FR 2641281 A1 19900706 FR 8900564 A 19890105 PROCEDE DE PURIFICATION DE POLYMERES NATURELS OU SYNTHETIQUES EN SOLUTION, HYDROSOLUBLES OU SOLUBLES EN MILIEU HYDRO-ALCOOLIQUE COMPORTANT DES GROUPEMENTS SULFATES La présente invention a pour objet un procédé de purification de polymères naturels ou synthétiques en solution, hydrosolubles ou solubles en milieu hydro-alcoolique comportant des groupements sulfates. Cela concerne notamment les biopolymères tels que les glycosaminoglycanes sulfatés dénommés ci-après "GAGs" dont les besoins en quantités industrielles sont sans cesse croissants du fait de leurs applications multiples notamment dans le domaine médical comme constituant de biomatériaux parmi lesquels on peut citer notamment la peau artificielle. Les glycosaminoglycanes sulfatés proviennent de divers tissus animaux: cartilages, cornée, peau et tissus conjonctifs en général. De façon connue en soi, l'extraction de ces composés s'effectue par broyage des tissus suivi de la dégradation de la partie protéique des protéoglycanes par des techniques conventionnelles telles que la digestion par des protéases à large spectre ou l'hydrolyse en milieu basique. L'extrait liquide obtenu contient, hormis les glycosaminoglycanes, divers contaminants, de nature polymérique ou non, qui peuvent être des substances non ioniques ou ioniques et, en particulier, des protéines, des peptides ou des acides aminés, non liés par covalence aux glycosaminogly- canes sulfatés ou GAGs. Il est clair qu'en vue notamment des applications médicales des GAGs, ces contaminants doivent être éliminés de façon à obtenir des solutions de glycosaminoglycanes sulfatés très pures. De nombreux procédés d'extraction et de purification des poly- saccharides tels que des GAGs contenus dans les hydrolysats de tissus sont connus à l'heure actuelle. Le plus courant est la précipitation par l'alcool éthylique en milieu salin. Cette technique nécessite de grands volumes de ce solvant et des solutions contenant au moins I à 2 % de GAGs, pour que la précipitation soit complète. Elle n'est donc pas très rentable tant sur le plan de la productivité que sur le plan économique. En outre, elle ne permet que l'élimination partielle des résidus protéiques contaminants compris dans le milieu de départ. La précipitation par des détergents cationiques tels que les 246 4 1 2 8 1 chlorures de céthylpyridinium ou de céthyltriméthylammonium est également très utilisée. Ce procédé, si il est plus performant au niveau du taux de purification que celui précité, présente un inconvénient important qui est le problème de l'élimination totale des détergents cationiques résiduels. On connaît par "The 3ournal of biological chemistry, N 1, january th, pages 77-87, 1969" un procédé d'isolation des GAGs, qualifié de destructif dans lequel la purification consiste en une combinaison des deux techniques mentionnées ci-avant, à savoir, tout d'abord, une précipitation par un détergent cationique, un sel de chlorure de céthylpyridinium, suivie d'une dissolution du précipité et, enfin, d'une précipitation par l'éthanol. Ce document souligne le fait que ce procédé destructif dénature les macro- molécules et diminue leurs coefficients de sédimentation. Il existe, par ailleurs, des techniques de purification par chroma- tographie par exemple par échange d'ions, qui permettent d'obtenir des produits hautement purifiés. Elles sont toutefois mal adaptées au traitement de quantités importantes de polysaccharides, en particulier lorsqu'ils sont pré- sents en faible proportion par rapport aux produits contaminants et lorsque les solutions sont très diluées. D'une façon générale, toutes ces techniques ne sont pas destinées à des purifications de polysaccharides à l'échelle industrielle. Elles ne permettent pas d'obtenir de manière - économique de grandes quantités de GAGs hautement purifiés. L'un des objectifs essentiels de la présente invention est de remédier à ces inconvénients en proposant un procédé de purification de polymères naturels ou synthétiques en solution, hydrosolubles ou solubles en milieu hydroalcoolique