FR 2643267 A1 19900824 FR 8902338 A 19890223 t La présente invention est relative à des compo- sitions à propriétés cytolytiques spécifiques vis-à-vis de cellules cibles appropriées, & leur application en tant que médicaments anticancéreux ainsi qu'à leur application à l'épuration de la moelle osseuse. Depuis le développement des anticorps monoclo- naux (Amc), l'un des buts de la biotechnologie a été la synthèse d'immunotoxines, ou "magic bullets", c'est-à-dire d'Amcs spécifiques d'un type de cellule (habituellement une cellule cancéreuse) couplés à un agent capable de détruire lesdites cellules. En général un Amc est préparé de manière à avoir une spécificité pour un antigène présent à la sur- face de la cellule cible, de telle sorte que l'Amc se liera à la cellule cible, et lorsqu'il sera incorporé à ladite cellule, il transportera son conjugué toxique à l'intérieur de cette dernière. Le conjugué toxique est, la plupart du temps, du ricin, ou la sous-unité A du ricin. La sous-unité B se lie aux résidus galactose omniprésents à lasurface des cellules, tandis que la sous-unité A inactive enzymatique- - ment les ribosomes. Il a été estimé qu'une seule molécule de ricin peut inactiver tous les ribosomes d'une cellule. La cellule envahie, incapable de produire de nouvelles pro- téines, meurt. Comme la sous-unité B est capable de se lier à presque n'importe quelle cellule, elle doit être désacti- vée ou exclue de toute thérapeutique. Dans le cas d'étude in vitro, le ricin est ha- bituellement utilisé globalement, la sous-unité B étant sa- turée avec du galactose pour empêcher les liaisons non-spé- cifiques. Dans les études in vivo, la sous-unité B est habituellement retirée et un conjugué Amc-ricin A est uti- lisé. Bien que la conjugaison du ricin à l'Amc aug- mente beaucoup la sélectivité de la cytotoxicité du ricin, sa toxicité résiduelle, due à des liaisons non spécifiques et à des liaisons avec les récepteurs Fc, est encore impor- tante. D'autres agents toxiques, quelquefois utilisés dans les immunotoxines comprennent des atomes radioactifs, la toxine diphtérique et des agents utilisés en chimiothé- rapie anticancéreuse. Ces immunotoxines présentent une toxicité résiduelle similaire à celle des immunotoxines comprenant du ricin, et ce, pour les mêmes raisons. S.J. KLEBANOFF (J. Exp. Med., 1967, 12., 1063- i0 1076), décrit une méthode pour détruire des bactéries in vitro, en utilisant la myéloperoxydase, des ions iodures et du peroxyde d'hydrogène. Le peroxyde d'hydrogène peut être remplacé par une combinaison de glucose et de glucose oxy- dase, qui, en fait, est plus efficace que le peroxyde d'hydrogène. L'effet bactéricide est apparemment dû à la formation de liaisons carboneiode directement, plutôt qu'à la formation d'iode suivie d'une iodination. KLEBANOFF mentionne également que l'iodure peut être remplacé par du bromure ou du chlorure. Les conditions de l'expérience demandent 0,01.M d'H202 en présence de 0,1 #M d'I-, ou 0,5 gM de glucose en présence de 0, 5 gg de glucose oxydase et 0,1 pM d'I-, à pH 5. Cependant, il faut noter qu'un pH de 5 est in- férieur au pH physiologique et que la concentration d'iodure dans le sérum normal est inférieur à environ 1 pg/100 ml (moins de 0,079 MM). STARKIE (WO 87/03205) décrit une composition pour détruire des cellules ou un organisme, in vivo, com- prenant un anticorps spécifique à la cellule ou à l'organisme à détruire, lié à une enzyme toxique. STARKIE cite notamment la glucose oxydase, qui en produisant du peroxyde d'hydrogène, détruit les cellules par oxydation des composés de la paroi cellulaire. Cependant, de nombreux types de cellules sont résistants au peroxyde d'hydrogène en raison de la présence d'agents antioxydants endogènes tels que les glutathions, de.telles cellules étant réfrac- taires à une composition de ce type. T.J. SULLLIVAN et al., Res. Commun. Chem. Path. Pharmacol., 1973,.6, 709-717, décrit une composition pour le traitement de la filaire du chien due à Dirofilaria immitis, comprenant de la glucose oxydase (GO) conjuguée & un anticorps anti-Dirofilaria immitis, suivi d'un traite- ment à la peroxydase de raifort et à la phénylènediamine. Le conjugué GO lié à la surface du parasite, produit du H202, qui est à son tour consommé par la peroxydase de rai- fort en convertissant la phénylène diamine en radicaux cy- totoxiques. SULLIVAN décrit également la radioiodination des parasites par l'utilisation de lactoperoxydase libre et d'iodure en combinaison avec le conjugué GO, mais il n'a pas mis en évidence d'effet cytotoxique. R.B. LAL et al., J. Immunol. Meth., 1985, /, 307-318 décrit une composition, pour éliminer sélectivement des sous-populations de lymphocytes, comprenant des conju- gués enzymes-anticorps. LAL a sélectionné des enzymes libres pour leur effet cytolytique et a déterminé que la glucose oxydase et la phospholipase C (PLC) sont cyto- toxiques vis-à-vis de sous-populations de lymphocytes, tan- dis que la xanthine oxydase, la phospholipase A2 et la phospholipase D sont sans effet, et que la choline oxydase est efficace en présence de 10 mM de choline. LAL a ensuite conjugué la glucose oxydase et la phospholipase C à un anticorps monoclonal de souris anti- IgG de rat. Ces conjugués se sont avérés sélectifs vis-à- vis de sous-populations de lymphocytes murins en présence de différents anticorps monoclonaux de rat anti-souris, (spécifiques des antigènes de surface cellulaire). La GO ou la PLC ajoutées à 2,5.10-8 g/ml entraînent la mort de 25 % et 28 % de cellules, alors que la combinaison GO et PLC en- traîne 75 % de mort cellulaire. La GO conjuguée ou la PLC conjuguée sont capables de détruire 85-90 % de thymocytes ciblés à 250.10-8 g/ml; cependant, la GO conjuguée est cy- totoxique vis-à-vis de cellules non-ciblées à 25:10-' g/ml. De plus, au delà de 15 jours, l'activité du conjugué GO dé- cline d'un facteur de 63 000, et a conduit LAL a arr#té ces tests. J. PENE et al. Biochem. Internat., 1986, 13, 233-43 décrit la destruction de cellules de myélome in vi- tro. Cet article montre en effet, le potentiel tumoricide de conjugués enzyme-anticorps sur des cellules de myélome !0 d'origine murine. Cet article décrit en particulier des conjugués anticorps-glucose oxydase et anticorps-lactoperoxydase qui véhiculent ces enzymes, de manière spécifique au niveau de la membrane de cellules myélomateuses. La toxicité de ces conjugués, vis-à-vis de cei- lules myélomateuses NSO est étudiée en fonction du pourcen- tage de libération de 51Cr. Les cellules myélomateuses peu- vent être tuées in vitro par préincubation avec un antisé- rum de lapin spécifique de la tumeur, suivi d'une incuba- __ tion avec de la glucose oxydase (GO) et de la lactoperoxy- dase (LPO) conjuguées à des anticorps monoclonaux Ig anti- lapin, suivi d'une incubation dans du glucose et du NaI. Le traitement utilisant tous les composés (avec NaI à 0,1 mM) est suffisant pour entraîner la libération de 85 % de 5sCr à partir des cellules myélomateuses in vitro, tandis que l'omission de l'un des composés précédemment défini en- traîne une chute de la libération de 5lCr aux valeurs contrôle. Le BCNU, également dénommé carmustine, est par- _c fois administré dans le traitement