FR 2644462 A1 19900921 FR 8812441 A 19880923 La présente invention s'inscrit dans le domaine du traitement thérapeutique de la malaria hu- maine, notamment des formes tissulaires. Les 2,5 milliards de personnes vivant dans les zones endémiques o sévit la malaria rappellent l'échec des efforts développés jusqu'à ce jour pour contrôler cette maladie. 400 millions de personnes vi- vent dans des régions o aucune mesure prophylactique n'est appliquée. L'Organisation Mondiale de la Santé (O.M.S.) estime qu'un million d'enfants de moins de cinq ans meurent chaque année de la maladie, et ce, dans le seul continent africain. Il y a quatre espèces de Plasmodies respon- sables de la maladie chez l'homme. Ils présentent un cycle évolutif similaire impliquant un vecteur, un moustique femelle du genre Anopheles et un hôte, l'homme. Plasmodium falciparum (fièvre tertiaire ma- ligne) est le plus redoutable; il est responsable des complications mortelles de la malaria cérébrale et est une des premières causes de la mortalité infantile dans les régions endémiques. Plasmodium vivax et P. ovale (fièvre ter- tiaire bénigne) sont moins virulents, mais ils produisent des formes latentes dans les hépatocytes, les hypno- zoites. Ce sont ces formes qui sont responsables des rechutes classiques pouvant persister durant de longues périodes (deux à cinq ans) après une seule infection. P. malariae est moins répandu; il est responsable de maladies rénales chroniques telles que les néphrites et les syndromes néphrotiques mortels, et peut persister dans le sang pendant plusieurs années. Plus précisément, la présente invention con- cerne la mise au point de nouveaux médicaments actifs sur de la malaria humaine, notamment ses formes tissu- laires, à savoir de nouveaux dérivés d'aminoquinoléine, notamment de nouveaux dérivés de la primaquine dont la structure est la suivante: CH30 Formule I HN-CH-CH-CHiCH2NH2 CH3 Dans la présente demande de brevet, on entend par aminoquinoléine un dérivé de quinoléine présentant au moins une fonction amine libre, particulièrement les 8-aminoquinoléines parmi lesquelles figurent la primaquine E6-méthoxy-8-(4-amino-1-méthylbutylamino)- quinoléine], mais aussi d'autres 8-aminoquinoléines ayant une fonction amine primaire en fin de chaîne latérale tellesque le Quinocide [ 6-méthoxy-8-(4- aminopentylamino)-quinoléinejou le SN 3883 [ 6-méthoxy- 8-{4-aminobutylamino)-quinoléine]. Mais, il existe également d'autres dérivés de la primaquine, dont les modifications portent sur le noyau quinoléine (en position 2,4,2-4,5,4-5) et sur la chaîne latérale (4-amino1-alkylbutylamino) qui sont concernés par la présente invention. Dans les traitements classiques du paludisme les schizontocides tissulaires essentiellement repré- sentés par les 8-aminoquinoléines (primaquine, quino- cide) sont responsables de la prophylaxie causale, à savoir la prévention de l'infection sanguine par la _ destruction des formes tissulaires (exoérythrocytaires) primaires à P. falciparum et du traitement radical par l'élimination des formes tissulaires secondaires de P. vivax et P. ovale. La primaquine, une 6-méthoxy-8- (4-amino-1-méthylbutylamino)-quinoldine de formule I, introduite il y a plus de trente ans, est cliniquement efficace sur les formes tissulaires persistantes de P. vivax et P. ovale chez l'homme et est toujours un médicament de choix. Néanmoins, la toxicité de la primaquine limite son emploi à une application clinique contrôlée. L'effet toxique le plus sérieux est l'hémolyse, particulière- ment pour les individus présentant une déficience géné- tique érythrocytaire, par exemple en glucose-6-phosphate déshydrogénase. La méthaemoglobinurie, les troubles gastro-intestinaux ainsi que certains effets sur le sys- tème nerveux central sont également des effets toxiques significatifs de la primaquine et autres 8-amino-quino- léines. Le nombre de médicaments antimalariques possédant une activité thérapeutique prophylactique cau- sale ou curative radicale est extrêmement limité. La primaquine est le seul médicament pour le traitement curatif radical mais les effets toxiques secondaires en limitent sévèrement l'emploi thérapeutique. Il est à remarquer que seuls les composés appartenant aux familles des 8aminoquinoléines sont susceptibles de produire une guérison radicale. Le but de la présente invention est donc de proposer de nouveaux dérivés de quinoléine antimalarique, notamment de nouveaux dérivés de 8aminoquinoléines possédant un index thérapeutique plus favorable. Autrement dit, le but de la présente invention est da réduire la toxicité intrinsèque desdites quino- leines antimalariques telles que la primaquine et d'aug- menter leur activité, notamment pour la primaquine, sur les formes tissulaires hépatiques. Pour ce faire, la présente invention a pour objet de nouveaux dérivés d'aminoquinoléine antimalarique, notamment de nouveaux dérivés de la primaquine, dont la caractéristique essentielle est qu'ils sont représentés schématiquement par la formule PQ-X, dans laquelle - PQ représente une aminoquinoléine antimalarique, notamment la primaquine, - X représente un amino-acide ou un peptide de 2 à 4 amino-acides, l'amino ou les amino-acides étant choisis parmi les acides aminés naturels et leurs dérivés, l'amino-acide adjacent à PQ n'étant pas la L-leucine, - la liaison PQ-X étant une liaison covalente peptidique entre le groupement amine libre de PQ et un groupement carboxylique de l'anino-acide ou du premier anmino-acide de x. La primaquine agit comme un oxydant et désta- bilise la membrane des globules rouges provoquant une hémolyse qui est à l'origine de sa toxicité principale. L'adjonction d'un amino-acide ou d'un peptide, conformément à la présente invention, réduit la péné- tration de la primaquine dans les globules rouges en raison de l'encombrement stérique. En outre, l'activité de ces nouveaux dérivés