FR 2636643 A1 19900323 FR 8811188 A 19880824 Peptide-signal, séquences d'ADN codant pour celui-ci, vecteurs d'expression portant L'une de ces séquences et procédé de produc- tion périplasmique d'un polypeptide. La présente invention concerne un peptide-signal. Elle concerne également les séquences d'ADN codant pour ce peptide- signal et les vecteurs d'expression portant l'une de ces séquences. Elle concerne encore un procédé de production périplasmique d'un polypeptide par une souche de bactéries gram négatives transformée par l'un de ces vecteurs. Il est connu que les bactéries gram négatives produisent naturellement des polypeptides, synthétisés sous la forme d'un précurseur dans le cytoplasme et exportés vers le périplasme, espace compris entre la membrane cytoplasmique et la paroi bacté- rienne, o ils s'accumulent sous la forme d'un polypeptide mature, c'est-à-dire d'un polypeptide capable d'assurer son action biolo- gique spécifique. Parmi ces polypeptides figurent notamment des enzymes, telles que par exemple la phosphatase alcaline. Il est connu également que l'on peut utiliser des bactéries gram négatives pour leur faire produire dans leur péri- plasme un polypeptide qui leur est étranger. Une telle production périplasmique revêt un intérêt certain car la séparation dudit polypeptide des autres constituants du périplasme est plus facile que la séparation de celui-ci des autres composants du cytoplasme, telle qu'elle est requise dans le cas d'une production avec accumu- lation cytoplasmique. Elle est également intéressante car le poly- peptide s'accumule sous sa forme mature sans qu'il y ait addition d'une méthionine N-terminale qu'il faudrait ensuite éliminer et sans qu'il y ait adoption d'une conformation secondaire défavo- rable. On sait que, pour que sa production soit périplasmique, un polypeptide doit être synthétisé sous la forme d'un précurseur correspondant au polypeptide mature allongé à son extrémité N-terminale d'un peptide constitué généralement de 15 à 30 acides aminés appelé peptide-signal. Ce peptide-signal, qui joue un rôle déterminant dans la sécrétion du polypeptide, est clivé au cours du processus libérant ainsi le polypeptide mature dans le périplasme. S'agissant d'adapter des bactéries à la production péri- plasmique d'un polypeptide qui lui était étranger et notamment d'origine eucaryote, les premiers travaux ont consisté à trans- former les bactéries à l'aide d'un vecteur d'expression portant une séquence d'ADN codant pour un précurseur naturel dudit polypeptide. Cette stratégie s'est à plusieurs reprises avérée peu adaptée en terme de quantité à une production industrielle. Une tentative pour apporter une solution satisfaisante a consisté à remplacer le peptide-signal naturel du polypeptide par celui d'un polypeptide bactérien synthétisé sous la forme d'un précurseur. La demande de brevet EP-A-0177343 présente des exemples de mise en oeuvre de tels peptides-signaux. La demanderesse, constatant que le choix d'un peptide- signal bactérien pouvait déterminer pour le précurseur d'un poly- peptide hétérologue, (notamment d'origine eucaryote) au fur et à - mesure de sa synthèse dans la bactérie, la prise par celui-ci d'une conformation secondaire inappropriée, a conçu un nouveau peptide- signal qui répond à la formule: M A P S G K S T L L L L F L L L C L P S W N A G A o A, C, F, G, K, L, M, N, P, S, T et W désignent des acides aminés selon le code suivant: A = Alanine M = Méthionine C = Cystéine N = Asparagine F = Phénylalanine P = Proline G = Glycine S = Sérine K = Lysine T = Thréonine L = Leucine W = Tryptophane L'invention concerne, selon un autre aspect, les séquences d'ADN codant pour le peptide-signal selon l'invention. Toutes les séquences que permet la dégénérescence du code