FR 2642072 A1 19900727 FR 9000718 A 19900123 Domaine de l'invention On prévoit de nouvelles matrices à base de silice, qui constituent un adsorbant thiophile pour utili- sation dans un système HPLC, et dans tout autre système o leurs caractéristiques peuvent être utilisées pour la purification des protéines, etUparticulièrement des anti- corps monoclonaux. On décrit de plus un procédé pour la fabrica- tion de ces adsorbants thiophiles. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé pour lapurification d'immunoglobulines et d'an- ticorps monoclonaux.D'autres aspects de l'invention appa- raitront dans ce qui suit. Arrière-plan technologique de l'invention La purification de certains types de protéines, et particulièrement des immunoglobulines, soulève un grand nombre de problèmes, et plus spécialement lorsqu'on recherche un très haut degré de pureté. Ce problème de- vient particulièrement sérieux lorsqu'il s'agitd' anti- corps et particulièrement d'anticorps monoclonaux, à haut degré de pureté. Les anticorps monoclonaux (Mabs) pos- sèdent de nombreuses applications dans la biotechnologie. Celles-c omprennent la chromatographie d'affinité, l'ob- tention de médicaments, les diagnostics d'immunité, la carte des épitopes, etc. Dans ce but, il est néces- saire d'utiliser des préparations de Mabs purifiés. Il est difficile de purifier des Mabs de façon homogène, car la plupart des lignes d'hybridomes de souris pro- duisent des Mabs appartenant à la classe IgG1 qui est assez inefficace pour la fixation protéine-A-Sepharose. Les méthodes conventionnelles de purificationtelles que chromatographie d'échange d'ions, chromatographie sur hydroxyapatite, sont très lentes et les Mabs obtenus sont souvent contaminés par de l'albumine et de la trans- ferrine. Résumé de l'invention On prévoit de nouvelles matrices à base de silice qui sont des adsorbants thiophiles,pour emploi dans un système HPLC, et dans tout autre système o leurs caractéristiques peuvent être utilisées pour la purification des protéines, et particulièrement des anticorps monoclonaux. On prévoit, de plus, un procédé pour la fa- brication de ces adsorbants thiophiles. De plus, un autre aspect de l'invention con- cerne un procédé pour la purification d'immunoglobu- lines et d'anticorps monoclonaux. D'autres aspects de l'invention apparaîtront dans ce qui suit. La présente invention concerne un adsorbant thiophile pour emploi en chromatographie liquide de haute performance (HPLC), pour la purification en une seule étape d'immunoglobulines, de Mabs, etc. L'adsor- bant thiophile est adapté à la purification de la sous- classe des IgG de la souris ou du rat. Les Mabs sont pu- rifiés dans un temps relativement court (10 mn) et le procédé peut être facilement adapté à une échelle prépa- rative. Préparation de l'adsorbant chromatographique La préparation de l'adsorbant sous forme de perles de silice est réalisée en trois stades. Au cours de la première étape, la silice (LiChrosorb Si 60, LiChrosphere Si 300 ou Kieselgel 60) est silanisée en condition anhydre selon -le procédé de Larsson et al. (Larsson, P.O., Adv. Chromatogr. 21, 41-85 (1983)). La résine est ensuite lavée au toluène, à l'acétone et à l'éther diéthylique, et séchée sous vide. Le nombre de groupes époxydesqui ont été introduits dans la résine, est déterminé par dosage. Dans la deuxième étape, les groupes époxydes sont ouverts par du sulhydrate de so- dium dans une solution tampon tris 0,2 M, à pH 8,5 pendant I h à température ambiante. La résine est alors lavée à l'eau, au méthanol, à l'acétone et à l'é- ther. Le nombre moyen de groupes thiol est environ de 800 mwnol/g de silice sèche. Dans la troisième étape, la silice est agitée pendant 1 heure dans un grand excès de divinyl sulfone (1,5 ml/g silice) dans le tampon tris 0,2 M, à pH 8,5. La silice activée par la divinyl- sulfone est alors lavée sur un filtre à verre fritté, avec de l'eau, de l'acétone et de l'éther. La résine est séchée sous vide. Le nombre