FR 2639357 A1 19900525 FR 8913325 A 19891012 L'invention concerne un procédé amélioré pour la fixation de protéines sur des supports solides en conservant dans une large mesure leur activité biologique. Toutes sortes de méthodes ont été proposees pour la fixation de matières biologiquement significatives sur des supports solides (cf. par exemple K. Buchholz, "Characterization of Immobilized Biocatalysts" dans Dechema-Monographie, vol. 84, n' 1724-1731, Verlag Chemie 1979). Conviennent, comme supports solides, aussi bien des matières inorganiques qu'organiques. Pour certaines d'entre elles, elles proviennent de matières présentes dans la nature; pour d'autres, elles sont produites par voie synthétique. Dans le cadre de la présente invention, il est porté intérêt aux supports fonctionnalisés, en particulier & ceux qui comportent des groupements réactifs qui réagissent avec les groupements nucléophiles de matières biologiquement significatives, telles notamment que des enzymes ou descellules, et, de la sorte, donnent lieu & une liaison covalente. De nombreux groupements fonctionnels réactifs (électrophiles>, qui sont connus dans la chimie organique technique et qui réagissent dans des conditions biologiquement acceptables avec les fonctions amino, thio ou hydroxy (nucléophiles) des matières biologiquement significatives, ont été utilises avec plus ou moins de succès pour la fixation covalente (les groupements disponibles pour leur fixation au support pouvant agir de façon limitative. On trouvera des indications détaillées dans K. Buchholz, op. cit.; cf. en outre Ullmann's Encyclopadie der techn. Chemie, 4ème édition, vol. 10, pp. 539-545, Verlag Chemie 1975; Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5ème édit., vol. A9, pp. 382-383, Verlag Chemie 1988). Des méthodes d'activation souvent appliquées sont par exemnle. dans le cas de supports comportant des groupements -OH. la réaction avec du cyanure de brome oour la formation des imides ou la réaction avec des s- triazines halogenees, dans le cas de supports comportant des groupements NH2, la diazotation ou la réaction avec le dialdéhyde glutarique et, dans le cas de supports comportant des groupements -COOH, la transformation en groupements azide d'acide ou l'activation avec par exemple le carbodiimide, connue d'après la synthèse de peptides. Des supports ayant par exemple des fonctions anhvdride ou époxy conviennent pour la réaction directe avec les nucléophiles présents, en particulier avec les fonctions amine des protéines. La fixation covalente de matières biologiquement significatives offre une série d'avantages par rapport & d'autres methodes de fixation. On citera entre autres la non-migration de la matière, la facile accessibilité des Structures actives fixées généralement sur la surface du support et, bien souvent, une stabilité thermique accrue. Mais d'autre part, il a fallu aussi s'accommoder occasionnellement de certains inconvénients, par exemple: a) un effet nuisible sur l'activité biologique par modification partielle des centres actifs;; b) une interaction trop forte entre le support et la matière fixée, limitant la mobilité et l'accessibilité de celle-ci; c) la difficulté de trouver les conditions de réaction optimales en fonction de la nature de la matière biologique (cf. Ullmann's Encyclopedia of industrial Chemistry, 5ème éd., vol. A9, op. cit., p. 384). Ullmann indique, comme autre inconvenient de la fixation ccvalente, en dehors de la non-régénérabilité du support, 1':moossibilité d'appliquer la méthode à toutes les cellules. De fait, dans des cas détermines, les conseéquences de l'immobilisation covalente indiquées en a) et en b) representent un handicap majeur pour cette methode. Cela peut être illustré par un exemple concret: Pour l'immobilisation des types les plus divers de protéines, un système de support constitué par un copolymère réticulé du (méth)acrylamide et du (méth)acrylate de glycidyle, de préférence sous forme de perles, s'est révélé excellent (produit du commerce Eupergit C , cf. DE-C 27 22 751, US-A 4 190 713, US-A 4 511 694). L'interaction principale entre ce système de support et les protéines se produit entre les groupements époxyde et les groupements amine libres des protéines. Toutefois, cette interaction n'est généralement pas limitée à un ou à quelques points de fixation, mais elle peut se produire en de nombreux autres points. En fin de compte, la fixation covalente aboutit alors à une inactivation de la protéine fixée. Le blocage des groupements amine, essentiels pour l'activité, peut aussi conduire, en cas de réactions avec le support, à l'inactivation de la protéine fixée. Il y avait donc à trouver le moyen de réaliser la fixation covalente de matières biologiquement significatives, dans toute la mesure du possible au moyen de systèmes de support éprouvés, sans les inconvénients mentionnés, en particulier sans l'inactivation biologique complète ou partielle. La présente invention concerne une façon de proceder oui peut etre appliquée en liaison avec les procedés de l'état de la technique pour la fixation covalente de matières biologiquement significatives & structure de protéines, l'activité biologique de ces matières étant toutefois conservée. Le procède selon l'invention pour la fixation covaiente de protéines biologiquement actives P sur des supports solides T comportant des groupements fonctionnels FG consiste en ce que, dans une première etape réactionnelle, les groupements amino les plus actifs de la protéine P sont modifiés par un agent chmic=ique qui peut être éliminé de façon réversible dans des conditions contrôlées, en ce que, dans une deuxième etape réactionnelle, la réaction avec les groupements fonctionnels FG du support T est effectuée, en ce que, dans une autre étape réactionnelle, les groupements fonctionnels FG restants du support T sont bloqués chimiquement et en ce qu'enfin le reste RE' de l'agent chimique RE modifiant les groupements amino de la protéine P est éliminé de façon contrôlée. L'anhydride diméthylmaléique convient particulière- ment bien comme agent chimique modificateur RE qui peut être éliminé de façon réversible dans des conditions contrôlées. Katières de support Le procédé de l'invention est applicable en principe avec toutes les matières de support T avec lesquelles le problème mentionné se pose manifestement, c'est-à-dire lorsqu'une interaction trop forte se produit entre le support et l'objet à fixer ou lorsque la fixation s'effectue en des points des matières biologiquement significatives qui ont une importance décisive pour l'activité biologique de ces matières et dont le blocage entraîne un amoindrissement ou la suppression de l'activité biologique. Ce risque peut être différemment grand pour différents groupements réactifs donnant lieu a une fixation covalente et pour des supports de différentes natures, mais il existe touJours en principe, en particulier en cas de densité suffisamment elevee et en cas de grande facilité de réaction --non indésirable en soi - des groupements fonctionnels electrophiles dans des conditions acceptables biologiquement (cf. K. Buchholz, op. cit., pp. 49-63; Ullmann, 4ème édition, vol. 10, op. cit. p. 540). En tant que groupements de ce genre, on peut citer par exemple des derives d'acides comme par exemple des halogénures d'acides, des azides, des esters activés, des imidoesters, des anhydrides d'acides et aussi, dans un sens plus large, des imidocarbonates, des isothiocyanates, des triazines halogenees, ainsi que des fonctions aziridine et en particulier époxyde (oxiranne). On prendra encore pour exemple le système de support, par ailleurs remarquablement approprié, constitue par un copolymere reticulé du méthacrylamide avec le methacrylate de glycidyle (Eupergit C mentionne précédemment). Des recherches sur la structure et l'activité de ce système de support conduisent a l'hypothèse d'une densité de groupements époxy à la surface, caractérisée par une distance de 5 A avec, en même temps, une