FR 2644177 A1 19900914 FR 9002974 A 19900308 La présente invention concerne des virus re- combinants modifiés, des procédés pour exprimer des produits de gène dans un hôte en utilisant de tels virus recombinants modifiés et des vaccins comprenant de tels virus recombinants modifiés. La présente invention a également pour objet un poxvirus modifié, particulièrement un virus de la vaccine modifié, et des procédés pour préparer et choisir celui-ci. Plus particulièrement, l'invention est relative à un système de sélection pour le clonage et l'expression d'un cadre de lecture ouvert dans un poxvirus recombinant, particulière- ment un poxvirus recombinant de la vaccine. On se réfère dans la présente description à plu- sieurs publications en utilisant, pour les désigner, des nombres en chiffres arabes placés entre parenthèse. La réfé- rence complète de ces publications se trouve à la fin de la description immédiatement avant les revendications. Ces publications antérieures décrivent l'état de la technique à laquelle appartient l'invention. Le virus de la vaccine et plus récemment d'autres poxvirus ont été utilisés pour l'insertion et l'expression de gènes étrangers. La technique de base pour insérer des gènes étrangers dans des poxvirus infectieux vivants impli- que la recombinaison entre des séquences de l'ADN de la vaccine qui est sur le flanc d'un élément génétique étranger dans un plasmide donneur et des séquences homologues présen- tes dans le boxvirus de sauvetage (32). En fait, les poxvirus recombinants sont construits en deux étapes connues dans la technique et analogues à celles de la construction de recombinants synthétiques du virus de la vaccine décrites dans le brevet des Etats-Unis n 4.603.112 dont la description est incorporée par référen- ce dans la présente demande. Tout d'abord la séquence des gènes de l'ADN à insérer dans le virus, particulièrement un cadre de lecture ouvert en provenance d'une source autre que la vaccine (non pox) est placée dans une construction de plasmide de l'E. Coli dans laquelle de l'ADN homologue à une section d'ADN non essentiel du poxvirus a été inséré. Séparément, la séquence du gène de l'ADN à insérer est liée à un promoteur. La liaison promoteur-gène est placée dans la structure de plasmide de sorte que la liaison promoteur-gène soit flan- quée à ses deux extrémités par un ADN homologue à une séquence d'ADN qui flanque une région non essentielle de l'ADN de la vaccine (du pox). La structure de plasmide résultante est ensuite amplifiée par croissance ou culture à l'intérieur de la bactérie E. Coli (4) et isolée (5, 22). Ensuite, le plasmide isolé contenant la séquence de gène d'ADN à insérer est transféré par injection aux fins d'altération dans une culture de cellules par exemple de fibroblastes d'embryons de poulets, en même temps que le poxvirus. La recombinaison entre l'ADN de la vaccine (pox) homologue dans le plasmide et le gènome viral donne respec- tivement un poxvirus modifié par la présence, dans une région non essentielle de son gènome, de séquences d'ADN étranger. L'expression ADN "étranger" désigne un ADN exo- gène, en particulier de l'ADN provenant d'une source qui n'est pas de la vaccine (source non pox), qui code les produits de gène qui ne sont ordinairement pas produits par le gènome dans lequel l'ADN exogène est placé. La recombinaison génétique est en général l'échan- ge de sections homologues d'ADN entre deux brins d'ADN. Dans certains virus, l'ARN peut remplacer l'ADN. Des sections homologues d'acide nucléique sont des sections d'acide nucléique (ADN ou ARN) qui ont la même séquence de bases de nucléotide. La recombinaison génétique peut avoir lieu d'une manière naturelle pendant la réplication ou la fabrication de génomes viraux nouveaux dans la cellule hôte infectée. Ainsi, la recombinaison génétique entre des gènes viraux peut se réaliser pendant le cycle de réplication virale qui se produit dans la cellule hôte qui est co-infectée par deux ou plusieurs virus différents ou autres structures généti- ques. Une section d'ADN d'un premier génome est utilisée de manière interchangeable pour construire la section du génome d'un second virus co-infectant dans lequel 1'ADN est homo- logue à celui du premier génome viral. Cependant, la recombinaison peut également se pro- duire entre des sections d'ADN dans des génomes différents qui ne sont pas parfaitement homologues. Si une première section de ce type provient d'un premier génome homologue à une section d'un autre génome à part la présence dans la première section de, par exemple, un marqueur génétique ou un gène qui code pour un déterminant antigénique inséré dans une portion de l'ADN homologue, la recombinaison peut encore se produire et les produits de cette recombinaison sont alors détectables par la présence de ce marqueur génétique ou gène dans le génome viral recombinant. Le succès de l'expression, par le virus infectieux modifié, de la séquence génétique d'ADN insérée exige deux conditions. La première condition est que l'insertion doit être effectuée dans une région non essentielle du virus afin que le virus modifié demeure viable. La seconde condition pour l'expression de l'ADN inséré est la présence d'un promoteur dans une relation convenable par rapport à l'ADN inséré. Le promoteur doit être placé de sorte qu'il soit disposé en amont de la séquence de l'ADN qui doit être exprimée. Une recombinaison non perturbée et réussie se produit à une fréquence d'environ 0,1 %. Une stratégie de triage de base pour récupérer ces virus modifiés par une recombinaison qui a abouti implique l'hybridation in situ des recombinants sur des filtres de réplication avec un marqueur ou sonde marqué par un élément radio-actif et qui est homologue aux séquences insérées (26, 28). Un certain nombre de modifications sont connues pour augmenter l'efficacité de la recombinaison elle-même ou pour faciliter l'identification des produits recombinés. Parmi ces modifications, on peut citer: l'utilisation d'un ADN donneur à un seul brin (38), I'identification de recombinants exprimant des fonctions enzymatiques uniques, par exemple l'incorporation de 125Iododéoxycytidine dans l'ADN par l'expression de la thymidine kinase du virus de l'Herpès simplex (28); les substrats chromogéniques pour la (co)expression de gènes étrangers en même temps que la B galactosidase (3, 29); la sélection pour l'expression de la thymidine kinase (20, 28); des réactions basées sur des anticorps pour visualiser des plaques recombinantes (21); l'utilisation de ts lethal conditionnel ou de mutants de drogues (9, 18); la sélection de recombinants utilisant le gène de résistance à la néomycine à partir du Tn5 et de l'antibiotique G418 (11); ou la sélection de pressions avec de l'acide mycophénolique et le gène gPt de l'E. Coli (2, 8). D'une manière désavantageuse, ces procédés connus pour identifier ou choisir des poxvirus recombinants impli- quent tous une identification des recombinants en plusieurs étapes, qui est fastidieuse, l'introduction de produits chimiques radio-actifs, des substrats chromogéniques, des produits chimiques biologiques utilisés pour la sélection, tels que l'acide mycophénolique et la bromodéoxyuridine, qui peuvent être nuisibles (mutagéniques) pour le génome viral lui-même, l'utilisation de réactifs sérologiques qui peuvent introduire des contaminants, et typiquement la présence d'un gène exogène dans le recombinant final en plus de l'élément génétique étranger intéressant. On peut ainsi apprécier que la mise au point d'un procédé pour fabriquer et sélectionner des recombinants de poxvirus, particulièrement des recombinants de la vaccine, procédé qui éviterait d'avoir à résoudre les problèmes discutés ci-dessus, constituerait une avance technique hautement désirable comparativement à l'état actuel de la technique. Des procédés ont été développés dans la technique antérieure qui permettent la création de virus de vaccine recombinants et d'avipoxvirus par l'insertion d'ADN de toute source (par exemple virale, prokariotique, eukariotique, synthétique) dans une région non essentielle du génome de la vaccine ou de l'avipox, y compris des séquences d'ADN qui codent les déterminants anti-génétiques d'un organisme pathogène. Les virus de la vaccine recombinants créés par ces procédés ont été utilisés pour induire une immunité spécifique chez les mammifères vis-à-vis d'une grande variété d'agents pathogènes des mammifères, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis n 4.603.112, incorporé dans la présente demande par référence. Des avipoxvirus recombinants créés par ces procédés ont été utilisés pour induire l'immu- nité spécifique chez des espèces aviaires (41) et des espèces non-aviaires. Le virus de la vaccine non modifiée a une longue histoire d'utilisation relativement sans danger et efficace pour réaliser une inoculation contre la petite vérole. Cependant, avant l'éradication de la petite vérole, lorsque la vaccine non modifiée était administrée largement, il y avait un risque faible, mais réel, de complications sous la forme d'une infection généralisée par la vaccine, particu- lièrement chez les personnes souffrant d'exzéma ou d'immuno- suppression. Une autre complication rare, mais possible, pouvant résulter de l'inoculation de vaccine est l'encépha- lite après vaccination. La plupart de ces réactions résul- taient de l'inoculation d'individus ayant des maladies de la peau, telles que l'exzéma, ou des systèmes immunitaires déficients, ou bien d'individus qui cohabitaient avec d'autres qui avaient de l'exzéma ou des réponse immuno- logiques diminuées. La vaccine est un virus vivant qui est est normalement dépourvu de danger pour un individu en bonne santé. Cependant, ce virus peut être transmis entre indivi- dus pendant plusieurs semaines après l'innoculation. Si un individu avec une réponse immunitaire diminuée par rapport à la normale est infecté soit par innoculation soit par trans- mission contagieuse à partir d'un individu récemment innoculé, les conséquences peuvent être sérieuses. Des mutants de virus convenablement modifiés por- tant des gènes exogènes qui sont exprimés chez un hôte en tant que déterminant antigénique provoquant la production par l'hôte d'anticorps vis-à-vis d'un agent pathogène hôte, avec réplication limitée du virus chez l'hôte, représentent des vaccins nouveaux qui évitent les inconvénients des vaccins classiques utilisant des organismes tués ou des organismes vivants atténués. Ainsi, par exemple, la pro- duction de vaccins à partir d'organismes tués exige la culture de grandes quantités d'organismes suivie par un traitement qui détruit sélectivement leur pouvoir d'infec- tion sans affecter leur pouvoir antigène. D'un autre côté, des vaccins contenant des organismes -vivants atténués présentent la possibilité d'une réversion de l'organisme atténué qui retourne à l'état pathogène. Contrairement à ceci, lorsqu'un poxvirus recombinant, qui a été modifié d'une manière convenable, est utilisé comme vaccin, la possibilité de reversion pour retourner à un organisme - pathogène est évitée étant donné que le poxvirus contient seulement le gène qui code le déterminant antigène de l'organisme qui produit la maladie et non pas ces portions génétiques de l'organisme qui sont responsables de la réplication de l'organisme pathogène. Ainsi, on peut se rendre compte qu'un procédé qui confère, par rapport à la technique connue, les avantages de l'innoculation de virus vivants, mais qui réduit ou élimine les problèmes discutés ci-dessus constituerait une avance hautement désirable par rapport à l'état actuel de la tech- nique. Ceci est même plus important aujourd'hui avec l'appa- rition de la maladie appelée syndrome acquis de déficience immunitaire (SIDA). Les victimes de cette maladie souffrent d'un disfonctionnement immunologique sévère et pourraient facilement être rendus malades par une préparation de virus vivants, qui serait normalement sans danger pour d'autres personnes, s'ils venaient en contact avec un tel virus soit directement, soit par contact avec une personne récemment immunisée avec un vaccin comprenant de tels virus vivants. C'est pourquoi l'invention a pour objet: - un vaccin pour induire une réponse immunologique chez un hôte, qui présente les avantages d'un vaccin à virus vivants, mais qui ne manifeste qu'un petit nombre ou aucun des inconvénients d'un vaccin à virus vivants ou d'un vaccin à virus tués, tels qu'énumérés ci-dessus; - des virus recombinants modifiés destinés à être utili- sés dans de tels vaccins; - un procédé pour exprimer un produit de gène chez un hôte par innoculation de l'hôte au moyen d'un virus recombinant modifié qui code et exprime le produit de gène chez l'hôte avec un réplication limitée du virus chez l'hôte; - un procédé pour exprimer un produit de gène dans une cellule cultivée in vitro par introduction dans la cellule d'un virus recombinant modifié contenant de 1'ADN qui code et exprime le produit de gène avec une réplication restreinte du virus dans la cellule; - des virus recombinants modifiés qui expriment des pro- duits de gène chez un hôte, avec une replication restreinte des virus chez l'hôte, et un procédé pour produire de tels virus recombinants modifiés; une identification rapide en une seule étape de virus recombinants et un tri rapide pour l'expression de cadres de lecture ouverts étrangers chez les recombi- nants; - un procédé pour préparer et sélectionner un poxvirus recombinant, particulièrement un virus de la vaccine recombinant, et préparer des séquences d'ADN produites ou impliquées comme intermédiaires dans ce procédé; - un système de sélection pour le clonage et l'expression d'un cadre de lecture ouvert dans un poxvirus recombi- nant, particulièrement un virus de la vaccine recombi- nant, dans lequel le virus recombinant ne contient pas de gène étranger autre que le cadre de lecture ouvert intéressant. Ces objets et avantages, ainsi que d'autres objets et avantages, de la présente invention apparaîtront claire- ment après lecture de ce qui suit: Suivant un aspect, la présente invention est rela- tive à un virus recombinant modifié dont les gènes qui sont inclus dans le domaine de replication chez l'hôte, c'est-à- dire qui se répliquent chez l'hôte, ont été enlevés de sorte que le virus manifeste une réplication limitée chez l'hôte, le virus recombinant modifié contenant de l'ADN qui code et exprime un produit de gène chez l'hôte avec une réplication limitée du virus chez l'hôte. Le virus selon la présente invention est avantageusement un poxvirus, particu- lièrement un virus de la vaccine. Suivant un autre aspect, la présente invention est relative à un procédé pour exprimer un produit de gène chez un hôte en innoculant l'hôte avec un virus recombinant modi- fié dont les gènes qui se répliquent chez l'hôte ont été supprimés de sorte que le virus possède un pouvoir de répli- cation limité chez l'hôte. Le virus recombinant modifié contient de l'ADN qui code et exprime le produit de gène chez l'hôte même avec une réplication limitée du virus chez l'hôte. Le virus utilisé dans le procédé selon la présente invention est avantageusement un poxvirus, particulièrement un virus de la vaccine. Le produit de gène exprimé chez l'hôte est avantageusement un antigène. Plus particulière- ment, l'hôte est un vertébré et l'antigène induit une réponse immunologique chez le vertébré. Suivant encore un autre aspect, la présente in- vention concerne un vaccin pour induire une réponse immuno- logique chez un hôte innoculé au moyen du vaccin, ce vaccin comprenant un véhicule et un virus recombinant modifié dont les gènes qui se répliquent chez l'hôte ont été éliminés de sorte que le virus manifeste une réplication limitée chez l'hôte. Le virus recombinant modifié contient de l'ADN qui code et exprime un produit de gène chez l'hôte même avec une réplication limitée du virus chez l'hôte. Le virus utilisé dans le vaccin selon la présente invention est avantageuse- ment un poxvirus, particulièrement un virus de la vaccine. L'invention, suivant un autre aspect, concerne un procédé pour sélectionner un poxvirus recombinant chez un hôte en combinant de l'ADN donneur et un poxvirus modifié pour former un poxvirus recombinant et pour identifier le poxvirus recombinant par sa capacité de se répliquer chez l'hôte. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé pour le clonage et l'expression d'un cadre de lecture ouvert chez un poxvirus recombinant dans un hôte par combinaison d'ADN donneur et d'un poxvirus modifié pour former un pox- virus recombinant, pour la réplication du poxvirus recombi- nant chez l'hôte et pour l'expression du cadre de lecture ouvert. Conformément à la présente invention, le poxvirus modifié a été débarassé des gènes qui se répliquent chez l'hôte de manière que le poxvirus modifié ne se réplique pas chez l'hôte et l'ADN donneur contient un cadre de lecture ouvert provenant d'une source qui est du type non pox et le gène qui se réplique chez l'hôte pour permettre au poxvirus recombinant de se répliquer chez l'hôte. Suivant un autre aspect encore, l'invention concerne un plasmide donneur pour préparer le poxvirus recombinant du système de sélection. Le plasmide donneur contient un cadre de lecture provenant d'une source du type non pox et un gène qui se réplique chez l'hôte pour permettre au poxvirus recombinant de se répliquer chez l'hôte. Avantageusement, le plasmide donneur peut également contenir un promoteur en amont du gène qui se réplique chez l'hôte du poxvirus, un codon d'amorçage ou commencement de traduction ou transcription en aval du promoteur suivi par des sites de restriction multiple de type uniquef des séquences de signal de fin de traduction et une séquence de signal de fin de transcription précoce. La présente invention sera mieux comprise en se référant à la description détaillée qui suit et aux dessins annexés sur lesquels: La Figure lA représente schématiquement un procédé pour la préparation du virus de la vaccine de suppression/ recombinaison vP293; La Figure lB est une carte de l'extrémité gauche du virus de la vaccine de sauvetage, VTK-79 au moyen de HindIII K; La Figure IC est une carte de l'extrémité gauche du virus de la vaccine suppression/recombinant vP293 au moyen de HindIII K; La Figure 2A montre schématiquement un procédé pour cloner le gène qui se réplique chez l'hôte, K1L dans le plasmide pMP528L et son insertion dans le vP293 pour engen- drer le virus de la vaccine vP457; La Figure 2B est une carte de l'extrémité gauche de vP293 par HindIII K; La Figure 2C est une carte de l'extrémité gauche de vP457 par HindIII K; La Figure 3A représente schématiquement un procédé pour la préparation des plasmides pMP528HRH et pHES1-4; La Figure 3B illustre la séquence d'ADN du promo- teur H6 synthétique et les sites de restriction en aval présents dans le pMP528HRH; La Figure 3C montre la séquence d'ADN (avec les sites de restriction, les codons d'arrêt et le signal de fin de transcription précoce) qui remplace la séquence entre crochets de la Figure 3B dans le plasmide pHESl; La Figure 3D illustre la séquence d'ADN (avec les sites de restriction, les codons d'arrêt et le signal de fin de transcription précoce), qui remplace la séquence entre crochets de la Figure 3B dans le plasmide pHES2; La Figure 3E illustre la séquence d'ADN (avec les sites de restriction, les codons d'arrêt et le signal de fin de transcription précoce) qui remplace la séquence entre crochets de la Figure 3B dans le plasmide pHES3; La Figure 3F illustre la séquence d'ADN (avec les sites de restriction, les codons d'arrêt et le signal de fin de transcription précoce) qui remplace la séquence entre crochets de la Figure 3B dans le plasmide pHES4; La Figure 4A illustre schématiquement un procédé pour la préparation des plasmides pHES31-34; La Figure 4B illustre les séquences d'ADN des oligonucléotides synthétiques HRL15-22; La Figure 5 illustre la séquence d'ADN du promo- teur u de la vaccine présent dans les plasmides pHES31-34; de plus, la Figure 5 montre, en une séquence entre crochets, les sites de restriction, les codons d'arrêt et les signaux de fin de transcription précoce présents dans pHES31-34 et les codons d'amorçage présents dans pHES31-33; La Figure 6A illustre schématiquement un procédé pour la préparation des plasmides pHES61-64; La Figure 6B illustre les séquences d'ADN des olignonucléotides synthétiques HRL33-34; La Figure 7 illustre la séquence d'ADN du promo- teur ATI synthétique présent dans les plasmides pHES61-64; en outre la Figure 7 illustre, en une séquence entre crochets, les sites de restriction, les codons d'arrêt et les signaux de fin de transcription précoce présents dans pHES61-64 et les codons d'amorçage présents dans pHES61-63; La Figure 8 illustre la séquence d'ADN (avec des sites de restriction) de 15.537 bp située au voisinage de l'extrémité gauche de la souche Copenhagen (Copenhague) de la vaccine; La Figure 9 illustre schématiquement un procédé pour la préparation des recombinants VP548 et VP661; La Figure 10 est une carte de l'extrémité gauche du génome du virus de la vaccine; La Figure Il illustre schématiquement un procédé de test des gènes potentiels qui se répliquent chez l'hôte la vaccine dans le système vP293; La Figure 12 illustre schématiquement un procédé pour la préparation des recombinants vP665, vP683, vP706 et vP716; La Figure 13 illustre schématiquement un procédé pour la préparation des plasmides pCP3 et pCP5 et pour tester le gène potentiel qui se réplique chez l'hôte du cowpox (vaccine de vache) dans le système de la vaccine; La Figure 14 illustre schématiquement un procédé pour la préparation des recombinants vP664 et vP668; La Figure 15 illustre schématiquement un procédé pour la préparation d'une série de plasmides dérivés du La Figure 16 illustre les séquences d'ADN des oligonucléotides synthétiques MPSYN238, MPSYN239, MPSYN250- 255 et MPSYN271-274; La Figure 17 illustre la séquence d'ADN synthéti- que contenant des sites de restriction, des codons d'arrêt et des signaux de fin de transcription précoce présents dans les plasmides pPMCS-1 et pMPCS-4; en outre, la Figure 17 illustre la région du promoteur H6 synthétique présent dans pCOPCS-3H et pCOPCS-5H à pCOPCS-1OH; en outre également, la Figure 17 illustre, en une séquence entre crochets, les sites de restriction, les codons d'arrêt et les signaux de fin de transcription précoce présents dans pCOPCS-3H et pCOPCS-5H à pCOPCS-10H et les codons d'amorçage présents dans pCOPCS-6H à pCOPCS-10H; La Figure 18 illustre schématiquement un procédé pour la préparation des plasmides pMLENDo et pMPREND4; La Figure 19 illustre la séquence d'ADN de 13.978 bp, produite par HindIII C, du génome de Copenhagen du virus de la vaccine, y compris les séquences de codage disposées à gauche de la séquence représentée sur la Figure 8; La Figure 20 illustre la séquence complète d'ADN pour HindIII F disposée immédiatement à gauche de HindIII K sur la Figure 8; La Figure 21, enfin, illustre la séquence d'ADN contenue dans HindIII B au voisinage de la terminaison de droite du génome du virus de la vaccine. L'invention concerne des virus recombinants modifiés dont on a éliminé les gènes qui se répliquent chez l'hôte de manière que le virus présente une réplication limitée chez l'hôte et qui contiennent de l'ADN qui code et exprime un produit de gène chez l'hôte avec une réplication limitée du virus chez l'hôte. L'invention concerne également un système de sélection pour des poxvirus recombinants, par- ticulièrement pour des vaccines recombinantes, et pour le clonage et l'expression d'un cadre de lecture ouvert chez le poxvirus, particulièrement le virus de la vaccine, en utilisant un mutant, qui se réplique chez l'hôte, du pox- virus, mutant qui est mortel d'une manière conditionnelle. Les mutants qui se répliquent chez l'hôte du poxvirus du lapin (24, 13) et du virus de la vaccine (6, 7, 12, 17, 23, 36) sont connus. Les mutants, qui se répliquent chez l'hôte, du poxvirus du lapin manquent, semble-t-il, d'une fonction de contrôle exigée pour la réplication du virus (10). L'analyse génomique ultérieure de ces mutants du poxvirus du lapin ont démontré des suppressions terminales importantes (jusqu'à 30 kb) d'ADN (19, 25). La mutagénèse sous l'effet de l'acide nitrique de la souche Copenhagen du virus de la vaccine a permis à Drillien et autres (6) d'isoler un mutant qui se réplique chez l'hôte, déficient au point de vue réplication dans la plupart des cellules humaines. L'analyse génomique de ce mutant a révélé une suppression importante d'environ 18 kb vers l'extrémité gauche (6). L'analyse additionnelle par des études de transfert de marqueur ont permis d'établir la carte de la fonction génétique responsable du domaine d'hô- te, au point de vue de la possibilité de réplication, vis-à- vis d'un fragment d'EcoRi de 5,2 kb (14) et finalement d'un cadre de lecture ouvert de 855 bp chevauchant les fragments de HindIII M/K (15). Le gène réplicable chez l'hôte de la souche WR du virus de la vaccine (27, 30) est situé entre 24 et 25,2 kb depuis l'extrémité gauche du génome de la vaccine. Ce gène réplicable chez l'hôte, transcris vers la gauche de HindIII K en HindIII M, est décrit ici comme le gène KiL suivant la nomenclature recommandée par Rosel et autres (33). Un mutant- de suppression du gène, réplicable chez l'hôte, de la souche WR de la vaccine a été engendré par insertion du gène de résistance à la néomycine du transposon Tn5 et sélection avec l'antibiotique G418. Ce virus de suppression/recombinant VP293 est déficient d'environ 21,7 kb d'ADN commençant 3,8 kb à partir de l'extrémité gauche du génome. VP293 est capable de former des plaques sur des fibroblastes d'embryons de poulets primaires (CEF), deux lignées de cellules de singe (BSC-40 ou VERO) mais est déficient au point de vue réplication dans la lignée de cellules humaines MRC-5. L'insertion du gène réplicable chez l'hôte, K1L, dans vP293 restaure la capacité de croissance sur des cellules 4IRC-5. On a préparé une série de plasmides qui, en plus du gène réplicable chez l'h6te, KIL, contiennent un promo- teur de la vaccine précoce/tardif, à savoir H6, suivi de préférence par des sites de restriction de multiclonage à séquence unique de polylinker (agent de laison multiple), des codons d'amorçage et de fin de transcription et un signal de fin de transcription précoce. Ces plasmides pMP528HRH et pHESl-4 permettent en une seule étape rapide le clonage et l'expression de tout cadre de lecture ouvert en cas de recombinaison avec vP293 et marquage pour culture ou croissance sur des cellules MRC-5. L'insertion d'un cadre de lecture ouvert étranger dans ces plasmides suivie par la recombinaison avec vP293 restaure simultanément la fonction de réplicabilité chez l'hôte (gène K1L) et introduit le cadre de lecture ouvert étranger dans le virus de sauvetage vP293. Les virus recombinants sont identifiés par leur capacité de former des plaques sur des cellules MRC-5. Les avantages de ce système comprennent l'absence de tout gène exogène qui n'est pas du type vaccine dans le recombinant final autre que l'élément génétique intéressant, l'absence de réversion génétique du virus, étant donné que vP293 est un mutant de suppression de K1L, et l'identifica- tion rapide en une seule étape des recombinants. Cette étape unique peut également être utilisée pour un tri rapide de l'expression du gène étranger, par exemple pour réaliser une carte épitope. On a préparé des plasmides supplémentaires conte- nant le gène réplicable chez l'hôte, KlL, dans lesquels le promoteur précoce/tardif H6 a été remplacé par un promoteur de la vaccine soit strictement précoce, soit strictement tardif. Avec de tels plasmides additionnels, les subtilités de la régulation temporelle de l'expression d'éléments génétiques étrangers peuvent être étudiées. Les sytèmes restrictifs de réplicabilité chez l'hôte de la présente invention sont utilisés avantageuse- ment pour des vaccins destinés à induire des réponses immunologiques chez un hôte innoculé avec le vaccin. A cet égard, le vaccin comprend un véhicule et un virus recombi- nant modifié. Le virus recombinant modifié a été débarassé de ses gènes qui se répliquent chez l'hôte de sorte que le virus a une capacité de réplication restreinte chez l'hôte. En outre, le virus recombinant modifié contient de l'ADN qui code et exprime un produit de gène chez l'hôte avec une réplication limitée du virus chez l'hôte. On a préparé des virus recombinants modifiés qui expriment des produits de gène, particulièrement des antigènes, avec une réplication restreinte du virus du fait- de la suppression, dans les virus, des gènes réplicables chez l'hôte. Dans un mode de réalisation, l'hôte est un vertébré et l'antigène induit une réponse immunologique chez le vertébré. Dans un autre mode de réalisation, l'hôte est une cellule cultivée in vitro. On peut se rendre facilement compte que des virus et des espèces supplémentaires, en plus de ceux cités dans la présente demande, peuvent être utilisés pour la restric- tion de la réplicabilité chez l'hôte. En outre, on peut facilement réaliser que des "gènes réplicables chez l'hôte", supplémentaires, existent chez le poxvirus. De plus, on peut facilement se rendre compte qu'un grand nombre de gènes étrangers peuvent être utilisés dans ces mutants réplicables chez l'hôte. Une meilleure compréhension de l'invention et de ses avantages peut se déduire des exemples ci-après donnés à titre d'illustration et qui ne sont pas limitatifs. Dans certains de ces exemples, la souche WR du virus de la vaccine a été utilisée. Son origine et ses conditions de culture ont été décrites précédemment (27). Dans certains des exemples, la souche Copenhagen du virus de la vaccine a été utilisée. Son origine et ses conditions de culture ont été décrites précédemment (50). Des fibroblastes d'embryons de poulets primaires (CEF), des lignées de cellu- les de singe (VERO [ATCC n CCL81] et BSC40) et une lignée de cellules humaines MRC-5 (ATCC n CCL171) ont été culti- vées dans le milieu essentiel minimal d'Eagle (MEM) conte- nant 5 % (VERO et BSC40) ou 10 % (MRC-5, CEF) de sérum fétal de bovin (FBS). Les plasmides ont été préparés, triés et cultivés par les procédures standard (22, 31, 32). ExemDle 1 - PREPARATION DU PLSMIDE DMP528PiN et PRODUCTION de vP293 En se référant à la Figure 1A, on a isolé un frag- ment EcoRI/SalI comprenant la terminaison de gauche à 3,8 kb de l'ADN de la vaccine à partir de pAGR (30) et on l'a insé- ré dans pUC13, coupé précédemment au moyen de EcoRI et de SalI. Le plasmide résultant, pMPS, a été digéré avec HindIII et SalI et joint avec un fragment de HindIII/SalI de 3,8 kb contenant les séquences de la vaccine correspondant à l'extrémité droite du fragment K de HindIII de la vaccine. Le plasmide résultant, pMP528, contient, ainsi les 3,8 kb de l'extrémité gauche du génome de la vaccine et 3,8 kb de l'extrémité droite du fragment K de HindIII, en supprimant la partie intermédiaire de 21,7 kb entre les sites de SalI à 3,8 et 25,5 kb de l'extrémité gauche du génome. Le site unique de SalI dans pMP528 a été changé en un site SmaI par addition d'agents de liaison ou linkers synthétiques (mis sur le marché par Collaborative Research Inc. de Bedford, Mass.) en produisant pMP528L. Un fragment de 1,4 kb de SmaI contenant le gène pour la néomycine phosphotransférase en provenance du transposon ou élément transposable Tn5 (1) a été isolé de pSV2-neo (35, ATCC n 37149) et placé sous le contrôle d'un promoteur de vaccine précoce (désigné ici comme Pi). Le promoteur Pi, de la région AvaI H de la vaccine, a été décrit (37). Plus particulièrement, ce pro- moteur dérive du fragment AvaI H (XhoI G) de la souche de vaccine WR variante L, dans lequel le promoteur conduit la transcription de la droite vers la gauche. L'emplacement sur la carte du promoteur est approximativement à 1,3 kb à partir de l'extrémité gauche de AvaI H, approximativement à 12,5 kb à partir de l'extrémité gauche du gènome de la vaccine et environ 8,5 kb à gauche de la jonction IncIII C/N. Ce promoteur a été localisé par une analyse de carte transcriptionnelle standard. La séquence de l'ADN Pi correspond à la région en amont d'un cadre de lecture ouvert codant une protéine riche en glycine de 5KDa récemment décrite (40). On a démontré que cet élément promoteur exprime des gènes étrangers dans les recombinants de la vaccine très peu de temps après infection (37). La cassette promoteur Pi terminée par SmaI/néogène a été liée au site SmaI du pMP528L en produisant pMP528PiN. pPM528PiN contient 0,4 kb de séquences de vaccine dérivée d'un sous-clone Sau3A de AvaI H contenant la région du promoteur Pi suivie par 1 kb de séquences Tn5 des sites BqlII à SmaI (1). pMP528PiN a été transfecté, altéré après infection, en CEF primaire et coinfectê avec le virus de la vaccine de sauvetage VTK-79 par des procédures classi- ques (28). Le virus recombinant a été choisi et cultivé sur du CEF primaire en présence de 300 gg/ml de G418 (1, 11, ). Les configurations génomiques de la vaccine recom- binante vP293 ont été confirmées par analyse d'hybridation par taches de Southern (Southern blot). La vaccine recom- binante vP293 a été débarassée de 21,7 kb de vaccine comme prédit et contenait le gène étranger codant néor. Les cartes de restriction de l'extrémité gauche du virus de sauvetage VTK-79 et du virus recombinant VP292 exprimant le gène néor et choisi sur le CED primaire en présence de G418 sont représentées sur les Figures lB et 1C. En l'absence de l'antibiotique G418, le vP293 a produit de larges plaques sur le CEF primaire et de bonnes plaques sur les cellules BSC40 ou VERO, bien que les plaques de vP293 étaient, d'une manière détectable, plus petites que le parent VTK-79 sur des cellules VERO. D'une manière signi- ficative, vP293 n'a pas donné de réplication mesurable et n'a pas formé des plaques sur la lignée de cellules humaines MRC-5. Exemple 2 - RECONSTRUCTION DE vP293 AVEC LE GENE REPLICABLE CHEZ L'HOTE, K1L Pour démontrer que le gène réplicable chez l'hôte, K1L, lorsqu'il est reconstitué dans le mutant de suppression vP292 de la souche WR de la vaccine, permet au virus de se répliquer sur les cellules humaines, le gène réplicable chez l'hôte, KlL, a été cloné dans le plasmide pPR528L et inséré dans vP293. En se référant maintenant à la Figure 2A, la séquence d'ADN de la vaccine composant le bras droit de pMP528L (Figures 1A et 2A) a été raccourcie pour éliminer les sites de restriction non désirés et pour faciliter les opérations futures de clonage. pM528L a été coupé par EcoRV/IncIII, ses extrémités ont été rendues franches avec le fragment de Klenow de la E. Coli polymérase et auto-lié. De cette manière, le bras droit du plasmide résultant pMP528E a été réduit en longueur à 0,4 kb d'ADN. Un fragment BqlII (partiel)/ HDaI de vaccine de 891 bp contenant la totalité de la séquence de codage et le promoteur du gène réplicable chez l'hôte de K1L (15) a été préparé à partir de pSD452VC, un sous-clone de la souche Copenhagen de la vaccine contenant des séquence de HindIII M et K. Le fragment contenant KIL a été cloné dans la région de polyliaison, c'est-à-dire du polylinker, de pUC8 dans le seul but de flanquer le gène avec les sites de restriction convenables. Le plasmide résultant pUC8HR a été digéré avec HindIII et SmaI pour isoler le fragment contenant K1L. L'extrémité HindIII a été remplie avec le fragment de l'ADN polymérase de E. Coli et le fragment cloné au site SmaI de pMP528E. Un plasmide pMP528HR avec l'orientation du gène réplicable chez l'hôte, KlL, lu de la gauche comme représen- té sur la Figure 2A, a été isolé par des procédés classi- ques. Les procédés pour la recombinaison et l'hydridisa- tion sur des filtres en nitrocellulose ont été mis en oeuvre comme connu de l'homme de l'art et comme décrit précédemment (28) avec les modifications ci-après. Le plasmide donneur pMP528HR a été introduit par électroporation dans des cellules de VERO ou de MRC-5, cha- cune co-infectée avec vP293. Des monocouches subconfluen- tes de cellules VERO ou MRC-5 ont été infectées avec un virus de sauvetage pendant 1 heure. Ces cellules ont été recueillies avec de la trypsine, lavées avec une-solution saline tamponnée de Hepes (HeBS) (16) et électroporées en présence de 25 gg de plasmide ADN dans HeBS. Les cellules infectées de virus ont été électroporées en utilisant un pulseur du type "Bio-Rad Gene Pulser" équipé d'un extenseur * de capacité du type "Bio-Rad-Gene Pulseur Capacitence Exten- der". La suspension de cellules (0,8 ml) a été placée sur de la glace pendant 10 minutes dans une cuvette de pulseur "Bio-Rad Gene"t, puis pulsée à 200 volts (capacitance de 960 gF) et placée sur de la glace pendant une autre période de minutes. Les cellules ont été ensuite diluées dans 8 ml de MEM + 5 % de FBS, type "Bio-Rad-Gene Pulser Capacitence Extender", soumis à la procédure de formation de plaques dans des boîtes de 60 mm contenant des mono-couches de cellules de VERO ou MRC- 5 (4 ml par boîte) et incubées à 37 C pendant la nuit. La progéniture a été récoltée et soumise à l'essai de formation de plaques sur des cellules VERO ou MRC-5. Le nombre des plaques obtenues sur des cellules de VERO était de 10 à 100 fois plus grand que le nombre des plaques obtenues sur des cellules de MRC-5. Des plaques isolées (de dimensions uniformes) ont été prélevées sur les cultures de cellules de MRC-5 et de VERO (à la fois des plaques de grande dimension et de petite dimension). Ces isolats de plaques ont été soumises à l'essai de formation de plaques sur des cellules de VERO et après trois jours les plaques résultantes ont été prélevées sur des disques filtrants en nitrocellulose et préparées pour hybridation in situ. Toutes les plaques provenant des cellules de MRC-5 et toutes les grandes plaques, mais non les petites plaques, provenant des cellules de VERO ont donné des signaux d'hybridation posi- tifs lorsqu'elles ont été essayées avec une sonde marquée au 32p pour les séquences de codage de K1L. Cette donnée est consistante avec la restauration des fonctions de capacité de replication chez l'hôte