FR 2636533 A1 19900323 FR 8909526 A 19890713 i L'invention concerne l'utilisation des limonoldes d'agrumes comme agents antitumoraux. La limonine et la nomiline, ainsi que d'autres limonoides, sont nrésentes dans les ruta- cfes qui comprennent les fruits comestibles cou- rants orange, citron, lime et pamplemousse. La structure moléculaire des limonoldes comporte une partie furanne à laquelle un triterpène fortement oxydé est fixé en position 3. On a constaté que des produits naturels comportant une partie furan- ne comme le kahwéol et le cafestol isolés de fèves de café vertes inhibaient la néoplasie induite chimiquement. L'action inhibitrice de ces classes et d'autres classes d'anticarcinogqnes a été attri- buée, au moins en partie, à leurs capacités d'in- duire une activité accrue de l'enzyme détoxifiante glutathione S-transférase (GST), voir V. L. Spar- nins, P. L. Venegus et L. W. Wattenberg, J. Natl. Cancer Inst. 68: 483496 (1982) et A. M. Benson, R. P. Batzinger, S. Y. L. Ou, E. Bueding, Y. N. Cha et P. Talalay. Cancer Res. 38: 4486-4495 (1978). La partie furanne dans le kahwéol et le cafestol a été déterminée comme étant le groupe fonctionnel qui est responsable de l'induction de l'augmentation de l'activité GST chez les animaux de laboratoire. voir L. K. T. Lam, V. L. Sparnins et L. W. Wattenberg. J. Med. Chem. 30: 1399-1403 (1987). Etant donné que les limonoldes comme la limonine et le nomiline sont des produits natu- rels contenant du furanne qui sont consommés ré- gulièrement par l'ensemble de la population, nous avons déterminé l'activité inductrice GST de ces limonoldes et nous avons constaté que le dernier composé est un inducteur enzymatique puissant tandis que le premier a aussi une certaine activité. La présente étude corrèle l'activité inductrice d'enzymes et l'inhibition de la tumeur de la partie antérieure de l'estomac induite par le benzopyrène chez la souris ICR/Ha, au moyen de la limonine et la nomiline. L'invention concerne donc une composition pharmaceutique qui comprend une quantité thérapeuti- quement efficace d'un limonoide d'agrumes et un ex- cipient pharmaceutiquement acceptable. Parmi les li- monoides d'agrumes, la limonine et la nomiline sont particulièrement efficaces. La composition est uti- lisable pour traiter les tumeurs. L'invention permet le traitement du cancer, c'est-à-dire le traitement et l'inhibition des tu- meurs, par administration, à une personne atteinte de cancer et de tumeur, d'une quantité thérapeutique- ment efficace d'un limonorde d'agrumes. Les limonoi- des d'agrumes de l'invention sont utilisables comme agent antitumoraux. L'invention concerne l'utilisa- tion des limonoides d'agrumes comme agent antitumo- ral et l'utilisation de ces limonoldes pour fabriquer un agent antitumoral. Dans l'invention, le limonorde d'agrumes spécifié ci-dessus, comme la limonine et la nomiline, est isolé de l'agrume et on a constaté qu'il est uti- lisable pour traiter les tumeurs. Il est utilisable aussi comme additif à la nourriture. Ces limonordes servent de constituants à goût amer. L'invention est utilisable en particulier pour le traitement, l'inhibition et la prévention des tumeurs gastriques. Trente-sept espèces de limonoldes peuvent être obtenues à partir des agrumes et on a constaté qu'elles avaient un groupe furanne dans leur structu- re respective. Parmi les limonoïdes, la limonine et la nomiline sont isoles comme étant les constituants les plus efficaces. La limonine et la nomiline sont