forte perméabilité des systèmes. Il tombe immédiatement sous le sens que dans de telles conditions, avec des matières à fixer déterminées - ce qui signifie dans le cas normal avec certaines protéines P - il se produit un "multi point attachment" (liaison multipoint) qui est suivi des effets négatifs mentionnés. Il y a toutefois lieu de souligner une fois encore qu'avec d'autres systèmes de support aussi, dans la mesure o il existe une densité suffisamment élevée des groupements fonctionnels FG et des conditions de structure suffisantes, c'est-a-dire une accessibilité suffisante, il se produit l'effet du "multi point attachment" qui peut avoir des consequences négatives. De ce point de vue, on ne peut exclure ni des supports inorganiques, comme par exemple le verre modifié en surface, en particulier silanise, le gel de silice, des argiles telles que la bentonite et l'hydroxyapatite, des metaux ou des composes métalliques tels entre autres que le nickel, l'oxyde de nickel, le dioxyde de titane, le dioxyde de zirconium (cf. E. Katchalski-Katzir, L. Goldstein Ed., Applied Biochemistry and Bioengineering, vol. 1. pp. 23 sqq.; H.H. Weetall Ed., Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and Peptides, Marcel Dekker, New York 1975, pp. 1 sqq.>, ni des polymeres organiques existant naturellement (modifies) ou produits synthetiquement. Comme exemples des premiers, on mentionnera en particulier des polyosides qui peuvent être rendus fonctionnels par reaction avec le cyanure de brome pour donner l'imide cyclique, avec l'acide chloTractique pour donner le derivé carboxyméthylé ou l'azide, par introduction d'un groupement amino diazotable ou par introduction d'un groupement glycidyl(éther) (cf. K. Luchholz, Characterization of Immobilized Biocatalysts, op. cit., pp. 52-54). Comnme on peut le comprendre facilement, la plus grande variabilité existe dans le cas de supports à base de polymères organiques synthétiques. D'une part, on utilise des polymères dans lesquels des groupements réactifs sont introduits ultérieurement par des réactions analogues sur polymère et, d'autre part, on peut aussi préparer des supports polymères par copolymérisation de monomères contenant des unités réactives. Outre la présence de groupements fonctionnels FG, on peut attendre de la matière de support T une capacité de charge mécanique, une stabilité physique, chimique et biologique et une innocuité toxicologique suffisantes. L'actualité de la présente invention sera illustrée par l'exemple d'un support T contenant des groupements epoxy. Comme prototype, on peut prendre le copolymère réticulé d'acrylamide ou de methacrylamide et d'acrylate ou de méthacrylate de glycidyle qui a déja éte cite et qui se compose de préférence de particules en forme de perle. De tels polymères de support sont décrits dans les brevets DE-C 27 22 751 ou US-A 4 190 713, ainsi que US-A 4 511 694. Les perles ont en règle générale un diametre de 5 a 1000 >m, en particulier de 30 & 1000 Mm et elles présentent une cavité intérieure (perles creuses). A titre d'indication de lateneur du polymère de support T en groupements glycidyle qui peuvent être mis en réaction, on donnera une valeur de 0,8 à 2,5 pmol par mg de matière de support sèche. On trouvera dans le tableau suivant d'autres caractéristiques d'un polymere matrice du cor.m=re (Eupergit C de Rbhm GmbH) qui est representctif des polymères de support T du type en questl4f. Caractéristiques Dimension Grosseur moyenne de grains 140 - 180 pm Diamètre des pores 40 nm Limite d'exclusion = L._ 2,10' daltons Surface active pour la fixation 180 m2/g (à sec) Teneur en époxydes 800 - 1000 mol/g (à sec) Absorption d'eau 2,3 ml/g (a sec) Densité = d42 1,20 Masse volumique apparente 0,34 g/ml Capacité de fixation (dans les conditions usuelles) Albumine humaine 48 g/g (humide) IgG humaine 34 mg/g (humide) Caractéristiques de gonflement à l'eau 1: 1,4 1 ml (à sec) donne 1,4 ml (humide) Caractéristiques Dimension Solubilité /dans l'eau, des tampons et des