FR 2636140 A1 19900309 FR 8811627 A 19880906 La présente invention est relative à un auto- mate de séparation de macromolécules ou de fragments de celles-ci. On connaît les techniques du "Southern blot" et du "Northern blot", qui associent des techniques de sé- paratlon, comme l'électrophorèse sur gel d'agarose ou de polyacrylamide à des méthodes de détection telles que l'hy- brldatlon entre deux séquences complémentaires d'acides nucléiques (ADN et ARN), en intercalant entre l'électropho- l, rèse et la révélation, une étape de transfert des acides nucléiques du gel sur un support solide, la détection pou- vant ensuite se faire sur ce support. De telles techniques de transfert ont également été appliquées aux protéines, en ce cas il s'agit de "Wes- tern blot". Ces techniques sont à l'heure actuelle très utilisées, mais ne sont absolument pas adaptées au traite- ment simultané d'une grand nombre d'échantillons diffé- rents. 2C La Demanderesse s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une installation de séparation d'une grande quantité de macromolécules différentes, notamment acides nucléiques (ADN, ARN) et protéines et/ou fragments de celles-cl préalablement extraites des cellules sélec- -F tlonnées de manière connue; elle s'est également donné pour but de pourvoir à une telle installation à fonction- nement rapide et mise en oeuvre facile. La présente invention a pour objet une instal- lation pour la séparation de macromolécules et/ou de frag- Zz ments de celles-ci, caractérisée en ce qu'elle comprend: - au moins un élément pour la migration-trans- fert desdites macromolécules comportant au moins un gel d'électrophorèse associé à une membrane de transfert-fixa- tion desdites macromolécules, - un moyen d'amenée desdites macromolécules vers le/les éléments de migration-transfert, - une cuve de migration comportant une struc- ture interne amovible formée d'une pluralité de cadres sus- ceptibles d'accueillir le/les élément(s) de migration- transfert, - au moins un moyen d'application d'un champ électrique provoquant la migration électrophorétique des macromolécules. - au moins un moyen de transfert des macromolé- cules entre les différentes parties dudit élément de mi- io gration-transfert pour fixation sur ladite membrane de transfertfixation; et - un microprocesseur d'automatisation pour la commande séquentielle, dudit/ desdits élément(s) de migra- tion-transfert, dudit moyen d'amenée des macromolécules, dudit/desdits moyens d'application d'un champ électrique et dudit/desdits moyen(s) de transfert. Chaque élément pour la migration-transfert com- prend avantageusement, associé à la membrane de transfert- fixation et au gel d'électrophorèse, un support, ledit élé- ment étant sous forme d'un empilage, dont la membrane de transfert-fixation peut être séparée. Pour la commande du transfert, l'invention pré- voit dans une première réalisation, une pompe à vide. L'invention prévoit, dans une deuxième réalisa- tion, un moyen d'application d'un champ électrique perpen- diculaire au champ électrique provoquant la migration élec- trophorétique des macromolécules, ledit moyen étant iden- tique ou différent du moyen d'application du champ élec- trique provoquant la migration électrophorétique. Le moyen d'amenée est constitué, de manière connue, d'un bras de transfert associé à un organe de pré- lèvement approprié desdites macromolécules, ledit moyen d'amenée déposant les macromolécules sur le gel d'élec- trophorèse en vue de la migration électrophorétique. Dans un mode de réalisation avantageux de l'installation, l'invention prévoit, dans le cas de la sé- paration d'acides nucléiques, préalablement à la migration électrophorétlque, un poste de traitement par digestion desdits acides nucléiques. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation de l'installation, le poste de traitement de digestion comporte des moyens d'introduction des réactifs de digestion dans les alvéoles d'une plaque de microtitra- tion contenant les acides nucléiques, ainsi que des moyens de réglage de la température de ladite plaque. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'installation, l'invention prévoit, que préalablement au dépôt des macromolécules sur le gel d'électrophorèse, le coulage dudit gel soit réalisé et des alvéoles soient pré- formées dans ledit gel au moyen d'outils appropriés, les- dits outils étant commandés par le microprocesseur d'automatisation. Dans un tel mode de réalisation, chaque élément pour la migratlon-transfert comprend quatre parois dont deux, adjacentes au moyen d'application du champ électrique de migration sont des membranes de dialyse, lesdites parois formant cuvette et servant de moule audit gel d'électropho- rèse, préalablement à sa solidification. Selon une autre caractéristique de l'invention, les cadres de la structure interne de la cuve de migration sont montés à pivotement autour d'un axe de celle-ci, pour pouvoir passer d'une position en laquelle les dépôts de ma- cromolécules sont possibles, à une position en laquelle s'effectue la migration-transfert. Selon encore une autre caractéristique de c l'installation, la cuve de migration comprend des moyens de réglage de sa température et des moyens de translation ver- ticale de la structure interne. L'installation comprend également des moyens de remplissage et des moyens d'évacuation de la cuve de migra- tion en produits liquides de migration et/ou de transfert, lesdits moyens étant commandés par le microprocesseur d'au- tomatisation. Selon encore une autre caractéristique de l'installation, celle-ci comprend également des moyens pour commander le pivotement des cadres, dans et hors de la cuve, alnsi que des moyens de commande pas à pas de l'ensemble de la structure interne, qui sont dans la direc- tion de l'axe. Dans un autre mode de réalisation préféré de : l'invention, les moyens d'application du champ électrique comprennent une série d'électrodes parallèles entre elles et aux éléments de migratlon-transfert, disposées dans des plans perpendiculaires à la direction de migration des ma- cromolécules, des moyens d'application de potentiels aux électrodes situées dans les plans précités et des moyens de commande pour faire varier dans l'espace et/ou dans le temps la distribution des potentiels desdits plans d'électrodes. En particulier, les électrodes sont disposées aux intersections de deux séries de plans, les premiers perpendiculaires aux éléments de migration et à la direc- tion précitée de migratlon, les seconds perpendiculaires aux premiers. Ains:, en commandant de la façon voulue la dis- tributlon des potentiels sur les électrodes, on peut obte- nlr dans un premier temps la séparation des macromolécules par migration dans une direction donnée, puis dans un se- cond temps leur transfert sur une membrane de l'élément de migrationtransfert. Ces moyens sont décrits en détail dans une autre Demande de Brevet au nom de la Demanderesse, concer- nant un procédé et un dispositif d'électrophorèse multiple, déposée le même jour que la présente Demande, et dont le contenu est incorporé, par référence, à la présente Demande de Brevet. On obtient ainsi, par la combinaison de moyens de la présente invention, une séparation et un transfert automatisés de macromolécules et/ou de fragments de celles- ci, rapides et faciles à mettre en oeuvre Dans le cas de la séparation d'acides nu- cléiques, la détection de ceux-ci sur la membrane, séparée de l'élément de migration-transfert, peut être effectuée à un poste approprié, par hybridation avec une sonde complé- mentaire. iCe Dans le cas de la séparation de protéines, la détection de celles-ci, sur la membrane, séparée de l'élé- ment de migratlon-transfert, peut être effectuée à un poste approprié, soit par marquage direct avec un colorant aspé- cifique, soit par marquage direct avec un ligand spécifique _-5 (anticorps, ligand physiologique), soit par marquage indi- rect avec deux ou trois ligands. Outre les dispositions qui précèdent, l'inven- tion comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à une des- cription détaillée de l'installation avec référence au des- sin annexé, dans lequel: - la Figure 1 représente une vue schématique illustrant l'installation; - la Flgure 2 représente une vue schématique en 2 perspective, illustrant le poste de traitement; - la Figure 3 représente une vue. schématique, en coupe longitudinale, d'un mode de réalisation d'élément pour la migration-transfert; - la Figure 4 représente une vue schématique, 3 en perspective, d'un mode de réalisation de la cuve de mi- gration. Il doit être bien