de doubles liaisons pré- sentes dans la silice activée à la divinylsulfone est dé- terminé par agitation de 100 mg de résine pendant 30 mi- nutes dans 5 ml de tampon-phosphate 0,05 M, pH 7,5 con- tenant 250 mg de dithiothréitol. Le nombre de groupes thiols présents dans la silice est déterminé. La con- centration en ligands présents sur la silice est mesurée à environ 800 gmoles de ligands par gramme de silice sèche. Dans l'étape finale de préparation de la silice, la silice activée à la divinylsulfone est traitée pendant minutes par un large excès de mercapto-2-éthanol dans le même tampon tris que celui indiqué plus haut. La résine est alors lavée à l'eau, à l'acétone, à l'éther, séchée et stockée sous vide. -25 L'invention concerne également les homologues efficaces de cette résine. Préparation et propriétés des adsorbant thiophiles On définit deuxmatrices différentes à base de silice comme adsorbants thiophiles pour emploi dans un système HPLC. La silice est ainsi modifiée pour contenir soit deux atomes de soufre (repérée dans le texte par silice 2S) soit trois atomes de soufre (repérée dans le texte par silice 3S). L'adsorbant silice 2S est préparé par couplage de Mercapto-2-éthanol sur unesilice conte- nant des groupes hydroxy primaires activés par la divinyl- sulfone. La structure générale de la silice 2S est la suivante: -O-Si (CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-SO2-(CH2)-S-(CH2)2-OH Cependant, lorsqu'on utilise la silice 2S dans un système HPLC, l'immunoglobuline qui est éluée est con- taminée par de l'albumine comme on peut en juger par élec- trophorèse sur gel de polyacrylamide SDS. Afin d'amé- liorer les propriétés adsorbantes de l'adsorbant thio- phile, on a préparé une résine à base de silice con- tenant trois atomes de soufre (silice 3S) (Schéma 1). Donc,une silice silanisée contenant des groupements époxydes est traitée avec un excès (10 fois) de NaSH pour introduire quantitativement des groupements thiol. La silice contenant des groupements thiol est ensuite modifiée par substitution par la divinylsulfone. Le système est optimisé en suivant la disparition des groupements SH libres et l'apparition des doubles liai- sons. La figure 1 montre l'optimisation du sys- tème. Le nombre de doubles liaisons introduites sur la silice contenant des groupements thiols est maximum lorsqu'on utilise 1,5 ml de divinylsulfone par gramme de silice. Cette quantité correspond bien au nombre maximum de groupements thiols ou de groupements époxydes origi- nels disponibles pour la substitution (environ 800 pmoles/ g de silice sèche). Dans l'étape finale de modification, on introduit le mercapto-2éthanol juqsu'à ce que les doubles liaisons ne puissent plus être détectées. L'adsorbant thiophile rend presque inutile l'em- ploi d'autres moyens pour la purification des anticorps. Nous avons utilisé de la silice contenant des groupements hydroxyles primaires et nous l'avons convertie, par des réactions analogues à celles utilisées pour le Sepharose, en structure thiophile, désignée par silice 2S. Il appa- rait que cet adsorbant ne fixe qu'une partie seulement des anticorps traités,et que la fraction éluée contient d'autres protéines (par exempte albumine de sérum) qui sont fixées de façon non spécifique. Afin d'accroître l'efficacité de l'adsorbant, et connaissant l'importance des groupes soufrés, nous avons introduit une liaison thioéther supplémentaire sur le support silice, équidis- tante du groupement sulfone, mais sur le côté opposé. Dans ce but, nous avons mis au point une méthode sim- ple d'ouverture des cycles époxydes en utilisant NaSH. Cette réaction permet l'introduction d'un groupement thiol sur la silice sans augmenter l'écartement sur les perles de silice, comme ce serait le cas en utilisant des réactifs tels que bis-mercaptoéthane ou DTT (de tels écartemehts peuvent augmenter l'adsorption non spécifi- que). La réaction de NaSH avec le groupement époxy sur la silice se trouve être quantitative et