solvants organiques) insoluble Stabilité à la pression 300 bars Au microscope électronique, on distingue la structure macroporeuse des perles avec des canaux et des cavités qui ont un diametre de 0,1 à 2, 5 jm (1000 & 25 000 A), ce qui fait que les molécules d'enzyme ou de substrat d'une grosseur de 10 à 100 A peuvent atteindre la totalité de l'intérieur de la matrice macroporeuse. Matières biologiquement significatives Les matières biologiquement significatives, que la presente invention vise à fixer de façon aussi optimale que possible sur des supports T, ont déjà été caractérisées précédemment (état de la technique). Elles présentent en règle generale des groupements nucléophiles. en particulier des groupements amino, qui reagissent avec les groupements fonctionnels FG des supports T dans des conditions acceptables biologiquement. Il s'agit en particulier de protéines. On mentionnera des biocatalyseurs tels que des enzymes, ainsi que des cellules, des organites et des matières et structures à activité immunologique, en particulier des anticorps. Les biocatalyseurs immobilisés peuvent servir par exemple à la production ou à la transformation de substrats de différents genres, tels que des amino- acides, des peptides et des enzymes, de sucres, d'acides organiques, d'antibiotiques, de stéroïdes, de nucléosides et de nucléotides, de lipides, de terpénoides et de substances chimiques de base (cf. Ullmann, 5ème édition, vol. 9A, op. cit., pp. 389-390). En tant que structures à activité immunologique, on citera par exemple des micro-organismes tels que les bactéries gram-positives et gram- négatives, les spirochètes, les mycoplasmes, les mycobactéries, les vibrions, les actinomycetes, les protozoaires tels que les protozoaires intestinaux, les amibes, les flagellés. les sporozoaires, les nematodes intestinaux et les nematodes tissulaires (vers), les trématodes (schistosomes, sangsues), les cestodes, les toxoplasmes, ainsi que les champignons, tels que sporotrichum, cryptocoecus, blastomyces, histoplasma, les coccidioïdes, candida, les virus et les rickettsies, notamment de l'hepatite du chien, du papillome de Shope, de la grippe A + B, de la peste aviaire, de l'herpès, des adénovirus. des polyomes, les virus de la variole, de la poliomyelite, de la rougeole, de la maladie de Carrée, de la leucémie, des oreillons, de la maladie de Newcastle, d'ECHO, de la fièvre aphteuse, de la psittacose, de la rage. de l'extromelie, les virus d'arbres, d'autres antigenes tissulaires, les enzymes telles que le chymotrypsinogène du pancréas, la procarboxypeplidase, la glucose-oxydase, la lactate-déshydrogenase, l'uricase, i'amino-acide oxydase, l'uréase, l'asparaginase, des proteases, les antigènes des cellules sanguines, les substances des groupes sanguins et d'autres isoantigenes, tels que les plaquettes sanguines, - les leucocytes, les protéines plasmatiques, les protéines du lait, les protéines de la salive, les protéines de l'urine. les anticorps, y compris les auto-anticorps. On mentionnera en particulier les anticorps monoclonaux qui sont dirigés par exemple contre des antigènes des types suivants. Classe d'antigènes Antigène Bactériens Toxoïde tétanique Polyoside de H. influenza type b Toxine diphtérique Chlamydia trachomatis X. leprae Lipopolyoside/endotoxine Pneumocoques LPO de P. aeruginosa Classe d'antigenes Antigène Bacteriens Exotoxine de P. aeruginosa Streptocoques groupe A, glucide Viraux Nucléeoprotéine du virus de la grippe X31 Virus de la rougeole HSV glycoproteine D Virus de la rougeole, nucléocapside, Virus de la maladie d'inclusion cellulaire Virus A de la grippe Antigenes de virus de la rubéole HTLV I Varicelle-zona HBsAg Autoimmuns ADN double brin Celluies des îlots de Langerhans (diabète sucré) Xyasthenis gravis, antigenotypes Récepteur de thyréotropine Facteur de rhumatisme Récepteur d'acétyl-choline Corps thyroïde Sperme Tumoraux Cancer du sein Cancer de la prostate Cancer du poumon - Cancer de l'estomac Mélanome BD2 (mèlanome