, 2ème édition 1974, 264). Par ailleurs, les capteurs électrochimiques, associés à un film, dans lequel est immobilisée une enzyme, sont déjà largement utilisés pour doser des composés se trouvant dans les milieux biologiques. Ainsi, il existe, à l'heure actuelle, un nombre important d'électrodes enzymatiques spécifiques du L- lactate, trouvantune application dans le domaine des industries agro-alimentaires, ainsi que dans celui des analyses médicales. Des électrodes à enzyme utilisant l'un des quatre systèmes enzymatiques envisageables pour de telles applications ont été décrites: - la LDH [Durliatt et al, Anal. Chem. 1980, 52, 2109]; - le cytochrome b2 (E.C. 1. 1.2.3) [Shinbo et ai, Anal. Chem. 1979, 51, 100]; -la lactate 2-mono-oxygénase (E.C.1.13.12.4) de Mycobacterium smegmatis qui catalyse la réaction suivante: L-lactate + 02->acétate + C02 + H20 associée à une électrode de Clark [Mascini et al, Anal. Chem. Acta 1984, 157, 45]; - la lactate oxydase (E.C.1.1.3.2) de Pediococcus sp., avec la- quelle on obtient les meilleurs résultats du point de vue de la stabilité, de la sensibilité et de la fiabilité et qui ca- talyse la réaction suivante: L-lactate + 02- -pyruvate + H202 associée à une détection de la pression partielle en oxygène [Mizutani et al, Anal. Chem. 1983, 55, 35] ou à une détection de H202 [Mullen et al, Clin. Chem. Acta 1986, 157, 191]. Pour atteindre l'objectif indiqué ci-dessus, qui est celui de pouvoir déterminer, par des mesures directes, les pa- ramètres biochimiques de la peau, il était intéressant d'uti- liser la méthode connue suivant laquelle l'échantillon à doser est amené au contact d'une membrane, dans laquelle est immobi- lisée (comme décrit par Romette, Thèse de doctorat, Université de Compiègne, 1986) une enzyme, qui catalysera la transforma- tion de la substance à doser avec, dans le cas notamment du L- lactate, consommation d'oxygène et production d'H202, des moyens étant prévus pour détecter un phénomène provoqué par la consommation d'oxygène ou la production d'H202, par exemple des moyens de détection ampérométriques de la diminution de la pression partielle d'oxygène, un exemple en étant l'électrode de Clark, décrite plus en détail ci-après, la membrane enzyma- tique étant appliquée à l'extrémité sensible de l'élec- trode. En effet, la sensibilité de tels biocapteurs est le plus souvent importante. Toutefois, l'application directe de l'électrode sur la surface cutanée s'est révélée impossible, par suite de difficultés venant de la compression du film d'é- lectrolyte, de la résistance mécanique de la membrane et de la mise en solution du substrat. La Société déposante a pallié ces inconvénients en associant à un biocapteur à enzyme du type précité, une cellu- le de mise en solution du substrat à doser, dans laquelle on peut faire circuler un milieu liquide approprié, tel qu'un tam- pon, cette cellule comportant une ouverture qui-, en position de mesure, est obturée par une zone de revêtement cutané, la- quelle constitue le site de mesure. Il découle également de la mise en place de cette cellule à circulation de fluide, fermée par une zone de peau au moment de la mesure, que l'injection du tampon de mesure peut être rendue automatique, et surtout que l'on peut effec- tuer plusieurs cycles de mesure sur un même site, ce qui répond à l'un des objectifs importants indiqués ci-dessus. La présente invention a donc d'abord pour objet un biocapteur à enzyme destiné à la mesure directe d'au moins un paramètre biochimique de la peau ledit biocapteur comprenant, d'une part, une membrane, dans laquelle est immobilisée une en- zyme destinée à catalyser la transformation d'un substrat in- tervenant dans le métabolisme cutané, et, d'autre part, des moyens pour détecter et mesurer un phénomène provoqué par la- dite transformation, qui est représentatif de la concentration du substrat à doser, celui-ci étant amené au contact de la mem- brane enzymatique, caractérisé par le fait qu'il comprend une cellule de mesure comportant une ouverture, cellule dont une zone de paroi est constituée par ladite membrane enzymatique et dont l'ouverture susmentionnée est apte à être obturée, lors de la mesure, par une zone de revêtement cutané, ladite cellule étant associée à des moyens pour y faire circuler un liquide de mise en solution du substrat à doser. Dans un tel système de mesure directe, le résultat obtenu est le reflet, d'une part, de la concentration du subs- trat cutané, que l'on veut doser, et d'autre part, des con- traintes diffusionnelles, que la peau peut opposer à la diffu- sion de ce substrat vers la cellule de mesure, ces contrain- tes diffusionnelles pouvant être reliées au type de peau. Dans un mode de réalisation préféré, suivant lequel la transformation du substrat à doser est une réaction qui con- somme de l'oxygène et/ou produit de l'H202, les moyens de détection et de mesure sont constitués par une électrode mesurant la dimi- nution de la pression partielle d'oxygène ou l'augmentation de la concentration en H202, la membrane enzymatique étant appli- quée contre la