est apparue beaucoup plus importante. On a observé éga- lement une baisse notable de la toxicité. Selon la présente invention, on a découvert en outre qu'une condition essentielle supplémentaire de la liaison covalente entre PQ et X est que celle-ci doit être stable dans le sérum et résistante aux hydrolases lyposomiales pour que le bénéfice de l'acide aminé ou du peptide puisse jouer pleinement. On notera que la L-leucine liée à la primaquine a été proposée dans la demande EP 37 388 compte tenu de son intérêt en tant que linker ou bras et donc dans le cadre de conjugué vecteur-bras-drogue. En effet, la Lleucyl-primaquine régénère le principe actif libre une fois soumis à la digestion lyposomiale. Toutefois, l'index thérapeutique des dérivés de PQ avec la L-leucine adjacente non conjuguée s'avère moins intéressant que ceux des dérivés qui font l'objet de la présente inven- tion. Avantageusement, l'amino-acide ou le premier amino-acide de peptide est l'acide L-gammaglutamique, lié à PQ par son groupement gammacarboxyle, ou l'acide L-pyroglutamique. Dans un mode de réalisation préférentiel, la présente invention a pour objet de nouveaux dérivés de la primaquine, dont la caractéristique essentielle est qu'ils sont représentés schématiquement par la formule PQ-X, dans laquelle: - PQ représente une aminoquinoléine antimalarique, notamment la primaquine; - X représente un acide aminé, l'acide L-gammaglutamique ou l'acide L-pyroglutamique; - la liaison PQ-X étant une liaison covalente peptidique entre le groupement aminé libre de la primaquine et le groupement carboxylique de X, stable dans le sérum et résistante aux hydrolases lysosomiales. Il s'agit donc des N-"-L-pyroglutamyl-PQ et N-Y-L-glutamyl-PQ. Il doit être bien entendu que le produit de base aminoquinoléine (PQ) peut être également substitué sans sortir du cadre de protection de la présente in- vention, pourvu qu'il comprenne une chaîne latérale aminée sur laquelle peuvent être greffés un ou plu- sieurs aminoacides (X), conformément à la présente in- vention. Les produits de base PQ ainsi que les pro- duits obtenus PQ-X peuvent se présenter sous forme de leurs sels d'addition avec des acides. La présente invention a également pour objet an procédé de préparation de ces nouveaux dérivés d'aminoquinoléine antimalarique, notamment des nouveaux dérivés de primaquine. Dans la caractéristique essentielle du pro- cédé selon la présente invention, on fait réagir par condensation un aminoacide ou un peptide sous forme acide, dont les fonctions amine, et le cas échéant la fonction carboxyle X, sont éventuellement protégées avec 2 l'aminoquinoléine ou un de ses sels protant donc une fonction amine libre, en présence d'un agent de condensa- tion. Les groupements protecteurs des fonctions amine sont des groupements classiques, mais de préférence on utilise le tertiobutyloxycarbonyle ou le benzyloxy- carbonyle. Les groupements protecteurs de la fonction carboxyle c sont des groupements classiques, tels que le ter-butyleaou le benzyle. 3G La fonction acide de l'aminoacide ou du peptide peut aussi être activée par exemple sous forme d'ester avec le N-hydroxysuccinimide. En général, l'agent de condensation est un carbodiimide comme le dicyclohexylcarbodiimide. Selon un mode de réalisation particulier du procédé, on part d'un sel d'aminoquinoléine, par exemple du diphosphate de primaquine et de l'acide aminé ou peptide dont la fonction aminée, et le c=s échéant la fonction carboxyles, sont éventuellement protégées par exemple par un groupe terbutyloxycarbonyle ou benzyloxycarbonyle pour la fonction aminé et le ter- butyleou benzylepour la fonction carbonyle >et on effectue les étapes suivantes: a) on fait réagir de la N-hydroxysuccinimide ou tout autre groupe activant la fonction acide non protégée de l'acide aminé ou du peptide, sur le dérivé éventuellement protégé de l'acide aminé ou peptide, b) on fait réagir l'aminoquinoléine, telle que la pri- maquine, libérée à partir de son sel par exemple par une solution d'ammoniaque, on la fait réagir donc avec par exemple l'ester Nhydroxysuccinimide du dérivé protégé de l'acide aminé ou peptide, c) le produit brut ainsi obtenu est purifié par chroma- tographie sut silicagel, d) les groupements protecteurs le cas échéant sont ensuite clivés en présence d'acide, par exemple l'acide trifluoroacétique pour donner le dérivé PQ-X sous forme de sel par exemple trifluoroacétate, ou sont clivés par hydrogénolyse. Ce groupement peut en effet être éliminé dans des conditions qui ne détruisent pas la liaison peptidique formée. Selon une autre caractéristique particulière du procédé, le contre anion trifluoroacétate est échangé en chlorhydrate ou phosphate. Dans le but d'inhiber les réactions d'oxy- dation, une autre caractéristique particulière du procédé prévoit que la solution aqueuse contenant le sel de chlorhydrate de dérivés selon la présente invention est traitée par du bisulfite de sodium. On peut préparer un dérivé PQ-X dans lequel X représente l'acide L pyroglutamyl,en transformant un estere. Y de l'acide L glutamiqtueen Ncarboxyanhydride, la réaction étant effectuée en présence de phosgène, lequel dérivé N-carboxyanhydride est couplé à PQ par réaction à 0 C dans le THF pour donner le dérivé L- pyroglutanyl-PQ. Avantageusement, l'ester de l'acide L gluta- mique est le gamma méthyl glutamate ou le gamma benzyl glutamate. La présente invention a également pour objet les composition pharmaceutiques contenant à titre de principe actif les nouveaux dérivés selon la présente invention ou leurs sels pharmaceutiquement acceptables. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre, faite en référence à la figure 1 qui repré- sente deux voies de synthèse du dérivé N-$-L pyroglutamyl- primaquine. EXEMPLE 1: SYNTHESE DES DERIVES DE LA PRIfAQUINE 1. Synthése de la N-4-L-pyroglutamyl-primaquine (pGLU-PQ) Le dérivé acide pyroglutamique de la primaquine (PQ) est obtenu selon deux voies, A et B, par condensation de la PQ soit à l'acide pyroglutamique (voie A), soit à un ester activé de l'acide glutamique (voie B). Les deux voies de synthèse sont présentées schématiquement à la figure 1. Ce composé est obtenu sous forme base (P.M.: 370,43) d'un sel monochlorhydrate (P.M.: 406,89) et d'un sel monophosphate (P.M.: 468,44). 1.1. Synthèse selon la voie A: Le dérivé acide pyroglutamique de la PQ est obtenu en deux étapes à partir de la PQ diphosphate et de l'acide pyroglutamique. a) Primaquine base La PQ sous sa forme libre est obtenue à partir de la PQ diphos- phate en neutralisant la solution aqueuse contenant le sel de PQ par NH4OH 25% jusqu'à obtention d'un pH de 8 puis extraction vigoureuse de la PQ base par CH2Cl2. b) Activation de l'acide pyroglutamique L'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide L-pyroglutamique est obtenu par réaction de l'acide pyroglutamique, dissous dans le diméthylformamide ou DMF (1 gr dans 5 ml), avec un équivalent de N-hydroxysuccinimide (891 mgr) et un équivalent de dicyclo- hexylcarbodiimide (1,6 gr). Le mélange est agité à 40C pendant 16 heures. c) L-pyroglutamyl-primaquine La primaquine base est dissoute dans un minimum de CH2Cl2 et 2 2 est ajoutée à l'ester activé à 4"C. Le mélange réactionnel est agité à 4"C pendant 16 heures. La dicyclohexyl urée est filtrée et les solvants sont évaporés. Le brut de réaction est repris alors dans du CH2C12 et est lavé trois fois avec une solution de NaHCO3 5Z puis trois fois par une solution saturée en NaCl. La phase dichloromé- thane est séchée sur Na2S04, filtrée et evaporée à sec. Le produit est élué par le mélange dichlorométhane-méthanol/ -5. Les fractions pures sont rassemblées et les solvants sont évaporés. 1,36 gr de L-pyroglutamyl primaquine sont alors isolés (rendement 47,5Z). 1.2. Svnthèse selon la voie B: a) Primaquine base La PQ sous sa forme libre est obtenue à partir de la PQ diphosphate en neutralisant la solution aqueuse contenant le sel de PQ (9,1 gr dans 100 ml) par l'équivalent de NaOH 1 Molaire (20 mi). Le pH de la solution finale est compris entre 9,5 et 10. La PQ base est alors extraite au CH2Ci12 (3 X 100 ml). Les phases organiques sont rassembées, séchées par entraînement au toluène ou au tétrahydrofurane (TIF). b) La dérivatisation en N-carboxyanhydride (NCA) o 1à R tOC_-CH-_CEh- I CR i-C^' RH '--' C H.C d R- ffO' lI OJl o.., NH2 C R. OCH3) OCH Có H5 La dérivatisation de l'acide aminé en N-carboxyanhydride est effectuée par la réaction de l'acide aminé avec le phosgène. Plus précisément, 10 gr de gazmma méthyl glutamate sont mis en suspension dans 20 ml de THF sec (reflux sur sodium en présence de benzophérone). D'autre part, une solution de phogène dans le THF est préparée au départ de phosgène gazeux condensé à basse température et de THF. La solution de phosgène (40 ml - 2,75 M) est alors ajoutée à la suspension de l'acide aminé dans le THF via un capillaire et avec une surpression en azote. L'appareil est alors équipé d'un réfrigérant à carboglace, lui-même connecté à deux trappes vides en série, suivi d'un tube plongé dans une solution concentrée de NaOH (capture du phosgène en excès). Le mélange réactionnel est porté à la tem- pérature de reflux. Cette température est maintenue jusqu'à la dissolution complète de l'acide aminé, soit 2 heures et demi. Les solvants sont évaporés à sec sous vide et à l'abri de l'humidité atmosphérique. Le N-carboxyanhydride est obtenu sous la forme d'une poudre blanche. Le NCA est éventuellement cristallisé par dissolution dans l'acétate d'éthyle (sec) chaud, addition d'un même volume d'éther de pétrole (sec) et refroidissement. c) Réaction de couplage Le dérivé NCA, dissous dans le tétrahydrofurane THF (sec), est perfusé lentement (3 heures) dans une solution de primaquine base dans le THF à sec à 0 C. Du CO2 se dégage du mélange de réaction, indiquant l'ouverture du cycle NCA. Le CO2 est dosé par la formation de BaCO3 lors du passage des dégagements gazeux dans une solution d'hydroxyde de borium. Après réaction, le solvant est évaporé à sec et le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur SiO, (CH2C12 - MeOH). 1.3. Formation des sels: 1 Sel de chlorhydrate La pglu-PQ est dissoute dans l'eau en présence de deux équi- valents d'acide chlorhydrique et lyophilisé. L'opération est répétée une seconde fois. 2 Sel de phosphate La pglu-PQ est dissoute dans de l'isopropanol et est ajoutée à un équivalent d'acide phosphorique dissous dans de l'iso- propanol (1,5% poids/volume). Le sel ne précipite pas dans ces conditions. Le solvant est évaporé et le sel est repris dans l'eau et lyophilisé. 1.4. Propriétés physiques et chimiques: 1.4.1. L-yroglutamyl-PQ Pureté par TLC Système: CH2C12/leOH (10/1 en volume) Plaques: Si-60 Rf: 0,26 Pureté par TLC: un seul spot Pureté par HPLC Colonne: silice greffée C8 (Waters). Eluant: mélange formiate d'ammonium 0,1 M pH 3,85/acétonitrile (70:30 en volume). Détecteur: U.V. à 363 nm Débit: 2 ml/min tR 4,8 min Pureté par HPLC: usuellement > 99Z en surface; solution lmgr/ml dans du tampon formiate d'ammonium 0,1 M pHli 3,85. Point de fusion: N.D. Pouvoir rotatoire: N.D. Stabilité: la pGLU-PQ est: 25. instable à te ambiante et à l'air; stable à t ambiante sous athmosphère inerte (argon) Résonnance magnétique nucléaire: RMN 1H: (CDC13 - TMS) IRHN 13C: (CDC13 - la raie centrale du CDCl3 servant de r 3frence 77300 ppm). référence 77.00 ppm). 