de tumeurs du système nerveux central. En tant que moutarde azotée bifonction- nelle, il est considéré comme inhibant la DNA nucléotidyl transférase; il interfère avec les acides nucléiques par alcoylation, et entraîne une série de troubles: altération Z: de la structure de la guanine favorisant l'appariement avec la thymine; clivage du cycle imidazole de la guanine; formation de liaison entre deux restes guanines, réalisant des ponts entre les deux brins de DNA qui empêchent la re- plication; dépurination du DNA provoquant une rupture du brin. s Sa forte solubilité dans les lipides lui permet de traverser la barrière hématoencéphalique de telle sorte que sa concentration dans le liquide céphalorachidien est supérieure à sa concentration plasmatique. Il présente, comme tous les anticancéreux de 1o nombreux effets indésirables, notamment une dépression re- tardée des cellules de la moelle osseuse, une thrombocyto- pénie et une leucopénie durant 2 à 7 semaines ainsi qu'une hépatotoxicité dans 26 % des cas. Le BCNU est rapidement éliminé de la circula- tion sanguine et a une demi-vie de 2 à 3 minutes. Chez la souris, sa DL5o est approximativement de 25 mg/kg, lorsqu'il est administré oralement, intrapéri- tonéalement et en sous cutanée. Chez l'homme, il est administré en I.V., à mg/m2 de surface corporelle. On a également montré que le BCNU inactive spé- cifiquement la glutathion réductase, qui joue un r8le im- portant pour la protection cellulaire vis-à-vis des molé- cules productrices d'oxygène; un certain nombres d'Auteurs ont montré que la désactivation de la gluthation réductase peut être envisagée pour induire une cytotoxicité vis-à-vis des cellules tumorales. J.R. BABSON et ai., Biochem. Pharmacol., 1981, , 2299-2304, décrit des expérimentations in vitro mon- trant une cytotoxicité accrue de l'adriamycine sur les hépatocytes, lorsqu'elle est administrée avec du BCNU. J.M. HARLAN et al., J. clin. Invest., 1984, 73, 706-713, montre que des cellules endothéliales traitées in vitro avec du BCNU puis par de la glucose oxydase sont plus sensibles aux dommages dus au peroxyde. 264326F En effet, le cycle redox du glutathion joue un rôle dans le mécanisme de défense antioxydant. Le BCNU inhibe sélectivement la glutathion ré- ductase et un prétraitement de cellules endothéliales par du BCNU potentialise toujours la lyse liée à la présence d'H202. La lyse de cellules prétraitées par du BCNU est également potentialisée par les complexes glucose-glucose oxydase et xanthine-xanthine oxydase. B.E. STARKE et al., J. Biol. chem., 1985, 260, 86-92 ont montré que l'inhibition du système de la gluta- thion réductase par le BCNU rend les cellules plus sen- sibles à l'attaque du peroxyde. Dans les expériences décrites, le peroxyde d'hydrogène est généré in situ en utilisant la glucose oxy- dase. Il est en particulier montré que l'inhibition de la catalase potentialise la mort cellulaire par un méca- nisme qul est insensible aux antioxydants, alors que _ l'inhlbltlon du cycle de la glutathlon réductase potentia- lise un mécanisme de mort cellulaire sensible aux antioxy- dants et accompagné de peroxydation lipidique et de produc- tion d'H202. Cet article montre que des doses de glucose oxydase qui tuent moins de 20 % d'hépatocytes natifs, en- traînent la mort de 50-70 % des cellules prétraitées avec du BCNU. I.E. COTGREAVE et al., Biochem. Pharmacol., 1987, 36, 2899-2904, montrent que le BCNU potentialise la cytotoxlcité du diquat (herbicide bipyridyle) qui produit de l'oxygène actif dans les cellules. Toutefois, cet article étudie plus particuliè- rement l'inhibition de la cytotoxicité du diquat par l'Ebselen seul ou associé à de la glutathion réductase de la N-acétylcystéine, en utilisant comme modèle d'étude des hépatocytes traités avec du BCNU. C.F. NATHAN et al., J. Exp. Med, 1981, 154, 1539-1553, décrit l'utilisation de glucose oxydase liée & des particules de latex pour traiter des tumeurs intrapéri- tonéales chez la souris. La combinaison de glucose oxydase liée et de BCNU est synergique dans le traitement des tumeurs résis- tantes au peroxyde. Cependant, les particules sont séparées en grumeaux qui forment des dépôts solides, qui sont répar- tis dans la totalité de la cavité péritonéale. O10 M.G. BATTELLI et al. décrit un conjugué anti- corps-enzyme consistant en xanthine oxydase liée à un anti- corps monoclonal. La xanthine oxydase catalyse l'oxydation de l'hypoxanthine en xanthine et celle-ci en acide urique. La xanthine oxydase existe sous deux formes: la D forme et la forme O. Lors de l'oxydation de l'hypoxanthine en xan- thine, catalysée par la xanthine oxydase sous sa forme O, des radicaux libres cytotoxiques sont produits, ce qui ag- grave les dommages cellulaires lors de la conversion de la forme D en la forme O. Le conjugué décrit dans cet article est cyto- toxique vis-à-vis des cellules cibles uniquement. C.F. NATHAN et al., J. Exp. Med., 1980, 153, 766-782 montre que l'inhibition du cycle redox du glutha- tion des cellules tumorales augmente leur sensibilité vis- à-vis des macrophages inducteurs de cytolyse. Le cycle redox glutathion participe à la dé- fense des cellules tumorales contre les antioxydants et est inhibé par le BCNU. Cet article montre également que les cellules tumorales prétraitées avec du BCNU sont plus sensibles à la lyse par le peroxyde. P.K. NAKANE et al., J. Histochem. Cytochem., 1984, 32, 8, 894-898, montrent que le composant sécréteur (SC) et l'antigène carcinoembryonaire sont distribués dif- féremment dans l'épithelium gastrointestinal normal et dans les cellules cancéreuses de l'épithelium gastroinstestinal. L'hypothèse est que de l'anti CEA injecté en I.V. n'est pas accessible aux cellules normales mais for- mera des complexes avec les cellules cancéreuses. Cet article décrit plus spécifiquement un conjugué efficace in vivo glucose oxydase-anti CEA injecté en I.V. puis suivi d'une injection de NaI. G.W. PHILPOTT, Surg., 1973, 74, 1, 51-58, dé- lO crit un système in vitro conjugué anticorps-GO, associé à de la lactoperoxydase (LP), et des iodures (I-) et précise que le couplage d'enzymes puissantes à des anticorps anti- tumeur peuvent être utiles pour obtenir une thérapie anti- tumorale sélective. Lorsque de l'iodure et une deuxième enzyme, la lactoperoxydase sont ajoutés au système, la cellule subit une iodlnation et meurt. R.B. BASCH et al., J. Immunol. Methods, 1983, 56, 269-2?d. décrit d'autre part un conjugué anticorps-ca- 2c talase qui rend les cellules résistantes au peroxyde d'hydrogène. Les compositions de l'Art antérieur présentent cependant un certain nombre d'inconvénients: - la plupart de ces compositions ont été tes- tées uniquement in vitro et leur comportement in vivo n'est pas connu; les compositions, qui ont été testées in vivo, ont l'inconvénient de présenter une toxicité non spé- cifique trop importante vis-à-vis de cellules présentes dans le même environnement que les cellules cibles; - les doses utilisées dans ces compositions sont toujours très toxiques pour l'Homme. La Demanderesse s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des compositions qui répondent mieux aux nécessités de la pratique que les compositions de l'Art an- térieur