génétique peuvent être utilisées. Une séquence préférée est la séquence: ' ATG-GCT-CCA-TCT-GGC-AAA-TCC-ACG-CTG CTT-CTC-TTA-TTT-CTG-CTC-CTG-TGC-CTG CCC-TCT-TGG-AAC-GCC-GGC-GCT 3' L'invention concerne encore les vecteurs d'expression portant une séquence d'ADN codant-pour un précurseur d'un poly- peptide caractérisé en ce que la portion de cette séquence codant pour le peptide-signal est une séquence selon l'invention. Le peptide-signal selon l'invention et les séquences d'ADN codant pour lui trouvent leur application dans la production périplasmique de polypeptides par les bactéries répondant de manière négative au test de coloration de Gram (ces bactéries sont dites gram négatives). Les souches de l'espèce Escherichia coli conviennent particulièrement; parmi celles- ci, les souches portant une ou plusieurs mutations affectant le gène cya et/ou le gène crp peuvent être utilisées sans inconvénient. L'invention concerne aussi selon un autre aspect un procédé de production périplasmique d'un polypeptide consistant à transformer une souche de bactéries gram négatives par un vecteur d'expression portant une séquence d'ADN codant pour un précurseur dudit polypeptide et à cultiver les bactéries de manière que, ladite séquence étant transcrite puis traduite, le polypeptide sous sa forme mature s'accumule dans le périplasme, caractérisé en ce que ledit vecteur porte une séquence d'ADN codant pour le peptide- signal selon l'invention. Le procédé selon l'invention permet une production aussi bien selon un mode inductible, lorsque l'expression de la séquence d'ADN codant pour le précurseur est placée sous le contrôle d'un promoteur inductible que selon un mode constitutif, o la produc- tion du polypeptide est continue dès la mise en culture de la souche transformée. Le procédé selon l'invention convient à la production de toutes sortes de polypeptides hétérologues par rapport à la souche mise en oeuvre. Il est ainsi adapté à la production de polypeptides d'origine eucaryote. Il peut s'agir de protéines à proprement parler, telles que notamment l'hormone de croissance humaine (hGH) ou de peptides de plus petite taille, tels que notamment une forme naturelle ou un variant de l'hirudine. La présente invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de deux exemples, dans lesquels il sera fait réfé- rence aux trois figures annexées. La figure I représente une carte de restriction du pl:rmide p163,1. Les différents segments de restriction sont marques de manière arbitraire selon la légende ci-dessous: j..... _ = Localisation de l'origine de réplication (ORI) = Segment d'ADN issu du plasmide pBR322 = Segment d'ADN contenant la séquence codant pour un précurseur naturel de l'hGH .} = Segment d'ADN du phage fd contenant un termi- nateur de transcription //777// /// = Segment d'ADN contenant un promoteur-opérateur hybride tryptophane-lactose UV5 = Segment d'ADN codant pour la p-lactamase (ApR: résistance à l'ampicilline) La figure 2 représente la carte de restriction d'un plasmide dont les fragments PvuIXhoI-BamHI(1) et PvuI-ORI-bamHI(2) proviennent respectivement des plamides p163,1 et pBR327 et dont le petit fragment BamHI(2)-BamHI(1) est le fragment 3 décrit dans L'exemple 1 ci-après. La figure 3 représente une carte de restriction commune aux plasmides p380,1 et p373,2. Les différents segments de restric- tion sont marqués de manière arbitraire selon la Légende ci-dessous: _+_+ __+_+_ = Séquence PvuI-BamHI issue du plasmide pBR327 = Séquence PvtlXhoI issue du plasmide p163,1 = Séquence XhoI-HincII issue du plasmide p163,1 ClaI NdeI PstI (HinI l l Fragment 4 décrit dans l'exemple 1 ciaprès XXXXXXXXXXX = Fragment 3 décrit dans l'exemple 1 ci-après 25... = Segment d'ADN du phage fd contenant un termi- nateur de transcription