FR 2645160 A1 19901005 FR 8904231 A 19890331 1. MICROSPHERES COMPOSITES MAGNETISABLES DE POLYMERE RETICULE HYDROPHOBE, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN BIOLOGIE La présente invention a pour objet des microsphères composites magnétisables de polymères vinylaromatiques réticulés hydrophobes, telles quelles ou en dispersion aqueuse, leur procédé de préparation et leur application en biologie notamment. Il est connu de préparer des perles magnétisables (brevet US n 4.339.337) de diamètre allant de 0,05 à 3 mm par polymérisation en suspension d'un monomère vinylaromatique en présence d'un amorceur organosoluble, d'un agent de suspension et d'une charge magnétisable dispersée au sein d'une solution dans ledit monomère d'un polymère non hydrosoluble. Les perles obtenues renferment des charges magnétisables réparties dans la matrice de polymère. Il a également été proposé (brevet US n 4.358.388) de préparer des latex de polymères hydrophobes magnétisables par homogénéisation d'une solution aqueuse d'émulsifiant et d'une dispersion d'une charge magnétisable dans une phase organique formée d'un amorceur organosoluble, de tout ou partie du monomére hydrophobe et/ou d'un composé organique insoluble dans l'eau, puis polymérisation. Les latex obtenus sont formés de particules de polymère de diamètre d'environ 0,03 à 5 pm renfermant des charges magnétisables réparties dans la matrice polymère, lesdites charges ayant tendance à migrer en périphérie. La demanderesse a maintenant trouvé des microsphères composites formées d'un coeur (core) essentiellement constitué de particules magnétisables et d'une écorce (shell) de polymère hydrophobe. Selon l'invention les microsphères composites magnétisables de polymère vinylaromatique réticulé hydrophobe sont caractérisées en ce que: - elles présentent un diamètre de l'ordre de 0,05 à 10 pm, de préférence de l'ordre de 0,1 à 5 pm; - elles comprennent: 2. un coeur essentiellement constitué de particules magnétisables présentant un diamètre inférieur à -4 -4 300 10 gm et de préférence de l'ordre de 50 10 à 10-4 pm; 5. et une écorce constituée d'un copolymère réticulé hydrophobe dérivé d'au moins un monomètre vinylaromatique hydrophobe et d'au moins un polymère émulsifiant polyéthyléniquement insaturé soluble dans ledit ou lesdits monomère(s) vinylaromatique(s) et susceptible de réticuler avec ledit ou lesdits monomère(s) vinylaromatique(s). Parmi les matériaux pouvant constituer les particules magnétisables formant le coeur des microsphères, on peut citer la magnétite, l'hématite, le dioxyde de chrome, les ferrites telles que les ferrites de manganèse, nickel, manganèse-zinc..., les alliages de cobalt, nickel, gadolinium, samarium-cobalt... Les matériaux préférentiels sont la magnétite et la l'hématite. La quantité de particules magnétisables formant le coeur correspond à environ 0,5 à 70 %, de préférence à environ 15 à 60 % du poids de la microsphère composite magnétisable. Parmi les monomères vinylaromatiques on peut citer ceux du type styrène, alpha-méthylstyrène, éthylstyréne, tertio- butylstyréne, vinyltoluène. Ces monomères vinylaromatiques sont présents seuls ou en mélange entre eux en toute proportion, ou encore en mélange avec un autre monomère copolymérisable, insoluble dans l'eau, pouvant constituer jusqu'à 50 % du mélange et choisi parmi les composés diéniques, tels que butadiène, isoprène; les acrylates et méthacrylates d'alkyle dont le groupe alkyle possède 3 à 10 atomes de carbone; les esters d'acides éthyléniques possédant 4 ou 5 atomes de carbone et d'alkyle possédant 1 à 8 atomes de carbone, tels que: fumarate d'heptyle, fumarate d'octyle, itaconate de méthyle, itaconate d'éthyle. Peuvent également être présents de 0 à 5 % en poids par rapport au(x) monomère(s), d'un monomère réticulant comme par exemple le divinylbenzéne, le méthacrylate de vinyle, les acrylates ou méthacrylates de mono-ou polyalkylène (2-4C) glycol, le cyanurate de triallyle, les