partie sensible d'extrémité de ladite électrode, le liquide de mise en solution étant un tampon susceptible de fournir de l'oxygène; la cellule de mesure est avantageuse- ment constituée par une bague, à une extrémité de laquelle est montée, de manière étanche, la partie sensible d'extrémité de ladite électrode, l'autre extrémité de ladite bague constituant l'ouverture de la cellule. Dans le biocapteur de l'invention, la membrane enzy- matique peut être avantageusement constituée d'un film-support de matériau hydrophobe à perméabilité sélective vis-à-vis des gaz et d'un film porteur de l'enzyme formé par réticulation d'au moins une protéine inerte par un agent pontant, comme le glu- taraldéhyde; le film-support de la membrane enzymatique est disposé du côté de l'électrode et le film porteur de l'enzyme est disposé en vis-à-vis de l'ouverture de la cellule de mesure. On peut mentionner, en particulier, un biocapteur se- lon l'invention destiné au dosage du L-lactate cutané, l'enzyme étant la L-lactate oxydase, notamment la L-lactate oxydase de Pediococcus sp., et l'électrode étant une électrode mesurant la diminution de la pression partielle d'oxygène (électrode dite de Clark); le film porteur de l'enzyme contient de 0,15 à 0,50 UI de L-lactate oxydase par cm2 de membrane. L'épaisseur du film porteur est, de préférence, comprise entre 30 et 50 pm; la protéine inerte est, par exemple, la gélatine. Dans le cas particulier indiqué, le matériau hydro- phobe constitutif du film-support est, de préférence, le poly- propylène ou le polytétrafluoréthylène. L'épaisseur du film- support est avantageusement comprise entre 6 et 15 um. Pour la préparation d'une membrane enzymatique des- tinée à un biocapteur selon l'invention prévu pour le dosage du L-lactate, on procède de la manière suivante: a) on prépare une solution aqueuse renfermant, par ml, de 4 à 20 UI de L-lactate oxydase et de 30 à 70 mg de gélatine; b) on étale ladite solution sur un film-support à raison de à 50 pl/cm2 et on fait sécher ce revêtement; c) sur le revêtement sec obtenu, on verse une solutionaqueuse de glutaraldéhyde ayant une concentration comprise entre 0,5 et 2 % en poids et on laisse réticuler pendant un temps compris entre 1,5 et 4 minutes. La présente invention a également pour objet un pro- cédé pour la mesure directe d'au moins un paramètre biochimique de la peau à l'aide d'un biocapteur tel que défini ci-dessus, caractérisé par le fait qu'on applique ledit biocapteur sur une zone choisie du revêtement cutané, de façon que l'ouverture de la cellule de mesure soit fermée par ladite zone de revêtement cutané; on injecte dans ladite cellule un liquide apte à solu- biliser le substrat cutané que l'on veut doser et dont la composition favo- rise la catalyse; après remplissage de la cellule de mesure, on effectue la détection et la mesure du phénomène provoque par la transformation du substrat due à la catalyse de l'enzyme de la membrane; puis on fait circuler le liquide de solubilisation du substrat. On peut avantageusement répéter le cycle de mesure précité sur le même site, auquel cas on n'expose pas la membra- ne enzymatique à l'air entre deux cycles successifs. Dans le cas o le biocapteur est destiné à mesurer le lactate cutané en mettant en oeuvre la lactate-oxydase, on peut avantageusement prévoir que l'on utilise, comme liquide de mise en solution du lactate cutané, un tampon ayant un pH compris entre 6 et 8; que l'on enregistre la variation de pression partielle d'oxygène pO2 en fonction du temps pendant la période de non-circulation du tampon dans la cellule; qu'on définit sur l'enregistrement le point A ayant pour abs- cisse le début d'injection du tampon et pour ordonnée la va- leur maximum de pO2; qu'on définit la droite D liant A au minimum B de la courbe enregistrée et qu'on mesure sa pente P pour l'utiliser comme valeur représentative du taux de lactate cutané. Dans ce type de mesure, la circulation du tampon est, de préférence, arrêtée pendant un temps compris entre 3 et 6 minutes. Pour mieux faire comprendre l'objet de l'invention, on va décrire plus en détail ci-après, à titre purement illus- tratif et non limitatif, la réalisation d'un biocapteur à usa- ge cutané pour le dosage du L-lactate, en se référant au des- sin annexé. Sur ce dessin: - les figures 1, 1A et 2 concernent l'électrode uti- lisée; - les figures 3 à 13 représentent différentes cour- bes obtenues lors des mesures effectuées, entre autres, pour optimiser ladite électrode. La figure 1 représente une électrode de Clark 1 de type connu, qui convient, comme élément de base, pour la réa- lisation d'un biocapteur de L-lactate selon l'invention, en vue de la mesure du L-lactate cutané. L'électrode 1 comprend un corps 3 logé dans une enveloppe 4. L'extrémité libre de l'électrode (1) est recouverte par un film hydrophobe 5, qui ne laisse passer que l'oxygène et qui est, par exemple, un film de polypropy- lène ou de polytétrafluoréthylène; cette extrémité de l'élec- trode est protégée par un embout 2 qui permet néanmoins les mesures. La fixation du film 5 est