contenues dans la séquence de codage de KiL. Un isolat obtenu à partir des cellules de MRC-5 a été purifié d'une manière plus poussée et désigné vP457. Dans vP457, le gène K1L a été restauré et a été situé à l'intérieur d'une suppression dans son orientation native lue de la droite vers la gauche. Les séquences de K1L ont remplacé la cassette promoteur Pi/gène de néomycine phos- photransférase présente dans vP293 comme illustré sur les Figures 2B et 2C. Comparé au génome de la vaccine variante L (30, 27), vP457 contient une suppression de 291 bp à droite du gène K1L et une suppression de 20,2 kb à gauche du gène KlL. Exemple 3 - PREPARATION DES PLASMIDES DM528HRH ET pHES1-4 Pour démontrer que la mutation lethale condition- nelle dans vP293 peut être exploitée pour préparer des plasmides donneurs dans lesquels des cadres de lecture ouverts supplémentaires peuvent être clones, une série de plasmides à savoir pMP528HRH et pHESl-4 ont été préparés. La recombinaison de cadres de lectures ouverts exogènes présents dans un plasmide contenant le gène replicable chez l'hôte, KiL, en vP293 fournit un procédé simple pour engendrer des recombinants de vaccine en vertu d'une restriction dans le domaine de replicabilité chez l'hôte. Un promoteur de vaccine, à savoir H6, a été ajouté en amont du gène KiL dans pMP528HR. Ce promoteur précoce/ tardif a été identifié précédemment par la construction d'une carte transcriptionnelle classique et une analyse de séquence d'ADN. Il comprend la séquence (positions -125 à +3) ATTCTTTATTCTATACTTAAAAAATGGAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGAGGGT TGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCGGTTAA GTTTGTATCGTAATG. La séquence est celle décrite comme étant en amont du cadre de lecture ouvert H6 par Rosel et autres (33). En se référant maintenant à la Figure 3, l'ADN correspondant aux positions -124 à -1 (avec la position -102 changée de A à G en vue d'empêcher l'introduction de tous codons d'amorçage potentiel) et suivi de sites de restric- tion XhoI, KpnI, et SmaI, a été synthétisé chimiquement (Figure 3B) et cloné au site SmaI de pMP528HR en produisant pM528HRH (Figure 3A). Ainsi pMP528HRH contient le promoteur H6 en amont du gène KiL qui est exprimé sous le contrôle du promoteur endogène KlL. Les deux se trouvent dans une orien- tation de droite à gauche par rapport aux bras de la vaccine (génome). Le promoteur H6 dans pMP528HRH se trouve immédia- tement en amont des sites de restrictions uniques XhoI, KpnI et SmaI. Pour accroître davantage l'utilité du système, on a dérivé une série de plasmides pHES1-4 à partir de pMP528HRH. On a préparé pHES1 par la procédure suivante: pMP525HRH a été coupé avec XhoI et XmaI et les oligonucléo- tides des HRL1 5'(TCGACCATGGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTCGAGTAAATAAATAATTTTTAT)3' et HRL2 '(CCGGATAAAAATTATTTATTTACTCGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCATGG)3' ont été clones en ce site. pHES2, pHES3 et pHES4 ont été préparés d'une manière similaire. pHES2 a été préparé avec les oligonucléotides HRL3 '(TCGACCATGGGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTCGAGTAAATAAATAATTTTTAT)3' et HRL4 '(CCGGATAAAAATTATTTATTTACTCGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCCATGG)3' pHES3 a été préparé avec les oligonucléotides HRL5 5' (TCGACCATGGGGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTCGAGTAAATAAATAATTTTTAT) 3' et HRL6 ' (CCGGATAAAAATTATTTATTTACTCGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCCCAT- GG) 3' et pHES4 a été préparé avec les oligonucléotides HRL7, 5' (TCGAGGATCCCGGGTACCGAGCTCTAAATAAATAATTTTTAT) 3' et HRL8 ' (CCGGATAAAAATTATTTATTTAGAGCTCGGTACCCGGGATCC) 3'. Les éléments de la séquence d'ADN pertinents, les sites de restriction et les signaux de transcription et de traduction de pM28HRH et de pHES1-4 sont les suivants. La séquence du promoteur H6 synthétique (positions -124 à -1 avec la base altérée en position -102 soulignée) et les sites de restriction en aval présents dans pMP528HRH sont illustrés sur la Figure 3B. La séquence entre crochets est replacée dans les plasmides pHES1-4 avec des sites de restriction, des codons d'arrêt et un signal de fin de transcription précoce comme indiqué, ainsi que cela est illustré sur la Figure 3C pour pHES1, la Figure 3D pour pHES2, la Figure 3E pour pHES3 et la Figure 3F pour pHES4. En plus des éléments contenus dans pMP528HRH, chaque plasmide, pHES1-3, contient un codon d'amorçage de traduction en aval du promoteur H6 suivi par des sites de restriction multiples de type unique, des séquences de signal de fin de traduction et une succession de signaux de fin de transcription précoce de vaccine spécifique (39). Chaque plasmide, pHESl-3, contient un codon d'amorçage de traduction dans l'un des trois cadres de lecture. C'est pourquoi toute séquence d'ADN qui contient un cadre de lecture ouvert peut être exprimée lorsqu'elle est clonée dans l'un de ces plasmides et recombinée en un virus de & vaccine. Le quatrième plasmide, à savoir pHES4, ne contient pas de codon d'amorçage de traduction mais contient des sites de restriction multiple de type unique, des séquences de fin de traduction et une séquence de signal de fin de transcription précoce. Une séquence d'ADN-qui contient un cadre de lecture ouvert et un codon d'amorçage peut être exprimée lorsqu'elle est clonée en pHES4 et recombinée en virus de la vaccine. Exemple 4 - INCORPORATION DE GENE LACZ BACTERIEN DANS LE VIRUS DE LA VACCINE ET SELECTION DES VIRUS RECOMBINANTS SUR LA BASE DE LA RESTRICTION DU DOMAINE DE REPLICABILITE CHEZ L'HOTE Pour démontrer l'utilité du système de sélection du domaine de réplicabilité chez l'hôter pHESl-4/vP293, un virus de la vaccine recombinant contenant le gène lacZ de 1'E. Coli codant la B galactosidase a été construit. Un fragment BamHI contenant des codons de 8 jus- qu'à la fin du gène lacZ a été obtenu à partir de pMC1871 (34). Ce fragment de BamHI lacZ a été cloné au site BamHi unique des plasmides pHES1-4. La recombinaison entre les plasmides résultant pHESLZl-4 transfectés individuellement dans les cellules VERO co-infectées avec le mutant réplicable chez l'hôte vP293 a été réalisée. 24 heures après l'infection, le virus constituant la progéniture a été recueilli par 3 cycles de congélation/ décongélation et soumis au test de formation de plaques soit sur des cellules VERO (Tableau lA), soit sur des cellules MRC-5 (Tableaux lB et 1C). Des mono-couches de VERO et de MRC-5 (Tableaux 1A et lB) tachées de rouge neutre ont été soulevées après 3 jours sur des filtres en nitrocellulose et préparées pour l'hybridation in situ (26) en utilisant des sondes de gènes lacZ marquées au 32p. Les mono-couches de VERO (chiffres non indiqués) et MRC-5 (Tableau 1C) ont été exposées à X-gal (5- bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galactopyranocide de Boehringer Mannheim) et le développement de couleur bleue a été noté après 8 heures. Lorsque la progéniture a été soumise au test de formation des plaques sur des cellules de VERO et l'expres- sion de B galactosidase testée en présence de X-gal; on n'a pas observé de plaques bleues dans les cellules transfectées avec pHESLZl, 2 ou 4. D'une manière significative, approxi- mativement 20 % des plaques engendrées avec le plasmide pHESLZ3 ont donné des plaques bleues en présence de X-gal (chiffres non indiqués). Lorsque la progéniture a été soumise au test de l'essai de plaques sur des cellules de VERO et des virus recombinants triés par hybridation in situ, 12 à 22 % des plaques ont donné des signaux d'hybridation positive au lacZ (Tableau 1A). Lorsqu'analysée par hybridation d'ADN in situ (26) chaque plaque sur MRC-5 a montré la présence du gène lacZ (Tableau lB). L'activité de B galactosidase a cependant été seulement constatée dans les plaques sur MRC-5 qui ont été dérivées de pHESLZ3 (Tableau 1C). Seule la structure de plasmide pHESLZ3 avait le gène lacZ en concordance avec le codon d'amorçage transitionnel. TABLEAU 1 Analyse de lacZ recombinant/virus de la vaccine engendrés avec les plasmides pHESLZ1-4 et vP293 du virus de la vaccine Plasmide donneur pHESLZ1 PHESLZ2 pHESLZ3 pHESLZ4 A. Plaques totales 1056 637 793 1344 Hybridation positive 153 141 95 269 % positif 14,5 22 12 20 B. Plaques totales 60 56 ND 71 Hybridation positive 60 56 ND 71 % positif 100 100 100 C. Plaques totales 60 55 59 70 X-gal positif 0 0 59 0 % positif 0 0 100 0 Exemple 5 - CONSTRUCTION DES PLASMIDES pHES3l-34 et PHES61-64 Pour démontrer que la mutation lethale condition- nelle de vP293 peut être exploitée pour construire d'autres plasmides donneurs et pour étendre le système de sélection du domaine de réplicabilité chez l'hôte basé sur la vaccine WR vP293, la série de plasmides pHES (Exemple 3) a été étendue en remplaçant le promoteur de vaccine précoce/tardif H6 par d'autres promoteurs réglés temporellement. Les plas- mides pHES31-34 et la série de plasmides pHES61-64 ont été engendrés pour régler l'expression de gènes étrangers, pré- coces ou tardifs respectivement. La localisation et la séquence du gène pour une protéine de 38 kDa dans le poxvirus de la vache (cowpox virus) exige pour la formation de pustules rouges hémora- giques sur une membrane chorioallantoique de poulet (CAM) a déjà été rapportée (43). Ce gène, à savoir u, est hautement exprimé promptement après l'infection. Le gène u constitue sur la carte un fragment NcoI-HaeIII de 1465 bp. La région du génome du virus de la vaccine souche Copenhagen contenant l'équivalent du gène u du cowpox a été déterminée par l'analyse des taches de Southern (44) en utilisant de l'ADN de cowpox cloné comme sonde. L'équivalent Copenhagen du gène u du cowpox est localisé sur la carte en HindIII B et correspond à l'emplacement du gène u dans le virus de la vaccine souche WR récemment rapporté (45). Dans le cowpox, la région du promoteur u est disposée en aval d'un site NcoI à -294 (43). De l'ADN contenant le gène u Copenhagen équivalent et le promoteur ont été séquences (46). Le gène u Copenhagen équivalent n'est pas fonctionnel et provoque la formation d'une pustule blanche pour le virus de la vaccine Copenhagen cultivé sur CAM du fait des mutations de la structure ou cadre dans la région de codage. La région en amont est hautement homologue à la région du promoteur de cowpox et est fonctionnelle. La vaccine recombinante contenant la beta-galactosidase d'E. Coli exprimée sous le contrôle du promoteur u de la vaccine Copenhagen forme des plaques bleues en présence d'un sub- strat chromogène de type X-gal. Comme pour le cowpox, le génome Copenhagen contient le site Ncol en amont de la région du promoteur u. Pour déplacer la région du promoteur u Copenhagen au système pHES, un site HindIII a été ajouté au site NcoI en amont du promoteur u par liaison avec l'oligonucléotide HELl4 (5' CATGGAAGCTTC 3'; site HindIII souligné) auto- recuit ou auto-hybridé. Un fragment HindIII-ClaI de 299 bp contenant la région du promoteur u depuis le site NcoI jusqu'au site ClaI en -6 a été isolé. Le promoteur H6 a été enlevé de pHES1 (Exemple 3) par digestion partielle au moyen de HindIII, suivie par digestion au moyen de KDnI. En se référant maintenant à la Figure 4, le fragment de vecteur HindIII-KDpnI de 7,8 kb a été isolé d'un gel d'agarose (Figu- re 4A). Pour remplacer les séquences de promoteur en aval du site ClaI et des séquences de l'agent de polyliaison ou polylinker jusqu'au site KpnI, huit oligonucléotides, à savoir HRL15 à HRL22, ont été synthétisés (Figure 4B).. Des paires d'oligonucléotides ont été recuites (hybridées) et liées avec un fragment de vecteur HindIII-KpnI de 7,8 kb de pHES1 et le fragment de promoteur u HindIII-ClaI en engen- drant des plasmides pHES31-34 (Figure 4A). En se référant maintenant à la Figure 5, les plasmides résultants pHES31 à pHES34 contiennent des régions de polyliaisons ou polylinker en aval de la région du promo- teur u Copenhagen (Figure 5). La séquence d'ADN de 0,3 kb spécifiant le promoteur u est indiquée sur la Figure 5 seulement pour le plasmide pHES31. La séquence identique est présente dans les plasmides pHES32 à pHES34. La séquence entre crochets qui suit la région du promoteur dans pHES31 est remplacée par les séquences indiquées entre crochets pour pHES32 à pHES34. Les sites de restriction sont indi- qués. Dans pHES31 à pHES33, la région de polyliaison ou polylinker est située en aval de l'ATG d'amorçage dans les trois cadres de lecture différents. Le plasmide pHES34 ne contient pas d'ATG d'amorçage. Dans tous les membres de la série pHES31 à pHES34, la région de polyliaison est suivie par des codons d'arrêt de traduction dans les trois cadres de lecture, soulignés, suivie par la séquence TTTTTAT, surlignée, qui a été illustrée pour spécifier la fin de la transcription pour les gènes précoces dans la vaccine (39). Comme avec la série de pHES1 à pHES4 de plasmides (Exemple 3), la série pHES31 à pHES31 permet l'expression de séquences de codage étrangères insérées dans la région de polyliaison. Les séquences de codage étrangères contenant un codon d'amorçage ont été exprimées sous le contrôle du promoteur u de la vaccine par insertion dans pHES34. Des séquences de codage étrangères privées d'un codon dit d'amorçage sont exprimées dans le cadre de lecture appro- prié par insertion dans pHES31, pHES32 ou pHES33. Comme dans le cas des séries pHES originales, pHES31 à pHES34 contiennent le gène réplicable chez l'hôte humain K1L (15). La recombinaison entre le mutant de suppression de la vaccine vP293 (Exemple 1) et tous les dérivés plasmidiques de la série pHES engendrent des virus de la vaccine recom- binants qui sont choisis suivant leur capacité a se développer sur des cellules humaines. Pour mieux adapter le système plasmidique pHES à l'expression des gènes étrangers dans la vaccine recombi- nante à une époque tardive après l'infection, le promoteur pour le gène ATI de 160 kDadu cowpox a été choisi (47). La région de 533 bp immédiatement en amont du gène ATI du cowpox, lorsqu'il est inséré dans le virus de la vaccine, produit de hauts niveaux d'expression de gènes étrangers à une période tardive après l'infection comme cela a été montré (48). La région de l'ADN du cowpox 663 bp s'étendant depuis l'amont du site BalII jusqu'au codon d'amorçage est suffisante pour agir comme promoteur pour l'expression de gènes étrangers dans la vaccine. L'ADN spécifiant cette région de promoteur a été synthétisé et inséré dans le système pHES comme détaillé ci-après. Le promoteur H6 a été éliminé de pHES1 (Exemple 3) par digestion partielle au moyen d'HindIII, suivie par di- gestion au moyen de BamHI. En se référant maintenant à la Figure 6, le fragment de vecteur HindIII-BamHI de 7,8 kb a été isolé à partir d'un gel d'agarose (Figure 6A). Pour remplacer les séquences de promoteur H6 avec les séquences de promoteur ATI du cowpox et la liaision BamHi aux sé- quences de polyliaison, on a synthétisé huit oligonucléo- tides, à savoir HRL33 à HRL40 (Figure 6B). Des paires d'oligonucléotides ont été recuites (hybridées) et liées avec un fragment de vecteur HindIIIBamHI de 7,8 kb en provenance de plasmides pHES 61-64 engendrant pHESI. Chaque paire recuite d'oligonucléotide contient la région de promoteur ATI de cowpox synthétique de 63 bp flanquée par des sites de restrictions HindIII et BamHI, comme indiqué. En se référant maintenant à la Figure 7, les plasmides résultants pHES61 à pHES64 contiennent les régions de polyliaison ou polylinker en aval de la région de promo- teur tardif ATI du cowpox (Figure 7). La séquence identique pour le promoteur ATI de cowpox, qui est présente dans pHES61 à pHES64, est indiquée seulement pour pHES61. La séquence entre crochets qui suit la région de promoteur dans pHES61 est remplacée par les séquences indiquées entre crochets pour pHES62 à pHES64. Les sites de restriction sont indiqués. Dans pHES61 à pHES63, la région de polyliaison est située en aval du codon d'amorçage ATG dans les trois cadres de lecture différents. Le plasmide pHES64 ne contient pas de codon d'amorçage ATG. Comme dans les séries de plasmides pHES contenant d'autres promoteurs, tous les membres de la série de plas- mides pHES61 à pHES64 contiennent des régions de polyliaison suivies par des signaux de fin de traduction (soulignés) ou de transcription (surlignés). Etant donné que des dérivés de la série pHES61 à pHES64 contiennent le gène réplicable chez l'h6te humain KIL de la vaccine, les virus progénitures de la vaccine recombinante engendré par la recombinaison de ces plasmides avec VP293 sont choisis en fonction de leurs capacité de croissance sur des cellules humaines. ExemDle 6 - CONSTRUCTION DES RECOMBINANTS VP548 ET VP661 La séquence de 15 537 bp d'ADN située au voisinage de l'extrémité gauche du génome Copenhagen est illustrée-de il gauche vers la droite sur la Figure 8. Cette séquence comprend 7218 bp entre le site SalI le plus à droite dans HindIII et la jonction HindIII C/N et s'étend à travers la totalité des séquences pour HindIII N (1544 bp; positions 7219 - 8762), HindIII M (2219 bp; positions 87863 - 10981) et HindIII K (4551 bp; positions 10 982 532). Aux fins de clarté, les séquences de codage et les sites de restric- tion sont désignés par les positions de base comme indiqué sur la Figure 8. Selon la nomenclature classique, les cadres de lecture ouverts de la vaccine (ORF) sont désignés en numérotant de la gauche vers la droite à l'intérieur de chaque fragment HindIII (33). Etant donné que les différen- tes souches de vaccine comportent des différences signifi- catives vers l'extrémité de gauche de HindIII C (le termi- nus de gauche du génome de vaccine), les ORF disposés à l'intérieur du fragment HindIII C de la vaccine sont dési- gnés ici en numérotant de la droite vers la gauche en commençant à la jonction HindIII C/N. Dans cette nomencla- ture, ORF C1L est l'ORF le plus à droite commençant dans le fragment HindIII de l'ADN de la vaccine Copenhagen (voir Figure 8). En se référant maintenant à la Figure 9, des plasmides ont été préparés pour supprimer le gène réplicable chez l'hôte humain K1L (15) à partir du virus Copenhagen dans l'idée que l'élimination du gène KlL produirait l'absence de possibilité pour le virus résultant de se répliquer sur les cellules humaines. Le fragment D de KDnI Copenhagen, qui comprend environ 2,5 kb d'ADN à gauche de la séquence représentée sur la Figure 8 et s'étend vers la droite jusqu'à la position 12 998, a été cloné dans le site KpnI de pUC18, en donnant pSD435 (Figure 9) (Sur la Figure 9, les plasmides de la série pSD contenant des insertions Copenhagen de la vaccine apparaissent avec la désignation "VC" optionnelle. Ainsi pSD435 est équivalent à pSD435VC. La désignation "VC" est omise sur la Figure 10) . Le fragment KpnD contient le gène K1L (positions 11 030 - 10 179). Pour faciliter la manipulation du gène KiL et sa région de flanc, pSD452, on a préparé (Figure 9) un sous-clone de pSD435 qui comprend des séquences entre le site SphI (position 9478) dans HindIII-M et le site ClaI dans HindIII K (position 11 731). Le gène K1L est indiqué par