condensats d'acides carboxyliques insaturés et de 3. polyols, comme par exemple les acrylate et methacrylate de triméthylol-propane. Parmi les polymères émulsifiants réticulant avec le ou les monomères vinylaromatiques on peut citer les polyesters d'alkylène glycol et de diacide insaturé aliphatique et/ou aromatique, les polymères carboxylés de diolefines... de masse molaire en poids de l'ordre de 500 à 10 000, de préférence de l'ordre de 1 000 à 5 000. Des exemples sont les polyesters de propylène glycol et d'anhydride maléique, les polyesters de propylène glycol, d'anhydride maléïque et d'anhydride phtalique. Les polymères émulsifiants réticulants représentent environ de 3 à 15 %, de préférence de 5 à 10 % du poids de monomère vinylaromatique hydrophobe. Ici le terme "monomère vinylaromatique hydrophobe" signifie l'ensemble formé par les monomères vinylaromatiques hydrophobes, leurs comonomères et leurs comonomères réticulants éventuels. Les microsphéres composites magnétisables faisant l'objet de l'invention peuvent se présenter telles quelles ou en dispersion dans l'eau; la quantité de microsphères dispersées correspond à environ 10 à 70 %, de préférence 15 à 50 % du poids total de la dispersion. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation desdites microsphères composites magnétisables. Le procédé consiste: - à disperser des particules magnétisables présentant un diamètre inférieur à 300 10-4 m, de préférence de l'ordre de 80 10-4 à 120 10-4 m, revêtues d'une couche monomoléculaire d'un agent dispersant non hydrosoluble dans un mélange constitué d'au moins un monomère vinylaromatique hydrophobe, d'au moins un polymère émulsifiant polyéthylèniquement insaturé soluble dans ledit ou lesdits monomère(s) vinylaromatique(s) et susceptible de réticuler avec ledit ou lesdits monomère(s) vinylaromatique(s) et éventuellement d'un agent dispersant complémentaire. - a préémulsionner le fluide magnétique ainsi obtenu dans de l'eau, après introduction préalable dans ledit fluide d'un amorceur organosoluble de polymérisation; 2645 1 60 4. - à copolymériser les composés éthylèniquement insaturés présents dans le milieu - à séparer les microsphéres magnétisables formées des microsphères non magnétisables - et éventuellement à redisperser dans l'eau les microsphères magnétisables. On entendra ci-après par: "monomères vinylaromatiques", l'ensemble formé par les monomères vinylaromatiques, leurs comonoméres et les comonoméres éventuels réticulants. La nature et leurs quantités respectives ont déjà été mentionnées ci-dessus; les éventuels comonomères réticulants peuvent être mis en oeuvre soit à l'étape de dispersion, soit à l'étape de préémulsion (ils peuvent alors servir de solvant à l'amor- ceur de polymérisation). - "composés éthylèniquement insaturés copolymérisables" l'ensemble formé par les "monomères vinylaromatiques" et le polymère émulsifiant réticulant. La nature des particules magnétisables a déjà été mentionnée ci-dessus. Parmi les agents dispersants formant un revêtement mono-molé- culaire hydrosoluble autour des particules magnétisables on peut citer ceux présentant une longue chaine hydrocarbonée terminée par un groupe polaire du type - COOH, NH2..., tels que les acides gras, les amines grasses... contenant au moins 12 atomes de carbone et plus particulièrement les acides gras en C18, tels que les acides oléique, linoléique et linolénique. Les particules magnétisables revêtues d'agent dispersant peuvent être préparées par exemple par peptisation dans l'agent dispersant de particules magnétiques obtenues par voie sol-gel, dispersion dans un liquide vecteur organique (brevet US n 3.843.540) puis floculation à l'aide d'un solvant polaire du type cétone, ester, alcool et séparation des particules enrobées. Les proportions de particules magnétisables représentent de 0,5 à 60 %, de préférence de 15 à 50 % du poids de composés éthylé- niquement insaturés copolymérisables. 