montrée plus en detail sur la figure la, laquelle représente, à échelle agrandie, la par- tie d'extrémité correspondante de l'électrode 1, sans l'embout 2. L'enveloppe 4 de l'électrode 1 comporte, au voisinage de son extrémité, une rainure annulaire 6 destinée à recevoir un joint torique 7, avec interposition du film 5. Au voisinage de son extrémité opposée au film 5, le corps 3 de l'électrode 1 com- porte un épaulement annulaire 3a en appui sur une portée cor- respondante 4a de l'enveloppe 4, avec interposition d'un joint 9; entre ledit joint 9, l'enveloppe 4 et le corps 3 de l'é- lectrode 1, on a ménagé un espace rempli d'électrolyte 10, l'électrolyte 10 étant interposé entre l'électrode 1 et le film 5. L'enveloppe 4 comporte, par ailleurs, une ouverture latérale 11, en vue de réaliser la purge de l'électrolyte, et l'equilibre de la pression de l'électrolyte, l'ouverture 11 étanm normalement obturée de manière étanche par une bague 12. Sur la figure 2, est représentée, de façon schéma- tique, l'extrémité de l'électrode de Clark correspondant aux figures 1 et la, telle qu'on l'a modifiée pour réaliser un biocapteur selon l'invention. Sur ladite extrémité, on a adap- té, conformément à la présente invention, une cellule de mesu- re 13 à circulation, constituée par un anneau sans fond 14. L'extrémité de l'électrode 1 est disposée, de manière étanche grâce à la présence d'un joint 14a, à une extrémité dudit an- neau 14, dont l'autre extrémité est destinée à être mise en appui sur la surface cutanée 15 lors de la mesure. La cellule 13 est destinée à être traversée par un flux de tampon de me- sure amené par la tubulure d'entrée 16 et évacué par la tubu- lure de sortie 17. Ce circuit de fluide comporte des moyens (non représentés) assurant l'injection du tampon de mesure par la tubulure 16, tels qu'une pompe. Pour réaliser un biocapteur selon l'invention, on fa- brique d'abord une membrane enzymatique appropriée puis on en équipe une électrode de Clark telle que ci-dessus décrite. On va donner ci-après un exemple précis pour ces deux étapes. 1) Réalisation de la membrane enzymatique On prépare une solution à 5 % (poids/volume) de gé- latine d'osséine Chaulée 250 blooms (Rousselot, France), dans un tampon phosphate 0,02 M, pH 6,8 (cette solution est conser- vée au maximum pendant une semaine à 4 C avant son utilisation). On solubilise, dans son flacon de 100 UI (référence: Sigma, n L-0638), la L-lactate oxydase de Pediococcus Sp. lyophilisée, par 500 r1 de tampon phosphate 0,1 M, pH 7,1 et on la conserve à 4 C avant son utilisation. On prépare extemporanément une solution de glutaral- déhyde à 1,25 % (poids/volume) dans un tampon phosphate 0,02 M, pH 6,8 à partir de glutaraldéhyde (Sigma n G-5882) en solution aqueuse à 25 % en poids, de qualité 1. On chauffe la solution de gélatine ainsi préparée à 45 C pendant 5 minutes. On la refroidit ensuite à 30 C. On prélève alors 1 ml de cette solution et on homogénéise le mé- lange avec 50 pl de la solution enzymatique (10 UI). On verse le mélange homogénéisé sur un film-support de polypropylène (Bolloré), d'une épaisseur de 6 Mm, fixé sur une plaque de verre parfaitement plane. La solution est étalée sur une sur- face d'exactement 35 cm2, délimitée par un ruban adhésif. L'ap- plication d'un flux d'air, à température ambiante, pendant 40 minutes, permet de sécher la membrane. On réalise alors la réticulation de cette membrane par la solution de glutaraldéhyde en appliquant 10 ml de celle- ci sur la membrane pendant exactement 3 minutes. Un rinçage avec 3 litres d'eau distillée est alors effectué par écoulement continu sur la membrane pour stopper la réticulation et éliminer l'excès de l'agent pontant.- On peut alors découper 12 membranes aptes à être ap- pliquées sur l'électrode de Clark utilisée, et les conserver à 4 C, dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,1 jusqu'à leur ajus- tement à l'extrémité de l'électrode et à leur utilisation. 2) Préparation et mise en oeuvre de l'électrode à enzyme On utilise une électrode de Clark (Radiometer, Copen- hague, Danemark, modèle E 5046) telle que représentée sur la figure 1. On recouvre la zone sensible à l'oxygène de cette électrode avec une membrane enzymatique 8, telle que préparée à l'étape précédente, le film- support 5 de polypropylène, qui est sélectif aux gaz, étant du côté de l'électrode. Pour la mesure, l'électrode ainsi obtenue est asso- ciée à une cellule de mesure thermostatée (Radiometer D616), afin de constituer le biocapteur tel que représenté sur la fi- gure 2 précédemment décrite. La réaction enzymatique, ayant lieu selon l'inven- tion à l'extrémité de l'électrode de Clark est la suivante: L-lactate + 02.)