EXEMPLE 1 Production périplasmique d'hormone de croissance humaine Une souche de l'espèce Escherichia coli directement appa- rentée à la souche, décrite dans la demande de brevet EP-A-0245138 et déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Paris, France) le 17 Février 1986 sous la référence 1-529, est mise en oeuvre. Cette souche porte une mutation cya par délétion et une mutation crp par détéltion. Un plasmide portant une séquence d'ADN codant pour un précurseur de l'hGH dont le peptide-signal est celui de l'invention a été préparé. Ce plasmide a été dénommé p398. 1. Construction du plasmide p398 La stratégie mise en oeuvre a fait appel à des fragments obtenus à partir de plasmides préexistants accessibles au public et à des fragments préparés par voie de synthèse selon les techniques ma tenant couramment utilisées. On a soumis le plasmide p163,1 (figure 1), décrit dans la demande de brevet EP-A-0245138 et déposée à la CNCM sous la réfé- rence 1-530 le 17 Février 1986, à une digestion par les enzymes PvuI et BamHI. Ce plasmide contient le gène codant pour l'hGH. Le fragment PvuIBamHI - ci-après fragment 1 - contenant le site d'action de l'enzyme de restriction XhoI, représenté sur la figure 1, a été purifié. De même, on a soumis le plasmide pBR327, bien connu de l'homme de l'art, (cf. SOBERON, X et al., Gene, 9 (1980) 287-305) à une digestion par les enzymes PvuI et BamHI. Le fragment PvuI-BamHI - ci-après fragment 2 -, contenant l'origine de réplication, a été purifié. Puis on a préparé le fragment 3, qui est un fragment synthéticque BamHI(1)-BamHI(2) contenant le gène lac i et son promo- teur dont la séquence est la suivante sur laquelle les deux extré- mités du brin son repérées.par les nombes 1 et 2 pour préciser l'orientation du fragment dans les plasmides décrits aux figures 2 et 3. ' 9 1i9199iv9 711 379391 11199YVY93 93V1 V3391 V 139739 93D1131315 911W9137 3VO3 lIV9 31119913V 119DW1 1 91 93399913 IDYVYD993 V3 9V9JW1 91D1993 i 9v9D93V9Y9 9119913D99 179919W 9V 311119 3393911111 DV3IID93D 931 339931 39 11W19 iW999119 9 39VY9191 191191VD97 339111BI 9019 31 DVDOWD99 199V9913V9 DgB9 991 9399193V93 9111 931 9 B9393WII 1V9 9939191 31VBIIgV33 3 3991DBgV 33 33 VY93 IVD3VI3119 311399393V 93ú1399 3V 1113939939 V391911V9 V9V9393911 9393V913V3 039VDl 91V VII9VIV993 9VD3lV3199 133úVD991V, V3993V3119 39 399V391 9VlIV3W99 3393WW1VV 9WOIVYBVV 9V319913i9 19991V9119 13VIWIV 339991V31 15193V193 9319V53393 V391391VgV 9339391W 13 33V9199139 111 93939 3VV1393339 991V l13W 9 319V9339 393 9V3933 93V39V339V 3391V11919 V9V919 939 11V9111 V9 139931V139 3311933311 319319 331 M3991V3V9 933VW91ú 9111991139 9111V39 3l1 V133391v9 3WB9919V3 931V39V33V VO9911931V 9i31V33939 V33393911V 3939.3991W 199313V993 339V39393 VD3DV9331V IV9V933 V1 V3331 1931 931 199311 319139V91V 3W1 1 999 3993VV1199 1991V91119 1331VW93' 33V33V3333 9111991393 VD319939W 39V39119 9 V9V9133399 133533 311 333911V913 9VDVV39993 V9V919V33V 3111131111 1991999V33 9399911V19 3911199399 V9 9999393 93W339931 W91WIIV3 9139V33919 319133VW9 99319 3311 139333913V 3139391193 911WlI VY 113YVV39V9 19 91W133 9199991339 WV919 VV IV39VV9939 D33V9 (T)IHweg ú lN3B9VU3 ú999ú9Z Les fragments 1, 2 et 3 ont été alors Ligués de manière à obtenir le plasmide intermédiaire décrit à la figure 2. Ce plasmide a été soumis a une digestion partielle par les enzymes de restriction HincII et PstI. Le grand fragment HincII-PstI, contenant l'origine de réplication et représenté sur la figure 2, a été ensuite ligué au fragment 4, représenté ci-apres, qui est un fragment synthétique d'ADN portant une séquence codant pour les 44 premiers acides aminés d'un précurseur naturel de l'hGH et en amont de cette séquence des signaux de régulation. FRAGMENT 4 ClaI ' TCGAGCTGACTGACCTGTTGCTTATATTACAkCGA _____-_________________________-_-_ AGCTCGACTGACTGGACAACGAATATAATGTAGT À NdeI TAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGATAACAATTTCACACAGXXXXXXXXXAAGAAGGAGATATACA, -- -----------------------------..