5. L'étape de dispersion des particules magnétisables est réali- sée par introduction progressive, sous agitation à une température de l'ordre de 0 à 30 C, des particules magnétisables revêtues d'agent dispersant non hydrosoluble dans les composés éthyléniquement insaturés copolymérisables. Si nécessaire cette étape peut être réalisée en présence d'un agent dispersant complémentaire anionique ou cationique; à titre d'exemple on peut citer les esters phospho- riques, alkylaromatiques éthoxylés...; ledit agent peut être mis en oeuvre à raison de 3 à 15 % du poids des composés éthyléniquement insaturés copolymérisables. Un amorceur organosoluble de polymérisation est ensuite introduit dans la dispersion, éventuellement sous forme de solution dans un peu de monomère vinylaromatique ou d'un de ses comonomères réticulants ou non. Il est mis en oeuvre en quantité comprise entre environ 0,1 à % en poids par rapport aux composés éthyléniquement insaturés copolymérisables. Comme exemple d'amorceur on peut citer les azonitriles comme l'azobisisobutyronitrile, l'azobiscyclohexane carbonitrile; ou les peroxydes, comme les peroxydes de benzoyle, dicumyle, ditertiobutyle, diacétyle, dioctanoyle, lauroyle, méthyléthylcétone, caprylyle, dichloro-2,4-benzoyle, parachlorobenzoyle; les perpivalate, diétyl- peracétate, perbenzoate de tertiobutyle; le diperphtalate de ditertiobutyle; le 1,1-ditertiobutyle-peroxyde-3,3,5-triméthyl- cyclohexane. L'étape de préémulsion est réalisée par homogénéisation du fluide magnétique obtenu avec de l'eau, à une température inférieure à celle de décomposition de l'amorceur, à l'aide d'un système d'agitation énergique tel que moulin à colloïdes, pompe à haute pression, agitateur à vibrations, appareil à ultra-sons... jusqu'à obtenir une émulsion de gouttelettes de fluide magnétique de taille de l'ordre de 0,03 à 10 pm, de préférence de l'ordre de 0,1 à 5 im. Cette opération de préémulsion est de préférence réalisée à un pH de l'ordre de 7 à 11. La quantité d'eau présente est telle que la dispersion aqueuse de microsphéres obtenue après copolymérisation contienne de 10 à %, de préférence de 10 à 30 % de son poids desdites microsphères. 6. Si nécessaire un émulsifiant complémentaire peut être présent; il peut être anionique, cationique ou non-ionique et utilisé à raison de 0,1 à 5 % en poids par rapport à celui du ferrofluide à préémulsionner. Parmi les agents émulsifiants anioniques peuvent être cités les sels d'acides gras; les alkylsulfates, alkylsulfonates, alkyl- arylsulfonates, alkylsulfosuccinates, alkylphosphates alcalins; les sulfosuccinates d'alkyle; les sulfonates d'éthers alkylphénolpoly- glycoliques; les sels d'esters d'acides alkylsulfopolycarboxyliques ; les produits de condensation des acides gras avec les acides oxy-et aminoalcanesulfoniques; les dérivés sulfatés des éthers polyglycoliques; les esters sulfatés d'acides gras et de polyglycols les alcanolamides d'acides gras sulfatés. Parmi les agents émulsifiants cationiques peuvent être cités les alkylamines et leurs sels solubles dans l'eau, les sels solubles des alkylamines N-substituées par des radicaux alkyle et/ou alkyl- aryle et/ou hydroxyalkyle. Et, parmi les agents émulsifiants non ioniques, les esters gras de polyalcools, les alcanolamides d'acides gras, les polyoxydes d'éthylène, les copolyoxydes d'éthylène et de propylène, les alkylphénols oxyéthylénés. L'opération de polymérisation est réalisée à une température de l'ordre de 30 à 130 C, et de préférence de l'ordre de 50 à 85 C. Elle dure environ de 2 à 10 heures et généralement de 2 à 5 heures. On obtient ainsi une dispersion aqueuse d'un mélange de microsphères composites magnétisables et de microsphères ne renfermant pas de charges magnétisables (microsphères "blanches"), dont le diamètre est de l'ordre de 0,05 à 10 pm, et généralement de l'ordre de 0,1 à 5 pm. Le taux de microsphères magnétisables peut représenter de 20 à 90 % en poids de la quantité totale de micro- sphères. Plus la concentration de