notamment en ce qu'elles présentent une spécificité accrue vis-àvis de cellules cibles, notamment vis-à-vis des cellules immunes ou tumorales, tout en permettant l'administration de doses inférieures à celles administrées antérieurement. La présente invention a pour objet une composi- tion à propriétés cytolytiques spécifiques vis-à-vis de cellules cibles appropriées présentant au moins un antigène de surface, caractérisée en ce qu'elle comprend en combi- naison: - un inhibiteur de la glutathion réductase; - au moins une immunotoxine comprenant une en- zyme conjuguée à un ligand spécifique d'un antigène de sur- face des cellules cibles. Selon un mode de réalisation avantageux de la- dite composition, celle-ci comprend en combinaison: - un inhibiteur de la glutathion réductase'; - une première immunotoxine comprenant une en- zyme El productrice d'oxygène réactif conjuguée à un ligand A spécifique d'un antigène de surface desdites cellules cibles (immunotoxine Ei-A); et - une deuxième immunotoxine comprenant une en- zyme Ez, productrice de dérivés halogénés en présence d'un halogénure et de l'oxygène réactif produit en présence de l'enzyme El, conjuguée à un ligand B capable de se lier spécifiquement à un antigène de surface desdites cellules cibles (immunotoxine E2-B). Selon un mode de réalisation préféré de la com- position conforme à l'invention, l'inhibiteur de la gluta- thion réductase est une nitrosourée. Selon une disposition de ce mode de réalisa- tion, la nitrosourée est avantageusement la 1-3 bis (2- chloroéthyl)-1-nitrosourée, également dénommée carmustine ou BCNU. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'enzyme conjuguée à un ligand pour former une immunotoxine ou l'enzyme Ei de la première immunotoxine 264326? O10 susdite, est choisie dans le groupe qui comprend la glucose oxydase, la NADPH oxydase, la xanthine oxydase,.la choles- térol oxydase, la choline oxydase, l'acide lactique oxydase et la pyruvate oxydase. Dans le cas o la composition à propriétés cy- tolytiques comprend en combinaison un inhibiteur de la glu- tathion réductase et une seule immunotoxine, cette dernière est avantageusement constituée par un conjugué d'une enzyme Ei productrice d'oxygène réactif et d'un ligand A spéci- fique d'un antigène de surface des cellules cibles. De préférence, l'enzyme générant de l'oxygène actif (El) utilise un substrat présent chez l'homme en quantités suffisantes pour que ladite enzyme E1 génère l'oxygène actif en quantité suffisante pour obtenir une cy- totoxicité convenable. Par exemple la GO (glucose oxydase) génère suf- fisamment d'H202 en présence du glucose présent dans le sé- rum pour détruire les cellules cibles choisies. Ladite enzyme E1 peut être d'origine humaine ou d'origine animale. Des enzymes recombinantes incluant des fragments d'enzymes comprenant le site actif peuvent égale- ment être utilisées. Selon un autre mode de réalisation de la compo- sition conforme à l'invention, l'enzyme E2 de la deuxième immunotoxine susdite, est choisie dans le groupe qui com- prend la myéloperoxydase, la lactoperoxydase, l'éosinophile peroxydase et la peroxydase salivaire. Le substrat de l'enzyme E2 est un halogénure et est administré concomitamment à la composition conforme à l'invention. Ledlt halogénure est administré séparément et est notamment du iodure de sodium, non toxique même à dose élevée. Selon un autre mode de réalisation de la compo- sition conforme à l'invention, le ligand conjugué à une en- zyme pour constituer une immunotoxine est choisi dans le groupe qui comprend les antisérums, les anticorps polyclo- naux, les anticorps monoclonaux et les fragments d'anticorps, capables de se lier spécifiquement à un anti- gène de surface de la cellule cible. * On entend par ligand, une substance capable de se lier à un antigène de surface désiré tout en ne se liant pas aux cellules non-cibles. Conformément à l'invention, dans le cas o la composition comprend les deux immunotoxines El-A et E2-B définies plus haut, le ligand A et le ligand B peuvent être o10 identiques ou différents et l'un et/ou l'autre, peuvent être avantageusement choisis parmi les ligands des récepteurs de l'antigène cellulaire T et les ligands de l'immunoglobuline de surface. L'immunoglobuline de surface est un marqueur préféré des lymphomes. On entend par fragments d'anticorps notamment les fragments Fab et les fragments F(ab')z. Le terme conjugué signifie que l'enzyme et le ligand sont connectés par des liaisons covalentes. Ceci est accompli par des moyens connus en soi et généralement appliqués aux anticorps marqués avec des enzymes pour les tests ELISA, typiquement en utilisant des réactifs de liai- son bifonctionnelle tels que le SPDP, le MBS et le SMCC et analogues. Chaque molécule de ligand peut être liée à une ou plusieurs molécules d'enzyme. L'enzyme et le ligand peu- vent également être conjugués à l'aide d'une méthode recom- binante, c'est-à-dire par l'expression de l'enzyme et du ligand comme une seule protéine de fusion. Par exemple, dans le cas des thymocytes commes cellules cibles, et avec comme antigène de surface le récepteur de l'interleukine-2, on peut préparer un vecteur d'expression (un plasmide) por- teur du gène codant pour 1'IL-2 (ou sa fraction de liaison) et fusionné avec un gène codant pour la glucose oxydase. L'expression de ce gène composé produit une proteine de fusion IL-2/GO, ayant un domaine de liaison à 264326F l'IL-2 capable de se lier au récepteur de l'IL-2 de la cel- lule T, et un domaine GO capable d'une action cytotoxique. Conformément à l'invention, les cellules cibles appropriées sont choisies dans le groupe qui comprend les cellules tumorales, les bactéries, les champignons, les protozoaires, les cellules autoimmunes, les cellules in- flammatoires, les cellules infectées par un virus, les le- vures, les virus, les parasites. On entend par cellule cible, n'importe quelle cellule que l'on désire détruire et qui comporte au moins un antigène de surface qul permet de la distinguer des cel- lules non-cibles. On entend par antigène de surface, une pro- téine, un glucide, un lipide qui est caractéristique de la cellule cible et qui est capable de lier spécifiquement un ligand approprié. Une telle composition présente un certain nombre d'avantages inattendus par rapport aux compositions de l'Art antérieur; en effet, non seulement il existe un effet cytolytique synergique entre la nitrosourée et l'imunotoxine Ei-A et entre la nitrosourée et les immuno- toxines Ei-A et E2-B, mais, les doses de nitrosourées sont nettement diminuées et l'on obtient de plus un gain de spé- cificité, dû à la présence d'au moins l'une de ces immuno- toxines. En outre, la présence de la deuxième immuno- toxine (E2-B) neutralise, de manière inattendue, la toxi- cité non spécifique de la première immunotoxine (El-A) et présente, de ce fait, à la fois une synergie de la toxicité spécifique et une neutralisation de la toxicité non spéci- fique. Selon encore un autre mode de réalisation, la composition conforme à l'invention contient en outre, une autre immunotoxine qui comprend une catalase conjuguée à un ligand C approprié, capable de se lier aux antigènes de surfaces de cellules présentes dans