définies par les formules suivantes (1) et (2) res- pectivement. Dans les structures, le groupe furanne est fixé en sa position 3 a un groupe triterpane fortement oxydé en position C-17 de celui-ci. La li- monine et la nomiline existent aussi dans les agru- mes sous la forme combinée avec le glucose représen- tée par le formules (3) et (4) respectivement. (1) limonine a 0, /30 1 1 (2) nomiline OAC 1. À.i 0o o% (3) limonine17-O-p-D-glucopyrannoside De 0,0" H'0 C OHO COUi OH Les limonoides comme la limonine et la nomi- line sont des principes amers que l'on trouve dans les fruits d'agrumes comestibles courants. La nomiline, lorsqu'elle est administrée 3 o5 fois, à raison de 5 et 10 mg par animal à intervalles de deux jours, induit une multiplication par 2,48 et 3,44 respectivement, par rapport au témoin de l'acti- vité glutathione S-transférase dans le foie de souris femelles ICR/Ha. L'activité GST de la muqueuse de l'intestin grêle devient 3,00 et 4,17 fois plus gran- de respectivement que celle du témoin. La limonine, lorsqu'elle est administrée aux mêmes doses, n'est pas active dans le foie. On obtient toutefois une fai- ble activité dans la muqueuse de l'intestin grêle. On a constaté que l'inducteur enzymatique le plus actif, la nomiline, inhibait la néoplasie induite par le benzo(a)pyrène dans la partie antérieure de l'estomac de souris ICR/Ha. Le résultat du traitement par la nomiline est que le nombre de souris porteuses de tu- meur baisse de 100 à 72 % et que le nombre de tumeurs par souris diminue de façon significative. La limoni- ne, qui est un inducteur enzymatique faible, est moins puissant comme inhibiteur de la néoplasie induite par le benzo(a)pyrène. Ces constatations suggèrent que les limonoldes, en tant que classe de produits naturels régulièrement consommes, peuvent être des agents de chimioprévention efficaces. Lorsque le composé selon la présente inven- tion est utilisé comme agent antitumoral, il est ha- bituellement administré par voie orale ou par voie parentérale (administration intramusculaire ou sous- cutanée). La dose n'est pas limitée de façon particu- lière et elle varie suivant le type de la maladie, les symptômes, l'age, l'état général et le poids cor- porel du patient, un autre traitement poursuivi en même temps que le présent traitement, s'il y en a un, la fréquence du traitement et la qualité de l'effet désiré. Habituellement, lorsqu'il est administré à des adultes par voie orale, la dose est d'environ 1 à 100 mg, de préférence d'environ 2 à 20 mg, et en particulier d'environ 8 à 10 mg par jour. Il peut être administré en une fois ou plusieurs fois par jour. Lorsqu'il est administré par injection, la do- se est d'environ 0,01 à 1 mg/kg, de préférence d'en- viron 0,03 à 0,1 mg/kg. L'agent de l'invention est, par exemple, sous forme de poudres, grains fins, granules, com- primés, gélules, suppositoires ou solutés injecta- bles. Dans les compositions, on utilise un excipient ordinaire et on emploie une méthode de préparation ordinaire. On prépare une composition solide pour voie orale en ajoutant un excipient et, si nécessai- re, un liant, un agent de désintégration, un lubri- fiant, un colorant, un correcteur de goût, etc. à l'ingrédient actif et en façonnant le mélange pour en faire des comprimés, des comprimés enrobés, des granules, de la poudre ou des capsules par un procé- dé classique. Les excipients utilisables comprennent par exemple le lactose, l'amidon de mats, le sucre blanc, le glucose, le