FR 2643073 A1 19900817 FR 8901947 A 19890215 L'invention concerne un procédé de préparation d'extraits polyphénoliques de type flavane-3-ol et iee extraits obtenus qui trouvent des applications en pharm.acie, en diététique et en cosmétologie. Le terme "pycnogénol" (étymologiquement: qui engendre des produits condensés) a été attribué en 1979 & une famille de polyphénols végétaux jusqu'alors englobés dans le groupe disparate des flavonoïdes, (cf. J. Masquelier et al dans Internat. J. Vit.Nutr.Res., 1979, 49, 307-311). Le système cyclique fondamentai des pycncgenols est celui du 2phénylchromanne (I) + CI> sur lequel sont généralement plusieurs groupements hydroxy en particulier en position 3 et 4. C'est le plus souvent par l'intermédiaire d'une consensation avec élimination d'HO20 entre le groupement hydroxy en C-4 d'une molécule et l'atome d'hydrogène en C-8 d'une autre molécule que se forment facilement les oligoméres et les polymères supérieurs, un exemple de dimére %OH COH Hoo. OH OH Les pysnogénols forment un ensemble hcmogene et autonome dent le caractère chim:que esser.tiel est une propension à la condensation. Leur interêt bioloEi.ue reside principalement dans leur intense pouvoir capteur envers les radicaux libres oxygenes (J. Masquelier. Bull. O.I.V. 1%S, 69-6g0, 554-578) qui leur ouvre de nombreuses applications en pharmacie, en diététique et en cosmetologie. Bien que largement répartis dans le regne végétal. les pycnogeno!s ne s'y trouvent pas a des ccncer.ntrations elevees et sont entourés de divers polyphénols qui r.e presentent pas d'intérêt sur le plan biologique recherche et sont en outre instables voire même toxiques et qu'il faut donc éliminer de l'extrait de pycnogenols. De ce fait, les techniques d'extraction antérieures mettent en oeuvre divers mélanges de solvants et nécessitent des opérations complexes de fractionnement et de purification, avec des rendements médiozre; et a des ccots de prcduction importants. En effet, les plantes à pycnogénols sont généralement des plantes à tanins, en raison d'une voie biogénetique commune. Or, ces tanins constituent une fraction à éliminer, en raison de leur peu d'intérêt pharmacologique, de leur instabilité et des incompatibilités biologiques qu'ils provoquent à cause de leur masse moléculaire élevée (fixation irréversible aux protéines sanguines par exemple). Dans l'industrie, l'élimination des tanins met en Jeu le relargage par les électrolytes. C'est ainsi que de nombreux procédés d'épuisement d'un matériel végétal comportent une phase de précipitation des tanins condensés indésirables à l'aide du chlorure de sodium à saturation. Cela entraîne le rejet d'énormes volumes de solutions salines, dont on ne peut se débarrasser sans polluer gravement l'environnement. Tout procédé permettant d'éliminer ces tanins sanris le recours a ce calage constitue donc un progrès primordial sous l'angle industriel. En outre, l'absence de sel permet éventuellement de récuperer le tanin comme sous-produit. Far ailleurs, en raison même de leur nature, les pycncgenols existent chez les plantes sous divers degrés de condensation: monomères, dimères, oligomères. polymères, que l'on trouve le plus souvent côte à côte dans la matière première végétale. Etant donne que les effets pharmacologiques ne sont pas uniformément repartis entre ces différentes formes de condensation, il importe que le procède d'extraction privilégie les fractions possedant au maximum la propriété recherchée. Par exemple, s'agissant des effets antiradicalaires, il faut obtenir en priorité les oligomeres (degré de condensation égal à 2, 3 et 4), puisque l'expérience démontre que leur pouvoir capteur est nettement plus éleve que celui des autres fractions. Une action antivirale conduira, en revanche, à sélectionner les polymères. Il est donc utile de pouvoir préparer a partir d'une matière première végétale un extrait riche en pvcnogénols et suffisamment purifié pour servir de matière première pour la confection de médicaments, de produits diététiques et de cosmetiques. La solubilite des pycnogénols dans l'eau est remarquable. Sauf pour les hauts polymères, qui ont peu d'Intérét au point de vue pharmacologique, l'eau s'avère donc le solvant extractif de choix, ses principaux avantages étant: - l'extraction d'un large éventail de pycnogénols - l'exclusion des hauts polymères - son cot faible par rapport à celui des solvants organiques. La présente invention fournit un tel procédé, qui comprend les étapes consistant à épuiser la matière végétale brute tout d'abord par l'eau, a filtrer le melar.ne, a centrifuger le filtrat apres séjour au froid, a epulser