humain) Gliome Cancer du rectum Leucémie Cancer du col Tis:.aires/ Rhésus D sarz.n s Antigène de groupe sanguin A HLA-A, B, C, DR Pilaments intermédiaires Classe d'antigènes Antigène Autres Paludisme Antigène de Forssman Erythrocytes de mouton Nitrophénol Dinitrophénol Trinitrophénol Hémocyanine de keyhole limpet (KLH> Facteur de rhumatisme Insuline Execution du procede de l'invention Dans une première étape réactionnelle du procédé, les groupements nucléophiles les plus actifs, en regle generale dans la pratique les groupements amine de la prote-t P. sont modifies par un agent chimique REqui peu.. f limine de façon réversible dans des conditions cc4 te.e. c'est-à-dire, dans toute la mesure du possible, sans consequences negatives sur l'activite de la protéine. Entrent de préférence en ligne de compte. comme agents chimiques RE, ceux qui ont la structure suivante l O o R a A c c j o c dans laquelle R est mis pour un groupement méthyle et R' pour un atome d'hydrogène ou un groupement methyle, et dans laquelle A et A' sont mis pour des groupements methyle ou symbolisent une double liaison. On citera en particulier l'anhydride dimethylmaléique et i'anhydride citraconique. L'utilisation de l'agent chimique anhydride 2,3dimethylmaléique a déjà ete décrite pour la modification covalente d'anticorps au niveau de leurs groupements amino (cf. N. Endo, N. Umemoto. Y. Kato, Y. Takeda et T. Hara, J. Immunol. Methods, I04 (1-2) 253-258, 1987). Ce procédé consiste à bloquer par l'agent chimique les groupements amino responsables du pouvoir d'action de l'antigène, puis à modifier les groupements amino restants et enfin à éliminer par hydrolyse le groupement protecteur dimethylmaleyle. La methode a été appliquée pour la conjugaison covalente de méthotrexate (MTX) avec deux anticorps monoclonaux au moyen de l'ester N- succinimidyicque de MTX. De façon semblable. des anticorps anti-mélanome monoclonaux ont été mis en réaction avec l'anhydride dimethylmaléique, puis avec la N-acetylhomocvsteine-thiolactone pour y introduire des groupements thiol réactifs qui peuvent réagir ultérieurement avec formation de liaisons S-S (cf. demande PCT WO 87/4174). On est parvenu de cette manière à une reaction avec le thiopropyl-Sepharose 4B. Il y a lieu de voir la présente invention dans le fait que la fixation de matières biologiquement significatives peut s'effectuer directement au moyen des groupements nucléophiles restants, en particulier de leurs groupements amino: pour cela, de façon surprenante, un nombre suffisant de ces groupements est encore disponible avec une accessibilité stérique suffisante pour la fixation, en dépit d'un fort excès d'agent chimique. La modification ou activation des groupements amino qui restent après le blocage par les agents chimiques R, en vue de la fixation sur le support T, n'est donc pas nécessaire, ce qui constitue un progrès important par rapport à l'état de la technique. D'une maniere -générale, le procede selon l'invention peut être conduit de la manière suivante. On prepare une solution, de préférence en utilisant un tampon se situant opportunément dans la gamme alcaline (par exemple à un pH de 8,7) et ayant une teneur en NaCl, tampon qui contient la matière biologiqement significative, en règle générale une protéine, par exemple un anticorps; on mélange avec un excès de l'agent chimique RE(environ 200 - 500 mol) qui a été dissous dans un solvant approprié, de préférence miscible à l'eau, en particulier le dimethylformamide (DXF), la teneur en solvant étant maintenue opportunément au-dessous de 5% en poids par rapport à la solution. Puis on met en incubation, opportunément sous refroidissement, par exemple dans un bain de glace, pendant 45 15 mn, pour que se produise la modification désirée de la matièere biologiquement significative. On transfère ensuite le liquide ainsi obtenu dans un récipient approprié (par exemple un verre de centrifugeuse) qui contient la matière de support T et on met en incubation, par exemple tout d'abord pendant