> pyruvate + H202. Pour l'étalonnage du biocapteur et son étude, on ali- mente la cellule 13 par un flux continu d'une solution aqueuse de lactate de concentration connue. La donnée étaionnable, pour ces mesures en flux continu, est la pente Smax au point d'inflexion de la courbe du signal de pO02 (pression partielle d'oxygène) enregistré par l'électrode. La figure 3 représente une courbe type obtenue au cours d'un cycle de mesure en flux continu: en abscisse, on a porté le temps en secondes et en ordonnée, la pression partielle d'oxygène (p02) exprimée en pourcentage par rapport à la pression p02 initiale du tam- pon. Dans ce cycle de mesure, au temps (1), du L-lactate est introduit dans la cellule avec du tampon phosphate 0,1 M, pH 7. Au temps (2), la cellule est rincée avec du tampon. Au temps (3), de l'air est introduit dans la cellule, pour assu- rer à nouveau la saturation d'oxygène à 100% de la membrane utilisée. Le traitement mathématique du signal est connu (Kernevez et al., Biotech. Bioeng. 1983, 25, 845). Le traite- ment automatique du signal, le circuit fluidique et l'acquisition des courbes d'étalonnage sont contrôlés par un micro-ordinateur, de façon connue. Le cycle de mesure en flux continu du biocapteur pré- paré comme indiqué ci-dessus comprend séquentiellement les trois phases correspondant aux temps (1) à (3) indiqués ci-des- sus en référence avec la figure 3, étant entendu qu'il commence par l'étape d'exposition à l'air de la membrane. L'étape d'ex- position à l'air est effectuée afin d'augmenter la concentra- tion en oxygène à l'intérieur de la membrane active, laquelle devient alors vingt fois plus importante que dans l'eau pour la même pression partielle d'oxygène (Belgith, H. Thèse de Docto- rat, Université de Compiègne, 1985). il1 Comme on va le voir ci-après, pour des mesures ré- pétitives directes sur une même localisation cutanée, l'étape d'exposition à l'air de la membrane est supprimée pour des raisons pratiques. L'utilisation effective du biocapteur-selon l'inven- tion est, dans cet exemple, réalisée comme suit. Le biocap- teur, dont la cellule de mesure a un volume de 100 pl pour une surface d'application de 0,6 cm2, est appliqué sur la peau. On injecte du tampon phosphate 0,1 M, pH 7,1 à température ambian- te (21 C), dans la cellule de mesure, grace à une pompe péri- staltique (Gilson Minipuls 3) assurant un débit de remplissage de l'ordre de 1,2 ml/min, constant et parfaitement reproducti- ble. Une fois la cellule remplie, la pompe est stoppée; on. enregistre en fonction du temps la valeur pO02 (voir courbe de la figure 12). Initialement pO02 a la valeur correspondant à l'air (pO02 air). Au temps O on introduit le tampon (point Ao de la courbe): la valeur de pO02 décroit pour se stabiliser à la valeur de la pression partielle d'oxygène dans le tampon (PO2 tampon). Puis on arrête la pompe de circulation du tampon au temps t1: p02 augmente ce qui traduit l'équilibrage de la température du tampon avec la température cutanée; mais depuis le temps 0, la membrane enzymatique a commencé son action qui tend à diminuer la valeur pO02 donnée par l'électrode, cette ac- tion étant masquée par les phénomènes ci-dessus définis. La valeur pO02 passe donc par un maximum A1 résultant des deux ac- tions antagonistes simultanées, ce maximum étant atteint pour un temps t2. Après quoi, p02 décroît en raison de l'action en- zymatique; cependant, cette décroissance est freinée par une fourniture d'oxygène du tampon; à chaque instant, on a donc un équilibre; mais la concentration en lactate dans la cellule de mesure augmente par diffusion du lactate au cours du temps à partir du revêtement cutané et la courbe obtenue traduit donc une succession d'états stationnaires. Au bout d'un temps suffi- sant, par exemple environ 4 minutes, on fait recirculer le tam- * pon: pO2 décroît rapidement pendant un court instant, ce qui traduit l'hétérogénéité du milieu dans la cellule de mesure puis, après un minimum B, réaugmente pour revenir approxima- tivement à la valeur de la pO2 du tampon de mesure. On a constaté que la donnée la plus représentative du taux de lactate cutané est la pente P de la droite D qui passe par les deux points A et B du graphique de la figure 12: point A: abscisse = temps O ordonnée = valeur du maximum A1 au temps t2 10. point B : minimum B atteint par la courbe après recirculation du tampon. La valeur P peut être utilisée pour exprimer le taux de lactate diffusant en nmoles/mn/cm2 à condition de se rappor- ter à un étalonnage effectué en mode stationnaire, c'est-à-dire à la valeur plateau de la pO2 obtenue lorsque l'oxygène consommé par la réaction enzy- matique est exactement compensé par l'oxygène fourni par le milieu de mesure. Comme indiqué précédemment, étant donné que chaque mesure est suivie d'une phase de circulation du tampon, on peut effectuer plusieurs cycles de mesure successifs sur un même site. La figure 13 donne, à titre indicatif, les valeurs obtenues (pentes P) pour des mesures effectuées sur l'avant- bras de neuf individus de sexe féminin. Ces valeurs sont des va- leurs cumulées résultant de quatre mesures par individu (2 me- sures successives pour une même localisation sur chaque avant- - bras). On va donner ci-après un certain nombre d'indications qui ont conduit à la mise au point du biocapteur optimisé, qui vient d'être décrit, et à son utilisation optimale. I. OPTIMISATION DU BIOCAPTEUR 1) Optimisation des étapes d'immobilisation de