un bloc hachuré, la direction de transcription étant indiquée par une flèche. pSD452 qui contient deux sites HpaI (positions 9561 et 1555) a été linéarisé par digestion partielle par HpaI et des linkers ou agents de liaison BqlII ont été liés sur le site HpaI (position 10 155) immédiatement en aval du gène K1L. Le plasmide résultant a été coupé au moyen de BqlII et auto-lié, en engendrant pSD453. Dans pSD453, le gène KiL et son promoteur sont supprimés. Le site de suppression est indiqué par un triangle (Figure 9). Un fragment contenant les séquences de codage de la beta-galactosidase (bloc marqué en pointillés, la direc- tion du gène étant indiquée par une flèche) sous le contrôle du promoteur tardif de la vaccine de 11 kDa (flèche sombre) (49) a été inséré dans le site BglII de pSD453 en engendrant pSD453BG (Figure 9). pSD453BG a été utilisé comme plasmide donneur pour la recombinaison avec vP410, un dérivé moins de la thymidine kinase du virus de la vaccine souche Copenhagen (50). Le virus constituant la progéniture a été testé en présence de X-gal. Des plaques bleues ont été prélevées et purifiées par croissance sur des cellules de VERO. Comme on s'y attendait, le recombinant qui en résulte, à savoir vP548, ne comportait pas, comme on l'a montré, de gène KiL lorsqu'on l'a testé avec des séquences de K1L marquées au 32p. D'une manière surprenante, vP548 formait des plaques sur des cellules de MRC-5. L'essai pour détecter la présence du gène pour la B-galactosidase dans vP548 était très significatif du fait de sa capacité à former des plaques sur des cellules de MRC- ; la cassette de 11 XDa/B-galactosidase a été enlevée de vP548 par recombinaison avec le plasmide donneur pSD453. Le recombinant de suppression de vaccine résultant, à savoir vP661, forme également des plaques sur des cellules de 264417? KRC-5. Exemple 7 - IDENTIFICATION DU GENE REPLICABLE CHEZ L'HOTE C7L A PARTIR DE LA SOUCHE COPENHAGEN DU VIRUS DE LA VACCINE Les résultats décrits dans l'Exemple 6 suggèrent que K1L n'est pas le seul gène de la vaccine réplicable chez l'hôte, capable de conférer la croissance sur des cellules humaines. On a investigué la possibilité que les régions supprimées du virus de la vaccine vP293 (Exemple 3) et du virus de la vaccine mutant de suppression de 18kb du domaine de réplicabilité chez l'hôte (14) étaient supprimées pour un autre gène, qui comme K1L, confère la possibilité de se développer sur des cellules humaines. La Figure 10 représen- te la carte de restrictions de l'extrémité gauche du génome du virus de la vaccine montrant les emplacements des gènes réplicables chez l'hôte potentiels. Les cartes de HindIII et EcoRI de l'extrémité gauche du génome du virus de la vaccine sont illustrées à la partie supérieure. On a indiqué seule- ment les sites de EcoRI qui ont de l'importance ici. L'éten- due des suppressions dans le domaine de la réplicabilité chez l'hôte dans les mutants de vP293 de suppression du virus de la vaccine (Exemple 3) et la suppression du domaine de réclicabilité chez l'hôte de 18 kb (14), aussi bien que la région supprimée commune aux deux mutants de suppression sont représentées par des traits épais. La région séquencée de 15 537 bp (Figure 8) depuis le site SalI le plus à droite jusqu'au fragment HindIII K a été dilatée. On n'a indiqué que les sites de restrictions qui présentent un intérêt ici. Les emplacements des gènes discutés ici sont indiqués dans des boîtes ouvertes. Les emplacements des fragments utilisés pour tester les gènes pour leur capacité de réplicabilité chez l'hôte ont été indiqués au-dessus d'auges. Les empla- cements des insertions de vaccine dans les plasmides décrits ici, en même temps que les sites de restriction qui présentent de l'intérêt ici ont été aussi indiqués. On a utilisé les désignations abrégées suivantes: S = SalI; E = EcoRI; H = HindIII; Bg = BalII; Kp = KpnI; B = BamHI; Sp = SphI; C = ClaI; Hp = HpaI. Comme indiqué sur la Figure 10, la région de suppression commune à la suppression du domaine de répli- cabilité chez l'hôte de 18kb et la suppression dans vP293 s'étend depuis un point non déterminé dans EcoRI C jusqu'au site SalI dans HindIII K (position 11 412). On a déterminé qu'une fonction de réplicabilité chez l'hôte s'appliquait comme carte sur le fragment d'EcoRI K (positions 7550- 12 875) (14) et un gène réplicable chez l'hôte K1L (posi- tions 11 030 - 10 179) a été identifié dans un fragment BglII D de 846 bp (positions 10 271 - 11 116) de l'inté- rieur de l'EcoRI K (15). Le fragment PZlII A (positions 8645 - 10 270) de l'EcoRI K n'a pas restauré la croissance sur des cellules humaines. Cependant, dans ces analyses, des gènes éventuels réplicables chez l'hôte dans le fragment d'EcoRI K qui sont situés entre EcoRI (position 7749) et BqlII (position 8644), ou entre sites BclII (position 11 116) et ClaI (position 11 731), auraient été ignorés. Egalement des gènes.qui croisent les sites EcoRI (position 7779), BqlII (position 8644) ou ClaI (position 11 731) de EcoRI K, ou la jonction EcoRI (position 1295) entre EcoRI C et J auraient été ignorés. L'analyse de la traduction d'amino-acides de la séquence de 15,5 kb décrite ici révèle quatre gènes poten- tiels qui n'auraient pas été testés précédemment (14, 15). Tous les quatre cadres de-lecture ouverts sont orientés de la droite vers la gauche. Les positions de ces quatres ORF, C7L (positions 1314 - 863), N2L (positions 7943 - 7416), MlL (positions 9329 - 7985) et K2L (positions 12 367 - 11 258) ont été indiquées sur la Figure 10. Le premier ATG sur le MiL ORF est disposé dans la position 9403. Etant donné que cet emplacement est en amont (à droite) des emplacements publiés pour les sites d'amorçage de la transcription pour MiL (51) et à l'intérieur des séquences de codage pour le gène M2L, on peut interpréter l'ATG en position 9329 comme le commencement véritable de la traduction du gène MiL. Des quatre gènes potentiels, le MlL semblait initialement le candidat le plus vraisemblable comme gène du domaine de réplicabilité chez l'hôte. Une sonde d'ADN marquée par 32p pour KIL interagit faiblement avec les séquences de M1L sur une tache de Southern (44) (valeurs non indiquées). La séquence du gène MlL dans la souche Copenhagen de la vaccine décrite ici diffère, à l'extrémité amino, de la séquence du M1L publiée dans la souche WR de la vaccine (51). L'insertion de deux bases (positions 9307, 9312) dans la présente séquence par rapport à la séquence publiée pro- voque des mutations de déplacement de cadres (de lecture), c'est-à-dire que le cadre de lecture normal est décalé. Dans la séquence décrite ici, la traduction commence au ATG dans la position 9329. Dans la séquence rapportée (51) la traduc- tion potentielle à partir de cet ATG serait terminée par un codon d'arrêt de cadre en position 9278 et la traduction de MiL commencerait en position 9247. Dans la séquence décrite ici, la traduction depuis la position 9329 est continue jus- qu'au codon d'arrêt de MiL rapportée précédemment (position 7987). Le résultat net est que le gène MiL décrit ici contient 27 acides aminés supplémentaires au terminal amino aussi bien que deux substitutions d'acide aminés comparati- vement au gène MlL rapporté (51). La séquence pour le gène WR N2L a été également publiée (51). Le gène N2L Copenhagen décrit ici possède quatre substitutions d'acides aminés relativement à la séquence publiée. L'analyse par ordinateur de la protéine codée par le virus de la vaccine Copenhagen M1L ORF décrit ici révèle un niveau supérieur de similarité avec la protéine K1L du virus de la vaccine Copenhagen (15) qu'avec toute autre protéine dans les bases de données PIR ou Swiss-Prot (valeurs non indiquées). Ce fait couplé aux valeurs dérivées par l'analyse des tâches de Southern suggère que le produit de gène MIL pourrait remplir une fonction similaire relative au domaine de réplicabilité chez l'hôte que le produit de gène K1L. C'est pourquoi, parmi les quatre gènes potentiels réplicables chez l'hôte humain, le gène MIL a été testé d'abord dans le système de sélection du domaine de réplica- bilité chez l'hôte du virus de la vaccine vP293 pour tester sa capacité à permettre la croissance du virus de la vacci- ne sur des cellules humaines. Pour recombiner le gène pour M1L et les gènes subséquents dans le système de sélection de vP293, on a utilisé comme plasmides vecteurs pMP528 (Exemple 1) et son dérivé pMP528E (Exemple 2). pMP528 est le plasmide de suppression de vaccine original à partir duquel le recombinant de vaccine vP293 a été déduit. pMP528 contient un site SalI à -la jonction de suppression entre les bras de flancs de la vaccine dérivés des régions d'ADN de la vaccine HindIII C / HindIII K. Dans pMP528E, le -bras de flanc droit qui dérive de l'ADN HindIIr K de la vaccine a été raccourci et ainsi le site SmaI a été substitué au site SalI original à la jonction de suppression HindIIIC/ HindIII K. L'essai des gènes potentiels réplicables chez l'hôte de la vaccine dans le système vP293 est représenté schématiquement sur la Figure 11. La carte de HindIII à l'extrémité gauche du génome du virus de la vaccine est don- née sur la ligne supérieure. Les emplacements des gènes sont indiqués à l'intérieur de boites, la direction de transcrip- tion étant indiquée par des flèches. L'emplacement des frag- ments de vaccine utilisés pour tester l'activité de réplica- bilité chez l'hôte des gènes est indiqué par des auges. - Un fragment d'ADN s'étendant de l'extrémité 3' de M2L (position 9384, 55 bases en amont à partir du codon d'amorçage de MIL) jusqu'au site ScaI (position 7906) en aval de M1L a été lié dans pMP528E coupé au moyen de SmaI (Figure 11). Le plasmide résultant, à savoir pMP528M, a été utilisé comme plasmide donneur pour recombinaison avec le virus de la vaccine vP293. Bien que l'analyse avec une sonde d'ADN marquée au 32p du gène MlL ait révélé que les séquences du M1L étaient insérées dans la vaccine, le virus de progéniture ne forme pas de plaques sur des cellules de MRC-5. Etant donné que la dimension de la région de promoteur nécessaire pour l'amorçage de la transcription du gène M1L est inconnue, il est possible que les 55 bases en amont des séquences de codage de M1L dans le plasmide pMP528 n'étaient pas suffisantes pour spécifier la transcription du gène MiL. C'est pourquoi un plus grand fragment d'ADN du virus de la vaccine souche Copenhagen contenant tous les gènes pour M2L, MiL et N2L a été essayé. Un fragment de HPaI de 2849 bp (positions 7307 -10 155) a été obtenu par diges- tion partielle avec HDaI de pSD420, un clone SalI de l'ADN du virus de la vaccine Copenhagen (positions 1 - 10 477). Ce fragment de HpaI contient tous les gènes pour M2L (positions 043 - 0381), MiL (positions 9329 - 7985) et N2L (posi- tions 7943 - 7416). Le fragment de HpaI a été cloné en pMP528E coupé au moyen de SmaI (Figure 11). Le plasmide résultant, désigné pMPml2n2 sur la Figure 3 a été utilisé comme plasmide donneur pour recombinaison avec vP293. Bien que l'analyse avec des sondes d'ADN marquées au 32p ait indiqué que les trois gènes ont été insérés dans la vac- cine, la progéniture virale recombinante n'a pas formé de plaques sur des cellules de MRC-5. Ceci indiquait que M1L et N2L n'étaient pas les gènes ou le gène présomptifs réplica- bles chez l'hôte. On ne s'attendait pas à ce que le M2L soit le gène réplicable chez l'hôte étant donné que le gène pour M2L est entièrement contenu dans le fragment de BalII A de EcoRI K testé précédemment (15). Les autres gènes éventuellement réplicables chez l'hôte humain du virus de la vaccine étaient K2L, qui manque dans le mutant réplicable chez l'hôte de 18 kb et est tron- qué dans vP293, et C7L, un ORF dans HindIII C qui couvre la jonction EcoRI C/J et présente la capacité de codage pour une protéine de 18 kDa. Le gène K2L décrit ici correspond au "ORF K1L" rapporté précédemment (52) pour la vaccine souche WR, mais diffère par deux substitutions d'acides aminés. Le mutant de suppression du virus de la vacinne, vP293, contient la masse des séquences de codage pour K2L immédiatement à droite de la jonction de suppression dans HindIII K (équivalent au site SalI en position 11 412). Pour tester le gène K2L (positions 12 367 - 11 258) en ce qui concerne sa capacité de permettre la croissance virale de la vaccine sur des cellules humaines, l'extrémité 3' du gène K2L de la vaccine a été restaurée sur le plasmide pMP528. Des polylinkers ou agents de polyliaisons synthétiques MPSYN52 (5'ATTATTTTTATAAGCTTGGATCCCTCGAGGGTACCCCCGGGGAGCTCGAATTCT3') et MPSYN53 (5'AGAATTCGAGCTCCCCGGGGGTACCCTCGAGGGATCCAAGCTTATAAAAATAAT3') ont été recuits (hybridés) et liés dans le site SspI (posi- tion 11 177) en aval du gène K2L dans un sous-clone plas- midique de HindIII K Copenhagen, et un fragment XhoI/SalI contenant l'extrémité 3' du gène K2L a été isolé. Le-plasmi- de pMP528 a été coupé au moyen de SalI et le fragment XhoI/ SalI contenant l'extrémité 3' du gène K2L a été inséré suivant l'orientation correcte (Figure 11). Le plasmide résultant, à savoir pMP528K2, a été utilisé comme plasmide donneur pour recombinaison avec le virus de la vaccine vP293. Une fois encore, la progéniture virale de la vaccine recombinante a été incapable de former des plaques sur des cellules de MRC-5, ce qui indique que K2L n'était pas le gène réplicable chez l'hôte humain. Le gène CL7 de la vaccine Copenhagen décrit ici correspond exactement, en ce qui concerne les acides aminés au gêne WR de 18 kDa précédemment rapporté (40). Pour tester le gène C7L (positions 1314 - 863) pour sa capacité de réplicabilité chez l'hôte, le plasmide pSD420 a été coupé au moyen de BamHI et BalII et un fragment de 1040 bp s'étendant du site ^amHI, en position 724, au site BqlII, en position 1764, a été isolé. Ce fragment BalII/amHI, qui contient la totalité du gène pour C7L a été lié en pMP528K2 qui a été coupé au moyen de BamHI (Figure 11). Lorsque le plasmide résultant, à savoir pMP528C7L, a été utilisé comme plasmide donneur pour recombinaison avec le virus de vaccine vP293, une progéniture virale a été produite qui forme des plaques sur les cellules de MRC-5. Ceci indiquait que C7L, comme KlL, était un gène réplicable chez l'hôte capable de spécifier la croissance sur des cellules humaines. Etant donné que le gène C7L recouvre la jonction EcoRI C/J, il n'avait pas été testé précédemment (14). Exemple 8 - SUPPRESSION DU GENE C7L DE LA SOUCHE COPEN- HAGEN DU VIRUS DE LA VACCINE Etant donné que, de même que le K1L, le gène C7L du virus de la vaccine est capable de restaurer la capacité du mutant de suppression vP293 de la vaccine, souche WR, de former des plaques sur des cellules humaines, l'effet de la suppression du gène C7L de la souche Copenhagen de la vaccine, à la fois comme une seule suppression et comme une double suppression, a été investigué avec l'autre gène * réplicable chez l'hôte, à savoir KiL. La préparation ou construction de plasmides pour la suppression du gène pour C7L et la production de recom- binants de la vaccine supprimés pour C7L ont été représen- tés schématiquement sur la Figure 12. Une carte de HindIII de l'extrémité de gauche du génome de la vaccine est repré- sentée sur la ligne supérieure. Le gène C7L est indiqué par une boîte avec des bandes, la direction de transcription étant indiquée par une flèche. Les extrémités du fragment de DNA de amHI-BgqlII (positions 725 - 1764) dérivé du plasmide pSD420 ont été rendues franches au moyen d'un fragment de Klenow de l'E. Coli polymérase et le fragment a été lié en pUC18 qui a été coupé au moyen de PvuII, en produisant le plasmide pMP420BB (Figure 12). pMP420BB a été linéarisé au moyen d'EcoRV, qui coupe à l'intérieur des séquences de codage pour C7L, et on a inséré un fragment d'ADN terminé par SmaI de 3,2 kb, consistant en une cassette du promoteur de 11 kDa de la vaccine (flèche foncée)/B-galactosidase (boite avec des pointillés foncés, la direction du gène étant indiquée par une flèche). Le plasmide résultant, à savoir pMPC7LKBG, contient la cassette promoteur de 11 kDa/B-galactosidase dans une orientation de gauche à droite par rapport aux séquences de la vaccine. On a réalisé une recombinaison en utilisant le plasmide donneur pMPC7LKBG et un virus de la vaccine Copenhagen de sauvetage, à savoir vP410, ce qui a produit de la vaccine recombinante, à savoir vP665, qui a été identifiée comme une plaque bleue en présence de X-gal. Pour supprimer le gène C7L de pMP420BB, le plas- mide a été linéarisé par coupure ausite unique SacI (posi- tion 999) dans le gène CL7, suivi par la digestion avec l'exonucléase Bal 31. La mutagénèse (53) a été réalisée sur le patron ou gabarit à double brin en utilisant un oligonu- cléotide synthétique 46-mer MPSPYN234 (5' TGTCATTTAACACTA TACTCATATACTGAATGGATGAACGAATACC 3'). Dans le plasmide ré- sultant, à savoir pMPC7 A, le gène C7L est supprimé (le site de suppression étant indiqué par un triange, Figure 12), en laissant des bras de vaccine sur le flanc de 140 bp à gauche et 400 bp à droite. On a utilisé pMC7zA comme plasmide donneur pour éliminer les séquences gène CL7 interrompu/promoteur de 11 kDa/galactosidase du vP665, en engendrant le vP706, qui a été identifié en tant que plaque incolore en présence de X-gal. vP665 et vP706 croissant tous deux sur des cellules de MRC-5. Ceci était attendu étant donné que ces recombinants contiennent encore le gène ré- plicable chez l'hôte KiL. Pour créer un virus privé des gènes à la fois pour K1L et C7L, on a utilisé pMPC7LKBG comme plasmide donneur pour recombinaison avec le virus recombinant vP661 de la vaccine avec suppression de K1L. Le virus résultant vP683 a été choisi en tant que plaque bleue en présence de Xgal. Le gène C7L a été supprimé du virus recombinant de la vaccine vP683 par recombinaison avec le plasmide donneur pMPC7z%. Le virus de la vaccine recombinant à double suppression qui en résulte a été choisi comme plaque incolore en présence de X- gal. vP683 et vP716 ne forment ni l'un ni l'autre de plaques sur les cellules de MRC-5, ce qui indique que la suppression des deux gènes K1L et C7L est suffisante pour empêcher la croissance du virus de la vaccine sur des cellules humaines. Le Tableau 2 compare la capacité des gènes des virus de la vaccine à restaurer les fonctions de réplicabi- lité chez l'hôte au mutant de suppression du virus de la vaccine, à savoir vP293. Ce que l'on compare est la capaci- té relative de se répliquer sur des cellules humaines ou de singe après que les gènes indiqués ont été réintroduits dans le virus de la vaccine vP293 par recombinaison. TABLEAU 2 Titre (pfu/ml) Virus Gènes insérés VERO MRC-5 VP293 M1L 1,7 x 105 0 VP293 K2L 2,5 x 105 0 VP293 M2L, M1L, N2L 1,5 x 105 0 VP293 KIL 1,7 x 105 4,7 x 103 VP293 C7L 1,4 x 105 5,9 x 103 Exemvle 9 - GENE DU COWPOX CODANT UN PRODUIT DE 77 kDA Contrairement au virus de la vaccine, le virus du cowpox (virus de la variole et de la vache) est capable de se développer sur des cellules d'ovaire d'hamster chinois (CHO). Une région du génome du cowpox qui permet la répli- cation du virus de la vaccine sur des cellules