sorbitol, la cellulose cris- talline et le dioxyde de silicium. Les liants com- prennent, par exemple, l'alcool polyvinylique, l'éther polyvinylique, l'éthylcellulose, la méthyl- cellulose, la gomme d'acacia, la gomme adragante, la gélatine, la gomme laque, l'hydroxypropylcellu- lose, l'hydroxypropylamidon et la polyvinylpyrroli- done. Les agents de désintégration comprennent par exemple l'amidon, l'agar-agar, la poudre de gélati- ne, la cellulose cristalline, le carbonate de cal- cium, l'hydrogénocarbonate de sodium, le citrate de calcium, la dextrine et la pectine. Les lubri- fiants comprennent, par exemple, le stearate de magnésium, le talc, le polyéthylèneglycol, la si- lice et les huiles végétales durcies. Les colo- rants comprennent ceux qui sont acceptés comme co- lorants pour les compositions médicinales. Les agents correcteurs comprennent par exemple la pou- dre de cacao, le menthol, la poudre aromatique, l'huile de menthe poivrée, le bornéol et la poudre de cannelle. Ces comprimés et granules peuvent être enrobés de façon adéquate avec du sucre, de la gé- latine, etc. Dans la préparation du soluté injectable, on ajoute, si nécessaire, des additifs comme un agent d'ajustement du pH, un tampon, un stabilisant ou un solubilisant, à l'ingrédient actif et on pré- pare le soluté pour injection intraveineuse à par- tir de ce mélange par un procédé classique. ESSAI PHARMACOLOGIQUE On a fait des essais sur la limonine et la nomiline du point de vue de leurs propriétés d'inducteur enzymatique puissant et d'inhibition de la tumeur gastrique induite par le benzopyrène. Le BP (benzo(a)pyrène) et le CDNB (1-chlo- ro-2,4-dinitrobenzène) proviennent de Aldrich Chemi- cal Co (Milwaukee, Wi, U. S. A.). Le 3-BHA (3-ter- tio-butyl-4-hydroxyanisole) est purifié par recris- tallisation à partir de BHA commercial (Sigma Chemi- cal Co., St. Louis, Mo, U. S. A.). La glutathione provient de Sigma Chemical Co. La limonine et la no- miline ont été isolées de pépins de pamplemousses comme suit. Les farines de pépins sont lavées avec un mélange d'hexanes et les limonoldes sont extraits à l'acétone. La limonine est obtenue par cristallisa- tion fractionnée dans le dichlorométhane à partir du mélange et la nomiline est obtenue par cristallisa- tion dans l'acétone à partir du résidu. Les structu- res sont confirmées par analyse spectrale de RMN. PREPARATION DU CYTOSOL Des souris ICR/Ha femelles, agées de 8 se- maines, provenant de Harlan Sprague Dawley Laborato- ry (Indianapolis, In, U. S. A.) suivent un régime alimentaire semi-purifié (ICN Nutritional Biochemi- cal, Cleveland, Oh, U. S. A.) pendant une semaine avant d'être diviséesen groupes expérimentaux et groupe témoin - trois souris par groupe. Aux groupes expérimentaux, on administre trois doses des compri- més à l'essai en suspension dans de l'huile de grai- nes de coton un jour sur deux. Au groupe témoin, on administre de l'huile de graines de coton seule. 24 heures après la dernière incubation, les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale, et le foie, les poumons, la partie antérieure de l'estomac et la muqueuse du tiers le plus proche de l'intestin grêle sont retirés en vue de la préparation enzymatique. On homogénéise les tissus dans une solution de KC1 à 1,15 % au moyen d'un homogénéseur Brinkman. Au bout d'une heure de centrifugation à 100 000 xg, on ob- tient le cytosol que l'on congèle à -80 C jusqu'à l'emploi. La concentration de protéines des échantil- lons est déterminée par la