on introduit ainsi sur le support une quantité élevée de groupements thiol. On peut alors introduire dans des conditions de réaction douce, une quantité élevée'de.divinylsulfone afin de convertir le silice-thiol en adsorbant thiophile (réaction de la divinylsulfone avec les groupements hy- droxyles à pH et température élevée). La silice 3S ainsi préparée pour cette méthode (schéma 1) se trouve être un excellent adsorbant pour la plupart des immunoglobuli- nes disponibles. La raison d'une telle spécificité éle- vée du support thiophile, pour les anticorps, et l'iden- tité des résidus sur l'anticorps responsables de cette interaction inhabituelle restent encore à être déter- minées. Par l'emploi d'un système simple d'adsorption et d'élution, ce support peut servir d'adsorbant uni- versel pour les immunoglobulines, qui montre une spéci- ficité plus large que celle trouvée pour les formes immo- bilisées des protéines A et G. Cette étude décrit la purification des immu- noglobulines dans un système HPLC à petite échelle (quantités de l'ordre du mg). Comme les réactions sont relativement simples et les produits peu coûteux, ce procédé peut être facilement adapté à une purification à grande échelle d'anticorps utilisant une chromatogra- phie préparative. Détermination des protéines et Electrophorèse sur Gel. La pureté des protéines séparées par HPLC est déterminée par électrophorèse sur gel SDS en utili- sant un gel à 10%. Des échantillons (10 gg) de fractions chromatographiques sont appliquées sous conditions ré- ductrices et l'électrophorèse est réalisée au cours d'une nuit à température ambiante. Les protéines sont visualisées par coloration au moyen de bleu brillant Coomassis. Procédé chromatoçgraphique HPLC On utilise pour la chromatographie HPLC un système chromatographique HPLC de Waters Associates (Milford, MA, USA, Modèle 6000A) et un détecteur UV constant (Modèle 441) opérant à 280 nm, et un injecteur (modèle U6K). La bouillie de silice activée dans du phosphate de sodium 0,05M, à pH 7,4, est chargée dans une colcnne d'acier inoxydable sous une pression de 105 bars. On injecte des échantillons (100 à 250 ml), fluides d'ascites, liqueur surnageante de cultures de clones secrétant des anticorps ou sérums de différentes origines (homme, souris,-rat ou cheval), dans une phase mobile contenant 0,5M de Na2SO4, 0,05M de (NH4)2SO4 3C ajustée à pH 8,0 (tampon d'adsorption). La colonne est lavée par la liqueur tampon d'adsorption jusqu'à élu- tion des produits non-adsorbés. Les immunoglobulines sont éluées par un tampon citrique 0,1M, pH 3,0. Toutes les expériences sont réalisées à la température ambiante. On détermine ensuite la concentration en protéines de chaque fraction. On contrôle pour chaque fraction son activité anticorps en utilisant l'immunofluorescence à résolution temporelle et sa pureté par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS. Détermination de la capacité La capacité de la silice thiophile est déter- minée par injectiorsmultiples. On répète des injec- tions (250 1l de fluide d'ascites), jusqu'à ce que la densité optique de l'effluent dépasse celle de l'applica- tion initiale. Le contenu en anticorps se trouve alors dans le pic d'élution mesuré par densité optique. L'adsorbant de silice 3S fixe les immunoglobu- lines provenant d'ascites d'homme, de cheval, de rat, de lapin aussi bien que de souris, contenant les sous- classes IgG1, IgG2a ou!gG2b (Tableau 1). La seule sous- classe médiocrement adsorbée est l'IgM de la souris. Il semble que la structure de l'immunoglobuline soit néces- saire pour une adsorption spécifique ou sélective sur l'adsorbant thiophile. Les conditions optimales pour la purification d'anticorps monoclonaux au, hCG sont les suivantes: On utilise des anticorps monoclonaux contre le hCG afin d'optimiser les conditions de purification d'anticorps monoclonaux provenant de fluide ascitique de souris dans différentes conditions de pH et de concentra- tions de sels. Le Tableau 2 