le surnageant par l'acetate d'ethTyle, a separer 'a phase organique contenant l'extrait, a distiller cette phase sous pression reduite pour recuverer l'acétate d'éthyle, à reprendre par l'eau le residu aqueux et à lyophiliser la solution aqueuse obtenue, ce qui fournit l'extrait recherché, sous forme d'une poudre entièrement soluble dans l'eau. De façon plus détaillée, le procéde comporte les étapes suivantes: 1. Ezuisemer.t de la matière première végétale par l'eau 2. Extraction de la solution aqueuse ainsi obtenue, directement par un solvant organique non miscible a l'eau mais envers lequel les pycnogenols manifestent un coefficient de partage le plus élevé possible. L'acétate d'éthyle remplit cette condition. En outre, il s'avère sélectif vis-à-vis des pycnogenols peu condenses contrairement a ce que l'on pensait ger.eralement, il ne dissout pas les tanins. La saturation par le chlorure de sodium de la solution aqueuse, qui semblait être le préalable essentiel à l'élimination des tanins, peut done être supprimée dans ce nouveau procéde, ce qui constitue une innovation aux conséquences pratiques importantes sur le plan industriel. 3. L'acétate d'éthyle, sépare de la phase aqueuse, est évaporé sous pression réduite, jusqu'àa l'obtention d'un résidu aqueux privé de tout reste de solvant organique. Cette solution est lyophilisée et le produit obtenu constitue l'extrait destiné aux usages diététiques et cosmetologiques. Le titre en pycnogénols de l'extrait obtenu est déterminé par spectrophotometrie. Pour obtenir un produit davantage purifié, par exemple pour usage pharmaceutique, l'extrait lyophilisé peut subir une purification complémentaire consistant à le dissoudre dans de l'acétate d'éthyle et & le precipiter de cette solution par un solvant organique ohlore tel que le dichlorométhane. On peut renouveler une seconde fois cette operation. Les differentes étapes peuvent être mises en oeuvre de la façon suivante. La première opération (extraction par l'eau) peut revêtir de multiples modalités o interviennent principalement quatre paramètres: volumes, température, duree, pH. - le rapport V/P (volume d'eau-/poids de matière brute) peut varier dans une large fourchette, selon que la matière vegetale est sèche ou fraîche, compacte ou divisee, mouillable ou hydrofuge. Il est bien évident que l'extraction de feuilles vertes exigera moins d'eau qu'une écorce sèche. Chaque type de matière brute constltue un cas d'espece. - La temperature de l'eau peut, elle aussi, faire 2'objet de multiples ajustements, depuis la simple maceration à froid (+4 C), à la température du laboratoire, ou a des températures variant de +20' à O00 C. L'eau a l'ébullition (décoction) et la vapeur d'eau sous pression (percolation) sont également utilisables. Le choix de la température idoine résulte d'essais préliminaires assortis du dosage global des pycnogénols extraits. - La durée de l'extraction par l'eau influe, dans chaque cas, sur le rendement, et doit être ajustée selon les résultats du dosage. Plus la température est élevée, plus le traitement est court, mais les pycnogénols ne supportent pas un long séjour-à température élevée: une extraction & +80' est, & cet égard, moins agressive qu'une décoction a l'ébullition. - Le pH: le contenu. cellulaire vegétal est en general situe a des pH inférieurs à 7. Par ailleurs, les ycnocenzi_ -suprorient mal un seiour en milieu alcalin. dc_- don- veler a ce que e pH de l'eau sct 6 -ce;_': est enr. general) au cours de l'extrantor.. En >re. i-,1 peut etre utile d'ajcuter a l'eau une zuostance reductrice, telle que le sulfite acide de sodium. à raison de 0, 5g par litre par exemple, pcur ev.er l'cxvdaticn des pycnogenols en ccurs d'ectraction. De meme, il faut priver l'eau de traces de fer cu de cuivre qui activent l'auto-cxydation des pLypnenole. L'eau distillée ou desionisee est a ccLse:;:er. Pc.r la seconde operation (épuisement à l'acetate d'ethvle de la solution aqueuse precedermment obtenue>, diversee modalites d'execution peuvent aust_ s'appliquer: - 7echr.niue de l'epuisement: :'acetate detkZv!e n'est pas mric' e a l'eau, maIs a son contact i_ s'en sature. L'euisement, cui est effectue a la temrerature amciante, peut se faire: par simple agitation des deux liquides et decanationr., solt spontanee, soit acceelree par centrifugation; par epuisement continu dans un extracteur du type HAGEN, ou par la technique à contre-courant. - Le rapport V1/V2, (volume de la solution aqueuse/volume d'acetate d'éthyle), varie selon le mode d'epuisement, la richesse du végetal en pycnogenols, les impératifs industriels de rendement. - La distillation de