179.198 (c-5 pglu); 172.233 (e-1 pglu); 159.152 (c-6 PQ); 144.640 (c-8 PQ) ; 144.106 (c-2 PQ); 135.022 (c-8a PQ); 134.696 (c-4 PQ); 129.704 (c-4a PQ) ; 121.709 (c-3 PQ); 96.647 (e-7 PQ); 91.507 (c-5 PQ); 56.985 (c-2 pglu); 54.978 (6-0CH3 PQ); 47.589 (c-l' PQ); 39.248 (c-4' PQ); 33.539 (c-2' PQ); 29.147 (c-4 pglu); 25.523 (c-3 pglu); 20.246 (c-5' PQ). Infra-roLuge: cm (%) 3386 (49%) broad; 1.684 (45%) broad; 1521 (45%); 1457 (51%); 1387 (49%); 1220 (54%); 1158 (53%); 822 (56%); 792 (56%); 668 (52%). Masse: FAB +: 371.2 (M +1) 175.1 (c10 H1iN20)+ FAB -: 369.1 (M - 1)+ 2. Synthèse de la N-d-L-glutamyl-primaouine (gGLU-PQ) Le dérivé acide eglutamique de la primaquine est obtenu selon la voie de synthèse décrite ci-dessous, sous forme d'un sel dichlor- hydrate (P.M. 388,45 + 72,92 - 461,38) et d'un sel monophosphate (P.M.: 468,44). 2.1. Synthèse Le dérivé acide glutamique de la PQ est obtenu en deux étapes à partir de la PQ diphosphate et de l'acide L-glutamique dont la fonction aminée est protégée soit par un groupe de tertbutyloxy- carbonyle (N-d-t-BOC), soit par un groupe benzyloxycarbonyle (N-*-CDZ). La fonction (-carboxyle est protégée soit par un groupe t-butyle, soit par un groupe benzyle. a) Primaquine base La primaquine sous sa forme libre est obtenue à partir de la PQ diphosphate en neutralisant la solution aqueuse contenant le sel de PQ par NH4OH 25% jusqu'à obtention d'un pH de 8 puis extraction vigoureuse de la PQ base par CH2C12. b) Activation de l'amino-acide protégé L'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide glutamique protégé est obtenu par réaction de 5,9 mM de la N-"-tBOC-L-GLU-Z-t-butyle (1,8 gr) - ou de la N-o-cbz-L-Glu-0-o-benzyle - avec 5,9 mM de N-OH-succinimide (0,68 gr) et 5,9 mM de dicyclohexylcarbodiimide (1,21 gr) dissous à 0 C dans de l'acétate d'éthyle. c) N-4-t-BOC-L-Glutamyl-PQ Après 16 heures de réaction entre l'acide glutamique protégé et la NHS à 0eC, on ajoute 5,9 mmoles (1,53 gr) de PQ base. Après 17 heures, la dicyclohexylurée est filtrée et le solvant chassé sous vide. L'huile brune obtenue est dissoute dans le CH2C12 et lavée à l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée. Le produit est purifié sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange dichorométhane-méthanol. Les fractions pures sont rassemblées et l'éluant évaporé con- duit à un produit plus ou moins cristallin. Rendement: 65%. d) Déprotection 1 Déprotection à l'acide trifluoroacétique et formation du sel d'hydrochlorure. Le composé obtenu précédemment est dissous dans 45 ml d'un mélange 1:1 de dichlorométhane et d'acide trifluoracétique. Le mélange est agité 4 heures à température ambiante. Les solvants sont évaporés sous vide et le résidu est repris dans de l'eau et lavé plusieurs fois au mélange acétate d'éthyle-éther (50:50 en volume). La phase aqueuse est récupérée et lyophilisée. La poudre jaune-orange est reprise dans l'eau et on ajoute deux équivalents d'acide chlorhydrique 0, 5 N. La solution ainsi obtenue est alors lyophilisée. Le cycle est répété deux fois. Le sel de chlorhydrate est isolé et gardé sous argon. 2 Déprotection par hydrogénolyse et formation du sel phosphate. La N- -cbz->-o-benzyl-L-Glutamyl-Primaquine obtenue précé- demment est dissoute dans de l'acétate d'éthyle (100 ml pour 0,01 mole). La solution est complétée par de l'éthanol absolu (150 ml). Le ballon d'un litre est alors purgé à l'argon. L'hydrogène est introduit après avoir mis le ballon sous vide. Le cycle vide-hydrogène est répété deux fois. La pression en hydrogène est portée à 20 Psi. Après 2 et 4 heures de réaction, le ballon est mis sous vide puis rempli d'hydrogène jusqu'à une pression de 20 Psi. Après 6 ou 7 heures de réaction, l'hydrogène est chassé sous vide et les solvants sont évaporés. La gaAm-glutamyl-prima- quine est séchée sous vide pendant 16 heures. Rendement: 100%. Formation du sel de hosphate La L--glutamyl-primaquine (0,01 mole) est dissoute dans ml d'éthanol et 10 ml d'acétate d'éthyle. Ce mélange est ajouté à une solution d'acide phosphorique (Merck 573; qualité pour analyse: 85Z dans l'isopropanol). Le volume est porté à 250 ml et le précipité est agité pendant I heure. Le précipité est filtré sur membrane Nilli- pore FH sous argon. Le produit est rincé deux fois avec de l'isopropanol, transvasé dans un ballon et séché sous vide +/- 20 heures. 4,4 gr de phosphate de L-a-glutamyl-primaquine sont ainsi isolés (90Z). 2.2. Propriétés physiques et chimiques 2.2.1. Lammna&lutaml-Primaquine Pureté par TLC Système: CH2C12/MeOH (18/2, en volume). Plaques: Si-60 Rf: 0,15 Pureté par TLC: un seul spot Pureté par HPLC Colonne: silice greffée C8 Eluant: mélange formiate d'ammonium 0,1 M pH 3, 85/acétonitrile (70:30 en volume). Détecteur: U.V. à 363 nm Débit: 2 ml/min tR: 2,2 min Pureté par HPLC: usuellement > 99% Point de fusion: N.D. *Pouvoir rotatoire: N.D. Stabilité: la gGLU-PQ est: instable à t ambiante et à l'air; 30. stable à t0 ambiante sous atmosphère inerte (argon). Résonnance magnétique nucléaire: RMN 'R: (CDcl3 - TMS) N.D. RMN 13c: (CDcl - la raie centrale du CDcl3 servant de 3 3 référence à 77.00 ppm). Infra-rouge Masse 2.2.2. L-ganmaZiutamyLn primaquine. hydrochlorure Pureté par HPLC: Usuellement > 99Z Conditions identiques à celles de 4.2.2.1. 2.2.3. L:!magllaml _Erimaquine phosphate Pureté par RPLC: Usuellement > 99Z Conditions identiques à celles de 4.2.2.1. EXEMPLE 2: ETUDE EXPERIMENTALELN VITRO 1. Stabilité en présence de sérum 1.1. Protocole L'influence du sérum sur la stabilité de la primaquine (PQ) et ses dérivés est déterminée en incubant ceux-ci à 37 C à la con- centration de 100 mg/ml dans 95% de sérum foetal de veau (SFV, Flow Laboratories), ou du sérum humain et du tampon phosphate salin (PBS 0,15 M, pH 7,2) comme contr6le. Toutes les solutions sont stérilisées par filtration sur filtre Millipore (Millex GV) de 0,20 pm de porosité. Au cours du temps, des échantillons de 1 ml sont prélevés puis extraits des protéines sériques par précipitation à l'acétonitrile. Pour ce faire, on ajoute à chaque échantillon un volume identique d'acétonitrile. Après mélange vigoureux au Vortex, les échantillons sont laissés 1 heure à 4 C et à l'abri de la lumière puis centri- fugés 5 minutes à 12.000 g. Les surnageants sont recueillis puis analysés par HPLC (aliquot de 20 à 50 mi) dans les conditions standard. 