montre l'activité anticorps de plusieurs anticorps monoclonaux avec une concentra- tion peu élevée en sel dans la phase mobile (50 mM NaH2PO4, pH 8,0). Le gel SDS (fig.2) des fractions cor- respondantes indique que la fraction éluée est contami- née par de l'albumine. Lorsque le pH est diminué à 7,0, la récupération de l'anticorps à partir des pertes de silice modifiée est très médiocre. La plus grande partie de l'activité anti- corps se trouve dans le pic effluent (Tableau 2). Le gel SDS montre également une adsorption non spécifique d'autres protéines en plus des immunoglobulines. Par ailleurs, si le pH est maintenu à 8,0 et si la concentra- tion en sel est élevée à plus de 500 mM dans la phase mobile, l'anticorps est complètement adsorbé et peut être élué par le tampon citrique (pH 3,0) sans perte significative d'activité (Tableau 2). En conséquence, nous avons choisi les condi- tions suivantes pour nos études ultérieures. On utilise une moyenne de 100 à 250 I1 de flui- de ascitique de souris, clair et non dilué. La colonne est équilibrée avec le tampon d'adsorption pendant deux minutes. Les échantillons sont injectés, et on procède à un lavage jusqu'à ce qu'aucune protéine ne soit détectée (généralement 5 minutes). Les immunoglobulines sont ensuite éluées par le tampon citrique (pH 3,0). La figure 3 montre le diagramme SDS sur gel de polyacrylamide d'un groupe de Mabs (voir aussi le Tableau 1). Le gel montre des chaînes de bandes lourdes et légères dans les frac- tions éluées. Les fractions purifiées possèdent des ban- des dominantes claires, et les impuretés sont en faibles quantités. Le gel montre également qu'il est possible, dans ces conditions, de purifier une variété de Mabs dérivés du rat ou de la souris et de différentes sous- classes. La colonne peut être utilisée pour isoler des anticorps directement à partir de sérums ou de fluides ascitiques, et pour améliorer la qualité d'anticorps préalablement purifiés par d'autres méthodes, par exemple la protéine-A-Sépharose. L'activité d'une fraction IgG purifiée d'un anticorps polyclonal du lapin anti-hCG, qui possède une faible activité constatée par fluo- rescence à résolution temporelle, est améliorée par pas- sage sur la colonne de silice (fig.4). L'anticorps mono- clonal du rat anti-LH (clone 1F10), qui est difficile à 264207? purifier par les méthodes conventionnelles, est facile- ment purifié en utilisant notre système HPLC, ainsi que démontré dans ce cas par les mesures d'activité Idia- gramme de gel SDS non présenté). Un anticorps testostéro- ne-3-BSA (IgM) peut également être partiellement puri- fié (Tableau 2), bien qu'une activité partielle ap- paraisse dans la fraction effluente. Capacité et Stabilité Après mise en oeuvre des conditions optimales pour l'adsorption et l'élution des anticorps, la capa- cité de la colonne a été contrôlée. On a trouvé qu'il fallait utiliser des injections multiples de fluide ascitique non inférieures à 20 mg/g. On a utilisé la LiChrosphère Si 300 possédant une dimension de pores de 3000nm et une dimension de particules de 10 im. Les perles de silice 3S sont très stables. Après 300 essais, en uti- lisant différentes sortes d' échantillons, nous n'avons observé aucun changement de capacité ni de sélectivité. Les perles de silice peuvent être nettoyées des protéi- -20 nes adsorbées, par hydrolyse de ces dernières au moyen d'un acide fort (HCl 0,5 M pendant 60 mn) et peuvent être réutilisées sans aucun changement de protocole expéri- mental. Légendes des figures Fig.1 - Détermination des doubles liaisons sur la silice modifiée par la divinyl sulfone. La silice con- tenant des groupements thiol est traitée par des quantités croissantes de divinyl sulfone, et la quantité de doubles liaisons fixées est con- trôlée comme décrit dans "Produits et Méthodes". Fig.2 - Caractérisation de la pureté d'un anticorps après passage sur silice 3S à pH 7,0 et à basse concen- tration en sel. Des échantillons de protéine de gg sont soumis à