charges magnétisables dans les microsphères est importante, plus grande est la quantité de micro- sphères "blanches". La séparation des microsphères magnétisables est de préférence réalisée par aimantation. Si désiré, les microsphères magnétisables séparées peuvent être redispersées dans l'-au afin d'obtenir une dispersion renfermant de 10 à 70 % en poids, de préférence 15 à 50 % en poids 7. de microsphères composites magnétisables. Les microsphéres composites magnétisables, telles quelles ou en dispersion aqueuse, ci-dessus décrites peuvent être utilisées en biologie pour immobiliser des substances biologiquement actives (protéines telles que anticorps, enzymes...; antigènes; médicaments..) par adsorption ou covalence; selon la nature de ladite substance active les produits de l'invention peuvent être avantageusement utilisés dans les tests de diagnostic (agglutination - "RIA" radioimmunological assay - "IRMA" immunoradiometric assay - "EIA" enzyme immuno assay), en chromatographie d'affinité, comme catalyseur enzymatique en biotechnologie, comme support de culture cellulaire. Les exemples suivants sont donnés à titre indicatif et ne peuvent être considérés comme une limite du domaine et de l'esprit de l'invention. Exemple 1 lère étape: dispersion du pigment magnétique On introduit: 20. 8 g de Résine A 123 (polycondensats de propylène glycol et d'anhydrides maléique et phtalique, commercialisé par ORKEM). et 4 g de GAFAC RE 610 (mélange de mono et diesters phospho- riques de dérivés alkyl-aryl ethoxylés, commercialisé par GAF) dans 75,5 g de styrène. On introduit petit à petit sous agitation dans le mélange obtenu 12,5 g de pigment magnétique constitué de 10 g de Fe304 de diamètre -4 -4 3 moyen de l'ordre de 80 10 à 120 10 pm surfacté par 2,5 g d'acide oléïque. 2ème étape: préémulsion On ajoute & 40 g du fluide magnétique obtenu, une solution de 0,6 g de peroxyde de dioctanoyle dans 1,5 g de divinylbenzène. La phase organique obtenue est introduite dans 230 g d'eau amenée à pH 10 par addition de potasse 1 N et dispersée dans la phase aqueuse à l'aide de l'homogénéiseur ULTRA-TURRAX (moteur d'entrainement T 45, tige de dispersion 45 N, générateur T 45/66, commercialisé par PROLABO). 2645 1-6 0 8. Le diamètre moyen des gouttelettes obtenues est de l'ordre de 0,4 pm (mesure à l'aide du granulomètre laser CILAS 850, commercia- lisé par CILAS). 3ème étape: copolymérisation La préémulsion obtenue est polymérisée dans un réacteur de 500 i & 80 C pendant 4 heures sous azote. Le milieu est ensuite refroidi; en cours de refroidissement 50 ml d'une solution aqueuse & 0,5 % en poids de laurylsulfate de sodium sont ajoutés. Le latex obtenu est filtré sur une toile de 5 gm; les mono- mères résiduels sont éliminés par stripping & l'aide d'un évaporateur rotatif. Les microsphères magnétisables sont ensuite séparées à l'aide d'un aimant; leur taux représente environ 65 % du poids total de microsphères. Les microsphères magnétisables présentent un diamètre moyen de l'ordre de 0,4 pm et renferment 18 % de leur poids de particules de ferrite formant le coeur des microsphères, comme le montre la photo de la figure n 1. (coupe des microsphères vue au microscope à transmission; grossissement 120.000). Exemple 2 On répète le mode opératoire de l'exemple 1 à l'aide des quantités suivantes des mêmes réactifs: lère étape - Résine A 123 6 g - GAFAC RE 610 4g - Styrène 60 g - Pigment magnétique 30 g 2ème étape - Peroxyde de dioctanoyle 0,7 g - Divinylbenzène 1,5 g - Phase organique de la lère étape 40 g - Eau à pH 10 200 g 3ème étape Les conditions de polymérisation sont identiques; 50 % du poids des microsphères formées sont magnétisables. 9. Les microsphères magnétisables présentent un diamètre moyen de l'ordre de 0,6 pm et renferment 43 % de leur poids de particules de ferrite formant le coeur des microsphères, comme le montre la photo de la figure n 2 (grossissement 44.000). 