FR 2640877 A1 19900629 FR 8815940 A 19881206 Procédé de préparation d'une librairie de déterminants antigéniques peptidiques et nouveaux peptides constitués par ou comportant les déterminants antigéniques obtenus. La présente invention a trait à un procédé de préparation d'une librairie de déterminants antigéniques peptidiques, librairie composée de peptides dont certains, au moins, présentent un déterminant antigénique similaire ou identique à un déterminant antigénique d'un produit exprimé par un microorganisme ou une cellule. L'invention est applicable, notamment, à la constitu- tion d'une librairie de peptides portant les déterminants antigéniques d'un virus tel que HIV, et en particulier, HIV1. L'une des principales difficultés rencontrées dans le domaine de l'immunologie consiste à identifier et à localiser,'dans une protéine exprimée par un organisme vivant, notamment un microorganisme, ou à partir d'un virus, le ou les quelques déterminants antigéniques ou épitopes constitués d'une séquence continue d'acides aminés. Généralement, ces épitopes continus sont étudiés par synthèse peptidiqe chimique ainsi que par des analyses informatiques de séquences (1) Ces procédés ont permis de caractériser quelques épitopes continus pour le virus HIVI mais ils ne sont guère faciles à utiliser pour une recherche et une caractérisation systématique de tous les épitopes d'une, voire de la totalité des protéines exprimées par un génome, par exemple, génome de HIV1. La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients et de fournir un procédé de préparation d'une librairie de déterminants antigéniques peptidiques continus pour le virus HIV1. Un autre objectif de l'invention est de fournir un tel procédé qui puisse également être utilisé pour la caractérisation de déterminants antigéniques peptidiques continus pour d'autres organismes ou microorganismes. Un autre objectif de l'invention est encore de fournir une librairie constituée par ou contenant des épitopes con- tinus de gènes, voire de génomes, de procaryotes, notamment HIV1, ou d'eucaryotes. Les épitopes caractérisés par le procédé selon l'invention peuvent être ensuite utilisés, notamment par voie de synthèse peptidique chimique ou biologique, pour préparer des substances de tests ou de diagnostic, destinées notamment à la recherche d'anticorps, pour faciliter la recherche d'anticorps monoclonaux spécifiques d'épitopes, ou pour préparer des vaccins. L'invention a pour objet, un procédé de préparation d'une librairie de déterminants antigèniques peptidiques d'une protéine ou d'une pluralité de protéines exprimée(s) par un organisme ou microorganisme et correspondant à son génome ou à une partie de son génome, par exemple un ou plusieurs gènes, caractérisé en ce que, - on fragmente ce génome ou cette partie de génome au hasard en une multitude de petits fragments pour constituer une librairie de fragments d'acide nucléique, - on exprime lesdits fragments dans un système d'expression ne présentant pas d'homologie avec ledit génome ou ladite partie de génome, à l'aide d'un vecteur d'expression approprié, - on crible la totalité ou la majeure partie des produits d'expression à l'aide d'anticorps, monoclonaux ou non, - et, éventuellement, on localise, dans une carte, les fragments reconnus lors du criblage et/ou on détermine leurs séquences. La première étape de fragmentation peut porter soit sur un génome entier, par exemple le génome de HIV1, soit une partie de génome suffisamment grande pour comporter une grande partie ou la totalité du gène codant pour une protéine dont on cherche à caractériser les épitopes. Si le matériau génétique initial est sous forme d'ARN, on utilise sa transcription ADN obtenue soit par voie naturelle, soit par un procédé usuel de transcription inverse. Par petits fragments dans le sens de la présente inven- tion, on entend des fragments d'ADN obtenus au hasard et ayant une taille de quelques dizaines à quelques centaines de paires de bases et qui, de préférence, pour la majorité d'entre eux, n'est pas supérieure à 50 à 150 pb (paires de bases) et, de préférence, de l'ordre de 50 pb. La fragmentation du matériau génétique traité peut être effectuée, de préférence, par digestion partielle enzyma- tique, par exemple, par DNAseI. Elle peut également être effectuée par tout autre méthode de fragmentation permettant de"réaliser au hasard une multitude de petits fragments, par exemple, par sonication. Dans le cas de la fragmentation de l'ADN proviral de HIV1, on peut obtenir 