FR 2641447 A1 19900713 FR 8912551 A 19890921 COMPOSITIONS VIRUCIDES A FAIBLE TOXICITE La présente invention se rapporte à des compositions virucides et plus particulièrement à des compositions contenant de la glutaraldéhyde et qui sont exemptes de phénol, inodores, stables et efficaces à de très hautes dilutions contre les virus lipophiles et hydrophiles. Il existe un besoin de compositions virucides qui contiennent une quantité minimum de produits chimiques présentant une toxicité faible, mais qui provoquent une mort rapide et générale des virus résistants, sur des surfaces vivantes ou inertes. Très peu de désinfectants chimiques sont actifs contre les virus résistants lorsqu'ils sont utilisés à de faibles concentrations de l'ordre de 0,006 à 0,00125% (poids/volume). Pour mesurer le pouvoir virucide de ce genre de compositions, le travail de Noll et Younger (Virology (:319-343, 1959) suggère la classification des virus d'après leur affinité pour les lipides. Les virus qui se combinent facilement aux lipides tels que le cholestérol sont appelés "lipophiles". Les virus qui ne se combinent pas rapidement aux lipides sont appelés "hydrophiles". En 1963, Klein et Deforest (Proceedings, 49th meeting of Chem. Spec. Manuf. Assoc., page 116-118, New-York), menent une investigation minutieuse sur le comportement de différents types de virus vis-à-vis de plusieurs désinfectants. Ils trouvent que la résistance des virus hydrophiles vis-à-vis de certains germicides est basée sur l'impossibilité de ces germicides de réagir avec les hydrophiles. D'un autre coté, les virus lipophiles sont plus sensibles à l'inactivation des germicides lipophiles. En utilisant trois virus hydrophiles résistants (Poliovirus Type 1, Coxsackie-virus B1 et Echovirus 6) et quatre virus lipophiles (Adénovirus Type 2, Herpes Simplex virus Type 1, Vacciniavirus et Asian Influenza virus), Klein et Deforest déterminent les plus faibles concentrations de germicides nécessaires pour inactiver ces virus en 10 min. Le tableau I montre leurs résultats se rapportant au virus le plus résistant (poliovirus Type 1). Tableau I CONCENTRATION LES PLUS FAIBLES (poids/volume %) DE DESINFECTANTS INACTIVANT LE POLIOVIRUS TYPE 1 EN 10 MINUTES. Hypochlorite de sodium: 0,02 Iodophore: 0,015 Dichlorure de mercure: 0,2 Formaline: 8,0 Glutaraldéhyde: 2,0 Alcool éthylique: 70,0 Alcool isopropylique: 95,0 Phénol: 5,0 o-phényl phénol: 12,0 (nég.) Ammonium quaternaire: 10,0 (24 h. contact nég.) --- Ainsi que l'avaient précédemment démontré Klein et Deforest (cf. tableau I), les phénols et les composés phénoliques tel l'orthophényl-phénol, ont peu ou pas d'activité contre les virus hydrophiles. Dans leur étude, Klein et Deforest montrent, par exemple, que meme à une concentration aussi élevée que 12%, l'ortho phényl-phénol ne tue pas les virus suivants: Polio Type 1, Coxsackie B1 et Echo 6. Le phénol lui-meme nécessite des concentrations aussi élevées que 5% pour être actif contre ces mêmes trois virus hydrophiles. Plus récemment, une étude d'un laboratoire indépendant (Hazelton Biotech Corp., projet No. 2288-100, 26 Juin, 1984), confirme qu'un mélange de phénol et de phénate de sodium, contenant 0,51% de ces composés, ne tue pas le Poliovirus Type 1, ATCC VR 192, suivant les normes de l'Agence des Etats-Unis pour la protection de l'environnement, appelée ci-dessous EPA, (DIS/TSS-7, Nov. 1981). Il est évident qu'il faut des concentrations élevées de -0 phénol ou de composés phénoliques. pour agir contre les virus résistants. D'autre part, le phénol, les sels phénoliques ou les composés phénoliques sont très toxiques à des concentrations de l'ordre de 0,5 à 5%. Des lésions locales de la peau englobent l'eczéma, l'inflammation, la Cécoloration, le papilliomas, la nécrose, l'escarre, la gangrène (voir Industrial Hygiène and Toxicology, vol. 2, 1363-1408, 2nd edition, Interscience Publishers, 1963). Les phénols monohalogénés, ou les méthylphénols ou les diméthylphénols, se montrent puissants pour favoriser le papillomas chez l'animal, comme le phénol lui-meme. Les biphényls polychlorés (PCB) ont été éliminés par l'EPA de la chaine alimentaire à cause de leur extrême toxicité même à des niveaux très bas de concentration. Plus récemment, d'autres concentrations minimales de germicides nécessaires pour l'inactivation en 10 min. ont été déterminées (Journ. Hosp. Supp. Process. Distrib., Jan. 1985, pages 40-47) avec le Poliovirus Type 1 et 2. Ces résultats ont été rassemblés par le Dr. J. Bednarz- Prashad (University of Texas Medical School, Houston), utilisant le test virucide normalisé AOAC, approuvé par l'Agence pour la protection de l'Environnement (EPA Notice, DIS/TSS-7, 12 Nov. 1981). Les résultats de cette étude montrant la concentration requise pour inactiver le virus après un temps de contact de 10 min. sont repris dans le tableau II Tableau II CONCENTRATION MINIMUM (poids/volume %) POUR INACTIVER LES POLIOVIRUS EN 10 MINUTES. (Méthode AOAC) Gluconate de chlorhexidine > 0,5 * Glutaraldéhyde + non ionique 0,25 Glutaraldéhyde + non ionique + glycol 0,19 o-phényl-phénol > 1,0 * Glutaraldéhyde-phénate. > 0,14 * * ceci représente la concentration la plus basse du produit commercial testé, le virus n'est pas inactivé à cette concentration La quantité minimum de glutaraldéhyde est huit fois plus basse dans les expériences de Prashad que dans celles de Klein et Deforest, parce que Prashad utilise une glutaraldéhyde activée par de petites quantités d'éthoxylates non ioniques d'alcools linéaires isomères (par exemple le Tergitol 15-S-12). En d'autres termes, ainsi qu'on l'a décrit dans le brevet US No. 3 968 248, et démontré par R.M.G. Boucher (AM. Journ. Hosp. Pharm. 