comportant des groupements sulfates qui soit tout à fait adapté aux contraintes industrielles que sont la production de masse et la rentabilité. Un autre objectif de l'invention est que ce procédé permette l'obtention à un haut degré de pureté de composés polymériques sulfatés non dénaturés par les agents réactionnels et de bonne qualité. Après de nombreuses études et expériences, l'inventeur est parvenu à mettre au point un procédé permettant d'atteindre ces objectifs, carac- térisé en ce qu'il consiste essentiellement, d'une part, en une précipitation sélective dans laquelle les polymères sulfatés à purifier sont complexés en milieu acide avec une polyamine insoluble à pH supérieur à 7 et, d'autre part, après isolement du complexe ainsi-formé, en un relargage progressif des polymères sulfatés. Ce procédé permet d'atteindre des rendements de purification proche de 100 % pour des solutions impures contenant des polymères sulfatés hydrosolubles ou solubles en milieu hydroalcoolique à des concentrations comprises entre 0,01 et 20 % en poids, les concentrations les plus appropriées étant comprises entre 0,05 et 5 % en poids. De plus, le procédé selon l'invention est parfaitement adapté à la purification à grande échelle de ces polymères sulfatés. En effet, sa mise en oeuvre ainsi que les moyens et les réactifs nécessaires sont relativement peu coûteux. Enfin, on a pu constater que les produits polymériques sulfatés isolés par ce procédé ne sont pas détériorés et conservent toutes 'leurs propriétés physico-chimiques. Il faut signaler qu'à l'inverse ce procédé permet également d'éli- miner les polymères sulfatés d'un milieu o ils sont considérés comme éléments contaminants et ce, même si ils sont présents en faible quantité. La précipitation sélective en milieu acide des polymères sulfatés avec une polyamine insoluble à pH supérieur à 7 est basée sur l'établissement de liaisons électrostatiques entre les deux polymères lorsqu'ils sont mélangés sous forme de solutions dans des conditions de pH déterminées. Le complexe formé est insoluble dans le milieu de précipitation en raison dé la formation de liaisons ioniques entre les groupements sulfates des polymères sulfatés et les groupements amine de la polyamine. Ces liaisons établies entre de multiples chaînes des deux polymères aboutissent à la formation d'un réseau dense de haut poids moléculaire. De préférence, le relargage progressif des polymères sulfatés à partir du complexe est effectué par alcalinisation du milieu de telle sorte que la polyamine insoluble à pH supérieur à 7 reste sous forme solide, tandis que les polymères sulfatés sont solubilisés par formation de sels. Ils sont ainsi totalement ionisés. Par contre, la polyamine initialement totalement ionisée devient totalement insoluble dans le milieu par perte de cette ionisation au niveau de ses fonctions amine. Il est alors aisé d'isoler les polymères sulfatés contenus dans la phase liquide du milieu par tout moyen de séparation approprié et connu en soi comme la filtration ou la centrifugation. Suivant une caractéristique avantageuse du procédé selon l'inven- tion, la polyamine utilisée comme agent de précipitation possède un haut poids moléculaire et ses fonctions amine ont un faible pKa. L'inventeur a donc choisi, comme polyamine, le chitosan qui est une polyglucosamine partiellement N-acétylée insoluble en milieu alcalin. Le chitosan présente l'avantage d'être un produit peu coûteux et non toxique, contrairement à l'éthanol et aux ammoniums quaternaires utilisés dans certaines techniques de purification connues et, par conséquent, inadaptées pour les applications médicales. Par ailleurs, le chitosan utilisé dans le procédé de l'invention est, de préférence, obtenu par N-désacétylation de chitine de crustacés. Son poids moléculaire est au moins égal à 50 KD, mais il a préférentiellement une valeur supérieure à 509 KD, tandis que son -degré d'acétylation est compris entre 0 et 30 %, préférentiellement 0-20 %. Conformément à un mode préféré de mise en oeuvre de l'inven- tion, le procédé consiste à exécuter