quelques heures (4 h environ à titre d'indication), puis pendant un temps beaucoup plus long, par exemple quadruple, à température réduite mais au- dessus de O'C, par exemple à 4'C. Après quoi, le blocage des groupements fonctionnels FG du support T qui ne sont pas entrés en réaction est effectué au moyen d'agents chimiques: dans le cas de supports contenant des groupements époxy, par exemple par réaction avec du 2-mercaptoéthanol, par exemple sous forme d'une solution 0,2 N et à la température ambiante. En regle générale, il suffit là aussi de laisser agir pendant plusieurs heures, par exemple pendant 4 h. La matière de support chargée est ensuite lavée, par exemple avec une solution tampon standard de phosphate (PBS). L'élimination des groupements protecteurs (qui ont été appliques sous forme de l'agent chimique R) est effectuée de preference par hydrolyse dans une gamme de pH apprczriée, par exemple dans la gamme faiblement acide, nota:-ment à un pH de 5,5, une duree d'hydrolyse d'environ 1 h pouvant être mentionnée a titre indicatif. La matière de support est ensuite lavée une fois encore avec PBS. Détermination de l'immuno-capacité d'antizcrrs fixes selon l'invention. La caDac:te de fixation des anticorps;.mobilises selon l'invention est déterminee par la mesure des antigenes, en particulier d'enzymes comme par exemple l'anti-carboxypeptidase (CPA), qui se fixent sur les anticorps. A cet effet par exemple, de la CPA en quantités constantes dans PBS est ajoutée à des tubes à essais qui contiennent chacun 100 mg de la matière de support T chargée. mais avec des charges différentes d'anticorps monoclonaux immobilises. La part de CPA fixee aux anticorps du polymère de la matrice a été déterminee comme suit: a) par détermination de la différence des teneurs respectives en protéine au moyen du test de Bradford et Pâr l'activité enzymatique qui était présente dans la $=lution de départ et finalement dans la solution residuelle, D) par détermination de l'activité enzymatique de l'enzyme immobilisée sur les perles de support T, par exemple au moyen de la méthode a la Ninhydrine dans le cas de la CPA. La détermination par le moyen de l'activité enzymatique est appliquée dans tous les cas o sont présents des anticorps qui n'ont pas d'influence défavorable sur l'activité enzymatique. Il se révèle que les anticorps fixés.' a matière de support conformément & l'invention conservent leur pleine activité immunologique pour la fixation de l'enzyme, par exemple de la CPA. Le rapport molaire d'anticorps monoclonaux a la CPA varie dans les limites de 2:1 à 1:1. Effets avantageux Les effets avantageux du procédé de l'invention seront décrits a propos d'une forme de réalisation dans laquelle des anticorps avaient été fixés sur une matière de support contenant des groupements époxy. En comparant des anticorps qui avaient éte fixés sur le même système de support T (Eupergit CM) par le procéde de l'invention et par le procédé de l'état de la technique, on a obtenu (avec une charge d'anticorps de 10 mg/g d'Eupergit C) les résultats reproduits dans le tableau. L'activité de tous les anticorps qui avaient été immobilisés selon l'invention s'était élevée. Le surcroît d'activité pour les différents anticorps variait entre 3 fois et id,7 fois, visiblement en fonction des caractérirF-flues spécifiques des anticorps individuels. Dans la mesure o les résultats obtenus Jusqu'ici permettent une affirmation, seule l'anti-peroxydase de raifort sauvage mAB, l'anticorps HRP2, n'a pas produit de surcroît d'activité après son immobilisation au moyen du procédé de l'invention, en comparaison de la méthode classique. L'influence de l'agent chimique RE a été déterminée avec des charges d'anticorps de grandeurs différentes par gramme de matière de support en forme de perles T. Afin de remplir les conditions préalables pour une comparaison directe entre les deux méthodes, le même anticorps (CPAB) a été immobilisé par les deux procédés dans la même expérience. Le surcroît d'activité