31: 546-557-, June 1974), la présence de petites quantités de tensioactifs non ioniques peut, dans certains cas, augmenter l'activité létale, c'est-à- dire "tueuse" de solutions de glutaraldéhyde. Du triéthylène-glycol a été ajouté à cette même composition pour la rendre inodore, et cette composition contenant du glycol a permis une concentration minimum de glutaraldéhyde égale à 0,19% (poids/vol.). Cette concentration est très proche de la valeur observée dans le cas de la solution de glutaraldéhyde contenant des éthoxylates non ioniques sans glycol. Ces résultats de l'art antérieur montrent le besoin de compositions présentant une plus grande activité virucide à des concentrations faibles et pratiquement dépourvues de toxicité. La présente invention a donc pour but de créer un type de compositions virucides liquides plus puissantes, exemptes de phénol, tout en réduisant la quantité de dialdéhyde nécessaire pour détruire des virus courants, lipophiles ou hydrophiles. Une composition virucide liquide dépourvue de phénol; selon la présente invention, est caractérisée en ce qu'elle comprend: a) un solvant se composant d'eau ou d'un alcool faible (alcanol) b) une monoaldéhyde saturée ou une dialdéhyde contenant de deux à environ six atomes de carbone c) un agent réducteur d'odeur, choisi parmi le groupe comprenant: l'éthylène-glycol, le propylène-glycol, le diéthylène-glycol, le triéthylène-glycol, le polyéthylène-glycol, le polypropylène-glycol et les mélanges de ceux-ci; d) un tensioactif anionique ayant un groupe hydrophile chargé négativement, choisi dans un groupe comprenant les sulfates d'alkyle, les sulfonates d'alkyle, les sulfates alcooliques, les sulfonates d'alkyle-aryle, les sulfosuccinates dialkyles et les mélanges de ceux-ci; et e) des sels tampons en quantité suffisante pour stabiliser le pH des solutions virucides dans la gamme de pH d'environ 4 à environ 7,4. De préférence, ladite dialdéhyde est la glutaraldéhyde. L'agent réducteur d'odeur préféré, est le triéthylène- glycol. De préférence, la quantité maximum de glycol est comprise entre 10 et 20% environ en poids par rapport au poids de la solution. Le tensioactif anionique préféré est le dodécylsulfate de sodium. Dans des formes de réalisation avantageuses de l'invention, le rapport des poids du composé glycol et de l'aldéhyde est compris entre 1 et 32, et d'autre part le rapport des poids du tensioactif anionique et de l'aldéhyde n'est pas inférieur à environ 1 à 4, ni supérieur à environ 10 à 11. De préférence, une composition aqueuse selon l'invention contient des sels tampons la maintenant dans une gamme de pH de 7,4 à 4,5 à température ambiante. Une composition aqueuse selon l'invention capable de détruire des virus avec ou sans enveloppe sur des surfaces inertes ou vivantes en moins de trente minutes, peut avoir une teneur en aldéhyde égale ou supérieure à 0,00125% en poids. La composition peut contenir un tampon choisi parmi le groupe comprenant: l'acide maléique, l'acide citrique trisodique, le tampon phospo-citrate, l'acide succinique, le tampon cacodylate, l'acide n-(2 acétamido)imino- diacétique, la n-pipérazine, l'acide nl-bis-2(2- éthanesulfonique), l'acide éthane 2(n-morpholino)sul- fonique et les mélanges de ces derniers, ayant un pKa compris entre 4,2 et 7,2. Dans une forme de réalisation particulière, une composition aqueuse selon l'invention est tamponnée dans une gamme de pH de 6,2 à 6,4 avec une combinaison de phosphate métallique monobasique et de phosphate anhydre de sodium dibasique. On a donc découvert que de nouvelles compositions virucides puissantes sont créées par la combinaison synergique d'un monomère de glutaraldéhyde, en équilibre avec ses hydrates et polymères, avec des molécules de glycol liées par des liaisons hydrogène, et avec un tensioactif anionique sélectionné dans un groupe de tensioactif anioniques d'un type particulier, dans lequel le dodécylsulfate de sodium est particulièrement préféré. De telles compositions sont efficaces contr6 les virus lipophiles et hydrophiles et montrent une activité virucide très forte vis-à-vis du virus Herpès Simplex Type 1 et une activité virucide améliorée contre les virus Coxsackie B. Les compositions virucides de cette invention sont efficaces dans des solutions aqueuses très diluées de glutarldéhyde, par exemple 0,0025% (poids/vol.) avec des tensioactifs anioniques présents à des concentrations aussi faibles que 0,0005% (poids/vol.) De plus, la pratique consistant à ajouter des molécules de glycol aux compositions de glutaraldéhyde pour désodoriser la composition est montrée dans le brevet US No. 3 886 269 auquel on se réfère ici dans son intégralité. L'adoption de cette pratique n'affecte pas de manière nuisible à la santé l'efficacité virucide de la composition selon la présente invention. Dans le dessin annexé, la figure unique représente une photographie de quatre jeux de hỉt boites, de cultures monocouches inoculées avec le virus Herpès Simplex Type 1 (HVS), traitées ou non comme on l'expliquera plus loin en détail. La figure montre un jeu de cultures de cellules poussant en cercle (monocouche) sur des boites en plastique. La couche monocellulaire est inoculée avec le virus Herpès Simplex Type 1 (HSV). Lorsqu'il y a un virus actif dans l'inoculum, le virus fait des trous (plaques) dans la couche monocellulaire. Ceux-ci apparaissent comme des zones déchiquetées blanches dans les monocouches sombres. Par comptage du nombre de plaques, on peut déterminer le nombre de virus actifs (unités formant des plaques, ou pfu) dans l'inoculum. Dans chaque case correspondant aux quadrants A à D de la figure, la rangée supérieure de quatre monocouches cellulaires est inoculée avec une dilution de 1/100 de HSV et non traitée du tout, et la rangée des quatre monocouches du bas dans chaque quadrant est inoculée avec une dilution au 1/1000 du virus. A la dilution de 1/1000, HSV est soit laissé non traité (rangée inférieure du quadrant A), soit traité pendant 10 min. à 23 C avec seulement 0,001% (poids/vol.) de dodécyl sulfate de sodium (SDS) (rangée inférieure du quadrant