successivement les étapes suivantes acidification de la solution contenant les extraits de polymères sulfatés pour l'amener à un pH compris entre 1 et 4 de manière à obtenir une solution de départ à partir de laquelle les polymères sulfatés sont isolés; - préparation d'une solution acide de chitosan à un pH compris entre 1 et 4; - mélange sous agitation de la solution de départ et de la solution de chitosan de manière à obtenir un complexe polymères sulfatés/chitosan, le chitosan pouvant être en léger excès; - isolement du complexe, puis relargage des polymères sulfatés par mise en suspension de ce dernier dans une solution alcaline aqueuse à un pH compris entre 9 et 13 tout en maintenant une agitation lente; - récupération de la fraction liquide de polymères sulfatés purifiés obtenue; - neutralisation de cette fraction liquide au moyen d'acide, - élimination des sels de cette fraction liquide. Les polymères sulfatés en solution ainsi obtenus peuvent être transformés en une forme solide par tout moyen approprié et connu en soi tel que la précipitation, la lyophilisation ou la déshydratation simple. L'Inventeur a pu constater, sans que cela ne soit limitatif, que le procédé selon l'invention est particulièrement adapté à la purification des dextranes sulfates ou des glycosaminoglycanes sulfatés (GAGs) d'origine humaine ou animale, tels que: - les chondroitines 4 et 6 sulfates, - le dermatane sulfate, - le kératane sulfate, - et l'héparane sulfate et les héparines. Pour ces derniers composés, il est préférable d'utiliser un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique pour l'étape d'acidification dans laquelle une valeur de pH de l'ordre de 2 est considérée comme optimale. Par ailleurs, un acide organique monocarboxylique tel que l'acide acétique est avantageusement employé pour la préparation de la solution acide de chitosan à un pH de l'ordre de 3, la concentration en chitosan de cette solution étant égale environ à I %. Le mélange: solution de départ de GAGs/solution acide de chitosan est maintenu sous agitation pendant une durée comprise entre vingt minutes et une heure trente minutes. L'alcalinisation de la solution pour le relargage des glycosamino- glycanes sulfatés s'effectue, de préférence, à l'aide d'hydroxyde de sodium aqueux, l'agitation lente étant maintenue pendant deux à vingt-quatre heures. Suivant une caractéristique avantageuse de l'invention, la récupé- ration de la fraction liquide contenant les glycosaminoglycanes sulfatés consiste à centrifuger ou à filtrer au moins une fois la solution alcaline. Cette technique de précipitation sélective permet d'éliminer les divers contaminants apparaissant comme sous-produits avec les glycosaminoglycanes sulfates dans les extraits bruts liquides obtenus après broyage et digestion enzymatique ou alcaline de tissus animaux. En fonction du mode d'hydrolyse choisi, ces extraits liquides bruts peuvent contenir certains sels tels les sulfates ou phosphates susceptibles de porter atteinte au rendement du procédé. Par conséquent, il peut s'avérer nécessaire de les soumettre à une dialyse afin de les séparer de ces sels. La solution est ensuite amenée à pH 1,5-3,7 par addition d'acide minéral dilué ou d'acide organique pur ou dilué, puis elle est agitée quinze à trente minutes et centrifugée si nécessaire. Les GAGs sont précipités à partir de la solution de départ ainsi obtenue. Le chitosan utilisé dans l'invention est obtenu par N-désacétylation de chitine de crustacés et purifié par dissolution en milieu acide, filtration et reprécipitation en milieu basique. Son poids moléculaire est supérieur à 500 KD et son degré d'acétylation est compris entre 0 et 20 %. Tous les chitosans, quelle que soit leur origine: crustacés, insec- tes, champignons, fermentation sont utilisables, à condition que leur degré d'acétylation et leur poids moléculaire soient compris entre les intervalles donnés. Dans le procédé conforme à l'invention, le précipité de chitosan est dissous dans une solution d'acide minéral ou organique maintenue à pH compris entre 1,5 et 3,7. Cette solution visqueuse