4x104 clones environ. Le système d'expression préféré, notamment pour la con- stitution de librairies virales, est une levure, de préférence, Saccharomyces cerevisiae. Ce système est préféré à des systèmes bactériens, car il permet de nombreuses modifications posttraductionnelles des peptides exprimés et, en outre, il ne comporte pas d'éléments toxiques pour les mammifères. Un procédé d'expression de protéines dans cette levure, utilisant le gène du facteur alpha, a déjà été décrit (2-5). La biosynthèse (5) du facteur alpha, qui est l'une des deux hormones peptidiques impliquées dans la reconnaissance sexuelle de la levure, inclut la formation d'un grand précurseur dont la partie N-terminale est vraisemblablement impliquée dans la reconnaissance d'un système de sécrétion alors que la moitié C-terminale contient quatre domaines hormonaux séparés par des sites de clivages spécifique Lys- Arg. Lorsqu'un ADN étranger est inséré en aval du premier site de clivage, la protéine recombinante peut être sécrétée dans le milieu de culture, pratiquement vierge de résidus de levure, avec des glycosylations sur les sites N- et même 0-. L'étape d'insertion des fragments dans la levure peut être effectuée de toute façon, en soi connue, en utilisant, par exemple, un vecteur plasmidique. Une fois la librairie plasmidique constituée, la cul- ture cellulaire, telle que Saccharomyces cerevisiae, est transfectée puis clonée. On peut alors procéder au criblage des clones à l'aide d'un lot de sérums et/ou d'anticorps selon des procédés usuels, par exemple selon Lyons et Nelson (13). Pour caractériser les séquences des inserts reconnus lors du criblage, on peut reprendre les vecteurs de la colonie du clone d'expression, par exemple levure, et récupérer les inserts qui peuvent être sous-clonés et séquences par l'un quelconque des procédés usuels de séquençage. La reconnaissance de fragments ayant réagi et se chevauchant partiellement simplifie cette étape. L'application du procédé selon l'invention au génome de HIV1 a permis de caractériser six épitopes continus dont deux n'avaient- jamais été décrit. La présente invention a également pour objet les nouveaux peptides contenant ces épitopes ou constitués par eux, et notamment un épitope dans l'endonucléase (pol). D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemples non limitatif et se référant au dessin annexé dans lequel: - la figure 1 représente la structure générale du précurseur du facteur alpha de Saccharomyces cerevisiae, - la figure 2 représente une carte du plasmide d'insertion et de transfection pSE-X, - la figure 3 représente le cadre de lecture au site de clonage de ce plasmide, - la figure 4 représente les chevauchements de séquence de plusieurs inserts définissant des épitopes, - la figure 5 représente les réactions comparées de différents sérums et anticorps détectant les épitopes exprimés dans la levure. - la figure 6 représente des courbes de sécrétion de peptides recombinants de plusieurs clones reconnus par l'un des sérums par test ELISA, - la figure 7 représente des courbes de sécrétion et de durée de croissance par mesure de la turbidité d'un clone reconnu par l'un des sérums. 1. CONSTITUTION D'UNE LIBRAIRIE DE PETITS FRAGMENTS DE HIV1. On a utilisé comme matériau de départ le plasmide pBT-1 qui est un plasmide pUC-18 (pUC18 est disponible chez Inter- national Biotechnologies, Inc., P.O.BOX 9558,'275 Winchester avenue, New Haven, CT 06535 USA), intégrant un provirus com- plet de HIV1, isolat BRU (10). Ce plasmide pBT-1 est acces- sible dans la collection du Professeur Luc Montagnier ou Pierre Sonigo, Institut Pasteur, 25 rue Dr Roux 75015 PARIS. Une quantité de 20 pg de pBT-1 a été digérée partielle- ment par la DNAse I selon le procédé décrit par Anderson (11), les conditions de lyse enzymatique et de purification des fragments par électrophorèse en gel d'agarose ayant été adaptées pour obtenir des fragments de l'ordre de 50-150 pb. Les extrémités des fragments obtenus ont été réparées par l'ADN polymérase du phage T4, mais n'ont pas été modifiées par l'adjonction d'ADN synthétiques du type linker. 