---------------------------------------. ATCGATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCXXXXXXXXXTTCTTCCTCTATATGTA ATG GCT ACC GGA TCC CGG ACT AGT CTG CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG TC CGA TGG CCT AGG GCC TGA TCA GAC GAG GAC CGA AAA CCG GAC GAC ACG GAC A T G S R T S L L L A F G L L C L -26 A aI CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT GCC TTC CCA ACC ATT CCC T TA tT AGA CTT TTT GGG ACC GAA GTT CTC CCG TCA CGG AAG GGT TGG TAA GGG AAT AGA TCT GAA AAA P W L Q E G S A F * P T I P L S R L F -1 1 GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CTG TTG CGA TAC GAG GCG CGG GTA GCA GAC GTG GTC GAC CGG AAA CTG TGG ATC D N A M L R A H R L H Q ' L A F L T Y PstI CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CA --..................------------------------' '' ' ' '-- '------------ GTC CTC AAA CTT CTT CGG ATA TAG GGT TTC CTT GTC TTC ATA AGT AAG G 5' Q E F E E A Y I P K E Q K Y S F Dans ce fragment, les acides aminés sont désignés par des lettres selon le code suivant: A = Alanine M = Méthionine C = Cystéine N = Asparagine D = Acide aspartique P = Proline E = Acide glutamique Q = Glutamine F = Phénylalanine R = Arginine G = Glycine S = Sérine H = Histidine T = Thréonine I = Isoleucine V = Valine K = Lysine W = Tryptophane L = Leucine Y = Tyrosine Sont successivement soulignées dans ce fragment les séquences -35 (TTGCTT) et -10 (TATAAT) de la séquence promotrice, et la séquence de shine et Dalgarno bien connue de l'homme de l'art. Les X positionnés en amont de cette sequence représentent la suite particulière ci-après de 9 nucleotides: ' TTTAACTTT AAATTGAAA 5' Le plasmide p380,1 a été ainsi obtenu. Le plasmide p380,1 (figure 3) a été ensuite soumis à une digestion par les enzymes de restriction ClaI et NdeI de manière à en éliminer le petit fragment ClaI - NdeI du fragment 4 ci-dessus et à lui substituer le fragment ClaI - NdeI ci-après: ClaI ' CGATAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA TATCGCATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGT NdeI ATTTCACACAGTTTTTCGCGAAGAAGGAGATATACA TAAAGTGTGTCAAAAAGCGCTTCTTCCTCTATATGTAT 5' Le plasmide résultant est le plasmide p373,2 (figure 3). Enfin, le plasmide p373,2 a été soumis à une digestion par les enzymes de restriction NdeI et XbaI de manière à en éli- miner le fragment NdeI - XbaI du fragment 4 ci-dessus et à lui substituer le fragment NdeI - XbaI synthétique représenté ci-après. NdeI ' TTG GCT CCA TCT GGC AAA TCC ACG CTG AC CGA GGT AGA CCG TTT AGG TGC GAC CTT CTC TTA TTT CTG CTC CTG TGC CTG GAA GAG AAT AAA GAC GAG GAC ACG GAC CCC TCT TGG AAC GCC GGC GCT-TTC CCA GGG AGA ACC TTG CGG CCG CGA AAG GGT XbaI ACC ATT CCC TTA T TGG TAA GGG AAT AGATC 5' Le plasmide p398 ainsi obtenu comporte la séquence d'ADN préféree codant pour le peptide-signal de l'invention. Cette séquence est délimitée ci-dessus par deux flèches. 2. Méthodologie générale Les essais réalisés ont porté sur 6 clones du plasmide p398 (Clones 2, 3, 5, 6, 7 et 8), les résultats étant appréciés par rapport au plasmide p373,2 qui contient une séquence d'ADN codant pour le peptide-signal de l'hGH. Ils ont consisté à cultiver les couples hôte-vecteur concernés, préalablement préparés (cf. 2.1), dans des conditions telles cu'une biomasse suffisante soit obtenue (cf. 2.2), et que les cellules soumises à une induction produisent l'hGH (cf. 2.3), à recueillir par choc osmotique les protéines contenues dans l'espace périplasmique (cf. 2.4), à soumettre les bactéries à une lyse totale de manière à disposer d'un extrait protéique total (cf. 2.5), à doser l'hGH périplas- mique recueillie en 2.4 (cf. 2.6) et à analyser par la technique dite du Western Blot les surnageants obtenus en 2.4 et en 2.5 (cf. 2.7). 