ne doit pas contenir plus de 1,5 % de chitosan. On retient de préférence une concentration de 1 %. I1 est à noter que la solution de départ et la solution de chitosan peuvent présenter des valeurs de pH identiques ou différentes fixées par l'addition dans chacune d'elles de solutions d'acides minéraux ou organiques monocarboxyliques, à l'exception des acides contenant des anions de valence supérieure à 1 tels que l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique par exemple. Lorsque des acides minéraux tels que l'acide chlorhydrique sont utilisés, le pH de la solution de départ doit être compris entre 1,5 et 2;5, et la solution de chitosan doit être amenée à un pH compris dans le même intervalle. Lorsque des acides organiques tels que l'acide acétique ou l'acide formique sont utilisés, les pH des solutions doivent être compris entre 3 et 3,7 pour l'acide acétique et 2,5-3,5 pour l'acide formique. Dans tous les cas, quel que soit l'acide carboxylique utilisé, le pH des solutions ne doit pas être supérieur à 3,8; de même, quel que soit l'acide minéral utilisé, le pH des solutions ne doit pas excéder 2,5. Comme indiqué ci-avant, les deux solutions réactives peuvent être amenées à pH acide par des acides différents. Ainsi, la solution de départ peut être ajustée à pH 2 par de l'acide chlorhydrique et la solution de chitosan à pH 3 par de l'acide formique ou à pH 3,5 par de l'acide acétique, par exemple. Toutes les combinaisons sont possibles mais la solution de GAGs est généralement acidifiée par un acide minéral, préférentiellement par l'acide chlorhydrique. Cette solution de GAGs doit être limpide avant précipitation par le chitosan. L'étape suivante est la formation d'un complexe glycosaminoglycanes sulfatés/chitosan par précipitation sélective. Elle consiste à ajouter lente- ment la solution de chitosan dans la solution de départ de glycosaminoglycanes sulfates maintenue sous forte agitation, cet ordre d'addition pouvant évi- demment être inversé. Un précipité blanc se forme alors instantanément et l'addition du chitosan est poursuivie jusqu'à la fin de la précipitation qui peut être appréciée par l'augmentation de la viscosité de la solution dès que le chitosan est en excès. Le complexe formé est insoluble dans le milieu de précipitation en raison de la formation de liaisons ioniques entre les groupements sulfate des glycosaminoglycanes et les groupements amine du chitosan. Ces liaisons, établies entre de multiples chaînes des deux polymères, aboutissent à la formation d'un réseau dense de haut poids moléculaire. Les espèces contaminantes principales dans les solutions de départ de glycosaminoglycanes sont des protéines et des peptides de nature ampho- tère présentant des fonctions carboxyliques portées par les résidus acide glutamique et acide aspartique principalement. Ces résidus, acides aminés acides sont capables de contracter des liaisons électrostatiques avec le chitosan. Ces liaisons s'établissent lorsque les groupements carboxyliques des aminoacides sont ionisés. En revanche, lorsque le milieu est défavorable à l'ionisation, les interactions électrostatiques avec le chitosan sont fortement réduites, voire nulles. Ces conditions défavorables sont obtenues par acidi- fication du milieu à des pH très inférieurs au pKa des fonctions carboxy- liques libres des résidus acides aspartique et glutamique. Les glycosaminoglycanes sulfatés, présents dans le milieu, contiennent sur une même molécule à la fois des groupements acide carboxylique et des groupements sulfate. L'influence des conditions acides sur ces deux types de groupement sera limitée à la suppression de l'ionisation des seuls groupements carboxyliques dont le pKa est voisin de 3,5. En revanche, les groupements sulfate qui peuvent être considérés comme des groupements acides forts demeureront ionisés pour des pH compris entre 1,5 et 2,5. Dans ces conditions, les seules molécules contenues dans les extraits qui peuvent contracter des liaisons électrostatiques avec le chitosan sont les glycosaminoglycanes, ces liaisons s'établissant au niveau de leurs