2. CONSTRUCTION DU VECTEUR pSE-X. Ce plasmide, obtenu à partir de pUC18 comporte cinq parties d'ADN étranger à savoir: un fragment de 600 pb du gène du facteur alpha (MFO portant un site d'origine de réplication. La région du. plasmide pUC18, qui permet le polyclonage au voisinage du site de clivage Hind III, a été éliminée. Cette construction plasmidique comporte un site de res- triction Hind III à la fin du fragment du gène MFc 1. La construction peut être effectuée de la façon suivante: partant du plasmide pUC18, on insère entre les sites Hind III - BamHI, un fragment Hind III - BamHI de 600 pb du gène du facteur qui porte le promoteur suivi de la séquence codante jusqu'au premier site de clivage Lys - Arg. Ensuite, on insère dans le site NdeI du plasmide, l'origine de réplication 2 microns de la levure puis le gène URA3. Le fragment PvuII - BamHI de 185 pb a été éliminé par restric- tion. Ce plasmide, mis au point par Allan Myers, Department of Biochemistry and Biophysic, Iowa State University, Ames, IA 50011, USA, et dénommé pSE3 (construction non publiée) a alors été modifié par échange du fragment de 90 pb Hind III - PvuII par un fragment de 35 pb Hind III XbaI du vecteur pEX2 (9), ce qui insère un codon stop pour chaque cadre de lecture du gène du facteur -x Dans le plasmide ainsi modifié, on insère dans le site PvuI de LacZ, le fragment EcoRI-Hind III de 400 pb du vecteur pTRP54 (3) qui contient tous les signaux terminateurs de ce gène dans la levure (3), ce qui donne le vecteur pSE-X. Toutes les liaisons mettant en oeuvre des extrémités d'ADN non compatibles ont été effectuées après traitement préalable à l'enzyme de Klenow ou à la T4 ADN polymérase. Le plasmide pSE-X a été déposé, dans E. coli, le 1er décembre 1988 sous le numéro 1-822 auprès de la CNCM (Col- lection Nationale de Cultures de Microorganismes). 3. INSERTION DES FRAGMENTS DANS LE VECTEUR pSE-X. Les fragments obtenus selon 1. ci-dessus ont été insérés dans la construction pSE-X à l'emplacement du site de restriction Hind III. Les différents vecteurs ainsi obtenus ont été utilisés pour transformer une souche de E. Coli (souche SCS1 de la société Stratagene), ce qui a permis d'obtenir environ 40.000 clones indépendants qui ont été amplifiés. Une analyse au hasard de 12 clones montre que 91 % possédaient un fragment inséré. 4. TRANSFECTION DE LA LEVURE. La souche de Saccharomyces cerevisiae W303-1B (MAT,c leu2, his3, ura3, trpl, ade2) a été utilisée (Slonimsky, CNRS, CGM, avenue de la Terrasse, 91190 Gif sur Yvette). Les différentes colonies bactériennes selon 3. ont été réunies et ont permis la préparation de 5 mg d'ADN plasmidique. 10 microgrammes de cet ADN ont été introduits dans la souche de levure précitée en utilisant la procédure au lithium (12). A titre de contrôle positif, on a également cloné dans le site Hind III de pSE-X un fragment d'ADN pstI-ApaI de 587 pb de pBT-1 codant pour les 167 résidus C-terminaux de la protéine p25 et les 28 résidus N-terminaux de la protéine p13 de HIV1. Cette construction a été appelé pGAG. 5. CRIBLAGE DES CLONES. Environ 10.000 clones de levure ont été dispersés sur boite de Pétri contenant un milieu sélectif (3) pour la per- sistance de plasmides contenant URA3. Après 30 heures de culture à 30'C, les levures ont été transférées sur filtre nitrocellulose et lysées in situ (13). La feuille de filtre a été analysée à la manière d'un western blot (procédure au lait écrémé). Toutefois, la plupart des sérums humains ont dû être immunoadsorbés de la façon suivante: de la levure de boulanger (Fould-Springer) a été dispersée dans de l'eau (lml d'eau par gramme de levure) et maintenue à 100'Cpendant mn. Le pH a été ajusté à 7, 3 et 0,05 volume de tampon 10X PBS a été ajouté. Les sérums ont été dilués dans le lysat de levure au 1/300 et incubés à 4 'C pendant une nuit. Après centrifugation, le surnageant a été utilisé directement pour l'incubation avec les filtres de nitrocellulose. On -a utilisé des seconds anticorps couplés à la péroxydase. La diaminobenzidine en présence de nickel (14) a été utilisée pour la coloration jusqu'à ce que le clone de contrôle négatif portant le plasmide pSE-X sans insert devienne légèrement visible. Le criblage a été effectué à l'aide de: trois sérums, 3, 5 et 6, fournis par l'Institut Pasteur et provenant de patients qui se sont avérés positifs pour toutes les protéines structurales du virus HIV1 dans une analyse western blot; un anticorps monoclonal humain, référencé m, provenant d'un volontaire pour un essai de vaccination (12) et trois anticorps monoclonaux de souris référencés a à c et dirigés contre la glycoprotéine gp110 de HIV1. Les résultats apparaissent sur la figure 5, qui a été obtenue comme pour une expérience de criblage, sauf qu'ont été étalés des clones préalablement caractérisés (en ce sens qu'il ont été détectés par des anticorps lors des expériences de criblage, et que les épitopes