B), ou avec seulement 0,0025% (poids/vol.) de glutaraldéhyde (rangée inférieure du quadrant C), ou avec un mélange de SDS à 0,001% (poids/vol.) et de glutaraldéhyde à 0,0025% (poids/vol.) (rangée inférieure du quadrant D). Dans tous les cas, le temps d'exposition est de 10 min. à température ambiante. Les cases B et C montrent peu ou pas de diminution du nombre de virus pfu, par rapport à la case A. Cependant, la case D présente une diminution de 80 à 90% en virus pfu. Donc, à la concentration utilisée dans cet essai, le SDS et la glutaraldéhyde doivent être présents ensemble et travailler en synergie, pour activer le virus HSV Type 1. Pour mieux comprendre pourquoi une combinaison fortement diluée de glutaraldéhyde avec un tensioactif anionique manifeste plus qu'une action virucide additionnelle, il est nécessaire d'analyser et de comprendre chacun des mécanismes d'action des deux substances chimiques et de déterminer comment chacune affecte la structure fondamentale des virus. Sans être lié à aucune théorie particulière, on peut croire que le raisonnement suivant est pertinent pour une compréhension de l'effet des compositions virucides selon la présente invention. D'abord, il faut considérer le mécanisme destructeur des aldéhydes en général et de la glutaraldéhyde en particulier. Les solutions aqueuses d'aldéhyde ont une concentration faible en molécules d'aldéhyde pure, appelée "monomère". Ce monomère, qui est considéré comme etant une molécule unique et simple d'aldéhyde, est toujours présent en équilibre avec des molécules plus grandes, plus complexes, considérées comme des "hydrates". Ces hydrates résultent de la condensation ou polymérisation de petites molécules de monomère en agglomérats plus grands. Dans toute solution d'aldéhyde, on sait que l'équilibre peut être rapidement établi entre des monomères relativement petits et des polymères plus grands ou des hydrates, résultant en une concentration relativement stable de chacun. Cet équilibre est basé sur des variables qui comprennent la concentration en produits chimiques, la température, la turbulence et plusieurs autres facteurs. L'aldéhyde monomère est l'agent destructeur (notamment virucide) primordial dans les solutions aqueuses d'aldéhydes. L'activité destructive de quelque formulation que ce soit contenant des aldéhydes (par ex. formaldéhyde, glutaraldéhyde,...) est directement liée au nombre de molécules de monomère présentes au moment de l'utilisation de la solution. L'équilibre entre le monomère, les hydrates plus grands et les polymères est illustré par les formules des tableaux III et IV, respectivement pour des solutions aqueuses de formaldéhyde et de glutaraldéhyde. Tableau III Méthanol (Formaldéhyde) et ses polymères en solution aqueuse OH H-CH - H20 _.,--- H-C-H -- HO(CH20) H. i 2 n H OH Formaldéhyde méthylène polyoxyméthylène (monomère) glycol glycol (polymères) Tableau IV Glutaraldéhyde et ses polmères en solution aqueuse il a I o o 0 OH [[ H- C-CH2-CH-CH2-C-H+H20,- --- H C-CH2-CH2-CH,-C-H OH I I ]1V ' OH OH H-C- CH2- C H2' CH2-,C-H =_ OH OH HO 0 HO OIn -O O n Pour la glutaraldéhyde (OHC-CH2-CH2-CH2-CHO) en solution aqueuse alcaline, le monomère est en équilibre avec des polymères de type II,III et IV comme le montre les formules du tableau IV. La formation de ces polymères est irréversible et ne peut retourner à la forme monomère active, même par chauffage ou ultrasons. aussi bien le vieillissement que le pH alcalin accélèrent fortement la formation irréversible de polymères. En d'autres termes, le vieillissement et l'alcalinité diminuent l'activité destructrice de la solution de glutaraldéhyde. Par contre, en milieu acide les monomères de la glutaraldéhyde ont une vitesse de polymérisation plus lente et sont en équilibre avec des polymères de type V qui sont réversibles. Ceci explique pourquoi les solutions acides de glutaraldéhyde ont une plus longue vie biocide que les solutions alcalines. Cette discussion peut être complétée par référence à l'article "Biocidal Mechanism of Saturated Dialdehydes and their Potentiation by Ultrasound", Boucher, Last and Smith, Proc. West. Pharmacol. Soc. 16: 282-288 (1973). La formaldéhyde et la glutaraldéhyde, ainsi que d'autres aldéhydes, sont des agents d'alkylation. Elles peuvent réagir chimiquement avec des groupes sulfhydrile, hydroxyle, amino et carboxyle. Beaucoup de ces groupes sont présents dans les composés de la structure des virus et les structures des virions sont fortement sensibles aux aldéhydes. En étudiant le virus de la fièvre aphteuse, Sanger et consorts (Journ. of Gen. Virology 21: 399-406, 1973) ont été les premiers à montré que la glutaraldéhyde produit des altérations considérables dans l'arrangement du RNA et des sous-unités protéiques dans ce picornavirus. De même, Hopwood montre (Histochem. J. 7:267, 1975) que la glutaraldéhyde réagit plus facilement avec le RNA (par ex. à température plus basse) qu'avec le DNA. Donc, les acides nucléiques aussi bien que les enzymes, les protéines et les lipides, réagissent tous avec la glutaraldéhyde. Cependant, les réactions les plus communément rencontrées sont celles incluant des groupes amino qui conduisent à la réticulation des protéines. Pour mieux comprendre l'action virucide de la combinaison des aldéhydes et des tensioactifs anioniques, nous avons étudié deux virus différents: le virus Herpès Simplex Type 1, le virus Coxsackie B6. Le virus Herpès Simplex (HSV) Type 1 est un virus relativement fragile, contenant du DNA (avec une enveloppe). Le virus Coxsackie B6 est un virus nu (sans enveloppe), résistant, contenant du RNA. Le virion HSV contient, dans sa structure principale, trois particularités importantes pour la présente invention: 1. un DNA linéaire à doubles brins ou dicaténaire, 2. une coque symétrique de protéines, appelée capside, 3. une enveloppe contenant des lipides. La capside est composée d'amas