FR 2646775 A1 19901116 FR 8906207 A 19890511 - vache. oour la fabrication d'une conposition. notamment d'un médicament. pour la prévention et le traitement des thromboses. La présente invention a été faite au Laboratoire des Protéines de l'Université de Paris V, Laboratoire associé au Centre National de la Recherche Scientifique N UA 1188 en collaboration avec l'Institut des Vaisseaux et du Sang. L'invention concerne la prévention et le traitement des thromboses. Elle a plus particulièrement pour objet l'utilisation du caséinogycopeptide ic, notamment de lait de vache, pour la fabrication d'une composition, notamment o10 d'un médicament, pour la prévention et le traitement des thromboses. Lors de la phase primaire de la coagulation du lait, la chymosine (EC 3.4. 23.4) scinde spécifiquement une liaison entre deux acides aminés à l'intérieur de la caséine ic de vache, à savoir la liaison entre la phénylalanine et la méthionine correspondant aux résidus 105-)106. Il y a alors libération du I5 caséinoglycopeptide K ou CGP (partie C-terminale de la caséine v; résidus 106-> 169), également appelé caséinomacropeptide. Ce caséinoglycopeptide ic qui est donc un peptide naturel s'obtient également par d'autres traitements de la caséine entière, par exemple par traitement chimique ou par la chaleur. Lors de la digestion du lait, le caséinoglycopeptide ic est le premier peptide libéré à l'intérieur du complexe appelé caséine entière ( cas 5, K) Dans l'article référencé Eur. J. Biochem. 15 379-382 (1986), Pierre JOLLES, Sylviane LEVY-TOLEDANO, Anne-Marie FIAT, Claudine SORIA, Dieter GILLESSEN, Annick THOMAIDIS, Fred W.DUNN et Jacques P. CAEN ont 2,J étudié, entre autres, I'aptitude de trois fragments du caséinoglycopeptide c de lait de vache, à savoir les fragments 106--1 12, 113---116 et 106-)116 obtenus soit par digestion du CGP par la trypsine (EC 3.4. 21.4) soit par synthèse, en ce qui concerne leur aptitude à inhiber in vyitro l'agrégation plaquettaire et/ou la liaison du fibrinogène aux plaquettes. Les résultats qu'ils ont ainsi obtenus sont très variables d'un peptide à l'autre. Ainsi ont-ils pu observer quinvitro le undécapeptide 106--116 du caséinoglycopeptide obligatoirement une activité antithrombotique in vivo. Ceci est confirmé notamment par le fait que la SOCIETE DES PRODUITS NESTLE S.A. qui cherchait à valoriser les caséinoglycopeptides K: d'origine bovine, caprine ou ovine n'a, dans sa demande de brevet EP 0 283 675 déposée 1S le 29 janvier 1988 et revendiquant la priorité d'un dépôt antérieur en Suisse du 26 février 1987, c'est-à-dire postérieur à la date de publication de l'article de Pierre JOLLES et coll. mentionné ci-dessus, fait aucune référence à une éventuelle activité antithrombotique de ces composés. Les activités anti-plaque et anti-carie dentaires décrites in vitro dans cette demande de brevet, et dont l'application est X0 revendiquée, n'ont rien à voir avec une activité antithrombotique in vivo. De même, la demande de brevet EP 0 291 264 de la société SNOW BRAND MILK PRODUCTS CO. LTD, déposée le 9 mai 1988 et revendiquant la priorité d'une demande de brevet japonaise du 15 mai 1987, qui concerne un procédé industriel de production de glycomacropeptide de caséine KC, ne fait aucune référence à une éventuelle application de ce glycopeptide à la prévention ou au traitement des thromboses. Elle fait seulement référence à l'utilisation connue du glycomacropeptide de la caséine: en tant qu'agent protecteur contre l'infection et revendique l'utilisation du glycomacropeptide de la caséine i:, obtenu par le procédé qu'elle décrit, pour la préparation d'un agent anorexiant utilisable dans des programmes de contrôle du poids. Les demandeurs ont maintenant établi que le caséinoglycopeptide de caséine