1.2. Résultats Les résultats de la stabilité de la primaquine et de ses deux dérivés en présence de sérum foetal de veau sont repris au tableau 1; les résultats sont exprimés en % de la concentration initiale (temps 0) après extraction. En présence de sérum, la primaquine est instable; elle se dégrade progressivement pour atteindre 7Z après 24 heures. Dans les con- ditions expérimentales utilisées, on observe un second pic (Y) en HPLC (tr: 4,2 minutes) après 2 heures d'incubation, ne dépassant toutefois pas 10Z. Tableau 1: Stabilité de la primaquine et de ses dérivés amino- acides en présence de sérum foetal de veau. a b COMPOSES a TEMPS D'INCUBATION (heures) 0 I 2 3 6 24 48 Primaquine PQ 100(2) 98(12) 87(9) 77(6) 34(4) 2 - Y 0 0 5 10 11 5 - gGLU-PQ PQX 98(1) 96(3) 95(8) 94(6) 83(3) 51(4) - PQ 2(1) 3(0) 4(2) 4(2) 4(1) 4(3) - pGLU-PQ PQX 100(0) 100(2) 101(3) 105(4) 103(6) 107(10) 87 PQ 0 0 0 0 0 0 0 a: les composés sont incubés à 37 C en présence de sérum foetal de veau (95% final) puis analysés par spectrophotométrie après HPLC. La pureté initiale des composés, déterminée par HPLC, est respec- tivement de 99,5Z, 98,6Z et 99,5Z. b : les résultats représentent la concentration relative en primaquine (PQ) et en dérivés (PQ-X) en fonction du temps d'incubation, exprimée en pourcentage de la concentration initiale (temps O) après extraction (moyenne +/- déviation standard; n = 4, PQ; _- n - 2, gGLU-PQ et n - 4, pGLU-PQ). La gGLU-PQ est stable pendant au moins 3 heures, puis une diminu- tion progressive de la concentration relative est observée après 6 heures d'incubation, sans augmentation significative de la concentration en PQ. La pGLU ne subit aucune modification au cours de son incubation dans le sérum. Les deux dérivés ne régé- nèrent pas de primaquine en présence de sérum après 24 heures ou 48 heures d'incubation. Des résultats similaires sont obtenus lors d'une incubation des composés en présence de sérum humain. Dans une solution tamponnée (PBS), les composés sont stables, sans aucune modification spec- trale significative après 24 heures. Les résultats obtenus montrent que la liaison covalente entre l'acide aminé et la primaquine est stable et résistante aux enzymes sériques. 2. Hydrolyse en présence d'enzymes lysosomiales 2.1. Protocole: Les composés, à une concentration finale de 15 pg/ml, sont incubés dans du tampon acétate 50 mM pH 4,5 à 37 C en présence de cystéine mM et d'une fraction d'enzymes lysosomiales (0,15 mg protéine/ ml), purifiée à partir de foies de rat. La fraction lysosomiale purifiée est préparée selon la méthode décrite par Trouet (1974, Méth. Enzymol., 31, 323-334). Au cours du temps, les échantillons correspondants sont retirés de l'incubation. La réaction enzymatique est arrêtée en ajoutant 4l d'HCl 10 M par ml d'échantillon. Un volume de 20 pl est prélevé et analysé directement par HPLC dans les conditions _- standard. 2.2. Résultats: L'effet des hydrolases lysosomiales à pH 4,5 sur la PQ et ses dérivés est présenté au tableau 2 ci-dessus. Tableau 2: Hydrolyse lysosomiale de. la primaquine et de ses dérivés amino-acides. i a b COMPOSES TEMPS D'INCUBATION (heures) 0 1 2 3 6 24 48 Primaquine 100 94 96 84 87 68 gGLU-PQ PQX 100 104 95 98 101 105 - PQ 0 0 0 0 0 0 - pGLU-PQ PQX 99 94 97 97 96 76 47 PQ 1 0 0 0 0 0 0 a: les composés sont incubés à pH 4,5 en présence d'enzymes lysoso- miales (0,15 mg protéine/ml) et de 5 mM cystéine, puis analysés par spectrophotométrie après HPLC. La pureté initiale des composés, déterminée par HPLC, est respectivement de 99,5Z, 99,7% et 98,8%. b : les résultats représentent la concentration relative en primaquine (PQ) et dérivés (PQX) en fonction du temps d'incubation, exprimée en pourcentage de la concentration initiale (temps 0) après extrac- tion. En présence d'enzymes lysosomiales, les deux dérivés de la prima- quine ne régénèrent pas la primaquine parentale après 24 ou 48 heures d'incubation. La liaison covalente entre l'acide aminé et la chaîne latérale de la PQ est résistante à l'hydrolyse lysosomiale. On observe toute- fois une diminution progressive de la concentration relative en PQ, atteignant 68% après 24 heures, sans apparition d'un nouveau pic en HPLC. Le même phénomène est également observé dans le cas de la pGLU-PQ apparaissant seulement après 6 heures d!incubation. 3. Perméabilité des érythrocytes humaines à la primaquine et dérivés 3.1. Protocole: Du sang humain frais (A+) sur CPDA est lavé deux fois dans du milieu RPMI contenant 20 mM de glucose à pH 7,4, puis resuspendu dans le même milieu à 37 C pour obtenir une suspension à 20% de globules rouges (2 109 érythrocytes/ml). A 1 ml de cette suspen- sion, on ajoute 1 ml d'une solution de PQ ou de dérivés à 0,250 mM dans le même milieu à 37 C. Après différents temps d'incubation à 37 C, 0,5 ml d'échantillon est prélevé puis transféré dans un tube Eppendorf contenant 0,4 ml d'huile de silicone (Merck, densité 1,06 g/ml). Après centrifugation pendant 30 secondes à 12.000 g, le surnageant et l'huile de silicone sont éliminés, tandis que les cellules du culot sont lysées en ajoutant 0,5 ml d'eau. Le composé quinolé- inique associé au lysat cellulaire est ensuite extrait par précipi- tation des protéines cellulaires à l'acétonitrile (0,5 ml), puis analysé par HPLC dans les conditions standard. La concentration intracellulaire en dérivé quinoléique est obtenue en soustrayant de la concentration totale dans le lysat cellulaire, la concentration en composé présent dans le milieu extracellulaire. Le volume extracellulaire contaminant est évalué à l'aide d'inuline tritiée. 