le même milieu que les cellules cibles (immunotoxine catalase-C) et qui est asso- ciée soit à la composition comprenant un inhibiteur de la glutathion réductase et une immunotoxine El-A, soit à la composition comprenant un inhibiteur de la glutathion r6- ductase et les immunotoxines Ei-A et E2-B. Une telle composition conforme à l'invention permet d'accroUtre encore la spécificité vis-à-vis des cel- lules cibles, en accroissant la protection vis-à-vis des cellules que l'on ne désire pas détruire. iC La catalase présente des propriétés protec- trices à partir de 2 pg/ml. La composition conforme à l'invention est avan- tageusement mise sous une forme qui permet, en l'associant à un véhicule approprié, son administration de préférence par vole parentérale et avantageusement en IV ou en perfu- sion. Comme tous les médicaments utilisés en chimio- thérapie, il est difficile de définir les doses à adminis- trer, celles-ci étant adaptées au patient et au type de tu- meur. La quantité efficace de BCNU, bien que celui-ci SOlt un agent thérapeutique connu et que son index théra- peutlque ait déjà été établi, varie en fonction des cel- lules cibles, de leur dépendance vis-à-vis de la gluthation réductase et de leur sensibilité à la lyse par le peroxyde. Cependant, de manière générale, la quantité ef- flcace de BCNU sera celle qui permettra d'obtenir une concentration comprise entre 0,03 et l0 pg/ml, de préfé- rence entre environ 0,1 et 3 pg/ml, ceci correspondant à environ 0,15-50 mg/dose, de préférence 0,5-15 mg/dose, alors que la posologie usuelle est de 100 mg/dose. La quantité efficace en immunotoxines est en- core plus difficile & établir et dépend de beaucoup de pa- ramètres. z5 En général, une quantité efficace de chacune des immunotoxines sera celle qui fournit une concentration comprise entre 0,5 et 10 Mg/ml. Ceci correspond à environ -25 mg/dose. La composition conforme à l'invention peut avantageusement être injectée en deux étapes successives: d'abord le BCNU, puis l'immunotoxine ou le mélange d'immunotoxines; l'halogénure est ensuite avantageusement administré par voie orale. Conformément à l'invention, ladite composition comprend, pour une dose, une quantité en BCNU comprise entre 0,15 et 50 mg et une quantité en immunotoxine Ei-A comprise entre 5 et 25 mg, ainsi que, si la deuxième immu- notoxine E2-B est présente, une quantité d'immunotoxine E2- B comprise entre 5 et 25 mg. Dans le cas des cancers, une composition cyto- toxique conforme à l'invention permet l'élimination des cellules tumorales et permet notamment l'obtention d'une rémission de la maladie. Dans le cas des maladies autoimmunes, une telle composition permet l'élimination spécifique des lymphocytes autoimmuns entraînant une répcnse immunitaire contre cer- tains organes propres à l'individu concerné, tel que les cellules Tcytotoxiques vis-à-vis des cellules des ilôts de Langerhans, dans le diabète insulino-dépendant. La composition conforme à l'invention est éga- lement applicable aux maladies infectieuses (bactériennes, virales et parasitaires). La présente invention a également pour objet un procédé d'épuration ex vivo de la moelle osseuse de cel- lules cibles indésirables présentant au moins un antigène de surface, caractérisé en ce qu'll comprend les étapes suivantes: (a) aspiration des cellules de la moelle os- seuse, (b) mise en contact desdites cellules avec une composition conforme à l'invention, pendant un temps appro- prié. Z643267 La composition conforme à l'invention est constituée par -la combinaison d'un inhibiteur de la gluta- thion réductase, soit avec une immunotoxine Ei-A comprenant une enzyme El productrice d'oxygène réactif conjuguée & un ligand A spécifique d'un antigène de surface des cellules cibles, soit avec deux immunotoxines, & savoir l'immunotoxine Ei-A précitée et l'immunotoxine Ez-B définie plus haut, soit avec trois immunotoxines, à savoir 1'immunotoxine Ei-A,l'immunotoxine E2-B et l'immunotoxine catalase-C également définie plus haut. Une variante de ce procédé comprend la mise en contact successive des différents composants de la composi- tions conforme à l'invention. Ledit procédé comprend alors les étapes sui- vantes: (a) aspiration des cellules de la moelle os- seuse, (b) mise en contact desdites cellules avec une quantité efficace d'inhibiteur de la glutathion réductase 2' puis (c) mise en contact desdites cellules avec une quantité efficace d'une immunotoxine constituée par un conjugué d'une enzyme avec un ligand capable de se lier spécifiquement à un antigène de surface spécifique des cel- lules cibles. Une autre variante de ce procédé comprend les étapes successives suivantes: (a) aspiration des cellules de la moelle os- seuse, (b) mise en contact desdites cellules avec une quantité efficace d'inhibiteur de la glutathion réductase puis (z> mise en contact desdites cellules avec une quantité efficace d'une première immunotoxine Ei-A, compre- nant une enzyme Ei générant de l'oxygène réactif conjuguée à un ligand A capable de se lier spécifiquement à un anti- gène de surface spécifique des cellules cibles, associée à une deuxième immunotoxine E2-B, comprenant une. enzyme E2 productrice de dérivés halogénés en présence d'un halo- génure et de l'oxygène réactif produit en présence de l'enzyme El, conjuguée à un ligand B capable de se lier spécifiquement à un antigène de surface desdites cellules cibles. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé d'épuration ex vivo de la moelle osseuse, il com- prend en outre: (d) la mise en contact desdltes cellules avec une troisième immunotoxine catalase-C, comprenant une cata- lase conjuguée à un ligand C approprié, capable de se lier aux antigènes de surface de cellules présentes dans le même milieu que les cellules-cibles. Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux de la présente invention, l'inhibiteur de la gluta- thion réductase est une nitrosourée. Selon une disposition avantageuse de ce mode úc de mise en oeuvre, la nltrosourée est avantageusement la 1- 3 bis (2-chloroéthyl)-l-nitrosourée, également dénommée carmustine ou BCNU. Selon un autre mode de mise en oeuvre de ce procédé conforme à l'invention, l'enzyme El est choisie dans le groupe qui comprend la glucose oxydase, la NADPH oxydase, la xanthine oxydase, la cholestérol oxydase, la choline oxydase, l'acide lactique oxydase et la pyruvate oxydase. Selon un autre mode de mise en oeuvre du pro- 3c0 cédé conforme à l'invention, l'enzyme E2 est choisie dans le groupe qui comprend la myéloperoxydase, la lactoperoxy- dase, l'éosinophile peroxydase et la peroxydase salivaire. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, le ligand conjugué à l'enzyme E1 ou à chacune des enzymes El, E2, catalase, est choisi dans le groupe qui comprend les antisérums, les an- ticorps, les fragments d'anticorps capables de se lier spé- cifiquement à un antigène de surface de la cellule cible. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, les cellules cibles à dé- truire sont des thymocytes et l'antigène de surface est une protéine caractéristique des thymocytes. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, ledit antigène de surface est choisi dans le groupe qui comprend l'antigène T4, l'antigène Ts et l'antigène Thyl. Selon un autre mode de mise en oeuvre du pro- cédé conforme à l'invention, les cellules cibles à détruire sont des cellules B de lymphomes. Le procédé d'épuration ex vivo de la moelle os- seuse conforme à l'invention, est applicable aussi bien dans le cas des autogreffes (épuration de la moelle osseuse des cellules cancéreuses) que dans le cas des allogreffes (épuration de la moelle osseuse à greffer des lymphocytes normaux qu'elle contient pour prévenir une réaction du - greffon contre l'hôte (G.V.H.)). Outre - les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui res- sortiront de la description qui va suivre, qui se réfère & des exemples de compositions conformes à l'invention, à la mise en évidence de leurs propriétés pharmacologiques ainsi qu'à des exemples de mise en oeuvre du procédé d'épuration. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1: Préparation des immunotoxines com- portant un anticorps anti-lapin de chèvre (g). l.a. Préparation de alucose oxvdase conruuée à un anticorDs antl-laDin de chèvre (a-GO). La glucose oxydase (GO) est obtenue à partir d'Aspergillus niger. L'anticorps anti-lapin de chèvre (g) peut être obtenu par des techniques standards ou peut être acheté (Antibodies Inc. par exemple). Par exemple, l'anticorps acheté chez Antibodies Inc., est purifié par chromatogra- phie d'affinité sur Sépharose 4B conjuguée avec des Ig de lapin normales. La GO est conjuguée à l'anticorps purifié à l'aide de glutaraldéhyde, comme décrit dans l'Art antérieur (AVRAMEAS, Immunochem., 1969, 5,43-52). Les conjugués obtenus sont repurifiés par chro- matographie d'exclusion sur une colonne S-300 dans 10 mM NaOAc, 150 mM Nacl, pH 5,8, de manière à éliminer l'enzyme non liée. On peut également purifier les conjugués obte- nus par immunoaffinité, en utilisant une colonne conjuguée à un anticorps monoclonal anti-Fv ou en utilisant une co- lonne conjuguée à l'antigène. Le conjugué g-GO peut être testé pour son acti- vité enzymatique en mesurant l'oxydation de l'o-dianisi- dine, en présence de peroxydase de raifort; la réaction est suivie au spectrophotomètre par la mesure de la densité optique à 460 nm. Une courbe standard utilisant de la GO purifiée donne à 460 nm, environ 0,42 DO/min/gg d'enzyme. l.b. Coniuqué QactoDeroxvdase-anticDQps anti- lapin de chvre (-LPO). La lactoperoxydase (LPO) de lait d'origine bo- vine est achetée chez Boehringer Mannheim. L'anticorps est obtenu comme dans l'exemple 1.a. Le conjugué g-LPO peut être testé par la mesure de l'oxydation du 2,2'-azinobis-(3-éthylbenzthiazoline sulfonique acide) en présence d'H202. Une courbe standard, obtenue à 435 nm donne en- viron une densité optique de 2,5/min/gg d'enzyme. Les conjugués obtenus en 1.a et 1.b peuvent être conservés en solution, ou de préférence lyophilisés. Exemple 2: Préparation d'immunotoxines compor- tant un anticorps DLC48. De telles immunotoxines ont comme cellules cibles spécifiques les cellules de lymphome SU4. - L'anticorps DLC48 est précipité avec 50 % de sulfate d'ammonium et désalé sur une colonne de Biogel P6. Il est ensuite couplé & des enzymes (GO, LPO, MPO) en utilisant un procédé SPDP/2-iminothiolane (2-IT) décrit par EISEN modifié (quantités de 2-IT diminuées, pH plus bas). On obtient ainsi les immunotoxines suivantes: DLC48-GO, DLC48-LPO, DLC48-MPO. Les quantités en enzyme et en anticorps des conjugués sont calculées comme suit: on estime tout d'abord l'activité enzymatique d'un conjugué donné, puis l'anticorps est estimé par soustraction de la valeur de l'enzyme du conjugué total à 280 nm. Ceci donne une ap- proximation de la quantité réelle en anticorps. La figure 1 montre la spécificité de ces immu- 2o notoxînes vis-à-vis des ce-iules SU4 par rapport à des im- munotoxines contrôle comprenant comme anticorps, le MOPC104E. 5.105 cellules (10.106 cellules/ml dans une so- lution de Dulbecco équilibrée en sel, associée à du sérum bovin fétal à 2, 5 %) sont incubées pendant 30 min à 37C avec des quantités croissantes d'immunotoxines et les cel- lules présentant une activité enzymatique sont estimées par spectrophotométrie. La figure la montre que les conjugués DLC48-G0 (O) se lient spécifiquement avec les cellules de lymphome SU4 et saturent 5.105 cellules SU4 à approximativement 35 ng d'enzyme liée pour moins de 10 pg/ml de conjugué. Le conjugé contrôle MOPC104E-GO (A) et la GO native (*) ne présentent pas une- liaison supérieure à la ligne de base. La figure lb montre des résultats semblables avec le conjugué LPO (O). La saturation est, en ce cas, obtenue autour de mg/5.105 cellules SU4. Il n'y a pas de liaisons non spécifiques avec la MOPC104E-LPO () ou la LPO native (-). Les liaisons des conjugués MPO sont représen- tées sur la figure lc. Le conjugué se lie aux cellules SU4 de la même manière que les autres conjugués. Exemple 3: Cytotoxicité in vitro de la compo- sition conforme à l'invention. i Les diagrammes de la figure 2 montrent le rôle du BCNU dans les compositions conformes à l'invention; les conjugués utilisés sont le Ramb-GO et le Ramb-LPO. Les anticorps Ramb sont obtenus chez le lapin et sont dlrlgés contre les membranes microsomiales de cel- ib iules du plasmocytome MOPC104E. La figure 2 montre l'accroissement de cyto- toxicité dû au BCNU vis-à-vis de cellules; en particulier, cette figure représente des histogrammes et montre l'absorbance à 540 nm, de différentes compositions testées. _ L'hlstogramme a montre l'absorbance correspondant à un mé- lange de Ramb-GO et de Ramb-LPO sans BCNU; l'histogramme b montre l'absorbance correspondant à un mélange d'lmmunotoxines Ramb-GO et RambLPO en présence de BCNU; l'histogramme c montre l'absorbance correspondant à du BCNU seul; l'histogramme d montre l'absorbance correspondant à l'immunotoxine Ramb-GO seule en présence de BCNU; l'histogramme e montre l'absorbance correspondant à l'lmaunotoxine Ramb- LPO seule; l'histogramme f montre l'absorbance correspondant à l'immunotoxine Ramb-LPO seule vo en présence de BCNU; l'histogramme g est un témoin négatif (sans immunotoxine et sans BCNU); l'histogramme h est un témoin négatif (avec BCNU et sans lmmunotoxine). Comme le montrent ces histogrammes, le BCNU augmente l'action aussï bien de l'immunotoxine Ramb-GO seule (histogramme c) que l'action d'un mélange Ramb-GO et Ramb-LPO (histogramme b). Exemple 4: Rôle de la combinaison de deux in- munotoxines dans. la composition conforme à l'invention: effet synergique. L'effet des immunotoxines seules ou en combi- naison sur la viabilité des cellules tumorales est étudié en utilisant trois tests différents: le test de libération s1Cr, le test colorimétrique MTT et la clonogénicité in vitro. Ces tests permettent d'obtenir des réponses si- lo milaires avec les différentes immunotoxines décrites. A titre d'exemple non limitatif, les exemples 4.a, 4.b et 4.c montrent l'effet sur la viabilité cellu- laire des immunotoxines g-GO et g-LO selon l'exemple 1, vis-à-vis des cellules NSO (cellules de plasmocytome mu- rin). 4.a: ____ e_______ 51 - Les cellules NSO sont cultivées in vitro dans du DMEM supplémenté avec 7 % de sérum de cheval décomplé- * menté. 