l'électrophorèse SDS (10% Gel, échantillons ébouillantés, conditions réduc- trices). Chenal 1:Marqueurs de poids moléculaire Chenal 2:Fluide ascitique d' anti ehCG ( B5) Chenal 3:Effluent de #B5 Chenal 4: Eluant de # B5 Chenal 5:Effluent d'anti LH ( k F10) Chenal 6: Eluant de # 1F10 Les flèches indiquent les chaînes lourdes et légères. Fig.3 - Caractérisation dela pureté d'un anticorps après passage sur la silice 3S à pH 8,0 et concentra- tion élevée en sel. Des échantillons de protéines de 20 lg sont soumis à l'électrophorèse SDS (10% de Gel, échantillons 1- ébouillantés, conditions réductrices) Chenal 1: Marqueurs de poids moléculaire Chenal 2: Fluide d'ascites d'anti hCG ( # Ell) Chenal 3:Effluent de # El Chenal 4: Eluant de A E11 Chenal 5: Effluent de # 6E2 Chenal 6: Eluant de e 6E2 Chenal 7: EfflUent de i B4 Chenal 8: Eluant de # B4 Fig.4 - Activité anticorps d'une protéine A-anti hCG purifié du lapin IgG après purification HPLC sur silice 3S. --O- Activité anticorps après purification de la protéine A. -X---XActivité anticorps après purification HPLC X-X Activité anticorps dans l'effluent silice 3S. L'anticorps a été déterminée par fluorescence de résolution temporelle. TABLEAU 1 - Caractérisation des anticorps monoclonaux* (Mab) utilisés dans cette étude. Nom du Type d'hybrodomes Clone Classe de Mab * chaîne lourde hCG sourissouris Ell IgG2b (.hCG souris-souris 1D5 IgG14 F;hCG souris-souris 1C7 IgG1 rhCG souris-souris 6E2 IgG hCG souris-souris 6E2 I g1 r.hCG ratsouris B5 IgG1 LE souris-souris 4F10 IgG1 LH rat-rat 1F10 IgG1 Testo- sterone- 3-BSA souris-souris 17F6 IgM * Ces anticorps ont été préparés etcaractérisés dans le Département des recherches hormonales, The Weissmann Institute of Science. TABLEAU 2 - Efficacité de la purification d'anticorps sur des résines de silice contenant du soufre, dans différentes conditions d'adsorption. Nom de Conditions d'adsorption Activité- Activité l'anti- de l'anti- de l'anti- corps corps corps dans et dans l'éluant* clone t l'effluent* (%) (%) Classe IgG2b hCG (E1) Silice 2S-salinité élevéepH7,6 47,0 53,0 Silice 3Ssalinité élevée,pH7.Q 58,1 41,9 Silice 3S-faible salinité.pH8,0 8,5 91,5 Silice 3S-salinité élevée.oH8.0 1,2 98,8 Classe -gG1 LR(P10)- Silice 3Ssalinité élevée.pHS,0 2.7 97,3 !%hCG(#1lC) Silice 3S-faible salinité,pH,. 0 10,5 89,5 "Si!ice 3S-salinité élevée,pH7,0 44,5 55,5 rhCG(#1D5) Silice 3S-faible salinité.,pH8S.0 14,7 85,3 Classe IgM Testo- sterone (#17F4) Silice 3S-salinité élevée-pH8,0 31,5 68,5 * L'activité des anticorps a été mesurée par immunofluo- métrie à résolution temporelle. Fig.1 Détermination de la divinylsulfone (en ordonnées) Doubles liaisons (pmoles/g de résine) (en abcisses) Divinyl sulfone (ml/g de résine) REVENDICATIONS 1. Une substance thiophile de formule OH O i, + Si-O-Si-(CH2)3-0-CH2-CH-CH2-S-CH2-CH2-S-CH2-CH2-S-CH2-CH2-OH 0 et ses homologues. 2. Procédé pour la production d'une substance thiophile conforme à la revendication 1, comprenant la silanisation d'une silice dans des conditions anhydres, son séchage sous vide, le clivage des groupements épo- xydes par un excès de sulfhydrate de sodium, la réaction du produit obtenu avec le divinyl sulfone et son traite- ment par le mercapto-2-éthanol en excès. 3. Procédé conforme à la revendication 2, dans lequel on utilise un excès d'environ 10 fois le sulfhydrate de sodium nécessaire. 4. Procédé conforme aux revendications 2 ou 3, dans lequel on utilise un grand excès de divinylsulfone, et o la réaction est effectuée dansune solution tam- pon tris. 5. Colonne de chromatographie HPLC pour fonc- tionnement à grande échelle-préparative, comprenant un produit actif tel que défini dans la revendication 1. 6. Procédé pour la purification des protéines et particulièrement des immunoglobulines et des anticorps monoclonaux, comprenant le passage de la substance sous forme de solution, à travers une colonne contenant une substance thiophile définie dans la revendication l,et la séparation du produit recherché.