l'acétate d'éthyle à l'issue de i'épuisement met en oeuvre toute technique permettant d'eliminer entierement le solvant sans lui faire subir une temperature trop élevée. On y parvient en créant un vide partiel, de telle sorte que le solvant distille sans déepasser la température de +50'C.; un atomiseur permettant de respecter cette norme peut fort bien être Des exemples de matières végetales pouvant être traitées par le procédé suivant l'invention sont les suivants sans que cette liste soit limitative: pepins de raisins; sommités fleuries d'aubépine; bractees de tilleul; écorce de pin des Landes; feuilles de noisetier; feuilles de ginkgo biloba; écorce de quinquina; racine de rhubarbe etc. Pour apprécier le rendement de l'extraction, en suivre les variations selon les modifications apportées et titrer l'extrait obtenu en pycnogénols, on a adopte une technique spectrophotometrique de dosage. En effet, les pycnogenols présentent, en lumière ultra-vilette, un spectre d'absorption dont le maximum est voisin de 280 nm, et le minimum voisin de 256 nm. On compare le résultat obtenu avec celui que donne le produit de référence, soit l'extrait séché à 100'C Jusqu'à poids constant. Le coefficient d'extinction & 280 nm d'une solution dans l'alcool à 95' de 4mg de produit sec pour lOOmI est de: E 1cpmo = 160. 1cm Tous les extraits obtenus selon le procédé sont identifiables par la réaction de BATE-SMITH, A 10ml d'une solution aqueuse de l'extrait à 17, on ajoute 2ml d'acide chlorhydrique pur et l'on chauffe le mélange au bain-marie bouillant (100'C). Une intense coloration rouge se forme en quelques minutes. Elle est due à une transformation des pycnogenols en dérivés des chlorures d'oxonium correspondant. A ce titre, la réaction est specifique et permet donc la caractéristique des produits obtenus. On décrit ci-après, à titre illustratif et nullement limitatif, deux exemples de mise en oeuvre du procédé de l'invention. & Exeprle 1. g de pépins entiers de raisin (Vitis vinifera: sont soumis pendant 2h a une infusion dans 21 d'eau distillee contenant 0,5g/l de sulfite acide de sodium, chauffée à 80' sous agitation constante. Le melange est filtre à chaud. Le filtrat (1600m1) séjourne ensuite une nuit à + 4'C, puis on le centrifuge. Un culot de matieres insolubles est abandonné. Le surnageant fait 1'objet d'une mesure d'absorption à 280nm. On l'épu:se alors par l'acétate d'éthyle (600m1) dans un extracteur liquide-liquide à contrecourant, jusqu'à ce que l'absorption de la phase aqueuse mesurée à 280nm soit réduite au 1/10- de sa valeur initiale. L'acétate d'ethyle - (500ml) est distillé sous pression réduite à une temperature inférieure a seC. Ii abandonne un résidu aqueux que l'on amène a 90ml par addition d'eau. La lyophilisation de cette dernière solution fournit un produit sec qui constitue l'extrait destiné aux emplois diététiques et cosmetologiques. Rendement: 9,55g par kg de pépins secs. A titre de comparaison, l'extraction de ces pépins selon une technique conventionnelle incluant un relargage par le chlorure de sodium ne livre que 4,78g d'extrait. Exemple 2. 200g d'écorce de pin des Landes (Pinus maritima) grossierement concassée subissent un traitement identique à celui de l'exemple 1. Le rendement en extrait pour usage diététique et cosmétologique est de 6,07g par kg. Les techniques anciennes avec relargage au chlorure de sodium appliquées à 'la même matière première ont un rendement de 3,0g par kg. En vue d'un usage pharmaceutique, l'extrait lyophilise (5g) est mis en solution dans l'acétate d'éthyle (lOOml). On ajoute à cette solution 200ml de dichlorométhane. Un volumineux précipite de pycnogenols se forme aussit5t. On le recueille par filtration sur verre fritte. Le filtrat, qui entraine les impuretés, est distillé pour recupérer les solvants. Les extraits obtenus selon le procéde de l'inventicn son% des produits pulvérulents, entièrement solubles dans l'eau. Leur richesse en pycnogénols les destine en particulier aux emplois reposant sur un effet capteur envers les radicaux libres oxygénés (cf. J. MASQUELIER, Congres de la Societe de Nutrition et de Dietetique de lar.ngue française, Bordeaux, 26 et 27 septembre 1986 et UCi:DA,S et al., Med. Sci. Res., 1987, 15, 831-832 qui montrent que l'effet antiradicalaire des pycnogenols surpasse de loin celui de tous les capteurs naturels déja connus). L'usage cosmetologique (cremes, gels, solutions, laits corporels, aérosols, sels de bain, capsules...) et l'usage diététiques à titre de complément alimentaire (en nature sous forme de poudres, solutions, tablettes, gelules, granules... ou incorpores à des produits de