Y, appelé ci-après CGP, notamment de lait de vache, agit non seulement sur certaines fonctions plaquettaires in vitro mais encore présente une activité antithrombotique in vivo. Plus précisément, l'activité sur les fonctions plaquettaires a été étudiée in vitro en ce qui concerne l'inhibition de l'agrégation des plaquettes provoquée par l'ADP ('agrégation à l'ADP'), l'inhibition de la liaison du fibrinogène aux plaquettes 26467t5 provoquée par 'ADP ('liaison du fibrinogène à l'ADP), I'inhibition de l'agrégation des plaquettes provoquée par la thrombine ('agrégation à la thrombine') et l'inhibition de la réaction provoquée par la thrombine ('réaction de sécrétion à la thrombine) c'est-à-dire la libération d'un des constituants du granule dense (sérotonine), témoin de l'activation plaquettaire. Cette activité du CGP sur les fonctions plaquettaires a été conmparée à celle de la caséine: et de la paracaséine ic. Il est rappelé à ce propos que la caséine ic fournit, sous l'action notamment de la chymosine, la paracaséine: (fragment 1-À ) et le caséinoglycopeptide ic ou CGP (fragment 106--4 169). Les essais effectués sont décrits plus en détail dans la partie expérimentale du présent mémoire. Dans tous les essais effectués, la paracaséine K est inactive. La caséine: inhibe seulement l'agrégation à la thrombine et la réaction de sécrétion à la thrombine (inhibition de 50 % à une concentration 10 pi M dans chaque cas) . Le 1,5 CGP provoque les mêmes inhibitions, aux mêmes concentrations mais est également capable de provoquer, à une concentration 250 li M, une inhibition de % de l'agrégation à l'ADP, alors que la caséine K est inactive dans cet essai. Par ailleurs,l'activité antithrombotique in vivo a été démontrée chez le rat, selon un protocole classique, explicité dans la partie expérimentale qui suit. t0 L'invention a donc pour objet l'utilisation du caséinoglycopeptide Kc, notamment de lait de vache, pour la fabrication d'une composition, notamment d'un médicament, pour la prévention et le traitement des thromboses. Comme il a été indiqué plus haut, le caséinoglycopeptide Kc, notamment de lait de vache, peut être obtenu par différents procédés connus de la littérature, et = en particulier selon la technique décrite dans la partie expérimentale du présent mémoire et qui peut se résumer comme suit Du lait délipidé est soumis à une dialyse contre de l'eau pour en retirer les sels et les sucres libres'. Le pH du lait ainsi traité est amené au point isoélectrique (4,6) au moyen d'un acide tel que HCi M, le lait est ensuite avantageusement O30 chauffé modérément (à environ 40 C) pour augmenter la précipitation de la caséine puis centrifugé, par exemple à 3000 tours/minute, pour séparer la caséine. La caséine, notamment après lyophilisation, est mise en solution à pH 6,8 par exemple dans du tampon pyridine 0,2N/acide acétique.Elle est ensuite digérée par un enzyme tel que la chymosine. Lorsque l'action de l'enzyme est terminée, le mélange est traité par un acide tel que l'acide trichloroacétique, ce 4 2646775 qui provoque la formation d'un précipité. Le surnageant qui contient le CGP est séparé par centrifugation. Le surnageant de centrifugation est à son tour filtré et lavé à l'éther. La phase aqueuse purifiée contient le CGP qui peut être conservé à l'état lyophilisé. Un processus analogue peut s'appliquer à la séparation de tout autre caséinoglycopeptide ic de lait de mammifère, par exemple de lait de chèvre ou de brebis. La composition, notamment le médicament, faisant l'objet de l'invention, peut être obtenue en incorporant le CGP dans une forme, notamment pharmaceutique, convenable en présense d'excipients et/ou diluants inertes et éventuellement d'autres principes actifs. En tant que formes pharmaceutiques, on