l'enzyme: La bonne stabilité, mécanique et biochimique, de la membrane enzymatique active est la condition essentielle rendant possible une utilisation analytique du biocapteur. Cette stabilité dépend de certains facteurs physiques, chimiques ou biochimiques: a) La concentration en enzyme dans la membrane active: La figure 4 du dessin annexé représente diffé- rentes courbes d'étalonnage (1) à (5), qui ont été établies avec des membranes contenant différentes concentrations de L- lactate oxydase et dans les conditions communes suivantes: Tampon phosphate: 0,1 M, pH 7,1; Temps de réticulation à l'aide d'une solution de glutaral- déhyde à 1,25 % (poids/volume): 3 minutes; Concentration de la solution de gélatine: 5 % (poids/volu- me); Température: 21 C; Légende de la figure 4: 15. Abscisse: concentration de L-lactate en mM; Ordonnée: pente Smax définie sur la courbe de la figure 3; Quantité de L-lactate oxydase (exprimée en UI pour 35 cm2 de film de gélatine) pour les courbes (1) à (5): respecti- vement 1; 4; 10; 20 et 30. Les résultats montrent que des concentrations en en- zyme élevées (> 4 UI/35 cm2) peuvent être utilisées pour mesurer des concentrations en lactate relativement basses (zone de linéarité de la réponse située entre 1 x 10 5 et 1 x 10 M). Quand la concentration en] actate varie entre 1 et 3 PE, des membranes contenant 4 UT doivent être utilisées. Par ailleurs, avec un excès d'enzyme (>4 UI), la ré;onse de l'électrode devient indépendante de la quantité d'enzyme. Ceci est lié à deux facteurs: _ la saturation de la membrane protéique en sites - actifs; et - l'augmentation de la masse protéique enzymatique et donc de l'épaisseur de la membrane (une augmentation de l'activité enzymatique dans la membrane ne pouvant être obtenue à masse protéique enzymatique constante). Le facteur limitant de la réponse de l'électrode devient alors le coefficient de diffusion du substrat. De telles conditicns expérimentales (saturation en enzyme, peuvent être utilisées de façon avantageuse, permettant d'obtenir des électrodes à réponse plus stable, une petiteperte d'activité enzymatique ou un relargage partiel de l'enzyme n'ayant que peu d'effet sur le signal. Compte tenu de ces résultats, dans les études suivantes, il a été choisi, pour chaque paramètre étudié, une concentration en enzyme de 10 UI pour 35 cm. b) Le temps de réticulation avec le glutaraldéhyde: Cette étape de la préparation de la membrane enzymatique est très importante, car le glutaraldéhyde, qui peut bloquer certains groupements amines libres d'amino-acides impliqués dans le site actif, est appliqué sur le film protéique pendant un laps de temps fixé. La figure 5 du dessin annexé représente différentes courbes de réponse (1) à (5) du biocapteur à L-lactate oxydase pour différents temps de réticulation à l'aide d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 1,25 % (poids/volume) (100 % de la réponse pour un temps de réticulation de 3 minutes), dans les conditions communes suivantes: Tampon phosphate: 0,1M, pH 7,1; Concentration de la solution de gélatine: 5 % (en poids/volume); 5. Température: 21 C. Légende de la figure 5: Abscisse: concentration de L-lactate (en mM); Ordonnée: pourcentage de la réponse par rapport à celle obtenue pour un temps de réticulation de 3 minutes; Temps de réticulation pour les courbes (1) à (5) respectivement 1,5; 3; 5; 7,5; et 10 mn. Cette figure montre que les réponses les plus impor- tantes du biocapteur ont été obtenues pour des temps de réticulation de 1, 5 à 3 minutes. Des temps de réticulation plus importants impliquent une dénaturation plus poussée de l'enzyme et une cohésion plus importante de la membrane, limitant le taux de diffusion du lactate. Ces deux facteurs conduisent à une décroissance du signal, qui est proportion- nelle au temps de réticulation pour des temps de contact supérieurs à 3 minutes. La mise en évidence de meilleures propriétés mécaniques pour un temps de réticulation de 3 minutes par rapport à 1,5 minute a conduit àchoisir celui-ci pour la réalisation des membranes dans l'exemple de réalisation précédemment décrit. c) La concentration en gélatine: On a testé des membranes contenant la même quantité d'enzyme (1C UI pour 35 cm2) avec des quantités variables de gélatine (szluticns de 3 à 7 % pour la fabri- cation des membranes selon le processus indiqué dans l'exemple précédemment décrit). La figure 6 représente des courbes d'étalonnage dans le cas d'utilisation de solutions de gélatine à différents pourcentages [ courbes (1) à (5)], dans les conditions communes suivantes: Tampon phosphate: 0,1 M, pH 7,1; Temps de réticulation à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde à 1,25 % (poids/volume): 3 minutes Température: 21 C. Légende de la figure 6: Abscisse: concentration de L-lactate en mM; Ordonnée: pente Smax (définie sur la figure 3) Pourcentage de gélatine dans les solutions de gélatines utilisées pour les courbes (1) à (5), respectivement 3; 4; 5; 6 et 7. Différents facteurs doivent être considérés: - premièrement, la densité finale en protéine enzyma- tique