groupe- ments sulfate. On peut montrer qu'à pH compris entre 1,5 et 2,5 la précipitation des glycosaminoglycanes sulfatés est totale lorsque la quantité de chitosan entrant dans la formation du complexe correspond à une égalité en nombre entre les groupements amine libre de ce composé et les groupements sulfate des glycosaminoglycanes. A la fin de la précipitation, la suspension obtenue est agitée pendant trente minutes à une heure, puis elle est centrifugée. Le surnageant est éliminé et le précipité est mis en suspension dans dix à cinquante fois son volume d'eau par agitation violente ou par broyage. La suspension est centrifugée et le culot est récupéré. Le complexe chitosan-glycosaminoglycanes se présente sous la forme de particules molles qui s'aggrègent pour donner une masse malléable qui se délite sous forte agitation. Cette substance peut être filée, étirée sous forme de films et moulée. Elle peut être déshydratée par différentes méthodes usuelles: lyophilisation, action de solvants organiques hydrophiles, vide,... La déshydratation par la chaleur donne un produit très dur qui peut être façonné. Ces propriétés font du complexe chitosan/glycosaminoglycanes un matériau intéressant pour des utilisations médicales. Il pourrait être utilisé, en particulier, en orthopédie par exemple, pour pallier un manque de substance osseuse. Le procédé de l'invention se poursuit par la phase de dissociation qui conduit au relargage des glycosaminoglycanes. Ce dernier peut être effectué suivant différentes techniques augmentation de la force ionique à l'aide de sels tels que' le chlorure de sodium ou le sulfate de sodium par exemple, jusqu'à des concentrations comprises entre 0,7 et 2 moles par litre; - augmentation du pH du milieu de relargage jusqu'à des valeurs comprises entre 9,5 et 12,5; - combinaison de ces deux techniques. Suivant l'invention, la technique préférée est celle qui fait inter- venir la seule alcalinisation du milieu. Elle consiste à disperser sous forte agitation le complexe chitosan-glycosaminoglycanes dans un volume d'eau de cinq à dix fois plus grand que celui du précipité, puis la suspension est ensuite amenée à un pH compris entre 9,5 et 12,5 préférentiellement 11, par ajout d'une solution concentrée d'hydroxydes alcalins tels que les hydroxydes de sodium ou de potassium et elle est agitée lentement pendant deux à vingt-quatre heures. Au terme de cette durée, qui varie en fonction des conditions opératoires telles que la granulométrie des grains du complexe, la force ionique, le pH du milieu et la température, la réaction de solubilisation est complète. Des phénomènes interviennent simultanément dans la libération des GAGs. Les liaisons ioniques SO4-- NH3+ entre le chitosan et les GAGs sont déplacées selon la réaction GAGs-SO4#.oNH3 -CHITOSAN + 2 NaoH.-GAGs-SO4.. Na+ + NH2-CHITOSAN+2H20 COOH COO-- --Na Les glycosaminoglycanes sont solubilisés par formation des sels de sodium des groupements sulfate et carboxyliques; les GAGs sont ainsi totalement ionisés. Le chitosan, totalement ionisé au sein du complexe, devient totalement insoluble dans le milieu par perte de cette ionisation au niveau de ses fonctions amine. Le chitosan sous forme solide ainsi obtenu est séparé de la solution de GAGs par filtration ou centrifugation. Il est lavé à l'eau, puis conservé sous forme humide à +40C ou déshydraté par des méthodes connues (chaleur, vide, solvants).. Il est ainsi recyclé pour d'autres opérations de purification des GAGs. La perte en chitosan au cours des différentes étapes de purifi- cation est estimée à 2-4 % de la masse de départ. La solution de glycosaminoglycanes, totalement débarrassée du chitosan, est neutralisée ou acidifiée jusqu'à un pH de l'ordre de 2. Avantageusement, la ou les solutions réunies purifiées de glycosaminoglycanes sulfatés sont dialysées contre de l'eau pour éliminer la majorité des sels. Le dialysat peut être utilisé tel quel ou concentré par des techniques usuelles telles que évaporation ou ultrafiltration jusqu'à l'obten- tion de solutions contenant de 2 à 20 % de matières sèches. A