3.2. Résultats: La PQ est captée rapidement par les érythrocytes (tableau 3). Après 5 minutes d'incubation, 18Z de la PQ présente dans le milieu extracellulaire se retrouve dans les globules rouges et cette con- centration se maintient pendant au moins une heure. La gGLU-PQ n'est pas accumulée dans les érythrocytes. La pGLU-PQ s'accumule plus lentement que la PQ; le taux maximal est atteint après 60 minutes et la concentration est similaire à celle de la PQ. Tableau 3: Perméabilité des globules rouges humaines à la primaquine et dérivés amino-acides COMPOSES a CONCENTRATION b (% concentration initiale) min. 10 min. 60 min. Primaquine 17,7 (1.2) 18,0 (3.4) 18,8 (0,2) gGLU-PQ 0c O O pGLU-PQ 13,8 16,9 17,8 : les composés sont incubés à une concentration finale de 100 mg/ ml en présence de globules rouges humaines à la densité de 109 érythrocytes/ml. : les résultats représentent la concentration en composés associée aux érythrocytes et exprimée en pourcentage de la concentration initiale (moyenne +/- déviation standard, n = 4 échantillons). c: composé non détectable dans les conditions d'analyse utilisées (seuil de détection = 50 ng). 4. Effet hémolytique et production de méthémoglobuline Deux des effets toxiques importants de la PQ ont été évalués sur les deux dérivés: l'effet hémolytique et la transformation de l'hémoglobine en méthémoglobine. Le bilan en glutathion (forme réduite et oxydée), intervenant dans le mécanisme de défense de la cellule contre les agents oxydants, a également été étudié. 4.1. Protocole: Du sang A+ est lavé deux fois dans du tampon phosphate salin 0,15 M à pH 7,4 contenant 20 mM de glucose (GPBS), puis resus- pendu à 50% dans le même tampon. A cette suspension, on ajoute un volume égal de composé en solution dans du GPBS à différentes concentrations (test) ou de GPBS (contr5le). L'hématocrite finale de la suspension est de 25%. Après 60 minutes d'incubation à 37 C, on détermine la concentration en hémoglobine et méthémoglobine sur la suspension totale ainsi que la concentration en hémoglo- bine présente dans le surnageant après centrifugation (hémoglo- bine extracellulaire) par les méthodes à la cyanméthémoglobine et à la benzidine (Fairbanks V.F., 1976, in "Fundamentals of Clinical Chemistry, M.W. Tietz Editors, Saunders").La teneur en glutathion réduite (GSM) et oxydée (GSSG) est évaluée sur la suspension de globules rouges par la méthode fluorimétrique de Hissin P.J. et Hilf R. (1976, Anal. Biochem., 74, 214-226). 4.2. Résultats Le tableau 4 représente l'hémolyse, c'est-à-dire la concentration en hémoglobine extracellulaire après 60 minutes d'incubation des érythrocytes en présence de la PQ et de ses dérivés. La PQ a un effet hémolytique dépendant de la concentration, 4,7% des globules rouges étant lysés après 1 heure en présence de mN de PQ. L'effet hémolytique est également fonction du temps d'incubation (résultat non montré). Les dérivés ont une activité hémolytique comparable à celle de la PQ, représentant à la concentration de 5 mM, une hémolyse de deux fois celle des contrBles. En ce qui concerne la production de méthémoglobine, celle-ci dépend également de la concentration en dérivé aminoquinoléique. Dans le cas de la PQ, 11,5Z d'hémoglobine sont oxydés en méthé- moglobine quand les érythrocytes sont en présence de 10 mM de PQ pendant 1 heure (tableau 4). En présence de la même concentration en dérivé, l'oxydation de l'hémoglobine est similaire à celle de la PQ pour la gGLU-PQ et 1,5 fois moindre pour la pGLU-PQ. Tableau 4: Effet sur les globules rouges humains de la primaquine et de ses dérivés amino-acides. COMPSESa b COMPOSES a CONCENTRATION HEMOLYSE- METHEMOGLOBINE b (mM) (%) (%) Primaquine 0 (T 0) 1,3 (0,6) 1,3 (0,8) 0 (T 1) 1,6 (0,4) 1,4 (0,9) 1 2,1 (1,0) 1,2 (0,5) 2 2,3 (1,1) 3,4 (1,8). 2,8 (I,2) 5,8 (0,2) 4,7 (1,7) 11,5 (4,2) gGLU-PQ O (T 0) 0,20 (0,1) 1,2 (0,8) 0 (T 1) 0,22 (0,05) 1,0 (0,6) 1 0,27 (0,03) 1,4 (0,0) 2 - 0,58 (0,05) 5,3 (0,0) - pGLU-PO 0 (T 0) 0,22 (0,02) 1,2 (0,8) 0 (T 1) 0,35 (0,03) 1,0 (0,6) 1 0,32 (0,06) 0,9 (0,1) 2 0,24 (0,02) 2,2 (0,9) 5 0,44 (0,02) 3,9 (0,0) 2,34 (0,06) -6,0 (0,2) a les composés, à différentes concentrations, sont incubés 1 heure à 37"C en présence de globules rouges humaines (hématocrite de 25%). Témoin sans composé au temps O (T 0) et après 1 heure d'incubation (T 1). : les résultats représentent la concentration en hémoglobine extra- cellulaire (hémolyse) et en méthémoglobine (hémoglobine oxydée), exprimée en Z de la concentration en hémoglobine totale respective à chaque échantillon (moyenne +/- déviation standard; n = 3 pour la PQ et n - 3 pour la gGLU-PQ et pGLU-PQ).). La concentration en glutathion réduit et oxydé après incubation des globules rouges avec la PQ et ses dérivés, est présentée au tableau 5. EXEMPLE 3: TOXICITE EXPERIIENTALE CHEZ L rANLMAL La toxicité aigUe en fonction de la dose unique administrée est déterminée sur des souris Swiss OF1 femelles de 22 à 25 g. Une série de dilutions de chaque composé est injectée par voie intra- veineuse à des groupes de 10 souris (0,1 mi par 10 gr de poids). La dose léthale pour 50% des souris (LD50) est déterminée par régression linéaire des logits du pourcentage des animaux survi- vants, en fonction du logarithme de la dose injectée (en mg PQ diphosphate équivalent/kg) (Logit Weighted Transformation, Berkson J., 1953; J. Am. Stat. Assoc. 