de CHO a été identifiée (54). Le gène du cowpox et le promoteur ont la carte d'un fragment de HpaI de 2,3 kb. Le gène code un produit de traduction prévu de 77 kDa. Le gène de cowpox n'a pas d'homologie significative au niveau de 1'ADN ou de la protéine, avec aucun des deux gènes réplicables chez l'hôte humain du virus de la vaccine, à savoir KiL (54), C7L décrits ici. En se référant maintenant à la Figure 13, comme préliminaire à l'expression du gène de cowpox de 77 kDa dans les systèmes de vaccine présents, on a digéré l'ADN de cow- pox au moyen de HpaI, et le fragment de 2,3 kb contenant le gène et son promoteur a été isolé à partir d'un gel d'agaro- se. Pour flanquer le gène au moyen d'agents de polyliaison (polylinkers), le fragment HpaI de cowpox a été lié en pIBI25, digéré par SmaI (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), en engendrant pCP3 (Figure 13). Pour insertion dans la vaccine, le gène de cowpox a été cloné dans la région de suppression d'ATI du plasmide vecteur Copenhagen pSD494VC comme décrit ci-dessus. L'équivalent de la vaccine de la région du gène ATI de cowpox dans la souche WR de vaccine a été localisé en faisant la séquence des clones appropriés de la vaccine WR en utilisant des initiateurs ou promoteurs de départ synthé- tisés en conformité avec la séquence d'ADN publiée à l'ex- trémité 5' de la séquence de codage ATI du cowpox (47). Contrairement au cowpox, dont le gène ATI code une protéine de 160 kDa, le gène de contrepartie de la vaccine WR code une protéine de 94 kDa (voir également 48). Contrairement à la souche WR, la souche Copenhagen du virus de la vaccine contient une suppression de 4,1 kb englobant l'extrémité 5' du gène équivalent de l'ATI et l'extrémité 3' du gène qui le précède immédiatement. Les parties restantes des deux ORF sont jointes en une structure ou cadre pour reproduire un ORF hybride de 966 bp. Le plasmide vecteur Copenhagen pSD494VC est un sous-clone plasmidique XbaI/BqlII du HindIII A Copenhagen dans lequel l'ORD hybride formé par la fusion du gène de contrepartie de 1'ATI de cowpox dans la souche Copenhagen et son voisin amont sont remplacés par la région de polyliaison. La région de polyliaison consiste en la séquence 'AGATCTCCCGGGAAGCTTGGATCCGAGCTCCTCGAGGAATTCGTTAAC 3' spécifiant les sites de restriction BalII, SmaI, HindIII, amnHI, SstI, XI, , EcoRI et HDaI. pSD494VC contient 0,7 kb d'ADN de vaccine de flanc à gauche de la région de poly- liaisons et 1,3 kb d'ADN de vaccine de flanc à droite de la région de polyliaisons. Le fragment EcoRI-BamHi de 2,3 kb contenant le gène de 77 kDa de cowpox et son promoteur ont été isolés à partir de pCP3. Ce fragment a été lié dans la région de polyliaison de pSD494VC, coupé au moyen d'EcoRI et de BamHI, en engendrant le plasmide pCP5 (Figure 13). Comme attendu, la recombinaison entre pCP5 contenant le gène de cowpox de 77 kDa et le virus vP410 de vaccine Copenhagen a produit un virus recombinant, à savoir vP695, qui a été capable de former des plaques sur des cellules de CHO. Le test pour savoir si le gène réplicable chez l'hôte CHO de cowpox de 77 kDa est également capable de spécifier la croissance du virus de vaccine sur des cellules humaines, une recombinaison a été réalisée entre laplasmide pCP5 contenant le gène de cowpox de 77 kDa et vP293, le mutant de suppression, réplicable chez l'hôte, de la vaccine WR qui ne forme pas de plaques sur des cellules humaines. Le virus progéniture recombinant vP698, formait des plaques sur des cellules de MRC-5. Ceci indique que, en plus d'être un gène du domaine de réplicabilité chez l'hôte CHO, le gène de cowpox de 77 kDa, comme les gènes de vaccine KIL et C7L, est également un gène réplicable chez l'hôte humain (Figure 13). A la lumière de l'observation que le gène du virus de cowpox de 77 kDa est capable de spécifier la croissance du virus de la vaccine à la fois sur CHO ET les cellules humaines MRC-5, il était intéressant de déterminer les rôles de C7L et KlL, les deux gènes réplicables chez l'hôte humain de la vaccine, sur la capacité du virus de la vaccine de se répliquer in vitro sur des cellules dérivées d'autres es- pèces. Egalement, il était intéressant de déterminer si d'autres gènes codés pour la vaccine étaient exigés d'une manière spécifique pour la croissance de la vaccine sur des cellules d'autres espèces. Initialement, les séries de mu- tants de suppression C7L et KiL du virus de la vaccine Copenhagen ont été essayes en ce qui concerne leur capacité de former des plaques sur des cellules de LLC-PK1, une lignée de cellules dérivées du rein de porc. - Des monocouches confluentes de cellules de VERO, MRC-5 et LLC-PK1 ont été infectées, dans des boites de mm, au moyen de dilutions en série de 10 fois du virus dans 200 gl en volume de MEM Eagles + 2 % de sérum de veau nouveau-né. Apres une période d'absorption de 1 heure, l'inoculum a -été enlevé et les monocouches ont été surmon- tées d'une couche de 5 ml de MEM Eagles contenant 0,7 % de Seakem Le Agarose et 10 % de sérum de veau nouveau-né. Les boites ont été incubées à 37 C. Quatre jours après l'in- fection, les monocouches ont été tachées par addition d'une couche supplémentaire consistant en 5 ml d'agarose à 0,6 % contenant 0,04 % de couche neutre. Des plaques ont été observées 6 heures après la souillure. Comme illustré sur le Tableau 3A, les mutants de suppression Copenhagen montrent des capacités identiques de formation de plaques sur des cellules LLC-PK1 de rein de porc en comparaison avec les cellules MRC-5 humaines. Des virus recombinants qui ont subi une suppression soit pour K1L (vP661), soit pour C7L (vP706), tout en retenant l'autre gène réplicable chez l'hôte humain, ont formé des plaques à la fois sur des cellules de MRC-5 et des cellules de LLC- PK1. Le virus recombinant ayant subi des suppressions à la fois pour K1L et C7L (vP716) n'a pas formé de plaques ni sur les cellules de MRC-5, ni sur les cellules de LLC-PK1. Ainsi, sur la base du critère de la capacité de former des plaques in vitro sur la lignée de cellules LLC-PK1, les deux gènes K1L et C7L, réplicables chez l'hôte humain, de la vaccine sont également des gènes réplicables chez l'hôte porçin. Comme observé avec la lignée de cellules humaines MRC-5, la présence soit de K1L soit de C7L dans le génome de la vaccine est suffisante pour permettre la formation de plaques du virus de la vaccine Copenhagen sur des cellules LLC-PK1 de rein de porc. Comme dans le cas des gènes ré- plicables chez l'hôte humain de la vaccine, K1L et C7L sont les seuls gènes réplicables chez l'hôte porçin de la vac- cine codés dans la souche Copenhagen du virus de la vac- cine, étant donné que le virus vP716 (K1L-; C7L-) de la vaccine recombinante ne forme pas de plaques sur des cellules LLC-PK1. Ces résultats ont été confirmés en utilisant du virus recombinant de la vaccine contenant les gènes réplicables chez l'hôte insérés dans le mutant vP293 de suppression de la vaccine WR (Tableau 3B). Comme attendu, vP293, qui comporte une grande suppression qui va de la région C7L à la région K1L, ne présente pas la capacité de former des plaques sur des cellules de LLC-PK1. L'insertion du gène pour K1L dans vP293 est suffisante pour permettre la croissance de la vaccine recombinante résultante (vP457) sur des cellules de LLC-PK1. Cependant, comme on l'a vu avec des cellules humaines de MRC-5, l'insertion du gène M1L dans le mutant de suppression WR, à savoir vP293, n'est pas suffi- sante pour permettre la formation de plaques du virus résultant (vP596) sur des cellules de LLC-PK1 (Tableau 3B). Lorsque soit le gène CL7 ou K1L du virus de la vaccine, soit le gène du virus de cowpox de 77 kDa est inséré dans le mutant de suppression WR, à savoir vP293, la capacité de former des plaques sur des cellules humaines MRC-5 est restaurée (Tableau 3B). De mêmes les virus recom- binants de la vaccine basés sur vP293, qui contiennent soit C7L (vP638) soit le gène de cowpox de 77 kDa (vP698), for- ment des plaques sur des cellules de LLC-PKi. Ainsi, le gène de cowpox de 77 kDa, en plus d'être un gène réplicable chez l'hâte pour l'ovaire d'hamster chinois (54) et les cellules humaines, est également un gène réplicable'chez l'hôte pour les cellules porcines. TABLEAU 3 ____________________________________________________________ A. Mutants de suppression à base de Copenhaaen Virus Suppression VERO MRC5 LLC-PK1 CHO vP410 + + + vP661 KiL + + + vP706 C7L + + + vP716 KlL, C7L + - - vP668 (C7L - K1L)+ - - ----__________ B. Mutants de suppression basés sur vP293 WR Virus Suppression VERO MRC-5 LLC-PK1 CHO vP293 + - - vP457 KiL + + + vP596 MiL + - - vP638 C7L + + + - vP698 cowpox de 77dKa + + + + -_________ Exemple 10 - CROISSANCE DE MUTANTS DE SUPPRESSION COPEN- HAGEN SUR DES LIGNEES DE CELLULES HUMAINES Dans les conditions habituelles de croissance (3 jours, revêtement d'agar Noble Difco), le mutant de suppression WR, à savoir vP293, n'a pas formé de plaques sur des monocouches de cellules MRC-5 humaines. Cependant, avec une durée accrue d'incubation ou une modification de la couche de revêtement d'agar, le vP203 peut former de petites plaques sur des monocouches de cellules de MRC-5. D'une manière spécifique, l'utilisation de 0,6 % à 1 % d'agarose Seakem ou d'agarose à bas point de fusion pour constituer la couche de revêtement, à la place d'agar, favorise la forma- tion de petites plaques du virus vP293 sur des cellules de MRC-5. La progéniture de vaccine recombinante produite par recombinaison entre vP293 et des plasmides basés sur pHES contenant le gène K1L (Exemple 3) forme de larges plaques sur une monocouche de MRC-5, qui se distinguent clairement de l'arrière-plan au fond des petites plaques de vP293. C'est pourquoi la capacité de vP293 et du jeu Copenhagen de mutants de suppression du domaine de réplicabilité chez l'hôte humain pour réaliser une infection limitée sur des cellules de MRC-5 et VERO sous une couche de revêtement liquide a été investiguée. Des flasques T-75 en double exemplaire ont été ensemencées avec 5 x 106 cellules MRC-5 ou VERO comme indiqué. Après deux jours, des monocouches confluentes ont été infectées à un moi de 0,01 pfu par cellule (titre d'introduction 103 pfu par flasque) de virus de vaccine comme indiqué dans le Tableau 3 dans un volume de 0,5 ml MEM + sérum de veau nouveau-né (NCS). Apras une période d'adsor- ption d'une heure, 10 ml du milieu ont été ajoutés à chaque flasque. Une flasque de chaque jeu a été congelée immédia- tement (échantillon de 1 hpi). Les flasques restantes ont été incubées à 370 jusqu'à 96 hpi et ensuite congelées. Des virus de tous les échantillons ont été collectés par trois cycles de congélation et de décongélation et titrés sur des cellules de VERO. Les cellules de MRC-5 et de VERO ont été infectées à un moi de 0,01 pfu par cellule. Après une incubation de 96 heures (96 hpi), le virus a été récolté et titré sur des cellules de VERO. Des mutants Copenhagen comportant des suppressions d'un des gènes réplicables chez l'hôte humain vP661 (C7L+, K1L-) et vP706 (C7L-, KilL+) ont montré une multiplication sensiblement égale (3 à 4 log10) tant sur les cellules de MRC-5 que sur les cellules de VERO, ce qui est équivalent au contrôle par vP410 (C7L+, KIL+). Les mutants Copenhagen supprimés des deux gènes réplicables chez l'hôte humain vP716 (C7L-, KlL-) et vP668 ([C7L à KlL]-) aussi bien que le mutant de suppression WR, à savoir vP293 (suppression de 21,7 kb) ont montré une multiplication sur les cellules de VERO approximativement équivalente à vP410, vP661 et vP706. La multiplication des virus de mutants de suppression vP716, vP668 et vP293 a été nettement positive sur les cellules humaines de MRC-5, bien que dramatiquement réduite si on la compare à la multiplication de ces virus sur des cellules de VERO. Dans les conditions utilisées ici, tous les trois virus de vaccin vP716, vP668 et vP293, qui ont subi une suppression pour les deux gènes, réplicables chez l'hôte humain, de la vaccine, K1L et C7L, sont capables de produire, mais d'une manière grandement restreinte, l'infection de cellules humaines de MRC-5 (une multiplica- tion d'environ 10 fois pendant une infection de 96 h). Ces résultats, montrés sur le Tableau 4 concordent avec les rapports précédents d'une multiplication par 2,3 pendant une infection de 36 h (6). TABLEAU 4 Croissance de mutants de suppression de la vaccine sur des cellules de VERO et de MRC-5 Titre à 96 hpi1 Multiplication du Virus2 Virus Suppressions VERO MCR-5 VERO MCR-5 vP410 - 1,9 x 107 1,0 x 106 5588 6250 vP661 K1L 3,8 x 107 1,1 x 107 9268 3335 vP706 C7L 2,3 x 107 8,6 x 106 10000 3440 vP716 C7L, K1L 1,3 x 107 3,4 x 104 4375 11 vP668 (C7L - K1L) 8, 0 x 106 6,4 x 104 2857 21 vP293 (WR de 21,7 kb) 6,9 x 106 6,4 x 103 3833 7 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 1 le titre initial est égal à 103 2 le rapport du titre à 96 hpi (heures après infection) au titre à 1 hpi (fin de la période d'adsorption). Pour déterminer si le virus de la vaccine comportant une suppression pour les gènes réplicables chez l'hôte humain, C7L et KlL, étaient capables d'une multipli- cation limitée sur des lignées de cellules humaines autres que MRC-5, la multiplication du mutant vP668 du virus de la vaccine Copenhagen (suppression de CL7 à KlL) sur ces trois lignées de cellules humaines supplémentaires comparées aux cellules de MRC-5 et de VRO a été examinée (Tableau 5). Les cellules ont été ensemencées dans des boîtes de 60 mm avec 1,5 x 106 cellules par boîte deux jours avant l'infection. Le virus de la vaccine vP470 ou vP468 a un moi de 0,01 pfu par cellule dans un volume de 0,5 ml de MEM + % de sérum de veau nouveau-né (NCS) a été ajouté aux boîtes en double contenant des monocouches de chaque lignée cellulaire. Après une période d'adsorption de 1 heure, 4 ml de milieu ont été ajoutés à chaque boîte et la moitié des boî- tes a été congelée (échantillon 1 hpi). Les boîtes restan- tes ont été soumises à une incubation à 37 C jusqu'à 96 hpi, ensuite congelées (échantillon de 96 hpi). Tous les échan- tillons ont été recueillis par trois cycles de congélation et décongélation et les virus titrés sur des cellules de VERO. Deux boîtes ont été infectées pour chaque instant ou point temporel et les titres ont'été moyennés. La multipli- cation de chaque virus sur chaque lignée de cellules est exprimée en tant que rapport du titre obtenu à 96 hpi au titre à 1 hpi. Tableau 5 Multiplication des virus vP410 et vP668 de la vaccine CoDenhagen sur des liqnéesl de cellules de sinQe et humaines _____________ Virus rendement- en % Lignée cellulaire vP410 vP668 vP668/vP410 de singe VERO 70.212 13.103 18,6 humaine MRC-5 7.333 10 0,14 WISH 19.480 0,4 0,002 HeLa 50.000 0,4 0,0008 Detroit 9.660 2,8 0,03 1 Lignées de cellules utilisées: VERO; ATCC CCL 81 de rein de singe; MRC-5: ATCC CCL 171 de poumon embryonnaire humain; HeLa: col de l'utérus humain, ATCC CCL 2 de carcinome épithéliolde, WISH: amnion humain (marqueurs HeLa) ATCC CCL 25; Détroit: ATCC CCL 54 de prépuce humain. 2 Rendement en % vP668/vP410 pour chaque lignée cellulaire est le rapport de la multiplication de vP668 (96 hpi/1 hpi) divisée par la multiplication de vP410 (96 hpi/1 hpi) x 100. Le virus vP668 manifeste une multiplication logarithmique de 1 sur des cellules de MRC-5 pendant une période d'incubation de 96 heures. Le rendement du virus vP668, 96 heures après l'infection (96 hpi) de la ligne cellulaire de Détroit (prépuce humain), est égale à 2,8 fois le titre qui suit l'absorption du virus (1 hpi). Pour les lignes cellulaires WISH (amnion humain) et HeLa (carcinome épithélioïde du col de l'utérus humain), les rendements du virus vP668 à 96 hpi était inférieur à celui observé après l'adsorption à 1 hpi, ce qui indique qu'il n'y a pas de réplication virale du mutant vP668 de suppres- sion de la réplicabilité chez l'hôte de la vaccine Copen- hagen sur ces lignes cellulaires. Toutes ces lignes cellu- laires étaient permissives pour le virus de la vaccine, comme montré par la multiplication du virus de contrôle vP410. D'autres ont également trouvé des différences dans la capacité de différentes lignées cellulaires humaines de supporter la croissance de leur mutant de la réplicabilité chez l'hôte (6). Exemple 11 - MUTANTS DE LA REPLICABILITE CHEZ L'HOTE DE VIRUS DE LA VACCINE EN TANT QUE VECTEURS DE VACCINE Des mutants de la réplicabilité chez l'hôte du virus de vaccine seraient très avantageux en tant que vec- teurs de vaccine recombinante. La réduction ou l'absence de réplication devrait accroître la perception de sécurité étant donné que le vecteur viral est défectueux en réplica- tion chez l'espèce en cause, par exemple l'homme ou le porc comme décrit ci-dessus. Ceci réduirait avantageusement la possibilité d'une infection qui s'emballerait du fait de la vaccination chez l'individu vacciné et diminuerait également la transmission d'individu vacciné à individu non vacciné ou la contamination de l'environnement. A cet effet, ces mutants de la réplicabilité chez l'hôte sont utiles comme vecteurs de vaccine. Le mutant de suppression vP293 (Exemple 3) abrite un élément génétique étranger. En outre, à cette fin, des recombinants contenant des gènes de virus de la pseudo-rage (une vaccine de porc appropriée) et des recombinants exprimant la glycoprotéine du virus de la rage (qui est d'intérêt non seulement pour des applications vétérinaires, mais également pour des applications humaines) ont également été préparés et sont décrits ci-dessus. On peut facilement apprécier qu'une variété de gènes étrangers peut être utilisée dans ces mutants de la réplicabilité chez l'hôte. En outre, on peut se rendre facilement compte quedes espèces supplémentaires, en plus de celles citées dans la présente demande peuvent être marquées pour la restriction du domaine de réplicabi- lité chez l'hôte de ces mutants de la vaccine par les procédés décrits ici. En outre, on peut facilement se rendre compte que des gènes supplémentaires réplicables chez l'hôte existent dans le poxvirus. Par exemple, la souche de la vaccine MVA a été reconnue comme étant atténuée, particulièrement chez les animaux dont on a supprimé l'immunité. Récemment, on a rapporté que le gène réplicable chez l'hôte humain, KlL, est partiellement supprimé dans le MVA (55). La présente analyse du génome de MVA confirme la suppression rapportée dans le gène de K1L, mais indique que le second gène réplicable chez l'hôte humain, à savoir C7L, est présent dans MVA, même si le virus de la vaccine MVA ne forme pas de plaques sur les cellules humaines. La région de promoteur en amont du gène C7L dans MVA est identique à la région amont dans le Copenhagen présenté ici. La séquence d'acides aminés du produit de traduction C7L putatif pour NVA est identique à celui du Copenhagen. Ceci indique que le gène réplicable chez l'hôte humain C7L, qui tant dans le WR que dans le Copenhagen semble être fonctionnellement équivalent au gène réplicable chez l'hôte humain K1L, est incapable en lui-même de spécifier la croissance du virus de la vaccine MVA sur des cellules humaines. En outre, le remplacement