produits ont été identifiés), chaque clone étant étalé sous forme d'une longue trainée. La feuille de nitrocellulose, après transfert des protéines, a été découpée perpendiculairement aux traînées, de sorte que chaque bandelette de filtre contenait en zones successives, les protéines (donc les épitopes) des clones de levures étudiées. Ainsi, l'activité de différents anticorps (sérum ou monoclonaux) a pu être aisément comparée. On a utilisé onze sérums humains, numérotés de 1 à 11, provenant de patients qui se sont avérés positifs pour toutes les protéines structurales du virus HIV 1 dans une analyse western blot, l'anticorps monoclonal humain, référencé m, et cinq anticorps monoclonaux de souris référencés de a à c (trois dirigés contre la gpO110: a, b et c; un dirigé contre la p25: d et un contre la gp41: e). Comme on pouvait s'y attendre, la colonie relative au plasmide de contrôle dépourvu de fragment, pSE-X, n'a été révélée par aucun des anticorps ou sérums. La colonie rela- tive au plasmide pGAG, contruite à titre de contrôle posi- tif, a révélé les sérums 5, 7, 10 et 11 ainsi que l'anticorps de souris d. En particulier, le sérum 5 a révélé, de façon très intense, la colonie de contrôle et avait donc été utilisé pour un premier criblage de la librairie. Ce criblage avait révélé 7 colonies référencées 1 à 7 et qui ont été analysées. Dans ce but, les plasmides présents dans chaque colonie positive ont été repris dans E. Coli (12). Des fragments PstI portant les inserts ont été sous clones dans M13 mp19 et séquences en utilisant soit une amorce classique M13 soit l'oligonucléotide TGCCAGCATTGCTGCT. Les différentes séquences chevauchantes que l'on obtient ont été représentées sur la figure 4 sur laquelle la numérotation des nucléotides est celle de GENEBANK référence HIVBRUCG. Les clones 1 à 4 ont révélé un premier épitope dans gp41 avec la structure suivante: YLKQQLLGIWGCSGKLICTTAVPW. Les clones 5 à 7 ont défini un deuxième épitope dans p25, ayant la structure TETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEM. L'épitope de gp41 est vraisemblablement le principal épitope viral actuellement localisé (16) et déjà utilisé sous forme de peptide synthétique dans des tests sanguins de seconde génération. Les deux anticorps monoclonaux de souris d et e (25.7 et 41.1), tous deux induits contre le virus entier avait été cartografiés dans ces positions. Ces anticorps monoclonaux ont réagi fortement avec quatre des sept clones et faible- ment avec les trois autres. Si cependant on analyse le sur- nageant de ces trois derniers clones dans un test ELISA, la réaction de ces anticorps monoclonaux s'avère également forte. Un examen attentif suggère la présence d'un second épitope dans les clones 5, 6 et 7 ayant révélé un épitope dans la région p25. L'anticorps monoclonal 25.7 (d) a révélé de façon pratiquement identique, les clones 5 et 6. Cepen- dant, le sérum humain 10 a fortement détecté le clone 5 sans détecter le clone 6. En fait, le clone 5, lorsqu'on le com- pare au clone 6, a inséré un fragment plus long, codant pour 17 aminoacides supplémentaire du côté N-terminal et on peut supposer qu'un autre épitope se trouve dans cette région. Du fait que les sérums 3 et 6 se sont avérés négatifs pour les clones 1 à 7, ils ont été utilisés pour un nouveau criblage de la librairie à la recherche d'autres épitopes. Le sérum 6 a alors détecté deux colonies, référencées 8 et 9, qui, après analyse et séquençage, se sont avérées pro- duire un épitope continu dans l'endonucléase (pol). La structure de cet épitope est: ASDFNLPPVVAKEIVASCDKCQLK. D'autres sérums (9, 10 et 11) ont également détecté cet épitope qui représente donc un épitope majeur de HIV1. Le criblage à l'aide de l'anticorps monoclonal humain m a révélé un clone, 10. A l'analyse, ce clone produit les 38 derniers résidus de gp41 (ce clone utilise effectivement le codon stop du gène env de HIV1 au lieu d'un signal stop pro- venant du vecteur. Du fait que le peptide synthétique com- posé des 15 derniers résidus de gp41 ne réagit pas avec l'anticorps monoclonal m, l'épitope en question n'est prob- ablement pas disposé complètement à l'extrémité C mais un peu en amont. Un épitope majeur dans les 129 derniers résidus de gp41 a déjà été décrit mais non encore carto- grafié exactement (18). Aucun épitope n'ayant été localisé dans gp110 par les criblages précités, il a été effectué un nouveau criblage à l'aide des anticorps monoclonaux de souris a (110.1), carto- graphié en 494-517, b (110.4) cartographié en 308-325 et c (110.5) non cartographiés. Le monoclonal a a détecté deux clones 11 et 13 alors que b et c ont détecté le même clone 12, ce qui suggère que ces anticorps sont similaires. 