individuels de polypeptides capsomères) qui sont codés par le virus. L'enveloppe est dérivée de la membrane nucléaire de la cellule infectée. Cette enveloppe contient des lipides, des hydrates de carbone et des protéines. Pendant la réplication du virus, de nombreuses enzymes sont présentes, telles les DNA polymérases; quand elles sont bloquées, la réplication virale est inhibée. Ainsi que mentionné auparavant, les molécules de glutaraldéhyde peuvent interférer avec les enzymes et les protéines- liées au DNA, mais probablement réagissent plus facilement avec les protéines de structure ou les glycoprotéines de l'enveloppe. Le virus Coxsackie B6 est un petit virus (24 à 30 nm) à -symétrie cubique. Ce virus à RNA n'a pas d'enveloppe; il a trente-deux capsomères qui s'ajustent bien serrés les uns aux autres pour former la capside. La capside parait très difficile à pénétrer et protège donc le noyau de l'acide nucléique. du virus. Les molécules de glutaraldéhyde peuvent cependant exiger des temps de contact plus longs pour atteindre les polypeptides clés internes ou les acides nucléiques qui peuvent être critiques pour l'inactivation du virus. Des agents anioniques spécifiques, tels que le dodécylsulfate de sodium (SDS) peuvent contribuer au mécanisme virucide des aldéhydes. Ce sulfate d'alkyle SDS a une charge négative très forte; il a la formule suivante: O o CH3-(CH2).-O-S-O-Na- avec x = 11 segment hydrophile La séquence suivante des événements peut. se produire lorsqu'une enveloppe virale est en présence de SDS. D'abord, l'agent anionique se lie à la membrane et provoque la lyse de celle-ci. La membrane est solubilisée sous forme de complexe lipidoprotéique anionique qui est par la suite solubilisé pour donner des complexes protéines-SDS et lipides-SDS. Ce mécanisme a été suggéré par Simons et consorts (Membrane Protein and Their Interaction with Lipids, Ed. Capaldi, vol. 1, 207-2343, Marcel Dekker, NY,1977). Ces auteurs ont travaillé avec le virus Semliki Forest (SFV), un virus alpha des Togaviridae. Le SFV contient une nucléocapside sphérique qui est composée d'une molécule de RNA monocaténaire et d'une espèce de protéine riche en lysine, la protéine de la nucléocapside. Cette dernière est -recouverte par une membrane de lipide qui est parsemée de glycoprotéines formant des saillies à la surface. La lyse de la membrane virale commence à des concentrations de SDS d'environ x10-5 mol. La dissociation de la nucléocapside en RNA et protéines se produit à des concentrations de SDS aussi basses que 10-4 mol. Les concentrations de SDS libre de 0,75x10-3 mol. sont suffisantes pour une délipidation complète. Ceci indique que la séquence entière, de la lyse à la délipidation, se produit à des concentrations de SDS inférieures à celle de la formation critique de micelles (CMC). Nous affirmons que cette destruction physique extrêmement rapide des enveloppes virales est le facteur clé permettant aux molécules de glutaraldéhyde de pénétrer et d'inactiver les virus au travers de réactions spécifiques avec des enzymes, des protéines de virions ou de l'acide nucléique. Le SDS peut inactiver les virus par le mécanisme décrit préalablement. Par exemple, dans le cas du virus Herpès Simplex Type 1, F. Burnet et Lush (Australian J. Exp. Biol. and Med. Sci., 18:141-150, 1940), ont conclu qu'une inactivation partielle du HSV se produit à une concentration de SDS de 0,002% (poids/vol.), tandis qu'une inactivation complète est observée pour une concentration en SDS de 0,005% (poids/vol.). Ceci est confirmé par notre étude récente (voir tableau VI) qui a été menée avec une méthode EPA légèrement modifiée et qui a montré une destruction complète en 10 min. avec une concentration de SDS de 0,005%. Ainsi que l'ont montré Burnet et Kush, plus les virus sont résistants., plus les concentrations de SDS doivent être élevées (0,025% poids/vol.) pour une inactivation complète des virus, comme dans le cas des virus Coxsackie ou Vaccine (un virus à DNA avec une couche complexe contenant des lipides). La présente invention démontre que la solubilisation et la dissociation des nucléocapsides par des agents anioniques, tels que les sulfates d'alkyles, permettent la pénétration rapide des radicaux d'aldéhyde active, pour exercer une action létale supplémentaire sur les composés clés de la structure virale. Ce mécanisme de "double action" destructrice peut être clairement observé d'après les résultats d'expériences figurant dans les tableaux V, VI, VII et VIII. Tableau V Etude d'inactivation du virus Coxsackie B6 (CBV) Expérience menées avec de la glutaraldéhyde, du triéthylène glycol et des tensioactifs non ioniques (Tergitol 15-S-12) et anioniques (SDS). TRAIREMENT DU VIRUS %D'ACTIVITE RESTANT APRES: 0 min. 5 min. 7,5 min. 10 min Sans addition (1) 100 92 TEG (2) 100 100 100 100 Terg. 100 100 70 100 SDS 100 82 48 46 TEG + Terg. 100 100 100 100 TEG + SDS 100 100 100 100 Glut 100 100 85 90 Glut + TEG 100 100 100 96 Glut + Terg 100 100 100 100 Glut + SDS 100 36 35 40 Glut + TEG t Terg. 100 100 86 72 Glut + TEG + SDS 100 45 42 12 (1) Les expériences sont effectuées à température ambiante, dans un volume réactionnel de 1 ml. La méthode est décrite dans le brevet. (2) Concentrations utilisées: triéthylène glycol (TEG) 0,04% Tergitol (15S-12) (Terg) 0,05% dodécylsulfate de sodium (SDS) 0,05% glutaraldéhyde (Glut) 0,006% Tableau VI Etude d'inactivation du virus Herpes Simplex (HSV) Type 1 Experiences menées avec la glutaraldéhyde et des tensioactifs-actifs non ioniques (Tergitol 15-S-12) et anioniques (SDS) Traitement du virus % d'activité restant après: 0 min. 10 min. 0.0006% Glut 100 100 0.0006% Glut 100 100 0. 00125% Glut 100 100 0.05% SOS 100 0 0.005% SOS 100 0 0.003% SDS 100 3 0.001 SDOS 100 58 0.00075% SODS 100 D100 0.00050% SODS 100 100 0.05% Terg 100 0 o.04% Terg 100 94 0.005% Terg 100 49 0.0005% Terg 100 100 0.00005% Terg 100 100 0.0000006% Terg 100 100 0.00125% Glut + 0. 