du gène K1L défectueux dans MVA par le gène KIL intact du Copenhagen ne confère pas au virus recombinant de la vaccine hybride la capacité de croître sur des cellules humaines. Le virus de la vaccine MVA est également gêné dans sa capacité de croitre sur des cellules de singe, ce qui suggère l'existence d'autre(s) gène(s), réplicable(s) chez l'hôte, non encore identifié(s). En utilisant des approches similaires à celles utilisées ici, il devrait être possible de définir les gènes nécessaires pour ces restrictions. De plus, il est bien reconnu que d'autres poxvirus tels que l'avipox et le pox porcin sont restreints en ce qui concerne l'hôte au point de vue réplication chez les espèces aviaire et porcine, respectivement. Ces restrictions en ce qui concerne l'hôte suggèrent clairement l'existence d'un certain nombre de gènes réplicables chez l'hôte dans les poxvirus. La définition de ces gènes par les moyens définis ici peut accroître le répertoire ou gamme des vecteurs de poxvirus préparés pour la réplicabilité chez l'hôte. Exemple 12 - INSERTION DE GENES GLYCOPROTEINIQUES DE LA RAGE DANS LE LOCUS DE SUPPRESSION TK DE DIF- FERENTS MUTANTS DE SUPPRESSION DE LA VACCINE COPENHAGEN La glycoprotéine de la rage a été choisie comme antigène étranger type pour insertion dans différents mu- tants de suppression de la vaccine Copenhagen pour permet- tre l'analyse comparée des effets relatifs de ces suppres- sions. Le gène pour la glycoprotéine de la rage (18, 42) a été placé sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine synthétique. Cette cassette d'expression a été insérée dans le plasmide vecteur pSD513VC de suppression TK Copenhagen. pSD5123VC est un sous-clone du fragment HindIII J de la vaccine Copenhagen dans lequel les séquences de codage pour le gène de thymidine kinase (TK) (56) sont remplacées par une région de polyliaison ou polylinker. La région de polyliaison consiste en la séquence 5' CCCGGGAGATCTCTC- GAGCTGCAGGGCGCCGGATCC 3' spécifiant les sites de restriction SmaI, BqlII, XhoI, PstI, NarI et BamHI. Le plasmide résul- tant contenant le gène glycoprotéinique de la rage a été désigné par pRW842. Dans pRW842, les séquences de codage pour le gène TK de la vaccine sont remplacées par la cassette promoteur H6/ gène glycoprotéine de la rage qui est orienté suivant une orientation de gauche à droite par rapport aux bras de flanc de la vaccine. La recombinaison entre pRW842 et tout virus de la vaccine donne un virus TK minus qui contient le gène glycoprotéine de la rage sous le contrôle du promoteur H6. La combinaison a été réalisée entre pRX842 et le jeu de virus de la vaccine Copenhagen contenant des suppres- sions d'un ou des deux gênes réplicables chez l'hôte humain. Le jeu résultant de recombinants de la vaccine contenant le gène glycoprotéinique de la rage se trouve dans la liste du Tableau 6. Des cellules de singe (VERO) ont été infectées avec le jeu de recombinants de la vaccine contenant le gène de la rage. Des précipitations immunes ont été réalisés en utilisant un anticorps monoclonal spécifique pour la glycoprotéine de la rage (42). Tous les recombinants expriment le gène. TABLEAU 6 Mutants de suppression du CoDenhaQen contenant le Qène qlycoprotéine de la race Virus Plasmide Virus Expression de la glyco- Parent donneur recombinant Suppressions protéine de la rage vP410 pRW842 vP744 TR + vP661 pRW842 vP745 TR, KiL + vP706 pRW842 vP746 TR, C7L + vP716 pRW842 vP750 TK, C7L, KIL + vP668 pRW842 vP752 TR, (C7L - KiL) + La vaccine recombinante vP750 contient le gène glycoprotéine de la rage sur un fond ou arrière-plan C7L-, K1L-. vP752 contient le gène de la rage dans un arrière plan de suppression (C7L à K1L). Etant donné que les deux gènes réplicables chez l'hôte humain manquent dans ces deux recombinants de la vaccine, on ne doit pas s'attendre à une infection productrice des cellules humaines par ces recom- binants. L'essai pour savoir si le gène de la rage peut être exprimé dans des cellules humaines en l'absence de gènes réplicables chez l'hôte humain, des cellules de MRC-5 ont été infectées avec le jeu complet des recombinants de la rage, y compris vP750 et vP752. Dans tous les membres de la série ou jeu, l'immunofluorescence a été détectée à la sur- face des cellules infectées. Exemple 13 - CLONAGE ET EXPRESSION DE GENES DE LA PSEUDO- RAGE (PRVY DANS UN ARRIERE-PLAN VP668 vP668, le mutant de suppression de la vaccine Copenhagen qui comporte une suppression recouvrant la région qui comprend les gènes réplicables chez les hôtes humain et porcin (C7L à K1L) a été choisi comme vecteur de base. vP668 ne forme pas de plaqueisur les cellules humaines de MRC-5 ou les cellules de rein de porc LLC-PK1 (voir Tableau 3). Les gènes de la pseudorage gII, gIII et gp50, qui contiennent des homologues aux gènes gB (57), gC (58) et gD (59), respectivement, du virus de l'herpès simplex (HSV) ont été insérés dans le vecteur vP668 comme détaillé ci- après. A. - Insertion du gène aII qlycoprotéine PRV dans le locus de suppression HA du virus de vaccine Copenhaqen L'ADN PRC a été digéré avec BamHI et les fragments résultants ont été clones en pBR322 coupé au moyen de BamHI. Le plasmide pPR9.25 contenant le fragment 1 de PRV BamHI (60) contient tout le gène pour la glycoprotéine PRV gII. Des portions de pPR9.25 contenant le gène pour gII (57) ont été sousclonés en pBR322, pUC18 et phage M13. La séquence de nucléotides pour le gène glI a été déterminée (46). Les séquences de codage pour le gène pRV gII ont été insérées dans le plasmide vecteur pTPI5 de vaccine Copenhagen (50). Dans le plasmide résultant, pR18, le gène gII est localisé dans le locus de suppression de l'hémaglu- tinine (HA) de la vaccine Copenhagen sous le contrôle du promoteur de vaccine H6. La recombinaison entre le plasmide pPR18 et le mutant de suppression vP668 de la vaccine Copenhagen a donné la vaccine recombinante vP726. Dans vP726, le gène pRV gII est inséré au locus de suppression HA sous le contrôle du promoteur précoce/tardif H6 de la vac- cine. Tous le PRC DNA 5' et 3' étranger au gène a été élimi- né. Une séquence spécifiant la fin de la transcription précoce de la vaccine (39) a été insérée en aval des séquen- ces de codage de PRV gII. B. - Insertion du qène PRV co50 au locus de suppression ATI du virus du vaccin Copenhaqen L'ADN codant le gène pour la glycoprotéine PRV gp50 est localisé sur le fragment 7 de BamHI du génome PRV (61). Le plasmide pR7.1 contient le fragment de 7 PRV BamHI cloné au site BamHI de pBR322. Un sous-fragment par StuI/ NdeI de pR7.1 contenant le gène entier pour PPRV gp50 a été sous-cloné dans le plasmide pPR22, en engendrant le pIBI25. La séquence de nucléotides pour le gène gp50 a été déter- minée (46). Les séquences de codage pour PRV gp50 ont Été placées sous le contrôle du promoteur de vaccine précoce/ intermédiaire équivalent aux séquences immédiatemment à l'amont de I3L (62, 63). Cet élément promoteur a été utilisé précédemment pour exprimer des gènes étrangers dans les virus recombinants de la vaccine (31, 64). L'ADN correspon- dant aux séquences du promoteur en amont du cadre de lecture ouvert I3L (62) ont été synthétisés par une réaction en chaîne de polymérase (65) en utilisant des initiateurs oligonucléotides synthétiques P50PPBAM (5' ATCATCGGATCCCGG- TGGTTTGCGATTCCG 3') et P50PPATG (5' GATTAAACCTAAATAATTG 3') et pMPlVC, un sous-clone du HindIII I Copenhagen, comme gabarit ou patron. Le fragment résultant a été digéré au moyen de BamHI pour engendrer une extrémité cohésive BamHI a l'extrémité 5' de la séquence du promoteur. L'extrémité 3' est restée avec une terminaison franche. Les séquences de codage PRV gp50 ont été excisées du plasmide pPR22. Le plasmide pPR22 a été digéré avec NsiI, qui coupe 7 bp en amont de 1'ATG et produit un surplomb en 3'. Le surplomb en 3' a été rendu franc à son extrémité par l'ADN polymérase T4 en présence de 2 mM dNTPs. L'ADN résul- tant a été digéré partiellement avec BqlII et un fragment de 1,3 kb franc/BglII contenant le gène PRV gp50 a été isolé. Le fragment de promoteur 126 bp I3L (BamHI/franc) et le gène gp50 de 1,3 kb contenant le fragment (franc/ BalII) ont été liés en un plasmide pBSSK (Stratagène, La Jolla, Californie), vecteur qui a été digéré au moyen de BamHI. Le plasmide résultant a été désigné pBSPRV5OI3. La cassette d'expression contenant le promoteur I31 lié au gène PRV gp50 a été éliminée par digestion au moyen de BamHI suivie par digestion partielle au moyen de SmaI. Un fragment de 1,4 kbp contenant le gène promoteur 13L/PRVgp50 a été isolé et on a rendu franche son extrémité en utilisant le fragment de Klenow de 1'E. Coli polymérase. pSD541 est un plasmide de suppression Copenhagen dans lequel les bras de flanc pour la région de suppression ATI (voir pSD494VC) ont été engendrés par une réaction en chalne de polymérase (PCR) (65) en utilisant des sousclones de HindIII A Copenhagen en tant que-gabarit ou patron. Des oligonucléotides synthétiques MPSYN267 (5'GGGCTGAAGCTTGCGGC- CGCTCATTAGACAAGCGAATGAGGGAC 3') et MPSYN268 (5'AGATCTCCCGGGCTCGAGTAATTAATTAATTTTTATTACACCAGAAAAGACGGCTT- GAGATC 3') ont été utilisés comme initiateurs pour fabriquer un bras de vaccine de 420 bp à droite de la suppression. Les oligonucléotides MPSYN269 (5'TAATTACTCGAGCCCGGGAGATCTAATTT- AATTTAATTTATATAACTCATTTTTTGAATATACT 3') et MPSYN270 (5' TATCTCGAATTCCCGCGGCTTTAAATGGACGGAACTCTTTTCCC 3') ont été utilisés comme initiateurs pour fabriquer le bras de vaccine de 420 bp à gauche de la suppression. Les bras de vaccine de gauche et de droite engendrés cidessus ont été mélangés en- semble et étendus par une réaction en chaîne de polymérase supplémentaire pour engendrer un fragment d'ADN constitué par les bras de flanc gauche et droite de la vaccine séparés par des sites de restriction spécifiant la région de poly- liaison, à savoir BglII, SmaI et XhoI. Le fragment engendré par PCR a été coupé au moyen de HindIII et EcoRI pour obte- nir des extrémités collantes et lié en pUC8 coupé au moyen * de HindIII et EcoRI. Le plasmide résultant est pSD54L. Le fragment a l'extrémité franche de 1,4 kb conte- nant le gène promoteur I3L/PRVgp50 a été inséré dans le plasmide vecteur Copenhagen pSD541 digéré au moyen de SmaI. Dans le plasmide résultant, à savoir pATIp50, le gène PRVgp50 est situé au locus de suppression ATI de la vaccine Copenhagen sous le contrôle de l'élément promoteur I3L de la vaccine de 126 bp. Dans pATIp50, tout le PRV ADN 3' étranger au gène a été enlevé. 7 bp de séquences de PRV étranger restent immédiatemment en amont du PRVgp50 ATG. Une séquence determinaison transcriptionnelle précoce de la vaccine (39) est située en aval des séquences de codage du PRVgp50. La recombinaison entre le plasmide pATIp50 et le mutant VP668 de suppression de la vaccine Copenhagen a été réalisée. C. - Insertion du cène qIII de glvcoprotéine PRV au locus de suppression TK du virus de la vaccine Copenhaqen Les séquences de codage pour gIII glycoprotéine PRV correspondent en carte aux fragments 2 et 9 BamHI du génome du PRV (58). Les plasmides pPR9.9 et pPR7.35 contiennent des fragments 2 et 9 de PRv BamHI respectivement clones au site BamHI de pPR322. Un fragment SphI/BamHI contenant l'extrémité 5' du gène PRV gIII a été isolé de pPR9.9. Un fragment NcoI/BamHI contenant le restant du gène gIII a été isolé de pPR7.35. La totalité du PRP gIII a été assemblée par liaison des deux fragments en pIBI25 en don- nant le plasmide pPR17. La séquence de nucléotide pour le gène gIII a été déterminée (46). Le gène PRV gIII a été placé sous le contrôle d'un élément promoteur u de la vaccine Copenhagen, ce qui a donné le plasmide pPR24 (la séquence du promoteur u de la vaccine est décrite dans l'Exemple 5, Figure 5). Une cas- sette d'expression contenant un élément promoteur u de la vaccine de 120 bp et le gène entier PRV gpIII a été excisé du plasmide pPR24 par digestion avec SnaBI (en position -120 en amont du codon d'amorçage) et avec DraI (en aval du gène PRV gIII). Le fragment à extrémité franche de 1,5 kb conte- nant le promoteur u/PRV gpIII a été isolé et lié au plasmide vecteur Copenhagen pSD513VC, digéré par SmaI, pour donner pPRVIIICTK. Dans pPRVOOOVCTK, les séquences de codage TK de la vaccine sont remplacées par le gène PRV gIII inséré en une orientation de la droite vers la gauche sous le contrô- le de l'élément promoteur u de la vaccine Copenhagen de 120 bp. Toutes les séquences 5' et 3' de PRV étrangères au gène gIII ont été éliminées. La recombinaison entre le plasmide pPRVIIICTK et le mutant de suppression de la vaccine Copenhagen, à savoir vP668, a été réalisé. D. - Expression de PRV qII dans la vaccine recombinante vP726 L'expression de PRV gII dans la vaccine Copenhagen recombinante vP726 a été essayée dans des cellules VERO, LLC-PK1 et MRC-5. vP726 contient PRV gII dans un arrière- plan ou fond de vP668 (suppression de C7L à R1L) et ainsi on ne s'attendrait pas à réaliser une infection productrice dans le LLC-PK1 du rein de porc et dans les cellules humai- nes MRC-5. Cependant, l'analyse immunofluorescente en utilisant un anticorps monoclonal spécifique au PRV gpII a démontré d'une manière surprenante l'expression du gène PRV gpII dans les cellules de porc, singe et de l'homme. E. - PREPARATION DE RECOMBINANTS PRV DOUBLES ET TRIPLES DANS L'ARRIERE-PLAN DE VIRUS DE LA VACCINE COPENHAGEN vP668 On a réalisé une recombinaison pour préparer des recombinants de la vaccine contenant des gènes PRV multi- ples. Les recombinaisons ont été réalisées en utilisant des plasmides donneurs pATIp50 (PRV gp50, locus de suppression ATI) et pPRV IIIVCTK (PRV gIII, locus de suppression TK) et le virus de sauvetage vP726, la vaccine recombinante Copen- hagen qui contient PVR gII au locus de suppression HA dans un arrière-plan de suppression (C7L à KiL). Ces recombinai- sons engendrent des vaccines recombinantes contenant des doubles insertions de gènes PRV gII + gp50 et gII + gIII respectivement. Un de ces recombinants PRV double de la vaccine a été utilisé comme virus de sauvetage pour recom- binaison avec le plasmide approprié pour produire un recom- binant triple contenant les gènes PRV, gII + gp50 + gIII. Exemple 14 - PREPARATION D'UNE SOUCHE COPENHAGEN A DE VIRUS DE LA VACCINE BASEE SUR UN SYSTEME DE SELECTION DE REPLICABILITE CHEZ L'HOTE Pour préparer un virus de la vaccine Copenhagen sur la base d'un système de sélection de réplicabilité chez l'hôte (COPCS), on a préparé des plasmides pour supprimer l'ADN qui englobe la région codant les gènes de C7L à gauche jusqu'à K1L à droite (Figure 8). Des virus de la vaccine comportant cette suppression ne sont pas supposés croître sur des cellules humaines étant donné que les deux gènes réplicables chez l'hôte, à savoir C7L (Exemple 7) et KIL (15), ont été supprimés. On a également préparé des plasmi- des pour supprimer la région s'étendant entre C6L et K1L. Etant donné que la suppression de C6L à KIL n'élimine pas le gène réplicable chez l'hôte humain, à savoir C7L, les virus de la vaccine comportant cette suppression ne sont pas supposés croître sur des cellules humaines. En se référant maintenant à la Figure 14, on a préparé un plasmide pSD420 (Figure 14) contenant un clone SalI de l'ADN du virus de la vaccine Copenhagen (Figure 8, ). Un fragment de la région HindIII C du virus de la vac- cine, souche Copenhagen, a été dérivé de pSD420 par section- nement au moyen de XbaI (positions 685), suivi par la forma- tion d'une terminaison franche au moyen d'un fragment de Klenow de la E. Coli polymérase et coupure au moyen de BalIII (positions 1784). Le fragment résultant de 1079 bp a été isolé à partir d'un gel d'agarose. pSV4>51 (Figure 9, 14) est un plasmide contenant l'ADN de la vaccine Copen- hagen entre le site SDhI de HindIII M (positions 9478) et le site KDnI dans HindIII K (position 12998). Un fragment de la région de HindIII K du virus de la vaccine, souche Copenha- gen, a été dérivé de pSD451 par coupure au moyen de BalII (positions 11116) et EcoRV (position 11834). Le fragment de restriction de 718 bp a été isolé à partir d'un gel d'aga- rose. Les deux fragments ont été liés en pUC8 qui a été coupé au moyen de HindIII, pourvu d'une terminaison franche au moyen d'un fragment de Klenow de E. Coli polymérase, et coupé avec SmaI (Figure 14). Le plasmide résultant a été appelé pMP581CK. pMP581CK (Figure 14) contient le gène C7L (bloc en noir, la direction de la transcription étant indiquée par une flèche). pMP581CK contient un site BqlII unique flanqué par un bras de vaccine gauche (positions 685- 1764) dérivé de HindII C et par un bras de vaccine III (positions 1111611834) dérivé de Hind III K. Le bras de vaccine gauche contient la totalité du gène pour C7L (sé- quences de codage positions 1314-863). Par rapport au génome de la vaccine Copenhagen, les deux bras sont séparés par une suppression de 9351 bp (positions 1315-11115). Le site de suppression entre les séquences de HindIII C et les séquences de HindIII K est indiqué par un triangle sur la Figure 14. Pour enlever l'excès d'ADN à la jonction de sup- pression, pMP581CK a été coupé par BalII et ensuite digéré au moyen de l'exonucléase Bal 31. On a réalisé une mutagé- nèse (53) sur le patron à double brin en utilisant un oligonucléotide 49mer synthétique, à savoir MPSYN228 (5' TTTCTTAATAAATATTATTTTTATTTAAATTCGTAGCGATATATAAAAC 3'). Le plasmide résultant pMPCTKla retient le gène, réplicable chez l'hôte humain, de la vaccine, à savoir C7L. Il est supprimé entre positions 1513 et 11165 et il est supprimé pour 11 gènes C6L à KIL (Figure 8). La recombinaison entre plasmide pMPCTK1 A et vP458, un virus de la vaccine Copen- hagen recombinant contenant le gène lacZ de E. Coli. au locus de suppression M2L, a engendré la vaccine recombinante vP664. Comme cela était attendu, vP664 est capable de former des plaques sur des cellules humaines, étant donné qu'il comporte un gène C7L intact. Pour enlever les séquences codantes (positions 1314-863) pour C7L-et l'excès d'ADN à la jonction de sup- pression, on a coupé pMP581CK par NcoI, opération suivie par digestion au moyen de l'exonucléase Bal31. On a réalisé la mutagénèse (53) sur le gabarit ou patron à double brin en utilisant un oligonucléotide 44mer synthétique, à savoir MPSYN233 (5' TGTCATTTAACACTATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT 3'). Le plasmide résultant, à savoir pMPCSK1i., est supprimé entre les positions 862 et 11163 et il est supprimé pour 12 gènes C7L à K1L. La recombinaison entre le plasmide pMPCSK1Iet vP451 a produit la vaccine recombinante vP668. Comme attendu, vP668 est incapable de former des plaques sur des cellules humaines étant donné que les deux gènes KiL et C7L réplicables chez l'hôte ont été supprimés. Une série de plasmides a été dérivée de pMPCTK1 par addition d'un ADN polylinker (agent de liaisions mul- tiples) synthétique à la jonction de suppression. La prépa- ration de plasmides dans les séries COPCS est résumée sur les Figures 15 à 17. Les séquences d'ADN pour tous les oligonucléotides synthétiques utilisés dans la préparation de ces plasmides sont représentées sur les Figures 15 