6. ETUDE DES CARACTERISTIQUES DES SECRETIONS DES CLONES. Des plaques ELISA ont été recouvertes de différentes quantités de surnageants de culture des colonies et on a procédé à l'immunodétection des épitopes. Les clones 3, 4 et 7 (voir figure 7), de même que les clones 11, 12 et 13 se sont avérés secréter de grandes quantités de peptides du fait que quelques microlitres de milieu de culture contien- nent suffisamment d'antigène pour entrainer des densités optiques proches de 1 lors de la réaction avec les anticorps. La courbe de sécrétion en fonction du temps a été estimé de façon similaire (figure 7). Ces clones ont donné un pic d'antigène après 30 heures de culture après quoi on assiste à une lente diminution. Les cinétiques de croissance de ces clones sont pratiquement identiques à- celles de la levure de contrôle logeant le plasmide pSE-X dépourvu d'insert, soulignant la très faible toxicité des produits recombinants exprimés. REFERENCES. 1. Westhof, E. et al. Nature 311, 123-126 (1984). 2. Ernst, J. F., Mermod, J. J., DeLamarter, J.F., Mattaliono, R. J. & Moonen, P. Biotechnology 5, 831-834 (1987). 3. Miyajima, A., Bond, M. W., Otsu, K., Arai, K. & Arai, N. Gene 37, 155-161 (1985). 4. Brake, A. J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 4642-4646 (1984). 5. Sterne, R. E., Fuller, R. S. & Thorner, J. Ann. Rev. Physiol. 50, 345-362 (1988). 6. Gnann, J. W., Nelson, J. A. & Oldstone, M. B., J. Virol. 61, 2639-2641 (1987). 7. Zagury, D. et al. Nature 332, 728-731 (1988). 8. Windheuser, M. G. & Wood, C. Gene 64, 107-119 (1988). 9. Stanley, K. K. & Luzio, J. P. EMBO J. 3, 1429-1434 (1984). 10. pBT-1 Luc Montagnier, Pierre Thiollais, et Marc Alizon; non publié;le plasmide pBT a le même insert que le phage >J19 = Alizon M. et al. Nature 312, 757-760 (1984); séquence des des nucléotides disponibles dans GENBANK sous le matricule HIVBRUCG. 11. Anderson, S. Nucleic Acids. Res. 9, 3015-3026 (1981). 12. Sherman, F., Fink, G. R. & Hicks, J. B. in Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986). 13. Lyons, S. & Nelson, N. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7426-7430 (1984). 14. De Blas, A. L. & Cherwinski, A. M. Anal. Biochem. 133, 214-219 (1983) REVENDICATIONS. 1. Procédé de préparation d'une librairie de déterminants antigéniques peptidiques continus d'une protéine ou d'une pluralité de protéines exprimée(s) par un organisme ou microorganisme et correspondant à son génome ou à une partie de son génome, caractérisé en ce que, - on fragmente ce génome ou cette partie de génome au hasard en une multitude de petits fragments pour constituer une librairie de fragments d'acide nucléique. - on exprime lesdits fragments dans un système d'expression ne présentant pas d'homologie avec ledit génome à l'aide d'un vecteur d'expression approprié, - et on crible la totalité ou la majeure partie des pro- duits d'expression à l'aide d'anticorps, monoclonaux ou non. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on séquence les fragments reconnus lors du criblage. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on l'applique au génome entier d'un virus. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le virus est HIV1. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on effectue la fragmentation dans des conditions conduisant à des fragments ayant en majorité une taille qui n'est pas supérieure à 50 pb. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on exprime lesdits fragments dans un système de levure. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on utilise'Saccharomyces cerevisiae, notamment dans le gène du facteur ". 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on insère les fragments dans le vecteur plasmidique ayant la construction décrite sous pSE-X, à l'emplacement du site de restriction Hind III. 9. Nouveaux peptides incluant ou contenant un épitope détecté par le procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 8. 10. Nouveaux peptides selon la revendication 9, con- tenant ou composés par au moins un épitope continu de HIV1. 11. Nouveaux peptides selon la revendication 10, con- tenant ou composés par l'épitope de l'endonucléase (pol). 12. Application des peptides selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, à la préparation de substances de test ou de diagnostic ou de vaccin.