48, 565-599). Les résultats repris au tableau 6 montrent que la dose maximale tolérée (MTD), définie comme étant la dose la plus élevée indui- sant une perte de poids inférieure ou égale à 5% du poids initial pendant une période de 5 jours suivant l'injection i.v., est de 24 mg/kg pour la PQ, 80 mg/kg pour la gGLU-PQ et 126 mg/kg pour la pGLU-PQ. La dose tuant 50% des animaux (LD50) après injection i.v. unique est de 31 mg/kg pour la PQ et respectivement de 100 mg/kg et 159 mg/ kg pour le dérivé gGLU-PQ et pGLU-PQ. Tableau 6: Toxicité aig e comparée de la primaquine et de ses dérivés chez la souris après administration i.v. unique. PRODUITa bTD LD C (mg/kg) (mg9kg) Primaquine 24 (2.1) 31 (0.7) gGLU-PQ +/80 +/- 100 pGLU-PQ 126 (13) 159 (6) a : les produits sont administrés par voie i.v. à des groupes de souris Swiss OF1 femelles de 22 à 25 gr, à raison de 5 doses par produit. b : dose maximale tolérée (MTD), définie comme étant la dose la plus élevée induisant une perte de poids inférieure ou égale à 5% du poids initial pendant une période de 5 jours suivant l'injection i.v. c: dose léthale pour 50% des souris après administration i.v. unique. :dose léthale pour 50% des souris après administration i.v. unique. EXEMPLE 4 ACTIVITE ANTIIALARIQUE CHEZ L'ANIMAL I. Protocole La pkimaquine et ses dérivés sont essayés dans le modèle de la malaria chez le rongeur utilisant l'infection de la souris par Plasmodium berghei, les sporozoites provenant de moustiques Anopheles stephensi infectés. Ce modèle, mis au point par Most H., Herman R. & Schoenfeld C. (1967), Am. J. Trop. Med. Hyg. I6, 572-575, permet de déterminer l'activité prophylactique causale (schizontocide tissulaire) de nouveaux composés thérapeutiques. La procédure utilisée est dérivée de celle de Most H. & Montuori W.A. (1975), Am. J. Trop. Med. Hyg. 24, 179-182. Il s'agit du système P. berghei berghei (ANKA) - Anopheles stephensi - souris Swiss OF1. La souche ANKA de P.b. berghei est entretenue cycliquement sur Anopheles stephensi. La souche de souris Swiss OF1 est particulière- ment sensible à P.b. berghei qui produit une infection toujours mortelle. - 1.1. Isolement des sporozoites des moustiques et infection expérimentale Les moustiques femelles (80 à 100 individus par préparation) sont débarassés de leurs pattes, ailes et abdomen, puis homogénéisés à 4 C à l'aide d'un potter en verre, dans du milieu MEM (GIBCO) contenant 10% de sérum foetal de veau. La suspension de sporozoltes est ensuite purifiée des débris du moustique par deux centrifuga- tions successives (2 min. à 50 g et 5 min. à'200 g) et le surnageant recueilli est conservé à 4 C. Après comptage dans une chambre de PetroffHausser, le nombre de parasites est ajusté par dilution avec le mîme milieu froid, à la densité de 2 X 105 sporozoltes/ml. L'effet résiduel éventuel des médicaments sur les premières formes érythrocytaires (effet schizontocide érythrocytaire) est déterminé par la méthode de Gregory K.G. & Peters W. (Ann. Trop. Med. Para- sitol., 1970, 64, 15-24), basée sur le test des 2Z de Warhurst. L'activité prophylactique causale des composés soit la dose permet- tant de guérir 50Z des animaux infectés (CPD50) est obtenue par l'analyse des logits de la réponse (exprimée en Z de LTS) en fonc- tion de la dose (mg PQ/kg). 2. Activité thérapeutique chez l'animal Les animaux infectés à l'aide de sporozoltes de P. berghei sont traités trois heures plus tard avec une seule injection des composés par voie i.v. Ce test permet de définir l'activité prophylactique causale des composés, soit la dose permettant de guérir 50% des animaux infectés (CPD50). La dose est toujours exprimée en mg de PQ diphosphate par kg. Les résultats de l'activité prophylactique causale (+ trois heures) de la primaquine et de ses deux dérivés amino-acides sont présentés au tableau 7. Ils indiquent clairement que les deux dérivés sont plus actifs que la PQ, la dose induisant la guérison de 50% des *25 animaux (CPD50) étant 22 fois moindre pour la gGLU-PQ et 1,9 fois pour la pGLU-PQ que pour la PQ. La dose minimale effective des deux dérivés est égalepent moins élevée que celle de la PQ. Tandis que la dose totalement curative ne peut être atteinte en une seule injection pour la PQ, en raison de sa toxicité (DEio0 de la PQ estimée à 54 mg/kg), celle de la gGLU-PQ et de la pGLU-PQ sont atteintes respectivement à 24 mg/kg et 22 mg/kg. L'ensemble de la procédure est toujours effectué dans un maximum de 35 minutes et permet de préserver la viabilité et l'infectivité des sporozoites. Un volume de 0,5 ml de la suspension conentant 105 sporozoites est injecté i.v. aux souris Swiss OF1 femelles de 20 à 25 g utilisées pour les tests thérapeutiques. 1.2. Traitements chimiothérapeutiques Des groupes de 20 à 25 souris infectées comme décrit ci-dessus sont traitées en une seule injection intraveineuse de primaquine diphosphate (PQ) ou de ses deux dérivés sous forme chlorhydrate trois heures après l'inoculation des sporozoltes. Le volume injecté est ajusté en fonction du poids de la souris, à raison de 0,25 ml pour un poids de 25 gr. Les composés sont dilués dans du tampon phosphate salin (PBS) pH 7,0 et le pH est ajusté à 7,0. Les souris infectées mais non traitées (5 par groupe) reçoivent le tampon seul et servent à contr8ler l'infectivité des sporozo- ites. 1.3. Paramètres utilisés pour évaluer l'efficacité de la primaquine et de ses dérivés Les souris expérimentales sont gardées durant une période de 50 jours. Le développement de la parasitémie est suivi en examinant quotidiennement des frottis de sang, colorés 60 min. au Giemsa à 5% dans du tampon SBrensen à pH 7,2, à partir du ème jour et ce, jusqu'au 5Ième jour. Le nombre d'animaux infectés peut ainsi être déterminé. Ces résultats permettent d'établir la survie à long terme (LTS, le nombre de souris survivantes non parasitées sur le nombre de souris infectées _ et traitées). Tableau 7: Activité prophylactique causale de la primaquine et de ses dérivés amino-acides sur souris OF1 infectées par Plasmodium berghei. COMPOSE a CPD50 MED DE1 c INDICE PQ 100NIEP (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) Primaquine 18,8 (1,3) 6,5 (2,6) TOX 1,00 gGLU-PQ 8,7 (0,7) 3,2 (1,1) 24,2 (9,8) 2,15 pGLU-PQ 10,0 (0,7) 4,6 (1,3) 21,8 (5, 7) 1,87 a: les composés sont administrés par voie i.v. trois heures après l'inoculation des sporozoltes. Les concentrations sont exprimées en mg équivalent PQ diphosphate/kg. : dose prophylactique causale guérissant 50% des animaux infectés et traités. c: dose minimale effective (MED) et dose totalement curative (DE100) calculée par régression linéaire (Weighted Logit Transformation). d :indice PQ (rapport CPD50 de la PQ/CPD50 du composé. 