2.1 Préparation des couples hôte-vecteur Les couples hôte-vecteur ont été préparés selon les techniques de transformation bactérienne connues de l'homme de l'art et qui sont décrites notamment dans les ouvrages ci-après. - Molecular cloning - A Laboratory Manual - T. Maniatis E.F., Fritsch and J. Sambrook - Cold Spring Harbor Labo- ratory - 1982. - Experiments in Molecular Genetics - J.H. MILLER - Cold Spring Harbor Laboratory - 1972. 2.2 Culture a) Ensemencement Une colonie isolée obtenue sur milieu solide, (milieu LB + agar-agar) a été mise en suspension dans 5 ml d'un milieu (milieu LB). Le milieu LB utilisé a les caractéristiques ci-après: - ses composants introduits avant autoclavage sont: de la Bactotryptone 10 g de l'extrait de levure 5 g du chlorure de sodium 5 g 20. de l'eau distillée qsp 1 l - son pH est ajusté à 7,3 avant autoclavage - de l'ampicilline est ajoutée après autoclavage à raison de 100 pg/ml b) Incubation La suspension préparée en a) a été placée à 37 C pendant 18 h de façon que la culture arrive en phase de croissance station- naire. La suspension dense obtenue a été diluée en milieu LB de manière à obtenir une valeur de densité optique lue à 600 nm - DO à 600 nm - proche de 0,03 puis 25 ml de cette suspension bactérienne ont été mis en incubation à 37 C sous agitation jusqu'à obtention d'une DO à 600 nm voisine de 0,3. 2.3 Induction A la suspension bactérienne obtenue selon 2.2.b, on a ajouté de l'isopropyl-P-D-thiogalactose (ou IPTG) en quantité telle que sa concentration finale soit égale à 1 mM; l'IPTG a été ici utilisé pour provoquer le déclenchement et le maintien de la synthèse du précurseur de l'hGH en neutralisant l'action du répresseur venant normalement se fixer sur l'opérateur-Lactose. La suspension additionnée d'IPTG a été maintenue sous agitation à 37 0C pendant 2 h 30. 2.4 Choc osmotique On s'est référé au protocole décrit par N.G. NOSSAL et L.A. HEPPEL dans "The Journal of Biological Chemistry 241 (1966) 3055-3063". a) Lavage au Tris et à l'EDTA Un échantillon de la suspension, telle qu'obtenue en 2.3. après induction, a été prélevé et centrifugé 5 minutes à 6 000 g. Le culot a été repris dans un volume de tampon à pH 7 (solution A) (cf. ci-dessus) de façon que La suspension obtenue présente une DO à 600 nm voisine de 10. Le tampon utilisé a été préparé par addition dans de l'eau distillée de: tri(hydroxyméthyl)aminométhane-HCl ou Tris-HCl ajouté de façon à avoir une concentration finale de 30 mM. acide éthylènediaminetétraacétique ou EDTA ajouté de façon à avoir une concentration finale de 1 mM. b) Action du saccharose La suspension obtenue en 2.4.a. a été centrifugée minutes à 6 000 g. Le culot a été repris délicatement à volume constant dans une solution B préparée extemporanément et correspondant à la solution A à laquelle est ajouté du saccharose à raison de 15 g pour 100 ml. La suspension a été laissée 10 minutes à 200C. Puis elle a été centrifugée 5 minutes à 6 000 g. Les tubes de centrifugation ont été placés dans de la glace fondante. On a éliminé avec soin le surnageant et on lui -a substitué (à volume constant) de l'eau désionisée et portée préala- blement à la température de la glace fondante. La suspension ainsi préparée (dont la DO à 600 nm était voisine de 10) a été laissée 5 minutes à 0 C. c) Recueil des protéines à localisation périplasmique La suspension obtenue en 2.4.b. a été centrifugée minutes à 18 000 g. Le surnageant qui contenait les protéines à localisation OS périplasmique a été recueilli. 