peut citer - les formes 'pharmaceutiques convenant à l'administration par voie intraveineuse, telles que la forme lyophilisée reconstituée dans un solvant compatible tel qu'une solution aqueuse stérile et apyrogène de chlorure de sodium à 9 %o, et - les formes pharmaceutiques convenant à l'administration par voie orale telles que des gélules, notamment gastrorésistantes, des nanosphères, des nanoparticules et des liposomes. Les nanosphères contenant le CGP sont avantageusement constituées d'une ou plusieurs matières permettant au CGP de passer la barrière digestive, telles que par exemple l'isobutylcyanoacrylate. Les gélules qui peuvent contenir de telles nanosphères peuvent avantageusement être constituées d'une matière gastrorésistante telle que l'acétophtalate de cellulose ou une résine méthacrylique. D'autres formes pharmaceutiques et d'autres voies d'administration peuvent être envisagées, sur la base des connaissances usuelles de l'homme du métier en la matière. Les médicaments selon l'invention peuvent être utilisés dans la prophylaxie et /ou le traitement des thromboses. Dans le cas de la prophylaxie des thromboses, la posologie usuelle chez l'adulte est avantageusement de 15 à 30 mg/kg de poids corporel, 2 fois par jour par voie intraveineuse, et de 50 à 100 mg/kg de poids corporel, 2 fois par jour par voie orale. Compte tenu de l'absence de toxicité du CGP, ces posologies peuvent être dépassées si besoin est. Elles peuvent aussi être dirrinuées, suivant la sensibilité et/ou la tolérance du patient. 2646775 Dans le cas du traitement des thromboses, la posologie usuelle chez l'adulte est avantageusement de 30 à 50 mg/kg de poids corporel, par jour, par voie intraveineuse continue, et de 50 àl00 rmg4g de poids corporel, 2fois par jour, par voie orale. Ici encore, ces posologies moyennes peuvent être augmentées ou diminuées selon l'état à traiter, par exemple. Les exemples non limitatifs dont la description suit sont destinés à illustrer l'invention. PARTIE EXPERIMENTALE I Roéparation: 1) Préparation de la caséine Du lait de vache est congelé à -20 C.Lors de la préparation de la caséine, le lait est décongelé et quelques gouttes de toluène sont ajoutées pour éviter la prolifération des bactéries. Pour retirer les graisses, le lait est centrifugé pendant une heure à 3000 tours/min. Le lait est ensuite refroidi à 4 C et maintenu 3 heures à 4 C. Une filtration sur coton permet de séparer les graisses du lait délipidé. Une dialyse contre de l'eau permet de retirer les sels et les sucres libres du lait. Le pH du lait est abaissé jusqu'au point isoélectrique de la caséine, à savoir 4,6 au moyen de HCI M. Pour augmenter la quantité du précipité, la température est élevée à 40 C pendant une demi-heure. Une centrifugation à 3000 tours/min pendant une demi-heure sépare la caséine des autres constituants du lait. La caséine est ensuite lavée avec de l'eau distillée puis recentrifugée, toujours à 3000 tours/min pendant une demi-heure. Le précipité qui correspond à la caséine est lyophilisé. 2) Préparation du caséinoglycopeptide xC de vache La caséine (2 %) est mise en solution dans un tampon pyridine 0,2N/acide acétique M, pH 6,8. La digestion enzymatique de la caséine est réalisée grâce à la chymosine (E/S=1/2000) (Sigma) pendant une heure trente à 37 C. On ajoute de l'acide trichloroacétique jusqu'à une concentration finale de 12 %. Un précipité se forme après 18 heures à 4 C. Le caséinoglycopeptide K se trouve dans le surnageant et est séparé du précipité par centrifugation pendant 2 heures à 3000 tours/min. Le sumageant est recueilli après passage sur verre fritté. Pour éliminer l'acide trichloroacétique dans le surnageant, on effectue des lavages à l'éther. Le surnageant qui contient le