entendu, toutefois, que ce dessin et les parties descriptives correspondantes sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. L'installation conforme à l'invention est il- lustrée schématiquement sur la Figure 1. Des acides nucléiques isolés de manière appro- priée sont amenés à un poste de traitement 20 qui, dans la réalisation représentée, est une plaque 10 de microtitra- tion à quatre vingt seize trous, à laquelle sont associés des rmoyens 22 de réglage de la température, Figure 2. Dans le poste de traitement 20 a lieu la diges- tion des acides nucléiques, en apportant dans chacun des !o puits 231i à 23n, la quantité d'enzyme de restriction néces- saire; on ajoute ensuite, dans les puits, de l'agarose "low melting" maintenue à l'état liquide par l'in- termédiaire des moyens de réglage de température non repré- sentés sur cette Figure, associés au poste de traitement, !5 au moyen d'une plpette mobile non représentée sur cette Fi- gure. Après digestion, les fragments d'acides nu- cléiques obtenus, contenus dans l'agarose liquide, sont transférés par l'intermédiaire du bras de transfert 21 qui permet le dépôt desdits fragments d'acides nucléiques sur le gel d'électrophorèse 31, d'un élément 30 pour la migra- tion-transfert, préalablement placé sur l'un des cadres 42 de la structure interne de la cuve de migration 40. Le gel d'électrophorèse comporte des alvéoles préformées dans les- quelles sont effectués les dépôts. Pour réaliser le dépôt, chaque élément pour la migration-transfert est extérieur à la cuve et orienté en position 30b, alors qu'après dépôt, l'élément est ramené dans sa position 30a, intérieure à la cuve. Lorsque les dépôts, par exemple douze dépÈts par gel, sont effectués sur le gel d'électrophorèse 31 d'un élément 30i porté par un cadre 421 en position (b), ledit cadre pivote de 90 jusqu'à la position (a) autour de l'axe 41 et ledit cadre 421 descend dans la cuve 40 d'un pas cor- respondant à l'intervalle entre deux cadres 42; le cadre suivant 422, initialement en position (a), pivote en posi- tion (b) et est prêt à recevoir une nouvelle série de dé- pôts, sur le gel de l'élément 302 porté par ledit cadre. Lorsque tous les acides nucléiques sont déposés dans les alvéoles des gels d'électrophorèse, les alvéoles sont complétées avec de l'agarose liquide et la structure interne (41; 421 à 42ny est complètement introduite dans la cuve de migration 40, la paroi amovible 43 de celle-ci est fermée et les moyens de réglage de température associés à ladite cuve et non représentés sur cette Figure assurent le refroidissement de ladite cuve, notamment pour la soli- dification du gel rapporté. Ladite cuve de migration 40 est alors remplie d'un liquide de migration constitué par un tampon approprié par l'intermédiaire de moyens de remplissage non représen- tés; elle comporte également des moyens d'évacuation et des moyens de translation verticale de la structure interne non représentés. On procède alors à la migration électrophoré- tique par l'intermédiaire des moyens d'application du champ électrique non représentés. Ledit champ est appliqué selon le grand axe des gels d'électrophorèse. Les moyens d'application du champ électrique peuvent comprendre avantageusement mais de manière non li- mitative, des électrodes sur les faces internes des deux parois opposées de la cuve 40, perpendiculaires au grand axe des gels d'électrophorèse 31. Un exemple détaillé desdits moyens d'application sont décrits dans la Demande de Brevet au nom de la Demanderesse déposée le même jour. Lorsque la migration électrophorétique est réa- lisée, le transfert sur la membrane 32 de transfert-fixa- tion dudit élément pour la migration-transfert est assuré, dans la réalisation représentée par l'intermédiaire d'un dispositif de pression différentielle, avantageusement une pompe à vide 34 associée au support 33, Figure 3. Les fragments d'acides nucléiques qui ont migré et ont été déposés sur la membrane 32, sont prêts pour l'hybridation et le repérage. Exemple 1: Séparation d'ADN à l'aide de 1'installation conforme à l'invention: 1') Digestion enzymatique des ADN Au poste de traitement 20 qui, dans une réali- sation préférée est une plaque 10 de microtitration à 96 trous, on introduit des réactifs de digestion dans lesdits trous ou alvéoles; on obtient par alvéole un volume final de 17 pl, après introduction des réactifs suivants: a) ADN: 3.g correspondant à 12 pl., pour obtenir une concentration finale de 176 ng/pl. b) Enzyme de Restriction: 15 unités correspondant à 3 pl., pour obtenir une concentration finale de 0,17 unité/ml. c) Tampon approprié à la réaction, d'un volume de 2 pl, composé généralement de produits tels que: Spermidine & une concentration finale de 2 mM Tris-HCl (pH 7,5-8)...................... 