regime déja existants) constituent donc les emplois majeurs des extraits obtenus selon le procédé. La préparation de médicaments est également possible, en particulier pour des indications dermatologiques. Le test au dithranol (J. MASQUELIER, inédit) montre en effet que les pycnogénols, très actifs in vitro sur les réactions radicalaires, manifestent le même pouvoir dans l'organisme humain. Il consiste à déposer sur la peau, en deux endroits distincts de la face interne de l'avant-bras, 10 microlitres d'une solution de dithranol à 2% dans le chloroforme, sur une aire circulaire de mm de diamètre. On Iaisse évaporer le solvant. Sur l'une des deux surfaces, on dépose 10 microlitres d'une solution alcoolique à 1% de l'extrait à tester. Après 24h, la surface témoin est le siège d'une forte reaction inflammatoire due à la production de radicaux libres oxygenes HiNNEN, M.J. et coll., The Lanzet, nov.!', lg84, p. I2-- 120. La surface traitee par les pycnoenzrs montre une réaction tres fortement atténuese, ou meme une absence d'inflammation, ce aui prouve bien que l'extrait selon ie procéde exerce son pouvoir capteur:n vivo sur l'organisme de l'homme. Un tel resultat n'a jamais pu être démontré objectivement avec les prcduits preccnisés Jusqu'à présent, pour lesquels seuis des tests in vitro fondent les propriétés antiradicalaires. Les radicaux. libres sont incrimines en tant que facteurs pathogéniques du vieillissement, de la senescene et de nombreuses affections medicales et chirurgizales. On sait également (NORDMAN. R., et coll., Bull. Acad. Ntie. Med., 1985, 169, 1201-I2O6) qu'ils sent impi-qués dans les effets toxiques hepaticues et nerveux de i'a'coolisme. Les extraits titres en pycncgencls se-cn le procede permettent d'envisazer une prevention de ces effets, en raison de leur pou':Or_ capteur élevé vis-a-vis des radicaux libres oxygenes. REVENDICATIONS R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Procedé de preparation d'extraits polyphénoliques de type flavane-3-ol purifiés ("pycnogénols") à partir de diverses matières premières végétales, caractérise en ce qu'il comprend les étapes consistant à épuiser la matière végétale brute tout d'abord par l'eau, à filtrer le melange, à centrifuger le filtrat après séjour au froid, a épuiser le surnageant par l'acétate d'éthyle, a séparer la phase organique contenant l'extrait, a distiller cette phase sous pression réduite pour récuperer l'acétate d'éthyle, à reprendre par l'eau le residu aqueux et à lyophiliser la solution aqueuse obtenue, ce qui fournit l'extrait recherché sous forme d'une poudre entièrement soluble dans l'eau. 2. Procéde suivant la revendication 1, caractérisée en ce que l'on effectue l'épuisement par l'eau à une temperature comprise entre 4'C et 100'C et avec une eau distillée ou désionisée dont le pH est inférieur ou égal à 6, en ce que l'on effectue l'épuisement par l'acétate d'éehyle à la température ambiante, et en ce que l'on distille la phase organique, pour récupérer l'acetate d'éthyle, sous un vide tel que la température de distillation ne depasse pas 50'C. 3. Frocede suivant la revendication 1 ou 2, caracter:se en ce que l'eau utiiisee pour l'epuisement par l'eau est additionnee d'une substance reductrice. 4. Procedé suivant la revendication 3, caracaterse en ce que la substance réductrice est le sulfite de sodium. 5. Procede suivant l'une quelconque des revendications i & 4, caractérise en ce que la matiere premiere vegetale est choisie parmi les matières vegetaies suivantes: pépins de raisins; sommitées fleuries d'aubepine; bractées de tilleul; écorce de pin des Landes; feuilles de noisetier; feuilles de ginkgo biloba; ecorce de quinquina; racine de rhubarbe. 6. Procedé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la matière première vegetale est constituée par des pépins enrtiers de raisins, en ce que l'épuisement par l'eau est une infusion effectuée a 80'C sous agitation co-nstante et suivie d'une filtration à chaud. l'eau employee etanr de l'eau distillée ou désionisee, ayant un pH inférieur à e, et additionnee de 0,5g/1 de sulfite acide de sodium, en ce que l'épuisement par l'acétate d'éthyle est effectue dans un extracteur à contre-courant à la temperature ambiante, et en ce que la distillation sous pression reduite des phases organiques surnageantes réunies est effectuée & une température inférieure à 'C. 7. Extrait polyphénolique de type flavane-3ol purifié obtenu par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 & 6. 8. Application de l'extrait suivant la revendication 7 comme constituant de produits cosmétiques, de produits dietetiques et de médicaments.