le plus marqué pour les anticorps immobilisés a été observé lorsque la charge d'anticorps était faible. Tableau Comnaraison des activités d'anticorps anti-CPA qui avaient été immobilises sur de l'Euoergit C par la methode classique et par le procédé de l'invention avec l'anhydride dimethylmaléique Activité des anticorps* Anticorps Méthode Procedé selon Facteur monoclonaux classique l'invention d'augmentation CPA1 0,040 0,362 9,0 CPAE 0,060 0,216 3,6 CPA9 0,082 0,242 3,0 CPA14 0.102 0,300 3,0 CPA18 0,030 0,322 10,7 * L'activite des anticorps est exprimée par l'activite de la CPA qui a été immobilisee par l'anticorps. L'actlvite de la CPA a été déterminée par la méthode à la Ninhvdrine. Les valeurs dans le tableau représentent l'absorptin nette a -50 nm après déduction de la valeur à blanc. Les resultats favorables obtenus en appliquant le procédé de l'invention permettent de développer une conception du mode d'action des anticorps immobiliseés sur l'Eupergit Cm. conception qui doit toutefois être sans influence sur la portée de la présente invention. Le succès du procédé repose principalement sur le blocage des fonctions oxiranne libres avant que la concentration d'agent chimique REn'ait baissé. Si le procédé se déroule de cette manière, on peut s'attendre à ce que deux mécanismes prennent effet. En premier lieu, les groupements amino, qui sont essentiels pour l'action des anticorps et qui ont été protégés par la réaction avec l'agent chimique RE avant la fixation au support, ne subissent pas la modification et peuvent donc déployer leur activité. En second lieu, le nombre des points de fixation entre les anticorps et la matière de support T ne peut qu'être relativement petit en comparaison du nombre auquel on doit s'attendre en cas d'interaction avec des anticorps non prétraités. En outre, on ne doit pas oublier qu'en dépit du fait que les points de fixation principaux proviendraient de l'interaction des groupements oxiranne avec la fonction amino de la lysine, d'autres groupements, comme par exemple les groupements sulfhydryle de restes cystéine, ainsi que les groupements hydroxyle de la tyrosine et de la serine, pourraient être aussi impliqués. Il se peut aussi que le blocage réversible de ces groupements hvdroxy contribue a l'augmentation d'activité supplémentaire des anticorps immobilisés Les exemples qui suivent sont destines a illustrer l'invention. Exempl 1 Technique opératoire générale On introduit 0,5 mg de perles de support (Eupergit C de la firme Rbhm GmbH) dans des tubes de centrifugeuse de Beckman d'un volume de 5-10 l1. Une solution des anticorps (5-10 pg par échantillon. 0,3-1,3 gg/jl, 5-30 pl) dans 25 mM de tampon de borate de sodium de pH 8, 7, qui contient 1 M de NaCl, est mélangée avec un excès (x 400 mol/mol) d'anhydride diméthylmaléique dans le diméthylformamide (DMF), la concentration résultante de DMF ne devant pas dépasser 5% en poids. Après que la solution a été mise en incubation dans un bain de glace pendant 30 - 60 mn, les anticorps modifiés sont ajoutés aux perles de support T et le mélange est maintenu pendant 4 h & la température ambiante, puis pendant 16 h encore & 4'C. Les groupements oxiranne (époxyde) encore présents sont alors bloqués chimiquement, par traitement du produit conjugué support-anticorps par une solution de 2- mercaptoéthanol (0,2 X, 4 h & la température ambiante). Les perles sont ensuite lavées avec une solution tampon ?639357 de phosphate stand-rd des anticorps monoclonaux murins, spécifiques pour la choriogonadotropine humaine, 3) des anticorps monoclonaux murins, specifiques pour l'insuline humaine, 4) une preparation d'anticorps polyclonaux de chèvre, specifique pour le fragment FG de l'IgG murine. Les activités d'anticorps anti-carboxypeptidase A l'invention étaient augmentées (c: tableau). L'augmentation d'activité a atteint, avec les différents anticorps, de 3 a 10,7 fois, visiblement en fonction des caractéristiques spécifiques des anticorps individuels. D'après les résultats