2c - Les con3ugués (g-GO et g-LPO) sont préparés conformément au protocole de l'exemple 1: - les anticorps Ramb sont obtenus chez le lapin et sont dirigés contre les membranes microsomiales de cel- lules de plasmocytome MOPC104E; les conjugués Ramb-GO et Ramb-LPO sont obtenus comme décrit dans l'exemple 1. - Test proprement dit: 1 à 5.106 cellules tu- morales sont marquées avec 100 gCi de 51 chromate de-sodium dans du DMEM-HS 10 % pendant une heure à 37'C dans un incu- bateur à C0 humide. Environ 1 500 à 4 500 cpm sont in- corporés /104 cellules. Les cellules sont lavées et incu- bées pendant 20 min à 37C dans un sérum de lapin contenant des anticorps anti-membrane de plasmocytome (Ramb) dilué au 1/15, ou dans du sérum de lapin normal décomplémenté (RNS), dans un milieu à raison de 10.106 cellules/ml dans des tubes de Falcon n' 2 001, comprenant une solution saline équilibrée de Dulbecco tamponnée au bicarbonate et du HS à 2,5 % décomplémenté (BBSS-HS 2,5 %). Les cellules sont la- vées et 50 Pl (1.105 cellules) sont distribuéep dans les puits d'une microplaque, puis on incorpore 50 il de diff6- rentes dilutions des immunotoxines (g-GO mélangé avec g-LPO ou chaque immunotoxine seule), lesdites dilutions étant réalisées dans du BSS-HS 2, 5 %. Après 20 min d'incubation à 22'C, suivie de deux lavages, les cellules sont mises en suspension dans 100 41 de milieu complet (CM): BBSS-HS ou -FBS 2,5 % supplémenté avec 4 g/l de dextrose et 0,1 mM lO NaI, transférées dans des tubes Falcon n' 2054 et placées à 37"C dans un incubateur à C02 humide pour réaliser la réac- tion cytotoxique. Les tubes sont retirés à des moments dif- férents, centrifugés et la radioactivité libérée est déter- minée sur un échantillon de surnageant de 50 pl. Le pour- centage de 51Cr libéré est déterminé à partir de la formule suivante: coups/min ds surnag. (50 P1) - coups/min B.F.(*) x 100 coups/min ds surnag. - coups/min B.F. Z cell. mises en susp. ds sol. HCl 4N} et correspond au pourcentage de coups/min relargués spéci- flquement. (') B.F. = bruit de fond. Les figures 3a et 3b montrent les quantités de 51Cr libérées à partir des cellules NSO lorsque ces cel- lules sont incubées comme précisé ci-dessus avec des doses différentes de g-GO et/ou de g-LPO. La figure 3a comporte en abscisse la concentra- tion en g-GO ajoutée et en ordonnée le pourcentage de 51Cr libéré. La courbe 1 correspond à une concentration en g-LPO de 0,48 Pg/ml; la courbe 2 correspond à une concentration en g-LPO de 0,12 pg/ml; la courbe 3 correspond à une concentration g-LPO de 0,24 pg/ml; la courbe 4 correspond à une concentration en g-LPO de 0,06 gg/ml; la courbe 5 correspond à une concentration en g-LPO de 0,03 mg/ml. La figure 3b montre que ni le g-LPO seul (courbe 6), ni le g-GO seul (courbe 7) ne provoquent une 264326r cytotoxicité à des doses o le mélange est cytotoxique; seules des doses élevées de g-LPO seul (courbe 6) entraîne une cytotoxicité. On voit que la libération en 51Cr est maximale pour les mélanges de g-GO et g-LPO et lorsque ces mélanges contiennent des concentrations optimales en chacun des deux conjugués comme suit: 0,12 à 0,48 Mg/ml de g-LPO et 0,03 à 0,25 pg/ml de g-GO. 4.b:SaaibTT Les cellules tumorales sont incubées dans des microplaques de microculture à une concentration de 1.106/ml avec différentes dilutions de Ramb-GO et/ou de Ramb-LPO, lesdites dilutions étant réalisées dans du BSS-HS 2,5 % ou du BSS-HS 2,5 % tamponné Hepes (HBSS) ou du BSS-FBS 2,5 %. On utilise comme contrôle des cellules tumorales incubées avec des immunotoxines ne réagissant pas avec lesdites cellules. Après 20 min à 22 C, puis lavage, 1.105 cellules sont transférées sur d'autres microplaques et mises en suspension dans 100 pl de CM et placées à 37C dans un incubateur à COz humide. Apres 45 min à deux heures 2e. d'incubation à 37'C, les cellules sont lavées dans du DMEM- HS 2,5 %, mises en-suspension dans 100 pl de DMEM-HS 2,5 % et 10 Ml de colorant MTT tetrazolium (5 mg/ml) est ajouté à chaque puits. Apres une nouvelle incubation de deux heures à 37'C, les microplaques sont centrifugées et 100 pl de DMSO sont ajoutés à chaque puits. La couleur développée est estimée spectrophotométriquement à 540 nm dans un appareil approprié. La densité optique des cellules tumorales non- traitée (100 % de viabilité) est comprise entre 0,8 et 1,4 de densité optique. Les résultats sont exprimés comme le pourcentage de i'absorbancecontrôle comme suit: DO des cellules traitées - DO de la ligne de base x 100 DO des cellules non-traitées - DO de la ligne de base Les figures 4a et 4b montrent les résultats ob- tenus. 264326T La figure 4a montre plus particulièrement les résultats obtenus avec un mélange des deux immunotoxines et comprend en abscisse la concentration en gg/ml de Ramb-LPO ajouté et en ordonnée la densité optique à 540 nm. La courbe 8 correspond à l'addition de Ramb-GO à une concen- tration de 1 pg/ml; la courbe 9 correspond à l'addition de Ramb-G0 à une concentration de 3 gg/ml. La mise en présence d'une dose aussi faible que 1 pg/ml de Ramb-GO associée à 2 mg/ml de Ramb-LPO réduit l'absorbance de plus de 99 %. La figure 4b montre les résultats obtenus avec soit le Ramb-GO seul (courbe 10), soit le Ramb-LPO seul (courbe 11). Cette figure montre que lorsque les cellules NSO sont mises en présence de 3 ou 4 pg/ml, soit des conju- gués Ramb-LPO seuls, soit des conjugués Ramb-GO seuls, ceux-ci ont peu d'effet sur la densité optique à 540 nm. Le conjugué Ramb-GO est toxique par lui-même seulement à des doses supérieures à 10 pg/ml. Les anticorps ne réagissant pas avec les cellules cibles n'entraînent aucune cytolyse, tel est le cas notamment de l'association Ramb-GO + Ramb- LPO vis-à-vis des cellules tumorales SU4. Une estimation de l'avantage, ou du gain quantitatif, de l'utilisation de la combinaison des deux immunotoxines peut être obtenue lorsqu'on calcule la cytotoxicité 50 % (environ une D.O. de 0,6) des courbes dose-réponse: le gain en cytotoxicité spécifique, obtenu avec l'association des deux immuno- toxines est environ de 3. Ce calcul est effectué en compa- rant la courbe 8 (figure 4a) et la courbe 10 (figure 4b). 4.c: essai de clonognicité Les cellules tumorales sont incubées comme dé- crit dans l'exemple 4.a (test au 5lCr), la concentration cellulaire étant de 0,6.106/ml. Après une incubation de 20 min à deux heures à 37'C dans du CM, les cellules sont la- vées deux fois, mises en suspension dans du DMEM-HS 10 % et sont distribuées à des concentrations de 104, 103, 102 et 10 cellules par puits dans des plaques de microculture à fond plat comprenant 96 puits. Les plaques sont cultivées à 264326T 37'C pendant 6 jours; au sixième jour les cellules sont supplémentées avec 100 pl de milieu frais et au douzième jour de 100 p1 de milieu est retiré et est remplacé par p1 de milieu frais. Les microplaques sont observées au microscope et les résultats sont exprimés par la fréquence de cellules survivantes. (figure 5) Le nombre de cellules tumorales qui ne sont pas détruites est estimé au moyen.du test de clonogénicité. Tant des cellules NSO indirectement ciblées, 0lo c'est-à-dire tout d'abord incubées avec un sérum de lapin contenant des anticorps anti- membrane de plasmocytome puis incubées avec des conjugués g-GO et