00075% SDS 100 71 0.00125% Glut + 0.00100% SDS 100 74 0.00125% Glut + 0. 003% SODS 100 9.4 0.00250% Glut 100 80 0.00250% Glut + 0.0005% Terg 100 50 0.00250% Glut + 0.0005% SDS 100 32 0.00250% Glut + 0.00075% SDS 100 38 0.00250% Glut + 0.001% SOS 100 24 O.00Z50% Glut + 0.003% SOS.100 4.7 Glut: glutaraldéhyde SDS: dodécylsulfate de sodium (tensioactif anionique) Terg: Tergitol 15-S-12, éthoxylates d'alcools linéaires isomères (tensioactifs non ioniques) 264 1 447 Tableau VII Pourcentage d'activation HSV 1 restant après un temps de contact de 10 min. avec: Compositions SDS Glut Résultats Résultats des solutions seul seul suppl. effectifs attendus Glut/SDS 0.0005% SDS 100 32 0.0025% Glut 80 0.00075% SOS 100 38 0.0025% Glut 80 0.001% SDS 58 38 24 0.0025% Glut 80 SDS: dodécylsulfate de sodium (tensioactif anionique) Glut: glutaraldéhyde Tableau VIII Influence du triéthylène glycol (TEG) sur l'inactivation du virus Herpès Simplex (HSV) Type 1, par des compositions non ioniques et anioniques de glutaraldéhyde Traitement du virus % d'activité restant après: (concentration en % poids/vol.) 0 min. 10 min. 0.04X TEG 100 100 0.04% TEG + 0.0005% SOS 100 100 0.04% TEG + 0.0005% SODS0.0025% Glut. 100 77 0.0005% SOS + 0.0025% Glut. 100 32 0.04% TEG À 0.0005% Terg * 0.0025% Glut. 100 100 0.0005% Torg À 0. 00256% Glut. 100 50 0.00075% SDS + 0.00125% Glut 100 71 0.00075% SDS + 0. 00125% Glut + 0.04% TEGC100 100 TEG: triéthylène glycol SDS: dodécylsulfate de sodium (tensioactif apionique) Terg: tergitol 15-s-12, éthoxylates d'alcools linéaires isomères (tensioactif non anionique) Glut: glutaraldéhyde Les formulations d'aldéhyde seule ou avec des tensioactifs sont très peu utilisables dans la pratique lorsque les applications nécessitent l'élimination et de l'odeur et du pouvoir irritant, qui sont toujours présents avec les solutions aqueuses d'aldéhyde. Pour éliminer l'odeur et diminuer l'agressivité de l'aldéhyde dans le liquide ou la phase gazeuse, nous avons combiné les substances anioniques et les aldéhydes avec des molécules du type glycol. Par liaisons hydrogène, le glycol et les aldéhydes vont former des complexes physiques (par ex. des molécules plus grandes) qui auront une tension de vapeur plus basse et présenteront une toxicité plus faible vis-à-vis des yeux et de la peau. Cette méthode a été suggérée d'abord par Trujillo et Lindell en 1973. Elle a été largement décrite aussi bien dans le brevet US No. 3 886 269 que dans un article intitulé "New Formaldehyde Base Disinfectants" (J. Appl. Microb. 26(1): 106-110, July 1973) qui traite de la formaldéhyde complexant avec le glycol, le glycérol et le propylène glycol. En 1973, Harriet Field, du Queen Mary Veteran's Hospital à Montréal (Canada), rend compte de l'élimination des vapeurs de glutaraldéhyde par la complexion de la glutaraldéhyde avec le propylène glycol et le glycérol. La complexion directe d'une solution de glutaraldéhyde avec le triéthylène glycol a été rapportée, pouf la première fois, en été 1975 par le présent inventeur. Le 15 février 1977, la première composition commerciale inodore de glutaraldéhyde/triéthylène glycol est approuvée par le USDA, sous l'appellation commerciale AGROCIDE 2. Un concentré de cette formule est enregistré plus tard par le EPA, le 2 février 1979, sous le No. 15136-5. Entre 1976 et 1977, H.D. Muller, de l'Université of Georgia College ofAgriculture, rend compte du remplacement, couronné de succès, de la formaldéhyde par la solution glutaraldéhyde/triéthylène glycol pour le nettoyage des couvoirs des volailles. L'usage de ces complexes de triéthylène glycol dans le domaine hospitalier est en outre rapporté par l'inventeur en novembre 1978 (Respiratory Care 23 (11): 1063-1072). Les solutions de glutaraldéhyde/triéthylène glycol utilisées ont leurs effets augmentés par la présence de tensioactifs non ioniques, ainsi que décrit dans le brevet US No. 3 968 250, ou par la combinaison de tensioactifs non ioniques et anioniques. Cependant, les tensioactifs non ioniques, cationiques et anioniques se comportent différemment et parfois en sens contraires lorsqu'ils sont en présence des composants clés (protéines, enzymes et membranes) -des virus. Par exemple, l'activité létale (virucide) des tensioactifs anioniques augmente lorsque le pH diminue, tandis que l'on observe l'effet opposé dans le cas des tensioactifs cationiques, ce qui indique que la première étape de l'interaction anionique consiste en' une absorption ionique sur la membrane. Ceci a comme résultat une cytolyse, une autolyse et éventuellement une inactivation du processus métabolique (voir D.F. Hoelzl Wallach, The Plasma Membrane, vol. 18, Heidelberg Science Library, Springer- Verlag, New-York, 1972). Dans le cas des protéines, les tensioactifs non ioniques ne montrent pas d'interaction du tout ou des interactions extrêmement faibles, tandis que les tensioactifs anioniques présentent une interaction intensive avec les protéines et les polymères. Les tensioactifs non ioniques n'inactivent pas ni ne dénaturent les enzymes. Les tensioactifs anioniques, par contre, se montrent fortement actifs en ce qui concerne l'inactivation et la dénaturation des enzymes, tandis que les tensioactifs cationiques se montrent généralement moins actifs que les anioniques (M.J. Schwuger and F.G. Bartnik. Ed. C. Gloxhuber, chapitre 1, p. 32, M. Dekker, Inc., NY 1980). Il est toutefois surprenant de découvrir que le remplacement des tensioactifs cationiques et non ioniques par des tensioactifs spécifiques anioniques, dans les solutions complexes de glutaraldéhyde-glycol, conduit à des formules virucides différentes et plus puissantes que ce que laisserait prévoir la simple addition des effets de chaque substance. Pour évaluer l'influence de l'efficacité des trois substances clés (glutaraldéhyde, triéthylène glycol et tensioactif anionique) utilisées dans la présente invention, nous avons effectué une série d'expériences avec les deux virus Coxsackie B6 et Herpès simplex Type 1, Les résultats de ces expériences sont donnés dans les tableaux V (CBV) et VI (HSV 1). Le tensioactif non ionique (brevet US No. 3 968 248) utilisé dans notre étude comparative est un mélange d'éthoxylates d'alcools isomères linéaires, fabriqué par Union Carbide sous l'appellation commerciale TERGITOL 15- S-12. La formule de ce tensioactif non ionique est la suivante: CH3-(CH2) =-CH-(CH2)=n--CH3 O-(CH2CH20) 12H o (n + n') = de 8 à 12 Il y a de 11 à 15 atomes de carbone dans la partie hydrophobe de la molécule. 