disponibles Jusqu'ici, il n'y a *U que l'antiperoxydase de raifort sauvage mAB, HPR2, à ne pas présenter d'augmentation d'activité après son immobilisation selon l'invention, en comparaison des produits d'immobilisation obtenus par le procedé de l'état de la technique. Dans les exemples qui précèdent, on a utilisé un excès molaire de 400 fois d'anhydride dimethylmaléique par rapport aux anticorps. Des études de variation du rapport anticorps/anhydride diméthylmaléique ont fait apparaître que des doses relativement faibles d'anhydrIde dimethylmaléique suffisent pour parvenir au plein effet. Un optimum pas très marqué a été enregistré dans la gamme d'un excès molaire de 200 à 500 fois. Si l'on élève l'exces jusqu'à 10 000 fois la concentration d'anticorps, il se produit une baisse progressive d'activité des anticorps immobilisés. REVENDICATIONS 1.- Procede de fixation covalente de protéines biologiquement actives sur des matieres de support solides presentant des groupements fonctionnels, caractérisé en ce que, dans une première étape reactionnelle, les groupements amine particulièrement réactifs de la proetéine sont modifiés par un agent chimique RE qui peut être élimine de façon réversible dans des conditions controlees, en ce que, dans une deuxième etape réactionnelle, la protéine est mise en réaction avec les groupements fonctionnels FG de la matière de support, en ce que, dans une troisième étape reactionnelle, les groupements fonctionnels FG restants de la matière de support T sont bloqués chimiquement et en ce que, dans l'étape réactionnelle finale, les groupements modificateurs RE', formes à partir de l'agent chimique RE sont éliminés en une réaction contrôlée. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce que l'agent chimique Eest un composé de formule A O R / XC Pl O R g | \ C dans laquelle R est mis pour un groupement méthyle. R' pour un atome d'hydrogène ou un groupement méthyle et A et A' sont mis pour des groupements methyle ou symbolisent une double liaison. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérise en ce que l'agent chimique REest choisi dans le groupe constitue par l'anhydride dimethvlmaléique et l'anhydride citraconique. 4.- Procédé selon - la revendication 2 ou. 3. caractérise en ce que l'agent chimique REest utilisé en un excès molaire de 200 à 500 fois par rapport aux protéines. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour la fixation d'anticorps. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la matière de support solide T présentant des groupements fonctionnels comporte des groupements oxiranne en tant que groupements fonctionnels. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la matière de support solide presentant des groupements fonctionnels est constituée par des perles creuses comportant des groupements oxiranne. 8.- Procedé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la première étape réactionnelle est conduite dans une solution tampon faiblement alcaline, de préférence a un pH de 8,7. 9.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la solution tampon est en outre 1 M en NaCi. 10.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans la deuxième étape réactionnelle, on met la protéine modifiée au moyen de l'agent chimique RE en incubation avec la matière de support, tout d'abord pendant quelques heures à la température ambiante, puis pendant un temps à peu près quadruple à une température peu supérieure à O'C. - Procedé selon la revendication 1 ou 11, caractérise en ce que dans la troisieme etape reactionnelle. on traite le produit conjugue de proteine et de la matière de support T, forme dans la deuxième etape reactionnelle, par une solution de 2- mercaptoethanol pour le blocage des groupements oxlranne encore presents. 12.- Procede selon l'une quelce:que des revendications 1 et 10-11, caractérise ï:: ce qu'on 0 debarrasse par hydrolyse le produit de la --tsième etape reactionnelle du groupement protecteur RE' orme a partir de l'agent chimique RE.