méthode de Lowry. Chaque Échantillon représente un tissu provenant d'un animal individuel. ESSAI GST On détermine l'activité de la GST du cyto- sol par la méthode de Habig et Coll., en employant du CDNB comme substrat. On contrôle le vitesse de réaction à 340 nm dans un spectrophotomètre Hewlett Packard HP8450A. On fait des essais à 30 C dans un tampon au phosphate 0,1 M, pH 6,5, en présence de mM GST et de 1 nM de CDNB. On emploie comme té- moin le mélange d'essai complet sans enzyme. INHIBITION DE TUMEURS On a effectué les expériences d'inhibi- tion de tumeurs selon des modes opératoires publiés antérieurement. Cent vingt souris ICR/Ha femelles (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, In), agées de 8 semaines, sont divisées également en six groupes. On donne aux souris une alimentation semi-purifiée une semaine avant le début de l'expérience et on les alimente de la même façon jusqu'à 3 jours après la dernière dose de traitement carcinogène. Du BP est administré par intubation par voie orale 2 fois par semaine pendant 4 semaines à une dose de 1 mg (dans 0,2 ml d'huile de mals). Les inhibiteurs sont administrés par intubation par voie orale 3 fois par semaine à des jours autres que ceux du traite- ment carcinogène. On administre trois doses supplé- mentaires d'inhibiteurs, 2 avant la première dose et 1 avant la dernière dose de carcinogène. Trois jours après la dernière dose de BP, les animaux re- çoivent à nouveau l'alimentation normale de labora- toire jusqu'à l'achèvement de l'expérience. Dix- huit semaines après la dernière dose de BP, les souris sont sacrifiées et les estomacs sont préle- vés et fixes par injection ig de formaline. Ils sont ensuite coupés et ouverts longitudinalement. On compte les tumeurs de la partie antérieure de l'estomac sous un microscope à dissection équipé d'une échelle millimétrique. On enregistre les tu- meurs qui ont 0,5 mm ou plus et on les vérifie du point de vue histopathologique. ANALYSE STATISTIQUE La signification du nombre de souris porteuses de tumeur est analysée par la méthode des carrés Chi. Les statistiques de nombre de tu- meurs par souris et d'essais enzymatiques sont analysées par le test de Student. RESULTATS Le Tableau 1 montre les effets inducteurs de la limonine et de la nomiline sur l'activité de la GST dans le foie et la muqueuse de l'intestin grêle de souris ICR/Ha. Dans les deux tissus, l'in- ducteur enzymatique connu et l'anticarcinogêne, le BHA, ont été inclus comme témoin positif. La nomi- line, à une dose de 5 et 10 mg, induit une multi- plication de l'activité de la GST par 2,48 et 3,44 par rapport à celle du témoin respectivement dans le foie de souris. Aux mêmes doses, la limonine n'est pas active. Dans la muqueuse de l'intestin grêle, qui est un tissu plus sensible quant à la réponse aux inducteurs, l'activité de la GST est multipliée par 3,00 et 4,17 par 5 et 10 mg de no- miline respectivement par rapport au témoin. Dans ce tissu, la limonine présente une faible activité (1,33 et 1,36 fois celle du témoin) comme inducteur enzymatique. Le pouvoir inhibiteur de ces composés sur les tumeurs de la partie antérieure de l'estomac induites par le BP chez la souris ICR/Ha a été cor- rélé avec leur activité inductrice enzymatique. Le Tableau 2 montre les effets inhibiteurs de la limo- nine et de la nomiline sur la néoplasie, induite par le BP, de la partie antérieure de l'estomac de sou- ris. A une dose de 10 mg, 72 % des animaux ont des tumeurs en comparaison de 