1. Etudes sur le virus Coxsackie B6 A. La solution stock du virus Coxsackie B6 contient 5,17(+/-2,3) 105 pfu/ml. Les concentrations en % (poids/vol.) des réactifs dans les mélanges réactionnels sont: glutaraldéhyde: 0,006% Tergitol: 0,05% SDS: 0,05% TEG: 0,04% Des portions des virus sont mélangées avec l'une ou l'autre des préparations suivantes: 1) de la glutaraldéhyde avec ou sans TEG, SDS, ou Tergitol, 2) de la glutaraldéhyde plus TEG avec ou sans SDS ou Tergitol, 3) SDS ou Tergitol. B. Le mélange réactionnel est incubé à température ambiante pendant 10 min. La réaction est arrêtée par l'addition de métabisulfite de sodium à une concentration finale de 0,1%. Des dilutions en série d'un facteur 10 sont faites à partir de chaque mélange réactionnel. Les dilutions sont maintenues à froid dans un bain de glace. C. Ensuite quatre portions de 0,2 ml de chaque série de dilutions sont inoculées dans quatre couches confluentes de cellules MA104 (fibroblastes de reins de singe). Après 1 heure d'incubation à 37 C, on enlève les inocula de chaque monocouche. Un gel d'agar-agar est ajouté à chaque monocouche.La couche d'agar-agar contient des éléments nutritifs pour les monocouches de cellules tandis que les virus survivants et viables sont répliqués. On compte les plaques de virus trois jours plus tard et les résultats des expériences sont enregistrés. Ce procédé diffère de celui du test AOAC par le fait que le virus est présent en solution et non sur des "pénicylindres", et que Il'on compte les plaques de virus pour quantifier le virus. Dans le test AOAC, le virus est séché sur des "pénicylindres" avant son exposition à un désinfectant. Dans le test AOAC également, le virus est quantifié différemment; les monocouches infectées de virus sont comptées positivement (plaques virales présentes) ou négativement (plaques virales non présentes) 2. Etudes sur le virus Herpès Simplex Type 1 A.La solution stock du virus Herpès Simplex Type 1 contient 2,48(+/-1,0)105pfu/ml. Les stocks de virus sont mélangés dans un volume final de 1 ml. avec différentes susbtances chimiques dont les concentrations finales sont indiquées dans le tableau VI. B. Après 10 min. à température ambiante (22 à 25 C), on effectue des dilutions de 10 en série et on les inocule à quatre monocouches cellulaires à la dilution de 0,1 ml/monocouche. C. Les cellules inoculées sont incubées pendant 60 min. pour permettre aux virus de s'attacher. Ensuite, on enlève l'inoculum et on ajoute une couche de milieu de croissance du virus contenant de la méthylcellulose. Des plaques se forment cinq jours plus tard. Pour augmenter la visibilité des plaques, les cellules sont fixées avec 0,5% de glutaraldéhyde et colorées avec 1,5% de cristal violet. On compte les plaques de chaque monocouche et on les enregistre. Une caractéristique importante de la présente invention est la présence de molécules de glycol en quantité telle qu'elles éliminent la plupart des odeurs des aldéhydes sans diminuer d'une manière drastique l'efficacité virucide de la solution anionique de glutaraldéhyde. Il y a peu de publications qui se rapportent à l'activité virucide des glycols en phase liquide. Klein et Deforest rapportent (Disinfection, Sterilization, and Preservation, Ed. S.S. Block, p. 432, par Lea and Fabiger 1983), que du propylène glycol à 100% inactive à 100% les virus Coxsackie B1, mais seulement 99% (2 logs) de l'activité du Polio-virus 3. On n'a pas rapporté d'effets virucides des glycols seuls, en solutions diluées. Robertson et consorts (Science, 97, 142-144,. 1943) rapportent qu'en atomisant des glycols dans une chambre (avec 40 à 60% d'humidité), on y inactive le virus de la grippe dispersé sous forme d'aérosol. Ces résultats n'ont pas été reproduits sous forme d'essais sur le terrain. Dans nos expériences (tableaux V et VI), on a utilisé le triéthylène glycol (TEG) sous forme liquide et non sous forme d'aérosol, à des concentrations très faibles (0,04%) et on n'attendait donc pas une contribution à l'action virucide. Avec le virus Coxsackie, on n'observe pas de substantielle augmentation ou diminution de l'activité virucide après l'addition de triéthylène glycol (0,04%) à la glutaraldéhyde (0, 006%). Ainsi que l'on s'y attendait théoriquement, le triéthylène glycol seul, à la concentration de 0,04%, n'a pas d'effet sur le titre viral après 10 min. Les memes résultats sont observés lorsque l'on utilise le TEG à 0,04% avec un tensioactif non ionique ou anionique à 0,05%. Pourtant, l'activité virucide augmente lorsque l'on teste les solutions aldéhydes/tensioactifs non ioniques et glutaraldéhyde/tensioactifs anioniques, en,présence de TEG à 0,04%. Dans tous les cas, les solutions de glutaraldéhyde/tensioactifs anioniques, avec ou sans glycol, montrent toujours une action virucide plus grande que les solutions correspondantes contenant des tensioactifs non ioniques. Saitanu et Lund (Appl. Microbiol. 