10-50 mM NaCl (chlorure de sodium)................ 0-100 mM MgCl2 (chlorure de magnésium)............ 10-20 mM. Après traitement des acides nucléiques par l'enzyme de restriction, on ajoute dans chaque alvéole: d) facultativement, un colorant du front de migration constitué de bleu de bromophénol ou autre; en intro- duisant un volume de 1 pl correspondant à une concen- tration finale de 0,02 % (g pour 100 ml); e) Agarose Low Melting: on introduit un volume de 7-8 pl correspondant à une concentration en produit ajouté de 1,5 à 4,5 % (g pour 100 ml de tampon de migration); on obtient une concentration finale de 0,5 à 1,5 % (g pour ml). - 2') Gel d'électrophorèse - tampon de migra- tion: a) le gel d'électrophorèse est constitué de: agarose (normal ou Low Melting) à une concentration fi- nale de 0,5 à 1,5 % (en gramme d'agarose pour 100 ml de tampon de migration). b) le tampon de migration est constitué de TEA/BET: Tris Acetate à une concentration finale de 40 mM EDTA à une concentration finale de 1 mM Bromure d'éthydium à une concentration finale de 0,5 Pg/ml c) Les paramètres de migration sont très variables et va- rient: - en temps: de une heure à quarante heures, et - en voltage: de 25 à 70 Volts. 3 ) Transfert sur la membrane de transfert- fixation: a) quel que soit le moyen de transfert des acides nu- cléiques sur la membrane de transfert-fixation, au préalable, l'élément de migration-transfert (gel d'électrophorèse) est traité par les tampons suivants: - HC1 à une concentration finale de 0,15 M - Tampon de dénaturation: NaCl à une concentration finale de 1,5 M, NaOH à une concentration finale de 0,5 M, - Tampon de neutralisation: NaCl à une concentration finale de 1,5 M, Tris-HCl (pH 7,2) à une concentration finale de 0,5 M, EDTA & une concentration finale de 1 mM. 4') Type de membrane: membrane inerte de nylon (HYBOND - AMERSHAM). Exemple 2: Le protocole est identique à celui de l'Exemple 1, seul le tampon de migration diffère et est constitué de TBE/BET: Tris-borate à une concentration finale de 89 mM Acide borique à une concentration finale de 89 mM EDTA à une concentration finale de 2 mM 3Z5 Bromure d'ethydium à une concentration finale de 0,5 mg/ml. Exemple 3: Séparation d'ARN à l'aide de l'installation conforme à l'invention: On procède comme dans l'Exemple 1; toutefois en ce cas le gel n'est pas traité par le tampon de dénatu.- ration. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'in- vention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'applications qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse, D au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. 56 36 1 4 G REVENDICATIONS 1') Installation pour la séparation de macromo- lécules et/ou de fragments de celles-ci, caractérisée en ce qu'elle comprend: - au moins un élément pour la migration-trans- fert (30) desdites macromolécules comportant au moins un gel d'électrophorèse (31) associé à une membrane de trans- fert-fixation (32) desdites macromolécules, - un moyen d'amenée (21) desdites macromolé- cules vers le/les éléments de migration-transfert, - une cuve de migration (40) comportant une structure interne amovible formée d'une pluralité de cadres (42) susceptibles d'accueillir le/les élément(s) de migra- tion-transfert, :!- -au moins un moyen d'application d'un champ électrique provoquant la migration électrophorétique des macromolécules. - au moins un moyen de transfert des macromolé- cules entre les différentes parties dudit élément de mi- 2c gration-transfert pour fixation sur ladite membrane de transfertfixation; et - un microprocesseur d'automatisation pour la commande séquentielle, dudit/ desdits élément(s) de migra- tion-transfert, dudit moyen d'amenée des macromolécules, dudit/desdits moyens d'application d'un champ électrique et dudit/desdits moyen(s) de transfert. 