100 % des animaux dans le groupe témoin. L'inhibiteur connu, le BHA, a été in- clus dans cette expérience comme témoin positif. Dans ce groupe, on a constaté que 69 % des animaux ont des tumeurs dans la partie antérieure de l'es- tomac. L'inhibition aussi bien par 10 mg de nomiline que par 7,5 mg de BHA est significativement diffé- rente de celle du témoin. Le nombre de tumeurs par souris est aussi réduit de façon significative dans le groupe à 10 mg de nomiline. Le groupe à 5 mg de nomiline, bien qu'il présente une légère diminution du nombre d'animaux ayant des tumeurs, n'est pas statistiquement différent du témoin. Les mêmes ré- sultats sont obtenus avec les deux niveaux de dose de limonine. Les Tableaux 3 et 4 montrent comment cer- taines espèces de limonoldes induisent l'activité GST dans les tissus de muqueuse d'intestin grêle et de foie. DISCUSSION On a constaté qu'un nombre significatif d'inhibiteurs de la carcinogénèse chimique indui- saient une activité accrue de l'enzyme détoxifian- te GST. Les résultats donnés dans la présente étu- de confirment la corrélation avec les limonoides d'origine naturelle. Les activités d'induction en- zymatique et d'inhibition de la carcinogénèse de la nomiline ont été trouvées égales en importance à celles du BHA aux doses employées dans l'expérien- ce. Etant donné que le poids moléculaire de la nomi- line est trois fois plus élevé que celui du BHA, on estime que l'activité biologique du premier est supé- rieure à celle de l'antioxydant phénolique rapportée à une mole. Il est possible que l'administration pro- longée de ces limonoades dans l'alimentation ait une meilleure action inhibitrice vis-à-vis de la néopla- sie induite par le BP. La nomiline, qui est un inhibiteur plus ef- ficace de la carcinogénèse chimique que la limonine, est présente dans les jus d'agrumes à plus faible concentration que cette dernière. Le rapport limoni- ne/nomiline dans les jus d'agrumes dépend d'un cer- tain nombre de facteurs qui comprennent la variété du fruit, la saison de récolte, la durée après prépa- ration du jus et le fait que le jus ait été on n'ait pas été soumis à un traitement thermique. En général, la concentration de la limonine est 5 à 10 fois plus élevée que celle de la nomiline. L'amertume de la limonine peut être appréciée au goût lorsque sa con- centration dans le jus dépasse 6 ppm. La consommation totale de ces deux limonoïdes n'est donc pas très élevée. Cependant, des données préliminaires sur d'autres limonoldes de structure apparentée indi- quent une activité d'induction enzymatique analogue. On suppose que ces composés sont aussi des agents de chimioprévention efficaces. Ainsi l'effet cumulé des liminoides et de produits naturels du type li- monoldes peut être assez important. Le glucoside de limonolde est hydrolysé dans l'intestin par des virus pour produire les li- monoldes correspondants, qui sont absorbés dans l'intestin. Le glucoside de limonolde est soluble dans l'eau et n'est pas aussi amer. C'est la raison pour laquelle le glucoside est aussi utilisable se- *lon l'invention. TABLEAU 1 - EFFET DE LA LIMONINE, DE LA NOMILINE ET DE L'HYDROXYANISOLE BUTYLE SUR L'\CTIVITE DE LA GLUTATHIONE S-TRANSFERASE DANS LES TISSUS DE SOURIS ICR/Ha FEMELLES *Foie Muqueuse de l'intestin grle ( t b:' AtvS G S 'R apport Aciit: (: e1 (Dose Activité GST RaiRapport) (Composés: (mg) :{(pmol/min/mg protéine);Essai/Témoin(pmol/,nin/mg: Essai/ à( àp rotéine) : Témoin) ( Témoin-- 1,15O,19 -: O,33 0,4 -- 6d: BHAa 7e5 5t24tof6 4,55 108-003 3,25 Limoni7,5:0 1,24 O,2:,0 0:5o 9 1:36 + + f ( Limonine:5: 1,29, 0,35 1,0045-0,08; 1,33) -- -- - -- -- - -- -- --- -- - -- -- --- -- - -- - -- - - - ------ am1 0 e + dOO ( Nomiline:5: 2,86-0,60 2,48: 1,OOO-0,03: 3,00) (: 3 ,: 1;39O, 15d À 4,17)'I À a 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole (Sigma Chemical Co., Recristallisé dans un mélange hexanes- acétone). b La limonine et la nomiline sont administrées en suspension fine dans 0,3 ml d'huile de graines de coton. Le BHA est facilement soluble dans l'huile de graines de coton. On administre au témoin uniquement de l'huile de graines de coton. c L'activité GST est déterminée par la méthode de Habig et al. avec utilisation de CNDB comme substrat Mean + S.D. (n = 3). d P f P TABLEAU 2 - EFFETS DE LA LIMONINE ET DE LA NOMILINE SUR LA NEOPLASIE INDUITE PAR LE BP DE LA PARTIE ANTERIEURE DE L'ESTOMAC DE SOURIS ICR/Ha. b (: Dose Nombre:Nombre de souris % de souris:Nombre de tumeurs par (: (mg): de;porteuses de tumeurs porteuses de: souris) (Composés *.souris: tumeurs (.: - ----: -.............:...........- -..-.------_--__-------- -) ( ( Témoin 18 18 100 3,6-0,8 (3,6-0,8)) ( t::. . . . ----------------- ----- ------- M---------------------------------s ( BHA: 7,5 s 16: 11: 69: 1,7-0,4g(2,5±O,4)) à -. ----------------------------n------------ ---------- (: s ( Limonine 5 16 14: 88 3,1+0,8 (3,5+0,8)) * (. .. .....:...... ..: ..... ) ( Limonine: 10: 19 16: 84 2,5+0,6 (3,0+0,7)) (à3à -:à2,5-0,6 (3,0-0,74)) (--------:-------S--__-_--_--_-_--- -_-_----_-----_- ----s---w-w- --w---------) ( 3 5 3 + + ( Nomiline 5 18 15: 83 2,3,4 (2,7-0,4) (: :. . - - _ - _ _ ( Nomiline: 10: 19: 13 72 1,7o,4(2,3t,4)) 7:. .. 4)) (___: A; )0 a Le BP (1 mg/0,2 ml d'huile de mals) est admi- nistré par intubation p.o. deux fois par semaines, pendant 4 semaines. b Les inhibiteurs dans 0,3 ml d'huile de mals sous forme de solution homogène (BHA) ou de suspension fine sont administrés par intubation p.o. 3 fois par semaine, pen- dant 4 semaines. c Indique le nombre effectif de souris a la fin de l'expérience. d Toutes les tumeurs > 0,5 mm ont été prises en compte. e Les nombres entre parenthèses indiquent le nombre de tumeurs par souris porteuse de tumeurs. f P g P 0,05. TABLEAU 3 MUQUEUSE DE L'INTESTIN GRELE Dose:Activité GST Rapport: (Composés (mg):(Fmol/rnin/mg: Essai/ P) : protéine) Témoin) À10 0,80 0,10: 1,06) ---- --- ---- --- --- --- - - - - - - - - - - - - Obacunone 10 1,24i0,05 1,65: (Acide Isso-. (actrice:1 1,2 6tO,06: 1,67 001 (bacLunoLque 10,6 :iMOnol 10 0 0,89 0,10 1,18 > ->0,05) (Désoxylimo. -à- nirne 10 0,74*0,03 0,98 -: - - - - - -: Ichangine 10 1,10*0,20:1,45 (TEMOIN 0,5-,0 TABLEAU 4 FOIE (: Dose:GST Activité Rapport (Composes: (mg):(pmol/min/mg: Essai/ P (: protéine) Témoin) (.........:::) Nomiline 10 6,051,08 2,74 -----__------------. 6,O5 - -,. 2,74 0,005 1 Désactyl-' 10 >005 *10 3,12 0,62: 1,41 0,05) nomiline;:::) Obacunone.10 5,55 0,76 2,51 (Dsoxyl imo'... (Désoxy1imO. 10 2,31 0,21: 1,05 > 0,50 ) Ichangine: 10 4,04+0,69 1,83 0, 02) TEMOIN * -- 2,21O0,21 -- REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un limo- nolde d'agrumes et un excipient pharmaceutiquement acceptable. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le limonoide d'agrumes est la limonine ou la nomiline. 3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le limonoade d'agrumes est un glucoside de limonolde. 4. Utilisation d'un limonorde d'agrumes comme agent antitumoral.