29 (5): 571-574) étudient aussi l'effet de la glutaraldéhyde sur le virus Coxsackie. Ils utilisent, pour la plus faible concentration, de la glutaraldéhyde à 0,05%. Ils rapportent une perte de 90% du titre en 20 min. et de 99% en 30 min. Nos résultats du tableau V montrent que la glutaraldéhyde, à une concentration de 0,006% (soit 1/80 de la quantité utilisée par Saitanu et Lung), peut conduire à une perte du titre viral de 60% en 10 min. si 0,5% de SDS est en présence de la glutaraldéhyde. Le SDS seul peut réduire le titre du virus Coxsackie B6; cependant, les cinétiques de cette réaction sont plus lentes que celles de la glutaraldéhyde à 0,006% additionnée de SDS à 0, 05%. Ceci démontre clairement l'augmentation de l'activité virucide qui se produit lorsqu'on ajoute du SDS en petites quantités à de faibles taux de glutarldéhyde. L'étude sur le virus Coxsackie B6 montre, ce qui est l'objet de la présente invention, que nous pouvons désodoriser, par l'adjonction de glycol, sans destruction de l'activité des mélanges de disladéhydes/tensioactifs anioniques. Pourtant, il est important d'insister sur le fait que les concentrations de glycol, dans la solution finale, doivent rester inférieures à 50% en poids, si l'on veut éviter une diminution de l'activité létale. Par exemple, en 1982 le Dr. Hopfer (tableau IX) à l'University of Texas System Cancer Center à Houston, a utilisé des concentrations commerciales de glutaraldéhyde (25 à 50% par poids) et a montré qu'il y avait une perte d'activité létale après adjonction de quantités importantes de glycol. La méthode analytique utilisée dans ces essais est celle du test sporicide AOAC. De bien plus petits pourcentages de glycol sont et doivent être utilisés dans la formule faisant l'objet de la présente invention. Il est dès lors très important de montrer que de faibles pourcentages de glycol n'affecteront pas d'une manière importante l'efficacité virucide de nos compositions. ! Tableau IX Activité sporicide de la gluaraldéhyde et du triéthylène glycol & 50% (poids/vol.) à température ambiante ____________________________-____________________________ Méthode AOAC 4015-4017 Organisme du test: Clostridium Sporogenies ATCC 3584 Support: Pénicylindres Solutions tests Nombre de tubes positifs sur le total testé Glutaraldéhyde à 50% 0/20 Glutaraldéhyde à 25% 1/20 Glutaraldéhyde à 25% + triéthy- lène glycol: 50% 10/20 Triéthylène glycol à 100% 20/20 On peut utiliser d'autres glycols pour désodoriser et diminuer l'agressivité des aldéhydes; cependant, on choisit le triéthylène glycol (TEG) à cause de sa complète solubilité dans les solutions acqueuses de glutaraldéhyde. Des études sur la toxicité des doses orales répétées ont montré que le TEG est plus sur que l'éthylène et que le diéthylène glycol. Les tests d'irritation des yeux ont également montré qu'il est moins irritant que le propylène glycol. Dans notre cas, nous avons utilisé entre 6,6 (CBV) et 16 fois (HSV) plus de TEG que le glutaraldéhyde. Cependant, des tests complémentaires montrent que l'élimination de l'odeur des aldéhydes se produit en utilisant des rapports TEG/glutaraldéhyde de 1 ou un peu plus élevés. Par conséquent, pour mettre en pratique cette invention, la quantité de triéthylène glycol ajoutée à la formule maximise l'élimination de l'odeur. Cette quantité devrait etre égale, mais pas inférieure, au pourcentage de glutaraldéhyde présent dans la solution aqueuse. Si nous examinons maintenant les données expérimentales se rapportant au virus Herpès Simplex Type 1 (Tableaux VI et VII), on trouve que les effets virucides, aux faibles concentrations des mélanges de glutaraldéhyde et de dodécylsulfate de sodium, sont de loin supérieurs aux effets virucides de chaque susbtance prise séparément. On a démontré précédemment le meme effet dans le cas du Coxsackie B6, plus résistant. Cependant, dans le cas du HSV 1, l'addition de TEG au mélange glutaraldéhyde/tensioactif n'augmente pas l'activité létale de cette formulation, mais la diminue légèrement (Tableau VIII). Avec le virus Coxsackie le mélange ternaire contenant l'agent anionique s'est avéré toujours plus virucide que la composition correspondante contenant le tensioactif non anionique. La diminution modérée de l'action virucide, due à l'addition de glycols dilués, est suffisamment faible pour ne pas affecter les nombreux usages de ces solutions désodorisées. Un autre avantage important de l'utilisation de tensioactifs anioniques selon l'invention est le fait que, contrairement aux tensioactifs non anioniques et cationiques, ils se combinent rapidement aux polymères et aux glycols. Dans le cas dupolyéthylène glycol, par exemple, S. Gravsholt (Proc. Scand. Symp. Surf. Active Agents 132-136, 1965) a démontré que le SDS peut facilement être lié à cette molécule. Donc la préparation de solutions virucides contenant, par exemple, les trois agents chimiques suivants: glutaraldéhyde, triéthylèné glycol et dodécylsulfate de sodium, est extrêmement facile puisque TEG et SDS se dissolvent en quelques minutes dans une solution aqueuse acide de glutaraldéhyde sous une agitation douce et à température ambiante. Ainsi que nous l'avions expliqué précédemment, le pH des solutions ternaires est extrêmement important puisqu'il définit (Boucher, Proc. West Pharmocol. Soc. 16:282-288, 1973) la quantité de monomères d'aldéhydes libres disponibles pour se combiner aux molécules critiques de la structure virale. Toutes les expériences menées avec des solutions dont le pH était supérieur à 7,5 ou inférieur à 4,2 ont présenté une activité virucide plus faible. La gamme de pH préférée s'étend de 7,2 à 4, 5. Une telle tendance a été déjà observée par Saitanu et Lund, étudiant l'activité des solutions de glutaraldéhyde sans M-lycol sur le virus Coxsackie B3 (Appl. Microb. 