partir de ces solutions, les GAGs peuvent être obtenus sous forme solide, soit par précipitation dans l'alcool éthylique, soit par lyophilisation ou déshydratation simple. L'étape de dialyse peut être supprimée dans le cas o l'ultra- filtration est utilisée comme moyen de concentration et si les GAGs sont obtenus sous forme solide à partir de la solution concentrée, par précipi- tation à l'éthanol ou avec un autre alcool. Il apparaît donc que le procédé de purification conforme à l'invention est tout à fait performant. En effet, les rendements qu'il permet d'atteindre sont proches de 100 % pour des solutions brutes contenant entre 0,01 % et 20 % de polymères sulfatés. En outre, l'agent réactif utilisé, une polyamine insoluble en milieu alcalin telle que le chitosan est un produit économique et non toxique. Cette dernière caractéristique est particulièrement intéressante pour la production de biopolymères sulfatés tels que les GAGs dont les applications principales se situent dans le domaine médical, pharmaceutique ou cosmétique. Enfin, un autre intérêt majeur de l'invention est que ce procédé de purification est tout à fait adapté à la production industrielle en grandes quantités à un moindre coût de revient. Il va de soi que le procédé ne se limite pas à la purification de glycosaminoglycanes sulfatés décrite en détail ci-avant, mais peut être étendu à tous les polymères sulfatés hydrosolubles ou solubles en milieu hydro-alcoolique. En vue de compléter l'illustration du procédé selon l'invention, il est décrit, ci-après, cinq exemples non limitatifs de mise en oeuvre de celui-ci. EXEMPLE I g d'extrait sec de chondroitines 4 et 6 sulfate contenant environ 130 g de GAGs purs sous forme de sel de sodium (dosage des hexosamines) sont dissous dans 10 kg d'eau et la solution est amenée à pH 2 par une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 5N. La solution est centrifugée après vingt minutes d'agitation à 2 000 g pendant dix minutes. Le surnageant limpide est additionné d'une solution de chitosan jusqu'à préci- pitation complète. La solution mère de chitosan est préparée par dissolution de 100 g de chitosan purifié dans 10 kg d'eau maintenue à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique 5N. La suspension est agitée pendant trente minutes puis laissée au repos pendant quinze minutes, puis le surnageant est éliminé (détection des glycosaminoglycanes par la précipitation au bleu alcian: négative). Le précipité gommeux obtenu est dispersé par broyage à l'aide 1l d'un homogénéiseur commercialisé sous la dénomination commerciale "Turrax" dans 5 kg d'eau déminéralisée puis après quinze minutes d'agitation, le précipité est collecté par décantation. Le précipité est alors dispersé dans 1,7 kg d'eau et de l'hydroxyde de sodium aqueux 5N est ajouté jusqu'à un pH 10 stable. Après trois heures et demi d'agitation, la suspension est filtrée et le filtrat est amené à pH 7 par de l'acide chlorhydrique 6N. Le rétentat constitué de chitosan est lavé par I kg d'eau puis essoré et les eaux de lavage sont mélangées au filtrat précédent après avoir été ajustées à pH 7. La solution obtenue est dialysée en continu contre de l'eau déminéralisée et le dialysat est filtré sur cellulose 40 Im, puis concentré par évaporation et enfin lyophilisé. La masse du lyophilisé obtenu est de 141 g comprenant environ 9 g d'eau et 127 + 5 g de glycosaminoglycanes (dosage des hexosamines). Le dosage des protéines par la méthode de Lowry a donné les résultats suivants - extrait brut de GAGs: 32 % équivalent BSA - lyophilisé: 0,35 % équivalent BSA. Le dosage effectué par la méthode du biuret a donné 24 % pour les extraits bruts et des quantités non détectables, c'est-à-dire inférieures à 0,5 %, pour les lyophilisés. EXEMPLE 2 Même protocole que précédemment mais la solution de chitosan est obtenue dans un milieu acide acétique à pH 3,5. EXEMPLE 3 Même protocole que dans l'exemple 2, mais l'acide acétique est remplacé par l'acide formique à pH 2,8. EXEMPLE 4 Même protocole que dans l'exemple 1, mais les solutions de GAGs et de chitosan sont acidifiées