g-LPO, en association, que des cellules NS0 directement ciblées avec Ramb-GO. + Ramb-LPO sont détruites très efficacement. La figure 5 comporte en abscisse le temps (en minutes) d'incubation dans le milieu CM, et en ordonnée, le pourcentage de cellules survivantes; la destruction cellulaire est une fonction du temps: les cellules NSO sont ciblées indirectement par incubation en présence de Ramb suivie d'une seconde incubation avec l'asscciation g- GO + g-LPO pour une concentration de 0,6 x 106 cellules/ml (O) ou pour une concentration de 2,5 x 106 cellules/ml (X), ou seulement avec g-GO pour une concentration de 0,6 x 106 cellules/ml ( À) ou avec g-LPO pour une concen- tration de 0,6 x 106 cellules/ml (Zi). Lorsque la première incubation est réalisée dans du sérum de lapin normal (NRS) à la place de Ramb, suivie d'une seconde incubation, on obtient la courbe sui- vante (g-GO + g-LPO pour 0,6 x 106 cellules/ml (A)). Le témoin négatif est représenté par la courbe (,S), pour la- quelle des cellules NSO (0,6 x 106 cellules/ml) sont incu- bées avec du Ramb ou dans un milieu tel que DMEM-HS 10 %. Dans tous les cas, le g-GO est ajusté à 0,05 pg/ml et le g-LPO est ajusté à 0,3 gg/ml. Après lavage, les cellules sont mises en sus- pension dans du CM, et aux temps indiqués sur l'axe des abscisses des échantillons sont retirés, lavés dans du DMEM-HS 10 % et mis en cultures sur des microplaques pour différentes concentration cellulaires. Les survivants sont comptés au 14ème jour. Lorsque les conjugués sont utilisés seuls ((); (z)), le g-GO () n'est pas cytotoxique et le g-LPO (ai) est peu toxique (deux logs de décroissance de viabilité en environ 100 minutes); le couple g-GO + g-LPO ( O; X) est très toxique, le ciblage à 0,6 x 106 cel- lules/ml étant optimal, entraîne un effet synergique des deux conjugués. En extrapolant la courbe, on peut obtenir six logs de décroissance cellulaire en un temps inférieur à minutes, ce qui permet d'envisager l'épuration d'autogreffes. Les témoins NSO ciblés avec du sérum de lapin normal (NRS) puis les deux conjugués (A,) et NSO sans ad- jonctions, ne sont pas cytotoxiques, ce qui démontre la spécificité du système. Exemple 5: Spécificité de l'effet cytotoxique ?c des immunotoxines conformes à l'invention. Cecl est réalisé avec un test MTT par estima- tion de la quantité de conjugués spécifiques versus la quantité de conjugués non spécifiques, ou les quantités d'enzymes natives GO ou LPO, ne réagissant pas avec les cellules testées. Comme le montre la figure 6 une quantité aussi faible que 0,01 pg/ml de g-GO mélangée à 0,3 gg/ml de g-LPO est suffisante pour obtenir un effet cytotoxique spé- cifique au point limite de 50 % et ceci est en accord avec les résultats obtenus avec le test de libération du 51 Cr (figure 3a). Par contre, l'incubation de cellules NSO avec des conjugués non spécifiques (ne réagissant pas avec les- dites cellules) ou des mélanges d'enzymes GO et LPO natives ne produisent qu'une cytotoxicité marginale. Le point li- Z5 mite de 50 % de cytotoxicité spécifique est séparé du point limite de cytotoxicité non spécifique par au moins 4 logs, ce qui correspond & un gain en cytotoxicité obtenu à l'aide des conjugués spécifiques. Ainsi le ciblage de cellules tu- morales par ces immunoconjugués réduit considérablement les concentrations efficaces du couple oxydase-peroxydase pou- vant procurer une cytotoxicité spécifique. La figure 6 montre le gain en cytotoxicité spécifique et comporte en abscisse la concentration en g-GO (mg/ml) et en ordonnée le pourcentage d'absorbance. La composition selon l'invention, de par la présence de deux immunotoxines entraîne une synergie de la toxicité spécifique, tout en neutralisant la toxicité non spécifique. Exemple 6: Absence de toxicité des immuno- toxines de l'invention vis-à-vis des cellules souches de la moelle osseuse. Lors de l'application de la composition conforme à l'invention à l'épuration de la moelle osseuse de cellules cibles appropriées, il est nécessaire de s'assurer en particulier de l'absence de toxicité des _- lmmunotoxines vis-à-vis des cellules souches. Une suspension de cellules de moelle osseuse est préincubée dans un sérum de lapin normal (NRS) dilué au 1/15e puis le ou les conjugués sont ajoutés comme indiqué ci-dessus. Les cellules sont incubées 20 min (exp. 1, 3, 4) ou 3 heures (exp. 2) dans un milieu CM, lavées et mises dans un milieu de clonage contenant de la carboxyméthylcel- lulose. Le nombre de colonies représentant des cellules souches hématopoiétiques est compté 14 jours plus tard. / TABLEAIL Traitement nombre de colonies récupé- (mg/ml) rées /105 cellules nucléées de moelle osseuse lère expérience -_ 244 43 g-GO + g-LPO (0,05) (0,3) 240 28 g-GO + g-LPO (1) (0,3) 313 6 g-GO + g-LPO (1) (2,5) 336 26 2ème Expérience 317 24 g-GO seule (30) g-LPO seule (30) 225 5 g-GO + g-LPO (10) (30) 263 9 264326? Traitement nombre de colonies récupé- (pig/ml) rées/105 cellules nucléées de moelle osseuse 3ème expérience gGO seule (25) g-GO + g-LPO (25) (1) g-GO + g-LPO (25) (10) 233 2 (25) (75) 267 8 4ème expérience 312 30 GO seule (25) GC + LPO t(500) (300) 244 Le tableau t montre que les immunotoxines g-GO et g-LPO associées ne sont pas toxiques pour les cellules formant colonies de la moelle osseuse même à la dose cyto- toxique optimale (lère expérience). Cependant l'incubation de cellules de la moelle dans 30 pg/ml de g-GO seule est très toxique pour les cel- lules et entraîne la destruction de tous les précurseurs (2ème expérience). Dans une étude sur la relation dose-réponse de ce phénomène de protection observé, on a remarqué que 10 pg/ml de g-LPO protège partiellement les cellules souches et 75 ig/ml de g-LPO protège jusqu'à 76 % des cellules souches (3ème expérience). Ainsi, le conjugué g-LP0 possède 264326? la propriété de neutraliser l'effet toxique non spécifique du conjugué g-GO. La composition conforme à l'invention en asso- ciant une nitrosourée aux deux immunotoxines telles que dé- finies, permet de réduire énormément les doses employées et de ce fait de telles compositions sont moins létales pour les cellules de l'environnement. Exemple 8: Exemple de formulation. Une formulation de l'invention est préparée comme suit: DLC48-GO 5 mg DLC48-LPO 5 mg BCNU 5 mg SAH 100 mg Tampon acétate 100 mM Ethanol 0,09 % eau p.p.i. 1 ml Lesdits composés sont mélangés, filtrés stéri- lement et conditionnés. ú Une formulation Iyophilisée peut être ensuite obtenue. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien- nent d'être décrits de façon plus explicité; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. RE]VYDIC&TION 1') Composition & propriétés cytolytiques spé- cifiques vis-&-vis de cellules cibles appropriées pr6sen- tant au moins un antigène de surface, caractérisée en ce qu'elle comprend en combinaison: - un inhibiteur de la glutathion réductase; - au moins une immunotoxine comprenant une en- zyme conjuguée à un ligand spécifique d'un antigène de sur- face des cellules cibles. 