3. Indice thérapeutique L'indice thérapeutique est défini comme étant le rapport entre la toxicité, exprimée par la LD50, et l'activité thérapeutique, exprimée par la CPD50 chez la souris. L'indice thérapeutique de la PQ est de 1,7 (tableau 8), tandis qu'il est supérieur à I1l et 15 pour la gGLU-PQ et la pGLU-PQ. Les données expérimentales d'activité dans le modèle de la malaria chez la souris et les données de toxicité indiquent que la gGLU-PQ a un indice thérapeutique au moins 6 fois plus élevé que celui de la PQ, le dérivé étant au moins 3 fois moins toxique et au moins deux fois plus actif que la PQ dans ce modèle expérimental de la malaria. Il en est de meme pour le dérivé pGLU-PQ avec un indice thérapeutique 9 fois supérieur à celui de la PQ, le dérivé étant au moins 5 fois moins toxique et au moins 1,9 fois plus actif que la PQ. Tableau 8: Indice thérapeutique de la primaquine et dérivés amino-acides. PRODUITS a LD50 CPD50 TI b 50 (mg/kg) (mg/kg) PQ 31 18,8 (1,3) 1,7 gGLU-PQ +/- 100 8,7 (0,7) +/- 11,4 pGLU-PQ 159 10,0 (0,7) 15,9 a :les produits sont inoculés par voie i.v. et les concentrations sont exprimées en équivalents de PQ diphosphate. b: l'indice thérapeutique (TI) est le rapport entre la LD50 et la CPD50. REVENDICATIONS 1. Nouveaux dérivés de quinoléine contenant une fonction amine libre et ayant des propriétés antimalariques, notamment nouveaux dérivés de la primaquine ou leurs sels d'addition avec des acides, caractérisés en ce qu'ils sont représentés schématiquement par la formule PQ - X dans laquelle - PQ représente des quinoléines contenant une fonction amine libre et ayant des propriétés antimalariques, notamment la primaquine, - X représente un amino-acide ou un peptide de 2 à 4 amino- acides, l'amino-acide ou les amino-acides étant choisis parmi les acides aminés naturels et leurs dérivés, l'amino-acide ou le premier amino-acide du peptide adjacent à PQ étant autre que le L-leucine, - la liaison PQ-X étant une liaison covalente peptidique entre le groupement amine libre de PQ et un groupement carboxylique de l'acide aminé ou l'acide aminé terminal deX, la liaison étant stable dans le sérum et résistante aux hydrolases lysosomiales. 2. Nouveaux dérivés selon la revendication 1, caractérisé en ce que - PQ est choisi parmi la primaquine et les autres 8-aminoquinoléines antimalariques et - X est choisi parmi un amino-acide ou un peptide, l'amino-acide ou le premier amino-acide du peptide étant choisi parmi l'acide L- gammaglutamique relié à PQ par son groupement gamma-carboxyle, l'acide L-pyroglutamique. 3. Nouveaux dérivés selon l'une des revendications précéden- tes, caractérisés en ce que X représente l'acide L-gammaglutamique ou l'acide L-pyroglutamique. 26444-62 4. Procédé de préparation des nouveaux dérivés selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on fait réagir par condensation d'une fonction carboxyle libre de X, dont les fonctions amine et la fonction -carboxyle sont éventuellement protégées, le cas échéant, avec la fonction amine libre de PQ ou un de ses sels, en présence d'un agent de condensation pour former la liaison peptidique PQ-X. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le groupement protecteur des fonctions amine est un groupement classique de préférence, le tertiobutyloxycarbonyle ou le benzyloxycarbonyle,et le groupement protecteur des fonctions 0X-carboxyles est, le cas échéant, un groupement classique, de préférence ter-butyle ou benzyle. 6. Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que la fonction acide libre de l'aminoacide ou du peptide est activée sous forme d'ester avec le N-hydroxysuccinimide. 7. Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'on part d'un. sel d'aminoquinoléine (PQ), de préférence du diphosphate de primaquine, et de l'acide aminé ou peptide (X), dont la fonction aminée et la fonction carboxyle-,, le cas échéant, sont éventuellement protégées par exemple par un groupe terbutyloxycarbonyle ou benzyloxycarbonyle pour la fonction amine, et ter-butyle ou benzyle pour la fonction carboxyle oc, et on effectue les étapes suivantes: a). on fait réagir de la N-hydroxysuccinimide ou tout autre groupe activant une fonction acide non protégée de X, sur le dérivé éventuellement protégé de X, b) on fait réagir PQ libérée à partir de son sel, par exemple par une solution d'ammoniaque, on l'a fait réagir par exemple avec l'ester N- hydroxysuccinimide du dérivé éventuellement protégé de X, c) le produit brut ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur silicagel, d) les groupements protecteurs, le cas échéant, sont ensuite clivés en présence d'acide, notamment l'acide trifluoroacétique pour donner le dérivé PQ-X sous forme de sel, notamment trifluoroacétate, ou le composé peut être déprotégé par hydrogénolyse. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le contre anion trifluoroacétate est échangé en chlorhydrate, ou phosphate. 9. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le sel chlorhydrate est traité par du bisulfite de sodium. 10. Procédé de préparation d'un dérivé PQ-X selon la revendication 3, dans lequel X représente l'acide L pyroglutamyl, caractérisé en ce qu'on transforme un ester enK5de l'acide L glutamique en N-carboxyanhydride, la réaction étant effectuée en présence de phosgène, lequel dérivé Ncarboxyanydride est couplé à PQ par réaction à 0 C dans le THF pour donner le dérivé L-pyroglutanyl-PQ 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'ester de l'acide L glutamique est le gamma méthyl glutamate ou le gamma benzyl glutamate. 12. Composition pharmaceutique contenant à titre de principe actif les nouveaux dérivés selon l'une des revendications précédentes ou leurs sels pharmaceutiquement acceptables.