2') Installation selon la revendication 1, caractérisée en ce que chaque élément pour la migration- transfert comprend avantageusement, associé à la membrane o30 de transfert-fixation (32) et au gel d'électrophorèse (31), un support (33), ledit élément étant sous forme d'un empi- lage, dont la membrane (32) de transfert-fixation peut être séparée. 3') Installation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que la commande du i2 transfert est réalisée par l'intermédiaire d'une pompe à vide. 4') Installation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que la commande du transfert est réalisée par l'intermédiaire d'un moyen d'ap- plication d'un champ électrique perpendiculaire au champ électrique provoquant la migration électrophorétique des macromolécules, ledit moyen étant identique ou différent du moyen d'application du champ électrique provoquant la mi- gration électrophorétique. ') Installation selon l'une quelconque des re- vendicatlons 1 à 4, caractérisée en ce que, dans le cas de la séparation d'acides nucléiques, elle comprend en outre un poste de traitement (20) par digestion desdits acides nucléiques, situé en amont des éléments de migration-trans- fert. 6') Installation selon la revendication 5, ca- ractérisée en ce que le poste de traitement (20) de diges- tion comporte des moyens d'introduction des réactifs de digestion dans les alvéoles d'une plaque de microtitration contenant les acides nucléiques, ainsi que des moyens de réglage de la température de ladite plaque. 7 ) Installation selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 6, caractérisée en ce que préalablement au dépôt des macromolécules sur le gel d'électrophorèse, le coulage dudit gel est réalisé et des alvéoles soit sont préformées dans ledit gel au moyen d'outils appropriés, lesdits outils étant commandés par le microprocesseur d'au- tomatisation. 8) Installation selon la revendication 7, ca- ractérisée en ce que chaque élément pour la migration- transfert comprend quatre parois dont deux, adjacentes au moyen d'application du champ électrique de migration sont des membranes de dialyse, lesdites parois formant cuvette et servant de moule audit gel d'électrophorèse, préalable- ment à sa solidification. 2636 1 40 9') Installation selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 8, caractérisée en ce que les cadres de la structure interne de la cuve de migration (40) sont montés à pivotement autour d'un axe (41) de celle-ci, pour pouvoir passer d'une position en laquelle les dépôts de macromolé- cules sont possibles, à une position en laquelle s'effectue la migration-transfert. ') Installation selon l'une quelconque des revendications I à 9, caractérisée en ce que la cuve de mi- o10 gration comprend des moyens de réglage de sa température et des moyens de translation verticale de la structure in- terne. 11') Installation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle comprend également des moyens de remplissage et des moyens d'évacua- tion de la cuve de migration en produits liquides de migra- tion et/ou de transfert, lesdits moyens étant commandés par le microprocesseur d'automatisation. 12') Installation selon l'une quelcona.e des revendications 9 à 11, caractérisée en ce qu'elle ccmprend également des moyens pour commander le pivotement des cadres, dans et hors de la cuve, ainsi que des moyens de commande pas à pas de l'ensemble de la structure interne, qui sont dans la direction de l'axe. 13') Installation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que les moyens d'application du champ électrique comprennent une série d'électrodes parallèles entre elles et aux éléments de mi- gration-transfert, disposées dans des plans perpendiculai- res à la direction de migration des macromolécules, des moyens d'application de potentiels aux électrodes situées dans les plans précités et des moyens de commende pour faire varier dans l'espace et/ou dans le temps la distribu- tion des potentiels desdits plans d'électrodes. 14') Installation selon la revendication 13, caractérisée en ce que les électrodes sont disposées aux 263 140 intersections de deux séries de plans, les premiers perpen- dlculaires aux éléments de migration et à la direction pré- citée de migration, les seconds perpendiculaires aux pre- miers.