2') Composition selon la revendication 1, ca- ractérisée en ce qu'elle comprend.en combinaison: - un inhibiteur de la glutathion réductase; - une première immunotoxine comprenant une en- zyme E productrice d'oxygène réactif conjuguée à un ligand A spécifique d'un antigène de surface desdites cellules cibles (immunotoxine Ei-A); et - une deuxième immunotoxine comprenant une en- zyme E2, productrice de dérivés halogénés en présence d'un halogénure etde l'oxygène réactif produit en présence de Zo l'enzyme Ei, conjuguée à un ligand B capable de se lier spécifiquement à un antigène de surface desdites cellules cibles (immunotoxine E2-B). 3 ) Composition selon l'une quelconque des re- vendications 1 et 2, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la glutathion réductase est une nitrosourée. 4') Composition selon la revendication 3, ca- ractérisée en ce que la nitrosourée est avantageusement la 1-3 bis (2chloroéthyl)-1-nitrosourée, également dénommée carmustine ou BCNU. 5') Composition selon l'une quelconque des re- vendications 1 et 2, caractérisée en ce que l'enzyme de l'immunotoxine selon la revendication 1 ou de la première immunotoxine selon la revendication 2 est choisie dans le groupe qui comprend la glucose oxydase, la NADPH oxydase, la xanthine oxydase, la cholestérol oxydase, la choline oxydase, l'acide lactique oxydase et la pyruvate oxydase. 6') Composition selon l'une quelconque des re- vendications 2 à 5, caractérisée en ce que l'enzyme E2 est choisie dans le groupe qui comprend la myéloperoxydase, la lactoperoxydase, l'éosinophile peroxydase et la peroxydase salivaire. 7) Composition selon l'une quelconque des re- vendications i à 6, caractérisée en ce que le ligand conju- gué & une enzyme pour constituer une immunotoxine est choi- si dans le groupe qui comprend les antisérums, les anti- corps polyclonaux, les anticorps monoclonaux et les frag- ments d'anticorps, capables de se lier spécifiquement à un antigène de surface de la cellule cible. 8') Composition selon l'une quelconque des re- vendications 2 à 7, caractérisée en ce que le ligand A et le ligand B sont identiques ou différents. 9') Composition selon l'une quelconque des re- vendications 7 et 8, caractérisée en ce que lesdits ligands A et/ou B sont avantageusement choisis parmi les ligands. des récepteurs de l'antigène cellulaire T et les ligands de $ l'immunoglobuline de surface. ') Composition selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 9, caractérisée en ce que les cellules cibles appropriées sont choisies dans le groupe qui com- prend les cellules tumorales, les bactéries, les champi- gnons, les protozoaires, les cellules autoimmunes, les cel- lules inflammatoires, les cellules infectées par un virus, les levures, les virus, les parasites. 11>) Composition selon l'une quelconque des re- vendications i à 10, caractérisée en ce qu'elle contient en outre, une autre immunotoxine qui comprend une catalase conjuguée à un ligand C approprié, capable de se lier aux antigènes de surface de cellules présentes dans le même mi- lieu que les cellules cibles (immunotoxine catalase-C). 12') Composition selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle est asso- ciée à un véhicule propre à permettre son administration de préférence par voie parentérale et avantageusement en IV ou en perfusion. 13') Procédé d'épuration ex vivo de la moelle osseuse de-cellules cibles indésirables présentant au moins un antigène de surface, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: (a) aspiration des cellules de la moelle os- seuse, (b)-mise en contact desdites cellules avec une composition selon l'une quelconque des revendications 1 & 11, pendant un temps approprié. 14') Procédé d'épuration de la moelle osseuse ex vivo de cellules cibles indésirables présentant au moins un antigène de surface, caractérisé en ce qu'il comprend successivement les étapes suivantes: (a) aspiration des cellules de la moelle os- seuse, (b} mise en contact desdites cellules avec une quantité efficace d'inhibiteur de la glutathion réductase puis (c) mise en contact desdites cellules avec une quantité efficace d'une immunotoxine constituée par un conjugué d'une enzyme avec un ligand capable de se lier spécifiquement à un antigène de surface spécifique des cel- lules cibles. ) Procédé d'épuration ex vivo de la moelle osseuse selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il comprend successivement les étapes suivantes: {-a) aspiration des cellules de la moelle os- seuse, (b) mise en contact desdites cellules avec une quantité efficace d'inhibiteur de la glutathion réductase puis (c) mise en contact desdites cellules avec une quantité efficace d'une première immunotoxine constituée par un conjugué d'une enzyme Ei générant de l'oxygène réac- tif avec un ligand A capable de se lier spécifiquement à un antigène de surface spécifique des cellules cibles, asso- ciée à une deuxième immunotoxine Ez-B, comprenant une en- zyme E2 productrice de dérivés halogénés en présence d'un halogénure et de l'oxygène réactif produit en présence de l'enzyme Ei, conjuguée à un ligand B capable de se lier spécifiquement à un antigène de surface desdites cellules cibles. 16') Procédé d'épuration selon l'une quelconque io des revendications 14 et 15, caractérisé en ce qu'il com- prend en outre (d) la mise en contact desdites cellules avec une autre immunotoxine catalase-C, comprenant un conjugué d'une catalase avec un un ligand C approprié, capable de se lier aux antigènes de surface de cellules présentes dans le même milieu que les cellules cibles. 17') Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 13 à 16, caractérisé en ce que l'inhibiteur de la gluthation réductase est une nitrosourée. * 2% 18-) Procédé selon la revendication 17, carac- térisé en ce que la nitrosourée est avantageusement la 1-3 bis (2-chloroéthyl)-l-nitrosourée, également dénommée car- mustine ou BCNU. 19') Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 13 à 18, caractérisé en ce que l'enzyme qui entre dans le conjugué qui forme l'immunotoxine ou la première immunotoxine est choisie dans le groupe qui comprend la glucose oxydase, la NADPH oxydase, la xanthine oxydase, la cholestérol oxydase, la choline oxydase, l'acide lactique oxydase et la pyruvate oxydase. *) Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 15 à 19, caractérisé en ce que l'enzyme E2 est choisie dans le groupe qui comprend la myéloperoxydase, la lactoperoxydase, l'éosinophile peroxydase et la peroxydase salivaire. 21') Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 14 à 20, caractérisé en ce que le ligand conjugué à l'enzyme selon la revendication 14 et/ou à chacune des enzymes selon la revendication 15 est choisi dans le groupe qui comprend les antisérums, les anticorps, les fragments d'anticorps capables de se lier spécifiquement à un anti- gène de surface de la cellule cible. 22') Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 13 à 21, caractérisé en ce que les cellules cibles à détruire sont des thymocytes et l'antigène de sur- face est une protéine caractéristique des thymocytes. 23') Procédé selon la revendication 22, carac- térisé en ce que ledit antigène de surface est choisi dans le groupe qui comprend l'antigène T4, l'antigène T8 et l'antigène Thyl. 24') Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 13 à 23, caractérisé en ce que les cellules cibles a détruire sont des cellules B de lymphomes.