décroît avec l'augmentation du pourcentage de gélatine; donc, théoriquement le film protéique doit être plus actif dans des membranes les plus fines; - deuxièmement, l'épaisseur de la membrane augmente quand la concentration en gélatine augmente, le coefficient de diffusion du lactate et, par conse- quent, la réponse de l'électrode sont modifies; - troisièmement, l'effet protecteur contre les propriétés inactivatrices du glutaraldéhyde (temps de réticula- tion égal à 3 minutes) augmente parallèlement au pourcentage de gélatine, l'activité catalytique est donc mieux préservée dans des films plus épais. Un compromis entre ces différents facteurs doit donc être trouvé. La figure 6 montre que la meilleure réponse de l'électrode est obtenue, pour des concentra- tions en substrat supérieures à 0,2 mM, avec des mem- branes à 5 % en gélatine. Les recommandations générales pour la réalisa- tion d'électrodes à enzyme selon l'invention sont d'utiliser une enzyme d'activité spécifique aussi élevée que possible pour assurer des cinétiques rapides dans une membrane aussi fine que réalisable pour assurer les meilleurs taux de diffusion du substrat. Cependant, les étapes d'optimisation doivent être effectuées pour chaque nouveau système et des résultats comme la résistance mécanique de la membrane peuvent jouer un r6le dans le choix final des conditions optimales. 2) Optimisation des conditions de la mesure A l'aide des membranes réalisées dans les condi- tions optimales déterminées ci-dessus (10 UI pour 35 cm2 temps de réticulation: 3 minutes; pourcentage de gélatine: 5 %; et concentration de substrat de 0,5 mM), on a étudié: a) L'effet de la molarité du tampon phosphate: La figure 7 représente les courbes (1) à (3) donnant la réponse du biocapteur selon l'invention en fonction de la concentration du tampon phosphate (pH 7,1) pour trois membranes différentes utilisant des quantités variables d'enzyme dans les conditions communes suivantes: Temps de réticulation à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde à 1,25 % (poids/volume): 3 minutes; Concentration de la solution de gélatine: 5 % (poids/volume); Température: 21 C; Concentration en L-lactate: 0,5 mM. Légende de la figure 7: Abscisse: concentration du tampon phosphate (en mM); Ordonnée: pente Smax (définie sur la figure 3); Quantité d'enzyme (UI pour 35 cm2) pour les courbes (1) à (3): respectivement 1; 4; et 10. Il est ainsi montré que la molarité du tampon aux concentrations étudiées n'a que très peu d'effet sur la réponse de l'électrode. Par ailleurs, quand on-augmente la force ionique d'un tampon phosphate 0, 1 M, pH 7,1 en ajoutant des quantités croissantes de NaCl (0,1 à 2,0M), la réponse de l'électrode ne varie pas (courbe non présentée). La durée de l'étape de rinçage de la membrane doit cepen- dant être augmentée et ceci probablement en liaison avec une augmentation de la viscosité de la solution. Il convient de noter que des variations de la force ionique ou du pH du tampon peuvent avoir lieu, par exemple, lors d'une mesure directe sur un milieu de concentration saline aussi variable que celle du stratus corneum. Les résultats ci-dessus montrent que de telles variations n'ont que très peu d'influence sur la réponse de l'électrode. b) L'effet u pHi du tampon de mesure sur la réponse de l'électrode. La figure 8 représernte la réponse du biocapteur (valeur de la pente Smax définie sur la figure 3) en fonction du pH, chaque point représentant la moyenne de quatre déterminations, dans les conditions communes suivantes: Membrane à 10 UI pour 35 cm2; Tampon phosphate: 0,1M; Temps de réticulation à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde à 1,25 % (poids/volume): 3 minutes; Concentration de la solution de gélatine: 5 % (poids/volume); Température: 21 C; Concentration en L-lactate: 0,5 mM. Il est ainsi montré que, quand le pH varie entre 6,5 et 8, on ne note pas de changement important dans la réponse de l'électrode. La réponse est maximum pour un pH de 7,1 dans les conditions du test. c) L'effet de la température du milieu de mesure: La figure 9 représente la réponse du biocapteur (valeur de la pente Smax définie sur la figure 3) en fonction de la température, chaque point noir repré- sentant la moyenne de quatre déterminations, dans les conditions communes suivantes: Membrane à 10 UI pour 35 cm2; Tampon phosphate 0,1M, pH 7,1; Temps de réticulation à l'aide d'une solution de glutaraldéhyde à 1,25 % (poids/volume): 3 minutes; Concentration de la solution de gélatine: 5 % (poids/volume); Concentration en L-lactate: 0,5mM. Le témoin (point cerclé) constitue une vérifi- cation de la stabilité de l'enzyme, dans les conditions précitées, au bout d'un cycle de test de température a:llant jusqu'à 50 C, et avec un retour à 25 C. Une augmentation de température poussée jusqu'à 50 C (temps de maintien à cette température: environ 15 minutes) n'a pas causé de modification notable de la réponse de l'électrode ramenée à 25 C. Comme le montre la figure 9, augmenter la température de 200C à 40 C pour une concentration en lactate de 0,5 rM améliore la réponse de l'électrode. Cependant, pour des températures supérieures à 35 C, le pourcentage de variation de la mesure devient très important (supérieur à 10 % à 40 C), ceci étant proba- blement lié au processus de dégazage de l'électrolyte. 