2.5 Lyse totale Un échantillon de la suspension, telle qu'obtenue en 2.3. après induction, a été prélevé et centrifugé dans un tube Eppendorf minutes à 6 000 g. Le culot a été remis en suspension dans un volume de tampon tel que 1 ml de suspension présente une DO à 600 nm de 0,2. Le tampon a été préparé à partir d'un tampon concentré 2 fois comprenant une solution dans l'eau distillée: - du Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8; - du dodécylsulfate de sodium (4 % (p/v)); - du glycérol (20 % (p/v)); - du Amercaptoéthanol (10 % (p/v)); - du bleu de bromophénol (0,02 % (v/v)). Le tube a été placé 10 minutes au bain-marie réglé à 0' 100 C puis la suspension a été centrifugée pendant 5 minutes à 6 000 g et le surnageant a été recueilli. 2.6. Dosage de t'hGH périplasmique Le surnageant obtenu en 2.4.c. a été soumis à une chroma- tographie de type liquide haute pression à l'aide d'un appareillage muni d'un système d'injection calibré et équipé d'un détecteur régLé sur 220 nm. On a utilisé: une colonne phase inverse C 8 -300 Angstr ms, en acier, de 10 cm de longueur et de 4,6 mm de diamètre interne (SYNCHROM référence C 8 R103-10), une phase mobile constituée par un gradient linéaire de minutes passant respectivement de 70 volumes de solution S1 et volumes de solution S2 à 40 volumes de solution S1 et volumes de solution S2. Les solutions S1 et S2 avaient les caractéristiques suivantes: S1 = eau purifiée contenant 0,1 % (v/v) d'acide trifluoroacétique, S2 = acétonitrile pour HPLC contenant 0,08 % (v/v) d'acide trifluoroacétique. Le débit était de 1 ml par minute. La densité optique des fractions a été mesurée et la quantité d'hGH périplasmique exprimée en microgrammes par ml de sur-ageant a été déterminée par comparaison avec une gamme étalon préetablie. 2.7. Analyse par la technique dite du Western Blot Il a été procédé successivement aux opérations suivantes: - séparation électrophorétique sur gel (selon le proto- cole décrit par LAEMMLI, U.K., Nature 227 (1970) 680-685) des différentes protéines contenues dans chacun des surnageants obtenus selon 2.4.c. et 2. 5; le gel utilisé était un gel de polyacrylamide (15 % p/v) contenant 0,5 % de dodécylsulfate de sodium; - transfert desdites protéines contenues dans le gel sur un filtre de nitrocellulose (selon la technique de H. TOWBIN et al. Proc. Natl. Acad. Scie. USA 76 (1979) 4350-4354); immunodétection réalisée selon la technique de BURNETTE (W.W. BURNETTE Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203); elle implique successivement: le rinçage du filtre de nitrocellulose 10 minutes avec un tampon A (Tris-HCl 10 mM, NaCL 170 mM, KI 1 mM); la mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant minutes à 37 C avec un tampon B (tampon A additionné de sérum-albumine bovine à raison de 3 g pour 100 ml); la mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant 18 h à 20 C avec un immun-sérum (un anticorps poly- clonal reconnaissant l'hGH mature et son précurseur); le rinçage du filtre de nitrocellulose avec le tampon B; la mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant 6 h à 20 C avec une solution de protéine A marquée à l'iode 125 à 0,1 microcurie par ml; le rinçage du filtre avec le tampon A; le séchage du filtre entre deux feuilles absorbantes; la mise au contact d'un film radiographique; la révélation du film. 3. RESULTATS 3.1 Dosage de L'hGH périplasmique Les résultats sont reportés dans le tableau ci-après: PLASMIDE TESTE Téêmoin][ |PLASMIDE 398 _ h373,2 398,2 1398,3 l398,5j 398,6 3987 398,8 hGH périplasmique exprimé en micro- grammes par ml de 1,5 2,5 2,9 2,8 3,1 3,1 3,4 surnageant recueilli après chqc osmotique et ramené à une turbidité telle que DO à 600 nm = 1 .. i . il i i , IL apparait clairement que le plasmide 398 permet une production périplasmique multipliée environ par deux par rapport à celle que permet le plasmide 373,2. 