10. REVENDICATIONS 1/ Microsphères composites magnétisables de polymère vinylaromatique réticulé hydrophobe caractérisées en ce que: - elles présentent un diamètre de l'ordre de 0,05 à 10 im - elles comprennent: un coeur essentiellement constitué de particules magnétisables présentant un diamètre inférieur à 300 10-4 pm 10. et une écorce constituée d'un copolymère réticulé hydrophobe dérivé d'au moins un monomètre vinylaromatique hydrophobe et d'au moins un polymère émulsifiant polyéthyléniquement insaturé soluble dans ledit ou lesdits monomère(s) vinylaromatique(s) et susceptible de réticuler avec ledit ou lesdits monomére(s) vinylaromatique(s). 2/ Microsphères selon la revendication 1 caractérisées en ce que le coeur en particules magnétisables représente de 0,5 à 70 % environ du poids desdites microsphères magnétisables. 3/ Microsphères selon la revendication 1 ou 2 caractérisées en ce que les particules magnétisables sont de la magnétite ou de l'hematite. 4/ Microspheres selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisées en ce que le polymère émulsifiant réticulant est un polyester d'alkylène glyc6l et de diacide insaturé aliphatique et/ou aromatique de masse moléculaire en poids de l'ordre de 500 à 10.000. / Microsphères selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que le polymère émulsifiant réticulant représente de 3 à 15 % environ du poids de monomère vinylaromatique hydrophobe. 6/ Microsphères selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce qu'elles se présentent en dispersion dans l'eau, la quantité de microsphères magnétisables dispersées correspondant à 10 à 70 % environ du poids de la dispersion aqueuse. 7/ Procédé de préparation de microsphères magnétisables se présentant telles quelles ou en dispersion dans l'eau caractérisé en ce qu'il consiste: 11. - à disperser des particules magnétisables présentant un diamètre inférieur à 300 10-4 pm, revêtues d'une couche monomoléculaire d'un agent dispersant non hydrosoluble dans un mélange constitué d'au moins un monomère vinylaromatique hydrophobe, d'au moins un polymère émulsifiant polyéthyleni- quement insaturé soluble dans ledit ou lesdits monomère(s) vinylaromatique(s) et susceptible de réticuler avec ledit ou lesdits monomère(s) vinylaromatique(s) et éventuellement d'un agent dispersant complémentaire. - à préémulsionner le fluide magnétique ainsi obtenu dans de l'eau, après introduction préalable dans ledit fluide d'un amorceur organosoluble de polymérisation; - à copolymériser les composés éthylèniquement insaturés présents dans le milieu - à séparer les microsphères magnétisables formées des micro- sphères non magnétisables - et éventuellement à redisperser dans l'eau les microsphères magnétisables. 8/ Procédé selon la revendication 7/ caractérisé en ce que les particules magnétisables représentent de 0,5 à 60 % environ du poids de composés éthyléniquement insaturés copolymérisables. 9/ Procédé selon la revendication 7/ ou 8/ caractérisé en ce que les particules magnétisables sont de la magnétite ou de l'hématite. / Procédé selon l'une quelconque des revendications 7/ à 9/ caractérise en ce que l'agent dispersant non hydrosolubie est un acide gras ou une amine grasse contenant au moins 12 atomes de carbone. 11/ Procécé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le polymère émulsifiant réticulant est un polyester d'alkylène glycol et de diacide insaturé aliphatique et/ou aromatique de masse moléculaire en poids de l'ordre de 500 à 10.000. 12/ Procécé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le polymère émulsifiant réticulant représente de 3 à 15 % environ du poids de monomère vinylaromatique hydrophobe. 13/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la quantité d'amorceur organosoluble est de 12. 0,1 à 10 % environ du poids de composés éthyléniquement insaturés copolymérisables. 14/ Utilisation des microsphéres magnétisables faisant l'objet de l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour immobiliser des substances biologiquement actives.