1 Toutes les expériences en flux continu ont donc été menées à 21 C. Ceci met en évidence l'importante stabilité thermique et mécanique de la membrane enzymatique du biocapteur selon l'invention. !I. UTILISATICX DU BIGCAPTEUR 1) Stabilit a) Stabilité en conditions de stockage: La figure 1C illustre la réponse en zone de linéarité, du biocapteur, à différents moments après la préparation de la membrane. Légende de la figure 10 Abscisse: concentration du L-lactate en mM; Ordonnée: pente Smax définie sur la figure 3; Courbes (1) à (4): respectivement 1; 9; 35 et jours après la préparation de la membrane. Les membranes enzymatiques sont stockées à 40C dans le tampon de mesure sans azide de sodium; aucune variation de la réponse de l'électrode n'est notée le premier mois. Jusqu'à 3 mois de stockage, la limite de détection et la zone de linéarité de la réponse sont conservées et des mesures peuvent toujours être effectuées de façon précise grâce à une courbe d'étalonnage appropriée. b) Stabilité en opération continue: La figure 11 illustre la réponse, en zone de linéarité du biocapteur après un fonctionnement de jours. Légende de la figure 11: Abscisse: concentration de L-lactate en mM; Ordonnée: pente Smax définie sur la figure 3; (1): courbe d'étalonnage de référence 10. (2): au bout de 15 jours. La stabilité de la réponse du biocapteur a été testée en cycle continu avec des concentrations standard de L-lactate de 2d. Huit cent cycles de mesure (environ 1 minute chacun) ont pu être effectués sans modification notable de la réponse (2 séries d'expé- riences). Dans le système à flux continu, la stabilité opérationnelle exceptionnelle peut en partie être attribuée au fait que le temps de contact avec le L-lactate est réduit à 10 secondes par cycle. Les oxydases présentent souvent des cinétiques d'auto- inactivation, par perte de cofacteur (FAD), par l'H202 ou par les espèces actives de l'oxygène produites pendant la réaction enzymatique. L'autoinactivation est d'autant plus sévère que la concentration des deux substrats est augmentée. Il est donc intéressant, pour obtenir des durées de stabilité maxima, de limiter autant que possible le temps de contact avec la solu- tion de L-lactate. c) Stabilité en opérations discontinues: La stabilité du biocapteur a été testée pour des périodes alternées de stockage (4 C dans le tampon phosphate) et de mesures (mesures cutanées et en flux continu à 21 C). Même quand la sensibilité décroît de façon notable (après 15 jours. et plus de 500 mesures), la li- mite de détection et la linéarité sont conservées et les mesu- res peuvent toujours être effectuées de façon précise. Ces résultats font du biocapteur selon l'invention un système dont les variations de sensibilité peuvent être contrôlées par de simples étalonnages quotidiens, assurant ainsi la fiabilité des résultats obtenus. 2) Précision des mesures: La variabilité des mesures effectuées en flux continu sous le contrôle d'un micro-ordinateur est inférieure à 4 % (reproductibilité parfaite des conditions pouvant in- fluer sur la mesure; pression d'injection de l'échantillon constante; cycle parfaitement reproductible). 3) Spécificité: On a comparé les résultats obtenus avec le bio- capteur selon l'invention et ceux obtenus à partir de prélè- vements soumis à une détermination du lactate par chromato- graphie en phase liquide. On a obtenu un coefficient de cor- rélation de 0,999 ce qui démontre le parfait fonctionnement du biocapteur selon l'invention et sa spécificité pour la me- sure du L-lactate sans interférence des autres composés pré- sents sur le revêtement cutanée REVENDICATIONS 1 - Biocapteur à enzyme destiné à la mesure directe d'au moins un paramètre biochimique de la peau, ledit biocap- teur comprenant, d'une part, une membrane dans-laquelle est immobilisée une enzyme destinée à catalyser la transformation d'un substrat intervenant dans le métabolisme cutané, et, d'autre part, des moyens pour détecter et mesurer un phéno- mène provoqué par ladite transformation, qui est représenta- tif de la concentration du substrat à doser, celui-ci étant amené au contact de la membrane enzymatique (8), caractérisé par le fait qu'il comprend une cellule de mesure (13) compor- tant une ouverture, cellule dont une zone de paroi est consti- tuée par ladite membrane enzymatique (8) et dont l'ouverture susmentionnée est apte à être obturée, lors de la mesure, par une zone de revêtement cutané (15), ladite cellule (13) étant associée à des moyens pour y faire circuler un liquide de mise en solution du substrat à doser. 