à 17. Le plasmide pMPCTK1 i (Figure 14) a été soumis à une digestion partielle par DraI et de l'ADN linéaire a été isolé & partir d'un gel d'agarose. Les oligonucléotides synthétiques MPSYN238/MPSYN239 ont été recuits (hybridés) et liés en pMPCTK1i6 dans une orientation de la droite vers la gauche à la jonction de suppression, ce qui a donné le plas- mide pMPCS-1. Pour ajouter un codon d'arrêt à un cadre de lectu- re ouvert, de petite dimension, entrant dans la région du polylinker depuis la gauche (ATG position 1485), on a coupé pMPCS-1 au moyen de PstI. La mutagénèse a été réalisée (53) en utilisant un oligonucléotide 72mer synthétique, à savoir MPSYN249 (5' GTTTGTTTTATATATCGCTACGAATTTAAATAAAAATTATTTA- TTT ATAGATCTAGAGTCGACCCGGGTACC 3'). Le plasmide résultant pCOPCS-4 (référencé sur la Figure 17 par son autre désigna- tion pMPCS-4) ne comporte pas de cadre de lecture ouverts entrant ou quittant la région du polylinker. Pour ajouter le promoteur H6 de vaccine à la région de polylinker, pMPCSl a été coupé par HindIII et Asp718. Un fragment d'ADN synthétique HindIII/AsD718 consistant en promoteur H6 modifié (Exemple 3) a été inséré, ce qui a donné le plasmide pCOPCS-3H (séquence du promoteur donnée sur la Figure 17). Tous les plasmides subséquents, pCOPCS-5H à les pCOPCS-10H dérivés de pCOPCS-3H contiennent la région du promoteur H6 qui est indiquée sur la Figure 17 pour pCOPCS-3H. La séquence entre crochets qui suit la ré- gion du promoteur dans le pCOPCS-3H est remplacée par les séquences entre crochets indiquées pour pCOPCS-5H à pCOPCS- H. Les codons d'amorçage ATG pour les plasmides pCOPCS-6H à pCOPCS-10H ont été soulignés. Il est à noter que pCOPCS-3H et pCOPCS-5H ne contiennent pas de codon d'initiation ou d'amorçage de ATG en amont de la région de polylinker. Le cadre de traduction commençant à 1'ATG des plasmides pCOPCS- 6H à pCOPCS-10H est indiqué. Pour ajouter un codon d'arrêt au petit cadre de lecture ouvert à partir de pMPCS-1 men- tionné ci-dessus, la mutagénèse équivalente utilisant MPSYN249 a été réalisée sur pCOPCS-3H ce qui a donné le plasmide pCOPCS-5H. Pour ajouter un codon d'amorçage ATG sur le plasmide pCOPCS-5H en aval du promoteur H6 dans tous les cadres de lecture relatifs aux sites de restriction du polylinker, pCOPCS-5H a été coupé au site NruI dans le promoteur H6 et au site BqlII dans la région du polylinker. Le fragment vecteur a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Les oligonucléotides synthétiques MPSYN250/MPSYN251 ont été recuits (hybridés) et insérés dans les vecteurs pCOPCS-5H, ce qui a donné le plasmide pCOPCS-6H. Les oligonucléotides synthétiques MPSYN252/MPSYN- 253 ont été recuits (hybridés) et insérés dans le vecteur pCOPCS-5H, ce qui a donné le plasmide pCOPCS-SH. pCOPCS-6H, pCOPCS-7H et pCOPCS-8H contiennent le promoteur H6 avec le codon d'amorçage ATG suivi par des sites de restriction dans les trois cadres de lecture diffé- rents. Le premier et le second acides aminés codés dans ces plasmides sont les suivants:pCOPCS-6H met/vaI; pCOPCS-7H met/ gly et pCOPCS-8H met/gly. Etant donné que le motif met/gly dans certains contextes (66) peut spécifier la myristylation du polypeptide traduit, le plasmide pCOPCS-6H a été modifié pour engendrer des plasmides contenant des codons d'amorçage ATG dans les deux autres cadres de lectu- res, qui, comme pCOPCS-6H, ne commencent pas la traduction avec le motif met/gly. pCOPCS-6H a été coupé avec NruI et Asp718 et le fragment vecteur a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Les oligonucléotides synthétiques MPSYN271/ MPSYN272 (hybridés) ont été recuits et insérés dans le vecteur pCOPCS-6H, ce qui a donné le plasmide pCOPCS-9H. Les oligonucléotides synthétiques MPSYN273/MPSYN 274 (hybridés) ont été recuits et insérés dans le vecteur pCOPCS/6H, ce qui a donné le plasmide pCOPCS-10H. Les deux premiers acides aminés codés dans ces plasmides sont les suivants t pCOPCS-9H met/ser et pCOPCS-10H met/thr. Dans les séries finales de cOPCS, l'ADN consistant en séquence de codage avec un promoteur est inséré pour l'expression en pCOPCS-4; des séquences de codage contenant un ATG sont insérées pour l'expression en pCOPCS-5H; et les séquences de codage sans un codon d'amorçage ATG sont insé- rées pour l'expression dans le cadre de lecture approprié entre un ou plusieurs des éléments de la série pCOPCS-6H à pCOPCS-10H. Les plasmides résultants ont été recombinés en mutants vP668, de suppression du virus de la vaccine Copen- hagen, ce qui restaure la capacité du virus de la vaccine de former des plaques sur des cellules humaines. ExempDle 15 - UTILITE DU SYSTEME COPCS POUR ANALYSER LA VIGUEUR DU PROMOTEUR La capacité de la progéniture de vaccine recom- binante engendrée par la recombinaison en utilisant le système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte du plasmide vP668/ COPCS du virus de la vaccine Copenhagen pour former des plaques sur des cellules humaines MRC-5 permet une identification rapide des recombinants. Le sys- tème vP668/COPCS est utilisé pour engendrer des vaccines recombinantes pour une variété de buts. Le plasmide pCOPCS-4, un membre de la série des COPCS qui ne contient pas de promoteur en amont de sa région de polylinker a été coupé par BalII. Un fragment de B. lII contenant la séquence de codage complète pour le gène glyco- protéine de la rage (18, 42) a été inséré dans pCOPCS-4 en une orientation de la droite vers la gauche, ce qui a donné le plasmide pCOPCS-RAB. Dans le pCOPCS-RAB, la région de polylinker est située en amont à partir du gène de la rage. Une variété de régions de promoteur synthétique et des pro- moteurs dérivés du virus de la vaccine et d'autres poxvirus ont été insérés dans la région de polylinker du pCOPCS-RAB en amont du gène glycéroprotéine de la rage. Les plasmides résultants sont utilisés en recombinaison avec le mutant vP668 de suppression du virus de la vaccine Copenhagen. Les divers membres de la progéniture recombinante sont sélec- tionnés selon leurs capacités à former des plaques sur des cellules de MRC-5. La vigueur relative du promoteur peut être testée par l'expression quantitative du gène glyco- protéine de la rage dans le virus progéniture recombinant en utilisant un anticorps monoclonal. Les utilités supplémen- taires sont comparables au système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte vP293. ExemDle 16 - SUPPRESSION DES REPETITIONS TERMINALES INVERSEES DU VIRUS DE LA VACCINE De grandes quantités d'ADN peuvent être supprimées du virus de la vaccine sans détruire sa capacité de croître sur une culture de tissus. Pour augmenter la stabilité du génome de la vaccine et enlever les gènes non essentiels qui peuvent être associés à la virulence, une suppression dans un seul virus recombinant de la vaccine de 32,7 kb d'ADN à partir du terminus de gauche et de 14,9 kb d'ADN à partir du terminus de droite ont été réalisées. Le génome du virus de la vaccine est composé d'ADN à deux brins. A chaque terminus, l'ADN à deux brins complé- mentaires comporte une liaison croisée-par un brin d'ADN qui forme une boucle terminale incomplète par mise en commun de bases par paires (67). Immédiatement à l'intérieur de la boucle terminale, le génome contient des séries de répéti- tions en tandem. Une version clonée du génome WR a été dé- crite comme contenant 13 copies tandem d'une unité répétée de 70 bp au voisinage de chaque extrémité du génome séparé par 435 bp d'ADN non répétitif d'un bloc supplémentaire de 17 copies tandem de l'unité répétée de 70 bp (68). La boucle terminale et l'ADN répétitif forment les portions distales de la répétition terminale inversée de la vaccine. La répé- tition terminale inversée, qui a été estimée à 10 kb pour la version clonée de WR (69), contient un certain nombres de gènes qui, étant donné qu'ils sont contenus à la fois dans les copies de gauche et de droite de la répétition termi- nale inversée sont présents en deux copies dans le génome de la vaccine. Lorsque l'ADN extrait du stock cloné sur plaque du virus de la vaccine Copenhagen (VC-2) utilisé ici est digéré avec des endonucléases de restriction et analysé sur un gel d'agarose, les fragments terminaux manifestent une hétéro- généité. Plutôt que de se présenter comme un brin unique, les fragments terminaux ont l'apparence d'une échelle, dont les échelons sont séparés en dimension par environ 1 kb. Environ 80 % des virus recombinants de la vaccine obtenus comme isolats de plaques à partir de VC-2 ou ses dérivés qui contiennent eux-mêmes des terminaisons hétérogènes, ont montré par analyse par restriction qu'ils contiennent des terminaisons hétérogènes. Dans les 20 % restants de la vaccine recombinante, l'hétérogénité des terminaisons a été perdue, et les fragments de restriction de l'ADN terminale apparaissent sous forme de bandes discrètes. Lorsque de nouveaux recombinants sont obtenus à partir de virus avec des terminaisons discrètes, ces recombinants comportent toujours des terminaisons discrètes, d'après l'observation qui en a été faite. Etant donné que les extrémités du virus VC-2 de base sont hétérogènes, on a choisi de cloner dans un plas- mide le fragment terminal du virus recombinant vP452, qui dérive de VC-2 et qui contient des terminaisons discrètes. vP452 est soumi à une suppression pour les gènes TK {thymi- dine kinase) de la vaccine et HA (hémaglutinine) (50). L'ADN a été extrait de vP452 et digéré au moyen de XhoI et la bande terminale deux fois molaire d'approximativement 7 kb a été isolée à partir d'un gel d'agarose. Le fragment isolé a été soumis à une digestion limitée au moyen de l'exonucléase BAL-31, suivie par la formation d'une terminaison franche au moyen d'un fragment de Klenow d'E. Coli polymérase. Le frag- ment à terminaison franche a été cloné au site SmaI de pUC8 en produisant pSD522VC (Figure 18). Le séquencement de l'ADN du pSD522VC révèle que, comme dans le cas de la vaccine WR, les terminaisons de la vaccine Copenhagen recombinante vP452 contiennent des unités répétées en tandem. En plus des blocs d'unités de répétition en tandem de 70 bp qui ont été rapportés pour l'isolat WR cloné sur plaque, les terminaisons de vP452, contrairement à l'isolat WR, contiennent des unités répétées en tandem composées de 54 bp et disposées à l'intérieur des unités répétées en tandem de 70 bp et au voisinage des séquences de codage. La Figure 19 donne la liste de la séquence d'une portion du génome Copenhagen en commençant avec la copie la plus interne de l'unité répétée en tandem de 54 bp (posi- tions 1-54). La séquence de 13978 bp présentée sur la Figure 19 a été déduite de pSD522VC et de différents clones d'ADN de Copenhagen VC-2 dans des plasmides à base de pUC. Elle comporte des séquences de codage dans HindIII C à droite du bloc final des unités répétées en tandem. La séquence pré- sentée sur la Figure 19 finit au site SalI qui est le com- mencement de la séquence de l'ADN Copenhagen présentée sur la Figure 8. Pour engendrer un plasmide contenant l'ADN répétitif de la vaccine dérivée du terminus de vP452, mais privée des séquences de codage de la vaccine, on a digéré pSD522VC avec ClaI et HindIII et on a isolé un fragment de 7 kb. Les oligonucléotides synthétiques MPSYN261 (5'CGATTCAGACACACGCTTTGAGTTTTGTTGAATCGAGATCTA 3') et MPSYN262 (5'AGCTTAGATCTCGATTCAACAAAACTCAAAGCGTGTGTCTGAAT3') ont été recuits (hybridés) et liés dans le fragment vecteur pSD522VC, en engendrant pMVCEND. pXVCEND contient de 1'ADN de la vaccine à partir de l'extrémité de pSD522VC (approxi- mativement 50 bp à partir de l'extrémité du génome) à tra- vers tous les blocs des unités répétées en tandem, finis- sant au site ClaI en position 338 sur la Figure 19. Un petit ORF (positions 292-336) qui croisait le site ClaI en position 305 a été reconstruit dans les oligonucléotides synthétiques MPSYN261/MPSYN262, qui introduit également un site BqlII pour faciliter les étapes de clonage futures. pMPVCEND, qui ne contient pas d'ORF dérivant de l'ADN de vaccine interne vers le terminus, a été utilisé comme plasmide vecteur et bras externe pour la création de plas- mides destinées à supprimer des gènes des terminus de gauche et de droite de la vaccine. A côté du terminus gauche, tous les gènes jusqu'au gène codant la plus petite sous-unité de ribonucléotide réductase, qui réside dans HindIII F (70) ont été suppri- més. On a déterminé la séquence pour le HindIII F Copen- hagen et on l'a représentée sur la Figure 20. Le HindIII F de la vaccine se trouve immédiatemment à droite de HindIII K. La séquence d'ADN présentée sur la Figure 20 est conti- guë à la séquence représentée sur la Figure 8, qui comprend la séquence entière pour HindIII K. La petite sous-unité pour la ribonucléotide réductase est codée par ORF F4 (positions 3506-2547, Figure 20). L'essai pour savoir si les 10 gènes (K2L à F4L) immédiatemment à droite de la suppression vP668 (C7L à K1L) étaient non essentiels, on a préparé comme suit un plasmide, à savoir pMPCTFR . pSD521VC est un sous-clone de HindIII F Copenhagen contenant des séquences de la jonction HindIII K/F (jonction de la Figure 8/Figure 10). Appendices A/C jusqu'à l'unique site BamHI de HindIII F (Figure 20, posi- tion 5663). Pour obtenir un bras de flanc à droite de F4, on a coupé pSD521VC avec ClaI en position 3576 en amont des séquences de codage F4 et avec BalII en position 2841, avec des séquences de codage F4L. Les oligonucléotides synthéti- ques MPSYN256 (5' CGATGTACAAAAAATCCAAGTACAGGCATATAGATAACTGA 3') et MPSYN257 (5' GATCTCAGTTATCTATATGCCTGTACTTGGATTTTTTGTACAT3') ont été recuits (hybridés) et liés en un vecteur plasmide pSD521VC entre les sites ClaI et BqlII. Dans le plasmide résultant, pMP256/257, la région de promoteur en amont de F4 ORF est recréée, reliée à un site B lII. Pour obtenir un bras de flanc droit pour la vaccine, on a coupé pMP256/257 avec bqlII et EcoRi et un fragment de 2,3 kb contenant les séquences de la vaccine en amont du gène F4 a été isolé. Le bras de flanc gauche de la vaccine à partir de HindIII C a été obtenu à partir du plasmide pCOPCS-4 (Exemple 14) qui contient le gène pour C7L et un fragment supplémentaire de bp de l'ADN de la vaccine vers la gauche. pCOPCS-4 est coupé au moyen de BqlII et EcoRI et le fragment vecteur de 3, 5 kb est lié au fragment de 2,3 kb contenant le bras droit de HindIII F. Le plasmide résultant, à savoir pMPCTFR i, contient un bras gauche de vaccine de HindIII C et un bras droit de HindIII F qui flanque une suppression de 20 gènes [C6L F4L]. pMPCRTFRÉ a été utilisé comme plasmide donneur pour la recombinaison avec vP668 (Exemple 9) et le virus recombinant choisi par culture sur des cellules de MRC-5. On a récupéré la progéniture de vaccine viable vP749 (suppres- sion C6L - F4L) a été récupéré en prouvant que tous les gènes dans la région supprimée étaient non essentiels. Pour supprimer tous les gènes de l'extrémité gau- che de la vaccine jusqu'à et y compris F4L, on a préparé le plasmide mMPLENDA\(Figure 18) comme suit. Un bras de flanc droit de HindIII F a été obtenu par digestion de pMPCTFR4 avec SmaI et BglII, puis isolation du fragment de 2,3 kb. pMPVCEND (Figure 18), qui contient des unités répétées en tandem d'ADN depuis le terminus de vP452 a été digéré au moyen de HindIII, opération suivie par la formation d'une terminaison franche avec un fragment de Klenow de E. Coli polymérase et coupure au moyen de BqlII. Les deux fragments ont été liés ensemble, ce qui a donné pMPLEND e. Dans pMPLEND L, le bras gauche de la vaccine est composé d'uni- tés répétées en tandem et le bras droit de vaccine est com- posé d'ADN dérivé de HindIII F. Dans le plasmide pMPLENDI, les 38 gènes les plus à gauche [C23L - F4L] du génome de 2644 177 Copenhagen sont supprimés, ce qui totalise 32 681 bp [de HINDIII C: Figure 19, position 340 jusqu'à la fin (13 638 bp supprimés); de HindIII C, M, N et K: toute la Figure 8 (15 537 bp) et de HindIII F: Figure 20, positions 1 à 3506]. Pour supprimer les gènes de l'extrémité droite du génome, on a préparé le plasmide pMPREND pour fournir des bras de vaccine de flanquage pour la suppression de la région hémorragique (u) de la vaccine (Exemple 5) et tous les gènes à droite de cette région. La séquence de HindIII B, le fragment le plus à droite de HindIII dans le génome, a été déterminée par le séquencement des clones variés à base de pUC de cette région (Figure 21). La comparaison des sé- quences dérivées des régions de gauche et de droite du géno- me révèle que la répétition terminale s'étend jusqu'à la position 8104 de la Figure 19. Ainsi, la répétition termi- nale inversée de la souche Copenhagen du virus de la vac- cine analysée ici est composée de 8,1 kb de région de codage en plus des blocs d'unités répétées en tandem. Les 9 ORF les plus à gauche de HindIII C, ORF C23L à C15L, corres- pondent aux 9 ORF les plus à droite dans le HindIIIB, ORF B29R & B21R. La Figure 21 illustre la séquence de HindIII B Copenhagen commençant à la jonction HindIII A/B et conti- nuant vers la droite à travers l'ORF le plus à droite qui commence dans les séquences d'ADN uniques (B20R). La copie de droite de la répétition terminale commence en position 17 132 de la Figure 21, 14 bp avant l'extrémité de B2OR ORF. pSD477VC est un sous-clone de NcoI/NruI basé sur pUC de l'HindIII B de la vaccine Copenhagen (Figure 21, positions 9713-11 299) qui contient la région hémorragique (u) (ORF B13R et B14R). pSD478VC (Figure 18) est un dérivé de pSD477VC dans lequel la totalité de la région u (posi- tions 10 024-11 014, Figure 21) est remplacée par une région de clonage multiple comprenant un site BalII. La paire d'oligonucléotidessynthétiques qui sont recuits ou hybridés à cet effet est constituée par SD41mer (5'CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGATCCGTT 3') et SD39mer (5' AACGGATCCCTCGAGCCCGGGGAGCTCAGATCTAGTAAT 3'). Pour obte- nir un bras de vaccine de flanc du côté gauche de la région u, on a coupé pSD478VC au moyen d'EcoRI à la jonction des séquences pUC/vaccine, on a réalisé une extrémité franche par le fragment de Klenow de l'E. Coli polymérase et on a coupé au moyen de BqclII. Un fragment de 0,3 kb contenant la région de promoteur u de la vaccine et les séquences de flanc sur la gauche de la région u a été isolé. Ce fragment a été lié à un fragment de vecteur obtenu en coupant pMPVCEND au moyen HindIII, suivi de l'obtention d'une extrémité franche au moyen d'un fragment de Klenow de E. Coli polméyrase et coupure au moyen de BqlII. Le plasmide résultant, à savoir pMREND Ai, contient un bras de vaccine de gauche dérivé de l'ADN de HindIII B en amont de B13 ORF et comprenant la région de promoteur B13R (u). Le bras de vaccine de droite dans pMREND A est constitué de blocs d'unités répétées en tandem et il est identique au bras de vaccine de gauche présent dans le plasmide de suppression à l'extrémité gauche, à savoir le pMPLENDA. Les deux bras de pMREND A flanquent une suppression de 17 ORF [B13R - B29R]. La dimension totale de la suppression entre les bras de vaccine de flanc dans le plasmide de suppression à l'extré- mité droite, à savoir pMREND A, est de 