caséinoglycopeptide x: est ensuite lyophilisé. S3S 3) Analyse du caséinoalycopeotide lc de vache J.Jollès et coll. (voir FEBS letters 30 (1973) 173-175) ont étaUbli la séquence du caséinoglycopeptide x 2-éthanol au 1/2000 pendant 18 heures à 110 C sous vide, on a vérifié que la composition en acides aminés (résidus/mole) était bien la suivante: Asp 5 Thr 12 Ser 6 Glu 10 Pro. 8 Gly 1 Ala 5 Val 6 Met 1 lie 6 Leu 1 Lys 3 La séquence N -termrinale du caséinoglycopeptide K de vache a également été vérifiée pour confirmer la pureté du produit et correspond à: Met - Ala lie - Pro - Pro - Lys - Lys -Asn -Gln - Asp - Lys - Thr - Glu -= -7 -7 -7 '7 --7 -7 -7 --' 7, -7 7 I1 Etude pharmacoloaique 1. Etude pharmacologique comparative in vitro de l'activité du CGP sur les fonctions plaquettaires. L'action de la chymosine sur la caséine Kc de vache donne naissance à deux peptides: la paracaséine ic (1--105) et le caséinoglycopeptide K ou CGP(106-- 2.5 169). Ces trois produits ( caséine K, paracaséine v et CGP) ont été testés sur l'agrégation des plaquettes humaines à l'ADP et à la thrombine, sur la fixation du fibrinogène en présence d'ADP et sur la réaction de sécrétion. Le tableau qui suit résume les résultats obtenus avec ces trois produits. La Bo caséine -K n'inhibe ni l'agrégation à l'ADP, ni la liaison du fibrinogène. Elle inhibe l'agrégation à la thrombine ainsi que la réaction de sécrétion avec une Cl 50 (concentration inhibant 50 % de l'agrégation par rapport au témoin) 10 p M environ. La paracaséine Kc n'a aucun effet sur aucune des fonctions plaquettaires testées. Le Caséinoglycopeptide inhibe l'agrégation à l'ADP. La concentration inhibitrice à 50 % (Cl 5) se situe autour de 250 g M. A cette concentraion, aucune 7 2646775 inhibition de la liaison du fibrinogène n'est obtenue. Ce Caséinoglycopeptide est également un inhibiteur très puissant de l'agrégation à la thrombine ainsi que de la réaction de sécrétion, puisque la concentration irnhibitrice à 50 % se situe autour de 10 pi M. TABLEAU Effets comparés de la caséine ic, de la paracaséine xc et du CGP sur différentes fonctions plaquettaires. Agrégation à Liaison du fibri- Agrégation à Réaction de sécré- LWDP nogn àGADP lattit cnàlahtne caséineiC__ 10- lOM 10 pM ian Paracaséine x aséinoglyco- peptide ou 250 1 M _ 10 p M 10 11 M CGP Notes: Les valeurs indiquées correspondent aux concentrations des produits qui induisent 50 % d'inhibition des différentes fonctions. -: pas d'inhibition. 2. Etude pharmacolojgiqe in vivo: effet du CGP sur la thrombogénèse chez le - rat L'action du caséinoglycopeptide (CGP) a été étudiée in vivo, chez le rat. I Méthode a. Thrombose expérimentale In vivo, dans le modèle utilisé, la thrombogénèse est induite par une lésion de l'endothélium des artérioles du mésentère de l'animal, par un rayon laser colorant, pulsé par un laser azoté. Le phénomène de thrombose est un phénomène cyclique répétitif. Plusieurs vaisseaux sont étudiés après une injection i. v. du peptide à tester. Chaque vaisseau est observé 15 minutes durant lesquelles on compte le nombre de thromboses formées. L'expérience dure au total environ 1h30 après l'injection i. v. du peptide. 8 2646775 b. Animaux Les animaux utilisés sont des rats mâles de race SpragueDawley, d'environ 500g. Résultats a. Thrombose expérimentale induite Chez le rat, à 0,5 la M/kg (5000 p g/kg), on observe un effet antithrombotique significatif: 1,4 thromboses/15 min pendant les 20 premières minutes d'observation (témoin: 4 thromboses/15min). Cet effet reste significatif jusqu'à 1h30 après l'injection i. v. du CGP. lO I11 Exemoles de préparations pharmaceutiaues: A - Exemple de Dréparation pour injection intraveineuse: On prépare deux flacons à mélanger extemporanément: - un flacon A contenant 300 mg