2 - Biocapteur selon la revendication 1, dans lequel la transformation du substrat à doser est une réaction qui consomme de l'oxygène et/ou produit de 1'H202, caractérisé par le fait que les moyens de détection et de mesure sont constitués par une électrode (1) mesurant la diminution de la pression par- tielle d'oxygène ou l'augmentation de la concentration en H202, la membrane enzymatique (8) étant appliquée contre la partie sensible d'extrémité de ladite électrode (1), le liquide de mi- se en solution étant un tampon susceptible de fournir de l'oxy- gene. 3 - Biocapteur selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la cellule de mesure (13) est constituée par une bague (14), à une extrémité de laquelle est montée, de ma- nière étanche, la partie sensible d'extrémité de ladite élec- trode (1), l'autre extrémité de ladite bague constituant l'ou- verture de la cellule. 4 - Biocapteur selon la revendication 2, destiné au dosage du L-lactate cutané, caractérisé par le fait que l'en- zyme est la L-lactate oxydase, notamment la L-lactate oxydase de Pediococcus sp., et que l'électrode (1) est une électrode mesurant la diminution de la pression partielle d'oxygène. 5 - Biocapteur selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la membrane enzymatique (8) est constituée d'un film-support (5) de matériau hydrophobe à per- méabilité sélective vis-à-vis des gaz et d'un film porteur de l'enzyme formé par réticulation d'au moins une protéine inerte par un agent pontant, le film-support (5) de la mem- brane enzymatique (8) étant disposé du côté de l'électrode (1) alors que le film porteur de l'enzyme est disposé en vis-à-vis de l'ouverture de la cellule de mesure (13). 6 - Biocapteur selon la revendication 5, caractérisé par le fait que la protéine inerte est la gélatine. 7 - Biocapteur selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé par le fait que.l'agent pontant est le glutaraldé- hyde. 8 - Biocapteur selon les revendications 4 et 5 prises simultanément, seules ou en combinaison avec l'une des revendi- cations 6 ou 7, caractérisé par le fait que le matériau hydro- phobe constitutif du film-support (5) est le polypropylène ou le polytetrafluoréthylene. 9 - Biocapteur selon les revendications 4 et 5 pri- ses simultanément, seules ou en combinaison avec l'une des re- vendications 6 à 8, caractérisé par le fait que le film-support (5) a une épaisseur comprise entre 6 et 15 Pm. - Biocapteur selon les revendications 4 et 5 pri- ses simultanément, seules ou en combinaison avec l'une des re- vendications 6 à 9, caractérisé par le fait que le film porteur de l'enzyme a une épaisseur comprise entre 30 et 50 pm. 11 - Biocapteur selon les revendications 4 et 5 pri- ses simultanément, seules ou en combinaison avec l'une des re- vendications 6 à 10, caractérisé par le fait que le film por- teur de l'enzyme contient de 0,15 à 0,50 UI de L-lactate oxy- dase par cm2 de membrane. 12 - Procédé de préparation d'une membrane enzymati- que destinée à un biocapteur selon les revendications 4 à 7 et , prises simultanément, caractérisé par le fait que: a) on prépare une solution aqueuse renfermant, par ml, de 4 à 20 UI de L-lactate oxydase et de 30 à 70 mg de gélatine; b) on étale ladite solution sur un filmsupport (5) à raison de 10 à 50 VI/cm2 et on fait sécher ce revêtement; c) sur le revêtement sec obtenu, on verse une solution aqueuse de glutaraldéhyde ayant une concentration comprise entre 0,5 et 2 % en poids et on laisse réticuler pendant un temps compris entre 1,5 et 4 minutes. 13 - Procédé pour la mesure directe d'au moins un pa- ramètre biochimique de la peau à l'aide d'un biocapteur selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé par le fait qu'on applique ledit biocapteur sur une zone choisie du revêtement cutané, de façon que l'ouverture de la cellule de mesure (13) soit fermée par ladite zone de revêtement cutané; on injecte dans ladite cellule (13) un liquide apte à solubiliser le substrat cutané que l'on veut doser dont la composition favorise la catalyse; après rem- plissage de la cellule de mesure (13), on effectue la détection et la mesure du phénomène provoqué par la transformation du substrat due à la catalyse de l'enzyme de la membrane (8); puis on fait circuler le liquide de solubilisation du substrat. 14 - Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait qu'on répète le cycle de mesure sur le même site, sans exposition de la membrane enzymatique (8) à l'air entre deux cycles successifs. 15 - Procédé selon l'une des revendications 13 ou 14, utilisant un biocapteur selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on utilise comme liquide de mise en solution du lactate cutané, un tampon ayant un pH compris entre 6 et 8; que l'on enregistre la variation de pression partielle d'oxy- gène p02 en fonction du temps pendant la période de non-circu- lation du tampon dans la cellule; qu'on définit sur l'enre- gistrement le point A ayant pour abscisse le début d'injection du tampon et pour ordonnée la valeur maximum de pO2; qu'on définit la droite D liant A au minimum B de la courbe enregis- trée et qu'on mesure sa pente P pour l'utiliser comme valeur représentative du taux de lactate cutané. 16 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que l'on arrête la circulation du tampon pendant un temps compris entre 3 et 6 minutes.