3.2 Analyse par la technique dite du Western BLot L'analyse des films autoradiographiques révèle que le précurseur n'a pas été détecté dans les extraits obtenus après lyse totale des bactéries transformées avec le plasmide p398 alors qu'il est détecté dans les extraits obtenus après lyse totale des bactéries du clone p373,2. Ceci montre que te peptide- signal selon l'invention est à même de permettre, avec une grande efficacité, le franchissement par le précurseur de la membrane cytoplasmique et sa maturation concomitante. Ces résultats soulignent le grand intérêt de l'utili- sation du peptide-signal selon l'invention pour la production péri- plasmique d'une protéine telle que l'hormone de croissance humaine. EXEMPLE 2 Production périplasmique d'un variant de L'hirudine 1. Souche et plasmide * La souche décrite à l'exemple 1 a été utilisée. Un plasmide dénommé p400 a été construit à partir du plasmide p373,2. Il porte une séquence d'ADN codant pour le variant (Lys47)HV2 décrit dans EPA-0273800 et dont la formule est ci-après rappelee: ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY LYS GLY ASN LYS CYS ILE LEU GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO LYS PRO GLU SER HIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLU GLU TYR LEU GLN Un fragment synthétique AccI-HindIII (fragment 5) contenant une séquence codant pour ce variant (sauf les 3 premiers acides aminés) a été préparé. Il est représenté ci-dessous, une flèche désignant le codon correspondant au dernier acide aminé: FRAGMENT 5 AccI AT ACA GAC TGC ACA GAA TCG GGT TGT CTG ACG TGT CTT AGC CCA CAA ATT TTG TGC CTC TGC GAG GGA AGC AAT GTT TTA AAC ACG GAG ACG CTC CCT TCG TTA GTT TGC GGT AAA GGC AAT AAG TGC ATA TTG CAA ACG CCA TTT CCG TTA TTC ACG TAT AAC GGT TCT AAT GGA AAG GGC AAC CAA TGT GTC CCA AGA TTA CCT TTC CCG TTG GTT ACA CAG ACT GGC GAA GGT ACA CCG AAA CCT GAA AGC TGA CCG CTT CCA TGT GGC TTT GGA CTT TCG CAT AAT AAC GGC GAT TTC GAA GAA ATT CCA GTA TTA TTG CCG CTA MAAG CTT CTT TAA GGT GAA GAA TAT TTA CA-'TGA AAA ATG MAAA GAA CTT CTT ATA AAT GTT ACT TTT TAC TTT CTT TAT CAA TCA TAG AGA ATT TTG ATT TGG GAA ATA GTT AGT ATC TCT TAA AAC TAA ACC CTT TTC GAA AAG TTC GCT GGT ACT MAAG GCT TTG AAG CTT TTC AAG CGA CCA TGA TTC CGA AAC TTA GAC GMAA GTT GTC MAAG AGC TCT GCT GCT MAAT CTG CTT CMAA CAG TTC TCG AGA CGA CGA GGT AAC ACC GTC ATC ATT GGT GGT GGT GAC CCA TTG TGG CAG TAG TAA CCA CCA CCA CTG ACT GCC ACT GTC GCT AAG AAG TAC GGT GTC TGA CGG TGA CAG CGA TTC TTC ATG CCA CAG HindIII ACT GAC MAAG ATC CCA TGA CTG TTC TAG GGT TCG A - 5' Le plasmide.-373,2 a été soumis b une digestion par Les enzymes de restriction NdeI et HindIII et le fragment Ndel-HindIII (fragment 6) contenant l'origine de réplication, tel que représenté à La figure 3, a été purifié. Un fragment synthétique NdeI-AccI (fragment 7) dont la séquence est donnée ci-dessous a été préparé. FRAGMENT 7 NdeI ' TeTGGCTCCATCTGGCAAATCCACGCTGCTTCTCTTATTTCTGCTCCTGTGCCTGCCCTCT- ACCGAGGTAGACCGTTTAGGTGCGACGAAGAGAATAAAGACGAGGACACGGACGGGAGA- ACCI Acc I TGGAACGCCGGCGCATTACGT ACCTTGCGGCCGCGATAATGCATA 5' Ce fragment contient la séquence d'ADN préférée codant pour le peptidesignal selon l'invention délimitée par deux flèches et suivie de nucleotides correspondant aux 3 premiers codons du variant de l'hirudine (Lys47)HV2. Les fragments 5, 6 et 7 ont été ligués; le plasmide obtenu est le plasmide p400. 