d'une préparation stérile et apyrogène de caséinoglycopeptide lyophilisée, et - un flacon B contenant une solution stérile et apyrogène de chlorure de sodium à 9 pour mille. Au moment de l'emploi, le flacon B est repris stérilement dans une seringue puis introduit dans le flacon A; la dilution du caséinoglycopeptide y est instantanée. Le caséinoglycopeptide en solution est repris dans la seringue et, par un changement de tubulure, utilisé tel que pour injection au malade selon une dose adaptée au poids du malade. B - Exemple de préparation pour absorption per os: Le caséinoglycopeptide est enrobé dans des nanoparticules d'isobutylcyanoacrylate pour lui permettrre de passerla barrière digestive. Pour éviter l'acidité gastrique, la suspension de nanoparticules est lyophilisée et enrobée dans des gélules d'acétophtalate de cellulose ou dans une résine méthacrylique. Les gélules sont dosées à 100 mg de caséinoglycopeptide. La prise est adaptée au poids du malade. Elle est répartie sur la journée en faisant attention aux prises médicamenteuses, par rapport aux prises alimentaires. 9 2646775 Revendications 1. Utilisation du caséinoglycopeptide c, notamment de lait de vache, pour la fabrication d'une composition, notamment d'un médicament, pour la prévention et/ou le traitement des thromboses. 2. Utilisation du caséinoglycopeptide a:, notamment de lait de vache, pour la fabrication d'un médicament pour la prévention et/ou le traitement des thromboses. 3. Utilisation selon la revendication 2, pour la fabrication d'un médicament utilisable dans la prévention des thromboses, à une posologie de 15 à 30 mg/kg de poids corporel, 2 fois par jour par voie intraveineuse, ou pour le traitement des thromboses, à une posologie de 30 à 50 mg/kg de poids corporel, pa jour, par voie intaveineuse continue. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que le médicament se présente sous forme lyophilisée, pour être reconstitué dans un solvant compatible, de préférence une solution aqueuse stérile et apyrogène de chlorure desodium à 9%o. 5. Utilisation selon la revendication 2, pour la fabrication d'un médicament utilisable dans la prévention des thromboses, à une posdologie de 50 à 100 mg/kg de poids corporel,2 fois par jour, par voie orale, ou dans le traitement des thromboses, à une posologie de 50 à 100 mg/kg de poids corporel, 2 fois par jour, par voie orale. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le médicament se présente sous forme de gélules, de préférence gastrorésistantes, de nanosphères ou de liposomes. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que les nanosphères contenant le caséinoglycopeptide ic ou CGP sont constituées d'une ou plusieurs matières gastrorésistantes permettant au CGP de passer la barrière digestive et comprenant de préférence de l'isobutylcyanoacrylate. 8. Utilisation selon la revendication 6, dans laquelle les gélules qui contiennent de préférence des nanosphères selon la revendication 7, sont constituées d'une matière gastrorésistante, de préférence d'acétophtalate de cellulose ou d'une résine méthacrylique. 9. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que l'on prépare deux flacons à mélanger extemporanément: - un flacon contenant 300mg d'une préparation stérile et apyrogène de caséinoglycopeptide a, lyophilisée; et - un flacon contenant une solution stérile et apyrogène de chlorure de sodium à 9 o 2646775 pour mille. 10. Utilisation selon l'une des revendicafions 5 à 8, caractérisée en ce que l'on enrobe le caséinoglycopeptide K dans des nanoparticules d'isobutylcyanoacrylate, on lyophilise la suspension de nanoparticules et on l'introduit dans des gélules d'acétophtalate de cellulose ou dans une résine méthacrylique, chaque gélule contenant 100 mg de CGP.