29 (5): L71-574, May 1975). Les sels tampons des substances chimiques suivantes et leurs mélanges ont été utilisés avec succès, avec les mélanges ternaires faisant l'objet de la présente invention: le potassium monobasique ou le phosphate de sodium avec du phosphate anhydre dibasique de sodium, l'acide maléique, l'acide citrique trisodique, le tampon citrate-phosphate, l'acide succinique, le tampon cacodylate, l'acide n-(2-acétamido)imino- diacétique, la n-pipérazine, l'acide nx-bis-(2-éthane sulfonique), l'acide 2(n-morpholino)éthane sulfonique, avec des pKa variant de 4,2 à 7,2. Deux des principaux avantages des compositions selon la présente invention sont l'élimination de l'odeur des aldéhydes et le faible degré d'irritation lorsqu'elles sont utilisées localement. Les liens entre le glycol et les aldéhydes monomères paraissent être suffisamment forts pour diminuer la tension de vapeur de la solution sans affecter grandement l'état de réaction des aldéhydes tant que la quantité totale de triéthylène glycol ne dépasse pas 10 à 25% de son poids. Pour évaluer le potentiel desdites compositions comme antiseptiques pour la peau, nous avons fait quelques tests d'irritation avec la composition utilisée lors de l'étude sur le virus Coxsackie B6 (voir tableau V). Les méthodes approuvées par la EPA et la FDA nous ont permis de calculer le niveau d'irritation primaire de la peau (PSI) suite à une simple application sur la peau intacte d'un lapin blanc de Nouvelle-Zélande. L'échelle des niveaux (voir T. Soc. Cosmet. Chem. 13(6): 281-289, 1962) s'étend de 0 (non irritant) à 8,0 (extrêmement irritant). Les trois catégories les plus basses sont: non irritant (0,00-0,09), extrêmement peu irritant (0,10-0,50) et légèrement irritant (0,50-1,50). La formulation du tableau V tombe dans la catégorie non irritant. Une autre étude a également été effectuée avec la même formulation, selon la méthode normalisée FDA, pour évaluer l'irritation vaginale potentielle. Le traitement de la muqueuse vaginale avec la formulation du tableau V ne provoque aucune irritation significative de la muqueuse. En ce qui concerne l'irritation de l'oeil, nous avons utilisé le test EPA (40 CFR 163.81-4) et la formulation a été considéré comme non irritante après 72 heures d'exposition. Tous les tests mentionnés ci-dessus indiquent que les formules virucides fortement diluées de la présente invention montrent un niveau de toxicité aussi faible et même plus faible que la plupart des antiseptiques et produits de nettoyage qui'sont à base de iodophores, de composés d'ammonium quaternaires, de gluconate de chlorhexidine et de solutions alcooliques. Il est également possible que la composition selon la présente invention contienne des alcools faibles tels que le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol ou similaires. Un mélange de deux alcools peut aussi être utilisé. Ces minimes modifications dans la composition du solvant seront dictées par la nature des applications: décontamination des instruments, des surfaces vivantes ou non, élimination des germes sur la peau, nettoyage de plaies, etc. S Bien que le concept de l'invention soit décrit ci-dessus au travers de plusieurs exemples spécifiques, à des fins d'illustration, l'invention n'est pas limitée aux caractéristiques spécifiques mentionnées dans ces exemples. Il est aussi bien entendu que des changements, modifications et variations peuvent être effectués sans s'écarter de l'esprit et du champ de la présente invention. REVENDICATIONS 1 Composition virucide liquide exempte de phénol, caractérisée en ce qu'elle comprend: a) un solvant se composant d'eau ou d'un alcool faible (alcanol) b) une monoaldéhyde saturée ou une dialdéhyde contenant de deux à six atomes de carbone; c) un agent réducteur d'odeur, choisi parmi le groupe comprenant: l'éthylène-glycol, le propylène-glycol, le diéthylèneglycol, le triéthylène-glycol, le polyèthylène-glycol, le polypropylèneglycol et les mélanges de ceux-ci; d) un tensioactif anionique ayant un groupe hydrophile chargé négativement, choisi dans un groupe comprenant les sulfates d'alkyle, les sulfonates d'alkyle, les sulfates alcooliques, les sulfonates d'alkyle-aryle, les sulfosuccinates dialkyles et les mélanges de ceux-ci; et e) des sels tampons en quantité suffisante pour stabiliser le pH des solutions virucides dans la gamme de pH d'environ 4 à environ 7,4. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite dialdéhyde est la glutaraldéhyde. 3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit agent réducteur d'odeur est le triéthylène- glycol. 4. Composition selon la revendication 1 ou 3, caractérisée en ce que la quantité maximum de glycol est comprise entre 10 et 20% environ en poids par rapport au poids de la solution. 5. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit tensioactif anionique est le dodécylsulfate de sodium. 6. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le rapport des poids du composé glycol et de l'aldéhyde est compris entre 1 et 32. 7. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le rapport des poids du tensioactif anionique et de l'aldéhyde n'est pas inférieur à environ 1 à 4, ni supérieur à environ 10 à 11. 8. Composition aqueuse selon la revendication 1, capable de détruire des virus avec ou sans enveloppe sur des surfaces inertes ou vivantes en moins de trente minutes, caractérisée en ce qu'elle a une teneur en aldéhyde égale ou supérieure à 0,00125% en poids. 9. Composition aqueuse selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient des sels tampons la maintenant dans une gamme de pH de 7, 4 à 4,5 à température ambiante. 10. Composition selon la revendication 1 ou 8, caractérisée en ce qu'elle contient un tampon choisi parmi le groupe comprenant: l'acide maléique, l'acide citrique trisodique, le tampon phospho-citrate, l'acide succinique, le tampon cacodylate, l'acide n-(2 acétamido)imino-diacétique, la n-pipérazine, l'acide nl- bis-2l2-éthanesulfonique), l'acide éthane 2(n- morpholino)sulfonique et les mélanges de ces derniers, ayant un pKa compris entre 4,2 et 7,2. 11. Composition aqueuse selon la revendication 1 ou 8, caractérisée en ce qu'elle est tamponnée dans une gamme de pH de 6,2 à 6,4 avec une combinaison de phosphate métallique monobasique et de phosphate anhydre de sodium dibasique.