2. Méthodologie générale Le plasmide p400 a été introduit partransformation dans la souche bactérienne. Les essais ont été réalises en parallèle sur deux clones distincts (clones p400,18 et p400,24) et conformément au mode opé- ratoire décrit aux paragraphes 2.1 et 2.2. Les cultures ont été induites selon la méthode indiquée au paragraphe 2.3 de l'exemple 1 mais en y apportant deux aménagements: l'induction a été initiée par l'addition d'IPTG lorsque la culture a atteint une DO à 600 nm d'environ 0,5 et elle a été maintenue pendant 3h30 pour un premier essai et 17 h pour un second essai. Après induction, les cellules ont été soumises à un choc osmotique (cf. 2.4, exemple 1) et l'activité antithrombine de l'hirudine du surnageant recueilli a été mesurée. La détermination de cette activité a fait appel à la technique décrite par Markwardt, F. et at. (Thromb. Haemostas. 52 (19) 160-163) et précisée par Harvey, R.P. et aL. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 1084-1088). Le variant de l'hirudine obtenu à partir de l'un des clones a été purifié par chromatographie liquide haute pression et sa séquence NH2-terminale a été déterminée. 3. RESULTATS Les résultats sont reportés sur le tableau ci-après. Ils sont exprimés en urités antithrombine par ml de surnageant recueilli après choc osmotique et ramené à une turbidité telle que DO à 600 nm = 10. t Plasmide p 400 clone clone p400,18 p400,24 . . . .u, Durée de B3h.30i 241 369 | l'induction | Les valeurs d'activité antithrombine spécifique de L'hirudine connues étant comprises entre 13000 et 17700 unités antithrombine par mg d'hirudine (Loison, G. et al., Bio/Technology 6:7277 (1988)), on peut en déduire que l'on a extrait après 17 h d'induction de 5 à 10 mg d'hirudine par litre de surnageant à DO à 600 nm = 1. Une telle quantité est bien plus éLevée que celLe que Dodt J. et ai. FEBS, 202 (1986) 373-377 ont décrite avec le variant HV1 de l'hirudine produit de façon périplasmique dans une souche d'E. coti transformée à L'aide d'un ptasmide portant une sequence codant pour un précurseur hybride de l'hirudine dont le peptide- signal est celui de la phosphatase alcaline. IL a d'autre part été constaté que l'hirudine produite par le clone p400, 18 a bien l'extrémité NH2-terminale caractéristique du variant (Lys 4)HV2. Ces résultats montrent que le peptide-signal selon l'invention est approprié à une production périplasmique efficace d'un peptide tel que le variant (Lys47)HV2 de l'hirudine. REVENDICATIONS 1. Peptide-signal de formule: MAPSGKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA o A = Alanine M = Méthionine C = Cystéine N = Asparagine F = Phénylalanine P = Proline G = Glycine S = Sérine K = Lysine T = Thréonine L = Leucine W = Tryptophane 2. Séquence d'ADN codant pour le peptidesignal selon la revendication 1. 3. Séquence selon la revendication 2, de formule: ' ATG-GCT-CCA-TCT-GGC-AAA-TCC-ACG-CTG CTT-CTC-TTA-TTT-CTG-CTC-CTG-TGC-CTG CCC-TCT-TGG-AAC-GCC-GGC-GCT 3' 4. Vecteur d'expression portant une séquence d'ADN codant pour un précurseur d'un polypeptide, caractérisé en ce que La portion de cette séquence codant pour le peptide-signal est une séquence selon l'une des revendications 2 ou 3. 5. Procédé de production périplasmique d'un polypeptide consistant à transformer une souche de bactéries gram négatives par un vecteur d'expression portant une séquence d'ADN codant pour un précurseur dudit polypeptide, à cultiver lesdites bactéries de manière que, ladite séquence étant transcrite puis traduite, le polypeptide sous sa forme mature s'accumule- dans le périplasme, caractérisé en ce que ledit vecteur est un vecteur selon la revendication 4. 6. Procédé de production d'hormone de croissance humaine selon la revendication 4. 7. Procédé de production d'hirudine selon la revendi- cation 5. 8. Procédé de production du variant (Lys47)HV2 de l'hirudine selon la revendication 5. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la souche de bactéries gram négatives est une souche E. coli. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la souche E. coli porte une mutation cya par délétion et une mutation crp par délétion.