14 873 bp, le tout depuis HindIII B (séquence représentée sur la Figure 21, entre les positions 1024 et 17 145; avec continuation dans la répétition terminale inversée, avec une séquence suppri- mée équivalente à celle représentée sur la Figure 19, posi- tions 8090 à 340). La stratégie pour la préparation des plasmides de suppression pMPLEND A et pMPREND t est repré- sentée schématiquement sur la Figure 18. Les blocs pleins indiquent l'ADN de la vaccine Copenhagen consistant en des unités répétées en tandem dérivées du terminus de vP452; les blocs ouverts indiquent d'autres ADN de la vaccine Copenhagen. L'emplacement des suppressions dans les plas- mides pMCTFR à, pSD478VC, pMPLEND C et pMPREND A est indiqué par des triangles. * Pour bénéficier de la pression sélective lors de la production de virus de vaccine recombinant dans lesquels on a supprimé une grande quantité d'ADN aux deux extrémités du génome, on a utilisé deux marqueurs sélectables. Le pre- mier est le gène réplicable chez l'hôte humain C7L de la vaccine (Exemple 7) avec sélection de la progéniture du virus recombinant sur des cellules humaines MRC-5. Le second est le gène E. Coli codant le gène pour la guanine phospho- ribozyle transférase (gène Ecogpt) avec sélection de la progéniture du virus de la vaccine recombinante en utili- sant de l'acide mycophénolique (2,8). Pour créer un fragment déplaçable contenant seulement le gène C7L de la vaccine et son promoteur, on a coupé pCOPCS-4 au moyen de NcoI au voisinage de l'extrémité 3' du gène C7L (position 870, Figure 8)et avec BamHI à 148 bp en aval des séquences de codage de C7L. L'extrémité du gène C7L a été reconstruite en utilisant des oligonucléo- tides synthétiques MPSYN258 (5' CATGGATTAATTAATTTTTTTG 3') et MPSYN259 (5' GATCCAAAAAAATTAATTAATC 3') qui sont recuits et liés avec le fragment vecteur en produisant le plasmide pMP258/259. pMP258/259 a été coupé au moyen de BqlII et BamnHI et un fragment de 660 bp contenant le gène C7L et son promoteur a été isolé pour insertion dans les plasmides de suppression de l'extrémité gauche et de l'extrémité droite, à savoir pMPLEND a et pMPREND A, respectivement. Un fragment BalII/BamHI de 670 bp contenant le gène Ecogpt a été dérivé à partir du plasmide pSV2gpt (ATCC n 37 145) (71) par l'addition d'un agent de liaison (lin- ker) BamHI au site AhaIII en aval des séquences de codage (72). Les plasmides pMPLEND A et pMPREND A, comportant des suppressions de vaccine auvoisinage des extrémités de gauche et de droite du génome de la vaccine, respectivement, on été coupés au moyen de BqlII. Des fragments BqmII/BamHI contenant le gène C7L et le gène Ecogpt ont été insérés dans les plasmides vecteurs en produisant au total quatre plasmi- des (Tableau 7). Il y a lieu de noter que le gène C7L est sous le contrôle de son propre promoteur tant dans pMPLUC7 que dans pMPR C7. Le gène Ecogpt est sous le contrôle du promoteur F4L dans pMPLgpt et sous le contrôle de B13R (u) du promoteur dans pMPRgpt. La recombinaison a été réalisée entre ces plasmides et le virus de sauvetage comme indiqué dans le Tableau 7. La progéniture du virus de vaccine re- combinant provenant de recombinaisons introduisant le gène C7L a été sélectionné en formant des plaques sur des cellu- les de mRC-5. Parmi la progéniture en provenance des recom- binaisons introduisant-le gène Ecogpt, on a sélectionné les membres sous l'effet de la croissance en présence d'acide mycophénolique. Il y a lieu de noter que la sélection pour le développement sur des cellules de MRC-5 est réalisée avantageusement en utilisant un virus de sauvetage tel que vP668, qui est supprimé tant pour C7L que pour K1L. TABLEAU 7 ____________________________________________________________ A. Construction de plasmides pour des suppressions au voisinage des terminus Copenhaqen Substrat de Marqueur Produit de plasmide sélectable plasmide Suppression ____________________________________________________________ pMPLEND.^ C7L pMPLIC7 C23L-F4L pMPLEND& Ecogpt pMPLgpt C23L-F4L pMPRENDA C7L pMPL4C7 B13R-B29R pMPREND-4 Ecogpt pMPLgpt B13R-B29R B. Recombinaison in vivo en utilisant des plasmides de supDpression avec le virus de la vaccine CoDenhaqen Mutant de suppression de Virus de sauvetage Plasmide la vaccine vP668(TK-, [C7L-K1L]-) pMPL C7([C23L-F4L]-, C7L+) vP789 vP668(TK-, [C7L-K1L]-) pMPRZAC7([B13R-B29R]-,C7L+) vP774 vP617(TK-, ATI-, HA-) pMPRgpt([B13R-B29R]-,Ecogpt+) vP759 vP617(TK-, ATI-,HA-) pMPLgpt([C23L-F4L]-, Ecogpt+) vP791 vP723(TK-, ATI-,HA-,U-) pMPLgpt([C23LF4L]-, Ecogpt+) vP796 vP796(TK-, ATI-,HA-/ [C23L-F4L]- Ecogpt+) pMPRAC7([B13R-B29R]- + C7L) vP811 Le mutant de suppression du virus de la vaccine recombinant vP796 a été engendré par recombinaison entre le plasmide de suppression de l'extrémité gauche portant le marqueur Ecogpt sélectable, à savoir pMPLgpt et le virus de sauvetage vP723, qui a subi en outre une suppression des gènes TK et HA, aussi bien que les régions équivalentes ATI et u. Par l'indice de restriction de 1'ADN, vP796 est sup- primé pour la région C23L à F4L), aussi bien que les ré- gions TK, HA, ATI et u. Etant donné que la suppression de 38 gènes au voisinage de l'extrémité gauche de vP796 comprend à la fois C7L et K1L, on a utilisé vP796 comme virus de sauvetage pour la recombinaison avec pMPR.C7, le plasmide de suppression de l'extrémité droite contenant C7L. Le recombinant de vaccine qui en résulte, comportant des suppressions au voisinage des deux extrémités, à savoir vP811, a été choisi par culture sur des cellules de MRC-5. REFERENCES 1. Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E.A., Reiss, B., and H. Schaller, Gene 19, 327-336 (1982). 2. Boyle, D.B. and B.E.H. Coupar, Gene , 123-128 (1988). 3. Chakrabarti, S., Brechling, K., and B. Moss, Mol. Cell. Biol. 5, 3403-3409 (1985). 4. Clewell, D.B., J. Bacteriol. 110, 667-676 (1972). 5. Clewell, D.B. and D.R. Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1159-1166 (1969). 6. Drillien, R., Koehren, F., and A. Kirn, Virology 111, 488-499 (1981). 7. Drillien, R., Spehner, D., and A. Kirn, J. Virol. 28, 843-850 (1978). 8. Falkner, F.G. and B. Moss, J. Virol. 62, 1849-1854 (1988). 9. Fathi, Z., Sridhar, P., Pacha, R.F., and R.C. Condit, Virology 155, 97-105 (1986). 10. Fenner, F. and J.F. Sambrook, Virology 28, 600-609 (1966). 11. Franke, C.A., Rice, C.M., Strauss, J.H., and D.E. Hruby, Mol. Cell. Biol. 5, 1918-1924 (1985). 12. Gangemi, J.D. and D.G. Sharp, Virology 85, 262-270 (1978). 13. Gemmell, A. and F. Fenner, Virology 11, 219-235 (1960). 14. Gillard, S., Spehner, D., and R. Drillien, J. Virol. 53, 316-318 (1985). 15. Gillard, S., Spehner, D., Drillien, R., and A. Kirn, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5573-5577 (1986). 16. Graham, F.L. and A.J. Van der Eb, Virology 54, 536-539 (1973). 17. Hruby, D.E., Lynn, D.L., Condit, R., and J.R. Kates, J. gen Virol. 47, 485-488 (1980). 18. Kieny, M.P., Lathe, R., Drillien, R., Spehner, D., Skory, S., Schmitt, D., Wictor, T., Koprowski, H., and J.P. Lecocq, Nature (London) 312 163-166- (1984). 19. Lake, J.R. and P.D. Cooper, J. gen Virol. 48, 135- 147 (1980). 20. Mackett, M., Smith, G.L. and B. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 279, 7415-7419 (1982). 21. Mackett, M. and J.R. Arrand, EMBO A, 3229-3235 (1985). 22. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) (1982). 23. Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V., and H. Stickl, Infection _, 6-14 (1975). 24. McClain, M.E., Aust. J. exp. Biol. med. Sci. 43, 31-44 (1965). 25. Moyer, R.W. and C.T. Rothe, Virology 102, 119-132 (1980). 26. Nakano, E., Panicali, D., and E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1593-1596 (1982). 27. Panicali, D., Davis, S.W., Mercer, S.R., and E. Paoletti, J. Virol. 37, 1000-1010 (1981). 28. Panicali, D. and E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982). 29. Panicali, D., Grzelecki, A., and C. Huang, Gene 47, 193-199 (1986). 30. Perkus, M.E., Panicali, D., Mercer, S., and E. Paoletti, Virol. 152, 285-297 (1986). 31. Perkus, M.E., Piccini, A., Lipinskas, B.R., and E. Paoletti, Science 229, 981-984 (1985). 32. Piccini, A., Perkus, M.E., and E. Paoletti, In: Methods in Enzymology, Vol. 153, ed. Wu, R. and L. Grossman (Academic Press), pp. 545-563 (1987). 33. Rosel, J.L., Earl, P.L., Weir, J.P., and B. Moss, J. Virol. Q60 436-449 (1986). 34. Shapira, S.K., Chou, J., Richaud, F.V., and M.J. Casadaban, Gene M, 71-82 (1983). 35. Southern, P.H. and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341 (1982). 36. Tagaya, I., Kitamura, T., and Y. Sano, Nature (London) 192, 381-382 (1961). 37. Wachsman, M., Aurelian, L., Smith, C.C., Lipinskas, B.R., Perkus, M.E. , and E. Paoletti, J. Inf. Dis. 155, 1188-1197 (1987). 38. Wilson, E.M., Hodges, W.M., and D.E. Hruby, Gene 49, 207-213 (1986). 39. Yuen, L. and B. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6417-6421 (1987). 40. Kotwal, G.J. and B. Moss, Virology 167, 524-537 (1988). 41. Taylor, J., Weinberg, R., Kawaoda, Y., Webster, R.G., and E. Paoletti, Vaccine 6, 504-508 (1988). 42. Taylor, J., Weinberg, R., Languet, B., Desmettre, P., and E. Paoletti, Vaccine 6, 497-503 (1988). 43. Pickup, D.J., Ink, B.S., Hu, W., Ray, C.A., and W.K. Joklik, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7698- 7702 (1986). 44. Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975). 45. Kotwal, G.J. and B. Moss, J. Virol. 63, 600-606 (1989). 46. Tabor, S. and C.C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767-4771 (1987). 47. Patel, D.D. and D.J. Pickup, EMBO 6, 3787-3794 (1987). 48. Patel, D.D., Ray, C.A., Drucker, R.P., and D.J. Pickup, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9431-9435 (1988). 49. Bertholet, C., Drillien, R., and R. Wittek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2096-2100 (1985). ; Guo, P., Goebel, S., Davis, S., Perkus, M.E., Languet, B., Desmettre, P. , Allen, G., and E. Paoletti, J. Virol. 63, 4189-4198 (1989). 51. Tamin, A., Villarreal, E.C., Weinrich, S.L., and D.E. Hruby, Virology 165, 141-150 (1988). 52. Boursnell, M.E.G., Foulds, I.J., Campbell, J.I., and M.M. Binns, J. gen Virol. 69, 2995-3003 (1988). 53. Mandecki, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177- 7181 (1986). 54. Spehner, D., Gillard, S., Drillien, R., and A. Kirn, J. Virol. 62, 1297-1304 (1988). 55. Altenburger, W., Suter, C.-P., and J. Altenburger, Arch. Virol. 105, 15-27 (1989). 56. Hruby, D.E., Maki, R.A., Miller, D.B., and L.A. Ball, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Q80, 3411-3415 (1983). 57. Robbins, A..K., Dorney, D.J., Wathen, M.W., Whealy, M.E., Gold, C., Watson, R.J., Holland, L.E., Weed, S.D., Levine, M., Glorioso, J.C., and L.W. Enquist, J. Virol. 61, 2691-2701 (1987). 58. Robbins, A.K., Watson, R.J., Whealy, M.E., Hays, W.W., and L.W. Enquist, J. Virol. 58, 339-347 (1986). 59. Wathen, M.W. and L.M.K. Wathen, J. Virol. 51, 57- 62 (1984). 60. Mettenleiter, T.C., Lukacs, N., Thiel, H.-J., Schreurs, C., and H.J. Rziha, Virology 152, 66-75 (1986). 61. Petrovskis, E.A., Timmins, J.G., Armentrout, M.A., Marchioli, C.C., Yancey, Jr., R.J., and L.E. Post, J. Virol. 59, 216-223 (1986). 62. Schmitt, J.F.C. and H.G. Stunnenberg, J. Virol. 62, 1889-1897 (1988). 63. Vos, J.C. and H.G. Stunnenberg, EMBO 7, 3487-3492 (1988). 64. Bucher, D., Popple, S., Baer, M., Mikhail, A., Gong, Y.-F., Whitaker, C., Paoletti, E., and A. Judd, J. Virol. 62, 3622-3633 (1989). 65. Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B., and H.A. Erlich, Science 23, 487-491 (1988). 66. Kaplan, J.M., Mardon, G., Bishop, J.M., and H.E. Varmus, Mol. Cell. Biol. Q, 2435-2441 (1988). 67. Baroudy, B.M., Venkatesan, S., and B. Moss, Cell 528, 315-324 (1982). 68. Wittek, R. and B. Moss, Cell 21, 277-284 (1980). 69. Wittek, R., Muller, H.K., Menna, A., and R. Wyler, FEBS Letters 90, 41-46 (1978). 70. Slabaugh, M., Roseman, N., Davis, R., and C. Mathews, J. Virol. 62, 519-527 (1988). 71. Mulligan, R.C. and P. Berg., Science 209, 1422- 1427 (1980). 72. Pratt, D. and S. Subramani, Nuc. Acids Res. 11, 8817-8823 (1983). 2644 1 77 REVENDICATIONS 1. Procédé pour sélectionner un poxvirus recom- binant chez un hôte caractérisé en ce qu'il consiste à: - combiner un ADN donneur et un poxvirus modifié pour former un poxvirus recombinant, le poxvirus modifié ayant des gènes réplicables chez l'hôte qui ont été supprimés de sorte que le poxvirus modifié ne se réplique pas chez l'hôte, et l'ADN donneur comprenant (a) un cadre de lecture ouvert provenant d'une source qui n'est pas du type pox et (b) au moins un gène réplicable chez l'hôte pour permettre au poxvirus recombinant de se répliquer chez l'hôte; et - identifier le poxvirus recombinant par sa capacité à se répliquer chez l'hôte. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le poxvirus est la vaccine. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que le cadre de lecture ouvert en provenance d'une source qui n'est pas du type pox est le gène E. Coli lacZ codant la B galactosidase. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que l'hôte est une lignée de cellules humaines. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la lignée de cellules humaines est MRC-5. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 2 à 5, caractérisé en ce que le gène réplicable chez l'hôte du poxvirus est le gène réplicable chez l'hôte de la vaccine, KiL et C7L. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que l'ADN donneur et le poxvirus modifié sont combinés pour former le poxvirus recombinant par recombinaison de l'ADN donneur et du pox- virus modifié. 8. Procédé pour cloner et exprimer un cadre de lecture ouvert dans un poxvirus recombinant chez un hôte, caractérisé en ce qu'il consiste à: combiner l'ADN donneur et un poxvirus modifié pour former un poxvirus recombinant, ce poxvirus modifié ayant un gène réplicable chez l'hôte qui lui a été enlevé, de sorte que le poxvirus modifié ne se réplique pas chez l'hôte, et l'ADN donifeur comprend (a) un cadre de lecture ouvert en provenance d'une source qui n'est pas du type pox et (b) le gène réplicable chez l'hôte pour permettre au poxvirus recombinant de se répliquer chez l'hôte; - répliquer le poxvirus recombinant chez l'hôte; et - exprimer le cadre de lecture ouvert. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le poxvirus est la vaccine. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le cadre de lecture ouvert en provenance de la source du type non-pox est un gène de l'E. Coli lacZ codant pour la B galactosidase. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 8 à 10, caractérisé en ce que l'hôte est une lignée de cellules humaines. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la lignée de cellules humaines est MRC-5. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 9 à 12, caractérisé en ce que le gène réplicable chez l'hôte poxvirus est le gène réplicable chez l'hôte de la vaccine K1L et C7L. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 8 à 13, caractérisé en ce que l'ADN donneur et le poxvirus modifié sont combinés pour former le poxvirus recombinant par recombinaison de l'ADN donneur et du poxvirus modifié. 15. Plasmide donneur caractérisé en ce qu'il comprend un gène réplicable chez l'hôte du poxvirus et un cadre de lecture ouvert en provenance d'une source qui n'est pas un pox. 16. Plasmide donneur selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un promoteur en amont du gène réplicable chez l'hôte du poxvirus. 17. Plasmide donneur selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un codon d'amorçage de traduction en aval du promoteur suivi par des sites de restriction multiples de type unique, des séquences de signal de fin de traduction et une séquence de signal de terminaison de transcription précoce. 18. Plasmide donneur selon la revendication 15, caractérisé en ce que le gène réplicable chez l'hôte de poxvirus est le gène réplicable chez l'hôte de la vaccine KlL et C7L. 19. Virus recombinant modifié pour exprimer un produit de gène chez un hôte, ce virus recombinant modifié comportant des gènes réplicables chez l'hôte qui ont été supprimés de sorte que le virus a une replication restreinte chez l'hôte et le virus recombinant modifié comprend de l'ADN qui code et exprime le produit de gène chez l'hôte avec une réplication restreinte du virus chez l'hôte. 20. Virus selon la revendication 19, caractérisé en ce que le virus est un poxvirus. 21. Virus selon la revendication 20, caractérisé en ce que le poxvirus est la vaccine. 22. Virus selon l'une quelconque des revendica- tions 19 à 21, caractérisé en ce que le produit de gènes est un antigène. 23. Virus selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'hôte est un vertébré et l'antigène induit une réponse immunologique chez le vertébré. 24. Virus selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'antigène est choisi dans le groupe constitué par l'antigène glycoprotéine de la rage et l'antigène glycopro- téine de la pseudo-rage. 25. Virus selon l'une quelconque des revendica- tions 19 à 24, caractérisé en ce que l'hôte est une cellule cultivée in vitro. 26. Procédé pour exprimer un produit de gènes chez un hôte, caractérisé en ce qu'il consiste à inoculer l'hôte avec un virus recombinant modifié dont on a éliminé les gènes réplicables chez l'hôte de sorte que le virus manifes- te une réplication restreinte chez l'hôte et le virus re- combinant modifié comprend de l'ADN qui code et exprime le produit de gène chez l'hôte avec une réplication limitée du virus chez l'hôte. 27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que le virus est un poxvirus. 28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que le poxvirus est la vaccine. 29. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 26 à 28, caractérisé en ce que le produit de gènes est un antigène. 30. Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce que l'hôte est un vertébré et l'antigène induit une réponse immunologique chez le vertébré. 31. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que l'antigène est choisi dans le groupe constitué par l'antigène glycoprotéine de la rage et l'antigène glycopro- téine de la pseudo-rage, 32. Procédé pour exprimer un produit de gène dans une cellule cultivée in vitro, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire dans la cellule un virus recombinant modifié dont les gènes réplicables chez l'hôte ont été enle- vés de sorte que le virus manifeste une réplication res- treinte dans la cellule, et ledit virus recombinant modifié comprend de l'ADN qui code et exprime le produit de gènes dans la cellule avec réplication restreinte du virus dans la cellule. 33. Vaccin pour induire une réponse immunologique chez un hôte inoculé avec ledit vaccin, caractérisé en ce que le vaccin comprend un véhicule et un virus recombinant modifiés dont on a supprimé les gènes réplicables chez l'hôte de sorte que le virus manifeste une réplication res- treinte chez l'hôte et le virus recombinant modifié comprend de 1'ADN qui code et exprime le produit de gène chez l'hôte avec réplication restreinte du virus chez l'hôte.