par de l'acide formique pur jusqu'à obtention d'un pH de 2,8. EXEMPLE 5 Protocole identique à l'exemple 4 mais l'acide formique est remplacé par l'acide acétique à pH 3,5. - REVENDICATIONS - 1- Procédé de purification de polymères naturels ou synthétiques en solution, hydrosolubles ou solubles en milieu hydro-alcoolique et com- portant des groupements sulfates, caractérisé en ce qu'il consiste essen- tiellement, d'une part, en une précipitation sélective dans laquelle les polymères sulfatés à purifier sont complexés en milieu acide avec une polyamine insoluble à pH supérieur à 7 et, d'autre part, après isolement du complexe ainsi formé, en un relargage progressif des polymères sulfatés. 2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le relargage progressif des polymères sulfatés à partir du complexe est effectué par alcalinisation du milieu de telle sorte que la polyamine insoluble à pH supérieur à 7 reste sous forme solide, tandis que les polymères sulfatés sont solubilisés par formation de sels. 3- Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, carac- térisé en ce que la polyamine utilisée comme agent de précipitation possède un haut poids moléculaire et en ce que ses fonctions amine ont un faible pKa. 4- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la polyamine est le chitosan. 5- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le chitosan a un poids moléculaire supérieur à 50 KD et un degré d'acétylation compris entre 0 et 30 S6. 6- Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à exécuter successivement les étapes suivantes: - acidification de la solution contenant les extraits de polymères sulfatés pour l'amener à un pH compris entre 1 et 4 de manière à obtenir une solution de départ à partir de laquelle les polymères sulfatés sont isolés; - préparation d'une solution acide de chitosan à un pH compris entre 1 et 4; - mélange sous agitation de la solution de départ et de la solution de chitosan de manière à obtenir un complexe polymères sulfatés/chitosan, le chitosan étant en excès; - isolement du complexe, puis relargage des polymères sulfatés par mise en suspension de ce dernier dans une solution alcaline aqueuse à un pH compris entre 9 et 13 tout en maintenant une agitation lente - récupération de la fraction liquide de polymères sulfatés obtenue purifiée - neutralisation de cette fraction liquide au moyen d'acide, - élimination des sels de cette fraction liquide. 7- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les polymères sulfatés sont des dextranes sulfates ou des glycosaminoglycanes sulfatés d'origine humaine ou animale tels que - les chondroitines 4 et 6 sulfates, - le dermatane sulfate, - le kératane sulfate, - l'héparane sulfate et les héparines. 8- Procédé selon la revendication 6 ou la revendication 7, carac- térisé en ce que l'on utilise un acide minéeral tel que l'acide chlorhydrique pour l'étape d'acidification dans laquelle la valeur du pH est de l'ordre de 2. 9- Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que l'on utilise un acide organique monocarboxylique tel que l'acide acétique pour la préparation de la solution acide de chitosan à un pH de l'ordre de 3, la concentration en chitosan de cette solution étant environ égale à 1 %. 10- Procédé selon selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le mélange solution de départ de GAGs/solution acide de chitosan est maintenu sous agitation pendant une durée comprise entre vingt minutes et une heure trente minutes. Il- Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 10, caractérisé en ce que l'alcalinisation de la solution pour le relargage des glycosaminoglycanes sulfatés s'effectue à l'aide d'hydroxyde de sodium ou d'hydroxyde de potassium aqueux, l'agitation lente étant maintenue pendant deux à vingt-quatre heures. 12- Complexe chitosan/glycosaminoglycanes sulfatés, caractérisé en ce qu'il est obtenu par mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à Il. 13- Glycosaminoglycanes sulfatés, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par mise en oeuvre des revendications 7 à Il.